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Research Collection
Doctoral Thesis
Synthese, Erkennung und Reparatur von DNAPhotoschadensanalogen
Author(s):
Butenandt, Jens
Publication Date:
1999
Permanent Link:
https://doi.org/10.3929/ethz-a-003824868
Rights / License:
In Copyright - Non-Commercial Use Permitted
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ETH Library
Diss. ETHNr. 13196
Synthese, Erkennung
und
Reparatur
von
DNA-Photoschadensanalogen
Abhandlung
Zur
Erlangung
des Titels
Doktor der Naturwissenschaften
der
EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE
ZÜRICH
Vorgelegt
von
JENS BUTENANDT
Dipl. Chem.
der
Univ.
Ludwigs-Maximilians-Universität München
Geboren
am
14. Mai 1970
In München/Deutschland
Angenommen
PD Dr. Thomas
Prof. Dr.
auf
Antrag
Carell, Referent
François Diederich,
Prof. Dr. Don
von
Korreferent
Hilvert, Korreferent
Zürich, 1999
Meinen Eltern, die mir diese
Ausbildung ermöglichten,
in Dankbarkeit
gewidmet.
Das grösste Glück des denkenden Menschen ist es,
das
und das
Erforderliche erforscht zu
Unerforschliche ruhig
Johann
zu
Wolfgang
haben
verehren.
von
Goethe
Danksagung
Allen
möchte ich meinen Doktorvätern PD Dr. Thomas Carell und Professor
voran
Diederich für die herzliche
François
Grenzgebiet
interessante Doktorarbeit im
entgegengebrachte
mit
Diskussionen
Vertrauen
Thomas
von
Wissen und seine
Kreativität.
Forschungsumfeld
liess kaum einen Wunsch offen.
Forschung
und die in seiner
Fundament dar,
um
von
neue
Professor Don Hilvert danke ich für die
der
dieser
Arbeit
fruchtbaren
bei.
Sein
François Diederich geschaffene
Professor
Die
Interdisziplinarität
erarbeiteten Arbeitstechniken
Gruppe
mit Thomas Carell
zahlreichen
Das
sind mir ebenso ein Vorbild wie sein
Vortragstil
Das
die
und
Gelingen
zum
eine
Biologie anzufertigen.
Chemie und
Carell
trugen wesentlich
ihm
seine Geduld und sein
Optimismus,
von
Herausforderung danken,
und die
Betreuung
Wege
zu
seiner
stellten ein gutes
gehen.
Übernahme des Korreferats und sein Interesse
an
vorliegenden Arbeit.
Dr. André P.
untersuchten
M.
Eker und Professor
DNA-Photolyasen
Alfred
Batschauer haben die in dieser Arbeit
Verfügung gestellt.
zur
Ihnen möchte ich hier für die
fruchtbare wissenschaftliche Zusammenarbeit danken.
Herr Lars
Burgdorfhat in
massgeblich
Fortgang
einem
zu
seiner
dieser Arbeit
Diplomarbeit
beigetragen.
mit der
Synthese
dessen
hier nicht beschrieben
Ergebnisse
Thymidinphotodimere
Für die Zusammenarbeit und sein Interesse
meiner Arbeit möchte ich ihm herzlichst danken.
Diplomanden,
der
Auch Richard
am
Quaderer,
sind, möchte ich für die
Zusammenarbeit und sein Vertrauen danken.
Herrn Dr. Martin
für ihre
Bolli, Herrn Dr. Ronald Micura und
Unterstützung
beim Erlernen der
Herrn Dr.
Stefan
Oligonukleotidsynthese
Pitsch danke ich
und für zahlreiche
wissenschaftliche Diskussionen.
Lars
Burgdorf, Anja Bahr, Philipp
aufmerksame Korrektur des
Korrektur des
Besonders
Laboratoriums
Ulrich
für
bin
ich
allen
Herrn Dr.
Mitgliedern
organische Chemie,
gilt mein
Hediger
Brandenberg
Manuskripts.
Liam
Cox
danke ich für die
Summary.
dankbar
Insbesondere
Weiermann und Edda Lehmann danke ich für die
die
der
einen
hervorragenden
Dank Dr. Walter Amrein, Oswald
für die gemessenen
Massenspektren;
und Dr. Monika Sevova
Manser und Michael Schneider für die
für die
analytischen
Abteilungen
Service
anboten.
Greter, Rolf'Häfliger und Hans-
Professor Bernhard Jaun,
Brigitte
aufgenommen NMR-Spektren;
Durchführung
des
von
Elementaranalysen;
Dieter
Dr. Paul
Seiler und Prof. Dr. Volker Grämlich für die
Bestimmung
Kristallstrukturen der
von
Photodimere.
Frau
und Herrn Dr.
Anja Schwögler
Zusammenarbeit innerhalb der
Dank
Atmosphäre
in
hier
danke
ich
und
für
Birgit Masjost
Boehringer Ingelheim Fonds
und die
Möglichkeit
die
fruchtbare
Mitgliedern
der
Besonders
angenehme
eine
Labor, Philipp Lustenberger für seine zahlreichen Erheiterungen
im Schreibraum und Anja Bahr für ihre Freundschaft und zahlreiche
Dem
für
Carell. Weiterhin möchte ich allen
Anne-Sophie Droz
unserem
Epple
für das gute und freundliche Arbeitsklima danken.
Diederich-Aibeitsgmpp&
gilt mein
Gruppe
Robert
zum
bin ich für das
Ratschläge.
Doktorandenstipendium von 1996-1998
fruchtbaren Austausch mit anderen
Stipendiaten
in
Hirschegg
sehr dankbar.
Der
Studienstiftung
des deutschen
Volkes und der Schweizerischen
danke ich im Rahmen dieser Arbeit für die
Sommer
wäre die
Einladung
zu
1995, auf der ich Thomas Carell kennen lernte.
vorliegende Arbeit nie
so
einer Sommerakademie im
Ohne dieses Zusammentreffen
entstanden.
Herrn Dr. Greiser und der Firma GREISERDRUCK danke ich für die
Drucks der
Studienstiftung
Übernahme des
vorliegenden Arbeit.
Allen Freunden und
lungsreiche Zeit in
Unterstützung
und
Kollegen
in Zürich möchte ich für die
Zürich danken.
Ermutigung
möchte ich hier Rebecca
Ein grosser Dank
und ihr Interesse
Allenspach
für ihre
an
geht
an
meinem
Zuneigung
schöne und
abwechs¬
meine Familie für die stete
Werdegang.
und Liebe danken.
Schliesslich
Teile dieser Arbeit wurden
•
oder
an
Kongressen vorgestellt:
Carell, T. und Butenandt, J., Angew. Chem. 1997,109, 1590-1593. Auf dem Weg
zu
synthetischen DNA-Reparatur-enzymen:
DNA-bindendes
•
publiziert
Einbau einer Flavin Aminosäure in ein
Oligopeptid.
Butenandt. J. und Carell, T. IUPAC Congress: Genf, Schweiz.
1997, Posterpräsentation, Synthesis and Investigation of
a
17.-22.
August
DNA-Lesion Model
Compound.
•
Burgdorf,
Butenandt, J„
L.
und
Zürich: Zürich. 15. Oktober 1998,
of Oligonucleotides containing
•
an
Crystal-Structure
ETH
Vortrag, Synthesis and Enzymatic Investigation
Isosteric DNA-Photolesion Analogue.
Butenandt, J., Eker, A.P.M. und Carell, T.,
Synthesis,
Herbstversammlung NSCG,
Carell, T.,
and
Chem. Eur. J.
Enzymatic Evaluation
of
1998, 4, 642-653.
a
DNA-Photolesion
Isostere.
•
•
Carell, T., Nachwuchswissenschaftlersymposium:
Butenandt. J..
Burgdorf,
Bioorganische
Chemie: Paderborn. 21-23.
Enzymatic
Investigation
Photolesion
Analogue.
L. und
of
September 1998, Vortrag, Synthesis
Oligonucleotides
Containing
an
Isosteric
and
DNA-
Butenandt, J., Burgdorf, L.T. und Carell, T., Angew. Chem. 1999, 111, 718-721.
'Base
Flipping": UV-Licht-geschädigte DNA-RNA-Duplexe
sind schlechte Substrate
für photoreaktivierende DNA-Reparaturenzyme.
•
Butenandt, J., Burgdorf, L.T. und Carell, T., Synthesis 1999,
Synthesis of DNA
Lesions and
7,
1085-1105.
DNA-Lesion-Containing Oligonucleotides
For DNA-
Repair Studies.
•
Kleiner, O., Butenandt, J., Carell, T. und Batschauer, A., Eur. J. Biochem 1999,
im Druck.
Class II DNA
photolyase from Arabidopsis
thaliana contains FAD
as
cofactor.
•
Butenandt, J., Epple, R., Wallenborn, E.-U., Eker, A. P. M., Grämlich, V., Carell,
T., Chem. Eur. J. 1999, im Druck. A Comparative Repair Study of Thymine- and
Uracil-Photodimers with Model
Compounds
and
a
Photolyase Repair Enzyme.
i
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung
I.
II.
1
v
Summary
v
ii
1
Einleitung
2
1.1 Struktur der DNA
1.1.1 Geschichte der
2
Strukturaufklärung
1.1.2 Strukturen der DNA
4
1.1.3 Struktur der DNA auf den Nukleosomen
6
1.1.4
Bedeutung
der unterschiedlichen DNA-Strukturen
1.2 DNA-Schäden und ihre
7
8
Bedeutung
1.2.1
Einführung
8
1.2.2
Darstellung geschädigter DNA-Fragmente
9
1.2.3
Schädigung
durch Chemikalien
10
für Chemikalien
1.2.3.1
Angriffspunkte
1.2.3.2
Darstellung von Oligonukleotiden
1.2.3.3
Untersuchungen
1.2.3.4
Biologische Bedeutung
an
modifizierten
11
mit
Alkyladdukten
Oligonukleotiden
der Addukte
12
13
14
1.2.4 Oxidative Schäden und Radikalschäden
14
1.2.4.1 Strukturen der oxidativen Schäden
14
1.2.4.2
Strangbrüche
1.2.4.3
Darstellung von Oligonukleotiden
1.2.4.4
Untersuchungen
17
an
modifizierten
mit Radikalschäden
17
Oligonukleotiden
19
1.2.5 Abasische Stellen
20
1.2.6
Analoge
20
1.2.7
UV-Strahlungsschäden
1.2.7.1
von
Darstellung
1.2.7.2 Einfluss
1.2.7.3
1.3
abasischen Stellen
von
von
Photodimeren
Photodimeren auf die DNA-Struktur
Biologische Bedeutung
Reparatur von
Erkennung
DNA-Fragmentes (NER)
1.4.1
Erkennung
1.4.1.1
(BER)
Reparatur
von
23
24
26
27
1.3.2 Herausschneiden einer Base
1.4
der Photoschäden
DNA
1.3.1 Herausschneiden eines
1.3.3 Direkte
21
28
29
29
DNA-Schäden durch Proteine
29
DNA durch Proteine
30
von
Erforschung
von
Protein-DNA-Wechselwirkungen
30
ii
1.4.1.2
Bindungsmotive
1.4.1.3 Chemische
1.4.1.4
1.4.2
Beitrag
Erkennung
Erkennung
über die Form
32
Konformationsänderungen
32
DNA-Schäden
33
Glykosylasen
1.4.2.1
34
1.4.2.2 Endonukleasen
35
1.4.2.3
Photolyasen
1.4.2.4
DNA-Reparaturenzyme,
2
Aufgabenstellung
3
Synthese
3.1 Bekannte
3.3 Generelle
von
Oligonukleotiden...37
Photodimeren
37
39
geeigneten Phosphodiesteranalogens
40
Synthesestrategie
Desoxyuridin
42
Uridin
3.4
Synthese
von
3.5
Synthese
der Formacetal-Donoren
3.6
Synthese der Formacetal-Akzeptoren
3.7
Kupplung
3.8
Belichtung
der Dinukleoside des
2'-Desoxyuridins
47
3.9
Belichtung
der Dinukleoside des
Thymidins
51
zum
aus
44
45
46
Dinukleosid
der Photodimere und Dinukleoside
3.10
Entschützung
3.11
Dimethoxytritylierung
und
Phosphitylierung
der
53
[cis,syn]-Photodinicve
und der Dinukleoside
3.12
Synthese
von
54
56
Oligonukleotiden
3.13 Diskussion der
Synthese
der Photodimeren
61
3.14 Kristallstrukturen der entschützten Photodimere
3.14.1
Vergleich
3.15
64
[cis,syn]-Photodimere
Vergleich
der
[cis,syn]-Photodimere:
Die
Cyclobutansubstruktur
64
3.14.1.2
Vergleich
der
[cz's,s;yn]-Photodimere:
Die
glykosidische Bindung
66
3.14.1.3
Vergleich
der
[cis,syn]-Photodimere:
Die Riboseeinheiten
[trans,^_yn-7]-Photodimer
Zusammenfassung
Enzymatische
4.1
der
62
3.14.1.1
3.14.2 Das
4
35
36
Darstellungen
3.2 Auswahl eines
Enzymklasse
eine interessante
Photodimer-enthaltenden
von
30
31
Erkennung
von
von
-
Studien
Reparaturstudien
68
69
70
DNA-Photolyasen
4.2 Erste
66
70
am
DNA-Einzelstrang
4.3 Konformation der DNA'DNA und
DNA-RNA-Duplexe
73
78
iii
4.4
Paarungseigenschaften
von
Photodimeren in DNA*DNA- und
80
DNA«RNA-Duplexen
4.4.1
Einleitung
4.4.2
Ergebnisse
80
der
4.4.3 Diskussion der
82
Denaturierungsexperimente
DeStabilisierung von
DNA»DNA- und DNA»RNA86
Duplexen durch Photodimere
4.4.4
Schlussfolgerung
4.5 Detaillierte
aus
enzymatische
den thermischen
Denaturierungsexperimenten
Studien mit Hilfe der A.
nidulans-Photolyase.
90
am
DNA-Einzelstrang
4.5.2 Studien
am
Doppelstrang
DNA'DNA-Duplexe
92
4.5.3 Studien
am
Doppelstrang DNA'RNA-Duplexe
93
Vergleich
-
-
Einzel-
versus
95
Doppelstrang
97
4.5.5 Studien mit Haarnadeln
4.6 Diskussion der
enzymatischen
4.6.2
Vergleich von
4.6.3
Biologische Konsequenzen
Thymidin-
98
und Uridindimeren
Vergleich
von
97
Studien
4.6.1
4.7
DNA-DNA und
DNA'RNA-Duplexen
100
102
103
Zusammenfassung
Synthese
von
104
Flavinnukleosiden
104
5.1
Einleitung
5.2
Vorgeschlagene
5.3
Synthese
eines
105
Flavinnukleoside
Phosphoramidits
5.4 Versuch des Aufbaus
von
von
178
Flavin-enthaltenden
106
Oligonukleotiden
durch
nachträgliche Modifikation
109
5.5 Diskussion
113
5.6
115
Zusammenfassung
6 Künstliche
7
90
4.5.1 Studien
4.5.4
5
89
Photolyasen:
Ein
experimenteller
Ausblick
116
6.1
Einleitung
116
6.2
Flavinhaltige Peptide
116
6.3
Reparatur
von
Photoschäden mit Flavin-enthaltenden
Peptiden
118
6.4 Diskussion
119
6.5
120
Zusammenfassung
Experimenteller
Teil
7.1
Allgemeine Arbeitsmethoden
7.2
Synthese
der Dinukleoside
121
121
125
IV
7.2.1 Generelle Vorschrift für die
127
Mitsonobu-Veresterung
7.2.2 Generelle Versuchsvorschrift
zur
Einführung
der
128
Methylthiomethylgruppe
der
Darstellung
7.2.4
Darstellung Formacetal-verknüpfter
7.3
Belichtung
7.3.1
Belichtung
von
Belichtung
Belichtung
5'-6>-Pivaloyl-2'-desoxyuridyl-3',5'-methylen-3'-
Belichtung
von
140
89
143
90
5'-0-Acetyl-2'-desoxyuridyl-3',5'-methylen-3'-acetyl-
von
2'-desoxyuridin
7.3.4
139
5'-0-Pivaloyl-2'-desoxyuridyl-3',5'-methylen-3'-acetyl-
von
2'-desoxyuridin
7.3.3
136
Dinukleoside
Dinukleosiden
von
benzyl-2'-desoxyuridin
7.3.2
131
Formacetalacceptoren
7.2.3
147
91
5'-0-Acetyl-thymidinyl-3',5'-methylen-3'-acetyl150
thymidin92
7.3.5
der Struktur
Zuordnung
am
Cyclobutanring
durch
Hydrolyse
153
Zuckers
7.4
Überführung
der
Belichtungsprodukte in
die
Phosphoramidite
7.4.1
Verseifung
der Photodimere und Dinukleoside
7.4.2
Einführung
der
7.4.3
Überführung
Dimethoxytritylgruppe
in die
Phosphoramidite
7.5 Mit Pac-Nukleosiden beladenes
CPG-Trägermaterial
7.6 Flavin enthaltende Nukleotide
7.7
des
Oligonukleotidsynthese im
7.7.2
Entschützung
7.7.3
Reinigung
der
7.7.4
Reinigung
von
1.3
|lmol-Massstab
synthetisierten Oligonukleotide
Oligonukleotide
RNA
Nachträgliche
Modifikation
7.9
Enzymatische
Studien
163
168
173
186
7.7.1
7.8
154
174
Oligonukleotidsynthese
der
154
186
186
187
188
von
Oligonukleotiden
190
190
8
Abkürzungsverzeichnis
192
9
Literaturverzeichnis
195
10
Anhang
232
V
Zusammenfassung
I.
DNA-Reparatur
und
DNA-Schädigung
Abbau der Ozonschicht findet
DNA-Pyrimidindimerschäden
Schädigung
von
entstehen
den
vor
'
allem
den
aus
trotz ihres
Die
beschäftigt
geringen Einflusses
D
sich mit der
108
und
Durch
konnten mittels
Die
um
.,
_r
Festphasensynthese
T[c,s]T
H:
UÏcslU
wie das
Frage,
Enzym
,.,
R
=
.,
...,_
Me:110
R
=
H:
108
die Photodimere
Diese
die hierzu bio-isostere
sich in
und
Nach
in
(Anacystis nidulans, Neurospora
crassa,
faktorzusammensetzung unterscheiden,
Schritte:
der
dargestellt.
als
Die
erkannt und
und
Phosphoramidite
werden.
Dabei musste
Schutzgruppe zurückgegriffen
zu
können
(Kap. 3).
DNA-Photolyasen
Potorous
[cis,syn]-
aus
[CTS,syn]-Cyclobutandimere
überführt.
entschützen
von
Zuerst
Formacetal-verbrückten Dinukleosid
Isolierung
wurden
der
Verbindungen
Formacetalakzeptoren
zum
Hilfe
Formacetalgruppe.
folgende
Oligonukleotide eingebaut
Bedingungen
mit
und
dargestellt
inkorporiert.
Phenoxyacetylgruppe
Oligonukleotide
eindeutig gezeigt werden,
1T
Me:
entsprechenden Phosphoramidite
unter sehr milden
erhaltenen
=
(Kap. 3) gliederte
erhalten.
für die anderen Basen auf die
werden,
'ÖH
des Dinukleosids wurde ein Gemisch
Belichtung
wurden diese in die
=
R
Oligonukleotide
und 108
[trans,syn]-Photodimeren
R
wurden
Anschliessend wurden diese beiden Bausteine
umgesetzt.
^ (
d'V
Formacetaldonoren
geeignete
/
\
p—o
Phosphodiesters
wurden
/
\
enthalten statt des zentralen
von
untersucht.
Jl
HO-'
in
Synthese
Substratanalogen
von
auf die DNA-Struktur erkennt.
110
Photodimeranaloge
110
Reparatur
f^isr^n
jt
Phosphoramidittechnologie
Die
DNA-Schäden, die durch UV-
an
n'^^isrv
[cis,syn]-
DNA-Photolyasen
Diese Arbeit
mit dem
[cis,syn]-
und
eines lichtinduzierten Elektronentransfers
spalten.
elementare
Zusammenhang
In
von
DNA-Photolyasen
Diese DNA-Schä-
durch
als
Jahren
In dieser Arbeit wurde die
die die Photodimere mit Hilfe
repariert,
^
Reparatur
[eis, sy n]-2'-Dcsoxymi-
U[c,s]U.
werden
allem die
durch
deaminierenden
Cytidindimeren
dindimere
letzten
den
DNA durch UV-
Thymidindimere T[c,s]T
sehr schnell
vor
grosses Interesse.
Strahlung erzeugt werden,
Strahlung
in
Prozesse grosse Aufmerksamkeit erhalten.
biologische
Bei der
haben
tridaetylis),
repariert.
dreier
Spezies
die sich in ihrer
Für diese
Enzyme
Ko-
konnte
das s die Formacetal-verbrückten DNA-Photoschäden sich als
gute Substratanaloge eignen und daher für detaillierte Studien verwendet werden können
(Kap. 4.2).
An dem effizientestem
Enzym,
der
Photolyase
von
A. nidulans, wurde untersucht, ob die
Struktur des Substrats und die Struktur der DNA die
Reparatureffizienz
beeinflusst
VI
Hierzu wurde die
(Kap. 4).
Oligonukleotiden (ss-DNA),
Reparaturrate
in
folgende Ergebnisse erhalten:
Photolyase
schneller
von
repariert
langsamer repariert
Thymidindimere
als im
DNA»RNA-Duplex mehr
als 15 mal
Beobachtungen korrellieren
Photodimere in
110.
Jedoch wurden
gefolgert,
dass die Effizienz der
ihr Substrat durch
Photolyasen
als
DNA-Reparatur
Herausklappen
Doppelhelix (base flipping) erkennen,
der
wurden im
DNA»RNA-Duplexe
die
Danach desta¬
DNA'RNA-Duplexe.
DeStabilisierung
Hypothese,
geschädigten
und kann das Auftreten
in
durch die lokale Struktur
Dieser Befund unterstützt die
ein
110
Parametern.
der DNA drastisch beeinflusst wird und mit dem Ausmass der
durch das Photodimer korreliert.
108 6-7 mal
DNA«DNA-Duplex.
als im
stärker
(1.3-1.6 x)
DNA»RNA-Duplexen
Uridinphotodimere
mit den für die DNA«DNA- und
DNA'DNA-Duplexe
der DNA-
von
etwas
Thymidinphotodimere
langsamer repariert
und in
Im wesentlichen
108 wurden
Denaturierungsexperimenten bestimmten thermodynamischen
Hieraus wird
einzelsträngigen
in
DNA»DNA-Duplexen
DNA»DNA-Duplex.
bilisieren Photodimere die
108
verglichen.
Uridinphotodimere
wurden ebenfalls als Substrat erkannt.
Diese
bestimmt und
A. nidulans in ss-DNA und in
als
und
doppelsträngigen DNA»DNA-Duplexen (B-Form)
DNA»RNA-Hybriden (A-Form) quantitativ
wurden
110
von
der DNA
dass DNA-
Basen
aus
der
von
Mutation Hot
von
Modellverbindungen
Spots
erklären.
In einem weiteren Teil wurden Vorarbeiten
für die
DNA-Photolyase
unternommen
und ein Photodimer in
Abhängigkeit
der
vorgestellt.
zu
Es wird die
Beim Versuch, dieses Flavinnukleosid in
werden können, da das Flavin in
Oligonukleotiden
über die
Als
wenn
sich die
Aminogruppe
an
Dies
einer
Synthese
wurde die
DNA über elektrostatische
einer
photochemischen
peptide dar,
die ein
gelingt
nur
der letzten Base
Flavin tragen.
unter
der
DNA die
von
Licht den
nachträgliche
am
5'-Ende des
zu
des
Modifikation
von
mit einem Säure¬
und
waren
nur
3
dann,
befindet.
vorgestellten Oligo¬
Polypeptide eingesetzt (Kap. 6),
Polypeptide
reparieren.
Verwendung
Phosphor
Oligonukleotids
Kapitel
stellte
in die DNA
in schlechten Ausbeuten und
Diese
Wechselwirkungen
Reaktion selektiv
Enzym
in
eines Flavinnukleosids
einzigen freien Aminogruppe
nukleotide als Substrate für verschiedene DNA-bindende
gebundenes
um
Phosphoramiditchemie
In Zusammenarbeit mit T. Carell wurden ausserdem die in
die ein kovalent
ein Flavinnukleosid
Oligonukleotide einzubauen,
Gegenwart
Ausweg
Kupplung
derivat des Flavins untersucht.
es,
dem Abstand zwischen dem Flavinkofaktor und dem
untersuchen.
Amidits sehr schnell oxidiert.
war
inkorporieren,
zu
sich heraus, dass Flavinnukleoside nicht über die
eingebaut
Art
neuen
Das Ziel
(Kap. 5).
DNA»DNA-Duplexe
Reparaturrate von
Photodimer in der DNA
einer
zu
in der
erkannten
Lage,
einzelsträngige
die Photodimere in
Sie stellen die ersten Kofaktor-
desselben Kofaktors nachahmen.
Vil
Summary
II.
elementary
repair
[cis,syn]-
sunlight damages DNA,
U[c,s]U)
a
t
thesis deals
This
recognizes
the
compounds,
group
O
-*uu
with
how
*u
and
110
synthesis
were
coupled
[cis,syn\-
and
into
oligonucleotides
protecting
of these
to
H:
T[c,s]T
U[c,s]U
small influence
under
the
on
R
=
Me:110
R
=
H:
108
DNA-structure.
in
prepared
large
mild
very
first
was
following steps:
these two
Subsequently,
On
irradiation,
a
obtained. After isolation of the
chemistry.
For the
were
prepared
deprotection
groups
were
and
of the
used
species (Anacystis nidulans, Neurospora
recognize
and
the
For these three enzymes, it
of cofactors,
composition
photodimer analogues
substrate
these
In
bio-isosteric formacetal
entailed the
prepared.
and
amounts
as
(Chapter 3).
which differ in their
good
a
conditions, phenoxyacetyl
tridactylis),
are
compounds
solid state
Potorous
linked DNA lesions
replaced by
corresponding phosphoramidites
from three different
repair
is
were
groups of the natural nucleobases
oligonucleotides.
Me:
=
the formacetal-linked dinucleoside.
oligonucleotides using
DNA-photolyases
=
[trans,syn]-photodimers
[cis,syn]-cyclobutane dimers,
incorporated
R
were
phosphodiester moiety
The
'OH
\
\
the
Suitable formacetal donors and acceptors
mixture of the
\—(
/
O"
R
photodimers despite their
the central
blocks
'ÖH
oligonucleotides using phosphoramidite methodology.
into
(Chapter 3).
building
rr\
\—/
HO-V
''0
\—I
\
NH
r
rr\
(
'Ö
\
transfer
photodimer analogues 108
incorporated
H0~j/
U
photodimers
electron
,u
tu-
These
rxXTA
R
O^cr^ N
>v
\—/
R
HN
^O
N
^X
0
0
HM-^t
v
NH
repaired by DNA-pho-
light-induced
process.
The
1.
which cleave these
a
enzyme
,1
are
DNA-lesions
using
formed.
are
.
tolyases
investigated using
was
V^MW
HN-
([c/s,yyn]-2'-desoxyuridine
dine dimers
,
UV-irradiation. In this work
ry^M^\—/^n^o
[cis,syn] -cyti-
of
products
deamination
dimers
the
layer,
ozone
O
o
^J
the
and
T[c,s]T
dimer s
thymidine
mT.
as
analogues.
substrate
If
by
by DNA-photolyases
dimer lesions
pyrimidine
of
of the
depletion
of DNA lesions caused
repair
the
on
attention
increasing
have received
DNA-repair
In connection with the
processes of life.
main interest centers
the
and
DNA-damage
In recent years
was
which
had been
unambiguously
analogues
and
can
were
crassa,
able to
incorporated
into
proven that formacetal-
therefore be used for
more
detailed studies.
The most efficient enzyme, the
how
efficiency depends
on
photolyase
from A.
nidulans,
was
employed
to
investigate
the structure of the substrate and the structure of DNA
Vlll
substrate, the repair
rates
determined
from A. nidluans
DNA-photolyase
than
faster
DNA'RNA-complexes
photodimers
Thymidine
110
thymidine photodimers
Photodimers in
uridine
repaired
108
dimers 110
repaired
were
repaired
were
slightly (1.3-1.6 x)
DNA-DNA-duplexes.
in
recognized
also
were
and
ss-DNA
substrates, however
as
DNA»DNA-duplex.
6-7 times slower than in the
more
The
obtained:
were
108
photodimers
uridine
in
results
following
The
compared.
duplexes (A-form)
and DNA-RNA
duplexes (B-form)
and
quantitatively
the structure of the
on
single stranded oligonucleotides (ss-DNA),
of 108 and 110 in
in double stranded DNA'DNA
were
repair efficiency
of the
dependence
the
study
To
(Chapter 4).
than 15 times slower than in the DNA'DNA-
duplex.
with
correlate
observations
These
DNA'DNA and DNA»RNA
data, photodimers destabilize DNA»DNA duplexes
these
DNA»RNA
We conclude that the
hybrids.
to
larger
a
to
than
extent
is influenced
repair
of DNA
efficiency
for
experiments. According
in thermal denaturation
duplexes
determined
thermodynamic parameters
the
by
the
local structure of DNA and that it correlates with the extent of destabilization of the DNA
by
the
their substrate
by
finding supports
This
photodimer.
a
base-flipping
the
hypothesis
mechanism and
can
that DNA
also
photolyases recognize
the observation of
explain
mutational hot spots.
project preliminary investigations
In another
DNA-photolyases
nucleoside and
the
repair
because the
light.
was
the
photodimer in
synthesis
flavonucleoside
of
undertaken
of
a
phosphoramidite
goal
was
in order to
duplexes
only
flavonucleoside
is
of the flavonucleoside
to
was
an
acid
analogue
still bound to the solid
study
if the amino group
was
situated
on
the
flavo-
a
dependence
photodimer
of
within the
of
this
into
oligonucleotides failed,
quickly
oxidized in the presence
oligonucleotide
modification of the
of the flavin to
support.
incorporate
Incorporation
presented.
problem postsynthetic
To circumvent this
oligonucleotide
and
type of model compounds for
phosphoramidite chemistry
standard
by
investigated by coupling
yield
The
(chapter 5).
DNA'DNA
novel
a
rate on the distance between the flavin cofactor and the
A
DNA.
a
were
of
a
single
free amino group in
This method worked
only
in low
the last base at the 5'-end of the
oligonucleotide.
In collaboration with T. Carell the
as
substrates for DNA
moiety (chapter 6).
interactions and
reaction.
cofactor.
These
are
binding polypeptides
These
were
oligonucleotides presented
that contained
in
a
chapter
of
selectively repairing
the first cofactor
peptides
the
an
in
enzyme
a
examined
bound flavin
by
DNA
photodimer
which mimic
were
covalently
polypeptides recognized single-stranded
capable
3
electrostatic
photochemical
using
the
same
Kap.
1
Einleitung
1
und
Informationsmanagement, Informationstechnologie, Datensicherung
sind
am
Ende des zweiten Jahrtausends
wickelten Industrieländer im
Information verbundenen
sind sie
magnetischen
oder
und andere
Technologien
zur
optischen
Information, die in der Natur
werden muss, ist ihre
für
gespeichert,
sondern auf sehr
die
Beispielsweise beträgt
Genoms
menschlichen
von
bis
vollständig gelesen
ehrgeizigsten
zu
einer
Genoms, also
menschlichen
auch
die
zum
DNA
Neben der bei
geschädigt [3].
ionisierende
Reihe
von
zu
Grundlage
eines Lebewesens.
oder
Diese
magnetisch
enthält
rund
drei
Milliarden
besteht und stets für eine der
Aminosäuren.
Basenpaare
Die
die
Beispiel
als
vor
zumindest
eines
des
Individuums
einer oxidativen
Schädigungen,
Bestimmte Viren wie z.B.
allem durch
Speichermedium
der
magnetische
vor
Felder und
Einwirkung, beschädigt
Erbinformation
beobachteten mechanischen
allem durch
intensiv
Schädigung
UV-Strahlung
und
Doch bereits der normale Zellstoffwechsel stellt
Schädigung
führen
die durch Chemikalien
[6].
Daneben
hervorgerufen
das AIDS-Virus nutzen Ribonukleinsäuren
Abkürzung
(Deoxyribonucleic acid)
RNA
bzw.
Projekt
dar, da die hierbei entstehenden Radikale die DNA
Obwohl die korrekten deutschen
Desoxyribonukleinsäure und
Man hofft, dieses
durch mechanische
Scherrkräften wird DNA in vivo
zu
Entschlüsselung
haben [2].
Strahlung geschädigt [4,5].
und
Sie bildet die
Chromosomenpaare aufgeteilten
Basenpaaren
Zentrifugation
eine Gefahr für die Information
angreifen
auf
Desoxyribonukleinsäuren (DNA).1
Es
[1].
drei
alle einzelnen
Speichermedien,
andere Umweltweinflüsse wie
von
aus
den
auf 23
Meter
Milliarde
abgeschlossen
Wie die elektronischen
aufgrund
Bezug
Probleme.
Ziele seit Bestehen der Naturwissenschaften.
wird
Datenträger
haben, ist das Ziel des Human Genome Projects, eines der
zu
bereits im Jahr 2002
werden,
als
codiert, enthält das Erbgut des Menschen also die Information für die
20 Aminosäuren
Anordnung
von
Der Natur
neu.
Speichermedien
Erscheinungsbild
des
Gesamtlänge
einen
Verwaltung
kein Leben. Freilich verwendet die
Genom genannt.
langen Molekülen,
knapp
sehr
Informationstechnologie optisch
Da ein Aminosäurecodon
Basenpaare.
Diese mit der
den einzelnen Lebewesen und Zellen verwaltet
von
in der
der hochent¬
der Daten, doch stellen sich in
grössere
das äussere
jeden möglichen Phänotyp,
es
Datenverlust
jeden Bürger
keineswegs
sondern andere
eigene Erbinformation,
Information wird nicht wie
gibt
Vervielfältigung
den Erhalt der Information ähnliche oder
Die
sind aber
Problemstellungen
denn ohne Information
lange bekannt,
die fast
Schlagwörter,
täglichen Leben beschäftigen.
Natur keine
1
1
gibt
es
eine ganze
werden [7].
All diese
(RNA) als Informationsträger.
für die Nukleinsäuren DNS und RNS wären, wird meist DNA
verwendet.
Daher
RNA für Ribonukleinsäure als
werden
im
folgenden
Abkürzungen gebraucht.
ebenfalls
DNA
für
Kap.
2
1
Arten
Schädigung
von
ständig repariert
führen
werden.
Mechanisme n, die
Ziel dieser Arbeit
zur
war
einem Verlust
Hierzu
gibt
eine Reihe unterschiedlicher
es
es,
die
Reparatur
durch ein
von
die
zu
und räumliche Struktur der DNA
der
DNA
und
vorgestellt
ihr
stellung
dieser Arbeit
Geschichte der
1.1.1
die
Einleitung
die
die chemische
zuerst auf die
wichtigsten
DNA-Struktur
Reparatur
Enzyme diskutiert,
von
können,
Schäden
sowie
ihre
DNA und die
bevor die
Aufgaben¬
wird.
Beginn
der
Strukturaufklärung
Strukturaufklärung
der DNA setzte im Jahr 1868 mit der
Nukleins durch Miescher ein [8]. Er isolierte
Gemisch
aus
Nukleinsäuren und
Bedeutung
dieser Nukleinsäuren konnte 1944
dass
zeigte,
er
Daraus wurde
einzig
DNA für die
geschlossen,
das sehr
sauer war.
Pathogenizität
des
Erst 1889 konnte
Nukleinsäure nannte.
von
Entdeckung
keine reine DNA, aber immerhin ein
zwar
Nukleoproteinen,
Altman Protein-freies Material isolieren, das
Er
auf
beschrieben. Abschliessend wird die
(Kapitel 2) vorgestellt
notwendig,
zu
in Ab¬
Struktur der DNA
1.1
Der
Einfluss
DNA und DNA-Schäden durch
von
werden
Anschliessend
physikochemischer
es
Daher wird in der
kennen.
eingegangen.
biologische Bedeutung
Erkennung
zu
DNA-Photolyase,
Um verstehen
untersuchen.
wie diese Schäden entstehen und wie sie entfernt werden, ist
Struktur
enzymatischer
Photodimeren, DNA-Schäden, die durch
DNA-Reparaturenzym,
der Globalstruktur der DNA
von
Erbinformation und müssen daher
an
Zeit intensiv erforscht werden.
UV-Strahlung entstehen,
hängigkeit
zu
Avery
von
dass die DNA und nicht
et
al.
Die
biologische
[9] aufgedeckt werden.
Pneumococcen verantwortlich ist.
irgendein
Protein die Erbinformation
trägt.
Zu diesem
von
Zeitpunkt
Nukleinsäuren
war
bereits bekannt, dass bei der sanften
Desoxyribonukleotide
der bis dahin unbekannten
Basen Adenin
(A),
Ausserdem hatte
und
Cytosin,
Der
aus
Guanin
man
2-Desoxy-D-ribose [10]
Phosphatgruppe,
und einer der vier
heterocyclischen
(G) [11], Cytosin (C) [12] und Thymin (T) [13] bestanden.
Thymin
Uracil
Ergebnissen abgeleitete Strukturvorschlag
[16] bestätigt
werden.
Diese
phosphoryliert
sind.
der
Totalsynthese
Arbeitsgruppe
ausserdem nach, dass die Nukleoside in den
5'- oder 3'-Ende
Adenin, Guanin
(U) [14] und als Zucker D-Ribose [15] enthielt.
dC: 2, dG: 3, dT: 4, Abb. 1) konnte durch
Todd
einer
aus
eine andere Nukleinsäure entdeckt, die als Basen
aber statt
diesen
erhalten werden, die
enzymatischen Hydrolyse
Desoxynukleoside (dA: 1,
durch die
Arbeitsgruppe
wies durch ihre
Hydrolyseprodukten
von
Totalsynthesen
der Nukleinsäuren
am
Kap.
3
NH2
NH2
O
O
N^S
N^Sr-N
HN"VN
«Av
>
°'/
o/?
Da bei der
Hydrolyse
sauren
C)
/
(A
+
endgültig verworfen,
auf
erklären.
zu
sowie Wilkins et al.
für
den
Paarungsmuster
von
Crick
konnten
und
(A«T)
das
war
und
von
Der
drib
von
Watson und Crick
war
nicht
nur
ein
Struktur der DNA, sondern stimmte auch mit den
für die B-Form
Beugungsmustern
beobachtete
Regel
Konsequenz
ihres
von
[22-24] überein.
Chargaff [18,19] bezüglich
Strukturvorschlags.
der DNA visualisieren.
Daher
war
Strukturaufklärung
der DNA vorerst
Watson und Crick
vorgeschlagene
2
'
H
Watson-Cn'dfc-Paarungen (A»T) und (G»C). (drib: 2'-Desoxyribose).
Modellvorschlag
polymère
Franklin hatte zwei
Form bei hoher
Doppelhelix
-H
O
Die
und
(G«C) (Abb. 2).
H
Abb. 2:
Franklin
von
einer
Watson- Cnc£-Paarung
als
G mit C
Hessen.
mit
[21]
war, mit einer
[23] beobachtet worden
Strukturvorschlag
das
Verhältnis
das
vermuten
Watson
stets
DNA die ersten
es, von
Struktur
Röntgenbeugungsmuster,
A mit T
herausfand, dass
Verhältnissen auftreten,
erhalten, die eine helikale
Erkenntnis
dieser
Grundlage
bezeichnete
als Chargaff [IS,19]
gleichen
Modellbaustudie eines der beiden2
Gosling [22]
Tetranukleotidhypothese [17] aufgestellt.
T) jedoch variiert. Astbury & Bell [20] gelang
Röntgenbeugungsmuster
Aufbauend
4
alle vier Basen in sehr ähnlichen Verhältnissen auftraten,
sowie G und C in den
A und T
+
wurde
ÖH
der DNA.
wurde bis 1940 für die Struktur der DNA die
Hypothese
HO^
3
Desoxynukleoside
Die vier
Abb. 1:
Q
HoJ-^
HO^MbH
12
(G
X
X
H°V\,H
Diese
HN'
w
o'
1
experimentell
Ausserdem
war
die
mit dem
experimentell
der Basenzusammensetzung eine
Vorschlag
abgeschlossen.
Struktur als die
für eine
beobachteten
Zudem konnten Watson und Crick die
Beugungsmuster beobachtet, eine
Feuchtigkeit.
Erklärungsmuster
von
Watson
Replikation
und
Crick die
In der Tat erwies sich die
in
der DNA
geringer Feuchtigkeit
und eine B-
häufigste Struktur,
A-Form bei
von
4
1
Kap.
vorliegt [25].
mit einer
Das
der
Beugungsmuster
Struktur
doppelhelikalen
Die frühe Erkenntnis der
werden
[26].
biologischen Bedeutung
von
gedeutet
Interesse, Nukleinsäuren chemisch
Polynukleotiden ermöglichte
[27-29] und die
erste
zu
in den 60er Jahren die
durch
Gensynthese
Ligation
der Kenntnisse über DNA-Strukturen.
strukturen
einen
kennt
neuen
man
Oligonukleotiden
von
Strukturtyp,
1.1.2
Von
die mit Hilfe
man
zu
mit den
von
einer
zu
Codes
Der stete
Verfeinerung
ersten
Einkristall¬
DNA und entdeckte
dieser drei DNA-Konformationen
von
Kristallstrukturen
konformationellen Familien der DNA,
sind in Tabelle 1 mit ihren
Strukturen
liegen
die Basen wie die
wichtigsten
Sprossen
nachgewiesen
2'-Desoxyribosen
C(T)-endo
der A-DNA eine
Bei allen drei
einer Leiter in der Mitte der
Doppelhelix,
wird.
Die unterschiedlichen
2'-Desoxyribosen bestimmt.
C(3')-endo Konformation,
Konformation aufweisen
A-, B- und Z-Form
Parametern beschrieben.
gegenläufigen Zuckerphosphatpolymeren gebildet
Formen werden durch die Konformation der
eine
genetischen
Fragmenten [30,31].
führte aber auch
jeder
Zugang
Strukturen der DNA
(Abb. 4),
von
Beispiele,
von
[35] und B-Form [36]
[37].
des
Aufklärung
belegte
einem grossen
zu
[25,38,39].
Die drei bedeutendsten
die
die Z-Form
heute zahlreiche
werden konnten
die A-
So
DNA führte
Der biochemische
synthetisieren.
Oligonukleotidsynthese [32-34]
Fortschritt in der
entdeckten A-Form konnte ebenfalls
gleichzeitig
So
zeigen
die
während sie in der B-DNA
(Abb. 3). Bei der Z-DNA
treten beide Zucker¬
konformationen auf.
o3'
C3'-endo
C2'-endo
Abb. 3
:
Schematische
Darstellung
der
C(2')-e>ido
und
C(3')-e«iio-Zuckerkonformation.
