Effektive Glykolyse-Inhibierung im Citrat

J Lab Med 2012;36(3):169–177 © 2012 by Walter de Gruyter • Berlin • Boston. DOI 10.1515/labmed-2012-0020
Point-of-Care Testing
Redaktion: P.B. Luppa
Effektive Glykolyse-Inhibierung im Citrat-gepufferten
venösen Vollblut und Plasma
Effective inhibition of glycolysis in venous whole blood
and plasma samples
Eray Yagmur1,*, Josef van Helden1, Alexander Koch2,
Johny Jadem1, Frank Tacke2 und Christian Trautwein2
MVZ Dr. Stein+Kollegen, Mönchengladbach,
Deutschland
2
Medizinische Klinik III, Universitätsklinikum
RWTH-Aachen, Aachen, Deutschland
1
Zusammenfassung
Einleitung: Komplette und sofortige Inhibierung der
Glykolyse im venösen Vollblut proximal der EnolaseHemmung ist durch Natrium-Fluorid (NaF)-Additiv nicht
möglich, so dass zusätzliches Ansäuern die effektive
Hemmung des Glukoseabbaus ermöglicht.
Methodik: Wirkung der Glykolyse-Inhibierung in Citratgepufferten GlucoEXACT-Röhrchen (Additiv: 0,4 mL,
Sarstedt) wurde gegen VenoSafe™ Glycaemia-Röhrchen
(Additiv: Pulvergemisch, Terumo; Empfehlung DDG/
DGGG-Leitlinie Gestationsdiabetes) verglichen. Parallel
wurden konventionelle NaF-Röhrchen (Sarstedt) verwendet.
Bei 10 gesunden Probanden wurde die Stabilität der Glukosekonzentration nach 0 – 0,5 – 1 – 1,5 – 2 – 3 – 4 – 8 und
12 Stunden Lagerung von sofort zentrifugierten und von den
Zellen getrennten venösen (VenoSafe™ Glycaemia)- und
(NaF)-Plasmaproben untersucht. Bei weiteren 5 gesunden
Probanden wurden Citrat-gepufferte venöse Vollblutproben
in VenoSafe™ Glycaemia- bzw. GlucoEXACT-Röhrchen
entnommen und nach 0 – 1 – 2 – 4 – 12 – 24 und 48 Stunden
Lagerung die Plasmaglukosekonzentrationen bestimmt. Die
Verdünnungs- und Hämatokrit-Abhängigkeit des SarstedtRöhrchens wurde in einer NaCl-Verdünnungsreihe sowie
durch den Zusatz von EDTA-Zellvolumen untersucht.
Ergebnisse: Sofort getrennte Terumo-Plasmaglukosekonzentrationen zeigten in den ersten 4 Stunden einen Abfall
von 94,9 mg/dL auf 92,5 mg/dL (–2,5%) und blieben nach
*Korrespondenz: Dr. med. Eray Yagmur, MVZ Dr. Stein+Kollegen,
Wallstraße 10, 41061 Mönchengladbach, Deutschland
Tel.: +49-2161-8194-442
Fax: +49-2161-8194-7442
E-Mail: [email protected]
12 Stunden stabil. NaF-Plasmaglukosekonzentrationen verringerten sich von 90 mg/dL auf 87 mg/dL (–3,3%; nicht
signifikant), um nach 12 h deutlich auf 82,6 mg/dL (–8,2%)
abzufallen. Gelagerte Vollblutproben in GlucoEXACT- und
VenoSafe™ Glycaemia-Röhrchen wiesen keine signifikant
unterschiedlichen Plasmaglukosekonzentrationen bei 0–4
bzw. 12–48 Stunden auf (lineare Regression: R2=0,9688;
GlucoEXACT (y)=5,3871+0,9431× VenoSafe™ Glycaemia
(x); Wilcoxon-Test: p=0,7125; gute Übereinstimmung der
Einzelglukosekonzentrationen: Kappa-Koeffizient 0,702; 95%
CI: 0,616–0,783). Sowohl das Volumen des Additivs in den
GlucoEXACT- als auch das Pulvergemisch in den TerumoRöhrchen haben keinen Einfluss auf die Glukosekonzentration.
Schlussfolgerung: GlucoEXACT-Röhrchen können als
diagnostisch gleichwertige Alternative zur Bestimmung der
Plasmaglukosekonzentration verwendet werden.
Schlüsselwörter: Ansäuerung; Citrat-Puffer; GlykolyseHemmung; Plasmaglukose.
Abstract
Background: To stabilise glucose immediately and to
prevent preanalytical loss of glucose from blood samples
after collection, additional acidification is needed.
Methods: In this study, we aimed to assess the value of
citrate-buffered GlucoEXACT tubes (Sarstedt) compared
to VenoSafe™ Glycaemia (Terumo) tubes. Conventional
sodium fluoride (NaF) tubes were used as internal controls.
First, stability of venous plasma glucose concentrations were
compared in 10 healthy volunteers at nine definite time points
(after 0 – 0,5 – 1 – 1,5 – 2 – 3 – 4 – 8 and 12 h). Blood
samples from VenoSafe™ Glycaemia and NaF tubes were
immediately centrifuged and separated. Moreover, glucose
concentrations in an additional five healthy volunteers were
compared by collecting blood samples simultaneously in
GlucoEXACT and VenoSafe™ Glycaemia tubes and storing
for 0 – 1 – 2 – 4 – 12 – 24 and 48 h until centrifugation.
Dilution- and haematocrit-dependent bias of plasma glucose
in GlucoEXACT tubes was assessed by serial dilution.
