Die Septine SEPT4, SEPT5 und SEPT8 in Hirntumoren

Aus dem Zentrum für Kinderheilkunde und Jugendmedizin
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.
Die Septine
SEPT4, SEPT5 und SEPT8
in Hirntumoren
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
vorgelegt 2005
von David Overberg
geboren in Filderstadt
Dekan:
Prof. Dr. med. C. Peters
1. Gutachter:
Prof. Dr. med. B. Zieger
2. Gutachter
Prof. Dr. med. A. Pagenstecher
Jahr der Promotion:
2007
Meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
1.
EINLEITUNG..................................................................................................... 1
1.1. Die Septine ...................................................................................................................................................... 1
1.2. Funktionen der Septine in Hefe .................................................................................................................... 2
1.3. Funktionen der Septine in Fruchtfliegen und anderen Modellorganismen .............................................. 3
1.4. Struktur und Eigenschaften der humanen Septine..................................................................................... 4
1.5. Septine und Neoplasien.................................................................................................................................. 5
1.6. Hirntumoren................................................................................................................................................... 7
1.7. Aufbau und Fragestellung der Arbeit .......................................................................................................... 8
2.
MATERIAL UND METHODEN........................................................................ 10
2.1. Chemikalien.................................................................................................................................................. 10
2.2. Gewebe .......................................................................................................................................................... 10
2.3. In-Situ-Hybridisierung ................................................................................................................................ 12
2.3.1. Grundlagen der nichtradioaktiven In-Situ-Hybridisierung...................................................................... 12
2.3.2. Vorbereitung der Paraffinschnitte ........................................................................................................... 13
2.3.3. Herstellung und nichtradioaktive Markierung von RNA-Sonden ........................................................... 13
2.3.4. Hybridisierung und immunologische Detektion ..................................................................................... 15
2.3.5. Färbereaktion .......................................................................................................................................... 16
2.4. Immunhistochemie....................................................................................................................................... 18
2.4.1. Grundlagen der Immunhistochemie ........................................................................................................ 18
2.4.2. Paraffinschnitte ....................................................................................................................................... 19
2.4.3. Kryostatschnitte ...................................................................................................................................... 20
2.5. Auswertung unter dem Lichtmikroskop.................................................................................................... 20
2.6. Western Blot ................................................................................................................................................. 21
2.6.1. Proteinextraktion ..................................................................................................................................... 21
2.6.2. SDS/ LDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese......................................................................................... 22
2.6.3. Western Blot ........................................................................................................................................... 22
2.6.4. Immunoblotting....................................................................................................................................... 23
3.
ERGEBNISSE ................................................................................................. 25
3.1. Expression des Septins SEPT4 in Hirntumoren ........................................................................................ 25
3.1.1. In-Situ-Hybridisierung und Immunhistochemie...................................................................................... 25
3.1.2. Western Blot ........................................................................................................................................... 30
3.2. Expression des Septins SEPT5 in Hirntumoren ........................................................................................ 32
3.2.1. In-Situ-Hybridisierung und Immunhistochemie...................................................................................... 32
3.2.2. Western Blot ........................................................................................................................................... 37
Inhaltsverzeichnis
II
3.3. Expression des Septins SEPT8 in Hirntumoren ........................................................................................ 39
3.3.1. In-Situ-Hybridisierung und Immunhistochemie...................................................................................... 39
3.3.2. Western Blot ........................................................................................................................................... 44
4.
DISKUSSION .................................................................................................. 46
4.1. Expressionsmuster der Septine in gesundem Gewebe .............................................................................. 46
4.1.1. SEPT4 in gesundem Gewebe .................................................................................................................. 46
4.1.2. SEPT5 in gesundem Gewebe .................................................................................................................. 46
4.1.3. SEPT8 in gesundem Gewebe .................................................................................................................. 47
4.2. Expression der Septine in Hirntumoren .................................................................................................... 48
4.2.1. SEPT4 in Hirntumoren............................................................................................................................ 48
4.2.2. SEPT5 in Hirntumoren............................................................................................................................ 48
4.2.3. SEPT8 in Hirntumoren............................................................................................................................ 49
4.2.4. Weitere Septine in Tumoren ................................................................................................................... 49
4.3. Bedeutung der Septine in der Zytokinese .................................................................................................. 50
4.4. Weitere Ansätze für die Bedeutung von Septinen in Tumorzellen .......................................................... 52
4.5. Expressionsmuster einzelner Spleißvarianten und funktionelle Differenzierung .................................. 54
4.6. Die Septine SEPT4, SEPT5 und SEPT8 als Teil eines Komplexes........................................................... 56
4.7. Septine bei anderen neurologischen Erkrankungen ................................................................................. 57
4.8. Schlussfolgerungen und Ausblick ............................................................................................................... 59
5.
ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................. 61
6.
LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................ 62
7.
ANHANG......................................................................................................... 77
7.1. Chemikalien für die In- Situ- Hybridisierung und Immunhistochemie .................................................. 77
7.2. Chemikalien für den Western Blot ............................................................................................................. 78
8.
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ....................................................................... 79
9.
DANKSAGUNG .............................................................................................. 81
10.
LEBENSLAUF ................................................................................................ 82
Einleitung
1
1. Einleitung
1.1. Die Septine
Die Septine sind eine Gruppe GTP-bindender Proteine, die 1971 in Hefe Saccharomyces
cerevisiae entdeckt wurden [Hartwell 1971]. Dort schrieb man ihnen zunächst Funktionen bei
der Sprossbildung und der Trennung von Mutter- und Tochterzelle zu. Da der Vorgang der
Sprossung für Hefe spezifisch ist, nahm man lange an, dass das Vorkommen der Septine auf
Hefe und andere Pilze beschränkt ist. Erst Jahre später fand man Septine auch in Drosophila
melanogaster [Neufeld and Rubin 1994], Caenorhabditis elegans [Nguyen et al. 2000] und
vielen anderen eukaryotischen Organismen. Auch in Zellen der Maus und des Menschen
wurden Proteine entdeckt, die den Septinen zugeordnet werden konnten [Nottenburg et al.
1990; Nakatsuru et al. 1994]. In den letzten Jahren wurden immer wieder neue humane
Septine bekannt und so stieg deren Anzahl auf derzeit zwölf.
Die Nomenklatur war in den Anfangsjahren nicht einheitlich und deshalb unübersichtlich.
Heute werden die humanen Septine in der Literatur fast ausschließlich nach dem Vorschlag
von Macara et al. [2002] benannt. Die Genloci und die entsprechenden Proteine aus der
Gruppe der humanen Septine erhalten die Bezeichnung SEPT bzw. SEPT und werden
durchnummeriert. Den bei vielen Septinen auftretenden Spleißvarianten wird der Zusatz _v1
etc. angehängt.
Bevor die Septine der Säugetiere und des Menschen näher beschrieben werden, soll erst auf
den Stand der Forschung an S. cerevisiae und D. melanogaster eingegangen werden. Denn
obwohl es in den vergangenen Jahren einen raschen Zuwachs an Daten über
Expressionsmuster und Funktionen der humanen Septine gegeben hat, stammt ein Großteil
des Wissens, insbesondere über funktionelle Zusammenhänge, aus der Forschung mit S.
cerevisiae und anderen Modellorganismen.
Einleitung
2
1.2. Funktionen der Septine in Hefe
Auf der Suche nach Genen, die den Zellzyklus der Hefe S. cerevisiae steuern, entdeckte
Hartwell [1971], dass Mutanten für die „cell-division-cycle“ -Proteine CDC3, CDC10,
CDC11 und CDC12 eine unvollständige Zellteilung aufweisen. Neuere Untersuchungen
zeigen, dass das Fehlen von CDC3 und CDC12 zu einem Zelluntergang führt, während
Mutanten für CDC10 und CDC11 einen milderen Phänotyp aufweisen. Es scheint, dass diese
Septine teilweise durch CDC3 und CDC12 ersetzt werden können [Longtine et al. 1996; Field
and Kellogg 1999].
Wie nehmen die Septine in Hefe diese Funktion bei der Zellteilung wahr? Erste Ansätze für
eine Erklärung lieferte die Entdeckung einer Ringstruktur aus 10nm dünnen Filamenten durch
Byers und Goetsch [1976], die diese elektronenmikroskopisch am Übergang zwischen
Mutterzelle und Spross von S. cerevisiae darstellen konnten. Diese parallelen Filamente sind
mit der Membran assoziiert, erscheinen kurz nach der Sprossbildung und verschwinden vor
der Zytokinese. Bei Mutanten für eines der von Hartwell [1971] beschriebenen CDC-Proteine
konnte diese Ringstruktur nicht gefunden werden. Diese Ergebnisse ließen vermuten, dass der
Ring aus den Filamenten von den Septinen gebildet wird. Weitere Studien konnten diese
These bekräftigen. So konnte später gezeigt werden, dass CDC12 [Haarer and Pringle 1987]
und CDC3 [Kim, H. B. et al. 1991] kolokalisiert zu den Filamenten sind. Eine weitere
bedeutende Entdeckung war, dass die vier Septine nach einer Protein-Aufreinigung
zusammen mit einem später entdeckten fünften Septin, Sep7 [Carroll et al. 1998], in vitro
filamentöse Strukturen bilden, die denen in der Hefe beobachteten gleichen [Frazier et al.
1998].
Die Lokalisation der beschriebenen Ringstruktur im Übergangsbereich zwischen Mutter- und
Tochterzelle sowie das zeitliche Auftreten im Zellzyklus legen - wie auch die oben
beschriebenen Ergebnisse von Hartwell [1971] - eine Bedeutung bei der Zytokinese nahe. Da
Kim et al. [1991] zudem zeigen konnten, dass CDC3 und CDC12 sich schon vor der
Sprossbildung an der entsprechenden Stelle befinden, vermutete man, dass die Septine die
Stelle der bevorstehenden Sprossbildung markieren können. Sie müssten sich zu stabilen
Komplexen zusammenlagern und fest mit der Membran verbunden sein. Ihre Fähigkeit,
Filamente zu bilden, ist dafür möglicherweise von Bedeutung. Wie es zur Bindung an
Einleitung
3
Membranlipide oder Membranproteine kommt, ist noch nicht abschließend geklärt, eventuell
spielt die GTP-Bindungsfähigkeit der Septine dabei eine entscheidende Rolle [Faty et al.
2002].
In diesem Zusammenhang ist auch die Funktion der Septine bei der Ausrichtung und
Aufrechterhaltung der Zellpolarität von S. cerevisiae zu sehen, die seit einigen Jahren
zunehmend im Mittelpunkt der Forschung steht [Faty et al. 2002; Irazoqui and Lew 2004].
Barral et al. [2000] und Takizawa et al. [2000] konnten zeigen, dass die Ringstruktur der
Septine eine Diffusionsbarriere zwischen Mutterzelle und Spross bildet. Der Ring hindert
Membranproteine, die für das Wachstum des Sprosses wichtig sind, daran, vom Spross in die
Membran der Mutterzelle zu gelangen. Dadurch bleibt das Wachstum auf den Spross
beschränkt. Nach der Kernteilung und Verteilung der Zellorganellen kommt es zur Aufteilung
des Septinrings und zur Vollendung der Zellteilung. Ohne die Septinfilamente ist keine
Umstellung auf isotropes Wachstum möglich, daher entstehen verlängerte Sprosse, und eine
Zytokinese findet nicht statt [Faty et al. 2002].
Neben den bereits beschriebenen fünf Septinen in Hefe wurden zwei weitere Proteine dieser
Gruppe identifiziert. Diese Septine SPR3 [Fares et al. 1996] und SPR28 [De Virgilio et al.
1996] haben nach derzeitigem Wissen jedoch keine wesentliche Bedeutung für eine
funktionierende Zellteilung, sondern spielen eine Rolle bei der Sporenbildung.
1.3. Funktionen der Septine in Fruchtfliegen und anderen
Modellorganismen
Die Forschung an den fünf bekannten Septinen der Fruchtfliege D. melanogaster hat wichtige
Erkenntnisse über biochemische Eigenschaften und Funktionen der Septine erbracht. Neufeld
und Rubin [1994] klonierten das erste Septin bei Metazoen. Sie konnten darstellen, dass
dieses membranständige Septin, Pnut, notwendig für eine normale Zytokinese ist.
Homozygote Mutanten für Pnut entwickeln sich bis zum Stadium der Puppe, weisen dann
jedoch viele große, mehrkernige Zellen auf und nehmen einen letalen Verlauf.
Morphologische Auffälligkeiten dieser Mutanten wurden besonders im Gehirn, in den
Lymphknoten und in den Imaginalscheiben beschrieben. Wie schon bei S. cerevisiae bilden
aufgereinigte Septine von D. melanogaster in vitro Komplexe, die sich zu Filamenten mit
Einleitung
4
einer wiederkehrenden Struktur zusammenlagern [Field et al. 1996]. Die Septinkomplexe
bestehen aus Heterotrimeren von Homodimeren und besitzen GTPase-Aktivität. Weitere
Studien legen nahe, dass es bei den Septinen von D. melanogaster eine funktionelle
Differenzierung gibt, da nicht alle Septine in Verbindung mit den Vorgängen der Zellteilung
gefunden werden können. Zudem wird vermutet, dass sich die an der Zytokinese beteiligten
Septine zumindest teilweise gegenseitig ersetzen können [Adam et al. 2000].
In C. elegans werden die beiden bekannten Septine in der Teilungsfurche gefunden und sind
ebenfalls für die Zytokinese erforderlich. Zudem benötigen beide Septine das jeweils andere
für eine adäquate Lokalisation während des Zellzyklus [Nguyen et al. 2000].
Nach diesem Überblick über die Erkenntnisse, insbesondere bei S. cerevisiae und D.
melanogaster, soll nun näher auf die Septine der Säugetieren bzw. des Menschen eingegangen
werden.
1.4. Struktur und Eigenschaften der humanen Septine
Die derzeit zwölf bekannten Septine des Menschen stellen eine Gruppe von Proteinen dar, die
über die Evolution der Wirbeltiere gut erhalten geblieben ist. Den Septinen gemeinsam ist
ihre zentrale GTP-Bindungsdomäne, deren Sequenz bei allen Septinen zu mindestens 58%
ähnlich oder identisch ist. Die GTP-Bindungsdomäne ist gekennzeichnet durch eine „P-loop“Struktur, die charakteristisch für viele GTPasen ist [Kinoshita, M. 2003]. N-terminal der
GTP-Bindungsdomäne befindet sich bei allen bekannten Septinen eine polybasische Region,
die möglicherweise Bindungsstelle für bestimmte Proteine ist [Zhang, J. et al. 1999;
Casamayor and Snyder 2003]. C-terminal der GTP-Bindungsdomäne haben viele, nicht
jedoch alle Septine eine Coiled-Coil-Struktur, die ebenfalls eine beträchtliche Homologie
aufweist. Bei den Septinen SEPT 1, 2, 4, 5 ist dieser Bereich kürzer als bei SEPT 6, 7, 8, 10,
11, und bei SEPT 3, 9, 12 kann keine Coiled-Coil-Domäne gefunden werden. Es wird
vermutet, dass diese Domäne mitverantwortlich ist für die Bildung der Septinkomplexe. Diese
Annahme wird gestützt durch Ergebnisse von Casamayor und Snyder [2003], die zeigen
konnten, dass die Coiled-Coil-Domäne für eine Interaktion der Hefeseptine CDC11 und
CDC3 notwendig ist. Gleiches konnten Sheffield et al. [2003] auch für SEPT6 und SEPT7
darstellen.
