Die Bedeutung von VEGF-C und NRP-2 für die
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Aus der Klinik und Poliklinik für Strahlentherapie und Radioonkologie und dem OncoRay – Nationales Zentrum für Strahlenforschung in der Onkologie Arbeitsgruppe: Translationale Radioonkologie und Klinische Strahlentherapie Direktorin: Frau Prof. Dr. med. habil. Mechthild Krause Die Bedeutung von VEGF-C und NRP-2 für die Strahlenresistenz im Prostatakarzinom Dissertationsschrift zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Biomedizin Doctor rerum medicinalium (Dr. rer. medic.) vorgelegt der Medizinischen Fakultät Carl Gustav Carus der Technischen Universität Dresden von Dipl.-Lebensmittelchem. Steffi Liebscher (geb. Haberlau) aus Frankfurt (Oder) Dresden 2017 1. Gutachter: Prof. Dr. Mechthild Krause 2. Gutachter: Prof. Dr. Georg Breier Tag der mündlichen Prüfung: 07.03.2017 gez.: Prof. Dr. Nils Cordes Vorsitzender der Prüfungskommission Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................ VIII 1 Einleitung und Zielstellung.................................................................................. 1 2 Grundlagen ........................................................................................................... 3 2.1 Zelluläre Auswirkungen der Bestrahlung ..................................................................... 3 2.2 Überlebensfördernde Signalwege ............................................................................... 6 2.3 Zellüberlebensstrategien ............................................................................................. 9 2.3.1 Autophagie....................................................................................................... 10 2.3.2 DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur ................................................................. 12 2.3.3 Zellzyklusarrest ................................................................................................ 13 2.4 Reaktionen von Tumoren auf Bestrahlung ................................................................ 14 2.5 Nelfinavir als Akt-Inhibitor ......................................................................................... 15 3 Material und Methoden ...................................................................................... 17 3.1 Material ..................................................................................................................... 17 3.1.1 Zelllinien .......................................................................................................... 17 3.1.2 Reagenzien und Substanzen ........................................................................... 17 3.1.3 Kits .................................................................................................................. 19 3.1.4 Primäre Antikörper ........................................................................................... 19 3.1.5 Sekundäre Antikörper ...................................................................................... 20 3.1.6 siRNA .............................................................................................................. 20 3.1.7 Primer .............................................................................................................. 20 3.1.8 Materialien und Hilfsmittel ................................................................................ 20 3.1.9 Geräte.............................................................................................................. 21 3.1.10 Software .......................................................................................................... 22 3.2 Methoden .................................................................................................................. 22 3.2.1 Zellkultur .......................................................................................................... 22 3.2.2 siRNA-Transfektion .......................................................................................... 23 3.2.3 Bestrahlung...................................................................................................... 24 3.2.4 Koloniebildungsassay ...................................................................................... 24 3.2.5 Autophagischer Flux ........................................................................................ 26 3.2.6 Semiquantitative Proteinbestimmung ............................................................... 27 3.2.7 mRNA-Quantifizierung ..................................................................................... 29 3.2.8 γH2AX Foci-Assay ........................................................................................... 31 IV Inhaltsverzeichnis 3.2.9 Zellzyklusanalyse ............................................................................................. 33 3.2.10 Tierversuch ...................................................................................................... 34 3.2.11 Statistische Auswertung ................................................................................... 37 4 Ergebnisse .......................................................................................................... 39 4.1 Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Strahlenresistenz ...................................... 39 4.1.1 Betrachtung der VEGF-C- und NRP-2-Gehalte in den Zelllinien PC-3, DU145 und LNCaP .......................................................................................... 39 4.1.2 Etablierung der VEGF-C- und NRP-2-siRNA-Transfektionen ........................... 39 4.1.3 Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Klonogenität bestrahlter Zellen ........ 40 4.2 Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf überlebensfördernde Signalwege unter Bestrahlung ............................................................................................................... 42 4.2.1 Aktivierung des Akt-Signalwegs ....................................................................... 43 4.2.2 Aktivierung des ERK1/2-Signalwegs ................................................................ 45 4.3 Untersuchungen zum Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Strahlenresistenz beeinflussende zelluläre und molekulare Prozesse ................................................... 46 4.3.1 Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Autophagie und deren Bedeutung für die Strahlenresistenz .................................................................................. 46 4.3.2 Einfluss von VEGF-C auf die Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen ......... 48 4.3.3 Der Einfluss von VEGF-C auf den Zellzyklus ................................................... 50 4.4 Inhibierung der Aktivierung von Akt durch Nelfinavir ................................................. 52 4.4.1 Einfluss von Nelfinavir auf die Klonogenität in vitro .......................................... 53 4.4.2 Tumorwachstumsverzögerung ......................................................................... 54 4.4.3 Lokale Tumorkontrolle ..................................................................................... 56 5 Diskussion .......................................................................................................... 59 5.1 VEGF-C- und NRP-2-Expression und -Herunterregulierung...................................... 59 5.2 Der Einfluss von VEGF-C auf die Strahlenresistenz .................................................. 59 5.3 Die Funktion von NRP-2 als Co-Rezeptor für VEGF-C bei der Vermittlung von Strahlenresistenz ...................................................................................................... 60 5.4 VEGF-C-abhängige Akt- und ERK1/2-Regulierung unter Bestrahlung ...................... 62 5.5 Der Einfluss der Autophagie auf die Strahlenresistenz .............................................. 62 5.6 Der Einfluss von VEGF-C auf die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur ...................... 63 5.7 Der Einfluss von VEGF-C auf den Zellzyklus ............................................................ 64 V Inhaltsverzeichnis 5.8 Der Einfluss von Nelfinavir auf das Wachstum und auf die Strahlenresistenz von PC-3-Zellen in vitro und in vivo ................................................................................. 65 5.9 Schlussfolgerung und Ausblick ................................................................................. 67 6 Zusammenfassung ............................................................................................. 69 7 Abstract ............................................................................................................... 72 8 Literaturverzeichnis ........................................................................................... 75 9 Abbildungsverzeichnis ...................................................................................... 89 10 Tabellenverzeichnis ........................................................................................... 90 Danksagung ............................................................................................................ 92 Anhang .................................................................................................................... 93 Anlage 1 ........................................................................................................................... 94 Anlage 2 ........................................................................................................................... 96 VI Abkürzungsverzeichnis Akt Proteinkinase B APS Ammoniumpersulfat ATG5 engl. autophagy-related gene 5 Bcl-2 engl. B-cell lymphoma 2 (ein Protein) BSA bovines Serumalbumin ct engl. cycle threshold; Wert, der den Anfang des exponentiellen Wachstums einer Kurve beschreibt DAPI 4‘,6-Diamidin-2-phenylindol ddH2O bidestilliertes Wasser DMSO Dimethylsulfoxid DNA engl. deoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure DSB DNA-Doppelstrangbruch DU145 eine humane Prostatakarzinomzelllinie EDTA Ethylendiamintetraacetat ELISA engl. enzyme-linked immunosorbent assay ERK1/2 engl. extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 FaDu eine humane Pharynxkarzinomzelllinie FITC Fluoresceinisothiocyanat FKS fötales Kälberserum fwd engl. forward, vorwärts γH2AX phosphoryliertes H2AX G Gauge, Maßeinheit für die Größe von Kanülen Gy Gray, SI-Einheit der Energiedosis H2AX ein Protein aus der Gruppe der Histone HIF1α engl. hypoxia-inducible factor 1-alpha HSPG Heparansulfat-Proteoglycane kDa Kilodalton, atomare Masseneinheit LNCaP eine humane Prostatakarzinomzelllinie mRNA engl. messenger RNA N1 eine embryonale Maus-Hypothalamus-Zelllinie NRP-2 Neuropilin-2 p.a. lat. pro analysi, zur Analyse pAkt phosphoryliertes Akt PBS engl. phosphate buffered saline VIII Abkürzungsverzeichnis PC-3 eine humane Prostatakarzinomzelllinie PCR engl. polymerase chain reaction, Polymerase-Kettenreaktion PE engl. plating efficiency, Plattierungseffizienz pH Protonenaktivitätsexponent PI3K engl. phosphoinositide 3-kinase PTEN engl. phosphatase and tensin homolog qRT-PCR engl. quantitative real-time PCR, quantitative Echtzeit-PCR rev engl. reverse, rückwärts rhVEGF-C rekombinantes humanes VEGF-C RIPA engl. radioimmunoprecipitation assay RNA engl. ribonucleic acid, Ribonukleinsäure RT Raumtemperatur (20-25 °C) SDS engl. sodium dodecyl sulfate, Natriumdodecylsulfat SDS-PAGE engl. sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis SF engl. surviving fraction, Überlebensfraktion siATG5 siRNA gegen ATG5 siNRP-2 siRNA gegen NRP-2 siRNA engl. small interferring RNA siSCR engl. scramble, nichtspezifische Kontroll-siRNA siVEGF-C siRNA gegen VEGF-C STAT3 engl. signal transducer and activator of transcription 3 TCD engl. tumour control dose, Tumorkontrolldosis TCP engl. tumour control probability, Tumorkontrollwahrscheinlichkeit TEMED Tetramethylethylendiamin TGTV2-V5 engl. tumour growth time, Tumorwachstumszeit für das 2- bis 5-fache Volumen des Entervolumens VDT engl. volume doubling time, Volumenverdopplungszeit VEGF engl. vascular endothelial growth factor VEGF-C engl. vascular endothelial growth factor C VEGFR engl. vascular endothelial growth factor receptor xg Vielfaches der Erdbeschleunigung g (1 xg ≈ 9,81 m/s2) Desweiteren wurden die gängigen SI-Einheiten / Einheiten und Abkürzungen verwendet. IX 1 Einleitung und Zielstellung Das Prostatakarzinom ist in Deutschland die häufigste Krebsneuerkrankung bei Männern. Einem Bericht des Robert Koch-Instituts zufolge traten im Jahr 2012 63.710 Neuerkrankungen auf, was 25,3 % der Neuerkrankungen aller Tumorentitäten (nichtmelanotischer Hautkrebs ausgenommen) entspricht (Kaatsch et al., 2015). Mit einem Anteil von 20,1 % war das Prostatakarzinom 2012 die dritthäufigste Krebstodesursache. Neben den palliativen Therapien, wie der Androgenablationstherapie (Markiewicz und Hanks, 1991) und der Chemotherapie (Harrington und Smith, 2008) beziehungsweise dem beobachtenden Abwarten, kommen vor allem bei Patienten mit diffusem oder weniger differenziertem Tumorgewebe die kurativen Therapien radikale Prostatektomie und Bestrahlung zum Einsatz. Diese führen zu sehr guten Ergebnissen für die lokale Tumorkontrolle und für das Überleben. Delaney et al. (2005) schätzen, dass die Bestrahlung für 60 % der Patienten mit Prostatakrebs innerhalb des Krankheitsverlaufs eine geeignete Therapie darstellt. Allerdings ist, wie bei der Operation auch, dabei das Risiko eines Rezidivs für fortgeschrittene Tumoren (T3-, T4-Stadium) im Gegensatz zu Tumoren in früheren Stadien (T1-, T2-Stadium) immer noch relativ hoch (Delaney et al., 2005; Pommier et al., 2016). Nach Kaatsch et al. (2015) befinden sich bei der Erstdiagnose bereits 25 % der Tumoren im T3- oder T4-Stadium. Eine aktuelle Studie empfiehlt für die Strahlentherapie bei fortgeschrittenen Tumoren eine Kombination mit einer Androgenablationstherapie vor und während der Bestrahlung (Pisansky et al., 2015). Hierbei wurden eine Lokalrezidivrate von 6 % und ein Gesamtüberleben von 66 % erreicht. Bei der Therapie von Tumoren in frühen Stadien hingegen bringt die Androgenablationstherapie zusätzlich zur alleinigen Strahlentherapie keinen Vorteil (Falchook et al., 2016). In dieser Studie lag bei beiden Behandlungsansätzen die Gesamtüberlebensrate bei rund 78 %. Anhand dieser Daten wird deutlich, dass eine hohe Dringlichkeit zur Verbesserung der Strahlentherapie vor allem für fortgeschrittene Tumoren besteht. Ein Ansatz hierfür ist die Kombination der Bestrahlung mit anderen molekularen Therapien. Ziel dabei ist es, bestimmte Zielproteine zu blockieren, um die Strahlensensibilität der Prostatakarzinomzellen zu erhöhen. Bereits seit einigen Jahren wird hierfür nach möglichen Biomarkern, Zielproteinen sowie Substanzen gesucht. Eine Reihe solcher Substanzen und Biomarker wurde bereits in präklinischen und klinischen Studien, teilweise mit vielversprechenden Ergebnissen, getestet (Dal Pra et al., 2016). In Hinblick auf die individuellen biologischen Unterschiede, die jeder Tumor aufweist, werden dementsprechend unterschiedliche Therapieansätze zur personalisierten Behandlung benötigt. Nach Dal Pra et al. (2016) wurden bisher Untersuchungen zur Blockade spezifischer Proteine innerhalb des 1 1 Einleitung und Zielstellung Androgen-Signalwegs, der Hypoxie-regulierten Signalwege, des DNA-SchadensantwortSignalwegs und abnormer extra- und intrazellulärer Signalwege in Prostatakarzinomzellen durchgeführt. Ein potentielles Target könnte auch die Blockade des VEGF-C/NRP-2/Akt-Signalwegs (VEGF-C – vascular endothelial growth factor C; NRP-2 – Neuropilin 2; Akt – Proteinkinase B) sein. Im Prostatakarzinom sind die Konzentrationen von VEGF-C und Neuropilin-2 im Vergleich zu normalen Prostatazellen erhöht (Jennbacken et al., 2005; Goel et al., 2012). Neuropilin-2 ist ein Rezeptorprotein und wirkt progressiv auf die Tumorgenese (Pellet-Many et al., 2008). VEGF-C ist ein NRP-2-Ligand und somit ebenfalls ein progressiver Faktor für die Tumorgenese. Die Ergebnisse von Muders et al. (2009) zeigen eine Aktivierung von Akt (Phosphorylierung zu pAkt) über die VEGF-C/NRP-2-Achse, welche mittels oxidativen Stress durch H2O2 aktiviert wurde. Dieser Signalweg führte in den getesteten Prostatakarzinomzelllinien unter den genannten Bedingungen zum Zellüberleben. Anai et al. (2007) vermuten, dass pAkt in Prostatakarzinomzellen auch unter Bestrahlung protektiv wirkt. Die Erkenntnisse von Muders et al. (2009) dienen als Grundlage für diese Arbeit. Im Rahmen dieser Dissertation wurden drei Fragestellungen untersucht. (1) Wird in Prostatakarzinomzelllinien Strahlenresistenz über den VEGF-C/NRP-2/AktSignalweg vermittelt? (2) Welche Strahlenresistenz vermittelnden Mechanismen werden durch VEGF-C und NRP-2 reguliert? (3) Führt eine Blockade der Akt-Aktivierung unabhängig von VEGF-C und NRP-2 zu einem strahlensensibilisierenden Effekt? 2 2 Grundlagen 2.1 Zelluläre Auswirkungen der Bestrahlung Ionisierende Strahlung, unter anderem die zur Therapie häufig angewandte Röntgenstrahlung, führt in Zellen zu Schädigungen von Makromolekülen wie Proteinen, Nukleinsäuren und Lipiden (Breen und Murphy, 1995; Laval, 1996; Herrmann et al., 2006). Die Ionisation kann dabei direkt im Zielmolekül oder indirekt über sekundäre Radikalreaktionen erfolgen (Herrmann et al., 2006). Da ein Großteil der Moleküle in der Zelle Wassermoleküle sind, kommt es bei der Bestrahlung verstärkt zur Ionisation dieser Teilchen (Radiolyse des Wassers). Hierbei entstehen zum Teil hochreaktive Sauerstoffspezies, welche ihre Reaktionsenergie auf andere Moleküle übertragen können und diese somit indirekt ionisieren (Breen und Murphy, 1995; Herrmann et al., 2006). Breen und Murphy (1995) fassten die Reaktionen der Radiolyse des Wassers folgendermaßen zusammen. In der initialen Hauptreaktion werden nach der Energieübertragung auf ein Wassermolekül ein ionisches H2O+-Radikal und ein Elektron, welches von einer Hydrathülle umgeben ist, gebildet (siehe Reaktion (1)). Das H2O+-Radikal kann im Weiteren mit einem Wassermolekül ein Hydronium-Ion (H3O+) und ein Hydroxyl-Radikal (●OH) bilden (2). Das Elektron kann mit einem Wassermolekül zu einem Wasserstoff-Radikal (H●) und einem Hydroxyl-Ion (OH-) reagieren (3). Ein sekundärer Prozess ist die homolytische Spaltung des Wassers zum Wasserstoff-Radikal (H●) und Hydroxyl-Radikal (●OH) (4). H2O H2O●+ + e-(aq) H2O●+ + H2O H2O + e-(aq) H2O H2O* H3O+ + ●OH H● + OHH● + ●OH (1) (2) (3) (4) Die Schädigung der DNA durch ionisierende Strahlung hat wahrscheinlich den größten Einfluss auf das Zellüberleben (Ross, 1999). Die Reaktionsprodukte der Radiolyse des Wassers, vor allem das hochreaktive Hydroxyl-Radikal (●OH), können zum Beispiel mit den Basen und Zuckermolekülen der DNA reagieren. Wird ein solcher Schaden nicht repariert, entsteht ein DNA-Einzelstrangbruch (Breen und Murphy, 1995). Treten mehrere nicht reparierte DNA-Einzelstrangbrüche nahe beieinander an beiden DNA-Strängen auf, kann es zur Bildung von DNA-Doppelstrangbrüchen kommen (Breen und Murphy, 1995), deren Reparatur im Gegensatz zu den eben genannten Schäden komplexer und nicht immer erfolgreich ist. 3 2.1 Zelluläre Auswirkungen der Bestrahlung Die meisten DNA-Schäden werden innerhalb kurzer Zeit repariert. Missglückt dies jedoch, führen sie zu Mutationen oder zum Zelltod (Ross, 1999). Die Reparatur von DNADoppelstrangbrüchen ist schwieriger als die der anderen DNA-Schäden. DNA- Einzelstrangbrüche treten zu rund 1000 und Basenschäden zu mehr als 1000 Schäden pro Zelle nach Bestrahlung mit 1 Gy auf, DNA-Doppelstrangbrüche hingegen deutlich seltener mit rund 20-40 Schäden Doppelstrangbrüche von pro allen Zelle. Arten Dennoch von korreliert die Anzahl der DNA-Schäden am stärksten DNA- mit der durch die Zelltodhäufigkeit (Ross, 1999; Joiner und van der Kogel, 2009). Die Strahlenempfindlichkeit der Zellen wird wesentlich beeinflusst Sauerstoffkonzentration während der Bestrahlung – bezeichnet als Sauerstoffeffekt. Durch den Sauerstoff werden bevorzugt Hydroperoxyl-Radikale (HOO●) gebildet. Diese besitzen eine geringere Reaktivität als das Hydroxyl-Radikal (●OH), können dadurch jedoch weiter diffundieren, um kritische Moleküle zu schädigen (Herrmann et al., 2006). Das Ziel der Strahlentherapie ist die Verhinderung der Proliferation oder die Abtötung von Tumorzellen (Galluzzi et al., 2007). In beiden Fällen kommt es zum sogenannten klonogenen Zelltod. Dieser wird durch verschiedene Mechanismen erreicht: durch den Mitosetod, durch Apoptose oder die Differenzierung von Tumorzellen (Herrmann et al., 2006). Für die Zellteilung verfügen die Zellen über ein spezielles Zellzyklus-Kontrollsystem. Kommt es bei der DNA-Replikation aufgrund eines strahleninduzierten DNA-Schadens an einer Stelle zu einem Fehler, wird der Zellzyklus an dem entsprechenden Checkpoint angehalten und der Fehler behoben. Funktionieren diese Checkpoints nicht, kommt es zu einer fehlerhaften Mitose. Liegen möglicherweise in der Zelle außerdem Mutationen vor, die einen Zelltod durch Apoptose infolge der fehlerhaften Mitose unmöglich machen, wird sich die Zelle bei der nächsten Zellteilung möglicherweise asymmetrisch teilen. Hierbei entstehen aneuploide Zellen (numerische Chromosomenaberration). Diese können entweder zum Selektionsvorteil für die Zelle werden und zum Tumorwachstum beitragen (Andreassen et al., 1996), oder die Zellen sind auf Dauer nicht überlebensfähig (Herrmann et al., 2006). Möglicherweise bleiben diese Zellen vorerst morphologisch intakt und können wenige Zellteilungen durchlaufen. Danach tritt jedoch ein Mangel an essentiellen Proteinen auf, die aufgrund der strahleninduzierte Mutation nicht nachgebildet werden können. Folglich sterben die Zellen am sogenannten Mitosetod (mitotische Katastrophe) (Herrmann et al., 2006). Die Apoptose kann ebenfalls durch ionisierende Strahlung induziert werden. Sie steht aber im Vergleich zum Mitosetod im Hintergrund. Dewey et al. fassten in ihrem Review von 1995 mehrere quantitative und semiquantitative in vitro-Studien zusammen und zeigten, dass Apoptose nicht mit dem klonogenen Überleben bestrahlter Zellen korreliert. Aus in vivo4 2 Grundlagen Studien zitierte Ross (1999) wiederum, dass der klonogene Zelltod nach Bestrahlung eher durch Apoptose als durch den Mitosetod verursacht wird. Wie bereits oben erwähnt, können in pro-apoptotischen Signalwegen Mutationen vorliegen, die diesen Zelltod unmöglich machen. Eines der wichtigsten pro-apoptotischen Proteine, auch als „Wächter“ des Genoms bezeichnet, ist der Transkriptionsfaktor p53 (Lane, 1992). Dieser beeinflusst die Apoptose, die DNA-Reparatur, den Zellzyklus und die Seneszenz (permanenter Zellzyklusarrest) (Eriksson und Stigbrand, 2010). Kommt es durch Einwirkung ionisierender Strahlung zum DNA-Schaden, wird über p53 der G1-Arrest eingeleitet. Anschließend erfolgt die DNA-Reparatur oder, sofern erfolglos, Zelltod durch Apoptose. Liegt jedoch eine p53-Mutation vor, können weder ein G1-Arrest noch eine DNA-Reparatur erfolgen. Stattdessen folgen entweder das Überleben oder der Mitosetod der entstandenen aneuploiden Zellen (Kastan et al., 1991; Lane, 1992; Ianzini et al., 2006). Die p53-Mutation tritt in humanen Tumoren unterschiedlicher Entitäten häufig auf (Hollstein et al., 1991). Van Veldhuizen et al. (1993) untersuchten hierzu 33 Prostatatumoren, wobei 26 Tumoren eine p53-Mutation aufwiesen. In Bezug auf die Strahlentherapie konnte nachgewiesen werden, dass eine p53-Mutation zur Progression von Prostatakarzinomen beiträgt (Effert et al., 1992). Die für diese Arbeit ausgewählten Zelllinien PC-3 und DU145 weisen ebenfalls eine p53-Mutation mit Funktionsverlust auf (Isaacs et al., 1991). Die Zelllinie LNCaP hingegen besitzt ein funktionelles p53 (Isaacs et al., 1991), jedoch stellten Chiu et al. (2012) nach Bestrahlung keinen signifikanten Anstieg der Apoptose in dieser Zelllinie fest, was ebenfalls die oben erwähnte Aussage unterstützt, dass Apoptose nach Bestrahlung eine untergeordnete Rolle spielt (Dewey et al., 1995). Ionisierende Strahlung kann weiterhin die Differenzierung von Zellen induzieren oder beschleunigen. Somit entstehen aus zuvor klonogenen Zellen sofort nach Bestrahlung oder nach wenigen Teilungen terminale Funktionszellen ohne weiteres Proliferationspotential (Herrmann et al., 2006). Eine weitere Folge der Bestrahlung ist die Induktion eines Zellzyklusarrests. Bei einem reversiblen Arrest ist eine anschließende Tumorprogression möglich. Wird jedoch ein permanenter Zellzyklusarrest (Seneszenz) durch die Bestrahlung erreicht, kommt es zum Verlust der Klonogenität, da dieser mit einer Zelldifferenzierung, Alterung oder Zellschädigung assoziiert ist (Joiner und van der Kogel, 2009). Seneszente Zellen können dennoch das Tumorwachstum beeinflussen, da sie immer noch metabolisch aktiv sein können und tumorunterdrückende und tumorfördernde Faktoren sezernieren können (Eriksson und Stigbrand, 2010). Auch für die Seneszenz spielt p53 eine Rolle. Lehmann et al. (2007) führten in vitroVersuche mit Prostatakarzinomzelllinien (unter anderem DU145 und LNCaP) durch. Dabei 5 2.2 Überlebensfördernde Signalwege konnten sie nachweisen, dass durch eine p53-Mutation die strahleninduzierte Seneszenz verringert ist. Zusammengefasst spielen vier wesentliche Mechanismen für den klonogenen Zelltod nach Einwirkung ionisierender Strahlung eine Rolle – der Mitosetod, die Apoptose, die Differenzierung sowie die Seneszenz. Zur Messung des klonogenen Zellüberlebens in vitro wird der sogenannte Koloniebildungsassay durchgeführt, bei dem nicht unterschieden wird, ob Zelltod oder Seneszenz zum klonogenen Zelltod geführt haben (Galluzzi et al., 2007). Bei diesem Assay werden Zellen vereinzelt ausgesät und bestrahlt. Nach einer zelllinienspezifischen Inkubationszeit (abhängig von ihrer Verdopplungszeit) werden die Kolonien erfasst, die mindestens 50 Zellen aufweisen (Herrmann et al., 2006). Da dafür eine bestimmte Anzahl an Zellteilungen notwendig ist, kann davon ausgegangen werden, dass die Zellen dieser Kolonien durch die Bestrahlung ihre Klonogenität nicht verloren haben. 