Page 1 (19) (10) DE 695 34 250 T2 2006.05.04 Bundesrepublik

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Bundesrepublik Deutschland
Deutsches Patent- und Markenamt
(10)
DE 695 34 250 T2 2006.05.04
Übersetzung der europäischen Patentschrift
C12N 15/11 (2006.01)
(97) EP 0 792 358 B1
(21) Deutsches Aktenzeichen: 695 34 250.9
(86) PCT-Aktenzeichen: PCT/US95/14899
(96) Europäisches Aktenzeichen: 95 939 161.6
(87) PCT-Veröffentlichungs-Nr.: WO 96/015241
(86) PCT-Anmeldetag: 13.11.1995
(87) Veröffentlichungstag
der PCT-Anmeldung: 23.05.1996
(97) Erstveröffentlichung durch das EPA: 03.09.1997
(97) Veröffentlichungstag
der Patenterteilung beim EPA: 01.06.2005
(47) Veröffentlichungstag im Patentblatt: 04.05.2006
(51) Int Cl.8:
(30) Unionspriorität:
338992
(84) Benannte Vertragsstaaten:
AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU,
NL, PT, SE
14.11.1994
US
(73) Patentinhaber:
Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, N.J., US;
N.V. Innogenetics S.A., Ghent, BE
(74) Vertreter:
Abitz & Partner, 81679 München
C12N 15/31 (2006.01)
A61K 39/04 (2006.01)
(72) Erfinder:
LIU, Margaret A., Rahway, US; MONTGOMERY,
Donna, Rahway, US; ULMER, Jeffrey, Rahway, US;
CONTENT, Jean, 9052 Ghent, BE; HUYGEN, Kris,
9052 Ghent, BE
(54) Bezeichnung: POLYNUKLEOTIDIMPFSTOFF GEGEN TBC
Anmerkung: Innerhalb von neun Monaten nach der Bekanntmachung des Hinweises auf die Erteilung des europäischen Patents kann jedermann beim Europäischen Patentamt gegen das erteilte europäische Patent Einspruch
einlegen. Der Einspruch ist schriftlich einzureichen und zu begründen. Er gilt erst als eingelegt, wenn die Einspruchsgebühr entrichtet worden ist (Art. 99 (1) Europäisches Patentübereinkommen).
Die Übersetzung ist gemäß Artikel II § 3 Abs. 1 IntPatÜG 1991 vom Patentinhaber eingereicht worden. Sie wurde
vom Deutschen Patent- und Markenamt inhaltlich nicht geprüft.
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Beschreibung
Hintergrund der Erfindung
[0001] Ein Haupthindernis für die Entwicklung von Vakzinen gegen Viren und Bakterien, insbesondere diejenigen mit mehreren Serotypen oder einer hohen Mutationsrate, gegen welche die Hervorrufung von neutralisierenden Antikörpern und/oder schützenden zellvermittelten Immunreaktionen wünschenswert ist, ist die Unterschiedlichkeit der äußeren Proteine bei verschiedenen Isolaten oder Stämmen. Nachdem zytotoxische
T-Lymphozyten (CTLs) in sowohl Mäusen als auch Menschen in der Lage sind, Epitope zu erkennen, die von
konservierten internen viralen Proteinen abgeleitet sind [J. W. Yewdell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82,
1785 (1985); A. R. M. Townsend et al., Cell 44, 959 (1986); A. J. McMichael et al., J. Gen. Virol. 67, 719 (1986);
J. Bastin et al., J. Exp. Med. 165, 1508 (1987); A. R. M. Townsend und H. Bodmer, Annu. Rev. Immunol. 7, 601
(1989)], und für erheblich bei der Immunreaktion gegen Viren gehalten werden [Y.-L. Lin und B. A. Askonas, J.
Exp. Med. 154, 225 (1981); I. Gardner et al., Eur. J. Immunol. 4, 68 (1974); K. L. Yap und G. L. Ada, Nature
273, 238 (1978); A. J. McMichael et al., New Engl. J. Med. 309, 13 (1983); P. M. Taylor und B. A. Askonas,
Immunol. 58, 417 (1986)], wurden Anstrengungen auf die Entwicklung von CTL-Vakzinen gerichtet, welche in
der Lage sind, einen heterologen Schutz gegen verschiedene Virusstämme bereitzustellen.
[0002] Es ist bekannt, dass CTLs viral oder bakteriell infizierte Zellen abtöten, wenn deren T-Zell-Rezeptoren
fremde Peptide in Assoziation mit MHC-Klasse I- und/oder -Klasse II-Molekülen erkennen. Diese Peptide können von endogen synthetisierten fremden Proteinen abgeleitet sein, unabhängig von der Lage oder Funktion
des Proteins innerhalb des Pathogens. Durch Erkennung von Epitopen von konservierten Proteinen können
CTLs einen heterologen Schutz bereitstellen. Im Falle von intrazellulären Bakterien werden Proteine, die von
den Bakterien sekretiert oder freigesetzt werden, prozessiert und von MHC-Klasse I- und -II-Molekülen präsentiert und dadurch T-Zell-Reaktionen hervorgerufen, welche eine Rolle bei der Verringerung oder Eliminierung
einer Infektion spielen können.
[0003] Die meisten Versuche zur Hervorrufung von CTL-Reaktionen verwendeten entweder replizierende
Vektoren, um das Protein-Antigen innerhalb der Zelle zu bilden [J. R. Bennink et al., ibid. 311, 578 (1984); J.
R. Bennink und J. W. Yewdell, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 163, 153 (1990); C. K. Stover et al., Nature 351,
456 (1991); A. Aldovini und R. A. Young, Nature 351, 479 (1991); R. Schafer et al., J. Immunol. 149, 53 (1992);
C. S. Hahn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89, 2679 (1992)], oder konzentrierten sich auf die Einführung
von Peptiden in das Zytosol [F. R. Carbone und M. J. Bevan, J. Exp. Med. 169, 603 (1989); K. Deres et al.,
Nature 342, 561 (1989); H. Takahashi et al., ibid. 344, 873 (1990); D. S. Collins et al., J. Immunol. 148, 3336
(1992); M. J. Newman et al., ibid. 148, 2357 (1992)]. Beide Ansätze haben Beschränkungen, welche deren
Brauchbarkeit für Vakzine mindern könnten. Retrovirale Vektoren haben Beschränkungen hinsichtlich der Größe und Struktur von Polypeptiden, die unter Aufrechterhaltung des Vermögens des rekombinanten Virus zur
Replikation als Fusionsproteine exprimiert werden können, [A. D. Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 1
(1992)] und die Wirksamkeit von Vektoren wie Vaccinia für nachfolgende Immunisierungen kann durch Immunreaktionen gegen Vaccinia beeinträchtigt werden [E. L. Cooney et al., Lancet 337, 567 (1991)]. Auch weisen
virale Vektoren und modifizierte Pathogene inhärente Risiken auf, welche deren Einsatz beim Menschen verhindern können [R. R. Redfield et al., New Engl. J. Med. 316, 673 (1987); L. Mascola et al., Arch. Intern. Med.
149, 1569 (1989)]. Ferner hängt die Auswahl von Peptid-Epitopen zur Präsentation von der Struktur der
MHC-Antigene eines Individuums ab und deshalb können Peptid-Vakzine aufgrund der Unterschiedlichkeit von
MHC-Haplotypen in Populationen nicht verwandter Individuen eine begrenzte Wirksamkeit aufweisen.
[0004] Benvenisty, N., und Reshef, L., [PNAS 83, 9551–9555, 1986)] zeigten, dass CaCl2-gefällte DNA, die
intraperitoneal (i.p.), intravenös (i.v.) oder intramuskulär (i.m.) in Mäuse eingeführt wurde, exprimiert werden
konnte. Es wurde gezeigt, dass die intramuskuläre (i.m.) Injektion von DNA-Expressionsvektoren in Mäusen
zur Aufnahme von DNA durch die Muskelzellen und zur Expression des von der DNA codierten Proteins führt
[J. A. Wolff et al., Science 247, 1465 (1990); G. Ascadi et al., Nature 352, 815 (1991)]. Es wurde gezeigt, dass
die Plasmide episomal aufrechterhalten wurden und nicht replizierten. Später wurde eine dauerhafte Expression nach i.m. Injektion in Skelettmuskel von Ratten, Fischen und Primaten und Herzmuskel von Ratten beobachtet [H. Lin et al., Circulation 82, 2217 (1990); R. N. Kitsis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88, 4138
(1991); E. Hansen et al., FEBS Lett. 290, 73 (1991); S. Jiao et al., Hum. Gene Therapy 3, 21 (1992); J. A. Wolff
et al., Human Mol. Genet. 1, 363 (1992)]. Die Technik der Verwendung von Nukleinsäuren als Therapeutika
wurde in WO 90/11092 (4. Oktober 1990) berichtet, worin nackte Polynukleotide zur Impfung von Vertebraten
verwendet wurden.
[0005] Kürzlich wurden die koordinierten Rollen von B7 und der Haupthistokompatibilitätskomplex
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(MHC)-Präsentation von Epitopen auf der Oberfläche von antigen-präsentierenden Zellen bei der Aktivierung
von CTLs zur Eliminierung von Tumoren untersucht [Edgington, Biotechnology 11, 1117–1119, 1993]. Sobald
das MHC-Molekül auf der Oberfläche einer antigen-präsentierenden Zelle (APC) einem T-Zell-Rezeptor (TCR)
ein Epitop präsentiert, wirkt das auf der Oberfläche derselben APC exprimierte B7 als zweites Signal durch
Bindung an CTLA-4 oder CD28. Das Ergebnis ist eine schnelle Teilung von CD4+-Helfer-T-Zellen, welche
CD8+-T-Zellen das Signal zur Proliferation und Abtötung der APC gibt.
[0006] Für den Erfolg des Verfahrens ist nicht erforderlich, dass die Immunisierung intramuskulär erfolgt. So
offenbarten Tang et al. [Nature, 356, 152–154 (1992)], dass die Einführung von Gold-Mikroprojektilen, beschichtet mit DNA, die für Rinderwachstumshormon (BGH) codierte, in die Haut von Mäusen zur Bildung von
Anti-BGH-Antikörpern in den Mäusen führte. Furth et al. [Analytical Biochemistry, 205, 365–368, (1992)] zeigten, dass ein Jet-Injektor zur Transfektion von Haut-, Muskel-, Fett- und Brustdrüsen-Geweben von lebenden
Tieren verwendet werden konnte. Verschiedene Verfahren zur Einführung von Nukleinsäuren wurden kürzlich
im Überblick dargestellt [Friedman, T., Science, 244, 1275–1281 (1989)]. Siehe auch Robinson et al. [Abstracts
of Papers Presented at the 1992 meeting on Modern Approaches to New Vaccines, Including Prevention of
AIDS, Cold Spring Harbor, S. 92; Vaccine 11, 957 (1993)], wobei die intramuskuläre, intraperitoneale und intravenöse Verabreichung von Vogel-Influenza-DNA in Hühnchen Berichten nach einen Schutz gegen eine tödliche Herausforderung ergab. Von Zhu et al. wurde gezeigt, dass eine intravenöse Injektion eines DNA: kationisches Liposom-Komplexes in Mäusen zur systemischen Expression eines klonierten Transgens führte [Science 261, 209–211 (9. Juli 1993); siehe auch WO 93/24640, 9. Dezember 1993]. Kürzlich berichteten Ulmer
et al. [Science 259, 1745–1749, (1993)] über den heterologen Schutz gegen eine Influenzavirus-Infektion
durch Injektion von DNA, die für Influenzavirus-Proteine codierte.
