Die Bedeutung von VEGF-C und NRP-2 für die

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Aus der Klinik und Poliklinik für Strahlentherapie und Radioonkologie
und dem OncoRay – Nationales Zentrum für Strahlenforschung in der Onkologie
Arbeitsgruppe: Translationale Radioonkologie und Klinische Strahlentherapie
Direktorin: Frau Prof. Dr. med. habil. Mechthild Krause
Die Bedeutung von VEGF-C und NRP-2 für die
Strahlenresistenz im Prostatakarzinom
Dissertationsschrift
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Biomedizin
Doctor rerum medicinalium (Dr. rer. medic.)
vorgelegt
der Medizinischen Fakultät Carl Gustav Carus
der Technischen Universität Dresden
von
Dipl.-Lebensmittelchem. Steffi Liebscher (geb. Haberlau)
aus Frankfurt (Oder)
Dresden 2017
1. Gutachter: Prof. Dr. Mechthild Krause
2. Gutachter: Prof. Dr. Georg Breier
Tag der mündlichen Prüfung:
07.03.2017
gez.: Prof. Dr. Nils Cordes
Vorsitzender der Prüfungskommission
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................ VIII
1 Einleitung und Zielstellung.................................................................................. 1
2 Grundlagen ........................................................................................................... 3
2.1 Zelluläre Auswirkungen der Bestrahlung ..................................................................... 3
2.2 Überlebensfördernde Signalwege ............................................................................... 6
2.3 Zellüberlebensstrategien ............................................................................................. 9
2.3.1 Autophagie....................................................................................................... 10
2.3.2 DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur ................................................................. 12
2.3.3 Zellzyklusarrest ................................................................................................ 13
2.4 Reaktionen von Tumoren auf Bestrahlung ................................................................ 14
2.5 Nelfinavir als Akt-Inhibitor ......................................................................................... 15
3 Material und Methoden ...................................................................................... 17
3.1 Material ..................................................................................................................... 17
3.1.1 Zelllinien .......................................................................................................... 17
3.1.2 Reagenzien und Substanzen ........................................................................... 17
3.1.3 Kits .................................................................................................................. 19
3.1.4 Primäre Antikörper ........................................................................................... 19
3.1.5 Sekundäre Antikörper ...................................................................................... 20
3.1.6 siRNA .............................................................................................................. 20
3.1.7 Primer .............................................................................................................. 20
3.1.8 Materialien und Hilfsmittel ................................................................................ 20
3.1.9 Geräte.............................................................................................................. 21
3.1.10 Software .......................................................................................................... 22
3.2 Methoden .................................................................................................................. 22
3.2.1 Zellkultur .......................................................................................................... 22
3.2.2 siRNA-Transfektion .......................................................................................... 23
3.2.3 Bestrahlung...................................................................................................... 24
3.2.4 Koloniebildungsassay ...................................................................................... 24
3.2.5 Autophagischer Flux ........................................................................................ 26
3.2.6 Semiquantitative Proteinbestimmung ............................................................... 27
3.2.7 mRNA-Quantifizierung ..................................................................................... 29
3.2.8 γH2AX Foci-Assay ........................................................................................... 31
IV
Inhaltsverzeichnis
3.2.9 Zellzyklusanalyse ............................................................................................. 33
3.2.10 Tierversuch ...................................................................................................... 34
3.2.11 Statistische Auswertung ................................................................................... 37
4 Ergebnisse .......................................................................................................... 39
4.1 Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Strahlenresistenz ...................................... 39
4.1.1 Betrachtung der VEGF-C- und NRP-2-Gehalte in den Zelllinien PC-3,
DU145 und LNCaP .......................................................................................... 39
4.1.2 Etablierung der VEGF-C- und NRP-2-siRNA-Transfektionen ........................... 39
4.1.3 Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Klonogenität bestrahlter Zellen ........ 40
4.2 Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf überlebensfördernde Signalwege unter
Bestrahlung ............................................................................................................... 42
4.2.1 Aktivierung des Akt-Signalwegs ....................................................................... 43
4.2.2 Aktivierung des ERK1/2-Signalwegs ................................................................ 45
4.3 Untersuchungen zum Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Strahlenresistenz
beeinflussende zelluläre und molekulare Prozesse ................................................... 46
4.3.1 Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Autophagie und deren Bedeutung
für die Strahlenresistenz .................................................................................. 46
4.3.2 Einfluss von VEGF-C auf die Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen ......... 48
4.3.3 Der Einfluss von VEGF-C auf den Zellzyklus ................................................... 50
4.4 Inhibierung der Aktivierung von Akt durch Nelfinavir ................................................. 52
4.4.1 Einfluss von Nelfinavir auf die Klonogenität in vitro .......................................... 53
4.4.2 Tumorwachstumsverzögerung ......................................................................... 54
4.4.3 Lokale Tumorkontrolle ..................................................................................... 56
5 Diskussion .......................................................................................................... 59
5.1 VEGF-C- und NRP-2-Expression und -Herunterregulierung...................................... 59
5.2 Der Einfluss von VEGF-C auf die Strahlenresistenz .................................................. 59
5.3 Die Funktion von NRP-2 als Co-Rezeptor für VEGF-C bei der Vermittlung von
Strahlenresistenz ...................................................................................................... 60
5.4 VEGF-C-abhängige Akt- und ERK1/2-Regulierung unter Bestrahlung ...................... 62
5.5 Der Einfluss der Autophagie auf die Strahlenresistenz .............................................. 62
5.6 Der Einfluss von VEGF-C auf die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur ...................... 63
5.7 Der Einfluss von VEGF-C auf den Zellzyklus ............................................................ 64
V
Inhaltsverzeichnis
5.8 Der Einfluss von Nelfinavir auf das Wachstum und auf die Strahlenresistenz von
PC-3-Zellen in vitro und in vivo ................................................................................. 65
5.9 Schlussfolgerung und Ausblick ................................................................................. 67
6 Zusammenfassung ............................................................................................. 69
7 Abstract ............................................................................................................... 72
8 Literaturverzeichnis ........................................................................................... 75
9 Abbildungsverzeichnis ...................................................................................... 89
10 Tabellenverzeichnis ........................................................................................... 90
Danksagung ............................................................................................................ 92
Anhang .................................................................................................................... 93
Anlage 1 ........................................................................................................................... 94
Anlage 2 ........................................................................................................................... 96
VI
Abkürzungsverzeichnis
Akt
Proteinkinase B
APS
Ammoniumpersulfat
ATG5
engl. autophagy-related gene 5
Bcl-2
engl. B-cell lymphoma 2 (ein Protein)
BSA
bovines Serumalbumin
ct
engl. cycle threshold; Wert, der den Anfang des exponentiellen
Wachstums einer Kurve beschreibt
DAPI
4‘,6-Diamidin-2-phenylindol
ddH2O
bidestilliertes Wasser
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
engl. deoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure
DSB
DNA-Doppelstrangbruch
DU145
eine humane Prostatakarzinomzelllinie
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
ELISA
engl. enzyme-linked immunosorbent assay
ERK1/2
engl. extracellular signal-regulated kinases 1 and 2
FaDu
eine humane Pharynxkarzinomzelllinie
FITC
Fluoresceinisothiocyanat
FKS
fötales Kälberserum
fwd
engl. forward, vorwärts
γH2AX
phosphoryliertes H2AX
G
Gauge, Maßeinheit für die Größe von Kanülen
Gy
Gray, SI-Einheit der Energiedosis
H2AX
ein Protein aus der Gruppe der Histone
HIF1α
engl. hypoxia-inducible factor 1-alpha
HSPG
Heparansulfat-Proteoglycane
kDa
Kilodalton, atomare Masseneinheit
LNCaP
eine humane Prostatakarzinomzelllinie
mRNA
engl. messenger RNA
N1
eine embryonale Maus-Hypothalamus-Zelllinie
NRP-2
Neuropilin-2
p.a.
lat. pro analysi, zur Analyse
pAkt
phosphoryliertes Akt
PBS
engl. phosphate buffered saline
VIII
Abkürzungsverzeichnis
PC-3
eine humane Prostatakarzinomzelllinie
PCR
engl. polymerase chain reaction, Polymerase-Kettenreaktion
PE
engl. plating efficiency, Plattierungseffizienz
pH
Protonenaktivitätsexponent
PI3K
engl. phosphoinositide 3-kinase
PTEN
engl. phosphatase and tensin homolog
qRT-PCR
engl. quantitative real-time PCR, quantitative Echtzeit-PCR
rev
engl. reverse, rückwärts
rhVEGF-C
rekombinantes humanes VEGF-C
RIPA
engl. radioimmunoprecipitation assay
RNA
engl. ribonucleic acid, Ribonukleinsäure
RT
Raumtemperatur (20-25 °C)
SDS
engl. sodium dodecyl sulfate, Natriumdodecylsulfat
SDS-PAGE
engl. sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis
SF
engl. surviving fraction, Überlebensfraktion
siATG5
siRNA gegen ATG5
siNRP-2
siRNA gegen NRP-2
siRNA
engl. small interferring RNA
siSCR
engl. scramble, nichtspezifische Kontroll-siRNA
siVEGF-C
siRNA gegen VEGF-C
STAT3
engl. signal transducer and activator of transcription 3
TCD
engl. tumour control dose, Tumorkontrolldosis
TCP
engl. tumour control probability, Tumorkontrollwahrscheinlichkeit
TEMED
Tetramethylethylendiamin
TGTV2-V5
engl. tumour growth time, Tumorwachstumszeit für das 2- bis 5-fache
Volumen des Entervolumens
VDT
engl. volume doubling time, Volumenverdopplungszeit
VEGF
engl. vascular endothelial growth factor
VEGF-C
engl. vascular endothelial growth factor C
VEGFR
engl. vascular endothelial growth factor receptor
xg
Vielfaches der Erdbeschleunigung g (1 xg ≈ 9,81 m/s2)
Desweiteren wurden die gängigen SI-Einheiten / Einheiten und Abkürzungen verwendet.
IX
1 Einleitung und Zielstellung
Das Prostatakarzinom ist in Deutschland die häufigste Krebsneuerkrankung bei Männern.
Einem
Bericht
des
Robert
Koch-Instituts
zufolge
traten
im
Jahr
2012
63.710
Neuerkrankungen auf, was 25,3 % der Neuerkrankungen aller Tumorentitäten (nichtmelanotischer Hautkrebs ausgenommen) entspricht (Kaatsch et al., 2015). Mit einem Anteil
von 20,1 % war das Prostatakarzinom 2012 die dritthäufigste Krebstodesursache. Neben
den palliativen Therapien, wie der Androgenablationstherapie (Markiewicz und Hanks, 1991)
und der Chemotherapie (Harrington und Smith, 2008) beziehungsweise dem beobachtenden
Abwarten, kommen vor allem bei Patienten mit diffusem oder weniger differenziertem
Tumorgewebe die kurativen Therapien radikale Prostatektomie und Bestrahlung zum
Einsatz. Diese führen zu sehr guten Ergebnissen für die lokale Tumorkontrolle und für das
Überleben. Delaney et al. (2005) schätzen, dass die Bestrahlung für 60 % der Patienten mit
Prostatakrebs innerhalb des Krankheitsverlaufs eine geeignete Therapie darstellt. Allerdings
ist, wie bei der Operation auch, dabei das Risiko eines Rezidivs für fortgeschrittene Tumoren
(T3-, T4-Stadium) im Gegensatz zu Tumoren in früheren Stadien (T1-, T2-Stadium) immer
noch relativ hoch (Delaney et al., 2005; Pommier et al., 2016). Nach Kaatsch et al. (2015)
befinden sich bei der Erstdiagnose bereits 25 % der Tumoren im T3- oder T4-Stadium.
Eine aktuelle Studie empfiehlt für die Strahlentherapie bei fortgeschrittenen Tumoren eine
Kombination mit einer Androgenablationstherapie vor und während der Bestrahlung
(Pisansky et al., 2015). Hierbei wurden eine Lokalrezidivrate von 6 % und ein
Gesamtüberleben von 66 % erreicht. Bei der Therapie von Tumoren in frühen Stadien
hingegen bringt die Androgenablationstherapie zusätzlich zur alleinigen Strahlentherapie
keinen Vorteil (Falchook et al., 2016). In dieser Studie lag bei beiden Behandlungsansätzen
die Gesamtüberlebensrate bei rund 78 %.
Anhand dieser Daten wird deutlich, dass eine hohe Dringlichkeit zur Verbesserung der
Strahlentherapie vor allem für fortgeschrittene Tumoren besteht.
Ein Ansatz hierfür ist die Kombination der Bestrahlung mit anderen molekularen Therapien.
Ziel dabei ist es, bestimmte Zielproteine zu blockieren, um die Strahlensensibilität der
Prostatakarzinomzellen zu erhöhen. Bereits seit einigen Jahren wird hierfür nach möglichen
Biomarkern, Zielproteinen sowie Substanzen gesucht. Eine Reihe solcher Substanzen und
Biomarker
wurde
bereits
in
präklinischen
und
klinischen
Studien,
teilweise
mit
vielversprechenden Ergebnissen, getestet (Dal Pra et al., 2016). In Hinblick auf die
individuellen biologischen Unterschiede, die jeder Tumor aufweist, werden dementsprechend
unterschiedliche Therapieansätze zur personalisierten Behandlung benötigt. Nach Dal Pra et
al. (2016) wurden bisher Untersuchungen zur Blockade spezifischer Proteine innerhalb des
1
1 Einleitung und Zielstellung
Androgen-Signalwegs, der Hypoxie-regulierten Signalwege, des DNA-SchadensantwortSignalwegs und abnormer extra- und intrazellulärer Signalwege in Prostatakarzinomzellen
durchgeführt.
Ein potentielles Target könnte auch die Blockade des VEGF-C/NRP-2/Akt-Signalwegs
(VEGF-C – vascular endothelial growth
factor C;
NRP-2 – Neuropilin 2;
Akt –
Proteinkinase B) sein. Im Prostatakarzinom sind die Konzentrationen von VEGF-C und
Neuropilin-2 im Vergleich zu normalen Prostatazellen erhöht (Jennbacken et al., 2005; Goel
et al., 2012). Neuropilin-2 ist ein Rezeptorprotein und wirkt progressiv auf die Tumorgenese
(Pellet-Many et al., 2008). VEGF-C ist ein NRP-2-Ligand und somit ebenfalls ein
progressiver Faktor für die Tumorgenese. Die Ergebnisse von Muders et al. (2009) zeigen
eine Aktivierung von Akt (Phosphorylierung zu pAkt) über die VEGF-C/NRP-2-Achse, welche
mittels oxidativen Stress durch H2O2 aktiviert wurde. Dieser Signalweg führte in den
getesteten Prostatakarzinomzelllinien unter den genannten Bedingungen zum Zellüberleben.
Anai et al. (2007) vermuten, dass pAkt in Prostatakarzinomzellen auch unter Bestrahlung
protektiv wirkt. Die Erkenntnisse von Muders et al. (2009) dienen als Grundlage für diese
Arbeit.
Im Rahmen dieser Dissertation wurden drei Fragestellungen untersucht.
(1) Wird in Prostatakarzinomzelllinien Strahlenresistenz über den VEGF-C/NRP-2/AktSignalweg vermittelt?
(2) Welche Strahlenresistenz vermittelnden Mechanismen werden durch VEGF-C und
NRP-2 reguliert?
(3) Führt eine Blockade der Akt-Aktivierung unabhängig von VEGF-C und NRP-2 zu einem
strahlensensibilisierenden Effekt?
2
2 Grundlagen
2.1
Zelluläre Auswirkungen der Bestrahlung
Ionisierende
Strahlung,
unter
anderem
die
zur
Therapie
häufig
angewandte
Röntgenstrahlung, führt in Zellen zu Schädigungen von Makromolekülen wie Proteinen,
Nukleinsäuren und Lipiden (Breen und Murphy, 1995; Laval, 1996; Herrmann et al., 2006).
Die
Ionisation
kann
dabei
direkt
im
Zielmolekül
oder
indirekt
über
sekundäre
Radikalreaktionen erfolgen (Herrmann et al., 2006). Da ein Großteil der Moleküle in der Zelle
Wassermoleküle sind, kommt es bei der Bestrahlung verstärkt zur Ionisation dieser Teilchen
(Radiolyse des Wassers). Hierbei entstehen zum Teil hochreaktive Sauerstoffspezies,
welche ihre Reaktionsenergie auf andere Moleküle übertragen können und diese somit
indirekt ionisieren (Breen und Murphy, 1995; Herrmann et al., 2006). Breen und Murphy
(1995) fassten die Reaktionen der Radiolyse des Wassers folgendermaßen zusammen. In
der initialen Hauptreaktion werden nach der Energieübertragung auf ein Wassermolekül ein
ionisches H2O+-Radikal und ein Elektron, welches von einer Hydrathülle umgeben ist,
gebildet (siehe Reaktion (1)). Das H2O+-Radikal kann im Weiteren mit einem Wassermolekül
ein Hydronium-Ion (H3O+) und ein Hydroxyl-Radikal (●OH) bilden (2). Das Elektron kann mit
einem Wassermolekül zu einem Wasserstoff-Radikal (H●) und einem Hydroxyl-Ion (OH-)
reagieren (3). Ein sekundärer Prozess ist die homolytische Spaltung des Wassers zum
Wasserstoff-Radikal (H●) und Hydroxyl-Radikal (●OH) (4).
H2O
H2O●+ + e-(aq)
H2O●+ + H2O
H2O + e-(aq)
H2O
H2O*
H3O+ + ●OH
H● + OHH● + ●OH
(1)
(2)
(3)
(4)
Die Schädigung der DNA durch ionisierende Strahlung hat wahrscheinlich den größten
Einfluss auf das Zellüberleben (Ross, 1999). Die Reaktionsprodukte der Radiolyse des
Wassers, vor allem das hochreaktive Hydroxyl-Radikal (●OH), können zum Beispiel mit den
Basen und Zuckermolekülen der DNA reagieren. Wird ein solcher Schaden nicht repariert,
entsteht ein DNA-Einzelstrangbruch (Breen und Murphy, 1995). Treten mehrere nicht
reparierte DNA-Einzelstrangbrüche nahe beieinander an beiden DNA-Strängen auf, kann es
zur Bildung von DNA-Doppelstrangbrüchen kommen (Breen und Murphy, 1995), deren
Reparatur im Gegensatz zu den eben genannten Schäden komplexer und nicht immer
erfolgreich ist.
3
2.1 Zelluläre Auswirkungen der Bestrahlung
Die meisten DNA-Schäden werden innerhalb kurzer Zeit repariert. Missglückt dies jedoch,
führen sie zu Mutationen oder zum Zelltod (Ross, 1999). Die Reparatur von DNADoppelstrangbrüchen
ist
schwieriger
als
die
der
anderen
DNA-Schäden.
DNA-
Einzelstrangbrüche treten zu rund 1000 und Basenschäden zu mehr als 1000 Schäden pro
Zelle nach Bestrahlung mit 1 Gy auf, DNA-Doppelstrangbrüche hingegen deutlich seltener
mit
rund
20-40
Schäden
Doppelstrangbrüche
von
pro
allen
Zelle.
Arten
Dennoch
von
korreliert
die
Anzahl
der
DNA-Schäden
am
stärksten
DNA-
mit
der
durch
die
Zelltodhäufigkeit (Ross, 1999; Joiner und van der Kogel, 2009).
Die
Strahlenempfindlichkeit
der
Zellen
wird
wesentlich
beeinflusst
Sauerstoffkonzentration während der Bestrahlung – bezeichnet als Sauerstoffeffekt. Durch
den Sauerstoff werden bevorzugt Hydroperoxyl-Radikale (HOO●) gebildet. Diese besitzen
eine geringere Reaktivität als das Hydroxyl-Radikal (●OH), können dadurch jedoch weiter
diffundieren, um kritische Moleküle zu schädigen (Herrmann et al., 2006).
Das Ziel der Strahlentherapie ist die Verhinderung der Proliferation oder die Abtötung von
Tumorzellen (Galluzzi et al., 2007). In beiden Fällen kommt es zum sogenannten
klonogenen Zelltod. Dieser wird durch verschiedene Mechanismen erreicht: durch den
Mitosetod, durch Apoptose oder die Differenzierung von Tumorzellen (Herrmann et al.,
2006).
Für die Zellteilung verfügen die Zellen über ein spezielles Zellzyklus-Kontrollsystem. Kommt
es bei der DNA-Replikation aufgrund eines strahleninduzierten DNA-Schadens an einer
Stelle zu einem Fehler, wird der Zellzyklus an dem entsprechenden Checkpoint angehalten
und der Fehler behoben. Funktionieren diese Checkpoints nicht, kommt es zu einer
fehlerhaften Mitose. Liegen möglicherweise in der Zelle außerdem Mutationen vor, die einen
Zelltod durch Apoptose infolge der fehlerhaften Mitose unmöglich machen, wird sich die Zelle
bei der nächsten Zellteilung möglicherweise asymmetrisch teilen. Hierbei entstehen
aneuploide Zellen (numerische Chromosomenaberration). Diese können entweder zum
Selektionsvorteil für die Zelle werden und zum Tumorwachstum beitragen (Andreassen et
al., 1996), oder die Zellen sind auf Dauer nicht überlebensfähig (Herrmann et al., 2006).
Möglicherweise bleiben diese Zellen vorerst morphologisch intakt und können wenige
Zellteilungen durchlaufen. Danach tritt jedoch ein Mangel an essentiellen Proteinen auf, die
aufgrund der strahleninduzierte Mutation nicht nachgebildet werden können. Folglich sterben
die Zellen am sogenannten Mitosetod (mitotische Katastrophe) (Herrmann et al., 2006).
Die Apoptose kann ebenfalls durch ionisierende Strahlung induziert werden. Sie steht aber
im Vergleich zum Mitosetod im Hintergrund. Dewey et al. fassten in ihrem Review von 1995
mehrere quantitative und semiquantitative in vitro-Studien zusammen und zeigten, dass
Apoptose nicht mit dem klonogenen Überleben bestrahlter Zellen korreliert. Aus in vivo4
2 Grundlagen
Studien zitierte Ross (1999) wiederum, dass der klonogene Zelltod nach Bestrahlung eher
durch Apoptose als durch den Mitosetod verursacht wird.
Wie bereits oben erwähnt, können in pro-apoptotischen Signalwegen Mutationen vorliegen,
die diesen Zelltod unmöglich machen. Eines der wichtigsten pro-apoptotischen Proteine,
auch als „Wächter“ des Genoms bezeichnet, ist der Transkriptionsfaktor p53 (Lane, 1992).
Dieser beeinflusst die Apoptose, die DNA-Reparatur, den Zellzyklus und die Seneszenz
(permanenter Zellzyklusarrest) (Eriksson und Stigbrand, 2010). Kommt es durch Einwirkung
ionisierender Strahlung zum DNA-Schaden, wird über p53 der G1-Arrest eingeleitet.
Anschließend erfolgt die DNA-Reparatur oder, sofern erfolglos, Zelltod durch Apoptose. Liegt
jedoch eine p53-Mutation vor, können weder ein G1-Arrest noch eine DNA-Reparatur
erfolgen. Stattdessen folgen entweder das Überleben oder der Mitosetod der entstandenen
aneuploiden Zellen (Kastan et al., 1991; Lane, 1992; Ianzini et al., 2006).
Die p53-Mutation tritt in humanen Tumoren unterschiedlicher Entitäten häufig auf (Hollstein
et al., 1991). Van Veldhuizen et al. (1993) untersuchten hierzu 33 Prostatatumoren, wobei 26
Tumoren eine p53-Mutation aufwiesen. In Bezug auf die Strahlentherapie konnte
nachgewiesen werden, dass eine p53-Mutation zur Progression von Prostatakarzinomen
beiträgt (Effert et al., 1992). Die für diese Arbeit ausgewählten Zelllinien PC-3 und DU145
weisen ebenfalls eine p53-Mutation mit Funktionsverlust auf (Isaacs et al., 1991). Die
Zelllinie LNCaP hingegen besitzt ein funktionelles p53 (Isaacs et al., 1991), jedoch stellten
Chiu et al. (2012) nach Bestrahlung keinen signifikanten Anstieg der Apoptose in dieser
Zelllinie fest, was ebenfalls die oben erwähnte Aussage unterstützt, dass Apoptose nach
Bestrahlung eine untergeordnete Rolle spielt (Dewey et al., 1995).
Ionisierende Strahlung kann weiterhin die Differenzierung von Zellen induzieren oder
beschleunigen. Somit entstehen aus zuvor klonogenen Zellen sofort nach Bestrahlung oder
nach wenigen Teilungen terminale Funktionszellen ohne weiteres Proliferationspotential
(Herrmann et al., 2006).
Eine weitere Folge der Bestrahlung ist die Induktion eines Zellzyklusarrests. Bei einem
reversiblen Arrest ist eine anschließende Tumorprogression möglich. Wird jedoch ein
permanenter Zellzyklusarrest (Seneszenz) durch die Bestrahlung erreicht, kommt es zum
Verlust
der
Klonogenität,
da
dieser
mit
einer
Zelldifferenzierung,
Alterung
oder
Zellschädigung assoziiert ist (Joiner und van der Kogel, 2009). Seneszente Zellen können
dennoch das Tumorwachstum beeinflussen, da sie immer noch metabolisch aktiv sein
können und tumorunterdrückende und tumorfördernde Faktoren sezernieren können
(Eriksson und Stigbrand, 2010).
Auch für die Seneszenz spielt p53 eine Rolle. Lehmann et al. (2007) führten in vitroVersuche mit Prostatakarzinomzelllinien (unter anderem DU145 und LNCaP) durch. Dabei
5
2.2 Überlebensfördernde Signalwege
konnten sie nachweisen, dass durch eine p53-Mutation die strahleninduzierte Seneszenz
verringert ist.