Die Anwesenheit beider Zuckerkonformationen führt
Rückgrats
und
dazu, dass die Z-DNA im Gegensatz
Bei der B- und der Z-DNA stehen die
mitten durch den
Basenstapel
Basenpaare
verläuft.
Helixachse in einem Hohlraum im
zur
einer
Zick-Zack-Anordnung
A- und B-DNA
nahezu senkrecht
Hingegen
zylindrischen
zu
zur
linksgängig
des
ist.
Helixachse, die
befindet sich in der A-DNA die
Zentrum des
Übermoleküls
und die
Basenpaare
sind
zur
Helixachse
Durch die
geneigt.
Moleküle wie Ethidiumbromid etc. in den
Wichtigste Helixparameter
Helixtyp
von
rechtsgängig
anti
anti
16-19°
-6°
-7°
10-10.4
12
11-12
Ganghöhe
pro Nukleotid
2.8
Abstände benachbarter
Â
5.62
Phosphate
Furchentiefe
3.38
Â
4.4-4.9
dG: syn
Â
7.38
À
À
/ 2 Nukleotide
pGp:
pCp:
6.68
-0.2--1.8
8.5
Nebenfurche
2.8
7.5
Hauptfurche
2.7
11.7
Nebenfurche
11.0
5.7
Furchenweite
-3Â
À
(A)
Erkennung
Lexitropsine
der
DNA durch Proteine und kleine
sind die beiden Furchen der
Doppelhelix
organische
äusserst relevant.
Moleküle
So ist die
furche in der B-DNA nahezu einen Nanometer weit und bietet zwei Ketten
molekülen Platz, während die Nebenfurche
bietet und
entsprechend
eng, dass der
Zugang
Insgesamt
von
von
wie
Haupt¬
Wasser¬
Wassermolekülen Platz
Hauptfurche
Hingegen
sehr tief und
so
ist die Nebenfurche
weit.3 Bei der Z-DNA ist nur die Nebenfurche als eine sehr tiefe
Die
Hauptfurche
ist ein Teil der Oberfläche und
erkennbar.4
kann die A-Form
weniger
Form der DNA mit 75% relativer
4
einer Kette
schmaler ist. In der A-DNA ist die
und sehr schmale Furche vorhanden.
daher nicht
nur
für Wassermoleküle beschränkt ist.
der Helix sehr flach und
3
6.1
6.4
(Â)
13.5
die
dG:
dC: anti
Hauptfurche
Für
C(T)-endo
C(y)~endo
C(2')-endo
Umdrehung
Basenpaare
linksgängig
dC:
C(3')-endo
der Basen
planarer
Z-DNA
rechtsgängig
der Helixachse
die Interkalation
A-, B- und Z- DNA. [40-42]
Basen pro
von
als die B-DNA.
der Helix.
B-DNA
Glykosidischer Winkel
Dislokation der
Basenstapel
A-DNA
Zuckerkonformation
Neigung
beispielsweise
pro Nukleotid
Ganghöhe
Helixwindung (360°) benötigt
Der Abstand zwischen den Basen beeinflusst
Tab. 1:
der Basen können diese
Neigung
näher aneinander rücken, weswegen die A-DNA eine kleinere
aufweist und mehr Basen für eine volle
1
Kap.
5
Die Z-Form der DNA wurde bei
weniger Wassermoleküle
Wasser binden.
Deswegen
wurde sie auch als die
dehydratisierte
Feuchtigkeit entdeckt.
nur
als A-DNA.
44% relativer
Feuchtigkeit
entdeckt.
Sie bindet also noch sehr viel
Kap.
6
1
Abb
4
Molekulare
Modelle
Entnommen
aus
A-,
von
Shabarova und
B-
und
Z-DNA
Varianten, die jeweils
Umgebungsbedingungen (Lösungsmittel, Salzgehalt
hohen
und
Kristall) abhängen. Während die Z-DNA
Salzkonzentrationen
d(GGBrUABrUACC)
beobachtet
nur
fand
wurde,
der
bestimmte
für
man
Zeitpunkten
Sequenzen,
aufgrund
wie bei der
die sich
zu
von
Zellteilung
Fehlpaarungen
vorkommen.
der
Oligo¬
bei
Oligonukleotid
die
an
[44].
besonderen
auftreten oder die
So
den
nur
zu
es
die G-Tetraden,
Tetraplexen zusammenlagern [45-47].
Sie werden als
gegenüberliegenden Stränge
palindrome Sequenzen
von
Sequenzen
das
ergänzt,
Strukturmotiv für die Telomere der Chromosomen diskutiert
denen die
Anordnung
sowohl die A- als auch die B-Form in demselben Kristall
Stellen des Chromosoms bzw.
GC-reiche
allem
vor
in GC-reichen
Die strukturelle Vielfalt der DNA wird durch Strukturen
besonderen
Studien
Bogdanov [43]
Die Konformationsfamilien besitzen zahlreiche
nukleotide im
kristallographischen
aus
nicht
gibt
[48-50].
Für
Regionen,
vollständig komplementär sind,
werden ausserdem Haarnadelstrukturen
in
und für
postuliert [51-
53].
1.1.3
DNA
Struktur der DNA auf den Nukleosomen
hegt
in Zellen nicht als lineares Molekül
superspiralisiert
und bildet in
sogenannte Chromatin [54].
Eukaryonten
vor.
einen
Vielmehr ist sie in
Komplex
mit
Histonproteinen,
Im Chromatin ist die DNA in Einheiten
Nukleosomen bezeichnet werden.
In diesen sind
145-147
Prokaryonten
organisiert,
Basenpaare (bp)
das
die als
um
ein
Kap.
7
Protein-Octamer
der
Aufklärung
von
Richmond
an
bilden zwei
gegenüber liegt.
der
je
zwei
Komplex
der vier
Kopien
die
an
Histone
Regionen bevorzugt
Regionen bevorzugt
Die
aus.
der DNA
Bindung
die Nebenfurche
in
die
an
dieser
Regionen
eine
in die
die DNA aber in der B-Konformation
zu
zugewandt
À (vom
Histon
anderen Proteinen grosse
Bedeutung
haben
Aufgrund
sind
Strukturen
in
ihrer
gehalten wird,
Z-DNA in
[58].
konnte Z-DNA sowohl in
Antikörpern nachgewiesen
Transkriptions-aktiven
Transkription
Eukaryonten
Auch für eine
durch
die
Spaltung
mit DNasel in einer
[56].
während
Insgesamt liegt
der lokalen Unterschiede in der
zwischen
3
 (zum
Histon
Wechselwirkung
werden.
biologischen
Da
Bereichen des
bei
mit
man
an, dass
durch
A-artigen
TATA-Box-Bindungs-Proteins
gewisse
erkennen.
als auch in
beobachtet
die
Z-DNA
wurde
und
heute, dass
vermutet man
DNA-Formen hat
Prokary-
man
induziert
heute erste
Proteine wie Restriktionsendonukleasen
Gesichert
Desoxyribonuklease
I
ist,
dass
ein
Oktamer,
(DNasel) resistent ist,
Konformation kristallisiert
mit seiner
sehr
Prozessen relevante
Eukaryonten
Genoms
RNA-Polymerase inhibiert,
teilweise
Trennung aufeinanderfolgender RNA-Polymerasen
A-artige DNA-Konformationen
der
werden können,
Eukaryonten
biologische Bedeutung A-artiger
Hinweise [38]. So nimmt
gegenüber
Dieses Phänomen
biologischen Bedeutung
DNA-Form
Z-DNA die
GC-reichen
[57].
Obwohl B-DNA für die in den meisten
besonders in
in
der unterschiedlichen DNA-Strukturen
Bedeutung
mittels
zeigt
Dies kann bei der
umstritten.
onten
Histonfläche
wird die Helix etwas
ist.
aufweisen
Hauptfurche
wegzeigend).
der
die Nebenfurche enger ist und
Regionen
vor.
zu
den Histonen, während in AT-reichen
Konformation variiert auch die Breite der Nebenfurche
vorgestellten
eines
Kontakte der Histone mit
So
Sequenzpräferenzen.
Argininen ausgebildet
zu
Beugung
diese
wenn
Wechselwirkungen
die Nebenfurche den Histonen
GC-reiche
Die
über das
die Histone wird dadurch verstärkt,
binden,
nach innen
Hauptfurche
stärkere Salzbrücken
1.1.4
Gruppe
Umdrehung
helikaler
pro
umfangreiche hydrophobe
entstehen lokale
deswegen
und 9
hauptsächlich
wird
und
vor
gebunden:
wird dadurch erklärt, dass in AT-reichen
zeigend)
DNA durch die
aufeinanderfolgende Phosphodiestergruppen Wasserstoffbrücken
Desoxyribose beobachtet. Aufgrund
es
gebundener
Seit
bp [55].
ist die Konformation der DNA auf den Nukleosomen
Ausserdem wurden
entwunden und
Histonproteine H2A, H2B,
wiederholt sich alle 200 ± 40
in der B-Form
liegt insgesamt
Sie
Argininseitenketten
dass
[56]
der ETH
Histonproteinen
den
aus
der Struktur eines Nukleosoms mit
Phosphodiesterrückgrat
Stranges
das
Dieser
gebildet wird.
H3 und H4
bekannt.
gewickelt,
1
Zielsequenz,
[59].
der
im
das
Komplex
Auch im Kokristall des
TATA-Box,
wurde
eine
Kap.
1
8
A-artige
zwar
DNA-Form beobachtet [60-62]. Generell wird heute angenommen, dass A-DNA
für die
Transkription unbedeutend,
aber dennoch
1.2 DNA-Schäden und ihre
biologisch relevant ist [38].
Bedeutung
Einführung
1.2.1
Als erkannt
wurde, dass DNA das Speichermedium der Erbinformation ist, wurde die
DNA zunächst für ein ausserordentlich stabiles Molekül
die
keineswegs
dass dies
allerdings klar,
Primärstruktur
der
Austausch
gezielten
tischen Zellen
tatsächlich
DNA
ist.
Umwandlung ausgesetzt
gibt
So
Evolution förderlich betrachten
Das
Bei der
die
der
dass die DNA in einem
ständige und
von
effiziente
DNA führt
repariert
zu
werden.
"Springen
Häufigkeit
einer
Fehlpaarungen,
nicht
möglich
die schon während der
Verschiebungen
Doch damit nicht genug:
wie die
Deaminierung von Cytosin
Adenin
zu
Depurinierungen
5
Krankheit in
Guanin
Tag
wie die
weit
durch Brücken
von
Cytosin
an
verbreitet,
A»C-Paarung
beschleunigt
Deaminierung
von
aus
zu
neuen
erkannt und müssen
2'-Desoxyuridin
statt
zu
Depurinierungen
Häufigkeit
führt
zu
gegen den
Wassermolekülen stabilisiert werden
[66],
Thymidin
von
Fehler,
Thymin,
und
von
Depyrimi-
2000 bis 10000
sichelzellförmigen
statt
runden
Dennoch ist
die
Malaria-Erreger resistent macht.
aber auch seltenere wie die C»U-, die
biologischen
Stranges
einer G»T- oder einer
das Häm ist merklich verschlechtert.
und Guanin in der DNA
entdeckt,
[67].
Hämoglobins
Träger
[64].5
weitere spontan auftretende
Xanthin.7
da sie den
das in zahlreichen
des
Methylcytosin (m6C)
und Zelle eines Menschen
Sauerstoffbindung
Malariagebieten
Vermutlich
zu
gibt
es
rechtzeitig
abasischen Stellen und dies mit einer
pro
Die
Fehlpaarungen,
Paarung können
7
Uracil,
zu
Die bei dieser Krankeit veränderte Form des
Blutkörperchen.
6
von
Es
auftritt
wurde schnell
Synthese
kann
Teil nicht
zum
hierfür ist die
Vervielfältigung
Fälschlicherweise kann auch
zu
noch als der
Bereits die
wäre.
später repariert werden.
und
man
dass ohne eine
Diese werden
führen
konstanten
geschädigt wird,
A«C-Paarung kommen.6
dierungen
einer
Beispiel
einzigen Aminosäure
Mutationsprozessen,
von
Reparatur Leben
Hypoxanthin
Genen" kann
von
starken Mass andauernd
so
Durch tautomere
eingebaut werden.
lernen, dass
spontane Mutationen als auch den
beobachtet. Das bekannteste
aufgrund der Mutation
Untersuchung
und
dynamisch
man
[63], bei Spontanmutationen wurde aber oft eine für den
Organismus ungünstige Auswirkung
Sichelzellanämie,
sehr
sowohl
es
Vielmehr musste
[3].
Genen, der sowohl in prokaryontischen als auch eukaryon-
von
beobachten ist.
zu
der Fall ist
Mit der Zeit wurde
gehalten.
m^G«U-
und die
m^G»G-
[65].
Prozessen involvierte Stickstoffmonoxid die
Kap.
9
Neben diesen Schäden
gibt
werden. Darunter fallen
können diese
aggressiven
DNA
zur
Enzyme
Wasserstoff¬
Substanzen
[69]
wie Vitamin E und C
Radikalfängern
Spermin [70] abzubauen,
eventuell sogar
oxidativ
und
Enzymen [68]
von
Wasser durch die
zu
Obwohl die Zelle versucht, diese
peroxid und Hydroxylradikale.
mit Hilfe
Sauerstoff
von
den Stoffwechsel in der Zelle
Nebenprodukte ständig Singulettsauerstoff,
entstehen als
Atmungskette
der
Schäden, die durch
allem die
Bei der Reduktion
werden.
hervorgerufen
weitere Defekte, die durch äussere Einflüsse verursacht
es
vor
1
gelangen
sowie
und
sie
schädigen.8
hervorgerufen.9
Weitere Schäden werden durch Umwelteinflüsse
Hierzu
gehören
sowohl
Schäden, die durch Strahlung hervorgerufen werden, als auch Schäden, die durch den
Angriff
Chemikalien
von
Strahlung gibt
sowohl direkte
es
Basen als auch indirekte
ionisierender
AU
auf die DNA entstehen
es
häufig
[74,75]. Dies
alle
kann
unreparierten
wird
nur
die
führen.
einer
zu
zu
Entartung
Schäden führen
zum
die
einem
Mutationen, die
Verlust
Verkürzung dieser,
zur
zu
Funktionsfähigkeit
chondrialer DNA
DNA
zu
den
durch
Schädigung
photochemische
Angriff
wichtigen
Reaktionen der
Radikalen, die
von
zum
der Zelle
Veränderung
zu
von
In sehr vielen
nicht
Entartung
So kann die
Replikation wichtigen
langfristig
und
blockiert,
der Erbinformation führen
zur
eingeschränkt.
Diese Prozesse führen mutmasslich
Replikation
einer Tumorzelle führen
Mitochondrien und die
für die
der
DNA-Replikation
direkten Tod oder
der Zelle
von
einer
Prozesse
Informationsverlust.
ständigen
Falls der Schaden die
Fällen resultiert der Zelltod.
kommt
durch
der
werden.
beeinflussen
und führen
Transkription [73]
durch
Schädigungen
Strahlung erzeugt
diese DNA-Schäden
Schädigungen
Bei
[7].
[76].
Nicht
der Zelle.
Schädigung
Schädigung
Oft
mito¬
der telomeren
Enden der Chromosomen
zum
Altem des betroffenen
Organismus [77].
1.2.2
Um
zu
Darstellung geschädigter DNA-Fragmente
verstehen, wie Schäden die Struktur der DNA beeinflussen und ob sie bei der
Replikation von
DNA
zu
einem
Stop
der
Replikation
oder
zu
einem Einbau eines Fehlers
führen, haben sich Chemiker und Biochemiker darum bemüht, derartige Schäden
synthetisieren und
8
Eisen-(II)-ionen eingebaut
fängern abgefangen
9
Zellen entweder
Frenkel und Klein
wurden [71].
entstehen,
Sie können dann nicht
wenn
in
rechtzeitig
Zinkfmgern
von
Radikal¬
werden.
Oxidative und durch Umwelteinflüsse
geschädigter
Oligonukleotide darzustellen.
können vermutlich auch lokal in der Nähe der DNA
Hydroxylradikale
statt Zinkionen
Schäden-enthaltende
zu
geben über
hervorgerufene
DNA-Schäden werden nach Isolation der DNA
chromatographisch, elektrophoretisch oder immunologisch nachgewiesen.
diese Techniken eine gute Übersicht [72],
10
1
Kap.
Prinzipiell
werden dabei drei Methoden
und
synthetisiert
Synthese
zur
geschädigte Oligonukleotide
von
im
und die
oder
Spektroskopie
Aufklärung
man
die
ermöglicht
der Struktur mittels NMR-
Da DNA-Schäden aber oft
Röntgenkristallographie.
Basen oder Säuren sehr instabil
Dies
herstellen.
Milligrammassstab
Schadens
Dabei kann
Oligonukleotiden eingesetzt.
physikochemische Charakterisierung
des
Phosphoramidite
werden
Totalsynthese
Bei der
Totalsynthese:
•
eingesetzt [78]:
gegenüber
sind, lassen sich nicht alle DNA-Schäden auf diese
Weise darstellen.
Modifikation
•
eines
Oligonukleotids:
nur
zu
in
niedrigen
kann oft
geschädigt
nur
werden kann.
Schaden nicht noch anderen
gebildete
sich
zum
ortsspezifischen
milden
sehr
Reaktionsbedinungen ausgesetzt
die
nur an
ist, dass der
Der Vorteil dieses Verfahrens
Einbau modifizierter Nukleotide nutzen.
das
Reaktionsbedingungen
ist die Gesamtausbeute derart
Allerdings
Sequenz eingesetzt werden,
werden
muss.
[79,80]: DNA-Polymerase und T4-RNA-Ligase lassen
Enzymatische Synthese
•
eine bestimmte
meist aber
Um eine hohe Reinheit
Ausbeuten und/oder nicht sehr rein erhalten.
gewährleisten,
einer Stelle
geschädigte Oligonukleotid
Dabei wird das
nachträglich gezielt schädigen.
lassen sich manchmal
Oligonukleotide
biologische Untersuchungen
nutzen
kann.
sehr
Addukt
dass
gering,
Dabei kann unter
präzise plaziert
man
die Methode
Auch ist die Zahl der als
werden.
für
nur
Triphosphate
einsetzbaren, geschädigten Nukleotide sowohl wegen der chemischen Zugänglichkeit
als auch wegen der
Notwendigkeit
ihrer
Erkennung
durch die
DNA-Polymerase
beschränkt.
Im
folgenden
hang
werden die bekanntesten DNA-Schäden
wird auf ihren Einbau in
bezüglich
1.2.3
der
biologischen
Schädigung
Oligonukleotide
und strukturellen
und die daraus resultierenden Erkenntnisse
Bedeutung eingegangen.
durch Chemikalien
Bestimmte Chemikalien bilden Addukte mit DNA.
reaktiven
gen,10
wie
Agentien
Benzochinonen und
nicht-kovalent
10
Nitrosoverbindungen
11
Chlorpromazin
eingesetzt.
an
Dabei ist
vor
allem der
gewissen Halogen-haltigen Verbindungen,
Epoxiden
die Furocumarine (Psoralene und
zuerst
In diesem Zusammen¬
vorgestellt.
von
Bedeutung.
Daneben
Angelicine) [82,83]
die DNA-binden und dann
und
gibt
Gocke
Nitrosoverbindun¬
es
Chemikalien wie
die
photochemisch mit DNA reagieren.
entstehen auch in vivo durch Reaktion
von
von
Chlorpromazin [84],n
von
Stickstoffmonoxid mit Aminen
und verwandte Phenothiazine werden seit über 40 Jahren als
Ihre Phototoxizität wurde
Angriff
zusammengefasst [85].
psychotrope
[81].
Medikamente
Kap.
11
Angriffspunkte
1.2.3.1
für
Chemikalien
insbesonders
Alkylierende Reagentien greifen bevorzugt Purinnukleoside,
guanosin
an
cw-Platin
[86,87],
So wird die
(Abb. 5).
Aflatoxin Bi addiert ebenfalls
auch
aber
die
an
N(7)-Position
bevorzugt
N(7)-Position
von
Guanin
von
Rutheniumkomplexen
und
[88-90],
1
an
N(7)-Position
die
Adenins
des
Stickstoffsenfgasen
[91,92]
angegriffen.
des Guanins
[95].
addieren
Desoxy-
[93,94], kann
TV-Nitroso-iV-methyl
-
harnstoff, Methyl- und Ethylmethanesulfonat sowie Dimethylsulfat reagieren ebenfalls
bevorzugt
mit der
Sauerstoffe
0(6)
des
N(7)-Postion
von
Guanins, können aber auch die exozyklischen
Guanin, 0(2) und 0(4)
Thymin
von
sowie
N(3)
von
Adenin und
Cytosin alkylieren [96-98].
N(6):
Arylhalogenide,
Benzo[a]pyrenemetaboliten
^
N(7):
Aflatoxin
B-i <^.
O
^NN-H
N-
//
u
kleine
O
-
n
N(3):
alkylierende Agentien
/
s>
C(5)=C(6):
Furocumarine
X
\
.._
alkylierende Agentien
[1
JJ-
H
^
drib
kleine
0(4):
<\
drib
NC):
^
Arylhalogenide N>
0(2): k|eine alkylierende
Arylhalogenide
Agentien
a
N(7):
alkylierende Agentien,
Arylhalogenide, Stickstoffsenfgase,
Cisplatin, Rutheniumkomplexe,
kleine
Benzo[a]pyrenemetaboliten,
Aflatoxin B^ ,Vinylchlorid
0(6):
kleine
alkylierende Agentien
/?
H *7
U\fl
N(4): Arylhalogenide, Halo(thio)ketene,
Benzoralovrenemetaboliten
Benzo[a]pyrenemetaboliten
C(8):
A/-Acxetoxyacetyl-
,
aminofluorene,
Chlorpromazin
^
O
m
H-N
({
^ x)
^^// xN-h
drib
\|=/
N-H
/}—\
N ^
N\
,\—n
\jrib
O
N(3): kleine alkylierende Agentien,
Arylhalogenide
H
/
N(2):
Arylhalogenide, Mitomycine,
Benzo[a]pyrenemetaboliten,
Adriamycin & Derivate, Halo(thio)ketene,
/V-Acetoxyacetylaminofluorene
Abb. 5:
Die
Angriffspunkte
für
alkylierende Reagentien.
exozyklische Aminogruppe (N(2))
und vielleicht auch
von
Guanin kann durch
Adriamycin [101] alkyliert
werden.
Die
Mitomycine [99,100],
Epoxidmetabolite
von
1
Kap.
12
aromatischen Kohlenwasserstoffen
polyzyklischen
exozyklische Aminogruppe
die
endocyclische Aminogruppe N(7)
ketene
7.0
unter
Positionen
Manche
addieren
und
an
die
an
Haloketene und HalothioGuanin und
von
Cytosin
Acetylarmnofluoren-JV-sulfat reagieren
Sulfats effizient mit den
und
N(2)
an
bei
C(8)
Guanin [107,108].
von
Alkylierungsreagenzien
wie
Vinylchlorid (zur Toxikologie
Vinylchlorid
von
[109]) und seine Metaboliten, Acrolein und Malonaldehyd reagieren mit zwei
siehe: Giri
Stickstoffatomen und bilden
Die
und
Cytosin
und
exozyklischen Aminogruppen
des Acetats bzw.
Abspaltung
Guanin
Guanin [102-105].
von
A^-Acetoxy-acetyl-aminofluorene
[106].
pH
ebenfalls die
greifen
Adenin,
von
(Benzo[a]pyrenen etc.)
Alkylierung
an
der
der Base und somit
zu
zyklische Etheno-
oder
N(7)-Position des Guanins führt
einer
apurinen
Stelle.
Diese
spontan auftretenden Depurinierung (siehe 1.2.5).
matisch sind
Propanoaddukte [110,111].
alkylierende Reagentien,
vor
allem
Eliminierung
Schädigung entspricht
Für die
Reparatur
die zwei reaktive Zentren
DNA-Einzelstränge verknüpfen können.12
einer
zu
Hierzu zählen
daher einer
besonders
proble¬
aufweisen, da diese die
Stickstoffsenfgase, ds-Platin,
Furocumarine, Mitomycine, Nitroacridine, aber auch Formaldehyd [113].
1.2.3.2
Darstellung
Oligonukleotiden
von
Viele dieser DNA-Addukte wurden
bislang
durch direkte
mit
Umsetzung
eines
Oligonukleo-
Gewisse DNA-Addukte
(4-0-Methyl-
tids mit dem
schädigenden Reagenz dargestellt.
thymidin
2-O-Methylthymidin [114], 4-O-Ethylthymidin
[115])
tide
und
konnten auch als
eingebaut
werden.
Phosphotriesterfür
biologische
Triphosphate
und
Für
einige
ortspezifischer Mutagenese
der DNA-Addukte wurden
physikochemische
wurden 1 ,Af(6)-Ethenoadenosin
[116]
4-ö-Isopropylthymidin
und
Phosphoramiditmethoden Oligonukleotide
und für
triestermethode in
mittels
Alkyladdukten
und
Studien
dargestellt.
Mittlerweile sind
Oligonukleo¬
mittlerweile über die
mit definierter
Sequenz
Als erste DNA-Addukte
4-O-Methylthymidin [117]
Oligonukleotide eingebaut.
in
über die
Phospho-
6-OAlkylguanosin [118-
121], l,#(2)-Ethenoguanosin [122], Benzochinonaddukte [123,124] und Addukte poly¬
zyklischer
Adenosin
aromatischer Kohlenwasserstoffe
[125-127]
sowie
Phosphoramiditsynthone
Ausserdem wurden
mit Hilfe der
12
Reagentien,
Ein
ein
oder
deren
Psoralenmonoaddukt
synthetisiert
Modellverbindungen
und
in
Epoxide
an
Guanosin
und
Thymidin [128-130]
als
Oligonukleotide
für die Acroleinaddukte
von
an
eingebaut
worden.
2'-Desoxyguanosin
Phosphoramiditchemie in Oligonukleotide inkorporiert [131,132].
die die beiden
Übersichtsartikel
von
DNA-Stränge verknüpfen,
Rajski
werden als Antitumor-Medikamente
und Williams beschreibt die
wichtigsten Verbindungen [112].
eingesetzt.
Eine Ausnahme bilden die
aufgrund
zu
N(7)-Addukte des Guanins und auch
positiven Ladung
der
am
nicht stabil genug,
N(7)
Manche dieser Addukte könnten aber in der
werden.
sein, da sie sich in ihren mutagenen Eigenschaften
Um zumindest etwas über die
lernen,
wäre
Diese sind
als Bausteine
dargestellt
DNA-Doppelhelix
stabilisiert
um
Stellen unterscheiden.
apurinen
und
darzustellen
analogen N(7)-Carbapurine
die
notwendig,
es
von
des Adenins.
dieser Addukte auf die DNA-Struktur
Auswirkungen
1
Kap.
13
zu
als
Phosphoramidite in Oligonukleotide einzubauen.
Untersuchungen
1.2.3.3
Dank der
Zugänglichkeit
Destabilisiemng
Spektroskopie
der
NMR-Spektroskopie
und
bezüglich
Dabei wurden drei
In
Abhängigkeit
epoxidierten Ring
die
Doppelhelix.
Basenstapel
bindet der
bezüglich
Epoxide polyzyklischer
ihrer strukturellen
Auswirkungen
grundlegende Anordnungen
der modifizierten Base und
von
Polyaromat
der
CD-
von
aromatischer
intensiv studiert
des Aromaten
zur
DNA
den Stereozentren
von
am
entweder in die Nebenfurche oder interkaliert in
er
entweder eine Base
verdrängen
oder den
aufweiten [140]. Es ist aber noch nicht ganz verstanden, ob die beobachteten
einzig möglichen
geklärt,
Aufgrund
der Interkalation in
al. [141,142]
warum
den
Nachträglich
Die
Alkyladdukte
vor
allem in
des
zu
keiner
ihre
Eigenschaft,
induzieren, hin untersucht.
dynamischen
Stabilität der
Paarungen13 [145]
N steht stellvertretend fur
eine
der
zu
Daher ist auch
Karzinogene
Es
sind als andere [140].
auf
wurden
zeigte sich,
Verzerrung
und des
A
—>
Man
A«T°Me bzw.
korrelieren
beeinflussen.
ebenso
von
grosses
Spielmann
dass sowohl Mono- als
der B-DNA und
Entwindung
G
2'-Desoxyguanosins (G0Me)
Basen
um
[143,144] bzw.
G
—>
wurden
A-Transitionen
hoffte, die Mutationen mit der thermo-
G«T0Me-Paarungen [117]
oder der
G0Me«N-
können, fand aber keinen direkten Zusammenhang.
vier
et
der Helix führen.
Biegung
Thymidins (TOMe)
Bezug auf
Gleichgewichtes
Oligonukleotide
untersucht.
auch Bisaddukte des Psoralens eine lokale
eines
häufigsten
sind Psoralene
Basenstapel
modifizierte
NMR-spektroskopisch
25-34° bewirken, aber
die
nur
manche Addukte stärkere
noch nicht
Interesse gestossen.
oder
DNA-Protein-Wechselwirkungen
darstellen und wie sie
zu
der Addukte
einige
untersucht werden.
Bei der Interkalation kann
Konformationen die
[115]
konnten
Benzochinon und der
von
Kohlenwasserstoffe wurden
gefunden.
Phosphoramidite
und ihres strukturellen Einflusses auf die DNA mit Hilfe
Vor allem die Addukte
[133-139].
Oligonukleotiden
modifizierten
an
A, C, G oder T.
Kap.
14
1
Die meisten Schäden führen
Polymerase und
damit
zu
einer teilweisen oder
zu
einem
Stop
blockieren auch die
Transkription
dass
Ausserdem wurde beobachtet,
Bindung
oder
Nukleosomen führen
entsprechend
und
alle
Singulettsauerstoff, Hydroxylradikalen
und
Diese
oxidativen
Schäden
sowohl
entstehen
Spezies
durch
Mutagenese, Carcinogenese
Strahlung
Wasserstoffperoxid
Reduktion
die
auch Radikale erzeugt, die
hier ebenfalls
Die
wichtigsten
dargestellt.17
Hydroxylradikale,
oxidativen Schäden der
Angriff
eines
isoguanosin 9,
14
Für einen
15
16
[156,157].
Da
Schäden
2'-Desoxyguanosin
bezeichneten
an
die
5
auch
zur
Transkription
Fe(II)-Komplexen in Hydroxylradikale überführt,
Peroxynitrit reagieren kann.
zur
Bildung
Dieses zerfällt nach
entsteht das
Fe-(II)-
2'-Desoxyman
das
[73]. Für Informationen über
[7].
Wasserstoffperoxid
die DNA
wie dem
Ausserdem kennt
siehe: Gniazdowski & Cera
der einzelnen Addukte siehe: Hemminki et al.
Stickstoffmonoxid trägt ebenfalls
6
2'-Desoxyadenosin
Systemen
2-Hydroxy-2'-desoxyadenosin genannt.
Übersichtsartikel
und
Abbildung
[158,159] und 6 sowie die
Wird DNA mit
7 und 8.
sind in
C(8)-Position die als 8-Hydroxy-
Verbindungen
Vermutlich werden sowohl Sauerstoffradikale als auch
mit
den
oxidativen Schäden führen, als
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) behandelt,
biologische Bedeutung
die
in
Die Schäden können in
2'-Desoxypurinnukleoside
Hydroxylradikals
Formamidopyrimidinnukleoside
von
oxidativen
der
8-Oxopurinnukleoside
Komplex
zu
[6,151].15
Sauerstoff
Zellen involviert sein
die
von
anderen Schäden führen, werden solche Radikalschäden
Aus den Purinnukleosiden
entstehen durch
oder
zu
von
Angriff
entstehen
von
Strahlung.16
den
vorgestellt.
Strukturen
1.2.4.1
und in das Altem
sowohl
durch
die
Schäden,
Mitochondrien [154] als auch durch ionisierende
ionisierende
der
Stabilisiemng
einer
zu
unspezifischen
einer
zu
Transkripts.14
des
und Radikalschäden
gehören
den
DNA-Addukte
grosse
Länge
Addukte
[150].
1.2.4 Oxidative Schäden
Zu
zumindest die
und als Referenz in
vorgestellten
Die meisten der
verringern
DNA-Bindungsproteinen
von
Aminofluoren-Addukte inhibieren
Bypass-Studien
Replikationsstudien eingesetzt werden [146-149].
Blockade der DNA-
vollständigen
Replikation.
der
derart effizient, dass sie für
DNA-Synthese
die
der Addukte
Biologische Bedeutung
1.2.3.4
durch eine Fenton-Reaktion
angreifen [152,153].
oxidativer Schäden
Protonierung
bei,
da
es
mit
in Stickstoffdioxid und
Superoxid
zu
Hydroxylradikal
[81,155].
17
Der exakte Mechanismus der
Bildung
gut beschrieben^]. Er wird daher hier
der meisten dieser
nur
Verbindungen
grob wiedergegeben und
wird
von
Breen &
nicht schematisch
Murphy
dargestellt.
sehr
Kap.
15
10 als ein
4,8-Dihydro-4-hydroxy-8-oxo-2'-desoxyguanosin
[160,161].
hervorrufen
Abb. 6:
Isolierte oxidative Schäden der
Hydroxylradikale
entweder
der
an
können
C(5)-
die
ist
ausserdem
14 bzw. die
gebildet (Abb. 7).
Hydroxidions
zur
nukleoside 17 und 18.
Bildung
der
eine Addition des
werden
nur
Thymidin
und beim
aus
an
werden die
so
der
Methylgruppe
2'-Desoxy-5-hydro-
6-Hydroxy-5,6-dihydropyrimidin-
12 und 13, das
der
abgegeben,
kommt
es unter
15
Addition
5,6-Dihydroxy-5,6-dihydropyrimidin-2'-desoxy-
Wasserabspaltung
aus
dem
Pyrimidinradikals
Cytosinderivat
19 und 20
an
führt auch
zur
(Abb. 7).
Sauerstoff mit anschliessender
der DNA, entstehen instabile Zwischenstufen mit einer
oc-Hydroxy-ß-hydroperoxygruppe.
folgenden
Thymidin
5-Hydroxymethyl-pyrimidin-2'-desoxynukleoside
Bildung
Die
Beim
H-Abstraktion
Wird aber ein Elektron
Abstraktion eines H-Radikals
sind
eine
5-Hydroxy-pyrimidin-2'-desoxynukleoside
Erfolgt hingegen
Im
angreifen.18
Wird anschliessend ein H-Atom abstrahiert,
2'-desoxynukleosid
und
Pyrimidinnukleoside 2'-Desoxycytosin
xy-5,6-dihydropyrimidinnukleoside
eines
Purin-2'-desoxynukleoside.
C(6)~Position
oder
5-Methyl-2'-desoxycytosin
bzw. 16
Säure die
Oxidationsschadens, des 2'-Desoxyoxanosins 11
eines bisher unbekannten
Bildung
Photooxidations-
salpetrige
Kürzlich wurde entdeckt, dass Stickstoffmonoxid oder
produkt.
möglich.
wichtiges
1
Diese
reagieren
die isolierten Produkte beschrieben.
aufgrund beschleunigter Deaminierung bisher
zu
den
5-Hydroxy-hydantoin-
Viele denkbare Produkte des
nicht isoliert worden.
Cytosins
Kap.
16
1
2'-desoxynukleosiden 21
2'-desoxynukleosiden
und 22 oder
wie 23 ab. Das
zu
analoge
5,6-dihydropyrimidin-2'-desoxycytosin,
Dabei wird das
anschliessend.
kann leicht
Cytosins, 5-Hydroxy-6-oxo-
Es tautomerisiert und deaminiert
ist instabil.
5,6-Dihydroxy-2'-desoxyuridin
24
Auch 23
gebildet.
2'-Desoxyribosylharnstoff
Durch ionisierende
26.
2'-Desoxyribosylformamid
27
Derivat des
Dabei bilden sich der
hydrolysieren.
5,6-Dihydrothymidin
5-Hydroxy-6-oxo-5,6-dihydropyrimidin-
den
25 und das
entsteht ausserdem das
Strahlung
(Abb. 7).
OOOO
HN^f
Hr<^
Hrsl^Y
Ö^tT
r>r
O^N^"OH
HN-^Sr"
O^ N
H°V"-OH H0V^bH H°VH'oh
OH
15
14
NH2
O
hxj::°°h HÄ0H
HXJ~
•V
"OH
H°-/
OH
17
JL
°^n\h
OH
19
0H
27
20
OH
oAAo
N'
HOx/S
HOV^nH
'OH
18
P
rr0H
0^
o^n-^oh
NH2
°^NH
H
°^NH
°^>
H°V^'OH
R
=
CH3:
21
R
=
H:
22
Abb. 7:
Isolierte oxidative Schaden der
Sowohl bei Purin- als auch bei
C(5')-Position
stattfinden.
C(8)-Position angreifen,
(Abb. 8).
Pynmidm-2'-desoxynukleoside.
Pyrimidinnukleosiden
Anschliessend kann das
wobei sich die
kann eine H-Abstraktion
C(5')-Radikal intramolekular
polyzyklischen Verbindungen
Daneben kann die Abstraktion eines H-Atoms
Isomerisierung
in die oc-Anomere
untersucht werden
[162].
am
28-31
anomeren
an
der
an
der
bilden
Zentrum
zur
führen, die entsprechend auch als DNA-Schäden
Kap.
17
Polyzyklische
Abb. 8:
oft
schädigen
zu
aber nicht
So führt das
[163].
ren
DNA-Schäden
Strangbrüche
1.2.4.2
Radikale
nur
die Basen, sie können auch
5,6-Dihydrothymid-5-yl-radikal
nium(IV)-
und
Osmium(IV)-Komplexe [168]
Daneben kennt
die Wasserstoffatome
dungen,
einleiten [170], sowie
rückgrat alkylieren
aus
Reagentien
und dadurch
Darstellung
1.2.4.3
einem
Strangbruch
in Anwesenheit
von
füh¬
Sauerstoff
zu
Studien in
Alkyladdukten
man
wie
führen
Strangbrüchen
Untersuchung
von
von
Verbin¬
Strangbruch
die das
Phosphat¬
mit
Radikalschäden
Daher konnten bisher
Phosphoramidite synthetisiert und für physikochemische
kaum durch
abschliessend verwendeten
der Bleo-
[171].
empfindliche Verbindungen.
Oligonukleotide eingebaut
gering.
Endiine als eine Klasse
Pyrrolo[l,2-a]benzimidazole,
nachträgliche
werden.
Die
bisher
und
Gegensatz
zu
Oligonukleotids erzeugt
biologischen Konsequenzen
sind in Tabelle 2
eines ein¬
und
die
aufgeführt.
Zur
synthetisierten Phosphoramidite
Entschützungsbedingungen
Strangbrüchen
Da sie aber im
Modifikation des
werden können, sind auch die Kenntnisse über die
Schadens
Eisen-(II)-komplexe
Oligonukleotiden
von
nicht alle dieser Schäden als
sowie die
Chrom(V)- [167], Ruthe-
wie
der DNA abstrahieren und dadurch den
Die oxidativen Schäden sind oft sehr
biologische
Metallkomplexe
werden aber auch durch
mycine hervorgerufen [169].
zelnen
zu
Strangbrüchen [164-166].
Strangbrüche
den
31
30
fl-29
28
1
wurden ausserdem Vorstufen für Radikale
synthe¬
tisiert, die als Phosphoramidite in Oligonukleotide eingebaut wurden. Als solche Vorstu¬
fen dienen die
und
von
Phosphoramidite
von
5,6-Dihydrothymid-5-yl-isopropylketon
4'-Pivaloyl-modifiziertem Thymidin
Vorläuferverbindung
siehe
Kap.
1.2.5.1
33
(Abb. 11).
[193] (Abb. 9).
Für
32
[165]
eine weitere
18
1
Kap.
Tab. 2:
Übersicht über bisher als Phosphoramidite in Oligonukleotide eingebaute oxidative Schäden
Schutzgruppe an der
geschädigten Base
Schaden
Schutzgruppentyp
anderen
EntschützungsbedingungenM
der
Literatur
Amidite^
PURINSCHÄDEN
5
Standard-Amidite
Me2NCH=N(2)
6
Pac
(N(6))
Me2NCH=N(6)
9
10
Ac
(N(2)),
Ac
NH4OH,
Pac-Amidite
RT, 2h
[173]
60°C, 48h
[174]
Pac-Amidite
NH4OH, 55°C, 14h
[175]
l.Pd°, pH 5.5 [176]
[177,178]
NH4OH,
NH4OH,
Bz-dA
(0(4))
[172]
0.1 M EtSH, 55°C, 6h
PYRIMIDINSCHÄDEN
12
Aoc
Aoc-Amidite
15
TBDMS
Standard-Amidite
2. hv
(Abspaltung
1.
12h
NH4OH, 60°C,
2. 80%
CPG)
von
15
Ac
Standard-Amidite
16
CNCH2CH2
Standard-Amidite
19
Ac
Pac-Amidite
19
Ac
n.
a.
NH4OH, 60°C,
5h
20
Ac
n.
a.
NH4OH, 60°C,
5h
21
-
26
-
27
NH4OH, 60°C,
12h
[180]
NH4OH, 65°C,
60h
[181]
4h
[183]
K2C03/MeOH, RT,
Pac-Amidite
-
25
-
NH4OH,
[182]
[184]
[184]
RT, 5h
[185]
Pac-Amidite
NH4OH, 20°C,
5h
[186,187]
Pac-Amidite
NH4OH, 20°C,
6h
[187,188]
Pac-Amidite
-
[179]
HOAc, RT, lh
NH4OH,
RT, 2h
[189]
BIZYKLISCHE SCHÄDEN
S-29^
Bz
Ac-dC, Bz-dA, iBu-dG
NH4OH, 55°C,
17h
[190]
RADIKALVORLÄUFER
32
33
a:
nurdT
-
n.
Standard-Amidite
-
Standard-Amidite sind Bz-dC, Bz-dA und iBu-dG.
Ac-dC bzw. iBu-dC.
NH4OH,
[165]
a.
55°C, 15h
[191]
Pac-Amidite sind Pac-dA, iPr-Pac-dG bzw. Pac-dG,
Letztere sind bei Pharmacia erhältlich.
Aoc-Amidite tragen Allyloxycarbonylabgespalten werden [176,192]; n.a.: nicht angegeben, b: NH4OH: konzentrierte
Ammoniumhydroxidlösung, c: Das biologisch relevantere Ä-Isomer konnte nicht erhalten werden.
gruppen, die mit Pd°
O
H
AP>-
diten in
HO.
N
dass die meisten dieser Schäden
den
Oligonukleotide eingebaut
ÖH
Vorteil, dass
milden
Bedingungen
Dadurch können
32
Abb. 9:
33
Vorläufer für Radikale
gegenüber
die
werden.
werden konnten.
den Standardamiditen
Schutzgruppen
labilere
Schäden
oxycarbonylgruppe (Aoc) zurückgegriffen
Pd-(0)
bei
pH
5.5 entfernt werden
[194].
eingebaut
In einem Fall musste sogar auf die
Diese kann unter äusserst milden
sehr
unter
entfernt werden können
auch
nur
Phenoxyacetyl-(Pac)-Ami-
von
Diese Amidite haben
O
0^
zeigt,
Verwendung
unter
HN
O^
ÖH
Tabelle 2
O
\
Alfyl-
werden.