2.2 Überlebensfördernde Signalwege In vorhergehenden Untersuchungen innerhalb unserer Arbeitsgruppe wurde gezeigt, dass in Prostatakarzinomzellen nach H2O2-induziertem oxidativen Stress über VEGF-C (vascular endothelial growth factor C) Zellüberleben vermittelt wird (Muders et al., 2009). Die Signalweiterleitung erfolgt hierbei über NRP-2 (Neuropilin-2) und Akt (Proteinkinase B). Ausgehend von diesen Erkenntnissen wurde in dieser Arbeit unter anderem untersucht, ob dieser Signalweg auch nach Induktion oxidativen Stresses durch ionisierende Bestrahlung für das Zellüberleben eine Rolle spielt. Bei VEGF-C handelt es sich um ein extrazelluläres Glycoprotein der VEGF-Familie, dessen Signaltransduktion über hochaffine Tyrosinkinase-Rezeptoren erfolgt (Byrne et al., 2005). VEGF-C wurde erstmals 1996 von Joukov et al. in Endothelzellen, in welchen es die Angiogenese (Blutgefäßbildung) und Lymphangiogenese (Lymphgefäßbildung) reguliert, nachgewiesen. Beide Prozesse sind in Tumoren von Bedeutung, da die endokrine oder parakrine Sekretion die Angiogenese die Nährstoff- und Sauerstoffversorgung von Tumoren ab einer Größe von 2-3 mm3 sicher stellt (Byrne et al., 2005) und die Lymphangiogenese das Wachstum und die Metastasierung von Tumoren ermöglicht (Jeltsch et al., 1997). VEGF-C bindet als Dimer an verschiedene Rezeptoren, darunter an die VEGF-Rezeptoren VEGFR-3 und VEGFR-2, wobei die Affinität zu VEGFR-3 höher als die zu VEGFR-2 ist (Kukk et al., 1996; Mäkinen et al., 2001; Chen et al., 2012). VEGF-C bindet dabei an die Immunglobulin-ähnlichen (Ig-like) Domänen 1 und 2 von VEGFR-3 beziehungsweise 2 und 3 von VEGFR-2. Die Bindung von VEGF-C zu VEGFR-3 ist Heparansulfat-abhängig (ein Glycosaminoglycan der Gruppe der Heparine, welches die Bindung und Aktivierung einiger vaskulärer Wachstumsfaktoren unterstützt) (Yin et al., 2011). Das Heparansulfat ist dabei an 6 2 Grundlagen einem Proteoglycan gebunden, welches ein Co-Rezeptor für die Aktivierung von VEGFR-3 sein könnte (Chen et al., 2012). Durch die Bindung des Liganden an VEGFR-3 oder VEGFR-2 wird eine Dimerisierung zum VEGFR-3-Homodimer beziehungsweise zum VEGFR-3/VEGFR-2-Heterodimer induziert, durch welche es nachgeschaltet zur Aktivierung (Phosphorylierung) von ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinases 1 and 2) beziehungsweise Akt über PI3K (phosphoinositide 3-kinase) kommt (Deng et al., 2015). Die Aktivierung von Akt durch PI3K kann wiederum durch den Tumorsuppressor PTEN (phosphatase and tensin homolog) blockiert werden (Haas-Kogan et al., 1998; Stambolic et al., 1998). VEGF-C bindet weiterhin an den Co-Rezeptor NRP-2, welcher keine zytoplasmatische Domäne zur Signaltransduktion besitzt (Byrne et al., 2005). Die Signaltransduktion erfolgt daher über die Assoziation mit VEGFR-2 oder VEGFR-3 (Favier et al., 2006; Kärpänen et al., 2006). Kärpänen et al. (2006) vermuten, dass die Interaktion von VEGF-C und NRP-2 durch Heparansulfat-Proteoglycane (HSPG) verstärkt wird. Favier et al. (2006) zeigten einen signalverstärkenden Einfluss von NRP-2 auf die VEGF-C/VEGFR-Signaltransduktion. Nach Caunt et al. (2008) und Deng et al. (2015) ist dieser Einfluss jedoch nur gering. Die Signaltransduktion von VEGF-C ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt. Abbildung 1: Signaltransduktion von VEGF-C. Abbildung modifiziert nach Chen et al. (2012) und inhaltlich adaptiert an Gerber et al. (1998), Haas-Kogan et al. (1998), Stambolic et al. (1998), Favier et al. (2006), Kärpänen et al. (2006), Wang et al. (2010), Yin et al. (2011a), Deng et al. (2015). 7 2.2 Überlebensfördernde Signalwege Wie bereits oben erwähnt, wird über die beschriebenen Signalweiterleitungen die Tumorgenese durch die Angiogenese und Lymphangiogenese begünstigt. Weiterhin wird durch ERK1/2 mit nachfolgender Induktion antiapoptotischer Proteine und des G1-Arrests das Zellüberleben und die Proliferation vermittelt (Bonni et al., 1999; Boucher et al., 2000). Akt schützt die Zelle ebenfalls vor der Induktion der Apoptose und vor dem mitotischen Zelltod (Gerber et al., 1998; Mäkinen et al., 2001; Yamaguchi und Wang, 2001; Skvortsova et al., 2008). Durch Akt kommt es zur Zellzyklusprogression, zum Wachstum und zur Migration von Zellen (Thakker et al., 1999; Mäkinen et al., 2001). Akt und ERK1/2 können durch Stress, wie zum Beispiel ionisierende Strahlung, aktiviert werden und zur Strahlenresistenz führen (Contessa et al., 2002; Gupta et al., 2002; Shonai et al., 2002; Yazlovitskaya et al., 2008; Marampon et al., 2014). Außerdem liegen VEGF-C, NRP-2 und Akt in einigen Tumoren höher exprimiert vor und werden in Bezug auf die Strahlentherapie zum Teil als mögliche prognostische Faktoren beschrieben. Beispielsweise fanden im Vergleich zum normalen Prostatagewebe Tsurusaki et al. (1999) erhöhte Gehalte an VEGF-C-mRNA und Jennbacken et al. (2005) erhöhte VEGF-CProteingehalte und eine erhöhte VEGFR-3-Expression in humanen Prostatakarzinomen, bei denen Lymphknotenmetasen vorhanden waren. Trojan et al. (2006), Yang et al. (2006) sowie Kostis et al. (2014) zeigten in Patientenstudien, dass die VEGF-C-Expression im Prostatatumorgewebe mit fortschreitendem Grad zunimmt. Aus einer Patientenstudie zur strahlentherapeutischen Behandlung von Blasenkarzinomen mit einer Nachbeobachtungszeit von 15 Jahren ist bekannt, dass nach transurethraler Resektion mit anschließender Strahlentherapie ein erhöhter VEGF-C-Gehalt mit einem schlechteren Gesamtüberleben korreliert (Keck et al., 2015). Auch der NRP-2-Gehalt ist in Prostatakarzinomen im Vergleich zu normalen Prostatazellen erhöht und korreliert mit dem Stadium der Erkrankung (Goel et al., 2012). In der bereits angesprochenen Patientenstudie zum Blasenkarzinom von Keck et al. (2015) ergab sich eine geringe, jedoch keine signifikante Korrelation zwischen der NRP-2-Expression und dem Gesamtüberleben. Eine Akt-Überexpression, wie sie in vielen Tumoren beobachtet wird, in Prostatakarzinomen zu 45-55 %, kann eine Folge einer Mutation mit Funktionsverlust des Tumorsuppressors PTEN sein (Altomare und Testa, 2005). Diese Mutation tritt in vielen Tumoren auf. Beispielsweise untersuchten Fallahabadi et al. (2016) 21 Prostatatumoren, von denen 11 Tumoren kein funktionelles PTEN aufwiesen. Die Akt-Überexpression kann in verschiedenen Tumoren mit dem zunehmendem Stadium korrelieren, was jedoch nicht in jedem Fall beobachtet werden konnte (Altomare und Testa, 2005). Gupta et al. (2002) konnten für KopfHals-Karzinomzellen in vitro nachweisen, dass eine Blockade von Akt eine Strahlensensibilisierung zur Folge hat. Innerhalb einer Patientenstudie zu Kopf-Hals8 2 Grundlagen Tumoren wurde von Freudlsperger et al. (2015) der pAkt-Status primär oder adjuvant bestrahlter Patienten ausgewertet. Hierbei zeigte sich eine signifikante Korrelation der AktAktivierung am Serin 473 (aber nicht am Threonin 308; Phosphorylierung an beiden Stellen ist möglicherweise für eine vollständige Aktivierung nicht nötig (Tsurutani et al., 2006)) mit dem Gesamtüberleben beziehungsweise dem progressionsfreien Überleben. Die Autoren dieser Studie leiteten aus ihren Ergebnissen ab, dass pAkt (Ser473) als prognostischer Biomarker für den Therapieerfolg der Bestrahlung dienen kann. Zum gleichen Ergebnis kamen Gupta et al. (2002) in ihrer in vitro-Studie und erkannten PI3K als potentielles Therapietarget. In einer Patientenstudie mit 74 Prostatakarzinompatienten fanden Malik et al. (2002), dass ERK1/2 im Gegensatz zu Akt im Prostatatumorgewebe im Vergleich zum Normalgewebe nicht überexprimiert ist. Der aktivierte Status (pERK1/2) ist im Tumor sogar geringer als im Normalgewebe und nimmt mit fortgeschrittenem Stadium ab (Malik et al., 2002). Dennoch ist ERK1/2 für die Strahlentherapie relevant, da auch dieses Protein durch Bestrahlung aktiviert werden (jedoch nicht in jeder Zelllinie) und Strahlenresistenz vermitteln kann, wie es in vitro beispielsweise für Darm-, Leukämie- und gynäkologische Karzinomzelllinien nachgewiesen wurde (Hosseinimehr et al., 2004; Carón et al., 2005; Appukuttan et al., 2014; Marampon et al., 2014). In Blasenkarzinomzellen hingegen konnte kein Einfluss von pERK1/2 auf die Strahlenresistenz gefunden werden (Gupta et al., 2001). 2.3 Zellüberlebensstrategien Die unter Abschnitt 2.2 betrachteten Proteine können Prozesse regulieren, die das Überleben der Zelle unter Stressbedingungen sichern. So ist für Prostatakarzinomzelllinien bekannt, dass unter Chemotherapeutikum Stress, Docetaxel, vermittelt durch das die zellüberlebensfördernde Zellteilung Autophagie hemmende über die VEGF-C/NRP-2-Achse aktiviert wird (Stanton et al., 2013a, 2013b). In den Untersuchungen von Stanton et al. (2013a) erfolgte die Signalweiterleitung allerdings nicht über Akt. Akt kann dennoch, sowie auch ERK1/2 an der Regulation der Autophagie beteiligt sein (Aoki et al., 2007). Für Kopf-Hals- und Blasenkarzinomzelllinien wurde gezeigt, dass Akt zur Reparatur strahleninduzierter DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) beiträgt (Fokas et al., 2012). Das DSBinduzierte Akt hat weiterhin die Funktion, den Zellzyklusarrest zu inhibieren, indem es das ebenfalls durch DSB-induzierte und bereits in Abschnitt 2.1 besprochene p53 blockiert (Xu et al., 2012). Akt trägt somit zur Strahlenresistenz der Zellen bei (Fokas et al., 2012; Xu et al., 2012). Für Gliomzellen sowie für die Prostatakarzinomzelllinien LNCaP und DU145 wurde gezeigt, dass ERK1/2 unter Bestrahlung die DNA-Einzel- und Doppelstrangbruchreparatur positiv 9 2.3 Zellüberlebensstrategien reguliert (Yacoub et al., 2003; Golding et al., 2009). ERK1 wird weiterhin benötigt für den Durchgang der Zellzyklusphase G2/M und ERK2 für den G1-Durchgang (Liu et al., 2004). 2.3.1 Autophagie Bei der Autophagie (griech. Selbstverdau) werden zytoplasmatische Komponenten, einschließlich langlebiger Proteine und Zellorganellen mit dem Ziel des Erhalts der zellulären Homöostase abgebaut. Autophagie läuft immer in geringem Maße in Zellen ab (basale Autophagie), wird aber durch extrazellulären Stress, wie zum Beispiel Bestrahlung, welche diverse Zellschäden verursacht, verstärkt induziert (Paglin et al., 2001; Zois und Koukourakis, 2009; Mizushima et al., 2010). Somit ist die Autophagie eine Möglichkeit eines Überlebensmechanismus unter Stressbedingungen. Es existieren unterschiedliche Formen der Autophagie. In dieser Arbeit wurde die Makroautophagie betrachtet. Zur Vereinfachung wird hierfür nachfolgend nur der Begriff Autophagie verwendet. Die Autophagie läuft in mehreren Etappen ab. Im ersten Schritt, der Nucleation, wird eine Isolationsmembran (oder Phagophor) als Doppelmembran aus Membranen anderer Zellorganellen gebildet. Beteiligt sind dabei die Membranen des rauen Endoplasmatischen Retikulums, der Mitochondrien und Endosomen, die Plasmamembran und Mitochondriumassoziierte Membranen (Dunn, 1990; Lamb et al., 2013). Bestandteile der Isolationsmembran sind in diesem Schritt ein ATG12-ATG5-ATG16-Komplex (ATG = autophagy-related gene), welcher mit Hilfe weiterer ATG-Proteine gebildet wird, sowie LC3-II, welches über LC3-I aus LC3 posttranslational mit Hilfe verschiedener ATG-Proteine gebildet wird, und ein Klasse III-PI3K-Komplex, welcher aus einer Reihe von Proteinen, darunter Beclin 1, ATG9 und verschiedenen Kinasen, besteht (Kabeya et al., 2000; Zois und Koukourakis, 2009). Der Schritt der Nucleation kann durch ATG-siRNAs, zum Beispiel siATG5, blockiert werden (Apel et al., 2008; Kim et al., 2008; Mizushima et al., 2010). Des Weiteren inhibieren bei der Nucleation Akt über mTOR sowie p53 die Autophagie; ERK1/2 wirkt Autophagie induzierend (Tasdemir et al., 2008; Zois und Koukourakis, 2009). Bei der anschließenden Initialisierungsphase elongiert die Membran mit Hilfe verschiedener ATGProteine und expandiert zum Autophagosom, wobei zytoplasmatisches Material (Proteine, Organellen, etc.) eingeschlossen werden (Mizushima et al., 2010; Lamb et al., 2013). Danach fusioniert die äußere Membran des Autophagosoms mit einem Lysosom, wodurch das Autolysosom entsteht. Die Fusion kann zum Beispiel mit der Substanz Bafilomycin A1 verhindert werden (Yamamoto et al., 1998). Innerhalb des Autolysosoms werden die innere Membran des Autophagosoms und die enthaltenen zytoplasmatischen Komponenten abgebaut. Die hierbei entstehenden Aminosäuren, Fettsäuren und andere kleine Moleküle 10 2 Grundlagen werden in das Zytoplasma zurück überführt, sodass sie von der Zelle zur Proteinsynthese oder zur Energieproduktion wiederverwendet werden können (Mizushima et al., 2010). Der beschriebene Mechanismus ist in Abbildung 2 dargestellt. Abbildung 2: Schematische Darstellung der Autophagie. Die Abbildung ist erstellt nach den Ausführungen in Dunn (1990), Yamamoto et al. (1998), Levine und Yuan (2005), Tasdemir et al. (2008), Zois und Koukourakis (2009), Mizushima et al. (2010) und Lamb et al. (2013). Wie oben bereits erwähnt, kann Autophagie zum Zellüberleben unter Stressbedingungen beitragen. Beispielsweise fanden Lomonaco et al. (2009) für Gliomzellen, dass strahleninduzierte Autophagie zur Strahlenresistenz beiträgt. In derselben Studie sowie in einer Studie mit Rektumkarzinomzellen beziehungsweise Brustkarzinomzellen wurde gezeigt, dass Autophagie eher in strahlenresistenten Zellen durch Bestrahlung induziert wird und in diesen Zellen somit einen größeren Beitrag zur Strahlenresistenz hat als in strahlensensiblen Zellen (Apel et al., 2008; Lomonaco et al., 2009; Chaachouay et al., 2011). Andere Studien haben hierzu gegensätzliche Ergebnisse gebracht. So haben Anbalagan et al. (2012) bei Untersuchungen an einer renalen strahlenresistenten Karzinomzelllinie nach Bestrahlung keinen signifikanten Anstieg der Autophagie und keine Korrelation mit der Strahlenresistenz festgestellt. Weiterhin zeigte die Studie von Kim et al. (2011), in der murine 11 2.3 Zellüberlebensstrategien hämatopoetische Progenitorzellen untersucht wurden, dass Autophagie zwar das klonogene Überleben nach Bestrahlung verbessert, die Autophagie jedoch nicht durch die Bestrahlung induziert wird. Für diese Versuche wurde Autophagie durch die Substanz Carbamazepin induziert. Es gibt weitere Studien, die belegen, dass Autophagie nicht zum Zellüberleben führt, sondern im Zusammenhang mit dem Zelltod beobachtet wird. So wurde für Lungenkarzinomzellen und für die Prostatakarzinomzelllinie PC-3 gezeigt, dass strahleninduzierte Autophagie mit einem verminderten klonogenen Überleben assoziiert ist (Cao et al., 2006; Kim et al., 2008; He et al., 2012). Somit scheint Autophagie in Abhängigkeit von der Zelllinie entweder zum Zellüberleben oder zum Zelltod zu führen. Dazu leiten Levine und Yuan (2005) in ihrem Review aus mehreren Studien ab, dass Autophagie parallel zur Apoptose auftreten und diese möglicherweise auslösen kann, jedoch selbst nicht zum Zelltod führt. Die innerhalb eines Zeitintervalls abgelaufene Autophagie kann praktisch über die Bestimmung des LC3-II-Umsatzes mittels Western Blot erfolgen, da die Menge an LC3-II mit der Anzahl der Autophagosomen korreliert (Kabeya et al., 2000). LC3-II ist in der inneren und äußeren Membran des Autophagosoms enthalten, wobei nur das LC3-II der inneren Membran im Autolysosom abgebaut wird (Kabeya et al., 2000; Mizushima und Yoshimori, 2007). Da somit ein Teil des LC3-II recycelt wird, muss die Menge an LC3-II vor der Fusion mit dem Lysosom und dem Abbau erfasst werden. Die Fusion kann mit Proteaseinhibitoren, wie dem Bafilomycin A1, erfolgen. Es werden dann die LC3-II-Gehalte der Proben mit beziehungsweise ohne Proteaseinhibitorzugabe verglichen (Mizushima und Yoshimori, 2007). 2.3.2 DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur Für bestimmte unter Abschnitt 2.2 genannte Proteine wurde weiterhin ein Einfluss auf die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur nachgewiesen. So zeigten Kesler et al. (2014), dass in normalen lymphatischen Endothelzellen mit erhöhtem VEGF-C-Gehalt durch Bestrahlung mehr DNA-Doppelstrangbrüche induziert werden. Für Akt haben Fokas et al. (2012) ermittelt, dass dieses durch DNA-Doppelstrangbrüche aktiviert wird und die DNA-Reparatur fördert. Als Surrogatmarker für die Bestimmung des Ausmaßes der DNA-Doppelstrangbruch (DSB)Reparatur wird γH2AX genutzt. Nach der Entstehung eines DSBs, werden innerhalb kurzer Zeit DNA-Schadenssensoren an den DSB rekrutiert und aktiviert. Es folgt daraufhin eine Aktivierung einer Vielzahl von Substraten, darunter hunderter bis tausender H2AX-Moleküle pro DSB im Chromatin, das den DSB umgibt (Celeste et al., 2003). Das Histon H2AX ist eine spezifische Variante des Histons H2A, welches nach der Aktivierung durch Phosphorylierung am Ser139 als γH2AX bezeichnet wird (Rogakou et al., 1998). Das Maximum der H2AX- 12 2 Grundlagen Aktivierung ist 10 bis 30 Minuten nach Bestrahlung erreicht (Rogakou et al., 1998; MacPhail et al., 2003). Das γH2AX ist dann für die Rekrutierung weiterer Reparaturproteine essentiell (Paull et al., 2000; Celeste et al., 2003). Nach der DSB-Reparatur wird γH2AX durch einen Phosphatase-Komplex dephosphoryliert, was der Zelle nach dem Zellzyklusarrest zur Schadensreparatur den Wiedereintritt in den Zellzyklus ermöglicht (Chowdhury et al., 2005; Keogh et al., 2006). γH2AX kann nach einer Antikörperreaktion mikroskopisch mit hoher Sensitivität detektiert werden (MacPhail et al., 2003). Dabei ergibt jeder DSB einen sichtbaren γH2AX-Focus, sodass die Auswertung quantitativ erfolgen kann (Sedelnikova et al., 2002). Innerhalb von 24 Stunden nach Bestrahlung wird ein Großteil der DSBs repariert. Die Quantifizierung der residuellen γH2AX-Foci nach 24 Stunden ermöglicht häufig einen Rückschluss auf die Strahlensensibilität der untersuchten Zellen, da die Anzahl der residuellen γH2AX-Foci mit dem klonogenen Überleben korreliert (Banáth et al., 2004; Menegakis et al., 2009). Diese Nachweismethode birgt jedoch auch Unsicherheiten. Zum Beispiel ist es möglich, dass γH2AX-Foci auch nach der DSB-Reparatur bestehen bleiben und somit zum Zeitpunkt der Quantifizierung nicht unbedingt einen physikalischen DSB anzeigen (Banáth et al., 2004; Mirzayans et al., 2006). Dies würde zu Fehleinschätzungen bezüglich der Strahlensensibilität der untersuchten Zellen führen. 2.3.3 Zellzyklusarrest Ein weiterer Überlebensmechanismus, der durch in Abschnitt 2.2 erwähnte Proteine beeinflusst werden kann, ist der Zellzyklusarrest. Strahleninduzierte DNA-Schäden können innerhalb des Zellzyklus an den Kontrollpunkten (Checkpoints) erkannt und in den dadurch ausgelösten G1-, S- oder G2/M-Arresten repariert werden (Kastan und Lim, 2000; Herrmann et al., 2006). Liegt allerdings eine Mutation vor, wodurch ein Checkpoint nicht funktionell ist, führt der unreparierte DNA-Schaden entweder zum Zelltod oder zur Tumorprogression (Joiner und van der Kogel, 2009). Eine in Karzinomzellen wesentliche Mutation ist die des Gens p53. Die Auswirkung dieser Mutation auf den Zellzyklus ist im Abschnitt 2.1 beschrieben. Reversible Zellzyklusarreste tragen zum Zellüberleben nach Bestrahlung bei (Hein et al., 2014). Zellen, deren Zellzyklusarrest jedoch irreversibel ist, werden infolge dessen einen apoptotischen oder nekrotischen Zelltod eingehen (Dewey et al., 1995; Pawlik und Keyomarsi, 2004). Wie oben schon erwähnt, können verschiedene Faktoren den Zellzyklusarrest beeinflussen. So zeigten Kesler et al. (2014) in normalen Lymphendothelzellen, dass nach VEGF-C-Zusatz die Zellen verstärkt einen S- und G2/M-Arrest eingehen. Studien mit Zelllinien 13 2.4 Reaktionen von Tumoren auf Bestrahlung unterschiedlicher Tumorentitäten ergaben, dass hingegen der PI3K/Akt-Signalweg progressiv auf den Zellzyklus wirkt (Albert et al., 2006; Fokas et al., 2012). 2.4 Reaktionen von Tumoren auf Bestrahlung Sofern nicht anders vermerkt, werden in diesem Abschnitt 2.4 die Ausführungen des Lehrbuchs Herrmann et al. (2006) zusammengefasst. Durch die Einwirkung ionisierender Strahlung werden Zellen geschädigt und infolge dessen das Tumorwachstum eingeschränkt (siehe Abschnitt 2.1). Werden dabei ausreichend viele Zellen abgetötet, lässt sich eine Tumorregression (Tumorschrumpfung) beobachten. Dies ist für die palliative Therapie von Bedeutung, bei der die durch den Tumor verursachten Symptome beseitigt werden sollen. Nach dem Therapieende kann nach einer Phase der Regression oder einer Phase stabiler Größe der Tumor erneut wachsen. Dies wird als Tumorwachstumsverzögerung bezeichnet. Sie ist definiert als die Zeit, die der Tumor benötigt, um ein spezifisches Volumen, zum Beispiel das Ausgangsvolumen bei Therapiebeginn, wieder zu erreichen. Eine kurative Therapie zielt hingegen auf eine vollständige Vernichtung des Tumors ohne späteres Auftreten eines Rezidivs - die lokale Tumorkontrolle - ab. Dies wird durch die Abtötung aller oder fast aller klonogenen Tumorzellen erreicht (Baumann et al., 1990). Die Wahrscheinlichkeit einer lokalen Tumorkontrolle kann zum Beispiel durch Veränderung des Fraktionierungsschemas der Bestrahlung, durch Kombination der Bestrahlung mit Chemotherapeutika oder molekular wirksamer Substanzen erhöht werden. Ein möglicher Wirkstoff hierfür ist Nelfinavir (siehe Abschnitt 2.5). Für die experimentelle Bestimmung des kurativen Potentials eines Wirkstoffs in Kombination mit Bestrahlung sind Tumorkontrollexperimente geeignet. Zwar können Tumorregression als auch Tumorwachstumsverzögerung in vivo einfacher und schneller experimentell ermittelt werden, jedoch korrelieren sie nur geringfügig mit der Inaktivierung klonogener Zellen (Krause et al., 2006). Bei Tumorkontrollexperimenten wird aus den kontinuierlich dokumentierten Messwerten der Tumorgrößen während und nach der Behandlung mit fraktionierter Bestrahlung mit oder ohne Wirkstoffgabe eine Dosiseffektkurve berechnet. Hieraus kann die TCD50 (engl. tumour control dose) abgelesen werden, die angibt, bei welcher Gesamtdosis der Tumor mit einer Wahrscheinlichkeit von 50 % lokal kontrolliert wird. 14 2 Grundlagen 2.5 Nelfinavir als Akt-Inhibitor Wie bereits im Abschnitt 2.2 ausgeführt, kann der PI3K/Akt-Signalweg durch Bestrahlung aktiviert werden (Contessa et al., 2002; Edwards et al., 2002) oder konstitutiv, zum Beispiel durch eine PTEN-Mutation, aktiviert sein, wie es unter anderem in der Prostatakarzinomzelllinie PC-3 der Fall ist (Grünwald et al., 2002; Altomare und Testa, 2005). Da der Signalweg über PI3K/Akt zum Zellüberleben durch Schutz vor Apoptose und mitotischem Zelltod führt, ist dieser ein wichtiges Target zur Strahlensensibilisierung (Gerber et al., 1998; Mäkinen et al., 2001; Yamaguchi und Wang, 2001; Skvortsova et al., 2008). Eine Möglichkeit zur medikamentösen Blockade der Akt-Aktivierung am Serin 473 über PI3K ist der Wirkstoff Nelfinavir, welcher ursprünglich als HIV-Proteaseinhibitor zum Einsatz kam. Die Einnahme erfolgt bei Patienten oral mit dem Essen. Nelfinavir wird in der Leber vor allem durch das Cytochrom P450 zu den Produkten M1 (2-Methoxy-3-hydroxy Nelfinavir), M3 (3,4Dihydroxy Nelfinavir) und M8 (Nelfinavir Hydroxy-tert-butylamid) metabolisiert (Kempf et al., 1997; Lillibridge et al., 1998a, 1998b, zitiert in Hirani et al., 2004), wobei Nelfinavir zu etwa einem Drittel zu M8 umgesetzt wird (gemessen im Blutplasma nach oraler Einnahme) (Strukturformeln siehe Abbildung 3) (Baede-van Dijk et al., 2001a; Pan et al., 2012). Der M1- Nelfinavir M8 Abbildung 3: Strukturformeln von Nelfinavir und dessen Hauptmetabolit M8. Gehalt ist im Blutplasma der Patienten deutlich geringer als der Gehalt von M8; M3 konnte im Plasma nicht nachgewiesen werden (Zhang et al., 2001). In vitro, unter anderem in PC-3Zellen, zeigten Guan et al. (2012) eine effektivere Inhibierung des Zellüberlebens durch Nelfinavir im Vergleich zu M8. Die maximalen Plasmakonzentrationen von Nelfinavir und M8 wurden in der Studie von Baede-van Dijk et al. (2001) rund 3 Stunden nach Nelfinavirgabe 15 2.5 Nelfinavir als Akt-Inhibitor gemessen und nach 2 Wochen wurde ein Gleichgewichtszustand der Plasmakonzentrationen erreicht. Zhang et al. (2001) ermittelten in Blutplasmaproben von 4 gesunden Probanden nach oraler Einnahme eine maximale Nelfinavir-Konzentration nach 4 Stunden und bei 10 HIV-Patienten nach täglicher oraler Einnahme einen Gleichgewichtszustand nach 28 Tagen. In in vivo-Versuchen mit Mäusen stellten Kim et al. (1998) nach 4 Stunden eine hohe Transportaktivität von Nelfinavir in verschiedene Organe fest. Gupta et al. (2005) zeigten in Kopf-Hals-Xenografts 5 Tage nach einer täglichen oralen Behandlung mit Nelfinavir eine deutliche Abnahme der Akt-Phosphorylierung. Für verschiedene Zelllinien unterschiedlicher Tumorentitäten, ausgenommen Prostata, konnte bereits in vitro (mittels Koloniebildungsassay) und in vivo (mittels Wachstumsverzögerung) gezeigt werden, dass die Inhibierung der Akt-Aktivierung durch Nelfinavir zur Strahlensensibilisierung führt (Gupta et al., 2005, 2007; Pore et al., 2006; Cuneo et al., 2007; Jiang et al., 2007; Kimple et al., 2010). Jiang et al. (2007) konnten beispielsweise in ihrer in vitro-Studie mit Glioblastomzellen eine Korrelation der Inhibierung der Akt-Phosphorylierung und der Strahlensensibilität nachweisen. Jedoch konnte dieser Zusammenhang, wie Bernstein und Dennis (2008) bei ihrer Recherche von mehreren Studien feststellten, in einer Reihe von Versuchen wiederum nicht nachgewiesen werden. Ein Grund dafür könnte sein, dass Nelfinavir nicht nur die Phosphorylierung von Akt, sondern auch eine Reihe weiterer Proteinaktivierungen blockiert und damit nach Bestrahlung in Zellüberlebensprozesse eingreift (hierauf wird im Abschnitt 5.8 näher eingegangen). Einen wichtigen Einfluss hat Nelfinavir außerdem auf die Veränderung der Perfusion des Tumors mit daraus resultierender erhöhter Oxigenierung des Tumorgewebes, was wiederum zur Strahlensensibilisierung führt (Pore et al., 2006; Qayum et al., 2009). In bisherigen in vitro- als auch in vivo-Studien wurden keine Versuche durchgeführt, die eine Strahlensensibilisierung durch Nelfinavir in Prostatakarzinomzelllinien belegen. Ebenso wurden bisher keinerlei Experimente mit dem klinisch relevanten Endpunkt lokale Tumorkontrolle durchgeführt. Bisher konnte nur in in vitro- und in vivo-Versuchen ohne Bestrahlung gezeigt werden, dass Nelfinavir allein in unterschiedlichen PTEN defizienten Prostatakarzinomzelllinien, darunter PC-3, einen Antitumoreffekt besitzt (Yang et al., 2005). Nelfinavir induziert hierbei eine Hemmung des Zellwachstums sowie Apoptose. 