Zusammengefasst spielen vier wesentliche Mechanismen für den klonogenen Zelltod nach
Einwirkung ionisierender Strahlung eine Rolle – der Mitosetod, die Apoptose, die
Differenzierung sowie die Seneszenz. Zur Messung des klonogenen Zellüberlebens in vitro
wird der sogenannte Koloniebildungsassay durchgeführt, bei dem nicht unterschieden wird,
ob Zelltod oder Seneszenz zum klonogenen Zelltod geführt haben (Galluzzi et al., 2007).
Bei diesem Assay werden Zellen vereinzelt ausgesät und bestrahlt. Nach einer
zelllinienspezifischen Inkubationszeit (abhängig von ihrer Verdopplungszeit) werden die
Kolonien erfasst, die mindestens 50 Zellen aufweisen (Herrmann et al., 2006). Da dafür eine
bestimmte Anzahl an Zellteilungen notwendig ist, kann davon ausgegangen werden, dass
die Zellen dieser Kolonien durch die Bestrahlung ihre Klonogenität nicht verloren haben.
2.2
Überlebensfördernde Signalwege
In vorhergehenden Untersuchungen innerhalb unserer Arbeitsgruppe wurde gezeigt, dass in
Prostatakarzinomzellen nach H2O2-induziertem oxidativen Stress über VEGF-C (vascular
endothelial growth factor C) Zellüberleben vermittelt wird (Muders et al., 2009). Die
Signalweiterleitung erfolgt hierbei über NRP-2 (Neuropilin-2) und Akt (Proteinkinase B).
Ausgehend von diesen Erkenntnissen wurde in dieser Arbeit unter anderem untersucht, ob
dieser Signalweg auch nach Induktion oxidativen Stresses durch ionisierende Bestrahlung
für das Zellüberleben eine Rolle spielt.
Bei VEGF-C handelt es sich um ein extrazelluläres Glycoprotein der VEGF-Familie, dessen
Signaltransduktion über hochaffine Tyrosinkinase-Rezeptoren erfolgt (Byrne et al., 2005).
VEGF-C wurde erstmals 1996 von Joukov et al. in Endothelzellen, in welchen es die
Angiogenese (Blutgefäßbildung) und Lymphangiogenese (Lymphgefäßbildung) reguliert,
nachgewiesen. Beide Prozesse sind in Tumoren von Bedeutung, da die endokrine oder
parakrine Sekretion die Angiogenese die Nährstoff- und Sauerstoffversorgung von Tumoren
ab einer Größe von 2-3 mm3 sicher stellt (Byrne et al., 2005) und die Lymphangiogenese das
Wachstum und die Metastasierung von Tumoren ermöglicht (Jeltsch et al., 1997).
VEGF-C bindet als Dimer an verschiedene Rezeptoren, darunter an die VEGF-Rezeptoren
VEGFR-3 und VEGFR-2, wobei die Affinität zu VEGFR-3 höher als die zu VEGFR-2 ist
(Kukk et al., 1996; Mäkinen et al., 2001; Chen et al., 2012). VEGF-C bindet dabei an die
Immunglobulin-ähnlichen (Ig-like) Domänen 1 und 2 von VEGFR-3 beziehungsweise 2 und 3
von VEGFR-2. Die Bindung von VEGF-C zu VEGFR-3 ist Heparansulfat-abhängig (ein
Glycosaminoglycan der Gruppe der Heparine, welches die Bindung und Aktivierung einiger
vaskulärer Wachstumsfaktoren unterstützt) (Yin et al., 2011). Das Heparansulfat ist dabei an
6
2 Grundlagen
einem Proteoglycan gebunden, welches ein Co-Rezeptor für die Aktivierung von VEGFR-3
sein könnte (Chen et al., 2012). Durch die Bindung des Liganden an VEGFR-3 oder
VEGFR-2 wird eine Dimerisierung zum VEGFR-3-Homodimer beziehungsweise zum
VEGFR-3/VEGFR-2-Heterodimer induziert, durch welche es nachgeschaltet zur Aktivierung
(Phosphorylierung)
von
ERK1/2
(extracellular
signal-regulated
kinases
1
and
2)
beziehungsweise Akt über PI3K (phosphoinositide 3-kinase) kommt (Deng et al., 2015). Die
Aktivierung von Akt durch PI3K kann wiederum durch den Tumorsuppressor PTEN
(phosphatase and tensin homolog) blockiert werden (Haas-Kogan et al., 1998; Stambolic et
al., 1998).
VEGF-C bindet weiterhin an den Co-Rezeptor NRP-2, welcher keine zytoplasmatische
Domäne zur Signaltransduktion besitzt (Byrne et al., 2005). Die Signaltransduktion erfolgt
daher über die Assoziation mit VEGFR-2 oder VEGFR-3 (Favier et al., 2006; Kärpänen et al.,
2006). Kärpänen et al. (2006) vermuten, dass die Interaktion von VEGF-C und NRP-2 durch
Heparansulfat-Proteoglycane (HSPG) verstärkt wird. Favier et al. (2006) zeigten einen
signalverstärkenden Einfluss von NRP-2 auf die VEGF-C/VEGFR-Signaltransduktion. Nach
Caunt et al. (2008) und Deng et al. (2015) ist dieser Einfluss jedoch nur gering.
Die Signaltransduktion von VEGF-C ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 1: Signaltransduktion von VEGF-C. Abbildung modifiziert nach Chen et al.
(2012) und inhaltlich adaptiert an Gerber et al. (1998), Haas-Kogan et al. (1998), Stambolic
et al. (1998), Favier et al. (2006), Kärpänen et al. (2006), Wang et al. (2010), Yin et al.
(2011a), Deng et al. (2015).
7
2.2 Überlebensfördernde Signalwege
Wie bereits oben erwähnt, wird über die beschriebenen Signalweiterleitungen die
Tumorgenese durch die Angiogenese und Lymphangiogenese begünstigt. Weiterhin wird
durch ERK1/2 mit nachfolgender Induktion antiapoptotischer Proteine und des G1-Arrests
das Zellüberleben und die Proliferation vermittelt (Bonni et al., 1999; Boucher et al., 2000).
Akt schützt die Zelle ebenfalls vor der Induktion der Apoptose und vor dem mitotischen
Zelltod (Gerber et al., 1998; Mäkinen et al., 2001; Yamaguchi und Wang, 2001; Skvortsova
et al., 2008). Durch Akt kommt es zur Zellzyklusprogression, zum Wachstum und zur
Migration von Zellen (Thakker et al., 1999; Mäkinen et al., 2001).
Akt und ERK1/2 können durch Stress, wie zum Beispiel ionisierende Strahlung, aktiviert
werden und zur Strahlenresistenz führen (Contessa et al., 2002; Gupta et al., 2002; Shonai
et al., 2002; Yazlovitskaya et al., 2008; Marampon et al., 2014). Außerdem liegen VEGF-C,
NRP-2 und Akt in einigen Tumoren höher exprimiert vor und werden in Bezug auf die
Strahlentherapie zum Teil als mögliche prognostische Faktoren beschrieben.
Beispielsweise fanden im Vergleich zum normalen Prostatagewebe Tsurusaki et al. (1999)
erhöhte Gehalte an VEGF-C-mRNA und Jennbacken et al. (2005) erhöhte VEGF-CProteingehalte und eine erhöhte VEGFR-3-Expression in humanen Prostatakarzinomen, bei
denen Lymphknotenmetasen vorhanden waren. Trojan et al. (2006), Yang et al. (2006)
sowie Kostis et al. (2014) zeigten in Patientenstudien, dass die VEGF-C-Expression im
Prostatatumorgewebe mit fortschreitendem Grad zunimmt. Aus einer Patientenstudie zur
strahlentherapeutischen
Behandlung
von
Blasenkarzinomen
mit
einer
Nachbeobachtungszeit von 15 Jahren ist bekannt, dass nach transurethraler Resektion mit
anschließender Strahlentherapie ein erhöhter VEGF-C-Gehalt mit einem schlechteren
Gesamtüberleben korreliert (Keck et al., 2015).
Auch der NRP-2-Gehalt ist in Prostatakarzinomen im Vergleich zu normalen Prostatazellen
erhöht und korreliert mit dem Stadium der Erkrankung (Goel et al., 2012). In der bereits
angesprochenen Patientenstudie zum Blasenkarzinom von Keck et al. (2015) ergab sich
eine geringe, jedoch keine signifikante Korrelation zwischen der NRP-2-Expression und dem
Gesamtüberleben.
Eine Akt-Überexpression, wie sie in vielen Tumoren beobachtet wird, in Prostatakarzinomen
zu 45-55 %, kann eine Folge einer Mutation mit Funktionsverlust des Tumorsuppressors
PTEN sein (Altomare und Testa, 2005). Diese Mutation tritt in vielen Tumoren auf.
Beispielsweise untersuchten Fallahabadi et al. (2016) 21 Prostatatumoren, von denen 11
Tumoren kein funktionelles PTEN aufwiesen. Die Akt-Überexpression kann in verschiedenen
Tumoren mit dem zunehmendem Stadium korrelieren, was jedoch nicht in jedem Fall
beobachtet werden konnte (Altomare und Testa, 2005). Gupta et al. (2002) konnten für KopfHals-Karzinomzellen
in
vitro
nachweisen,
dass
eine
Blockade
von
Akt
eine
Strahlensensibilisierung zur Folge hat. Innerhalb einer Patientenstudie zu Kopf-Hals8
2 Grundlagen
Tumoren wurde von Freudlsperger et al. (2015) der pAkt-Status primär oder adjuvant
bestrahlter Patienten ausgewertet. Hierbei zeigte sich eine signifikante Korrelation der AktAktivierung am Serin 473 (aber nicht am Threonin 308; Phosphorylierung an beiden Stellen
ist möglicherweise für eine vollständige Aktivierung nicht nötig (Tsurutani et al., 2006)) mit
dem Gesamtüberleben beziehungsweise dem progressionsfreien Überleben. Die Autoren
dieser Studie leiteten aus ihren Ergebnissen ab, dass pAkt (Ser473) als prognostischer
Biomarker für den Therapieerfolg der Bestrahlung dienen kann. Zum gleichen Ergebnis
kamen Gupta et al. (2002) in ihrer in vitro-Studie und erkannten PI3K als potentielles
Therapietarget.
In einer Patientenstudie mit 74 Prostatakarzinompatienten fanden Malik et al. (2002), dass
ERK1/2 im Gegensatz zu Akt im Prostatatumorgewebe im Vergleich zum Normalgewebe
nicht überexprimiert ist. Der aktivierte Status (pERK1/2) ist im Tumor sogar geringer als im
Normalgewebe und nimmt mit fortgeschrittenem Stadium ab (Malik et al., 2002). Dennoch ist
ERK1/2 für die Strahlentherapie relevant, da auch dieses Protein durch Bestrahlung aktiviert
werden (jedoch nicht in jeder Zelllinie) und Strahlenresistenz vermitteln kann, wie es in vitro
beispielsweise für Darm-, Leukämie- und gynäkologische Karzinomzelllinien nachgewiesen
wurde (Hosseinimehr et al., 2004; Carón et al., 2005; Appukuttan et al., 2014; Marampon et
al., 2014). In Blasenkarzinomzellen hingegen konnte kein Einfluss von pERK1/2 auf die
Strahlenresistenz gefunden werden (Gupta et al., 2001).
2.3
Zellüberlebensstrategien
Die unter Abschnitt 2.2 betrachteten Proteine können Prozesse regulieren, die das
Überleben der Zelle unter Stressbedingungen sichern. So ist für Prostatakarzinomzelllinien
bekannt,
dass
unter
Chemotherapeutikum
Stress,
Docetaxel,
vermittelt
durch
das
die
zellüberlebensfördernde
Zellteilung
Autophagie
hemmende
über
die
VEGF-C/NRP-2-Achse aktiviert wird (Stanton et al., 2013a, 2013b). In den Untersuchungen
von Stanton et al. (2013a) erfolgte die Signalweiterleitung allerdings nicht über Akt. Akt kann
dennoch, sowie auch ERK1/2 an der Regulation der Autophagie beteiligt sein (Aoki et al.,
2007).
Für Kopf-Hals- und Blasenkarzinomzelllinien wurde gezeigt, dass Akt zur Reparatur
strahleninduzierter DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) beiträgt (Fokas et al., 2012). Das DSBinduzierte Akt hat weiterhin die Funktion, den Zellzyklusarrest zu inhibieren, indem es das
ebenfalls durch DSB-induzierte und bereits in Abschnitt 2.1 besprochene p53 blockiert (Xu et
al., 2012). Akt trägt somit zur Strahlenresistenz der Zellen bei (Fokas et al., 2012; Xu et al.,
2012).
Für Gliomzellen sowie für die Prostatakarzinomzelllinien LNCaP und DU145 wurde gezeigt,
dass ERK1/2 unter Bestrahlung die DNA-Einzel- und Doppelstrangbruchreparatur positiv
9
2.3 Zellüberlebensstrategien
reguliert (Yacoub et al., 2003; Golding et al., 2009). ERK1 wird weiterhin benötigt für den
Durchgang der Zellzyklusphase G2/M und ERK2 für den G1-Durchgang (Liu et al., 2004).
2.3.1
Autophagie
Bei der Autophagie (griech. Selbstverdau) werden zytoplasmatische Komponenten,
einschließlich langlebiger Proteine und Zellorganellen mit dem Ziel des Erhalts der zellulären
Homöostase abgebaut. Autophagie läuft immer in geringem Maße in Zellen ab (basale
Autophagie), wird aber durch extrazellulären Stress, wie zum Beispiel Bestrahlung, welche
diverse Zellschäden verursacht, verstärkt induziert (Paglin et al., 2001; Zois und
Koukourakis, 2009; Mizushima et al., 2010). Somit ist die Autophagie eine Möglichkeit eines
Überlebensmechanismus unter Stressbedingungen.
Es existieren unterschiedliche Formen der Autophagie. In dieser Arbeit wurde die
Makroautophagie betrachtet. Zur Vereinfachung wird hierfür nachfolgend nur der Begriff
Autophagie verwendet.
Die Autophagie läuft in mehreren Etappen ab. Im ersten Schritt, der Nucleation, wird eine
Isolationsmembran (oder Phagophor) als Doppelmembran aus Membranen anderer
Zellorganellen gebildet. Beteiligt sind dabei die Membranen des rauen Endoplasmatischen
Retikulums, der Mitochondrien und Endosomen, die Plasmamembran und Mitochondriumassoziierte
Membranen
(Dunn,
1990;
Lamb
et
al.,
2013).
Bestandteile
der
Isolationsmembran sind in diesem Schritt ein ATG12-ATG5-ATG16-Komplex (ATG =
autophagy-related gene), welcher mit Hilfe weiterer ATG-Proteine gebildet wird, sowie
LC3-II, welches über LC3-I aus LC3 posttranslational mit Hilfe verschiedener ATG-Proteine
gebildet wird, und ein Klasse III-PI3K-Komplex, welcher aus einer Reihe von Proteinen,
darunter Beclin 1, ATG9 und verschiedenen Kinasen, besteht (Kabeya et al., 2000; Zois und
Koukourakis, 2009). Der Schritt der Nucleation kann durch ATG-siRNAs, zum Beispiel
siATG5, blockiert werden (Apel et al., 2008; Kim et al., 2008; Mizushima et al., 2010). Des
Weiteren inhibieren bei der Nucleation Akt über mTOR sowie p53 die Autophagie; ERK1/2
wirkt Autophagie induzierend (Tasdemir et al., 2008; Zois und Koukourakis, 2009). Bei der
anschließenden Initialisierungsphase elongiert die Membran mit Hilfe verschiedener ATGProteine und expandiert zum Autophagosom, wobei zytoplasmatisches Material (Proteine,
Organellen, etc.) eingeschlossen werden (Mizushima et al., 2010; Lamb et al., 2013).
Danach fusioniert die äußere Membran des Autophagosoms mit einem Lysosom, wodurch
das Autolysosom entsteht. Die Fusion kann zum Beispiel mit der Substanz Bafilomycin A1
verhindert werden (Yamamoto et al., 1998). Innerhalb des Autolysosoms werden die innere
Membran des Autophagosoms und die enthaltenen zytoplasmatischen Komponenten
abgebaut. Die hierbei entstehenden Aminosäuren, Fettsäuren und andere kleine Moleküle
10
2 Grundlagen
werden in das Zytoplasma zurück überführt, sodass sie von der Zelle zur Proteinsynthese
oder zur Energieproduktion wiederverwendet werden können (Mizushima et al., 2010). Der
beschriebene Mechanismus ist in Abbildung 2 dargestellt.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Autophagie. Die Abbildung ist erstellt nach
den Ausführungen in Dunn (1990), Yamamoto et al. (1998), Levine und Yuan (2005),
Tasdemir et al. (2008), Zois und Koukourakis (2009), Mizushima et al. (2010) und Lamb et
al. (2013).
Wie oben bereits erwähnt, kann Autophagie zum Zellüberleben unter Stressbedingungen
beitragen. Beispielsweise fanden Lomonaco et al. (2009) für Gliomzellen, dass
strahleninduzierte Autophagie zur Strahlenresistenz beiträgt. In derselben Studie sowie in
einer Studie mit Rektumkarzinomzellen beziehungsweise Brustkarzinomzellen wurde
gezeigt, dass Autophagie eher in strahlenresistenten Zellen durch Bestrahlung induziert wird
und in diesen Zellen somit einen größeren Beitrag zur Strahlenresistenz hat als in
strahlensensiblen Zellen (Apel et al., 2008; Lomonaco et al., 2009; Chaachouay et al., 2011).
Andere Studien haben hierzu gegensätzliche Ergebnisse gebracht. So haben Anbalagan et
al. (2012) bei Untersuchungen an einer renalen strahlenresistenten Karzinomzelllinie nach
Bestrahlung keinen signifikanten Anstieg der Autophagie und keine Korrelation mit der
Strahlenresistenz festgestellt. Weiterhin zeigte die Studie von Kim et al. (2011), in der murine
11
2.3 Zellüberlebensstrategien
hämatopoetische Progenitorzellen untersucht wurden, dass Autophagie zwar das klonogene
Überleben nach Bestrahlung verbessert, die Autophagie jedoch nicht durch die Bestrahlung
induziert wird. Für diese Versuche wurde Autophagie durch die Substanz Carbamazepin
induziert. Es gibt weitere Studien, die belegen, dass Autophagie nicht zum Zellüberleben
führt, sondern im Zusammenhang mit dem Zelltod beobachtet wird. So wurde für
Lungenkarzinomzellen
und
für
die
Prostatakarzinomzelllinie
PC-3
gezeigt,
dass
strahleninduzierte Autophagie mit einem verminderten klonogenen Überleben assoziiert ist
(Cao et al., 2006; Kim et al., 2008; He et al., 2012).
Somit scheint Autophagie in Abhängigkeit von der Zelllinie entweder zum Zellüberleben oder
zum Zelltod zu führen. Dazu leiten Levine und Yuan (2005) in ihrem Review aus mehreren
Studien ab, dass Autophagie parallel zur Apoptose auftreten und diese möglicherweise
auslösen kann, jedoch selbst nicht zum Zelltod führt.
Die innerhalb eines Zeitintervalls abgelaufene Autophagie kann praktisch über die
Bestimmung des LC3-II-Umsatzes mittels Western Blot erfolgen, da die Menge an LC3-II mit
der Anzahl der Autophagosomen korreliert (Kabeya et al., 2000). LC3-II ist in der inneren
und äußeren Membran des Autophagosoms enthalten, wobei nur das LC3-II der inneren
Membran im Autolysosom abgebaut wird (Kabeya et al., 2000; Mizushima und Yoshimori,
2007). Da somit ein Teil des LC3-II recycelt wird, muss die Menge an LC3-II vor der Fusion
mit dem Lysosom und dem Abbau erfasst werden. Die Fusion kann mit Proteaseinhibitoren,
wie dem Bafilomycin A1, erfolgen. Es werden dann die LC3-II-Gehalte der Proben mit
beziehungsweise ohne Proteaseinhibitorzugabe verglichen (Mizushima und Yoshimori,
2007).
2.3.2
DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur
Für bestimmte unter Abschnitt 2.2 genannte Proteine wurde weiterhin ein Einfluss auf die
DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur nachgewiesen. So zeigten Kesler et al. (2014), dass in
normalen lymphatischen Endothelzellen mit erhöhtem VEGF-C-Gehalt durch Bestrahlung
mehr DNA-Doppelstrangbrüche induziert werden. Für Akt haben Fokas et al. (2012) ermittelt,
dass dieses durch DNA-Doppelstrangbrüche aktiviert wird und die DNA-Reparatur fördert.
Als Surrogatmarker für die Bestimmung des Ausmaßes der DNA-Doppelstrangbruch (DSB)Reparatur wird γH2AX genutzt. Nach der Entstehung eines DSBs, werden innerhalb kurzer
Zeit DNA-Schadenssensoren an den DSB rekrutiert und aktiviert. Es folgt daraufhin eine
Aktivierung einer Vielzahl von Substraten, darunter hunderter bis tausender H2AX-Moleküle
pro DSB im Chromatin, das den DSB umgibt (Celeste et al., 2003). Das Histon H2AX ist eine
spezifische Variante des Histons H2A, welches nach der Aktivierung durch Phosphorylierung
am Ser139 als γH2AX bezeichnet wird (Rogakou et al., 1998). Das Maximum der H2AX-
12
2 Grundlagen
Aktivierung ist 10 bis 30 Minuten nach Bestrahlung erreicht (Rogakou et al., 1998; MacPhail
et al., 2003). Das γH2AX ist dann für die Rekrutierung weiterer Reparaturproteine essentiell
(Paull et al., 2000; Celeste et al., 2003). Nach der DSB-Reparatur wird γH2AX durch einen
Phosphatase-Komplex dephosphoryliert, was der Zelle nach dem Zellzyklusarrest zur
Schadensreparatur den Wiedereintritt in den Zellzyklus ermöglicht (Chowdhury et al., 2005;
Keogh et al., 2006).
γH2AX kann nach einer Antikörperreaktion mikroskopisch mit hoher Sensitivität detektiert
werden (MacPhail et al., 2003). Dabei ergibt jeder DSB einen sichtbaren γH2AX-Focus,
sodass die Auswertung quantitativ erfolgen kann (Sedelnikova et al., 2002). Innerhalb von 24
Stunden nach Bestrahlung wird ein Großteil der DSBs repariert. Die Quantifizierung der
residuellen γH2AX-Foci nach 24 Stunden ermöglicht häufig einen Rückschluss auf die
Strahlensensibilität der untersuchten Zellen, da die Anzahl der residuellen γH2AX-Foci mit
dem klonogenen Überleben korreliert (Banáth et al., 2004; Menegakis et al., 2009). Diese
Nachweismethode birgt jedoch auch Unsicherheiten. Zum Beispiel ist es möglich, dass
γH2AX-Foci auch nach der DSB-Reparatur bestehen bleiben und somit zum Zeitpunkt der
Quantifizierung nicht unbedingt einen physikalischen DSB anzeigen (Banáth et al., 2004;
Mirzayans et al., 2006). Dies würde zu Fehleinschätzungen bezüglich der Strahlensensibilität
der untersuchten Zellen führen.
2.3.3
Zellzyklusarrest
Ein weiterer Überlebensmechanismus, der durch in Abschnitt 2.2 erwähnte Proteine
beeinflusst werden kann, ist der Zellzyklusarrest.
Strahleninduzierte DNA-Schäden können innerhalb des Zellzyklus an den Kontrollpunkten
(Checkpoints) erkannt und in den dadurch ausgelösten G1-, S- oder G2/M-Arresten repariert
werden (Kastan und Lim, 2000; Herrmann et al., 2006). Liegt allerdings eine Mutation vor,
wodurch ein Checkpoint nicht funktionell ist, führt der unreparierte DNA-Schaden entweder
zum Zelltod oder zur Tumorprogression (Joiner und van der Kogel, 2009). Eine in
Karzinomzellen wesentliche Mutation ist die des Gens p53. Die Auswirkung dieser Mutation
auf den Zellzyklus ist im Abschnitt 2.1 beschrieben.
Reversible Zellzyklusarreste tragen zum Zellüberleben nach Bestrahlung bei (Hein et al.,
2014). Zellen, deren Zellzyklusarrest jedoch irreversibel ist, werden infolge dessen einen
apoptotischen oder nekrotischen Zelltod eingehen (Dewey et al., 1995; Pawlik und
Keyomarsi, 2004).
Wie oben schon erwähnt, können verschiedene Faktoren den Zellzyklusarrest beeinflussen.
So zeigten Kesler et al. (2014) in normalen Lymphendothelzellen, dass nach VEGF-C-Zusatz
die Zellen verstärkt einen S- und G2/M-Arrest eingehen. Studien mit Zelllinien
13
2.4 Reaktionen von Tumoren auf Bestrahlung
unterschiedlicher
Tumorentitäten
ergaben,
dass
hingegen
der
PI3K/Akt-Signalweg
progressiv auf den Zellzyklus wirkt (Albert et al., 2006; Fokas et al., 2012).
2.4
Reaktionen von Tumoren auf Bestrahlung
Sofern nicht anders vermerkt, werden in diesem Abschnitt 2.4 die Ausführungen des
Lehrbuchs Herrmann et al. (2006) zusammengefasst.
Durch die Einwirkung ionisierender Strahlung werden Zellen geschädigt und infolge dessen
das Tumorwachstum eingeschränkt (siehe Abschnitt 2.1). Werden dabei ausreichend viele
Zellen abgetötet, lässt sich eine Tumorregression (Tumorschrumpfung) beobachten. Dies
ist für die palliative Therapie von Bedeutung, bei der die durch den Tumor verursachten
Symptome beseitigt werden sollen. Nach dem Therapieende kann nach einer Phase der
Regression oder einer Phase stabiler Größe der Tumor erneut wachsen. Dies wird als
Tumorwachstumsverzögerung bezeichnet. Sie ist definiert als die Zeit, die der Tumor
benötigt, um ein spezifisches Volumen, zum Beispiel das Ausgangsvolumen bei
Therapiebeginn, wieder zu erreichen.