Einleitung
5
In den N-und C-terminalen Regionen unterscheiden sich die Septine sowohl in der Länge als
auch in der Sequenz deutlich. Hinzu kommt eine Vielzahl von Spleißvarianten der einzelnen
Septine, deren funktionelle Bedeutung noch weitgehend ungeklärt ist. Die bisher bekannten
Septine haben ein Molekulargewicht von 20-80 kDa.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Struktur der Septine: N = N-Terminus; C = C-Terminus;
PB = Polybasische Domäne; GBD = GTP-Bindungsdomäne; CC = Coiled-Coil-Domäne
1.5. Septine und Neoplasien
Wie beschrieben spielen die Septine in vielen eukaryotischen Organismen eine wichtige Rolle
bei der Zytokinese. Obwohl sich die Vorgänge bei der Zellteilung in Hefe stark von denen in
tierischen Zellen unterscheiden, sind auch hier die Septine beim Ablauf des Zellzyklus von
Bedeutung. Wie bei D. melanogaster [Neufeld and Rubin 1994] konnte nach deren
Entdeckung auch bei Zellen von Säugetieren und Menschen schon bald die Notwendigkeit der
Septine für die Zytokinese gezeigt werden. Kinoshita [1997] konnte darstellen, dass Zellen,
denen zuvor Antikörper gegen SEPT2 injiziert wurden, keine komplette Zellteilung zeigen
und in Folge mehrkernige Zellen aufweisen, die denen bei D. melanogaster gefundenen
gleichen. Auch konnte er eine Interaktion mit Stressfasern feststellen. In den letzten Jahren
folgten viele Studien, die verschiedene Aspekte der Bedeutung der Septine in menschlichem
Gewebe untersuchten. Neben weiteren Erkenntnissen der Vorgänge bei der Zytokinese
wurden verschiedene Funktionen außerhalb dieses Bereiches entdeckt und beschrieben
[Trimble 1999]. Die bisher bekannten Ergebnisse lassen vermuten, dass es auch bei den
menschlichen Septinen eine funktionelle Differenzierung gibt.
Einleitung
Genlocus /
Protein
SEPT1 / SEPT1
6
Akzessionsnummer
Coiled-
Alte
chromosomale
Bezeichnungen
Lokalisation
CoilDomäne
16p11.1
Ja
2q37.3
Ja
22q13.2
Nein
17q23
Ja
22q11.2
Ja
Xq24
Ja
NM 052838
Nedd5,
SEPT2 / SEPT2
NM 004404
Pnutl3,
Diff6,
KIAA0158
SEPT3 / SEPT3
NM 145733
H5,
Bradeion,
Pnutl2,
SEPT4 / SEPT4
NM 004574
ARTS,
MART,
hCDCrel-2
Septin-M
Pnutl,
SEPT5 / SEPT5
NM 002688
SEPT6 / SEPT6
NM 145799
SEPT7 / SEPT7
NM 001788
hCdc10
7p14.2
Ja
SEPT8 / SEPT8
XM 034872
KIAA0202
5q31
Ja
17q25.3
Nein
hCDCrel-1
Sept2
KIAA0128
AF17q25 gene,
MSF,
SEPT9 / SEPT9
AF189713
SepD1,
Ov/Br septin,
Pnutl4
KIAA0991
SEPT10 /
SEPT10
SEPT11 /
SEPT11
SEPT12 /
SEPT12
AF146760
Sep1-like
8q11.23
Ja
NM 018243
FLJ10849
4q21
Ja
NM 144605
FLJ25410
16p13.3
Nein
Tabelle 1: Bisher bekannte humane Septine (nach Hall et al. [2004] und Macara et al. [2002] )
Einleitung
7
Als ein Schwerpunkte der Forschung hat sich die Bedeutung der Septine in Neoplasien
entwickelt [Kartmann and Roth 2001]. Dieses Interesse beruht sowohl auf den bekannten und
vermuteten Funktionen im Zellzyklus, als auch auf spezifischen Expressionsmustern der
Septine in Tumoren und weiteren Verknüpfungen. So konnten verschiedene Septine als
Fusionsproteine des MLL-Proteins identifiziert werden, dem eine große Bedeutung bei akuten
Leukämien nach chromosomalen Translokationen zugeschrieben wird. Als Fusionsproteine
im Leserahmen konnten SEPT5 [Megonigal et al. 1998; Tatsumi et al. 2001], SEPT6
[Borkhardt et al. 2001; Ono et al. 2002; Slater et al. 2002; Kim, H. J. et al. 2003], SEPT9
[Osaka et al. 1999; Taki et al. 1999] und SEPT11 [Kojima et al. 2004] gefunden werden.
Derzeit gibt es verschiedene Erklärungsmodelle zu der Funktion der Septine als
Fusionsproteine bei der Entstehung der MLL-assoziierten akuten Leukämie. Denkbar ist, dass
die Fähigkeit der Septine, Oligomere zu bilden, von Bedeutung ist, da die meisten Modelle
dieser Form der Leukämie eine Regulation des MLL-Proteins durch Dimerisation annehmen
[Ayton and Cleary 2001; Hsu, K. and Look 2003]. Aber auch in anderen Tumoren, darunter
den in dieser Arbeit näher betrachteten Hirntumoren, werden den Septinen Funktionen
zugeschrieben.
1.6. Hirntumoren
Die Tumoren des Nervensystems sind eine Gruppe von Neoplasien sehr unterschiedlichen
Ursprungs. Sie umfasst nach den WHO-Kriterien für die Klassifikation dieser Tumoren neben
denen des neuroepithelialen Gewebes unter anderen auch Tumoren der Meningen, der Hirnund Rückenmarksnerven, Lymphome und Keimzelltumoren [Kleihues et al. 2002].
Für die vorliegende Arbeit wurden nur Tumoren neuroepithelialen Ursprungs gewählt. Bei
den untersuchten Tumoren handelt es sich um Astrozytome WHO I-III, Glioblastome,
Oligoastrozytome WHO II, Ependymome WHO III und primitive neuroektodermale
Tumoren.
Die Tumoren des zentralen Nervensystems sind bei Kindern von besonderer Bedeutung, da
sie die größte Diagnosegruppe aller soliden Tumoren darstellen. Mit knapp über 20% aller
Krebserkrankungen im Kindesalter sind sie nach den Leukämien die zweithäufigsten
Einleitung
8
überhaupt [Kaatsch 2004]. Die mit Hilfe des Kinderkrebsregisters in Mainz ermittelte
Wahrscheinlichkeit für ein Neugeborenes, bis zu seinem 15. Lebensjahr an einem Hirntumor
zu erkranken, liegt bei 43/ 100000 (kumulative Inzidenz) [Kaatsch 2004]. Die häufigsten
Tumoren in dieser Altersgruppe sind in dieser Reihenfolge Astrozytome, primitive
neuroektodermale Tumoren und Ependymome. Bei den Astrozytomen wiederum finden sich
vornehmlich solche mit niedrigerem Malignitätsgrad (WHO I-II), bei den primitiven
neuroektodermalen Tumoren überwiegen Medulloblastome [Kaatsch et al. 2001]. Die
Auswahl der Tumoren in dieser Arbeit umfasst somit auch die wichtigsten Hirntumoren im
Kindesalter.
Nur 68% der an einem Hirntumor erkrankten Kinder leben fünf Jahre nach der
Diagnosestellung noch. Die Überlebenswahrscheinlichkeit bei Hirntumoren hat in den letzten
Jahren zwar zugenommen, bleibt aber weiterhin deutlich geringer als bei anderen kindlichen
Krebserkrankungen [Kaatsch et al. 2001; Kaatsch 2004]. Hinzu kommt noch, dass die
Spätfolgen selbst nach einer erfolgreichen Behandlung von Hirntumoren oft gravierend sind.
Neben direkten Schäden - neurologische Ausfallserscheinungen - durch den Tumor und die
Operation
treten
besonders
nach
Bestrahlung
des
zentralen
Nervensystems
neuropsychologische Störungen mit der Folge einer geistigen Entwicklungsverzögerung auf
[Kühl 2001]. Die Häufigkeit der Hirntumoren und deren schlechte Langzeitprognose zeigen,
dass eine weitere Erforschung dieser Tumorgruppe, insbesondere auch für Patienten im
Kindesalter, von großer Bedeutung ist. In den letzten Jahren gab es einen beachtlichen
Wissenszuwachs über molekularbiologische Grundlagen dieser Tumoren. In diesem
Zusammenhang sollen auch die möglichen zellulären Funktionen der Septine näher erforscht
werden. Ein besseres Verständnis der Vorgänge in den Tumorzellen und ihrer Regulation
kann möglicherweise auch neue Therapieoptionen eröffnen.
1.7. Aufbau und Fragestellung der Arbeit
In dieser Arbeit soll die Expression der Septine SEPT4, SEPT5 und SEPT8 in sieben
verschiedenen Hirntumoren untersucht werden. Bei den drei genannten Septinen handelt es
sich um klassische Vertreter dieser Gruppe, alle drei zeigen den beschriebenen Aufbau
(Abbildung 1) mit Coiled-Coil-Domäne am C-Terminus. Diese drei Septine waren schon
zuvor Gegenstand verschiedener experimenteller Arbeiten der Arbeitsgruppe von Prof. Dr.
9
Zieger [Zieger et al. 1997; Zieger et al. 2000; Bläser et al. 2002; Bläser et al. 2003; Bläser et
al. 2004]. Die Ergebnisse der umfangreichen Expressionsuntersuchungen in gesundem
Gewebe und verschiedenen Zelllinien zeigen, dass alle drei untersuchten Septine besonders
ausgeprägt in gesundem Hirngewebe exprimiert werden. Dieses Expressionsmuster konnte
von anderen Arbeitsgruppen für SEPT4 [Paavola et al. 1999; Tanaka et al. 2002], SEPT5
[Caltagarone et al. 1998; Kinoshita, A. et al. 2000] und SEPT8 [Ihara et al. 2003] bestätigt
werden.
Dieser Arbeit liegt die Absicht zugrunde, einen detaillierten Überblick über die Expression
der drei Septine in Hirntumoren zu geben. Da diese Proteingruppe auch mit Neoplasien in
Verbindung gebracht wird, ist es von besonderem Interesse, das Vorkommen dieser drei
Septine in Tumoren jenes Gewebes zu untersuchen, in dem sie am stärksten exprimiert
werden. Welche Bedeutung können die Ergebnisse einer solchen Expressionsuntersuchung
haben? Bei verschiedenen Tumoren konnten schon spezifische Expressionsmuster von
Septinen oder deren Spleißvarianten, unter anderen von SEPT4, nachgewiesen werden.
Diesen Ergebnissen wird zum Teil eine diagnostische und eventuell therapeutische Bedeutung
zugeschrieben [Tanaka et al. 2002; Elhasid et al. 2004; Gottfried, Voldavsky et al. 2004].
Zudem nimmt das Wissen über die Funktionen der Septine in der Zelle schnell zu, sodass man
einer Verknüpfung der Ergebnisse von Expressionsuntersuchungen mit den Erkenntnissen
über die Funktionen der Septine näher kommt.
Um die Expression der drei Septine in Hirntumoren zu untersuchen, wurden neben Western
Blot-Analysen zwei mikroskopische Verfahren gewählt. Zum einen wurde eine In-SituHybridisierung durchgeführt, bei der die messenger-RNA der Septine detektiert werden kann,
und zum anderen mit einer Immunhistochemie das Protein sichtbar gemacht. Mit Hilfe dieser
Methoden kann gezeigt werden, ob die Septine auch tatsächlich in den Zellen dieser Tumoren
exprimiert werden und nicht nur in ebenfalls noch vorhandenem gesunden Gewebe.
Material und Methoden
10
2. Material und Methoden
2.1. Chemikalien
Die verwendeten Chemikalien, die nicht in den folgenden Abschnitten beschrieben werden,
sind im Anhang I aufgeführt.
2.2. Gewebe
Die histologischen Schnittpräparate wurden aus Gewebe von 14 Tumoren und zwei gesunden
Kontrollproben hergestellt. Alle Gewebe wurden von Prof. Dr. Pagenstecher (Abteilung
Neuropathologie, Pathologisches Institut, Universitätsklinikum Freiburg) zur Verfügung
gestellt. Sie stammen von Patienten, bei denen neurochirurgisch eine Tumorresektion
durchgeführt wurde. Die histologische Beurteilung erfolgte in der Abteilung Neuropathologie.
Die Einteilung wurde nach den WHO-Kriterien für die Klassifikation von Tumoren des
Nervensystems vorgenommen. Als Astrozytom WHO Grad I (A I) diente Gewebe zweier
junger Patienten, bei denen ein pilozytisches Astrozytom diagnostiziert worden war, als
Astrozytom WHO II (A II) ein gemistozytäres und ein fibrilläres Astrozytom. Desweiteren
wurden Präparate hergestellt von je zwei Patienten mit anaplastischem Astrozytom (A III),
multiformem Glioblastom (GBM), Oligoastrozytom WHO Grad II (OA II), Ependymom
WHO Grad III (EP III) und primitivem neuroektodermalem Tumor (PNET). Bei dem
Ependymom und PNET stammt je ein Tumorgewebe von einem Patienten im Kindesalter
(Tabelle 2).
Material und Methoden
Tumor
11
PräparatNummer
Alter
Geschlecht
Astrozytom
1
8J
♀
WHO I
2
14 J
♂
3
28 J
♀
4
30 J
♂
Astrozytom
5
45 J
♀
WHO III
6
37 J
♂
Glioblastoma
7
45 J
♂
multiforme
8
81 J
♀
Oligoastrozytom
9
55 J
♂
WHO II
10
28 J
♀
Ependymom WHO
11
58 J
♂
III
12
4J
♂
Primitiver
13
41 J
♂
14
7J
♀
Astrozytom
WHO II
neuroektodermaler
Tumor
Tabelle 2: Tumorgewebe für In-Situ-Hybridisierung und Immunhistochemie
gemistozytäres
Astrozytom
Fibrilläres
Astrozytom
Material und Methoden
12
2.3. In-Situ-Hybridisierung
2.3.1. Grundlagen der nichtradioaktiven In-Situ-Hybridisierung
Die Technik der In-Situ-Hybridisierung erlaubt den Nachweis spezifischer Nukleinsäuren, in
diesem Fall von messenger RNA (mRNA), im Gewebe [John et al. 1969; Pardue and Gall
1969]. Für die nichtradioaktive In-Situ-Hybridisierung werden Digoxigenin-markierte Sonden
hergestellt, die eine komplementäre Sequenz (antisense) zu der gesuchten mRNA besitzen.
Diese binden in situ an die mRNA. Danach wird ein gegen das DIG gerichtetes
Antikörperfragment auf die Präparate gegeben, das mit einem Enzym gekoppelt ist. Hier
wurde alkalische Phosphatase (AP) verwendet, die 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-Phosphat
(BCIP) dephosphoryliert. Anschließend wird BCIP oxidadativ in einen blauen Farbstoff
ungewandelt. Als Oxidationsmittel dient Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT), das dabei
ebenfalls zu einem blauen Farbstoff reduziert wird und somit farbverstärkend wirkt. Als
Negativkontrolle werden Sonden mit der Sequenz der gesuchten mRNA (sense) eingesetzt.
Abbildung 2: Prinzip der In-Situ-Hybridisierung
Material und Methoden
13
2.3.2. Vorbereitung der Paraffinschnitte
Bei der Vorbereitung für die In-situ-Hybridisierung ist darauf zu achten, dass keine RNase auf
die Schnittpräparate gelangt. Zunächst wurden die Schnitte entparaffiniert und rehydriert.
Dafür wurden sie zweimal zehn Minuten in Xylol und anschließend je zweimal zwei Minuten
in 100%, 95%, 70% Ethanol und PBS gestellt. Es folgte eine fünfminütige Fixierung in 4%
Formaldehyd, eine Deproteinierung mit Proteinase K bei 37° C für 15 Minuten und eine
Acetylierung für zehn Minuten. Nach der Fixierung, Deproteination und Acetylation wurde
jeweils für zwei Minuten mit PBS gewaschen. Im Weiteren wurden die Schnitte wieder
dehydriert, indem sie je zweimal fünf Minuten in 70%, 95% und 100% Ethanol inkubiert und
anschließend luftgetrocknet wurden.