Results: Mean Terumo plasma glucose concentrations
decreased within the first 4 h from 94,9 mg/dL to 92,5 mg/dL
Bereitgestellt von | DGKL (DGKL)
Angemeldet | 172.16.1.226
Heruntergeladen am | 11.05.12 10:36
170 Yagmur et al.: Effektive Glykolyse-Inhibierung im Citrat-gepufferten venösen Vollblut und Plasma
(–2,5%) and remained stable after 12 h. Mean conventional
NaF plasma glucose concentrations decreased within the first
4 h from 90 mg/dL to 87 mg/dL (–3,3%, not significant) and
decreased significantly after 12 h (82,6 mg/dL, –8,2%). There
was no significant decrease or difference of plasma glucose
levels in stored blood samples collected in GlucoEXACT
and VenoSafe™ Glycaemia tubes [linear regression analysis:
R2=0,9688; GlucoEXACT (y)=5,3871+0,9431×VenoSafe™
Glycaemia (x); Wilcoxon test, p=0,7125]. Citrate buffer in
GlucoEXACT tubes does not impair glucose concentration.
Conclusions: Determination of plasma glucose concentration
in GlucoEXACT tubes is a suitable diagnostic alternative
compared with Terumo VenoSafe™ Glycaemia tubes.
Keywords: acidification; citrate buffer; glycolysis; venous
plasma.
Einleitung
Die Glukose-basierte Labordiagnostik des Diabetes mellitus
sowie des Gestationsdiabetes mellitus (GDM) erfährt in
jüngster Zeit einen bedeutenden Wandel. Bisherige klinische
Entscheidungsgrenzen für die Glukosekonzentration im
venösen Plasma werden auf der Grundlage epidemiologischer
Studien immer stärker hinterfragt [1–3]. Die präanalytische
Vermeidung der Verfälschung der Glukosekonzentration
im venösen Vollblut bzw. Plasma wird hierbei zunehmend
in den Mittelpunkt der Labordiagnostik gestellt [4–8].
Ungewöhnlich deutlich wird diese Position in der Diagnostik
des Gestationsdiabetes mellitus von der Deutschen Diabetes
Gesellschaft sowie Deutschen Gesellschaft für Gynäkologie
und Geburtshilfe (DDG/DGGG) aber auch von der American Diabetes Association (ADA) und IADPSG (International Association of the Diabetes and Pregnancy Study
Groups) vertreten [9–11]. Genaue Stabilisierungskriterien
für die venöse Blutentnahme werden beschrieben. Die Verwendung von Kapillarblut für die Fragestellung GDM wird
als unzureichend definiert [9, 12, 13]. Gründe hierfür sind
neben Studien zur Glukosestabilisierung auch die klinische
Signifikanz der epidemiologischen Daten, die den Stellenwert
der Präanalytik erheblich multipliziert [1–3]. Randomisierte
Studien von Crowther et al. und Landon et al. demonstrierten
2005 und 2009, dass Schwangere bereits von der Therapie
eines „milden“ GDM signifikant profitierten und weniger
Komplikationen für Mutter und Kind beobachtet wurden
[1, 2]. Die prospektive und multizentrische HAPO (Hyperglycemia and Adverse Pregnancy Outcome)-Beobachtungsstudie bestätigte 2008, dass in der Schwangerschaft der
Anstieg der Glukosekonzentration im venösen Plasma, unterhalb der bis dato anerkannten labordiagnostischen Grenzen,
das signifikant zunehmende Risiko für ungünstige maternale,
fetale und neonatale Ereignisse darstellt [3]. Basierend
auf diesen Studien empfiehlt IADPSG inm Jahr 2010 die
“outcome based”-Kriterien für die Klassifikation der Glukosekonzentration während der Schwangerschaft. Sie nennt für
den 75-g oralen Glukosetoleranz-Test (oGTT) in der 24+0
bis 27+6 Schwangerschaftswoche (SSW) neue Grenzwerte
(Tabelle 1) [11, 15]. Auch der Bundesauschuss der Ärzte
über die ärztliche Betreuung während der Schwangerschaft
nimmt 2012 das Screening auf GDM (50-g Vortest) in die
Mutterschafts-Richtlinien auf [16]. Noch in 2003 wurde eine
routinemäßige Untersuchung in der Schwangerschaft nicht
in die Mutterschafts-Richtlinien aufgenommen. Die Gründe
waren vermeintlich international uneinheitliche Kriterien
für den oGTT und fehlende evidenzbasierte Daten darüber,
dass unbehandelter GDM Mutter und Kind schadet. Die
Deutsche Diabetes Gesellschaft empfiehlt 2011 in seiner
aktualisierten Leitlinie darüber hinaus bei Erstvorstellung der
Schwangeren vor der 24. SSW und Vorliegen von Risikofaktoren die Messung der venösen Gelegenheits-Plasmaglukose
unabhängig von der Tageszeit und Nahrungsaufnahme.
Alternativ kann die venöse Nüchtern-Plasmaglukosekonzentration bestimmt werden (Abbildung 1) [9].
Die hierzu notwendige Hemmung der Glykolyse im
venösen Vollblut durch z.B. Natrium-Fluorid (NaF)/EDTAAdditiv erfolgt auf der Ebene der Inaktivierung der Enolase
und gilt als unzureichend [17]. Eine sofortige GlykolyseHemmung kann nicht stattfinden. Der Grund ist die übergeordnete Bildung von Glukose-6-Phosphat und ATP gekoppelte
Glukosephoshorylierung bzw. Glukosemetabolisierung bis
zum Äquilibrium proximal der Enolase-Wirkung [18]. Diese
fortlaufende Metabolisierung der Glukose in NaF-Röhrchen
erklärt den präanalytischen Verlust der Glukose während der
ersten 30–90 Minuten nach Blutentnahme [4, 19]. Tirosh
et al. berichteten den Abfall der Glukosekonzentration im
venösen NaF-Vollblut nach 120 Minuten um 9 mg/dL (0,5
mmol/L) [20]. Gambino et al. zeigten durch den Zusatz von
Citrat-Puffer und somit Ansäuern der Vollblutproben, dass
eine sofortige und komplette pH-abhängige Hemmung der
Glykolyse erreicht werden konnte [8]. In Reflektion auf die
frühe Diagnostik des GDM ist die effektive Präanalytik durch
zusätzliches Ansäuern des Additivs somit eine Voraussetzung
zur Minimierung der Risiken für ungünstige maternale, fetale
und neonatale Ereignisse.