[0007] Wang et al. [P. N. A. S. USA 90, 4156–4160 (Mai 1993)] berichteten über die Hervorrufung von Immunreaktionen in Mäusen gegen HIV durch intramuskuläre Impfung mit einem klonierten genomischen (ungesplicten) HIV-Gen. Jedoch war das Niveau der erzielten Immunreaktionen sehr niedrig und das System verwendete
Teile des Promotors des langen terminalen Repeats (LTR) des Maus-Mammatumorvirus (MMTV) und Teile des
Promotors und Terminators des Simian-Virus 40 (SV40). SV40 transformiert bekanntermaßen Zellen, möglicherweise durch Integration in zelluläre Wirts-DNA. Somit ist das von Wang et al. beschriebene System vollständig ungeeignet für die Verabreichung an Menschen, welche eine der Aufgaben der vorliegenden Erfindung
ist.
[0008] WO 93/17706 beschreibt ein Verfahren zur Impfung eines Lebewesens gegen ein Virus, wobei Trägerpartikel mit einem Gen-Konstrukt beschichtet und die beschichteten Partikel beschleunigt in Zellen eines Lebewesens eingebracht werden.
[0009] Studien von Wolff et al. (oben) demonstrierten ursprünglich, dass die intramuskuläre Injektion von
Plasmid-DNA, codierend für ein Reportergen, zur Expression des Gens in Myozyten an und in der Nähe der
Injektionsstelle führt. Kürzliche Berichte demonstrierten die erfolgreiche Immunisierung von Mäusen gegen Influenza durch die Injektion von Plasmiden, welche für Influenza A-Hämagglutinin (Montgomery, D. L., et al.,
1993, Cell Biol., 12, S. 777–783) oder -Nukleoprotein (Montgomery, D. L., et al., oben; Ulmer, J. B., et al., 1993,
Science, 259, S. 1745–1749) codierten. Über den ersten Einsatz von DNA-Immunisierung gegen ein Herpesvirus wurde berichtet (Cox et al., 1993, J. Virol., 67, S. 5664–5667). Die Injektion eines Plasmids, codierend für
Glycoprotein g IV von Rinderherpesvirus 1 (BHV-1 ), führte zu Anti-g IV-Antikörpern in Mäusen und Kälbern.
Nach intranasaler Herausforderung mit BHV-1 zeigten immunisierte Kälber verringerte Symptome und schütteten wesentlich weniger Virus als Kontrollen aus.
[0010] Tuberkulose (TB) ist eine chronische Infektionskrankheit der Lunge, verursacht durch das Pathogen
Mycobacterium tuberculosis. TB ist eine der klinisch bedeutsamsten Infektionen weltweit, mit einem Auftreten
von drei Millionen Todesfällen und 10 Millionen neuen Fällen jedes Jahr. Es wurde geschätzt, dass bis zu einem Drittel der Weltbevölkerung infiziert sein könnte, und in den Entwicklungsländern wurden 55 Millionen Fälle aktiver TB berichtet. Bis zur Jahrhundertwende war TB die Haupttodesursache in den Vereinigten Staaten.
Mit den verbesserten Hygieneverhältnissen und dem Erscheinen von antimikrobiellen Wirkstoffen nahm die
Häufigkeit der Sterblichkeit jedoch stetig ab bis zu dem Punkt, an dem vorausgesagt wurde, dass die Krankheit
bis zum Jahr 2000 ausgelöscht sein würde. Jedoch ist in den meisten entwickelten Ländern die Anzahl der
Fälle aktiver TB seit der Mitte der 80er Jahre des 20. Jahrhunderts jedes Jahr gestiegen. Ein Teil dieses Wiederanstiegs wurde auf Immigration und die wachsende Anzahl von immungeschwächten, HIV-infizierten Individuen zurückgeführt. Falls kein Rückgang stattfindet, wird vorausgesagt, dass TB mehr als 30 Millionen
menschliche Leben in den nächsten 10 Jahren fordern wird. So alarmierend wie diese Zahlen erscheinen mögen, ist es sogar von noch größerer Bedeutung, dass mehrfacharzneiwirkstoff-resistente („multidrug resistant";
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von TB ein effektives Vakzin sein [hinsichtlich eines Überblicks siehe Bloom und Murray, 1993, Science 257,
1055].
[0011] M. tuberculosis ist ein intrazelluläres Pathogen, das Makrophagen infiziert und in der Lage ist, innerhalb der rauhen Umgebung des Phagolysosoms in diesem Zelltyp zu überleben. Die meisten inhalierten Bacilli
werden durch aktivierte alveolare Makrophagen zerstört. Jedoch können sich die überlebenden Bacilli in Makrophagen vermehren und nach Zelltod freigesetzt werden, was die Infiltration von Lymphozyten, Monozyten
und Makrophagen an der Stelle signalisiert. Die Lyse der mit Bacilli beladenen Makrophagen wird durch eine
Hypersensitivität vom verzögerten Typ („delayed-type hypersensitivity"; DTH) vermittelt und führt zur Entwicklung eines festen verkästen Tuberkels, welches das Gebiet infizierter Zellen umgibt. Fortgesetzte DTH verursacht die Verflüssigung des Tuberkels und dadurch die Freisetzung eingeschlossener Bacilli. Die große Dosis
extrazellulärer Bacilli löst weitere DTH aus und verursacht eine Schädigung der Bronchien und eine Zerstreuung auf lymphatischen, hämatogenen und bronchialen Routen und erlaubt schließlich die Verbreitung infektiöser Bacilli durch die Atmung.
[0012] An der Immunität gegen TB sind mehrere Typen von Effektorzellen beteiligt. Eine Aktivierung von Makrophagen durch Cytokine, wie z.B. γ-Interferon, ist ein wirksames Mittel zur Minimierung intrazellulärer mykobakterieller Vermehrung. Jedoch wird eine vollständige Auslöschung der Bacilli auf diese Weise oft nicht erreicht. Ein Schutzerwerb gegen TB erfordert T-Lymphozyten. Von diesen scheinen sowohl CD8+- als auch
DC4+-T-Zellen von Bedeutung zu sein [Orme et al., 1993, J. Infect. Dis. 167, 1481). Diese Zelltypen sekretieren
γ-Interferon als Reaktion auf Mykobakterien, was eine Th1-Immunreaktion anzeigt, und besitzen eine zytotoxische Aktivität gegenüber mit Mykobakterien gepulsten Targetzellen. In kürzlichen Studien unter Verwendung
von β-2-Mikroglobulin- und CD8-defizienten Mäusen wurde gezeigt, dass CTL-Reaktionen kritisch bei der Bereitstellung eines Schutzes gegen M. tuberculosis waren [Flynn et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,
12013; Flynn et al., 1993, J. Exp. Med. 178, 2249; Cooper et al., 1993, J. Exp. Med. 178, 2243]. Im Gegensatz
dazu scheinen B-Lymphozyten nicht beteiligt zu sein und ein passiver Transfer von antimykobakteriellen Antikörpern ergibt keinen Schutz. Deswegen müssen effektive Vakzine gegen TB zellvermittelte Immunreaktionen
hervorrufen.
[0013] Die antigene Stimulation von T-Zellen erfordert eine Präsentation durch MHC-Moleküle. Damit mykobakterielle Antigene Zugang zu dem Antigen-Präsentationsweg erhalten, müssen sie aus den Bakterien freigesetzt werden. In infizierten Makrophagen könnte dies durch Sekretion oder bakterielle Lyse erfolgen. Mykobakterien besitzen viele potentielle T-Zell-Antigene und mehrere wurden nun identifiziert [Andersen 1994, Dan.
Med. Bull. 41, 205]. Einige dieser Antigene werden von den Bakterien sekretiert. Es wird allgemein angenommen, dass die Immunität gegen TB durch CD8+- und CD4+-T-Zellen vermittelt wird, die gegen diese sekretierten Antigene gerichtet sind. In Maus- und Meerschweinchen-Modellen von TB wurde ein Schutz vor einer bakteriellen Herausforderung, wie gemessen durch verringerten Gewichtsverlust, durch Verwendung einer Mischung sekretierter mykobakterieller Antigene erzielt [Pal und Horowitz, 1992, Infect. Immunity 60, 4781; Andersen 1994, Infect. Immunity 62, 2536; Collins, 1994, Veterin. Microbiol. 40, 95].
[0014] Mehrere potentiell schützende T-Zell-Antigene wurden in M. tuberculosis identifiziert und einige davon
werden als Vakzin-Targets untersucht. Kürzliche Arbeiten wiesen darauf hin, dass die vorwiegenden T-Zell-Antigene diejenigen Proteine sind, welche von Mykobakterien während ihres Aufenthalts in Makrophagen sekretiert werden, wie z.B. i) der Antigen 85-Komplex von Proteinen (85A, 85B, 85C) [Wiker und Harboe, 1992, Microbiol. Rev. 56, 648], ii) ein 6-kD-Protein mit der Bezeichnung ESAT-6 [Andersen 1994, Infect. Immunity 62,
2536], iii) ein 38-kD-Lipoprotein mit Homologie zu PhoS [Young und Garbe, 1991, Res. Microbiol. 142, 55; Andersen, 1992, J. Infect. Dis. 166, 874], iv) das 65-kD-GroEL-Hitzeschockprotein [Siva und Lowrie, 1994, Immunol. 82, 244], v) ein 55-kD-Protein, das reich an Prolin und Threonin ist [Romain et al., 1993, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90, 5322], und vi) ein 19-kD-Lipoprotein [Faith et al., 1991, Immunol. 74, 1].
[0015] Die Gene für jedes der drei Antigen 85-Proteine (A, B und C) wurden kloniert und sequenziert [Borremans et al., 1989, Infect. Immunity 57, 3123; Content et al., Infect. Immunity 59, 3205; DeWit et al., 1994, DNA
Seq. 4, 267]. Darüber hinaus sind diese strukturell verwandten Proteine Targets für starke T-Zell-Reaktionen
nach sowohl Infektion als auch Impfung [Huygen et al., 1988, Scand. J. Immunol. 27, 187; Launois et al., 1991,
Clin. Exp. Immunol. 86, 286; Huygen et al., 1992, Infect. Immunity 60, 2880; Munk et al., 1994 Infect. Immunity
62, 726; Launois et al., 1994, Infect. Immunity 62, 3679]. Deshalb werden die Antigen 85-Proteine als gute Vakzin-Targets betrachtet.
