Neue Testsysteme für Histonmethyltransferasen und

Neue Testsysteme für Histonmethyltransferasen und
Histondemethylasen
INAUGURALDISSERTATION
zur Erlangung des Doktorgrades
der Fakultät für Chemie, Pharmazie und
Geowissenschaften
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
vorgelegt von
Astrid Spannhoff
2007
1
Auf Veranlassung des Promotionsausschusses der Fakultät für Chemie,
Pharmazie und Geowissenschaften der Albert-Ludw igs-Universität Freiburg
wurde der folgende Hinw eis eingefügt:
In der Einleitung dieser Arbeit sind zum Teil wörtliche Textteile aus den
Doktorarbeiten von F. Herrmann, Universität Hamburg, 200677 und V.
Seitz, Universität München, 200731 enthalten.
Diese Textteile sind in der vorliegenden Fassung durch die entsprechenden
Zitate kenntlich gemacht.
2
Vorsitzender des Promotionsausschusses:
Referent:
Korreferent:
Datum der Promotion:
Professor Dr. Rolf. Schubert
Professor Dr. Manfred Jung
Professor Dr. Willi Bannw arth
15. 10. 2007
3
Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von Juni 2003 bis August 2007 am Institut
für Pharmazeutische W issenschaften der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg unter
der Anleitung von Herrn Professor Dr. Manfred Jung.
Ihm gilt mein besonderer Dank für die Aufnahme in seinen Arbeitskreis, den
Vorschlag des interessanten Themas, die großzügige Unterstützung, ständige
Disskussionsbereitschaft und die angenehme Arbeitsatmosphäre.
Mein Dank gilt außerdem meiner Kollegin Lisa Huda und meinen Kollegen
Dr. Afshin Ghasemi, Dr. Vassil Valkov, Dr. Stefan Schäfer, Ulf Mathias, Dr. Johannes
Trapp, Robert Neugebauer, Alexander Hauser und Jörg Schemies für die gute
Zusammenarbeit. Ursula Predoiu sowie allen Mitarbeitern des Instituts, die zur
Entstehung dieser Arbeit beigetragen haben, danke ich für die Unterstützung und
Hilfsbereitschaft.
W eiterhin danke ich Herrn Professor Dr. Roland Schüle für die Ermöglichung meiner
Arbeiten im Zelllabor. Dr. Eric Metzger, Kristin Fischer, Enrica Charbonnier,
Franziska
Klott,
Melanie
W issmann,
Dr.
Natalia
Kunowska
und
Dr. Dominica W illmann danke ich für die wertvolle Unterstützung.
Mein Dank gilt weiterhin Frau Prof. Dr. Beate Brand-Saberi für die Ermöglichung der
experimentellen
Arbeiten
an
Hühnerembryonen.
Dr.
Alexander
Bonafede,
Faisal Yusuf, Lidia Koschny, Gabriela Morosan-Puopolo und Ulrike Pein danke ich
für die Einarbeitung und Unterstützung meines Projektes.
Ferner möchte ich Prof. Dr. Axel Imhof für die Ermöglichung eines vierwöchigen
Praktikums am Adolf-Butenandt-Institut in München danken. W ährend dieser Zeit
konnte ich mich mit der MALDI-TOF-Technik vertraut machen und wertvolle Einblicke
in die Proteomanalytik gewinnen.
Prof. Dr. W olfgang Sippl und seinen Mitarbeitern Sonja Schlimme und Ralf Heinke
danke ich für die Erstellung des PRMT1-Modells und die Durchführung der DockingExperimente.
4
Dr. Gerald Brosch, Dr. Patrick Trojer und Ingo Bauer danke ich für die Bereitstellung
von RmtA und hPRMT1.
Prof. Dr. Ronald Gust danke ich für die Durchführung der Estrogen-RezeptorgenExperimente für hPRMT1.
Ich möchte mich außerdem herzlich bei Prof. Dr. W illi Bannwarth für die Übernahme
des Koreferats und bei Prof. Dr. Andreas Bechthold für die Übernahme des
Drittprüferamts bedanken.
5
Teile dieser Arbeit wurden bereits auf wissenschaftlichen Tagungen präsentiert:
• Posterpräsentation auf der SBS Konferenz "Drug Discovery: From Targets to
Candidates " in Genf vom 11. bis 15. September 2005
A. Spannhoff, M. Jung: New Assay for Histone Methyltransferases
• Posterpräsentation auf der Jahrestagung der Deutschen Pharmazeutischen
Gesellschaft in Mainz vom 5. bis 8. Oktober 2005
A. Spannhoff, M. Jung: Development of Novel Assays for Histone
Methyltransferases
• Posterpräsentation auf dem 19th International Symposium on Medicinal Chemistry
in Istanbul vom 29. August bis 02. September 2006
R. Heinke, R. Meier, W . Sippl, A. Spannhoff, M. Jung: Structure-based Virtual
Screening of Histone Methyltransferase (PRMT1) Inhibitors
• Posterpräsentation auf der EORT C-NCI-AACR Konferenz "Molecular Targets
and Cancer Therapeutics" in Prag vom 7. bis 10. November 2006
A. Spannhoff, L. W essels, I. Bauer, E. Metzger, R. Gust, G. Brosch, W .
Sippl, R. Schüle, M. Jung: New Assays for Histone Methyltransferases
• Posterpräsentation auf der Jahrestagung der GDCh/ DPhG-Gruppentagung
"Frontiers in Medicinal Chemistry" in Berlin vom 22. bis 24. März 2007
R. Heinke, R. Meier, W . Sippl, A. Spannhoff, M. Jung: Virtual and Biological
Screening of
Novel Histone
Arginine
Methyltransferase PRMT1 Inhibitors
• Posterpräsentation auf der EMBO Konferenz “Chromatin and Epigenetics“
in Heidelberg vom 3. bis 6. Mai 2007
A. Spannhoff, L. W essels, I. Bauer, E. Metzger, R. Gust, G. Brosch, W . Sippl, R.
Schüle, M. Jung: New Assays for Histone Methyltransferases
6
• Posterpräsentation auf dem 21. Molecular Modeling W orkshop in Erlangen 15.
bis 17. Mai 2007
R. Heinke, R., R. Meier, A. Spannhoff, I. Bauer, R. Gust, G. Brosch, M. Jung und
W . Sippl: Virtual and Biological Screening of Novel Histone Arginine
Methyltransferase PRMT1 Inhibitors
Publikationen:
• Spannhoff A, Heinke R, Bauer I, Trojer P, Metzger E, Gust R, Schule R, Brosch
G, Sippl W , Jung M.
Target-based approach to inhibitors of histone arginine methyltransferases.
J Med Chem 2007, 50, 2319-2325.
• Spannhoff A, Machmur R, Heinke R, Trojer P, Bauer I, Brosch G,
Schule R, Hanefeld W , Sippl W , Jung M.
A novel arginine methyltransferase inhibitor with cellular activity.
Bioorg Med Chem Lett 2007, 17, 4150-4153.
• zwei weitere Publikationen (1 Originalarbeit, 1 Übersichtsartikel) befinden
sich zurzeit in Vorbereitung.
7
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1.1 Aufbau des Chromatins
1.2 Euchromatin und Heterochromatin
1.3 Die Histone
2. Posttranslationale Histonmodifikationen
2.1 Acetylierung
2.2 Desacetylierung
2.3 Phosphorylierung
2.4 Ubiquitinylierung
2.5 ADP-Ribosylierung
2.6 Methylierung
3. Methylierung von Lysinen
3.1 Methylierung an Lysin 4 Histon H3
3.2 Methylierung an Lysin 9 Histon H3
3.3 Regulation der Lysin-Methylierung (Demethylierung v on Lysinen)
4. Methylierung von Argininen
4.1 Struktur der Protein-Arginin-Methyltransferasen
4.2 Regulation zellulärer Prozesse durch Arginin-Methylierung
4.3 Regulation von RNA-Prozessierung und Transport
4.4 Regulation der Transkription
4.5 DNS-Reparatur
4.6 Regulation der Arginin-Methylierung
4.7 Inhibitoren
5. Histonmodifizierende Enzyme als Arzneistoffziel
5.1 PRMT1 als Zielmolekül
5.2 LSD1 als Zielmolekül
6. Ziele der Arbeit
7. Verwendung von Screeningmethoden bei der Wirkstofffindung
7.1 Target-basiertes Screening
7.2 Analyse des Bindungsmodus ausgewählter Verbindungen
8. Verwendete Substanzbanken
8.1 NCI-Diversity Set
8.2 Hans-Knöll-Institut
8.3 Chembridge
8.4 Maybridge
8.5 Interne Substanzbank
8.6 World-Drug-Index
8.7 Tocris
9. Entwicklung des in-vitro Testsystems für Histonmethyltransferasen
9.1 Zeitaufgelöste Fluoreszenz
9.2 Testsysteme mit zeitaufgelöster Fluoreszenz
9.3 Verwendung von Lanthanidkomplexen in Testsystemen
9.4 In-vitro-Assay für PRMT1
9.5. Bestimmung der Bindungskapazität der Kav itäten
9.6 Bestimmung der optimalen Verdünnung an primärem Antikörper
9.7 Bestimmung der optimalen Verdünnung an sekundärem Antikörper
9.8 Erstellung einer Substrat-Kalibrationsreihe
9.9 Umsetzung des Substrats durch PRMT1
9.10 Testung von Inhibitoren
9.11 Fazit zur Assayentwicklung
10. Testung der im virtuellen Screening ermittelten Verbindungen
10.1 Allgemeine Bemerkungen
10.2 Verwendung v on RmtA als Histonmethyltransferase
10.3 Überprüfung des Modells
10.4 Ergebnisse der Testung
10.5 Untersuchung der HKI-Substanzbank
10.6 Testung von analogen Substanzen der HKI-Substanzbank
10.6.1 Testung der Fluormethylanaloga
10.6.2 Testung der Oroidin-Verbindungen
10.6.4 Testung der Verbindungen mit α-Methylthioglykolamid-Struktur
10.7 NCI-Substanzbank
10.8 Interne Substanzbank
10.9 Chembridge-Verbindungen
10.10 Maybridge-Verbindungen
10.11 Tocris-Verbindungen
10.12 World-Drug-Index
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10.13 Abschließende Beurteilung
11. Testung der Verbindungen an hPRMT1
11.1 Aktiv itätsbestimmung und Testung an Sinefungin
11.2 Testung der RmtA-Inhibitoren
11.3 Ergebnisse der Testung an hPRMT1
12. Selektivitätstestung an SET7/9
12.1 Entwicklung eines Testsystems für SET7/9
12.2 Selektiv itätstestungen an SET7/9
12.3 Ergebnisse der Selektivitätstestungen an SET7/9
13. Selektivitätstestung an G9a
13.1 Ergebnisse und Diskussion der Testungen
14. Testung an nativen Histonen
14.1 Ergebnisse der Testungen
14.2 Diskussion der Ergebnisse
15. Kinetische Untersuchungen an RM-65 III
15.1 Theorie
15.2 Ergebnisse
15.3 Diskussion der Ergebnisse
16. Untersuchung der PRMT1- Inhibitoren im Western Blot
16.1 Durchführung der Experimente
16.2 Ergebnisse der Westernblot-Experimente
16.3 Diskussion der Western-Blot-Ergebnisse
17. Entwicklung eines zellbasierten Testsystems
17.1 Testung der zellulären Aktivität der Methyltransferase-Inhibitoren
17.2 Diskussion der Ergebnisse des Cellisa
18. Reportergenassays für PRMT1-Inhibitoren
18.1 Estrogen-Reportergen-Assays
18.2 Estrogen-Reportergen-Assay für PRMT1-Inhibitoren
18.3 Androgen-Reportergen-Assay für PRMT1-Inhibitoren
19. Entwicklung eines in-vivo-Testsystems
19.1 Entwicklung des Kükens im Ei
19.2 Immunhistochemische Arbeiten an Gallus gallus
19.3 Inkubation mit Inhibitoren
19.4 Überprüfung des apoptotischen Potentials
19.5 Abschließende Bewertung der Experimente am Modellorganismus
20. Entwicklung eines homogenen Testsystemes für hPRMT1
20.1 Wahl des Testformats und Aufbau des Testsystems
20.2 Entwicklung eines homogenen Testsystems für hPRMT1
20.2.1 Entwicklungsschritte
20.2.2 Testung von AMI-1, Allantodapson und Stilbamidin
20.2.3 Fazit der Entwicklung eines homogenen Testsystems für
Methyltransferasen
21. Untersuchungen an Histon demethylierenden Enzymen
22. Androgen-Reportergen-Assay für LSD1
22.1 Disskussion der Ergebnisse
23. Untersuchung von A34 mittels der Western Blot-Methode
23.2 Ergebnisse der Western Blot-Untersuchungen
24. Zellbasiertes Testsystems für Demethylasen
24.1 Diskussion der Ergebnisse
25. Entwicklung eines heterogenen Testsystems für Demethylasen
25.1 Bestimmung der optimalen Verdünnung an primärem Antikörper
25.2 Bestimmung der optimalen Verdünnung an sekundärem Antikörper
26. Demethylaseaktivität in Zellextrakten
26.1 Demethylaseaktivität in Rattenleberextrakten
26.2 Bestimmung der Aktivität der einzelnen Fraktionen
26.3 Demethylaseaktivität in Tumorzellen
26.4 Aufarbeitung von Tumorzellen
26.5 Aktiv itätsbestimmung der erhaltenen Fraktionen
26.6 Untersuchung von Inhibitoren
26.7 Disskussion der Ergebnisse
27. Entwicklung eines homogenen Testsystems für LSD1
28. Zusammenfassung und Ausblick
29. Methoden zur Entwicklung des in-vitro Testsystems
(Histonmethyltransferasen)
29.1 Verwendete Geräte und Materialien
29.2 Durchführung der Experimente
30. Durchführung der Western Blot-Untersuchungen für PRMT1-Inhibitoren
30.1 Verwendete Geräte und Materialien
30.2 Durchführung des Western-Blot-Experiments
30.3 Testung der PMRT1-Inhibitoren Allantodapson und Stilbamidin
31. Methoden zur Entwicklung des zellbasierten Testsystems für
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9
Methyltransferasen
31.1 Verwendete Geräte und Materialien
31.2 Durchführung
32. Methoden des Androgen-Reportergen-Assays für PRMT1
32.1 Verwendete Geräte und Materialien
32.2 Durchführung
33. Entwicklung eines in-vivo-Testsystems für
Methyltransferase-Inhibitoren
33.1 Verwendete Geräte und Materialien
33.2 Vorbereitung der Acrylamidbeads
33.3 Präparation der Beads
33.4 Vorbereitung der Hühnereier
33.5 Implantation der Beads
33.6 Fixierung des Embryos
33.7 Paraffineinbettung
33.8 Immunhistochemie
33.9 Überprüfung des Einflusses von Stilbamidin auf apoptotische Vorgänge
34. Entwicklung eines homogenen Testsystems für
Methyltransferasen
34.1 Verwendete Geräte und Materialien
34.2 Bestimmung der optimalen Substratkonzentration
34.3 Bestimmung der optimalen Antikörperverdünnung
34.4 Bestimmung der optimalen Enzymverdünnung
34.5 Testung von Verbindungen
35. Methoden des Androgen-Reportergen-Assays für LSD1
35.1 Verwendete Geräte und Materialien
35.2 Durchführung
36. Untersuchung von A34 mittels Western Blot
36.1 Verwendete Geräte und Materialien
36. 2 Durchführung
37. Entwicklung eines zellbasierten Testsystems für Demethylasen
37.1 Verwendete Geräte und Materialien
37. 2 Durchführung
38. Methoden zur Bestimmung der Demethylaseaktivität in
Zellextrakten
38.1 Verwendete Geräte und Materialien
38.2 Durchführung für Rattenleber
38.2.1 Aufreinigungsprotokoll
38.2.2. Bestimmung der Aktivität der gesammelten Fraktionen
38.3 Durchführung für Tumorzellen
38.3.1 Aktivitätsbestimmung
39. Entwicklung eines homogenen Testsystems für Demethylasen
39.1 Verwendete Geräte und Materialien
39.2 Bestimmung der optimalen Substratkonzentration
39.3 Bestimmung der optimalen Antikörperverdünnung
39.4 Erstellung einer Kalibrationsreihe mit abnehmenden Mengen an
Substratpeptid
39.5 Bestimmung der optimalen Enzymverdünnung/ Bestimmung der
Enzymaktivität
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10
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1.1: Darstellung der Packungsdichten des DNS-Histon-Komplexes
15
Abb. 2.1: Posttranslationale Modifikationen der Histone
21
Abb. 3.1: Methylierung eines Lysins im N-Terminus eines Histons
26
Abb. 3.2: Postulierte Demethylierung von Dimethyllysin 4 H3 durch LSD1
29
Abb. 4.1: Schematische Darstellung der Arginin-Methylierung
32
Abb. 4.2: Die Familie der Protein-Arginin-Methyltransferasen
33
Abb. 4.3: Regulierung zellulärer Prozesse durch Arginin-Methylierung
39
Abb. 4.4: Regulierung der Arginimethylierung durch Peptidyl-Arginin-Deiminasen
41
Abb. 4.5: AMI-1
41
Abb. 7.1: Schematische Darstellung der Bindungstasche mit verbliebenem SAH
46
Abb. 7.2: GRID basiertes Pharmakophor
47
Abb. 7.3A: Dockinglösung von Stilbamidin im PRMT1-Modell
48
Abb. 7.3B: Detaillierte Ansicht der Interaktionen zwischen polarer Amidingruppe und
Aminosäureresten im Eingangsbereich der Bindungstasche
48
Abb. 7.4A: Dockinglösung von Allantodapson im PRMT1-Modell
49
Abb. 7.4B: Detaillierte Ansicht der Interaktionen zwischen der polaren Allantoingruppe
und Aminosäureresten im Eingangsbereich der Bindungstasche
49
Abb. 7.5: Dockinglösung v on AMI-1
50
Abb. 9.1: Biotinyliertes Histonpeptid
54
Abb. 9.2: Schematische Darstellung des neuentwickelten Assays
55
Abb. 9.3: Mechanismus der Fluoreszenzemission eines Eu 3+-Komplexes
56
Abb. 9.4: Prinzip der zeitaufgelösten Fluoreszenzmessung
58
Abb. 9.5: Prinzip des DLCLLA
59
Abb. 9.6: Darstellung des DELFIA-Prinzips
60
Abb. 9.7: (p-Isothiocyanatobenzyl)-diethylentriamin-N1,N2,N3,N3-tetraessigsäure
60
Abb. 9.8: Fluoreszierender Europium 3+-Komplex innerhalb der Schutzmizelle
60
Abb. 9.9: Prinzip der Enzym-verstärkten Lanthanidlumineszenz
61
Abb. 9.10: Bestimmung der Bindungskapazität der Mikrotiterplattenkavitäten
62
Abb. 9.11: Bestimmung der optimalen Konzentration an primärem Antikörper
62
Abb. 9.12: Bestimmung der optimalen Konzentration an sekundärem Antikörper
63
Abb. 9.13: Kalibrationsreihe Histon H4- Peptid
64
Abb. 9.14: Umsetzung des Substrats durch PRMT1
65
Abb. 9.15: Sinefungin
65
Abb. 10.1: IC50-Bestimmungen der Pyrrol-Imidazol-Alkaloide
67
Abb. 10.2: IC50-Bestimmungen der potentesten α-Methylthioglykolamide
68
11
Abb. 10.3: IC50-Bestimmungen ausgewählter NCI-Verbindungen
83
Abb. 11.1: Aktivitätsbestimmung GST-hPRMT1
89
Abb. 12.1: Schematische Darstellung des Testsystems für SET7/9
92
Abb. 12.2: Bestimmung der optimalen Verdünnung des primären Antikörpers
93
Abb. 12.3: IC50-Bestimmungen an SET7/9
96
Abb. 13.1: G9a-Inhibitor BIX-01294
97
Abb. 15.1: Schematische Darstellung der Interaktion, RM65-III und hPRMT
101
Abb. 15.2: Kompetitionsanalyse RM-65 III
103
Abb. 16.1: Ergebnisse der Western Blot Untersuchungen an Arginin 3 H4
106
Abb. 17.1: Einfluss auf den Methylierungsgrad an Arginin 3 Histon H4 und Lysin 4
Histon H3
109
Abb. 17.2: Einfluss diverser Verbindungen auf den Methylierungsgrad an Arginin 3
Histon H4
111
Abb.17.3 : Graphische Darstellung der IC50-Bestimmung im zellbasierten
Testsystem
112
Abb. 18.1: Austausch eines Gens gegen das Luziferasegen
113
Abb. 18.2: Schematische Darstellung eines Estrogen-Reportergen-Assays
114
Abb. 18.3: Umsetzung des Luziferins zu Oxyluziferin unter Lichtemission
115
Abb. 18.4: Im Estrogen-Reportergen-Assay getestete Verbindungen
116
Abb. 18.5: Blockierung der estrogenvermittelten Rezeptoraktiv ierung
117
Abb. 19.1A: Sechsfache Vergrößerung des angefärbten Paraffinschnitts (HH24)
123
Abb. 19.1B: Sechsfache Vergrößerung des angefärbten Paraffinschnitts (HH24)
123
Abb. 19.2: Paraffinschnitt nach Inkubation mit Stilbamidin 75 µM
124
Abb. 19.3: Apoptosetest durch Anfärbung mit Nilsulfatblau
126
Abb. 20.1: Schematische Darstellung des AlphaScreen-Prinzips und der
Generierung von Chemoluminezenz
128
Abb. 20.2: Nodulisporinsäure A
130
Abb. 20.3: Bestimmung der optimalen PRMT1-Verdünnung
134
Abb. 20.4: Schematische Darstellung des homogenen Testsystems für PRMT1
134
Abb. 20.5: IC50-Bestimmungen im homogenen Testsystem für PRMT1
136
Abb. 23.1: Ergebnisse der Western Blot Untersuchungen
141
Abb. 24.1: Testung von A34 als potentiellem LSD1-Inhibitor
142
Abb. 25.1: Schematische Darstellung des heterogenen Testsystems
143
Abb. 25.2: Bestimmung der optimalen Konzentration an primärem Antikörper
144
Abb. 25.3: Bestimmung der optimalen Konzentration an sekundärem Antikörper
144
Abb. 26.1: Prinzip der Formaldehydbestimmung nach Nash (Hantzsch-Reaktion)
146
12
Abb. 26.2: Kalibrationsreihe 10- 0 µmol Formaldehyd /Küvette
Abb. 26.3: Umsetzung des Substratpeptides durch Zellextrakte
146
148
Abb. 26.4: Umsetzung des Substratpeptides
149
Abb. 26.5: Umsetzung des Substratpeptides
149
Abb. 27.1: Graphische Darstellung der resultierenden Signalintensitäten
153
Abb. 28.1: Die im Estrogen-Reportergen-Assay aktiv en Verbindungen
155
Tabellenverzeichnis
Tab. 9.1: Inhibitorische Aktivität der Argininderivate
66
Tab. 10.1: Ergebnis der Testung der als inaktiv eingestuften Verbindungen
70
Tab. 10.2: Inhibitorische Aktivität von Verbindungen aus dem HKI-Naturstoffpool
74
Tab. 10.3: Ergebnisse der Trifluormethylverbindungen
75
Tab. 10.4: IC50-Bestimmungen der Pyrrol-Imidazol-Alkaloide
76
Tab. 10.5: Inhibitorische Aktivität der α-Methylthioglykolamidverbindungen
78
Tab. 10.6 : Inhibitorische Aktivität von Verbindungen aus der NCI-Substanzbank
82
Tab. 10.7: Inhibitorische Aktivität von Verbindungen der internen Substanzbank
84
Tab. 10.8: Inhibitorische Aktivität von Chembridge-Verbindungen
85
Tab. 10.9 : Inhibitorische Aktivität von Maybridge-Verbindungen
86
Tab. 10.10: Inhibitorische Aktivität der Tocris-Substanzen gegenüber RmtA
87
Tab. 10.11: Inhibitorische Aktivität von World-Drug-Index-Verbindungen
88
Tab. 11.1: Ergebnisse der Chembridgeverbindungen an hPRMT1
90
Tab. 11.2: IC50-Bestimmungen an hPRMT1
91
Tab. 12.1: Inhibitorische Aktivität von NCI-Verbindungen an SET7/9
95
Tab. 13.1: Inhibitorische Aktivität von NCI- Verbindungen an G9a
98
Tab. 14.1: Testung ausgewählter Substanzen im radioaktiven Assay
99
Tab. 18.1: Einfluss der Testsubstanzen (c= 40 µM) auf Aktiv ierbarkeit des AR
119
Tab. 18.2: Einfluss der Testsubstanzen (c= 8 µM) auf Aktiv ierbarkeit des AR
113
Tab. 20.1: Ermittlung der optimalen Substratkonzentration
133
Tab. 20.2: Ermittlung der optimalen Antikörperverdünnung
133
Tab. 20.3: Vergleich der IC50-Werte an PRMT1
135
Tab. 22.1: Einfluss der Testsubstanzen auf die Aktiv ierbarkeit des AR
139
Tab. 26.1: Inhibierung enzymatischer Aktivität durch MAO-Hemmer und A34
150
Tab. 27.1: Ermittlung der optimalen Substratkonzentration
142
Tab. 27.2: Ermittlung der optimalen Antikörperverdünnung
142
Tab. 29.1: Reziproke Initialgeschwindigkeiten/ Substratkonzentrationen
162
Tab. 38.1: Ergebnisse der Formaldehydbestimmung nach Nash
189
13
1. Einleitung
Histone sind kleine basische Proteine, um die die DNS im Zellkern gewickelt ist.
Durch diese Kompaktierung wird die Unterbringung des DNS-Stranges in der Zelle
erst ermöglicht. Durch posttranslationale Modifikationen der Histone wird die
Genablesung reguliert. Diese Modifikationen werden durch spezifische Enzyme
ausgeführt. Ziel dieser Arbeit war es, Testsysteme für einige dieser Enzyme,
insbesondere Argininmethyltransferasen zu entwickeln.
1.1 Aufbau des Chromatins
In den Kernen eukaryotischer Zellen liegt die Desoxyribonukleinsäure (DNS)
zusammen mit Histonen und Nicht-Histon-Proteinen als komplexes Gebilde; als sog.
Chromatin vor. Das Chromatin weist trotz seiner hohen Packungsdichte dynamische
Eigenschaften auf. Die humane DNS besitzt ca. 3x109 Basenpaare, welche im
Zellkern jeder somatischen Zelle untergebracht werden müssen. Der negativ
geladenen DNS lagert sich ein stark basisch geladener Histonproteinkomplex an.
Dieser besteht aus je 2 H2A-, H2B-, H3- und H4-Histonproteinen, den sog. CoreHistonen. Die DNS ist auf einer Länge von ca. 146 Basenpaaren mit zwei
linksgängigen, superhelikalen W indungen um dieses Histonoktamer geschlungen.
Diese aus Histonproteinkomplex und DNS bestehende Einheit stellt das kleinste sich
wiederholende Verpackungselement des Chromatins dar und wird als Nukleosom
(alternativ
auch
„Core-Partikel“) bezeichnet.
Das
Nukleosom
besitzt
einen
Durchmesser von 10 nm; kristallisiert und mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse
dargestellt wurde es erstmals 1997
1
.
Das Histon H1 ist kein Teil des Histonoktamers,
es lagert sich jedem Nukleosom an der Ein- und Austrittsstelle der aufgewickelten
DNS an. Die DNS zwischen den einzelnen Nukleosomen wird als Verbindungs-DNS
bezeichnet. Sie umfasst 10-50 Basenpaare. Durch die wechselnde Folge von
Nukleosomen und Verbindungs-DNS entsteht bei niedrigen Salzkonzentrationen ein
Gebilde, welches elektronenmikroskopisch betrachtet an eine Perlenkette erinnert
(„beads on a string“)2. Dieser 10-11 nm dicke Chromatinfaden stellt die niedrigste
Verpackungseinheit dar, er kondensiert bei physiologischen Salzkonzentrationen zu
einem sog. Soleonid mit einer Dicke von 30 nm. Hier sind pro W indung 6-8
Nukleosomen schraubenförmig angeordnet. Der Aufbau dieses Fadens scheint nicht
14
durchgängig regelmäßig zu sein, über das Auftreten von „zig-zag-Elementen“
zwischen den
verschiedener
einzelnen
Nukleosomen
Nukleosomen
wurde
untereinander
berichtet3,4.
werden
Die
insbesondere
Interaktionen
durch
die
5
N-Termini der Histone vermittelt , die Faltungen, die durch die Solenoid- und
„zig-zag-Struktur“ zustande kommen, werden nochmals stabilisiert. Histon H1 und
die
Nicht-Histonproteine sind
von
besonderem Interesse,
wenn es
um die
Betrachtung aller höheren Verpackungsordnungen geht. H1 beispielsweise erhöht
die Dichte des Chromatins und stabilisiert die Ein- und Austrittsstellen der DNS im
Nukleosom6. Nach der 30 nm-Faser stellt der sog. Chromonema-Faden die
nächstdichtere Verpackungseinheit dar. Dieser ist 60-130 nm dick. Die höchste
Kompaktierung erreicht die DNS als Mitosechromosom. Dieses ist aufgrund der
Packdichte auch im Lichtmikroskop sichtbar.
Abb. 1.1: Darstellung der Packungsdichten des DNS-Histon-Komplexes.
(Abb. aus „T he Cell“, 4. Auflage, Sinauer Associates Inc.)
15
1.2 Euchromatin und Heterochromatin
In den meisten eukaryotischen Zellkernen liegt das Genom in zwei mikroskopisch
unterscheidbaren „Chromatin-Dichtegraden“ vor. Zu ca. 10 % kann das sehr dicht
gepackte Heterochromatin
ausgemacht
werden,
zu ca. 90 % das weniger
kompaktierte Euchromatin. Bei dieser Einteilung ist zu berücksichtigen, dass
Chromatin ein sehr dynamisches Gebilde darstellt und die Übergänge wahrscheinlich
fließend sind7. Die Existenz von Heterochromatin wurde 1928 erstmals von Heitz
beschrieben. Er entdeckte in Mooszellen, dass ein Chromosom sich beim Übergang
von der Mitose- in die Interphase nicht dekondensierte. Desweiteren sah er, dass
Metaphasenchromosomen sich beim Übergang in die Interphase nicht komplett
entfalteten. Regionen um das Zentomer und T elomer behielten ihre kompaktere
Struktur bei, während sich Euchromatin in den Bereichen dazwischen ausbildete8. Es
werden
zwei
Arten
von
Heterochromatin
unterschieden:
Als
konstitutives
Heterochromatin werden die perizentromeren Regionen und die Telomerregionen
der Chromosomen bezeichnet. Jede somatische Zelle weist an derselben Stelle
Chromatin in kondensierter Form auf. Diese Bereiche spielen in der Mitose eine
wichtige Rolle für die Chromosomensegregation
auf
die Tochterzellen9. Als
fakultatives Heterochromatin wird jenes Chromation bezeichnet, welches auch als
Euchromatin vorliegen kann und nicht an eine bestimmte Lokalisation im Chromatin
gebunden ist. Ein Beispiel für fakultatives Heterochromatin ist das inaktivierte
X-Chromosom weiblicher Säugetiere, das sog. „Barr-Körperchen“. Ob das maternale
oder paternale X-Chromosom inaktiviert wird, scheint dem Zufall überlassen zu
werden. Die Information, welches X-Chromosom schließlich ausgewählt wurde, wird
an die Tochterzellen weitergegeben 10. Diese W eiterleitung der Information macht
deutlich, dass sich heterochromatische Bereiche nach erfolgter Replikation wieder
herstellen. W ie die Entstehung von Heterochromatin gestartet wird, ist noch nicht
geklärt. Es wird jedoch deutlich, dass diese Information nicht in Form einer DNSSequenz „gespeichert“, sondern in Chromatin-assoziierten Faktoren festgelegt ist.
Für konstitutives Heterochromatin sind im Bereich der perizentrischen und telomeren
Chromatinregionen repetitive Satellitensequenzen (repeats) charakteristisch, diese
stellen jedoch keine Vorraussetzung für die Entstehung von Heterochromatin dar.
Diese repeats variieren in ihre Länge und werden mit Erkrankungen wie bsp. Chorea
Huntington oder Friedreich-Ataxie in Zusammenhang gebracht11. Insbesondere bei
23
kurzen repeats
Experimentelle
wurde
eine
inkorrekte Chromosomensegregation
Untersuchungen
ab 1930
zeigten,
dass
beobachtet.
heterochromatische
Chromatinbereiche einen reprimierenden Einfluss auf die Genexpression haben.
Dieser Einfluss scheint auch über einige Megabasen hinweg eine Stillegung der
Genablesung auslösen zu können, ohne das Enhancer oder Suppressoren direkt
beteiligt sind. Dieses Phänomen spiegelt sich in dem als Position Effect Variegation
(PEV)
bezeichneten
Effekt
wieder.
Dieserwurde besonders
intensiv
am
Modellorganismus Drosophila melanogaster untersucht. W urde ein Gen, das z.B. für
die rote Augenfarbe codiert, in die Nähe des heterochromatischen Zentromers
gebracht, war die Exprimierung des Gens nicht mehr stabil. Die Fruchtfliegen fielen
durch ihre weißen bzw. rot-weißen Augen auf. In den sich anschließenden
Untersuchungen wurden
Suppressoren
(Su(var)- Suppressorsof PEV) und
Aktivatoren (e(var)- Enhancers of PEV) der PEV entdeckt. Begründet durch weitere
Experimente lag es nahe, beide als Chromatin-assoziierte Faktoren zu betrachten,
die das Chromatin strukturell und funktionell verändern könnten12. Unter anderem
wurden su(var)3-9 und su(var)2-5 als für die Entstehung und Aufrechterhaltung von
Heterochromatin wichtige Faktoren
identifiziert13.
Su(var)2-5 codiert
für das
Heterochromatin-Protein HP1, ein Protein, welches Affinität zu Heterochromatin
aufweist 14. Da endeckt wurde, dass Heterochromatin zu großen Teilen aus ehemals
fremdem genetischem Material besteht15, wurde die Theorie aufgestellt, dass
eukaryotische Zellen sich vor der Aktivierung dessen durch die Ausbildung
heterochromatischer Strukturen schützen16. Zunächst blieb jedoch unklar, was die
Bindung von HP1 an Chromatin auslöste. Im Jahr 2000 wurde die erste humane
Histonmethyltransferase
entdeckt17.
Su(var)3-9,
bislang
als
PEV-Suppressor
bekannt, methyliert die Aminosäure Lys9 im Histon H3. In mutierten Zellen, sog.
Su(var)3-9 Doppel-Null Zellen, konnte kein methyliertes Lys9H3 detektiert werden.
Ebenso fehlte eine Interaktion von HP1 und Heterochromatin. 2001 konnte durch
durch Lachner und Jakobs gezeigt werden, das diese Interaktion auf die im HP1
vorhandene Chromodomäne zurückzuführen ist, welche eine Affinität zu H3 Lysin 9methyl besitzt18. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass Su(var)3-9 mit der
Histondesacetylase HDAC1 assoziiert ist. An Lys9 im Histon H3 acetylierte Histone
müssen somit erst desacetyliert werden, bevor sie eine mit Heterochromatin
assoziierte Modifikation erhalten. Dadurch kann sichergestellt werden, dass auch
Bereiche, in denen sich Markierungen für eine verstärkte („aktivierte“) Genablesung
befinden, stillgelegt werden können19. Viele Spezies weisen noch ein Merkmal
24
heterochromatischer Bereiche auf: die DNS-Methylierung. Diese an den Cytosinen in
sog. CpG-Inseln („CpG islands“) befindliche Markierung wird mit Genstillegung
assoziiert. Sie scheint jedoch nicht zwingend notwendig zu sein. Drosophila
melanogaster besitzt z.B. nur einen sehr geringen DNS-Methylierungsgrad20.
1.3 Die Histone
Die Histone des Chromatins sind hoch konservierte Proteine: Auch in entfernter
verwandten Spezies unterscheiden sie sich nur um wenige Aminosäuren. Die hohe
Konservierung legt nahe, dass die Histone im Nukleus eukaryonter Organismen eine
essentielle Aufgabe übernehmen. Die Core-Histonproteine H2A, H2B, H3 und H4
sind relativ klein und haben ein Molekulargewicht zwischen 11 kDa (H4) und 15 kDa
(H3), während Histon H1 mit 19-23 kDa das größte Histon darstellt. Alle Histone sind
stark basisch und deshalb bei physiologischen Salzkonzentrationen und pH-W erten
positiv geladene Moleküle. Der Grund hierfür liegt an dem hohen Anteil basischer
Aminosäuren: H4 weißt z.B. einen Arginingehalt von 15 % auf, H1 einen Lysingehalt
von 29 %. Die positiven Ladungen sind für die Nukleosomenentstehung erforderlich:
Die Histone interagieren mit dem negativ geladenen Ribose-Phosphat-„Rückgrat“ der
DNS-Doppelhelix. Dabei berühren die kleinen Furchen der DNS-Doppelhelix ca. alle
10 bp das Histonoktamer und interagieren dort insbesondere mit den positiv
geladenen Arginin-Seitenketten. Die polaren N-terminalen Enden der Histone ragen
weit in die Umgebung des Nukleosoms hinaus. Es wurde gezeigt, dass sie mit
benachbarten
Strukturen
Kontakt
aufnehmen
und
für
die
Lebensfähigkeit
eukaryonter Organismen essentiell sind21.
Histone werden nach ihrer Synthese (posttranslational) im Zytoplasma von den dort
ansässigen Histonacetyltransferasen an Lysin 5 H4, Lysin 12 H4 und Lysin 14 H3
acetyliert und gelangen in diesem Zustand in den Zellkern. Die posttranslationale
Acetylierung der neu synthetisierten Histone scheint für die Histon-Chaperone von
großer Bedeutung zu sein. Diese haben die Aufgabe, Histone zur DNS zu
eskortieren und arbeiten mit Nukleosom-Remodeling-Komplexen zusammen, um
eine geordnete und regelmäßige Abfolge von Nukleosomen entlang der DNS
sicherzustellen. Zuerst wird je ein H3-H4-Tetramer mit je 2 H2A-H2B-Dimeren zu
einem Histonoktamer zusammengesetzt und erst daraufhin mit DNS umwickelt. Es
25
wurde gezeigt, dass der Chromatin-Assembly Factor 1 (CAF1) mit acetylierten H3und H4-Histonen assoziiert ist22. Daraufhin wurde beobachtet, dass die von CAF1
und RCAF1 (replication coupled assembly factor 1) benötigte Acetylierung von H4
von dem Enzym HAT1 abhängt23: CAF1 und RCAF können ein (H3-H4)-Tetramer
binden, wenn es an Lysin 5 und Lysin 12 H4 acetyliert ist. Nach der Formung der
acetylierten Histone zu Nukleosomen erfolgt rasch deren Desacetylierung. W arum
die zytoplasmatische, der Nukleosombildung vorrausgehende Histon-Acetylierung
existiert, ist nicht bekannt24. W ird die Acetylierung der Histone verhindert, findet
trotzdem eine Nukleosomenassemblierung statt, jedoch ist die entstandene
Nukleosomenkette
in
der
Abfolge
der
einzelnen
Nukleosomen
deutlich
unregelmäßiger25. Dies weist darauf hin, dass die regelmäßige Positionierung der
Nukleosomen entlang der DNS durch Histon-Chaperone nur im Zusammenwirken
mit Remodeling-Faktoren bewerkstelligt werden kann. Ist die Assemblierung von
Histonen und DNS zu einer Nukleosomenkette erfolgt, können diese kleinsten
funktionalen Einheiten des Chromatins auf drei grundlegend verschiedene Arten
verändert werden: Die Position eines Nukleosoms kann durch sog. RemodelingKomplexe unter Energieaufwand (Hydrolyse von ATP) verändert werden. Diese
Aktivität spielt bei DNS-gebundenen Prozessen, wie z.B. der Transkription eine
essentielle Rolle. Die DNS wird partiell mobilisiert und für Enzymkomplexe
zugänglich gemacht. Bereits assemblierte Nukleosomen können an den Histon-NTermini mit posttranslationalen Modifikationen verändert werden,
welche zu
strukturellen und funktionellen Veränderungen führen. Eine weitere mögliche
Veränderung bergen die sog. Histonvarianten, welche außerhalb der Replikation in
entstehende Nukleosomen inkorporiert werden. Sie ersetzen die Core-Histone,
wodurch sie bestimmte Chromatinbereiche markieren26. Die Histonvarianten werden
replikationsunabhängig synthetisiert und in das bestehende Nukleosom eingebaut.
Auch dieser Einbau findet unabhängig vom Zellzyklus statt. Die „normalen“ Histone
hingegen werden nur in der S-Phase synthetisiert und eingebaut. Durch die
zellzyklusunabhängige „Verfügbarkeit“ der Histonvarianten wird
es der
Zelle
ermöglicht, rasch auf spezifische Signale, z.B. DNS-Schäden reagieren zu können.
Histonvarianten existieren für alle Histone bis auf H4 und H2B. Die dabei
auftretenden Veränderungen in der Aminosäuresequenz sind jedoch nur gering
ausgeprägt. Diese Änderungen führen jedoch zu einer einzigartigen Chromatin
26
regulierenden Aktivität und einer im Vergleich zum „normalen“ Histon geänderten
Affinität gegenüber Chromatin assoziierten Faktoren. Bei transkriptionsaktiven
Genen ist grundsätzlich Histon H3 gegen die Variante H3.3 ausgetauscht. Der Ersatz
von H2A durch H2A.Z korreliert mit der Transkriptionsaktivität und kann das
Vorliegen nukleosomfreier Promoterregionen anzeigen. Das Vorliegen von H2A.Z
wurde andererseits jedoch auch in stillgelegtem Chromatin beobachtet. Eine weitere
Histonvariante von H2A ist H2A.X, das im gesamten Chromatin vorhanden ist. Es
wurde mit DNS-Schäden und -Reparaturprozessen assoziiert, nachdem beobachtet
wurde, dass DNS-Doppelstrangbrüche an nahegelegenen H2A.X-Histonen eine
27
Phosphorylierung induzieren . Die
MacroH2A-Histone ersetzen im inaktiven
X-Chromosom von Säugetieren reguläres H2A und sind mit heterochromatischen
Bereichen assoziiert28. Passend zu den Attributen des Heterochromatins blockieren
Nukleosomen
mit
MacroH2A-Histonen
sowohl
das
Andocken
von
Transkriptionsfaktoren, als auch die für die Transkription benötigte RemodelingAktivität des sog. Swi/Snf-Komplexes29.
27
2. Posttranslationale Histonmodifikationen
In den 1960er Jahren entdeckte Vincent Allfrey die Acetylierung, Methylierung und
Phosphorylierung von eukaryotischen Histonen. Histone zählen desweiteren zu den
ersten Proteinen, an denen eine Ubiquitinylierung entdeckt wurde. Obwohl Allfrey
zahlreiche
Verbindungen
von
Histonmodifizierungen
und
transkriptionsaktivem
Chromatin nachweisen konnte30, wurde eine kausale Rolle der posttranslationalen
Histonmodifikationen bezüglich der Genregulation bis in die 1990er Jahre in Frage
gestellt.
Abb. 2.1: Posttranslationale Modifikationen der Histone.
(Abb. aus „Chromatin disruption and modification“, Nucleic Acid Research, 1999)
2.1 Acetylierung31
Die Histonacetylierung zählt zu den am besten untersuchten posttranslationalen
Histonmodifikationen. Sie ist eine dynamische, durch Desacetylierung reversible und
für die Transkription essentielle Modifikation. Die Histonacetyltransferasen (HAT s)
werden in HAT-A- (im Nukleus) und HAT-B-Enzyme (im Zytoplasma) unterteilt.
Innerhalb HAT A/B werden mehrere HAT-Familien unterschieden. Diese sind in ihrer
Sequenz homolog32. Acetylierte Lysine, vor allem im N-Terminus von H3 und H4,
führen zu einer Mobilitätssteigerung eines Nukleosoms entlang des DNS-Fadens.
28
Dieses Phänomen ist für die Dekondensation des Chromatins äußerst wichtig: Mit
der Histonacetylierung geht eine Verminderung der positiven Ladungen der Lysine
einher, wodurch sich die gegenseitige Anziehung zwischen den positiv geladenen
Histonen und dem negativ geladenen Ribose-Phosphat-Gerüst der DNS vermindert.
Vereinfacht kann man in heterochromatischen Chromatinabschnitten von einem
hypoacetylierten Zustand ausgehen, während euchromatisches bzw. transkriptionell
aktives Interphasechromatin regelmäßig an den Histon-N-Termini acetyliert ist. Die
partielle Entfaltung des Chromatins und der somit geschaffene Zugang zur DNS ist
für alle DNS-gebundenen Vorgänge essentiell: Eine Transkriptionssteigerung ist
beispielsweise in diesem Bereich des Chromatins nun durch das Andocken von
Transkriptionsfaktoren und des RNA-Polymerasekomplexes möglich33. Es existieren
außerdem funktionsgebundene Proteine, die nur dann an die Histon-N-T ermini
binden, wenn sie ihr Bindungsmotiv aus bestimmten acetylierten Aminosäuren
erkennen können. Charakteristisch für diese Proteine ist die „Bromodomäne“, die
beispielsweise in TAF-250 (ein für die Transkription wichtiges TBP-assoziiertes
Protein) vorkommt34. Die Bedeutung der zytoplasmatischen HAT s (HAT-B) ist für die
Bildung neuer Nukleosomen
entscheidend. Nach der replikationsgekoppelten
Synthese der Histone in der S-Phase werden diese noch im Zytosol acetyliert und
dann in den Nukleus überführt34. Die Assemblierung von Histonen zu Nukleosomen
ist von den Histon-Chaperonen wie CAF1 (Chromatin assembly factor 1) oder RCAF
(replication coupled assembly factor 1) abhängig36. Für CAF1 konnte gezeigt werden,
dass es mit acetylierten H3- und H4-Histonen vorliegt22. Im Nukleus werden neu
synthetisierte Nukleosomenverbände nach dem Import aus dem Zytoplasma
desacetyliert36.