Das Ziel dieser Studie ist die Überprüfung der Glukosestabilisierung im venösen Plasma mit Citrat-gepufferten Blutentnahme-Röhren. Die Wirkung der Glykolyse-Inhibierung
in Citrat-gepufferten GlucoEXACT-Röhrchen (Sarstedt AG
Tabelle 1 IADPSG-Konsensus-Empfehlung für die Diagnose
des GDM in der 24+0 bis 27+6 SSW vs. bisherige Definition nach
Carpenter/Coustan.
24 + 0 bis 27+ 6 SSW
75-g oGTT
Neue Grenzwerte
Alte Grenzwerte
mg/dL
mmol/L
mg/dL
mmol/L
Nüchtern
Nach 1 Stunde
Nach 2 Stunden
<92
<180
<153
<5,1
<10,0
< 8,5
<95
<180
<155
<5,3
<10,0
< 8,6
Untersuchungsmaterial der 1. Wahl ist das venöse Plasma. Ist
mindestens einer der Grenzwerte erreicht oder überschritten, kann die
Diagnose eines GDM gestellt werden. In [14] beschriebenen Richtwerte für kapilläres Vollblut (Hämolysat) (nüchtern: <90 mg/dL;
nach 1 Stunde: <180 mg/dL; nach 2 Stunden: <155 mg/dL) gelten
nicht mehr, da das Material als obsolet definiert wurde.
Bereitgestellt von | DGKL (DGKL)
Angemeldet | 172.16.1.226
Heruntergeladen am | 11.05.12 10:36
Yagmur et al.: Effektive Glykolyse-Inhibierung im Citrat-gepufferten venösen Vollblut und Plasma
Gelegenheits-Glukose
≥200 mg/dL (11,1 mmol/L)
171
Nüchtern-Glukose
≥92 mg/dL (5,1 mmol/L)
Nüchtern-Glukose (Zweitmessung)
<92 mg/dL
(5,1 mmol/L)
92-125 mg/dL
(5,1-6,9 mmol/L)
Kein GDM
≥126 mg/dL
(7,0 mmol/L)
Manifester
Diabetes mellitus
GDM
Abbildung 1 Diagnosepfad der GDM-Leitlinie der DDG/DGGG.
Diagnostik bei Erstvorstellung vor der 24. Schwangerschaftswoche und Vorliegen von Risikofaktoren (DDG/DGGG). Risikofaktoren
(mindestens 1): Alter >45 Jahre, BMI >30 kg/m2 präkonzeptionell, körperliche Inaktivität, familiäre Diabetesbelastung, ethnische
Risikopopulation (z.B. Asien, Lateinamerika), Geburt eines Kindes >4500 g, GDM anamnestisch, RR >140/90 mm Hg oder Antihypertensiva,
Dyslipidämie, PCOS, früherer Prä-Diabetes, Klinische Insulinresistenz, KHK, pAVK, zerebral-arterielle Makroangiopathie, Kontrainsulinäre
Medikation (z.B. Glukokortikoide).
& Co., Nümbrecht, Deutschland) wurde gegen die in der
DDG/DGGG-Leitlinie zu GDM empfohlene VenoSafe™
Glycaemia-Röhrchen (Terumo GmbH, Eschborn, Deutschland) verglichen [21]. Dabei wurde die Abhängigkeit der
Glukosekonzentration von der Lagerungszeit und Latenzzeit
des Vollblutes bis zur Trennung der korpuskulären Elemente
bzw. Herstellung des venösen Plasmas untersucht [21].
Material und Methoden
Blutentnahme und Probandenkollektiv
Bei 15 gesunden Freiwilligen (7 männlich/8 weiblich,
medianes Alter 32 Jahre), wurde nach mindestens 8-stündiger
Nahrungskarenz morgens (09.00 Uhr) in verschiedenen Blutentnahme-Röhrchen venöses Blut entnommen (jeweils Citratgepufferte VenoSafe™ Glycaemia- und GlucoEXACT- sowie
NaF-Röhrchen). Die Studie wurde durch die Ethikkommission
der Medizinischen Fakultät der RWTH-Aachen zustimmend
bewertet (EK 090/12). Bei jedem Probanden wurde vor Blutentnahme eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.
Entsprechend der Hersteller-Angaben wurden unmittelbar nach
jeder Blutentnahme Sarstedt-Röhrchen 3x und VenoSafe™
Glycaemia-Röhrchen 0x über Kopf gemischt.
Ausschlusskriterien für die Auswahl freiwilliger Probanden wurden wie folgt definiert: BMI >30 kg/m2, Eltern
oder Geschwister mit Diabetes, Angehörige einer ethnischen
Risikopopulation (z. B. Asiatinnen, Lateinamerikanerinnen),
Geburt eines Kindes >4,500 g, Arterielle Hypertonie (Blutdruck >140/90 mm Hg) oder Einnahme von Medikamenten
zur Therapie der arteriellen Hypertonie, Dyslipidämie
(HDL <35 mg/dL und/oder Triglyceride >250 mg/dL),
Polyzystisches Ovarsyndrom, Einnahme kontrainsulinärer
Medikation (z.B. Glukokortikoide).
Die Blutentnahmen erfolgen in zufälliger Reihenfolge.
Immer wurden die ersten entnommenen Proben verworfen.
Bei 10 von 15 gesunden Freiwilligen (5 männlich/
5 weiblich, medianes Alter 32 Jahre) wurde in Citrat-gepuffertem
VenoSafe™ Glycaemia- und NaF-Röhrchen venöses Blut
entnommen. Alle Blutproben wurden sofort nach Entnahme bei
Raumtemperatur für 10 Minuten und 2000 g zentrifugiert, von
den Zellen getrennt und als venöse Plasmaproben bis zur Analyse der Glukosekonzentration bei Raumtemperatur gelagert.