16 3 Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Zelllinien Tabelle 1: Verwendete Zelllinien Zelllinie Firma/bereitgestellt durch DU145 American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, D FaDu-Sublinie* Sublinie der ATCC geführten Zelllinie, American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, D LNCaP American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, D N1** PC-3 Bereitgestellt durch Prof. Kunz-Schughart, OncoRay, Dresden, D American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, D * als Kontrolle für die korrekte Bewertung der γH2AX-Foci Die verwendete FaDu-Sublinie weist verglichen mit der FaDu-Linie, welche von ATCC bereitgestellt wird, auf dem Allel 2 im Exon 7 eine splice site Mutation auf. Dies betrifft das Protein p53 (Eicheler et al., 2002). Für die Versuche in dieser Arbeit ist die Mutation unerheblich. ** diploide Zellen als Kontrolle für die Durchflusszytometrie 3.1.2 Reagenzien und Substanzen Tabelle 2: Verwendete Reagenzien und Substanzen Reagenz Firma ® Acrylamid 30 %: Rotiphorese Gel 30 Roth, Karlsruhe, D APS (Ammoniumpersulfat) Roth, Karlsruhe, D Aqua ad iniectabilia Braun B. Braun, Melsungen, D Bafilomycin A1 Sigma-Aldrich, Taufkirchen, D Blocking buffer Life Technologies, Darmstadt, D BSA (Bovines Serumalbumin), 2 mg/ml Thermo Fisher Scientific, Dreieich, D cOmpleteTM protease inhibitor cocktail Roche Diagnostics, Mannheim, D Coomassie Brillant Blau G 250 Roth, Karlsruhe, D DAPI (4‘,6-Diamidin-2-phenylindol), 1 mmol/l Invitrogen, Karlsruhe, D DharmaFECT 1 Transfection Reagent Dharmacon, GE Healthcare Dharmacon Inc., Lafayette, CO, USA DharmaFECT 2 Transfection Reagent Dharmacon, GE Healthcare Dharmacon Inc., Lafayette, CO, USA di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat, p.a. Merck, Darmstadt, D DMEM-Medium (w 3.7 g/L NaHCO3, w 4.5 g/L DGlucose, w stable glutamine, w/o Na-Pyruvate, low endotoxin) Merck, Darmstadt, D DMSO (Dimethylsulfoxid), ≥99,8 %, p.a. Roth, Karlsruhe, D 17 3.1 Material EDTA (Ethylendiamintetraacetat) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, D Entwickler-Konzentrat Carestream GBX, Rochester, NY, USA Essigsäure 100 % (Eisessig) Merck, Darmstadt, D Ethanol, 96,3 %, vergällt Berkel AHK, Berlin, D FITC (Fluorescein-12-dUTP Solution), 1 mmol/l Thermo Fisher Scientific, Dreieich, D Fixierer-Konzentrat Carestream GBX, Rochester, NY, USA FKS (Fötales Kälberserum) (vor Zugabe inaktiviert: 20 min 56 °C) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, D Fluorescent Mounting Medium Dako, Glostrup, DK Formaldehyd, 4 %, neutral gepuffert SAV LP, Flintsbach am Inn, D Glycerol Roth, Karlsruhe, D ® ® ® Glycin, Pufferan ≥99 %, p.a. Roth, Karlsruhe, D HALT TM Phosphatase Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific, Dreieich, D HALT TM Protease Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific, Dreieich, D Kaliumchlorid, p.a. AppliChem, Darmstadt, D Kaliumdihydrogenphosphat, p.a. Ketamin 500 Curamed ® AppliChem, Darmstadt, D Curamed Pharma, Karlsruhe, D Laemmli Sample Buffer Bio-Rad Laboratories GmbH, München, D Luminol Reagenz Santa Cruz, Heidelberg, D Matrigel: BD Matrigel Matrix Growth Factor Reduced BD, Heidelberg, D TM Maxima SYBR Green qPCR Master Mix Fermentas, St. Leon-Rot, D 2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich, Steinheim, D Methanol Merck, Darmstadt, D Milchpulver (blotting grade) Roth, Karlsruhe, D Natriumchlorid, > 99,5 %, p.a. Roth, Karlsruhe, D PBS (phosphate buffered saline), 1x (für die 2+ 2+ Zellkultur) (Dulbecco w/o Ca w/o Mg ) Biochrom, Berlin, D Ponceau S solution, 0,1 % (w/v) in 5 % Essigsäure Sigma-Aldrich, Steinheim, D Propidiumiodid, 1 mg/ml in H2O Sigma-Aldrich, Taufkirchen, D Proteinleiter: PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, ~10 … 250 kDa Thermo Fisher Scientific, Dreieich, D Restore TM western blot stripping buffer Thermo Fisher Scientific, Bonn, D rhVEGF-C (rekombinantes humanes VEGF-C) R&D Systems, Wiesbaden, D Ribonuclease A (RNase) Invitrogen, Karlsruhe, D RIPA-buffer Sigma-Aldrich, Taufkirchen, D RPMI-1640 Medium (w 2.0 g/L NaHCO3, w stable glutamine, low endotoxin) Biochrom, Berlin, D SDS (Natriumdodecylsulfat), ≥ 99,3 %, blotting grade Roth, Karlsruhe, D TEMED (Tetramethylethylendiamin) Bio-Rad Laboratories GmbH, München, D Trichloressigsäure Merck, Darmstadt, D Tris-Hydrochlorid, Pufferqualität AppliChem, Darmstadt, D Triton X-100 Serva, Heidelberg, D Trypsin/EDTA,10x (0,5%/0,2 % (w/v) in 10x PBS, 2+ 2+ w/o Ca w/o Mg ) Biochrom, Berlin, D 18 3 Material und Methoden Tryptanblau, 0,5 % (w/v) in physiological saline ® Tween 20 Pure Serva, Heidelberg, D ® Viracept (nelfinavir mesylate) (Tabletten, 625 mg) Xylazin, Rompun 3.1.3 Biochrom, Berlin, D ® Agouron, Durham, NC, USA Bayer Healthcare GmbH, Leverkusen, D Kits Tabelle 3: Verwendete Kits Kit Firma DNase I-Kit TM Pierce Invitrogen, Karlsruhe, D BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Dreieich, D RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit ® Thermo Fisher Scientific, Dreieich, D RNeasy Mini kit Qiagen, Hilden, D Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit Roche Diagnostics, Mannheim, D 3.1.4 Primäre Antikörper Die Antikörper für den Western Blot wurden in Milchpulverlösung (5 % in PBS) gelöst. Tabelle 4: Verwendete primäre Antikörper Antikörper Firma Verdünnung Verwendung Akt, Kaninchen, polyklonal Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA 1:1000 Western Blot Akt (pan) (11E7), Kaninchen, monoklonal Cell Signaling, Frankfurt a. M., D 1:1000 Western Blot (für Versuch mit 10 min) Anti-beta Actin [AC-15], Maus, monoclonal Abcam, Cambridge, UK 1:50.000 Western Blot Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) (JBW301), Maus, monoklonal Millipore, Schwalbach am Taunus, D 1:2000 in Blocking buffer Foci-Assay Atg5, Kaninchen, polyklonal Cell Signaling, Frankfurt a. M., D 1:1000 Western Blot LC3-II, Kaninchen, polyklonal Cell Signaling, Frankfurt a. M., D 1:1000 Western Blot Neuropilin-2 (H-300), Kaninchen, polyklonal Santa Cruz, Heidelberg, D 1:500 Western Blot p44/42 MAPK (ERK1/2) (137F5), Kaninchen, monoklonal Cell Signaling, Frankfurt a. M., D 1:1000 Western Blot Phospho-Akt (Ser473) Antibody, Kaninchen, polyklonal Cell Signaling, Frankfurt a. M., D 1:2000 Western Blot Phospho-Akt (Ser 473) (D9E) ® XP , Kaninchen, monoklonal Cell Signaling, Frankfurt a. M., D 1:1000 Western Blot (für Versuch mit 10 min) Phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2) (Thr202/Tyr204) (20G11), Kaninchen, monoklonal Cell Signaling, Frankfurt a. M., D 1:1000 Western Blot 19 3.1 Material 3.1.5 Sekundäre Antikörper Die Antikörper für den Western Blot wurden in Milchpulverlösung (5 % in PBS) gelöst. Tabelle 5: Verwendete sekundäre Antikörper Antikörper Firma Verdünnung Verwendung Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Invitrogen, Karlsruhe, D 1:500 in Blocking buffer Foci-Assay goat anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz, Heidelberg, D 1:20.000 Western Blot goat anti-rabbit IgG-HRP Santa Cruz, Heidelberg, D 1:10.000 Western Blot ® 3.1.6 siRNA Tabelle 6: Verwendete siRNAs siRNA Firma Nichtspezifische Kontroll-siRNA (siSCR): 5’-GCAGCUAUAUGAAUGUUGUtt-3’ Eurofins, Hamburg, D ON-TARGETplus Human ATG5 – SMARTpool GE Healthcare Dharmacon Inc., Lafayette, CO, USA ON-TARGETplus Human NRP2 – SMARTpool GE Healthcare Dharmacon Inc., Lafayette, CO, USA ON-TARGETplus Human VEGFC (7424) – SMARTpool GE Healthcare Dharmacon Inc., Lafayette, CO, USA 3.1.7 Primer Tabelle 7: Verwendete Primer Primer Firma Spezifizierung β2-M Eurofins, Hamburg, D fwd: 5‘-TGCTATGTGTCTGGGTTTCATC-3‘ rev: 5‘-CCATGATGCTGCTTACATGTCT-3‘ VEGF-C Eurofins, Hamburg, D fwd: 5‘-AGGGTCAGGCAGCGAACAAGA-3‘ rev: 5‘-CCTCCTGAGCCAGGCATCTG-3‘ 3.1.8 Materialien und Hilfsmittel Tabelle 8: Verwendete Materialien und Hilfsmittel Materialien und Hilfsmittel Firma Belichtungskassette: Hypercassette TM Amersham Biosciences, Freiburg, D ® Blot-System: Mini Trans-Blot Module Bio-Rad Laboratories GmbH, München, D Deckgläschen: 24 x 60 mm Gelelektrophorese-System: Mini-Protean (Spacer-Platte: Geldicke 1,5 mm) Engelbrecht, Edermünde, D ® Bio-Rad Laboratories GmbH, München, D FACS-Rundbodenröhrchen, 5 ml, 12 x 75 mm, Polystyrol BD, Heidelberg, D Insulinspritze, 30G x ½‘‘ (0,3 mm x 12 mm) B. Braun, Melsungen, D 20 3 Material und Methoden Kanüle für die Zelltransplantation: 20G x 1½‘‘ (0,9 x 40 mm) BD, Heidelberg, D Kryoröhrchen Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, D Mikroplate, 96-Well, F-bottom, clear (für Proteinbestimmung) Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, D TM Mr. Frosty Gefrierbehälter Thermo Fisher Scientific, Dreieich, D TM Nitrozellulose-Membran: Whatman S85 Reinforced NC TM TM Nunc Lab-Tek II Chamber Slide ® Well Permanox Slide QIAshredder Optitran BA- TM System, 4 TM Thermo Fisher Scientific, Dreieich, D Qiagen, Hilden, D qRT-PCT-Platten: 0.2 mm Non-skirted low profile 96-well PCR plate Röntgenfilme: Amersham Hyperfilm Zellkulturflasche T-25 cm GE Healthcare Limited, Buckinghamshire, UK TM ECL 2 Thermo Fisher Scientific, Dreieich, D GE Healthcare Limited, Buckinghamshire, UK Nunc, Roskilde, DK 2 Zellkulturflaschen T-75 cm , T-175 cm 2 Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, D Zellkulturplatten, 6-Well Falcon, Wiesbaden, D Zellschaber, 28 cm Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, D 3.1.9 Geräte Tabelle 9: Verwendete Geräte Gerät Firma Spezifizierung CASY cell counter Innovatis, Bielefeld, D CASY 1 Dosimeter PTW, Freiburg, D PTW Unidos Durchflusszytometer BD Biosciences, Heidelberg, D BD FACS Canto II Inverses Fluoreszenzmikroskop Zeiss, Jena, D Axio Imager M1, Kamera: Axio Cam MRm, Objektiv: EC PlanNeofluar 40x/0,75 M27 Microplate-Reader (für Proteinbestimmung) Tecan, Männedorf, CHE GENios Mikroskop (Auflicht, Auszählung Koloniebildungsassays) Olympus, Hamburg, D SZ40 Mikroskop (Durchlicht, Zellkultur) Olympus, Hamburg, D CK2 pH-Meter Beckman Coulter, Inc., Krefeld, D Φ40pH Meter Röntgenröhre Yxlon, Hamburg, D Typ: YXLON Y.TU 320-D03 Eigenfilterung: 3,0 mm Be + 3,0 mm Al RT-PCR-Gerät Bio-Rad Laboratories, Munich, D iCycler iQ Sprektrophotometer PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, D NanoDrop®, ND-1000 Thermocycler (cDNA-Synthese) Eppendorf, Hamburg, D Mastercycler ep Gradient S 21 ® TM 3.2 Methoden 3.1.10 Software Tabelle 10: Verwendete Software Software Firma/Programmierer AxioVS 40x64 V 4.9.1.0 Zeiss, Jena, D BD FACSDiva Flow Cytometry Software BD Biosciences, Heidelberg, D BIOVIA Draw 16.1 Dassault Systèmes, Vélizy-Villacoublay, F CFX Manager Software, Version 1.0.0.0 Bio-Rad Laboratories, Munich, D GraphPad Prism 5 GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA ImageJ 1.48v Wayne Rasband (National Institutes of Health), MD, USA Inkscape 0.91 Open Source Magellan V7.2 Tecan, Männedorf, CHE Microsoft Excel 2007 Microsoft Corp., Redmond, WA, USA MultiCycle AV Software Version 6.0 Phoenix Flow Systems, Inc., San Diego, CA, USA STATA/SE 11.2 StataCorp LP, College Station, TX, USA 3.2 3.2.1 Methoden Zellkultur Reagenzien DMEM-Komplettmedium: DMEM Medium + 10 % Fötales Kälberserum (FKS) RPMI-Komplettmedium: RPMI-1640 Medium + 10 % Fötales Kälberserum (FKS) Trypsin/EDTA: 10x Trypsin 1:10 verdünnt in ddH2O Die Zelllinien PC-3, DU145 und LNCaP wurden in RPMI-Komplettmedium und die Zelllinie FaDu in DMEM-Komplettmedium bei 37 °C, 95 % Luftfeuchte und 5 % CO2 kultiviert. Das Passagieren erfolgte bei 70-80 % Konfluenz. Hierfür wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit Trypsin/EDTA bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde mit dem jeweiligen Medium abgestoppt und bei ~300 xg und 4 °C für 5 min zentrifugiert. Die Langzeitlagerung der Zellen erfolgte in Kryoröhrchen suspendiert in 90 % FKS/10 % DMSO. Die Kryoröhrchen wurden in einem Einfrierbehältnis mit Isopropanol langsam auf -80 °C herunter gekühlt, bevor sie in flüssigem Stickstoff aufbewahrt wurden. Das Auftauen der Zellen erfolgte schnell. Die Zellen wurden auf Eis in ein 15 mlZentrifugenröhrchen überführt, in das anschließend tropfenweise 4 ml kaltes Medium dazugegeben wurde und bei ~130 xg und 4 °C für 5 min zentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen in 5 ml Komplettmedium resuspendiert und in insgesamt 10 ml Komplettmedium in einer T-25 Zellkulturflasche bei 37 °C inkubiert. Nach 24 h erfolgte ein Mediumwechsel. 22 3 Material und Methoden Die Vitalität der aufgetauten Zellen wurde mit Tryptanblau überprüft. Nur Zellen, die mindestens 80 % vitale Zellen aufwiesen, wurden für die Versuche verwendet. Die Zellzahl wurde mit Hilfe des CASY cell counters bestimmt. Der Ursprung und die Stabilität der Zelllinien wurden mittels Mikrosatellitenanalyse vor Anlegen des Kryostocks routinemäßig überprüft. Ebenfalls vor Anlegen des Kryostocks wurde auf Mykoplasmen getestet. Alle Versuche wurden mit Zellen in den Passagen zwischen 4 und 20 durchgeführt. 3.2.2 siRNA-Transfektion Bei dieser Methode bindet die small interferring RNA (siRNA) in den transfizierten Zellen an die entsprechende mRNA, wodurch das Gen nicht exprimiert werden kann. PC-3 und DU145 wurden mit einer Zelldichte, wie in Tabelle 11 angegeben, ausgesät. Nach einer Inkubationszeit von 24 h erfolgte die Transfektion unter sterilen Bedingungen. Sowohl die siRNA als auch DharmaFECT2 für PC-3 bzw. DharmaFECT1 für DU145 wurden mit RPMI-Medium ohne Zusatz von FKS bei Raumtemperatur (RT) für 5 min inkubiert. Anschließend wurden die siRNA- und DharmaFECT-Ansätze im Verhältnis 1:1 gemischt, weitere 20 min bei RT inkubiert und dann tropfenweise zu den mit PBS gewaschenen Zellen gegeben. Dazu pipettiert wurde das vierfache Volumen an Komplettmedium. Die verwendeten Volumina sind in Tabelle 11 ersichtlich. Tabelle 11: Zellzahlen und Volumina für die siRNA-Transfektion Chamber-Slides 6-Well Zellkulturflasche T-175 PC-3 DU145 Zellzahl 70.000 - siVEGF-C + RPMI [µl] 1,125 + 48,875 - DharmaFECT2 +RPMI [µl] 1,25 + 48,75 - Zellzahl 200.000 150.000 siVEGF-C + RPMI [µl] 4,5 + 195,5 4,5 + 195,5 siNRP-2 + RPMI [µl] 6,0 + 194,0 4,5 + 195,5 siATG5 + RPMI [µl] 3,0 + 197,0 - DharmaFECT +RPMI [µl] 5,0 + 195,0 5,0 + 195,0 Zellzahl 7.000.000 5.000.000 siVEGF-C + RPMI [µl] 33,75 + 1466,25 33,75 + 1466,25 DharmaFECT +RPMI [µl] 3,5+1462,5 3,5+1462,5 Die Endkonzentration von siVEGF-C betrug für PC-3 und DU145 22,5 nmol/l; von siNRP-2 für PC-3 30 nmol/l, für DU145 22,5 nmol/l; und von siATG5 jeweils 15 nmol/l. Die optimalen Konzentrationen, bei denen die Herunterregulierung auf mRNA- (für VEGF-C) und 23 3.2 Methoden Proteinebene (für NRP-2 und ATG5) maximal war, wurden zuvor in 6-Wellplatten ermittelt (siehe Abschnitt 4.1.2). Die Dauer bis zu dieser Wirkung betrug 48 h. Anschließend wurden die Versuche durchgeführt. Als Kontrolle wurde stets eine nichtspezifische Kontroll-siRNA (siSCR) in entsprechender Konzentration mitgeführt. 3.2.3 Bestrahlung Die Bestrahlung der Zellen erfolgte bei RT mit 200 kV Röntgenstrahlen (zusätzlicher Filter: 0,5 mm Kupfer) bei einer Dosisleistung von ca. 1,3 Gy/min. Die Dosisleistung wurde täglich kontrolliert. 3.2.4 Koloniebildungsassay Das Ziel der Strahlentherapie ist der Verlust der unbegrenzten Teilungsfähigkeit der Tumorzellen (Verlust der Klonogenität). Als klonogen wird eine Zelle definiert, die mehrere Zellteilungen durchlaufen kann, sodass aus dieser mindestens 50 Tochterzellen hervorgehen (Herrmann et al., 2006). Zur Bestimmung überlebender klonogener Zellen nach Bestrahlung dient der Koloniebildungsassay. Lösungen 80 % Ethanol: 800 ml Ethanol auf 1 l ddH2O Coomassie-Färbelösung: 100 ml Methanol + 37,5 ml Eisessig + 0,25 g Coomassie 250 auf 500 ml ddH2O Versuchsansätze Die Koloniebildungsassays wurden mit zuvor unterschiedlich behandelten Zellen angesetzt. Transfizierte Zellen (siehe Abschnitt 3.2.2) wurden 24 h nach Transfektion trypsiniert und in 6-Wellplatten ausgesät. Nach weiteren 24 h wurde PC-3 mit den Zellzahlen 500/1500/3000/10.000 und DU145 mit den Zellzahlen 300/1000/2000/7000 mit 0/2/4/6 Gy bestrahlt. Nach einer Inkubationszeit von 10 Tagen für PC-3 und 7 Tagen für DU145, in der klonogene Zellen Kolonien bilden konnten, wurden die Zellen mit PBS gewaschen, für 10 min mit 80 %igem Ethanol fixiert und für 10 min mit Coomassie-Lösung gefärbt. Die Zellen der Linie LNCaP wurden in 6-Wellplatten mit den Zellzahlen 700/1500/3000/10.000 für 0/2/4/6 Gy ausplattiert. 24 h später wurde rhVEGF-C, gelöst in 24 3 Material und Methoden 0,1 %igem bovinem Serumalbumin (BSA), mit einer Endkonzentration von 75 ng/ml dazugegeben. Die Kontrolle wurde mit dem entsprechenden Volumen an 0,1 %igem BSA behandelt. Nach 48 h wurde bestrahlt und im direkten Anschluss daran das Medium gewechselt. Die Zellen wurden dann für 12 Tage zur Koloniebildung inkubiert. Aufgrund der geringen Adhäsion von LNCaP-Zellen konnten diese nicht fixiert und mit Coomassie-Lösung gefärbt werden, sondern wurden ungefärbt unter einer stärkeren Vergrößerung ausgezählt. Die PC-3-Zellen, die für den Koloniebildungsassay mit Nelfinavir in Form von Viracept® behandelt werden sollten, wurden zuvor für die Bestrahlung mit 0/2/4/6 Gy mit Zellzahlen von 300/1000/3000/5000 in 6-Wellplatten ausplattiert. Nach 24 h wurde Nelfinavir, gelöst in DMSO, mit der Endkonzentration von 10 µmol/l zu den Zellen gegeben. Die Kontrolle wurde mit dem entsprechenden Volumen an DMSO behandelt. Nach 1 h wurde das Medium gewechselt und etwa 5 min später bestrahlt. Die Nelfinavirkonzentration und die Inkubationszeit wurden analog der von Pore et al. (2006) angewendeten Versuchsbedingungen gewählt. Die anschließende Inkubationsdauer betrug 10 Tage. Danach wurden die Zellen wie oben beschrieben fixiert und gefärbt. Alle Koloniebildungsassays wurden dreifach angesetzt und mindestens dreimal unabhängig voneinander durchgeführt. Auswertung Das Auszählen der Kolonien erfolgte unter einem Lichtmikroskop mit einer 3,6-fachen Vergrößerung. Kolonien mit mindestens 50 Zellen wurden gezählt. Die Plattierungseffizienz (PE, plating efficiency) und die Überlebensfraktion (SF, surviving fraction) wurden wie folgt berechnet. Die mathematische Auswertung der Koloniebildungsassays erfolgte mit dem LinearQuadratischen(LQ)-Modell nach Kellerer und Rossi (1973). Für die Auswertung des Koloniebildungsassays für LNCaP + rhVEGF-C wurde jedoch das Multi-Target Single-HitModell angewandt, da sich hiermit eine deutlich bessere Kurvenanpassung ergab. Dieses Modell fand bereits für die Beschreibung des klonogenen Überlebens humaner Tumorzellen nach Röntgenbestrahlung von Puck und Marcus (1956) Anwendung. 25 3.2 Methoden LQ-Modell (Herrmann et al., 2006): , mit SF… Überlebensfraktion D … applizierte Dosis [Gy] α … zellspezifische Konstante [Gy-1] β … zellspezifische Konstante [Gy-2] Multi-Target Single-Hit-Modell (Herrmann et al., 2006): , mit n … Extrapolationszahl, Schnittpunkt der Funktion mit der Ordinate D … applizierte Dosis [Gy] D0 … Dosis, die das Überleben um e-1 verringert [Gy] (zellspezifisches Maß für die Strahlenempfindlichkeit) 3.2.5 Autophagischer Flux Für die Bestimmung, wie viel Autophagie in PC-3 abläuft (autophagischer Flux), wurden die Zellen mit Bafilomycin A1 behandelt, welches zur Akkumulation von Autophagosomen führt. In der Membran der Autophagosomen ist das Protein LC3-II enthalten, das im Anschluss an den Flux mittels Western Blot nachgewiesen werden kann. Eine Vergleichsprobe wurde mit dem Lösungsmittel für Bafilomycin A1, DMSO, behandelt. Anhand der Differenz des LC3-IIGehaltes der Bafilomycin A1- und der DMSO-behandelten Zellen wurde der autophagische Flux berechnet. Durchführung 48 h nach der siRNA-Transfektion und der sich direkt anschließenden Bestrahlung mit 2 Gy wurde eine Probe mit einer Endkonzentration von 10 nmol/l Bafilomycin A1 (gelöst in DMSO) behandelt, während eine zweite Probe als Referenz diente und mit dem entsprechenden Volumen an DMSO versetzt wurde. Nach einer Inkubationszeit von 7 h wurden die Zellen für den Western Blot aufgearbeitet. Die Differenz der Intensität der LC3-II-Banden entspricht dem Ausmaß an Autophagie, die innerhalb der 7 h Inkubationszeit in der Zelle abgelaufen ist. Die Versuche wurden dreimal unabhängig voneinander durchgeführt. 26 3 Material und Methoden 3.2.6 Semiquantitative Proteinbestimmung Gele und Lösungen Tabelle 12: Zusammensetzung der Gele für die SDS-PAGE 5 % Sammelgel 10 % Trenngel 1,63 ml ddH2O 3,12 ml ddH2O 0,72 ml 0,5 mol/l Tris/HCl pH 6,8 2,13 ml 3 mol/l Tris/HCl pH 8,8 0,50 ml Acrylamid 30 % 2,83 ml Acrylamid 30 % 0,06 ml 50 % Glycerol (v/v in ddH2O) 0,17 ml 50 % Glycerol (v/v in ddH2O) 0,03 ml 10 % SDS (w/v in ddH2O) 0,085 ml 10 % SDS (w/v in ddH2O) 0,06 ml 10 % APS (w/v in ddH2O) 0,17 ml 10 % APS (w/v in ddH2O) 0,0048 ml TEMED 0,0068 ml TEMED Die Lösungen wurden wie folgt angesetzt. Auftragspuffer: 95 % Laemmli Sample Buffer + 5 % Mercaptoethanol (v/v) 1x Blotpuffer: 100 ml 10x Blotpuffer + 200 ml Methanol auf 1 l ddH2O 10x Blotpuffer: 30,3 g Tris + 144,1 g Glycin auf 1 l ddH2O, 1:10 verdünnt mit ddH2O Lysepuffer: 94 % RIPA-buffer + 4 % cOmpleteTM protease inhibitor cocktail + 1 % HALTTM Phosphatase Inhibitor Cocktail + 1 % HALTTM Protease Inhibitor Cocktail 5 % Milchpulver: 5 % Milchpulver in 1x PBS (w/v) 1x PBS: 160 g NaCl + 4 g KCl + 36 g Na2HPO4*2H2O + 4,8 g KH2PO4 auf 1 l ddH2O, 1:20 verdünnt mit ddH2O 0,5 % PBS/Tween: 1 l 1x PBS + 0,5 ml Tween 20 Ponceau S: 0,2 g Ponceau + 3 g Trichloressigsäure auf 100 ml ddH2O SDS-Laufpuffer: 30,3 g Tris + 144,1 g Glycin + 10 g SDS auf 1 l ddH2O, 1:10 verdünnt mit ddH2O 0,5 mol/l Tris/HCl: 30,275 g Tris/500 ml in ddH2O, eingestellt auf pH 6,8 mit HCl 3 mol/l Tris/HCl: 181,71 g Tris/500 ml in ddH2O, eingestellt auf pH 8,8 mit HCl Probenaufarbeitung Die Lyse der Zellen erfolgte auf Eis. Nach dem Waschen der Zellen mit PBS wurden je 6Well 70 µl Lysepuffer auf die Zellen pipettiert. Anschließend wurden die Zellen mit einem 27 3.2 Methoden Zellschaber abgetragen und in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt, in dem die Suspension für 20 min auf Eis inkubiert wurde. Zur weiteren Lyse wurde die Suspension mehrfach mit einer Insulinspritze auf- und abgezogen. Anschließend wurde mit 8000 xg bei 4 °C für 10 min zentrifugiert und der Überstand in ein frisches 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt. Die Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration erfolgte spektroskopisch mit einem TecanMicroplate-Reader bei 570 nm. Hierfür wurde das PierceTM BCA Protein Assay Kit verwendet. Bovines Serumalbumin (BSA) wurde in 0,15 mol/l NaCl verdünnt und diente als Standardreihe (0/0,1/0,2/0,4/0,6/0,8/1,0 mg/ml). In eine 96-Wellplatte wurden dreifach je 10 µl Standard bzw. 5 µl einer 1:4 mit 0,15 mol/l NaCl verdünnten Probe pipettiert. Dazu gegeben wurden 250 µl BCA-Reagenz (Reagenz A:B = 50:1). Nach Inkubation bei 37 °C für 30 min wurde mit dem Tecan-Microplate-Reader und der dazugehörigen Software Magellan V7.2 die Gesamtproteinkonzentration ermittelt. Das Volumen, das 25 µg oder 30 µg Gesamtprotein entspricht, wurde in 0,2 mlReaktionsgefäße mit demselben Volumen an Auftragspuffer gemischt. Anschließend wurden die Proteine für 5 min bei 95 °C denaturiert. Bei Unterbrechung des Versuchs erfolgte die Lagerung der Proben bei -20 °C für wenige Tage oder bei -80 °C für einen längeren Zeitraum. Nach Auftauen wurde erneut denaturiert. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Die Gelelektrophorese dient der Auftrennung von Proteinen in Abhängigkeit von ihrer molekularen Masse. Das verwendete Gel bestand aus einem 10 %igen Trenngel und einem darüber liegenden 5 %igen Sammelgel mit 15 Taschen (á ~30 µl). Die Dicke des Gels betrug 1,5 mm. Die Taschen wurden vor dem Auftragen der Proben mit SDS-Laufpuffer gespült. Als Größenstandard diente eine Proteinleiter mit Banden zwischen 10 kDa und 250 kDa. Die Gelelektrophorese lief in SDS-Laufpuffer mit einer Spannung von 200 V. Western Blot Die im SDS-Gel aufgetrennten Proteine wurden im Western Blot mittels Elektrophorese bei einer Stromstärke von 350 mA für 100 min in 1x Blotpuffer unter Kühlung auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Die Proteine wurden dann mit Ponceau S-Lösung angefärbt, um die Membran abhängig von den zu untersuchenden Proteinen horizontal zu schneiden. Die geschnittenen Membranen wurden anschließend in PBS wieder entfärbt. 28 3 Material und Methoden Die Membranen wurden dann 30 min mit 5 %igem Milchpulver geblockt. Die anschließende Inkubation mit primären Antikörpern erfolgte unter langsamen Schwenken (maschinell) bei 4 °C über Nacht. Die Membranen wurden hierfür mit einer Antikörperlösung (Antikörper verdünnt in 5 %iger Milchpulverlösung) in Folie eingeschweißt. Die Verdünnungen sind der Tabelle 4 zu entnehmen. β-Actin diente als Ladekontrolle. Um unspezifisch gebundene Antikörper wieder zu entfernen, wurden die Membranen mit 0,5 %iger PBS/Tween-Lösung zweimal für 10 min gewaschen. Anschließend erfolgte die Inkubation mit sekundären Antikörpern eingeschweißt unter Schwenken bei RT für 1 h. Wie die primären Antikörper wurden auch die sekundären in 5 %iger Milchpulverlösung verdünnt (siehe Tabelle 5). Die Membranen wurden anschließend zweimal für 10 min mit 0,5 %iger PBS/Tween-Lösung und einmal für 10 min mit PBS gewaschen. Die Membranen wurden dann mit Luminol Reagenz für 1 min unter Lichtausschluss inkubiert und die damit erzeugte Chemolumineszenz in Belichtungskassetten in der Dunkelkammer mit Röntgenfilmen detektiert. Die Filme wurden manuell entwickelt und fixiert. Membranstücke, die weitere Proteine ähnlicher molekularen Masse enthielten, wurden für 15 min mit RestoreTM western blot stripping buffer behandelt, zweimal mit 0,5 %iger PBS/Tween-Lösung gewaschen und erneut blockiert. Anschließend erfolgten die Antikörperreaktionen und die Detektion wie oben beschrieben. Auswertung des Western Blots Die Auswertung der Bandenstärken auf den eingescannten Filmen erfolgte densitometrisch mit der Software ImageJ 1.48v. Dabei wurden die Proteinexpressionen in Relation zur Ladekontrolle β-Actin beziehungsweise die Phosphorylierungen zum entsprechenden unphosporylierten oder entsprechenden gesamten Protein (phosphoryliert und unphosphoryliert (=pan) gesetzt. 