2.2 Desacetylierung31
Die Einteilung der verschiedenen Histondesacetylasen (HDACs) richtet sich nach der
Abhängigkeit von Kosubstraten. Klasse I- und II-HDACs benötigen für ihre Aktivität
Zinkionen, während die Klasse III HDACs das Kosubstrat NAD+ benötigen37. HDACs
sind
häufig
mit
anderen
Proteinen
oder
Proteinkomplexen
assoziiert,
die
DNS-Bindungen eingehen können oder transkriptionell regulatorisch wirken. Die
dynamischen Eigenschaften der Histonacetylierung wären ohne die HDACs nicht
vorhanden. Da die Histonacetylierung zu einer Destabilisierung bzw. „Auflockerung“
der Chromatinstruktur führt, bewirkt die Desacetylierung eine Kondensierung des
29
Chromatins. Die N-terminalen Lysine besitzen wieder eine positive Ladung, dadurch
nimmt
die
Anziehung
zwischen
DNS
und
Histonen
zu.
Die
kompaktere
Chromatinstruktur ist transkriptionell inaktiv. Die Assoziationen von HDACs mit
reprimierend wirkenden Proteinen wurde an dem DNS-methylierenden Enzym
Dnmt338, an der Histonmethyltransferase Su(var)3-919, sowie an Polycomb-GruppenProteinen demonstriert39. Eine inkorrekte oder unvollständige Histondesacetylierung
wurde mit der Entstehung von Neoplasien in Verbindung gebracht40. Es wird davon
ausgegangen, dass im gesamten Genom in differenzierten Zellen ein Gleichgewicht
zwischen
Acetylierung
und
Desacetylierung
vorliegt41,
welches
in
malignen
entarteten Zellen gestört ist. Man hat beobachtet, dass HDAC-Inhibitoren (z.B.
Butyrate, Valproat, Trichostatin A, u.a.) Klasse I- und II-HDACs in vitro inhibieren
können. In vivo konnten HDAC-Inhibitoren Zellen in der S-Phase arretieren42 und
möglicherweise vor der Transformation bewahren43. Daraus erfolgte die Annahme,
dass HDAC-Inhibitoren wichtige Signalwege für den Zellzyklus blockieren können44.
W egen der transkriptionell reprimierenden Eigenschaften der Histondesacetylierung
nimmt man bezüglich der W irkungsweise von HDAC-Inhibitoren an, dass sie durch
die Hemmung der HDACs zu einer „Re-Expression“ von Genen führen, die für eine
ausreichende Differenzierung einer Zelle vonnöten sind45. Die Differenzierung einer
Zelle durch die Ausprägung spezifischer Merkmale ist eine entscheidende Fähigkeit,
welche transformierten - also entdifferenzierten - Zellen verloren gegangen ist. Nach
ausführlichen Versuchen an humanen Tumorzelllinien haben HDAC-Inhibitoren in
der Therapie bösartiger Erkrankungen (insbesondere bei Leukämien) bereits Erfolge
in klinischen Studien erbracht46 und seit 2007 ist Vorinostat zur Behandlung des
kutanen T-Zelllymphoms zugelassen.
2.3 Phosphorylierung 31
Alle Histone können auch phosphoryliert werden, wobei diese Modifikation nicht an
N-terminalen
Lysinen
oder
Argininen
sondern
an
Serinen
erfolgt.
Die
Phosphorylierung von Serin 10 im Histon H3 ist zellzyklusabhängig und wurde am
besten untersucht47. Die Serin 10-Phosphorylierung an H3 stellt in Eukaryonten
einen Marker für die Mitose dar48. Mittlerweile konnte auch gezeigt werden, dass die
Serin
10
H3-Phosphorylierung
für
die
korrekte
Durchführung
der
Chromosomenkondensation und Chromosomensegregation in der Mitose und der
30
Meiose von Bedeutung ist49. Es gibt auch Hinweise, dass diese Modifikation mit einer
Transkriptionsaktivierung
in
Eukaryonten
zusammenhängt47:
Der
Anteil
phosphorylierter H3-Histone in zuvor ruhenden Zellen steigt nach Stimulation mit
W achstumsfaktoren sprunghaft an50. Die Beobachtung der gegenseitigen Inhibition
der Phophorylierung von Serin 10 und der Methylierung von Lysin 9 führte zu der
Annahme, dass die einzelnen Modifikationen sich untereinander beeinflussen. Eine
Genaktivierung bzw. -stilllegung wäre somit dass Resultat des Zusammenspiels
einzelner
bezeichnet.
Modifikationen.
Diese
Ansicht
wird
auch
als
Histon-Code-These
Die an Peptiden in vitro beobachteten Ergebnisse wurden durch die
Doppel-Null-Mutation von su(var)3-9 in embryonalen Maus-Fibroblasten untermauert,
die vermehrt an Serin 10 in H3 phosphoryliert waren17. Dagegen wird die
Acetylierung von Lysin 14 H3 durch die Phosphorylierung von Serin 10 H3
gefördert51.
2.4 Ubiquitinylierung 31
Die Ubiquitinylierung wurde außer an H4 an allen Histonproteinen nachgewiesen und
besitzt das größte Molekulargewicht aller Histonmodifikationen (ca. 8,5 kDa). Über
die Bedeutung dieser Modifikation an Histonen ist allerdings noch nicht sehr viel
bekannt. Normalerweise wird ein Protein durch Polyubiquitinylierung für den Abbau
in einem Proteosomenkomplex gekennzeichnet. Die Monoubiquitinylierung von H2B
wurde in Versuchen mit Tetrahymena mit Transkripitionsaktivierung in Verbindung
gebracht52. Im Sinne eines Histon-Codes53 scheint die Ubiquitinylierung von H2B an
Lysin 123 in Hefe für die Methylierung von H3 Lysin 4 durch die HMTase Set1
Vorraussetzung zu sein54.
2.5 ADP-Ribosylierung31
Die ADP-Ribosylierung von Histonen ist bisher vor allem mit den Prozessen des
Alterns, der Ausbildung der DNS-W indungen und der Transkriptionsaktivierung in
Verbindung
gebracht
worden.
Der
Rückschluss
auf
die
Beeinflussung
der
Transkription erfolgte durch die Beobachtung, dass es offensichtlich eine Parallele
zwischen der Histonacetylierung und der ADP-Ribosylierung gibt. W ie oben bereits
erwähnt, kann insbesondere die Acetylierung von Histon H4 mit einer gesteigerten
31
transkriptionellen Aktivität assoziiert sein. Steigt die H4-Acetylierung experimentell
an, so nimmt auch die ADP-Ribosylierung am H4-Molekül zu55. Möglicherweise ist
die im Alter beobachtete, reduzierte Histon-ADP-Ribosylierung in einer reduzierten
Transkriptionsrate der Zellen begründet56. Die ADP-Ribosylierung wurde mit weiteren
nukleären Prozessen wie der DNS-Reparatur, der Apoptose und der Genomstabilität
in Verbindung gebracht57. Das ADP-ribosylierende Enzym PARP1 (Poly-ADPRibose-Polymerase1) wird z.B. durch DNS-Doppelstrangbrüche aktiviert und führt zu
einer lokalen Anhäufung ADP-ribosylierter Histone in diesem Bereich58.
2.6 Methylierung
Die Methylierung von Histonen stellt eine komplexere Modifikation als die bislang
aufgeführten dar. Sie kann sowohl an Argininen als auch Lysinen auftreten, wobei je
nach Modifikationsstelle die Transkription gesteigert oder vermindert wird. Zur
Komplexität trägt auch die Tatsache bei, dass die Methylierung in unterschiedlichen
Graden auftreten kann. Lysin kann mono-, di-, oder trimethyliert werden, beim
Arginin verläuft die Methylierung zum Mono- oder Dimethylarginin. Bislang sind
24 Lysin- bzw. Arginin-Methylierungsstellen für die Core-Histone beschrieben.
Zusammen mit der Tatsache, dass unterschiedliche Methylierungsstufen auftreten
können, ergibt sich ein ernormes kombinatorisches Potential („Histon-Code“).
32
3. Methylierung von Lysinen
Die Tatsache, dass sich Lysinreste in Histonen im methylierten Zustand befinden
können, war schon lange bekannt. Im Jahr 2000 wurde von Rea die erste
Lysinmethyltransferase, die Histone als Substrat verwendet identifiziert17. Inzwischen
wurde eine Vielzahl weiterer Histonlysinmethyltransferasen (HKMTs) identifiziert. Alle
bis auf Dot1, weisen als Gemeinsamkeit die sog. SET-Domäne auf. Diese
beherbergt das aktive Zentrum und ermöglicht die Bindung des Kosubstrates. Ihren
Namen erhielt sie aufgrund ihres Vorkommens in Su(var)3-959, dem PolycombGruppen-Protein E(Z)60 und dem T rithorax-Gruppen-Protein Trithorax61. Die Anzahl
der Methylgruppen an einem Lysin hängt von den jeweiligen Enzymen ab, z.B. kann
DIM-5 Lysin 9 H3 trimethylieren62, während SET7/9 Lysin 4 H3 nur monomethylieren
kann63. Von den vielen Methylierungsstellen sind bislang sechs gut charakterisiert
worden: auf dem Histon H3 sind dies Lysin 4, 9, 27, 36 und 79, auf dem Histon H4
Lysin 20. Die Methylierung von Lysin 4 H3, Lysin 36 H3, Lysin 79 H3 aktiviert die
Transkription, wohingegen die anderen Modifikationen mit Transkriptionsrepression
in Verbindung gebracht werden. Dimethyllysin 79 H3 und Dimethyllysin 20 H4 sind
auch
in
den Prozess
der
DNS-Reperatur
eingebunden.
Für
jede
der 6
Modifikationsstellen wurden spezifische Proteine entdeckt, welche die Modifikation
erkennen. Diese Proteine besitzen je eine der drei für die Erkennung von
methyliertem Lysin bekannten Domänen: die Tudor-, Chromo- oder PHD-Domäne20.
Auf die Methylierung von Lysin 4 H3 und Lysin 9 H3 soll im folgenden Abschnitt
genauer eingegangen werden.
Abb. 3.1: Methylierung eines Lysins im N-Terminus eines Histons.
33
3.1 Methylierung an Lysin 4 Histon H3
Die Methylierung von Lysin 4 H3 ist eine Modifikation, die in euchromatischen
Bereichen auftritt. Es wird angenommen, dass die Dimethylierung an Lysin 4 H3
einen allgemeinen Mechanismus darstellt, um die Stillegung von Genen zu
verhindern20. Bei Dimethyllysin 4 H3 handelt es sich um ein globales Merkmal
euchromatischen Chromatins, während die Trimethylierung an Lysin 4 mit aktiver
Transkription korreliert. Trimethyliertes Lysin 4 wird z.B. an den 5`-Enden von Genen
während der Aktivierung der Transkription beobachtet. Drei Komponenten der
Transkriptionsmaschinerie tragen zur Entstehung der Modifikation bei. Zunächst
rekrutiert RNA-Polymerase II die HKMT Set1, welche Lysin 4 H3 in der Nähe von
Promotern methyliert. Der PAF-Komplex, welcher eine Rolle im RNA-Metabolismus
spielt, interagiert ebenfalls mit SET1. Die dritte Komponente, welche für die
Entstehung von Trimethyllysin 4 H3 von Bedeutung ist, ist die Monoubiquitinylierung
von H2B an Lysin 120. Die Modifikation Trimethyllysin 4 H3 rekrutiert im Folgenden
spezifische Faktoren wie das CHD1-Protein und den NURF-Komplex, welcher die
Fähigkeit besitzt, Nukleosomen mobilisieren zu können20. Im Gegensatz zu den
meisten Histonlysinmethyltransferasen handelt es sich bei der in dieser Arbeit für
Selektivitätsstudien verwendete SET7/9 um eine Monomethyltransferase64. W elche
Aufgabe eine
Monomethylmarkierung an Lysin 4 besitzt, ist bislang noch nicht
bekannt.
3.2 Methylierung an Lysin 9 Histon H3
Die Methylierung an Lysin 9 H3 gehört
zu den am besten untersuchten
Modifikationen, was zum Teil darin begründet ist, dass die erste beschriebene
humane HKMT, SUV39, Methylierungen an Lysin 9 H3 vornimmt. Das homologe
Enzym in Drosophila, Su(var)3-9 war ursprünglich als PEV-Supressor entdeckt
worden59. Die Methylierung an Lysin 9 H3 zählt zu den Modifikationen, die an der
Ausbildung
bzw.
Erhaltung
von
Heterochromatin
beteiligt
sind.
W ährend
Trimethyllysin 9 H3 an der Ausbildung konstitutiven Heterochromatins beteiligt ist,
hat die Modifikation Dimethyllysin 9 H3 Einfluss auf die Kontrolle der Transkription.
Ein Enzym, welches Lysin 9 H3 lediglich monomethyliert, ist bislang noch nicht
entdeckt worden20. Die di- und trimethylierte Form von Lysin 9 H3 wird vom
34
Heterochromatin-Protein1 (HP1) erkannt und gebunden. Da HP1 nur
an
euchromatische Promoterregionen bindet und auf diese Regionen begrenzt bleibt,
wird für HP1 von einer „Ankerfunktion“ ausgegangen, die die euchromatischen
Bereiche näher an heterochromatische Kompartimente bringt65.
3.3 Regulation der Lysin-Methylierung (Demethylierung von Lysinen)
Die in die Arginin- und Lysinmethylierung unterteilte Histonmethylierung ist über
Jahre als irreversible Histonmodifikation angesehen worden. Mit der Entdeckung der
ersten Deiminase (Deimination von methyliertem Arginin) durch Cuthbert et al. wurde
auch die Suche nach Lysin-Demethylasen intensiviert66. Sechs Jahre nach der
Entdeckung der ersten Histon-Lysin-Methyltransferase konnte von Shi et al. 2004
erstmals eine Lysin-Demethylase identifiziert werden und somit das „Dogma der
Irreversibilität“ der Lysin-Methylierung aufgehoben werden67. Die von Shi et al.
gefundene Demethylase LSD1 demethyliert Lysin 4 H3 durch eine Amin-OxidationsReaktion und zeigt nur geringe Aktivität an methylierten nukleosomalen Histonen.
LSD1 liegt in einem Komplex zusammen mit HDAC-1 und -2 und dem Protein
CoREST vor, das die nukleosomale Demethylase-Aktivität von LSD1 ermöglicht und
es vor proteolytischem Verdau schützt. Aufgrund der mit aktiver Transkription
assoziierten Lysin 4 H3 Methylierung und der HDAC-Akivität propagierten Shi et al.
einen
Komplex,
der
zu
einer
repressiven
führt68.
Chromatinkonstitution
Interessanterweise konnte von Shi et al. in einem Versuch gezeigt werden, dass die
Demethylierung
von
hyperacetylierten
im
Vergleich
zu
hypoacetylierten
Nukleosomen weniger stark ausgeprägt war. Dies ist eine interessante Parallele zu
den Desacetylase-Versuchen an methylierten H4-Peptiden und kann als weiterer
Hinweis gewertet werden, dass ein Nebeneinander methylierter und acetylierter
Histone ein normaler Zustand im Chromatin zu sein scheint. Offensichtlich kann sich
die Spezifität von LSD1 auf noch unbekannte W eise ändern: Metzger et al. konnten
zeigen, dass LSD1 mit dem Androgenrezeptor in normalem und neoplastischem
Prostatagewebe assoziiert ist und durch eine Lysin 9 H3 Demethylierung (im Sinne
einer
„De-Repression“)
zu
einer
Transkriptions-Aktivierung
von
Androgen-
abhängigen Genen führt69. Es wäre denkbar, dass die Spezifität von verschiedenen
Kosubstraten
innerhalb
eines
LSD1-Komplexes
abhängt.
LSD1
ist
eine
flavinabhängige Mono- und Didemethylase. Da die Demethylierungsreaktion von
35
LSD1 über ein sog. Imin-Intermediat abläuft und hierzu mindestens eine freie
W asserstoffvalenz benötigt
wird,
kann eine Amin-Oxidase wie
LSD1 keine
trimethylierten Histone demethylieren.
Abb. 3.2: Postulierte Demethylierung von Dimethyllysin 4 H3 durch LSD1.
(Abb. aus „Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.”,
Cell, 2004)
Nach
Vorschlag
eines
Protein-hydroxylierenden
Mechanismus
für
die
Demethylierung durch sog. JmjC-Domänen-Proteine von Trewick et al. konnten die
ersten Lysin-Demethylasen mit
JmjC-Domänen identifiziert
werden70.
Mit
den
SET-Domäne-Proteinen teilen sich die JmjC-Demethylasen die Eigenschaft, dass sie
sehr substratspezifisch sind und in Untergruppen zusammengefasst werden können.
Tsukada et al. identifizierten das JHDM1A- (bzw. FBXL11-) Protein aus der JmjCFamilie. JHDM1 demethyliert Mono- und Dimethyllysin 36 im Histon H3 mit Hilfe der
Kofaktoren alpha-Ketoglutarat und Fe(II). Es konnte demonstriert werden, dass die
JmjC-Domäne für die
Demethylase-Aktivität verantwortlich
ist71. Die
kürzlich
entdeckte Demethylase JHDM2 benötigt dieselben Kofaktoren wie JHDM1 (alphaKetoglutarat und Fe(II)). Die Demethylierung ist spezifisch gegen Methylierungen an
Di-Trimethyllysin 9 H3 gerichtet. Ähnlich der Aminoxidase LSD1 konnte auch für
JHDM2 gezeigt werden, dass diese Demethylase mit Genen assoziiert ist, die durch
Androgen-Rezeptoren aktiviert werden. Auf diese W eise wird die W irkung des
Hormons – die Transkription spezifischer Gene – durch die Demethylierung von
36
Histon Lysin 9 H3 im Sinne einer „De-Repression“ bewerkstelligt72. W eitere
Demethylasen, die kürzlich entdeckt wurden, werden als JMJD2-Familie bezeichnet.
Die Besonderheit dieser Demethylasen liegt in ihrer Fähigkeit, auch trimethyliertes
Lysin 36 H3 oder Lysin 9 H3 zu demethylieren. Es konnte gezeigt werden, dass
sowohl mono- als auch dimethylierte Lysine als Reaktionsprodukte resultieren
können. Dies eröffnet vollkommen neue Perspektiven für das „Finetuning“ im
Zusammenhang mit den Graden der Histonmethylierung und den hiermit assoziierten
Funktionen73. Als Besonderheit konnten innerhalb der JMJD2-Familie Proteine mit
verschiedenen Spezifitäten identifiziert werden: JMJD2B demethyliert nur H3
Trimethyllysin 9, JMJD2C nur Trimethyllysin 9 H3 und Trimethyllysin 36 H3, JMJD2D
nur Di/T rimethyllysin 9 H3. Eine weitere, interessante Erkenntnis sind die zwei sog.
Tudor-Domänen der DMT ase JMJD2A (Demethylierung von Di/Trimethyllysin 9 H3
und Di/Trimethyllysin 36 H3), die in der Lage sind, methyliertes Lysin 4 H3 und
methyliertes Lysin 20 H4 zu erkennen und zu binden74. Diese neuesten Ergebnisse
wecken Spekulationen über ein ausgeklügeltes Gleichgewicht zwischen Methylierung
und Demethylierung, bzw. zwischen der Aktivität von SET -Domänen-HKMTs und
JmjC-Domänen-DMTasen. Möglicherweise
existieren
auch Assoziationen
von
HMTasen und DMTasen innerhalb größerer Komplexe. Beispielsweise konnte in S.
pombe ein Komplex identifiziert werden, der sowohl Proteine mit einer JmjC-Domäne
als auch die HMTase SET1 enthält, welche Lysin 4 H3 methyliert75. Zwar ist zu
erwarten, dass aufgrund der Vielzahl von JmjC-Proteinen im humanen Genom noch
weitere Enzym-Familien aufgedeckt werden, die wahrscheinlich neben H3 auch
andere Histone an methylierten Lysinen demethylieren und somit Einfluss auf die
Chromatin-Organisation
nehmen
können.
Alternativ
könnten
auch
einige
Methylierungen stark konserviert sein und von DMTasen gar nicht oder nur teilweise
entfernt werden. Noch sind beispielsweise keine H4-Demethylasen entdeckt worden,
welche
die
PRset7-vermittelte
Lysin
20-Methylierung
entfernen
könnte.
Möglicherweise gibt es keine Enzymklasse hierfür oder die Methylierung an Lysin20
im Histon H4 ist eine konstitutionelle Modifikation, die beispielsweise aufgrund ihrer
Lage am (oder im) Übergang zwischen N-Terminus und Nukleosomen-Core nicht
entfernt werden kann. Ebenso wurde noch keine DMTase für die Lysin 27 H3
Methylierung identifiziert, welche von der HMTase E(z) (PRC2-Komplex) ausgeführt
wird. Aufgrund der wichtigen Aufgaben beider HMTasen hinsichtlich der Genaktivität
und der Funktionalität des globalen Chromatins sowie aufgrund bislang nicht
37
nachgewiesener Lysin 20 H4- oder Lysin 27 H3-Demethylasen, werden die
HMTasen PRset7 und E(z) in einem aktuellen Beitrag von Trojer et al. als beständige
„epigenetische
präsentiert76.
Regulatoren“ in
Ein
noch
zu
einem
hypothetischen
identifizierender
Vererbungsmodell
Vererbungsmechanismus
der
Histonmethylierungen Lysin 20 H4 und Lysin 27 H3 wird die Funktion dieser
epigenetischen
Markierungen
und
des
epigenetischen
Zellgedächtnisses
verständlicher machen.
4. Methylierung von Argininen77
Die Methylierung von Argininresten in Proteinen wurde vor beinahe 40 Jahren zum
ersten Mal an Proteinfraktionen aus Kalbsthymus beschrieben78. Bis heute konnten
zahlreiche
Protein-Arginin-Methyltransferasen
(PRMT s)
in
verschiedenen
eukaryotischen Organismen wie Hefe, Drosophila melanogaster und in Säugetieren
identifiziert werden78,79,80,81. Zudem wurden durch Genom-Sequenzierungsprojekte
weitere PRMT-Gene in Danio rerio82, Xenopus, C. elegans und Arabidopsis
gefunden. In Säugetierzellen wurden bislang acht PRMT-Gene identifiziert, die starke
Homologien untereinander
CARM1/PRMT4,
aufweisen
PRMT5/JBP1,
und
für PRMT1,
PRMT6,
PRMT7
PRMT2,
und
PRMT3,
PRMT8
kodieren83,84,85,86,87,88,78,89. Es werden zwei Typen von PRMTs unterschieden. Beide
Typen katalysieren die Übertragung der Methylgruppe von S-Adenosylmethionin
(SAM) auf die Guanidinogruppe von Arginin in bestimmten Proteinsubstraten,
wodurch in einem ersten Schritt monomethyliertes Arginin (MMA) und freies
S-Adenosylhomocystein (SAH) entstehen. Die beiden T ypen unterscheiden sich in
der nachfolgenden Reaktion, die zur Bildung von zweifach methyliertem Arginin führt.
Typ-I-PRMTs übertragen
zwei
Methylreste auf den
gleichen Stickstoff der
Guanidinogruppe, wobei ein „asymmetrisches“ Dimethylarginin (aDMA) entsteht;
Methyltransferasen von Typ II übertragen je eine Methylgruppe auf jeden Stickstoff,
so dass ein „symmetrisches“ Dimethylarginin (sDMA) entsteht. Dabei sind PRMT 5
und PRMT7 die einzigen bekannten Typ-II-Methyltransferasen. Alle anderen PRMT-
38
Familienmitglieder gehören zum T yp I.
Abb. 4.1: Schematische Darstellung der Arginin-Methylierung.
Im ersten Schritt wird von den beiden PRMT -T ypen I und II Monomethylarginin gebildet.
T yp I-Methyltransferasen erzeugen in einem zweiten Schritt asymmetrisches Dimethylarginin.
Symmetrisches Dimethylarginin wird von den T yp II- Methyltransferasen gebildet.
Die Methylierung verändert den basischen Charakter des Argininsrestes nicht, trägt aber zu
dessen Vergrößerung bei. Gleichzeitig werden Wasserstoffatome von der
Guanidinogruppe
entfernt, dadurch ergibt sich eine Veränderung im Wasserstoffbrückenbildungsmuster.
In den letzten Jahren wurden zahlreiche verschiedene Nicht-Histonsubstrate von
PRMTs identifiziert90. Der größte T eil wurde dabei von PRMT 1 methyliert, die mit
über 90 % den größten Teil zu der Typ-I-Aktivität in Säugetierzellen beiträgt91.
PRMT1 stellt somit die vorherrschende Arginin-Methyltransferase in humanen Zellen
und Geweben dar.
4.1 Struktur der Protein-Arginin-Methyltransferasen77
Die acht humanen PRMT s variieren in ihrer Länge zwischen 361 (PRMT1) und 692
Aminosäuren (PRMT7). Allen gemeinsam ist eine hochkonservierte Kernregion, in
der die Methyltransferaseaktivität lokalisiert ist. Die PRMT-typische THW -Schleife
liegt am C-terminalen Ende der Kernregion. Die größten Sequenzunterschiede
zwischen den einzelnen PRMT Familienmitgliedern liegen im N-terminalen Abschnitt
der Proteine. Hier findet sich bei PRMT6 eine Kernlokalisationssequenz (NLS), bei
PRMT3
eine
Zinkfingerstruktur
und
bei
PRMT2
eine
SH3-Domäne,
die
39
möglicherweise die Substratspezifität steuert92. Von menschlicher PRMT1 sind
außerdem vier alternative Spleißformen bekannt, die in der Länge des N-Terminus
variieren93. Interessanterweise findet man in PRMT7 eine möglicherweise durch
Genduplikation entstandene Duplizierung aller PRMT-typischen Sequenzmotive.
Durch Kristallstrukturanalysen von PRMT1, PRMT 3 (beide aus Ratte) und Hmt1 (aus
Hefe) konnten interessante Einblicke in die Funktionen der konservierten Regionen
gewonnen werden94,95,96. Die C-terminale Hälfte der Kernregion formt eine PRMTspezifische β-Fass-Domäne, die sich auf die S-Adenosylmethionin-Bindestelle im
N-Terminus zurückfaltet. In der Spalte zwischen den beiden Domänen befinden sich
das aktiveZentrum
kristallografischen
und die Bindestelle für Substratproteine. In allen drei
Untersuchungen
wurde
außerdem
eine
identische
Dimerisierungsdomäne identifiziert, die für die enzymatische Aktivität der PRMTs
essenziell ist. Sowohl die Mutation von Aminosäuren in der Dimerisierungsdomäne
von Hmt1 als auch die vollständige Deletion dieses Bereichs in PRMT1 (AS 188-222)
führten
zu
einer
vollständigen
enzymatischen
Inaktivierung
der
Methyltransferasen94,96.
Abb. 4.2: Die Familie der Protein-Arginin-Methyltransferasen.
(Abb. aus „Arginine methylation an emerging regulator of protein function.”, Mol Cell, 2005)
Durch die Dimerisierung entsteht eine ringförmige Struktur. Damit befinden sich die
aktiven Zentren der beiden Monomere in räumlicher Nähe zueinander. Die
Ausbildung
Methyldonor
einer
solchen
Struktur ist
S-Adenosylmethionin
möglicherweise
notwendig,
damit
der
korrekt gebunden werden kann. Außerdem
könnte die räumliche Nähe der beiden aktiven Zentren eine fortlaufende Herstellung
des Endprodukts Dimethylarginin erleichtern. Einige PRMTs neigen zusätzlich zur
Dimerisierung zur Bildung größerer homo-oligomerer Komplexe. So bilden Hmt1 und
40
PRMT1 Hexamere und PRMT 5 aggregiert in Komplexen, die aus zahlreichen
Untereinheiten bestehen96,88,97. Die Multimerisierung von PRMT1 und PRMT5 scheint
essenziell für die enzymatische Aktivität der beiden Enzyme zu sein98. Die
Funktionen der unterschiedlichen N- und C-Termini von PRMT s sind bislang noch
unklar. Es wird angenommen, dass sie eine wichtige Rolle bei der spezifischen
Regulation einzelner PRMTs spielen. So beeinträchtigte die Deletion des N-Terminus
von
Hmt1
(Hefe)
die
Stabilität
des
Hexamers und
verminderte
somit die
enzymatische Aktivität des Proteins96. Zudem scheint eine Interaktion der N- und CTermini von PRMT5 die Ausbildung homomerer Komplexe zu beeinflussen97. Die
Deletion des N-terminalen Bereichs von PRMT 3 inklusive der Zinkfingerdomäne
führte ebenfalls zu einer Abnahme der enzymatischen Aktivität und beeinträchtigt
möglicherweise die Erkennung von Substratproteinen88,99. Für die N-terminale
Region von CARM1/PRMT4 wurde bislang keine regulatorische Funktion gezeigt.
Allerdings spielt der CARM1/PRMT 4-spezifische C-Terminus eine wichtige Rolle für
die
Funktion
des
Enzyms
als
transkriptioneller
Coaktivator100.
Die
Kristallstrukturanalysen an Hmt1, PRMT1 und PRMT 3 haben gezeigt, dass sich auf
der Oberfläche der Methyltransferasen ein lange, mäandrierende Furche befindet.
Möglicherweise
liegen
dort
mehrere
Bindestellen
für
verschiedene
Konsensussequenzen der Substratproteine. Somit könnte erklärt werden, warum ein
einzelnes
Enzym mehrere Substrate
mit variierenden Konsensussequenzen
erkennen kann94. Trotz der hochkonservierten Methyltransferasedomäne besitzen
alle PRMTs eine typische Substratspezifität101,85. Der exakte Mechanismus der
Substraterkennung von PRMTs ist allerdings trotz kristallografischer Studien noch
immer unklar. Hinweise geben vor allem Untersuchungen, bei denen die bevorzugten
Methylierungsstellen auf bestimmten Substratproteinen kartiert wurden. Dabei ist
deutlich geworden, dass Typ-I-Enzyme bevorzugt Arginine methylieren, die in GlycinArginin-reichen (GAR) Bereichen mit der Aminosäuresequenz RGG, RXR oder GRG
vorliegen79,103,104. Dieses Sequenzmotiv findet sich besonders häufig bei RNAbindenden Proteinen wie z.B. den hnRNP-Proteinen105. Allerdings methyliert
CARM1/PRMT4 keine Arginine in
GAR-Sequenzen und besitzt eine höhere
Substratspezifität als die anderen Typ-I-PRMTs. Bislang ist kein Sequenzmotiv
identifiziert worden, welches von CARM1/PRMT4 bevorzugt methyliert wird106. Die
Typ-II-Methyltransferasen PRMT5 und PRMT7 methylieren sowohl isolierte Arginine
als auch Arginine in Gly-Ala-Arg-Sequenzen89.
41
4.2 Regulation zellulärer Prozesse durch Arginin-Methylierung77
Die funktionelle Bedeutung der Arginin-Methylierung für die lebende Zelle ist bis
heute noch nicht ausreichend verstanden. Die verfügbaren Daten legen nahe, dass
die Arginin-Methylierung sich hauptsächlich auf Prozesse im Zellkern auswirkt. So
wurden
in
den
letzten
Jahren
zahlreiche
Substrate
der
Protein-Arginin-
Methyltransferasen identifiziert, die an verschiedenen zellulären Prozessen wie z.B.
RNA-Prozessierung, transkriptionelle Regulation, Reparatur von DNS-Schäden, aber
auch bei der Signaltransduktion oder bei Differenzierungsvorgängen beteiligt sind. In
den folgenden Abschnitten werden diese Prozesse detaillierter beschrieben.
4.3 Regulation von RNA-Prozessierung und Transport77
RNA-Bindeproteine wie die heterogenen nukleären Ribonukleoproteine (hnRNPs)
erfüllen zahlreiche strukturelle und funktionelle Aufgaben in eukaryotischen Zellen.
Sie binden prä-mRNA und sind an der Bildung der Ribonukleokomplexe und der
Spleißosom-Komplexe beteiligt. Somit spielen sie eine wichtige Rolle bei der
Verpackung und Prozessierung von RNA sowie der Regulation der Transkription und
Translation.
Es
sind
zahlreiche
verschiedene
Ribonukleoproteine
mit
unterschiedlichen Funktionen bekannt. Die meisten RNA-Bindeproteine besitzen
GAR-Sequenzabschnitte, die für Bindung der RNA verantwortlich sind. Zahlreiche
Studien haben gezeigt, dass Argininreste in diesen Bereichen die bevorzugten
107
Substrate von Typ-I-Methyltransferasen sind
. So konnte für einige hnRNP-
Proteine wie hnRNP-A, hnRNP R und hnRNP K bereits eine Methylierung durch
PRMT1 nachgewiesen werden108. Aus diesem Grund wird angenommen, dass die
Methylierung von Argininen einen Einfluss auf die Nukleinsäurebindung dieser
Proteine hat. Die wenigen Experimente zu dieser Thematik führten allerdings zu
keiner eindeutigen Aussage. So führte die Methylierung von „fragile X mental
retardation protein“ (Fmrp)
zu einer verminderten Bindung an die minimale
RNA-Sequenz sc1109. Die Methylierung von hnRNP-A1 hat einen Effekt auf die
sequenz-unspezifische
Bindung
an
homo-polymere
RNA110,
während
die
Methylierung von hnRNP-K und von Hrp1 (Hefe) die Affinität der Proteine zu RNA
nicht beeinflusste
111
. Möglicherweise stellt die Arginin-Methylierung auch ein
„Reifungssignal“ für Proteine dar. So wurde von mehreren Gruppen gezeigt, dass die
42
durch
PRMT5
und
möglicherweise
PRMT7
vermittelte
Methylierung
der
spleißosomalen Sm-Proteine B/B´, D1 und D3 essenziell für ihren korrekten Einbau
in den Sm-Kern des Spleißosoms ist89. Das Spleißosom ist ein makromolekularer
Komplex, welcher sich aus Proteinen und einer prä-mRNA aufbaut und das Spleißen
im Zellkern von Eukaryoten katalysiert. Die Sm-Proteine werden nur im methylierten
Zustand vom „survival of motor neuron“ (SMN)-Protein gebunden112 und mit Hilfe des
SMN-Komplexes auf den snRNAs assembliert113. In einigen Fällen scheint die
Methylierung von Argininresten auch die zelluläre Lokalisation der betroffenen
Proteine zu beeinflussen. So wurde bei den von Hmt1 methylierten hnRNP-Proteinen
Np13p, Hrp1p und Nab2p in S. cerevisiae gezeigt, dass sie nur im methylierten
Zustand aus dem Zellkern exportiert werden können
von
hnRNP-A2
wird
ebenfalls
durch
seinen
114
. Die zelluläre Lokalisation
Methylierungsstatus
reguliert.
Normalerweise lokalisiert hnRNP-A2 bevorzugt im Zellkern. Allerdings führt eine
Inhibierung
der
Methylierung
durch
den
Methyltransferaseinhibitor
Adenosin-
Dialdehyd (Adox) zu einer cytoplasmatischen Anreicherung des Proteins115. Der
gleiche Effekt war für das RNA-Bindeprotein Sam68 beschrieben worden, dessen
genaue zelluläre Funktion bislang noch ungeklärt ist. Allerdings verhinderte die
Deletion der Methylierungsstellen den Sam68-vermittelten Export von HIV-RNA116.
Außerdem veränderte Sam68 seine Bindung an andere Proteine in Abhängigkeit von
seinem Methylierungsstatus117. Die Methylierung bestimmter Argininreste führte
dabei
zu
einer
Abnahme
der
Bindung
an
SH3-Domänen
bestimmter
Interaktionspartner wie p59 (fyn) und Phospholipase Cγ-1. Die Methylierung des
ribosomalen Proteins rpS2 ist eine von Hefe bis Mensch hochkonservierte
Modifizierung und spielt eine wichtige Rolle bei der Modulation der ribosomalen
Biosynthese118. Die funktionelle Bedeutung der Methylierung von weiteren RNABindeproteinen wie den poly(A)-Bindeproteinen (PABPs) und des Ewing Sarcoma
Protein (EW S) ist noch nicht bekannt 106.
4.4 Regulation der Transkription77
W ie in den vorangegangenen Kapiteln bereits erläutert, stehen posttranslationale
Modifikationen von Histonen in engem Zusammenhang mit der Aktivierung und der
Repression von Transkriptionsvorgängen. Die Histonmodifikationen beeinflussen
sich in vielen Fällen gegenseitig, so dass spezifische Muster auftreten. Mindestens
43
drei
Mitglieder
der
PRMT-Familie
sind
an
dieser
Steuerung
von
Transkriptionsvorgängen beteiligt. PRMT1 methyliert spezifisch das Histon H4 an
Arginin 3 in vivo und CARM1/PRMT 4 methyliert Histon H3 an Arginin 2, -17 und -26
in vitro. Beide Enzyme besitzen coaktivierende Eigenschaften bei der „nuclear
receptor“-abhängigen transkriptionellen Regulation. Es wurde ebenfalls berichtet,
dass eine Arginin 3 H4-Methylierung eine nachfolgende Acetylierung von H4
verstärkt119. Mit dem hSW I/SNF-Komplex assoziierte PRMT 5 methyliert bevorzugt
hypoacetyliertes Histon H3 an Arginin 8 bzw. H4 an Arginin 3 und scheint zu einer
Inaktivierung der Transkription von c-myc abhängigen Zielgenen beizutragen. Die
Arginin-Methylierung repräsentiert damit ähnlich wie die Histon-(Des)-Acetylierung
eine Histonmodifikation, die zu einer Aktivierung bzw. Repression von Transkription
führen kann89.
Chromatinstruktur
„High-mobility group“ (HMG)-Proteine sind an der Modulation der
beteiligt
entwicklungsbiologischen
und
spielen
Mechanismen.
wichtige
Die
Rollen
Proteine
der
bei
verschiedenen
HMGA-Subfamilie
verfügen über je drei hochkonservierte DNS-bindende Domänen („AT-Hooks“), mit
denen sie in die schmale Furche AT -reicher DNS binden. Außerdem vermittelt dieser
Bereich auch Interaktionen mit Transkriptionsfaktoren wie z.B. NF-κB oder ATF-2.
Die AT-Hooks von HMGA1a enthalten zahlreiche RG-Sequenzen mit methylierten
Argininen120. Das Methylierungsmuster und der Methylierungsgrad dieser Bereiche
variiert dabei in unterschiedlichen Zelllinien. Zudem konnte in apoptotischen Zellen
eine deutliche Zunahme der Arginin-Methylierung von HMGA1a beobachtet werden.
Die Methylierung dieser „AT-Hooks“ durch PRMT 6121 könnte zur Modulation von
Protein-DNS-
oder
Protein-Protein-
W echselwirkungen
beitragen.
Transkriptionsfaktoren wie p53, YY1 und NFκB rekrutieren die PRMTs an die
Promotorregionen spezifischer Gene, wo sie zahlreiche regulative Aufgaben bei der
Transkription erfüllen. So wurde die in vivo-Methylierung von Argininresten des
transkriptionellen Co-Aktivators p300/CBP durch CARM1/PRMT 4 beschrieben. Diese
Modifikation verhindert die Assoziation von p300/CBP mit dem Transkriptionsfaktor
CREB und beeinflusst somit die Regulation der T ranskription122. W eitere Studien
haben gezeigt,
dass
Arginin-Methylierung auch an anderen Prozessen
der
transkriptionellen Regulation beteiligt ist. So wurde gezeigt, dass PRMT 1 und
PRMT5 den Elongationsfaktor SPT5 binden und methylieren. Durch die Methylierung
von SPT5 werden die promotorspezifischen Bindungseigenschaften von SPT5
verändert und die Elongation der T ranskription beeinträchtigt123. Außerdem scheint
44
die Arginin-Methylierung auch bei der Regulation der Transkription von Virus-Genen
beteiligt zu sein. So führte die Methylierung des HIV-T ransaktivatorproteins Tat durch
PRMT6 zu einer Verminderung Tat-abhängiger Transkription124. Zudem führte die
verminderte Expression von PRMT6 zu einer erhöhten HIV-Replikation.
4.5 DNS-Reparatur77
Das Genom wird kontinuierlich durch UV-Strahlung, reaktive Sauerstoffspezies und
eine Vielzahl anderer exogener und endogener Ursachen geschädigt. Dadurch
entstehen vererbbare Mutationen, die zu einer malignen Entartung der Zelle führen
können, wenn die aufgetretenen Schäden nicht durch enzymatische Prozesse
repariert werden. Innerhalb sehr kurzer Zeit nach einem DNS-Schaden kommt es zu
einer Anreicherung zahlreicher Reparaturenzyme in nukleären Reparatur-Foci an der
betroffenen Region. Dabei ist phosphoryliertes Histon H2AX (γ-H2AX) essenziell für
die effiziente Erkennung und/oder Reparatur von DNS-Doppelstrangbrüchen. Auch
bei der Regulation dieser Prozesse scheint Arginin-Methylierung eine wichtige Rolle
zu spielen. Boisvert et al. konnten zeigen, dass mindestens ein Protein des MRE11RAD50-NBS1 (MRN)
DNS-Reparaturkomplexes
methyliert
vorliegt92.
In
einer
Folgestudie wurden dann Argininreste in der C-terminalen GAR-Domäne von MRE11
als Substrat von PRMT1 identifiziert. Der Methylierungsstatus von MRE11 hatte
keinen Einfluss auf die MRN-Komplexbildung. Allerdings verlor MRE11 seine
Exonukleaseaktivität, wenn die Arginine in der GAR-Domäne mutiert waren. W urden
Zellen mit Methylierungsinhibitoren oder mit PRMT 1-siRNA behandelt, so führte dies
zu einer fehlerhaften „checkpoint“-Kontrolle während der S-Phase des Zellzyklus.
Interessanterweise blieb MRE11 dabei in sogenannten „Promyelocytic Leukemia“
(PML)-Körperchen
DNS-Schäden
gebunden,
war
und
die
stark reduziert.
Ausbildung
von
Möglicherweise
γ-H2AX
wird
Foci
durch
an
den
Methylierungsstatus von MRE11 die Bindung an nukleäre Strukturen wie PMLKörperchen oder Reparatur-Foci reguliert. Ein vergleichbarer Effekt wird bei dem
p53-Bindeprotein1 (53BP1) beobachtet, das ebenfalls eine Rolle bei der Reparatur
von DNS-Doppelstrangbrüchen spielt. Die DNS-Bindung dieses Proteins wird durch
eine von PRMT1 methylierte GAR-Domäne vermittelt, die zudem an die interne
Tudor-Domäne von 53BP1 bindet.125 Huyen konnte 2004 zeigen, dass 53BP1 mit
seiner Tudor-Domäne an methylierte Lysine von Histon H3 bindet. Möglicherweise
45
führen
DNS-Schäden
zu
einer
Konformationsänderung
der
DNS,
wodurch
methyliertes Lysin-79 im Histon H3 von 53BP1 gebunden werden kann126. W eitere
Studien werden zeigen müssen, ob fehlerhafte Arginin-Methylierung zum Entstehen
genomischer Instabilität beiträgt.
Abb. 4.3: Regulierung zellulärer Prozesse durch Arginin-Methylierung.
4.6 Regulation der Arginin-Methylierung77
Im Jahr 2004 wurde gezeigt, dass die Methylierung von Histonen durch PeptidylArginin-Deiminase-4
(PAD4)
rückgängig
gemacht
werden
kann66. Bei
dieser
Reaktion werden sowohl unmodifiziertes als auch monomethyliertes, nicht aber
dimethyliertes
(Desiminierung)
Arginin
127
irreversibel
durch
in
die
Abspaltung
eines
nichtproteinogene
Guanidino-Stickstoffs
Aminosäure
Citrullin
umgewandelt. Da bislang noch keine Aminotransferase identifiziert wurde, die eine
46
Rückumwandlung
in
Arginin
katalysiert,
ist
die
funktionelle
Bedeutung
der
Desiminierung von (methylierten) Argininresten noch unklar. Möglicherweise handelt
es sich bei der Arginin-Methylierung um eine irreversible oder zumindest sehr
dauerhafte Modifikation, die nur unter sehr speziellen Umständen durch Abspaltung
des methylierten Guanidino-Stickstoffs entfernt werden kann. Die Regulation der
Arginin-Methylierung
unterscheidet
sich
daher
höchstwahrscheinlich
von
der
Regulation der Lysin-Methylierung.
Neben der Peptidyl-Arginin-Deiminase-4-Aktivittät müssen in der Zelle noch andere
Regulationsmechanismen
vorhanden
sein,
die
eine
Modulation
der
Methylierungsreaktion ermöglichen. So könnte die Aktivität von PRMTs durch
posttranslationale Modifikationen, Protein-Protein Interaktionen oder Regulation der
Substrat-Zugänglichkeit kontrolliert
werden. Tatsächlich
besitzt PRMT6
eine
Automethylierungsaktivität85, deren Funktion aber bisher nicht untersucht wurde.
Möglicherweise spielt
auch die
Homo-Multimerisierung
einiger
PRMTs
eine
regulatorische Rolle für deren enzymatische Aktivität94,96. Von PRMT1, PRMT 3 und
CARM1/PRMT4 ist zudem bekannt, dass ihre
enzymatische Aktivität durch
Interaktionen mit anderen Proteinen reguliert werden kann127. PRMT5 liegt in
mindestens einem cytoplasmatischen und zwei nukleären Komplexen gebunden vor.
Als Bestandteil des „Methylosom“-Komplexes methyliert PRMT5 die Sm-Proteine
und spielt wie im vorigen Abschnitt beschrieben eine Rolle bei der Herstellung der
snRNP-Partikel Die Bindung von PRMT5 an den hSW I/SNF-Komplex führt zu einer
verstärkten Methyltransferase-Aktivität des Enzyms128.