Entsprechend einer definierten zeitlichen Abfolge wurden die
Plasmaproben bis zur Analytik in Mikrocups gelagert: 0, 30, 60,
90 Minuten und 2, 3, 4, 8, 12 Stunden.
Bei fünf weiteren Probanden (2 männlich/3 weiblich,
medianes Alter 37 Jahre) wurden nur Citrat-gepufferte
venöse Vollblutproben in GlucoEXACT- und VenoSafe™
Glycaemia-Röhrchen entnommen und bei Raumtemperatur
als Vollblut in den Original-Röhrchen gelagert. Erst nach 0,
1, 2, 4, 12, 24 und 48 Stunden Lagerung erfolgte die Zentrifugation der Citrat-gepufferten Vollblutproben.
In beiden Untersuchungsgruppen wurde als Glukose-Zielkonzentration die jeweilige 0 Stunden-Plasmaglukosekonzentration definiert (frischeste Untersuchungsprobe). Wegen
10-minütiger Zentrifugation und ca. 10 Minuten Pipettierund Transferzeit des Vollblutes/Plasmas in Mikrocups zur
Analytik wurde ein maximaler Zeitverlust für die GlukoseZielkonzentration von ca. 20 Minuten kalkuliert.
Bestimmung der Glukosekonzentration
Die quantitative Bestimmung der Glukosekonzentration
wurde mit der enzymatischen Hexokinase-Methode am cobas
c702 (Roche Diagnostics, Mannheim) entsprechend den Hersteller-Angaben durchgeführt. Die Intra-assay Präzision der
Methode beträgt 0,8% bis 1,0% und die Inter-assay-Variabilität liegt bei 1,7% bis 1,9%.
Untersuchung der Hämatokrit- und
Verdünnungsabhängigkeit der
Plasma-glukosekonzentration in Citrat-gepufferten
GlucoEXACT-Röhrchen
Citrat-gepufferte GlucoEXACT-Röhrchen enthalten 0,4 mL
Additiv, sodass bei zusätzlichem Blutfüllvolumen von
2,7 mL zum Ausgleich der Blutverdünnung die ermittelten
Plasmaglukosekonzentrationen mit 1,148 faktorisiert wurden.
Bereitgestellt von | DGKL (DGKL)
Angemeldet | 172.16.1.226
Heruntergeladen am | 11.05.12 10:36
172 Yagmur et al.: Effektive Glykolyse-Inhibierung im Citrat-gepufferten venösen Vollblut und Plasma
Zur Untersuchung der Verdünnungs- und Hämatokrit
(HKT)-abhängigen Veränderung der Glukosekonzentration
im Vergleich zu VenoSafe™ Glycaemia-Röhrchen wurde
eine NaCl (0,9%)-Verdünnungsreihe (1:2; 1:4; 1:8 und 1:16)
und anschließendem 1 mL-EDTA-Zellvolumenzusatz (Endverdünnung: 1:1,6; 1:2,3; 1:3,0 und 1:3,4) hergestellt.
Statistische Analyse
Die Daten der mittleren Glukosekonzentrationen aller Probanden/innen je Gruppe und Untersuchungszeitpunkt sind
verglichen worden. Die Prüfung auf Unterschiede der Verteilung der Plasmaglukosekonzentrationen insbesondere
in VenoSafe™ Glycaemia- und GlucoEXACT-Röhrchen
erfolgte mittels Wilcoxon-Rangsummen-Test.
Der Grad der Vorhersagbarkeit der Plasmaglukosekonzentrationen in GlucoEXACT-Röhrchen aus Plasmaglukosekonzentrationen der Terumo-Röhrchen wurde mittels linearer
Regression und die Stärke der Übereinstimmung der Einzelglukose-konzentrationen mit dem Kappa-Koeffizienten
berechnet. Die statistischen Analysen erfolgten mit MedCalc
11.4.2.0 (MedCalc, Mariakerke, Belgien).
VenoSafe™ Glycaemia-Röhrchen resultieren für die gelagerten Vollblutproben (n=5; 7 Zeitpunkte) keine signifikanten
Unterschiede der mittleren Plasmaglukosekonzentrationen
nach 4 bzw. nach 12–48 Stunden (nach 4 Stunden: GlucoEXACT 97,1 mg/dL (+0,7%, SD ±12,8 mg/dL, p=0,250), Terumo 96,2 mg/dL (+0,2%, SD ±14,8 mg/dL, p=0,625); nach 48
Stunden: GlucoEXACT 92,7 mg/dL (–3,8%, SD ±14,8 mg/
dL, p=0,063), Terumo 93,9 mg/dL (–2,2%, SD ±15,2 mg/dL,
p=0,063) (GlucoEXACT vs. Terumo: 4 Stunden p=0,438; 48
Stunden p=0,438) (Abbildungen 3A und 3B).
Des Weiteren zeigt sich eine deutliche Korrelation der
Plasmaglukosekonzentrationen
zwischen
VenoSafe™
Glycaemia und GlucoEXACT [lineare Regression:
R2=0,9688; GlucoEXACT (y)=5,3871+0,9431× VenoSafe™
Glycaemia (x)]. Die Verteilung der Plasmaglukosekonzentrationen unterscheidet sich nicht signifikant (Wilcoxon-Test:
p=0,7125) [Abbildungen 4A (lineare Regression) und 4B
(Bland-Altman Plot)]. Die Stärke der Übereinstimmung der
Einzel-Glukosekonzentrationen zwischen den verwendeten
GlucoEXACT- und VenoSafe™ Glycaemia-Röhrchen ist
als gut zu bewerten (Kappa-Koeffizient: 0,702; 95% CI:
0,616–0,783).
