Doktorarbeit_Marc_7_nach Kolloq

Aus der Medizinischen Universitätsklinik
Abteilung Innere Medizin IV
(Nephrologie)
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
Die Rolle von micro-RNAs bei der Entwicklung der
Mausniere
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
Vorgelegt 2008
von Marc Philipp Albersmeyer
geboren in Freiburg i. Br.
-Für meine Eltern-
Dekan:
Prof. Dr. Christoph Peters
Erster Gutachter:
Prof. Dr. Thomas Benzing
Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Heymut Omran
Jahr der Promotion: 2008
1.
1.1
1.1.1
1.1.2
1.1.3
1.2
1.3
2.
2.1
2.1.1
2.1.2
2.1.3
2.1.4
2.1.5
2.1.6
2.1.7
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
2.9
2.10
3.
3.1
3.1.1
3.1.2
3.1.3
3.1.4
3.1.5
3.2
3.2.1
3.2.2
3.2.3
3.4
4.
5.
6.
7.
7.1
7.2
7.3
Einleitung ..........................................................................................................1
Überblick über die Entwicklung der Mausniere.................................................1
Bedeutung und Funktion der Niere ...................................................................1
Die Morphogenese ...........................................................................................1
Molekularbiologische Aspekte der Nierenentwicklung, Klinik............................4
Einführung in das Gebiet der micro-RNAs........................................................8
Fragestellung und Zielsetzung der Arbeit .......................................................21
Methoden........................................................................................................22
Materialien und Lösungen..............................................................................22
Gewinnung embryonaler Nieren und RNA-Extraktion.....................................22
In situ – Hybridisierung: whole mount, Schnitte, embryonale Nierenkultur .....22
Zell- und Organkultur ......................................................................................24
DNA, Plasmide und Klonierungen ..................................................................24
Herstellung von siRNA....................................................................................24
Transfektionen ................................................................................................24
Luciferase-Assay ............................................................................................24
Gewinnung, Kultur und Fixierung embryonaler Nieren ...................................25
RNA-Gewinnung für microRNA-Micro-Array...................................................25
In situ-Hybridisierung: „whole mount“ sowie embryonale Nierenkulturen .......27
In situ-Hybridisierung: Paraffinschnitte ...........................................................29
DNA, Plasmide, und Klonierungen .................................................................30
Zellkultur .........................................................................................................31
Herstellung von siRNA....................................................................................31
Transfektionen ................................................................................................32
Luciferase-Assays ..........................................................................................32
Ergebnisse......................................................................................................34
Expressionsprofil von 427 micro-RNAs während der Nierenentwicklung .......34
Anordnung und Auswertung des Micro-Arrays ...............................................34
Vergleich der einzelnen Zeitpunkte mit der Referenz Sample 9 .....................37
Vergleich der einzelnen Zeitpunkte untereinander..........................................40
Analyse der absoluten Expression..................................................................48
Beurteilung des Micro-Arrays..........................................................................49
Expressionsanalyse durch in situ-Hybridisierung............................................50
„Whole mount“ – in situ-Hybridisierung...........................................................50
Schnitt– in situ-Hybridisierung ........................................................................54
In situ-Hybridisierungen embryonaler Nierenkulturen .....................................58
Validierung der Funktion der miRNA let-7 durch Luciferase-Assays ..............60
Diskussion ......................................................................................................63
Zusammenfassung .........................................................................................67
Literatur...........................................................................................................68
Anhang ...........................................................................................................76
Abkürzungen...................................................................................................76
Danksagung....................................................................................................78
Lebenslauf ......................................................................................................80
1.
Einleitung
1.1
Überblick über die Entwicklung der Mausniere
1.1.1 Bedeutung und Funktion der Niere
Die Niere ist eines der Hauptausscheidungsorgane unseres Körpers. Sie erfüllt zwei
grundlegende Funktionen:
1. Die Niere eliminiert den Großteil der Stoffwechselendprodukte; diese werden
dem Blut entzogen, um mit dem Urin ausgeschieden zu werden.
2. Die Zusammensetzung der Körperflüssigkeiten (beispielsweise Salzgehalt und
Harnsäurekonzentration) wird von der Niere durch Kontrolle von Exkretion und
Reabsorption verschiedener Substanzen reguliert. Darüber hinaus erfüllt die
Niere auch noch wichtige Aufgaben im Hormon- und Vitaminhaushalt des
Körpers.
Da die Entwicklung der Niere bei Modellorganismen wie Xenopus oder Dario rerio
(Zebrafisch) relativ gut zu beobachten ist und die Nierenentwicklung auch in vitro
nachgeahmt werden kann, dient die Niere seit längerer Zeit als Modell, um
Mechanismen der Organentstehung zu verstehen. So konnten einige Phänomene
näher beobachtet werden, die während der Nierenentwicklung eine große Rolle
spielen. Dazu gehören:
•
Verzweigung epithelialer Gangstrukturen („branching“)
•
wechselseitige Induktion der Morphogenese
•
Zellmigration, -adhäsion, -proliferation, -differenzierung, -polarisation
•
Mesenchymal-epitheliale Transformation
Auf diese Weise konnten auch einige Gene identifiziert werden, die insbesondere bei
erblichen Nierenerkrankungen eine Rolle spielen. Die starke Konservierung
genetischer Hierarchien zwischen unterschiedlichen Spezies unterstreicht die
gemeinsame Herkunft der embryonalen Nieren in allen Vertebraten – und ermöglicht
so eine sinnvolle Verwendung von Modellorganismen wie Xenopus, Dario rerio,
Gallus gallus (Haushuhn) und Mus musculus (Maus), um letzten Endes auch die
Entwicklung der menschlichen Niere besser zu verstehen.
1.1.2 Die Morphogenese
Das Anlagematerial für die Nieren und Harnwege von Säugetieren stammt aus dem
intermediären Mesoderm, dem unsegmentierten Mesodermabschnitt, der lateral der
1
Somiten ein vom Hals bis zum Sakralbereich reichendes Blastem (Holonephros)
ausbildet. Erstes morphologisches Zeichen der Nierenentwicklung ist die Bildung des
Urnierenganges (Wolff-Gang). Dabei handelt es sich um einen epithelialen
Gewebsstrang mit Lumen, der sich auf Höhe des 12. Somiten nach kaudal bis zur
Kloake ausdehnt. In drei Abschnitten bilden sich in kranio-kaudaler Abfolge im
umgebenden Mesenchym epitheliale Tubuli. Der kraniale Teil der gebildeten Tubuli
bleibt beim Menschen rudimentär und wird als Pronephros (Vorniere) bezeichnet.
Nur niedere Vertebraten wie Xenopus entwickeln funktionelle Vornieren. Die weiter
kaudal gelegenen Tubuli bilden das Mesonephros (Urniere). Es enthält einige
wenige, komplett funktionsfähige Nephrone, die in utero in der Lage sind, Urin zu
filtrieren. Wie auch die Vorniere ist die Anlage des Mesonephros nur transient. Die
Nachniere (Metanephros) entwickelt sich zeitlich und räumlich unabhängig von Pround Mesonephros. Aus dem Metanephros entwickelt sich die definitive, adulte Niere.
Der Übergang zwischen den unterschiedlichen Nierenvorstufen verläuft sehr rasch
und ist in wenigen Tagen vollzogen.
Die Entwicklung der endgültigen Niere aus dem Metanephros weist ein stereotypes,
immer gleiches Muster auf. Aus dem Wolff-Gang wächst die Ureterknospe in das sie
umgebende Mesenchym, das metanephrogene Blastem, ein und teilt sich dichotom
(siehe Abb. 1A,C). Dies geschieht in der Maus am 11. Entwicklungstag (E11.5).
Dabei aggregieren einige der mesenchymalen Zellen an den Spitzen der
Ureterknospe
und durchlaufen
eine
mesenchymal-epitheliale Transformation.
Dadurch bildet sich aus dem locker angeordneten Mesenchym ein epithelialer
Zellverband. Ein weiterer Anteil des Mesenchyms aggregiert nicht, sondern bildet das
interstitielle Stroma.
Aus den kappenartigen Kondensaten an der Spitze der Ureterknospe entsteht ein
polarisiertes Nierenkörperchen, das zum Epithel der Ureterspitze Kontakt hat (siehe
Abb. 1B). Eine erste Spaltbildung innerhalb des Nierenkörperchens lässt die typische
Komma-Form, eine weitere Spalte die S-Form entstehen (siehe Abb. 1D). Das distale
Ende fusioniert mit der Ureterknospe und bildet so ein durchgängiges Lumen. Das
proximale Ende bildet gemeinsam mit den einwandernden Endothelzellen das
Glomerulum aus (siehe Abb. 1E). Aus der Interaktion zwischen Endothel und
glomerulärem
Epithel
mesenchymaler
Herkunft
entsteht
die
glomeruläre
Basalmembran (GBM), ein wichtiger Bestandteil der späteren Filtrationsbarriere.
2
Während dieser Prozesse wächst und teilt sich die Ureterknospe weiterhin dichotom,
jede neue Spitze induziert ein weiteres mesenchymales Aggregat (siehe Abb. 1C).
So liegen die ältesten Nephrone nahe der Medulla, während sich die neueren
Nephrone weiter distal in der nephrogenen Zone befinden. Bei der Maus verlangsamt
sich die Teilung der Ureterknospe zwischen dem 15. und 16. Entwicklungstag
(E15.5), neue Nephrone werden aber noch bis zu 5 Tagen postnatal angelegt. Im
Gegensatz dazu ist beim Menschen die Entwicklung von Nephronen mit der Geburt
abgeschlossen.
Abbildung 1: Die einzelnen Entwicklungsschritte während der Entstehung der
Säugerniere. MET: Mesenchymal-epitheliale Transformation. Quelle: Dressler G.R.,
Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2006.
3
1.1.3 Molekularbiologische Aspekte der Nierenentwicklung, Klinik
Bildung und Wachstum der Ureterknospe
Entscheidend für die korrekte Nierenentwicklung ist die richtige Position der
Ureterknospe. Eine falsch angelegte Ureterknospe kann zu schwerwiegenden
Syndromen wie vesikoureteralem Reflux oder Obstruktion der Harnwege sowie zu
einem Hydroureter führen.
Die Positionierung der Ureterknospe erfolgt durch das RET/GDNF/GFRα1-System
(Dressler 2006). Der Tyrosinkinase-Rezeptor RET ist entlang des gesamten WolffGanges, das Signalmolekül GDNF („glial cell-line derived neurotrophic factor“) nur im
metanephrogenen Blastem exprimiert. Zu den positiven Regulatoren dieses Systems
gehören EYA-1 und SIX-1. Beim Menschen führen Mutationen im EYA-1- oder SIX1-Gen zum Branchio-oto-renalen Syndrom (BOR-Syndrom) (Abdelhak, Kalatzis et al.
1997; Ruf, Xu et al. 2004). Patienten, die von diesem Syndrom betroffen sind, zeigen
unterschiedlich
ausgeprägte
Nierenfehlbildungen
bis
hin
zur
vollständigen
Nierenagenesie, Ohrdeformitäten des Außen-, Mittel- und Innenohrs sowie laterale
Halsfisteln. Weitere mesenchymale Signale vermitteln die Transkriptionsfaktoren WT1 und GATA-3. Mutationen in WT-1 können zu kindlichen Nierentumoren (WilmsTumor) (Davies, Moore et al. 1999) führen, oder die WAGR-(Wilms-Tumor, Aniridie,
Wachstumsretardierung, Nierenfehlbildung), Denys-Drash- und Frasier-Syndrome
auslösen, die allesamt durch renale und gonadale Fehlbildungen gekennzeichnet
sind (Pelletier, Bruening et al. 1991; Parker, Schimmer et al. 1999). GATA-3 reguliert
die korrekte Expression von RET entlang des Wolff-Gangs: Mutationen führen zu
vermehrter Proliferation der Gangzellen sowie zu fehlgerichteten Ureterknospen.
Beim Menschen führen Mutationen im GATA-3-Gen zum HDR-Syndrom, das durch
Hypothyreoidismus, Taubheit und Nierenanomalien gekennzeichnet ist (Van Esch,
Groenen et al. 2000).
Induktionsvorgänge im Mesenchym
Die Induktion des Mesenchyms ist permissiv, das bedeutet, dass das Schicksal
dieses Gewebes schon festgelegt ist und Signalprozesse nur noch den Weg zu
dieser Entwicklung hin einleiten können (Saxen and Sariola 1987).
Diese
Induktionsvorgänge
führen
zur
Transformation
des Mesenchyms
zu
epithelialen, polarisierten Zellen. Für diesen Vorgang sind unter anderem WNTMoleküle im klassischen WNT-Signalweg von großer Bedeutung. WNT-Proteine
4
werden zwar sezerniert, diffundieren aber nicht frei. Für ihre Funktion sind
Proteoglykane
entscheidend,
die
aus
einem
Kernprotein
und
Glykosaminoglykan(GAG)-Seitenketten bestehen. Patienten mit Simpson-GolabiBehmel-Syndrom (SGBS) weisen eine Mutation im Gen Glypican-3 (GPC-3) auf,
welches für ein Proteoglykan kodiert. SGBS-Patienten sind hochwüchsig und haben
zystisch-dysplastische Nieren.
Für die Stromazellen konnte gezeigt werden, dass auch sie wichtige Überlebens- und
Proliferationssignale
beisteuern.
Stromazellen
exprimieren
die
nukleären
Retinolsäurerezeptoren RAR-α und -ß. Dieser Befund ist mit dem stimulierenden
Effekt
von
Retinoiden
auf
Nierenkulturen
gut
vereinbar
und
könnte
den
pathologischen Befund einer Nierenhypoplasie unter Vitamin-A-Mangel erklären
(Dressler 2006).
Die Vielzahl dieser Signale zeigt, dass es sich beim Induktionsvorgang des
Mesenchyms um einen vielschichtigen, multifaktoriellen Prozess handelt.
Die Entwicklung des Nephrons
Das Epithel des Nephrons entwickelt sich größtenteils aus den mesenchymalen
Aggregaten an den Spitzen der Ureterknospe. Nachdem die Aggregate epitheliale
Form angenommen haben, exprimieren sie typische Zonula occludens- und Zonula
adherens-Proteine, nehmen eine palisadenartige Form an und bilden das
Nierenkörperchen
mit
kleinem
Lumen
aus
(siehe
Abb.
1B).
Um
das
Nierenkörperchen herum wird eine Basalmembran angelegt. Im Komma-Stadium
fusioniert dessen distales Ende mit der Ureterknospe, um ein kontinuierliches Lumen
zu bilden. Essentiell für diesen Prozess sind unter anderem JNK-Kinasen und
Cadherine. Mäuse mit Mutationen in JNK-1, -2, und -3 zeigen hypoplastische Nieren
sowie Kolobome des Nervus opticus (Dressler 2006).
Auch entlang seiner proximal-distalen Achse entwickelt sich das Nierenkörperchen
differentiell. Aus proximalen Anteilen entsteht glomeruläres Epithel, weiter distal
gelegene Anteile des Körperchens stellen proximales und distales Tubulusepithel.
Einen wichtigen Beitrag scheint die NOTCH-Signalkaskade zu leisten: So führt die
Inhibition dieses Signalwegs beziehungsweise der Verlust von Notch-1 zu einer
Reduktion glomerulärer und proximal-tubulärer Zellen (Cheng, Miner et al. 2003;
Wang, Pereira et al. 2003; Cheng and Kopan 2005).
5
Die Entwicklung des Glomerulum
Das adulte Glomerulum besteht aus 4 Zelltypen:
•
kapilläres, fenestriertes Endothel
•
Mesangialzellen
•
Podozyten
•
parietales Epithel der Bowman-Kapsel
Die Entwicklung des Glomerulum beginnt, wenn im S-förmigen Stadium (siehe Abb.
1D)
Vorläuferzellen
am
proximalen
Ende
podozyten-spezifische
Proteine
exprimieren. Dazu gehören die Transkriptionsfaktoren WT-1 und POD-1, die (Trans-)
Membran-Proteine Podocin, Glepp-1 und Nephrin, sowie der Wachstumsfaktor
VEGF. Während der Migration und Proliferation des Endothels kommt es zur
Interaktion mit den Podozyten, was die Bildung der glomerulären Basalmembran zur
Folge hat. Diese besteht zunächst aus α-1 und -2 Ketten von Typ-IV-Kollagen,
welche später durch α-3, -4 und -5 Ketten dieses Kollagens ersetzt werden. Dieser
Wechsel ist essentiell für die Aufrechterhaltung der glomerulären Basalmembran und
der Filtrationsbarriere. Mutationen in jedweder der reifen Kollagen-IV-Ketten kann zu
einer hereditären Form der Glomerulonephritis (Alport-Syndrom) führen. Der
Wechsel zu den adulten Kollagenketten kann durch LMX-1b vermittelt werden, ein
Homöodomänenprotein,
welches
auch
die
Expression
anderer
–
für
die
Podozytenentwicklung entscheidender – Gene aktiviert (Dressler 2006). In der Klinik
erlangt LMX-1b Bedeutung, da es beim Nail-Patella-Syndrom – einer hereditären
Erkrankung, die mit Nierenschäden einhergeht – mutiert ist (Dreyer, Zhou et al.
1998).
Für
die
korrekte
Fußfortsätze
interdigitieren.
Entwicklung
ausbilden,
Daran
die
scheint
müssen Podozyten
mit
die
den
Fortsätzen
Phosphorylierung
primäre
und
sekundäre
benachbarter
Podozyten
des
zytoplasmatischen
Schwanzes von Nephrin und dessen Interaktion mit Nck beteiligt zu sein (Verma,
Wharram et al. 2003; Jones, Blasutig et al. 2006; Verma, Kovari et al. 2006).
Von grundlegender Bedeutung für die Podozytenfunktion ist die Schlitzmembran. Es
handelt sich dabei um einen spezialisierten Zell-Zell-Kontakt zwischen zwei
benachbarten Podozytenfußfortsätzen, an den eine Reihe spezifischer Proteine
lokalisiert, unter anderem Nephrin, Podocin, CD2AP und Neph1-3. Die Integrität der
Schlitzmembran ist für die Filtrationsbarriere von größter Bedeutung. Mutationen in
Nephrin, das an der Schlitzmembran lokalisiert ist, führen zu einer schwerwiegenden
6
Filtrationsstörung, dem angeborenen nephrotischen Syndrom vom finnischen Typ
(CNF), das sich bereits in utero manifestiert. Ein typisches morphologisches Korrelat
ist dabei die Verplumpung der Podozytenfußfortsätze.
7
1.2
Einführung in das Gebiet der micro-RNAs
1.2.1 Grundriss
Für die Entdeckung der RNA-Interferenz (RNAi) im Jahre 1998 erhielten Andrew Fire
und Craig Mellow 2006 den Nobelpreis für Medizin und Physiologie (Fire 1998). Es
handelt sich hierbei um einen bis dahin in der Molekulargenetik völlig unbekannten
Mechanismus: Sie konnten zeigen, dass kurze RNA-Moleküle – die bislang kaum
Beachtung gefunden hatten – in der Lage sind, an komplementäre mRNA zu binden
und so posttranskriptionell die Expression von Genen zu regulieren.
Ein wichtiges Standbein der RNAi stellen dabei die so genannten micro-RNAs (auch:
miRNAs) dar. miRNAs sind kurze, 20-24 Nukleotide umfassende RNA-Moleküle, die
sowohl von Tieren als auch von Pflanzen endogen exprimiert werden. Nachdem ihre
Entdeckung im Jahr 1993 durch Ambros et al. zunächst weitestgehend unbeachtet
blieb (Lee, Feinbaum et al. 1993), wurden ab 2001 hunderte von miRNAs in
unterschiedlichen Spezies nachgewiesen und es zeigte sich, dass sehr viele dieser
miRNAs phylogenetisch hochgradig konserviert sind (Lagos-Quintana, Rauhut et al.
2001; Lau, Lim et al. 2001; Lee and Ambros 2001). Diese kurzen RNA-Moleküle
kontrollieren eine Reihe wichtiger Prozesse: sie regulieren unter anderem die
zeitliche Abfolge von embryonalen Entwicklungsschritten, Zelltod und -proliferation,
die Hämatopoiese, sowie die Organogenese und Gewebsdifferenzierung. Die Zahl
der bekannten miRNAs und ihrer Funktionen nimmt durch intensive Forschung stetig
zu. Aktuell schätzt man, dass etwa 30% aller Gene des Menschen durch miRNAs
reguliert werden (Lewis, Burge et al. 2005). Durch diese Vielfalt ermöglicht die Welt
der
miRNAs
eine
völlig
neue
Sicht
auf
molekularbiologische
Prozesse,
beispielsweise die Entstehung von Organen wie der Niere.