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Zusammenfassung der Erfindung
[0016] Zum Testen der Wirksamkeit einer DNA-Immunisierung bei der Verhütung einer M.tb-Erkrankung wurden für M.tb-Protein codierende DNA-Sequenzen in eukaryotische Expressionsvektoren kloniert. Diese
DNA-Konstruktionen rufen bei Injektion in Lebewesen eine Immunreaktion hervor. Immunisierte Lebewesen
werden mit Mykobakterien infiziert, um abzuschätzen, ob eine direkte DNA-Immunisierung mit dem Gen (oder
anderen M.tb-Genen) diese vor einer Erkrankung schützen könnte. Nukleinsäuren, einschließlich DNA-Konstrukte und RNA-Transkripte, welche zur Induktion einer in vivo-Expression von M.tb-Proteinen nach direkter
Einführung in tierische Gewebe mittels Injektion oder auf andere Weise in der Lage sind, werden somit offenbart. Die Injektion dieser Nukleinsäuren kann Immunreaktionen hervorrufen, welche zur Bildung von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs), die spezifisch für M.tb-Antigene sind, sowie zur Bildung von M.tb-spezifischen
Helfer-T-Lymphozyten-Reaktionen, welche nach einer anschließenden Herausforderung schützend wirken,
führen. Diese Nukleinsäuren sind geeignet als Vakzine zur Induktion einer Immunität gegen M.tb, welche eine
Infektion verhindern und/oder eine M.tb-bezogene Erkrankung lindern kann.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
[0017] Fig. 1 Das allgemeine Prinzip zur Klonierung von M.tb-Genen in Expressionsvektoren wird gezeigt.
[0018] Fig. 2 Eine Vektorkarte von V1Jns.tPA85A.C1 wird gezeigt.
[0019] Fig. 3 Eine Vektorkarte von V1Jns.85A.C2 wird gezeigt.
[0020] Fig. 4 Eine Vektorkarte von V1Jns.85A.C3 wird gezeigt.
[0021] Fig. 5 Eine Vektorkarte von V1Jns.tPA85B.C1 wird gezeigt.
[0022] Fig. 6 Eine Vektorkarte von V1Jns.tPA85C.C1 wird gezeigt.
[0023] Fig. 7 Eine N-terminale Sequenzbestätigung von Konstrukten wird gezeigt.
[0024] Fig. 8 Die Expression von M.tb-Proteinen in Gewebekultur wird gezeigt.
[0025] Fig. 9 Die Bildung von antigen 85A-spezifischen Antikörpern in DNA-geimpften Mäusen wird gezeigt.
[0026] Fig. 10 Die IL-2-Produktion in BALB/c-Mäusen durch ein Tb-DNA-Vakzin wird gezeigt.
[0027] Fig. 11 Die IL-2-Produktion in C57BL/6-Mäusen durch ein Tb-DNA-Vakzin wird gezeigt.
[0028] Fig. 12 Die IFN-γ-Produktion in BALB/c-Mäusen durch ein Tb-DNA-Vakzin wird gezeigt.
[0029] Fig. 13 Die IFN-γ-Produktion in C57BL/6-Mäusen durch ein Tb-DNA-Vakzin wird gezeigt.
[0030] Fig. 14 Die fehlende IL-4-Produktion in BALB/c-Mäusen durch ein Tb-DNA-Vakzin wird gezeigt.
[0031] Fig. 15 Die fehlende IL-6-Produktion in Mäusen durch ein Tb-DNA-Vakzin wird gezeigt.
[0032] Fig. 16 Die fehlende IL-10-Produktion in Mäusen durch ein Tb-DNA-Vakzin wird gezeigt.
[0033] Fig. 17 Die Verringerung der BCG-Vermehrung in Lungen von C57BL/6-Mäusen, die mit einem
Tb-DNA-Vakzin geimpft wurden, wird gezeigt.
[0034] Fig. 18 Die Verringerung der BCG-Vermehrung in Lungen von BALB/c-Mäusen, die mit einem
Tb-DNA-Vakzin geimpft wurden, wird gezeigt.
[0035] Fig. 19 Die Verringerung der BCG-Vermehrung in Milzen von BALB/c-Mäusen, die mit einem
Tb-DNA-Vakzin geimpft wurden, wird gezeigt.
[0036] Fig. 20 Die Verringerung der BCG-Vermehrung in Milzen von C57BL/6-Mäusen, die mit einem
Tb-DNA-Vakzin geimpft wurden, wird gezeigt.
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Detaillierte Beschreibung der Erfindung
[0037] Diese Erfindung stellt Polynukleotide bereit, welche bei direkter Einführung in einen Vertebraten in vivo, einschließlich Säuger wie z.B. Menschen, die Expression codierter Proteine innerhalb des Lebewesens induzieren. Wie hier verwendet, ist ein Polynukleotid eine Nukleinsäure, welche essentielle regulatorische Elemente enthält, so dass sie nach Einführung in eine lebende Vertebratenzelle in der Lage ist, die zelluläre Maschinerie zu steuern, um Translationsprodukte zu bilden, die von den Genen, die das Polynukleotid umfasst,
codiert werden. In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Polynukleotid eine Polydesoxyribonukleinsäure, umfassend Mycobacterium tuberculosis (M.tb)-Gene in funktionsfähiger Verknüpfung mit einem transkriptionalen Promotor. Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfasst das Polynukleotid-Vakzin Polyribonukleinsäure, codierend für M.tb-Gene, welche einer Translation durch die eukaryotische zelluläre Maschinerie (Ribosomen, tRNAs und andere Translationsfaktoren) zugänglich sind. Ist das von dem Polynukleotid codierte Protein eines, welches normalerweise in dem Lebewesen nicht vorkommt, außer unter pathologischen
Bedingungen (d.h. ein heterologes Protein), wie z.B. Proteine, die mit M.tb assoziiert sind, wird das Immunsystem des Lebewesens aktiviert, um eine schützende Immunreaktion zu starten. Nachdem diese exogenen Proteine von den eigenen Geweben des Lebewesens gebildet werden, werden die exprimierten Proteine von dem
Haupthistokompatibilitätssystem (MHC) in analoger Weise prozessiert wie wenn eine tatsächliche M.tb-Infektion stattfindet. Das Ergebnis, wie in dieser Offenbarung gezeigt, ist die Induktion von Immunreaktionen gegen
M.tb. Polynukleotide zum Zwecke der Erzeugung von Immunreaktionen gegen ein codiertes Protein werden
hier als Polynukleotid-Vakzine oder PNV bezeichnet.
[0038] Es gibt viele Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, welche Fachleute auf dem Gebiet anhand der Patentbeschreibung erkennen können. So können verschiedene transkriptionale Promotoren, Terminatoren, Trägervektoren oder spezielle Gensequenzen erfolgreich eingesetzt werden.
[0039] Somit wird hier ein Vakzin wie in Anspruch 1 beansprucht bereitgestellt. Ferner wird ein Plasmid wie
in Anspruch 10 beansprucht bereitgestellt.
[0040] Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit zur Verwendung eines Polynukleotids, welches
nach Einführung in ein Säugergewebe die Expression, in vivo, des Polynukleotids induziert, wodurch das codierte Protein gebildet wird. Für Fachleute auf dem Gebiet ist unschwer ersichtlich, dass Variationen oder Derivate der Nukleotidsequenz, die für ein Protein codiert, hergestellt werden können, welche die Aminosäuresequenz des codierten Proteins ändern. Das veränderte exprimierte Protein kann eine veränderte Aminosäuresequenz aufweisen, ruft jedoch immer noch Immunreaktionen hervor, welche mit dem mykobakteriellen Protein reagieren, und wird als funktionelles Äquivalent betrachtet. Darüber hinaus können Fragment der Vollängen-Gene, welche für Teile des Vollängen-Proteins codieren, ebenfalls konstruiert werden. Diese Fragmente
können für ein Protein oder Peptid codieren, das Antikörper hervorruft, welche mit dem mykobakteriellen Protein reagieren, und werden als funktionelle Äquivalente betrachtet.
[0041] In einer Ausführungsform dieser Erfindung ist ein für ein M.tb-Genprodukt codierendes Gen in einem
Expressionsvektor inkorporiert. Der Vektor enthält einen transkriptionalen Promotor, der von eukaryotischer
RNA-Polymerase erkannt wird, und einen transkriptionalen Terminator am Ende der für das M.tb-Gen codierenden Sequenz. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor der Cytomegalovirus-Promotor mit
der Intron A-Sequenz (CMV-intA), obwohl Fachleute auf dem Gebiet erkennen werden, dass beliebige einer
Anzahl anderer bekannter Promotoren, wie z.B. der starke Immunglobulin-Promotor oder andere eukaryotische Genpromotoren, verwendet werden können. Ein bevorzugter transkriptionaler Terminator ist der Rinderwachstumshormon-Terminator. Die Kombination von CMVintA-BGH-Terminator ist bevorzugt. Darüber hinaus
ist zur Unterstützung der Herstellung der Polynukleotide in prokaryotischen Zellen ein Antibiotikaresistenzmarker ebenfalls fakultativ in dem Expressionsvektor unter der transkriptionalen Kontrolle eines geeigneten prokaryotischen Promotors eingeschlossen. Ampicillinresistenzgene, Neomycinresistenzgene oder irgendwelche
andere geeignete Antibiotikaresistenzmarker können verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung codiert das Antibiotikaresistenzgen für ein Genprodukt für Neomycin/Kanamycinresistenz. Ferner ist es zur Unterstützung einer starken Produktion des Polynukleotids durch Wachstum in prokaryotischen Organismen vorteilhaft, dass der Vektor einen prokaryotischen Replikationsursprung enthält und
eine hohe Kopienzahl aufweist. Beliebige aus einer Reihe im Handel erhältlicher prokaryotischer Klonierungsvektoren stellen diese Elemente bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung werden diese
Funktionalitäten von den im Handel erhältlichen Vektoren bereitgestellt, die als die pUC-Reihe bekannt sind.
Es kann jedoch wünschenswert sein, nicht essentielle DNA-Sequenzen zu entfernen. So können die lacZ- und
lacI-codierenden Sequenzen von pUC entfernt werden. Es ist auch wünschenswert, dass die Vektoren nicht
zur Replikation in eukaryotischen Zellen in der Lage sind. Dies minimiert das Risiko der Integration von Poly-
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nukleotid-Vakzin-Sequenzen in das Genom des Empfängers.
[0042] In einer weiteren Ausführungsform wird der Expressionsvektor pnRSV verwendet, wobei das lange
terminale Repeat (LTR) des Rous-Sarkom-Virus (RSV) als Promotor verwendet wird. In einer noch weiteren
Ausführungsform wird V1, ein mutierter pBR322-Vektor, in den der CMV-Promotor und der BGH-Transkriptionsterminator kloniert wurden, verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wurden die
Elemente von V1 und pUC19 kombiniert, um einen Expressionsvektor mit der Bezeichnung V1J zu ergeben.