HKT- und Verdünnungsabhängigkeit in
Citrat-gepufferten GlucoEXACT-Röhrchen
Ergebnisse
Makroskopisch-visueller Probenaspekt gelagerter
Vollblutproben
Vergleich lagerungsabhängiger
Plasmaglukosekonzentrationen
Die Verdünnungs- und Hämatokrit-Abhängigkeit des Sarstedt-Röhrchens wurde in einer NaCl-Verdünnungsreihe (1:2
bis 1:16) sowie durch den Zusatz von EDTA-Zellvolumen
(Hämatokritbereich 25% bis 58%) untersucht. Das Volumen
des Citrat-Puffer-Zusatzes in den GlucoEXACT-Röhrchen
(0,4 µL) hat keinen Einfluss auf die Glukosekonzentration.
Ebenso wird auch unter Zusatz von EDTA-Zellvolumen zur
Verdünnungsreihe keine Beeinflussung der Plasmaglukosekonzentration durch das HKT im Bereich von 25%–58%
gefunden (gemessen vs. berechnet; Tabelle 2). Auch die
VenoSafe™ Glycaemia-Röhrchen besitzen dieselben
Eigenschaften, sowohl für die NaCl-(0,9%)-Verdünnung als
auch im HKT-Bereich von 27%–67%.
Plasma-Lagerung 0 bis 12 Stunden (VenoSafe™ Glycaemia- vs. NaF) VenoSafe™ Glycaemia-Plasmaglukose-
Diskussion
Die prolongierte Lagerung der Vollblutproben bis zu 12
Stunden weist sowohl in GlucoEXACT- als auch VenoSafe™
Glycaemia-Röhrchen keine visuellen Hämolysezeichen
auf. Ab 24 Stunden Lagerung ist nach Zentrifugation der
makroskopische Hämolyse-Aspekt des Plasmas in TerumoRöhrchen deutlich ausgeprägter, zumal der Hersteller Terumo
eine häufigere (10×) über Kopf Mischung seiner Röhrchen
empfiehlt.
konzentrationen zwischen 0 und 12 Stunden jeweils gemittelt
über alle Probanden (n=10; 9 Zeitpunkte) zeigten nach 4
Stunden Lagerung einen mittleren Abfall von 94,9 mg/dL
(Zielwert) auf 92,5 mg/dL (–2,5%, SD ±9,0 mg/dL, p=0,625)
und bleiben mit einer mittleren Plasmaglukosekonzentration
von 93,4 mg/dL nach 12 Stunden stabil (–1,6%, SD ±9,0
mg/dL, p=0,938). Plasmaglukosekonzentrationen in NaFRöhrchen fallen nach 4 Stunden von 90 mg/dL (Zielwert) auf
87 mg/dL (–3,3%, SD ±8,9 mg/dL, p=0,031) ab, um nach 12
h deutlich auf eine mittlere Plasmaglukosekonzentration von
82,6 mg/dL (–8,2%, SD ±7,5 mg/dL, p=0,031) weiter abzufallen (GlucoEXACT vs. Terumo: 4 Stunden p=0,078; 12
Stunden p=0,016) (Abbildung 2).
Vollblut-Lagerung 0 bis 48 Stunden (VenoSafe™ Glycaemia vs. GlucoEXACT) Zwischen GlucoEXACT- und
Zur klinischen Beurteilung der Glukosekonzentration wurde
eine stabile Glykolyse-Inhibierung in Vollblut bei Verwendung von Blutentnahmeröhrchen mit der bisher üblichen
NaF-Präparierung vorausgesetzt. Die vorliegende Studie
zeigt jedoch, dass die Glykolyse im sofort nach Entnahme
zentrifugierten und bis zu 12 Stunden gelagerten Plasma
fortschreitet. Ein mittlerer Abfall der Plasmaglukosekonzentration nach 12 Stunden um –8,2% ist ein Anhalt für die
ineffektive Inhibition der Glykolyse. Die Annahme, dass
die Ursache für die fortschreitende Glykolyse in NaF-Vollblut der verzögerte Eintritt des Fluorids in die Erythrozyten
oder Leukozyten sei, ist vor diesem Hintergrund keine ausreichende Erklärung [6, 22]. Eine ähnliche Beobachtung
machten Chan et al. und zeigten, dass die Rate des Konzentrationsabfalls der Glukose in Vollblut insbesondere in der
Bereitgestellt von | DGKL (DGKL)
Angemeldet | 172.16.1.226
Heruntergeladen am | 11.05.12 10:36
Yagmur et al.: Effektive Glykolyse-Inhibierung im Citrat-gepufferten venösen Vollblut und Plasma
Plasma-Lagerung
VenoSafe™ Glycaemia
(0 h = Zielwert: 94,9 mg/dL)
Mittelwert (mg/dL)
Standardabweichung (mg/dL)
P-Wert (vs. Zielwert)
Natrium-Fluorid (NaF)
(0 h = Zielwert: 90,0 mg/dL)
Mittelwert (mg/dL)
Standardabweichung (mg/dL)
P-Wert (vs. Zielwert)
P-Wert (VenoSafe™ Glycaemia vs. NaF)
173
0,5 h
1h
1,5 h
2h
3h
4h
8h
12 h
96,4
6,5
0,945
92,5
8,2
0,383
94,0
8,0
0,438
92,1
7,8
1,0
93,4
6,9
0,375
92,5
9,0
0,625
94,0
8,8
0,641
93,4
9,0
0,938
92,5
6,1
0,688
0,008
88,6
9,7
0,875
0,156
91,4
6,2
0,148
0,125
89,2
9,4
0,219
0,016
89,5
5,4
0,016
0,063
87,0
8,9
0,031
0,078
85,8
8,2
0,156
0,016
82,6
7,5
0,031
0,016
98
96
MittelwertGlukose, mg/dL
94
92
90
88
86
84
Terumo (Plasma)
82
Sarstedt NaF (Plasma)
80
0
1
2
3
4
5
6
7
Zeitachse (alle Probanden; 1=0 Stunden, 9=12 Stunden)
8
9
10
Abbildung 2 Lagerungsstudie venöses Plasma.