4.7 Inhibitoren
Prinzipiell ist die Beeinflussung der Methylierung auch durch den Einsatz von
Inhibitoren der Histonmethyltransferasen möglich. Diese sollten aufgrund der
unterschiedlichen W irkungen der einzelnen Enzyme bzgl. Genaktivierung oder
-Stilllegung möglichst spezifisch nur eine Methyltransferase hemmen. Im Jahre 2004
wurde von Cheng et al der erste PRMT1-Inhibitor, AMI-1, beschrieben129. Dieser
wurde neben einigen Eosinderivaten (u.a. AMI-5) beim Durchsuchen einer 20.000
Substanzen umfassenden Bank entdeckt. AMI-1 wurde als selektiv für PRMT1
beschrieben (keine Inhibition vom Bisubstrattyp, d.h. keine Konkurrenz mit dem
Kosubstrat S-Adenosylmethionin um die Bindungstasche). AMI-5 war bezüglich der
Selektivität gegenüber SET7/9 schwächer als AMI-1, diente aber zu einem späteren
47
Zeitpunkt als Leitstruktur zur Synthese neuer Inhibitoren130. AMI-1 selber wurde in
einer späteren Veröffentlichung als Leitstruktur verwendet 131.
Abb. 4.4: Regulierung der Arginimethylierung durch Peptidyl-Arginin-Deiminasen.
O
O S O
OH
O
OH
O
-O
S
O
N
N
H
H
Abb. 4.5: AMI-1.
48
5. Histonmodifizierende Enzyme als Arzneistoffziel
5.1 PRMT1 als Zielmolekül
Inzwischen haben einige Histondesacetylaseninhibitoren die Phase der klinischen
Prüfungen hinter sich gelassen und stehen nun für die Behandlung diverser
Erkankungen zur Verfügung. Als Beispiel sei hier Vorinostat erwähnt. Der W irkstoff
SAHA
(Suberoylanilidhydroxamsäure),
identifiziert,
zeigte
T-Zelllymphoms.
gute
W irksamkeit
als
bei
einer
der
der
ersten
Behandlung
HDAC-Hemmer
des
kutanen
Eine Hemmung der Histon-Desacetylase hat zur Folge, dass eine
Hyperacetylierung der Histone auftritt. Dies kann u.a. einen kontrollierten Zelltod
(Apoptose) der Krebszellen bewirken
132
. Interessanterweise sind normale Zellen von
Histon-Desacetylase-Hemmern nicht in diesem Ausmaß betroffen, sodass auf
diesem W ege eine therapeutische Anwendung möglich sein müsste. W eitere aktuelle
Studien betreffen Darmkrebs und Kombinationstherapien bei soliden Tumoren. Im
Gegensatz zu den Histondesacetylasen sind Histonmethyltransferasen noch weit
davon entfernt, als therapeutisches Target zu gelten. Noch dringlicher stellt sich hier
außerdem die Frage der Selektivität eines Inhibitors gegenüber den einzelnen
Vertretern dieser Enzymklasse. Für PRMT1 konnte bei der Identifizierung von
Hemmstoffen ein blockierender Einfluss sowohl auf den Estrogen- als auch auf den
Androgenrezeptor
nachgewiesen
werden129.
Eine
Anwendung
von
PRMT1-
Inhibitoren bei estrogen- bzw. androgenabhängigen T umoren wäre somit denkbar.
5.2 LSD1 als Zielmolekül
LSD1 spielt eine Rolle im Androgen abhängigen Tumorwachstum: Durch die
Interaktion des Androgenrezeptors mit LSD1 wird das Histon H3 spezifisch an
Lysin 9 demethyliert. Dies führt zur Aktivierung bestimmter Gene und hat eine
ungewollte Vermehrung des Prostatagewebes zur Folge. Eine Hemmung der
Demethylase LSD1 konnte für den MAO-Hemmer Pargylin gezeigt werden69. Auf
diese W eise wird die Androgenrezeptorabhängige T ranskription blockiert und die
Zellvermehrung unterbunden. Dieser Mechanismus eröffnet einen neuen W eg, über
den die Funktion des Androgenrezeptors reguliert werden kann, unabhängig von der
Menge an Testosteron, die produziert wird. Dies betrifft T umore aller Gewebe, in
denen der Androgenrezeptor eine wichtige Rolle spielt, neben der Prostata auch
49
Tumoren des Gehirns und des Hodens. Darüber hinaus gibt die Menge an dem
Enzym LSD1 in den Tumorzellen der Prostata Aufschluss über die Aggressivität des
Tumors. Eine
Inhibition
von
LSD1
durch
MAO-Hemmer
findet
im
niedrig
mikromolaren Bereich statt, eine mögliche Interaktion mit den MAO-A/ MAO-BEnzymen ist somit nicht auszuschließen. Die Suche nach selektiven Hemmstoffen ist
somit auch hier von Bedeutung.
6. Ziele der Arbeit
Primäres Ziel der Arbeit war die Entwicklung eines nicht-radioaktiven in-vitroTestsystems für Histonmethyltransferasen, im speziellen PRMT1. Mit Hilfe dieses
Testsystems sollten in einem T arget-basierten Screening Inhibitoren von PRMT1
identifiziert werden. Diese Inhibitoren sollten anschließend in einem zellbasierten
Assay und darüber hinaus im Modellorganismus Huhn weiter charakterisiert werden.
Bei den Histon-Demethylasen, im speziellen LSD1, stand neben der Entwicklung von
Testsystemen die Erschließung von Enzymquellen im Vordergrund.
50
7. Verwendung von Screeningmethoden bei der Wirkstofffindung
Bei der Entwicklung therapeutisch einsetzbarer W irkstoffe dauert es im Schnitt 14
Jahre, bis aus einem gefundenen Treffer ein Arzneimittel mit Marktreife geworden
ist134. Zur Verkürzung des Entwicklungszeitraums wurden verschiedene Methoden
entwickelt; Beispiele seien hier die kombinatorische Chemie und die genaue
Identifizierung und Charakterisierung therapeutischer Targets durch Untersuchungen
des Genoms und Proteoms. In den letzten 10 Jahren hat sich das sog. Screening
(englisch für: Durchsiebung, Rasterung, Selektion, Durchleuchten) ebenfalls als
Vorgehensweise etabliert. Hierbei wird eine große Anzahl von Substanzen in einem
Testsystem auf ihre Aktivität bzgl. einer bestimmten Fragestellung geprüft. Da das
Verfahren im Mikromaßstab angewandt wird, ist eine Testung von 100.000
Substanzen/
Tag
pharmazeutische
(auch
„High-Throughput-Screening“
als
Unternehmen
keine
Seltenheit.
Die
bezeichnet)
Testung
für
großer
Substanzbibliotheken kann aber Probleme beinhalten, einer wachsenden Anzahl von
Testsubstanzen steht
z.T. eine sinkende Trefferrate gegenüber.
Um dieses
Verfahren effizienter zu gestalten, wird deshalb oft auf rechnergestützte Methoden
zurückgegriffen.
Dabei
Substanzbibliotheken,
erfolgt
wobei
zunächst
von
eine
vornherein
Vor-Filterung
ungeeignete
großer
Verbindungen
ausgeschlossen und auf das jeweilige Ziel („Target“) optimierte (fokussierte)
Bibliotheken erstellt werden. Eine Methode, die es ermöglicht eine derartige VorFilterung
durchzuführen
ist
das
virtuelle
Screening.
Hierbei
werden
mittels
rechnergestützter Methoden große Substanzbibliotheken in silico durchsucht. Der
Begriff „Virtuelles Screening“ umfasst eine Reihe von Verfahren, die sich in zwei
Kategorien einteilen lassen. Dies sind zum einen indirekte, ligandbasierte Ansätze,
bei denen Informationen von aktiven Verbindungen für die Suche nach weiteren,
spezifischeren Liganden genutzt werden, ohne die 3D-Struktur des Zielproteins zu
kennen. In diese Kategorie fallen Verfahren wie Pharmakophor-, Ähnlichkeits- oder
Substruktur-Suche. Zum anderen existieren direkte, proteinbasierte Ansätze, die bei
vorliegender
3D-Struktur
sogenannte
Docking-
des
und
Zielproteins
Anwendung
Scoringmethoden
zum
ligandbasierte und proteinbasierte Verfahren kombiniert
finden.
Einsatz.
Hier
Häufig
kommen
werden
134, 135
.
51
7.1 Target-basiertes Screening
In
der
vorliegenden Arbeit
Entdeckung
von
wurden
Inhibitoren
der
erstmals T argetstrukturinformationen
Protein-Arginin-Methyltransferasen
zur
(PRMTs)
verwendet. Es ist bislang keine Röntgenstruktur einer humanen PRMT bekannt, aber
für die hoch homologen Ratten-PRMT1 und PRMT 3 liegen strukturelle Daten vor,
aus denen von unserem Kooperationspartner W olfgang Sippl,
Martin-Luther-
Universität Halle-W ittenberg, ein Homologiemodell für ein virtuelles Screening
generiert wurde. Da die Kristallstruktur der PRMT1 bei einem unphysiologischen pHW ert (pH 4,7; maximale Aktivität bei pH 8,0) aufgenommen wurde und ein wichtiger
helikaler Proteinabschnitt in der Nähe der Bindungstasche nicht aufgelöst werden
konnte,
stellten
die
in
der
Protein-Datenbank
abgelegten
Ratten-PRMT1-
Enzymstrukturen (1ORI, 1OR8, 1ORH) keine geeigneten Targetstrukturen für das
virtuelle Screening dar. Eine aktive und komplette Form einer Ratten-PRMT war für
den Subtyp 3 verfügbar (1F3L)
Screening
zu
erhalten,
136
. Um eine geeignete Targetstruktur für das
wurde
deshalb
unter
Verwendung
der
beiden
Kristallstrukturen 1F3L und 1ORI ein Homologiemodell für A. nidulans PRMT1
(RmtA) erstellt. Die Homologie zwischen beiden Subtypen ist dafür ausreichend hoch
(Identität
humane PRMT1 und PRMT3 47 %, Identität
Ratten-PRMT 1 und
A. nidulans-PRMT1 59 %, Identität humane PRMT 1 und Ratten-PRMT1 95 %).
Insbesondere
im
Bereich
der
Bindungstasche
sind
die
Aminosäuren
hoch
konserviert. Die Erstellung des PRMT1-Modells wurde unter Verwendung des
COMPOSER-Moduls im Programm SYBYL 7.0137 durchgeführt. Für die PRMT3Kristallstruktur und das
erstellte
PRMT1-Modell wurde anschließend geprüft,
inwieweit das Dockingprogramm GOLD138 in der Lage war, die korrekte Position des
in PRMT3 (F3L)
und
PRMT1 (1OR8)
cokristallisierten
Kosubstrat-Analogons
S-Adenosylhomocystein (SAH) und der zu methylierende Argininseitenkette des
Substrats cokristallisiert mit PRMT1 (1OR8) in der Bindungstasche wieder zu finden.
GOLD war in der Lage, die Position und Konformation der beiden Moleküle unter den
zehn besten Dockinglösungen für PRMT3 und PRMT1 wieder zu finden. Die
ermittelten RMSD-W erte lagen dabei unter 1,5 Å. Eine gleiche Orientierung und
Konformation
von
SAH
und
Arginin
wurde
ebenfalls
für
das
erstellte
Homologiemodell erhalten. Die Guanidinogruppe des Arginins interagiert mit zwei
52
sauren Resten der Bindungstasche (Glutamat 144 und 153), die auch als
W echselwirkungspartner für mögliche Inhibitoren gefunden wurden.
Abb. 7.1: Schematische Darstellung der Bindungstasche mit verbliebenem SAH.
(Abb. aus Spannhoff et al., J. Med. Chem 2007)
Als
Substanzdatenbanken
wurden
neben
dem
„NCI
Diversity
Set“
(~2200 Verbindungen), dem HKI Naturstoffpool und dem Chembridge Diversity Set
(~43500 Verbindungen) auch Datenbanken der Firmen Maybridge und Tocris, sowie
eine arbeitskreisinterne Bank verwendet. Dadurch war eine große strukturelle Vielfalt
gegeben. Auf der Basis verschiedener Deskriptoren wie logP W ert, polare
Moleküloberfläche, Molekulargewicht, die mit dem Programm MOE139a erstellt
wurden,
wurden
Verbindungen,
die
unerwünschte
pharmakokinetische
Eigenschaften vermuten ließen, ausgeschlossen. Die verbliebenen Substanzen
(~1630 Verbindungen) wurden unter Verwendung des PRMT1-Homologiemodells
und dem Programm GOLD (Docking-Standardeinstellungen) in die Bindungstasche
gedockt. Das Kosubstrat-Analogon S-Adenosylhomocystein (SAH) verblieb dabei in
der Bindungstasche und wurde als Bestandteil des Proteins betrachtet. Zusätzlich
wurde mit Hilfe des Homologiemodells und des Programms GRID139b eine detaillierte
Karte erstellt, die die Interaktionsbereiche innerhalb der Bindungstasche
Es
wurden
hierzu
eine positiv geladene
Amino-
und
eine
abbildete.
aromatische
53
Kohlenstoffsonde
verwendet.
Interaktionsfeldern
wurde
Basierend
unter
auf
Verwendung
den
des
mit
GRID
errechneten
MOE PCH-Programms
ein
einfaches Pharmakophormodell erstellt. Dieses bestand aus einer kationischen bzw.
W asserstoffbrückendonorfunktion und zwei aromatischen/ hydrophoben Funktionen.
Abb. 7.2: GRID basiertes Pharmakophor.
Basierend auf den GRID Interaktionsfeldern, die mit Hilfe einer aromatischen (gelb) und einer
kationischen Stickstoffsonde (violett) erhalten wurden, wurde das Pharmakophor generiert.
Zwei aromatische/ hydrophobe Gruppen (grüne Kugeln) und eine kationische oder als
Wasserstoffbrückendonor fungierende Gruppe (blaue Kugel) wurden verwendet. Das erstellte
Modell diente als Postdockingfilter. Die Verbindung Allantodapson ist exemplarisch dargestellt
(magentafarben).
Alle mit GOLD erhaltenen Dockingresultate wurden mit Hilfe dieses Pharmakophors
analysiert.
Ein
Dockingresultat
wurde
nur
bei
Übereinstimmung
mit
dem
Pharmakophormodell weiter verwendet. Dies bedeutete auch, dass eine Interaktion
mit
einem
der
beiden
Glutamatreste
weiterverwendeten
Verbindungen
Auswertung
top-gerankten
der
der
vorhanden
Bindungstasche
war.
Dockinglösungen
Die
all
diesen
anschließende
visuelle
erfolgte
bei
nach
folgenden
Gesichtspunkten: Nähe einer polaren/ basischen Gruppe des Liganden zu Glutamat
152 (hPRMT1-Nummerierung) und sinnvolle geometrische Ausrichtung des Inhibitors
innerhalb der Bindungstasche.
Die verbleibenden Verbindungen wurden
anschliessend in einem in dieser Arbeit neu entwickelten antikörperbasierten Assay
auf ihre Hemmung an RmtA/ PRMT1 getestet.
54
7.2 Analyse des Bindungsmodus ausgew ählter Verbindungen
Die Interaktionen zwischen Allantodapson und Stilbamidin sollten an dieser Stelle
exemplarisch vorgestellt werden. Ein gemeinsames Element dieser Inhibitoren stellt
die Interaktion (W asserstoffbrückenbindung) zwischen einer basischen oder polaren
Gruppe
mit Glutamat 152
dar.
Die basischen
Bereiche
der
resultierenden
Verbindungen imitieren alle die Guanidingruppe der Argininseitenkette des Substrats.
Stilbamidin schließt zusätzlich W asserstoffbrückenbindungen mit Aspartat 336 und
Serin 353, welche sich im oberen Part der Bindungstasche befinden. Die
aromatischen
Bereiche
interagieren
mit
den
aromatischen
Seitenketten
der
Seitenketten von Tyrosin 156 und Tyrosin 160.
Abb. 7.3A: Dockinglösung von Stilbamidin im PRMT 1-Modell.
Abb. 7.3B: Detaillierte Ansicht
der
Interaktionen zwischen
polarer
Amidingruppe und
Aminosäureresten im Eingangsbereich der Bindungstasche.
Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Stilbamidin und PRMT 1 sind als gestrichelte grüne
Linien gekennzeichnet; SAH in orange.
55
Allantodapson
interagiert
mit
verschiedenen
aromatischen
Aminosäuren
der
Bindungstasche, Tyrosin 47, Tyrosin 156, Tyrosin 160 und Tryptophan 302 und stellt
einen W asserstoffbrückenbindungsakzeptor der Aminosäure Asparagin 333 dar.
Abb. 7.4A: Dockinglösung von Allantodapson im PRMT 1-Modell.
Abb. 7.4B: Detaillierte Ansicht der Interaktionen zwischen der polaren Allantoingruppe und
Aminosäureresten im Eingangsbereich der Bindungstasche.
Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Allantodapson und PRMT 1 sind als gestrichelte
grüne Linien gekennzeichnet; SAH in orange.
56
Zusätzlich wurde der Interaktionsmodus beider Substanzen mit dem von AMI-1, der
verwendeten „Referenzsubstanz“, verglichen. Zu diesem Zweck wurde AMI-1 ins
PRMT1-Modell gedockt. Sinnvolle Ergebnisse konnten hier nur erzielt werden, wenn
das Kosubstratanalogon SAH entfernt wurde. Abb. 7.5 zeigt Interaktionensbereiche
von AMI-1 im Vergleich zu SAH im PRMT1-Modell. Sowohl AMI-1 als auch SAH
weisen
gleiche
Sulfonylgruppen
Interaktionsbereiche
interagieren
mittels
innerhalb
der
Bindungstasche
elektrostatischer
Anziehung
auf.
und
Die
über
W asserstoffbrückenbindungen mit Lysin 40, Arginin 62 und Arginin 335, wohingegen
die Hydroxylgruppen W asserstoffbrückenbindungen mit Glutamat 137 und Glycin 86
eingehen.
Das erhaltene Dockingresultat legt nahe, dass AMI-1 entgegen der publizierten
Daten eher mit der Kosubstratbindungstasche als mit der Substratbindungstasche
interagiert.
Abb. 7.5: Dockinglösung von AMI-1 in der Kosubstratbindungstasche des PRMT 1-Modells.
SAH und T eile des Inhibitors Allantodapson sind zum Vergleich abgebildet.
57
8. Verwendete Substanzbanken
8.1 NCI-Diversity Set
Die Verbindungen des Diversity Set wurden aus fast 140000 dem NCI zur Verfügung
stehenden Substanzen zusammengestellt. Nur Verbindungen, die in größerer Menge
(mindestens 1 g) vorhanden waren, kamen in die engere Auswahl. Die verbleibenden
71.756 Verbindungen wurden dann zum finalen Set reduziert. Dies geschah mit Hilfe
des Programms Chem-X (Oxford Molecular Group). Chem-X gebraucht definierte
Eigenschaften (W asserstoffbrückenakzeptor/ -donor, positive Ladung, aromatisch,
hydrophob, sauer, basisch) und definierte Abstände, um ein bestimmtes Set von
Pharmakophoren zu erschaffen. Die verbliebenen Verbindungen wurden auf ihre
Ähnlichkeit mit diesen Pharmakophoren verglichen. Nur wenn eine Verbindung neue
Eigenschaften aufweisen konnte wurde sie in das Diversity Set aufgenommen. Diese
Prozedur resultierte in der Auswahl von 1990 Verbindungen
140
.
8.2 Hans-Knöll-Institut
Die zweite große Substanzquelle stellte der Naturstoffpool des Hans-Knöll-Instituts
(HKI) dar. Die Kollektion aus Naturstoffen, ihren Derivaten und synthetischen
Analogen enthält um die 9000 Verbindungen, die von über 80 Forschergruppen
bereitgestellt wurden. Dieses internationale Projekt wurde 1995 mit dem Ziel,
Naturstoffe stärker ins High-T hroughput-Screening einzubinden, ins Leben gerufen.
Die Verbindungen werden als DMSO-Lösungen in der Konzentration 1mg/ ml auf 96W ell Mikrotiterplatten bereitgestellt
141
.
8.3 Chembridge
Von Chembridge sind mehrere Substanzkollektionen erhältlich, die auf bestimmte
Eigenschaften/
geringes
Anforderungen
Molekulargewicht
wie
von
Ionenkanalmodulierung,
250-450
oder
Kinasehemmung,
Arzneistoffähnlichkeit
hin
zusammengestellt wurden. Die ExpressPick-Kollektion, die für die Dockingstudien
58
verwendet wurde, umfasst all diese Einzelkollektionen und enthält somit über 435000
Verbindungen142.
8.4 Maybridge
Die Firma Maybridge bietet zwei Bibliotheken an, zum einen die „Building Blocks“,
die eine Auswahl an reaktiven und minimal substituierten Zwischenprodukten enthält,
zum anderen die sog. „Screening Collection“. Diese besteht aus über 56000
organischen Verbindungen. Sie zeichnen sich durch Diversität, Arzneistoffähnlichkeit
und Übereinstimmung mit “Lipinskis Rule of 5” aus143.
8.5 Interne Substanzbank
Auch eine in unserem Arbeitskreis erstellte Substanzbank wurde für das Docking
verwendet. Diese enthält gebräuchliche Arzneistoffe, Verbindungen, die im Rahmen
von Dissertationen in unserem Arbeitskreis synthetisiert wurden, und Verbindungen
von universitären
Kooperationspartnern. Auch hier stehen die Stoffe als
massenbasierte DMSO-Lösungen (1mg/ml) auf 96-W ell Platten bereit.
8.6 World-Drug-Index
Der W orld Drug Index ist eine Auflistung sich auf dem Markt befindender Arzneistoffe
und solcher, die sich noch in
der Entwicklung befinden. Er enthält
Bezeichnungen der
Synonymbezeichnungen sowie Struktur- und
Arzneistoffe,
INN-
Aktivitätsdaten der einzelnen Verbindungen144.
8.7 Tocris
Die Firma Tocris bietet eine Vielzahl von Chemikalien an, die für biologische
Vorgänge, wie z.B. Signalübertragung eine Rolle spielen145.
59
9. Entwicklung des in-vitro Testsystems für
Histonmethyltransferasen
Eines der primären Ziele der vorliegenden Arbeit war es, ein in-vitro-Testsystem für
Histonmethyltransferasen zu
schaffen.
Zu dem Zeitpunkt,
an dem
mit
der
Entwicklung eines solchen Assays begonnen wurde, standen lediglich Testsysteme
zur Verfügung,
die
entweder
den
Nachteil
der
radioaktiven
Messmethode
beinhalteten oder wie z.B. die W estern Blot-Technik zeitaufwendig waren. Der neue
Assay sollte somit den Vorteil bieten, relativ schnell und ohne größeren Aufwand
(hohe Sicherheitsanforderungen im Umgang mit Radioaktivität/ radioaktivem Müll)
realisierbar zu sein. Die Möglichkeit zur simultanen Testung mehrerer Substanzen
auf ihre inhibitorische Aktivität bzgl. der Methyltransferasen wurde ebenfalls
angestrebt. Für den Assay wurde daher ein Mikrotiterplattenformat gewählt.
Da noch nicht bekannt war, ob Histonmethyltransferasen auch Nichthistonproteine
als Substrat akzeptieren, wurden den Histonen H3 bzw. H4 in den Aminosäuren 1-21
identische Peptide als Substrat gewählt. Da sich Substrat und umgesetztes Substrat
(Produkt)
weder
in
ihren
UV/Vis-
noch
in
ihren
Fluoreszenzeigenschaften
unterscheiden würden, wurde eine antikörperbasierte Detektionsmethode gewählt.
Um das Testsystem für möglichst viele Histonmethyltransferasen anwenden zu
können, wurde mit primärem und sekundärem Antikörper gearbeitet. Als primäre
Antikörper
wurden
kommerziell
erhältliche,
im
Kaninchen
produzierte
Immunglobuline der Klasse G verwendet. Diese richteten sich jeweils gegen die
methylierte Form des Substrats. Universell einsetzbar war der sekundäre Antikörper,
ein in der Ziege erstellter gegen Kaninchen-IgG gerichteter Antikörper. Dieser war
zusätzlich mit einem Eu-Label versehen, welches die nachfolgend erläuterte
Fluoreszenzmessung im Zeitaufgelösten Modus ermöglichte. Um jeweils nur den an
das Substrat
gebundenen Anteil
an primärem
bzw.
sekundärem
Antikörper
bestimmen zu können, musste der jeweils nicht gebundene Anteil entfernt werden.
Dies beinhaltete die Fixierung des Substrats an die W ände und den Boden der
Kavitäten der Mikrotiterplatte. Diese Fixierung sollte so fest sein, dass sie eine
Vielzahl von W aschschritten überstehen würde. Aus diesem Grund bot sich die
Verwendung des Streptavidin-Biotin-Systems an. Dieses nutzt die starke Affinität von
60
Streptavidin aus Streptomyces avidinii für Biotin (Vitamin B7, Vitamin H) aus.
Streptavidin besteht aus 4 identischen Untereinheiten, von denen jede mit sehr hoher
Affinität (Kd ~1015 M-1) ein Biotinmolekül nichtkovalent binden kann. Die Bindung
zwischen Streptavidin und Biotin kommt schnell zustande und ist nicht-reversibel, sie
wird nicht durch die Verwendung organischer Lösungsmittel, denaturierender
Reagenzien oder extreme pH-W erte beeinflusst. Ursprünglich entdeckt wurde die
starke Affinität von Biotin zu einem anderen tetrameren Protein, Avidin, welches
zusammen mit Biotin in Hühnereidotter vorkommt146. Streptavidin wird jedoch in
Testsystemen häufiger verwendet, da es im Gegensatz zu Avidin kein Glykoprotein
ist. Störende Interaktionen z.B. mit Kohlenhydratrezeptoren sind somit nicht zu
erwarten.
O
HN
NH
H
H
H
GGK
OH
S
N
H
O
Biotin
Histonpeptid
Histonpeptid mit "GGK-Brücke"
((3a S, 4 S, 6a R) (+)-Enantiom er)
O
HN
NH
H
H
H
H
N
S
GGK
O
Histonpeptid
biotinyliertes Peptid
Abb. 9.1: Biotinyliertes Histonpeptid.
Ein ähnlicher Ansatz wurde von der Firma Upstate in dem kommerziell erhältlichen
Testsystem für Histon-Acetyltransferasen verwirklicht. Die Umsetzung vom Histon
zum acetylierten Produkt erfolgt hier auch antikörperbasiert, allerdings kommt als
sekundärer Antikörper eine
Meerrettich-Peroxidase gelabelte
Anti-Kaninchen-
Immunoglobulin G-Fraktion zum Einsatz147. Bei der Suche nach Hemmstoffen für die
Histonlysin-Methyltransferase G9a wurde 2007 ein ähnlich aufgebautes System
verwendet, was ebenfalls mit zeitaufgelöster Fluoreszenzmessung arbeitet148. Cheng
61
et al präsentierten bei der Suche nach PRMT1-Inhibitoren via „random Screening“
ein modulartiges Testverfahren, welches GST-gelabelte Oligonukleotide als Substrat
und einen Peroxidase gelabelten sekundären Antikörper einsetzte129.
Mit Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatten waren kommerziell erhältlich. Die von
der Firma Nunc produzierten wiesen eine mittlere Bindungskapazität von 13 pmol
Biotin pro Kavität auf. Die mit Streptavidin beschichtete Fläche wurde mit einem
Füllvolumen von 100 µl pro W ell abgedeckt. Ebenfalls kommerziell erhältlich waren
biotinylierte Peptide, welche in den Aminosäuren 1-21 mit Histon H3 bzw. H4
identisch sind. Das Biotin ist über 3 Aminosäuren (Gly-Gly-Lys, „GGK-Brücke“) mit
der Aminosäure 21 verbunden.
Abb. 9.2: Schematische Darstellung des neuentwickelten Assays.
9.1 Zeitaufgelöste Fluoreszenz
Fluoreszenzbasierte Messmethoden
wie
Fluoreszenzintensität,
Fluoreszenzlebenszeit oder Fluoreszenzanisotropie
bilden eine der wichtigsten
Gruppen im Bereich der Analytik. Sie finden Anwendung sowohl im in-vitro als auch
im in-vivo Bereich. Aufgrund ihres speziellen Fluoreszenzverhaltens ergeben sich für
Lanthanidkomplexe
vielfältige
Anwendungsmöglichkeiten.
Die
Fluoreszenz
konventioneller Fluorophore ist das Ergebnis mehrerer Prozesse, die der linken Seite
der unten abgebildeten Darstellung entsprechen. Im angeregten Zustand absorbiert
62
das Fluorophor die Energie extern zugeführter Strahlung und gelangt so vom
Grundzustand S0 auf ein beliebiges Niveau des angeregten Zustands S1. Die
meisten Fluorophore im angeregten Zustand relaxieren sehr schnell und gelangen
zum Schwingungsgrundniveau von S1. Die dabei freiwerdende Energie wird als
W ärmestrahlung abgegeben. Erst im S1 Grundzustand ist das Auftreten von
Fluoreszenzemission möglich. W ährend der Emission wird ein Photon abgegeben
und das Fluorophor gelangt zum Grundzustand S0. Alternative Prozesse wie die
Selbstabsorption, Energietransfer oder Interaktionen mit dem Lösungsmittel können
ebenfalls auftreten. Sie zählen zum strahlungslosen Zerfall. Der Übergang von S1
zum Energieniveau T 1 wird als strahlungslose Spinumkehr bezeichnet. Er ist genau
wie der Übergang von T 1 zu S0 „verboten“, daher ist die Zerfallsrate gering. Die
resultierende Strahlung wird als Phosphoreszenz bezeichnet.
Abb. 9.3: Mechanismus der Fluoreszenzemission eines Eu 3+-Komplexes.
(S0: Singulettgrundzustand, S1: erster angeregter Singulettzustand, T 1: T riplettzustand.)
Von den 15 Elementen der Lanthanidgruppe sind nur Sm3+, Eu3+, Tb3+ und Dy3+ zur
Fluoreszenz befähigt. Das Absorptions- und Emissionsverhalten dieser Ionen ist
jedoch sehr schwach ausgeprägt und analytisch kaum nutzbar. Die Ionen brauchen
in den meisten Fällen eine organische Komponente, welche als „Antenne“ für den
Energietransfer
zum
Ion
dient.
Der
Fluoreszenzemissionsprozess
von
Lanthaniodkomplexen weist einige Besonderheiten im Vergleich zu konventionellen
Fluorophoren auf: die organische Komponente, häufig als Ligand bezeichnet, und
63
nicht das Lanthanidion
absorbiert externe Strahlung. Sie gelangt so von S0 in die
angeregten Schwingungszustände von S1. Nach dem Prozess der strahlungslosen
Inaktivierung kann sich die strahlungslose Spinumkehr, also der Übergang von S1 zu
T1
anschließen. Von T 1
aus ist eine „W eiterleitung“ der Energie auf das 4f-
Energienivau des Lanthanidions möglich, welches nun seinen eigenen angeregten
Zustand erreichen kann. Dieses ist jedoch nur möglich, wenn folgende Bedingungen
zutreffen: Übergänge von S1 zu S0 und T 1 zu S0
müssen minimal sein, das
Energieniveau T 1 sollte sich in räumlicher Nähe zu 4f befinden und einen höheren
Energiegehalt als dieses aufweisen. Desweiteren werden multiple Emissionen
beobachtet. In Europium-Komplexen sind dies: 5D0 Æ 7Fj (J = 0, 1, 2, 3, 4) und 5D1 Æ
7
Fj (J = 1, 2, 3, 5, 6), die intensivsten Übergänge sind 5D0 Æ 7F 2 und 5D0 Æ 7F 1 mit
resultierenden Emissionen um 610 – 660 nm und 585 – 600 nm149.
Der oben beschriebene Mechanismus resultiert in den drei Vorteilen, die der Einsatz
von Lanthanidkomplexen in der Analytik bietet. Als erstes ist die große Stokes`sche
Verschiebung zu nennen. Durch die Energiezerstreuung während strahlungsloser
Umwandlung, strahlungsloser Spinumkehr und intramolekularem Energietransfer ist
der Unterschied zwischen absorbierter und emittierter Strahlung sehr groß, was in
einer Stokes`schen Verschiebung von 150 – 300 nm resultiert150. Beim Einsatz
herkömmlicher Fluorophore kann es zu einer Überlappung des Exitations- und
Emissionsspektrums kommen. Das Fluorophor fungiert als innerer Filter, der die
Fluoreszenzausbeute
mindert.
Zweiter
Vorteil
ist
das
Auftreten
schmaler
Emissionsbanden (1 – 20 nm). Diese resultieren aus der Abschirmung des f-Orbitals
durch die höheren s- und p-Orbitale. Die bandenförmige Emission ermöglicht den
Einsatz mehrerer Lanthanide in einem Testsystem, ohne die Überlappung der
Spektren befürchten zu müssen. Dritter Vorteil ist das durch Energietransfer
verzögerte Auftreten der Fluoreszenzstrahlung
150
.
9.2 Testsysteme mit zeitaufgelöster Fluoreszenz
Die Abklingzeit der Fluoreszenz ist eines der wichtigsten Charakteriska eines
Fluorophors.
Verglichen
mit
Lanthanidkomplexen
besitzen
konventionelle
Fluorophore relativ kurze Zerfallszeiten zwischen 5 und 100 ns. Die Zerfallszeiten
des
Strahlungshintergrunds
der
Lichtquelle
(Tyndall-Effekt,
Raman-
und
Rayleightstreuung) sowie des Testsystems (Küvette, Platte und Matrix) bewegen
64
sich zwischen 0.1 und 10 ns. Fluoreszenzmessungen bei Verwendung von
Lanthanidkomplexen beginnen mit dem Anregungsimpuls, die Emission wird aber
erst gemessen, nachdem die Hintergrundstrahlung abgeklungen ist. In den meisten
Fällen wird für die Anregung eine Xenonblitzlampe verwendet. Um Schwankungen
der Impulsintensität auszugleichen, wird die Emission in einem Intervall erfasst151.
Abb. 9.4: Prinzip der zeitaufgelösten Fluoreszenzmessung.
9.3 Verw endung von Lanthanidkomplexen in Testsystemen
Fluoreszierende Lanthanidkomplexe haben sich als Label oder Sonden für den
Einsatz in sensitiven und selektiven Testsystemen bewährt. Innerhalb der letzten
zwei Jahrzehnte wurden Einsatzmöglichkeiten für die Bereiche Immunoassays, DNSHybridisierung, Enzymassays, Fluoreszenzmikroskopie und die Bestimmung von
Zellaktivitäten erschlossen. Bei allen Genannten kann zwischen heterogenen und
homogenen Testformaten unterschieden werden. Der Bereich der heterogenen
Testsysteme wird
hauptsächlich
Lanthanidchelatlabel-basierender
durch
drei
Methoden
Lumineszenzassay
abgedeckt:
Direkter
(DLCLLA)152,
Dissoziationsverstärkter Lanthanidbasierter Fluoreszenzimmunoassay (DELFIA)153
und Enzym-verstärkte Lanthanidlumineszenz (EALL)154. Der experimentelle Ansatz
für das DLCLLA-Format ist relativ einfach. Das Messprinzip beruht auf dem Einsatz
von Molekülen, welche dazu befähigt sind, ein Antigen zu erkennen und zu binden.
65
Diese Moleküle sind mit einem fluoreszierenden Lanthanidchelat versehen. Die
gemessene Fluoreszenzintensität spiegelt die Menge von erfasstem Analyten
wieder, nachdem ein Überschuss von Fängermolekülen durch W aschen entfernt
wurde.
Das am häufigsten verwendete Chelat
für Eu3+-Ionen ist 4,7-Bis-
(chlorosulfophenyl)-1,10-phenanthrolin-2,9-dicarbonsäure (BCPDA)152.
Abb. 9.5: Prinzip des DLCLLA.
Das Delfia-System hingegen verwendet Erkennungsmoleküle, die mit einem Chelat
gelabeled sind, das zwar starke Affinität zum Lanthanid aufweist, allerdings keine
oder nur schwache fluoreszierende Eigenschaften besitzt. Neben der Entfernung
nicht-gebundener Fängermoleküle muss hier das Lanthanidion vor Beginn der
Messung noch einem Chelatmolekül mit fluoreszierenden Eigenschaften zugeführt
werden.
Als
an
das
Fängermolekül
gebundener
Chelator
wird
z.B. (p-Isothiocyanatobenzyl)-diethylentriamin-N1,N2,N3,N3-tetraessigsäure (DTTA)
eingesetzt. Die DTTA-Gruppe formt einen stabilen Komplex mit Eu3+ oder Sm3+, die
aromatische Isothiocyanatgruppe dient der Kopplung an ein Fängermolekül. Dieses
muss dazu eine freie Aminogruppe aufweisen. Für den Detektionsschritt ist die
Zugabe von Dissoziationsreagenz (Enhancement solution) notwendig. Diese enthält
Säure, ein β-Diketon und Detergenz. Durch die Säure wird die Interaktion zwischen
Lanthanid und DTTA-Gruppe unterbunden, das Lanthanidion
bildet nun einen
Komplex mit dem β-Diketon. Dieser Komplex nimmt eine micellare Struktur an153.
66
Abb. 9.6: Darstellung des DELFIA-Prinzips.
SCN
N
N
N
COO
OOC
- OOC - OOC 3+
Eu
Abb. 9.7: (p-Isothiocyanatobenzyl)-diethylentriamin-N1,N2,N3,N3-tetraessigsäure.
R
´R
O
R
O
Eu
O
R´
O
3+
O
R´
O
R
Abb. 9.8: Fluoreszierender Europium 3+-Komplex innerhalb der Schutzmizelle.
Die letztgenannte Methode wurde erstmals 1991 publiziert. Das Erkennungsmolekül
ist hier mit einem Enzym gekoppelt und nicht mit einem Lanthanidchelat. Nachdem
die Antigenerkennung stattgefunden hat, wird ein Substrat für das Enzym
67
zugegeben.
Das Reaktionsprodukt kann dann mit einem zugegebenen Lanthanid
einen fluoreszierendes Chelat bilden154.
Abb. 9.9: Prinzip der Enzym-verstärkten Lanthanidlumineszenz.
9.4 In-vitro-Assay für PRMT1
Zum Einsatz kommen sollte das in-vitro-Testsystem vor allem bei der Suche nach
Inhibitoren der
PRMT1. Daher wurden alle Entwicklungsschritte primär auf dieses
Enzym ausgelegt.
9.5. Bestimmung der Bindungskapazität der Kavitäten
Zu Beginn der Arbeiten wurde zunächst die tatsächliche Bindungskapazität für das
verwendete
Substrat
bestimmt.
Die
Kavitäten
einer
streptavidinbeschichteten
Mikrotiterplatte wurden mit steigenden Mengen an Histon H4-Peptid 1 h bei 30 °C
inkubiert. Der tatsächlich gebundene Anteil wurde anschließend antikörperbasiert
detektiert. Zwischen den einzelnen Inkubationschritten wurden die nicht gebundenen
Anteile an Peptid/ Antikörpern durch W aschen der Mikrotiterplatte entfernt.
68
Relative
Fluoreszenzeinheiten
(RFU)
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
Histon H4-Peptid/well (pmol)
Abb. 9.10: Bestimmung der Bindungskapazität der Mikrotiterplattenkavitäten.
Es zeigte sich, das ab einer Konzentration von 20 pmol Peptid pro W ell die mit
Streptavidin beschichtete Fläche abgesättigt war. Daher wurde die Menge von 20
pmol/ Kavität als Substratkonzentration für alle weiteren Versuche gewählt.
9.6 Bestimmung der optimalen Verdünnung an primärem Antikörper
Im folgenden Experiment wurde die günstigste Konzentration an primärem Antikörper
untersucht. Als Antikörper wurde Anti-Histon H4-Kaninchen-IgG verwendet. Von den
getesteten Verdünnungen 1: 250, 1: 500, 1: 1000, 1: 2500 und 1: 5000 ergaben die
Verdünnungen 1: 500 und 1: 1000 das beste Signal-Rausch-Verhältnis.
Rel at ive
Fl uor ezen zein heit en
(RFU)
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
Verdünnung des Anti-Histon H4
Kaninchen-IgG Ant ikör pers
Abb. 9.11: Bestimmung der optimalen Konzentration an primärem Antikörper.
69
9.7 Bestimmung der optimalen Verdünnung an sekundärem Antikörper
Bei der Konzentrationsermittlung des sekundären Antikörpers wurde ebenfalls eine
Verdünnungsreihe im Bereich von 1:500-1:10000 erstellt. Es zeigte sich, dass die
Verdünnungen bis 1:5000 gleich gute Signal-Rauschverhältnisse ergaben. Dies lässt
den Schluss zu, dass nur eine begrenzte Zahl von sekundären Antikörpern an die
sandwichartige Struktur aus Streptavidin, biotinyliertem Substrat und primärem
Antikörper binden konnte.
Abb. 9.12: Bestimmung der optimalen Konzentration an sekundärem Antikörper.
9.8 Erstellung einer Substrat-Kalibrationsreihe
Danach wurde eine Kalibrierung im Bereich 20-0 pmol Histon H4-Peptid pro Kavität
durchgeführt. Für jede Kavität wurden insgesamt jeweils 20 pmol Histonpeptid
eingesetzt. Der „fehlende“ Anteil an Histon H4 wurde durch Histon H3 ersetzt. Dieser
Ansatz wurde gewählt, da keine „Positivkontrolle“, also Dimethyl-Histon H4(Arg3)
kommerziell
Anti-Histon
Zunehmende
erhältlich
H4-Kaninchen-IgG
Histon
war.
gegen
Als
primärer
unmodifiziertes
H4-Peptid-Konzentrationen
Antikörper
Histon
resultierten
H4
in
wurde
verwendet.
zunehmenden
Signalintensitäten. Eine enzymatische Umsetzung des Substrats z.B. durch PRMT1
sollte somit messbar sein.
70
Relative
Fluoreszenzeinheiten
(RFU)
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
Histon H4-Peptid/ well (pmol)
Abb. 9.13: Kalibrationsreihe Histon H4- Peptid.
9.9 Umsetzung des Substrats durch PRMT1
Im nächsten Experiment wurde die enzymatische Umsetzung des Substratprodukts
durch humane PRMT1 überprüft. Dieses Enzym wurde als GST-getagtes Protein
(Expression in E. coli) von Gerald Brosch, Leopold-Franzens-Universität Innsbruck
zur Verfügung gestellt. Bei einer gewählten Inkubationszeit von 60 min bei 30 °C
fand
eine
vollständige
Umsetzung
des
Substrats
statt.
Der
Verlauf
der
enzymatischen Umsetzung wurde anschließend über 100 min in 5- bis 20- minütigen
Abständen untersucht. In der untenstehenden Abbildung ist ebenfalls zu erkennen
ist, das bei fehlendem Kosubstrat bzw. fehlendem Enzym keine Umsetzung
stattfand. Die dort gemessenen Fluoreszenzwerte lagen im Bereich des Blindwerts.
Der hier eingesetzte Antikörper war Anti-Dimethyl-Histon H4(Arg3)-Kaninchen-IgG.
Er wurde deshalb verwendet, da der Anti-Histon H4-Antikörper nicht zwischen
modifiziertem und unmodifiziertem Peptid unterscheiden konnte. Ein steigender
Anteil an dimethyliertem Peptid resultierte somit in steigenden Signalintensitäten.
71
Relative
Fl uor eszenzeinheiten
(RFU)
+ PRMT1, + Cosubstrat
60000
- PRMT1, + Cosubstrat
50000
+ PRMT1, - Cosubstrat
Blank
40000
30000
20000
10000
0
0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Inkubationsz eit (min.)
Abb. 9.14: Umsetzung des Substrats durch PRMT 1.
9.10 Testung von Inhibitoren
Im nächsten Schritt wurde überprüft, ob das entwickelte Testsystem in der Lage war,
Inhibitoren zu erkennen. Sinefungin und drei einfache Argininderivate wurden auf
ihre Hemmwirkung an PRMT1 untersucht. Bei Sinefungin handelt es sich um ein
antibiotisch wirksames Nukleosid aus Streptomyces griseolus. Dieses kann als
Analogon von
Adenosylhomocystein aufgefasst
Sinefungin als unspezifischer kompetitiver
Methyltransferasen beschrieben
werden.
In
der
Literatur
ist
Inhibitor von Protein- und DNS-
155
. Die drei getesteten Argininderivaten finden
Verwendung in der Peptidsynthese. Es handelte sich um mit einer Boc- bzw.
Benzoylschutzgruppe versehene L- bzw. D-Aminosäuren. Diese waren zuvor noch
nicht als mögliche Inhibitoren für PRMT1 beschrieben worden.
NH2
N
N
N
O
N
NH2
HO
O
NH2
HO OH
Abb. 9.15: Sinefungin.
72
Falls nicht explizit erwähnt, fanden alle IC50-Bestimmungen mit zuvor frisch aus
Festsubstanz erstellten DMSO-Lösungen statt. Eine mögliche Zersetzung der
Verbindung durch Aufbewahrung in DMSO/ Auftau-Einfrierzyklen der Lösung sollte
somit ausgeschlossen werden können. Alle erhaltenen W erte (inhibitorische Aktivität
oder IC50) resultierten aus Doppelbestimmungen. Die Angabe „± x µM“ bezieht sich
somit auf den Standardfehler des IC50.
Sinefungin zeigte im neu entwickelten Assay einen IC50 von 31,1 ± 4,4 µM an
hPRMT1. Die Argininverbindungen wurden in den Konzentrationen von 10 und 100
µM an PRMT1 getestet. Das D-Argininderivat zeigte in der Konzentration von 10 µM
keine Hemmwirkung mehr. Von den verbleibenden L-Aminosäurederivaten wurden
anschließend IC50-W erte bestimmt.
Substanzbezeichnung
Boc-D-ArgOH HCl·H2 O
Strukturformel
NH2
Inhibition hPRMT 1 (%)
48,36 % bei 100 µM
HN
k.H. bei 10 µM
N
H
O
N
H
O
Boc-L-ArgOH HCl·H2 O
COOH
N H2
IC50: 69,49 ± 1,1 µM
HN
N
H
O
O
Benzoyl-Arg-NH 2 · HCl
N
H
COOH
N H2
IC50: 69,97 ± 2,3 µM
HN
N
H
O
O
N
H
NH2
Tab. 9.1: Inhibitorische Aktivität der Argininderivate.