Bedingungen
[176,192].
mit
Kap.
19
Untersuchungen
1.2.4.4
8-Hydroxy-2'-desoxyguanosin
Von den oxidativen Schäden ist das
besten untersuchte Schaden. Da sowohl
merasen
DNA-Polymerasen Desoxycytosin
als auch mitochondriale
der
Stabilität
ein stabiles
Desoxyadenosin
dieses
und dass
Basenpaar
auch
Basenpaar
8HOdG»dC-Basenpaar.
Eine
durch
Schadens
im Falle der
guanosin
im Falle der
für die
Paarung
Glykosylase
mit
Paarung
mit
Verzerrung
Untersuchung
Desoxycytosin gibt
2'-Desoxycytosin
nur
auch
siehe
(MutY,
die
mit
Paarung
Gegenstranges
mit dC das
Ausserdem wurde
Bestrahlung
Spot"
für
von
geschädigter
DNA sehr schnell
betrachtet
dem
Ansonsten sind bisher
Daher
ist
vor
vor
wenig
allem
allem
2'-Desoxyguanosin
und
die
vorhanden.
des
Fehlpaarung
8HOdG*dA.
dass erst nach
Neusynthese
die
so
Die
Eine andere
endgültig
beheben kann
[202].
zu
G
Es wird daher als
2-Hydroxy-2'-desoxyadenosin,
untersucht
oder ein
erklärt
den
A und G
Untersuchung
2'-Desoxycytosin
—»
zur
Fehlpaarung
häufig
der
beobachteten
Einbau
Zeit
Wichtig
mit
Die
von
thermodynamischen
ist aber, dass
Charakterisierung
von
zu
Replikation.
es
T Transitionsmutationen kommt
und
das
Watson-Crick-Basenpaar.
Daten über die strukturellen und
—»
"Hot
Die Tauto-
[204].
Sie verursacht bei der
der beschriebenen Schäden bekannt.
oxidativer Schäden
Erkennung
Desoxycytidin [201].
2'-Desoxyisoguanosin während
nur
von
8-Hydroxy-2'-desoxy-
Enzyme
depuriniert.
wurde
"WoM?/e"-Basenpaar
mögliche Watson-Crick-Basenpaamng
Thymidin gegenüber
Paarung
[203].
merie wurde auch im Kristall beobachtet.
entweder ein
das
Daher sind
MutM den Schaden
8-Hydroxy-2'-desoxyguanosin
Auswirkungen
dass
als
syn-Konformation.
eine
2'-Desoxyisoguanosin tautomerisiert, kristallographisch
Thymidin
der
ist
bewiesen, dass 8-Hydroxy-2'-desoxyguanosin bei der
kurzem
vor
Strahlungsschäden
Neben dem
Enzym
und
einnimmt,
Interessanterweise entfernt diese nicht 8HOdG sondern dA,
des
untersucht
eine anri-Konformation
erkennt
1.4.2.1)
stabiler
Hinweise auf die
Wichtig ist,
Desoxyadenosin hingegen
MutM erkennt
im Mittel¬
der DNA-Helix bilden
thermodynamisch geringfügig
dieses Schadens in Escherichia coli zwei
Reparatur
Glykosylase
ohne grosse
Reparaturenzyme [201].
am
Desoxyadenosin
NMR-spektroskopisch
kristallographische
und
8-Hydroxy-2'-desoxyguanosin
und
8-Hydroxy-2'-desoxyguanosin
dass
Im Wesentlichen erkannte man,
[199,200].
der
Sie wurde sowohl hinsichtlich ihrer
auch
als
[172,198]
(8HOdG)
Fehlpaarung 8HOdG«dA
die
physikochemischen Untersuchungen.
thermodynamischen
5
prokaryontische DNA-Poly-
und
eukaryontische
gegenüber 8HOdG inserieren [195-197], stand
punkt
Oligonukleotiden
modifizierten
an
1
grosser
der
infolge
[205].
Schäden
Bedeutung [205].
von
20
1
Kap.
Abasische Stellen
1.2.5
Abasische Stellen entstehen
Spaltung
anschliessender
als der
häufigsten
am
können vier Formen
zu
in
Bindung
oder
Depuriniemng
vorliegen,
die
Strangbrüchen.
zyklischen
36
Hydrat
Desoxyuridin
durch
C
Sie
Prinzipiell
[67,206].
ß-Hemiacetale
oder
a-
U und
von
Depyrimidierung.
auftretende Schaden in der DNA
35 bzw. dessen
azyklische Aldehyd
labil und führen
glykosidischen
der
zu
Deaminiemng
der
Folge
aber auch durch spontane
Uracilglykosylase,
gelten
allem in
vor
sowie der
34
Diese Schäden sind äusserst
(Abb. 10).
2'-Desoxyribono-
Eine andere abasische Stelle ist das
37, ein Schaden, der durch Medikamente wie Endiin Antibiotika (z.B. Neocarzino-
lacton
statin) [207],
kationische
[151,209] erzeugt
oder
Manganporphyrine [169,208]
y-
wird. Dieser Schaden ist mutagen und resistent
nukleasen. Er führt
zu
DNA-Strangbrüchen
über
ß
OH
und
und
UV-Strahlung
gegenüber Reparatur-
Ô-Eliminierungsprozesse.
HO,
nwyJ
Ho\
HOv^-oh
Bei der
von
abasischen Stellen
biologischen Untersuchung
Uracil-DNA-Glykosylase
[210,211]).
Für
aus
217].
39
synthetisiert
zurückgegriffen
34
mit
werden.
Daher wurden
wurde
das
Phosphoramidit
des
Analoge
dieser
Als Isosteres der
Tetrahydrofuran-
Oligonukleotide eingebaut [212,213]. Oligonukleotide,
und in
enthielten, wurden für Replikations- [214] und NMR-Studien eingesetzt [215Als ein weiteres
mit Hilfe der
Analog
von
34 wurde das
Phosphotriestermethode
spektroskopisch untersucht [218].
Als
2'-Desoxyribonolacton
eingebaut
werden
zu
2'-desoxyribonukleosid
Phosphoramidit
in
41
in
Methyl-2'-desoxy-a-D-ribofuranosid
Oligonukleotide eingebaut
des
Aldehyds
35 wurde
und
NMR-
1,3-Propanediol
Replikations Studien eingesetzt [214].
37 ist ebenfalls
können.
in
Analog
40 [214,219] verwendet, und ebenfalls in
Das
gezielt
kann auf diese Methoden wegen der
Oligonukleotide eingebaut (Abb. 11).
in
1,2-Didesoxy-D-ribofuranose
die 38
abasischen Stellen werden diese meist
physikochemische Untersuchungen
Phosphoramidite
Derivates 38
von
ortsspezifisch eingebautem 2'-Desoxyuridin erzeugt (z.B.
Labilität der Schäden aber nicht
Schäden als
37
Abasische DNA-Schäden.
Analoge
1.2.6
OH
36
35
34
Abb. 10:
hcxAS
OH
Es kann aber
um
als
photochemisch
aus
zu
instabil,
gepufferter Lösung erzeugt
Oligonukleotide eingebaut werden [220].
Phosphoramiditsynthon
einem
werden.
l-(7-Nitroindol)41
konnte als
21
Kap.
1
OMe
0
>
H0V
Q
"ÖH
H°V^ÖH
H0-/\)H
39
40
38
Abb. 11
Verwendete
:
Von NMR-Studien
Analoge
für abasische Stellen.
Analoge
mit
2'-Desoxyuridin erzeugten
und
die abasische Stelle die Helix
38
Destabilisierung,
Base im
in
von
man,
situ
aus
dass beim Vor¬
Basenstapel bleibt.
Ob
destabilisiert, ist stark Sequenz¬
thermodynamischen Untersuchungen
Abasische Stellen führen
den benachbarten Basen
zu
einer
an
dem
enthalpischen
abhängt [223].
UV-Strahlungsschäden
1.2.7
Bei der
von
[221,222] weiss
ob sie die Helix
von
bestätigt.
deren Ausmass
NMR-Studien
gegenüberliegende
beugt und
Dies wird auch
Tetrahydrofurananalogen
neueren
abasischen Stellen
handensein einer abasischen Stelle die
abhängig [222].
aus
Bestrahlung
dargestellten
Entstehung
Photoschäden 42
von
Ozonschicht
DNA mit UV-Licht entstehen
von
Hautkrebs in
47
[4,5].
allem die in
Biosphäre
zu
Abbildung
12
Viele dieser Schäden wurden mit der
Zusammenhang gebracht [224].
in der
[225], der
-
vor
einer
Erhöhung
Wegen
der
des Abbaus der
UV-Strahlung
führt
[226,227], wird die Reparatur dieser Schäden intensiv untersucht [228].
Die
Photoschäden sind die
häufigsten
Cycloaddition
44 das
entstehen
Hauptprodukt.
wöhnlichen
(Abb. 12). Dabei
In
gebildet
ist das
einzelsträngiger
Doppelhelixkonformation
Photodimer 43
Cyclobutanpyrimidindimere,
werden [229].
[cis-syn]-konfiguiieüe Thymidindimer
DNA und
kann in
die in einer [2tc+27ü]-
DNA-Regionen
geringen Mengen
Das zweite
wurde bisher nicht isoliert. Es kann aber in kleinen
mit einer unge¬
auch das
mögliche [trans-syn-U]-lsomer
Mengen
ebenso anwesend sein
Ausserdem können in einer Paterno-Büchi-Reaktion mit anschliessender
(6-4)-Photoaddukte
bestrahlt,
so
wie 46 entstehen.
können sie
zu
45
(Abb. 12).
[231,232].
Werden diese mit Licht
Dewar-Valenz-Isomeren wie 47
Ein weiterer Schaden, der durch
Es entsteht
bei der
Bestrahlung
42
[230].
Umlagerung
längerer Wellenlängen
umlagern (Abb. 12).
UV-Strahlung hervorgerufen wird,
nur
[trans-syn-I]-
von
ist das Photoaddukt
A-DNA und
von
Sporen
22
1
Kap.
O
MeMe 9
9
r_J[
HN
NH
.,
„
Tf
MeMe
o
HN^j—V^NH
n
0VUh
OH
V)
HO-V
f
0"
42
43
o-
S*
HN'
n
N
,IM
^O
Y-l.
% P
>
Abb. 12:
0A0
HO
wichtigsten Pyrimidin-Pynmidin DNA-Schaden,
der
sechs
Bestrahlung
von
DNA mit UV-Licht
wichtigen
UV-Strahlung
nukleosids 17
gebildet
zur
48 isolieren (Abb. 13) [233],
Bildung
(Abb. 7) beiträgt
des
NH2
[234,235],
das über eine
UV-Strahlung
N^N
man
N
0
13
Seltenere Photoschaden
diskutiert, ob
und
der
dTpdA-
nachträgliche
elek-
°wN
0
X
N
49
Verknüpfung
NHo
«h
OH
48
der
Poly(dA)
ein Photoaddukt des
HN
ho-p
Abb
die kovalente
^N
kX>—CO
man aus
Auch wird
[27t+27ü]-Cycloaddition
O
H2N
bei
5,6-Dihydroxy-5,6-dihydropyrimidin-2'-desoxy-
und ob
gepaarten DNA-Stränge auslösen kann. Daneben kennt
Dinukleosids 49
die
werden
Schäden werden weitere diskutiert: So konnte
8,8-Adenosindehydrodimer
durch
47
46
Strukturen
Neben diesen
OH
'OH
O. A
45
ein
OH
0=/—0
0=P—O
er
°
O
\
''o f
HO-*
MeMe
jî
y-NH2
pN
|r
Ji
1
°X
50
H
Kap.
23
trozyklische Öffnung
bei der
des
Bestrahlung
Strahlung
in der
Cyclobutanringes
dTpdG-Dinukleosiden
von
Gegenwart
oxidationsprodukt
von
von
entsteht das instabile
zu
da
sie
ebenfalls, aber sehr viel langsamer,
mit DNA
mit UVAAls Photo-
52
Wasser
DNA-Doppelstrang
zu
deaminieren
Cytidin
von
Wird die
[238].
C(5)-C(6)-
bewirken kann.
kann.
zu
Dabei
dehydratisieren
dehydratisiert
Dieses
Folglich
Uridin (Schema 1) [237].
dass DNA-bindende Proteine durch
werden
die
an
2'-Des-
zu
2'-Desoxyuridin 53 (Schema 1).
Deaminiemng
nachgewiesen,
verknüpft
von
(Abb. 13)
2'-Desoxycytidin
von
das entweder sehr schnell wieder
Uridinhydrat
die
Addition
2 im
Cytidinhydrat 51,
katalysiert UV-Strahlung
Deaminiemng
die
2'-Desoxycytidin
dem stabileren
Ausserdem ist
Bedingungen
unter aeroben
Schaden
neuer
Riboflavin als Photosensibilisator entdeckt.
kann aber auch die
oxyuridin beschleunigen,
oder
Kürzlich wurde ein
entsteht hierbei der bisher unbekannte DNA-Schaden 50
[236]. UV-Strahlung
Doppelbindung
entsteht.
1
UV-Strahlung
UV-Strahlung
von
kovalent
Photosensibilisatoren
absorbiert, können ausserdem oxidative Schäden entstehen [239].
NH2
NH2
A
X)
O^NT
hVi+H2o
O^N-^OH
^
OH
der
Darstellung
Häufigkeit,
Relevanz
biologischen
wird
durch
Kapitel
Bestrahlung
darzustellen,
einzubauen
um
44
Deaminierung
kurzer
°^n
h2o
—*
OH
von
OH
53
2'-Desoxycytosin.
des
auftreten, und ihrer damit verbundenen
längerem versucht,
ihre
Auswirkungen
sie
als
Phosphoramidite
auf die DNA
(6-4)-Photoaddukts
und 43
46 sowie
zu
von
dargestellt [229,240-242].
Oligonukleotide
zu
.
Photodimeren
3.1 im einzelnen diskutiert.
diese mittels HPLC
[243].
die
seit
Phosphoramidite
[trans,syn-l]-Photodimeren
werden in
O^N^OH
"^
mit der Photoschäden
Oligonukleotide einzubauen,
wurden bisher
von
Tj
52
UV-Strahlung beschleunigt
1.2.7.1
Wegen
+h20>
51
:
O
Ti
OH
2
Schema 1
o
reinigen
untersuchen.
den
[cis,syn\-
Diese
in
So
und
Synthesen
Daneben wurde schon früh versucht,
Photodimere
und per
Ligation
enthaltende
in
DNA-Stränge
längere Oligonukleotide
Kap.
24
1
Einfluss
1.2.7.2
von
Photodimeren auf die DNA-Struktur
auf die DNA wurde in theoretischen Studien
[cis,syn] -Photodimere 44
DerEinfluss der
Die ersten
[244-252].
intensiv untersucht
So wurde in einer Studie ein starkes Abknicken
widersprüchlich.
Beugung
daraus eine grosse
der DNA berechnet
eine eher der A- als der B-Konformation
in der Nähe des Dimers
zwischen dem
Erstens
Experimente
mit
der
Unterbrechung
führt
der DNA
um
Oligonukleotiden,
einer
zu
14° im
10°
ca.
dynamischen Untersuchungen
von
keinen Verlust
elektronenmikroskopische
Erste
Photodimer die DNA
eine
Beugung
Untersuchungen,
des
von
Basenstapels
Geometrie
nur
von
um
7°
sowie
30°
gefolgert,
einer
an
definierter Position
Aus ersten thermo¬
einem
[c/s.^nJ-Thymidindimer
thermodynamische
deuteten
Gelelektrophoretische
beugt [257].
dass
daraufhin,
Studien
ergaben
das
aber
[258,259]. Aus gelelektrophoretischen und thermodynamischen
Untersuchungen
geringfügig
Diese wiesen
zu
ungeschädigten Duplex [250].
während andere
Untersuchungen
zur
der Zucker für Radikale und
Zugänglichkeit
gefolgert,
dass das Photodimer die Helix-
verändert und dass die DNA im Bereich des
Dimers stärker verzerrt ist als im Bereich des
262].
dass ein
[249-
Wasserstoffbrückenbindungen ergaben [253-256].
für Ethidiumbromid wurde
[cis,syn]-Photodimere
Adenin
gegenüberliegenden
[cis,syn] -Photodimer
AT-Basenpaaren entspricht [243],
4.3
Untersuchungen
nur
wurde
einem
gegenüber
Wasserstoffbrückenbindung
einer
zum
nur
Hauptauswirkungen
grösseren Verzerrung der DNA und
Vergleich
die ein
um
in
vorgeschlagen [248].
hervorgerufenen Änderungen
DNA
des Photodimers und dem
5'-Thymin
Beugung
Struktur
enthielten, ergaben anfangs auch sehr widersprüchliche Ergebnisse.
Verlust
nur
Übergang
mit einem lokalen
entsprechenden
Beugen
und zweitens
(6-4)-Photoaddukt
zusätzlichen
und
Diese konformationellen
beobachten sind. Die Dimere haben zwei
zu
auf die DNA-Struktur:
ungeschädigten Duplex
Änderung
dass die durch das Photodimer
zeigen,
Neuere Studien
Das
Thymidindimer
sollten auf der 5'-Seite des Dimers grösser sein als auf der 3'-Seite [247].
Es wurde auch eine grosse konformationelle
252].
am
sehr
waren
während andere Studien
[244,246],
geringe konformationelle Änderungen vorhersagten [245,247].
Änderungen
Art
dieser
Untersuchungen
5'-Thymins
des
3'-Thymins [255].
wurden auch in fünf NMR-Studien untersucht
[253,254,260-
daraufhin, dass der Cyclobutanring eine andere Verdrehung (twist)
einnimmt als in einer Kristallstruktur des Dinukleotids [254,263,264],
und dass das
[cz'^sjwJ-Cyclobutandimer
verzerrt.
Dabei ist die
3'-Ende.
Daraus wurde
Verzerrung
gefolgert,
5'-Seite
am
5'-Ende des Dimers stärker
dass die
ist
[260].
die DNA
nur
wenig
ausgeprägt als
Wasserstoffbrückenbindung
geschwächt
Thymidindimer
die Struktur der DNA
zum
am
gegenüberliegenden
Die neuesten NMR-Studien
nur um
7-9°
beugt [260,265].
zeigen,
Adenin
dass das
an
der
[cis,syn]-
Dies stimmt sehr gut mit den
25
gelelektrophoretischen
Studien
überein.
14
Abbildung
DNA-Duplexes
5'
im
aktuellste
die
zeigt
Vergleich mit
und den
dem nativen
jüngsten Berechnungen [249-252]
NMR-Struktur
C
G
A
T
A
A
T
A
T
T
A
T
A
C
G
C
G
T
A
G
C
C
G
NMR-Struktur
eines
B
[cis,syri]-haltigen DNA-Duplexes (B)
DNA-Duplex (A).
Nebenfurche
Die Strukturen sind
Photodimer
am
(T8-T9) schaut.
miteinander verbindet, ist als Band
Die
dargestellt.
NMR-Stmktur
[254].
Vermutlich kommt
es
Sie
zeigt
zu
einem Knick oder einer
Doppelhelix und
Auswirkungen
ebenfalls
dimer 46
eine sehr viel
sind
19
(6-4)-
nur
am
mit
Entnommen
aus
Verschiebung
zu
McAteer
et
al. [260].
als ungepaarte
an
der
Schmelzpunktes19 Tm
5'-Stellung
des
um
31°C [254].
und der Dewar-Photoschäden auf die DNA sind mittlerweile
untersucht worden
des Dimers
Dies führt
zu
einer
die
[256,266-270].
3'-Ende des
ist die
gefolgert,
Temperatur,
Einzelstränge vorliegen (siehe Kap. 4.2.1).
(6-4)-Photo-
Wasserstoffbrückenbindungen
(6-4)-Photodimers
Denaturierungspunkt Tm
Beim
Beugung der DNA-Doppelhelix
Aus diesen beiden Befunden wurde
Der Schmelz- oder
eine
erst
einer erheblichen Destabilisie-
Ausserdem wurde beobachtet, dass (6-4)-Photodimer T
gegenüber dem
dem
grössere Verzerrung der DNA-Doppelhelix.
einem Absinken des
3'-Ende
unterbrochen.
[271,272].
Adenin
der
zu
NMR-spektroskopisch
Gegenstrang
ren
Vergleich
Linie, die die Phosphodiestergruppen
Dimers [254]. Das [trans, sy n-l]-Photodimct führt auch
[267].
im
dass der Betrachter in die
dargestellt,
so
[trans, syn-1] -Isomere 43-enthaltenden DNA-Strängen existiert bisher
Von das
Die
[cis,syn\ -haltigen
3'
nativen
rung der
eines
DNA-Duplex.
A
Abb. 14:
1
3'
T
5'
[258,259]
Kap.
—>
gebunden
bei der die
um
44°
C-Mutationen induzie¬
dass Guanin
besser
zum
verglichen
mit
werden könnte.
DNA'DNA-Duplexe
zu
50%
26
1
Kap.
Dewar-Photoschaden
Der
-Stapelung,
thermodynamischen Untersuchungen bestätigt [256,269].
wurde in
Vermutung
Diese
die sich
von
47
führt
der normalen B-DNA und
führt
Dewar-Isomeren
zum
einer
zu
Veränderung
Dabei wird die starke helikale
Duplexes.
thermodynamischen Destabilisierung
als die
Destabilisiemng
entfallen also nicht
nur
als das
Oligonukleotid-
44° auf 21° reduziert
von
führen
Stelle
zu
gegenüber
3'-Thymins
einer
grösseren
Sie ist sogar
[cis,syn\-Photodimere.
die Wasserstoffbrücken des
(6-4)-Photoaddukts
des
Struktur des
der
(6-4)-Photoaddukt
apyrimidinische
durch eine
Basenpaarung und -Stapelung
der
der DNA
Beugung
Sowohl das Dewar- als auch das
[270].
von
Isomerisierung
Die
46-enthaltender DNA unterscheidet [268].
und
ungewöhnlichen Basenpaarung
einer
zu
grösser
Folglich
Adenin.
gegenüberliegenden
zum
Adenin, vielmehr werden auch die Wasserstoffbrücken des 5'-Thymins geschwächt
[256].
Biologische Bedeutung
1.2.7.3
lange bekannt,
dass
Systeme beeinträchtigt [273].
Der
Es ist bereits
nur
kurz auf die
[cis,syn\-Photodimere
Inhibierung
heutige
[279,280].
die sonst nicht aktiv
prozessiert.
keinen T
C
wichtigsten
->
die
durch
T- und CC
häufigsten
Erbgutes
des
Schädigung
sind, kommt
Dabei kommt
G Mutationen
—»
DNA-Polymerasen,
Die
Unter
es
aber
->
[279].
es vor
allem
zu
T
einer
A und
C
—>
führen
Cyclobutandimere hervorgerufenen
TT-Transitionen
im
zu
im
T
—>
C
eukaryontische
[282,283].
Mutationen sind
jedoch
die
Hautkrebspatienten
Sie sind die bei
Tumorunterdrückungsgen p53 [284].
deaminiert [285].
einem Einbau
T-Transition zustande
Deaminierung
7% der
C
—>
T-Transitionen
Cytidine enthalten,
schneller in die £-Iminoform tautomerisiert und auch sehr viel schneller
Uridinanalogen
analoge
ca.
T[c,s]T-Photodimere sehr effizient übergehen [281].
Mutationen im
Cytidineinheit
zum
Proteinen
wenigen
auch
man
in
Bypass-Replikation
kommen dadurch zustande, dass in Photodimeren, die ein oder zwei
die
von
Bedingungen
—»
Mittlerweile kennt
vollständigen
SOS-Bedingungen,
eine Vielzahl
zu
Daher
eingegangen.
einer fast
zu
Bei T[c,s]T-Photodimeren werden unter diesen
Schäden falsch
jedoch
der Photoschäden
Bedingungen
Mutagenese
[224,274-276].
erörtert
Replikation [277,278].
denen die Zelle nach einer massiven
exprimiert,
Übersichtsartikeln
führen unter normalen
und
Leistungsfähigkeit biologischer
Stand der Kenntnisse über die
wichtigsten Auswirkungen
Transkription
der
die
UV-Strahlung
durch UV-Licht wurde in mehreren
wird hier
Photoschäden
der
von
[286].
Sowohl die E-ïmhxofovm als auch das Uridin-
Adenosin bei der
Replikation,
Obwohl mittlerweile
gezeigt
C[c,s]C-Photodimer mit einer Halbwertszeit
C[c,s]T-Photodimer
mit einer Halbwertszeit
von
von
dadurch kommt die
worden ist, dass die
fünf
fünf Stunden [288]
Tagen [287]
um
und
sechs bis acht
Kap.
27
Grössenordnungen schneller ist
Tautomerisierung oder
Säugetieren
eine
diskutiert.
mehr Zeit
Rutschen
Es führt
an
ihre
die
spielen,
zur
von
in 6% aller Fälle
bei
die
führen
5'-(T
zu
—>
->
T-reicher
sind
als
die
Mutationen
zwar
einem breiteren
zu
etwas
Bedingungen
zu
16 %
Dieser
Kausalzusammenhang
erstes
beim Tintenfisch
von
/?53-Gens
Reparatur
DNA-Schäden treten
Entsprechend
sind
5'-(T
3'-(T
-4
C)
weniger mutagen
der
Dabei kommt
—>
A)
es
Transversionen
Die
meisten
Transitionen
der
[271,272].
(6-4)-Photoaddukte
als die
Dabei wurden
Typen
Schädigung
induzierte
von
so
zwischen
vor
UV-Strahlung
Erbguts,
allem
5'-(T
—>
A)
ausgesetzten Zellen
die sich
zum
Melanom äussern kann
und
malignem
Beispiel
[5,293].
Melanom wurde als
Auf molekularer Ebene ist die durch
Photokarzinogenese heute
am
besten verstanden
[295].
DNA
häufig auf,
hat
des
bösartigen
nachgewiesen [294].
man
Reparatursystem gefunden.
verschieden
Stop
Überraschenderweise wurden
Cyclobutanphotodimere.
Hautkrebsarten wie dem
Bildung
wäre.
einem
zu
übergangen.
neben den
Mutationsspektrum.
einer massiven
in der
1.3
Mittlerweile ist
C) Mutationen beobachtet [271,272].
[292]. Sie führen
Mutation des
Sequenzen
gewissen Transkriptions¬
Die beschriebenen Mutationen treten in allen dem Sonnenlicht direkt
auf
der
Dabei führen sie unter S OS-Bedingungen
Bedingungen.
Mutationsrate
Dewarphotoaddukte
3'-(T
aufgrund
werden ebenfalls unter S OS-Bedingungen in E. coli öfter
(6-4)-Photoaddukt-induzierten
und
von
A)-Transversionen [271].
—>
als unter normalen
zu
Sie könnte aber in Zellen
[288].
Bindung
SOS-Bedingungen
Dewarphotoaddukte
führen aber
spielt.
C) Transitionen beobachtet [291].
einer höheren
Die
Cytosin-enthaltenden
Thymidinen [224].
normalen
unter
allem
zu
der für
für die Mutation ist [287-
Replikation
der
ein oder zwei
vor
übergangen
steht
Verfügung
[îratts,£yn-I]-2'-Desoxyuridinphotodimere
und
aufgrund
da hier für mutagene Prozesse
für
(6-4)-
es
DNA-Bindungsstelle blockieren [290].
werden aber unter
5'-(T
ist
der
Deaminiemng
E. coli keine Rolle
[cis,syn]-Photodimere
[trans,syn-I]-Photodimere
Replikation,
Schlüsselereignis
das
(Slipping)
Deletion
zur
auch bekannt, dass
faktoren
Rolle
wichtige
das
wird
von
Cytosin,
von
Halbwertszeit immer noch umstritten, ob die
dass
an,
Mutagenese
langsameren Zellteilung
Daneben
Deaminierung
heute
nimmt
Man
Photodimere bei der
von
die
Deaminierung
langen
Prozesse noch recht
biologische
289].
als die
1
unterteilen
dass ohne
bislang
Diese
[76]:
in
Reparatur
jedem
der Schäden kein Leben
möglich
zellulären Lebewesen mindestens ein
Reparatursysteme
kann
man
prinzipiell
in
vier
Kap.
•
28
1
das
Herausschneiden
von
DNA-Fragment (Nucleotide
einem
Repair,
Excision
NER) [296-298],
•
das Eliminieren der
•
die direkte
•
die
geschädigten
Reparatur
Reparatur
der
Base
Excision
(Base
Repair, BER) [299-301],
Base
geschädigten
[302], bei der
durch Rekombination
es
Austausch
zum
von
DNA-
kommt.
Fragmenten
Die vier verschiedenen
sind in
Reparatursysteme
Abbildung
15
dargestellt.
a
b
BER
NER
Ligase
Ligase
I
MM
l
IIIITTTTTTT
TTTT
c
(hv)
Direkte
Reparatur
DNA-Polymerase
fi 111111111CHPIITTTTTTT fill IIII
gllllllllll"IIITTTTTTT
Mill 111ITTTTTTT
d
AP-Endonuclease
DNA-Polymerase
Rekombi¬
nation
LTE
tm
Abasische Stelle
"
mir
TTTTTT
/*
1111 a 11 '
11
\
1111111111111111111111
Abb. 15:
Darstellung
Excision
der vier bekannten
Repair, BER), b) Herausschneiden
Repair, NER); c)
1.3.1
Direkte
geschädigten Stranges
tisiert die
DNA-Polymerase
3'-Richtung
sierten
breite
Stranges
neu.
des Schadens;
eines
um
DNA-Fragments (Nucleotide
mit Hilfe des
Abschliessend
DNA-Fragmentes (NER)
ein
langes
Anschliessend
synthe¬
wird
ungeschädigten Gegenstranges
ligiert
Excision
d) Rekombinationsprozess.
den Schaden hemm entfernt.
mit der 5'-Schnittstelle
Substratspezifität
eines
Herausschneiden einer Base (Base
DNA-Fragmentes (Nucleotid Excision)
Stück des
—>
Reparatur
Herausschneiden
Beim Herausschneiden eines
5'
DNA-Reparaturwege: a)
eine
[299,300].
Ligase
als
das 3'-Ende des
Dieses
Templat
neu
Reparatursystem
in
syntheti¬
weist eine
auf und kann die meisten der grossen DNA-Addukte entfernen.
Kap.
29
Es erfordert aber auch die
der
Die
geschädigten
Enzyme,
katalysieren,
Base
die
DNA-Polymerase
und
Glykosylase als
1.3.3
auch eine
Direkte
AP-Lyase
Enzym
Aktivität
der
aus
apyrimidine
E. coli
Zu den
Stelle
(AP)
und
der
mit einer
und die Lücke
DNA-Glykosylasen gehört
besitzt sowohl eine
Pyrimidindimer-N-
[307].
DNA-Reparaturenzyme,
Kategorie gehören Suizidenzyme
triester
Base
[306] entfernt
wie Ada
die den Schaden direkt,
Nukleotide, reparieren.
[308,309],
die
alkylierte
0(6)-Alkylguanin [118,310], 0(4)-Alkylthymin [117,143,144]
wie
auf
sind die DNA-
reparieren,
geschädigten
das heisst ohne Herausschneiden der Base oder mehrerer
dieser
Substratspezifität
Reparatur
Schäden existieren
einige wenige
Für
Dieses
Proteine, die die
Uracil-DNA-Glykosylase [304,305].
DNA-Ligase ergänzt.
auch die T4-Endonuklease-V.
weisen
eine kleine
nur
zwischen
AP-Endonuklease wie der AP-Endonuklease m
durch
(BER)
Anschliessend wird die entstehende
2'-Desoxyribose.
aufgrund
Energie-aufwendig [297].
die über diesen Prozess die DNA
glykosidische Bindung
Proteinen und ist
DNA-Fragmentes
Ihr bekanntester Vertreter ist die
Glykosylasen.
spalten
Herausschneiden eines
zum
einer
Eliminierung
Sie
dreissig
mehr als
Herausschneiden einer Base
Gegensatz
[303].
von
sehr Material- und
benötigen Nukleotidtriphosphate
1.3.2
Im
Beteiligung
1
Zu dieser Klasse
dealkylieren.
gehören
und
auch verschiedene
Zu
DNA-Basen
Alkylphospho-
DNA-Photolyasen
[300,311], die Cyclobutanpyrimidindimere oder (6-4)-Photodimere in einer lichtabhän¬
gigen
Reaktion
reparieren.
Auf den Mechanismus der
butanpyrimidindimere reparieren,
1.4
Die
Erkennung
Reparatur
Regionen.
von
Um
von
wird in
DNA funktioniert nicht ohne die
zu
Cyclo¬
eingegangen.
DNA-
verstehen, wie diese Erkennung abläuft, wird im folgenden
zuerst
der
diskutiert.
von
Erkennung
der
geschädigten
Proteine
eingegangen und
4.1 noch genauer
die
DNA-Schäden durch Proteine
anhand der bisher bekannten Motive
DNA durch
Kapitel
DNA-Photolyasen,
DNA-bindenden Proteine die
Anschliessend wird
mögliche Erkennungsmechanismus
auf
Erkennung
Reparaturproteine
kurz erörtert.
von
näher
30
1
Kap.
Erkennung
1.4.1
Nicht
bei der
nur
Ausserdem
Enzymen,
Reparatur, sondern auch bei
gibt
den DNasen
zu
Transkription
der
sie
um
vor
Regulation,
und ihrer
der
beteiligt.
Proteine
DNA-bindende
sind
DNA
methylieren,
die DNA
Enzyme,
es
der
Verpackung
und der
Replikation
DNA durch Proteine
von
einer anderen Klasse
von
schützen, die DNA abbauen. Es Hegt nahe, dass jede Klasse
dieser DNA-bindenden Proteine die DNA auf eine andere Art und Weise erkennt und
und -repressoren eine definierte DNA-
Transkriptionsaktivatoren
bindet.
So müssen
Sequenz
erkennen können. Aber auch Restriktionsendonukleasen sind auf eine definierte
Sequenz spezialisiert
erwartet
strängiger DNA
zu
von
röntgenkristallographisch
aufgeklärt
werden
Bindungsmotive
Man vermutet, dass
man
eine
einzel-
Sequenz¬
diese
Transkriptionsfaktoren
-
Erkennung
Zink
an
(Leucinzipper)
in die
Neben den
die
bezüglich
(Zinkfinger)
Bildung
Bindungsdomänen [314].
mangelt
Erkennung
Form
Erkennungschritt
über die Form.
Die
wichtigsten Eigenschaften
ihrer
von
oc-helikalen
von
Allerdings
oder
[323]
richtige Anordnung
zur
Dimeren
der
Bindungs¬
erläutert.
Peptiddomänen
in die
ß-Turns abwechseln,
durch
Dimerisierungsdomänen
Bindungstelle gebracht.
(Homo-
oder
durch
Dabei wird die
Heterodimere)
oder durch
wird noch ein weiteres diskutiert, der sogenannte copper fist.
In diesem Motiv koordiniert mutmasslich ein
es
40 Kokristallstrukturen
ca.
über die
bei dem sich a-Helices und
vorgestellten Bindungsmotiven
und
Röntgenkristall-
[342,343]. Diese a-Helices werden entweder durch das Helix-
[315,316],
Koordination
durch
konnten
bereits einem ersten
binden meist mit Hilfe
der B-DNA
Turn-Helix-Motiv
Spezifität
Bisher
mit
(Tab. 3) [313].20
können
Bindungsmotive
motive werden im Folgenden kurz
Hauptfurche
Komplexe
DNA-bindende Proteine als
untersuchen.
zu
dienen und bezeichnet dies als die
Sequenz
geworden
von
[312]. Dabei wurden unterschiedliche Bindungsmotive entdeckt, die in
Gruppen eingeteilt werden
1.4.1.2
die
Reparaturenzymen erwartet man
mehr als 50 DNA-bindenden Proteinen und
von
20
Stabilisiemng
und eine
Protein-DNA-Wechselwirkungen
entscheidend sind, versucht
strukturen
sieben
Polymerasen
verstehen, welche Wechselwirkungen für die Spezifität und die Stärke der
Bindung
DNA
Von
Schaden-spezifische Erkennung.
Erforschung
1.4.1.1
Um
im aktiven Zentrum. Von
aber
unabhängige
Sequenz-unabhängige Bindung
eine
man
und müssen diese ebenfalls erkennen können.
sind
Komplex
von
nach meinem Wissen
an
aus
diesem
acht
Kupferionen
Bindungsmotiv
einer Kristallstruktur.
und
nur
Cysteinen
ein paar
des Proteins
Beispiele
bekannt
Kap.
31
kann auch über ein
Dimerisierung
Bindungsmotive
Tab. 3:
von
Helix-Turn-Helix
I
erreicht.
Zinkfinger
Diese
ß-Fass erfolgen (Gruppe VI, [343]).
DNA-bindenden Proteinen
Motiv
Gruppe
verschiedener
oder
gleichartiger
Aneinanderreihung
1
Bindungs¬
region
prominente Beispiele
a-helikal
Cro-Repressor [317,318], Trp-Repressor [319,320],
Lambda-Repressor [321], CAP-Protein [322]
[315,316]
H
Zinkfinger [323]
a-helikal
Glucocorticoidrezeptor
kriptionsfaktor IIIA
m
Leucinzipper
a-helikal
HefeGCN4
IV
ß-Faltblatt [328]
[324],
[325,326], Myo
D
Xenopus
Trans¬
[327]
ß-Faltblatt TATA-Bindungs-Protein [60-62],
Met J
Repressor
[329]
Diverse Motive
V
ß-Fass
VI
Dimer
"High Mobility Group"
vn
Eine
dem
von
Proteine der
ß-Fass
VI
Gruppe
beugt
vor
merase
a-helikal
Papilloma virus
a-helikal
HMG1 B-Domäne der Ratte
und die
um
beinahe 90°.
ß-Faltblatt-Domäne
bei den
bei
man
von
Polymerasen
Besonderheit stellt die
Gyrase dar,
[341]
die
weisen
Bindungsprotein,
Dadurch
hegt
das die
Nukleasen
der
Gruppe
nicht mit der
interagieren
Transkription
Spalten,
a-Helices
ß-Untereinheit
aktiviert.
die beide nahezu
[346,347]
[328].
sowie
V an, in der die
DNA-Reparaturproteine
Erkennung
der
Bindungs¬
So findet
DNA-Doppelhelix hineinpasst,
während
findet, die in die Hauptfurche binden.
DNA-Polymerase Holoenzymes
ringförmige
Es
die DNA lokal in einer A-Konformation
in die die
des
Haupt¬
die Proteine
Sekundärstmkturelementen erreicht wird [312].
tiefe
Endonukleasen
interagieren
bindet in die Nebenfurche
[303,348] gehören ausschliesslich
stelle mit einer Vielzahl
[340]
Faltungsmotiv
Ebenfalls mit der Nebenfurche
Gyrasen [344], Polymerasen [345],
man
unterscheidbares
dimerisieren. Viele dieser Proteine
IV wie das TATA-Box
die DNA
E2 Protein des Rindes
auf, die ebenfalls über eine a-Helix mit der DNA wechselwirken,
sondern mit der Nebenfurche.
der
E. coli DNA
Loops,
Stränge,
Spalten,
Ringe
Helix-Turn-Helix-Motiv
Gmppe
aber über ein
Gyrase [330,331], T7 RNA Poly¬
[332,333], E. coli Polymerase I Klenow
Fragment [334], E. coli Polymerase III ß-Untereinheit [335], EcoRV und EcoRI Restriktionsendonukleasen [336-338], Haemophilus haemolyticus
Methyltransferase [339]
Helices,
Strukturen aufweisen,
Eine
und die DNA-
durch die die DNA
gleitet.
1.4.1.3
Die
Chemische
Erkennung
Erkennung
der DNA über die Form des
Erkennungstyp ergänzt,
die "chemische
Bindungsmotivs
Erkennung" [349].
wird durch einen zweiten
Sie ist für die molekulare
32
1
Kap.
verantwortlich und beruht auf H-Brücken, van-der-Waals- Wechsel Wirkungen,
Spezifität
hydrophoben Interaktionen, globalen
dazu, eine Proteindomäne
eingehen
den Basen
0(6)
der
unspezifische Wechselwirkungen
Meist dienen
Salzbrücken.
so
kann.
Repulsion
Spezifität
ebenso
wichtig
kann durch
beschriebene
Beitrag
1.4.1.4
N(7) oder N(6) des Adenosins durch Glutamin in
Methylgruppe
Thymidin
des
für die sterische
Zusätzliche
der Nebenfurche mit Seitenketten erreicht werden.
Dimeren und die
Spezifität der
Aneinanderreihung
chemischen
werden in der B-Form der DNA
der DNA und dem Protein
allem
vor
Bindungsmotiven
von
Erkennung.
Erkennung
ebenfalls
Wechselwirkungen
erlaubt die B-Form eine höhere
wichtig [350].
zwischen der
treten in
Hingegen
ausgebildet.
hauptsächlich Wechselwirkungen zwischen der
der A-Form der DNA
Nebenfurche und dem Protein auf
Spezifität,
da in der
unterscheidbar sind. In der A-Form ist diese
So
Hauptfurche
Hauptfurche
[351].
die Basen¬
paare G»C und C«G bzw. A«T und T»A über ihr Wasserstoffbrückendonor- und
tormuster
Die
Konformationsänderungen
von
Die DNA-Struktur und ihre Flexibilität ist für die
Prinzipiell
N(7) oder
von
wie für van-der-Waals-Kontakte. mit dem Protein.
von
erhöht darüber hinaus die
und
Femer ist die
Erkennung
Bildung
Phosphatrückgrat
mit dem
Erkennung
Element wurde die
häufiges
Arginin
Hauptfurche beobachtet.
sowie lokalen
orientieren, dass sie spezifische Wechselwirkungen mit
zu
Als
des Guanosins durch
Wechselwirkungen
elektrostatischen
-akzep-
Unterscheidung nicht möglich.
Da
aber zwischen den beiden konformationellen Grenzstrukturen A- und B-DNA fliessende
Übergänge
Doch nicht
eine
alle
bestehen, kommt
nur
oft
zu
Konformationsänderung eingehen.
DNA-Sequenzen
mit etwa der
nur an
kann, dass der korrekte
1.4.2
folgenden
die
Die
Erkennung
von
von
[355]. Daher wird hier
nur
von
"proxy
Spezifität
die Konformation der DNA sich
geschädigter
werden.21
auf direkt
Spezifität
oft
so
erreicht
verändern
[354].
DNA-Schäden
DNA-Schäden
oder einem
Ihre
gleichen Bindungskonstante.
DNA-Reparaturenzymen,
erörtert
der
Erhöhung
[352,353].
So bindet die £coi?V-Restriktionsendonuklease
Zielsequenz
von
Erkennung
reparieren,
"Matchmakern"
der
der DNA-Struktur
muss zur
Überblick über die allgemeine Erkennung
Kristallstrukturen
direkt
Verzerrung
Übergangszustand gebildet wird
Erkennung
Nach diesem
einer
die DNA, sondern auch das Protein
sie dadurch, dass
21
es
von
DNA
anhand
die die
geschädigte
Aus der Klasse der
durch
DNA durch Proteine soll im
von
mit
Sancar in einem
reparierende Enzyme eingegangen.
bisher
bekannten
Base entfernen oder
Glykosylasen [303]
DNA-Reparaturproteine
mechanism" wurde
der
Hilfe
von
wurden
molekularen
Übersichtsartikel diskutiert
Kap.