1.2.2 Genetik von micro-RNAs
Um die Genetik von miRNAs zu verstehen, müssen diese in verschiedene Gruppen
eingeteilt werden: intergenische, intronische und exonische miRNAs sowie miRNAs,
die zu benachbarten Genen gegenläufig orientiert sind. Intergenische miRNAs
stammen aus Bereichen im Genom fernab von bekannten Genen, so dass
angenommen werden muss, das diese miRNAs von einer eigenen, unabhängigen
Transkriptionseinheit abgelesen werden (Lagos-Quintana, Rauhut et al. 2001). Dies
gilt auch für diejenigen miRNAs, die in gegenläufiger Orientierung zu benachbarten
8
Genen lokalisiert sind. Etwa die Hälfte aller bekannten micro-RNAs aus Säugern liegt
aber entweder innerhalb von Introns und Exons sowohl protein-kodierender als nichtkodierender Gene und hat somit keine eigene Transkriptionseinheit (Bartel 2004;
Rodriguez, Griffiths-Jones et al. 2004). Diese miRNAs sind in gleicher Orientierung
wie die mRNA ausgerichtet, was darauf hinweist, dass sie aus dieser prozessiert
werden. Durch die koordinierte Expression sind zahlreiche Regulationsmöglichkeiten
denkbar: Die Expression eines Gens sorgt dafür, dass gleichzeitig ein anderes oder
dasselbe Gen durch die in der gleichen Sequenz kodierte miRNA reguliert wird.
Diese Kombination von miRNA und mRNA erscheint überaus sinnvoll, vervielfacht
die molekularen Effekte durch Expression eines einzelnen Gens und ist sowohl in
Insekten wie in Säugetieren konserviert (Aravin, Lagos-Quintana et al. 2003).
Ein weiterer, bedeutender Anteil an miRNAs liegt gehäuft in Gruppen, so genannten
„Clustern“, vor. In der Fruchtfliege Drosophila melanogaster sind etwa die Hälfte aller
miRNA-Gene als Cluster zusammengefasst, während beim Wurm und beim
Menschen nur wenige miRNAs als Cluster vorliegen (Aravin, Lagos-Quintana et al.
2003; Lim, Glasner et al. 2003; Lim, Lau et al. 2003). Dabei entstehen multicistronische primäre Transkripte, was bedeutet, dass alle im Cluster enthaltenen
miRNAs von einer Transkriptionseinheit abgelesen werden und einen gemeinsamen
Vorläufer bilden, aus dem dann die einzelnen miRNAs entstehen. Sinnvollerweise
sind in Clustern zusammengefasste miRNAs oft untereinander sequenzverwandt und
zeigen eine signifikante Koexpression (Lagos-Quintana, Rauhut et al. 2001).
Derzeit sind 533 humane und 442 murine miRNAs offiziell annotiert (MiRBase
release 9.2). Insgesamt gehen aktuelle Schätzungen aber von über 1.000 miRNAGenen beim Menschen aus (Berezikov, van Tetering et al. 2006). Bioinformatische
Studien lassen derzeit darauf schließen, dass etwa 5300 Gene des Menschen,
entsprechend 30% aller Gene, von miRNAs reguliert werden (Lewis, Burge et al.
2005).
1.2.3 Konservierung von micro-RNAs in Pflanzen, Tieren und Menschen
Obwohl sowohl die Tier- als auch die Pflanzenwelt ein miRNA-System besitzen,
haben sich beide Systeme wohl unabhängig voneinander entwickelt, da es keine
Homologien untereinander zu geben scheint.
Fast alle bekannten miRNA-Gene sind in nahe verwandten Spezies untereinander
konserviert. Als Beispiel sei die let-7-miRNA-Familie genannt, welche in allen
bilateralen
Tieren
bis
auf
Symsagittifera
roscoffensis
(„acoel
flatworm“)
9
phylogenetisch konserviert ist (Pasquinelli, Reinhart et al. 2000). Besonders hoch ist
der Grad der Konservierung zwischen Mensch und Maus sowie unter den
Nematoden Caenorhabditis elegans (C. elegans) und C. briggsae (Lim, Glasner et
al. 2003; Lim, Lau et al. 2003). Dabei gibt es zu vielen der miRNAs aus C. elegans
homologe miRNAs im Menschen (Lagos-Quintana, Rauhut et al. 2003). Als weiteres
Beispiel sei an dieser Stelle miR-1 genannt. miR-1 ist über Würmer, Säugetiere und
Insekten hinweg konserviert (Chen 2007).
Konservierungen
von
sowohl
miRNA
als
auch
Ziel-mRNA
über
große
Evolutionsschritte hinweg sind jedoch nur selten beschrieben. Dazu gehört die
miRNA let-7 mit deren Ziel-mRNAs lin-41 und let-60-RAS sowie die miRNA lin-4 mit
der mRNA lin-28. Die Regulation dieser mRNAs durch die beiden miRNAs ist
zwischen C. elegans und Wirbeltieren konserviert (Chen 2007).
Auch Viren scheinen sich des Prinzips von micro-RNAs zu bedienen. So kodiert
beispielsweise das Epstein-Barr-Virus, zur Familie der Herpesviren gehörend, 23
miRNAs (Pfeffer, Zavolan et al. 2004).
Vom Blickpunkt der Evolution aus ist der Entstehungsprozess neuer miRNAs derzeit
in vollem Gange. Von den schätzungsweise 1000 menschlichen miRNA-Genen sind
etliche primaten- oder gar humanspezifisch. Neue miRNAs entstehen bei Tieren
einem Modell zufolge am ehesten zufällig aus Haarnadelstrukturen im Genom, im
menschlichen Genom gibt es davon schätzungsweise 11 Millionen. In der Evolution,
so vermutet man, konnten durch Bildung neuer miRNAs neue Gewebetypen und
Organe entstehen (Sempere, Cole et al. 2006; Prochnik, Rokhsar et al. 2007).
1.2.4 Expression von micro-RNAs
Da die miRNAs let-7 und lin-4, die zuerst im Wurm C. elegans entdeckt wurden, eine
entscheidende Rolle in der zeitlichen Regulation von larvalen Entwicklungsstadien
des Nematoden haben, wurden miRNAs zunächst „small-temporary RNAs“ genannt
(Lagos-Quintana, Rauhut et al. 2001; Lau, Lim et al. 2001). Dass dieser Begriff
durchaus seine Richtigkeit besitzt, zeigt sich im zeitlich unterschiedlichen
Expressionsmuster, das diese miRNAs aufweisen. So wird let-7 im Wurm erst ab
dem 3. Larvenstadium, in Drosophila erst ab dem 3. Puppenstadium exprimiert, um
dann lebenslang auf hohem Niveau exprimiert zu werden (Pasquinelli, Reinhart et al.
2000).
Neben diesem zeitlichen Muster zeigt die Expression von miRNAs auch ein
räumliches, zell-spezifisches Verteilungsmuster: miR-1 wird überwiegend im
10
Säugerherzen, miR-122 in der Leber exprimiert (Lagos-Quintana, Rauhut et al.
2002), miR-223 kommt hauptsächlich in Granulozyten und Lymphozyten des
Knochenmarks von Mäusen vor (Chen, Li et al. 2004) und die miRNA-Cluster 35-42
in C.elegans (Lau, Lim et al. 2001) und 290-295 in der Maus (Houbaviy, Murray et al.
2003) zeigen ein stammzellspezifisches Expressionsmuster. Daraus lässt sich
schließen,
dass
zu
jedem
Zeitpunkt
jede
Zelle
ihr
eigenes,
zell-
und
entwicklungsspezifisches miRNA-Expressionsmuster besitzt (Bartel 2004).
Über die quantitative Expression von miRNAs ist bekannt, dass manche miRNAs mit
einer sehr hohen Anzahl an Kopien im Cytosol vorkommen, von miR-2, miR-52 und
miR-58 liegen beispielsweise etwa 50.000 Moleküle pro Zelle vor. Einige miRNAs
werden jedoch in geringerer Menge produziert, so finden sich zum Beispiel
durchschnittlich nur ca. 800 Kopien von miR-124 in Zellen (Lim, Lau et al. 2003).
1.2.5 Biogenese: Transkription und Reifung von micro-RNAs
Wie bereits erwähnt, werden einige miRNAs, die in Introns von pre-mRNAs liegen,
bei der Transkription der pre-mRNA ko-transkribiert. Die intergenisch gelegenen
miRNAs werden über eigene, teilweise noch unbekannte Promotoren abgelesen.
Diese primären Transkripte werden pri-miRNA genannt und sind wesentlich länger
als die Haarnadelstruktur, durch die ein miRNA-Gen definiert ist (siehe Abb. 2A).
Während derzeit die Transkription durch die Typ-III-Polymerase für etwa 50 miRNAGene angenommen wird (Borchert, Lanier et al. 2006), unterliegt der Großteil der
bekannten miRNAs der Transkription durch die Typ-II-Polymerase (Lee, Kim et al.
2004).
Nach der Transkription – oder aber nach Prozessierung aus dem Intron – wird aus
der pri-miRNA durch den nukleären Proteinkomplex aus Drosha/DGCR8 („Di George
critical region gene 8“) die 60-80 Basen lange, haarnadelförmige pre-miRNA
hergestellt (siehe Abb. 2A).
11
Abbildung 2: Biogenese und Effekte von miRNAs.
DGCR8 verfügt über eine dsRNA-bindende Domäne und ist somit in der Lage, die
doppelsträngigen pri-miRNAs zu binden. So kann Drosha, eine Typ-III-RNAEndonuklease, korrekt positioniert werden, um die 60-80 Basen umfassende
Haarnadelschleife („stem loop“) vom Rest der pri-miRNA abzutrennen (Seitz and
Zamore 2006). An der pre-miRNA bleibt durch den Schnitt der Typ-III-RNAEndonuklease Drosha am 5’-Ende ein Phosphatrest stehen. Am 3’-Ende hinterlässt
Drosha einen Überhang von 2 Nukleotiden. Die so entstandene pre-miRNA wird
GTP-abhängig durch den Export-Rezeptor Exportin-5 aus dem Kern transportiert
(siehe Abb. 2A) (Yi, Qin et al. 2003; Bohnsack, Czaplinski et al. 2004; Lund,
Guttinger et al. 2004).
Im Cytosol wird die pre-miRNA durch Dicer, eine weitere Typ-III-RNAse sowie deren
dsRNA-Bindungspartner TRBP2 und PACT (Lee, Hur et al. 2006) verarbeitet (siehe
Abb. 2C). Dabei trennt Dicer die Haarnadelschleife entsprechend der späteren
miRNA-Länge 20-24 Nukleotide oberhalb der Drosha-Schnittstelle ab. Da Dicer,
genau wie Drosha, eine Typ-III-Endonuklease ist, hinterlässt auch Dicer am 5’-Ende
12
einen Phosphat- und am 3’-Ende einen 2-Nukleotid-Überhang. Gleichzeitig übergibt
dieser Komplex die miRNA an den Effektorkomplex.
Auf diese Art entsteht ein asymmetrischer RNA-Doppelstrang, dessen einer Arm als
reife miRNA, der andere als miRNA* bezeichnet wird (siehe Abb. 2C). Nur ein Strang
wird weiter verwendet, der andere wird schnell degradiert. Welcher der beiden
Stränge an den Effektorkomplex übergeben wird, hängt im Wesentlichen von der
thermodynamischen Stabilität der jeweiligen Enden des Duplexes ab (Bartel 2004;
Tomari and Zamore 2005). Im Fall einiger miRNAs führt dies zur Funktionalität beider
Stränge, so dass beide später im Effektorkomplex zu finden sind (Lagos-Quintana,
Rauhut et al. 2002; Krichevsky, King et al. 2003; Schwarz, Hutvagner et al. 2003).
1.2.6 Der Effektorkomplex: Aufbau und Funktion
Prinzipiell unterscheidet man zwei Effektorkomplexe, die zugleich stellvertretend für
die zwei unterschiedlichen Effekte von miRNAs sind: sie vermitteln entweder die
Zerschneidung der Ziel-mRNA („cleavage“) durch Endonukleasen oder sie hemmen
deren Translation (siehe Abb. 2C).
Der „RNA-induced silencing complex“ (RISC) vermittelt die klassische Funktion von
RNAi, nämlich die Zerschneidung der mRNA. Der RISC ist ein variabel
zusammengesetzter Effektorkomplex, er variiert teilweise erheblich in seiner Größe:
Man findet RISC-Komplexe mit einer Größe von etwa 160 kDa sowie Komplexe,
welche bei 15-80S ausfallen und somit bis zu 4200 kDa groß sind (Pillai 2005).
Effektorkomplexe, die stattdessen eher eine Repression auf Translationsebene oder
einen beschleunigten Zerfall der Ziel-mRNA zur Folge haben, werden miRNP
(„miRNA Ribonucleoproteinkomplex“) genannt.
In beiden Effektorkomplexen spielen Argonaut-Proteine eine Schlüsselrolle. Der
funktionelle miRNA-Strang wird in den Effektorkomplex geladen. Dort bindet die
miRNA ein Mitglied der Argonaut-Proteinfamilie (siehe Abb. 2C). Argonaut-Proteine
sind essentiell für die embryonale Entwicklung, Zelldifferenzierung und die Wahrung
von Stammzellidentität (Peters and Meister 2007). Während in C. elegans 27
Argonaut-Gene vorkommen, besitzen Mensch und Maus jeweils 8 Gene. Die
Argonaut-Proteine lassen sich in AGO-Proteine, die ubiquitär exprimiert werden,
sowie in PIWI-Proteine unterteilen, die spezifisch nur in der Keimbahn vorkommen.
AGO-Proteine, von denen der Mensch 4 (AGO1-4) und die Maus 5 Subtypen besitzt,
sind etwa 100 kDa große Proteine mit drei typischen Domänen. Die PAZ („PIWIArgonaut-Zwille“)-Domäne bindet spezifisch den 2-Nukleotid-Überhang am 3’-Ende
13
der miRNA. Die Sekundärstruktur der PIWI-Domäne gleicht einer RNAse-H und kann
als Endonuklease fungieren (Lingel and Sattler 2005). Zwischen diesen beiden
Domänen liegt die MID-Domäne, die den Phosphatrest am 5’-Ende der miRNA
bindet und diese somit auf dem AGO-Protein verankert. Beim Menschen fungiert nur
AGO-2 als Endonuklease (Meister, Landthaler et al. 2004).
Zu den Effektorkomplexen werden außer der Ago-Familie noch andere Proteine
zugeordnet, deren genaue Funktion in Bezug auf den Effektorkomplex derzeit noch
nicht genau bekannt ist (Valencia-Sanchez, Liu et al. 2006).
Wenn der Effektorkomplex fertig zusammengesetzt ist, lenkt ihn die miRNA durch
ihre (Teil-)Komplementarität zu ihrem Ziel, dem 3’-UTR der zu regulierenden mRNA
(siehe Abb. 2C). Auch Zielsequenzen im 5’-UTR sowie in der kodierenden Region
können durch eine miRNA reguliert werden, sind aber verhältnismäßig selten
(Kloosterman, Wienholds et al. 2004).
1.2.7 Mechanismen der Genregulation durch micro-RNAs
Bindet eine miRNA an den 3’-UTR einer mRNA, so hat dies zur Folge, dass die ZielmRNA auf zwei unterschiedliche Arten reguliert wird:
•
Zerschneidung der mRNA durch Endonukleasen („cleavage“)
oder
•
Repression der Translation und/oder verminderte mRNA-Stabilität
Pflanzliche miRNAs besitzen meist eine ausgeprägte Komplementarität zu ihrer ZielmRNA („Target“). Dies hat zur Folge, dass ein RISC aktiviert wird, welcher die mRNA
zerschneidet. Derartig zerschnittene mRNAs werden zügig abgebaut, indem sie von
Exonukleasen weiter gespalten oder dem Exosom zugefügt werden. Dieses Prinzip
trifft auch für einige wenige miRNAs aus dem Tierreich zu (miR-127, miR-136, miR196, miR-431, miR-433-3p, miR-433-5p, miR-434-3p und miR-434-5p) (Du and
Zamore 2005). Die Minimalzusammensetzung eines RISC, der mRNA zerschneidet,
besteht aus einer miRNA bzw. siRNA sowie Ago2 (Rivas, Tolia et al. 2005).
Allerdings
gibt
es
Ausnahmen,
denn
nicht
immer
genügt
komplette
Komplementarität, um die Endonuklease zu aktivieren (Chen 2004). Dies lässt den
Schluss zu, dass auch andere, bislang unbekannte Faktoren eine Rolle spielen
müssen.
Während in Pflanzen über die gesamte Länge der miRNA eine Komplementarität
zum 3’-UTR besteht, zeigen miRNAs bei Tieren und Menschen nur am 5’-Ende der
miRNA eine ausgeprägte Komplementarität. Dies sind im Wesentlichen die
14
Nukleotide 2-8 am 5’-Ende der miRNA, welche auch als „Seed“ bezeichnet werden
(Lewis, Burge et al. 2005). Die Seed-Sequenz ist bei untereinander verwandten
miRNAs meist hochgradig konserviert (Chen 2007).
Diese insgesamt nicht einhundertprozentig perfekte Bindung der miRNA an den 3’UTR der mRNA, die vielmehr Ausbuchtungen und Schleifen bei der Paarbildung
vorweist, hat meist eine Repression der Translation oder vermehrten mRNA-Abbau
zur Folge. Die Bindung der miRNA mit der mRNA an dieser Stelle stellt die
Grundlage für die weiteren Effekte dar. Viele Ergebnisse zeigen, dass eine miRNA
das Proteinexpressionsniveau der Ziel-mRNA wesentlich stärker verändert als die
quantitative mRNA-Menge (Brennecke, Hipfner et al. 2003; Poy, Eliasson et al. 2004;
Cimmino,
Calin
et
al.
Translationshemmung
zu
2005)
–
somit
scheinen
miRNAs
auch
wirken.
Der
genaue
Mechanismus
durch
dieser
Translationshemmung ist noch Gegenstand aktueller Forschung. Bei der „normalen“
Translation wird die am 5’-Ende der mRNA gelegene 7-Methylguanosin-Kappe
(„Cap“) vom Initiationsfaktor eIF4e erkannt. Dies führt letztlich dazu, dass die 40SUntereinheit daraufhin die 5’-Region nach dem Startkodon absucht, die 60SUntereinheit dazustößt und die Elongationsphase der Translation beginnt (ValenciaSanchez, Liu et al. 2006). Auch ohne Kappenstruktur kann Translation stattfinden,
nämlich
durch
IRES
(„internal
ribosomal
entry
sites“),
welche
die
Translationsmaschinerie unabhängig aktivieren können.
Einem hypothetischen Modell zufolge binden Argonaut-Proteine an den nicht
vollständig komplementären miRNA:mRNA-Duplex am 3’-Ende der mRNA. Dies führt
zur Rekrutierung einer Reihe von Proteinen, die mit dem Transkriptionsinitationsfaktor eIF4e, welcher an die Kappenstruktur am 5’-Ende der mRNA
gebunden ist, interagieren. So entsteht eine geschlossene, die Translation
verhindernde mRNA-Schleife. Eine weitere Vermutung ist, dass AGO-Proteine über
NOT- und CCR-4-Deadenylasen den Abbau der mRNA beschleunigen (Jackson and
Standart 2007).
Ein Teil der abzubauenden mRNAs wird in Prozessier-Körper („Processing-bodies,
auch: P-Bodies, GW-bodies“) verfrachtet. P-bodies sind subzelluläre Strukturen, in
welchen das Decapping und der konsekutive Abbau von mRNA beobachtet wurde
(Sheth and Parker 2003). In diesen subzellulären Strukturen können sowohl AGOProteine, miRNAs, mRNAs als auch Proteine der Decapping-Maschinerie und
Nukleasen nachgewiesen werden. Neben dem Abbau von mRNAs können diese P15
Bodies auch deren Speicherung und Relokalisation zur Translationsmaschinerie
vermitteln (Bhattacharyya 2006; Jackson and Standart 2007).
1.2.8 Verschiedene Klassen von RNAi: miRNA, siRNA, rasiRNA und piRNA
Es gibt viele Klassen kleiner RNAs, die Expressionsregulation betreiben können.
Dazu gehören miRNA, siRNA, rasiRNA, und piRNA.
Micro-RNAs und silencing-RNAs (siRNAs) unterscheiden sich vor allem dadurch,
dass die etwa 21 Nukleotide langen miRNAs im Gegensatz zu den siRNAs aus dem
etwa 70 Nukleotide langen haarnadelförmigen Vorläufer (pre-miRNA) hergestellt
werden. Meistens liegt in diesem Vorläufer keine genau übereinstimmende
Basenpaarung vor.
Zwar haben siRNAs eine ähnliche Länge, ihr Ursprung liegt aber in längeren
Vorläufern, die keine Haarnadelstruktur ausbilden, sondern stattdessen aus
doppelsträngiger RNA prozessiert werden, wobei die Komplementarität beider
Stränge zueinander ausgeprägt ist (siehe Abb. 2B). In Säugetieren spielen siRNAs
vor allem als Werkzeuge der zellbiologischen Forschung eine Rolle, mit denen
Genfunktionen entschlüsselt werden können, während miRNAs das endogen
exprimierte Korrelat darstellen. Im Modellorganismus D. melanogaster ist des
Weiteren noch die Klasse der „repeat-associated small interfering“ RNAs (rasi-RNAs)
bekannt,
die
aus
Transposons
und
genomischen
Wiederholungssequenzen
entstehen (Aravin, Lagos-Quintana et al. 2003). Sie entspringen vornehmlich aus
dem gegensinnigen DNA-Strang von „Repeats“. Vermutlich wirken sie über eine
andere RNA-Signalkaskade, dabei spielen PIWI-Proteine eine Rolle.