Es konnte somit gezeigt werden, dass das Testsystem in der Lage war, an hPRMT1
inhibitorisch wirkende Verbindungen zu erkennen. Daher konnte der nächste Schritt
des Projekts getätigt werden: die Testung von im virtuellen Screening ermittelten
potentiellen Inhibitoren.
73
9.11 Fazit zur Assayentw icklung
Es ist hier gelungen, ein neues Testsystem für Histonmethyltransferasen zu
etablieren. Der Assay zeichnet sich durch seine leichte Durchführbarkeit aus und
bietet den Vorteil, Messungen ohne radioaktive Reagenzien durchführen zu können.
Durch
die
notwendigen W aschschritte
bietet
das
System insbesondere
für
enzymatisch aktive Gewebshomogenate/Zellaufschlüsse einen Vorteil. Störende
Matrixeffekte durch Zellbestandteile/ Fremdproteine spielen für die abschließende
Signalauslesung keine Rolle mehr, da nach dem enzymatischen Reaktionsschritt
jedes
W ell
Europium-gelabelten
gewaschen
sekundären
wird.
Die
Antikörpers
Verwendung
ermöglicht
die
Messung
eines
im
zeitaufgelösten Modus, d.h. auch auf dieser Ebene findet eine Ausblendung
störender
Matrixeffekte
statt.
Eventuell
vorhandene
Eigenfluoreszenz
der
Testsubstanzen stört die Signalauslesung aus den oben angeführten Gründen
(W aschschritt, Zeiaufgelöster Messmodus) ebenfalls nicht. Durch den modulartigen
Aufbau ist es relativ einfach, das Testsystem auch für andere Histonmodifizierende
Enzyme zu verwenden. Es kann entweder mit biotinyliertem Histon H3- oder H4Peptid gearbeitet werden. Der verwendete primäre Antikörper muss neben seiner
Spezifität für eine bestimmte Histonmodifikation nur die Eigenschaft aufweisen ein
Immunglobulin der Klasse G aus dem Kaninchen zu sein.
74
10. Testung der im virtuellen Screening ermittelten Verbindungen
10.1 Allgemeine Bemerkungen
W ie bereits im vorherigen Kapitel erwähnt, fanden alle IC50-Bestimmungen mit zuvor
frisch aus Festsubstanz erstellten DMSO-Lösungen statt. Eine mögliche Zersetzung
der Verbindung durch Aufbewahrung in DMSO/ Auftau-Einfrierzyklen der Lösung
sollte somit ausgeschlossen werden können. Alle erhaltenen W erte (inhibitorische
Aktivität oder IC50) resultierten aus Doppelbestimmungen. Die Angabe „± x µM“
bezieht sich somit auf den Standardfehler des IC50.
10.2 Verw endung von RmtA als Histonmethyltransferase
Bei
RmtA
handelt
es
um
eine
aus
Aspergillus
nidulans
stammende
Histonmethyltransferase, welche spezifisch Arginin 3 im Histon H4 methyliert. RmtA
wurde neben RmtB und RmtC 2004 von Trojer et al. erstmals beschrieben156.
Aspergillus nidulans gehört zur Gattung der Schimmelpilze und wurde ab 1940 als
Modellorganismus für die biologische Grundlagenforschung etabliert. Der Pilz weist
sowohl einen sporoiden als auch sexuellen W eg der Fortpflanzung auf und ist seit
über 20 Jahren auch molekularbiologischen Techniken zugänglich157.
Im Falle der Entdeckung der RmtA wurde das Genom des Schimmelpilzes auf
mögliche PRMTs analysiert, anschließend wurden fungale Proteinextrakte auf ihre
enzymatische Aktivität untersucht. Die Extrakte wurden aufgereinigt und die für die
enzymatische Aktivität verantwortlichen Proteine als GST -Fusionsproteine in e. coli
exprimiert.
Von
drei
identifizierten
PRMT s
besaß
RmtA
signifikante
156
Sequenzübereinstimmung mit PRMT1
. Aufgrund dieser Sequenzhomologie (59 %
Identität, siehe (Kapitel 7.1) und der relativ leichten Zugänglichkeit wurde RmtA für
das primäre Screening auf Histon-Arginin-Methyltransferase-Inhibitoren verwendet.
Das Enzym wurde von Gerald Brosch, Leopold-Franzens-Universität Innsbruck zur
Verfügung gestellt.
75
10.3 Überprüfung des Modells
W ährend des Ranking der Verbindungen aus den einzelnen Substanzdatenbanken,
wurde jeder Verbindung ein sog. Goldscore zu geteilt. Je größer dieser Score war,
desto größer war die im Modell bestimmte Affinität zum Enzym. Es wurde
desweiteren auch nach explizit an RmtA/ PRMT1 inaktiven Verbindungen gesucht.
Dieses waren Verbindungen mit niedrigen Goldscore, d.h. keiner Affinität zum
erstellten PRMT1-Modell. Diese Verbindungen dienten der Kontrolle des erstellten
Modells. Sie sollten keine Aktivität an RmtA/ hPRMT1 aufweisen. Aus der NCIDatenbank wurden 6 Verbindungen ausgewählt, die nachfolgend an RmtA/ hPRMT1
in den Konzentrationen 10 und 40 µM getestet wurden.
Substanz-
Strukturformel
Inhibition RmtA ( %)
Inhibition hPRMT 1 (%)
nicht aktiv bei 40 µM
nicht aktiv bei 40 µM
nicht aktiv bei 10 µM
nicht aktiv bei 10 µM
nicht aktiv bei 40 µM
nicht aktiv bei 40 µM
nicht aktiv bei 10 µM
nicht aktiv bei 10 µM
nicht aktiv bei 40 µM
nicht aktiv bei 40 µM
nicht aktiv bei 10 µM
nicht aktiv bei 10 µM
nicht aktiv bei 40 µM
nicht aktiv bei 40 µM
nicht aktiv bei 10 µM
nicht aktiv bei 10 µM
bezeic hnung
NSC25141
NSC97845
NSC114572
NSC118176
76
NSC134754
NSC143099
nicht aktiv bei 40 µM
nicht aktiv bei 40 µM
nicht aktiv bei 10 µM
nicht aktiv bei 10 µM
nicht aktiv bei 40 µM
nicht aktiv bei 40 µM
nicht aktiv bei 10 µM
nicht aktiv bei 10 µM
Tab. 10.1: Ergebnis der T estung der als inaktiv eingestuften Verbindungen.
10.4 Ergebnisse der Testung
Alle vom erstellten PRMT1-Modell als inaktiv erkannten Verbindungen zeigten keine
Inhibition der RmtA in den getesteten Konzentrationen von 10 und 40 µM und waren
ebenfalls inaktiv an hPRMT1. Da die 6 Verbindungen strukturelle Unterschiede
aufwiesen, konnte davon ausgegangen werden, dass das Modell nicht nur eine
bestimmte Substanzklasse als inaktiv kennzeichnen würde.
Aus den Ergebnissen liess sich ableiten, dass das Modell inaktive Verbindungen
erkennen konnte.
10.5 Untersuchung der HKI-Substanzbank
Aus der HKI-Substanzbank wurden 43 Substanzen an RmtA untersucht. Da dies die
erste Substanzbank war, die auf potentielle Inhibitoren getestet wurde, wurden alle
Verbindungen mit einem Goldscore > 30 zur Testung ausgewählt. Alle Substanzen
wurden zunächst in einer Konzentration von 50 µM an RmtA getestet, die
Verbindungen, deren inhibitorische W irkung bei dieser Konzentration über 50 % lag,
wurden bei 20 µM bzw. 10 µM weiter charakterisiert. Von den potentesten wurde
anschließend der IC50-W ert bestimmt. Zwei Substanzen marinen Ursprungs, (E)Oroidin und (Z)-Oroidin, welche von der Arbeitsgruppe Prof. Lindel synthetisiert
wurden158, zeigten ebenfalls inhibitorische W irkung an RmtA, so dass hier die beiden
Ausgangsverbindungen sowie zwei weitere Substanzen als Feststoffe zur Testung
77
angefordert wurden. Auch HKI14806,
Bremerhaven
synthetisiert
wurde,
welches
zählt
zu
von der Arbeitsgruppe Köck,
dieser
Substanzklasse.
Seine
inhibitorische Aktivität ist jedoch schwächer als die der Oroidine. Desweiteren wurde
Ha/Or 26 mit einem IC50 von 46,48 ± 7,68 µM als Inhibitor der RmtA identifiziert.
Aufgrund der nichtarzneistoffähnlichen Struktur und der Tatsache, dass die Substanz
an hPRMT1 keine Aktivität zeigte, wurde unsere eigene Substanzbank nach
ähnlichen Verbindungen durchsucht,
Strukturelement
enthielten.
Diese
die ebenfalls
wurden
ein α-Methylthioglykolamid-
anschließend
auf
ihre
Hemmung
gegenüber RmtA getestet. HKI15369 (CD-314), welche vom Arbeitskreis Prof.
Röschenthaler synthetisiert wurde, zeigte ebenfalls eine starke Inhibition der RmtA
(70,35 % Inhibition bei 20 µM). Die Substanz enthält eine Trifluormethylgruppe.
Perfluoralkylgruppen,
besonders
CF3,
bieten
einen
interessanten
Ansatz
zur
Modifizierung organischer Verbindungen. Aus dem Bereich der Arzneistoffe sind
Celecoxib und Efavirenz zu erwähnen 159.
CD-314 wurde als Feststoff zusammen mit drei analogen Verbindungen zur T estung
angefordert. Die Substanz Chaetocin ein Epidithio-diketopiperazin, befand sich nicht
in der durch virtuelles Screening erstellten Auswahl. Sie wurde 200 von Greiner et al
als Hemmstoff für Su(var)3-9 präsentiert, zeigte aber auch an RmtA ~ 50 % Inhibition
bei 10 µM.
In der HKI-Bank befinden sich leider keine Informationen bzgl. der Stereochemie, so
dass bei chiralen Verbindungen keine Aussagen darüber gemacht werden können,
welches Enantiomer vorlag oder ob die Verbindung das Racemat darstellte.
Goldscore
Substanz-
Strukturformel
Inhibition RmtA ( %)
Bezeichnung
72,90
Inhibition der hPRMT 1 (%)
O
14957
54,99 % bei 50 µM
N
H
H
N
O
O
N
H
N
H
OH
O
61,81
O
7055
OH
MH341
N
40,34 % bei 50 µM
NH
O
H
N
N
H
NH2
H
Br
59,87
3841
N
Br
(E)-Oroidin
N
H
Br
N
2
N
H
NL-1
51,63 % bei 20 µM
NH
H
O
78
59,25
15581
75,89 % bei 50 µM
N
N
N
H
HN
NH
57,98
14806
NH 2
Br
Br
N
8,95 % bei 10 µM
N
N
Br
ageliferin
54,45 % bei 50 µM
O
HN
Dibromo-
2
H
H
H
H
N
NN
N
H
56,07
3342
H2N
NH
NH
2
76,91 % bei 50 µM
O
45,39 % bei 10 µM
N
NH
O
H N
2
55,98
Ru
3845
F
F
P
F
2+
O
79,54 % bei 50 µM
F
C
O
N
F
F
O
45,85 % bei 10 µM
N
O
53,89
14684
65,74 % bei 50 µM
O
N
32,60 % bei 10 µM
O
H
H
O
O
OH
N
O
O
52,66
Br
14623
53,50 % bei 20 µM
H
(Z)-Oroidin
Br
NH
N
H
52,58
N
N
O
60,08 % bei 50 µM
N
3148
N
Br
28,81 % bei 10 µM
H
N
N
H
50,67
O
66,98 % bei 50 µM
N
3147
N
+
N
N
Br
H
N
N
H
50,58
2
N
H
N
19,01 % bei 10 µM
O
15574
74,98 % bei 50 µM
NH
50,46
15875
O
SH
N
H
Ha/Or 36
49,98
O
HS
N
H
7,48 % bei 40 µM
OH
H
N
3312
O
OH
15,87 % bei 50 µM
NH
NH
H
O
20,19 % bei 50 µM
O
O
H
N
N
H
N
H
N
H
O
49,53
14590
nicht aktiv bei 50 µM
H
N
O
Cl
49,39
HN
3883
99,76 % bei 50 µM
N
N
N
N
HO
+
75,43 % bei 10 µM
93,91 % bei 40 µM
90,76 % bei 20 µM
79
48,64
16187
89,98 % bei 50 µM
+
N
H2
S
OH
15,67 % bei 10 µM
Cl
F
46,82
15017
74,96 % bei 50 µM
N
N
46,48
N
3846
55,76 % bei 50 µM
Cl
N
NH2
N
H
45,98
34,65 % bei 10 µM
OH
15761
91,98 % bei 50 µM
N
43,87 % bei 10 µM
N
N
N
N
44,62
N
O
15874
15,87 % bei 10 µM
O
60,01 % bei 50 µM
HS
N
H
Ha/Or 26
43,98
NH2
15305
40,73 % bei 50 µM
N
N
NH2
HO
OH
43,87
16294
OH
61,59 % bei 50 µM
H
16,89 % bei 10 µM
HO
O
H
N
O
43,43
3888
26,95 % bei 50 µM
N
N N
NH
41,65
16191
55,43 % bei 50 µM
N
41,60
15,78 % bei 10 µM
N
HN
OH
O
H2N
15962
57,98 % bei 50 µM
HN
O
17,27 % bei 10 µM
N
H
41,45
HO
15131
HO
18,39 % bei 50 µM
+
NH
2
Br
40,76
14843
O
OH
NH2
45,89 % bei 50 µM
H
N
OH
O
N
80
40,75
15107
NH
N
H
H
N
N
43,46 % bei 50 µM
NH2
O
OH
40,21
F
15369
F
F
70,35 % bei 20 µM
N
CD-314
N
SH
N
39,64
Cl
16383
55,89 % bei 50 µM
O
NH3
N
15881
Ha/Or 73
32,48
O
N
S
NH2
O
39,20
+
S
O
N
N
N
H
3348
O
17,97 % bei 10 µM
O
O
S
H
N
98,54 % bei 50 µM
37,59 % bei 20 µM
36,08 % bei 50 µM
N
NH
O
NH
O
N
N
30,89
15758
11,10 % bei 50 µM
N
N
N
H
N
---------------
3328
---
Chaetocin
N
O
H
N S
S N
O
45,12 % bei 10 µM
O
O
N
N
H
O
S
S N
O
Tab. 10.2: Inhibitorische Aktivität von Verbindungen aus dem HKI-Naturstoffpool.
Ergebnisse an hPRMT1 sind fett markiert.
10.6 Testung von analogen Substanzen der HKI-Substanzbank
Neben den ursprünglich identifizierten Verbindungen der HKI-Substanzbank wurden
auch Analoge dieser Verbindungen getestet.
10.6.1 Testung der Fluormethylanaloga
Neben CD-314 wurden noch drei weitere Fluormethylverbindungen getestet. Die
ursprünglich erzielte Hemmpotenz konnte nicht bestätigt werden, es ist also
anzunehmen, dass die Substanz CD-314 als DMSO-Lösung nicht unbegrenzt stabil
81
ist. Insgesamt zeigen alle getesteten Analoga nur eine schwache inhibitorische
W irkung an RmtA.
Substanz-
Strukturformel
Inhibition RmtA ( %)
Bezeichnung
Inhibition hPRMT 1 (%)
CD-230
31,51 % bei 40 µM
N
F
F
N
20,60 % bei 10 µM
F
3,98 % bei 40 µM
N
NH 2
keine Aktivität bei 20 µM
CD-398
N
7,97 % bei 10 µM
F
F
F
F
F
F
F
N
CD-314
F
F
N
H
11,88 % bei 10 µM
F F
N
F
N
N
SH
CD-135
keine Aktivität bei 40 µM
N
F
F
HN
F
keine Aktivität bei 10 µM
N
O
Tab. 10.3: Ergebnisse der T rifluormethylverbindungen.
Ergebnisse an hPRMT 1 sind fett markiert.
10.6.2 Testung der Oroidin-Verbindungen
Neben (E)-Oroidin
wurden
rac-Cyclooroidin sowie L-Aminohistidin
und
rac-
Dibromphakellstatin an RmtA getestet. Die Pyrrol-Imidazol-Alkaloide bilden eine
Familie von
etwa 90 Sekundärmetaboliten, die
bislang ausschliesslich aus
Meeresschwämmen isoliert worden sind. Ihre Biosynthese scheint nicht durch
symbiotische Bakterien, sondern durch die Schwammzellen selbst zu erfolgen. Der
Naturstoff Prä-Oroidin, welcher keine Imidazol-Teilstruktur enthält, wird als mögliche
Vorstufe aufgefasst. Die hauptsächlich produzierten Alkaloide Oroidin und Sceptrin
dienen der Verteidigung der Schwämme gegen Fische, Bakterien und Korallen160.
Oroidin gilt als zentraler Baustein der Pyrrol-Imidazol-Alkaloid- Familie. Es leitet
seinen Namen von Agelas oroides ab, aus dem es 1971 isoliert wurde161. Über die
Biosynthese ist derzeit noch wenig bekannt, eventuell stellt der Naturstoff PräOroidin,
welcher
keine
Imidazol-Teilstruktur
enthält,
die
mögliche
Biosynthesevorstufe dar. Die Pyrrol-Imidazol-Alkaloide werden in drei Untergruppen
eingeteilt: die nicht-cyclischen Derivate des Oroidins, die cyclischen Monomere des
81
Oroidins, zu denen
das tetracyclische Dibromphakellstatin und das trizyklische
Cyclooroidin gehören und die echten Dimere des Oroidins, z. B. das oben erwähnte
Sceptrin. L-Aminohomo-Histidin ist als Baustein einer Vorstufe des Oroidins denkbar.
Substanz-
Strukturformel
Inhibition RmtA ( %)
Bezeichnung
(E)-Oroidin
Inhibition hPRMT1(%)
NH2
Br
IC50: 10,68 ± 1,2 µM
N
Br
H
N
N
H
NH
10,30 % bei 40 µM
O
2,91 % bei 20 µM
NH 2
rac-Cyclooroidin
N
IC50: 7,67 ± 0,4 µM
NH
71,56 % bei 40 µM
Br
N
40,43 % bei 20 µM
NH
Br
O
H2 N
L-Aminohomo-Histidin (L-Ahh)
IC50: 8,32 ± 11,3 µM
HOOC
N
NH
2
N
H
O
rac-Dibromphakellstatin
HN
NH
IC50: 19,64 ± 2,4 µM
Br
N
N
Br
O
Tab. 10.4: IC50-Bestimmungen der Pyrrol-Imidazol-Alkaloide.
Ergebnisse an hPRMT 1 sind fett markiert.
82
Oroidin
rac-Cyclooroidin
100
Inhibition RmtA (%)
Inhibition RmtA (%)
100
75
50
25
0
10 0
75
50
25
0
10 1
10 2
10 0
c(µM)
10 2
c(µM)
L-Amino-Homohistidin
rac-Dibromphakellstatin
100
100
Inhibition RmtA (%)
Inhibition RmtA (%)
10 1
75
50
25
0
10 0
10 1
10 2
75
50
25
0
10 0
c(µM)
10 1
10 2
c(µM)
Abb. 10.1: IC50-Bestimmungen der Pyrrol-Imidazol-Alkaloide.
10.6.4 Testung der Verbindungen mit α-Methylthioglykolamid-Struktur
Ausgehend von Ha/Or26, welches an RmtA eine Inhibition von 60,01 % bei 50 µM
erzielte, wurde die interne Substanzbank nach ähnlichen Verbindungen durchsucht,
welche ein α-Methylthioglykolamid-Strukturelement beinhalteten, gleichzeitig aber
einen einem Arzneistoff ähnlicheren Aufbau als Ha/Or26 aufwiesen. Als potentiell
geeignete Substanzen konnten RM62, RM65III, RM82 und RM108 identifiziert
werden. Alle Verbindungen wurden bei 40 und 10 µM getestet. Bei allen
Verbindungen handelt es sich um chirale Substanzen; sie wurden als Racemate
getestet 162. Potenteste Verbindung war RM65-III, ein N,N'-(Ethan-1,2-diyl)bis (2-(9HXanthen-9-ylthio)propanamid. Strukturelle Ähnlichkeit besteht mit RM62, hier ist der
Spacer
zwischen
den
beiden
Thioglykolamidelementen
um
eine
83
Dimethoxyethangruppe verlängert. Diese Modifikation des Moleküls resultierte
jedoch in einer schwächeren Hemmung der RmtA.
Substanz
Strukturformel
Inhibiton der RmtA ( %)
O
Ha/Or 26
IC50: 46,84 ± 2,9 µM
HS
N
H
NH2
RM62
7,55 % bei 40 µM
O
H
O
S
N
O
keine Aktivität bei 10 µM
S
O
N
H
O
RM65III
O
IC50: 46,19 ± 1,4 µM
O
O
S
H
N
S
N
H
O
O
RM82
19,49% bei 40 µM
O
N
keine Aktivität bei 10 µM
S
O
RM108
keine Aktivität bei 40 µM
N
keine Aktivität bei 10 µM
O
S
S
Tab. 10.5: Inhibitorische Aktivität der α-Methylthioglykolamidverbindungen.
Ha/Or 26
RM65-III
100
Inhibition RmtA (%)
Inhibition RmtA (%)
100
75
50
25
0
75
50
25
0
10 0
10 1
10 2
c(µM)
10 3
10 0
10 1
10 2
10 3
c(µM)
Abb. 10.2: IC50-Bestimmungen der potentesten α-Methylthioglykolamide.
84
10.7 NCI-Substanzbank
Aus der NCI-Substanzbank wurden fast 40 Verbindungen an RmtA getestet.
Darunter befand sich Dapson, welches ein bateriostatisches Chemotherapeutikum
darstellt und bei der Leprabehandlung in Kombination mit Rifampicin eingesetzt wird.
Sich wiederholende Strukturelemente innerhalb der Bank sind die Guanidinogruppe,
die sek. Sulfonsäureamidgruppe und die Thioamidingruppe. Alle Verbindungen
wurden
zunächst
in
einer
Konzentration
von
10
µM
an
der
fungalen
Methyltransferase getestet. Die potentesten Verbindungen wurden danach auf ihre
Hemmwirkung in einer Konzentration von 2 µM
überprüft. Einige dieser
Verbindungen besaßen bei 2 µM keine inhibitorische Aktivität mehr, die Substanzen
mit inhibitorischer W irkung wurden an hPRMT getestet. Von 4 Verbindungen
(Stilbamidin, Allantodapson, Dapson und NSC310342) wurde der jeweilige IC50-W ert
bestimmt. Auf eine weitergehende Charakterisierung der NSC-Verbindung 39322
wurde aufgrund ihres nichtarzneistoffähnlichen Aufbaus verzichtet.
Gold-
Substanz-
score
Bezeichnung
59,22
57,26
Strukturformel
N
66184
28977
56,61
OH
O
Cl
N
IC50: 52,94 ± 8,9 µM
S
35,89 % bei 40 µM
15,89 % bei 20 µM
O N
O
H2 N
43,98 % bei 40 µM
22,90 % bei 20 µM
S
O
O
NH
H 2N
202409
hPRMT 1 (%)
33,69 % bei 10 µM
H
N
S
56,80
RmtA ( %)
NH
N
H2N
310342
Inhibition
30,6 % bei 40 µM
H
N
O
56,93
Inhibition
S
288391
61,62 % bei 10 µM
60,02 % bei 40 µM
nicht aktiv bei 2 µM
33,47 % bei 20 µM
41,58 % bei 10 µM
84,47 % bei 1 µM
51,76 % bei 0,5 µM
O
N
S
H2N
55,70
18807
NH
NH 2
HN
H
N
NH 2
N
H
HO
S
74,74 % bei 10 µM
75,56 % bei 40 µM
nicht aktiv bei 2 µM
34,38 % bei 20 µM
73,89 % bei 10 µM
75,56 % bei 40 µM
32,48 % bei 2 µM
34,38 % bei 20 µM
OH
O
54,65
39322
H 2N
S
S
NH2
85
54,65
HN
18758
24,37 % bei 10 µM
H2 N
NH
53,59
OH
17383
12,84 % bei 10 µM
S
80,67 % bei 40 µM
17,06 % bei 20 µM
N
Cl
52,07
154983
S
NH2
51,50
46613
H
N
N
N
HN
51,02
113989
N
NH
N
HN
33,78 % bei 40 µM
26,13 % bei 2 µM
22,98 % bei 20 µM
68,32 % bei 10 µM
35,89 % bei 40 µM
nicht aktiv bei 2 µM
32,40 % bei 20 µM
64,68 % bei 10 µM
25,78 % bei 40 µM
34,93 % bei 2 µM
11,27 % bei 20 µM
N
N
N
76,99 % bei 10 µM
H
N
49,98
24205
71,17 % bei 10 µM
N
+
nicht aktiv bei 2 µM
N
HN
NH
NH 2
49,58
O
521717
OH
53,84 % bei 10 µM
4,67 % bei 2 µM
HN
H2N
49,12
NH
92987
39,06 % bei 40 µM
HN
N
O
48,94
H
N
93967
24,92 % bei 20 µM
S
H 2N
HO
O
S
OH
59,08 % bei 10 µM
O
O
N
H
71,61 % bei 40 µM
nicht aktiv bei 2 µM
N
O
48,67
Cl
35400
25,84 % bei 10 µM
Cl
Cl
OH
S
45,45 % bei 20 µM
+ O
N
Cl
Cl
HN
76,00 % bei 40 µM
O
NH 2
48,32
52075
H2 N
Cl
H
N
50,42 % bei 10 µM
nicht aktiv bei 2 µM
N
N
86
48,30
O
34238
O
Allantodapson
O
O
N
O
48,23
IC50: 8,31 ± 0,3 µM
S
N
H
N
H
O
9,54 % bei 1 µM
N
45869
71,14 % bei 2 µM
77,23 % bei 10 µM
N
nicht aktiv bei 2 µM
S
H2N
47,77
NH
Cl
20878
HO
H 2N
S
83,88 % bei 10 µM
45,89 % bei 40 µM
18,25 % bei 2 µM
7,26 % bei 20 µM
Cl
NH
47,69
N H2
25561
23,72 % bei 10 µM
S
HN
NH
S
H2N
47,50
74472
74,94 % bei 10 µM
nicht aktiv bei 2 µM
NH
H 2N
47,44
45870
H2N
S
O
O
S
47,21
5,66 % bei 10 µM
NH
334340
O
OH
OH
52,55 % bei 10 µM
O
N
45,90
528168
H
H
nicht aktiv bei 2 µM
NH2
45,30 % bei 10 µM
N
S
H2 N
NH
S
O
45,41
NH
35605
Stilbamidin
IC50: 29,93 ± 1,3 µM
H2N
25,77 % bei 40 µM
18,98 % bei 20 µM
NH
NH
44,56
35950
4,17 % bei 10 µM
Cl
H2N
S
NH
OH
O
O
N +
O
N+
O-
43,12
305831
-
HN
H 2N
24,19 % bei 10 µM
O
NH
NH 2
87
42,95
121771
19,39 % bei 40µM
N
S
HN
42,44
NH 2
NH2
47799
HN
56,20 % bei 10 µM
NH
nicht aktiv bei 2 µM
H
O
40,63
Dapson
40,48
O
6091
S
OH
O
IC50: 110,1 ± 4,0 µM
25,38 % bei 20 µM
NH 2
H 2N
43,41 % bei 40 µM
14288
63,43 % bei 10 µM
nicht aktiv bei 2 µM
HN
O
NH2
37,27
NH
303851
N
H2N
29,16
126757
H
N
H
O
HN
- N
O +
N
NH
2
N
H
27,09
18,69 % bei 10 µM
H
N
H
65238
75,13 % bei 10 µM
48,40 % bei 40 µM
15,60 % bei 2 µM
21,56 % bei 20 µM
5,25 % bei 10 µM
OH
O
H2N
22,92
95676
45,11 % bei 40 µM
N
+
N
+
Tab. 10.6 : Inhibitorische Aktivität von Verbindungen aus der NCI-Substanzbank.
88
NSC34238
Alla ntod ap s o n
NSC35605
Stilbamidin
100
Inhibition RmtA (% )
Inhibition RmtA (% )
100
75
50
25
0
10 0
10 1
75
50
25
0
10 0
10 2
10 1
c(µM)
NSC6091
Dapson
NSC310342
100
Inhibition RmtA (% )
Inhibition RmtA (% )
100
75
50
25
0
10 0
10 2
c(µM)
10 1
10 2
75
50
25
0
10 0
10 3
10 1
c(µM)
10 2
10 3
c(µM)
Abb. 10.3: IC50-Bestimmungen ausgewählter NCI-Verbindungen.
10.8 Interne Substanzbank
Von den damals knapp 200 Verbindungen wurden 10 mit einem Goldscore > 40
ausgewählt. Alle Verbindungen wurden in der Konzentration von 10 µM an RmtA
getestet. Darunter befanden sich vier Derivate des Sulfanilamids. Diese waren bis
auf den Fünfring-Heterozyklus strukturell gleich. Den besten inhibitorischen W ert
zeigte die Verbindung J0071 mit
dem in 5-Stellung substituierten Isoxazol-
Substituenten. Sie schien offensichtlich wesentlich besser in die Bindungstasche des
Enzyms zu passen, als die Verbindung J0068 mit dem 2-fach substituierten
Oxazolsubstituenten. Allgemein korrelierte der Goldscore hier gut mit den an RmtA
erzielten Hemmwerten. Die zwei besten inhibitorisch wirksamen Verbindungen
wurden jeweils noch in der Konzentration von 2 µM auf ihre Hemmwirkung
untersucht. Hier zeigte sich jedoch keine inhibitorische Aktivität mehr. Anzumerken
ist, dass offensichtlich auch einfach strukturierte Verbindungen wie L-Glutamin
bereits inhibitorische Aktivität an RmtA zeigten.
89
Gold-
Nummer
Bezeichnung
Strukturformel
Inhibition RmtA ( %)
Score
54,03
Inhibition hPRMT 1 (%)
J0071
Sulfamethoxazol
69,29 % bei 10 µM
O
O
O
S
N
H
N
50,78 % bei 40 µM
H2N
53,44
J0069
nicht aktiv bei 2 µM
41,09 % bei 20 µM
Sulfathiazol
S
52,08 % bei 10 µM
N
O
O
N
H
nicht aktiv bei 2 µM
S
32,98 % bei 40 µM
H2N
10,89 % bei 20 µM
53,42
J0070
Sulfisoxazol
44,74 % bei 10 µM
O
O
S
N
H
O N
H2 N
52,55
J0104
O
L-Glutamin
44,35 % bei 10 µM
O
H
H2N
OH
NH2
46,71
J0100
O
5-N,N-DimethylAmilorid-HCl
Cl
N
N
N
N
38,59 % bei 10 µM
N
N
N
HCl
44,45
J0048
Naphazolin
36,89 % bei 10 µM
N
N
43,99
J0068
Sulfamoxol
O
O
O
35,65 % bei 10 µM
S
N
H
N
H2N
42,29
J0103
6Furfurylaminopurin
H
N
H
N
N
N
42,02
J0016
32,68 % bei 10 µM
O
N
Cl
Chloroquin
N
37,16 % bei 10 µM
70,92 % bei 40 µM
NH
N
41,85
J0106
Guanin
1,20 % bei 10 µM
O
N
HN
HN
2
41,76 % bei 20 µM
N
N
H
Tab. 10.7: Inhibitorische Aktivität von Verbindungen der internen Substanzbank.
Ergebnisse an hPRMT1 sind fett markiert.
90
10.9 Chembridge-Verbindungen
Aus der Chembridge ExpressPick-Kollektion wurden fünf Verbindungen mit einem
Goldscore > 40 zur Testung ausgewählt. Die Verbindungen C-7112201 und
C-7155176 wiesen
Strukturähnlichkeit
auf,
offensichtlich
wurde
durch
einen
Chlorsubstituenten in para-Position die inhibitorische W irkung erhöht. Den besten
Hemmwert erzielte die Verbindung C-5784982 mit einer stickstoffsubstituierten
Seitenkette, an deren Ende sich eine Aminogruppe befindet. Von Chembridge
ebenfalls erhältlich ist AMI-1 (s. Kapitel 4.6). Diese Substanz wurde in allen weiteren
Testungen als Referenzsubstanz gehandhabt.
GoldScore
Nummer
Strukturformel
Inhibition RmtA ( %)
Inhibition hPRMT 1 (%)
59,54
N
C-5784982
N
57,49 % bei 10 µM
O
O
43,98 % bei 30 µM
N
H
H2N
58,64
C-7112201
N
40,13 % bei 10 µM
S
N O N
H2N
58,20
47,99 % bei 30 µM
N
NH2
H2N
C-7155176
46,90 % bei 10 µM
N
64,53 % bei 30 µM
S
N
N
H2N
49,67
N O
NH2
C-5756663
42,42 % bei 10 µM
N
62,70 % bei 30 µM
N
H
45,13
C-6000016
43,99 % bei 10 µM
NH2
N
H2 N
50,12 % bei 30 µM
N
H
NH2
---------------
IC50: 33,8 ± 7,8 µM
O
C-5255879
O
AMI-1
S
O
88,32 % bei 20 µM
OH
+
Na
O
OH
O
+
Na
S
N
H
O
N
H
O
Tab. 10.8: Inhibitorische Aktivität von Chembridge-Verbindungen.
Ergebnisse an hPRMT 1 sind fett markiert.
91
10.10 Maybridge-Verbindungen
Aus den Maybridge-Substanzbanken wurden die vier Verbindungen zur T estung
angefordert, deren GoldScore über 40 lag. Sie wurden zunächst in einer
Konzentration von 40 µM am RmtA getestet. Die Substanz mit dem höchsten
Goldscore
zeigt auch im in-vitro Assay die größte Aktivität. Die stärksten
Verbindungen wurden anschließend auf ihre Hemmwirkung bei 10 µM überprüft.
Insgesamt waren sie jedoch um ein vierfaches weniger potent als die Substanzen
der Chembridge-Bibliothek.
GoldScore
Nummer
62,57
M-SPB00853
Strukturformel
N
H2 N
56,45
N
N
H
54,58 % bei 40 µM
O
N
S
6,85 % bei 10 µM
N
N
M-CD02761
Cl
O
49,81 % bei 40 µM
N
S
Cl
M-CD02830
S
NH
M-SB01947
H
N
H3C
1,87 % bei 10 µM
26,61 % bei 40 µM
N
H
N
47,59
+
NH2
NH2
Cl
55,59
Inhibition RmtA ( %)
+
O
N
Cl
O
NH2
42,41 % bei 40 µM
O
Tab. 10.9 : Inhibitorische Aktivität von Maybridge-Verbindungen.
10.11 Tocris-Verbindungen
Aus dem Sortiment wurden fünf Substanzen mit einem Goldscore von über 40
ausgewählt und in den Konzentrationen 40 µM und 10 µM an RmtA getestet.
A-3 Hydrochlorid ist als Proteinkinaseinhibitor beschrieben, BW 723C86 als 5-HT 2BAgonist. Clobenpropit (VUF 9153) ist ein hoch potenter H3-Antagonist und partieller
Agonist an H4. Bei GF 109203X (Gö 6850, Bisindolylmaleimide I) handelt es sich um
einen Protein Kinase C Inhibitor, bei Guanfacin-Hydrochlorid um einen α
2A-
Agonisten145.
92
Alle Substanzen waren im Vergleich mit Verbindungen aus anderen Substanzbanken
eher schwache Inhibitoren der RmtA. Eine weitere Charakterisierung (Bestimmung
der Inhibition von hPRMT1, Selektivität gegenüber SET 7/9) wurde deshalb nicht
durchgeführt.
Goldscore
Substa nz-
Strukturformel
Inhibition RmtA ( %)
Bezeichnung
57,30
Cl
Guanfacin
H
N
Hydrochlorid
Cl
O
32,65 % bei 40 µM
NH2
17,19 % bei 10 µM
NH
HCl
55,33
NH
Clobenpropit
N
S
Dihydrobromid
N
H
52,95
nicht aktiv bei 10 µM
Cl
2 HBr
BW 723C86
Hydrochlorid
35,79 % bei 40 µM
O
S
NH 2
N
H
HCl
43,75
nicht aktiv bei 40 µM
N
H
A-3 Hydrochlorid
O
O
S
H
N
0,80 % bei 10 µM
35,86 % bei 40 µM
NH 2
15,81 % bei 10 µM
HCl
Cl
41,20
H
N
GF 109203X
O
14,91 % bei 40 µM
O
11,34 % bei 10 µM
N
N
H
N
Tab. 10.10: Inhibitorische Aktivität der Tocris-Substanzen gegenüber RmtA.
10.12 World-Drug-Index
Hier wurden ebenfalls die Verbindungen mit einem Goldscore > 40 an RmtA getestet.
Unter den Substanzen befanden sich auch zwei Verbindungen (Mefloquin und
Primaquin), die Aktivität gegenüber Plasmodien besitzen und als Antimalariamittel
Verwendung finden. Die größte Hemmwirkung gegenüber RmtA besaß jedoch DAPI
(4',6-Diamidino-2-phenylindol), das in der Fluoreszenzmikroskopie zur Markierung
von DNS eingesetzt wird. Die übliche Konzentration beträgt hier 0,1 - 1 µg/ml, was
einer Konzentration von 285,5 bzw. 2855 µM entspricht163. Aufgrund dieser Tatsache
93
wurde auf eine weitere Untersuchung von
DAPI als möglichem
Histonmethyltransferasehemmstoff verzichtet, da
bei einem IC50 von 30 µM an
RmtA mit unerwünschten W irkungen die DNS-Replikation betreffend, zu rechnen
wäre.
Goldscore
Substanz
58,31
Mefloquin
Strukturformel
F
F
Inhibition RmtA ( %)
33,51 % bei 10 µM
F
F
N
F
F
H
N
HO
55,86
Primaquin
CH3O
41,05 % bei 40 µM
N
HN
52,16
O
Propafenon-
28,56 % bei 20 µM
OH
H+
N
H
O
Hydrochlorid
49,63
NH 2
14,29 % bei 10 µM
Cl -
4',6-Diamidino2-phenylindol
IC50: 29,27 ± 2,0 µM
H 2N
NH
N
H
DAPI
NH
NH 2
Tab. 10.11: Inhibitorische Aktivität von World-Drug-Index-Verbindungen.
10.13 Abschließende Beurteilung
Insgesamt war die Trefferrate im durchgeführten Screening relativ hoch. Dies kann
mehrere Gründe haben. Zum einen wurden Substanzen (bzw. deren Analoge)
getestet, für
die
im PRMT1-Modell
eine
hohe
Inhibierungswahrscheinlichkeit
prognostiziert wurde. Da zu Beginn dieser Arbeit keine spezifischen Inhibitoren der
PRMT1 bekannt waren, wurden zunächst recht hohe Konzentrationen im Assay
eingesetzt. W ährend der Durchführung des Screenings zeigte sich jedoch bald, dass
neben mittelpotenten Substanzen
auch höherpotente Verbindungen (z.B.
Allantodapson) gefunden wurden. Desweiteren kann nicht ausgeschlossen werden,
dass die Hemmung einiger Verbindungen auf unspezifischen Effekten beruht. Um
dieses zu überprüfen, waren weitere Testungen notwendig. Erst dann liesse sich die
tatsächliche Trefferrate ermitteln.
94
11. Testung der Verbindungen an hPRMT1
Alle Verbindungen, die an RmtA aus Aspergillus nidulans inhibitorische W irkung
aufwiesen, wurden
anschließend
auf ihre
Hemmpotenz gegenüber
hPRMT1
getestet. Ebenso wie RmtA wurde dieses Enzym als GST-getagtes Protein von
Gerald Brosch, Leopold-Franzens-Universität Innsbruck zur Verfügung gestellt164.
11.1 Aktivitätsbestimmung und Testung an Sinefungin
Analog zur Testreihe an RmtA wurde auch hier zunächst eine Aktivitätsbestimmung
durchgeführt. Neben dem unverdünnten Protein wurden 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:20 und
1:50-Verdünnungen in hPRMT1-Enzympuffer auf ihre Aktivität im in-vitro-Assay
getestet.
Relati ve
Fl uor eszenzeinhei ten
(RFU)
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
Verdünnung GST- hPRMT1
Abb. 11.1: Aktivitätsbestimmung GST -hPRMT 1.
Um auch bei diesem Enzym davon ausgehen zu können, dass mögliche Inhibitoren
erkannt würden, wurde Sinefungin als Kontrollsubstanz eingesetzt. Bei 100 µM
zeigte sich eine Reduzierung des Methylierungsgrades um 65,98 %.
11.2 Testung der RmtA-Inhibitoren
Es erfolgte zunächst eine orientierende Testung der ausgewählten Verbindungen bei
40 und 20 µM bzw. bei 30 µM (Chembridge-Verbindungen). Allantodapson und
NSC288391 wurden aufgrund der Vortestungen an RmtA im niedrig mikromolaren
Bereich geprüft. Von den potentesten Verbindungen wurde anschließend der
95
IC50-W ert bestimmt. Aus Gründen der Übersichtlichkeit finden sich die Ergebnisse
der Vortestungen bei den Ergebnissen an RmtA. Einige Chembridgeverbindungen
wurden zu einem späteren Zeitpunkt getestet. Da bereits gute Ergebnisse für einige
Chembridgeverbindungen vorlagen, wurde auf orientierende T estungen an RmtA
verzichtet.
Substanz-
Strukturformel
Inhibition hPRMT 1 (%)
Bezeichnung
Chembridge
O
89,25 % bei 30 µM
H
N
H2 N
C-5102096
Chembridge
O
C-6689772
S
82,25 % bei 30 µM
O
N
H
H2 N
Chembridge
O
C-7280948
S
80,09 % bei 30 µM
O
N
H
H2N
NH2
Chembridge
N
C-7736382
O
C-7789734
S
O
O
Chembridge
82,21 % bei 30 µM
81,28 % bei 30 µM
H2N
S
O
H
N
O
Tab. 11.1: Ergebnisse der Chembridgeverbindunge n an hPRMT 1.
Substanzbezeichnung
IC50 hPRMT 1
NSC6091 Dapson
50,88 ± 6,0 µM
NSC17383
29,79 ± 0,3 µM
NSC20878
53,23 ± 1,6 µM
NSC28977
24,50 ± 1,9 µM
NSC34328 Allantodapson
1,73 ± 0,04 µM
NSC34500
24,11 ± 0,9 µM
NSC35605 Stilbamidin
56,97 ± 3,3 µM
NSC46613
56,83 ± 4,4 µM
NSC92987
30,93 ± 2,6 µM
NSC93967
14,32 ± 1,5 µM
NSC113989
54,77 ± 2,2 µM
NSC126757
75,77 ± 7,1 µM
NSC154983
88,23 ± 8,2 µM
NSC202409
22,32 ± 1,3 µM
96
NSC288391
0,52 ± 0,04 µM
NSC310342
64,48 ±11,0 µM
J0016 Chloroquin
20,66 ± 2,2 µM
J0071 Sulfamethoxazol
30,43 ± 4,9 µM
L-Aminohomo-Histidin
30,00 ± 7,4 µM
Dibromphakellstatin
33,92 ± 4,6 µM
rac-Cyclooroidin
21,50 ± 2,0 µM
HKI3883
6,51 ± 0,4 µM
Chembridge C-5102096
39,29 ± 3,2 µM
Chembridge C-5255879 AMI-1
1,2 ± 0,5 µM
Chembridge C-5756663
14,34 ± 1,3 µM
Chembridge C-5784982
33,36 ± 8,3 µM
Chembridge C-6000016
33,81 ± 16,6 µM
Chembridge C-6689772
16,93 ± 3,2 µM
Chembridge C-7112201
36,74 ± 10,9 µM
Chembridge C-7155176
21,88 ± 2,45 µM
Chembridge C-7280948
12,75 ± 2,9 µM
Chembridge C-7736382
29,91 ± 1,7 µM
Chembridge C-7789734
15,32 ± 4,8 µM
Tab. 11.2: IC50-Bestimmungen an hPRMT 1.
11.3 Ergebnisse der Testung an hPRMT1
Die getesteten Verbindungen zeigten weitgehende Übereinstimmung zwischen den
an RmtA und hPRMT1 erzielten Hemmwerten. Dies unterstützt das erstellte
Screening-Modell, zum anderen stellen sich auch hier noch die Frage in wieweit
unspezifische Effekte bei den einzelnen Verbindungen eine Rolle gespielt haben
könnten. Um die recht hohe Hitrate weiter einzugrenzen und um zusätzliche
Informationen über die vielversprechendsten Verbindungen zu erhalten, schlossen
sich Testungen auf zellulärer Ebene an.
97
12. Selektivitätstestung an SET7/9
Neben den Histonlysinmethyltransferasen MLL1 und SET1 besitzt auch SET7/9
Affinität zu Lysin 4 H3. Im Gegensatz zu den Erstgenannten überträgt SET7/9 jedoch
nur eine Methylgruppe. Kristallographische Untersuchungen zeigten, dass der
schmale tunnelartige Aufbau des Enzyms im Bereich des aktiven Zentrums dafür
verantwortlich ist165. Über eine Rolle SET7/9s bei der Entstehung von Krankheiten,
speziell Tumoren ist bislang nur wenig bekannt. Ein möglicher Einfluss auf Gene, die
mit Krebserkrankung in Verbindung gebracht werden, z.B. MDR1, wird derzeit
untersucht166.
12.1 Entw icklung eines Testsystems für SET7/9
Das heterogene Testsystem für SET7/9 basierte ebenfalls auf einem modulartigen
Aufbau. Die Matrix bestand auch hier aus streptavidinbeschichteten Mikrotiterplatten.
Statt des biotinylierten Histon H4-Peptids wurde hier biotinyliertes Histon H3-Peptid
verwandt.