Terumo-Plasmaglukosekonzentrationen zeigen in den ersten 4 Stunden einen Abfall von 94,9 mg/dL auf 92,5 mg/dL (–2,5%) und blieben nach
12 Stunden stabil. Sarstedt-Plasmaglukosekonzentrationen verringern sich von 90 mg/dL auf 87 mg/dL (–3,3%; p>0,05), um nach 12 h deutlich
auf 82,6 mg/dL (–8,2%) abzufallen. Angegeben sind Mittelwerte aller Probanden (n=10) je Zeiteinheit (P-Werte ermittelt mit dem WilcoxonTest; Signifikanz-Niveau p<0,05 [Fettdruck]).
ersten Stunde nach Blutentnahme sowohl mit als auch ohne
NaF fast identisch war. Nach zwei Stunden erreichte die
Glukolyse eine inakzeptable Reduktion um bis zu 9 mg/dL
[4, 20, 23].
Gambino et al. postulierten 2007, dass eine vermeintlich
marginale präanalytische Reduzierung der Glukosekonzentration im venösen Plasma signifikant das Risiko für
die Entwicklung eines Diabetes mellitus erhöhen kann [5].
Beispielsweise ist die altersadaptierte Wahrscheinlichkeit,
einen Typ II Diabetes zu entwickeln, bei Glukosekonzentrationen zwischen 87–90 mg/dL etwa 1,8× höher als bei
Personen mit Glukosekonzentrationen <82 mg/L [20]. Aufgrund der steigenden diagnostischen und prognostischen
Bedeutung der korrekten Glukosekonzentrationsbestimmung
für die Prävention des Krankheitsrisikos und Früherkennung
des Diabetes mellitus, erscheint die Verwendung von NaFstabilisiertem Vollblut ohne zusätzliche Citrat-Pufferung
inadäquat. Die bisherigen effektivsten Präanalytik-Kriterien
zur Minimierung der Glykolyse wären aus diesen Gründen
die sofortige Eiskühlung des venösen Vollblutes und Aufrechterhaltung der Kühlkette bis zur Analytik sowie umgehende Zentrifugation und Trennung des Plasmas von den
Zellen innerhalb von 15–30 Minuten. Diese aufwendige
Maßnahme ist jedoch nicht konstant praktikabel [19]. Ein
Ausweg aus diesen logistisch aufwendigen Prozeduren ist die
prompte Stabilisierung der venösen Vollblutglukose durch
Ansäuerung [8]. Unsere Vergleiche der Citrat-gepufferten
VenoSafe™ Glycaemia- und GlucoEXACT-Röhrchen unterstreichen diese Form der sicheren Stabilisierung der Glukosekonzentration in Vollblut mit einer Wiederfindungsrate der
Plasmaglukose-Zielkonzentration von 100,2% und 100,7% in
den ersten 4 Stunden. Auch nach 48 Stunden Lagerung verliert das Citrat-gepufferte Vollblut lediglich 2,2% bzw. 3,8%
seiner Glukosekonzentration im Vergleich zur sofortigen
Analytik. Diese sichere und prompte Neutralisierung der
präanalytischen Störgröße ist eine wichtige Maßnahme auf
dem Weg hin zu einer Harmonisierung der interpretatorischen
Einschätzung der Diabetes-Wahrscheinlichkeit anhand von
Plasma-Glukosekonzentrationen. So wird entsprechend der
Ergebnisse der HAPO-Beobachtungsstudie bei Erstvorstellung ab der 24. SSW oder bei Risiko-Patientinnen nach
Ausschluss einer Hyperglykämie vor der 24. SSW der 75-g
oGTT favorisiert und der 50-g Vortest als Alternative mit
folgender Einschränkung erwähnt: (a.) für Schwangere in der
Bereitgestellt von | DGKL (DGKL)
Angemeldet | 172.16.1.226
Heruntergeladen am | 11.05.12 10:36
174 Yagmur et al.: Effektive Glykolyse-Inhibierung im Citrat-gepufferten venösen Vollblut und Plasma
Vollblut-Lagerung
GlucoEXACT
(0 h = Zielwert: 96,4 mg/dL)
Mittelwert (mg/dL)
Standardabweichung (mg/dL)
P-Wert (vs. Zielwert)
VenoSafe™ Glycaemia
(0 h = Zielwert: 96,0 mg/dL)
Mittelwert (mg/dL)
Standardabweichung (mg/dL)
P-Wert (vs. Zielwert)
P-Wert
(VenoSafe™ Glycaemia vs. GlucoEXACT)
1h
2h
4h
12 h
24 h
48 h
96,0
15,2
0,625
95,3
15,8
0,625
97,1
12,8
0,250
95,0
16,1
0,438
94,0
15,5
0,125
92,7
14,8
0,063
95,8
15,5
0,813
0,813
96,3
16,3
0,625
0,313
96,2
14,8
0,625
0,438
93,8
16,2
0,063
0,313
94,8
15,4
0,125
0,625
93,9
15,2
0,063
0,438
A 100
Glukose (mg/dL) Mittelwert
99
98
97
96
95
94
GlucoEXACT
93
VenoSafe™ Glycaemia
92
Zielwert (0 h)
1h
2h
4h
12 h
Zeitachse (alle Probanden)
24 h
48 h
Abbildung 3A Lagerungsstudie Vollblut.
Plasmaglukosekonzentrationen wurden nach Lagerung der Vollblutproben gemessen. Keine signifikant unterschiedlichen
Plasmaglukosekonzentrationen bei 0–4 bzw. 12–48 Stunden. Angegeben sind Mittelwerte aller Probanden (n=5) je Zeiteinheit (P-Werte
ermittelt mit dem Wilcoxon-Test; Signifikanz-Niveau p<0,05).
