Synthese und Untersuchung von Modellsystemen Enzym DNA

Research Collection
Doctoral Thesis
Synthese und Untersuchung von Modellsystemen der
lichtinduzierten Reparatur von UV-Schäden der DNA durch das
Enzym DNA-Photolyase
Author(s):
Epple, Robert
Publication Date:
1999
Permanent Link:
https://doi.org/10.3929/ethz-a-002046376
Rights / License:
In Copyright - Non-Commercial Use Permitted
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ETH Library
Diss. ETHNr. 13081
Synthese
und
Untersuchung
der lichtinduzierten
Reparatur
durch das
von
von
Modellsystemen
UV-Schäden der DNA
Enzym DNA-Photolyase
ABHANDLUNG
zur
Erlangung
des Titels
DOKTOR DER NATURWISSENSCHAFTEN
der
EIDGENÖSSISCHEN
TECHNISCHEN HOCHSCHULE
vorgelegt
von
ROBERT EPPLE
Dipl.
geboren
Natw. ETH
am
15. Juli 1971
in Linz
Angenommen
Prof. Dr.
(OÖ)
auf Antrag
François Diederich,
PD Dr. Thomas
von:
Referent
Carell, Korreferent
Prof. Dr. Bernhard Jaun, Korreferent
Zürich 1999
ZÜRICH
Danksagung
An erster Stelle möchte ich mich bei meinen Doktorvätern, Herrn Prof.
Diederich und Herrn PD Dr.
Forschungsthema,
die
Thomas
grosszügige
Freiheiten bedanken.
Arbeit
mir stets hohe Motivation und
fast
war
Arbeit bei.
vorliegenden
diesem
Durch seine
Umfang ermöglicht.
chemischer
Das kritische Interesse
und
Sein
Carell trugen
Unterstützung
zu
begeistern,
sowie
Herrn Diederich
Durchführung
massgebend
dieser
dieser Arbeit. Die
Gelingen
zum
der
die
und umfassendes Verständnis
seine
Fähigkeit,
Mitarbeiter
auf
Übernahme des
Korreferats.
Durch sein
werden.
und ausführlich mit mir diskutiert.
herzliche und
bereitwillige Art
Ein besonderer Dank
Manuskripts
und die
sprachlich
Burgdorf,
an
in Rat und Tat wurde die Arbeit in
Prof. Dr. Volker Grämlich hat die in dieser Arbeit enthaltenen
ein
und die mir
meiner Arbeit und seine lehrreichen Kommentare konnte die Arbeit zusätzlich
an
abgerundet
Unterstützung
werden mir auch in Zukunft ein grosses Vorbild sein.
Herrn Prof. Dr. Bernhard Jaun danke ich für die
Interesse
von
ständiger Optimismus
biologischer Vorgänge
freundschaftliche Art
der
Ansporn bei
Diskussionen mit Herrn
täglichen
François
Carell, für das interessante und hochaktuelle
intellektuelle und materielle
gewährten
Dr.
danken.
gebührt
Herrn Dr.
dazugehörigen
hohes Niveau
Röntgenstrukturen gelöst
Insbesondere möchte ich ihm auch für seine sehr
Markus
Rüttimann
für
die
Korrektur
des
Diskussionen. Durch seine Hilfe konnte die Arbeit auf
gebracht
werden.
Weiters
Herr Derk Joester sowie Dr. Liam Cox
waren an
beteiligt.
der Korrektur Herr Lars
Auch ihnen ein herzliches
Dankeschön.
Herr Derk Joester hat sich in seiner
Polypyrrole
zustande
verdient
gemacht.
Ohne seine
um
die im fünften
ausgezeichnete
Kapitel
beschriebenen
Arbeit wäre dieses
Kapitel
nicht
gekommen.
Des weiteren danke ich meinen
die
Diplomarbeit
vorzügliche
Hilfe im Labor.
Vollpraktikanden,
Herrn
Jürgen
und Matthias
Albert, für
Folgenden
Mitarbeitern des L.O.C. bin ich
und Herrn
für die Aufnahme
Rolf Häfliger
Brandenberg
und Herrn
der in der Arbeit
zu
Philipp
Dank
von
Frau
Anja Schwögler
und
Herrn
Jens
Kernresonanzspektren
quantenmechanischen Berechnungen,
Butenandt
Carell.
Gruppe
Arbeitsgruppe Diederich
Seite
zur
gestanden
danke
ich
für
eine
Weiters bedanke ich mich
die
fruchtbare
bei
allen
für ihre Freundschaft und das gute Arbeitsklima.
Darüberhinaus bedanke ich mich bei allen, die mir
freundschaftlich
Brigitte
sind.
Zusammenarbeit innerhalb der
der
von
sowie Frau
dargestellten Verbindungen.
Kapitel aufgeführt
Mitgliedern
Herrn Dr. Walter Amrein
Massenspektren,
Zumbrunnen für die Aufnahme
Herrn Ernst-Udo Wallenborn danke ich für die
im dritten
verpflichtet:
sind:
vor
allem ausserhalb
Monika Fritz, Gabriela
der Chemie
Bischofberger, Roger
Moeri, Richard Haldimann, Markus Rüttimann, Lars Burgdorf, Derk Joester, Res
Osterwalder, Christoph Widauer, Marcos Gomez, Marc Leduc, Christian Fokas, Rudolf
Flutsch sowie die Leute
Erinnerung
Der
vom
Rühmli.
Durch sie werde ich meine Zeit in Zürich in bester
behalten.
grösste Dank gebührt den Menschen, denen diese Arbeit gewidmet ist: Meinen Eltern
Günther und Ursula
Epple,
die mir dieses Studium
ermöglicht
haben sowie meinem Schatz
Carine Bast, die mit mir durch dick und dünn gegangen ist und das hoffentlich noch
tun wird.
lange
Teile dieser Arbeit wurden
•
Thomas
publiziert
oder
an
Carell, Robert Epple, Volker Grämlich, Angew. Chem. 1996, 70S, 676-679;
Angew. Chem.,
Engl. 1996, 35, 620-623.
Int. Ed.
Enzym DNA-Photolyase: Synthese von
•
Thomas Carell, Robert
Synthesis
2203.
Kongressen vorgestellt:
Epple,
Volker
and Structure of
Zur
Flavin enthaltenden
DNA-Reparatur
durch das
Modellverbindungen.
Grämlich, Helv. Chim. Acta 1997, 80, 2191-
(Carboxymefhyl)-Functionalized Cyclobuta-Fused
Uracil Dimers.
•
Robert
Epple,
Ernst-Udo
Wallenborn,
and Thomas
Carell, /. Am. Chem. Soc. 1997,
119, 7440-7451. Investigation of Flavin-Containing DNA-Repair Model Compounds.
•
Robert
Epple,
Int. Ed.
Thomas Carell,
Engl. 1998, 37,
Photolyasen
938-941.
II
Typ
vom
Angew.
Chem.
1998, 110, 986-989; Angew. Chem.,
Charakterisierung
mit
Flavin
und
des
Energietransfers
Desazaflavin
in DNA-
enthaltenden
Modellverbindungen.
•
Thomas
Light
•
Carell, Robert Epple, Eur. J. Org. Chem. 1998, 1245-1258. Repair of UV
Induced DNA Lesions: A
Robert
Epple,
Comparative Study
Thomas Carell, /. Am.
Dependent DNA-Repair Requires
•
Robert
Epple,
•
Robert
Investigation
Functional Models for
Epple
Large
Cofactor
Thomas Carell, 36. IUPAC
1997. Poster-Präsentation:
Compounds:
a
Chem. Soc.
and
Thomas
Type
Carell,
with Model
1999, eingereicht.
Congress, Genf, Schweiz,
of Flavin and Deazaflavin
II
Dimers
by
Model
Light
17.-22.
Containing
August
Model
DNA-Photolyases.
Herbstversammlung
Compounds
Efficient
Separation.
Lausanne, 15. Oktober 1997. Poster-Präsentation und
Pyrimidine
Compounds.
NSCG,
University
Vortrag: Photoreactivation
of DNA-Photolyase.
of
of
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
v
Zusammenfassung
viii
Summary
1.
1
Einleitung
1.1 Die DNA
-
ein sensibler
1
Informationsträger
1.2 UV-induzierte DNA-Schäden und ihre
2
Folgen
1.2.1 Die Photochemie der DNA und die Struktur der DNA-Photoschäden
1.2.2 Die
1.3 Die
3
5
Mutagenität der Pyrimidin-Cyclobutandimere
7
Reparatur von UV-induzierten DNA-Schäden
1.3.1
Excisionsreparatur
8
1.3.2
Mismatch-Reparatur
8
1.3.3
Postreplikative Reparatur
8
1.3.4 Induzierte
9
Photoreaktivierung
1.3.5
1.4 Die
9
Reparatur
10
DNA-Photolyäsen
1.4.1 Vorkommen
1.4.2 Strukturelle
1.4.3
von
Eigenschaften
Schadenserkennung
1.4.4 Mechanismus der
1.4.5 Verwandte
10
Photolyasen
durch
von
10
Photolyasen
12
Photolyasen
13
Photoreaktivierung
Enzyme
der
1.5 Die Kofaktoren der Klasse II
17
Photolyasen
18
DNA-Photolyasen
18
1.5.1 Das Flavin-Adenin-Dinukleotid
18
a) Nomenklatur
b) Synthese
c)
Das
von
19
Flavinen
19
Flavin-Redoxsystem
21
d) Die Photochemie der Flavine
8-Hydroxy-5-desazaflavin
23
a) Das Desazaflavin-Redoxsystem
23
1.5.2 Das
b)
25
Die Photochemie der Desazaflavine
1.5.3 Zusammenfassende
Bemerkungen in Bezug
l
auf die
DNA-Photolyase
26
Inhaltsverzeichnis
1.6
Modellsysteme
1.6.1
zur
Photoreaktivierung
frei in
26
Lösung
31
1.6.3 Das
33
Through-Bond Coupling Konzept
1.6.4
Photosensibilisierung
1.6.5
Quantenchemische Analyse
kovalenter
der
Indol-Pyrimidindimer-Derivate
Pyrimidindimer-Spaltung
Modellsysteme
34
37
39
Zielsetzung
2.2
26
1.6.2 Hinweise für die Existenz eines Radikalmechanismus
2.1 Generelle
3.
Pyrimidindimeren
Pyrimidindimerspaltung mit Photosensibilisatoren
1.6.6 Flavin-enthaltende
2.
von
42
Aspekte
bei der Auswahl eines
Ungeklärte Gesichtspunkte
Flavin-enthaltende
der
DNA-Photolyase-Modellsystems
enzymatischen Photoreaktivierung
Modellverbindungen
42
45
47
3.1
Synthese
von
Uracildimeren
47
3.2
Synthese
von
Thymindimeren
51
3.3
Synthese
der Kofaktorderivate
54
3.3.1
Synthese
von
Hydroxyethyl-substituierten
3.3.2
Synthese
von
Aminoethyl-substituierten Flavinen
3.4 Kovalente
Verknüpfung
Synthese der Spaltprodukte
3.6
Untersuchung
von
Flavin-enthaltenden
Modellverbindungen
3.6.2 Generelle
3.6.3
3.7
59
Deprotonierung
Durchführung
Bestimmung
der
56
57
Spaltungsreaktion
3.6.1 Reduktion und
54
55
der Dimer- und Flavinbausteine
3.5
der
Flavinen
von
der Flavineinheit
59
Spaltungsexperimenten
Quantenausbeute der Spaltungsreaktion
3.6.4 Die
Abhängigkeit
der
3.6.5 Ein
Vergleich
Spaltungsraten
der
Spaltungsreaktion
von
von
der Struktur des Dimers
Uracil- und
Thymindimeren
61
64
69
72
3.6.6
Quantenchemische Berechnungen
75
3.6.7
pH-Abhängigkeit
78
3.6.8
Lösungsmittelabhängigkeit
der
Spaltungsreaktion
der
Spaltungsreaktion
Zusammenfassung
80
85
ii
Inhaltsverzeichnis
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
Modellverbindungen
88
Synthese der Flavineinheiten
4.1
88
N(3)-alkylierten Aminoethylflavinen
4.1.1
Synthese
von
4.1.2
Synthese
eines kovalenten Flavin-Indolderivats
89
90
Synthese der Desazaflavineinheiten
4.2
N(3)-alkylierten Aminoethyldesazaflavinen
4.2.1
Synthese
4.2.2
Festphasensynthese
von
von
Desazaflavin-Prolin-Peptiden
4.3
Synthese von Desazaflavin-enthaltenden Modellverbindungen
4.4
Untersuchung
4.4.1
von
Flavin- und Desazaflavin-enthaltenden
Untersuchung
der Desazaflavin-vermittelten
Modellsystemen
Dimerspaltung
4.4.3
Energietransfer in gemischten Modellverbindungen
4.4.4
Aktionsspektren
Auswirkungen
4.4.7 Die
5.
98
98
107
109
eines kovalent
Abstandsabhängigkeit
verknüpften Indolrings
von
Energietransfer
und
Spaltungsreaktion
110
113
121
Zusammenfassung
4.5
95
Spaltungsreaktion in
gemischten Modell Verbindungen
4.4.6
92
105
gemischten Modellverbindungen
4.4.5 Quantenausbeuten der
90
101
4.4.2 Die selektive Reduktion der Flavineinheit
der
88
Flavin-funktionalisierte
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
124
124
5.1 DNA-bindende Moleküle
5.1.1 DNA-bindende Proteine
124
5.1.2 Kleinere DNA-bindende Moleküle
125
5.1.3
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
127
134
5.2
Aufgabenstellung
5.3
Synthese
des
5.4
Synthese
des Imidazol-B austeins
5.5
Festphasensynthese
136
Pyrrol-Bausteins
der
5.5.1
Vorexperimente
5.5.2
Synthese
eines
5.5.3
Synthese
von
139
140
Polyamide
140
Tripyrrol-Flavin-Polyamids
funktionalisierten
Haarnadel-Polyamiden
in
141
143
Inhaltsverzeichni s
Polyamide
5.6
5.6.1
Template
5.6.2
Allgemeiner
zur
Untersuchung
Aufbau der
der
Polyamid-vermittelten DNA-Reparatur
Spaltungsexperimente
150
153
5.6.3 Die
Polyamid-vermittelte Reparatur
an
DNA-Einzelsträngen
154
5.6.4 Die
Polyamid-vermittelte Reparatur
an
DNA-Doppelsträngen
155
157
Zusammenfassung
5.7
6.
150
als künstliche Reparaturenzyme
Experimenteller
6.1
159
Teil
159
Abkürzungen
6.2 Material und Methoden
162
6.3
165
Synthesen
165
Cyclobutandimere
6.3.1
Synthese
der
6.3.2
Synthese
der Flavinbausteine
177
6.3.3
Synthese
der Desazaflavinbausteine
193
6.3.4
Synthese
der
Modellverbindungen
204
6.3.5
Synthese
der
Spaltprodukte
228
6.3.6
Synthese
der
Pyrrol-
6.3.7
Synthese
der
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
und Imidazolbausteine
233
240
7.
Literaturverzeichnis
245
8.
Anhang
281
281
Kristallographische Daten
8.1
8.1.1
Kristallographische
Daten
von
48
281
8.1.2
Kristallographische Daten
von
49
286
8.1.3
Kristallographische Daten
von
57
291
8.1.4
Kristallographische
Daten
von
58
296
8.1.5
Kristallographische Daten
von
59
300
8.1.6
Kristallographische
von
60
305
Daten
8.2
Fluoreszenzspektren
der
gemischten Modellverbindungen
309
8.3
Synthese-Protokolle
der
Polyamide
310
IV
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Pyrimidin-Cyclobutandimere werden
zweier
[27C+27ü]-Cycloaddition
lichtinduzierten
enthält einen
Kofaktor.
dieser
Reparatur
3
ist
die
Untersuchung der
Flavin-enthaltenden
Wellenlänge (z.B.
sowie
Flavin-Chromophor
Spaltungsreaktion liegen
als
niedriger
Die
bis
10
diejenigen
war
des
belegte,
dass
für
eine
deprotonierten
ausserdem in
der
Zustand
ist
Cyclobutanrings
Modellverbindungen
(pKa
wird
in
werden.
am
(Faktor
2).
entsprechenden
Überlappung
können
mit
mit
möglicherweise
das
aber
um
der
einen Faktor 10
pH-Bereich
das Flavin
muss.
Die
in
von
3
seinem
Spaltungsreaktion
Die beobachtete moderate
an
vergleichbaren
Rücktransfer des Elektrons
vor
der
durch die ausserordentliche Stabilität
./Wz'-dimerisierte
als
Verzerrung
7t*(C(4)=0)
Elektron
v
und
besser
gespalten
Thymindimere gespalten
unterstützen
Diejenigen Modellverbindungen,
übertragene
Pyrimidine
durch das reduzierte Flavin nicht
Berechnungen
der antibindenden Orbitale
Flavin
angeregten,
Umprotonierungsreaktionen unterdrückt.
Befunde durch die unterschiedliche
vom
nur
Befunden
wurden Uracildimere schneller
Dimere.
vom
konzertierte
cz's-yyn-dimerisierten Pyrimidinen spalteten schneller als
Quantenmechanische
experimentellen
definierter
Quantenausbeuten
über den
schnellsten.
kompetitive
vorliegenden Modellsystemen
Darüberhinaus
Die
Dimers
6.3) vorliegen
=
Einklang
Der
des
trans-syn-dimmsi&rten Pyrimidinen (Faktor 10).
konnten in den
ausgearbeitet,
Licht
synchrone,
ausgelöst.
Spaltung
des Flavinradikals sowie durch intramolekulare
solche mit
nicht
Spaltungsreaktion
effiziente
Ladungsverschiebungs-prozessen.
des
Versuchsablauf
Flavin-
mit
Funktionalisierung
monochromatischem
Diese
polaren Lösungsmitteln
Lösungsmittel-abhängigkeit
Spaltung
Carboxymethyl-
Enzyms.
systematische Untersuchung
reduzierten und
8-Hydroxy-5-desazaflavin-
1-10% und sind somit
von
Das
Cyclobutanrings (Spaltungsreaktion) dieser
auf die Dimereinheit
im Bereich
Studium der
Enzym DNA-Photolyase.
allgemeiner
mit
erlaubte.
nm)
deren
Arbeit befasst
zum
verschiedensten
von
der DNA durch
vorliegende
wird durch einen intramolekularen Elektronentransfer
Cycloreversion
reduzierten
Reversion des
Modellverbindungen
366
Die
durch das
Herstellung
Derivaten beschrieben. Des weiteren wurde ein
der die
UV-Bestrahlung
aktiven Flavin- und einen
Pyrimidindimer-Isomeren
substituierten
von
Modellverbindungen
von
Pyrimidindimere
katalytisch
Kapitel
In
Folge
Pyrimidinbasen gebildet.
Synthese und Untersuchung
sich mit der
Enzym
als
des
die
eine
Erklärung
Cyclobutanrings
eine
der
der
grösstmögliche
a*(C(5)-C(5')) aufweisen,
über
den
Cyclobutanring
Zusammenfassung
delokalisieren.
geschwächte C(5)-C(5')-Bindung
Eine auf diese Weise
erleichtert die
Öffnung des Cyclobutanrings.
In
Kapitel
4 wird die
Synthese
und
Untersuchung
(gemischten) Modellverbindungen
enthaltenden
selektive Reduktion der Flavineinheit in diesen
Zustände des Flavin- sowie des
DNA-Photolyase
oxidierten
(pKa
=
vermutet
Zustand)
Benzylierung
"hydroxy"
gemischten Modellverbindungen
Die
maximalen
der
Umsatz
teilweise
Spaltungsreaktion
bei
Wellenlängen,
entsprechenden Desazaflavin-Einheiten
"chinoid": 430
nm).
aber kein Flavin
einzugehen.
Andererseits
Lichtsammeieinheit
zu
die
schwache
..:..
Form der
(im
C(8)OH-Gruppe
des reduzierten Flavins in den
Dieser Befund deutet auf
des Desazaflavins
dieser
bei
zum
einen
reduzierten Flavin hin.
gemischten Modellverbindungen zeigen
welchen
auch
die
Modellverbindungen,
die
Absorptionen
("hydroxy":
zwar
ein
der
400 nm;
Desazaflavin,
des
Desazaflavin-Chromophors darin,
des
reduzierten
Flavins
bei
als
höheren
(3) Elektronentransfer
(4) Dimerspaltung
o
O
lr,s
125
R
=
OBn
126
R
=
0-
o
bei
des intramolekularen Abstands zwischen Flavin-
gleichbleibendem Flavin-Pyrimidindimer
Prolin-Einheiten bei den
der
der
die
(1)hv
(2) Energietransfer
Desazaflavineinheit
Zunahme
Gegenwart
Absorption
Vergrösserung
von
es,
Die Desazaflavineinheit
Deprotonierung
gelöscht.
Aufgabe
Eine kontinuierliche
Einschub
bzw.
Die
kompensieren.
o
und
Modellverbindungen ermöglichte
ein Maximum aufweisen
waren
besteht die
(4)
^J^.J
beschrieben.
enthalten, nicht in der Lage, die Spaltung der Pyrimidindimer-Einheit
Folglich
Wellenlängen
126
als auch in ihrer "chinoiden" Form erhalten.
Resonanz-Energietransfer
Aktionsspektren
und
werden, exakt nachzustellen.
Die Fluoreszenz des Desazaflavins ist in
intramolekularen
Flavin- und Desazaflavin-
Desazaflavin-Kofaktors, wie sie in der aktiven
wurde durch
6.0) sowohl in ihrer
wie 125
von
Geschwindigkeit
der
Abstand
gemischten Modellverbindungen resultierte
Spaltungsreaktion,
vi
obwohl
die
durch
in einer
Effizienz
des
Zusammenfassung
mit wachsendem Flavin-Desazaflavin-Abstand abnahm. Dieser scheinbare
Energietransfers
Widerspruch
wurde mit
Elektronentransfer-Prozessen zwischen Flavin- und
kompetitiven
sich auf den
die
Desazaflavineinheit erklärt,
Flavin-Pyrimidindimer-Elektronentransfer
insbesonders bei kleinen Flavin-Desazaflavin-Abständen störend auswirken.
Kapitel
Da sich die in
Gegebenheiten
und 4
3
im aktiven Zentrum
von
die
dargestellten Modellsysteme
sehr eng
DNA-Photolyasen anlehnen,
könnten ähnliche
an
Kriterien, wie sie für die Spaltungsreaktion der Modellsysteme in der vorliegenden Arbeit
gefunden wurden,
Kapitel
der
5 beschreibt den Aufbau
erfolgreich
von
durch die Fmoc-Variante der
Festphasensynthese
Assoziatonskonstanten
(Ka
~
107-109)
in die kleine Furche
binden, indem sie eine Haarnadelstruktur ausbilden.
solche
Systeme
nach
Thymindimere
Chromophore
zu
lässt
die
der
Die
jedoch
Trotzdem wurde mit diesen
der
relativ
dass
vermuten,
Polyamide
an
in
langsam
unter
den
der
an
gezeigt werden,
Lage sind,
verlaufende
die
Reparatur
sperrigen
S
-Nk ^N^O
XXv~V^bx^£
J^n^y
HN
;
v
H2N^O
l
HN
I /
HN^°
x
1
H
Pj
H
NH
IMn2
vn
'
der
Flavinstören.
"künstlicher" DNA-
NHp
V
Thymin-
DNA-Doppelstrang empfindlich
Richtung
dass
doppelsträngigen
Reparatur vollzogen.
°
guten
DNA-Doppelsträngen
an
anderem
ein erster Schritt in
Polyamiden
von
auch
als
relativ
mit
Es konnte
Flavineinheit
einzelsträngigen
an
reparieren.
Bindung
der
Reduktion
sowohl
Cyclobutandimere
Oligonukleotiden
wie 166
Polyamide eingebaut
in diese
sollten
Moleküle
Distamycin-ähnlichen
Diese
werden.
Oligo-Pyrrol/Imidazol-polyamiden
Lösung synthetisierte Flavin- und Desazaflavinaminosäuren konnten
In
Festphase.
Enzym katalysierte DNA-Reparatur gelten.
auch für die durch das
O
Summary
Summary
Pyrimidine cyclobutane
irradiation of DNA
synthesis
The enzyme contains
a
active flavin-cofactor.
of defined
pyrimidine
of model
8-hydroxy-5-deazaflavin-cofactor
3
describes the
These
of these
concerted reversion is induced
building
flavin-containing
bases. The
principal topic
DNA-photolyase.
of various
carboxymethyl-
of the reversion of the
compounds by
model
The
catalytically
covalently
were
able to
are
in addition to the
blocks
UV-
upon
which
the enzyme
elucidated.
was
formed
compounds
synthesis
investigation
assay for the
general
wavelength (e.g. 366 nm)
flavin-chromophore
of two
pyrimidine dimers by
dimer isomers.
ring (splitting reaction)
major photolesions
investigation
of these
Chapter
pyrimidine
flavin derivatives. A
light
and
light-induced repair
substituted
the
are
by [27t+27t]-cycloaddition
of this thesis is the
mimic the
dimers
attached to
cyclobutane
monochromatic
non-synchronous,
but
intramolecular electron transfer from the excited, reduced
by
to the dimer unit.
reaction varied from 1-10%, which is
The determined quantum
only
a
yields
of the
factor of 10 lower than the
splitting
corresponding
quantum yields of the enzyme.
A
systematic investigation
that efficient
splitting
of the
deprotonated
flavin unit
(pKa
solvent
of
dependence, being
comparable charge
splitting
of the
semiquinone
Model
10
faster
radical
uracil dimers
were
The
as
by
splitting
polar media.
A
may be
only
achieved
reaction exhibited
cr*(C(5)-C(5')
a
are
of the
largest overlap
the
high stability
splitting by
splitting
leads to
an
were
thymine
dimers.
degree
of
findings
prior
to
the
between the
rate on the
degree
antibonding
accelerated
bond
opening
viii
coupling.
of the
split by
factor of
Anri-dimerised
In
addition,
of distortion of the
Model
orbitals
by
a
Quantum mechanical
experimental findings.
cyclobutane ring by through
C(5)-C(5')-bond
and
of the flavin
the flavin unit.
able to délocalise the electron transferred
the
reduced
moderate
a
trans-syn-dimerised pyrimidines.
factor of 2 faster than
dependence
a
back electron transfer
suppressed by
which would account for the
the
across
a
by
3-10 revealed
This result is in agreement with
competitive
inert towards reductive
split by
pH
intramolecular proton shifts.
containing
were
predict
which possess
of the
fastest in
well
those
cyclobutane ring,
efficiently
6.3).
dimer is
in the range of
compounds containing cis-syn-dimensed pyrimidines
dimers
calculations
=
shift processes.
as
splitting reaction
pyrimidine
cyclobutane ring
than
pyrimidine
of the
compounds
7r.*(C(4)=0)
and
the flavin unit most
The
resulting weakening
cyclobutane ring.
Summary
In
(mixed)
the
Chapter 4,
model
compounds,
a
scenario
states of the two cofactors in the
and
"hydroxy"
=
forms
"quinoid"
investigation
like 125 and 126 is
compounds
flavin unit in these
and
synthesis
was
of flavin- and
presented. By
selective reduction of the
created, which models the postulated active
The deazaflavin unit
enzyme.
by benzylation
deazaflavin-containing
or
deprotonation
available in both
was
of the
C(8)OH group (pKa
6.0), respectively.
The deazaflavin fluorescence
This
compounds.
quenching
was
revealed maximal
compounds
range of the deazaflavin
Conversely,
revert the
model
ascribed to
was
deazaflavin to the reduced flavin.
quenched by
splitting
rates at
maxima
absorption
dimer unit.
resonance
The measured action
compounds containing
pyrimidine
the reduced flavin in the mixed model
Therefore, deazaflavins only
o
o^N'-rtj-N^o
act as
were
the deazaflavin
R
=
OBn
126 R
=
0~
o
compounds,
chromophore
distance remained constant.
increasing
although
the
the energy transfer
unit, which
was
are most
not able to
to
NH
N-^O
rV
^n0
was
0
V-y-o
the intramolecular distance between the flavin and
increased
The
interchromophoric
explained by competetive
nm).
photoantennas
0
In the mixed model
430
higher wavelengths.
I J
N^N-"
125
the
(1)hv
(2) energy transfer
(3) electron transfer
(4) dimer splitting
(4)
i
"quinoid":
deazaflavins but lack flavins
at
from
which turned out to be in the
400 nm;
("hydroxy":
transfer
spectra of the mixed model
wavelengths,
compensate for the weak absorbance of reduced flavins
o
energy
using proline
investigation
distances
of the
caused
less efficient. These
an
spacers while the flavin-dimer
splitting
reaction revealed that
increase in the
splitting
apparently contradicting
results
rates,
were
electron transfer processes between the flavin and the deazaflavin
effective at small flavin-deazaflavin distances.
IX
Summary
The results obtained in
important
for the
be of crucial
on
enzyme's
splitting
synthesis
reaction
were
based
by investigation
of these model
the
~
107-109) by forming
a
hairpin
into
structure.
specifically incorporated into single
rather slow
repair
chromophores,
rates
which
especially
these
compounds, might
The
distamycin-like
relatively high
studies
Preliminary
unit,
are
capable
double stranded
affect efficient
of
a
phase
supported
association constants
repairing thymine
be
a
result of the
interaction
by
that
dimers
oligonucleotides. However,
might
as
molecules should
the
bulky
steric
first step towards "artificial" DNA
NH2
S
f\
o
rr
"N
p
hn-/"^
o
\
H
o
HN
166
x
such
solution
solid
repair.
\ir^YNYNY°o
also
clearly demonstrate,
DNA-polyamide
polyamides represent
by
polyamides by
in double stranded DNA
negatively
hindrance. Nevertheless, these
or
found to be
oligopyrrole/imidazole polyamides
Fmoc-protecting strategy.
these systems, upon reduction of the flavin
site
were
many
the enzyme.
bind in the minor groove of DNA double strands with
(Ka
situation in
features
in this work
The flavin and deazaflavin amino acids derived
successfully incorporated
on
splitting
Thus, similar criteria, which
5 describes the construction of
solid support.
chemistry
active site.
the
compared to
presented
importance for DNA repair catalysed by
Chapter
166
3 and 4 may be
because the model system
DNA-photolyases,
similarities to the
Chapters
1.
1.
EINLEITUNG
1.1
Die DNA
Der
ein sensibler
-
Code
genetische
und
prokaryotischen
ist
die
eukaryotischen
Informationsträger
Doppelhelix
für Proteine und
einschliesslich
durch die
die für
Replikation und Transkription
dieser Makromoleküle.
zur
des Genoms sind für den
Der natürliche
kann
jedoch
jeder
in Form
pro Zelle auf.
überlebenswichtige
manchmal
zu
von
Die in
Templat
Funktionen
[2] (Abb. 1).
Es ist
einen der verwundbarsten
bleibenden
fehlerhafter
aus
zu
Proteine
Replikationsstops [3].
meistens
Beschädigungen
den sich ändernden
der Evolution
sowie
zu
Solche Mutationen
schädlich, in vielen Fällen sogar lethal.
Umweltbedingungen resultiert,
Verbesserung
gesteigerte Anpassungs-
Grundlagen
er
Erbinformation dient als
Zelle
auch bewirken, dass eine Mutation eine
eine der bedeutendsten
Kopien
Polynukleotide
oder
Organismus
darstellt. Eine durch Mutationen
1-2
nur
steuern und durchführen
es
manchmal auch
Selektionsdruck, der
Funktion
fehlende oder strukturell veränderte Basen führen
Strangbrüche,
Replikationsschwierigkeiten,
und
verschiedenartigste Reparaturvorrichtungen (siehe
Trotzdem kommt
veränderter
Expression
in
die
deshalb nicht weiter verwunderlich, dass diese
Punkte der Zelle darstellen und durch
Aufbau
In den meisten Fällen tritt
Zelle [1].
Basensequenz festgelegte
Proteinkomplexe,
1.3) geschützt werden.
für
Grundlage
doppelsträngiger Desoxyribonukleinsäure (DNA)
dieser
Einleitung
und
der
Überlebenschance
Überlebensfähigkeit
wird als
angesehen [4].
Replikation
Abb. 1. Der Fluss der
Die vielen
genetischen Information,
zufälligen Schäden,
unterschiedliche Ursachen haben
das zentrale
Dogma
der Genetik.
die immer wieder in der DNA auftreten, können ganz
[5]. Sie können das Resultat zellulärer Prozesse
1
sein oder
1.
Einleitung
durch
Einwirkungen
der Umwelt entstehen.
Basenfehlpaarungen,
spontane
Zu der ersten
durch
Schädigungen
Stoffwechselprodukte (z.B. OH-Radikale) [6]
Chemikalien zählen
Strahlung,
Kapitel
wie
z.
Neben einer ganzen Reihe
UV-Strahlung [8],
mit der wir
In den 70er-Jahren hat
Erde auseinanderzusetzen
Ozon
[9, 10].
in einer Höhe
von
UV-C und UV-B
wieder
gelangende
zellulären
Disauerstoff
Licht dieser
spezifische
240
Reaktionen
Disauerstoff
aus
entsteht
[12-14].
Das
auf
restliche,
als auch
von
die
wobei
aus
Erdoberfläche
kann
sowohl
von
DNA-Basen absorbiert werden [17, 18].
sind dadurch
UV-A
energetisch
in der
Lage,
VIS
320
des
der
^
400
UV-Wellenlängenbereichs des
Ozonschicht
durch
vermehrt
auftretende
Erhöhung
der Mutationsrate
UV-induzierte
Stickstoff-,
zur
Modifikationen
Folge [23-25],
760
Sonnenlichts in [nm].
Bromoxide hätte für das Leben auf der Erde dramatische
würde.
Organismen
Strahlung (Abb. 2) weitgehend herausgefiltert,
schädigenden Wellenlängen (240-320 nm)
280
übersteigen
Trifft Sonnenlicht
wird die für die auf der Erde lebenden
UV-B
Zerstörung
gebildet.
einzugehen.
Spektrale Einteilung
Die
so
Folgen
sich mit der schützenden Ozonschicht der
UV-Quanten angeregten Moleküle
UV-C
im nächsten
uns
Das diese Schutzhülle bildende Ozon wird in der
20-25 km
Photorezeptoren [15, 16]
Die durch die
Abb. 2.
angefangen,
man
[11] auf diesen Schutzmantel,
gefährliche
von
auseinandersetzen wollen.
UV-induzierte DNA-Schäden und ihre
Stratosphäre
endogener
mutagenen Umwelteinflüssen auch verschiedene Arten
B. ionisierende oder
etwas näher
1.2
den
zu
Angriff
allem
vor
oder durch nicht ganz fehlerfrei arbeitende
DNA-Polymerasen und DNA-Reparatursysteme gezählt [7].
von
werden
Kategorie
Wasserstoff-,
Chlor-
Konsequenzen [19-22].
der
die die
DNA
hätten
Kapazität
der
eine
und
Dadurch
drastische
Reparatursysteme
Welche Strukturen die resultierenden Photoschäden haben bzw.
welcher Art die Mutationen sind und wie
können, soll in den folgenden Absätzen
schwerwiegend die Folgen
etwas
2
genauer
besprochen
der
Schädigungen
werden.
sein
1.
Einleitung
1.2.1 Die Photochemie der DNA und die Struktur der DNA-Photoschäden
Wenn eine DNA-Base ein Photon absorbiert, wird sie in den ersten
angeregten Singlet-Zustand gebracht.
durch
internal
conversion
aufgenommene Energie
in
den
Im Normalfall fällt die angeregte Base sehr rasch
Grundzustand
wird somit in Form
von
Die
zurück.
Wärme wieder
durch
Ausbildung
von
kovalenten DNA-Protein-Addukten
Photohydrierungen (siehe
handelt sich dabei
um
nicht denkbar wären.
können sogenannte
1 und 2 in Schema
Reaktionen, die
In
Sporen,
aus
1) [27]
[26],
oder
zu
Sporen-Photoprodukte (3) gebildet
Base die
in den ersten angeregten
Triplet-Zustand
aufgenommene Energie
weitergeben,
eingehen [27, 30].
Reaktionen
von
Die weitaus
und
Strangbrüchen [28, 29].
Es
dehydratisierter
werden [7]
häufigste
Hoffmann photochemisch erlaubte,
Form
vorliegt,
(Schema 1).
geht
durch intersystem
Auch in diesem Zustand kann die
Energietransfer
der in der DNA
an
die nächsten Basen
beobachtbaren, UV-induzierten
Triplet-Zustand
ist
aber thermisch verbotene
Pyrimidinbasen [31-34].
Purinbasen involviert sein
energetisch
relaxieren, oder mit benachbarten Basen Reaktionen
DNA-Basen im angeregten
zweier benachbarter
über.
entweder durch
in den Grundzustand
Energie jedoch
dem Grundzustand der DNA-Basen
deren DNA in stark
Photon
Photoionisierungen
zu
Ein weiterer, kleiner Prozentsatz der angeregten DNA-Basen
crossing
das
freigesetzt.
Bei einem kleinen Teil der angeregten Moleküle führt die absorbierte
zur
(oder höheren)
[35-37].
3
In
eine nach
Woodward-
[27ts+27ts]-Cycloaddition
seltenen Fällen
können
aber
auch
1.
Einleitung
Schema 1.
von
Photoprodukte der UV-Licht-induzierten Reaktionen von Pyrimidinbasen der DNA am Beispiel
Thymidinen (4). In Klammern sind die relativen Häufigkeiten in % angegeben.
zwei benachbarten
o
o
uu'y^ >s||
O
Xx
0A®J
N
0'
^O
hv
0°
Pyrimidin-Radikalkation
2
Ö A.
/
\
-P
HpO
Sporen-Photoaddukt
(<0.1)
1
(<0.1)
e
0',o
Pyrimidin-Photohydrat
(2)
O'
O
tA.
A
O
NH
o
(aqK^
o
o^i
hv
hv
Ö
O
I!
b-VQ
0°
hv
d(TpT)
Ö--
[271+271]
4
[2n+2n]
o
HN^f—V^NH
HN
O
^4
NH
°©
(6-4)-Photoaddukt
(10)
c/'s-syn-Cyclobutandimer 5
(75)
frans-syn-Cyclobutandimer
(2)
7
6
Dewar-Valenzisomer 8
4
3
Die Detektion und
der dabei entstehenden
Quantifizierung
Hilfe verschiedenster Methoden erreicht
besitzt, stellt
die
es
Energiesenke
[44]. Die bei der Reaktion
Pyrimidinbasen führt
zu
zwei
von
abgebildet [45-48].
Schema 1
beim
Die
[38-43].
Thymidinen (4)
Cycloaddition
da eine Reaktion
am
ungewöhnlicher
prinzipiell
in
einzelsträngiger
Stränge denkbar,
Etwa zehn mal seltener
[27T,+27u]-Cycloaddition
C(4)=0-Ketogruppe
die
Eine erneute
als
zweier
und
Bildung
UV-Bestrahlung
Diese sind in den meisten Fällen
zwei in
der
nach
an
7 führt
direkt
entsprechenden
vor
und
DNA
mit
Cyclobutandimere
sind
zweier verschiedener DNAwerden.
Cyclobutandimeren
einer
kommt
Pyrimidinbase
Dieser
Reaktionstyp
des
7
es
zur
mit
der
erinnert
instabilen
(6-4)-Photoadduktes
Umwandlung
zur
Die
doppelsträngiger
Ringöffnung
eines sogenannten
von
DNA-Doppelhelix
nachgewiesen
Pyrimidinbase.
hat
der
Pyrimidinen
Bildung
zur
einer benachbarten
die
C(5)-C(6)-Doppelbindungen
C(5)-C(6)-Doppelbindung
einer
Paterno-Büchi-Rtaktion
Zwischenprodukts
von
dar
sind in
Anfr'-konstituierte
aber noch nicht
jetzt
DNA-Doppelhelix
der
Hauptprodukte
sowie
Konformation beobachtet [49].
konnten bis
niedrigste Triplet-Energie
kommen etwa 50 mal seltener
DNA
bei intermolekularen Reaktion
wurde mit
wahrscheinlichsten ist.
?rans-5;yft-konfigurierten Pyrimidindimere (6)
allem
Photoprodukte
entstehenden
der
von
Einleitung
die
Energietransfer entlang
übereinanderliegenden Pyrimidinbasen
vor
Thymin
cyclobutanartigen Photodimeren.
cis-syn-konûganert (5),
werden
Da
1.
an
Oxetan-
Folge [50].
zur
in das Dewar-Valenzisomer 8
[51-53].
1.2.2 Die
Mutagenität
der
Pyrimidin-Cyclobutandimere
Vor allem in den letzten Jahren wurden immer mehr
Zusammenhänge
zwischen den
oben erwähnten Photoschäden und vielen weitverbreiteten Hautkrebsarten wie
oder Basalzellcarcinomen
hergestellt [55-58].
xeroderma
Reparatursysteme
zur
Anhäufung
[8, 54] sowie den sehr gefährlichen bösartigen Melanomen
Hinweise dafür liefert auch die seltene,
pigmentosum,
bei
der
die
normalerweise
für DNA-Photoschäden in der Zelle
von
Schuppen¬
Pyrimidindimeren
Risiko der betroffenen Patienten,
an
in der DNA.
Hautkrebs
5
obiger
genetisch bedingte
sehr
lahmgelegt
Die
Art
Folge
zu
effektiv
sind
[59, 60].
Krankheit
arbeitenden
Es kommt
ist ein 1000-fach erhöhtes
erkranken
[61].
1.
Einleitung
der zuletzt in der Literatur sehr
Untersuchungen
Suppressor-Gene gaben
weisen eine grosse Zahl
Die
von
Cycloadditionen
10
Aminoderivats
Cyclobutandimers
unter
Guanosins
als
komplementäre
des
Cyclobutanring
C—>T-Transition.
Zudem
Photoschadens
Thymidin
macht
arbeitendes
seinem
Reparatursystem
Replikationsstops,
irgendeine
Für
[78-81].
Man
des
Tautomerisierung
Deaminierung
des
h) [33, 72-75].
2-3
anstelle
eines
den
Reparaturenzyme
(siehe
1.3.5)
und
das
wäre in beiden Fällen die
Folge
instabiler
primärer Photoprodukte
könnte
verhalten
es
sich auch mit dem
Ein
[77]).
schnell
den
während der
unüberwindbare Hindernisse führen
Kommt
DNA-Abschnitt,
von
Reparatur {error prone)
so
es
zu
einer
Anhäufung
zu
von
kann diese Situation eintreten.
DNA-Polymerasen
(meistens ein Adenosin) gegenüber
einfach überlesen
dem Schaden
In
{bypass),
eingebaut
wird
sieht, dass die hohe Mutagenizität der Cytidindimere für C—>T-Transitionen
auch hier ihre Ursache
schwerer
Polymerasen
die für die Zelle lethal sind.
Base
[2n+2it\-
ist für die Zelle deshalb unerlässlich.
solchen Fällen werden die Dimere
indem
durch
deutlich, dass oft nicht die DNA-
Dewar-Valenzisomer
in einem kurzen
Pyrimidindimeren
sowie
Wasserstoffbrücken-
können
[76] (ähnlich
Gefahr droht der DNA auch durch fehlerhafte
Replikation (siehe 1.3.3/4).
Die
Folgeprodukte
für die hohe Mutationsrate verantwortlich sind
und
Thymidin)
=
Adenosins
revertieren
ersetzen.
Beispiel
Photoschäden selbst, sondern vielmehr
(6-4)-Photoprodukt
veränderten
Einbau eines
zum
führen.
Base
Dieses
T
anschliessender
(Halbwertszeit:
die
oder 12
deaminierten
entstandene Uridin 13 durch ein
besagte
können
11
mit
11
des Uridins 12
Bildung
von
eine
(Schema 2) begünstigen
Replikation
Paarungseigenschaften
Cytidin,
=
C(5)-C(6)-Doppelbindung
der
in das ii-Iminoderivat
der
Während
9
Pyrimidindimeren
von
Gerade solche Mutationen sind charakteristisch für
Sättigung
Cytidin
p53-Tumor-
Hautzell-Carcinom befallenen Zellen
von
C^T-Punktmutationen (C
[69-71]:
von
der
p53-Gene
CC—>TT-Tandemmutationen auf [68].
DNA-Photoschäden
Zusammenhang
weitere Indizien für den
[62-67].
und Hautkrebs
erwähnten
häufig
hat, während Thymidindimere korrekt überlesen werden.
UV-Bestrahlung
noch drastischere
System jedoch
den Zelltod
SOS-Reparatur [5]
zu
vermeiden, werden solche Passagen durch die
überwunden.
selbst fehlerhaft arbeitet, kommt
Mutationen ganz unterschiedlicher Art.
Es
trans, syn-konfiguriertes
ein
darstellt und daher
Pyrimidindimer
hochmutagen
ist
Um bei
[82].
6
sei
es
Da dieses sehr schnell
folglich
an
angemerkt,
erhebliches
diesen Stellen
dass
arbeitende
häufig
zu
schon ein einzelnes
Hindernis
für
Polymerasen
1.
Schema 2. Lichtinduzierte
Deaminierung
des
Einleitung
Cytidins.
NH
hn^^i—£
Tautomerisierung
I
Cytidin
<
Amino-Tautomer 10
9
E-Imino-Tautomer 11
Deaminierung
k=10"12S-1
Deaminierung
k=10-6s"1
o
hn^^i—<
Reparatur
cAA;
12
Die
besonders
Bestrahlung
gefährlichen
beobachtet
[83, 84].
Basen auslassen und
{slippage-Mcchmismus),
pyrimidinreichen Sequenz umgeben
wird der gesamte
1.3
Die
Triplet-Code
Reparatur
der
ist.
besonders,
Fehlen dem
Basensequenz
von
Wie weiter oben bereits
wurden
einfach über
so
wenn
die im letzten
Kapitel
der
den
Schaden
neusynthetisierten Strang
verschoben
UV-
Schaden
von
1-2
einer
Basen,
(frameshift).
UV-induzierten DNA-Schäden
erwähnt, weiss sich die UV-Licht bestrahlte Zelle mit
zahlreichen, sehr effektiv arbeitenden Reparaturmechanismen
Normalfall ist dies ein
bei
ebenfalls
Es wird angenommen, dass die durch ein Photodimer
aufgehaltenen Polymerasen einige
hinwegrutschen
Leserastermutationen
zu
helfen
[2, 5, 7].
Zusammenspiel verschiedenartigster Reparaturprozesse [85],
beschriebenen (oft
schwerwiegenden) Folgen
(Abb. 3).
7
Im
sodass
für die Zelle ausbleiben
1.
Einleitung
1.3.1
Excisionsreparatur
Basen-Excisionssystem
Das
glykosidischen Bindung
Glykosylase.
zwischen der
AP-Endonukleasen
Phosphodiesterbindungen
beiden
entfernt die schadhafte Stelle durch
(z.
Desoxyribose und
B.
T4-Endo V
neben der AP-Stelle
der N-
Hydrolyse
der Base mit Hilfe einer DNA-
[86, 87]) hydrolysieren eine der
(Apurin-
bzw.
Apyrimidin-Stelle)
und der Zucker wird entfernt.
Bei
beschädigten DNA-Strang
und
erkannt
von
speziellen Enzymen,
Sie
entfernt.
grosszügigen Entfernung
einen
wird
Oligonukleotid-Excisionsreparatur
der
hydrolysieren
die
auf beiden Seiten der
den
der
veränderte
Abschnitt
im
DNA-Reparatur-Endonukleasen,
Phosphodiesterbindungen
beschädigten
in
einer
Nukleotide und schaffen
so
einzelsträngigen DNA-Abschnitt.
Die
DNA-Polymerase
füllt die durch Basen- oder
Lücke anhand der Information des intakten
schliesst die letzte
Oligonukleotidexcision
Gegenstranges
im
Phosphodiesterbindung
wieder auf.
reparierten Strang,
der
Die
entstandene
DNA-Ligase
Doppelstrang
ist
wiederhergestellt.
1.3.2
Mismatch-Reparatur
Die
und
zu
Mismatch-Reparaturenzyme
durch den
dieses
Vor allem nach der
ersetzen.
Replikation
UV-geschädigten Elternstrang
System
vor
Einsatz kommt,
allem
um
so
Deshalb enthalten viele
vor
der
induzierte
Lage, fehlgepaarte
weisen die
Tochterstrang
DNA-Polymerase-Komplexe
auch
Basen
zu
erkennen
neusynthetisierten Stränge
Fehlpaarungen
postreplikativen Methylierung
zwischen Eltern- und
Mismatch-Reparatur befähigt
1.3.3
sind in der
auf.
Wichtig ist,
einzelner DNA-Basen
unterscheiden
eine
zu
Untereinheit,
dass
zum
können.
die
zur
ist.
Postreplikative Reparatur
Weisen die
Stränge
nach der
Rekombinations-Reparatur
Polymerase
Moleküle
beim
Replikation
behoben werden.
Überspringen
geschlossen
So werden
z.
B.
auf, können diese durch
Lücken, die die DNA-
dimerisierter Basen hinterlässt, mit Teilen intakter DNA-
ausgetauscht (rekombiniert).
Strang befindet,
immer noch Fehler
Die
Lücke, die sich
kann ohne Hindernisse mit der
werden.
8
nun
DNA-Polymerase
auf dem intakten DNAund
DNA-Ligase
wieder
Einleitung
1.
1.3.4 Induzierte
Reparatur
Befindet sich eine stark UV-bestrahlte Zelle durch
Reparatursysteme"
im Zustand höchster
Gefahr,
so
Überlastung
wird sämtliche
der
"normalen
Reparaturkapazität
Überleben herangezogen, auch solche, die möglicherweise ungenau arbeitet.
Replikation
in
solchen
Situationen
aufrechtzuerhalten,
Replikations-Enzymkomplex eingesetzt,
abbricht.
zur
und wird daher
Folge
ein
unleserlichen DNA-Stellen
an
veränderter
weniger häufig
als letzter
nur
Ausweg
aktiviert.
Photoreaktivierung
UV-Strahlung
stellt für die Zelle ein
hochspezielle Enzyme,
Hauptschäden
der
dafür
Um die
Diese fehlerhaft arbeitende, sogenannte S OS-Antwort der Zelle hat eine erhöhte
Mutationsrate
1.3.5
der
wird
zum
direkt
die
am
DNA-Photolyasen,
DNA-Doppel-
Reparatur ist Ausgangspunkt
soll ihr ein
derartiges Gefahrenpotential dar,
oder
entwickelt
Einzelstrang
haben, die die oben genannten
revertieren können.
der in dieser Dissertation
eigener Abschnitt gewidmet
dass sich sogar
Diese Form
verfolgten Forschung,
deshalb
werden.
1111111111111
Ligase
£.1111111111
DNA-Photolyase
£.11111
I
IUI
(a)
MUMM
DNA-Polymerase
IM II
hv
I I I I
M I
(c)
Endonuklease
Milium
AP-Endonuklease
(b)
N-Glykosylase
gl
(d)
Rekombinations
g.nii^ 11111 m i nran
Enzyme
II III III I'M MIHI IM
vi i i i i n
"
Abb. 3. Vereinfachte
der DNA.
Darstellung enzymatischer Reparaturmechanismen
zur
<
Behebung
i
i
i
i
1\
i
i
i
i
i
von
i
UV-Schäden in
(a) Photoreaktivierung; (b) Basenexcision; (c) Nukleotidexcision; (d) Rekombination.
9
I I I I
1.
Einleitung
Die
1.4
DNA-Photolyasen
1.4.1 Vorkommen
von
Photolyasen
sind in der Natur weitverbreitet.
DNA-Photolyasen
Aktivität in
so
Organismen
unterschiedlichen
Pflanzen und in den meisten höheren
mögliche
Ausnahme sind
der Vertebraten finden
Das Vorhandensein oder Fehlen
Säugetiere.
man
Photolyase-
Bakterien, Algen, Pilzen,
wie
Gruppen
So konnte
höheren
Eine
[88, 89].
von
Photolyasen
im
Menschen wird immer noch kontrovers diskutiert [90-94].
1.4.2 Strukturelle
Eigenschaften von Photolyasen
DNA-Photolyasen
kDa
[95, 96].
Nur
weisen sie ein paar
sind
monomere
wenige Photolyasen
spezifische
[99-101],
Form)
von
Photolyase
in seiner reduzierten,
während
Methenyltetrahydrofolat (5,10-MTHF) [102]
Demnach unterscheidet
[103] ist (Abb. 4).
Jede mikrobielle
(Chromophore) [97, 98] (siehe 1.5).
1,5-Dihydroflavin-Adenin-Dinukleotid (FAD
deprotonierten
Molekulargewicht
55-65
sind bis heute gut charakterisiert worden, doch
Gemeinsamkeiten auf.
zwei lichtabsorbierende Kofaktoren
immer
Proteine mit einem
oder
man
der
andere
enthält
Einer davon ist
möglicherweise
entweder
5,10-
8-Hydroxy-5-desazariboflavin (8-HDF)
bei diesen
Enzymen
die Folat- und die
Desazaflavinklasse [104].
Erst in
jüngster
Röntgenstrukturen
der
5
von
DNA-Photolyase
zeigt
[108].
die
Zeit ist
gelungen, Photolyasen
Vertretern beider Klassen
aus
zu
zu
kristallisieren
lösen.
[105, 106] und die
Die erste Struktur wurde
von
Escherichia coli als Vertreter der Folatklasse [107] erhalten. Abb.
DNA-Photolyase
In höheren
es
von
Anacystis
Organismen gibt
es
nidulans als Verteter der Desazaflavinklasse
allerdings
weitere Formen
die sich nicht in diese beiden Klassen einordnen lassen
10
[109].
von
DNA-Photolyasen,
1.
Einleitung
H2N
i^Xj
eP„^
ii
HOHO-
-H
HO-
-H
H-
-H
XI
ii
-HO
I
n
OH OH
O
4.
<j-N
gelb
=
-H
HO-
-H
HO-
-H
H-
-H
N
H
,NH
^
H2N
N
O
N
H
5,10-MTHF
Strukturen der in
Darstellung
8-HDF;
rot
=
der
8-HDF
DNA-Photolyasen enthaltenen Kofaktoren. Photolyasen
diejenigen der Desazaflavinklasse enthalten FADH" und
enthalten FADH" und 5,10-MTHF,
Abb. 5.
HO-
HN
,
FADH"
Abb.
ÇH2OH
NHR
O
DNA-Photolyasen
des
Cyanobakteriums A.
FADH".
11
der Folatklasse
8-HDF.
nidulans (Desazaflavinklasse
=
Typ II);
1.
Einleitung
Sequenzvergleich
Ein
Mechanismus der
Photolyasen
den
DNA-Photolyasen
von
Kofaktoren
beide
durch
ehesten
am
lichtgetriebenen Reparaturprozesse
wobei
1.4.4),
(siehe
erklären
Flavin-enthaltenden
anderen
sich
Dies lässt
Redoxenzymen ergab keinerlei Homologie.
einzigartigen
mit
DNA-Photolyasen
von
ihren
in
sowohl
Grundzuständen als auch in den angeregten Zuständen binden müssen.
den
lassen sich bei
Grob
Photolyasen
getrennte Domänen erkennen, eine N-terminale
beinhaltet die
katalytischen
der Domäne für den
einer
zu
rund
um
geladenen Argininen
reparierenden
sowohl
[110].
(MTHF
oder
und
Die helikale
HDF).
zugänglich ist.
Photoschaden
Konformation
Das FAD wird dabei in
gebunden. Aussergewöhnlich
dieses aktive Zentrum. Des weiteren zieht sich ein Band
über die
Schadenserkennung
Die
Spalt
einen
sind auch
hochkonservierten, polaren Kontakte zwischen dem FAD-Kofaktor und dem
Proteingerüst
1.4.3
durch
Kofaktor FAD, welcher durch ein Loch in der Oberfläche
ungewöhnlichen U-förmigen
die vielen
zwei
Domäne und eine C-terminale helikale
für den zweiten Kofaktor
Bindungstasche
Domäne bindet den
oc/ß
Klassen
typische Oligonukleotid-Bindungsdomäne gefaltet
Die erstere ist wie eine
Domäne.
beider
Enzymoberfläche um das
durch
Die
Bindung
Veränderungen
ist
als auch
zu
Modell der
Folgendes
elektrostatischen Potentials der
van
zur
Arginine folgt [121].
richtigen
der Waafo-Kontakt
Polarität der
zum
hydrophob,
Pyrimidindimere.
geschwächten Wasserstoffbrückenbindungen
wird
durch
nur
geschädigten
Substraterkennung
DNA-
durch DNA-
Enzyms [122, 123].
Dieser
der
des
Spur
Dimensionen hat,
zu
ein
um
Thyrnin-
polar,
und ist somit
Dabei erleichtem die durch das Dimer
der destabilisierten DNA-Helixstruktur
aus
dem
Doppelstrang
base-flipping-Mtchanismus
12
das
Die Innenseite der
bringen.
auf der anderen
um
um
positiven
Diese befinden sich direkt
FAD
115, 119] das hypothetische Herausdrehen des Dimers
Zentrum des
eines
Enzyms [120], wobei die DNA
aktiven Stelle ist auf der einen Seite
komplementär
sie
Phosphat-Rückgrat {backbone) (4-5 Phosphate
Loch in der helikalen Domäne, welches die
in
d.h.
[107]:
die Oberfläche des
Cyclobutandimer
Proteinen, die
DNA mit ähnlichen Affinitäten binden
Bindungseigenschaften
Zunächst bindet die DNA über ihr
an
seltenen DNA-bindenden
einzelsträngige
der Struktur und der
wurde entworfen
den Schaden)
den
völlig sequenzunabhängig [111],
Stranges [112-119] ausgelöst.
Photolyasen
aktive Zentrum dieser Domäne.
Photolyasen
DNA-Photolyasen gehören
geschädigte doppel-
positiv
von
wurde
[112,
in das aktive
zuvor
bereits
1.
Methyltransferasen [126,
127]
Pyrimidin-Cyclobutandimeren
durch
und
125]
124,
einige DNA-Glykosylasen [87,
für
Einleitung
vorgeschlagen.
1.4.4 Mechanismus der
Bereits
Photoreaktivierung
50 Jahren wurde die
vor
von
Prozess erkannt
lichtgetriebener
als ein
DNA-Photolyasen
Reparatur
Wellenlängenbereichs
Licht des für die Zelle unschädlichen
Pyrimidindimere
wieder in ihre Monomer-Einheiten
Pyrimidindimere
mit anschliessender,
ausgeschlossen,
500
da die
keine
Eine thermische
hohe
verboten und weist deshalb
Grundzustand, wodurch Elektronen in den
direkte
Bestrahlung angeregt
eleganten Weg gefunden,
verschiedenster
spektakulären
Absorption
bei diesen
ist
Cycloreversion
nun
um
Anregung
auf.
aus
Problem
die
der
ist
Wellenlängen (350-
Symmetriegründen
Auch
gibt
es
keinerlei
Pyrimidindimeren
im
tiefer liegenden Orbitalen des Dimers durch
Das
[130].
zu
Enzym
umgehen.
Arbeitsgruppen [48, 98, 131-135]
Mechanismus der
350-500 nm,
Direkte
des FAD-Kofaktors mit
werden könnten
dieses
=
spalten.
Aktivierungsenergien
charge îra/is/èr-Komplexe
Hinweise für
X.
symmetrieerlaubter [27t+2ît]-Cycloreversion [27]
Cyclobutandimere
nm) aufweisen [129].
zu
von
Enzym benötigt
Das
[128].
haben
Photoreaktivierung
von
hat vielmehr einen sehr
Zahlreiche
zum
heute
Untersuchungen
generell postulierten,
Pyrimidindimeren
durch DNA-
Photolyasengeführt (Schema 3):
1) Photoreduktion des Flavins über
Photolyasen mit
isoliert
Chromophor".
Tatsächlich wurden
dem Flavin als freiem Radikal in seiner semireduzierten Form
(vgl. 1.5.1).
Kofaktor
"dritten
einen
Da die aktive Form des
Enzyms
den
vollständig
(FADH") braucht [136], wurde ein Elektonentransfer
Tryptophanrestes
(Trp) [137,
postuliert [139-141].
138]
Ausserdem
auf
das
konnte
in
reduzierten
eines
Indolring
semireduzierte
lichtangeregte,
in
vom
(FADH)
Flavin
vzYro-Experimenten nachgewiesen
werden, dass der Indolring eines anderen Tryptophanrestes bei Anregung mit Licht
<
350
[142].
nm
ein
Cyclobutandimer
Aufgrund
des dabei
durch
Elektronenübertragung
eingesetzten,
direkt
für Zellen schädlichen
reparieren
kann
Wellenlängenbereichs
(< 350 nm) spielt dieser "Reparatur"-Prozess bei der enzymatischen Photoreaktivierung
keine Rolle.
13
1.
Einleitung
2) Energietransfer zwischen den beiden Kofaktoren.
höheren
Extinktionskoeffizienten
verglichen
mit
zweiten
der
reduzierten
dem
Chromophor
ersten
wird
(FADH")
nach
Förster
das
bringt
[143]
('FADH"). Steady-
angeregten Singlet-Zustand
ersten Kofaktor in den
schliesslich den
MTHF)
zweiten Kofaktor absorbiert.
vom
Dipol-Dipol-Wechselwirkung
durch
oder
Chromophore (HDF
photoreaktivierende Licht (350-500 nm) grösstenteils
Energietransfer
durch die etwa 5-10 mal
Bedingt
state-Fluoreszenzlöschung [118, 144], zeitaufgelöste spektroskopische Untersuchungen
des
(Reparaturrate
der
Absorptionsspektren
Chromophore ('FADH-
60 kcal
schliesst eine direkte
Energietransfers
darüberhinaus
schwache
Ein
Vorschlag.
unterstützen diesen
mol"1)
jeweiligen
fest
des
sich
der relativen
des Dimers
Energien
kcal
und
aus
mit
genau
überdecken
Chromophore
Vergleich
Anregung
147],
[130,
der angeregten
mol1; 'Dimer
die
legt
den
120 kcal
des
Richtung
Die lichtsammelnde Aktivität des zweiten Kofaktors ist
[135].
Absorption
zweiten
mol1; 'MTHF/'HDF 70-90
Gründen der
aus
die
Enzyme,
Aktionsspektren
absoluten
die
sowie
der
Wellenlänge)
vs.
146]
[145,
Chromophors
zweiten
katalytischen
reduzierten
Enzyms sinnvoll,
Effizienz des
Flavins
über
Wellenlängen
bei
400
um
die
nm
zu
kompensieren.
3) Elektronentransfer des
sind
ausgezeichnete
Waa/s-Kontakt
ersten
Kofaktors auf das Pyrimidindimer. Lichtangeregte Flavine
Redox-Kofaktoren
zwischen
Elektronenübertragung
vom
^ADH"
Flavin
und
auf
dem
das
Einelektronen-Reduktion des Dimers wurde
reduzierten Flavins
am
Enzym
kcal
mol"1
[152].
für
Prinzipiell
Elektronentransfer
vom
aus
Dimer) ausgeschlossen
werden
=
vom
kcal
mol"1
hingegen
Die thermische Reversion
[153]).
Die
exotherm
trimethylenverbrückte
Reversion
verlaufen
Dimere
von
(AH°
=
[154]; AH°
=
14
-26
-19 kcal
des
+45
kcal
(AG
=
mol"1
-30
für
[48].
Cyclobutan
neutralen
eines
Die
Dimer auf das
Gründen
4) Konzertierte, aber nicht synchrone Reversion des Cyclobutanrings
Pyrimidindimer.
eine
EPR-Experimente [146,
thermodynamischen
AG
der
transienten Radikalen bei
und durch
Dimer,
zum
wird
Fluoreszenzlöschung
wäre auch Elektronentransfer
Dieser kann aber
Elektronentransfer
von
van
ermöglicht.
(ToT)
durch
[118, 148] sowie durch das Auftreten
148, 151] nachgewiesen.
postulierten
Pyrimidindimer
Dimer
zeitaufgelöster Absorptionsspektroskopie [149, 150]
Flavin denkbar
Durch den
(siehe 1.5.1).
im
ist endotherm
reduzierten
(AH°
c/s-syn-Pyrimidindimers
kcal
mol"1
für
=
+18
würde
N(3),N(3')-
mol"1 für unverbrückte Dimere
1.
Gründe dafür sind die
[155]).
zwischen
Wechselwirkung
konjugierter
Ringsysteme
den
Aufhebung
sterisch und elektronisch
Pyrimidinen sowie
zusätzlich
die
ungünstiger
Wiederherstellung
Aufhebung
der
Thymindimeren
durch
zur
Einleitung
zweier
des
Ringspannung
Cyclobutanringes.
Mechanismus der
Schema 3.
ET
=
Elektronentransfer,
RET
=
Photoreaktivierung
von
Resonanz-Energietransfer,
ERT
=
DNA-Photolyasen.
Elektronenrücktransfer.
Typ
II
N
Wie bereits
angesprochen,
Pyrimidindimers
möglich.
das
ist eine
sowohl thermisch als auch
Man könnte einwenden, dass ein
Symmetrieverbot
die
entsprechenden
überwunden
verlaufende
pericyclische
photochemisch mit
Enzym durchaus
werden
Ansprüche
in der
Lage wäre,
eines solchen Vorhabens
Aktivierungsenergien
können.
Aus
15
sogar
Reversion des
Licht über 250
der thermischen Reversion des neutralen Dimers
Anscheinend sind die kinetischen
dass
synchron
von
thermodynamischer
^O
nm
nicht
sich über
hinwegzusetzen.
jedoch
einem
so
Enzym
Sicht
weist
hoch,
nicht
ein
1.
Einleitung
(AH°
Elektronentransfer auf das Dimer keinen entscheidenden Vorteil auf
mol"1
für
unverbrückte
schafft
Molekülorbitaltheorie,
verändertes Szenario
Radikalanion
ein
Steigerung
Cycloreversion
der
(siehe
Abfolge
von
deuterierten
ein
völlig
Elektron besetzt im Dimer-
(siehe 1.6.3/4). Dies führt nicht
der
Reaktion
1.6.5)
und
allem
vor
der
zu
(nach
exergonischer
eine
zwar
Eine solche
Vorschlag
Reaktionsabfolge
Cyclobutandimeren
der
Reduktive Reversion des
[156-158]
Cyclobutanringes
16
in
die
der
synchron
noch
Schema 4
enzymatischen
wird auch durch
Untersuchung
und
zeitaufgelöste
durch
enzymatischen Spaltungsreaktion [149]
konzertierten Reaktionsablauf.
einer
als die des
immer
[135].
für den Ablauf der
ist
Abnahme
nicht
schrittweisen,
dadurch
nur zu
Schätzungen
einer dramatischen
nunmehr
ermöghcht
14 nach 18 als
Absorptionsspektroskopie
Schema 4.
übertragene
aber kinetisch erleichterte thermische Reversion
Cyclobutanring-Spaltung.
an
aufweist
Exergonizität
Cycloreversion
symmetrieverbotene,
die
Pyrimidinen
[135]), sondern
Aktivierungsenergie
zeigt
Flavin
des Dimer-Radikalanions etwa 7 kcal mol"1
neutralen Dimers
verlaufenden
vom
die
man
Einelektronen-Übertragung jedoch
die
Das
[129].
Betrachtet
[155]).
-26 kcal
Molekülorbital, das im Cyclobutanring antibindenden Charakter
zwischen den beiden
leichten
Dimer-Radikalanionen
=
Thymidindimeren
unterstützt.
über einen nicht
synchronen,
1.
5) Elektronenrücktransfer auf den
erfolgter Spaltung
wieder auf das Flavin zurück
überschüssige Elektron
wird das
Nach
Kofaktor.
ersten
übertragen.
Einleitung
des Dimers
Damit ist der
katalytische Zyklus abgeschlossen.
Zusammenfassend kann
das
man
Enzyme
der
ungeklärt
forschen
und rein
So wurden
[159].
zu
grosse
Sequenzhomologien zu
haben
gezeigt,
dass diese
den
Enzyme
beschriebenen Mechanismus sind nach
Kapitel generell
spekulativ.
Gebiet
Es
vor
aber noch weitere Gründe,
gibt
einigen
Jahren
nicht
nur
haben
Photolyasen
verwandt sein könnten [161].
evolutionär denselben
[160], sondern wohl auch
Unter ihnen befinden sich weitere
aus
(6-4)-Photolyasen genannt.
Bestrahlung
verursachte
Cyclobutandimere [50].
[163]
DNA-Helix
Photoprodukt
und
Hauptschäden
Sie verursachen
sind
enthaltenden
der
zu
wie die DNA-
weitläufige,
Oligonukleotide
deren
reparieren [162].
sind
DNA,
hochmutagen [164,
dieser
Ursprung
(6-4)-Photoprodukte,
165].
Die
Aufgabe
Sie werden
als weitere durch UV-
noch
strukturelle
Oligonukleotiden [166, 167]
Reparaturstudien [170, 171]
Jüngste Untersuchungen
spezielle DNA-Reparaturenzyme,
Die
gefährlicher
Synthese
Analogie
photochemisch
zu
den
induzierten
in der
(6-4)-
von
[168, 169] und
mit bisher isolierten
Enzymen [162,
Die
Spaltung
eines
reduzierten
zu
den
dieser Intermediate
Pyrimidincyclobutandimer-Photolyasen
Elektronentransfer
die
sowie Mutations-
Oxetan- oder Azetidin-Intermediaten revertiert werden.
in
als
Veränderungen
172-174] ergaben, dass während der Reparatur die (6-4)-Photoprodukte zunächst
könnte
die
mechanistischen Gründen eng mit den
ist, (6-4)-Photoprodukte wie 7 und 8 (Schema 1)
deshalb auch
auf diesem
spezifische Enzyme entdeckt,
aufweisen.
DNA-Photolyasen
Photolyasen
es
Prozess thermisch
Photolyasen
Viele Details des im letzten
vor
nichtsynchronen
ein Elektron auf
wird.
1.4.5 Verwandte
wie
Enzym photochemisch
wodurch dieses in einem
Pyrimidindimer überträgt,
gespalten
sagen, dass das
wiederum
durch
FAD-Chromophors
erfolgen.
Noch erstaunlicher sind
blauen
176]
Homologien
Photorezeptoren [160, 161].
der
DNA-Photolyasen
Die bisher isolierten
enthalten sowohl einen Folat- als auch einen
17
mit der Familie der
Enzyme dieser
Familie
[175,
Flavin-Chromophor [177, 178],
ein
1.
Einleitung
Klasse-I-Photolyasen.
Charakteristikum der
in der
Signaltransduktion.
Nach
Die blauen
Anregung
Photorezeptoren spielen
mit blauem Licht
regulieren
eine Rolle
sie Zellwachstum
[179], Blütezeiten [180], Phototropismus [181] und vermitteln Vorgänge im circadischen
Rhythmus [182-184],
und
zur
DNA-Reparatur befähigt [177, 185].
"Photolyase-Kofaktoren"
Auftreten der beiden
Energie-
sind aber nicht
Elektronentransferprozesse
der
gewünschten chemischen Signale umwandeln
1.5
Die Kofaktoren
ist
es
sehr wahrscheinlich, dass
Chromophore
das
blaue
Durch das
gekoppelte
Licht
in
die
könnten.
DNA-Photolyasen
der Klasse II
1.5.1 Das Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD)
a) Nomenklatur
Die Nomenklatur
von
Flavinderivaten und -kofaktoren ist
(Abb. 6).
Riboflavin besteht
gelb) [186]
und der reduzierten Form
(ADP) ergibt
aus
dem
von
Trivialnamen
geprägt
gelb gefärbten 7,8-Dimethylisoalloxazin (flavus
von
D-Ribose.
Veresterung
mit
Adenosindiphosphat
FAD.
r
c
'n
HO
HO
CO
X
=
P
<
P
ii
ii
o
o
'c?
OH OH
\w
Lumiflavin
Riboflavin
(Vitamin B2)
Flavin-monophosphat
Flavin-adenin-dinukleotid
Abb. 6. Nomenklatur und
Nummerierung des Flavin-Adenin-dinukleotids (FAD) und seiner Derivate.
18
=
Einleitung
1.
des in der
Aufgrund
Biosynthese
Riboflavin auftretenden Pteridin-Vorläufers
von
6,7-Dimethyl-8-ribityl-lumazin [187] gebraucht
Chemical Abstracts
Dimethyl-10-ribityl-benzo[G]pteridine-2,4-(3H,10H)-dion
Vitamin
von
die Kondensation
von
oder
dihalogenierten
anschliessender
abgeänderten
Barbitursäuren.
mit
Umsetzung
Kondensationsreaktion genannt.
Behandlung
Flavinsynthese
nach Kuhn
korrekten
Namen
für
[186] und
aromatischen o-Diaminen mit Alloxan in
bedient sich in einer etwas
durch
7,8-
Flavinen
Die Schlüsselreaktion bei der
mono-
Namen
B2.
b) Synthese
[189]
als
den
mit
NaN02
saurer
Form der Kondensation
Die
o-Diazotiemng
Barbitursäure
Karrer
[188] ist
Lösung.
Tischler
Anilinderivaten und
von
wird
[190]
Diaminen mit
von
Tischler-
auch
Mit 6-Chloruracil substituierte Anilinderivate können
in Flavin-N-oxide umgesetzt
Dithionit und anschliessende Oxidation mit
02 ergibt
Reduktion mit
werden.
Flavinderivate in hohen Ausbeuten
Auch 5-Desazaflavine können in einem Schritt durch Kondensation
[191, 192].
substituierten Aminouracilen mit
o-Halogenbenzaldehyden nach
Yoneda
von
6-
dargestellt
werden
Flavoproteinen
bei der
[193].
c)
Das
Flavin-Redoxsystem
Der Flavin-Kofaktor ist ein sehr
Katalyse
von
vielseitiges Werkzeug
verschiedensten Elektronentransfer-Reaktionen
von
entweder einzeln oder simultan zwei Elektronen aufnehmen oder
H"
Transferreaktionen).
kinetisch
vollständig
Verbindungen,
Spezies.
d. h. in
abgeben (vgl.
Die Redoxreaktionen des Flavins sind
reversibel.
jedem
Darüberhinaus
Redoxzustand
gibt
es
sind
e", H' oder
thermodynamisch
freie
Flavine
und
amphotere
neutrale, kationische und anionische
Demnach werden die Redoxreaktionen des Flavins stark
verwendeten
Flavine können
[194-197].
pH-Wert
vom
Lösung beeinflusst. Dieses einzigartige Redoxsystem
ist
in
der
Schema
5
dargestellt.
Das oxidierte Flavin
neutralen Form
(Flox)
N(3), während die
basischen
vor.
Stelle
Bedingungen
sauren
Mit einem
pKa
bei
pH-Werten
von etwa
zwischen 0 und 10 in seiner
10 dissoziiert das Proton
N(l) die höchste Basizität aufweist [198].
kann
trizyklischen Ringsystems
200]. Unter
(Flavochinon) liegt
es vor
und
Bedingungen
zur
allem bei N(3)-substituierten Flavinen
Abspaltung
von
ist der aromatische
19
an
Bei
zur
der Stelle
sehr
Öffnung des
Harnstoffderivaten kommen
Isoalloxazinring jedoch
stark
[199,
sehr stabil.
1.
Einleitung
Durch Aufnahme eines Elektrons erhält
Im neutralen Molekül
(Flavosemichinon).
N(5)
und nicht
verschiedene
an
der Stelle
unterschiedlich
Flavinradikale
(F1H)
nicht mehr als 2% dieser
Schema 5. Das
(Fl")
Strukturen
zum
Ausdruck kommt
Flavinradikal
Proton
an
der Stelle
Lösungsmittels
existieren
des
Flavinradikals,
[202].
Die neutralen
in
was
("blauen")
zeichnen sich durch ihre hohe Stabilität aus, trotzdem lässt sich in
wässrigen Lösungen aufgrund
Flavinradikale
(F1H) befindet sich das
mesomere
gefärbten Spezies
"halbreduzierte"
das
Je nach Polarität des
N(l) [201].
und
tautomere
man
ist
Disproportionierungstendenz (siehe unten)
einer starken
Spezies
hingegen
nachweisen
[203, 204]. Die anionische ("rote")
Form der
relativ instabil [205].
Redoxsystem amphoterer Flavinderivate.
R
R
R
H
rx/e
XßxX^XCC^^
,NH
o
FUH+
FIQ
ox
e0,H®
R
R
l
N^
^NL ^O
pKa
=
2.3
I
NL
^NL
,0
w
8.3
-
NH
O,
FIH
0
Fl
e0,H@
?
R
H
H
N-
'NY°
pKa
=
N^
6.3
^n9^.o
~
N'—NH
H
FlredH3+
Im
O
FlredH2
Gegensatz
Flavochinon
zum
wird
F'redH
das
vollständig
reduzierte
Flavin
(Flavohydrochinon)
zunächst
die Stelle
physiologischen Bedingungen deprotoniert vorliegen (FlredH") [198].
Auch
im
N(l)
voll
unter
reduzierten
biologischer Bedeutung
an
der Stelle
Zustand
sein könnten.
N(5) protoniert.
existieren
mehrere
Flavohydrochinone
20
Mit einem
tautomere
pKa
von
Formen,
6.3 kann
die
von
sind gute Reduktionsmittel und
1.
können die beiden Elektronen einzeln oder
gemeinsam abgeben [206].
Komplexe
Redoxreaktion über kovalente Addukte oder
Sauerstoff [207].
[208,
der
erfolgt
Reduktion
Es wird angenommen, dass das reduzierte Flavin nicht eine
sondern
209],
bei
wie
Oft
Einleitung
eine
der
in
geknickte
N(5)-N( 10)-Achse
Struktur
die
von
planare
{butterfly-
Konformation) besitzt [210, 211]. Ein voll durchkonjugiertes, planares Flavohydrochinon
hätte 20 7C-Elektronen und wäre damit antiaromatisch und elektronenreich.
könnten
konformationellen
Die
Stellung
FMN
Änderungen regulieren
Redoxpotentiale
beträgt
das
Redoxpotential
(gemessen
vs.
(E°(FlH/FlredH2)
=
-170
mV)
Da
mV).
Elektronenabgabe ausgehend
Eine
-240
vom
-50 bis -400 mV ab
Redoxpotential
negativer
dies
die
dem
man
Gleichung (1) zeigt
(1)
Man
geht
Katalysetätigkeit
(FlH'/FlredH2)
diese
2 FHT
sich
als
auch
Flox
davon
ein
rasch
+
aus,
solcher
nach Art und
Für
[214, 215].
bei
pH
das
für
des
7 etwa
-
den
einstellenden
von
des ersten
zweiten
Elektrons
Fall
umgekehrten
man
der
bei Flavinderivaten
Elektronenübertragung.
Gleichgewicht
reduzierten Formen des Flavins
Disproportionierung
=
H20
je
Übertragung
für die
Flavohydrochinon gilt, spricht
Flavinradikalen und den oxidierten bzw.
d) Die
decken bereits
einem oberen und einem unteren Shuttle der schrittweisen
Beobachtung,
Kontrolle
Die Aufnahme der einzelnen Elektronen lässt sich
Dabei ist das
=
von
H20
für zwei-Elektronen Reduktion in
SHE) [216].
(E°(F10X/F1H)
Elektrons
durch
[212, 213].
freien Flavinderivaten in
von
elektrochemisch auflösen.
von
Flavin-Kofaktors
der Substituenten einen breiten Bereich
200 mV
oft
des
Redoxpotential
das
Flavoenzyme
zwischen
zuschreibt.
Flavinradikalen.
FlredH2
dass
sämtliche
bekannte
Einelektronentransfer eine Rolle
für die Redoxaktivitäten
Flavoproteine,
spielt,
nur
den
bei
deren
Shuttle
unteren
gebrauchen [217].
Photochemie der Flavine
Die
und 270
Absorptionsspektren
zwei
nm
langwelligen
(Flox) zeigen
neben zwei Banden bei 220
weitere, längerwellige Maxima bei 370 und 450
nm
Banden weisen relativ hohe Extinktionskoeffizienten auf (e
und werden 71-71*
den ersten
der Flavochinone
Übergängen zugeschrieben. Anregung
angeregten Singlet-Zustand
Fluoreszenz bei etwa 520
nm
^Fl^),
bei diesen
[218].
~
Die beiden
10000
M'cm"1)
Wellenlängen ergibt
der
normalerweise sehr
schnell
relaxiert oder durch
intersystem crossing
in den ersten
21
durch
1.
Einleitung
(3F10X) übergeht.
angeregten Triplet-Zustand
Flavochinone in der
kann
Lage,
eine Reihe
Gerade
Photoreaktionen
von
Amine
Purine,
etc.),
Photodehydrogenierung,
Photoadditionen
Photoelektronentransfer,
Photosensibilisierung sonstiger
Reaktionen durch
Charakteristisch für neutrale Flavinradikale
500 und 560
durch
Photodealkylierung,
intramolekularer
Photoreduktion
Flavohydrochinonen
und
Art)
Energietransfer einteilen.
sind
(F1H)
Absorptionsmaxima
da sie schon in ihrem Grundzustand sehr reaktiv sind.
spärlich beschrieben,
oft
(Aminosäuren,
340,
um
Photoreaktionen der Flavosemichinone sind in der Literatur
[222, 223].
nm
und
(inter-
sind
Grob
einzugehen [219-221].
diese in Photoreduktionen durch externe Elektronendonoren
man
jedoch
diesem Zustand heraus
aus
der
und
erzeugt
oder
Flavochinone
gehen
Sie werden
Photooxidation
durch
von
(Disproportionierung,
Folgereaktionen
Elektronentransfer, Radikaladditionen) ein.
Flavohydrochinone (FlredH2)
von
370 bis 500
nicht
optischen Eigenschaften
Im Hinblick auf die
reduzierten,
Einfluss auf das
des reduzierten Flavins
DNA-Photolyasen
Flavinen
deprotonierten
Flavohydrochinone
nur
frei in
im
Fluoreszenz-Lebensdauer
%
Deprotonierte Flavohydrochinone
(x
Photolyase
eine Fluoreszenz bei 505
durch
eine
0.8
Pyrimidindimers
[144, 145].
[230].
des
Photolyse
Lebensdauer
Nach etwa 40
[230, 231].
des
nach
nm
(x
=
reduzierten
Enzym führt
100 ps,
ns
FlredH2
einiger
neuesten
zu
einer
1.2
Eigenschaften
untersucht.
sehr
[225].
Neutrale
Daraus
kurzlebig
Picosekunden
von
geht
ist und eine
hegt [226].
Messungen jedoch
schwach
zeigt gebunden
an
die
ns) [144, 228], womöglich verstärkt
Isoalloxazin-Rings.
Fluoreszenzlöschung (t
Bindung
=
0.16
ns)
eines
von
90%
daraus, dass die Reparatur der Dimere über den angeregten
FlredH" ergab
etwa
von
freiem
Bereich
reduzierten, deprotonierten
von
Absorptionsbande
war
das
Man schloss
Singlet-Zustand
Flash
an
Zustand
Der reduzierte Kofaktor FADH"
ns) [227].
Planarisierung
wurden insbesondere die
von
sondern auch
[224].
angeregten
im
sind
fluoreszent
~
Oxidationspotential,
bei RT sind nicht fluoreszent
Lösung
hervor, dass der angeregte Singlet Zustand
mögliche
langgezogene Endabsorption
Planarität des Moleküls, Substituenten- und
Protonierungsgrad,
nm aus.
Lösungsmitteleffekte nehmen
auf die
zeichnen sich durch eine
eine transiente
die dem angeregten
wurde bei
bei etwa 700
Flavins
nm
('FADH") erfolgt [229].
Absorption
bei 490
nm
mit einer
Singlet 'Fl^H" zugeordnet
biphotonischer Anregung
entdeckt, die bei der Zugabe
Laser-
wurde
ausserdem eine breite
von
N20
nicht
zu
sehen
Demnach wurde diese Bande durch Elektronenausstoss des angeregten,
reduzierten Flavins verursacht
(Gleichung
2 und
22
3).
1.
(2)
Fl^H'
+
hv^HedH-
(3)
lF\TeßT
+
hv
Untersuchung
Durch die
(x
etwa -2.8 V
von
e"(aq)
+
N20-gesättigten Lösungen
Das
lis) [232].
längerlebige Triplet 3FlredH" wurde
ein
und
Achse
N(5)-N(10)
konnte das Flavin in seinem
380 und 600
Einelektronen-Oxidationspotential
(vs SHE) geschätzt [233] und stellt damit ein
dar. Für das
der
1
~
FHT
3FlredH" mit Absorptionsmaxima bei
angeregten Triplet-Zustand
werden
-*
Einleitung
etwas
enorm
von
nm
detektiert
^l^H"
wird auf
starkes Reduktionsmittel
ein verstärkter Knick des Moleküls
schwächeres
Oxidationspotential (>
entlang
-2.3
V)
vorgeschlagen [234].
1.5.2 Das 8-Hvdroxv-5-desazaflavin (8-HDF)
a)
Das
Desazaflavin-Redoxsystem
Literatur
der
In
Nikotinamiden
und
werden
nicht
5-Desazaflavine
Flavinen
von
Nikotinamiden wird ihre Redoxchemie
h.
von
"Zweielektronen"-Reaktionen
von
Dehydrogenierung
(dFl0X) [239]
von
desazaflavinderivat, spielt
wichtige
und andere
Desazaflavins, nämlich die Stelle
Angriffs [243],
Schema 6
das
5-Desazaflavine einen
Zustand
gehen
die
-Abgabe bestimmt,
Dazu
cc-Ketosäuren
zu
amphoteren
Methanogenese
C(5),
an.
Im
Konjugation
(dFl")
durch das
die
1,5-
8-Hydroxy-5-
der Archebakterien
Gegensatz
von
5-Desazaflavinen.
das
elektrophilste
zu
den Flavinen
wie die
Im oxidierten
Protonierungsdes Flavins
und
(Schema
kann
5)
nicht
erklärt
und
an
sp3-hybridisierte
der
Stelle
C(5)
Die sehr
Vergleich
Protonierung
erfolgen,
C-Atom unterbrochen wäre.
23
im voll reduzierten
Deprotonierungsreaktionen
(Schema 5) ein.
werden.
können.
Wie Flavine besitzen auch
ablaufenden Einelektronentransfer-Reaktionen können durch einen
Radikalanions
ein
Koenzym F420,
Nukleophile (RH) greifen
Charakter.
Desazaflavine
Redoxsystem
B.
z.
Aminosäuren durch
photochemischer Anregung weiterreagieren
Redoxsystem
vergleichbaren pKa-Werten
Flavin
zählen
d.
C(5)-Addukte (dFlredRH) als Folgeprodukte des nukleophilen
die erst nach
zeigt
bei
Wie
235-238].
und
von
Ketonen durch oxidierte Desazaflavine
Rolle in der
Zentrum des
oft stabile
Analoge
5-Desazaflavinen werden auch in biochemischen
Hydridionen ("H"")
man
zu
von
[241, 242].
beobachtet
chemische
[205,
6).
grössere Bedeutung eingeräumt.
eine
als
Hydrid-Aufnahme
(Schema
Aminierung
Dihydrodesazaflavine (dFlredH2) [240].
Prozessen immer
beschrieben
sekundären Alkoholen
oder die reduktive
häufig
da
des
die
mit
langsam
mit
dem
instabilen
trizyklische
Vielmehr
erfolgt
die
1.
Einleitung
Protonierung
der
an
Stelle
beitragen
Desazaflavinradikals
Erst bei verschärften
nicht
C(5)-Addukte
stabilen
C(5)-C(5')-Dimeren
N(5)
Stickstoffatoms
Radikals
des Radikals
siehe
Folgereaktion
kommt
Als
[245].
Spin-Delokalisierung
und
konnten
unten)
es
(dFlH)
Bildung
zur
Instabilität
Die
die
zeigt
(dFlH)
Desazaflavins
des
Lichtanregung,
des
Notwendigkeit
von
des
des Semichinon-
Stabilisierung
in Flavinen.
(F1H)
Schema 6. Das
für die
Stabilisierung
zur
Vermeidung
(HdFl-5,5'-dFlH)
5-Desazaflavinradikalen
halbreduzierten
unter
B.
Bedingungen (z.
Desazaflavinradikale detektiert werden [244].
von
entscheidend
Nichthydrid-Redoxreaktionen
kann.
laufen deshalb meist über kovalente
ab.
die
N(l),
Desazaflavin-Redoxsystem.
?
H
N^
,NL
H®,hv
JO
dFlredH2
-*-
.©
+
R
?
H
l
NH
o
-*-
O
HN
H
R
HdFI-5,5'-dFIH
R
H
rx^= fr
H
H
H
o
dFlredH"
Die
Wechselwirkungen
ausschliesslich auf ihre
(dFlredH2)
sind
Redoxpotential
-300 mV
wurde
in
der
zwischen
Redoxeigenschaften
Lage,
hin untersucht.
(Flox)
zu
und
hingegen
-200 mV bei
Flavinen).
auf etwa -800 mV
(vgl.
Das
24
ö
H
Flavinen
reduzieren
Redoxpotential
-240 mV bei
NH
wurden
l,5-Dihydro-5-desazaflavine
für Zweielektronen-Aufnahme durch 5-Desazaflavine
(vgl.
r
r
dFlredH2
Desazaflavinen
Flavochinone
N. ^N^O
Flavinen)
[243,
beträgt
in
246].
Das
H20
etwa
für Einelektronenaufnahme
bestimmt
[205].
Einleitung
1.
Substituenten
und
physikalischen
Elektronendonoren
Redoxpotential
der
an
8
Stelle
dieser
Stelle, wie
5-Desazaflavinen
von
zu
z.
eine
B.
negativeren
das relativ schwer
(8-0~-dFl0X),
Man nimmt an, dass
F420-Redoxenzyme (F420
Kofaktor deshalb in seiner
protonierten
Schema 7. Die
des
Deprotonierung
(E°(HDF)
Werten
zu
~
auf
6) ergibt
verschieben das
reduzieren ist
-350
~
ein
mV) [242,
elektronenreiches,
(Schema 7) [250].
8-Hydroxy-5-desazaflavinderivat)
ist ein
Form halten müssen
die
haben.
Desazaflavine
Hydroxy-Gruppe,
247-249]. Die Deprotonierung der C(8)OH Gruppe (pKa
"chinoides" Anion
Auswirkungen
der
Eigenschaften
chemischen
an
beträchtliche
können
den
[236].
8-Hydroxy-5-desazaflavins (8-OH-dFl0X).
O
8-OH-dFlox
8-0--dFlox
"hydroxy"-Form
b)
"quinoide"
Form
400
(e
Die Photochemie der Desazaflavine
5-Desazaflavine
einer
ausgeprägten
Substituenten
kommen
an
der Stelle 8
(A.max
~
470
von
nm
[251].