4% Formaldehyd
10% Formaldehyd (36,5% Lösung) (v/v)
in PBS
PBS
154mM NaCl
2,28mM KH2PO4
8,32mM Na2HPO4
Deproteinierungslösung
24µg/ ml (2,4x 10-3 % (w/v)) Proteinase K
5x TE
5x TE
50mM Tris
5mM EDTA
Acetylierungslösung
0,25 % Essigsäure Anhydrid (v/v)
in PBS
2.3.3. Herstellung und nichtradioaktive Markierung von RNA-Sonden
Die Digoxigenin-markierten Sonden wurden von den Arbeitsgruppen Pagenstecher und
Zieger in Zusammenarbeit angefertigt und für diese Arbeit zur Verfügung gestellt. Die
Herstellung der DNA-Stücke wurde detailliert von Zieger et al. [2000] und Hainmann [2002]
Material und Methoden
14
beschrieben. Die Sonden wurden für alle drei Septine so gewählt, dass sich deren Sequenzen
nicht überlappen oder ähneln. Die Sonde für SEPT4 erstreckt sich über die Exons 2 und 3, die
Länge der Sonde beträgt 305 Basenpaare (bp). Sie erkennt so die Spleißvarianten SEPT4_v1
und SEPT4_v3. Die Sonde für SEPT5 ist 678 bp lang, umspannt die Exons 3 bis 8 und bindet
an SEPT5_v2. Für SEPT8 ist die Sonde 555 bp lang, umfasst die Exons 2-5 und detektiert so
alle drei bekannten Spleißvarianten von SEPT8 (Tabelle 3). Alle DNA-Stücke wurden jeweils
in den pGEM4Z-Vektor kloniert. Eine ausführliche Beschreibung der nun geschilderten
Methoden findet sich bei Pagenstecher et al. [1998]. Es erfolgte eine Transformation in
kompetente
E.coli-Bakterienstämme,
Kultivierung
und
Selektion
der
erfolgreich
transformierten Bakterien, Aufarbeitung der rekombinanten Plasmid-DNA und schließlich
eine Kontrollsequenzierung. Die Plasmid-DNA wurde linearisiert und für zwei Stunden bei
37° C im Transkriptionsansatz inkubiert. Der Transkriptionsansatz enthielt neben dem
Markierungsmix (DIG-Labeling Mix, Enzo/Roche) die RNA-Polymerase SP6 bzw. T7 für die
sense- bzw. antisense-Sonde. Die Bestimmung der Konzentration der hergestellten Sonden
erfolgte anhand von Verdünnungsreihen nach dem Protokoll von Roche (DIG RNA labeling
kit (SP6/T7)). Aufgrund der festgestellten Konzentration wurde mit den Sonden die Solution
B hergestellt. Für die Arbeitslösung, die auf die Präparate aufgetragen wurde, wurde dann 1/5
Solution B zu 4/5 Solution A hinzugegeben.
Sonde
Länge
Exon
SEPT4
305 bp
2-3
SEPT5
678 bp
3-8
SEPT8
555 bp
2-5
Tabelle 3: Sonden für die In-Situ-Hybridisierung
Solution A
12mM EDTA
30mM Natriumcitrat
0,3M NaCl
2,5% 50x Denhardt´s Solution
25% Dextransulfat (50%)
61% Formamid (deionisiert)
Material und Methoden
Solution B
15
0,5% tRNA (w/v)
1 µg/ ml (1x10-4 % (w/v)) Sonde
50mM DTT
0.5M NaCl
50mM Natriumcitrat
50x Denhardt´s Solution
1% Ficoll (w/v)
1% Polyvinylpyrrolidon (w/v)
1% BSA (w/v)
2.3.4. Hybridisierung und immunologische Detektion
Auf die Objektträger der - wie oben beschrieben - vorbereiteten Schnittpräparate wurde eine
Maske (GeneFrame von ABgene) aufgeklebt, 100µl der Arbeitslösung aufgetragen und diese
mit einer Folie luftblasenfrei über dem Präparat verteilt. So wurden sie bei 60°C über Nacht
inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Schnitte viermal für fünf Minuten in 2x SSC
gewaschen, dann folgte bei 37°C für 35 Minuten ein RNase-Verdau. Daraufhin wurden sie
zweimal fünf Minuten in 2x SSC, fünf Minuten in 1x SSC, 10 Minuten in 0,5x SSC und bei
60°C für 30 Minuten in 0,1x SSC gestellt. Alle SSC-Lösungen wurden aus der 20x SSCStammlösung mit Wasser (MilliQ) hergestellt. Im Weiteren wurden die Schnitte kurz in PBS
gewaschen und für fünf Minuten in Puffer P1 belassen. Die Präparate wurden auf den
Objektträgern mit einem Fettstift umrandet, es wurde zum Blockieren Puffer P2 aufgetragen
und für eine Stunde in einer feuchten Kammer inkubiert. Dann wurde der DIG-Antikörper
(DIG Nucleic Detection Kit, Roche; 1:4000 in Puffer P2) dazugegeben und erneut für 1,5
Stunden in der feuchten Kammer belassen. Nach zweimaliger Waschung für 30 Minuten in
Puffer P1, wurden die Schnitte für fünf Minuten in Puffer P3 äquilibriert.
20x SSC
3M NaCl
0,3M Natriumcitrat
Material und Methoden
RNase-Lösung
16
20µg/ ml (2x 10-4 % (w/v)?) RNase
RNase Puffer
RNase-Puffer
0,5M NaCl
10mM Tris pH 7,6
1mM EDTA
Puffer P1
0,1M Maleinsäure
0,15M NaCl
pH 7,5
Puffer P2
Blockierungsstammlösung (DIG Nucleic Detection Kit,
Roche) 1:10 in Puffer P1
Puffer P3
0,1M Tris-HCl
0,1M NaCl
50mM MgCl2
pH 9,5
2.3.5. Färbereaktion
Die Objektträger wurden aus dem Puffer P3 herausgenommen und mit der Präparatseite nach
unten in eine Schale mit Färbelösung gelegt. Im Folgenden wurden die Schnitte in
regelmäßigen Abständen unter dem Mikroskop angesehen und die Färbung kontrolliert. Bei
ausreichender Färbung wurden sie aus den Schalen genommen und die Färbereaktion in
Puffer P4 abgestoppt. Die Schnitte wurden kurz in Wasser gestellt, für zwei Sekunden in
Hämatoxylin gegengefärbt und unter laufendem Leitungswasser für 15 Minuten gebläut.
Anschließend wurden sie mit Elvanol eingedeckelt.
Bei allen drei Septinen wurde das gesamte Protokoll mit sense-Sonden als Negativkontrolle
durchgeführt.
Material und Methoden
Färbelösung
17
0,66% NBT (5%) (v/v)
0,33% BCIP (v/v)
in Puffer P3
5% NBT
5% NBT (w/v)
70% DMF
Puffer P4
10mM Tris-HCl
1M EDTA
pH 8,0
Elvanol
8 g Mowiol wurden bei 50 -60 °C in 40 ml Tris (0,2 M,
pH 8,5) gelöst. Dazu wurden 20 ml Glycerol gegeben,
als anti-fading Mittel wurde 1 % (w/v) 1,4-Diazabicyclo(2,2,2)-octan zugesetzt. Nach 15minütiger Zentrifugation
bei 5000 x g wurde der Überstand bei -20 °C eingefroren
und bis zur Verwendung gelagert.
Material und Methoden
18
2.4. Immunhistochemie
2.4.1. Grundlagen der Immunhistochemie
Die Immunhistochemie macht sich die spezifische Bindung von Antikörpern an ein
Oberflächen- oder Gewebsantigen zunutze. Meist werden zwei Antikörper eingesetzt. Der
erste ist gegen das gesuchte Antigen (z.B. SEPT4), der zweite gegen den Fc-Teil der
Immunglobuline derjenigen Tierspezies gerichtet, aus welcher der erste Antikörper gewonnen
wurde. Dieser zweite Antikörper ist biotinyliert. Anschließend werden Avidin, Biotin und
Peroxidase zugesetzt. Dafür wird meist ein Ansatz mit allen drei Reagenzien (ABC)
verwendet [Hsu, S. M. et al. 1981]. Diese binden an den zweiten Antikörper und bilden einen
Komplex. Das nun zugesetzte 3,3´ Diaminobenzidin (DAB) wird von der Peroxidase in ein
unlösliches Produkt umgewandelt. Diese farbigen Ablagerungen sind unter dem
Lichtmikroskop zu erkennen.
Abbildung 3: Prinzip der Immunhistochemie
Material und Methoden
19
2.4.2. Paraffinschnitte
Die Färbung der Paraffinschnitte erfolgte nach folgendem Protokoll. Die Schnitte wurden
zunächst zweimal je 15 Minuten in Xylol entparaffiniert und in einer absteigenden
Alkoholreihe rehydriert. Die verwendete Alkoholreihe bestand stets aus 2x 100%, 2x 95%
und 2x 70% Ethanol, in das die Schnittpräparate jeweils fünf Minuten gestellt wurden. Die
Antigenität wurde erhöht, indem die Schnitte gekocht wurden. Dafür wurde Citrat-Puffer im
Dampfkochtopf zum Kochen gebracht, die Schnitte wurden hineingestellt und für vier
Minuten gekocht. Um die endogenen Peroxidasen zu blockieren, wurden die Schnitte
anschließend für 18 Minuten in 0,3% H2O2 inkubiert. Die Schnitte wurden auf dem
Objektträger mit einem Fettstift umrandet und für mindestens 30 Minuten mit Normalserum
der Ziege (Vectastain ABC Kit Pk 4001, Vector Laboratories) blockiert. Anschließend wurde
der Erstantikörper in der zuvor ausgetesteten Verdünnung aufgetragen und über Nacht bei
4°C inkubiert. Zur Verwendung kamen der SEPT4-Antikörper in einer Verdünnung von
1:100, der polyklonale SEPT5-Antikörper in einer Verdünnung von 1:10 und der SEPT8Antikörper in einer Verdünnung von 1:10 in der unten aufgeführten Verdünnungslösung (für
Antikörper siehe Tabelle 5, Seite 24). Das Inkubieren aller Schritte erfolgte in einer feuchten
Kammer. Am Morgen wurde dreimal je fünf Minuten mit PBS gewaschen und der
biotinylierte Zweitantikörper (Goat anti-rabbit, Vectastain, Vector Laboratories) für eine
Stunde zugegeben. Danach wurde erneut dreimal mit PBS gewaschen und dann eine Stunde
mit dem ABC-Reagenz (Vectastain, Vector Laboratories) inkubiert. Wieder wurde mit PBS
gewaschen
und
die
DAB-Färbelösung
(Microscopy
DAB-Puffertabletten,
Merck)
aufgetragen. Die Zeitdauer war von der Geschwindigkeit der Farbreaktion abhängig und
wurde unter dem Mikroskop kontrolliert. Die Farbreaktion wurde in PBS abgestoppt. Die
Schnitte wurden kurz in Wasser gestellt, daraufhin für zwei Sekunden mit Hämatoxylin
gegengefärbt und 15 Minuten unter fließendem Leitungswasser gebläut. Nachdem sie zur
Dehydrierung eine aufsteigende Alkoholreihe durchlaufen hatten, wurden sie zweimal 15
Minuten in Xylol gestellt. Die Erstellung eines Dauerpräparates erfolgte mit Histofluid
(Marienfeld) und einem Deckglas.
Für alle verwendeten Antikörper wurden Negativkontrollen durchgeführt, indem der
Erstantikörper weggelassen und anschließend nach Protokoll verfahren wurde.
Citrat-Puffer
7mM Natriumcitrat
pH 6,0
Material und Methoden
0,3% H2O2
20
1% H2O2 (30% Lösung)
in PBS
Verdünnungslösung für Erstantikörper
1% BSA (w/v)
0,01% NaN3 (w/v)
in PBS
DAB-Grundlösung
1 DAB Puffertablette
auf 10ml H2O
auf 1ml aliquotieren
DAB-Färbelösung
DAB-Grundlösung
0,2% H2O2 (30% Lösung) (v/v)
2.4.3. Kryostatschnitte
Da mit den Antikörpern gegen SEPT5 und SEPT8 auf Paraffinschnitten auch nach Kochen
und Proteinase K-Behandlung kein zufriedenstellendes Ergebnis erreicht werden konnte,
wurden diese beiden Antikörper auf Kryostatschnitten eingesetzt. Dafür wurden im
Kryostaten aus dem Gewebe 14µm dünne Schnitte gefertigt und bei Raumtemperatur für
mindestens eine halbe Stunde luftgetrocknet. Danach wurden sie für eine Minute in 1:1
Methanol/Aceton-Gemisch fixiert. Das Methanol/Aceton-Gemisch wurde bei -20° C gelagert,
der Arbeitsschritt wurde bei dieser Temperatur im Kryostaten durchgeführt. Nach der
Fixierung wurden die Schnitte in PBS gestellt. Es folgte eine Blockierung der endogenen
Peroxidasen für 18 Minuten in 0,3 % H2O2, anschließend wurde fortgefahren wie bei den
Paraffinschnitten beschrieben.
2.5. Auswertung unter dem Lichtmikroskop
Die Auswertung der histologischen Schnitte nach Immunhistochemie und In-SituHybridisierung erfolgte unter dem Lichtmikroskop Axioplan 2 (Zeiss). Die photographische
Dokumentation wurde am selben Mikroskop mit der AxioCam (Zeiss) durchgeführt.
Material und Methoden
21
2.6. Western Blot
2.6.1. Proteinextraktion
Die Proteinextraktionen aus Gewebeproben 14 verschiedener Hirntumoren und zwei gesunder
Gehirne wurden ebenfalls von Prof. Dr. Pagenstecher bereitgestellt. Sie stammen alle vom
Menschen. Es handelt sich wie bei den Gewebeproben für die Herstellung der histologischen
Schnittpräparate um je eine Probe zweier Astrozytome WHO I, II und III, Glioblastome,
Oligoastrozytome, Ependymome, PNET sowie zweier normaler Gehirne (Tabelle 4). Die
Proteinkonzentration wurde nach Bradford [1976] gemessen.
Histologie
Probennummer
Alter
Geschlecht
1
8J
♀
2
14 J
♂
3
45 J
♀
4
29 J
♂
Astrozytom III
5
38 J
♂
Glioblastoma multiforme
6
43 J
♂
7
81 J
♀
8
55 J
♂
9
28 J
♀
10
4J
♂
11
58 J
♂
12
7J
♀
13
8J
♀
Astrozytom I
Astrozytom II
Oligoastozytom II
Ependymom III
PNET
Tabelle 4: Proteinextraktionen aus Hirntumoren für Western Blot
Material und Methoden
22
2.6.2. SDS/ LDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Die Auftrennung des Proteingemisches erfolgte nach der zuerst von Laemmli [1970]
beschriebenen Methode. Von jeder Probe wurden 50µg Proteinextrakt je 5µl 4fach LDSLadepuffer zugesetzt und für 5 Minuten bei 95°C inkubiert. Danach wurden die Proben und
ein Marker (Multicolored Standard von Invitrogen) in die Taschen eines 4-12% Bis-Tris Gels
(NuPage von Invitrogen) aufgetragen. Als Laufpuffer wurde ein 1fach MOPS-Puffer
verwendet. Über das Gel wurde eine Spannung von 200 V angelegt und es wurde gewartet,
bis die Coomassie Brilliant Blau Bande den unteren Rand des Gels erreicht hatte.
4fach LDS-Ladepuffer:
0,25M Tris pH 8,5
0,5mM EDTA
0,075% Coomassie Brilliant Blau G250 (w/v)
0,025% Phenol Red (w/v)
8% LDS (w/v)
10% β-Mercaptoethanol (v/v)
20% Glycerol (v/v)
1x MOPS-Puffer
50mM MOPS
50mM Tris
3,5mM SDS
0,8mM EDTA
2.6.3. Western Blot
Als Western Blot bezeichnet man die Übertragung eines nach der oben beschriebenen
Methode aufgetrennten Proteingemisches auf eine Trägermembran [Towbin et al. 1979].