33
Uracil-DNA-Glykosylasen (UDG) [304,356-358],
bisher Kristallstrukturen zweier
Glykosylase-Aktivität
sen, wurden
AP-Lyase-Aktivität (Spaltung
eine
bisher Kristallstmkturen der Endonuklease-III
T4-Endonuklease-V (T4 Endo V) [307,362,363]
AP-Lyasen,
zweier
(HAP1) [365]
abasischer Stellen) aufwei¬
(Endo III) [306,361]
Auch die Kristallstmkturen
gelöst.
sind bereits bekannt. Daneben kennt
man
von
eine Kristallstruktur des Suizid¬
Photolyasen [366,367].
Glykosylasen
1.4.2.1
Die Uracil DNA
Glykosylase bindet
die DNA mit Hilfe einer
positiv geladenen
Furche im
Innerhalb dieser Furche befindet sich eine Tasche mit dem aktiven Zentrum, das
Enzym.
erreicht werden kann,
die Base
wenn
aus
der Helix
herausgedreht (base flipping)
Dass sich die Base wirklich ausserhalb der Helix und in der Tasche
wird.
und der
(ExoIII) [364] und der humanen AP-Lyase-1
[308], sowie zwei Kristallstmkturen
enzyms Ada
nur
der Exonuklease-III
reparierende
5
Endonukleasen, die neben
Aus der Klasse der
DNA-Glykosylase (MutY) gelöst [202].
der
8-Oxoguanin
und eine
reparierende DNA-Glykosylase (AlkA) [359,360]
eine
Alkylschäden
eine
Fehlpaarungen reparierende DNA-Glykosylase (MUG) [305],
G«T/U
1
konnte in einer Kokristallstmktur
wird erreicht, indem ein
abasische Stellen und
Arginin
klappt
werden
gezeigt
geringer Sequenzidentität
die Base ersetzt. Interessanterweise bindet UDG auch
auch diese
aus
der Helix heraus
DNA-Glykosylase
die
paarung zwischen Guanin und
Das Herausdrehen der Base
[356].
Thymin
MUG
an
[358].
Homologie
strukturelle und funktionelle
Eine bemerkenswerte
befindet,
UDG
zu
zeigt
trotz
Sie erkennt eine Fehl¬
[305].
oder Uracil ebenfalls durch das Herausdrehen der
Base, wie mit Hilfe einer Kokristallstmktur gezeigt wurde.
Auch für die
nommen.
Glykosylase
Dieses
Enzym
AlkA wird ein Herausdrehen der
entfernt
alkylierte
Basen wie
geschädigten
N(3)-Methyladenin, N(3)-Methyl-
guanin, N(7)-Methylguanin, 0(2)-Methylcytosin und 0(2)-Methylthymin.
des aktiven Zentrums dieses
aussergewöhnlich viele
nur
bei
Motiv
aromatische Reste aufweist.
(HhH-Motiv), begrenzt.
Diese
die
Da die
Region
hydrophobe Spalte,
Spalte
wird
von
die
einem bisher
dem Helix-Haarnadel-Helix-
hydrophobe Spalte
positiv geladene Base binden könnte,
In der
über
7C-Donor/Akzeptor-
wurde ein Herausdrehen der
postuliert [359].
Eine weitere
diese
befindet sich eine grosse
DNA-Reparaturenzymen gefundenen Faltungsmotiv,
WechselWirkungen
Base
Enzyms
Base ange¬
kristallographisch
Hypothese.
entfernt in einer
inhibiert.
Es
untersuchte
Es handelt sich
um
8HOdG«dA-Fehlpaarung
gelang,
Glykosylase
die
das
mit dem HhH-Motiv unterstützt
DNA-Glykosylase
MutY.
2'-Desoxyadenosin
eine Kristallstmktur des
Dieses
und wird
Enzym-Adenin-Komplexes
von
zu
Enzym
Adenin
erhalten.
Kap.
34
1
Das Adenin befindet sich in einer
begrenzt
Aus dieser
wird.
Abstand zwischen zwei
wird die DNA
gebogen
Spalte,
Beobachtung
die ebenfalls auf einer Seite
wird
Pyrimidine
bindet vermutlich B-DNA
langen
entlang
der
Faltungsmotiv begrenzt
Dieses
Aufnahme der
Für
geschädigten Base
eine mit
von
Cyclobutanpyrimidindimeren.
Adenin
herausgeklappt.
apurine/apyrimidine
Stellen.
Lösungsmittel gefüllte Tasche,
Folglich postulierte
Dieses
man
einer
Base
Enzym spaltet
bereits
die
sondern durch intensive Kontakte
des Photodimers.
Für die
Erkennung
in
einer
gegenüber¬
nicht direkt über die
Pyrimidindimer
sehr
zur
wichtig
Herausdrehen des Adenins und dem Abwinkeln der Helix
zum
die der
glykosidische
zentralen
scheint auch
sein, dass eine der drei Protein-Helices in die Nebenfurche binden kann.
vermutlich
Sie
auch für dieses
Hierzu wird das der 5'-Einheit
Dabei wird das
verknüpften Cyclobutanringe erkannt,
Phosphodiesterbindung
und
Herausdrehen
Kokristallstmktur beobachtet werden [307].
zu
[202].
[306].
die T4-Endonuklease-V konnte das
liegende
Dadurch
Achse des Proteins mit Hilfe des HhH-
dienen könnte.
ein Herausdrehen der Base
Bindung
reduziert.
Strang
und das Herausdrehen des Adenins initiiert
Die Endonuklease III entfernt oxidierte
Enzym
in einem
Endonukleasen
1.4.2.2
Motivs.
dass das HhH-Motiv den
geschlossen,
Phosphodiesterbindungen
HhH-Motiv
vom
Dies führt
um
60°
am
Pyrimidindimer.
Das Photodimer kann anschliessend
des Proteins
N(l) der 5'-Einheit protoniert werden, wodurch die glykosidische
am
Bindung gespalten
a/ß-Sandwich aufgebaut
Polymer ase-I (DNA
erweiterte
eine
Pol
I) [59,368].
Loop-Regionen
Bindungstelle
Tasche, die
vom
für
dinierte
am
Sie unterscheiden sich
Rand des
a/ß-Sandwich
Desoxyribose
aus
wie die DNA-
a/ß-Sandwich [364,365].
Das aktive Zentrum,
befindet sich bei beiden
Loop-Regionen gebildet
mit einer Kokristallstmktur
der Helix herausdrehen
beobachtet wurde
Faltung
Endonuklease
der DNA Pol I durch
lässt darauf schliessen, dass beide AP-Endonukleasen die
DNA-Glykosylase
Aminogruppe
von
und den
Vergleich
apurine/apyrimidine
und haben eine ähnliche
zweiwertige Metallionen,
aktiven Zentrums und ein
[59,368]
der terminalen
wird [307].
Sowohl die Exonuklease III als auch die humane
HAP1 sind als
von
[358].
[364,365],
wie
wird.
von
Enzymen
Die
in der
Lage
des
DNasel mit DNA
depurinierte/depyrimies
auch bei der Uracil-
Kap.
35
1
Photolyasen
1.4.2.3
Auch die beiden kristallisierten
die zueinander eine grosse
DNA-Photolyasen,
Homologie
aufweisen, zeigen eine interessante Bindungsstelle für den DNA-Schaden [366,367].
Beide
Enzyme
bestehen
Domäne ein für die
Aus der
das
Bindung
Anordnung
zu
von
und einer helikalen
oc/ß-Domäne
erwarten, dass das
Enzym
das
des
doppelsträngige
einzel- oder
Pyrimidindimer
auf der Oberfläche des
des
im Photodimer die
bindet.
Enzyms
Dinukleotids
aus
vielleicht
diese
Diese
Da eine
bindet.
Enzym
positiv
Wechselwirkung
wurde
an
Methyliemng
des zentralen
[372], wird vermutet,
Wie das Herausdrehen eines
allerdings gänzlich
der DNA abläuft, ist bisher
Kokristallstmktur könnte
keine Präferenz für
die
nicht beeinflusst
Erkennung
dass das Photodimer in die Tasche im
Photolyasen
Folglich
der DNA-Helix
geschädigten Stranges
Methyliemngsexperimente untermauert [372].
Phosphodiester
aus
muss.
[370,371].
Phosphodiesterrückgrat
Man vermutet, dass das
geladene Region
DNA aufweisen
binden
Enzyms
[369].
aufweist
schliessen, dass
Kofaktoren lässt sich
gebundenen
ein Loch in der
Domäne, wobei die cc/ß-
typisches Faltungsmuster
Dinukleotiden
Dies wird auch dadurch unterstützt, dass
herausdreht.
durch
a/ß-
einer
der im Kristall
Pyrimidindimer in
ist auch hier
aus
Frage beantworten,
Eine
unverstanden.
ist
bisher
aber
nicht
vorhanden.
DNA-Reparaturenzyme,
1.4.2.4
Die
DNA-Reparaturenzyme zeigen
III
der Endonuklease
ein
eine
alle hochinteressante
universelles
gleichen Prinzipien
vor
allem
an
das
aktiven Zentrums
Oberfläche
alle
Entdeckung,
Dadurch können sie
für chemische Reaktionen nutzen wie
Schlüssel-Schloss-Prinzip
zu
möglich
Enzyme,
[374].
denken, wie sie
ist
für die
nur
und
an
Enzymkiasse
So wurde anhand
Eigenschaften.
DNA-Deformierungsmotiv,
entdeckt [373]. Noch interessanter aber ist die
DNA herausdrehen können
interessante
an
dass
am
das
Enzyme
HhH-Motiv,
Basen
aus
der
Makromolekül DNA die
kleinen Molekülen. Dabei ist
die wohldefinierte
Umgebung
innerhalb eines Proteins und nicht
an
des
der
[375]. Bisher allerdings ist das Herausdrehen der Base weder für
es
selbst verstanden [377].
vorgeschlagen wurde,
bewiesen
[376], noch ist der Vorgang
Kap.
36
2
Aufgabenstellung
2
Ziel dieser Doktorarbeit
war
durch das
pyrimidindimeren
es, die
Erkennung
Reparatur
Enzym DNA-Photolyase
Hierzu sollte im ersten Teil der Arbeit ein
Phosphoramidit
und
zu
Schadensanaloges synthetisiert werden,
[cz's,syn]-Cyclobutandimeren.
von
bei die
eines
Synthese
des
Analogen
sollten
von
[c/^sjnJ-Cyclobutandimers
anschliessend
in
war.
dessen
Taylor dargestellten
Von besonderem Interesse
dinukleosids, da dieses bisher nicht synthetisch zugänglich
Thymidindimers
[eis, syn]-Cyc\obutan-
untersuchen.
einfacher erhalten werden kann als die bisher
Phosphoramidite
des
von
des
war
2'-Desoxyuridin-
Dieses und das
Oligonukleotide
hier¬
eingebaut
Analoge
werden
(Kapitel 3).
Im zweiten Teil der Arbeit
die
war
Erkennung
durch
inkorporierten [cz^, yyrc]-Cyclobutandimere
An einem
untersuchen.
Enzym
katalysierten Reparatur quantitativ
die Effizienz der
Reparatur
von
und
sollte die
Reparatur
Oligonukleotide
der in
verschiedene
DNA-Photolyasen
Substratabhängigkeit
der
DNA-Photolyase
studiert werden. Besonders interessierte die
Photodimeren durch
Photolyasen
von
zu
Frage,
ob
der Struktur des
Dimeren, der DNA-Sequenz oder der DNA-Konformation beeinflusst wird (Kapitel 4).
In
bezug
der
auf den
vorgeschlagenen Mechanismus,
DNA-Doppelhelix,
das Herausdrehen des Photodimers
sollte die durch die Photodimere
der Helix für verschiedene DNA-Konformationen
aus
hervorgerufene Destabilisiemng
quantifiziert und mit
den
Reparaturraten
verglichen werden.
Ausserdem
kovalent
die
war
vorgeschlagen worden, Phosphoramidite
gebundenes
Flavin enthalten.
Damit könnten
DNA-Photolyase aufgebaut (Kapitel 5)
Abstand des Flavins
In einem weiteren
untersucht
zum
und die
zu
synthetisieren,
die
ein
neuartige Modellverbindungen
Abhängigkeit
der
Reparaturrate
für
vom
Photodimer in der DNA untersucht werden.
Projekt
sollte die
Reparatur
von
Photodimeren durch
Modellproteine
werden, die ein kovalent gebundenes Flavin als Kofaktor enthalten (Kapitel 6).
Kap.
37
Synthese
3
Oligo¬
Photodimer-enthaltenden
von
3
nukleotiden
Im ersten Teil der Arbeit sollten
die
der Photodimere
Analoge
Da diese
siden enthalten.
bauen
zu
können. Dies ist
Phosphoramidite
3.1
Zu
nur
möglich,
waren
nötig,
war es
in der
Thymidindinukleound
diese
enzymatische
Sequenz spezifisch auf¬
Oligonukleotidsynthese
synthetisch zugänglich
bereits
und
physikochemische
für
wenn
Darstellungen
dieser Arbeit
Sequenz dargestellt werden,
2'-Desoxyuridindinukleosiden
Ohgonukleotide
der Photodimere
Bekannte
Beginn
von
verwendet werden sollten,
Untersuchungen
definierter
Oligonukleotide
einsetzbare
sind.
Photodimeren
von
einige Phosphoramidite
von
Photodimeren bekannt
(Abb. 16).
O
MeMe
HN'
Vh h^n
N
R10-V
^o
/'öR2
ö
o
R10~/
X
0
o
o
R10—f'o
ÖR2
O
0=P
/
ÖR2
O
\
<X
55
MeMe
56
o
o
o
xrtx
HN"
X
'H H' ?
N
b
I
(X
54
XX
G
0=P
MeMe
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H
û
0=P—0
\
<X
H
I
U
U
O
O
ÏÏ MeMe
O
Hlrr ^f—X "t11-1
z
Xk
°
O
ÏÏMeH
O
^:
-^
"NH
-XX kÂn
o<^N/yr~r^N'^o
°
o
Q^/
O
/
^
fr"
57
Abb. 16:
Bekannte
R2
R2
=
=
Phosphoramidite
NC
von
Cyclobutandimeren. R1
P(OCH3)(N(CH2CH2)20)
(54);
P(OCH2CH2CN)(Ni-Pr2) (57
-
59).
R2
=
=
DMTr
(Alle Verbindungen);
P(OCH3)(Nj-Pr2)
(55,
56);
Kap.
38
3
O
O
tV
b,
a,
DMTrO
hx
n^
(XX
c
CT
N
60
DMTrO
0=P:
OR2
Schema 2
54 bzw. 58
Bekannte
Synthesen
Taylor
et
al
von
Phosphoramiditen
R1
[242]
=
80%
HOAc,
Trennung
63
na,
(27%
+
THF, AcOH, 73%, g)
Ohtsuka
R4=
al
et
d) MeCN,
30%
14%)22,
(15%
64
R1
[240]
=
von
Thymidmdimer 54,
Thymidindimers
das
56
Phosphoramidit
dargestellt [240].
Taylor
vom
nicht über ein
Die beiden
16%)22,
+
30%
TBDMS,
=
H20,
und HPLC-
e) DMTrCl, Py; 60%, f) TBAF,
R2
53%
R3
OCH2CH2CN,
=
Tetrazol, MeCN, b')
=
I2, (THF, Py, H20),
5% Aceton
Sihcagel-Trennung
Lev;
74%
63
Phosphoramidit-Derivate
dargestellt [229,242,379].
58 des
dass ein
Taylor
Dieser
ein
und das
sich auf je
und
vom
vom
Gruppe
von
57
des
Phosphodiester-Einheit
hydrolysiert
der beiden
Epimere
[cis,syn]-
[trans,syn-I]Ohtsuka
bei
der
59
[cis,syn\durch
den
Entschützung
des
bei dem die beiden Nukleoside
[380].
eines
g)
Phosphothioatanaloge
Phosphoramidit
Cyclobutandimer entsteht,
sind
dTpdU
Daneben hat die
bei dem die zentrale
Phosphat verbrückt
Angaben beziehen
von
[cis.syn] -Thymidindimers
Ausserdem hatte
:
54%
hat bereits die
Diester der Phthalsäure ersetzt ist.
so
H20, Acetophenon, Silicagel-
[cis,syn]-Photodimer 55
Thymidindimers dargestellt,
Ohgonukleotids,
R3
Me,
20%, e) DMTrCl, Py; 76%, f) H2NNH2«H20, Py, AcOH, 78%,
P(N*-Pt-2)2OCH2CH2CN, DIEA;
Arbeitsgruppe
=
[378], b) I2-H20, 65% (a+b) [378],
MeCN
N(CH2CH2)20,
(a+b), c) 80% HOAc, 73%, d) MeCN,
Die
R2
HN(CH2CH2)20, PC120CH3, DIEA;
P(OCH2CH2CN)Ni-Pr2, a)
42%, 64
[cw,.?;y«]-Cyclobutandimere
N(CH2CH2)20,
R4= P(OCH3)N(CH2CH2)20, a) HOBT,
c)
der
der jeweiligen
Verbindung
Kap.
39
Im wesentlichen
folgen
aufgeführten Strategie.
61
zum
die
Ein
einem Dinukleosid
das Dinukleosid 62
produkte
63
in
und 64
Phosphoramidite 54
Phosphoramidit
gekoppelt.
Gegenwart
Arbeitsgruppen
60 wird mit einem
der
Entfernung
der in Schema 2
3'-geschützten
Nukleosid
Dimethoxytritylgruppe
eines Photosensibilisators
belichtet.
[ds.syn]-Photoprodukt
wird
Die Photo¬
63
wird in die
und 58 überführt.
geeigneten Phosphodiesteranalogens
Methyliemngsexperimenten nachgewiesen wurde,
[cis,syn]-Photodimers
des
Nach
beider
werden isoliert und das
3.2 Auswahl eines
Da in
Syntheserouten
3
nicht für die
dass der zentrale
durch
Erkennung
Phosphodiester
Photolyasen benötigt
wird
[372,380,381], sollten Analoge der Cyclobutandimere synthetisiert werden, die über eine
Phosphodiestergmppe
zur
Grappe
bio-isostere
sollte kein Chiralitätszentxum
Gruppe verknüpft
enthalten,
um
die
sind.
Die
verknüpfende
Trennungsschwierigkeiten
zu
umgehen.
Die
Idee, die Phosphodiestergmppe in Oligonukleotiden
Antisense-Forschung
wurden sehr viele
Analoge
für die
zu
ersetzen, ist nicht
neu.
In der
Phosphodiestergmppe untersucht
[382]. Tabelle 4 gibt einen Überblick über die verwendeten Gruppen.
Tab. 4: In der
Antisense-Forschung eingesetzte Analoge
Verknüpfung
Formel
Amid
3'-CH2CONH-5'
Carbamat
3'-OCONH-5'
Dimethylensulfid
3'-CH2SCH2-5'
Hydroxylaminether
3'-CH2N(Me)0-5'
Siloxan
Sulfonamid
Sulfon
Allerdings
Die
unter
[389]
[400,401]
Verknüpfung
Formel
Amid
3'-CH2NHC0-5'
Carbonat
3'-OCOO-5'
[387,388]
Formacetal
3'-OCH20-5'
[390-399]
Methylphosphonat
Literatur
[383]
3'-OP(O)(Me)0-5'
[402]
3'-OSiR20-5'
Sulfonat
3'-0S02CH2-5'
[404]
3'-NHS02CH2-5'
[404]
Sulfoxid
3'-CH2SOCH2-5'
[389]
3'-CH2SQ2CH2-5'
[389]
Thioformacetal
3'-SCH2Q-5'
[393]
Gruppen
Gruppe
Verbindungen bio-isoster zur Phosphodiesterbindung
ist die
wurden mit
Computer gestützten
Formacetalgmppe
66
65.
(Abb. 17) die geeignetste,
ist.
geometrischen Auswirkungen
Formacetalgmppe
23
[384-386]
sind nicht alle dieser
da sie die kleinste
[383]
Phosphodiesterbindung (3' -opo2 -0-5')
[403]
Von den bio-isosteren
Die
Literatur
der
eines Ersatzes der
Phosphodiesterbindung
Berechnungen23 grob abgeschätzt:
molekularen
Modellierungen
wurden mit dem
Verwendung der Amber-Parameter durchgeführt [405-408].
durch eine
In einem unbelichteten
Programm
Macromodel V5.0
Kap.
40
3
Dinukleosid2
0(A3')
und
Photodimer
erwartet
in der
zwischen
À.
[cis,syn\-
À, OP020:
2490
2'-Desoxyuridindinukleosids,
eines
Â.
Bei
des O-0-Abstandes
Einführung
um
der
berechnet
zu
rechnen.
Veranschaulichung
Wie Tabelle 4
entnehmen
zu
um
2.4 °C
H
II
I
strukturelle
fen
hauptsächlich die
Schmelzpunktes
formation
65 bio-isosteren
Aufgmnd
des
Formacetalgmppe
Verzerrungen
um
3 °C
den
[409].
Schmelzpunkt Tm
66.
dass die
der beiden
X-O-Bindungen
eines 10-mers
generelle
Diese
Verzerrungen
Die
bleiben
hervor¬
betref¬
jedoch
Erniedrigung
im
des
notwendige gauche-gauche-Kon-
im Falle der
Formacetalgruppe (X=CH2)
als im Falle der
Phosphodiestergruppe (X=P02) [409,410].
Einflusses der
Formacetalgmppe
sollte als Photodimer ein Formacetal-verbrücktes
und
Struktur des
Formacetalgmppe
Formacetalgmppe direkt benachbarten Basen,
dass die
untersucht
NMR-Untersuchungen
Aus
minimal sind [409,410].
zurückgeführt,
geringen
Formacetalgmppe
Hybridisierungseigenschaften
in der B-Form bleibt und durch die
ungünstiger ist
sollte
ist, wurden bereits Formacetale als Analoge der Phospho¬
wird darauf
entlang
Â,
Verkürzung
also mit einer
geringe Abweichung
der für die B-DNA beobachteten Torsionswinkel.
Rahmen
sehr viel
Phosphodiestergruppe
Berechnungen wurde geschlossen,
der
günstigsten
der
66
[395] bzw. eines 12-mers
DNA»DNA-Duplexes
gerufene
zur
Danach senkt die
den darauf beruhenden
Diese
O
und hinsichtlich der
diesterbindung getestet
[391,395,409].
der
das
Phosphodiesterrückgrat haben.
65
Abb. 17:
man
in
man
Formacetalgmppe wäre
0.2 A oder 10%
keinen grossen Einfluss auf das
Betrachtet
0(A3') und 0(B5'): OCH20: 2.329
Abstände zwischen
folgende
2.520
günstigsten Konformation folgende Abstände
2.296
0(B5'): OCH20:
Konformation
OP02-0:
man
auf die Struktur der B-DNA
Cyclobutanpyrimidindimer dargestellt
werden.
3.3
Generelle
Schema 3
zeigt
die
Synthesestrategie
Retrosynthese
den letzten Schritten der
Synthese
entsprechende Phosphoramidit
2
Formacetal-verbrückter Photodimere.
das in einer
68
für die
Belichtung
erhaltene Photodimer 67 in das
Oligonukleotidsynthese
überführt werden.
In den Dinukleosiden und Photodimeren wird das 5'-Nukleosid in dieser Arbeit mit
mit B bezeichnet.
Danach sollte in
A, das 3'-Nukleosid
Kap.
41
Dieses
Photodimer sollte
Belichtung
zur
in
Gegenwart
einem
aus
eines
69
Formacetal-verbrückten Dinukleosid
Triplett-Photosensibilisators
von
Matteuci
durch
Methoden
erhalten werden.
Darstellung Formacetal-verbrückter Dinukleoside wurden
3
[390-393] und
DMTrO
à à
po-/
/
'b
op
°-A_
X0
S—
70
69
°6
HO —»
Schema 3
Synthesestrategie
dimere
van
Boom
dessen
zur
Darstellung
(P Schutzgruppe,
R
=
der
H oder
Phosphoramidite
«-«
{
OH
53
Me:
4
Formacetal-verbrückter Photo¬
Me)
[394-399] entwickelt. Hierbei wird ein als Donor 70 bezeichnetes Nukleosid,
5'-Hydroxygrappe geschützt
thiomethylether
funktionahsiert
ist und dessen
als
Methyl-
ist, in Gegenwart eines Thiophils mit einem
3'-Hydroxygruppe geschützten Nukleosid,
wurden verschiedene
3'-Hydroxygrappe
dem
Reagentien eingesetzt,
Akzeptor 71, umgesetzt.
so
wurden Brom
succinimid [390] und N-Iodsuccinimid [395,397,398]
erfolgreich
Als
[392,393],
an
der
Thiophile
N-Brom-
verwendet. Auch kann
Kap.
die
42
3
Methylthiomethylgrappe
3'-0-(Dibutoxyphosphoryloxy)methylgruppe (3'-0-CH2-0P(0)(0Bu)2) [394]
oder eine
überführt und anschliessend mit
Voraussetzung
die
Acylhydroxymethylgrappe (3'-0-CH2-OAc) [396]
in eine
für eine selektive
5'-Hydroxygruppe
wendeten
Trimethylsilyloxytriflat (TMSOTf) aktiviert
Umsetzung
des Donors und die
Schutzgmppen
müssen einerseits
ist die
Verwendung
des
3'-Hydroxygrappe
gegenüber
sein, andererseits sollten sie einfach einzuführen und
von
Schutzgmppen
Akzeptors.
Die
für
ver¬
Reaktionsbedingungen stabil
den
Da über das
entfernen sein.
zu
werden.
Aussage gemacht
Trennverhalten der Formacetal-verbrückten Photodimere keine
werden
konnte, sollten ausserdem Schutzgmppen gewählt werden, die unabhängig voneinander
entfernt werden könnten. Dies sollte
es
im Falle schlechter Trennbarkeit der Photodimere
erleichtem, eine der beiden Schutzgmppen abzuspalten und dann grössere Polaritäts¬
unterschiede
führung
des
zu
erzielen.
Entsprechend
ungeschützten
Nukleosids in den Donor 70 und den
sollte einerseits
gangsmaterial
sind die ersten Schritte der
2'-Desoxyuridin 53,
werden, da die Photodimere des Thymidins die
3.4
Da
Thymidin
die
Über¬
Als Aus¬
4 verwendet
auftretenden Photodimere
häufigsten
aus
den Photodimeren des
entstehen [287].
Synthese
Desoxyuridin
Desoxyuridin
von
in der Natur
nach
nur
Uridin als RNA-Baustein
hingegen
als
preiswerter
Desoxyuridin
von
und
Desoxyuridinphotodimere gewählt.
2'-Hydroxygruppe
Die selektive
et
al.
Deaminierung
jeder
wurde
Zur
produziert wird,
daher
der
untersucht.
[411]
2'-Hydroxygrappe
von
entwickelt.
aus
Nukleosiden wurde
mit
Tributylzinnhydrid
Im Falle der
und AIBN
stereoselektiven
als
muss
die
die
mehreren
Anschliessend wird die
teure
verwendet werden
Schutzgruppe
3'-Hydroxy
wird.
C-O-Bindung
Diese Methode
[412,413].
verwendet werden
und insbesondere im Falle des
-
2'-Hydroxygruppe
in einen Ester überführt, dessen
Deuterierung
von
3',5'-0-(l,l,3,3-tetraiso-
homolytisch hydrogenolysiert
Nachteil, dass eine sehr
Pyrimidine
von
Bei dieser Methode wird die 5'- und die
Phenoxythiocarbonylchlorid (PTC-Cl)
den
53
Desoxyuridin
für
Eine für alle Nukleoside einsetzbare Methode wurde
mit
zur
ist Uridin sehr viel
Ausgangsmaterial
als
Darstellung
propyldisiloc-l,3-diyl)nukleosid geschützt.
allerdings
Zelle
Desoxycytosin vorkommt,
von
l,3-Dichloro-l,l,3,3-tetraisopropyldisiloxan
gruppe mit
kann auch
Uridin
aus
des Uridins 72 selektiv entfernt werden.
Entfernung
Arbeitsgrappen
Robbins
71.
Akzeptor
andererseits
2'-Desoxyuridinphotodimere durch Deaminierung
sind und die
Cytosins
am
Synthese
Uridins
beschrieben, die über Anhydroderivate wie 73 ablaufen [414-421].
Sie hat
muss.
wurden
Synthesen
Diese
Synthesen
43
nutzen
die
Möglichkeit
die
dass
aus,
Rückseitenangriff das C(2')-Atom der
Abgangsgrappe
befindet.
Anhydroderivats
73
als
Im
C(2)-Carbonylgrappe
Ribose
Rahmen
Intermediat
Kap.
angreifen kann,
dieser
Arbeit
Uracils über einen
falls sich
wurde
die
an
diesem eine
Bildung dieses
benötigten Desoxyuridins
des
Darstellung
zur
des
3
ausgenutzt.
O
AcBr, HBr/HOAc,
MeCN, 60°C, 5 h
HO^
OH
o
A
o
72
74
73
X
O^
J
±
Bu3SnH, [AIBN],
Toluol, 110°C, 3h
N
CT
NH3/MeOH,
N
RT, 48 h,
tf^u'
UN
à
65%
,0
U
74
Schema 4'
Die
3
(über
Stufen)
/—-.
HO-S
53
75
Synthese
Umsetzung
von
von
2'-Desoxyuridin
Uridin mit
2'-bromo-2'-desoxyuridin
74.
53
aus
Acetylbromid
OH
Undm 72.
führt
zur
Bildung
von
5',3'-Di-0-acetyl-
Wurde diese Reaktion ohne Bromwasserstoff
durchge¬
führt, bildete sich neben dem erwünschten Produkt 74 das unerwünschte 5',3',2'-Tri-0-
acetyluridin,
so
dung
Essigsäure gelöstem Bromwasserstoff [421]
von
gebildet.
in
dass eine
chromatographische Trennung notwendig
Durch Reduktion
2'-desoxyuridin
75 erhalten.
von
75
74
mit
Über
von
die drei Stufen wurden nach Kristallisation das
65% erhalten (Schema 4).
wurde
Entfernung
mittels Extraktion direkt mit ammoniakalischem Methanol
Bei Verwen¬
wurde 74 nahezu
Tributylzinnhydrid
wurde nach der
war.
zu
der
5',3'-Di-0-acetyl-
Zinnverbindungen
2'-Desoxyuridin
Endprodukt in
quantitativ
53 verseift.
einer Gesamtausbeute
Kap.
3
3.5
44
der Formacetal-Donoren
Synthese
dieser Arbeit wurde
Im Rahmen
und die
Pivaloylschutzgmppe
Gegenwart
wurde
von
Pivaloylchlorid
erhalten
des
in
für
Schutzgmppe
Acetylschutzgrappe
Base selektiv mit der
Darstellung
zur
als
die
verwendet.
5'-Hydroxygruppe
76
bei -20°C umgesetzt und 76
Pyridin (Py)
Daher
[422].
mit
2'-Desoxyuridin
in Ausbeuten
in
von
84%
(Schema 5).
AcOH, DEAD,
PPh3, THF, RF,
2 h, 80-85%
84%
Einführung der Pivaloyl-
Schema 5:
Zur selektiven
Einführung
der
R
=
H:
R
=
Me:
und der
auf die
Variante dieser Reaktion [424] wurden
53
R
=
H:
4
R
=
Me: 78
wurde auf die
Acetylierung
Mitsonobu-Veresterung [423]
Nukleosiden
von
2'-Desoxyuridin
53 und
carbonsäure-diethylester (DEAD), Triphenylphoshin (PPh3)
Tetrahydrofuran (THF) umgesetzt.
5'-0-Acetylthymidin
Die Produkte
78 wurden in Ausbeuten
O
von
OAc
II
H3C-S—CH3
J2±L*
H3C
S
ausgerichteten
Thymidin
und
4 mit Azodi-
Essigsäure (AcOH)
5'-0-Acetyl-2'-desoxyuridin
80-85% erhalten
CH3
77 und
OCHR1R2
H3C-S—CH3
+
AcOH
B
ROCH2SMe
Schema 6:
+
AcOH
ROH
Mechanismus der
liegt
das
H2C—S CH3
-*
Einführung
Gleichgewicht
hingegen Essigsäure
den
Reaktionsweg
der
+
AcOH
MeSMe
Methylthiomethylgruppe:
A auf der rechten Seite und
vorhanden
liegt
das
Gleichgewicht
B kann sich das Intermediat
Methylthiomethylgeschützten
Alkohol
es
+
R1R2C=0
+AcOH
Ist keine Säure vorhanden
bildet sich ein Keton.
Ist
A auf der linken Seite und über
bilden, das mit einem Alkohol
abreagiert.
in
(Schema 5).
R1R2CHOH
I
-ArO"
77
Acetylschutzgrappe.
Acetylgmppe
Analog einer
zurückgegriffen.
+
die
Pivaloylchlorid reagiert
der Nukleoside
5'-0-Pivaloyldesoxyuridins
PivCI, Py,
-20°C, 3 h,
Ac20
5'-Hydroxygruppe
zum
Kap.
45
Anschliessend musste die
die
von
Hierzu wurde auf
werden.
Poyer und Angyal [425] eingeführte Variante der Swera-Oxidations-Reaktion
zurückgegriffen,
und
Methylthiomethylgmppe eingeführt
3
folglich die
bei der in
Gegenwart
von
Säure die Elimination
Oxidation unterbunden wird
Dimethylmercaptan
von
(Schema 6).
Gemäss einer verbesserten Variante dieser Vorschrift
konnte durch
[426]
Umsetzung
von
76, 77 oder 78 mit Dimethylsulfoxid (DMSO), Essigsäure und Acetanhydrid die
Formacetaldonoren 79, 80 und 81 in 60% Ausbeute erhalten werden
chromatographische Reinigung
dieser
problematisch.
Sie
der
als
Säule
Reinigung für
die
Darstellung
der
erwies sich
Verbindungen
wurden
daher
meist
Formacetal-verknüpften
(Schema 7).
infolge Zersetzung
Die
auf
chromatographische
ohne
Dinukleoside
eingesetzt.
,R
Ac20, DMSO,
O^V
AcOH, RT,
48 h, 60%
c>
>
R20 -*
o—\
s—
R2=Piv,
R2
R2
Schema 7:
3.6
Der
R
H:
76
R2: Piv,
H:
77
R2: Ac, R
=
H:
R2: Ac,
=
Me: 81
=
=
Ac, R
=
=
Ac, R
=
=
der Formacetal-Donoren
der
Formacetal-Akzeptor
-
um
Zur
eine
muss
an
53 mit
von
und
74%iger
beider
zu
Schutzgruppen
84 mit
mit einer Ausbeute
Benzylbromid
in
können,
wurde
die eine
von
durchführen
72%
Gegenwart
Dabei wurde 84 in
zu
eines
80%iger
Um im
von
einerseits
lässt.
der
die
Ander¬
Acetylgmppe enthielten,
zu
können.
82 (Schema 8) wurde
Trifluoressigsäure (TFA)
Ausbeute erhalten.
werden.
hydrogenolytisch abspalten
3'-0-Benzyl-2'-desoxyuridin
Natriumhydrid benzyliert.
von
entschützten
die sich selektiv
Tritylchlorid in Pyridin
Umsetzung
80
3'-Hydroxygruppe unabhängig
Formacetal-Akzeptoren dargestellt,
wurde anschliessend mit
79
Methylthiomethylgruppe.
3'-Hydroxygruppe geschützt
der
der Dinukleoside
gleichzeitige Abspaltung
Darstellung
R
H:
=
Formacetal-Akzeptoren
Benzylschutzgruppe gewählt,
erseits wurden auch
der
Einführung
Falle schlechter Trennbarkeit der Photodimere die
5'-Hydroxygruppe
R
=
Me: 78
Darstellung
Synthese
=
2'-Desoxyuridin
83 umgesetzt
[427].
83
Phasentransferkatalysators
Ausbeute erhalten.
in n-Butanol
Durch
[428] wurde 82
in
Kap.
46
3
JLJ
JLJ
TrCI.Py,
N
0
°
RT, 40 h,
y
O'}
Darstellung
Schema 8
Einführung
tntyhert und
Nach
der
ohne
Entfernung
86%iger
in
Reinigung
mit
eine
des
durch
Zugabe
Losungsmittels
87%iger
Ausbeute
Gesamtausbeute
zu
87
H
R
=
Me:
Schema9
von
64% erzielt
I
J
Die
4
R
=
Me-
eines
Thiophils
methylgmppe
abgespalten
Abspaltung
z.B.
vorhergehende
Es wurde über drei
86
(86%)
R
=
H
(n i.)
R
=
Me: 88
Acetyl geschützten Formacetal-Akzeptoren 87
87
und 88
(87%)
(64%)a>
ni
nicht
Dinukleosid
zum
1+
werden und
aus
es
Protons
reagiert (Schema 10).
werden
80%iger
in
Ausbeute fur 88 über 3 Stufen
des Donors
eines
Erhitzen
in
0
85
des Formacetaldonors mit dem
Kupplung
durch
und
"o^f
H:
Kupplung
acetyhert.
80% AcOH,
RF, 0 5 h
W
=
a)
Pyridin
(Schema 9)
R
der
in
85 und 86
zu
86 konnte ohne
cr^lST
Ac20, EtN/-Pr2,
Py, RT, 5 h
Darstellung
85
detrityhert
53
isoliert
3.7
wurde
88
zu
4
bzw
chromatographisch gereinigt
detntyliert.
TrO--'
=
wurden 53
Acetanhydnd
wurde 85
Essigsäure
TrCI, EtN/-Pr2,
Py, RT, 16 h
2
von
Anschliessend
refluxierender
1
R
82.
Acetylschutzgrappe (Schema 9)
Aufarbeitung
82
84
3'-Benzyl-2'-desoxyundin
von
Ausbeute erhalten
Essigsaure
Stufen
TrO
83
53
Zur
^
h, 80%
12
OH
TrO—'
^X
NaH, [Bu4NI],
BnBr.THF,
iV-Iodsuccinimid
(RO-CH2-SCH3)
entsteht
zum
em
Formacetalakzeptor
(NIS)
den Schwefel der
an
erreicht
Oxomumion, das
wird durch
Dadurch kann
mit
Formacetal-verbruckten
dem
Angriff
Methylthio¬
lodmethylsulfid
Akzeptor (R^H)
Dinukleosid
unter
(RO-CH2-OR1)
Kap.
47
Me
Mechanismus der
Schema 10:
Für
die
Kupplung
der
CH3SI
+
79
Komponenten
82
und
Dabei konnte
wurden verschiedene Methoden
wendung
A^-Iodsuccinimid (NIS) und Trifluormethansulfonsäure
erfolgreiche Umsetzung
ausprobiert.
erzielt werden. Alle anderen
Dinukleosid
zum
(Schema 11)
von
RO-CH2-OR1
-H+>
Formacetal-verbrückter Dinukleoside
Bildung
beiden
R1OH
R"0^
RO'
RO-CH2-SCH3
3
nur
89
unter Ver¬
(TfOH) [398]
eine
Methoden, bei denen Brom [393],
THF, NIS, [TfOH],
4À Molsieb, 0° C
*-
RiO
°^_
H^O
HO
OR2
s—
R
=
H, Rt
=
Piv:
79
R
=
H, R2
=
R
=
h, R!
=
Ac:
80
R
=
H, R2
=
R
=
Me, R-[
Ac: 81
R
=
Me, R2
Schema 11
:
=
Kupplung
Bn:
82
Ac:
87
=
R
=
H, Ri
=
Piv, R2
=
Bn:
89
(78%)
R
=
H, R,
=
Piv, R2
=
Ac:
90
(68%)
R
=
H, H,
=
Ac, R2
91
(94%)
R
=
Me, Ri
Ac: 92
(96%)
Ac: 88
der Formacetal-Donoren und
-Akzeptoren
zu
=
Ac:
=
Ac, R2
=
den Formacetal-verbrückten
Dinukleosiden.
Af-Bromsuccinimid
blieben
Auch die
erfolglos.
Bedingungen gute
gelöst, eingeengt
THF
gelöst
und
Bedingungen
und 92
3.8
(NBS) [390] oder Thionylchlorid als Thiophil eingesetzt wurden,
Kupplung
Ausbeuten.
mit NIS und TfOH
Hierzu wurde der Donor und
und anschliessend zweimal
gepulvertes,
gibt
aus
unter wasserfreien
Akzeptor
absolutem THF
aktiviertes Molekularsieb
konnten auch die Dinukleoside 90
nur
zugegeben
in
Acetonitril
eingeengt,
bevor in
wurde. Unter diesen
(aus 79 und 87), 91 (aus 80 und 87)
(aus 81 und 88) in guten Ausbeuten dargestellt werden (Schema 11).
Belichtung
Um die
der Dinukleoside des
Photodimerisierang durchzuführen,
Photosensibihsator bestrahlt. Bei der
Belichtung
photoinduzierte [27ts+27ts]-Cycloaddition
(Schema 12).
wurden
vor
von
2'-Desoxyuridins
die Dinukleoside
in Aceton
als
89 in Aceton entstanden über eine
allem die
Photoprodukte 93,
94
und 95
Kap.
48
3
R
=
Bn, R'= Piv: 89
R
=
Ac, R'= Piv: 90
R
=
Ac, R'= Ac: 91
Aceton, hv
O
0
O
O
X2JX
.-w—-V%H
^N^O
R'O
R'O
\—b
\—b
R
=
Bn, R'= Piv: 93 (12%)
R
=
Bn, R'
=
Piv:
94(14%)
R
=
Bn, R'
=
Piv:
R
=
Ac, R'
98
(16%)
R
=
Ac, R'
=
Piv:
100(17%)
R
=
Ac, R'
=
Piv:
R
=
Ac, R'= Ac:
99
(15%)
R
=
Ac, R'
=
Ac:
101
(17%)
R
=
Ac, R'= Ac:
Piv:
=
Schema 12:
ander getrennt werden. Um die
bleiben nach
Methanol
von
unlösliches
Kopplungsmusters
94
zum
Präzipitat
mit dem höheren
der
102(41%)
103(44%)
zu
97.
Verbindung
95
anderen
Diese
Cyclobutanring
/x^Werten reagierten
zugeordnet
hydrolysiert.
lassen
zuordnen.
zu
96
sich
und 97
leicht
Dabei
als in
anhand
des
Die beiden Produkte 93
und das
Produkt mit dem
konnte das Produkt mit dem
werden.
zum
Belichtungsprodukte entsprechend
Uracilcyclobutan-Dimere 96
Dementsprechend
vonein¬
ROESY-Spektren aufgenommen.
mit 4 N HCl unter Rückfluss
zurück.
am
chromatograpisch
den Strukturen zuzuordnen, wurden
wurden die
der Salzsäure die
der Protonen
niedrigsten i?f-Wert
i?^Wert
Varghese [429]
Entfernung
Säule (Silica-H)
Photoprodukte
Abbau-Experimente (Schema 13)
einer Vorschrift
und
gekühlten
Abbau-Experimente durchgeführt,
Für die
(45%)
Belichtung der 2'-Desoxyuridindinukleoside in Aceton.