3.2.7 mRNA-Quantifizierung Probenaufarbeitung Die RNA-Extraktion erfolgte mit dem RNeasy® Mini kit von Qiagen auf Eis. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, mit 350 µl/6-Well RLT-Puffer versetzt und mit einem Zellschaber von der Oberfläche abgelöst. Die Suspension wurde dann in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und 20 min auf Eis inkubiert. Zur weiteren Lyse der Zellen wurde das Gemisch mit einer Insulinspritze mehrmals auf- und abgezogen. Um feste Zellbestandteile zu entfernen, wurde es dann in eine QIAshredderTM-Säule überführt und bei 4 °C mit 11.600 xg für 2 min 29 3.2 Methoden zentrifugiert. Das Zentrifugat wurde anschließend mit 350 µl 70 %igem Ethanol gemischt, um die RNA zu fällen, und in eine Säule des RNeasy® Mini Kits überführt. Diese wurde bei 4 °C mit 11.600 xg für 15 s zentrifugiert. Die membrangebundene RNA wurde mit 700 µl RW1Puffer gewaschen, worauf erneut bei 4 °C mit 11.600 xg für 15 s zentrifugiert wurde. Anschließend wurde mit RPE-Puffer gewaschen und bei 4 °C mit 11.600 xg für 2 min zentrifugiert. Die RNA wurde dann mit 40 µl RNase-freiem Wasser in ein frisches Reaktionsgefäß mittels Zentrifugation bei 4 °C mit 11.600 xg für 1 min eluiert. Danach wurde die RNA-Konzentration spektrophotometrisch bestimmt. Proben mit einem Mindestgehalt von 400 ng/µl, einem 260 nm/280 nm-Wert von ungefähr 2 und einem 230 nm/260 nm-Wert zwischen 1 und 2 konnten für das weitere Vorgehen verwendet werden. Für den Verdau der genomischen DNA wurde das DNase I-Kit von Invitrogen verwendet. Ab diesem Schritt wurde eine Negativkontrolle (5,5 µl Wasser statt RNA) mitgeführt. Es wurde ein Probenvolumen entsprechend 1 µg RNA mit 1 µl DNase I, 1 µl 10x DNase reaction buffer und RNase-freies Wasser (Gesamtvolumen 7,5 µl bei Verwendung des cDNase-Kits von Roche bzw. 10 µl bei Kit von Thermo Fisher Scientific) für 15 min bei RT inkubiert. Die Reaktion wurde dann mit 1 µl EDTA und Inkubation bei 65 °C für 10 min abgestoppt. Die cDNA-Synthese erfolgte mit Hilfe des Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit von Roche oder mit dem RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit von Thermo Fisher Scientific. Zum DNA-Verdau-Ansatz wurden 2 µl (Roche) bzw. 4 µl (Thermo) Reaktionspuffer, 4 µl MgCl2 (bei Roche), 2 µl Nukleotid-Mix, 2 µl (Roche) bzw. 1 µl (Thermo) Random-Primer, 0,5 µl (Roche) bzw. 1 µl (Thermo) RNase-Inhibitor und 1 µl reverse Transkriptase pipettiert. Die cDNA-Synthese erfolgte im Thermocycler nach dem folgenden Programm: 25 °C für 10 min 42 °C für 60 min 95 °C für 5 min (bei Kit von Roche) bzw. 70 °C für 10 min (bei Kit von Thermo) Der Probenansatz wurde anschließend 1:2 mit 20 µl RNA-freiem Wasser verdünnt und konnte bei -20 °C gelagert werden. Quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) Auf Eis wurden zu 10,5 µl Probe 52,5 µl MaximaTM SYBR Green, 1,05 µl FITC und 34,65 µl RNA-freies Wasser pipettiert und anschließend als Dreifachbestimmung 14,1 µl dieses 30 3 Material und Methoden Ansatzes und 0,9 µl Primerlösung in die Wells einer PCR-Platte pipettiert. Die Primerlösungen enthielten je 5 pmol Vorwärts- und Rückwärts-Primer für den Analyten VEGF-C beziehungsweise für das Haushaltsgen β2-M. Die Sequenzen der Primer sind in Tabelle 7 ersichtlich. Die qRT-PCR lief im iCycler iQTM von Bio-Rad mit folgendem Programm: Zyklus 1 (1x): Zyklus 2 (40x): Zyklus 3 (1x): 95,0 °C für 08:00 [min] Schritt 1: 95,0 °C für 00:20 Schritt 2: 58,0 °C für 00:30 Schritt 3: 72,0 °C für 00:10 Schritt 4: 76,0 °C für 00:05 Schritt 1: 72,0 °C für 02:00 Schritt 2: 95,0 °C für 01:00 Zyklus 4 (180x): 60,0 °C für 00:04 je Durchgang wurde die Temperatur um 0,2 °C erhöht Zyklus 5 (1x): 20,0 °C für 00:10 Auswertung Die Auswertung der Messwerte erfolgte mit der CFX Manager Software von Bio-Rad Laboratories. Die relative mRNA-Expression wurde mit Microsoft Excel 2007 folgendermaßen berechnet (ct - cycle threshold): 3.2.8 γH2AX Foci-Assay Die durch Bestrahlung induzierten potentiell letalen DNA-Doppelstrangbrüche führen zum Anschalten zellulärer Reparaturmechanismen, an denen unter anderem das Histon H2AX beteiligt ist. Dieses wird in Nachbarschaft zum DNA-Doppelstrangbruch zum sogenannten γH2AX phosphoryliert (Rogakou et al., 1998). Die Immunfluoreszenzfärbung des γH2AX ermöglicht, DNA-Doppelstrangbrüche sichtbar zu machen. 31 3.2 Methoden Lösungen Blocking buffer: 10 mg/ml gelöst in 1x PBS DAPI: 1:1000 verdünnt in 1x PBS Triton X-100: 0,1 %ig in PBS (v/v) Versuchsansatz Für die Bestimmung der DNA-Doppelstrangbrüche wurden 70.000 PC-3 Zellen in 4-Well Chamber Slides ausplattiert. 24 h später erfolgte die Transfektion der Zellen mit siVEGF-C bzw. siSCR wie in Abschnitt 3.2.2 beschrieben. Nach weiteren 48 h wurden die Zellen mit 4 Gy und 6 Gy bestrahlt. Unbehandelte Zellen wurden 24 h vor dem Zeitpunkt der Bestrahlung ausplattiert. Immunfluoreszenzfärbung Die Zellen der Färbekontrolle wurden 30 min nach der 4 Gy-Bestrahlung und die Zellen aller weiteren Proben 24 h nach der Bestrahlung für 15 min mit 4 %iger Formaldehydlösung fixiert und 3 mal für 5 min mit PBS gewaschen. Die Zellmembranen wurden anschließend mit einer Triton X-100-Lösung permeabilisiert. Nach einmaligem Waschen mit PBS für 5 min wurden unspezifische Bindungsstellen durch 60 minütige Inkubation mit Blocking buffer blockiert. Die Zellen wurden als nächstes mit dem Antikörper gegen γH2AX, mit einer Verdünnung von 1:2000, für 60 min inkubiert und anschließend dreimal mit PBS für 5 min gewaschen. Ab hier erfolgte die Probenaufarbeitung unter Lichtausschluss. Der sekundäre Antikörper Alexa Fluor® 594 wurde in einer Konzentration 1:500 für 60 min zu den Zellen gegeben. Es erfolgten wieder drei Waschgänge, bevor mit DAPI 1:1000 die Zellkerne angefärbt und erneut dreimal gewaschen wurde. Zum Schluss wurde mit Fluorescent Mounting Medium eingedeckelt. Nach Trocknen bei RT über Nacht wurden die Objektträger bei 4 °C unter trockenen Bedingungen und unter Lichtausschluss gelagert. Der Versuch wurde dreimal unabhängig voneinander durchgeführt. Als Kontrolle für die korrekte Bewertung der Foci wurde in einem Durchgang parallel zur nicht transfizierten PC-3 Probe die in unserer Arbeitsgruppe für die Foci-Bestimmung gut etablierte Zelllinie FaDu (80.000 Zellen/Well) mitgeführt. Auswertung Je Probe wurden 10 Bilder in 40-facher Vergrößerung mit dem inversen Fluoreszenzmikroskop Axio Imager M1 und der Kamera Axio Cam MRm aufgenommen. Mit 32 3 Material und Methoden der Software AxioVS 40x64 V 4.9.1.0 erfolgte die Auswertung der γH2AX Foci und der Kernfläche. γH2AX wurde mit einem rot fluoreszierenden sekundären Antikörper angefärbt. Zur besseren Erkennbarkeit wurde die Farbe in der Aufnahme auf grün umgestellt. Alle auswertbaren Zellkerne wurden nummeriert und davon randomisiert 10 Zellkerne ausgewertet. Auf diese Weise wurden je Probe die Fläche von 100 Zellkernen und deren Foci-Anzahl bestimmt. Von der Auswertung ausgeschlossen waren Zellen in der S-Phase, mitotische, nekrotische und apoptotische Zellen, sowie deformierten Kerne und Mikrokerne. Die Berechnung der korrigierten Anzahl residueller γH2AX Foci pro Zellkern erfolgte wie in Menegakis et al. (2015) beschrieben: , mit … korrigierte Anzahl residueller γH2AX Foci … Mittelwert aller Zellkernflächen unter gleichen experimentellen Bedingungen … Fläche des individuellen Zellkerns … Anzahl der γH2AX Foci des individuellen Zellkerns 3.2.9 Zellzyklusanalyse Lösungen PBS/0,5 mmol/l EDTA: 105 mg Tetrasodium-EDTA auf 500 ml 1x PBS Ribonuclease A (RNase), 1 mg/ml: 1:20 in 1x PBS Versuchsansatz Die Zellzyklusanalysen wurden mit PC-3 und DU145 durchgeführt. Die Transfektion mit siRNA gegen VEGF-C erfolgte in T-175 Zellkulturflaschen wie in Abschnitt 3.2.2 beschrieben. Nach 24 h wurden die Zellen in T-75 Zellkulturflaschen umgesetzt. 24 h später erfolgte die Bestrahlung mit 4 Gy. Nach weiteren 4/8/12/24/72 h wurden die Zellen für die Zellzyklusanalyse aufgearbeitet. Die Zellzyklusanalysen wurden dreifach angesetzt und insgesamt dreimal unabhängig voneinander durchgeführt. Probenaufarbeitung Die Zellen wurden zunächst trypsiniert und mit PBS/EDTA gewaschen. Die sich anschließende Zentrifugation erfolgte bei ~300 xg und 4 °C für 5 min. Danach wurden die 33 3.2 Methoden Zellen auf Eis in PBS/EDTA (1x106 Zellen/ml) resuspendiert und zur Fixierung in ein FACSRöhrchen, in dem das 2,5-fache Volumen an 100 %igen kalten Methanol vorgelegt war, tropfenweise unter Schütteln gegeben. Die so aufbereiteten Proben konnten mit Parafilm abgedichtet bei 4 °C mehrere Wochen gelagert werden. Ab jetzt wurde die Zelllinie N1 als Kontrolle mit diploiden Zellen mitgeführt. Diese Zellen wurden nicht selbst kultiviert, da sie innerhalb der eigenen Arbeitsgruppe bereits fixiert zur Verfügung standen. Die Zellsuspension wurde bei ~470 xg und 4 °C für 8 min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und die Zellen mit 2 ml PBS/EDTA für 15 min auf Eis rehydriert. Nach erneuter Zentrifugation und Absaugen des Überstandes wurden 200 µl PBS und 25 µl Ribonuclease A (1 mg/ml) pro 1x106 Zellen zugegeben und bei 37 °C für 30 min inkubiert. Circa 3 min vor der Messung wurden unter Lichtausschluss und auf Eis 25 µl Propidiumiodid (1 mg/ml)/1x106 Zellen (mindestens 15 µl) dazugegeben. Durchflusszytometrie Die Messung erfolgte mit dem FACS Canto II mit Hilfe der BD FACSDiva Flow Cytometry Software. Es wurden mindestens 20.000 Zellen gemessen. Auswertung Die Erstellung der Histogramme aus den Messwerten und die Integration der Kurven im Histogramm (Ermittlung der Zellzyklusverteilung) erfolgten mit der MultiCycle AV Software. 3.2.10 Tierversuch Versuchstiere und Tumormodell Die Versuche wurden an 7-15 Wochen alten NMRI-Nacktmäusen durchgeführt, welche aus der hauseigenen pathogenfreien Zucht stammten. Für eine zusätzliche Immunsuppression wurden die Tiere mit 4 Gy 2-5 Tage vor Tumortransplantation ganzkörperbestrahlt. Zur Tumortransplantation wurden 500.000 PC-3 Zellen in 50 µl Matrigel/PBS (1:2) suspendiert und subkutan auf das rechte Hinterbein mit einer 20 G-Kanüle transplantiert. Während der Transplantation waren die Tiere mit 120 mg/kg Körpergewicht Ketamin und 16 mg/kg Körpergewicht Xylazin (intraperitoneal) anästhesiert. Die Konstanz des Tumormodells wurde mittels Mikrosatellitenanalyse der ursprünglichen Zelllinie aus dem Kryostock und mittels Volumenverdopplungszeit (VDT) der Tumore von jeweils 5 unbehandelten Tieren pro Transplantationskohorte kontrolliert. Die Mediane der VDT für die Transplantationskohorte Wachstumsverzögerung betrug 9,8 Tage (min=6,2 d, max=11,0 d), für die erste Transplantationskohorte für die lokale Tumorkontrolle 10,3 Tage (min=9,0 d, max=13,7 d) 34 3 Material und Methoden und für die zweite 11,2 Tage (min=6,3 d, max=14,5 d). Die Mediane weisen keine signifikanten Abweichungen auf und stimmen mit den VDTs anderer in vivo-Studien mit PC-3-Xenografts überein (Bourré et al., 2003; Hensley et al., 2011). Die Einzelwerte der VDT-Tumoren sind im Anhang in Tabelle A1 aufgelistet. Die Tierhaltung und die Experimente wurden entsprechend den Richtlinien des OncoRays und den deutschen Tierschutzvorschriften durchgeführt und genehmigt (Landesdirektion Sachsen, AZ: 24-9168.11-1/2013-52). Die Berechnung der VDTs erfolgte mit der exponentiellen Regressionsformel RKP in Microsoft Excel (2007), wobei als y-Werte die Tumorvolumina von etwa 100 mm3 bis 400 mm3 (in diesem Bereich ist die VDT annähernd konstant) und als x-Werte die dazugehörigen Tage nach Behandlungsbeginn gesetzt wurden. Aus den ausgegebenen Regressionskenngrößen für die Formel y=b∙(m1^x1)∙(m2^x2)∙...∙(mn^xn) wurde die VDT wie folgt berechnet: Experimentelles Design Sobald die Tumore einen Durchmesser von 6-8 mm erreicht hatten, wurden die Tiere in den Versuch aufgenommen. Zwei Endpunkte wurden ausgewertet: Wachstumsverzögerung und lokale Tumorkontrolle. Für die Wachstumsverzögerung wurden die Tiere mit 80 mg Nelfinavir/kg Körpergewicht (Wirkstoff von Viracept®), suspendiert in 350 µl Wasser (Aqua ad iniectabilia Braun), 5-mal wöchentlich für 6 Wochen oral per Schlundsonde behandelt. Die Wirkstoffkonzentration wurde in Anlehnung an die Veröffentlichung von Pore et al. (2006) gewählt. Die Kontrollgruppe erhielt 350 µl Wasser. Die Anzahl der Versuchstiere für Nelfinavir betrug 17, die für Wasser 18. Zur Ermittlung der lokalen Tumorkontrolle wurde wie beschrieben Nelfinavir beziehungsweise Wasser gegeben und zusätzlich 4 h nach jeder Verabreichung bestrahlt (6 Wochen, 30 Fraktionen). Dieses Zeitintervall zwischen Medikamentenverabreichung und Bestrahlung wurde gewählt, da hiernach eine hohe Transportaktivität von Nelfinavir in unterschiedliche Organe in vivo besteht (Kim et al., 1998). Die Gesamtdosen der Strahlentherapie betrugen 30/40/50/60/72,5/85/100/120 Gy. Zur Berechnung der DosisWirkungs-Beziehung konnten 87 Tiere der Nelfinavir/Bestrahlungsgruppe und 92 Tiere der Kontrollgruppe (Wasser/Bestrahlung) verwendet werden. 35 3.2 Methoden Nachbeobachtungszeit und Auswertung der Endpunkte Wachstumsverzögerung und lokale Tumorkontrolle Die Tumorgröße wurde zweimal pro Woche mit einer Schiebelehre bestimmt und das Tumorvolumen folgendermaßen berechnet: , mit a … längster Durchmesser b … kürzerer Durchmesser, senkrecht zu a Leidende Tiere, Tiere, deren Tumor die maximal zulässige Endgröße von 15 mm erreicht hatte und Tiere nach der Nachbeobachtungszeit von 270 Tagen nach Behandlungsende wurden getötet. Mit der langen Nachbeobachtungszeit sollte sichergestellt werden, dass keine weiteren Rezidive nach dem Zeitpunkt der Auswertung der lokalen Tumorkontrolle (Tag 180 nach Behandlungsende) auftreten. Für die Ermittlung der Wachstumsverzögerung wurde aus der Wachstumskurve jedes Tumors die Zeit bis zum Erreichen des 2- bis 5-fachen des Startvolumens abgelesen (Tumorwachstumszeit, TGTV2-V5). Die Tiere, die aufgrund ihres schlechten Allgemeinzustandes getötet wurden, wurden in die Auswertung mit einbezogen (Nelfinavir: n=1; Wasser: n=1). Ulzeröse Tumore wurden bis zur Schrumpfung berücksichtigt (Nelfinavir: n=3; Wasser: n=2). Zu einem zweiten Tumor angrenzende Tumore wurden bis zum Zusammenwachsen einbezogen (Nelfinavir: n=1; Wasser: n=3). Die lokale Tumorkontrolle wurde für den Tag 180 nach Behandlungsende ausgewertet. Die Tumorkontrollwahrscheinlichkeiten (TCP) und die Tumorkontrolldosis, bei der 50 % der Tumore lokal kontrolliert sind (TCD50) sowie das dazugehörige 95 %-Konfidenzintervall wurden mit einem binären logistischem Modell wie in Yaromina et al. (2011) beschrieben, von PD Dr. Steffen Löck und Dr. Lydia Koi berechnet. Als Rezidiv wurde gewertet, wenn das Tumorvolumen an drei Messtagen zunahm, nachdem es vorher geschrumpft oder stabil war oder wenn der Tumor ohne Schrumpfen weiter gewachsen ist. Hierbei musste das Tumorwachstum an mindestens jedem übernächsten Messtag zugenommen haben. Rezidive nach Tag 180 nach Behandlungsende wurden für die Berechnung der TCD50 als lokal kontrolliert gewertet (Nelfinavir: n=3; Wasser: n=2). Das Einbeziehen dieser Werte als Rezidive in die Berechnung hatte keinen entscheidenden Einfluss auf das Ergebnis. Tiere wurden zensiert, wenn sie ohne Rezidiv nach Tag 20 nach Behandlungsende starben. Tiere, die vor Tag 20 nach Behandlungsende ohne Rezidiv starben, wurden von der Auswertung ausgeschlossen. 36 3 Material und Methoden 3.2.11 Statistische Auswertung In vitro-Versuche Die Datenanalyse für alle in vitro-Daten wurde mit der GraphPad Prism 5 Software durchgeführt. Für alle Versuche wurden die Mittelwerte ± Standardfehler berechnet. Die Stichproben wurden mit dem t-Test für nicht verbundene Stichproben unter Annahme ungleicher Varianzen (Welch-Test) vor eventueller Normalisierung der Werte auf die Kontrolle verglichen. Mediane wurden mit dem Mann-Whitney-U-Test verglichen. Die Kurvenanpassungen der Koloniebildungsassays wurden mit dem F-Test verglichen. Ausreißertests wurden nach Grubbs durchgeführt. Für alle Tests wurde ein Signifikanzniveau von α = 0,05 angenommen. Ein p-Wert ≤ 0,05 wurde als statistisch signifikant (*), ≤ 0,01 als statistisch sehr signifikant (**) und ≤ 0,001 als hoch signifikant (***) bewertet. In vivo-Versuche Die Mediane der Tumorwachstumszeit und der Wachstumsverzögerung wurden mit dem Mann-Whitney-U-Test (nicht verbundene Stichproben, keine Normalverteilung) mit Hilfe der GraphPad Prism 5 Software verglichen; Signifikanzniveau: α = 0,05. Die statistische Analyse der lokalen Tumorkontrolle wurde mit der Software STATA/SE 11.2 durchgeführt. Zur Bewertung der p-Werte siehe oben. 37 4 Ergebnisse 4.1 4.1.1 Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Strahlenresistenz Betrachtung der VEGF-C- und NRP-2-Gehalte in den Zelllinien PC-3, DU145 und LNCaP Für die Bewertung der Funktion von VEGF-C und NRP-2 im Prostatakarzinom wurden die kommerziell erhältlichen Prostatakarzinomzelllinien PC-3, DU145 und LNCaP verwendet. Diese Zelllinien besitzen eine unterschiedlich hohe VEGF-C- und NRP-2-Expression, welche mittels qRT-PCR beziehungsweise semiquantitativer Proteinanalyse ermittelt wurde. Bei VEGF-C handelt es sich um ein sezerniertes Protein, weshalb es nicht vollständig mittels semiquantitativer Proteinanalyse erfasst werden kann. Daher wurde dessen mRNAExpression nur mittels qRT-PCR gemessen. Ein ELISA wurde nicht durchgeführt. PC-3 wies die höchsten und LNCaP die niedrigsten Werte für VEGF-C auf mRNA-Ebene und für NRP-2 auf Proteinebene auf. Der Gehalt von VEGF-C-mRNA in LNCaP lag unterhalb der Bestimmungsgrenze (Abbildung 4). Abbildung 4: VEGF-C- und NRP-2-Expressionen in den Zelllinien PC-3, DU145 und LNCaP. (A) VEGF-C-Gehalte von PC-3 und DU145 wurden mittels qRT-PCR bestimmt; der VEGF-C-Gehalt von LNCaP lag unterhalb des Bestimmungsbereichs (Mittelwerte mit Standardfehler, n = 3). (B) Die NRP-2-Gehalte von PC-3, DU145 und LNCaP wurden mittels Western Blot detektiert. 4.1.2 Etablierung der VEGF-C- und NRP-2-siRNA-Transfektionen Für die Transfektionen wurden kommerziell erhältliche siRNA Pools verwendet. Zunächst wurden die Konzentrationen der siRNAs, bei denen die Herunterregulierung der mRNAExpression von VEGF-C und die Proteinexpression von NRP-2 maximal war, für PC-3 und DU145 eingestellt. Dafür wurde die niedrigste Konzentration für die siRNAs ermittelt, um mögliche off-target-Effekte der verwendeten siRNA zu vermeiden. LNCaP konnte aufgrund der geringen Gehalte nicht erfolgreich transfiziert werden. Für PC-3 war die Transfektion mit 39 4.1 Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Strahlenresistenz 22,5 nmol/l siVEGF-C und 30 nmol/l siNRP-2, für DU145 mit jeweils 22,5 nmol/l siVEGF-C beziehungsweise siNRP-2 effektiv (Abbildung 5). Abbildung 5: Herunterregulierung von VEGF-C und NRP-2 in PC-3 und DU145. Die Effektivität der Transfektion mit siVEGF-C wurde mittels qRT-PCR auf mRNA-Ebene (Mittelwerte mit Standardfehler, n = 3) (A) und die Transfektion mit siNRP-2 mittels Western Blot auf Proteinebene (B) nachgewiesen. 4.1.3 Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Klonogenität bestrahlter Zellen Der Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Strahlenresistenz der Zellen wurde mittels Koloniebildungsassay mit Einzeldosen von 0 - 6 Gy untersucht. Die durch siRNATransfektion verminderte VEGF-C-Expression in PC-3 und DU145 resultierte in signifikant verringertem klonogenen Überleben der Zellen (p = 0,02 beziehungsweise p = 0,006, F-Test) (Abbildung 6A und B). Aufgrund der geringen VEGF-C-Expression in LNCaP wurde diesen Zellen rekombinantes humanes (rh) VEGF-C mit 75 ng/ml zugesetzt, welches das klonogene Überleben der Zellen signifikant verbesserte (p = 0,015, F-Test) (Abbildung 6C). Das durch siRNA-Transfektion herunter regulierte NRP-2 hatte in PC-3 und DU145 unterschiedliche Effekte auf das klonogene Überleben. Während die NRP-2- Herunterregulierung DU145 strahlensensibilisiert, erhöht es die Strahlenresistenz in PC-3 (p = 0,002 beziehungsweise p = 0,03) (Abbildung 7). 40 4 Ergebnisse Abbildung 6: Koloniebildungsassays von PC-3, DU145 und LNCaP nach Veränderung des VEGF-C-Status. Koloniebildungsassays mit dazugehörigen Plattierungseffizienzen bei 0 Gy ohne Normalisierung, t-Test (Welch), p-Werte relativ zur Kontrolle. (A und B) Klonogenes Überleben von PC-3 und DU145 nach siRNA-Transfektion gegen VEGF-C und Bestrahlung mit 0 – 6 Gy. Mittelwerte mit Standardfehler, PC-3: n = 4, DU154: n = 3. Kurvenanpassung nach dem Linear-Quadratischen-Modell, verglichen mit dem F-Test. (C) Klonogenes Überleben von LNCaP nach Inkubation mit rekombinantem humanem (rh) VEGF-C (75 ng/ml) und Bestrahlung mit 0 – 6 Gy. Mittelwerte mit Standardfehler, n = 3. Kurvenanpassung nach dem Multi-Target Single-Hit-Modell, verglichen mit dem F-Test. In allen Koloniebildungsassays hatte die Transfektion beziehungsweise die Behandlung mit rhVEGF-C keinen signifikanten Einfluss auf die Plattierungseffizienz (t-Test, Welch). Es kann somit davon ausgegangen werden, dass die Behandlung selbst die Koloniebildung nicht signifikant beeinflusst und der zu erkennende Unterschied der Überlebenskurven tatsächlich auf den Strahleneffekt durch VEGF-C beziehungsweise NRP-2 zurückzuführen ist. 41 4.2 Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf überlebensfördernde Signalwege unter Bestrahlung Abbildung 7: Koloniebildungsassays von PC-3 und DU145 unter verminderter NRP-2Expression. Klonogenes Überleben von PC-3 und DU145 nach siRNA-Transfektion gegen NRP-2 und Bestrahlung mit 0 – 6 Gy. Mittelwerte mit Standardfehler, PC-3: n = 4, DU154: n = 3. Kurvenanpassung nach dem Linear-Quadratischen-Modell, verglichen mit dem F-Test. Dazugehörige Plattierungseffizienzen bei 0 Gy ohne Normalisierung, t-Test (Welch), p-Werte relativ zur Kontrolle. Die folgenden Untersuchungen dienten der Klärung des Mechanismus der positiven Wirkung von VEGF-C auf die Strahlenresistenz der Prostatakarzinomzelllinien. Aufgrund des gegensätzlichen Ergebnisses im Koloniebildungsassay für PC-3 und DU145 nach Herunterregulierung von NRP-2, wurde für den Großteil der nachfolgenden Versuche der Schwerpunkt auf die Untersuchungen zu VEGF-C gelegt. 4.2 Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf überlebensfördernde Signalwege unter Bestrahlung Muders et al. (2009) zeigten, dass in verschiedenen Prostatakarzinomzelllinien unter oxidativem Stress, induziert durch H2O2, das Zellüberleben durch VEGF-C und NRP-2 über Akt1 reguliert wird. Mäkinen et al. (2001) beschrieben für humane dermale mikrovaskuläre Endothelzellen (HMVEC) ebenfalls eine durch VEGF-C induzierte Aktivierung von pAkt (Ser473) sowie von ERK1/2. In den folgenden Experimenten wurde daher untersucht, ob und in welchem Ausmaß VEGF-C beziehungsweise NRP-2 auch unter strahleninduziertem oxidativem Stress die Aktivierung von Akt und ERK1/2 in den Zelllinien PC-3 und DU145 beeinflussen. 42 4 Ergebnisse 4.2.1 Aktivierung des Akt-Signalwegs Die Phosphorylierung von Proteinen erfolgt nach der Bestrahlung prinzipiell innerhalb kurzer Zeit. Es wurden mehrere Versuche zur Ermittlung der Dauer zwischen Bestrahlung und maximaler Veränderung der Akt-Aktivierung in PC-3 und DU145 durchgeführt. Diese Versuche waren jedoch nicht reproduzierbar und die Ergebnisse wurden nicht verwendet. Für die Untersuchung des Einflusses von VEGF-C und NRP-2 auf die Akt-Aktivierung unter Bestrahlung wurde daher bezüglich des Zeitparameters auf Literaturwerte zurückgegriffen. In verschiedenen Arbeiten wurde die pAkt/Akt-Bestimmung in Prostatakarzinomzelllinien 24 h nach Bestrahlung mit 2 Gy oder 4 Gy gemessen (Anai et al., 2007; Diaz et al., 2009; Zhu et al., 2013). Daher wurde für den durchzuführenden Versuch ebenfalls zunächst diese Zeitspanne angesetzt. Für den ersten Versuch wurden 250.000 PC-3- beziehungsweise 150.000 DU145-Zellen in 6-Wellplatten ausplattiert, nach 24 h mit siRNA transfiziert und nach weiteren 48 h mit 2 Gy bestrahlt. Die Zellen wurden 24 h nach Bestrahlung für die Proteinbestimmung mittels Western Blot aufgearbeitet. Abbildung 8: Einfluss von NRP-2 und VEGF-C auf die Phosphorylierung von Akt unter Bestrahlung (24 h). Western Blots von transfizierten PC-3- und DU145-Zellen 24 h nach Bestrahlung mit 2 Gy (n=3). (A) Auswertung Western Blots der siSCR-transfizierten Zellen mit und ohne Bestrahlung. Angegeben sind die Mittelwerte mit Standardfehler, t-Test (Welch), p-Werte relativ zur Kontrolle. (B) Angegeben sind die Verhältnisse der Bandenintensitäten von pAkt/Akt jeweils normiert auf die Ladekontrolle β-Actin. 43 4.2 Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf überlebensfördernde Signalwege unter Bestrahlung Wie nach der semiquantitativen Proteinanalyse dreier unabhängiger Versuche in Abbildung 8A zu sehen ist, führt die Bestrahlung in siSCR-transfizierten PC-3- und DU145-Zellen zu einer nicht signifikanten Aktivierung von Akt am Serin 473. Nach Herunterregulierung von NRP-2 und vor allem von VEGF-C schwanken die Werte sehr stark (Abbildung 8B). In bestrahlten und unbestrahlten Proben wurde sowohl eine erhöhte als auch verminderte AktPhosphorylierung ermittelt. Somit waren die Versuche nicht reproduzierbar, sodass unter diesen Versuchsbedingungen keine Aussage dazu getroffen werden kann, ob oder wie NRP-2 und VEGF-C die Akt-Aktivierung beeinflussen. Über einen zweiten Versuch wurde untersucht, ob sich die Akt-Aktivierung am Serin 473 reproduzierbar beeinflussen lässt, wenn die Versuchsbedingungen in Bezug auf Bestrahlungsdosis und Zeitpunkt der Messung verändert werden. Nach Yazlovitskaya et al. (2008) und Edwards et al. (2002) ergab sich die maximale Phosphorylierung von Akt in humanen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) nach 3 min beziehungsweise nach 15 min. Dieser Versuch wurde aufgrund der etwas höheren Passagenzahl mit 200.000 PC-3beziehungsweise 120.000 DU145-Zellen pro 6-Well durchgeführt. Die Dosis wurde auf 6 Gy erhöht und die Zeit bis zum Abstoppen des Versuchs nach der Bestrahlung auf 10 min verkürzt. Der Versuch wurde auf die Herunterregulierung von VEGF-C beschränkt. Abbildung 9: Einfluss von VEGF-C auf die Phosphorylierung von Akt unter Bestrahlung (10 min). (A) Repräsentative Western Blots von transfizierten PC-3- und DU145-Zellen 10 min nach Bestrahlung mit 6 Gy. (B) Berechnete Verhältnisse von pAkt/Akt nach densitometrischer Auswertung der Western Blots. Die Versuche erfolgten dreimal voneinander unabhängig. Angegeben sind die Mittelwerte mit Standardfehler. 