[0043] Ein M.tb-Gen, wie z.B. eines der Gene des Antigen 85-Komplexes oder irgendein anderes M.tb-Gen,
welches Anti-M.tb-Immunreaktionen (CTLs, Helfer-T-Lymphozyten und Antikörper) induzieren kann, wird in
V1J, V1JtPA oder einen anderen wünschenswerten Expressionsvektor kloniert. In einer weiteren Ausführungsform wird das Ampicillinresistenzgen aus V1J entfernt und durch ein Neomycinresistenzgen ersetzt, um
V1J-neo herzustellen, in den irgendeines einer Reihe verschiedener M.tb-Gene zur Verwendung gemäß dieser
Erfindung kloniert werden kann. In einer noch weiteren Ausführungsform ist der Vektor V1Jns, welcher derselbe wie V1Jneo ist, mit Ausnahme dessen, dass eine nur einmal vorkommende Sfi1-Restriktionsstelle in die einzige Kpn1-Stelle an Position 2114 von V1J-neo eingeführt wurde. Das Vorkommen von Sfi1-Stellen in humaner
genomischer DNA ist sehr gering (etwa eine Stelle pro 100.000 Basen). Somit erlaubt dieser Vektor eine sorgfältige Überwachung der Expressionsvektor-Integration in Wirts-DNA einfach durch Sfi1-Verdauung von extrahierter genomischer DNA. In einer weiteren Ausführungsform ist der Vektor V1R. Bei diesem Vektor ist so viel
nicht-essentielle DNA wie möglich "weggeschnitten", um einen sehr kompakten Vektor zu erzeugen. Dieser
Vektor erlaubt die Verwendung größerer Inserts mit weniger Bedenken, dass unerwünschte Sequenzen codiert
werden, und optimiert die Aufnahme durch Zellen, wenn das für spezielle Virusgene codierende Konstrukt in
das umgebende Gewebe eingeführt wird. Die Verfahren, welche zur Erzeugung der vorstehenden Vektormodifizierungen verwendet wurden, und Entwicklungsverfahren können nach Fachleuten auf dem Gebiet bekannten Verfahren durchgeführt werden.
[0044] Anhand dieser Arbeit werden Fachleute auf dem Gebiet erkennen, dass eine der Einsatzmöglichkeiten
der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines Systems für sowohl in vivo- als auch in vitro-Tests und
-Analysen ist, so dass eine Korrelation der M.tb-Sequenzdiversität mit CTL- und T-Zell-Proliferationsreaktionen
sowie anderer Parameter vorgenommen werden kann. Die Isolierung und Klonierung dieser verschiedenen
Gene kann nach Verfahren durchgeführt werden, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Diese Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur systematischen Identifizierung von M.tb-Stämmen und Sequenzen für die
Vakzinherstellung bereit. Die Inkorporation von Genen aus primären Isolaten von M.tb-Stämmen ergibt ein Immunogen, welches Immunreaktionen gegen klinische Isolate des Organismus induziert, und stillt somit einen
bisher nicht gestillten Bedarf auf diesem Gebiet. Ferner kann, falls sich die Virusisolate verändern, dass Immunogen modifiziert werden, um erforderlichenfalls neue Sequenzen zu reflektieren.
[0045] In einer Ausführungsform dieser Erfindung ist ein für ein M.tb-Protein codierendes Gen direkt mit einem transkriptionalen Promotor verknüpft. Die Verwendung von gewebespezifischen Promotoren oder Enhancern, beispielsweise des Muskel-Kreatinkinase (MCK)-Enhancerelements kann wünschenswert sein, um die
Expression des Polynukleotids auf einen speziellen Gewebetyp zu beschränken. Beispielsweise sind Myozyten terminal differenzierte Zellen, welche sich nicht teilen. Die Integration von fremder DNA in Chromosomen
scheint sowohl eine Zellteilung als auch Proteinsynthese zu erfordern. Somit kann eine Beschränkung der Proteinexpression auf nicht-teilende Zellen wie Myozyten bevorzugt sein. Jedoch ist die Verwendung des
CMV-Promotors adäquat für die Erreichung einer Expression in vielen Geweben, in welche das PNV eingeführt
wurde.
[0046] M.tb und andere Gene werden vorzugsweise in einen Expressionsvektor ligiert, welcher speziell für
Polynukleotid-Impfungen optimiert wurde. Elemente umfassen einen transkriptionalen Promotor, immunogene
Epitope und zusätzliche Cistrons, welche für immunverstärkende oder immunmodulatorische Gene codieren,
mit ihren eigenen Promotoren, Transkriptionsterminator, bakteriellen Replikationsursprung und Antibiotikaresistenzgen, wie hier beschrieben. Gegebenenfalls kann der Vektor interne Ribosomen-Eintrittsstellen ("IRES")
zur Expression von polycistronischer mRNA enthalten. Fachleute auf dem Gebiet werden erkennen, dass
RNA, welche in vitro transkribiert wurde, um multicistronische mRNAs zu erzeugen, die von den DNA-Gegenstücken codiert werden, vom Umfang dieser Erfindung umfasst wird. Für diesen Zweck ist es wünschenswert,
als transkriptionalen Promotor solche starken RNA-Polymerase-Promotoren wie die T7- oder SP6-Promotoren
zu verwenden und eine "Run-on"-Transkription mit einer linearisierten DNA-Matrize in vitro durchzuführen. Diese Verfahren sind im Stand der Technik wohlbekannt.
[0047] Die Schutzeffizienz von Polynukleotid-M.tb-Immunogenen gegen eine nachfolgende Herausforderung
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wird demonstriert durch Immunisierung mit der DNA dieser Erfindung. Dies ist vorteilhaft, da kein infektiöses
Agens beteiligt ist, keine Assemblierung/Replikation von Bakterien erforderlich ist und eine Determinantenselektion ermöglicht wird. Ferner wird, da die Sequenz von mykobakteriellen Genprodukten bei verschiedenen
Stämmen von M.tb konserviert sein mag, ein Schutz gegen eine nachfolgende Herausforderung durch einen
anderen Stamm von M.tb erhalten.
[0048] Die Injektion eines DNA-Expressionsvektors, codierend für das Antigen 85A, B oder C, kann zur Erzeugung einer signifikanten schützenden Immunität gegen eine nachfolgende Herausforderung führen. Insbesondere können spezielle CTLs und Helfer-T-Lymphozytenreaktionen hervorgerufen werden.
[0049] Nachdem jedes der M.tb-Genprodukte einen hohen Konservierungsgrad bei den verschiedenen Stämmen von M.tb aufweist und nachdem Immunreaktionen als Reaktion auf eine intrazelluläre Expression und
MHC-Prozessierung hervorgerufen werden können, steht zu erwarten, dass viele verschiedene
M.tb-PNV-Konstrukte zu kreuzreaktiven Immunreaktionen führen werden.
[0050] Die Erfindung bietet ein Mittel zur Induktion einer heterologen schützenden Immunität ohne das Erfordernis selbstreplizierender Agenzien oder Adjuvanzien. Die Bildung von Antikörpern mit hohem Titer gegen exprimierte Proteine nach Injektion von viralem Protein und humaner Wachstumshormon-DNA [Tang et al., Nature 356, 152, 1992] weist darauf hin, dass dies ein leichtes und hochwirksames Mittel zur Herstellung von Vakzinen auf Antikörperbasis, entweder separat oder in Kombination mit zytotoxischen T-Lymphozyten- und Helfer-T-Lymphozyten-Vakzinen, die auf konservierte Antigene gerichtet sind, darstellt.
[0051] Die Leichtigkeit der Erzeugung und Reinigung von DNA-Konstrukten ist vorteilhaft im Vergleich zu herkömmlicher Proteinreinigung und erleichtert die Herstellung von Kombinationsvakzinen. Somit können Mehrfachkonstrukte, beispielsweise codierend für Gene des Antigen 85-Komplexes und irgendein anderes
M.tb-Gen, auch einschließlich Nicht-M.tb-Gene, hergestellt, gemischt und gemeinsam verabreicht werden.
Darüber hinaus wird die Proteinexpression nach DNA-Injektion aufrechterhalten [H. Lin et al., Circulation 82,
2217 (1990); R. N. Kitsis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88, 4138 (1991); E. Hansen et al., FEBS Lett. 290,
73 (1991); S. Jiao et al., Hum. Gene Therapy 3, 21 (1992); J. A. Wolff et al., Human Mol. Genet. 1, 363 (1992)],
die Dauerhaftigkeit der B- und T-Zell-Erinnerung kann erhöht werden [D. Gray und P. Matzinger, J. Exp. Med.
174, 969 (1991); S. Oehen et al., ibid. 176, 1273 (1992)], wodurch eine langlebige humorale und zellvermittelte
Immunität erzeugt wird.
[0052] Die Menge an exprimierbarer DNA oder transkribierter RNA, die in einen Vakzin-Empfänger eingeführt
werden soll, wird einen sehr breiten Dosierungsbereich aufweisen und kann von der Stärke der verwendeten
transkriptionalen und translationalen Promotoren abhängen. Darüber hinaus kann die Größe der Immunreaktion von dem Niveau der Proteinexpression und der Immunogenizität des exprimierten Genprodukts abhängen. Im allgemeinen liegt eine wirksame Dosis im Bereich von etwa 1 ng bis 5 mg, 100 ng bis 2,5 mg, 1 μg bis
750 μg und vorzugsweise werden etwa 10 μg bis 300 μg DNA direkt in Muskelgewebe verabreicht. Subkutane
Injektion, intradermale Einführung, Impression durch die Haut und andere Verabreichungswege, wie z.B. intraperitoneale, intravenöse Abgabe oder Abgabe mittels Inhalation, sind ebenfalls geeignet. Es wird auch in Betracht gezogen, dass Booster-Impfungen vorgesehen werden können. Nach einer Impfung mit M.tb-Polynukleotid-Immunogen wird ein Boosting mit M.tb-Protein-Immunogenen, wie z.B. den Antigen 85-Komplex-Genprodukten, ebenfalls in Betracht gezogen. Eine parenterale Verabreichung, wie z.B. intravenös, intramuskulär,
subkutan, oder eine andere Verabreichungsweise des Interleukin-12-Proteins (oder anderer Cytokine, z.B.
GM-CSF), gleichzeitig mit oder nach der parenteralen Einführung des PNV dieser Erfindung kann von Vorteil
sein.
