K-RAS
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Funktionelle Genomik praktische Anwendungen Schmelzpunkt der DNA Einzelsträngige DNA absorbiert UV-Licht effektiver SYBR Green fluoresziert nur wenn es an doppelsträngiger DNA bindet Fluoreszenz erhöht sich bis auf Schmelzpunkt, TM Nimmt nach dem TM ab Kehrt zur Nullwert nach dem vollkommenen Schmelzen der DNA zurück Programmiertes Aufheizen der PCR-Produkte ermöglicht Analyse Real time PCR Gerät Real-Time PCR Anwendungen im Laborpraxis VNTR/Satelliten-Analyse von 5 Personen (unterschiedliche Farben). Welche Schmelzkurve an welchem Gelfoto gehört? Die Fluoreszenz nimmt proportional mit der Menge der PCR-Produkte zu. Diese Fluoreszenzfarbstoffe lagern sich in die DNA ein (interkalieren) bzw. binden an die doppelsträngige DNA, wodurch die Fluoreszenz dieser Farbstoffe ansteigt. Die Zunahme der Target-DNA korreliert daher mit der Zunahme der Fluoreszenz von Zyklus zu Zyklus Real-Time PCR Anwendungen im Laborpraxis 5 2 6 3 4 Real-Time PCR Anwendungen im Laborpraxis 5 2 6 3 4 Was der Genotyp der Patienten ist? Real-Time PCR Anwendungen im Laborpraxis 5 2 6 3 4 Die 5 Patienten weisen 2 morphologische Varianten auf #2 und # 6: Homozygot, mehrere Wiederholungen #3, #4: Heterozygot #5: Homozygot, weniger Wiederholungen der Satelliten-Einheiten Real-Time PCR Demonstrierung von Punktmutation 3 Patienten, Amplifizierung des Mutanten Exons G-C->A-T Austausch verniedrigt TM 3 Genotypen Real-Time PCR Demonstrierung von Punktmutation Homozygot, Wildtyp 3 Patienten, Amplifizierung des Mutanten Exons G-C->A-T Austausch verniedrigt TM Real-Time PCR Demonstrierung von Punktmutation Homozygot, Wildtyp Heterozygot Real-Time PCR Demonstrierung von Punktmutation Homozygot, Wildtyp Homozygot, Mutant Heterozygot Real-Time PCR, Genexpressionsanalyse A: Gesund, Kontrolle B: Patient Überexprimierung in Patient kann diagnostischen Wert vertreten DNA-Chip Kinetik der Genexpression Pharmakogenomik: Test eines Wirkstoffes auf Genexpression; A, B, C, D: Unterschiedliche Geweben A B C D v 0h 2h 4h 6h 8h 10h Analyse von Expressionsmuster Gen 0h 2h 4h 6h 8h 12h Q 1 2 3 4 3 2 S 1 3 4 4 3 2 T 1 2 3 4 3 2 V 4 6 8 6 4 2 Die Gene Q und T weisen identische Expression auf Ob die Gene S und V mit Q und T zusammenhängend sind rechnet man mithilfe Pearson-Korrelation aus 1: Beide Genexpression ändern sich in der selben Richtung -1: Ändern sich gegenseitig 0.5: Deutlich positiver Zusammenhang -0.5: Deutlich negativer Zusammenhang ρ(Q,S)=0,897, deutlich positiver Zusammenhang Korrelation zwischen X und Y Strukturelle Genomik Praktikum Was ist ein SNP? Untersuchung von SNP Was ist ein SNP? Einzelnukleotid Polymorhpismus Untersuchung von SNP Was ist ein SNP? Einzelnukleotid Polymorhpismus Wie oft ist ein SNP? Untersuchung von SNP Was ist ein SNP? Einzelnukleotid Polymorhpismus Wie oft ist ein SNP? >1% Untersuchung von SNP Was ist ein SNP? Einzelnukleotid Polymorhpismus Wie oft ist ein SNP? >1% Wie können wir es bestimmen? Untersuchung