44 4 Ergebnisse Unter diesen Bedingungen war der Versuch reproduzierbar. Interessanterweise kam es nach der Bestrahlung in allen Proben zu einer Abnahme der Akt-Phosphorylierung am Serin 473, die jedoch nicht signifikant war (Abbildung 9). Die Transfektion mit siVEGF-C hatte ebenfalls keinen signifikanten Einfluss. 4.2.2 Aktivierung des ERK1/2-Signalwegs Parallel zur pAkt/Akt-Bestimmung wurden 10 min nach Bestrahlung pERK1/2 (Thr202/Tyr204) und ERK1/2 detektiert. Auch hier nahm die ERK1/2-Phosphorylierung nach der Bestrahlung nicht signifikant ab und es konnten keine signifikanten Zusammenhänge von VEGF-C auf die Aktivierung von ERK1/2 gefunden werden. Die Daten sind in Abbildung 10 dargestellt. Abbildung 10: Einfluss von VEGF-C auf die Phosphorylierung von ERK1/2 unter Bestrahlung. (A) Repräsentative Western Blots von transfizierten PC-3- und DU145-Zellen 10 min nach Bestrahlung mit 6 Gy. (B) Berechnete Verhältnisse von pERK1/2/ERK1/2 nach densitometrischer Auswertung der Western Blots. Die Versuche erfolgten dreimal voneinander unabhängig. Angegeben sind die Mittelwerte mit Standardfehler. 45 4.3 Untersuchungen zum Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Strahlenresistenz beeinflussende zelluläre und molekulare Prozesse 4.3 Untersuchungen zum Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Strahlenresistenz beeinflussende zelluläre und molekulare Prozesse 4.3.1 Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Autophagie und deren Bedeutung für die Strahlenresistenz Autophagie ist ein Prozess, der in Stresssituationen zum Beispiel durch Bestrahlung zum Überleben oder zum Tod der Zellen beitragen kann (Apel et al., 2008; Kim et al., 2008; Lomonaco et al., 2009). Daher wurde untersucht, ob Autophagie durch VEGF-C oder NRP-2 reguliert wird und zur Strahlenresistenz beziehungsweise -sensibilität führt. Die Versuche wurden ausschließlich mit PC-3 durchgeführt, da in DU145 das für die Autophagie essentielle ATG5 mutiert ist, was dazu führt, dass die Translation dieses Gens vorzeitig beendet und LC3-II nicht gebildet wird, wodurch Autophagie nicht ablaufen kann (Ouyang et al., 2013). LNCaP wurde nicht untersucht, da es sich hierbei um eine eher strahlensensible Zelllinie handelt und Autophagie in strahlensensiblen Zellen durch Bestrahlung deutlich weniger als in strahlenresistenten Zellen induziert wird und die Autophagie in strahlensensiblen Zellen das klonogene Überleben nach Bestrahlung nicht beeinflusst (Chaachouay et al., 2011). Für die Untersuchung der in den Zellen innerhalb einer bestimmten Zeitspanne abgelaufenen Autophagie (autophagischer Flux) wurden die Zellen mit Bafilomycin behandelt, sodass deren Autophagosomen nicht abgebaut werden konnten. Das so akkumulierte LC3-II in der Autophagosomenmembran wurde per Western Blot bestimmt und diente im Verhältnis zur mit DMSO behandelten Kontrolle als Maß für die Autophagie. Zunächst wurde ein geeigneter Zeitpunkt zur Bestimmung von LC3-II ermittelt. Hierzu wurden 500.000 PC-3-Zellen in 6-Wellplatten ausgesät und nach 24 h mit 2 Gy bestrahlt. Zu verschiedenen Zeitpunkten innerhalb von 1 – 24 h nach Bestrahlung wurde abgestoppt und die Proben zur Detektion von LC3-II aufgearbeitet. Abbildung 11: LC3-II-Bestimmung mittels Western Blot. (A) Bestimmung der maximalen Expression von LC3-II 1-24 h nach Bestrahlung mit 2 Gy; n = 3. Western Blots einer repräsentativen Wiederholung. (B) Western Blot aller Wiederholungen (I-III) für den Zeitpunkt 7 h. 46 4 Ergebnisse Wie in Abbildung 11 ersichtlich, war die LC3-II-Konzentration 7 h nach der Bestrahlung maximal. Dieser Zeitpunkt wurde zur Bestimmung des autophagischen Flux ausgewählt. Im nächsten Schritt erfolgte die Bestimmung des autophagischen Flux in PC-3-Zellen nach vorheriger siRNA-Transfektion gegen NRP-2 beziehungsweise VEGF-C ohne und mit Bestrahlung mit 2 Gy. Unbestrahlte transfizierte Zellen wiesen einen geringeren autophagischen Flux auf als die Kontrolle (Abbildung 12A und B). Das heißt, dass in diesen Zellen die Autophagie reduziert ablief. Der Effekt von siVEGF-C war hierbei signifikant (p = 0,006) und stärker als der von siNRP-2. Das Ergebnis der Transfektion unter Bestrahlung mit 2 Gy war im Gegensatz zu dem der unbehandelten Proben in 3 voneinander unabhängig durchgeführten Versuchen nicht reproduzierbar (Abbildung 12C). Abbildung 12: Autophagischer Flux in PC-3 nach siRNA-Transfektion gegen NRP-2 und VEGF-C ohne und mit Bestrahlung mit 2 Gy. (A) Repräsentativer Western Blot für LC3-II aus PC-3-Zelllysaten nach autophagischem Flux mit Bafilomycin A1 nach siNRP-2 beziehungsweise siVEGF-C. Der Versuch erfolgte dreimal voneinander unabhängig. (B) Darstellung des berechneten autophagischen Flux nach densitometrischer Auswertung der Western Blots nach dreifach unabhängigen Versuchen wie in (A) gezeigt. Dargestellt sind die Mittelwerte mit Standardfehler. Die Mittelwerte wurden mit dem t-Test (Welch) verglichen, pWerte relativ zur Kontrolle. (C) Western Blots von drei unabhängigen Ansätzen für den autophagischen Flux nach Transfektion mit siNRP-2 beziehungsweise siVEGF-C und Bestrahlung mit 2 Gy. Angegeben sind die Differenzen der Bandenintensitäten von Bafilomycin-behandelten Zellen und deren Kontrolle nach densitometrischer Auswertung normalisiert zur jeweiligen unbestrahlten Kontrolle. 47 4.3 Untersuchungen zum Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Strahlenresistenz beeinflussende zelluläre und molekulare Prozesse Im Ergebnis konnte nicht geklärt werden, ob und wie NRP-2 und VEGF-C die Autophagie unter Bestrahlung regulieren. Da aber in den unbestrahlten Proben nachgewiesen werden konnte, dass eine Verminderung des VEGF-C-Gehaltes signifikant zur Reduktion der Autophagie führte, sollte im Weiteren getestet werden, ob Autophagie unabhängig von VEGF-C zu einer Veränderung der Strahlenresistenz von PC-3-Zellen führt. Um die Autophagie zu blockieren, wurde ATG5, welches ein wichtiges Protein zur Autophagieinduktion ist, mittels siRNA-Transfektion herunter reguliert. In Abbildung 13A ist die erfolgreiche siATG5-Transfektion dokumentiert und in Abbildung 13B ist zu erkennen, dass durch siATG5-Transfektion der autophagische Flux vermindert wurde. Nach siATG5Transfektion wurde ein Koloniebildungsassay durchgeführt. Die blockierte Autophagie hatte keinen signifikanten Effekt auf die Klonogenität von PC-3-Zellen (p = 0,3, t-Test (Welch)). Abbildung 13: Einfluss der Autophagie auf die Klonogenität von PC-3 unter Bestrahlung. (A) Die Effektivität der Transfektion mit siATG5 wurde mittels Western Blot auf Proteinebene nachgewiesen. (B) Western Blot für den autophagischen Flux nach Transfektion mit siATG5. (C) Klonogenes Überleben nach siRNA-Transfektion gegen ATG5. Mittelwerte mit Standardfehler, n = 3. Kurvenanpassung nach dem Linear-QuadratischenModell, verglichen mit dem F-Test. Dazugehörige Plattierungseffizienzen bei 0 Gy ohne Normalisierung, t-Test (Welch), p-Wert relativ zur Kontrolle. 4.3.2 Einfluss von VEGF-C auf die Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen Die Ergebnisse der Koloniebildungsassays haben gezeigt, dass VEGF-C zum klonogenen Überleben der Zellen beiträgt. Um zu untersuchen, ob VEGF-C dabei an der Reparatur der strahleninduzierten DNA-Doppelstrangbüche beteiligt ist, wurden die residuellen γH2AX-Foci 48 4 Ergebnisse Abbildung 14: Ergebnis des γH2AX-Foci-Assays. PC-3-Zellen wurden mit siVEGF-C transfiziert und mit 0/4/6 Gy bestrahlt. 24 h nach Bestrahlung wurden die residuellen Foci gezählt. Für jede Bedingung wurden 100 Zellkerne randomisiert und ausgewertet. (A) Berechnete korrigierte Anzahl residueller γH2AX-Foci. Boxplots mit 5- und 95%-Perzentilen dreier unabhängig voneinander durchgeführter Versuche (n = 3, 300 ausgewertete Zellkerne). Parallel lief zu einem der Ansätze eine Probe unbehandelter Zellen mit (Wt, Wildtyp) (n = 1, 100 ausgewertete Zellkerne). Die Mediane wurden mit dem Mann-WhitneyU-Test verglichen. ***, p ≤ 0,0001. n.s., nicht signifikant. (B) Repräsentative fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der γH2AX-Foci (grün) mit Zellkernen (blau) nach Transfektion und 0/4/6 Gy. (C) Repräsentative fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der γH2AX-Foci (grün) mit Zellkernen (blau) von PC-3- und FaDu-Wildtyp-Zellen. 49 4.3 Untersuchungen zum Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Strahlenresistenz beeinflussende zelluläre und molekulare Prozesse nach siRNA-Transfektion gegen VEGF-C und Bestrahlung mit 4 Gy und 6 Gy beziehungsweise ohne Bestrahlung ausgewertet. Die Bestrahlung der PC-3-Zellen führte zu einem hochsignifikanten Anstieg (p ≤ 0,0001) der residuellen γH2AX-Foci. Eine Veränderung der Anzahl der DNA-Doppelstrangbrüche durch VEGF-C wurde jedoch nicht beobachtet (Abbildung 14A und B). Da bereits bei den nicht bestrahlten Kontrollproben (siSCR) die Foci-Anzahl relativ hoch war, wurde mit einem Ansatz unbehandelter Zellen (Wildtyp) überprüft, ob die Transfektion mit siSCR bereits einen DNAschädigenden Effekt hatte. Auch die Wildtyp-Zellen zeigten einen ungewöhnlich hohen Grundwert von etwa 20 Foci pro Zellkern. Daher wurde zum weiteren Vergleich die in unserer Arbeitsgruppe für den γH2AX-Foci-Assay gut etablierte FaDu-Zelllinie (eine humane Pharynxkarzinomzelllinie) genutzt. Im Ergebnis ist ein deutlicher Unterschied in der Anzahl der DNA-Doppelstrangbrüche in PC-3- und FaDu-Zellkernen zu erkennen Abbildung 14C. Die Aufnahme der FaDu-Zellkerne entspricht der von Menegakis et al. (2009) veröffentlichten Ergebnissen. Es kann daher angenommen werden, dass das Auszählen der Foci im Versuch mit PC-3 korrekt war. 4.3.3 Der Einfluss von VEGF-C auf den Zellzyklus Da sich die Strahlensensibilität innerhalb der Zellzyklen verändert, wurde untersucht, ob VEGF-C zu einer Verschiebung der Zellzyklusphasen führt. Tatsächlich konnte nachgewiesen werden, dass relativ zur siSCR-transfizierten Kontrolle signifikant mehr siVEGF-C-transfizierte PC-3-Zellen einen G2/M-Arrest eingingen (p = 0,04, t-Test (Welch)). Wurden die transfizierten Zellen bestrahlt, bestand dieser G2/M-Arrest auch noch 72 h nach Bestrahlung signifikant (p = 0,013, t-Test (Welch)) (Abbildung 15). 50 4 Ergebnisse Abbildung 15: Zellzyklusanalyse mit PC-3. 48 h nach Transfektion mit siVEGF-C wurden die Zellen mit 4 Gy bestrahlt. (A) 4/8/12/24/48/72 h nach Bestrahlung wurden die Zellzyklen der unterschiedlich behandelten Zellen analysiert. Für jeden Zeitpunkt sind die Mittelwerte von 3 unabhängigen Versuchen mit Standardfehlern für die jeweiligen Zellzyklusphasen dargestellt. (B) Darstellung der Mittelwerte mit Standardfehlern für 0 Gy + 4 h sowie 0/4 Gy + 72 h. Die Mittelwerte wurden mit dem t-Test (Welch) verglichen. Im Gegensatz zu PC-3 zeigte DU145 nach Transfektion keine Unterschiede in der Zellzyklusverteilung (Abbildung 16). 51 4.4 Inhibierung der Aktivierung von Akt durch Nelfinavir Abbildung 16: Zellzyklusanalyse mit DU145. 48 h nach Transfektion mit siVEGF-C wurden die Zellen mit 4 Gy bestrahlt. (A) 4/8/12/24/48/72 h nach Bestrahlung wurden die Zellzyklen der unterschiedlich behandelten Zellen analysiert. Für jeden Zeitpunkt sind die Mittelwerte von 3 unabhängigen Versuchen mit Standardfehlern für die jeweiligen Zellzyklusphasen dargestellt. (B) Darstellung der Mittelwerte mit Standardfehlern für 0 Gy + 4 h sowie 0/4 Gy + 72 h. Die Mittelwerte wurden mit dem t-Test (Welch) verglichen. 4.4 Inhibierung der Aktivierung von Akt durch Nelfinavir Die in dieser Arbeit durchgeführten Versuche basieren unter anderem auf den Schlussfolgerungen von Prostatakarzinomzelllinien Muders nach et al. (2009), H2O2-induziertem wonach das oxidativen Zellüberleben Stress über von den VEGF-C/NRP-2/Akt-Signalweg vermittelt wird. Nach den in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnissen wird das klonogene Überleben abhängig von der untersuchten Zelllinie zwar über VEGF-C und auch über NRP-2 vermittelt, jedoch nicht generell über den von Muders et al. (2009) beschriebenen Signalweg. Da in der Zelllinie PC-3 eine PTEN-Mutation vorliegt, wodurch Akt konstitutiv aktiviert ist (Grünwald et al., 2002) und bekannt ist, dass die Aktivierung von Akt zur Strahlenresistenz führt (Gupta et al., 2002), sollte für PC-3 weitergehend untersucht werden, ob mit einer Blockade der AktAktivierung eine Strahlensensibilisierung erreicht werden kann. Hierfür wurde der bereits bei 52 4 Ergebnisse HIV-Patienten verwendete Wirkstoff Nelfinavir strahlensensibilisierender Effekte in verschiedenen wachstumsverzögernden Effektes in vivo sowie aufgrund vielversprechender Tumormodellen der bereits in gezeigten vitro, des klinischen Anwendbarkeit bei Darmkrebspatienten ausgewählt (Gupta et al., 2005, 2007; Jiang et al., 2007; Kimple et al., 2010; Hill et al., 2016). 4.4.1 Einfluss von Nelfinavir auf die Klonogenität in vitro In der Literatur finden sich für PC-3 unterschiedliche Erkenntnisse in Bezug auf eine Erhöhung beziehungsweise Verringerung der Phosphorylierung von Akt nach Bestrahlung (Potiron et al., 2013; Zhu et al., 2013). In dem in Abbildung 17A gezeigten Ergebnis der eigenen Untersuchungen sind beide Tendenzen zu erkennen. In zwei von drei Ansätzen stieg die Akt-Aktivierung in PC-3 10 min nach der Bestrahlung mit 6 Gy an. Der Versuch wurde wie in Abschnitt 4.2.1 beschrieben durchgeführt. Da aus diesem und aus dem Versuch aus Abschnitt 4.2.1 bereits bekannt ist, dass die Ergebnisse nur schlecht reproduzierbar sind, sollte dennoch getestet werden, ob mit einer Blockade der AktPhosphorylierung PC-3-Zellen strahlensensibilisiert werden können. Um den Einfluss von pAkt auf die Klonogenität der Zellen in vitro untersuchen zu können, wurde zunächst bestimmt, nach welcher Dauer der Inkubation mit 10 µmol/l Nelfinavir die Akt-Phosphorylierung maximal inhibiert wird. Die Zellen wurden für 1/2/4/8/24 h inkubiert. Der Western Blot in Abbildung 17B zeigt, dass nach 1 h die Akt-Phosphorylierung an Ser473 maximal blockiert war. Daher wurde der Koloniebildungsassay nach 1 h Nelfinavir-Inkubation durchgeführt. Es zeigte sich, dass Nelfinavir nur einen geringen Effekt auf die Klonogenität der PC-3-Zellen hat. Trotz des geringen Effekts war das klonogene Überleben nach Bestrahlung und Nelfinavir-Behandlung signifikant höher im Vergleich zu den ausschließlich bestrahlten Zellen (p = 0,02, t-Test (Welch)) (Abbildung 17C). Die Behandlung mit Nelfinavir allein ergab keine signifikante Veränderung der Plattierungseffizienz, sodass angenommen werden kann, dass die Substanz zu keinen relevanten zytotoxischen Effekten in vitro führt. 53 4.4 Inhibierung der Aktivierung von Akt durch Nelfinavir Abbildung 17: Blockade der Akt-Aktivierung und dessen Einfluss auf die Klonogenität. (A) Western Blots von PC-3-Zellen (Wildtyp), 10 min nach Bestrahlung mit 6 Gy, dreifach unabhängig wiederholt. Angegeben sind die pAkt/Akt-Verhältnisse nach densitometrischer Auswertung der Bandenintensitäten. (B) Western Blot für pAkt (S473) und β-Actin und für Akt und β-Actin nach Inkubation mit Nelfinavir (Darstellung zusammengefasst aus ursprünglich je einem Western Blot, siehe Anhang Abbildung A1). Für die semiquantitative Auswertung wurden die Verhältnisse pAkt/Akt berechnet, wobei jeder Wert zuvor in Relation zum dazugehörigen β-Actin-Wert gesetzt wurde. Angegeben sind die Bandenintensitäten nach densitometrischer Auswertung relativ zur Kontrolle (DMSO Behandlung). (C) Klonogenes Überleben von PC-3 nach Inkubation mit 10 µmol/l Nelfinavir beziehungsweise dessen Lösungsmittel DMSO für 1 h. Das Medium wurde kurz vor Bestrahlung gewechselt. Mittelwerte mit Standardfehler, n = 3. Kurvenanpassung nach dem Linear-QuadratischenModell, verglichen mit dem F-Test. Dazugehörige Plattierungseffizienzen bei 0 Gy ohne Normalisierung, t-Test (Welch), p-Wert relativ zur Kontrolle. 4.4.2 Tumorwachstumsverzögerung In der Literatur werden unterschiedliche in vitro- und in vivo-Ergebnisse für die Kombination Bestrahlung und Nelfinavir-Behandlung von Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom- und Lungenkarzinomzellen beschrieben. Hierbei wurden in Koloniebildungsassays in vitro geringe, bei den Tumorvolumen-basierten Assays in vivo hingegen aber deutlich höhere Effekte beobachtet (Pore et al., 2006). Trotz des in den eignen Versuchen ebenfalls gezeigten geringen Effektes in vitro (Abschnitt 4.4.1) wurden aufgrund der Erkenntnisse von Pore et al. (2006) zusätzliche in vivo-Experimente durchgeführt. Zuerst wurde mittels Bestimmung der Tumorwachstumsverzögerung in vivo getestet, ob Nelfinavir die Proliferation von PC-3-Zellen beeinflusst. Hierfür wurde die mediane Zeit 54 4 Ergebnisse berechnet, die der Tumor benötigte, um das 2- bis 5-fache des Ausgangsvolumens zu erreichen. Wie in Abbildung 18 dargestellt, kam es zu einer geringen Verlängerung der Tumorwachstumszeiten, welche aber nicht signifikant war (die p-Werte liegen zwischen 0,2 und 0,4, Mann-Whitney-U-Test). Abbildung 18: Tumorwachstumszeiten nach Behandlung mit Nelfinavir. Relative Tumorvolumen von PC-3-Xenografts nach Behandlung mit Nelfinavir (80 mg/kg Körpergewicht). Mediane mit Quartilen. 55 4.4 Inhibierung der Aktivierung von Akt durch Nelfinavir 4.4.3 Lokale Tumorkontrolle Im Anschluss an die Bestimmung der Tumorwachstumsverzögerung nach NelfinavirBehandlung wurde der Einfluss von Nelfinavir auf die lokale Tumorkontrolle untersucht. Die Daten für die Nachbeobachtung sind in Tabelle 13 zusammengefasst. Tabelle 13: Nachbeobachtungsdaten für die lokale Tumorkontrolle. Nachbeobachtung der Tiere, die mit Nelfinavir oder dessen Trägersubstanz Wasser und fraktionierte Bestrahlung über 6 Wochen behandelt wurden. Behandlung Anzahl lokal kontrollierter Tumore/Anzahl auswertbarer Tumore Anzahl zensierter Tiere (Zeitpunkt der Zensur in Tagen) Anzahl ausgeschlossener Tiere aufgrund Todes vor Tag 20 nach Behandlung 95 % der Rezidive vor Tag/letztes Rezidiv erfasst an Tag Nelfinavir + 30 Gy 1/10 1 (29) 2 80 Nelfinavir + 40 Gy 1/11 4 (31-41) 1 78 Nelfinavir + 50 Gy 2/11 3 (36-122) 0 122 Nelfinavir + 60 Gy 1/13 9 (20-101) 2 85 Nelfinavir + 72,5 Gy 2/10 7 (22-129) 0 134 Nelfinavir + 85 Gy 2/11 7 (26-124) 0 76 Nelfinavir + 100 Gy 6/12 3 (33-134) 0 36 Nelfinavir + 120 Gy 5/9 2 (57-155) 1 55 Gesamt Nelfinavir + IR 20/87 36 (20-155) 6 122/134 Wasser + 30 Gy 1/12 0 (-) 0 52/57 Wasser + 40 Gy 1/11 3 (27-52) 1 103 Wasser + 50 Gy 2/13 3 (54-68) 1 97 Wasser + 60 Gy 2/12 6 (45-146) 2 143 Wasser + 72,5 Gy 3/11 6 (36-162) 0 73 Wasser + 85 Gy 4/11 5 (41-176) 0 96 Wasser + 100 Gy 3/10 3 (43-76) 1 64 Wasser + 120 Gy 3/12 9 (22-140) 0 - Gesamt Wasser + IR 19/92 35 (22-176) 5 106/143 Die Bestimmung der lokalen Tumorkontrolle ergab keinen Unterschied zwischen NelfinavirBehandlung kombiniert mit fraktionierter Bestrahlung und alleiniger fraktionierter Bestrahlung (Abbildung 19) (p = 0,9). Die statistische Auswertung ergab für die TCD50 der Nelfinavir + IRGruppe eine Bestrahlungsdosis von 68,8 Gy (95 %-Konfidenzintervall: 50,8 Gy - 91,9 Gy) und für die Kontrollgruppe 64,6 Gy (95 %-Konfidenzintervall: 54,8 Gy - 83,4 Gy). 56 4 Ergebnisse Abbildung 19: Lokale Tumorkontrolle nach fraktionierter Bestrahlung in Kombination mit Nelfinavir. Beobachtete lokale Tumorkontrollraten (Symbole) und berechnete Tumorkontrollwahrschenlichkeiten (TCP) nach Behandlung mit Nelfinavir (80 mg/kg Körpergewicht) beziehungsweise dessen Trägersubstanz Wasser und Bestrahlung mit 30 Fraktionen innerhalb von 6 Wochen. Die Fehlerbalken geben das 95 %-Konfidenzintervall der TCD50 an. 57 5 Diskussion 5.1 VEGF-C- und NRP-2-Expression und -Herunterregulierung Für die Versuche wurden Zelllinien mit unterschiedlich hoher VEGF-C- und NRP-2Expression benötigt und anhand von Literaturdaten ausgewählt. Li et al. (2005) zeigten, dass PC-3 im Vergleich zu DU145 und LNCaP die höchste VEGF-C-Expression auf mRNA- und Proteinebene aufweist. Die VEGF-C-mRNA-Expression in DU145 betrug 66 % der Expression in PC-3 (Li et al., 2005) und war damit deutlich höher als in den DU145-Zellen, die in dieser Arbeit hier verwendet wurden (nur 12 % der Expression in PC-3). Die Angaben von Li et al. (2005) zur VEGF-C-Expression in LNCaP sind mit den hier vorliegenden Daten vergleichbar. Aufgrund des sehr geringen VEGF-C-Gehaltes wurde LNCaP für verschiedene Versuche humanes rekombinantes VEGF-C zugesetzt, um den Einfluss von VEGF-C auf die Strahlensensibilität untersuchen zu können. Für die NRP-2-Expression hingegen haben sich größere Unterschiede zu den Literaturdaten ergeben. Blanc et al. (2011) fanden auf mRNA-Ebene einen deutlich geringeren NRP-2Gehalt in LNCaP im Vergleich zu den NRP-2-Gehalten in PC-3 und DU145, welche in der gleichen Größenordnung lagen. Hingegen erkannten Goel et al. (2012) auf Proteinebene eine Korrelation zwischen der NRP-2-Expression und dem negativen PTEN-Status in den untersuchten Zelllinien sowie in Prostatatumorgewebe. Demzufolge würde DU145, welches funktionelles PTEN aufweist (Grünwald et al., 2002), weniger NRP-2 exprimieren als LNCaP. Dies ist in den in dieser Arbeit untersuchten Zelllinien jedoch nicht der Fall. Bei den hier verwendeten DU145-Zellen war eine Herunterregulierung von NRP-2 mittels siRNATransfektion effektiv möglich, im Gegensatz dazu für LNCaP aufgrund des zu geringen NRP-2-Gehaltes nicht. Die hohe NRP-2-Expression in PC-3 stimmt hingegen mit den Werten von Goel et al. (2012) überein. 5.2 Der Einfluss von VEGF-C auf die Strahlenresistenz Nach Yang et al. (2006) ist die Expression von VEGF-C im Prostatatumorgewebe relativ zum umgebenden Normalgewebe signifikant erhöht und nimmt mit fortschreitendem Stadium zu. Patientenstudien mit Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus und Blasenkarzinomen zeigten eine Korrelation zwischen erhöhten VEGF-C-Gehalten und einer schlechteren Überlebensrate nach Resektion (Tanaka et al., 2010) beziehungsweise tendenziell nach Resektion und Strahlentherapie (Keck et al., 2015). Dies kann zum einen durch eine höhere Strahlenresistenz bei Tumoren mit erhöhtem VEGF-C-Gehalt bedingt sein, zum anderen wäre der Effekt aber auch durch eine höhere Aggressivität solcher Tumoren im Sinne einer 59 5.3 Die Funktion von NRP-2 als Co-Rezeptor für VEGF-C bei der Vermittlung von Strahlenresistenz stärkeren Invasivität und frühzeitigen Metastasierung erklärbar. In einer von unserer Arbeitsgruppe veröffentlichten Patientenstudie mit resezierten und anschließend bestrahlten Prostatatumoren konnte dieser Zusammenhang ebenfalls festgestellt werden (Haberlau et al., 2014). In dieser Studie wurde ein häufigeres biochemisches Rezidiv (PSA, prostataspezifisches Antigen) für Tumoren mit VEGF-C-Überexpression beobachtet. Auch hier könnte ein biochemisches Rezidiv durch Metastasen oder durch ein Lokalrezidiv hervorgerufen werden. Somit liegt insgesamt ein Einfluss von VEGF-C auf die Strahlenresistenz nahe. Die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse der Koloniebildungsassays nach Herunterregulierung von VEGF-C in PC-3 und DU145 beziehungsweise nach Zugabe von humanem rekombinanten VEGF-C zu LNCaP unterstützen die oben genannten klinischen Daten und bestätigen eine VEGF-C-vermittelte Strahlenresistenz in vitro. 5.3 Die Funktion von NRP-2 als Co-Rezeptor für VEGF-C bei der Vermittlung von Strahlenresistenz Muders et al. (2009) haben in Prostatakarzinomzelllinien nach H2O2-induziertem oxidativen Stress festgestellt, dass VEGF-C die Signale zum Zellüberleben über den Co-Rezeptor NRP-2 transduziert. In den in der hier vorliegenden Arbeit durchgeführten Bestrahlungsversuchen kann jedoch ein genereller Einfluss der NRP-2-Signaltransduktion auf das Zellüberleben nicht bestätigt werden. Die Koloniebildungsassays mit PC-3 und DU145 ergaben gegensätzliche Ergebnisse dahingehend, dass in PC-3 NRP-2 signifikant zur Strahlensensibilität und in DU145 signifikant zur Strahlenresistenz beitrug. In den bereits unter 5.2 erwähnten Patientenstudien zum Blasenkarzinom von Keck et al. (2015) beziehungsweise innerhalb der Studie zum Prostatakarzinom (Haberlau et al., 2014) wurde neben VEGF-C auch der Einfluss von NRP-2 auf die Strahlenresistenz untersucht (bislang unveröffentlichte Daten). In diesen beiden Studien konnte kein signifikanter Zusammenhang festgestellt werden. Diese Resultate führen zu der Annahme, dass der Einfluss von NRP-2 auf die VEGF-Cvermittelte Strahlenresistenz abhängig von der Zelllinie oder dem jeweiligen Tumorgewebe sein könnte. Verantwortlich hierfür könnten die Interaktion von NRP-2 als Co-Rezeptor mit VEGFR-2 und die Verfügbarkeit von VEGFR-2 und -3 sein. Favier et al. (2006) und Gray et al. (2008) zeigten, dass NRP-2 das Zellüberleben in mikrovaskulären Endothelzellen beziehungsweise in kolorektalen Karzinomzelllinien vermittelt, dies jedoch über unterschiedliche nachgeschaltete Signalweiterleitung. Im ersten Fall interagierte NRP-2 mit VEGFR-2 und VEGFR-3, im zweiten Fall mit VEGFR-1 (Favier et 60 5 Diskussion al., 2006; Gray et al., 2008). Da Untersuchungen zufolge in Prostatatumorgewebe kein VEGFR-1 exprimiert ist (Goel et al., 2012), wird im Folgenden Bezug auf VEGFR-2 und VEGFR-3 genommen. Nach der Induktion von VEGF-C bildet dessen Rezeptor VEGFR-3 entweder ein Homodimer oder mit VEGFR-2 ein Heterodimer (Deng et al., 2015). Als Co-Rezeptor von VEGFR-2 erhöht NRP-2 die Zellantwort durch Verstärkung der VEGF-C-VEGFR-Bindung (Favier et al., 2006). Somit scheint eine Funktion von NRP-2 für die VEGF-C-vermittelte Strahlenresistenz in DU145 plausibel. Im Gegensatz zu der Erkenntnis von Favier et al. (2006) wurde aber auch gezeigt, dass die Blockade von NRP-2 die VEGFR-Aktivierung (Caunt et al., 2008) und die Signalweiterleitung nur geringfügig vermindert (Deng et al., 2015). Dass in PC-3 die Herunterregulierung von NRP-2 jedoch eine erhöhte Strahlenresistenz zur Folge hat, kann mit den eben beschriebenen Zusammenhängen nicht erklärt werden. Hierfür müssen andere Signalwege in Betracht gezogen werden. NRP-2 ist nicht nur Co-Rezeptor für VEGFR-2, sondern auch Co-Rezeptor für sekretierte Semaphorine der Klasse 3 (Sema3) (Tamagnone et al., 1999). Für Ovarial- und Prostatatumoren konnte von Jiang et al. (2015) und Yacoub et al. (2009) gezeigt werden, dass die Sema3A-Expression mit früheren pathologischen Stadien korreliert und höhere Sema3A-Gehalte eine bessere Prognose bedeuten. In verschiedenen Prostatakarzinomzelllinien sind Semaphorine, deren Rezeptoren – die Plexine – und Neuropiline (NRP-1 und NRP-2) co-exprimiert (Blanc et al., 2011). PC-3 weist von allen Semaphorinen der Klasse 3 mehr auf als DU145; die Gehalte von Plexinen der Gruppe A, welche mit den Neuropilinen assoziieren (Yoshida, 2012), weisen kaum Unterschiede auf (Blanc et al., 2011). Die Ergebnisse der hier vorliegenden Arbeit zeigten außerdem einen höheren NRP-2-Gehalt in PC-3 als in DU145. Möglicherweise könnte in PC-3 der Signalweg über die Semaphorine der Klasse 3 bevorzugt gegenüber dem Signalweg über VEGFR-2 ablaufen und somit zu einer gegensätzlichen Zellantwort führen. Diese Hypothese muss jedoch mit Vorsicht betrachtet werden, da sich in der Literatur bislang keine Hinweise dazu finden lassen, ob Semaphorine das Zellüberleben nach Bestrahlung beeinflussen. Weitere Untersuchungen in dieser Arbeit sollten zeigen, wie die Strahlenresistenz in Prostatakarzinomzelllinien vermittelt wird. Hierbei wurde teilweise nur für VEGF-C betrachtet, da NRP-2 in Abhängigkeit der untersuchten Zelllinie eine unterschiedliche Wirkung auf die Strahlenresistenz hatte. 