[0053] Das Polynukleotid kann nackt sein, d.h. nicht assoziiert mit irgendwelchen Proteinen, Adjuvanzien
oder anderen Agenzien, welche das Immunsystem des Empfängers beeinflussen. In diesem Fall ist es wünschenswert, dass das Polynukleotid in einer physiologisch annehmbaren Lösung, wie z.B., jedoch nicht beschränkt auf, sterile Salzlösung oder sterile gepufferte Salzlösung, vorliegt. Alternativ kann die DNA mit Liposomen assoziiert sein, wie z.B. Lecithin-Liposomen oder anderen Liposomen, die im Stand der Technik bekannt sind, als DNA-Liposom-Mischung, oder die DNA kann mit einem im Stand der Technik bekannten Adjuvans assoziiert sein, um Immunreaktionen zu fördern, wie z.B. einem Protein oder einem anderen Träger.
Agenzien, welche die zelluläre Aufnahme von DNA fördern, wie z.B., jedoch nicht beschränkt auf, Calciumionen, können ebenfalls eingesetzt werden. Diese Agenzien werden hier im allgemeinen als transfektions-erleichternde Reagenzien und pharmazeutisch annehmbare Träger bezeichnet. Techniken zur Beschichtung von
Mikroprojektilen, die mit Polynukleotid beschichtet sind, sind im Stand der Technik bekannt und ebenfalls in
Verbindung mit dieser Erfindung geeignet. Für DNA, die zur Anwendung beim Menschen bestimmt ist, kann
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es nützlich sein, das endgültige DNA-Produkt in einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder einer pharmazeutisch annehmbaren Pufferlösung zu haben. Pharmazeutisch annehmbare Träger oder Pufferlösungen
sind im Stand der Technik bekannt und schließen diejenigen ein, welche in einer Vielfalt von Texten, wie z.B.
Remington's Pharmaceutical Sciences, beschrieben werden.
[0054] In einer weiteren Ausführungsform ist die Erfindung ein Polynukleotid, welches zusammenhängende
Nukleinsäuresequenzen umfasst, die nach Einführung des Polynukleotids in eukaryotische Gewebe in vivo in
der Lage sind, exprimiert zu werden, um ein Genprodukt zu bilden. Das codierte Genprodukt wirkt vorzugsweise entweder als Immunstimulans oder als Antigen, das zur Hervorrufung einer Immunreaktion in der Lage ist,
wirken. Somit codieren die Nukleinsäuresequenzen in dieser Ausführungsform für ein immunogenes M.tb-Epitop und fakultativ für ein Cytokin oder ein T-Zell-Costimulationselement, wie z.B. ein Mitglied der B7-Familie
von Proteinen.
[0055] Es gibt mehrere Vorteile der Immunisierung mit einem Gen statt mit dessen Genprodukt. Der erste ist
die relative Einfachheit, mit der natives oder nahezu natives Antigen dem Immunsystem präsentiert werden
kann. Säugerproteine, die rekombinant in Bakterien, Hefe oder sogar Säugerzellen exprimiert werden, erfordern oft eine umfangreiche Behandlung, um eine geeignete Antigenizität zu gewährleisten. Ein zweiter Vorteil
der DNA-Immunisierung ist das Potential für das Immunogen, den MHC-Klasse I-Weg einzuschlagen und eine
zytotoxische T-Zell-Reaktion hervorzurufen. Die Immunisierung von Mäusen mit DNA, die für das Influenza
A-Nukleoprotein (NP) codierte, rief eine CD8+-Reaktion auf NP hervor, welche Mäuse gegen eine Herausforderung mit heterologen Influenza-Stämmen schützte (Montgomery, D. L., et al., oben; Ulmer, J., et al., oben).
[0056] Es gibt starke Indizien, dass die zellvermittelte Immunität bei der Kontrolle einer M.tb-Infektion von Bedeutung ist [Orme et al., 1993, J. Infect. Dis. 167, 1481; Cooper et al., 1993, J. Exp. Med. 178, 2243; Flynn et
al., 1993, J. Exp. Med. 178, 2249; Orme et al., 1993, J. Immunol. 151, 518]. Nachdem eine DNA-Immunisierung sowohl humorale als auch zellvermittelte Immunreaktionen hervorrufen kann, könnte deren größter Vorteil
darin liegen, dass sie ein relativ einfaches Verfahren zur Untersuchung einer großen Anzahl von M.tb-Genen
hinsichtlich ihres Vakzinpotentials bietet.
[0057] Die Immunisierung durch DNA-Injektion erlaubt auch, wie oben erörtert, die schnelle Assemblierung
von Multikomponenten-Untereinheitsvakzinen. Eine gleichzeitige Immunisierung mit mehreren Influenzagenen
wurde kürzlich berichtet (Donnelly, J., et al., 1994, Vaccines, S. 55–59). Der Einschluss von Genen, deren Produkte verschiedene Zweige des Immunsystems aktivieren, in ein M.tb-Vakzin könnte auch einen umfassenden
Schutz vor einer nachfolgenden Herausforderung bieten.
[0058] Die Vakzine der vorliegenden Erfindung eignen sich zur Verabreichung an domestizierte oder landwirtschaftliche Tiere sowie an Menschen. Vakzine der vorliegenden Erfindung können zur Verhütung und/oder Bekämpfung einer Infektion beliebiger landwirtschaftlicher Tiere, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf,
Milchvieh, welche für eine mykobakterielle Infektion anfällig sind, verwendet werden. Die Techniken zur Verabreichung dieser Vakzine an Tiere und Menschen sind Fachleuten auf dem Gebiet der Human- und Veterinärmedizin bekannt.
[0059] Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung, ohne diese jedoch darauf
zu beschränken.
BEISPIEL 1
Vektoren für die Vakzinherstellung
A) V1-Expressionsvektor
[0060] Der Expressionsvektor V1 wurde aus pCMVIE-AKI-DHFR konstruiert [Y. Whang et al., J. Virol. 61,
1796 (1987)]. Die AKI- und DHFR-Gene wurden durch Spalten des Vektors mit EcoRI und Selbstligierung entfernt. Dieser Vektor enthält kein Intron A in dem CMV-Promotor, so wurde es als ein PCR-Fragment zugegeben, das eine deletierte interne SacI-Stelle aufwies [bei 1855 gemäß der Nummerierung in B. S. Chapman et
al., Nuc. Acids Res. 19, 3979 (1991)]. Die für die PCR-Reaktionen verwendete Matrize war pCMVintA-Lux, hergestellt durch Ligieren des HindIII- und des NheI-Fragments aus pCMV6a120 [siehe B. S. Chapman et al.,
ibid.], einschließlich des hCMV-IE1-Enhancer/Promotors und Introns A, in die HindIII- und XbaI-Stellen von
pBL3, um pCMVIntBL zu erzeugen. Das 1881-Basenpaar-Luciferase-Genfragment (HindIII-SmaI, mit Klenow
aufgefüllt) aus RSV-Lux [J. R. de Wet et al., Mol. Cell Biol. 7, 725, 1987] wurde in die SalI-Stelle von pCMVIntBL
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kloniert, welche mit Klenow aufgefüllt und mit Phosphatase behandelt worden war.
[0061] Die Primer, welche Intron A überspannten, sind:
5'-Primer, SEQ-ID: 1:
Der 3'-Primer, SEQ-ID: 2:
[0062] Die Primer, welche zur Entfernung der SacI-Stelle verwendet wurden, sind:
Sense-Primer, SEQ-ID: 3:
und der Antisense-Primer, SEQ-ID: 4:
[0063] Das PCR-Fragment wurde mit SacI und BglII gespalten und in den Vektor inseriert, der mit den gleichen Enzymen gespalten worden war.
B) V1J-Expressionsvektor
[0064] Der Zweck der Schaffung von V1J war die Entfernung der Promotor- und Transkriptionsterminationselemente aus dem Vektor V1, um sie in einen definierteren Kontext zu bringen, einen kompakteren Vektor zu
schaffen und die Plasmidreinigungsausbeuten zu verbessern.
[0065] V1J ist von den Vektoren V1 und pUC18, einem im Handel erhältlichen Plasmid, abgeleitet. V1 wurde
mit den Restriktionsenzymen SspI und EcoRI verdaut, die zwei DNA-Fragmente ergaben. Das kleinere dieser
Fragmente, enthaltend den CMVintA-Promotor und Rinderwachstumshormon (BGH)-Transkriptionsterminationselemente, welche die Expression heterologer Gene steuern, wurde aus einem Agaroseelektrophoresegel
gereinigt. Die Enden dieses DNA-Fragments wurden dann mit Hilfe des Enzyms T4-DNA-Polymerase "glattendig" gemacht, um dessen Ligierung mit einem anderen "glattendigen" DNA-Fragment zu erleichtern.
[0066] pUC18 wurde gewählt, um das "Gerüst" des Expressionsvektors bereitzustellen. Es ergibt bekanntermaßen hohe Plasmidausbeuten, ist hinsichtlich Sequenz und Funktion gut charakterisiert und hat eine geringe
Größe. Das gesamte lac-Operon wurde aus diesem Vektor durch partielle Verdauung mit dem Restriktionsenzym Haell entfernt. Das verbleibende Plasmid wurde aus einem Agaroseelektrophoresegel gereinigt, mit der
T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht, mit alkalischer Kalbsdarmphosphatase behandelt und mit dem oben
beschriebenen CMVintA/BGH-Element ligiert. Plasmide, die eine von zwei möglichen Orientierungen der Promotorelemente innerhalb des pUC-Gerüsts aufwiesen, wurden erhalten. Eines dieser Plasmide ergab viel höhere Ausbeuten an DNA in E. coli und wurde als V1J bezeichnet. Die Struktur dieses Vektors wurde durch Sequenzanalyse der Verbindungsbereiche verifiziert und von ihm wurde anschließend gezeigt, dass er eine vergleichbare oder höhere Expression heterologer Gene im Vergleich zu V1 ergibt.
C) V1Jneo-Expressionsvektor
[0067] Es war erforderlich, das für die Antibiotikaselektion von Bakterien, die V1J beherbergten, verwendete
ampr-Gen zu entfernen, da Ampicillin in großmaßstäblichen Fermentern nicht wünschenswert sein mag. Das
ampr-Gen aus dem pUC-Gerüst von V1J wurde durch Verdauung mit den Restriktionsenzymen SspI und
Eam1105I entfernt. Das verbleibende Plasmid wurde mittels Agarosegelelektrophorese gereinigt, mit
T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht und dann mit alkalischer Kalbsdarmphosphatase behandelt. Das im
Handel erhältliche kanr-Gen, abgeleitet von dem Transposon 903 und in dem Plasmid pUC4K enthalten, wurde
mit Hilfe des Restriktionsenzyms PstI ausgeschnitten, mittels Agarosegelelektrophorese gereinigt und mit
T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht. Dieses Fragment wurde mit dem V1J-Gerüst ligiert und Plasmide mit
dem kanr-Gen in jeder Orientierung wurden erhalten, welche als V1Jneo # 1 und 3 bezeichnet wurden. Jedes
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dieser Plasmide wurde durch Restriktionsenzymverdauungsanalyse, DNA-Sequenzierung der Verbindungsbereiche verifiziert und von ihm gezeigt, dass es ähnliche Mengen an Plasmid wie V1J bildete. Die Expression
heterologer Genprodukte für diese V1Jneo-Vektoren war ebenfalls vergleichbar mit V1J. V1Jneo # 3, hier im
folgenden als V1Jneo bezeichnet, welcher das kanr-Gen in der gleichen Orientierung wie das ampr-Gen in V1J
als Expressionskonstrukt enthält, wurde ausgewählt.