Alle drei Isomere konnten in einer
einen
95
niedrigsten
49
O
O
O
O
n'Vh
N
NH
HN
'
'
N
[H
''(O
PivO—'
X1\X NH
O-^^N
"N" ^O
H
jf
93
HN
95
4 N
Ar
J^N^O
H
H
Charakterisierung
Zuordnung
0
N
H
H
Photoprodukte 93,
der
auf.
und H-3' der beiden Zucker.
nur
an
ROESY-Experimenten
In
Wichtig
zwischen den Wasserstoffen H-6
artefakte
A
Im
für die
Zuordnung
Cyclobutanring
am
H
sind die
°
mit den Wasserstoffen
Fernkopplung
zu
lassen.
Da eine
an
der
ROESYveran¬
Fernkopplungen
H-l', H-2'
von
den Protonen
dem
H-AT,
zwischen H-A6 und H-A2' ist sehr
mit H-Al' und H-A3' könnten sich daher auch als
in der anfz'-Konformation
N
R
in Abb. 18
[cis,syn]-Isomer 95 sind Fernkopplungen
beobachten. Die
interpretieren
J
wurde mit
treten die
Position 6 des Uracils des Zuckers A)
Kopplungen
L
H
94 und 95.
[trans,syn]-Verbindungen 93, 94
der
Kopplungen
zu
HCl,
97
Experimenten vervollständigt.
(Proton
OBn
-O
96
intensiv. Die
(
o
Ktu NH
H
H-A2' und H-A3'
u.
U
\
l
O
O^N^V
Proton H-A6
H
HCl, A
O
schaulichten
H
PivO~v
94
4 N
Die weitere
/^N'X)
V
I
OBn
3
o
,
*—0
-O
Schema 13:
,
A
O^
°
'q /"0Bn
PjvO—/
0
-'
HN"r—t"nh
°
Kap.
Fernkopplung
Kopplungs¬
zwischen H-A6 und H-A2' aber
glykosidischen Bindung
in der 5'-Ribose
möglich
ist, ist die Zuordnung bereits eindeutig. H-B6 koppelt mit H-B2'. Auch diese Fernkopp¬
lung
ist
nur
Die beiden
in der
anfz-Stellung
der Base
an
möglich.
Position 6 der Uracile und den Protonen
Zucker. Das Isomer mit dem höchsten
Tx"^Wert zeigt
zwischen dem Proton H-A6 und dem Proton
H-B6 und H-Bl'.
am
der 3'-Ribose
[trans, syn] -Isomere zeigen grosse Unterschiede in den Fernkopplungen
zwischen den Protonen
lungen
an
Diese beiden
Fernkopplungen
die intensivsten
an
Position 1' der
ROESY-Fernkopp-
H-A2', sowie zwischen dem Proton
sind
nur
erklärbar,
5'-Ende des Dimers in anrf-Konformation und das Uracil B
am
wenn
das Uracil A
3'-Ende des Dimers in
Kap.
3
50
svtt-Konformation steht.
Folglich
ist das Isomer mit
[trans,syn (5'-anti,3'-syn)]-lsomcr 93,
das auch
dem höchsten
i?^Wert
das
[trans,syn-II]-Isomer genannt wird.25
95
O
O
X/H HiX
Ht"|—T^TH
o^^-^VTpN^o
rjA6Hß5~t<s-i
93
er
vflA2,a
PivO-CH2
H»
hj
,CH2
t)Bn
H2
94
>HB2'
-..
m
«,-.
PivO-CH2
i*H
H'%t
*
"-H
TrW
CH 2 TDBn
°Vxr
H2
Abb. 18:
Relevante
beiden
25
Die
Fernkopplungen
Schutzgruppen
Bezeichnung [trans,syn-T\
Isomeren
am
und
im
ROESY, je in einer 3D-Darstellung (Chem3D) ohne
und in einer
die
graphischen Darstellung.
[trans,syn-ll] ist aufgrund der Reihenfolge der Entdeckung
Phosphodiester-verbrückten Thymidindimer entstanden.
der beiden
Kap.
51
zwischen den H-A6 und
kopplungen
Verbindung steht
dieser
niedrigeren i?f Wert zeigt
mit dem
[trans,syn]-Isomer
Das
und das Uracil B
die intensivsten ROESY-Fern-
am
Fernkopplungen kann
es
Über
diese beiden
94, das [trans,syn (5'-syn, 3'-anti)]-
als das Isomer
eindeutig
syn-Konformation
5'-Ende des Dimers in
3'-Ende des Dimers in anft'-Konformation.
am
In
H-Al', sowie zwischen H-B6 und H-B2'.
somit das Uracil A
3
Isomer, identifiziert werden, das auch [trans,syn-ï]-lsome.i genannt wird.
Proton
Kopplung
Dabei handelt sich
Zucker B auftritt.
am
fällt femer
[trans,syn] -Isomere
zwischen einem der 2'-Protonen
Fernkopplung
eine
der
Zuordnung
Bei der
Im Laufe der Doktorarbeit wurden noch weitere
durchgeführt,
geschützt
waren.
5'-
an
103) sehr gut
mittels
eines sehr
nur
in kleinen
Mengen
des
Die
bereits mit
waren
dige Trennung
Photodimer
vom
von
mit anderen
[trans,syn]-Photodimere
zweites Mal
anderen Isomer
Interesse war,
zu
u.
den
Photodimeren
Pivaloyl-geschützten
geeignetsten,
der
101)
Aufgmnd
trennen.
erhält
Banden),
u.
(102
und 100
98
man
sehr viele
Hauptfraktionen
werden mussten,
um
Da für diese Arbeit
nur
des
Belichtung
und
102
unter
eine vollstän¬
das
[cis,syn]-
beidseitig Acetyl-ge¬
da die Photodimeren 103 im
95
Belichtungs¬
100 bzw. 99
trennen, wobei die
gereinigt
erwies sich die
am
an
und
99 und 101 liessen sich in grösseren
erreichen.
schützten Dinukleosids 91
Gruppen
die [eis, syn] -Photodimere
Mengen mittels Silica-H-Chromatographie
stets ein
2'-Desoxyuridindi-
[trans,syn]-Fhotodimerc
Mitteldrack-Chromatographie
jeden Trennung
mit
5'-Pivaloyl/3'-Acetyl- (90)
[trans, syn] -Photodimeren (98
Die
und dem 3'-
H-A3' steht.
Dinukleosids ähnliche Ausbeuten
ausgeprägten Tailings (langsames Abflachen
Mischfraktionen.
zum
Belichtungen
Belichtung
abtrennbar.
Flash-Chromatographie
liessen sich
einer
den beiden
von
(H-A2'-a)
3'-Hydroxylgruppe
(Schema 12). In beiden Fällen
erhalten
produkten
und
Dabei wurden auch bei
3',5'-Diacetyl-geschützten (91)
des
u.
die
Zucker A
das 2'-Proton, das keine vicinale
um
Proton H-A3' aufweist und somit trans
zum
nukleosiden
am
auf, dass im Isomeren 94 auch
milden
Gegensatz
zu
Bedingungen
entschützt werden konnten.
3.9
Belichtung
Da sich bei der
der
der Dinukleoside des
Synthese
Acetylschutzgruppen
photodimere
Belichtung
direkt
von
92
vom
in
der
als
Cyclobutandimere
günstig erwies,
Acetyl-geschützten
Aceton
des
Thymidins
2'-Desoxyuridins
wurde bei der
Darstellung
Dinukleosid 92
(Methode A)
entstanden
die
Verwendung
der
ausgegangen.
nicht
wie
Photodimere, sondern nur ein Haupt- und ein Nebenprodukt (Schema 14).
Thymidin¬
Bei
erwartet
der
drei
52
3
Kap.
b
AcO—*
OAc
\
\-b
92
hv
Methode A: Aceton,
H20, MeCN, Acetophenon, hv
Methode B:
O
O
ÏÏ MeMe
O
O
ÏÏ MeMe ÏÏ
HN
O'
O
^W—^SjlH
CT
NX)
N
J^
N
H
AcO
OAc
104
Methode A: 1%
Methode A: 60%
Methode A:
Methode B: 1%
Methode B: 14%
Methode B: 40%
Belichtung
des
Analyse
heraus, dass
sich
es
das
als
der
Thymidindinukleoside
gebildet.
verwendeten
Hauptproduktes
um
das
mit
mittels
105
Deshalb wurden die
von
Aceton
105 (1%)
es
(Methode
charakterisiert
Taylor
et
104
in Aceton im
0%
in
zu
das
die
werden.
hatte sich
Es wurde
[cis,syn]-Isomci 106
Abtrennung
den beiden
erhaltenen Rückstandes in Aceton zurück. Diebeiden
liessen sich durch
Das
des
für
als
die
hingegen
Yang [430]
Acetophenon
statt
Lösungsmittel
entstand neben den
[trans,syn]-
Hauptprodukt
als
[eis,syn]-Isomeren als sehr
[trans,syn]-Isomeren
Es bleibt daher beim Aufnehmen des nach
gelöstes [cis,syn]-Isomer
stellte sich
Nebenprodukt
al. [242] und Liu und
Bedingungen
(14%)
Gegensatz
Das
Wasser/Acetonitril-Mischung
Unter diesen
und
bzw
A)
ROESY-NMR-Spektroskopie
Photodimerisierungs-Bedingungen eingesetzt.
(40%). Überraschenderweise erwies sich
sowie
in
DNA-Photolyasen benötigte [eis, syn] -Isomer
verwendet (Methode B).
löslich ist.
92
[trans,syn-I]-Isomeie. 104 handelte.
Aceton als Photosensibihsator und eine
einfach, da
106
(2:1) mit Acetophenon als Photosensibihsator (Methode B).
[trans,sy/r-ID-Isomere
Reparaturstudien
Isomeren
OAc
V-b
Wasser/Acetonitril
nicht
''
O
105
Schema 14:
konnte
i
J4 °i
-O
Bei der
H
•
"OAc
<
Ö
^0
N
'
»
I
QK "o\
AcO
O
MeMe
Entfernung
des
[trans,syn]-Isomere
sehr schlecht
Lösungsmittels
105 und 104
Chromatographie (Silica-H)
trennen.
53
Als erste Photodimere standen die Photodimere 93
geschützten
Dinukleosids 89
Tetrabutylammoniumbromid
Photodimeren 95 die
Verbindung
heraus,
in
Pivaloylgrappe
Bei der
dass das entstehende Diol 108
durch Celite
zur
5'-Pivaloyl-
Hydrolyse
Phasentransferkatalysator
als
(Schema 15).
Reaktionsmischung
95 des
-
Durch
Verfügung.
zur
Abtrennung
des
3'-Benzyl-
[cis,syn]-
vom
Die erhaltene
abspalten.
mit Pd/C in 108
in Methanol stellte sich
schwer löslich ist.
zu
sich
katalytische Hydrierung
Hydrierung
und
mit 1 N NaOH und
liess
Ausbeute
72%-iger
107 sollte anschliessend durch
überführt werden
3
der Photodimere und Dinukleoside
Entschützung
3.10
Kap.
allerdings
Bei der Filtrieren der
Katalysators
bheb das Produkt auf
dem Filterkuchen zurück.
NaOH,
[Bu4NBr],
1 N
ß "p
THF,
72%
HO-^
(
L-b
O
H2, 4 bar,
[Pd/C],
O
MeOH
nicht
vom
Pd/C
abtrennbar,
mutmasslich 108
OBn
107
95
H2, 4 bar>
[Pd/C],
HN
Aceton/
NH
f
MeOH,
CT
88%
^N"l
H
!
PivO—'
1 N
NaOH,
[Bu4NBr],
U^N"^0-^^^
THF
H
55%
1
THF,
RT.
h
/
'
b
"oh
—t
wurde durch
mit
Pivaloylgrappe abgespalten
(Schema 15).
Im Fall der
102 wurde durch
108 in
von
Hilfe
und
59%-iger Ausbeute
von
das
in Methanol/Aceton
Natronlauge
Diol
und
108
,
(Tab. 5).
unter
in
(3:1) in 109 überführt.
Phasentransferkatalyse
55%-iger
die
Ausbeute
erhalten
3'-acetylgeschützten Photodimere
wie z.B.
mit konzentrierter
erhalten
/
95.
5'-pivaloyl-
Umsetzung
°
108
katalytische Hydriemng
Anschliessend wurde
h
V-b
109
Entschutzungsversuche
n
O
V-b
Schema 15:
r
RT,
à
u
95
Produkt,
schwer lösliches
Ammoniumhydroxidlösung
das Diol
Kap.
54
3
Höhere Ausbeuten wurden bei der
103
erzielt.
bei 0°C
duktes
Dieses liess sich mit
quantitativ
aus
diacetylgeschützten
wasserfreiem, ammoniakalisch gesättigtem Methanol
2'-Desoxyuridindinukleosids
Thymidins,
des
die unbelichteten Dinukleoside
sowie
Für die unbelichteten Dinukleoside konnte konzentrierte
Entschützung
verwendet werden. Diese
Von den beiden
Tab. 5:
91
106,
92
und
gelang
Kristalle
es
Diese werden in
Entschützung der
zu
Kapitel
110,
und
108
sowie
dem
quantitativ.
[trans,syn-l]-
3.13 diskutiert.
Reaktionsbedingung:
Edukt:
ebenfalls
zur
erhalten, die für die Röntgenstmkturanalyse
geschützten Cyclobutandimere
als Ester
Ammoniumhydroxidlösung
Entschützungen verlaufen
[ci5,syn]-Photodimeren
Photodimeren 114
waren.
und die Photodimere
(Tab. 5).
verwendet werden
geeignet
Photodimers
(Tab. 5). Dieselben Entschützungsbedingungen konnten für die [trans,syn]-
104
und
des
Dabei fiel während der Reaktion ein Grossteil des Pro¬
entschützen.
Photodimere 99 und 101 des
105
Entschützung
unter verschiedenen
Bedingungen.
Produkt:
Ausbeute
108
59%
f c is. s y n\ -Photodimere :
102
25%
0.1 N
102
NH4OH,
3 h, 80°C
LiOH/THF/MeOH/H20,
2
108
69%
n.
U.K.
91%
n.
U.K.
h, RT
103
MeOH,
NH3, 0°C,
12 h
108
106
MeOH,
NH3, RT,
16 h
110
Quant.
\ trans. syn\ Photodimere :
-
99
MeOH,
NH3, 0°C,
24 h
111
101
MeOH,
NH3,0°C,
24 h
112
46%
n.b.26
105
MeOH,
NH3, RT,
16 h
113
Quant.
104
MeOH, NH3, RT, 16 h
114
Quant.
n.
U.K.
Unbelichtete Dinukleoside:
90
25%
91
MeOH,
Für die
Oligonukleotidsynthese
Die
Verbindung
war
ist
es
115
Quant.
116
Quant.
und
Phosphitylierung
trotz Umkristallisierens
zu
U.K.
der
und der Dinukleoside
notwendig,
angegeben
n.
RT, 16 h
Dimethoxytritylgmppe
können. Daher kann keine Ausbeute
85%, 63%
16 h
Dimethoxytritylierung
[cis,syn]-Photodimere
mit der sehr Säure-labilen
26
NH3,
115
h, 80°C
3
NH3, RT,
MeOH,
92
3.11
NH4OH,
die
zu
unsauber,
werden.
5'-Hydroxygruppe
schützen und die
um
der Nukleoside
3'-Hydroxygruppe
mittels NMR charakterisiert werden
zu
55
in das
Phosphoramidit
überführen.
zu
Dimethoxytritylgmppe und
selektive
Trityhemng
der
Kap.
Aufgrund
des hohen sterischen
der höheren Reaktivität der
5'-Hydroxygruppe
primären Hydroxygmppe
auf. Die Reaktion wurde in
O^
HO—/
/
tritt eine
Pyridin mit Di-
"N^
N
O^N^
O
AP
n
b
der
HN
NH
u
Ansprachs
OH
\-b
OH
\-b
R
=
H:
108
R
=
Me:
110
R
=
H:
R
=
Me:
DMTrCl, Py,
DIEA, RT, 76-88%
115
116
DMTrCl, Py,
DIEA, RT, 68-82%
O
O
R
f vh
°
DMTrO
a
y
CtSt CtNt
^
AP,
DMTrO
OH
O
R
=
H:
117
R
=
Me:
118
R
=
H:
119
R
=
Me:
120
-CN
CEDCI,
CH2CI2, DIEA,
CH2CI2) DIEA,
crRN
RT, 1-3 h, 50-65%
•<
CEDCI,
9'
-
RT, 1-3 h,
55-70%
CEDCI: 121
v
n'
er
/
H
J
"n" ^O
b
r»
=
H:
122
R
=
Me:
123
Dimethoxytritylierung
n
\
.CN
/
°'PxN^
-o
-O
R
Schema 16:
°A
DMTrO—/
b
\
CtSt CtSt
-CN
I
°6
y,
DMTrO->
H
und
Dinukleoside 115, 116.
Phosphitylierung
R
=
H:
124
R
=
Me:
125
der Photodimere
108,
110
3
und
Kap.
56
3
Dabei
methoxytritylchlorid durchgeführt.
in
propylamin, DIEA)
Ausbeuten konnten
erhalten werden,
sehr rein
unbelichteten Dinukleoside
gelang
Anschliessend konnten
den
aus
stärkere
das
wenn
Die
waren.
vorteilhaft, Hünigsbase (N-Ethyldiiso-
als
equimolaren Mengen
nur
Dimethoxytritylchlorid
war es
Pyridin,
lierten Dinukleosiden 119 und 120 in
122 und 123 bzw. 124
Photodimeren 117 und 118
Methylenchlorid
erhalten werden
70%)
Synthese
3.12
Die
zuvor
mit
an
Träger27.
Form
Hünigsbase
die
und
trity-
2-Cyano-
entsprechenden
Phos¬
in zufriedenstellenden Ausbeuten
(50-
Oligonukleotiden
von
Phosphoramidite
wurden
Synthese [431] eingesetzt.
in Schema 17 beschriebenen
Endes
bzw. den
(Schema 16).
beschriebenen
einer maschinellen
und 125
und das
Hünigsbase
(Schema 16).
ethyl-MN-diisoproplychlorophosphoramidit (CEDCI, 121)
phoramidite
die
Gute
zuzusetzen.
der Photodimere und der
Trityhemng
mit 76-88% Ausbeute
tritylierten
Base
der festen Phase
Die
Weg.
aufgebaut.
Aufbau
Der verwendete
Sequenz
Als
zum
wird
vom
Trägermaterial
von
Oligonukleotiden
Synthesezyklus folgt
3'-Ende in
gebunden (Schema 17,
Der
unten).
dem
des 5'-
Richtung
dient üblicherweise ein CPG-
An diesen ist über einen Linker bereits das erste Nukleosid in seiner
links
in
Synthesezyklus beginnt
tritylierten
mit der
Abspal¬
tung der 5'-Dimethoxytritylgmppe mit Dichloressigsäure in Dichlorethan (Schema 17,
Detritylierang).
amidits unter
Kuppeln).
Anschliessend wird das nächste Nukleosid in Form seines
Tetrazolkatalyse
Die nicht
Kupplungsschritt
Kappen).
abreagierten,
Acetanhydrid
Dies verhindert die
Iod wird das
Die nächste
am
mit
Phosphit
zum
Behandlung
27
Da
oder
werden direkt nach dem
Phenoxyacetanhydrid28
umgesetzt (Schema 17,
von
frei
Polystyrrol(PS)-
setzt
(Schema 17, Oxidation).
wiederum die
(Schema 17, Kuppeln).
Sequenz
und zudem keine hohen
auch
verwendet.
Beim Versuch diese ebenfalls einzusetzen, stellte sich
Partikelgrösse
zu
klein war,
um
(Gene-Assembler) gewährleisten
28
Bei der
um
eine
Verwendung
von
Umamidierung
zu
5'-Hydroxygruppe
so
dass ein weiteres
Die
Zyklen
werden
Beladungsdichten vorweist,
Polystyrrol-Polyethylenglykol(PS-PEG)-träger
werden
[432-435]
heraus, dass in beiden Fällen die
ein einwandfreies Funktionieren des verwendeten
zu
des
erhalten ist.
neuerdings
und
Durch Oxidation mit
(Schema 17, Detritylierang),
werden kann
sehr teuer ist
Fehlsequenzen.
oxidiert
Dichloressigsäure
bis die erwünschte
CPG-Trägermaterial
5'-Hydroxygmppe gekuppelt (Schema 17,
5'-Hydroxygruppen
Phosphotriester
mit
Phosphoramidit gekuppelt
freien
Verlängemng
Träger gebundenen Oligomers
solange wiederholt,
die freie
an
Phosphor-
Syntheseautomaten
können.
Pac-Amiditen ist die
Verwendung
von
vermeiden und die Vorteile der milden
Phenoxyacetylacetanhydrid notwendig,
Entschützung beibehalten
zu
können.
Kap.
57
3
O
R
DMTrO
=
R
Base
=
Kuppeln
0 1 M
A 6% DMAP
Amidit, 600 ul Tetrazol,
400 ul
20
(6
min
min
CH3CN
in
B
(Standard-amidite) Ac20/MeCN/Collidin (15
B
(Pac-amidite)
1 3 umol
Pac-Amidite)
f
-
CH2OC6H5
Kappen
Phosphoramidit, 0 5 M Tetrazol
120 nl Amidit, 400 ul Tetrazol,
6 mm (2 min f Pac-Amidite)
1 3 umol
10 umol
RA
CH3
bzw.
10 umol-
Pac20
20%
je 400 ul,
je600ul,
MeCN/Collidin
in
25 10)
(4 1)
30 s,
ca
75 s
ca
DMTrO
DMTrO
Detritylierung
Dichloressigsäure,
1,2-Dichlorethan
1 3 |jmol 60 s Fluss 2
O^
3%
10 umol
200
s
Base
Oxidation
5 ml
0 01 M lod
|\jq
Fluss 2 5 ml
1 3 umol
DMTrO
Schema 17
10 umol
Synthese
dass
von
jeweils
Oligonukleotiden
nur
Kupplungszeiten
der
von
in
1.5
dieser
der festen Phase
gezeichnet
ist.
Die
Alle
30
60
s
s
6
30)
Fluss 2 5 ml
Fluss 2 5 ml
Schlangenlinie
Mengen
deutet an,
Verhältnisse sind
angegeben
Arbeit
auf 6 min
(10 |j,mol-Ansatz) heraufgesetzt.
durchschnittlich
an
das letzte Nukleotid
als Volumenverhaltnisse
Bei dem Einbau
in
CH3CN/Collidin/H20 (65
beschriebenen
(1.3 fimol-Ansatz) und
Dabei wurden
Kupplungsausbeuten
Phosphoramidite
von
gemäss
von
wurden
3 auf 20 Minuten
dem Geräte-internen
97-99% erzielt.
die
Tritylassay
58
3
Kap.
Nach Abschluss der
verbleibende
maschinellen
Dimethoxytritylgmppe
Allerdings empfiehlt
(Trityl-OFF).
diese
Kupplungsausbeuten
Dimethoxytritylgmppe
5'-Ende des
am
sich bei
es
hydrophober
als
der
an
Phase
festen
vorzunehmen
oder schlechten
da
die
Reinigung
des
(Trityl-ON),
und die
Anker dienen kann
die
werden
Ohgonukleotids abgespalten
längeren Sequenzen
nicht
Abspaltung
noch
kann
Synthese,
Ohgonukleotids vereinfacht.
Nach Abschluss der
Schutzgmppen
an
Synthesezyklen tragen
den
Aminogruppen,
die
die Basen Adenin,
abgespalten
wurden sowohl die Standardamidite als auch die
Sie unterscheiden sich in den
verwendet.
Beide
Schutzgruppen für
Basen.
die
Aminogruppen
zum
Schutz der Amino¬
der Basen
Adenin
Benzoyl (Bz)
Phenoxyacetyl (Pac)
Cytosin
Benzoyl (Bz)
Isobutyryl (Ibu)
Guanin
Isobutyryl (Ibu)
Isopropylphenoxyacetyl ((-Pr-Pac)
werden basisch entfernt,
Spaltung
des
auftritt und das
so
dass
mit der Entschüt¬
gleichzeitig
Esters, über den das Oligonukleotid
Oligonukleotid freigesetzt
Schutzgruppentypen
den
an
CPG-Träger
wird.
unterscheiden sich in Ihrer
Empfindlichkeit gegenüber
Üblicherweise werden mit Standardamiditen synthetisierte Oligonukleotide mit
der Pac-Amidite und unter
Benutzung
55°C während 16 h entschützt. Bei
von
Phenoxyacetylanhydrid [437]
kann sehr schnell oder unter sehr milden
die schnelle
Entschützung
Stunden entschützt.
10%
die
Pac-Schutzgruppe
25%iger Ammoniumhydroxidlösung bei
Reagenz,
Schutzgruppen,
Standard-Schutzgruppe:
zung der Basen die
Die beiden
Phenoxyacetyl-Amidite (Pac-Amidite)
Base
Schutzgrappentypen
gebunden ist,
In dieser Arbeit
werden müssen.
Adenin, Cytosin und Guanin verwendet werden (Tab. 6) [194,436].
gruppen der Basen
Tab. 6:
und Guanin noch
Cytosin
wird mit 25%
Als sehr milde
Bedingungen
als
Capping-
entschützt werden.
Ammoniumhydroxidlösung
Entschützungsbedingung gilt
l,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU)
Verwendung
die
Für
bei 70°C für 2
Entschützung
mit
in wasserfreiem Methanol über Nacht bei
Raumtemperatur.
Bei
Verwendung
stellte
sich
der Standardamidite und der
bei
der
Synthese
entsprechenden Entschützungsbedingungen
des
Ohgonukleotids
5'-d(CGCGTU=UTGCGC)-3') heraus, dass zwei Produkte
Mengen entstanden,
die durch HPLC trennbar
eine Massendifferenz
von
höherer Polarität wies die
waren
und im
16 Masseneinheiten aufwiesen.
richtige
Masse auf und wurde in
in
126
(Sequenz
annähernd
gleichen
MALDI-Massenspektrum
Das
Oligonukleotid
Reparaturstudien
von
mit
DNA-
59
Photolyasen (Kap. 4.2) repariert.
Das
um
16 Masseneinheiten höhere
der
DNA-Photolyase nicht repariert.
mit dem
Experimente
Oxidation mit
Molekulargewicht
eine neue,
etwas
Untersuchungen nachgewiesen
den verwendeten
Daher wurden bei der
eingesetzt
Bildung
und sich bei der
werden konnte.
Oligonukleotidsynthese
Entschützung
des
Ammoniak
gesättigtes,
worden war, die
stabil
in bis
Entschützung
das Photodimer
statt der
der
gegenüber
50%-
zu
die durch
war.
HPLC-
Entsprechend wurde vermutet,
dass
wird.
angegriffen
Standardamidite die Pac-Amidite
Unter diesen
Acetyl-geschützten
wasserfreies Methanol als
Es
dieses
mit
Bedingungen
wurde die
nicht beobachtet. Da sich DBU sehr schwer entfernen lässt
gesättigtes,
verwendet.
Reparaturstudien
weniger polare Verbindung,
Entschützungsbedingungen
Nebenproduktes
dass
3
Polarität wies das
Cap/?mg-Bedingungen
der basischen
und mit DBU in Methanol entschützt.
des
niedrigerer
zeigten,
unter den
Bedingungen
mit
auf und wurde in
[eis,syn]-Photodimer 108
Jedoch bildete sich unter den
unter
Oligonukleotid
Iod, gegenüber Tetrazol und
igem Mengenanteil
Kap.
hervorragend geeignet erwies,
wasserfreies Methanol
zeigte sich, dass, solange
Entschützung
ohne
Photodimers 103 mit Ammoniak
zur
Entschützung der Oligonukleotide
die ammoniakalische
Bildung
des
wurde auch mit
Lösung
frisch zubereitet
Nebenproduktes erfolgte.
1)
CPG, DIEA, Py,
DMF, 72 h
O^N
Ï
DMTrO-^
(H2C^
^°
(H2C)5
DMTrO
//
OpISMf
^°
\\
VO
O
^T^x-
-NH
^PG
128
130
127
129
60
Schema 18:
Allerdings
die bei
Darstellung
war
mit Pac-Nukleosiden beladenem
unter diesen
Verwendung
war, oft
von
Bedingungen
käuflichen
die
CPG-Trägermaterial.
Entschützung
Trägermaterials
umol/g
mit einer
der letzten Base
am
Standardschutzgmppe
3'-Ende,
beladen
unvollständig.
Um mit den Pac-Amiditen
(Schema 18), wurde
nach
kompatibles Trägermaterial
Schulhof et
al.
127
verwenden
zu
können
[436] 5'-0-Dimethoxytrityl-A/^-isobutyryl-2'-
60
3
Kap.
desoxycytidin
128
Schutzgruppe
an
der Aminofunktion des
Photodimer des
gesättigtem,
Ausbeute
64%iger
in
dieses
Verwendung
Unter
das statt der
wurde anschliessend durch
Verbindung
[438,439]
synthetisiert,
Umsetzung
Trägermaterials
2'-Desoxyuridins
konnten
wasserfreiem Methanol
zur
Entschützung
130
CPG-Trägermaterial umgesetzt.
Sequenzen,
108 enthielten, unter
als
dieser
Nitropimelinsäureester
mit dem
und mit dem
Isobutyrylgruppe
Der Aktivester 129
Cytosins trägt.
hergestellt
die
Benzoylgruppe
Verwendung
ohne Bildung
die
das
von
mit Ammoniak
von
[cis,syn]-
Nebenprodukten
dargestellt werden.
Tab. 7: Verwendete Amidite und
zugehörige Entschützungbedingungen für Oligonukleotide
Amidit
Entschützungsbedingung
Standardamidit
(25% NH4OH)/EtOH
=
3/1 55°C, 16 h
Pac-Amidit
(25% NH4OH)/EtOH
=
3/1 70°C, 2 h
Pac-Amidit
10% DBU/MeOH, 4° C, 4 d
Pac-Amidit, spez. Pac-CPG-Träger
mit
Tabelle
Anschliessend
gereinigt und
dieser
einen
gibt
7
an
gibt
Die exakten
ges.
MeOH, RT, 10 h
Überblick über die verwendeten Entschützungsbedingungen.
Entschützung
entsalzt.
Reinigung
Tabelle 8
die
NH3
wurden die
Oligonukleotide,
mit 50% Ameisensäure
die
Oligonukleotide HPL-chromatographisch
Trityl-ON synthetisiert wurden,
detrityliert und
entsalzt.
eine Übersicht über die für diese Arbeit
Angaben
experimentellen
Teil
zu
synthetisierten Oligonukleotide.
Ansatzgrösse, Entschützung, Reinigung
aufgeführt (vgl.
Tab.
wurden nach
und Ausbeute sind im
25)
Alle Sequenzen sind in 5'—>3'-Richtung
Oligonukleotide.
desoxy, r: ribo, f : Formacetal, A: Adenin, C: Cytosin, G: Guanin, T: Thymidin, T=T:
Formacetal-verbrücktes Thymidin-[cis.syri]-Photodimer 110, U=U: Formacetal-verbrücktes 2'-Desoxyuridin-[cw,i,y«]-Photodimer 108
Tab.
8:
In dieser Arbeit verwendete
geschrieben,
d:
Sequenz
Oligo¬
Oligo¬
126
d(CGCGTU=UTGCGC)
131
d(CGCGTUfUTGCGC)
132
d(CGACGT=TGCAGC)
133
d(CGACGU=UGCAGC)
134
d(CGACGTfTGCAGC)
135
d(CGACGUfUGCAGC)
136
d(GCTGCAACGTCG)
137
r(GCTGCAACGTCG)
138
d(CGTATT=TATTCTGC)
139
d(CGTATU=UATTCTGC)
140
d(CGTATTfTATTCTGC)
141
d(CGTATUfUATTCTGC)
142
d(GCAGAATAAATACG)
143
r(GCAGAATAAATACG)
144
d(CGAACGTT=TTCGTTCG)
145
d(CCGAACGTTTTCGT=TCGG)
146
d(TACT=TGGAGTCAGGT)
147
RNA-Sequenzen
gestellt. Die DNA-Sequenzen
Die
Sequenz
nukleotid
nukleotid
137
und 143
d(TACTfTGGAGTCAGGT)
wurden freundlicherweise
146 und 147 wurden für eine
von
der Firma
Kooperation
Xeragon zur Verfügung
synthetisiert.
mit L. Beese
61
3.13 Diskussion der
in
Die
dieser
Arbeit
Thymidin dargestellt
worden.
ausgehend
Gesamtausbeute
Photodimeren
Betrachtet
bzw.
9-10% pro
eingesetztem Monomer,
also auf die
5%
Dies erschwert aber den
Vergleich
beträgt.
von
Photodimeren.
ist daher
Es
Weg
Darstellung
Ausbeuten
der
Darstellung
19% erzielt.
waren
zum
aus
Teil
betrachten
um
Dinukleosid
epimerenrein dargestellt [379].
Gruppe
Dimer
nicht
angegeben;
Darst. des
Dinukleosid
aus
Mononukleosiden
Taylor
T[c,s]T
Nukleosiden, aber
Darstellung
In
der
=
nicht
von
von
n.a.
{3}
{2}
mittels
HPLC
wurde daher bereits
Phosphoramiditen
das
der
isoliert)
Totalausbeute
Belichtung
ab Darst. des
[c,s] / [t,s-I] / [t,s-II]
Totalausbeute
ab
Dinukleosid
Lit.
Belichtung
{Stufen}
{Stufen}
27% /
{3}
T[t,s-I]T
18%.
6-21% erzielt.
Photodimere
einem Fall
Synthesen
n.i.
von
Phospodiester-verbrückten
der
n.
i./ n.i.
n.a.
6%
{7}
41% / 36% / n.i.
n.a.
64% / n.i.
11%
Taylor
T[c,s]U
51%
Ohtsuka
T[c,s]T
54% {3}
42% / 20% / n.i.
Diese
U[c,s]U
94% {1}
T[c,s]T
96% {1}
/ n.i.
(9%)a>
[242]
{4}
(41%)/(31%)/n.i.a)
Taylor
über 4 Stufen
92
der Dinukleoside mit 94-96% Ausbeute
{Stufen}
n.a.
Darstellung
der Dinukleoside eine Ausbeute
steigern.
Tab. 9: Übersicht über die Ausbeute verschiedener
=
bzw.
der Dinukleoside Ausbeuten
notwendig,
Cyclobutanphotodimere (n.a.
zur
ca.
In diesem Fall wurden für die
den Dinukleosiden 91
Darstellung
zu
kann die
so
berechnet werden, die
den beiden
aus
(Tab. 9).
aufwendige Trennungen
die Ausbeute
Thymidin
mit anderen Vorschriften
Darstellung
Belichtung
Syntheseweg
bzw.
eingesetzte 2'-Desoxyuridinmenge
Darstellung
haben für die
Forschungsgruppen
ab der
zu
Da die
sich inklusive der
Phosphoramidite
Dabei
deren
Phosphoramidite
von
erfolgt, ergibt
Andere
zu
2'-Desoxyuridin
aus
besten, den Syntheseweg entweder ab dem
am
Dinukleosid inklusive oder exklusive der
ohne den
sind
den gesamten
man
2'-Desoxyuridin
von
3
der Photodimeren
Synthese
beschriebenen
Kap.
{7}
17%
{4}
[229]
{5}
21%
{3}
[379]
7% {7}
13%
{4}
[240]
48%/16%/16%
18%
{4}
19% {3}
40%/14%/l%
18%
{4}
19%
Arbeit
It
{3}
a) Ausbeuten mit HPLC-Trennung
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass der Ersatz der
durch die
Formacetal-Verknüpfung
die Gesamtausbeute erhöht.
stellen sind aber auch bei dem in dieser Arbeit
[eis,syn]-Photodimer
während
Phosphityliemng.
man
geringe
Ist
Ausbeute bei der
auch
der
an
Phosphodiester-Verknüpfung
Belichtung
grössten Schwach¬
vorgestellten Syntheseweg
Belichtung,
den
Die
die
die Ausbeute
Dimethoxytrityliemng
[trans,syn]-Photodimeren interessiert,
in Kauf genommen werden, da die
und
an
die
kann die
Synthese
der
62
3
Kap.
Photodimere eine einfache
Formacetal-verknüpften
Die
erlaubt.
sind
Phosphitylierang
die
Ausbeuten
geringen
Dimethoxytritylgmppe
bei der
Reparatur
Phosphoramidite dargestellt,
zur
Verfügung
da kein
vom
Entschützung
Vermutlich führt das
Beobachtungen
Trägermaterial
macht.
111
und 112
ihrer
Untersuchung
mit
Desoxyuridin-haltigen
das Photodimer
zu
mehr als
von
zur
Epple [440]
Spaltung
eines
Abspaltung
25%
abgebaut
beobachtet, bevor auf Pac-
mit Ammoniak in wasserfreiem Methanol
Hydroxidion
wurden
von
die
erstmalig beide
der Basen und der
Entschützung
Dieser Abbau wurde in dieser Arbeit auch
wurde [379].
Amidite und
für die
Enzym
Methoden
Bisherige
werden.
Photodimeren scheiterten daran, dass bei der
Ohgonukleotids
dies
man
[eis, syn] -Photodimer des Desoxyuridindinukleosids in
das
Oligonukleotide eingebaut
des
da
stand.
erstmalig
Zudem konnten
der
bei
Oligonukleotidsynthese nötig
[trans,syn\-lsomext zugänglich. Im Rahmen dieser Arbeit wurden
noch keine
Wollte
ist.
der Formacetal-verbrückten Photodimere
Synthese
und
Monomethoxytritylgmppe eingesetzt werden,
allerdings etwas längere Entschützungszeiten
Zusätzlich macht die
photolabil
sehr säurelabil aber auch
könnte versuchsweise die
umgehen,
[trans,syn]-Isomeren
Reinigung zurückzuführen,
allem auf Verluste während der
vor
aller
Dimethoxytritylierung
der
bei
Isolierung
umgestellt
Desoxyuridinringes.
wurde.
Ahnliche
beschrieben.
3.14 Kristallstrukturen der entschützten Photodimere
Von den beiden
dimeren 114
waren
[eis,syn]-Photodimeren
gelang
nur
Kristalle
Die
(Abb. 19).
kristallisierten
es
in
zu
108
und
erhalten, die für die Röntgenstmkturanalyse geeignet
und 149
148
[frans,syn]-Photodimere
feinen, langen Nadeln und
Alle Dimere kristallisierten
analyse ungeeignet.
110, sowie dem [trans,syn-I]-Photo¬
waren
aus
des
daher für die
2'-Desoxyuridins
Röntgenstmktur¬
reinem Wasser in Form farbloser
Kristalle, die ein Wassermolekül pro Photodimer enthielten. Tabelle 10 gibt eine ÜberTab. 10:
T
=
Übersicht über die Raumgruppen und Zelldimensionen. Die Kristallstrukturen bei
293 K (110 und 114) aufgenommen.
(von 108) bzw. bei T
100 K
=
Kristalltyp /
Raumgruppe
108
monoklm/
R(F)-
a
(Â)
b
(Â)
c
(Â)
a
(°)
ß (°)
y
(°)
Wert
QQ26
9 39g
°'031
9-787(4)
QQ50
n601(9)
(2)
9.886
11.647(1)
90.00
104.38(1)
90.00
13.127(4)
17.620(5)
90.00
90.00
90.00
6.847 (3)
14.626(9)
90.00
100.30(5)
90.00
(1)
P2(D
110
114
arombii
°Sj?Snbim
P2(l)2(l)2(l)
monoklm/
onoklii
P2(D
'
63
sieht über die
dungen der
Da
Raumgrappen
(Abb. 12)
und Zelldimensionen der Kristalle.
Kristallstrukturen finden sich im
Kristallstmkturanalysen
oder eines
Kap.
eines
Die ORTEP-Abbil-
Anhang.
Phosphodiester-verbrückten Thymidindimers
Desoxyuridinanalogs
et
al. [263,264] konnten
allerdings
erhalten, das einen Phosphotriester
struktur kann
als
Phosphodiestern
0.05
Â
eine Kristallstruktur eines
statt
verkürzt ist.
in der
Im
Länge
der
Phosphodiesters
[trans-syn-I]-Vhotodivae,x
folgenden werden
114 mit dem
150: Cadet et al.
von
150
sich
110
108
u.
110: Diese Arbeit.
150
Phosphotriester
von
die im Triester
um
[eis,syn]-Photo¬
wird das
verglichen.
150
denen bisher eine Kristallstruktur erhalten werden
[263,264];
werden.
Diese Kristall¬
verglichen. Anschliessend
110
von
enthält.
die Kristallstmkturen der
[eis,syn]-Photodimer
108
[eis,syn]-Photodimere,
da
verglichen
Thymidindimers
P-O-Bindungen unterscheiden,
dimere mit der bekannten Kristallstruktur
Abb. 19:
des
gute Näherung betrachtet werden,
nur
wie 44
nicht vorhanden sind, können die Formacetal-
verbrückten Photodimere nicht direkt mit dem natürlichen Photodimer
Cadet
3
konnte;
Kap.
64
3
3.14.1
Vergleich
Die bekannte
[c/s,sy/i]-Photodimere
der
Phosphotriesterstruktur
•
Der
Cyclobutanring
•
Die
glykosidische Bindung
Die
zeigt
drei wesentliche
Eigenschaften.
ist verzerrt.
der 5'-Einheit des Dimers
an
(Ribosering A)
befindet sich
syn-Konformation.
in einer
•
150
der 3'-Ribose
glykosidische Bindung
(Ribosering B)
befindet sich in einer anti-
Konformation.
Vergleich
3.14.1.1
der
[c/s,sy/7]-Photodimere:
Cyclobutan-
Die
substruktur
Tabelle 11
zeigt
gibt
wichtigsten
die
Parameter des
Cyclobutanrings
Nummerierung
die für die Diskussion verwendete
Abbildung
wieder.
20
der Atome in den Photodimeren.
O 31
O 30
Y 34 Y 35
4
HIST
5
3
11
29 0^SK~T^lf^b32
28 0
Abb. 20:
Nummerierung
0 33
der Atome in der
für 150, sonst X
=
CH2.
kennzeichnen die beiden
Y
=
Beschreibung der Röntgenkristallstrukturen.
H
für 108, sonst Y
=
CH3.
X
-
gestrichelten
Die
Diagonalen (keine Bindungen) C(5)-C(7)
und
PO2"
Linien
C(6)-C(8), die
diskutiert werden.