Eine neue Klasse kleiner RNAs stellen piRNAs dar, die eine Länge von 29-30
Nukleotiden haben und keimbahnspezifisch sind (Girard, Sachidanandam et al.
2006; Lau, Seto et al. 2006). Sie kommen in Wirbeltieren vor und wirken ebenfalls
durch PIWI-Proteine.
1.2.9 Bioinformatik – Vorhersage neuer micro-RNAs und Ziel-mRNAs
Durch bioinformatische Methoden können zwei unterschiedliche Aspekte von
miRNAs untersucht werden. Um einerseits neue miRNA-Gene zu finden, können
Programme im Genom nach Homologen zu bereits bekannten miRNAs suchen und
so orthologe und paraloge Gene identifzieren. Auch in Nachbarschaft zu bereits
beschriebenen miRNAs lassen sich häufig neue miRNAs finden, da einige miRNAs
als Cluster vorkommen. Komplexere Programme wie miRScan (Lim, Lau et al. 2003)
16
und miRSeeker (Lai, Tomancak et al. 2003) durchsuchen das Genom nach
konservierten Segmenten außerhalb der protein-kodierenden Gene, die zusätzlich
potentiell in der Lage sind, eine Haarnadelstruktur auszubilden und eine geeignete
Thermodynamik vorweisen. Über experimentelle Methoden wie PCR, Northern
blotting- und Micro-Array-Technik können vorhergesagte miRNA-Gene validiert
werden. Validierte Gene und ihre Homologe werden in der miRNA Registry
(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/) verzeichnet (Bartel 2004).
Zum anderen können mögliche neue Targets einer miRNA identifiziert werden.
Während Vorhersagen für Pflanzen relativ einfach sind, da miRNAs hier meist eine
komplette Komplementarität zur Ziel-mRNA aufweisen, sind Vorhersagen für
Tierorganismen wesentlich komplexer. Die meisten Vorhersagen beruhen hier auf
dem Seed-Modell, wobei die exakte Basenpaarung der ersten 6-8 Basen am 5’-Ende
der miRNA für die Funktion der miRNA entscheidend ist. Zusätzlich werden
Konservierungs-Merkmale herangezogen. Daher suchen Vorhersageprogramme 3’UTRs
nach
multiplen,
konservierten
miRNA-Bindungsstellen
ab.
Auch
die
thermodynamische Stabilität und Kinetik der mRNA-miRNA-Bindung wird von einigen
Algorithmen berechnet (John, Enright et al. 2004; Krek, Grun et al. 2005; Lewis,
Burge et al. 2005). Mit diesen Methoden konnte geschätzt werden, dass von 17530
orthologen Genen aus Hund, Maus, Ratte und Mensch etwa 30% von miRNAs
potentiell reguliert werden könnten (Lewis, Burge et al. 2005).
1.2.10
Funktionen und Bedeutung von micro-RNAs
Neuartige Techniken, insbesondere die in situ-Hybridisierung mit modifizierter RNA,
so genannter „locked nucleic acids“-RNA („LNA“) sowie neue Klonierungs- und
Micro-Array-Techniken, ermöglichten die genaue Analyse des Expressionsmusters
von miRNAs während der Entwicklung verschiedener Organismen (Aboobaker,
Tomancak et al. 2005; Kloosterman and Plasterk 2006). Dabei zeigt sich, dass viele
miRNAs sehr gewebsspezifisch exprimiert werden und somit wahrscheinlich eine
wichtige Rolle in der Festlegung und Aufrechterhaltung der Gewebsidentität spielen.
Dabei folgt die Regulation durch miRNAs zwei Prinzipien: Ist im 3’-UTR der ZielmRNA nur eine Bindungsstelle vorhanden, ist die Regulation eher schwach. Diese
Art der Regulation trifft für die meisten Ziel-mRNAs zu (Stark, Brennecke et al. 2005).
Ein Effekt, vermittelt durch diese miRNA-Target-Interaktion, kommt insbesondere
dann zu tragen, wenn die Ziel-mRNA nur in geringem Maße exprimiert wird.
Wenngleich die messbaren Effekte einer solchen Regulation sehr klein sein mögen,
17
so spielen sie vom evolutionären Standpunkt aus eine große Rolle. Andere miRNAs
haben hingegen eine Schalterfunktion inne. Einige wenige Ziel-mRNAs enthalten
sehr viele, teilweise auch zu mehreren miRNAs komplementäre Bindungsstellen. Die
Regulation, die diese mRNAs durch miRNAs erfahren, kann sehr stark sein. Dies und
die Redundanz sequenz-verwandter miRNAs erklärt, warum nur eine begrenzte
Anzahl von Defekten durch Ausschalten einzelner miRNAs zu beobachten ist und
warum nur wenige miRNAs in genetischen Untersuchungen („Screens“) von
phänotypisch auffälligen Organismen entdeckt wurden.
Stoffwechsel, Apoptose, Kanzerogenese
Einige miRNAs beeinflussen den Stoffwechsel der Zelle und sitzen an der
Schnittstelle zum programmierten Zelltod. In einem Aufsehen erregenden Artikel
konnten Poy et al. 2004 zeigen, dass miR-375 in den Inselzellen des Pankreas
exprimiert wird und die Glukose-abhängige Sekretion von Insulin regulieren kann
(Poy, Eliasson et al. 2004). He et al. konnten 2007 zeigen, dass Überexpression von
miR-29,
welche
bei Modell-Mäusen
für Diabetes
mellitus
Typ
2
in der
Skelettmuskulatur gefunden werden kann, Insulinresistenz vermitteln kann (He, Zhu
et al. 2007).
Durch zahlreiche Hinweise auf eine Beteiligung von miRNAs an Apoptosevorgängen
(Brennecke, Hipfner et al. 2003) und bei der Zellzykluskontrolle (He, He et al. 2007)
liegt die Frage nach einer Beteiligung von miRNAs an der Krebsentstehung auf der
Hand. In der Tat gibt es etliche Beispiele für eine solche Beteiligung. Viele miRNAs
liegen an „breakpoint“-Regionen oder an besonders fragilen Stellen des Genoms
(Calin, Sevignani et al. 2004). Lu et al konnten zeigen, dass der Differenzierungsgrad
und die Abstammung eines Tumors durch sein miRNA-Profil widergespiegelt wird
(Lu, Getz et al. 2005). Darüber hinaus besteht auch eine Beziehung zwischen dieser
Expressions-Signatur und der Überlebensrate (Yanaihara, Caplen et al. 2006).
Niedrige Expressionsraten von let-7 korrelieren bei einigen Lungentumoren mit einer
erniedrigten Überlebensrate. Das miRNA-Profil von Tumoren hat somit einen
erheblichen prognostischen Wert.
18
Weitere Beispiele für die Beteiligung von miRNAs an Tumoren sind:
•
Neuroblastome (miR-9, -125a, -125b) (Laneve, Di Marcotullio et al. 2007)
•
chronisch lymphoide Leukämie (CLL) (Deletion miR-15a, -16a) (Cimmino,
Calin et al. 2005)
•
akut myeloide Leukämie (AML) (miR-181) (Debernardi, Skoulakis et al. 2007)
•
Mantelzelllymphom (miR-17-92-Cluster ) (Rinaldi, Poretti et al. 2007)
Entwicklung
Die Bedeutung von miRNAs für die Entwicklung wird deutlich, wenn ihre Reifung
durch Ausschalten („knockout“) von Dicer blockiert wird. Dicer-defiziente Mäuse
sterben bereits im Embyronalstadium (Bernstein, Kim et al. 2003). Murine
embryonale
Stammzellen
weisen
erhebliche
Defekte
der
Proliferation
und
Differenzierung auf (Murchison, Partridge et al. 2005). Aufgrund der Letalität dieser
genetischen Veränderungen wurden konditionale „knockouts“ erstellt, die es
ermöglichten, Dicer in einem spezifischen Gewebe zu einem bestimmten Zeitpunkt
auszuschalten. Dadurch konnte gezeigt werden, dass Dicer und somit miRNAs für
die korrekte Entwicklung von Haut (Andl, Murchison et al. 2006; Yi, O'Carroll et al.
2006), Lungenepithel (Harris, Zhang et al. 2006), Pankreas (Kloosterman, Lagendijk
et al. 2007) und Extremitäten (Harfe, McManus et al. 2005) nötig sind.
Eine wichtige Funktion von miRNAs besteht in der zeitlichen Steuerung von
Entwicklungsprozessen. Die ersten, in C. elegans entdeckten miRNAs, lin-4 und let7, steuern entscheidende Vorgänge. Lin-4 stellt einen zeitlichen Gradienten der
mRNA lin-14 her – nur dies ermöglicht den zeitgerechten Übergang zwischen
Larvenstadien. Ein weiteres Target von lin-4, lin-28, ist stark konserviert und kommt
außer in C. elegans auch bei Maus und Mensch vor. Lin-28 wird während der
Entwicklung zeitabhängig exprimiert und herunterreguliert (Moss and Tang 2003).
Auch let-7 ist ein wichtiger Zeitschalter. Durch Regulation von lin-41 und hbl-1
(„hunchback-homolog-1“) kontrolliert diese miRNA in C. elegans das zeitliche
Entwicklungsmuster. Diese Regulation ist interessanterweise hochgradig konserviert
(Pasquinelli, Reinhart et al. 2000).
Durch ihre Regulation greifen miRNAs auch in Signalkaskaden ein: Wird lin-4 in C.
elegans
überexprimiert,
ist
die
Lebensdauer
der
Würmer
verlängert.
Der
Verlängerung der Lebensdauer liegt eine Beteiligung von lin-4 an der Insulin/Insulinlike-growth-factor-receptor-Signalkaskade zugrunde (Boehm and Slack 2005). Auch
19
die Notch-Kaskade, die für die Entwicklung und Musterbildung notwendig ist, wird
von miRNAs beeinflusst und über konservierte Motive reguliert (Lai, Tam et al. 2005).
Im Zebrafisch konnte gezeigt werden, dass miR-214 die Expression von Genen des
Hedgehog-Signalweges verändert und dadurch während der Entwicklung die
Spezifikation von Muskelzellen kontrolliert (Flynt, Li et al. 2007).
MiRNAs wirken auch auf der Signalebene oberhalb von Transkriptionsfaktoren. Das
Homöobox-Gen Hoxb-8, welches die Expression von Sonic hedgehoc (Shh) und
somit die anterio-posteriore Entwicklung der Extremitäten reguliert, wird durch miR196 auf Transkriptionsebene reguliert (Hornstein, Mansfield et al. 2005).
Es existieren auch spannende Belege für die Beteiligung von miRNAs an der
Organogenese: miR-1, konserviert vom Wurm bis zu Säugern, wird sowohl in
Muskeln der Fliege und der Maus als auch im Mausherzen exprimiert (Aboobaker,
Tomancak et al. 2005; Zhao, Samal et al. 2005). Ein „knockout“ von miR-1 verhindert
zwar nicht die Entwicklung von Muskulatur, aber nach Aufzucht und Wachstum zeigt
die Muskulatur starke, abnorme Veränderungen. Als Konsequenz lässt sich sagen,
dass manche miRNAs zwar nicht für die Entwicklung eines Zelltyps, wohl aber für
das weitere Wachstum sowie für die Wahrung der Zellidentität außerordentlich
wichtig
sind.
Überexpression
von
miR-1
führt
zu
einem
verfrühten
Entwicklungsstillstand, dünneren Ventrikeln und konsekutiv zum Herzversagen.
Ultrastrukturell lassen sich vorzeitige Proliferation und Differenzierung der Myozyten
erkennen. Eine Deletion von miR-1 zeigt dessen wichtige Rolle in Bezug auf
Kardiogenese, elektrische Leitung und Zellzykluskontrolle auf, da hier Defekte
nachzuweisen sind (Zhao, Ransom et al. 2007). In vitro hemmt miR-1 HDAC4, einen
transkriptionellen Repressor der Muskeldifferenzierung (Chen, Mandel et al. 2006).
HDAC4 wird auch durch miR-140 reguliert, was zeigt, dass während der Entwicklung
durchaus auch zwei oder mehrere verschiedene miRNAs eine Ziel-mRNA regulieren
können. miR-140 ist für die Osteoblastendifferenzierung und Skelettentwicklung von
Bedeutung. Die genomische Organisation von miR-1 zeigt ein weiteres Phänomen:
miR-1 liegt in einem Cluster gemeinsam mit miR-133 vor. Beide haben
unterschiedliche Seed-Sequenzen und unterscheiden sich deutlich in ihrer Funktion,
da
miR-133
die
Differenzierung
des
Muskelgewebes
inhibiert
und
die
Muskelzellproliferation durch Hemmung von SRF fördert. Beiden miRNAs ist
gemeinsam, dass sie im Herzen regional unterschiedlich exprimiert werden und die
Expression von Kaliumkanälen regulieren (Luo, Xiao et al. 2007).
20
MiRNAs sind auch an der neuronalen Entwicklung beteiligt. In C. elegans regulieren
zwei miRNAs (lsy-6 und miR-273) die Asymmetrie von Chemosensoren (Chang,
Johnston et al. 2004). Durch Regulation der Kinase Limk-1 kontrolliert eine weitere
miRNA, miR-134, die synapsennah im Rattenhippocampus nachgewiesen wurde, die
Entwicklung von dendritischen Ausbuchtungen, so genannten „spines“ (Schratt,
Tuebing et al. 2006). In kortikalen Neuronen konnte miR-132 nachgewiesen werden,
dessen Inhibition das Auswachsen und die Morphogenese von Neuronen erheblich
behindert (Vo, Klein et al. 2005). Darüber hinaus weisen während der
Gehirnentwicklung
Expressionsänderung
in
der
auf
Maus
(Krichevsky,
etliche
King
miRNAs
et
al.
eine
2003).
signifikante
So
ist
die
Herunterregulation des SCP1-Gens durch miR-124 entscheidend für die Entwicklung
des zentralen Nervensystems (Visvanathan, Lee et al. 2007).
1.3
Fragestellung und Zielsetzung der Arbeit
Wie bereits erwähnt, ist die Entwicklung der Niere ein komplexer Vorgang, bei dem
etliche Gene wechselseitig die Entstehung dieses Organs beeinflussen. In anderen
Organen und Organismen konnte bereits gezeigt werden, dass miRNAs für die
regelrechte embryonale Entwicklung und Organogenese eine entscheidende
Bedeutung haben. Um deren Rolle in der Entwicklung der Säugerniere zu verstehen
wäre es daher hilfreich, mehr über miRNAs zu erfahren, die während der
Nierenentwicklung exprimiert und differentiell reguliert sind.
In dieser Arbeit ging es uns daher darum, ein miRNA-Expressionsprofil während der
Nephrogenese der Maus zu erstellen und einen Ausblick auf die Funktion dieser
miRNAs zu geben.
21
2.
Methoden
2.1
Materialien und Lösungen
Für die verschiedenen Experimente und Methoden wurden zahlreiche Lösungen und
Reagenzien verwendet, die hier kurz aufgelistet sind.
2.1.1 Gewinnung embryonaler Nieren und RNA-Extraktion
-
Embryonale Mausnieren der Stadien E11.5, E13.5, E16.5 sowie Nieren von
neugeborenen Tieren
-
PBS: 136 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 6,25 mM Na2 HPO4; 1,5 mM KH2PO4
-
PBS+: wie PBS, zusätzlich Ca2+ 1 mM und Mg2+ 0,5 mM, eiskalt
-
Scheren, Pinzetten (World Precision)
-
GTC-Puffer für RNA: GTC (Fluka) 4M; N-Laurylsarcosine (Sigma) 5mM (1 g / 200 ml
GTC), Na-Citrat (Merck) 25 mM, NaOH (Riedel de Haen) 0,5 mM, steril filtriert durch
0,8 µm-Filter (Corning); End-pH: pH=7,0; Zugabe von 7 µl Mercaptoethanol (Merck) /
ml GTC-Puffer
-
Li-Acetat (Sigma-Aldrich) 102 mM, mit Essigsäure (Riedel de Haen) auf pH=4,0 titriert
-
Aqua-Phenol (Q-Biogene), pH < 5
-
Chloroform (J.T.Baker) – Isoamylalkohol (Merck) im Verhältnis 49:1
-
Isopropanol (Merck)
-
Ethanol-Lösung 70%, eiskalt (J.T. Baker)
-
Aufreinigung der RNA: RNeasy Mini Kit™ (Qiagen), Ethanol (J.T. Baker), Puffer RLT
(Qiagen), Puffer RPE (Qiagen)
2.1.2 In situ – Hybridisierung: whole mount, Schnitte, embryonale Nierenkultur
Gewinnung der Embryos, Gewebepräparation
-
Dissektion in PBS, Fixierung in Paraformaldehyd (PFA) (Sigma) 4% in PBS,
Dehydrierung: Methanol (JT Baker), PBT = PBS (Zusammensetzung s.o., nur mit
H2O-DEPC) + 0,1% Tween-20 (Sigma); DEPC blockiert nach dem Autoklavieren
RNAsen
Gewebepräparation für Paraffinschnitte
-
PFA 4% in PBS
-
Einbettmedium: Paraffin (Engelbrecht)
-
Mikrotom (Leica)
-
Objektträger (Fisher Scientific)
-
Ethanol (JT Baker), Methanol
-
Xylene (JT Baker)
22
Instrumente
-
Scheren, Pinzetten (World Precision)
-
Einmal-Pasteurpipetten (Roth)
Allgemein
-
H2O-DEPC 0,1% (Fluka)
-
PBT (s.o.)
-
H2O2 30% (Merck) in PBT
-
Proteinase K 2 µg/ml (Roche)
-
Glyzin (Sigma) in PBS, 2 mg/ml
-
Glutaraldehyd (Sigma)
-
Acetylate: Acetanhydrid 2,5 mM (Sigma); Triethanolamin 0,1 M (Sigma); frisch
hergestellt, da instabil
Hybridisierungspuffer
-
„low stringency hybridization buffer“: Formamid 50% (Fluka); 2x SSC pH 4,5 (NaCl
0,3M, Na-Citrat 30 mM); Yeast-RNA (Sigma) 50 µg/ml; Tween-20 0,1%; Heparin
50 µg/ml (Sigma); Denhardt’s solution 1x
-
Denhardt’s Solution 50x: Ficoll Typ 400 500 mg (Pharmacia); Polyvinylpyrolidone
500 mg (Sigma); BSA 500 mg (Sigma), H2O-DEPC ad 50 ml
Sonden
-
miRCURY™ LNAs („locked nucleic acids“), 3’-DIG-UTP gelabelt (Exiqon)
Waschlösungen
-
TBST: 0,14 M NaCl; 2,7 mM KCl; 25 mM Tris-HCl, pH 7,5 (Sigma); 1% Tween-20,
2 mM Levamisole (Applichem)
-
Formamid 50%; Tween-20 0,1%; 1x SSC
Antikörperreaktion
-
Blockierlösung: Lamm-Serum 5% (Initrogen); 1% BSA in PBT
-
anti-DIG-Fab-Fragment (Roche)
Färbereaktion
-
NTMT: 100 mM NaCl; 100 mM TrisHCl, pH 9,5; 50 mM MgCl2; Tween-20 0,1%;
Levamisole 2 mM
-
NBT (100 mg/ 1ml 70% Dimethylformamid, Roche)
-
BCIP (50 mg/ml, Roche)
-
Stopplösung: PBS pH 5,5; 1 mM EDTA (Serva)
Aufbewahrung
-
Rotihistol (Roth), Entellan (Merck)
23
2.1.3 Zell- und Organkultur
-
DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium) (Invitrogen) mit 4,5 g/l Glucose mit
2,5 mM L-Glutamine und Zusatz von 5% Kälberserum und Eisen
-
Trypsin-EDTA (Invitrogen) mit HBSS ohne Magnesium und Calcium
-
PBS: 136 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 6,25 mM Na2 HPO4; 1,5 mM KH2PO4
-
HEK 293T- Zellen (human embryonic kidney), Prof. Dr. B. Seed (Harvard Medical
School, Boston)
-
Medium für embryonale Nierenkultur: DMEM mit 2,5 mM Glutamin (Invitrogen), FCS
10% und Penicillin (100 U/ml)/Stretptomycin (100 µg/ml)
2.1.4 DNA, Plasmide und Klonierungen
-
T4- Ligase (New England BioLabs)
-
Pfu- Polymerase (Stratagene)
-
Restriktionsenzyme (New England BioLabs)
-
Rekombinase-Enzyme für das Gateway-System (Invitrogen)
-
Plasmid-Präparationskit (Qiagen)
2.1.5 Herstellung von siRNA
-
Einzelstrang-RNA (Biomers)
-
Annealing Buffer 5x: Tris pH 8.0 50 mM, NaCl 100 mM
-
Agarose 3% (Biozym )
-
Na-Acetat pH 5,2 3 M (Sigma)
-
Isopropanol (Roth)
-
Ethanol
-
PBS (s.o)
2.1.6 Transfektionen
-
Lipofectamine 2000 (Invitrogen)
-
Optimem (Invitrogen)
2.1.7 Luciferase-Assay
-
Dual Luciferase Assay Kit (Promega), enthält: Passive Lysis Buffer (5x), LARII- sowie
Stop&Glo-Färbelösung
-
Luminometer: Mithras LB 940 (Berthold)
24
2.2
Gewinnung, Kultur und Fixierung embryonaler Nieren
Für die Gewinnung von RNA für den Micro-Array wurden embryonale Nieren von
NMRI-Mäusen der Stadien E11.5, E13.5, E16.5 sowie Nieren von neugeborenen
Mäusen präpariert und deren RNA extrahiert. Für embryonale Nierenkulturen wurden
Embyros aus schwangeren NMRI-Mäusen (im Stadium E11.5 oder E12.5)
entnommen. Die Entnahme erfolgte unter sterilen Kautelen und in RNAse-freier
physiologischer Lösung (PBS). Nach Präparation des Uterus mit Pinzetten wurde
dieser in 20 ml vorgekühltem, autoklaviertem PBS+ gewaschen und in sauberes
PBS+ transferiert. Nach stumpfer Eröffnung des Uterus und Entfernung des Amnions
unter dem Mikroskop wurden die so gewonnenen einzelnen Embryos durch
Pinzettendruck unmittelbar unterhalb der oberen Extremität in eine kraniale und eine
kaudale Hälfte geteilt. Aus der kaudalen Hälfte entnahmen wir nach der
Freipräparation der Urogenitalfalten die sich daran befindlichen embryonalen Nieren.