D) V1Jns-Expressionsvektor
[0068] Eine SfiI-Stelle wurde V1Jneo hinzugefügt, um Integrationsstudien zu erleichtern. Ein im Handel erhältlicher 13-Rasenpaar-SfiI-Linker (New England BioLabs) wurde an der KpnI-Stelle innerhalb der BGH-Sequenz des Vektors hinzugefügt. V1Jneo wurde mit KpnI linearisiert, gelgereinigt, mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht und mit dem glattendigen SfiI-Linker ligiert. Klonale Isolate wurden mittels Restriktionskartierung ausgewählt und mittels Sequenzierung über den Linker verifiziert. Der neue Vektor wurde als V1Jns bezeichnet. Die Expression heterologer Gene in V1Jns (mit SfiI) war mit der Expression der gleichen Gene in
V1Jneo (mit KpnI) vergleichbar.
E) ViJns-tPA
[0069] Zur Bereitstellung einer heterologen Leader-Peptidsequenz für sekretierte Proteine und/oder Membranproteine wurde V1Jns modifiziert, um den Leader des für Humangewebe spezifischen Plasminogenaktivators (tPA) einzuschließen. Zwei synthetische komplementäre Oligomere wurden verschmolzen und dann in
V1Jn ligiert, welcher mit BglII verdaut worden war. Die Sense- und Antisense-Oligomere waren 5'-GATC ACC
ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGC TGT GTG CTG CTG CTG TGT GGA GCA GTC TTC GTT
TCG CCC AGC GA-3', SEQ-ID: 5, und 5'-GAT CTC GCT GGG CGA AAC GAA GAC TGC TCC ACA CAG CAG
CAG CAC ACA GCA GAG CCC TCT CTT CAT TGC ATC CAT GGT-3', SEQ-ID: 6. Die Kozak-Sequenz ist in
dem Sense-Oligomer unterstrichen. Diese Oligomere haben überhängende Basen, die für die Ligierung mit
BGlII-gespaltenen Sequenzen kompatibel sind. Nach der Ligierung ist die stromaufwärts gelegene BglII-Stelle
zerstört, während die stromabwärts gelegene BglII-Stelle für nachfolgende Ligierungen erhalten bleibt. Sowohl
die Verbindungsstellen als auch die gesamte tPA-Leader-Sequenz wurden durch DNA-Sequenzierung verifiziert. Um mit dem konsensus-optimierten Vektor ViJns (= V1Jneo mit einer SfiI-Stelle) konform zu gehen, wurde zusätzlich eine SfiI-Restriktionsstelle an der KpnI-Stelle innerhalb des BGH-Terminatorbereichs von
V1Jn-tPA plaziert, indem die KpnI-Stelle mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht wurde, gefolgt von Ligierung mit einem SfiI-Linker (Katalog-Nr. 1138, New England BioLabs). Diese Modifizierung wurde durch Restriktionsverdauung und Agarosegelelektrophorese verifiziert.
F) pGEM-3-X-IRES-B7 (worin X = ein beliebiges antigenes Gen)
[0070] Als Beispiel eines dicistronischen Vakzinkonstrukts, welches die koordinierte Expression eines Gens,
das für ein Immunogen codiert, und eines Gens, das für ein immunstimulatorisches Protein codiert, ergibt, wurde das Maus-B7-Gen aus der B-Lymphom-Zellinie CH1 (erhalten von der ATCC) PCR-amplifiziert. B7 ist ein
Mitglied einer Familie von Proteinen, welche für die essentielle costimulatorische T-Zell-Aktivierung durch ein
Antigen im Kontext der Haupthistokompatibilitätskomplexe I und II sorgt. CH1-Zellen ergeben eine gute Quelle
von B7-mRNA, da sie den Phänotyp der konstitutiven Aktivierung aufweisen und B7 hauptsächlich von aktivierten antigen-präsentierenden Zellen, wie z.B. B-Zellen und Makrophagen, exprimiert wird. Diese Zellen wurden weiter in vitro stimuliert unter Verwendung von cAMP oder IL-4 und mRNA wurde mittels Standardguanidiniumthiocyanat-Verfahren hergestellt. cDNA-Synthese erfolgte unter Verwendung dieser mRNA mittels des
GeneAmp RNA-PCR-Kits (Perkin-Eimer Cetus) und eines für B7 spezifischen Primer-Oligomers (5'-GTA CCT
CAT GAG CCA CAT AAT ACC ATG-3', SEQ-ID: 7), lokalisiert stromabwärts des offenen Translationsleserahmens von B7. B7 wurde mittels PCR amplifiziert unter Verwendung der folgenden Sense- und Antisense-PCR-Oligomere: 5'-GGT ACA AGA TCT ACC ATG GCT TGC AAT TGT CAG TTG ATG C-3', SEQ-ID: 8
bzw. 5'-CCA CAT AGA TCT CCA TGG GAA CTA AAG GAA GAC GGT CTG TTC-3', SEQ-ID: 9. Diese Oligomere liefern BglII-Restriktionsenzymstellen an den Enden des Inserts sowie eine Kozak-Translationsinitiationssequenz, welche eine NcoI-Restriktionsstelle enthält, und eine zusätzliche NcoI-Stelle, die sich unmittelbar
vor der 3'-terminalen BglII-Stelle befindet. NcoI-Verdauung ergab ein Fragment, das zur Klonierung in
pGEM-3-IRES, welcher mit NcoI verdaut worden war, geeignet war. Der resultierende Vektor,
pGEM-3-IRES-B7, enthält eine IRES-B7-Kassette, welche leicht in V1Jns-X überführt werden kann, worin X
ein antigen-codierendes Gen repräsentiert.
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G) pGEM-3-X-IRES-GM-CSF (worin X = ein beliebiges antigenes Gen)
[0071] Dieser Vektor enthält eine analoge Kassette zu der in Abschnitt C oben beschriebenen, mit der Ausnahme, dass das Gen für das immunstimulatorische Cytokin GM-CSF anstelle von B7 verwendet wird.
GM-CSF ist ein Makrophagen-Differenzierungs- und -Stimulations-Cytokin, von dem gezeigt wurde, dass es
potente Antitumor-T-Zellaktivitäten in vivo hervorruft [G. Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 3539
(1993)].
H) pGEM-3-X-IRES-IL-12 (worin X = ein beliebiges antigenes Gen)
[0072] Dieser Vektor enthält eine analoge Kassette zu der in Abschnitt C oben beschriebenen, mit der Ausnahme, dass das Gen für das immunstimulatorische Cytokin IL-12 anstelle von B7 verwendet wird. Von IL-12
wurde gezeigt, dass es eine einflussreiche Rolle bei der Verlagerung von Immunreaktionen zu zellulären,
T-Zell-dominierten Wegen im Gegensatz zu humoralen Reaktionen spielt [L. Alfonso et al., Science, 263, 235,
1994].
BEISPIEL 2
Herstellung des Vektors V1R
[0073] In einem Versuch zur Fortsetzung der Optimierung des Basis-Vakzinierungsvektors wurde ein Derivat
von V1Jns, als V1R bezeichnet, hergestellt. Der Zweck dieser Vektorkonstruktion war der Erhalt eines Vakzinvektors minimaler Größe ohne überflüssige DNA-Sequenzen, welcher immer noch die insgesamt optimierten
heterologen Genexpressionscharakteristiken und hohen Plasmidausbeuten behielt, welche V1J und V1Jns liefern. Es wurde anhand der Literatur sowie durch Versuche festgestellt, dass (1) Regionen innerhalb des
pUC-Gerüsts, welche den E. coli-Replikationsursprung umfassen, entfernt werden konnten, ohne die Plasmidausbeute aus Bakterien zu beeinflussen; (2) die 3'-Region des kanr-Gen nach dem offenen Leserahmen
von Kanamycin entfernt werden konnte, wenn statt dessen ein bakterieller Terminator inseriert wurde; und (3)
~300 bp von der 3'-Hälfte des BGH-Terminators ohne Beeinflussung seiner regulatorischen Funktion entfernt
werden konnten (nach der ursprünglichen KpnI-Restriktionsenzymstelle innerhalb des BGH-Elements).
[0074] V1R wurde mit Hilfe von PCR konstruiert, um drei DNA-Segmente von V1Jns, repräsentierend den
CMVintA-Promotor/BGH-Terminator, Replikationsursprung bzw. Kanamycinresistenz-Elemente, zu synthetisieren. Restriktionsenzyme, die für jedes Segment einmalig waren, wurden jedem Segment hinzugefügt unter
Verwendung der PCR-Oligomere: SspI und XhoI für CMVintA/BGH; EcoRV und BamHI für das kanr-Gen und
BclI und SalI für den orir. Diese Enzymstellen wurden gewählt, da sie eine richtungsgesteuerte Ligierung jedes
der PCR-abgeleiteten DNA-Fragmente mit einem anschließenden Verlust jeder Stelle erlauben: EcoRV und
SspI hinterlassen glattendige DNAs, welche für die Ligierung kompatibel sind, während BamHI und BclI komplementäre Überhänge zurücklassen, wie dies SalI und XhoI tun. Nach dem Erhalt dieser Segmente mittels
PCR wurde jedes Segment mit den geeigneten, oben angegebenen Restriktionsenzymen verdaut und dann in
einer einzigen Reaktionsmischung, die alle drei DNA-Segmente enthielt, ligiert. Das 5'-Ende des orir war so
gestaltet, dass die rho-unabhängige T2-Terminatorsequenz, die normalerweise in dieser Region gefunden
wird, eingeschlossen war, so dass sie eine Terminationsinformation für das Kanamycinresistenzgen liefern
konnte. Das ligierte Produkt wurde durch Restriktionsenzymverdauung (> 8 Enzyme) sowie DNA-Sequenzierung der Ligierungsverbindungsbereiche bestätigt. DNA-Plasmid-Ausbeuten und heterologe Expression unter
Verwendung viraler Gene innerhalb von V1R scheinen ähnlich zu V1Jns zu sein. Die erreichte Nettoreduktion
der Vektorgröße war 1346 bp (V1Jns = 4,86 kb; V1R = 3,52 kb).
