3. Konditionale transgenische Systeme

3. Konditionale transgenische Systeme
3. Konditionale transgenische Systeme
FOLIE 32 Das Cre-loxP System
Der Cre-loxP Rekombinations-Mechanismus vom P1 Bakteriophag wurde von der Molekularbiologie in ein
spezifisches Rekombinations-technologisches System gewandelt. Ähnlich zu den auf homologer Rekombination
basierenden Systemen können wir mit der Cre-lox Technologie fremde Gene in einem gegebenen DNS Lokus
gezielt eintragen oder ausschalten, aber diese Technik ist auch zu anderen Zwecken verwendbar. Zuerst müssen
wir die Grundlage des Systems untersuchen. Das Cre Enzym erkennt zwei aus gleichen 34 Basenpaaren
bestehende sogenannte loxP Sequenzen.
(a) Wenn die zwei loxP Sequenzen in tandem Orientation stehen, dann schneidet das Enzym „Cre“ die zwischen
ihnen platzierte DNS Sequenz aus.
(b) Wenn die zwei loxP Sequenzen einander gegenüber stehen, dann kehrt Cre die Orientation der sich zwischen
diesen befindenden DNS um.
(c) Wenn sich die loxP Sequenzen auf unterschiedlichen DNS- Strängen befinden, dann kann eine Translokation
ablaufen.
In der transgenischen/Knockout Technologie wird vor allem die (a) Version verwendet.
FOLIE 33 Konditionale knockout Tiere
Wir stellen ein Beispiel für die Anwendung des Cre-lox Systems in der knockout Technologie dar. Für das
Herstellen des hypothetischen Knockouts müssen vorerst zwei transgenische Eltern geschaffen werden. Das eine
Elternteil drückt das Rekombinase Gen aus, das andere enthält ein zusammengesetztes Genexpressions System:
das auszuschaltende Gen wird von tandem orientierten loxP Sequenzen umgeben, und es wird auch ein GFP Gen
ohne Promoter hinter dem 3’ Ende vom loxP eingebaut; das GFP Gen ist also nicht aktiv, da es über kein eigenes
Promoter verfügt. Die zwei transgenischen Tiere werden miteinander gekreuzt. Wenn die Eltern auf die
Transgene gesehen Homozygoten waren, dann werden alle Nachkömmlinge beide Transgene enthalten, wenn die
Eltern Heterozygoten waren, dann nur ¼ - der Abstammenden (aber auch diese nur auf einem homologen
Chromosom). In den beide Transgene enthaltenden Nachkömmlingen schneidet das Cre Rekombinase das
fragliche Gen aus, und so gerät das GFP Gen unter die Kontrolle des Promoters des ausgeschalteten Gens, und
wird so aktiviert, dadurch wird das knockout Tier zugleich grün, was zeigt, dass die Genausschaltung vorgefallen
ist. Das System kann komplizierter gemacht werden, indem das Cre Gen mit Zellen-spezifischen oder
induzierbaren Regulationselementen versehen wird. Im vorigen Fall findet die Genausschaltung nur in
bestimmten Zellen statt, im zweiten Fall nur dann, wenn man Induktion anwendet (siehe Tetracyklin System). Die
hypothetischen Knockout Tiere spielen in der Gehirn-Forschung eine unersetzbare Rolle.
FOLIE 34 Brainbow
Das Cre-loxP System ist in solchen transgenischen Systemen verwendbar, wo die benachbarten Neuronzellen mit
unterschiedlichen Farben markiert sind. Die in die Maus eingebaute Expressions-Kassette enthält mehrere loxP
Loci, die vom Cre Rekombinase Zufallsmässig erkannt werden, und so entstehen auch die unterschiedlichen
Farben auf zufälliger Weise.