Aus den so präparierten Nieren wurde entweder RNA gewonnen (siehe 2.3) oder sie
wurden für die Nierenkultur weiter behandelt, indem die Nieren jetzt mit einer Pipette
auf einen Filter (0,4 µm Porengröße, PE, Corning) in das Medium überführt und bei
37°C und 5% CO2 in einer Luft-Medium-Interphase im befeuchteten Brutschrank
inkubiert wurden. Ein Wechsel des Mediums erfolgte alle 2 Tage. Der Umgang mit
den Nieren fand unter einem sterilen Abzug statt, um eine Kontamination zu
vermeiden. Nach 3, 5 oder 7 Tagen in Kultur wurden die Nieren durch folgende
Reihe in Methanol überführt, um sie zu dehydrieren und sie bei -20°C zu lagern:
2.3
-
PBS, 2 min, 1x
-
PFA 4%, 5 min, 1x
-
PBS, 5 min, 3x
-
Methanol (25 – 50 – 75 – 100% in PBS), jeweils 1x
RNA-Gewinnung für microRNA-Micro-Array
Für den Micro-Array wurden embryonale Nieren von NMRI-Mäusen der Stadien
E11.5, E13.5, E16.5, sowie Nieren von neugeborenen Mäusen, wie unter 2.2
beschrieben, präpariert und deren RNA nach der von Chomczynski et al. 1987
beschriebenen Methode extrahiert (Chomczynski and Sacchi 1987). Durch Zugabe
von 500-1000 µl GTC-Puffer wurde das embryonale Nierengewebe lysiert und die
25
RNA, die ansonsten sehr labil ist, stabilisiert. Um bei Nieren von neugeborenen
Tieren das Lysieren des Gewebes zu verbessern, wurden die Nieren in GTC-Puffer
zermörsert. Anschließend wurde die RNA durch Phenol-Chloroformextraktion
aufgereinigt und schließlich in H2O aufgenommen. Um so gewonnene miRNAs und
Gesamt-RNA weiter aufzureinigen benutzten wir ein RNA-Säulen-Elutionsverfahren
(RNeasy Mini Kit™, Qiagen). Zunächst wurden 350 µl RLT-Puffer, anschließend
1225 µl Ethanol 100% zugegeben. Dieses Gemisch wurde auf eine Säule (RNeasy
Mini spin column, Qiagen) gebracht und diese nach Zentrifugation mit 500µl Puffer
RPE gewaschen. Danach wurde die nun an die Säule gebundene RNA mit RNAsefreiem
Wasser
(40 µl)
durch
Tischzentrifugation
eluiert.
Von
jedem
Entwicklungszeitpunkt wurden biologische Duplikate angefertigt. Die Proben wurden
bei -80°C eingefroren und auf Trockeneis versandt. Um Menge und Qualität der RNA
zu bestimmen, wurde von der Firma Exiqon die Konzentration, die rRNA-Ratio
(28S/18S) und die RNA-Intergritätsnummer (RIN) mit dem Bioanalyzer (Agilent)
ermittelt. Die RIN wird ermittelt, da sich zeigte, dass die rRNA-Ratio als Marker für
die RNA-Qualität inkonsistent ist. Die RIN wird durch eine Software bestimmt (Agilent
2100 Bioanalyzer), welche die Banden der mikrokapillären RNA-Elektrophorese
analysiert. Eine RIN von 1,0 weist dabei vollständig degradierte, eine RIN von 10,0
vollständig intakte RNA aus (Schroeder, Mueller et al. 2006). Eine Übersicht über die
Qualität der so gewonnenen RNA gibt Abbildung 3. Insgesamt ergibt sich eine
durchwegs sehr gute Qualität aller gewonnenen Proben.
26
Stadium
Probennr.
RNA-Konz.
rRNA-
[ng/µl]
Ratio
RIN
[28S/18S]
E11.5
1
260
1,8
10,0
E11.5
2
447
1,8
10,0
E13.5
3
355
1,7
10,0
E13.5
4
253
1,7
10,0
E16.5
5
457
1,7
10,0
E16.5
6
380
1,7
10,0
newborn
7
502
2
9,1
newborn
8
446
1,8
9,8
Abbildung 3: Überwiegend gute bis sehr gute Qualität der extrahierten RNA. Oben:
Beispiel der Qualitätsanalyse an RNA von Sample 1. Unten: Übersicht über die Qualität
der einzelnen Proben.
2.4 In
situ-Hybridisierung:
„whole
mount“
sowie
embryonale
Nierenkulturen
Die „whole mount“ in situ- Hybridisierung ist eine sehr sensitive Methode, um RNA zu
detektieren. Dabei können auch die räumliche Verteilung und die Stärke der
Expression bestimmt werden. Für die Gewinnung dieser Mäuseembyros wurden
schwangere NMRI-Mäuse im entsprechenden Gestationsalter (E10.5, E11.5 sowie
E16.5) verwendet. Nach Präparation des Uterus wurden die Embryos in sterilem
PBS(+DEPC) unter dem binokularen Mikroskop stumpf präpariert. Nach vorsichtiger
Entfernung des Amnions überführten wir die gewonnen Embryos sofort in gekühltes
PBS, anschließend wurden die Embryos mit PFA 4% bei 4°C über Nacht fixiert.
27
Durch eine aufsteigende Methanol-Reihe (25% - 50% - 75% - 100% Methanol in
PBT) wurden die Embryos dehydriert.
Für die eigentliche Hybridisierung wurden sowohl die Embryos als auch embryonale,
kultivierte Nieren (Gewinnung: siehe 2.1) durch dieselbe Reihe (75% - 50% - 25%
Methanol:PBT, jeweils 5min) wieder rehydriert und anschließend in PBT überführt.
Zum Bleichen der Embryos sowie der Nieren wurden diese eine Stunde bei
Raumtemperatur in eine 2%-H2O2-Lösung in PBT gegeben. Überschüssiges H2O2
wurde durch dreimaliges Waschen mit PBT bei Raumtemperatur wieder entfernt. Um
das embryonale Gewebe für die Sonden permeabel zu machen, wurden die Embryos
für 20 (Nierenkultur) – 30 („whole mount“) Minuten mit Proteinase K in einer
Endkonzentration von 19,7 µg/1 ml PBT behandelt. Anschließend wurde die
Proteinase durch drei Waschschritte mit PBT entfernt. Daraufhin wurden die
Embryos mit PFA 4% und Glutaraldehyd 0,2% in PBT für 20min postfixiert, zwei
Waschschritte mit PBT entfernten danach das Fixans. Im weiteren Verlauf wurde das
embryonale Gewebe 10 min in frisch hergestelltem Acetylat inkubiert. Die
Acetylierung bewirkt, dass die an der RNA haftenden Ribosomen abgelöst werden
und so eine Maskierung der RNA verhindert wird, somit wird die RNA zugänglich für
Sonden.
Jetzt
wurde
„low
stringency
hybridization
buffer“
ohne
Sonde
(Prähybridisierungslösung) hinzugegeben und das Gewebe für 1 h mit der späteren
Hybridisierungstemperatur prähybridisiert. Als Hybridisierungstemperatur wählten wir
eine Temperatur 20-22°C unterhalb des Schmelzpunktes der miRNA-LNA-Sonde,
bei der die Paarbildung zwischen RNA und LNA-Sonde am stärksten ausgeprägt ist
(Kloosterman, Wienholds et al. 2006). Bei den verwendeten Sonden lag dieser Punkt
bei 47°C. Nach Entfernung der Prähybridisierlösung wurde die Hybridisierlösung
(„low stringency hybridization buffer“) mit 10 nM miRNA-LNA-Sonde auf die Embryos
gegeben. Diese war zuvor für 5min auf 65°C erhitzt worden, um eventuelle
unspezifische Paarbildungen der Sonde wieder zu trennen. Bei 47°C erfolgte die
Hybridisierungsreaktion über Nacht.
Nach der Hybridisierung wurden die Proben 3x 30min bei Hybridisierungstemperatur
mit „Solution 1“ (Formamid 50%; 5x SSC pH 4,5; SDS 1%) gewaschen, anschließend
3x 30 min bei 4°C mit „Solution 3“ (Formamid 50%; 2x SSC pH 4,5). Um das
Gewebe für die Antikörperreaktion abzublocken, wurde es nach 3 Waschschritten in
TBST für 2,5 h in Blockierlösung gegeben. Über Nacht wurden die Embryos mit
1:2.500 verdünntem Anti-DIG-Antikörper in Blockierlösung inkubiert.
28
Nach Abschluss der Antikörperreaktion wurde das Antiserum entfernt und wie folgt
ausgewaschen:
•
TBST, 3x, 5 min
•
TBST, 5x, 1,5 h
•
TBST, 4°C, über Nacht
Zur Vermeidung eines unspezifischen Hintergrundsignals muss die endogene
alkalische Phophatase (AP)-Aktivität des embryonalen Gewebes durch Zugabe von
Levamisol zu der Pufferlösung NTMT blockiert werden. Diese Substanz blockiert die
Funktion der endogenen alkalischen Phophatase, nicht jedoch die AP-Isoform,
welche an den Antikörper gekoppelt ist. Die eigentliche Färbereaktion, die
gebundene Antikörper mit eigener Phosphatase-Aktivität nachweist, entsteht durch
Zugabe von gleichen Teilen NBT/BCIP. Die Dauer dieser Färbereaktion variiert stark
und kann wenige Minuten bis einige Tage dauern. Um die Reaktion zu stoppen,
wurde das embryonale Gewebe zweimal mit PBS pH 5,5 gewaschen, anschließend
in PFA 4% und Glutaraldehyd 0,1% in PBS für 1-2 h fixiert.
2.5
In situ-Hybridisierung: Paraffinschnitte
Wie
auch
für
die
„whole
mount“-Hybridisierungen
wurden
Embryonen
unterschiedlicher Stadien gewonnen. Für Hybridisierungen auf mikroskopischen
Schnitten wurden die Embryos direkt nach ihrer Präparation in Paraffin eingebettet,
es wurden 8 µm dicke Schnitte angefertigt und auf Objektträger gebracht. Das
Gewebe wurde in frischem 4%-igen PFA fixiert und anschließend bei 60°C für 20
Minuten von überschüssigem Paraffin befreit. Nach 2x 10 min in Xylene wurden die
Objektträger über mehrere Ethanolwaschschritte (100% - 95% - 90% - 80% - 70% 50% - 30% Ethanol:H2O) hydriert und in PBS überführt.
Die Schnitte auf den Objektträgern wurden erneut bei 4°C für 10min in PFA 4%
fixiert, anschließend dreimal mit PBS gewaschen. Um das Gewebe für die Sonden
durchgängig zu machen, wurde es 12 min mit 2 µg/ml Proteinase K in PBS behandelt
und diese Reaktion mit Glyzin (2 mg/ml PBS) abgestoppt. Nach 10 min in frisch
angesetztem Acetylat wurden die Embryos erneut 3x in PBS gewaschen. Für die
Hybridisierung wurde zunächst dem „low stringency hybridization buffer“ die miRNASonde zu einer Endkonzentration von ca. 30 ng/µl zugegeben. Die Puffer-SondenLösung wurde für 5 min auf 65°C erhitzt, um eventuelle unspezifische Paarbildungen
29
der Sonde wieder zu trennen. Nach Abkühlen auf Eis wurden 100 µl der SondenHybridisierlösung pro Slide aufgetragen und diese mit Parafilm bedeckt, um
sämtliches Gewebe auf dem Objektträger mit der Lösung zu benetzen. Die
Objektträger wurden nun bei einer Temperatur von 47°C über Nacht mit den Sonden
hybridisiert. Diese Hybridisierung erfolgte in einer Kammer, die zuvor mit einer
Lösung aus Formamid 50% und 1x SSC befeuchtet wurde.
Nach
der
Hybridisierung
wurden
die
Objektträger
zunächst
10
min
bei
Raumtemperatur mit 5x SSC gewaschen, danach 2x 30 min mit der Waschlösung bei
47°C gewaschen. Nach zwei Waschschritten bei Raumtemperatur, 15 min in 0,2x
SSC und 15 min in PBS, folgte die Antikörperreaktion. Dafür wurden die Slides
zunächst 1 Stunde in Blockierlösung gegeben, um anschließend 2-3 h bei 4°C mit
dem in Blockierlösung 1:4.000 verdünnten anti-DIG Fab-Fragment inkubiert zu
werden. Um den Antikörper zu entfernen, wurde 2x 30 min in PBT und 3x 15 min in
PBS gewaschen.
Zur Blockade der endogenen AP-Aktivität wurden die Slides in Levamisol-haltigem
NTMT-Puffer gewaschen. Anschließend erfolgte der Start der Färbereaktion in einer
abgedunkelten Kammer durch Zugabe von 2 ml NBT/BCIP pro Objektträger. Um die
Färbereaktion zu beenden, wurden die Objektträger einmal in PBS pH 5,5 mit 1 mM
EDTA und zweimal in PBS gewaschen. Zum Eindeckeln mussten die Objektträger
zunächst dehydriert werden. Dies geschah durch eine aufsteigende Ethanol-Reihe
(70% - 80% - 90% - 95% - 100%) und eine Behandlung mit Rotihistol für 5-10 min.
Mit Entellan wurde das Deckglas aufgetragen.
2.6
DNA, Plasmide, und Klonierungen
Alle in dieser Arbeit verwendeten DNA-Konstrukte wurden mit Standardmethoden
durch Polymerasekettenreaktion, Restriktionsenzymverdau und T4-Ligation in den
dualen Reportervektor pGL4 (psiCheck2™, Promega) kloniert.
Alle Konstrukte
wurden mit dem E. coli- Stamm DH10T1alpha (Invitrogen) generiert. Die DNA wurde
durch Elution über DNA-Elutionssäulen (Maxi Prep Kit, Qiagen) aus Bakterien
gewonnen. Alle Konstrukte wurden durch Sequenzierung verifiziert.
30
2.7
Zellkultur
Für die Versuche wurden HEK 293T-Zellen verwendet. Alle Zelllinien wurden in
einem befeuchteten Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Hierzu wurden die
Zellen in 10 cm-Schalen in DMEM- (Dulbecco`s Modified Eagle´s Medium) Medium
mit 10% FBS kultiviert. Der Umgang mit den Zellen fand unter einem sterilen Abzug
statt, um eine Kontamination der Zellen zu vermeiden.
Die Subkultivierung der konfluenten Zellen erfolgte durch Trypsinisierung und eine
1:5-Passage. Dabei wurde das alte Medium abgesaugt. Es folgte ein kurzer
Waschschritt mit sterilem PBS (25°C). Tropfenweise konnte nun 1 ml Trypsin zu den
Zellen gegeben werden. Damit sich die Zellen besser ablösen konnten, wurden die
10 cm-Schalen für 1-2 Minuten erneut in den Brutschrank gestellt. Nachdem die
Zellen durch das Trypsin nun weitgehend nicht mehr adhärent waren, wurden die
Zellen in 9 ml Medium aufgenommen und je nach Passageverhältnis auf
entsprechend viele vorbereitete 10 cm-Schalen oder 96-well-Platten für die
Luciferase-Assays verteilt.
2.8
Herstellung von siRNA
Um siRNAs transfizieren zu können, müssen diese als Doppelstrang in die Zelle
eingebracht werden. Um die als Einzelstrang vorliegenden RNAs zu hybridisieren,
führten wir zunächst die zusammengehörigen Stränge in einer Konzentration von je
20 µM in Annealing Buffer zusammen. Dieses Gemisch wurde im Block auf 95°C für
1 min erhitzt, um die Stränge gut zu trennen. Danach wurde der Block langsam auf
37°C heruntergekühlt, um ein Annealing zu ermöglichen. Das korrekte Annealing
wurde auf einem 3%-Agarosegel überprüft.
Anschließend wurde die siRNA durch Zugabe von 0,1x Volumen an 3 M Na-Acetat
und 1 Volumen an Isopropanol aufgereinigt. Nach Kühlung auf Eis für 5 min und
Tischzentrifugation für 10 min wurde der Überstand verworfen. Das entstandene
Pellet wurde mit 0,5 ml Ethanol 70% gewaschen, luftgetrocknet und schließlich in
sterilem PBS aufgenommen.
31
2.9
Transfektionen
Am Vortag in ein 96-well gesplittete, ca 75% konfluente HEK 293T-Zellen wurden mit
der liposomalen Methode transient transfiziert. Die Zellen wurden dafür wie unter
2.10 beschrieben gesplittet. Diese Methode ist sehr gut geeignet, um sowohl DNA
(Felgner, Gadek et al. 1987) als auch RNA (Malone, Felgner et al. 1989) in Zellen zu
transfizieren. Lipofectin bildet als Mischung mit Nukleinsäuren Komplexe aus DNA
und kationischen Lipiden aus. Bei dieser Methode nutzt man die Fähigkeit der Zellen
aus, diese Lipid-DNA-Komplexe über Endozytose aufzunehmen (Zuhorn and
Hoekstra 2002). Unter dem sterilen Abzug wurden im 96-well pro well 30 ng DNA,
25 µl Optimem und 7,5 pmol der siRNA gemischt und es wurde eine Mischung aus
25 µl Optimem und 0,25 µl Lipofectamine 2000 zugefügt. Dieses Gemisch wurde
20 min bei Raumtemperatur unter dem sterilen Abzug inkubiert, damit sich
ausreichend Lipid- DNA/RNA-Komplexe bilden konnten. Anschließend wurde die
Lösung auf HEK-293T-Zellen in einem 96-well gegeben. Mit dieser Lösung wurden
die Zellen für 24 h im Brutschrank inkubiert.
2.10 Luciferase-Assays
Der Luciferase-Assay ist ein nützliches Werkzeug, um die Regulation des 3’-UTRs
eines Gens zu untersuchen. Dafür muss dieser 3’-UTR über Klonierungen in den
pGL4-Vektor psiCheck2™ (Promega) eingefügt werden. Dieser Vektor kodiert für
zwei Luciferasen, die Renilla- und die Firefly-Luciferase. Die Klonierungsstellen sind
so angebracht, dass der zu untersuchende, neu eingefügte 3’-UTR zugleich den
künstlichen 3’-UTR der mRNA darstellt, die für die Renilla-Luciferase kodiert.
Jedwede Regulation dieses 3’-UTR führt zu einer Änderung der Renilla-Akitivtät, die
mit dem Luminometer messbar ist. Die Firefly-Luciferase wird von einem HSV-TKPromotor aktiviert und ist konstitutiv aktiv. Sie dient bei diesen Versuchen der
Transfektionskontrolle sowie der Normalisierung des Hintergrundes, da sie keiner
Regulation unterliegt.