[0075] PCR-Oligomersequenzen, welche zur Synthese von V1R verwendet wurden (Restriktionsenzymstellen sind unterstrichen und in Klammern nach der Sequenz angegeben):
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BEISPIEL 3
Zellkultur und Transfektion
[0076] Zur Herstellung von stabil transfizierten Zellinien, die M.tb-Antigene exprimieren, wurden RD-Zellen
(Human-Rhabdomyosarkom ATCC CCL 136) bei 37°C, 5% CO2 in Dulbecco's Modified Eagle's Medium
(DMEM), ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 20 mM HEPES, 4 mM L-Glutamin und 100
μg/ml an jeweils Penicillin und Streptomycin, gezüchtet. Die Zellen wurden mit 1,5 × 106 Zellen/100 mm2-Platte
ausgesät und 18 h lang gezüchtet. Die Zellen wurden mit 10 μg/Platte des TB-Konstrukts und 10 μg cotransfiziertem Cat-Konstrukt unter Verwendung des CellPhect-Kits (Pharmacia) transfiziert und einem Glycerinschock (15% Glycerin in PBS, pH 7,2, für 2,5 Minuten) 5 h, nachdem DNA den Zellen zugegeben worden war,
unterworfen. Die Kulturen wurden 72 h nach der Transfektion geerntet durch Waschen der Platten mit 2 × 10
ml kaltem PBS, pH 7,2, Zugabe von 5 ml kaltem TEN-Puffer (40 mM TRIS-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 150 mM
NaCl) und Abkratzen. Zur Analyse der Proteinexpression wurden Zell-Pellets in 50 μl Single Detergent Lysis
Buffer (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,02% NaN3, 1% Nonidet P-40, 100 mM PMSF, 2 μg/ml Aprotinin,
2 μg/ml Leupeptin und 1 μg/ml Pepstatin A) lysiert und auf Eis (Pulse von 2–15 Sekunden) beschallt. Die Lysate
wurden mit 13.000 × g 10 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert. Die Proteinkonzentration wurde mit dem Bradford-Verfahren bestimmt und 20 μg Zellextraktprotein pro Spur wurde auf ein 10%iges TRIS-Glycin-Polyacrylamidgel (Novex) aufgebracht, dann auf eine Immobilon P (Millipore)-Membran überführt. Die Immunoblots
wurden über Nacht mit einer 1:20-Verdünnung des monoklonalen Maus-Antikörpers TD 17-4 [Huygen et al.,
1994, Infect. Immunity 62, 363] umgesetzt, gefolgt von 1,5 h Reaktion mit einer 1:1000-Verdünnung von Antimaus-Ziegen-IgGFc-Peroxidase (Jackson). Die Blots wurden unter Verwendung des ECL-Kits (Amersham)
entwickelt.
BEISPIEL 4
Klonierung und DNA-Herstellung
1. Die Konstruktion von V1Jns-tPA-85A (enthält reifes Ag85A mit der tPA-Signalsequenz) erfolgte unter Verwendung der folgenden Primer:
Sense-85A.C1-Primer [SEQ-ID-NR. 16]
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Antisense-85A-Primer [SEQ-ID-NR. 17]
[0077] Das Ag85A aus M. tuberculosis wurde aus dem Plasmid p85A.tub, welches durch Ligierung eines
800-bp-HindIII-Fragments mit einem 1600-bp-HindIII-SphI-Fragment aus Fig. 2 von Borremans et al., 1989
[Infect. Immunity 57, 3123], hergestellt worden war, amplifiziert. Das resultierende 2400-bp-Insert wurde in die
HindIII- und SphI-Stellen des BlueScribe M13+ subkloniert. Die gesamte codierende Sequenz und flankierende
Regionen in BlueScribe M13+ (VCS/Stratagene) wurden mittels PCR mit den angegebenen Primern unter den
folgenden Bedingungen amplifiziert. Jede 100-μl-Reaktion enthält 2,5 Einheiten Cloned Pfu DNA Polymerase
(Stratagene), 200 mM dNTP, 0,5 μg eines jeden Primers und 250 ng Matrizen-DNA in dem mit dem Enzym
gelieferten Reaktionspuffer (Stratagene). Der Hybaid Thermal Reactor wurde wie folgt programmiert: 5 Minuten Denaturierung bei 94°C, gefolgt von 25 Zyklen (1 Minute bei 94°C, 2 Minuten bei 55°C und 3 Minuten bei
72°C), endend mit einer zehnminütigen Verlängerung bei 72°C.
[0078] Amplifizierte DNA wurde mit 50 μg/ml Proteinase K (Boehringer Mannheim) 30 Minuten lang bei 37°C
verdaut, 10 Minuten lang auf 95°C erwärmt, gefolgt von 2 Phenol (Chloroform-Isoamylalkohol)-Extraktionen,
und präzipitiert mit 1 Volumen Isopropanol, sie wurde zweimal mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und
gelöst in 20 μl H2O. 3 μg amplifizierter DNA wurden mit 40 Einheiten BglII (Boehringer Mannheim) verdaut und
das 907-bp-Fragment (im Falle von 85A-C1) wurde auf einem einprozentigen Agarosegel isoliert und auf "Prep
a Gene" (BioRad) nach den Anweisungen des Herstellers extrahiert.
[0079] 50 ng dieses Fragments wurden mit 20 ng des mit BglII verdauten und dephosphorylierten
V1Jns.tPA-Vektors in einer 10-μl-Reaktion, enthaltend 2,5 Einheiten T4-DNA-Ligase (Amersham) in Ligierungspuffer 16 h lang bei 14°C ligiert, in kompetente DH5-E. coli (BRL) transformiert und auf LB-Agarmedium,
enthaltend Kanamycin (50 μg/ml), ausplattiert. Transformanten wurden gepickt und deren Plasmid-DNA mit
BglII gespalten (um die Anwesenheit des Inserts zu bestätigen) und mit PvuII, um dessen Orientierung festzulegen.
2. Die Konstruktion von V1Jns-85 [C2] (enthält reifes Ag85A ohne Signalsequenz) erfolgte unter Verwendung der folgenden Primer:
Sense-85A-C2 [SEQ-ID-NR. 18]
Antisense-85A [SEQ-ID-NR. 17]
Es wurde derselben Prozedur wie in 1 oben gefolgt, mit Ausnahme dessen, dass die Klonierung in V1Jns
stattfand.
3. Die Konstruktion von V1Jns-85A [C3] (enthält Ag85A mit seiner eigenen Signalsequenz) erfolgte unter
Verwendung der Primer:
Sense-85A-C3 [SEQ-ID-NR. 19]
Antisense-85A [SEQ-ID-NR. 17]
Es wurde derselben Prozedur wie in 1 oben gefolgt, mit Ausnahme dessen, dass die Klonierung in V1Jns
stattfand.
4. Die Konstruktion von V1Jns-tPA-85B [C1] (enthält Ag85B mit der tPA-Signalsequenz) erfolgte unter Verwendung der folgenden Primer:
Sense-85B [C1] [SEQ-ID-NR. 20]
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Antisense-85B [SEQ-ID-NR. 21]
Es wurde derselben Prozedur wie in 1 oben gefolgt, mit Ausnahme dessen, dass die Matrize für die PCR
p85B.tub war.
5. Die Konstruktion von V1Jns-tPA-85C [C1] (enthält Ag85C mit der tPA-Signalsequenz) erfolgte unter Verwendung der folgenden Primer:
Sense-85C [C1] [SEQ-ID-NR. 22]
Antisense-85C [SEQ-ID-NR. 23]
Es wurde derselben Prozedur wie in 1 oben gefolgt, mit Ausnahme dessen, dass die Matrize für die PCR
p85C.tub war.
6. Die Konstruktion von V1Jns-85B [C2] (enthält Ag85B ohne Signalsequenz) erfolgt unter Verwendung der
folgenden Primer:
Sense-85B [C2] [SEQ-ID-NR. 24]
Antisense-85B [SEQ-ID-NR. 21]
Es wird derselben Prozedur wie in 1 oben gefolgt, mit Ausnahme dessen, dass die Matrize für die PCR
p85B.tub ist und die Klonierung in V1Jns stattfindet.
7. Die Konstruktion von V1Jns-85C [C2] (enthält Ag85C ohne Signalsequenz) erfolgt unter Verwendung der
folgenden Primer:
Sense-85C [C2] [SEQ-ID-NR. 25]
Antisense-85C [SEQ-ID-NR. 23]
Es wird derselben Prozedur wie in 1 oben gefolgt, mit Ausnahme dessen, dass die Matrize für die PCR
p85C.tub ist und die Klonierung in V1Jns stattfindet.
[0080] Nach der Restriktionsanalyse werden alle Konstruktionen partiell über die Vektorverbindungsbereiche
sequenziert. Eine großmaßstäbliche DNA-Präparation erfolgte im wesentlichen wie beschrieben (Montgomery,
D. L., et al., oben).
[0081] Die Plasmidkonstruktionen wurden durch Restriktionskartierung und Sequenzanalyse der Vektor-Insert-Verbindungsbereiche charakterisiert (siehe Fig. 1–Fig. 6). Die Resultate standen in Einklang mit den veröffentlichten M.tb-Sequenzdaten und zeigten, dass das Initiationscodon für jedes Konstrukt intakt war (Fig. 7).
Ebenfalls gezeigt sind die verschiedenen zusätzlichen Aminosäurereste, die mit M.tb-Ag85 nicht in Bezug stehen, welche als Ergebnis der Klonierung inseriert wurden.
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BEISPIEL 5
Expression von M.tb-Proteinen von V1Jns.tPA-Plasmiden
[0082] Rhabdomyosarkom-Zellen (ATCC CCL136) wurden einen Tag vor der Verwendung in einer Dichte von
1,2 × 106 Zellen pro 9,5-cm2/Mulde in 6 Mulden-Gewebekulturcluster in DMEM mit hohem Glucosegehalt, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kalbsserum, 2 mM L-Glutamin, 25 mM HEPES, 50 E/ml Penicillin und
50 μg/ml Streptomycin (alles von BRL-Gibco), verpflanzt. Phenol:Chloroform-extrahierte, mit Cäsiumchlorid
gereinigte, Plasmid-DNA wurde mit Calciumphosphat unter Verwendung von Pharmacia CellPhect-Reagenzien nach den Instruktionen des Kits präzipitiert, mit Ausnahme dessen, dass 5–15 μg für jede Mulde von 9,5
cm2 von RD-Zellen verwendet wurden. Die Kulturen wurden einem Glycerinschock 6 h nach Zugabe von Calciumphosphat-DNA-Präzipitat ausgesetzt; nach erneuter Versorgung mit Nährstoffen wurden die Kulturen zwei
Tage lang vor der Ernte inkubiert.
[0083] Lysate von transfizierten Zellen wurden in 1 × RIPA (0,5% SDS, 1,0% TRITON X-100, 1 Natriumdesoxycholat, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 25 mM TRIS-HCl, pH 7,4), ergänzt mit 1 μM Leupeptin, 1 μM Pepstatin,
300 nM Aprotinin und 10 μM TLCK, präpariert und kurz beschallt, um die Viskosität zu verringern. Lysate wurden durch Elektrophorese auf 10%igen Tricin-Gelen (Novex) aufgetrennt und dann auf Nitrocellulosemembranen überführt. Immunoblots wurden mit den monoklonalen M.tb-Antikörpern 17/4 und 32/15 [Huygen et al.,
1994, Infect. Immunity 62, 363] behandelt und mit dem ECL-Nachweiskit (Amersham) entwickelt.