Dafür wurden das Gel aus der Schale genommen, die Taschen abgeschnitten und eine PVDFMembran (Hybond-P, Amersham Biosciences) aufgelegt. Das Gel und die PVDF-Membran
wurden zwischen zwei Blotpapiere (3M) gelegt. Die PVDF-Membran wurde zuvor in
Methanol und anschließend kurz, wie auch das Blotpapier, in Blotpuffer angefeuchtet. Die
Blotbox, die das Gel, die PVDF-Membran und die Blotpapiere enthielt, wurde in den mit
Material und Methoden
23
Blotpuffer gefüllten Elektroblot eingespannt. Es wurde eine Stunde bei 400mA geblottet. Der
Blotpuffer wurde währenddessen auf 10°C gekühlt. Danach wurde die PVDF-Membran kurz
in Ponceau S angefärbt, um die Proteinübertragung zu kontrollieren.
Blot-Puffer
1M Glycin
125mM Tris
15% Methanol (v/v)
Ponceau S
0,5% Ponceau S (w/v)in
1% Eisessig (v/v) lösen
mit H2O auffüllen
2.6.4. Immunoblotting
Nach erfolgreicher Proteinübertragung wurde die PVDF-Membran für mindestens eine halbe
Stunde in 5% Magermilch inkubiert, um die unspezifischen Bindungsstellen zu blockieren.
Danach wurde die Blockierungslösung abgegossen und der erste Antikörper (Tabelle 5) in 5%
Magermilch für eine Stunde bei Raumtemperatur auf die Membran gegeben. Dann wurde
viermal für fünf Minuten mit TBST gewaschen, wobei jeweils der Puffer gewechselt wurde.
Für 45 Minuten wurde der zweite Antikörper (Tabelle 5) in 5% Magermilch zugegeben und
anschließend erneut viermal mit TBST gewaschen. Hinterher wurde die Membran gut
abgetupft und die Färbelösung (ECL Plus Western Blotting Detection System von Amersham
Biosciences) gleichmäßig aufgetragen. Nach fünf Minuten wurde die Membran nochmals
sorgfältig abgetupft und in Folie verpackt. Die Belichtung erfolgte auf ChemiluminenzFilmen (Hyperfilm, Amersham Biosciences).
Für die Loading-Kontrolle mit GAPDH-Antikörpern wurde die PVDF-Membran 10
Sekunden in Methanol angefeuchtet, mit Wasser gewaschen und fünf Minuten mit TBST
gespült. Anschließend wurde der erste Antikörper dazugegeben, und der Arbeitsgang wurde
fortgesetzt wie oben beschrieben.
Material und Methoden
5% Magermilch
24
5% Magermilchpulver (w/v)
TBST
TBST
50mM Tris
150mM NaCl
0,05% Twean (w/v)
1.Antikörper
Konzentration
SEPT4
SEPT5
SEPT5
SEPT8
GAPDH
polyklonal
polyklonal
monoklonal
polyklonal
monoklonal
1mg/ ml
1mg/ ml
1mg/ ml
1mg/ ml
1mg/ ml
gesamtes
erkennt
AS 10-112
Protein
AS 8-113
SEPT5_v1
J. Ware, The
AG Zieger
AG Zieger
Scripps
AG Zieger
[Bläser et
[Zieger et al.
Research
[Bläser et al.
al. 2004]
2000]
Institut,
2002]
Chemicon
International
La Jolla, USA
Verdünnung
2.Antikörper
1:500
1:100
Ziege gegen Kaninchen
1:1000
1:500
1:4000
Ziege gegen
Ziege gegen
Ziege gegen
Maus
Kaninchen
Maus
alle: Peroxidase conjugiert, Jackson ImmunoResearch
Verdünnung
1:25000
1:25000
Tabelle 5: Verwendete Antikörper für den Immunoblot
1:50000
1:25000
1:50000
Ergebnisse
25
3. Ergebnisse
3.1. Expression des Septins SEPT4 in Hirntumoren
3.1.1. In-Situ-Hybridisierung und Immunhistochemie
3.1.1.1. SEPT4 in normalem Hirngewebe
Sowohl bei der In-Situ-Hybridisierung als auch bei der Immunhistochemie wurde SEPT4 im
Gewebe von gesundem Gehirn gefunden. Eine besonders starke Expression zeigte sich bei
beiden Methoden in den Neuronen des Cortex (Abbildung 4). Bei der In-Situ-Hybridisierung
war der Farbniederschlag überwiegend perinukleär zu sehen, während das Protein bei der
Immunhistochemie im gesamten Zytoplasma, aber auch diffus im Neuropil gefunden wurde.
SEPT4 scheint ebenfalls in Gliazellen exprimiert zu werden. Es konnte in der Mehrzahl der
Astrozyten dargestellt werden. Die Negativkontrollen zeigten keine entsprechende Färbung.
Abbildung 4: SEPT4 in normalem Hirngewebe: Angefärbte Neurone (
Hybridisierung (li.) und Immunhistochemie (re.)
) des Cortex bei In-Situ-
3.1.1.2. SEPT4 in pilozytischen Astrozytomen WHO I
Beide pilozytischen Astrozytome zeigten kaum eine Expression von SEPT4. Das
Tumorgewebe bestand überwiegend aus kleinen Tumorzellen mit rundem Kern. Bei der InSitu-Hybridisierung stellten sich einzelne Tumorzellen mit einer schwachen perinukleären
Färbung dar. Auch immunhistochemisch ließ sich SEPT4 nur stellenweise im Tumor
nachweisen (Abbildung 5).
Ergebnisse
Abbildung 5: SEPT4 in pilozytischen Astrozytomen: Einzelne positive Tumorzellen (
Hybridisierung (li.) und Immunhistochemie (re.)
26
) in der In-Situ-
3.1.1.3. SEPT4 in Astrozytomen WHO II
Im Tumor mit überwiegend gemistozytären Anteilen (Probe Nr. 3) fand sich SEPT4
ausgeprägt in den Zellen mit großem Zellleib und exzentrisch gelegenem Zellkern. Dieser
positive Befund bei der In-Situ-Hybridisierung und auch bei der Immunhistochemie stand im
Kontrast zu den benachbarten Gefäßstrukturen, die keine Anfärbung aufwiesen (Abbildung
6). Auch im fibrillären Astrozytom (Probe Nr. 4) fand sich SEPT4 bei beiden Methoden.
Abbildung 6: SEPT4 in Astrozytomen II: Gemistozytäre Zellen ( ) mit Färbung bei der In-SituHybridisierung (li.) und Immunhistochemie (re.), negative Blutgefäße ( )
Ergebnisse
27
3.1.1.4. SEPT4 in Astrozytomen WHO III
Bei den anaplastischen Astrozytomen zeigten sich neben unterschiedlich ausgeprägten
Kernatypien wie mehrkernigen Riesenzellen Zellen mit weitreichenden fibrillären Ausläufern.
Die In-Situ-Hybridisierung ließ zum Teil eine perinukleäre Färbung erkennen, während sich
mit dem Antikörper gegen SEPT4 das Zytoplasma der Tumorzellen deutlich anfärbte. Am
eindeutigsten war die Färbung der Zellen mit den erwähnten fibrillären Ausläufern, kaum
sichtbar war diese bei den Zellen mit stark polymorphen Zellkernen (Abbildung 7).
Abbildung 7: SEPT4 in Astrozytomen III: Tumorzellen ( ) mit zum Teil polymorphen Zellkernen bei
der In-Situ-Hybridisierung (li.). Bei der Immunhistochemie (re.) positive Zellen ( ) mit weitreichenden
Ausläufern
3.1.1.5. SEPT4 in Glioblastomen
Beide untersuchten Glioblastome wiesen neben großen nekrotischen Bereichen Tumorzellen
mit unterschiedlich starken Kernpolymorphien auf. Außerdem fanden sich ausgeprägte
Gefäßproliferationen mit zum Teil an Glomeruli erinnernden Formen. Bei beiden Methoden
stellten sich die Tumorzellen nur schwach positiv bis negativ dar (Abbildung 8). Die
vaskulären Strukturen zeigten keine Anfärbung.
Ergebnisse
28
Abbildung 8: SEPT4 in Glioblastomen: Tumorzellen (
) mit kaum darstellbarer perinukleärer
Anfärbung bei der In-Situ-Hybridisierung (li.) und ebenfalls nur schwacher Anfärbung
immunhistochemisch (re.). Keine derartige Anfärbung der Blutgefäße ( )
3.1.1.6. SEPT4 in Oligoastrozytomen WHO II
In den Tumoren mit astrozytär und oligodendroglial differenzierten Anteilen waren erstere bei
der In-Situ-Hybridisierung wie bei der Immunhistochemie positiv zu erkennen. Während der
Farbniederschlag bei der In-Situ-Hybridisierung auch hier perinukleär zu finden war, färbte
sich immunhistochemisch insbesondere das Zytoplasma der Zellen mit ihren fibrillären
Ausläufern an (Abbildung 9).
Abbildung 9: SEPT4 in Oligoastrozytomen II: Bei der In-Situ-Hybridisierung (li.) und der
Immunhistochemie (re.) färbten sich die astrozytär differenzierten Zellen des Glioms ( ) an, die
Blutgefäße ( ) nicht
Ergebnisse
29
3.1.1.7. SEPT4 in Ependymomen WHO III
Eines der beide anaplastischen Ependymome zeigte eine deutliche, das andere eine schwache
Expression von SEPT4. Bei der Immunhistochemie färbten sich die faserreichen, perivaskulär
kernfreien Bereiche, die so genannten Pseudorosetten, deutlich an. Sie hoben sich so von den
Gefäßstrukturen ab (Abbildung 10).
Abbildung 10: SEPT4 in Ependymomen III: In-Situ-Hybridisierung (li.) mit Anfärbung um die Zellkerne
der Ependymomzellen ( ). Zusätzlich positive Pseudorosetten (∆) bei der Immunhistochemie (re.).
Keine Färbung der zentral gelegenen Blutgefäße( )
3.1.1.8. SEPT4 in primitiven neuroektodermalen Tumoren
Beide primitiven neuroektodermalen Tumoren wiesen außer nekrotischen Anteilen zellreiches
Gewebe mit runden Zellkernen auf. In den Tumorzellen ließ sich bei der In-SituHybridisierung und der Immunhistochemie keine oder nur eine äußerst geringe Anfärbung
darstellen (Abbildung 11).
Ergebnisse
30
Abbildung 11: SEPT4 in PNET: Sehr dichtliegende Zellen überwiegend ohne Anfärbung bei der In-SituHybridisierung (li.) und Immunhistochemie (re.)
3.1.2. Western Blot
Bei den untersuchten Proteinextraktionen aus Hirntumoren und gesundem Hirngewebe wurde
SEPT4 unterschiedlich ausgeprägt in allen Proben gefunden. Es stellten sich zwei Banden von
etwa 48 kDa und 54 kDa dar, wobei die Bande bei 54 kDa sich überwiegend kräftiger zeigte.
Von SEPT4 sind bisher vier Spleißvarianten bekannt. Die Spleißvariante SEPT4_v1 kodiert
für ein Protein aus 478 Aminosäuren (AS), SEPT4_v2 aus 274 AS, SEPT4_v3 aus 459 AS
und SEPT4_v4 aus 208 AS. Die im Western Blot dargestellte Bande bei 54 kDa entspricht der
Isoform SEPT4_v1. Die Bande bei 48 kDa scheint etwas zu klein für SEPT4_v3, eine Bande
bei dieser Größe wurde jedoch auch von einer Arbeitsgruppe gefunden, die mit einem anderen
Antikörper arbeiten [Kinoshita, A. et al. 2000; Ihara et al. 2005]. Dabei muss offen bleiben,
ob es sich um SEPT4_v3 oder vielleicht eine weitere Isoform dieses Septins handelt. Die
beiden anderen bekannten Isoformen SEPT4_v2 und SEPT4_v4 werden von dem
verwendeten Antikörper nicht erkannt. Das stärkste Signal fand sich bei den Proben aus
gesundem Hirngewebe, den Oligoastrozytomen und den Astrozytomen WHO II und III. Die
Kontrolle mit GAPDH-Antikörpern stellt eine gleichmäßige Proteinauftragung dar
(Abbildung 12). Einen Vergleich zu den Ergebnissen der In-Situ-Hybridisierung und
Immunhistochemie für SEPT4 zeigt Tabelle 6. Ein deutlicher Unterschied fand sich bei den
Ergebnissen
eines
Ependymoms,
Immunhistochemie klar positiv zeigte.
das
sich
bei
der
In-Situ-Hybridisierung
und
Ergebnisse
31
Abbildung 12: Western Blot der Proteinextraktionen aus den Hirntumoren und normalem Hirngewebe
mit dem Antikörper gegen SEPT4
AI
Probe
In-SituHybridisierung
Immunhistochemie
A II
A III
GBM
OA II
5
7
9 10 11
1
2
3
4
6
-
(+)
+
+ (+) + (+) (+) +
(+) (+) ++ + (+) + (+)
8
+
+
EP III
PNET
12
13
14
NG
15
16
+
+
(+)
-
(+) ++ ++
+
+
(+)
-
(+) ++ ++
Tabelle 6: SEPT4 in Hirntumoren und normalem Hirngewebe: Übersicht der Ergebnisse der In-SituHybridisierung und der Immunhistochemie; Einstufung: ++ = stark positiv, + = positiv, (+) = schwach
positiv, -= negativ
Ergebnisse
32
3.2. Expression des Septins SEPT5 in Hirntumoren
3.2.1. In-Situ-Hybridisierung und Immunhistochemie
3.2.1.1. SEPT5 in gesundem Hirngewebe
Das Septin SEPT5 wird wie schon SEPT4 in gesundem Hirngewebe exprimiert. Bei der InSitu-Hybridisierung und der Immunhistochemie zeigte sich eine intensive Anfärbung der
Neurone. Das Protein wurde erneut recht diffus verteilt gefunden, neben einem positiven
Zytoplasma färbte sich auch das Neuropil an (Abbildung 13). In Gliazellen scheint SEPT5
wenig oder nicht vorzukommen. So konnte es nur in vereinzelten Astrozyten und
Oligodendrogliazellen dargestellt werden und auch nur schwach ausgeprägt. Die
Negativkontrollen zeigten keine entsprechende Färbung.
Abbildung 13: SEPT5 in normalem Hirngewebe: Stark positive Neurone (
Hybridisierung (li.) und Immunhistochemie (re.)
) bei der In-Situ-
3.2.1.2. SEPT5 in pilozytischen Astrozytomen WHO I
In den Gewebeproben der beiden pilozytischen Astrozytome war eine Expression von SEPT5
zu erkennen. Bei der In-Situ-Hybridisierung zeigte sich eine schwache Anfärbung
perinukleär, immunhistochemisch war sie weniger streng lokalisiert. Insgesamt erschien die
Expression bei beiden Methoden schwach (Abbildung 14).
Ergebnisse
Abbildung 14: SEPT5 in pilozytischen Astrozytomen: Tumorzellen (
In-Situ-Hybridisierung (li.) und Immunhistochemie (re.)
33
) mit schwacher Anfärbung bei der
3.2.1.3. SEPT5 in Astrozytomen WHO II
Wie schon in den pilozytischen Astrozytomen wurde SEPT5 im gemistozytären sowie im
fibrillären Astrozytom gefunden. Auch bei den hier untersuchten Tumorgeweben zeigte sich
nur ein schwach positives Ergebnis einzelner Zellen bei beiden Methoden (Abbildung 15).
Bei der In-Situ-Hybridisierung war perinukleär zumindest teilweise eine leichte Anfärbung zu
erkennen.
Abbildung 15: SEPT5 in Astrozytomen II : Gemistozytäres Astrozytom bei der In-Situ-Hybridisierung
(li.) mit nur schwacher perinukleärer Färbung ( ). Fibrilläres Astrozytom bei der Immunhistochemie
(re.)
Ergebnisse
34
3.2.1.4. SEPT5 in Astrozytomen WHO III
Die anaplastischen Astrozytome wiesen bei der In-Situ-Hybridisierung ebenso eine nur wenig
ausgeprägte Anfärbung auf. Das Tumorgewebe unterschied sich so deutlich von den ebenfalls
in Gewebeprobe 6 vorhandenen, viel stärker gefärbten Neuronen. Immunhistochemisch
konnte SEPT5 in den Präparaten mit vielen Kernpolymorphien etwas deutlicher
nachgewiesen werden (Abbildung 16).