Als
primärer
Antikörper
wurde
Anti-Monomethyl-Histon
H3(Lys4)-
Kaninchen-IgG eingesetzt. Beim sekundären Antikörper handelte es sich um
denselben, der bei den Untersuchungen an RmtA/ hPRMT1 eingesetzt worden war
(europiumgelabelter Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper).
Abb. 12.1: Schematische Darstellung des Testsystems für SET 7/9.
98
Die für die optimale Plattenbindung ermittelte Konzentration an biotinyliertem
Substrat wurde ebenso wie die Verdünnung des sekundären Antikörpers aus den
Entwicklungsexperimenten des RmtA/ hPRMT1-Assays übernommen.
Zusätzlich wurde die optimale Verdünnung des primären Antikörpers bestimmt.
Rel at ive
Fl uor ezen zein heit en
(RFU)
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
Verdünnung des Anti-Monomethyl-Histon H3 (Lys4)
Kaninchen-IgG Antikör pers
Abb. 12.2: Bestimmung der optimalen Verdünnung des primären Antikörpers.
12.2 Selektivitätstestungen an SET7/9
Da die verschiedenen Histonmethyltransferasen unterschiedlichen Einfluss auf die
Aktivierung/ Stilllegung der Ablesung von Genabschnitten nehmen, ist die Frage
nach der Selektivität identifizierter Inhibitoren ein wichtiger Punkt innerhalb der
Entwicklung biochemischer Agentien oder therapeutisch nutzbarer Substanzen. Die
an
RmtA/ hPRMT1
identifizierten
Histonmethyltransferase-Inhibitoren
wurden
deshalb auch an SET7/9 getestet. Zunächst wurde eine orientierende Konzentration
gewählt, die um das zwei-dreifache höher als die jeweilige T estkonzentration an
RmtA bzw. hPRMT1 lag. Analog zu den Testungen an RmtA/ hPRMT1 wurden von
den an SET7/9 aktiven Verbindungen IC50-W erte bestimmt. Aus Gründen der
Übersichtlichkeit sind nur die Verbindungen aufgeführt, bei denen eine signifikante
Henmmung auftrat.
99
Substanz-
Strukturformel
Inhibition SET 7/9 (%)
Bezeichnung
NSC113989
N
N
N
IC50: 37,24 ± 2,4 µM
NH
N
H
HN
N
NSC310342
NH
H2N
O N
O
NSC34238
Allantodapson
IC50: 49,12 ± 4,1 µM
Cl
N
S
O
O
O
N
O
IC50: 8,80 ± 0,6 µM
S
N
H
N
NH2
H
O
HKI3328
42,77 % bei 40 µM
O
H
O
N S
S N
N
Chaetocin
13,42 % bei 10 µM
O
O
N
N
H
S
O
S
N
O
HKI3846
34,88 % bei 30 µM
Cl
N
NH 2
N
H
O
HKI15017
37,05 % bei 30µM
N
42,32 % bei 50 µM
N
N
OH
HKI15761
23,63 % bei 30 µM
N
N
N
N
N
N
Chembridge
N
N O N
C-7112201
24,63 % bei 20 µM
S
N
H2N
NH2
O
AGH9
32,67 % bei 20 µM
S
O
O
N
N
H
32,43 % bei 40 µM
NH
O
O
O
AGH9a
27,89 % bei 30 µM
S
O
H2N
35,66 % bei 60µM
NH
O
Chembridge
IC50: 11,26 ± 1,6 µM
O
O
C-5255879
S
O
OH
+
Na
O
AMI-1
OH
O
+
S
N
H
O
Na
N
H
O
100
Boc-L-ArgOH
NH2
35,07 % bei 140 µM
HN
N
H
HCl H2 O
O
COOH
N
H
O
NH2
rac-Cyclooroidin
N
23,90 % bei 14 µM
NH
24,36 % bei 30 µM
Br
N
NH
Br
O
NH
Sinefungin
67,32 % bei 100 µM
2
N
N
N
O
N
NH2
HO
O
NH 2
HO
OH
Tab. 12.1: Inhibitorische Aktivität von NCI-Verbindungen an SET 7/9.
12.3 Ergebnisse der Selektivitätstestungen an SET7/9
Sinefungin diente auch hier der Methodenüberprüfung und hemmte SET7/9 zu über
60 % bei 100 µM. Erwartungsgemäß zeigten die eingesetzten modifizierten Arginine
der
Firma
Novabiochem
nur
geringe
inhibitorische
Aktivität
an
der
Lysinmethyltransferase SET 7/9. Die meisten getesteten Verbindungen zeigten keine
bzw. nur schwach ausgeprägte inhibitorische Aktivität. AMI-1, als eigentlich selektiv
für PRMT1 beschrieben, hemmte das Enzym in einer Konzentration von 30 µM noch
fast vollständig. Von NCI310342, NSC113989 und Allantodapson wurde der IC50W ert bestimmt. Im Gegensatz zu Stilbamidin, welches auch bei einer Konzentration
von 50 µM keine inhibitorische Aktivität zeigte, wies Allantodapson einen IC50-W ert
von 8.8 µM auf. Es scheint sich hierbei also um einen dualen Inhibitor sowohl für
PRMT1 als auch für SET7/9 zu handeln. Interessanterweise zeigte auch die
Verbindung Chaetocin (in der Literatur als selektiv für Su(var)3-9 beschrieben65)
inhibitorische Aktivität an SET7/9 (42,77 % Hemmung bei 40 µM, 13.42 % Hemmung
bei 10 µM).
101
C-5255879
AM I-1
NSC34238
Allantodapson
100
Inhibition SET7/9 (%)
Inhibition SET7/9 (%)
125
100
75
50
25
0
10 -1
10 0
10 1
75
50
25
0
10 0
10 2
10 1
c( µ M)
c( µ M)
NSC113989
NSC310342
100
Inhibition SET7/9 (%)
100
Inhibition SET7/9 (%)
10 2
75
50
25
0
10 1
10 2
c( µ M)
75
50
25
0
10 0
10 1
10 2
10 3
c( µ M)
Abb. 12.3: IC50-Bestimmungen an SET 7/9.
102
13. Selektivitätstestung an G9a
Bei G9a handelt es sich um eine der euchromatischen Lysin-Methyltransferasen,
welche Di- bzw. Trimethyllysin an Lysin 9 im Histon H3 im Bereich von
Targetpromotoren
etablieren.
Da
die
Lysin
9
H3
Methylierung
zu
den
am besten untersuchten Modifikationen im eukaryotischen Chromatin gehört, ist
bekannt, dass vor allem die Dimethylierung für die Stilllegung von Promotoren
verantwortlich ist. Diese Markierung und nicht Trimethyllysin 9 H3 wird bei der
Reaktivierung von Tumorsuppressorgenen entfernt20. Daher stellt auch G9a ein
interessantes Target im Bereich der Krebsforschung dar. 2007 wurde der erste nicht
kosubstratkompetitive Inhibitor von G9a präsentiert. Es handelt sich hierbei um BIX01294, eine im HTS gefundene Verbindung mit Chinazolingrundgerüst. Diese bewirkt
z.B. eine Reduzierung der Dimethylierung an G9a T argetgenen167.
O
O
N
H
N
N
N
N
N
Abb. 13.1: G9a-Inhibitor BIX-01294.
In
der
vorliegenden
Arbeit
wurde
G9a
wie
schon
zuvor
SE7/9
zur
Selektivitätsbestimmung genutzt. Das GST-getaggte Fusionsprotein wurde von
Thomas Jenuwein, Universität W ien zur Verfügung gestellt. Da nur geringe Mengen
des Enzym zur Verfügung standen, konnten nur wenige Verbindungen untersucht
werden.
13.1 Ergebnisse und Diskussion der Testungen
Sinefungin wurde eingesetzt, um zu kontrollieren, ob auch von diesem Testsystem
Inhibitoren erkannt würden. Bei 100 µM zeigte siche eine Inhibierbarkeit des Enzyms
zu fast 50 %. Das Boc-geschützte Argininderivat zeigte erwartungsgemäß keine
103
starke
Inhibition
der
Lysinmethyltransferase
G9a.
Auch
alle
anderen
Testverbindungen zeigten keine nennenswerte Inhibierung. Um jedoch detaillierte
Aussagen treffen zu können, wären weitere Untersuchungen unerlässlich.
Substanz
Strukturformel
Inhibition G9a (%)
H2 N
NCI35605
12,95 % bei 50 µM
Stilbamidin
NH2
NCI310342
NH
Cl
N
H2 N
O
N
O
NCI34238
Allantodapson
O
O
N
N
H
12,87 % bei 20 µM
S
O
O
24,91 % bei 120µM
S
O
N
NH
2
H
NH2
Boc-L-ArgOH
18,66 % bei 140µM
HN
HN
HCl H2 O
O
Novabiochem
O
N
H
COOH
NH2
Sinefungin
45,97 % bei 100 µM
N
N
N
O
N
NH2
HO
NH2
O
HO
OH
Tab. 13.1: Inhibitorische Aktivität von NCI- Verbindungen an G9a.
104
14. Testung an nativen Histonen
Die potentesten und selektivsten Verbindungen (Ausnahme: Allantodapson)
wurden
anschließend von Gerald Brosch, Leopold-Franzens-Universität Innsbruck in einem
radioaktiven Assay auf ihre Hemmwirkung an hPRMT1 untersucht. AMI-1 diente
hierbei
als
Referenz.
Als
Substrat
wurden
native
Core-Histone
aus
Hühnererythrozyten verwendet.
14.1 Ergebnisse der Testungen
Substanzbezeichnung
Hemmung ( %)
Chembridge 5784982
22,1 % bei 2,06 mM
Chembridge 6000016
29,9 % bei 2,15 mM
Chembridge 7155176
Chembridge 7112201
IC 50
1,28 mM
26,9 % bei 1,7 mM
Chembridge 5255879
54,0 µM
AMI-1
AGH9a
22,3 % bei 1,77 mM
Chloroquin-phosphat J0016
0,98 mM
Sulfathiazol J0069
2,18 mM
Sulfamethoxazol J0071
605 µM
(E)-Oroidin
808 µM
Cyclooroidin
680 µM
NSC20878
282 µM
NSC46613
38 % bei 2,15 mM
Dapson
NSC34238
43,0 µM
Allantodapson
NSC35605
19,7 µM
Stilbamidin
NSC113989
keine Hemmung bei 2,06 mM
NSC126757
35,3 % bei 2,34 mM
NSC154983
36,6 % bei 2,64 mM
Tab. 14.1: Testung ausgewählter Substanzen im radioaktiven Assay.
105
Bei der Testung an Core-Histonen zeigte sich bei den meisten Substanzen ein weit
geringeres inhibitorisches Potential als erwartet. Stilbamidin hingegen zeigte ein
besseres Ergebnis als im in dieser Arbeit beschriebenen heterogenen Assay.
Generell reduzierte sich die Zahl der weiter zu charakterisierenden Substanzen, die
W estern-Blotexperimente wurden deshalb z.B. nur mit AMI-1, Allantodapson und
Stilbamidin durchgeführt.
14.2 Diskussion der Ergebnisse
Das die meisten Verbindungen nur sehr geringe Hemmwirkung im radioaktiven
assay aufwiesen kann mehrere Gründe haben: zum einen wurden native Histone
verwendet. Die daher
Acetylierung
könnten
auch vorhandenen weiteren
die
PRMT 1-Aktivität
gehemmt
Modifikationen, wie
haben.
Um
dieses
z.B.
zu
überprüfen, könnten in einem erneuten Test die nativen durch rekombinante Histone
ersetzt werden. Außerdem kann PRMT1 in vitro auch Histon H2A methylieren156. Da
davon ausgegangen werden kann, dass die Methylierung der unterschiedlichen
Histone nicht parallel abnimmt, könnte also durchaus die Methylierung an Arginin 3
im Histon H4 bereits gehemmt sein, die an H2A hingegen noch nicht. Dies hätte
natürlich Einfluss auf den resultierenden IC50-W ert.
106
15. Kinetische Untersuchungen an RM-65 III
W ie bereits in Kapitel 7.3 erwähnt, interagieren die Verbindungen Allantodapson und
Stilbamidin mit der der Substratbindungstasche. Ein anderer Interaktionsmodus
muss
für
AMI-1 angenommen
werden,
hier
liegt
eine
Interaktion
mit
der
Kosubstratbindungstasche vor. Die im in-vitro-Screening als potent charakterisierte
Substanz RM65-III wurde von W olfgang Sippl, Martin-Luther-Universität HalleW ittenberg genauer untersucht. Analog zu AMI-1 konnten bei Docking sinnvolle
Ergebnisse nur erzielt werden, wenn das Kosubstratanalogon SAH entfernt wurde.
Abb. zeigt die Interaktionen von RM65-III mit PRMT1. Es existieren zahlreiche vander-W aals-Interaktionen mit aromatischen Aminosäureresten (T yrosin 43, Tyrosin 47,
Methionin 56, Valin 108, Tyrosin 156, Tyrosin 160, und Glutamat 161) sowohl der
Kosubstrat-
als
auch
der
Substratbindungstasche.
Desweiteren
können
W asserstoffbrückenbindungen mit Tyrosin 47, Tyrosin 156, und Glutamat 161
angenommen
werden.
Bei
RM-65
III
schien
es
sich
somit
um
einen
Bisubstratinhibitor zu handeln.
Um
dieses
auch
experimentell
zu
bestätigen,
wurden
kinetische
Studien
durchgeführt.
Abb.
15.1:
Schematische
Darstellung
der
Interaktion,
RM65-III
und
hPRMT 1.
Wasserstoffbrückenbindungen zwischen RM65-III und hPRMT 1 sind als gestrichelte Linien
dargestellt, hydrophobe Interaktionen hingegen als kreisförmige Linien.
107
15.1 Theorie
Michaelis
und
Menten
veröffentlichten
1913
eine
Gleichung,
welche
die
Initialgeschwindigkeit v0 einer enzymatischen Reaktion mit der Substratkonzentration
[S] verbindet. Eine wichtige Rolle spielt hierbei die sog. Michaelis-Menten-Konstante
Km.
v 0 = vmax * [S] /Km + [S]
Km ist eine charakteristische Größe für die Affinität eines Substrats zu einem Enzym.
Je kleiner der Km-W ert, desto höher ist die Affinität. Km bezeichnet die
Substratkonzentration, bei der die Reaktionsgeschwindigkeit halbmaximal verläuft,
wobei Km gleichzeitig unabhängig von der Enzymkonzentration im Reaktionsansatz
ist. Der Km für ein Enzym kann experimentell bestimmt werden, in dem die
Anfangsgeschwindigkeit v 0
einer enzymkatalysierten Reaktion bei verschiedenen
Substratkonzentrationen und einer konstanten Enzymkonzentration gemessen wird.
Zur einfachen graphischen Bestimmung von Vmax und Km kann auf die doppelt
reziproke Darstellung nach Lineweaver-Burk zurückgegriffen werden, welche die
Form der allgemeinen Geradengleichung y = m* x + b besitzt: m bezeichnet hier die
Steigung der Geraden, b den Ordinatenabschnitt.
1/ v 0 = Km/ Vmax + 1/[S] + 1/ Vmax
Nach Lineweaver-Burk wird die reziproke Initialgeschwindigkeit v 0 als lineare
Funktion der reziproken Substratkonzentration aufgetragen Durch Extrapolation der
resultierenden Geraden können Vmax und Km sicher bestimmt werden. Sie ergeben
sich aus den Schnittpunkten der generierten Gerade mit der Abzisse (-1/ Km) bzw.
der Ordinate (1/ Vmax).
Auf Bisubstratreaktionen ist die Michaelis-Menten-Gleichung strenggenommen nicht
anwendbar. Eine Durchführung ist jedoch möglich, wenn eines der Substrate bei
einer hohen Konzentration konstant gehalten wird und nur das andere wird variiert167.
Im durchgeführten Experiment wurde daher die Konzentration an Histon H4-Peptid
ebenso wie die Konzentration an Enzym konstant gehalten, die Konzentration an
Kosubstrat variierte. Ob sich nun ein Hemmstoff kompetitiv zu einem Enzymsubstrat
108
verhält, kann in verschiedenen Reaktionsansätzen über Km und Vmax bei
steigenden Hemmstoffkonzentrationen bestimmt werden.
Für die Untersuchungen an PRMT1 wurden deshalb folgende Bedingungen gewählt:
während die Konzentration an biotinyliertem Histon H4-Peptid jeweils pro Kavität 20
pmol betrug, variierte die zugegebene Menge an S-Adenosylmethionin zwischen 32
und 0,8 µM. RM-65 wurde in den Konzentrat 0, 10, 25 und 50 µM getestet. Es
wurden für jeden Reaktionsansatz 1/ v0 sowie 1/ [S] berechnet und gegeneinander
aufgetragen.
15.2 Ergebnisse
20
15
1/V o (min*L/µmol)
RM65-III 0µM
10
RM65-III 10µ M
RM65-III 25µM
RM65-III 50µM
5
0
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
-5
1/[S-Adenosylmethionin] (µM)
Abb. 15.2: Kompetitionsanalyse RM-65 III.
109
15.3 Diskussion der Ergebnisse
Die erhaltene Grafik nach Michaelis-Menten zeigt einen Schnittpunkt aller vier
Geraden
im
II.
Quadranten
des
Koordinatenkreuzes.
Dies
ist
typisch
für
enzymatische Reaktionen in Anwesenheit von Inhibitoren vom Bisubstrattyp. Mit
zunehmender Inhibitorkonzentration steigt die Steilheit der jeweiligen Gerade, die
enzymatische Umsetzungsgeschwindigkeit nimmt also ab. Somit handelt es sich bei
RM-65III tatsächlich um einen Inhibitor vom Bisubstrattyp.
16. Untersuchung der PRMT1- Inhibitoren im Western Blot
Aufgrund der sehr hohen Hitrate in den in-vitro-Experimenten wurden einige der
identifizierten „Hits“ auf zellulärer Ebene untersucht. Eine Standardmethode ist
hierbei die Durchführung eines W estern-Blot-Experiments. Die Bezeichnung Blotten
(dt.: Übertragen) bezieht sich auf den Transfer biologischer Proben von einem Gel
auf eine Membran und die nachfolgende Detektion der Proben auf dieser Membran.
Der W estern-Blot dient allgemein der Identifikation und Quantifizierung spezifischer
Proteine in komplexen Proteingemischen. Dabei können einzelne Proteine z.B. aus
Zelllysaten nachgewiesen werden. Nach Auftrennung der Proteine, abhängig von
ihrer Größe, im elektrischen Feld werden sie auf eine Membran transferiert und
dadurch immobilisiert. Auf der Membran erfolgt der Nachweis des Proteins mittels
eines spezifischen Antikörpers. Der gebundene erste Antikörper wird durch einen
zweiten Antikörper, der entweder radioaktiv markiert oder an ein Enzym (Peroxidase,
Phosphatase, etc.) gekoppelt ist, detektiert. Das Verfahren wurde 1979 von T owbin
vorgestellt und zählt heute zu den Routinetechniken der Proteinanalyse 168. In der
vorliegenden Arbeit wurde die W estern-Blot-Methode genutzt, um die im in-vitro
Testsystem als RmtA/ PRMT1-Inhibitoren identifizierten Verbindungen auf ihre
Aktivität in Zellen zu überprüfen. Ein Einfluss auf den Methylierungsgrad an Arginin 3
im Histon H4 sollte auf Proteinebene nachgewiesen werden.
110
16.1 Durchführung der Experimente
Für die Experimente wurden HepG2-Zellen verwendet. Diese zeichneten sich durch
leichte Handhabbarkeit sowohl bei der Anzucht, als auch bei der Durchführung der
Tests aus. Diese Zellen wurden 1975 aus T umorgewebe eines 15-jährigen
argentinischen
immortale
Jungen
Zelllinie
mit
hepatozellulärem
etabliert.
beschrieben169, weisen
Die
Karzinom
Zellen, erstmals
in qualitativer
Hinsicht ein
entnommen
1979
von
den
primären
und
als
et
al.
Aden
humanen
Leberzellen ähnliches Enzym- und Proteinmuster auf (z.B. Albumin, Transferrin,
Plasminogen, verschiedene Komplementaktivatoren und Retinolbindendes Protein).
Ferner enthalten sie die meisten Xenobiotika metabolisierenden Enzyme. Die
HepG2-Zellen
zeichneten
sich
durch
adhärentes,
epithelialzellenähnliches
W achstum in kleinen Aggregaten aus. Ihre Verdopplungsrate lag bei 50- 60 h, was
bedeutete, dass die Zellen alle drei Tage 1: 10 gesplittet werden mussten.
Die Testsubstanzen wurden in den Konzentrationen 150, 50 und 25 µM getestet und
verblieben als DMSO-Lösung auf den Zellen. Da von allen Histonmodifikationen die
Histonmethylierung
das stabilste und langlebigste Signal darstellt, wurde eine
Inkubationszeit von 72 h gewählt.
16.2 Ergebnisse der Westernblot-Experimente
Nach Aufarbeitung der Zellen und anschließender Proteindetektion durch AntiDimethyl-Histon H4(Arg3)-Kaninchen-IgG als primärem und HRP-gelabeltem AntiKaninchen-IgG-Antikörper konnten folgende Resultate erhalten werden: ein Einfluss
auf die Histonmethylierung an Arginin 3 im Histon H4 konnte für alle drei
Testsubstanzen bereits durch visuellen Vergleich der Banden festgestellt werden.
Jede Substanz in jeder Konzentration verringerte den Methylierungsgrad im
Vergleich zur DMSO-Kontrolle. Am deutlichsten fiel der Effekt jedoch bei AMI-1 und
Stilbamidin in der Konzentration 150 µM aus. Allantodapson zeigte einen wesentlich
schwächeren Einfluss.
Die
densitometrische
Auswertung
der
mit
Testsubstanz behandelten
Zellen
resultierte in den folgenden prozentualen Abnahmen: AMI-1: 65 % Reduktion des
Methylierungslevels bei 150 µM, 40 % Reduktion bei 50 µM und 42 % Reduktion bei
25 µM. Stilbamidin: 58 % Reduktion des Methylierungslevels bei 150 µM, 50 %
111
Reduktion bei 50 µM und 32 % Reduktion bei 25 µM. Allantodapson: 35 % Reduktion
des Methylierungslevels bei 150 µM, 27 % Reduktion bei 50 µM und 15 % Reduktion
bei 25 µM. Zur Ermittlung der der Reduktionswerte waren die erhaltenen Banden mit
der Bande verglichen worden, die von den DMSO-behandelten Zellen stammte. Alle
Banden waren zuvor jeweils auf den tatsächlichen Histon H4-Gehalt normalisiert
worden.
Abb. 16.1: Ergebnisse der Western Blot Untersuchungen an Arginin 3 H4.
Die obere Bande eines jeden Paares stellt das Ergebnis der Inkubation mit Anti-DimethylHistone H4(Arg3)-Antikörper dar. Bei der unteren Bande wurde das Ergebnis durch Färbung
mit Anti-Histon H4- Antikörper erhalten. Diese Bande diente zur Kontrolle der jeweils
aufgetragenen Proteinmenge.
16.3 Diskussion der Western-Blot-Ergebnisse
Es waren relativ hohe Konzentrationen am jeweiligen Inhibitor notwendig, um einen
blockierenden Effekt auf die Methylierung an Arginin 3 im Histon H4 zu erzielen.
Dabei ist natürlich die Möglichkeit in Erwägung zu ziehen, dass die untersuchten
Substanzen über keinegute
Zellgängigkeit bzw. nur ein eingeschränktes
Inhibitionspotential verfügen. Hier wäre die Synthese und Testung von den
Leitstrukturen abgewandelter Substanzen ein Ansatzpunkt. Desweiteren stellt sich
112
die
Frage,
ob
eine
Reduktion
des
Methylierungsgrads
zu
113
100 % erfolgen muss, oder ob nicht schon eine T eilreduktion der Methylierung
ausreichend wäre. Zuletzt bleibt die Frage, inwiefern die metabolismusaktiven
HepG2-Zellen Anteil an den benötigten hohen Inhibitorkonzentrationen besitzen.
17. Entwicklung eines zellbasierten Testsystems
Neben der in-vitro-Aktivität einer Verbindung ist auch ihr Potential an Zellkulturen zu
bestimmen. Eine etablierte, aber zeitintensive Möglichkeit stellt die in Kapitel 14
vorgestellte W estern-Blot-Technik dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher nach
einer Methode gesucht, welche es ermöglichen sollte, möglichst viele Substanzen
zur gleichen Zeit in einem zellbasierten Testsystem zu charakterisieren. Die
Detektion des Methylierungsstatus erfolgte analog zum in-vitro-Assay ebenfalls über
einen primären Kaninchen-IgG-Antikörper und den sekundären Europium gelabelten
Antikörper, welcher gegen Kaninchen-IgG gerichtet war. Durch diesen modulartigen
Aufbau war wiederum eine Untersuchung aller Methylierungsstellen im Histon
prinzipiell denkbar. Ursprünglich wurde die Methode zur Untersuchung des
Acetylierungsstatus in HCT116- und HT29-Zellen entwickelt170. Im Rahmen der
vorliegenden Arbeit wurde dieses Testsystem erstmals für Untersuchungen des
Methylierungsstatus
in
HepG2-Zellen
weiterentwickelt.
Durch
ihre
starke
Haftfähigkeit erwiesen sich diese für den nachfolgend erläuterten sog. Cellisa als
geeignet.
Das 96-W ell-Format erlaubt die Überprüfung vieler Substanzen zur gleichen Zeit, es
ist somit ebenfalls für ein Hochdurchsatz-Screening geeignet. Durch W ahl des
primären Antikörpers konnte der Einfluss der Testsubstanzen auf unterschiedliche
Methylierungsstellen im Histon ermittelt werden. Alle Experimente wurden als
Doppelbestimmungen durchgeführt. Da insbesondere bei Testung von Substanzen
mit Einfluss auf die Proliferation von HepG2-Zellen von unterschiedlichen Zellzahlen
in den einzelnen W ells ausgegangen werden musste, wurde anschließend der
Proteingehalt in den einzelnen Kavitäten bestimmt. Hierzu wurde eine modifizierte
BCA-Methode angewandt. Abschließend wurden die Fluoreszenzsignale auf die
Absorptionssignale normalisiert.
Untersucht wurde der Einfluss der Screening gefundenen Verbindungen auf den
Methylierungsgrad an Arginin 3 im Histon H4 (Methylierung durch PRMT1) und Lys4
114
im Histon H3( Methylierung durch SET7/9). Daher wurde für die Untersuchungen an
Arginin 3 im Histon H4 Anti-Dimethyl(Arg3)-Histon H4-Kaninchen-IgG, für die
Untersuchungen
an
Lys4
im
Histon
H3
Anti-Monomethyl(Lys4)-Histon
H3-
Kaninchen- IgG als primärer Antikörper verwendet.
17.1 Testung der zellulären Aktivität der Methyltransferase-Inhibitoren
Zunächst wurden die Substanzen Stilbamidin und Allantodapson getestet. AMI-1
diente als Referenzsubstanz. Das bei unbehandelten Zellen erhaltene Signal wurde
gleich 100% Methylierung gesetzt. Es zeigte sich, dass relativ hohe Konzentrationen
an Hemmstoff notwendig sind, um einen robusten Effekt auf die Methylierung an
Arginin 3 nachzuweisen. Finale Konzentrationen von 150 µM führten bei AMI-1 und
Stilbamidin zu fast vollständiger Inhibierung der Methylierung, bei Allantodapson fiel
die Hemmung geringfügig schwächer aus. Gleiche Konzentrationen zeigten einen
geringeren Effekt auf die Methylierung an Lys 4. Bei AMI-1 und Stilbamidin lag dieser
Effekt unter 25 %, bei Allantodapson bei unter 35 %.
Desweiteren wurden die im in-vitro-Screening gefundenen potentesten Substanzen
auf ihren Einfluss auf die Methylierung an Arginin 3 im Histon H4 untersucht.
Clobenpropit-Dihydrobromid hatte im in-vitro-PRMT1-Assay keine Aktivität gezeigt
und wurde
somit
als
Negativkontrolle
verwendet.
Ein
Einfluss
auf
den
Methylierungsgrad an Arginin 3 war auch im Cellisa nicht zu beobachten. Dapson
zeigte im Cellisa keine nennenswerte Reduzierung des Methylierungsstatus (10 %
Reduzierung bei 150 µM). Die Verbindungen NSC46613, NSC154983, NSC113989,
NSC20878, NSC126757 zeigten in der höchsten getesteten Konzentration (150 µM).
eine Hemmwirkung deutlich unter 25 %. Es zeigte sich, dass von allen getesteten
Substanzen nur Lie1417 annähernd über das
Potential von Stilbamidin und
Allantodapson verfügte. Nennenswerte Inhibierung (≥ 25%) der Methylierung an
Arginin 3 war bei Oroidin und RM 65-III zu beobachten.
115
Stilbamidin
Reduktion des M e t hy li e r un gsg r a de s
(% )
R eduktion des M ethyli erungsgr ades
(% )
AM I-1
100
75
50
25
0
100
75
50
25
0
c(µ M)
c(µ M)
H4R3
H3K4
H4R3
H3K4
Redukt ion des M e t hy li er ung s gr a ds
(% )
Allantodapson
100
75
50
25
0
c(µ M)
H4R3
H3K4
Abb. 17.1: Einfluss auf den Methylierungsgrad an Arginin 3 Histon H4 und Lysin 4 Histon H3.
(AMI-1, Stilbamidin und Allantodapson).
116
Reduzier ung des M et hyli erungsgrads
(%)
25
0
NSC113989
100
75
50
25
0
NSC126757
100
75
50
25
0
AGH9a
100
75
50
25
0
c(µM)
Reduzier ung des M ethyli erungsgrads
(% )
50
Reduzierung des M ethyl ierungsgrads
(% )
Reduzier ung des M ethyl i erungsgrads
(% )
75
Reduzier ung des M ethyli er ungsgrads
(%)
Reduzier ung des M ethyli erungsgrads
(%)
100
Reduzier ung des M et hyli erungsgrads
(%)
Reduzier ung des M et hyli erungsgrads
(%)
NSC46613
NSC154983
100
75
50
25
0
c(µM)
c( µM)
NSC20878
100
75
50
25
0
c(µM)
c( µM)
NSC6091
Dapson
100
75
50
25
0
c(µM)
c(µM)
CD230
100
75
50
25
0
c( µM)
117
100
75
50
25
0
Reduzi erung des M e t hyli er ungsgra ds
(% )
Reduzi erung des M e t hyli er ungsgra ds
(% )
Clobenpr opit
Dihydr obr omid
Or oidin
100
75
50
25
0
c(µM)
100
75
50
25
0
Sinefungin
100
75
50
25
0
c( µM)
RM 65-III
100
75
(% )
REduzier ung des M et hylie r ungs gra ds
c( µM)
Reduzier ung des M e t hyli erungs gra ds
(% )
r ac-Cyclo-Oroidin
(% )
Reduzier ung des M e thyli er ungs gra ds
c(µM)
50
25
0
c(µM)
Abb. 17.2: Einfluss diverser Verbindungen auf den Methylierungsgrad an Arginin 3 H4.
Bei der Verbindung RM 65-III wurde anschließend eine IC50-W ertbestimmung
durchgeführt.
118
Abb.17.3 : Graphische Darstellung der IC50-Bestimmung im zellbasierten T estsystem.
Für RM65-III ergab sich ein IC50 von 127,9 ± 25,85 µM. Die Substanz zeigte klare
Dosisabhängigkeit.
17.2 Diskussion der Ergebnisse des Cellisa
Die erhaltenen IC50-W erte sind naturgemäß in einem zellbasierten Testsystem höher
als am isolierten Enzym. Ein Vergleich mit zugelassenen Arzneistoffen, z.B.
Vorinostat, fällt schwer, da zumeist nur der Einfluss auf die Proliferationsrate der
Zellen bestimmt wird, nicht aber der Einfluss auf das molekulare Target. Generell
sind auch hier die gleichen Überlegungen anzustellen, wie bei den W estern BlotExperimenten. Zum einen den Einfluss der Zelllinie betreffend, zum anderen bleibt
die Frage, ob strukturoptimierte Verbindungen aufgrund besserer Zellgängigkeit und
eines größeren W irkpotentials bessere Ergebnisse erzielen würden. Auffällig ist die
Tatsache, dass Stilbamidin, Allantodapson und AMI-1 bei 150 µM im Cellisa die
Methylierung an Arginin 3 Histon H4 fast vollständig blockieren, während dies bei
den W esten Blot-Experimenten nicht der Fall war. W ie gut die Korrelation
zwischen W estern Blot und Cellisa im Allgemeinen ist, muss durch weitere
Experimente geklärt werden. Generell ist das entwickelte Testsystem jedoch als
Filter nach den in-vitro-Bestimmungen am isolierten Enzym geeignet.
119
18. Reportergenassays für PRMT1-Inhibitoren
18.1 Estrogen-Reportergen-Assays
Estrogen-Reportergen-Assays benutzen genetisch veränderte Zellen, in denen ein
Enzym, z.B. Luziferase oder ß-Galactosidase, als Reportergen zusammen mit einem
Estrogenrezeptor
sensitiven
Promotor
(Estrogen-RezeptorResponse
Element
(ERE)) vorliegt. Ein solches Reportergen-Konstrukt kann erhalten werden, wenn
zunächst die
interessierende Promotersequenz (ERE)
isoliert und
mit dem
Luziferasegen fusioniert wird. Bei der Aktivierung des Rezeptors wird nach wie der
Promotor aktiviert, statt des ursprünglich vorhandenen Gens wird nun das
Luziferasegen transkribiert. Die Zellen können zwar nicht mehr das ursprüngliche
Protein herstellen, sie reagieren aber auf Rezeptoragonisten mit der Expression von
Luziferase.
Das
Ausmaß
dieser
Transkriptionsaktivität
kann
mit
einem
Chemolumineszenassay bestimmt werden. Das exprimierte Protein Luziferase
katalysiert in Gegenwart von ATP und Mg2+ die oxidative Decarboxylierung von
Luziferin. Die dabei freiwerdende Lumineszenz korreliert mit der enzymatischen
Aktivität. Zum Nachweis der Luziferasexpression werden die Zellen lysiert und das
Zellhomogenat wird mit Luziferin, AT P und Mg2+ gemischt.
Abb. 18.1: Austausch eines Gens gegen das Luziferasegen.
Falls nicht endogen vorhanden, muss auch der Rezeptor selbst in die Zellen
hineinkloniert werden.
120
W erden diese Zellen mit einer estrogen aktiven Testsubstanz inkubiert, aktiviert
diese den ER und und über die Aktivierung des Promotors wird das Reportergen
„abgelesen“. Die Messung der estrogenen Aktivität erfolgt durch Zugabe eines
Enzymsubstrates und Messung der Umsetzungsrate.
Abb. 18.2: Schematische Darstellung eines Estrogen-Reportergen-Assays.
Ebenso kann ein „antiestrogener“ Effekt von Substanzen überprüft werden. Hier wird
neben dem
natürlichen
zugegeben.
Liganden
Estrogen
die
zu
überprüfende
Substanz
Zeigt diese einen „antiestrogenen“ Effekt, so ist die
Lumineszenzausbeute im Vergleich zur Kontrolle (nur Estrogenzugabe) reduziert.
Die Umsetzung des Substrats Luziferin durch die exprimierte Luziferase verläuft in
mehreren Teilschritten. Zunächst wird das Luziferin mit AT P unter katalytischem
Einfluss von Mg2+
und Luziferase zum gemischten Anhydrid von Luziferin und
Adenosinmonophosphat umgesetzt. Es bildet sich unter Sauerstoffeinfluss ein
Hydroperoxid. Dieses reagiert unter Abspaltung von Adenosinmonophosphat weiter
zu einem zyklischen Peroxid. Aus dem zyklischen Peroxid entstehtt nach Abgabe
von CO 2 die Carbonylverbindung im angeregten Zustand. Bei der Rückkehr in den
Grundzustand wird Licht der W ellenlänge 528 nm emittiert.
121
Abb. 18.3: Umsetzung des Luziferins zu Oxyluziferin unter Lichtemission.
18.2 Estrogen-Reportergen-Assay für PRMT1-Inhibitoren
Für die erste als PRMT 1-Inhibitor identifizierte Verbindung AMI-1 konnte von Cheng
et al. eine Aktivität in einem Estrogen-Rezeptor basierten T estmodell nachgewiesen
werden129. Daher wurden auch die in dieser Arbeit identifizierten Inhibitoren auf ihre
Aktivität in einem solchen Assay überprüft. Diese Arbeiten wurden von Ronald Gust,
Freie Universität Berlin durchgeführt. Als Zelllinie wurde die MCF-7a-Zellinie
verwendet. Diese aus dem Pleuraerguss eines metatasierenden Brustkrebstumors
gewonnene Zelllinie ist hormonabhängig und exprimiert den Estrogenrezeptor α. Sie
ist stabil mit dem EREwtc-luc-Plasmid transfiziert. Dem Reportergen ist hier als
Enhancer in seiner Promotorregion nur ein ERE (Estrogen Response Element)
122
vorgeschaltet. Kinetische Untersuchungen zeigten, dass die Luziferaseexpression
der MCF-7-2a-Zelllinie nach 42 h einen Maximalwert erreichte171. Eine Inkubation mit
Testsubstanzen erfolgte daher für 50 h. Getestet wurden folgende Substanzen:
Stilbamidin, Allantodapson, NSC20878, NSC46613, NSC113989, NSC126757,
NSC154983 und Dapson. AMI-1 diente als Referenzsubstanz.
O
-
O S O
NH
OH
H 2N
O
OH
O
-O
S
O
N
N
H
H
NH 2
NH
AMI-1
NSC35605
O
S
O
O
O
N
O
N
H
O
S
NH2
N
H3C
H
NSC154983
NSC34238
H
CH 3
NH2
CH3
N
N
Cl
OH
H
H
N
N
N
N
H
S
Cl
N
N
N
N
N
N
H
NSC20878
NSC113989
NSC46613
O
H2 N
O 2N
NH2
NH
S
NH
N
N
N
O
H
H2 N
H
NH2
Daps on
NSC126757
Abb. 18.4: Im Estrogen-Re portergen-Assa y getestete Verbindungen.
Für Stilbamidin zeigte sich bei einer Konzentration von 150 µM ein deutlicher
blockierender
(antiestrogener)
Effekt.
Die
bei
Allantodapson
bei
150
µM
beobachteten negativen W erte sind mit einem zusätzlich bei dieser Konzentration
auftretenden
zytotoxischen
Potential
zu
erklären.
NSC46613
zeigte
ein
widersprüchliches Verhalten, bei 100 µM konnte ein deutlicherer antiestrogener
Effekt erzielt werden als bei 150 µM. Alle anderen Verbindungen zeigten nur
schwach ausgeprägtes bzw. nicht vorhandenes antiestrogenes Potential. Dapson
zeigte den am schwächsten ausgeprägten Einfluss auf die estrogenvermittelte
Rezeptoraktivierung. AMI-1 zeigte überraschenderweise keine signifikante (d.h. über
123
25 % hinausgehende) Blockierung der estrogenvermittelten Rezeptoraktivierung.
Laut Literatur wäre ein deutlicher Effekt zu erwarten gewesen.
Für Stilbamidin und Allantodapson konnte hingegen bei 150 µM eine Aktivität im
Estrogen-Reportergen-Assay nachgewiesen werden. Ein therapeutischer Nutzen
dieser Verbindungen bzw. Leitstrukturen bei der Behandlung estrogenabhängiger
Tumore wäre somit denkbar.
Die Ergebnisse des Reportergenassays korrelieren außer bei AMI-1 recht gut mit
den erhaltenen Messdaten des zellbasierten Testsystems. Allantodapson und
Stilbamidin
zeigten
in
beiden Testsystemen eine
stärkere
Inhibierung der
Methylierung als die anderen Verbindungen.
Abb. 18.5: Blockierung der estrogenvermittelten Rezeptoraktivierung.
124
18.3 Androgen-Reportergen-Assay für PRMT1-Inhibitoren
Nachdem der Einfluss einiger in dieser Arbeit als Methyltransferase-Inhibitoren
identifizierter Verbindungen auf den Estrogen-Rezeptor untersucht worden war,
wurde in einem weiteren Experiment von mir überprüft, ob auch ein Einfluss auf den
Androgen-Rezeptor vorlag.
Der
Aufbau
dieses
Reportergenassays
entspricht
prinzipiell dem für die Untersuchung der antiestrogenen Aktivität verwandten System.
(s. vorheriges Kapitel). Die Experimente wurden an 293-Zellen durchgeführt, diese
sind im Gegensatz zu den
MCF-7a-Zellen nicht stabil mit dem Rezeptor-
Reportergen-Konstrukt versehen. Somit mussten bei dieser Versuchsreihe auch das
Plasmid für den Androgenrezeptor sowie das Plasmid für das Reportergen in die
Zellen gebracht werden. Dies geschah mit Hilfe etablierter Transfektionsmethoden.
Unter T ransfektion (aus Transformation und Infektion) ist der Transfer von FremdDNS in Zellen mit anschließender Expression zu verstehen. Es wurden viele
Methoden
entwickelt,
einzubringen.
Dabei
um
wird
eukaryotische
zwischen
DNS
transienten
in
kultivierte
und
stabilen
Säugerzellen
Transfektionen
unterschieden. Säugerzellen sind in der Lage DNS-Calciumphosphat-Copräzipitate
zu phagozytieren. Über die Endosomen gelangt die Fremd-DNS in die Zellen
(transiente Transfektion). Es ist möglich, verschiedene Plasmide gemeinsam zu
transfizieren (Cotransfektion). Erstmal wurde diese Methode 1963 von Graham und
van der Eb publiziert
172
.
Da von sehr vielen Substanzen nur noch geringe Mengen vorhanden waren, konnte
eine Testung nur bei den Konzentrationen 40 und 8 µM durchgeführt werden.
125
Substanz
Konzentration
Aktivierung Androgenrezeptor
Kontrollwert
Reduzierung um Faktor
8,4
NSC20878
40 µM
8,2
NSC34238
40 µM
3,3
1,0
Allantodapson
NSC35605
2,5
40 µM
3,6
Stilbamidin
2,3
NSC46613
40 µM
1,2
7,0
NSC113989
40 µM
5,2
1,6
NSC126757
40 µM
1,4
6,0
NSC154983
40 µM
5,7
1,5
NSC310342
40 µM
3,7
2,3
HKI3883
40 µM
3,1
2,7
(E)-Oroidin
40 µM
4,6
1,8
rac-Cyclooroidin
40 µM
2,6
3,2
J0069 Sulfathiazol
40 µM
4,6
1,8
J0071
40 µM
3,4
Sulfamethoxazol
2,5
Tab.18.1: Einfluss der T estsubstanzen (c= 40 µM) auf Aktivierbarkeit des AR.
Substanz
Konzentration
Kontrollwert
Aktivierung AR
Reduzierung um Faktor
8,4
NSC20878
8 µM
7,5
0,9
NSC34238
8 µM
5,9
2,5
8 µM
4,6
3,8
NSC46613
8 µM
6,0
2,4
NSC113989
8 µM
4,6
3,8
NSC126757
8 µM
3,5
4,9
NSC154983
8 µM
8,4
0,0
NSC310342
8 µM
5,9
2,5
HKI3883
8 µM
6,5
1,9
(E)-Oroidin
8 µM
6,2
2,2
rac-Cyclooroidin
8 µM
3,4
5,0
J0069 Sulfathiazol
8 µM
6,7
1,7
J0071
8 µM
4,4
4,0
Allantodapson
NSC35605
Stilbamidin
Sulfam ethoxazol
Tab. 18.2: Einfluss der T estsubstanzen (c= 8 µM) auf Aktivierbarkeit des AR.
126
Bei den getesteten Verbindungen zeigten vor allem NSC46613 und NSC1266757 bei
der
Konzentration
Androgenrezeptors.
von
Dieses
40
µM
eine
verminderte
Potential
lässt
weitere
Aktivierbarkeit
T estungen
bei
des
höheren
Konzentrationen sinnvoll erscheinen. Sehr schwache Aktivität zeigten hingegen
Stilbamidin und Allantodapson, dies könnte an den zu geringen Testkonzentrationen
gelegen haben. Beim Estrogen-Reportergenassay zeigte sich ein signifikanter
blockierender (antiestrogener) Effekt erst bei einer Konzentration von 150 µM.
19. Entwicklung eines in-vivo-Testsystems
Im Laufe der Entwicklung neuer therapeutischer Agentien steht nach Testungen auf
zellulärer Ebene auch die Überprüfung der W irksamkeit in lebenden Organismen an.
Diese Untersuchungen werden in sog. Modellorganismen durchgeführt. Bei diesen
Modellorganismen handelt es sich um Bakterien, Pflanzen, Pilze oder Tiere, die
hinsichtlich ihres Aufbaus sehr gut dokumentiert sind. Sie gehören z.B. zu den ersten
Organismen, deren komplettes Genom entschlüsselt wurde. Modellorganismen
zeichnen
sich
weiterhindadurch
aus,
dass
zell-
und
entwicklungsbiologische Fragestellungen an ihnen recht einfach untersucht werden
können. Bekannte Vertreter der Modellorganismen sind die Taufliege Drosophila
melanogaster, der Fadenwurm Caenorhabditis elegans und die Ackerschmalwand
Arabidopsis thaliana. Die W ahl des Modellorganismus hängt vor allem von der
biologischen Fragestellung ab. Grundsätzliche zellbiologische Prozesse werden in
wenig komplexen Einzellern untersucht, entwicklungsbiologische Experimente
werden an mehrzelligen Lebewesen durchgeführt. Im Bereich der Immunologie ist
die Maus (Mus musculus) bevorzugter Modellorganismus, Fragestellungen im
Bereich der Embryologie, der Virologie sowie der Entwicklung von Gliedmaßen
werden am Hühnerembryo (Gallus gallus) untersucht. Arbeiten auf diesem Gebiet
haben den zusätzlichen
Vorteil, dass
sie
nicht
unter
tierschutzrechtliche
Bestimmungen fallen. In kurzbebrüteten Hühnereiern ist das Nervensystem des
Embryonen noch nicht soweit ausgebildet, so dass es zu Schmerzempfinden
kommen könnte
173
.