[0084] Die Expression von M.tb-Antigen 85-Komplex-Genen wurde durch vorübergehende Transfektion von
RD-Zellen demonstriert. Lysate von transfizierten oder scheintransfizierten Zellen wurden mittels SDS-PAGE
fraktioniert und mittels Immunoblots analysiert. Fig. 8 zeigt, dass mit V1Jns.tPA-85A(C1), V1Jns.tPA-85A(C2),
V1Jns.tPA-85A(C3) und V1Jns.tPA-85B(C1) transfizierte RD-Zellen ein immunreaktives Protein mit einem
scheinbaren Molekulargewicht von etwa 30–32 kD exprimieren.
BEISPIEL 6
Immunisierung mit PNV und Expression von Antigen 85-Proteinen in vivo
[0085] Fünf bis 6 Wochen alte weibliche BALB/c- und C57BL/6-Mäuse wurden durch intraperitoneale (i.p.) Injektion einer Mischung von 5 mg Ketamin-HCl (Aveco, Fort Dodge, IA) und 0,5 mg Xylazin (Mobley Corp.,
Shawnee, KS) in Salzlösung anästhesiert. Die Hinterbeine wurden mit 70%igem Ethanol gewaschen. Den Tieren wurden dreimal 100 μl DNA (2 mg/ml), suspendiert in Salzlösung, injiziert: 50 μl für jedes Bein. Nach 17–18
Tagen nach der Immunisierung wurden Serumproben gewonnen und hinsichtlich der Anwesenheit von Anti-Ag85-Antikörpern analysiert. Fig. 9 zeigt die spezifische Immunoblot-Reaktivität von Seren aus Mäusen, denen Ag85-DNA injiziert worden war (C1), jedoch nicht von Mäusen, die eine Kontroll-DNA ohne ein Gen-Insert
(V1J) erhielten. Reaktivität wurde bis zu einer Serumverdünnung von mindestens 1:160 gegen 300 ng gereinigtes Antigen 85A nachgewiesen ( Fig. 9b). Dies demonstriert, dass die Injektion von Ag85-DNA zu einer
Ag85-Expression in vivo führte, so dass sie für die Hervorrufung von Antikörperreaktionen in sowohl BALB/cals auch C57BL/6 (B6)-Mäusen verfügbar war.
BEISPIEL 7
Antigen 85-spezifische T-Zell-Reaktionen
[0086] Milzzellen aus geimpften Mäusen wurden hinsichtlich Cytokin-Sekretion als Reaktion auf eine spezifische Antigenrestimulation wie in Huygen et al., 1992, beschrieben [Infect. Immunity 60, 2880] analysiert. Konkret wurden Milzzellen mit Kulturfiltrat (CF)-Proteinen von M. bovis-BCG, gereinigtem Antigen 85A oder einem
20-mer-Peptid (p25) entsprechend einem bekannten T-Zell-Epitop für C57BL/6-Mäuse (Aminosäuren
241–260), inkubiert. Mäuse wurden mit V1Jns.tPA85A(C1) (100 μg) dreimal in dreiwöchigen Intervallen immunisiert und 17 Tage nach der letzten Injektion analysiert. Assays für Cytokine wurden unter Anwendung von
Bioassays für IL-2, Inferferon-γ (IFN-γ) und IL-6 und mittels ELISA für IL-4 und IL-10 durchgeführt. Eine substantielle IL-2- und IFN-γ-Produktion wurde in sowohl BALB/c- als auch C57BL/6-Mäusen, die mit
V1Jns.tPA85A(C1) geimpft worden waren, beobachtet (Fig. 10–Fig. 13). Ferner reagierten C57BL/6-Mäuse
auch mit dem H-2b-beschränkten T-Zell-Epitop (Fig. 13). Die IL-4-, IL-6- und 11-10-Niveaus waren in mit
V1Jns.tPA85A-geimpften Mäusen nicht erhöht (Fig. 14–Fig. 16). Diese Ergebnisse zeigen an, dass ein
Th1-Typ einer Helfer-T-Zell-Reaktion durch das DNA-Vakzin hervorgerufen wurde.
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BEISPIEL 8
Schutz vor einer mykobakteriellen Herausforderung
[0087] Zum Testen der Wirksamkeit eines M.tb-DNA-Vakzins wurden Mäuse mit einer intravenösen Injektion
von lebenden M. bovis-BCG (0,5 mg) herausgefordert und die BCG-Vermehrung wurde in den Milzen und Lungen analysiert. Als Kontrollen wurde die BCG-Vermehrung in herausgeforderten nativen Mäusen (primäre Infektion) und herausgeforderten Mäusen, welche mit BCG zum Zeitpunkt der DNA-Injektion geimpft worden waren (sekundäre Infektion), gemessen. Die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (CFU) in Lungen von mit
V1Jns.tPA85A (C1) geimpften Mäusen war substantiell verringert im Vergleich zu Mäusen mit einer primären
Infektion oder Mäusen, die mit der Kontroll-DNA V1J geimpft worden waren. In C57BU6-Mäusen waren die
CFU um 83% am Tag 8 nach der Herausforderung verringert (Fig. 17) und in BALB/c-Mäusen waren die CFU
um 65% am Tag 20 verringert (Fig. 18). In der Milz waren die CFU um etwa 40% am Tag 20 nach der Herausforderung in BALB/c-Mäusen (Fig. 19) und am Tag 8 in C57BU6-Mäusen verringert (Fig. 20). Somit ergaben
die nach Injektion eines M.tb-DNA-Vakzins beobachteten Immunreaktionen einen Schutz in einem Herausforderungsmodell mit lebenden M. bovis.
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Patentansprüche
1. Vakzin, welches nach Verabreichung an einen Säuger in der Lage ist, den Säuger vor einer nachfolgenden Herausforderung durch Mycobacterium tuberculosis oder Mycobacterium bovis zu schützen, wobei das
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Vakzin, zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, mindestens eine DNA-Polynukleotidsequenz, die für ein Mycobacterium tuberculosis-Antigen-85A-Protein, ein Mycobacterium tuberculosis-Antigen-85B-Protein oder ein Mycobacterium tuberculosis-Antigen-85C-Protein kodiert, in funktionsfähiger Verknüpfung mit einem Transkriptionspromotor umfasst, wobei die DNA-Sequenz in einem Expressionsvektor
enthalten ist.
2. Vakzin nach Anspruch 1, umfassend mindestens eines der Plasmide V1Jns-85A-C2 wie in Fig. 3 definiert, V1Jns-tPA-85B-C1 wie in Fig. 5 definiert und V1Jns-tPA-85C-C1 wie in Fig. 6 definiert.
3. Vakzin nach Anspruch 2, wobei das Plasmid dicistronisch ist und das Plasmid ferner eine zusätzliche
Nukleotidsequenz umfasst, die für ein immunmodulatorisches oder immunstimulatorisches Gen kodiert.
4. Vakzin nach Anspruch 3, wobei die zusätzliche Nukleotidsequenz aus der Gruppe ausgewählt ist, die
aus Nukleotidsequenzen, kodierend für GM-CSF, IL-12, Interferon und ein Mitglied der B7-Familie von
T-Zell-costimulatorischen Proteinen, besteht.
5. Vakzin nach Anspruch 1, wobei der Transkriptionspromotor der Cytomegalovirus-Promotor ist und der
Expressionsvektor ferner die Intron A-Sequenz und den Rinderwachstumshormon-Terminator umfasst.
6. Vakzin nach Anspruch 1, wobei die Nukleotidsequenz ferner für eine Signalsequenz kodiert, die mit dem
Protein funktionsfähig verknüpft ist.
7. Vakzin nach Anspruch 6, umfassend das Plasmid V1Jns-85A-C3 wie in Fig. 4 definiert.
8. Vakzin nach Anspruch 6, wobei die Signalsequenz eine eukaryotische Signalsequenz von dem für humangewebe-spezifischen Plasminogenaktivator kodierenden Gen ist.
9. Vakzin nach Anspruch 8, umfassend das Plamid V1Jns-tPA-85A-C1 wie in Fig. 2 definiert.
10. Plasmid zur Verwendung bei der Herstellung eines DNA-Vakzins zur Immunisierung eines Säugers gegen eine Infektion durch Mycobacterium tuberculosis oder Mycobacterium bovis, wobei das Plasmid mindestens eine DNA-Polynukleotidsequenz, die für ein Mycobacterium tuberculosis-Antigen-85A-Protein, ein Mycobacterium tuberculosis-Antigen-85B-Protein oder ein Mycobacterium tuberculosis-Antigen-85C-Protein kodiert, in funktionsfähiger Verknüpfung mit einem Transkriptionspromotor umfasst.
11. Plasmid nach Anspruch 10, wobei das Plasmid eines der Plasmide V1Jns-85A-C2 wie in Fig. 3 definiert, V1Jns-tPA-85B-C1 wie in Fig. 5 definiert und V1Jns-tPA-85C-C1 wie in Fig. 6 definiert ist.
12. Plasmid nach Anspruch 10, wobei das Plasmid dicistronisch ist und das Plasmid ferner eine zusätzliche
Nukleotidsequenz umfasst, die für ein immunmodulatorisches oder immunstimulatorisches Gen kodiert.
13. Plasmid nach Anspruch 12, wobei die zusätzliche Nukleotidsequenz aus der Gruppe ausgewählt ist,
die aus Nukleotidsequenzen, kodierend für GM-CSF, IL-12, Interferon und ein Mitglied der B7-Familie von
T-Zell-costimulatorischen Proteinen, besteht.
14. Plasmid nach Anspruch 10, wobei der Transkriptionspromotor der Cytomegalovirus-Promotor ist und
das Plasmid ferner die Intron A-Sequenz und den Rinderwachstumshormon-Terminator umfasst.
15. Plasmid nach Anspruch 10, wobei die Nukleotidsequenz ferner für eine Signalsequenz kodiert, die mit
dem Protein funktionsfähig verknüpft ist.
16. Plasmid nach Anspruch 15, wobei das Plasmid V1Jns-85A-C3 wie in Fig. 4 definiert ist.
17. Plasmid nach Anspruch 15, wobei die Signalsequenz eine eukaryotische Signalsequenz von dem für
humangewebe-spezifischen Plasminogenaktivator kodierenden Gen ist.
18. Plasmid nach Anspruch 17, wobei das Plasmid V1Jns-tPA-85A-C1 wie in Fig. 2 definiert ist.
19. Plasmid zur Verwendung bei der Herstellung eines DNA-Vakzins zur Immunisierung eines Säugers gegen eine Infektion durch Mycobacterium tuberculosis oder Mycobacterium bovis wie in irgendeinem der An-
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sprüche 10 bis 18 definiert, wobei der Säuger ein Haustier oder Vieh ist.
Es folgen 14 Blatt Zeichnungen
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Anhängende Zeichnungen
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