Die Diederwinkel zwischen den Flächen
Diagonalen C(5)-C(7)
entlang
Bereich
der
152°. Dies
weisen für alle
149° bis 152° auf. Hierbei ist der
spiegelt
ringfläche wieder,
RMS: Root
sowie zwischen den Flächen
Diagonalen C(6)-C(8)
von
C(5)-C(8)-C(7) und C(5)-C(6)-C(7) entlang
mean
sich auch in der
die für 108
square; mittlere
C(6)-C(5)-C(8)
[eis,syn]-Photodimeren
Cyclobutanring
RMS-Abweichung29
von
C(6)-C(7)-C(8)
einen
Betrag
im
108 der flachste mit je
der Atome
mit 0.135 A die kleinste bei den
Quadratwurzel.
und
der
von
der
Cyclobutan-
[eis,syn]-Photodimeren
65
Entsprechend
ist.
(Tab. 11)
mit 19.7
auch
ist
der
Dadurch wird auch die
Verzerrung
108 mit einer CB_~ Verzerrung30
CB "-Verzerrung
Tab. 11:
von
Durchschnitt
etwas kleiner
(4)°
als bei den
von
der
endo-zyklischen
-26°
um
Torsionswinkel
Thymidinphotodimeren
Cyclobutanrings
des
3
Kap.
150
und 110.
Sie ist für
etwas vermindert.
und 110
3° kleiner als für 150
mit einer
-29°.
Übersicht über die wichtigsten Parameter
am
Cyclobutanring
150
110
108
114
C(5)-C(8)-C(7) und C(5)-C(6)-C(7)
151°
150°
152°
165°
und
150°
149°
152°
165°
Diederwinkel zwischen den Flächen:
C(6)-C(5)-C(8)
RMS-Abweichung
C(6)-C(7)-C(8)
von
der Fläche
0.147
0.143 A
Â
Â
0.135
0.071
À
endo-zyklische Torsionswinkel
C(8)-C(5)-C(6)-C(7)
20.5°
21.0°
19.5°
10.5°
C(5)-C(6)-C(7)-C(8)
-21.2°
-21.6°
-19.8°
-10.7°
C(6)-C(7)-C(8)-C(5)
20.4°
21.3°
19.5°
10.4°
C(6)-C(5)-C(8)-C(7)
-21.1°
-21.4°
-19.9°
-10.4°
0(Betrag):
20.8°
21.3°
19.7°
10.5°
Verdrillung (pucker)
N(l)-C(6)-C(7)-N(12) bzw.
H(36)-C(6)-C(7)-N(12)
-28.6
°
-30.4
°
-27.0
°
-22.8
°
H(36)-C(6)-C(7)-H(37) bzw.
N(l)-C(6)-C(7)-H(37)
-28.5
°
-27.1
°
-24.5
°
-23.2
°
C(4)-C(5)-C(8)-C(9) bzw.
C(34)-C(5)-C(8)-C(9)
-29.4
°
-29.8
°
-27.7
°
-14.2°
C(34)-C(5)-C(8)-C(35) bzw.
C(4)-C(5)-C(8)-C(35) bzw.
H(34)-C(5)-C(8)-H(35)
-28.3
°
-29.5
°
-23.6
°
-16.0°
0:
-26°
-29°
-29°
-19°
Bindungslängen
Längen
der
C(5)-C(6)
1.545
(6) Â
1.556
(2) Â
1.544 (2)
Â
1.538
(7) À
C(5)-C(8)
1.596
(6)
A
1.582
(2) Â
1.565 (2)
Â
1.582
(8) A
C(6)-C(7)
1.591
(6) A
1.563
(2)
A
1.575 (2)
À
1.536(7) A
C(7)-C(8)
1.538
(6) A
1.537
(2)
A
1.541
(2) Â
1.553
(6) Â
2.148
(6) A
2.141
(2)
A
2.149
(2) Â
2.190
(7) À
2.185
(2) À
2.182
(6) A
Diagonalen
C5-C7
C6-C8
30
Bei der
2.211
Verzerrung des Cyclobutanrings handelt
den 5-C-5-C
und
6-C-6-C-Bindungen.
Dies
H(36)-C(6)-C(7)-H(37), C(4)-C(5)-C(8)-C(9)
C(4)-C(5)-C(8)-C(35)
um
eine
(6)
bzw.
es
A
sich
sind die
bzw.
2.191
um
(2)
A
den Mittelwert
folgenden
aus
den Torsionswinkeln
vier Winkel:
C(34)-C(5)-C(8)-C(9)
und
N(1)-(C6)-(C7)-N(12),
C(34)-C(5)-C(8)-C(35)
H(34)-C(5)-C(8)-H(35). Sind der Mittelwert negativ (positiv), handelt
CB"(CB+)-Verzerung.
an
es
bzw.
sich
Kap.
Die
66
3
Bindungslängen
ähnlich
und -winkel der
denen des
zu
Unterschied
an
110
als die
länger
Auch für die
zu
die für das Uridindimer 108
Bei allen
der
Länge
Diagonalen
gegenüber
Hinderung
dem
durch
Cyclobutanrings ergibt
des
[eis, syn]-Photodimeren ist die C(6)-C(8)-Diagonale
C(5)-C(7)-Diagonale.
Vergleich
3.14.1.2
erwarten, tritt der stärkste
Wie
1% verkürzt ist, da in 108 keine sterische
um
sich ein einheitliches Bild.
etwas
150.
Phosphotriesterderivats
auftritt.
Methylgrappen
sind in beiden Fällen sehr
C(5)-C(8)-Bindung auf,
der
Thymidindimer
Cyclobutanring-Einheit
Die
[c/s,sy/7]-Photodimere:
der
glykosidische
Bindung
Cyclobutansubstruktur
auffallenden
der
Neben
Phosphotriesters
150 eine
anti-Konformation
(%(B)
syn-Konformation (%(A)
[eis,syn]-Photodimeren
verbrückten
Bindung (025-C24-N1-C2)
mitx(A)
69.3
=
=
-72.7
bzw.
60.7°)
Ribosering
am
am
Bei
den
%(A)
=
59.0
(3)° (110);
der
A und eine
Formacetal-
syn-orientiert
glykosidische Bindung
die
n/gn-anrf-Konfoimation31
eine
zeigt
des
glykosidische
Die
beobachtet.
bzw. eine anri-Konformation mit
(3)°) (108)
Ribosering
auf.
B
ähnliches
wird
3'-Zuckers
des
Vergleich
3.14.1.3
=
Struktur
bekannte
des 5'-Zuckers ist in beiden Fällen ebenfalls
(3)° (108)
(017-C13-N12-C11)
(%(B)
-103.7°)
=
die
wies
[c/s,syn]-Photodimere:
%(A)
-95.8
=
(3)° (110).
Die
Riboseeinheiten
Überlagert
man
Unterschiede
zu
die
Cyclobutansubstmkturen
beobachten.
Diese sind
aller
drei
hauptsächlich
sind
Strukturen,
im
Rückgrat
nur
geringe
finden.
zu
Der
grösste Unterschied ist die Verkürzung des 0(21)-0(19) Abstandes aufgrund der C-O-
Bindungen,
Triesterbindungen
Verkürzung
beobachtet.
erwarteten
(1) À signifikant kürzer ist als typische P-O-Diester oder P-O-
die mit 1.41
von
2.55 (1)
Diese
Â
mit 1.60
bzw. 1.55
À (150)
Verkürzung
Verkürzung
des
den Torsionswinkeln des
Â.
Für den
auf 2.317
von
0(21)-0(19) Abstand wurde
(2) À (110)
0.2 A oder 10%
0(21)-0(19)-Abstandes (Kap. 3.2).
Rückgrats
können
jedoch
(2) Â (108)
bzw. auf 2.340
entspricht
eine solche
der
aus
eine
Berechnungen
Geringe Änderungen
in
Verkürzung weitgehend
ausgleichen [441].
Die das
Rückgrat
zwischen der
31
beschreibenden Torsionswinkel
Phosphotriesterverbindung
Anti-Konformationen sind
sowie
von
von
es
sich bei
150 und der
-90° bis +90° definiert.
-90° bis -180° definiert.
Somit handelt
a
-
ç unterscheiden sich
analogen Formacetal Verbindung
£yn-Konformationen
ffig/i-anri-Konformationen liegen
high-anti-Konformationen eigentlich
um
sowohl
eine
sind
im Bereich
von
+90° bis +180°
von
.syn-Konformation.
-90° bis
-70°.
Kap.
67
als auch zwischen den beiden
110
(Tab. 12).
erheblich
Formacetal-[cz's,syn]-Photodimeren
Ihre Variationsbreite
den
Möglichkeiten hat,
durch
Cyclobutanring
den
auszuweichen.
Nur der Torsionswinkel
kleinen Bereich
von
vor
allem
Tab. 12:
von
der
140-160°.
nur, dass das
zeigt
Ôa hegt
und 108
eine Vielzahl
Rückgrat
von
Spannungen
hervorgerufenen
bei allen drei Dimeren in einem sehr
Dies ist nicht verwunderlich, da dieser Torsionswinkel
Verdrillung der Ribose bestimmt wird.
Übersicht über die wichtigsten Torsionswinkel
[263,264]
T[c,s]T
U[c,s]U
T[t,sI]T
150
110
108
114
69.3 (3)
67.5 (3)
XA
C(2)-N(l)-C(24)-0(25)
60.7
59.0
(3)
XB
C(ll)-N(12)-C(13)-0(17)
-103.7
-95.8
(3)
JA
C(22)-C(26)-C(27)-0(28)
-64.5
52.5
(3)
Sa
0(21)-C(22)-C(26)-C(27)
158.5
141.3
(3)
-88.9
(3)
56.5 (3)
42.2
(3)
-72.7
(3)
(3)
147.8
(3)
140.9
163.7 (3)
-48.3
(3)
-169.9(3)
-99.1(3)
87.7
(3)
66.7
(3)
X(20)-O(21)-C(22)-C(26)
-152.9
Ça
O(19)-X(20)-O(21)-C(22)
-132.9
ocB
C(18)-O(19)-X(20)-O(21)
51.6
-79.4
(3)
ßB
C(16)-C(18)-O(19)-X(20)
-117.0
143.6
(3)
YB
C(15)-C(16)-C(18)-0(19)
-171.0
54.1
SB
0(33)-C(15)-C(16)-C(18)
81.2
70.3
V0A
C(23)-C(24)-0(25)-C(26)
-16.0
-25.6
V1A
C(22)-C(23)-C(24)-0(25)
34.9
38.4
V2A
C(26)-C(22)-C(23)-C(24)
-39.9
V3A
C(23)-C(22)-C(26)-0(25)
eA
110
3
77.2
150.23
-158.6(3)
41.7
(3)
120.9
(3)
-18.5(3)
176.5
(3)
143.8
(3)
-30.6
(3)
40.8
(3)
-35.9
(3)
-34.4
(3)
31.6
22.1
(3)
18.1
(3)
2.0
(3)
(3)
(3)
(3)
7.7
(3)
-90.6 (3)
32.0
C(24)-0(25)-C(26)-C(22)
-9.5
?A
Pseudorotationsphasen-
175.4
158.3
150.1
2T3
2Tl
2Tl
(3)
(3)
-33.2(3)
(3)
V4A
(3)
23.3
(3)
-3.2
(3)
166.8
winkel der Ribose
Stereodeskriptor
von
A
2T3,
fast
2E
V0B
C(14)-C(13)-0(17)-C(16)
-10.3
-10.6(3)
-35.7
(3)
-49.9
(3)
V1B
0(17)-C(13)-C(14)-C(15)
-16.8
-18.8(3)
44.6 (3)
47.6
(3)
V2A
C(13)-C(14)-C(15)-C(16)
35.6
38.8
(3)
-36.1
(3)
-27.4
(3)
V3A
C(14)-C(15)-C(16)-0(17)
-42.4
-46.0
(3)
16.2
(3)
-1.2(3)
V4A
C(15)-C(16)-0(17)-C(13)
33.4
36.3
(3)
11.9(3)
31.6(3)
Pseudorotationsphasen-
32.3
31.8
145.6
122.9
3T4
3T4
2Tl
lTo
?B
winkel der Ribose
Stereodeskriptor von
Tabelle
die
gibt
12
B
Torsionswinkel
in
der
Ribose
Pseudorotationswinkel32 sowie den Stereodeskriptor
drei
32
[eis,syn]-Photodimere
Der
tan P
=
Pseudorotationswinkel
{(vi
+
v4)
-
(vo
+
eine
P
an.
und
sich
v3)}/{2 xv2x (sin 36°
aus
+
den
sin
daraus
berechneten
An der 5'-Ribose weisen alle
C2'-enJo-Verdrillung (2T3
berechnet
den
oder
2Ti)
Torsionswinkeln
72°)} [442].
der
auf.
Ribose
An der
gemäss
68
3
Kap.
3'-Ribose
(3T4).
auf.
zeigen
Thymidinphotodimere
Uridinphotodimer
Das
Verdrillung
sowohl die
108 weist
NMR-Untersuchungen
Da aber
Wechsel
die
am
150 und 110 eine C3'-en<io-Konformation
natürlichen
der Ribose als auch die
unterliegt [443-445],
eine C2'-enJo-Konformation
hingegen
CB+/CB--Verzermng
geschlossen werden,
kann
44
Thymidindimer
dass die
(2Ti)
zeigten,
dass
einem schnellen
wichtigsten Eigen¬
schaften, wie die syn- und die anfr'-Konformation der glykosidischen Bindungen und die
in
CB~-Verzerrung
strukturellen
den
Unterschiede
sind
somit
die
auf
Verdrillung
also auf den flexibelsten Teil der
Rückgratwinkel,
sind.
vorhanden
Formacetal-Analoge
beobachteten
Die
der
Ribose
und
die
Dadurch wird
Moleküle, limitiert.
unterstützt, dass die Formacetal-verbrückten Photodimere 108 und 110 gute strukturelle
Bio-Isostere des DNA-Photo Schadens 44 sind.
3.14.2
Die
[trans,syn-l]-Photodimer
Das
wichtigsten kristallographischen
ebenfalls in den Tabellen 11 und 12
einheit
(Abb. 21)
fällt
Daten
des
aufgeführt.
114
[trans, syn-ï] -Photodimers
Beim Blick auf die
sind
Cyclobutandimer-
auf, dass der Cyclobutanring flacher ist als beim entsprechenden
[eis, syn] -Photodimer 110.
Die beiden Diederwinkel zwischen den Flächen
C(5)-C(8)-
C(7) und C(5)-C(6)-C(7) bzw. C(6)-C(5)-C(8) und C(6)-C(7)-C(8) betragen jeweils
165°.
Der
Cyclobutanring
Photodimer 110
(150°).
ist also
betragen und
RMS-Abweichung
der vier
somit halb
so
Cyclobutanring
[cis.syn]-
enJo-cyclischen Torsionswinkeln,
gross sind wie bei 110
Cyclobutan-Kohlenstoffe
im
von
(21.5°),
der Fläche des
und in der
Cylobutanrings
D
o
statt
Verzerrung auf,
Abb. 21:
15° flacher als der
Dies äussert sich auch in den
die im Mittel 10.5°
(0.071 A
um
Das
0.147
A).
die mit -19°
Insgesamt
um
weist
10° kleiner ist als für das
[trans,.yynT]-Photodimer 114
zugehörige
auch dieser
Kristallstruktur.
in
einer
Cyclobutanring
eine
CB"-
[eis,syn]-Isomere.
schematischen
Darstellung
und
die
69
glykosidische Bindungen
Die
Isomeren. An der 5'-Ribose
Auch
7°
ebenfalls eine
hegt
der anri-Konformation des
von
syn-Konformation
Dieser
110.
von
(2T3
fast
2E)
Hingegen zeigt
auf.
Eine
Drehung
konformation
3.15
•
Dies könnte einen
das
wichtigen Beitrag
Pac-Amiditen in
der
Der Ersatz
die
für
und über die
[frans,syn-I]-Isomerie
dazu liefern, dass bei der
Vergleich
Struktur eines
der
Zugänghchkeit
es
eine
Photodimere
Bildung
unter
und
Verwendung
Formacetalbrücke
als
auch
für
erwies
den
Einbau
sich
der
ausserdem beide bei der
[trans, syn]-Photodimere
Belichtung
zu
des
2'-Desoxy-
isolieren.
der Kristallstmkturen dieser Photodimere mit der bekannten Kristall-
Phosphotriesterderivates belegt eine
geeignete
Photodimere keine
Substrate
für
sehr gute strukturelle Übereinstim¬
Daher sollten die
Enzyme sein,
Wechselwirkungen zum
zentralen
gegenüber
dem
butanrings
auf.
von
die
vorgestellten [cis,syn]-
bei
der
Erkennung
der
Phosphodiester ausbilden.
In der Kristallstraktur weist das Formacetal-verbrückte
geringfügig
Thymidin
als vorteilhaft.
mung mit dem natürlichen Photodimer.
Photodimere
von
Phosphoramiditmethode
durch
Phosphodiesterbrücke
uridindinukleosids entstehenden
•
des 3'-Zucker-
Oligonukleotide eingebaut werden.
Die Formacetalbrücke erlaubte
Der
die
Formacetal-verknüpften [eis, syn] -Photodimere
empfindlichen 2'-Desoxyuridindimere
•
Änderung
und eine
um
77°.
nur
Zusammenfassung
sowohl
•
-99° (oder 271°)
114
[trans, syn-ï] -Isomer gegenüber dem [trans, syn-II] -Isomer
2'-Desoxyuridin dargestellt
•
statt
von
ist.
Es konnten die
von
beträgt
Formacetalbindung C(20)-O(21)
Thymidindimeren
begünstigt
Dieser
Ci'-endo nach CY-exo reicht also aus,
von
auszugleichen.
der
die
um
Ç,A.
die 3'-
Am stärksten
den bei 110 beobachteten Torsionswinkeln.
unterscheidet sich der Winkel
von
(iT°).
Überraschenderweise unterscheiden sich die Torsionswinkel a-Ç des Rückrats
von
der
der 5'-Riboseeinheit fast keine
an
weist mit einem Pseudorotationswinkel
167° nahezu die ideale C2'-endo-Konformation
nicht besonders stark
an
[cis,syn]-Isomers (-95.8°).
Ribosering
Riboseeinheit eine CV-exo Konformation
[cis,syn]-
während
vor,
3
Letztere unterscheidet sich mit -88.9°
des Zuckerkonformation findet sich
bezüglich
Abweichung
haben eine ähnliche Konformation wie im
nig/i-anri-Konformation vorliegt.
3'-Ribose eine
nur um
Kap.
[trans, syn-I]-Thymidindimer
[eis, syn] -Thymidindimer eine geringere Verzerrung des Cyclo¬
Die Torsionswinkel des
Rückgrats
unterscheiden sich
nur
äusserst
den im [eis, syn] -Thymidindimer beobachteten Torsionswinkeln.
Kap.
4
4
70
Enzymatische Studien
Die
Oligonukleotide wurden dargestellt,
untersuchen.
zu
Eigenschaften
kurz
Oligonukleotide
4.1
Im
folgenden wird
und die
Reparatureffizienz
daher diese
bevor
vorgestellt,
die
um
enzymatischen
die
Enzymklasse
DNA-Photolyasen
und ihre
wichtigsten
physikochemische Charakterisiemng
Studien
der
vorgestellt werden.
DNA-Photolyasen
Man hatte bereits sehr früh beobachtet, dass nach der
Strahlung
diese sich in
Gegenwart
bezeichnete
Phänomen
Reparaturprozess,
den
man
man
als
(PRE)
oder
Enzyms
Schritt, absorbiert ein Photon
Cyclobutanring.
Enzym
Photoreaktivierung
von
wird.
Enzym
aus
[446,447].
Er isoherte ein
DNA-Photolyase genannt
auf. Danach bindet das
Bestrahlung
von
Bakterien mit UV-
Licht wieder erholen und vermehren.
von
entdeckte
Phänomen aufklären [448,449].
das
von
und
Er klärte auch das
Pyrimidine
DNA-
Rupert
dieses
Wirkungsprinzip
einem
dieses
Licht-unabhängigen
dem nahen UV-sichtbaren Bereich und
Hierdurch werden intakte
erste
Photoreaktiviemngsenzym
das
Pyrimidindimere in
an
der
war
1958 konnte
Erst
Enzym,
es
Dieses
spaltet
dann den
erhalten. Anschliessend dissoziert
der DNA.
xä&
-OH
NHR
H—OH
H-
NH2
-OH
-H
HO
O
0=P-0-P-0.
6-
6-
\^2>
H2N
OH OH
FADHAbb. 22:
Dieses
dener
konnte nach dem
Photolyasen bestätigt
faktorsystem (Abb. 12).
werden.
Die
erfolgreichen
Dabei entdeckte
monomeren
N
H
5,10-MTHF
8-HDF
Kofaktoren, die in DNA-Photolyasen nachgewiesen wurden, in
Wirkungsprinzip
N
der
Fischer-Projektion.
Klonieren der Gene verschie¬
man
ein
Proteine mit einem
aus
sergewöhnliches
Molekulargewicht
von
Ko55-
65 kDa enthalten mindestens einen, meist aber zwei Kofaktoren in stöchiometrischen
Mengen.
nukleotid
Der Kofaktor, der in allen
(FADH").
Photolyasen gefunden
Ein zweiter Kofaktor wurde bisher
nur
wurde ist Flavinadenindi-
in mikrobiellen
Photolyasen
71
Es handelt sich entweder
(Klasse I) nachgewiesen.
(5,10-MTHF; Typ I) oder
erweitert das
bis
zu
500
Die
Man ist heute
höherer
der
Meinung,
angeregten Zustand ein Elektron
an
das
Flavin-Radikal
300
Flavin
Energie
mit
Studien
in
der
werden.
aufgeklärt
des Substrats die
Photolyase
über
wird anschliessend in
Dieses
übertragen.
Pyrimidindimer abgeben.
Radikalanion ist instabil und zerfällt in ein
von
konnte bisher kein
der Kofaktoren
Bindung
das
Bereich
werden daher einer
und
Photolyasen
Die absorbierte
auf
sogenannten Försfer-Prozess
anion des zweiten
Dieser Kofaktor
längerwelligen
[450,451].Insbesondere
dass nach
den zweiten Kofaktor Licht absorbiert.
einem
5,10-Methenyltetrahydrofolat
Photolyasen
Zusammenspiel
4
unterscheiden sich in ihrer Amino¬
Bei diesen
werden
E. coli konnte das
generell
ein
in den
Eukaryonten
den mikrobiellen
von
nachgewiesen
zweiter Kofaktor
aus
Photolyase
der
zugerechnet (Klasse II).
anderen Klasse
um
8-Hydroxydeazaflavin (8-HDF; Typ II).
Photolyasen
säuresequenz sehr stark
Photolyase
ein
Absorptionsspektrum
nm.
Kap.
kann
im
Das dabei entstehende
ungeladenes Pyrimidin
und in das Radikal-
Von letzterem wird das ungepaarte Elektron auf das
Pyrimidins.
zurückübertragen,
wodurch die
Photolyase regeneriert wird (Schema 19).
\ hv
\
8-HDF bzw.
5,10-MTHF
För ster-
\
Ene rgie-i
\
trän sfer
e-
hv
•
—^
Flavin
i
i
I
'
Pyrimidin
(FADH")
Darstellung
vom
des
Pyrimidin
(FADH)
Pyrimidin
Schema 19: Schematische
Licht wird
Flavin
i
i
der
Wirkungsprinzips
zweiten Kofaktor
Pyrimidin
DNA-Photolyasen. Langwelliges
(8-HDF bzw. 5,10-MTHF) absorbiert.
Über¬
Durch
tragung der absorbierten Energie in einem Förster-Energietransfer oder durch Absorp¬
tion
von
kurzwelligem
Licht wird das Flavin angeregt,
Pyrimidindimer abgeben
instabil. Die
Pyrimidine
kann.
werden
Die
an
das
negativ-geladene Cyclobutandimereinheit
ist
zurückgebildet
so
dass
es
und das Elektron
ein Elektron
an
das Flavin zurück¬
übertragen.
Die
Gleichgewichtskonstanten (Ä^D)
Komplexe liegen
im Bereich
Assoziationsraten
von
106
-
von
der
lO"9
bislang
-
untersuchten
DNA-Photolyase-Substrat-
10"nM [371,381,452,453].
107 M_1 s_1 nimmt
man
an, dass
Aufgrund
Photolyasen
ihr Substrat
über dreidimensionale Diffusion und nicht über eindimensionale Diffusion
DNA erkennen
[300].
Dies wird dadurch unterstützt, dass
Photolyasen
der
mit
entlang
nur
der
ein bis
4
Kap.
72
ionische
zwei
Bindungen
eine
nur
schwache
Wechselwirkung
der
mit
DNA
eingehen [454].
Die Substratstruktur beeinflusst die
gewissen
Rahmen.
Ribosen)
und das
dennoch
mit hoher Affinität
dung
Bindung
zur
bei
des
[372,380,381].
die
Bindung
derselben
an
(ds-DNA) [370,457,458].
denen das
Enzym
Für das
aufstellen:
nur
Reparatur
Reparatur nicht
Man
daher vor, dass die
durch
Methylgrappen
M)
binden
[455],
als Minimalstruktur für eine Bin¬
Phosphat
des Photodimers nicht
T[c,s]U
coli konnte
U[c,s]U
>
bindet E.
So
(ss-DNA)
>
man
die
C[c,s]C.
und
an
coli
Photolyase
doppelsträngige
mit
DNA
Methylierangsexperimenten überein, gemäss
mit dem
geschädigten Strang eingeht [372].
Erkennung
von
E.
aus
als auch die Sekundärstruktur der DNA auf
der Photodimere ebenfalls nicht.
Es
entspannter und superspiralisierter DNA mit
entwinden oder abknicken
muss.
Carbonylgruppen (C(2)=0
spezifische Wasserstoffbrücken gebunden
dass die
(i^D=10"4
[370]. Hieraus kann geschlossen werden, dass das Enzym die
DNA für die
schlägt
>
haben.
zu
Dies stimmt mit
fast alle Kontakte
Effizienz abläuft
[cz's,syn]-Thymindimer (ohne
Grössenordnung [455].
eine
um
DNA-Sequenz
Die DNA-Tertiärstruktur beeinflusst die
gleicher
das
Enzym
T[c,s]T
einzelsträngige
wurde beobachtet, dass die
an
Das zentrale
abhängt.
keinen grossen Einfluss
Affinität
zwar
das Substrat in einem
an
Ausserdem wurde beobachtet, dass die Affinität auch
Innerhalb dieser Reihe sinkt die Affinität
scheint sowohl die
Photolyase
des Dinukleosids
[372,454,456].
folgende Affinitätsreihenfolge
Hingegen
der
Typs NpT[c,s]TpNpNp
der Art des Photodimers
von
Photolyasen
[eis,syn]-Photodimer
Sequenz
eine
gilt
So können
Bindung
werden.
u.
C(4)=0)
des Photodimers
Zusätzlich wird angenommen,
über van-der-Waals-Kontakte oder
hydrophobe
Interaktionen
erkannt werden [300].
Der
vorgeschlagene
Mechanismus lässt darauf schliessen, dass die Struktur des Photo¬
dimers einen entscheidenden Einfluss auf die
schwindigkeit
seiner
Eine
in der
C[c,s]C (0
beiden
Struktur
dass für die
und
0.05)
Substitutionsmuster
dem
konnte
Photolyase
Reihenfolge T[c,s]T ((f)
=
=
abnimmt [455].
von
aus
0.9)
>
Öffnungsge¬
Kim und Sancar
E. coli die
T[c,s]U (<p
des
Cyclobutanrings
nachgewiesen
werden.
Quantenausbeute ((f))
=
0.8)
>
von
U[c,s]U (<j>
für die
=
0.6)
Es wird vermutet, dass dieser Effekt durch die
Methylgruppen hervorgerufen wird,
die nahezu
sind und daher das Dimer destabilisieren und die
[459].
da die
im Radikalanion des Photodimers ausschliesslich
derartige Abhängigkeit
beobachteten,
Spaltung
»
Cyclobutanrings
geometrischen
abhängt.
Sie
des
Reparaturrate hat,
ekliptisch
Spaltungsrate
zueinander
angeordnet
dadurch erhöhen könnten
Kap.
73
Die Ursache dieser
Studien
Beobachtung
photodimer bestätigen,
abgesenkt
stellen aber in
wird [460,461].
ob die
Frage,
quantenchemische
So konnten
einen destabilisierenden Effekt der beiden
zwar
dadurch
ist aber umstritten.
Methylgrappen
Energie
Statt dessen weisen
4
Thymidin-
im
Übergangszustandes
des
Untersuchungen darauf
neue
hin, dass die unterschiedlichen Reparaturraten durch unterschiedliche Bindungsgeo¬
Thymidinphotodimere innerhalb
metrien der Uridin- und
gerufen
einer
[462].
werden könnten
Aufgrund
dieser
Beobachtungen
ist
Photolyasen gültig sind.
Daher sollten
nidulans
und
für
kompetitiven
2'-Desoxyuridindimere
dieses
Enzym
die
von
der
Stammregion
sollte
wird,
einer Haarnadel
einer Haarnadel
repariert
Reparaturstudien
4.2 Erste
Um
DNA-Reparaturrate
Reparatureffizienz
DNA-Sequenz
Abhängigkeit
der
DNA-Photolyase
ein
werden und die
Da für die
untersucht
zusätzlich
einer
an
ob
werden,
ein
oder schneller als in
signifikant langsamer
wird.
DNA-Einzelstrang
am
nachzuweisen, dass sich die eingeführten Analoge als Substrate für DNA-Photo¬
lyasen eignen,
wurden
am
Photolyasen durchgeführt.
Organismen Anacystis Nidulans,
einem
unterscheiden sich in dem zweiten Kofaktor.
Methenyltetrahydrofolat
weisen eine hohe
und
als zweiten Kofaktor
Sequenzhomologie
zur
die
zu
den Klasse
mikrobiellen
bisher
nicht
Il-Photolyasen.
Photolyasen (nur
mit
Untersuchungen
einem
wurde
das
Photolyase verwendet [450].
Photolyase
Photolyase
von
von
gut untersuchten Photolyase
Die
Photolyase
Sie hat eine kleinere
aus
Kofaktor
isoliert
Glutation-S-transferase
Aufgrund
werden
(GST)
den
einem
Photolyasen
A. nidulans ein
N.
crassa
Beide
E. coli
von
aus
P.
identisch)
ein
Enzyme
[300]
Tridactylis
Sequenzhomologie
12-14% der Aminosäuren sind
zweiten
stammten
(Klasse I, Typ I) [466].
(39% aller Aminosäuren sind identisch) [450].
gehört
Diese
Die untersuchten drei
So hat die
Typ II)[463-465]
(Klasse I,
(Tab. 8) Reparatur¬
Cyanobakterium, Neurospora Crassa,
Pilz, und Potorous Tridactylis, einem Beuteltier.
Deazaflavin
126
einzelsträngigen Oligonukleotid
studien mit drei verschiedenen
auf
der
von
Anacystis
aus
Zusätzlich sollte für
bestimmt werden.
Sequenz überprüft
diskutiert
Loopregion
die
coli,
E.
aus
für alle DNA-
Spaltungsrate
Typ Il-Photolyase
der DNA-Stmktur untersucht werden.
Photodimer in der
der
einer
an
Thymidindimere
und
Unabhängigkeit
Flipping-mzchamsmus,
DNA-Photolyase
nicht-kompetitiven Bedingungen
GC-reichen und einer AT-reichen
Reparatur
ob die für die
fraglich,
beobachteten Unterschiede in der
Typ I-Photolyase,
unter
des aktiven Zentrums hervor¬
zu
den
und konnte
die
ersten
Fusions-Protein
dieser
[450].
Für
des fehlenden zweiten Kofaktors und der
Anwesenheit der GST-Untereinheit wurde eine
signifikant erniedrigte Aktivität
erwartet.
Kap.
Für
74
4
die
Reparaturstudien
geschädigte Oligonukleotid
lässt. Für die
126
Trennung dieser
(151)
14.1 min
Intensitität
Assay entwickelt, mit
dessen
Hilfe
151
(Tab. 8)
reparierten Oligonukleotid
vom
beiden
graphische Trennung (Nucleogel
nukleotide wurden
ein
wurde
Sax
Grundlinien-getrennt
das
trennen
erwies sich eine Ionen-chromato¬
Oligonukleotide
1000-8/46)
sich
besten
am
mit Retentionszeiten
geeignet.
Beide
12.3 min
von
Oligo¬
(126)
und
eluiert.
(A26o)
151
t
t
=
=
60 min
20 min
t= 10 min
t
t
"1
I
10
16
14
Retentionszeit
Abb. 23:
Photoreaktivierung von
Reaktionsmischung
126 durch die
Für
den
Assay
5mMDTT,
wurde
10 mM
tridactylis
GST-Fusions
aus
dem
des A.
N.
crassa.
151:
Der
Photoreaktivierungspuffer
0.1 M
nidulans und N.
NaCl).33
crassa
zu
halten.
Nach
Enzyms
Zugabe
und 250
enthält Dithiothreithol (DTT),
um
Um für
(200 ul:
gelöst
der DNA-
pmol
Proteins) im Dunkeln, wurde die Assay Lösung in
Photoreaktivierungspuffer
Zustand
repariertes Oligonukleo¬
Teil.
Kuvctte überführt und mit monochromatischem Licht bestrahlt.
33
Proben der bestrahlten
aufgeführten Zeitpunkten analysiert.
Oligonukleotid.
126
KH2P04 pH 7.0,
Photolyasen (25 pmol
Photolyase
Experimenteller
in
20
[min]
Methode I /
Bedingungen:
0 min
18
wurden mittels HPLC bei den
126: Photoschaden 108 enthaltendes
tid.
4.5 min
I
1
12
=
=
des P.
eine kleine
jedes Enzym
die
den Flavin-Kofaktor im reduzierten
75
maximale
Aktivität
erzielen,
zu
Photoreaktivierangsaktivität
für das
Enzym
wurde
aus
P.
=
405
tridactylis
konzentrierte
wurde
Ohgonukleotids
23
eine Serie
zeigt
von
wurden
Proben
um
analysiert,
beträgt X
der
aus
die
X
von
die Reaktion
um
maximalen
=
Photolyase.
Wellenlänge
wurden.
HPL-Chromatogrammen,
435
nm
Für das
380
=
nm
Assaylösung
Die
stoppen.
zu
Menge
des
reparierten
die mit dem N.
In der Anwesenheit einer der
bewirkte die
Bestrahlung das Abreagieren
eines
neuen
Ohgonukleotids
keine
Ändemng
151.
In der Abwesenheit
in der Konzentration
von
drei
Ohgonukleotids
des
126
126 und das Auftreten
126 beobachtet.
bestätigte,
crassa
DNA-Photolyasen
DNA-Photolyase
von
Oligonukleotid
unabhängig synthetisiertem Oligonukleotid
Minuten dem
eine
crassa
4
quantifizieren.
zu
Enzym durchgeführt
mit
der
verwendet. Diese
Essigsäure zugegeben,
vorbereiteten Proben wurden mittels HPLC
Wellenlänge
für die N.
nm
Nach definierten Zeitintervallen
entnommen und
Abbildung
die
jeweiligen Enzyms
A. nidulans und X
aus
GST-Fusions Protein
verwendet.
des
Kap.
wurde
Koinjektion
dass die Bande bei 14.1
reparierten DNA-Strang entspricht.
100
-,
80
-
60
-
151
[%]
40
-
20
1
10
20
30
t
Abb. 24:
Zeit-abhängige Bildung
Anacystis nidulans;
des
:
tridactylis;
Photolyase zugegeben). Bedingungen:
Abbildung
alle drei
24
zeigt
die
des
Beide mikrobieUen
Formacetal-verbrückte Photodimer 108
zu
50
60
[min]
K:
Methode I /
zeitabhängige Bildung
analysierten Enzyme.
40
reparierten Ohgonukleotids
Potorous
4
»-
151. •:
Neurospora
crassa; :
Kontrollexperiment (keine
Experimenteller
reparierten Oligonukleotid
Photolyasen
DNA-
Teil.
sind in der
reparieren. Wie erwartet, ist
151 für
Lage,
das
die Aktivität der
Kap.
76
4
Photolyase
aus
höhere
musste eine
Enzymkonzentration
126
Photolyasen
eindeutig
151
zu
Untersuchungen geeignetes
reparieren,
von
die
Isoster für
aller drei
Fähigkeit
Die
Erkennung
hat. Bei
Ein genauerer
Eignung
sollten die
Oligonukleotid
Vergleich
zu
des DNAKlasse II
Die ersten
enzymatische
DNA-Photoschäden wie 44
Phosphat
zu
erkennen und
zu
innerhalb des Photodimers
ist. Dieses
nur
möglich,
mit dem
Ergebnis
einen
ist konsistent
geringen
Absorption
hinsichtlich der
132, 133, 138 und 139
untersucht werden.
sigmoide
worden
der
Fragestellungen
das
es
zur
Bildung
herausstellte.
Zunahme mit einem
Haarnadelbildung
über eine
war
von
einer
Statt
einer
Wendepunkt
GC-Paarung
Beantwortung obiger Fragestellungen, die Sequen¬
als Photodimer-enthaltende
Einzelstränge zeigten
menten eine lineare Zunahme der
natürliche
Substratabhängigkeit
dieser
da
sich
Sie befindet
das natürliche Substrat
wenn
Schmelzpunktstudien
Dies kann durch eine
A. nidulans mit
DNA-Photolyasen nachgewiesen
Beantwortung
wurde eine
aus
Einfluss auf
wie für das
gleichen Assay
Sequenz ungünstig gewählt,
erklärt werden. Daher wurden für die
Diese
Zur
wie sich in
neigte,
bei 66°C beobachtet.
(Tab. 13).
nur
Substratanalog
untersucht werden.
linearen Zunahme der
zen
ist
108 als Substrat für
von
126 in der
Sekundärstruktur
ein für
(Abb. 19)
Grössenordnung
vorgestellten Fragestellungen
Reparatur gezielt
selbst
akzeptieren.
Quantenausbeute abgeschätzt.
in derselben
also
und das formacetal-verbrückte
Nachdem die
dass
zeigt,
dieses Substrat
notwendig
Reparatur
späteren Reparaturstudien mit der Photolyase
zwischen 50 und 100%,
[453].
die
als Substrat
innerhalb des Dimers
Hilfe eines Fluorimeters wurde die
war,
Enzyme,
Photoreaktivierung
um
Gruppen durchgeführten Methylierungsstudien [372,380,381],
Phosphodiestergruppe
Erkennung
Substrat
Dies
Cyclobutandimer
des Photoschadens
verschiedenen
wonach die
nachweisbar.
weist klar daraufhin, dass das zentrale
nicht für die
mit
verwendet werden,
dass das Photodimer 108
Reparaturstudien zeigen daher,
Daher
Grössenordnungen) geringer.
synthetische Schadensanalog 108
das
(Abb. 12) ist.
2-3
tridactylis Photolyase
Dennoch ist auch für P.
beobachten.
Stranges
tridactylis signifikant (um
P.
in
DNA-Stränge
verwendet
thermodynamischen Denaturierungsexperi-
UV-Absorption
und weisen
dementsprechend
keine
Sekundärstruktur auf.
Als
Gegenstrang
zu
oligonukleotid 136
den GC-reichen
für
DNA'DNA-Duplexe
DNA»RNA-Duplexe eingesetzt.
Desoxyribooligonukleotid
für
DNA*RNA-Duplexe
nukleotide 134 und 140
Sequenzen
und
Für die AT-reichen
142 für
als
132 und 133 wurde das
das
Gegenstrang
verwendet.
synthetisiert (Tab. 13).
Ribooligonukleotid 137
Sequenzen
DNA»DNA-Duplexe
Desoxyribo-
und das
für
138 und 139 wurde das
Ribooligonukleotid
Als Referenzen wurden die
143
Oligo¬
77
Für die
Reparaturstudien
chromatographie
überlappten,
wurde
verwendet.
wurde
Kap.
den meisten
in
Experimenten
Da die Banden aber sehr breit
RP-Chromatographie (RP
Ionenaustausch-
und sich daher stark
waren
phase
reversed
=
die
4
=
Umkehrphase)
getestet. Diese erwies sich bei Verwendung einer Nucleosil 120-3 C18-Säule und eines
Acetonitril-Gradienten in
der
Oligonukleotide
Ammoniumacetatpuffer
hinsichtlich der
Retentionszeiten der verschiedenen
Die
Trennung
tide mit dem
Allerdings
dem
über
2'-Desoxyuridinphotodimer
ist auch das
RP-System
zu
erhalten.
in beiden
von
denen mit dem
zur
Trennung
Tabelle 13
zeigt
Trennung
der
Oligonukleo¬
Auswertung
zu.
der Daten auf
selben Zeit eluiert wie DTT.
vorbereitet werden,
um
die
Chromatographiesystemen.
Thymidinphotodimer
nicht ideal. So wurde die
Aus diesem Grand wären für dieses
farbstoff markierte
Tab.
sorgfältig
geeignet.
lässt ausserdem eine
dadurch erschwert, dass 135
RP-System
6.5 als Eluent in der
pH
als besser
Olignukleotide
RP-Chromatographie
müssen die Puffer sehr
linie
Auflösung
bei
eine
möglichst
System
Auch
stabile Grund¬
mit einem Fluoreszenz¬
Oligonukleotide besser geeignet.
13:34 Retentionszeiten der in Reparaturstudien verwendeten Oligonukleotide in zwei
Chromatographiesystemen: (RP:
Nucleosil 120-3 C18, 250
ml/min.
A: 20 mM
B.
IAT:
Nucleogel-Sax 1000-8/77,
B:
l.OMNaCl, 10
CH3C02NH4 pH 6.5,
mM
2
B: 50%
ml/min,
Na2HPQ4 pH 11.4;
Oligo¬
x
4 mm, 3
u.
Porengrösse, 0.7
MeCN, 50% A (v/v), 0^20 min: 6->16%
A: 0.2 M
NaCl, 10 mM
Na2HP04 pH 11.4;
0^6 min: 100% A, 6-^23 min: 0-H>51%
Sequenz
Retentionsze it
nukleotid
B)
| min
RP
IAT
7.7
14.8
132
5'-d(CGACGT=TGCAGC)-3'
133
5'-d(CGACGU=UGCAGC)-3'
6.8
15.0
134
5'-d(CGACGTfTGCAGC)-3'
10.8
17.1
135
5'-d(CGACGUfUGCAGC)-3'
9.8
17.2
136
5'-d(GCTGCAACGTCG)-3'
10.4
18.3
137
5'-r(GCTGCAACGTCG)-3'
4.0
20.3
13.3
18.0
5'-d(CGTATU=UATTCTGC)-3'
12.2
18.0
140
5'-d(CGTATTfTATTCTGC)-3'
17.6
19.6
141
19.5
138
5'-d(CGTATT=TATTCTGC)-3
139
'
5'-d(CGTATUfUATTCTGC)-3'
14.6
142
5'-d(GCAGAATAAATACG)-3'
10.9
15.8
143
5'-r(GCAGAATAAATACG)-3'
5.0
19.6
DTT
Dithiothreitol
9.7
1.9
Breite
34
Abkürzungen
in
T:
Thymidin,
U:
des
Signals
an
der
Oligonukleotidsequenzen:
Uridin,
Formacetal-verbrücktes
T
=
T:
d:
Basislinie:
desoxy,
ribo,
r:
Formacetal-verbrücktes
Thymidindinukleosid
152,
ca.