Abbildung 16: SEPT5 in Astrozytomen III: Tumorzellen ( ) mit schwacher Anfärbung bei der In-SituHybridisierung (li.) und etwas deutlicherer bei der Immunhistochemie (re.)
3.2.1.5. SEPT5 in Glioblastomen
Die Tumorzellen der untersuchten Glioblastome zeigten bei beiden Methoden in einem Teil
der Tumorzellen einen leicht positiven Befund auf, der bei der Immunhistochemie stärker
ausgeprägt war. Bei der In-Situ-Hybridisierung hob sich das Tumorgewebe vom
hyperplastischen und hypertrophen Gefäßendothel ab (Abbildung 17).
Ergebnisse
35
Abbildung 17: SEPT5 in Glioblastomen: In-Situ-Hybridisierung (li.) und Immunhistochemie (re.) mit
angefärbten Zellen des Tumors ( ). Die pathologischen Gefäßproliferate ( ) zeigen wenig bis keine
Färbung
3.2.1.6. SEPT5 in Oligoastrozytomen WHO II
Auch in den gemischtglialen Tumoren konnte SEPT5 schwach bei der In-Situ-Hybridisierung
sowie bei der Immunhistochemie gefunden werden. Bei der In-Situ-Hybridisierung sah man
den Farbniederschlag um den Kern herum, immunhistochemisch war er weniger streng
lokalisiert (Abbildung 18).
Abbildung 18: SEPT5 in Oligoastrozytomen II: Positive Zellen des Glioms (
Hybridisierung (li.) und Immunhistochemie (re.)
) bei der In-Situ-
Ergebnisse
36
3.2.1.7. SEPT5 in Ependymomen WHO III
In den beiden anaplastischen Ependymomen war eine Anfärbung kaum zu erkennen
(Abbildung 19). Insbesondere bei der In-Situ-Hybridisierung erschienen nur einzelne
Tumorzellen positiv.
Abbildung 19: SEPT5 in Ependymomen: Kaum wahrnehmbare Anfärbung (
Hybridisierung (li.) und Immunhistochemie (re.)
) bei der In-Situ-
3.2.1.8. SEPT5 in primitiven neuroektodermalen Tumoren
Sowohl bei der In-Situ-Hybridisierung als auch bei der Immunhistochemie konnte keine
Expression von SEPT5 dargestellt werden (Abbildung 20). Die zellreichen Tumoren zeigten
bei beiden Methoden keine lichtmikroskopisch sichtbare Anfärbung.
Abbildung 20: SEPT5 in PNET: Zellreicher Tumor ohne Anfärbung bei der In-Situ-Hybridisierung (li.)
und Immunhistochemie (re.)
Ergebnisse
37
3.2.2. Western Blot
Im Western Blot war SEPT5 zumindest schwach in den Proteinextraktionen aller
Hirntumoren und des normalen Hirngewebes zu sehen. Es stellte sich durchgehend eine
Bande bei etwa 42 kDa dar. Von dem Septin SEPT5 sind zwei Spleißvarianten bekannt. Die
Proteine bestehen aus 369 (SEPT5_v1) und 346 Aminosäuren (SEPT5_v2). Die im
durchgeführten Western Blot sichtbare Bande bei etwa 42 kDa entspricht der Variante
SEPT5_v1 und eventuell auch SEPT5_v2 (siehe Tabelle 5, Seite 24). Bei zwei Proben war
auch eine Bande bei etwa 52 kDa zu sehen, die von der Größe keiner bekannten Isoformen
des Septins SEPT5 entspricht und daher möglicherweise eine Kreuzreaktion mit einem
anderen Protein darstellt.
Die beiden Proben aus normalem Hirngewebe zeigten die kräftigsten Banden, deutlich waren
sie auch bei den Astrozytomen, Glioblastomen, einem Oligoastrozytom und einem PNET. Die
Kontrolle mit GAPDH ließ eine recht gleichmäßige Proteinauftragung erkennen, die
Doppelbande bei den Proben aus normalem Hirngewebe und einem Oligoastrozytom stellen
Kreuzreaktionen mit dem hier verwendeten und zuvor aufgetragenen monoklonalen
Antikörper gegen SEPT5 dar (siehe Material und Methoden). Tabelle 7 zeigt zum Vergleich
eine Übersicht der Ergebnisse der In-Situ-Hybridisierung und Immunhistochemie für SEPT5.
Man erkennt eine in allen Methoden eher schwache Expression von SEPT5 in den
untersuchten Tumoren.
Ergebnisse
38
Abbildung 21: Western Blot der Proteinextraktionen aus Hirntumoren und normalem Hirngewebe mit
dem monoklonalen Antikörper gegen SEPT5
AI
Probe
In-SituHybridisierung
Immunhistochemie
1
A II
2
3
4
A III
GBM
OA II
EP III
PNET
5
7
9
11
13 14 15
6
8
10
(+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) + (+) (+)
+
(+)
+
(+)
+
(+)
+
+
+
12
-
(+) (+)
NG
16
-
-
++ ++
-
-
+
++
Tabelle 7: SEPT5 in Hirntumoren: Übersicht der Ergebnisse der In-Situ-Hybridisierung und
Immunhistochemie; Einstufung: ++ = stark positiv, + = positiv, (+) = schwach positiv, -= negativ
Ergebnisse
39
3.3. Expression des Septins SEPT8 in Hirntumoren
3.3.1. In-Situ-Hybridisierung und Immunhistochemie
3.3.1.1. SEPT8 in normalem Hirngewebe
Die stärkste Expression von SEPT8 in normalem Hirngewebe konnte in den Neuronen
dargestellt werden. Bei der In-Situ-Hybridisierung sowie bei der Immunhistochemie war eine
deutliche Anfärbung zu erkennen. Bei der Betrachtung der immunhistochemisch behandelten
Präparate fiel neben den positiven Zellkörpern eine diffuse Anfärbung des Neuropils auf
(Abbildung 22). SEPT8 wurde außerdem auch in den Zellen der Glia gefunden. Allerdings
war die Anfärbung in der Immunhistochemie mit dem Antikörper gegen SEPT8 in den
meisten Präparaten nicht immer klar vom Hintergrund abzugrenzen, sodass die Ergebnisse bei
allen Präparaten zurückhaltend interpretiert werden sollten. Die Negativkontrollen zeigten
jedoch keine entsprechende Färbung.
Abbildung 22: SEPT8 in normalem Hirngewebe: Die Neurone ( ) zeigen eine deutliche Anfärbung bei
der In-Situ-Hybridisierung (li.) und der Immunhistochemie (re.). Immunhistochemisch fällt zudem ein
positives Neuropils auf
3.3.1.2. SEPT8 in pilozytischen Astrozytomen WHO I
In beiden pilozytischen Astrozytomen konnte SEPT8 dargestellt werden. Bei der In-SituHybridisierung war der Farbniederschlag um die kleinen runden Zellkerne zu sehen
(Abbildung 23), immunhistochemisch war er im Zytoplasma der Tumorzellen und bei deren
Zellfortsätzen lokalisiert.
Ergebnisse
40
Abbildung 23: SEPT8 in pilozytischen Astrozytomen: Positive Tumorzellen (
) bei der In-SituHybridisierung (li.) und Immunhistochemie (re.). Leichte Anfärbung einzelner Zellen der Blutgefäße ( )
3.3.1.3. SEPT8 in Astrozytomen WHO II
SEPT8 wird im Gewebe des gemistozytären und des fibrillären Astrozytoms exprimiert. Im
hier abgebildeten fibrillären Astrozytom (Abbildung 24) stand die Anfärbung der
Tumorzellen im Kontrast zu den ebenfalls vorhandenen Gefäßen, bei denen kein
Farbniederschlag zu erkennen war.
Abbildung 24: SEPT8 in Astrozytomen II: Angefärbte Zellen des fibrillären Astrozytoms ( ) im
Kontrast zu den negativen vaskulären Strukturen ( ) bei In-Situ-Hybridisierung (li.) und
Immunhistochemie (re.)
Ergebnisse
41
3.3.1.4. SEPT8 in Astrozytomen WHO III
Wie schon die niedriggraden Astrozytome waren auch die anaplastischen positiv für SEPT8.
Beide Methoden ließen eine Anfärbung des Tumorgewebes (Abbildung 25) mit seinen
zahlreichen Kernpolymorphien erkennen. Wie bei SEPT5 zeigten die am Rande des Tumors
zu findenden Neurone (Probe 6) bei der In-Situ-Hybridisierung eine deutlich ausgeprägtere
Färbung als die Tumorzellen.
Abbildung 25: SEPT8 in Astrozytomen III: Tumorzellen ( ) mit zum Teil polymorphen Kernen zeigen
einen positiven Befund bei der In-Situ-Hybridisierung (li.) und der Immunhistochemie (re.)
3.3.1.5. SEPT8 in Glioblastomen
In den aus dem Gewebe der beiden Glioblastome mit ihren zahlreichen Gefäßneubildungen
und großflächigen Nekrosen hergestellten Schnittpräparaten fanden sich bei der In-SituHybridisierung und Immunhistochemie durchwegs positiv gefärbte Tumorzellen (Abbildung
26).
Ergebnisse
Abbildung 26: SEPT8 in Glioblastomen: Angefärbte Zellen des Glioms (
bei der In-Situ-Hybridisierung (li.) und Immunhistochemie (re.)
42
) und Gefäßneubildungen (
)
3.3.1.6. SEPT8 in Oligoastrozytomen WHO II
Auch bei beiden untersuchten Oligoastrozytomen mit ihren astrozytär und oligodendroglial
differenzierten Anteilen konnte bei beiden Methoden eine Expression von SEPT8 dargestellt
werden (Abbildung 27).
Abbildung 27: SEPT8 in Oligoastrozytomen II: Positive Tumorzellen (
(li.) und Immunhistochemie (re.)
) bei der In-Situ-Hybridisierung
Ergebnisse
43
3.3.1.7. SEPT8 in Ependymomen WHO III
In-Situ-Hybridisierung und Immunhistochemie der anaplastischen Ependymome zeigten
einen Nachweis für SEPT8 (Abbildung 28). Die mRNA war überwiegend perinukleär
lokalisiert, das Protein auch in den fibrillären Zellfortsätzen.
Abbildung 28: SEPT8 in Ependymomen III: Bei der In-Situ-Hybridisierung (li.) und Immunhistochemie
(re.) angefärbte Ependymomzellen ( ) und Blutgefäße ( )
3.3.1.8. SEPT8 in primitiven neuroektodermalen Tumoren
Im zellreichen Gewebe der beiden untersuchten primitiven neuroektodermalen Tumoren war
kaum eine Anfärbung zu erkennen. Eines der untersuchten Präparate stellte sich bei der InSitu-Hybridisierung negativ, das andere nur schwach positiv dar. Immunhistochemisch war
die Anfärbung ebenfalls nur gering (Abbildung 29).
Abbildung 29 SEPT8 in PNET: Tumorgewebe (
darstellbarer Anfärbung (Immunhistochemie/ re.)
) ohne (In-Situ-Hybridisierung/ li.) und mit kaum
Ergebnisse
44
3.3.2. Western Blot
Im Western Blot der Proteinextraktionen aus den Hirntumoren und normalem Hirngewebe
war eine Bande bei etwa 50 kDa und 54 kDa, sowie eine Doppelbande bei etwa 64 kDa zu
sehen. Vom dritten hier untersuchten Septin, SEPT8, sind bisher drei Spleißvarianten
bekannt, die von Bläser et al. [2003] beschrieben wurden. Sie kodieren für Proteine mit einer
Länge von 508 (SEPT8_v1), 562 (SEPT8_v2) und 453 Aminosäuren (SEPT8_v3). Die hier
zu erkennenden Bande bei 50 kDa (SEPT8_v3), 54 kDa (SEPT8_v1) und 64 kDa
(SEPT8_v2) entsprechen in ihrer Größe den drei Isoformen. Somit erkennt der verwendete
Antikörper alle drei Varianten.
Die Bande bei 50 kDa war bei allen aufgetragenen Proben mit Ausnahme einer der primitiven
neuroektodermalen Tumoren deutlich ausgebildet. Die Bande bei 54 kDa war am
ausgeprägtesten bei den Proteinextraktionen aus normalem Hirngewebe und den
Oligoastrozytomen. Während die Doppelbande bei 64 kDa in den Proben der Tumoren mit
Ausnahme der Astrozytome I und eines Glioblastoms erschien, war sie nicht bzw. kaum bei
den Proben des normalen Hirngewebes zu sehen. Bei den Proben aus normalem Hirngewebe
und einer Probe eines Oligoastrozytoms war zudem eine Bande bei etwa 33 kDa zu erkennen,
die wie schon bei SEPT5 wohl eine Kreuzreaktion mit einem anderen Protein darstellt. Die
Kontrolle mit dem Antikörper gegen GAPDH zeigte eine gleichmäßige Proteinauftragung.
Zum Vergleich findet sich in Tabelle 8 eine Übersicht der Ergebnisse der In-SituHybridisierung und Immunhistochemie für SEPT8. Es ist zu erkennen, dass die Ergebnisse
aller drei verwendeten Methoden weitestgehend übereinstimmen.
Ergebnisse
45
Abbildung 30: Western Blot der Proteinextraktionen von Hirntumoren und normalem Hirngewebe mit
dem Antikörper gegen SEPT8
AI
Probe
In-SituHybridisierung
Immunhistochemie
A II
A III
GBM
OA II
EP III
PNET
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
14
NG
15
16
(+) ++ ++
(+) (+) ++
+
Tabelle 8: SEPT8 in Hirntumoren und normalem Hirngewebe, Übersicht über die Ergebnisse der In-SituHybridisierung und Immunhistochemie; Einstufung: ++ = stark positiv, + = positiv, (+) = schwach positiv
Diskussion
46
4. Diskussion
4.1. Expressionsmuster der Septine in gesundem Gewebe
4.1.1. SEPT4 in gesundem Gewebe
In dieser Arbeit werden die Expressionsmuster von drei Proteinen aus der Gruppe der Septine
untersucht. Um der Bedeutung der Septine in Hirntumoren nachzugehen, soll zunächst deren
Expression in gesundem Gewebe dargelegt werden. Für SEPT4 haben frühere
Expressionsuntersuchungen der Arbeitsgruppe Zieger ergeben, dass dieses Septin in
verschiedenen Hirnregionen zu finden ist [Hainmann 2002; Bläser et al. 2004]. Die dort
durchgeführten Northern Blots zeigten eine recht einheitliche Expression in allen
untersuchten Regionen des zentralen Nervensystems [Bläser et al. 2004]. Eine Expression von
SEPT4 im Gehirn wiesen auch Paavola et al. [1999] und Tanaka et al. [2001] nach. Kinoshita
et al. [2000] konnten elektronenmikroskopisch zudem eine Lokalisation von SEPT4 in Zellen
der Astroglia erkennen. Die Ergebnisse der hier durchgeführten In-Situ-Hybridisierung und
Immunhistochemie bestätigen diese Erkenntnisse, insbesondere konnte neben dem Nachweis
von SEPT4 in Neuronen auch wie bei Kinoshita et al. [2000] eine Expression in Astrozyten
gefunden werden.
Außer im Gehirn wird SEPT4 in vielen verschiedenen Geweben gefunden. Ebenfalls
ausgeprägt ist die Expression in Herzgewebe, deutlich noch in Milz, Leber, Hoden, Ovar und
Thrombozyten [Paavola et al. 1999; Zieger et al. 2000; Tanaka et al. 2001; Bläser et al. 2004].