Eine kurative Therapie zielt hingegen auf eine vollständige Vernichtung des Tumors ohne
späteres Auftreten eines Rezidivs - die lokale Tumorkontrolle - ab. Dies wird durch die
Abtötung aller oder fast aller klonogenen Tumorzellen erreicht (Baumann et al., 1990). Die
Wahrscheinlichkeit einer lokalen Tumorkontrolle kann zum Beispiel durch Veränderung des
Fraktionierungsschemas
der
Bestrahlung,
durch
Kombination
der
Bestrahlung
mit
Chemotherapeutika oder molekular wirksamer Substanzen erhöht werden. Ein möglicher
Wirkstoff hierfür ist Nelfinavir (siehe Abschnitt 2.5).
Für die experimentelle Bestimmung des kurativen Potentials eines Wirkstoffs in Kombination
mit Bestrahlung sind Tumorkontrollexperimente geeignet. Zwar können Tumorregression als
auch Tumorwachstumsverzögerung in vivo einfacher und schneller experimentell ermittelt
werden, jedoch korrelieren sie nur geringfügig mit der Inaktivierung klonogener Zellen
(Krause et al., 2006). Bei Tumorkontrollexperimenten wird aus den kontinuierlich
dokumentierten Messwerten der Tumorgrößen während und nach der Behandlung mit
fraktionierter Bestrahlung mit oder ohne Wirkstoffgabe eine Dosiseffektkurve berechnet.
Hieraus kann die TCD50 (engl. tumour control dose) abgelesen werden, die angibt, bei
welcher Gesamtdosis der Tumor mit einer Wahrscheinlichkeit von 50 % lokal kontrolliert
wird.
14
2 Grundlagen
2.5
Nelfinavir als Akt-Inhibitor
Wie bereits im Abschnitt 2.2 ausgeführt, kann der PI3K/Akt-Signalweg durch Bestrahlung
aktiviert werden (Contessa et al., 2002; Edwards et al., 2002) oder konstitutiv, zum Beispiel
durch
eine
PTEN-Mutation,
aktiviert
sein,
wie
es
unter
anderem
in
der
Prostatakarzinomzelllinie PC-3 der Fall ist (Grünwald et al., 2002; Altomare und Testa,
2005). Da der Signalweg über PI3K/Akt zum Zellüberleben durch Schutz vor Apoptose und
mitotischem Zelltod führt, ist dieser ein wichtiges Target zur Strahlensensibilisierung (Gerber
et al., 1998; Mäkinen et al., 2001; Yamaguchi und Wang, 2001; Skvortsova et al., 2008).
Eine Möglichkeit zur medikamentösen Blockade der Akt-Aktivierung am Serin 473 über PI3K
ist der Wirkstoff Nelfinavir, welcher ursprünglich als HIV-Proteaseinhibitor zum Einsatz kam.
Die Einnahme erfolgt bei Patienten oral mit dem Essen. Nelfinavir wird in der Leber vor allem
durch das Cytochrom P450 zu den Produkten M1 (2-Methoxy-3-hydroxy Nelfinavir), M3 (3,4Dihydroxy Nelfinavir) und M8 (Nelfinavir Hydroxy-tert-butylamid) metabolisiert (Kempf et al.,
1997; Lillibridge et al., 1998a, 1998b, zitiert in Hirani et al., 2004), wobei Nelfinavir zu etwa
einem Drittel zu M8 umgesetzt wird (gemessen im Blutplasma nach oraler Einnahme)
(Strukturformeln siehe Abbildung 3) (Baede-van Dijk et al., 2001a; Pan et al., 2012). Der M1-
Nelfinavir
M8
Abbildung 3: Strukturformeln von Nelfinavir und dessen Hauptmetabolit M8.
Gehalt ist im Blutplasma der Patienten deutlich geringer als der Gehalt von M8; M3 konnte
im Plasma nicht nachgewiesen werden (Zhang et al., 2001). In vitro, unter anderem in PC-3Zellen, zeigten Guan et al. (2012) eine effektivere Inhibierung des Zellüberlebens durch
Nelfinavir im Vergleich zu M8. Die maximalen Plasmakonzentrationen von Nelfinavir und M8
wurden in der Studie von Baede-van Dijk et al. (2001) rund 3 Stunden nach Nelfinavirgabe
15
2.5 Nelfinavir als Akt-Inhibitor
gemessen
und
nach
2
Wochen
wurde
ein
Gleichgewichtszustand
der
Plasmakonzentrationen erreicht. Zhang et al. (2001) ermittelten in Blutplasmaproben von 4
gesunden Probanden nach oraler Einnahme eine maximale Nelfinavir-Konzentration nach 4
Stunden
und
bei
10
HIV-Patienten
nach
täglicher
oraler
Einnahme
einen
Gleichgewichtszustand nach 28 Tagen. In in vivo-Versuchen mit Mäusen stellten Kim et al.
(1998) nach 4 Stunden eine hohe Transportaktivität von Nelfinavir in verschiedene Organe
fest. Gupta et al. (2005) zeigten in Kopf-Hals-Xenografts 5 Tage nach einer täglichen oralen
Behandlung mit Nelfinavir eine deutliche Abnahme der Akt-Phosphorylierung.
Für verschiedene Zelllinien unterschiedlicher Tumorentitäten, ausgenommen Prostata,
konnte
bereits
in
vitro
(mittels
Koloniebildungsassay)
und
in
vivo
(mittels
Wachstumsverzögerung) gezeigt werden, dass die Inhibierung der Akt-Aktivierung durch
Nelfinavir zur Strahlensensibilisierung führt (Gupta et al., 2005, 2007; Pore et al., 2006;
Cuneo et al., 2007; Jiang et al., 2007; Kimple et al., 2010). Jiang et al. (2007) konnten
beispielsweise in ihrer in vitro-Studie mit Glioblastomzellen eine Korrelation der Inhibierung
der Akt-Phosphorylierung und der Strahlensensibilität nachweisen. Jedoch konnte dieser
Zusammenhang, wie Bernstein und Dennis (2008) bei ihrer Recherche von mehreren
Studien feststellten, in einer Reihe von Versuchen wiederum nicht nachgewiesen werden.
Ein Grund dafür könnte sein, dass Nelfinavir nicht nur die Phosphorylierung von Akt, sondern
auch eine Reihe weiterer Proteinaktivierungen blockiert und damit nach Bestrahlung in
Zellüberlebensprozesse eingreift (hierauf wird im Abschnitt 5.8 näher eingegangen). Einen
wichtigen Einfluss hat Nelfinavir außerdem auf die Veränderung der Perfusion des Tumors
mit daraus resultierender erhöhter Oxigenierung des Tumorgewebes, was wiederum zur
Strahlensensibilisierung führt (Pore et al., 2006; Qayum et al., 2009).
In bisherigen in vitro- als auch in vivo-Studien wurden keine Versuche durchgeführt, die eine
Strahlensensibilisierung durch Nelfinavir in Prostatakarzinomzelllinien belegen. Ebenso
wurden bisher keinerlei Experimente mit dem klinisch relevanten Endpunkt lokale
Tumorkontrolle durchgeführt. Bisher konnte nur in in vitro- und in vivo-Versuchen ohne
Bestrahlung gezeigt werden, dass Nelfinavir allein in unterschiedlichen PTEN defizienten
Prostatakarzinomzelllinien, darunter PC-3, einen Antitumoreffekt besitzt (Yang et al., 2005).
Nelfinavir induziert hierbei eine Hemmung des Zellwachstums sowie Apoptose.
16
3 Material und Methoden
3.1
Material
3.1.1
Zelllinien
Tabelle 1: Verwendete Zelllinien
Zelllinie
Firma/bereitgestellt durch
DU145
American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, D
FaDu-Sublinie*
Sublinie der ATCC geführten Zelllinie, American Type Culture Collection
(ATCC), Wesel, D
LNCaP
American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, D
N1**
PC-3
Bereitgestellt durch Prof. Kunz-Schughart, OncoRay, Dresden, D
American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, D
* als Kontrolle für die korrekte Bewertung der γH2AX-Foci
Die verwendete FaDu-Sublinie weist verglichen mit der FaDu-Linie, welche von ATCC
bereitgestellt wird, auf dem Allel 2 im Exon 7 eine splice site Mutation auf. Dies betrifft das
Protein p53 (Eicheler et al., 2002). Für die Versuche in dieser Arbeit ist die Mutation
unerheblich.
** diploide Zellen als Kontrolle für die Durchflusszytometrie
3.1.2
Reagenzien und Substanzen
Tabelle 2: Verwendete Reagenzien und Substanzen
Reagenz
Firma
®
Acrylamid 30 %: Rotiphorese Gel 30
Roth, Karlsruhe, D
APS (Ammoniumpersulfat)
Roth, Karlsruhe, D
Aqua ad iniectabilia Braun
B. Braun, Melsungen, D
Bafilomycin A1
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, D
Blocking buffer
Life Technologies, Darmstadt, D
BSA (Bovines Serumalbumin), 2 mg/ml
Thermo Fisher Scientific, Dreieich, D
cOmpleteTM protease inhibitor cocktail
Roche Diagnostics, Mannheim, D
Coomassie Brillant Blau G 250
Roth, Karlsruhe, D
DAPI (4‘,6-Diamidin-2-phenylindol), 1 mmol/l
Invitrogen, Karlsruhe, D
DharmaFECT 1 Transfection Reagent
Dharmacon, GE Healthcare Dharmacon Inc.,
Lafayette, CO, USA
DharmaFECT 2 Transfection Reagent
Dharmacon, GE Healthcare Dharmacon Inc.,
Lafayette, CO, USA
di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat, p.a.
Merck, Darmstadt, D
DMEM-Medium (w 3.7 g/L NaHCO3, w 4.5 g/L DGlucose, w stable glutamine, w/o Na-Pyruvate, low
endotoxin)
Merck, Darmstadt, D
DMSO (Dimethylsulfoxid), ≥99,8 %, p.a.
Roth, Karlsruhe, D
17
3.1 Material
EDTA (Ethylendiamintetraacetat)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, D
Entwickler-Konzentrat
Carestream GBX, Rochester, NY, USA
Essigsäure 100 % (Eisessig)
Merck, Darmstadt, D
Ethanol, 96,3 %, vergällt
Berkel AHK, Berlin, D
FITC (Fluorescein-12-dUTP Solution), 1 mmol/l
Thermo Fisher Scientific, Dreieich, D
Fixierer-Konzentrat
Carestream GBX, Rochester, NY, USA
FKS (Fötales Kälberserum) (vor Zugabe inaktiviert:
20 min 56 °C)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, D
Fluorescent Mounting Medium
Dako, Glostrup, DK
Formaldehyd, 4 %, neutral gepuffert
SAV LP, Flintsbach am Inn, D
Glycerol
Roth, Karlsruhe, D
®
®
®
Glycin, Pufferan ≥99 %, p.a.
Roth, Karlsruhe, D
HALT
TM
Phosphatase Inhibitor Cocktail
Thermo Fisher Scientific, Dreieich, D
HALT
TM
Protease Inhibitor Cocktail
Thermo Fisher Scientific, Dreieich, D
Kaliumchlorid, p.a.
AppliChem, Darmstadt, D
Kaliumdihydrogenphosphat, p.a.
Ketamin 500 Curamed
®
AppliChem, Darmstadt, D
Curamed Pharma, Karlsruhe, D
Laemmli Sample Buffer
Bio-Rad Laboratories GmbH, München, D
Luminol Reagenz
Santa Cruz, Heidelberg, D
Matrigel: BD Matrigel Matrix Growth Factor
Reduced
BD, Heidelberg, D
TM
Maxima
SYBR Green qPCR Master Mix
Fermentas, St. Leon-Rot, D
2-Mercaptoethanol
Sigma-Aldrich, Steinheim, D
Methanol
Merck, Darmstadt, D
Milchpulver (blotting grade)
Roth, Karlsruhe, D
Natriumchlorid, > 99,5 %, p.a.
Roth, Karlsruhe, D
PBS (phosphate buffered saline), 1x (für die
2+
2+
Zellkultur) (Dulbecco w/o Ca w/o Mg )
Biochrom, Berlin, D
Ponceau S solution, 0,1 % (w/v) in 5 % Essigsäure
Sigma-Aldrich, Steinheim, D
Propidiumiodid, 1 mg/ml in H2O
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, D
Proteinleiter: PageRuler Plus Prestained Protein
Ladder, ~10 … 250 kDa
Thermo Fisher Scientific, Dreieich, D
Restore
TM
western blot stripping buffer
Thermo Fisher Scientific, Bonn, D
rhVEGF-C (rekombinantes humanes VEGF-C)
R&D Systems, Wiesbaden, D
Ribonuclease A (RNase)
Invitrogen, Karlsruhe, D
RIPA-buffer
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, D
RPMI-1640 Medium (w 2.0 g/L NaHCO3, w stable
glutamine, low endotoxin)
Biochrom, Berlin, D
SDS (Natriumdodecylsulfat), ≥ 99,3 %, blotting
grade
Roth, Karlsruhe, D
TEMED (Tetramethylethylendiamin)
Bio-Rad Laboratories GmbH, München, D
Trichloressigsäure
Merck, Darmstadt, D
Tris-Hydrochlorid, Pufferqualität
AppliChem, Darmstadt, D
Triton X-100
Serva, Heidelberg, D
Trypsin/EDTA,10x (0,5%/0,2 % (w/v) in 10x PBS,
2+
2+
w/o Ca w/o Mg )
Biochrom, Berlin, D
18
3 Material und Methoden
Tryptanblau, 0,5 % (w/v) in physiological saline
®
Tween 20 Pure
Serva, Heidelberg, D
®
Viracept (nelfinavir mesylate) (Tabletten, 625 mg)
Xylazin, Rompun
3.1.3
Biochrom, Berlin, D
®
Agouron, Durham, NC, USA
Bayer Healthcare GmbH, Leverkusen, D
Kits
Tabelle 3: Verwendete Kits
Kit
Firma
DNase I-Kit
TM
Pierce
Invitrogen, Karlsruhe, D
BCA Protein Assay Kit
Thermo Fisher Scientific, Dreieich, D
RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit
®
Thermo Fisher Scientific, Dreieich, D
RNeasy Mini kit
Qiagen, Hilden, D
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit
Roche Diagnostics, Mannheim, D
3.1.4
Primäre Antikörper
Die Antikörper für den Western Blot wurden in Milchpulverlösung (5 % in PBS) gelöst.
Tabelle 4: Verwendete primäre Antikörper
Antikörper
Firma
Verdünnung
Verwendung
Akt, Kaninchen, polyklonal
Cell Signaling
Technology, Inc.,
Danvers, MA, USA
1:1000
Western Blot
Akt (pan) (11E7), Kaninchen,
monoklonal
Cell Signaling,
Frankfurt a. M., D
1:1000
Western Blot
(für Versuch mit
10 min)
Anti-beta Actin [AC-15], Maus,
monoclonal
Abcam, Cambridge,
UK
1:50.000
Western Blot
Anti-phospho-Histone H2A.X
(Ser139) (JBW301), Maus,
monoklonal
Millipore,
Schwalbach am
Taunus, D
1:2000 in
Blocking
buffer
Foci-Assay
Atg5, Kaninchen, polyklonal
Cell Signaling,
Frankfurt a. M., D
1:1000
Western Blot
LC3-II, Kaninchen, polyklonal
Cell Signaling,
Frankfurt a. M., D
1:1000
Western Blot
Neuropilin-2 (H-300), Kaninchen,
polyklonal
Santa Cruz,
Heidelberg, D
1:500
Western Blot
p44/42 MAPK (ERK1/2) (137F5),
Kaninchen, monoklonal
Cell Signaling,
Frankfurt a. M., D
1:1000
Western Blot
Phospho-Akt (Ser473) Antibody,
Kaninchen, polyklonal
Cell Signaling,
Frankfurt a. M., D
1:2000
Western Blot
Phospho-Akt (Ser 473) (D9E)
®
XP , Kaninchen, monoklonal
Cell Signaling,
Frankfurt a. M., D
1:1000
Western Blot
(für Versuch mit
10 min)
Phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)
(Thr202/Tyr204) (20G11),
Kaninchen, monoklonal
Cell Signaling,
Frankfurt a. M., D
1:1000
Western Blot
19
3.1 Material
3.1.5
Sekundäre Antikörper
Die Antikörper für den Western Blot wurden in Milchpulverlösung (5 % in PBS) gelöst.
Tabelle 5: Verwendete sekundäre Antikörper
Antikörper
Firma
Verdünnung
Verwendung
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse
IgG (H+L)
Invitrogen,
Karlsruhe, D
1:500 in
Blocking buffer
Foci-Assay
goat anti-mouse IgG-HRP
Santa Cruz,
Heidelberg, D
1:20.000
Western Blot
goat anti-rabbit IgG-HRP
Santa Cruz,
Heidelberg, D
1:10.000
Western Blot
®
3.1.6
siRNA
Tabelle 6: Verwendete siRNAs
siRNA
Firma
Nichtspezifische Kontroll-siRNA (siSCR):
5’-GCAGCUAUAUGAAUGUUGUtt-3’
Eurofins, Hamburg, D
ON-TARGETplus Human ATG5 – SMARTpool
GE Healthcare Dharmacon Inc.,
Lafayette, CO, USA
ON-TARGETplus Human NRP2 – SMARTpool
GE Healthcare Dharmacon Inc.,
Lafayette, CO, USA
ON-TARGETplus Human VEGFC (7424) – SMARTpool
GE Healthcare Dharmacon Inc.,
Lafayette, CO, USA
3.1.7
Primer
Tabelle 7: Verwendete Primer
Primer
Firma
Spezifizierung
β2-M
Eurofins, Hamburg, D
fwd: 5‘-TGCTATGTGTCTGGGTTTCATC-3‘
rev: 5‘-CCATGATGCTGCTTACATGTCT-3‘
VEGF-C
Eurofins, Hamburg, D
fwd: 5‘-AGGGTCAGGCAGCGAACAAGA-3‘
rev: 5‘-CCTCCTGAGCCAGGCATCTG-3‘
3.1.8
Materialien und Hilfsmittel
Tabelle 8: Verwendete Materialien und Hilfsmittel
Materialien und Hilfsmittel
Firma
Belichtungskassette: Hypercassette
TM
Amersham Biosciences, Freiburg, D
®
Blot-System: Mini Trans-Blot Module
Bio-Rad Laboratories GmbH, München, D
Deckgläschen: 24 x 60 mm
Gelelektrophorese-System: Mini-Protean
(Spacer-Platte: Geldicke 1,5 mm)
Engelbrecht, Edermünde, D
®
Bio-Rad Laboratories GmbH, München, D
FACS-Rundbodenröhrchen, 5 ml, 12 x 75 mm,
Polystyrol
BD, Heidelberg, D
Insulinspritze, 30G x ½‘‘ (0,3 mm x 12 mm)
B. Braun, Melsungen, D
20
3 Material und Methoden
Kanüle für die Zelltransplantation: 20G x 1½‘‘
(0,9 x 40 mm)
BD, Heidelberg, D
Kryoröhrchen
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, D
Mikroplate, 96-Well, F-bottom, clear (für
Proteinbestimmung)
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, D
TM
Mr. Frosty
Gefrierbehälter
Thermo Fisher Scientific, Dreieich, D
TM
Nitrozellulose-Membran: Whatman
S85 Reinforced NC
TM
TM
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide
®
Well Permanox Slide
QIAshredder
Optitran BA-
TM
System, 4
TM
Thermo Fisher Scientific, Dreieich, D
Qiagen, Hilden, D
qRT-PCT-Platten: 0.2 mm Non-skirted low profile
96-well PCR plate
Röntgenfilme: Amersham Hyperfilm
Zellkulturflasche T-25 cm
GE Healthcare Limited, Buckinghamshire, UK
TM
ECL
2
Thermo Fisher Scientific, Dreieich, D
GE Healthcare Limited, Buckinghamshire, UK
Nunc, Roskilde, DK
2
Zellkulturflaschen T-75 cm , T-175 cm
2
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, D
Zellkulturplatten, 6-Well
Falcon, Wiesbaden, D
Zellschaber, 28 cm
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, D
3.1.9
Geräte
Tabelle 9: Verwendete Geräte
Gerät
Firma
Spezifizierung
CASY cell counter
Innovatis, Bielefeld, D
CASY 1
Dosimeter
PTW, Freiburg, D
PTW Unidos
Durchflusszytometer
BD Biosciences, Heidelberg,
D
BD FACS Canto II
Inverses Fluoreszenzmikroskop
Zeiss, Jena, D
Axio Imager M1, Kamera: Axio
Cam MRm, Objektiv: EC PlanNeofluar 40x/0,75 M27
Microplate-Reader (für
Proteinbestimmung)
Tecan, Männedorf, CHE
GENios
Mikroskop (Auflicht, Auszählung
Koloniebildungsassays)
Olympus, Hamburg, D
SZ40
Mikroskop (Durchlicht, Zellkultur)
Olympus, Hamburg, D
CK2
pH-Meter
Beckman Coulter, Inc.,
Krefeld, D
Φ40pH Meter
Röntgenröhre
Yxlon, Hamburg, D
Typ: YXLON Y.TU 320-D03
Eigenfilterung: 3,0 mm Be +
3,0 mm Al
RT-PCR-Gerät
Bio-Rad Laboratories,
Munich, D
iCycler iQ
Sprektrophotometer
PEQLAB Biotechnologie
GmbH, Erlangen, D
NanoDrop®, ND-1000
Thermocycler (cDNA-Synthese)
Eppendorf, Hamburg, D
Mastercycler ep Gradient S
21
®
TM
3.2 Methoden
3.1.10 Software
Tabelle 10: Verwendete Software
Software
Firma/Programmierer
AxioVS 40x64 V 4.9.1.0
Zeiss, Jena, D
BD FACSDiva Flow Cytometry Software
BD Biosciences, Heidelberg, D
BIOVIA Draw 16.1
Dassault Systèmes, Vélizy-Villacoublay, F
CFX Manager Software, Version 1.0.0.0
Bio-Rad Laboratories, Munich, D
GraphPad Prism 5
GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
ImageJ 1.48v
Wayne Rasband (National Institutes of Health), MD,
USA
Inkscape 0.91
Open Source
Magellan V7.2
Tecan, Männedorf, CHE
Microsoft Excel 2007
Microsoft Corp., Redmond, WA, USA
MultiCycle AV Software Version 6.0
Phoenix Flow Systems, Inc., San Diego, CA, USA
STATA/SE 11.2
StataCorp LP, College Station, TX, USA
3.2
3.2.1
Methoden
Zellkultur
Reagenzien
DMEM-Komplettmedium: DMEM Medium + 10 % Fötales Kälberserum (FKS)
RPMI-Komplettmedium: RPMI-1640 Medium + 10 % Fötales Kälberserum (FKS)
Trypsin/EDTA:
10x Trypsin 1:10 verdünnt in ddH2O
Die Zelllinien PC-3, DU145 und LNCaP wurden in RPMI-Komplettmedium und die Zelllinie
FaDu in DMEM-Komplettmedium bei 37 °C, 95 % Luftfeuchte und 5 % CO2 kultiviert. Das
Passagieren erfolgte bei 70-80 % Konfluenz. Hierfür wurden die Zellen mit PBS gewaschen
und mit Trypsin/EDTA bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde mit dem jeweiligen Medium
abgestoppt und bei ~300 xg und 4 °C für 5 min zentrifugiert.
Die Langzeitlagerung der Zellen erfolgte in Kryoröhrchen suspendiert in 90 % FKS/10 %
DMSO. Die Kryoröhrchen wurden in einem Einfrierbehältnis mit Isopropanol langsam auf
-80 °C herunter gekühlt, bevor sie in flüssigem Stickstoff aufbewahrt wurden.
Das Auftauen der Zellen erfolgte schnell. Die Zellen wurden auf Eis in ein 15 mlZentrifugenröhrchen überführt, in das anschließend tropfenweise 4 ml kaltes Medium
dazugegeben wurde und bei ~130 xg und 4 °C für 5 min zentrifugiert. Anschließend wurden
die Zellen in 5 ml Komplettmedium resuspendiert und in insgesamt 10 ml Komplettmedium in
einer T-25 Zellkulturflasche bei 37 °C inkubiert. Nach 24 h erfolgte ein Mediumwechsel.
22
3 Material und Methoden
Die Vitalität der aufgetauten Zellen wurde mit Tryptanblau überprüft. Nur Zellen, die
mindestens 80 % vitale Zellen aufwiesen, wurden für die Versuche verwendet.
Die Zellzahl wurde mit Hilfe des CASY cell counters bestimmt.
Der Ursprung und die Stabilität der Zelllinien wurden mittels Mikrosatellitenanalyse vor
Anlegen des Kryostocks routinemäßig überprüft. Ebenfalls vor Anlegen des Kryostocks
wurde auf Mykoplasmen getestet.
Alle Versuche wurden mit Zellen in den Passagen zwischen 4 und 20 durchgeführt.
3.2.2
siRNA-Transfektion
Bei dieser Methode bindet die small interferring RNA (siRNA) in den transfizierten Zellen an
die entsprechende mRNA, wodurch das Gen nicht exprimiert werden kann.
PC-3 und DU145 wurden mit einer Zelldichte, wie in Tabelle 11 angegeben, ausgesät. Nach
einer Inkubationszeit von 24 h erfolgte die Transfektion unter sterilen Bedingungen. Sowohl
die siRNA als auch DharmaFECT2 für PC-3 bzw. DharmaFECT1 für DU145 wurden mit
RPMI-Medium ohne Zusatz von FKS bei Raumtemperatur (RT) für 5 min inkubiert.