Wiederfindung (%)
Vollblut-Lagerung
1h
GlucoEXACT
(Zielwert: 96,4 mg/dL=100%)
VenoSafe™ Glycaemia
(Zielwert: 96,0 mg/dL=100%)
99,6
99,8
2h
4h
12 h
24 h
48 h
98,9
100,7
98,5
97,5
96,2
100,3
100,2
97,7
98,8
97,8
B 102
Wiederfindung, %
101
100
99
98
97
96
GlucoEXACT
VenoSafe™ Glycaemia
95
1h
Abbildung 3B
2h
4h
12 h
Zeitachse (alle Probanden)
Zielwert-Wiederfindung in Citrat-gepufferten Proben.
Bereitgestellt von | DGKL (DGKL)
Angemeldet | 172.16.1.226
Heruntergeladen am | 11.05.12 10:36
24 h
48 h
Yagmur et al.: Effektive Glykolyse-Inhibierung im Citrat-gepufferten venösen Vollblut und Plasma
A
175
125
120
GlucoEXACT, mg/dL
115
110
105
100
95
90
85
80
80
GlucoEXACT, mg/dL - VenoSafe™ Glycaemia, mg/dL
B
90
100
110
VenoSafe™ Glycaemia, mg/dL
120
130
6
+1,96 SD
4,9
4
2
Mean
-0,0
0
-2
-4
-1,96 SD
-5,0
-6
80
90
100
110
GlucoEXACT, mg/dL
120
130
Abbildung 4 Lineare Regressionsanalyse und Bland-Altman Plot.
(A) Lineare Regressionsanalyse. Starke Korrelation bei einem Bestimmtheitsmaß von R2=0,9688. Regressionsgleichung: Sarstedt
(y)=5,3871+0,9431×Terumo (x). (B) Bland-Altman Plot. In der Bland-Altman Grafik zeigt sich keine systematische Verzerrung
(Glukosekonzentration nach Vollblutlagerung und anschließende Bestimmung der Plasmaglukosekonzentration).
Tabelle 2
HKT- und Verdünnungs-Abhängigkeit in Citrat-gepufferten GlucoEXACT S-Monovetten.
Plasmaglukose
Unverdünnt
1:2 (1:1,6)
1:4 (1:2,3)
1:8 (1:2,9–3,0)
1:16 (1:3,4)
HKT
GlucoEXACT (1)
VenoSafe™ Glycaemia (2)
(1)
(2)
Gemessen
Berechnet
Gemessen
Berechnet
58,2
40,1
31,7
27,6
25
65,4
46,5
35,7
30,2
27,1
99,9
58
37,9
28,1
25,3
95
55,5
37,5
28,5
23,5
96
60
41,7
33,1
28,2
97
60,6
42,2
32,3
28,5
Glukose-Mittelwerte (mg/dL) nach NaCl (0,9%)-Verdünnung und anschließendem 1 mL EDTA-Zellvolumenzusatz [Endverdünnung in
Klammern; Plasmaglukose (mg/dL); HKT (%)].
Bereitgestellt von | DGKL (DGKL)
Angemeldet | 172.16.1.226
Heruntergeladen am | 11.05.12 10:36
176 Yagmur et al.: Effektive Glykolyse-Inhibierung im Citrat-gepufferten venösen Vollblut und Plasma
24+0 bis 27+6 SSW existieren nur für den standardisierten
75-g oGTT an Schwangerschaftskomplikationen und dem
neonatalen Ausgang festgelegte Grenzwerte; (b.) bei Frauen
mit hohem Diabetesrisiko resultiert eine hohe Rate an
Doppeltestungen, sodass bei dem induzierten 2-Schritt-Vorgehen die Diagnose und damit auch die Behandlung des GDM
bis in die 30.–34. SSW verzögert werden kann, wo bereits
Effekte der Hyperglykämie und Makrosomie wirken [9, 11].
Dennoch ist die Ansäuerung des Vollblutes kein
Garant für die sichere Erkennung der Diagnose, da
andere Einflussgrößen die Glukosekonzentration empfindlich verfälschen können. Troisi et al. beschreiben,
dass chronobiologische Schwankungen der Glukosekonzentration zwischen morgendlichen und nachmittäglichen Glukosebestimmungen eine Differenz von bis zu
5% begründen [24]. Zusammenfassend bestätigen unsere
Ergebnisse, dass die herkömmliche NaF-Hemmung der
Glykolyse im venösen Vollblut nicht die vollständige
Glukosemetabolisierung proximal der Enolase-Inhibition
erfasst. Es resultiert eine pH-Wert abhängige fortbestehende
Erniedrigung der Glukose-Konzentration vor allem in den
ersten 4 Stunden nach Blutentnahme. Citrat-gepufferte
Sarstedt- und Terumo-Röhrchen führen zu keinen signifikanten Unterschieden in den Glukosekonzentrationen
innerhalb von 0 bis 4 bzw. 12 bis 48 Stunden. GlucoEXACTRöhrchen können als diagnostisch gleichwertige Alternative
zu den VenoSafe™ Glycaemia-Röhrchen bei der Diagnostik
eines Gestationsdiabetes und Typ II Diabetes mellitus eingesetzt werden. Eine Beschränkung nur auf einen Hersteller, wie
derzeit in der GDM-Leitlinie der DDG/DGGG angegeben,
erscheint daher nicht erforderlich. Wegen der weiten Verbreitung der Sarstedt-Blutentnahme-Systeme in Deutschland
bietet GlucoEXACT eine anwenderfreundliche Handhabung
(kein umständliches Wechseln des Blutentnahme-Bestecks
sowie keine umständliche Mischung der Vollblutprobe). Die
zunehmende Verbreitung der zusätzlich Citrat-gepufferten
Röhrchen wird neben der Gewährleistung einer stabilen
Präanalytik auch die Präzision der Glukosebestimmung
verbessern helfen. Ob die dadurch zu erwartende leichtere
Diagnosestellung die Inzidenz und Prävalenz des Diabetes
mellitus und/oder GDM signifikant verändern wird, bleibt
abzuwarten
Interessenkonflikt
Die Autoren erklären, dass keine wirtschaftlichen oder persönlichen
Interessenskonflikte bestehen.