A:
Adenosin,
0.7
C:
ca.
Cytidin,
G:
1.4
Guanosin,
Thymidin-[eis,syn]-Photodimer 110, TfT:
Formacetal-verbrücktes 2'-Desoxyuridin[cis,syn]-Fhotodimer 108, UfU: Formacetal-verbrücktes 2'-Desoxyuridindinukleosid 153,
U
=
U:
Kap.
4
78
Grundlage
für die
DNA-Struktur
Untersuchung
war
herauszufinden, ob
der
es, die DNA-Konformation
es
zu
(Abschnitt 4.3)
gen, bevor die
Abhängigkeit
war es
bestimmen. Im
und die
nötig,
diese Parameter in thermischen
folgenden
zum
anderen mussten mit derselben
Spektrums
Tab. 14:
Reparatur
können
DNA-Duplexe
Konformation
DNA-Duplexe
anhand
zugeordnet
Duplexe:
B-Konformation
5'd(CGACGUfUGCAGC)3
5'd(CGTATU=UATTCTGC)3
3'd(GCATAA ATAAGACG)5'
man
beobachten.
'
3'r(GCTGCA ACGTCG)5'
5'd(CGACGUfUGCAGC)3'
5'd(CGTATT=TATTCTGC)3'
3'r(GCATAA ATAAGACG)5'
165
5'd(CGTATTfTATTCTGC)3
167
5'd(CGTATU=UATTCTGC)3
'
3'r(GCATAA ATAAGACG)5'
'
5'd(CGTATUfUATTCTGC)3'
3'r(GCATAA ATAAGACG)5'
durch
Salzgehalt
einen
Zugabe
übergeht.
Übergang
von
Ethanol bei Ethanolkonzen-
Für bestimmte GC-reiche
von
Sequen¬
der A- in die Z-Konformation
Sowohl hohe Alkohol- als auch hohe Salzkonzentrationen beeinflussen die
Aktivität der meisten
Einstellung
5'd(CGACGU=UGCAGC)3
weiss man, dass DNA üblicherweise in der B-Konfor¬
Dehydratisierung
bei hohem
5'd(CGACGTfTGCAGC)3'
169
3'd(GCATAA ATAAGACG)5'
konnte
A-Konformation
3'r(GCATAA ATAAGACG)5'
5'd(CGTATUfUATTCTGC)3'
und bei
Duplexe:
157
'
trationen über 60% in die A-Konformation
zen
(CD)
3'r(GCTGCA ACGTCG)5'
163
5'd(CGTATTfTATTCTGC)3'
vorliegt
Circular-Dichroismus
3'r(GCTGCA ACGTCG)5'
3'd(GCATAA ATAAGACG)5'
derartigen Untersuchungen
mation
Licht unterschiedlich
5'd(CGACGT=TGCAGC)3'
'
3'd(GCATAA ATAAGACG)5'
Aus
musste zum
155
161
5'd(CGTATT=TATTCTGC)3
j6g
ihres
'
3'd(GCTGCA ACGTCG)5'
166
können,
DNA-Konformationen erzeugt
polarisiertem
15o
3'd(GCTGCA ACGTCG)5'
164
zu
3'r(GCTGCA ACGTCG)5'
5'd(CGACGU=UGCAGC)3'
162
(Abschnitt 4.5).
eindeutig nachgewiesen werden,
DNA»RNA
3'd(GCTGCA ACGTCG)5'
160
Denaturierungs-
in A- und B-Konformation
5'd(CGACGTfTGCAGC)3'
1Sg
und
werden.
3'd( GCTGCA ACGTCG)5'
156
Um
DNA^RNA-Duplexe
Sequenz verschiedene
5'd(CGACGT=TGCAGC)3'
154
werden
untersuchen
Da die DNA-Konformationen mit
einer Konformation
DNA'DNA
der
Doppelstrang vorliegende
wechselwirken,
haben.
der
wird daher erst auf die Konformationsstudien
Reparaturstudien vorgestellt und diskutiert
werden können.
zu
von
thermodynamischen Untersuchungen (Abschnitt 4.4) eingegan¬
Konformationsabhängigkeit
einen die im
Reparatur
thermodynamischen Parametern
4.3 Konformation der DNA*DNA und
Um die
der
eindeutig nachgewiesen
eine Korrelation zwischen den
Reparatureffizienz gibt,
experimenten
einer eventuellen
Enzyme drastisch.
einer Konformation
Daher sind diese Methoden
ungeeignet.
Da aber
auch
zur
gezielten
RNA'RNA-Duplexe
und
79
RNA'DNA-Duplexe35
die A-Konformation
4
Kap.
einnehmen, wurden RNA'DNA-Duplexe als
Modell für DNA in A-Konformation untersucht
(siehe Übersicht in Tabelle 14).
A
A
4-
Ae
[mM"1cnrf1]
0-
v"'
-4_
-
VC
\i
-8.
200
v
-4
Abb. 25:
1
i
i
i
220
240
260
280
300
CD-Spektren
bzw
163
der
Durchführung
enthaltenden
Spektren
tren der DNA'RNA
Solche
z.
B.
[467,468].
meisten der
B.
von
In
RNA
Deoxyribosen
[469,470].
(B),
(A)
bei 20°C in 150 mM NaCl,
von
280
300
320
155
(A)
bzw.
162
(B),
10 mM Tris/HCl
den DNA'DNA und den
die
um
(c0iig0
=
DNA»DNA-Duplexes
5
A).
die
dar
zeigen
DNA'DNA-Duplexes
nur
(Abb. 25).
DNA-Transkription,
relevant. Für eine detaillierte
einen
der
Die
alle Charakteristika
Der Einbau des
nicht. Die
Duplexe
DNA-Replikation
Untersuchung
Duplexe
164 und des Photo¬
wenig (Abb. 25, B).
übergeordnete B-Struktur
Hybride
JIM) aufgenommen
Auch im Falle der AT-reichen
162
zu
156 und des Photodimer
155 und 157 sowie der DNA'RNA
C2'-endo-
Konformation
unabhängigen Messungen
des Referenz
bilden DNA*RNA
eine
wurden
154 sind sehr ähnlich und
sind wahrend der
biologisch
Losung
260
154
wurden bei 25°C
fünf
folglich
Duplexe
Hybrid Duplexe
Tianskription
(B)
DNA'DNA-Duplexes
Photodimers 110 beeinflusst
35
aus
Doppelhelix (Abb. 25,
dimer-enthaltenden
240
RNA-DNA-Duplexe:
aufgenommen,
CD-Spektren
DNA#DNA-Duplexes
unterscheidet sich die
bzw. 165
Reparaturstudien
von
des GC-reichen Referenz
einer B-Form
(A)
bzw. 164
(A)
und stellen einen Mittelwert
CD-Spektren
220
5 U.M.
=
Die
belegen [469-471].
und der
DNA-DNA-Duplexe
CD-Spektren
DNA#RNA-Duplexen
200
A,(nm)
(B),
pH 7.4, collgo
320
(nm)
157
156
Vor der
-8
i
X
-
CD-Spek¬
163 und 165
und der
reversen
ihrer Konformation siehe
insgesamt mehr A-artigen Duplex,
in der die
und der Ribosen eine C3'-endo Konformation annehmen; siehe
z.
Kap.
4
80
weisen eine A-Form
Duplexe
enthaltenden DNA«RNA
Dies
Sequenzen
nicht beeinflussen.
Im Falle des
typische positive
A-Konformation
Referenz 165.
155 und des
Dies kann
so
dass sich im
Photodimer 162 bei 260
nm
eine
dass das Photodimer die
des AT-reichen
bildenden
DNA-Stränge
der durch die
beiden
Bildung
Stränge
Anwendungen.36
DNA'DNA-Duplexes
von
wird, die durch eine lokale
in
Zunahme der
spricht
Oligonukleotide voneinander getrennt.
sich
voneinander.
erhalten werden.
von
Durch Erhitzen wird
findet
Vorgang
Mischungen
von
langsamen Abkühlen überhaupt
er
genutzt,
untersuchen.
Die
Diese normiert
Hypochromizität.
so
Hypochromizität.38
Dies
36
Die
37
Neben den
beobachtet
wichtigste Anwendung
In
eine
den Einfluss
um
Entstapelung
man
von
Einzelsträngen,
dass eine
sind vermutlich die
DNA-Komplexen
von
Entstapelung
Denaturierungszyklen
einsetzen:
spektroskopische
am
modifizierten
der Basen führt
sich auch die
zu
einer
Temperatur
die keine Sekundärstraktur
Zunahme der
Untersucht
Absorption
in
man
bzw. der
der Basen erst dann
möglich
Polymerase-Kettenreaktionen.
folgenden Methoden
Untersuchung
zur
Differential Scanning Calorimetry (DSC), Isothermal
Calorimetry (ITC), Differential Thermoanalysis (DTA),
Verfahren sind aber die
komplementären
auf den Wert bei tiefster
sigmoide
UV-spektroskopischen Verfahren lassen
Denaturierung
Titration
man
liegt daran,
zahlreiche
erst ein definierter
bilden, wird eine lineare Zunahme der UV-Absorption beobachtet.
hingegen Duplexe,
und
Da sich dieser Prozess relativ einfach mittels UV-
beobachten lässt, wird
zu
Duplex
Energiegewinn ausgeglichen
Dieser
kann durch Aufheizen einer
UV-Absorption.
dann
Dabei werden die beiden den
Wasserstoffbrücken erreichte
Basen auf die DNA-Straktur
Bei
mit dem
werden könnte.
und anschliessendem
DNA#DNA-Duplex
Spektroskopie37
oder
trennen
So
Oligonukleotiden
38
Ausbildung
Unterstützt wird diese Inter¬
Schulter beobachtet
lassen sich thermisch denaturieren.
DNA-Duplexe
benötigt
ist die für die
sogar etwas stärker als in der
nm
Sequenzen begünstigt.
positive
163
von
Einleitung
AAA
der
der Schaden¬
155 sind wiedemm
Paarungseigenschaften von Photodimeren
DNA*DNA- und DNA'RNA-Duplexen
4.4
und
CD-Spektrums
Bande bei 260
Spektrum
Konformationsänderang bewirkt
die
CD-Spektren
Referenzduplexes
interpretiert werden,
der A-Konformation in AT-reichen
pretation dadurch,
Die
das die Photoschäden auch die A-Konformation in GC-reichen
identisch.
zeigt,
[467-471]
auf.
Duplexstruktur
meisten verwendeten
CD- und
NMR-Spektroskopie.
UV-
Verfahren, da hierfür weniger Material
wird als für alle anderen Verfahren.
gewissen Sequenzen
In diesem Fall wird eine
kann
durch
Hoogsten-Faarungsmuster
doppeltsigmoide
Kurve mit drei statt einem
die Sekundärstrukturen bilden,
Absorption.
es
zeigen entsprechend
zur
Bildung
Wendepunkt
von
Triplexen
auch keine lineare sondern eine
kommen.
Einzelstränge,
erhalten.
sigmoide
Zunahme der
Kap.
81
ist,
wenn
Man beobachtet daher die
sie nicht mehr über Wasserstoffbrücken fixiert sind.
Abhängigkeit
thermische
zwischen dem
Gleichgewichts
eines
4
D und den beiden
Duplex
Monomeren Ml und M2:
K
M1
M2
+
D
^
Der
Punkt, bei dem 50% der Duplexe in Monomere dissoziert ist, wird als Schmelzpunkt
Tm
des
bezeichnet.
Duplexes
50%-igen
bzw. der
Absorption.39
Zunahme der
Überlegungen,
theoretischen
dem Maximum der
entspricht
Er
Breslauer
solange c(Ml)
dass
al.
et
[472-474] zeigten in
dieser
c(M2)
=
Absorptionsänderung
der
Vorgang
Gleichgewichtskonstante
all
K
=
(1-a)2(CT/2)
folgt,
wobei
CT
die
Gesamtkonzentration, also die Konzentration je eines Monomeren bei
vollständiger Denaturierung
Paarung ist. (1
und der
't
van
Gleichung
-
die Konzentration
oder
a) gibt den Grad
denaturiertem
an
Hoff Gleichung AHyn
für den
des
Komplex
-R(dlnK/d(l/T))
=
bei
Duplexes
vollständiger
Gleichung
Aus dieser
an.
die
folgende
der sich bei
Auftragen
stellten
sie
auf:
Schmelzpunkt
AH°
Tm
=
R«lnCT
von
gegen In
IITm
Duplexes
die
erhält
Gleichung
Aus dem Kehrwert dieser
CT
aus
Enthalpie AH°und
+
man
Experimenten
die
1
Die
50%-ige
gebräuchliche
Zunahme der
dem Fortschirtt der
Wendepunkts
mit Hilfe eines
Marky
und Breslauer
Multiplexen
in
n
da der Summand
(-R
AH°
lässt sich
nur
graphisch
dann verwendbar,
lassen sich die
ermitteln
wenn
einen für
aufgestellt.
Im Falle eines
In 4/
und
war
daher
die
früher
die Grundlinie nicht driftet.
Denaturierungskurven allerdings
im
Mit
Bereich des
bestimmen.
zum
Stränge
komplementären Duplex.
des
Konzentrationen
AS°-R[n4
[472] haben diese Gleichung in einer allgemeinen
Monomere
selbst-komplementäre
verschiedenen
Polynom fitten. Über dessen Ableitung lässt sich dann das Maximum der
Absorptionsänderung eindeutig
40
allerdings
Rechnerleistung
aus
+
AH°
Absorption
Sie ist
Definition.
bei
R
Tm
eine Gerade,
Entropie AS10 bestimmen lassen:40
lnCT
39
zlS0-Rln4
nicht-selbst-komplementäre Stränge
Diese
Gleichung
ergibt
selbst-komplementären Duplexes
AH°) nicht auftritt.
Form für die Dissoziation
sich
für
und
einen
von
anderen für
zum
nicht-selbst¬
vereinfacht sich die
Gleichung,
Kap.
4
82
Aus AG
°
T*AS° + AH° lässt sich abschliessend die freie
=
ist
a
eine Funktion
die
thermodynamischen
wurde
a(T;C-p)
Strazewski mathematisch für
von
und daher auch
a
für Haarnadeln die
Temperatur-unabhängig ist,
einsetzbar,
wenn
Anhand dieser
einander
kein
liegt darin,
Temperatur-abhängiges
thermodynamischen
werden.
verglichen
Das
werden.
in der
eine
Da
bestimmen.
überfordert.
Ausserdem
es
dürfen
nur
Driften der Grundlinie auftritt.
eine
nur
Aussage
Duplexe
für den gesamten
Duplexe gleicher Länge
nur
modifizierte
Base
meist
lokal
nur
die
thermodynamischen
den gesamten
ist
nur
bestimmt werden,
sie
ist
Die
enthält
Exponentialterme
Wasserstoffbrückenbindungen beeinflusst,
Duplex
zu
Parameter lassen sich verschiedene
kann immer
heisst,
sowie für selbst¬
Dieses Verfahren ist
Parameter
dass die Funktion drei
Fittingprogramme
vergleichen. Allerdings
getroffen
CT,
Gleichgewichtskonstante
beschrieben [475].
einzige Möglichkeit, thermodynamische
effiziente
auch
nicht-selbst-komplementäre
als auch für Haarnadeln, bei denen die
Problematik in der Methode
daher
T und der Gesamtkonzentration
Temperatur
Parameter AH° und AS10 als Konstanten auftreten. Diese Funktion
komplementäre Duplexe
und
der
Enthalpie berechnen. Eigentlich
bei
kurzen
mit
Duplex
miteinander
Stärke
die
der
Parameter aber für
Sequenzen
ein
Effekt
beobachtbar, der ausserhalb des Fehlers der bestimmten Daten liegt.
4.4.2
Ergebnisse
Bereits
früher
wurde
dass
vergleichen
in
zeigen
AG°\5°c
die
41
van
't
bestimmt [472].
je
einer Konzentration
Schmelzpunkte (Tm)
von
Abbildungen
und
27 und 29
DNA»RNA-Duplexe.
zwei Messreihen
AG wird für 15°C
angegeben.
Enzym-Reparatur-Kinetiken,
aufgeführt.
Dies erlaubt den
die in einem
in A- bzw.
zeigen
der
Die
für die DNA»DNA-
-
8.0
uM)
wurde
graphisch
die
über die
Parameter AH°, AS° und
die van't
i/o/fDiagramme
für
In Tabelle 15 sind diese als Mittel¬
Tabelle 15
Vergleich
untersucht.
untersucht und
zeigt
thermodynamischen Parameter bestimmten Schmelzpunkt bei
41
destabili¬
4 uM.
(0.5
Hoff Gleichung die thermodynamischen
DNA»DNA-Duplexe
wert von
der
Duplexe
Hypochromizität
fünf verschiedene Konzentrationen
Konzentrationsabhängigkeit
modifizierte
B-DNA-Duplex
Denaturierungsexperimenten
die beobachtete
Duplexe bzw. DNA'RNA-Duplexe bei
von
den
können, wurden die DNA'DNA-Duplexe und
zu
thermischen
26 und 28
Aus Messreihen
Photodimere
Um den Einfluss der Photodimere auf
B-DNA untereinander
Abbildungen
Denaturierungsexperimente
gezeigt,
sieren [243,254,255].
DNA»RNA-Duplexe
der
4
ausserdem den über
\lM.
thermodynamischen
Phosphat-Puffer (pH 7.0)
die
bei 15°C
Daten direkter mit den
durchgeführt
wurden.
83
Unter den beschriebenen
einen
Tm (4 uM)
Bedingungen,
58.2°C
von
Thymidinphotodimeren
bewirkt eine
162, die rm-Werte (4 uM)
Einbau der
(156)
von
Kap.
weisen die zwei Referenz DNA»DNA
und 46.8°C
(164)
auf
(Tab. 15).
signifikante Destabilisiemng
51.0°C
(154)
2'-Desoxyuridinphotodimeren
und 41.2°C
bewirkt eine
Duplexe
Der Einbau des
Duplexe 154
der
(162) aufweisen.
Destabilisiemng
und
Auch der
in derselben
Grössenordnung; die 7/m-Werte (4 tiM) betragen 50.7°C (158) und 40.9°C (166).
O iL
B
-
!
y[%]
1 6-
I
J
'
n
'
l
20
30
'
i
40
i
°n
r
'
50
60
1
"l
10
1
20
i
'
T[°C]
y:
Tris/HCl
:
Tm
=
m
Tm
164
(TfT), Tm
41.6 ± 0.3°C;
B:-
:
=
bei 260
DNA'DNA-Duplexe (A)
165
=
=
Bedingungen:
und
50
i
60
T[°C]
DNA'RNA-Duplexe (B).
-:
166
:
(U=U), Tm
=
:
167, Tm
:
=
44.2
+
162
(T=T),
41.3 ± 0.3°C.
46.3 ± 0.3°C;
45.7 ±0.3°C;
'
150 mM NaCl, 10 mM
46.5 ± 0.3°C;
-
i
4.0 u.M.
ca.
=
-
(TfT), Tm
in %.
nm
pH 7.4, c(Duplex)
A:
40
^
Abb. 26: Aufheizkurve der AT-reichen
Hypochromizität
'
i
30
163
0.3°C
(T=T),
(U=U).
1000
"T^
I
'
'
I
'—I—'—f
I
i
-14.5-14 -13.5 -13 -12.5 -12
'
Hoff Diagramme
(T=T, T),
167
(U=U,
166
(U=U,
)).
InC-T
der AT-reichen
))
r
14.5 -14-13.5 -13-12.5 -12
lnCT
Abb. 27: van't
und
DNA-DNA-Duplexe (A,
RNA-RNA-Duplexe (B,
165
4
164
(TfT, ),
(TfT, ),
163 (T=T,
162
T),
Kap.
Die
4
zur
54.9°C
in diese
84
Referenz
(157)
DNA»RNA
dargestellten
bzw.
Tm (4 uM)
A-artige Duplex
46.3°C
=
Heteroduplexe
(165).
schmelzen bei
Der Einbau des
Tm (4 uM)
Thymidinphotodimers
signifikant geringere Destabilisierung
Stmktur bewirkt eine
=
des
y C5-»]
y[%]
i—'—i—'—r
20
30
40
50
60
bei 260
pH 7.4, c(Duplex)
A:
:
Tm
=
51.1
B:
+
:
rm
=
20
30
40
ca.
=
DNA-DNA-Duplexe (A)
in %.
nm
50
60
70
Bedingungen:
und
DNA'RNA-Duplexe (B).
150 mM NaCl,
10 mM
y:
Tris/HCl
4.0 u.M.
(TfT), Tm
58.3
=
0.3°C;
157
r
I
T[°C]
Abb. 28: Aufheizkurve der GC-reichen
154
70
T[°C]
*-
Hypochromizität
1—'—I—'
:
(TfT), Tm
+
0.3°C;
158
(U=U), Tm
54.9 ±0.3°C;
=
51.0±0.3°C;
:
159
(U=U),
154
:
50.5 ±
=
rm
0.3°C).
155
(T=T),
48.5 ±
0.3°C).
:
=
(T=T),
A
3.14-
v^
1000
T
3.1
^^
-
CK"1]
n
^-¥
-
3.06-
^^^^^
3.02-
-14.25
'
I
'
I
-13.5
'
I
'
I
-12.75
-12
-14.25
-13.5
lnCT
Abb. 29:
van't
Hoff Diagramme
(T=T, T), 158 (U=U,
159
Duplexes:
die
(U=U,
*
der GC-reichen
))
und
RNA'RNA-Duplexe (B,
157
156
(TfT, ),
-12
lnCT
(TfT, ),
155 (T=T,
154
T),
)).
Messungen ergeben
45.6°C für 163.
DNA'DNA-Duplexe (A,
-12.75
einen
Diese Werte sind
Referenzen 157 bzw. 165.
nur
Hingegen
Tm (4 fiM)
um
von
51.5°C für 155
3.4°C bzw. 0.7°C
destabilisieren die
niedriger
und
von
als die der
2'-Desoxyuridindimere
den
85
DNA»RNA-Duplex
stärker als die
48.6°C
Tm (4 iiM)
(159)
bzw.
Kap.
Thymidindimere.
=
44.1°C
(167))
Vergleich
zu
(15%) bzw.
den
+11
Thymidindimeren
kJ»moH (14%) im Vergleich
2'-Desoxy-uridindimers
in die GC-reiche
Sie
ungefähr
um
Schmelzpunkte (Tm (4 |iM)
sind immerhin
als die der Referenzen 157 bzw. 165.
niedriger
Ihre
erniedrigen
6.3°C bzw. 2.2°C
den
rm-Wert
156 bzw. 164.
Sequenz (158)
=
also im
doppelten Betrag.+12 kJ^mok1
den
zu
um
4
führt
zu
einer
Der Einbau des
Verminderung
der
Schmelztemperaturen Tm (°C), Freie Enthalpien AG\yC (kJ»mol"1), Enthalpien AH°
und Entropien AS° (kl-K^mo!"1) sowie TAS10 für T
15°C für DNA-DNA und DNA'RNA
erhalten
't
aus
van
Duplex Bildung
HoffPlots.
Tab. 15:
(Id-mof1)
=
Sequenz
T,„
AG\5°r
(°C)W
(kJ-mol-1)
AH°
AS°
(kJ-mol"1) (kJ'K"1
•mof"*)
B-DNA
156
154
158
164
Tl5°c'AS°
(kJ-mol"1)
Duplexe
5'd(CGACGTfTGCAGC)3'
3'd(GCTGCA ACGTCG)5'
5'd(CGACGT=TGCAGC)3'
3'd(GCTGCA ACGTCG)5'
5'd(CGACGU=UGCAGC)3'
3'd(GCTGCA ACGTCG)5'
5'd(CGTATTfTATTCTGC)3'
58.2
-81
-366
-0.99
-285
51.0
-69
-321
-0.88
-252
50.7
-68
-312
-0.85
-244
46.8
-79
-458
-1.32
-379
41.2
-68
-417
-1.21
-349
40.9
-64
-375
-1.08
-311
54 Q
?8
-371
-1.02
-293
51 5
—
-344
-0.94
-272
4g g
6g
-343
-0.95
-274
o
-76
-433
-1.24
-357
45 g
^
-413
-1.18
-340
44 1
_?3
-435
-1.26
-362
3'd(GCATAA ATAAGACG)5'
162
5'd(CGTATT=TATTCTGC)3'
3'd(GCATAA ATAAGACG)5'
166
5'd(CGTATU=UATTCTGC)3'
3'd(GCATAA ATAAGACG)5'
A-DNA
j-„
Duplexe
5'd(CGACGTfTGCAGC)3'
3'r(GCTGCA ACGTCG)5'
155
j-o
165
5'd(CGACGT=TGCAGC)3'
3'r(GCTGCA ACGTCG)5'
5'd(CGACGU=UGCAGC)3'
3'r(GCTGCA ACGTCG)5'
5'd(CGTATTfTATTCTGC)3'
4fi
3'r(GCATAA ATAAGACG)5'
163
5'd(CGTATT=TATTCTGC)3'
3'r(GCATAA ATAAGACG)5'
167
5'd(CGTATU=UATTCTGC)3'
3'r(GCATAA ATAAGACG)5'
M Bedingungen: 150 mM NaCl,
0.3°C. [°] erhalten durch
Konzentrationen und zwei
5%
42
AG wird für 15°C
direkter mit den
wurden.
10 mM Tris/HCl pH 7.4,
4.0 u.M.
Fehler in Tm
c0iig0
Daten von wenigstens
Auftragen von l/Tm gegen In (Cj).
bis drei unabhängigen Messungen wurden verwendet; abgeschätzter Fehler
angegeben.
=
Dies erlaubt einen direkten
Enzym-Reparatur-Kinetiken,
die in einem
Vergleich
der
thermodynamischen
Phosphat-Puffer (pH 7.0) bei
15°C
ist
+
fünf
bei ±
Daten
durchgeführt
Kap.
86
4
gleichen Grössenordnung (+13 kJmioH, 17%)
Stabilität in der
Thymidinphotodimers.
stärkere
4.4.3
der AT-reichen
In
Destabilisiemng
+15
um
Sequenz
166
wie der Einbau des
wurde eine eineinhalbmal
kJ»moH (18%) beobachtet.
Diskussion der
Destabilisiemng von DNA*DNADuplexen durch Photodimere
DNA-RNA-
In einer ersten Studie untersuchten
einziges
Thymidin-Photodimer
thmidylaten
und
mit einer
und
dem 10-mer
aufweist. Dies
dTjo
et
die
al.
[243] bereits 1971, wie sehr sich ein
zwischen
Wechselwirkung
auswirkt.
von
Sie stellten die
Oligodesoxy-
Oligonukleotide dTig,
dar und paarten sie mit
d(T4-T=T-T4)
Durchschnittlslänge
stellten sie fest, dass das mit
gegenüber
auf
Polydesoxyadenylaten
dTg, dT7, dTg, dT5, dT4
adenylaten
Hayes
und
250 Nukleotiden
Polydesoxy¬
Dabei
(dA025o)(dA025o)-
dA025o gemischte Oligonukleotid d(T4-T=T-T4)
um
erniedrigten Schmelzpunkt43
24.2 K
entspricht theoretisch
dem
schlössen daraus, dass maximal 4.3 AT
Schmelzpunkt
von
von
Tm
-
einen
28.1°C
für n=5.7.
dTn»dA025o
Basenpaare gebrochen werden,
Sie
vermutlich die
zwei, die das Photodimer beinhalten, und die beiden benachbarten auf jeder Seite sowie
die beiden übernächsten
Auswirkung
In
al.
et
Einführang
dem
an
des
Dimers
13
um
Erniedrigung
dem Photodimer benachbarten
nennenswerte
K
Parameter für die
AH° sowie eine
auf
(AT4)
lassen aber eine kleinere
im
destabilisiert wird. Diese
Neuere Studien für
von
eine Abnahme der
sind aber im
(AT5)
verschiedener
freien
Abweichung
kann
130 uM
Bedingungen:
6 mM DNA, 50 mM
zum
das
bestimmten
die
Erniedrigung
G6-Iminoproton
die
um
daraus, dass die
AT-Basenpaarung
Basenpaar AT4
eine
Iminoprotonen
ungeschädigten Duplex
Sie schlössen
Länge zeigen
von
aber dadurch erklärt
Bedingungen:
nur
aber
stärker als für AT5.
für alle [eis, syn] -Photodimere
Enthalpie -AG0 zwischen
wurde eine sehr viel stärkere Abnahme
durch
Ausserdem beobachteten sie alle
bleiben,
ist für das
Sie
Auch die beiden AT
verschoben.
stellten
Duplexes44
beobachteten eine
wobei
Vergleich
intakt
des
erniedrigt.
(Tab. 16).
aufwies.
Destabilisiemng
negativen
330+.2K
AS°
wesentlichen
Duplexe
Schmelzpunkt
GC-Iminoprotonen,
und 0.84 ppm
GC-Basenpaamngen
der
Duplexbildung und
Verschiebung (0.32 ppm)
konnten beobachtet werden,
1.62 ppm
Untersuchungen
Duplex d(GCGT=TGCG)»d(CGCAACGC)
[253,261] fest, dass sich
thermodynamischen
von
Neuere
des Photodimers auf die DNA-Struktur erwarten.
NMR-Untersuchungen
Kemmink
15%.
je
zu
5% und 15%.
23% beobachtet
(Tab. 16).
In einem Fall
Diese starke
werden, dass ein 21mer mit der Sequenz
Gesamtnukleotidkonzentration,
Natriumphosphat,
1.0 M
Na+ pH 7.0.
200 mM
NaCl, 0.02% NaN3
87
Kap.
d(GTGT=TAACGTGAGTATAGCGT>d(ACGCTATACTCACGTTAACAC)
wurde
enfemt
[255], bei dem das Photodimer
Die
hegt.
Destabilisiemng beitragen
Isomeren ist die
Im
Destabilisiemng
Arbeit gemessene
des
Sequenz
in derselben
Zentmm des
vom
kann
Ohgonukleotids
Vergleich
durch
zu
also
Ohgonukleotids
massgeblich
dem bisher untersuchten
[cz,y,,syn]-Photodimere
untersucht
aber gering
Grossenordnung
wie
in
zur
[trans,syn-ï]Die
in
durch die Formacetal-verbmckten Photodimere
Destabilisiemng
DNA#DNA-Duplex
sehr weit
4
dieser
hegt im
den bisher bekannten Studien
Tab. 16: Zusammenstellung der thermodynamischen Parameter fur das Monomer
Doppelhehx-Gleichgewicht fur Duplexe, die Cyclobutan-Dimere (CPD) enthalten
AAG°
(kJ'mol^1)
8-mer
ohne CPD
eis
10-mer
12-mer
14-mer
21
mer
6
-
cis-syn
48
5
( 9%)
trans-syn-l
26
28
(53%)
ohne CPD
64
6
syn
81
cis-syn
69
ohne CPD
79
cis-syn
68
ohne CPD
139
cis-syn
108
-
0 55
268 ±
25d
276 ±
29d
-
-
3
12
11(14%)
-31
(23%)
-
40
02
29
02
0 75 ± 0
08d
41
10
0 79 ± 0
08d
34
10
322 ± 16
0 90 ± 0 05
48
1 0
0 89 ± 0 05
42
1 0
0 95 ± 0 05
43
0 25
0 89 ± 0 05
42
0 25
-
0 99
0 05g
60
0 15
0 88 ± 0 05§
52
0 15
458 ± 23S
1 32
0 07§
48
0 15
417 + 21Ê
1 21 ± 0 06S
44
0 15
0
25h
61
0 1
2 05±0
21h
60
0 1
321± 16S
(15%)
0 03e
0 1
-366+18S
-
(M)
0 60 ± 0 08e
+
6
314+16
(5%)
NaCl
0 55 ± 0 05e
-334± 16
-
Tm (°C)b
184+ 17e
314 ± 16
(10%)
61
58
ohne CPD
-
-
58
syn
ohne CPD
Berechnet
-
-
205 ± 12e
214 ± 29e
(13%)
53
eis
12-mer
41
syn
AS°
(kJ'K"1 «mol-1)
-
ohne CPD
eis
12-mer
47
AH°
(kJ'mol-1)
779 ±
84h
699
75h
+
-
-
den
2 22
+
+
+
15°C
thermodynamischen Parametern fur T
b) Berechnet aus den
eine Einzelstrangkonzentration von 10 pJvl
c) Abgeleitet aus der
Temperaturabhangigkeit des T5CH3 !H NMR Signals in 200 mM NaCl und 50 mM Natriumphosphat
Puffer bei einem pH von ca 6 [253]
d) Abgeleitet aus Temperatur- und Konzentrations-abhangigen UV
Messungen in 1 M NaCl, 10 mM Natriumphosphat Puffer pH 7, und 0 1 mM EDTA [254]
e)
Abgeleitet aus der Temperaturabhangigkeit des T5CH3 JH NMR Signals in UV Messungen in 0 1 M
NaCl, 10 mM Natriumphosphat Puffer pD 9 5 [254] f) Abgeleitet aus Temperatur- und Konzentrationsabhangigen UV Messungen in 10 mM Cacodylat pH 7 0, 0 1 mM EDTA [256] g) Abgeleitet aus
Temperatur und Konzentrations-abhangigen UV Messungen in 0 15 M NaCl, 10 mM Tris/HCl pH 7 4
(diese Arbeit) h) Abgeleitet aus Temperatur- und Konzentrations abhangigen UV Messungen m 0 1 M
NaCl, 10 mM Tris/HCl pH 7 [255]
a)
aus
thermodynamischen
-
Parametern fur
Man schreibt die bei den
des kleinen
Betrags
Dimers
DNA-Duplex
im
einer
[cw.synJ-Photodimeren gefundene Destabilisiemng aufgmnd
lokalen
zu
Störung
der
[243,254,255].
suchungen [253,255,261,265]
und
7t-Stapel-
und H-Brucken-Interaktionen des
Dies ist
im
Einklang
Berechnungen [249-252],
der Dimer-Schaden noch innerhalb des
mit
NMR-Unter¬
die vermuten lassen, dass
Duplexes positioniert ist.
Kap.
88
4
Innerhalb
DNA»RNA-Serie
A-Form
der
im
Thymidinphotodimere
Vergleich
ist
DNA»DNA
zu
A(AG) beträgt +6 kJ#moH
Unterschied
Erniedrigung
die
Duplexen
um
(8%) zwischen 157
der
durch
Stabilität
Der
2-4 mal kleiner.
und
und
155,
nur
kJ*moH (4%) zwischen 165 und 163. Das 2'-Desoxyuridindimer destabilisiert den
+3
Duplex (159)
GC-reichen A-Form
Im AT-reichen
Thymidinphotodimere.
des
Erniedrigung
nur
Schmelzpunktes
eine ähnliche grosse
Auswirkung
Vergleicht
des
im
bei der Dissoziation
gerufene
zur
Abnahme
stellt
man
=
3
kJ»moH (3%)
in 163
als
fest, dass mit Ausnahme des 2'-Desoxy-
freien
Enthalpie
freigesetzte Entropie abnimmt,
von
die
AG° führen.
Photodimere
Da aber
nimmt AG° nicht
um
zu
einer
gleichzeitig
den
Betrag
die
von
ist die durch den Einbau der Photodimere hervor¬
AH° als auch
AS° deutlich
von
geringer.
Folglich
können im
die Photodimere besser gepaart und besser über Wasserstoffbrücken¬
bindungen gebunden
Strang
A(AG)
Thymidinphotodimer
DNA'RNA-Duplex46
DNA'RNA-Duplexen
DNA#RNA-Duplex
Tab. 17:
wie für das
(12%) mehr als die
wurde aber trotz einer stärkeren
46.3°C auf 44.TC mit
so
AT-reichen
Enthalpiebeitrags
AH° ab. In den
9 kJ'mok1
167
Duplex
Destabilisiemng
Enthalpien AH°,
uridinphotodimers
Abnahme des
von
=
2'-Desoxyuridindimers beobachtet.45 (Tab. 17).
die
man
A(AG)
mit
werden.
Vergleich der thermodynamischen Parameter bei T=15°C zwischen Photodimer enthaltenden
Referenzstrang. In Klammern die prozentuale Veränderung bezogen auf die Referenz.
und dem
Dimer
A(AG°15oC)
A(AH°)
kJ*mol_1
kJ'morl
A(T
x
AS°)
kJrnior*
DNA'DNA-Duplexe
154
-
156
T=T
12(15%)
45
(12%)
33
(12%)
158
-
156
U=U
13
(17%)
54
(15%)
41
(14%)
162
-
164
T=T
11(14%)
41
(9%)
164
U=U
14(18%)
83
(18%)
68
(18%)
(8%)
27
(7%)
21
(7%)
(6%)
(5%)
166
-
30
(8%)
DNA'RNA-Duplexe
155
-
159
-
163
-
167
-
157
T=T
157
U=U
(12%)
28
(8%)
19
165
T=T
3
(4%)
20
(5%)
17
165
U=U
3
(3%)
-2
(1%)
-5(1%)
6
9
Eine Besonderheit stellen die AT-reichen
uridindimer enthalten.
drigung
45
46
von
zeigt
der
166 und 167 dar, die das
DNA'DNA-Duplex
2'-Desoxy-
die stärkste beobachtete Ernie¬
AH°, AS"3 und AG° während der DNA'RNA-Duplex sogar eine geringfügige
Der Grund für diese
Die
So
Duplexe
Abweichung
thermodynamischen
erklärt sich
aus
der unterschiedlichen
Daten unterscheiden sich
zwischen 163
experimentellen Fehlers und können daher nicht diskutiert werden.
Steigung
und
der van't Hoff Kurve.
165
nur
im
Rahmen des
89
Erhöhung
AH° und
von
Abweichungen
AS°, aber eine leichte Erniedrigung
einer AT-reichen
Sequenz
photodimer hervorgerafene Destabilisiemng
als
ausgleichen
Allerdings
ein
GC-reicher
die lokale
bewirkt
zeigt.
AG°
von
kann also die lokal durch
durch ein
oder
Strang
der
Destabilisiemng
4
Diese
der Referenz befinden sich aber im Rahmen des Fehlers.
von
DNA*RNA-Strang
Kap.
Der
2'-Desoxyuridin-
2'-Desoxyuridinphotodimer
besser
entsprechende DNA'DNA-Strang.
durch das
Photodimer
dennoch
eine
grössere Absenkung des Schmelzpunktes Tm (4 |iM) als für das Thymidinphotodimer im
entsprechenden DNA'RNA-Duplex
Unterschiede in den
beobachtet und in
experimenten
mit 0.75
des
Doppelstrangs
Thymin
durch
Stabilisierung
der
Uracil und
näher untersucht.
und Kool
Wang
von
Thymin wurden bereits
Gemäss thermischen
früher
Denautierungs-
[476] trägt die Methylgruppe in DNA*DNA-Duplexen
(± 0.54) kJ/mol und in DNA'RNA-Duplexen mit 0.75 (± 0.63) kJ/mol
Stabilisierung
Uracil
Paarungseigenschaften
Berechnungen
von
163.
um
1.13
ersetzt,
bei.
Wird im
äussert
(± 0.46) kJ/mol.
sich
im
DNA»RNA-Duplex
der
In einem
RNA-Strang
Methylgmppeneffekt
RNA»RNA-Duplex
gleichen Grössenordnung (1.17 (+0.84) kJ/mol)
bemerkbar
mit
macht
[476].
einer
sich in
er
In dieser
Studie wird auch
gezeigt,
vorgeschlagenen
erhöhten Polarisierbarkeit der Base beruht und nicht auf einem
anderen
dass der
Methylgmppeneffekt
auf der
Gruppen [478,479] vorgeschlagenen hydrophoben
von
zur
Sowers
al.
et
[477]
von
Effekt zwischen benachbarten
Methylgrappen.
Rechnungen weisen
lokalen
Anstieg
DNA verändert
ebenfalls daraufhin, dass die
der Flexibilität des
Komplexes
Entfernung
der
Methylgrappe
führt und dabei lokal die
durch die
Thymidindimere.
stärkeren
Polarisierang
Watson-Cncfc-Paarung
Auch in den Photodimeren sollte die
der benachbarten
als
Methylgrappe
Carbonylgruppe (C(4)=0) führen,
Wasserstoffbrückenakeptor
auftritt.
Es kann
DNA'RNA-Duplexen
Hierzu wären
angelegte DenaturierungsStudien
Berechnungen
der
oder breit
zu
einer
die in der
sein, dass bei
stärker bemerkbar
macht.
erforderlich.
Schlussfolgerung aus den thermischen
Denaturierungsexperimenten
Schlussfolgernd gilt
daher für die untersuchten
Photodimere destabilisieren
um
Beugung
geringere Destabilisierung
Photodimeren dieser Effekt sich in
•
einem
[480].
Diese Arbeiten unterstützen die in dieser Arbeit beobachtete
4.4.4
zu
2-4 mal stärker als
Duplexe:
DNA'DNA-Duplexe
mit einem
DNA'RNA-Duplexe (3-8 kJ/mol).
Betrag
von
11-14 kJ/mol
Kap.
•
90
4
2'-Desoxyuridin- und Thymidinphotodimere destabilisieren DNA'DNA-Duplexe
gleichen Grössenordnung.
der
•
Schmelzpunkt
Basierend auf dem
dimeren
möglicherweise
werden
A.
der
Untersuchung
Reparaturexperimente
wurden
Typ
II
Quantenausbeute
weist mit einer
von ca.
DNA-Photolyasen (Quantenausbeute:
Studien
4.5.1
Die
Untersuchung
der
Replikation
älteren Studien
repariert wird,
repariert
wird.
nicht
von
wurden diese
Reparatur
Interesse ist
zu
Studien
Schluss zu, dass
am
Da bei der
zeigt
besten
eine
sich
es
Doppel-
in bestimmten
I
und
Einzelstrang gibt.
weil während
Aus
vorliegt.
DNA
einzelsträngige
DNA
doppelsträngige
DNA
Sequenzen
dennoch
Sequenzen
Modellverbindungen
schneller
repariert
Reparatur einzelsträngiger
Gegenstrang
Von noch
vor¬
einen
grösserem
von
werden als
DNA die
keinen Einfluss
lassen den
Epple
Thymidin¬
Paarungseigen¬
nehmen, lässt sich
an
untersuchen, welche Photodimere schneller repariert werden.
dass
es
einzustellen.
nicht
Dies
einfach
liegt
Extinktionskoeffizienten bereits einen Fehler
anderen
und
Übersicht über die bei verschiedenen Experimenten beobachteten
heraus,
Oligonukleotiden
Bedeutung,
nicht mit definierten
Zeiten, bei denen die Hälfte der Photodimeren repariert
stellte
Enzym
untersuchen, ob alle Dimere mit gleicher Effizienz repariert
schaften des Photodimers mit dem
Tabelle 18
ob
2'-Desoxyuridinphotodimere
am
von
einzelsträngige
Experimente
niedermolekularen
an
photodimere [440].
Einzelsträngen
DNA ist
der Effizienz unterscheiden sollte, mit der
Unterschied zwischen
aber
Diese
0.6) [481].
DNA lokal
von
genommen und daher blieb offen,
werden.
als das aktivste
bereits bekannt, dass sich die Effizienz mit der
Allerdings
es
durchgeführt.