von SNP Was ist ein SNP? Einzelnukleotid Polymorhpismus Wie oft ist ein SNP? >1% Hogyan lehet azonosítani? ASA (AS-PCR) Untersuchung von SNP Was ist ein SNP? Einzelnukleotid Polymorhpismus Wie oft ist ein SNP? >1% Hogyan lehet azonosítani? ASA (AS-PCR) DNA Sequenzierung Untersuchung von SNP Allelspezifische Analyse (ASA) • (wt) – 5’CGT AGT CCT TGA AGC TAT ……………… TAT GTA CGT AGC TGA • (m) – 5’CGT AGT CCT TGA AGC TAC ……………… TAT GTA CGT AGC TGA Allelspezyfische Amplifikation - ASA • (wt) – 5’CGT AGT CCT TGA AGC TAT ……………… TAT GTA CGT AGC TGA • (m) – 5’CGT AGT CCT TGA AGC TAC ……………… TAT GTA CGT AGC TGA Allelspezyfische Amplifikation - ASA • (wt) – 5’CGT AGT CCT TGA AGC TAT ……………… TAT GTA CGT AGC TGA • (m) – 5’CGT AGT CCT TGA AGC TAC ……………… TAT GTA CGT AGC TGA • Konstruieren Sie ein Primerpaar! Allelspezyfische Amplifikation - ASA • (wt) – 5’ – 3’ CGT AGT CCT TGA AGC TAT ……………… TAT GTA CGT AGC TGA3’ GCA TCA GGA ACT TCG ATA .…………….. ATA CAT GCA TCG ACT5’ • (m) – 5’ – 3’ CGT AGT CCT TGA AGC TAC ……………… TAT GTA CGT AGC TGA3’ GCA TCA GGA ACT TCG ATG .…………….. ATA CAT GCA TCG ACT5’ • Wie viele Primers brauchen wir? Allelspezyfische Amplifikation - ASA • (wt) – 5’ – 3’ CGT AGT CCT TGA AGC TAT ……………… TAT GTA CGT AGC TGA3’ GCA TCA GGA ACT TCG ATA .…………….. ATA CAT GCA TCG ACT5’ • (m) – 5’ – 3’ CGT AGT CCT TGA AGC TAC ……………… TAT GTA CGT AGC TGA3’ GCA TCA GGA ACT TCG ATG .…………….. ATA CAT GCA TCG ACT5’ • Wie viele Primers brauchen wir? 3 Allelspezyfische Amplifikation - ASA (wt) ◦ ◦ CGT AGT CCT TGA AGC TAT ……………… TAT GTA CGT AGC TGA3’ 3’GCA TCA GGA ACT TCG ATA .…………….. ATA CAT GCA TCG ACT5’ 5’ (m) ◦ ◦ CGT AGT CCT TGA AGC TAC ………… TAT GTA CGT AGC TGA3’ 3’GCA TCA GGA ACT TCG ATG .………… ATA CAT GCA TCG ACT5’ 5’ Allelspezyfische Amplifikation - ASA (wt) ◦ ◦ CGT AGT CCT TGA AGC TAT ……………… TAT GTA CGT AGC TGA3’ 3’GCA TCA GGA ACT TCG ATA .…………….. ATA CAT GCA TCG ACT5’ 5’ (m) ◦ ◦ CGT AGT CCT TGA AGC TAC ………… TAT GTA CGT AGC TGA3’ 3’GCA TCA GGA ACT TCG ATA .………… ATA CAT GCA TCG ACT5’ 5’ Allelspezyfische Amplifikation - ASA • FAST PCR in silico PCR • http://primerdigital.com/fastpcr.html • Kontrollierung: mir dem Program: MultAlin – www.multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html • Reverse Primerkontrollierung: – www.bioinformatics.org/SMS/rev_comp.html Primerplanung mit Internetprogrammen (wt) CGT AAT GAA TTC AGT TGC EcoRIErkennungsstelle Verdauung mit RE (m) CGT AAT GAA CTC AGT TGC EcoRI-Erkennungsstelle Ein SNP steht im Erkennungssequenz eines Restriktionsenzyms (m) CGT AAT GAA CTC AGT TGC EcoRI akcióban Keine Verdauung Gelelektroforese m wt Gelelektroforese • Was ist die Reihefolge der Nukleotiden in 5’->3’ Richtung aufgrund des Gelphotos? GGCCA GGCCATCGTTGA GGC GGCC GGCCATC n A C GGCCATCG GGCCATCGTTG G GGCCAT GGCCATCGT GGCCATCGTT T 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Sanger-sequenzierung • Was ist die Reihefolge der Nukleotiden aufgrund des Gelphotos? • Welche kurze Sequenz gehört zu den Bänden? GGCCA GGCCATCGTTGA GGC GGCC GGCCATC