Verschiebungen
nm
Wie bereits erwähnt kann
der
einer
zu
als
Steigerung
420
nm,
e
Reaktionsverhalten im Grundzustand
Modell
in der Reaktivität dadurch
kompensiert
~
~
(3dFl0X)
zu
Quantenausbeute
40000
zu
einer
M^cm"1)
und
zeigen
von
wie die angeregten
Rehm und Weller [255, 256] wird der Unterschied
aufgehoben, indem
die höhere
die Desazaflavine
das
niedrigere Reduktionspotential
photochemische Anregungsenergie
im
Vergleich
des
zum
wird.
Die gut untersuchten Photoreduktionen des angeregten Desazaflavins
Zustand
durch
Substituenten
der
vergleichbare Einelektronentransfer-Reaktivität
[254]! Nachdem
Desazaflavins durch
Absorption (kmax
es
mit
und Fluoreszenzmaxima
Absorptions-
Elektronendonoren
der Maxima sowie
M^cm"1)
20000
~
nm) [242].
zum
im angeregten Zustand
Flavin
450
um
[253]. Die Deprotonierung der C(8)OH-Gruppe in 8-HDF führt
Im Unterschied
Flavine
um
allgemeinen führen
Im
Intensivierung
Fluoreszenz
zu
Verschiebungen
der Fluoreszenz
weiteren
Fluoreszenz
[252].
bathochromen
zeigen Absorptionsmaxima
mit Einelektronendonoren
[243, 245,
25
252,
im
Triplet-
257] führen jedoch fast
1.
Einleitung
ausschliesslich
zur
Bildung
im Fall des Flavins,
zur
des kovalenten 5,5'-Dimers
Bemerkungen
in
redoxinaktiven Form
deprotonierten,
l) bei "ungefährlichen" Wellenlängen (À,max
Energietransfer
Der
auf den
des "chinoiden"
1.6
420
als lichtsammelnden
(8-0"-dFl0X)
(e
~
8-HDF-Kofaktors,
um
einen effizienten Förster-
Modellsysteme
in
seinem
~
-2.3
V) [258]
zu
Photoreaktivierung
zur
zu
erreichen.
Singlet-Zustand
angeregten
negatives Redoxpotential (E*(FlredH7FlredH )
Pyrimidindimer (E(D/D'")
M4cm"
40000
nm) und die hohen Quantenausbeuten der
FAD-Kofaktors
des
hat ein ausreichend
ein Elektron auf das
~
8-HDF-Kofaktor
die den
reduzierten, deprotonierten FAD-Kofaktor (FlredH")
Flavin-Chromophor
('Fl^H")
DNA-Photolyase
Sie nützen die hohen Extinktionskoeffizienten
Chromophor verwenden.
(<3?f > 50%)
auf die
Bezug
bislang einzigen Enzyme,
sind die
DNA-Photolyasen
Fluoreszenz
nicht, wie
vollständig reduzierten Form (dFlredH2).
1.5.3 Zusammenfassende
scheinbar in seiner
und
(HdFl-5,5'-dFlH)
~
-2.8
V),
um
übertragen.
Pyrimidin¬
von
dimeren
Niedermolekulare
mechanistischen Details in
[259]. Auch der
durch
entworfen werden
von
ganz
konnte
[260, 261].
unterschiedlichen
Verständnis der
1.6.1
enzymatischen
in Schema 3 und 4
DNA-Photolyasen
Pyrimidindimerspaltung
Reversion der
durch Licht
die Dimere im
von
Untersuchungen
soll einen
und
Verbindungen
auf welchem
Es
Wellenlängen über
300
Wellenlängenbereich
Monomere sollte somit über einen
war
Aufklärung
von
Die
Umweg
über 300
nm
Chromophor
26
Frage
kleinen Modellen
Beiträge
zum
wurden.
Lösung
es
dem
Enzym gelingt,
der
Aktionsspektren
nicht in
an
wichtige
deshalb klar, dass direkte
nm
Photoreaktivierung
Überblick geben, wie mit Hilfe
DNA-Photolyasen geliefert
auszulösen.
nm.
der
Mechanismus der
mit Photosensibilisatoren frei in
Pyrimidindimere
von
Kapitel
Methoden
gerätselt,
haben ihre Maxima über 400
allem mittels
Dieses
bei
Reaktionsabläufen einen sehr hohen Stellenwert
vorgeschlagene
vor
Reparaturfunktion
Schon früh wurde
haben
Modellverbindungen
DNA-Photolyasen
Anregung
kommen konnte
nicht absorbieren.
vermittelt werden.
die
Die
der Dimere
[262, 263], da
Spaltung
in die
Zudem können sowohl
1.
ausgeschlossen werden,
Dimer
der
Chromophore (>
hohen
Triplet-Triplet-Energietransfer
als auch
Singlet-Singlet-
350
energetisch aufgrund
da dies
oder
Acetophenon
Ben-Hur und Rosenthal konnten
wie
nicht
bereits
jedoch
zur
neben
die
Wässrige Lösungen,
revertieren.
Pyrimidindimeren (Abb. 7) Benzo-, Naphtoenthielten, führten nach Bestrahlung
Ausbeuten
an
von
der 70er-Jahre
cis-syn-
19-24
oder
(>
300
nm)
zu
Elad
und
Photosensibilisatoren in
[265]
organischen Lösungsmitteln
Trinitrobenzol
"Monomerisierung"
auftretenden
erste Hinweis für einen
den
erweiterten
Tetracyanoethylen,
Sensibilisatoren
u.
waren
der
in
monomerisieren
Die
a..
Kreis
photoreaktivierenden
der
Verbindungen
wie
Charakterisierung
des
um
Verlauf der Reaktion
sogar
Übergangsmetallionen
Lage,
Cyclobutandimere
[266-269].
Auffällig
zwischen
Komplexbildung
unwahrscheinlich,
da
Chloranil,
bei
[265].
der
der
war
Verblüffenderweise
(Abb. 7)
mit diesen
werden.
Cyclobutanreversion gleichzeitig
UV-,
IR-
auch
und
der
Fem in Kaliumferricyanid (26)
wie
mit
hohen
Quantenausbeuten
zu
zudem, dass die besten Photosensibilisatoren
war
die
Sensibilisatoren
temperaturabhängige Messungen
dafür
quantitativen
Nebenproduktes Bis-5,5'-(l,3-dimethyl)uracil
nichtsynchronen
gespalten
In der Tat
der
(Schema 8) [264]
oft nahezu
konnten die normalerweise unreaktiven anri-konstimierten Dimere
8)
zu
Pyrimidinmonomeren.
S as s on
(Schema
(Abb. 7)
trans-syn-konfigunerte-n
oder Anthrachinone wie 25
Licht
eindeutig
Lage sind, Pyrimidindimere
Dimethylthymins
Derivate des
Cyclobutan-dimerisierten
Dimerspaltung.
Anfang
dass andere chemische Photosensibilisatoren in der
die
langwelligen Absorption
nm) nicht möglich ist. Zudem führten Sensibilisatoren mit relativ
Tripletenergien wie Aceton
zeigen,
der
auf das
Chromophor
diesem
von
Einleitung
besten
und
Oxidationsmittel
Dimer
in
ihren
waren.
Eine
Grundzuständen
NMR-spektroskopische Untersuchungen
Reaktionsgeschwindigkeit [265]
ist
sowie
keinerlei Indizien
zeigten.
Aufgrund
Komplexes
zur
Beobachtungen
wurde
die
Bildung
eines
Charge-transfer-
zwischen dem angeregten Photosensibilisator und dem Dimer
postuliert [265].
könnte
dieser
Ein Elektronentransfer
Auslösung
der
Dimerspaltung
vom
Dimer auf den angeregten Sensibilisator
führen
27
(Exciplex)
[270].
Unterstützt wurde diese These
1.
Einleitung
auch durch relativ
schwache Intensitäten der Molekülionen
Pyrimidindimeren
von
in
massenspektrometrischen Untersuchungen [271].
Herauszuheben sind jüngste
mit Hilfe
von
direkt
der DNA
an
Untersuchungen
katalytischen Mengen
an
von
interkalierenden
bis
zu
Mitarbeitern, die
Rhodiumkomplexen Thymindimere
Da dies auch bei einem kovalent
reparieren konnten [272-274].
Oligonukleotid gebundenen Komplex
/. K. Barton und
einem Abstand
beobachtet werden konnte, wurde ein Elektronentransfer
vom
von
36
Â
zum
an
das
Dimer
Dimer durch den DNA
Basenpaar-stacÄ; auf den Metallointerkalator postuliert.
cis-syn
trans-syn
19
20
N(3),N(3')trimethylenverbrückt
N(1),N(1')-
trimethylenverbrückt
23
Abb.
7.
Die
vier
möglichen
Cyclobutandimers (19-22).
CM-ivn-Dimere 23 und 24
Etwa
von
zur
Lamola
zu
Konstitutions-
Zusätzlich sind die
und
Konfigurationsisomeren
synthetisch
leichter erhältlichen
DimethylthyminTrimethylen-verbrückten
des
dargestellt.
selben Zeit wie die Studien
ähnlichen
den Chinonen auch
jedoch keine
24
von
Elad oder Rosenthal kam die
Ergebnissen [275, 276].
Naphthoimidazole
zur
Es konnte
gezeigt werden,
Dimerspaltung befähigt
Aktivität.
28
Arbeitsgruppe
sind.
dass neben
Flavine
zeigten
1.
Methoxyindol (21)
der
Dimerspaltung
Radikalische
Schema 8.
2-Anthrachinonsulfonat
Photosensibilisatoren
und
Einleitung
der
Cyclobutandimere von Thyminderivaten am Beispiel
(19) und Hexacyanoferrat (20) {oxidativ) bzw.
5-
Dimethylanilin (22) {reduktiv).
Reduktionsmittel
HsCO,
Zudem
von
bestätigte
generiertes
=
nicht
Cyclobutandimeren
0.05.
nur
herbeigeführt
Elektronendonoren
<D
Lamola ältere
Elektronenakzeptoren,
durch
werden
konnte.
solvatisiertes Elektron monomerisiert
Allein
Absorptions-Maximum
transiente
Wurde das
Radikalspezies bei
Einzig Radiolyse
in
77 K
nur
des
Dimer-Radikalanion
ergaben,
als
durch
dass selbst bei diesen
von
zugeordnet
von
Pulsradiolyse
29
von
Mikrosekunden nach dem
nm
ein
Pyrimidinmonomer zugeordnet
durch
war
die
Pulsradiolyse generierten
Temperaturen ds-yyn-konfigurierte
[279, 280].
1,3-Dimethyluracil ergab Signale,
werden könnten.
durch
mit einer Effizienz
Radikalanionen der Monomere sichtbar werden
trans-syn-Dimexs
auch
N20-gesättigter Lösung durchgeführt,
nicht sichtbar. Neuere EPR Studien
Spezies
Pyrimidindimere
Experiment
sondern
Spaltung
der solvatisierten Elektronen bei etwa 700
Maximum bei 440 nm, das dem Einelektronen-reduzierten
wurde [233].
ein
Pyrimidindimere
Zeitaufgelöste Absorptionsspektroskopie zeigt einige
Puls neben dem
in welchen die
Untersuchungen [277, 278],
die dem
1.
Einleitung
die Dimere
von
(«J>
=
Die starke
0.07).
Pyrimidindimeren wurde
Dimer erklärt
Derivate des
spalten
Mit einer ähnlichen Effizienz
mit
wie 27
Tryptophans
Elektronentransferprozessen
vom
(Schema 8)
bei Anwesenheit
Indolring
auf das
[281].
Dimethylthymindimeren
Elektronendonor
in
(<3>
Oxidationspotentiale
Aus
dem
Abhängigkeit
in
im angeregten Zustand wurde das
Dimethylthymindimers
19 auf -2.2 V, das des
Der beachtliche Unterschied wurde
Effekten
im Fall des
(Abb. 8)
schwachen Donor-Effekt der
entsprechenden
Methylgruppen
ist das
des
ihrer
cis-syn-
20 auf -1.7 V bestimmt
ungünstigen
stereoelektronischen
Durch den
geschätzte Reduktionspotential
der
positiver [284].
19"~
=
einiger
Stärke
cw-syn-Dimer-Radikalanions zugeschrieben.
Uracildimere etwa 0.1 V
Ered
der
des
Cytosindimere
Reduktionspotential
trans-syn-T>imers
[258, 284, 285].
einem starken
Fluoreszenzlöschung
an
von
Absorption
Uracil- und
Lage,
Ausmass
Pyrimidindimere
transiente
eine
DMA ist auch in der
[283].
durch
Elektronendonoren
0.4) zeigte die Monomerisierung
Laserspektroskopie zeigte
[282].
spalten
=
Gegenwart von Dimethylanilin (28) (Schema 8),
Dimethylanilin-Radikalkations.
zu
des
Fluoreszenzlöschung
Erheblich höhere Quantenausbeuten
effizient
Tryptophans
20*
-2.20 V
Ered
=
-1.73 V
Abb. 8. Stereoelektronische
Wechselwirkung zwischen dem Dipol der C(4)=0 Bindung und der Ladung der
C(4')-0 Bindung der Radikalanionen des cis-syn- (19) und des trans-syn- (20) konfigurierten
Dimethylthymindimers. Da im Fall des trans-syn-Dimeis 20 die negativen Ladungen weiter voneinander
reduzierten
entfernt sind, ist das Dimer in dieser
Aufgrund
Generation
der
Konfiguration
Ergebnisse
(Schema 8) lag
Pyrimidin-Cyclobutandimeren
von
die
leichter
zu
reduzieren.
Untersuchungen
an
Vermutung nahe,
diesen
dass
Modellsystemen
die
der ersten
Photoreaktivierung
von
über einen oxidativen oder reduktiven Radikalmechanismus
verlaufen könnte.
30
1.
Einleitung
1.6.2 Hinweise für die Existenz eines Radikalmechanismus
{chemically induced dynamic nuclear polarisation)
Der CIDNP-Effekt
Kopplung
des elektronischen
Radikale.
Ein
Triplet
Triplet-Radikalpaar
werden
Wechselwirkungen
kann schwer
Zustand des
sowohl
der beiden
ausgelöst.
Interaktionen
Daher
Kernspinzuständen.
sorting.
Radikale als
Sekunden
Man
erfolgt,
durch
von
können
von
auch durch
Polarisation des
NMR-Spektren
der
dazu
Pyrimidindimeren
wie 23
[288].
Radikalkations
[289].
von
Lösungen
nur
eine
ähnliche
(Abb. 7)
Die
mit anderen
Radikalpaare
oder
in der
mit
nuclear
spin
Grössenordnung
von
von
(je nachdem,
welcher
des
Kernspin
2-Anthrachinonsulfonat 19 und
von
Das Fehlen
für die
eines
Spaltprodukte,
CIDNP-Effekts
also für
für die
Kernspin-Polarisation
Experimente
verbrückten
folgt
anschliessender
Cyclisierung
die
stattfindet und
mit
von
aufgelöst
des
werden kann.
also die Detektion des Dimer-
CIDNP-Effekten des Dimers bei
neue
der
Der
schnellen
Polarisation
polarisierten
31
Bestrahlungen
Erkenntnis, nämlich die Reversibilität des
Systemen.
Generierung
zum
Folgereaktionen
N(l),N(l')-trimethylenverbrückten
Trimethylenbrücke ermöglicht
Radikalkations
durch
direkte Hinweise auf das Vorhandensein eines Dimer-
Das Auftreten
in
Radikalpaare
schnelle, irreversible Spaltungsreaktion (Lebensdauer des
verbrückten Monomeren brachte eine
Spaltungsprozesses
es
10"9 s) und eine schwache /z;y;?er/zne~Wechselwirkung des Dimer-
ergaben
Radikalkations
Elektxon-Zeeman-
diamagnetischen Folgeprodukte
oder Emission
Sensibilisator-Monomer-Radikalpaares
Gegensatz
gibt
Kernspins
polarisierten Kernspins
bestrahlten
Radikalkations erklärt, sodass
Im
in den
dass Radikale im Verlauf der Reaktion auftraten.
Dimere wurde durch eine sehr
entstandenen
vom
Elektron-Kern-/ry/?er/mß-
Mit anderen Worten
Dimethylthyminmonomere [286, 287].
<
dieser
Übergang
Übergänge
den
die
Dimethylthymindimeren (Abb. 7) ergaben verstärkte Signale
Dimer-Radikalkations
Kernspins
Triplet-zu-Singlet Ubergangswahrschemlichkeit
gesteigerte Absorption
Spektren
in
die schneller rekombinieren als
spricht
überpopuliert wird) beweisen,
CIDNP
die
hängt
Da die Relaxation solcher
Radikalpaares
die
mit den
rekombinieren, weil der
Unterschieden
von
der Kerne ab.
Spins
gewissen Kernspinzuständen,
einigen
Radikalpaares
eines
in den Grundzustand normalerweise elektronisch verboten ist.
Singlet-Zustand
vom
Spinzustandes
basiert auf der
im
Dimer [290].
Spaltung
des
Dimer-
Monomer-Radikalpaar
mit
1.
Einleitung
Auch bei
Bestrahlung
wie 27
Indolen
von
CIDNP-Effekte des Dimer-Radikalanions direkt
Studien
unverbrückten
von
und
dieselben
qualitativ
Sensibilisator brachten
beschriebenen oxidativen
Schema 9.
Mechanistischer
verbrücktem
6-Iodomethyl
verbrückten
nachgewiesen
Dimeren
Ergebnisse
konnten
Dimethyluracidimeren
und
CIDNP-
werden [291].
als
N-Acetyltryptophan
mit
Studien des im oben
wie die
Spaltungsprozesses [292].
Vorschlag
Uracildimer
DDQ-sensibilisierte Spaltung
für die
von
N(3),N(3')-Trimethylen-
(29).
I)
II
MeOOC
30
/
N
CT
^o
^^/
N'
Nhs
O
I
MeOOC
O^
N
MeOOC
MeOOC
MeOOC
MeOOC
J®
MeOOC
31
der
Chinon-sensibilisierten
Bindungsspaltung [293].
(k
>
zum
Als
Photodimer-Fragmentierung
hervorragende Radikalfallen
Radikalzentrum erwiesen, da deren
5xl09 s"1) [294].
Gegenwart
^O
I
I
^N' "O
Ein Beweis für die Existenz eines radikalischen Mechanismus
Stellung
N
HO
J
Blockade
/
I
von
Produktanalyse
DDQ zeigte
die
nach
Bestrahlung
Hauptprodukte
32
nach
haben sich C-I
Homolyse
durch
gelang
der
die
ersten
Bindungen
in
ß-
ein sehr schneller Prozess ist
der
Modellverbindung
30 und 31 in einem Verhältnis
29 in
von
etwa
1:1
Dieses
(Schema 9).
trapping-Experiment spricht
verlaufenden Mechanismus für die
1.6.3 Das
Fragmentation
gegen
Einleitung
einen
synchron
der Dimer-Radikalkationen.
Through-Bond Coupling-Konzept
Pac und Mitarbeiter
konnten
die
redox-photosensibilisierte Cycloreversion
Tetrahydrocyclobutaindenderivaten [295] erfolgreich
auf Pyrimidindimere
Dabei werden aromatische Kohlenwasserstoffe (z. B.
(Schema 10).
photochemisch angeregt und
Radikalkation ist in der
spalten.
auch
1.
mit Hilfe
von
/7-Dicyanobenzol
Lage, Pyrimidindimere
Die erstaunlich hohen
wie 19
Quantenausbeuten (O
>
übertragen [296]
Phenanthren
33 ionisiert.
und 20
Chloranil-sensibilisierte
(Abb. 7)
oxidativ
1) wurden durch das Auftreten
Experimente bestätigten
Zeitaufgelöste Absorptionsspektroskopie ergab,
298].
die
spalteten
wurde durch
schneller als
(Abb. 7) spalteten
am
dass
(Abb. 7)
als
völlig
Beobachtung,
Pyrimidindimere könnte
des
von
eine
eine
mit dem
des
der
zur
M'V1).
Die
Trans-syn-Dimtxe
Dimere wie 2 3
Aufstellung
through-bond
des
Im Falle der
syn-konstituierten
zwischen den Orbitalen der nichtbindenden
positiven Ladung
Bindungscharakters
im o-Orbital bewirken.
Dimeren
erklären.
ungünstige Verzerrung
cis-syn-Dixnex
verhindert eine maximale
Cyclobutanring
durch Abnahme der
Eine daraus
Dies könnte auch die schnellere oxidative
involvierten Orbitale
über den
resultierende
oder
des
der
Eine
für
Cyclobutanringes
durch eine
Delokalisierung
Monomerisierung
zusätzliche
die
C(6)-C(6')-
Verzerrung
könnte die treibende Kraft für eine schnelle
gegenüber c/s-syn-konfigurierten
Abstossung
erleichtert.
Pyrimidindimer.
Delokalisierung
Cyclobutanbindungsgerüstes
im
109
=
Das Radikal-Kation des Sensibilisators bildet
Wechselwirkung
Schwächung
Bindungsordnung
bereitstellen.
(kET
Elektronentransfer
N(l) und N(l') ("n-Orbitale") sowie dem bindenden Orbital a(C(6)-C(6'))
Cyclobutanrings
und damit eine
spielen
dass sich anri-konstituierte Dimere wie 21 und
unreaktiv erwiesen, führte
charge transfer-Kompl&x
Elektronen
von
schlechtesten.
coupling-Koxizepts [299-302] (Schema 10):
einen
der
cis-syn-Dixxiexz. N(l),N(r)-trimethylenverbrückte
Diese Resultate und die
22
polare Lösungsmitteln
zu
obigen Ergebnisse [297,
zwischen Sensibilisator und Dimer ein sehr schneller Prozess ist
Monomerisierung
32)
Das entstandene
Kettenreaktionen erklärt, die auch in weiter oben erwähnten Studien eine Rolle
könnten.
von
Ringöffnung
von
trans-syn-
Überlappung
durch sterisch
Verbrückung
positiven Ladung. Anri-Isomere
33
des
des
der
bedingte
Dimers
des Dimers
1.
Einleitung
würden in diesem
Konzept
durch das Fehlen des zweiten n-Orbitals
nur
eine sehr kleine
Ladungsdelokalisierung erfahren.
Schema 10.
Das
sensibilisierter
Through-Bond Coupling-Konzept
anhand des
Beispiels
Phenanthren/Dicyanobenzol
von
Dimerspaltung.
32
o
O
o
O
"N
j^KV
CT
r
"N
5'4' N3,
c
6
6
1|
i
NT.
O
I
19
O
O
o
in
>
O
II
-
^N^O
|U
I
N
r
0^Nd
©
o
o
I
I
o
O
~N'
*n'
0XJ
IX
N
I
1.6.4
Photosensibilisierung kovalenter Indol-Pyrimidindimer-Derivate
In
sich
Modellreaktionen, bei denen Dimer und Photosensibilisator in Lösung sind und
für
die
Monomerisierung
Reaktionsraten im
Um
^O
I
die
Vergleich
Abhängigkeit
zu
müssen,
enzymatischen
solcher
Exciplexbildungskonstanten
kovalent
zur
finden
wurden
Modelle
in
der
verknüpfte Systeme hergestellt [303] (Abb. 9).
34
Quantenausbeuten
Reaktion oft falsch
intermolekularen
vermeiden,
können
interpretiert
von
Ein
werden.
Komplex-
Arbeitsgmppe
weiterer
und
von
Vorteil
oder
Rose
von
1.
intramolekularen Modell Verbindungen wie 34 und 35 ist die
der
zu
bestrahlenden
und die
von
Untersuchungen
solcher
Spaltungseffizienz
eine
von
~
Die fast
0.05.
in
N20-gesättigten Lösungen
Die relativ
Vergleich
bewies
Enzym
zum
Prozesse eine grosse Rolle
zur
Detektion
Erklärung
Spaltung
von nur
wäre
des
der
spielen.
Spuren
an
Cyclobutanringes,
DNA-Photolyasen
zum
F/as/i-Photolyse
Dimerspaltung
der
Elektronentransfer
solcher
ladungsgetrennten
Modellverbindungen
Eine
führte
mögliche
des Moleküls
Zustandes
im
konkurrierende
Indol-Radikalkationen nach 0.7 fis [304].
des
Kollaps
dass
Indol-Dimer
effektive
niedrige Quantenausbeute
jedoch,
der
vollständige Auslöschung
Indolfluoreszenz in Anwesenheit des Dimers deutete auf sehr
Wechselwirkungen hin.
Verdünnung
ist.
Dimer-Indol-Systeme
<E>
zur
Assoziaten vermieden werden
photochemische Transparenz der Lösungen gegeben
Erste
ergaben
womit Kettenreaktionen
Lösung,
Möglichkeit
Einleitung
der
vor
d. h. Rückelektronentransfer auf das Indol-Radikalkation.
müssen also unter anderem dafür sorgen,
dass diese konkurrierenden
Reaktionen unterdrückt werden.
35
verknüpften Pyrimidindimer-Arylamine 34 und 35 als intramolekulare
lichtgetriebene, reduktive Dimerspaltung.
Strukturen der kovalent
Abb. 9.
Modellsysteme
für die
Auch Rose
stützte
erhöhte Labilität der
auf das
sich
auf
Molekülorbital-theoretische
Cyclobutandimer-Radikalanionen zu
Pyrimidindimer
19
Betrachtungen,
erläutern [129]
dem
Wechselwirkung
transferiertes Elektron wird zunächst das LUMO
antibindenden
Pyrimidinrings
kinetische
des entstandenen SOMOs
Orbital
G*(C(5)-C(5'))
bis
{single occupied
hin
wird das ungepaarte Elektron über den
Beschleunigung
transferierte Elektron die
durch
zum
Einelektronenreduktion
Energiedifferenz
molecular
7t*(C(4')=0)
Cyclobutanring
wird
Ein
(Schema 11).
unoccupied molecular orbital), vorzugsweise das 7t*-Orbital der C(4)=0 Gruppe,
Durch
die
um
{lowest
besetzen.
orbital)
des
zweiten
delokalisiert.
erreicht,
mit
indem
Eine
das
zwischen Dimer-Radikalanion und anionischem
35
1.
Einleitung
Übergangszustand
im
Vergleich
ungeladenem Übergangszustand
zwischen neutralem Dimer
Energiedifferenz
zur
verkleinert.
Es wird deshalb angenommen, dass die Reversion des
Prozess durch
nichtsynchronen
abläuft.
anfänglichen
Allerdings ergaben Experimente
sekundären
jedoch
Studien
eine
1.6.2)
die
Schema
Umwandlung
N(3),N(3')-Trimefhylen
Reversibilität der
in einem
geschwächten Bindung C(5)-C(5')
Bmch der
Deuterium-Isotopeneffekt [156].
Experimenten festgestellte
Pyrimidindimers
mit deuterierten Derivaten kovalent
Indol-Dimer-Modelle nicht den durch die
erwarteten
und
von
vier
Da die
sp3
in vier
verknüpfter
sp2-Zentren
Pyrimidindimere
in diesen
Brücke aufwiesen, könnte die in CIDNP
Monomerisierung
solcher
Verbindungen (siehe
Ergebnisse verfälscht haben.
Beschleunigte Cycloreversion
11.
Pyrimidindimeren
von
durch
Elektron-Delokalisierung
im
Dimer-Radikalanion.
o
o©
o
+ e
I
o
N
N
O^N-
I
nAo
I
19
o©
o
o©
o
t
o
2Va^—o^J \v—cAnMa
Tiefe
[305].
einer
II
Temperaturen inhibieren
die
Es konnte
für
die
kinetischen
wie
I
vor
der
Aktivierungsenergie,
Konformation
die
es zu
des
Eine
um
Aufgabe
Übergangszustandes
Dimerspaltung liegen.
36
des
ist.
im Dimer-Radikalanion
gilt.
1.3 kcal
von
des
Immobilisierung
zurückzuführen
überwinden
konnte errechnet werden, dass diese
Stabilisiemng
Dimer-Indol-Modellverbindungen
von
Cyclobutanreversion
den Rückelektronentransfer [306].
der
Photolyse
dass dies nicht auf eine
Spaltung ungünstigen
Beschleunigung
eine
Messungen
gezeigt werden,
II
Aus
Systems
Trotz
gibt
es
in
der
nach
temperaturabhängigen
mof1 grösser ist als jene für
DNA-Photolyasen
thermischen
könnte daher in
Prozesses
bei
der
1.
des
Lösungsmittels,
bevor
Lösungsmittelabhängige
eine
starke
Zunahme
der
unpolaren Lösungsmitteln
Reorganisationsenergie
inverted
wenn
die
Reorganisationsenergie
die
Ladungsrekombination
Eine alternative
werden. Solche
die
thermodynamische
ist.
Bei
Dimermit
Spaltungseffizienz
erklärt
Danach wird die höchste
Triebkraft der Reaktion
Systeme
gleich
Ladungsrekombinationsprozessen
in
als die
befinden sich in der sogenannten Marcus
wieder
Aktivierungsenergie
wird effektiv
d.
steigt,
die
h.
langsamer.
Erklärung ist die Bildung
Dimer und angeregtem
und
thermodynamische Triebkraft jedoch grösser
kann die
wobei
region,
[307].
Befund kann durch die Marcus-Theorie [311]
paradoxe
Elektronentransferrate erreicht,
wie
stattfindet
Lösungsmittels [308-310].
werden, sofern der Elektronentransfer nicht adiabatisch ist.
hoch
die
auf
Reorganisation
Dimer-Indol-
kovalenten
von
Dimefhoxybenzol-Systemen ergaben
Dieser scheinbar
Elektronentransfer
eigentliche
der
Messungen
abnehmender Polarität des
Einfluss
grossen
Elektronentransfer-Prozesse erfordern
ausüben.
Ladungsrekombination
einen
kann
Lösungsmittels
des
Polarität
Die
Einleitung
eines intramolekularen Exciplexes zwischen
Indol, dessen Dissoziationskonstante in polaren Lösungsmitteln
höher wäre.
Eine dritte
(Pyrimidin
Möglichkeit
Radikalanion)
Ladungsdelokalisierung
Medien stärker
Aktivierungsenergie
erhöhen.
zur
waren,
ging
Enzym
aus.
man
Wie bereits
unterschiedlich
beim
diese
Übergangszustandes
des
aufgrund
Übergangszustand
zum
Vergleich
dieser Befunde
Analyse
der
von
Unterschiede
beobachtet.
Uracil- und
erklären
im
von
einer eher
Vergleich
müsste
in
unpolaren
den
polare Lösungsmittel
und
die
somit
DNA-Photolyasen
bekannt
unpolaren Bindungstasche
Abhängigkeiten
im
Spaltungsrate
können,
37
für
Modellsystemen [285, 297, 298]
sowohl in
Unterschiedliche
der
Spaltungsraten ergaben
sich auch
Thymin-Cyclobutandimeren [118, 260, 283, 296].
zu
zur
Pyrimidindimer-Spaltung
konfigurierte Pyrimidindimere
von
Effekt
des Produktes
Ladung
stabilisieren
Röntgenstrukturen
erwähnt wurden strukturelle
Enzym [98]
Dieser
Mit anderen Worten würden
Zeit dieser Studien keine
1.6.5 Ouantenchemische
als auch im
sowie
ausgeprägt sein.
relativ
Da
Delokalisierung
im Dimer-Radikalanion.
Ausgangszustand
der
ist die bessere
wurden
MO-theoretische
Um
Rechnungen
1.
Einleitung
energetischer
beim
Veränderungen
verschiedener
Spaltungsreaktion
der
Ablauf
Pyrimidindimere durchgeführt.
Die
Spaltung
MNDO-PM3-Methode
bestimmten
Spaltungsenthalpien (Cyclobutan:
diesen
Uracil-
zu
Thyminderivaten
zunimmt. Die
gerechneten und experimentell
+37 kcal
mof1 gerechnet; +18 kcal mof1
Pyrimidindimere (neutral
im Bereich 0 bis -10 kcal
Rechnungen
Aufhebung
von
sowie
von
trans-syn-
«s-syn-konfigurierten
zu
Einfluss auf die
Thermodynamik
der Reaktion.
Spaltungsenthalpie
nur
hat also einen
Ein zusätzlich
Diese
Senkung
der
von
nach Aufnahme
eines Elektrons
zur
Spaltung
über beide
C(5)-C(5')-Bindung
der
Pyrimidine
delokalisiert
dass Elektronenaufnahme
enormen
einem
Im
Die Reaktion
geschwindigkeitsbestimmende
Übergangszustand
keine grossen Vorteile
Schritt
ist das Elektron gut
Zusammenfassend kann
(vgl. 1.5.4).
Bei diesen
planaren Cyclobutanring
systematischen
führt.
thermodynamisch
Einfluss nimmt.
eine
20-40 kcal mof1 für die Reversion des neutralen
wobei der erste,
Zwischenprodukt,
dieselben
qualitativ
Dimers auf etwa 3-5 kcal mol"1 für Reversion des Dimer-Radikalanions.
verläuft über ein
Elektron
geringfügig (vgl. 1.4.4).
Rechnungen ergaben
Aktivierungsenergien
Dimeren
signifikanten
übertragenes
Rösch und Mitarbeiter finden nach der AMI-UHF-Methode
Ergebnisse [313].
von
bedingter Abstossung zwischen
Delokalisationsenergie
an
die
nach
Radikalanionen) liegen
als
sterisch und elektrostatisch
und der Gewinn
hingegen verändert
oder
mof1 [312], wobei die Exothermizität
Pyrimidinen
den
semiempirischen
den
Unterschiede in
deutliche
experimentell [153]).
Heelis fand nach der
ist endotherm.
Cyclobutan
von
bringt,
kinetisch
wurde
semiempirischen Rechnungen
festhalten,
man
jedoch
jedoch
von
ausgegangen, wodurch die bestimmten Werte mit einem
Fehler behaftet sind und deshalb
Anhaltspunkte
als erste
nur
betrachtet
werden müssen.
Ab-initio-MCSCF
Hofßnann-Regelxi
Ergebnis,
Rechnungen
verbotenen
die Reaktion
dass
des
Reaktionswegs
Cycloreversion
in
nur
einer
von
schrittweisen
Aktivierungsenergien (40-60
Auch nach der ab-initio
Methode
Cyclobutandimeren
dem
Aktivierungsenergie
Abnahme dieser
Verzerrung
des
aus
durch
endothermen
hoch bleibt.
Es wurde
an
über
führte
ein
zum
Diradikal
verlaufen kann [314].
neutralen
Prozess,
Pyrimidinwobei
eines Elektrons führt
gezeigt,
eine beträchtliche
38
mol"1)
exothermer
Erst die Aufnahme
Aktivierungsenergie.
Cyclobutanringes,
kcal
Woodward-
den
Cyclobutan
Abfolge
Rechnungen
ein
nach
neutralem
endotherm und mit hohen
wird
der
zu
die
einer
dass die Geometrie, also die
Auswirkung
auf diese Abnahme der
Einleitung
1.
haben sollte
Aktivierungsenergie
beeinflusst werden kann.
DNA-Photolyasen
durch
Modellsysteme
1.6.6 Flavin-enthaltende
dass
Nachdem bekannt wurde,
Kofaktoren enthalten
Chromophore
in
systematische
Studie
[99, 103], legte
von
man
mehr
konnten
von
Rokita und Walsh [317]
revertieren,
Pyrimidindimeren
bei
hingegen
Quantenausbeuten (<î>
10"3-10"4).
=
der
photosensibilisierte Spaltung
der
Spaltungseffizienz.
sensibilisierten
Spezies
werden [318]. Yoneda et al. fand
durch
Chromophore
scharfem
In
Mitarbeitern
[320-322]
und
Spaltung
von
dazu
Verlaufs
des
Inhibierung
intramolekular
Thymindimeren
der Reaktion
aber
keine
in
detektiert
von
durch
die
Pac
und
Dimethylthymindimeren [319].
stehen
erstaunlich
spätere
Untersuchungen
von
[323], nach denen durch Perchlorsäure
hohe
Derivate des Riboflavins bei
Quantenausbeuten
(O
zeitaufgelöste Laserspektroskopie
Durch
kleinen
mit
Dimerisierungsprozesses
Desazaflavinderivate,
Magnesiumperchlorat komplexierte
aufwiesen.
Desazaflavin
Dimere
nm
(Abb. 10) brachte keine Erhöhung
36
während des
eine
die
waren,
durch Photo-CIDNP-Studien der Flavin-
und Hartman und Rose
Dimerkonzentrationen
Dimerspaltung
zwar
Flavin-
Gegensatz
oder durch
protonierte
hohen
verursachte
und
N(1),N(1')-Trimethylen-verbrückten
von
alkalischem Milieu radikalische
Dimethylthymin
jedoch
oxidierten
von
als 350
Bedingungen
mittels
die
dieser
Eine erste
unfähig
8
Wellenlängen grösser
Modellverbindung
Es konnten
Spaltung
Auch
Untersuchung
dass Derivate
Position
basischen
stark
auf die
Lumiflavin und 5-Desazariboflavin
durchzuführen.
unter
nur
der
Riboflavinen als
von
Pyrimidindimeren.
von
ergab,
an
mit Licht der
Bestrahlung
auch
wenn
Augenmerk
mit der Reversion
Zusammenhang
Derivate
DNA-Photolyasen
Flavinen mit elektronenreichen Substituenten
Photospaltung
Katalyse
Ein weiterer Faktor, der bei der
[315, 316].
=
für
1)
konnten
die
protonierte
Semichinon-Radikale der Flavinderivate als Transienten der Reaktion detektiert werden
[321, 324].
Protonierung
Reduktionspotentials
essentiell
zu
sein
Monomerisierung
von
Singlet-
darauffolgenden
Komplexierung
Aus
Pyrimidindimere
Triplet-Exciplexen
Elektronentransfer
Sauerstoff enthaltenden
verursacht einen
positiven
Shift des
Flavine, der für die effiziente Dimerspaltung in diesen Systemen
scheint.
der
und
der
bzw.
Lösungen
den
Ergebnissen
in sauerstoffreien
der
Dimere
propagiert wird,
mit
Lösungen
den
geschlossen,
vor
allem via
dass
Bildung
angeregten Flavinen
während die
zusätzlich durch einen
39
wurde
und
Spaltungsreaktion
in
Kettenreaktionsmechanismus,
1.
Einleitung
diesen
Beobachtungen
(Abb. 10)
beschleunigt wird.
über das Monomer-Radikalkation,
vorzugsweise
erwies sich die
mit erheblich
Bestrahlung
der kovalenten
geringeren Spaltungseffizienzen
von
<!>
~
Im
mit
Einklang
37
Modellverbindung
10"2 [323].
CH2OAc
(CHOAc)3
CH2
i\'
N
O
36
Abb. 10.
37
Die kovalenten
Die
Modellverbindungen
36 und 37 nach Walsh und Rose.
Erkenntnis, dass aktive DNA-Photolyasen
nicht den oxidierten Flavin-Kofaktor
Modellsystemen
Handhabung
Dihydroflavinen
(FADH") und
(FAD) enthalten [325] [326], schürte das
mit eben diesen reduzierten
von
den voll reduzierten
sind
Chromophoren.
der
Aufgrund
in der Literatur
Beispiele
Interesse
nur
schwierigen
spärlich gesät.
Schuman-Jorns untersuchte verschiedenste reduzierte Flavinderivate auf ihre
Pyrimidindimere
reduktiv
Desazariboflavin
(<D
=
spalten [327].
zu
10"2)
unter basischen
schwach und 5-Desazaflavine gar nicht
Untersuchung
des
Emeut
wurden
die
die
Anregung
hohen
eines
cw-syn-Pyrimidindimers
Dimerspalmng
Transienten
Flavins
noch
Dimerspaltung
nm
durch
Quantenausbeuten
mit
während Lumiflavine
in der
Lage
1nur
Genauere
waren.
Tetraacetylriboflavin propagierten
obiger
Flavins
Experimente
kompetetiven Kettenreaktionsmechanismus
deprotonierten,
Fähigkeit,
wurden
Notwendigkeit des reduzierten, deprotonierten
Dimerkonzentration mit einem
Die
Ergebnisse
Bedingungen erzielt,
einer bei 436
pH-Profils
Dimerspaltung ergab
zur
Die besten
an
[328].
bei
hoher
erklärt.
reduzierten Flavinderivats in Anwesenheit eines
in kleinerer Konzentration durch
signifikante Änderungen
der
Blitzlicht-Photolyse ergab
Spektren
und
weder
Lebensdauern
der
[230]. Dies wurde auf die Kurzlebigkeit des angeregten Singlet-Zustands des
^FL^H") zurückgeführt
{x
~
100
ps),
Dimer im untersuchten Konzentrationsbereich
schliesst reduktive
Dimerspaltung
durch
(bis
den
40
die keine diffusive
10
mM) zuliess.
Begegnung
Dasselbe
mit dem
Experiment
angeregten Triplet-Zustand des
Flavins
1.
(3FlredH )
erhöhte Lebensdauer des
aus, da die
dem Dimer
ermöglichen
Nach einer Idee
wurde als
hergestellt
Rezeptor
[331,
von
für
Hirst und Hamilton
Pyrimidindimere
das
kovalenten Indolderivaten die
Abb.
11.
molekularer
ein
kovalent
Während
Pyrimidindimere
die
eine
Wechselwirkung
Der Grund dafür
mit
o
reduziertes
Verbindung
spalten konnte,
war
38
39
waren
mit
die
höchstwahrscheinlich die
pH.
Xxfxx
o
H-r-
N7H
verknüpftes,
verwandte
erkennen und
o
N
H
\
CO
^-N^/
u
11).
Rezeptoren inaktiv.
N-H
/f=\
lis)
makrozyklisches Bis(diaminopyridin)
CO
OC
1
[329] und Rebek und Mitarbeitern [330]
neutralem und nicht bei basischem
S
of
ein
zusätzlich
Lumiflavinderivat enthielt (Abb.
Bestrahlung bei
~
würde.
332],
Flavin enthaltenden
Triplets (t
Einleitung
38
R
=
39
R
=
F|avjny|
lndolyl
Modellverbindungen zur Spaltung nicht
Erkennung nach Goodman und Rose.
41
kovalent
verknüpfter Thymindimere
durch Einsatz
2.
Zielsetzung
2.
ZIELSETZUNG
2.1
Generelle
Aspekte
DNA-Photolyase-
bei der Auswahl eines
Modellsystems
In der
der
Einleitung
wurde
des
Aufklärung
vor
Erstaunlicherweise
den
katalytischen
wurden
sowie
von
Chromophoren,
die
zu
Beginn
von
dieser Arbeit
Einfluss des
die sich
zum
von
der
Art
Holoenzyms.
mechanistische
Teil deutlich
mit
Untersuchungen
der Simation im
von
Enzym
Trimethylen-verbrückten Pyrimidindimeren
mit den
wenig
die
über
Dimerspaltung,
dahin
bis
Der Einsatz
(vgl. 1.5).
Photoreaktivierung
der
Dennoch bestanden
der
bei
Modellverbindungen durchgeführt,
unterscheiden
grosse Fortschritte bei
Unsicherheiten und Kontroversen über die Rolle der
Chromophore
Cyclobutanringöffnung und
Modellsysteme
Mechanismus
werden konnten.
1995 nach wie
enzymatischen
dass durch
enzymatischen
Pyrimidindimeren gemacht
im Herbst
aufgezeigt,
Kofaktoren
enzymatischen
gemeinsam
haben, könnten aber leicht über die wahren Gegebenheiten im Enzym hinwegtäuschen. Des
weiteren können
nicht mit denen des
Derivate der
entweder
Enzyms verglichen
oder wiesen eine sehr
Das Ziel dieser Arbeit
das
so
direkter können die
Aufklärung
war
die
Je exakter die
Ergebnisse
Spaltung
der
waren
eines
die
Modellsysteme,
Pyrimidindimere einsetzten,
geringe Quantenausbeute
Entwicklung
den in Schema 3
enzymatische
der
mechanistischer Details des
möglich sein,
zur
Darüberhinaus
auf
(siehe 1.6.6).
Modellsystems
für die DNA-
gut wie möglich mit dem natürlichen Szenario im aktiven Zentrum des
Enzyms übereinstimmt.
umso
werden.
enzymatischen Chromophore
erfolglos
Photolyase,
die durch Kettenreaktionen beeinflusst werden,
Spaltungseffizienzen,
Situation
Untersuchungen
solcher
Enzyms herangezogen
postulierten Mechanismus
42
nachgestellt
zu
werden
kann,
Modellverbindungen
werden.
untersuchen.
zur
Dadurch sollte
es
Zielsetzung
2.
Das schematische
dargestellt
und umfasst
(i)
Das
Herzstück
der
den
an
Planarisierung
des
Stellen
oder
Substituenten
ermöglichen,
sowohl
{syn
vs.
einem
aus
bzw
N(l)
kovalente
N(l')
bleiben,
sind durch die Reversibilität der
Cyclobutanrings
aufweisen.
Spaltungsreaktion
wahrscheinlich nicht
Cyclobutanring
Der
Das
angestrebte
Gerade die
sowie
Nachstellung
zur
sollte
Modellsystem
variabel
Untersuchungen
der
sein
kovalenter
Spaltungsrate
von
trans) einzubauen.
vs.
den
Modellsysteme
Chromophoren
haben
gezeigt,
Kettenreaktionen vermieden werden kann.
Systemen
erlaubt zudem eine starke
optische Transparenz,
was
Intramolekularität
der
Verdünnung
für die
der
Reaktionslösung
geplanten Messungen
Spaltungsreaktion
Reaktion in der aktiven Tasche näher als intermolekulare
(iii)
Die
Pyrimidindimere
im
Chromophore,
des
kovalenten
von
und
sowie das
somit
garantiert
essentiell ist.
Ausserdem
enzymatischen
Verlauf der
Systeme.
lichtgetriebene
Cycloreversion
der
sollten den Kofaktoren der Klasse II
sein.
Es wurden deshalb Derivate des Riboflavins
8-Hydroxy-desazaflavins gewählt.
Durch Variation des Substitutionsmuster sowie
Protonierungs-
aktiven
die
Modellsystem ermöglichen,
DNA-Photolyasen möglichst ähnlich
und des
welche
dem
Abhängigkeit
Chromophor
Der Einsatz
Art
Frühere
verknüpft.
dass dadurch die
Assoziationskonstanten zwischen Dimer und
von
kommt die
mit
sollte,
Auftreten
deren
es
als auch Uracil-Dimere unterschiedlicher Konstitutionen
Thymin-
anti) und Konfiguration {eis
Länge
der
sollte ebenfalls keine
(ii) Das Cyclobutandimer wird über einen Abstandhalter {linker), der in seiner
und
12
Pyrimidin-
aufweisen.
Trimethylenbrücken
enzymatischen Photoreaktivierung geeignet.
zusätzlichen
besteht
Ansonsten sollte das Dimer unverändert
Methylgruppen
Trimethylen-verbrückten Dimere
durch die
Modellverbindung
aufweist.
Verknüpfungsmöglichkeiten
also keine zusätzlichen
in Abb.
folgende Gesichtspunkte:
welches
Cyclobutandimer,
angestrebten Modellsystems ist
des
Grundgerüst
Spezies
und
Oxidationszustandes
erkannt und
bezüglich
ihrer
der
Chromophore
Fähigkeit
zur
sollen die
Durchführung
katalytisch
der
Reparatur
untersucht werden.
(iv)
Die
Löslichkeit
der
Modellverbindungen
Lösungsmitteln sichergestellt werden,
breiten Polaritätsbereich durchführen
um
zu
sollte
in
möglichst
Lösungsmittel-abhängige Messungen
können.
43
Dazu würde sich eine
vielen
in einem
Alkyliemng
der
2.
Zielsetzung
Flavinbausteine
eine solche
ein
der Stelle
Derivatisierung
(v)
weiteren
an
Die Stelle
Chromophor,
Modellsystem,
Photolyasen
z.
N(3) anbieten,
Redoxeigenschaften
der Flavine durch
kaum verändert werden.
N(3)
des
Flavinchromophors
B. mit einem
das die
da die
Indolderivat, substituiert werden.
Untersuchung
erlauben würde
könnte alternativ auch mit einem
des sogenannten dritten
Man hätte damit
Chromophors
von
DNA-
(vgl. 1.4.4).
Variationsmöglichkeit
des Pyrimidindimers
w
Variationsmöglichkeit
oo
des Abstandhalters
Jl
Jl 3'
HN'W—\^rNH
3
A2
5e
65
A
O^N-T—f-N%
H
H
O
I
1
O
40
Variationsmöglichkeit
des "dritten"
Chromophors
Variationsmöglichkeit
Chromophors
des zweiten
Abb. 12.
Struktur eines variablen kovalenten
Modellsystems
Cyclobutandimeren durch DNA-Photolyasen.
44
zum
Studium der
Reparatur
von
Pyrimidin-
2.
der
Ungeklärte Gesichtspunkte
2.2
Zielsetzung
enzymatischen
Photoreaktivierung
Mit Hilfe des in Abb. 12
wesentliche
sollte
es
möglich sein, einige
DNA-Photolyasen betreffend,
durch
Reparaturprozess
den
Fragen,
dargestellten Modellsystems
zu
beantworten:
(i) Es ist nicht bekannt,
ob und in welchem Mass das
Elektronentransfer-Reaktionen beeinflusst,
einer hoher Effizienz
(O
nahezu 1 bedeutet, dass
=
um
die
Spaltung
von
Eine
0.7-0.9) durchzuführen [130].
jedes
absorbierte Photon auch
führt. Dabei könnte unter anderem die genaue
zur
Spaltung
Positionierung
die
Energie-
und
Pyrimidindimeren
mit
Quantenausbeute
von
Enzym
eines
Pyrimidindimers
der Dimerschäden
bezüglich
des Flavins für einen effektiven Elektronentransfer entscheidend sein. Die aktive Stelle des
Enzyms
könnte für die
Cyclobutanrings
des
Stabilisiemng
und für die
des
Übergangszustandes
Unterdrückung
Rückelektronentransfers verantwortlich sein.
genaue Kenntnis über die
notwendig,
von
der
Polarität
Aminosäuren und
des
Chromophore und
Bisherige Untersuchungen
ergaben
sehr kontroverse
(ii)
Der
Modellsystemen
dieser
Modellverbindungen,
zur
nicht
produktiven
Beantwortung dieser Fragen
Zur
der
Mediums,
Spaltungsreaktion
von
der Struktur des
Abhängigkeiten
Öffnung
Weg
am
der
vom
Anwesenheit
Cyclobutandimeren
Enzym
und
an
ist
es
pH-Wert,
bestimmter
zu
erlangen.
Modellsystemen
Ergebnisse (vgl. 1.6).
Energietransfer
nicht
von
kompetitiven,
eines
Abhängigkeit
umgebenden
auf dem
untersucht
zwischen Flavinen und Desazaflavinen ist bisher
worden.
die beide Kofaktoren der
direkten Beweis für die Existenz eines solchen
Die
Synthese und Untersuchung
DNA-Photolyase enthalten,
Energietransfers
an
von
könnten einen
zwischen den Kofaktoren
liefern.
(iii)
Unbekannt ist,
DNA-Photolyasen
nahe
Anordnung
sehr
wäre
warum
grosszügig
bemessen ist (
==
18
Â, vgl.
1.4.2).
Eine
möglichst
sinnvoll, da die Effizienz des Energietransfers nach Förster mit
zunehmendem Abstand abnimmt.
Modellverbindungen
der Abstand zwischen den beiden Kofaktoren in
Variation des Abstands der beiden
könnte Aufschluss über den Gmnd der
Enzym geben.
45
Separation
Chromophore
in
der Kofaktoren im
2.
Zielsetzung
(iv)
unzureichend
Die
Reduktion
des
Man
aufgeklärt.
Elektronentransfer
von
einem
dass
vermutet,
Tryptophan
innerhalb
Flavins
photoaktiven
auf das
des
Reduktion
die
lichtangeregte
Enzyms
durch
ist
einen
Flavin-Semichinon im
o
angeregten Quartettzustand erfolgt (vgl. 1.4.4). Dieser Transfer müsste über mehr als 13 A
erfolgen.
Durch kovalente
Flavin-Tryptophan-Modellverbindungen
kann versucht werden,
diese Photoreduktion nachzustellen.
(v)
Dem Postulat eines
Cyclobutanringöffnung
Konzepts (vgl. 1.6.3/4).
nicht
via Radikalanion
synchronen,
folgte
die
Aufstellung
Das Bereitstellen einer effizient
breiten
Variationsmöglichkeiten
durch
einen
Vergleich
von
unterschiedlich strukturierter
erlaubt die Verifikation
experimentell
Pyrimidindimere.
46
aber
konzertierten Ablaufs
des
through
bond
der
coupling-
spaltenden Modellverbindung
mit
quantenchemischer Betrachtungen
ermittelten
gemessenen
Spaltungsraten
Modellverbindungen
3. Flavin-enthaltende
FLAVIN-ENTHALTENDE MODELL¬
3.
VERBINDUNGEN
3.1
Synthese
Uracildimeren
von
Zum Zweck des Studiums der
Cyclobutandimeren boten
sich die
an
lichtgetriebenen
den Stellen
alle in Absatz
Synthesevorschriften
[329,
Basische
Carboxymethyl-substituierte
jedoch,
dass sich nach
symmetrischen
Dimer 41
dass dieses
Da basische
in 44.
die
gewünschte
Eine
asymmetrische Hydantoin-
Überraschend
(Schema 12) besitzt.
auch die
war
Bedingungen
die
transoide
Konfiguration
des bestrahlten Vorläufers nicht ändern sollte, leitet sich damit auch
symmetrische Carboxymethyl-substituierte
denen
cis-syn-konfiguriertem
Eigene Untersuchungen [334] zeigten
Hauptprodukt
Struktur 42 ab. Dieser Befund steht auch in
nach
einen
sollte dann das
Ethylenglycol
ergeben.
über
des bestrahlten Vorläufers mit LiOH neben einem
Behandlung
Cyclobutanringes
des
Cyclobutanrings
für das
von
bereits
eines
Bestrahlung
an
existierten
Photodimer ein unerwartetes Produkt in über 70% Ausbeute bildete.
enthaltende Struktur 44
des
nach
Sie
(Schema 12).
an
Zudem
Vorläufers eine hohe Ausbeute
Abspaltung
Röntgenstrukturanalyse ergab,
Konfiguration
die
333],
Ethylenglycoldiester verbrückten
Dimer beschreiben.
Pyrimidindimere
aufgeführten Anforderungen.
2.1
Flavin-derivatisierten
von
N(1),N(1') Carboxymethyl-substituierten
Uracildimere 41-43 als leicht funktionalisierbare
erfüllen
Reversion
sämtliche
den
an
Pyrimidine bei Bestrahlung
Stellen
Einklang
N(l)
ausschliesslich
Photodimer die unerwünschte transoide
und
mit früheren
N(l')
Beobachtungen [335],
Polyoxyethylen-verbrückten
frans-syn-Cyclobutandimere lieferten.
Das
von
Schultz und Mitarbeitern zunächst als cis-syn-konfiguriertes Dimer angenommene Produkt
konnte ebenfalls kristallisiert werden und
syn-Konfiguration
Strategie ermöglichte
konfigurierten Uracil-Cyclobutandimers
Diplomarbeit
[334]
vorliegenden
Arbeit
ausgearbeiteten
optimiert
zum
1-Carboxymethyluracil
die
Carboxylate
Benzylalkohol
zu
nach
Röntgenstrukturanalyse
eine trans-
Cyclobutanrings [336].
des
Eine alternative
zeigte
von
46
und
47 verestert
41
schliesslich, die Synthese des cis-syn-
(Schema
12)
Synthesebedingungen
vervollständigt.
46 umgesetzt
mit
es uns
[333].
zu
erreichen.
wurden
Uracil 45 wurde mit
Danach wurden
aus
Dicyclohexylcarbodiimid (DCC)
[337, 338].
47
im
Die
in
Verlauf
der
der
Chloressigsäure
Löslichkeitsgründen
aktiviert
und
mit
3. Flavin-enthaltende
Schema 12.
Synthese
Modellverbindungen
der
Uracil-Cyclobutandimere 41-43. a) H2, Pd/C, HOAc, RT, 2h, 91%; b)
HCl, Rückfluss, lh, 51%; c) IN NaOH, RT, 3.5h, 86%.
Die Ausbeuten der
Cyclobutandimeren
konz.
beziehen
benzylierten Verbindungen 48-51. Die Bezeichnung cis-cisoid-cis bzw. cis-transoid-cis bezieht
Konfiguration der Brückenkopf-Substituenten. Die Bezeichnung syn bzw. anti bezieht sich auf
die Konstitution der direkt mit dem Cyclobutanring verknüpften N-Atome.
Im Text werden die in der
Literatur gebräuchlicheren Kürzel cis-syn, cis-anti, trans-syn und trans-anti verwendet. Bn
Benzyl; Im2CO
1,1 -Carbonyl-bis( 1 H-diimidazol].
sich auf die
sich auf die
=
'
=
H
n''h
J
HOOC
COOH
^COOH
hTVo
<r<•N
H
H00C'
44
1.) HOCH2CH2OH, lm2CO, DMF, RT,
2.) hv, H20/Aceton, RT,
3.) LiCH, H20, RT,
CICH2COOH,
HN'
KOH
H20, Ti,
20h
HN'
BnOH, lm2CO
DMF, RT, 28h
90 mi
hv, Aceton
O^N'
95%
66%
COOH
47
O
R
**
n
NA041
ROOC
R
=
48
=
O
I
=
Dn"~laï
HJa>
O
J
j|
1%
R
=
42
R
=
H ^
=
Bnnc)
}
"COOR
cis-transoid-cis, syn (trans-syn)
COOR
NY°51R
50
NH
43
R
=
H -*J c'
°
ROOC
cis-cisoid-cis, anti (cis-anti)
Bestrahlungen
durchgeführt.
Bn-,..
49
L
r
I
Die
H
36%
H
¥nvNH
n
h h
BnOOC
H
XOOBn
H
HN
O
x^ y-x
~n^^H
N^H^Ao
ROOC
cis-cisoid-cis, syn (cis-syn)
H
HN
Bn-
COOR
O
RT, 3h
COOBn
46
NH
14h
2h
Die
cis-transoid-cis, anti (trans-anti)
wurden in einer
Endabsorption
30%
Wasser-gekühlten Pyrex-Belichtungsapparatur
des Uracil-Monomers 47 reicht über 290 nm, während
die Photodimeren 48-51 in diesem Bereich keine
48
Absorption
aufweisen
(vgl. Abb. 14).
3. Flavin-enthaltende
Das
absorbiert Licht mit
Pyrex-Glas
eines Monomer-Dimer
Gleichgewichtes
Eduktes 47 erreicht.
Als
Ansatz wurden
300
Pro
Wellenlängen
Lichtquelle
ml
einer
<
290
nm.
verhindert und eine
Modellverbindungen
Dadurch wird die
Bildung
vollständige Umsetzung
des
wurde eine 150 W
Hg-Mitteldrucklampe eingesetzt.
0.05
des
M
Lösung
47
Uracilderivats
3
h
in
sauerstofffreiem Aceton bestrahlt.
Dünnschichtchromatographie (DC)
aus
dem sich nach
Bestrahlung
worauf auf den DC-Platten die
des
werden
ihrerseits durch mehrfaches Umfallen
48
und
CHCl3/MeOH 10:1) getrennt
und
49
nm-Bestrahlung
kann). Mehrfaches Fällen
Isomere
konnten
zudem
50
und
aus
aus
Cyclobutandimere
wurden
Cyclobutandimere,
Monomers 47
der Isomere 49
HCOOH/H20
und
werden konnten.
säulenchromatographisch
Die
51,
kristallisiert
und
(Abb. 13).
wurden durch
ihre
die
Die aceton-
(Kieselgel-//;
syn-konstituierten Cyclobutandimere
werden
50 und 51
Hauptprodukte
Aceton und Abfiltrieren des Rückstandes
CHC13 getrennt
gereinigt.
Produktgemisch,
klar die vier
revertieren die
Anreicherung
die
ein
des stärker absorbierenden
aus
Röntgenstrukturanalyse eindeutig zugeordnet
konstituierten
nm-UV-Lampe
Entstehung
Reaktionsgemisches ermöglichte
löslichen
Reaktionslösung zeigte
mit einer 254
48-51 abzeichneten (durch die 254
verfolgt
der
Struktur
48
mittels
Die Strukturen der anti-
Interpretation
der
*H-NMR
Spektren zugeordnet [334].
Die stark unterschiedlichen Löslichkeiten der vier
verschiedene
Reaktionsprotokolle
Cyclobutandimer
48 konnte mittels
Kohle
Katalysator
(Pd/C)
als
zur
für die
Verseifung
Isomeren
der
katalytischer Hydrierung
Benzylester.
49 unter Rückfluss in konz. HCl
wurde durch
Hydrolyse
ergab
42.
des trans-anti-Isomexs 51 mit 1 N
49
erforderten
Das
cis-syn-
in HO Ac mit Palladium auf
Dicarbonsäure 41 umgesetzt werden.
syrc-Isomers
48-51
Erhitzen des trans-
Die Disäure 43
schliesslich
NaOH-Lösung hergestellt.
3. Flavin-enthaltende
Abb. 13.
ORTEP
Die
(trans-syn).
Modellverbindungen
Darstellung
der Molekularstruktur der
Verschiebungsellipsoide
Uracil-Cyclobutandimeren 48 (cis-syn)
und 4 9
der Atome sind willkürlich nummeriert und beinhalten 50%
Aufenthaltswahrscheinlichkeit.
Die
UV/VIS
Cyclobutandimere
Spektren
41-43
des
(Abb.
entsprechenden Absorptionsspektren
Monomers
Cyclobutandimere
zu
in diesem
sind
in
und
der
Übereinstimmung
guter
ähnlicher Uracilderivate
<
250
Dimere erwarten.
geschädigter
nm
Aufgrund
Wellenlängenbereich
einem hohen Umsatz
Wellenlängen
zur
14)
46
[283].
Die
Uracilmit
den
Absorption
des
46, die im Wellenlängenbereich des UVB- und UVC-Anteils des Sonnenlichts
(um 270 nm) liegt, ist klar sichtbar.
DNA
Carboxymethyluracils
würde
Bestrahlung
der
man
der
vernachlässigbaren Absorption
kommt
Pyrimidinbasen
eine effektive
mit Licht dieser
zu
es
auch bei
UV-Bestrahlung
Cyclobutandimeren.
zwecks
der
Erst bei
photochemische Cycloreversion
Wellenlängen
der
Reparatur
der
UV-
Zellen wäre ineffektiv und äusserst schädlich und ist daher keine Alternative
Photoreparatur
durch
DNA-Photolyasen.
50
3. Flavin-enthaltende Modell Verbindungen
25000
20000
E
,-P
15000
10000
5000
310
Abb. 14.
syn),
42
Absorptionsspektren
(trans-syn)
und 43
Synthese
3.2
Die
41-43
(trans-anti)
in
erhalten
Bestrahlung
55
56
von
Cyclobutandimere
Polaritäten
zu
werden
Carboxymethylthymin
(Schema
in
den
Somit
13).
wiedemm
wurde
56
Benzylester
Da diese im Unterschied
Aceton
angereichert
und
zu
53
Synthese
(cis-
konnten
im
der
der Uracildimere
54
Thymin
überführt.
Gemisch
ein
aufweisen, konnte lediglich ein Teil
aus
52
Thymindimere
der in Abschnitt 3.1 beschriebenen
ergab
57-60.
Reaktionsgemisches
41
Thymindimeren
von
Analogie
Uracil-Cyclobutandimeren
H20.
Carboxymethyl-substituierten
wesentlichen in
und der drei
des Uracilmonomers 46
über
das
Anschliessende
vier
isomeren
1-
UV-
Thymin-
den Uracildimeren recht ähnliche
der Isomere 58 und 60 durch Fällen des
werden.
Säulenchromatographie (Kieselgel-
60, CH2Cl2/Aceton 7:1—»5:1) erlaubte die Trennung des in der Reaktionsmischung
verbliebenen Rests der Isomere 58 und 60
von
den Isomeren 57 und 59.
chromatographische Reinigung (Kieselgel-dO, CHCl3/MeOH 15:1)
Fällung
aus
ausgezeichneter
MeOH
Reinheit und
Isomere 58 und 60
und
ergab
aus
anschliessender
schliesslich
ausreichender
HCOOH/H20
alle
vier
Menge.
und anschliessende
Thymin-Cyclobutandimere
Durch
Kristallisation
sowie der c/s-Isomere 57 und 59
Röntgenkristallstrukmranalyse
Thymindimere 57-60 eindeutig zugeordnet
werden (Abb.
51
Mehrmaüge
konnten
15).
die
aus
der
in
trans-
MeOH/H90
Stmkturen
der
3. Flavin-enthaltende
Modellverbindungen
der im
Aufgrund
Vergleich
mit den Uracilderivaten 48-51 besseren Löslichkeit der
Thymindimere
57
entsprechenden
Dicarbonsäuren 52 und 53 umgesetzt werden.
und
58
konnten
beide
katalytische Hydrierung
durch
die
in
Schema 13.
Synthese der Thymin-Cyclobutandimere 52 und 53. a) H2, Pd/C, HOAc, RT, 2h, 90-100%.
Bn
Cyclobutandimere beziehen sich auf die benzylierten Verbindungen 57-60.
Benzyl; Im2CO l,l'-Carbonyl-bis[lH-diimidazol].
Die Ausbeuten der
=
=
CICH2COOH,
BnOH, lm2CO
hv, Aceton
DMF, RT, 28h
RT, 3h
KOH
H20,îi,
90 minr„A
97%
86%
COOH
COOBn
54
56
O
O
J
ROOC
H
H
J^o
52
R
=
Bn-,
I
I
H -J a>
I
58
."
Oö
=
mR=BnDM—I
J^^Jç—:k.A„ 53
O' ^N^-^N^O
L
R
=
>
H-Ja>
k_
J
"COOR
2%
j"USf-4^NH
"
HH
,^N
57R,
H"
O^N'k.
O
O
A7VA NH
HN
ROOC
cis-cisoid-cis, syn (cis-syn)
"COOR
38%
cis-transoid-cis,syn (trans-syn)
COOBn
.COOBn
60
H
BnOOC'
S
3%
BnOOC"
cis-cisoid-cis, anti (cis-anti)
Durch
die
funktionalisierten
Grammengen
verbesserten
ein
war
Photolyasen gemacht
cz's-syn-Derivate
41
Funktionalisierung
Haptene
können
zur
worden.
mit
52
und
Schritt
grosser
und
verschiedener
(41-43)
Modellsystemen
35%
cis-transoid-cis, anti (trans-anti)
Verfügbarkeit
Uracil-
o
„,„,
für
die
Isomere
Thyminin
(52,53)
Richtung
der
Synthese
nur
zur
synthetisch
symmetrischen
Chromophoren herangezogen werden,
Herstellung
von
Cyclobutandimeren
von
neuartigen,
kataly tischen Antikörpern
nicht
oder
sondern
dienen.
zugänglichen
asymmetrischen
z.
B.
auch als
Bisherige Antikörper
lediglich fran.y-.s'yrc-konfigurierte Cyclobutandimere binden und spalten [336].
weiteren könnten die
in
enzymatische Photoreaktivierung durch DNA-
Zudem könnten die bisher
nicht
Carboxymethyl-
von
cw-syn-Derivate 41
und 52
52
an
Festphasen gebunden
Des
werden und
so
3. Flavin-enthaltende Modell
Verbindungen
als Substrate für das
und künstlichen
Abb. 15.
(trans-syn),
ORTEP
59
Aufspüren (Screening)
Photolyasen
von
kombinatorisch generierten Rezeptoren
in Betracht gezogen werden.
Darstellung der Molekularstruktur der Thymin-Cyclobutandimeren 57 (cis-syn),
und 60 (trans-anti). Die
Verschiebungsellipsoide der Atome sind analog zu
(cis-anti)
Uracildimeren in Abb. 13 nummeriert und beinhalten 50 %
53
Aufenthaltswahrscheinlichkeit.
5 8
den
3. Flavin-enthaltende Modell Verbindungen
der Kofaktorderivate
Synthese
3.3
3.3.1
Synthese
Hydroxyethyl-substituierten Flavinen
von
Aus der Vielzahl der
Gerüstes
[339]
Flavinsynthese
Isoalloxazinring
wurde
an
der Stelle
basiert auf der
Verlauf
zur
N(10)
des Isoalloxazins ist einfach
Borsäure-katalysierten Kondensation
des
N(10)-Hydroxyethyl-substituierten
und
werden,
erhalten
Stufen
klassische
die
Dadurch kann der
Weygand [186, 340] ausgewählt.
wenig
des Isoalloxazin-
Herstellung
Diplomarbeit [334]
der
mit Alloxan 61 und ist in Schema 14
Darstellung
nach Kuhn und
im
verhältnismässig
in
o-phenylendiaminen
Schema 14.
bereits
nach Kuhn und
Funktionalisiemng
Synthese
synthetischen Möglichkeiten
zu
erreichen.
eine
Die
iV-Alkyl- oder JV-Aryl-
von
dargestellt.
Flavinderivates 69 auf einem
Syntheseweg
Weygand.
O^XF3
NH2
Br'
NH
(CF3CO)20
RT, 2h, 90%
64
N02
N02
v^OMe
DMF,
,K2C03
tl,
R
87%
63
62
-o'
1.5h
65
R
=
N02
66
R
=
NH2-*J
—i
H2/Pd, HOAc
RT, 15h
H
B(OH)3
Ar'
HOAc, RT, 3h, 46%
o
O^
61
OH
S
r"x£
N
r^T0
BBr3
CH2CI2, 0"C, 5h
n
81%
R
y
O
69
67 R
=
R
=
68
H
—i
Et-J
Etl, K2C03
DMF, RT, 11h
88%
Das
käufliche
4,5-Dimethyl-2-nitro-phenylamin
Trifluoessigsäureanhydrid geschützte
mit
l-Brom-2-methoxyethan
Brommethoxyethan 64 wurde
Dimethylsulfat
und
64
über
wurde
Nitroanilin 63 [341] unter basischen
alkyliert,
zuvor
(62)
wodurch das Nitroanilin 65
durch Destillation einer
CaC03 hergestellt [342].
54
Suspension
das
Bedingungen
entstand.
aus
mit
Das
Bromethanol,
Katalytische (Pd/C) Hydrierung
des
Modellverbindungen
3. Flavin-enthaltende
Nitroanilins 65 unter
H2 ergab
Phenylendiamins
an
weitere
aus
66
der Luft
vorzubeugen,
Flavin
umkristallisierte
HOAc/H20
68
Derivat
Isoalloxazin 67 kondensiert.
Das
und
Ethyliodid
zum
68
wurde
zum
wurde
67
alkyliert.
66. Um einer Oxidation des instabilen
wurde 66 nach Filtration durch Celite ohne
mit Alloxan 61 und Borsäure
Reinigung
löslicheren
Phenylendiamin
das
K2C03
mit
N(3)-Alkyl-Flavin
Das
und anschliessend mit
chromatographisch (Kieselgel-6~0, Aceton/CH2Cl2 1:1) gereinigt
Bortribromid
3.3.2
zur
Synthese
Hydroxyethyl-funktionalisierten Zielverbindung
von
Aminoethyl-substituierten
Untersuchungen
ergaben,
was
bei
die
dass die
der
enthaltenden
durch
stabilere
Aminoethyl-funktionalisierte Flavin
basischem Milieu stabile
Alkylierung
(175 °C) ergab
70
(siehe Tab. 1)
das Phthalimidoanilid 72.
teilweise verseift wurden,
wie 79
Hydrolyse
Damit lassen sich auch in
(Tab. 1) synthetisieren.
1-Bromoethylphthalimid (71)
Die hohen
Temperaturen
Katalytische Hydrierung
in der Schmelze
waren
notwendig,
ergab
das
entsprechende N(3)-alkylierte
Phthalimido-geschützten
Amins 75 nach
Hydrazin
als starkes
Fehlen
guter Syntheseprotokolle
[344, 345] ist dadurch
Isoalloxazinring
funktionalisierte
zu
ebenfalls in der
Durch Erhitzen der
von
Verbindung
Zielverbindung
von
Flavinderivat
Ing
Nukleophil
da das
Literatur
Umsetzung
und Manske
den
74 mit
75.
Ethyliodid
und
(61)
CaC03
Die
Entschützung
des
[343] schlug
in diesem Fall
fehl,
Isoalloxazinring
irreversibel öffnete.
Amino-funktionalisierten
Flavinderivaten
in
erklären, dass nicht protonierte Aminosubstituenten
Lage sind,
das
Flavingerüst
intramolekular
75 unter Rückfluss in konz. HCl konnte die
70
jedoch
als stabiles
55
da
72 in HOAc, Filtration
von
und anschliessende Kondensation des resultierenden Anilinderivates 73 mit Alloxan
und Borsäure lieferte das Isoalloxazin 74.
das
wurde
vorzubeugen,
hergestellt (Schema 15).
des Nitroanilins 62 mit
in basischem Milieu
Um dieser unerwünschten
Antidbindungen
Modellverbindungen
sich 71 als relativ unreaktiv erwies.
76
Verbindungen
Messungen beeinträchtigte.
pH-Werten
69 umgesetzt.
Flavinen
Modellverbindungen wie
Esterbindungen
Genauigkeit
hohen
von
säulen-
Hydrochlorid isoliert
zu
Das
der
am
öffnen.
Aminoethyl-
werden.
3. Flavin-enthaltende
Schema 15.
Modellverbindungen
N(3)-Alkyl-N(10)-Aminoethyl-substituierten
des
Darstellung
Flavinderivates 70.
Npt
Phthalimido.
,NPt
Br'
NH;
71
175°C, 5h, 24%
N02
62
72
R
=
73
R
=
N02 —1 H2/Pd,
NH2-«-l
HOAc
RT, 50°C, 30h
B(OH)3
61
HOAc, RT, 16h, 47%
NPt
NH3CI
r1
NyNY°
rYY
konz. HCl
U, 4h,
^
92%
N
\
N.
R
o
70
Die in Schema 14 und 15
Herstellung
von
ausreichender
3.4
Kovalente
Die
=
R
=
H
—i
Etl, K2C03
Et -*J DMF, RT, 24h, 86%
es, die für die
Modellverbindungen benötigten Kofaktorderivate in
exzellenter Reinheit in
Verknüpfung
bzw.
Verestemngen
R
75
vorgestellten Syntheserouten ermöglichten
Flavin-enthaltenden
Menge und
74
wenigen Tagen Laborarbeit darzustellen.
der Dimer-
Amidierungen
und Flavinbausteine
der
Pyrimidin-Cyclobutandimer-
Dicarbonsäuren 41-43 und 52-53 mit den Flavinderivaten 69 und 70 konnte durch
Aktivierung
Carboxylate
der
mit
Castro's
Reagenz
(Benzotriazol-1-yloxy-
tris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphat, BOP) [342, 346]
Hierzu wurde zunächst eine der unter 3.1 und 3.2
DMF
gelöst.
Nach
Zugabe
vorgelösten Überschusses
von
BOP und eines
Chromophore nach Anregung
verfolgt
werden.
aus
der Flavmderivate 69
Zugabe einiger Tropfen NEt3 durchgeführt
bei 366
Danach wurde das
nm
hergestellten
werden.
Dicarbonsäuren 41-43 in
Löslichkeitsgründen
oder 70
erzielt werden.
konnte
in etwas DMF
die Reaktion durch
Durch die Fluoreszenz der Flavin-
konnte der Verlauf der Reaktion mittels DC gut
Reaktionsgemisch eingeengt
56
und das Produkt
aus
3. Flavin-enthaltende
abfiltriert. Restliche
CHC13/Ether gefällt und
(Kieselgel-//; CHCl3/MeOH-Gemische) gereinigt
Reaktionsansatz
100
etwa
Modellverbindungen 76-79 (Tab. 1)
Um
den
in
in
Medien
die
hergestellt,
Dimer nach
Vorschrift
obiger
Reinigung
Rohprodukte ergab
für eine
Mono(flavin)-Verbindung
Schema 16.
Darstellung
der
Verbindungen
asymmetrische Modellverbindungen
Dazu wurde die
zu
den
eingewogen
eingesetzten
und mit dem
Reaktionsgemisch
oder
(Kieselgel-Z/;
CHCl/MeOH-Gemische)
asymmetrische
84 in Schema 16
Pentylamin
zugesetzt.
der
jeweiligen Modellverbindungen 80-86
Modell Verbindung ist die
Synthese
der
aufgeführt.
Mono(flavin)-Modellverbindung
84.
O
O
H
1)1 eq70, BOP, NEt3, DMF,
2) 6 eq n-Pentylamin, 3h
H
HN
1h
»-
O
HO
die Löslichkeit der
Pentylalkohol
pro Ansatz etwa 30-60 mg der
Beispiel
erhalten.
Anschliessend wurden dem
verknüpft.
Benzylalkohol,
an
Säulenchromatographische
Als
auch
um
des Flavinderivates
equimolare Menge
exakt
Überschuss
(Tab. 1).
wurden
eine Kofaktoreinheit enthalten.
nur
Pyrimidindimeren
erhöhen,
zu
und
Bis(flavin)-
symmetrischen
zwischen den Flavineinheiten in
mögliche Stapel-Wechselwirkungen (stacking)
unpolaren
am
Auf diese Weise wurden pro
werden.
ausgezeichneter Reinheit
Modellverbindungen auszuschliessen [347]
ein
DMF wurden durch Trocknen
entsprechenden
der
mg
an
Rohprodukte säulenchromatographisch
Anschliessend konnten die
beseitigt.
Hochvakuum
Spuren
Modellverbindungen
I
H
H
25%
i
y
v
O
O
41
3.5
Synthese
der
Um den Verlauf
genau
verfolgen
zu
Spaltprodukte
von
Spaltungsexperimenten
können,
Spaltungsreaktion hergestellt
mussten
werden.
Die
zudem
mit den
obigen Modellverbindungen
die
erwartenden
Spaltprodukte
57
zu
Produkte
87-89 wurden in
Analogie
der
zur
3. Flavin-enthaltende
Darstellung
der
Modellverbindungen
ModeUverbindungen synthetisiert
Pyrimidin-Cyclobutandimer-Dicarbonsäuren
Carboxymethyl-Pyrimidine
Tab. 1.
Übersicht
46 und 55
aller Flavin-enthaltenden
und sind in Tab. 2
ModeUverbindungen
Ri
R2
80 Ri
R2
81
77
82
78
NH
j
J
H
Ri
monomeren
76-86.
76
x
Statt der
eingesetzt.
x
Lx.,
entsprechenden
die
wurden
aufgelistet.
83
S
o
58
R1
R2
Ri
R2
R!
R2
Ri
R2
R1
R2
=
o
=
H
=
Flavinyl
=
H
=
Benzyl
=
H
=
Pentyl
=
H
=
Flavinyl
=
H
=
Benzyl
=
H
=
Flavinyl
=
H
=
Benzyl
X
Ri
R2
84 R!
R2
85 R-|
79
R2
86
R-|
R2
=
NH
=
H
=
Flavinyl
=
H
=
=
=
Pentyl
CH3
Pentyl
=
CH3
=
Pentyl
3. Flavin-enthaltende
Übersicht der Flavin-enthaltenden Spaltprodukte 87-89.
Tab. 2.
x
87
Untersuchung
3.6
enthaltenden
3.6.1 Reduktion und
Lösungsmitteln
Die
Magnetstab
wie
H20,
führte
zu
50
pi
des
geleitet,
Dieser
werden
langwellige
Flavins
=
H
R
=
CH3
Flavin-
wurden
um
die
Vorgang
von
Übergang
Septum
Sauerstoff
zu
befreien.
(Flox)
zum
Die für ein oxidiertes Flavin
von
denen eines
vollständig
typischen
reduziertes
Ein sicheres Indiz für die
ist unter anderem für die
Somit
ModeUverbindungen
59
Die
Flavohydrochinon
aUem das Verschwinden des Maximums
(Abb. 16B).
und
konnte mittels UV/VIS- und Fluoreszenz-
wurden
vor
104 M
Dithionitlösung (lOfacher Überschuss)
abgelöst (Abb. 16A) [198].
ist
mit
von
Durch eine Kanüle wurde sodann 10
Lösung
(Abb. 16).
verantwortlich.
in den
in einer Konzentration
des Flavochinons
nm
Für erste
QuarzKüvette (1x1x3 cm)
abgeschlossen.
bei 370 und 450
Fluoreszenzlöschung
wurden
eine 3 ml
Flavin-Chromophors
oxidierten
R
89
Experimente
einer frisch zubereiteten 0.06 M
Flavins (300 und 370 nm)
Dieser
88
polaren
Lösungsmitteln
Spektroskopie gut verfolgt
nm.
NH
erwiesen sich als gut löslich in
in diesen
(FlredH2) [348] (siehe 1.5.1).
450
von
=
der Flavineinheit
einer schnellen Reduktion
Absorptionsbanden
H
Ethylenglycol (Etgly).
Lösung wurde in
Reduktion des
=
DMF oder
transferiert und luftdicht
von
R
X
ModeUverbindungen
min Stickstoff in die Küvette
Injektion
o
Spaltungsreaktion
Deprotonierung
ModeUverbindungen
gelöst.
der
=
synthetisierte ModeUverbindungen
Sämtliche
die
ModeUverbindungen
,
Fluoreszenz
einer
völligen
Flavin-Chromophore
reduziert
kommt
deren
ausgeprägte
um
es
zu
3. Flavin-enthaltende
ModeUverbindungen
36
O
Tr-rrr
250
400
350
300
X
Abb
16
H20
A
450
X
(nm)
(pH 7-10),
—
Fur
Losungen
B.
H2/Pd/BaS04.
—
Selbst der
aus
650
700
(nm)
Repräsentative UV-Spektren (18A) und Fluoreszenz-Spektren (18B) der Modellverbindung 84 in
84 reduziert (pH 3-5),
84 reduziert (pH 6),
84 reduziert
84 oxidiert (pH 3-10);
—
bei
pH
•
-
3-6 wurde 0 5 M
wurde 0.5 M Tris HCl Puffer verwendet.
ist
600
550
500
450
500
den
durch
pH-Werten
Fur
Zugabe
bei 366 oder 450
mit Hilfe
von
Änderung
pH-Bereich (pH 3-10) erfährt, ergaben
Losungen
bei
Na2S204
von
pH
7-10
oder durch
nm.
jeweiligen Modellverbindung
Zu diesem Zweck wurden
Während das oxidierte Flavin keine
untersuchten
verwendet
der Flavineinheit in der
ersichtlich.
84 bei definierten
erfolgte
Anregung
84 reduziert,
—
Protonierungsgrad
UV-Spektren
Verbindung
hergestellt.
84 oxidiert;
Zitratpuffer
Reduktion
wässrige Lösungen
Zitrat- bzw.
seines
der
TrisHCl-Puffern
UV-Spektmms
sich in der reduzierten
über den
Verbindung
kleine, aber signifikante Unterschiede (Abb. 16A). Damit wurde die in der Literatur [349]
mit einem
pKa
von
6.3
seine anionische Form
des
angegebene Deprotonierung
(FlredH~) bestätigt.
Isoalloxazingerüstes
ModeUverbindungen
0.1 M in der
Schütteln der
vollständigen
in
(siehe
1.5.1).
organischen
Küvette) beobachtet.
Deprotoniemng erfolgt
Die
Medien nach
gleiche
Zugabe
Reoxidation der
entsprechenden Lösungen
Wiederherstellung
Die
der
an
des reduzierten Flavins
von
an
der Stelle
Verändemng
30
pl
(FlredH2)
wurde
HOAc bzw.
ModeUverbindungen
und
Fluoreszenzspektren
N(l)
bei
NEt3 (=
konnte durch
der Luft erreicht werden und führte
UV-
in
zu
einer
der
oxidierten
unpolareren Lösungsmitteln
musste auf
Flavinspezies.
Die Reduktion der
einem alternativen
Weg
ModeUverbindungen
erreicht
in
werden, da sich die Lösung bei Zugabe
60
von
Dithionit trübte
3. Flavin-enthaltende
und damit die
für dieses
geeignet
Mengen
unten)
optische Transparenz
Unterfangen
Pd auf BaS04 als
an
erwies sich eine
Katalysator.
Dithionit-reduzierten mit
von
derselben nicht mehr
Durch
ModeUverbindungen
gegeben
Am besten
war.
katalytische Hydrierung
Vergleich
mit
geringen
Spaltungseffizienten (siehe
der
katalytisch hydrierten Lösungen
sichergestellt
konnte
werden, dass der Katalysator keinen Einfluss auf die Spaltungsreaktion hatte. Dithiol- und
Nikotinamidderivate führten ebenfalls
waren
jedoch aufgrund
beschriebenen
3.6.2
ihrer
zu
einer
Absorptionen
vollständigen
im Bereich über 350
Durchführung
Die Küvette
mit
den
von
jeweiligen Lösungen
ModeUverbindungen
ausgestattet
Daraufhin
war.
wurden
die
monochromatischem Licht einer definierten
Um
zu
überprüfen, ob
reduzierten Zustand
luftdicht
abgeschlossenen
was
wurden der
und in
zur
waren
einer
Reoxidation der
Die
Mengen
Auswertung
an
Lösungen
zwischen
350
in
festgelegten
Flavin-Chromophore
der
vor
Dies
und
von
50
kräftiges
der während der
H20/CH3CN
oder
Die Flussrate
betrug
der Proben einer
p.1
Spritze
entnommen
Schütteln der
Reaktionslösung
durch
nach
Quantifizierung
der
Bestrahlung
Spaltungsreaktion
von
zu
der
der
geschah mittels Umkehrphasen-HPLC (Reversed Phase
entstandenen
Spezies erfolgte
zeigt
84 in MeOH, die
zuvor
sehen ist die saubere
61
eine Serie
von
bei 366
nm.
HPL-Chromatogrammen
nm
Umwandlung
Die
durch einen
detektiert wurde im Normalfall bei 450
0.7-1 ml min"1. Abb. 17
bestrahlt wurde. Deutlich
der
Lichtkontakt geschützt wurden.
Spaltprodukten
H20/MeOH Gradienten,
Lösung
der
in der Küvette
HPLC, RP-HPLC) jeder einzelnen Probe mit einer Lichrospher 100-5 RP-18 Säule.
Trennung
nm
beobachtet.
Reoxidation
dass die Proben der
mit
in ihrem
Reoxidation
sofortige
Spaltungsexperimente erfolgte
Ausgangsverbindung
ModeUverbindungen.
sichergestellt,
die
nm
450
Mit Hilfe einer
war.
Luftzufuhr und
hatte
Rühren
und
Bedingungen
Zeitintervallen Proben
transferiert.
Es wurde
die
jedoch
mehr als ausreichend
Magnetrührer
Bestrahlung
während der
verhinderten
deprotonierten
heftigem
unter
WeUenlänge
Vortex-Schüttelapparatur
Folge.
zur
und
das mit einem
für etwa eine Stunde reduktive
Experimente
Reaktionslösung
Flavineinheiten
bis
für die
mit
reduzierten
eingesetzt,
Verbindungen
Küvetten
Irru-Eppendorfer-Gefässe
Lösungen
die
der
verbleiben, wurde gleichzeitig die Emission bei 520
Flavineinheiten. Somit
garantiert,
Folgenden
Spaltungsexperimenten
wurde in ein Fluorimeter
Die
für die im
nm
Spaltungsexperimente ungeeignet.
Generelle
bestrahlt.
Reduktion der Flavineinheit,
der
nach
obiger
Prozedur
Ausgangsverbindung
3. Flavin-enthaltende
ModeUverbindungen
(Retentionszeit (Rt): 17 min)
des
88 mit Proben
Spaltproduktes
sich bei dem im
in ein
Produkt
neues
aus
den
synthetisierten Spaltprodukt
um
ein und diesselbe
wurden
Verbindung
2) Die
des
Tatsache,
dass
keine
Spaltungsreaktion
366
bei
nm
in
Flavinderivaten in Konzentrationen bis
strikte Intramolekularität des
Es
war
von
oxidierten
somit
DNA-Reparatur
nm
durch
Gegenwart
zu
handelte.
führten sowohl in An- als
von
in den
ModeUverbindungen ergab
ersten
oxidierten
Der
lichtgetriebenen Spaltungsreaktion
allen drei Redoxstufen sehr
Art
eingehen (siehe 1.5.1).
Bestrahlungsexperimenten
ist
photoaktiv
saubere
Uracil
reduzierten
ModeUverbindungen.
keinerlei
Spaltung.
verblüffend,
für die
die sich durch den Einsatz
Umsatz
wenn
der
man
an
das
von
von
der Natur
Modellverbindung
in
der
bedenkt, dass Flavine in
sind und gerne Nebenreaktionen unterschiedlichster
Auch bei allen weiteren
keine
oder
funktionstüchtigen ModeUverbindungen
DNA-Photolyasen herzustellen,
anlehnen.
des
Bestrahlung
unverbrückten Dimeren sowie des relevanten Kofaktors zudem stark
vorgegebene System
zur
10"3 M beobachtet werden konnte, beweist die
Spaltungsprozesses
gelungen, die
durch
unabhängig
Flavin-Reduktion verwendeten Reduktionsmittel nicht
zur
es
Cyclobutanrings.
Cyclobutandimers 41
3) Bestrahlung
dass
durchgeführt:
1) Bestrahlung des Uracil Cyclobutandimers 41 bei 366
Cycloreversion
min). Koinjektion
entstandenen Produkt und dem
Folgende weitere Kontrollexperimente
auch in Abwesenheit der
7
Spaltungsexperimenten ergab eindeutig,
Bestrahlungsexperiment
88
(Retentionszeit (Rt):
Nebenprodukte
Zeitabstände der Probenentnahme verrät
ModeUverbindungen
detektiert werden.
konnten in den
Ein Blick auf die
ausserdem, dass schon in wenigen Minuten ein
guter Umsatz erzielt werden kann. Einer systematischen Untersuchung der Abhängigkeiten
der
Spaltungsreaktion
stand damit nichts mehr im
62
Wege.
3. Flavin-enthaltende
o
1) Reduktion
2) Bestrahlung
3) Reoxidation
o
ModeUverbindungen
o
HN
if" Hvfl
NH
H H
o
o
84
115-,
5
10
15
20
Retentionszeit (min)
Abb. 17.
Bestrahlungsexperiment der Modellverbindung
der Flavineinheit wurde mit
durch
Zugabe
von
30 ul
H2
und
Pd/BaS04 erreicht.
NEt3 garantiert. Injektion
von
84 in
Die
je
MeOH(10"4 M)
Deprotonierung
25 ul der mit
bei 366
Retentionszeiten:
H20 / B
MeOH);
Rt (88) 7.3 min; Rt (84) 17.4 min.