Anschließend wurden die siRNA- und DharmaFECT-Ansätze im Verhältnis 1:1 gemischt,
weitere 20 min bei RT inkubiert und dann tropfenweise zu den mit PBS gewaschenen Zellen
gegeben. Dazu pipettiert wurde das vierfache Volumen an Komplettmedium. Die
verwendeten Volumina sind in Tabelle 11 ersichtlich.
Tabelle 11: Zellzahlen und Volumina für die siRNA-Transfektion
Chamber-Slides
6-Well
Zellkulturflasche
T-175
PC-3
DU145
Zellzahl
70.000
-
siVEGF-C + RPMI [µl]
1,125 + 48,875
-
DharmaFECT2 +RPMI [µl]
1,25 + 48,75
-
Zellzahl
200.000
150.000
siVEGF-C + RPMI [µl]
4,5 + 195,5
4,5 + 195,5
siNRP-2 + RPMI [µl]
6,0 + 194,0
4,5 + 195,5
siATG5 + RPMI [µl]
3,0 + 197,0
-
DharmaFECT +RPMI [µl]
5,0 + 195,0
5,0 + 195,0
Zellzahl
7.000.000
5.000.000
siVEGF-C + RPMI [µl]
33,75 + 1466,25
33,75 + 1466,25
DharmaFECT +RPMI [µl]
3,5+1462,5
3,5+1462,5
Die Endkonzentration von siVEGF-C betrug für PC-3 und DU145 22,5 nmol/l; von siNRP-2
für PC-3 30 nmol/l, für DU145 22,5 nmol/l; und von siATG5 jeweils 15 nmol/l. Die optimalen
Konzentrationen, bei denen die Herunterregulierung auf mRNA- (für VEGF-C) und
23
3.2 Methoden
Proteinebene (für NRP-2 und ATG5) maximal war, wurden zuvor in 6-Wellplatten ermittelt
(siehe Abschnitt 4.1.2). Die Dauer bis zu dieser Wirkung betrug 48 h. Anschließend wurden
die Versuche durchgeführt.
Als Kontrolle wurde stets eine nichtspezifische Kontroll-siRNA (siSCR) in entsprechender
Konzentration mitgeführt.
3.2.3
Bestrahlung
Die Bestrahlung der Zellen erfolgte bei RT mit 200 kV Röntgenstrahlen (zusätzlicher Filter:
0,5 mm Kupfer) bei einer Dosisleistung von ca. 1,3 Gy/min. Die Dosisleistung wurde täglich
kontrolliert.
3.2.4
Koloniebildungsassay
Das Ziel der Strahlentherapie ist der Verlust der unbegrenzten Teilungsfähigkeit der
Tumorzellen (Verlust der Klonogenität). Als klonogen wird eine Zelle definiert, die mehrere
Zellteilungen durchlaufen kann, sodass aus dieser mindestens 50 Tochterzellen hervorgehen
(Herrmann et al., 2006). Zur Bestimmung überlebender klonogener Zellen nach Bestrahlung
dient der Koloniebildungsassay.
Lösungen
80 % Ethanol:
800 ml Ethanol auf 1 l ddH2O
Coomassie-Färbelösung: 100 ml Methanol + 37,5 ml Eisessig + 0,25 g Coomassie 250 auf
500 ml ddH2O
Versuchsansätze
Die Koloniebildungsassays wurden mit zuvor unterschiedlich behandelten Zellen angesetzt.
Transfizierte Zellen (siehe Abschnitt 3.2.2) wurden 24 h nach Transfektion trypsiniert und in
6-Wellplatten
ausgesät.
Nach
weiteren
24 h
wurde
PC-3
mit
den
Zellzahlen
500/1500/3000/10.000 und DU145 mit den Zellzahlen 300/1000/2000/7000 mit 0/2/4/6 Gy
bestrahlt. Nach einer Inkubationszeit von 10 Tagen für PC-3 und 7 Tagen für DU145, in der
klonogene Zellen Kolonien bilden konnten, wurden die Zellen mit PBS gewaschen, für
10 min mit 80 %igem Ethanol fixiert und für 10 min mit Coomassie-Lösung gefärbt.
Die
Zellen
der
Linie
LNCaP
wurden
in
6-Wellplatten
mit
den
Zellzahlen
700/1500/3000/10.000 für 0/2/4/6 Gy ausplattiert. 24 h später wurde rhVEGF-C, gelöst in
24
3 Material und Methoden
0,1 %igem bovinem Serumalbumin (BSA), mit einer Endkonzentration von 75 ng/ml
dazugegeben. Die Kontrolle wurde mit dem entsprechenden Volumen an 0,1 %igem BSA
behandelt. Nach 48 h wurde bestrahlt und im direkten Anschluss daran das Medium
gewechselt. Die Zellen wurden dann für 12 Tage zur Koloniebildung inkubiert. Aufgrund der
geringen Adhäsion von LNCaP-Zellen konnten diese nicht fixiert und mit Coomassie-Lösung
gefärbt werden, sondern wurden ungefärbt unter einer stärkeren Vergrößerung ausgezählt.
Die PC-3-Zellen, die für den Koloniebildungsassay mit Nelfinavir in Form von Viracept®
behandelt werden sollten, wurden zuvor für die Bestrahlung mit 0/2/4/6 Gy mit Zellzahlen von
300/1000/3000/5000 in 6-Wellplatten ausplattiert. Nach 24 h wurde Nelfinavir, gelöst in
DMSO, mit der Endkonzentration von 10 µmol/l zu den Zellen gegeben. Die Kontrolle wurde
mit dem entsprechenden Volumen an DMSO behandelt. Nach 1 h wurde das Medium
gewechselt und etwa 5 min später bestrahlt. Die Nelfinavirkonzentration und die
Inkubationszeit
wurden
analog
der
von
Pore
et
al.
(2006)
angewendeten
Versuchsbedingungen gewählt. Die anschließende Inkubationsdauer betrug 10 Tage.
Danach wurden die Zellen wie oben beschrieben fixiert und gefärbt.
Alle Koloniebildungsassays wurden dreifach angesetzt und mindestens dreimal unabhängig
voneinander durchgeführt.
Auswertung
Das Auszählen der Kolonien erfolgte unter einem Lichtmikroskop mit einer 3,6-fachen
Vergrößerung. Kolonien mit mindestens 50 Zellen wurden gezählt. Die Plattierungseffizienz
(PE, plating efficiency) und die Überlebensfraktion (SF, surviving fraction) wurden wie folgt
berechnet.
Die mathematische Auswertung der Koloniebildungsassays erfolgte mit dem LinearQuadratischen(LQ)-Modell nach Kellerer und Rossi (1973). Für die Auswertung des
Koloniebildungsassays für LNCaP + rhVEGF-C wurde jedoch das Multi-Target Single-HitModell angewandt, da sich hiermit eine deutlich bessere Kurvenanpassung ergab. Dieses
Modell fand bereits für die Beschreibung des klonogenen Überlebens humaner Tumorzellen
nach Röntgenbestrahlung von Puck und Marcus (1956) Anwendung.
25
3.2 Methoden
LQ-Modell (Herrmann et al., 2006):
, mit SF… Überlebensfraktion
D … applizierte Dosis [Gy]
α … zellspezifische Konstante [Gy-1]
β … zellspezifische Konstante [Gy-2]
Multi-Target Single-Hit-Modell (Herrmann et al., 2006):
, mit n … Extrapolationszahl, Schnittpunkt der Funktion mit der
Ordinate
D … applizierte Dosis [Gy]
D0 … Dosis, die das Überleben um e-1 verringert [Gy]
(zellspezifisches Maß für die Strahlenempfindlichkeit)
3.2.5
Autophagischer Flux
Für die Bestimmung, wie viel Autophagie in PC-3 abläuft (autophagischer Flux), wurden die
Zellen mit Bafilomycin A1 behandelt, welches zur Akkumulation von Autophagosomen führt.
In der Membran der Autophagosomen ist das Protein LC3-II enthalten, das im Anschluss an
den Flux mittels Western Blot nachgewiesen werden kann. Eine Vergleichsprobe wurde mit
dem Lösungsmittel für Bafilomycin A1, DMSO, behandelt. Anhand der Differenz des LC3-IIGehaltes der Bafilomycin A1- und der DMSO-behandelten Zellen wurde der autophagische
Flux berechnet.
Durchführung
48 h nach der siRNA-Transfektion und der sich direkt anschließenden Bestrahlung mit 2 Gy
wurde eine Probe mit einer Endkonzentration von 10 nmol/l Bafilomycin A1 (gelöst in DMSO)
behandelt, während eine zweite Probe als Referenz diente und mit dem entsprechenden
Volumen an DMSO versetzt wurde. Nach einer Inkubationszeit von 7 h wurden die Zellen für
den Western Blot aufgearbeitet. Die Differenz der Intensität der LC3-II-Banden entspricht
dem Ausmaß an Autophagie, die innerhalb der 7 h Inkubationszeit in der Zelle abgelaufen
ist.
Die Versuche wurden dreimal unabhängig voneinander durchgeführt.
26
3 Material und Methoden
3.2.6
Semiquantitative Proteinbestimmung
Gele und Lösungen
Tabelle 12: Zusammensetzung der Gele für die SDS-PAGE
5 % Sammelgel
10 % Trenngel
1,63 ml
ddH2O
3,12 ml
ddH2O
0,72 ml
0,5 mol/l Tris/HCl pH 6,8
2,13 ml
3 mol/l Tris/HCl pH 8,8
0,50 ml
Acrylamid 30 %
2,83 ml
Acrylamid 30 %
0,06 ml
50 % Glycerol (v/v in ddH2O)
0,17 ml
50 % Glycerol (v/v in ddH2O)
0,03 ml
10 % SDS (w/v in ddH2O)
0,085 ml
10 % SDS (w/v in ddH2O)
0,06 ml
10 % APS (w/v in ddH2O)
0,17 ml
10 % APS (w/v in ddH2O)
0,0048 ml
TEMED
0,0068 ml
TEMED
Die Lösungen wurden wie folgt angesetzt.
Auftragspuffer:
95 % Laemmli Sample Buffer + 5 % Mercaptoethanol (v/v)
1x Blotpuffer:
100 ml 10x Blotpuffer + 200 ml Methanol auf 1 l ddH2O
10x Blotpuffer:
30,3 g Tris + 144,1 g Glycin auf 1 l ddH2O, 1:10 verdünnt mit ddH2O
Lysepuffer:
94 % RIPA-buffer + 4 % cOmpleteTM protease inhibitor cocktail + 1 %
HALTTM Phosphatase Inhibitor Cocktail + 1 % HALTTM Protease Inhibitor
Cocktail
5 % Milchpulver:
5 % Milchpulver in 1x PBS (w/v)
1x PBS:
160 g NaCl + 4 g KCl + 36 g Na2HPO4*2H2O + 4,8 g KH2PO4 auf 1 l
ddH2O, 1:20 verdünnt mit ddH2O
0,5 % PBS/Tween: 1 l 1x PBS + 0,5 ml Tween 20
Ponceau S:
0,2 g Ponceau + 3 g Trichloressigsäure auf 100 ml ddH2O
SDS-Laufpuffer:
30,3 g Tris + 144,1 g Glycin + 10 g SDS auf 1 l ddH2O, 1:10 verdünnt
mit ddH2O
0,5 mol/l Tris/HCl:
30,275 g Tris/500 ml in ddH2O, eingestellt auf pH 6,8 mit HCl
3 mol/l Tris/HCl:
181,71 g Tris/500 ml in ddH2O, eingestellt auf pH 8,8 mit HCl
Probenaufarbeitung
Die Lyse der Zellen erfolgte auf Eis. Nach dem Waschen der Zellen mit PBS wurden je 6Well 70 µl Lysepuffer auf die Zellen pipettiert. Anschließend wurden die Zellen mit einem
27
3.2 Methoden
Zellschaber abgetragen und in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt, in dem die Suspension
für 20 min auf Eis inkubiert wurde. Zur weiteren Lyse wurde die Suspension mehrfach mit
einer Insulinspritze auf- und abgezogen. Anschließend wurde mit 8000 xg bei 4 °C für 10 min
zentrifugiert und der Überstand in ein frisches 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt.
Die Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration erfolgte spektroskopisch mit einem TecanMicroplate-Reader bei 570 nm. Hierfür wurde das PierceTM BCA Protein Assay Kit
verwendet. Bovines Serumalbumin (BSA) wurde in 0,15 mol/l NaCl verdünnt und diente als
Standardreihe (0/0,1/0,2/0,4/0,6/0,8/1,0 mg/ml). In eine 96-Wellplatte wurden dreifach je
10 µl Standard bzw. 5 µl einer 1:4 mit 0,15 mol/l NaCl verdünnten Probe pipettiert. Dazu
gegeben wurden 250 µl BCA-Reagenz (Reagenz A:B = 50:1). Nach Inkubation bei 37 °C für
30 min wurde mit dem Tecan-Microplate-Reader und der dazugehörigen Software Magellan
V7.2 die Gesamtproteinkonzentration ermittelt.
Das Volumen, das 25 µg oder 30 µg Gesamtprotein entspricht, wurde in 0,2 mlReaktionsgefäße mit demselben Volumen an Auftragspuffer gemischt. Anschließend wurden
die Proteine für 5 min bei 95 °C denaturiert.
Bei Unterbrechung des Versuchs erfolgte die Lagerung der Proben bei -20 °C für wenige
Tage oder bei -80 °C für einen längeren Zeitraum. Nach Auftauen wurde erneut denaturiert.
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die Gelelektrophorese dient der Auftrennung von Proteinen in Abhängigkeit von ihrer
molekularen Masse.
Das verwendete Gel bestand aus einem 10 %igen Trenngel und einem darüber liegenden
5 %igen Sammelgel mit 15 Taschen (á ~30 µl). Die Dicke des Gels betrug 1,5 mm. Die
Taschen wurden vor dem Auftragen der Proben mit SDS-Laufpuffer gespült. Als
Größenstandard diente eine Proteinleiter mit Banden zwischen 10 kDa und 250 kDa. Die
Gelelektrophorese lief in SDS-Laufpuffer mit einer Spannung von 200 V.
Western Blot
Die im SDS-Gel aufgetrennten Proteine wurden im Western Blot mittels Elektrophorese bei
einer Stromstärke von 350 mA für 100 min in 1x Blotpuffer unter Kühlung auf eine
Nitrozellulosemembran übertragen. Die Proteine wurden dann mit Ponceau S-Lösung
angefärbt, um die Membran abhängig von den zu untersuchenden Proteinen horizontal zu
schneiden. Die geschnittenen Membranen wurden anschließend in PBS wieder entfärbt.
28
3 Material und Methoden
Die Membranen wurden dann 30 min mit 5 %igem Milchpulver geblockt. Die anschließende
Inkubation mit primären Antikörpern erfolgte unter langsamen Schwenken (maschinell) bei
4 °C über Nacht. Die Membranen wurden hierfür mit einer Antikörperlösung (Antikörper
verdünnt in 5 %iger Milchpulverlösung) in Folie eingeschweißt. Die Verdünnungen sind der
Tabelle 4 zu entnehmen. β-Actin diente als Ladekontrolle.
Um unspezifisch gebundene Antikörper wieder zu entfernen, wurden die Membranen mit
0,5 %iger PBS/Tween-Lösung zweimal für 10 min gewaschen. Anschließend erfolgte die
Inkubation mit sekundären Antikörpern eingeschweißt unter Schwenken bei RT für 1 h. Wie
die primären Antikörper wurden auch die sekundären in 5 %iger Milchpulverlösung verdünnt
(siehe Tabelle 5). Die Membranen wurden anschließend zweimal für 10 min mit 0,5 %iger
PBS/Tween-Lösung und einmal für 10 min mit PBS gewaschen.
Die Membranen wurden dann mit Luminol Reagenz für 1 min unter Lichtausschluss inkubiert
und die damit erzeugte Chemolumineszenz in Belichtungskassetten in der Dunkelkammer
mit Röntgenfilmen detektiert. Die Filme wurden manuell entwickelt und fixiert.
Membranstücke, die weitere Proteine ähnlicher molekularen Masse enthielten, wurden für
15 min mit RestoreTM western blot stripping buffer behandelt, zweimal mit 0,5 %iger
PBS/Tween-Lösung
gewaschen
und
erneut
blockiert.
Anschließend
erfolgten
die
Antikörperreaktionen und die Detektion wie oben beschrieben.
Auswertung des Western Blots
Die Auswertung der Bandenstärken auf den eingescannten Filmen erfolgte densitometrisch
mit der Software ImageJ 1.48v. Dabei wurden die Proteinexpressionen in Relation zur
Ladekontrolle β-Actin beziehungsweise die Phosphorylierungen zum entsprechenden
unphosporylierten
oder
entsprechenden
gesamten
Protein
(phosphoryliert
und
unphosphoryliert (=pan) gesetzt.
3.2.7
mRNA-Quantifizierung
Probenaufarbeitung
Die RNA-Extraktion erfolgte mit dem RNeasy® Mini kit von Qiagen auf Eis. Die Zellen wurden
mit PBS gewaschen, mit 350 µl/6-Well RLT-Puffer versetzt und mit einem Zellschaber von
der Oberfläche abgelöst. Die Suspension wurde dann in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt
und 20 min auf Eis inkubiert. Zur weiteren Lyse der Zellen wurde das Gemisch mit einer
Insulinspritze mehrmals auf- und abgezogen. Um feste Zellbestandteile zu entfernen, wurde
es dann in eine QIAshredderTM-Säule überführt und bei 4 °C mit 11.600 xg für 2 min
29
3.2 Methoden
zentrifugiert. Das Zentrifugat wurde anschließend mit 350 µl 70 %igem Ethanol gemischt, um
die RNA zu fällen, und in eine Säule des RNeasy® Mini Kits überführt. Diese wurde bei 4 °C
mit 11.600 xg für 15 s zentrifugiert. Die membrangebundene RNA wurde mit 700 µl RW1Puffer gewaschen, worauf erneut bei 4 °C mit 11.600 xg für 15 s zentrifugiert wurde.
Anschließend wurde mit RPE-Puffer gewaschen und bei 4 °C mit 11.600 xg für 2 min
zentrifugiert. Die RNA wurde dann mit 40 µl RNase-freiem Wasser in ein frisches
Reaktionsgefäß mittels Zentrifugation bei 4 °C mit 11.600 xg für 1 min eluiert.
Danach wurde die RNA-Konzentration spektrophotometrisch bestimmt. Proben mit einem
Mindestgehalt von 400 ng/µl, einem 260 nm/280 nm-Wert von ungefähr 2 und einem
230 nm/260 nm-Wert zwischen 1 und 2 konnten für das weitere Vorgehen verwendet
werden.
Für den Verdau der genomischen DNA wurde das DNase I-Kit von Invitrogen verwendet. Ab
diesem Schritt wurde eine Negativkontrolle (5,5 µl Wasser statt RNA) mitgeführt. Es wurde
ein Probenvolumen entsprechend 1 µg RNA mit 1 µl DNase I, 1 µl 10x DNase reaction buffer
und RNase-freies Wasser (Gesamtvolumen 7,5 µl bei Verwendung des cDNase-Kits von
Roche bzw. 10 µl bei Kit von Thermo Fisher Scientific) für 15 min bei RT inkubiert. Die
Reaktion wurde dann mit 1 µl EDTA und Inkubation bei 65 °C für 10 min abgestoppt.
Die cDNA-Synthese erfolgte mit Hilfe des Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit von
Roche oder mit dem RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit von Thermo Fisher
Scientific.
Zum
DNA-Verdau-Ansatz
wurden
2 µl
(Roche)
bzw.
4 µl
(Thermo)
Reaktionspuffer, 4 µl MgCl2 (bei Roche), 2 µl Nukleotid-Mix, 2 µl (Roche) bzw. 1 µl (Thermo)
Random-Primer, 0,5 µl (Roche) bzw. 1 µl (Thermo) RNase-Inhibitor und 1 µl reverse
Transkriptase pipettiert. Die cDNA-Synthese erfolgte im Thermocycler nach dem folgenden
Programm:
25 °C für 10 min
42 °C für 60 min
95 °C für 5 min (bei Kit von Roche)
bzw. 70 °C für 10 min (bei Kit von Thermo)
Der Probenansatz wurde anschließend 1:2 mit 20 µl RNA-freiem Wasser verdünnt und
konnte bei -20 °C gelagert werden.
Quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR)
Auf Eis wurden zu 10,5 µl Probe 52,5 µl MaximaTM SYBR Green, 1,05 µl FITC und 34,65 µl
RNA-freies Wasser pipettiert und anschließend als Dreifachbestimmung 14,1 µl dieses
30
3 Material und Methoden
Ansatzes und 0,9 µl Primerlösung in die Wells einer PCR-Platte pipettiert. Die
Primerlösungen enthielten je 5 pmol Vorwärts- und Rückwärts-Primer für den Analyten
VEGF-C beziehungsweise für das Haushaltsgen β2-M. Die Sequenzen der Primer sind in
Tabelle 7 ersichtlich.
Die qRT-PCR lief im iCycler iQTM von Bio-Rad mit folgendem Programm:
Zyklus 1 (1x):
Zyklus 2 (40x):
Zyklus 3 (1x):
95,0 °C für 08:00 [min]
Schritt 1:
95,0 °C für 00:20
Schritt 2:
58,0 °C für 00:30
Schritt 3:
72,0 °C für 00:10
Schritt 4:
76,0 °C für 00:05
Schritt 1:
72,0 °C für 02:00
Schritt 2:
95,0 °C für 01:00
Zyklus 4 (180x):
60,0 °C für 00:04
 je Durchgang wurde die Temperatur um 0,2 °C erhöht
Zyklus 5 (1x):
20,0 °C für 00:10
Auswertung
Die Auswertung der Messwerte erfolgte mit der CFX Manager Software von Bio-Rad
Laboratories.
Die
relative
mRNA-Expression
wurde
mit
Microsoft
Excel
2007
folgendermaßen berechnet (ct - cycle threshold):
3.2.8
γH2AX Foci-Assay
Die durch Bestrahlung induzierten potentiell letalen DNA-Doppelstrangbrüche führen zum
Anschalten zellulärer Reparaturmechanismen, an denen unter anderem das Histon H2AX
beteiligt ist. Dieses wird in Nachbarschaft zum DNA-Doppelstrangbruch zum sogenannten
γH2AX phosphoryliert (Rogakou et al., 1998). Die Immunfluoreszenzfärbung des γH2AX
ermöglicht, DNA-Doppelstrangbrüche sichtbar zu machen.
31
3.2 Methoden
Lösungen
Blocking buffer: 10 mg/ml gelöst in 1x PBS
DAPI:
1:1000 verdünnt in 1x PBS
Triton X-100:
0,1 %ig in PBS (v/v)
Versuchsansatz
Für die Bestimmung der DNA-Doppelstrangbrüche wurden 70.000 PC-3 Zellen in 4-Well
Chamber Slides ausplattiert. 24 h später erfolgte die Transfektion der Zellen mit siVEGF-C
bzw. siSCR wie in Abschnitt 3.2.2 beschrieben. Nach weiteren 48 h wurden die Zellen mit
4 Gy und 6 Gy bestrahlt. Unbehandelte Zellen wurden 24 h vor dem Zeitpunkt der
Bestrahlung ausplattiert.
Immunfluoreszenzfärbung
Die Zellen der Färbekontrolle wurden 30 min nach der 4 Gy-Bestrahlung und die Zellen aller
weiteren Proben 24 h nach der Bestrahlung für 15 min mit 4 %iger Formaldehydlösung fixiert
und 3 mal für 5 min mit PBS gewaschen. Die Zellmembranen wurden anschließend mit einer
Triton X-100-Lösung permeabilisiert. Nach einmaligem Waschen mit PBS für 5 min wurden
unspezifische Bindungsstellen durch 60 minütige Inkubation mit Blocking buffer blockiert. Die
Zellen wurden als nächstes mit dem Antikörper gegen γH2AX, mit einer Verdünnung von
1:2000, für 60 min inkubiert und anschließend dreimal mit PBS für 5 min gewaschen. Ab hier
erfolgte die Probenaufarbeitung unter Lichtausschluss. Der sekundäre Antikörper Alexa
Fluor® 594 wurde in einer Konzentration 1:500 für 60 min zu den Zellen gegeben. Es
erfolgten wieder drei Waschgänge, bevor mit DAPI 1:1000 die Zellkerne angefärbt und
erneut dreimal gewaschen wurde. Zum Schluss wurde mit Fluorescent Mounting Medium
eingedeckelt. Nach Trocknen bei RT über Nacht wurden die Objektträger bei 4 °C unter
trockenen Bedingungen und unter Lichtausschluss gelagert.
Der Versuch wurde dreimal unabhängig voneinander durchgeführt.
Als Kontrolle für die korrekte Bewertung der Foci wurde in einem Durchgang parallel zur
nicht transfizierten PC-3 Probe die in unserer Arbeitsgruppe für die Foci-Bestimmung gut
etablierte Zelllinie FaDu (80.000 Zellen/Well) mitgeführt.
Auswertung
Je
Probe
wurden
10
Bilder
in
40-facher
Vergrößerung
mit
dem
inversen
Fluoreszenzmikroskop Axio Imager M1 und der Kamera Axio Cam MRm aufgenommen. Mit
32
3 Material und Methoden
der Software AxioVS 40x64 V 4.9.1.0 erfolgte die Auswertung der γH2AX Foci und der
Kernfläche. γH2AX wurde mit einem rot fluoreszierenden sekundären Antikörper angefärbt.
Zur besseren Erkennbarkeit wurde die Farbe in der Aufnahme auf grün umgestellt.
Alle auswertbaren Zellkerne wurden nummeriert und davon randomisiert 10 Zellkerne
ausgewertet. Auf diese Weise wurden je Probe die Fläche von 100 Zellkernen und deren
Foci-Anzahl bestimmt. Von der Auswertung ausgeschlossen waren Zellen in der S-Phase,
mitotische, nekrotische und apoptotische Zellen, sowie deformierten Kerne und Mikrokerne.