Die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse wurden von mir im Arbeitskreis von
Frau Prof. Dr. Brand-Saberi, Universität Freiburg durchgeführt. Dort war zuvor der
127
Histondeasacetylaseinhibitor TSA untersucht worden. Es konnte ein Einfluss dieser
Substanz auf die Entwicklung der Gliedmaßen von Hühnerembryonen gezeigt
werden174.
Daher
war
es
von
Interesse,
zu
überprüfen,
ob
auch
Histonmethyltransferaseinhibitoren eine W irkung auf die Genese der Extremitäten
besitzen.
19.1 Entw icklung des Kükens im Ei
Die Entwicklung des Kükens im Ei beginnt mit der Bebrütung. Sie ist nach 21 Tagen
abgeschlossen. W ährend dieser Zeit durchläuft der Embryo eine Vielzahl von
Entwicklungsschritten.
Nach
Furchung und
Gastrulation
beginnt
24 h
nach
Bebrütungsbeginn die Ausbildung der Urwirbel (Somiten). 27 h später beginnen sich
die
Gliedmaßen
zu
differenzieren.
Da
z.B.
Temperaturschwankungen
die
Entwicklung des Embroys verzögern können, wird der Entwicklungsstand nicht in
Stunden oder Tagen angegeben, sondern in sog. Stadien eingeteilt. Die 1951
publizierte Einteilung in 46 Stadien (HH) nach Hamburger und Hamilton ist die heute
gebräuchlichste
175
.
Grundsätzlich lässt sich die Entwicklung von Extremitäten auf molekularbiologischer,
immunhistochemischer und mikros- bzw. makroskopischer Ebene beobachten. Im
Bereich der Molekularbiologie kann z.B. das Auftreten und die Verteilung von sog.
Morphogenen detektiert werden, die Immunohistochemie arbeitet mit der Detektion
von Antigenen in fixiertem Gewebe durch Antikörper.
Um ermitteln zu können, ob die Methylierung von Histonen im Hühnerembryo durch
die in dieser Arbeit identifizierten Inhibitoren beeinflusst wird, wurde zunächst ein
immunohistochemischer
Ansatz
für
die
Experimente
gewählt,
da
sich
die
Arbeitsschritte auf diesem Gebiet vergleichsweise einfach realisieren ließen.
128
19.2 Immunhistochemische Arbeiten an Gallus gallus
Zunächst wurde überprüft, ob der bislang für die entwickelten Testsysteme
verwandte Antikörper auch für immunhistochemische Arbeiten geeignet war. Dazu
wurde eine Verdünnungsreihe des Antikörpers von 1:25- 1:5000 an Paraffinschnitten
eines 72 h (entspricht Stadium 18) alten Embryos getestet.
Als sekundärer Antikörper
wurde ein Merretichperoxidase-gelabelter Antikörper
eingesetzt, welcher in der Ziege generiert wurde. Die vom Hersteller empfohlene
Verdünnung lag bei 1: 250. Als HRP-Substrat wurde W asserstoffperoxid und als
Chromogen Diaminobenzidin (DAB) eingesetzt. DAB bildet durch Oxidation am Ort
des Zielantigens ein dunkelbraunes, in wässrigen Lösungen stabiles Präzipitat, das
mit dem Lichtmikroskop darstellbar ist. Das Enzym Peroxidase bildet mit seinem
Substrat
W asserstoffperoxid
(H2O2)
einen
Komplex,
wobei
DAB
als
elektronenspendendes Chromogen fungiert. Das Enzym selbst wird dabei nicht
verbraucht und kann mehrere Reaktionen katalysieren. Es kommt somit zur
Amplifikation,
was
einen
entscheidenden
Vorteil
enzymatischer
Reaktionen
gegenüber der Immunfluoreszens darstellt. Nach 10 min. Reaktionszeit war die
beabsichtigte Intensität erreicht und die weitere Farbreaktion wurde durch W aschen
in TBS gestoppt.
Bei einer Verdünnung von 1:25 war eine Bindung des Antikörpers erkennbar.
Anschließend wurden Paraffinschnitte von Embryonen der Stadien 18-29 mit der
1: 25-Verdünnung des Antikörpers untersucht. Ziel war es, ein für die Bindung des
Antikörpers optimales Stadium im Bereich der Extremitätenentwicklung zu finden. Es
zeigte sich, dass die Stadien 18-24 die stärkste Bindung des Antikörpers aufwiesen.
Eine Bindung des Antikörpers war im Bereich der Extremitäten vor allem in der
Epithelleiste und im Mesoderm zu beobachten. Des W eiteren konnte eine Bindung
des Antikörpers im Dermomyotom, in der Retina, im Neuralrohr sowie im Entoderm
nachgewiesen werden. Die sehr starke Anfärbung des Neuralrohres kam durch die
dort vorherrschende hohe Zelldichte zustande.
129
Abb. 19.1A: Sechsfache Vergrößerung des angefärbten Paraffinschnitts (HH24).
Abb. 19.1B: Sechsfache Vergrößerung des angefärbten Paraffinschnitts (HH24).
130
19.3 Inkubation mit Inhibitoren
Als nächstes sollte experimentell überprüft werden, ob die bislang auf in-vitro/
zellulärer Ebene als Methyltransferaseinhibitoren gefundenen Verbindungen AMI-1,
Stilbamidin und Allantodapson auch im Modellorganismus eine W irkung erzielten.
Dazu wurden die einzelnen Stoffe als DMSO-Lösung auf Acrylamid-Kügelchen
(Beads) aufgetragen. Je ein Bead wurde anschließend in das Extremitätengewebe
implantiert. Alle Stoffe wurden in den Konzentrationen 150 und 75 µM getestet.
Abb. 19.2: Paraffinschnitt nach Inkubation mit Stilbamidin 75 µM.
131
Lediglich bei den mit Stilbamidin behandelten Embryonen ließ sich eine deutliche
Abnahme der Antikörperfärbung im Bereich des implantierten Beads erkennen.
Da jedoch
nicht
ausgeschlossen
werden konnte, dass
dieser
Beobachtung
apoptotische Vorgänge zugrunde lagen, wurde in einem weiteren Experiment der
Einfluss von Stilbamidin auf die Apoptose von Zellen untersucht.
19.4 Überprüfung des apoptotischen Potentials
Dazu wurde sich der von van den Eijnde et al. publizierten Methode bedient176. Die
Embryonen wurden wie zuvor mit Beads präpariert und 24 h inkubiert. Danach
erfolgte keine Fixierung, stattdessen wurden die Embryonen in Nilblausulfatlösung
eingelegt und anschließend unter dem Mikroskop betrachtet. Nilblausulfat ist ein
wasserlöslicher und in leicht saurer bzw. neutraler Lösung beständiger kationischer
Farbstoff. Er kann z.B. zum Nachweis von Carboxylgruppen bzw. zum Nachweis von
Neutralfetten eingesetzt werden. Bei dem in dieser Arbeit durchgeführten Experiment
drang der Farbstoff in alle Zellen ein, die sich im Degenerationsprozess befanden.
Ein physiologischerweise auftretendes Absterben von Zellen wurde somit ebenso
erfasst wie ein Auftreten von Apoptose. Eine am Rand der Extremitäten auftretende
Blaufärbung ist durch physiologische Degeneration von Zellen der Epithelschicht zu
erklären. Sie tritt unabhängig von apoptotischen Vorgängen im Embryo auf und dient
als Qualitätskriterium für ein gelungenes Experiment. Ist sie nicht zu beobachten,
muss das Experiment wiederholt werden.
Es zeigte sich, dass durch Stilbamidin weder bei 150 noch bei 75 µM apoptotische
Vorgänge ausgelöst wurden. Ein Auftreten gefärbter Bereiche war nur in der
Epithelschicht zu erkennen, die Durchführung des Experiments war somit erfolgreich.
132
Abb. 19.3: Apoptosetest durch Anfärbung mit Nilsulfatblau.
(re: Stilbamidin 150µM, li: Stilbamidin 75µM).
19.5 Abschließende Bew ertung der Experimente am Modellorganismus
Die Möglichkeit der Untersuchung von Substanzen mit inhibierendem Potential bzgl.
der Histonmethylierung (speziell durch PRMT 1) und ihrem Einfluss auf die
Organogenese mittels antikörperbasierter Technik wurde in dieser Arbeit zum ersten
Mal beschrieben.
Es zeigte sich, dass durch Stilbamidin weder bei 150 noch bei 75 µM apoptotische
Vorgänge ausgelöst wurden. Eine Beeinflussung der Antikörperbindung sollte somit
durch Stilbamidin selbst verursacht worden sein. W eshalb die Verbindungen AMI-1
und Allantodapson keine W irkung zeigten, ist bislang noch nicht in allen Einzelheiten
geklärt. Als mögliche Gründe kämen in Frage, das die beiden Stoffe tatsächlich keine
Aktivität im Modellorganismus besitzen, bzw. Allantodapson hydrolytisch inaktiviert
wird. Es wäre aber auch denkbar, dass die Acrylamidbeads kein geeignetes Vehikel
für die Substanzen darstellten.
Daher sind Untersuchungen die eingesetzten Inhbitoren betreffend von Interesse und
stellen einen Anknüpfungspunkt an diese Arbeit dar.
133
20. Entwicklung eines homogenen Testsystemes für hPRMT1
Eine weitere Möglichkeit zur Detektion der Aktivität Histon modifizierender Enzyme
besteht in der Entwicklung und Verwendung eines homogenen Testsystems. Im
Gegensatz zum heterogenen Ansatz wird hier der Immunkomplex in Lösung
detektiert. Nicht gebundene Komponenten stören die signalgebende Bindung nicht,
weshalb hierbei keine T renn- oder W aschschritte nötig sind. Als Probenträger dient
meist eine Mikrotiterplatte.
Ein homogenes Testsystem ist insbesondere im Hinblick auf HochdurchsatzScreenings interessant, da im Vergleich zum heterogenen Ansatz die Durchführung
auf
den
Enzymreaktionsschritt und
einen
sich
anschließenden
einstufigen
Detektionschritt vereinfacht werden kann. Etablierte Methoden sind beispielsweise
der Scintilliation Proximity Assay (SPA), der Enzyme Channeling Immunoassay, der
Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Assay (FRET ) oder die Enzyme-Multiplied
Immunoassay Technique (EMIT). Im Falle der vorliegenden Arbeit wurde ein
homogenes Testsystem für Histon modifizierende Enzyme entwickelt, welches
dieselben Vorteile wie das zuvor beschriebene heterogene T estsystem aufweisen
sollte: zum einen die Verwendung einer nicht-radioaktiven Messtechnik, zum
anderen einen modulartigen Aufbau, der eine breite Anwendbarkeit im Bereich der
Histonmethyltransferasen ermöglicht.
Hierzu wurde
sich der von der Firma
PerkinElmer im Jahre 2000 eingeführen AlphaScreen-Technologie bedient. Das
Akronym AlphaScreen steht hier für Amplified Luminescent Proximity Homogeneous
Assay. Das Prinzip dieser Messmethode beruht auf der Amplifikation eines Signals,
das bei der Interaktion von sogenannten Donor- und Akzeptorbeads entsteht. Über
dieses System kann die Annäherung zweier Moleküle sehr empfindlich gemessen
werden. Ullman et al. publizierten 1994 diese Methode als W eiterentwicklung des
Prinzips der Latex-Agglutination177. Die damals gewählte Bezeichnung Luminescent
Oxygen Channeling Immunoassay (LOCI) ist für Produkte der klinischen Diagnostik
(z.B. TSH- und Tumormarkerbestimmungen) erhalten geblieben. Unter dem Namen
Alphascreen werden Produkte für Forschungs- und Entwicklungszwecke von
PerkinElmer
angeboten.
Es
werden
zwei
unterschiedliche
ligand-
oder
rezeptorbeschichtete Polystyrol-Latex-Partikel des Durchmessers
von250
nm
verwendet. Eine Partikelart ist mit einem Photosensibilisator versehen, welcher bei
Anregung durch Licht der W ellenlänge 680 nm Singulettsauerstoff produziert. Als
134
Singulettsauerstoff bezeichnet man ein Sauerstoffmolekül im angeregten Zustand.
Beide Elektronen im höchsten antibindenden Energieniveau besitzen antiparallelen
Spin zueinander. Die zweite Partikelart trägt fein verteilt ein Olefin, welches bei
Kontakt mit Singulettsauerstoff Chemolumineszenz aussendet. Die Reaktion mit
Singulettsauerstoff und die nachgelagerte Lichtemission hängen stark von der
räumlichen Nähe der beiden Partikelarten ab. W ie nachfolgend beschrieben wird,
geht man davon aus, dass nur durch miteinander verbundene Partikel ein Signal
generiert wird.
N
N
S
N
S
S
O
O
O
O
O
Thioxen
O
+
h* v
O
Dioxetan
Abb. 20.1: Schematische Darstellung des AlphaScreen-Prinzips und der Generierung von
Chemoluminezenz.
Beide Partikelarten sind mit einem Hydrogel beschichtet, welches einerseits
unspezifische Bindungen mit Matrixkomponenten minimiert und gleichzeitig eine
funktionale Oberfläche bietet, an welche Antikörper und Analyte gebunden werden
können.
Als Photosensibilisator wurde modifiziertes Phthalocyanin gewählt, welches eine
starke Absorption bei 680 nm aufweist (ε= 180000l mol
-1
· cm
-1
) und molekularen
Sauerstoff in ausreichendem Maße in Singulettsauerstoff umwandelt. Unmodifiziertes
Phthalocyanin erwies sich als weniger geeignet, da durch eine bessere Löslichkeit im
Polystyrol nicht alle gebundenen Moleküle durch Laserbestrahlung erfasst wurden178.
135
Folgende Eigenschaften sind für die chemolumineszierende Komponente wichtig:
zum einen ausreichende Löslichkeit in Polystyrol und rasche Reaktion mit
Singulettsauerstoff, zum anderen ein rascher Zerfall des Addukts aus Komponente
und Singulettsauerstoff mit anschließender hoher Ausbeute an Chemolumineszenz.
Bestimmte Thioxene entsprechen diesen Anforderungen. Seine maximale Löslichkeit
in Latex beträgt 60 mmol · l-1, seine Reaktionsgeschwindigkeit mit Singulettsauerstoff
2 x 10
8
l · mol-1 · s-1. Des W eiteren zerfällt das gebildete Dioxetan in Latex mit einer
Geschwindigkeitskonstante von 1,3 s-1.
Dies
erlaubt
einen Spitzenwert
der
Lichtemissionsmessung schon nach einer Belichtungszeit von 1 s. In den Versuchen
von Ullmann et al. war die Lichtemissionsausbeute bei 390 nm jedoch gering.
Deshalb wurde den Latexpartikeln zusätzlich ein Fluoreszenzenergieakzeptor, in
diesem Fall 9, 10-Bisphenylethenylanthracen beigegeben179.
Nach
erfolgter
Präparation
der
Latexpartikel
chemolumineszierenden Komponenten werden
mit
beide
Sensibilisator
Partikeltypen
bzw.
mit
einem
Hydrogel überzogen, dieses enthält die aktiven Gruppen für die Bindung von
Rezeptoren und Liganden. Es handelt sich hierbei um reaktive Aldehydgruppen.
W ie bereits erwähnt, wird ein Messignal nur dann generiert, wenn beide
Partikeltypen in räumlicher Nähe zu einander sind. Singulettsauerstoff besitzt in
wässriger Umgebung eine Lebenszeit von 4 µs. Die Distanz, die die angeregten
Moleküle in dieser Zeit zurücklegen können wird mit 115 nm angegeben. Mit
zunehmender Entfernung von der Partikeloberfläche nimmt die Konzentration an
Singulettsauerstoff stetig ab, in einer Entfernung von 250 nm ist sie um den Faktor >
100 reduziert. Da die Latexpartikel einen Durchmesser von ungefähr 250 nm
besitzen, werden somit fast ausschließlich die Partikel zur Chemolumineszenz
angeregt, die sich in der Bindungsdistanz zu einem Sensibilisatorpartikel befinden.
Da das Messsignal auf einer kaskadenartigen Freisetzung von Singulettsauerstoff
beruht
und
pro
Laserblitz
von
einem
Donorpartikel
ungefähr
60000
Singulettsauerstoffmoleküle in der Sekunde produziert werden, ermöglicht die
Methode Messungen der Bindungspartner im femtomolaren Konzentrationsbereich.
Durch die Kombination von Anregung bei 680 nm und Signalmessung mit zeitlicher
Verzögerung bei 570 nm werden Matrixeffekte ausgeblendet. Freie Latexpartikel
verursachen ebenfalls kein Störsignal. Als Resultat ergeben sich ein niedriges
Hintergrundrauschen und ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis. Laut Produkthersteller
können S/B Ratios im dreistelligen Bereich erreicht werden.
136
Störungen des AlphaScreensignals durch Substanzen beruhen im W esentlichen auf
vier
Mechanismen:
1.
Löschung
bzw.
Verminderung
der
entstehenden
Singulettsauerstoffmenge, 2. Aufhebung der Interaktion zwischen Rezeptor und
Ligand, 3. Verhalten als innerer Filter, 4. Verhalten als Analoge der Donor- bzw.
Akzeptorpartikel. Unter die erste Kategorie fallen vor allem Metallionen wie Al3+,
Fe2+/3+, Cu2+, Ni2+, Zn2+, wenn sie in mikromolarer Konzentration eingesetzt werden,
sowie Antioxidanzien wie Ascorbinsäure oder Azide. Substanzen, welche strukturelle
Ähnlichkeit zu Thioxen (im Konzentrationsbereich 100 µM-10 mM) bzw. Hämoglobin
besitzen, stören ebenfalls.
Unter dem 2. Punkt finden sich die Stoffe, welche Rezeptor- oder Ligandähnlichkeit
besitzen.
Bei
der
Interaktion
von
streptavidinbeschichteten
Partikeln
mit
biotinyliertem Substrat sind dies beispielsweise biotinähnliche Strukturen. Als innerer
Filter verhalten sich die Substanzen, welche Licht der W ellenlänge 680 bzw. 520620 nm absorbieren. Daher ist bei grünen bzw. blauen Lösungen eine Interferenz mit
dem Testsystem zu erwarten. Analoge zu Donorpartikeln sind Substanzen, welche in
der Lage sind Singulettsauerstoff zu produzieren. Für gewöhnlich sind dies
Porphyrinstrukturen, z.B. Phthalocyanin und seine Derivate. Als Akzeptoranaloge
kommen vor allem aromatische Heterozyklen in Frage. PerkinElmer führt hier als
Beispiel Derivate der
Nodulisporinsäure
an. Diese
könnten vor allem in
Naturstoffsubstanzbanken vorhanden sein180.
O
O
OH
N
OH
HO
O
Abb. 20.2: Nodulisporinsäure A.
Unter
der
Markenbezeichnung
AlphaScreen
bietet
PerkinElmer
sowohl
gebrauchsfertige Kits (bsp. für IP3- oder cAMP-Bestimmungen) als auch einzelne
Komponenten zur Entwicklung eigener Testsysteme an. Die Latexpartikel, welche mit
der photosensibilisierenden Komponente versehen sind, werden von PerkinElmer als
Donorbeads bezeichnet, die Partikel mit chemolumineszierenden Komponenten
werden
Akzeptorbeads
genannt.
Die
Donorbeads
sind
kommerziell
mit
137
Streptavidinbeschichtung erhätlich. Dies ermöglichte bei der Entwicklung des
Testsystems die Verwendung der biotinylierten Histonpeptide der Firma Upstate,
welche bereits als Substrate für die heterogenen Assays eingesetzt wurden.
Vorteilhaft
war hier
wiederum die hohe Bindungsaffinität
des Biotins
zum
Streptavidin.
20.1 Wahl des Testformats und Aufbau des Testsystems
Bei der Entwicklung eines Testsystems kann zwischen direkten und indirekten
Formaten unterschieden werden. Das direkte Format beinhaltet beim AlphaScreen
eine biotinylierte Komponente, welche von einem Antikörper erkannt wird, der direkt
an den Akzeptorbead gebunden ist. Beim indirekten Format bindet die biotinylierte
Komponente an ein Protein bzw. einen Antikörper, welcher nicht direkt an einen
Akzeptorbead gebunden ist. Dieser Akzeptorbead ist dann entweder mit einem
sekundären Antikörper oder Protein A beschichtet. Noch dringlicher als beim direkten
Format ist hierbei zu beachten, dass die Beads sich in einer räumlichen Nähe von
200 nm befinden müssen, um ein Signal generieren zu können.
Zur Detektion der Substratumsetzung wurden primäre Kaninchen IgG-Antikörper
eingesetzt. Um jedoch die Anwendbarkeit des gesamten Systems nicht nur auf eine
Spezies zu begrenzen, wurden als Akzeptorbeads solche mit Protein A-Beschichtung
gewählt. Protein A ist ein bakterielles Zellwandprotein von Staphylococcus aureus
mit einer spezifischen Affinität zur Fc-Region von Immunglobulinen der G-Klasse
(IgG). Es besitzt ein Molekulargewicht von 42 kDa und weist eine hohe pH-Stabilität
im Bereich von pH 2-10 auf. Das gewählte Testformat ist somit ein indirektes.
Da
die
Beads
entsprechenden
eine
gewisse
Schritte
unter
Lichtempfindlichkeit
einer
mit
aufwiesen,
ChromaGreen-Folie
wurden
alle
ausgestatteten
Lichtquelle durchgeführt. Diese Folie ließ nur Strahlung im Grünbereich des
Spektrum passieren und filterte somit den für das Ausbleichen der Beads
verantwortlichen Anteil des Lichts heraus. Die Lichtempfindlichkeit der Beads zeigte
sich auch beim Detektionsschritt: die Lasereinstrahlung führt zu einem Ausbleichen
der
Beads;
nochmalige
Bestrahlung
bei
680
nm
führte
zu
einer
Signalintensitätminderung von 75%.
138
20.2 Entw icklung eines homogenen Testsystems für hPRMT1
Für die Untersuchungen an PRMT1 wurde als Substrat ein synthetisches Peptid
eingesetzt. Dieses bestand aus 21 Aminosäuren, welche mit den Aminosäuren 1-21
des humanen Histons H4 identisch waren. Am N-terminalen Ende befand sich durch
einen GG-Linker verknüpft die Biotingruppe, welche an ein Lysin gebunden war
(SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV-GGK-biotin).
Als
Antikörper
wurde
ein
im
Kaninchen generierter polyklonaler IgG Antikörper eingesetzt, welcher das an der 3.
Aminosäure (Arginin) dimethylierte Peptid erkannte. Maximales Signal war somit bei
vollständiger enzymatischer Umsetzung des Substrats durch PRMT1 zu erwarten.
Um eine maximale Signalstärke und ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu erzielen,
wurden die optimalen Assay-Konzentrationen des eingesetzten Substrats und des
verwendeten Antikörpers durch T itration bestimmt. Es wurden finale, d.h. nach
Zugabe aller Assaykomponenten resultierende Konzentrationen im nanomolaren
Bereich angestrebt.
20.2.1 Entw icklungsschritte
Zunächst
wurden
bei
einer
fixen
Antikörperverdünnung
von
1:1000
Substratkonzentrationen in einem Bereich von 0.1-100 nM vermessen. Da keine
kommerziell erhältliche Positivkontrolle (Dimethyl-Histonpeptid H4(Arg3), biotinyliert)
zur Verfügung stand, wurde der enzymatische Reaktionsschritt der Bestimmung
vorgeschaltet. Als Reaktionsbedingungen wurden eine Temperatur von 30 °C und
eine Inkubationszeit von 60 min. gewählt. Als Enzymlösung wurde zunächst eine
1:5-Verdünnung in PRMT1-Enzymreaktionspuffer eingesetzt. Diese Verdünnung
hatte ausreichende Aktivität im heterogenen Ansatz gezeigt. Eine Lösung aus
Antikörper und den beiden Beadsorten wurde, bevor sie zum Reaktionsansatz
gegeben wurde, 45 min-1 h lang bei Raumtemperatur geschüttelt. W ährend dieser
Zeit gingen Antikörper und Akzeptorbead eine nicht-kovalente Bindung ein. Im
anschließenden Detektionsschritt
Enzymreaktion
pipettiert.
Die
wurde die Bead-Antikörper-Mischung
Mikrotiterplatte
wurde
zu der
anschließend
bei
Raumtemperatur 1 h unter Schütteln inkubiert. Das biotinylierte Substrat wurde dabei
an die Donorbeads gebunden. Danach erfolgt die Detektion bei 680/570 nm.
Anschließend wurden die erhaltenen Signalintensitäten für die unterschiedlichen
139
Substratkonzentrationen, die Negativkontrolle (d.h. Umsetzung ohne Kosubstrat) und
den Blindwert verglichen.
Das beste Signal-Rausch-Verhältnis erzielte hier die Konzentration vom 100 nM.
Finale Konzentration an biotin. Substratpeptid (nM)
Resultierendes Signal-Rausch-Verhältnis
0,1
1
1
5
3
15
10
57
30
199
100
456
Tab. 20.1: Ermittlung der optimalen Substratkonzentration.
(fixe Antikörperverdünnung: 1: 1000).
Es wurde sich jedoch aus Kostengründen für eine finale Substratkonzentration von
30 nM entschieden, da sich auch hier ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis ergab.
Im 2. Schritt der Assay-Optimierung wurde die geeignete Antikörperverdünnung
bestimmt. Bei einer fixen Substratkonzentration von 30 nM wurde der verwendete
Antikörper in einem Verdünnungsbereich von 1: 250- 1: 5000 vermessen. Die für die
einzelnen Antikörperverdünnungen erhaltenen Signalintensitäten wurden bzgl. ihres
Signal-Rausch-Verhältnisses miteinander verglichen. Das beste Verhältnis lieferte
die 1: 250-Verdünnung mit einem W ert von 449, das schlechteste die 1: 5000Verdünnung. Hier fiel der W ert auf 31 ab. Da die Verdünnung von 1: 1000 ebenfalls
einen akzeptablen W ert lieferte, wurde sie für die weiteren Experimente ausgewählt.
Verdünnung des Antikörpers
resultierendes Signal-Rausch-Verhältnis
1: 250
449
1: 500
367
1: 1000
199
1: 2500
62
1: 5000
31
Tab. 20.2: Ermittlung der optimalen Antikörperverdünnung.
(fixe Substratkonzentration 30 nM).
Anschließend wurde die optimale Enzymverdünnung experimentell bestimmt. Dazu
wurden unverdünntes GST-PRMT1, eine 1:1-, 1:2-, 1:5, 1:10, 1:20- und eine
140
1:50-Verdünnung getestet. Als Substratkonzentration wurden 30 nM Peptid, als
Antikörperverdünnung eine 1:1000 Verdünnung eingesetzt. W ie aus der folgenden
Abbildung ersichtlich ist, zeigt eine Verdünnung von 1:10 die größte Aktivität. Alle
weiteren Experimente wurden daher mit dieser Verdünnung ausgeführt.
90000
cps
80000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
Abb. 20.3: Bestimmung der optimalen PRMT1-Verdünnung.
Abb. 20.4: Schematische Darstellung des homogenen T estsystems für PRMT 1.
141
20.2.2 Testung von AMI-1, Allantodapson und Stilbamidin
Im Folgenden wurden exemplarisch die bereits als PRMT1-Inhibitoren identifizierten
Verbindungen Stilbamidin und Allantodapson getestet. AMI-1 wurde auch hier als
Vergleichsubstanz eingesetzt. Sie wurde zunächst in zwei Konzentrationen, 10 und
50 µM vermessen. 10 µM AMI-1 inhibierten PRMT 1 zu 86,19 %. Bei 50 µM zeigte
sich
ein
Signalquenching,
d.h.
das
Signal
wurde
unter
das
Signal
der
Negativkontrolle (keine enzymatische Umsetzung durch fehlendes Kosubstrat)
gedrückt. Eine weitere Messung bestätigte den für 10 µM erhaltenen W ert, für eine
Konzentration von 0.05 µM AMI-1 wurde eine inhibitorische Aktivität von 14,39 %
erhalten. Da es sich bei der DMSO-Lösung von AMI-1 um eine gefärbte Flüssigkeit
handelt, muss anscheinend auch hier von einer Interferenz mit dem AlphascreenSystem ausgegangen werden, die sich insbesondere bei höheren Konzentrationen
bemerkbar macht. Anschließend wurden für Stilbamidin und Allantodapson IC50Bestimmungen durchgeführt. Für Stilbamidin ergab sich ein IC50-W ert von 46,5 ± 5,5
µM, für Allantodapson wurde ein IC50 von 2,3 ± 0,6 µM erhalten. Der IC50 für AMI-1
wurde mit 4,9 ± 0,3 µM bestimmt. Die W erte sind somit mit denen im heterogenen
Assay für PRMT1 erzielten vergleichbar.
Substanzbezeichnung
IC50 an hPRTM1
IC50 an hPRTM1
Heterogenes Testsystem
Homogenes Testsystem
AMI-1
1,2 ± 0,5 µM
4,9 ± 0,3 µM
Allantodapson
1,7 ± 0,04 µM
2,3 ± 0,6 µM
Stilbamidin
57,0 ± 3,3 µM
46,5 ± 5,5 µM,
Tab. 20.3: Vergleich der IC50-Werte an PRMT1.
(heterogenes und homogenes T estsystem).
142
AMI-1
Stilbamidin
100
Inhibiti on hPRMT1 (% )
Inhibiti on hPRMT1 (% )
100
75
50
25
0
10 -1
10 0
10 1
10 2
75
50
25
0
10 0
10 1
10 2
10 3
c( µM)
c( µ M)
Allantodapson
Inhi bition hPRMT1 (% )
100
75
50
25
0
10 -2
10 -1
10 0
10 1
10 2
c( µ M)
Abb. 20.5: IC50-Bestimmungen im homogenen T estsystem für PRMT 1.
20.2.3 Fazit der Entw icklung eines homogenen Testsystems für
Methyltransferasen
Es ist hier gelungen,
nach dem heterogenen Assay zusätzlich ein homogenes
Testsystem für Methyltransferasen zu etablieren. Der Vorteil gegenüber dem
ebenfalls in dieser Arbeit entwickelten heterogenen Aufbau liegt in der Zeitersparnis.
Durch den W egfall diverser Pipettier- und W aschschritte reduziert sich die Dauer des
einzelnen Experiments. Durch die Entwicklung des Assays für das 384-W ell-Format
können zusätzlich mehr Substanzen pro Experiment untersucht werden. Dieser
Miniaturisierungsschritt ist zusätzlich mit einer Kostenreduzierung verbunden.
W ie aus Tabelle ersichtlich ist, sind die ermittelten IC50-Bestimungen mit denen im
heterogenen Ansatz vergleichbar. Daher sollte, insbesondere für automatisierte d.h.
roboterunterstützte Screeningprojekte dem homogenen Ansatz der Vorzug gegeben
werden. Störende Interferenzen wurden bei dem Einsatz farbiger Verbindungen in
143
höheren Konzentrationen (ab 50 µM), wie z.B. AMI-1 beobachtet. Es kam hier zu
einem sog. „Quenchingeffekt“, d.h. das erhaltene Signal lag noch unter dem für das
nicht umgesetzte Peptid. Bei einem Screening sollte also die Testkonzentration
unterhalb 50 µM liegen. Die Lichtempfindlichkeit der Beads stellt die einzige
„logistische“ Herausforderung des Testsystems dar, sollte aber durch einen mit
Chromagreenfolie ausgestatteten Arbeitsplatz kein Problem darstellen.
144
21. Untersuchungen an Histon demethylierenden Enzymen
W ie bereits im Einleitungskapitel erwähnt, wurden im Rahmen dieser Arbeit auch
Enzyme bzw. Zellextrakte mit demethylierender Aktivität untersucht. Ziel war es
hierbei neue Enzymquellen zu erschließen und T estplattformen für diese zu
erstellen. Die theoretischen Überlegungen bzgl. der einzelnen
Systeme wurden in
den Methyltransferase-Kapiteln aufgeführt und gelten auch für die folgenden
Abschnitte.
22. Androgen-Reportergen-Assay für LSD1
Um für ein mögliches Screening über Positivkontrollen der LSD1-Inhibition zu
verfügen, wurden ausgewählte Verbindungen im Reportergentestsystem untersucht.
293-Zellen wurden mit Androgenrezeptor-abhängigen Reportern in Anwesenheit des
AR-Expressionsplasmids transient transfiziert. Schüle et al. wiesen nach, das die
Co-Expression von LSD1 und AR zu einer starken ligand-abhängigen Aktivierung
eines Maus Mammary Tumor Virus (MMTV)-Luziferase-Reporters führte180. Eine
Aktivierbarkeit verwandter Steroidhormonrezeptoren durch LSD1 konnte nicht
nachgewiesen werden, es scheint sich um eine selektive Stimulation zu handeln. Es
wurde weiterhin experimentell bewiesen, dass dafür bereits die AminoxidaseDomäne des LSD1 ausreicht. Da die Entfernung repressiver Histonmodifikationen
durch LSD1 die AR-abhängige Genexpression steigert, sollten LSD1-Inhibitoren die
AR-Aktivität reduzieren181.W ie bereits in Kapitel 5.2 erläutert, wurde die Substanz
Tranylcypromin als Inhibitor der LSD1 beschrieben133. Zusätzlich wurden von uns die
Verbindungen Moclobemid und Rasagilin untersucht. Aufgrund ihrer zusätzlichen
Beeinflussung der MAO-A/MAO-B stellen sie aber keine idealen Verbindungen dar.
Die Substanz A34 wurde in unserem Arbeitskreis synthetisiert.
145
Testsubstanz
A34
Moclobemid
Testkonzentration
Aktivie rung
Reduzierung um
(M)
Androgenrezeptor (AR)
Faktor
0
55,0-fach
10
-3
2,6-f ach
21,2
10
-4
4,8-f ach
11,5
10 -5
19,4-fach
2,8
0
8,7-f ach
-3
6,3-f ach
1,4
10 -4
8,2-f ach
1,1
16,0-fach
0,5
10
10
Rasagilin
Tranylcypromin
-5
0
10,9-fach
10
-3
1,7-f ach
6,4
10
-4
3,0-f ach
3,6
10 -5
4,3-f ach
2,5
0
8,9-f ach
10
-3
3,7-f ach
2,4
10
-4
4,8-f ach
1,9
10
-5
10,3-fach
0,9
Tab. 22.1: Einfluss der T estsubstanzen auf die Aktivierbarkeit des AR.
22.1 Disskussion der Ergebnisse
Lediglich bei A34 war eine signifikante Reduzierung der Aktivierbarkeit des
Androgenrezeptors zu erkennen. Begründbar wäre dieses mit der Tatsache, dass bis
auf A34 alle untersuchten Verbindungen als MAO-Hemmer eingesetzt werden. Da
sich LSD1 und MAO A bzw. B in ihrer Struktur unterscheiden133, wäre dies eine
mögliche Erklärung für Unterschiede in der W irkpotenz. A34 hingegen könnte als
mögliche Leitstruktur bei der Entwicklung von Inhibitoren der LSD1 dienen.
Aufgrund dieser Ergebnisse wurde A34 im zellbasierten T estsystem und mittels der
W estern-Blot-Technik weiter charakterisiert.
146
23. Untersuchung von A34 mittels der Western Blot-Methode
In der vorliegenden Arbeit wurde die W estern-Blot-Methode genutzt, um die im invitro Testsystem als LSD1-Inhibitor identifizierte Verbindung auf ihre Aktivität in
Zellen zu überprüfen. Ein Einfluss auf den Methylierungsgrad an Lysin3 im Histon H4
sollte auf Proteinebene nachgewiesen werden. Für die Experimente wurden HepG2Zellen verwendet. A34 wurde jeweils in den Konzentrationen 1 mM, 100 µM und 10
µM als DMSO-Lösung getestet und verblieb für 24 h auf den Zellen.
23.2 Ergebnisse der Western Blot-Untersuchungen
Nach Aufarbeitung der Zellen und anschließender Proteindetektion konnten folgende
Resultate erhalten werden:
ein Einfluss auf die Histonmethylierung an Lysin 4 im
Histon H3 konnte für alle 3 T estkonzentrationen festgestellt werden. Bei den mit
Testsubstanz behandelten Zellen war eine Steigerung des Methylierungsgrads im
Vergleich zur DMSO-Kontrolle zu beobachten. Am deutlichsten, und damit auch
visuell sichtbar fiel der Effekt für die Konzentration 1 mM aus.
Die
densitometrische
Auswertung
der
mit
Testsubstanz behandelten
Zellen
resultierte in den folgenden prozentualen Zunahmen des Methylierungsgrads: 279 %
Zunahme
des
Methylierungslevels
bei
1
mM,
37
%
Zunahme
des
Methylierungslevels bei 100 µM und 30 % Zunahme des Methylierungslevels bei
10 µM. Zur Ermittlung der der prozentualen Zunahme waren die erhaltenen Banden
mit der Bande verglichen worden, die von den DMSO-behandelten Zellen stammte.
Alle Banden waren zuvor jeweils auf den tatsächlichen Histon H3-Gehalt normalisiert
worden.
147
Abb. 23.1: Ergebnisse der Western Blot Untersuchungen.
Die obere Bande eines jeden Paares stellt das Ergebnis der Inkubation mit Anti-DimethylHistone H3(Lys4)-Antikörper dar. Bei der unteren Bande wurde das Ergebnis durch Färbung
mit Anti-Histon H3-Antikörper erhalten. Diese Bande diente zur Kontrolle der jeweils
aufgetragenen Proteinmenge.
24. Zellbasiertes Testsystems für Demethylasen
Das zellbasierte Testsystem sollte prinzipiell auch zur Detektion von DemethylaseInhibitoren geeignet sein. Bei aktiven Verbindungen wäre eine Steigerung des
Methylierungsgrads im Vergleich zur Kontrolle zu erwarten. Die im W estern Blot und
in transienten Transfektionen als Demethylase-Inhibitor identifizierte Substanz A34
zeigte im Cellisa-Testsystem (zur Theorie s. Kap. 15 Entwicklung eines zellbasierten
Testsystems für Methyltransferasen) keine Aktivität. Die Testung wurde auch hier an
HepG2-Zellen durchgeführt. Für die Transfektionen eingesetzte 293-Zellen erwiesen
sich als ungeeignet, da sich diese schlecht fixieren ließen und durch die wiederholten
W aschschritte aus den Kavitäten der Mikrotiterplatte entfernt wurden.
Die getesteten Konzentrationen an A34 waren 150-25 µM. Die Zellen wurden 24 h
bzw. 72 h mit Substanz inkubiert. Da LSD1 spezifisch Lysin 4 im Histon H3
demethyliert, wurde der Methylierungsgrad dieser Modifikationsstelle bestimmt.
148
Reduzierung des Methylierungsgrads
(%)
Steigerung des Methylierungsgrads
(%)
24 h Inkubation
100
75
50
25
0
-25
(µM)
72 h Inkubation
100
75
50
25
0
c(µM)
Abb. 24.1: Testung von A34 als potentiellem LSD1-Inhibitor.
Ergebnisse nach 24- und 72- stündiger Inkubation.
24.1 Diskussion der Ergebnisse
Beide Inkubationen zeigten unerwartete Ergebnisse. Nach 24-stündiger Inkubation
war zwar ein Anstieg des Methylierungsgrads zu beobachten, dieser verhielt sich
jedoch nicht
dosisabhängig.
Nach
72-stündiger
Inkubation
war
sogar
eine
Reduzierung des Methylierungslevels zu sehen.
25. Entwicklung eines heterogenen Testsystems für Demethylasen
Da bei der Verwendung von Zellextrakten als Enzymquelle ein höheres Risiko
störender Interaktionen besteht, als bei der Verwendung isolierter Enzyme, wurde
zur Untersuchung der Zellextrakte ein heterogener Testsystemaufbau gewählt.
Analog zur Detektion methylgruppenübertragender Enzyme beruhte auch dieses
Testsystem
auf
der
Fixierung
des
biotinylierten
Substrats
an
streptavidinbeschichteten Kavitäten. Die Detektion der Substratumsetzung erfolgte
auch hier antikörperbasiert, wobei der sekundäre Antikörper analog zu den anderen
heterogenen Testsystemen ebenfalls
ein Europiumlabel besaß, was wiederum die
Vorteile der zeitaufgelösten Fluoreszenzdetektion bot.
149
Als Substrat wurde ein biotinyliertes Peptid verwendet, welches dem Histon H3 in
den Aminosäuren 1-21 identisch war. Dieses Peptid war an der 4. Aminosäure
(Lysin) dimethyliert und entsprach somit dem von LSD1 akzeptierten Substrat.
Der primäre Antikörper, ein im Kaninchen generierter IgG, richtete sich gegen die
dimethylierte Form des Histonpeptids. Der verwendete sekundäre Antikörper richtete
sich gegen die Kaninchen IgG-Fraktion. Analog zu den bereits beschriebenen
Testsystemen wurden auch hier streptavidinbeschichtete 96-W ell-Mikrotiterplatten
verwendet. Im Gegensatz zum heterogenen Testsystem für Methyltransferasen
ergab sich hier das höchste Detektionssignal bei Nichtumsetzung des Substrats, also
bei Inhibition der enzymatischen Aktivität.
Abb. 25.1: Schematische Darstellung des heterogenen T estsystems.
25.1 Bestimmung der optimalen Verdünnung an primärem Antikörper
Im folgenden Experiment wurde die günstigste Konzentration an primärem Antikörper
untersucht.
Als
Antikörper
wurde
Anti-Dimethyl-Histon H3(Lys4)-Kaninchen-IgG
verwendet. Von den getesteten Verdünnungen 1:250, 1:500, 1:1000, 1:2500,
1:5000 und 1:10.000 ergaben die Verdünnungen bis zu 1:5000 vergleichbar gute
Ergebnisse.
150
Rel at ive
Fluor ezenzein heit en
(RFU)
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
Verdünnung des Anti-Dimethyl-Histon H3 (Lys4)
Kaninchen-IgG Antikörpers
Abb. 25.2: Bestimmung der optimalen Konzentration an primärem Antikörper.
25.2 Bestimmung der optimalen Verdünnung an sekundärem Antikörper
Bei der Konzentrationsermittlung des sekundären Antikörpers wurde ebenfalls eine
Verdünnungsreihe im Bereich von 1:500-1:10000 erstellt. Es zeigte sich, dass die
Verdünnungen bis 1:5000 gleich gute Signal-Rauschverhältnisse ergaben. Dies lässt
den Schluss zu, dass nur eine begrenzte Zahl von sekundären Antikörpern an die
sandwichartige Struktur aus Streptavidin, biotinyliertem Substrat und primärem
Antikörper binden konnte.
Abb. 25.3: Bestimmung der optimalen Konzentration an sekundärem Antikörper.
151
26. Demethylaseaktivität in Zellextrakten
Im Rahmen dieser Arbeit wurde auch die Möglichkeit der Gewinnung von Enzymen
mit Demethylaseaktivität aus Zellextrakten untersucht. Rekombinantes LSD1 stand
zu der Zeit noch nicht im Arbeitskreis zur Verfügung.
26.1 Demethylaseaktivität in Rattenleberextrakten
Aufarbeitung von Rattenleber
1974 wurde die Aufreinigung von Epsilon-Alkyllysinase (offizieller Name: N(6)methyl-Lysine Oxidase) aus Rattenleber bzw. -niere erstmals von Paik und Kim
beschrieben.
Das Enzym wird als identisch mit Histondemethylase angesehen und
katalysiert unter Sauerstoffverbrauch die Umsetzung von 6-N-Methyl-L-lysin bzw.
6-N-Dimethyl-L-lysin zu L-lysin und Formaldehyd. Den Beobachtungen zufolge steigt
die Expression an Epsilon-Alkyllysinase mit zunehmendem Alter einer Ratte an und
erreicht kurz vor dem Erwachsenenalter mit ca. 8 W ochen den maximalen W ert. Die
Expression von Protein-Methylase III (Phenol-O-methyltransferase) verhält sich
gegenläufig, hier wird die größte Aktivität im juvenilen Stadium festgestellt77.
Das in der obigen Literatur beschriebene Enzymaufreinigungsprotokoll wurde in der
vorliegenden Arbeit genutzt, um eine mögliche Enzymquelle aus Rattenleber zu
erschließen.
Das
Protokoll
beinhaltete
die
Extraktion
enzymatisch
aktiver
Proteinlösungen und anschließende Reinigung über eine Sephadex-G 200-Säule.
26.2 Bestimmung der Aktivität der einzelnen Fraktionen
Der von Paik und Kim eingesetzte Assay zur Bestimmung der Demethylaseaktivität
basiert auf der Verwendung einer radioaktiven Messmethodik. Daher wurde für die
vorliegende Arbeit nach einer alternativen Bestimmungsmethode gesucht. W ie oben
erwähnt, entsteht bei der Umsetzung von 6-N-Monomethyl-L-lysin Formaldehyd. Ein
Nachweis von freiem oder abspaltbarem Formaldehyd ist mit Chromotropsäure durch
die
Chromotropsäure-Reaktion
Methylbenzothiazolonhydrazon
möglich.
oder
Außerdem
ist
Fuchsinschwefliger
ein
Nachweis
Säure
mit
(Schiffsches
Reagenz) möglich. Das Europäische Arzneibuch lässt bei der Grenzprüfung auf
152
Formaldehyd Acetylaceton zugeben, und die Tiefe der entstandenen Färbung mit
einer Referenz vergleichen. Die in dieser Arbeit verwendete Bestimmungsmethode
nach Nash basiert ebenfalls auf der Reaktion von Formaldehyd mit Acetylaceton181.
Hier reagiert Formaldehyd in Gegenwart überschüssigen Ammoniumsalzes zum
Kondensationsprodukt 3,5-Diacetyl-1,4-dihydrotoluidin, dass bei 415 nm fotometrisch
vermessen werden kann.