=
=
63
Die Reduktion
02 reoxidierten Proben.
(Säule: Lichrospher 100-5 RP-18; Gradient: 0-9 min 55% A / 45% B; 9-25 min 80%
min 80-H>55% A / 20->45% B (A
nm.
des reduzierten Flavins wurde
RP-HPLC
A / 20%
B; 25-30
Detektion bei 450 nm; Flussrate: 0.7
ml/min).
3. Flavin-enthaltende
3.6.3
Bestimmung
Die
ModeUverbindungen
der Ouantenausbeute der
Spaltungsreaktion.
Quantenausbeute einer Reaktion ist
umgesetzten Moleküle und der Anzahl der
von
als
definiert
der
Quotient der
Reaktionslösung
Anzahl
der
absorbierten Photonen
(siehe Gleichung (6)).
Um letztere
Lichtstrahls
zu
bestimmen,
berechnet
werden.
Arbeit für die
vorliegenden
der Photonenfluss des auf die Küvette treffenden
muss
Der
Photonenfluss
durch
Bestrahlungsexperimente
Grundlage
dieser
Methode
Phenanthrolinkomplexes
Wellenlängenbereichs
Oxalatlösung Fe(II) generiert.
grossen
der
Wellenlängenbereich
Bestrahlung
Reaktionszeit auf die
wird
nach
Da die
tabelliert
Anschliessend
sind, kann
wurden in
aquamaringrüne Kristalle
Ferrioxalat-Aktinometer
Synthese
und
Des
weiteren
der
C2042"
+
Reaktionslösung
g
folgende
360 ml 1 N
H20).
Lösungen
Fe(II)-
einer
Fe(III)-
Quantifizierung
Absorption
der während
des
die
Fe(II)-
während
+
der
2C02
Aktinometerlösung hergestellt: FeCl3
20
h
bei
0
und 1 h bei RT
°C
gehalten,
Umkristallisation
in
analysenreiner
Stammlösungen
Eichgeraden
wurde
HzO);
11
unterschiedlicher
in
1
1
Form.
die Linearität des
bestimmt
FeS04-Konzentrationen
64
N
gerührt.
wobei
Die
sich
den
gesamte
durchgeführt.
angerichtet:
0.1
und 3
H20 ergab
aus
H2S04);
Aktinometerpuffer (600
Fe(II)-Phenanthrolinkomplexes K2Fe°(C12H8N2)3
wurden
des
mit Licht eines
aus
schliessen,
2Fe2+
-»
K3Fe(C204)3-3H20
mg in 100 ml
Mittels einer
konnte
sehr schwache, nicht im
Bestrahlung
die
Photonen
Zweimalige
Phenanthrolinlösung (150
H2S04,
nur
des Aktinometers wurden unter Lichtausschluss
wurden
40 ml
durch
(über
hv
K3Fem(C204)3-3H20
Aktinometerlösung (2.947
Absorption
H20 gelöst, zusammengegeben
bildeten.
Aufarbeitung
man
Fe(II)-Ionen
Fe3++
2
die
starken
Durch
der
trafen.
Lösung
wurde
in
[350-352] bestimmt werden.
Reaktionsgleichung (4)
Zu diesem Zweck wurde zunächst die
Äquivalente K2C204
des
Quantenausbeuten dieser Reaktion in einem relativ
auf die Anzahl
(4)
der
bilden.
Komplexe
entstandenen
Phenanthrolinkomplexes)
auf
510 nm, während Fe(III)-Ionen
um
sichtbaren Bereich absorbierende
breiten
beruht
Küvette
verwendeten Fluorimeters
mittels Ferrioxalat-Aktinometrie nach Hatchard und Parker
Die
die
0.006
M
0.15%
o-
ml 1 N
NaOAc,
Extinktionskoeffizienten des
[351]
in
(Abb.
18).
Dazu
o-Phenanthrolin-haltigem
3. Flavin-enthaltende
eine halbe Stunde im Dunkeln
Aktinometerpuffer
Absorption
bei 510
einer Konzentration
vier
ersten
nm
10"4
Phenanthrolinkomplexes
M
auf
wurde
Konzentration
Aktinometerlösung (3 ml)
(Fe(II) Produktion
bestimmten
zusammen
im linearen
bei
wurde in die Küvette mit
Bereich)
B. 366
Wellenlänge (z.
gegeben und mit H20
nm) bestrahlt.
Konzentration
Magnetstab,
Absorption
Aktinometerlösung
für jede
und 0.5 ml
Fe(U)-
1-3 min
lang
bei einer
wurde dann 1 ml
Aktinometerpuffer
in einen
Anschliessend wurde die
Lösung
bei 510
nm
bestimmt.
ebenso verfahren.
Bestrahlungszeit
65
Lösung
an
welche auch für
kräftigem Rühren
Von dieser
auf 10 ml verdünnt.
30 min im Dunkeln belassen und die
Wellenlänge und
des
i-1>
I"')
steigender
im Fluorimeter unter
o-Phenanthrolinlösung
wurde mit 1 ml unbestrahlter
der
16
14
Spaltungsexperimente verwendet wurde, gegeben und
mit 2 ml 0.15%
Messkolben
für jede
12
Bildung des Fe(II)-Phenanthrolin-Komplexes
gleichbleibender Menge an Phenanthrolin.
die oben beschriebenen
nur
Extinktionskoeffizient
der
5/—,
Fe(ll) /10"° (mol
Abb. 18. Linearität der
Die
Berücksichtigung
zu
1.1010"4 M"1 (Lit.: 1.11-104 M1 [350]) bestimmt.
10
Ionen und
Unter
Fe(II) gegeben ist.
Eichgeraden
der
Punkte
Danach wurde die
Aus Abb. 18 ist ersichtlich, dass die Linearität bis
gemessen.
von etwa
stehengelassen.
ModeUverbindungen
Als Referenz
Diese Prozedur wurde
mindestens fünfmal wiederholt.
3. Flavin-enthaltende
ModeUverbindungen
Der Photonenfluss
(bzw. die Lichtintensität) geht
(5)
L
A"
=
Vi'V3
aus
Gleichung (5)
[Einstein
hervor:
min"1]
e-O^t-Vj
A
V[
V2
=
Absorption
=
bestrahltes Volumen
=
V3
=
t
=
<&x
=
£
=
Phenanthrolinkomplexes nach Bestrahlung der Aktinometerlösung
derAktinometerlösung in ml
Volumen der entnommenen bestrahlten Aktinometerlösung in ml
Volumen des Messzylinders in ml
Bestrahlungszeit in min
Quantenausbeute der Fe(II)-Produktion bei der BestrahlungsWellenlänge
Extinktionskoeffizient des Fe(II)-Phenanthrolinkomplexes bei 510 nm in ml mol"1
Für
eine
Absorption
ml:
V3
=
dreiminütige Bestrahlung
des
Phenanthrolinkomplexes
10 ml;
Photonenfluss
Tab. 3.
des
e
=
von
zu
1.10-107 ml mol"1 0366
I0(366)
=
=
des
Aktinometers
A
0.626 bestimmt.
=
1.20
[350];
t
=
bei
3 min
366
Mit
Vj
ergibt
wurde
nm
=
3
sich
-
folglich
=
1
ein
4.83 -10"7 Einstein min"1.
Photonenfluss einer Osram 1907 450W
Xenon-Lampe (Typ XBO OFR) im 5/>ex-Fluorimeter
Aktinometerlösung wurde in Analogie zu den Bestrahlungsexperimenten stark
Wellenlange; A Absorption; <I> Quantenausbeute des Aktinometers; I0 Photonenfluss.
(2mm Schlitzbreiten).
gerührt. X
ml; V2
die
Die
=
=
=
À, (nm)
A
4>
In (E-min *)
360
0.614
1.21
4.70-10"7
370
0.640
1.20
4.94-10"7
380
0.650
1.18
5.10-10'7
390
0.605
1.16
4.83-10'7
400
0.666
1.15
5.36-10"7
410
0.579
1.14
4.70-10"7
420
0.598
1.12
4.95-10"7
430
0.538
1.11
4.48-10"7
440
0.467
1.10
3.93-10"7
450
0.461
1.09
3.91-10"7
66
3. Flavin-enthaltende
Zur
der
Bestimmung
die Flächen unter den Edukt-
Integration
HPLC-Anlage
(Edukt
(1
=
und
Produkt) geteilt.
des Detektors
monoexponentieUe
Zunahme des
Spaltproduktes
88
der
von
Edukt oder
wurden gegen die
Modellverbindung
bestätigten
der
Die auf diese Weise
Ausgangskonzentration)
aufgetragen (Abb. 19). Monoexponentielle Abnahme
wurden
HPL-Chromatogramm durch
wurden die relativen Werte bestimmt, d. h. die Flächen
standardisierten relativen Konzentrationen
erster
Spaltungsreaktion
Lichtintensitätsschwankungen
von
Produkt wurden durch die Gesamtfläche
Zeit
im
Produkt-Peaks
bzw.
Aufgrund
ermittelt.
k der
Geschwindigkeitskonstanten
ModeUverbindungen
einen
84 bzw.
Reaktionsverlauf
Ordnung.
1u
0.9^
0.8^
:
r
0./-
o
*-*
CO
_
0.6-^
4—»
c
CD
N
r
0.5-
o
-
^
0.4-
Cl)
1_
0.3^
0.2-
0.1-j
0^
0
2
4
6
10
8
t
Abb. 19.
88
in
Exponentieller
Abhängigkeit
12
Bestrahlungszeit (1
=
~
aus
Berechnung
der Definition
der
18
20
Modellverbindung
von
Ausgangskonzentration).
Anpassungen ergeben eine relative Geschwindigkeitskonstante
X ist direkt vom Schnittpunkt der beiden Kurven ablesbar (x
Die
16
(min)
Verlauf der relativen Konzentrationen
der
14
von
17
k
=
84 und
Spaltprodukt
Die
monoexponentiellen
4.06-10"2 min"1. Die Halbwertszeit
min).
Quantenausbeute der Spaltungsreaktion lässt sich relativ leicht
(6) herleiten,
da in
unserem
denselben Extinktionskoeffizienten aufweisen.
67
Fall Edukt
(E) und Produkt (P) der Reaktion
ModeUverbindungen
3. Flavin-enthaltende
dcß/dt Umsatz von E
Oe Quantenausbeute der Photoreaktion
=
=
E
E
P
I0
I
(6)
cDEb
=
dt
iE
.
Lichtintensität beim Verlassen der Küvette
=
IE
I
=>
Iep
=
absorbierte
E absorbierte
cE,cP
Konzentrationen
=
dcE
=
~dT
k
•
c„
des Edukts
=
=
=
Geschwindigkeitskonstante der Photoreaktion
Volumen des Reaktionslösung
cE-d
+
ep-cp-d
I0-(1-10B)
=
I0-ü-10-E)
=
eE-
10"E
I0
<E»b
=
Edukt und Produkt
Schichtdicke der Küvette
d
k
-1
=
1-10
Ie =Io
V
•
von
Edukt und Produkt
von
Ausgangskonzentration
1-10
Ir
=
=>
Lichtmenge
Lichtmenge
Extinktionskoeffizienten
I0
=
von
=
log (Ir/T)
=
=>
Die
=
=
V
E
insgesamt
=
eE,eP
c0
Lambert Beer.
Lichtintensität beim Auftreffen auf die Küvette
=
IEP
dec
—-
Extinktion
=
•
E/E
-EA
(eE- cE-d
+
eP-cP-d)
-E
eE-
•
Ir
cE-d
k
cDE
•
c„
•
k
V
Cp
•
•
V
=
1-10"
eE-
Sonderfall:
eE
eP ; c0
=
=
cE+cP
k
$B
•
E
=>
Cr
ein,
so
eE
4900
=
Wert
ergibt
ist
alle Grössen in die
l-mol"1-cm"1;
etwa
d
100
Spaltungsexperimenten
=
+
eP-cp-d
-eE-c0-d\
1 cm; V
=
mal
von
=
höher
eE"
Gleichung
4.06-10"2 min"1; c0
0.003 1 eine
als
die
Cyclobutandimeren
Konzentrationsbereich gemessen worden sind
68
cE-d
zur
eE-c0-d
•
V
Io-fl-lO^E'^
der
Berechnung
10"4 mol-1"1;
=
=
k•Cn
•
sich für k
cE-d
V
•
eE-c0-d
nun
eE-
=
4-10
Setzen wir
=
cE-d
I0(366)
=
Quantenausbeute
Quantenausbeuten
4.83-10"7
von
Quantenausbeuten,
mol-min"1;
etwa 4%. Dieser
die
bisher
in
mit Flavinen als Sensibilisatoren in diesem
[261]
!
3. Flavin-enthaltende
Es sei erwähnt, dass alle für die kinetische
mindestens
dreimal
Quantenausbeuten
Untersuchungen
In den
±15%.
wiederholt
für
wurden
über
Aussagen
verwendet wurde.
einer Messreihe diskutiert, die eine exzellente
Kontrollexperiment ergaben,
im Bereich
10"3-10"5
M
der
den
werden
der
Kapiteln
berechneten
beschriebenen
Quantenausbeuten liegt
jedoch
im Bereich
relative Werte innnerhalb
nur
Reproduzierbarkeit aufwiesen.
der
Messungen
dass diese für die
O
Quantenausbeute
Spaltungsreaktion
konzentrationsunabhängig
Wechselwirkungen der ModeUverbindungen
Mittelwert
nächsten
Der Fehler dieser
nachfolgenden Experimenten
Konzentrationsabhängige
in
die
verwendeten Messreihen
Auswertung
und
ModeUverbindungen
(Abb.
war
sind dadurch
von
als
weiteres
ModeUverbindungen
Intermolekulare
20).
auszuschliessen.
endgültig
5-/1
4-
2.9
2.9
1
1
1
O
3.3
3.0
2.8
1
2-
0^
10
-3
5x10"*v4
10"*\-4
5x10"
Konzentration
Abb. 20.
Konzentrationsabhängigkeit
der
Spaltungseffizienz
(mol
der
10"
I"1)
Modellverbindung
Die Reduktion
erfolgte mit Dithionit oder durch katalytische Hydrierung.
Quantenausbeuten lagen innerhalb des Messfehlers.
nm.
3.6.4 Die
Abhängigkeit
der
Spaltungsreaktion von
Bisherige Messungen
Reversion
des
Konstitutions-
sehr unterschiedlich sein kann. Die
nach Art des verwendeten
[264],
in
Chloranil [301] oder
dass die
und
Phenanthren/Dicyanobenzol [129, 296]
für die
von
Ergebnisse divergierten jedoch
stark
Während Anthrachinonsulfonat
Dicyanoanthracen [263, 298]
besser
Spaltungsrate
Konformationsisomeren
Modellsystems (vgl. 1.6).
trans-syn-koxiüguxiexten Dimere
Etgly bei 366
Schwankungen der
in
der Struktur des Dimers
Modellsystemen ergaben,
Cyclobutanringes
Pyrimidindimeren
je
an
84
Die
als Photosensibilisatoren die
reparieren konnten, ergaben Experimente
oder
Pulsradiolyse [279]
69
bessere
Spaltung
mit
der cis-
3. Flavin-enthaltende
ModeUverbindungen
Dimere.
syn-konfigurierten
einigen wenigen Modellsystemen
In
konstituierte Dimere revertiert werden [265, 298].
dass
Photolyasen trans-syn-Dimtx&
wurde auf die
nur
mangelhafte Bindung
sogar anti-
konnten
Enzymatische Untersuchungen zeigten,
schlecht
Dies
können [353, 354].
reparieren
Enzymtasche zurückgeführt
dieses Isomers in die
[354].
Da, wie in 3.1 beschrieben, aUe Isomere
zur
Verfügung standen, konnte
sensibilisierten
Spaltungsreaktion
und nach
obigem
Quantenausbeuten
der
von
Eindeutig
Um
Aus
die
um
in
den
Modellverbindungen
die
bei
und EtOH
unreaktiv
cis-synwar
die
anri-konstituierte
waren.
wurden
auszuschliessen,
die
wiederholt, sie brachten qualitativ dieselben
vergleichbaren Quantenausbeuten
gleichbleibender
die
effizient
während
Uracildimeren,
frappante
Isomeren
weniger
Etgly
dass die
zeigt,
Spaltungsrate zeigten
Etwa zehn mal
Lösungsmitteleffekte
CH3CN
Abb. 21
verschiedenen
schnellste
0.04.
76-78 und 80-83 in
vermessen.
gewählten Bedingungen völlig
mögliche
Spaltungsexperimente
Ergebnisse.
für
trans-syn-koxxLiguxiextuxi
Uracildimere unter den
und Konformation des Dimers
ModeUverbindungen
nm
Pyrimidindimeren
der intramolekular Flavin-
Abhängigkeit
Konfiguration
Verfahren bei 366
Uracildimere mit Quantenausbeuten
von
der
Spaltungsreaktion
Unterschiede aufweisen.
Reversion
erstmals die
Dazu wurden die
untersucht werden.
gelöst
nun
funktionalisierbaren
von
Struktur
des
von
Mono-
Dimers
und
kann
man
Bis(flavin)ausserdem
schliessen, dass Stapel-Effekte zwischen den Flavm-Chromophoren vernachlässigbar sind
und nicht für die beobachtete
Abhängigkeit
Dimeren verantwortlich sind.
Variation der Konzentration der
der
Spaltungsreaktion
von
der Struktur der
ModeUverbindungen (10"3-
10"5 M) sowie Bestrahlung mit Licht anderer Wellenlängen (350-450 nm) ergab keine
Veränderung
der
Ergebnisse.
Auch
ein
Vergleich
konfigurierten Thymin-Modellverbindung (85
Stabilität des
vs.
trans-syn-Thyrrrin-Cyclobutandimers
angeregte Flavineinheit zutage.
70
der
86)
bei
cis-syn- mit
brachte
reduktiver
eine
der
trans-syn-
deutlich
Spaltung
höhere
durch
die
3. Flavin-enthaltende
ModeUverbindungen
0
u
iji
°
h h
n
H H
u
cis-syn
0
?
H H
HN^f—V^NH
O
in
u
in
H H
u
trans-syn
82
81
83
80
78
Mono(flavin)Modellverbindungen
Abb.
21.
77
76
U
J
H H
|
Bis(flavin)ModeUverbindungen
trans-anti
Abhängigkeit der Quantenausbeute von der Konstitution und Konfiguration des UracilZur Veranschaulichung sind neben dem Diagramm die einzelnen Pyrimidindimervisualisiert: cis-syn (76, 80, 83); trans-syn (77, 81); trans-anti (78, 82). Die Bestrahlungen der
Die
Cyclobutandimers.
Isomere
104 M Lösungen wurden in Etgly bei 366
Lösungen
gewährleisten.
durch Dithionit.
Flavins
zu
Die
nm
Die Reduktion der Flavineinheiten
durchgeführt.
enthielten zusätzlich 30
|rt NEt3,
um
die
Deprotonierung
Aufgrund des positiveren Reduktionspotentials (vgl. Abb. 8)
auf das
Elektronenübertragung
das
frans-syn-konfigurierte
cis-syn -konfigurierte Dimer (Ered
Elektronentransfer des
reduzierten
geschwindigkeitsbestimmende
mussten.
Dies ist im
[260] und
der
und
des
Abstossung
der
in
im
Dimer kann
V) und nicht auf
Der intramolekulare
demnach
106
~
bestimmt wurden.
Quantenausbeuten
nicht
sonst schneller
s"1) [282],
(kET
=
der
Spaltung
spalten
109
die mit Hilfe
Deshalb müssen sich
von
der
s"1)
von
mögliche
cis-syn- und
Öffnung des Cyclobutanrings konzentrieren.
einleuchtend, dass
Cyclobutanrings
-1.7
=
[258].
erwarten
auf das
ist eine schnellere
mit den schnellen Elektronentransferraten
DNA-Photolyasen
auf die
(Ered
sein, da die trans-syn-Dimexe
für die unterschiedlichen
trans-syn-Dimexcn
Es ist
zu
langsamen Cyclobutanringöffnung (kSP
Modellsystemen
Erklämngen
V)
Flavins
Schritt
Einklang
-2.2
=
Dimer
erfolgte
des reduzierten
aus
themiodynamischen
cis-syn-Dixn&x
diesem
Fall
zu
erwarten ist.
Gründen eine einfachere
Die sterische und elektrostatische
übereinanderliegenden Pyrimidinringe
71
Öffnung
hat
sicherlich
3. Flavin-enthaltende
Auswirkungen
ModeUverbindungen
auf die
keine solchen sterisch und elektronisch
Thermodynamik jedoch einen
muss
syn- und
in
das
uns
wohl doch
günstigere Verzerrung
der
die entscheidende Rolle
könnte auch eine
relevanten Molekülorbitale
von
zeigen
trans-syn-Dimexon
Bindung
Reparaturrate
Da
beeinflussen.
ist
sind,
vorliegenden Ergebnisse,
durch
DNA-Photolyasen
diese
bei
Form
der
ModeUverbindungen
Verbindungen
der
Katalyse
Flavin-vermittelten
78
und
83
des
der
völligem Einklang
der
mit
davon
für
mit
Einklang
geringe Spaltungseffizienz
zurückzuführen ist.
des
Das
Enzym
aktiv
Cyclobutandimers
cis-syn-Cyclobutandimere konzipiert
£rafts-syft-konfigurierte
Spaltung
unproduktiven
sich
Cyclobutandimere
gering
Spaltungsraten
von
ausgehen, dass die
ekliptisch angeordneten Methylgruppen
des
für eine
an
die
Flavin auf das Dimer
vom
des
Folglich
ist die
Cyclobutanrings,
Befund steht.
Thymindimeren
erhöhte sterische
im FaU der
welche
syn-
through bond coupling
Öffnung
Ausklammemng
72
entsprechenden
verhindert werden.
Uracil- und
man unter
den
Nach dem
Delokalisierung
zu
von
anft'-konstituierten
C=0-Gruppe (C(4')=0),
obigem experimentellen
Auch in diesem Fall könnte
Konzepts
Enzyms
Cyclobutanring
C(5)-C(5')-Bindung
Vergleich
in
nicht ausschliesslich auf die schlechtere
unterscheiden
sollte dadurch eine effektive
Schwächung
3.6.5 Ein
die reduktive
zusammengefasst sind.
dass die
Cyclobutanringes angrenzt.
Elektrons über den
in
im Fall
möglich.
übertragenen
was
für
ins
müsste im Fall des
auch
steht
Verzerrung
durch das Fehlen einer zweiten
C(5)-C(5')-Bindung
Konzept
zusätzliche
DNA-Photolyasen eigentlich
wahrscheinlich nicht
Die
durch
Cyclobutanrings
Überlappung der für
die in Abschnitt 3.6.6
dieses Isomers in der aktiven Stelle des
die
könnte
die
Die
Postulat
Dieses
quantenchemischen Berechnungen,
Jedenfalls
spielen.
des
7t*(C(4)=0) und <y*(C(5)-C(5'))
sein.
günstiger
cis-syn-Isoxatxs
gering.
zu
vorgestellte through bond coupling-Konzept
1.6.3
so
Spaltung
Ob die
erfahren.
Unterschiede zwischen cis-
thermodynamischen
Gedächtnis zurück,
cis-syn-Dimexe
trans-syn-Dixnex sollte
Spaltungseffizienz ausübt,
derart grossen Einfluss auf die
^rarcs-syn-konfigurierten Dimeren
Rufen wir
Das
ungünstigen Wechselwirkungen
werden. Dazu sind die
angezweifelt
(vgl. 1.6.5).
der Reaktion
Exergonizität
des
through
Wechselwirkung
bond
coupling
zwischen den
cw-^y«-Thymin-Modellverbindung
85
3. Flavin-enthaltende
im
Vergleich
85
zur
coli
In der Tat
nicht
Cyclobutandimer enthielten,
eine erhöhte
für die
Oligonukleotiden (<D366(ToT)
=
Überraschenderweise
Modell Verbindung 84
enthaltende
ein
Photoreaktivierung
aber
ausgearbeitet,
85.
Bestrahlung
bei
366
entstanden
reoxidierten Proben
(Rt
(Rt
=
20
8
=
min)
schneller als die
Um diesen Befund
zeigen
(Rt
=
84. Die
89
Dazu wurde eine
Ansonsten wurde das
durchgeführt.
DeutUch
etwa
(Abb. 22B).
zu
Die
Spezies,
erkennen
könnte
es
sein,
Methylgruppen,
den induktiven
die
ist
es
dass
zu
die
Der
so
3.6.4
ModeUverbindungen
Dimerspaltung
die
Faktor
sterisch
ungünstige
Spaltung
die
6
=
min)
der
der
und 8 9
Spaltung
jedoch
Spaltprodukts
der
in
für diesen Befund.
Thymindimers
zu
auch
88 im
anderen
sind dadurch auszuschliessen.
Wechselwirkung
des
und damit
Thymindimer
sollte
während
schnellere
zwei wurde
Erklämngsmöglichkeiten
Reduktionspotentials
festgestellt haben,
der
ModeUverbindungen
schnelle Zunahme des
ungefähre
einer schnelleren
der Flavineinheit auf das
Ein HPLC-Gradient
der zeitlichen Zunahme der relativen Konzentration
doppelt
mehrere
mit
Lösung
HPL-Chromatogramme
(+1) Effekt der Methylgruppen übertroffen wird.
einer Abnahme des
von
gibt
den
Bestrahlungsexperiment
nämlich die
Lösungsmitteln bestätigt (Abb. 23). Lösungsmitteleffekte
Grundsätzlich
mit
untermauern, wurde zusätzlich
zu
min) sowie ihre Spaltprodukte 88 (Rt
Auswertung
Spaltprodukte ergab eine
zu
erlaubte.
23
sondern auch
entsprechende Thymindimer-
Basislinien-Trennung
die vier erwarteten
min) (Abb. 22A).
Vergleich
vollständige
beschrieben
und 85
Uracilverbindung
der
Spezies
oben
wie
nm
die
in der
Die Uracidimer-enthaltende
ModeUverbindungen in Etgly angerichtet.
der
Thymin-
Thymindimer-enthaltenden
von
Resultate.
Kompetitionsexperiment durchgeführt (Abb. 22).
wurde
2-107),
=
Spaltungsexperimente
umgekehrte
spaltete signifikant
beider
ein
Thymindimers
des
Bindung
DNA-Photolyase
oder
Uracü-
5-107 M-l; Ka(UoU)
zeigten
Modellverbindung
äquimolaren Mengen
84
=
ein
der
an
0.9; 0366(UoU) =0.6) [118].
84 und 85 genau
ModeUverbindungen
entweder
eine bessere
nur
Enzyms (Ka(ToT)
Quantenausbeute
die
für
gesteigerte Spaltungsrate
ergaben Reparaturstudien
Oligonukleotiden,
mit
aktiven Stelle des
84 eine
cw-syn-Uracil-Modellverbindung
haben sollte.
Folge
E.
aus
der
zu
ModeUverbindungen
Erstens
zwischen
führen
den
sollte, durch
Dieser Effekt führt
zu
einer erschwerten Aufnahme des
transferierten Elektrons.
Wie wir bereits unter
in den im Verlauf dieser Arbeit
verwendeten
Übertragung des Elektrons nicht entscheidend für die Effizienz der
sein.
73
3. Flavin-enthaltende
Abb. 22. A:
Etgly.
HPL-Chromatogramme
Die Reduktion
wurde durch
jeweils
ModeUverbindungen
Zugabe
Kompetitionsexperiments mit 84 (10~5 M) und 85 (105 M) in
Zugabe von 25 ul 0.06 M Dithionitlösung. Die Deprotonierung
NEt3 erreicht. Die Bestrahlung wurde bei 366 nm durchgeführt. Es wurden
erfolgte
von
10 ul
70 ul-Proben entnommen.
20->80% A / 80->20%
HPLC-Gradient: 0-25 min 80->50% A / 20->50% B; 25-30 min
B; 30-35 min 80% A / 20% B (A
Flussrate: 0.7 ml/min.
Monoexponentieller
eines
durch
Retentionszeiten: 88
(6 min);
Fit der relativen Konzentration der
=
H20
89
/ B
=
CH3CN).
Detektion bei 450 nm;
(8 min); 84 (20 min); 85 (23 min).
Spaltprodukte
Falls die Flavineinheit für den Elektronentransfer in van-der-Waals-Koxitakt
Dimer kommen muss, könnten die
Aus
in
Erfahrung weiss
man
Methylgruppen
von
wenn
Donor und
aber, dass der überwiegende Anteil der transferierten Elektronen
überhaupt,
Akzeptor
zum
des Thymins dies deutlich erschweren.
vergleichbaren intramolekularen Systemen vorzugsweise
bond) und,
B:
88 und 89 in Funktion der Zeit.
nur zu
einem
oder über das
geringen
durch die
Bindungen (through
Anteü durch van-der-Waals-Koxitakt
Lösungsmittel (through space)
[307, 311, 355-361].
74
vermittelt werden
3. Flavin-enthaltende
Wir erklären die
experimentellen Befunde wiederum über
und damit über die unterschiedliche
Thymindimeren.
und
Molekülorbitale
das
ModeUverbindungen
through
bond
Verzerrung (puckering) des Cyclobutanrings
Ein durch die
Mefhylgruppen ausgelöster,
ungünstiger Ring-pucker
könnte die Kinetik der
für die
in Uracil-
Überlappung
Spaltungsreaktion
Erneut wurde dieses Postulat durch die in Abschnitt 3.6.6
beeinflussen.
coupling
der
stark
aufgeführten
quantenchemischen Berechnungen unterstützt.
LM
H20/pH8
DMF
Etgly
EtOH
EtOAc
8
78.3
36.7
37.7
24.6
6.0
Abb.
23.
Quantenausbeuten
eines
Kompetitionsexperiments
Lösungsmitteln. Reduktion
Zugabe von 10 \\\ NEt3. Bestrahlung bei
Dielektrizitätskonstanten e angegeben.
verschiedenen
3.6.6 Ouantenchemische
Um
in
den
unsere
[301]
und
Hypothese,
dass
[129]
für
nm.
(10~5 M)
84
und
von
aüem der unterschiedlich verzerrte
experimentell beobachteten
die
zu
angesteUten
Gedächtnis. Demnach wird das
Elektron
vor
verantwortlich sind,
Rose
366
mit
85
(105 M)
in
Hydrierung mit Pd/BaS04. Deprotonierung durch
Unter den Lösungsmitteln (LM) sind zusätzlich die
Berechnungen
ModeUverbindungen
Spaltungsraten
durch kat.
H20/pH3
überprüfen,
rufen wir
uns
Unterschiede
noch einmal die
Molekülorbital-theoretischen
der Flavineinheit auf das
Cyclobutanring
Überlegungen
Pyrimidindimer
vorzugsweise das 7U*-Orbital der C(4)=0-Bindung besetzen. Durch
dieses 7t*-Orbitals mit dem a*-Orbital der
C(5)-C(5')-Bindung
75
von
der
Pac
ins
transferierte
Überlappung
wird Elektronendichte über
3. Flavin-enthaltende
den
Cyclobutanring
delokalisiert. Die daraus resultierende
Öffnung
erleichterten
relevanten
der
ModeUverbindungen
der
C(5)-C(5')-Bindung.
entscheidenden
Orbitale
Kristallstrukturen der
cis-syn-
findet sich ein Unterschied
Da die
der
des
Berechnungen
wurden
durchgeführt..
von
Dazu
Röntgenkristallstrukturen
wurden
als
Laut den
stark
bestimmt
die
aus
erwartet
in
den
(Abb. 13),
der
so
mit
von
Prof.
der
U.
P.
Wild
vorliegenden
für die ab initio berechneten neutralen und
Pyrimidindimere
verwendet. Die
sind in Tab. 4
C(5)-C(5')-Bindung
signifikante Schwächung.
des
quantenchemischen
Die
Gruppe
Geometrie
Pyrimidindimeren
von
[362].
aus
den
Berechnungen
aufgelistet.
aller
nach Aufnahme eines Elektrons eine deutliche Abnahme der
und damit eine
die
Molekülgeometrien
Ausgangspunkt
erfährt die
durch
Bindungsenergien
Mayer-Bindungsordnungen [363]
Rechnungen
Überlappung
0-C(4)-C(5)-C(5')
48 und 49
zur
hindeuten, dass die Geschwindigkeit der
Wallenborn
U.
radikalanionischen Stmkturen der
resultierenden
darauf
GAMESS(US)
E.
führt
mehr als 20° !
ModeUverbindungen
Programms
den für die
man
Torsionswinkel
bceinflusst wird, wurden
Cyclobutanringes
Betrachtet
trans-syn-Uxacildixnex&
bisherigen Ergebnisse
Spaltungsreaktion
Hilfe
von
bzw.
Bindungsschwächung
syn-konstituierten
Bindungsordnung (12-19%)
C(6)-C(6')-Bindung hingegen
Die
Dimere
bleibt wie
nahezu unverändert.
Eine sehr
geringe
C(6')-Bindungen
aufgelistet),
des
Cyclobutanings
die
was
Abnahme der
mangelnde
Bindungsordnung
war
für die
im trans-anti-Isoxn&x
Reaktivität
C(5)-C(5')beobachten
zu
anri-konstituierter
und
C(6)-
(Daten nicht
ModeUverbindungen
bestätigt.
Vergleicht
Radikalanions
man
(19%)
die Abnahme der
mit denen des
signifikant gesteigerte
Dies
Thymin-Modellverbindungen
Während die
Bindungsordnung
Methode
17%
gerade
um
entspricht
dem
C(5)H und C(5')H
gefundenen
des reduzierten
Durch zusätzliche
Atome
experimentellen
wurden in den ab initio
gesenkt wird, beträgt
einmal 12%.
cis-syn-Uxacildimex-
durch
wird eine
cis-syn-Dimexs in Spaltungsexperimenten durch die
Auch die in den Messreihen unter 3.6.5
und
des
frans-syn-Uracildimer-Radikalanions (16%),
Labihtät des
Rechnungen prognostiziert.
Bindungsordnungen
Befund
Unterschiede zwischen Uracil-
Berechnungen gut reproduziert.
czs-syn-Uracidimers
die Abnahme im Fall des
Kontrollrechnungen,
Methylgruppen
76
ein
(siehe 3.6.4).
nach der UHF/DZP-
czs-syn-Thymindimers
bei denen nach Ersetzen der
künstliches
Thymindimer
mit
3. Flavin-enthaltende
Uracilstruktur
Methylgmppen
lag
(T=TÖU) erzeugt wird,
konnte
Spaltungsreaktion
auf die
ein
zusätzlicher
beobachtet werden.
ModeUverbindungen
negativer
Die
Einfluss
Bindungsschwächung
nämlich mit etwa 14% zwischen den Werten der tatsächlichen Strukturen.
ähnlichen
Ergebnis gelangte
Protonen im
Tab. 4.
man
übrigens
der
auch durch Ersetzen der
Zu einem
Methylgruppen
mit
Thymindimer (U=UTr).
Mayer-Bindungsordnungen für neutrale und radikalanionische Pyrimidindimere. Die Rechnungen
Programm GAMESS(US) basierend auf den Röntgenkristallstrukturen der jeweiligen
wurden mit dem
Dimere
mit RHF/4-31G optimierten H-Atomen durchgeführt.
Die prozentuellen Abnahmen der
Bindungsordnungen wurden aus den UHF/DZP (UHF/DZV) Daten entnommen. T=T Thymindimer; U=U
Uracildimer; T=TUU Thymindimer mit Uracilgeometrie; tfeU-n- Uracildimer mit Thymingeometrie.
=
=
=
=
neutrales Dimer
Isomer
cis-syn-U
C(5)-C(5')
anionisches
C(6)-C(6')
Dimer
C(5)-C(5')
C(6)-C(6')
U
=
UHF/6-3 IG*
0.947
0.938
0.778
0.936
UHF/DZV
0.850
0.852
0.692
0.857
UHF/DZP
0.897
Differenz %
-16.7
0.747
(-18.5)
trans -syn-\J = U
UHF/6-3 IG*
0.964
0.914
0.826
0.924
UHF/DZV
0.890
0.870
0.748
0.884
UHF/DZP
Differenz %
cis-syn-T
=
(-15.9)
T
UHF/6-3 IG*
0.943
0.835
UHF/DZP
0.913
0.805
Differenz %
-11.8
c/s-syn-T=TijTj
UHF/6-3 IG*
0.941
0.802
UHF/DZP
0.920
0.788
Differenz %
-14.3
cis-syn-l]=\JT;j
UHF/6-3 IG*
0.849
0.812
UHF/DZP
0.908
0.785
Differenz %
-13.5
Die Resultate der
experimentell
through
bond
quantenchemischen Rechnungen legen
beobachteten strukturellen
coupling
der
Abhängigkeiten
Pyrimidindimer-Stmkturen
77
der
den Schluss nahe, dass die
Spaltungsreaktion
zustande kommen.
durch das
Somit hat der
3. Flavin-enthaltende
ModeUverbindungen
Überlappungsgrad der
relevanten
Cyclobutandimeren einen
Photodimere.
Weitere
haben
auf
die
wie
Faktoren
durch
Wechselwirkungen
und
a*(C(5)-C(5'))-Orbitale
entscheidenden Einfluss auf die
Überlappungsgrad
Dieser
festgelegt.
7t*(C(4)=0)-
wird durch die Geometrie des
induktive
Effekte
ekliptisch angeordneten
der
Geschwindigkeit
Spaltungsrate
oder
Pyrimidin-
der
jeweiligen
Cyclobutanrings
ungünstige
Substituenten
reduktiven
in
des
sterische
Cyclobutanrings
Spaltungsreaktion
eine
geringere
Auswirkung.
3.6.7
pH-Abhängigkeit der Spaltungsreaktion
Bisher wurde in einer
einzigen Untersuchung [328]
reduzierte Flavine zusätzlich
Pyrimidindimeren
Spaltung
der
von
durchführen
zu
können.
dieser
Kettenreaktion
erhöhten
Dimerspaltung
in
Übereinstimmung
darüberhinaus
Lösungen
mit dem
gegenüber
Untersuchung
mit
der
wurde erst
Dimeren
pH-Werten
dass
Spaltung
von
über
DNA-Photolyase
und
möglich
8.
Dieser
stark veränderten
ergab
Wert
(pKa
Die
ist
6.3
=
Messung
einer durch eine
aufgrund
des reduzierten Flavins
pKa-Wert
der
eine effiziente
2,3,4,5-Tetraacetylriboflavin.
Spaltungsexperimente
Spaltungsrate
um
Hypothese aufgestellt,
Diese Studie beruht auf der intermolekularen
Uracildimeren mit reduziertem
pH-Abhängigkeit
dieser
sein müssen,
deprotoniert
die
effiziente
nicht
[349]).
in
Die
Rahmenbedingungen
veranlassten uns, diese Befunde mit den kovalenten
Modellsystemen
nachzuprüfen.
Dazu wurde
die
84
Verbindung
wässrigen Lösungen gelöst,
bei 366
in
nm
bei
verschiedenen
bestrahlt und die
(Abb. 24A). Die Messungen zeigten auf,
dass die
eine effiziente
ist.
pKa-Wert
Spaltung
des
vorliegenden
Flavins
absolut
ist in
[349]
Arbeit gemessenen
Lösungen (pH
<
Deprotonierung
des
6)
ergab
Flavins
notwendig
wird
Quantenausbeuten bestimmt
Deprotonierung
der Flavineinheit für
Der in der Literatur mit 6.3
ausgezeichnetem Einklang mit
pH-Profil
nur
pH-Werten gepufferten
eine
der
dem während
Spaltungsreaktion. Bestrahlung
geringe
Hintergrundspaltung.
nach dem Elektronentransfer
angegebene
der
von sauren
Durch
die
ein
ladungsgetrennter
Ladungsverschiebung.
Die Vorteile eines
solchen Elektronentransfer-Prozesses werden ausführlich im nächsten
Kapitel diskutiert.
Zustand vermieden. Es kommt vielmehr
Der zunächst überraschende AbfaU der
darauf
zu
einer
Quantenausbeuten
bei
Lösungen
schliessen, dass die Deprotonierung der Dimereinheit (pKa
negative Auswirkung
auf die
Elektronenübertragung vom Flavin
78
~
über
10.5
pH
8 lässt
[364])
auf das Dimer hat.
eine
Es ist
3. Flavin-enthaltende
zu
erwarten, dass ein
deprotoniertes
Dimer ein erheblich
ModeUverbindungen
negativeres Reduktionspotential
als das neutrale Dimer aufweist.
Bestätigung
Eine
Lösungsmitteln
von
erreicht
durch
84
Bestrahlte
(Abb. 24B).
Zugabe
von
schwachen oder
zu
gar keiner
Bestrahlung mit Zugabe
Abbruch der
Spaltungsreaktion.
Die
reduzierter
Ergebnisse
und
der
was
ohne Zusatz
von
HOAc
von
NEt3,
angesäuert,
Flavinkofaktor
Reparatur von Cyclobutandimeren
in
organischen
rein
guten Spaltungsraten führte.
zu
pH-abhängigen Messungen
deprotonierter
in
kam
es
für
die
so
Lösung
führte dies
zum
eindeutig,
belegen
hohen
einer äusserst
zu
Wurde eine basische
Dimerspaltung.
während der
auch
In diesen Medien wurde die reduzierte Flavineinheit
NEt3 deprotoniert,
hingegen Lösungen
man
wurde
pH-Abhängigkeit
dieser
von
84
sofortigen
dass
ein
Quantenausbeuten
der
DNA-Photolyasen benötigt
wird.
D CH3CN
ö
EtOH
Dioxan
6
B
4.6
5H
c?
4
o
3
^
Wiik?
G
m
1.6
2
1
0
r"—-rJ—T-
8
9
10
11
keine Base
+
50
(iL NEt3
pH-Wert
pH-Abhängigkeit der Quantenausbeuten der Dimerspaltung von 84 (104 M) in wässrigen
Verwendung von 0.5 M Zitratpuffer (pH 3-6), 0.5 M TrisHCl-Puffer (pH 7-9) und 0.5 M
Phosphatpuffer (pH 10,11). Reduktion durch Dithionit. Bestrahlung bei 366 nm. B: Quantenausbeuten
Abb. 24.
Lösungen
der
A:
unter
Dimerspaltung
von
Reduktion durch kat.
84
(10"4 M)
Hydrierung
mit
in org. Lösungsmitteln mit und ohne
Pd/BaS04. Bestrahlung bei 366 nm.
79
Zusatz
von
50
u.1
NEt3.
3. Flavin-enthaltende
3.6.8
Lösungsmittelabhängigkeit
Die
35
ModeUverbindungen
der
Rose beschriebenen
von
Spaltungsreaktion
der kovalenten
Bestrahlungen
(Abb. 9) in verschiedenen Lösungsmitteln ergaben
Medien
unpolaren
Dies wurde mit einer
[310].
Rückelektronentransfers
in
der
inverted
Marcus
zunutze machen würde und darum eine
eine schnellere
unpolare Bindungstasche
in
unproduktiven
1.6.4).
(vgl.
DNA-Photolyase
die
34 und
Dimerspaltung
des
Verlangsamung
region erklärt
wurde vermutet, dass sich auch
Schlussfolgerung
Modellsysteme
Als
diesen Effekt
für das Flavin und das
Pyrimidindimer bereitstellt.
Die Kristallstmktur der
anderes
Bild
25).
(Abb.
Wasserstoffbrücken
eine H-Brücke
zu
(H-Brücken) eingebettet.
Glu274.
aus.
Das
C(3')OH Gruppe
Asp374.
einer
hoch
polarisierbaren
Netz
zahlreichen
aus
C(2)=0-Gruppe
des Flavins
ist über eine H-Brücke in
H-Brücke
zu
büdet eine intramolekulare H-Brücke mit der
gibt
weitere hochkonservierte
es
polare
(Arg344, Asp372, Arg226, Asn341, Arg342).
Das Flavin befindet sich durch den van-der-Waals-Koxitakt
in
ein
in
Flavin-N(5)H bildet eine
Zusätzlich
Reste in unmittelbarer Nähe des Kofaktors
ist
C(4)=0-Gruppe
Das
deprotonierte Flavin-N(l)
der Riboseeinheit.
[107] vermittelt jedoch ein völlig
Dabei bildet die
Auch die zweite
von
E. coli
aus
FAD-Kofaktor
Der
Kontakt mit dem Amid-NH
Asn378
DNA-Photolyase
Umgebung,
was
zur
zur
Salzbrücke
Stabilisiemng
Arg344-Asp372
des
neutralen
Flavinradikals, welches nach dem Elektronentransfer auf das Dimer entsteht, beitragen
könnte. Alles in allem befindet sich das Flavin in der
Umgebung,
die als
DNA-Photolyase
Um diese
polar
aus
Brücken
79
und 84
Diese beiden
Donor-
und
Dielektrizitätskonstante.
Spaltungsreaktion
Quantenausbeuten
in
polarisierbar
A. nidulans ist bis auf
widersprüchlichen
ModeUverbindungen
hergestellt.
und leicht
wenige
Befunde
zu
Lösungsmittel
5
Ausnahmen
weisen im
zeigt
zunehmender
völlig
die
Gehalt
Vergleich
auf,
zu
besitzen
gemessenen
Deufüch
zu
in einer
identisch
aufgebaut.
Spaltungsreaktion in H20/EtOH-Gemischen ergab qualitativ
an
Etgly
oder
EtOH
H20 vergleichbare
jedoch
eine
H-
kleinere
Quantenausbeuten
der
sehen ist eine Abnahme der
Etgly-Konzentration.
80
Enzyms
klären, wurden wässrige Lösungen der
Akzeptoreigenschaften
Tab.
des
bezeichnen ist. Das aktive Zentrum der
mit unterschiedlichem
H20/Etgly-Mischungen.
mit
zu
Bindungstasche
die
Die
Untersuchung
gleichen Ergebnisse.
der
3. Flavin-enthaltende
Abb. 25.
Darstellung
Tab. 5.
Lösungsmittelabhängigkeit
der
FAD-Bindungstasche der E.
der
coli
ModeUverbindungen
DNA-Photolyase.
Quantenausbeute <J> für die Verbindungen 84 und 79.
schlechter Löslichkeit nicht bestimmt.
Mischung (% Etgl)
0(84)
0(79)
Wasser/Etgl(0%)
0.062
.__a
Wasser/Etgl (33%)
0.052
a
Wasser/Etgl (50%)
0.051
0.049
Wasser/Etgl (66%)
0.041
0.047
Wasser/Etgl (100%)
0.033
0.038
DMF
0.051
0.045
81
a
Wegen
3. Flavin-enthaltende
In
einer
ModeUverbindungen
zweiten
Versuchsreihe
wurde
84
in
Lösungsmitteln gelöst, reduziert und bestrahlt (Tab. 6).
ist auch hier ein
Lösungsmittels
Tab. 6.
e
=
eindeutiger
Trend feststellbar.
nimmt auch die
Lösungsmittelabhängigkeit
verschiedensten
Betrachtet
Quantenausbeute ab.
der
Quantenausbeute O für die Verbindungen 84.
Lösungsmittel bei 25 °C; ET
empirischer Parameter der
nach Reichardt
=
[365].
a
Keine
Spaltung
detektierbar.
£r
£N
$
1,4-Dioxan
2.21
0.16
0.016
Benzol
2.27
0.11
Essigsäureethylester
6.02
0.23
0.024
tert-Butanol
12.47
0.39
0.037
Ethanol
24.55
0.65
0.044
Methanol
32.66
0.76
0.040
Acetonitril
35.94
0.46
0.046
Lösungsmittel
Augenfällig
Spaltungsreaktion
Dioxan).
Spaltungsraten,
die
Mit der Abnahme der Polarität des
Dielektrizitätskonstante für das reine
Lösungsmittelpolarität
man
Im
(Abb. 9) ist
ist die
insgesamt
die
dennoch relativ
für die kovalenten
Gegensatz
Spaltung
zu
in
sehr gut mit der Situation im
den kovalenten
Umgebung
erzielt werden kann, ist damit
von
(Abb. 9)
die Simation im
neutrale
Modellsystem
Frage,
Enzym
von
warum
nicht
Rose
besten.
die
nur
in
ist eine bessere
Medien
zu
Modellsysteme
einer
kann die Triebkraft
für
eine
dass die
unpolaren
sich
des
erwarten.
von
nach
Ladungsrekombination
82
Rose
Stabilisierung
Rose wie 34 und 35
richtig nachstellen können, gibt
befindet
von
zu
Befindet sich ein Elektronen-Donor-
region,
polaren
H20
der
Dieser Befund ist auch
dem
Abb. 26.
in
Das
intramolekularen
Elektronentransfer in einem zwitterionischen (ladungsgetrennten) Zustand.
Systemen
von
bislang geltende Hypothese,
Pyrimidindimeren
nicht in der Marcus inverted
Eine Antwort auf die
Die
am
wiederlegt.
nach dem Elektronentransfer in
4
Indol-Dimer-Modellverbindungen
vereinbar.
Flavin-getriebene Spaltung
Radikalpaares
geringe Lösungsmittelabhängigkeit
polaren Lösungsmitteln
Enzym
a
Flavin-Dimer-Modellsysteme (Faktor
effektivste
Akzeptor System
organischen
In
solchen
unpolaren
Medien
3. Flavin-enthaltende
durchaus
so
werden, dass sich der Rückelektronentransfer in der
gross
inverted
postulierten
region [366] befindet und somit
daraus
Die
erfährt.
Rückelektronentransfers
bestätigt
Intramolekulare
ablaufende Prozesse
ist
für
(kLR
>
1010 s"1 [355, 359]).
Folgereaktionen
pKa(DimerH)
~
verlaufen sollte
hochexergonischen
Systeme
experimentell
wären normalerweise sehr schnell
Würden sie nicht in die Marcus inverted
ladungsgetrennten
Zustand kaum mit ihnen
sehr
vor
allem in
unpolaren
1010 s~l [373, 374]), könnte
=
Donor-Akzeptor-Systems
einigen Donor-Akzeptor-Systemen
Die in dieser Arbeit verwendeten
führt
Einerseits das neutrale
zu
einer
[370,
Eine
371];
Medien diffusionskontroUiert
einem
neutralen, diradikalischen
Stabilisiemng
folgenden Protonentransferprozesse
beobachtet
Flavin-Dimer-Systeme
des reduzierten Flavins bereits eine
Systemen
zu
5
~
führen und somit für eine zusätzliche
Solche direkt auf einen Elektronentransfer
Deprotonierung
des
106 s"1 [282]) in Modellsystemen wie 34 und 35 möglich.
~
[292, 372]), die
(kUP
Öffnung
ablaufende
langsam
mögliche Umprotonierungsreaktion (pKa(IndolH)
7
wurden bereits in
diesen
im
vergleichsweise
die
jedoch
dadurch ebenfalls
sorgen.
Aktivierungsenergie
des
intramolekulare
vergleichbare
der
Marcus
Durch die Abnahme der Rückelektronentransfer-Rate in der invertierten
Cyclobutanrings (kSP
Zustand des
ist
Anstieg
Verlangsamung
Ladungsrekombinationsprozesse
könnten
konkurrieren.
Region
resultierende
einen
von
[357, 367-369].
worden
region fallen,
ModeUverbindungen
[375-378].
wie 84
negative Ladung.
Ladungsverschiebung
Elektronentransfer in
Flavin
vom
tragen nach der
auf
das
Dimer.
Flavinradikal, dessen hohe Stabilität hinreichend bekannt ist (vgl.
1.5), andererseits das Dimer-Radikalanion, dessen Elektron über den Cyclobutanring
delokalisiert
wird,
Unterdrückung
können
zur
besonderen
des Rückelektronentransfers
Stabilität
beitragen.
des
Radikalpaares
Eine weitere
bzw.
Stabilisiemng
zur
des
Radikalpaares
durch
(pKa(FlH)
[197]), ohne dass der Rückelektronentransfer in die Marcus inverted region
~
8
Umprotonierungsreaktionen [379]
getrieben
werden
Systemen
ohnehin höchst unwahrscheinlich.
nur
in
polaren
muss.
Das Erreichen der Marcus
inverted
Die Stabilität des
Medien zusätzlich erhöht werden.
83
ist in diesem Fall also denkbar
region
ist mit
Radikalpaares
solchen
kann somit
3. Flavin-enthaltende
ModeUverbindungen
+H
Ind
Ind
hv
IndH
-
Dimer
IndH
^
FI
LadungsverVerschiebung
-H
FIH2-Dimer
Abb. 26.
©
FIH
Dimer
-
u
IndH
+H
.0
.©
Dimer
-
FI
-
Dimer
FIH
^
-
Umprotonierung
.i_i©
-
-
M
M
+
©
-.
DimerH
H
hv
,©
^
DimerH
-
Umprotonierung
-H®
Ladungstrennung
©
Dimer
-
FIH®- M
Dimer
+
M
Mechanismus der
Spaltungsreaktion in kovalenten Indol-Dimer-Modellsystemen (neutral) und
Flavin-Dimer-Modellsystemen (anionisch). IndH Indol; Fl Flavin; M Monomer.
kovalenten
=
Die
DNA-Photolyase
könnte die Reversion
=
der
=
Pyrimidindimere
nach ähnlichen
Kriterien, wie sie bei der Spaltung der Flavin-enthaltenden Modellverbindung 84 gelten,
katalysieren (Abb. 27).
Pyrimidindimer
Enzyms
Zunächst wird nach dem Elektronentransfer des Flavins auf das
das entstandene
stabilisiert.
durch die
polaren
Reste der aktiven Stelle des
Anschliessend könnte ein in der Nähe der
Pyrimidindimer-Radikalanions
auf diese
Radikalpaar
befindlicher
Gruppe übertragen.
Argininrest
des
C(4)=0-Gruppe
Enzyms [380, 381]
Damit wäre eine maximale Stabüität des
(neutrales Flavinradikal; neutrales, protoniertes Dimerradikal) erreicht.
Verzerrung
des
eine zusätzliche
könnte die
Cyclobutanrings
Beschleunigung
des
der
Pyrimidindimers
Spaltungsrate
enzymatische Reparatar
von
könnte das
des Dimers erzielen.
Pyrimidindimeren
eine
ein Proton
Radikalpaares
Durch
Enzym
des
aktive
darüberhinaus
Auf diesem
Weg
Quantenausbeute
von
nahezu 100% erreichen.
Neutrale
der
Lage,
die
untersuchten
Modellsysteme
wie die
Gegebenheiten
im
kovalenten
enzymatischen Dimerspaltung
polare Bindungstasche
für das
Indol-Dimer-Systeme
Enzym
nachzustellen.
von
Die in der
Flavin-Dimer-Modellsysteme
durch
DNA-Photolyasen
Enzym eindeutig
84
von
Rose sind also nicht in
vorliegenden
hingegen
sehr nahe und
Vorteil ist.
kommen
zeigen,
Arbeit
der
dass die
3. Flavin-enthaltende
Enzym
-ArgH®
Enzym-ArgH®
Dimer
Enzym
M-M
Enzym
hv
-
ArgH
-
FIH
Dimer
FIH
FIH
ModeUverbindungen
©
ArgH
Dimer
i
Enzym
-
Arg
DimerH*
FIH*
FIH""" M-M
©
Möglicher Mechanismus der Spaltung von Pyrimidindimeren durch DNA-Photolyasen. Enzym
DNA-Photolyase; Arg Arginin; Fl Flavin; Dimer Pyrimidindimer; M Pyrimidinmonomer.
Abb. 27.
=
=
Zusammenfassung
3.7
•
:
=
=
Durch die in den Abschnitten
enthaltenden
des Mechanismus der
ModeUverbindungen
beschriebenen
Synthesen
wurde der Grundstein für eine
DNA-Reparatur
in
konnten
3.4
bis
ModeUverbindungen 76-86
Untersuchung
AUe
3.1
durch
ausreichenden
der
Flavin-
systematische
DNA-Photolyasen gelegt.
Mengen
für
die
Messungen
bereitgestellt werden.
•
Die
Flavin-Chromophore
Spaltungsexperimenten
dem sich auch der
der
76-86
ModeUverbindungen
durch in situ Reduktion in den Zustand
katalytisch
aktive FAD-Kofaktor der
konnten
den
vor
gebracht werden,
DNA-Photolyasen
in
befindet
(3.6.1).
•
Es
wurde ein
genereller
Spaltungsreaktion
Versuchsablauf
Flavin-enthaltenden
von
monochromatischem Licht definierter
Spaltungsreaktion
wurde durch
Die Intensität der
Aktinometrie
in der
ermittelt
Spaltungsreaktion lagen
Wellenlänge
der die
im Bereich
der
mit
Der relative Umsatz der
erlaubt.
der
Mengen
an
Edukt
(3.6.2/3).
Spaltungsreaktion
(3.6.3).
Untersuchung
ModeUverbindungen
zeitabhängige Quantifizierung
und Produkt via RP-HPLC bestimmt
•
ausgearbeitet,
Die
von
verwendeten
daraus
1-10%.
85
Lichtquelle
berechneten
wurde durch
Quantenausbeuten
der
Somit stellen die oben beschriebenen
3. Flavin-enthaltende
ModeUverbindungen
ModeUverbindungen
funktionstüchtige Modellsystem
das erste
DNA-Photolyase
für die
dar, welches mit dem katalytisch aktiven Kofaktor des Enzyms arbeitet.
•
Untersuchung
Die
Abhängigkeit
der
Cyclobutandimers ergab,
Spaltungsreaktion
der
Berechnungen (3.6.6)
ModeUverbindungen
spalten
am
•
verbindungen (3.6.7)
Pyrimidindimeren
deprotonierten
(pH
Eine
jeweiligen
die eine
7t*(C(4)=0) und c*(C(5)-C(5')) aufweisen,
übertragene
Elektron besser über den
oben
dass
eine
lichtgetriebene
in diesen
eindeutig,
Systemen
nur
Es konnte
es
sehr
katalytisch aktive
deprotonierten
Quantenausbeuten
der
Reversion
von
ihrem reduzierten
und
gezeigt werden,
dass eine
physiologischen Bedingungen
wahrscheinlich, dass für eine effektive DNA-
FAD-Kofaktor der
Zustand
ModeU¬
beschriebenen
mit Flavinen in
ist.
(FlredH") möglich
systematische Untersuchung
DNA-Photolyasen
(FADH") vorliegen
der
unterschiedlicher
Spaltungsreaktion
mit
in
Lösungsmitteln
und
dass
die
Polarität
(3.6.8)
steigender
Polarität des
Einklang
Ladungsverschiebungs-Prozessen,
in seinem
muss.
Spaltungsreaktion
ebenfalls leicht zunehmen. Dieser Befund steht in
klassischen
konnten
experimenteUen
in den
der
bewies
Lösungsmittelgemischen
zu
Cyclobutanrings
des reduzierten Flavins bereits unter
auch der
reduzierten und
als
Diejenigen ModeUverbindungen,
Flavin
vom
die
Spaltungsreaktion
7) erfolgt. Deshalb ist
~
Reparatur
•
der
Zustand
Deprotonierung
schneller
delokalisiert werden kann.
pH-Abhängigkeit
Die
des
Verzermng
der Orbitale
schnellsten, da das
Cyclobutanring
als
Quantenmechanische
dass
Schlussfolgerung,
erklärt werden können.
grösstmögliche Überlappung
schneller
Pyrimidindimere
nicht revertiert werden.
unterstützen die
Befunde durch eine unterschiedliche
Uracildimere
und
Anft-konstituierte
revertiert werden.
vorliegenden Modellsystemen
in den
des
cw-syn-konfigurierte Pyrimidindimere
dass
trans-syn-koxifiguxiexte Pyrimidindimere (3.6.4)
Thymindimere (3.6.5)
Struktur
der
von
ergab,
Lösungsmittels
mit Resultaten
welche in
polaren
von
Studien
Medien etwas
erleichtert werden.
•
Auch
DNA-Photolyasen
Elektronentransfer
weisen eine
generierten
polare
radikalischen
aktive Stelle auf,
Spezies
um
zusätzlich
zu
die nach dem
stabilisieren.
Darüberhinaus könnte in Protonentransfer eines in der Nähe des Dimers befindlichen
Argininrests
des
Enzyms
den
unproduktiven Rückelektronentransfer
86
auf das Flavin
vor
3. Flavin-enthaltende
der
Dimerspaltung
unterdrücken.
möglicherweise über
eine aktive
Die
Beschleunigung
des
ModeUverbindungen
Reversionsprozesses
wird
Verzerrung des Cyclobutanrings des Pyrimidindimers
erzielt.
87
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
ModeUverbindungen
FLAVIN- UND DESAZAFLAVIN- ENTHALTENDE
4.
MODELL VERBINDUNGEN
der Flavineinheiten
Synthese
4.1
Synthese
4.1.1
Die
wurde im
Synthese
Zuge
Ethylendiamins
90
von
der
Der
(Schema 17).
Diamin
N(3)-alkylierten Aminoethylflavinen
von
Oxidation des
Ethylendiamin
durch
durch
62
in
dreifachem
Dinitrobenzol
Reaktionslösung
mit
durch
dargestellt.
unter
Zugabe
löslicheren Derivaten 96 bzw. 97
des
alkyliert
N(10)-Aminoethyl-Substituenten
(TFA)/H20
von
95:5 erreicht werden.
Die
mit
dem
in DMF
werden. Die
durch
Zugabe
an
Hydrolyse
der
mit
93
94,
Alloxan 61
Alkyliodiden
N(3)
zu
den
Boc-Schutzgruppe
Trifluoressigsäure
N(3)-alkylierten Aminoethylflavine
88
von
Diamin
von
der Stelle
Abspaltung
wurden in Form ihrer stabilen Trifluoracetatsalze isoliert.
geschützten
Nitrogruppe
Dieses Flavin konnte mit
CsC03
konnte
(//wo-Substitution
entsprechenden
durch Celite und anschliessender
und Borsäure wurde das Isoalloxazin 95 erhalten.
Schrittweise
[382, 383] ergab das
Nach Reduktion der
zum
geschützte
eingesetzten
erhalten.
Umsetzung
Pd/C-Katalysator
Boc-geschützten
Überschuss
aromatischen Substitution
91
(Schema 15)
Das einfach
nach Literaturvorschrift
nukleophilen
90 das Nitroanilin 93
(Ethyliodid, Pentyliodid)
einfach
des
tert-Butyloxycarbonylanhydrid (Boc20)
In einer
dem
des
Reaktion
Dimethyl-nitroanilins
aus
Umsetzung
70
weiter verbessert
gemischten ModeUverbindungen
4,5-Dimethyl-l,2-dinitrobenzol (91).
katalytische Hydrierung
Filtration der
von
Schlüsselschritt ist die
92 mit
o-Dinitrobenzol 91.
[384]) wurde
Darstellung
90 mit dem
wurde
Ethylendiamins
Aminoethyl-funktionalisierten Flavinderivaten wie
98
und 99
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
Schema
17.
Darstellung
Benzyloxycarbonyl.
N(3)-Alkyl-N(10)-aminoethylflavinderivate
der
ModeUverbindungen
98
und
99.
Boc
=
,NH2
HpN'
92
Boc20, 20h,
^
H2N'
N02
XX,
NHBoc
62%
NHBoc
NH
90
Pyridin, 90°C, 24h, 67%
62
R
=
NH2—I 1) H2S05,
91
R
=
N02-*J
R
48h, 90%
2) HN03, H202, HOAc
93
R
=
94
R
=
100°C,2h, quant.
NOa—i H2, Pd/C, HOAc
RT, 7h
NH2-*J
61,B(OH)3,
HOAc, RT, 12h,
NH2-CF3COOH
nYny°
^
NHBoc
TFA/H20
NX.NR
80%
95:5
RT, 1.5h, 97%
O
4.1.2
98
R
=
99
R
=
Synthese
Die
Ethyl
Pentyl
in
Einführung
eines
Aminogruppe
succinimid
billigere
mit
H
=
Ethyl
-J
97
R
=
Pentyl
-*J
Bromessigsäure-tert-butylester
95:5
des
ergab
das
N(10)-Substituenten
(Fmoc-OSu)
zum
der
von
der
Carboxylatgmppe
Schema 18.
von
103
102 wurde mit
Etl
(Pentl), K2C03
DMF RT 3h
ergab
103 mit
50o/o
die Flavin Verbindung
des Indolflavinderivats 106. Fmoc
=
N(3)-Alkylierung
Bildung
des
von
101
fe/t-Butylesters
Aminosäure
102.
Die
Fluorenylmethoxycarbonyl-O-
zu
Tryptamin (104)
89
die
unter
entsprechenden Flavinderivat 103
Aminethyl-funktionalisierten Indolflavinderivat
Darstellung
100
freien
Chlorid (Fmoc-Cl) erwies sich für diesen Zweck als
zum
—1
Boc-Schutzgruppe und
Trifluoracetatsalz
Fmoc-geschützten Flavinaminosäure
DMF
=
R
Carboxymethyl-Substituenten wurde über
(Schema 18). Simultane Hydrolyse
TFA/H20
R
96
eines kovalenten Flavin-Indolderivats
des Flavinderivats 95
erreicht
95
erneut
unreaktiv.
nach
geschützt.
Das
Amidiemng
der
BOP-Aktiviemng
der
105, die mit 20% Piperidin in
106 entschützt werden konnte.
Fluorenylmethyloxycarbonyl.
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
ModeUverbindungen
NHBoc
NHBoc
IN
O
Br
NNO
S
X
^^OtBu
100
NvNy
<*L^NH
Cs2C03l DMF, RT, 5h, 75%
OtBu
O
o
101
95
TFA/H20
95:5
RT, 2h, quant.
NHR
n
NHR
<>
yny°
N^ ^N^^O
104
°
YYyy
BOP, NEt3, DMF, 2h,
°
45%
o
4.2
4.2.1
=
H
—i
Fmoc-J
FmocOSu, K2C03,
H20,1.5h,
80%
Synthese
von
piperidin,
-*J RT, 1.5h, quant.
—i
der
Desazaflavineinheiten
Nf3)-alkylierten Aminoethyldesazaflavinen
Darstellung
8-Benzyloxy-5-desazaflavinderivaten
von
(Schema 19) wurde zunächst
aus
dem bereits in der
109
Dihydroxybenzaldehyd
wurde
mit
Reaktionslösung
Yoneda
rc-Butanol
umgesetzt
und
109
in
in
werden.
Benzylalkohol
DMF
auf
durch
Das 6-Chloruracil 108 konnte mit
Erhitzen
Der
erhältliche
120
in
unter
einer
Rückfluss
Stufe
90
wonach
beim
Alkyhemng
von
90
111
an
der Stelle
N(3)
Abkühlen
zum
6-
2,4-
aus
2,4-Dibenzyloxybenzaldehyd
°C erhitzt,
nach
zum
das 5-Desazaflavin 111 ausfiel und nach Filtration in Form eines
Pulvers erhalten wurde.
[193]
durch Reaktion mit
Flavinsynthese eingesetzten Boc-geschützten Ethylendiamin
Pfleiderer und Niebel [387]
Aminouracilderivat
nach
2,4,6-Trichlorpyrimidin (107)
Natronlauge 6-Chloruracil (108) hergestellt [385, 386].
[388]
H
=
rrnuu
=
Synthese
Zur
=
Fmoc
R
106 R
R
R
=
105
102
103
110
der
gelben
löslicheren
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
112
Desazaflavinderivat
beschriebenen
Synthese
funktionalisierte
Schema
19.
Entschützung
Flavin
von
mit
99
95:5
TFA/H20
(Schema
17)
analog
zu
oben
Aminoethyl-
das
ergab
der
8-Benzyloxy-5-desazaflavin 113.
Darstellung
Butyloxycarbonyl;
und
ModeUverbindungen
Bn
=
der
N(3)-Pentyl-N(10)-aminoethyldesazaflavinderivates
113.
Boc
=
tert-
Benzyl.
O
N^
ClÄAci
HN'
>j
cAn^CI
NaOH
RT' 5h' 9°0/*
90
HN
C4H9OH, U, 4h, 65%
^X^^^NHBoc
H
H
H
109
108
107
|1
0HCxx
DMF, 120'C, 20h
52%
110
NH2CF3COOH
BnO
NHBoc
w
TFA/H20
BnO
95:5
RT, 2h, 97%
113
Eine erste kovalente
werden.
das freie Amin
Entschützung
=
H
R
=
Pentyl -J
dieser
—i
Verbindung
wurde.
91
mit 40%
zur
Pentyliodid, Cs2C03
dmf, 60°c, 2h, 70%
114 konnte durch
mit dem Desazaflavinamin
115, dass ohne weitere Reinigung
(siehe 4.3) eingesetzt
R
112
Flavin-Desazaflavin-Verbindung
des BOP-akti vierten Flavinderivates 103
dargestellt
111
113
Dimethylamin
Synthese
von
Kupplung
(Schema 20)
in
H20 ergab
ModeUverbindungen
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
Darstellung
Schema 20.
der
\^yNyNY°
ModeUverbindungen
Aminoethyl-funktionalisierten Flavin-Desazaflavin-Verbindung
113, bop, NEt3
o
^
-^^N^^OH
DMF, RT, 1.5h,
33%*
YYNyNy°
o
^O^n*^YNvAn
Ji
r^
O
H
n
^-N
Ö
103
115.
114
R
=
Fmoc—i
115
R
=
H
NHMe2,
-*JRT, 1.5h, quant.
/
\
\
/
BnO
Festphasensynthese
4.2.2
Die
Synthese
der
und
des Desazaflavinderivats 111
des
als
Zwecke
das
konnte
des
experimentellen
Das
mit TFA /
95:5 wurde die
H20
Die
Als
Referenzverbindung
117 unter Einsatz
Peptidkupplungen
wurde
DMF
Das
in
einer
mit einer
Durch
Anwendung
mit der
Fmoc-geschützte
116 im
durch
von
Pd auf
Beladungsdichte
von
wurde
etwa
0.6
wurde nach dem Standardverfahren der Fmoc-
detaillierte
Syntheseprotokoll
Schüttelapparatur
mit
Die
gewaschen.
gebundenen Oligopeptids
an
für
119
(Schema 22)
findet
Piperidin
mit
sich
Filtrierangsmöglichkeit
entschützt und mit
im
Kupplung
des Kaiser-Tests
der
Vergleich
zu
zu
kuppelnden
Aminosäuren
in
NMP
(Ninhydrinfärbung primärer
Amine
Aminosäure
Aminosäure 116 in NMP
den freien
Aminogruppen
92
in
N-Methylpyrrolidon
wurde
[389]) konnte ermittelt werden, ob eine vollständige Umsetzung des
wurde die
Nach der
Bromessigsäure-terr-butylester
der Desazaflavinderivate 120-122
Dimethylformamid (DMF) gequollen,
durchgeführt.
der
Teil.
Harz
(NMP) oder
zu
werden.
durchgeführt.
[389]
analog
8-Hydroxy-5-desazaflavinderivat
das AfovaB/oc/zera-Rink-Amide-MBHA-Harz
Methode
werden.
8-Benzyloxy-5-desazaflavins
Festphasensynthese
rnmol/g gewählt.
hergestellt
117 mit
zu
freien Aminosäure 118
Katalysator hergestellt
Für die
konnte
Desazaflavinderivat 116 umgesetzt.
katalytische Hydrierung
BaS04
(Schema 21)
N(10)-Substituenten der Desazaflavinaminosäure 118 mit Fmoc-OSu
Fmoc-geschützten
spektroskopische
zur
116
Flavinaminosäure 103
Fmoc-geschützten
Entschützung
Aminogruppe
zum
Desazaflavin-Prolin-Peptiden
Fmoc-geschützte Desazaflavinaminosäure
N(3)-Alkyliemng
(100)
von
stattgefunden
gelöst (etwa
an
hat.
das
Harz
Zunächst
1.5facher Überschuss
des Harzes) und
zusammen
mit N-
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
Hydroxybenzotriazol (HOBT,
tetrafluoroborat
Uberschuss)
3facher
(TBTU, 3facher
Harz
zum
Uberschuss), Benzotriazolyl-tetramethyluronium-
Uberschuss)
gegeben [390].
Aminosäure wurde 48 h mit dem Harz
ModeUverbindungen
und
Düsopropylethylamin (DIPEA,
Die auf diese Weise Benzotriazol-akti vierte
geschüttelt.
Darstellung der Fmoc-geschützten 8-Benzyloxy-5-desazaflavinaminosäure
debenzylierten 8-Hydroxy-5-desazaflavinderivates 119.
Schema 21.
NHBoc
sowie des
f
N. „NO
100
0
Cs2C03, DMF
60°C, 5h,
OtBu
49%
111
117
H2, Pd/BaS04,
HOAc, 2h, quant.
TFA/H20 95:5
RT, 3h, quant.
NHR
NHBoc
r
C
N.
-NrO
BnO
0
N. „NO
OtBu
Nach
erfolgreicher Kupplung (Kaiser-Test)
die
gewaschen,
in
gekuppelt.
Aminogruppe
0
OH
119
Zur
116
NHBoc
BnO
Piperidin
9facher
der nunmehr
118
R
=
H
116
R
=
Fmoc-*J
3
FmocOSu, K2C03,
H20, 1.5h, 73%
wurde das Harz mit NMP und DMF
gekuppelten
Aminosäure 116 entschützt
(20%
DMF) und die nächste Aminosäure (Fmoc-geschütztes Prolin (Fmoc-Pro))
Anschliessend wurde erneut
Abspaltung
gründlich gewaschen
der
Peptide vom Harz
und mit einer
(TIBS) und H20 umgesetzt
120 wurde mittels
gewaschen
Lösung
und entschützt.
wurde das Harz mit
aus
CH2C12,
MeOH und Ether
Trifluoressigsäure (TFA), Triisobutylsüan
und filtriert. Das im Filtrat befindliche
Rohprodukt
präparativer Umkehrphasen-HPLC (RP-HPLC;
Säule:
des
Peptids
Nucleoprep
100-
12 C-18; Gradient: 0-5 min 100%^25% A / 0%^75% B; 5-40 min 25%^0% A /
75%^100% B; 40-50 min 0%^100% A / 100%->0% B (A
CH3CN);
Flussrate: 5 ml
min-1; Rt (120)
min) gereinigt. Fällung des gereinigten
=
20
min, Rt (121)
Produktes
93
aus
=
=
H20(1% TFA)
29
TFA / Ether
/ B
min, Rt (122)
ergab
das
Peptid
=
=
35
120.
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
Für die
Synthese
Pro nicht
der
ModeUverbindungen
entsprechenden Peptide
121 und 122 wurde die Aminosäure Fmoc-
einmal, sondern zwei- bzw. viermal gekuppelt.
Schema 22.
Festphasensynthese
der
Peptide
120-122.
OMe
R
=
=
=
Fmoc
H
—i
Fmoc
R
—i
R
J
20%
Piperidin
DMF
NHR
116,
HOBT, TBTU,
DIPEA
R=Fmoc—i
R=Fmoc-i
NMP, 48h
R
=
J
H
20%
Piperidin
DMF
Fmoc-Pro,
HOBT, TBTU
DIPEA
NMP, 3-5h
TFA/HgOATIBS
95
:
2.5
o
:
2.5
°YN^
n
n
-N
OBn
120
n
=
1
121
122
n
=
2
n
=
4
94
=
1,2,4
R
=
Fmoc
—i
R
=
H
-J
20%
Piperidin
DMF
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
Synthese
4.3
ModeUverbindungen
Desazaflavin-enthaltenden
von
ModeUverbindungen
Die kovalente
113 mit dem
Verknüpfung
mit
phosphat (BOP)
nach Castro erzielt
der
Debenzyliemng
katalytische Hydriemng
Desazaflavin-Chromophore
Modellverbindung
säulenchromatographischer Reinigung
der Anwesenheit der relativ
präparativer
mit Pd auf
konnten
RP-HPLC
an
isoliert
sauren
Uberschuss
der
Während die
normaler Phase
wurde,
musste
die
C(8)OH-Gruppe
(Säule: Nucleoprep
100-12
Schema 23.
Synthese
der
gXi_xANH
AN-^—î-N-^0
|
min"1; Rt (124)
Flussrate: 5 ml
H
H
V
=
Luft
k
=
Modellverbindung
der
nach
3 cm, /
124
=
25
aufgmnd
Desazaflavineinheiten mittels
(A
=
H20(1% TFA)
/ B
=
werden.
123 und 124.
O^N''£""?"N^O
0
I
VH
W
H|HH|H
V
rV
„•A.A../1
O
d
123
HN-^f—^i
|
O
O
O
,
Die dabei
debenzylierten
zur
(Kieselgel-//
\
DMF, RT, 2h, 20%
Bis(desazaflavins)
C-18; Gradient: 0-50 min 100%^0%
Bis(desazaflavin)-Modellverbindungen
113, BOP, NEt3
des
Modellverbindung
min) gereinigt
32
hexafluoro-
BaS04 durchgeführt.
an
der
des Desazaflavinamins 113
A / 0%^100% B; 50-60 min 0%^100% A / 100%^0% B
CH3CN);
Aktivierung
Bis(desazaflavin)-enthaltenden
8-Benzyloxygruppen
124 aufoxidiert werden.
CHCL/MeOH 7.5:1—>5:1)
Für die
(vgl. 3.4).
123 und 124 wurde ein
eingesetzt (Schema 23).
123 wurde durch
41 wurde erneut über eine
Benzotriazol-l-yloxy-tris(dimethylamino)phosphonium
ModeUverbindungen
cm;
Flavin- und Desazaflavinbausteine 99 bzw.
neuen
cw-syn-Uracil-Cyclobutandimer
Carboxylate
reduzierten
der
O
Vi
O
k
41
123
124
Für die Flavin- und Desazaflavin-enthaltenden
(Schema
24).
Desazaflavinderivat
113
wurden
umgesetzt.
die
=
ModeUverbindungen
Äquivalent des
wurde das Uracildimer 41 zunächst mit einem
Danach
Bn—i 1) H2, Pd/BaS04, HOAc,
R
R= H -J 2) 02, quant.
nicht
Carboxylate
Säulenchromatographische
95
125 und 126
Flavinderivates 99
abreagierten
1h
gekuppelt
mit
Reinigung
dem
des
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
Rohproduktes (Kieselgel-Zf
,
d
=
3 cm, /
Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
Modellverbindung
enthaltende
Synthese
Schema 24.
ModeUverbindungen
127
=
25 cm;
CHCL/MeOH 7.5:1—>5:1) ergab
Modellverbindung
125
(16%)
ModeUverbindungen
der Flavin- und Desazaflavin-enthaltenden
H
h
u
C
"*
H
1) BOP, NEt3, DMF
2) 1 eq. 99, RT, 1h
3) 113, RT, 3h
^
H
HN
X£_iXNH
I
SA.
H
H
i
h
k
Die Modell Verbindung 126 wurde durch
anschliessender Reoxidation der
Reinigung
des
cA-W-A
„
nan rV
LXJ I
125
R
=
126
R
=
von
an
=
35
min).
96
H
°
-
Sa NAN
5 LAA
Bn—i 1) H2> Pd/BaS04, HOAc, 1h
H —' 2) 02, quant.
der Luft erhalten.
126 auf RP-HPLC
derBis(desazaflavin)-enthaltenden ModeUverbindungen
(Rt (126)
H
katalytische Hydrierung
Chromophore
Rohprodukts
O
HN^f—V^NH
\,
41
werden
H
O
V
0
musste bei der
H
+
k^OH
v
Ö
0
H
-°
-
HO.^J
125 und 126.
127
o^n-TTn^c
H
Bis(flavin)-
(14%).
o
o
sowie die
die
124
mit
Pd/BaS04
und
Auch in diesem Fall
analog
zur
Reinigung
(siehe oben) zurückgegriffen
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
Übersicht
25.
Schema
ModeUverbindungen
aus
der
dargestellten ModeUverbindungen 128-134 wurden
41
und
98,106,115,113,120-122
130 und 132 wurden nicht über
(CHCl3/MeOH-Gradienten),
und 122
Desazaflavin-enthaltenden)
und
(Flavin-
gemischten
Uracildimer-Dicarbonsäure
Desazaflavinaminen
Verbindungen
weiteren
128-134.
Die in Schema 25
Weise
der
ModeUverbindungen
=
30
ModeUverbindungen 128,
=
Analogie
zu
37
min).
Die
130
und
132
gleicher
Flavin-
und
Prolin-enthaltenden
Die
Säulenchromatographie
min; Rt (132)
97
entsprechenden
erhalten.
sondern mittels RP-HPLC in
gereinigt (Rt (130)
Desazaflavineinheit der
den
in
an
Kieselgel-i/
den Edukten 121
Debenzyliemng
durch
der
katalytische
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
mit
Hydrierung
Pd
auf
BaS04
ModeUverbindungen
wurde
Bestrahlungsexperimenten durchgeführt,
Fluoreszenzspektroskopie
4.4
Untersuchung
sowie durch
ohne
zusätzliche
wobei der
analytische
direkt
Reinigung
Umsatz durch UV- und
quantitative
RP-HPLC
den
vor
überprüft
wurde.
Flavin- und Desazaflavin-enthaltenden
von
Modellsystemen
4.4.1
Untersuchung
Die
der Desazaflavin-vermittelten
des
Rolle
Dimerspaltung
Methenyltetrahydrofolats-Chromophors (5-MTHF)
DNA-Photolyasen ist
oxidierten Zuständen.
Dabei
maximale
aus
zur
5,10-MTHF) wirkte sich
nur
Photoreaktivierung stattfindet,
und hat somit eine
in den
sowie auf die Effizienz des
zu
in ihren
Enzymen
mit
Apoenzyms
katalytische
Chromophors (8-
Wellenlängenbereich,
in
welchem
Spaltungsprozesses
Aktionsspektren
und Abnahme der
Verschiebung
Gegensatz
für die
Das Fehlen des zweiten
auf den
Im
des
Flavinchromophor (FAD)
Aktivität des Enzyms entscheidend ist [229].
oder
Chromophore
ergaben Rekonstitutionsexperimente
einem bzw. beiden Kofaktoren, dass der
5-
des
als zweitem Kofaktor neben FAD in
extensiv untersucht worden [130, 229, 391-394].
dem Flavinkofaktor befinden sich diese zweiten
HDF
bzw.
8-Hydroxy-5-desazaflavin-Chromophors (8-HDF)
der
Photolyasen
Folge [130].
Bisherige
Studien
von
Desazaflavin-enthaltenden
Desazaflavine in ihrem oxidierten Zustand
spalten [103, 236, 317, 327].
relativ
gering (<£>
Zur
<
Die
Klärung
der
Verbindung
zur
HOAc oder
124
(Anwesenheit
konnte
auf
die
zurückgeführt
ob
5-Desazaflavine
in
123 und 124
oben
NEt, gelöst.
(Schema 23) in DMF
Die UV- und
Fluoreszenzspektren
signifikante Verändemng
HOAc) ins basische Milieu (Anwesenheit
Deprotonierung
werden
den
zu
aber
waren
dargestellten
Spaltung des Cyclobutanringes befähigt sind,
erfuhren eine
von
Lage sind, Pyrimidindimere
Quantenausbeuten dieser Spaltungsprozesse
Frage,
Bis(desazaflavin)-Verbindungen
von
in der
dass 5-
10"3).
ModeUverbindungen
Zugabe
prinzipiell
Modellsystemen ergaben,
der
(pKa(C(8)OH)
~
C(8)OH-Gruppe
6; vgl. 1.5.2).
98
des
oder
der
beim Wechsel
von
wurden
Etgly
die
unter
debenzylierten
vom
NEt3) (Abb. 28).
sauren
Dies
Desazaflavin-Chromophors
Das Maximum der
Absorption
der
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
"hydroxy"-Form
124
von
einer Fluoreszenz
430
um
(protoniertes C(8)OH
nm.
Die "chinoidc" Form
Desazaflavins)
absorbiert maximal bei 430
[395].
weiteren
Des
("hydroxy")
auf 4-105
gegenüber dem
verdoppelt
nm
sich
der
Die
("chinoid") [396].
Flavin
des
($F1(Flavin)
=
0.32
Desazaflavins) liegt
124
von
und
ModeUverbindungen
zeigt
400
nm
mit
(deprotoniertes C(8)OH
des
um
eine Fluoreszenz
um
470
2-105
Extinktionskoeffizient
von
Quantenausbeuten der
Fluoreszenz sind
etwa
[397]) stark erhöht (^(Desazaflavin)
=
[253]), wobei die Fluoreszenzquantenausbeuten der "chinoiden" Form vermutlich
höher als die der
saurem
"hydroxy"
Form
liegen.
als auch in basischem Milieu die
Die
nm
benzylierte Verbindung
123
spektroskopischen Charakteristika
zeigt
der
0.51
etwas
sowohl in
"hydroxy"-
Form des Desazaflavins.
O
8-OH-dFbx
8-0--dFlox
"hydroxy"-Form
300
"chinoide" Form
400
350
X
450
500
550
400
450
500
550
600
650
A,(nm)
(nm)
Absorptions- und Fluoreszenzspektren der Modellverbindung 124 in Etgly. A
124 "hydroxy" (Zusatz von HOAc);
124 "chinoid" (Zusatz von NEt3)
B
Absorptionsspektren.
124 "hydroxy" (10° M; Zusatz von HOAc, Anregung bei 410 nm);
124
Fluoreszenzspektren:
"chinoid" (105 M, Zusatz von NEt3, Anregung bei 430 nm)
Abb.
28.
Die
entsprechenden Lösungen
Wellenlängen
bestrahlt
>
350
wurden,
aufgenommenen
nm
bestrahlt.
waren
von
wurden, nicht
zu
der
ModeUverbindungen
Die
HPL-Chromatogramme
denjenigen,
unterscheiden.
99
die
vor
123 und 124 wurden bei
dem
von
Lösungen,
die 1 h
Bestrahlungsexperiment
HPL-Chromatogramme
von
synthetisch
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
hergestellten Spaltprodukten
135
Retentionszeiten (Abb. 29). Daraus
Bis(desazaflavin)-enthaltenden
Mengen
an
ModeUverbindungen
und
136
folgt,
dass während der
zeigten jedoch
ModeUverbindungen
o
unterschiedliche
Bestrahlungsexperiments
(123,124)
entsprechenden Spaltprodukten (135,136)
HN
deutlich
von
detektierbaren
keine
auftraten.
o
hv
NH
I—I
hTN^O
2
123
R
=
OBn
135 R
=
Bn
124
R
=
OH
136
R
=
OH
R
=
0"
R
=
0_
135
136
I23
40-
i
124
i
3530
25'
^
£
—
20
15
10-
:i-
5
0
-5-
!
10
|
I
I
I
I
|
14
12
I
1
|
I
.
16
I
M
|
18
1
|
I
20
I
I
|
.
I
22
Retentionszeit
I
|
I
I
I
24
|
I
26
M
I
|
28
H
30
(min)
Abb.
29.
HPL-Chromatogramme der ModeUverbindungen 123 (
) und 124 (
) nach 1 h
und
136
Bestrahlungsdauer und ihrer synthetisch hergestellten Spaltprodukte 135 (
)
(
). Analyt.
RP-HPLC (Säule: Lichrospher 100-5 RP-18; Gradient: 0-5 min 90%->30% A / 10%-V70% B; 5-30 min
30%->10% A / 70%->90% B; 40-50 min 10%-^90% A / 90%->10% B (A
Flussrate: 0.7 ml
Damit ist
min1; Rt (123)
zu
mit Licht
spalten.
>
27
eindeutig belegt,
sowie in seiner oxidierten,
effektiv
=
350
=
26 min,
R, (135)
=
=
H20(1% TFA)
18 min,
dass das 5-Desazaflavin in seiner
deprotonierten
Auch die
nm
min, R, (124)
Bestrahlung
[398] brachte
Form nicht in der
von
kein
R, (136)
=
=
MeOH);
16
min).
oxidierten, protonierten
Lage ist, Pyrimidindimere
123 in seiner Dithionit-reduzierten Form
Auftreten
Spaltprodukt. Bei längerer und intensiverer Bestrahlung
100
/ B
von
detektierbaren
wurden
zum
Mengen
Teil kleinere
an
Mengen
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
an
Edukt
(< 10%)
zu
anderen Produkten mit Retentionszeiten zwischen 8 und 12 min
umgesetzt. Erst bei sehr hoher Lichtintensität und Zusatz
bildete sich
um
aus
123 ein definiertes,
beträchtlichen
von
irreversibles Produkt
(Rt
das in der Literatur bekannte 5,5'-Addukt handeln könnte
könnte
durch
Photoreduktion
anschliessende
Ausbildung
mit
intramolekulare
der kovalenten
als
NEt3
Kombination
der
DNA-Photolyasen
Weg gefunden werden,
ModeUverbindungen
min), bei dem
sich
es
(vgl. 1.5.2). Dieses Produkt
und
(siehe 4.4.2)
Desazaflavinradikale
beiden
unter
in
gemischten ModeUverbindungen
der Flavin-Kofaktor in seiner
den
selektiv den
Flavin-
und
reduzierten, deprotonierten
in seinem oxidierten Zustand, musste ein
Desazaflavin-enthaltenden
Flavin-Chromophor
zu
(gemischten)
reduzieren.
weiss, dass Derivate des Lumiflavins ausgezeichnete Einelektronen-Donoren
Man
und
12
Mengen NEt3
5,5'- Bindung entstanden sein.
vorliegt, der Desazaflavin-Kofaktor jedoch
Form
=
Einelektronendonor
4.4.2 Die selektive Reduktion der Flavineinheit in
Da in
ModeUverbindungen
-Akzeptoren
sind
(vgl. 1.5.1).
Einelektronen-Transfer auf das
verlieren diese
einzigartige
Atoms mit einem
Deshalb hat das
Enzym
Pyrimidindimer gewählt.
diesen
Die
für den
Chromophor
8-Hydroxy-5-desazaflavine
Stabilität des Flavinradikals durch die Substitution des
C(5)-Atom (vgl. 1.5.2).
N(5)-
Sie weisen deshalb schlechte Einelektronen-
Shuttles auf.
Die
Modellverbindung
desazaflavin.
das sowohl
Erste Reduktionsstudien dieser
zur
Chromophore
um
Einelektronen- als auch
reduziert werden. Der
einiges langsamer
vollständig
125 (Schema 24) enthält ein Flavin und ein
reduziert
zur
Zugabe
Behandlung
beider
von
Dithionit
Sekundenschnelle
zu
einer
ist, beide
des Desazaflavins verläuft
Während das Flavin in
Dabei
reoxidiert.