Für den Assay wurden zunächst konfluente HEK-293T-Zellen trypsinisiert, in
frischem Medium aufgenommen, ausgezählt und anschließend 4x105 Zellen pro well
in eine 96-well-Zellkulturschale überführt. Am nächsten Tag wurden die Zellen wie
unter 2.9 beschrieben mit Lipofectamine transfiziert. Nach weiteren 24 h wurde die
32
Transfektion gestoppt. Nach Absaugen des Mediums wurden die Zellen 15 min mit
20 µl Passive Lysis Buffer (Promega) lysiert. Anschließend wurden 10 µl auf eine
Lumineszenz-Platte übertragen und diese mit dem Luminometer ausgewertet. Für
die Bestimmung der Lumineszenzen injiziert dieser Automat zunächst ein Reagens
(LARII, Promega), welches die Firefly-Luciferase aktiviert. Diese rasch abfallende
Lumineszenz wird anschließend für 12 s gemessen. Danach wird das Stop&GloReagens injiziert, welches die Aktivität der Firefly-Luciferase effizient unterdrückt und
gleichzeitig die Renilla-Luciferase aktiviert. Auch hier misst das Gerät die
Lumineszenz für 12 s. Bei beiden Lumineszenzen ist der lineare Messbereich sehr
groß, er erstreckt sich über 6-7 Größenordnungen. Die Ergebnisse wurden
anschließend elektronisch ausgewertet, die statistische Auswertung erfolgte durch
die Software JMP 4.1.
33
3.
Ergebnisse
3.1
Expressionsprofil
von
427
micro-RNAs
während
der
Nierenentwicklung
3.1.1 Anordnung und Auswertung des Micro-Arrays
Um zu untersuchen, welche Rolle miRNAs für die Entwicklung der Niere spielen, galt
es, zunächst diejenigen miRNAs zu identifizieren, die in der sich entwickelnden Niere
entweder hoch exprimiert sind oder aber während der Entwicklung eine signifikante
Änderung ihrer Expression aufweisen. Dafür wurden embryonale Nieren von Mäusen
der Stadien E11.5, E13.5, E16.5 (entsprechend Tagen post conceptionem) sowie
Nieren von neugeborenen Mäusen präpariert (siehe 2.2) und deren RNA wie unter
2.3 beschrieben extrahiert. Von jedem Stadium wurden biologische Duplikate
angefertigt.
Das
microRNA-Expressionsprofil
von
acht
Proben
wurde
auf
miRCURY™ LNA Arrays (Exiqon) analysiert. Die miRCURY™ LNA Arrays enthalten
427 verschiedene Sondentypen. Diese Messungen wurden von der Firma Exiqon
durchgeführt. Die statistische Auswertung erfolgte durch die Firma IMGM
(Martinsried). Die miRNA-Array-Analyse umfasste die folgenden Proben:
Sample-Nr. Probenbezeichnung
Beschreibung
Sample 1
E11.5 - A
E11,5: Replikat 1
Sample 2
E11.5 - B
E11,5: Replikat 2
Sample 3
E13.5 - A
E13,5: Replikat 1
Sample 4
E13.5 - B
E13,5: Replikat 2
Sample 5
E16.5 - A
E16,5: Replikat 1
Sample 6
E16.5 - B
E16,5: Replikat 2
Sample 7
new - A
Neugeboren: Replikat 1
Sample 8
new - B
Neugeboren: Replikat 2
Sample 9
reference
Mischung von gleichen Teilen der Samples 1 bis 8
Die Hybridisierungen auf miRCURY™ LNA Arrays (Exiqon) wurden als „Two-Color“Experimente durchgeführt: Die RNA der Samples 1 bis 8 wurde mit dem
Fluoreszenzfarbstoff Hy5™ (Cy5, rot) gelabelt, die Referenz-RNA (Sample 9) mit
Hy3™ (Cy3, grün). Es wurden 8 „Slides“ ausgewertet, wobei je Slide eine Mischung
aus dem Referenz-Sample 9 und einem der anderen Samples aufgetragen wurde, so
dass eine kompetitive Hybridisierung Cy3- und Cy5-gelabelter miRNAs aus den
Mausnieren mit den Array-Sonden stattfinden konnte. Nicht hybridisierte RNA wird
34
anschließend weggewaschen. Durch Exzitation bei bestimmten Wellenlängen mittels
Laser kommt es zur Emission unterschiedlich starker, jeweils für Cy3 und Cy5
typischer Fluoreszenzsignale. Diese Fluoreszenzsignale wurden ausgelesen und die
Aufnahmen mit Hilfe der Bildanalysesoftware ImaGene ausgewertet.
Die Datenanalyse beruht im Wesentlichen auf log-Ratio-Werten. Diese sind die log2transformierten Quotienten der Messwerte aus rotem (Cy5, „R“) und grünem (Cy3,
„G“) Kanal. Dabei gilt:
M = log2(R/G) = log2R – log2G.
Die log-Transformation übt einen normalisierenden Effekt auf die Daten aus. Darüber
hinaus ist eine weitere Normalisierung notwendig, um Unterschiede in der GesamtSignalintensität der verschiedenen Arrays auszugleichen und die Datenverteilung an
eine Normalverteilung anzunähern.
Zur Normalisierung wurde die Global loess-Methode angewendet. Diese ist sehr
gebräuchlich für die Analyse von Zweifarben-Experimenten (Cy3/Cy5) und gehört bei
cDNA-Arrays zu den Standardmethoden. Sie basiert auf einer lokal gewichteten,
linearen Regression und glättet die Datenverteilung, indem jeder Datenpunkt an die
Werte
benachbarter
Punkte
angeglichen
wird.
Zuvor
erfolgte
eine
Hintergrundkorrektur.
Für jeden Sonden-Typ entstehen pro Slide vier log-Ratio-(M-) Werte, da jede Sonde
in insgesamt 4 Sub-Arrays enthalten ist. Aus diesen Werten wurden durch
Entlogarithmieren die Ratios errechnet, also die normalisierten Quotienten der Hy5und Hy3-Signale. Um die durchschnittliche Ratio eines Sonden-Typs zu ermitteln,
wurde der Median der Ratios der vier zusammengehörigen Sonden errechnet, sofern
dies die Flag-Werte erlaubten. Hierbei wird jeder Sonde ein Flag-Wert zugeordnet,
dieser kann die Werte 0, 1, 2 oder 3 annehmen:
0 = kein Flag, Signal gut.
1 = negativer Spot (Signal < Background)
2 = leerer Spot ((Signal – Background)/(Standardabweichung der
Pixelintensitäten über die lokale Backgroundregion hinweg) < 1)
3 = suboptimaler Spot (Signalsättigung oder Spot-Morphologie nicht optimal)
Bezogen auf alle Sonden ergibt sich je nach Slide eine Quote von 20,7 – 41% aller
Sonden, die kein Flag-Tag erhalten haben.
Um die Ähnlichkeit der zusammengehörigen Duplikate zu ermitteln, wurde die
Korrelation der einzelnen Slides untereinander untersucht. Dazu wurden die Daten
35
vorgefiltert: Die geflaggten Sonden (Flag=1 oder Flag=2) wurden ausgeschlossen,
außerdem wurden die Kontrollspots weggefiltert. Somit wurde die Korrelation der
Probenpaare nur von verlässlich detektierbaren miRNA-Sonden mit dem Pearson’s
Korrelationskoeffizienten R berechnet. Am besten ist dabei die Korrelation der
Proben 1 und 2, also der RNA-Duplikate von E11.5, sie liegt bei 0,903. Etwas
geringer ist die Korrelation der anderen zusammengehörigen Duplikate (R= 0,820,
0,800 und 0,846). Zwischen den Slides aufeinander folgender Zeitpunkte besteht
teils noch eine gewisse Korrelation (z.B. Slide 6 / Slide 7: R = 0.597), zwischen vielen
Proben ist aber keinerlei Ähnlichkeit festzustellen (z.B. Slide 1 / Slide 5: R = 0.162).
Die Korrelation der Signale der biologischen Duplikate war geringer als dies bei
bisher üblichen Gesamtgenom-Expressionsarrays zu beobachten gewesen war.
Vermutlich ist diese verringerte Korrelation zum Teil in methodenbedingten
Variationen begründet. Zum anderen dürften aber auch die im Vergleich zu den
Gesamtgenom-Genexpressionsarrays deutlich geringere Anzahl von Spots auf dem
Array (427 x 4 im Vergleich zu mehr als 30.000 Spots) und der relativ geringe
dynamische Bereich der Signale (zwei Zehnerpotenzen im Vergleich zu fünf
Zehnerpotenzen bei den Gesamtgenomarrays) dazu beitragen, dass die Ergebnisse
breiter streuen und somit der Korrelationskoeffizient niedriger liegt.
Im Gegensatz dazu korreliert das Kontrollsignal (Hy3) erwartungsgemäß gut
zwischen den verschiedenen Slides: Die Korrelationskoeffizienten der normalisierten
Hy3-Signale lagen recht homogen in einem Bereich von 0.945 bis 0.984. Slide 1
korreliert dabei tendenziell etwas schlechter mit den übrigen Slides.
Da die zusammengehörigen Duplikate eine ausreichend starke Korrelation zeigten,
wurden ihre Daten zusammengefasst. Die medianen Ratios der zusammengehörigen
Duplikate wurden hierzu gemittelt („Average Median Ratio“). Dabei zeigt sich die
Korrelation der Probenpaare untereinander: Nah aneinander liegende Stadien
korrelieren recht gut (R=0,857 für E11.5/E13.5), während entfernte Stadien nur sehr
schlecht (R=0,053 E11.5/E16.5) korrelieren.
Um
das
Expressionsniveau
einer
miRNA
zu
bestimmen,
wurden
die
FoldChange(FC)-Werte ermittelt. Die M-Werte können dabei als logarithmische
FoldChange-Werte gegenüber der Referenz-Probe „Sample 9“ betrachtet werden:
Ein M-Wert von 0 bedeutet demnach, dass das Signal der Probe (Hy5) gleich stark
wie das Signal der Kontrolle (Hy3) ist, der FoldChange beträgt somit 1. FoldChange36
Werte unter 1 bedeuten daher eine Expression unter dem Kontrollniveau, während
ein Wert über 1 eine höhere Expression bedeutet.
Anschließend wurde die differentielle miRNA-Expression zwischen verschiedenen
Stadien ermittelt, indem ihre gemittelten Median-Werte (Average Median Ratio) ins
Verhältnis gesetzt wurden. Die Signale der Referenzprobe Sample 9 fallen beim
Bilden dieser Quotienten rechnerisch heraus.
Datenfilterung
Um diejenigen miRNAs zu ermitteln, die sich in einem bestimmten Stadium von der
Mischung aller Proben (Referenz Sample 9) oder die sich untereinander
unterscheiden, wurde mit zwei unterschiedlich stringenten FoldChange-Kriterien
gefiltert:
•
Weniger stringente Filterung: Expression der miRNA ist im betrachteten
Stadium gegenüber der Referenz um das mindestens 1,5fache dereguliert.
•
Stringente Filterung: Expression der miRNA ist im betrachteten Stadium
gegenüber der Referenz um das mindestens 2-fache dereguliert.
3.1.2 Vergleich der einzelnen Zeitpunkte mit der Referenz Sample 9
Um diejenigen miRNAs zu ermitteln, die sich in (mindestens) einem Stadium deutlich
von den übrigen Proben unterscheiden, wurde der aus den gemittelten MedianRatioWerten abgeleitete FoldChange zum Filtern verwendet.
3.1.2.1 Induktion in E11.5 im Vergleich zur Referenz
Zunächst wurde durch stringente Filterung analysiert, welche miRNAs in den Proben
1 und 2 (E11.5) gegenüber der Referenzprobe im Mittel um den Faktor 2 oder größer
induziert waren. Es handelt sich um eine Sonde, der momentan in miRBase noch
keine murine miRNA zugeordnet ist, der allerdings die humane miRNA hsa-miR-452*
entspricht, die auch ein entsprechendes Korrelat im Mausgenom besitzt. Dabei gibt
der Stern an, dass es sich dabei um den komplementären Gegenstrang von hsamiR-452 handelt. Diese Annotation gilt für alle folgenden miRNA-Sonden. Hsa-miR452* war gegenüber der Referenzprobe um den Faktor 5 induziert. Durch weniger
stringente Filterung wurden 6 weitere miRNAs identifiziert (hsa-miR-492, FC 1,57;
mmu-miR-300, FC 1,63; mmu-miR-341, FC 1,52; mmu-468, FC 1,95; hsa-miR519e*, FC 1,58; hsa-miR-526c, FC 1,56).
37
3.1.2.2 Repression in E11.5 im Vergleich zur Referenz
Bei stringenter Filterung (FC E11.5/Referenz ≤ 0,5) ließen sich 18 miRNA-Sonden
identifizieren, die gegenüber der Referenzprobe reprimiert waren. Unter ihnen sind
sieben Mitglieder der let-7-miRNA-Familie vertreten (siehe Tab. 1).
Die weniger stringente Filterung (FC ≤ 0,66) resultierte in 11 weiteren miRNASonden. Dazu gehören: mmu-miR-130, FC 0,51; mmu-miR-15a, FC 0,54; mmu-miR16, FC 0,66; mmu-miR-23a, FC 0,64; mmu-miR-23b, FC 0,53; mmu-miR-24, FC
0,54; mmu-miR-26a FC 0,55; mmu-miR-26b, FC 0,61, hsa-miR-498, FC 0,65; mmumiR-292-5p, FC 0,65; mmu-miR-27b, FC 0,51.
3.1.2.3 Induktion in E13.5 im Vergleich zur Referenz
Anschließend wurde mittels stringenter Filterung analysiert, welche miRNAs in den
Proben 3 und 4 (E13.5) gegenüber der Referenzprobe um den Faktor 2 oder größer
induziert waren.
Nur zwei Sonden-IDs erfüllten die Kriterien. Es handelt sich erneut um hsa-miR-452*
(FC 5,9) und zudem um mmu-miR-484 (FC 2,1). Die weniger stringente Filterung
(FoldChange 1.5) ergab 7 Sonden-IDs: mmu-miR-181, FC 1,5; hsa-miR-492, FC 1,7;
hsa-miR-512, FC 1,6; mmu-miR-434-3p, FC 1,6; rno-miR-151, FC 1,6. Die Sonde
rno-miR-151 steht dabei für eine miRNA, die in der Maus noch nicht annotiert ist,
jedoch der miRNA-151 der Ratte (Rattus norvegicus) entspricht.
3.1.2.4 Repression in E13.5 im Vergleich zur Referenz
Nach stringenter Filterung blieben 10 miRNA-Sonden übrig, die zum Zeitpunkt E13.5
gegenüber der Referenzprobe reprimiert waren. Auch hier sind erneut Mitglieder der
let-7-Familie vertreten. Die weniger stringente Filterung ergab 22 miRNA-Sonden,
zusätzlich zu den bereits stringent gefilterten waren dies mmu-let-7g, FC 0,53; mmumiR-126-3p, FC 0,56; mmu-let-7-i, FC 0,63; mmu-miR-193, FC 0,5; mmu-miR-196,
FC 0,63; mmu-miR-23a, FC 0,58; mmu-miR-24, FC 0,66; mmu-miR-26a, FC 0,66;
mmu-miR-30a-5p, FC 0,48; mmu-miR-30c, FC 0,5; mmu-miR-451, FC 0,55; mmumiR-27b, FC 0,6; hsa-miR-451, FC 0,55.
3.1.2.5 Induktion E16.5 im Vergleich zur Referenz
Lediglich drei Sonden genügten den stringenten Kriterien, dies waren die miRNAs
hsa-miR-452*, mmu-miR-484 und hsa-miR-500. Ihre FoldChange-Werte sind in Tab.
38
1 dargestellt. Die weniger stringente Filterung (FoldChange >1.5) resultierte in 7
Sonden, zusätzlich zu den bereits stringent gefilterten traten die miRNAs mmu-miR200b, FC 1,5; hsa-miR-346, FC 1,7; hsa-miR-451, FC 1,8; mmu-miR-451, FC 1,6
auf.
3.1.2.6 Repression E16.5 im Vergleich zur Referenz
Nach stringenter Filterung (FC ≤ 0,5) blieb hier keine einzige Sonde übrig. Die
weniger stringente Filterung (FC ≤ 0,66) lieferte 3 miRNA-Sonden: mmu-miR-450, FC
0,5; mmu-miR-133b, FC 0,6; hsa-miR-373*, FC 0,63.
3.1.2.7 Induktion in den „new born“-Proben im Vergleich zur Referenz
Durch stringente Filterung wurde untersucht, welche miRNAs in den „new born“Proben im Vergleich zur Mischung aller Proben um den Faktor 2 oder größer
induziert waren. Erneut erfüllten nur 3 Sonden die Filterkriterien: mmu-miR-429, rnomiR-352 und hsa-miR-452*. Ihre FoldChange-Werte sind in Tab. 1 wiedergegeben.
Nach weniger stringenter Filterung (FoldChange 1.5) ergaben sich 9 Sonden, hier
sind nun mehrere let-7-miRNAs unter den induzierten Genen vertreten:
miRNA
FoldChange
mmu-let-7a
1,64
mmu-let-7f
1,68
mmu-let-7b
1,63
mmu-let-7c
1,89
mmu-let-7d
1,68
mmu-miR-27b
1,50
3.1.2.8 Repression in den „new born“-Proben im Vergleich zur Referenz
Durch stringente Filterung (FC ≤ 0,5) wurden 6 Sonden identifiziert, die im Vergleich
zur Referenz in den „new born“-Proben um mindestens Faktor 2 reprimiert waren:
mmu-miR-450, mmu-miR-133b, hsa-miR-373*, hsa-miR-498, hsa-miR-483, mmumiR-483. Die FoldChange-Werte sind in Tab. 1 dargestellt.
Die weniger stringente Filterung (FC ≤ 0,66) resultierte in 6 weiteren miRNA-Sonden:
mmu-miR-130b, FC 0,58; mmu-miR-18, FC 0,63; mmu-miR-296, FC 0,56; hsa-miR492, FC 0,63; mmu-miR-290, FC 0,51; mmu-miR-292-5p, FC 0,62.
39
3.1.3 Vergleich der einzelnen Zeitpunkte untereinander
In Abbildung 4 ist eine „Heatmap“-Darstellung der Ergebnisse abgebildet. Dafür
wurden die M-Werte, also die log2-transformierten Hy5/Hy3-Werte der einzelnen
Stadien verwendet und diese mit der Software TMeV 4.0 durch eine so genannte
„hierarchische Clustering-Methode“ analysiert. Dadurch werden zum einen relative
Expressionsänderungen einer miRNA farblich kodiert dargestellt, zum anderen
lassen sich unterschiedliche Gruppen (Cluster) von miRNAs unterscheiden. So sind
in Abb. 4A vorrangig miRNAs dargestellt, die in späteren Stadien vermehrt exprimiert
werden – während Abb. 4B vor allem diejenigen miRNAs aufführt, die in früheren
Stadien hochreguliert sind. In Abbildung 4C ist eine Gruppe von miRNAs dargestellt,
welche diese beiden Kriterien nicht erfüllen. Dass in dieser Darstellung mehr miRNAs
vorkommen, als unter 3.1.3 erwähnt, liegt am Weglassen der stringenten Filterung für
das hierarchische Clustering. Die Ergebnisse des Arrays in Form der FoldChangeWerte sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
40
Abbildung 4A,B,C: Heatmaps aller miRNAs, die während der Nierenentwicklung
exprimiert sind. Abgebildet sind die log2-transformierten Hy5/Hy3-Werte der jeweiligen
Stadien; diese wurden mittels eines hierarchischen Clustering ausgewertet. Abbildung 4A
zeigt eine Gruppe von miRNAs, die vorrangig in späten Stadien der Entwicklung
hochreguliert sind, während Abb. 4B miRNAs darstellt, die in frühen Stadien vermehrt
exprimiert sind. Abbildung 4C zeigt miRNAs einer dritten Gruppe, welche diese Kriterien
nicht erfüllen. Die absoluten Hy-3 Expressionswerte sind in Abb. 5 dargestellt.