Die Berechnung der korrigierten Anzahl residueller γH2AX Foci pro Zellkern erfolgte wie in
Menegakis et al. (2015) beschrieben:
, mit
… korrigierte Anzahl residueller γH2AX Foci
… Mittelwert aller Zellkernflächen unter gleichen
experimentellen Bedingungen
… Fläche des individuellen Zellkerns
… Anzahl der γH2AX Foci des individuellen
Zellkerns
3.2.9
Zellzyklusanalyse
Lösungen
PBS/0,5 mmol/l EDTA:
105 mg Tetrasodium-EDTA auf 500 ml 1x PBS
Ribonuclease A (RNase), 1 mg/ml:
1:20 in 1x PBS
Versuchsansatz
Die Zellzyklusanalysen wurden mit PC-3 und DU145 durchgeführt. Die Transfektion mit
siRNA gegen VEGF-C erfolgte in T-175 Zellkulturflaschen wie in Abschnitt 3.2.2
beschrieben. Nach 24 h wurden die Zellen in T-75 Zellkulturflaschen umgesetzt. 24 h später
erfolgte die Bestrahlung mit 4 Gy. Nach weiteren 4/8/12/24/72 h wurden die Zellen für die
Zellzyklusanalyse aufgearbeitet.
Die Zellzyklusanalysen wurden dreifach angesetzt und insgesamt dreimal unabhängig
voneinander durchgeführt.
Probenaufarbeitung
Die Zellen wurden zunächst trypsiniert und mit PBS/EDTA gewaschen. Die sich
anschließende Zentrifugation erfolgte bei ~300 xg und 4 °C für 5 min. Danach wurden die
33
3.2 Methoden
Zellen auf Eis in PBS/EDTA (1x106 Zellen/ml) resuspendiert und zur Fixierung in ein FACSRöhrchen, in dem das 2,5-fache Volumen an 100 %igen kalten Methanol vorgelegt war,
tropfenweise unter Schütteln gegeben. Die so aufbereiteten Proben konnten mit Parafilm
abgedichtet bei 4 °C mehrere Wochen gelagert werden.
Ab jetzt wurde die Zelllinie N1 als Kontrolle mit diploiden Zellen mitgeführt. Diese Zellen
wurden nicht selbst kultiviert, da sie innerhalb der eigenen Arbeitsgruppe bereits fixiert zur
Verfügung standen. Die Zellsuspension wurde bei ~470 xg und 4 °C für 8 min zentrifugiert.
Der Überstand wurde abgesaugt und die Zellen mit 2 ml PBS/EDTA für 15 min auf Eis
rehydriert. Nach erneuter Zentrifugation und Absaugen des Überstandes wurden 200 µl PBS
und 25 µl Ribonuclease A (1 mg/ml) pro 1x106 Zellen zugegeben und bei 37 °C für 30 min
inkubiert. Circa 3 min vor der Messung wurden unter Lichtausschluss und auf Eis 25 µl
Propidiumiodid (1 mg/ml)/1x106 Zellen (mindestens 15 µl) dazugegeben.
Durchflusszytometrie
Die Messung erfolgte mit dem FACS Canto II mit Hilfe der BD FACSDiva Flow Cytometry
Software. Es wurden mindestens 20.000 Zellen gemessen.
Auswertung
Die Erstellung der Histogramme aus den Messwerten und die Integration der Kurven im
Histogramm (Ermittlung der Zellzyklusverteilung) erfolgten mit der MultiCycle AV Software.
3.2.10 Tierversuch
Versuchstiere und Tumormodell
Die Versuche wurden an 7-15 Wochen alten NMRI-Nacktmäusen durchgeführt, welche aus
der hauseigenen pathogenfreien Zucht stammten. Für eine zusätzliche Immunsuppression
wurden die Tiere mit 4 Gy 2-5 Tage vor Tumortransplantation ganzkörperbestrahlt. Zur
Tumortransplantation wurden 500.000 PC-3 Zellen in 50 µl Matrigel/PBS (1:2) suspendiert
und subkutan auf das rechte Hinterbein mit einer 20 G-Kanüle transplantiert. Während der
Transplantation waren die Tiere mit 120 mg/kg Körpergewicht Ketamin und 16 mg/kg
Körpergewicht Xylazin (intraperitoneal) anästhesiert. Die Konstanz des Tumormodells wurde
mittels Mikrosatellitenanalyse der ursprünglichen Zelllinie aus dem Kryostock und mittels
Volumenverdopplungszeit (VDT) der Tumore von jeweils 5 unbehandelten Tieren pro
Transplantationskohorte kontrolliert. Die Mediane der VDT für die Transplantationskohorte
Wachstumsverzögerung
betrug
9,8
Tage
(min=6,2 d,
max=11,0 d),
für
die
erste
Transplantationskohorte für die lokale Tumorkontrolle 10,3 Tage (min=9,0 d, max=13,7 d)
34
3 Material und Methoden
und für die zweite 11,2 Tage (min=6,3 d, max=14,5 d). Die Mediane weisen keine
signifikanten Abweichungen auf und stimmen mit den VDTs anderer in vivo-Studien mit
PC-3-Xenografts überein (Bourré et al., 2003; Hensley et al., 2011). Die Einzelwerte der
VDT-Tumoren sind im Anhang in Tabelle A1 aufgelistet.
Die Tierhaltung und die Experimente wurden entsprechend den Richtlinien des OncoRays
und den deutschen Tierschutzvorschriften durchgeführt und genehmigt (Landesdirektion
Sachsen, AZ: 24-9168.11-1/2013-52).
Die Berechnung der VDTs erfolgte mit der exponentiellen Regressionsformel RKP in
Microsoft Excel (2007), wobei als y-Werte die Tumorvolumina von etwa 100 mm3 bis
400 mm3 (in diesem Bereich ist die VDT annähernd konstant) und als x-Werte die
dazugehörigen Tage nach Behandlungsbeginn gesetzt wurden. Aus den ausgegebenen
Regressionskenngrößen für die Formel y=b∙(m1^x1)∙(m2^x2)∙...∙(mn^xn) wurde die VDT wie
folgt berechnet:
Experimentelles Design
Sobald die Tumore einen Durchmesser von 6-8 mm erreicht hatten, wurden die Tiere in den
Versuch aufgenommen. Zwei Endpunkte wurden ausgewertet: Wachstumsverzögerung und
lokale Tumorkontrolle.
Für die Wachstumsverzögerung wurden die Tiere mit 80 mg Nelfinavir/kg Körpergewicht
(Wirkstoff von Viracept®), suspendiert in 350 µl Wasser (Aqua ad iniectabilia Braun), 5-mal
wöchentlich für 6 Wochen oral per Schlundsonde behandelt. Die Wirkstoffkonzentration
wurde in Anlehnung an die Veröffentlichung von Pore et al. (2006) gewählt. Die
Kontrollgruppe erhielt 350 µl Wasser. Die Anzahl der Versuchstiere für Nelfinavir betrug 17,
die für Wasser 18.
Zur
Ermittlung
der
lokalen
Tumorkontrolle
wurde
wie
beschrieben
Nelfinavir
beziehungsweise Wasser gegeben und zusätzlich 4 h nach jeder Verabreichung bestrahlt (6
Wochen, 30 Fraktionen). Dieses Zeitintervall zwischen Medikamentenverabreichung und
Bestrahlung wurde gewählt, da hiernach eine hohe Transportaktivität von Nelfinavir in
unterschiedliche Organe in vivo besteht (Kim et al., 1998). Die Gesamtdosen der
Strahlentherapie betrugen 30/40/50/60/72,5/85/100/120 Gy. Zur Berechnung der DosisWirkungs-Beziehung konnten 87 Tiere der Nelfinavir/Bestrahlungsgruppe und 92 Tiere der
Kontrollgruppe (Wasser/Bestrahlung) verwendet werden.
35
3.2 Methoden
Nachbeobachtungszeit und Auswertung der Endpunkte Wachstumsverzögerung und lokale
Tumorkontrolle
Die Tumorgröße wurde zweimal pro Woche mit einer Schiebelehre bestimmt und das
Tumorvolumen folgendermaßen berechnet:
, mit a … längster Durchmesser
b … kürzerer Durchmesser, senkrecht zu a
Leidende Tiere, Tiere, deren Tumor die maximal zulässige Endgröße von 15 mm erreicht
hatte und Tiere nach der Nachbeobachtungszeit von 270 Tagen nach Behandlungsende
wurden getötet. Mit der langen Nachbeobachtungszeit sollte sichergestellt werden, dass
keine weiteren Rezidive nach dem Zeitpunkt der Auswertung der lokalen Tumorkontrolle
(Tag 180 nach Behandlungsende) auftreten.
Für die Ermittlung der Wachstumsverzögerung wurde aus der Wachstumskurve jedes
Tumors die Zeit bis zum Erreichen des 2- bis 5-fachen des Startvolumens abgelesen
(Tumorwachstumszeit, TGTV2-V5).
Die Tiere, die aufgrund ihres schlechten Allgemeinzustandes getötet wurden, wurden in die
Auswertung mit einbezogen (Nelfinavir: n=1; Wasser: n=1). Ulzeröse Tumore wurden bis zur
Schrumpfung berücksichtigt (Nelfinavir: n=3; Wasser: n=2). Zu einem zweiten Tumor
angrenzende Tumore wurden bis zum Zusammenwachsen einbezogen (Nelfinavir: n=1;
Wasser: n=3).
Die lokale Tumorkontrolle wurde für den Tag 180 nach Behandlungsende ausgewertet. Die
Tumorkontrollwahrscheinlichkeiten (TCP) und die Tumorkontrolldosis, bei der 50 % der
Tumore lokal kontrolliert sind (TCD50) sowie das dazugehörige 95 %-Konfidenzintervall
wurden mit einem binären logistischem Modell wie in Yaromina et al. (2011) beschrieben,
von PD Dr. Steffen Löck und Dr. Lydia Koi berechnet. Als Rezidiv wurde gewertet, wenn das
Tumorvolumen an drei Messtagen zunahm, nachdem es vorher geschrumpft oder stabil war
oder wenn der Tumor ohne Schrumpfen weiter gewachsen ist. Hierbei musste das
Tumorwachstum an mindestens jedem übernächsten Messtag zugenommen haben.
Rezidive nach Tag 180 nach Behandlungsende wurden für die Berechnung der TCD50 als
lokal kontrolliert gewertet (Nelfinavir: n=3; Wasser: n=2). Das Einbeziehen dieser Werte als
Rezidive in die Berechnung hatte keinen entscheidenden Einfluss auf das Ergebnis. Tiere
wurden zensiert, wenn sie ohne Rezidiv nach Tag 20 nach Behandlungsende starben. Tiere,
die vor Tag 20 nach Behandlungsende ohne Rezidiv starben, wurden von der Auswertung
ausgeschlossen.
36
3 Material und Methoden
3.2.11 Statistische Auswertung
In vitro-Versuche
Die Datenanalyse für alle in vitro-Daten wurde mit der GraphPad Prism 5 Software
durchgeführt. Für alle Versuche wurden die Mittelwerte ± Standardfehler berechnet. Die
Stichproben wurden mit dem t-Test für nicht verbundene Stichproben unter Annahme
ungleicher Varianzen (Welch-Test) vor eventueller Normalisierung der Werte auf die
Kontrolle verglichen.
Mediane wurden mit dem Mann-Whitney-U-Test verglichen.
Die Kurvenanpassungen der Koloniebildungsassays wurden mit dem F-Test verglichen.
Ausreißertests wurden nach Grubbs durchgeführt.
Für alle Tests wurde ein Signifikanzniveau von α = 0,05 angenommen.
Ein p-Wert ≤ 0,05 wurde als statistisch signifikant (*), ≤ 0,01 als statistisch sehr signifikant
(**) und ≤ 0,001 als hoch signifikant (***) bewertet.
In vivo-Versuche
Die Mediane der Tumorwachstumszeit und der Wachstumsverzögerung wurden mit dem
Mann-Whitney-U-Test (nicht verbundene Stichproben, keine Normalverteilung) mit Hilfe der
GraphPad Prism 5 Software verglichen; Signifikanzniveau: α = 0,05. Die statistische Analyse
der lokalen Tumorkontrolle wurde mit der Software STATA/SE 11.2 durchgeführt.
Zur Bewertung der p-Werte siehe oben.
37
4 Ergebnisse
4.1
4.1.1
Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Strahlenresistenz
Betrachtung der VEGF-C- und NRP-2-Gehalte in den Zelllinien PC-3, DU145 und
LNCaP
Für die Bewertung der Funktion von VEGF-C und NRP-2 im Prostatakarzinom wurden die
kommerziell erhältlichen Prostatakarzinomzelllinien PC-3, DU145 und LNCaP verwendet.
Diese Zelllinien besitzen eine unterschiedlich hohe VEGF-C- und NRP-2-Expression, welche
mittels qRT-PCR beziehungsweise semiquantitativer Proteinanalyse ermittelt wurde. Bei
VEGF-C handelt es sich um ein sezerniertes Protein, weshalb es nicht vollständig mittels
semiquantitativer Proteinanalyse erfasst werden kann. Daher wurde dessen mRNAExpression nur mittels qRT-PCR gemessen. Ein ELISA wurde nicht durchgeführt. PC-3 wies
die höchsten und LNCaP die niedrigsten Werte für VEGF-C auf mRNA-Ebene und für NRP-2
auf Proteinebene auf. Der Gehalt von VEGF-C-mRNA in LNCaP lag unterhalb der
Bestimmungsgrenze (Abbildung 4).
Abbildung 4: VEGF-C- und NRP-2-Expressionen in den Zelllinien PC-3, DU145 und
LNCaP. (A) VEGF-C-Gehalte von PC-3 und DU145 wurden mittels qRT-PCR bestimmt; der
VEGF-C-Gehalt von LNCaP lag unterhalb des Bestimmungsbereichs (Mittelwerte mit
Standardfehler, n = 3). (B) Die NRP-2-Gehalte von PC-3, DU145 und LNCaP wurden mittels
Western Blot detektiert.
4.1.2
Etablierung der VEGF-C- und NRP-2-siRNA-Transfektionen
Für die Transfektionen wurden kommerziell erhältliche siRNA Pools verwendet. Zunächst
wurden die Konzentrationen der siRNAs, bei denen die Herunterregulierung der mRNAExpression von VEGF-C und die Proteinexpression von NRP-2 maximal war, für PC-3 und
DU145 eingestellt. Dafür wurde die niedrigste Konzentration für die siRNAs ermittelt, um
mögliche off-target-Effekte der verwendeten siRNA zu vermeiden. LNCaP konnte aufgrund
der geringen Gehalte nicht erfolgreich transfiziert werden. Für PC-3 war die Transfektion mit
39
4.1 Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Strahlenresistenz
22,5 nmol/l siVEGF-C und 30 nmol/l siNRP-2, für DU145 mit jeweils 22,5 nmol/l siVEGF-C
beziehungsweise siNRP-2 effektiv (Abbildung 5).
Abbildung 5: Herunterregulierung von VEGF-C und NRP-2 in PC-3 und DU145. Die
Effektivität der Transfektion mit siVEGF-C wurde mittels qRT-PCR auf mRNA-Ebene
(Mittelwerte mit Standardfehler, n = 3) (A) und die Transfektion mit siNRP-2 mittels Western
Blot auf Proteinebene (B) nachgewiesen.
4.1.3
Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Klonogenität bestrahlter Zellen
Der Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Strahlenresistenz der Zellen wurde mittels
Koloniebildungsassay mit Einzeldosen von 0 - 6 Gy untersucht. Die durch siRNATransfektion verminderte VEGF-C-Expression in PC-3 und DU145 resultierte in signifikant
verringertem klonogenen Überleben der Zellen (p = 0,02 beziehungsweise p = 0,006, F-Test)
(Abbildung 6A und B). Aufgrund der geringen VEGF-C-Expression in LNCaP wurde diesen
Zellen rekombinantes humanes (rh) VEGF-C mit 75 ng/ml zugesetzt, welches das klonogene
Überleben der Zellen signifikant verbesserte (p = 0,015, F-Test) (Abbildung 6C).
Das durch siRNA-Transfektion herunter regulierte NRP-2 hatte in PC-3 und DU145
unterschiedliche
Effekte
auf
das
klonogene
Überleben.
Während
die
NRP-2-
Herunterregulierung DU145 strahlensensibilisiert, erhöht es die Strahlenresistenz in PC-3
(p = 0,002 beziehungsweise p = 0,03) (Abbildung 7).
40
4 Ergebnisse
Abbildung 6: Koloniebildungsassays von PC-3, DU145 und LNCaP nach Veränderung
des VEGF-C-Status. Koloniebildungsassays mit dazugehörigen Plattierungseffizienzen bei
0 Gy ohne Normalisierung, t-Test (Welch), p-Werte relativ zur Kontrolle. (A und B)
Klonogenes Überleben von PC-3 und DU145 nach siRNA-Transfektion gegen VEGF-C und
Bestrahlung mit 0 – 6 Gy. Mittelwerte mit Standardfehler, PC-3: n = 4, DU154: n = 3.
Kurvenanpassung nach dem Linear-Quadratischen-Modell, verglichen mit dem F-Test. (C)
Klonogenes Überleben von LNCaP nach Inkubation mit rekombinantem humanem (rh)
VEGF-C (75 ng/ml) und Bestrahlung mit 0 – 6 Gy. Mittelwerte mit Standardfehler, n = 3.
Kurvenanpassung nach dem Multi-Target Single-Hit-Modell, verglichen mit dem F-Test.
In allen Koloniebildungsassays hatte die Transfektion beziehungsweise die Behandlung mit
rhVEGF-C keinen signifikanten Einfluss auf die Plattierungseffizienz (t-Test, Welch). Es kann
somit davon ausgegangen werden, dass die Behandlung selbst die Koloniebildung nicht
signifikant beeinflusst und der zu erkennende Unterschied der Überlebenskurven tatsächlich
auf den Strahleneffekt durch VEGF-C beziehungsweise NRP-2 zurückzuführen ist.
41
4.2 Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf überlebensfördernde Signalwege unter Bestrahlung
Abbildung 7: Koloniebildungsassays von PC-3 und DU145 unter verminderter NRP-2Expression. Klonogenes Überleben von PC-3 und DU145 nach siRNA-Transfektion gegen
NRP-2 und Bestrahlung mit 0 – 6 Gy. Mittelwerte mit Standardfehler, PC-3: n = 4, DU154:
n = 3. Kurvenanpassung nach dem Linear-Quadratischen-Modell, verglichen mit dem F-Test.
Dazugehörige Plattierungseffizienzen bei 0 Gy ohne Normalisierung, t-Test (Welch), p-Werte
relativ zur Kontrolle.
Die folgenden Untersuchungen dienten der Klärung des Mechanismus der positiven Wirkung
von VEGF-C auf die Strahlenresistenz der Prostatakarzinomzelllinien. Aufgrund des
gegensätzlichen Ergebnisses im Koloniebildungsassay für PC-3 und DU145 nach
Herunterregulierung von NRP-2, wurde für den Großteil der nachfolgenden Versuche der
Schwerpunkt auf die Untersuchungen zu VEGF-C gelegt.
4.2
Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf überlebensfördernde Signalwege unter
Bestrahlung
Muders et al. (2009) zeigten, dass in verschiedenen Prostatakarzinomzelllinien unter
oxidativem Stress, induziert durch H2O2, das Zellüberleben durch VEGF-C und NRP-2 über
Akt1 reguliert wird. Mäkinen et al. (2001) beschrieben für humane dermale mikrovaskuläre
Endothelzellen (HMVEC) ebenfalls eine durch VEGF-C induzierte Aktivierung von pAkt
(Ser473) sowie von ERK1/2. In den folgenden Experimenten wurde daher untersucht, ob und
in welchem Ausmaß VEGF-C beziehungsweise NRP-2 auch unter strahleninduziertem
oxidativem Stress die Aktivierung von Akt und ERK1/2 in den Zelllinien PC-3 und DU145
beeinflussen.
42
4 Ergebnisse
4.2.1
Aktivierung des Akt-Signalwegs
Die Phosphorylierung von Proteinen erfolgt nach der Bestrahlung prinzipiell innerhalb kurzer
Zeit. Es wurden mehrere Versuche zur Ermittlung der Dauer zwischen Bestrahlung und
maximaler Veränderung der Akt-Aktivierung in PC-3 und DU145 durchgeführt. Diese
Versuche waren jedoch nicht reproduzierbar und die Ergebnisse wurden nicht verwendet.
Für die Untersuchung des Einflusses von VEGF-C und NRP-2 auf die Akt-Aktivierung unter
Bestrahlung wurde daher bezüglich des Zeitparameters auf Literaturwerte zurückgegriffen. In
verschiedenen Arbeiten wurde die pAkt/Akt-Bestimmung in Prostatakarzinomzelllinien 24 h
nach Bestrahlung mit 2 Gy oder 4 Gy gemessen (Anai et al., 2007; Diaz et al., 2009; Zhu et
al., 2013). Daher wurde für den durchzuführenden Versuch ebenfalls zunächst diese
Zeitspanne angesetzt.
Für den ersten Versuch wurden 250.000 PC-3- beziehungsweise 150.000 DU145-Zellen in
6-Wellplatten ausplattiert, nach 24 h mit siRNA transfiziert und nach weiteren 48 h mit 2 Gy
bestrahlt. Die Zellen wurden 24 h nach Bestrahlung für die Proteinbestimmung mittels
Western Blot aufgearbeitet.
Abbildung 8: Einfluss von NRP-2 und VEGF-C auf die Phosphorylierung von Akt unter
Bestrahlung (24 h). Western Blots von transfizierten PC-3- und DU145-Zellen 24 h nach
Bestrahlung mit 2 Gy (n=3). (A) Auswertung Western Blots der siSCR-transfizierten Zellen
mit und ohne Bestrahlung. Angegeben sind die Mittelwerte mit Standardfehler, t-Test
(Welch), p-Werte relativ zur Kontrolle. (B) Angegeben sind die Verhältnisse der
Bandenintensitäten von pAkt/Akt jeweils normiert auf die Ladekontrolle β-Actin.
43
4.2 Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf überlebensfördernde Signalwege unter Bestrahlung
Wie nach der semiquantitativen Proteinanalyse dreier unabhängiger Versuche in Abbildung
8A zu sehen ist, führt die Bestrahlung in siSCR-transfizierten PC-3- und DU145-Zellen zu
einer nicht signifikanten Aktivierung von Akt am Serin 473. Nach Herunterregulierung von
NRP-2 und vor allem von VEGF-C schwanken die Werte sehr stark (Abbildung 8B). In
bestrahlten und unbestrahlten Proben wurde sowohl eine erhöhte als auch verminderte AktPhosphorylierung ermittelt. Somit waren die Versuche nicht reproduzierbar, sodass unter
diesen Versuchsbedingungen keine Aussage dazu getroffen werden kann, ob oder wie
NRP-2 und VEGF-C die Akt-Aktivierung beeinflussen.
Über einen zweiten Versuch wurde untersucht, ob sich die Akt-Aktivierung am Serin 473
reproduzierbar
beeinflussen
lässt,
wenn
die
Versuchsbedingungen
in
Bezug
auf
Bestrahlungsdosis und Zeitpunkt der Messung verändert werden. Nach Yazlovitskaya et al.
(2008) und Edwards et al. (2002) ergab sich die maximale Phosphorylierung von Akt in
humanen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) nach 3 min beziehungsweise nach
15 min. Dieser Versuch wurde aufgrund der etwas höheren Passagenzahl mit 200.000 PC-3beziehungsweise 120.000 DU145-Zellen pro 6-Well durchgeführt. Die Dosis wurde auf 6 Gy
erhöht und die Zeit bis zum Abstoppen des Versuchs nach der Bestrahlung auf 10 min
verkürzt. Der Versuch wurde auf die Herunterregulierung von VEGF-C beschränkt.
Abbildung 9: Einfluss von VEGF-C auf die Phosphorylierung von Akt unter
Bestrahlung (10 min). (A) Repräsentative Western Blots von transfizierten PC-3- und
DU145-Zellen 10 min nach Bestrahlung mit 6 Gy. (B) Berechnete Verhältnisse von pAkt/Akt
nach densitometrischer Auswertung der Western Blots. Die Versuche erfolgten dreimal
voneinander unabhängig. Angegeben sind die Mittelwerte mit Standardfehler.
44
4 Ergebnisse
Unter diesen Bedingungen war der Versuch reproduzierbar. Interessanterweise kam es nach
der Bestrahlung in allen Proben zu einer Abnahme der Akt-Phosphorylierung am Serin 473,
die jedoch nicht signifikant war (Abbildung 9). Die Transfektion mit siVEGF-C hatte ebenfalls
keinen signifikanten Einfluss.
4.2.2
Aktivierung des ERK1/2-Signalwegs
Parallel
zur
pAkt/Akt-Bestimmung
wurden
10 min
nach
Bestrahlung
pERK1/2
(Thr202/Tyr204) und ERK1/2 detektiert. Auch hier nahm die ERK1/2-Phosphorylierung nach
der Bestrahlung nicht signifikant ab und es konnten keine signifikanten Zusammenhänge von
VEGF-C auf die Aktivierung von ERK1/2 gefunden werden. Die Daten sind in Abbildung 10
dargestellt.
Abbildung 10: Einfluss von VEGF-C auf die Phosphorylierung von ERK1/2 unter
Bestrahlung. (A) Repräsentative Western Blots von transfizierten PC-3- und DU145-Zellen
10 min nach Bestrahlung mit 6 Gy. (B) Berechnete Verhältnisse von pERK1/2/ERK1/2 nach
densitometrischer Auswertung der Western Blots. Die Versuche erfolgten dreimal
voneinander unabhängig. Angegeben sind die Mittelwerte mit Standardfehler.