Veränderung
Lösung
es
wird
zu
von
Prozess.
schnell
oxidieren. Somit kommt
zunächst
von
Das oxidierte Flavin ist
Desazaflavins durch das Flavin.
es zu
Durch
der
wenigen
125 in
Absorptionsspektren
Etgly abgeschätzt
einer schnellen und
Oxidation
langsamer
zu
Zweielektronen-Übertragung befähigt
jedoch
Sekunden
sind in 5 min erst etwa 10% des Desazaflavins reduziert.
mit Sauerstoff kommt
Chromophore.
Dithionit,
Reduktionsprozess
Diese Werte konnten durch die zeitliche
nach
dass durch
als der des Flavins.
vorliegt,
Verbindung belegten,
8-Benzyloxy-
das
Flavin
Desazaflavinen
jedoch
werden.
vollständigen
durch
mit
seinerseits in der
von
den
Durch
Reoxidation
Sauerstoff
Sauerstoff
Lage,
125
ist
in
ein
Desazaflavine
einer intramolekularen Oxidation des reduzierten
vorsichtige Zugabe
101
einer bestimmten
Menge
an
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
Dithionit (etwa 2-3facher
Uberschuss)
Reduktionsmittel
exakt
jedoch
für
ModeUverbindungen
einer
zu
die
Lösung
Reduktion
125
von
des
in
Etgly
reichte das
Flavin-Chromophors.
Das
Desazaflavin blieb in seinem oxidierten Zustand, da kein Reduktionsmittel mehr vorhanden
(Überprüfung
war
mittels
erfolgte
Bestrahlungsexperimente
UV-Spektroskopie).
der Flavin- und Desazaflavin-enthaltenden
an
125 mit selektiver Dithionitreduktion des
Ein alternativer
Chromophore
Weg
Prinzipiell
zur
also
Modellverbindung
Flavin-Chromophors möglich.
selektiven Flavin-Reduktion wäre die Photoreduktion dieser
mit tertiären Aminen als Einelektronen-Reduktionsmittel.
nach intensiver
sind
Bestrahlung (450 nm)
ausschliesslich das Flavin reduziert.
einer
Lösung
125
von
Diese bei moderaten
in
Tatsächlich wurde
Gegenwart
NEt3
von
Strahlungsintensitäten
sauber
verlaufenden Methode hat ausserdem den Vorteil, dass keine weiteren Zusätze für die
Bestrahlungsexperimente benötigt
nur
reduziert, sondern auch deprotoniert,
Spaltungsreaktion
Das
an,
werden.
Das Flavin wird durch das tertiäre Amin nicht
was, wie wir bereits wissen
der
DNA-Photolyase
aus
A. Nidulans bei 440
dass sich der oxidierte Desazaflavin-Kofaktor eher in seiner
C(8)OH-Gruppe [108].
in das aromatische
Ringsystem
kommt
Durch die
nicht
es
spektroskopischen Eigenschaften (siehe
Abb.
Veränderungen
des Desazaflavins.
deprotonierte,
der
"chinoide"
angegeben [236].
benötigen
debenzylierten
führt
Durchfühmng
zur
Enzymen
Form des
ein
negativen
Zusatz
von
von
um
430
In der Literatur wird das
gegenüber
Reduktionsmitteln
derartigen "Ausbleichung"
lassen
Lichtanregung gewinnt
Enzyme
1.5.2).
C(8)OH-protonierten
Dithionit
Form
vor.
einzusetzen, bei
zu
der
mit
NEt3
NEt3
kommt
es
zur
deprotonierten,
Reduktion
etwa
80%
des
des
auch in diesem Fall erst
einer Photoreduktion des Desazaflavins.
sich
Der
Vorteil ist.
(Schema 24) ausschliesslich
nm zu
der
recht drastischen
Redoxreaktionen (siehe
deshalb in seiner
Bei der Photoreduktion mit
bei hohen Lichtintensitäten
reoxidieren. Durch
von
Chromophors
Modell Verbindung 126
Flavin-Chromophors.
einer
als inert
zu
Form
Veränderung
scheinen diesen Kofaktor jedoch für andere Zwecke
deprotonierte
Tatsächlich
8-Hydroxy-5-desazaflavin
in diesen
DNA-Photolyasen
denen die
28), sondern auch
der
Die meisten bisher charakterisierten Desazaflavin-enthaltenden
den Kofaktor
Chromophor liegt
Die
Redoxeigenschaften
einer
zu
deutet
(Lys248, Arg51)
Delokalisierung
nur
nm
deprotonierten
Dafür sorgen zwei invariante basische Aminosäurereste
in unmittelbarer Nähe der
Ladung
für die
essentiell ist.
Absorptionsmaximum
befindet [147].
(siehe 3.6.7),
Desazaflavins
Nach
wieder
das "chinoide" Desazaflavin also wieder etwas
102
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
an
obwohl
Redox-Kapazität,
es
dabei auch
zur
Bildung
von
ModeUverbindungen
irreversiblen
Nebenprodukten
kommen kann.
durch
Die
vorgestellten
die
Flavineinheit konnte durch
debenzylierten
Modell Verbindung 126 führte
Vergleich
Als
oxidierten Flavins.
Mono(flavin)-Modellverbindung
abgebildet.
Gut
zu
Maximums
von
126
Abb. 28).
(vgl.
sind
deprotoniert)
Verbindung
400
84
(enthält
nm
nach 430
Die
nm
nach
UV-Spektren
kein
von
es
126
mit
aktiven
Das
Modellverbindung
Typ
II
in
den
der
debenzylierten Verbindung
saurem
der
benzylierten
mit Sauerstoff steUte die
wieder her.
gelungen, Modellsysteme bereitzustellen,
entspricht
5-Desazaflavin
die neben dem
entweder
in
seiner
(debenzylierten, deprotonierten)
genau den Redox-Zuständen der beiden Kofaktoren in
Gerade
das
UV-Spektrum
126 in basischem Milieu (Abb. 31) ist dem
DNA-Photolyasen
Milieu (C(8)OH nicht
UV-Spektren
Spezies
Form oder in seiner "chinoiden"
DNA-Photolyasen.
und reduzierten
des Desazaflavin-
Verschiebung
ModeUverbindungen vollständig
reduzierten, deprotonierten Flavin ein oxidiertes
"hydroxy" (benzylierten)
der
Desazaflavin, siehe Tab. 1) ebenfalls
Deprotoniemng
hingegen deckungsgleich
Auf diese Weise ist
der oxidierten
Spektren
sind die
(Abb. 30).
Dithionitreduktion
bzw.
der
einem Verlust der 450 nm-Bande des
zu
sehen ist auch die bathochrome
der oxidierten Form der
Form enthalten.
125
Reduktion
werden
nachgewiesen
Reoxidation der Flavin-reduzierten
125.
UV-Spektren
leicht
benzylierten Modellverbindung
der
Photoreduktion
UV-Spektroskopie
selektive
ermöglichte
Methoden
sehr ähnlich.
Damit wurde
HDF-Kofaktor in seiner chinoiden Form bindet.
103
bestätigt,
der
Flavin-reduzierten
Absorptionsspektmm
dass das
Enzym
der
den 8-
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
ModeUverbindungen
5-j
5-j
A
,£-
B
-
4-
4-
3-
3-
E
^
*.
-
.-
o
'
2-
^4-
\
:
-
O
l
2-
i
/
i
X
'
\
i
X
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*
....
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/
w
\
1-
/
>
1-
\
t
'''
V
0
;
I
s'
0
i
i
280
i
i
i
i
330
i
il
|
i
i
380
i
i
i
|
430
i
i
i
i
i
u-|
i
480
280
530
,
,
,
|
,
330
380
430
A,
À,(nm)
480
530
(nm)
Abb. 30.
UV-Spektren der ModeUverbindungen 84, 125 und 126 in Etgly (In Klammern sind die
84 (Flox);
125 (Flox, dFl0X-OBn);
Chromophoren angegeben). A: Oxidierte Spezies
126 (Flox, dFlox-CT). B: Flavin-reduzierte Spezies
84 (FlredH-);
125 (FlredH", dFl0X-OBn);
126 (FlredH", dFl0x-O"). Flavinreduktion in 84 und 126 mittels Dithionit; Flavinreduktion in 125
Zustände der
mittels Photoreduktion bei 450
nm
mittels
NEt3.
0
I
126
Abb.
31.
(FlredH")
Form
Modellverbindung
und mit dem
O
H
H
H
H
i
(FlredH- dFlox-0-)
mit dem
Flavin-Chromophor in der reduzierten, deprotonierten Form
Desazaflavin-Chromophor in der oxidierten, C(8)OH-deprotonierten Form ("chinoide"
126
dFlox-0").
104
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
4.4.3
Energietransfer in gemischten ModeUverbindungen
Aufgmnd
der
passiven
Pyrimidin-Cyclobutandimers
zur
wurde angenommen, dass dieser
im
des
Energietransfer
DNA-Photolyasen
übereinstimmt,
der zweiten Kofaktoren
auf
aufgenommene Energie
den
ungefährlichen
scheiden
Energietransfer
durch
der
Untersuchungen
Enzymatische
ihnen
Wellenlängenbereichs
stark
[143]
nach Förster
starken
DNA-Photolyasen [147,
=
oder
mittels
Reparaturprozesses
dass ein
Dabei
induziert
Donor) absorbierte Photon ein
Übergangsmoment,
das,
anstatt ein Photon
Dies wäre auch in
Gegenwart
vom
worden ist
emittieren
Bedingungen
1)
Resonanz
erfüllt sein
Die Donor-
elektronische
2) Es
da das Flavin über die
ein
Der auf
Emissions-
(Fluoreszenz), ein neuerliches
induziert.
Man
Übergangs-Dipolmomente
spricht
angeregt
[399].
einen
Für
Chromophor (=
seinerseits
erzeugt
mit der
Einklang
des FAD-Kofaktors in
zweiten
Absorptions-Ubergangsmoment im Flavin-Chromophor (Akzeptor)
Dipol-Dipol-Mechanismus,
und
Fluoreszenz-
Absorptions-Ubergangsmoment.
zu
aus.
Resonanz-Energietransfers.
des
das
angeregte Desazaflavin-Chromophor
Weise
Â)
Dipol-Dipol-Resonanz-Energietransfer
des 8-HDF-Kofaktors in
394],
Enzym (18
Kollisionsübertragung
zeitaufgelöster
die wahrscheinlichste Variante ist.
Fluoreszenzlöschung
Desazaflavin
oder durch
Reabsorption
Absorptionsspektroskopie [145] ergaben,
dem
von
Ein
übertragen
der beiden Kofaktoren im
Trennung
Komplexbildung
Mögüchkeit
die
Damit bleibt
von
die
muss
erhöhen.
Durch die relativ weite räumliche
diese
Aktionsspektmm
im wesentlichen mit
absorbierenden Desazaflavins auf das Flavin würde die Effizienz des
enorm
ausschliesslich
werden.
Kofaktor
katalytischen
sichtbaren,
das
Da
[130, 229].
der
Wellenlänge)
als Funktion der
Absorptionsspektmm
einnimmt
Chromophor
des reduzierten Flavins anwesend ist,
Lichtabsorption
also eine lichtsammelnde Funktion
(Spaltungsrate
(8-HDF) bei der Reversion des
Rolle des zweiten Kofaktors
der schwachen
Unterstützung
dem
ModeUverbindungen
einige
gmndlegende
[400]:
und
Akzeptorchromophore
eine beträchtliche
Absorptionsspektmm
zum
jedoch
müssen
müssen
Übergänge im Bereich zwischen nahen UV-
muss
proportional
Energietransfer
des
Überlappung
Akzeptors
des
und
(schwach verbotene)
IR-Wellenlängen
Emissionsspektrums
vorhanden sein.
Überlappungsintegral der beiden Spektren.
105
starke
Der
aufweisen.
des Donors mit
Energietransfer
ist direkt
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
3)
der
Donor- und
Akzeptormoleküle
Energietransfer
Energietransfer
Abstand
=
einem Abstand R
zu
Emissions-Übergangsmoment
Ubergangsmoment
Der
müssen räumlich relativ nahe
R"6 abnimmt (R
mit
wird jedoch bis
Das
4)
ModeUverbindungen
des
Akzeptors
ist
maximal,
Energietransfer
des
sollten eine
wenn
von
zusammen
Donor-Akzeptor).
À
etwa 100
Absorptions-
das
günstige Orientierung
die beiden
Resonanz-
beobachtet.
und
Donors
sein, da
zueinander haben.
Übergangsmoment-Vektoren parallel
zueinander stehen.
5) Die Emission
Ein
Abb. 32
Vergleich
des Donors sollte eine hohe
der
Absorptionsspektren
dass die
zeigt,
in Abb. 30 und der
126
und
sind.
gegeben
Die
Desazaflavin-Referenzverbindungen 117 ("hydroxy"-Form)
die
zeigen
in
bereits
Abb.
Modellverbindungen bei
diesen
Regionen
450
um
28
nm
ein deutliches
(bis
der Desazaflavine
Die
125
ModeUverbindungen
Vorhandensein eines
von
125; 430
Emission
der
ausgelöscht,
zu
und
126
Energietransfers
Absorptionsmaxima
nm
117
der
und 119
Emission
der
("chinoide" Form)
Bis(desazaflavin)-
auf. Bei der reduzierten
Überlappung mit den
Desazaflavine.
oxidierten
des
reduzierte
Fluoreszenzbereichen
jedoch
um
von
Vielmehr
Lösungsmittelabhängige Messungen
geschlossen werden,
der
Flavin-reduzierten
Beweis
ersten
ist
die
3-4
nm
geringer
und
der
etwas
119
dass beide Formen des
und
der
fast
völlig
Werden die
nm),
Nach wie
starken
vor
so
kommt
ist
diese
Referenzverbindungen
("chinoides"
Desazaflavin).
125 und 126
Absorptionsspektren.
ergaben
Daraus
Desazaflavin-Chromophors ("hydroxy"
106
das
Anregung
typischen,
verstärkt wird.
als in den
für
"hydroxy"-Fall
im
mehr bei 520
ModeUverbindungen
Fluoreszenz-
zu
nm
Eine
Desazaflavinfluoreszenz
(keine Fluoreszenz
von
(400
126) führt nicht
der Desazaflavinfluoreszenz.
("hydroxy"-Desazaflavin)
geringfügige Änderungen
einen
der Desazaflavineinheiten
einen Faktor
der
zwischen Flavin und Desazaflavin.
während die Flavinfluoreszenz bei 520
Anstieg
und
(Abb. 32) liefern
im "chinoiden''' Fall
einem leichten
Fluoreszenz
Fluoreszenzspektren
langgezogene Endabsorption
der
Flavineinheiten in 125 und 126 reduziert
es
den
zu.
Fluoreszenzspektren
im Bereich der
Energietransfer in
Absorptionsmaximum
500 nm) lässt jedoch trotzdem eine
in
Die oxidierte Flavineinheit weist in
[395].
nm
Flavineinheit fehlt dieses Maximum, die
Flavins
starke
dargestellte
430 bzw. 470
Fluoreszenzspektren
für einen solchen
Grundbedingungen
125
ModeUverbindungen
Quantenausbeute besitzen.
nur
kann
und
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
"chinoid")
einem relativ effizienten
zu
oxidierten und reduzierten Form
fähig
Ein weiteres Indiz für den
Desazaflavin-Einheit bei 400
460
Abb. 32.
Flavin-Chromophor in
seiner
sind.
Desazaflavin-Flavin-Energietransfer
von
125
übrigens
die
Anregung
der
war
durch
(siehe 4.4.6, Abb. 35).
nm
560
510
X
und 119
auf den
der Photoreduktion der Flavin-Einheit
Beschleunigung
410
Energietransfer
ModeUverbindungen
590
540
610
À,(nm)
(nm)
Fluoreszenzspektren der ModeUverbindungen 125 und 126 sowie der Referenzverbindungen 117
(alle 10'6 M in Etgly; Zusatz von 10 tll NEt3). A: Desazaflavin in der "hydroxy"-Form; Anregung
117
bei 400 nm;
125
(dFl0X-OBn);
Desazaflavin in der "chinoiden" Form;
(Flox, dFlox-OBn);
Anregung
bei 430 nm;
(Fl^H", dFl0X-OBn). B:
126 (Flox, dFlox-0~
(dFlox-0^);
125
(FlredH-, dFlox-0).
);
126
4.4.4
Aktionsspektren
Falls
die
auf
Auswirkungen
der
gemischten ModeUverbindungen
Reduktion
ModeUverbindungen
der
wirklich durch
die
Desazaflavinfluoreszenz
Energietransfer
der
Abhängigkeit
Verbindungen
haben.
Im
Enzym
dem
Rekonstitution des
zu
Aktionsspektren-Maximums
Spaltungsgeschwindigkeit
Apoenzyms
des
reduzierten,
430-440
der
von
mit dem FAD-
deprotonierten
mit beiden Kofaktoren resultiert in einer
zu
gemischten
einem maximalen Umsatz bei 360-370
Absorptionsmaximum
Apoenzyms
den
wird, musste dies auch
vemrsacht
führt die Rekonstitution des
Kofaktor, aber ohne 8-HDF-Kofaktor,
in
dieser Flavin- und Desazaflavin-enthaltenden
Bestrahlungswellenlänge (Aktionsspektren)
entspricht
119
nm,
Desazaflavin-Chromophors entspricht [394].
107
was
genau
der
nm.
Dies
Flavins.
Verschiebung
Absorptionsbande
des
des
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
ModeUverbindungen
Ganz ähnliche Verhältnisse wurden für die
gefunden.
drei
Spaltungsexperimente
Die Reduktion des
mit jeder der drei
wurde
Mittelwerte
der
Geschwindigkeitskonstanten (vgl. 3.6.3)
Die Maxima der
aufgetragen.
Absorptionsspektren
kommt
nm
zu
(126
einer
via
370
nm
"hydroxy"-Form)
Die
relativen
errechneten
entsprechenden Wellenlängen
stimmen auch hier
von
und
3.6.2).
(vgl.
hervorragend
ModeUverbindungen (Abb. 30B)
des Maximums
der
je
nm
Etgly durchgeführt.
in
bestimmt
RP-HPLC
Aktionsspektren
mit Desazaflavin in
10
von
Modellverbindung
an
wurden gegen die
der Flavin-reduzierten
Verschiebung
Menge
Spaltungsexperimenten
den
aus
ModeUverbindungen
Die
durchgeführt.
entsprechenden Spaltprodukten
wurden im Abstand
wurde sowohl durch Photoreduktion als auch
Flavin-Chromophors
Dithionitreduktion
durch
gezeigten Aktionsspektren
Für die in Abb. 33
125 und 126
ModeUverbindungen 84,
(84
ohne
mit den
überein.
Desazaflavin)
sowie nach 430
nm
zu
(126
Es
400
mit
Desazaflavin in der "chinoiden" Form).
/
•
0.04-
i1
•p
*
84
(FlredH-)
•
125
(FlredH-, dFlox-OBn)
A
126
(FlredH- dFI0X-01
•/
-
T\
0.03-
0.02-
—A-
\"\
-
0.01-
\*
\
-
u_l—'—i—'—i—i—i—'—i—'—r^"
360
380
400
X
Abb.
33.
Aktionsspektren
ModeUverbindungen 84, 125
von
25
ul
nm.
Reoxidation der Proben mit
460
440
(nm)
(Geschwindigkeitskonstante
und 126.
Reduktion des
NEt3.
Photoreduktion bei 480
420
Es
k
Die Konzentration der
Flavinchromophors
wurden je 50 u.1
via
als
Zugabe
Proben
Funktion
Lösungen
im
von
war
25
Abstand
der
Wellenlänge
5-10'5 M in Etgly.
ul
0.05
von
1-3
M
=
R, (135)
=
18 min,
der
Zusatz
Dithionit
min
oder
entnommen.
02. Analyt. RP-HPLC (Säule: Lichrospher 100-5 RP-18; Gradient: 0-5 min
70%^20% A / 30%H>80% B; 5-25 min 20%->10% A / 80%->90% B; 25-30 min
90%->30% B (A
X)
H20(1% TFA)
14 min).
/ B
=
MeOH); Flussrate: 0.7 ml min1; R, (125)
108
=
10%-V70% A /
24 min,
R, (126)
=
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
Der
den Kofaktoren
Energietransfer zwischen
erstmals in
Modellsystemen nachgestellt
8-Hydroxy-5-desazaflavins
die "chinoide" Form des
reduzierte Flavin
sowie die etwas
gesteigerte Quantenausbeute
"chinoiden" Form
(Of1
Photolyasen gerade
4.4.5
>
Nach der
und 480
nm
der
Bestimmung
125
Spaltungsgeschwindigkeit
sind die
angestiegen ist,
werden
ausschliesslich
Reduktion der
flexiblen
von
auf das
der Emission des Desazaflavins in der
in
und
126
und
im
zur
Quantenausbeuten
also nicht
effizient
so
Wellenlängen
konnten die
werden
(Tab.
ist
Donor-Akzeptor-Systemen
zu
zwischen 350
den Faktor 2-3
um
die
gesunken.
84
etwas
Die bei den
Spaltungsreaktion genützt
erwarten, da der
keinesfalls mit
die
Während
7).
der Desazaflavineinheit absorbierten
von
für
Verbindung
Energietransfer
hundertprozentiger
wie
84.
die
Eine
in konformationell
Effizienz verläuft.
Quantenausbeuten der Spaltungsreaktion der ModeUverbindungen 84, 125 und 126.
Quantenausbeuten wurden 50 nm um das Maximum der Aktionsspektren berechnet und gemittelt.
Tab. 7.
Modell-
Zustand des
Zustand des
Verbindung
Flavins
Desazaflavins
(nm)
())
125
FlredH-
dFlox-OBn
400
0.014
126
FlredH-
dFlcx-O-
430
0.012
370
0.031
370
0.031
84
125
Fl
H-
rlredrl
dFlrpdH"-OBn
109
der
(gemischten)
Mono(flavin)-Modellverbindung
der Flavineinheit absorbierten Photonen der
Quantenausbeuten
DNA-
Quantenausbeuten
Desazaflavin-enthaltenden
errechnet
Vergleich
warum
gemischten ModeUverbindungen
(vgl. 3.6.3)
gemischten ModeUverbindungen hauptsächlich
Photonen
Energieübertragung
"ungefährlicheren" Wellenlängen
des Lichtflusses bei sämtlichen
Flavin-
der
ModeUverbindungen
als auch
bevorzugen.
Spaltungsreaktion
durch Ferrioxalat-Aktinometrie
Spaltungsreaktion
zur
konnte hiermit
"hydroxy"-Form,
0.5, vgl. 4.4.1) könnten die Ursachen dafür sein,
diese Form des Kofaktors
Quantenausbeuten
ist
bei
Absorption
Die höhere
befähigt.
DNA-Photolyasen
von
Sowohl die
werden.
ModeUverbindungen
max.
Aktivität
Quantenausbeute
Die
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
ModeUverbindungen
Der beobachtete beträchtliche Unterschied zwischen O
(125 und 126)
jedoch
kam
unerwartet.
Flavin und reduziertem Desazaflavin
0.031.
Das bedeutet, dass
Senkung
der
des
nur
negative
32)
Anstieg
einen
«
0.013
von
125 mit reduziertem
der
Quantenausbeute auf
Desazaflavineinheit für
oxidierte
wenig Lichtquanten
sehr
nur
den
die
Absorption (siehe
Gewicht
ins
Spaltungsexperimente (siehe 4.4.7)
Absorptionen
das
30B) des Desazaflavins sollte
Energietransfer
kleinere
hätte
sondern auch einen destruktiven
Abb.
von
mindestens 60% (siehe
Dennoch
fallen.
der
sein, dass
Damit
aufnehmen kann.
direkt
gewünschten unterstützenden,
nicht
(5-105 M),
ist. Mit anderen Worten: Es könnte
Effekt bei einer Effizienz des
jedoch
die Additivität der
Desazaflavins
Komponenten nicht mehr gegeben
Effekt. Durch die 10-20fach höhere
Abb.
ergaben
ausschliesslich die
Absorption
Desazaflavin nicht
dieser
Spaltungsexperimente
und <E>
(84)
sein, dass in dem von uns verwendeten Konzentrationsbereich
durch die starke
das Flavin
0.031
Quantenausbeute verantwortlich ist.
Es könnte
einzelnen
=
für
wurden
Konzentrationen
der
weitere
bestrahlenden
zu
ModeUverbindungen eingesetzt.
Eine
alternative
Erklärung wäre,
zwischen
Wechselwirkungen
den
dass
die
Chromophoren,
B.
z.
durch
Elektronentransfer des Flavins auf das Desazaflavin anstatt auf die
behindert wird. Ein
angeregten Flavin
günstiger
Vergleich
(E*ox
der
-2.8
=
ist als auf das Dimer
Chromophore
Redoxpotentiale ergibt,
einen
~
-2.2
V) [258].
kompetetiven
Pyrimidindimer-Einheit
dass ein Elektronentransfer
V) [258] auf das Desazaflavin (Ered
(Ered
störende
durch
Spaltungsreaktion
-
-0.9
vom
V) [401]
Gerade bei kleinen Abständen der
könnten diese störenden elektronischen
Wechselwirkungen
ins
Gewicht
fallen.
Aus diesem Grund wurde der Abstand zwischen Flavin und Desazaflavin in
weiteren
ModeUverbindungen
4.4.6
Auswirkungen
variiert
eines kovalent
(siehe 4.4.7).
verknüpften Indolrings
Die Photoreduktion des semireduzierten Flavinradikals
Quartett-Zustand
4FADH)
Elektronentransfer
von
bewerkstelligt,
in
DNA-Photolyasen
einem in der Nähe befindlichen
der seinerseits durch eine externe
[135, 139, 140, 402]. Erst
(Flavin im
wird
ersten
wahrscheinlich
durch
des
Enzyms
Tryptophan-Rest
Elektronenquelle
wieder reduziert wird
nach dieser Photoreduktion befindet sich das
aktiven Form.
110
angeregten
Enzym
in seiner
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
Die im
Zuge
des
Studiums
der
ModeUverbindungen
untersuchte Indol-enthaltende
Verbindung
oxidierten
die
Zustand
Desazaflavins durch
zeigte
134
Verbindung
Energietransfer
ModeUverbindungen
125
und
126
ebenfalls
nicht die erwarteten Effekte.
zeigte
neben
der
Fluoreszenzlöschung
Im
des
auch eine starke Reduktion der Flavinfluoreszenz.
Dieser Effekt ist in der Literatur bekannt
und
wird
auf eine
Wechselwirkung
des
elektronenreichen Indols mit dem elektronenarmen oxidierten Flavin in seinem angeregten
Zustand
zurückgeführt [403-410].
Bereich >300
nm
Das
Absorptionsspektmm
blieb
verglichen
mit 125 im
unverändert, wodurch charge transfer-Komplexe zwischen Indol und
Flavin im Grundzustand
Abb. 34. Ein mechanistischer
von
134 auszuschliessen sind.
Vorschlag
zur
Photoreduktion der
111
Modellverbindung
134.
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
ModeUverbindungen
Es wurde deshalb erwartet, dass die Photoreduktion des Flavins
(Anregung
bei 450
nm) in 134 mit NEt3 durch die Anwesenheit des Indols beschleunigt wird (Abb. 34).
Der
Photoreduktion
eine
des
Flavins
zum
Semichinon
intramolekulare Photoreduktion durch das Indol
Gegenteil
dazu wurde auch nach intensiver
Lösungen der Verbindung 134
(FIH)
zum
Absorptionsspektren
Lösungsmitteln
der Flavineinheit blieben unverändert.
den Prozess der Photoreduktion.
und in
(3F10X)
oxidierten Flavins
genug
populiert,
Die
um
durch die Anwesenheit des
eine Photoreduktion mit
Quantenausbeuten
der
NEt3
zu
Im
Der
Indolrings
Gegenwart
von
Die Fluoreszenz- und
Indolring
wird der angeregte
Möglicherweise
musste
sauerstofffreien 5-10"5 M
von
keine Photoreduktion des Flavins beobachtet (Abb. 35).
NEt3
NEt3
Hydrochinon (FlredH") folgen.
Bestrahlung
in verschiedensten
durch
nicht
inhibiert also
Triplet-Zustand
lange
des
und effizient
erlauben [411].
Spaltungsreaktion
der
Modellverbindung
134
nach
Reduktion der Flavin-Einheit mit Dithionit wurden durch die Anwesenheit des Indols
weder
positiv
noch
Modellverbindung
negativ
beeinflusst und
lagen
im Bereich der
Quantenausbeuten der
125.
16-,
1412-
-*-•
4—*
10-
CO
c
CD
-
8-
_c_
!»
6-
k-
420-
0
100
200
t
Abb. 35.
300
(see)
Photoreduktion der
(134, Anregung bei 400 bzw.
ModeUverbindungen 84, 125 und 134.
bei
450
Die
125, Anregung
(84
nm);
nm);
(125, Anregung bei 400 nm).
Konzentration der Lösungen betrug 10"4 M in Etgly, Zusatz von 50 jil NEt3. Es wurde die Abnahme der
relativen Fluoreszenz des Flavins bei 520 nm in Abhängigkeit der Zeit gemessen. Gut zu sehen ist die
verringerte Fluoreszenz der Flavineinheit in 134 in Anwesenheit des Indols. Während der Anregung von
134 bei den Wellenlängen der Absorptionsmaxima des Flavins (450 nm) oder des Desazaflavins (400 nm)
450
bzw.
wurde keine Photoreduktion beobachtet.
112
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
Photoreduktion
Die
des
Flavins
Modellverbindung nicht nachgestellt
von
DNA-Photolyasen ermöglicht
Funktion des
Tryptophans
bei
über
Indolring
einen
werden. Es bleibt die
wird.
der
konnte
Frage offen,
sind kürzlich
Allerdings
Photoreduktion
ModeUverbindungen
des
also
mit
dieser
wie dieser Prozess
Zweifel
FAD-Semichinons
über
die
in
DNA-
effizient miteinander
agieren
Photolyasen aufgetreten [412].
4.4.7 Die
Abstandsabhängigkeit von Energietransfer und Spaltungsreaktion
Obwohl die Kofaktoren in
DNA-Photolyasen möglichst
sollten, sind sie in den Enzymen doch mindestens 18 A voneinander entfernt.
Hypothese aufgestellt,
wurde die
optimiert
während der Evolution nie
Experimente
eine für die
Die
dass
wurde
Enzym durch
Katalyse ungünstige Wechselwirkung
der
Vergrösserung
132 (Schema
wurden entnommen und mit 10
Lösungen
durchgeführten
Kofaktor-Separation
24/25)
zeichnen sich
des Flavin-Desazaflavin-Abstandes
414]. Die Verbindungen wurden in einer Konzentration
dieser
die weite
Kofaktoren
Chromophore vermeidet.
ModeUverbindungen 128, 125, 130 und
durch eine kontinuierliche
beiden
Die in 4.4.5
[107, 108].
lassen jedoch vermuten, dass das
der
Wechselwirkung
die
Daraufhin
fxl NEt3
von
aus
[413,
10"6 M in Etgly gelöst, 3 ml
versetzt.
Ebenso wurde mit den
entsprechenden debenzylierten ModeUverbindungen 129, 126,
131 und 133 verfahren.
Beide Messreihen wurden durch
Dithionitlösung reduziert,
wobei die Menge
Das
von
0.05 M
Dithionit genau für die Reduktion des
an
verblieb
Desazaflavin
vorsichtige Zugabe
in
seinem
oxidierten
Flavinchromophors
Zustand.
wurden die Redox-Zustände durch
Bestrahlungsexperimenten
Vor
und
ausreichte.
während
den
Absorptionsspektroskopie
überprüft.
Um eine erste
das
reduzierte
Abschätzung
Flavin
Fluoreszenzspektren
zu
Anregung
bei
ModeUverbindungen,
(Anregung
bekommen,
gemessen. Abb. 36A
die ein Desazaflavin in der
nach
der Effizienz des
400
Energietransfers
wurden
zeigt
von
allen
In
die Fluoreszenz der
36B
Abb.
sind
die
Desazaflavinderivate 117
("hydroxy"-Form)
beiden Fällen ist ein deutlicher
Anstieg
state-
ModeUverbindungen,
Fluoreszenzspektren
der
enthalten, abgebildet
nm). Als Referenz sind zusätzlich die
und 119
("chinoide" Form) angegeben.
der Desazaflavinfluoreszenz
113
steady
bei 430 nm) enthalten,
die ein Desazaflavin in der "chinoiden" Form
bei 430 nm, Emissionsmaximum bei 470
Desazaflavin auf
Lösungen
"hydroxy"-Form (Emissionsmaximum
nm.
vom
von
den
In
Verbindungen
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
der
mit
kleinsten
Distanz
Fluoreszenzlöschung
95%)
>
Chromophoren (132
proportional
Die
R"6 (R
zu
vollständig
den
Förster
von
sehen.
zu
die Effizienz des
Das ist in
Energietransfers
ist.
vom
Abstand der beiden
Die
Fluoreszenzspektren
sollten sich die unterschiedlichen
Spaltungsgeschwindigkeit und
ModeUverbindungen
sollten diese bei
schlechtesten
25%)
Chromophore
der oxidierten
zwischen Flavin und Dimereinheit in allen
gleichgehalten wurde,
abnehmenden
~
eine ähnliche
wie die Flavin-
Verbindungen
Anhang.
Da die Distanz
Da die
129;
grössten Distanz zwischen den
ModeUverbindungen (Flox, dFl0X) zeigten
oxidierten
ModeUverbindungen.
befinden sich im
die
[399], wonach
Donor-Akzeptor)
Abhängigkeit des Energietransfers
reduzierten
mit der
Verbindungen
bzw.
(128
Chromophoren
133; Fluoreszenzlöschung
Abstand
=
den
zwischen
zu
bzw.
mit der Theorie
Einklang
ModeUverbindungen
die
128
Bestrahlung
Energietransfers
Energietransfer-Raten
direkt auf
Quantenausbeuten der Spaltungsreaktion auswirken.
bzw.
auch
ModeUverbindungen
am
129
den
stärksten
schnellsten
Energietransfer aufweisen,
gespalten
bei 132 bzw. 133 sollten diese
werden.
Aufgrund
ModeUverbindungen
des
die
Spaltungsraten zeigen.
8n
A
7-
16-
B
*>
146-
*
X
up
.
5-
O
\
/
j
m
b
\
/
co
Q.
Q.
°
ü
3^
2-
/
10
f
X
4-
w
12
:'
',
-
/
\
8-
6
I
ii/
\
V
-I.'
1^
\
"
?>
\J-\f—i—i—i—i—|—i—i—i—i—|
-
-
410
460
o.-
510
X
Abb
--
i
i
-.
i^T|
"
560
jnnfnip
—1
610
440
490
540
X
(nm)
590
640
(nm)
36
Die
Abhängigkeit des Energietransfers vom intramolekularen Abstand Flavin-Desazaflavin
Verbindungen smd nach zunehmendem Abstand Flavin-Desazaflavin angegeben A- Fluoreszenzspektren der
), 125 (
ModeUverbindungen 128 (
), 130 (•
), 132 (— -) und 117 (
)
106
M
m
Zusatz
10
u.1
B
von
Anregung
Etgly,
NEt3
Fluoreszenzspektren der Flavinreduzierten ModeUverbindungen 129 (
), 126 (
), 131 (•), i33 (——) und H9 (
)• Anregung
bei 430 nm, 106 M in Etgly; Zusatz von 10 ul NEt3
Flavin-reduzierten
bei 400 nm;
114
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
Einbau
Durch
konnten die
empfindlicheren Detektionsanlage
einer
der
Messung
Aktionsspektren
Spaltungsraten
der einzelnen
Aktionsspektren glichen.
entspricht den
(vgl. 3.6.3)
beschrieben
enthaltende
ModeUverbindungen
Für die
dargestellt.
Bestrahlung
spalteten bei
Man
430
und die
ist in Abb. 37
Maxima
(Bildung
(k
~
min"1)
aufweisen. Die
erstaunlich gute Rate (k
Quantenausbeuten
des
wurden
Spaltproduktes
in
wie
bereits
Mono(flavin)-
Der Umsatz bei den
gemessen.
der
einzelnen
der
Zeit)
entspricht
dies
Abhängigkeit
130 und 132
Verbindungen 129, 126, 131
~
0.3
Verbindungen
Dieses scheinbare
(Tab. 8).
Geschwindigkeitskonstanten
Konformationsanalyse
in
CHC13
mit dem
und in
H20
mit dem
Energietransfer (132
min"1).
wieder
Energietransfer (128
Zur
auch
und 133
115
129)
die schlechteste
grössten Flavin-Desazaflavin-
133) zeigen hingegen
bzw.
Widerspmch spiegelt sich
Halbwertszeiten
aufgelistet.
Programm Macro-Model
erhalten.
bzw.
Veranschaulichung
die
Abstände zwischen Flavin und Desazaflavin
Gasphase,
Dies
sieht, dass in den Messreihen die ModeUverbindungen mit dem kleinsten Flavin-
0.01
relativen
mit
schnellsten.
Abstand und dem schlechtesten
den
durchgeführt.
Aktionsspektren
der
bei 400 nm, die "chinoiden"
Desazaflavin-Abstand und mit dem besten
Rate
dargestellten
mehrmals
Als Referenz wurde zusätzlich die
"hydroxy"-Verbindungen 128, 125,
nm am
nm
Quantenausbeuten
gleichen Bedingungen
jeweiUgen
der
Wellenlängen
400 und 430
dass die
ergab,
nm
abgebildeten Aktionsspektren.
bestimmt.
84 unter
Verbindung
106 M durchgeführt
von
Spaltungsexperimente
die
Wellenlängen 370,
Geschwindigkeitskonstanten
Die
HPLC-Apparatur
in ihrer Form den in Abb. 33
wurden
Maxima der in Abb. 33
die
über den Bereich 350-470
Verbindungen
Darauf
monochromatischem Licht der
einer
bei einer Konzentration
Spaltungsexperimente
werden. Eine
in
ModeUverbindungen
auch in
sind hier neben den
und
die
geschätzten
Die Abstände wurden
5.5
eine
durch
(Kraftfeld: amber*) in der
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
ModeUverbindungen
132
•
130
a
125
128
A
0
2
4
6
8
10
t
12
14
16
18
20
(min)
133
•
126
N
Î3
B
131
129
CO
E
=3
Q)
10
t
Abb. 37.
Zeit t.
Relativer Umsatz (1
Durch
=
100%
monoexponentielle
A : Messreihen der
Fits
12
14
16
18
20
(min)
Spaltung)
der
konnten
die
gemischten ModeUverbindungen in Funktion der
Spaltungsraten k in [min1] ermittelt werden.
ModeUverbindungen mit benzyliertem Desazaflavin ("hydroxy"-Form) 132, 130, 125,
Abstand); Bestrahlung der 10"6 M Lösungen in Etgly bei 400 nm; Zusatz von 10
128 (nach abnehmendem
84 (
B: Messreihen der ModeUverbindungen mit
(il NEt3;
) ist als Referenz angegeben.
debenzyliertem, deprotoniertem Desazaflavin ("chinoide" Form) 133, 131, 126, 129 (nach abnehmendem
Abstand); Bestrahlung der 10"6 M Lösungen in Etgly bei 430 nm; Zusatz von 10 Ul NEt3. 84 (
) ist als
Referenz
angegeben.
116
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
ModeUverbindungen
der Ergebnisse von Bestrahlungsexperimenten der benzylierten ("hydroxy")
Modellverbindungsserie (132, 130, 125, 128; Bestrahlung bei 400 nm) sowie der
debenzylierten, deprotonierten ("chinoiden") Desazaflavin-Flavin Modellverbindungsserie (133, 131, 126,
Zusätzlich sind als Referenz die Ergebnisse für die Flavin
129; Bestrahlung bei 430 nm).
Tab.
Auflistung
8.
Desazaflavin-Flavin
Modellverbindung
Desazaflavin; krd
=
Modell-
(Bestrahlung bei 400 bzw. 430 nm) angegeben.
Geschwindigkeitskonstante; t1/2 Halbwertszeit; $
84
relative
=
Zustand des
Zustand des
Fl-dFl
o
Fl-dFl
=
=
Flavin-
Abstand
Quantenausbeute.
krel
*-l/2
<t>
Verbindung
Flavins
Desazaflavins
(A)
(min1)
(min)
132
FlredH-
dFlox-OBn
19
0.27
2
0.10
130
FlredH-
dFlox-OBn
16
0.07
9
0.03
125
FlredH-
dFlox-OBn
12
0.05
13
0.02
128
FlredH-
dFl0X-OBn
7
0.01
78
0.005
84
FlredH-
0.02
32
0.08
133
FlredH-
dFl0X-O"
0.39
1
0.10
131
FlredH-
dFl0X-O"
0.23
3
0.06
126
FlredH-
dFlox-0"
0.08
8
0.02
129
FlredH-
dFlox-0"
0.02
32
0.01
84
FUH-
0.01
50
0.08
Der
geht
Anstieg
der
Quantenausbeute
O
von
«
einher mit einer Abnahme der Halbwertszeit
2 bzw. 1 min
und
(132, 133).
Bis auf die
Desazaflavin-enthaltenden
enthaltende
Spaltungsrate
ist unübersehbar.
Desazaflavins ist die
nahen UV-Bereich
Die
negativen
84.
(370 nm) in
den
Beim
derzeitigen Stand der Dinge wird
werden in den
System
10%
(132, 133)
(128, 129)
spalten
als
die
alle Flavin-
Flavin
nur
auf die
ModeUverbindungen
sichtbaren Bereich
wie sie bereits
Messreihen deutlich.
störende elektronische
zu
nahe
Anordnung
Wechselwirkungen
zwischen der Desazaflavineinheit und der Flavin- oder der Dimereinheit auslöst.
Veranschaulichung
sind
die
Vorgänge
während
117
des
vom
(400 bzw. 430 nm).
Spaltungsreaktion,
abstandsabhängigen
auf
der Anwesenheit des
davon ausgegangen, dass eine
dem Flavin-Dimer
-
Energietransfers
günstige Auswirkung
energieärmeren
4.4.5
an
schneller
Effekt des
Einflüsse des Desazaflavins auf die
festgestellt wurden,
128 und 129
deutlich
positive
auf O
80 bzw. 30 min
des Aktionsmaximums der
unter
des Desazaflavins
Der
Eine weitere
Verschiebung
von etwa
Verbindungen
Verbindungen
Referenzverbindung
(128, 129)
1%
Spaltungsexperiments
Zur
der
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
Modellverbindung 125
wurde entworfen
ModeUverbindungen
zusammenfassend in Schema 26
(ähnliche Systeme
siehe Ref.
(i)
wird die Desazaflavineinheit durch ein
absorbiertes Photon (ii) in den angeregten Zustand
Flavin hat
führt
mehrere
nun
zur
361] (through bond)
bzw. über das
der reduzierten Flavineinheit.
überträgt ein
Elektron durch die
oder durch van-der-Waals-Koxitakt
Lösungsmittel [422-424] (through space)
durch reduktive
Effektiver intramolekularer
gebracht.
Das angeregte
Möglichkeiten des Elektronentransfers [366, 418, 419]:
Das angeregte Flavin
1)
Anregung
Szenario
[357, 360, 415-417]:
Nach der selektiven Reduktion des Flavins
Energietransfer (iii)
dargestellt. Folgendes
Öffnung
des
Cyclobutanrings
Bindung [307, 357, 359,
(Exciplex-Bildung [420, 421])
auf das
in seine Monomere
gespalten
(vii-ix).
wird
2) Das angeregte Flavin übertägt ein Elektron auf das Pyrimidindimer,
Öffnung
des
kommt
Cyclobutanrings
es
jedoch
zu
das
Pyrimidindimer (iv),
der
vor
einem Rückelektronentransfer auf das
(vi).
Flavin
3) Das angeregte Flavin überträgt ein Elektron through bond über das Pyrimidindimer
oder
through
space "direkt" auf das Desazaflavin
erneut mehrere
Möglichkeiten,
Aufgmnd
dieser
Spaltungsreaktion von
through
das Elektron wieder
Postulate
sich
Das semireduzierte Desazaflavin hat
abzugeben.
die
beobachteten
Chromophore
von
R
=
100
Â
zu
Elektronentransfer-Prozesse sehr viel schneller mit dem
effektive
erklären.
through .space-Elektronentransfer-Prozesse
finden sind
Während die immer
und noch
[425, 426],
Donor-Akzeptor-Abstand
braucht
es
Donor und
nehmen
ab.
von
R
Â
die
in
finden
vorliegenden
[311].
Die
through èon<i-Elektronentransfer-Reaktionen,
Modellsystemen
sicherlich
Elektronentransfer-Prozesse ausmachen werden,
427-429].
118
den
Hauptanteil
der
nehmen normalerweise mit
Für
Akzeptor
zumindest nahezu van-der-Waals-Kontakt, sie sind jedoch kaum in Abständen
zu
der
Abhängigkeiten
Resonanzenergietransfer-Prozesse mit R"6 abnehmen
Akzeptor-Donor-Distanzen
über
lassen
der Distanz der beiden
space verlaufenden
(v).
>
in
10
den
auftretenden
e"R ab [307,
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
ModeUverbindungen
Veranschaulichung der Vorgänge während der Spaltungsreaktion der gemischten
R
Pentyl. (i) Photoreduktion durch Bestrahlung bei 480 nm in Gegenwart
von NEt3; (ii) Bestrahlung bei 400 nm; (iii) Resonanz-Energietransfer von der Desazaflavineinheit auf die
Flavineinheit; (iv) Elektronentransfer vom Flavin auf das Cyclobutandimer; (v) konkurrierender
Elektronentransfer auf die Desazaflavineinheit; (vi) konkurrierender Rückelektronentransfer auf das Flavin;
(vii) reduktive Öffnung des Cyclobutanrings; (viii) Spaltung des Cyclobutanrings in die
Schema 26. Schematische
125.
ModeUverbindungen
=
Monomereinheiten 135 und 136; (ix) Rückelektronentransfer auf das Flavin.
(i)
o
H
H
i
ri
N
RN
I
H
U
o
V
h
Xe
Vu*
N
RN
rY
J
Yi
o
o
(FlredH7dFI0X-0Bn)
125
BnO'
0
BnO'
O
HN^-4^NH
°^nTh N^°
HN^f-V^NH
I
ô
I
H
H
H
I
Y
rV
°
W
k
O
H
Yï
X^X J
k
°
(v)
o
HN^
o
(ui)
cr^f^vf
X
O
W nAnR
RNANG rV
L.
|
X
^
N-^r
„.
"o
<z
BnO'
BnO'
©,-
(viii), (ix)
NH
i
O^N^-3-N^o
>
H
«
¥
tl
I
H
H
I
0
^A NANR
h
V\ I
,ull)
/T
N-^O
0
Vy-D
136
BnO'
BnO'
Die hohen Quantenausbeuten der
also dadurch
zu
erklären
sein,
dass
Desazaflavineinheit und
dem
mögUch ist, während die
Distanzen für
involvieren, bereits
zu
ModeUverbindungen
durch
den
Einschub
Flavin-Dimer-System
der
131-133 (<E>
der
Proline
119
10%) könnten
zwischen
Energietransfer immer
Elektronentransferprozesse,
hoch sind [425, 429],
=
der
noch
die das Desazaflavin
Mit anderen Worten wären die
positiven
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
Effekte der Anwesenheit des
Effekte
negativen
ModeUverbindungen
Desazaflavins
ausgeschaltet
through
Elektronentransfer
Ered(Pyrimidindimer)
das
~
-2.2
128 (O
=
zumindest nach
die
den
Spaltungsrate
Dimer
oder
Die
muss.
in
durchaus
ist jedoch
die
(132
und
zu
zwischen den
=
in
für das Desazaflavin in der
dass diese
Aufnahme eines Elektrons
ModeUverbindungen
erreicht.
131
Der
ModeUverbindungen
Beide
beide
mit
C(8)OH
In
Chromophore
fähig
sind.
Durch
gegenüger
den
Der Abstand des
dem
Tetraprolin-
geladene, debenzylierte
ModeUverbindungen
zu
klein.
Es kommt
ModeUverbindungen
Der Abstand zwischen den
2%).
mit dem
Fällen
zeigen
zu
maximale
Hier
spaltet die Verbindung
=
3%)
Chromophoren
Interchromophor-Abstand
in
130
dem Paar
konkurrierenden Elektronentransfer-Prozess auf das
=
reduzierte
im FaU der
etwa zwischen dem
(ungeladenes Desazaflavin)
wie das Paar
fast maximale Quantenausbeuten (<3>
Flavin-Desazaflavin
zeigen
Diprolin-Abstandhalter (130, 131) liegt
vergleichbaren Quantenausbeuten (<D
Verbindung
der
10%). Bei den ModeUverbindungen 125 und 126 ist der Abstand
der oben genannten Paare.
mit
V;
erschwert ist.
Desazaflavineinheit als auch auf die
Elektronentransfer-Prozessen,
=
-0.9
Sie werden als redox-inaktiv bezeichnet.
zur
beiden
Chromophoren in beiden
Quantenausbeuten (O
4.4.5
erwarten, dass diese Elektronenaufnahme
gross.
zu
Quantenausbeuten (O
Abschnitt
133) ist sowohl für einen konkurrierenden Elektonentransfer auf
ungeladene, benzylierte
Desazaflavineinheit
bond-
niedrigen Quantenausbeuten
(siehe 4.4.2) konnte gezeigt werden,
Desazaflavin
Abstandhalter
through
~
Diese Annahme würde auch auf die Daten in Tab. 8 zutreffen.
zum
wären nach
klar für einen Elektronentransfer auf
Reduktionspotentiale
benzylierten, ungeladenen Desazaflavinen
Flavins
die
0.5%) Rechnung trägt.
Lichtanregung
negative Ladung
während
129, in denen sich das Flavin
das
erstaunlich
"chinoiden" Form bekannt.
den Photoreduktionsstudien
vorhanden,
vor
(Ered(8-Hydroxy-5-desazaflavin)
was
In der Literatur sind keine
deprotonierten,
auf
V) sprechen zumindest
benzylierte Desazaflavin,
Modellverbindung
und
Desazaflavin entscheiden
Reduktionspotentiale
erwähnten
128
bond-Elektronentransfer
auf das
wie
Ganz schlecht für die
wurden.
obiger Erklärung die ModeUverbindungen
zwischen
nach
6%)
125/126, während die
wie das
130/131
Paar
132/133
reicht also für
einen
ungeladene "hydroxy"Desazaflavin
in
130, nicht aber auf das Desazaflavin in 131, das eine negative Ladung trägt.
Um weitere Informationen
den
oben
beschriebenen
bezüglich
der
Energie-
ModeUverbindungen
120
zu
und
Elekronentransferprozesse
erlangen,
wurden
in
in
einer
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
Zusammenarbeit mit Dr. M. Volk und C.
Beyerle
an
der
physikalischen Abteilung
Absorptionsmessungen
auf eine Diskussion
der
deprotonierten
Wellenlängen
birgt
erzielten Resultate
der
sodass
Spaltungsreaktion
der
Einklang
zu
mit den in DNA-
Auch die
eine maximale
um
bei höheren
gesteigerten Absorption
negativeren Reduktionspotentials.
sprechen
Â).
Das Desazaflavin in seiner
erzielen.
neben der
Kauf,
in
Energietransfer
durch
daher für eine genaue
DNA-Photolyasen
Die mit den
Feinabstimmung
und nicht für ein in der
Zusammenfassung
Die in Abschnitt 4.2 beschriebene
die
Synthese
ModeUverbindungen (4.3).
Herstellung
8-Hydroxy-5-desazaflavinderivaten
von
Flavin-
von
Zusätzlich wurde durch die
(Abschnitte
in
Oligopetide
erster Schritt in diese
Chromophore
Richtung
wurde durch die
Oligoprolin-Desazaflavinderivate
Die Desazaflavineinheit der in
wurde durch
"hydroxy"
Durch
Benzylierung
Desazaflavin-enthaltenden
und
Desazaflavinaminosäuren 103 und 116
für den Einbau dieser
•
Ende
zum
unoptimiert angesehenes Energietransfer-System.
ermöglichte
•
Bis
Interkofaktor-Distanzen (> 18
in der DNA
Enzym
Fluoreszenz- und
abgeschlossen werden,
stehen auch in
grosszügigen
für das
nicht
M. E. Michel-
Prof.
zeitaufgelöste
Untersuchung
des Abstandes der Kofaktoren in
Literatur als
•
relativ
den weiteren Vorteil des
ModeUverbindungen
4.5
der
Chromophore
Pyrimidindimere
Form
von
verzichtet wurde.
nehmen einen etwas schlechteren
Reparaturrate
(tuning)
Messungen jedoch
vorliegenden Ergebnisse
Variation des Abstandes der
Enzyme
der TU München
vorläufiger Ergebnisse
Photolyasen gefundenen,
Gruppe
obigen Verbindungen durchgeführt.
Arbeit konnten diese
vorliegenden
Die
an
der
Kompa
ModeUverbindungen
bzw.
Synthese
4.1 und
an
der
der Flavin- bzw.
4.2) die Vorraussetzung
Festphase gegeben.
Festphasensynthese
der kovalenten
120-122 erreicht.
diesem
Kapitel
Deprotoniemng
beschriebenen
der
ModeUverbindungen
C(8)OH-Gruppe
sowohl in ihrer
als auch in ihrer "chinoiden" Form in basischem Milieu erhalten
die
Untersuchung
Modellverbindungen
123
Desazaflavin-Chromophore
und
Ein
der
124
Spaltungsreaktion
(4.4.1)
konnte
der
geklärt
(4.4.1).
Bis(desazaflavin)werden,
dass
in ihren oxidierten und reduzierten Zuständen nicht
121
die
zur
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
Reversion
lichtgetriebenen
•
ModeUverbindungen
Pyrimidin-Cyclobutandimeren fähig
von
ModeUverbindungen
123 und 124
keinen Umsatz in das
entsprechende Spaltprodukt
zeigten
auch nach
Die selektive Reduktion der Flavineinheit in den
längerer Bestrahlungsdauer
gemischten (Flavines,
In
Analogie
zur
ist auch in den
DNA-Photolyase
Desazaflavins
reduzierten Flavin hin.
zum
Aktionsspektren
der
entsprechenden
mit der
von
mit
dem
aus
Aktionsspektrum
A. nidulans.
Pyrimidindimeren
Lichtsammeieinheit
Absorption
im
zu
Verlängerung
Desazaflavin-Einheit bei
ModeUverbindungen
Spaltungsreaktion,
katalysieren,
zu
(4.4.4). Verglichen
Wellenlängenbereich
der
um
Modellverbindung
Flavin-
und
besteht ihre
60
126
nm
ist
Desazaflavin-
Lage sind,
die
alleinige Aufgabe darin,
Wellenlängenbereich
die
schwache
des intramolekularen Abstands zwischen Flavin- und
gleichbleibendem
resultierte
der
der
kompensieren.
in
Flavin-Dimer Abstand in den
einer
obwohl die Effizienz des
Desazaflavin-Abstand abnahm (4.4.7).
kompetitiven
Absorption
Da Desazaflavine nicht in der
"ungefährlichen"
des reduzierten Flavins
Eine kontinuierliche
84 verschiebt sich der
Aktionsspektmm
gemessene
enthaltendenPhotolyase
Reversion
bei welchem auch die
in Anwesenheit des "chinoiden" Desazaflavins in 126
Das
deckungsgleich
Energietransfer des
gemischten ModeUverbindungen
Desazaflavin-Einheiten ein Maximum aufweisen
Spaltung
bathochrom.
als
Wellenlängen,
Mono(flavin)-Modellverbindung
maximaler
dieser
Spaltungsreaktion
maximalen Umsatz bei
die
Gegenwart des oxidierten oder reduzierten Flavins
Dieser Befund deutet auf einen intramolekularen
zeigen
•
gemischten ModeUverbindungen
verringert (4.4.3).
Die
DNA-Photolyase
werden, exakt nachzustellen.
Fluoreszenz des Desazaflavins in
•
und Desazaflavin-
die Zustände des Flavin-
sowie des Desazaflavin-Kofaktors, wie sie in der aktiven Form der
•
Die
136.
enthaltenden) ModeUverbindungen (4.4.2) ermöglichte
vermutet
sind.
Zunahme
der
Energietransfers
Dieser scheinbare
gemischten
Geschwindigkeit
der
mit wachsendem Flavin-
Widersprach
wurde mit
Elektronentransfer-Prozessen zwischen Flavin- und Desazaflavineinheit
erklärt, die sich auf den Flavin-Dimer-Elektronentransfer störend auswirken.
Im
Gegensatz
mit
zu
zunehmendem
Energietransfer-Prozessen
Donor-Akzeptor-Abstand
verlieren
schnell
122
an
Elektronentransfer-Prozesse
Wirkung.
Folglich
wirken bei
4. Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
grösseren
Flavin-Desazaflavin-Abständen
Energietransfer-Prozesse,
während
Chromophoren vernachlässigbar
grossen Abstand
Photolyase
(>
18
Â)
die
überwiegend
die
ModeUverbindungen
spaltungsfördernden
Elektronentransfer-Prozesse
werden.
Dies könnte der Grand
zwischen
den
für den relativ
zwischen Flavin- und Desazaflavin-Kofaktor in der DNA-
sein.
123
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
5. Flavin-funktionalisierte
5.
FLAVIN-FUNKTIONALISIERTE OLIGOPYRROL/IMIDAZOL-POLYAMIDE
5.1
DNA-bindende Moleküle
den
Neben
offenen
durch
Cyclobutandimeren
Fragen
zum
beantwortet werden konnten, ist auch die
der DNA eine weitere unverstandene
zunächst
einige
Erkennung
Eigenschaft
und
der
Kapiteln
3
und 4
reparieren
Klassen
von
können.
Als kurze
Teil
eines Photodimers in
Bindung
Photolyasen.
Einführung
von
zum
Deshalb wurde im
versucht, kleine Modellsysteme aufzubauen, die Photodimere
Rahmen dieser Arbeit
DNA erkennen und
die in den
DNA-Photolyasen,
Photoreaktivierung
der
Mechanismus
an
der
in dieses Thema sollen hier
die DNA erkennen und
Verbindungen vorgestellt werden,
reversibel binden.
5.1.1 DNA-bindende Proteine
Viele
beteiligten
und Translation
Replikation, Transkription
der
an
Proteine binden
sequenzspezifisch
an
DNA.
Tertiärstmkturen charakterisieren können, die für die
Zu den bekanntesten
der
gehören
Die
"Zinkfinger" [430].
das
oder
deren
Regulation
Man hat mehrere Sekundär- und
DNA-Bindung verantwortlich
sind.
"helix-turn-helix"-Motiv, das "two-ß-strand"-Motiv und
Bindung erfolgt
im
in der
aUgemeinen
großen
Furche der
DNA-Doppelhelix.
Die
Bindung
der
Basensequenz erfolgen.
Wechselwirkung mit
und
entlang
der
Veränderungen,
In
durch
Photolyasen
Man nimmt an, dass diese
dem
gleiten
[121]
die das Photodimer in der
Photolyasen
Enzyme
DNA-Bindungsstudien
jedoch unabhängig
von
der
zunächst durch elektostatische
1.4.3).
auslöst
an
die DNA binden
Durch
strukturelle
[112, 115, 119], wird das
möglicherweise über
in das aktive Zentrum des
mit dem
unspezifische,
(siehe
Doppelhelix
erkannt und
(siehe 1.4.3) [122, 123]
konnte eine schwache
muss
negativ geladenen Zucker-Phosphat Rückgrat
Doppelhelix
Photodimer durch die
Mechanismus
DNA
einen
"base-flipping"-
Enzyms gedreht.
positiv geladenen Tripeptid Lys-Trp-Lys [281]
auf elektrostatischen
124
Wechselwirkungen
bemhende
5. Flavin-funktionalisierte
Bindung
erreicht
DNA
an
Anwesenheit dieses
werden.
Peptids
führte
Die
Bestrahlung photogeschädigter
DNA
einer teilweisen Reversion der Photodimere.
zu
DNA-bindende Domäne des
unspezifisch
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Poly amide
Transkriptionsfaktors MyoD
konnte
Reparaturstudien
mit
eingebautem
Reversion des Dimers mit Halbwertszeiten
vollständige
erfolgt
einzelsträngigen Oligomeren
an
von
Photodimer
einigen
grossen Furche der
T.
Erste
zeigten
Stunden. Die
in diesem Fall über eine dimerisierte a-Helix-Einheit eines
Die
von
Carell mittels Einbau einer Flavin-Aminosäure [431] funktionalisiert werden [432].
in
eine
Bindung
Polypeptids
in der
DNA-Doppelhelix.
5.1.2 Kleinere DNA-bindende Moleküle
Im
Vergleich
Proteinen, die große Kontaktflächen
zu
Bindung
die Zahl der Kontakte bei der
die Anzahl der funktionellen
in der kleinen Furche der
Gruppen
der Waals-Koxitakt der
besser ist als in der
großen
gehören Polyamid-
und
A
gebundenen
Furche.
(139)
aus
der Stoffklasse der
Die
Einlagerung
ist nicht
Bei
der DNA.
et
al.
häufig
eingesetzt.
Das
Spaltprozess
Bei der
zu
revertieren
Bindung
handelt
Polyamide sind Triostin
Arugomycin
besitzen
Einheiten.
liegenden DNA-Basenpaaren
aber
sich
es
interkalierende
bevorzugt
immer
um
Solche
ein.
Diese
in GC-reichen Abschnitten
ausgedehnte
aromatische
In einer interessanten Studie
/.
K.
(9,10-Phenanthrenchinondiimin)-Rhodium-Komplexe
in
Reparatur
Rhodium(III)
DNA als auch die des
Es ist
139
elektronenarm sind.
zur
für
Zu den zuckerenthaltenden Molekülen zählt
und
wurden
kataly tischen Mengen
den Basen in der kleinen Furche
Molekülen, die in der kleinen Furche binden,
sequenzspezifisch, erfolgt
[272]
zu
DNA-Doppelhelix geringer
Anthracycline (Abb. 38).
Interkalatoren
die
Ringsysteme,
Zu den
sich zwischen übereinander
lagern
Interkalatoren
Barton
137
Polyamide
Moleküle
Obwohl
Es wird angenommen, daß der
Oligosaccharid-Antibiotika. Beispiele
(137) und Distamycin (138).
können, ist
kleinerer Moleküle beschränkt [433, 434].
ist, erfolgt die Bindung der kleineren Moleküle meist hier.
van
DNA ausbilden
zur
war
Pyrimidindimeren
von
in der
an
der
von
DNA-Doppelhelix
die Photoschäden in einem oxidativen
Lage,
(vgl. 1.6.1).
eines
Liganden
Liganden,
man
an
die DNA ändert sich sowohl die Struktur der
spricht
dabei
von
induzierter Passform
(induced fit).
bekannt, dass die meisten beschriebenen DNA-Liganden, die in der kleinen Furche
binden, eine hohe Sequenzspezifität aufweisen.
125
Die
Komplexität
der
Wechselwirkungen
5. Flavin-funktionalisierte
und die
anspruchsvolle
haben eine
Hingegen
Moleküle
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
Stereochemie und
Entschlüsselung
der
Typ
des
der chiralen Aminosäuren und Zucker
entsprechenden Erkennungscodes
sind durch die Arbeiten
vom
Synthese
von
Distamycins
Dervan et ai.
[435]
die
bis
Bindungseigenschaften
138 sehr gut untersucht worden.
Synthese sequenzspezifisch bindender Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
möglich [435-437].
Im
folgenden
i
o.
HN
sollen diese
o
o
Systeme
i_JLN^JLN_L<o
\
O
—N
H
Design
und
ist seit kurzer Zeit
vorgestellt
werden.
i
^
*rjh
-NH
O
O
CH3
(TriostinA)
137
N
,
genauer
Auch
der
Yo
V
COr*
jetzt verhindert.
P
\1J-Lff
.o
HN
138
Y
(Distamycin)in)
NHHCI
H?N
02N
O OH
MeO
°-^o
HO
139
MeO
(Arugomycin)
°VOH
5<5^o
4?U
MeO
Abb. 38.
und
Einige
natürlich vorkommende
Arugomycin (139)
Moleküle, die
an
doppelsträngige
besitzen interkalierende Untereinheiten.
137 und 139 binden wie auch
Distamycin (138)
Die
126
DNA binden. Triostin A
Peptid-
in der kleinen Furche der
'o
(137)
bzw. Zucker-Einheiten
DNA-Doppelhelix.
von
5. Flavin-mnktionalisierte
Oligo-Pymol/Imidazol-Polyamide
5.1.3
ist ein natürlich vorkommendes Antibiotikum.
Distamycin (138)
die Struktur
138 wurde ein Reihe ähnlicher
von
Arbeiten
hergestellt [433].
des
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
von
P. B. Dervan et al. führten
sowie der
Bindungsverhaltens
Verbindungen
Sequenzspezifität
von
zur
Pyrrol-
In
Anlehnung
an
Chemotherapeutika
als
weitgehenden Aufklärung
und
Imidazol-Polyamiden
[438].
Grundbausteine dieser
imidazolringe,
die
Polyamide
Moleküle,
regelmässigem Abstand
"äussere" Kante weist
"innerer"
deren
an
entsprechend Carbonylsauerstoffe
da die freien Amine sehr
sind Acet- und Formamide anzutreffen, aber auch
wird meist
Carboxyterminus
Der
nur
Um
zu
manchmal eine
bereitstellen. Ein
wieder ein
das
komplexere
fungieren
Die
können.
Der Aminoterminus
Substituenten sind
die unter
liegt
möglich.
physiologischen
Regel,
die
die dort vorhandenen funktionellen
ein
A-T-Basenpaar
der N-
drei Funktionalitäten
C(2)-Amino-Funktion
Das
N(3) des Adenins,
C(2)=0
an
daß der Abstand der
H-Brückendonoren und
Akzeptorfunktionen
DNA fast genau dem Abstand der Donorfunktionen in den
von
mehr als
fünf
Moleküle "ausser Takt" [439].
jedem
vierten
Pyrrol
des
Cytosins
des Guanins ein H-Donor und das Guanin-
H-Akzeptor. Übereinanderliegende Basenpaare ergeben
zeigt sich,
bei einer Kette
an:
Gruppen
in der kleinen Furche zwei
und das
C(2)=0 des Thymins
kleinen Furche charakteristisches Muster
um
in
Amid-(NH)-Gruppen
oxidationsempfindlich sind. Häufig
Gruppe gebildet,
man
dargestellt, wird
G-C-Basenpaar bietet
H-Akzeptor,
daher nach
flache,
positive Ladung.
Wasserstoffbrückenakzeptoren,
Es
N-Methyl-
entstehen
Somit trägt der C-Terminus in der
binden können, muß
betrachten. Wie in Abb. 39
N(3)
auf.
Es
oder
verstehen, wie diese Moleküle in der kleinen Furche der DNA-Doppelhelix
sequenzspezifisch
ist ein
einer
von
Bedingungen protoniert vorliegt.
Terminus
Kante
zueinander als Wasserstoffbrückendonoren
acylierter Form vor,
immer in
N-Methyl-pyrrol-
und 4-Amino-substituiert sind.
2-Carboxy-
"halbmondförmige"
sind aromatische
somit ein in der
-akzeptoren.
in der kleinen Furche der
Oligopyrrolen entspricht.
aufeinanderfolgenden Pyrroleinheiten geraten
Für die
Herstellung längerer Polyamidketten
braucht
bzw. Imidazol einen Abstandhalter mit definierter
das Molekül wieder "in Takt"
zur
Erst
DNA
zu
bringen.
127
die
es
Länge,
5. Flavin-funktionalisierte
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
H
N=\
N=\
^^ ^
u
9
D
D
T-A
Basenpaar
C-G
Abb. 39.
Wasserstoffbrückenakzeptoren (A)
Verfügung
stehenden funktionellen
Liegt
ein
OUgopyrrol
Gruppen
der
Länge nach
ausgebildet (Abb. 40).
eine Wasserstoffbrücke
Waals-Kontakte
der
kürzlich
der
des
stabilisieren den
Basenpaare spezifisches
in der kleinen Furche,
Amidprotonen
und den
so
werden
sowie
Salzbrücken
zwischen
Van-der-
den
negativ
und den
positiv geladenen Gruppen
Komplex zwischen
DNA und
Polyamiden
Pyrrol/Imidazol-Liganden demonstrierte,
eines
daß
Oligonukleotids
die bisher
Experimente [440] abgestützten Bindungsverhältnisse
auf
mit
der
Akzeptor N(3)
DNA-Rückgrates
publizierte Co-Kristallstraktur
zur
gegabelte
H-Akzeptorfunktionen
Imidazole können zusätzlich über den
Ringe
Die
Muster.
C(2)-Amino-Funktion des Guanins ausbilden.
aromatischen
geladenen Phosphaten
Polyamide
zu
in der kleine Furche der DNA.
(D)
bilden ein für A-T und G-C
Wasserstoffbrücken zwischen dessen
DNA-Basen
und -donoren
Basenpaar
der
zusätzlich. Eine erst
gebundenen Oligo-
zweidimensionale
NMR-
auch im Kristall anzutreffen sind
[441].
Distamycin (138)
Dabei
liegen
aufgeweitet
zwei
wird.
ist ausserdem in der
Distamycine antiparallel
in der kleinen
Der Aminoterminus des
Distamycins liegt
DNA-Bindungssequenz [442].
zu
den
Akzeptorzentren
Das
Lage, 2:l-Komplexe
mit
zu
y-Aminobuttersäure
liegen
bilden.
Furche, die dadurch erheblich
immer auf der 5'-Seite der
der Basen ausbilden.
kann durch kovalente
erzwungen
haamadelförmige Komplexe (hairpins),
übereinander
zu
Jedes der beiden Moleküle kann dabei Wasserstoffbrücken
Bindungsmotif dieser 2:1-Komplexe
Oligopyrrole
mit der DNA
werden.
bilden
sich
in denen die beiden verbundenen
kommen (siehe 140 in Abb. 41).
ist ebenfalls so, dass der N-Terminus in
Bausteine des N-terminalen Teils des
Es
Verknüpfung
5'-Richtung
der
Die
dadurch
Oligopyrrole
der Haarnadel
Erkennungssequenz zeigt.
Polyamids bilden,
128
Orientiemng
zweier
wie in Abb. 41
gezeigt,
Die
H-
5. Flavin-funktionalisierte
Brücken
Teils
zu
zu
den Basen eines einzelnen
den Basen des
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
Stranges, diejenigen
des
antiparallelen,
C-terminalen
gegenüberliegenden Strangs.
1/
H-N©
)
3'
o(
DNA
/
5'
/
g/t
o/a
oJ-Hs::a^0
-O i/o
5'
3'
Gegabelte Wasserstoffbrücken im l:l-Komplex zwischen Distamycin (138) und einem poly(AT)
DNA-Doppelstrang. Die kleine Furche der DNA wurde in dieser Darstellung auf der Ebene abgerollt. Die
umkreisten Punkte symbolisieren freie Elektronenpaare der Wasserstoffbrückenakzeptoren.
Abb. 40.
N-
Abb. 41. Wasserstoffbrücken zwischen dem
Haarnadel-Komplex 140 und einem DNA-Strang. Die Amidgegenüberliegenden Pyrrolen bilden dabei H-Brücken zu den Akzeptorzentren eines
Basenpaares. Zusätzlich wird eine H-Brücke zwischen dem N(3) des Imidazol-Bausteins und der 2-AminoFunktion des Guanins ausgebildet.
Protonen
von
zwei
129
5. Flavin-funktionalisierte
Aus
Gründen
entropischen
Stabilität. Die
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
Komplexbildung
ist
besitzen
diese
entropisch begünstigt,
die Wassermoleküle, die in der kleinen Furche
hingegen
bemht
Sequenzspezifität
Erkennungssequenzen
über die
Haarnadelkomplexe
auf
da bei
Bindung
der
gebunden sind, freigesetzt
enthalpischer
sehr
hohe
Oligopyrrole
Die
werden.
Unterscheidung
der oben beschriebenen
Ausbildung
eine
der
DNA-
Wasserstoffbrücken-
Bindungen [443].
Mit den Bausteinen
Pyrrol (Py),
Imidazol
lassen
3-Hydroxy-Pyrrol (Hp) (Abb. 42)
formulieren
Paarungsregeln
(Im)
sich
und dem erst kürzlich beschriebenen
in
die
Tab.
zusammengefassten
9
[435].
für
Paarungsregeln der Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide. Ein + steht für bevorzugte, ein
Baustein-Kombination.
mit
der
eines
angegebenen
Haarnadelpolyamids
benachteiligte Basenpaar-Bindung
Die Baustein-Kombination bezieht sich auf die in Haarnadelkomplexen einander gegenüberliegenden
Tab. 9.
-
Fünfring-Aromaten,
die
jeweils
für die
Ausbildung
von
H-Brücken
zu
der Base auf ihrer Seite der kleinen
Furche verantwortlich sind.
Basenpaar
B austein-Kombination
G-C
Im/Py
+
Py/Im
*fc*
I
Py-Baustein
Die Einheiten des
=
+
Imidazol; Hp
=
H
\—N
^—N
^V
l
o
o
Im-Baustein
Polyamids,
-
-
H
-N
Im
-
+
-
H
Pyrrol;
-
+
-
Py/Hp
T-A
A-T
-
-
Hp/Py
Abb. 42.
C-G
die mit der DNA in
3-Hydroxypyrrol.
130
OH
$Y*
l
O
Hp-Baustein
spezifische Wechselwirkung
treten.
Py
=
5. Flavin-funktionalisierte
Guanin
(G) bildet bevorzugt mit Im H-Brücken, während Cytosin (C) das Py
vorzieht. Weil die Bausteine der
antiparallelen
H-Brücken ausbilden, muß Im über G
Unterscheidbarkeit
beide gut
Py.
an
zwischen dem
G-C bzw. C-G
von
Erst durch
Teile der Haarnadel
liegen
zu
Basenpaaren.
Einführung
des
des
C(2)=0
Thymins
liegen
zu
und dem
unterschiedlich starke
Schwächung
Es sind eine Reihe
dungsmodi
schematisch
aufgeführt.
kommt.
aufweisen
von
Somit
Man beachte
zu
zugehörigen
jedoch,
einer
Daraus
je einem Strang
ergibt
asymmetrische
N(3) des Adenins.
Der
Komplexbindung stärker,
wird
die
Sequenzspezifität
Furche
3-Hydroxywenn
Hp
durch
im
eine
"erkauft".
Eine Auswahl
die unterschiedliche Bin¬
findet
Assoziationskonstanten
daß sich die Werte
sich die
(A) und Thymin (T) binden
Polyamiden synthetisiert worden,
Die
mit
kann zwischen A-T und T-A
jeweiligen Komplexes
[435, 437, 443-446].
dargestellt.
Oligonukleotids um bis
des
Adenin
nur
ist vermutlich die
Substituent ragt in diese Furche hinein und stört die
über T
kommen.
Hp-Bausteins
Unterscheidungsmerkmal
unterschieden werden.
Komplex
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
sich in Abb.
sind
in
Tab.
43
10
je nach Länge des verwendeten
Grössenordnung verändern
können.
Bindungseigenschaften einiger Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide. Py
4-Amino-l-methyl3-Hydroxy-4-amino-l-methyl-pyrrol-2-carbonsäure, Im
4-Amino-l-methylpyrrol-2-carbonsäure, Hp
1N,1Nimidazol-2-carbonsäure, ß
y-Aminobuttersäure, Gly
ß-Alanin, y
Glycin, Dp
Dimethylpropyl-l,3-diamin. Die Hp-enthaltenden Haarnadeln sind nicht in Abb. 43 wiedergegeben.
Tab.
10.
=
=
=
=
=
=
=
KJM1]
Verbindung
Erkennungssequenz
Distamycin (138)
d(A,T)5
ImPyPyyPyPyPyDp (140)
dfTGTTA)
Haarnadel
108
ImPyPyylmPyPyß-
d(AAAAAGACA)
verlängerte
2-1010
PyPyPyGlyDp
Bindungsmodus
2:1
Komplex
107
Haarnadel
ImlmHpPyylmPyPyPyßDp
dfTGGTCA)
Haarnadel
1010
ImPyPyßPyPyPyGlyDp
d(A,T)5GAC(A,T)5
2:1 verschoben
4-107
-ImPyPyyPyPyPyy-
dCTGTTA)
Ring
3-109
131
5. Flavin-funktionalisierte
G
T
T
T
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
A
T
•-O-Ck
C
A
T
A
T
A
^^o-o-cA
g^O-O-O^
A
T
T
G
C
A
A
A
AAAAAGACA
C
A
T
A
ATATAGACATATA
TTTTTCTGT
TATATCTGTATAT
-^
-^
Verschobenes 2:l-Motiv
Verlängertes Hairpin-Motiv
©
Imidazol
Q
Abb. 43.
A
T
2:l-Motiv
Ring-Motiv
Hairpin-Motiv
T
@^o-o-o
T
A
G
/
Pyrrol
GK^^Q
N,N Dimethylpropyl
N-(3-ammopropyl>pyrrol
GABA
beta-Alamn
Bindungsmotive der Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide.
DNA-Stränge.
Die Pfeile markieren die 5'—>3'
Richtung
der einzelnen
Die
langwierige
Polyamide
in
Lösung
Untersuchung
werden
aufwendige Synthese
war
lange Zeit
Ausweitung
und die
eine sehr effiziente
und
Synthese
als Bausteine
(Abb. 44)
gekuppelt.
Die Ausbeuten
die
Synthese
im
Vergleich
von
und
zur
Vor kurzem wurde
Festphase vorgestellt [437].
liegen routinemäßig
Festphasensynthese
Synthese
systematische
bzw.
und
ist
Synthese
in
schnelle
Reinigungsschritte
Molekülen
Reinigung
eine
über 99%
Imidazol-Einheiten
aus
eines
der
von
Haarnadel-Polyamids
Lösung
von
einigen
132
Polyamid
Synthesemethode
Zwischenprodukte.
vielen Bausteinen
(142)
je Kupplungsschritt.
einfache
und
jedoch
Bei dieser Methode
und als aktivierte Benzotriazol-Ester auf das wachsende
aufwendige Isolierangsbei der
Anwendungsgebietes.
Boc-geschützte Pyrrol- (141)
verwendet
Die
ein wesentliches Hindernis für ihre
ihres
der
an
der in diesem Abschnitt beschriebenen
an
Vorteil.
der
Monaten auf
Dies ist
vor
ohne
allem
Der Zeitaufwand für
Festphase verringert
einige Tage.
sich
Dadurch wird
5. Flavin-funktionalisierte
es
in
möglich,
Anwendungen
zu
großem
Masstab
die
Eignung
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
Polyamide
der
für
medizinischen
untersuchen.
H
H
Boc-N
Boc-N
/"*
OH
N
Ö
I
141
Abb. 44.
Ausgangsverbindungen
Dervan. Boc
Die
das
=
142
für die
Festphasensynthese
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamiden
von
DNA durch
Polyamide ermöglicht
direkt als Wirkstoff einzusetzen oder durch kovalente
funktionellen Einheit letztere in unmittelbare Nähe einer
bringen.
nach
terf-Butyloxycarbonyl.
sequenzspezifische Bindung
Polyamid
von
es, entweder
Verknüpfung
mit einer
ausgewählten DNA-Sequenz
Der erste Ansatz dazu wurde durch Dervan und Mitarbeitern
zu
realisiert, der zeigen
konnten, dass ein Haarnadel-Polyamid durch Bindung in der Promotor-Region eines Gens
dessen
Transkription
verhindern kann [447].
Pyrrol/Imidazol-Polyamide
Chemotherapeutika
membrangängig
unerlässlich ist.
Paamngsmöglichkeiten
in der
et
al. stellte
sind,
Durch die
DNA-Doppelhelix
Regulatoren der Genexpression
Bouziane
Dabei wurde auch
einiger
für
was
daß die
den
könnten die
Polyamide
Oligo-
Einsatz
Unterscheidung sämtlicher
in Zukunft eine grosse
vor
gezeigt,
als
vier Basen-
als künstliche
Bedeutung erlangen.
Zeit ein erstes funktionalisiertes
Netropsinderivat
143 her, welches eine Flavin-Einheit im oxidiertem Zustand besitzt und bei
Belichtung
Einzelstrang-Brüche
künstliches
Restriktionsenzym
induzieren
144 wurde
EDTA-Fe(n)-Einheit
mit einem
aufwendigen Synthese
von
kann
von
[448]
Dervan
et
(Abb.
45).
et
anderes
al. durch die kovalente
Polyamid hergestellt [436],
Yoneda
Ein
Verknüpfung
Erst kürzlich wurde in einer
al. ein Desazaflavin-funktionalisiertes
potentieller Antitumorwirkstoff beschrieben [449].
133
einer
Oligopyrrol
als
5. Flavin-funktionalisierte
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
144
Abb. 45. Funktionalisierte
DNA
zu
Im
erzeugen.
Polyamide
wurden bisher
sequenzspezifische Strangbrüche in der
oxidierte, protonierte Flavin-Einheit diese Aufgabe,
eingesetzt,
um
Polyamid 143 übernimmt eine
komplexierte Fe11 dafür verantwortlich.
in 144 ist das durch EDTA
Aufgabenstellung
5.2
Die
Synthese
Polyamide
einer "künstlichen"
erreicht werden.
dargestellten
unterschiedlicher
werden.
Die
Dervan
[437]
Länge
Synthese
an
der
Oligonukleotid-Einzel-
zu
(Abb.
45)
eine
von
vorgestellten
Bouziane
soUte nicht in
Lösung,
sondern nach dem Vorbild
Festphase durchgeführt
und
Doppelsträngen
geben,
mit
werden.
zu
reparieren.
134
al.
[448]
Erste
von
verknüpft
Baird und
Untersuchungen
an
ortsspezifisch eingebautem Pyrimidindimer
ob diese funktionalisierten
binden und Photoschäden
et
Ohgo-Pyrrol/Irnidazol-Polyamidkette
kovalent mit Flavin- und/oder Desazaflavinderivaten
sollten Aufschluss darüber
DNA
sollte über die in 5.1
Dabei sollte nach dem Vorbild des
143
Moleküls
Photolyase
in der
Lage sind,
Falls diese ersten Versuche
erfolgreich
Polyamide
5. Flavin-funktionalisierte
sein
gezielt sequenzabhängige Bindungs-
können
sollten,
unterschiedlichen Flavin-enthaltenden
gesteigertes
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Poly amide
Verständnis der
in der DNA könnte dem
und
Polyamiden durchgeführt werden.
sequenzabhängigen Reparaturprozesse
längerfristigen Ziel
kleine, synthetische Moleküle
von
Ein dadurch
Pyrimidindimeren
von
sequenzunabhängigen Reparatur
durch
grossem Nutzen sein.
wurden
Folgende Anforderungen
einer
mit
Reparaturstudien
die
an
Struktur
der
DNA-bindenden
Einheit
gestellt:
Einheit
die Stabilität des
muss
Einfache,
•
und
Kombination
durch das
an
Desazaflavin)
Polyamids
sein,
um
Energie-
und
müssen
diese einzeln
und
Das Flavin
einbaubar sein.
gelangen.
in die Nähe des Dimers
Polyamid
der Flavin-
Um den Effekt der verschiedenen
studieren,
zu
Deprotoniemng
sein.
flexible Synthese:
verschiedenen Stellen des
voneinander soll steuerbar
Der Abstand der
in
muss
Chromophore
Elektronentransferprozesse
untersuchen
können.
Starke, aber reversible Bindung
•
ist
für Reduktion und
Polyamids gegeben
schnelle und
Chromophore (Flavin
zu
Bedingungen
Stabilität: Unter den
•
ein
schnelles
soll
nur
lange
initiieren. Die Anwesenheit der
Bindung
•
DNA: Für eine
möglichst
Assoziations-Dissoziations-Gleichgewicht wichtig.
Chromophor-Konjugat
auf die
von
des
Polypyrrols
genug
Chromophore
an
DNA
binden,
darf keinen
um
Das
einen
Katalyse
Polypyrrol-
Reparaturzyklus
übermässigen negativen
zu
Einfluss
die DNA nehmen.
Unveränderte Reaktivität: Der
der Elektronentransfer
an
effiziente
Energietransfer
zwischen den
Chromophoren
und
reduzierten Flavin auf das Dimer darf durch die DNA-bindende
vom
Einheit nicht verhindert werden.
•
passieren
Bioverfügbarkeit:
zu
Diese
können,
um
später möglicherweise
Anforderungen
erfüllt werden.
Das Molekül sollte das Potential
könnten
von
Wie Baird und Dervan
Synthese zugänglich [437].
auch in vivo Studien
zu
gestatten.
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamiden vollständig
zeigte,
Eine für die
besitzen, Zellmembranen
sind diese durch
Optimiemng
135
Festphasen-Polyamid-
des "künstlichen
Enzyms"
sehr
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
5. Flavin-funktionalisierte
wichtige Möglichkeit,
Synthese
Bibliothek
einer
Verbindungen,
von
Dervan Harz und Bausteine unter
erforderlich
Schutzgruppen
Fluorwasserstoff und anderer
möglicherweise
des
Zusätzlich
synthetisierten
der
birgt
erfordert
Gegenwart
wurden
von
Boc-
Einsatz
von
die Kofaktor-Aminosäuren
könnte die
Die
bereits
einsetzbar sind.
(Abb. 46)
Deshalb
war
es
erforderlich, die Festphasensynthese nach Baird und Dervan
Strategie
im
der
Bedingungen
Abschnitt
4.2.2
und 4.2
Darstellung
im Rahmen dieser Arbeit
der Boc- auf die Fmoc-
umzustellen.
NHFmoc
La
46.
Flavin-
funktionalisierten
5.3
Abspaltung
direkt für die
von
NHFmoc
Abb.
Baird und
von
den
ihre
auf
diese Methode den Vorteil, dass die unter 4.1
Kofaktoraminosäuren 103 und 116
angestrebten Polyamide
wurden
Fmoc-Bedingungen jedoch
Fmoc-Strategie
kombinatorische
sie für den Einsatz
Dies
in deren
die
Screening
Trifluoressigsäure erfolgen.
der
nach
Festphasensynthese
beschrieben.
Reagenzien,
mit
Harz
vom
wie
verwendet.
nicht stabil sind. Unter
Polyamids
AUerdings
Bedingungen,
sind,
durch
die
hin untersucht werden könnten.
Reparaturaktivität
ist
Festphasensynthese bietet,
welche die
Synthese
Für die
wesentlichen die
Pyrrolderivat
Acylierung
Fmoc
des
Synthese
Schritt wurden
und
(103)
Polyamiden.
Desazaflavin-Bausteine
=
die
Festphasensynthese
des
Fmoc-geschützten Pyrrolbausteins
148 umgesetzt.
von
145 (Schema 27) wurde im
Baird und Dervan [437] übernommen.
und
Tris(chloro)-acetylchlorid (147)
Die hohe Reaktivität
von
146
in dieser
kurzen Reaktionszeiten und nach der Umkristallisation
exzellenten Ausbeuten
an
von
Pyrrol-Bausteins
N-Methylpyrrol (146)
zu
für
Fluorenylmethyloxycarbonyl.
Synthesevorschrift
führte
(116)
OH
148.
Dieser Umstand ist
136
wichtig,
da die
Im ersten
in Et,0
zum
Friedel-Craftsaus
CHC13
zu
Säureempfindlichkeit
5. Flavin-funktionalisierte
der
Pyrrole keinen
erfolgte
eine
Position
von
Lewissäuren als
elektrophile Nitrierung
C(4)
wird im
Erstsubstituenten
während
Einsatz
der
an
Vergleich
des
Reaktion
gelblicher
149 mittels einer
in den
Methanolyse
substöchiometrisch erzeugte (0.1
Analysenreiner Methylester 150
konnte durch
in Ether
mussten
gelagert
Einführung
ausgearbeitet
des
Hydrolyse
Hydrochlorid
152 gut mit
Zusatz
von
pH
anschliessende
ist ein
Zur
Reaktionsvolumen durch
zuzugebenden
wurde die
Fmoc-OSu
Stabilisierung
CHC13
aus
Nitropyrrol
zum
Einsatz.
gefällt,
auf Kohle
(10%)
das besonders bei
des Amins wurde 151
welches abfiltriert und bei
und die
Hydrolyse
der Basenlabilität der
des
gründlich
zu
Wie erwartet läßt
von
DIEA
Zugabe
zu
von
auf
stellte sich als
Argon
mit
10
eingestellt.
Nach
zu
154 in guter Ausbeute.
137
entgasen,
zu
Umsatz
aus
zur
die
um
isolieren,
NaHC03
Sodann
extrahiert und
Der
drei Teilen
wurde
die Löslichkeit des
vollständigem
CHC13
EtOAc
um
sich das
wichtig heraus,
durch Ultraschall
verdreifacht,
wurde
Umsatz
von
Ohne die Aminosäure 153
etwa
DMF
aus
Vollständiger
durch Neutralisation mit 2 N
gewährleisten.
Niederschlags
152.
152
60 °C verseifen.
Lösungsmittelgemisch
Es
unter
vermeiden.
von
Methylesters
Fmoc-Schutzgruppe
methanohsch-wässriger Natronlauge bei
Reaktionslösung angesäuert,
Umkristallisation des
grünliches Öl,
152
Hydrochlorid
Reaktionsgemisches
Zugabe
NaH und MeOH
wurde Palladium
Katalysator
151
Aufgrund
der Reaktion
des
aus
Methylesters durchgeführt.
Polymerisationsreaktionen
wurde der
partielle
Nitropyrrol-
2 N NaOH und einem Teil MeOH erreicht.
so
auf
was
Im nächsten Schritt wurde der
Aminosäure 153 wurde nach 5 h Erhitzen in einem
vor
schwarz,
wurde
Methanol in
Methanol erhöhte dabei die Löslichkeit
Lösungsmittel
Reaktionslösung
wurde.
werden.
zunächst die
Die
aus
Fmoc-Schutzgruppe
der
Effekts des
dirigierenden
einmalige Umkristallisation
oxidationsempfindlich ist.
sehr
-20 °C im Dunkeln
Die
Aminopyrrol
Das
und mit HCl-Gas als
gelöst
Als
des
Die
150 überführt. Als Base kam das in situ
Natrium-methoxid
eq)
C(4) des Pyrrolrings.
Anschließend wurde das
Kristalle.
Ausbeute erhalten werden.
(Pd/C) verwendet.
bis
Im zweiten Schritt
Einfache Umkristallisation
Methylester
methylester 150 katalytisch hydriert.
Lichteinwirkung
dunkelrot
erlaubt.
am
C(5) aufgrund
zurückzuführen ist.
Pyrrols
148
C(2) bevorzugt nitriert.
lieferte 149 in Form grosser,
ausgezeichneter
Katalysatoren
Pyrrolderivats
Position
zur
der Position
zehnstündigen
Polymerisation
des
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
und
das
später
(DC-KontroUe)
MeOH
gefällt.
ergab das Fmoc-geschützte Pyrrolderivat
5. Flavin-funktionalisierte
der relativ unreaktiven
Aufgrund
Pyrrol
154 nicht in situ
aktiviert und isoliert.