41
E13.5 versus E11.5
Repression
Induktion
miRNA
FoldChange miRNA
FoldChange
keine miRNA
mmu-let-7i
8,37
mmu-let-7f
3,73
mmu-let-7g
3,62
mmu-miR-200a
3,05
mmu-let-7a
2,89
mmu-let-7d
2,37
mmu-miR-193
2,33
mmu-let-7c
2,16
E16.5 versus E11.5
Repression
Induktion
miRNA
FoldChange miRNA
FoldChange
hsa-miR-492
0,53
mmu-let-7i
18,40
mmu-miR-296
0,58
mmu-let-7f
11,32
mmu-miR-99b
0,65
mmu-let-7a
7,97
mmu-miR-214
0,65
mmu-let-7g
7,75
rno-miR-327
0,65
mmu-miR-200a
6,87
hsa-miR-512-5p
0,65
mmu-let-7d
6,35
hsa-miR-373*
0,67
mmu-let-7c
5,84
hsa-miR-510
0,67
hsa-miR-451
5,26
mmu-miR-193
5,18
mmu-miR-451
4,14
mmu-let-7b
3,92
mmu-miR-200b
3,05
mmu-miR-143
2,74
hsa-miR-500
2,57
mmu-miR-30a-5p
2,20
mmu-miR-30c
2,15
"newborn" versus E11.5
Repression
Induktion
miRNA
FoldChange miRNA
FoldChange
hsa-miR-492
0,40
mmu-let-7i
18,32
mmu-miR-133b
0,41
mmu-let-7f
16,22
mmu-miR-296
0,42
mmu-let-7a
10,33
mmu-miR-212
0,46
mmu-let-7c
10,25
mmu-miR-196a
0,50
mmu-let-7g
8,71
hsa-miR-373*
0,50
mmu-let-7d
8,14
mmu-miR-200a
8,11
mmu-let-7b
5,77
mmu-miR-193
5,36
mmu-miR-422b
5,01
mmu-miR-143
3,70
hsa-miR-451
3,29
mmu-miR-30a-5p
3,05
mmu-miR-27b
2,97
mmu-miR-30c
2,97
mmu-miR-200b
2,84
mmu-miR-30b
2,83
mmu-miR-21
2,77
mmu-miR-451
2,76
mmu-miR-23b
2,59
mmu-miR-24
2,23
42
miRNA
E16.5 versus E13.5
Repression
Induktion
FoldChange miRNA
FoldChange
hsa-miR-373*
hsa-miR-492
0,45
0,49
hsa-miR-451
mmu-let-7f
mmu-miR-451
mmu-let-7a
mmu-let-7c
mmu-let-7d
mmu-let-7b
mmu-miR-200a
mmu-miR-143
mmu-miR-193
mmu-let-7i
mmu-miR-126-3p
mmu-let-7g
3,48
3,04
2,79
2,76
2,70
2,68
2,46
2,25
2,23
2,22
2,20
2,19
2,14
"newborn" versus E13.5
Repression
Induktion
miRNA
FoldChange miRNA
FoldChange
hsa-miR-373*
0,33
mmu-let-7c
4,74
hsa-miR-492
0,37
mmu-let-7f
4,35
mmu-miR-133b
0,41
mmu-let-7b
3,62
mmu-miR-296
0,42
mmu-let-7a
3,57
mmu-miR-212
0,48
mmu-let-7d
3,43
hsa-miR-498
0,49
mmu-miR-143
3,01
mmu-miR-200a
2,66
mmu-miR-30a-5p
2,64
mmu-miR-30b
2,59
mmu-miR-27b
2,51
mmu-let-7g
2,41
mmu-miR-126-3p
2,36
mmu-miR-30c
2,34
mmu-miR-193
2,30
mmu-miR-21
2,24
mmu-miR-23a
2,21
mmu-let-7i
2,19
hsa-miR-451
2,18
"newborn" versus E16.5
Repression
Induktion
miRNA
FoldChange miRNA
FoldChange
hsa-miR-346
0,46
mmu-miR-129-5p
2,19
hsa-miR-500
0,47
Tabelle 1: Darstellung der FoldChange-Werte der einzelnen Stadien zueinander. Die
gemittelten Median Ratios zweier Zeitpunkte sind hierbei direkt zueinander bezogen
worden und geben die relative Expressionsänderung einer miRNA an. Die fett
hervorgehobenen miRNAs wurden durch in situ-Hybridisierungen getestet.
43
3.1.3.1 Induktion in E13.5 gegenüber E11.5
Zunächst wurden durch die stringente Filterung alle miRNAs identifiziert, die zum
Zeitpunkt E13.5 im Mittel mindestens doppelt so hoch exprimiert waren wie zum
Zeitpunkt E11.5. 8 miRNA-Sonden erfüllten die Filterkriterien, unter anderem die
miRNAs let-7a, -7c, -7d, -7f, -7g und -7h. Anschließend wurden durch weniger
stringente Filterung alle miRNA-Sonden identifiziert, die zum Zeitpunkt E13.5 im
Vergleich zu E11.5 im Mittel um den Faktor 1.5 oder größer induziert waren. Die
Filterkriterien wurden von insgesamt 12 Sonden erfüllt: mmu-let-7, FC 1,59; hsa-miR451, FC 1,51; mmu-miR-292-5p, FC 1,57; mmu-miR-484, FC 1,53.
3.1.3.2 Repression in E13.5 gegenüber E11.5
Keine einzige Sonde erfüllte weder die stringenten, noch die weniger stringenten
Filterkriterien.
3.1.3.3 Induktion in E16.5 gegenüber E11.5
Durch stringente Filterung wurde untersucht, welche miRNAs zum Zeitpunkt E16.5
im Vergleich zu E11.5 um den Faktor 2 oder größer induziert waren.
16 miRNA-Sonden erfüllten die Filterkriterien, es sind sieben Mitglieder der let-7miRNA-Familie enthalten. Die miRNAs sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Durch weniger stringente Filterung (FC ≥ 1.5) wurden insgesamt 28 miRNA-Sonden
identifiziert, zusätzlich wurden somit detektiert: mmu-miR-126-3p, FC1,70; mmu-miR21, FC 1,80; mmu-miR-10a, FC 1,66; mmu-miR-16, FC 1,50; mmu-miR-23a, FC
1,58; mmu-miR-23b, FC 1,96; mmu-miR-24, FC 1,90; mmu-miR-26a, FC 1,73; mmumiR-26b, FC 1,52; mmu-miR-30b, FC 1,90; hsa-miR-346, FC 1,51; mmu-miR-484,
FC 1,66.
3.1.3.4 Repression in E16.5 gegenüber E11.5
Durch stringente Filterung (FC ≤ 0,5) sollten alle miRNA-Sonden identifiziert werden,
deren Signale zum Zeitpunkt E16.5 im Vergleich zum Zeitpunkt E11.5 auf die Hälfte
oder weniger reduziert waren. Keine miRNA erfüllte diese Filterkriterien.
Die weniger stringente Filterung (FC ≤ 0,66) ergab 8 miRNAs: hsa-miR-492, mmumiR-296, mmu-miR-99b, mmu-miR-214, rno-miR-327, hsa-miR-512-5p, hsa-miR373* und hsa-miR-510.
44
3.1.3.5 Induktion in „new born“ gegenüber E11.5
Durch stringente Filterung erhält man diejenigen miRNAs, die im Nierengewebe
neugeborener Mäuse (Proben 7 und 8) durchschnittlich mindestens doppelt so hoch
exprimiert sind wie zum Zeitpunkt E11.5 (Proben 1 und 2).
Es handelt sich um 22 Sonden, unter denen erneut sieben Mitglieder der let-7Familie vertreten sind. Sie sind in Tabelle 1 dargestellt. Die weniger stringente
Filterung ergab zusätzlich 9 Sonden, sodass insgesamt 31 Sonden >1,5 fach
exprimiert sind. Zu den 9 Sonden gehören: mmu-miR-126-3p, FC 1,83; mmu-miR10a, FC 1,57; mmu-miR-129-5p, 1,56; mmu-miR-148b, FC 1,77; mmu-miR-16, FC
1,52; mmu-miR-22, FC 1,58; mmu-miR-222, FC 1,67; mmu-miR-23a, FC 1,99; mmumiR-26b, FC 1,94.
3.1.3.6 Repression in „new born“ gegenüber E11.5
Anschließend wurden durch stringente Filterung alle miRNA-Sonden mit einem FC ≤
0,5 in den „new born“-Proben im Vergleich zum Zeitpunkt E11.5 identifiziert, es
handelt sich dabei um 6 Proben: hsa-miR-492, mmu-miR-133b, mmu-miR-296, mmumiR-212, mmu-miR-196a, hsa-miR-373* (siehe Tab. 1).
Sodann wurden im Vergleich von „new born“ und E11.5 durch weniger stringente
Filterung alle miRNAs mit einem FC ≤ 0,66 identifiziert. Diese Filterung ergab 19
Sonden: mmu-miR-100, FC 0,64; mmu-miR-130b, FC 0,62; mmu-miR-18, FC 0,65;
mmu-miR-20a, FC 0,67; hsa-miR-512-5p, FC 0,59; mmu-miR-17-3p, FC 0,63; mmumiR-341, FC 0,60; rno-miR-151, FC 0,64; hsa-miR-519e*, FC 0,55; hsa-miR-526c,
FC 0,55; mmu-miR-17-5p, FC 0,66; hsa-miR-483, FC 0,52; mmu-miR-483, FC 0,65.
3.1.3.7 Induktion in E16.5 gegenüber E13.5
Durch stringente Filterung (FC ≥ 2) wurden die miRNA-Sonden identifiziert, die zum
Zeitpunkt E16.5 (Proben 5 und 6) durchschnittlich mindestens doppelt so hoch
exprimiert sind wie zum Zeitpunkt E13.5 (Proben 3 und 4): 13 Sonden erfüllen diese
Kriterien. Erneut sind sieben Mitglieder der let-7-miRNA-Familie in dieser Liste
enthalten (siehe Tab. 1).
Die weniger stringente Filterung (FC ≥ 1.5) ergab 20 miRNA-Sonden. Unter diesen
sind die drei zu einer Familie gehörigen miRNAs mmu-miR-30a-5p, mmu-miR-30b
und mmu-miR-30c vertreten: mmu-miR-196b, FC 1,83; mmu-miR-23a, FC 1,75;
45
mmu-miR-24, FC 1,56; mmu-miR-30a-5p, FC 1,91; mmu-miR-30b, FC 1,73; mmumiR-30c, FC 1,70; hsa-miR-143, FC 1,83.
3.1.3.8 Repression in E16.5 gegenüber E13.5
Bei stringenter Filterung ergeben sich lediglich 2 miRNA-Sonden (hsa-miR-373*, hsamiR-492), die mindestens um den Faktor 2 geringer exprimiert sind. Die weniger
stringente Filterung lieferte 5 Sonden: mmu-miR-129-5p, FC 0,63; mmu-miR-296, FC
0,59; hsa-miR-512-5p, FC 0,63.
3.1.3.9 Induktion in „new born“ gegenüber E13.5
Durch stringente Filterung wurden die miRNAs identifiziert, die im Nierengewebe
neugeborener Mäuse (Proben 7 und 8) durchschnittlich mindestens doppelt so hoch
exprimiert sind wie zum Zeitpunkt E13.5 (Proben 3 und 4). Es handelt sich um 18
Sonden, zu ihnen zählen sieben let-7-Familienmitglieder und drei miR-30-Vertreter
(siehe Tab. 1).
Die Kriterien der weniger stringenten Filterung (FC ≥ 1.5) erfüllten 24 miRNASonden. Unter anderem sind die miRNAs mmu-miR-23a und mmu-miR-23b sowie
mmu-miR-26a und mmu-miR-26b in dieser Liste enthalten: mmu-miR-196b, FC 1,84;
mmu-miR-23b, FC 1,94; mmu-miR-24, FC 1,83; mmu-miR-26a, FC 1,80; mmu-miR26b, FC 1,77; mmu-miR-451, FC 1,86.
3.1.3.10 Repression in „new born“ gegenüber E13.5
Anschließend wurden durch stringente Filterung alle miRNA-Sonden identifiziert, die
in den „new born“-Proben im Mittel mindestens um den Faktor 2 oder geringer
exprimiert sind als zum Zeitpunkt E13.5: dies trifft auf 6 Sonden zu. Sie sind in
Tabelle 1 aufgeführt. Die weniger stringente Filterung ergab insgesamt 23 Sonden:
46
miRNA
FoldChange
mmu-miR-100
0,56
hsa-miR-106a
0,65
mmu-miR-130b
0,53
mmu-miR-18
0,66
mmu-miR-196a
0,57
mmu-miR-324-3p
0,62
hsa-miR-346
0,58
hsa-miR-512-5p
0,57
mmu-miR-17-3p
0,56
mmu-miR-290
0,51
mmu-miR-292-5p
0,61
mmu-miR-341
0,62
mmu-miR-345
0,66
mmu-miR-351
0,65
rno-miR-151
0,59
hsa-miR-452*
0,57
hsa-miR-519e*
0,58
3.1.3.11 Induktion in „new born“ gegenüber E16.5
Mittels stringenter Filterung wurden zunächst alle miRNA-Sonden identifiziert, die im
Nierengewebe neugeborener Mäuse (Proben 7 und 8) durchschnittlich mindestens
doppelt so hoch exprimiert sind wie zum Zeitpunkt E16.5 (Proben 5 und 6). Es
handelt sich um lediglich eine miRNA (mmu-miR-129-5p), siehe Tabelle 1. Die
weniger stringente Filterung ergab 3 miRNA-Sonden, auch hier ist ein Mitglied der
let-7-Familie vertreten: mmu-let-7c, FC 1,76; mmu-miR-21, FC 1,54.
3.1.3.12 Repression in „new born“ gegenüber E16.5
Die stringente Filterung lieferte diejenigen miRNA-Sonden, die in den „new born“Proben im Mittel mindestens um den Faktor 2 geringer exprimiert sind als zum
Zeitpunkt E16.5, 2 Sonden erfüllen die Kriterien: hsa-miR-346, hsa-miR-500. Ihre
FoldChange-Werte sind in Tab. 1 ersichtlich.
Die weniger stringente Filterung ergab 9 Sonden: mmu-miR-450, FC 0,64; mmu-miR130b, FC 0,62; mmu-miR-133b, FC 0,60; mmu-miR-212, FC 0,55; hsa-miR-451, FC
0,63; rno-miR-151, FC 0,65; mmu-miR-484, FC 0,62.
47
3.1.4 Analyse der absoluten Expression
Durch die Analyse der mittleren Hy3-Signale der miRNA-Sonden lässt sich eine
Aussage über die absolute Expression einer miRNA über alle Proben hinweg treffen.
Filtert man alle diejenigen miRNA-Sonden heraus, deren mittleres Hy3-Signal > 4000
liegt, so zeigt sich, dass einige wenige miRNAs ein besonders starkes Hy3-Signal
liefern, also wahrscheinlich auch stark exprimiert sind. Dies ist in Abbildung 5
dargestellt. Es fallen dabei vor allem die miRNAs hsa-miR-498, mmu-miR-290, mmumiR-292-5p sowie mmu-miR-298 auf, deren mittlere Hy3-Werte über 30.000 liegen.
Abbildung 5: Absolute Expression der über alle Stadien am höchsten exprimierten
miRNAs. Das Hy3-Signal aller 8 Arrays repräsentiert die co-hybridisierte Referenz-RNA
(bestehend aus einem Pool aller 8 Proben). Die Abbildung zeigt die Mittelwerte des Hy3Signals aller 8 Arrays – und somit die absolute Expression – für abundante miRNAs
(mittleres Hy3-Signal > 4.000).
48
3.1.5 Beurteilung des Micro-Arrays
Zunächst wurden diejenigen miRNA-Sonden identifiziert, deren Signal sich in einem
der untersuchten Stadien von der kompetitiv hybridisierten Referenz-Probe, die aus
einer Mischung der acht RNAs bestand, um den Faktor 2 bzw. 1,5 unterscheidet. Die
Zahl dieser deregulierten miRNAs war insgesamt eher gering.
Anschließend wurden die verschiedenen Zeitpunkte untereinander in allen möglichen
Kombinationen
verglichen.
Auch
hier
wurde
mit
zwei
unterschiedlichen
Stringenzkriterien gefiltert. Relativ ausgeprägte Unterschiede ließen sich zwischen
zeitlich weit auseinander liegenden Stadien feststellen, z.B. zwischen E11.5 und
newborn oder zwischen E13.5 und newborn.
Interessanterweise lagen die FoldChanges, also die Änderungsfaktoren der miRNAExpression, in einer recht niedrigen Größenordnung. Nur sehr wenige miRNAs waren
um einen Faktor deutlich > 2 dereguliert, während auf der Ebene der mRNAs bei
ähnlichen Fragestellungen in Micro-Arrays FoldChanges von 10 und größer
gefunden werden können. Deshalb erschien es sinnvoll, mit vergleichsweise
geringen Schwellenwerten (FC 2 bzw. 1.5) zu filtern, um überhaupt interessante
miRNA-Kandidaten zu erfassen. Es ist denkbar, dass die Expression von miRNAs
sehr fein reguliert und justiert wird und in engeren Grenzen als die Expression vieler
mRNAs verläuft.
Zusammenfassend wurde somit an Duplikaten mit verhältnismäßig geringen
Korrelationskoeffizienten eine Filterung mit niedrigen FoldChange-Schwellenwerten
vorgenommen. Dieses Vorgehen birgt die Gefahr in sich, viele falsch positive Treffer
zu erhalten, sodass eine Validierung der Ergebnisse über alternative Verfahren
sinnvoll erscheint. Sehr wahrscheinlich stellt beispielsweise das Resultat von hsamiR-452* einen derartigen falsch-postiven Treffer dar. Die FoldChanges dieser
miRNA sind in allen Stadien gegenüber der Referenz deutlich erhöht, was auf einen
methodenbedingten Fehler hinweist.
Allerdings ergab die Filterung nach deregulierten miRNAs wiederholt Cluster
verwandter miRNAs. So wurden bis zu sieben Mitglieder der let-7-miRNA-Familie
parallel im Zeitverlauf des Experiments induziert. Ebenso nahm die Expression von
drei Mitgliedern der miR-30-Familie von Stadium zu Stadium zu.
Da eine Koregulation der Expression von miRNA-Familien vermutet wird, sind diese
Befunde ein Indiz dafür, dass die erhaltenen Daten (oder zumindest Teile davon)
biologisch korrekt und relevant sind.
49
3.2
Expressionsanalyse durch in situ-Hybridisierung
3.2.1 „Whole mount“ – in situ-Hybridisierung
Um die Array-Daten zu validieren und um einen Überblick über die Expression der im
Array deregulierten miRNAs zu gewinnen, führten wir in situ-Hybridisierungen an
Embryonen der Stadien E10.5, E11.5 sowie 13.5 durch. Bei älteren Stadien liegt die
Schwierigkeit darin, dass die Gewebepenetration für die „Locked nucleic acid“ (LNA-)
Sonden stark abnimmt. Daher wurden bei Stadien, die älter als E13.5 waren, die
Abb. 6: Grafische Darstellung der Expressionsdaten des miRNA-Micro-Arrays
derjenigen miRNAs, die für in situ-Hybridisierungen als Sonden verwendet wurden.
Für miRNAs mit ausgeprägter Deregulation der Expression sind gerundete Fold-ChangeWerte angegeben.
embryonalen Nieren präpariert und anschließend isoliert hybridisiert und gefärbt, um
so eine bessere Penetration der Sonde zu ermöglichen. Dafür wählten wir folgende
Sonden aus: miR-1, let-7f, miR-30c, miR-373*, miR-290, sowie miR-494. Einen
Überblick über die Expressionsdaten dieser miRNAs im zuvor durchgeführten MicroArray gibt Abbildung 6.
50
Da miR-1 ein streng herz- und skelettmuskelspezifisches Expressionsmuster zeigt
(Kloosterman, Wienholds et al. 2006), diente es als Kontrollsonde. Die beiden
miRNAs let-7f und miR-30c zeigten im zuvor durchgeführten miRNA-Micro-Array eine
starke (let-7f) beziehungsweise mäßige (miR-30c) Hochregulation ihrer Expression in
älteren Embryonalstadien (siehe Abb. 4A, 6). Let-7 ist ein heterochronisches Gen,
das im Wurm C. elegans die Differenzierung von neuronalem und hypodermalem
Gewebe steuert (Reinhart, Slack et al. 2000; Sempere, Freemantle et al. 2004). Wir
wählten miR-373* aus, da diese miRNA in älteren Stadien vergleichsweise niedriger
exprimiert wird. Um auch miRNAs zu repräsentieren, die keine signifikant
differentielle Expressionsänderung aufweisen, wurden auch die miRNAs miR-290
und miR-494 als Sonden verwendet. Während miR-290 in älteren Stadien leicht
herunterreguliert wird (siehe Abb. 4C, 6), bleibt miR-494 in unserem Array in allen
Stadien in etwa auf demselben Expressionsniveau. Von miR-290 war bislang nur
bekannt, dass diese miRNA für embryonale Stammzellen spezifisch ist und in
Embryos vor der Implantation eine Rolle spielt (Houbaviy, Dennis et al. 2005).
Während von miR-494 und miR-30c noch keine biologischen Daten bekannt sind, ist
zu
miR-373
eine
Beteiligung an
testikulären
Keimzelltumoren
beschrieben
(Voorhoeve, le Sage et al. 2006), über die Funktion des Gegenstrangs miR-373* sind
hingegen bislang keine Daten bekannt. Darüber hinaus gehören die miRNAs miR290, miR-494, miR-30c, miR-373* und let-7 zu denjenigen miRNAs, die während der
Nierenentwicklung überaus abundant exprimiert sind – weisen doch diese miRNAs
im Array überaus hohe Absolutwerte für Hy3 (>4.000) auf (siehe Abb. 5). Zu diesem
Zweck wurden Embryos der Stadien E10.5, E11.5 sowie E16.5 nach einem
adaptierten Protokoll der Erstbeschreiber dieser Methode, Kloosterman et al.
(Kloosterman, Wienholds et al. 2006), hybridisiert und gefärbt. Nach Beendigung der
Färbereaktion wurden die Embryonen unter einem binokularen Mikroskop analysiert
und fotografiert. Die Ergebnisse sind in Abb. 7A wiedergegeben.