45
4.3 Untersuchungen zum Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Strahlenresistenz
beeinflussende zelluläre und molekulare Prozesse
4.3
Untersuchungen zum Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Strahlenresistenz
beeinflussende zelluläre und molekulare Prozesse
4.3.1
Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Autophagie und deren Bedeutung für
die Strahlenresistenz
Autophagie ist ein Prozess, der in Stresssituationen zum Beispiel durch Bestrahlung zum
Überleben oder zum Tod der Zellen beitragen kann (Apel et al., 2008; Kim et al., 2008;
Lomonaco et al., 2009). Daher wurde untersucht, ob Autophagie durch VEGF-C oder NRP-2
reguliert wird und zur Strahlenresistenz beziehungsweise -sensibilität führt. Die Versuche
wurden ausschließlich mit PC-3 durchgeführt, da in DU145 das für die Autophagie
essentielle ATG5 mutiert ist, was dazu führt, dass die Translation dieses Gens vorzeitig
beendet und LC3-II nicht gebildet wird, wodurch Autophagie nicht ablaufen kann (Ouyang et
al., 2013). LNCaP wurde nicht untersucht, da es sich hierbei um eine eher strahlensensible
Zelllinie handelt und Autophagie in strahlensensiblen Zellen durch Bestrahlung deutlich
weniger
als in
strahlenresistenten Zellen induziert
wird und die Autophagie in
strahlensensiblen Zellen das klonogene Überleben nach Bestrahlung nicht beeinflusst
(Chaachouay et al., 2011).
Für die Untersuchung der in den Zellen innerhalb einer bestimmten Zeitspanne
abgelaufenen Autophagie (autophagischer Flux) wurden die Zellen mit Bafilomycin
behandelt, sodass deren Autophagosomen nicht abgebaut werden konnten. Das so
akkumulierte LC3-II in der Autophagosomenmembran wurde per Western Blot bestimmt und
diente im Verhältnis zur mit DMSO behandelten Kontrolle als Maß für die Autophagie.
Zunächst wurde ein geeigneter Zeitpunkt zur Bestimmung von LC3-II ermittelt. Hierzu
wurden 500.000 PC-3-Zellen in 6-Wellplatten ausgesät und nach 24 h mit 2 Gy bestrahlt. Zu
verschiedenen Zeitpunkten innerhalb von 1 – 24 h nach Bestrahlung wurde abgestoppt und
die Proben zur Detektion von LC3-II aufgearbeitet.
Abbildung 11: LC3-II-Bestimmung mittels Western Blot. (A) Bestimmung der maximalen
Expression von LC3-II 1-24 h nach Bestrahlung mit 2 Gy; n = 3. Western Blots einer
repräsentativen Wiederholung. (B) Western Blot aller Wiederholungen (I-III) für den Zeitpunkt
7 h.
46
4 Ergebnisse
Wie in Abbildung 11 ersichtlich, war die LC3-II-Konzentration 7 h nach der Bestrahlung
maximal. Dieser Zeitpunkt wurde zur Bestimmung des autophagischen Flux ausgewählt.
Im nächsten Schritt erfolgte die Bestimmung des autophagischen Flux in PC-3-Zellen nach
vorheriger siRNA-Transfektion gegen NRP-2 beziehungsweise VEGF-C ohne und mit
Bestrahlung mit 2 Gy.
Unbestrahlte transfizierte Zellen wiesen einen geringeren autophagischen Flux auf als die
Kontrolle (Abbildung 12A und B). Das heißt, dass in diesen Zellen die Autophagie reduziert
ablief. Der Effekt von siVEGF-C war hierbei signifikant (p = 0,006) und stärker als der von
siNRP-2.
Das Ergebnis der Transfektion unter Bestrahlung mit 2 Gy war im Gegensatz zu dem der
unbehandelten Proben in 3 voneinander unabhängig durchgeführten Versuchen nicht
reproduzierbar (Abbildung 12C).
Abbildung 12: Autophagischer Flux in PC-3 nach siRNA-Transfektion gegen NRP-2
und VEGF-C ohne und mit Bestrahlung mit 2 Gy. (A) Repräsentativer Western Blot für
LC3-II aus PC-3-Zelllysaten nach autophagischem Flux mit Bafilomycin A1 nach siNRP-2
beziehungsweise siVEGF-C. Der Versuch erfolgte dreimal voneinander unabhängig. (B)
Darstellung des berechneten autophagischen Flux nach densitometrischer Auswertung der
Western Blots nach dreifach unabhängigen Versuchen wie in (A) gezeigt. Dargestellt sind die
Mittelwerte mit Standardfehler. Die Mittelwerte wurden mit dem t-Test (Welch) verglichen, pWerte relativ zur Kontrolle. (C) Western Blots von drei unabhängigen Ansätzen für den
autophagischen Flux nach Transfektion mit siNRP-2 beziehungsweise siVEGF-C und
Bestrahlung mit 2 Gy. Angegeben sind die Differenzen der Bandenintensitäten von
Bafilomycin-behandelten Zellen und deren Kontrolle nach densitometrischer Auswertung
normalisiert zur jeweiligen unbestrahlten Kontrolle.
47
4.3 Untersuchungen zum Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Strahlenresistenz
beeinflussende zelluläre und molekulare Prozesse
Im Ergebnis konnte nicht geklärt werden, ob und wie NRP-2 und VEGF-C die Autophagie
unter Bestrahlung regulieren. Da aber in den unbestrahlten Proben nachgewiesen werden
konnte, dass eine Verminderung des VEGF-C-Gehaltes signifikant zur Reduktion der
Autophagie führte, sollte im Weiteren getestet werden, ob Autophagie unabhängig von
VEGF-C zu einer Veränderung der Strahlenresistenz von PC-3-Zellen führt.
Um die Autophagie zu blockieren, wurde ATG5, welches ein wichtiges Protein zur
Autophagieinduktion ist, mittels siRNA-Transfektion herunter reguliert. In Abbildung 13A ist
die erfolgreiche siATG5-Transfektion dokumentiert und in Abbildung 13B ist zu erkennen,
dass durch siATG5-Transfektion der autophagische Flux vermindert wurde. Nach siATG5Transfektion wurde ein Koloniebildungsassay durchgeführt. Die blockierte Autophagie hatte
keinen signifikanten Effekt auf die Klonogenität von PC-3-Zellen (p = 0,3, t-Test (Welch)).
Abbildung 13: Einfluss der Autophagie auf die Klonogenität von PC-3 unter
Bestrahlung. (A) Die Effektivität der Transfektion mit siATG5 wurde mittels Western Blot auf
Proteinebene nachgewiesen. (B) Western Blot für den autophagischen Flux nach
Transfektion mit siATG5. (C) Klonogenes Überleben nach siRNA-Transfektion gegen ATG5.
Mittelwerte mit Standardfehler, n = 3. Kurvenanpassung nach dem Linear-QuadratischenModell, verglichen mit dem F-Test. Dazugehörige Plattierungseffizienzen bei 0 Gy ohne
Normalisierung, t-Test (Welch), p-Wert relativ zur Kontrolle.
4.3.2
Einfluss von VEGF-C auf die Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen
Die Ergebnisse der Koloniebildungsassays haben gezeigt, dass VEGF-C zum klonogenen
Überleben der Zellen beiträgt. Um zu untersuchen, ob VEGF-C dabei an der Reparatur der
strahleninduzierten DNA-Doppelstrangbüche beteiligt ist, wurden die residuellen γH2AX-Foci
48
4 Ergebnisse
Abbildung 14: Ergebnis des γH2AX-Foci-Assays. PC-3-Zellen wurden mit siVEGF-C
transfiziert und mit 0/4/6 Gy bestrahlt. 24 h nach Bestrahlung wurden die residuellen Foci
gezählt. Für jede Bedingung wurden 100 Zellkerne randomisiert und ausgewertet. (A)
Berechnete korrigierte Anzahl residueller γH2AX-Foci. Boxplots mit 5- und 95%-Perzentilen
dreier unabhängig voneinander durchgeführter Versuche (n = 3, 300 ausgewertete
Zellkerne). Parallel lief zu einem der Ansätze eine Probe unbehandelter Zellen mit (Wt,
Wildtyp) (n = 1, 100 ausgewertete Zellkerne). Die Mediane wurden mit dem Mann-WhitneyU-Test verglichen. ***, p ≤ 0,0001. n.s., nicht signifikant. (B) Repräsentative
fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der γH2AX-Foci (grün) mit Zellkernen (blau) nach
Transfektion und 0/4/6 Gy. (C) Repräsentative fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der
γH2AX-Foci (grün) mit Zellkernen (blau) von PC-3- und FaDu-Wildtyp-Zellen.
49
4.3 Untersuchungen zum Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Strahlenresistenz
beeinflussende zelluläre und molekulare Prozesse
nach
siRNA-Transfektion
gegen
VEGF-C
und
Bestrahlung
mit
4 Gy
und
6 Gy
beziehungsweise ohne Bestrahlung ausgewertet.
Die Bestrahlung der PC-3-Zellen führte zu einem hochsignifikanten Anstieg (p ≤ 0,0001) der
residuellen γH2AX-Foci. Eine Veränderung der Anzahl der DNA-Doppelstrangbrüche durch
VEGF-C wurde jedoch nicht beobachtet (Abbildung 14A und B). Da bereits bei den nicht
bestrahlten Kontrollproben (siSCR) die Foci-Anzahl relativ hoch war, wurde mit einem Ansatz
unbehandelter Zellen (Wildtyp) überprüft, ob die Transfektion mit siSCR bereits einen DNAschädigenden Effekt hatte. Auch die Wildtyp-Zellen zeigten einen ungewöhnlich hohen
Grundwert von etwa 20 Foci pro Zellkern. Daher wurde zum weiteren Vergleich die in
unserer Arbeitsgruppe für den γH2AX-Foci-Assay gut etablierte FaDu-Zelllinie (eine humane
Pharynxkarzinomzelllinie) genutzt. Im Ergebnis ist ein deutlicher Unterschied in der Anzahl
der DNA-Doppelstrangbrüche in PC-3- und FaDu-Zellkernen zu erkennen Abbildung 14C.
Die Aufnahme der FaDu-Zellkerne entspricht der von Menegakis et al. (2009)
veröffentlichten Ergebnissen. Es kann daher angenommen werden, dass das Auszählen der
Foci im Versuch mit PC-3 korrekt war.
4.3.3
Der Einfluss von VEGF-C auf den Zellzyklus
Da sich die Strahlensensibilität innerhalb der Zellzyklen verändert, wurde untersucht, ob
VEGF-C
zu
einer
Verschiebung
der
Zellzyklusphasen
führt.
Tatsächlich
konnte
nachgewiesen werden, dass relativ zur siSCR-transfizierten Kontrolle signifikant mehr
siVEGF-C-transfizierte PC-3-Zellen einen G2/M-Arrest eingingen (p = 0,04, t-Test (Welch)).
Wurden die transfizierten Zellen bestrahlt, bestand dieser G2/M-Arrest auch noch 72 h nach
Bestrahlung signifikant (p = 0,013, t-Test (Welch)) (Abbildung 15).
50
4 Ergebnisse
Abbildung 15: Zellzyklusanalyse mit PC-3. 48 h nach Transfektion mit siVEGF-C wurden
die Zellen mit 4 Gy bestrahlt. (A) 4/8/12/24/48/72 h nach Bestrahlung wurden die Zellzyklen
der unterschiedlich behandelten Zellen analysiert. Für jeden Zeitpunkt sind die Mittelwerte
von 3 unabhängigen Versuchen mit Standardfehlern für die jeweiligen Zellzyklusphasen
dargestellt. (B) Darstellung der Mittelwerte mit Standardfehlern für 0 Gy + 4 h sowie 0/4 Gy +
72 h. Die Mittelwerte wurden mit dem t-Test (Welch) verglichen.
Im Gegensatz zu PC-3 zeigte DU145 nach Transfektion keine Unterschiede in der
Zellzyklusverteilung (Abbildung 16).
51
4.4 Inhibierung der Aktivierung von Akt durch Nelfinavir
Abbildung 16: Zellzyklusanalyse mit DU145. 48 h nach Transfektion mit siVEGF-C wurden
die Zellen mit 4 Gy bestrahlt. (A) 4/8/12/24/48/72 h nach Bestrahlung wurden die Zellzyklen
der unterschiedlich behandelten Zellen analysiert. Für jeden Zeitpunkt sind die Mittelwerte
von 3 unabhängigen Versuchen mit Standardfehlern für die jeweiligen Zellzyklusphasen
dargestellt. (B) Darstellung der Mittelwerte mit Standardfehlern für 0 Gy + 4 h sowie 0/4 Gy +
72 h. Die Mittelwerte wurden mit dem t-Test (Welch) verglichen.
4.4
Inhibierung der Aktivierung von Akt durch Nelfinavir
Die in dieser Arbeit durchgeführten Versuche basieren unter anderem auf den
Schlussfolgerungen
von
Prostatakarzinomzelllinien
Muders
nach
et
al.
(2009),
H2O2-induziertem
wonach
das
oxidativen
Zellüberleben
Stress
über
von
den
VEGF-C/NRP-2/Akt-Signalweg vermittelt wird.
Nach den in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnissen wird das klonogene Überleben abhängig
von der untersuchten Zelllinie zwar über VEGF-C und auch über NRP-2 vermittelt, jedoch
nicht generell über den von Muders et al. (2009) beschriebenen Signalweg. Da in der
Zelllinie PC-3 eine PTEN-Mutation vorliegt, wodurch Akt konstitutiv aktiviert ist (Grünwald et
al., 2002) und bekannt ist, dass die Aktivierung von Akt zur Strahlenresistenz führt (Gupta et
al., 2002), sollte für PC-3 weitergehend untersucht werden, ob mit einer Blockade der AktAktivierung eine Strahlensensibilisierung erreicht werden kann. Hierfür wurde der bereits bei
52
4 Ergebnisse
HIV-Patienten
verwendete
Wirkstoff
Nelfinavir
strahlensensibilisierender
Effekte
in
verschiedenen
wachstumsverzögernden
Effektes
in
vivo
sowie
aufgrund
vielversprechender
Tumormodellen
der
bereits
in
gezeigten
vitro,
des
klinischen
Anwendbarkeit bei Darmkrebspatienten ausgewählt (Gupta et al., 2005, 2007; Jiang et al.,
2007; Kimple et al., 2010; Hill et al., 2016).
4.4.1
Einfluss von Nelfinavir auf die Klonogenität in vitro
In der Literatur finden sich für PC-3 unterschiedliche Erkenntnisse in Bezug auf eine
Erhöhung beziehungsweise Verringerung der Phosphorylierung von Akt nach Bestrahlung
(Potiron et al., 2013; Zhu et al., 2013). In dem in Abbildung 17A gezeigten Ergebnis der
eigenen Untersuchungen sind beide Tendenzen zu erkennen. In zwei von drei Ansätzen
stieg die Akt-Aktivierung in PC-3 10 min nach der Bestrahlung mit 6 Gy an. Der Versuch
wurde wie in Abschnitt 4.2.1 beschrieben durchgeführt. Da aus diesem und aus dem
Versuch aus Abschnitt 4.2.1 bereits bekannt ist, dass die Ergebnisse nur schlecht
reproduzierbar sind, sollte dennoch getestet werden, ob mit einer Blockade der AktPhosphorylierung PC-3-Zellen strahlensensibilisiert werden können.
Um den Einfluss von pAkt auf die Klonogenität der Zellen in vitro untersuchen zu können,
wurde zunächst bestimmt, nach welcher Dauer der Inkubation mit 10 µmol/l Nelfinavir die
Akt-Phosphorylierung maximal inhibiert wird. Die Zellen wurden für 1/2/4/8/24 h inkubiert.
Der Western Blot in Abbildung 17B zeigt, dass nach 1 h die Akt-Phosphorylierung an Ser473
maximal blockiert war. Daher wurde der Koloniebildungsassay nach 1 h Nelfinavir-Inkubation
durchgeführt. Es zeigte sich, dass Nelfinavir nur einen geringen Effekt auf die Klonogenität
der PC-3-Zellen hat. Trotz des geringen Effekts war das klonogene Überleben nach
Bestrahlung und Nelfinavir-Behandlung signifikant höher im Vergleich zu den ausschließlich
bestrahlten Zellen (p = 0,02, t-Test (Welch)) (Abbildung 17C). Die Behandlung mit Nelfinavir
allein ergab keine signifikante Veränderung der Plattierungseffizienz, sodass angenommen
werden kann, dass die Substanz zu keinen relevanten zytotoxischen Effekten in vitro führt.
53
4.4 Inhibierung der Aktivierung von Akt durch Nelfinavir
Abbildung 17: Blockade der Akt-Aktivierung und dessen Einfluss auf die Klonogenität.
(A) Western Blots von PC-3-Zellen (Wildtyp), 10 min nach Bestrahlung mit 6 Gy, dreifach
unabhängig wiederholt. Angegeben sind die pAkt/Akt-Verhältnisse nach densitometrischer
Auswertung der Bandenintensitäten. (B) Western Blot für pAkt (S473) und β-Actin und für
Akt und β-Actin nach Inkubation mit Nelfinavir (Darstellung zusammengefasst aus
ursprünglich je einem Western Blot, siehe Anhang Abbildung A1). Für die semiquantitative
Auswertung wurden die Verhältnisse pAkt/Akt berechnet, wobei jeder Wert zuvor in Relation
zum dazugehörigen β-Actin-Wert gesetzt wurde. Angegeben sind die Bandenintensitäten
nach densitometrischer Auswertung relativ zur Kontrolle (DMSO Behandlung). (C)
Klonogenes Überleben von PC-3 nach Inkubation mit 10 µmol/l Nelfinavir beziehungsweise
dessen Lösungsmittel DMSO für 1 h. Das Medium wurde kurz vor Bestrahlung gewechselt.
Mittelwerte mit Standardfehler, n = 3. Kurvenanpassung nach dem Linear-QuadratischenModell, verglichen mit dem F-Test. Dazugehörige Plattierungseffizienzen bei 0 Gy ohne
Normalisierung, t-Test (Welch), p-Wert relativ zur Kontrolle.
4.4.2
Tumorwachstumsverzögerung
In der Literatur werden unterschiedliche in vitro- und in vivo-Ergebnisse für die Kombination
Bestrahlung
und
Nelfinavir-Behandlung
von
Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom-
und
Lungenkarzinomzellen beschrieben. Hierbei wurden in Koloniebildungsassays in vitro
geringe, bei den Tumorvolumen-basierten Assays in vivo hingegen aber deutlich höhere
Effekte beobachtet (Pore et al., 2006). Trotz des in den eignen Versuchen ebenfalls
gezeigten geringen Effektes in vitro (Abschnitt 4.4.1) wurden aufgrund der Erkenntnisse von
Pore et al. (2006) zusätzliche in vivo-Experimente durchgeführt.
Zuerst wurde mittels Bestimmung der Tumorwachstumsverzögerung in vivo getestet, ob
Nelfinavir die Proliferation von PC-3-Zellen beeinflusst. Hierfür wurde die mediane Zeit
54
4 Ergebnisse
berechnet, die der Tumor benötigte, um das 2- bis 5-fache des Ausgangsvolumens zu
erreichen. Wie in Abbildung 18 dargestellt, kam es zu einer geringen Verlängerung der
Tumorwachstumszeiten, welche aber nicht signifikant war (die p-Werte liegen zwischen 0,2
und 0,4, Mann-Whitney-U-Test).
Abbildung 18: Tumorwachstumszeiten nach Behandlung mit Nelfinavir. Relative
Tumorvolumen
von
PC-3-Xenografts
nach
Behandlung
mit
Nelfinavir
(80 mg/kg Körpergewicht). Mediane mit Quartilen.
55
4.4 Inhibierung der Aktivierung von Akt durch Nelfinavir
4.4.3
Lokale Tumorkontrolle
Im Anschluss an die Bestimmung der Tumorwachstumsverzögerung nach NelfinavirBehandlung wurde der Einfluss von Nelfinavir auf die lokale Tumorkontrolle untersucht. Die
Daten für die Nachbeobachtung sind in Tabelle 13 zusammengefasst.
Tabelle 13: Nachbeobachtungsdaten für die lokale Tumorkontrolle. Nachbeobachtung
der Tiere, die mit Nelfinavir oder dessen Trägersubstanz Wasser und fraktionierte
Bestrahlung über 6 Wochen behandelt wurden.
Behandlung
Anzahl lokal
kontrollierter
Tumore/Anzahl
auswertbarer
Tumore
Anzahl
zensierter Tiere
(Zeitpunkt der
Zensur in
Tagen)
Anzahl ausgeschlossener Tiere
aufgrund Todes
vor Tag 20 nach
Behandlung
95 % der
Rezidive vor
Tag/letztes
Rezidiv erfasst
an Tag
Nelfinavir + 30 Gy
1/10
1 (29)
2
80
Nelfinavir + 40 Gy
1/11
4 (31-41)
1
78
Nelfinavir + 50 Gy
2/11
3 (36-122)
0
122
Nelfinavir + 60 Gy
1/13
9 (20-101)
2
85
Nelfinavir + 72,5 Gy
2/10
7 (22-129)
0
134
Nelfinavir + 85 Gy
2/11
7 (26-124)
0
76
Nelfinavir + 100 Gy
6/12
3 (33-134)
0
36
Nelfinavir + 120 Gy
5/9
2 (57-155)
1
55
Gesamt Nelfinavir + IR
20/87
36 (20-155)
6
122/134
Wasser + 30 Gy
1/12
0 (-)
0
52/57
Wasser + 40 Gy
1/11
3 (27-52)
1
103
Wasser + 50 Gy
2/13
3 (54-68)
1
97
Wasser + 60 Gy
2/12
6 (45-146)
2
143
Wasser + 72,5 Gy
3/11
6 (36-162)
0
73
Wasser + 85 Gy
4/11
5 (41-176)
0
96
Wasser + 100 Gy
3/10
3 (43-76)
1
64
Wasser + 120 Gy
3/12
9 (22-140)
0
-
Gesamt Wasser + IR
19/92
35 (22-176)
5
106/143
Die Bestimmung der lokalen Tumorkontrolle ergab keinen Unterschied zwischen NelfinavirBehandlung kombiniert mit fraktionierter Bestrahlung und alleiniger fraktionierter Bestrahlung
(Abbildung 19) (p = 0,9). Die statistische Auswertung ergab für die TCD50 der Nelfinavir + IRGruppe eine Bestrahlungsdosis von 68,8 Gy (95 %-Konfidenzintervall: 50,8 Gy - 91,9 Gy)
und für die Kontrollgruppe 64,6 Gy (95 %-Konfidenzintervall: 54,8 Gy - 83,4 Gy).
56
4 Ergebnisse
Abbildung 19: Lokale Tumorkontrolle nach fraktionierter Bestrahlung in Kombination
mit Nelfinavir. Beobachtete lokale Tumorkontrollraten (Symbole) und berechnete
Tumorkontrollwahrschenlichkeiten (TCP) nach Behandlung mit Nelfinavir (80 mg/kg
Körpergewicht) beziehungsweise dessen Trägersubstanz Wasser und Bestrahlung mit 30
Fraktionen innerhalb von 6 Wochen. Die Fehlerbalken geben das 95 %-Konfidenzintervall
der TCD50 an.
57
5 Diskussion
5.1
VEGF-C- und NRP-2-Expression und -Herunterregulierung
Für die Versuche wurden Zelllinien mit unterschiedlich hoher VEGF-C- und NRP-2Expression benötigt und anhand von Literaturdaten ausgewählt. Li et al. (2005) zeigten, dass
PC-3 im Vergleich zu DU145 und LNCaP die höchste VEGF-C-Expression auf mRNA- und
Proteinebene aufweist. Die VEGF-C-mRNA-Expression in DU145 betrug 66 % der
Expression in PC-3 (Li et al., 2005) und war damit deutlich höher als in den DU145-Zellen,
die in dieser Arbeit hier verwendet wurden (nur 12 % der Expression in PC-3). Die Angaben
von Li et al. (2005) zur VEGF-C-Expression in LNCaP sind mit den hier vorliegenden Daten
vergleichbar. Aufgrund des sehr geringen VEGF-C-Gehaltes wurde LNCaP für verschiedene
Versuche humanes rekombinantes VEGF-C zugesetzt, um den Einfluss von VEGF-C auf die
Strahlensensibilität untersuchen zu können.
Für die NRP-2-Expression hingegen haben sich größere Unterschiede zu den Literaturdaten
ergeben. Blanc et al. (2011) fanden auf mRNA-Ebene einen deutlich geringeren NRP-2Gehalt in LNCaP im Vergleich zu den NRP-2-Gehalten in PC-3 und DU145, welche in der
gleichen Größenordnung lagen. Hingegen erkannten Goel et al. (2012) auf Proteinebene
eine Korrelation zwischen der NRP-2-Expression und dem negativen PTEN-Status in den
untersuchten Zelllinien sowie in Prostatatumorgewebe. Demzufolge würde DU145, welches
funktionelles PTEN aufweist (Grünwald et al., 2002), weniger NRP-2 exprimieren als LNCaP.
Dies ist in den in dieser Arbeit untersuchten Zelllinien jedoch nicht der Fall. Bei den hier
verwendeten DU145-Zellen war eine Herunterregulierung von NRP-2 mittels siRNATransfektion effektiv möglich, im Gegensatz dazu für LNCaP aufgrund des zu geringen
NRP-2-Gehaltes nicht. Die hohe NRP-2-Expression in PC-3 stimmt hingegen mit den Werten
von Goel et al. (2012) überein.
5.2
Der Einfluss von VEGF-C auf die Strahlenresistenz
Nach Yang et al. (2006) ist die Expression von VEGF-C im Prostatatumorgewebe relativ zum
umgebenden Normalgewebe signifikant erhöht und nimmt mit fortschreitendem Stadium zu.