Carboxylgruppe
Verestemng
auf die
was
von
Zur
der
Reaktionsgemisch
thermischen
145.
durchgeführt
der
vor
Säuregruppe
Labilität
Die
wurde
wurde die
in DMF aktiviert.
Die
langsam (40-50 h),
zurückzuführen ist. Die Reaktion kann
154
von
nicht
bei
höherer
Temperatur
ausgefallenen Dicyclohexylharnstoffs,
Synthese
das
Festphasensynthese
Pyrrolbausteins 145
ausserordentlich
Eiswasser und UmkristalUsation
aus
Darstellung des
Schema 27.
des aktivierten
Raumtemperatur
Filtration des
Pyrrolbaustein
50 g Masstab
sondern bereits
Dicyclohexylcarbodiimid (DCC)
Reaktivität der
werden.
Carboxyl-Funktionalität (siehe 5.5)
Festphase,
Darstellung
154 mit
mangelnde
durchgeführt
aktivierten
der
an
mit HOBT verlief bei
aufgrund
aber
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
aus
MeOH
Fällen des
ergab schliesslich
den
145 konnte nach dieser Vorschrift im
von
werden.
aktivierten
Pyrrol-Bausteins 145.
O
U
Cl'XCIg
02N
147
/r-a
Il
CCI 3
u
RT,4h,97%
^/^T
RT,4h,97%
^N/
N
h2so4, hno3, Ac2o
Et20,t20,
—
-40=C^RT'9h
^N^Y
I
I
146
148
QS
CCI3
O
149
NaH, MeOH
RT, 3h, 98%
HCIH2N
RHN
p
ÇH
NaOH, MeOH
60°C, 5h
R
^V"
R
=
H
154
R
=
Fmoc-*J pH 10, RT, 2h, 87%
—| Fmoc-OSu, DMF/H20,
152
DCC, HOBT
DMF, RT, 40h, 87%
145
«
5h, 72%
OMe
OH
153
HCI(g), Et20
N=N
138
fry
I
OMe
150
R
=
151
N02—|H2,Pd/C,
R
=
NH2-*J EtOAc,
RT, 48h
5. Flavin-funktionalisierte
des Imidazol-Bausteins
Synthese
5.4
Die
der
Synthese
ähnlich der
Synthese
Ethylester
158
Pyrrol (siehe 5.3)
Es
ist
Wie bei der
umgesetzt.
musste auch hier auf den Einsatz
zurückgeführt,
Trichloracetylgruppe
weniger
etwas
Begründung
um
zu
für die
Dieses
die freiwerdende Salzsäure
vermeiden.
werden konnte.
überführt.
Nach
Diese
von
Nachfolgend
Reaktion
wird
zu
analytisch
harte
an
20:1 lieferte das Nitro-imidazol 159 in
des
die
auf
Imidazolderivats
159
Aminoimidazols 160 mit HCl-Gas in
wurde
so
die
deshalb
Protonierung
158
in das Nitro-Imidazol
da
das
den
was
ImidazolUnter den
elektrophilen
und Umkristallisation
analysenreiner Qualität.
katalytisch hydriert,
E^O ergab
7).
Ausbeuten.
Imidazol-ethylester
Bedingungen,
CH2C12
~
öliges Rohprodukt
ein
Nitrierung
vor,
(pKa
war
Position 2 desaktiviert ist.
Extraktion mit
[450].
blieb
reinem
wurde 158 durch
erforderte
massigen
abzufangen und
Aufarbeitung
158 durch den Erstsubstituenten
zusätzlich erschwert
Nitrogruppe
elektrophilen
des Imidazols 156
gewählten Bedingungen liegt der Imidazolring protoniert
CCL/EtOH
bei
Phänomen
Reaktionszeit und die
lange
zurück, das durch Vakuumdestillation
Ringsystem
ist.
Friedel-Crafts Acylierung
bei der
NEt3
von
Imidazol-Ringes
gereinigt
reaktiv
am
Lewissäuren verzichtet werden.
von
welches auch für die Basizität des Imidazols verantwortlich ist
unbedingt erforderlich,
Angriff
der
zweiten, elektronegativen Heteroatoms N(3) im aromatischen Ring
wohl die
liegt
Ein Zusatz
159
Friedel-Crafts Acylierung
in einer
Einführung
Zunächst wurde N-
bekannt, daß der Imidazolring gegenüber dem Pyrrolring
Anwesenheit des
des
Ethylchloroformat (157)
(Schema 28) verlief
154 [437].
entsprechenden Pyrrolderivats
mit
Substitutionsreaktionen
Darin
Imidazol-Aminosäure 155
Fmoc-geschützten
des
Methyl-imidazol (156)
zum
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
Die
eine
schliesslich das stabile
aus
eingeführte
des
Fällung
Hydrochlorid
161.
Die
folgenden
Schritte wurden wiedemm
wurde zunächst mit 2 N NaOH
Fmoc-Schutzgruppe
zur
mit Hilfe des
konnte 162 mit Fmoc-Cl
zur
neu
ausgearbeitet.
Das
freien Aminosäure 162 umgesetzt. Die
Reagenzes
Fmoc-geschützten
Aminosäure 155
des Imidazolderivats 155 leichter als im
aktivieren liess
aktivierten
(siehe 5.5.1),
Verbindung
wurde auf die
161
Einführung
der
Fmoc-OSu verlief sehr unsauber, dennoch
umgesetzt werden. Da sich bei Kupplungsversuchen in Lösung und
Säuregruppe
Hydrochlorid
Synthese
verzichtet.
139
in guten Ausbeuten
an
der
Festphase
entsprechenden Pyrrolderivat
und
Isolierung
die
154
der Benzotriazol-
5. Flavin-funktionalisierte
Schema 28.
Darstellung
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
des Imidazol-Bausteins 155.
O
U
CI^XDEt
157, NEt3
N
o
CH3CN, RT,
N
,OEt
konz.
»
ÎI, 9h,
N
40h, 57%
I
H2S04, HN03
/-«
40%
O
156
H2, Pd/C,
158
160
R
=
NH2^RT?oh
HCI(g), Et20
83%
Fmoc
H2N
Fmoc-OSu, DMF/H20
HCIH2N
'*
//
2N NaOH
t
pH10, RT, 2h,
60°C, 1h
70%
OH
Festphasensynthese
5.5
5.5.1
der
Vorexperimente
Nach
Fertigstellung
Vorexperimenten
in
Festphasensynthese
dieser
neuen
der Monomerbausteine 145 und 155
Lösung
und
Polyamide
der
Kaiser-Test
zu
unreaktiv für die
erste Aufschlüsse über die
Kupplungseigenschaften
sollten.
Polyamide
Ausbildung
Dies
an
werden kann.
einer
155
und Imidazolbausteine
154
Aktivierungsreagenzien
HOBT/TBTU/DIEA
Kupplung
hingegen
eines
Pyrrols
relativ
Aktivierungsreagenzien
DCC und
Als
allem
vor
Festphase
Kupplung
aller
in
nötig,
Pyrrole
Base mit
Lösung
Art unter
und Imidazole
Ninhydrin.
der
neuen
besonders
bzw.
war.
der
Die
mit einem Imidazol verlief
schlecht
erwiesen
DMAP, mit denen weder in Lösung noch
140
Pyrrol-
Verwendung
(siehe 4.2.2) sehr erfolgreich
Pyrrol
der
da
nicht mehr durch den
Die Amine der
mit Aminen
mit einem weiteren
langsam.
der
war
farbigen Schiffschen
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die
und
von
die im Hinblick auf die
Verbindungen geben
routinemässig überprüft
wurde eine Reihe
Festphase durchgeführt,
der
an
Reaktionsablauf beim Aufbau der
sind
Polyamide
sich
am
die
Harz
5. Flavin-funktionalisierte
quantitative
Umsätze erzielt werden konnten.
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
Durch Einsatz des
Pyrrol-Benzotriazolesters
145 konnten diese Probleme jedoch behoben werden.
die
Für
Festphasensynthese
der
herangezogen,
kein
wurde
zusätzliches
Aktivierungsreagenz
Aminosäuren wurden via HOBT/TBTU/DIEA
Kupplungszeiten lagen
geplante
die
in der
NMP oder DMF
in DMF
5.5.2
durchgeführt (je
Synthese
eines
Als eine erste
terminalen
unter
Für
Die
geeignet.
zwei mal etwa 5
0.6
von
ebenfalls
Die
protoniert
Piperidin
dargestellt,
wurde 163
die
aus
vor
und sollte die
Bindung
an
der DNA sicherstellen. Zusätzlich ist das Flavin nach der
vor
Unter
und sollte die
physiologischen Bedingungen liegt
Bindung
Lysin liegt
die
negativ
Abspaltung
diese Einheit
durch elektrostatische
DNA-Rückgrat
zum
einem C-
weiter verstärken.
Synthese
ist
Benzotriazolesters
Syntheseprotokoll
des
163 ist in Schema 29
Drei-Ring-Polyamids
Boc-geschützt)
145
und
die
in
Gegenwart
und anschliessender
gleichzeitig
Lysin-Seitenkette
Reaktionsgemisches
entfernt
mittels
163 wurde bei einer Retentionszeit
HPLC isoliert und
vollständig
von
Pyrrol-Einheit
DIEA
Teil.
des
konnte
=
charakterisiert.
überprüft
44 min
141
unter
wurde in Form ihres
Ein
Nach
von
ausführliches
Schrumpfen
vom
des
Harz mit
der e-Aminofunktion
Zusammensetzung
werden.
Das
des
Hauptprodukt
detektiert, mittels präparativer RP-
Die Ausbeute
Diese Ausbeute ist ein unterer Grenzwert, da bei der
auftrat.
die
Das Fmoc-
wurden
Roh-Polyamids
Boc-Schutzgruppe
RP-HPLC
Rt
103
eingeführt.
experimentellen
wurde,
analytischer
Die
Abspaltung
die säurelabile
gezeigt.
Flavin-Aminosäure
von
findet sich unter 6.3.7 im
(vgl. 4.2.2)
95% TFA, bei der
der
wurde in 20-50%
min).
TBTU/HOBT/DIEA-Bedingungen gekuppelt.
Harzes
Entschützung
Lösungsmittel
Tripyrrol-Flavin Polyamids
Aminoethyl-substituiert.
(e-NH2
Lysin
Als
mmol/g gewählt.
Firma
der
drei Pyrroleinheiten und einem N-terminalen Flavin besteht.
Lysin,
Wechselwirkung
zu
Rink-Amide-MBKA-Haxz
das
physiologischen Bedingungen protoniert
Harz
Nicht-Pyrrol
bei etwa einer Stunde, maximal bei zwei Stunden.
Aktivierung analog
Polyamid-Modellverbindung
geladenen Phosphate
vom
besten
benötigt.
4.2.2
145
Baustein
Die
Beladungsdichte
am
der
gekuppelt.
wurde
Festphasensynthese
NovaBiochem mit einer
waren
Regel
ausschliesslich
demnach
betrug
Reinigung
nach
Reinigung
40%.
ein beträchtlicher Verlust
5. Flavin-funktionalisierte
Schema 29.
DMF, RT, 5
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
Festphasensynthese des Polyamids FlavPyPyPyLys (163): a) 2x Piperidin 20 (50) % in
+ 5 min; b) FmocLys(Boc), TBTU, HOBT, DIEA, NMP, RT, 45 min; c) FmocPyOBT
(145), DIEA, NMP, RT, 1.5 h; d) FmocFlavOH (103), TBTU, HOBT, DIEA, NMP, RT,
TFA:H20:TIPS 95:2.5:2.5, RT, 2x 45 min.
OMe
a), c), a), c),
a), c), a), d), a)
Boc
OMe
Roc
HN
NH
f
II
OH
V
O
N^
\
°v/Nl
H
H
O
°VV
TT
H
O
e)
O
^NH
H
*—<
H,N
163
HoN
142
.0 Q
NHo
tit,
I
1.5
h, e)
5. Flavin-mnktionalisierte
Das
UV-Spektmm
charakteristischen
370
Pyrrolringen
Polyamids 163
Absorptionbanden
des
Absorptionsmaxima
Die
nm.
des
und
ist in Abb. 47
Flavins, mit einem Maximum bei 450
zwischen
250
200
und
400
350
300
X
nm,
wiedergegeben.
300
nm
Es
nm
stammen
die
zeigt
und bei
von
den
Amidbindungen.
200
Abb. 47. Das
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
UV-Spektrum des Polyamids
Flavin-Chromophors.
163.
Gut
450
500
550
(nm)
zu
sehen sind die
typischen Absorptionsbanden (370
450 nm) des
Mit der
Methodik
Darstellung
geeignet ist,
des
kurze
Polyamids 163
Polyamide
konnte
gezeigt werden,
daß die entwickelte
herzustellen und durch eine Flavin-Aminosäure
zu
funktionalisieren.
5.5.3
Synthese
von
funktionalisierten
Mit einem zweiten
oben beschriebenen
geeignet
ist.
verbunden.
Ausbildung
Es ist
Typ
von
Haarnadel-Polyamiden
ModeUverbindungen
Synthesebedingungen
Dazu wurden zwei
Dervan
einer Haarnadel schleife durch
Darstellung längerer Polyamide
auch für die
Tripyrrol-Einheiten
Dieser Linker ist laut
sollte untersucht werden, ob die
und
Bindung
über
y-Aininobuttersäure
Mitarbeitern
an
die
die
Bindung
an
die DNA schwächt.
143
optimal
für
die
DNA-Doppelhelix.
bekannt, dass sterisch anspruchsvolle Substitution
Ring-Polyamids
[451]
miteinander
Für das
am
N-Terminus eines Drei-
Polyamid
163 könnte die
5. Flavin-funktionalisierte
sperrige
führen
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
Flavin-Aminosäure
[445]. Deshalb
ein Abstandhalter
wurde in den im
gebunden ist,
bei der
wenn es
Bindung
an
die
DNA
an
zu
Problemen
folgenden beschriebenen Polyamiden zusätzlich
eingebaut. Untersuchungen
dass das N-terminale Flavin,
Bindung
N-Terminus bei der
am
an
über eine
ball and sficfc-Molekülmodellen
ß-Alanin-Einheit
DNA-Doppelhelix gut in
an
das
zeigten,
Polypyrrol-System
der kleinen Furche
liegen
zu
kommt.
Darüberhinaus
Polyamid
der
auch
Kupplung
Kupplung
von
Pyrrolen
auch in beiden Fällen
präparative
von ewa
RP-HPLC
40 min ein
gereinigt und
Um
Menge
der
Synthese
Ac20/DIEA acetyliert.
jedoch
zu
einer weiteren
Nebenprodukten
für
Die
Synthese
des
RP-HPLC konnte bei
lag jedoch
nur
bei etwa
entsteht.
die
unreagierten,
des
Modifizierung
der Ausbeuten.
die
Anders als bei
grösseren Systemen doch eine
von
jedem Kupplungsschritt
Verschlechtemng
das
einzuschränken, wurden bei einer
etwas
Wider Erwarten führte diese
Reaktionsschritte
zusätzlichen
Synthese
Nebenprodukte
nach
analytischer
an
werden und brachte
Resultate.
isoliert werden. Die Ausbeute
Abbruch- und
die Vielzahl der
Wiederholung
mit
an
ß-Alanin
detektiert werden und sodann durch
Hauptprodukt
20%. Dieser Befund deutet an, dass bei der
beträchtliche
durchgeführt
positive
Mittels
dargestellt.
und
Festphasensynthese.
konnte hier der Kaiser-Test
Decamers 164 ist in Schema 30
einer Retentionszeit
y-Aminobuttersäure
von
über den Verlauf der
Anhaltspunkte
Synthese
während der
die
gab
Bildung
Es ist also
weiteren
von
freien Amine
Syntheseablaufs
möglich,
dass die
Nebenprodukten
mitverantwortlich sind.
In einem
Experiment
wässriger Lösung stehengelassen.
Lösung zeigte
kovalenter
das
Auftreten
schlechten Ausbeuten sein. Die
werden.
Sauerstoff sollte
deshalb
von
Zersetzungsprodukten.
unter
möglichst
Argon
Reparatureigenschaften
Synthese
Eine direkte
könnte
der
dieser
also
Lichtbestrahlung
Lichtausschluss
Systeme
der
Polyamide
vermieden werden.
und
während 48
Chromatographische (RP-HPLC) Analyse
Pyrrol-Flavin-Verbindungen
durchgeführt
Polyamids 164
wurde eine Probe des
Die
Eine
Grund
für
sollte also in
144
die
dieser
Instabilität
beobachteten
möglichst kurzer Zeit
des Harzes und der Kontakt mit
Synthese
durchgeführt.
des
Polyamids 164
Zur
sollten zudem immer frische
werden.
inhärente
h in
wurde
Untersuchung
der
Lösungen angerichtet
5. Flavin-funktionalisierte
Schema 30.
% in
Polyamids FlavßPyPyPyyPyPyPyLys (164): a) 2x Piperidin 20 (50)
5 min; b) FmocLys(Boc), TBTU, HOBT, DIEA, NMP; c) FmocPyOBT (145),
Festphasensynthese
DMF, RT, 5
+
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
des
DIEA, NMP; d) Fmoc-y-Aminobuttersäure, TBTU, HOBT, DIEA, NMP; e) Fmoc-ß-Alanin, TBTU,
HOBT, DIEA, NMP; f) FmocFlavOH (103), TBTU, HOBT, DIEA, NMP; g) TFA:H20:TIPS 95:2.5:2.5,
RT, 2x 45 min.
OMe
-Fmoc
Linker
Harz
a), b), a), c), a), c), a), c),
a), d), a), c), a), c), a), c),
a), e), a), f), a), g)
N^^O
^^
O
N
^-^
IM
HN
V.H1..1
N^
./
164
H2N
O
Als weitere Vertreter der Klasse der
165 und 166
hergestellt,
Haarnadel-Polyamide
isoliert und charakterisiert werden
145
konnten die
(Abb. 48).
Verbindungen
5. Flavin-funktionalisierte
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
S
H
H
O
H2N
O
H2N^O
N|_
165
NH2
S
-N^N^O
rN
O
YYnyVuo
o
o
OBn
Jx
h
H
T
0
HN-^
«f0
/
166
HN'
Abb.
NH?
48.
Darstellung des Flavin-enthaltenden Polyamids 165 und des Flavin- und DesazaflavinPolyamids 166. Beide Verbindungen wurden auch in der Mtr-geschützten Form des Arginins
erhalten (Massenspektren: [M+213]"1").
Eine nochmalige Entschützung in TFA brachte die
vollständige
Abspaltung der Mtr-Schutzgruppe. Mtr 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzensulfonyl.
enthaltenden
=
Die
die
Synthese
Verwendung
des
des
Polyamids 166
165 sah statt der
Mtr-geschützten Arginins
Imidazol-Baustein 155
Schema 29/30
Polyamids
eingesetzt.
Die
Kupplung
vor.
wurde mit der
Kupplung
Boc-geschützten Lysins
Des weiteren wurde erstmals der
Kupplungsschritte
dargestellten Synthesen durchgeführt.
des
wurden in
Bei der
Analogie
der in
Festphasensynthese
der Desazaflavin-Aminosäure 116
146
zu
an
des
das Harz
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
5. Flavin-funktionalisierte
begonnen.
zur
folgte die Kupplung von ß-Alanin.
Dann
des
Synthese
Polyamids
konnte unter anderem durch
165
durchgeführt.
Alle weiteren Schritte wurden
erfolgreiche Einbau
Der
werden
UV-Spektroskopie nachgewisen
analog
des Desazaflavins
(Abb. 49).
E
o
b
x
w
i
I
200
250
i
i
400
350
300
i
I
i
i
i
450
i
l
i
i
i
i
l
550
500
X(nm)
UV-Spektren
Abb. 49.
Polyamid
der
165
Verbindungen
in Ausbeuten
lediglich
vorherige Optimiemng
Da bei der
lag
<
Die
der
der
an
(
die
um
nm.
5%
erhalten werden konnten,
Polyamid-Systeme
nach
wäre
Verdacht
nahe,
diese
dass
unvernünftig,
obiger Vorschrift
des
Arginins
Aminograppe
von
Aminosäuren in
einer
etwa
11
min
unvollständig
TatsächUch
herrührte.
vor
allem die
eingebauten
Polyamid
165.
behob
eine
147
von
weiteren
Imidazols erwies sich als ein
Lösung
mit
sollten in Zukunft die Imidazole mit
Lösung verknüpft
Dervan und Mitarbeitern
Kupplung
Da diese Schritte in
werden.
die kovalenten Irnidazol-Aminosäure-Dimere auf das Harz
von
von
und 166
dieses Problem.
eines bereits
Synthese
von
ohne
durchzuführen.
Polyamide 165
der
Aufspaltung
des Imidazol-Bausteins 155 und
wurde bereits
es
durch einen Unterschied in der Retentionszeit
HOBT-Aktiviemng erfolgreich verliefen,
entsprechenden
Strategie
Der Einbau des Desazaflavins im
).
400
aufwendiger chromatographischer Reinigung (RP-HPLC)
weitere
limitierender Faktor in der
DCC- oder
neuen
TFA-Entschützungszeiten
Kupplung
Aminosäuren
166
Bande
nach
abgespaltenen Mtr-Schutzgmppe
Verlängerung
) und
chromatographischen Analyse (RP-HPLC)
Produktgruppen
auftraten,
den
(
166 äussert sich durch das Auftreten der
Da die
zwei
Polyamide
Anschliessend könnten
gekuppelt
werden.
vorgeschlagen [437].
Dieselbe
5. Flavin-funktionalisierte
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
grösste Problem bei der Synthese
Das
Auftreten der zahlreichen
Nebenverbindungen
Desazaflavin-enthaltenden
auf.
kombinierten
vor
Polyamiden
allem bei der
Synthese
war
von
jedoch
das
Flavin- und
Diese Probleme traten auch ohne den Einbau eines
Polyamiden.
Polyamid
Imidazols in das
von
QueUe der beobachteten Nebenreaktionen
Um die
zu
lokalisieren, wurde das Pyrrol-Polyamid 167 hergestellt. Mehrmals während der Synthese
des
167 wurden Proben des Harzes entnommen, das bis
Polyamids
hergestellte Polyamidfragment
vom
Harz
abgespalten
und mit Hilfe
zu
diesem
Zeitpunkt
RP-HPLC und
von
Massenspektrometrie analysiert (Abb. 50).
Die
Kupplung
Ergebnisse
dieser
der zweiten
Pyrrol-Triade
dem Einbau
Zeitpunkt
diesem
Nach
von
wie
vor
Analysen belegten,
Pyrrolen
der
kam
den
in
war
Somit
Aminosäuren
eingegrenzt.
war
des
Piperidins
zu
einer
zu
Abspaltung
verlaufen
chromatographischen
und
der
ein
auf etwa 60%.
Zu
Hauptprodukt
klares
Kupplung
Stand
Während die
Schwarzverfärbung
des Flavins mit 20%
Kupplung
Rohpolyamids
des
ß-Alanins
des
massenspektrometrischen Analysen
kein
Zugabe
Nach
der
in
den
Hauptprodukt
mehr
Harzes.
Harz
vom
davon
muss
bei dieser letzten Stufe nach
es
zu
der letzten beiden
Dinge
der
Fmoc-Schutzgruppe
schien, kam
des
jedoch
einer leichten Braun Verfärbung des Harzes.
verursacht.
plötzlichen
Abspaltung
anschliessenden
zu
augenblicklichen
Schwierigkeiten
und des Flavins normal
sinkt die Ausbeute
zur
Nach
90% relativ gut verläuft.
um
Chromatogrammen jedoch
Zum
ausgegangen werden, dass die
in DMF die
es
bis
Festphasensynthese
die
die Ursache des Problems auf die
identifizieren.
Piperidin
mit Ausbeuten
drei weiteren
Synthese
dass
konnte
ausgemacht werden.
Eine
mögliche Erklämng
Verknüpfung
ist die
von
weiteren
Ausbildung
solchen
für
Pyrrolen
den
beobachteten
nach der
AbfaU
Kupplung
des
einer Haamadelschleife auf dem Harz.
der
Ausbeuten
bei
der
y-Aminobuttersäure-Linkers
Durch das Ausbilden einer
Stniktur, die durch Stapelwechselwirkungen der Pyrrole begünstigt wäre, würden
die freien Amine für die aktivierten
gekuppelt wird,
nur
der
Säuregruppe
mehr unter erschwerten
Aminosäure,
Bedingungen erreichbar
Stmkturen wurden bereits für die Abnahme der Ausbeuten bei der
die
als
sein.
nächstes
Ahnliche
Festphasensynthese
von
längeren Polypeptiden verantwortlich gemacht [389].
Die
Zersetzung des Produktes bei Behandlung
Nähe der Flavin- und
Annähemng
mit
Piperidin
Desazaflavinchromophore zurückgeführt
der beiden
Chromophore
wäre durch die
148
muss
auf die räumliche
werden.
Eine zusätzliche
Ausbildung
einer Haarnadelstruktur
5. Flavin-funktionalisierte
gegeben.
Sehr
häufig
wurden bei Reaktionen mit
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
Verbindungen,
bei denen Flavin- und
Desazaflavinderivate in nahem Kontakt zueinander waren, eine Vielfalt
beobachtet.
Möglicherweise
beschrieben wurden,
zum
führen
ähnliche
Auftreten dieser
Mechanismen,
an
wie
Nebenreaktionen
sie
in
Kapitel
4
Zersetzungen.
<5%
/H2N
60%
yyn yv°
°
o
//rNv*°
/ rl
.0
98%
V
O
H
OBn
O
r
MeO
HN
X
N
Kl
u
H
o^T
N^-N^^N
HN
NF+V
ÜV
^\
HN
.N
Y
N
i
—
H.^O
0
'-
90%
167
o
O
MeO
Abb. 50. Die
Analyse
der Ausbeuten der einzelnen Teilschritte der
Die strichlierten Linien
geben
die Unterbrüche des
Syntheseablaufs
Festphasensynthese
Zeitpunkt aufgebauten Polyamids vom Harz abgespalten wurde. Die Ausbeuten
Fragmente von 167 wurden mittels HPLC und Massenspektrometrie geschätzt.
149
des
Polyamids 167.
an, bei denen ein Teil des bis zu diesem
der dadurch erhaltenen
5.
Flavin-funktionalisierteOligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
5.6.1
als künstliche
Polyamide
5.6
Template zur Untersuchung
Für die
der
Reparaturenzyme
Polyamid-vermittelten DNA-Reparatur
Photodimeren
der DNA durch die
Reparatur
von
enthaltenden
Polyamide
ist
Systeme
Photoschaden in der kleinen Furche des
zum
die
Gerade
Grundvorraussetzung.
Elektronen- und
jedoch
von
eher
sequenzunabhängig erfolgen,
Fall ist.
Durch Einsatz
Bindung
an
AT-reiche
Abschnitte sind als
Sequenzen
könnte
des
(hot spots)
Polyamids
des
ist
der
Untersuchungen
und
der funktionalisierten
die DNA
an
Enzym DNA-Photolyase
der
sequenzunabhängige
eine relativ
man
Polyamide
Polyamids
der DNA durchaus erreichen.
Stellen
bevorzugte
Bindung
von
erfüllt sein:
Chromophoren
wie dies auch beim
Polypyrrolen
von
auf
HinbKck
sequenzspezifische Bindung
Vorteil. Für spätere Studien sollte die
dieser
DNA-Doppelstrangs (Abb. 51)
zwischen den
Energietransfer-Prozesse
dem Photoschaden der DNA ist eine
Polyamide
Flavinchromophors
des
Gmndbedingungen
im
Flavin-
hergestellten,
eines DNA-Abschnittes durch die
sequenzspezifische Erkennung
Eine
natürlich
optimale Platzierung
Dazu müssen mehrere
Bedeutung.
entscheidender
eine
an
Gerade solche DNA-
für das Auftreten
von
cyclobutanartigen
Photoschäden bekannt.
Die
des
Orientiemng
willkürlich.
keineswegs
Polyamids in
Bisherige
Studien haben
Fall die
Polyamide (im vorliegenden
Beobachtung
beim
mitberücksichtigt und
Durch
Doppelhelix
zweiten
diese
auf ihre
ist
zu
die
an
in
Photoschäden
Richtung
Polyamid
sollte
explizit
5'-Ende
zusätzlichen
von
der
5'-Ende
des
Substituenten der oben
zum
Photodimer
ß-Alanin-Abstandhalter
von
den
musste
DNA-Stränge
nach
und der DNAüber dem
entsprechenden
Polyamid-
der
zu
Polyamiden
hegen
gewährleistet.
kommt
(Abb. 51).
Dieses
Auf diese Weise wäre die
Ist das Flavin durch einen
Pyrrol/hnidazol-Einheiten getrennt,
150
diese
Flavin-Chromophor
durch ein Photodimer ersetzt werden.
räumliche Nähe des Flavins
N-Termini
zum
enthaltenden
163 der
Bindungssequenz eines Oligonukleotid-Doppelstrangs
Basenpaar
die
ist
werden.
ball and ifz'c£-Modellen
vermuten, dass im
Basenpaar
sperrigen
Obwohl die
Gültigkeit hin überprüft
Veranschaulichung
dass
Simation erheblich beeinflussen könnten,
der
Design
ergeben,
DNA-Doppelhelix
"Flavin-Termini") preferentiell
gebundenen DNA-Strangs zeigen [442].
dargestellten Polyamide
der kleinen Furche der
wie das
5. Flavin-funktionalisierte
in den
Polyamiden
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
164-166 der Fall ist, sollte das dritte
Polyamid-Bindungsregion
im
DNA-Doppelstrang
Basenpaar
in 5'-Ende nach der
durch den Photoschaden ersetzt werden.
51-
X
X
ToT
T(A) T(A) T(A)
X
X
X
O—CKK>^
Y
Y
A
A
Y
A(T) A(T) A(T)
Y
Y
,
5'-
X
X
ToT
G
X
T(A) T(A)
^3'
X
X
B
3'-*-
O
Pyrrol
•
Imidazol
C^>
^^
Flavin
©
Lysin
(Arginin)
b-Alanin
AA
g-Aminobuttersäure
Sequenzspezifische Bindung der Polyamide 163 (A) und 165 (B) an definierte DNAOligonukleotid-Doppelstränge. X,Y
beliebiges Basenpaar; A(T), T(A)
Adenin-Thymin bzw. ThyminAdenin Basenpaar; G,C
ToT
Guanin-Cytosin Basenpaar;
c/s-syn-Thymincyclobutandimer.
Abb.
51.
=
=
=
=
Durch Arbeiten in
Thymidin-Photodimers
Oligonukleotide
unserer
in ausreichenden
einzubauen [452,
DNA vorkommenden
zur
eine
(Abb. 52) erfolgte
hergestellt.
durch
herzustellen und
Formacetal-Gmppe
cis-syn-
sequenzspezifisch
in
als verbindendes Glied
Die
Sequenzen
169 und 170 sowie deren
Des weiteren wurden die
der
von
/.
Gegenstränge
reparierten Stränge 173
Der Einbau des Formacetal-verbrückten Dimers 168
Standard-Phosphoramidit-Chemie
aufwendigen Reinigung
dargestellten optimalen Sequenzen
Isostere des
Isostere enthalten statt der natürlich in der
Verfügung gestellten DNA-Stränge
und 174 als Referenz
relativ
Mengen
möglich,
ds-syn-Thymindimers (Abb. 52).
171 und 172 finden sich in Abb. 52.
der
seit kurzem
es
453]. Diese
Phosphat-Gruppe
der beiden Zuckerreste des
Butenandt
ist
Gmppe
der
Oligonukleotide
für die in Abschnitt 5.5
151
an
der
Festphase.
konnten
die
in
Aufgmnd
Abb.
synthetisierten Polyamide
51
bis
5. Flavin-funktionalisierte
zum
Ende der
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
vorliegenden
Arbeit nicht
Verfügung gestellten DNA-Oligomercn
bereitgestellt
werden.
ein erster Eindruck der nicht
Spaltungseffizienz dieser künstlichen Reparaturenzyme
Zur
Herstellung
Einzelstränge
H20 gelöst.
wurde auf
sowie die
Die
pH
der
7
Doppelstränge
eingestellt.
des
1 °C pro
Doppelstrangs
vereinigt,
abgekühlt.
Einzelstrang
und
NaH2P04
auf 90
Sequenz)
Einzelstränge
169 und 170
an
NaCl und
und
des
°C erhitzt und anschliessend
zur
in
2-10"4 M in
Einzelstrangs
Diese Prozedur hatte die
Gegenstrang
enthaltenden
von
und 0.15 M
eines
Folge.
hergestellten Doppelstränge 169/171 (AT-reiche Sequenz)
wie auch die
Photodimer
das
wässrigen Lösungen
wurden
auf RT
min)
aus
Die
gewonnen werden.
die
an
zur
sequenzspezifischen
in einer Konzentration
ausserdem 0.01 M
war
entsprechenden Gegenstrangs
langsam (~
wurden
jeweiligen Gegen stränge
Lösungen
Jedoch konnte mit den
und
quantitative Bildung
Danach wurden die
170/172
Stammlösungen
(GC-reiche
zu
je
60
p,M
bereitgesteUt.
O
O
HN^Î-P^NH
O^N^~^lAo
DMTrO
169:
5'-d(CGTATToTATTCTGC)-3'
170:
5'-d(CGACGToTGCAGC)-3'
171:
3'-d(GCATAAATAAGACG)-5'
172:
3'-d(GCTGCAACGTCG)-3'
173:
5'-d(CGTATTfTATTCTGC)-3l
174:
5'-d(CGACGTfTGCAGC)-3'
AT-reich
Abb. 52.
Darstellung
des
Phosphoramidits
GC-reich
168 sowie die
gestellten DNA-Oligonukleotide 169-174. TfT
=
Sequenzen
der
von
/. Butenandt
formacetal-verknüpfte Thymine.
152
zur
Verfügung
5. Flavin-funktionalisierte
5.6.2
Allgemeiner Aufbau
Zur
Oligonukleotiden
Die
Spaltungsexperimente
der
der
Untersuchung
Polyamid vermittelten Reparatur
musste ein neuer
der
Komponenten
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
von
Photodimer-enthaltenden
Spaltungsassay ausgearbeitet werden.
Bestrahlungslösung
wässrigen
wurden
folgenden
zu
10mMNaH2PO4
Bedingungen optimiert:
150 mM NaCl
1
M
m
Polyamid
6 uM DNA
7.6
pH
Unter diesen
Polyamide
luftdicht
Der
wurde
Lösung
den
vor
und
abgeschlossen
Eigenschaften
pH-Wert
Sauerstoff befreit.
von
also
es
zu
Modellverbindung 134
konstantem Rühren bei 366
(il H20
oder
Lysins
Polystopfen
Dies erinnerte
an
ähnliche
Auch im Fall
(siehe 4.4.6).
mit dem oxidierten Flavin.
Pyrrole
Polyamiden
einem
mit EDTA
schlug
wie bei
jedoch durch Zugabe
erreicht werden.
nm
wurde nach der Reduktion
im Fluorimeter bestrahlt.
in bestimmten Zeitintervallen Proben
zu
der Flavin-Einheit unter
Während der
Bestrahlung
10 ul entnommen und mit 40
verdünnt.
Die
SAX
der
134
mit
fehl. Die Reduktion der Flavineinheit konnte
DNA-Polyamid-Lösung
Lösung
des
der
war, dass die Fluoreszenz
war.
Modellverbindung
Wechselwirkungen
wässrigen Dithionit-Lösung
wurden der
Auffällig
völlig gelöscht
Eine Photoreduktion der Flavin-Einheit in den
Die
Seitengruppe
Bestrahlungsexperimenten
der Flavineinheit in der
Polyamide kommt
einer
die
während
Deprotoniemng
für die
war
sowie die
-Doppelstränge
protoniert bleibt.
des Flavins im oxidierten Zustand fast
der
die DNA-Einzel- bzw.
Flavin-Einheit ausreichend,
weiterhin
Die
waren
Zeit stabil.
längere
über
reduzierten
Arginins
Bedingungen
Auswertung
der
Ionentauscher-Chromatographie (Gradient: 0-5
mittels Einsatz
von
Nucleogel
min 100% A / 0% B;
5-30 min
Reparatur-Experimente erfolgte
100%-^45% A / 0%^55% B; 30-35 min 45%->0% A / 55%^100% B; 35-40 min
0%^100% A / 100%-^0% B; A
(169)
=
20 min;
min; Rt (174)
Rt (170)
=
19
min.).
Ologonukleotidstrang,
getrennt
und bei 260
=
18
H20,
B
min; Rt (171)
=
=
H20 (IM NaCl);
17
min; Rt (172)
Flussrate: 1 ml
=
16 min;
min"1; Rt
Rt (173)
=
22
Auf diese Weise konnten der das Photodimer enthaltende
dessen
nm
=
Gegenstrang
detektiert werden.
sowie
Die
153
der
Menge
an
reparierte Oligonukleotidstrang
repariertem DNA-Strang
wurde
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
5. Flavin-mnktionalisierte
über
Integration
der
den
unter
Geschwindigkeitskonstanten
Spaltungsexperimenten
Oligonukleotids
5.6.3 Die
durch
der
Wechselwirkung
spielen
des
an
3.6
Abschnitt
relativen
Die
beschriebenen
DNA-
reparierten
DNA-Einzelsträngen
von
den
Pyrrol/Imidazol-Einheiten
Polyamid
sowie des
Solche
Aminoethyl-Restes
Lysin-
bzw.
reduzierten,
DNA-Einzelsträngen
Rolle.
wird
Hauptteil
Wechselwirkungen
Arginin-Seitenketten
der
von
sich
positiven
negativen Ladungen
attraktiven,
den
sollten
und der
wirkt sicherlich die
das
Flavins,
Der
mit der
wahrscheinlich
der Flavin-Einheit einerseits und den
deprotonierten
Die
werden konnten.
Polyamid-Rückgrates
untergeordnete
Wechselwirkungen getragen.
der
repariert
DNA-Einzelstrang
und
positiven Ladungen
dass die in
recht gut
Polyamiden
DNA-Rückgrates andererseits ausbilden. Störend
des
in
der relativen Zunahme des
Auftragen
bei diesem Prozess sicher eine
elektrostatischen
zwischen den
den
zu
dargestellten Ergebnisse zeigen,
zwischen
Bindung
des
analog
Polyamid-vermittelte Reparatur
enthaltenen Photodimere
Ladung
konnten
bestimmt.
Flächen
liegenden
gegen die Zeit bestimmt werden.
Die in Abb. 53
DNA
Peaks
negative Ladung
elektrostatischen
Wechselwirkungen entgegenwirkt.
Die beste
Reparatur
konnte für das kleinste
während sich der Einschub weiterer
negativ
(z.
B.
auf die
Reparaturrate
Lys-Flavin-Lys)
Eine
Erklärung
Reparatur des
da die
Bindung
des
163
beobachtet werden,
und Imidazoleinheiten bei 164
Pyrrol-
Möglicherweise
wäre durch ein
und 165
simples Tripeptid
ein ähnlicher oder sogar besserer Umsatz erzielt worden.
für die im
AT-reichen
möglich,
auswirkte.
Polyamid
Vergleich
GC-reichen
Stranges 169 (Abb. 53A)
sequenzspezifisch
Polyamids
zum
an
bindenden
DNA-Einzelstränge
sollten.
154
ist
zum
Pyrrolnur
Strang
170 (Abb. 53B) bessere
gegenwärtigen Zeitpunkt
nicht
und Imidazol-Einheiten bei der
eine
untergeordnete
Rolle
spielen
5. Flavin-funktionalisierte
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
DNA-Strang
169
163
•
169
164
À
169
165
170
163
170
164
170
165
•
0
20
40
60
t
80
100
Polyamid
120
(min)
Abb. 53. Die
100%
Reparatur der DNA-Einzelstränge 169 (A) und 170 (B) durch die Polyamide 163-165 (1
Reparatur). Reduktion der Flavin-Einheit durch Zugabe von Dithionit. Bestrahlung bei 366 nm.
5.6.4 Die
Polyamid-vermittelte Reparatur
Auf den ersten Blick
ernüchterndes Bild
niedrig,
sodass
es
(Abb. 54).
nicht
die
ergeben
Die
möghch
verlangsamen. Insgesamt
am
DNA-Doppelstrang
etwa
ist die
DNA-Doppelsträngen
Reparaturraten
war,
genaue
DNA-Doppelstränge
Werte
für
die
ein etwas
erwiesen sich als
jeweiligen
zu
relativen
Der Umsatz scheint sich nach etwa 30 min stark
Reparatur
3-4 mal
der
entsprechenden Reparaturraten
Geschwindigkeitskonstanten abzuleiten.
zu
an
=
von
langsamer
155
als
Photodimeren durch das
am
Polyamid 163
entsprechenden Einzelstrang.
5. Flavin-funktionalisierte
Erklärung
Eine
DNA-Rückgrat
von
deprotonierte Flavin
aromatischen
Umgebung abgeschirmt
der
somit das
muss
Fünfringe
Polyamide in
um
Hauptanteil
der
ein Faktor der
nur
könnten diese die
um trotz
Doppelstrang
zu
Region
eine effektive
innerhalb
Reparatur
sind im Fall der
Im FaU der
nicht
Oligonukleotiden
Bindung
des
der
DNA
optimaler
DNA-Polyamid-Bindung verstärkenden Komponenten
Erklärung
um
Polyamids
an
nicht
den DNA-
könnte auch die durch das Photodimer veränderte
das Photodimer
dafür sorgen, dass die
abgeschwächt
durch das
DNA-Doppelstrangs
Spaltung
des
Polyamids jedoch
wird.
Bindung
Es könnte
des
Polyamids
sein, dass die
Polyamid gut gebunden
zu
weit
Cyclobutanrings propagieren
zu
vom
werden.
Photodimer entfernt,
können.
Tatsache, dass die Polyamide 163-165 dennoch in der Lage sind, Photodimere
doppelsträngiger
DNA
Modellsystemen ermutigend.
zu
überlassen,
ob
Doppelstrangs
die
Flavineinheit
die
nicht
blieb
es
in den
des
Polyamids
genau neben einem Photodimer
über die
ist für weitere Studien mit
reparieren,
Durch
synthetisierten DNA-Doppelstränge
Aussagen
Bindung
einzelsträngiger
Polyamids ausmachen,
mit den
Polyamide
Dadurch wäre die Flavin-Einheit des
Die
einer effizienten
der
gewährleisten.
unveränderten Stellen des
um
Vorteile einer
Polyamid-DNA Komplexbildung.
DNA-Doppelhelix (vgl. 5.1.1)
allem in der
entropischen
Die Salzbrücken, die in
des
sollten die
Dabei
treten.
zu
van-der-Waals-Kontakte
die
des Flavin-Restes eine effektive
In einer alternativen
vor
der
geladenen Phosphat-Rückgrats
Dimer
zum
und
reduzierte
sperrige,
Das
DNA-Doppelstrangs
(siehe 5.1.3).
vorliegenden Reparaturstudien
Struktur der
in Kontakt
unspezifischen Bindung
DNA
doppelsträngigen
ausreichen,
ist.
mit den DNA-Basen und die
sein
das Photodimer recht gut durch das
Potential des
negative
die kleine Furche des
zuträglich
Photodimere
Sequenz
Doppelstrang
Wasserstoffbrückenbindungen,
ausgeprägten
den
dafür wäre, dass im
überwinden,
der DNA erst
der
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
zu
optimale
zur
in
liegen
Verfügung
156
der
vorliegenden Studien jedoch
der
kleinen
Furche
bis
anhin
dem Zufall
des
DNA-
kommt. Deshalb können genauere
Polyamid-vermittelte DNA-Reparatur
"massgeschneiderte" Oligonukleotide
Sequenz
derartigen
stehen.
erst
getroffen werden,
wenn
5. Flavin-funktionalisierte
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
DNA-Helix
0.25
•
i
0
20
'
'
40
'
i
60
t
'
i
80
Polyamid
169:171
163
169:171
164
169:171
165
170:172
163
170:172
164
170:172
165
'
100
120
(min)
0.25
•
t
Abb. 54.
Die
(min)
Reparatur
der DNA-Doppelstränge 169:171 (A) und 170:172 (B) durch die
Polyamide
Reparatur). Reduktion der Flavin-Einheit durch Zugabe von Dithionit. Bestrahlung
bei 366 nm.
Aufgmnd des relativ geringen Umsatzes wurde auf eine Anpassung durch eine
monoexponentielle Funktion verzichtet.
163-165
5.7
•
(1
=
100%
Zusammenfassung
Die
Synthesen
Grundlage
der
Pyrrol-
für den Aufbau
und Imidazolbausteine 145 und 155
von
(5.3/5.4) bildeten
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamiden
157
an
der
die
Festphase.
5. Flavin-funktionalisierte
Boc-Strategie
Die
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide
der
Festphasensynthese
nach Baird und
Dervan
wurde
dabei
erfolgreich auf eine Fmoc-Strategie umgestellt.
•
Die Flavin- und Desazaflavinaminosäuren 103 und 116 konnten
diese
Ausbeuten isoliert wurden
(5.5.2),
Desazaflavins erwies sich als
Entschützung
Dennoch konnten
in relativ guten
Polyamide
in
dieses Schritts ist
Optimiemng
Polyamidsysteme
einige längere Polyamide
in
des Flavins in Anwesenheit eines
Eine
problematisch.
daher beim Aufbau Flavin-enthaltender
Festphase
längeren Systemen {Volyaxxixd-hairpins)
traten in
Vor aUem die
(5.5.3).
Probleme auf
Während kurze
werden.
Polyamide eingebaut
der
an
allerdings
in Zukunft unerlässlich.
schlechten Ausbeuten isoliert
werden.
•
Erste
Messungen
•
zu
Polyamide
in der
Lage,
in
von
Oligonukleotiden
Spaltungsexperiments
waren
nach Reduktion der Flavineinheit
als auch in
eingebauten
verliefen
PyrroLTmidazolPolyamide
generellen
einzelsträngigen (5.6.3)
sowohl in
(5.6.4)
eines
Ausarbeitung
beschriebenen
Reparaturfähigkeit
durch Flavin-enthaltende
Thymindimeren
Durch
der
positiv.
die
oben
Thymindimere
doppelsträngigen Oligonukleotiden
revertieren.
in
Photodimere
elektrostatische
DNA-Einzelsträngen
Wechselwirkung
wurden
wahrscheinlich
des Flavin-enthaltenden
über
Polyamids
unspezifische
mit dem DNA-
Rückgrat propagiert.
•
Die relativ
langsame Reparatur
lässt vermuten, dass
Polyamide
•
an
Für genauere
den
unter
der Photodimere
anderem die
sperrigen
DNA-Doppelstrang empfindlich
Aussagen
DNA-Doppelsträngen
über die
müssen
Vorzüge
einer
den
Oligonukleotid-Doppelsträngen
Flavin-Einheiten die
Photodimeren
von
Oligonukleotide bereitgestellt werden,
aufweisen.
158
der
an
die eine für die
Nur in solchen
spezifischen Polyamid-DNA Bindung
kommen.
Bindung
stören.
Polyamid-vermittelte Reparatar
Polyamid-DNA Bindung optimale Sequenz
können die
an
voll
Systemen
zur
Geltung
6.
6.
EXPERIMENTELLER TEIL
6.1
Abkürzungen
Experimenteller
Teil
abs.
absolut
Ac20
Essigsäureanhydrid
AMI
Austin Modell 1
Anal.
Elementaranalyse
ber.
berechnet
Boc
tert-Butyloxycarbonyl
BOP
B enzotriazol-1 -yloxy-tris(dimethylamino)phosphonium
hexafluorophosphat (Castro's Reagenz)
br.
breit
cps
counts per
d
Tag
d
Dublett
D
Pyrimidin-Cyclobutandimer
DC
Dünnschichtchromatogi-amm
DCC
Dicyclohexylcarbodiimid
DDQ
2,3-Dichloro-5,6-dicyano-l,4-benzoquinon
DIEA
Düsopropylethylamin
DMF
V,A^-Dimethylformamid
DZP
double zeta polarisation
DZV
double zeta valence
e
Extinktionskoeffizient
EA
Elementaranalyse
Etp
Diethylether
Etgly
Ethylenglykol
EI
Elektronenstoss
ESI
electrospray ionization
EtOAc
Essigsäur eethylester
EtOH
Ethanol
FAB
(Beschuss
second
(NMR)
(electron impact)
mit schnellen Atomen
bombardment)
159
(fast atom
6.
Experimenteller
Teil
Fmoc
9-Fluorenylmethoxycarbonyl
FmocOSu
9-Fluorenylmethoxycarbonyl-A7-hydroxysuccinimid
GAMESS(US)
general
atomic and molecular electronic structure
system (USA-Version)
gef.
gefunden
ges.
gesättigt
h
Stunde
HATU
2-(7-Azabenzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-
tetramethyluronium-hexafluorophosphat
HOAc
Essigsäure
HOBt
1 -Hydroxy-benzotriazol
HPLC
high pressure liquid chromatography
HR
hochaufgelöst (high resolution)
HV
Hochvakuum
Ind
Indol
IR
Infrarotspektroskopie
kDa
kilo-Dalton
konz.
konzentriert
1
Wellenlänge
Lsg.
Lösung
Lsm.
Lösungsmittel
M
Molmasse
m
Multiplett (NMR),
M
Pyrimidinmonomer
MALDI
Matrix-unterstützteLaser-Desorptionsionisation
MCSCF
multi
MeOH
MeOH
min
Minute
MNDO-PM3
modified neglect of differential overlap parametric
mittel
(medium, IR)
configuration self consistent field
-
model 3
MS
Massenspektrum
Mtr
4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzensulfonyl
NMP
N-Methylpyrrolidinon
NMR
Kernresonanzspektroskopie (nuclear magnetic
resonance)
160
6.
Experimenteller Teil
org.
organisch
q
Quartett (NMR)
quint
Quintett (NMR)
3-NOBA
3-Nitrobenzylalkohol (M= 153)
ppm
parts per mülion
Rf
Retentionsfaktor für DC
RHF
restricted Hartree Fock
RP
reversed phase
Rt
Retentionszeit
RT
Raumtemperatur
s
Singulett (NMR),
Sdp.
Siedepunkt
SHE
Standard-Wasserstoffelektrode (standard
(HPLC)
stark
(strong, IR)
hydrogen
electrode)
Smp.
Schmelzpunkt
t
Triple« (NMR)
tBu
tert-Butyl
TBTU
2-(Bezotriazol-1 -yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoroborat
TFA
Trifluoressigsäure
TIPS
Triisopropylsilan
TMS
Tetramethylsüan
UHF
unrestricted Hartree Fock
UV
Ultraviolettspektoskopie
w
schwach
(weak, IR)
161
6.
Experimenteller Teil
Material und Methoden
6.2
Aktinometrie
wurde mit
Standardverfahren
dem
der
Ferrioxalat-Aktinometrie
nach
Hatchard,Parker durchgeführt. Dazu wurde der Aktinometer K3Fe(C204)3-3H20 nach der
Vorschrift
Hatchard,Parker
von
Lichtausschluss
unter
und
hergestellt
folgende
Stammlösungen angerichtet:
11 Aktinometrie-Puffer
1 1 0.006 M
(600
ml 1 N NaOAc, 360 ml 1 N
Aktinometer-Lösung (2.947
g
H2S04,
K3Fe(C204)3-3H20,
40 ml
H20)
100 ml 1 N
H2S04,
900 ml
H20)
100 ml 0.2%
o-Phenanthrolinlösung
100 ml 0.04 M
FeS04
in 0.1 N
Bestrahlungsexperimente
Spektroskopie)
Lichtquelle
Lampe
in
H2S04
wurden
bei einer Schlitzbreite
Leistung
von
Aluminium)
366
nm.
der Firma Merck
Es wird
jeweils
einem
2
mm
Spex
Fluorimeter
(Bandbreite:
Bestrahlung
3.4
(siehe Fluoreszenz-
nm) durchgeführt.
Als
wurde eine Osram XBO OFR Xenon-
450 W verwendet.
Dünnschichtchromatogramme
oder
an
von
für die monochromatische
mit einer
H20
wurden mit
Fertigplatten (Kieselgel-60 F254
Die Detektion
durchgeführt.
auf Glas
bei 254
erfolgte
nm
oder
die stationäre Phase, das Laufmittel und der Retentionsfaktor
angegeben.
Elementaranalysen
durchgeführt.
wurden
Es wurden die Gehalte
Fluoreszenz-Spektroskopie
durchgeführt.
Die
Lösungen
Konzentrationsbereich
=
3
ml, d
=
1
vom
5-10"7
-
an
HPL-Chromatographie
interface box, variable
injector, Eurochrom
der
ETH
wurden,
von
Spex
wenn
5-10"6 M angerichtet
2
wurde auf einer
mm
1680 0.22m double
nicht
anders
und in einer Hellma
(Bandbreite:
3.4
Spectrometer
angegeben,
nm) gemessen.
Knauer-Anlage (Knauer
Software) sowie
auf einer
im
Quartz-Küvette (V
HPLC
pump
wavelength monitor, degasser, dynamic mixing chamber,
2000 HPLC
Zürich
C, H und N bestimmt.
wurde auf einem
cm) bei einer Schlitzbreite
Labor
Mikroanalytischen
64,
manual
Merck-Hitachi-Anlage (L-7400
UV-Detector,L-7100 HPLC Pump, L-7200 Autosampler, L-7612 Solvent Degasser, Lab
Source Pelcooler, D-7000 Interface Module, D-7000 HPLC
162
System Manager,
D-7500 Data
6.
File Conversion
Utility) durchgeführt.
wurden pro Run 20-100
bzw.
Substanz
jlxI
H20/CH3CN (HPLC-Qualität)
deprotonierbaren Substanzen
bzw.
254
450
Pumpenköpfe
Firma
analytische Reversed Phase
Für
100-5 RP-18 Säule der Firma
Lichrospher
CC-250/4
präparative
Für
nm.
1 % TFA
Reversed
Es kamen Gradienten
H20/MeOH
von
bzw.
H20/CH3CN
Einsatz. Für Ionentauscher HPLC wurde eine
M NaCl /
1.0 ml/min Flussrate
pH 12) mit
wurden
Infrarotspektren
zum
von
relativen Intensitäten
Gemini 200 (50 MHz
('H)),
(13C),
(13C),
BrukerAMX 400
500
verwendet.
(!H)).
Die
Es
(100
in ppm
zusätzlich in Klammem die
Multiplett),
Protonen
die
Zur
Messung
(13C),
400
(XH))
J
zum
pH 12)/H2O(1.0
Substanz)
mittel,
w
Lösungsmittel
(75 MHz (13C),
vom
d
Varian
300 MHz
(125
MHz
Glaser AG
der Firma Dr.
Für
und deren
aufgenommen:
NMR-Service des
aufgenommen.
angegeben.
oder
schwach).
und Bruker AMX 500
Spinmultiplizität (s Singulett,
Kopplungskonstante
Die chemische
'H-NMR Spektren wird
Dublett,
t
Triplett,
q
Quartett,
m
(in Hz) sowie die Anzahl der signalerzeugenden
angegeben.
Massenspektren
wurden
vom
der ETH Zürich gemessen.
Die
MS-Service des Laboratoriums für
Spektrometer
waren vom
Typ
Tribrid (EI, 70 eV), VG ZAB2-SEQ (FAB, 3-NOBA-Matrix),
Probenkonzentration
N2,
m
Varian Gemini 300
TMS
aufgetrennt.
Signale (in cm"1)
Geräten
folgenden
Chemie der ETH Zürich
bezüglich
Substanz
wurde ein Perkin-Elmer
auf Bruker AMX 400 und 500 wurden
Organische
Verschiebung wird
MHz
(1H)),
wurden deuterierte
Spektren
Laboratoriums für
200 MHz
auf
pl
(0.3%
bezüglich Basissignal angegeben (s stark,
wurden
präparative
100-12 C-18 Säule der
M NaCl /
H2O(0
Es werden Wellenzahlen der
Kernspinresonanzspektren
wurden
bei
Einsatz.
Chloroformlösungen (2% Substanz) aufgenommen.
1600 FT-IR-Gexkt verwendet.
erfolgte
mit 5-10 ml/min Flussrate
KBr-Presslingen
von
Bei leicht
Sax 1000-8/77 Säule der Firma
Nucleogel
Es kamen Gradienten
Macherey-Nagel verwendet.
Nucleoprep
Es
H20/MeOH
von
Detektion
HPLC
Es wurden pro Run 500-1000
verwendet.
Einsatz.
zum
zugesetzt.
Phase
der Firma Knauer sowie eine VP 250/21
Macherey-Nagel eingesetzt.
Macherey-Nagel
mit 0.7-1.5 ml/min Flussrate
H20
HPLC wurde eine
Es kamen Gradienten
aufgetrennt.
wurde dem
Experimenteller Teil
Polarität +4.5
ca.
Organische
Chemie
Hitachi-Perkin-Elmer VG
Finnigan TSQ
7000 (ESI,
10"5 M in MeOH oder CH3CN, Fluss 25 ftl/min, Zerstäubergas
kV, KapiUartemperatur 473 K, Gasdruck 50 psi) und Bruker-Reflex
Spectrometer (MALDI-TOF)
gemessen. Es werden die
163
Quotienten
aus
Masse und
Ladung
6.
Experimenteller Teil
charakteristischer
einiger
sowie
des Molekülions
Signalintensität
Klammem die jeweilige
und ein
Quantenmechanische Berechnungen
von
U.
Wild
P.
an
der
Abteilung
ab
Programm GAMESS(US)
für
Mayer-Bindungsordnungen
von
E. U.
in
Wallenborn
aus
der
Grappe
Chemie der ETH Zürich mit dem
physikalische
über den Basissatz RHF/4-3 IG
optimiert.
Röntgenkristallstmkturen
wurden basierend auf den
wurden
Wasserstoff-Atome
Die
durchgeführt.
initio
folgt
dahinter
Zuordnungsvorschlag.
wurden
Röntgenkristallstrukturen
basierend auf den
Fragmente angegeben,
Die
über die
Basissätze UHF/6-3 IG*, UHF/DZV oder UHF/DZP berechnet.
Reagenzien
erhältlichen
Lösungsmittel
und
Qualitäten puriss.
a.
p.
wurden
oder purum
für
eingesetzt
Fluka, Aldrich, Acros, Sigma
oder Novabiochem.
Säulenchromatographie
technischer
Abdestillieren
bzw.
Rotationsverdampfer
waren
Einengen
der Firma Büchi
am
Röntgenkristallstrukturanalysen
Laboratorium für
Kristallographie
Qualität und wurden
in
wurden
von
der ETH Zürich
Details und Tabellen sind im
Anhang aufgeführt.
Säulenchromatographie
wurde mit
vor
den Firmen
Gebrauch destilliert.
wurde
mit
einem
durchgeführt.
Volker
Dr.
Prof.
von
für Extraktionen und
vacuo
Wasserstrahlvakuum
kommerziell
den
und stammen
Lösungsmittel
Lösungsmitteln
von
in
Reaktionen
Die
durchgeführt.
Grämlich
am
experimenteUen
Kieselgel-6~0 ( Korngrösse 0.040-0.063 mm)
der
Firma
Merck, Flash-K\ese\ge\ (0.063-0.1 mm) oder Kieselgel-tf (0.005-0.040 mm) der
Firma
Fluka
unter
Druck
0.3
(Pressluft,
bar
Überdruck)
Säulendurchmesser und das Laufmittel werden in Klammern
Schmelzpunkte
oder Büchi
wurden mit Hilfe einer
Melting
Point B540 in offenen
der
UV-Bestrahlungen
spektrale Lichtleistung
Kühlung
reicht
von
vom
Kapillaren bestimmt und
wurden
Mitteldmck("Hochdruck")-Strahler (Leistungsaufnahme:
200-600
nm.
ist erforderlich.
164
Die
Der
angegeben.
Schmelzpunktapparatur
Pyrimidinmonomere
durchgeführt.
Typ
Smp 20
sind nicht
korrigiert.
mittels
Quecksilber-
150-250 Watt)
Lampen
Büchi
durchgeführt. Die
sind nicht fokussierbar, eine
6.
UV-Spektroskopie
durchgeführt.
wurde auf einem Varian
Die
Lösungen
Konzentrationsbereich 5-10"6
=
3
ml, d
=
1
-
wurden,
Cary
Experimenteller Teil
5 UV/VIS/NIR
nicht
wenn
anders
Spectrophotometer
angegeben,
im
5-10"5 M angerichtet und in einer Hellma Quartz-Küvette (V
cm) gemessen.
Synthesen:
6.3
6.3.1
Synthese
der
Cyclobutandimere:
O
HN
]|5
iL
46
JL
COOH
1,2,3,4-Tetrahydro-2,4-dioxopyrimidin-l-essigsaure (46).
wurde in
H20 (150 ml)
aufgeschlämmt.
KOH-Lösung gegeben.
Lösung
entstand.
Das
Reaktionsgemisch
Chloressigsäure (16.90
90 min unter Rückfluss erhitzt.
eingestellt.
und über
Smp.:
Zu dieser
g, 178
Uracil (10.00 g, 89.2 mmol)
Suspension
wurde bei RT
mmol)
wurde
in
vacuo
286-288 °C
getrocknet (9.98
287 °C
(Lit.:
gerührt,
beigegeben
bis eine klare
und
es
Anschliessend wurde mit konzentrierter HCl auf
Die über Nacht auskristallisierten farblosen Plättchen
P2Os
wurden 50 ml einer 3.6M
von
wurde
pH
1
46 wurden abfiltriert
66%).
g,
IR
[338]).
(KBr):
341
Iw, 3111m, 2789m, 2456m,
1983m, 171U 1477m, 1401m, 1348m, 1276m, 1205m, llllw, 956m, 827m, 762m..
XH-NMR (200 MHz, (CD3)2SO): 4.42 (s,
C(5)H); 7.60 (d,
J=
7.9,
1
2
H, C(7)H2); 5.62 (dd, J
H, C(6)H); 11.33 (s, 1 H, N(3)H).
(CD3)2SO): 48.18; 100.42; 145.82; 150.56; 163.36; 169.12.
(66);
82
gef.:
C
(100);
28
(39).
Anal. ber. für
C6H6N204 (170.12):
42.35, H 3.61, N 16.53.
165
=
7.9, /
2.2, 1 H,
13C-NMR (50 MHz,
EI-MS: 170
C
=
(12, M+); 126
42.36, H 3.55, N 16.47;
6.
Experimenteller
Teil
47
l,2,3,4-Tetrahydro-2,4-dioxopyrimidin-l-essigsäure-benzylester (47).
46
(4.97
29.2 mmol) und
g,
wurden in DMF
(50 ml)
mmol) zugegeben
der
Umkristallisation des
Benzylester
l,l'-Carbonyl-bis[l//-diimidazol] (6.00
Nach 10 min wurde
gerührt.
und 28 h bei RT
abgezogen,
Vakuum
bei RT
in
H20
Smp.:
37.0
ml)
mmol)
g, 39.0
Lösungsmittel
suspendiert
MeOH und Trocknen über
aus
47 als farblose Nadeln (7.19 g,
0.38.
(30
g,
Benzylalkohol (4.20
Danach wurde das
gerührt.
Rückstand
Rohproduktes
Rf (CHCL/MeOH 10:1)
Das Uracilderivat
und
unter
filtriert.
P205 ergab
den
95%).
187-188 °C.
IR
(KBr): 3422w, 3156m, 3111m,
3031m, 2878m, 2827m, 1733s, 1717s, 1682s, 1468s, 1428s, 1384s, 1347s, 1254s,
1231s,
1205s,
(CD3)2SO):
7.39
(s,
1103m,
4.60 (s, 2 H,
5 H,
C(ar)H);
948m,
886m,
C(7)H2);
7.65
(d,J
=
5.20
828w,
(s,
2
H,
806m,
'H-NMR
761s.
CH2-Bn);
5.63 (d,J
=
(200
MHz,
1.9, 1 H, C(5)H);
1.9, 1 H, C(6)H); 11.43 (s, 1 H, N(3)H).
13C-NMR
(50 MHz, (CD3)2SO): 48.80; 66.63; 101.36; 128.22; 128.49; 128.74; 135.79; 146.11;
151.28; 164.02; 169.12.
EI-MS: 260 (4,
M+); 153 (21); 91 (100);
82
(52); 65 (10);
28
(8). Anal. ber. für C13H12N204 (260.25): C 60.00, H 4.65, N 10.76; gef.: C 59.93,
H
4.92, N 10.50.
Synthese
Der
der vier isomeren
Benzylester
47
(4.00
Ultraschallbad entgast.
1-Carboxymethyluracil-benzylester-Cyclobutandimere
g, 15.4
Danach wurde die
Belichtungsapparatur transferiert,
sauerstoffreie
Lösung
mmol) wurde in Aceton (320 ml) gelöst und 15 min im
Lösung
in eine
durch die 15 min
lang
Stickstoff
wurde während 3 h mit einer 150 W
Anschliessend wurde filtriert und mehrmals
aus
Aceton
wassergekühlte
aus
CHC13 ergab
Filtrat: Isomer
von
25 g
zweimal
Si02
beide Isomere in
umgefällt,
49). Das Aceton-Filtrat (~
zur
vollständigen
analysenreiner
2.5
g)
Trockenheit
chromatographisch (Kieselgel-//;
d
=
166
3 cm, /
Pyrex
wurde.
Die
bestrahlt.
wobei der Rückstand die
Mehrfaches Fällen dieses
Form
(Rückstand: Isomer 51;
wurde in Dioxan
eingeengt.
geleitet
Hg-Mitteldrucklampe
Isomere 49 und 51 in Form eines weissen Pulvers enthielt.
Pulvers
400 ml
gelöst
und mit
Zugabe
Das verbleibende Pulver wurde
=
18 cm;
CHCl3/MeOH
15:1
)
6.
gereinigt.
beseitigt.
Restliche
Spuren
Edukt
(47)
Experimenteller
wurden mittels Fällen der Fraktionen
Teil
CHC13
aus
Es konnten die Isomere 48 und 50 als weisse Pulver gewonnen werden.
O
6
H
—
48
HH
I
HH
I
M
I
V
8
,0
V
o
O
cis-4a-cisoid-4a,4b-cis-4b-Dodecahydro-2,4,5,7-tetraoxo-cyclobuta[l,2-d:4,3-d']
dipyrimidin-l,8-diessigsäure-dibenzylester
(CHCLVMeOH 10:1)0.24. Smp.:
(48).
180-183 °C.
IR
Ausbeute:
340
3.74
(m,
2
H, C(4a)H, C(4b)H); 4.00 (d, J
N(8)C//H); 4.21 (m,
2
H, C(8a)H, C(8b)H); 4.24 (d, J
N(8)ŒH); 5.14 (s, 4 H,
NMR
CH2-Bn);
XH-NMR (500 MHz,
=
17.4,
2
H,
N(1)C#H,
=
17.4,
2
H,
N(1)C#H,
7.36 (s, 10 H, C(ar)H); 10.58 (s, 2 H, NH).
(125 MHz, (CD3)2SO): 38.11; 47.20; 54.97; 66.00;
135.61; 152.63; 166.94; 168.56.
FAB-MS: 521
Rf
(KBr): 3267w, 1744s, 1696s, 1475m,
1389w, 1361w, 1278w, 1218m, 1200m, lOOOw, 759w, 694w.
(CD3)2SO):
(9%).
mg
127.75;
128.01;
(5, [M+H]+); 74 (100).
13C-
128.33;
C26H24N408
(520.50).
49
cis-4a-txaxisoid-4a,4b-cis-4b-Dodecahydro-2,4,5,7-tetraoxo-cyclobuta[l,2-d:4,3-d']
dipyrimidin-l,8-diessigsäure-dibenzylester
(CHCl3/MeOH 10:1)
0.31.
Smp.:
(49).
217 °C.
IR
Ausbeute:
1.45
4.36
(CD3)2SO):
(m,
2
3.41
(m,
2
H, C(8a)H, C(8b)H); 5.05 (d, J
=
ein
Signal überlagert
von
R{
:H-NMR (500
H, C(4a)H, C(4b)H); 4.09 (s, 4 H, N(1)CH2,
N(8)CH2);
12.5, 2 H, CH2-Bn); 5.13 (d, J
H, CH2-Bn); 7.35 (s, 10 H, C(ar)H); 10.71 (s, 2 H, NH).
(CD3)2SO):
(36%).
(KBr): 3199w, 3067w, 1689s, 1477m,
1406w, 1365m, 1317w, 1276m, 1217m, 1194m, 972w, 741w, 700w.
MHz,
g
=
12.5,
2
13C-NMR (125 MHz,
(CD3)2SO; 48.42; 59.29; 66.00; 127.89; 128.04;
167
6.
Experimenteller Teil
128.34; 135.48; 151.58; 169.22; 169.64. FAB-MS: 521 (71, [M+H]+); 261 (100).
ber. für
C26H24N4O8-0.5H2O (529.50):
C
Anal,
58.97, H 4.76, N 10.58; gef.: C 58.85, H 4.76,
N 10.88.
-o^^
^
HHN^°
r
o
"^
jK
cr*N
A
J^
50
.NH
cis-4a-cisoid-4a,4b-cis-4b-Dodecahydro-2,4,6,8-tetraoxo-cyclobuta[l,2-d:3,4-d']
dipyrimidin-l,5-diessigsäure-dibenzylester
(CHCL/MeOH 10:1)
0.42.
(50).
227-230 °C.
Smp.:
Ausbeute:
IR
40
mg
(1%).
Rf
(KBr): 1712s, 1475m, 141 lw,
1389w, 1361m, 1300w, 1267m, 1222m, 1194m, 1178m, 994w, 744w, 694w.
XH-NMR
(500 MHz, (CD3)2SO): 3.79 (t,
J=
8.7, 2 H, C(4a)H, C(8a)H); 3.89 (d, J= 17.9, 2 H,
N(l)C/m, N(5)C#H);
J=
8.7, 2 H, C(4b)H, C(8b)H); 4.43 (d, J= 17.9, 2 H,
4.38
(t,
N(1)C/YH, N(5)C/ffl); 5.17 (s,
NH).
4 H,
CH2-Bn);
(s, 10 H, C(ar)H); 10.66 (s, 2 H,
13C-NMR (125 MHz, (CD3)2SO): 44.06; 46.91; 48.16; 65.98; 127.73; 128.00;
128.34; 135.65; 151.45; 167.39; 168.62.
ber. für
7.37
C26H24N4O80.5H2O (529.50):
FAB-MS: 521
C 58.97, H
N 10.41.
168
(5, [M+H]+);
74
(100).
Anal,
4.76, N 10.58; gef.: C 58.80, H 5.16,
6.
J^v
H
Teil
51
NH
I
Experimenteller
(1
H
cis-4a-txax\soid-4a,4b-cis-4b-Dodecahydro-2,4,6,8-tetraoxo-cyclobuta[1,2-d:3,4-d']
dipyrimidin-l,5-diessigsäure-dibenzylester
(CHCl3/MeOH 10:1)
0.42.
(51).
286 °C.
Smp.:
IR
Ausbeute:
1.20
(30%).
g
(KBr): 3286m, 1733s, 1717s, 1684s,
'H-NMR
1484m, 1417w, 1394w, 1375m, 1290m, 1231m, 1194m, 987w, 747m, 696w.
(500 MHz, (CD3)2SO): 3.76 (m,
N(l)Ciffl, N(5)CÄH);
4.20
C(4b)H, C(8b)H); 5.17 (s,
4
(d,
2 H,
J
=
Rf
C(4a)H, C(8a)H);
4.02
(d, J
=
17.8,
2
H,
17.6, 2 H, N(1)C#H, N(5)C#H); 4.34 (m, 2 H,
H, CH2-Bn); 7.36 (s, 10 H, C(ar)H); 10.69 (s, 2 H, NH).
I3C-NMR (125 MHz, (CD3)2SO): 42.99; 46.22; 52.89; 66.13; 127.77; 127.92; 128.34;
135.59; 151.13; 168.28; 168.37.
für
C26H24N4O8-0.5H2O (529.50):
MS
C
(MALDI-TOF): 543 (100, [M+Na]+).
Anal. ber.
58.97, H 4.76, N 10.58; gef.: C 59.16, H 4.76, N
10.94.
cis-4a-cisoid-4a,4b-cis-4b-Dodecahydro-2,4,5,7-tetraoxo-cyclobuta[l,2-d:4,3-d{]
dipyrimidin-l,8-diessigsäure (41).
(25 ml) gelöst und
10%
Lösung zugegeben.
vereinigten
Produkt 41
in
vacuo
gefällt.
Die
Mischung
getrocknet.
wurde
2 h in
einer
in HOAc
wurde in HOAc
(1 ml),
Niederschlag
vacuo
eingeengt.
wurde
wurde der
H2-Atmosphäre gerührt
Der Rückstand wurde mit heisser HOAc
Filtrate wurden in
Der
(415 mg, 0.798 mmol)
Pd/C-Katalysator (10 mg), suspendiert
anschliessend durch Celite filtriert.
und die
Der Diester 48
Durch
Zugabe
von
Et20
und
gewaschen
wurde das
abfiltriert, mit wenig Aceton gewaschen und
Die Dicarbonsäure 41
erhalten.
wurde als weisses Pulver
169
(247
mg,
91%)
6.
Experimenteller Teil
Smp.:
280-283 °C.
IR
(KBr): 3600-2800m, 3422m, 3189m, 3067m, 2844m, 1710s,
*H-NMR (200 MHz,
1690s, 1483s, 1394m, 1372m, 1278s, 1189m, 756m, 533w.
(CD3)2SO):
3.39
C(4b)H);
4.10
C(8b)H);
10.28
(d,
J
(d,
J
=
=
16.8, 2 H, N(1)ŒH, N(8)C#H); 3.64 (m, 2 H, C(4a)H,
16.8, 2 H, N(l)C/ffl, N(8)C#H); 4.13
(170.12):
C(8a)H,
13C-NMR (50 MHz, (CD3)2SO): 21.02; 47.38; 54.71;
(s, 2 H, NH).
152.54; 167.16; 170.09. FAB-MS: 341 (100, [M+H]+).
C
(m, 2 H,
42.36, H 3.55, N 16.47;
gef.:
C
42.46,
H
Anal. ber. für
C12H12N408
3.81, N 16.40.
42
cis-4a-txansoid-4a,4b-cis-4b-Dodecahydro-2,4,5,7-tetraoxo-cyclobuta[l,2-d:4,3-d']
dipyrimidin-l,8-diessigsäure (42).
konzentrierter HCl
abgekühlt
(50 ml)
und 24 h bei 4
Der Diester 49
(1.05 g, 2.02 mmol) wurde in
1 h unter Rückfluss erhitzt.
°C
stehengelassen.
Anschliessend wurde auf RT
Der entstandene
Niederschlag
wurde
abfiltriert, dreimal mit H20 gewaschen und über P205 getrocknet (42, 350 mg, 51%).
Smp.:
>
300 °C
(Lit.: 346-350 °C [336]).
IR
(KBr): 3167m, 3056m, 2856w, 1744s,
1690s, 1485s, 1420m, 1383m, 1318m, 1301s, 1233w, 1189s, 911w, 889w, 850w,
797w, 750n>, 650w.
3.90
(d,
J=
N(8)C/ffl);
COOH).
:H-NMR (200 MHz, (CD3)2SO): 3.43 (m, 2 H, C(4a)H, C(4b)H);
17.5, 2 H, N(l)Cr7H, N(8)Ciffl); 4.00 (d, J= 17.5,
4.30
2
H, N(1)C#H,
(m, 2 H, C(8a)H, C(8b)H); 10.64 (s, 2 H, NH), 12.80 (br.s, 2 H,
13C-NMR (50 MHz, (CD3)2SO): ein Signal überlagert
59.19; 151.17; 169.40; 170.33.
C12HI2N4O8-0.5H2O (349.25):
FAB-MS: 341
C
von
(CD3)2SO; 48.14;
(10, [M+H]+); 307 (100).
Anal. ber. für
41.27, H 3.75, N 16.04; gef.: C 41.34, H 4.03, N
16.04.
170
6.
o
oh
r
H
H
Experimenteller Teil
K,
HN
X
O'
43
NH
N
V
HO.
O
cis-4a-txansoid-4a,4b-cis-4b-Dodecahydro-2,4,6,8-tetraoxo-cyclobuta[l,2-d:3,4-d']
dipyrimidin-l,5-diessigsäure (43).
(25 ml) suspendiert und
mit konzentrierter
weisse
Rückstandes über
Smp.:
>
3.5 h bei RT
H2S04
Niederschlag
auf
pH
1
IR
(500
mg, 1
mmol)
gerührt. Anschliessend
eingestellt
H20
dreimal
wurde in IN NaOH
wurde die
und 24 h auf 4 °C
wurde abfiltriert und mit
P205 ergab
300 °C.
Der Diester 51
Reaktionslösung
Der entstandene
gekühlt.
Trocknen des
gewaschen.
die Dicarbonsäure 43 (291 mg,
86%).
(KBr): 3433m, 3237m, 1733m, 1698s, 1485m, 1433w, 1384m,
1301m, 1237m, 1206m, 989w, 801w, 750w. *H-NMR (200 MHz, (CD3)2SO): 3.76 (m,
2 H,
C(4a)H, C(8a)H); 3.80 (d,
2 H,
N(l)C/m, N(5)CffH);
NMR
J
4.28
=
IIA, 2 H, N(1)C#H, N(5)C/ffl); 4.10 (d, J
(m,
2
H, C(4b)H, C(8b)H); 10.61 (s, 2 H, NH).
(50 MHz, (CD3)2SO): 42.86; 45.91; 52.76; 151.03; 168.43; 169.74.
(13, [M+H]+);
307
=
17.4,
13C-
FAB-MS: 341
(100). Anal. ber. für C12H12N408H20 (358.26): C 40.23, H 3.94,
N
15.60; gef.: C 39.96, H 3.80, N 15.19.
55
l,2,3,4-Tetrahydro-5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-l-essigsäure (55).
79.3
mmol) wurde in H20 (150 ml) aufgeschlämmt.
einer 3.6M
klare
und
KOH-Lösung gegeben.
Lösung
es
entstand (30
Das
pH
min). Chloressigsäure (15.00
1
eingestellt.
Suspension
Reaktionsgemisch wurde
wurde 90 min unter Rückfluss erhitzt.
konzentrierter HCl auf
Zu dieser
g, 159
Die erkaltete
Thymin (10.00
bei RT
171
P205
in
wurden 50 ml
gerührt,
bis eine
mmol) wurde beigegeben
Reaktionslösung
Nach 24 h bei 4 °C wurden die
kristallisierten farblosen Plättchen abfiltriert und über
g,
vacuo
aus
wurde mit
der
Lösung
getrocknet (55,
12.50
6.
Experimenteller Teil
g,
86%). Smp.: 268-270 °C (Lit.:
(d,
J
(s,
1
=
1.2, 3 H,
C(5)CH3);
270 °C
4.54 (s, 2 H,
[338]).
XH-NMR (400 MHz, (CD3)2SO): 1.76
C(7)CH2);
7.50
(d,
J
H, NH); 13.00 (br.s, 1 H, COOH). 13C-NMR (100 MHz,
=
1.2, 1 H, C(6)H); 11.35
(CD3)2SO): 11.79; 48.31;
108.23; 141.72; 150.89; 164.27; 169.56. C7H8N204 (184.15).
56
1,2,3,4-Tetrahydro-5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-l-essigsäure-benzylester
Thyminderivat
55
mmol) wurden
in DMF
76.1
in
vacuo
Umkristallisation des
Benzylester
Das
(10 g, 54.3 mmol) und l,l'-carbonyl-bis[l/f-diimidazol] (12 g, 74.0
(80 ml)
bei RT
gerührt. Nach
15 min wurde
mmol) zugegeben und die Reaktionslösung 35 h bei
Lösungsmittel
(56).
eingeengt,
der Rückstand in
Rohproduktes
56 als farblose Plättchen
R{ (CHCL/MeOH 10:1)
0.65.
aus
(14.5
Smp.:
RT
Benzylalkohol (8
gerührt.
Danach wurde das
HzO (50 ml) suspendiert
MeOH und Trocknen über
g,
g,
und filtriert.
P205 ergab
den
97%).
179-181 °C. IR
(KBr): 3156m, 3043m, 2944m,
1737s, 1693s, 1650s, 1458m, 1420m, 1387m, 1360m, 1224s, 1150m, 958m, 894w,
865w, 793w, 757s. 'H-NMR (400 MHz, (CD3)2SO): 1.76 (s, 3 H, C(5)CH3); 4.55 (s, 2
H, C(7)CH2); 5.19 (s, 2 H, CH2-Bn); 7.38 (s, 5 H, C(ar)H); 7.53 (s, 1 H, C(6)H); 11.41
(s, 1 H, NH).
13C-NMR (100 MHz, (CD3)2SO): 11.79; 48.38; 66.34; 108.56; 127.86
(2C); 128.12; 128.38 (2C); 135.46; 141.45; 150.89; 164.21; 168.11.
M+);
167 (17); 139 (57); 91 (100); 65 (7); 41
(9);
28
(12).
Anal. ber. für
(274.28): C 61.31, H 5.14, N 10.21; gef.: C 61.25, H 5.34, N 10.18.
172
EI-MS: 274
(19,
C14H14N204
6.
Herstellung
Der
der vier isomeren
Benzylester
1-Carboxymethylthymin-benzylester-Cyclobutandimere
56 (2.00 g, 7.3 mmol) wurde in Aceton
Ultraschallbad entgast.
Danach wurde die
Belichtungsapparatur transferiert,
Lösung
durch die 15 min
gefällt,
Reaktionsgemisch
wobei ein Teil der Isomere 58
Rückstand verblieb.
Chromatographie
lang
Gemisch der Isomere 57 und 59.
d
(Kieselgel-6'0,
anschliessend
HCOOH/H20
3
=
aus
/
cm,
MeOH
und 60
18
gefällt.
in
ml
Pyrex
wurde.
geleitet
Die
Hg-Mitteldrucklampe bestrahlt.
in Form eines
(Kieselgel-öü,
weissen
d
=
Aceton
wenig
aus
Pulvers
3 cm, /
=
im
18 cm,
des Restes der Isomere 58 und 60 sowie ein
cm,
Chloroform/Methanol
Umkristallisation
und der Isomere 57 und 59
Thymin-Cyclobutandimere
Stickstoff
Das Gemisch wurde erneut zweimal
=
und 15 min im
wassergekühlte 250
filtriert und mehrmals
des Filtrates
CH2C12/Aceton 7:1, 5:1) ergab Trennung
(200 ml) gelöst
in eine
sauerstofffreie Lösung wurde während 3 h mit einer 150 W
Anschliessend wurde das
Experimenteller Teil
der
15:1)
Isomere
MeOH/H20
aus
chromatographisch
58
gereinigt
und
60
aus
und
lieferte alle vier isomeren
analysenreiner Form.
O
O
Ar
57
°^J
H
H
o
^SJ
o
cis-4a-cisoid-4a,4b-cis-4b-Dodecahydro-4a,4b-dimethyl-2,4,5,7-tetraoxo-cyclobuta
[l,2-d:4,3-d'] dipyrimidin-l,8-diessigsäure-dibenzylester (57). Ausbeute:
(CHCL/MeOH 10:1)
0.50.
Smp.: 146-148 °C.
IR
40 mg
2%). Rf
(KBr): 341 lw, 3217w, 3078w,
2956w, 1744s, 1709s, 1475m, 1391w, 1361w, 1287m, 1194m, 965w, 754w, 698w.
!H-NMR (400 MHz, (CD3)2SO):
2
1.31
(s, 6 H, C(4a)CH3, C(4b)CH3); 3.92 (d, J
H, N(1)C#H, N(8)CÄH); 3.99 (s, 2 H, C(8a)H, C(8b)H); 4.29 (d, J
N(l)C/ffl, N(8)Gr7H); 5.12 (d,
Bn); 7.36 (s,
10
J=
=
=
17.4,
17.4, 2 H,
12.5, 2 H, CH2-Bn); 5.18 (d, J= 12.5, 2 H, CH2-
H, C(ar)H); 10.53 (s, 2 H, NH).
13C-NMR (100 MHz, (CD3)2SO):
18.18; 46.09; 47.15; 59.34; 66.07; 127.82 (2C); 128.05; 128.33 (2C); 135.56; 152.17;
168.54; 170.34.
(548.56):
C
FAB-MS: 549 (100,
[M+H]+);
338 (18).
61.31, H 5.14, N 10.21; gef.: C 61.37,
173
H
Anal. ber. für
5.28, N 10.15.
C28H28N408
6.
Experimenteller Teil
58
cis-4a-txaxisoid-4a,4b-cis-4b-Dodecahydro-4a,4b-dimethyl-2,4,5,7-tetraoxo-cyclobuta
[l,2-d:4,3-d'] dipyrimidin-l,8-diessigsäure-dibenzylester (58). Ausbeute: 750 mg (38%).
Rf (CHCL/MeOH 10:1)
0.58.
Smp.: 204-206 °C.
IR
(KBr): 3430m, 3178w, 3065w,
2856w, 1745s, 1700s, 1687s, 1478s, 1388w, 1378w, 1358m, 1284m, 1208s, 956w,
754iv, 698vf.
3.98
=
2
(s,
2
XH-NMR (400 MHz, (CD3)2SO): 1.23 (s, 6 H, C(4a)CH3,
C(4b)CH3);
H, C(8a)H, C(8b)H); 4.09 (d, J= 17.7, 2 H, N(1)C#H, N(8)Gr7H); 4.25 (d, J
17.7, 2H, N(1)CÄH. N(8)CÄH);5.11 (d,J= 12.5, 2 H, CH2-Bn); 5.15 (d, J= 12.5,
H, CH2-Bn); 7.36 (s, 10 H, C(ar)H); 10.65 (s, 2 H, NH).
(CD3)2SO): 20.82; 45.66; 48.17; 63.32; 66.12;
135.51; 151.31; 169.17;
170.73.
C28H28N4O8-0.5H2O (557.56):
C
H
(2C); 128.08;
(100, [M+H]+); 338 (55).
FAB-MS: 549
60.32,
127.90
13C-NMR (100 MHz,
5.24,
N
128.35
(2C);
Anal. ber. für
10.05; gef.: C 60.59, H 5.30, N
10.34.
59
KA^kJ
°
cis-4a-cisoid-4a,4b-cis-4b-Dodecahydro-4a,8a-dimethyl-2,4,6,8-tetraoxo-cyclobuta
[l,2-d:3,4-d'] dipyrimidin-l,5-diessigsäure-dibenzylester (59).
(CHCL/MeOH 10:1) 0.55. Smp.: 215-217 °C.
IR
50
mg
(2.5%).
Rf
(KBr): 3433m, 3078w, 2967w,
1744m, 1710s, 1633w, 1475m, 1456w, 1389w, 1356w, 1300w, 1244m, 1194m, 96lw,
756w,
(s,
2
700w.
:H-NMR (400 MHz, (CD3)2SO): 1.43 (s, 6 H, C(4a)CH3, C(8a)CH3); 3.74
H, C(4b)H, C(8b)H); 3.84 (d, /= 17.6, 2 H, N(1)C//H, N(8)C/m); 4.48 (d, J
17.6, 2 H, N(l)C/m, N(8)C/ffl); 5.14 (d, J
H, CH2-Bn); 7.38 (s,
10 H,
C(ar)H);
=
10.57
174
12.4, 2 H, CH2-Bn); 5.19 (d, J
(s,
2
H, NH).
=
=
12.4, 2
13C-NMR (100 MHz,
6.
(CD3)2SO): 20.82; 47.56; 47.87; 61.49; 66.13;
127.89
Experimenteller Teil
128.34
(2C); 128.07;
(2C);
135.57; 151.01; 168.58; 170.71. FAB-MS: 549 (100, [M+Hf); 491 (8); 338 (45). Anal,
ber. für
C28H28N408 (548.56):
C
61.31,
H
5.14, N 10.21; gef.: C 61.03, H 5.24, N
10.34.
60
cis-4a-txaxisoid-4a, 4b-cis-4b-Dodecahydro-4a, 8a-dimethyl-2,4,6,8-tetraoxo-cyclobuta
[l,2-d:3,4-d] dipyrimidin-l,5-diessigsäure-dibenzylester (60). Ausbeute:
Rf (CHCL/MeOH 10:1)
0.73.
Smp.:
242-244 °C.
IR
200 mg
(35%).
(KBr): 3429m, 3233m, 3067w,
1744m, 1711s, 1683s, 1473m, 1389m, 1356w, 1283m, 1256w, 1224m, 982w, 756w,
135w.
=
!H-NMR (400 MHz, (CD3)2SO): 1.25 (s, 6 H,
17.5, 2 H, N(1)C//H, N(8)C#H); 3.95 (s,
2
C(4a)CH3, C(8a)CH3);
H, C(4b)H, C(8b)H); 4.44 (d, J
H, N(1)C#H, N(8)CF/H); 5.13 (d, J= 12.4, 2 H, CH2-Bn); 5.18 (d, J
CH2-Bn);
7.37
(s,
10
3.61
=
=
(d,
J
17.5, 2
12.4, 2 H,
H, C(ar)H); 10.78 (s, 2 H, NH). 13C-NMR (100 MHz, (CD3)2SO):
17.91; 44.67; 47.13; 61.38; 66.26; 127.91 (2C); 128.09; 128.34 (2C); 135.50; 151.46;
168.02; 172.63.
FAB-MS: 549
C28H28N4Og (548.56):
C
(10, [M+H]+); 491 (10); 338 (28).
Anal. ber.
61.31, H 5.14, N 10.21; gef.: C 61.28, H 5.32, N 10.16.
175
für
6.
Experimenteller Teil
O
O
o
o
cis-4a-cisoid-4a, 4b-cis-4b-Dodecahydro-4a, 4b-dimethyl-2,4,5,7-tetraoxo-cyclobuta
[l,2-d:4,3-d'] dipyrimidin-l,8-diessigsäure (52).
wurde in HOAc
die
Reaktionsgemisch
Filtrate wurden in
vereinigten
wurde das Produkt 52
Aceton
Das
und anschliessend durch Celite filtriert.
gewaschen,
gewaschen
gefällt.
und in
Pulver
(168 mg, 100%)
Smp.:
229-231 "C.
vacuo
getrocknet.
(s,
2
eingeengt.
IR
von
Et20
abfiltriert, mit wenig
wurde als weisses
(KBr): 3600-2800m, 3433w, 3222w, 3067h>, 1703s, 1486s,
=
NH); 12.5-13.5 (s,br, 2 H, COOH).