4.1.2. SEPT5 in gesundem Gewebe
Im Gehirn findet sich auch bei SEPT5 eine besonders starke Expression [Yagi et al. 1998;
Toda et al. 2000; Zieger et al. 2000]. Dabei kommt SEPT5 im gesamten Gehirn vor und wird
nur in Proben des Rückenmarks und der Medulla oblongata schwächer exprimiert gefunden
[Hainmann 2002]. In dieser Arbeit konnte SEPT5 in den Neuronen des gesunden
Hirngewebes festgestellt werden. Das Protein stellte sich immunhistochemisch diffus verteilt
im Neuropil dar. Die Verteilung ähnelte der synaptischer Proteine und wurde so auch in
anderen Arbeiten beschrieben [Caltagarone et al. 1998; Kinoshita, A. et al. 2000]. Kinoshita
Diskussion
47
et al. [2000] konnten SEPT5 elektonenmikroskopisch im präsynaptischen Bereich der Axone
nachweisen und so die vermutete Erklärung für dieses Verteilungsmuster bestätigen.
Einige Arbeiten deuten darauf hin, dass die Expression des Septins SEPT5 im Verlauf der
neuronalen Entwicklung zunimmt. Während im Gehirn von Embryonen anfangs nur eine
geringe Expression erkannt werden kann [Maldonado-Saldivia et al. 2000; Peng et al. 2002],
wird die stärkste Expression von SEPT5 im Gehirn erst postnatal erreicht [Peng et al. 2002].
Allerdings fand Hainmann [2002] im Northern Blot auch bei fetalem Gewebe SEPT5.
Außer im Gehirn wird eine deutliche Expression von SEPT5 noch im Herz und in
Thrombozyten beschrieben. In Proben anderer Gewebe konnte nur wenig oder kein SEPT5
nachgewiesen werden [Yagi et al. 1998; Toda et al. 2000; Zieger et al. 2000].
4.1.3. SEPT8 in gesundem Gewebe
Über Expressionsmuster des Septins SEPT8 liegen bisher weniger Daten vor als bei den
beiden zuvor beschriebenen Septinen. SEPT8 wird ebenfalls deutlich exprimiert im Gehirn
gefunden. Northern Blot-Analysen der Arbeitsgruppe Zieger ergaben eine recht einheitliche
Expression dieses Septins in verschiedenen Hirnregionen [Bläser et al. 2003]. Die hier
durchgeführte In-Situ-Hybridisierung und Immunhistochemie zeigten, dass SEPT8 wie schon
SEPT4 nicht nur in den Neuronen exprimiert wird, sondern sich auch in den Astrozyten
darstellen lässt. Zudem findet sich eine eher diffuse Verteilung des Proteins im Neuropil, die
derjenigen bei SEPT5 gefundenen entspricht.
Außer im Gehirn wird SEPT8 am stärksten noch in Gewebe von Herz, Ovar, Hoden, Prostata
und in Thrombozyten exprimiert [Bläser et al. 2002; Bläser et al. 2003; Bläser et al. 2004].
Diskussion
48
4.2. Expression der Septine in Hirntumoren
4.2.1. SEPT4 in Hirntumoren
Die untersuchten Tumoren wiesen teilweise eine deutliche Expression von SEPT4 auf.
Besonders in einigen Tumoren astroglialen Ursprungs fand sich eine mit normalem
Hirngewebe vergleichbar starke Expression von SEPT4. Schon Hainmann [2002] konnte im
Northern Blot verschiedener Tumorzelllinien die stärkste Expression von SEPT4 in der
Glioblastom-Zelllinie U373 feststellen. Auch immunhistochemisch ließ sich SEPT4 in der
Zelllinie U373 darstellen [Kim, D. S. et al. 2004], allerdings handelt es sich dabei um eine
andere Isoform, die von dem hier verwendeten Antikörper nicht detektiert wird. Dies ist
eventuell der Grund für die eher schwache Expression in den hier untersuchen Glioblastomen.
Möglich ist aber auch, dass sich die Expression in den Zelllinien von derjenigen in den
Tumoren unterscheidet. Eine denkbare Erklärung für die zum Teil starke Expression in den
Tumoren astroglialen Ursprungs wäre das Vorhandensein von SEPT4 auch in normalen
Astrozyten
[Kinoshita,
A.
et
al.
2000].
In
den
beiden
untersuchten
primitiv
neuroektodermalen Tumoren fand sich wenig bis kein SEPT4. Bisher gibt es kaum Literatur
zur Expression von SEPT4 in diesen Tumoren. Kim et al. [2004] wiesen in verschiedenen
Medulloblastom-Zelllinien SEPT4 nach, allerdings handelt es sich wie schon bei dem
Glioblastom um eine von dem Antikörper nicht detektierte Isoform.
4.2.2. SEPT5 in Hirntumoren
Bei der Verteilung von SEPT5 in den untersuchten Hirntumoren fällt im Vergleich zu SEPT4
zunächst eine in allen verwendeten Methoden weniger ausgeprägt darstellbare Expression auf.
Selbst in den Tumoren glialen Ursprungs, in denen noch die stärkste Expression von SEPT5
zu erkennen war, blieb diese deutlich geringer als in den Kontrollproben aus gesundem
Hirngewebe. Schon in vorhergegangenen Expressionsanalysen der Glioblastom-Zelllinie
U373 zeigte sich dieser Unterschied zu SEPT4 [Hainmann 2002]. Auch Kim et al. [2004]
konnten SEPT5 in dieser Zelllinie immunhistochemisch nur schwach darstellen. SEPT5 findet
sich - anders als SEPT4 - wenig oder gar nicht in normalen Astrozyten, es scheint vielmehr
ein überwiegend neuronal exprimiertes Protein zu sein. Dieser Unterschied könnte auch die
geringere Expression dieses Septins in den Tumoren astroglialen Ursprungs begründen. Die
Diskussion
49
primitiven neuroektodermalen Tumoren wiesen keine Expression von SEPT5 auf. Da auch im
gesunden Gehirn SEPT5 erst im Verlauf der Entwicklung exprimiert wird [MaldonadoSaldivia et al. 2000; Peng et al. 2002], ist dies möglicherweise eine Erklärung für das Fehlen
in diesen nicht bis wenig differenzierten Tumoren.
4.2.3. SEPT8 in Hirntumoren
Das Septin SEPT8 wurde in allen hier untersuchten Tumoren nachgewiesen - mit Ausnahme
der primitiven neuroektodermalen Tumoren, in denen auch die beiden anderen Septine wenig
oder nicht exprimiert wurden. Die Expression von SEPT8 in den Tumoren ist ebenso stark
wie im normalen Hirngewebe. Das durchgehende Vorkommen in den Tumoren glialen
Ursprungs ließe sich wieder durch die ebenfalls dargestellte Expression von SEPT8 in den
normalen Astrozyten erklären. Von Interesse ist hier jedoch die unterschiedliche Expression
der einzelnen Spleißvarianten. Während in den Proben des normalen Hirngewebes die
Isoformen SEPT8_v1 und in geringerer Stärke SEPT8_v3 zu finden sind, überwiegt in den
Tumoren SEPT8_v3. SEPT8_v1 wird in den meisten Tumoren sehr viel schwächer exprimiert
oder ist nicht nachweisbar. Die dritte und größte Isoform SEPT8_v2 findet sich dagegen nur
in
den
Proteinextraktionen
der Tumoren.
Bisher
gibt
es
kaum
Literatur über
Expressionsmuster von SEPT8 in Tumoren. Jersch [2003] untersuchte mit Hilfe von Northern
Blots die mRNA-Expression von SEPT8 in verschiedenen Tumorzelllinien. Alle dort
untersuchten Hirntumor-Zelllinien wiesen SEPT8 auf, die Medulloblastom-Zelllinie Daoy
und die Neuroblastom-Zelllinie HN 25 zeigten zudem die in dieser Arbeit beschriebene
typische Verteilung der Spleißvarianten mit Überwiegen von SEPT8_v3 und SEPT8_v2.
Bläser et al. [2004] berichteten gleiches für die Glioblastom-Zelllinie U373.
4.2.4. Weitere Septine in Tumoren
Neben SEPT4, SEPT5 und SEPT8 wurden weitere Septine in Hirntumoren nachgewiesen. In
verschiedenen Gliom- und Medulloblastom-Zelllinien konnten auch SEPT2, SEPT6, SEPT7,
SEPT9 und SEPT11 gefunden werden. SEPT3 zeigte sich nur in den MedulloblastomZelllinien [Sakai et al. 2002; Kim, D. S. et al. 2004]. Zudem wurde über Septine in anderen
Tumoren berichtet, wobei sich die Expression in den Tumoren zum Teil von der in gesundem
Gewebe unterschied. SEPT4 konnte von mehreren Autoren in Kolonkarzinomen
Diskussion
50
nachgewiesen werden, nicht jedoch im gesunden Kolongewebe [Kostic and Shaw 2000;
Tanaka et al. 2001; Hainmann 2002; Tanaka et al. 2002]. Über die Expression von SEPT9 in
Tumoren gibt es unterschiedliche Ergebnisse. Während Montagna et al. [2003] eine
Überexpression von SEPT9 in Brustkrebs-Zelllinien beschrieben, fanden Russel et al. [2000]
in Ovarialtumoren teilweise eine Deletion von SEPT9. Für diese Tumoren wurde zuletzt auch
ein verändertes Expressionsmuster mit vermehrter Expression einer Spleißvariante von
SEPT9 nachgewiesen [Burrows et al. 2003].
4.3. Bedeutung der Septine in der Zytokinese
Welche Funktion haben nun die Septine in den Hirntumoren? Eine mögliche Erklärung ist
ihre Bedeutung in der Zytokinese. Wie einleitend beschrieben, ist inzwischen gut bekannt,
dass die Septine in Hefe, aber auch in tierischen Zellen für eine funktionierende Zellteilung
essentiell sind. Auch in Zellen von Säugetieren und Menschen konnte ein derartiger
Zusammenhang gezeigt werden. Am besten untersucht ist die Funktion des Septins SEPT2
während der Zytokinese. Kinoshita et al. [1997] konnten mit einer Injektion von SEPT2Antikörpern in Zellen zeigen, dass eine Blockierung des Septins zu einer verlängerten
Zytokinesedauer und zur Entstehung binukleärer Zellen führt, ähnlich den bei D.
melanogaster beobachteten [Neufeld and Rubin 1994]. Des Weiteren konnten sie darstellen,
dass SEPT2 sich während der Anaphase und frühen Telophase an der Membran nahe des
kontraktilen Rings findet [Kinoshita, M et al. 1997]. Während der Interphase und
postmitotisch war SEPT2 lokalisiert an den Stressfasern, deren Vorhandensein Voraussetzung
für die Bildung der Septinfilamente und deren regelrechte Lokalisation ist [Kinoshita, M et al.
1997]. Später konnten Kinoshita et al. [2002] ebenfalls zeigen, dass umgekehrt SEPT2 auch
für die normale Bildung von Stressfasern notwendig ist. Schmidt et al. [2004] kamen
ebenfalls zum Ergebnis, dass SEPT2 für die Aufrechterhaltung und Stabilisierung von
Stressfasern von Bedeutung ist und zudem ohne SEPT2 die Expression von Aktin verringert
wird. Eine Phosphorylierung von SEPT2 wird als Steuerungsmechanismus diskutiert [She et
al. 2004]. Um die Funktion dieses Septins in Tumorzellen zu verstehen, untersuchten Kim et
al. [2004] die Expression von SEPT2 in der Glioblastom-Zelllinie U373. Dabei konnten sie
eine zellzyklusabhängige Expression von SEPT2 feststellen mit einem maximalen Level
während der G2-und M-Phase. Wie schon bei Kinoshita et al. [1997] zeigte sich SEPT2
während der Zellteilung an der zytoplasmatischen Teilungsfurche. Zudem wiesen die Zellen
Diskussion
51
der Glioblastom-Zelllinie U373 ohne Expression von SEPT2 ebenfalls eine nicht vollständige
Zellteilung auf. Alle diese Ergebnisse sprechen für die Notwendigkeit von SEPT2 für eine
regelrechte Zellteilung in gesundem Gewebe und in Hirntumoren.
Ein anderes Septin, dessen Bedeutung für den Zellzyklus schon näher untersucht wurde, ist
SEPT9. In der Interphase wird SEPT9 kolokalisiert mit Stressfasern, Mikrotubuli und dem
Septin SEPT2 gefunden. Während der Mitose scheint SEPT9 dagegen primär mit Tubulin an
den Spindeln zu interagieren [Surka et al. 2002; Nagata, K. et al. 2003]. Wie bei SEPT2 findet
in Zellen, die mit Antikörpern gegen SEPT9 oder siRNA behandelt wurden, keine normale
Zellteilung statt, und es treten multinukleäre Zellen auf [Surka et al. 2002; Nagata, K. et al.
2003]. Immunhistochemische Untersuchungen zeigen außerdem, dass SEPT9 für eine
normale Lokalisation der Mikrotubuli nötig ist [Nagata, K. et al. 2003].
Für die in dieser Arbeit untersuchten Septine SEPT4, SEPT5 und SEPT8 sind ähnliche
Funktionen in der Zytokinese am besten für SEPT4 beschrieben. Xie et al. [1999] konnten für
SEPT4 eine Lokalisation an Stressfasern und während der Zytokinese an der Teilungsfurche
darstellen, ähnlich wie dies für SEPT2 berichtet wurde. Anders als bei SEPT2 findet sich bei
weiteren Septinen, darunter SEPT4 und SEPT5, jedoch keine zellzyklusabhängige Expression
[Whitfield et al. 2002]. In Kolonkarzinom-Zelllinien konnte gezeigt werden, dass eine
abgeschwächte Expression von SEPT4_v1 und SEPT4_v4 das Wachstum der Tumorzellen
inhibiert und zu einem G2-Arrest führt [Tanaka et al. 2002]. Da SEPT4 nur im Tumorgewebe,
nicht aber im gesunden Kolon exprimiert wird, erwägt man auch eine diagnostische und
therapeutische Bedeutung [Tanaka et al. 2002; Tanaka et al. 2003]. Neueste Arbeiten mit
SEPT4_null-Mäusen zeigen, dass SEPT4 für die Spermatogenese essentiell ist und die
Männchen dieser Mäuse unfruchtbar sind [Ihara et al. 2005; Kissel et al. 2005]. Da sie
allerdings wie auch SEPT5_null-Mäuse lebensfähig sind, kann man davon ausgehen, dass
SEPT4 für die Zytokinese nicht zwingend erforderlich ist. Die Mäuse zeigen jedoch einige
Auffälligkeiten. So ist der ATP-Verbrauch der Spermatozoen verringert und die Expression
von Aktin schwächer [Ihara et al. 2005].
Das Septin SEPT5 wurde bisher überwiegend mit anderen Funktionen als der Zytokinese in
Verbindung gebracht, insbesondere aufgrund der ausgeprägten Expression in Gewebe, das
kaum Zellteilungsaktivität aufweist. Auch Untersuchungen an SEPT5_null-Mäusen legen
nahe, dass dem Septin SEPT5 keine essentielle Rolle bei der Zellteilung zukommt, da diese
Diskussion
52
Mäuse eine fast normale Entwicklung und keine Zytokinesedefekte zeigen. Allerdings wird
ein Fehlen von SEPT5 eventuell durch eine erhöhte Expression anderer Septine wie SEPT2
ausgeglichen [Peng et al. 2002].
Über das Septin SEPT8 liegen bisher keine vergleichbaren Daten vor. Es wurden jedoch
schon einige Interaktionen dieses Septins mit anderen beschrieben. Unter diesen
Interaktionspartnern sind SEPT4, SEPT5 und SEPT7, denen zum Teil eine Bedeutung in der
Zytokinese zugeschrieben wird [Bläser et al. 2002; Bläser et al. 2004; Nagata, K. et al. 2004].
Auf die Rolle dieser Septininteraktionen soll später eingegangen werden.