O
O-
O
O
+
NH4 +
H
H
O
- H2O
N
H
Abb. 26.1: Prinzip der Formaldehydbestimmung nach Nash (Hantzsch-Reaktion).
Die Bestimmung der Enzymaktivität erfolgte als Bestimmung des Formaldehyds. Zur
Vergleichbarkeit wurde eine Kalibrationsreihe mit 10 µmol-0 µmol zugespiktem
Formaldehyd erstellt.
Abb. 26.2: Kalibrationsreihe 10- 0 µmol Formaldehyd /Küvette.
Die erhaltenen Absorptionswerte der beiden Proben waren mit den gemessenen
W erten für die
1
µmol
Kalibrationslösung
vergleichbar.
Eine
enzymatische
Umsetzung des Substrats durch Rattenleberextrakt war somit detektierbar. Eine
stärkere Aktivität wäre jedoch wünschenswert gewesen. Die schwache Aktivität
könnte
durch
den
Erhitzungschritt
begründet
sein,
der
Bestandteil
des
153
Aufreinigungsprotokolls ist. Hier wird die Suspension für 6 min. auf 55 °C erhitzt, was
lt. Literatur mit einem Verlust der ursprünglich detektierbaren Aktivität einhergeht77.
Ein weiterer Grund für die schwache Aktivität könnte sein, dass Rattenleber als
Ausgangsmaterial verwendet wurde. Paik und Kim berichten, dass in der Niere
erwachsener Ratten die gefundene Demethylaseaktivität höher war. Ein erneuter
Aufreinigungsversuch unter Verwendung von Rattenniere ist für weitere Arbeiten auf
dem Gebiet der Histon-Demethylasen geplant.
26.3 Demethylaseaktivität in Tumorzellen
Als Alternative zur Enzymgewinnung aus tierischen Geweben wurde die Möglichkeit
der Gewinnung von Enzymen mit Demethylaseaktivität aus Tumorzellen untersucht.
Als
Ausgangsmaterial
standen
HeLa-Zellen,
293-Zellen,
U2OS-Zellen
(Osteosarkomzelllinie) und NIH 3T3-Zellen (murine Fibroblasten) zur Verfügung.
26.4 Aufarbeitung von Tumorzellen
Das Aufreinigungsprotokoll sah eine Reihe von Zentrifugationsschritten und die
Behandlung mit Puffern unterschiedlicher Salzkonzentration vor.
Ausgangsvolumen für die Aufreinigung waren 900 ml HeLa-Zellen mit einer
Konzentration von 106 Zellen/ ml.
26.5 Aktivitätsbestimmung der erhaltenen Fraktionen
Die einzelnen Fraktionen wurden auf ihre demethylierende Aktivität am Histon H3
Lys 4 untersucht.
154
70000
60000
RFU
50000
40000
30000
20000
10000
0
Abb. 26.3: Umsetzung des Substratpeptides durch Zellextrakte.
2 h Inkubation, T = 37 °C.
ZE = zytosolischer Extrakt, NS = nukleosolischer Extrakt, NE = nukleärer Extrakt
Die Umsetzung des Substratpeptides erfolgte lediglich bei HeLa-Zellen durch
zytosolischen Extrakt, nukleosolischen Extrakt und nukleären Extrakt 100 mM sowie
beim zytosolischen Extrakt der 293-Zellen. Bei den Hela-Zellen konnte eine
Abnahme der enzymatischen Aktivität im Bereich der nukleären Extrakte beobachtet
werden. Je höher die Konzentration an NaCl war, desto geringere Aktivität wurde
detektiert. Für die nachfolgenden Untersuchungen wurde der nukleosolische Extrakt
aus HeLa-Zellen verwandt. Es wurde zunächst eine Versuchsreihe mit absteigenden
Mengen an Extrakt durchgeführt.
155
60000
50000
RFU
40000
30000
20000
10000
0
Abb. 26.4: Umsetzung des Substratpeptides.
Unterschiedliche Mengen Extrakt, 2 h Inkubation, T = 37°C.
Da auch 1 µl Extrakt eine fast vollständige Umsetzung des Substrats bewirkte,
wurden Verdünnungen des Extrakts im Bereich von 1:10- 1:50 getestet. Ziel war es,
die enzymatische Umsetzung des Substrats in einem Bereich zu detektieren, der im
Bereich der Anfangsgeschwindigkeit der Enzymreaktion lag. Als Inkubationszeit
wurde 1,5 h gewählt.
60000
50000
RFU
40000
30000
20000
10000
0
Abb. 26.5: Umsetzung des Substratpeptides.
Unterschiedliche Verdünnungen, 1.5 h Inkubation, T = 37°C.
156
26.6 Untersuchung von Inhibitoren
Als Folgeexperiment wurde die Möglichkeit der Inhibierung der enzymatischen
Aktivität durch die etablierten MAO-Hemmer Pargylin und Rasagilin sowie durch A34
untersucht.
Die
Inhibitionsexperimente
verliefen
analog
zu
den
Aktivitätsbestimmungen, beim Enzymreaktionsschritt wurden neben dem Zellextrakt
5µl Inhibitorlösung in die Kavitäten pipettiert. Da die Substanzen als Lösungen in
DMSO vorlagen, wurde auch der Einfluss reinen DMSOs untersucht. Die
Hemmwirkung von reinem DMSO lag jedoch unter 10 %.
Substanzbezeichnung
c (µM)
Inhibition des Zellextraktes ( %)
Pargilin
400
20,6 %
300
13,6 %
150
6,9 %
300
53,3 %
150
42,8 %
50
30,3 %
300
56,8 %
150
23,7 %
50
14,5 %
Moclobemid
A34
Tab. 26.1: Inhibierung enzymatischer Aktivität durch MAO-Hemmer und A34.
26.7 Disskussion der Ergebnisse
Es zeigte sich, dass recht hohe Konzentrationen an Inhibitor nötig waren, um die
Aktivität des Enzyms deutlich zu senken. Ein Grund dafür könnte sein, dass das
Enzym im Zellextrakt nicht in reiner Form vorliegt. Eine Beinflussung durch andere
Proteine ist denkbar. Es ist deshalb geplant, den
nukleosolischen Hela-Zellextrakt
über eine Sephadex-G-200-Säule chromatographisch aufzureinigen.
157
27. Entwicklung eines homogenen Testsystems für LSD1
Eine weitere Anwendung der AlphaScreen-Technik bestand in der Entwicklung eines
Testsystems für Histon-Demethylasen, im speziellen für LSD1. Dieses Enzym besitzt
eine Substratspezifität für dimethyliertes Lysin, welches sich in Position 4 im Histon
H3
befindet
und
vermag
das
Substrat
zum
Monomethyllysin
bzw.
zum
unmodifizierten Lysin umzusetzen67. Da für ein geplantes robototerunterstütztes
Screening die Assayplattform möglichst einfach gehalten werden sollte, wurde ein
homogenerTestaufbau gewählt.
Bei der Testsystementwicklung wurden analog zum homogenen MethyltransferaseAssay die optimalen Substrat- und Antikörperkonzentrationen bestimmt.
Als Substrat wurde biotinyliertes Dimethyllysin 4 Histon H3 eingesetzt, als Antikörper
fand ein im Kaninchen generierter monoklonaler IgG-Antikörper Verwendung. Dieser
erkannte
die
dimethylierte
Form
des
Substrats.
Analog
zum
homogenen
Methyltransferase-Assay wurden streptavidinbeschichtete Donorbeads und Protein
A-beschichtete Akzeptorbeads genutzt. Das Testformat war somit ebenfalls ein
indirektes. Maximales Signal ergab sich hier jedoch bei Nichtumsetzung des
Substrats. Das finale Assayvolumen betrug 25 µl, die Konzentration an Donor- und
Akzeptorbead jeweils 20 µg/ml.
27.1 Ermittlung der optimalen Substrat- und Antikörperkonzentrationen
Bei der Ermittlung der optimalen Substratkonzentration wurden zunächst finale
Konzentrationen zwischen 100 und 0,1 nM vermessen. Als Antikörperkonzentration
wurde
zunächst
eine
Verdünnung
von
1:
1000
gewählt.
Das
beste
Signalrauschverhältnis lieferte hierbei eine Substratkonzentration von 50 nM. Diese
wurde in den weiteren Experimenten eingesetzt.
158
Konzentration an biotin. Substrat (nM)
Resultierendes Signal-Rausch-Verhältnis
100
668
75
688
50
783
25
545
10
247
5
143
1
28
0,1
3
Tab. 27.1: Ermittlung der optimalen Substratkonzentration.
(fixe Antikörperverdünnung: 1: 1000).
Als Antikörperverdünnungen wurden anschließend Verdünnungen von 1:500- 1:5000
getestet. Als optimal erwies sich eine Verdünnung von 1:1000.
Antikörperverdünnung
Resultierendes Signal-Rausch-Verhältnis
1/500
265
1/1000
407
1/2500
289
1/5000
299
Tab. 27.2: Ermittlung der optimalen Antikörperverdünnung.
(fixe Substratkonzentration 30 nM).
Danach wurde eine Kalibration im Bereich 50-0 nM Dimethyllysin 4 Histon H3 Peptid
durchgeführt.
Abnehmende
Dimethylpeptidkonzentrationen
resultierten
in
abnehmenden Signalintensitäten. Eine enzymatische Umsetzung des Substrats z.B..
durch LSD1 sollte somit messbar sein.
159
500000
cps
400000
300000
200000
100000
0
50.0 40.0 30.0 20.0 10.0 5.0 1.0 0.5 0.0
Dimethyl-Histone H3(Lys4) Peptid
c(nM)
Abb. 27.1: Graphische Darstellung der resultierenden Signalintensitäten.
(abnehmende Substratkonzentrationen).
Eine geeignete Enzymquelle stand jedoch zum Zeitpunkt der Testsystementwicklung
nicht zur Verfügung. Verwendetes His-LSD1 zeigte keine enzymatische Aktivität; es
ist geplant, die Experimente mit aufgereinigten Zellextrakten weiterzuführen.
160
28. Zusammenfassung und Ausblick
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein heterogenes Testsytem für die ArgininMethyltransferase PRMT1 entwickelt. Dieses ermöglichte es, die Aktivität des
Enzyms ohne radioaktive Reagenzien zu bestimmen. Das T estsystem zeichnete sich
durch Robustheit sowie ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis aus. Durch seinen
modulartigen Aufbau war die Ausdehnung auf andere Arginin-Methyltransferasen wie
RmtA und Lysinmethyltransferasen wie SET7/9 und G9a leicht zu bewerkstelligen.
Mit Hilfe dieses Testsystems wurden potentiell inhibitorisch wirkende Verbindungen
auf ihre Aktivität gegenüber PRMT1 untersucht. Diese Verbindungen wurden durch
unseren Kooperationspartner in einem sog. „Target-basierten Screening“ aus zum
Teil sehr umfangreichen Substanzbibliotheken „herausgefiltert“. Es wurden nur
Verbindungen ausgewählt, die neben einer hohen Inhibierungswahrscheinlichkeit
(ausgedrückt
in
einem
hohen
Gold-Score)
auch
mit
dem
entwickelten
Pharmakophormodell übereinstimmten.
Da hPRMT1 nur in begrenzter Menge zur Verfügung stand, wurden orientierende
Testungen am homologen RmtA aus Aspergillus nidulans durchgeführt. Sowohl für
RmtA als auch für hPRMT1 wurde eine recht hohe T refferrrate erzielt. Dies kann
mehrere Gründe haben. Zum einen wurden Substanzen (bzw. deren Analoge)
getestet, für
die
im PRMT1-Modell
eine
hohe
Inhibierungswahrscheinlichkeit
prognostiziert wurde. Da zu Beginn dieser Arbeit keine spezifischen Inhibitoren der
PRMT1 bekannt waren, wurden zunächst recht hohe Konzentrationen im Assay
eingesetzt. W ährend der Durchführung des Screenings zeigte sich jedoch bald, dass
neben mittelpotenten Substanzen (IC50 ~ 30 µM), auch höherpotente Verbindungen
(IC50 < 10µM) gefunden wurden. Desweiteren kann nicht ausgeschlossen werden,
dass die Hemmung einiger Verbindungen auf unspezifischen Effekten beruhte. Das
PRMT1-Modell selber war zu Beginn auf seine Funktionstüchtigkeit überprüft
worden: vier vom Modell als an PRMT1 inaktiv gekennzeichnete Verbindungen
wurden auf ihre Aktivität an RmtA und hPRMT1 getestet. An beiden Enzymen zeigte
sich keine inhibitorische Aktivität der Verbindungen.
Um
die
Trefferrrate
einzugrenzen
und
gleichzeitig
Informationen
über
die
Zellgängigkeit der Verbindungen zu erhalten, wurden die potentesten Verbindungen
in einem ELISA-artigen zellbasierten Testsystem untersucht. Ein solcher zuvor für
161
Histonacetyltransferasen beschriebener Assay wurde im Rahmen dieser Arbeit
modifiziert
und
erstmals
angewandt.
für
Untersuchungen
des
Histonmethylierungslevels
Hierbei zeigte sich, dass nur bei wenigen Substanzen die
Zellgängigkeit/ W irkpotenz ausreichend hoch war, um einen inhibierenden Einfluss
auf den Methylierungsgrad zu erzielen. Die hierbei notwendigen Konzentrationen
waren größer als in den in-vitro-Experimenten. Hierfür können mehrere Gründe
angeführt werden: mangelnde Zellgängigkeit der Substanzen, metabolische Aktivität
der Leberzellen sowie unspezifische Bindungen an andere Proteine.
Neben
dem
zellbasierten
Testsystem
wurden
W estern-Blot-Experimente
durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass identische Konzentrationen an Inhibitor im
zellbasierten
ELISA-Assay
bereits
eine
vollständige
Reduzierung
des
Methylierungsgrads ergaben, während im W estern-Blot nur eine partielle Reduktion
beobachtet werden konnte. W ie gut die Korrelation zwischen der neuentwickelten
und der etablierten Methode ist, muss durch weitere Experimente geklärt werden.
Da für PRMT1 co-aktivierende Eigenschaften bezüglich nukleärer Rezeptoren
nachgewiesen
wurden,
wurden ausgewählte Verbindungen
jeweils
in einem
Estrogen- und Androgen-Reportergenassay untersucht. Im Estrogen-ReportergenAssay zeigte sich, das nur die Substanzen Allantodapson und Stilbamidin neben der
Referenzsubstanz AMI-1 über das Potential verfügten, die estrogenvermittelte
Rezeptoraktivierung zu blockieren. Somit konnte die anfangs recht hohe Trefferrrate
zugunsten auch funktionell aktiver Verbindungen deutlich reduziert werden.
O
O
O
O
H2 N
O
N
N
H
NH
S
N
O
NH2
NH
H
2
NH
Stilbamidin
Allantodapson
Abb. 28.1: Die im Estroge n-Re portergen-As say aktiven Verbindungen.
Allantodapson und Stilbamidin.
Die
Selektivitätstestungen an
zwei
Lysinmethyltransferasen
ergaben,
dass
Allantodapson und AMI-1 in-vitro auch über inhibitorische Aktivität an SET 7/9
162
verfügten, während Stilbamidin selektiv für PRMT 1 ist. G9a wurde von keiner
Testsubstanz signifikant gehemmt.
Neben der in-vitro- und zellbasierten Testung wurde in dieser Arbeit auch ein in-vivo
Testsystem
am
Modellorganismus
Gallus
gallus
entwickelt.
Mittels
immunhistochemischer Methoden und dem Aufbringen der Testsubstanzen auf
Acrylamidbeads konnte erstmalig ein Einfluss auf die Arginin-Methylierung in
Hühnerembryonen durch einen Hemmstoff (Stilbamidin) nachgewiesen werden.
Allantodapson
und
AMI-1
zeigten
keinerlei
Aktivität
unter
den
gewählten
Bedingungen. Eventuell wurden die beiden Stoffe nicht von den Acrylamidbeads
aufgenommen.
Nachdem Ende 2004 das erste histondemethylierende Enzym, LSD1, entdeckt
wurde, wurden die experimentellen Arbeiten auch auf dieses Gebiet ausgedehnt.
Hier standen die Entwicklung von Testsystemen sowie die Erschließung von
Enzymquellen
aus
Aktivitätsbestimmung
Tumorzellen/
der
tierischem
Enzymextrakte
Gewebe
wurde
ein
im
Vordergrund.
heterogenes
Zur
Testsystem
entwickelt. Mit Hilfe dieses Systems wurden anschließend einige als Inhibitoren der
MAO A/B beschriebene Verbindungen und eine in unserem Arbeitskreis entwickelte
experimentelle Substanz auf
ihre
inhibitorische Aktivität hin untersucht.
Die
Verbindungen hatten zuvor in einem Androgen-Reportergen-Assay ihre funktionelle
Aktivität bewiesen. Es zeigte sich, dass der aus HeLa-Zellen gewonnene Extrakt
durch die eingesetzten Inhibitoren in seiner Aktivität gehemmt werden konnte. Als am
potentesten erwies sich hierbei die neue Testsubstanz.
Da die heterogenen Testsysteme relativ zeit- und arbeitsaufwändig waren, wurden
sowohl für PRMT1 als auch für LSD1 homogene in-vitro-Assays entwickelt. Diese
stellen z.B. bei „Hochdurchsatz“-Screenings eine Alternative zu den heterogenen
Systemen dar, sind allerdings auch störanfälliger (Quenching duch gefärbte
Substanzen).
Es wird folgende Vorgehensweise zur
zukünftigen
Charakterisierung neuer
Hemmstoffe vorgeschlagen:
1. Virtuelles Screening bzw. Verwendung abgewandelter Leitstrukturen
2. In-vitro-Testung am entsprechenden Enzym
3. Testung im zellbasierten ELISA-Assay und auf Proteinebene (W estern Blot)
4. Funktionelle Testung (Reportergen-Assays)
5. eventuelle in-vivo-Testung am Hühnerembryo
163
Abschlier..end lass!
sich sagen, dass
durch die in dieser Arbeit
Testsysteme W erkzeuge zur lnhibitorsuche
prasentierten
fUr PRMT1 und LSD1 zur Verfligung
stehen.
164
Methodenteil
29. Methoden zur Entwicklung des in-vitro Testsystems
(Histonmethyltransferasen)
29.1 Verw endete Geräte und Materialien
1,5 ml Reaktionsgefäße (Eppendorf)
Columbus Plattenwascher (Tecan)
Immobilizer Streptavidin C8 96-W ell-Mikrotiterplatten (Nunc)
Titramax 1000, Inkubator 1000 (Heidolph)
BSA Fraktion V, 99%, Proteasefrei (Sigma)
DMSO (Merck)
Enhancementlösung (PerkinElmer)
Glycerol 80 % (Merck)
Hepes (Merck)
KCl (Merck)
MgCl 2 (Merck)
NaCl (Merck)
S-(5′-Adenosyl)-L-Methionin p-Toluensulfonatsalz, gewonnen aus mit
L-Methionin angereicheter Hefe, ≥80% (Sigma)
Tris Base (Roth)
TRIS-HCl (Roth)
Tween 20 (Merck)
Enzyme :
•
GST- RmtA (AG Brosch Innsbruck)
•
GST-hPRMT1 (AG Brosch Innsbruck)
•
GST-G9a (AG Jenuwein, W ien)
165
•
SET7/9 (Biotrend)
Enzymreaktionspuffer:
•
RmtA/hPRMT1: pH 8,0 15 mM TRIS-HCl, 10 mM NaCl,
0,25 mM EDTA-Dinatriumsalz, 10 % Glycerol 80%,
1 mM 2-Mercaptoethanol
•
SET7/9: pH 8,5 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT (frisch)
•
G9a: pH 8,5 50mM T ris HCl , 10 mM DTT
Tris-Inkubationspuffer pH7,5: 100 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween-20
W aschpuffer: 100 mM Trispuffer, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20; pH 7.5
•
biotinyliertes Histon H3-Peptid (Upstate) für G9a, SET7/9
•
biotinyliertes Histon H4-Peptid (Upstate) RmtA/ hPRMT 1
Primäre Antikörper:
•
hPRMT1/RmtA: Anti-Dimethyl-Histon H4(Arg3), Kaninchen IgG, polyklonal
(Upstate)
•
SET7/9:
Anti-Monomethyl-Histon H3(Lys4),
Kaninchen
IgG,
polyklonal
(Upstate)
•
G9a: Anti-Dimethyl-Histon H3(Lys9), Kaninchen IgG, polyklonal (Upstate)
Sekundärer Antikörper: Anti-Kaninchen IgG, Europiumgelabelt (PerkinElmer)
166
29.2 Durchführung der Experimente
Beschichtung der Kavitäten
Eine Lösung des Histonpeptids in W aschpuffer wurde in jede Kavität der Mikrotiterplatte gefüllt, so dass die Konzentration an Histonpeptid/ Kavität 20 pmol betrug.
Das Füllvolumen der Platte betrug hier und bei allen folgenden Inkubationsschritten
100 µl. Die Platte wurde 1 h bei 30°C geschüttelt. Danach wurde der nichtgebundene
Anteil an Peptid durch sechsmaliges W aschen der Kavitäten mit W aschpuffer
entfernt. Mit dem letzten W aschschritt wurden die Kavitäten leergesaugt.
Enzymreaktion
Neben 90 µl Enzymreaktionspuffer wurden 5 µl Enzymlösung und 5 µl einer 800 µM
S-Adenosylmethioninlösung in die Kavitäten gefüllt.
In vier Kavitäten wurde nur Enzymreaktionspuffer gefüllt, diese Kavitäten dienten als
Substratkontrolle (Negativkontrolle) bzw. als Blank (keine nachfolgende Inkubation
mit Antikörper). Die Platte wurde für 1 h bei 37 °C inkubiert. Danach wurden die
Kavitäten sechsmal gewaschen. Mit dem letzten W aschschritt wurden die Kavitäten
leergesaugt.
Inkubation mit primärem Antikörper
Alle Kavitäten wurden mit einer 1:1000 Verdünnung des 1. Antikörpers in
Tris-
Inkubationspuffer befüllt und bei 37 °C 1 h lang inkubiert. Danach wurden die
Kavitäten sechsmal gewaschen. Mit dem letzten W aschschritt wurden die Kavitäten
leergesaugt.
Inkubation mit sekundärem Antikörper
Alle Kavitäten bis auf zwei wurden mit 100 µl einer 1:5000 Verdünnung des 2.
Antikörpers in Inkubationspuffer befüllt und bei 37 °C 1 h lang inkubiert. Die zwei
167
ausgesparten Kavitäten wurden mit Inkubationspuffer befüllt. Es folgte ein
Inkubationsschritt für 1 h bei 37 °C.
Danach wurden die Kavitäten sechsmal gewaschen. Mit dem letzten W aschschritt
wurden die Kavitäten leergesaugt.
Alle Kavitäten wurden mit 100 µl Enhancementlösung befüllt und 5 min unter
leichtem Schütteln inkubiert. Anschließend erfolgte die Signalauslesung bei
340/ 615 nm.
Die Inhibitionsexperimente
verliefen
analog
den
Aktivitätsexperimenten,
beim
Enzymreaktionsschritt wurden neben dem Zellextrakt 5 µl Inhibitor in die Kavitäten
pipettiert.
Für die kinetischen Untersuchungen wurde folgender Ansatz gewählt:
während die Konzentration an biotinyliertem Histon H4-Peptid jeweils pro Kavität 20
pmol betrug, variierte die zugegebene Menge an S-Adenosylmethionin zwischen 32
und 0,8 µM. RM-65 wurde in den Konzentrat 0, 10, 25 und 50 µM getestet. Es
wurden für jeden Reaktionsansatz 1/ v0 sowie 1/ [S] berechnet und gegeneinander
aufgetragen.
168
RM65-III (µM)
S-Adenosylmethionin (µM)
1/ v0
1/ [S]
0
32
0,61217589
0,03125
0
16
0,63171247
0,0625
0
8
0,69838817
0,125
0
4
0,7788658
0,25
0
0,8
1,97840749
1,25
10
32
1,00200401
0,03125
10
16
1,25344698
0,0625
10
8
1,5595758
0,125
10
4
2,20848057
0,25
10
0,8
7,34922509
1,25
25
32
1,35135135
0,03125
25
8
2,39693193
0,125
25
4
4,36300175
0,25
25
0,8
12,5313283
1,25
50
32
0,79164028
0,03125
50
16
1,87265918
0,0625
50
8
3,5971223
0,125
50
4
5,94530321
0,25
50
0,8
15,1975684
1,25
Tab. 29.1: Reziproke Initialgeschwindigkeiten/ Substratkonzentrationen.
(variierende Inhibitor- und Kosubstratkonzentrationen).
169
30. Durchführung der Western Blot-Untersuchungen für PRMT1Inhibitoren
30.1 Verw endete Geräte und Materialien
1,5 ml Reaktionsgefäße (Eppendorf)
6-W ell-Microtiterplatte, steril (Greiner)
Entwicklungsmaschine 3000 RA (Kodak)
Nitrozellulosemembran (W hatman)
Photoschalen
Quantity One 1-D Analysis Software (Bio-Rad)
Ultraschallbad Sonorex RH100 (Bandelin)
Röntengenfilm M6-404 (Kodak)
Scanner LiDE 70 (Canon)
W hatman-Blotting-Papiere (W hatman)
Zentrifuge 5417C (Eppendorf)
Zellabstreifer (Greiner)
Zellophanfolie
BSA Fraktion V, 99%, Proteasefrei (Sigma)
DMSO (Merck)
DTT (Merck)
Eisessig (Merck)
Glycin (Sigma)
KH2PO4 (Merck)
2-Mercaptoethanol (Calbiochem)
Methanol (Merck)
Na2HPO4 (Merck)
Ponceau S (Sigma)
SDS (Merck)
Tris Base (Roth)
Triton X-100 (Merck)
Tween- 20 (Merck)
DMEM, 10 % FCS
170
Anodenpuffer I: 30 mM Tris, 20 % Methanol
Anodenpuffer II: 300 mM T ris, 20 % Methanol
Blockierungspuffer: 5 g BSA/ 100 ml PBS
Kathodenpuffer: 25 mM Tris, 40 mM Aminocapronsäure, 20 % Methanol
Laufpuffer: 25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0.1 % SDS
Lysepuffer: 9.8 mM K2HPO4, 0.92 mM KH2PO4, pH 7.8, 0.2 % Triton X-100,
1 mM DTT
PBS-Puffer pH 7,2: 140 mM NaCl, 10 mM KCl, 6,4 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4
PBS-Puffer mit 0,5 % T ween-20 und 5 % BSA PBSPuffer mit 0,05 % Tween-20 und 5 % BSA Ponceaurot
S-Lösung: 0.1% Ponceaurot, 1% Eisessig
Probenpuffer: 2 % SDS, 62.5 mM Tris-HCl, 10 % Glycerol, 5 % Mercaptoethanol,
0,01 % Bromphenolblau, pH 6.8
Sammelgelpuffer: 125 mM Tris-HCl, 0.1 % SDS, pH 6.8
5 x SDS-Ladepuffer: 0,25 M Tris-HCl pH 6,8, 10 % SDS, 50 % Glycerin 80%,
0,5% Bromophenolblau
Strippinglösung: 5 ml Tris pH 6,8, 5 ml 20 %-iges SDS,350 μl 2-Mercaptoethanol,
45 ml bidest. W asser
Trenngelpuffer: 375 mM T ris-HCl, 0.1 % SDS, pH 8.8
Enhancent Luminol Reagent Plus Kit (PerkinElmer)
Prestained Protein Marker, 6-175kDa (New England Biolabs)
Primäre Antikörper:
Anti-Dimethyl-Histon H4(Arg3), Kaninchen IgG, polyklonal (Upstate)
Anti-Histon H4, Kaninchen IgG, polyklonal (Upstate)
Sekundärer Antikörper: Anti-Kaninchen IgG, HRP-Label (Sigma)
30.2 Durchführung des Western-Blot-Experiments
Je 2.5 ml HepG2-Zellsuspension der Konzentration 105 Zellen/ ml wurden in die
Kavitäten einer 6-W ell-Microtiterplatte ausgesät und 24 h bei 37 °C inkubiert. Das
verbrauchte Medium wurde vorsichtig abgesaugt und durch neues ersetzt. 25 µl
171
Testsubstanz, gelöst in DMSO, wurden zugegeben. Die Platte wurde vorsichtig
geschüttelt, um eine optimale Verteilung der Testsubstanz im Medium zu erreichen.
Als Kontrolle wurden 25 µl reines DMSO eingesetzt, dies entsprach einer
Konzentration von 1 % DMSO im Medium.
Nach 72 h bei 37 °C wurde das Medium abgesaugt. Die Zellen wurden in 500 µl
eiskaltem PBS resuspendiert und unter Zuhilfenahme eines Zellabstreifers in 1,5 ml
Reaktionsgefässe überführt. Die Reaktionsgefässe wurden bei 4 °C und 2500 rpm
für zwei min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 50
µl
Lysepuffer resuspendiert. Die Zellen wurden anschließend durch 30-sekündige
Behandlung im Ultraschallbad geöffnet. Die Reaktionsgefässe verblieben für 10 min
auf Eis, gefolgt von einem Zentrifugationsschritt bei 4 °C und 14.000 rpm für 10 min.
5 µl des Überstands wurden für die anschließende Analyse verwandt und in ein
neues Reaktionsgefäss überführt, das restliche Lysat wurde bei -20 °C gelagert.
Zu den 5 µl Lysat wurden 4 µl eines fünffach konzentrierten SDS-Ladepuffers und
11 µl PBS gegeben. Die Proben wurden 5 min bei 99 °C im Heizblock erhitzt und zur
Auftrennung auf ein Polyacrylamidgel geladen.
Um eine optimale Auflösung der Proteine zu erhalten, wurde ein zweischichtiges Gel
verwandt.
Das
Trenngel
besaß
einen
pH-W ert
von
8,8
und
eine
Polyacrylamidkonzentration von 15 %, das sogenannte Sammelgel wies einen pHW ert von 6,8 bei einer Polyacrylamidkonzentration von 5 % auf. In die erste T asche
des Gels wurden 10 µl des Molekulargewichtsmarkers, der bereits vorgefärbt war
und ohne Zugabe von SDS-Ladepuffer verwandt werden konnte, gefüllt. Die
Elektrophoresekammer wurde mit Laufpuffer befüllt. Der Gelkammerdeckel wurde
aufgesetzt und die Elektrophorese wurde gestartet. Ausgangsbedingungen waren:
35 mA pro Gel, 1,5 h Laufzeit; der Blaumarker erreichte in dieser Zeit das untere
Ende des Gels. Nach Beendigung der Gelelektrophorese wurde das für den
W estern-Blot vorgesehene Gelstück aus der Halterung genommen, mit dest. W asser
abgespült und in eine Photoschale gegeben, die Anodenpuffer 2 enthielt. Ebenfalls
wurden zwei W hatman-Blotting-Papiere in diese Schale gelegt. In eine weitere
Schale, die mit Anodenpuffer 1 gefüllt war, wurden 4 Papiere gelegt, in eine dritte
Schale wurde genügend Kathodenpuffer für sechs Papiere gegeben. In die Schale
mit Anodenpuffer 2 wurde zusätzlich eine Nitrozellulosemembran gelegt. Bei
Vorliegen mehrerer Gele wurde die Anzahl der Papiere/ Membranen entsprechend
erhöht. Nachdem die Papiere durchtränkt waren, wurden sie sandwichartig,
172
beginnend mit den Anodenpuffer 1-Papieren, auf der Anodenseite der Blotkammer
angeordnet. Gefolgt
von der Nitrozellulosemembran wurden die Anodenpuffer-2
Papiere und danach das Gel aufgelegt. Die Kathodenpuffer-Papiere bildeten den
Abschluss. Die einzelnen Schichten wurden jeweils luftblasenfrei aufgelegt. Die
Kammer wurde geschlossen und der Versuch wurde gestartet (68 mA/ Gel, Laufzeit:
1 h 10 min. Nach erfolgtem Blotten wurde die Membran aus der Blotkammer
genommen und 1 min lang mit 10 ml Ponceau S-Lösung gefärbt. Die Membran
wurde anschließend mit dest. W asser gewaschen, bis aller überschüssige Farbstoff
entfernt worden war und die reversibel gefärbten Proteinbanden sichtbar wurden. Die
Banden des Markers wurden mit Kugelschreiber vorsichtig markiert. Die Membran
wurde danach 1 h lang bei Raumtemperatur in PBS-Puffer, welcher 0,5 % Tween-20
und 5
% BSA enthielt,
unter
Schütteln
inkubiert,
um alle
unspezifischen
Proteinbindungsstellen zu blockieren. Realisiert wurden dieser sowie alle weiteren
Inkubationsschritte in einem verschließbaren 50 ml Zentrifugengefäß.
Anschließend erfolgte die spezifische Anfärbung mittels primärem und sekundärem
Antikörper. Diese wurden in den vom Hersteller empfohlenen Verdünnungen
eingesetzt. Die Verdünnungen wurden jeweils in PBS-Puffer mit 0,5 % Tween und
5 % BSA erstellt. Die Membran wurde 1 h lang bei Raumtemperatur unter Schütteln
mit der primären Antikörperlösung inkubiert. Danach erfolgte ein viermaliges
W aschen für je 5 min mit je 20 ml PBS-Puffer, der 0,05 % T ween-20 enthielt. Die
Inkubation mit sekundärem Antikörper, welcher im Esel generiert und gegen
Kaninchen IgG gerichtet war, wurde als 1: 5000-fache Verdünnung in PBS-Puffer mit
0,05 % T ween und 5 % BSA für 1 h unter Schütteln bei Raumtemperatur verwirklicht.
Viermaliges W aschen für je 5 min mit 20 ml PBS-Puffer, der 0,05 % Tween-20
enthielt, entfernte den nicht gebundenen Anteil an sekundärem Antikörper. W ährend
des letzten W aschschritts wurde der anschließende Detektionsschritt vorbereitet: je
200 µl aus den beiden Gefäßen des Enhancent Luminol Reagent Plus Kits wurden
auf einem Stück Zellophanfolie gemischt. Die Membran wurde dem Zentrifugengefäß
entnommen und mit der Vorderseite auf die Detektionslösung gelegt und unter
kreisenden Bewegungen für 1 min darin belassen. Die Membran wurde entnommen
und in eine lichtundurchlässige Kassette gelegt. In der Dunkelkammer wurde
anschließend ein Film auf die Membran gelegt und für 1 min darauf belassen.
Anschließend wurde der Film in einem Prozessor entwickelt.
173
Für die anschließende Bestimmung der auf der Membran befindlichen Histonmenge
wurden die gebundenen Antikörper wieder von der Membran entfernt. Dazu wurde
die Membran in ein verschließbares 50 ml Zentrifugationsgefäß gelegt und in einer
Lösung für 30 min bei 50 °C im W asserbad erhitzt. Anschließend wurde die
Membran viermal mit 20 ml PBS 0,05 % gewaschen.
Die Membran wurde danach 1 h lang bei Raumtemperatur in PBST 0,5 %, welcher
5 % BSA enthielt unter Schütteln inkubiert, um unspezifische Bindungsstellen
abzusättigen. Die nachfolgenden Schritte verliefen analog zur beschriebenen
Inkubation mit primärem/ sekundärem Antikörper und nachfolgender Detektion. Statt
eines
spezifischen
Antikörpers
wurde
jedoch
ein
Kaninchen
IgG-Antikörper
verwendet, welcher gegen unmodifiziertes Histon gerichtet war. Die Verdünnung
richtete sich wieder nach den Angaben des Herstellers.
Nach erfolgter Filmentwicklung wurden bei beiden Filmen die relevanten Banden,
mittels eines Scanners erfasst und als TIFF-Dateien im Auswerteprogramm Quantity
One 1-D Analysis Software
weiterbearbeitet. Die Banden wurden in ihrer Größe/
Intensität erfasst und normalisiert, d.h. auf die tatsächliche Menge an Histonprotein
bezogen. Durch den anschließenden Vergleich mit den Kontrollbanden konnte die
prozentuale
Abnahme
bzw.
Zunahme
des
modifikationsspezifischen
Signals
errechnet werden.
30.3 Testung der PMRT1-Inhibitoren Allantodapson und Stilbamidin
Für die Testung der PMRT-Inhibitoren wurden in die Kavitäten zweier Sechs-W ellPlatten Zellen ausgesät. Von den beiden Testsubstanzen Allantodapson und
Stilbamidin, sowie der Vergleichssubstanz AMI-1 wurden 15,15 mM DMSOStammlösungen hergestellt. Für die höchste Testkonzentration von 150 µM wurden
25 µl direkt entnommen, für die Konzentrationen von 50 und 25 µM wurden DMSOVerdünnungen erstellt, die das 101-fache der gewünschten finalen Konzentration
darstellen. Die ersten 3 Kavitäten waren für die Kontrollen C1- C3 vorgesehen, in die
anderen wurden je 25 µl Testlösung pipettiert. Jede Konzentration jeder Substanz
wurde als Einfachbestimmung vermessen.
Das Experiment wurde nach oben beschriebenem Protokoll durchgeführt. Als
primärer Antikörper wurde ein polyklonaler Kaninchen-IgG-Antikörper eingesetzt,
welcher gegen Dimethyl-Arginin in Position 3 des Histons H4 gerichtet war. Die
174
verwendete Verdünnung betrug 1: 1000. Für die Gesamthistonbestimmung wurde
Anti-Histon H4-Kaninchen-IgG in einer Verdünnung von 1: 2000 eingesetzt.
31. Methoden zur Entwicklung des zellbasierten Testsystems für
Methyltransferasen
31.1 Verw endete Geräte und Materialien
96-W ell-Polystyrol Mikrotiterplatten, steril (Greiner Bio-One)
Brutschrank INCO2 (Memmert)
Heidolph Titramax 1000 und Inkubator 1000
Plattenreader Polarstar (BMG)
VV3 Vortexer (VW R)
BSA Fraktion V, 99%, Proteasefrei (Sigma)
DMSO, 99.8% (Fluka)
Glutardialdehydlösung 25 % (Merck)
KCl (Merck)
KH2PO4 (Merck)
NaCl (Merck)
Na2HPO 4, wasserfrei (Merck)
Paraformaldehyd (Merck)
Tris-HCl (Roth) Tris
Base(Roth) Triton X100 (Merck)
BCA-Protein Kit (Pierce)
BSA-Lösung: 5 mg BSA/ 100 µl PBS-Puffer pH 7.2
Enhancementlösung (PerkinElmer)
Fixierlösung: 4 % Paraformaldehyd, 0,25 % Glutardialdehydlösung 25 %,
0,25 % T riton X-100
PBS-Puffer pH 7,2: 140 mM NaCl, 10 mM KCl, 6,4 mM Na2HPO4, 2 mM KH 2PO 4
175
Tris-Inkubationspuffer pH7,5: 100 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween-20
HepG2-Zellen
Primäre Antikörper:
•
PRMT1: Anti-Dimethyl-Histon H4(Arg3), Kaninchen IgG, polyklonal (Upstate)
•
SET7/9:
Anti-Monomethyl-Histon H3(Lys4),
Kaninchen
IgG, polyklonal
(Upstate)
Sekundärer Antikörper: Anti-Kaninchen IgG, Europiumgelabelt (PerkinElmer)
31.2 Durchführung
Zu Beginn des Experiments wurden HepG2-Zellen in DMEM aufgenommen und auf
eine Konzentration von 105 Zellen/ ml gebracht. Je 100 µl der Zellsuspension wurden
in die Kavitäten einer 96-W ell-Mikrotiterplatte pipettiert.
Nach 24-stündiger Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2 wurde das Medium abgesaugt.
Um eine gleichmäßige Verteilung der Testsubstanz im Medium zu gewährleisten,
wurde die jeweilige in DMSO gelöste Verbindung mit 100 µl Medium gemischt und
danach in die jeweilige Kavität pipettiert. Als Kontrollsubstanz diente reines DMSO; in
den W ells, die für die Positivkontrolle und den Blank vorgesehen waren, befand sich
reines Medium. Nach Zugabe aller Komponenten verblieben die Zellen für 72 h bei
37 °C und 5 % CO2. Danach wurde das Medium entfernt und je 100 µl Fixierlösung
wurde in die einzelnen Kavitäten gegeben. Diese verblieb für 30 min bei 37 °C auf
den Zellen. Nach sechsmaligem W aschen mit PBS-Puffer pH 7,2 (je 300 µl) wurden
je 100 µl einer 5 % BSA-Lösung (in PBS) eingefüllt. Diese wurde ebenfalls für 30
min auf den Zellen belassen. Nach einem weiteren W aschritt wurde eine 1: 2000
Verdünnung des primären Antikörpers hergestellt, je 100 µl wurden in die einzelnen
Kavitäten pipettiert. Die Mikrotiterplatte wurde 1 h bei 37° C inkubiert, danach wurde
der nicht gebundene Anteil durch sechsmaliges W aschen (s.o) entfernt. Die Aufgabe
des
sekundären
Inkubationspuffer.
Antikörperlösung
Antikörpers
Nach
durch
erfolgte
einstündiger
einen
als
1:
Einwirkzeit
5000
bei
Verdünnung
37
abschließenden W aschschritt
°C
in
T ris-
wurde
entfernt.
die
100
µl
Enhancement Solution wurden in jedes W ell pipettiert und nach zehnminütigem
Schütteln bei Raumtemperatur und niedriger Intensität bei 340 /615 nm vermessen.
176
Anschließend wurde der Proteingehalt der einzelnen Kavitäten bestimmt. Hierzu
wurde eine modifizierte BCA-Methode angewandt. Lösung A und Lösung B wurden
im Verhältnis 50:1 gemischt. Je 100 µl dieser Lösung wurden in die Kavitäten gefüllt.
Die Mikrotiterplatte wurde für 30 min bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde die
Absorption bei 570 nm vermessen. Eine mit BSA-Lösungen im Bereich von
2.000- 25
µg/
Abschließend
ml
erstellte
wurden
die
Kalibrationsreihe
diente
der
Methodenkontrolle.
auf
die
Absorptionssignale
Fluoreszenzsignale
normalisiert.
Für die Untersuchungen an Lysin 4 im Histon H3 wurden als primärer Antikörper
Anti-Monomethyl-Histon
H3(Lys4)-Kaninchen-IgG,
für
die
Untersuchungen
an
Arginin 3 im Histon H4 Anti-Dimethyl-Histon H4(Arg3)-Kaninchen-IgG verwendet. Als
sekundärer
Antikörper
wurde
Europiumgelabelter
Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper
eingesetzt.
32. Methoden des Androgen-Reportergen-Assays für PRMT1
32.1 Verw endete Geräte und Materialien
12-W ell Polystyrolplatten, steril (Greiner)
96-W ell-Mikrotiterplatten, durchsichtig (Greiner)
96-W ell-Mikrotiterplatten, weiß (Greiner)
1,5 ml Reaktionsgefäße (Eppendorf)
15 cm Petrischalen, steril (Greiner)
Brutschrank INCO2 (Memmert)
Luminometer L9507 (Bertold)
Zentrifuge 5417C (Eppendorf)
BES: N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure (Sigma)
CaCl2 (Merck)
DMSO (Fluka)
R1881 (Sigma)
FCS (Sigma)
Na2HPO 4, wasserfrei (Merck)
177
KH2PO4 (Merck)
2,5 M CaCl2-Lösung: 277,45 g/ 1l Bidestilliertes W asser
DMEM, 10 % dsFCS
PBS-Puffer pH 7,2: 140 mM NaCl, 10 mM KCl, 6,4 mM Na2HPO4, 2 mM KH 2PO 4
Luziferase-Reagenz (Promega)
Phenolrot-freies DMEM, mit 10 % ds FCS
Proteinassay-Lösung (Bio-Rad)
Reporter Lyse Puffer (Promega)
Trypsin/ EDTA-Lösung: 0.5 g/l Trypsin, 0.2 g/l EDTA•4Na
Reporter Lyse Puffer (Promega)
Luziferase-Reagenz
(Promega)
Proteinassay-Lösung (Bio-Rad)
Plasmide: MMTV-luc Reporter-Promotorkonstrukt, pSG5AR(0)-Plasmid, puc18
HEK 293-Zellen
32.2 Durchführung
Die 293-Zellen wurden für die Experimente in DMEM mit 10 % FCS als
Monolayerkulturen in 15cm Petrischalen
bei 37 °C und 5
% CO2
im
Gewebekulturbrutschrank vermehrt. Sobald die Zellen nahezu Konfluenz erreicht
hatten, wurde das Medium abgesaugt und die Zellen wurden vorsichtig mit 5 ml PBS
gewaschen. Es folgte eine Behandlung mit 3-5 ml T rypsin/EDT A für 2-5 Minuten im
Brutschrank. Dadurch lösten sich die Zellen ab. Durch Zugabe von frischem Medium
wurden die Zellen 1: 5 bis 1: 10 gesplittet und in neue Petrischalen überführt. Für die
Transfektionsexperimente wurden 1x 10
5
Zellen pro Kavität einer 12-W ell-Platte
ausgesäht. Nach 24 h Kultur hatten sich die Zellen angeheftet und das Medium
wurde erneuert. Im Gegensatz zur Anzucht der Zellen erfolgte die Aussat der Zellen
hier in Phenolrot-freiem DMEM, welchem 10 % zweifach über Aktivkohle gereinigtes
FCS (ds FCS) zugefügt wurde. Die Transfektion erfolgte bei ca. 60% Konfluenz. Vor
Beginn der Transfektion wurde das Medium abgesaugt und durch neues ersetzt. Es
178
wurde zunächst ein sog. Mastermix aus 18 µg (1 μg/µl) MMTV-luc ReporterPromotorkonstrukt, AR-Plasmid (0,05 µg/µl) und puc18 (1 µg/µl) sowie 810,9 µl
bidestilliertem H2O
hergestellt.