EXTRAANFORDERUNG
Frontlinien der Molekularbiologie
Boldogkői Zsolt ©
3. Konditionale transgenische Systeme
DIA 35 Das Tetracyklin System
(a) Das ursprüngliche System der Bakterien ist für die Antibiotikum-Resistenz gegen Tetracyklin verantwortlich.
Das Tetracyklin wird von den Streptomyces Bakterien (und nicht Pilze!) produziert, und hemmt die Translation
von anderen Bakterien. Ähnlich zu dem lac Operon koppelt im Grundfall auch an das Operon des Resistenz Gens
von Tetracyklin ein Repressor (vom TetR Repressor Gen kodiert) an, daher wird dieses Resistenz-Gen nicht
ausgedrückt. Das Tetracyklin koppelt - in die Bakteriumzelle hereingeraten - an den Repressor an, dessen
Raumstruktur sich dadurch ändert, und der sich so vom Operator trennt. Da die Hemmung nicht mehr vorhanden
ist wird das Resistenz-Gen aktiv, und beginnt das TetA Protein herzustellen, welches ein Antiporter ist und das
Tetrazyklin aus der Zelle entfernt (während es H+ in die Zelle geraten lässt).
(b) Tet- OFF System. Das originale Tetracyklin Operon/Repressor System wurde von Molekularbiologen so
verändert, dass dies zu in Säugetieren induzierbarer Genexpression verwendbar ist. Auf dem Bereich des Tet-off
Systems haben sie zwei wichtige Änderungen fortgeführt: (1) Der Tetracyklin Repressor wurde in einen starken
Aktivator umgewandelt (tTA; tetracyklin Transaktivator) indem das Rezeptor Gen mit einem DNS bindendem
Transaktivator des Herpes Simplex Virus’ fusioniert wurde (VP16). (2) An den Tetrazyklin Operator wurde der
Minimal (kurze) Promoter des IE1 Gens des Human Citomegalovirus’ fusioniert (TetO-Pmin). Es wurde deshalb
nur der minimal Promoter angewendet, damit dieser selbst nicht fähig ist eine Genexpression zu beginnen. Im
Tet-Off System erkennt das Komponent des tTA Repressors die TetO (Tetrazyklin Operator) Region des FusionsPromoters, aber das Ergebnis ist hier nicht die Repression, sondern im Gegenteil, die starke Aktivation des
gewünschten fremden Gens. Der Basenzustand des Tet-off Systems wird so eine hohe Genexpression sein,
welche durch Zufügung von Tetracyklin beendet werden kann. Die Forscher haben festgestellt, dass ein anderes
Antibiotikum, das Doxicyklin wirksamer ist als Tetracyklin.
(c) Im Tet-ON System wurde solch eine Änderung durchgeführt in welcher der Aktivator des Tet-Off Systems
(tTA) mit speziellen Mutationen in umgekehrte Funktion umgewandelt wurde (rtTA; r: reverse= umgekehrt). Das
rtTA koppelt in Grundlage nicht an das TetO-Pmin Promoter; der Promoter erkennt es nur dann, wenn Doxicyklin
daran gekoppelt ist. Das heisst, dass man im Tet-Off System durch Beifügung von Doxicyklin die Funktion eines
sich im transgenischen Tier ausdrückenden fremden Gens ausschalten kann, während im Tet-ON System
Doxicyklin die Funktion des Transgens aktiviert. Doxicyklin kann in das Futter der Tiere gemischt werden. Wenn
man den Aktivator (tTA oder rtTA) unter die zellspezifische Regulierung des Promoters stellt, bekommt man ein,
nur in bestimmten Zellen repressierbares (tTA) oder induzierbares (rtTA) System. Man muss bemerken, dass das
Tetracyklin oder ähnliche Systeme die Genexpression von transgenischem Gewebe möglich machen, was in der
Heilkunde in Zukunft ein sehr wichtiges Mittel sein kann.
EXTRAANFORDERUNG
Frontlinien der Molekularbiologie
Boldogkői Zsolt ©