Literatur
1. Crowther C, Hiller JE, Moss JR, McPhee AJ, Jeffries WS,
Robinson JS, ACHOIS Trial Group. Effect of treatment of gestational diabetes mellitus on pregnancy outcomes. N Engl J Med
2005;352:2477–86.
2. Landon MB, Spong CY, Thom E, Carpenter MW, Ramin SM,
Casey B, et al. A multicenter, randomized trial of treatment for
mild gestational diabetes. N Engl J Med 2009;361:1339–48.
3. Metzger BE, Lowe LP, Dyer AR, Trimble ER, Chaovarindr U,
Coustan DR, et al., HAPO Study Cooperative Research Group.
Hyperglycemia and adverse pregnancy outcomes. N Engl J Med
2008;358:1991–2002.
4. Chan AY, Swaminathan R, Cockram CS. Effectiveness of
sodium fluoride as a preservative of glucose in blood. Clin Chem
1989;35:315–7.
5. Gambino R. Glucose: a simple molecule that is not simple to
quantify. Clin Chem 2007;53:2040–1.
6. Mikesh LM, Bruns DE. Stabilization of glucose in blood
specimens: mechanism of delay in fluoride inhibition of
glycolysis. Clin Chem 2008;54:930–1.
7. Bruns DE, Knowler WC. Stabilization of glucose in blood samples: why it matters. Clin Chem 2009;55:850–2.
8. Gambino R, Piscitelli J, Ackattupathil TA, Theriault JL, Andrin
RD, Sanfilippo ML, et al. Acidification of blood is superior to
sodium fluoride alone as an inhibitor of glycolysis. Clin Chem
2009;55:1019–21.
9. Kleinwechter H, Schäfer-Graf U, Bührer C, Hoesli I, Kainer F,
Kautzky-Willer A, et al. Gestationsdiabetes melltius (GDM).
Evidenzbasierte Leitlinie zu Diagnostik, Therapie und Nachsorge
der Deutschen Diabetes-Gesellschaft (DDG) und der Deutschen
Gesellschaft für Gynäkologie und Geburtshilfe (DGGG).
2011.
10. Sacks DB, Arnold M, Bakris GL, Bruns DE, Horvath AR, Kirkman
MS, et al. Position statement: guidelines and recommendations
for laboratory analysis in the diagnosis and management of diabetes mellitus. Diabetes Care 2011;34:1419–23.
11. Metzger BE, Gabbe SG, Persson B, Buchanan TA, Catalano PA,
Damm P, et al. International association of diabetes and pregancy
study groups recommendations on the diagnosis and classification
of hyperglycemia in pregnancy. Diabetes Care 2010;33:
676–82.
12. Standards of medical care in diabetes-2010. Diabetes Care
2010;33(Suppl 1):S11–61.
13. Haeckel R, Brinck U, Colic D, Janka H, Plüntmann I, Schneider
J, et al. Comparability of blood glucose concentration measured
in different sample systems for detecting glucose intolerance.
Clin Chem 2002;48:936–9.
14. Kerner W, Brückel J. Definition, Klassifikation und Diagnostik des
Diabetes mellitus. Diabetologie und Stoffwechsel 2008;3:131–3.
15. Carpenter MW, Coustan DR. Criteria for screening tests for
gestational diabetes. Am J Obstet Gynecol 1982;144:768–73.
16. Richtlinien des Bundesausschusses der Ärzte und Krankenkassen
über die ärztliche Betreuung während der Schwangerschaft
und nach der Entbindung („Mutterschafts-Richtlinien“).
Veröffentlicht im Bundesanzeiger Nr. 36, S. 914. In Kraft
getreten am 03. März 2012.
17. Waring WS, Evans LE, Kirkpatrick CT. Glycolysis inhibitors
negatively bias blood glucose measurements: potential impact
on the reported prevalence of diabetes mellitus. J Clin Pathol
2007;60:820–3.
18. Feig SA, Shohet SB, Nathan DG. Energy metabolism in
human erythrocytes, I: effects of sodium fluoride. J Clin Invest
1971;50:1731–7.
19. Stahl M, Jørgensen LG, Hyltoft Petersen P, Brandslund I, De Fine
Olivarius N, Borch-Johnsen K. Optimization of preanalytical
conditions and analysis of plasma glucose. 1. Impact of the
new WHO and ADA recommendations on diagnosis of diabetes
mellitus. Scand J Clin Lab Invest 2001;61:169–79.
20. Tirosh A, Shai I, Tekes-Manova D, Israeli E, Pereg D, Shochat T,
et al. Normal fasting plasma glucose levels and type 2 diabetes in
young men. N Engl J Med 2005;353:1454–62.
Bereitgestellt von | DGKL (DGKL)
Angemeldet | 172.16.1.226
Heruntergeladen am | 11.05.12 10:36
Yagmur et al.: Effektive Glykolyse-Inhibierung im Citrat-gepufferten venösen Vollblut und Plasma
21. Uchida K, Okuda S, Tanaka K, inventors; Terumo Corporation,
assignee. Method of inhibiting glycolysis in blood samples. US
patent 4,780,419. 1988 Oct 4. 20.
22. Chapman BE, Kuchel PW. Fluoride transmembrane exchange
in human erythrocytes measured with 19F NMR magnetization
transfer. Eur Biophys J 1990;19:41–5.
177
23. Gambino R, Reichberg S, Schwartz JG. Normal fasting plasma
glucose level and type 2 diabetes. N Engl J Med 2006;354:87–8.
24. Troisi RJ, Cowie CC, Haris MI. Diurnal variation in fasting
plasma glucose. Implications for diagnosis of diabetes in
patients examined in the afternoon. J Am Med Assoc 2000;284:
3157–9.
Bereitgestellt von | DGKL (DGKL)
Angemeldet | 172.16.1.226
Heruntergeladen am | 11.05.12 10:36