Patientenstudien mit Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus und Blasenkarzinomen
zeigten eine Korrelation zwischen erhöhten VEGF-C-Gehalten und einer schlechteren
Überlebensrate nach Resektion (Tanaka et al., 2010) beziehungsweise tendenziell nach
Resektion und Strahlentherapie (Keck et al., 2015). Dies kann zum einen durch eine höhere
Strahlenresistenz bei Tumoren mit erhöhtem VEGF-C-Gehalt bedingt sein, zum anderen
wäre der Effekt aber auch durch eine höhere Aggressivität solcher Tumoren im Sinne einer
59
5.3 Die Funktion von NRP-2 als Co-Rezeptor für VEGF-C bei der Vermittlung von
Strahlenresistenz
stärkeren Invasivität und frühzeitigen Metastasierung erklärbar. In einer von unserer
Arbeitsgruppe veröffentlichten Patientenstudie mit resezierten und anschließend bestrahlten
Prostatatumoren konnte dieser Zusammenhang ebenfalls festgestellt werden (Haberlau et
al., 2014). In dieser Studie wurde ein häufigeres biochemisches Rezidiv (PSA,
prostataspezifisches Antigen) für Tumoren mit VEGF-C-Überexpression beobachtet. Auch
hier könnte ein biochemisches Rezidiv durch Metastasen oder durch ein Lokalrezidiv
hervorgerufen werden. Somit liegt insgesamt ein Einfluss von VEGF-C auf die
Strahlenresistenz nahe.
Die
in
dieser
Arbeit
erhaltenen
Ergebnisse
der
Koloniebildungsassays
nach
Herunterregulierung von VEGF-C in PC-3 und DU145 beziehungsweise nach Zugabe von
humanem rekombinanten VEGF-C zu LNCaP unterstützen die oben genannten klinischen
Daten und bestätigen eine VEGF-C-vermittelte Strahlenresistenz in vitro.
5.3
Die Funktion von NRP-2 als Co-Rezeptor für VEGF-C bei der Vermittlung von
Strahlenresistenz
Muders et al. (2009) haben in Prostatakarzinomzelllinien nach H2O2-induziertem oxidativen
Stress festgestellt, dass VEGF-C die Signale zum Zellüberleben über den Co-Rezeptor
NRP-2
transduziert.
In
den
in
der
hier
vorliegenden
Arbeit
durchgeführten
Bestrahlungsversuchen kann jedoch ein genereller Einfluss der NRP-2-Signaltransduktion
auf das Zellüberleben nicht bestätigt werden. Die Koloniebildungsassays mit PC-3 und
DU145 ergaben gegensätzliche Ergebnisse dahingehend, dass in PC-3 NRP-2 signifikant
zur Strahlensensibilität und in DU145 signifikant zur Strahlenresistenz beitrug.
In den bereits unter 5.2 erwähnten Patientenstudien zum Blasenkarzinom von Keck et al.
(2015) beziehungsweise innerhalb der Studie zum Prostatakarzinom (Haberlau et al., 2014)
wurde neben VEGF-C auch der Einfluss von NRP-2 auf die Strahlenresistenz untersucht
(bislang unveröffentlichte Daten). In diesen beiden Studien konnte kein signifikanter
Zusammenhang festgestellt werden.
Diese Resultate führen zu der Annahme, dass der Einfluss von NRP-2 auf die VEGF-Cvermittelte Strahlenresistenz abhängig von der Zelllinie oder dem jeweiligen Tumorgewebe
sein könnte. Verantwortlich hierfür könnten die Interaktion von NRP-2 als Co-Rezeptor mit
VEGFR-2 und die Verfügbarkeit von VEGFR-2 und -3 sein.
Favier et al. (2006) und Gray et al. (2008) zeigten, dass NRP-2 das Zellüberleben in
mikrovaskulären
Endothelzellen
beziehungsweise
in
kolorektalen
Karzinomzelllinien
vermittelt, dies jedoch über unterschiedliche nachgeschaltete Signalweiterleitung. Im ersten
Fall interagierte NRP-2 mit VEGFR-2 und VEGFR-3, im zweiten Fall mit VEGFR-1 (Favier et
60
5 Diskussion
al., 2006; Gray et al., 2008). Da Untersuchungen zufolge in Prostatatumorgewebe kein
VEGFR-1 exprimiert ist (Goel et al., 2012), wird im Folgenden Bezug auf VEGFR-2 und
VEGFR-3 genommen.
Nach der Induktion von VEGF-C bildet dessen Rezeptor VEGFR-3 entweder ein Homodimer
oder mit VEGFR-2 ein Heterodimer (Deng et al., 2015). Als Co-Rezeptor von VEGFR-2
erhöht NRP-2 die Zellantwort durch Verstärkung der VEGF-C-VEGFR-Bindung (Favier et al.,
2006). Somit scheint eine Funktion von NRP-2 für die VEGF-C-vermittelte Strahlenresistenz
in DU145 plausibel.
Im Gegensatz zu der Erkenntnis von Favier et al. (2006) wurde aber auch gezeigt, dass die
Blockade von NRP-2 die VEGFR-Aktivierung (Caunt et al., 2008) und die Signalweiterleitung
nur geringfügig vermindert (Deng et al., 2015). Dass in PC-3 die Herunterregulierung von
NRP-2 jedoch eine erhöhte Strahlenresistenz zur Folge hat, kann mit den eben
beschriebenen Zusammenhängen nicht erklärt werden. Hierfür müssen andere Signalwege
in Betracht gezogen werden. NRP-2 ist nicht nur Co-Rezeptor für VEGFR-2, sondern auch
Co-Rezeptor für sekretierte Semaphorine der Klasse 3 (Sema3) (Tamagnone et al., 1999).
Für Ovarial- und Prostatatumoren konnte von Jiang et al. (2015) und Yacoub et al. (2009)
gezeigt werden, dass die Sema3A-Expression mit früheren pathologischen Stadien korreliert
und höhere Sema3A-Gehalte eine bessere Prognose bedeuten. In verschiedenen
Prostatakarzinomzelllinien sind Semaphorine, deren Rezeptoren – die Plexine – und
Neuropiline (NRP-1 und NRP-2) co-exprimiert (Blanc et al., 2011). PC-3 weist von allen
Semaphorinen der Klasse 3 mehr auf als DU145; die Gehalte von Plexinen der Gruppe A,
welche mit den Neuropilinen assoziieren (Yoshida, 2012), weisen kaum Unterschiede auf
(Blanc et al., 2011). Die Ergebnisse der hier vorliegenden Arbeit zeigten außerdem einen
höheren NRP-2-Gehalt in PC-3 als in DU145. Möglicherweise könnte in PC-3 der Signalweg
über die Semaphorine der Klasse 3 bevorzugt gegenüber dem Signalweg über VEGFR-2
ablaufen und somit zu einer gegensätzlichen Zellantwort führen. Diese Hypothese muss
jedoch mit Vorsicht betrachtet werden, da sich in der Literatur bislang keine Hinweise dazu
finden lassen, ob Semaphorine das Zellüberleben nach Bestrahlung beeinflussen.
Weitere Untersuchungen in dieser Arbeit sollten zeigen, wie die Strahlenresistenz in
Prostatakarzinomzelllinien vermittelt wird. Hierbei wurde teilweise nur für VEGF-C betrachtet,
da NRP-2 in Abhängigkeit der untersuchten Zelllinie eine unterschiedliche Wirkung auf die
Strahlenresistenz hatte.
61
5.4 VEGF-C-abhängige Akt- und ERK1/2-Regulierung unter Bestrahlung
5.4
VEGF-C-abhängige Akt- und ERK1/2-Regulierung unter Bestrahlung
In der Literatur sind größtenteils Ergebnisse zu finden, in denen in unterschiedlichen
Zelllinien (darunter PC-3) 10 min bis hin zu 24 h nach der Bestrahlung die Akt-Aktivierung
induziert wird (Contessa et al., 2002; Edwards et al., 2002; Sunavala-Dossabhoy et al., 2004;
Albert et al., 2006; Zhu et al., 2013). In den in der hier vorliegenden Arbeit beschriebenen
Versuchen wurde in den PC-3 und DU145 Kontrollen (siSCR) 24 h nach Bestrahlung
ebenfalls ein – jedoch nicht signifikanter – Anstieg von pAkt (Ser473) gezeigt. Die
entsprechenden Ergebnisse nach VEGF-C- beziehungsweise NRP-2-Herunterregulierung
waren jedoch nicht reproduzierbar, weshalb die Versuchsbedingungen analog zu den in
verschiedenen Publikationen beschriebenen Bedingungen verändert wurden. Diese
Versuche ergaben gegensätzliche Ergebnisse. Hierbei kam es durch Bestrahlung nach
10 min in PC-3 und in DU145 zu einer nicht signifikanten Abschwächung der Akt-Aktivierung.
Dieses Resultat entspricht dem von Potiron et al. (2013), welche die gleichen Zelllinien unter
ähnlichen Bedingungen untersuchten.
Ebenso wie für Akt sind auch für ERK1/2 unterschiedliche Ergebnisse in der Literatur
bezüglich der Aktivierung nach Bestrahlung zu finden. Yacoub et al. (2003) beispielsweise
beschrieben eine rasche Zunahme von pERK1/2 nach Bestrahlung in DU145, aber eine
Abnahme in LNCaP. In der hier vorliegenden Arbeit konnte für PC-3 und für DU145 eine
nicht signifikante Abnahme der ERK1/2-Aktivierung nach Bestrahlung gezeigt werden.
Im Gegensatz zu den eben erwähnten Autoren schlussfolgerten Huang et al. (2014) aus
ihren Versuchen mit der Zervixkarzinomzelllinie HeLa, dass Bestrahlung möglicherweise die
Akt- und ERK-Phosphorylierung vermindern kann, jedoch beobachteten sie gleichzeitig eine
Hochregulierung des VEGF/VEGFR-2-Signalwegs, der zur Strahlenresistenz führte.
Die in der hier vorliegenden Arbeit gewonnenen und den in Publikationen veröffentlichten
Ergebnisse veranschaulichen die diffizil erfassbare und unterschiedliche Regulierung von
Akt. Die hier gezeigten Untersuchungsergebnisse lassen vermuten, dass die ursprünglich
vermutete strahleninduzierte und VEGF-C-vermittelte Aktivierung von Akt in PC-3 und
DU145 nicht stattfindet.
5.5
Der Einfluss der Autophagie auf die Strahlenresistenz
In weiteren Experimenten sollten mögliche zelluläre und molekulare Prozesse ermittelt
werden, über die VEGF-C Strahlenresistenz vermittelt. Ein Mechanismus der hierbei
untersucht wurde, ist die Autophagie. Diese kann durch Bestrahlung induziert werden und
das
Zellüberleben
fördern,
was
unter
anderem
für
Brust-,
Kopf-Hals-,
und
Leberkarzinomzelllinien in vitro und für Lungenkarzinomzellen in vivo festgestellt wurde (Kim
62
5 Diskussion
et al., 2008; Chaachouay et al., 2011; Chen et al., 2011; Tseng et al., 2011). Für
Prostatakarzinomzelllinien, u.a. PC-3 und DU145, konnte bisher gezeigt werden, dass
Autophagie infolge von Stress durch ein Chemotherapeutikum induziert wird (Stanton et al.,
2013b) und zur Stressresistenz (Schutz vor Apoptose) gegenüber dem verwendeten
Chemotherapeutikum führte (Stanton et al., 2013a). Die Autophagie wurde dabei über die
VEGF-C/NRP-2-Achse, jedoch nicht über Akt vermittelt (Stanton et al., 2013b).
In den hier vorliegenden Ergebnissen konnte nachvollzogen werden, dass in den PC-3Zellen nach VEGF-C-Herunterregulierung signifikant und nach NRP-2-Herunterregulierung
nicht signifikant weniger Autophagie ablief. Jedoch hatte die Blockade der Autophagie durch
Inhibierung von ATG5 mittels siRNA keinen Effekt auf das klonogene Überleben. Hieraus
kann geschlussfolgert werden, dass die Strahlenresistenz zwar über VEGF-C vermittelt,
jedoch nicht durch die Induktion von Autophagie erreicht wird. Entsprechend konnte auch
keine klare Regulierung der Autophagie durch VEGF-C unter Bestrahlung nachgewiesen
werden.
5.6
Der Einfluss von VEGF-C auf die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur
Ein weiterer Mechanismus, der auf einen Einfluss von VEGF-C unter Bestrahlung untersucht
wurde, ist die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur. Im Gegensatz zu dem in der Literatur
beschriebenen fördernden Einfluss von VEGF-C auf die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur
in normalen Lymphendothelzellen (Kesler et al., 2014), konnte hier in den Zellen mit
blockierter VEGF-C-Expression keine signifikante Veränderung in der Anzahl der residuellen
γH2AX-Foci festgestellt werden.
Das Ergebnis ist kritisch zu betrachten, denn bereits die Anzahl residueller γH2AX-Foci in
den unbehandelten Zellen war mit rund 20 Foci pro Zellkern auffallend hoch. Zu diesem
Sachverhalt gibt es in der Literatur gegensätzliche Angaben. So veröffentlichten ErbaykentTepedelen et al. (2014) für die Zelllinie PC-3, dass rund 80 % der ausgewerteten Zellen
keine und rund 20 % maximal 30 Foci pro Zellkern aufwiesen. Hingegen konnte in den in der
hier vorliegenden Arbeit untersuchten Zellen kein Zellkern ohne Foci ermittelt werden.
Potiron et al. (2013) zeigten weiterhin, dass PC-3-Zellen 24 h nach Bestrahlung im Mittel nur
rund 6 Foci pro Zellkern hatten. Eine Erklärung für die unterschiedliche Foci-Anzahl könnte
sein, dass im eigenen Versuch eventuell eine höhere Passagenzahl der untersuchten Zellen
zum Zeitpunkt vor dem Anlegen des Kryostocks vorlag. Eine hierzu vergleichende Angabe
findet sich in der Literatur allerdings nicht. Banáth et al. (2004) und Mirzayans et al. (2006)
zeigten, dass in p53-defizienten Zellen die residuellen γH2AX-Foci auch längere Zeit als in
normalen Zellen persistieren können. Da PC-3 ebenfalls p53-negativ ist, besteht die
Möglichkeit, dass die DNA-Doppelstrangbrüche mit höherer Passage zunehmen.
63
5.7 Der Einfluss von VEGF-C auf den Zellzyklus
5.7
Der Einfluss von VEGF-C auf den Zellzyklus
Die Zellzyklusanalyse ergab, dass sowohl die Transfektion mit VEGF-C-siRNA als auch die
Bestrahlung in PC-3-Zellen einen G2/M-Arrest zur Folge haben. Während dieser Arrest in
den nicht bestrahlten transfizierten Zellen nach 72 h wieder aufgehoben war, bestand der
strahleninduzierte G2/M-Arrest weiterhin in den bestrahlten transfizierten Zellen. Da Zellen in
der G2/M-Phase am strahlensensibelsten sind (Pawlik und Keyomarsi, 2004), wird hier eine
Korrelation
mit
dem
Ergebnis
aus
dem
Koloniebildungsassay,
in
dem
der
strahlensensibilisierende Effekt der VEGF-C-Blockade nachgewiesen wurde, angenommen.
Dagegen zeigte die Zellzyklusanalyse mit DU145 keine Unterschiede zwischen transfizierten
Zellen und der Kontrolle. Somit kann vermutet werden, dass ein potentieller Mechanismus
der VEGF-C-vermittelten Strahlenresistenz die Aufhebung des G2/M-Arrests sein könnte,
dies aber abhängig von der untersuchten Zelllinie ist. Möglicherweise besteht hier eine
Abhängigkeit zum VEGFR-2-Gehalt der Zellen, wie folgende Ausführung zeigt.
Die dargestellten Ergebnisse zur Zelllinie PC-3 sind konform zu den Erkenntnissen von
Huang et al. (2014). Diese zeigten für die Zervixkarzinomzelllinie HeLa, dass eine
VEGF/VEGFR-2-Blockade zum G2/M-Arrest führt und dass der durch VEGF/VEGFR-2 nach
Bestrahlung beschleunigte Ablauf des Zellzyklus unabhängig von Akt ist (Huang et al.,
2014). Konkret auf VEGF-C bezogen sich Michaelsen et al. (2016) und wiesen eine
reduzierte Proliferation nach Herunterregulierung von VEGF-C von VEGFR-2-positiven
Glioblastomkarzinomzellen in vitro und in vivo nach. Diese korrelierte mit dem G2/M-Arrest
und der über VEGF-C induzierten Apoptose.
In der Literatur lassen sich hierzu auch gegensätzliche Erkenntnisse finden, bei denen
VEGF-C zu einem erhöhten G2/M-Arrest führt (Kesler et al., 2014). Dies wurde jedoch für
normale Lymphendothelzellen beschrieben. Hieraus lässt sich eventuell ein interessanter
Therapieansatz ableiten, bei dem in Abhängigkeit von den Zelleigenschaften ein G2/M-Arrest
durch VEGF-C-Blockade erreicht und damit die Wirksamkeit der Bestrahlung erhöht werden
könnte.
Weiterhin zeigten Kesler et al. (2014), dass die Lymphendothelzellen nach Zusatz von
VEGF-C 20 Stunden nach Bestrahlung mit 4 Gy und 8 Gy vermehrt γH2AX-Foci aufwiesen.
In den in dieser Arbeit gezeigten Ergebnissen konnte jedoch trotz des G2/M-Arrests kein
Einfluss von VEGF-C auf die DSB-Reparatur festgestellt werden. Mögliche Gründe hierfür
wurden bereits im Abschnitt 5.6 diskutiert.
Deckbar et al. (2007) zeigten, dass ein G2/M-Arrest aufgehoben wird, sobald nur noch rund
20 γH2AX-Foci pro Zelle verbleiben. Es ergibt sich daher die Hypothese, dass ein höherer
VEGF-C-Gehalt zur Anhebung dieser Toleranz und so zur Strahlenresistenz beiträgt.
64
5 Diskussion
5.8
Der Einfluss von Nelfinavir auf das Wachstum und auf die Strahlenresistenz von
PC-3-Zellen in vitro und in vivo
Für die Untersuchungen zum Einfluss von Nelfinavir auf das Wachstum und die
Strahlenresistenz in vitro und in vivo wurde die Zelllinie PC-3 verwendet. Für diese Zelllinie
ist aus der Literatur bekannt, dass Nelfinavir in vitro die Akt-Aktivierung inhibiert (Yang et al.,
2005). Für andere Tumorentitäten wurde in vivo ebenfalls eine erfolgreiche Akt-Inhibierung
gezeigt (Gupta et al., 2005).
In den in dieser Arbeit durchgeführten Versuchen hatte Nelfinavir ohne Bestrahlung trotz
Blockade der Akt-Aktivierung nur einen geringen und nicht signifikanten Effekt auf das
klonogene Überleben in vitro beziehungsweise auf das Tumorwachstum in vivo. Mathur et al.
veröffentlichten 2014 vergleichbare Untersuchungsergebnisse zum Einfluss von Nelfinavir
auf das Überleben und das Tumorwachstum von Prostatakarzinomzelllinien, darunter PC-3
und LNCaP C4-2B. Hierbei wurde zwar ein anderes Behandlungsschema als in dieser Arbeit
angewendet, sie fanden aber ebenfalls eine nicht signifikante Inhibierung des Zellüberlebens
in vitro und keinen signifikanten Einfluss auf das Tumorwachstum in vivo. In der Studie von
Yang et al. (2005) hingegen hatte Nelfinavir eine signifikante Wachstumsverzögerung von
Xenografts der Prostatakarzinomzelllinie LNCaP zur Folge. Diese wurde sogar durch eine im
Vergleich zu dieser Arbeit geringere Dosis und kürzere Anwendungsdauer von Nelfinavir
erreicht. Innerhalb des gleichen Datensatzes zeigten Yang et al. (2005) außerdem, dass
Nelfinavir
auch die Proliferation von DU145
in vitro
inhibiert. DU145
ist
eine
Prostatakarzinomzelllinie, deren Akt nicht konstitutiv aktiviert ist – im Gegensatz zu den
Zelllinien LNCaP und PC-3 (Grünwald et al., 2002). Jedoch war der Effekt in DU145 geringer
als in PC-3 und LNCaP, wobei letztere am stärksten auf Nelfinavir ansprach (Yang et al.,
2005).
Aus den nach dem Linear-Quadratischen-Modell berechneten Kurvenverläufen des
Koloniebildungsassays wäre abzuleiten, dass Nelfinavir in Kombination mit der Bestrahlung
zum signifikant verbesserten klonogenen Überleben von PC-3-Zellen, das heißt zu einer
Steigerung der Strahlenresistenz, führt (siehe Abbildung 17C). Dies erscheint aber fraglich,
da der Unterschied zwischen den Gruppen trotz der statistischen Signifikanz extrem gering
ist.
Da für Zelllinien verschiedener Tumorentitäten bekannt ist, dass Nelfinavir allein einen eher
geringeren Effekt hat, aber vor allem in vivo, mehr als in vitro, strahlensensibilisierend wirkt
(was auf Mikromilieu-Effekte im Tumor zurückgeführt wurde) (Pore et al., 2006; Jiang et al.,
2007; Zeng et al., 2011), wäre in dem in dieser Arbeit durchgeführten Tierversuch mit
kombinierter Therapie ein strahlensensibilisierender Effekt von Nelfinavir zu erwarten
65
5.8 Der Einfluss von Nelfinavir auf das Wachstum und auf die Strahlenresistenz von PC-3Zellen in vitro und in vivo
gewesen. Dies konnte jedoch nicht bestätigt werden. Nelfinavir verbesserte den kurativen
Effekt der Bestrahlung nicht.
Aus
verschiedenen
zusammengefasst,
Veröffentlichungen
dass
die
durch
wurde
Nelfinavir
von
Bernstein
blockierte
und
Dennis
Akt-Aktivierung
(2008)
und
die
Strahlensensibilität nicht immer korrelieren. Der Erfolg der Nelfinaviranwendung kombiniert
mit Bestrahlung steht also nicht nur in Abhängigkeit von der Funktionalität des PI3K/AktSignalweges, sondern auch von weiteren zellulären Mechanismen, die durch Nelfinavir
beeinflusst werden können. Nelfinavir greift neben dem PI3K/Akt-Signalweg in eine Reihe
anderer Signalwege ein. So inhibiert Nelfinavir beispielsweise STAT3 (signal transducer and
activator of transcription 3), ERK1/2, den Androgen Rezeptor und Bcl-2 (Ikezoe et al., 2004;
Yang et al., 2005, 2006b), welche sonst zur Strahlenresistenz einer Zelle beitragen (Gilbert
et al., 1996; Cho et al., 2002; Wang et al., 2006; Yin et al., 2011b; Polkinghorn et al., 2013).
Nelfinavir bewirkt außerdem eine Herunterregulierung von VEGF und HIF1α (hypoxiainducible factor 1- α), was grundsätzlich sekundär zur Akt-Inhibierung erfolgen könnte (Pore
et al., 2006). Dadurch werden weniger nicht funktionelle Blutgefäße gebildet, was eine
verstärkte Oxigenierung des Tumors und eine Strahlensensibilisierung zur Folge hat (Pore et
al.,
2006). Weiterhin induziert
Nelfinavir
Stressreaktionen des Endoplasmatischen
Retikulums, welche zur Strahlensensibilisierung führt (Isohashi et al., 2008). Durch diesen
wird einerseits Apoptose eingeleitet (Gills et al., 2007; Brüning et al., 2010, 2012; Guan et
al., 2012), andererseits wird auch überlebensfördernde Autophagie induziert (Gills et al.,
2007; Brüning et al., 2010; Guan et al., 2012; Johnson et al., 2015).
Nelfinavir greift gemäß dieser Veröffentlichungen also in verschiedene überlebensfördernde
und -hemmende Signalwege ein, welche in den verschiedenen Tumorzellen unterschiedlich
stark exprimiert sind. Möglicherweise wäre eine Vorhersage über den Erfolg einer
Nelfinavirbehandlung auch in Kombination mit einer Bestrahlung nach Bewertung der
Expression der Zielmoleküle für die jeweiligen Tumorzellen möglich und sinnvoll. Hierzu
müssten zuvor Versuche durchgeführt werden, in denen eine mögliche Korrelation zwischen
den Signalwegexpressionen und der Wirkung von Nelfinavir untersucht werden.
Da sich in dieser Arbeit für die Zelllinie PC-3 herausgestellt hat, dass Nelfinavir keinen
strahlensensibilisierenden Effekt hat, könnten einerseits Versuche zur Definition von
potentiellen Biomarkern für die Wirksamkeit von Nelfinavir angestrebt werden, andererseits
auch Experimente zur Kombination mit Chemotherapeutika. Die Kombination von Nelfinavir
mit Radiochemotherapie wurde bereits in klinischen Phase I-Studien mit einer akzeptablen
Toxizität und vielversprechendem Ansprechen auf die Therapie für Pankreas-, Rektal- und
Lungenkarzinomen durchgeführt (Brunner et al., 2008; Rengan et al., 2012; Buijsen et al.,
2013).
66
5 Diskussion
5.9
Schlussfolgerung und Ausblick
Zusammenfassend betrachtet wurden folgende neue Erkenntnisse aus den Versuchen
gewonnen:
(1) VEGF-C vermittelt in allen drei untersuchten Prostatakarzinomzelllinien (PC-3, DU145,
LNCaP) Strahlenresistenz.
(2) NRP-2 führt in Abhängigkeit von der Zelllinie zur Strahlenresistenz (DU145) oder
Strahlensensibilisierung (PC-3).
(3) VEGF-C beeinflusst in bestrahlten oder unbestrahlten PC-3- und in DU145-Zellen weder
die Akt- noch die ERK1/2-Aktivierung.
(4) In unbestrahlten PC-3-Zellen fördert VEGF-C die Autophagie, NRP-2 jedoch nicht. Unter
Bestrahlung ist ein Effekt beider Proteine nicht reproduzierbar nachweisbar. In PC-3 hat
Autophagie keinen Einfluss auf das klonogene Überleben nach Bestrahlung.