61 5.4 VEGF-C-abhängige Akt- und ERK1/2-Regulierung unter Bestrahlung 5.4 VEGF-C-abhängige Akt- und ERK1/2-Regulierung unter Bestrahlung In der Literatur sind größtenteils Ergebnisse zu finden, in denen in unterschiedlichen Zelllinien (darunter PC-3) 10 min bis hin zu 24 h nach der Bestrahlung die Akt-Aktivierung induziert wird (Contessa et al., 2002; Edwards et al., 2002; Sunavala-Dossabhoy et al., 2004; Albert et al., 2006; Zhu et al., 2013). In den in der hier vorliegenden Arbeit beschriebenen Versuchen wurde in den PC-3 und DU145 Kontrollen (siSCR) 24 h nach Bestrahlung ebenfalls ein – jedoch nicht signifikanter – Anstieg von pAkt (Ser473) gezeigt. Die entsprechenden Ergebnisse nach VEGF-C- beziehungsweise NRP-2-Herunterregulierung waren jedoch nicht reproduzierbar, weshalb die Versuchsbedingungen analog zu den in verschiedenen Publikationen beschriebenen Bedingungen verändert wurden. Diese Versuche ergaben gegensätzliche Ergebnisse. Hierbei kam es durch Bestrahlung nach 10 min in PC-3 und in DU145 zu einer nicht signifikanten Abschwächung der Akt-Aktivierung. Dieses Resultat entspricht dem von Potiron et al. (2013), welche die gleichen Zelllinien unter ähnlichen Bedingungen untersuchten. Ebenso wie für Akt sind auch für ERK1/2 unterschiedliche Ergebnisse in der Literatur bezüglich der Aktivierung nach Bestrahlung zu finden. Yacoub et al. (2003) beispielsweise beschrieben eine rasche Zunahme von pERK1/2 nach Bestrahlung in DU145, aber eine Abnahme in LNCaP. In der hier vorliegenden Arbeit konnte für PC-3 und für DU145 eine nicht signifikante Abnahme der ERK1/2-Aktivierung nach Bestrahlung gezeigt werden. Im Gegensatz zu den eben erwähnten Autoren schlussfolgerten Huang et al. (2014) aus ihren Versuchen mit der Zervixkarzinomzelllinie HeLa, dass Bestrahlung möglicherweise die Akt- und ERK-Phosphorylierung vermindern kann, jedoch beobachteten sie gleichzeitig eine Hochregulierung des VEGF/VEGFR-2-Signalwegs, der zur Strahlenresistenz führte. Die in der hier vorliegenden Arbeit gewonnenen und den in Publikationen veröffentlichten Ergebnisse veranschaulichen die diffizil erfassbare und unterschiedliche Regulierung von Akt. Die hier gezeigten Untersuchungsergebnisse lassen vermuten, dass die ursprünglich vermutete strahleninduzierte und VEGF-C-vermittelte Aktivierung von Akt in PC-3 und DU145 nicht stattfindet. 5.5 Der Einfluss der Autophagie auf die Strahlenresistenz In weiteren Experimenten sollten mögliche zelluläre und molekulare Prozesse ermittelt werden, über die VEGF-C Strahlenresistenz vermittelt. Ein Mechanismus der hierbei untersucht wurde, ist die Autophagie. Diese kann durch Bestrahlung induziert werden und das Zellüberleben fördern, was unter anderem für Brust-, Kopf-Hals-, und Leberkarzinomzelllinien in vitro und für Lungenkarzinomzellen in vivo festgestellt wurde (Kim 62 5 Diskussion et al., 2008; Chaachouay et al., 2011; Chen et al., 2011; Tseng et al., 2011). Für Prostatakarzinomzelllinien, u.a. PC-3 und DU145, konnte bisher gezeigt werden, dass Autophagie infolge von Stress durch ein Chemotherapeutikum induziert wird (Stanton et al., 2013b) und zur Stressresistenz (Schutz vor Apoptose) gegenüber dem verwendeten Chemotherapeutikum führte (Stanton et al., 2013a). Die Autophagie wurde dabei über die VEGF-C/NRP-2-Achse, jedoch nicht über Akt vermittelt (Stanton et al., 2013b). In den hier vorliegenden Ergebnissen konnte nachvollzogen werden, dass in den PC-3Zellen nach VEGF-C-Herunterregulierung signifikant und nach NRP-2-Herunterregulierung nicht signifikant weniger Autophagie ablief. Jedoch hatte die Blockade der Autophagie durch Inhibierung von ATG5 mittels siRNA keinen Effekt auf das klonogene Überleben. Hieraus kann geschlussfolgert werden, dass die Strahlenresistenz zwar über VEGF-C vermittelt, jedoch nicht durch die Induktion von Autophagie erreicht wird. Entsprechend konnte auch keine klare Regulierung der Autophagie durch VEGF-C unter Bestrahlung nachgewiesen werden. 5.6 Der Einfluss von VEGF-C auf die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur Ein weiterer Mechanismus, der auf einen Einfluss von VEGF-C unter Bestrahlung untersucht wurde, ist die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur. Im Gegensatz zu dem in der Literatur beschriebenen fördernden Einfluss von VEGF-C auf die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur in normalen Lymphendothelzellen (Kesler et al., 2014), konnte hier in den Zellen mit blockierter VEGF-C-Expression keine signifikante Veränderung in der Anzahl der residuellen γH2AX-Foci festgestellt werden. Das Ergebnis ist kritisch zu betrachten, denn bereits die Anzahl residueller γH2AX-Foci in den unbehandelten Zellen war mit rund 20 Foci pro Zellkern auffallend hoch. Zu diesem Sachverhalt gibt es in der Literatur gegensätzliche Angaben. So veröffentlichten ErbaykentTepedelen et al. (2014) für die Zelllinie PC-3, dass rund 80 % der ausgewerteten Zellen keine und rund 20 % maximal 30 Foci pro Zellkern aufwiesen. Hingegen konnte in den in der hier vorliegenden Arbeit untersuchten Zellen kein Zellkern ohne Foci ermittelt werden. Potiron et al. (2013) zeigten weiterhin, dass PC-3-Zellen 24 h nach Bestrahlung im Mittel nur rund 6 Foci pro Zellkern hatten. Eine Erklärung für die unterschiedliche Foci-Anzahl könnte sein, dass im eigenen Versuch eventuell eine höhere Passagenzahl der untersuchten Zellen zum Zeitpunkt vor dem Anlegen des Kryostocks vorlag. Eine hierzu vergleichende Angabe findet sich in der Literatur allerdings nicht. Banáth et al. (2004) und Mirzayans et al. (2006) zeigten, dass in p53-defizienten Zellen die residuellen γH2AX-Foci auch längere Zeit als in normalen Zellen persistieren können. Da PC-3 ebenfalls p53-negativ ist, besteht die Möglichkeit, dass die DNA-Doppelstrangbrüche mit höherer Passage zunehmen. 63 5.7 Der Einfluss von VEGF-C auf den Zellzyklus 5.7 Der Einfluss von VEGF-C auf den Zellzyklus Die Zellzyklusanalyse ergab, dass sowohl die Transfektion mit VEGF-C-siRNA als auch die Bestrahlung in PC-3-Zellen einen G2/M-Arrest zur Folge haben. Während dieser Arrest in den nicht bestrahlten transfizierten Zellen nach 72 h wieder aufgehoben war, bestand der strahleninduzierte G2/M-Arrest weiterhin in den bestrahlten transfizierten Zellen. Da Zellen in der G2/M-Phase am strahlensensibelsten sind (Pawlik und Keyomarsi, 2004), wird hier eine Korrelation mit dem Ergebnis aus dem Koloniebildungsassay, in dem der strahlensensibilisierende Effekt der VEGF-C-Blockade nachgewiesen wurde, angenommen. Dagegen zeigte die Zellzyklusanalyse mit DU145 keine Unterschiede zwischen transfizierten Zellen und der Kontrolle. Somit kann vermutet werden, dass ein potentieller Mechanismus der VEGF-C-vermittelten Strahlenresistenz die Aufhebung des G2/M-Arrests sein könnte, dies aber abhängig von der untersuchten Zelllinie ist. Möglicherweise besteht hier eine Abhängigkeit zum VEGFR-2-Gehalt der Zellen, wie folgende Ausführung zeigt. Die dargestellten Ergebnisse zur Zelllinie PC-3 sind konform zu den Erkenntnissen von Huang et al. (2014). Diese zeigten für die Zervixkarzinomzelllinie HeLa, dass eine VEGF/VEGFR-2-Blockade zum G2/M-Arrest führt und dass der durch VEGF/VEGFR-2 nach Bestrahlung beschleunigte Ablauf des Zellzyklus unabhängig von Akt ist (Huang et al., 2014). Konkret auf VEGF-C bezogen sich Michaelsen et al. (2016) und wiesen eine reduzierte Proliferation nach Herunterregulierung von VEGF-C von VEGFR-2-positiven Glioblastomkarzinomzellen in vitro und in vivo nach. Diese korrelierte mit dem G2/M-Arrest und der über VEGF-C induzierten Apoptose. In der Literatur lassen sich hierzu auch gegensätzliche Erkenntnisse finden, bei denen VEGF-C zu einem erhöhten G2/M-Arrest führt (Kesler et al., 2014). Dies wurde jedoch für normale Lymphendothelzellen beschrieben. Hieraus lässt sich eventuell ein interessanter Therapieansatz ableiten, bei dem in Abhängigkeit von den Zelleigenschaften ein G2/M-Arrest durch VEGF-C-Blockade erreicht und damit die Wirksamkeit der Bestrahlung erhöht werden könnte. Weiterhin zeigten Kesler et al. (2014), dass die Lymphendothelzellen nach Zusatz von VEGF-C 20 Stunden nach Bestrahlung mit 4 Gy und 8 Gy vermehrt γH2AX-Foci aufwiesen. In den in dieser Arbeit gezeigten Ergebnissen konnte jedoch trotz des G2/M-Arrests kein Einfluss von VEGF-C auf die DSB-Reparatur festgestellt werden. Mögliche Gründe hierfür wurden bereits im Abschnitt 5.6 diskutiert. Deckbar et al. (2007) zeigten, dass ein G2/M-Arrest aufgehoben wird, sobald nur noch rund 20 γH2AX-Foci pro Zelle verbleiben. Es ergibt sich daher die Hypothese, dass ein höherer VEGF-C-Gehalt zur Anhebung dieser Toleranz und so zur Strahlenresistenz beiträgt. 64 5 Diskussion 5.8 Der Einfluss von Nelfinavir auf das Wachstum und auf die Strahlenresistenz von PC-3-Zellen in vitro und in vivo Für die Untersuchungen zum Einfluss von Nelfinavir auf das Wachstum und die Strahlenresistenz in vitro und in vivo wurde die Zelllinie PC-3 verwendet. Für diese Zelllinie ist aus der Literatur bekannt, dass Nelfinavir in vitro die Akt-Aktivierung inhibiert (Yang et al., 2005). Für andere Tumorentitäten wurde in vivo ebenfalls eine erfolgreiche Akt-Inhibierung gezeigt (Gupta et al., 2005). In den in dieser Arbeit durchgeführten Versuchen hatte Nelfinavir ohne Bestrahlung trotz Blockade der Akt-Aktivierung nur einen geringen und nicht signifikanten Effekt auf das klonogene Überleben in vitro beziehungsweise auf das Tumorwachstum in vivo. Mathur et al. veröffentlichten 2014 vergleichbare Untersuchungsergebnisse zum Einfluss von Nelfinavir auf das Überleben und das Tumorwachstum von Prostatakarzinomzelllinien, darunter PC-3 und LNCaP C4-2B. Hierbei wurde zwar ein anderes Behandlungsschema als in dieser Arbeit angewendet, sie fanden aber ebenfalls eine nicht signifikante Inhibierung des Zellüberlebens in vitro und keinen signifikanten Einfluss auf das Tumorwachstum in vivo. In der Studie von Yang et al. (2005) hingegen hatte Nelfinavir eine signifikante Wachstumsverzögerung von Xenografts der Prostatakarzinomzelllinie LNCaP zur Folge. Diese wurde sogar durch eine im Vergleich zu dieser Arbeit geringere Dosis und kürzere Anwendungsdauer von Nelfinavir erreicht. Innerhalb des gleichen Datensatzes zeigten Yang et al. (2005) außerdem, dass Nelfinavir auch die Proliferation von DU145 in vitro inhibiert. DU145 ist eine Prostatakarzinomzelllinie, deren Akt nicht konstitutiv aktiviert ist – im Gegensatz zu den Zelllinien LNCaP und PC-3 (Grünwald et al., 2002). Jedoch war der Effekt in DU145 geringer als in PC-3 und LNCaP, wobei letztere am stärksten auf Nelfinavir ansprach (Yang et al., 2005). Aus den nach dem Linear-Quadratischen-Modell berechneten Kurvenverläufen des Koloniebildungsassays wäre abzuleiten, dass Nelfinavir in Kombination mit der Bestrahlung zum signifikant verbesserten klonogenen Überleben von PC-3-Zellen, das heißt zu einer Steigerung der Strahlenresistenz, führt (siehe Abbildung 17C). Dies erscheint aber fraglich, da der Unterschied zwischen den Gruppen trotz der statistischen Signifikanz extrem gering ist. Da für Zelllinien verschiedener Tumorentitäten bekannt ist, dass Nelfinavir allein einen eher geringeren Effekt hat, aber vor allem in vivo, mehr als in vitro, strahlensensibilisierend wirkt (was auf Mikromilieu-Effekte im Tumor zurückgeführt wurde) (Pore et al., 2006; Jiang et al., 2007; Zeng et al., 2011), wäre in dem in dieser Arbeit durchgeführten Tierversuch mit kombinierter Therapie ein strahlensensibilisierender Effekt von Nelfinavir zu erwarten 65 5.8 Der Einfluss von Nelfinavir auf das Wachstum und auf die Strahlenresistenz von PC-3Zellen in vitro und in vivo gewesen. Dies konnte jedoch nicht bestätigt werden. Nelfinavir verbesserte den kurativen Effekt der Bestrahlung nicht. Aus verschiedenen zusammengefasst, Veröffentlichungen dass die durch wurde Nelfinavir von Bernstein blockierte und Dennis Akt-Aktivierung (2008) und die Strahlensensibilität nicht immer korrelieren. Der Erfolg der Nelfinaviranwendung kombiniert mit Bestrahlung steht also nicht nur in Abhängigkeit von der Funktionalität des PI3K/AktSignalweges, sondern auch von weiteren zellulären Mechanismen, die durch Nelfinavir beeinflusst werden können. Nelfinavir greift neben dem PI3K/Akt-Signalweg in eine Reihe anderer Signalwege ein. So inhibiert Nelfinavir beispielsweise STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3), ERK1/2, den Androgen Rezeptor und Bcl-2 (Ikezoe et al., 2004; Yang et al., 2005, 2006b), welche sonst zur Strahlenresistenz einer Zelle beitragen (Gilbert et al., 1996; Cho et al., 2002; Wang et al., 2006; Yin et al., 2011b; Polkinghorn et al., 2013). Nelfinavir bewirkt außerdem eine Herunterregulierung von VEGF und HIF1α (hypoxiainducible factor 1- α), was grundsätzlich sekundär zur Akt-Inhibierung erfolgen könnte (Pore et al., 2006). Dadurch werden weniger nicht funktionelle Blutgefäße gebildet, was eine verstärkte Oxigenierung des Tumors und eine Strahlensensibilisierung zur Folge hat (Pore et al., 2006). Weiterhin induziert Nelfinavir Stressreaktionen des Endoplasmatischen Retikulums, welche zur Strahlensensibilisierung führt (Isohashi et al., 2008). Durch diesen wird einerseits Apoptose eingeleitet (Gills et al., 2007; Brüning et al., 2010, 2012; Guan et al., 2012), andererseits wird auch überlebensfördernde Autophagie induziert (Gills et al., 2007; Brüning et al., 2010; Guan et al., 2012; Johnson et al., 2015). Nelfinavir greift gemäß dieser Veröffentlichungen also in verschiedene überlebensfördernde und -hemmende Signalwege ein, welche in den verschiedenen Tumorzellen unterschiedlich stark exprimiert sind. Möglicherweise wäre eine Vorhersage über den Erfolg einer Nelfinavirbehandlung auch in Kombination mit einer Bestrahlung nach Bewertung der Expression der Zielmoleküle für die jeweiligen Tumorzellen möglich und sinnvoll. Hierzu müssten zuvor Versuche durchgeführt werden, in denen eine mögliche Korrelation zwischen den Signalwegexpressionen und der Wirkung von Nelfinavir untersucht werden. Da sich in dieser Arbeit für die Zelllinie PC-3 herausgestellt hat, dass Nelfinavir keinen strahlensensibilisierenden Effekt hat, könnten einerseits Versuche zur Definition von potentiellen Biomarkern für die Wirksamkeit von Nelfinavir angestrebt werden, andererseits auch Experimente zur Kombination mit Chemotherapeutika. Die Kombination von Nelfinavir mit Radiochemotherapie wurde bereits in klinischen Phase I-Studien mit einer akzeptablen Toxizität und vielversprechendem Ansprechen auf die Therapie für Pankreas-, Rektal- und Lungenkarzinomen durchgeführt (Brunner et al., 2008; Rengan et al., 2012; Buijsen et al., 2013). 66 5 Diskussion 5.9 Schlussfolgerung und Ausblick Zusammenfassend betrachtet wurden folgende neue Erkenntnisse aus den Versuchen gewonnen: (1) VEGF-C vermittelt in allen drei untersuchten Prostatakarzinomzelllinien (PC-3, DU145, LNCaP) Strahlenresistenz. (2) NRP-2 führt in Abhängigkeit von der Zelllinie zur Strahlenresistenz (DU145) oder Strahlensensibilisierung (PC-3). (3) VEGF-C beeinflusst in bestrahlten oder unbestrahlten PC-3- und in DU145-Zellen weder die Akt- noch die ERK1/2-Aktivierung. (4) In unbestrahlten PC-3-Zellen fördert VEGF-C die Autophagie, NRP-2 jedoch nicht. Unter Bestrahlung ist ein Effekt beider Proteine nicht reproduzierbar nachweisbar. In PC-3 hat Autophagie keinen Einfluss auf das klonogene Überleben nach Bestrahlung. (5) VEGF-C hat in PC-3 keinen Einfluss auf die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur. (6) Eine Verminderung des VEGF-C-Gehalts führt in PC-3 zum G2/M-Arrest; in DU145 konnte kein Effekt beobachtet werden. (7) Die Blockade von Akt durch Nelfinavir führt in PC-3-Xenografts zu keiner Tumorwachstumsverzögerung und wirkt in vitro und in vivo nicht strahlensensibilisierend. In den Versuchen konnte gezeigt werden, dass VEGF-C Strahlenresistenz vermittelt. Dies könnte als ein Forschungsansatz zur Entwicklung einer kombinierten Therapie aus VEGF-CBlockade und Bestrahlung dienen. Die Blockade von VEGF-C könnte hierfür weitergehend in vivo mit Prostatakarzinomzelllinien und transplantiertem Tumormaterial aus Patienten getestet werden. Hierbei sollte auch die Untersuchung der Zellen bezüglich eines G2/MArrests zur weiteren Klärung, in welchem Umfang VEGF-C über diesen Mechanismus Strahlenresistenz vermittelt, im Focus stehen. In Bezug auf das Ergebnis (2) sollten weiterführende Untersuchungen zum Einfluss von NRP-2 auf die Strahlenresistenz erfolgen. Hierbei wäre vor allem Rolle von Semaphorinen der Klasse 3 zu klären. Die in der vorliegenden Arbeit erhaltenen Ergebnisse aus den Versuchen mit Nelfinavir sowie die diesbezüglichen Erkenntnisse aus bereits genannten Veröffentlichungen lassen den Schluss zu, dass Tumorzellen unterschiedlich stark auf Nelfinavir reagieren. Da Nelfinavir in eine Reihe von Signalwegen eingreift, welche das Zellüberleben fördern oder hemmen, sollte weiter geklärt werden, ob Tumorzellen mit einem bestimmten genetischen Profil besser auf die Behandlung mit Nelfinavir ansprechen. In der hier durchgeführten Tierstudie wurde erstmals der Endpunkt lokale Tumorkontrolle in vivo nach kombinierter Therapie von Nelfinavir und Bestrahlung getestet. Hierbei zeigte sich, dass Nelfinavir 67 in PC-3-Xenografts für diesen klinisch relevanten Endpunkt der 5.9 Schlussfolgerung und Ausblick Strahlentherapie zu keinem Vorteil führt. Die Untersuchungen zur lokalen Tumorkontrolle sollten jedoch für andere Tumormodelle fortgeführt werden, da, wie in Abschnitt 2.5 bereits ausgeführt, andere in vivo-Studien mit anderen Tumorentitäten gezeigt haben, dass die Kombination von Nelfinavir und Bestrahlung zumindest zur Tumorwachstumsverzögerung führt. 68 6 Zusammenfassung Hintergrund Die Strahlentherapie ist neben der radikalen Prostatektomie eine Standardtherapie zur Behandlung von Prostatatumoren und führt zu sehr guten Ergebnissen für die lokale Tumorkontrolle und für das Überleben. Allerdings ist, wie bei der Operation auch, dabei das Risiko eines Rezidivs für fortgeschrittene Tumoren im Gegensatz zu Tumoren in früheren Stadien relativ hoch. Daher besteht eine hohe Dringlichkeit zur Verbesserung der Strahlentherapie vor allem bei fortgeschrittenen Tumoren. Ein Ansatz hierfür ist die Kombination der Bestrahlung mit molekularen Therapien. Ziel dabei ist es, bestimmte Zielproteine zu blockieren, um die Strahlensensibilität der Prostatakarzinomzellen zu erhöhen. Ein potentielles Target könnte hierbei die Blockade des VEGF-C/NRP-2/AktSignalwegs (VEGF-C – vascular endothelial growth factor C; NRP-2 – Neuropilin 2; Akt – Proteinkinase B) sein. Im Prostatakarzinom sind die Konzentrationen von VEGF-C und NRP-2 im Vergleich zu normalen Prostatazellen erhöht. Aus Untersuchungen ist bekannt, dass beide Proteine eine progressive Wirkung auf die Tumorgenese haben. In Vorarbeiten zeigen Muders et al. (2009) zudem eine Aktivierung von Akt über die VEGF-C/NRP-2-Achse und eine darüber vermittelte Resistenz gegenüber oxidativem Stress durch H2O2. Akt wirkt in verschiedenen Tumorentitäten außerdem protektiv gegenüber Bestrahlung. Es besteht die Annahme, dass dies auch für Prostatakarzinomzellen gilt. Zielstellung Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob und über welchen Mechanismus VEGF-C, NRP-2 und Akt die Strahlenresistenz in Prostatakarzinomzelllinien beeinflussen. Methoden Es wurden in vitro- und in vivo-Experimente in den humanen Prostatakarzinomzelllinen PC-3, DU145, LNCaP sowie in PC-3-Xenografts durchgeführt. Der Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Strahlenresistenz wurde in vitro nach Herunterregulierung der entsprechenden Gene mittels siRNA beziehungsweise nach Supplementierung mit humanem rekombinanten VEGF-C in Koloniebildungsassays untersucht. Zur Ermittlung des Einflusses von VEGF-C und von NRP-2 auf mögliche Zellüberlebensmechanismen wurden der autophagische Flux nach Blockade der Autophagie mit Bafilomycin A1 mittels Western Blot, die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur mittels Quantifizierung der γH2AX Foci sowie die Zellzyklusverteilung mittels Durchflusszytometrie untersucht. Die Signalweiterleitung von 69 6 Zusammenfassung VEGF-C über Akt sowie, als weitere Möglichkeit, die Signalweiterleitung über ERK1/2 wurden nach siRNA-Transfektion mit und ohne Bestrahlung mittels Western Blot geprüft. Weitere Versuche zu Akt erfolgten in vitro und in vivo mit dem PI3K/Akt-Inhibitor Nelfinavir in PC-3-Zellen. Der in vitro-Effekt von Nelfinavir auf die Strahlenresistenz wurde dabei mithilfe eines Koloniebildungsassays nach Behandlung der Zellen mit 10 µM Nelfinavir getestet. In vivo wurde die Wirkung von Nelfinavir ohne sowie in Kombination mit Bestrahlung in PC-3Xenografts in Nacktmäusen untersucht. Für die Bestimmung der Tumorwachstumszeit wurden die Mäuse mit 80 mg Nelfinavir/kg Körpergewicht 30 mal innerhalb von 6 Wochen behandelt. In einem weiteren Versuch wurde die lokale Tumorkontrolle bei gleichzeitiger fraktionierter Bestrahlung mit Gesamtdosen von 30 bis 120 Gy und einer Nachbeobachtungszeit von 180 Tagen bestimmt. Ergebnisse Die Untersuchungen zur Strahlenresistenz über den VEGF-C/NRP-2/Akt-Signalweg haben ergeben, dass in den drei Prostatakarzinomzelllinien PC-3, DU145 und LNCaP VEGF-C signifikant Strahlenresistenz vermittelt. Für NRP-2 hingegen wurde festgestellt, dass es in Abhängigkeit von der Zelllinie entweder zur Strahlenresistenz (DU145) oder zur Strahlensensibilisierung (PC-3) führt. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass durch VEGF-C in PC-3 und DU145 weder über Akt noch über ERK1/2 Strahlenresistenz vermittelt wird. Die Versuche zu Strahlenresistenz vermittelnden Mechanismen ergaben, dass VEGF-C in unbestrahlten PC-3-Zellen die Autophagie fördert, NRP-2 jedoch nicht. Unter Bestrahlung war ein Effekt von VEGF-C und NRP-2 auf die Autophagie nicht reproduzierbar nachweisbar. Ein weiterer Versuch hat gezeigt, dass in PC-3 Autophagie keinen Einfluss auf das klonogene Überleben nach Bestrahlung hat. Außerdem wurde festgestellt, dass VEGF-C in PC-3 die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur nicht beeinflusst. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass eine Verminderung des VEGF-C-Gehalts in PC-3 zum G2/M-Arrest führt. In DU145 konnte jedoch kein Effekt beobachtet werden. In den Untersuchungen zum Einfluss von Akt auf die Strahlenresistenz unabhängig von VEGF-C und NRP-2 wirkte Nelfinavir inhibierend auf die Akt-Phosphorylierung am Ser473 und beeinflusste das klonogene Überleben von PC-3-Zellen minimal. In PC-3-Xenografts führte Nelfinavir zu keiner Tumorwachstumsverzögerung und wirkte in vitro und in vivo nicht strahlensensibilisierend. Schlussfolgerung In den Versuchen konnte gezeigt werden, dass VEGF-C in Prostatakarzinomzellen Strahlenresistenz vermittelt. Diese Erkenntnis könnte als ein Forschungsansatz zur 70 6 Zusammenfassung Entwicklung einer kombinierten Therapie aus VEGF-C-Blockade und Bestrahlung dienen. Ein potentieller Mechanismus, über den VEGF-C die Strahlenresistenz vermittelt, ist, in Abhängigkeit von der Zelllinie, die Aufhebung des G2/M-Arrests. NRP-2 wirkt in der Vermittlung von Strahlenresistenz beziehungsweise -sensibilität je nach Zelllinie unterschiedlich. Hierzu sollten weitere Untersuchungen bezüglich möglicher Interaktionen innerhalb anderer Signalwege mit strahlensensibilisierendem Einfluss erfolgen. Innerhalb des untersuchten Signalwegs konnte weiterhin festgestellt werden, dass VEGF-C Strahlenresistenz nicht über Akt vermittelt. Die vorliegende Arbeit enthält die erste Studie sowohl zur Untersuchung des Einflusses von Nelfinavir in Kombination mit Bestrahlung auf das Überleben von Prostatakarzinomzellen in vitro als auch auf die Tumorwachstumszeit und die lokale Tumorkontrolle in vivo. Hierin konnte keine strahlensensibilisierende Wirkung von Nelfinavir nachgewiesen werden. Da Nelfinavir in Zellen anderer Tumorentitäten strahlensensibilisierend wirkt und außerdem bekannt ist, dass es in eine Reihe von Signalwegen eingreift, die das Zellüberleben fördern oder hemmen, sollte weiter geklärt werden, ob Tumorzellen mit einem bestimmten genetischen Profil besser auf die Behandlung mit Nelfinavir ansprechen. 