152.12;
wurde
Zugabe
erhalten.
H, C(8a)H, C(8b)H); 4.16 (d, J
59.22;
Durch
Die Dicarbonsäure 52
(s, 6 H, C(4a)CH3, C(4b)CH3); 3.65 (d, J= 17.3,
47.07;
H2-Atmosphäre
Der Rückstand wurde mit heisser HOAc
gefällte Niederschlag
Der
vacuo
wurde 2 h in einer
1396m, 1290m, 1219m, 1194m, 800w, 112w, 156w.
1.34
(250 mg, 0.456 mmol)
(20 ml) gelöst und Pd/C(10%)-Katalysator (10 mg), suspendiert in HOAc
(1 ml), wurden zugegeben.
gerührt
Der Diester 57
170.00;
!H-NMR (400 MHz, (CD3)2SO):
2
H, N(l)Gr7H, N(8)C#H); 3.94
17.3, 2 H, N(1)C#H, N(8)C//H); 10.41 (s, 2 H,
13C-NMR (100 MHz, (CD3)2SO): 18.23; 46.19;
170.51.
FAB-MS:
369
(64,
[M+H]+);
338
(100).
C14H16N408 (386.31).
53
cis-4a-txaxisoid-4a,4b-cis-4b-Dodecahydro-4a,4b-dimethyl-2,4,5,7-tetraoxo-cyclobuta
[l,2-d:4,3-d'] dipyrimidin-l,8-diessigsäure (53).
wurde in HOAc
(20 ml) gelöst
(1 ml), wurden zugegeben.
gerührt
und
Das
Der Diester 58
(300 mg, 0.547 mmol)
Pd/C(10%)-Katalysator (10 mg), suspendiert
Reaktionsgemisch
und anschliessend durch Celite filtriert.
176
wurde 2 h in einer
in HOAc
H2-Atmosphäre
Der Rückstand wurde mit heisser HOAc
6. Experimenteller Teil
gewaschen,
die
vereinigten
wurde das Produkt 53
gewaschen
Aceton
(185
Smp.:
243-245 °C.
mg,
ausgefällt.
und in
Pulver
Filtrate wurden in
vacuo
Der
vacuo
eingeengt.
gefäUte Niederschlag
Durch
E^O
von
wurde abfiltriert, mit
Die Dicarbonsäure 53
getrocknet.
Zugabe
wenig
wurde als weisses
92%) erhalten.
(KBr): 3600-2800m, 3400w, 323lw, 3067w, 2867w, 1761m,
IR
1693s, 1483s, 1385m, 1302m, 1239m, 1160m, 883w, 822>v, 759w.
(400
TL-NMR
MHz, (CD3)2SO): 1.27 (s, 6 H, C(4a)CH3, C(4b)CH3); 3.89 (s, 2 H, C(8a)H, C(8b)H);
3.97
(d,
J
17.6,
=
N(8)C#H);
10.55
2
H, N(1)C#H, N(8)CÄH); 4.04 (d, J
2
(s,
=
17.6, 2 H, N(l)CflH,
H, NH); 11-13 (s,br, 2 H, COOH).
"C-NMR (100 MHz,
(CD3)2SO): 21.02; 45.60; 48.40; 63.69; 151.24; 170.63;
[M+H]+);
338
(100);
273
(24);
165
(398.33): C 45.23, H 4.55, N 14.07; gef.:
6.3.2
Anal. ber.
(30).
C
170.76.
für
FAB-MS: 369
(20,
C14H16N4O8-0.5CH3COOH
44.94, H 4.87, N 14.05.
der Flavinbausteine:
Synthese
N02
65
N-(2-Methoxyethyl)-4,5-dimethyl-2-nitro-anilin (65).
[342]
und
l-Bromo-2-methoxyethan (64)
4,5-dimethyl-2-nitro-V-(trifluoroacetyl)-anilin
Literaturvorschrift
hergestellt.
Eine
Lösung
von
(63)
12.0 g, 86.3
vereinigt,
braunen
ergab
über
und dreimal mit
MgS04 getrocknet,
Öl,
extrahiert.
filtriert und in
Rohproduktes (Kieselgel-6'0,
ein rotbraunes
H20
das bei -4 °C
d
=
zu
vacuo
6 cm, /
=
vacuo
Die
nach
K2C03 (16.0
Dann wurden l-Bromo-2-
mmol) vorsichtig zugegeben.
wurde 90 min unter Rückfluss erhitzt. Danach wurde in
CHC13 aufgenommen
wurden
63 (8.00 g, 30.5 mmol) und
g, 116 mmol) in DMF (100 mL) wurde auf 100 °C erhitzt.
methoxyethan (64,
[341]
Die
Reaktionsmischung
eingeengt,
organischen
der Rückstand in
Phasen wurden
eingeengt. Chromatographie
10 cm, Toluol—>Toluol/EtOAc
einem orangenen Feststoff
(65, 6.12
g,
des
10:1)
89%)
kristallisierte.
Rf (Toluol/EtOAc 20:1)
0.48.
Smp.:
33-35 °C.
IR
(CHC13) 3378w,
301
lw, 2922w,
1632s, 1574s, 1507s, 1409m, 1336m, 1241s, 1156m, 1121m, 1022w, 1006w, 850w.
XH-NMR (200 MHz, CDC13): 2.18 (s, 3 H, C(4)CH3); 2.27 (s, 3 H, C(5)CH3); 3.43 (s, 3
H,
OCH3);
3.49
(t,
J
=
5.4,
2
H, NHCH2C#2); 3.67 (t, J
H, C(3)H); 7.93 (s, 1 H, C(6)H); 8.10 (m, 1 H, NH).
177
=
5.4,
2
H, NHCH2); 6.64 (s,
1
13C-NMR (50 MHz, CDC13):
6.
Experimenteller
Teil
18.73; 20.91; 43.01; 59.31; 70.84; 114.38; 114.43; 124.86; 126.88; 144.40; 147.53.
MS: 224 (20,
[M-H]+);
179
106
(100);
(15); 28 (6). CnH17N203 (225.27).
b
o
10-(2-Methoxyethyl)-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin-2,4-(3H,l0H)-dion (67).
HOAc
(50 ml) gelösten Nitroanilin
Aktivkohle
(50 mg)
Reaktionsgemisch
filtriert.
als
wurde unter
Zu dem im Filtrat
H2
in HOAc
243
H20
und
ges.
filtriert und in
suspendiert
und abfiltriert. Umkristallisation des
rotgelbes
vacuo
eingeengt.
Pulver (1.79 g,
Rf (CHCL/MeOH 10:1)0.29. Smp.:
H,
(s,
3
H,
C(7)CH3);
N(10)CH2C#2);
C(6)H);
8.62
(br.s,
2.55
4.91
1 H,
(t,
J
Der
mit
CHC13
extrahiert.
Die
Na2C03 gewaschen,
5.2,
goldbraune
N(3)H).
vereinigten
MgS04
Rückstand wurde in
Rohproduktes
aus
H20
HOAc/H20 ergab
das
46%).
279-281 °C.
2
7.00 g,
über
IR
(CHC13): 3378w, 3010w, 1717m,
JH-NMR (200 MHz, CDC13):
(s, 3 H, C(8)CH3); 3.30 (s, 3 H, OCH3); 3.92 (t,
=
Das
Danach wurde durch Celite
AUoxanmonohydrat (61,
1677m, 1600w, 1581m, 1547s, 1344w, 1261w, llllw.
2.45
wurde 10% Palladium auf
mmol) gegeben und 3 h bei RT gerührt.
getrocknet,
Flavin 67 als
gerührt.
Diamin 66 wurden
g,
Zu dem in
ml) tropfenweise gegeben.
(1
Reaktionsgemisch dreimal
Pèhasen wurden mit
organischen
mmol)
13.3
15 h bei RT
gelösten
43.7 mmol) und Borsäure (15.0
Anschliessend wurde das
63 (3.00 g,
Suspension
EI-
H,
N(10)CH2);
7.69
(s,
1
J
=
5.2, 2
H, C(9)H); 8.04 (s, 1 H,
13C-NMR (50 MHz, CDC13): 18.37; 20.28; 43.50;
58.06; 67.83; 116.29; 130.38; 130.98; 133.25; 135.35; 136.70; 145.86; 149.83; 155.12;
159.48.
EI-MS: 300
(3, M+); 242 (100); 171 (80); 156 (28); 44 (34).
C15H16N4O30.5H2O (309.32):
C 58.25, H 5.50, N 18.12;
18.03.
178
gef:
C
Anal. ber. für
58.77,
H
5.42, N
6.
Experimenteller Teil
68
3-Ethyl-10-(2-methoxyethyl)-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin-2,4-(3H, lOH)-dion
Das Flavin 67 (1.09 g, 3.63 mmol) wurde in DMF (50 ml)
21.7
mmol)
versetzt.
11 h bei RT
Nach 5 min wurde
Anschliessend wurde die
gerührt.
verdünnt und dreimal mit
getrocknet,
Ethyliodid (2.50
filtriert
H20
und
Die
extrahiert.
in
Das resultierende
g,
Öl kristallisierte
aus
und mit
g, 16.0
organische
d
=
MeOH/H20
mit
3 cm, /
=
und
MgS04
Rohprodukt
15 cm,
rotgelben
g,
CHC13 (200 ml)
Phase wurde über
Das
zu
K2C03 (3.00
mmol) zugegeben
Reaktionslösung
eingeengt.
vacuo
säulenchromatographisch gereinigt (Kieselgel-60,
1:1).
gelöst
(68).
wurde
Aceton/CH2Cl2
Plättchen
(68, 0.990
83%).
Rf (CHCL/MeOH 10:1)0.60. Smp.:
204-205 °C.
IR
(CHC13): 3000w, 1706>v, 1651m,
1583m, 1548s, 1439w, 1339w, 1117w. 'H-NMR (200 MHz, CDC13): 1.31 (t, J
=
7.1, 3
H, N(3)CH2C#3); 2.43 (s, 3 H, C(7)CH3); 2.53 (s, 3 H, C(8)CH3); 3.29 (s, 3 H, OCH3);
3.91 (t, J
5.3,
2
=
5.3,
2
H, N(10)CH2C//2); 4.17 (q, J
=
7.1, 2 H, N(3)C//2CH3); 4.88 (t, J
H, N(10)CH2); 7.65 (s, 1 H, C(9)H); 8.02 (s, 1 H, C(6)H).
=
13C-NMR (50 MFIz,
CDC13): 12.78; 19.18; 21.25; 36.87; 44.94; 58.93; 69.22; 116.28; 131.85; 131.92;
134.63; 135.39; 136.20; 147.03; 148.40; 155.17; 159.41.
(100);
242
62.18,
H
(23);
199
(32); 171 (22);
44
6.14, N 17.06; gef: C 62.23,
(16).
H
6.13,
EI-MS: 328
Anal. ber. für
(4, M+)\
270
C17H20N4O3 (328.37):
C
N 17.05.
OH
oçc
•
3-Ethyl-10-(2-hydroxyethyl)-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin-2,4~(3H,l0H)-dion
Das Isoalloxazin 68
abgekühlt.
(0.980
g, 2.71
Dann wurde unter
N2
mmol)
wurde in
CH2C12 (50 ml) gelöst
Bortribromid (3.5 ml, 36.3 mmol)
179
(69).
und auf 0 °C
zugegeben.
Nach 4.5
6.
Experimenteller
Ted
h Rühren bei 0 °C wurden
H20 (2.5 ml)
und Aceton
(5 ml) tropfenweise hinzugefügt.
Anschliessend wurde vorsichtig weiter Aceton (300 ml) und
die rötliche
Lösung
°C
die nach 24 h
gekühlt,
bis auf die
ausgefallenen
Das Flavin 69 wurde in Form
Smp.: 205-208 °C.
IR
Wasserphase
gelber
in
vacuo
H20 (200 ml) zugegeben
eingeengt.
Kristalle abfiltriert und
Nadeln
(0.690
81%)
g,
Die
aus
Lösung
CHC13
und
wurde auf -4
umkristallisiert.
erhalten.
(CHC13): 3689w, 3011s, 1706w>, 1650m, 1583m, 1548s, 1461w,
'H-NMR (200 MHz, CDC13): 1.27 (t, J= 7.1, 3
1439w, 1339w, 1133m, 928w, 622m.
H, N(3)CH2C#3); 2.44 (s, 3 H, C(7)CH3); 2.54 (s, 3 H, C(8)CH3); 3.00 (t, J= 5.5, 1
H); 4.09 (q, J
=
=
7.1, 2 H, N(3)C#2CH3); 4.21 (t, J
5.5,
=
2
H, N(10)CH2C#2); 4.92 (t, J
5.5, 2 H, N(10)CH2); 7.64 (s, 1 H, C(9)H); 8.02 (s, 1 H, C(6)H).
MHz, CDC13):
13.20;
19.67; 21.76; 37.37; 47.39; 60.18;
116.28;
13C-NMR (50
132.05;
132.78;
135.43; 137.08; 137.30; 148.27; 149.45; 155.72; 159.84. EI-MS: 314 (1, M+); 298 (13);
270
(43);
199
(40);
171
C 57.77, H 6.02, N
(25);
77
16.85; gef:
44
(27);
C
(100).
Anal. ber. für
57.80, H 5.62, N 16.63.
l\J
IP
6
mmol) und
ein
Uberschuss
an
Das
verfestigte
gespült,
gehalten.
4,5-Dimethyl-2-nitroanilin (62,
N-(2-Bromoethyl)-phtalimid (71,
mmol) wurden in einer Reibschale vermischt
Gemisch 5 h bei 175 °C
72
\
H
4,5-Dimethyl-2-nitro-N-(2-phthaloylethyl)-anilin (72).
3.00 g, 18.1
C16H18N403H20 (332.34):
und
pulverisiert.
8.00 g, 31.5
Daraufhin wurde
Anschliessend wurde die Schmelze auf RT
Material wurde mit kochendem EtOH (200 ml)
aus
Lösung
zweimal
EtOH umkristallisiert und lieferte 72
aus
wurde über Nacht bei -4 °C
gehalten.
(1.44
Das braune
gelöst.
Präzipitat
24%) in Form
g,
abgekühlt.
dem Reaktionskolben
10 min unter Rückfluss erhitzt und weitere 30 min im Ultraschallbad
resultierende
das
von
Die
wurde
braunen
Nadeln.
Rf (Toluol/EtOAc 10:1)
0.41.
Smp.:
213-215 °C.
IR
(CHC13): 3378w>, 1772w, 1717s,
1633w, 1572m, 1506m, 1394m, 1339w, 1122m, 1106m.
2.16 (s, 3 H,
4.01
(t, J
=
C(4)CH3);
2.28
(s, 3 H, C(5)CH3); 3.63 (q,
TL-NMR
J=
(300 MHz, CDC13):
6.3, 2 H, NHCH2C#2);
6.3, 2 H, NHCH2); 6.80 (s, 1 H, C(3)H); 7.74 (m, 2 H, C(ar)H); 7.87 (m,
H, C(ar)H); 7.92 (s, 1 H, C(6)H); 8.10 (q, J
CDC13): 18.72; 20.91; 36.82; 41.55; 114.36;
=
6.3,
123.83
132.26; 134.55 (2C); 143.86; 147.73; 168.65 (2C).
180
1
H, NH).
2
13C-NMR (75 MHz,
(2C); 125.37; 126.94; 130.75 (2C);
EI-MS: 339 (13,
M+);
304
(8); 179
6.
(100); 160 (28);
(357.36):
147
(11); 133 (10); 104 (16); 77 (21).
C 60.50, H 5.36, N 11.76;
gef:
60.47,
C
H
Experimenteller Teil
Anal. ber. für
C18H17N304-H20
4.91, N 11.75.
R
VVr-V
74
o
7,8-Dimethyl-10-(2-phthaloylethyl)-benzo[G]pteridin-2,4-(3H, 10H)-dion
Nitroanilin 72
Suspension
Die
aus
10% Palladium auf Aktivkohle
Diamin 73 wurden
Reaktionslösung
Reaktionsgemisch
organischen
mit
Phasen
H20
getrocknet,
filtriert und in
Zugabe
Ether
EtOH
von
ergab
und 16 h bei RT
400 mg, 2.50
gerührt.
verdünnt und dreimal mit
wurden
mit
vacuo
H20
und
eingeengt.
CHC13
das Flavin 74 als
0.43.
extrahiert.
4.91
(t,
C(9)H); 7.88 (s,
1 H,
C(6)H);
242
Die
Das resultierende
gelbe Öl
gelbes
Pulver
Smp.:
(115
mg,
vereinigten
über
MgS04
wurde durch
298-300 °C.
J
=
aus
47%).
IR
(CHC13) 3378w, 1772w, 1717s,
'H-NMR (300 MHz,
(s, 3 H, C(7)CH3); 2.40 (s, 3 H, C(8)CH3); 4.03 (t, J
N(10)CH2C#2);
(4); 371 (7);
mmol) und Borsäure
Anschliessend wurde das
1633w, 1583m, 1550s, 1394m, 1244m, 1167w, 989m, 894m.
2.34
Zu dem im Filtrat
Na2C03 gewaschen,
ges.
stark
(200 ml) gefällt und abfiltriert. Umkristallisation des Rohproduktes
Rf (CHCL/MeOH 10:1)
(CD3)2SO):
H2-Atmosphäre
durch Celite filtriert.
Alloxanmonohydrat (61,
(800 mg, 12.96 mmol) gegeben
Eine
(15 mg) in HOAc (1 ml) wurde zugegeben.
wurde während 30 h bei 50 °C in einer
Danach wurde die
gelösten
Das
(200 mg, 0.589 mmol) wurde bei 50 °C in HOAc (20 ml) gelöst.
Reaktionsmischung
gerührt.
(74).
=
6.0, 2 H,
6.0, 2 H, N(10)CH2); 7.79 (m, 4 H, C(ar)H); 7.82 (s, 1 H,
11.26 (s, 1 H,
(4); 174 (5); 107 (12).
N(3)H).
FAB-MS: 416
Anal. ber. für
58.53, H 4.69, N 15.51; gef: C 58.70, H 4.39, N 15.59.
181
(100, [M+H]+); 391
C22H17N504-2H20 (451.44):
C
6.
Experimenteller Teil
R
yyVV
T
T
n
i
75
O
3-Ethyl-7,8-dimethyl-10-(2-phthaloylethyl)-benzo[G]pteridin-2,4-(3H, lOHfdion
Zu einer
mmol) in
Suspension
DMF
CHC13 (200 ml)
%)
Danach wurde mit
gerührt.
extrahiert.
filtriert und in
gereinigt (Kieselgel-#,
mg, 86
(240 mg, 0.578 mmol)
und trockenem
K2CO3 (800 mg, 5.79
(20 ml) wurde Ethyliodid (0.75 ml, 9.28 mmol) gegeben.
wurde 24 h bei RT
getrocknet,
74
aus
wurde als
d
vacuo
=
gelbes
Rf (CHCL/MeOH 10:1)
Die
vereinigten organischen
eingeengt.
3 cm, /
=
Das
20 cm,
Smp.:
verdünnt und dreimal mit
Phasen wurden über
Rohprodukt
wurde
CHCl3/MeOH 12:1).
254-256 °C.
1589m, 1549s, 1439w, 1394m, 1333w.
7.75
MgS04
chromatographisch
Das Flavin 75
2.33
IR
(220
(CHC13): 1772w, 1716s, 1656m,
XH-NMR (300 MHz, (CD3)2SO): 0.95 (t, J
(s, 3 H, C(7)CH3); 2.39 (s, 3 H, C(8)CH3); 3.75 (q,
6.9, 2 H, N(3)C#2CH3); 4.00 (t, /= 5.6, 2 H, N(10)CH2C#2); 4.93 (t, J
N(10)CH2);
Das Gemisch
Pulver erhalten.
0.68.
6.9, 3 H, N(3)CH2C//3);
H20 (100 ml)
(75).
(m, 4 H, C(ar)H); 7.84 (s,
1
=
5.6,
H, C(9)H); 7.91 (s, 1 H, C(6)H).
=
I=
2
H,
13C-
NMR(75MHz, (CD3)2SO): 12.70, 18.60, 20.54, 34.66, 35.71, 41.87, 115.86, 123.13
(2C), 130.78, 131.38, 131.47 (2C), 134.24, 134.49 (2C), 136.08 (2C), 147.03, 149.28,
154.11,
158.96,
167.98
C24H21N504H20 (461.48):
(2C).
C
FAB-MS:
444
(100,
[M+Hf).
Anal.
ber.
für
62.47, H 5.02, N 15.18; gef: C 62.59, H 4.69, N 15.12.
182
6.
NH2
Experimenteller Teil
-HCl
10-(2-Aminoethyl)-3-ethyl-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin-2,4-(3H, 10H)-dion (70).
Suspension
aus
erhitzt. Das
filtriert.
mg, 92
(455 mg, 1.03 mmol) in konz. HCl (30 ml) wurde
Reaktionsgemisch wurde
Zweimaliges
in
vacuo
Waschen mit Aceton
eingeengt,
ergab
mit MeOH
als Rückstand das
4 h unter Rückfluss
(20 ml)
gelbe
versetzt und
Pulver 70
(330
%).
Smp.: 286-288
1250s, 1193m,
(CD3)2SO):
C(8)CH3);
=
75
Eine
°C.
IR
1022w, 929w,
1.16 (t,J=
3.20
(CHC13): 3444m, 1713s, 1615s, 1580s, 1542s, 1458m, 1343m,
2
(m,
6.9,
3
H,
'H-NMR (300 MHz,
878w, 806w, 113w, 443w.
N(3)CH2C//3);
2.42
H, N(10)CH2Cr72); 3.94 (q, J
=
(s, 3 H, C(7)CH3); 2.50 (s,
6.9, 2 H,
N(3)Gr72CH3);
4.91
3
H,
(t,
J
6.0, 2 H, N(10)CH2); 7.98 (s, 1 H, C(9)H); 8.05 (s, 1 H, C(6)H); 8.17 (m, 3 H, NH2).
13C-NMR (75 MHz, (CD3)2SO): 12.82; 18.63; 20.41; 35.93; 35.99; 41.11;
116.05;
130.68; 131.28; 134.30; 136.20; 136.46; 147.31; 149.63; 154.68; 159.25. FAB-MS: 314
(100, [M-Cl]+);
271
232
(15);
(7). C16H20N5O2Cl (349.82).
HpN'^'V^V
N-text-Butyloxycarbonyl-ethylendiamin (90) [454].
(92, 25.0
Lösung
ml)
g, 0.42
aus
bei
in 1,4-Dioxan
RT
zugegeben.
vacuo
Nach
der
eingeengt.
Die
Zu einer
wurde
Lösung
Reinigung
gerührt.
von
tropfenweise
30 g, 0.14
vollständigen Zugabe
bei RT für weitere 20 h
Wasserstrahlvakuum ohne
90
(150 ml)
terf-Butyloxycarbonylanhydrid (Boc20,
Reaktionsmischung
Filtrat in
mol)
90
Ethylendiamin
während 2 h eine
mol) in 1,4-Dioxan (100
von
Boc20
wurde
die
Anschliessend wurde filtriert und das
des Produktes 90 wurde durch Destillation im
Vigreuxkolonne (105°C,
20
Torr) durchgeführt.
Das Diamin
(13 g, 62%) wurde als farbloses, zähes Öl erhalten und ohne weitere Reinigung in die
nächste Stufe
C(CH3)3);
eingesetzt. XH-NMR (300 MHz, CDC13):
2.72
(t,
J
=
6.0, 2 H, CH2); 3.10 (m,
C7H16N202 (160.22).
183
2
1.19
(s,
2
H, NH2); 1.38 (s, 9 H,
H, CH2); 5.20 (br.s., 1 H, NH).
6.
Experimenteller Teil
3
N02
91
5ylN02
D
4,5-Dimethyl-l,2-dinitrobenzol (91).
Eiswasser
zum
62
(400 ml) suspendiert. Kaliumpersulfat (30 g)
Erhalt einer klaren
Umsatz
zeigte.
und
vacuo
Das
bei
Zwischenprodukt
7
Lösung (2 h) gerührt.
Es wurde 30 h bei RT
gegeben.
in
°C
Eisessig (150 ml)
Es wurde eine
verdünnt und auf RT
wurde 91
Smp.:
abgekühlt.
50%) abfiltriert
aus
und in
aus
g,
wurde in konz.
Lösung
über
zu
mmol) wurde in
H2S04 (30 ml)
der
Suspension
bis
von
vollständigen
der Reaktion wurde abfiltriert
Anschliessend
Dann wurde
H2O2 (30%,
100
wurde
ml) in Eisessig (50 ml)
bildete.
Anschliessend wurde mit Eiswasser
Diese
(300ml)
verfestigte Reaktionsprodukt
P205 getrocknet.
das
Salpetersäure (65%,
orangefarbene Lösung
Nach 24 h wurde das
vacuo
wurde
quant.).
gelöst.
bis sich eine klare
gerührt.
g, 58.3
bis die DC-Kontrolle einen
bei 100 °C
Lösung
wurde weitere 2 h bei 100°C
g,
gerührt,
getrocknet (11.4
solange tropfenweise zugegeben,
(5.94
Diese
(10
hellorange Nitroso-Zwischenprodukt
50
in
ml) zugegeben.
Lösung
Das Nitroanilin 62
Für die
91
Elementaranalyse
Ethanol umkristallisiert.
111-112 °C
(Lit: 118 °C [383]).
IR
(KBr): 3100, 3044, 2922, 2367, 1761, 1583,
1551, 1528, 1483, 1444, 1379, 1338, 1256, 1237, 1146, 1024, 1002, 894, 883, 859,
807, 751, 660, 584, 548, 417.
C(5)CH3),
(196.16):
7.70
(s,
2
!H-NMR (200 MHz, CDCL): 2.44 (s, 6 H, C(4)CH3,
H, C(3)H, C(6)H); EI-MS: 196 (M\ 75).
C 48.93, H 4.11, N
Anal. ber. für
C8H8N204
14.28; gef: C 48.89, H 3.90, N 14.37.
,N02
93
N-(text-Butyloxycarbonylaminoethyl)-4,5-dimethyl-2-nitro-anilin (93).
geschützte Ethylendiamin
wurde eine
Lösung
aus
90 (6.3 g, 39.3 mmol) wurde in
l,2-Dinitro-4,5-dimethylbenzol
Die
anschliessend in
Der Rückstand wurde
eingeengt.
Reaktionsmischung
93 wurde in Form roter Nadeln erhalten (5.3 g,
184
67%).
mono-Boc
Pyridin (1.5 ml) gelöst.
Es
91 (5 g, 25.5 mmol) in Pyridin
(50 ml) tropfenweise zugegeben.
vacuo
Das
wurde 24 h bei 90 °C
aus
Isopropanol
gerührt,
umkristallisiert.
6.
R{ (Toluol/EtOAc 10:1)
0.33.
120-122 °C.
Smp.
Experimenteller Teil
(KBr): 3378m, 3356m, 2978w,
IR
2933w, 1683s, 1639m, 1572m, 1528s, 1511m, 1461w, 1400w, 1367w, 1344w, 1311w,
1294iv, 1289w, 1250w, 1222m, 1194s, 1172m, 1150s, 1033w, lOOOw, 861w.
NMR (400 MHz,
C(5)CH3);
3.19
6.93 (s, 1 H,
8.09
(t,
J=
1.37 (s, 9 H,
CDC13):
(q,
J
=
C(3)H);
6.0,
7.01
2
(t,
C(CH3)3);
2.14
(s,
H, C(1)NHCH2C#2); 3.38 (m, /
J
C(4)CH3);
3 H,
=
2.25 (s, 3 H,
5.8, 2 H, C(1)NHCH2);
5.3, 1 H, C(1)NHCH2CH2NZ7); 7.82 (s, 1 H, C(6)H);
=
5.8, 1 H, C(l)NH). 13C-NMR (100 MHz, CDC13): 17.94; 20.08; 28.08 (3C);
38.82; 42.23; 77.70; 114.48; 124.01; 125.35; 128.86; 143.81; 147.31; 155.86.
309 (3,
N
[H-
M+), 179 (100),
57
(47).
Anal. ber. für
C15H23N304 (309.37):
C
EI-MS:
58.24, H 7.49,
13.58; gef: C 58.35, H 7.52, N 13.52.
95
lO-(text-Butyloxycarbonylaminoethyl)- 7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin-2,4-(3H, 10H)-dion
(95).
Eine
langsam zu
gegeben.
Suspension
einer
Das
aus
Lösung
Pd/C(10%)-Katalysator (100 mg)
der
Nitroverbindung
Reaktionsgemisch
mmol)
und Borsäure
(14
wurde 7 h bei RT unter
Anschliessend wurde mit
extrahiert.
Die
g, 230
organischen
Das Isoalloxazin 95 wurde
Phase wurde mit
(3.02 g, 80%) in
Form
orangefarbener
Rf (CHCl3/MeOH 10:1)0.46. Smp.:
1712m,
1683m,
1581m, 1548s,
1272w, 1164m, 867w.
2
Dann wurde durch
wurde 12 h bei RT
und dreimal mit
aus
(150 ml)
in MeOH
und in
d
=
EtOH und
8 g,
gerührt.
H20 (250 ml)
vacuo
eingeengt.
3 cm, /
=
15 cm,
1,4-Dioxan lieferte
Nadeln.
212-214 °C.
1506m,
IR
1458w,
(CHC13): 3456w, 3378w, 3007w,
1394w,
!H-NMR (400 MHz, (CD3)2SO):
(s, 3 H, C(7)CH3); 2.49 (s, 3 H, C(8)CH3); 3.41 (q,
(t,J= 6.0,
es
MgS04 getrocknet
Umkristallisation
wurde
AUoxanmonohydrat (61,
säulenchromatographisch (Kieselgel-i/,
CHCl3/MeOH 15:1-»10:L) gereinigt.
95
verdünnt
mmol)
H2 gerührt.
mmol) zugegeben und
CHC13 (500 ml)
Essigsäure (10 ml)
93 (3.0 g, 9.70
Celite filtriert. Dem im Filtrat befindlichen Diamin 94 wurde
50
in
J=
1368w,
1.23
(s,
9
1344w,
1294w,
H, C(CH3)3); 2.40
6.0, 2 H, N(10)CH2Cr72); 4.64
H, N(10)CH2); 6.96 (t,J= 6.0, 1 H, C(10)NHCH2CH2N#); 7.83 (s, 1 H,
185
6.
Experimenteller Teil
13C-NMR (100 MHz, (CD3)2SO)
C(9)H); 7.89 (s, 1 H, C(6)H); 8.31 (s, 1 H, N(3)H).
18.67; 20.75; 27.94 (3C); 36.82; 44.13; 79.13; 116.17; 130.91; 131.44; 133.85; 135.62
136.82; 146.26; 150.35; 155.46; 155.76; 159.86. EI-MS: 385 (1,M+); 312 (10); 256 (9)
243
84
(100);
(28); 49 (31). Anal. ber. für C19H23N504 (385.42):
59.21, H 6.01, N
C
18.17; gef: C 59.35, H 6.12, N 18.29.
10-(text-Butyloxycarbonylaminoethyl)-3-ethyl-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin-2,4(3H,10H)-dion (96).
Ethyliodid (1.0 ml,
Suspension
des Flavinderivats 95
1.83
in über Molsieb
mmol)
RT
gerührt.
mit
H20 (80 ml) gewaschen.
und in
vacuo
eingeengt.
3 cm, /
=
Form
gelber Nadeln (380
18 cm,
Rf (CHCl3/MeOH 20:1)
DMF
Reaktionsgemisch
mit
Die
organische
(50 ml) gegeben.
CHC13 (200 ml)
Phase wurde über
CHCl3/MeOH 20:1)
mg,
0.41.
zu
einer
mmol) und trockenem Cs2C03 (0.6 g,
Das Produkt 96 wurde nach
H, d
=
mg, 1.30
mmol) wurde tropfenweise
À) getrocknetes
(4
Dann wurde das
(500
12.37
Es wurde 3 h bei
verdünnt und dreimal
MgS04 gtrocknet,
filtriert
Säulenchromatographie (Kieselgel-
undUmkristaUisation
aus
MeOH/H20
in
71%) erhalten.
227-229 °C.
Smp.:
IR
(KBr): 3398w, 2977w>, 2933w,
1706m, 1693m, 1644s, 1583s, 1545s, U41w, 1433w, 1367w, 1337m, 1311w, 1294w,
1H-
1272w, 1250w, 1230m, 1200w, 1176m, 1017w, 994w, 933w, 889w, 806w, 712w.
NMR
(400 MHz, (CD3)2SO): 1.16 (t, J
C(CH3)3);
2.40
N(10)CH2C#2);
6.98 (t, J
=
(s,
3
3.93
C(7)CH3);
H,
(t,
J
=
7.0,
2
2.50
=
(s,
7.0, 3 H, N(3)CH2C#3); 1.22 (s, 9 H,
3
H,
C(8)CH3);
H, N(3)CH2CH3); 4.66 (t, J
3.41
=
(q,
5.7,
2
J
=
5.7,
2
H,
H, N(10)CH2);
5.7, 1 H, C(10)NHCH2CH2Nr7); 7.86 (s, 1 H, C(9)H); 7.93 (s,
1
H,
13C-NMR (100 MHz, (CD3)2SO): 12.83; 18.63; 20.71; 27.86 (3C); 35.82;
C(6)H).
36.90; 43.95; 77.75; 116.10; 130.87; 131.33; 134.10; 135.69; 135.86; 146.40; 148.87;
154.40; 155.69; 159.09. FAB-MS: 414 (100, [M+H]+); 358 (6); 340 (8); 271 (36). Anal,
ber. für
C21H27N504-2/3H20 (419.49):
C
59.28, H 6.71, N 16.46; gef: C 59.21, H 6.65,
N 16.29.
186
6.
Experimenteller
Teil
97
10-(text-Butyloxycarbonylaminoethyl)-7,8-dimethyl-3-pentyl-benzo[G]pteridin-2,4(3H,lOH)-dion (91). 1-Bromopentan (588
zu
einer
(0.6
des Flavinderivats 95
Suspension
g, 1.83
h bei RT
mmol)
gerührt.
dreimal mit
Dann wurde das
vacuo
d
(Kieselgel-i/,
eingeengt.
3
-
in Form
cm,
gelber
Rf (CHCL/MeOH 20:1)
/
Nadeln
0.46.
(500 mg, 1.30 mmol)
À) getrocknetes
Reaktionsgemisch
mit
Die
organische
Das Produkt 97
18
=
mmol, 0.48 ml) wurde tropfenweise
DMF
(4
H20 (80 ml) gewaschen.
filtriert und in
MeOH/H20
in über Molsieb
mg, 3.89
cm,
Smp.:
(50 ml) gegeben.
CHC13 (200 ml)
Phase wurde über
wurde nach
CHCl3/MeOH 20:1)
(140 mg, 24%)
und trockenem
Cs2C03
Es wurde 3
verdünnt und
MgS04 gtrocknet,
Säulenchromatographie
undUmkristaUisation
aus
erhalten.
228-230 °C.
IR
(KBr): 3329w, 293lw, 2867w,
1706m, 1691m, 1644s, 1583s, 1547s, 1450m, 1433m, 1366m, 1336m, 1289m, 1230m,
1206m, 1175m, I012w, 1015w, 885>v, 807w. 'H-NMR (400 MHz, (CD3)2SO): 0.88 (t,
J
=
6.7,
3
H,
N(3)(CH2)4C#3);
N(3)(CH2)2(Ci72)2CH3);
C(7)CH3);
2.50
1.58
(m,
2
1.22
H,
(s,
9
H,
C(CH3)3);
1.32
N(3)CH2C#2(CH2)2CH3);
(s, 3 H, C(8)CH3); 3.41 (q, J= 5.9,
2
7.85
(s,
1
4
H,
(s,
3
H,
2.41
H, N(10)CH2C//2); 3.88 (t, J
7.4, 2 H, N(3)C//2(CH2)3CH3); 4.67 (t, /= 5.9, 2 H, N(10)CH2); 6.96 (t, J
C(10)NHCH2CH2Nr7);
(m,
H, C(9)H); 7.93 (s, 1 H, C(6)H).
=
=
5.9, 1 H,
13C-NMR (100
MHz, (CD3)2SO): 13.78; 18.68; 20.76; 21.85; 27.00; 27.93 (3C); 28.55; 36.95; 40.77;
44.00; 77.80; 116.16; 130.94; 131.41; 134.18; 135.72; 135.93; 146.43; 148.96; 154.63;
155.74; 159.35.
Anal. ber. für
FAB-MS: 456
(100, [M+H]+); 356 (53); 313 (71);
C24H33N5O40.5H2O (464.57):
C
7.23, N 15.04.
187
243
(36);
198 (28).
62.05, H 7.38, N 15.07; gef: C 62.21, H
6.
Experimenteller Teil
NH2
CF3COOH
•
r1
^^N
N^O
99
10-(Aminoethyl)-7,8-dimethyl-3-pentyl-benzo[G]pteridin-2,4-(3H, 10H)-dion (99).
Lösung
aus
dem
Boc-geschützten
90 min bei RT
wurde
Reaktionsprodukt
oranges
99
Flavin 97 (180 mg, 0.40 mmol) in
Anschliessend wurde
gerührt.
durch
Zugabe
Trifluoracetatsalz erhalten und ohne weitere
eingesetzt (180
mg,
vacuo
Reinigung
95:5 (5 ml)
eingeengt
Das Flavinamin 99
Et20 gefällt.
von
in
TFA/H20
Eine
und das
wurde als
in die nächste Stufe
97%).
#f (CHCL/MeOH/AcOH, 5:1:1)
=
Smp.: 196-198 °C.
0.38.
IR
(KBr): 3433w, 3100w,
3033w, 2958w, 2856w, 1689s, 1660s, 1584s, 1549s, 1461m, 1436m, 141 lw, 1349w,
XH-NMR (500 MHz, (CD3)2SO):
1254m, 1201m, 1133m, 1133m, 1020w, 798w, 722w.
6.9, 3 H, N(3)(CH2)4Ctf3); 1.32 (m, 4 H, N(3)(CH2)2(C//2)2CH3); 1.59 (m,
0.88
(t, J
2 H,
N(3)CH2C#2(CH2)2CH3);
J=
6.5,
=
2
H,
N(10)CH2Gr72);
2.41
(s,
3
3.89
(t,
/
H, C(7)CH3); 2.51 (s, 3 H, C(8)CH3); 3.24 (t,
7.4,
=
2
H, N(3)C//2(CH2)4CH3); 4.88 (t, J
6.5, 2 H, N(10)CH2); 7.84 (s, 1 H, C(9)H); 7.97 (s,
1
=
H, C(6)H); 8.02 (br.s., 2-3 H,
13C-NMR (125 MHz, (CD3)2SO): 13.80; 18.70; 20.58; 21.85; 26.98; 28.54;
NH2).
36.48; 40.84; 41.11; 115.63; 130.47; 131.26; 134.14; 136.04; 136.36; 146.98; 149.61;
154.66;
159.25.
FAB-MS:
396
[M-CF3COO]+);
(100,
356
(97).
C21H26N504F3
(469.47).
HN
S
,N^
KK
101
^
JD
xx^çou
O
[10-(text-Butyloxycarbonylaminoethyl)-7,8-dimethyl-benzo[GJpteridin-2,4-(3H,10H)dion-3-yl]essigsäure-text-butylester (101).
wurde
zusammen
mit
Cs2C03 (1
g, 3.07
Die
mmol)
188
Flavinverbindung
und
95
(1
g, 2.59
mmol)
Bromessigsäure-fert-butylester (100,
6.
1.5 g, 7.69
mmol) in
DMF
CHC13 (250 ml) verdünnt,
eingeengt.
(100 ml) suspendiert. Nach 5
mit
H20 (150 ml)
Rohprodukt
Das
Umkristallisation
EtOAc/Etp
aus
organische
Phase in
vacuo
gefällt,
filtriert
und
Aceton/H20
aus
säulenchromatographisch gereinigt (Kieselgel-60,
15:1).
h Rühren bei RT wurde das mit
extrahiert und die
wurde
d
3 cm, /
=
lieferte 101
Experimenteller Teil
18 cm,
=
CHCL/MeOH
(0.93 g, 75%) in Form gelber
Nadeln.
R{ (CHCl3/MeOH 10:1)
0.73.
198-200 °C.
Smp.:
IR
(CHC13): 3458w, 3007m, 3000m,
1742m, 1709s, 1661s, 1628w, 1584s, 1549s, 1504m, 1460m, 1369m, 1157s, 855w.
'H-NMR (400 MHz, (CD3)2SO): 1.22 (s, 9 H, C(CH3)3); 1.43 (s, 9 H, C(CH3)3); 2.42 (s,
3 H,
2
2.52 (s, 3 H,
C(7)CH3);
4.70
N(3)CH2);
H,
C(10)NHCH2CH2NiD;
C(8)CH3);
(t, J
7.90
5.9,
=
(s,
1
3.45
2
(q,
H,
J
=
5.9,
H, N(10)CH2C#2); 4.54 (s,
2
6.97
N(10)CH2);
(t, J
H, C(9)H); 7.97 (s, 1 H, C(6)H).
5.9,
=
1
H,
I3C-NMR (100
MHz, (CD3)2SO): 18.68; 20.83; 27.63 (3C); 27.90 (3C); 36.95; 42.90; 44.39; 77.84;
81.35; 116.34; 131.00; 131.69; 134.45; 135.36; 136.13; 147.03; 149.10; 154.12; 155.75;
159.18; 166.97. FAB-MS: 500 (100, [M+H]+); 388 (9); 344 (28); 198 (9). Anal. ber. für
C25H33N506 (499.57):
60.11, H 6.66, N 14.02; gef: C 60.16, H 6.48, N 14.00.
C
NH2
•
CF3COOH
r1
N
YN Y°
A-^-A
°
102
o
[10-(Aminoethyl)-7,8-dimethyl-10H-benzo[G]pteridin-2,4-(3H,l0H)-dion-3-yl]essigsäure
(102).
Eine
Lösung
wurde 2 h bei RT
durch
Zugabe
des Isoalloxazins 101
gerührt.
von
Et^O gefällt.
eingesetzt (0.73
g,
g, 0.160
Anschliessend wurde in
Pulver und wurde nach Trocknen
Stufe
(0.8
Fütration
am
mmol)
vacuo
1702m,
2.53
N(3)CH2);
4.91
8.05
(br.s.,
2-3
3
95:5
(20 ml)
und das Produkt 102
102
Reinigung
als
gelbes
in die nächste
quant.).
1661m, 1584m, 1548s,
(s,
eingeengt
Hochvakuum ohne weitere
1136m, 1036w, 936w, 802w, 725w.
C(7)CH3);
TFA/H20
ergab das Trifluoracetatsalz
#f (CHCL/MeOH/AcOH, 5:1:1)0.45. Smp.: 153-155 °C.
2700w,
in
H,
(t,J= 6.4,
C(8)CH3);
2
H, NH2);
1464w,
IR
(KBr): 3600-3200m,
1352w,
1325w,
1247m,
1197m,
!H-NMR (500 MHz, (CD3)2SO): 2.43 (s,
3.27
3100-
(m, 2 H, N(10)CH2C#2); 4.59 (s,
3
H,
2
H,
H, N(10)CH2); 7.89 (s, 1 H, C(9)H); 8.01 (s, 1 H, C(6)H);
11.5-13.5
(br.s,
189
1
H,
COOH).
13C-NMR (125 MHz,
6.
Experimenteller Teil
(CD3)2SO): 18.70; 20.63; 39.00; 41.48; 42.36; 115.77; 130.78; 131.36; 134.44; 135.85;
136.39; 147.60; 149.80; 154.23; 159.08; 169.21.
302
(32); 255 (33);
200
(33). HRMS
ber. für
FAB-MS: 345 (100,
[M-CF3COO]+);
[M-CF3COO]+: 344.1359; gef:
344.1359.
CI8H18N506F3 (457.37).
TT
HN
^V
xjCço.;
-
o
[10-(Fluorenylmethyloxycarbonylaminoethyl)-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin-2,4(3H,10H)-dion-3-yl]essigsäure (103).
wurde in
Bei
Die Flavinaminosäure 102 (250 mg, 0.55 mmol)
wässriger K2C03-Lösung (9%,
Erreichen
dieser
TemperaPr
10 ml)
wurde
gelöst
90
min
Reaktionsgemisch mit H20
aus
CHC13 extrahiert,
eingeengt.
die
bei
RT
gerührt.
Das
Eisbad
Danach
verdünnt und mit Zitronensäure
organischen
Das Produkt wurde
aus
gekühlt.
Flurenylmethyloxycarbonyl-O-succinimid
(FmocOSu, 300 mg, 0.89 mmol) zugegeben.
Reaktionslösung
und im Eisbad auf 0 °C
Phasen über
wurde
wurde
entfernt und
das
angesäuert.
gelblich
trübe
Es wurde zweimal
MgS04 getrocknet
CHC13/Et20 gefällt
die
und abfiltriert
und
(103,
in
vacuo
250 mg,
80%).
Rf (CHCL/MeOH/AcOH, 5:1:1)
0.80.
Smp.:
179-181
°C.
IR
(KBr): 3600-3200m,
3056w, 2956w, 1711s, 1661s, 1583s, 1547s, 1450m, 1411w, 1350w, 1322w, 1261m,
1231m, 1206m, 101 lw, 761w, 742w.
C(7)CH3);
2.33
(s, 3 H, C(8)CH3); 3.51 (q,
7.0, 1 H, Fmoc-CH); 4.21 (d, J
J=
'H-NMR (400 MHz, (CD3)2SO): 2.29 (s, 3 H,
=
7.0, 2 H,
J=
5.9, 2 H,
Fmoc-CH2);
N(10)CH2C#2);
4.53
(s,
2
4.05
(t,
J
=
H, N(3)CH2); 4.73 (t,
5.9, 2 H, N(10)CH2); 7.38-7.95 (m, 11 H, C(ar)H, NH); 11.5-13.5 (br.s, 1 H,
COOH).
13C-NMR (100 MHz, (CD3)2SO): 18.57; 20.66; 37.06; 42.21; 43.62; 46.49;
65.63; 115.92; 119.98 (2C); 124.89 (2C); 126.91 (2C); 127.50 (2C); 130.99; 131.53;
134.36; 135.46; 136.06; 140.56 (2C); 143.66 (2C); 146.98; 149.10; 154.13; 156.41;
159.14; 169.23. FAB-MS: 566 (100, [M+H]+); 460 (13). C31H27N506 (565.59).
190
6.
Experimenteller
Teil
[10-(Fluorenylmethyloxycarbonylaminoethyl)-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin-2,4-
(3H,10H)-dion-3-yl]-N-(2-(indol-3-yl)-ethyl)-essigsäureamid
geschützte
Flavinaminosäure 103
(600
1.35
mg,
(400
Die Reaktion wurde mit 7
gerührt.
Danach wurde mit
Phasen
3
/
cm,
18
=
Dioxan/MeOH
H20 gefällt
cm,
ergab
2922w,
1006w.
1711m,
=
2.81
Aktivierungsreagenz
ml) gestartet und 2 h
MgS04 getrocknet
und abfiltriert.
und
(t, J
=
in
H20
BOP
vacuo
eingeengt.
Der
Säulenchromatographie (Kieselgel-60,
und anschliessende
195-197 °C.
Smp.:
1583m,
1548s,
IR
1511m,
7.3, 2 H, Ind-CH2); 3.33 (q, J
4.46 (s, 2 H,
bei RT
extrahiert. Die
Umkristallisation
d
aus
(CHCLJ: 3311w, 3000w, 2951w,
1456w,
=
1350w,
1261w,
C(7)CH3);
2.35
N(3)CH2);
4.74
(t,
J
=
1150w,
(s,
3
H,
7.3, 2 H, Ind-CH2C#2); 3.51 (q,
5.9, 2 H, N(10)CH2Gr72); 4.08 (t, J= 6.9, 1 H, Fmoc-CH); 4.24 (d, J
Fmoc-CH2);
Fmoc-
(225 mg, 45%) als gelbes Pulver.
0.43.
1657m,
0.5
'H-NMR (400 MHz, (CD3)2SO): 2.31 (s, 3 H,
C(8)CH3);
J
das
verdünnt und zweimal mit
CHCL/MeOH 15:1)
105
Rf (CHCL/MeOH 15:1)
Tropfen NEt3 (~
CHC13 (100 ml)
wurden über
Rückstand wurde mit
=
mmol),
Die
mmol) und Tryptamin (300 mg, 1.87 mmol) wurden in DMF (20 ml)
gelöst.
organischen
mg, 0.71
(105).
=
6.9,
2
H,
5.9, 2 H, N(10)CH2); 6.94-7.95 (m, 16
H, C(ar)H, N(10)CH2CH2Nr7); 8.17 (t, J= 5.8, 1 H, N(3)CH2CONr7); 10.81 (s, 1 H,
Ind-NH).
13C-NMR (100 MHz, (CD3)2SO): 18.59; 20.65; 25.02; 37.08; 39.45; 40.50;
43.53; 46.51; 65.62; 111.23; 111.58; 115.92; 118.12 (2C); 119.99 (2C); 120.77; 122.60;
124.91 (2C); 126.91 (2C); 127.08; 127.50 (2C); 130.97; 131.32; 134.14; 135.95; 135.98;
136.11; 140.58 (2C); 143.68 (2C); 146.72; 149.06; 154.41; 156.44; 159.36; 166.49.
FAB-MS: 708
(100, [M+H]+); 548 (24). C41H37N705 (707.79).
191
6.
Experimenteller Teil
NH2
r
r\
Yyn yY
W
°
5
i»«
H
[10-(Aminoethyl)-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin-2,4-(3H,10H)-dion-3-yl]-N-(2-(indol-3yl)-ethyl)-essigsäureamid (106).
DMF
(265
mg, 0.33
(20 ml) und Piperidin (5 ml) gelöst und 30 min bei RT gerührt.
Reaktionslösung
ergab
Das Flavinderivat 105
in
vacuo
eingeengt
das Flavinamin 106
ohne weitere
Smp.:
aus
(160 mg, quant.), welches
in die nächste Stufe
Reinigung
145-147 "C.
und der Rückstand
eingesetzt
mmol) wurde in
Dann wurde die
MeOH/Et20 gefällt.
nach Trocknen
am
Filtration
Hochvakuum
wurde.
(KBr): 3378m, 3056w, 2922w, 1706m, 1656s, 1582s, 1545s,
IR
1458m, 1433m, 1411w, 1352m, 1328w, 1254m, 1200m, llOOw, 1028w, 933w, 806w,
741m.
'H-NMR (400 MHz, (CD3)2SO): 2.42 (s, 3 H, C(7)CH3); 2.53 (s, 3 H, C(8)CH3);
2.82
J
(t,
NH2);
=
3.35 (m, 2 H,
N(10)CH2);
(d,
J
=
7.3, 2 H, Ind-CH2); 2.99 (t, J
6.97 (t, J
Ind-CH2C#2);
=
N(3)CH2CON//);
6.8,
2
H, N(10)CH2CH2); 3.31 (br.s, 2 H,
4.49 (s, 2 H,
N(3)CH2);
4.66 (t, J= 6.8,
2
H,
7.0, 1 H, Ind-C(ar)H); 7.05 (t, J= 7.0, 1 H, Ind-C(ar)H); 7.16
2.2, 1 H, Ind-C(ar)H); 7.32 (d, J
Ind-C(ar)H); 7.95 (s,
=
1 H,
10.82
=
10.1, 1 H, Ind-C(ar)H); 7.53 (d, J
C(9)H); 7.97 (s, 1 H, C(6)H);
8.17
(t,
J
=
=
7.8, 1 H,
5.5,
1
H,
13C-NMR (100 MHz, (CD3)2SO): 18.68;
(s, 1 H, Ind-NH).
20.53; 25.02; 38.50; 40.10; 43.60; 46.67; 111.23; 111.56; 116.43; 118.11 (2C); 120.77;
122.61; 127.07;
130.86;
131.24;
134.10;
135.98;
136.10;
146.84;
148.94;
159.43; 162.20; 166.58. FAB-MS: 486 (100, [M+H]+); 377 (14); 338 (72).
(485.55).
192
154.52;
C26H27N703
6.
6.3.3
Synthese
Experimenteller Teil
der Desazaflavinbausteine
O
H3Ï
115
0^2^Ni
h1
109
H
N^^ Y
n
^C
h
/\
6-Amino-N-(2-N-text-butyloxycarbonylethyl)-pyrimidin-2,4-(3H, lOH)-dion (109).
einfach
Boc-geschützte Ethylendiamin
Lösung
aus
während 4 h
90
(6.5
41 mmol,
g,
1.5
eq.)
wurde
6-Chloruracil (108, 4 g, 27 mmol) in n-Buthanol (100 ml)
zum
Rückfluss erhitzt.
wurde das rc-Butanol in
Nach dem Abkühlen der
abgezogen.
vacuo
abfiltriert und nochmals
mikrokristallinen Pulvers
Rf (CHCL/MeOH 10:1)
H20
aus
(4.8
0.18.
g,
gegeben
Reaktionslösung
Der Rückstand wurde in siedendem
und 12 h bei 4 °C unter leichtem Rühren auskristallisiert.
umkristallisiert.
zu
Das
einer
und
auf RT
H20 gelöst
Die farblosen Nadeln wurde
109 wurde in Form eines weissen,
65%) erhalten.
Smp.:
221-223 °C.
IR
(KBr): 3310s, 3222s, 3100m,
2978m, 1726s, 1683s, 1596s, 1539s, 1449m, 1389m, 1364m, 1333m, 1277m, 1244m,
1223m, 1170m, 1106w, 1039w, 1017w, 987w, 964w, 829w, S06w, 161w, 548m.
NMR
4.48
(400 MHz, (CD3)2SO): 1.38 (s, 9 H, C(CH3)3); 3.05 (m,
(s,
1
I3C-NMR (100 MHz, (CD3)2SO):
(3C); 38.81; 41.09; 72.54; 77.81; 150.80; 154.08; 155.74; 164.24.
(96, [M+H]+); 215 (22);
N
H, NHC#2C/72NH);
H, C(5)H); 6.08 (br.s, 1 H, C(6)NHCH2CH2N#); 6.89 (br.s, 1 H, C(6)NH);
9.98 (br.s, 1 H, N(l)H); 10.12 (br.s, 1 H, N(3)H).
28.17
4
XH-
171
(31).
Anal. ber. für
20.73; gef: C 48.98, H 6.83, N 20.70.
193
CuH18N404 (270.29):
C
FAB-MS: 271
48.88, H 6.71,
6.
Experimenteller Teil
8-Benzyloxy-10-(text-butyloxycarbonylaminoethyl)-5-carba-5-desaza-benzo[G]pteridin2,4-(3H,10H)-dion (111).
mmol) in
Die
gegeben.
°C
DMF
abgekühlt.
mit
Etp
(50 ml)
Zu einer
wurde
Reaktionslösung
Das
Lösung
des 6-Aminouracilderivats 109
2,4-Dibenzyloxybenzaldehyd
wurde 20 h bei 120 °C
110
(2.1
gerührt. Anschliessend
ausgefallene zitronengelbe Reaktionsprodukt 111
intensiv gewaschen.
Desazaflavin 111 als
Zweimalige
hellgelbes,
Rt (CHCL/MeOH 10:1)
0.41.
Umkristallisation
mikrokristallines Pulver (0.9 g,
Smp.:
183-185 °C.
g,
IR
(1
6.6
g,
3.7
mmol)
wurde auf 4
wurde abfiltriert und
aus
MeOH lieferte das
52%).
(KBr): 3419m, 3133w, 2967w,
2811w, 1699s, 1661m, 1603s, 1561m, 1527s, 1492m, 1456m, 1405m, 1367m, 1242s,
1188m, 1167m, 1144m, 983w, 796w, 579w. 'H-NMR (500 MHz, (CD3)2SO): 1.28 (s, 9
H, C(CH3)3); 3.36 (q, J
(s,
2
7.53
=
6.5,
2
H, N(10)CH2Ctf2); 4.67 (br.s, 2 H,
N(10)CH2);
5.41
H, CH2-Bn); 7.23 (m, 2 H, C(ar)H); 7.38 (m, 1 H, NH); 7.44 (m, 2 H, C(ar)H);
(d,
J= 7.1, 2 H,
8.90 (s, 1 H,
C(5)H);
C(ar)H); 7.71 (s,
10.97
1 H,
(s, 1 H, N(3)H).
C(ar)H); 8.10 (d, J
=
9.0,
1 H,
C(6)H);
I3C-NMR (125 MHz, (CD3)2SO): 27.97
(3C); 36.81; 44.18; 70.34; 77.99; 99.91; 111.87; 114.85; 115.90; 127.91 (2C); 128.20;
128.51
(2C); 133.46; 135.89; 141.19; 142.87; 156.06; 156.50; 157.67; 162.24; 164.26.
FAB-MS: 463 (100,
(480.53):
C
[M+H]+);
389
(8); 363 (21).
62.49, H 5.87, N 11.66; gef: C 62.39,
194
Anal.
H
ber.
für
5.82, N 11.48.
C25H26N405H20
6.
Experimenteller
Teil
8-Benzyloxy-10-(text-butyloxycarbonylaminoethyl)-3-pentyl-5-carba-5-desazabenzo[G]pteridin-2,4-(3H,10H)-dion (112). 1-Brompentan (0.4 ml,
tropfenweise
bei 60 °C
einer
zu
Suspension
mmol) und trockenem Cs2C03 (0.5
(50 ml) gegeben.
DMF
Es
(100 ml)
extrahiert.
Die
1.53
g,
wurde
Reaktionsgemisch mit CHC13 (200 ml)
organische
aus
2
bei
in über Molsieb
60
0.67.
Smp.:
hellgelber
216-217 °C.
IR
N(3)(CH2)4C/f3);
(m,
2 H,
1.37
N(10)CH2CH2N/f);
J
7.77
=
4
4.82
5.46
=
3.55
(br.s.,
2
(m,
H,
2
460
vacuo
umkristallisiert.
(0.4 g, 70%).
(KBr): 3434m, 3044w, 2932w,
141
lw, 1367w, 1236s, 1167m,
N(10)CH2);
=
J
=
5.09
2.1, /
(t,
=
7.1,
=
3
H,
J
=
116.67;
28.38
6.0,
=
(2C); 128.39;
ber. für
10.52; gef: C 67.46, H 6.73, N 10.45.
195
1
H,
=
7.2,
2
H, C(ar)H);
13C-NMR
(3C); 29.21; 37.29; 41.35; 43.85; 71.10;
127.68
(13); 433 (14); 390 (11). Anal.
7.6, 2 H,
8.8, 1 H, C(7)H); 7.36
7.2, 2 H, C(ar)H); 7.53 (d, J
135.87; 142.15; 143.27; 156.49; 156.69; 157.26; 162.17; 165.43.
N
und in
8.8, 1 H, C(6)H); 7.93 (s, 1 H, C(ar)H); 8.77 (s, 1 H, C(5)H).
80.11; 99.39; 111.96; 116.23;
6.81,
H20
H, N(10)CH2CH2); 4.05 (t, J
(s, 2 H, CH2-Bn); 7.13 (dd,
(125 MHz, CDC13): 14.03; 22.51; 27.63;
[M+H]+);
dreimal mit
H, N(3)(CH2)2(C#2)2CH3); 1.46 (s, 9 H, C(CH3)3); 1.70
7.2, 1 H, C(ar)H); 7.42 (t, J
(d, J
das
'H-NMR (500 MHz, CDC13): 0.90 (t, J
N(3)CH2C772(CH2)2CH3);
N(3)C#2(CH2)3CH3);
(t,
(m,
wurde
Dann
CHCL/MeOH
Nadeln erhalten
(0.5 g, 1.08
Â) getrocknetem
MgS04 getrocknet
aus
2867w, 1702m, 1638s, 1607s, 1537s, 1500m, 1457m,
1126w, 1006w, 956w, 798w.
gerührt.
(4
organische Phase
Phase wurde über
Das Desazaflavin 112 wurde in Form
R{ (CHCL/MeOH 20:1)
°C
verdünnt und die
Anschliessend wurde der feste Rückstand
eingeengt.
mmol) wurde
dem Desazaflavinderivat 111
mmol)
h
3.31
128.72
(2C); 132.94;
FAB-MS: 533
C30H36N4O5 (532.64):
C
(100,
67.65, H
6.
Experimenteller Teil
NH2
•
CF3COOH
BnO.
113
10-(Aminoethyl)-8-benzyloxy-3-pentyl-5-carba-5-desaza-benzo[G]pteridin-2,4-(3H,l0H)dion
(113).
Das
TFA/H20 (95:5)
dem
Boc-geschützte
2 h bei RT
öligen Rückstand
Desazaflavinderivat 112
gerührt.
wurde durch
(300
mg, 0.56
Es wurde anschliessend in
Zugabe
Desazaflavinamin 113 wurde als
hellgelbes
Rt (CHCL/MeOH/HOAc 5:1:1)
0.72.
von
E^O
vacuo
241-243 °C.
IR
wurde in
eingeengt
das Produkt 113
Trifluoracetatsalz erhalten
Smp.:
mmol)
und
gefällt.
aus
Das
(300 mg, 97%).
(KBr): 3426m, 3033w,
2944w, 1703m, 1606s, 1535s, 1500w, 146 lw, 1417w, 1372w, 1254m, 1189m, 1150h>,
994w, 739w.
1.30
2
'H-NMR (500 MHz, (CD3)2SO): 0.86 (t, J= 7.0, 3 H, N(3)(CH2)4Ctf3);
(m, 4 H, N(3)(CH2)2(C#2)2CH3); 1.56 (m, 2 H, N(3)CH2C#2(CH2)2CH3); 3.20 (m,
H, N(10)CH2C//2); 3.86 (t, J
N(10)CH2);
5.38
=
7.4, 2 H, N(3)C/72(CH2)3CH3); 4.90 (t, J
(s, 2 H, CH2-Bn); 7.33 (dd, J
(m, 4 H, C(ar)H); 7.53 (rf, /
=
=
=
6.3, 2 H,
1.9, /= 8.9, 1 H, C(7)H); 7.37-7.45
7.2, 2 H, C(ar)H); 7.98 (br.s., 2-3 H, NH2); 8.19 (d, J
=
8.9, 1 H, C(6)H); 8.97 (s, 1 H, C(5)H). 13C-NMR (125 MHz, (CD3)2SO): 13.82; 21.84;
27.08; 28.59; 36.41; 40.18; 41.47; 70.53; 100.33; 111.62; 114.03; 116.33; 128.29 (2C);
128.38; 128.59 (2C); 134.21; 135.78; 142.03; 142.37; 155.65; 156.80; 161.43; 164.62.
FAB-MS: 433
(100, [M-CF3COO ]+); 390 (12); 343 (5). C27H29N405F3 (546.55).
BnO.
[8-Benzyloxy-10-(2-text-butyloxycarbonylaminoethyl)-5-carba-5-desaza-benzo[G]pteridin2,4-(3H, 10H)-dion-3-yl]essigsäure-text-butylester (117).
(100,
1.1
Bromessigsäure-ter/-butylester
ml, 7.3 mmol) wurde bei 60 °C tropfenweise
Desazaflavinderivats 111 (1 g, 2.2 mmol) und trockenem
196
zu
einer
Cs2C03 (1
Suspension
g, 3.06
des
mmol) in
6.
über Molsieb (4
bei 60 QC
ml)
Â) getrocknetem DMF (50 ml) gegeben.
gerührt.
Die
extrahiert.
eingeengt.
/
cm,
Dann wurde mit
organische
Der Rückstand wurde
18
=
cm,
CHC13 (200 ml)
MgS04 getrocknet
20:1)
Smp.:
und
und
in
vacuo
gelber Nadeln
219-221 °C.
erhalten
d
umkristallisiert.
MeOH
aus
(0.62
g,
5 h
H20 (100
säulenchromatographisch gereinigt (Kieselgel-60,
Desazaflavinderivat 117 wurde in Form
0.74.
Reaktionsgemisch wurde
verdünnt und dreimal mit
Phase wurde über
CHCl3/MeOH
#f (CHCL/MeOH 20:1)
Das
Experimenteller Teil
=
3
Das
49%).
IR (KBr): 3423m, 3044w, 2978w,
2933w, 1735m, 1691m, 1640s, 1609s, 1567m, 1537s, 1498s, 1456m, 1412m, 1370m,
XH-NMR
1322w, 1289w, 1244s, 1189m, 1157m, 1039w, 990w, 937w, 828w, 796w.
(500 MHz, CDCLJ:
1.47
(s, 9 H, C(CH3)3);
(s, 9 H, C(CH3)3); 3.55 (q,
1.48
H, N(10)CH2C/Y2); 4.73 (s, 2 H, N(3)CH2); 4.83 (br.s, 1 H,
N(10)CH2);
J=
7.3, 2
5.06 (t, J
=
6.1, 1 H, N(10)CH2CH2N#); 5.47 (s, 2 H, CH2-Bn); 7.15 (dd, 1=2.2, J= 8.8, 1 H,
C(7)H);
7.77
7.37
(d, J
NMR
=
(m,
1
H, C(ar)H);
7.42
8.8, 2 H, C(6)H); 7.98 (d, J
(125 MHz, CDC13):
28.10
81.97; 99.44; 111.56; 116.25;
2
(m,
(3C);
H, C(ar)H); 7.54 (d,J=1.3, 2 H, C(ar)H);
1.5, 1 H, C(ar)H); 8.80 (s, 1 H, C(5)H). 13C-
=
28.38
116.96;
(3C); 37.26; 42.99; 44.05; 71.17; 80.16;
127.70
(2C); 128.41;
128.73
135.83; 142.56; 143.46; 156.71; 156.73; 161.98; 165.66; 167.42.
[M+H]+); 521 (9);
503
503 (10); 434 (21); 421
(10); 434 (21); 421 (44).
(44).
Anal. ber. für
FAB-MS: 577
(2C); 133.02;
FAB-MS: 577 (100,
(100, [M+H]+);
C31H36N407 (576.65):
C
64.57,
H
521
(9);
6.29, N
9.72; gef: C 64.42, H 6.25, N 9.65.
HN
<>
N^
KK
Ji^ ^O
Y'
n
0
119
WC
[10-(2-text-Butyloxycarbonylaminoethyl)-5-carba-5-desaza-8-hydroxy-benzo[GJpteridin2,4-(3H,lOH)-dion-3-yl]essigsäure-text-butylester (119).
117
(300
mg, 0.52
10% Palladium auf
mmol) wurde
BaS04 (15 mg)
während 20 h bei RT in
Reaktionsgemisch
bei RT in HOAc
einer
in HOAc
vacuo
197
benzylierte
Desazaflavin
(30 ml) gelöst. Eine Suspension
(0.3 ml) wurde zugegeben.
H2-Atmosphäre
durch Celite filtriert und in
Das
stark
gerührt.
eingeengt.
Danach
aus
Es wurde
wurde
Das resultierende
das
gelbe Öl
6.
Experimenteller Teil
wurde
aus
MeOH/Et20 gefällt,
filtriert und
Desazaflavin 119 wurde in Form eines
Smp.:
152-154 °C.
Hochvakuum
am
gelbgrünen
Pulvers
getrocknet.
(250
mg,
Das
debenzylierte
quant.) erhalten.
(KBr): 3426m, 2978w, 2922w, 1744m, 1701m, 1639s, 1606s,
IR
1578m, 1534s, 1511s, 1472m, 1394m, 1367m, 1267m, 1228m, 1161s, 1039w, 961w,
'H-NMR (400 MHz, (CD3)2SO):
939w, 856w, 806w, 194w.
1.42
(s, 9 H, C(CH3)3);
4.50 (s, 2 H,
N(3)CH2);
C(9)H); 7.26 (s,
1 H,
1.28
(s, 9 H, C(CH3)3);
3.38
(q, J= 6.0,
2
H, N(10)CH2C/f2); 3.40 (br.s, 1 H, OH);
4.63
(t, /= 6.0,
2
H, N(10)CH2); 7.04-7.09 (m, 2 H, C(7)H,
N(10)CH2CH2N#);
8.04
(d,
J
=
8.9, 1 H, C(6)H); 8.90 (s, 1 H,
C(5)H). 13C-NMR (100 MHz, (CD3)2SO): 27.59 (3C); 27.96 (3C); 36.99; 42.23; 44.08;
77.75; 81.04; 100.96; 109.28; 115.27; 115.53; 134.07; 142.26; 143.55; 155.22; 155.76;
156.15; 161.46; 165.48; 167.26.
(23);
(16);
242
213
(18).
FAB-MS: 487
HRMS
ber.
(100, [M+H]+);
413
(8); 331 (52); 288
[M+H]+: 487.2193; gef:
für
487.2192.
C24H30N4O7 (486.53).
NH2 -CF3COOH
BnO.
118
[10-(2-Aminoethyl)-8-benzyloxy-5-carba-5-desaza-benzo[G]pteridin-2,4-(3H,10H)-dion3-yl]essigsaure (118).
wurde in
vacuo,
TFA/H20
Das
geschützte
Desazaflavinderivat 117
95:5 (15 ml) 3 h bei RT gerührt.
Fällen des Rückstands
Aminosäure 118 als
gelbes
aus
Et,0 und Trocknen
Trifluoracetatsalz
R{ (CHCl3/MeOH/HOAc 5:1:1)
Einengen
0.09.
(640
mg,
mg,
1.2
mmol)
Reaktionsgemisches
Hochvakuum
ergaben
in
die
quant.).
251-253
Smp.:
am
des
(680
°C.
IR
(KBr): 3422m,
3400-
2300m, 1689m, 1603s, 1534s, 1494m, 1467m, 1416w, 1367w, 1317w, 1260m, 1194m,
1172m, 1133m, 1033w, 983w, 944w, 833w>, 794w, 721w.
(CD3)2SO):
3.26
'H-NMR (400 MHz,
(t, J= 6.1, 2 H, N(10)CH2C#2); 4.56 (s, 2 H, N(3)CH2); 4.94 (br.s, 2
H, N(10)CH2); 5.40 (s, 2 H, CH2-Bn); 7.34-7.47 (m, 5 H, C(ar)H); 7.54 (d, 2 H,
C(ar)H); 8.10 (br.s, 2-3 H, NH2);
11.8-13.5
(br.s,
1
H, COOH).
70.2; 100.32; 111.12; 114.40;
8.21
(d,
J
=
8.8, 1 H, C(6)H); 9.0 (s, 1 H, C(5)H)
13C-NMR (100 MHz, (CD3)2SO): 36.22; 41.75; 41.80
116.44;
128.33
(2C); 128.40;
128.61
(2C); 134.35
135.77; 142.33; 142.87; 155.30; 156.90; 161.28; 164.91; 169.52. FAB-MS: 421 (8, [M-
198
6.
CF3COO]+);
277
421.1512; gef:
(30);
(68);
241
421.1513.
185
(100);
149
(47).
Experimenteller Teil
HRMS ber. für
[M-CF3COO]+:
C24H21N407F3 (534.45).
BnO.
N-
-N. ^.O
Y
9
116
OH
[8-Benzyloxy-10-(fluorenylmethyloxycarbonylaminoethyl)-5-carba-5-desazabenzo[G]pteridin-2,4-(3H,lOH)-dion-3-yl]essigsäure
Aminosäure 118
gelöst
(FmocOSu,
wurde entfernt und die
zweimal
und in
gefällt
aus
Lösung
mit
eingeengt.
und abfiltriert
Die
Dann wurde
mmol) gelöst in
90 min bei RT
Desazaflavin-
Flurenylmethyloxycarbonyl-O-
DMF
gerührt.
(1 ml) zugegeben.
die
vereinigten organischen
Fmoc-geschützte
Das Eisbad
Anschliessend wurde das
verdünnt und mit Zitronensäure
H20
CHC13 extrahiert,
vacuo
gekühlt.
300 mg, 0.89
Reaktionsgemisch
trübe
Die
(250 mg, 0.47 mmol) wurde in wässriger K2C03-Lösung (9%, 15 ml)
und im Eisbad auf 0 °C
succinimid
(116).
Es wurde
angesäuert.
Phasen über
gelbUch
MgS04 getrocknet
Aminosäure 116 wurde
CHC13/Et20
aus
(220 mg, 73%).
Rf (CHCL/MeOH/AcOH 5:1:1)
0.92.
Smp.:
202-204
°C.
IR
(KBr): 3600-2500m,
3398m, 3333m, 3038w, 2952w, 1703s, 1605s, 1535s, 1490m, 1466m, 1417w, 1375w,
1254s, 1202m, 1152w, 996w, 192w, 142w. *H-NMR (400 MHz, (CD3)2SO): 3.46 (q, J
=
6.0,
2
H, N(10)CH2C#2); 4.15 (t,
Fmoc-CH2);
4.51
(s,
2
Bn); 7.21 (dd,J= 2.0,
(m,
7.86
8 H,
H,
/=
N(3)CH2);
/=
7.0, 1 H, Fmoc-CH); 4.27 (d, J
4.74
(br.s, 2 H, N(10)CH2); 5.30 (s,
2
7.0, 2 H,
2
H, CH2-
8.9, 1 H, C(7)H); 7.27 (t, J= 7.5, 2 H, C(ar)H); 7.35-7.43
C(ar)H, NH); 7.55 (d, J= 7.5, 2 H, C(ar)H); 7.70 (t, J
(d,J=1.5,
=
=
6.0, 1 H, C(ar)H)
H, C(ar)H); 8.15 (d, J= 9.0, 1 H, C(6)H); 8.99 (s, 1 H, C(5)H)
12.69 (br.s, 1 H, COOH). 13C-NMR (100 MHz,
(CD3)2SO): 37.09; 41.73; 43.66;
46.61
65.71; 70.33; 99.80; 110.89; 115.05; 116.22; 120.06 (2C); 124.99 (2C); 126.99 (2C)
127.56
(2C); 128.01 (2C); 128.24; 128.50 (2C); 133.79; 135.70; 140.66 (2C); 142.49
142.95; 143.73 (2C); 155.27; 156.28; 156.72; 161.34; 164.57; 169.58.
(100, [M+H]+); 460 (13). C37H30N4O7 (642.67).
199
FAB-MS: 643
6.
Experimenteller Teil
Die
Syntheseschritte
für die
Darstellung
der
Peptide
120. 121 und 12 2
der
an
Festphase:
1) Es wurden 2.2 g (Beladung 1.36 mmol) NovaBiochem Rink Amide MBHA Harz
(Beladungsdichte
0.62
2 h in DMF
mmol/g)
(10 ml) gequollen.
2) Das Harz wurde 15 min in 20% Piperidin in DMF (10 ml) geschüttelt.
3) Danach wurde dreimal
4) Die
Schritte
3 min mit DMF
(5 ml) gewaschen.
2) und 3) wurden wiederholt.
5) Es wurde ein Kaiser-Test durchgeführt und nach positivem Ergebnis (Harzkügelchen
(beads) färben sich blau) wurde das
Harz zweimal 3 min mit
N-MethylpyrroUdinon (NMP)
gewaschen.
6)
Die
Fmoc-geschützte Aminosäure
mit HOBt
wurde
h
(0.52
g, 3.42
mmol)
116
(1.10 g, 1.71 mmol) wurde in NMP gelöst und
und TBTU
(1.10 g, 3.42 mmol)
Hünigs-Base (Düsopropylethylamin, DIEA,
zum
1.91 ml, 11.16
Harz
gegeben.
mmol) gegeben
Dazu
und 48
geschüttelt.
7) Das Harz wurde dreimal
3 min mit NMP und einmal 3 min mit DMF
gewaschen.
8) Nach negativem Ergebnis des Kaiser-Tests (Harzkügelchen (beads)
konnte mit dem Entschützen der
Schritte 2) bis
9)
NMP
gelöst
mmol)
zum
werden.
farblos)
Dazu wurden die
5) wiederholt.
Fmoc-geschützte
Die
Aminograppe fortgefahren
bleiben
und
Harz
Aminosäure Prolin
zusammen
gegeben.
mit HOBt
(Fmoc-Pro,
1.38
g,
4.09
mmol) wurde in
(0.73 g, 4.77 mmol) und TBTU (1.53 g, 4.77
Dazu wurde DIEA
(2.1 ml, 12.27 mmol) gegeben
und 3-5 h
geschüttelt.
10) Für die Entschützung wurden die Schritte 7) und 8) wiederholt.
11) Zur Synthese der Verbindungen 121 bzw. 122 wurden die Schritte 9) und 10) einmal
bzw. dreimal wiederholt.
12) Zur Abspaltung
mit
CH2C12,
der
Peptide
vom
dreimal mit MeOH und dreimal mit
13) Anschliessend wurden
15
ml
Triisobutylsüan (2.5%) zugegeben
14)
Bei
unbefriedigenden
15) Die
die
Harz wurde das Harz dreimal mit
Rohpeptide
einer
und 1 h
Ausbeuten
an
DMF, siebenmal
EtjO gewaschen.
Lösung
aus
TFA
(95%), H20 (2.5%) und
geschüttelt.
Rohprodukt
wurde Schritt
enthaltenden Filtrate wurden in
vacuo
13) wiederholt.
eingeengt
und mit
Et20
gefällt.
16)
Die
Säule:
Rohprodukte
Nucleoprep
wurden mittels
100-12
präparativer Umkehrphasen-HPLC (RP-HPLC;
C-18; Gradient: 0-5 min 100%^25% A / 0%^75% B; 5-40
min 25%^0% A / 75%-» 100%
B; 40-50 min 0%^100% A / 100%->0% B (A
200
=
6.
H20(1% TFA)
Rt (121)
=
/B
=
29 min,
CH3CN);
Rt (122)
=
Flussrate: 5 ml
35
min"1;
Retentionszeiten
Experimenteller
Rt (120)
=
20
Teil
min,
min) gereinigt.
O
BnO.
N.
^ISL ^O
V^
o
La NH2
120
[10-((2S-Pyrrolidin-2-yl)carbonylaminoethyl)-8-benzyloxy-3-pentyl-5-carba-5-desazabenzo[G]pteridin-2,4-(3H,10H)-dion-10-yl]essigsäureamid (120).
34%.
Smp.:
107-109 °C.
IR
Ausbeute:
240
mg,
(KBr): 3600-2500m, 3404m, 3200m, 3067m, 2956m,
1678s, 1604s, 1567m, 1534s, 1494m, 1463m, 1417m, 1372m, 1255s, 1200s, 1133m,
'H-NMR (400 MHz,
1026w, 994w, 933w, 833w, 795w, 721w.
(m,
3
=
2 H,
3.72
(m,
1
H, Pro-CH); 4.05 (m,
N(10)CH2);
5.42 (s, 2 H,
1
CH2-Bn);
H, Pro-CH); 4.45 (s, 2 H, N(3)CH2); 4.82
7.07 (s, 1 H, Pro-NH); 7.32 (dd, J
8.9, 1 H, C(7)H); 7.38-7.56 (m, 6 H, C(ar)H); 8.20 (d, J= 8.9,
(br.s,
1.60-1.90
H, Pro-CH); 2.13 (m, 1 H, Pro-CH); 3.13 (m, 2 H, N(10)CH2C#2); 3.49 (m, 1 H,
Pro-CH);
(m,
(CD3)2SO):
1
H, CON#H); 8.84 (t, J
9.30 (br.s, 1 H,
CONHtf).
=
1
-
2.0, /
H, C(6)H); 8.52
5.9, 1 H, N(10)CH2CH2N//CO); 8.98 (s, 1 H, C(5)H)
13C-NMR (100 MHz, (CD3)2SO): 23.30; 28.79; 36.05
42.59; 42.96; 45.35; 59.02; 70.37; 100.25; 111.33; 114.47; 116.16; 128.18 (2C); 128.29
128.55 (2C); 134.00; 135.80; 142.25; 142.34; 155.65; 156.51; 161.41; 164.43; 168.65
168.82.
FAB-MS:
539
(7,
[M+Na]+);
517
(100,
[M+H]+); 460
C27H28N605 (516.56).
HN
BnO.
Nk
JyO 0
KX NH;
201
121
(7);
338
(16).
6.
Experimenteller Teil
[10-((2S-N-((2S-Pyrrolidin-2-yl)carbonyl)-pyrrolidin-2-yl)carbonylaminoethyl)-8-
benzyloxy-3-pentyl-5-carba-5-desaza-benzo[G]pteridin-2,4-(3H,\0H)-dion-10yljessigsäureamid (121).
Ausbeute: 270 mg, 49%.
Smp.:
110-112 °C.
IR
(KBr): 3600-
2500m, 3400m, 3200m, 3067m, 2956m, 1678s, 1650s, 1604s, 1567m, 1535s, 1494m,
1461m, 1417m, 1372m, 1254s, 1198s, 1139m, 1026w, 994w, 933w, 833w, 195w,
12lw, lOOw. *H-NMR (400 MHz, (CD3)2SO): 1.60-1.95 (m, 6 H); 2.08 (m, 1 H); 2.26
(m, 1 H); 3.05-3.30 (m,
2
2
H); 3.30-3.75 (m, 4 H); 4.31 (m, 1 H); 4.44 (m, 1 H); 4.45 (s,
H); 4.70 (m, 2 H); 5.42 (s,
7.56 (m, 6
H); 8.15 (rf,
H); 9.50 (br.s,
1
H).
2
H); 7.06 (s, 1 H); 7.26 (dd, J
/= 9.0, 1
H); 8.48 (fcr.j,
1
=
H); 8.52 (t,
2.0, J
J=
=
5.8,
8.9, 1 H); 7.381
H); 8.95 (s, 1
13C-NMR (100 MHz, (CD3)2SO): 23.36; 24.42; 27.65; 29.11
35.46; 42.65; 42.97; 45.59; 46.69; 58.28; 59.84; 70.42; 99.78; 111.28; 115.13; 116.03
128.26 (2C); 128.32; 128.54 (2C); 133.72;
135.81; 142.04; 142.58; 155.54; 156.16
161.44; 164.52; 166.59; 168.88; 172.06. FAB-MS: 614 (100, [M+H]+); 491 (8); 474 (7)
460
(20); 338 (58). C32H35N706 (613.68).
HN
BnO.
122
[10-((2S-N-((2S-N-((2S-N-((2S-Pyrrolidin-2-yl)carbonyl)-pyrrolidin-2-yl)carbonyl)-
pyrrolidin-2-yl)carbonyl)-pyrrolidin-2-yl)carbonylaminoethyl)-8-benzyloxy-3-pentyl-5carba-5-desaza-benzo[G]pteridin-2,4-(3H, \0H)-dion-10-yl] essigsäureamid
Ausbeute: 550 mg, 50%.
Smp.:
186-188 °C.
IR
(122).
(KBr): 3600-3000m, 3430m, 2967w\
2878w, 1678s, 1644s, 1605s, 1561w, 1535s, 1489w, 1455m, 1411m, 1367w, 1311w,
1252m, 1191m, 1161m, 1133m, 1022w, 928w, 833w, 794w.
(CD3)2SO):
TLNMR
(500 MHz,
1.60-2.45 (m, 16 H); 3.05-3.70 (m, 10 H); 4.10-4.60 (m, 4 H); 4.44 (s, 2 H);
202
6.
4.70
(m, 2 H); 5.44 (s,
(m, 6 H); 8.16 (rf,
(br.s,
9.39
1
/
H);
2
7.04
(s, 1 H); 7.25 (rfrf, J
=
2.0, /
=
Experimenteller
Teil
8.8, 1 H); 7.37-7.55
9.0, 1 H); 8.32 (t, J= 5.8, 1 H); 8.44 (br.s, 1 H); 8.96 (s, 1 H);
=
13C-NMR (125 MHz, (CD3)2SO): 23.42; 24.14; 24.26; 24.40; 27.38;
H).
27.58; 28.92; 30.67; 35.68; 42.65; 43.09; 45.74; 46.35; 46.54; 46.61; 57.46; 57.82;
58.17; 59.40; 70.35; 99.78; 111.28; 115.24; 116.01; 128.24 (2C); 128.46; 128.49 (2C);
133.62; 135.85;
142.00;
142.66;
168.85; 172.86. FAB-MS:
831
155.51; 156.17;
161.45;
164.51;
(16, [M+Na]+); 809 (100, [M+H]+);
616
165.98;
168.56;
(4). C42H49N908
(807.91).
[10-(Fluorenylmethyloxycarbonylaminoethyl)-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin-2,4(3H,l0H)-dion-3-yl]-N-[2-(8-benzyloxy-3-pentyl-5-carba-5-desaza-benzo[G]pteridin-2,4(3H,1 OH) -dion-10-yl) ethyljessigsäureamid
(114).
-
Flavinaminosäure 103
2.27
2
mmol)
und das
Fmoc-geschützte
Aktivierungsreagenz
BOP (1.00 g,
mmol) wurden in DMF (30 ml) gelöst. Danach wurde das in DMF (5 ml) gelöste
Desazaflavin 113
(~
(285
mg, 0.50
Die
(275
ml) gestartet.
extrahiert,
Produkt
die
mg, 0.50
Es wurde 90 min bei RT
organischen
wurde
aus
(160
mg,
Phasen über
rf
=
3 cm, /
=
und die Reaktion mit 20
Tropfen NEt3
gerührt, anschliessend zweimal
MgS04 getrocknet
CHC^/E^O gefällt
Reinigung (Kieselgel-60,
Pulver
mmol) zugegeben
und
18 cm,
abfiltriert.
und in
vacuo
aus
CHC13
eingeengt.
Das
Säulenchromatographische
CHCL/MeOH 20:1) ergab
114 als
gelbes
33%).
Rf (CHCL/MeOH 10:1)
0.58.
Smp.:
182-184 °C.
IR
(KBr): 3429m, 2950w, 2933w,
2856w, 1706m, 1639m, 1607s, 1578m, 1541s, 1456m, 1406w, 1250m, 1228m, 1022w,
739w.
'H-NMR (500 MHz, (CD3)2SO): 0.85 (t, J= 7.1, 3 H, dFl-N(3)(CH2)4C#3); 1.28
(m, 4 H, dFl-N(3)(CH2)2(Œ2)2CH3); 1.53 (m,
203
2
H,
dFl-N(3)CH2C#2(CH2)2CH3);
2.33
6.
Experimenteller Teil
(s,
3
H, F1-C(7)CH3); 2.38 (s, 3 H,
N(10)CH2C#2);
Fmoc-CH);
=
(rf,
4.24
dFl-N(10)CH2);
/
3.83
(t,
/
4.72
J=
F1-C(8)CH3);
7.4, 2 H,
3.45
(m,
2
4
H, Fl-N(10)CH2C//2, dFl-
dFl-N(3)Œ2(CH2)3CH3);
6.9, 2 H, Fmoc-CH2); 4.45 (s,
=
(m,
4.08 (t, J= 6.9,
1
H,
H, F1-N(3)CH2); 4.60 (m, 2 H,
2
H, F1-N(10)CH2); 5.36 (s, 2 H, CH2-Bn); 7.21 (rfrf, J= 2.0,
8.9, 1 H, dFl-C(7)H); 7.26 (t,J
=
1.4, 2 H, C(ar)H); 7.27 (t, J
7.4, 1 H, C(ar)H);
=
7.33
(t, J
(rf,
/
=
7.0, 2 H, C(ar)H); 7.54 (d, J
(rf,
/
=
7.4, 2 H, C(ar)H); 7.86 (s, 1 H, F1-C(6)H); 7.94 (s, 1 H, C(ar)H); 8.12 (rf, /
=
7.4, 2 H, C(ar)H);
7.39
(t,
=
J
=
7.4, 2 H, C(ar)H,
F1-N(10)CH2CH2N#);
7.46
7.4, 2 H, C(ar)H); 7.73 (s, 1 H, F1-C(9)H); 7.85
=
8.9, 1 H, dFl-C(6)H); 8.61 (t, J= 5.8, 1 H, Fl-N(3)CH2CON#); 8.91 (s, 1 H, dFl13C-NMR (125 MHz, (CD3)2SO): 13.76; 18.61; 20.67; 21.78; 26.99; 28.55;
C(5)H).
35.30; 37.10; 40.07; 42.91; 43.39; 43.68; 46.51; 65.59; 70.25; 99.44; 111.20; 115.18;
115.96; 119.96 (2C); 124.89 (2C); 126.88 (2C); 127.48 (2C); 127.73; 128.08 (2C);
128.16;
128.35
(2C); 130.98; 131.13; 133.51; 134.09; 135.75; 135.99; 136.06; 140.56
(2C); 141.91; 142.53; 143.66 (2C); 146.83; 149.03; 154.31; 155.60; 155.86; 156.41;
159.38; 161.38; 164.46; 168.28.
FAB-MS: 1003
(15, [M+Na]+); 981 (100, [M+H]+);
914(5). C56H53N908 (980.10).
6.3.4
Synthese
Generelle
der
ModeUverbindungen:
Vorschrift für
die
Darstellung
von
1-Carboxymethyluracil-cyclobutandimer-
bisflavinestern:
Zu
dem
in
DMF
(2
ml)
gelösten
Carboxymethyluracildimer (41-43,
mmol) gegeben.
Die entstandene
Lösung
Hydroxyethylflavin
aus
dem
Tropfen NEt3 (~
die
1
Reaktionslösung
gewaschen.
eingeengt.
Die
mit
Rückstand wurde mittels
orangefarbenen
trans-anti-1-
mmol) wurde BOP (150 mg, 0.323
gerührt.
Dann wurde eine
69 (100 mg, 0.32 mmol) in DMF (3 ml) und
Es wurde 6-8 h bei RT
orangefarbene Öl
Et20
,
rf
ModeUverbindungen
Pulvern mit durchschnittlichen Ausbeuten
konnten.
204
10
dreimal
filtriert und in
vacuo
versetzt und filtriert.
F/as/i-Chromatographie (Kieselgel-//
wodurch die
H20 (100 ml)
MgS04 getrocknet,
wurde mit
ca.
gerührt. Anschliessend wurde
verdünnt und mit
Phase wurde über
CHCL/MeOH 10:1) gereinigt,
oder
trans-syn-
wurde 10 min bei RT
CHC13 (100 ml)
organische
Das erhaltene
50 mg, 0.15
Lösung
ml) zugegeben.
cis-syn-,
von
=
3 cm, /
76-78
=
Der
15 cm;
in Form
von
50-75% erhalten werden
6.
O
O
4^f—V^NH
HN
La,,
Experimenteller Teil
^
h
h
„aJ
c°.
l,8-Bis-(((2-(3-ethyl-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin-2,4-(3H,10H)-dion-10-yl)-ethyl)hydroxycarbonyl)-methyl)-cis-4a-cisoid-4a,4b-cis~4b-dodecahydro-2,4,5,7tetraoxocyclobuta[l,2-d:4,3-d'] dipyrimidin (76). i?f (CHCL/MeOH 10:1)0.27.