n 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 A GGCCAT GGCCATCGT GGCCATCGTT GGCCATCG GGCCATCGTTG C G T A3’G T T G C T A C C5’ Sanger-sequenzierung DNA-Sequenzierung nach Sanger Templat: 3’ CCGGTAGCAACT Primer : 5’ GG 3’ dATP dCTP + ddCTP dGTP dTTP dATP + ddATP dCTP dGTP dTTP GGCCA GGCCATCGTTGA GGC GGCC GGCCATC n 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 A 5’ dATP dCTP dGTP + ddGTP dTTP GGCCATCG GGCCATCGTTG C G T A3’ G T T G C T A C C5’ dATP dCTP dGTP dTTP + ddTTP GGCCAT GGCCATCGT GGCCATCGTT Mit dem Templat komplementere Sequenz DideoxyKettenterminierung • Was ist die Sequenz des Templatstranges? N 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 A C G T A3’G T T G C T A C C5’ Sanger-sequenzierung • GGTAGCAA5’ • Was ist die Sequenz des Templatstranges? n A 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 C G T A3’G T T G C T A C C5’ • GGTAGCAACT5’ Sanger-sequenzierung Pyrosequenzierung • (DNA)n + dNTP • APS + PPi • dNTP • ATP Sulfurylase Apyrase T/G polimorfizmus pirogramja Pyrogram der DNA Sequenzen DNA-Polymerase ATP (DNA)n+1 + PPi Luziferase dNDP + dNMP + Pi ADP + AMP + Pi Licht • Aufgrund des Pyrograms bestimmen Sie die Sequenz! Pirosequenzierung • Aufgrund des Pyrograms bestimmen Sie die Sequenz! G C A G G C C T Pirosequenzierung • Aufgrund Pyrogrammes in welcher Reihenfolge wurden dNTPs zugegeben? • GCTA • Wie die Sequenz lautet? GCAGGCCT Pyrosequenierung Klinische Anwendung von Pyrosequenzierung • Kann eine Chemotherapie unnötig sein? • K-RAS ist ein Onkogen 12p12 • RAS Molekülfamilie, GTPase (K-, N- und H-RAS) • Das Gen kodiert ein 21kD Protein (p21ras oder K-Ras) K-Ras Funktion: Umwandler in Signaltransduktion zB in EGFR/RTK Signalweg, Schaltprotein Mutation tritt sehr häufig in Tumoren auf • K-RAS Gen ist ein BIOMARKER • Das Genprodukt reguliert die Zellüberlebensprozesse, wie die Proliferation oder Angiogenese der Zellen • Der mutante Genprodukt verursacht unkontrollierte Vermehrung der Krebszellen • Genanalyse von K-RAS kann den Erfolg der Chemotherapie voraussagen Untersuchung von Tumorresistenz in AntiEGFR Therapie normal Normal Mit anti-EGFR Mutant mit anti-EGFR KRAS Genanalyse mit Pyrosequenzierung •Wenn eine Mutation im K-RAS-Gen auftritt -> wird das Protein immer aktiv (betrifft GTP-Bindungsstelle)-> Krebs • Die häufigste Mutationen sind in 12., 13., 61. Kodon KRAS K-RAS Genanalyse mit Pyrosequenzierung K-RAS Genanalyse mit Pyrosequenzierung K-RAS Genanalyse mit Pyrosequenzierung SMRT: single molecule real time (sequencing) Video -Ergänzungsmaterial • Real time PCR: http://www.youtube.com/watch?v=5FaFIvq_eAI (englisch) • http://www.youtube.com/watch?v=yXj0jY9HeUY (englisch) • SNP: • http://www.youtube.com/watch?v=4FVu995ek8I&list=PL5A4 2E6BBB7D49579&index=57 (deutsch) • Sequenzierung: http://www.youtube.com/watch?v=n6BW62P9XGY (deutsch) • http://www.youtube.com/watch?v=_ApDinCBt8g (englisch) • (verschiedene Techniken: • http://www.youtube.com/user/biotechgermany?feature=watch) (deutsch) ENDE