71 7 Abstract Background In addition to radical prostatectomy, radiotherapy is a standard therapy for the treatment of prostate tumours and leads to good results for local tumour control and survival. However, as with the resection, the risk of recurrence for advanced tumours is relatively high compared to tumours in earlier stages. Therefore, there is a high urgency to improve radiotherapy especially for advanced stages. One approach is the combination of irradiation with molecular therapies. The aim is to block certain target proteins to increase the radiosensitivity of the prostate carcinoma cells. A potential target could be the blockade of the VEGF-C/NRP-2/Akt signalling pathway (VEGF-C – vascular endothelial growth factor C; NRP-2 – neuropilin 2; Akt – protein kinase B). In prostate cancer the concentrations of VEGF-C and NRP-2 are increased compared to normal prostate cells. Studies have shown that both proteins have a progressive effect on tumourigenesis. In preliminary work Muders et al. (2009) also showed the activation of Akt via the VEGF-C/NRP-2 axis and a resistance to H2O2 induced oxidative stress. Akt also has a protective effect against irradiation in various tumour entities. It is assumed that this also applies to prostate carcinoma cells. Aim of the study Within the framework of this thesis, it was investigated whether and via which mechanism VEGF-C, NRP-2, and Akt affect the radioresistance in prostate carcinoma cell lines. Methods In vitro and in vivo experiments were performed in the human prostate carcinoma cell lines PC-3, DU145, LNCaP, as well as in PC-3 xenografts. The influence of VEGF-C and NRP-2 on the radioresistance was examined in vitro after knock down of the corresponding genes using siRNA or after supplementation with human recombinant VEGF-C in colony formation assays. In order to determine the influence of VEGF-C and NRP-2 on possible cell survival mechanisms, the autophagic flux was examined after the blockade of autophagy with bafilomycin A1 using western blot, the DNA double strand break repair by quantification of the γH2AX foci, and the cell cycle distribution by flow cytometry. The signal transduction of VEGF-C via Akt as well as, as a further possibility, the signal transduction via ERK1/2 were tested after siRNA transfection with and without irradiation using western blot. Further experiments on Akt were performed in vitro and in vivo with the PI3K/Akt inhibitor nelfinavir in PC-3 cells. The in vitro effect of nelfinavir on radioresistance was tested using a colony 72 7 Abstract formation assay after treatment of the cells with 10 μM nelfinavir. In vivo, the effect of nelfinavir without and in combination with irradiation in PC-3 xenografts was investigated in nude mice. For the determination of the tumour growth time, the mice were treated with 80 mg nelfinavir/kg body weight 30 times within 6 weeks. In a further experiment, the local tumour control was determined with simultaneous fractionated irradiation with total doses of 30 to 120 Gy and a follow-up time of 180 days. Results The investigations on radioresistance via the VEGF-C/NRP-2/Akt signalling pathway showed that in the three prostate carcinoma cell lines PC-3, DU145, and LNCaP VEGF-C significantly mediates radioresistance. For NRP-2 however, it was found that, depending on the cell line, it either leads to radioresistance (DU145) or radiosensitization (PC-3). Further, it was shown that in PC-3 and DU145 VEGF-C does not mediate radioresistance via Akt or ERK1/2. The experiments on radioresistance mediating mechanisms revealed that VEGF-C promotes autophagy in untreated PC-3 cells, but NRP-2 does not. Under irradiation, an effect of VEGF-C and NRP-2 on autophagy could not be detected reproducibly. A further experiment has shown that in PC-3 autophagy has no influence on the clonogenic survival after irradiation. In addition, it was found that VEGF-C does not affect the DNA double strand break repair in PC-3. Furthermore, it was shown that a reduction in the VEGF-C content leads to a G2/M arrest in PC-3. However, no effect could be observed in DU145. In studies regarding the influence of Akt on radioresistance independent of VEGF-C and NRP-2, nelfinavir inhibited Akt phosphorylation at Ser473 and minimally affected the clonogenic survival of PC-3 cells. In PC-3 xenografts, nelfinavir did not lead to any tumour growth delay and did not have a radiosensitizing effect in vitro or in vivo. Conclusion In the experiments, it was shown that VEGF-C mediates radioresistance in prostate cancer cells. This finding could serve as a research approach for the development of a combined therapy of a VEGF-C blockade and irradiation. A potential mechanism by which VEGF-C mediates radioresistance is the reverse of the G2/M arrest, depending on the cell line. NRP-2 acts differently in the mediation of radioresistance or radiosensitivity, depending on the cell line. On this, further investigations should be carried out with regard to possible interactions within other signalling pathways with a radiosensitizing influence. Within the investigated signalling pathway, it was further shown that VEGF-C does not mediate radioresistance via Akt. 73 7 Abstract The present work contains the first study examining the effect of nelfinavir in combination with irradiation on prostate cancer cell survival in vitro as well as on growth time and local tumour control in vivo. Herein no radiosensitizing effects of nelfinavir could be detected. Since nelfinavir radiosensitizes cells of other tumour entities and is also known to interfere with a series of signalling pathways that promote or inhibit cell survival, it should be clarified whether tumour cells with a particular genetic profile are more responsive to treatment with nelfinavir. 74 8 Literaturverzeichnis Albert JM, Kim KW, Cao C, Lu B. 2006. Targeting the Akt/mammalian target of rapamycin pathway for radiosensitization of breast cancer. Mol Cancer Ther 5:1183–1189. Altomare DA, Testa JR. 2005. Perturbations of the AKT signaling pathway in human cancer. Oncogene 24:7455. Anai S, Shiverick K, Medrano T, Nakamura K, Goodison S, Brown BD, Rosser CJ. 2007. Downregulation of BCL-2 induces downregulation of carbonic anhydrase IX, vascular endothelial growth factor, and pAkt and induces radiation sensitization. Urology 70:832–837. Anbalagan S, Pires IM, Blick C, Hill MA, Ferguson DJP, Chan DA, Hammond EM. 2012. Radiosensitization of renal cell carcinoma in vitro through the induction of autophagy. Radiother Oncol 103:388–393. Andreassen PR, Martineau SN, Margolis RL. 1996. Chemical induction of mitotic checkpoint override in mammalian cells results in aneuploidy following a transient tetraploid state. Mutat Res Mol Mech Mutagen 372:181–194. Aoki H, Takada Y, Kondo S, Sawaya R, Aggarwal BB, Kondo Y. 2007. Evidence That Curcumin Suppresses the Growth of Malignant Gliomas in Vitro and in Vivo through Induction of Autophagy: Role of Akt and Extracellular Signal-Regulated Kinase Signaling Pathways. Mol Pharmacol 72:29–39. Apel A, Herr I, Schwarz H, Rodemann HP, Mayer A. 2008. Blocked Autophagy Sensitizes Resistant Carcinoma Cells to Radiation Therapy. Cancer Res 68:1485–1494. Appukuttan A, Flacke J-P, Flacke H, Posadowsky A, Reusch HP, Ladilov Y. 2014. Inhibition of soluble adenylyl cyclase increases the radiosensitivity of prostate cancer cells. Biochim Biophys Acta BBA - Mol Basis Dis 1842:2656–2663. Baede-van Dijk PA, Hugen PW, Verweij-van Wissen CP, Koopmans PP, Burger DM, Hekster YA. 2001. Analysis of variation in plasma concentrations of nelfinavir and its active metabolite M8 in HIV-positive patients. AIDS Lond Engl 15:991–998. Banáth JP, MacPhail SH, Olive PL. 2004. Radiation Sensitivity, H2AX Phosphorylation, and Kinetics of Repair of DNA Strand Breaks in Irradiated Cervical Cancer Cell Lines. Cancer Res 64:7144–7149. Baumann M, Dubois W, Suit HD. 1990. Response of human squamous cell carcinoma xenografts of different sizes to irradiation: relationship of clonogenic cells, cellular radiation sensitivity in vivo, and tumor rescuing units. Radiat Res 123:325–330. Bernstein WB, Dennis PA. 2008. Repositioning HIV Protease Inhibitors as Cancer Therapeutics. Curr Opin HIV AIDS 3:666–675. Blanc V, Nariculam J, Munson P, Freeman A, Klocker H, Masters J, Williamson M. 2011. A role for class 3 semaphorins in prostate cancer. The Prostate 71:649–658. Bonni A, Brunet A, West AE, Datta SR, Takasu MA, Greenberg ME. 1999. Cell Survival Promoted by the Ras-MAPK Signaling Pathway by Transcription-Dependent and Independent Mechanisms. Science 286:1358–1362. 75 8 Literaturverzeichnis Boucher MJ, Morisset J, Vachon PH, Reed JC, Lainé J, Rivard N. 2000. MEK/ERK signaling pathway regulates the expression of Bcl-2, Bcl-X(L), and Mcl-1 and promotes survival of human pancreatic cancer cells. J Cell Biochem 79:355–369. Bourré L, Simonneaux G, Ferrand Y, Thibaut S, Lajat Y, Patrice T. 2003. Synthesis, and in vitro and in vivo evaluation of a diphenylchlorin sensitizer for photodynamic therapy. J Photochem Photobiol B 69:179–192. Breen AP, Murphy JA. 1995. Reactions of oxyl radicals with DNA. Free Radic Biol Med 18:1033–1077. Brüning A, Friese K, Burges A, Mylonas I. 2010. Tamoxifen enhances the cytotoxic effects of nelfinavir in breast cancer cells. Breast Cancer Res 12:R45. Brüning A, Matsingou C, Brem GJ, Rahmeh M, Mylonas I. 2012. Inhibin beta E is upregulated by drug-induced endoplasmic reticulum stress as a transcriptional target gene of ATF4. Toxicol Appl Pharmacol 264:300–304. Brunner TB, Geiger M, Grabenbauer GG, Lang-Welzenbach M, Mantoni TS, Cavallaro A, Sauer R, Hohenberger W, McKenna WG. 2008. Phase I Trial of the Human Immunodeficiency Virus Protease Inhibitor Nelfinavir and Chemoradiation for Locally Advanced Pancreatic Cancer. J Clin Oncol 26:2699–2706. Buijsen J, Lammering G, Jansen RLH, Beets GL, Wals J, Sosef M, Den Boer MO, Leijtens J, Riedl RG, Theys J, Lambin P. 2013. Phase I trial of the combination of the Akt inhibitor nelfinavir and chemoradiation for locally advanced rectal cancer. Radiother Oncol 107:184– 188. Byrne AM, Bouchier-Hayes DJ, Harmey JH. 2005. Angiogenic and cell survival functions of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF). J Cell Mol Med 9:777–794. Cao C, Subhawong T, Albert JM, Kim KW, Geng L, Sekhar KR, Gi YJ, Lu B. 2006. Inhibition of Mammalian Target of Rapamycin or Apoptotic Pathway Induces Autophagy and Radiosensitizes PTEN Null Prostate Cancer Cells. Cancer Res 66:10040–10047. Carón RW, Yacoub A, Mitchell C, Zhu X, Hong Y, Sasazuki T, Shirasawa S, Hagan MP, Grant S, Dent P. 2005. Radiation-stimulated ERK1/2 and JNK1/2 signaling can promote cell cycle progression in human colon cancer cells. Cell Cycle Georget Tex 4:456–464. Caunt M, Mak J, Liang W-C, Stawicki S, Pan Q, Tong RK, Kowalski J, Ho C, Reslan HB, Ross J, Berry L, Kasman I, et al. 2008. Blocking Neuropilin-2 Function Inhibits Tumor Cell Metastasis. Cancer Cell 13:331–342. Celeste A, Fernandez-Capetillo O, Kruhlak MJ, Pilch DR, Staudt DW, Lee A, Bonner RF, Bonner WM, Nussenzweig A. 2003. Histone H2AX phosphorylation is dispensable for the initial recognition of DNA breaks. Nat Cell Biol 5:675–679. Chaachouay H, Ohneseit P, Toulany M, Kehlbach R, Multhoff G, Rodemann HP. 2011. Autophagy contributes to resistance of tumor cells to ionizing radiation. Radiother Oncol 99:287–292. Chen J-C, Chang Y-W, Hong C-C, Yu Y-H, Su J-L. 2012. The Role of the VEGF-C/VEGFRs Axis in Tumor Progression and Therapy. Int J Mol Sci 14:88–107. Chen YS, Song HX, Lu Y, Li X, Chen T, Zhang Y, Xue JX, Liu H, Kan B, Yang G, Fu T. 2011. Autophagy inhibition contributes to radiation sensitization of esophageal squamous carcinoma cells: Autophagy inhibition. Dis Esophagus 24:437–443. 76 8 Literaturverzeichnis Chiu H-W, Chen Y-A, Ho S-Y, Wang Y-J. 2012. Arsenic trioxide enhances the radiation sensitivity of androgen-dependent and -independent human prostate cancer cells. PloS One 7:e31579. Cho HN, Lee YJ, Cho CK, Lee SJ, Lee Y-S. 2002. Downregulation of ERK2 is essential for the inhibition of radiation-induced cell death in HSP25 overexpressed L929 cells. Cell Death Differ 9:448–456. Chowdhury D, Keogh M-C, Ishii H, Peterson CL, Buratowski S, Lieberman J. 2005. γ-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair. Mol Cell 20:801–809. Contessa JN, Hampton J, Lammering G, Mikkelsen RB, Dent P, Valerie K, Schmidt-Ullrich RK. 2002. Ionizing radiation activates Erb-B receptor dependent Akt and p70 S6 kinase signaling in carcinoma cells. Oncogene 21:4032–4041. Cuneo KC, Tu T, Geng L, Fu A, Hallahan DE, Willey CD. 2007. HIV Protease Inhibitors Enhance the Efficacy of Irradiation. Cancer Res 67:4886–4893. Dal Pra A, Locke JA, Borst G, Supiot S, Bristow RG. 2016. Mechanistic Insights into Molecular Targeting and Combined Modality Therapy for Aggressive, Localized Prostate Cancer. Front Oncol 6:24. Deckbar D, Birraux J, Krempler A, Tchouandong L, Beucher A, Walker S, Stiff T, Jeggo P, Löbrich M. 2007. Chromosome breakage after G2 checkpoint release. J Cell Biol 176:749– 755. Delaney G, Jacob S, Barton M. 2005. Estimating the optimal external-beam radiotherapy utilization rate for genitourinary malignancies. Cancer 103:462–473. Deng Y, Zhang X, Simons M. 2015. Molecular controls of lymphatic VEGFR3 signaling. Arterioscler Thromb Vasc Biol 35:421–429. Dewey WC, Ling CC, Meyn RE. 1995. Radiation-induced apoptosis: Relevance to radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys 33:781–796. Diaz R, Nguewa PA, Diaz-Gonzalez JA, Hamel E, Gonzalez-Moreno O, Catena R, Serrano D, Redrado M, Sherris D, Calvo A. 2009. The novel Akt inhibitor Palomid 529 (P529) enhances the effect of radiotherapy in prostate cancer. Br J Cancer 100:932–940. Dunn WA. 1990. Studies on the mechanisms of autophagy: formation of the autophagic vacuole. J Cell Biol 110:1923–1933. Edwards E, Geng L, Tan J, Onishko H, Donnelly E, Hallahan DE. 2002. Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt Signaling in the Response of Vascular Endothelium to Ionizing Radiation. Cancer Res 62:4671–4677. Effert PJ, Neubauer A, Walther PJ, Liu ET. 1992. Alterations of the P53 gene are associated with the progression of a human prostate carcinoma. J Urol 147:789–793. Eicheler W, Zips D, Dörfler A, Grénman R, Baumann M. 2002. Splicing Mutations in TP53 in Human Squamous Cell Carcinoma Lines Influence Immunohistochemical Detection. J Histochem Cytochem 50:197–204. Erbaykent-Tepedelen B, Karamil S, Gonen-Korkmaz C, Korkmaz KS. 2014. DNA damage response (DDR) via NKX3.1 expression in prostate cells. J Steroid Biochem Mol Biol 141:26–36. 77 8 Literaturverzeichnis Eriksson D, Stigbrand T. 2010. Radiation-induced cell death mechanisms. Tumor Biol 31:363–372. Falchook AD, Basak R, Mohiuddin JJ, Chen RC. 2016. Evaluation of the effectiveness of adding androgen deprivation to modern dose-escalated radiotherapy for men with favorable intermediate-risk prostate cancer. Cancer 122:2341–2349. Fallahabadi ZR, Noori Daloii MR, Mahdian R, Behjati F, Shokrgozar MA, Abolhasani M, Asgari M, Shahrokh H. 2016. Frequency of PTEN alterations, TMPRSS2-ERG fusion and their association in prostate cancer. Gene 575:755–760. Favier B, Alam A, Barron P, Bonnin J, Laboudie P, Fons P, Mandron M, Herault J-P, Neufeld G, Savi P, Herbert J-M, Bono F. 2006. Neuropilin-2 interacts with VEGFR-2 and VEGFR-3 and promotes human endothelial cell survival and migration. Blood 108:1243–1250. Fokas E, Yoshimura M, Prevo R, Higgins G, Hackl W, Maira S-M, Bernhard EJ, McKenna WG, Muschel RJ. 2012. NVP-BEZ235 and NVP-BGT226, dual phosphatidylinositol 3kinase/mammalian target of rapamycin inhibitors, enhance tumor and endothelial cell radiosensitivity. Radiat Oncol Lond Engl 7:48. Freudlsperger C, Horn D, Weißfuß S, Weichert W, Weber K-J, Saure D, Sharma S, Dyckhoff G, Grabe N, Plinkert P, Hoffmann J, Freier K, et al. 2015. Phosphorylation of AKT(Ser473) serves as an independent prognostic marker for radiosensitivity in advanced head and neck squamous cell carcinoma: AKT signaling and radiosensitivity in HNSCC. Int J Cancer 136:2775–2785. Galluzzi L, Maiuri MC, Vitale I, Zischka H, Castedo M, Zitvogel L, Kroemer G. 2007. Cell death modalities: classification and pathophysiological implications. Cell Death Differ 14:1237–1243. Gerber HP, McMurtrey A, Kowalski J, Yan M, Keyt BA, Dixit V, Ferrara N. 1998. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3’-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. J Biol Chem 273:30336–30343. Gilbert MS, Saad AH, Rupnow BA, Knox SJ. 1996. Association of BCL-2 with membrane hyperpolarization and radioresistance. J Cell Physiol 168:114–122. Gills JJ, LoPiccolo J, Tsurutani J, Shoemaker RH, Best CJM, Abu-Asab MS, Borojerdi J, Warfel NA, Gardner ER, Danish M, Hollander MC, Kawabata S, et al. 2007. Nelfinavir, A Lead HIV Protease Inhibitor, Is a Broad-Spectrum, Anticancer Agent that Induces Endoplasmic Reticulum Stress, Autophagy, and Apoptosis In vitro and In vivo. Clin Cancer Res 13:5183–5194. Goel HL, Chang C, Pursell B, Leav I, Lyle S, Xi HS, Hsieh C-C, Adisetiyo H, Roy-Burman P, Coleman IM, Nelson PS, Vessella RL, et al. 2012. VEGF/Neuropilin-2 Regulation of Bmi-1 and Consequent Repression of IGF-IR Define a Novel Mechanism of Aggressive Prostate Cancer. Cancer Discov 2:906–921. Golding SE, Morgan RN, Adams BR, Hawkins AJ, Povirk LF, Valerie K. 2009. Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells. Cancer Biol Ther 8:730–738. Gray MJ, Van Buren G, Dallas NA, Xia L, Wang X, Yang AD, Somcio RJ, Lin YG, Lim S, Fan F, Mangala LS, Arumugam T, et al. 2008. Therapeutic targeting of neuropilin-2 on colorectal carcinoma cells implanted in the murine liver. J Natl Cancer Inst 100:109–120. 78 8 Literaturverzeichnis Grünwald V, DeGraffenried L, Russel D, Friedrichs WE, Ray RB, Hidalgo M. 2002. Inhibitors of mTOR Reverse Doxorubicin Resistance Conferred by PTEN Status in Prostate Cancer Cells. Cancer Res 62:6141–6145. Guan M, Fousek K, Chow WA. 2012. Nelfinavir inhibits regulated intramembrane proteolysis of sterol regulatory element binding protein-1 and activating transcription factor 6 in castration-resistant prostate cancer. FEBS J 279:2399–2411. Gupta AK, Bakanauskas VJ, Cerniglia GJ, Cheng Y, Bernhard EJ, Muschel RJ, McKenna WG. 2001. The Ras Radiation Resistance Pathway. Cancer Res 61:4278–4282. Gupta AK, Cerniglia GJ, Mick R, McKenna WG, Muschel RJ. 2005. HIV Protease Inhibitors Block Akt Signaling and Radiosensitize Tumor Cells Both In vitro and In vivo. Cancer Res 65:8256–8265. Gupta AK, Li B, Cerniglia GJ, Ahmed MS, Hahn SM, Maity A. 2007. The HIV Protease Inhibitor Nelfinavir Downregulates Akt Phosphorylation by Inhibiting Proteasomal Activity and Inducing the Unfolded Protein Response. Neoplasia N Y N 9:271–278. Gupta AK, McKenna WG, Weber CN, Feldman MD, Goldsmith JD, Mick R, Machtay M, Rosenthal DI, Bakanauskas VJ, Cerniglia GJ, Bernhard EJ, Weber RS, et al. 2002. Local Recurrence in Head and Neck Cancer Relationship to Radiation Resistance and Signal Transduction. Clin Cancer Res 8:885–892. Haas-Kogan D, Shalev N, Wong M, Mills G, Yount G, Stokoe D. 1998. Protein kinase B (PKB/Akt) activity is elevated in glioblastoma cells due to mutation of the tumor suppressor PTEN/MMAC. Curr Biol 8:S1. Haberlau S, Hönscheid P, Jimenez R E, Baretton G B, Tindall D J, Datta K, Krause M, Muders M H. 2014. VEGF-C induziert Strahlenresistenz im Prostatakarzinom ohne Beteiligung der Autophagie. Vortrag auf der 98. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Pathologie e.V. Berlin. Harrington SE, Smith TJ. 2008. The Role of Chemotherapy at the End of Life. JAMA J Am Med Assoc 299:2667–2678. He Z, Mangala LS, Theriot CA, Rohde LH, Wu H, Zhang Y. 2012. Cell Killing and Radiosensitizing Effects of Atorvastatin in PC3 Prostate Cancer Cells. J Radiat Res (Tokyo) 53:225–233. Hein AL, Ouellette MM, Yan Y. 2014. Radiation-induced signaling pathways that promote cancer cell survival (Review). Int J Oncol 45:1813–1819. Hensley HH, Hannoun-Levi J-M, Hachem P, Mu Z, Stoyanova R, Khor L-Y, Agrawal S, Pollack A. 2011. PKA Knockdown Enhances Cell Killing In Response To Radiation And Androgen Deprivation. Int J Cancer J Int Cancer 128:962–973. Herrmann T, Baumann M, Dörr W. 2006. Klinische Strahlenbiologie. Kurz und bündig. 4. Auflage. Elsevier GmbH, München. Hill EJ, Roberts C, Franklin JM, Enescu M, West N, Macgregor TP, Chu K-Y, Boyle L, Blesing C, Wang LM, Mukherjee S, Anderson EM, et al. 2016. Clinical Trial of Oral Nelfinavir Before and During Radiation Therapy for Advanced Rectal Cancer. Clin Cancer Res clincanres.1489.2015. Hirani VN, Raucy JL, Lasker JM. 2004. Conversion of the Hiv Protease Inhibitor Nelfinavir to a Bioactive Metabolite by Human Liver Cyp2c19. Drug Metab Dispos 32:1462–1467. 79 8 Literaturverzeichnis Hollstein M, Sidransky D, Vogelstein B, Harris CC. 1991. p53 mutations in human cancers. Science 253:49–53. Hosseinimehr SJ, Inanami O, Hamasu T, Takahashi M, Kashiwakura I, Asanuma T, Kuwabara M. 2004. Activation of C-Kit by Stem Cell Factor Induces Radioresistance to Apoptosis through ERK-dependent Expression of Survivin in HL60 Cells. J Radiat Res (Tokyo) 45:557–561. Huang Y, Luo Y, Zheng W, Chen T. 2014. Rational Design of Cancer-Targeted BSA Protein Nanoparticles as Radiosensitizer to Overcome Cancer Radioresistance. ACS Appl Mater Interfaces 6:19217–19228. Ianzini F, Bertoldo A, Kosmacek EA, Phillips SL, Mackey MA. 2006. Lack of p53 function promotes radiation-induced mitotic catastrophe in mouse embryonic fibroblast cells. Cancer Cell Int 6:11. Ikezoe T, Saito T, Bandobashi K, Yang Y, Koeffler HP, Taguchi H. 2004. HIV-1 protease inhibitor induces growth arrest and apoptosis of human multiple myeloma cells via inactivation of signal transducer and activator of transcription 3 and extracellular signalregulated kinase 1/2. Am Assoc Cancer Res 3:473–479. Isaacs WB, Carter BS, Ewing CM. 1991. Wild-Type p53 Suppresses Growth of Human Prostate Cancer Cells Containing Mutant p53 Alleles. Cancer Res 51:4716–4720. Isohashi F, Endo H, Mukai M, Inoue T, Inoue M. 2008. Insulin-like growth factor stimulation increases radiosensitivity of a pancreatic cancer cell line through endoplasmic reticulum stress under hypoxic conditions. Cancer Sci 99:2395–2401. Jeltsch M, Kaipainen A, Joukov V, Meng X, Lakso M, Rauvala H, Swartz M, Fukumura D, Jain RK, Alitalo K. 1997. Hyperplasia of Lymphatic Vessels in VEGF-C Transgenic Mice. Science 276:1423–1425. Jennbacken K, Vallbo C, Wang W, Damber J. 2005. Expression of vascular endothelial growth factor C (VEGF‐C) and VEGF receptor‐3 in human prostate cancer is associated with regional lymph node metastasis. The Prostate 65:110–116. Jiang H, Qi L, Wang F, Sun Z, Huang Z, Xi Q. 2015. Decreased semaphorin 3A expression is associated with a poor prognosis in patients with epithelial ovarian carcinoma. Int J Mol Med 35:1374–1380. Jiang Z, Pore N, Cerniglia GJ, Mick R, Georgescu M-M, Bernhard EJ, Hahn SM, Gupta AK, Maity A. 2007. Phosphatase and Tensin Homologue Deficiency in Glioblastoma Confers Resistance to Radiation and Temozolomide that Is Reversed by the Protease Inhibitor Nelfinavir. Cancer Res 67:4467–4473. Johnson CE, Hunt DK, Wiltshire M, Herbert TP, Sampson JR, Errington RJ, Davies DM, Tee AR. 2015. Endoplasmic reticulum stress and cell death in mTORC1-overactive cells is induced by nelfinavir and enhanced by chloroquine. Mol Oncol 9:675–688. Joiner MC, Kogel A van der. 2009. Basic Clinical Radiobiology. London: Edward Arnold. Joukov V, Pajusola K, Kaipainen A, Chilov D, Lahtinen I, Kukk E, Saksela O, Kalkkinen N, Alitalo K. 1996. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases. EMBO J 15:290–298. 80 8 Literaturverzeichnis Kaatsch P, Spix C, Katalinic A, Hentschel S, Luttmann S, Stegmaier C, Caspritz S, Christ M, Ernst A, Folkerts J, Hansmann J, Klein S, et al. 2015. Krebs in Deutschland 2011/2012. Eine gemeinsame Veröffentlichung des Robert Koch-Instituts und der Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e. V. Berlin. 10. Ausgabe. Berlin. Kabeya Y, Mizushima N, Ueno T, Yamamoto A, Kirisako T, Noda T, Kominami E, Ohsumi Y, Yoshimori T. 2000. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J 19:5720–5728. Kärpänen T, Heckman CA, Keskitalo S, Jeltsch M, Ollila H, Neufeld G, Tamagnone L, Alitalo K. 2006. Functional interaction of VEGF-C and VEGF-D with neuropilin receptors. FASEB J Off Publ Fed Am Soc Exp Biol 20:1462–1472. Kastan MB, Lim D. 2000. The many substrates and functions of ATM. Nat Rev Mol Cell Biol 1:179–186. Kastan MB, Onyekwere O, Sidransky D, Vogelstein B, Craig RW. 1991. Participation of p53 protein in the cellular response to DNA damage. Cancer Res 51:6304–6311. Keck B, Wach S, Taubert H, Zeiler S, Ott OJ, Kunath F, Hartmann A, Bertz S, Weiss C, Hönscheid P, Schellenburg S, Rödel C, et al. 2015. Neuropilin-2 and its ligand VEGF-C predict treatment response after transurethral resection and radiochemotherapy in bladder cancer patients. Int J Cancer 136:443–451. Kellerer AM, Rossi HH. 1973. The Biophysical Properties of 3.9-GeV Nitrogen Ions: VI. Interpretation of Results. Radiat Res 55:447–456. Kempf DJ, Marsh KC, Kumar G, Rodrigues AD, Denissen JF, McDonald E, Kukulka MJ, Hsu A, Granneman GR, Baroldi PA, Sun E, Pizzuti D, et al. 1997. Pharmacokinetic enhancement of inhibitors of the human immunodeficiency virus protease by coadministration with ritonavir. Antimicrob Agents Chemother 41:654–660. Keogh M-C, Kim J-A, Downey M, Fillingham J, Chowdhury D, Harrison JC, Onishi M, Datta N, Galicia S, Emili A, Lieberman J, Shen X, et al. 2006. A phosphatase complex that dephosphorylates γH2AX regulates DNA damage checkpoint recovery. Nature 439:497–501. Kesler CT, Kuo A, Wong H-K, Masuck DJ, Shah JL, Kozak K, Held KD, Padera TP. 2014. Vascular endothelial growth factor-C enhances radiosensitivity of lymphatic endothelial cells. Angiogenesis 17:419–427. Kim H, Bernard ME, Flickinger J, Epperly MW, Wang H, Dixon TM, Shields D, Houghton F, Zhang X, Greenberger JS. 2011. The autophagy-inducing drug carbamazepine is a radiation protector and mitigator. Int J Radiat Biol 87:1052–1060. Kim KW, Hwang M, Moretti L, Jaboin JJ, Cha YI, Lu B. 2008. Autophagy upregulation by inhibitors of caspase-3 and mTOR enhances radiotherapy in a mouse model of lung cancer. Autophagy 4:659–668. Kim RB, Fromm MF, Wandel C, Leake B, Wood AJ, Roden DM, Wilkinson GR. 1998. The drug transporter P-glycoprotein limits oral absorption and brain entry of HIV-1 protease inhibitors. J Clin Invest 101:289–294. Kimple RJ, Vaseva AV, Cox AD, Baerman KM, Calvo BF, Tepper JE, Shields JM, Sartor CI. 2010. Radiosensitization of EGFR/HER2 positive pancreatic cancer is mediated by inhibition of Akt independent of Ras mutational status. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res 16:912. 