179-181 °C.
Smp.:
IR(KBr): 3450m, 1703s, 1647m, 1583m, 1547s, 1461m, 1386w, 1358w,
1339w, 1275w, 1233m, 1203m. 'H-NMR (500 MHz, (CD3)2SO): 1.14 (t, J= 7.1, 6 H,
2
x
F1-N(3)CH2C#3);
(m,
2
2.38
(s, 6 H, 2
x
F1-C(7)CH3);
x
F1-N(3)C//2CH3);
4.00
(rf,
C(8a)H, D-C(8b)H); 4.50 (m, 4 H, 2
N(lO)GrYH);
x
(s, 6 H,
2
x
F1-C(8)CH3);
3.57
H, D-C(4a)H, D-C(4b)H); 3.67 (rf, /= 17.3, 2 H, D-N(1,8)C//H); 3.86 (#, /
7.1, 4 H, 2
H, 2
2.49
5.00
F1-C(6)H);
(m,
2
10.48
H, 2
x
/
=
x
17.3, 2 H, D-N(1,8)CH#); 4.13 (m, 2 H, D-
F1-N(10)CH2C#2);
Fl-N(lO)CHrT);
(s, 2 H, 2
x
=
7.83
(s, 2 H,
4.80 (m, 2 H,
2
x
F1-C(9)H);
2
x
Fl-
7.91 (s, 2
D-N(3)H). 13C-NMR (125 MHz, (CD3)2SO): 12.84;
18.76; 20.65; 35.97; 38.16; 42.81; 46.94; 54.83; 61.28; 116.11; 130.92; 131.14; 134.06;
136.06; 136.28; 146.90; 149.19; 152.56; 154.72; 159.11; 166.93; 168.62; alle Signale
entsprechen
933.3320.
2C. FAB-MS: 933
(100, [M+H]+). HRMS ber. für [M+H]+: 933.3280; gef:
C44H44N12012 (932.91).
205
6.
Experimenteller Teil
\X
HN
^•^\—S^M-^,
"N'T?
°
I
°
N
^yl
LA..
7,
,T
H
H
NH
N
°
°
lyO.
I
.A.J
l,8-Bis-(((2-(3-ethyl-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin-2,4-(3H,10H)-dion-10-yl)-ethyl)hydroxycarbonyl)-methyl)-cis-4a-transoid-4a,4b-cis-4b-dodecahydro-2,4,5,7tetraoxocyclobuta[l,2-d:4,3-d'] dipyrimidin (77). i?f (CHCL/MeOH 10:1)0.14.
158-160 °C.
(CHC13):
IR
XH-NMR (400 MHz, (CD3)2SO):
1267w, 612w.
N(3)CH2C#3);
2.37
(s, 6 H, 2
x
F1-C(7)CH3);
H, D-C(4a)H, D-C(4b)H); 3.90 (q, J
2
Smp.:
1706m, 1650m, 1583m, 1550s, 1467w, 1339w,
301 lw,
=
2.47
7.1, 4 H,
2
1.14
(s,
x
(t, J
6 H, 2
x
7.1,
=
6
H,
F1-C(8)CH3);
F1-N(3)C/Y2CH3);
2
x
Fl-
3.35 (m, 2
3.95 (rf, 7
=
17.7,
H, D-N(1,8)ŒH); 4.12 (rf, /= 17.7, 2 H, D-N(l,8)CHfl); 4.31 (m, 2 H, D-C(8a)H,
D-C(8b)H);
4.50
(s, 2 H, 2
F1-C(9)H); 7.85 (s,
NMR
x
(m, 4 H, 2
x
Fl-N(10)CH2C//2);
2
H, 2
x
4.87 (m, 4 H, 2
F1-C(6)H);
10.62
x
(s, 2 H,
F1-N(10)CH2);
2
x
D-N(3)H).
7.83
13C-
(100 MHz, (CD3)2SO): 12.78; 18.65; 20.48; 35.88; 38.12; 42.59; 47.92; 58.84;
61.08; 115.94; 130.75; 130.97; 133.89; 135.88; 136.08; 146.79; 148.79; 151.40; 154.58;
158.90; 169.26; 169.49;
(33);
397
(53);
297
(99);
aUe
207
Signale entsprechen
(100).
2C.
HRMS ber. für
C44H44NI2012 (932.91).
206
FAB-MS: 933
(36, [M+H]+); 467
[M+H]+: 933.3280; gef: 933.3441.
6.
La.,
N
.o
N
j
h
h
V
Experimenteller
Teil
I
o
78
l,5-Bis-(((2-(3-ethyl-7,8-dimethyl-benzo[GJpteridin-2,4-(3H,10H)-dion-10-yl)-ethyl)hydroxycarbonyl)-methyl)-cis-4a-transoid-4a,4b-cis-4b-dodecahydro-2,4,6,8tetraoxocyclobuta[l,2-d:3,4-d'] dipyrimidin (78). i?f (CHCL/MeOH 10:1)0.26.
170-172 °C.
IR
(CHC13): 3689w>, 3389w, 3011m, 1756w, 1706m, 1656m, 1589m,
1550s, 1467w, 1339w.
N(3)CH2C/f3);
Smp.:
2.38
'H-NMR (500 MHz, (CD3)2SO): 1.13 (t,J=l.l, 6 H, 2
(s, 6 H,
2
x
F1-C(7)CH3);
2.50
(s, 6 H, 2
x
F1-C(8)CH3);
3.47
x
Fl-
(m,
2
H, D-C(4a)H, D-C(8a)H); 3.82 (rf, 7= 17.7, 2 H, D-N(1,5)C#H); 3.90 (q,J=l.l, 4 H,
2
x
Fl-N(3)Ctf2CH3);
D-C(8b)H);
(s,
2
H, 2
NMR
x
4.53
(m,
3.99
4
(d, J
H, 2
x
17.7, 2 H, D-N(1,5)CH#); 4.13 (m, 2 H, D-C(4b)H,
=
F1-N(10)CH2C#2);
F1-C(9)H); 7.90 (s,
2
H, 2
x
4.92 (m, 4 H, 2
x
F1-C(6)H); 10.56 (s, 2 H,
F1-N(10)CH2);
2
x
D-N(3)H).
7.89
13C-
(125 MHz, (CD3)2SO): 12.78; 18.67; 20.56; 35.88; 42.59; 42.87; 46.12; 52.75;
61.15; 116.05; 130.90; 130.99; 133.88; 135.84; 136.20; 146.96; 148.96; 150.92; 154.46;
158.98; 168.01; 168.35; alle Signale entsprechen 2C. FAB-MS: 933 (100, [M+H]+); 727
(27). HRMS ber. für [M+H]+: 933.3280; gef: 933.3412. C44H44N12012 (932.91).
207
6.
Experimenteller Teil
Generelle
Vorschrift für
Darstellung
die
1-Carboxymethyluracil-cyclobutandimer-
von
monoflavin-monobenzylestern:
Zu
dem
in
DMF
(2
ml)
gelösten
Carboxymethyluracildimer (41-43,
mmol) gegeben. Die
Lösung
Tropfen NEt3 (~
gerührt.
1
ml) zugegeben
Danach wurde mit
gewaschen.
eingeengt.
Die
Die
rf
wurden durch
15 cm;
=
durchschnittlichen Ausbeuten
von
in DMF
und
10
ca.
und weitere 20 h bei RT
verdünnt und mit
H20 (100 ml)
MgS04 getrocknet,
von
(3 ml)
Anschliessend wurde ein
gerührt.
Zugabe
mg, 0.323
Dann wurde eine
gerührt.
mmol) zugegeben
82 und 83 wurden nach
3 cm, /
mmol)
und 4 h bei RT
mg, 0.38
trans-anti-l-
mmol) wurde BOP (150
mg, 0.15
CHC13 (100 ml)
Rohprodukte
=
(47
oder
trans-syn-
wurde 10 min bei RT
Phase wurde über
organische
ModeUverbindungen 80,
(Kieselgel-#,
Lösung
Benzylalkohol (40
an
50 mg, 0.15
69
Hydroxyethylflavin
aus
Uberschuss
entstandene
cis-syn-,
dreimal
filtriert und in
EtjO gefällt
vacuo
und filtriert.
Die
säulenchromatographischer Reinigung
CHCL/MeOH 10:1)
als
Pulver mit
orangefarbene
20-45% erhalten.
l-(((Benzyl)-hydroxycarbonyl)-methyl)-8-(((2-(3-ethyl-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin2,4-(3H,10H)-dion-10-yl)-ethyl)-hydroxycarbonyl)-methyl)-cis-4a-cisoid-4a,4b-cis-4bdodecahydro-2,4,5,7-tetraoxocyclobuta[l,2-d:4,3-d'] dipyrimidin (80). R{ (CHCl3/MeOH
10:1)0.25.
Smp.:
153-157 °C.
IR
(CHC13): 3389w, 2989w, 1711s, 1650m, 1583m,
1550s, 1467m, 1406w, 1339w, 1267m, 1056w, 1017w, 922w.
(CD3)2SO):
H,
1.11
F1-C(8)CH3);
N(1/8)C#H);
J
3.63
3.83
N(3)C/72CH3);
N(8/l)CH/7);
(t,
4.09
=
7.1, 3 H,
(m,
(rf,
(rf,
J
/
1
Fl-N(3)CH2C//3);
2.38
(s,
3
H,
Ti-NMR
F1-C(7)CH3);
H, D-CH); 3.71 (m, 1 H, D-CH); 3.72 (rf, /
=
=
4.14 (m, 2 H, 2
17.4,
1
H, D-N(1/8)CH#); 3.89 (q, J
17.4, 1 H, D-N(8/l)C/ffl); 4.13 (rf, J
x
D-CH);
4.52
(m,
208
2 H,
(500 MHz,
=
=
=
F1-N(10)CH2C#2);
2.49
(s,
3
17.4, 1 H, D7.1,
17.4,
2
H, Fl-
1 H,
D-
4.79 (m, 1 H,
6.
5.03
Fl-N(IO)ŒH);
C(ar)H);
1 H,
(s,
7.86
(s,
1
(m,
1
Experimenteller
Teil
H, F1-N(10)CH#); 5.13 (s, 2 H, CH2-Bn); 7.35 (m, 5 H,
H, F1-C(9)H); 7.91 (s, 1 H, F1-C(6)H); 10.49 (s, 1 H, D-NH); 10.57
13C-NMR (125 MHz, (CD3)2SO): 12.85; 18.73; 20.62; 35.95; 37.90
D-NH).
38.45; 42.84; 46.96; 47.13; 54.80; 54.98; 61.44; 66.14; 116.23; 127.88 (2C); 128.12
128.43 (2C); 130.96; 131.10; 134.06; 135.65;
136.00; 136.32; 146.79; 149.21; 152.57
152.64; 154.76; 159.14; 166.86; 167.09; 168.55; 168.61. FAB-MS: 727 (100, [M+H]+)
467 (14).
HRMS ber. für
[M+H]+: 727.2476; gef.:
727.2527.
C35H34N8O10 (726.71).
l-(((Benzyl)-hydroxycarbonyl)-methyl)-8-(((2-(3-ethyl-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin2,4-(3H,l0H)-dion-10-yl)-ethyl)-hydroxycarbonyl)-methyl)-cis-4a-transoid-4a,4b-cis-4bdodecahydro-2,4,5,7-tetraoxocyclobuta[l,2-d:4,3-d'J dipyrimidin (82). Rf (CHCL/MeOH
10:1)0.12.
Smp.:
200-202 °C.
IR
(CHC13): 3500w, 3389w, 3022w, 1706s, 1656m,
1600s, 1550s, 1467m, 1406w, 1356w, 1272m, 1056w, 972w, 922w, 850w.
(400 MHz, (CD3)2SO): 1.14 (t,
C(7)CH3);
(rf,
/
=
2.50
(s,
3
J
=
JH-NMR
7.1, 3 H, Fl-N(3)CH2C//3); 2.38 (s, 3 H, Fl-
H, F1-C(8)CH3); 3.38 (m, 1 H, D-CH); 3.39 (m, 1 H, D-CH); 3.89
17.5, 1 H, D-N(1/8)ŒH); 3.90 (q,J=l.l,
2
H,
F1-N(3)C//2CH3);
3.99
17.5, 1 H, D-N(1/8)CH#); 4.09 (rf,/= 17.8, 1 H, D-N(8/1)ŒH); 4.13 (d, J
=
(rf,
/
=
17.8, 1
H, D-N(8/1)CH//); 4.29 (m, 1 H, D-CH); 4.35 (m, 1 H, D-CH); 4.44 (m, 1 H, Fl-
N(10)CH2C#H);
(rf,
/
7.86
=
(s,
D-NH).
4.54
(m,
1
H, F1-N(10)CH2CH#); 4.91 (m, 2 H,
12.5, 1 H, C/m-Bn); 5.08 (rf, /
1 H,
F1-C(9)H);
7.39
(s,
1
=
F1-N(10)CH2);
5.03
12.5, 1 H, CHtf-Bn); 7.29 (m, 5 H, C(ar)H);
H, F1-C(6)H); 10.65 (s, 1 H, D-NH); 10.71 (s, 1 H,
13C-NMR (100 MHz, (CD3)2SO): 12.78; 18.65; 20.52; 35.84; 38.23; 38.29;
42.55; 48.10; 48.25; 59.08; 59.10; 61.05; 65.96; 115.97; 127.73 (2C); 128.00; 128.26
(2C); 130.86; 131.01; 133.92; 135.41; 135.86; 136.20; 146.69; 149.09; 151.44; 151.54;
209
6.
Experimenteller Teil
154.51; 158.98; 169.13; 169.16; 169.56; 169.60.
(30). HRMS ber.
für
FAB-MS: 727
(100, [M+H]+); 467
[M+H]+: 727.2476; gef: 727.3066. C35H34N8O10 (726.71).
l-(((Benzyl)-hydroxycarbonyl)-methyl)-5-(((2-(3-ethyl-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin2,4-(3H,l0H)-dion-10-yl)-ethyl)-hydroxycarbonyl)-methyl)-cis-4a-transoid-4a,4b-cis-4b-
dodecahydro-2,4,6,8-tetraoxocyclobuta[l,2-d:3,4-d'J dipyrimidin (83). Rf (CHCL/MeOH
10:1)
0.24.
Smp.:
173-175 °C.
IR
(CHC13): 3378w, 3289w, 1744m, 1709s, 1672m,
1656m, 1583m, 1549s, 1500w, 1467m, 1406w, 1372m, 1267w.
(CD3)2SO):
1.14
(t,
J
=
6.9,
3
H, Fl-N(3)CH2Cr73); 2.39 (s, 3 H,
XH-NMR (300 MHz,
F1-C(7)CH3);
H, F1-C(8)CH3); 3.47 (m, 1 H, D-CH); 3.76 (m, 1 H, D-CH); 3.83 (rf, /
J
N(1/5)C#H); 3.90 (q,
N(l/5)CHr7);
4.02
(rf,
/
=
=
6.9, 2 H, F1-N(3)C#2CH3); 4.01
(rf,
/
=
=
2.50
(s,
3
17.5, 1 H, D17.5,
1
H, D-
17.8, 1 H, D-N(5/1)C#H); 4.14 (m, 1 H, D-CH); 4.22 (rf, J
=
17.8, 1 H, D-N(5/1)CH#); 4.35 (m, 1 H, D-CH); 4.53 (m, 2 H, F1-N(10)CH2C#2); 4.94
(m,
2
H, F1-N(10)CH2); 5.18 (s,
C(9)H); 7.91 (s,
mangelnder
MS: 727
1 H,
2
H, CH2-Bn); 7.38 (m, 5 H, C(ar)H); 7.90 (s, 1 H, Fl-
F1-C(6)H); 10.56 (s,
Löslichkeit konnten
1
H, D-NH); 10.69 (s, 1 H, D-NH).
13C-NMR Spektren
(100, [M+H]+). C35H34N8O10 (726.71).
210
nicht
aufgenommen werden.
Wegen
FAB-
6.
Experimenteller Teil
l-(((Pentyl)-hydroxycarbonyl)-methyl)-8-(((2-(3-ethyl-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin-2,4(3H,lOH)-dion-10-yl)-ethyl)-hydroxycarbonyl)-methyl)-cis-4a-cisoid-4a,4b-cis-4bdodecahydro-2,4,5,7-tetraoxocyclobuta[l,2-d:4,3-d'] dipyrimidin (81).
Modellverbindung
wurde
81
in
Monoflavinester 80, 82 und 83
80
Tropfen,
mg,
0.91
(23
mg,
hergestellt.
rf
=
obigen generellen
zur
Anstatt
mmol) eingesetzt.
Rohprodukts (Kieselgel-//,
Pulver
Analogie
Benzylalkohol
Die
pentylierte
Vorschrift
für
wurde 1-Pentanol
Säulenchromatographische Reinigung
3 cm, /= 18 cm;
die
CHCL/MeOH 10:1) ergab
81 als
(5
des
gelbes
12%).
R{ (CHCL/MeOH 10:1)0.20. Smp.:
146-148 °C.
IR
(CHC13): 3689w, 3389w, 1733m,
lïi-
1711s, 1650m, 1583m, 1550s, 1467m, 1406w, 1339w, 1267m, 1017w, 922w.
NMR(500MHz, (CD3)2SO):
0.85
(t,
J=
7.0, 3 H,
D-0(CH2)4C#3);
1.14
(t,
J=
7.0, 3
H, F1-N(3)CH2C#3); 1.27 (m, 4 H, D-0(CH2)2(C//2)2CH3); 1.56 (quint., J= 7.0, 2 H,
D-OCH2Cf72(CH2)2CH3);
(m,
1 H,
D-CH);
3.71
2.40 (s, 3 H,
F1-C(7)CH3);
2.50
(s, 3 H, F1-C(8)CH3); 3.63
(m, 1 H, D-CH); 3.73 (rf, /= 17.3, 1 H, N(1,8)CH2); 3.74 (d,
J
=
17.3, 1 H, N(1,8)CH2); 3.91 (q, J= 7.1, 2 H, F1-N(3)C#2CH3); 4.03 (m, 2 H, D-
OC#2(CH2)3CH3);
N(8,1)CH2);
4.06
4.14 (m, 2 H, 2
Fl-N(10)C/ffl); 5.03 (m,
C(6)H);
(rf,
10.50
1
/=
x
17.1,
1 H,
N(8,1)CH2);
D-CH); 4.52 (m,
2
H,
4.10
(rf,
/
F1-N(10)CH2C#2);
=
17.1,
4.81
(m,
1
H,
1 H,
H, Fl-N(IO)CHH); 7.87 (s, 1 H, F1-C(9)H); 7.93 (s, 1 H, Fl-
(s, 1 H, D-NH); 10.53 (s, 1 H, D-NH). 13C-NMR (125 MHz, (CD3)2SO):
12.84; 13.79; 18.73; 20.60; 21.69; 27.42; 27.68; 35.94; 37.95; 38.38; 42.82; 46.92;
47.14; 54.80; 54.91; 61.41; 64.66; 116.23; 130.94; 131.09; 134.04; 135.98; 136.33;
146.77; 149.22; 152.54; 152.60; 154.75; 159.12; 166.85; 167.06; 168.60; 168.61.
MS: 707 (100,
[M+H]+); 467 (33). HRMS
ber. für
C33H38N8O10 (706.72).
211
FAB-
[M+H]+: 707.2789; gef: 707.2824.
6.
Experimenteller Teil
l,8-Bis(((2-(3-ethyl-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin-2,4-(3H,WH)-dion-10-yl)-ethyl)aminocarbonyl)-methyl)-cis-4a-cisoid-4a,4b-cis-4b-dodecahydro-2,4,5,7tetraoxocyclobuta[l,2-d:4,3-d']dipyrimidin (19).
erfolgte
in
des
Synthese
Flavins
Analogie
69
eingesetzt.
generellen
Amidanalogs
das
von
Darstellung
76
wurde
des
statt
Die Reaktionszeiten verkürzten sich
79
wurde
sondern durch
Rf (CHCL/MeOH 5:1)
mangels
dreimalige
0.18.
des Bisflavinamides 7 9
Vorschrift für die Bisflavinester 76-78.
um
Löslichkeit
Umkristallisation
Smp.:
270-272 "C.
Für
die
N(10)-Hydroxyethyl-N(3)-Ethyl-
N(10)-Aminoethyl-N(3)-Ethyl-Flavin
Modellverbindung
gereinigt,
zur
Die
70
0.343
mg,
mmol)
ein Drittel auf 2-3 h.
etwa
nicht
(120
Die
mittelsF/as/z-Chromatograpnie
aus
MeOH erhalten
IR
(KBr): 3416m, 3322m, 1704s,
(60
mg,
44%).
1650s, 1584s, 1547s, 1461s, 1337m, 1267m, 1230s, 1194m, 1172m, 1150m, 1018w,
928w, 845w, 807w, 770w.
F1-N(3)CH2C#3);
/
=
TLNMR
(s, 6 H, 2
2.39
x
(400 MHz, (CD3)2SO):
F1-C(7)CH3);
16.7, 2 H, D-N(l,8)C/ffl); 3.47 (m, 4 H, 2
C(4a)H, D-C(4b)H); 3.92 (q,
J
=
6.6, 4 H, 2
C(8a)H, D-C(8b)H);
/
=
16.7,
N(10)CH2);
CONH);
7.90
10.43
(s,
(s,
2
4.11
2
H, 2
(rf,
x
F1-C(9)H);
2
2.49
(s, 6 H,
1.14
2
x
(t, J= 6.6, 6 H,
F1-C(8)CH3);
x
F1-N(10)CH2C#2);
x
Fl-N(3)Ctf2CH3);
3.39
(s,
2
H, 2
x
4.09 (m, 2 H,
F1-C(6)H);
x
(rf,
3.62 (m, 2 H, D-
H, D-N(8,l)GrYH); 4.63 (m, 4 H, 2
7.94
2
8.30
(m,
2
x
D-
Fl-
H, 2
x
H, N(3)H, N(6)H). 13C-NMR (100 MHz, (CD3)2SO): 12.88; 18.72;
20.82; 35.66; 35.95; 38.87; 42.92; 48.08; 54.88;
115.99;
130.90;
131.07;
134.11;
135.93; 136.24; 146.75; 149.01; 152.37; 154.68; 159.13; 167.30; 168.36; alle Signale
entsprechen
2C.
FAB-MS: 931 (100,
[M+Hf);
613
(6); 466 (15).
[M+H]+: 931.3599; gef: 931.3593. C44H46N14O10 (930.95).
212
HRMS ber. für
6.
Experimenteller
Teil
l,8-Bis(((2-(3-pentyl-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin-2,4-(3H,WH)-dion-10-yl)aminocarbonyl)-methyl)-cis-4a-cisoid-4a,4b-cis-4b-dodecahydro-2,4,5,7tetraoxocyclobuta[l,2-d:4,3-d']dipyrimidin (127).
Herstellung des Bisflavinamides 79,
das
N(3)-Pentyl-Flavinethylamin
Modellverbindung
cm;
127 wurde
nur
99
Die
wurde statt des
(150
mg,
Synthese verlief analog
N(3)-Ethyl-Flavinethylamins
0.320
mmol)
eingesetzt.
säulenchromatographisch (Kieselgel-//,
CHCL/MeOH 7.5:1—»5:1) gereinigt
und als
zur
orangefarbenes
rf
Pulver
=
Die
3 cm, /
(75
70
=
25
49%)
mg,
erhalten.
Rf (CHCl3/MeOH/HOAc 5:1:1)
0.21.
Smp.:
>250 °C.
IR
(KBr): 3414m, 3056w, 2954w,
2856w, 1706s, 1656s, 1584s, 1548s, 1462s, 1350m, 1268m, 1228m, 1205m, 101 lw,
806w, 756>v.
!H-NMR (500 MHz, (CD3)2SO): 0.85 (t,
N(3)(CH2)4C#3);
1.30
(m,
N(3)CH2C#2(CH2)2CH3);
3.43
(rf,
/
=
16.5,
2 H,
8
H, 2
2.40
x
Fl-N(3)(CH2)2(Cr72)2CH3);
(s, 6 H, 2
x
N(10)CH2);
H, 2
x
7.92
(s,
4.12
2
F1-C(7)CH3);
D-N(1,8)C#H); 3.48 (m,
H, D-C(4a)H, D-C(4b)H); 3.87 (m, 4 H, 2
C(8a)H, D-C(8b)H);
H, 2
CONH); 10.46 (s,
2
(rf,
x
/
=
J
4
H, 2
x
2.51
=
6 H,
6.9,
1.57
2
(m, 4 H, 2
(s, 6 H,
2
x
4.08
2
16.5, 2 H, D-N(8,l)Gf/H); 4.64 (m, 4 H,
2
7.94
H, N(3)H, N(6)H).
(s, 2 H,
2
x
F1-C(6)H);
8.35
Fl-
3.63 (m, 2
(m,
F1-C(9)H);
x
Fl-
F1-C(8)CH3);
Fl-N(10)CH2C//2);
F1-N(3)C#2(CH2)3CH3);
x
x
(t, J
=
H, Dx
Fl-
5.8, 2
13C-NMR (125 MHz, (CD3)2SO): 13.74
18.65; 20.75; 21.76; 26.90; 28.51; 35.57; 38.94; 40.78; 42.81; 48.04; 54.84; 115.91
130.82; 130.99;
134.03;
135.84;
136.12;
146.66;
167.23; 168.31; alle Signale entsprechen 2C.
ber. für
[M+H]+: 1015.4538; gef:
1015.4528.
213
148.90;
152.31;
FAB-MS: 1015 (100,
154.76;
[M+H]+).
C50H58N14O10 (1015.11).
159.22
HRMS
6.
Experimenteller Teil
HNATiA
^
O
'j4
h
NH
°
ï
H
°
123
OBn
BnO
l,8-Bis(((2-(8-Benzyloxy-3-pentyl-5-carba-5-desaza-benzo[G]pteridin-2,4-(3H,\0H)dion-10-yl)-ethyl)-aminocarbonyl)-methyl)-cis-4a-cisoid-4a,4b-cis-4b-dodecahydro2,4,5,7-tetraoxocyclobuta[l,2-d:4,3-d']dipyrimidin (123).
zur
Herstellung
99 das
des Bisflavinamides 127,
N(3)-Pentyl-Desazaflavinethylamin
Bisdesazaflavinamid 123 wurde
cm;
es
Die
wurde statt des
113
(180
Synthese
Rf (CHCL/MeOH/HOAc 5:1:1)
0.75.
als
Smp.:
mg, 0.33
mmol) eingesetzt.
hellgelbes Pulver (35
209-211 °C.
analog
N(3)-Pentyl-Flavinethylamins
säulenchromatographisch (Kieselgel-//,
CHCL/MeOH 7.5:1-^5:1) gereinigt und
verlief
IR
rf
=
3 cm, /
Das
=
25
20%) erhalten.
mg,
(KBr): 3397m, 3056w,
2954w, 2856w, 1698s, 1639s, 1607s, 1537s, 1463m, 1412m, 1367m, 1246s, 1183m,
1156w, 1122w, 1019w, 191w. 'H-NMR (500 MHz, (CD3)2SO): 0.84 (t,J=1.0, 6 H,
x
dFl-N(3)(CH2)4C#3);
1.28 (m, 8 H, 2
dFl-N(3)CH2C#2(CH2)2CH3);
C(4a)H, D-C(4b)H); 3.63 (rf,
3.44 (m, 4 H, 2
/
4.18
D-N(8,l)Gf/H); 4.63 (m,
4 H, 2
=
7.18
(rf,
/
=
x
1.54 (m, 4 H, 2
dFl-N(10)CH2C#2);
2
(m,
8.9, 2 H, 2
x
7.0, 4 H, 2
=
H, D-C(8a)H, D-C(8b)H); 4.19 (d, J
dFl-N(10)CH2);
x
5.41 (rfrf, /
dFl-C(7)H); 7.35 (t,
J
=
=
12.4, J
=
=
C(5)H);
x
10.48
dFl-C(6)H); 8.59 (t,
(s,
2
J
=
H, N(3)H, N(6)H).
5.3, 2 H, 2
x
x
16.5, 2 H,
15.2, 4 H, 2
x
7.2, 2 H, C(ar)H); 7.41 (t, J
7.2, 4 H, C(ar)H); 7.50 (rf, /= 7.2, 4 H, C(ar)H); 7.77 (s, 2 H, C(ar)H); 8.09 (rf, /
8.9, 2 H, 2
x
3.61 (m, 2 H, D-
16.5, 2 H, D-N(1,8)C//H); 3.84 (t, J
=
dFl-N(3)Ctf2(CH2)3CH3);
CH2-Bn);
dFl-N(3)(CH2)2(C/72)2CH3);
x
2
CONH);
8.90
(s,
2
H,
2
x
=
dFl-
13C-NMR (125 MHz, (CD3)2SO): 13.73; 21.76
26.99; 28.55; 35.40; 38.95; 40.12; 42.80; 48.17; 55.06; 70.27; 99.57; 111.30; 115.08
115.98; 127.85 (4C); 128.13; 128.49 (4C); 133.56; 135.78; 141.85;
142.39; 152.43
155.67; 155.98; 161.36; 164.38; 167.23; 168.79; alle Signale entsprechen 2C,
anders
angegeben.
FAB-MS: 1169
wenn
nicht
(100, [M+H]+). HRMS ber. für [M+H]+: 1169.4844;
gef: 1169.4858. C62H64N12012 (1169.27).
214
6.
Experimenteller Teil
l,8-Bis(((2-(8-Hydroxy-3-pentyl-5-carba-5-desaza-benzo[G]pteridin-2,4-(3H,10H)-dion10-yl)-aminocarbonyl)-methyl)-cis-4a-cisoid-4a,4b-cis-4b-dodecahydro-2,4,5,7tetraoxocyclobuta[l,2-d:4,3-d']dipyrimidin
Modellverbindung
Suspension
Die
123
gelbe Öl
aus
(124)
Smp.:
32
min)
124
Desazaflavin-
in HOAc
wurde nach
vacuo
am
HV
Eine
(0.3 ml) wurde zugegeben.
H2 heftig gerührt.
eingeengt.
getrocknet.
Reinigung
Danach
Das resultierende
Die
debenzylierte
mittels RP-HPLC
(Säule:
C-18; Gradient: 0-50 min 100%->0% A/ 0%-»100% B; 50-60 min
0%-*100% A / 100%^0% B
=
BaS04 (3 mg)
MeOH/Et,0 gefällt, filtriert und
100-12
benzylierte
mmol) wurde in HOAc (3 ml) gelöst.
durch Celite filtriert und in
Desazaflavin-Modellverbindung
Nucleoprep
Die
wurde während 20 h bei RT unter
Reaktionslösung
wurde
0.004
mg,
10% Palladium auf
aus
Reaktionsmischung
wurde die
(5
(124).
in Form eines
210-212 °C. IR
(A
=
H20(1% TFA)
gelbgrünen
Pulvers
/B
=
CH3CN);
Flussrate: 5 ml min
'; Rt
(4 mg, quant.) erhalten.
(KBr): 3438m, 3067w, 2956w, 2856w, 1700s, 1633s, 1606s,
1583s, 1548s, 1466m, 1389w, 1356w, 1265m, 1228w, 1200w, 1156w, 1022w, 800w.
FAB-MS: 989 (100,
989.3910.
[M+Hf);
495
(21);
338
(6). HRMS
C48H52N12012 (989.02).
215
ber. für
[M+H]+: 989.3906; gef:
6.
Experimenteller Teil
Ï^N
N'*
H
H
84
l-(((Pentyl)-aminocarbonyl)-methyl)-8-(((2-(3-ethyl-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin-2,4(3H,lOH)-dion-10-yl)-ethyl)-aminocarbonyl)-methyl)-cis-4a-cisoid-4a,4b-cis-4b-
dodecahydro-2,4,5,7-tetraoxocyclobuta[l,2-d:4,3-d']dipyrimidin (84).
(2 ml) gelösten cis-syn- 1-Carboxymethyluracildirners (41, 50
BOP
(150 mg,
des
Lösung
0.323
1
ml) zugegeben.
Anschliessend wurde ein
Die
Uberschuss
an
Nach 5 h Rühren bei RT wurde mit
dreimal
vacuo
gewaschen.
eingeengt.
0.15
mg,
Die
organische
Das resultierende
CHCL/MeOH 7.5:1-^-5:1)
mmol) in
Reaktionslösung
orangefarbene Öl
gelbes
Pulver
(3 ml) und
1
~
H20 (100 ml)
MgS04 getrocknet,
filtriert und in
Et20
versetzt und
(Kieselgel-i/,
rf
=
3 cm, /
(m, 4 H, D-NH(CH2)2(C#2)2CH3);
J
=
7.0, 2 H,
2.41
(s,
3
H,
D-NHC#2(CH2)3CH3);
F1-C(7)CH3);
3.34
(rf,
J
=
1 H,
D-CH); 3.92 (q, J
=
7.1, 2 H,
=
20 cm;
(CHC13): 3333m, 3222m,
IR
2.50
16.5,
(quint.,
1.37
1
(s,
3
H,
F1-N(3)C//2CH3);
J
TI-NMR
=
=
7.0, 2 H, D-
H, N(1/8)C#H);
4.01
(m,
1
1
(500
7.0, 3 H, Fl-
F1-C(8)CH3);
16.5, 1 H, N(8/1)C#H); 3.49 (m, 2 H, F1-N(10)CH2C#2); 3.63 (m,
(m,
filtriert.
(41 mg, 39%).
MHz, (CD3)2SO): 0.85 (t, J= 7.0, 3 H, D-NH(CH2)4Gr73); 1.14 (t, J
NHCH2C#2(CH2)2CH3);
gerührt.
mmol) zugegeben.
1706s, 1650m, 1583m, 1550s, 1467m, 1339w, 1272m, 1017w, 928w.
1.24
10
ca.
verdünnt und mit
Smp.: 197-199 °C.
0.30.
mg,
wurde mit
des Rückstandes
DMF
wurde 2 h bei RT
1-Pentylamin (100
CHC13 (100 ml)
lieferte 84 als
Rf (CHCL/MeOH/HOAc 5:1:1)
mg, 0.15
Phase wurde über
Säulenchromatographische Reinigung
N(3)CH2C//3);
mmol) wurde
mmol) gegeben. Es wurde 10 min bei RT gerührt. Dann wurde eine
N(3)-Ethyl-Flavinethylamin 70 (55
Tropfen NEt3 (~
Zu dem in DMF
3.02
3.44
(rf,
(q,
/
=
H, D-CH); 3.64
H, D-CH); 4.11 (m,
1 H,
D-CH); 4.12 (rf,
4.58
(m, 1 H, Fl-N(IO)ŒH); 4.74 (m, 1 H, Fl-N(lO)CHtf); 7.90 (s, 1 H, F1-C(9)H);
7.92 (t, J
=
7=
16.3,
1
H, N(1/8)CH#); 4.13 (d, J
=
16.3, 1 H, N(8/1)CH#);
7.0, 1 H, D-CONH); 7.96 (s, 1 H, F1-C(6)H); 8.25 (t, J
CONH); 10.39 (s,
1 H,
D-NH);
10.42
(s,
1
=
7.0, 1 H, D-
H, D-NH). "C-NMR (125 MHz, (CD3)2SO):
216
6.
Experimenteller Teil
12.89; 13.87; 18.74; 20.82; 21.79; 28.52; 28.75; 35.74; 35.96; 38.19; 38.51; 38.69;
42.99; 48.08; 48.14; 54.49; 55.35; 116.04; 130.95; 131.09; 134.13; 135.95; 136.28;
146.75; 149.11; 152.39; 152.42; 154.73; 159.17; 166.95; 167.14; 167.55; 168.40. FABMS: 705
(100, [M+H]+); 479 (24).
[M+H]+: 705.3109; gef: 705.3126.
HRMS ber. für
C33H40N10O8 (704.75).
o
o
HN-^-V^NH
•^-"T^nH
H
85
l-(((Pentyl)-aminocarbonyl)-methyl)-8-(((2-(3-ethyl-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin-2,4(3H,10H)-dion-10-yl)-ethyl)-aminocarbonyl)-methyl)-cis-4a-cisoid-4a,4b-cis-4bdodecahydro-4a,4b-dimethyl-2,4,5,7-tetraoxocyclobuta[1,2-d:4,3-d'']dipyrimidin
Die
Thymin-Modellverbindung
84
Modellverbindung
wurde das
wurde
3 cm, l
20 cm;
mg,
wurde in
Analogie
Statt dem
synthetisiert.
c/s-syn-Carboxymethyl-thymindimer
Rohprodukt
=
85
=
aus
MeOH/Et^O gefällt
CHCL/MeOH
7.5:1
-
und
zur
(85).
oben beschriebenen
Uracil-
cz's-syrc-Carboxymethyl-uracildimer
52
(55 mg, 0.15 mmol) eingesetzt.
41
Das
säulenchromatographisch (Kieselgel-//
,
rf
5:1) gereinigt. 85 wurde als gelbes Pulver (38
35%) erhalten.
Rf (CHCL/MeOH 10:1)
0.22.
Smp.:
240-242 °C.
IR
(KBr): 3430m, 3211m, 3078w,
2933w, 2856w, 1704s, 1650s, 1584m, 1548s, 1465m, 1389w, 1282m, 1228m, 1017w,
928w, 806w. *H-NMR (500 MHz, (CD3)2SO): 0.86 (t, J
1.15 (t, J
=
7.0, 3 H, Fl-N(3)CH2Ctf3); 1.26 (m, 4 H,
=
7.1, 3 H,
D-NH(CH2)2(Gr72)2CH3);
1.31
(s,
D-NHCH2C#2(CH2)2CH3);
2.42
(s,
3
H, D-CH3); 1.36 (s, 3 H, D-CH3); 1.37 (m
3
H, F1-C(7)CH3); 2.52 (s, 3 H, F1-C(8)CH3); 3.05 (m, 2 H,
,
2
H,
D-NH(CH2)4C#3);
D-NHCr72(CH2)3CH3);
3.34
(m, 1 H, D-CH); 3.49 (m, 2 H, F1-N(10)CH2C#2); 3.79 (rf, /= 5.2, 1 H, N(1/8)C#H);
3.87 (rf, J
=
5.2,
N(3)C//2CH3);
1
H, N(8/1)C#H); 3.91 (m, 1 H, D-CH); 3.93 (q, J
4.15
(rf,
N(8/1)CH#); 4.61 (m,
/
1 H,
=
16.5,
1
H, N(1/8)CH#); 4.20
Fl-N(10)C/ffl);
4.73
217
(rf,
J
=
=
7.1, 2 H, Fl-
16.5,
1
H,
(m, 1 H, F1-N(10)CH#); 7.92 (s, 1 H,
6.
Experimenteller
F1-C(9)H);
7.93
Teil
(t,
J=
5.6, 1 H, D-CONH); 7.97 (s, 1 H, F1-C(6)H); 8.22 (t, J
=
6.0, 1
13C-NMR (125 MHz,
H, D-CONH); 10.36 (s, 1 H, D-NH); 10.39 (s, 1 H, D-NH).
(CD3)2SO): 12.82; 13.80; 18.06; 18.21; 18.66; 20.70; 21.72; 28.46; 28.66; 35.76; 35.88;
38.44; 42.91; 46.34; 46.57; 47.77; 47.84; 59.30; 59.61; 115.99; 130.87; 131.03; 134.09;
135.87; 136.15;
146.70;
170.47; 170.53.
FAB-MS: 733 (100,
149.05;
733.3422; gef: 733.3426.
151.96;
151.97;
166.96;
168.32;
HRMS ber. für
[M+H]+:
154.61;
[M+H]+); 507 (13).
159.07;
C35H44N10O8 (732.80).
l-(((Pentyl)-aminocarbonyl)-methyl)-8-(((2-(3-ethyl-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin-2,4(3H,lOH)-dion-10-yl)-ethyl)-aminocarbonyl)-methyl)-cis-4a-transoid-4a,4b-cis-4b-
dodecahydro-4a,4b-dimethyl-2,4,5,7-tetraoxocyclobuta[l,2-d:4,3-d']dipyrimidin
Die
^rans-syn-konfigurierte Thymin-Modellverbindung
konfigurierten
Thymin-ModeU Verbindung
Carboxymethyl-Thymindimer 52
thymindimer
gefällt
und
53
wurde
85
das
(55 mg, 0.15 mmol) eingesetzt.
Rf (CHCl3/MeOH 10:1)
0.28.
analog
Statt
cis-syn-
zur
dem
cis-syn-
entsprechende fr-ans-syn-CarboxymethylDas
wurde als
Rohprodukt
rf
,
=
3 cm, l
gelbes
200-202 °C.
Smp.:
wurde
synthetisiert.
säulenchromatographisch (Kieselgel-i?
7:1) gereinigt. Die Modellverbindung 86
86
(86).
Pulver
=
wurde
aus
20 cm;
(35
mg,
MeOH/E^O
CHCL/MeOH
32%)
erhalten.
IR (KBr): 3430m, 3200m, 3078w,
2956w, 2922w, 2856w, 1700s, 1650s, 1578m, 1548s, 1473m, 1406w, 1372w, 1355m,
1289m, 1224m, 1150w, 1094w, 933w.
7.1, 3 H,
CH3);
D-NH(CH2)4C#3);
1.23
H,
1.16 (t, /= 7.1, 3 H,
F1-N(3)CH2C#3);
(m, 4 H, D-NH(CH2)2(C#2)2CH3); 1.27 (s,
NHCH2C#2(CH2)2CH3);
2
XH-NMR (500 MHz, (CD3)2SO): 0.86 (t,
2.41
D-NHCH2(CH2)3CH3);
H, D-CH); 3.73
(rf,
J
=
(s,
3.48
16.6,
3
H,
(q,
1
J
F1-C(7)CH3);
=
6.9,
2 H,
3
(s,
H, D-CH3); 1.38 (m
2.51 (s, 3 H,
,
F1-C(8)CH3);
F1-N(10)CH2C#2);
H, D-N(1/8)CHH); 3.85 (rf, /
218
1.20
J
=
3
H, D-
2
H, D-
3.02
(m,
3.65 (rf, /= 8.2, 1
=
16.6,
1
H,
D-
6.
N(8/1)CHH);
3.97
=
(rf,
7=
(rf,
3.87
16.5,
1
7=
8.2, 1 H, D-CH); 3.93 (q, J
H, D-N(1/8)C//H);
Experimenteller Teil
7.1, 2 H,
=
4.00 (rf, /= 16.5, 1 H,
F1-N(3)C#2CH3);
D-N(8/1)C#H);
4.63 (t, J
6.9, 2 H, F1-N(10)CH2); 7.87 (t, J= 5.8, 1 H, D-CONH); 7.92 (s, 1 H, F1-C(9)H);
7.93
(s, 1 H, F1-C(6)H); 8.25 (t, J
(s, 1 H, D-NH).
=
6.0, 1 H, D-CONH); 10.46 (s, 1 H, D-NH); 10.50
13C-NMR (125 MHz, (CD3)2SO): 12.82; 13.80; 18.71; 20.70; 20.83
21.16; 21.73; 28.47; 28.59; 35.45; 35.83; 38.52; 42.93; 45.38; 45.40; 45.59; 49.13
63.77; 63.87; 115.98; 130.86; 131.03; 134.03; 135.93; 136.05; 146.69; 148.76; 151.22
151.44; 154.52; 159.07; 167.63; 168.98; 170.73; 170.79.
507
(100); 480 (10);
338
(9).
HRMS ber.
FAB-MS: 733
(26, [M+H]+)
[M+H]+: 733.3422; gef:
für
733.3423.
C35H44N10O8 (732.80).
N' t
0
H
3 T "°
H
|
H
N
V
o
125
BnO
l-(((2-(8-Benzyloxy-3-pentyl-5-carba-5-desaza-benzo[G]pteridin-2,4-(3H,10H)-dion-10-
yl)-ethyl)-aminocarbonyl)-methyl)-8-(((2-(3-pentyl-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin-2,4(3H,lOH)-dion-10-yl)-ethyl)-aminocarbonyl)-methyl)-cis-4a-cisoid-4a,4b-cis-4b-
dodecahydro-2,4,5,7-tetraoxocyclobuta[l,2-d:4,3-d']dipyrimidin (125).
(5 ml) gelösten cis-syn- 1-Carboxymethyluracildimer
(300
mg, 0.646
mmol) gegeben.
Dann wurde eine
Lösung
DMF
ca.
(3 ml) und
gerührt.
wurde die
Die
Das
Uberschuss
(3 ml) zugegeben
Reaktionslösung
gewaschen.
eingeengt.
DMF
organische
(100
Lösung
mit
1.5 ml)
an
99
zugegeben.
(150
und weitere 30 min bei RT
Phase wurde über
aus
verdünnt und mit
säulenchromatographisch (Kieselgel-//
219
,
rf
=
gefällt.
3 cm,
mg, 0.32
113
gerührt.
BOP
gerührt.
mmol) in
(230
mg, 0.42
Anschliessend
H20 (100 ml)
MgS04 getrocknet,
CHCL/Ether
mmol) wurde
Es wurde 30 min bei RT
Aminoethyldesazaflavin
CHC13 (100 ml)
Rohprodukt wurde
mg, 0.30
wurde 10 min bei RT
N(3)-Pentyl-aminoethylflavins
Tropfen NEt3 (~
Danach wurde ein
mmol) gelöst in
wurde
15
des
Die entstandene
41
Zu dem in DMF
dreimal
filtriert und in
vacuo
Der abfiltrierte Rückstand
/
=
25
cm;
CHCL/MeOH
6.
Experimenteller Teil
7.5:1—>5:1) gereinigt.
wurde als
Die Flavin- und Desazaflavin-enthaltende
orangefarbenes Pulver (53
Rf (CHCL/MeOH/HOAc 5:1:1)
16%)
mg,
0.44.
125
erhalten.
>250 °C.
Smp.:
Modellverbindung
IR
(KBr): 3414m, 3064w, 295Iw,
2862w, 1700s, 1647s, 1605s, 1584m, 1538s, 1462m, 1410w, 1252m, 1228m, 1017w,
798w. 'H-NMR (500 MHz,
(CD3)2SO):
0.84
7.0, 3 H, Pentyl-CH3); 1.28 (m, 8 H, 4
2.37
(s, 3 H, F1-C(7)CH3); 2.48 (s,
3.51
dFl-N(10)CH2Cr72);
N(8/1)C//H); 3.63 (m,
2
(rf,
J=
H, 2
x
3
(t,
J
=
7.0, 3 H, Pentyl-CH3); 0.86 (t, J
Pentyl-CH2);
x
1.55
(m,
4 H, 2
16.7,
1
H, D-N(1/8)C//H); 3.57 (rf, 7= 16.7, 1 H, D-
D-CH); 3.85 (m, 4 H,
2
H, 2
x
2
Pentyl-CH2);
x
D-CH); 4.19 (rf,
/
=
N(8/l)CHtf); 4.58 (m, 2 H, Fl-N(10)Ci7H, dFl-N(10)C/fH); 4.69
2.0, J
=
5.44
Pentyl-CH2);
H, F1-C(8)CH3); 3.45 (m, 4 H, F1-N(10)CH2C#2,
16.5, 1 H, D-N(1/8)CH7/); 4.14 (m,
N(10)CH#, dFl-N(10)CH#);
x
=
(rfrf,
J=
12.2, J
=
16.4,
(rf,
4.13
16.5,
(m,
1
2
J
H, DH,
Fl-
H, Bn-CH2); 7.21 (rfrf, /
2
=
=
8.9, 1 H, dFl-C(7)H); 7.37 (m, 1 H, C(ar)H); 7.44 (m, 2 H, C(ar)H); 7.54 (m, 2
H, C(ar)H); 7.80 (s, 1 H, C(ar)H); 7.89 (s, 1 H, F1-C(9)H); 7.91 (s, 1 H, F1-C(6)H);
8.11
(rf,
/
=
8.9, 1 H, dFl-C(6)H); 8.34 (t, J
D-CONH); 8.91 (s,
NMR
1
=
6.0, 1 H, D-CONH); 8.59 (t, J
=
5.8, 1 H,
H, dFl-C(5)H); 10.46 (s, 1 H, D-NH); 10.48 (s, 1 H, D-NH).
13C-
(125 MHz, (CD3)2SO): 13.72; 13.75; 18.62; 20.72; 21.76; 21.77; 26.89; 27.00;
28.51; 28.56; 35.38; 35.59; 38.80 (2C); 40.10; 40.78; 42.76; 42.77; 48.04; 48.19; 54.84;
55.06; 70.28; 99.56; 111.28; 115.12; 115.89; 115.99;
127.88
130.79; 130.97;
133.58;
134.02;
135.79;
135.81;
136.10;
141.90;
142.39;
146.61;
148.88; 152.35;
152.42;
154.74;
155.67;
155.96;
159.20;
161.35;
164.40;
167.23;
167.25; 168.36; 168.79.
HRMS ber. für
FAB-MS: 1093
(2C); 128.15; 128.52 (2C);
(100, [M+H]+); 585 (12); 508 (6); 473 (25).
[M+H]+: 1092.4691; gef: 1092.4690. C56H61N13On (1092.19).
220
6.
Experimenteller
Teil
l-(((2-(8-Hydroxy-3-pentyl-5-carba-5-desaza-benzo[G]pteridin-2,4-(3H,10H)-dion-10yl)-ethyl)-aminocarbonyl)-methyl)-8-(((2-(3-pentyl-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin-2,4(3H,10H)-dion-10-yl)-ethyl)-aminocarbonyl)-methyl)-cis-4a-cisoid-4a,4b-cis-4b-
dodecahydro-2,4,5,7-tetraoxocyclobuta[l,2-d:4,3-d']dipyrimidin (126).
125
Modellverbindung
Suspension
Die
aus
wurde die
benzylierte
(20 mg, 0.018 mmol) wurde bei RT in HOAc (5 ml) gelöst.
10% Palladium auf
Reaktionsmischung
Die
BaS04 (5 mg)
in HOAc
(0.5 ml) wurde zugegeben.
wurde während 30 h bei RT unter
Reaktionslösung
durch Celite filtriert und in
vacuo
Eine
H2 heftig gerührt.
eingeengt.
Danach
Das resultierende
Öl wurde mittels präparativer RP-HPLC (Säule: Nucleoprep 100-12 C-18; Gradient: 0-50
min
100%^0% A / 0%^100% B; 50-60 min 0%^100% A / 100%^0% B
H20(1% TFA)
/B
wurde in Form eines
Smp.:
CH3CN);
=
253-255 °C.
Flussrate: 5 ml
gelbgrünen
IR
Pulvers
min"1; Rt (126)
35 min)
=
gereinigt.
C(7)CH3);
2.49
x
(m, 2 H, 2
=
x
D-CH);
3.85
1
1.55
(m, 4 H, 2
(m, 4 H, 2
3.42
4.15
x
(rf,
0.86 (t, J
Pentyl-CH3);
dFl-N(10)CH2C#2);
16.6, 1 H, D-N(1/8)CH#);
(m,
7.0, 3 H,
(s, 3 H, F1-C(8)CH3);
N(10)CH2, dFl-N(10)CH2);
1
=
Pentyl-CH2);
H, Fl-N(10)CH2C//2,
(rf, /
3.49
=
=
6.83 (m, 1 H,
8.44
(t,J= 5.6,
1
=
JH-NMR (500
7.0, 3 H, Pentyl-CH3);
Pentyl-CH2);
2.39
(s, 3 H, Fl-
16.8, 1 H, D-N(1/8)C7/H); 3.45 (m, 4
(d,
Pentyl-CH2);
J
x
J
16.8,
=
1
H, D-N(8/1)CHH); 3.63
4.09 (m, 2 H, 2
x
D-CH);
4.13
16.6, 1 H, D-N(8/l)CHif>; 4.60 (m,
dFl-C(7)H); 7.03 (m,
H, dFl-C(6)H); 7.92 (s, 1 H, F1-C(9)H); 7.93 (s,
H, D-CONH);
126
(KBr): 3436s, 2952w, 2922w, 2856w, 1700m, 1628m, 1600m,
MHz, (CD3)2SO): 0.85 (t, J
(m, 8 H, 4
=
(18 mg, 99%) erhalten.
1578m, 1546s, 1467m, 1267m, \222w, \20lw, 1182w, 1156w, 1028w.
1.30
(A
1
1 H,
4
(rf, J
H, Fl-
dFl-C(9)H);
7.88
H, F1-C(6)H); 8.40 (t, J= 5.8,
H, D-CONH); 8.69 (s, 1 H, dFl-C(5)H); 10.44 (s, 1
H, D-NH); 10.45 (s, 1 H, D-NH).
13C-NMR (125 MHz, (CD3)2SO): 13.74; 13.76;
18.64; 20.76; 21.78 (2C); 26.91; 27.08; 28.51; 28.59; 35.54; 35.55; 38.53; 39.00; 40.15;
221
6.
Experimenteller Teil
40.77; 42.82; 42.83; 47.98; 47.99; 54.69; 55.04
100.75;
108.20
114.70;
115.91
130.86; 130.96;
133.84;
134.04;
135.79;
135.80
136.16;
140.90
143.80;
146.60
148.91; 152.32;
152.39;
154.77;
155.87;
155.88
159.26;
161.73
163.90;
167.17
167.32; 168.05; 168.34.
474 (11); 338
FAB-MS: 1002 (100,
(69). HRMS
ber. für
[M+H]+); 676 (14);
508
(10);
[M+H]+: 1002.4222; gef: 1002.4220.
491 (10)
C49H55N13On
(1002.07).
l-((2S-2-(2S-2-(((8-benzyloxy-3-pentyl-5-carba-5-desaza-benzo[G]pteridin-2,4-
(3H,10H)-dion-10-yl)-ethyl)-aminocarbonyl)-pyrrolidin-l-yl)-aminocarbonyl-pyrrolidin-lyl)-methyl)-8-(((2-(3-pentyl-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin-2,4-(3H,10H)-dion-10-yl)ethyl)-aminocarbonyl)-methyl)-cis-4a-cisoid-4a,4b-cis-4b-dodecahydro-2,4,5,7tetraoxocyclobuta[l,2-d:4,3-d']dipyrimidin (130).
Carboxymethyluracildimers (41,
0.452 mmol)
gegeben
70 mg, 0.21
Zu
mmol)
und 10 min bei RT
einer
in DMF
gerührt.
Lösung
Uberschuss
aus
zugegeben und
in
vacuo
Diese
Lösung
Aminoethylflavin
70
Dann wurde
weitere 90 min bei RT
auf etwa 15 ml
eingeengt
wurde 90 min bei RT
(100
mg,
eine
gerührt.
mmol) gelöst
des
Lösung
zusammen
Anschliessend wurde die
gerührt.
und mittels
0.29
cis-syn-]-
(8 ml) wurde BOP (210 mg,
Desazaflavinderivates 121 (130 mg, 0.21 mmol) in DMF (7 ml)
Tropfen NEt3 zugegeben.
des
mit
ca.
15
Dann wurde ein
in
DMF
(5 ml)
Reaktionslösung
präparativer HPLC (Säule: Nucleoprep
100-
12 C-18; Gradient: 0-5 min 100%-*25% A / 0%^75% B; 5-40 min 25%^0% A /
75%^100% B; 40-50 min 0%^100% A / 100%^0% B (A
CH3CN);
Flussrate: 5 ml
min"1; Rt (130)
wurde als
orangefarbenes
Pulver
=
30
=
H20(1% TFA)
/ B
=
min) gereinigt. Die Modellverbindung 130
(60 mg, 32%, Gemisch
222
aus
2
Diastereomeren)
erhalten.
6.
Smp.:
232-234 °C.
IR
Experimenteller
(KBr): 3423s, 3061w, 2961w, 2878w, 1700s, 1646s, 1606s,
1585m, 1537s, 1459m, 1417w, 1372w, 1333w, 1254m, 1228m, 1189w, 1017w.
(24, [M+H]+);
MS: 1231
Teil
(8); 676 (29);
1013
338
(100).
HRMS ber. für
FAB-
[M+H]+:
1231.4709; gef: 1231.4707. C60H62N16O14 (1231.26).
l-((2S-2-((2S-2-((2S-2-((2S-2-(((8-benzyloxy-3-pentyl-5-carba-5-desaza-
benzo[G]pteridin-2,4-(3H,10H)-dion-10-yl)-ethyl)-aminocarbonyl)-pyrrolidin-l-yl)aminocarbonyl)-pyrrolidin-l-yl)-aminocarbonyl)-pyrrolidin-l-yl)-aminocarbonyl)pyrrolidin-l-yl)-methyl)-8-(((2-(3-pentyl-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin-2,4-(3H,10H)-
dion-10-yl)-ethyl)-aminocarbonyl)-methyl)-cis-4a-cisoid-4a,4b-cis-4b-dodecahydro2,4,5,7-tetraoxocy clobuta[l,2-d:4,3-d'jdipyrimidin (132).
gelösten cis-syn- 1-Carboxymethyluracildimers
mg, 0.581
Lösung
mmol) gegeben.
Lösung
des Desazaflavinderivates 122
Tropfen NEt3 zugegeben.
Uberschuss
zugegeben
vacuo
Die
an
Es
mg, 0.27
dem
in
DMF
gerührt.
mg,
RT
0.37
gerührt.
Dann wurde eine
mmol) gelöst in
präparativer
ca.
Danach wurde
gerührt.
Anschliessend wurde die
und mittels
(6 ml)
mmol) wurde BOP (270
(220 mg, 0.27 mmol) in DMF (5 ml) und
wurde 90 min bei
und weitere 3 h bei RT
eingeengt
(90
wurde 10 min bei RT
Aminoethylflavin 70 (130
auf etwa 10 ml
41
Zu
RP-HPLC
DMF
20
ein
(5 ml)
Reaktionslösung
in
(Säule: Nucleoprep
100-12 C-18; Gradient: 0-5 min 100%-^25% A / 0%^75% B; 5-40 min 25%^0% A /
75%-^100% B; 40-50 min 0%^100% A / 100%^0% B (A
CH3CN);
Flussrate: 5 ml
min"1; Rt (132)
wurde als
orangefarbenes
Pulver (5 mg, 1%, Gemisch
Smp.:
266-268 "C.
IR
=
37
=
H20(1% TFA)
/ B
=
min) gereinigt. Die Modellverbindung 132
aus
2
Diastereomeren) erhalten.
(KBr): 3450s, 2967w, 2878w, 1700s, 1629s, 1583s, 1546s,
1455m, 1428w, 1367w, 1336m, 1261w, 1229s, 1056w, 1017w, 922w.
223
FAB-MS: 1426
6.
Experimenteller Teil
(33, [M+H]+); 411 (19); 338 (69); 165 (100).
[M+H]+: 1425.5765; gef:
HRMS ber. für
C70H76N18O16 (1425.50).
1425.5790.
l-(((Pentyl)-aminocarbonyl)-methyl)-8-(((2-(3-((([2-(8-benzyloxy-3-pentyl-5-carba-5desaza-benzo[GJpteridin-2,4-(3H,10H)-dion-10-yl)-ethyl])-aminocarbonyl)-methyl)-7,8dimethyl-benzo[G]pteridin-2,4-(3H,lOH)-dion-10-yl)-ethyl)-aminocarbonyl)-methyl)-cis4a-cisoid-4a,4b-cis-4b-dodecahydro-2,4,5,7-tetraoxocyclobuta[l,2-d:4,3-d']dipyrimidin
(128).
Die Flavin-und Desazaflavin-enthaltende
wurde in DMF
(6 ml) gelöst.
20 min bei RT
eingeengt
Eine
mmol) und
Lösung
(150
BOP
Dann wurde eine
10
Anschliessend wurde
gerührt.
Es wurde mit
organische
mit einem
CHC13 (100 ml)
wurde
aus
Reinigung (Kieselgel-#
Modellverbindung
mmol)
in DMF
an
rf
(6 ml)
(93
in
am
vacuo
verdünnt und mit
und
3
cm,
/
128 als oranges Pulver
20
=
(28
mg,
224
versetzt und weitere 2 h
filtriert.
0.15
gerührt.
Anschliessend wurden die
dreimal
filtriert und in
cm;
mg,
mmol) in DMF (5 ml) und
H20 (100 ml)
MgS04 getrocknet,
=
gerührt.
scharf
Hochvakuum
wurde 10 min bei RT
mg, 0.122
1-Pentylamin
CHC13/Et20 gefällt
,
Reaktionslösung
(93 mg, quant.)
und 30 min bei RT
Uberschuss
Phase wurde über
Rohprodukt
115
des freien Amins 115
Tropfen NEt3 zugegeben
Reaktionslösung
die
cis-syn- 1-Carboxymethyluracildimers 41 (50
des
mg, 0.323
Lösung
114 (120 mg, 0.122 mmol)
Dimethylamin in H20 (2 ml) zugegeben und
und das verbleibende freie Amin
getrocknet.
ca.
Es wurden 40%
Verbindung
vacuo
gerührt.
gewaschen.
Die
eingeengt.
Das
Säulenchromatographische
CHCL/MeOH 10:1->7:1) ergab
20%).
6.
Rf (CHCl3/MeOH 10:1)
0.19.
Smp.:
227-229 °C.
IR
Experimenteller Teil
(KBr): 3436s, 3078w, 2950w,
2933w, 2856w, 1689s, 1644s, 1604s, 1578m, 1538s, 1463m, 1406w, 1372w, 1247m,
'H-NMR (500 MHz, (CD3)2SO): 0.84 (t, J
1228m, 121 lw, 1183w, 1156w, 1017w.
7.1, 3 H, Pentyl-CH3); 0.86 (t, J= 7.1, 3 H, Pentyl-CH3); 1.25 (m, 8 H, 4
CH2);
2.55
1.36
(s,
3
(m,
2 H,
Pentyl-CH2);
H, F1-C(8)CH3); 3.00 (q, J
N(1/8)C#H); 3.46 (m,
3.50
4.05
N(1/8)CHH);
1
2
(m,
1
(rf,
7
4.15
Bn-CH2);
C(ar)H);
(rf,
7.48
CONH); 7.97 (s,
C(6)H);
1
H, Pentyl-CH2); 2.44 (s,
2
6.9, 2 H, Pentyl-CH2);
3.38
3
(rf,
Pentyl-
H, F1-C(7)CH3);
/
16.5, 1 H,
=
D-
H, F1-N(10)CH2Œ2); 3.47 (rf, 7= 16.5, 1 H, D-N(8/l)CflH);
2
x
D-CH); 3.84 (t,
H, D-CH); 4.11 (m, 1 H, D-CH); 4.13 (rf, /
=
J
=
7.3, 2 H,
16.4, 1 H,
D-
16.4, 1 H, D-N(8/l)CHfl); 4.52 (s, 2 H, F1-N(3)CH2); 4.63
=
H, Fl-N(IO)CHH); 4.64 (m, 2 H, dFl-N(10)CH2); 4.74 (m, 1 H, Fl-N(lO)CHfl);
5.40 (s, 2 H,
(s,
=
(m,
(m, 2 H, dFl-N(10)CH2C#2); 3.65 (m, 2 H,
Pentyl-CH2);
(m,
1.54
x
=
8.34
7
=
7.23
6.9,
1 H,
2
(rfrf,
1
=
2.0, 7
=
8.9, 1 H, dFl-C(7)H); 7.31 (m, 3 H,
H, C(ar)H); 7.77 (s, 1 H, C(ar)H); 7.92 (f, 7
F1-C(9)H);
(t, J= 5.8,
7
8.00
(s,
=
5.6, 1 H,
D-
H, F1-C(6)H); 8.14 (rf, 7= 8.9, 1 H, dFl-
1
H, D-CONH); 8.61 (f, 7
=
5.8, 1 H, Fl-N(3)CH2CON7/); 8.93
H, dFl-C(5)H); 10.39 (s, 1 H, D-NH); 10.43 (s, 1 H, D-NH).
13C-NMR (125
MHz, (CD3)2SO): 13.76; 13.78; 18.70; 20.82; 21.70; 21.77; 26.99; 28.43; 28.55; 28.66;
35.30; 35.69; 38.27; 38.40; 38.93; 40.08; 42.92; 43.04; 43.78; 48.04; 48.16; 54.55;
55.17; 70.29; 99.49; 111.23; 115.20; 115.98; 116.06; 128.12 (2C); 128.25; 128.37 (2C);
130.74; 131.09;
133.55;
134.06;
135.76;
136.13;
136.24;
141.95;
142.56;
147.11;
149.09; 152.31;
152.34;
154.53;
155.63; 155.90;
159.36;
161.40;
164.49;
166.87;
167.13; 167.44; 168.31; 168.38.
910 (18).
HRMS
ber.
für
FAB-MS:
[M+H]+:
1172(19, [M+Naf); 1149 (100, [M+H]+);
1149.4906;
(1149.24).
225
gef:
1149.4899.
C58H64N14012
6.
Experimenteller Teil
8-(((2-(8-Benzyloxy-3-pentyl-5-carba-5-desaza-benzo[G]pteridin-2,4-(3H,l0H)-dion-10yl)-ethyl)-aminocarbonyl)-methyl)-l-(((2-(3-(((2-(indol-3-yl)-ethyl)-aminocarbonyl)methyl)-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin-2,4-(3H,10H)-dion-10-yl)-ethyl)-aminocarbonyl)methyl)-cis-4a-cisoid-4a,4b-cis-4b-dodecahydro-2,4,5,7-tetraoxocyclobuta[l,2-d:4,3Zu einer
d']dipyrimidin (134).
mg, 0.30
mmol)
10 min bei RT
mmol)
0.31
min bei RT
mg, 0.42
in DMF
gerührt.
(4 ml)
gerührt.
vacuo
cm;
ca.
10
Lösung
mg, 0.646
des Flavin-Indol-Derivats 106
DMF
Die
Das
134 wurde
Phase wurde über
Rohprodukt
Reaktionslösung
CHC13 (100 ml)
wurde
verdünnt und mit
CHC13/Ether
säulenchromatographisch (Kieselgel-//,
CHCL/MeOH 7:1—>5:1) gereinigt
und
als
orangefarbenes
(150
mg,
rf
Pulver
113
(230
nochmals 40
MgS04 getrocknet,
aus
(100
Es wurden weitere 30
Aminoethyldesazaflavin
und die
(5 ml) zugegeben
organische
an
41
Es wurde
mmol) gegeben.
Tropfen NEt3 zugegeben.
Anschliessend wurde mit
eingeengt.
Modellverbindung
und
(300
Danach wurde ein Uberschuss
ml) dreimal gewaschen.
in
cis-syn- 1-Carboxymethyluracildimers
wurde BOP
(7 ml)
mmol) gelöst in
min bei RT
des
Dann wurde eine
gerührt.
in DMF
Lösung
H20 (100
filtriert und
Die
gefällt.
=
3 cm, l
(58
mg,
=
27
16%)
erhalten.
Rf (CHCl3/MeOH 10:1)
0.05.
Smp.:
201-203 °C.
IR
(KBr): 3414m, 3067w, 2956w,
2867w, 1700-1620s, 1603s, 1582m, 1540s, 1463m, 141 lw, 1372w, 1250m, 1234m,
1211w, 1189w, 1161iv, 1128W, 1022w, 747w.
(t,
J= 7.1, 3
(m,
2
Ti-NMR
(500 MHz, (CD3)2SO): 0.86
H, dFl-N(3)(CH2)4C/73); 1.29 (m, 4 H, dFl-N(3)(CH2)2(Ctf2)2CH3); 1.54
H, dFl-N(3)CH2C772(CH2)2CH3); 2.40 (s, 3 H, F1-C(7)CH3); 2.50 (s, 3 H, Fl-
C(8)CH3);
2.80 (t, J
=
7.4, 2 H, Ind-CH2); 3.34 (m, 2 H, dFl-N(10)CH2C7T2); 3.42 (m, 2
H, Fl-N(10)CH2C/72); 3.43 (m, 1 H, Ind-CH2C7/H); 3.47 (rf, 7
226
=
16.7,
1
H,
D-
6.
N(1/8)C#H); 3.56 (m,
(m,
2
H, 2
1 H,
Ind-CH2CH//);
D-CH); 3.86 (t,
x
CH); 4.13 (rf,
7=
16.7,
1 H,
7
7.1, 2 H,
=
3.60
(rf,
7
=
16.7,
1
Experimenteller
H, D-N(8/1)C7/H); 3.62
dFl-N(3)C#2(CH2)3CH3);
D-N(1/8)CH//); 4.17 (m,
1
Teil
4.07 (m, 1 H, D-
H, D-CH); 4.19 (rf, 7
=
16.7,
1
H, D-N(8/1)CH#); 4.51 (s, 2 H, F1-N(3)CH2); 4.59 (m, 1 H, Fl-N(lO)CtfH); 4.65 (m, 1
H, F1-N(10)CH#); 4.70 (m, 2 H, dFl-N(10)CH2); 5.43 (s, 2 H, Bn-CH2); 6.93 (rff, 7
1.0, 7
=
7.0, 1 H, Ind-C(ar)H);
7.02
(dt,
J
=
1.0,
7
=
7.0, 1 H, Ind-C(ar)H); 7.14 (rf, 7
=
=
2.0, 1 H, Ind-C(ar)H); 7.23 (rfrf, 7= 2.0, J= 8.9, 1 H, dFl-C(7)H); 7.29 (m, 1 H,
C(ar)H); 7.36 (m,
1
1
H, C(ar)H); 7.42 (m, 2 H, C(ar)H); 7.51 (m, 3 H, C(ar)H); 7.79 (s,
H, C(ar)H); 7.94 (s, 1 H, F1-C(9)H); 7.98 (s, 1 H, F1-C(6)H); 8.12 (rf, 7= 8.9, 1 H,
dFl-C(6)H);
8.59
(t,
J
=
8.19
5.6,
(t,J=5.1,
1
1
H, Fl-N(3)CH2CONr7); 8.36 (t, J
H, D-CONH); 8.92 (s,
(s, 1 H, D-NH); 10.79 (rf, 7
=
2.0,
1
1
=
5.9, 1 H, D-CONH);
H, dFl-C(5)H); 10.45 (s, 1 H, D-NH); 10.47
13C-NMR (125 MHz, (CD3)2SO):
H, Ind-NH).
13.76; 18.65; 20.77; 21.77; 25.01; 27.01; 28.55; 35.36; 35.79; 38.56; 38.94; 39.70;
40.11; 42.76; 43.11; 43.56; 48.16; 48.28; 54.84; 55.04; 70.27; 99.61; 111.19; 111.27;
111.54; 115.15; 115.90; 116.01; 118.04; 118.08; 120.73; 122.57; 127.05;
127.89 (2C);
128.14; 128.52 (2C); 130.83; 131.06; 133.58; 134.12; 135.82; 136.01; 136.08; 136.12;
141.94; 142.41;
161.38;
164.42;
[M+Na]+);
1222
147.04;
166.57;
149.12;
167.20;
(100, [M+H]+);
1221.4780; gef: 1221.4785.
152.30;
152.39;
167.33;
1063
154.62;
168.36;
155.71;
168.79.
(12); 638 (7); 585 (29).
C63H63N15012 (1222.30).
227
155.95;
159.26;
1245
(19,
HRMS ber. für
[M]+:
FAB-MS:
6.
Experimenteller Teil
6.3.5
der
Synthese
Spaltprodukte:
87
l-(((2-(3-Ethyl-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin-2,4-(3H,l0H)-dion-10yl)-ethyl)hydroxycarbonylj-methyl)-1,2,3,4-tetrahydro-2,4-dioxopyrimidin (87).
1-Carboxymethyluracil
DMF (3
ml)
mmol) in
bei RT
vacuo
DMF
mg, 0.588
gerührt.
Lösung
Anschliessend wurde mit
eingeengt.
Die
Das
organische
Nach
Beigabe des
wurde mittels
CHC13 (100 ml)
Phase wurde über
verbleibende
Öl
Flavins 69
mg, 0.589
(185
wurde
MgS04 getrocknet,
aus
Das
Spaltprodukt
18 h
verdünnt und dreimal mit
und
E^O gefällt
Säulenchromatographie (Kieselgel-/7
CHCL/MeOH 10:1) gereinigt.
von
mmol) und BOP (300 mg, 0.646 mmol) in
(3 ml) wurden der Reaktionslösung 10 Tropfen NEt3 zugegeben und
extrahiert.
Rohprodukt
(100
wurde 10 min bei RT
gerührt.
(50 ml)
46
Eine
,
rf
=
H20
filtriert und in
filtriert.
3 cm, /
87 wurde als oranges Pulver
=
Das
15 cm;
(165
mg,
60%) erhalten.
Rf (CHCL/MeOH 10:1)
0.29.
Smp.:
190-192 °C.
IR
(CHC13): 1756m;, 1694s, 1650m,
1583m, 1550s, 1461w, 1339w, 1189w.
'H-NMR (400 MHz, (CD3)2SO): 1.16 (t, 7
7.0, 3 H,
F1-C(7)CH3);
(q, J
=
Fl-N(3)CH2Ci73);
2.41 (s, 3 H,
2.50 (s, 3 H,
F1-C(8)CH3);
7.0, 2 H, F1-N(3)C#2CH3); 4.39 (s, 2 H, M-N(1)CH2); 4.58 (t, J
N(10)CH2C/72);
4.94 (t, J
7.51 (rf, 7= 7.9,
11.29 (s, 1 H,
1 H,
=
=
=
3.93
5.3, 2 H,
Fl-
5.3, 2 H, F1-N(10)CH2); 5.00 (rf, 7= 7.9, 1 H, M-C(5)H)
M-C(6)H);
7.87
(s, 1 H, F1-C(9)H); 7.94 (s, 1 H, F1-C(6)H)
M-N(3)H). 1JC-NMR (100 MHz, (CD3)2SO): 12.85; 18.73; 20.62; 35.94
42.70; 48.27; 61.64; 101.03; 116.08; 130.95; 131.07; 134.03; 136.03; 136.20; 145.43
146.87; 149.15; 150.77; 154.70; 159.08; 163.48; 168.11.
447 (100); 391
(16);
371
(24).
HRMS ber.
C22H22N606 (466.46).
228
für
FAB-MS: 467
(33, [M+H]+)
[M+H]+: 467.1679; gef:
467.1676
6.
Experimenteller Teil
88
l-(((2-(3-Ethyl-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin-2,4-(3H,10H)-dion-10-yl)~ethyl)aminocarbonyl)-methyl)-l,2,3,4-tetrahydro-2,4-dioxopyrimidin (88).
Spaltprodukts
88
wurde statt des
(206
mg,
erfolgte
Analogie
Synthesevorschrift
zur
N(3)-Ethyl-Flavinethylalkohols
0.588
Rohprodukt
in
mmol) eingesetzt.
wurde mittels
das
69
Die Reaktionszeit
Darstellung des
für 87. Für die
Synthese
N(3)-Ethyl-Flavinethylamin 70
verkürzte sich
Säulenchromatographie (Kieselgel-H
CHCl3/MeOH 10:1) gereinigt.
Die
,
rf
=
auf 3
3 cm, /
h.
15 cm;
=
Das Uracilderivat 88 wurde als oranges Pulver
Das
(96
mg,
35%) erhalten.
Rt (CHCL/MeOH 10:1)
0.16.
Smp.:
265-267 °C.
1550s, \456w, 1339w, 1194m, 1118w, 1156w.
(t,
J
3.51
=
6.9,
(q,
J
3
=
H,
Fl-N(3)CH2Cr73);
2.41
IR
H-NMR (400 MHz, (CD3)2SO): 1.15
(s, 3 H, F1-C(7)CH3); 2.49 (s, 3 H, F1-C(8)CH3);
5.6, 2 H, Fl-N(10)CH2C7/2); 3.93 (q, J
(s, 2 H, M-N(1)CH2); 4.68 (t, 7= 5.6,
C(5)H); 7.44 (rf,
C(6)H); 8.37 (t,
7=
J
=
(CHC13): 1694s, 1650m, 1583m,
2
=
6.9, 2 H, F1-N(3)C#2CH3); 4.20
H, F1-N(10)CH2); 5.55 (rf, 7= 7.9, 1 H, M-
7.9, 1 H, M-C(6)H); 7.85 (s, 1 H, F1-C(9)H); 7.95 (s, 1 H, Fl-
5.6, 1 H, CONH); 11.25 (s, 1 H, M-N(3)H).
13C-NMR (100 MHz,
(CD3)2SO): 12.89; 18.75; 20.80; 35.97; 40.30; 42.91; 49.27; 100.70; 115.92; 130.93;
131.07; 134.14;
135.94;
163.81; 167.78.
FAB-MS: 466
ber. für
136.25;
[M+H]+: 466.1839; gef:
146.22;
146.79;
150.91; 154.71;
159.17;
(100, [M+H]+); 391 (13); 371 (28); 329 (11).
HRMS
466.1856.
149.14;
C22H23N705 (465.47).
229
6.
Experimenteller Teil
89
l-(((2-(3-Ethyl-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin-2,4-(3H,l0H)-dion-10-yl)-ethyl)aminocarbonyl)-methyl)-5-methyl-1,2,3,4-tetrahydro-2,4-dioxopyrimidin
Darstellung
des
1-Carboxymethylthymin
wurde mittels
89
erfolgte
Uracilderivat 88. Für die
entsprechende
46 das
Thyminderivats
55
in
Analogie
Synthese
Das
Spaltprodukt 89
Rf (CHCL/MeOH 10:1)
0.33.
Smp.:
,
=
3 cm, /
wurde als oranges Pulver
>300 °C.
IR
=
Das
15 cm;
Rohprodukt
CHCl/MeOH
(185 mg, 65%) isoliert.
(KBr): 3439s, 3056w, 2978w, 2933w,
1689s, 1639s, 1578m, 1546s, 1456w, 1383w, ]333w, \261w, 1227m, 1017w.
NMR (400 MHz,
(CD3)2SO):
1.16
(t,
J
=
7.0, 3 H,
Fl-N(3)CH2C//3);
1.75
H, F1-N(10)CH2C772); 3.94 (q, J
N(1)CH?);
4.69 (t, J
=
6.3,
2
=
=
6.3,
7.0, 2 H, F1-N(3)C#2CH3); 4.17 (s, 2 H, M-
H, F1-N(10)CH2); 7.28 (rf, 7= 1.1, 1 H, M-C(6)H); 7.86
(s, 1 H, F1-C(9)H); 7.96 (s, 1 H, F1-C(6)H); 8.35 (t,
H, M-N(3)H).
XH-
(rf, 7=1.1,3
H, M-C(5)CH3); 2.42 (s, 3 H, F1-C(7)CH3); 2.51 (s, 3 H, F1-C(8)CH3); 3.51 (q, J
2
das
1-Carboxymethyluracils
(110 mg, 0.590 mmol) eingesetzt.
rf
Die
Synthesevorschrift für
wurde statt des
Säulenchromatographie (Kieselgel-i/
10:1) gereinigt.
zur
(89).
7
=
6.0, 1 H, CONH); 11.27 (s, 1
13C-NMR (100 MHz, (CD3)2SO): 11.82; 12.83; 18.69; 20.73; 35.68
35.83; 42.84; 49.09; 108.12; 115.84; 130.88; 130.99; 134.05; 135.86; 136.15; 141.85
146.71; 149.03; 150.82; 154.61; 159.10; 164.32; 167.81. FAB-MS: 480 (100, [M+H]+)
338
(47);
227
(13).
HRMS ber. für
[M+H]+: 480.1995; gef:
(479.50).
230
480.1986.
C23H25N705
6.
Experimenteller
Teil
136
l-(((2-(3-Pentyl-7,8-dimethyl-benzo[G]pteridin-2,4-(3H,10H)-dion-10-yl)-ethyl)aminocarbonyl)-methyl)-l,2,3,4-tetrahydro-2,4-dioxopyrimidin (136).
der
Verbindung
wurde statt des
mg,
0.588
136
erfolgte
in
Analogie
N(3)-Ethyl-Flavinethylamins
mmol) eingesetzt.
(Kieselgel-7/,
zur
rf
=
3 cm, /
wurde als oranges Pulver
=
Das
15 cm;
(215
mg,
Rf (CHCl3/MeOH/AcOH 5:1:1)
Synthesevorschrift
70 das
Rohprodukt
für 88.
Die
Darstellung
Für die
N(3)-Pentyl-Flavinethylamin
wurde
Synthese
99
(275
mittels
Säulenchromatographie
CHCL/MeOH 10:1) gereinigt.
Das Uracilderivat 136
72%) erhalten.
0.55.
Smp.:
>250 °C.
IR
(KBr): 3421m, 3050w, 2943w,
2863w, 1715s, 1666s, 1612m, 1577m, 1543s, 1446w, 1379w, 1340m, 1249m, 1206w,
1013w,
•H-NMR (400 MHz,
807w.
N(3)(CH2)4CH3);
1.31
(m,
N(3)CH2C#2(CH2)2CH3);
(q,
J
=
6.0,
2
4
2.41
H,
(CD3)2SO):
0.87
(t,
Fl-N(3)(CH2)2(C7f2)2CH3);
J
=
1.59
6.9,
3
H,
Fl-
(m,
2
H,
Fl-
(s, 3 H, F1-C(7)CH3); 2.50 (s, 3 H, F1-C(8)CH3); 3.52
H, F1-N(10)CH2C#2); 3.94 (t, J= 7.0, 2 H, F1-N(3)C#2(CH2)3CH3); 4.21
(s, 2 H, M-N(1)CH2); 4.69 (t, J
C(5)H); 7.45 (rf,
C(6)H); 8.36 (t,
7=
=
6.0, 2 H, F1-N(10)CH2); 5.56 (rf, 7
7.9, 1 H, M-C(6)H); 7.85 (s,
7= 5.9, 1 H,
CONH); 11.25 (s,
1 H,
1 H,
=
7.9,
F1-C(9)H); 7.93 (s,
M-N(3)H).
1 H, M1
H, Fl-
13C-NMR (100 MHz,
(CD3)2SO): 14.71; 19.64; 21.69; 22.76; 27.88; 29.46; 36.89; 41.72; 43.78; 50.16;
101.62; 116.78;
131.77;
131.95;
135.01;
136.83;
137.06;
147.11;
147.69;
150.00;
151.82; 155.79; 160.22; 164.71; 168.68. FAB-MS: 508 (9, [M+H]+); 391 (100). HRMS
ber. für
[M+H]+: 508.2308; gef:
508.2308.
C25H29N705 (507.55).
231
6.
Experimenteller Teil
l-(((2-(8-Benzyloxy-3-pentyl-5-carba-5-desaza-benzo[G]pteridin-2,4-(3H,l0H)-dion-10yl)-ethyl)-aminocarbonyl)-methyl)-l,2,3,4-tetrahydro-2,4-dioxopyrimidin
(135).
Darstellung
Analogie
des
für das
Synthesevorschrift
wurde statt des
113
(320
N(3)-Pentyl-Flavinethylamins
0.588
mg,
in
erfolgte
entsprechende Flavin-Spaltprodukt 136.
mmol)
Desazaflavin-Spaltprodukt
R{ (CHCL/MeOH/AcOH 5:1:1)
99 das
eingesetzt.
Säulenchromatographie (Kieselgel-7/,
Das
135
Desazaflavin-Spaltprodukts
rf
=
=
15 cm;
Rohprodukt
Smp.:
Synthese
>250 °C.
IR
wurde
mittels
CHCl3/MeOH 10:1) gereinigt.
135 wurde als oranges Pulver
0.77.
zur
N(3)-Pentyl-Desazaflavinethylamin
Das
3 cm, /
Für die
Die
(240 mg, 70%) erhalten.
(KBr): 3431m, 3056w, 2956w,
2865w, 1691s, 1628s, 1605m, 1571w, 1537s, 1461w, 1383w, 1254m, 1128w, 1022w,
'H-NMR (400 MHz,
194w.
(m,
4
(q,
J=
4.32
(CD3)2SO):
0.87
(t,
J=
H, dFl-N(3)(CH2)2(CZf2)2CH3); 1.57 (m, 2 H,
6.9, 3 H,
dFl-N(3)(CH2)4Cr73);
1.30
dFl-N(3)CH2C/72(CH2)2CH3);
3.47
6.0, 2 H, dFl-N(10)CH2Ctf2); 3.87 (t, 7= 6.9, 2 H,
(s,
2
H, M-N(1)CH2); 4.70 (m, 2 H, dFl-N(10)CH2); 5.43 (s, 2 H, Bn-CH2); 5.53
(rf,7= 7.9,
C(ar)H);
dFl-N(3)C#2(CH2)3CH3);
1 H,
7.42
M-C(5)H);
7.27
(rfrf,
7=
2.0, 7= 8.9, 1 H, dFl-C(7)H); 7.36 (m, 1 H,
(m, 2 H, C(ar)H); 7.49 (rf, 7
C(6)H); 7.69 (s,
CONH); 8.95 (s,
1
=
7.1, 2 H, C(ar)H); 7.52 (rf, 7
=
H, C(ar)H); 8.15 (rf, 7= 8.9, 1 H, dFl-C(6)H); 8.62 (t, J
1
H, dFl-C(5)H); 11.25 (s, 1 H, M-N(3)H).
7.9, 1 H, M=
5.8, 1 H,
13C-NMR (100 MHz,
(CD3)2SO): 13.76; 21.79; 27.02; 28.54; 38.85; 40.06; 42.84; 49.32; 70.12; 99.50;
100.65; 111.37; 115.09; 116.07; 127.66 (2C); 128.07; 128.50 (2C); 133.66; 135.87;
141.99; 142.43; 146.22; 150.95; 155.76; 156.13; 161.44; 163.76; 164.36; 168.12. FABMS: 585
(100, [M+H]+); 529 (7); 391 (52).
585.2453.
C31H32N606 (584.64).
232
HRMS ber. für
[M+H]+: 585.2461; gef:
6.
6.3.6 Synthese der
Pyrrol-
und Imidazol-Bausteine
I
o
l-Methyl-2-trichloroacetyl-lH-pyrrol (148).
420
mmol)
wurde in frisch destilliertem
45 min wurde
1-Methyl-lH-pyrrol (146,
El^O (100 ml)
Trichloroacetylchlorid (147,
47
gerührt.
75
Zugabe
von
147 wurde die
Danach wurde die Reaktion durch
ml) beendet.
Das
umkristallisiert.
148
die
ml, 34 g,
N2 gerührt.
Während
Temperatur
Reaktionsmischung
bis
zum
Siedepunkt.
weitere 3 Stunden bei RT
einer
wässrigen KjCOj-Lösung (25%,
148
wurde
Zugabe
acetylierte Pyrrolderivat
(92
bei RT unter
37.25
ml, 76.14 g, 420 mmol) in abs. Et20 (100
ml) tropfenweise zugegeben. Zwischenzeitlich stieg
Nach beendeter
Experimenteller Teil
filtriert
und
aus
97%) wurde in Form weisser Nadeln isoliert und ist
g,
CHC13
der
an
Luft und unter Lichteinfluss nicht stabil.
Rf (Toluol/EtOAc 7:2) 0.82, R{ (Toluol)
NMR(300 MHz, (CD3)2SO):
C(4)H);
7.40
3.88
(s,
3
0.73.
13C-NMR (75 MHz,
109.22; 120.85; 123.84; 135.48; 172.10.
Cl 46.96;
gef:
Anal. ber. für
C
62-64 °C
(Lit.: 64-65 °C [455]).
*H-
H, N(1)CH3); 6.26 (rfrf, 7= 4.0, 7= 2.5, 1 H,
(m, 2 H, C(3)H, C(5)H).
(92, [M-CC13]+).
Smp.:
EI-MS: 225 (1,
C7H6N0C13 (224.95):
C
(CD3)2SO):
M+); 162 (7);
37.92 ;
131
96.18;
(14);
108
37.12, H 2.67, N 6.18, O 7.06,
37.12, H 2.67, N 6.34, Cl 46.93.
02N
^~^.CCI3
Ï
O
l-Methyl-4-nitro-2-trichloroacetyl-lH-pyrrol (149).
mmol)
wurde in
gerührt.
Ac20 (500 ml) gelöst
Rauchende
Dabei wurde die
40 °C
Das
gehalten.
Lösungsmittels
in
mit einem Kältebad
wurde weitere 8 h
vacuo
Pyrrolderivat 148 (91
wurden über 90 min
g,
400
gerührt.
zwischen -20 und
Temperatur langsam
auf RT
-
gebracht.
Dann wurden etwa zwei Drittel des
abdestilliert und die verbleibende
233
N2
tropfenweise zugegeben.
(Trockeneis/Aceton)
Nach Ende der Reaktion wurde die
Reaktionsgemisch
Das
und bei -40 °C mit einem KPG-Rührer unter
Salpetersäure (40 ml)
Temperatur
149
Lösung
auf -20 °C
abgekühlt.
6.
Teil
Experimenteller
Das
149 wurde mit eiskaltem
Nitro-Pyrrol
-20 °C umkristallisiert
(40
Rt (Toluol)
0.50.
(CD3)2SO):
3.97 (s, 3 H,
Smp.:
Isopropanol (500 ml) gefällt und
aus
CHC13
bei
37%, große, gelbe Plättchen).
g,
121-123 °C
N(1)CH3);
(Lit: 135-140 °C [455]).
7.76
(rf,
7=
*H-NMR (300 MHz,
2.5, 1 H, C(3)H); 8.51 (rf, 7= 2.5, 1 H,
C(5)H). 13C-NMR (75 MHz, (CD3)2SO): 39.02; 94.68; 116.47; 120.77; 132.74; 134.44;
(3,M+);
173.06. EI-MS: 270
(269.93):
30.97,
C
207
(5); 153 (100, [M-CC13]+). Anal. ber. für C7H5N203C13
1.86, N 10.32, O 17.68, Cl 39.18; gef: C 30.77,
H
H
1.80, N 10.53,
O 17.99, Cl 39.27.
02N
XN
°—
I
150
o
l-Methyl-4-nitro-lH-pyrrol-2-carbonsäure-methylester (150) [437].
149 (27 g, 100 mmol) wurde in MeOH
(350
Öl)
mg, 60% in
Suspension
149
von
Reaktionsgemisch
wurde
wurde in MeOH
gegeben.
durch
das
filtriert,
umkristallisiert. Das
tropfenweise Zugabe
Filtrat
8.25
(rf,
3.77
7=
(s,
0 °C
(20 ml) bei
gelöst
Es wurde 3 h bei RT
in
Pyrrolderivat
150
von
(18
g,
und
gerührt.
tropfenweise
NaH
zu
der
konz. Schwefelsäure neutralisiert.
Es
und
der
Smp.:
Rückstand
MeOH
aus
in Form weisser Nadeln.
121-123 °C.
TT-NMR (200 MHz,
H, OCH3); 3.81 (s, 3 H, N(1)CH3); 7.28 (rf, 7= 1.8, 1 H, C(3)H);
3
1.8, 1 H, C(5)H).
