Vervielfältigung von DNA-Abschnitten mit PCR - Wiley-VCH

|
T R E F F P U N K T FO R SC H U N G
© Lorelyn Medina –
FOTOLIA
DIE LABORSEITE
GUT ZU WISSEN
Vervielfältigung von
DNA-Abschnitten mit PCR
Bei der PCR (Polymerase-Kettenreaktion) handelt es sich um einen relativ junge Methode. Sie wurde erst 1983 von Kary Mullis erfunden,
der für diese Erfindung den Nobelpreis in Chemie bekam. Diese Methode wird für die Vervielfältigung von kurzen DNA-Sequenzen benutzt
und kann z.B. für einen Vaterschaftstest, zum Erkennen von Krankheiten und zum Klonieren von Genen eingesetzt werden. Mit der PCRMethode kann allerdings kein komplettes Genom vervielfältigt werden.
Zum Vergleich: Das menschliche Genom besteht aus circa 3 Milliarden
Basenpaaren (bp). Die PCR-Methode stößt bei bereits 3000bp an ihre
Grenzen.
ABB. 1
SCHEMATISCHE DARSTELLUNG EINES PCR-ZYKLUS
Von unten
nach oben:
Denaturierung, Primerhybridisierung und
Elongation.
Bild: DHGP.
Der PCR-Prozess besteht aus einer
Anzahl von 25 bis 50 Zyklen, die
in einem so genannten Thermocycler durchgeführt werden. Bei
jedem Zyklus werden DNA-Moleküle denaturiert. Anschließend
lagern sich spezifische Primer an,
die als Startpunkt für eine hitzestabile DNA-Polymerase dienen.
Der DNA-Vermehrungsprozess ist
exponentieller Natur. Jeder Zyklus
verdoppelt die Templatemenge
(2n; n= Zyklenzahl; d.h. 30 Zyklen
würden DNA auf 230= 1 Billion
Kopien erhöhen).
Im Prinzip besteht jeder Zyklus
aus den gleichen, sich immer wiederholenden Schritten:
1. Denaturierung: Hier wird
der DNA-Doppelstrang erhitzt (z.B.
30 s bei 94°C). Die beiden Stränge
trennen sich voneinander. Im ersten Zyklus wird die Denaturierungszeit erhöht (z.B. 3 min bei
94°C), um die vollständige Trennung der beiden Stränge und auch
eventuell zusammengelagerter
Primer sicherzustellen.
2. Primerhybridisierung /
Anlagerung (Annealing): Die
Temperatur wird auf die optimale
Primerannealing-Temperatur gesenkt (je nach Primer verschieden,
z.B. 30s 60°C). Diese Temperatur
liegt normalerweise 3-5°C unterhalb des Schmelzpunktes der Primer. Eine Faustformel zur Errechnung der Schmelztemperatur steht
in BIUZ 3/2007, S.151.
Wählt man eine zu hohe Temperatur, so können sich die Primer
nicht mehr anlagern. Ist die gewählte Temperatur zu niedrig,
wird die Reaktion sehr unspezifisch und die Primer lagern sich an
falschen Stellen an.
3. Elongation: In diesem
Schritt füllt die DNA-Polymerase
die freien Stränge mit Nukleotiden
vom 3’-Ende her auf. Die Temperatur richtet sich nach dem Tempera-
© 2008 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
Reaktionskomponenten der PCR
1. Reaktionspuffer
Stellt den von der Polymerase benötigten pH-Wert und
die Ionen-Konz. ein
2. Magnesiumionen (Mg2+) als MgSO4 oder MgCl2
– werden von der Polymerase als Co-Faktor benötigt.
– bilden Komplexe mit den Desoxynukleotiden, nur diese
Komplexe werden von der Polymerase eingebaut
– stabilisieren die DNA-Doppelhelix und erhöhen so den
Schmelzpunkt
– zu wenig Mg2+: spezifische Produkte, aber wenig Ausbeute
– zu viel Mg2+: hohes Risiko für unspezifische Produkte,
aber höhere Ausbeute
3. Desoxynukleotide (dNTPs) dATP, dCTP, dGTP, dTTP
= Substrat für DNA-Polymerase
4. Primer (forward, reverse)
– 15-35 Nukleotide lang
– Schmelzpunkt ∼ 50-60°C (beide Primer sollten ungefähr die gleiche Schmelztemperatur haben!)
– Ausgewogener GC- und AT-Gehalt
– sequenzspezifisch (komplementär zu je einem der
beiden Stränge im Randbereich)
– keine Sekundärstruktur-Ausbildung. (Primer sollen
keine in sich komplementären Sequenzen haben)
5. Thermostabile DNA-Polymerase
z.B: Taq-Polymerase (Nachteil: hohe Fehleranfälligkeit;
führt zu Mutation in DNA-Sequenz)
Alternative: Enzyme mit Korrekturmechanismus; z.B.
Pfu-Polymerase (aus Archaea gewonnen)
6. Template-DNA (Matrize)
– möglichst rein (OD260nm/OD280nm >1,7)
– im Ansatz zwischen 1 pg und 100 ng
– frei von Hemmstoffen (z.B: EDTA, Heparin) und Kontaminanten
7. Wasser
turoptimum der verwendeten Polymerase (z.B. 30s 72°C). Am Ende
des letzten Zyklus empfiehlt sich
eine verlängerte (finale) Elongationsphase (z.B. 5min 72°C).
Die PCR-Produkte können für
kurze Zeit (Tage) bei 4°C aufbewahrt werden. Für eine längere
Aufbewahrung empfiehlt sich die
Lagerung bei -20°C. Mittels Agarose-Gelelektrophorese können
die Proben aufgetrennt und ausgewertet werden. Die vervielfältigte
DNA erscheint als Bande auf den
Gel. Mithilfe von Größenstandards
kann die Größe des DNA-Fragmentes abgeschätzt werden.
Viel Spaß beim Experimentieren
wünscht Andrea Schrödel,
Heidelberg
www.biuz.de
1/2008 (38)
|
Biol. Unserer Zeit
|
15