Dabei zeigten die „whole mount“-Hybridisierungen der Stadien E10.5 und 11.5
insbesondere für die miRNAs -30c, -373, -290 und -494 eine sehr deutliche
Farbreaktion. Die als Negativkontrolle verwendete Hybridisierung ohne Sonde
(„control“ in Abb. 7A) weist ein leicht erhöhtes Hintergrundniveau der Färbereaktion
auf. Für die als Positivkontrolle verwendete miR-1-Sonde zeigt sich die bereits
beschriebene Färbung von Herz und Somiten, während die Niere keine besondere
Färbung aufweist (siehe Abb. 7B). Da die Negativkontrolle weitgehend ungefärbt
51
bleibt, ist trotz eines erhöhten Hintergrundlevels davon auszugehen, dass auch die
anderen Färbungen von miRNAs ihrer tatsächlichen Expression entsprechen. Die mit
miR-30c hybridisierten Embryonen weisen eine starke Färbung auf, die mit
Ausnahme des dorsalen Neuralrohrs ubiquitär vorkommt. In der Färbung für miR373* zeigt sich eine Expression in den Somiten, den Branchialbögen sowie in den
Extremitätenknospen. Insgesamt erscheint die Färbung weniger spezifisch und ist im
Stadium E10.5 eher schwächer als am folgenden Entwicklungstag. Hingegen
erscheint das Expressionsmuster für miR-290 überaus spezifisch und distinkt, es
ergibt sich in beiden Stadien eine starke Färbung des Neuralrohrs, des Gehirns, der
Branchialbögen, der Extremitätenanlagen sowie der Somiten. Noch stärker als miR290 erweist sich die Färbung der Embryonen mit miR-494, die äußerst distinkt das
Gehirn und Neuralrohr, die anteriore Extremitätenknospe, die Branchialbögen sowie
die Somiten anfärbt. Eine Färbung von Embryonen mit der miRNA let-7f ergab kein
spezifisches Expressionsmuster, sondern lediglich eine schwache, ubiquitäre
Färbung. Die „whole mount“-Hybridisierungen der embryonalen Nieren im Alter von
E16.5 zeigen ebenfalls unterschiedliche Färbemuster (siehe Abb. 7A, untere Zeile).
Im Vergleich zur Negativkontrolle weisen alle Nieren eine leichte bis starke Färbung
auf. Während miR-30c und miR-373* eine homogene Färbung nur leicht über dem
Hintergrundniveau der Kontrollsonde miR-1 (siehe Abb. 7B) aufweisen, zeigen die
miRNAs miR-290 und miR-494 ein sehr kräftiges und distinktes Expressionsmuster.
Während die Niere bei miR-290 fein punktiert erscheint, sind bei miR-494 einzelne,
kräftige und punktförmige Färbungen zu erkennen. Makroskopisch ähnelt dieses
Muster stark einer ureterknospenspezifischen Genexpression, wobei zum Vergleich
die Expression von Wnt-11 aufgeführt werden kann (Vainio 2002).
52
Abbildung 7A: „Whole mount“ in situ-Hybridisierungen von Embryonen der
Stadien E10.5, 11.5 sowie von embryonalen Nieren aus dem Stadium E16.5. Control:
Hybridisierung ohne Sonde.
Abbildung 7B: In situ-Hybridisierungen mit der Kontrollsonde miR-1 an Embryonen
der Stadien E10.5, 11.5 sowie an embryonalen Nieren aus dem Stadium E16.5.
Heart magnification: Vergrößerung der Herzregion durch das binokulare Mikroskop.
53
3.2.2 Schnitt– in situ-Hybridisierung
Um noch genauere Aussagen über die Ortsauflösung und den Zeitverlauf der
untersuchten miRNAs treffen zu können, fertigten wir mikroskopische Schnitte der
Embryonen bzw. deren Nieren an. Von diesen stellten wir 8µm dicke Paraffinschnitte
her, welche anschließend, wie unter 2.5 beschrieben, hybridisiert und gefärbt
wurden. Die so entstandenen Präparate wurden unter dem Mikroskop ausgewertet
und fotografiert. Auch hier verwendeten wir dieselben Sonden wie für die „whole
mount“-Hybridisierungen. Abbildung 7C zeigt die Ergebnisse dieser Untersuchungen.
Die miRNA let-7f ergab erneut ein nur schwaches Färbemuster (siehe Abb. 7C, Teil
1). Eine spezifische Färbung ist auch in den Schnittbildern nicht zu erkennen, die
Färbung liegt insgesamt nur geringfügig oberhalb des durch die Positiv- und
Negativkontrolle gegeben Hintergrundniveaus. Den im
Array beschriebenen
kontinuierlichen Anstieg der Expression von let-7f konnte die in situ-Hybridisierung
nur geringfügig zwischen den Stadien E14.5 und E16.5 bestätigen.
Embryonen, welche mit miR-30c hybridisiert worden waren, zeigen im Stadium E12.5
eine starke Färbung vieler Zellen, besonders im ZNS, den inneren Organen und den
Somiten. Trotz intensiver Färbung des umgebenden Gewebes zeigt sich hier auch
eine Färbung der Nieren. Diese wiederum weisen in älteren Stadien ab E14.5
besonders kortikal in der Region der Glomeruli eine intensive Färbung auf. Bei
höherer Vergrößerung stellt sich heraus, dass etliche Erythrozyten in den Glomeruli
sehr viel Farbprodukt umgesetzt haben und somit ein starkes glomeruläres
Expressionsmuster vortäuschen. Zwischen neugeborenen und erwachsenen Nieren
besteht ein deutlicher Unterschied in der Färbung auf miR-30c, erwachsene Nieren
weisen nur noch eine schwache Färbung im äußersten Kortex und in einigen
Glomeruli auf. Dieses Bild ist mit dem Ergebnis unseres Micro-Arrays nur schlecht
vereinbar, da dieser einen Anstieg der Expression in älteren Stadien zeigte (siehe
Abb. 6). Daher spricht dieses Ergebnis am ehesten für eine unspezifische Färbung
der Embryonen, insbesondere durch Erythrozyten.
Auch miR-290 zeigt im Stadium E12.5 im Sagittalschnitt ein starkes Signal in allen
Zellen und Geweben (siehe Abb. 7C, Teil1), im Stadium E14.5 sind bei weiterhin
hoher Umgebungsfärbung einige Glomeruli dunkler gefärbt. Die embryonale Niere
aus E16.5 zeigt ein starkes Staining aller Zellen, während im Stadium E18.5 die
Färbung der Randstruktur der Niere besonders stark ist – darunter befinden sich
auch einige Glomeruli. In der Medulla hingegen zeigte diese Niere bis auf einige
54
epitheliale Gänge keine Färbung. In der neugeborenen und in der adulten Niere war
die Färbung vor allem auf die Randstruktur begrenzt.
Die miRNA miR-373* (siehe Abb. 7C, Teil 2) wiederum weist im Stadium E12.5 eine
sehr schwache Färbung im Bereich der Hirnventrikel auf. Besonders deutlich ist die
Färbungszunahme des Embryos und vor allem der Niere im Stadium E14.5. Dies ist
mit den Ergebnissen des Arrays konsistent, denn auch dieser beschreibt eine
Zunahme der Expression von miR-373* bis zum Stadium E13.5 mit sukzessiver
Repression der Expressionsraten bis hin zu neugeborenen Tieren (siehe Abb. 6).
Auch in E16.5 ist noch eine schwache Nierenfärbung zu erkennen, bei der sich
einige, an Glomeruli erinnernde Strukturen anfärben. In den Stadien E18.5 und P1
(Neugeborene) färben sich die äußerste kortikale Randzone sowie einige Glomeruli
nahe dieser Region an.
Die Hybridisierungen von miR-494 (siehe Abb. 7C, Teil 2) weisen eine
außerordentlich starke und kortikal betonte Nierenfärbung auf. Im Stadium E12.5 ist
diese Färbung vor allem im Ektoderm und äußeren Gewebeschichten sehr kräftig,
nach innen nimmt sie in ihrer Stärke ab. Einige Ventrikelwände sind sehr intensiv
gefärbt, die Niere ist nicht auffallend gefärbt. Zum Entwicklungszeitpunkt E14.5 ist
erneut das Ektoderm der Außenhülle des Embryos sehr kräftig angefärbt, die Niere
zeigt jetzt aber eine schwache, diffuse Färbung. Die Nieren der Stadien E16.5 und
18.5 zeigen eine sehr intensive Färbung der äußersten Peripherie der Niere, der sich
mikroskopisch kein spezifisches Gewebe zuordnen lässt.
55
Abbildung 7C, Teil 1: Schnitt in situ-Hybridisierungen von Embryonen der Stadien
E12.5, 14.5, embyonaler Nieren der Stadien E16.5, 18.5 sowie von Nieren
neugeborener (P1) und erwachsener Tiere (adult). 2,5x, 10x, 20x: Angabe der
Vergrößerung.
56
Abbildung 7C, Teil 2: Schnitt in situ-Hybridisierungen von Embryonen der Stadien
E12.5, 14.5, embryonaler Nieren der Stadien E16.5, 18.5 sowie von Nieren
neugeborener (P1) und erwachsener Tiere (adult). 2,5x, 10x, 20x: Angabe der
Vergrößerung.
57
3.2.3 In situ-Hybridisierungen embryonaler Nierenkulturen
Dieses Experiment führten wir durch, um zu untersuchen, ob im Micro-Array
aufgezeigte Deregulationen einiger miRNAs in der in vitro-Nierenkultur nachvollziehund detektierbar sind. Dafür wurden Nieren aus Embryos im Stadium E11.5 und
E12.5, wie unter 2.4 beschrieben, gewonnen und nach 3, 5 oder 7 Tagen in Kultur
über eine Dehydrierung dem Färbeprozess zugeführt. Die Ergebnisse sind in Abb.
7D dargestellt.
Abbildung 7D: In situ-Hybridisierungen von in vitro-Nierenkulturen. Die Nieren
wurden 3, 5 oder 7 Tage in Kultur gehalten. control: Hybridisierung ohne Sonde.
In Hinblick auf den Grad der Färbung ähneln die miRNAs let-7e, let-7f sowie miR-30c
sehr stark der Kontrolle miR-1 sowie der Negativkontrolle ohne Sonde. Daher lässt
sich auch kein überzeugendes Expressionsmuster für diese miRNAs festlegen. Die
schwache Expression von miR-30c in diesem Versuch untermauert den Verdacht,
58
dass die Färbung der Nieren in der Schnitt- in situ-Hybridisierung auf eine
unspezifische Färbung insbesondere von Erythrozyten zurückzuführen ist. Die
miRNAs miR-290, -373* sowie -494 sind hingegen überaus kräftig exprimiert. Die
Nieren, die mit miR-290 hybridisiert wurden, sind stark und gleichmäßig gefärbt.
Durch die punktförmige Färbung wirken die Nieren insgesamt blumenkohlartig.
Dieses, wenngleich nicht ausschließlich vorkommende Muster lässt auf eine
Expression dieser miRNA unter anderem auch in den Spitzen der verzweigten
Ureterknospen schließen. Dasselbe gilt für miR-373*, wenn auch in geringerem
Ausmaß, denn die Färbung ist hier wesentlich schwächer als für miR-290. Dennoch
lässt sich auch hier eine Färbung aller Nierenkompartimente zeigen. Das zwar
schwache, aber doch erkennbare punktförmige Muster deutet auch hier auf eine
Expression in den Spitzen der Ureterknospen hin.
Die Nieren, die auf miR-494 gefärbt wurden, weisen wiederum eine recht kräftige
Färbung auf. Hier sind nicht alle Kompartimente gleich stark gefärbt, besonders stark
ist die Färbung in den Kortexarealen. Auch hier sei wieder auf das blumenkohlartige
Muster hingewiesen, welches auch bei dieser miRNA für eine Expression in den
Spitzen der Ureterknospe spricht.
Insgesamt zeigt sich somit vor allem für die miRNAs miR-290, -373* und -494 ein
deutliches Expressionsmuster, unter anderem in den Spitzen der Ureterknospen.
Eine zeitabhängige Expressionsänderung, wie durch den Array beschrieben, lässt
sich hier allerdings nicht nachvollziehen. Dies mag zum einen in der mangelnden
Sensitivität der Methode für geringe Änderungen begründet sein, könnte aber auch
daran liegen, dass die Nierenkultur nicht der physiologischen Situation entspricht.
Dass Mitglieder der let-7-Familie, die im Array die stärkste Expressionszunahme
gezeigt hatten, auch in diesem Versuch kein spezifisches Staining ergeben, kann
mehrere Gründe haben: Zum einen könnte das Ergebnis des Arrays falsch positiv
sein, zum anderen könnten die in situ-Hybridisierungen nicht sensitiv genug sein, um
ein Signal von let-7-RNA zu detektieren.
59
3.4
Validierung der Funktion der miRNA let-7 durch Luciferase-Assays
Dieses Experiment führten wir durch, um zu zeigen, dass im Array gefundene
miRNAs tatsächlich in der Lage sind, in der Niere exprimierte Gene zu regulieren.
Daher untersuchten wir die bioinformatischen Vorhersagen aus PicTar und
TargetScan für die im Array am stärksten deregulierte miRNA let-7f. Es stellte sich
heraus, dass sämtliche Algorithmen HMGA2 als stark reguliertes Target für let-7
vorschlugen. HMGA2 ist ein nukleärer Faktor, der in der Lage ist, AT-reiche DNASequenzen zu binden. Durch die Fähigkeit, Nukleoproteinkomplexe zu organisieren,
trägt HMGA2 zur Transkriptionsregulation bei. Ferner ist bekannt, dass HMGA2 nur
während der Embryogenese exprimiert wird, während adulte, nicht tumoröse
Gewebe kein HMGA2 mehr exprimieren (Gattas, Quade et al. 1999). Auch während
der Nierenentwicklung wird HMGA2 exprimiert, in adulten Nieren findet sich keine
Expression mehr. Darüber hinaus spielt HMGA2 eine Rolle für die epithelialmesenchymale Transition (Thuault 2006). Es konnte auch gezeigt werden, dass die
Verhinderung der Interaktion zwischen let-7 und HMGA2 zu Dedifferenzierung und
konsekutiv maligner Transformation führt (Mayr, Hemann et al. 2007). HMGA2
besitzt zwei Spleiß-Varianten, die erste besitzt einen langen 3’-UTR (etwa 3000 bp),
die zweite Variante nur einen sehr kurzen 3’-UTR (etwa 400 bp). Diesen Prognosen
zufolge verfügt nur die lange Variante von HMGA2 über etwa 5-7 Bindungsstellen für
let-7, die allesamt einen hohen Konservierungsgrad aufweisen. Von der langen
Spleißvariante klonierten wir den 3’-UTR von murinem HMGA2 (mHMGA2) in den
psicheck2™-Vektor, wo dieser als künstlicher 3’-UTR einer Renilla-Luciferase
eingefügt wurde. Den 3’-UTR der kurzen Variante 2 klonierten wir aus einer humanen
cDNA-Bibliothek (hHMGA2 Var. 2) in denselben Vektor. Als Zelllinie wählten wir
HEK-293T-Zellen, da diese Zelllinie let-7 nicht exprimiert (Landgraf, Rusu et al.
2007). Für die Transfektion stellten wir daher auch zwei künstliche, mit let-7
identische siRNAs her. Die siRNA „let-7 perfect“ zeichnet sich dadurch aus, dass
beide Stränge des künstlich hybridisierten siRNA-Doppelstranges exakt zueinander
komplementär sind und so genau eine perfekte Paarbildung („Annealing“) ausführen
können. Derartige siRNAs lassen sich zwar sehr gut transfizieren, entsprechen aber
nicht der physiologischen Situation. Daher stellten wir die siRNA „let-7 original“ her,
die der natürlich vorkommenden miRNA entspricht und Lücken in der Paarbildung
aufweist. Das korrekte Annealing wurde jeweils durch Gel-Elektrophorese kontrolliert.
60
Nach Überführung von 4x105 Zellen/well ins 96-well-Format wurden am nächsten
Tag pro well 100ng psicheck-Vektor-DNA sowie 7,5pmol siRNA mit 0,25µl
Lipofectamine transfiziert. Als Kontrollen dienten die alleinige Transfektion von
HMGA2 beider Varianten sowie die Kotransfektion von miR-20. Diese miRNA weist
keine Ähnlichkeit zu let-7 auf und HMGA2 enthält auch keine vorhergesagten
Bindungsstellen. Nach 24h wurde die Transfektion beendet und die Zellen wurden
15min in Lyse-Puffer lysiert. Anschließend wurden die Lumineszenz-Werte sowohl
der Renilla- als auch der Firefly-Luciferase mit dem Luminometer bestimmt und
anschließend ausgewertet. Alle Versuche wurden viermal durchgeführt. Die
Ergebnisse sind in den Abbildungen 8A und 8B dargestellt.
Abbildung 8A: Luciferase-Assays: Der 3’-UTR von mHMGA2 unterliegt einer
Regulation durch let-7 siRNA. Dabei stellt mHMGA2 die lange Splice-Variante mit
allen let-7-Bindungsstellen dar. RL/FL: Verhältnis der Renilla- zu den FireflyLumineszenzen, n=4. p<0,0000000000001.
61
Abbildung 8B: Luciferase-Assays: Der 3’-UTR von hHMGA2 Variante 2 unterliegt
keiner Regulation durch let-7 siRNA. Dabei stellt hHMGA2 die kurze Splice-Variante
ohne let-7-Bindungsstellen dar. RL/FL: Verhältnis der Renilla- zu den FireflyLumineszenzen, n=4.
Verglichen mit alleine transfiziertem mHMGA2 zeigt sich bei Kontransfektion von
mHMGA2 und let-7 ein erheblicher Rückgang der relativen Renilla-Aktivität. Mit let-7
perfect beträgt so die Renilla-Aktivität noch 30%, mit let-7 original noch 35% des
Ausgangsniveaus (siehe Abb. 8A). Um unspezifische Effekte durch die Zugabe von
siRNA auszuschließen, kotransfizierten wir miR-20 mit mHMGA2 und verglichen
auch dies mit der Kotransfektion von let-7. Auch hier ging durch let-7 die relative
Renilla-Aktivität um 72% (let-7 perfect) bzw. 68% (let-7 original) zurück. Dieser
Rückgang ist hochgradig signifikant, die im Stutent’s-T-Test ermittelten p-Werte für
let-7 „perfect“ und „original“ liegen bei p=1,4x10-14 beziehungsweise p=6,5x10-14
gegenüber der Transfektion mit miR-20. Dieselbe Versuchsreihe für hHMGA2, der
kurzen Variante ohne let-7 Bindungsstellen, zeigt einen beinahe kompletten Verlust
dieser Regulation (siehe Abb. 8B). Die hohe relative Renilla-Aktivität bei
Kotransfektion von hHMGA2 Var. 2 mit miR-20 lässt sich durch die höhere
Standardabweichung in diesen 4 Versuchen erklären. Diese Untersuchungen zeigen,
dass der 3’-UTR der langen Spleißvariante von HMGA2, nicht aber der 3’-UTR der
kurzen Variante, einer Regulation durch let-7 unterliegt. Damit wird auch deutlich, wie
wichtig der 3’-UTR für die differentielle Expression von Genen ist: So werden diese
zwei
Isoformen
nicht
nur
durch
Spleiß-Vorgänge,
sondern
auch
durch
posttranskriptionelle Mechanismen unterschiedlich reguliert.
62
4.
Diskussion
Die ersten miRNAs, lin-4 und let-7, wurden in C. elegans entdeckt, wo diese miRNAs
entscheidende Entwicklungsprozesse beim Übergang zwischen Larvenstadien
steuern (Lee, Feinbaum et al. 1993; Reinhart, Slack et al. 2000). Seither wurden
stetig neue Belege für die essentielle Rolle, die einige miRNAs für die Entwicklung
von Organismen und Organen haben, gefunden. Ohne Dicer – und somit miRNAs –
weisen sowohl Zebrafisch- (Giraldez, Cinalli et al. 2005) als auch Mausembryonen
(Bernstein, Kim et al. 2003) erhebliche letale Entwicklungsdefekte auf. Auch für
einzelne Organsysteme wie Herz (Zhao, Samal et al. 2005), Haut (Yi, O'Carroll et al.
2006), Lungenepithel (Harris, Zhang et al. 2006), Extremitäten (Harfe, McManus et
al. 2005), Gehirn bzw. Neuronen (Krichevsky, King et al. 2003; Vo, Klein et al. 2005;
Visvanathan, Lee et al. 2007) und Pankreas (Kloosterman, Lagendijk et al. 2007)
konnte eine essentielle Rolle von miRNAs an Entwicklungsprozessen gezeigt
werden. Dagegen war bisher völlig unbekannt, ob und welche miRNAs bei der
Entwicklung der Niere eine Rolle spielen.
Die Nierenentwicklung ist geprägt durch induktive Vorgänge, die auf einer
Expressionsänderung oder einem temporospatialen Expressionsgradienten beruhen.