4.4. Weitere Ansätze für die Bedeutung von Septinen in
Tumorzellen
Neben der Wichtigkeit der Septine bei der Zytokinese und der eingangs erwähnten
Identifikation von Septinen als Fusionsproteine von MLL bei akuten Leukämien nach
Chromosomentranslokationen werden weitere Funktionen der Septine diskutiert, die auch von
Interesse für deren Bedeutung in Tumorgewebe sind. Zum einen konnte ein Zusammenhang
zwischen Septinen und Apoptose festgestellt werden. Larisch et al. [2000] beschrieben als
erste die Rolle einer Isoform von SEPT4, SEPT4_v2, in der Apoptose. Die Apoptose ist eine
Form des programmierten Zelltodes, die von großer Bedeutung bei malignen Tumoren und
anderen Erkrankungen ist. SEPT4_v2 befindet sich zunächst in den Mitochondrien, wird in
den Kern verlagert und führt dabei zur Aktivierung von Kaspasen, denen eine entscheidende
Stellung beim Ablauf der Apoptose zugeschrieben wird [Larisch et al. 2000]. Neuere
Ergebnisse legen nahe, dass SEPT4_v2 das Protein XIAP, einen Inhibitor der Kaspasen,
bindet und so diese aktiviert [Gottfried, Rotem et al. 2004]. Zwei Studien beschäftigen sich
mit der Bedeutung dieser Isoform in malignen Tumoren. Elhasid et al. [2004] wiesen ein
Fehlen von SEPT4_v2 in den Lymphoblasten von Kindern nach, die an akuter lymphatischer
Leukämie erkrankt waren. Zudem zeigten die Autoren, dass in Leukämie-Zelllinien ohne
SEPT4_v2 keine Apoptose induziert werden kann. Gottfried et al. [2004] untersuchten die
Expression von SEPT4_v2 in Tumoren astroglialen Ursprungs. Dabei stellten sie allerdings
mit zunehmender Malignität der Tumoren eine steigende Expression von SEPT4_v2 fest.
Während in niedriggradigen Astrozytomen ( WHO I ) kaum SEPT4_v2 gefunden wurde, war
die Expression in Glioblastomen ( WHO IV ) am höchsten. Die vermehrte Expression von
Diskussion
53
SEPT4_v2 korreliert mit einer erhöhten Apoptoserate. Die Autoren verglichen zudem die
Überlebenszeiten von Patienten, deren Tumoren entweder eine hohe Expression von
SEPT4_v2 oder eine geringe bis fehlende Expression zeigten. Dabei konnten sie ein längeres
Überleben bei Patienten nachweisen, bei denen keine oder eine nur geringe Expression von
SEPT4_v2 zu erkennen war. Daher schreiben sie SEPT4_v2 auch eine diagnostische und
eventuell therapeutische Bedeutung zu [Gottfried, Voldavsky et al. 2004]. Dieser
Zusammenhang zwischen SEPT4 und Apoptose konnte bisher nur für die Isoform SEPT4_v2
gezeigt werden. Da SEPT4_v2 von dem in dieser Arbeit verwendeten Antikörper und der
Sonde nicht erkannt wird, kann keine Aussage über die Expression dieser Spleißvariante
gemacht werden. Der von den Autoren beschriebene Zusammenhang von höherer Expression
mit zunehmender Malignität konnte für die hier erkannten Spleißvarianten nicht gefunden
werden.
In diesem Zusammenhang ist die mehrfach beschriebene Korrelation zwischen der Expression
von p53 und SEPT4 von Interesse [Kostic and Shaw 2000; Gottfried, Voldavsky et al. 2004].
Dem Protein p53 werden viele verschiedene Regulationsfunktionen im Zellzyklus, aber auch
bei der Onkogenese und der Apoptose zugeschrieben. Weshalb eine erhöhte Expression von
p53 mit einer ebenfalls erhöhten von SEPT4 oder umgekehrt einhergeht, ist bisher nicht
bekannt. Außerdem wurden Interaktionen zwischen Septinen und weiteren Proteinen, die für
die Onkogenese von Wichtigkeit sind, berichtet. So interagieren die Septine SEPT2, SEPT6
und SEPT7 mit S100A4, einem Protein, das mit der Metastasierung von malignen Tumoren
assoziiert wird [Koshelev et al. 2003].
Als weiterer Ansatzpunkt für die Bedeutung der Septine wird der Zusammenhang zwischen
Onkogenese und Membranvorgängen wie Exozytose bzw. Endozytose erwogen [Hall and
Russell 2004]. Eine solche Verknüpfung wäre besonders von Bedeutung für SEPT5, da
inzwischen verschiedene Arbeiten eine Regulation von Exozytosevorgängen durch dieses
Septin nachweisen konnten. So ist bekannt, dass SEPT5 an Syntaxin bindet und die
Exozytose inhibiert [Beites et al. 1999; Beites et al. 2001]. Neuere Arbeiten zeigen, dass
SEPT5 mit α-SNAP um die Bindungsstelle an SNARE-Proteinen konkurriert. Diese SNAREProteine werden für das Andocken und/ oder die Fusion der Vesikel mit der Plasmamembran
verantwortlich gemacht [Beites et al. 2004]. Auch weisen die Thrombozyten von
SEPT5_null-Mäusen Defekte in der Sekretion auf. Diese Thrombozyten sezernieren
Serotonin schon bei unterschwelligen Reizen. Daher wird angenommen, dass der
Diskussion
54
inhibitorische Effekt von SEPT5 für eine regelrechte und zeitlich koordinierte Sekretion
notwendig ist [Dent et al. 2002]. Daneben gibt es weitere Arbeiten, die über einen
Zusammenhang zwischen SEPT5 und Exozytosevorgängen berichten [Zhang, Y. et al. 2000;
Dong et al. 2003].
Aber auch andere Septine haben eine Bedeutung bei diesen Vorgängen. In Thrombozyten
konnten neben SEPT5 auch SEPT8 und SEPT4 um α-Granula lokalisiert gefunden werden
[Bläser et al. 2002; Bläser et al. 2004]. Die Septine SEPT2, SEPT4, SEPT6 und SEPT7 sind
ebenfalls an der Exozytose beteiligt. Alle diese Septine interagieren mit dem sec6/8-Komplex,
der auf der Plasmamembran Bereiche für den Exozytoseprozess markiert [Hsu, S. C. et al.
1998]. Zuletzt konnten Kinoshita et al. [2004] zudem in Astrozyten eine Steuerung des
Glutamat-Transporters GLAST durch SEPT2 zeigen. Ohne SEPT2 nehmen die Astrozyten
weniger Glutamat auf. Ebenfalls bei der Endozytose beteiligt zu sein scheint SEPT9, das um
Phagosome lokalisiert gefunden wurde [Pizarro-Cerda et al. 2002].
Zusammengefasst verdeutlichen diese Arbeiten, dass viele Septine, darunter die in dieser
Arbeit untersuchten, Funktionen in Exozytose- und Endozytoseprozessen wahrnehmen.
Diesen Prozessen wird eine Bedeutung in der Biologie von Tumorzellen zugeschrieben
[Floyd and De Camilli 1998; Bryant and Stow 2004; Polo et al. 2004]. Wie Exozytose und
Endozytose auf die Vorgänge in Tumorzellen Einfluss nehmen, ist noch nicht abschließend
geklärt. Derzeit wird diskutiert, ob die Endozytose über eine Abschwächung antiproliferativer
Signale wirkt [Polo et al. 2004].
4.5. Expressionsmuster einzelner Spleißvarianten und funktionelle
Differenzierung
Wie bereits beschrieben, existieren von den meisten bekannten Septinen verschiedene
Spleißvarianten. Das alternative Spleißen von mRNA führt dazu, dass von vielen Septinen
mehrere verschiedene Proteine translatiert werden. Die meisten Spleißvarianten sind von
SEPT9 bekannt. Bisher wurden 18 verschiedene Transskripte dieses Septins entdeckt, die für
15 verschiedene Proteine kodieren [McIlhatton et al. 2001; Hall and Russell 2004]. Aber auch
von allen hier untersuchten Septinen gibt es mehrere Spleißvarianten.
Diskussion
55
Für verschiedene Spleißvarianten wurden zudem spezifische Expressionsmuster gefunden.
Untersuchungen von Tumorzelllinien zeigten, dass die Spleißvarianten von SEPT9 sehr
unterschiedlich exprimiert werden [Robertson et al. 2004]. Außerdem wird in Ovarialtumoren
ein Transskript von SEPT9 (zeta) gefunden, das in gesundem Gewebe nicht exprimiert wird
[Burrows et al. 2003]. Wie die Ergebnisse der hier durchgeführten Untersuchung und anderer
Arbeiten zeigen, wird für SEPT4_v2 in Tumoren glialen Ursprungs ein anderes
Expressionsmuster beschrieben als für die hier untersuchten Spleißvarianten dieses Septins
[Gottfried, Voldavsky et al. 2004]. Ferner war in Lymphoblasten von Patienten mit akuter
lymphatischer Leukämie, die keine Expression von SEPT4_v2 aufwiesen, kein Verlust von
SEPT4_v1 zu sehen [Elhasid et al. 2004]. Bei den in der vorliegenden Arbeit untersuchten
Geweben zeigte sich für SEPT8 ein Unterschied zwischen den exprimierten Spleißvarianten
im gesunden Hirngewebe und den Tumoren. Während sich im gesunden Gehirn vornehmlich
SEPT8_v1 fand, überwogen in den Tumoren die Varianten SEPT8_v3 und SEPT8_v2 (siehe
Seite 49). Auch gibt es Unterschiede bei der Lokalisation verschiedener Isoformen in der
Zelle. Während sich SEPT4_v2 mitochondrial findet, wurde zumindest für zwei andere
Isoformen eine zytoplasmatische oder membranassoziierte Lokalisation beschrieben [Xie et
al. 1999; Bläser et al. 2004; Larisch 2004], die sich auch mit den Ergebnissen dieser Arbeit
deckt.
Welche Bedeutung haben die verschiedenen Spleißvarianten? Eine Reihe von Daten deuten
darauf hin, dass es eine funktionelle Differenzierung gibt. SEPT4_v2 wird eine Bedeutung in
der Apoptose zugeschrieben [Gottfried, Rotem et al. 2004]. Ein solcher Zusammenhang
konnte für die anderen Isoformen nicht gezeigt werden und ist aufgrund der unterschiedlichen
Expressionsmuster und der zellulären Lokalisation wohl auch nicht unbedingt anzunehmen.
In Mausgewebe wurde eine weitere Isoform von SEPT4 gefunden, die während der
neuronalen Differenzierung hochreguliert ist und mit Proteinen interagiert, die dabei von
Bedeutung sind. Auch diese Interaktion weist SEPT4_v1 nicht auf [Takahashi et al. 2003].
Auch wenn diese Ergebnisse sicher erst den Anfang der Forschung in diesem Bereich
darstellen, wird jetzt schon deutlich, dass sich die Funktionen der Proteingruppe der Septine
durch das alternative Spleißen noch zusätzlich komplexer gestalten.
Diskussion
56
4.6. Die Septine SEPT4, SEPT5 und SEPT8 als Teil eines Komplexes
Eine weitere charakteristische Eigenschaft der Septine ist die Bildung von Komplexen. Wie
schon für die Septine in Hefe und anderen Modellorganismen beschrieben, findet man
vielfältige Interaktionen zwischen den Mitgliedern dieser Proteingruppe. Auch für die Septine
der Säugetiere und des Menschen konnte in den letzten Jahren eine derartige
Zusammenlagerung nachgewiesen werden [Kinoshita, M. 2003]. Besonders interessant für die
hier beschriebenen Untersuchungen sind die Ergebnisse von Bläser et al. [2002; 2004], die
eine Interaktion von SEPT8 mit SEPT4 und SEPT5 zeigen konnten. Auch Martinez et al.
[2004] konnten darstellen, dass diese drei Septine sowohl mit sich selbst (homotypisch) als
auch mit den jeweils beiden anderen (heterotypisch) interagieren. Zudem konnten sie für
SEPT5 und SEPT8 zeigen, dass das Vorhandensein des jeweils anderen für eine normale
Lokalisation in den Zellen notwendig ist. Auch andere Septine interagieren miteinander.
Kinoshita et al. [2002] und Sheffield et al. [2003] fanden eine Interaktion von SEPT2, SEPT6
und SEPT7 und konnten zudem darstellen, dass sich diese Septine zu Filamenten
zusammenlagern. Auch Nagata et al. [2004] beschrieben eine Komplexbildung von SEPT7,
SEPT9 und SEPT11, zudem interagieren offensichtlich auch SEPT2 und SEPT8 mit SEPT7.
Doch wie binden die Septine aneinander? Für die Septine SEPT4, SEPT5 und SEPT8 wurde
die Bedeutung der verschiedenen Domänen für die Interaktion untersucht [Bläser et al. 2004;
Martinez et al. 2004]. Für die homotypische Interaktion aller drei Septine konnte die Cterminale Coiled-Coil-Domäne als Bindungsvoraussetzung identifiziert werden, während die
heterotypische Interaktion nicht auf diese Domäne angewiesen ist [Martinez et al. 2004].
Zumindest für eine SEPT5-SEPT5 und SEPT8-SEPT8 Bindung war zudem der N-terminale
Bereich Voraussetzung. Für die heterotypische Interaktion von SEPT5 und SEPT8 [Martinez
et al. 2004] scheint die zentrale GTP-Bindungsdomäne verantwortlich zu sein. Dagegen
zeigten Bläser et al. [2004] die Notwendigkeit des N-Terminus für die Interaktion von SEPT4
und SEPT8. Sheffield et al. [2003] stellten für die heterotypische Interaktion zwischen SEPT6
und SEPT7 die Coiled-Coil-Domäne als entscheidend dar. Auch Nagata et al.
[2004]
identifizierten den N-und C-Terminus als entscheidende Region für die heterotypische
Interaktion von SEPT7, SEPT9 und SEPT11. Diese unterschiedlichen Ergebnisse zeigen, dass
bisher noch keine einheitlichen Interaktionsmechanismen der Septine gefunden werden
konnten. Ob es solche gibt, muss in weiteren experimentellen Arbeiten untersucht werden.
Die Rolle der GTP-Bindungsdomäne ist ebenfalls noch nicht geklärt. Neuere Ergebnisse
Diskussion
57
zeigen, dass die Septinkomplexe in Hefe kaum GTPase-Aktivität besitzen [Vrabioiu et al.
2004], weshalb diskutiert wird, ob die GTP-Bindung eher für die regelrechte Proteinstruktur
benötigt wird und so eine strukturelle Bedeutung für die Septine hat [Mitchison and Field
2002; Vrabioiu et al. 2004].
Jedenfalls scheinen die Komplexe für die Wahrnehmung der Funktionen der Septine
notwendig zu sein. Sheffield et al. [2003] stellten fest, dass Borg3, ein Effektor von cdc42, an
Dimere von SEPT6 und SEPT7 sowie Trimere von SEPT2, SEPT6 und SEPT7 bindet, nicht
jedoch an Monomere dieser Septine. Da SEPT5 für eine reguläre zelluläre Lokalisation auf
das Vorhandensein von SEPT8 angewiesen ist [Martinez et al. 2004], ist es interessant zu
untersuchen, ob die Funktionen von SEPT5 bei der Exozytose ohne SEPT8 eingeschränkt
sind. Auch ob fehlende Septine durch solche mit ähnlicher Struktur ersetzt werden können,
wie es erste Ergebnisse bei SEPT5_null Mäusen von Peng et al. [2002] vermuten lassen, ist
noch ungeklärt.
4.7. Septine bei anderen neurologischen Erkrankungen
Die Septine wurden außer bei Hirntumoren auch bei verschiedenen anderen neurologischen
Erkrankungen gefunden. Kinoshita et al. [1998] entdeckten zunächst, dass die Septine SEPT2
und SEPT4 in Neurofibrillen bei Patienten mit Morbus Alzheimer vorhanden sind. Ihara et al.
[2003] konnten das Vorkommen von SEPT4 auch in intraneuronalen Einschlüssen bei
Morbus Parkinson und multipler Systematrophie bestätigen, die Septine SEPT2, SEPT5,
SEPT6, SEPT7 und SEPT8 konnten dort jedoch nicht nachgewiesen werden. SEPT4 bildet
einen Komplex mit α-Synuklein und Synphilin und führt in dieser Kombination zum
Untergang der Zellen [Ihara et al. 2003].