Davon wurden je 106 µl in 8
Eppendorff-
Reaktionsgefäße pipettiert. Anschließend wurden pro Reaktionsgefäß 42 μl CaCl2Lösung (2,5 M) und tropfenweise unter Vortexen 168 μl 2 × BES zugegeben. Nach
20 min. Inkubation bei Raumtemperatur gebildeten feinen Präzipitat wurden 80
µl/W ell vorsichtig auf die Zellen pipettiert. Die Zellen wurden für 6 h bei 37 °C und 5
% CO2 im Brutschank aufbewahrt. Danach wurde das nun getrübte Medium entfernt,
die Zellen wurden vorsichtig mit je 1 ml PBS gewaschen, anschließend wurde die
Hälfte der Kavitäten mit 1 ml DMEM 10 % ds FCS neu gefüllt. Die andere Hälfte
bekam je 1 ml mit R1881 versehendes DMEM 10 % ds FCS. Die Konzentration an
R1881 betrug 10
Stimulation
des
-10
M. Durch Zugabe des synthetischen Liganden wurde eine
ARerreicht.
Anschließend
der Testsubstanzen in den Konzentrationen 4 · 10
-5
erfolgte
die
M und 8 · 10
-6
Zugabe
M. Nach 20-
stündiger Inkubation im Brutschrank wurde das Medium entfernt, jedes W ell wurde
vorsichtig je zweimal mit PBS gewaschen. Danach wurden je 50 µl Reporter Lyse
Puffer
zu jedem W ell gegeben. Nach 10 min wurden die Zellen in 1,5 ml
Rektionsgefäße überführt, 2 min bei 14.000 rpm zentrifugiert, danach wurden je 10 µl
des
Überstands
in
eineweiße
96-W ell
Mikrotiterplatte
überführt.
Die
Luziferaseaktivität im Zelllysat wurde unverzüglich im Luminometer bestimmt. Das
dazu notwendige Luziferase-Reagenz wurde automatisch vom Gerät hinzugegeben.
(100µl Reagenz/ W ell). Die Luziferaseaktivität wurde auf den Proteingehalt der Probe
normalisiert.
Die
Proteinbestimmung
wurde
in
durchsichtigen
96-W ell-
Mikrotiterplatten durchgeführt. Dazu wurden je 3 µl Probe mit 25 µl Bio-Rad
Proteinassay-Lösung und 100 µl H2O in die Kavitäten der Platte pipettiert und bei
595 nm im Absorptionsmodus vermessen.
179
33. Entwicklung eines in-vivo-Testsystems für
Methyltransferase-Inhibitoren
33.1 Verw endete Geräte und Materialien
5 cm-Petrischalen (Greiner Bio-One)
Brutschrank Vomo3 (Schuhmacher)
Deckgläser (VW R)
Einwegspritze mit 1 ml Kanüle
Gießform aus Metall
Heparin-Acrylamidbeads (Sigma)
Leukosilk® (Beiersdorf)
Metallbox
Mikrotom HM650 VD (Microm)
OP-Set: Pinzette, Schere, W olframnadel, Sieblöffel
Parafilm „M“ (Pechiney)
Porzellantiegel
Silanisierte Objekträger (Merck)
Zellstoff (VW R)
BSA, Fraktion V, 99%, Proteasefrei (Sigma)
DAB (Sigma)
DMSO, 99.8% (Fluka)
100% Essigsäure (Merck)
100 % Ethanol (Merck), daraus erstellte Verdünnungen mit dest. W asser
Entellan® (Roth)
Formaldehyd 37 % (Merck)
Kernechtrot (Merck)
KH2PO4 (Merck)
Methanol 100 % (Merck)
NaCl (Merck)
Na2HPO 4, wasserfrei (Merck)
Nilblausulfat (Merck)
180
Paraffin (Merck)
PBS-Puffer pH 7,2, steril: 140 mM NaCl, 10 mM KCl, 6,4 mM Na2HPO4,
2 mM KH2PO4
Rotihistol
(Roth)
Tris Base (Roth)
W achs (Merck)
W asserstoffperoxidlösung 30 % (Sigma)
BSA-Lösung: 1 mg BSA/ 100 µl PBS-Puffer pH 7.2
DAB-Lösung: 0,1 % DAB und 0,01% H2O2 in TBS
Kernechtrotlösung 0,1 g Kernechtrot/ 100 ml dest. W asser
Nilblausulfatlösung: 0,005 g/ 100 ml dest. W asser
Serra: 60 % Ethanol 100 %, 30 % Formaldehyd 37 %, 10 % Eisessig
TBS pH 7.6: Tris Base 61 g, NaCl 90 g/ 1 l bidestilliertes W asser
Hühnereier
Primärer Antikörper: Anti-Dimethyl-Histon H4(Arg3), Kaninchen IgG,
polyklonal (Upstate)
Sekundärer Antikörper: Peroxidasegelabelter Anti-Kaninchen Antikörper (Sigma)
33.2 Vorbereitung der Acrylamidbeads
Bevor die Beads verwendet wurden, wurden sie dreimal mit PBS-Puffer gewaschen.
33.3 Präparation der Beads
Auf den Boden einer 5 cm-Petrischale mit Deckel wurde ein Stück Parafilm
aufgeklebt. Auf den Parafilm wurde eine kleine Menge Beads gegeben. Die
überschüssige Pufferlösung wurde vorsichtig unter Zuhilfenahme einer Pipette
abgesaugt. Anschließend wurden etwa 10 µl der DMSO-Lösung der betreffenden
Verbindung auf die Beads gegeben. Die Petrischale wurde mit geschlossenem
Deckel 12 h bei 4°C aufbewahrt. Der Rand der Schale wurde innen zusätzlich mit
feuchtem Zellstoff ausgekleidet, um ein Austrocknen der Beads zu vermeiden.
181
33.4 Vorbereitung der Hühnereier
Die Eier wurden 72 h bei 37 °C bebrütet. Nach Entnahme aus dem Brutschrank
wurde jedes Ei durchleuchtet und die Position des Embryos markiert. Anschließend
wurde die Schale mit 70 % Ethanol abgewischt und das Ei wurde in einer Petrischale
fixiert. Am stumpfen Ende des Eis wurde mit einer Pinzette ein Loch gebohrt. Mit
einer Kanüle wurde etwas dünnflüssiger Dotter entnommen. Danach wurde die
Eischale im Bereich der Markierung aufgesägt und entfernt. Die Umrandung der
Markierung mit W achs erleichterte das spätere Arbeiten. Die äußere und innere
Schalenhaut wurden mit Hilfe einer Pinzette abgenommen und es wurde soviel
steriler PBS-Puffer in die Öffnung geträufelt, bis der Embryo sich leicht aus der
Öffnung
wölbte.
Anschließend
Durch
wurde
die W achsschicht
vorsichtig
mit
Hilfe
wurde
von
ein
sterilen
Überlaufen
verhindert.
W olframdrähten
die
Vitellinmembran im Bereich des Embryos aufgetrennt. Ab diesem Schritt war der
Embryo Implantationen zugänglich.
33.5 Implantation der Beads
Mit einer W olframnadel wurde ein Schnitt in Flügel und/ oder Beingewebe gesetzt.
Mit einer Pinzette wurde ein Acrylamidbead in diese Öffnung gesetzt. W enn davon
ausgegangen werden konnte, dass der Bead in dieser Position fest saß, wurde die
Vitellinmembran über den Embryo geschoben. Mit Hilfe einer Spritze wurde etwas
Dotterflüssigkeit wie zuvor beschrieben entnommen, dadurch sackte der Embryo in
das Eiinnere zurück. Es wurden einige Tropfen PBS-Puffer nachgefüllt, anschließend
wurde die Öffnung mit Leukosilkband verschlossen. Das Ei wurde weitere 24 h bei
37 °C bebrütet.
33.6 Fixierung des Embryos
Nach der 24-stündiger Bebrütung wurde der Embryo aus dem Ei entnommen. Dazu
wurde das Leukosilkband entfernt, das Loch mit Hilfe einer Schere vergrößert und
der Embryo mit einem Sieblöffel aus dem Ei gehoben. W ährend der Entfernung
überschüssiger Häute wurde der Embryo in PBS aufbewahrt. Anschließend wurde
der Embryo für 24 h in Serra fixiert. Danach erfolgte die Vorbereitung für
182
Paraffineinbettung. Der Embryo wurde je 15 min unter leichtem Schütteln in 70 %,
80 %, 90 %, je zweimal in 95 % und 100 % Ethanol dehydriert. Danach erfolgte die
Aufbewahrung in Rotihistol (Xylolersatz) über Nacht.
33.7 Paraffineinbettung
Anschließend wurde der Embryo in einen Porzellantiegel gelegt, der Tiegel wurde mit
Paraffin aufgefüllt und 1 h im Ofen bei 50 °C aufbewahrt. Danach wurde der Embryo
in eine Gießform gelegt und mit Paraffin übergossen. Nachdem das Paraffin
abgekühlt war, wurde die Gießform bei 4 °C verwahrt. Am nächsten Tag konnte der
Paraffinblock aus der Gießform genommen werden. Aus dem Block konnten jetzt mit
Hilfe eines Mikrotoms 30 µm-Schnitte erstellt werden, diese wurden auf silanisierte
Objektträger aufgezogen.
33.8 Immunhistochemie
Zur Vorbereitung auf die Antikörperfärbung wurden die Objektträger entparaffiniert.
Dazu wurden sie für je 5 min je viermal in Rotihistol und zweimal in 100 % Ethanol
getaucht. Anschließend wurden sie zur Blockierung von Peroxidasen für 30 min in
Methanol, welcher 0,03 % W asserstoffperoxidlösung 30 % enthielt, belassen.
Anschließend wurden die Objektträger zweimal für 5 min mit PBS gespült. Danach
erfolgte die Präinkubation mit BSA-Lösung (1 % in PBS) für 20 min. Die Objektträger
wurden in eine dampfgesättigte Metallbox gelegt und mit 200 µl der BSA-Lösung
beschichtet. Die silanisierte Oberfläche der Objektträger verhinderte ein Überlaufen.
Danach wurde die BSA-Lösung abgegossen und der 1. Antikörper wurde in einer
Verdünnung von 1:25 aufgegeben. Dieser blieb über Nacht auf dem Objektträger.
Anschließend wurde der Objektträger zweimal für 5 min mit PBS gespült, danach
wurde der zweite Antikörper, ein Peroxidase-gelabelter Anti-Kaninchen-Antikörper in
der
Verdünnung
1:250
aufgegeben.
Die
Inkubationsdauer
betrug
90
min.
Anschließend wurden die Objektträger zweimal für 5 min mit PBS gespült. Danach
wurde der Objektträger für 10 min. in eine frisch hergestellte DAB-Lösung getaucht,
zweimal
kurz
mit
destilliertem
W asser
Kernechtrotlösung für 10 s gegengefärbt.
gespült
und
anschließend
mit
Danach wurde wieder zweimal kurz mit
destilliertem W asser gespült. Abschließend erfolgte die Dehydration durch kurzes
183
Eintauchen in 70 %, 80 %, 90 %, je zweimal in 95 % und 100 % Ethanol sowie in
Rotihistollösung. Danach wurden die Schnitte durch Auflegen eines mit Entellan®
bestrichenes Deckglas dauerhaft fixiert.
33.9 Überprüfung des Einflusses von Stilbamidin auf apoptotische Vorgänge
In zwei Hühnerembryonen wurden wie oben beschrieben Beads implantiert, die mit
75 bzw. 150 µM Stilbamidinlösung getränkt waren. Nach 24 h Inkubation bei 37 °C
wurden die Embryonen aus dem Ei entnommen, alle extraembryonalen Membranen
wurden entfernt. Die Embryonen wurden anschließend für 30 min bei 37 °C in einer
Nilblausulfatlösung inkubiert. Anschließend wurden die Embryonen zweimal mit PBS
gewaschen, auf Eis aufbewahrt und sofort unter dem Mikroskop betrachtet.
34. Entwicklung eines homogenen Testsystems für
Methyltransferasen
34.1 Verw endete Geräte und Materialien
384-W ell Optiplate (PerkinElmer)
Envision 2102 Multilabel Reader (PerkinElmer)
Heidolph Titramax 1000 und Inkubator 1000
Tischlampe mit Chromagreenfolie (Rosco)
Biotinyliertes Histon H4-Peptid (Upstate)
DMSO (Fluka)
EDTA-Dinatriumsalz (Merck)
Glycerol 80% (Roth)
2-Mercaptoethanol (Calbiochem)
NaCl (Merck)
S-(5′-Adenosyl)-L-Methionin p-Toluensulfonatsalz, gewonnen aus mit
L-Methionin angereicheter Hefe, ≥80% (Sigma)
TRIS-HCl (Roth)
184
Alphascreen ® General IgG (Protein A) Detection Kit
AlphaScreen-Detektionspuffer 0,1 M Tris, 0.01% Tween-20, pH 8.0
PRMT1-Reaktionspuffer pH 8,0: 15 mM TRIS-HCl, 10 mM NaCl,
0,25 mM EDTA-Dinatriumsalz, 10 % Glycerol 80%,
1 mM 2-Mercaptoethanol
Anti-Dimethyl-Histon H4(Arg3), Kaninchen IgG, polyklonal (Upstate)
34.2 Bestimmung der optimalen Substratkonzentration
5 µl PRMT1-Lösung (1:5 verdünnt in PRMT1- Enzymreaktionspuffer) wurden
zusammen mit 5 µl biotinyliertem H4-Peptid in den finalen Konzentrationen von 0.1100 nM und 5 µl PRMT1- Enzymreaktionspuffer in die Kavität einer 384-W ellMikrotiterplatte
pipettiert.
Jede
Peptidverdünnung
enthielt
40
µM
S-Adenosylmethionin. Um sicher zu sein, dass das detektierte Signal auf PRMT1Aktivität beruhte, wurde die Kontrollreaktion ohne S-Adenosylmethionin durchgeführt.
Für den Blindwert wurden 15 µl AlphaScreen-Detektionspuffer in eine Kavität gefüllt.
W ährend der enzymatischen Umsetzung (60 min bei 30 °C und unter leichtem
Schütteln) wurde der anschließende Detektionsschritt vorbereitet. Da die Beads eine
gewisse Lichtempfindlichkeit aufwiesen, wurden alle folgenden Pipettierschritte unter
einer
mit
Chromagreenfolie
ausgestatteten
Lichtquelle
durchgeführt.
Zur
Antikörperverdünnung von 1: 1000 in AlphaScreen-Detektionspuffer wurden jeweils
Akzeptor- und Donorbeadlösung zupipettiert, so dass eine finale Beadkonzentration
von je 20 µg/ml resultierte. Dem Detektionspuffer war zuvor soviel BSA frisch
hinzugefügt worden, dass eine finale Konzentration von 0.1 % vorlag.
Die Bead-Antikörper-Mischung wurde 45 min-1 h bei Raumtemperatur im Dunklen
unter leichtem Schütteln inkubiert. Anschließend wurden von dieser Mischung je
10 µl zu den einzelnen Enzymreaktionen, der Negativkontrolle und dem Blindwert
gegeben. Nach einer weiteren Inkubation für 1 h
bei Raumtemperatur und unter
leichtem Schütteln erfolgte die Detektion bei 680/ 570 nm.
185
34.3 Bestimmung der optimalen Antikörperverdünnung
Die Bestimmung der optimalen Antikörperverdünnung verlief von den Arbeitschritten
her analog zur Bestimmung der optimalen Substratkonzentration. Unterschiede
bestanden darin, dass die resultierende Substratkonzentration jetzt fix bei 30 nM für
alle Messpunkte (außer dem Blindwert) lag.
Variabel waren hingegen die
Antikörperverdünnungen, es wurden Verdünnungen von 1:500 – 1:1000 eingesetzt.
Diese Verdünnungen wurden in AlphaScreen-Detektionspuffer erstellt.
34.4 Bestimmung der optimalen Enzymverdünnung
Die Bestimmung der optimalen Enzymverdünnung verlief von den Arbeitschritten her
genau wie die Ermittlung der optimalen Substratkonzentration/ der optimalen
Antikörperverdünnung.
Experimenten
als
Hier
optimal
wurden
ermittelten
jedoch
W erte
die
in
den
vorangegangenen
(Substratkonzentration
30
nM,
Antikörperverdünnung 1:1000) eingesetzt. Als Enzymlösungen wurden unverdünntes
GST- PRMT1, eine 1:1-, 1:2-, 1:5, 1:10, 1:20- und eine 1:50-Verdünnung getestet.
Die Verdünnungen wurden mit PRMT1-Enzyminkubationspuffer hergestellt. Als
Negativkontrolle diente ein Ansatz ohne Kosubstratzugabe, als Blindwert wurde
AlphaScreen-Detektionspuffer eingesetzt.
34.5 Testung von Verbindungen
Die Bestimmung des inhibitorischen Potentials von Verbindungen an hPRMT1 verlief
analog zu den bislang beschriebenen Experimenten. Die Verbindungen wurden als
DMSO-Lösungen eingesetzt. 5 µl GST- PRMT1-Lösung (1: 10 verdünnt in PRMT1Enzymreaktionspuffer) wurden zusammen mit 5 µl biotinyliertem H4-Peptid (finale
Konzentration 30 nM) und 5 µl der DMSO-Lösung der betreffenden Verbindung in die
Kavität einer 384-W ell-Mikrotiterplatte pipettiert. Jede Peptidverdünnung enthielt 40
µM S-Adenosylmethionin. Um sicher zu sein, dass das detektierte Signal auf
PRMT1-Aktivität beruhte, wurde die Kontrollreaktion ohne S-Adenosylmethionin
durchgeführt. Für den Blindwert wurden 15 µl AlphaScreen-Detektionspuffer in eine
Kavität gefüllt. Die enzymatische Umsetzung fand für 1 h bei 30 °C unter leichtem
186
Schütteln statt. Der Detektionschritt wurde wie oben beschrieben vorbereitet und
ausgeführt. Die verwendete Antikörperverdünnung war 1:1000.
35. Methoden des Androgen-Reportergen-Assays für LSD1
35.1 Verw endete Geräte und Materialien
12-W ell Polystyrolplatten, steril (Greiner)
96-W ell-Mikrotiterplatten, durchsichtig (Greiner)
96-W ell-Mikrotiterplatten, weiß (Greiner)
1,5 ml Reaktionsgefäße (Eppendorf)
15 cm Petrischalen, steril (Greiner)
Brutschrank INCO2 (Memmert)
Luminometer L9507 (Bertold)
Zentrifuge 5417C (Eppendorf)
BES: N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure (Sigma)
CaCl2 (Merck)
DMSO (Fluka)
FCS (Sigma)
Na2HPO 4, wasserfrei (Merck)
KH2PO4 (Merck)
R1881 (Sigma)
2,5 M CaCl2-Lösung: 277,45 g/ 1 l Bidestilliertes W asser
DMEM, 10 % FCS
PBS-Puffer pH 7,2: 140 mM NaCl, 10 mM KCl, 6,4 mM Na2HPO4, 2 mM KH 2PO 4
Phenolrot-freies DMEM, mit 10 % ds FCS
Trypsin/ EDTA-Lösung: 0.5 g/l Trypsin, 0.2 g/l EDTA•4Na in Hank's Balanced Salt
Solution mit Phenolrot (Sigma)
Reporter Lyse Puffer (Promega)
187
Luziferase-Reagenz (Promega)
Proteinassay-Lösung (Bio-Rad)
Plasmide: MMTV-luc Reporter-Promotorkonstrukt, AR-Plasmid, puc18, CMX LSD1,
CMX PL2
HEK 293-Zellen
35.2 Durchführung
Die 293- Zellen wurden für die Experimente in DMEM mit 10 % FCS als
Monolayerkulturen
in
15cm
Petrischalen
bei
37
°C
und
5
%
CO2
im
Gewebekulturbrutschrank vermehrt. Sobald die Zellen nahezu Konfluenz erreicht
hatten, wurde das Medium abgesaugt und sie wurden vorsichtig mit 5 ml PBS ohne
Calcium und Magnesium gewaschen. Es folgte eine Behandlung mit 3-5 ml
Trypsin/EDTA für 2-5 Minuten im Brutschrank. Dadurch lösten sich die Zellen ab.
Durch Zugabe von frischem Medium wurden die Zellen 1: 5 bis 1: 10 gesplittet und in
neue Petrischalen überführt.
Für die Transfektionsexperimente wurden 1· 105 Zellen pro Kavität einer 12- W ellPlatte ausgesäht. Nach 24 h Kultur hatten sich die Zellen angeheftet und das
Medium wurde erneuert. Im Gegensatz zur Anzucht der Zellen erfolgte die Aussaat
der Zellen hier in Phenolrot-freiem DMEM, welchem 10 % zweifach über Aktivkohle
gereinigtes FCS zugefügt wurde. Die Transfektion erfolgte bei ca. 60 % Konfluenz.
Vor Beginn der Tansfektion wurde das Medium abgesaugt und durch neues ersetzt.
Es wurden zunächst ein sog. Mastermix aus 18 µg (1μg/µl) MMTV-luc ReporterPromotorkonstrukt, AR-Plasmid (0,05 µg/µl) und puc18 (1 µg/µl) sowie 810,9 µl
bidest. H2O hergestellt. Davon wurden je 106 µl in 8 Eppendorff- Reaktionsgefäße
pipettiert. Zu je 4 Reaktionsgefäßen wurden je 20 µl CMX LSD1 (0.1 µg/µl) bzw.
CMX PL2 (0.1 µg/µl) zupipettiert. Anschließend wurden pro Reaktionsgefäß 42 μl
CaCl2-Lösung (2,5 M) und tropfenweise unter Vortexen 168 μl 2× BES zugegeben.
Vom nach 20 min. Inkubation bei Raumtemperatur gebildeten feinen Präzipitat
wurden 80 µl/ W ell vorsichtig auf die Zellen pipettiert. Die Zellen wurden für 6 h bei
37 °C und 5 % CO2 im Brutschank aufbewahrt. Danach wurde das nun getrübte
Medium entfernt, die Zellen wurden vorsichtig mit je 1 ml PBS gewaschen,
anschließend wurde die Hälfte der Kavitäten mit 1 ml DMEM 10 % ds FCS neu
gefüllt. In die andere Hälfte wurde je 1 ml mit R1881 versehendes DMEM 10% ds
188
FCS gefüllt. Die Konzentration an R1881 betrug 10-10 M. Durch Zugabe des
synthetischen Liganden wird eine Stimulation des AR erreicht. Anschließend erfolgte
die Zugabe der Testsubstanzen in den Konzentrationen 10-3, 10-4, 10-5 M. Nach 20stündiger Inkubation im Brutschrank wurde das Medium entfernt. Es wurden 50 µl
Reporter Lyse Puffer (Promega) zu den Zellen gegeben. Nach 10 min wurden die
Zellen in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt, 2 min bei 14.000 rpm zentrifugiert,
danach wurden je 10 µl des Überstands in eine weiße 96-W ell-Mikrotiterplatte
überführt. Die Luziferaseaktivität im Zelllysat wurde unverzüglich im Luminometer
bestimmt. Das dazu notwendige Luziferase-Reagenz wurde automatisch vom Gerät
hinzugegeben. (100 µl Reagenz/ W ell). Die Luziferaseaktivität wurde auf den
Proteingehalt der Probe normalisiert. Die Proteinbestimmung wurde in durchsichtigen
96-W ell-Mikrotiterplatten durchgeführt. Dazu wurden je 3 µl Probe mit 25 µl Bio-Rad
Proteinassay-Lösung und 100 µl H2O in die Kavitäten der Platte pipettiert und bei
595 nm im Absorptionsmodus vermessen. Die Luziferaseaktivität wurde auf den
Proteingehalt der Probe normalisiert.
189
36. Untersuchung von A34 mittels Western Blot
36.1 Verw endete Geräte und Materialien
s. Kap. 30: Durchführung der W estern Blot-Untersuchungen für PRMT1-Inhibitoren
Primäre Antikörper:
•
LSD1: Anti-Dimethyl-Histon H3(Lys4), Kaninchen IgG, monoklonal (Upstate)
36. 2 Durchführung
Testung der experimentellen Substanz A34
Für die T estung von A34 wurden in die Kavitäten einer 6-W ell-Platte Zellen ausgesät.
Von der Testsubstanz wurde eine 101 mM DMSO-Stammlösung hergestellt. Für die
höchste Testkonzentration von 1 mM wurden 25 µl direkt entnommen, für die
Konzentrationen von 100 und 10 µM wurden DMSO-Verdünnungen erstellt, die das
101-fache der gewünschten finalen Konzentration darstellen. Die ersten 3 Kavitäten
waren für die Kontrollen C1-C3 vorgesehen, in die anderen wurden je 25 µl
Testlösung
pipettiert.
Jede
Konzentration
jeder
Substanz
wurde
als
Einfachbestimmung vermessen.
Das Experiment wurde nach oben beschriebenem Protokoll durchgeführt. Die
Inkubationszeit mit Testsubstanz betrug jedoch nur 24 h. Als primärer Antikörper
wurde
ein
monoklonaler
Kaninchen-IgG-Antikörper
eingesetzt,
welcher
gegen
Dimethyllysin in Position 4 des Histons H3 gerichtet war. Die verwendete
Verdünnung betrug 1: 1000. Für die Gesamthistonbestimmung wurde Anti-Histon
H3-Kaninchen-IgG in einer Verdünnung von 1: 5000 eingesetzt.
190
37. Entwicklung eines zellbasierten Testsystems für Demethylasen
37.1 Verw endete Geräte und Materialien
s. Kapitel 31
Entwicklung eines zellbasierten T estsystems für Methyltransferasen
HEK293-Zellen
Primäre Antikörper:
•
LSD1: Anti-Dimethyl-Histon H3(Lys4), Kaninchen IgG, monoklonal (Upstate)
37. 2 Durchführung
s. Kapitel 31
Entwicklung eines zellbasierten T estsystems für Methyltransferasen
191
38. Methoden zur Bestimmung der Demethylaseaktivität in
Zellextrakten
38.1 Verw endete Geräte und Materialien
15 cm-Petrischale, steril (Greiner)
1,5 ml Reaktionsgefäße (Eppendorf)
ÄKTA Prime (GE Healthcare)
Columbus Plattenwascher (Tecan)
Dry Bath (Abimed)
Immobilizer Streptavidin C8 96-W ell-Mikrotiterplatten (Nunc)
Magnetrührer Mini MR (IKA)
Reagenzgläser 10cm
mit Sephadex G-200 befüllte Säule
Titramax 1000, Inkubator 1000 (Heidolph)
Ultra-Thurax T 25 basic (IKA)
Ultrazentrifuge Optima™ L-XP (Beckman)
Verbandmull, steril
DMEM Medium
Ammoniumacetat (Merck)
(NH4)2SO 4 (Merck)
biotinyliertes Dimethyl Histon H3(Lys4)-Peptid (Upstate)
biotinyliertes Histon H3-Peptid (Upstate)
BSA Fraktion V, 99%, Proteasefrei (Sigma)
CaCl2 (Merck)
Ca-Phosphatgel, 17,6 mg solid/ ml, (Sigma)
Complete Protease Inhibitor Cockail Tabletten (Roche)
DMSO (Merck)
Enhancementlösung (PerkinElmer)
ε-N-Monomethyl-L-lysin (Bachem)
192
Flavin-adenin-dinucleotid (Sigma)
Glycerol 80 % (Merck)
Hepes (Merck)
KCl (Merck)
KH2PO4 (Merck)
MgCl 2 (Merck)
NaCl (Merck)
Na2HPO 4 (Merck)
NP-40 (Sigma)
Phenazinmethosulfat (Fluka)
Saccharose (Merck)
Trichloressigsäure (Merck)
Triton-X-100 (Merck)
TRIS-HCl (Roth)
Tween (Merck)
0,4 % Acetylacetonlösung in bidest. W asser
gesättigte Ammoniumsulfatlösung
5 mM ε-N-Monomethyl-L-Lysinlösung
50 mM ε-N-Monomethyl-L-Lysinlösung
1 mM Flavin-adenin-dinucleotidlösung in bidest. W asser
Hypotonischer Puffer: 20 mM Hepes, pH 7.5, 20 mM NaCl, 5 mM MgCl2
Hypotonischer Puffer (100mM): 20 mM Hepes, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2
Hypotonischer Puffer (250mM): 20 mM Hepes, pH 7.5, 250 mM NaCl, 5 mM MgCl2
Hypotonischen Puffer (450mM): 20 mM Hepes, pH 7.5, 450 mM NaCl, 5 mM MgCl2
Hypotonischen Puffer (650mM): 20 mM Hepes, pH 7.5, 650 mM NaCl, 5 mM MgCl2
Hypotonischer Puffer mit Complete-Tablette: 20 mM Hepes, pH 7.5, 20 mM NaCl
5 mM MgCl2, 1 T ablette Complete/ml
bidest. W asser, je 20 µl/ ml Puffer
Hypotonischer Puffer mit NP-40: 20 mM Hepes, pH 7.5, 20 mM NaCl, 5 mM MgCl2,
0,5% NP-40
LSD1-Reaktionspuffer pH 8,5: 50 mM Tris, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 % BSA,
5 % Glycerol
Nash-Reagenz: 100 g 0,4 % wässr. Acetylacetonlsg, 30,0 g Ammoniumacetat
193
1 % Phenazinmethosulfatlösung in bidest. W asser
0,3 M Phosphatpuffer pH 7.2
5 mM Phosphatpuffer pH 7.2, 10% Glycerol
0,25 M Saccharose-Lösung mit 6 mM CaCl2
0,5 % Triton-X-100-Lösung
W aschpuffer: 100 mM Trispuffer, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20; pH 7.5
Rattenleber
Tumorzellinien: HeLa-Zellen, 293-Zellen, U2OS-Zellen, NIH 3T 3-Zellen
Primärer Antikörper: Anti-Dimethyl-Histon H3(Lys4), Kaninchen IgG, monolyklonal
(Upstate)
Sekundärer Antikörper: Anti-Kaninchen IgG, Europiumgelabelt (PerkinElmer)
38.2 Durchführung für Rattenleber
38.2.1 Aufreinigungsprotokoll
Alle Schritte wurden, wenn nicht anders angegeben, bei 0-3 °C durchgeführt,
Zerkleinerungen und der Transport wurden auf Eis durchgeführt.
5 g Rattenleber wurden in 9-fachem Volumen 0,25 M Saccharose-Lösung, die 6 mM
CaCl2 enthielt, mit Hilfe eines Ultra-Thurax homogenisiert. Das Homogenat wurde
durch doppellagigen sterilen
Verbandmull gefiltert.
Anschließend erfolgte ein
Zentrifugationsschritt bei 39.000 g für 20 min. Der Überstand wurde kühl aufbewahrt,
das Präzipitat wurde mit 20 ml 0,5% Triton-X-100-Lösung 10 min. lang unter Einsatz
des Ultra-Thurax behandelt. Die entstandene Suspension wurde 30 min. bei
39.000 g 30 min. lang zentrifugiert. Zum Überstand wurden 40 ml Ca-Phosphatgel
(17,6 mg solid/ml) gegeben, die Lösung wurde gerührt. Anschließend erfolgte ein
weiterer Zentrifugationsschritt bei 700 g für 5 min. Das Präzipitat wurde zweimal mit
reichlich bidest. H2O gewaschen und in 10 ml 0,3 gesättigte Ammoniumsulfatlösung
aufgenommen. Danach wurde wieder für 10 min. bei 39.000 g zentrifugiert. Zum
Überstand wurde gesättigte Ammoniumsulfatlösung gegeben, wobei das Verhältnis
Ammoniumsulfatlösung : Überstand 6 : 10 betrug. Die Lösung wurde 10 min. gerührt,
194
anschließend für 10 min. bei 39.000 g zentrifugiert. Nach diesem Schritt besteht laut
Literatur die Möglichkeit, das Enzym einzufrieren, die Aktivität soll für 14 Tage
erhalten bleiben.
Das erhaltene Präzipitat wurde in 1,8 ml 5mM ε-N-Monomethyl-L-Lysinlösung gelöst,
die Suspension wurde für 6 min. auf 55 °C erhitzt. Anschließend erfolgte die Kühlung
in Eis. Der nächste Zentrifugationsschritt erfolgte für 20 min. bei 105.000g. Der
erhaltene Überstand wurde auf einer Sephadex G-200-Säule chromatographiert. Die
Säule wurde zuvor mit 5 mM Phosphatpuffer pH 7.2, welcher 10 % Glycerol enthielt
equilibriert. Das Fließmittel, 5 mM Phosphatpuffer pH 7.2; 10 % Glycerol wurde mit
einer Flußrate von 1 ml/ min über die Säule geschickt. Das Volumen der
gesammelten Fraktionen betrug 1 ml.
38.2.2. Bestimmung der Aktivität der gesammelten Fraktionen
Als Inkubationsansatz wurden
200 µl 50 mM ε-N-monomethyl-L-lysin
200 µl 50 mM Phosphatpuffer pH 7.2
100 µl 1 mM Flavin-adenin-dinucleotid (FAD)
100 µl 1 % Phenazinmethosulfatlösung
200 µl Enzymlösung
in ein 1,5 ml Eppendorff-Reaktionsgefäß gegeben und bei 37 °C 2 h lang unter
Schütteln inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,8 ml Trichloressigsäure
beendet. Es folgte ein Zentrifugationsschritt für 5 min. bei 3000 rpm. Als Kontrolle
diente ein Ansatz, der oben aufgeführtem entsprach. Die Enzymlösung war jedoch
zuvor durch Erhitzen bei 100 °C für 10 min. inaktiviert worden. FAD und
Phenazinmethosulfat werden beide als Elktronenakzeptor eingesetzt, wobei FAD den
auch physiologisch vorhandenen Akzeptor darstellt.
Die Bestimmung der Enzymaktivität erfolgte als Bestimmung des Formaldehyds:
Zu je 1 ml nach Proteinfällung und Zentrifugation erhaltenen Überstand wurde 1 ml
frisch zubereitetes Nash-Reagenz (100 g 0.4 % wässr. Acetylacetonlsg, 30.0 g
Ammoniumacetat) gegeben. Die Proben verblieben 30 min. bei 60 °C, danach
195
wurden sie im Eisbad abgekühlt und nach 15 min bei 415 nm gegen die Kontrolle
vermessen. Zur Vergleichbarkeit wurde eine Kalibrationsreihe mit 10 µmol - 0 µmol
zugespiktem Formaldehyd erstellt. Als Matrix diente Rattenleberhomogenat. Als
Blindwert wurde eine Lösung aus 1 ml Nash-Reagenz und
1 ml
5 mM
Phosphatpuffer pH 7,2 verwendet.
1. Küvette
2. Küvette
1. Küvette -
2. Küvette -
Blindwert
Blindwert
Probe
0,098
0,102
0,086
0,090
Kontrolle
0,015
0,016
0,003
0,004
10 µmol Formaldehyd
0,856
0,874
0,844
0,862
5 µmol Formaldehyd
0,412
0,45
0,400
0,438
2.5 µmol Formaldehyd
0,211
0,221
0,199
0,209
1 µmol Formaldehyd
0,157
0,142
0,145
0,130
0 µmol Formaldehyd
0,014
0,015
0,002
0,003
Blindwert
0,014
0,01
Tab. 38.1: Ergebnisse der Formalde hydbestimmung nach Nash.
38.3 Durchführung für Tumorzellen
Die Zellen wurden in DMEM Medium auf einer 15 cm-Petrischale kultiviert, bis ca.
80
%
der
Platte
mit
Zellverbänden
bedeckt
waren.
Alle
Schritte
des
Aufreinigungsprotokolls wurden bei 4 °C durchgeführt. Alle Zentrifugationsschritte
wurden mit 1000 g für 5 min. durchgeführt. Ausgangsvolumen für die Aufreinigung
waren 900 ml HeLa-Zellen mit einer Konzentration von 10
6
Zellen/ ml. Als erstes
wurden die Zellen für 5 min mit einer Kraft von 1000 g zentrifugiert. Danach wurde
das Pellet zweimal mit hypotonischem Puffer gewaschen. Die Zellen wurden mit 9 ml
hypotonischen Puffer, dem eine Tablette Complete zugegeben wurde, auf etwa108
Zellen/ ml verdünnt und für 10 Minuten auf Eis gelassen. In folgendem wurde die
Suspension fünf- sechsmal mit einem Homogenisator bearbeitet. Danach erfolgte ein
Zentrifugationschritt. Das erhaltene Pellet enthielt die intakten Zellkerne und der
Überstand das Zytosol. Dieser „zytosolische Extrakt“ wurde zur Untersuchung
aufgehoben. Das Pellet wurde leicht geschüttelt, um die Auflösung im Puffer zu
erleichtern. Die Zellen wurden in 9 ml hypotonischen Puffer, der NP-40 enthielt
aufgenommen und 15 min. auf Eis gelassen. W ährend dessen wurde zwei-dreimal
196
geschüttelt.
Nach
erneuter
Zentrifugation
erhält
man
als
Überstand
den
„nukleosolischen Extrakt“. Das Pellet enthielt die Kerne ohne die Kernmembran, also
das Chromatin. Die am Chromatin gebundenen Proteine wurden durch Behandlung
mit steigender NaCl-Konzentration herausgelöst. Das Pellet wurde in 9 ml
hypotonischen Puffer mit 100 mM NaCl gelöst und 15 min auf Eis gelassen. Es
wurde wieder zentrifugiert und der Überstand als „nukleärer Extrakt 100 mM“
bezeichnet. Die beiden letzten Schritte wurden jeweils mit hypotonischen Puffer mit
250 bzw. 450 mM NaCl wiederholt. Die erhaltenen Fraktionen wurden als „nukleärer
Extrakt 250 mM“ und „nukleärer Extrakt 450 mM“ bezeichnet.
38.3.1 Aktivitätsbestimmung
Beschichtung der Kavitäten
Eine Lösung des Histonpeptids in W aschpuffer wurde in jede Kavität der
Mikrotiterplatte gefüllt, so dass die Konzentration an Histonpeptid/ Kavität 20 pmol
betrug. Das Füllvolumen der
Platte betrug hier und bei allen folgenden
Inkubationsschritten 100 µl. In zwei Kavitäten wurde biotinyliertes, nicht an Lys4
modifiziertes Histon H3-Peptid gefüllt (20 pmol/ Kavität). Diese Kavitäten dienten
später als Produktkontrolle (Negativkontrolle). Die Platte wurde 1 h bei 30°C
geschüttelt. Danach wurde der nichtgebundene Anteil an Peptid durch sechsmaliges
W aschen der Kavitäten entfernt. Mit dem letzten W aschschritt wurden die Kavitäten
leergesaugt.
Enzymreaktion
Neben 90µl Enzymreaktionspuffer wurden 10µl Zellextrakt in die Kavitäten gefüllt. In
zwei Kavitäten wurde nur
LSD1-Puffer gefüllt,
diese Kavitäten dienten als
Substratkontrolle (Positivkontrolle). In die 2 Kavitäten, die als Negativkontrolle
dienten, wurde ebenfalls nur Enzympuffer gefüllt. Die Platte wurde für 2 h bei 37 °C
inkubiert. Danach wurden die Kavitäten sechsmal gewaschen. Mit dem letzten
W aschschritt wurden die Kavitäten leergesaugt.
197
Inkubation mit primärem Antikörper
Alle Kavitäten wurden mit einer 1:5000 Verdünnung des 1. Antikörpers in
Inkubationspuffer befüllt und bei 37 °C 1 h lang inkubiert. Danach wurden die
Kavitäten sechsmal gewaschen. Mit dem letzten W aschschritt wurden die Kavitäten
leergesaugt.
Inkubation mit sekundärem Antikörper
Alle Kavitäten bis auf 2 wurden mit 100 µl einer 1:5000 Verdünnung des
2. Antikörpers in Inkubationspuffer befüllt und bei 37 °C 1 h lang inkubiert. Die zwei
ausgesparten
Kavitäten
wurden
mit
Inkubationspuffer
befüllt.
Es
folgte
ein
Inkubationsschritt für 1 h bei 37 °C. Danach wurden die Kavitäten sechsmal
gewaschen. Mit dem letzten W aschschritt wurden die Kavitäten leergesaugt.
Alle Kavitäten wurden mit 100 µl Enhancementlösung befüllt und 5 min unter
leichtem Schütteln inkubiert. Anschließend erfolgte die Signalauslesung bei
340/ 615 nm.
Die Inhibitionsexperimente
verliefen
analog
den
Aktivitätsexperimenten,
beim
Enzymreaktionsschritt wurden neben dem Zellextrakt 5 µl Inhibitor in die Kavitäten
pipettiert.
198
39. Entwicklung eines homogenen Testsystems für Demethylasen
39.1 Verw endete Geräte und Materialien
s. Kap. 34
Entwicklung eines homogenen Testsystems für Methyl-transferasen
Anti-Dimethyl-Histon H3(Lys4), Kaninchen IgG, polyklonal (Upstate)
39.2 Bestimmung der optimalen Substratkonzentration
Jeweils 5 µl Substratlösung (finale Konzentrationen 100 – 0,1 nM) und 10 µl LSD1Pufferlösung wurden in die Kavitäten einer 384-W ell Mikrotiterplatte pipettiert. Für
den Blindwert wurden 15 µl AlphaScreen-Detektionspuffer in eine Kavität gefüllt.
Zuvor war der Detektionsschritt vorbereitet worden. Zur Antikörperverdünnung von 1:
1000
in
AlphaScreen-Detektionspuffer
wurden
jeweils
Akzeptor-
und
Donorbeadlösung zupipettiert, so dass eine finale Beadkonzentration von je 20 µg/ml
resultierte. Dem Detektionspuffer war zuvor soviel BSA frisch hinzugefügt worden,
dass eine finale Konzentration von 0,1 % vorlag. Die Bead-Antikörper-Mischung
wurde 45 min -1 h bei Raumtemperatur im Dunklen unter leichtem Schütteln
inkubiert. Anschließend wurden von dieser Mischung je 10 µl zu den einzelnen
Kavitäten gegeben. Nach einer weiteren Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur und
unter leichtem Schütteln erfolgte die Detektion bei 680/ 570 nm.
39.3 Bestimmung der optimalen Antikörperverdünnung
Jeweils 5 µl Substratlösung (finale Konzentrationen 30 nM) und 10 µl LSD1Pufferlösung wurden in die Kavitäten einer 384-W ell Mikrotiterplatte pipettiert. Für
den Blindwert wurden 15 µl AlphaScreen-Detektionspuffer in eine Kavität gefüllt.
Zuvor war der Detektionsschritt vorbereitet worden. Zur Antikörperverdünnung von
1: 500- 1: 5000 in AlphaScreen-Detektionspuffer wurden jeweils Akzeptor- und
Donorbeadlösung zupipettiert, so dass eine finale Beadkonzentration von je 20 µg/ml
199
resultierte. Dem Detektionspuffer war zuvor soviel BSA frisch hinzugefügt worden,
dass eine finale Konzentration von 0,1 % vorlag. Die Bead-Antikörper-Mischung
wurde 45 min-1 h bei Raumtemperatur im Dunklen unter leichtem Schütteln inkubiert.
Anschließend wurden von dieser Mischung je 10 µl zu den einzelnen Kavitäten
gegeben. Nach einer weiteren Inkubation für 1 h
bei Raumtemperatur und unter
leichtem Schütteln erfolgte die Detektion bei 680/ 570 nm.
39.4 Erstellung einer Kalibrationsreihe mit abnehmenden Mengen an
Substratpeptid
Jeweils 5 µl Substratlösung (finale Konzentrationen 50 – 0 nM) und 5 µl LSD1Pufferlösung wurden in die Kavitäten einer 384-W ell Mikrotiterplatte pipettiert. Dazu
wurden je 5 µl Histon H3- Peptidverdünnung gegeben, so dass in jedem W ell eine
finale Konzentration an Peptid von 50 nM resultierte.Für den Blindwert wurden 15 µl
AlphaScreen-Detektionspuffer in eine Kavität gefüllt. Zuvor war der Detektionsschritt
vorbereitet
worden.
Zur
Antikörperverdünnung
von
1:1000
in
AlphaScreen-
Detektionspuffer wurden jeweils Akzeptor- und Donorbeadlösung zupipettiert, so
dass eine finale Beadkonzentration von je 20 µg/ml resultierte. Dem Detektionspuffer
war zuvor soviel BSA frisch hinzugefügt worden, dass eine finale Konzentration von
0,1 % vorlag. Die Bead-Antikörper-Mischung wurde 45 min-1 h bei Raumtemperatur
im Dunklen unter leichtem Schütteln inkubiert. Anschließend wurden von dieser
Mischung je 10 µl zu den einzelnen Kavitäten gegeben. Nach einer weiteren
Inkubation für 1 h
bei Raumtemperatur und unter leichtem Schütteln erfolgte die
Detektion bei 680/ 570 nm.
39.5 Bestimmung der optimalen Enzymverdünnung/ Bestimmung der
Enzymaktivität
Jeweils
5
µl
Substratlösung
(finale
Konzentrationen
30
nM)
und
5
µl
LSD1-Pufferlösung sowie 5 µl LSD1-Enzymlösung wurden in die Kavitäten einer
384-W ell Mikrotiterplatte pipettiert. Als Negativkontrolle dienten 5 µl Substratlösung
(finale Konzentrationen 30 nM) und 10 µl LSD1-Pufferlösung. Für den Blindwert
wurden 15 µl AlphaScreen-Detektionspuffer in eine Kavität gefüllt. Die Mikrotiterplatte
wurde für 1 h bei 37°C unter Schütteln inkubiert. W ährend dieser Zeit war der
200
Detektionsschritt vorbereitet worden. Zur Antikörperverdünnung von 1:1000 in
AlphaScreen-Detektionspuffer
wurden
jeweils
Akzeptor-
und
Donorbeadlösung
zupipettiert, so dass eine finale Beadkonzentration von je 20 µg/ml resultierte. Dem
Detektionspuffer war zuvor soviel BSA frisch hinzugefügt worden, dass eine finale
Konzentration von 0,1 % vorlag. Die Bead-Antikörper-Mischung wurde 45 min-1 h bei
Raumtemperatur im Dunklen unter leichtem Schütteln inkubiert. Anschließend
wurden von dieser Mischung je 10 µl zu den einzelnen Kavitäten gegeben. Nach
einer weiteren Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur und unter leichtem Schütteln
erfolgte die Detektion bei 680/ 570 nm.
201
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