(5) VEGF-C hat in PC-3 keinen Einfluss auf die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur.
(6) Eine Verminderung des VEGF-C-Gehalts führt in PC-3 zum G2/M-Arrest; in DU145
konnte kein Effekt beobachtet werden.
(7) Die
Blockade
von
Akt
durch
Nelfinavir
führt
in
PC-3-Xenografts
zu
keiner
Tumorwachstumsverzögerung und wirkt in vitro und in vivo nicht strahlensensibilisierend.
In den Versuchen konnte gezeigt werden, dass VEGF-C Strahlenresistenz vermittelt. Dies
könnte als ein Forschungsansatz zur Entwicklung einer kombinierten Therapie aus VEGF-CBlockade und Bestrahlung dienen. Die Blockade von VEGF-C könnte hierfür weitergehend in
vivo mit Prostatakarzinomzelllinien und transplantiertem Tumormaterial aus Patienten
getestet werden. Hierbei sollte auch die Untersuchung der Zellen bezüglich eines G2/MArrests zur weiteren Klärung, in welchem Umfang VEGF-C über diesen Mechanismus
Strahlenresistenz vermittelt, im Focus stehen.
In Bezug auf das Ergebnis (2) sollten weiterführende Untersuchungen zum Einfluss von
NRP-2 auf die Strahlenresistenz erfolgen. Hierbei wäre vor allem Rolle von Semaphorinen
der Klasse 3 zu klären.
Die in der vorliegenden Arbeit erhaltenen Ergebnisse aus den Versuchen mit Nelfinavir
sowie die diesbezüglichen Erkenntnisse aus bereits genannten Veröffentlichungen lassen
den Schluss zu, dass Tumorzellen unterschiedlich stark auf Nelfinavir reagieren. Da
Nelfinavir in eine Reihe von Signalwegen eingreift, welche das Zellüberleben fördern oder
hemmen, sollte weiter geklärt werden, ob Tumorzellen mit einem bestimmten genetischen
Profil besser auf die Behandlung mit Nelfinavir ansprechen.
In der hier durchgeführten Tierstudie wurde erstmals der Endpunkt lokale Tumorkontrolle in
vivo nach kombinierter Therapie von Nelfinavir und Bestrahlung getestet. Hierbei zeigte sich,
dass Nelfinavir
67
in PC-3-Xenografts für
diesen klinisch relevanten Endpunkt der
5.9 Schlussfolgerung und Ausblick
Strahlentherapie zu keinem Vorteil führt. Die Untersuchungen zur lokalen Tumorkontrolle
sollten jedoch für andere Tumormodelle fortgeführt werden, da, wie in Abschnitt 2.5 bereits
ausgeführt, andere in vivo-Studien mit anderen Tumorentitäten gezeigt haben, dass die
Kombination von Nelfinavir und Bestrahlung zumindest zur Tumorwachstumsverzögerung
führt.
68
6 Zusammenfassung
Hintergrund
Die Strahlentherapie ist neben der radikalen Prostatektomie eine Standardtherapie zur
Behandlung von Prostatatumoren und führt zu sehr guten Ergebnissen für die lokale
Tumorkontrolle und für das Überleben. Allerdings ist, wie bei der Operation auch, dabei das
Risiko eines Rezidivs für fortgeschrittene Tumoren im Gegensatz zu Tumoren in früheren
Stadien relativ hoch. Daher besteht eine hohe Dringlichkeit zur Verbesserung der
Strahlentherapie vor allem bei fortgeschrittenen Tumoren. Ein Ansatz hierfür ist die
Kombination der Bestrahlung mit molekularen Therapien. Ziel dabei ist es, bestimmte
Zielproteine zu blockieren, um die Strahlensensibilität der Prostatakarzinomzellen zu
erhöhen. Ein potentielles Target könnte hierbei die Blockade des VEGF-C/NRP-2/AktSignalwegs (VEGF-C – vascular endothelial growth factor C; NRP-2 – Neuropilin 2; Akt –
Proteinkinase B) sein. Im Prostatakarzinom sind die Konzentrationen von VEGF-C und
NRP-2 im Vergleich zu normalen Prostatazellen erhöht. Aus Untersuchungen ist bekannt,
dass beide Proteine eine progressive Wirkung auf die Tumorgenese haben. In Vorarbeiten
zeigen Muders et al. (2009) zudem eine Aktivierung von Akt über die VEGF-C/NRP-2-Achse
und eine darüber vermittelte Resistenz gegenüber oxidativem Stress durch H2O2. Akt wirkt in
verschiedenen Tumorentitäten außerdem protektiv gegenüber Bestrahlung. Es besteht die
Annahme, dass dies auch für Prostatakarzinomzellen gilt.
Zielstellung
Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob und über welchen Mechanismus VEGF-C,
NRP-2 und Akt die Strahlenresistenz in Prostatakarzinomzelllinien beeinflussen.
Methoden
Es wurden in vitro- und in vivo-Experimente in den humanen Prostatakarzinomzelllinen
PC-3, DU145, LNCaP sowie in PC-3-Xenografts durchgeführt. Der Einfluss von VEGF-C und
NRP-2
auf
die
Strahlenresistenz
wurde
in
vitro
nach
Herunterregulierung
der
entsprechenden Gene mittels siRNA beziehungsweise nach Supplementierung mit
humanem rekombinanten VEGF-C in Koloniebildungsassays untersucht. Zur Ermittlung des
Einflusses von VEGF-C und von NRP-2 auf mögliche Zellüberlebensmechanismen wurden
der autophagische Flux nach Blockade der Autophagie mit Bafilomycin A1 mittels Western
Blot, die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur mittels Quantifizierung der γH2AX Foci sowie
die Zellzyklusverteilung mittels Durchflusszytometrie untersucht. Die Signalweiterleitung von
69
6 Zusammenfassung
VEGF-C über Akt sowie, als weitere Möglichkeit, die Signalweiterleitung über ERK1/2
wurden nach siRNA-Transfektion mit und ohne Bestrahlung mittels Western Blot geprüft.
Weitere Versuche zu Akt erfolgten in vitro und in vivo mit dem PI3K/Akt-Inhibitor Nelfinavir in
PC-3-Zellen. Der in vitro-Effekt von Nelfinavir auf die Strahlenresistenz wurde dabei mithilfe
eines Koloniebildungsassays nach Behandlung der Zellen mit 10 µM Nelfinavir getestet. In
vivo wurde die Wirkung von Nelfinavir ohne sowie in Kombination mit Bestrahlung in PC-3Xenografts in Nacktmäusen untersucht. Für die Bestimmung der Tumorwachstumszeit
wurden die Mäuse mit 80 mg Nelfinavir/kg Körpergewicht 30 mal innerhalb von 6 Wochen
behandelt. In einem weiteren Versuch wurde die lokale Tumorkontrolle bei gleichzeitiger
fraktionierter
Bestrahlung
mit
Gesamtdosen
von
30
bis
120 Gy
und
einer
Nachbeobachtungszeit von 180 Tagen bestimmt.
Ergebnisse
Die Untersuchungen zur Strahlenresistenz über den VEGF-C/NRP-2/Akt-Signalweg haben
ergeben, dass in den drei Prostatakarzinomzelllinien PC-3, DU145 und LNCaP VEGF-C
signifikant Strahlenresistenz vermittelt. Für NRP-2 hingegen wurde festgestellt, dass es in
Abhängigkeit von der Zelllinie entweder zur Strahlenresistenz (DU145) oder zur
Strahlensensibilisierung (PC-3) führt. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass durch VEGF-C in
PC-3 und DU145 weder über Akt noch über ERK1/2 Strahlenresistenz vermittelt wird.
Die Versuche zu Strahlenresistenz vermittelnden Mechanismen ergaben, dass VEGF-C in
unbestrahlten PC-3-Zellen die Autophagie fördert, NRP-2 jedoch nicht. Unter Bestrahlung
war ein Effekt von VEGF-C und NRP-2 auf die Autophagie nicht reproduzierbar nachweisbar.
Ein weiterer Versuch hat gezeigt, dass in PC-3 Autophagie keinen Einfluss auf das
klonogene Überleben nach Bestrahlung hat. Außerdem wurde festgestellt, dass VEGF-C in
PC-3 die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur nicht beeinflusst. Darüber hinaus wurde
nachgewiesen, dass eine Verminderung des VEGF-C-Gehalts in PC-3 zum G2/M-Arrest
führt. In DU145 konnte jedoch kein Effekt beobachtet werden.
In den Untersuchungen zum Einfluss von Akt auf die Strahlenresistenz unabhängig von
VEGF-C und NRP-2 wirkte Nelfinavir inhibierend auf die Akt-Phosphorylierung am Ser473
und beeinflusste das klonogene Überleben von PC-3-Zellen minimal. In PC-3-Xenografts
führte Nelfinavir zu keiner Tumorwachstumsverzögerung und wirkte in vitro und in vivo nicht
strahlensensibilisierend.
Schlussfolgerung
In den Versuchen konnte gezeigt werden, dass VEGF-C in Prostatakarzinomzellen
Strahlenresistenz vermittelt. Diese Erkenntnis könnte als ein Forschungsansatz zur
70
6 Zusammenfassung
Entwicklung einer kombinierten Therapie aus VEGF-C-Blockade und Bestrahlung dienen.
Ein potentieller Mechanismus, über den VEGF-C die Strahlenresistenz vermittelt, ist, in
Abhängigkeit von der Zelllinie, die Aufhebung des G2/M-Arrests.
NRP-2 wirkt in der Vermittlung von Strahlenresistenz beziehungsweise -sensibilität je nach
Zelllinie unterschiedlich. Hierzu sollten weitere Untersuchungen bezüglich möglicher
Interaktionen innerhalb anderer Signalwege mit strahlensensibilisierendem Einfluss erfolgen.
Innerhalb des untersuchten Signalwegs konnte weiterhin festgestellt werden, dass VEGF-C
Strahlenresistenz nicht über Akt vermittelt.
Die vorliegende Arbeit enthält die erste Studie sowohl zur Untersuchung des Einflusses von
Nelfinavir in Kombination mit Bestrahlung auf das Überleben von Prostatakarzinomzellen in
vitro als auch auf die Tumorwachstumszeit und die lokale Tumorkontrolle in vivo. Hierin
konnte keine strahlensensibilisierende Wirkung von Nelfinavir nachgewiesen werden. Da
Nelfinavir in Zellen anderer Tumorentitäten strahlensensibilisierend wirkt und außerdem
bekannt ist, dass es in eine Reihe von Signalwegen eingreift, die das Zellüberleben fördern
oder hemmen, sollte weiter geklärt werden, ob Tumorzellen mit einem bestimmten
genetischen Profil besser auf die Behandlung mit Nelfinavir ansprechen.
71
7 Abstract
Background
In addition to radical prostatectomy, radiotherapy is a standard therapy for the treatment of
prostate tumours and leads to good results for local tumour control and survival. However, as
with the resection, the risk of recurrence for advanced tumours is relatively high compared to
tumours in earlier stages. Therefore, there is a high urgency to improve radiotherapy
especially for advanced stages. One approach is the combination of irradiation with
molecular therapies. The aim is to block certain target proteins to increase the
radiosensitivity of the prostate carcinoma cells. A potential target could be the blockade of
the VEGF-C/NRP-2/Akt signalling pathway (VEGF-C – vascular endothelial growth factor C;
NRP-2 – neuropilin 2; Akt – protein kinase B). In prostate cancer the concentrations of
VEGF-C and NRP-2 are increased compared to normal prostate cells. Studies have shown
that both proteins have a progressive effect on tumourigenesis. In preliminary work Muders
et al. (2009) also showed the activation of Akt via the VEGF-C/NRP-2 axis and a resistance
to H2O2 induced oxidative stress. Akt also has a protective effect against irradiation in various
tumour entities. It is assumed that this also applies to prostate carcinoma cells.
Aim of the study
Within the framework of this thesis, it was investigated whether and via which mechanism
VEGF-C, NRP-2, and Akt affect the radioresistance in prostate carcinoma cell lines.
Methods
In vitro and in vivo experiments were performed in the human prostate carcinoma cell lines
PC-3, DU145, LNCaP, as well as in PC-3 xenografts. The influence of VEGF-C and NRP-2
on the radioresistance was examined in vitro after knock down of the corresponding genes
using siRNA or after supplementation with human recombinant VEGF-C in colony formation
assays. In order to determine the influence of VEGF-C and NRP-2 on possible cell survival
mechanisms, the autophagic flux was examined after the blockade of autophagy with
bafilomycin A1 using western blot, the DNA double strand break repair by quantification of
the γH2AX foci, and the cell cycle distribution by flow cytometry. The signal transduction of
VEGF-C via Akt as well as, as a further possibility, the signal transduction via ERK1/2 were
tested after siRNA transfection with and without irradiation using western blot. Further
experiments on Akt were performed in vitro and in vivo with the PI3K/Akt inhibitor nelfinavir in
PC-3 cells. The in vitro effect of nelfinavir on radioresistance was tested using a colony
72
7 Abstract
formation assay after treatment of the cells with 10 μM nelfinavir. In vivo, the effect of
nelfinavir without and in combination with irradiation in PC-3 xenografts was investigated in
nude mice. For the determination of the tumour growth time, the mice were treated with
80 mg nelfinavir/kg body weight 30 times within 6 weeks. In a further experiment, the local
tumour control was determined with simultaneous fractionated irradiation with total doses of
30 to 120 Gy and a follow-up time of 180 days.
Results
The investigations on radioresistance via the VEGF-C/NRP-2/Akt signalling pathway showed
that in the three prostate carcinoma cell lines PC-3, DU145, and LNCaP VEGF-C
significantly mediates radioresistance. For NRP-2 however, it was found that, depending on
the cell line, it either leads to radioresistance (DU145) or radiosensitization (PC-3). Further, it
was shown that in PC-3 and DU145 VEGF-C does not mediate radioresistance via Akt or
ERK1/2.
The experiments on radioresistance mediating mechanisms revealed that VEGF-C promotes
autophagy in untreated PC-3 cells, but NRP-2 does not. Under irradiation, an effect of
VEGF-C and NRP-2 on autophagy could not be detected reproducibly. A further experiment
has shown that in PC-3 autophagy has no influence on the clonogenic survival after
irradiation. In addition, it was found that VEGF-C does not affect the DNA double strand
break repair in PC-3. Furthermore, it was shown that a reduction in the VEGF-C content
leads to a G2/M arrest in PC-3. However, no effect could be observed in DU145.
In studies regarding the influence of Akt on radioresistance independent of VEGF-C and
NRP-2, nelfinavir inhibited Akt phosphorylation at Ser473 and minimally affected the
clonogenic survival of PC-3 cells. In PC-3 xenografts, nelfinavir did not lead to any tumour
growth delay and did not have a radiosensitizing effect in vitro or in vivo.
Conclusion
In the experiments, it was shown that VEGF-C mediates radioresistance in prostate cancer
cells. This finding could serve as a research approach for the development of a combined
therapy of a VEGF-C blockade and irradiation. A potential mechanism by which VEGF-C
mediates radioresistance is the reverse of the G2/M arrest, depending on the cell line.
NRP-2 acts differently in the mediation of radioresistance or radiosensitivity, depending on
the cell line. On this, further investigations should be carried out with regard to possible
interactions within other signalling pathways with a radiosensitizing influence. Within the
investigated signalling pathway, it was further shown that VEGF-C does not mediate
radioresistance via Akt.
73
7 Abstract
The present work contains the first study examining the effect of nelfinavir in combination
with irradiation on prostate cancer cell survival in vitro as well as on growth time and local
tumour control in vivo. Herein no radiosensitizing effects of nelfinavir could be detected.
Since nelfinavir radiosensitizes cells of other tumour entities and is also known to interfere
with a series of signalling pathways that promote or inhibit cell survival, it should be clarified
whether tumour cells with a particular genetic profile are more responsive to treatment with
nelfinavir.
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9 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Signaltransduktion von VEGF-C. ....................................................................... 7
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Autophagie. ..................................................... 11
Abbildung 3: Strukturformeln von Nelfinavir und dessen Hauptmetabolit M8. ....................... 15
Abbildung 4: VEGF-C- und NRP-2-Expressionen in den Zelllinien PC-3, DU145 und
LNCaP. ............................................................................................................ 39
Abbildung 5: Herunterregulierung von VEGF-C und NRP-2 in PC-3 und DU145. ................. 40
Abbildung 6: Koloniebildungsassays von PC-3, DU145 und LNCaP nach Veränderung
des VEGF-C-Status. ........................................................................................ 41
Abbildung 7: Koloniebildungsassays von PC-3 und DU145 unter verminderter NRP-2Expression. ...................................................................................................... 42
Abbildung 8: Einfluss von NRP-2 und VEGF-C auf die Phosphorylierung von Akt unter
Bestrahlung (24 h). .......................................................................................... 43
Abbildung 9: Einfluss von VEGF-C auf die Phosphorylierung von Akt unter Bestrahlung
(10 min). .......................................................................................................... 44
Abbildung 10: Einfluss von VEGF-C auf die Phosphorylierung von ERK1/2 unter
Bestrahlung...................................................................................................... 45
Abbildung 11: LC3-II-Bestimmung mittels Western Blot. ....................................................... 46
Abbildung 12: Autophagischer Flux in PC-3 nach siRNA-Transfektion gegen NRP-2 und
VEGF-C ohne und mit Bestrahlung mit 2 Gy. ................................................... 47
Abbildung 13: Einfluss der Autophagie auf die Klonogenität von PC-3 unter Bestrahlung. ... 48
Abbildung 14: Ergebnis des γH2AX-Foci-Assays. ................................................................ 49
Abbildung 15: Zellzyklusanalyse mit PC-3. ........................................................................... 51
Abbildung 16: Zellzyklusanalyse mit DU145. ........................................................................ 52
Abbildung 17: Blockade der Akt-Aktivierung und dessen Einfluss auf die Klonogenität. ....... 54
Abbildung 18: Tumorwachstumszeiten nach Behandlung mit Nelfinavir. .............................. 55
Abbildung 19: Lokale Tumorkontrolle nach fraktionierter Bestrahlung in Kombination mit
Nelfinavir. ......................................................................................................... 57
Abbildung A1: Western Blot für pAkt (S473) und β-Actin und für Akt und β-Actin nach
Inkubation von PC-3-Zellen mit Nelfinavir. ....................................................... 93
89
10 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Verwendete Zelllinien ...........................................................................................17
Tabelle 2: Verwendete Reagenzien und Substanzen ...........................................................17
Tabelle 3: Verwendete Kits ...................................................................................................19
Tabelle 4: Verwendete primäre Antikörper............................................................................19
Tabelle 5: Verwendete sekundäre Antikörper .......................................................................20
Tabelle 6: Verwendete siRNAs .............................................................................................20
Tabelle 7: Verwendete Primer ..............................................................................................20
Tabelle 8: Verwendete Materialien und Hilfsmittel ................................................................20
Tabelle 9: Verwendete Geräte ..............................................................................................21
Tabelle 10: Verwendete Software .........................................................................................22
Tabelle 11: Zellzahlen und Volumina für die siRNA-Transfektion .........................................23
Tabelle 12: Zusammensetzung der Gele für die SDS-PAGE ................................................27
Tabelle 13: Nachbeobachtungsdaten für die lokale Tumorkontrolle. ..................................... 56
Tabelle A1: Einzelwerte der VDT-Tumoren. .........................................................................93
90
Danksagung
An erster Stelle möchte ich mich bei Prof. Mechthild Krause bedanken, die mir die
Möglichkeit gegeben hat, an diesem interessanten Thema zu arbeiten. Ich danke Prof.
Mechthild Krause und PD Dr. Michael H. Muders sehr für ihre wertvollen Anregungen, die
konstruktiven Diskussionen und die stetige Unterstützung während der Anfertigung dieser
Arbeit.
Dorothee Pfitzmann und Pia Hönscheid möchte ich für ihre große Unterstützung, vor allem
bei der Einarbeitung in mir neue Analyseverfahren, danken.
Dorothee Pfitzmann, Dr. Annett Linge und Dr. Ina Kurth danke ich weiterhin für die
Durchführung spezieller Versuche, die ich nicht selbst durchführen konnte.
Bei den Tierversuchen habe ich große Unterstützung von Katja Schumann, Elisabeth Jung
und Anne Kluske erhalten. Vielen Dank dafür. Ohne euch wären diese Versuche nicht
durchzuführen gewesen.
Bei Dr. Lydia Koi und PD Dr. Steffen Löck möchte ich mich für die statistische Auswertung
der Tierversuche bedanken. PD Dr. Steffen Löck hat mich zusätzlich bei Fragen zur
statistischen Auswertung diverser in vitro-Versuche beraten, was äußerst hilfreich war.
Dr. Cläre von Neubeck danke ich für die Unterstützung bei der Auswertung der γH2AX-Foci
und für ihre stets konstruktiven Ratschläge.
Für die Finanzierung des Projekts danke ich der Wilhelm-Sander-Stiftung. Die Finanzierung
der Endphase meines Promotionsstudiums erfolgte über ein Stipendium, für das ich der
Graduiertenakademie, die aus Mitteln der Exzellenzinitiative des Bundes und der Länder
finanziert wird, danken möchte.
Sehr herzlich möchte ich mich auch bei meiner Familie für ihre stetige Unterstützung und
Motivation, vor allem auch in den schwierigeren Phasen meiner Arbeit, bedanken. Meinem
Mann gilt dabei außerdem mein Dank für seine Beratung bei der Anwendung spezieller
Software, die mir die Recherchearbeit und die Anfertigung von Abbildungen deutlich
erleichtert hat.
92
Anhang
Tabelle A1: Einzelwerte der VDT-Tumoren. Einzelne Volumenverdopplungszeiten (in
Tagen) von n = 5 Mäusen pro Transplantationskohorte.
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Transplantationskohorte I
9,79
6,16
11,02
10,25
6,39
Transplantationskohorte II
10,26
8,98
10,33
10,34
13,75
Transplantationskohorte III
14,48
6,31
11,16
12,54
8,40
Abbildung A1: Western Blot für pAkt (S473) und β-Actin und für Akt und β-Actin nach
Inkubation von PC-3-Zellen mit Nelfinavir.
93
Anhang
Anlage 1
Technische Universität Dresden
Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus
Promotionsordnung vom 24. Oktober 2014
Erklärung zur Eröffnung des Promotionsverfahrens
1. Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und
ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden
Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht.
2. Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des
Manuskripts habe ich Unterstützungsleistungen von folgenden Personen erhalten:
Frau Prof. Dr. med. habil. Mechthild Krause, Herr PD Dr. med. Michael H. Muders, Frau Dr.
rer. nat. Cläre von Neubeck, Frau Dr. rer. medic. Lydia Koi, PD Dr. rer. nat. Steffen Löck.
3. Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht
beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe eines kommerziellen Promotionsberaters in
Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte
Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten
Dissertation stehen.
4. Die Arbeit wurde bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form
einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
5. Die Inhalte dieser Dissertation wurden in folgender Form veröffentlicht:
i)
Haberlau S, Hönscheid P, Jimenez R E, Baretton G B, Tindall D J, Datta K, Krause
M, Muders M H (2014). VEGF-C induziert Strahlenresistenz im Prostatakarzinom
ohne Beteiligung der Autophagie. Vortrag auf der 98. Jahrestagung der Deutschen
Gesellschaft für Pathologie e.V., Berlin.
ii) Haberlau S, Hönscheid P, Jimenez R E, Baretton G B, Tindall D J, Krause M, Datta
K, Muders M H (2015). The Role of Vascular Endothelial Growth Factor C in
Promoting Radioresistance in Prostate Cancer. Poster auf dem American Association
for Cancer Research-Meeting, vorgestellt durch PD Dr. Muders.
iii) Liebscher S, Hönscheid P, Jimenez R, Baretton G, Datta K, Krause M, Muders M
(2016). Strahlensensibilisierung des Prostatakarzinoms durch Blockade von VEGF-C.
8. Symposium der Arbeitsgemeinschaft urologische Forschung, Bonn. Vorgetragen
durch PD Dr. Muders.
iv) Steffi Liebscher, Lydia Koi, Steffen Löck, Michael H. Muders, Mechthild Krause
(2016). The HIV protease and PI3K/Akt inhibitor nelfinavir does not improve the
94
Anhang
curative effect of fractionated irradiation in PC-3 prostate cancer in vitro and in vivo.
Im Druck bei Clinical and Translational Radiation Oncology.
6. Ich bestätige, dass es keine zurückliegenden erfolglosen Promotionsverfahren ab.
7. Ich bestätige, dass ich die Promotionsordnung der Medizinischen Fakultät der
Technischen Universität Dresden anerkenne.
8. Ich habe die Zitierrichtlinien für Dissertationen an der Medizinischen Fakultät der
Technischen Universität Dresden zur Kenntnis genommen und befolgt.
Dresden, 09.01.2017
Unterschrift des Doktoranden
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Anhang
Anlage 2
Hiermit bestätige ich die Einhaltung der folgenden aktuellen gesetzlichen Vorgaben im
Rahmen meiner Dissertation

das
zustimmende
Votum
der
Ethikkommission
bei
Klinischen
Studien,
epidemiologischen Untersuchungen mit Personenbezug oder Sachverhalten, die das
Medizinproduktegesetz betreffen [entfällt]

die Einhaltung der Bestimmungen des Tierschutzgesetzes
Aktenzeichen der Genehmigungsbehörde zum Vorhaben/zur Mitwirkung:
Landesdirektion Sachsen, AZ: 24-9168.11-1/2013-52

die Einhaltung des Gentechnikgesetzes [entfällt]

die Einhaltung von Datenschutzbestimmungen der Medizinischen Fakultät und des
Universitätsklinikums Carl Gustav Carus.
Dresden, 09.01.2017
Unterschrift des Doktoranden
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