Daher führten wir in dieser Arbeit einen miRNA-Micro-Array durch, um diejenigen
miRNAs zu identifizieren, die im Verlauf der Nierenentwicklung in der Maus eine
differentielle Expression aufweisen. Im Array zeigte sich, dass die meisten miRNAs
nur eine geringe Expressionsänderung (Fold Change) um etwa den Faktor 2
aufwiesen, was die Gefahr falsch positiver Treffer erhöhte. Es ist jedoch zum einen
gut vorstellbar, dass bei diesem niedrigen Gesamtexpressionsniveau schon kleine
Änderungen in der Expression einer miRNA genügen, um drastische Veränderungen
der Expression der miRNA-Targets zu bewirken. Zum anderen könnte man den
Schluss ziehen, dass tatsächlich nur wenige miRNAs eine Schalterfunktion – ähnlich
der Funktion von let-7 in C. elegans – besitzen. Die übrigen, zahlreichen miRNAs
wären dann eher an der Homöostase der Zellen auf Genexpressionsebene beteiligt.
Dass die so entdeckten miRNAs tatsächlich in der sich entwickelnden Niere
exprimiert sind, konnten wir durch verschiedene miRNA- in situ-Hybridisierungen
nachweisen. Es ergab sich jedoch eine Inkongruenz zwischen dem Array und diesen
Untersuchungen. Wir waren nur schwerlich in der Lage, den zeitlichen Gradienten,
den unter anderem die miRNAs let-7f, miR-200a und miR-30c im Array gezeigt
63
hatten, durch die in situ-Hybridisierung nachzuweisen. Dies ist sicherlich zum
größten Teil methodenbedingt, weist doch die in situ-Hybridisierung nur eine
begrenzte Sensitivität auf, um die geringfügigen Expressionsänderungen zu
detektieren. Genauer ließe sich das Array-Ergebnis durch eine quantitative PCR
belegen. Diese Methode wird derzeit in unserem Labor etabliert.
Um die Funktionalität der gefundenen miRNAs zu beweisen, untersuchten wir in
einem Luciferase-Assay die Regulation von HMGA2 durch let-7. HMGA2 wird nur
während der Entwicklungsphase in der Niere exprimiert (Gattas, Quade et al. 1999).
Wie die Assays zeigen, ist die Regulation, die dieses Gen durch let-7 erfährt,
überaus stark. In der Zwischenzeit wurden auch einige Publikationen veröffentlicht,
die diese Regulation ebenfalls bestätigen (Lee and Dutta 2007).
Insgesamt konnten wir somit eindeutig zeigen, dass miRNAs während der
Entstehung der Mausniere in renalem Gewebe exprimiert sind und teilweise stark
differentiell reguliert sind. Dies lässt darauf schließen, dass sie somit auch für den
Gesamtkontext der Nierenentwicklung von Bedeutung sind.
Die möglichen Funktionen von miRNAs für die Nierenentwicklung
Die Niere ist ein Organ, deren molekulare Entwicklungsmechanismen sehr gut
untersucht sind, einige Fragen sind aber nach wie vor ungeklärt. Dazu gehört auch
das Verständnis von Differenzierungsvorgängen. Neue Publikationen zeigen, dass
der Verlust der Regulation von HMGA2 durch let-7 zu onkogener Transformierung
führt – und damit den Rückfall in ein embryonales Stadium anzeigt (Lee and Dutta
2007; Mayr, Hemann et al. 2007; Park, Shell et al. 2007). Im Umkehrschluss ließe
sich die Vermutung anstellen, dass die auch durch uns gezeigte Regulation von
HMGA2 durch let-7 für die Differenzierung von Zellen – und damit auch renaler
Vorläuferzellen - von Bedeutung ist. In dem in dieser Arbeit durchgeführten miRNAArray konnten wir zeigen, dass let-7 in älteren Nierenstadien vermehrt exprimiert
wird. Ein weiterer, bislang unpublizierter mRNA-Array aus unserem Labor bestätigt
darüber hinaus, dass HMGA2 in früh-embryonalen Stadien der Niere vermehrt
exprimiert wird. Diese gegensinnige Expressionsänderung von HMGA2 und let-7
könnte somit ein wichtiges Charakteristikum von Differenzierungsvorgängen, auch in
der Niere, darstellen.
Unklar ist weiterhin auch, weshalb sich mesodermale Zellen zum intermediären
Mesoderm differenzieren, um dann Markergene wie die Homöoboxgene Pax-2 oder
64
Pax-8 zu exprimieren (Patel and Dressler 2004), womit das spätere Nierengewebe
determiniert ist. Mansfield et al. konnten 2004 zeigen, dass miRNAs während der
Entwicklung die Expression von Homöoboxgenen regulieren (Mansfield, Harfe et al.
2004). Es wäre also denkbar, dass primär das richtige miRNA-Umfeld von Nöten ist,
damit das spätere intermediäre Mesoderm diese beiden Pax-Gene exprimiert. Dass
miRNAs in der Signalkaskade oberhalb der Hox-Gene stehen, wurde bereits gezeigt
(Hornstein, Mansfield et al. 2005). Ebenfalls nicht völlig geklärt ist, welche
Mechanismen
die
für
die
Nierenentwicklung
so
wichtigen
Gen-Gradienten
ermöglichen. Die Grundlage für die Entwicklung der Niere stellen wechselseitige,
induktive Prozesse (beispielsweise zwischen Ureterknospe und Mesenchym) dar. Sie
beruhen darauf, dass zwei oder mehr Zelltypen unterschiedliche Gene exprimieren
und so aufeinander antworten können. Hier könnten miRNAs durch ihre einzigartige
Fähigkeit, temporospatial Gene herunterzuregulieren und so ein zelltypspezifisches
Expressionsmilieu zu schaffen, eine entscheidende Rolle spielen. So könnte es sein,
dass das miRNA-Expressionsmuster eines bestimmten Zelltypus, wie beispielsweise
der Zellen der Ureterknospe durch Regulation von Zielgenen, die Genexpression –
ähnlich eines Negativbildes – in diesen Zellen entscheidend beeinflusst. Es wären
demnach vor allem diejenigen Gene exprimiert, die keine miRNA-Bindungsstellen
aufweisen oder nur schwach reguliert sind.
Als weiteres Beispiel seien die Podozyten und proximalen Tubuluszellen genannt,
die
während
ihrer
Entstehung
ab
dem
Komma-
und
S-Stadium
den
Transmembranrezeptor Notch-1 exprimieren. Diese Expression ist entscheidend für
die Entwicklung dieser spezifischen Strukturen (Cheng and Kopan 2005). Diese
plötzliche Aktivierung von Notch-1 könnte durch eine Expressionsänderung
derjenigen miRNAs bedingt sein, die entweder zuvor Notch-1 direkt oder als
Bestandteil eines Regelkreises herunterreguliert hatten. Dass miRNAs Notch-Gene
regulieren können, war bereits gezeigt worden (Lai, Tam et al. 2005).
Zusammenfassend kann man sagen, dass die möglichen Angriffspunkte von miRNAs
so vielfältig wie ihre Zielgene sind. Durch die Fähigkeiten dieser neuen
Molekülklasse, unterschiedlichste Gene vom Transkriptionsfaktor bis hin zum
Transmembranrezeptor zu regulieren, und dies auch noch in unterschiedlicher Stärke
– je nach Bindungsstellen und Komplementarität – potenzieren sich die möglichen
Funktionen für miRNAs während der Nierenentwicklung.
65
Daher erscheint es überaus sinnvoll, zunächst durch bio-informatische Analyse der
Bindungsstellen mögliche Zielgene für diejenigen miRNAs zu identifizieren, die unser
Micro-Array aufgezeigt hat. Zwar hat der Array das RNA-Profil von isolierten
embryonalen Nieren untersucht, diese sind aber natürlich aus unterschiedlichsten
Gewebe-
und
Zelltypen
zusammengesetzt.
Genauere
Untersuchungen,
beispielsweise isolierter Ureterknospen oder des metanephrogenen Blastems,
werden weitere Erkenntnisse über dort exprimierte miRNAs liefern. Die wichtige Rolle
von miRNAs könnte auch ein nierenspezifischer, konditionaler Dicer-Knockout im
Mausmodell bestätigen. Erste, bisher unpublizierte Ergebnisse unterstützen diese
Vermutung.
So wird sich letztlich ein neues, klareres Bild der Nierenentwicklung ergeben. Durch
die Erkenntnis, welche Vorgänge dafür sorgen, dass unter anderem hochgradig
spezialisierte
Zellen
wie
die
Podozyten
entstehen,
lassen
sich
neue
molekularbiologische Einblicke in die Physiologie der Niere gewinnen. So führt die
Identifizierung und Untersuchung von miRNAs vielleicht dazu, dass neue, bislang
unbekannte Gene oder Genfunktionen identifiziert werden können. Es ist auch
vorstellbar, dass Nierenerkrankungen, ob hereditär oder erworben, unter einem
neuen „miRNA-Aspekt“ betrachtet werden. Dies lässt hoffen – auf neue
diagnostische oder therapeutische Möglichkeiten, die letztendlich den Patienten zu
Gute kommen.
66
5.
Zusammenfassung
Micro-RNAs sind kurze, 20-24 Nukleotide lange RNA-Moleküle, die in fast allen
Spezies vom Nematoden bis zum Menschen endogen exprimiert werden und in der
Lage sind, Gene auf Translationsebene zu regulieren. Die ersten miRNAs let-7 und
lin-4 wurden im Wurm C. elegans entdeckt. Dort steuern diese miRNAs
entscheidende Entwicklungsprozesse. Seither konnten unzählige Beweise für eine
Beteiligung von miRNAs an Entwicklungsprozessen, auch in Vertebraten, gefunden
werden. Ob miRNAs bei der Entwicklung der Säugerniere involviert sind, war bislang
noch völlig unbekannt. Daher versuchten wir in der vorliegenden Arbeit, miRNAs zu
identifizieren, die während der Nephrogenese in der Maus entweder hoch exprimiert
sind oder eine augenfällige Deregulation aufweisen. Zu diesem Zweck untersuchten
wir in einem Micro-Array die Expression von 427 miRNAs. Tatsächlich zeigten
zahlreiche miRNAs eine erhebliche Deregulation. Beispielsweise nimmt die
Expression der miRNA let-7 zwischen Nieren des Stadiums E11.5 und neonatalen
Nieren um das 16-fache zu, diejenige von miR-200a um das 8-fache. Die von uns
durchgeführten in situ-Hybridisierungen zeigten, dass die miRNAs let-7, miR-373*,
miR-494 und miR-290 tatsächlich in embryonalen Nieren exprimiert sind. Für miR373*, -494 und -290 lässt sich interessanterweise eine Expression in den
Ureterknospen nachweisen. Zusätzlich legen unsere Befunde aus Luciferase-Assays
nahe, dass die identifizierten miRNAs auch funktional sind. Exemplarisch konnten wir
für let-7 eine starke Regulation des onkogen wirkenden Transkriptionsfaktors
HMGA2 zeigen. Während let-7 im Verlauf der Entwicklung vermehrt exprimiert wird,
ist HMGA2-Expression nur in früh-embryonalem Gewebe zu detektieren.
Die so entdeckten miRNAs werfen ein neues Licht auf die Entstehung der Niere, die
zwar gut untersucht, aber bei Weitem nicht ausreichend verstanden ist. Durch die
Analyse möglicher Targets der in dieser Arbeit gefundenen miRNAs – wie
beispielsweise HMGA2 – mag es gelingen, neue Gene oder Genfunktionen zu
identifizieren, die für die korrekte Nephrogenese von Bedeutung sind.
Diese Untersuchungen legen somit nahe, dass miRNAs bei der Entwicklung der
Mausniere eine Rolle spielen. Welche Rolle dies im Detail ist, muss noch
weitergehend erforscht werden. Hier wird in naher Zukunft ein nierenspezifischer,
konditionaler Dicer-Knockout im Mausmodell für weitere Erkenntnisse sorgen.
67
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75
7.
Anhang
7.1
Abkürzungen
AGO
BCIP
BSA
C. elegans
CCR-4
CNF
D. melanogaster
DEPC
DIG-UTP
EDTA
EYA-1
Fab
FCS
GATA-3
GDNF
GFRα1
GTC
GTP
HBL
HDAC4
HDR
HEK
HMGA-2
HOXB8
hsa
IRES
JNK
LET
LIMK-1
LIN
LNA
LSY
miRNA
miRNP
mmu
NBT
NCK
NMRI
NTMT
PACT
PAX
PAZ
PBS
PCR
piRNA
PIWI
RARα
Argonaute
5-Bromo-4-Chloro-Indolyl-Phosphatase
Bovines Serumalbumin
Caenorhabditis elegans (Nematod)
Chemokine (C-C motif) receptor 4
Congenital nephrotic syndrome of the Finnish type
Drosophila melanogaster
Diethylpyrocarbonat
Digoxigenin-Uridintriphosphat
Ethylene diamine tetraacetic acid
Eyes-absent-1
Antigenbindendes Immunglobulinfragment
Fetal calf serum
GATA binding protein 3
Glial cell derived neurotrophic factor
Glial cell line derived neurotrophic factor family receptor alpha 1
Guanidinisothiocyanat
Guanosintriphosphat
HunchBack Like
Histone deacetylase 4
Hypoparathyroidism-Deafness-Renal dysplasia- syndrome
Human embryonic kidney
High mobility group AT-hook 2
Homeo box B8
Homo sapiens
Internal ribosomal entry site
Jun N-terminal Kinase
Lethal
LIM domain kinase 1
Abnormal cell LINeage
Locked nucleic acid
Laterally SYmmetric
micro-RNA
miRNA Ribonucleoproteinkomplex
Mus musculus
Nitroblue Tetrazolium
Non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein 1
Naval Medical Research Institute
Na-TrisHCl-MgCl2-Tween-20-Buffer
Homo sapiens protein activator of the interferon-induced protein
kinase
Paired box gene
PIWI-Argonaut-Zwille-Domäne
Phosphate buffered saline
Polymerase chain reaction
Piwi-associated RNAs
P-element induced wimpy testis in Drosophila
Retinoic acid receptor, alpha
76
rasiRNA
RET
RISC
RNA
RNAi
rno
rRNA
SCP-1
siRNA
SIX-1
SRF
SSC
TBST
TRBP-2
UTR
VEGF
WNT
WT-1
Repeat associated RNA
Receptor tyrosine kinase
RNA-induced silencing complex
Ribonucleic acid
RNA-Interferenz
Rattus norvegicus
Ribosomale RNA
Sarcoplasmic calcium-binding protein 1
silencing-RNA
Sine oculis-related homeobox 1 homolog
Serum response factor
Standard saline citrate
Tris-Buffered Saline Tween-20
TAR (HIV-1) RNA binding protein 2
Untranslated region
Vascular endothelial growth factor
wingless-related MMTV integration site
Wilms tumor 1 protein (WT1) gene
77
7.2
Danksagung
Ohne die Hilfe zahlreicher Personen wäre diese Arbeit undenkbar gewesen – an
dieser Stelle möchte ich ihnen daher meinen Dank aussprechen.
Zuallererst möchte ich mich bei meinem Doktorvater Prof. Dr. Thomas Benzing
bedanken, der mich von Beginn an für die experimentelle Forschung begeistert hat
und mir dieses spannende Thema überließ. Ich danke ihm für die intensive
Betreuung sowie für seine zahlreichen Anregungen und Impulse. Es war eine große
Ehre und Freude für mich, in einem so umfassend ausgestatteten und renommierten
Labor mit so guter Betreuung forschen zu dürfen.
Herrn PD Dr. Bernhard Schermer möchte ich für die intensiven und äußerst
lehrreichen Fortbildungen danken, die mir überhaupt erst die Grundlage dazu gaben,
molekularbiologische Denkweisen und Techniken zu verstehen und selber
anzuwenden. Auch für die weitere, umfassende und freundliche Unterstützung bei
meiner Arbeit bis hin zur Korrektur möchte ich mich herzlich bedanken.
Herrn Prof. Dr. Gerd Walz möchte ich herzlich dafür danken, dass er es mir
ermöglichte, die exzellente Infrastruktur der Labors zu nutzen, um erfolgreich
experimentieren zu können.
Ein ganz besonderer Dank gebührt Dr. Roman-Ulrich Müller. Er war es, der mich in
die Welt der kleinen RNAs entführte, die mich von Beginn an ihren Bann zog – und
deren neue Themen und Entdeckungen mich auch weiterhin überaus faszinieren.
Von Beginn an hat er mich für dieses Thema motiviert und mich konsequent
gefordert und gefördert. Seine grenzenlose, freundschaftliche Hilfsbereitschaft sowie
sein überwältigendes Wissen haben mich zutiefst beeindruckt – nicht zuletzt, da er
mir unter anderem sogar während seines Staatsexamens mit Rat und Tat zur Seite
stand.
Der umfangreiche in situ- Teil dieser Arbeit wäre ohne Dr. Heiko Schweizer
undenkbar gewesen. Sein umfassendes Fachwissen, seine Hilfsbereitschaft und sein
Engagement für die Betreuung meiner Arbeit – auch über seine Tätigkeit im Labor
hinaus – schätze ich sehr.
Nachhaltig haben mich auch die engagierten MTAs des Labors beeindruckt. Trotz
vieler Doktoranden und vollen Auftragsbüchern fanden Christina Engel, Stefanie
Keller, Petra Daemisch und Charlotte Meyer stets Zeit, um uns Doktoranden etwas
beizubringen, uns zu beraten oder uns zu helfen. Dies ist längst nicht
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selbstverständlich und ich habe diese Unterstützung und freundschaftliche
Zusammenarbeit sehr geschätzt.
Den Postdocs Dr. Martin Höhne und Dr. Katja Höpker sowie meinen Mitdoktoranden
möchte ich für die tolle Zusammenarbeit danken – ich habe die Zeit im Labor mit
Ihnen sehr genossen.
Zu guter Letzt sei meinen Eltern und meiner Familie, meiner Freundin sowie meinen
Freunden gedankt für Ihre Anregungen, ihre Geduld und ihre Unterstützung während
der Entstehung dieser Arbeit.
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7.3
Lebenslauf
Personalien
Geburtsdatum:
in:
Nationalität:
29.05.1982
Freiburg i.Br.
schweizerisch / deutsch
Ausbildung
09/2005 – heute
Doktorarbeit in der Nephrologie, anschließend
Tätigkeit als wissenschaftliche Hilfskraft
Doktorvater: Prof. Thomas Benzing
Thema: Die Rolle von microRNAs bei der Entwicklung der
Mausniere
10/2002 - heute
Medizinstudium an der Universität Freiburg i. Br.
Physikum Herbst 2004
1992 – 2001
Gymnasium am Romäusring, Villingen
Famulaturen
08/2007 – 09/2007
Krankenanstalt Rudolfstiftung der Stadt Wien,
Anästhesiologie und Intensivmedizin
03/2007 – 04/2007
Klinik für Unfallchirurgie, Klinikum VillingenSchwenningen
Famulatur in der Notaufnahme
08/2006 – 10/2006
Dr. von Haunersches Kinderspital der LMU München
Pädiatrie: Endokrinologie, Genetik, Neuropädiatrie
Kinderchirurgie
02/2005 – 03/2005
Klinik für Innere Medizin III, Klinikum VillingenSchwenningen
Kardiologie, Pneumologie, Angiologie
03/2003 – 04/2003,
09/2001 – 06/2002
Klinikum Villingen-Schwenningen
Pflegepraktikum auf Stationen für Neurochirurgie, GefäßThoraxchirurgie, Allgemein- u. Viszeralchirurgie
Nebentätigkeiten
08/2003 – 08/2006
Universitätsspital Basel,
Zentrale für Temporäreinsätze in der Pflege
Sitzwache im Pflegedienst
80
2000 - heute
Tennistrainer im Kinder- und Jugendbereich
TC BW Villingen sowie TC Freiburg
(C-Trainer-Lizenz Badischer Tennisverband)
Präsentationen & Publikationen
Sommer 2006
Posterpräsentation auf dem Nephrologie-Kongress,
Essen
“The 3’UTR of PKD1 messenger RNA confers miRNAdependent post-transcriptional regulation of protein
expression”
Müller, R.-U., Albersmeyer, M., Heiss, J., Schermer, B., Walz, G.,
Benzing, T.
Stipendien
2001 - 2005
Stipendiat bei e-fellows.net
Netzwerk von Roche, McKinsey, Holtzbrinck, Deloitte u.a.
Auslandsaufenthalte
Sommer 2000
Focus America
6-wöchiger USA-Aufenthalt im Rahmen eines Programms
des Oberschulamts Stuttgart und des United States
Holocaust Memorial Museum, Washington, DC
08/1999
Sprachkurs an der California State University, Northridge,
CA
1997&1996
Schulaustausch mit Fair Oak, England und Pontarlier,
Frankreich
Fremdsprachen- & PC-Kenntnisse
Englisch und
Französisch
Italienisch
fließend
Grundkenntnisse
PC
MS Office, Photoshop, Freehand
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