13C-NMR (75 MHz,
(CD3)2SO): 37.39; 51.74; 111.61;
122.71; 129.54; 134.34; 160.05. FAB-MS: 185 (100, [M+H]+); 168 (30).
C7H8N204 (184.05):
gerührt.
das
98%) kristallisierte
0.90.
bei 0 °C
Nitro-Pyrrol
Danach wurde
eingeengt
vacuo
Rf (Toluol) 0.19, (CHCL/MeOH 10:1)
(CD3)2SO):
(90 ml) suspendiert und
Das
C
Anal. ber. für
45.66, H 4.38, N 15.21, O 34.75; gef: C 45.60, H 4.49, N
15.16, O 34.92.
HCl
H2N
152
I
o
4-Amino-l-methyl-lH-pyrrol-2-carbonsäure-methylester-hydrochlorid (152) [437].
Pyrrolderivat
Suspension
150
von
(30
g,
1.7 g Pd
100
mmol) wurde in EtOAc (350 ml) bei
RT
gerührt.
(10% auf Kohle) in EtOAc (30 ml) wurde zugegeben.
234
Das
Eine
Danach
6.
wurde unter
während 50 h
H2
abgelaufen (DC-Kontrolle).
kräftig gerührt.
Die
Die Reaktion
Reaktionslösung
Rückstand mit EtOAc
gewaschen.
151 wurde in kaltem
El^O (300 ml) aufgenommen
Hydrochlorid
Die
152
gefällt.
Fällungsprozedur
Der
eingeengt.
vacuo
und durch Einleiten
wurde einmal wiederholt.
Das
Amino-Pyrrol
Rt (CHCL/MeOH 10:1) 0.40, (CHCL/MeOH/HOAc 5:1:1)
7.24
(rf,
3.73
(s,
7= 2.0,
1
3
vollständig
Der Rückstand
von
wurde abfiltriert und mit
wurde nicht weiter aufgereinigt und wurde bei -20 °C im Dunkeln
(CD3)2SO):
nach 2 d
war
wurde durch Celite filtriert und der
Das Filtrat wurde in
Niederschlag
Experimenteller Teil
HCl-Gas als
Et20 gewaschen.
152 (13.4 g, 72%)
gelagert.
0.53.
^-NMR
(200 MHz,
H, OCH3);3.84 (s, 3 H, N(1)CH3); 6.79 (rf, 7= 2.0, 1 H, C(3)H);
H, C(5)H); 10.16 (s, 3 H, NH2).
13C-NMR
36.47; 51.24; 111.65; 113.98; 120.88; 123.93; 160.46.
(75 MHz, (CD3)2SO):
FAB-MS: 154.0
(45, [M-Cl]+).
C7HnN202Cl (190.63).
154
4-Fluorenylmethoxycarbonylamino-l-methyl- lH-pyrrol-2-carbonsäure
Pyrrolamin
ml) gelöst
152
(8g,
42
mmol) wurde in gründlich entgaster
und während 4 h bei 60 °C
freien Carboxamin 153
eingestellt.
DMF
durch
Zugabe
dreimal mit
von
CHC13
rückextrahiert.
Zitronensäure auf
(100 ml) wurden zugegeben. Das in
Es wurde 2 h bei RT
pH
extrahiert und die
Die
vereinigten
5
Das
eingestellt.
organische
organischen
Phase
Phasen
gerührt,
MeOH
gefällt.
Der
Niederschlag
gewaschen. Umkristallisation
aus
wurde
mit
zum
abfütriert und
DMF
der auf 0 °C
die Reaktion dann
zitronensaurem
wurden
EtOAc und anschließende
zu
Reaktionsgemisch
eingeengt
Hochvakuum getrocknet. Das bräunliche Öl wurde in Dioxan (25 ml)
mit
Umsatz
(80
Es wurde sodann auf RT erwärmt
(100 ml) gelöste FmocOSu (20.8 g, 65 mmol) wurde portionsweise
gekühlten Reaktionsmischung gegeben.
Das
2 N NaOH / MeOH 3:1
gerührt. DC zeigte danach quantitativen
(Rf (CHCl3/MeOH 10:1) 0).
und mit DIEA/HCl auf pH 10
(154).
wurde
Wasser
und
aufgenommen
mit
eiskaltem
Trocknung
über
am
und
MeOH
P205 ergab
154 als ein feines, weisses Pulver (13.3 g, 87%).
Rf (CHCL/MeOH 10:1) 0.57, (CHCl3/MeOH/HOAc 5:1:1)
(KBr):
3311 m,
0.95.
Smp.:
187-189 °C.
IR
2944m, 1699s, 1658s, 1585s, 1547s, 1448s, 1444m, 1398m, 1384m,
235
6.
Experimenteller Teil
1354w, 1278m, 1253s, 1231s, 1202s, 1155s, 1099w, 1085m, 1063m, 1005w, 892w,
829w, 797>v, 760m, 741s, 668w, 618w. iH-NMR (400 MHz, (CD3)2SO): 3.78 (s, 3 H,
N(1)CH3);
4.28
(t,
6.3, 1 H, Fmoc-CH); 4.44 (rf, 7= 6.3, 2 H, Fmoc-CH2); 6.63 (s, 1
J=
H, C(3)H); 7.04 (s, 1 H, C(5)H); 7.34 (td, J= 7.4, J= 1.0, 2 H, Fmoc-C(ar)H); 7.42 (t,
7= 7.4, 2 H, Fmoc-C(ar)H); 7.72
Fmoc-C(ar)H);
9.41
(rf,
7=
7.4, 2 H, Fmoc-C(ar)H); 7.90 (rf, 7= 7.4, 2 H,
(s, 1 H, C(4)NH); 12.00-12.25 (br.s, 1 H, COOH).
13C-NMR
(100
MHz, (CD3)2SO): 35.98; 46.61; 65.28; 107.47; 118.67; 119.90; 120.06 (2C); 122.29;
124.96
(2C); 127.00 (2C); 127.54 (2C); 140.70 (2C); 143.74 (2C); 153.21; 161.76.
FAB-MS: 363 (100,
362.1278.
[M+H]+);
Anal. ber. für
362 (93,
M+).
C21H18N204 (362.13):
HRMS ber.
für M+:
362.1266; gef:
C 69.60, H 5.01, N 7.73, O 17.66;
gef:
C 69.45, H 5.27, N 7.67.
°)_NH
j^l
4-Fluorenylmethoxycarbonylamino-l-methyl-lH-pyrrol-2-carbonsäure-(benzotriazol-1-yl)ester
(145).
Die
Fmoc-gescützte
Aminosäure 154
ml) gelöst. HOBT (2.7 g, 17.6 mmol)
Die
Reaktionsmischung
wurde 40 h bei RT
(Dicyclohexylharnstoff) bildete
auf kräftig
gerührtes
und DCC
wässrige Phase
CH2C12 gelöst,
und die
Phasen wurden
Niederschlag,
Ein
vereinigt
Vorsichtiges
0.95.
und in
Niederschlag
Reaktionsmischung
(5.8
Smp.:
g,
(100
eingeengt.
der
wurde
Niederschlag.
dann abfiltriert. Der Rückstand
noch zweimal mit
vacuo
Erwärmen
der nach Filtration 145
Rf (CHCL/MeOH 10:1)
der
in DMF
weisser, kristalliner Niederschlag
Eiswasser filtriert. Dabei bUdete sich sofort ein weißer
wurde in
suspendiert.
mmol) wurde
sich während der Reaktion. Die
gerührt,
MeOH
g, 13.8
(3.5 g, 17 mmol) wurden zugegeben.
gerührt.
Es wurde 30 min bei 0 °C weiter
organischen
(5
CH2C12
extrahiert.
Die
Der Rückstand wurde in
Suspension
ergab
einen
weissen
87%) lieferte.
99-101 °C.
IR
(KBr): 3242m, 3094m, 3054m,
2940m, 1759s, 1718s, 1592s, 1469w, 1446m, 1436m, 1405s, 1380m, 1355m, 1269m,
1255m, 1221s, 1192m, 1159s, 1102m, 1078m, 1001s, 979s, 924m, 834m, 782m, 763m,
736s, 622w, 545w. 'H-NMR (400 MHz, (CD3)2SO): 3.86 (s, 3 H, N(1)CH3). 4.32 (t, J
=
6.0, 1 H, Fmoc-CH); 4.53 (rf,
7=
6.3,
2
7=
H, C(ar)H); 7.42 (t, J
=
6.0,
2
H, Fmoc-CH2); 7.23 (s, 1 H, C(ar)H); 7.36 (t,
7.2, 2 H, C(ar)H); 7.53 (dt, 7= 7.5, 7= 1.0, 2 H,
236
6.
C(ar)H); 7.66 (dt,
7=
J=
Experimenteller
Teil
7.4, 7= 0.8, 1 H, C(ar)H); 7.74 (rf, 7= 7.3, 2 H, C(ar)H); 7.82 (rf,
8.2, 1 H, C(ar)H); 7.91 (rf, 7= 7.3, 2 H, C(ar)H); 8.16 (rf, 7= 8.4, 1 H, C(ar)H);
9.74
(s,
C(4)NH).
1 H,
(100 MHz, (CD3)2SO): 36.25; 46.62; 65.46; 109.21;
13C-NMR
110.01; 112.52; 119.75; 120.10 (2C); 124.09; 124.93; 125.13 (2C); 127.04 (2C); 127.58
(2C); 128.61; 129.06; 140.75 (2C); 142.66; 143.70 (2C); 153.33; 155.90. FAB-MS: 959
(19, [M2+H]+), 480 (88, [M+H]+). HRMS
Anal. ber. für
H
ber. für
[M+H]+: 480.1672; gef:
C 67.63, H 4.41, N
C27H21N504 (479.50):
14.61,
O 13.35;
480.1671.
gef:
67.59,
C
4.65, N 14.55.
VN3
/
158
iV^
I
o
1-Methyl-lH-Imidazol-2-carbonsäure-ethylester (158). 1-Methyl-lH-imidazol (156,
ml, 41.1 g, 500 mmol) wurde in CH3CN (250 ml) und NEt3 (125 ml) bei -20 °C
Argon gerührt. Ethylchloroformat (157,
zugegeben,
während die
Temperarar
100
wurde die
Reaktionsmischung
fortgesetzt.
Anschliessend wurde der kristalline
CH3CN gewaschen.
Das
gebracht.
Filtrat wurde
in
Das
vacuo
bei -20 °C
158 kristallisierte (44 g, 57 %).
(CD3)2SO):
1.26
OCtf2CH3);
7.02
(m,
(rf,
0.10.
3
7=
H,
Smp.:
44-46 °C
OCH2C7Q;
(Lit.:
3.88
(s,
2
das
abfiltiert und mit
resultierende
H,
[456]).
!H-NMR
N(1)CH3);
4.24
1.3, 1 H, C(4)H); 7.40 (rf, 7= 1.3, 1 H, C(5)H).
MHz, (CD3)2SO): 13.95; 35.38; 60.49; 127.32; 128.70; 136.22; 158.95.
(35, [M2+H]+); 155 (100, [M+H]+). Anal. ber.
N 18.29, O
für
C7H9N202 (154.07):
20.89; gef: C 54.59, H 5.98, N 18.20, O 21.00.
237
Dann
Öl
am
mbar) ergab ein farbloses Öl, das
44 °C
3
wurde.
Rühren wurde während 40 h
eingeengt,
getrocknet. Vakuumdestillation (160 °C,
Rf (Toluol/EtOAc 7:2)
gehalten
Niederschlag (NEt3/HCl)
Hochvakuum
zu
unter
ml, 114 g, 1050 mmol) wurde tropfenweise
zwischen -20 und -25 °C
auf RT
42.3
C
(200 MHz,
2
H,
"C-NMR
(75
(m,
FAB-MS: 309
54.89,
H
5.92,
6.
Experimenteller Teil
02N
W^
I
159
o
1-Methyl-4-nitro-lH-Imidazol-2-carbonsäure-ethylester (159).
Das Imidazolderivat 158
(40 g, 260 mmol) wurde in eiskalter konz. H2S04 (125 ml) gelöst und mit eiskalter,
rauchender
HN03 (100 ml)
Rückflusskühler
wurde
Die
versetzt.
über
einen
Reaktionsmischung wurde vorsichtig
wurde dabei
Temperatur
auf
Cryostaten
zum
(1.5 1)
CH2C12
extrahiert. Die
getrocknet. Anschliessend
aus
20:1 umkristallisiert.
CCL/EtOH
war, wurde die
Der
Die
gebracht.
vacuo
Sobald die
eingeengt
Temperatur
Reaktionsmischung
Niederschlag.
organischen Phasen
wurde in
gehalten.
Sieden erhitzt. Danach hält die bei der Reaktion
Es bildet sich ein weisser
gegossen.
dreimal mit
abgefallen
°C
-30
freiwerdende Wärme die Reaktion für 1 h unter Rückfluss.
Ende der Reaktion auf RT
5 °C
<
Die
wurden
und der
auf Eiswasser
wässrige
vereinigt
nach
Phase wurde
und über
MgS04
grünlich-weisse Rückstand
159 (20.8 g, 40%) kristallisierte in Form weisser
Plättchen.
Rf (Toluol/EtOAc 7:2) 0.35, (CHCL/MeOH 10:1)
[456]).
!H-NMR
N(1)CH3);
4.31
(300 MHz, (CD3)2SO):
(q,
7=
1.30
0.76.
Smp.:
(t, J= 7.7,
3
200
OCH2C#3);
H,
7.7, 2 H, OC772CH3); 8.59 (s, 1 H, C(5)H).
(CD3)2SO) 13.85; 36.71; 61.71; 126.93; 134.99; 145.10;
[M2+H]+);
119-121 DC
(100, [M+H]+).
Anal. ber. für
157.90.
C7H8N304 (199.06):
(Lit.:
3.96
13C-NMR
118 °C
(s,
(75 MHz,
FAB-MS: 399
C
3 H,
(19,
42.43, H 4.07, N
21.21, O 32.30; gef: C 42.18, H 4.37, N 20.97, O 32.29.
HCl
H2N
I
o
4-Amino-l-methyl-lH-Imidazol-2-carbonsäure-ethylester-hydrochlorid (161) [437].
Nitro-Imidazol 159
gerührt.
Eine
zugegeben.
(20
g, 100
Suspension
Die
von
mmol) wurde in EtOAc/EtOH 1:1 (1 1) gelöst und bei RT
Pd/C(10%)-Katalysator (4 g)
Reaktionsmischung
der
Katalysator
mit
Etp gewaschen.
Das
wurde 22 h
kräftig
mittels Fütration durch Celite entfernt.
Das Filtrat wurde in
vacuo
238
in EtOAc
in unter
(100 ml) wurde
H2 gerührt.
Dann wurde
Der Rrückstand wurde
eingeengt
und mit eiskaltem
gründlich
Et20 (1 1)
6.
versetzt.
gefällt
Das
Hydrochlorid
161
(17.2
83.4%)
g,
Experimenteller Teil
wurde durch Einleiten
von
HCl-Gas
und abfiltriert.
Rf (CHCL/MeOH 10:1)
OCH2C/73);
0.42.
3.91 (s, 3 H,
C(5)H); 9.50-11.00 (br.s,
*H-NMR (300 MHz,
N(1)CH3);
2-3 H,
4.26
NH2).
61.29; 116.82; 131.87; 132.48; 157.30.
(q,
J=
1.26 (t, 7= 7.1, 3 H,
(CD3)2SO):
7.1, 2 H, OC#2CH3); 7.42 (s, 1 H,
13C-NMR
(75 MHz, (CD3)2SO): 13.90; 35.98;
FAB-MS: 339
(3, [M2-HC12]+); 170 (100, [M-
Clf). C7H12N302C1 (205.65).
PH
155
4-Fluorenylmethoxycarbonylamino-l-methyl-lH-imidazol-2-carbonsäure
Hydrochlorid
161
(2.5
und 60 min bei dieser
g, 12.1
N
Die
Temperatur gerührt.
(CHCl3/MeOH 10:1) 0)
mit 2
mmol) wurde bei 60 °C in 2
war
mittels DC gut
zu
gekühlt.
Es wurde 5 h bei RT
gerührt.
dreimal mit
CHC13 extrahiert,
organischen
rückextrahiert.
Das
Lösungsmittel
CHC13 aufgenommen
g,
die
und
aus
(10 ml) suspendiert
Die Reaktion wurde sodann
14.5
mmol)
Anschliessend wurde das
wurde in
(Rf
(25 ml) und DIEA (3 ml) zugegeben und
Portionsweise wurde FmocCl (3.6 g,
zugegeben.
Das
der freien Aminosäure 162
beobachten.
HCl neutralisiert. Danach wurden DMF
auf 0 °C
Bildung
NaOH
N
(155).
Phasen
vereinigt
abgezogen,
vacuo
El^O gefällt. Umkristallisation
in DMF
(3 ml)
Reaktionsgemisch
und mit
H20
zweimal
der Rückstand in etwas
aus
Aceton
ergab
155
(3.0
70%) als ein leicht bräunliches Pulver.
Rf (CHCL/MeOH 10:1) 0.10, (CHCl3/MeOH/HOAc 5:1:1)
0.85.
Smp.:
161-163 °C.
IR
(KBr): 3189m, 2952m„ 1729s, 1650s, 1578s, 1449s, 1356s, 1311s, 1251s, 1087m,
1017w, 801w, 822w, 720m, 140w, 62lw.
3
(400 MHz, (CD3)2SO): 3.89 (br.s,
H, N(1)CH3); 4.30 (m, 1 H, Fmoc-CH); 4.40 (m, 2 H, Fmoc-CH2); 7.21 (s, 1 H,
C(5)H); 7.34 (td,
=
'H-NMR
7=
7.4, 7= 0.8, 2 H, C(ar)H); 7.42 (t, 7= 7.4, 2 H, C(ar)H); 7.76 (rf, 7
6.3, 2 H, C(ar)H); 7.90 (rf,
7=
7.5,
2 H,
C(ar)H);
10.14
(100 MHz, (CD3)2SO): 35.21; 46.43; 65.84; 112.28;
(s,
120.04
1
H, C(4)NH).
"C-NMR
(2C); 125.25 (2C); 127.03
(2C); 127.60 (2C); 133.79; 137.10; 140.66 (2C); 143.65 (2C); 153.29; 160.20.
239
FAB-
6.
Experimenteller Teil
MS: 386
(39, [M+Na]+), 364 (100, [M+H]+).
364.1315.
6.3.7
[M+H]+: 364.1297; gef:
C20H17N3O4 (363.38).
Synthese
Manuelle
HRMS ber. für
der
Oligo-Pyrrol/Imidazol-Polyamide:
Polypyrrolsynthese
der
an
Festphase:
Harz: NovaBiochem Rink Amide MB HA; 0.59
Lösungsmittel (Lsm): DMF,
mmol/g Beladungsdichte
NMP
Alle Reaktionen wurden im Dunkel, bei RT unter
Quellen des
Harzes:
Vor
Beginn
der
Argon durchgeführt.
Synthese
wurde das Harz mind.
2 h in NMP
geschüttelt.
Ein üblicher
besteht
Zyklus
aus
den
folgenden
Schritten: Entschützen des
Harzes,
Waschen, Ninhydrintest, Aktivierung, Kopplung, Waschen, Ninihydrintest, Acetylierung
(wenn erforderlich), Waschen.
nach einer
Kupplung
wurde entschützt und
werden,
wurde diese wiederholt.
Harz
vom
Kupplung
und bei -20 °C
gelagert.
Entschützen:
Abspaltung
der
(bzw. 50%) Piperidin
20%
Waschen:
Ein
Waschzyklus
und Entfernen des
Pyrrolbausteins
zugegeben,
die Probe bis
nötig, vorsichtig
Aktivierung
Die
aus
über Nacht ausgesetzt
der Reaktor
zugegeben,
zweimalige Suspension
des Harzes in
min).
Zugabe
von
145:
Lsm (~ 5
zur
145 wurde in 3 ml Lsm
vollständigen Auflösung
ml),
Schütteln für 3 min
suspendiert.
1 ml DIEA wurde
mit Ultraschall behandelt
oder,
erwärmt.
Die
Äquivalente
1.2
Suspension
jeweilige Fmoc-geschützte
Aminosäure wurde
HOBT und TBTU sowie DIEA
wurde im Ultraschallbad
Äquivalente
HATU und DIEA (1
(1 ml)
in
Lsm
wurden
(3
ml)
zugegeben.
vollständig gelöst.
b) HATU: Die jeweilige Fmoc-geschützte Aminosäure
1.5
Sequenz
anderer Bausteine:
a) TBTU/HOBT:
suspendiert.
bestand
/ 10
einer
Lösungsmittels (Lsm).
Einsatz des
wenn
(15 min
durch
Kupplung
Synthese
und Waschen 5 ml NMP
Fmoc-Gruppe
/ DMF
ausgefallenen Ninhydrintest
Nach der letzten
Musste die
abgespalten.
wurde nach
so
abgedichtet
Bei nicht zufriedenstellend
wurde in 3 ml Lsm.
ml) wurden zugegeben und
suspendiert.
im Ultraschallbad
vollständig gelöst.
c) DCC/HOBT: Die jeweilige Fmoc-geschützte Aminosäure wurde
suspendiert.
1.2
Äquivalente
DCC und HOBT wurden
240
zugegeben und
in
3
ml
Lsm.
im Ultraschallbad
6.
Unmittelbar
Zugabe
Die wie oben
Kupplung:
Harz
der
vor
10 min wurde DCU als kristalliner
Nach
vollständig gelöst.
zum
Kupplungszeiten
gegeben.
Niederschlag
abfiltriert.
(1 ml) zugegeben.
Harz wurde DIEA
angegeben
Experimenteller Teil
aktivierten Aminosäuren wurden auf das entschützte
waren
Pyrrol-
60-90 min für
allgemein
der Imidazol-
Aminosäuren, 60 min für alle anderen Aminosäuren.
Acetyliemng: Ac20 (1 ml)
Harz
und DIEA
Nach 5 min wurde die
zugegeben.
(2 ml) suspendiert
wurden in NMP
(1 ml)
Acetyüerungslösung
und
zum
entfernt und das Harz
gewaschen.
Abspaltung
vom
wurde in ein
und 3x mit
Glasgefäss
Et20 gewaschen.
Eine frisch bereitetete
während 45 min bewirkte die
Abspaltung
des
Polyamids
TFA
gespült,
TFA
aufgenommen
3x
die
gründlich gewaschene
mit Fritte überführt. Es wurde dann 7x mit
wurde auf das
Triisopropylsilan (TIPS)
2.5%
Das mit dem Lsm
Aufarbeitung:
Harz und
Harz. Die
Lösungen vereinigt
und mit
Lösung
und in
Et20 gefällt.
Der
von
wurde
vacuo
95%
Harz
geschrumpfte
der Boc- bzw.
Abspaltung
vom
Lösung
CH2C12,
TFA, 2.5% H20 and
Schütteln
gegeben.
sowie die
das Harz mit 2x 2 ml
Der Rückstand wurde in
eingeengt.
Niederschlag
3x mit MeOH
Mtr-Schutzgruppen
abgesaugt,
Harz
wurde abfiltriert und mit
Et^O
gewaschen.
HoN
NH2
~fi-H
/^
163
4-[(4-[(4-[2-(10-[2-Aminoethyl]-7,8-Dimethyl-2,4-Dioxo-4,10-Dihydro-2H-
Benzo[g]pteridin-3-yl)-Acetylamino]-1-Methyl-lH-Pyrrol-2-Carbonyl)-Amino]-l-MethyllH-Pyrrol-2-Carbonyl)Amino]-l-Methyl-lH-Pyrrol-2-Carbonsäure-(5-Amino-lSCarbamoyl-pentanfamid (163).
Standard-Verfahren,
Syntheseprotokoll
HPLC
wie
Ansatz: 0.12
oben
befindet sich im
mmol.
angegeben,
Anhang.
Das
Synthese
durchgeführt.
Rohprodukt
(Säule: Nucleoprep 100-12 C-18; Gradient: 0-60
241
Die
wurde nach dem
Ein
ausführliches
wurde mittels
präparativer
min 100%^40% A/ 0%->60%
6.
Experimenteller Teil
B; 60-65 min 40%-^100% A / 60%^0% B; (A
Flussrate: 5 ml
HPLC: 40 mg
«-NMR
1
min"1; Rt (163)
53
=
H20(1% TFA)
=
min) gereinigt.
/ B
Ausbeute nach
CH3CN);
=
präparativer
RP-
(40%).
(500 MHz, MeOD):
1.52
(m,
2
H, Lys-CH2); 1.70 (m, 2 H, Lys-CH2); 1.80 (m,
H, Lys-CHU); 1.95 (m, 1 H, hys-CHH); 2.41 (s, 3 H, F1-C(7)CH3); 2.55 (s, 3 H, Fl-
C(8)CH3);
2.93
(m,
N(1)CH3);
3.81
(s, 6 H,
4.80
2
H,
F1-N(10)CH2C#2);
2
x
Py-N(1)CH3);
3.5
4.48
(m,
2 H,
(rfrf,
7=
3.76
Lys-CH2);
5,
7= 9, 1 H,
(s, 3 H, Py-
F1-N(10)CH2);
(s, 2 H, NH2); 5.01 (br.s, 2 H, F1-N(3)CH2); 6.75 (s, 1 H, Py-C(3)H); 6.82 (s,
1
H, Py-C(3)H); 6.87 (s, 1 H, Py-C(3)H); 7.08 (m, 3 H, Py-C(5)H); 7.76 (s, 1 H, Fl-
C(9)H); 7.88 (s, 1 H, F1-C(9)H).
"C-NMR
(125 MHz, MeOD): 19.47; 21.44;
24.06
28.18; 32.80; 36.78; 36.87; 36.98; 38.80; 40.62; 43.60; 45.19; 53.95; 106.12; 106.37
106.79; 116.65;
120.81;
120.82;
122.75;
123.31
123.41;
124.01;
124.36;
124.58
132.20; 133.16;
136.63;
139.26;
150.79;
151.23
157.63;
160.94;
161.19;
161.83
162.82; 163.10; 163.83; 167.21; 177.28. FAB-MS
[M+H]+).
ESI-MS: 419
859.2 (14,
(100, [M+H]2+); 838 (32, [M+H]+).
[M+Na]+); 837.2 (100
HRMS ber. für
[M+H]+
837.3908; gef: 837.3911. C40H4gN14O7 (836.92).
NH2
r1
/
-N
i^x^x^:^
HN.
HlLi
HN^°
HoN
für die
164.
Ansatz: 0.24 mmol.
Festphasensynthese,
Syntheseprotokoll
HPLC
Die
wie oben
befindet sich im
HN'^0
V^J
164
Polyamid
Synthese
wurde nach dem Standard-Verfahren
angegeben, durchgeführt.
Anhang.
Das
O
Rohprodukt
Ein
wurde mittels
(Säule: Nucleoprep 100-12 C-18; Gradient: 0-60 min 100%^40%
B; 60-65 min 40%^100% A / 60%-^0% B; (A
242
=
ausführliches
H20(1% TFA)
präparativer
A / 0%^60%
/ B
=
CTLCN);
6.
Flussrate:
5
präparativer
min"1; Rt (164)
ml
=
39
min) gereinigt.
Experimenteller
Ausbeute
nach
Teil
zweimahger
RP-HPLC: 60 mg, 19%.
MALDI-TOF-MS:
1382 (14,
[M+Na]+); 1361 (100, [M+H]+).
ESI-MS:
681
(100,
[M+H]2+). C65H78N22012 (1359.49).
NH2
,NL
/
JO
^ISL
hn^n'
xxj^j^j/y^
NH
u\,
H
X
H2N-N^YH?N
Polyamid
für die
165.
HPLC
uk/^O
HN
\_J
16S
"O
Ansatz: 0.24 mmol.
Festphasensynthese,
Syntheseprotokoll
.0
HN^
wie
befindet sich im
Die
oben
Synthese
wurde nach dem Standard-Verfahren
angegeben, durchgeführt.
Anhang.
Das
Rohprodukt
Ein
ausführliches
wurde mittels
präparativer
(Säule: Nucleoprep 100-12 C-18; Gradient: 0-60 min 100%^40% AI 0%^60%
B; 60-65 min 40%->100% A / 60%^0% B; (A
Flussrate:
5 ml
min"1; Rt (163)
präparativer RP-HPLC:
MALDI-TOF-MS: 1411
[M+H]2+);
1390 (11,
=
40
=
H20(1% TFA)
min) gereinigt.
/ B
Ausbeute nach
=
CH3CN);
zweimaliger
11 mg, 3%.
(14,
[M+Na]+);
1390 (100,
[M+H]+).
[M+H]+). C64H77N25012 (1388.49).
243
ESI-MS:
695
(100,
6.
Experimenteller Teil
NH2
.0
N^ ^NL
0
y> ^f
N
J
0
H
H
O
N^
HN.
Q
166
BnO
Polyamid
166.
Die
Festphasensynthese,
Syntheseprotokoll
HPLC (Säule:
Synthese
wie
oben
befindet sich im
Nucleoprep
wurde
nach
angegeben,
Anhang.
Das
Rohprodukt
MALDI-TOF-MS:
2 mg,
1885
Ein
für
die
ausführliches
wurde mittels
präparativer
100-12 C-18; Gradient: 0-60 min 100%^40% AI 0%^60%
min"1; Rt (166)
präparativer RP-HPLC:
Standard-Verfahren
durchgeführt.
B; 60-65 min 40%^100% A / 60%-^0% B; (A
Laufmittelfluss: 5 ml
dem
(12,
<
=
44
=
H20(1% TFA)
min) gereinigt.
/ B
Ausbeute nach
=
CH3CN);
zweimaliger
1%.
[M+Naf);
1863
[M+H]2+). C89H100N30O17 (1861.98).
244
(100,
[M+H]+).
ESI-MS:
932
(100,
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Trans-
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coli
Photolyase by
from
S.-T. Kim, A. Sancar, C. Essenmacher, G.
T.
(FADH2~T=T)
Babcock, 7. Am.
of
Cyclobutane Thymine
T. Okamura, A. Sancar, P. F. Heelis, T. P.
Dimer
by
Begley,
DNA
Y.
Photorepair
of
Pyrimidine
Photolyase Deoxyuridine
S.-T.
Kim,
Beyerle,
M.
Volk,
Dimers
G.
Repair
by
Photodimer
7. Am. Chem. Soc.
Intermediate in the
DNA
a
-
VI. Action
Chem.
Soc.
Radical Intermediate
Photolyase.
Photolyase
Photolyase.
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Extended
E.
E. Baird, P.
Hairpin Polyamide
Dervan, Chem. Biol. 1996, 3, 369-377.
B.
Motif For
Sequence Specific Recognition
In the Minor
Groove Of DNA.
[447]
j. M. Gottesfeld, L.
Neely,
J. W.
1997, 387, 202-205. Regulation
[448]
M. Bouziane, C. Ketterle, P.
C.
of Gene
Helissey,
Cleavage
of DNA
by
a
E. E.
Baird, P. B. Dervan, Nature
Expression by
P.
Auclair, Biochemistry 1995, 34,
Strand
[449]
Trauger,
Small Molecules.
Hcrfeld, M. L. Bret, S. Giorgi-Renault,
14051-14058.
Netropsin-Flavin Hybrid
Sequence-Directed Single
Molecule.
Y. Kanaoka, Y. Ikeuchi, T. Kawamoto, K. Bessho, N. Akimoto, Y. Mikata, M.
Nishida, S. Yano, T. Sasaki, F. Yoneda, Bioorganic and Medicinal Chemistry
1998,
6,
301-314.
Synthesis
pyrrolecarboxamide(s) Hybrid
Antitumor
[450]
D. T.
as
Nitro
Novel DNA
5-Deazaflavin-
Targeted
Bioreductive
Davies, Aromatic Heterocyclic Chemistry, Vol. 2, Oxford University Press,
Tokyo 1994.
M. Mrksich, M. E. Parks, P. B. Dervan, 7. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 7983-
7988.
Hairpin Peptide Motif
Recognition
[452]
Molecules
of
Agents.
Oxford New York
[451]
Evaluation
and
J.
A New Class of
Oligopeptides
for
Sequence-Specific
in the Minor Groove of Double-Helical DNA.
Butenandt, A. P. M. Eker, T. Carell, Chem. Eur. J.
Synthesis, Crystal-Structure
and
Enzymatic Evaluation
of
1998, 4, 642-653.
a
DNA-Photolesion
Isostere.
[453]
Burgdorf,
L.
von
durch
Isostere
Thymidin-Photodimere
zum
Sequenzspezifischen Aufbau
UV-Strahlung Geschädigter Oligonukleotide, Diplomarbeit,
ETH Zürich
1998.
[454]
C.
Petry, Synthese
und
Untersuchungen Macroheterocyclischer Donor-Akzeptor-
Cyclophane, Dissertation, Ruprecht-Karls-Universität, Heidelberg 1993.
[455]
E. Nishiwaki, S. Tanaka, H. Lee, M.
1952.
Efficient
Synthesis
of
Shibuya, Heterocycles 1988, 27,
Oligo-N-Methylpyrrolcarboxamides
and
1945-
Related
Compounds.
[456]
K.
Krowicki, W. J. Lown, 7. Org. Chem. 1987, 52, 3493-3501. Synthesis of
Novel
Imidazole-Containing DNA Minor
the Antiviral Antibiotic
Netropsin.
280
Groove
Binding Oligopeptides
Related to
8.
8.
ANHANG
8.1
Kristallographische
8.1.1
Kristallographische
Daten
Daten
von
48
CI41
1
0I4'I
CHI.
mi
i
C(2'l
CI2I
@
rief"9 cmi
CI3I
fe. JI3I
cj^f
SCCI) Cl|2.,
*
«:i-2i
CII31
C1Î4I
Table
1.
CII31
Crystal data and
refinement
structure
Identification code
csttoh
Empirical formula
C21
Formula
weight
H30
N4
Oil
Temperature
293(2)
0.71073
Crystal system
Orthorhombic
Space group
P2(l)2(l)2(l)
cell dimensions
Volume
K
A
a
=
9.787(4)
b
=
13.127(4)
A
beta
c
=
17.620(5)
A
gamma
2263.7(13)
Z
alpha
A
90
=
deg.
=90
deg.
90
deg.
=
A~3
4
Density
(calculated)
1.510
Mg/m"3
Absorption coefficient
0.123
mmA-l
F(000)
1088
Crystal size
Theta range
Index
0.5
for
data collection
0.5
x
1.93
x
collected
0<=k<=19,
Independent reflections
4576
None
Refinement method
Full-matrix
/
restraints
Goodness-of-fit
Final R indices
indices
Absolute
(all
on
/ parameters
F^2
[I>2sigma(I)]
data)
structure parameter
4576
[R(int)
/
0
/
=
0.0000]
least-squares
446
0.938
=
0.0312,
wR2
=
0.0756
RI
=
0.0374,
wR2
=
0.0768
0.2(7)
Extinction coefficient
0.0138(11)
0.346
and hole
0<=1<=26
Rl
Largest diff.
peak
mm
deg.
4576
Absorption correction
Data
0.5
32.57
to
0<=h<=14,
ranges
Reflections
R
48.
514.49
Wavelength
Unit
for
281
and
-0.175
e.AA-3
on
F^2
Anhang
8.
Anhang
Table
2.
Atomic
coordinates
displacement parameters
as
one
third of
the
trace
x
(
(A^2
of
x
x
10A4)
10^3)
the
and
for
equivalent
U(eq)
48.
orthogonal!zed Uij
z
y
isotropic
is
defined
tensor.
U(eq)
N(l)
8759(1)
4478(1)
3437(1)
C(2)
8017(1)
4652(1)
4081(1)
23(1)
N(3)
8573(1)
4336(1)
4764(1)
27(1)
21(1)
C(4)
9680(2)
3728(1)
4878(1)
25(1)
C(5)
10470(1)
3428(1)
4179(1)
21(1)
C(6)
9795(1)
3677(1)
3402(1)
19(1)
C(7)
11248(1)
4009(1)
3129(1)
19(1)
C(8)
11686(1)
4166(1)
3959(1)
23(1)
C(9)
11437(2)
5264(1)
4196(1)
27(1)
N(10)
11404(2)
5967(1)
3626(1)
28(1)
C(ll)
11546(2)
5814(1)
2849(1)
25(1)
N(12)
11511(1)
4829(1)
2602(1)
22(1)
C(13)
11853(2)
4645(1)
1803(1)
25(1)
C(14)
12604(2)
3638(1)
1659(1)
28(1)
C(15)
11476(2)
2951(1)
1343(1)
28(1)
C(16)
10733(2)
3729(1)
858(1)
28(1)
0(17)
10629(1)
4593(1)
1356(1)
31(1)
C(18)
9373(2)
3468(1)
520(1)
34(1)
0(19)
8405(1)
3126(1)
1078(1)
31(1)
C(20)
7065(2)
3456(1)
925(1)
34(1)
0(21)
6894(1)
4482(1)
1154(1)
35(1)
C(22)
6244(2)
4641(1)
1878(1)
26(1)
C(23)
6877(2)
4023(1)
2515(1)
26(1)
C(24)
8132(2)
4661(1)
2692(1)
21(1)
0(25)
7703(1)
5700(1)
2624(1)
26(1)
C(26)
6546(1)
5742(1)
2109(1)
25(1)
C(27)
5363(2)
6286(1)
2492(1)
37(1)
0(28)
4808(1)
5747(1)
3116(1)
51(1)
0(29)
6930(1)
5119(1)
4094(1)
34(1)
0(30)
9983(1)
3455(1)
5517(1)
39(1)
0(31)
11329(2)
5521(1)
4859(1)
45(1)
0(32)
11685(2)
6549(1)
2433(1)
38(1)
0(33)
11957(2)
2142(1)
894(1)
51(1)
C(34)
10881(2)
2304(1)
4229(1)
31(1)
C(35)
13145(2)
3886(2)
4183(1)
40(1)
0(1W)
12531(2)
7374(1)
1018(1)
57(1)
282
8.
Table
3.
Bond
lengths
[A]
and
angles
[deg]
for
Anhang
48.
(1)-C(2)
1
366(2)
(11
-N(12)
1.363(2)
(D-C(6)
1
463(2)
(12
-C(13)
1.467(2)
(1)-C(24)
1
468(2)
(13
-0(17)
1.436(2)
(2)-0(29)
1
228(2)
(13
-C(14)
1.534(2)
(2)-N(3)
1
385(2)
(14
-C(15)
1.530(2)
(3)-C(4)
1
361(2)
(15
-0(33)
1.406(2)
(4)-O(30)
1
218(2)
(15
-C(16)
1.517(2)
(4)-C(5)
1
506(2)
(16
-0(17)
1.437(2)
(5)-C(34)
1
533(2)
(16
-C(18)
1.499(2)
(5)-C(6)
1
555(2)
(18
-0(19)
1.438(2)
(5)-C(8)
1
582(2)
(19
-C(20)
1.407(2)
(6)-C(7)
1
563(2)
(20
-0(21)
1.416(2)
(7)-N(12)
1
445(2)
(21
-C(22)
1.441(2)
(7)-C(8)
1
538(2)
(22
-C(23)
1.517(2)
(8)-C(9)
1
521(2)
(22
-C(26)
1.529(2)
(8)-C(35)
1
526(2)
(23
-C(24)
1.519(2)
(9)-0(31)
1
221(2)
(24
-0(25)
1.432(2)
(9)-N(10)
1
364(2)
(25
-C(26)
1.453(2)
(lO)-C(ll)
1
392(2)
(26
-C(27)
1.519(2)
(ll)-0(32)
1
219(2)
(27
-0(28)
1.415(2)
(2)-N(l)-C(6)
121
58(11)
(32
-C(ll) -N(12)
124.23(13)
(2)-N(l)-C(24)
119
53(11)
(32
-C(ll) -N(10)
119.15(13)
(6)-N(l)-C(24)
111
68(10)
(12
-C(ll) -N(10)
116.61(12)
(29)-C(2)-N(l)
124
04(12)
(11
-N(12) -C(7)
120.38(11)
(29)-C(2)-N(3)
118
.22(12)
(11
-N(12) -C(13)
(1)-C(2)-N(3)
117
61(12)
(7) -N(12)- C(13)
122.33(11)
110.15(12)
117.12(11)
(4)-N(3)-C(2)
128
04(12)
(17
-C(13) -N(12)
(30)-C(4)-N(3)
120
14(13)
(17
-C(13) -C(14)
105.51(12)
(30)-C(4)-C(5)
123
61(14)
(12
-C(13) -C(14)
114.24(12)
(3)-C(4)-C(5)
116
25(12)
(15
-C(14) -C(13)
102.87(12)
(4)-C(5)-C(34)
109
85(12)
(33
-C(15) -C(16)
110.58(13)
(4)-C(5)-C(6)
116
54(11)
(33
-C(15) -C(14)
114.10(14)
(34)-C(5)-C(6)
111
33(12)
(16
-C(15) -C(14)
98.84(12)
(4)-C(5)-C(8)
115
26(11)
(17
-C(16) -C(18)
111.09(13)
(34)-C(5)-C(8)
113
95(12)
(17
-C(16) -C(15)
102.82(11)
(6)-C(5)-C(8)
88
60(10)
(18
-C(16) -C(15)
119.74(14)
(1)-C(6)-C(5)
114
07(11)
(13
-0(17) -C(16)
108.26(11)
(1)-C(6)-C(7)
116
30(11)
(19
-C(18) -C(16)
112.61(13)
(5)-C(6)-C(7)
86
71(10)
(20
-0(19) -C(18)
112.78(13)
(12)-C(7)-C(8)
117
52(11)
(19
-C(20) -0(21)
110.32(14)
(12)-C(7)-C(6)
124
59(11)
(20
-0(21) -C(22)
116.27(13)
89
95(10)
(21
-C(22) -C(23)
113.40(12)
(8)-C(7)-C(6)
(9)-C(8)-C(35)
107
90(14)
(21
-C(22) -C(26)
106..69(12)
(9)-C(8)-C(7)
110
04(11)
(23
-C(22) -C(26)
103..29(11)
(35)-C(8)-C(7)
118
34(13)
(22
-C(23) -C(24)
100..79(11)
(9)-C(8)-C(5)
113
11(11)
(25
-C(24) -N(l)
110..69(11)
(35)-C(8)-C(5)
119
55(13)
(25
-C(24) -C(23)
105.71(11)
86
62(10)
(D--C(24)- C(23)
(31)-C(9)-N(10)
121
03(14)
(24
-0(25) -C(26)
108.48(10)
(31)-C(9)-C(8)
122
59(14)
(25
-C(26) -C(27)
109.49(12)
(10)-C(9)-C(8)
116
32(12)
(25
-C(26) -C(22)
106.30(11)
(9)-N(10)-C(ll)
128
64(13)
(27
-C(26) -C(22)
114.53(13)
(7)-C(8)-C(5)
283
115.55(11)
if*
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O
Inj
O
O
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00
8.
Table
5.
Hydrogen coordinates
displacement parameters
x
(A~2
x
(
x
10^3)
y
10^4)
for
and
isotropic
48.
z
U(eq)
H(24)
8822(16)
4539(12)
2338(9)
H(232)
7145(21)
3338(15)
2372(11)
38(5)
H(202)
6390(22)
3023(15)
1189(11)
36(5)
13(3)
H(7)
11666(18)
3407(14)
2931(9)
24(4)
H(6)
9451(17)
3116(13)
3139(9)
19(4)
11416(21)
6574(16)
3754(11)
30(5)
6880(21)
3459(14)
370(11)
31(5)
24(4)
H(10)
H(201)
H(26)
6856(19)
6119(13)
1673(10)
H(16)
11342(20)
3893(14)
436(10)
H(13)
12349(17)
5208(13)
1646(9)
20(4)
41(6)
29(5)
H(271)
4649(22)
6369(16)
2114(12)
H(342)
11523(25)
2216(16)
4661(12)
48(6)
H(341)
11412(22)
2033(15)
3754(12)
39(5)
H(352)
13777(26)
4377(18)
3937(13)
55(7)
H(141)
13294(22)
3714(15)
1249(11)
37(5)
H(182)
9449(24)
2896(17)
115(13)
55(7)
H(181)
9070(21)
4006(15)
282(11)
32(5)
H(231)
6285(20)
4059(14)
2955(10)
30(5)
H(351)
13198(29)
3943(21)
4667(17)
72(8)
H(22)
5240(23)
4494(17)
1826(13)
46(6)
H(15)
10808(18)
2707(13)
1728(10)
25(4)
H(142)
13077(22)
3350(15)
2107(12)
40(5)
7371(29)
7913(23)
8471(17)
84(10)
H(353)
13288(28)
3233(20)
4054(15)
62(8)
H(272)
5673(23)
694407)
2659(12)
45(6)
H(1W)
H(33)
12297(31)
1716(25)
1107(18)
81(11)
H(28)
5495(29)
5639(22)
3430(15)
68(8)
H(2W)
H(343)
H(3)
8274(31)
7875(22)
9138(16)
74(9)
10135(20)
1883(16)
4336(12)
39(5)
8183(23)
4572(16)
5174(12)
42(5)
285
Anhang
8.
Anhang
8.1.2
Kristallographische Daten
von
49
0(4')
C(!3I
Table
1.
Crystal data and
refinement
structure
Identification code
tsloh
Empirical
C21
Formula
formula
weight
H30
N4
Temperature
293(2)
1.54178
Crystal system
Monoclinic
Space group
P2(l)
cell
Oil
514.49
Wavelength
Unit
dimensions
K
A
a
=
11.601(9)
b
=
6.847(3)
c
=
14.626(9)
Volume
1143.1(12)
Z
2
Density (calculated)
Absorption coefficient
1.222
Mg/mA3
0.559
mnT-1
F(000)
450
Crystal size
Theta range
0.5
for data
collection
Index ranges
Reflections
0.4
x
3.07
Refinement method
Full-matrix
restraints
Goodness-of-fit
Final R indices
R
indices
Absolute
on
/ parameters
F"2
[I>2sigma(I)]
(all data)
structure
parameter
Extinction coefficient
=90
deg.
100.30(5)
=
=90
deg.
mm
deg.
0<=k<=6
0<=1<=14
1291
None
/
gamma
0.2
x
-ll<=h<=ll,
collected
beta
A
49.95
to
alpha
A
A
A~3
Independent reflections
Absorption correction
Data
for 49.
1291
1291
[R(int)
/
0
/
=
0.0000]
least-squares
327
1.056
Rl
=
0.0497,
wR2
=
0.1283
Rl
=
0.0497,
wR2
=
0.1285
0.0(4)
0.017(3)
286
on
F^2
deg.
8.
Largest diff.
Table 2.
peak and hole
Atomic coordinates
displacement parameters
as
one
0.322
third of
the
trace
x
(
(A^2
of
x
x
10A4)
10^3)
the
and
-0.330
and
for
e.AA-3
equivalent isotropic
U(eq)
49.
orthogonalized Uij
y
z
is
defined
tensor.
U(eq)
0(33)
7856(3)
2254
7072(2)
46(1)
N(12)
10795(3)
4743(8)
6007(2)
30(1)
0(21)
10061(3)
10045(8)
8861(2)
38(1)
0(32)
9657(3)
5469(9)
4604(2)
52(1)
0(17)
9347(3)
6320(8)
6695(2)
38(1)
0(25)
12591(3)
9903(9)
8392(2)
44(1)
N(10)
11599(3)
5091(11)
4653(2)
44(1)
O(30)
15508(3)
3421(10)
7044(2)
65(1)
0(19)
8862(3)
7263(8)
8624(2)
41(1)
N(l)
12926(3)
6799(10)
7814(2)
44(1)
C(8)
12919(4)
3675(10)
5973(3)
30(1)
0(28)
13456(3)
9225(9)
10439(2)
54(1)
0(31)
13281(3)
3707(10)
4421(2)
61(1)
C(7)
11974(4)
4439(10)
6514(3)
29(1)
C(15)
8644(4)
3714(10)
7515(3)
34(1)
C(16)
8350(4)
5770(10)
7103(3)
34(1)
N(3)
14627(3)
4880(11)
8116(3)
50(1)
C(ll)
10619(4)
5116(11)
5062(3)
35(1)
C(14)
9828(4)
3270(10)
7268(3)
32(1)
C(5)
13786(4)
5287(11)
6476(3)
33(1)
C(24)
12051(4)
C(13)
9761(4)
8077(10)
8102(3)
37(1)
4495(9)
6397(3)
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C(6)
12746(4)
6218(11)
6836(3)
30(1)
C(27)
13100(4)
11008(11)
9967(4)
47(2)
C(26)
12119(4)
10691(11)
9150(3)
37(1)
C{22)
11160(4)
9296(10)
9314(3)
35(1)
0(29)
14032(3)
6527(10)
9265(2)
62(1)
C(9)
12629(4)
4114(10)
4941(3)
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C(18)
8079(4)
7342(12)
7738(3)
44(2)
C(4)
14698(4)
4423(11)
7213(3)
44(2)
C(23)
11496(4)
7378(11)
8903(3)
41(1)
C(34)
14423(5)
6583(11)
5878(4)
58(2)
C(20)
9091(4)
9081(11)
9082(3)
44(2)
C(2)
13844(4)
6112(13)
8435(4)
49(2)
C(35)
13249(5)
1541(11)
6106(4)
47(2)
O(IW)
15667(16)
9690(35)
8400(15)
287
354(12)
Anhang
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124.2(5)
0(29)-C(2)-N(3)
117.7(4)
Table
The
-2
4.
Anisotropie displacement parameters
anisotropic displacement
piA2
N(l)-C(2)-N(3)
[ hA2
a*A2
Uli
+
Uli
U22
...
factor
+
2
(AA2
exponent takes
h k a*
b*
U12
10A3)
x
the
118.1(4)
for
49.
form:
]
U33
U23
U13
U12
0(33)
31(2)
36(2)
73(2)
-9(2)
15(2)
-5(2)
N(12)
25(2)
35(3)
28(2)
1(2)
1(2)
3(2)
0(21)
31(2)
36(2)
47(2)
-3(2)
7(1)
4(2)
0(32)
39(2)
79(3)
37(2)
9(2)
4(2)
22(2)
0(17)
39(2)
29(2)
48(2)
1(2)
17(2)
3(2)
0(25)
49(2)
46(3)
40(2)
-9(2)
15(2)
-4(2)
N(10)
45(3)
59(3)
29(2)
9(2)
10(2)
17(3)
0(30)
32(2)
86(4)
73(2)
-30(3)
-2(2)
20(3)
0(19)
37(2)
42(3)
45(2)
-4(2)
10(2)
0(2)
N(l)
33(2)
52(3)
42(2)
-20(2)
-4(2)
15(2)
C(8)
27(3)
29(3)
34(3)
1(2)
9(2)
3(2)
0(28)
52(2)
67(3)
37(2)
-8(2)
-6(2)
7(2)
0(31)
53(2)
93(4)
41(2)
-7(2)
17(2)
32(3)
C(7)
28(3)
32(3)
29(2)
5(2)
9(2)
3(2)
C(15)
35(3)
34(3)
33(3)
-2(3)
7(2)
-1(3)
C(16)
29(3)
39(3)
38(3)
3(3)
14(2)
2(3)
N(3)
32(2)
67(4)
45(2)
-9(3)
-10(2)
17(3)
C(ll)
30(3)
44(3)
31(3)
6(3)
4(3)
11(3)
C(14)
31(3)
33(3)
34(2)
4(3)
10(2)
-3(3)
C(5)
30(3)
31(3)
39(3)
-4(3)
10(2)
0(3)
C(24)
30(3)
45(4)
34(2)
-14(3)
-2(2)
2(3)
C(13)
25(2)
29(3)
29(2)
1(2)
2(2)
0(2)
C(6)
31(2)
29(3)
30(2)
0(2)
2(2)
2(2)
C(27)
42(3)
55(4)
43(3)
-23(3)
1(2)
-7(3)
C(26)
35(3)
43(4)
34(2)
-6(3)
10(2)
6(3)
C(22)
35(3)
39(3)
31(2)
-3(2)
8(2)
8(3)
0(29)
48(2)
95(4)
37(2)
-19(2)
-8(1)
26(3)
C(9)
33(3)
42(3)
36(3)
0(3)
3(3)
10(3)
C(18)
38(3)
49(4)
44(3)
2(3)
6(2)
9(3)
C(4)
27(3)
48(4)
58(3)
-15(3)
8(2)
-3(3)
-7(3)
C(23)
36(3)
32(3)
56(3)
-7(3)
7(2)
C(34)
63(4)
42(4)
81(4)
-3(4)
44(3)
-9(3)
C(20)
36(3)
47(4)
49(3)
-12(3)
13(2)
-3(3)
C(2)
26(3)
66(5)
52(3)
-11(3)
0(2)
8(3)
C(35)
39(3)
34(4)
65(3)
-2(3)
4(3)
4(3)
0(1W)
347(22)
184(17)
574(30)
134(19)
289
200(25)
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H
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8.
8.1.3
Kristallographische
Daten
von
<f
141
Y
57
0.4'.
7015?
0(21
Table
Crystal data and
1.
structure
refinement
Identification code
ttcs
Empirical
C28
Formula
formula
weight
H28
N4
Temperature
293(2)
1.54178
Crystal system
Monoclinic
Space group
P2(l)/n
dimensions
08
K
A
a
=
15.003(9)
b
=
6.238(5)
A
beta
=
99.08(9)
c
=
28.09(4)
A
gamma
=
90
Volume
2596(5)
Z
4
Density (calculated)
Absorption coefficient
1.403
Mg/mA3
0.872
mmA-l
F(000)
1152
Crystal size
Theta
range
Index
ranges
Reflections
0.3
for
data
collection
0.1
x
3.15
2099
Refinement method
Full-matrix
Goodness-of-fit
Final
R
R
indices
indices
on
/ parameters
FA2
[I>2sigma(I)]
(all data)
Extinction coefficient
Largest diff.
peak
and hole
deg.
90
deg.
mm
deg.
0<=k<=5,
None
restraints
=
-25<=1<=25
2203
Independent reflections
/
0.1
x
45.00
to
0<=h<=13,
collected
alpha
A
AA3
Absorption correction
Data
57.
548.54
Wavelength
Unit cell
for
2099
[R(int)
/
0
=
0.0203]
least-squares
362
/
0.923
Rl
=
0.0411,
wR2
=
0.1063
Rl
=
0.0817,
wR2
=
0.1360
0.00020(14)
0.180
291
and
-0.172
e.AA-3
on
FA2
deg.
Anhang
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8.
Table
3.
Bond
lengths
[A]
and
angles
[deg]
for
Anhang
57.
0(8')-C(8')
1.196(6)
N(3')-C(2')
1.388(6)
0(9')-C(8')
1.316(6)
N(3)-C(2)
1.365(6)
O(9')-C(10')
1.466(6)
N(3)-C(4)
1.373(6)
0(4')-C(4')
1.217(6)
0(4)-C(4)
1.209(6)
1.527(7)
0(9)-C(8)
1.333(6)
C(5)-C(5A)
O(9)-C(10)
1.464(6)
C(5)-C(4)
1.531(7)
N(l)-C(2)
1.355(6)
C(8')-C(7')
1.509(7)
1.486(7)
N(l)-C(6)
1.453(6)
C(10')-C(ll')
N(l)-C(7)
1.454(6)
C(7)-C(8)
1.508(7)
C(5')-C(4')
1.505(7)
C(ll')-C(16')
1.361(7)
C(5')-C(5A')
1.525(6)
C(ll')-C(12')
1.386(8)
C(5')-C(6')
1.536(6)
C(ll)-C(12)
1.366(8)
C(5')-C(5)
1.571(6)
C(ll)-C(16)
1.387(8)
0(2')-C(2')
1.199(6)
C(ll)-C(10)
1.481(8)
0(2)-C(2)
1.225(6)
C(14)-C(15)
1.347(9)
N(l')-C(2')
1.372(6)
C(14)-C(13)
1.376(11)
N(l')-C(6')
1.448(6)
C(12)-C(13)
1.409(10)
N(l')-C(7')
1.450(6)
C(12')-C(13')
1.357(8)
0(8)-C(8)
1.191(6)
C(16)-C(15)
1.360(8)
C(6)-C(5)
1.537(7)
C(15')-C(16')
1.383(9)
C(6)-C(6')
1.551(6)
C(15')-C(14')
1.385(10)
N(3')-C(4')
1.365(6)
C(14')-C(13')
1.361(10)
C(8')-O(9')-C(10')
116.3(4)
0(9')-C(10')-C(ll')
107.6(4)
C(8)-O(9)-C(10)
116.8(4)
0(4)-C(4)-N(3)
121.0(5)
C(2)-N(l)-C(6)
123.4(4)
0(4)-C(4)-C(5)
123.7(5)
C(2)-N(l)-C(7)
116.6(4)
N(3)-C(4)-C(5)
115.2(5)
C(6)-N(l)-C(7)
117.3(4)
N(l)-C(7)-C(8)
113.3(4)
C(4')-C(5')-C(5A')
105.9(4)
C(16')-C(ll')-C(12')
119.1(5)
C(4')-C(5')-C(6')
111.7(4)
C(16')-C(ll')-C(10')
120.7(5)
C(5A')-C(5')-C(6')
117.5(4)
C(12')-C(ll')-C(10' )
120.2(6)
C(4')-C(5')-C(5)
115.6(4)
0(4')-C(4')-N(3')
121.2(5)
C(5A')-C(5')-C(5)
118.7(4)
0(4')-C(4')-C(5')
122.9(5)
87.0(3)
N(3')-C(4')-C(5')
115.5(5)
C(2')-N(1')~C(6')
123.1(4)
C(12)-C(ll)-C(16)
118.3(5)
C(2')-N(l')-C(7')
116.1(4)
C(12)-C(ll)-C(10)
120.6(6)
C(6')-N(l')-C(7')
120.1(4)
C(16)-C(ll)-C(10)
121.0(5)
N(l)-C(6)-C(5)
114.3(4)
C(15)-C(14)-C(13)
119.7(7)
N(l)-C(6)-C(6')
114.7(4)
C(ll)-C(12)-C(13)
119.5(7)
C(6')-C(5')-C(5)
C(5)-C(6)-C(6')
87.7(3)
C(13')-C(12')-C(ll')
119.6(6)
C(4')-N(3')-C(2')
127.6(5)
C(15)-C(16)-C(ll)
121.9(6)
C(2)-N(3)-C(4)
128.7(5)
0(2)-C(2)-N(l)
122.0(5)
N(l')-C(6')-C(5')
117.0(4)
0(2)-C(2)-N(3)
120.2(5)
N(l')-C(6')-C(6)
121.2(4)
N(l)-C(2)-N(3)
117.7(5)
C(5')-C(6')-C(6)
90.0(3)
C(16')-C(15')-C(14' )
118.7(7)
C(5A)-C(5)-C(4)
107.9(4)
0(8)-C(8)-0(9)
124.9(5)
C(5A)-C(5)-C(6)
112.7(4)
0(8)-C(8)-C(7)
125.7(5)
C(4)-C(5)-C(6)
116.0(4)
0(9)-C(8)-C(7)
109.3(5)
C(5A)-C(5)-C(5')
112.7(4)
C(13')-C(14')-C(15')
119.4(7)
C(4)-C(5)-C(5')
117.5(4)
O(9)-C(10)-C(ll)
109.9(5)
C(6)-C(5)-C(5')
89.3(3)
C(14)-C(15)-C(16)
120.4(7)
0(8')-C(8')-0(9')
126.1(5)
C(12')-C(13')-C(14')
121.8(7)
0(8')-C(8')-C(7')
123.7(5)
C(ll')-C(16')-C(15')
121.4(6)
0(9')-C(8')-C(7')
110.1(5)
0(2')-C(2')-N(l')
121.8(5)
N(l')-C(7')-C(8')
112.7(4)
0(2')-C(2')-N(3')
122.2(5)
293
8.
Anhang
N(l')-C(2')-N(3')
Table
piA2
C(14)-C(13)-C(12)
Anisotropie displacement parameters
anisotropic displacement
The
-2
4.
116.0(5)
hA2
[
a*A2
Uli
+
...
factor
+
h k a*
2
(AA2
exponent takes
b*
U12
10A3)
x
the
120.2(7)
for 57.
form:
]
Uli
U22
U33
0(8')
55(2)
37(2)
43(2)
0(2)
14(2)
7(2)
0(9' )
44(2)
39(2)
39(2)
4(2)
2(2)
16(2)
3(2)
U23
U13
U12
0(4')
55(2)
18(2)
63(2)
10(2)
7(2)
0(9)
54(2)
36(2)
43(3)
4(2)
-2(2)
1(2)
N(l)
39(2)
25(3)
28(3)
8(2)
7(2)
12(2)
C(5' )
35(3)
15(3)
35(3)
1(3)
6(3)
5(2)
0(2')
49(2)
42(3)
58(3)
-2(2)
-15(2)
-12(2)
26(2)
0(2)
62(3)
41(2)
49(2)
2(2)
17(2)
N(l')
35(3)
20(3)
40(3)
5(2)
-1(2)
2(2)
0(8)
75(3)
30(3)
64(3)
12(2)
18(2)
-10(2)
C(6)
33(3)
16(3)
42(3)
2(3)
4(2)
2(2)
N(3')
41(3)
14(3)
51(3)
2(3)
3(3)
-6(2)
N(3)
52(3)
26(3)
36(3)
9(2)
12(2)
20(2)
C(6')
37(3)
12(3)
43(3)
3(3)
7(3)
6(2)
0(4)
78(3)
47(3)
42(3)
5(2)
3(2)
30(2)
C(5)
35(3)
17(3)
35(3)
-2(2)
1(2)
7(3)
C(5A')
50(3)
32(3)
51(3)
-4(3)
18(3)
8(3)
C(8')
41(4)
13(3)
37(4)
3(3)
3(3)
0(3)
C(7')
42(4)
34(3)
44(3)
9(3)
2(3)
7(3)
C(IO')
33(3)
48(4)
59(4)
5(3)
5(3)
19(3)
C(4)
38(3)
27(4)
46(4)
-1(3)
8(3)
4(3)
C(7)
41(3)
26(3)
41(4)
4(3)
8(3)
4(3)
C(5A)
44(3)
29(3)
55(4)
-5(3)
3(3)
-1(3)
C(ll')
32(3)
41(4)
44(4)
6(4)
-3(3)
10(3)
C(4')
37(3)
17(4)
46(4)
2(3)
11(3)
6(3)
C(ll)
48(3)
49(4)
34(4)
5(4)
1(3)
2(3)
C(14)
55(5)
124(9)
71(7)
32(6)
-9(4)
-25(5)
C(12)
64(4)
80(5)
62(5)
-14(5)
14(4)
-14(4)
C(12')
55(4)
37(4)
76(5)
13(4)
6(3)
3(3)
C(16)
78(4)
65(5)
41(4)
8(4)
0(3)
21(4)
C(2)
38(3)
24(4)
41(4)
7(3)
11(3)
11(3)
C(15')
71(5)
105(7)
62(6)
-15(5)
-5(4)
11(5)
C(8)
41(3)
41(4)
33(4)
6(3)
8(3)
11(3)
C(14')
68(5)
136(9)
62(5)
32(6)
14(5)
40(6)
C(10)
59(4)
48(4)
72(4)
-14(4)
-12(4)
-5(3)
C(15)
65(5)
83(5)
72(5)
23(5)
0(4)
8(4)
C(13')
68(5)
78(6)
88(6)
45(5)
20(4)
11(4)
-4(4)
C(16')
55(4)
61(5)
56(5)
0(4)
-1(3)
C(2')
36(3)
18(4)
53(4)
-6(3)
8(3)
1(3)
C(13)
81(5)
144(8)
43(5)
-14(6)
7(4)
-49(6)
Table
5.
Hydrogen coordinates
displacement parameters
(AA2
x
(
x
10A3)
294
10A4)
for
and
57.
isotropic
x
y
z
U(eq)
46
H(6A)
1301(3)
2754(8)
52(2)
H(3'A)
3962(3)
8636(6)
104(2)
54
339(3)
8921(6)
-386(2)
56
46
H(3A)
H(6'A)
2748(3)
2156(8)
-68(2)
H(5AA)
3789(3)
4564(8)
-724(2)
64
H(5AB)
3071(3)
2759(8)
-869(2)
64
H(5AC)
2945(3)
5016(8)
-1116(2)
64
H(7'A)
3120(3)
1478(8)
783(2)
61
H(7'B)
3542(3)
3315(8)
1120(2)
61
H(10A)
6180(3)
1015(9)
1227(2)
71
H(IOB)
5675(3)
-1177(9)
1143(2)
71
H(7A)
1752(3)
3792(8)
896(2)
54
H(7B)
1004(3)
5434(8)
964(2)
54
H(5AD)
618(3)
2803(8)
-902(2)
65
H(5AE)
1436(3)
3209(8)
-1175(2)
65
H(5AF)
1532(3)
1590(8)
-743(2)
65
H(14A)
4680(4)
2234(17)
3335(3)
128
H(12A)
3348(4)
7726(12)
2857(3)
103
H(12B)
5421(4)
-3416(10)
1809(3)
85
H(16A)
3809(4)
3099(11)
1926(2)
94
H(15A)
6984(4)
1589(15)
2866(3)
122
H(14B)
6536(5)
-1729(18)
3154(3)
133
H(IOC)
2852(4)
8248(9)
2039(2)
93
H(IOD)
3626(4)
7565(9)
1760(2)
93
H(15B)
4495(4)
985(12)
2554(3)
111
116
H(13A)
5728(5)
-4108(13)
2628(3)
H(16B)
6644(4)
2333(10)
2037(2)
88
H(13B)
4085(6)
5573 (20)
3499(3)
134
295
8.
Anhang
8.1.4
Kristallographische
Daten
von
58
C112)
CI13)
C(iM)
Table
Crystal data and
1.
refinement
structure
for
58.
Identification code
epl
Empirical
C18.67 H18.67 N2.67
formula
Formula weight
365.70
Temperature
293(2)
Wavelength
0.71073
Crystal system
Monoclinic
Space group
C2/c
Unit cell
dimensions
K
A
a
=
18.174(13)
b
=
8.282(3)
c
=
18.732(11)
Volume
2653(3)
Z
6
Density (calculated)
1.373
Mg/mA3
0.102
mmA-l
F(000)
1152
Theta
range
0.5
2.31
collected
2413
Index ranges
Reflections
Independent reflections
2337
None
Refinement method
/ restraints
Goodness-of-fit
Final
R
R
indices
indices
on
FA2
[I>2sigma(I)]
(all data)
Extinction coefficient
Largest diff.
peak and hole
2337
[R(int)
/
A
=
gamma
=
90
deg.
0
/
=
-22<=1<=21
0.0285]
least-squares
194
0.921
=
0.0492,
wR2
=
0.1319
Rl
=
0.0713,
wR2
=
0.1383
0.006(2)
296
deg.
109.78(5)
mm
Rl
0.320
=90
deg.
0<=k<=9,
Full-matrix
/ parameters
beta
0.3
x
25.05
to
0<=h<=21,
Absorption correction
Data
0.3
x
for data collection
alpha
A
A
AA3
Absorption coefficient
Crystal size
05.33
and -0.213
e.AA-3
on
FA2
deg.
to
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8.
Anhang
8.1.5
Kristallographische
Daten
von
59
ciai
CII5)
CI16)
CI8I/0
C(7J
0(4-,
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CII6')
01,5,1
Crystal data and
1.
0(4)
0(8'.
•
Table
C(7'l
refinement
structure
Identification code
ttca
Empirical
C28
Formula
formula
weight
H28
N4
for
08
548.54
Temperature
293(2)
Wavelength
0.71073
Crystal system
Monoclinic
K
A
Space group
P2(l)/c
Unit cell
a
=
13.032(13)
A
b
=
16.156(11)
A
c
=
12.639(8)
dimensions
Volume
2635(4)
Z
4
Density (calculated)
1.383
Mg/mA3
0.103
mmA-l
F(000)
1152
Crystal size
.5
for
data
collection
Index ranges
Reflections
x
.4
1.58
to
.4
x
beta
A
gamma
=
0<=1<=13
3652
Independent reflections
3463
None
Refinement method
Full-matrix least-squares
/
restraints
Goodness-of-fit
Final R indices
R
indices
on
/
parameters
FA2
[I>2sigma(I)]
(all data)
3463
[R(int)
/
0
/
0.0156]
362
0.858
=
0.0400,
wR2
=
0.0966
Rl
=
0.0595,
wR2
=
0.1009
0.0105(11)
Largest diff.
0.213
and hole
=
Rl
Extinction coefficient
peak
deg.
deg.
-17<=k<=0,
Absorption correction
Data
98.02(7)
=90
mm
22.55
-14<=h<=13,
collected
alpha =90 deg.
AA3
Absorption coefficient
Theta range
59.
300
and
-0.177
e.AA-3
on
FA2
deg.
8. Anhan
Table
2.
Atomic
coordinates
displacement parameters
as
one
third of
the
trace
of
x
x
10A4)
10A3)
the
equivalent isotropic
U(eq)
59.
z
9735(1 )
is
defined
tensor.
U(eq)
1251(1)
48(1
-4913(1
11045(1
-68(1)
54(1
N(3')
-965(2
10838(1
593(2)
44(1
N(l')
-878(1
10433(1
2376(1)
41(1
0(9)
-5371(1
12322(1
1733(2)
59(1
N(3)
-3792(2
10310(1 )
1109(2)
46(1
70(1
0(2)
4(1
and
for
orthogonalized Uij
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x
0(2')
(
(AA2
0(8')
1025(2
9587(1
4445(2)
0(4')
-1774(1
11978(1
-118(1)
56(1
N(l)
-3688(1
11749(1
1006(2)
42(1
1016(1
10701(1
3383(1)
59(1
C(6)
-2884(2
11784(2
1916(2)
39(1
0(4)
-2876(1
9537(1
2376(2)
65(1
C(5')
-1705(2
11807(2
1766(2)
39(1
0(9')
C(5)
-2710(2
10995(1
2596(2)
36(1
C(4)
-3111(2
10219(2
2028(2)
42(1
C(6')
-1517(2
11118(2
2615(2)
39(1
C(2')
-573(2
10301(2
1413(2)
39(1
C(2)
-4173(2
11042(2
650(2)
43(1
0(8)
-5723(2
13247(1
414(2)
92(1
2813(2
10290(2
3277(2)
59(1
C(ll')
596(2
10032 (2
3756(2)
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-4135(2
12516(2
558(2)
56(1
-486(2
9869(2
3229(2)
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12734(2
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C(5A' )
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C(8')
C(7)
C(7')
C(4')
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11552(2
661(2)
42(1
C(5A)
-3088(2
11036(2
3689(2)
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C(16)
-8125(2
12829(2
1202(3)
69(1
C(16')
3826(2
10218(2
3736(2)
62(1
C(13')
3195(2
9333(3
1923(3)
97(1
C(ll)
-7274(2
12324(2
1299(3)
69(1
C(15)
-8980(2
12680(2
446(3)
75(1
C(12' )
2499(2
9833(3
2364(3)
97(1
C(15')
4510(2
9730(2
3285(3)
65(1
C(14')
4199(2
9286(2
2379(2)
72(1
124(2
C(12)
-7295(3
11652(2
629(4)
C(10)
-6348(2
12518(2
2109(3)
81(1
2103(2
10856(2
3775(3)
76(1
C(IO')
C(13)
-8147(3
11517(3
-135(4)
142(2
C(14)
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8.
Anhang
C(ll')-C(12')-C(13')
120.8(3)
O(9)-C(10)-C(ll)
112.9(3)
C(14')-C(15')-C(16')
121.1(3)
O(9')-C(10')-C(ll';
112.4(2)
C(13,)-C(14')-C(15')
118.9(3)
C(14)-C(13)-C(12)
121.1(4)
C(ll)-C(12)-C(13)
119.9(3)
C(13)-C(14)-C(15)
119.7(4)
Table
The
-2
Anisotropie displacement parameters
4.
anisotropic displacement
piA2
[
hA2
a*A2
Uli
+
Uli
U22
0(2')
48(1)
0(2)
50(1)
N(3')
51(1)
N(l')
0(9)
...
factor
+
2
(AA2
exponent takes
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b*
U12
10A3)
x
the
for
59.
form:
]
U33
U23
58(1)
38(1)
-5(1)
9(1)
64(1)
43(1)
-3(1)
-9(1)
0(1)
58(1)
25(1)
-2(1)
8(1)
11(1)
44(1)
54(1)
27(1)
3(1)
10(1)
12(1)
47(1)
53(1)
79(1)
8(1)
13(1)
6(1)
N(3)
51(1)
40(1)
43(1)
-9(1)
-5(1)
4(1)
U13
U12
15(1)
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71(1)
91(2)
44(1)
11(1)
-1(1)
26(1)
0(4')
65(1)
63(1)
41(1)
11(1)
9(1)
10(1)
N(l)
37(1)
42(1)
47(1)
5(1)
-1(1)
-1(1)
0(9' )
49(1)
70(1)
59(1)
-5(1)
4(1)
2 (1)
C(6)
38(1)
44(2)
36(1)
-7(1)
7(1)
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0(4)
67(1)
48(1)
74(1)
9(1)
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C(5')
40(1)
44(2)
33(1)
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6(1)
-3(1)
C(5)
35(1)
46(2)
28(1)
-2(1)
7(1)
1(1)
C(4)
37(1)
46(2)
44(2)
1(1)
5(1)
3(1)
C(6')
35(1)
53(2)
29(1)
-7(1)
5(1)
1(1)
C(2' )
36(1)
49(2)
31(2)
-4(1)
4(1)
0(1)
C(2)
39(2)
52(2)
37(2)
-2(1)
5(1)
1(1)
0(8)
67(1)
59(1)
143(2)
33(1)
-17(1)
9(1)
C(ll')
47(2)
77(2)
52(2)
-9(2)
5(1)
-7(2)
C(8')
51(2)
60(2)
33(2)
-4(2)
11(1)
13(2)
C(7)
51(2)
51(2)
64(2)
18(2)
1(1)
-6(1)
C(7')
49(2)
60(2)
34(2)
8(1)
11(1)
10(1)
C(8)
46(2)
38(2)
84(2)
10(2)
-12(2)
-1(1)
C(5A')
54(2)
58(2)
61(2)
-12(2)
7(1)
-12(1)
C(4')
37(1)
50(2)
38(2)
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C(5A)
48(2)
77(2)
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16(1)
C(16)
58(2)
65(2)
88(2)
-11(2)
20(2)
2(2)
C(16')
60(2)
69(2)
53(2)
-5(2)
-6(2)
-7(2)
-2
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C(13')
57(2)
169(4)
64(2)
-46(2)
3(2)
5(2)
C(ll)
43(2)
61(2)
106(3)
-19(2)
22(2)
-6(2)
C(15)
57(2)
73(2)
94(3)
0(2)
15(2)
-5(2)
C(12')
52(2)
168(4)
66(2)
-41(3)
-3(2)
8(2)
C(15')
53
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70(2)
69(2)
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-5(2)
C(14")
57(2)
100(3)
61(2)
-3(2)
14(2)
1(2)
C(12)
56(2)
93(3)
224(5)
-84(3)
15(3)
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C(10)
48(2)
87(2)
110(3)
-22(2)
19(2)
4(2)
C(IO')
50(2)
94(2)
83(2)
-25(2)
2(2)
-6(2)
C(13)
58(2)
138(4)
228(5)
-117(4)
16(3)
-24(3)
C(14)
55(2)
111(3)
116(3)
-30(3)
17(2)
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8.
8.1.6
Kristallographische
Daten
von
60
CI14I
C(13)
(^
^C(15)
r^Cllô)
'cmi
rC(2)
if
C(5a)|"C(4]
0(4)
Table
1.
Crystal data and
refinement
structure
Identification code
ep2
Empirical formula
C24
Formula weight
468.45
H24
N2
Temperature
293(2)
Wavelength
0.71073
Crystal system
Triclinic
Space group
P-l
Unit cell
dimensions
08
A
a
=
7.611(3)
A
alpha
=
73.56(4)
deg.
b
=
7.980(4)
A
beta
=
87.47(4)
deg.
c
=
12.368(7)
663.6(6)
Z
1
1.172
Mg/mA3
Absorption coefficient
0.089
mmA-l
F(000)
246
0.5
for
data
collection
Index ranges
collected
Independent
reflections
Absorption correction
Refinement method
/
restraints
Goodness-of-fit
Final R indices
R
indices
on
0.3
x
25.04
to
0<=h<=9,
Reflections
Data
0.4
x
1.72
FA2
[I>2sigma(I)]
(all data)
=
67.45(3)
mm
deg
-8<=k<=9
,
-14<=1<=14
2345
[R(int)
=
0. 0130]
None
2345
/
0
/
least -squares
182
0.849
Rl
=
0.0420,
wR2
=
0.1202
Rl
=
0.0554,
wR2
=
0.1255
Extinction coefficient
0.047(13)
Largest diff.
0.245
peak and hole
gamma
2536
Full-matrix
/ parameters
A
AA3
Density (calculated)
Crystal size
60.
K
Volume
Theta range
for
305
and
-0.190
e.AA-3
on
FA2
deg
Anhang
000000033300
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8.
Anhang
C(8)-O(9)-C(10)
115.1(2)
C(ll)-C(12)-C(13)
120.3(2)
C(2)-N(l)-C(6)
124.09(13)
C(ll)-C(16)-C(15)
120.8(2)
C(2)-N(l)-C(7)
118.32(14)
C(14)-C(15)-C(16)
120.7(2)
C(6)-N(l)-C(7)
116.05(13)
0(2)-C(2)-N(l)
123.7(2)
N(l)-C(6)-C(5)
117.32(12)
0(2)-C(2)-N(3)
119.4(2)
N(l)-C(6)-C(5)#l
117.26(14)
N(l)-C(2)-N(3)
116.84(14)
C(5)-C(6)-C(5)#l
90.99(12)
C(4)-C(5)-C(5A)
110.09(14)
0(8)-C(8)-0(9)
124.6(2)
C(4)-C(5)-C(6)
115.17(13)
0(8)-C(8)-C(7)
124.1(2)
C(5A)-C(5)-C(6)
114.16(13)
0(9)-C(8)-C(7)
111.3(2)
C(4)-C(5)-C(6)#l
110.64(13)
N(l)-C(7)-C(8)
110.9(2)
C(5A)-C(5)-C(6)#1
116.49(14)
O(9)-C(10)-C(ll)
110.1(2)
C(6)-C(5)-C(6)#l
C(12)-C(ll)-C(16)
118.3(2)
C(4)-N(3)-C(2)
C(12)-C(ll)-C(10)
117.5(2)
0(4)-C(4)-N(3)
121.12(14)
C(16)-C(ll)-C(10)
124.1(2)
0(4)-C(4)-C(5)
121.32(14)
C(14)-C(13)-C(12)
120.9(2)
N(3)-C(4)-C(5)
117.53(13)
C(15)-C(14)-C(13)
118.9(2)
89.01(12)
127.71(13)
Symmetry transformations used to generate equivalent atoms:
#1
Table
Anisotropic displacement parameters
anisotropic displacement
The
-2
4.
-x,-y+l,-z
pi
^2
hA2
[
Uli
a*'2
Uli
+
...
factor
+
2
h k
U22
U33
(AA2
exponent takes
a*
b*
U12
U23
10A3)
x
the
for
60.
form:
]
U13
U12
0(9)
38(1)
71(1)
41(1)
-14(1)
13(1)
-22(1)
N(l)
27(1)
28(1)
40(1)
-7(1)
10(1)
-11(1)
C(6)
25(1)
25(1)
34(1)
-11(1)
7(1)
-8(1)
C(8)
29(1)
44(1)
45(1)
-6(1)
8(1)
-11(1)
C(7)
29(1)
41(1)
44(1)
-7(1)
9(1)
-16(1)
C(10)
47(1)
94(2)
42(1)
-17(1)
7(1)
-27(1)
0(8)
38(1)
112(1)
50(1)
-17(1)
4(1)
-27(1)
C(ll)
47(1)
61(1)
38(1)
-13(1)
8(1)
-19(1)
C(13)
86(2)
123(2)
45(1)
-25(1)
22(1)
-28(2)
C(14)
65(2)
85(2)
71(2)
-22(1)
33(1)
-32(1)
C(12)
60(1)
112(2)
46(1)
-25(1)
7(1)
-24(1)
C(16)
55(1)
109(2)
51(1)
-32(1)
16(1)
-38(1)
C(15)
58(2)
112(2)
78(2)
-40(2)
24(1)
-45(2)
C(2)
36(1)
30(1)
40(1)
-10(1)
6(1)
-14(1)
C(5)
24(1)
26(1)
33(1)
-11(1)
4(1)
-9(1)
N(3)
32(1)
26(1)
52(1)
-17(1)
15(1)
-10(1)
0(2)
54(1)
32(1)
75(1)
-12(1)
19(1)
-22(1)
C(4)
24(1)
28(1)
33(1)
-10(1)
3(1)
-7(1)
C(5A)
35(1)
39(1)
47(1)
-16(1)
0(1)
-14(1)
0(4)
26(1)
36(1)
66(1)
-19(1)
16(1)
-10(1)
307
8.
Anhang
Table
5.
Hydrogen coordinates
displacement parameters
x
(AA2
x
(
x
10A3)
y
10A4)
for
and
isotropic
60.
z
U(eq)
H(6A)
873(2)
5097(2)
-1359(1)
H(7A)
3338(2)
6518(3)
-1503(1)
58
H(7B)
2469(2)
8715(3)
-1776(1)
58
93
42
H(10A)
1976(3)
8964(4)
-5148(2)
H(10B)
2600(3)
6775(4)
-4830(2)
93
H(13A)
6321(4)
7579(4)
-7868(2)
133
H(14A)
9105(4)
7284(4)
-6991(2)
111
H(12A)
3587(4)
7808(4)
-6859(2)
112
H(16A)
6473(3)
7398(4)
-4082(2)
102
H(15A)
9186(3)
7160(4)
-5093(2)
115
H(3A)
-3185(2)
10069(2)
-353(1)
54
H(5AA)
-3605(2)
4957(2)
-836(2)
59
H(5AB)
-2592(2)
5696(2)
-1886(2)
59
H(5AC)
-1573(2)
3648(2)
-1069(2)
59
308
8.
8.2
Fluoreszenzspektren
der
gemischten ModeUverbindungen
(Flavin-und Desazaflavineinheit im oxidierten Zustand)
8
128
7
125
6
"?
5
o
x
I
4.
-
Q.
3-
132
\
CO
ü
130
\
I
117
\
/
2-
<^^
410
460
Anhang
510
X
309
560
(nm)
610
660
4x/2x
4x/2x
15/10
15/10
15/10
FmocPyOBT
FmocPyOBT
FmocPyOBT
FmocFlavOH
2x 30'
mmol/g:
+++
+++
TFA/H20/TIPS 95:2.5:2.5
15 / 10 min.
Ac20, 5'.
2mL NMP / 0.9 mL DIEA.
2mL DIEA / lmL
Entschützung:
Abspaltung:
Letzte
Acetylierung:
Kupplungsvolumen:
280 mg Rink Amide MB HA Resin 0.42
4x/2x
4x/2x
-test
NMP
4x/2x
hydrin
15/10
Ne¬
DMF/
310
130
130
[mg]
TBTU
reagenz:
Kupplungs¬
120 urnol Ansatz.
220
180
180
180
180
[mg]
AS
Kupplung:
Polyamide
Waschen
163
15/ 10
[min]
ungsdauer
Entschütz
von
der
FmocLys(BOC)
Harz
AS:
Synthese-Protokoll
Synthese-Protokolle
Anhang
8.3
8.
60
60
[mg]
HOBT
-reagenz:
Kupplungs
90'
90'
90'
90'
60'
Dauer
Kupplungs
-test
DMF
4x
4x
4x
4x
4x
Ninhydrin
Waschen
-
-
-
-
-
Cap.
Anhang
-test
DMF
Dauer
4x
4x
4x
4x
4x
150'
120'
120'
90'
90'
HATU: 330
330
230
300
300
300
220
300
4x/2x
4x/2x
4x/2x
4x/2x
4x/2x
4x/2x
15/10
15/10
15/10
15/10
15/ 10
15/10
FmocyOH
FmocPyOBT
FmocPyOBT
FmocPyOBT
FmocßOH
FmocFlavOH
2mL DIEA / lmL
45 min.
240]imol
Ac20,
TFA/H20/TIPS 95:2.5:2.5
5'
2mL NMP / 0.9 mL DIEA
Entschützung: 15 / 10 min.
Abspaltung:
Letzte
Acetylierung:
Kupplungsvolumen:
400 mg Rink Amide MBHA Resin:
+?+!!
+ +
311
160
+
+
4x
120'
—
4x
120' /120'
HATU: 330
300
4x/2x
15/10
FmocPyOBT
4x
120'
300
15/ 10
FmocPyOBT
+
+
4x/2x
+++
4x/2x
15/10
FmocPyOBT
300
+++
4x/2x
15/10
FmocLys(BOC)
4x
+
Cap.
4x
—
Ninhydrin
Waschen
Kupplungs
120'
160
[mg]
rmgi
330
HOBT
TBTU
[mg]
test
NMP
[min]
330
-reagenz:
reagenz:
AS
hydrin¬
DMF/
Dauer
Kupplungs
Kupplungs¬
Kupplung:
Nin¬
Waschen
164
Entsch.
von
60' / 60'
Harz
AS:
Synthese-Protokoll
8.
Anhang
15/10
15/10
15/10
15/ 10
15/10
15/10
15/10
15/10
FmocPyOBT
FmocPyOBT
FmocyOH
FmocPyOBT
FmocPyOBT
FmocImOH
FmocßOH
FmocFlavOH
4x/2x
4x/2x
4x/2x
4x/2x
2.5
TFA/H20/TIPS
95:2.5:2.5
15 / 10 min.
Ac20, 5'
390
440
300
330
330
230
330
330
330
420
[mg]
AS
Kupplung:
Ansatz
2mL NMP / 0.9 mL DIEA
2mL DIEA / lmL
Entschützung:
Abspaltung:
Letzte
Acetylierung:
Kupplungsvolumen:
+?
+++
+++
+++
test
hydrin¬
Nin¬
240(imol
4x/2x
4x/2x
4x/2x
4x/2x
4x/2x
4x/2x
400 mg Rink Amide MBHA Resin:
15/10
NMP
[min]
15/ 10
DMF/
FmocPyOBT
Waschen
Dauer
165
Entsch.
von
FmocArg(Mtr)
Harz
AS:
Synthese-Protokoll
8.
330
330
330
160
160
160
160
[mg]
330
HOBT
[mg]
reagenz:
Kupplungs
TBTU
reagenz:
Kupplungs¬
90'
60' / 60'
90'
90'
90'
60'
90'
90'
90'
60' / 45'
Dauer
Kupplungs
4x
4x
4x
4x
4x
4x
4x
4x
4x
4x
DMF
Waschen
+
/
+
-test
Ninhydrin
+
+
-
-
+
-
-
-
-
Cap.
8.
Anhang
Synthese-Protokoll
von
166
-test
Ninhydrin
Entsch.
AS:
DMF
Waschen
AS
Kupplung:
[mg]
HOBT
Dauer
Nin¬
Trng]
TBTU
15/10
15/ 10
4x/2x
4x/2x
4x/2x
+++
+++
330
330
420
220
330
330
160
160
160
90'
60'/45'
60'
60'
4x
4x
4x
4x
4x
4x
-/-
+
Kupplungs
hydrin¬
[mg]
330
-reagenz:
DMF/
Waschen
test
450
Kupplungs
Dauer
NMP
+++
reagenz:
15/10
Kupplungs¬
15/10
FmocArg(Mtr)
15/ 10
[min]
FmocdFlavOH
+++
FmocPyOBT
Harz
FmocßOH
FmocPyOBT
90'
Cap.
+
-
-
-
+
4x
330
4x
4x/2x
60'
-
-
90'
15/10
160
FmocPyOBT
330
230
+
330
4x
+
4x/2x
4x
4x/2x
90'
4x
15/ 10
90'
15/10
60' / 90'
FmocTOH
160
FmocPyOBT
330
330
4x/2x
300
15/ 10
440
15/10
4x/2x
15/10
4x/2x
FmocßOH
4x
FmocImOH
90'
+?
160
4x/2x
330
15/ 10
(imol
Ac20, 5'
2mL NMP / 0.9 mL DIEA
2mL DIEA / lmL
15/10 min.
2.5h TFA/H20/TIPS 95:2.5:2.5
Entschützung:
Abspaltung:
Letzte
Acetylierung:
Kupplungs volumen:
400 mg Rink Amide MBHA Resin: 240
FmocFlavOH
390
FmocPyOBT
++
90'
Ansatz
313
Lebenslauf
Epple
Name:
Robert
Geburtsdatum:
15.07.1971
Geburtsort:
Linz /
Eltern:
Ursula
Österreich
Epple (geb. Michaelis)
Dr. Günther
Eduard
Addresse:
Epple
Haas-Weg
9
A-4113 St. Martin i.M.
Österreich
Nationalität:
(OÖ)
1977-1980
Volksschule St. Martin i. M.
1981-1989
Stiftsgymnasium Kremsmünster (humanist,
1989
österr. Matura
1989-1990
Stiftsgymnasium Einsiedeln (Sz)
1990
Schweiz. Matura
1990-1995
Studium der
neusprachl. Ausbildung)
u.
(Stiftsgymnasium Kremsmünster)
(Typus B, Stiftsgymnasium Einsiedeln)
Biologie
an
der
Technischen Hochschule
Eidgenössischen
(ETH) Zürich, Fachrichtung Chemie-Biologie, Vertiefung in Chemie
biologische Fächer: Genetik, Immunologie
1995
Diplomarbeit
zur
'Synthese
und
Verknüpfung
dimeren mit Flavinbausteinen' in der
unter
1995-1999
der
Leitung
von
Promotionsarbeit in
Gruppe
von
von
Uracil-Cyclobutanphoto-
Prof.
Dr. F. Diederich
Dr. T Carell
organischer
Chemie unter der
Leitung
von
Prof.
Dr. F.
Diederich und Dr. T. Carell
Vollpraktikanden (Fachrichtung: Bioorganische Chemie)
1996
Betreuung
eines
1996
Betreuung
eines Praktikums der org. Chemie für Studenten der Pharmazie
1997
zehntägiger
Besuch der
München für
Gruppe
von
Prof.
M. E.
Michel-Beyerie
der TU
zeitaufgelöste laserspektroskopische Messungen
organischen
Chemie
1997
Betreuung
eines
Diplomanden
1998
Betreuung
eines
Vollpraktikanden (Fachrichtung: Biochemie)
Zürich, Februar 1999
an
der
Robert
Epple