In den letzten Jahren rückte zudem eine neue Verbindung zwischen Morbus Parkinson und
den Septinen in den Mittelpunkt der Forschung. Die Isoform SEPT5_v2 konnte als
Interaktionspartner von Parkin identifiziert werden [Choi et al. 2003]. Dem Protein Parkin
wird eine Schlüsselfunktion bei der Entstehung der autosomal-rezessiven juvenilen Form des
Parkinson zugeschrieben, da es als Ubiquitin-Ligase den Abbau bestimmter Proteine, unter
anderen SEPT5, in Neuronen bewirkt [Zhang, Y. et al. 2000; Mizuno et al. 2001]. Beim
autosomal-rezessiven Parkinson liegt eine Mutation im Parkin-Gen vor, die zum
Diskussion
58
Funktionsverlust von Parkin führt. Daraus könnte ein vermehrtes Vorkommen von SEPT5
resultieren. Dong et al. [2003] konnten zeigen, dass eine Überexpression von SEPT5 eine
verminderte Sekretion von Dopamin bewirkt, dessen neurotoxische Wirkung den Untergang
der Neurone der Substantia nigra zur Folge hat.
Daneben wurde SEPT5 mit dem DiGeorge-Syndrom in Verbindung gebracht, da eine bei
DiGeorge häufige Deletion auf dem Chromosom 22q11 auch den Genlocus von SEPT5
umfasst [McKie et al. 1997]. Zudem wird diese mögliche Verbindung durch Untersuchungen
der Expression von SEPT5 während der Embryonalentwicklung gestützt [Maldonado-Saldivia
et al. 2000]. Auch wenn die Beobachtungen an der SEPT5_null-Maus gezeigt haben, dass ein
Fehlen von SEPT5 nicht zwangsläufig zur Ausbildung eines vergleichbaren Krankheitsbildes
führt, kann das Auftreten von eher diskreten Symptomen des DiGeorge Syndroms nicht
ausgeschlossen werden [Dent et al. 2002; Hainmann 2002]. Da außerdem bekannt ist, dass
Patienten mit einem DiGeorge-Syndrom ein erhöhtes Risiko haben, an einer Schizophrenie zu
erkranken, ist die Arbeit von Barr et al. [2004] von Interesse. Sie stellten bei Ratten nach
Isolation eine geringere Expression von SEPT5 im Striatum fest, weshalb eine Bedeutung
dieses Septins bei der Entstehung von Schizophrenie diskutiert wird.
Außerdem findet sich im Gehirn von Föten mit Morbus Down eine abgeschwächte
Expression von SEPT6 und SEPT7 sowie eine gesteigerte Expression von SEPT9 [Cheon et
al. 2001; Engidawork et al. 2003]. Bei Mäusen mit motorischen Defiziten wird zudem eine
erniedrigte Expression von SEPT5 berichtet. Und zuletzt soll Ecstasy die Expression von
SEPT2 und SEPT5 im Mittelhirn verringern [Simantov and Peng 2004]. Auch wenn bei
vielen dieser Zusammenhänge der Mechanismus noch nicht bekannt ist, zeigen diese
Arbeiten, dass die Septine einen Einfluss auf verschiedene neurologische Funktionen und
damit verbundene Erkrankungen haben.
Diskussion
59
4.8. Schlussfolgerungen und Ausblick
Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen eine unterschiedliche Expression der untersuchten Septine
SEPT4, SEPT5 und SEPT8 in den verschiedenen Hirntumoren erkennen. In den primitiven
neuroektodermalen Tumoren zeigte keines der drei Septine eine deutliche Expression. In
Tumoren astroglialen Ursprungs waren SEPT4 und SEPT8 teilweise stark exprimiert. Welche
Bedeutung haben diese Ergebnisse für Zellvorgänge in den Tumoren? Zum jetzigen Zeitpunkt
kann dies noch nicht abschließend beantwortet werden. Auch wenn einige der hier
diskutierten Funktionen der Septine experimentell schon recht gut gesichert sind, ist deren
Mechanismus meist noch nicht oder nur ansatzweise bekannt. In den letzten Jahren hat sich
der Wissensstand über die Septine und deren Funktionen zwar rasch vergrößert, aber gerade
über das Septin SEPT8 und dessen drei Spleißvarianten ist erst wenig bekannt. Möglichweise
ist die hier gefundene unterschiedliche Expression der Spleißvarianten Zeichen einer
funktionellen Differenzierung, welche wiederum eine Bedeutung für zelluläre Funktionen
haben könnte, wie dies für Spleißvarianten von SEPT4 gezeigt wurde [Elhasid et al. 2004;
Gottfried, Voldavsky et al. 2004].
Neben der Bindung der Septine untereinander werden auch immer neue Interaktionspartner
außerhalb dieser Proteingruppe gefunden, die eine Verknüpfung mit Proteinen wie z.B. cdc42
ergeben. Diese haben wiederum wichtige Schlüsselfunktionen in den Zellen [Sheffield et al.
2003; Nagata, K. I. and Inagaki 2004]. Die Erforschung dieser Interaktionen beginnt erst und
es ist noch nicht ausreichend zu beurteilen, inwieweit die genannten Ergebnisse auch in vivo
eine Rolle spielen. Ferner ist zu erwarten, dass die Zahl der bekannten Septine und ihrer
Spleißvarianten weiter ansteigt.
Weitergehende Studien sollten daher besonders die Funktionen der Septine, ihrer
Spleißvarianten bzw. Isoformen sowie deren Komplexe näher erforschen. Hierfür sind
zusätzliche Antikörper notwendig, die spezifisch die verschiedenen Septine, aber möglichst
auch deren Isoformen detektieren. Auch im Bereich der hier untersuchten Tumoren gibt es
vielfältige Möglichkeiten, die Funktionen der Septine besser zu erfassen. Denkbar sind
Arbeiten mit Hirntumor-Zelllinien, die Auswirkungen fehlender Septine einzeln oder in
Kombination untersuchen, wie dies für SEPT2 in der Glioblastom-Zelllinie U373 dargestellt
wurde [Kim, D. S. et al. 2004]. So könnte die Bedeutung der Septine, auch der hier
Diskussion
60
untersuchten, bei der Zytokinese und anderen Zellvorgängen besser geklärt werden. Auch
eine weitere Untersuchung der unterschiedlichen Funktionen der Isoformen von SEPT4 und
SEPT8 ist von großem Interesse.
Zusammenfassung
61
5. Zusammenfassung
Die Septine sind GTP-bindende Proteine, die erst seit wenigen Jahren intensiv erforscht
werden. Ursprünglich wurden sie in Hefe Saccharomyces cerevisiae entdeckt, dort schreibt
man ihnen wichtige Funktionen bei der Zytokinese zu. Septine kommen aber auch in den
Zellen der Säugetiere und des Menschen vor, in denen sie mit weiteren Zellvorgängen,
darunter der Exozytose und Apoptose, in Verbindung gebracht werden. Außerdem werden sie
in einer zunehmenden Anzahl von Forschungsarbeiten im Zusammenhang mit Neoplasien
diskutiert. In dieser Arbeit wurde die Expression von drei Septinen – SEPT4, SEPT5 und
SEPT8 – in Hirntumoren untersucht. Neben Gewebeproben von gesundem Gehirn wurden
Proben von Astrozytomen WHO I-III, Glioblastomen, Oligoastrozytomen, Ependymomen
und primitiven neuroektodermalen Tumoren verwendet. Außer Western Blot-Analysen wurde
mit
den
Schnittpräparaten
der
Tumoren
eine
In-Situ-Hybridisierung
sowie
eine
Immunhistochemie durchgeführt. Im gesunden Gehirn konnte dabei eine Expression aller drei
untersuchten Septine in den Neuronen und von SEPT4 und SEPT8 in den Astrozyten
festgestellt werden. Die Expressionsuntersuchungen der Tumoren ergaben kein einheitliches
Bild. In den primitiven neuroektodermalen Tumoren fand sich für keines der hier
untersuchten Septine eine deutliche Expression. In einem Teil der Tumoren astroglialen
Ursprungs war die Stärke der Expression von SEPT4 und SEPT8 mit der des gesunden
Gewebes vergleichbar, in dem diese schon in den Astrozyten exprimiert worden waren.
Zudem fiel im Western Blot ein Unterschied bei der Expression der verschiedenen
Spleißvarianten von SEPT8 zwischen dem gesunden Hirngewebe und den Tumoren auf. Im
gesunden Gewebe zeigte sich vor allem die Isoform SEPT8_v1, in den Tumoren hingegen
überwogen die Isoformen SEPT8_v2 und SEPT8_v3. Neben der Bedeutung verschiedener
Septine bei der Zytokinese werden darüber hinaus weitere zelluläre Funktionen dieser
Proteine diskutiert, die in den Tumoren von Relevanz sein könnten. Auch eine funktionelle
Differenzierung der Spleißvarianten von SEPT8 sowie die Interaktion der drei untersuchten
Septine werden erörtert.
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76
Anhang
77
7. Anhang
Hier werden alle Chemikalien aufgeführt, die nicht im Kapitel „Material und Methoden“
beschrieben wurden.
7.1. Chemikalien für die In- Situ- Hybridisierung und
Immunhistochemie
30% H2 O2
Otto Fischar
36,5% Formaldehyd
Riedel- deHaёn
Aceton
Merck
BSA
Paesel+ Lorei
Dabco
Aldrich
Dextransulfat
Sigma
DTT (1,4-Dithiothreitol)
Carl Roth
EDTA
Sigma
Essigsäure Anhydrid
Carl Roth
Ethanol
J.T.Baker
Ficoll 400
Fluka Chemie
Formamid (deionisiert)
Carl Roth
Glycerol 85%
Otto Fischar
Hämatoxylin
Merck
Histofluid
Marienfeld
KH2PO4
Merck
Maleinsäure
Fluka Chemie
Methanol
Merck
MgCl2
Merck
Mowiol
Calbiochem
Na2HPO4
Merck
NaCitrat
Merck
NaCl
Fluka Chemie
NaN3
Merck
Anhang
78
Polyvinylpyrrolidon
Sigma
Proteinase K
Peqlab
Tris
Carl Roth
t-RNA
Sigma
Xylol
Fluka Chemie
7.2. Chemikalien für den Western Blot
0,5% Phenol Red
Sigma
Coomassie Brillant Blau
Merck
EDTA
Sigma
Eisessig
Merck
Glycerol
Sigma
Glycin
Carl Roth
LDS
Merck
Magermilchpulver
Difco, Becton Dickinson
Methanol
Merck
MOPS
Carl Roth
NaCl
Sigma
Ponceau S
USB corporation
SDS
Sigma
Tris
Sigma
Twean
Sigma
β- Mercaptoethanol
Sigma
Abkürzungsverzeichnis
79
8. Abkürzungsverzeichnis
AI
Astrozytom WHO I
A II
Astrozytom WHO II
A III
Astrozytom WHO III
AP
alkalische Phosphatase
AS
Aminosäuren
ATP
Adenosintriphosphat
BCIP
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-Phosphat
bp
Basenpaare
BSA
Rinderserumalbumin
C
Celsius
C.
Caenorhabditis
CC
Coiled- Coil Domäne
CDC
cell-division-cycle
D.
Drosophila
DAB
3,3´ Diaminobenzidin
DIG
Digoxigenin
DMF
Dimethyl-formamid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
DTT
1,4-Dithiothreitol
EDTA
Ethylendiamin-tetraessigsäure
EP III
Ependymom WHO III
g
Gramm
GAPDH
Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
GBD
GTP- Bindungsdomäne
GBM
Glioblastom
GTP
Guanosintriphosphat
kDa
kiloDalton
l
Liter
LDS
Lithiumdodecylsulfat
li.
links
Abkürzungsverzeichnis
80
m
Meter
M
Molar
m_
Milli-
MLL
Mixed-Lineage-Leukemia
MOPS
3-Morpholinopropansulfonsäure
mRNA
messenger-RNA
n
Nano-
NBT
Nitroblautetrazoliumchlorid
NG
Normales Gehirn
Nr.
Nummer
OA II
Oligoastrozytom WHO II
PB
Polybasische Domäne
PBS
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
PNET
Primitiver neuroektodermaler Tumor
PVDF
Polyvinylidenfluorid
re.
rechts
RNA
Ribonukleinsäure
S.
Saccharomyces
s.
siehe
s.o.
siehe oben
s.u.
siehe unten
SDS
Natriumdodecylsulfat
SSC
Natriumchlorid-Natriumcitrat-Lörung
TBST
Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween
Tris
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
V
Volt
WHO
Weltgesundheitsorganisation
z.B.
zum Beispiel
(v/v)
(volume/volume)
(w/v)
(weight/volume)
µ
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Danksagung
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9. Danksagung
An erster Stelle möchte ich mich herzlich bei Frau Prof. Dr. Barbara Zieger für die
Überlassung des Themas und die hervorragende Betreuung während der Erstellung dieser
Arbeit bedanken. Sie ermöglichte mir, in einer äußerst angenehmen Atmosphäre in die
wissenschaftliche Arbeit einzusteigen.
Mein ganz besonderer Dank gilt auch Herrn Prof. Dr. Axel Pagenstecher für die
Bereitstellung der Gewebeproben, die ausgezeichnete Unterstützung in der Abteilung für
Neuropathologie und nicht zuletzt für die Begutachtung dieser Arbeit. Für meine Fragen hatte
er immer ein offenes Ohr, er hat mit seiner Freundlichkeit und Hilfsbereitschaft entscheidend
zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen.
Frau Dr. Susanne Bläser bin ich für ihre umfassende Einweisung und ihre zahlreichen
Anregungen im Labor der Arbeitsgruppe Zieger ausgesprochen dankbar. Sie hat mir auch bei
der Interpretation der Ergebnisse viel geholfen und die Arbeit geduldig und kritisch
durchgesehen.
Dr. Markus Hofer, Tina Hagena und allen Mitarbeitern der Abteilung Neuropathologie
möchte ich für die freundliche Unterstützung im Labor danken. Mit ihrer langjährigen
Laborerfahrung und ihrem Einsatz haben sie mir die histologischen Arbeiten dort erst möglich
gemacht.
Dr. Ingrid Bartsch, Anja Busse und Sabrina Röseler standen mir stets mit Rat und Tat zur
Seite. Eine große Hilfe waren mir auch die Laborarbeiten und Erfahrungen von Daniela
Wunderle, auf die ich meine Experimente aufbauen konnte. Und schließlich möchte ich auch
Harald Henning, Mareike Lieber und allen anderen Doktoranden sowie der gesamten
Arbeitsgruppe für die schöne Zeit und das gute Arbeitsklima danken.
Mein besonderer Dank gilt meinen Eltern, die schon meine ersten naturwissenschaftlichen
„Forschungen“ in der frühen Kindheit gefördert haben und mir bis heute immer zur Seite
stehen. Meine liebe Yamila hat mich durch die arbeitsintensiven Phasen engagiert und
verständnisvoll begleitet und mich mit ihrer Heiterkeit und Lebendigkeit stets motiviert.
Lebenslauf
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10. Lebenslauf
Name:
Overberg
Vornamen:
David Bernhard
Geburtsdatum:
21. Dezember 1978
Geburtsort:
Filderstadt
Familienstand:
ledig
Schulbildung:
1985-1989
Grundschule Hinterweiler, Gomaringen
1989-1998
Ludwig-Uhland-Gymnasium, Tübingen
18.06.1998
Allgemeine Hochschulreife am LudwigUhland-Gymnasium, Tübingen
Zivildienst:
1998-1999
Abteilung Kinderchirurgie der Klinik für
Kinderheilkunde und Jugendmedizin
am Universitätsklinikum Tübingen
Studium:
1999/2000
Studium der Humanmedizin an der
Medizinischen Fakultät der Eberhard-KarlsUniversität, Tübingen
seit 2000
Studium der Humanmedizin an der
Medizinischen Fakultät der Albert-LudwigsUniversität, Freiburg i.Br.
Examina:
09/ 2001
Ärztliche Vorprüfung
03/ 2003
Ärztliche Prüfung erster Teil
08/ 2005
Ärztliche Prüfung zweiter Teil
05/ 2007
Ärztliche Prüfung dritter Teil