81 8 Literaturverzeichnis Kostis G, Ioannis L, Helen K, Helen P. 2014. The expression of vascular endothelial growth factor-C correlates with lymphatic microvessel density and lymph node metastasis in prostate carcinoma: An immunohistochemical study. Urol Ann 6:224–230. Krause M, Zips D, Thames HD, Kummermehr J, Baumann M. 2006. Preclinical evaluation of molecular-targeted anticancer agents for radiotherapy. Radiother Oncol 80:112–122. Kukk E, Lymboussaki A, Taira S, Kaipainen A, Jeltsch M, Joukov V, Alitalo K. 1996. VEGF-C receptor binding and pattern of expression with VEGFR-3 suggests a role in lymphatic vascular. Development 122:3829–3837. Lamb CA, Yoshimori T, Tooze SA. 2013. The autophagosome: origins unknown, biogenesis complex. Nat Rev Mol Cell Biol 14:759–774. Lane DP. 1992. p53, guardian of the genome. Nature 358:15–16. Laval J. 1996. Role of DNA repair enzymes in the cellular resistance to oxidative stress. Pathol Biol (Paris) 44:14–24. Lehmann BD, McCubrey JA, Jefferson HS, Paine MS, Chappell WH, Terrian DM. 2007. A Dominant Role for p53-Dependent Cellular Senescence in Radiosensitization of Human Prostate Cancer Cells. Cell Cycle 6:595–605. Levine B, Yuan J. 2005. Autophagy in cell death: an innocent convict? J Clin Invest 115:2679–2688. Li J, Wang E, Rinaldo F, Datta K. 2005. Upregulation of VEGF-C by androgen depletion: the involvement of IGF-IR-FOXO pathway. Oncogene 24:5510–5520. Liu X, Yan S, Zhou T, Terada Y, Erikson RL. 2004. The MAP kinase pathway is required for entry into mitosis and cell survival. Oncogene 23:763–776. Lomonaco SL, Finniss S, Xiang C, DeCarvalho A, Umansky F, Kalkanis SN, Mikkelsen T, Brodie C. 2009. The induction of autophagy by γ‐radiation contributes to the radioresistance of glioma stem cells. Int J Cancer 125:717–722. MacPhail SH, Banáth JP, Yu TY, Chu EHM, Lambur H, Olive PL. 2003. Expression of phosphorylated histone H2AX in cultured cell lines following exposure to X-rays. Int J Radiat Biol 79:351–358. Mäkinen T, Veikkola T, Mustjoki S, Karpanen T, Catimel B, Nice EC, Wise L, Mercer A, Kowalski H, Kerjaschki D, Stacker SA, Achen MG, et al. 2001. Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3. EMBO J 20:4762–4773. Malik SN, Brattain M, Ghosh PM, Troyer DA, Prihoda T, Bedolla R, Kreisberg JI. 2002. Immunohistochemical Demonstration of Phospho-Akt in High Gleason Grade Prostate Cancer. Clin Cancer Res 8:1168–1171. Marampon F, Gravina GL, Popov VM, Scarsella L, Festuccia C, La Verghetta ME, Parente S, Cerasani M, Bruera G, Ficorella C, Ricevuto E, Tombolini V, et al. 2014. Close correlation between MEK/ERK and Aurora-B signaling pathways in sustaining tumorigenic potential and radioresistance of gynecological cancer cell lines. Int J Oncol 44:285–294. Markiewicz D, Hanks GE. 1991. Therapeutic options in the management of incidental carcinoma of the prostate. Int J Radiat Oncol Biol Phys 20:153–167. 82 8 Literaturverzeichnis Mathur A, Elmageed ZYA, Liu X, Kostochka ML, Zhang H, Abdel-Mageed AB, Mondal D. 2014. Subverting ER-Stress towards Apoptosis by Nelfinavir and Curcumin Coexposure Augments Docetaxel Efficacy in Castration Resistant Prostate Cancer Cells. PLOS ONE 9:e103109. Menegakis A, Neubeck C von, Yaromina A, Thames H, Hering S, Hennenlotter J, Scharpf M, Noell S, Krause M, Zips D, Baumann M. 2015. γH2AX assay in ex vivo irradiated tumour specimens: A novel method to determine tumour radiation sensitivity in patient-derived material. Radiother Oncol 116:473–479. Menegakis A, Yaromina A, Eicheler W, Dörfler A, Beuthien-Baumann B, Thames HD, Baumann M, Krause M. 2009. Prediction of clonogenic cell survival curves based on the number of residual DNA double strand breaks measured by γH2AX staining. Int J Radiat Biol 85:1032–1041. Michaelsen SR, Nedergaard MK, Broholm H, Bartkova J, Staberg M, Aghi M, Lucacova S, Perryman L, Poulsen HS, Hamerlik P. 2016. P01.12 VEGF-C contributes to autocrine VEGF Receptor 2 signaling and cellular maintenance in Glioblastoma. Neuro-Oncol 18:iv20-iv21. Mirzayans R, Severin D, Murray D. 2006. Relationship between DNA double-strand break rejoining and cell survival after exposure to ionizing radiation in human fibroblast strains with differing ATM/p53 status: Implications for evaluation of clinical radiosensitivity. Int J Radiat Oncol Biol Phys 66:1498–1505. Mizushima N, Yoshimori T. 2007. How to Interpret LC3 Immunoblotting. Autophagy 3:542– 545. Mizushima N, Yoshimorim T, Levine B. 2010. Methods in Mammalian Autophagy Research. Cell 140:313–326. Muders MH, Zhang H, Wang E, Tindall DJ, Datta K. 2009. Vascular Endothelial Growth Factor-C Protects Prostate Cancer Cells from Oxidative Stress by the Activation of Mammalian Target of Rapamycin Complex-2 and AKT-1. Cancer Res 69:6042–6048. Ouyang D-Y, Xu L-H, He X-H, Zhang Y-T, Zeng L-H, Cai J-Y, Ren S. 2013. Autophagy is differentially induced in prostate cancer LNCaP, DU145 and PC-3 cells via distinct splicing profiles of ATG5. Autophagy 9:20–32. Paglin S, Hollister T, Delohery T, Hackett N, McMahill M, Sphicas E, Domingo D, Yahalom J. 2001. A Novel Response of Cancer Cells to Radiation Involves Autophagy and Formation of Acidic Vesicles. Cancer Res 61:439–444. Pan J, Mott M, Xi B, Hepner E, Guan M, Fousek K, Magnusson R, Tinsley R, Valdes F, Frankel P, Synold T, Chow WA. 2012. Phase I study of nelfinavir in liposarcoma. Cancer Chemother Pharmacol 70:791–799. Paull TT, Rogakou EP, Yamazaki V, Kirchgessner CU, Gellert M, Bonner WM. 2000. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Curr Biol 10:886–895. Pawlik TM, Keyomarsi K. 2004. Role of cell cycle in mediating sensitivity to radiotherapy. Int J Radiat Oncol 59:928–942. Pellet-Many C, Frankel P, Jia H, Zachary I. 2008. Neuropilins: structure, function and role in disease. Biochem J 411:211. 83 8 Literaturverzeichnis Pisansky TM, Hunt D, Gomella LG, Amin MB, Balogh AG, Chinn DM, Seider MJ, Duclos M, Rosenthal SA, Bauman GS, Gore EM, Rotman MZ, et al. 2015. Duration of Androgen Suppression Before Radiotherapy for Localized Prostate Cancer: Radiation Therapy Oncology Group Randomized Clinical Trial 9910. J Clin Oncol 33:332–339. Polkinghorn WR, Parker JS, Lee MX, Kass EM, Spratt DE, Iaquinta PJ, Arora VK, Yen W-F, Cai L, Zheng D, Carver BS, Chen Y, et al. 2013. Androgen Receptor Signaling Regulates DNA Repair in Prostate Cancers. Cancer Discov 3:1245–1253. Pommier P, Chabaud S, Lagrange J-L, Richaud P, Prise EL, Wagner J-P, Azria D, Beckendorf V, Suchaud J-P, Bernier V, Perol D, Carrie C. 2016. Is There a Role for Pelvic Irradiation in Localized Prostate Adenocarcinoma? Update of the Long-Term Survival Results of the GETUG-01 Randomized Study. Int J Radiat Oncol Biol Phys 96:759–769. Pore N, Gupta AK, Cerniglia GJ, Jiang Z, Bernhard EJ, Evans SM, Koch CJ, Hahn SM, Maity A. 2006. Nelfinavir Down-regulates Hypoxia-Inducible Factor 1α and VEGF Expression and Increases Tumor Oxygenation: Implications for Radiotherapy. Cancer Res 66:9252–9259. Potiron VA, Abderrhamani R, Giang E, Chiavassa S, Di Tomaso E, Maira S-M, Paris F, Supiot S. 2013. Radiosensitization of prostate cancer cells by the dual PI3K/mTOR inhibitor BEZ235 under normoxic and hypoxic conditions. Radiother Oncol 106:138–146. Puck TT, Marcus PI. 1956. Action of X-Rays on Mammalian Cells. J Exp Med 103:653–666. Qayum N, Muschel RJ, Im JH, Balathasan L, Koch CJ, Patel S, McKenna WG, Bernhard EJ. 2009. Tumor Vascular Changes Mediated by Inhibition of Oncogenic Signaling. Cancer Res 69:6347–6354. Rengan R, Mick R, Pryma D, Rosen MA, Lin L, Maity A, Evans TL, Stevenson JP, Langer CJ, Kucharczuk J, Friedberg J, Prendergast S, et al. 2012. A Phase I Trial of the HIV Protease Inhibitor Nelfinavir with Concurrent Chemoradiotherapy (CT-RT) for Unresectable Stage IIIA/IIIB NSCLC: A Report of Toxicities and Clinical Response. J Thorac Oncol 7:709– 715. Rogakou EP, Pilch DR, Orr AH, Ivanova VS, Bonner WM. 1998. DNA Double-stranded Breaks Induce Histone H2AX Phosphorylation on Serine 139. J Biol Chem 273:5858–5868. Ross GM. 1999. Induction of cell death by radiotherapy. Endocr Relat Cancer 6:41–44. Sedelnikova OA, Rogakou EP, Panyutin IG, Bonner WM. 2002. Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody. Radiat Res 158:486–492. Shonai T, Adachi M, Sakata K, Takekawa M, Endo T, Imai K, Hareyama M. 2002. MEK/ERK pathway protects ionizing radiation-induced loss of mitochondrial membrane potential and cell death in lymphocytic leukemia cells. Cell Death Differ 9:963–971. Skvortsova I, Skvortsov S, Stasyk T, Raju U, Popper B-A, Schiestl B, Guggenberg E von, Neher A, Bonn GK, Huber LA, Lukas P. 2008. Intracellular signaling pathways regulating radioresistance of human prostate carcinoma cells. Proteomics 8:4521–4533. Stambolic V, Suzuki A, Pompa JL de la, Brothers GM, Mirtsos C, Sasaki T, Ruland J, Penninger JM, Siderovski DP, Mak TW. 1998. Negative Regulation of PKB/Akt-Dependent Cell Survival by the Tumor Suppressor PTEN. Cell 95:29–39. Stanton MJ, Dutta S, Polavaram NS, Roy S, Muders MH, Datta K. 2013a. Angiogenic growth factor axis in autophagy regulation. Autophagy 9:789–790. 84 8 Literaturverzeichnis Stanton MJ, Dutta S, Zhang H, Polavaram NS, Leontovich AA, Honscheid P, Sinicrope FA, Tindall DJ, Muders MH, Datta K. 2013b. Autophagy Control by the VEGF-C/NRP-2 axis in Cancer and its Implication for Treatment Resistance. Cancer Res 73:160–171. Sunavala-Dossabhoy G, Fowler M, De Benedetti A. 2004. Translation of the radioresistance kinase TLK1B is induced by γ-irradiation through activation of mTOR and phosphorylation of 4E-BP1. BMC Mol Biol 5:1. Tamagnone L, Artigiani S, Chen H, He Z, Ming G, Song H, Chedotal A, Winberg ML, Goodman CS, Poo M, Tessier-Lavigne M, Comoglio PM. 1999. Plexins Are a Large Family of Receptors for Transmembrane, Secreted, and GPI-Anchored Semaphorins in Vertebrates. Cell 99:71–80. Tanaka T, Ishiguro H, Kuwabara Y, Kimura M, Mitsui A, Katada T, Shiozaki M, Naganawa Y, Fujii Y, Takeyama H. 2010. Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) in esophageal cancer correlates with lymph node metastasis and poor patient prognosis. J Exp Clin Cancer Res CR 29:83. Tasdemir E, Chiara Maiuri M, Morselli E, Criollo A, D’Amelio M, Djavaheri-Mergny M, Cecconi F, Tavernarakis N, Kroemer G. 2008. A dual role of p53 in the control of autophagy. Autophagy 4:810–814. Thakker GD, Hajjar DP, Muller WA, Rosengart TK. 1999. The Role of Phosphatidylinositol 3Kinase in Vascular Endothelial Growth Factor Signaling. J Biol Chem 274:10002–10007. Trojan L, Rensch F, Voß M, Grobholz R, Weiss C, Jackson DG, Alken P, Michel MS. 2006. The role of the lymphatic system and its specific growth factor, vascular endothelial growth factor C, for lymphogenic metastasis in prostate cancer. BJU Int 98:903–906. Tseng H-C, Liu W-S, Tyan Y-S, Chiang H-C, Kuo W-H, Chou F-P. 2011. Sensitizing effect of 3-methyladenine on radiation-induced cytotoxicity in radio-resistant HepG2 cells in vitro and in tumor xenografts. Chem Biol Interact 192:201–208. Tsurusaki T, Kanda S, Sakai H, Kanetake H, Saito Y, Alitalo K, Koji T. 1999. Vascular endothelial growth factor-C expression in human prostatic carcinoma and its relationship to lymph node metastasis. Br J Cancer 80:309–313. Tsurutani J, Fukuoka J, Tsurutani H, Shih JH, Hewitt SM, Travis WD, Jen J, Dennis PA. 2006. Evaluation of Two Phosphorylation Sites Improves the Prognostic Significance of Akt Activation in Non–Small-Cell Lung Cancer Tumors. J Clin Oncol 24:306–314. Van Veldhuizen PJ, Sadasivan R, Garcia F, Austenfeld MS, Stephens RL. 1993. Mutant p53 expression in prostate carcinoma. The Prostate 22:23–30. Wang HP, Long XH, Sun ZZ, Rigaud O, Xu QZ, Huang YC, Sui JL, Bai B, Zhou PK. 2006. Identification of differentially transcribed genes in human lymphoblastoid cells irradiated with 0.5 Gy of γ-ray and the involvement of low dose radiation inducible CHD6 gene in cell proliferation and radiosensitivity. Int J Radiat Biol 82:181–190. Wang Y, Nakayama M, Pitulescu ME, Schmidt TS, Bochenek ML, Sakakibara A, Adams S, Davy A, Deutsch U, Lüthi U, Barberis A, Benjamin LE, et al. 2010. Ephrin-B2 controls VEGFinduced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature 465:483–486. Xu N, Lao Y, Zhang Y, Gillespie DA. 2012. Akt: a double-edged sword in cell proliferation and genome stability. J Oncol 2012:951724. 85 8 Literaturverzeichnis Yacoub A, McKinstry R, Hinman D, Chung T, Dent P, Hagan MP. 2003. Epidermal growth factor and ionizing radiation up-regulate the DNA repair genes XRCC1 and ERCC1 in DU145 and LNCaP prostate carcinoma through MAPK signaling. Radiat Res 159:439–452. Yacoub M, Coulon A, Celhay O, Irani J, Cussenot O, Fromont G. 2009. Differential expression of the semaphorin 3A pathway in prostatic cancer. Histopathology 55:392–398. Yamaguchi H, Wang H-G. 2001. The protein kinase PKB/Akt regulates cell survival and apoptosis by inhibiting Bax conformational change. Publ Online 22 Novemb 2001 Doi101038sjonc1204984 20:. Yamamoto A, Tagawa Y, Yoshimori T, Moriyama Y, Masaki R, Tashiro Y. 1998. Bafilomycin A1 Prevents Maturation of Autophagic Vacuoles by Inhibiting Fusion between Autophagosomes and Lysosomes in Rat Hepatoma Cell Line, H-4-II-E Cells. Cell Struct Funct 23:33–42. Yang J, Wu H-F, Qian L-X, Zhang W, Hua L-X, Yu M-L, Wang Z, Xu Z-Q, Sui Y-G, Wang XR. 2006a. Increased expressions of vascular endothelial growth factor (VEGF), VEGF-C and VEGF receptor-3 in prostate cancer tissue are associated with tumor progression. Asian J Androl 8:169–175. Yang Y, Ikezoe T, Nishioka C, Bandobashi K, Takeuchi T, Adachi Y, Kobayashi M, Takeuchi S, Koeffler HP, Taguchi H. 2006b. NFV, an HIV-1 protease inhibitor, induces growth arrest, reduced Akt signalling, apoptosis and docetaxel sensitisation in NSCLC cell lines. Br J Cancer 95:1653. Yang Y, Ikezoe T, Takeuchi T, Adachi Y, Ohtsuki Y, Takeuchi S, Koeffler HP, Taguchi H. 2005. HIV-1 protease inhibitor induces growth arrest and apoptosis of human prostate cancer LNCaP cells in vitro and in vivo in conjunction with blockade of androgen receptor STAT3 and AKT signaling. Cancer Sci 96:425–433. Yaromina A, Kroeber T, Meinzer A, Boeke S, Thames H, Baumann M, Zips D. 2011. Exploratory Study of the Prognostic Value of Microenvironmental Parameters During Fractionated Irradiation in Human Squamous Cell Carcinoma Xenografts. Int J Radiat Oncol Biol Phys 80:1205–1213. Yazlovitskaya EM, Linkous AG, Thotala DK, Cuneo KC, Hallahan DE. 2008. Cytosolic phospholipase A2 regulates viability of irradiated vascular endothelium. Cell Death Differ 15:1641–1653. Yin X, Johns SC, Lawrence R, Xu D, Reddi K, Bishop JR, Varner JA, Fuster MM. 2011a. Lymphatic Endothelial Heparan Sulfate Deficiency Results in Altered Growth Responses to Vascular Endothelial Growth Factor-C (VEGF-C). J Biol Chem 286:14952–14962. Yin Z-J, Jin F-G, Liu T-G, Fu E-Q, Xie Y-H, Sun R-L. 2011b. Overexpression of STAT3 Potentiates Growth, Survival, and Radioresistance of Non-Small-Cell Lung Cancer (NSCLC) cells. J Surg Res 171:675–683. Yoshida Y. 2012. Semaphorin Signaling in Vertebrate Neural Circuit Assembly. Front Mol Neurosci 5:71. Zeng J, See AP, Aziz K, Thiyagarajan S, Salih T, Gajula RP, Armour M, Phallen J, Terezakis S, Kleinberg L, Redmond K, Hales RK, et al. 2011. Nelfinavir induces radiation sensitization in pituitary adenoma cells. Cancer Biol Ther 12:657–663. 86 8 Literaturverzeichnis Zhang KE, Wu E, Patick AK, Kerr B, Zorbas M, Lankford A, Kobayashi T, Maeda Y, Shetty B, Webber S. 2001. Circulating Metabolites of the Human Immunodeficiency Virus Protease Inhibitor Nelfinavir in Humans: Structural Identification, Levels in Plasma, and Antiviral Activities. Antimicrob Agents Chemother 45:1086–1093. Zhu W, Fu W, Hu L. 2013. NVP-BEZ235, Dual Phosphatidylinositol 3-Kinase/Mammalian Target of Rapamycin Inhibitor, Prominently Enhances Radiosensitivity of Prostate Cancer Cell Line PC-3. Cancer Biother Radiopharm 28:665–673. Zois CE, Koukourakis MI. 2009. Radiation-induced autophagy in normal and cancer cells: Towards novel cytoprotection and radio-sensitization policies? Autophagy 5:442–451. 87 9 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Signaltransduktion von VEGF-C. ....................................................................... 7 Abbildung 2: Schematische Darstellung der Autophagie. ..................................................... 11 Abbildung 3: Strukturformeln von Nelfinavir und dessen Hauptmetabolit M8. ....................... 15 Abbildung 4: VEGF-C- und NRP-2-Expressionen in den Zelllinien PC-3, DU145 und LNCaP. ............................................................................................................ 39 Abbildung 5: Herunterregulierung von VEGF-C und NRP-2 in PC-3 und DU145. ................. 40 Abbildung 6: Koloniebildungsassays von PC-3, DU145 und LNCaP nach Veränderung des VEGF-C-Status. ........................................................................................ 41 Abbildung 7: Koloniebildungsassays von PC-3 und DU145 unter verminderter NRP-2Expression. ...................................................................................................... 42 Abbildung 8: Einfluss von NRP-2 und VEGF-C auf die Phosphorylierung von Akt unter Bestrahlung (24 h). .......................................................................................... 43 Abbildung 9: Einfluss von VEGF-C auf die Phosphorylierung von Akt unter Bestrahlung (10 min). .......................................................................................................... 44 Abbildung 10: Einfluss von VEGF-C auf die Phosphorylierung von ERK1/2 unter Bestrahlung...................................................................................................... 45 Abbildung 11: LC3-II-Bestimmung mittels Western Blot. ....................................................... 46 Abbildung 12: Autophagischer Flux in PC-3 nach siRNA-Transfektion gegen NRP-2 und VEGF-C ohne und mit Bestrahlung mit 2 Gy. ................................................... 47 Abbildung 13: Einfluss der Autophagie auf die Klonogenität von PC-3 unter Bestrahlung. ... 48 Abbildung 14: Ergebnis des γH2AX-Foci-Assays. ................................................................ 49 Abbildung 15: Zellzyklusanalyse mit PC-3. ........................................................................... 51 Abbildung 16: Zellzyklusanalyse mit DU145. ........................................................................ 52 Abbildung 17: Blockade der Akt-Aktivierung und dessen Einfluss auf die Klonogenität. ....... 54 Abbildung 18: Tumorwachstumszeiten nach Behandlung mit Nelfinavir. .............................. 55 Abbildung 19: Lokale Tumorkontrolle nach fraktionierter Bestrahlung in Kombination mit Nelfinavir. ......................................................................................................... 57 Abbildung A1: Western Blot für pAkt (S473) und β-Actin und für Akt und β-Actin nach Inkubation von PC-3-Zellen mit Nelfinavir. ....................................................... 93 89 10 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Verwendete Zelllinien ...........................................................................................17 Tabelle 2: Verwendete Reagenzien und Substanzen ...........................................................17 Tabelle 3: Verwendete Kits ...................................................................................................19 Tabelle 4: Verwendete primäre Antikörper............................................................................19 Tabelle 5: Verwendete sekundäre Antikörper .......................................................................20 Tabelle 6: Verwendete siRNAs .............................................................................................20 Tabelle 7: Verwendete Primer ..............................................................................................20 Tabelle 8: Verwendete Materialien und Hilfsmittel ................................................................20 Tabelle 9: Verwendete Geräte ..............................................................................................21 Tabelle 10: Verwendete Software .........................................................................................22 Tabelle 11: Zellzahlen und Volumina für die siRNA-Transfektion .........................................23 Tabelle 12: Zusammensetzung der Gele für die SDS-PAGE ................................................27 Tabelle 13: Nachbeobachtungsdaten für die lokale Tumorkontrolle. ..................................... 56 Tabelle A1: Einzelwerte der VDT-Tumoren. .........................................................................93 90 Danksagung An erster Stelle möchte ich mich bei Prof. Mechthild Krause bedanken, die mir die Möglichkeit gegeben hat, an diesem interessanten Thema zu arbeiten. Ich danke Prof. Mechthild Krause und PD Dr. Michael H. Muders sehr für ihre wertvollen Anregungen, die konstruktiven Diskussionen und die stetige Unterstützung während der Anfertigung dieser Arbeit. Dorothee Pfitzmann und Pia Hönscheid möchte ich für ihre große Unterstützung, vor allem bei der Einarbeitung in mir neue Analyseverfahren, danken. Dorothee Pfitzmann, Dr. Annett Linge und Dr. Ina Kurth danke ich weiterhin für die Durchführung spezieller Versuche, die ich nicht selbst durchführen konnte. Bei den Tierversuchen habe ich große Unterstützung von Katja Schumann, Elisabeth Jung und Anne Kluske erhalten. Vielen Dank dafür. Ohne euch wären diese Versuche nicht durchzuführen gewesen. Bei Dr. Lydia Koi und PD Dr. Steffen Löck möchte ich mich für die statistische Auswertung der Tierversuche bedanken. PD Dr. Steffen Löck hat mich zusätzlich bei Fragen zur statistischen Auswertung diverser in vitro-Versuche beraten, was äußerst hilfreich war. Dr. Cläre von Neubeck danke ich für die Unterstützung bei der Auswertung der γH2AX-Foci und für ihre stets konstruktiven Ratschläge. Für die Finanzierung des Projekts danke ich der Wilhelm-Sander-Stiftung. Die Finanzierung der Endphase meines Promotionsstudiums erfolgte über ein Stipendium, für das ich der Graduiertenakademie, die aus Mitteln der Exzellenzinitiative des Bundes und der Länder finanziert wird, danken möchte. Sehr herzlich möchte ich mich auch bei meiner Familie für ihre stetige Unterstützung und Motivation, vor allem auch in den schwierigeren Phasen meiner Arbeit, bedanken. Meinem Mann gilt dabei außerdem mein Dank für seine Beratung bei der Anwendung spezieller Software, die mir die Recherchearbeit und die Anfertigung von Abbildungen deutlich erleichtert hat. 92 Anhang Tabelle A1: Einzelwerte der VDT-Tumoren. Einzelne Volumenverdopplungszeiten (in Tagen) von n = 5 Mäusen pro Transplantationskohorte. # # # # # Transplantationskohorte I 9,79 6,16 11,02 10,25 6,39 Transplantationskohorte II 10,26 8,98 10,33 10,34 13,75 Transplantationskohorte III 14,48 6,31 11,16 12,54 8,40 Abbildung A1: Western Blot für pAkt (S473) und β-Actin und für Akt und β-Actin nach Inkubation von PC-3-Zellen mit Nelfinavir. 93 Anhang Anlage 1 Technische Universität Dresden Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus Promotionsordnung vom 24. Oktober 2014 Erklärung zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 1. Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. 2. Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskripts habe ich Unterstützungsleistungen von folgenden Personen erhalten: Frau Prof. Dr. med. habil. Mechthild Krause, Herr PD Dr. med. Michael H. Muders, Frau Dr. rer. nat. Cläre von Neubeck, Frau Dr. rer. medic. Lydia Koi, PD Dr. rer. nat. Steffen Löck. 3. Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe eines kommerziellen Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. 4. Die Arbeit wurde bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. 5. Die Inhalte dieser Dissertation wurden in folgender Form veröffentlicht: i) Haberlau S, Hönscheid P, Jimenez R E, Baretton G B, Tindall D J, Datta K, Krause M, Muders M H (2014). VEGF-C induziert Strahlenresistenz im Prostatakarzinom ohne Beteiligung der Autophagie. Vortrag auf der 98. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Pathologie e.V., Berlin. ii) Haberlau S, Hönscheid P, Jimenez R E, Baretton G B, Tindall D J, Krause M, Datta K, Muders M H (2015). The Role of Vascular Endothelial Growth Factor C in Promoting Radioresistance in Prostate Cancer. Poster auf dem American Association for Cancer Research-Meeting, vorgestellt durch PD Dr. Muders. iii) Liebscher S, Hönscheid P, Jimenez R, Baretton G, Datta K, Krause M, Muders M (2016). Strahlensensibilisierung des Prostatakarzinoms durch Blockade von VEGF-C. 8. Symposium der Arbeitsgemeinschaft urologische Forschung, Bonn. Vorgetragen durch PD Dr. Muders. iv) Steffi Liebscher, Lydia Koi, Steffen Löck, Michael H. Muders, Mechthild Krause (2016). The HIV protease and PI3K/Akt inhibitor nelfinavir does not improve the 94 Anhang curative effect of fractionated irradiation in PC-3 prostate cancer in vitro and in vivo. Im Druck bei Clinical and Translational Radiation Oncology. 6. Ich bestätige, dass es keine zurückliegenden erfolglosen Promotionsverfahren ab. 7. Ich bestätige, dass ich die Promotionsordnung der Medizinischen Fakultät der Technischen Universität Dresden anerkenne. 8. Ich habe die Zitierrichtlinien für Dissertationen an der Medizinischen Fakultät der Technischen Universität Dresden zur Kenntnis genommen und befolgt. Dresden, 09.01.2017 Unterschrift des Doktoranden 95 Anhang Anlage 2 Hiermit bestätige ich die Einhaltung der folgenden aktuellen gesetzlichen Vorgaben im Rahmen meiner Dissertation das zustimmende Votum der Ethikkommission bei Klinischen Studien, epidemiologischen Untersuchungen mit Personenbezug oder Sachverhalten, die das Medizinproduktegesetz betreffen [entfällt] die Einhaltung der Bestimmungen des Tierschutzgesetzes Aktenzeichen der Genehmigungsbehörde zum Vorhaben/zur Mitwirkung: Landesdirektion Sachsen, AZ: 24-9168.11-1/2013-52 die Einhaltung des Gentechnikgesetzes [entfällt] die Einhaltung von Datenschutzbestimmungen der Medizinischen Fakultät und des Universitätsklinikums Carl Gustav Carus. Dresden, 09.01.2017 Unterschrift des Doktoranden 96