Quantenausbeute auf als Typ
0.9 eine höhere
ca.
DNA-Photolyasen
durch
nidulans
Vorexperimenten
Reparatur einzelsträngiger
und Translation
war
A.
aus
und
Photodimere
DNA-Einzelstrang
am
der
verschiedener
Reparaturrate
Enzym
erwies sich in den
DNA-Photolyase
die
auf
mit dem
2'-Desoxyuridin-
Thymidinphotodimeren.
von
Auswirkung
verschiedener DNA-Konformationen
von
Studien mit Hilfe der
enzymatische
nidulans-Photolyase
detaillierten
Zur
DNA'RNA-Duplexe
stärker destabilisiert als
Detaillierte
4.5
in
von
Bei den
Experimenten
gleichkonzentrierte Lösungen
ist,
zum
waren.
einen
bis
zu
daran,
dass
die
an
berechneten
10% aufweisen können, und
zum
daran, dass bei der Verdünnung der Oligonukleotide Pipettierfehler auftreten.
Ausserdem wurden
zu
vergleichende Experimente
stets am
gleichen Tag
mit denselben
91
Stocklösungen
Photolyase
von
und DTT
durchgeführt,
Enzymkonzentration möglichst gering
aktiven
Kap.
zu
die Unterschiede in der
um
halten.
Übersicht über verschiedene Reparaturstudien am Einzelstrang bei 435
angegebenen Bandbreite und der angegebenen Menge an Reaktionslösung (V).
Tab. 18:
T=T
[M]
U=U
AT-reiche
c(PHR)
c(DNA)
Oligo
Bandbrei
V
[M]
[M-I]
ll/2
te
und der
nm
Verh.
ti/2 (U=U)
(T=T)
[min]
[min]
1.6 + 0.2
Einzelstränge:
138
139
1.0E-07
5.0 E-08
700
1.7
nm
1.7 + 0.2
138
139
1.0E-06
5.0E-08
600
1.7
nm
12+1
7
1.1
1
+
1.7
138
139
ti
600
1.7
nm
12 ± 1
11± 1
1.1
138
139
"
"
600
3.4
nm
8±1
8± 1
1.0
138
139
5.0 E-06
2.5 E-08
750
5.1
nm
13.5 + 0.6
12.0 ± 0.6
1.1
138
139
1.0E-05
5.0 E-08
750
5.1
nm
9+1 min
8+ 1
1.1
"
0 (Verhältnis der Halbwertszeiten
GC-reiche
von
T=T-Dimer 138
zu
U==U-Dimer
133
1.0 E-07
5.0 E-08
900
1.7
nm
132
133
1.0 E-06
2.6
+
5.0 E-08
600
1.7
nm
10 ±1
133
ii
600
3.4
nm
4.3 ± 0.5
132
133
il
"
750
3.4
nm
5.9
132
133
750
5.1
nm
5.0 E-06
0 (Verhältnis
Aus diesen
2.5 E-08
der Halbwertszeiten
voni
T=T-Dimer 132
Experimenten ergab sich,
dass
(im Durchschnitt: 1.2x) repariert werden
dies ein Fehler oder doch ein Trend
Tabelle 19
zeigt
Ergebnisse
die
langsamer repariert
als
Tab. 19: Halbwertszeiten
132
U=U
139
1.4
1
0.8
+
5.1 ±0.5
0.8
0.6
0.9
6.4
+
18 ± 1
1.2
133):
1.0
Thymidinphotodimere.
Um
zu
schneller
klären, ob
Experimente.
In allen
Thymidinphotodimere
Kompetitionsexperimenten
werden
um
einen Faktor
1.5
2'-Desoxyuridindimere.
aus
Kompetitionsexperimenten
c(PHR)
[M]
[M]
[Rl]
5.0E-08
600
0.5E-06
it
V
ti
tl
750
138
133
138
139
je 2.5E-06
2.5E-08
133
ii
M
132
0.6
0.2
2'-Desoxyuridindimere geringfügig
als
c(DNA)
je
13
22 ± 1
U==U-Dimer
+
ist, wurden Kompetitionsexperimente durchgeführt.
dieser
wurde derselbe Trend beobachtet:
zu
+
1.9
0.3
it
T=T
1.2
139):
Einzelstränge:
132
132
4
n
bei 435
Band-
breite
3.4
5.1
nm
nm
nm
und del
t1/2 (T=T)
[min]
angegebenen
t1/2 (U=U)
Bandbreite.
T==T/U=U
[min]
4.0 ± 0.3
2.7
0.3
1.5
5.5 ± 0.3
3.8 ±0.3
1.5
21 + 1
13+ 1
1.6
24+1
15 ±1
1.6
+
Kap.
92
4
Studien
4.5.2
Bei
Doppelstrang
am
in
Doppelsträngen
den
(DNA»DNA-Duplexe)
der DNA
ging
Daneben
Oligonukleotide
gewählt.
Tabelle 20
Duplexe
T=T
2'-Desoxyuridin-photodimeren gibt.
132 und 133 als
Frage,
von
es
Beispiel
als
Beispiel
Reparatur¬
Sequenz abhängig
der
für
ist.
AT-reiche
eine
für eine GC-reiche
Sequenz
durchgeführten Experimente:
Reparaturstudien mit DNA»DNA-Duplexen bei
angegebenen Menge an Reaktionslösung (V).
c(DNA)
V
c(PHR)
[M]
[M]
[ul]
Band¬
435
und der
nm
t1/2(T=T)
t1/2(U=U)
[min]
[min]
breite
Verh.
DNA«DNA-Duplexe:
166
1.0E-07
5.0 E-08
700
1.7
162
166
1.0 E-06
5.0 E-08
600
3.4
162
166
tt
162
166
5.0 E-06
2.5 E-08
IT
162
166
tt
"
1t
ti
750
0 (Verhältnis der Halbwertszeiten
von
nm
0.9
+
0.1
0.7 ±0.1
1.3
nm
3.4
+
0.5
2.5 ± 0.5
1.4
5.0 ± 0.5
4.4 ± 0.5
1.1
1.0
14+ 1.0
1.1
20+ 1.0
14 ± 1.0
1.4
tt
5.1
15
nm
"
T=T-Dimer 162
+
U==U-Dimer
zu
166):
1.3
DNA'DNA-Dupl exe:
154
158
1.0E-07
5.0 E-08
900
1.7
154
158
1.0 E-06
5.0 E-08
600
3.4
154
154
158
"
"
750
158
5.0 E-06
2.5 E-08
n
0 (Verhältnis der Halbwertszeiten
Im DNA»DNA
schneller
und
138 und 139
162
GC-reiche
in der
die
Bandbreite und der
U=U
AT-reiche
aus
ob
um
einen Überblick über die
gibt
Tab. 20: Halbwertszeiten
angegebenen
Thymidin-
Oligonukleotide
Hierzu wurden die
und die
erneut
Interesse, ob die Reparatureffizienz
war es von
Sequenz
es
B-Konformation
vorliegenden
normalerweise
der
effizienz einen Unterschied zwischen
DNA«DNA-Duplexe
-
von
Duplex zeigt
repariert
werden als
um
0.6 ±0.1
1.5
nm
3.3 + 0.3
2.8+0.3
1.2
4.8
4.4
0.4
1.1
5.1
9.5 ± 1.0
1.6
0.4
15 ± 1.0
nm
zu
+
U==U-Dimer
+
158):
1.4
ebenfalls, dass 2'-Desoxyuridinphotodimere
Thymidinphotodimere.
Kompetitionsexperimenten überprüft:
Thymidinphotodimere
0.9 ± 0.1
ti
T=T-Dimer 154
sich
nm
Aus Tabelle 21
den Faktor 1.6 mal
Auch dieses
ergibt sich,
langsamer repariert
Ergebnis
dass im
etwas
wurde in
Doppelstrang
werden als
2'-Desoxy-
uridinphotodimere.
Kompetitionsexperimente mit DNA'DNA-Duplexen:
angegebenen Bandbreite (jeweils 750 ul Reaktionslösung).
Tab. 21:
T=T
U=U
c(DNA)
[M]
162
166
154
158
162
166
c(PHR)
[M]
Band-
breite
T=T
vs.
U=U bei 435
nm
t1/2(T T)
t1/2(U=U)
[min]
[min]
33 ±3
21 ±2
=
und der
T=T/U=U
je
5.0E-06
2.5E-08
5.1
nm
je
5.0E-06
2.5E-08
5.1
nm
17 ±2
11± 1
1.6
je
5.0E-06
2.5E-08
5.1
nm
29
12 ± 1
2.4
+
3
1.6
93
Vergleicht man
selben
AT- mit GC-reichen
Kap.
Sequenzen,
Tag durchgeführter Experimente, dass
Sequenzabhängigkeit gibt.
Kompetitionsexperimente durchgeführt.
Das
unter
1.5 bis 1.8
bezogen
auf die Halbwertszeiten
zweier
Fehlergrenzen
abzusichern
wurden
am
keine
auch
hier
30. Es stellt sich
Ergebnis zeigt Abbildung
kompetitiven Bedingungen AT-reiche Sequenzen
heraus, dass
Vergleich
beim
im Rahmen der
es
Ergebnis
dieses
Um
ergibt sich
so
4
einen Faktor
um
von
werden als GC-reiche
langsamer repariert
Sequenzen.
100
100
y
y[%]
m
"A:iV2
:
0
tv2
=
12.6 + 0.6 min
=23
t
Kompetitionsexperiment
162
(A) bzw. 166 (B).
Studien
am
gefunden.
ten, dass bestimmte
können.
AT-reiche
hängigkeit
Da in
In
=
Sequenzen
2.5 E-06 M,
Daher
eine
der
zu
(Abschnitt 4.3)
die A-Konformation
Lösung
tion aus, doch
bilden
DNA#DNA-Duplexe
liegen
an
AT-reich:
:
nur
ist aber
geringe
zu
beach¬
in der DNA hervormfen
auch durch Proteine oder durch die
Superspiralisierung
von
DNA
Interesse, die Reparaturrate in Ab¬
untersuchen.
für die
DNA«RNA-Duplexe
wurde, wurden die
gewählt.47
bei
die Riboseeinheiten
riboseeinheiten wie in der B-DNA eine
[min]
y: Anteil
wurden
Sequenzabhängigkeit
grossem
nachgewiesen
DNA'RNA-Hybride
nur
von
30
2.5 E-08 M.
=
Konformationsändemng
war es
der DNA-Konformation
t
(A) bzw. 158 (B);
c(PHR)
25
20
DNA«RNA-Duplexe
-
Bei der Diskussion der
Modell für DNA in A-Konformation
47
=12.7 ±0.6 min
DNA'DNA-Duplexe.
: GC-reich: 154
Doppelstrang
Sequenzen
werden.
CD-Studien
eindeutig
in %.
GC-reiche
vs.
der DNA in Nukleosomen oder durch die
hervorgerufen
t-i/2
15
Derartige Konformationsändemngen können
Verpackung
:
-*-
c(Duplex)
Zwischen AT- und GC-reichen
Unterschiede
=8.5 ±0.4 min
[min]
repariertem Oligonukleotid
4.5.3
t-i/2
10 15 20 25 30 35 40 45
5
Abb. 30:
1 min
+
k:
Betrachtung
der
Die
der
Messung
Doppelhelix
der
Oligonukleotide
DNA»RNA-Duplexe
der
zwar
Dimerreparatur
eine
A-artige
als
von
Konforma¬
m
C(3')-endo Konformation vor, während die DesoxyC(2')-endo Konformation einnehmen. Siehe z.B. [469,470].
Kap.
4
94
Thymidinphotodimeren
und
163) ergab
in
der
dramatisch reduzierte
durchgeführten Experimente
Umgebung
DNA-RNA
konnte
Reparatureffizienzen (Abb. 31).
in
einem
vernünftigen
werden, dass die Hälfte des Substrats umgesetzt
Zeitpunkt,
bei
dem 20%
repariert
(RNA-DNA-Duplexe:
waren,
In keinem der
Zeitrahmen
beobachtet
Daher wird in Tabelle 22 der
war.
aufgeführt
und
mit dem
am
selben
durchgeführten DNA'DNA-Duplex-Experiment gleicher Sequenz verglichen.
dieser
Auswertung wurden Thymidinphotodimere
langsamer
im
als
repariert
konnten
jedoch
Vergleich
DNA'RNA-Duplexe
DNA
repariert
2'-Desoxyuridindimere
der
Zeitpunkte, zu denen
Sequenz bei 435
derselben
c(Oligo)
RNA
T=T-Dimere
das Vier- bis Achtfache. Für diese
werden.
im
Nach
eine
die
das
signifikant
DNA'RNA-Duplexe
Im
Vergleich
mit den
also noch
DNA«RNA-Duplex
repariert.
Tab. 22:
Oligo
die
DNA'RNA-Duplexe,
167) enthielten, zeigten ebenfalls
mehr als 50% des Photodimers
Thymidindimeren werden
erstaunlich gut
um
und
Tag
20 bis 50 mal
DNA*RNA-Duplex
DNA'DNA-Duplex.
2'-Desoxyuridinphotodimer (159
verringerte Reparatureffizienz
im
155
c(PHR)
[M]
in
GC-reichen
und der
V
[M]
repariert waren
angegebenen Bandbreite.
20% der Photodimere
nm
Band¬
t0 2(DNA)
t02(RNA)
[min]
[min]
breite
[ul]
für DNA#DNA und
Verh.
Duplexen
154
155
1.0 E-06
5.0 E-08
600
3.4
nm
1.2 ± 0.2
ca.
50
50
154
155
1.0 E-06
5.0 E-08
750
3.4
nm
1.7 ± 0.2
ca.
40
23
3.4
nm
1.2 + 0.2
ca.
30
30
1.7
nm
0.6 ± 0.1
15 ±1
25
3.4
nm
2.0 ± 0.5
ca.
40
20
T=T-Dimere
in
AT-reichen
Duplexen
162
163
1.0 E-06
5.0 E-08
162
163
1.0E-07
5.0 E-08
162
163
1.0 E-06
5.0 E-08
U=U-Dimere
in
GC-reichen
600
750
Duplexen
158
159
1.0 E-06
5.0 E-08
600
3.4
nm
0.6 ±0.1
5.0 ± 0.5
8.3
158
159
1.0 E-06
5.0 E-08
750
3.4
nm
1.6 ±0.2
10 ± 1.0
6
3.4
nm
1.0 + 0.2
4.0 ± 0.5
4
1.7
nm
1.6 ±0.2
6.5 ± 0.6
4
3.4
nm
1.7 ±0.5
12.5 ± 1.0
7
U=U-Dimere
in
AT-reichen
Duplexen
166
167
1.0 E-06
5.0 E-08
166
167
1.0E-07
5.0 E-08
166
167
1.0 E-06
5.0 E-08
Eine andere
600
750
Vergleichsmöglichkeit
Funktion der Form Y
=
A
x
X
zu
ist es,
die ersten
fitten (Abb. 31).
Messpunkte
Auch über diese
mit einer linearen
Auswertung ergibt
sich, dass Thymidinphotodimere in einem DNA»DNA-Duplex mehr als 15 mal schneller
repariert
wurden als in einem
DNA^RNA-Duplex.
2'-Desoxyuridindimere
in einem
DNA»RNA-Duplex.
Auch
Thymidindimeren
im
DNA»DNA-Duplex
diese
Hingegen reparierte
nur
während des
Photolyase
6-7 mal schneller als in einem
Auswertung berücksichtigt nicht,
DNA»RNA-Duplex
die
Experimentes
stets
dass
nur
bei
den
ein Anteil
95
von
weniger
als 50% oft
erklärbar sein,
dass
als 20% umgesetzt wurde.
weniger
Thymidindimere
nur
Kap.
in
4
Dies könnte dadurch
DNA»RNA-Duplexen repariert
werden
können, die teilweise denaturiert sind.
Y^]
40
y
[%]
y
[%]
[%]
y
y [%]
y m
=
=
=
=
Abb. 31:
Um
11.0 %/min
*
9.78 %/min
*
1.69 %/min
*
0.45 %/min
*
Vergleich
der
t
[min],
[min],
t
R
[min],
R
t
[min],
R
=
=
96.0 %
:
[%]
von
an
y: Anteil
von
163
V
750 ul, Bandbreite 3.4
=
)
4.5.4
*
1.84 %/min
=
=
*
0.71 %/min
*
t
[min],
R
t
[min],
R
t
[min],
R
t
[min],
R
c(Duplex)
=
(B),
1.0 E-06 M,
99.8 %
91.8 %
)
und
und eine GC-
(A) bzw.
c(PHR)
97.6 %
=
Reparatur
167
97.3 %
=
=
U=U:
'
Sequenz (A)
von
=
=
von
159
(B),
5.0 E-08 M,
nm.
die neben einem
von
RNA die
Einzelstrang
Somit kann
Photolyase inhibiert,
oder einem
Experimenten
wurden
DNA*DNA-Duplex
wurde keine
ausgeschlossen werden,
Erniedrigung
dass
RNA die
inhibiert.
man
Einzelstränge
Doppelstränge.
Einzel-
versus
die Halbwertszeiten
menten am Einzel-
mente
10.6 %/min
für eine AT-reiche
RNA enthielten. In diesen
Vergleich
Vergleicht
=
*
DNA'DNA-Duplexen (T=T:
162 (A) bzw. 154
von
auszuschliessen, dass die Anwesenheit
Photolyase
y
11.1 %/min
=
repariertem Oligonukleotid in %.
(A) bzw. 155 (B).
Reparaturrate festgestellt.
[%]
[%]
DNA'RNA-Duplexen (T=T:
(A) bzw. 158 (B),
y
:
: y
reiche-Sequenz (B).
166
[%]
99.0 %
Anfangsreparaturrate
und
: y
98.6 %
=
U=U:
nicht-komplementäre
der
99.3 %
=
t
Experimente durchgeführt,
der
R
und
von am
Doppelstrang
selben
Tag durchgeführten Reparaturexperi¬
Doppelstrang derselben Sequenz,
im Durchschnitt
Hierzu konnten mit
1.4
mal
so
zeigt sich,
länger dauert,
RP-Chromatographie
als
die
ebenfalls
dass die
der
Reparatur
DNA'DNA-
Kompetitionsexperi-
durchgeführt werden, in dem ein GC-reicher Einzelstrang mit einem AT-reichen
Kap.
96
4
und
Doppelstrang
Abbildung
strängige
umgekehrt verglichen
dargestellt.
32
repariert
wird als
von
der Konzentration
an
Reparaturkurven
sind in
Kompetitionsexperiment doppel¬
einzelsträngige Oligonukleotide.
sich ausserdem, dass die
durchgeführten Experimente zeigt
Einzelstrangs
Die erhaltenen
dass im
zeigt sich,
Es
DNA 2-4 mal schneller
drei der vier
wurde.
In
Reparaturrate
des
geschädigtem Doppelstrang abhängt.
100
B
80
y
[%]
y
*''
-
/
[%]
V
60
l
-
40
t
"i
i j~
20
*i
~\
10
r
20
30
t
-
:t)/2
=13
1
50
10
min, 162
.
30
t
Abb. 32:
:
ti/2
:
U/2
==
=
8
+
50
A
u.
=
**":
=
5.0 E-06 M,
C: T=T-Dimere; B
U/2
*:ti/2
Oligonukleotid
)
20
u.
vs.
=
(A.)
2.5E-08 M, V
D: U=U-Dimere.
=
=
vs.
=
[min]
17+1
min, 158
25
min, 139
+
DNA*DNA-Duplex.
ss-DNA
%;
c(PHR)
min, 133
30
t
in
[min]
min, 166
=30 + 3
[min]
38 + 2 min, 138
c(
9± 1
10
Kompetitionsexperimente: Einzelstrang
c(A)
t
50
[%]
1 min, 154
repariertem
=
t1/2
y
20
ti/2
40
30
—
[%]
10
20
[min]
=39 ±2 min, 132
k:t1/2
y
+
40
1
y
=
Anteil
DNA'DNA-Duplexe
750 ul, Bandbreite: 5.1
an
(
);
nm.
Kap.
97
4
Studien mit Haarnadeln
4.5.5
Möglichkeit Sequenzabhängigkeit
Eine andere
untersuchen ist es, die Photodimere in
zu
Haarnadeln einzubauen. Dabei sollte ein Photodimer im
Basenstapelung herausgeklappt
sollte gepaart
liegen
zu
Erkennt
vorliegen.
nun
ungepaart und
stets
Ein Photodimer im Stamm
kommen.
die
Loop
aus
der
hingegen
eines dieser beiden Konforma¬
Photolyase
tionen, die das Photodimer einnimmt bevorzugt, sollte dies schneller repariert werden als
das andere.
100—
f//
80-
[%1
60-
60-
-A
40-
A
40-
/§
20-
"
'
'
i
Oligonukleotide
33
synthetisiert
Sie
Haamadelstruktur
und
)
(
nm
deren
und 280
i
6
10
8
[min]
Denaturierungsverhalten.
nm
(-
-) für die beiden
-
(A) und 170 (' )
171
Oligonukleotide
zeigen
durchgeführten Experimenten
'
i
4
2
einen
171 und 170, die für diesen
Denaturierungspunkt
und sollten daher bei 15°C in der Haarnadelstruktur
zeigte sich,
'
i
t
in % bei 260
die beiden
wurden.
'
40
30
mit
Hypochromizität
zeigt
/
0-
'
t
[min]
t
Oligonukleotide
Abbildung
i
20
*-
y:
'
i
10
Abb. 33:
--/
20-
A
0-
(170)
j^
T
y[%]
i
-
B
A
als auch in einem
dass die Haarnadel mit dem Dimer im
von
70°C
vorliegen.
(171)
Vergleich
und 50°C
Sowohl in separat
Kompetitionsexperiment (Abb. 34),
Loop
um
10%
als die Haarnadel mit dem Dimer im Stamm. Dies ist ein sehr
langsamer repariert
geringer
wird
Unterschied in der
Reparaturrate.
4.6 Diskussion der
enzymatischen
Mit Hilfe eines HPLC-basierenden
nachgewiesen werden,
Formacetal-verbrückte
machte
es
oder das
dass
diese
Assays
konnte für drei verschiedene
Photolyasen
Enzyme das in ein Oligonukleotid eingebaute,
2'-Desoxyuridinphotodimer
möglich, Oligonukleotide,
Studien
108
die entweder das
Thymidinphotodimer 110 enthielten,
für
als Substrat
erkennen.
Dies
2'-Desoxyuridinphotodimer
108
bezüglich
der
detaillierte Studien
Kap.
98
4
Reparatureffizienz
[eis, syn]-Photodimeren in einzelsträngiger DNA-, DNA*DNA-
DNA»DNA- und
DNA'RNA-Duplexen durch
Destabilisiemng
die
und
einzusetzen
DNA#RNA-Duplexen
und
Duplexen
von
die Photodimere
untersuchen.
zu
*'
B
.-^
TT
y[%]
von
60-
M
40-
20-
/
0-
30
20
t
Abb. 34: y
=
Anteil
an
1.0E-5
=
4.6.1
Die
Vergleich
Frage,
ob
vivo
in %.
M, c(170,
)
A:
Vergleich
1.0E-5
=
c(PHR)
=
5.0E-8 M, V
900
=
unabhängiger
=
c(171, A)
5.0E-8 M;
Ex¬
B:
1.0E-7 M,
=
ul, Bandbreite: 3.4
nm.
und Uridindimeren
Thymidin-
oder die durch
Deaminiemng
effizienter
2'-Desoxyuridindimere [285-289]
dass
1 0
8
[min]
M, c(PHR)
Fragestellung heutiger DNA-Photolyaseforschung.
nachgewiesen,
zweier
'
i
6
"Haarnadef-Oligonukleotiden.
Thymidinphotodimere
dimeren entstehenden
eine zentrale
von
mit
'
i
40
repariertem Oligonukleotid
1.0E-7 M,
=
i
t
Kompetitionsexperiment
)
'
i
[min]
perimente c(171, A)
c(170,
1
von
Cytosinphoto-
repariert werden,
ist
So wurde bereits früh in
T[c,s]T-Photodimere effizienter repariert
werden als
T[c,s]C-
Photodimere, die wiederum effizienter repariert werden als C[c,s]C-Photodimere [273].
Eine in vitro Studie
geringe
gab
erste Hinweise
Quantenausbeute
zur
niedrigen
beiträgt [482]. Jüngere Ergebnisse
Photolyase C[c,s]C-Photodimere
Photodimere bindet und erstere
repariert.
Dieselbe Studie
Photodimeren mit
einer
darauf, dass die geringe Bindungsaffinität und die
ergab,
3-fach
von
Reparaturrate
Kim und Sancar
mit einer
10-fach
ergaben,
geringeren
auch mit einer 20-fach
dass
C[c,s]C-Photodimeren
von
dass die E. coli DNAAffinität als
geringeren Quantenausbeute
U[c,s]U-Photodimere im Vergleich
Affinität
geringeren
T[c,s]T-
und
einer
1.5-fach
zu
T[c,s]T-
geringeren
Quantenausbeute repariert werden [455].
Eine
Übertragung
dieser
Ergebnisse
auf das
vorliegenden Arbeit nicht möglich.
Statt einer
Photodimere wurden sowohl im
Einzelstrang
Enzym
aus
A.
nidulans ist gemäss der
geringeren Reparatureffizienz
als
auch im
für
U[c,s]U-
DNA*DNA-Duplex
leicht
99
erhöhte Halbwertszeiten für die
experimenten
äusserst
Reparatur
T[c,s]T-Photodimere gefunden.
dieser Unterschied mit einer
war
Auch in den
gering.
1.0-1.2-fach
DNA'DNA-Duplexstudien
T[c,s]T-Photodimeren
von
Kap.
fache erhöht. In
Kompetitionsexperimenten
Doppelsträngen
wurde eine
das
um
1.5
mit
bis
Einzelstrang¬
erhöhten Halbwertszeit
die Halbwertszeit für die
aber immerhin
geringfügig,
nur
war
In den
4
Einzelsträngen wie
das 1.3-1.4-
um
auch mit DNA'DNA-
1.6-fach erhöhte Halbwertszeit für die
T[c,s]T-Photodimere gefunden.
Daraus ist
schliessen, dass die Typ Il-Photolyase
zu
dimere etwas schneller
Affinität oder
ein
experimenten
gezogen
einer erhöhten
an
T[c,s]T-Photodimere.
Dies kann
Quantenausbeute liegen.
Da in
als
repariert
nidulans U[c,s]U-Photo-
A.
aus
an
einer erhöhten
den
Kompetitions¬
grösserer Unterschied beobachtet wurde, kann die Schlussfolgerung
werden, dass die DNA-Photolyase U[c,s]U-Photodimere mit einer erhöhten
Affinität bindet und dies
die
Ursache
für
erhöhte
die
Halbwertszeit
der
T[c,s]T-
Photodimere ist.
Die erhaltenen
von
In
Kim und Sancar
Typ Il-Photolyase
Saccharomyces
cerivisiae
ein
Bindungsstelle
aus
dass
Photolyase
Phenylalanin (Phe494)
Photolyase
aus
E. coli und deren Kristallstruktur
Thymidinphotodimers
Aminosäure
entspricht
Da die
(Phe494)
einem
an
das
Enzym
mit beiden
Tryptophan
in E. coli
des
wäre
(Trp384) und in A.
zu
von
A. nidulans
vom
allerdings
dimeren
Kim
geben [455].
und
auch die
Frage,
und durch
Substrate
dargestellt.
[484]
ob die
Sancar korrekte
Sie hatten für ihre auf
gegriffen
Photodimeren
sei
Bestrahlung
dTpdT
dass
Dieses
des
diese
Phenylalanin
Photolyasen (Trp392).
gemäss der
Überlagerung
DNA-Photolyase T[c,s]T-
Experimente
Affinitäten
und
Oligonukleotide
eine
DNA-
von
Amino¬
sind, wesentlich beeinflusst wird.
Sie beriefen sich darauf, dass für
und für
zur
coli DNA-Photolase fast keinen
poly(dT)-, poly(dU)-
dieser
postulierten
Bindung
denn, dass die Selektivität
entfernten Zentmm weiter entfernt
Es stellt sich
von
es
DNA-
In dieser Studie
postuliert,
nidulans
erwarten, dass auch die
Dimere besser bindet als U[c,s]U-Dimere,
säuren, die
und
der
in der
ein Modell für die
vorgeschlagen
Enzym
in
Photolyase
cerevisiae
[366],
seiner Kristallstruktur mit der Kristallstruktur der E.
zeigt [367],
wenn
Methylgruppen interagiert [483]
postulierte Bindungsregion
Unterschied
wird,
durch Alanin ersetzt wird.
wurde, basierend auf der Sequenzhomologie der S.
den
Typ I-Photolyase
derselbe Affinitätsverlust
beobachtet
von
E. coli bestimmten Daten ab.
wurde ausserdem für eine andere
gezeigt,
wie bei der E. coli
Photolyase
nidulans weichen
A.
aus
[455] für die Typ I-Photolyase
Untersuchungen [483]
neueren
aus
für die
Ergebnisse
80%-Bildung
mit den
Quantenausbeuten wieder¬
und
poly(dC)-20mere
in 10%
rUprU
von
U[c,s]U-Photo-
wässrigem
eine
zurück¬
Aceton ihre
70%-ige Bildung
Photodimeren
[430]
von
bei der
Kap.
100
4
Bestrahlung
dass
es
mit Aceton als Photosensibihsator auftritt. Dabei wurde nicht
poly(dU)-Ohgomere
im Falle der
beider [trans, syn] -Photodimere kommt und im Falle der
Bildung
des
poly(dT)-Ofigomere
Daher
kommt.
[trans,syn-I]-Photodimers
und des
[eis,syn]-
[eis, syn] -Photodimers und
des
Bildung
zur
berücksichtigt,
[eis, syn] -Photodimere vermutlich nicht in den postulierten Verhältnissen
Überdies ist
Quantenausbeuten.
Photodimere die
Reparatur
Daten
von
repariert wird [485].
DNA-Photolyasen
Daher wäre
geringfügig
schneller
werden als
DNA'DNA-Doppelstrangexperimenten
und könnte ein Indiz dafür
Photodimer für die
Reparatur günstiger
Reparaturrate
ist vermutlich nicht
Verständnis der
Photoreaktivierung
Vergleich
Die mit den
Daten
thermodynamischen
Hinweise
gibt,
die
überprüfen.
zu
dass
kompetetiven
als
U[c,s]U-Photodimere
war
von
A. nidulans das
U[c,s]U-
binden kann und sich daher eine leicht erhöhte
Ein derart
geringer
auch
Unterschied in der
Er kann aber
biologischer Konsequenz.
Unterschiede zwischen
beitragen.
DNA-RNA-Duplexen
hinsichtlich
der
sowohl hinsichtlich
sehr
Reparaturdaten
U[c,s]U- und T[c,s]T-Photodimeren.
durch die
zum
So
viel
war
des
Duplexes
aber
grösser als die Destabilisiemng des DNA'RNA-Duplexes durch
Destabilisiemng
DNA«DNA-Duplex
es
grösser als in Einzelstrangexperimenten
etwas
und ihrer Evolution
als
es
unterschiedliche
wurde sowohl unter
DNA'DNA und
von
und
vor,
Typ I-Photolyase
DNA»RNA-Duplexen gemachten Beobachtungen zeigen
aussagekräftigere
die
von
die
T[c,s]T-Photodimere. Dieser Unterschied
U[c,s]U-Photodimere ergibt.
für
der
anhand einer
sein, dass die DNA-Photolyase
Reparaturrate
4.6.2
nötig,
es
vorgestellten Experimenten
repariert
lagen
bei hohen Konzentrationen mit schlechten
nicht-kompetetiven Bedingungen beobachtet,
auch unter
da
messen,
zu
Kim und Sancar mit einem definierten Substrat
In den in dieser Arbeit
in
durch
zur
kritisch, in Gegenwart der [trans,syn]-
äusserst
[trans,syn-I]-Photodimer
dass zumindest das
Ausbeuten
es
auch
als
Mfinitäten
unterschiedliche
sowohl
sich
ergeben
nur
T[c,s]T-Photodimere.
DNA«RNA-Duplexe
In
der
werden
U[c,s]U-Photodimere
Reparaturrate spiegelt
zwar
sich dieses
signifikant langsamer repariert
als die
geringer
Bild wieder.
als im
Die
DNA»DNA-Duplexe.
Zusätzlich werden
T[c,s]T-Photodimere in DNA'RNA-Duplexen vier- bis sechsmal
langsamer repariert
als
Aus diesen
U[c,s]U-Photodimere (Abb. 31 und Tabelle 23).
Experimenten
kann
durch das Photodimer für die
den
Reparatareffizienz
postulierten Vorgang
des
klappen
des Photodimers
aus
wurde
bereits
nach
gefolgert werden,
Herausklappens
der
Destabilisiemng
des
Duplexes
essentiell ist. Dies kann ein Hinweis auf
des Photodimers sein.
der DNA für die
Aufklärung
dass die
Reparatur
Kristallstniktur
durch
der
Dass das Heraus¬
Photolyasen nötig ist,
E.
coli
Photolyase
Kap.
101
Auch eine
postuliert [366].
zu
E. coli
Dieses
Hypothese [483].
unterstützt diese
Photolyase
Mutations Studie
neuere
Mutationsstudie konnte
Übereinstimmung
(Lys330, Glu384, Phe494, Trp384)
Photodimer
senkt
für
Bindungsenergie
Vermutung stimmt mit der
im Falle der
die
Reparaturrate erniedrigt
auch
ist
in
Enzym-Substrat-Komplexbildung
von
Hypothese.
zu
Im Falle der
DNA»DNA-Duplexe
ist
Es wäre
beobachten
zu
zu
klein,
unnatürlichen
Base
beeinträchtigen sollte,
die
Reparaturrate
Experiment
Arbeitsgruppe
untersuchte in
waren.
nicht
Bei einer
Befanden sich jedoch
PNA
nucleic
sich
zu
von
aus
des
Schuster
die sie durch
der
Paarung
Photodimers
aus
mit
den
der Helix
et
gemacht [486].
al.
Diese
Peptidnukleinsäuren (PNA)48
die
der DNA oder PNA
Bestrahlung
heraus, dass Thymidindimere, die sich im PNA-
Hingegen
wurden
befanden und mit einem
mit einem
gegenüber
die
Thymidindimere
parallelen PNA-Strang
antiparallelem PNA-Strang
wurde keine
dem Photodimer zwei Adenine befanden.
dem Photodimer keine
Untersuchungen ist
zu
Pseudopeptidketten
Adenine, wurde wieder Reparatur
schliessen, dass in den stabileren,
acids) sind DNA-Nachbildungen, in
sind. Diese
Destabilisiemng
Experimente möglich.
stärkeren
einer
DNA und
wurden.
Paarung
gegenüber
Pseudopeptid-Kette geknüpft
Komplexe
der
ebenfalls senkt.
DNA-Strang
wenn
Aus diesen
(peptid
einen
zum
repariert
sie sich im
Reparatur beobachtet,
beobachtet.
Duplexen
Thymidindimeren,
Sie fanden
Strang befanden,
gepaart
von
die
des Photodimers mit der
Paamng
Herausklappen
wurde bereits
Ein ähnliches
von
die
2,6-Diaminopurin,
Photodimeren führen und somit das
wenn
Bindungsstudien
Unterschied in
einen
um
Auch hier sind weitere
können.
könnte untersucht werden, ob eine
repariert,
in
nötig,
der Unterschied in der
Beispielsweise
erhalten hatten.
nun
DNA'RNA-Duplexen unabhängig
hingegen
T[c,s]T- und U[c,s]U-Photodimere
Reparaturraten
der
bestimmen.
Reparaturrate
Reparaturrate
Unterschied in
erhebliche
der
T[c,s]T- und U[c,s]U-Photodimeren, der mit den thermodynamischen
Affinität für Photodimere in DNA»DNA und
durch
durch das Photodimer
DNA'RNA-Duplexe
der
dass
gemachten Beobachtung überein,
Insbesondere
ist.
Daten korreliert, unterstützt diese
stabile
Dies
[483].
nach denen die Photodimer-Einheit
die
in dieser Arbeit
geringeren Destabilisiemng
Reparaturrate
48
In der
[453,454,485].
liefert
Diese
das
Struktur.
Aminosäuren
Untersuchungen,
mit früheren
der
50%
ungefähr
für
Affinität
die
Alanin
durch
gleiche
die Substitution einer der vier in der
dass
gezeigt werden,
postulierten Bindungstasche liegenden
die
Modelling- Studien
auf und besitzt nach
der Hefe
50%-ige Sequenzhomologie
weist eine
Enzym
Phrl-Photolyase
der
an
4
denen
die
bilden über
mit sich selbst und natürlichen Nukleinsäuren.
normalen
Basen
an
eine
Watson-Crick-Basenpaarungen
102
4
Kap.
ein
antiparallelen DNA'PNA-Duplexen
Duplexen
Photodimers
Dieses
ermöglichen,
unterstützt die hier
Auswirkung
der
Paarung
des Photodimers nicht stattfinden
darf in den
der
dass
schliessen,
über die Stabilität der
nur
Ergebnis
zu
der beobachtete Verlust in der
zu
zu
das Photodimer keine Wasserstoffbrücken
Experimenten
den
aus
Herausklappen
Um dieses
kann.
Herausklappen
eingehen
antiparallelen
Reparatureffizienz
des
die
Erkennung
des
nicht aber über seine Struktur beeinflusst.
vorgestellten Untersuchungen
2'-Hydroxygruppen
Des weiteren ist
können.
Gegenstrang
DNA»PNA-
und schliesst aus, dass
DNA'RNA-Duplexen
in den
sein könnte.
Gegenstranges
nur
eine
Um ausschliessen
können, dass die 2'-Hydroxygruppen einen Einfluss auf die Reparatureffizienz haben,
wäre
es
wie 172
nötig, Duplexe
DNA-Fenster befindet
sollten ausreichen,
untersuchen, in denen sich das Photodimer in einem
zu
Die Ribonukleotide
(Abb. 35).
eine A-Form
um
Ersatz einer
Desoxyribose
begünstigen
kann. [467]
zu
an
den Enden des
Gegenstranges
induzieren, da beobachtet wurde, dass bereits der
die A-Form
DNA»DNA-Duplex
durch eine Ribose in einem
5'-d(CGA)d(CGT=TGC)d(AGC)-3'
3'-r(CGT)d(GCA ACG)r(TCG)-5'
Abb. 35:
4.6.3
DNA'RNA-Duplexe
zu
172 mit DNA-Fenster im
Gegenstrang
Biologische Konsequenzen
Aus den in dieser Arbeit
ist
Duplex
folgern,
Photolyase
durch
der A-Konformation
bedeutend schlechter
Photolyasen
Transkriptions-aktiven
dass in
erheblich
durchgeführten Reparaturstudien geht eindeutig hervor,
langsamer repariert
vorliegen,
repariert
werden.
Mutations
Hot
werden und dass Bereiche des
ebenfalls sehr viel schlechter
Spots
sich
Daraus
Bereichen DNA-Schäden durch die DNA-
repariert
Genoms, die in
werden.
weil die A-Konformation eine im Genom selten beobachtete Konformation
UV-induzierte
dass
in
DNA-Bereichen
mit
Gerade
ist, könnten
A-Konformation
befinden.
Aus den
Experimenten
Photodimere in einer
an
Haarnadeln
Loopregion
geht
des weiteren
weder schneller noch
hervor, dass DNA-Photolyasen
langsamer reparieren
als in einer
gepaarten Stammregion.
Ein interessantes
und
Ergebnis
doppelsträngiger DNA.
Duplexe
Diese weisen
vorhanden sind, diese
massiven
Schädigung
Transkription
repariert.
lieferten auch die
oder
Kompetitionsexerimente
eindeutig daraufhin,
bevorzugt repariert
des Genoms durch
werden.
UV-Strahlung
Replikation einzelsträngige
DNA
dass
zwischen einzel-
solange
DNA'DNA-
Somit werden bei einer
Bereiche in denen
vorliegt,
aufgmnd
erheblich
von
langsamer
Kap.
103
4.7
•
Zusammenfassung
ähnlichen
um
2-4 mal stärker als
um
wurde
3 kJ/mol stärker destabilisiert als
für die
nur
geringfügig.
um
1.5 °C
11-13 kJ/mol
als in
erheblich
(T[c,s]T).
Thymidinphotodimeren (6 kJ/mol).
für
und
2'-Desoxyuridin-
sind die
Tm-Werte
erniedrigt.
repariert.
gleich
Es konnte keine
mit derselben
schneller
A.
Geschwindigkeit.
nidulans
repariert
als
DNA-Photolyase
Thymidindimere.
werden als Substrat
DNA'DNA-Duplexen.
in ss-DNA
erkannt, aber sehr viel
Dabei werden
2'-Desoxyuridin-
(4-8x) schneller repariert als Thymidinphotodimere.
Thymidinphotodimeren
Bei
Thymidin¬
Photodimere in ds-DNA und ss-DNA
von
DNA»RNA-Duplexen
langsamer repariert
photodimere
werden
(1.3-1.6x)
und in ds-DNA etwas
in der
Photodimere in Haarnadelstmkturen sowohl in
Loopregion
2'-Desoxyuridinphotodimere
11-
werden.
DNA-Photolyase repariert
der Stamm- als auch in der
von
2'-Desoxyuridindimeren (9 kJ/mol)
wird ds-DNA schneller
Kompetition
Sequenzabhängigkeit beobachtet
Photodimere in
von
wurde
DNA-Photolyase repariert
A. nidulans
(U[c,s]U) bzw.
Destabilisiemng (3 kJ/mol) gefunden, allerdings
2'-Desoxyuridindimeren
A. nidulans
von
DNA»RNA-Duplex
schnell. Bei einer
•
geringfügig.
DNA'DNA-Duplexe
destabilisieren
13-14 kJ/mol
DNA'RNA-Duplex
Ein GC-reicher
dimere dieselbe
•
nur
DNA^RNA-Duplexe (3-8 kJ/mol).
Thymidindimere
und
2'-Desoxyuridin-
dem AT-reichen
•
mit
in der B-Konformation
[eis, syn] -Photodimere destabilisieren DNA'DNA-Duplexe mit einem Betrag
um
•
Photolyase
repariert.
Das Photodimer beeinflusst die Konformation nicht oder
gleichen Grössenordnung
•
das natürliche Substrat
nidulans
Das Photodimer beeinflusst die Konformation nicht oder
14 kJ/mol
•
Quantenausbeuten wie
A.
von
[eis, syn] -Photodimer-enthaltende DNA'RNA-Duplexe liegen in der A-Konformation
vor.
•
Sie werden
Subtypen.
[cz'^synJ-Photodimer-enthaltende DNA'DNA-Duplexe liegen
vor.
•
DNA-Photolyasen aller
Formacetal-verbrückte Photodimere sind ein Substrat für
bekannten Klassen und
•
4
konnte im
DNA'RNA-Duplex
keine
Bei den
vollständige Reparatur
erreicht werden.
•
Das Ausmass der
Destabilisiemng
DNA'DNA-Duplexe
DNA'RNA-Hybride
am
stärksten
werden
durch
korreliert mit der
destabilisiert
das
entsprechend langsamer repariert
Thymidindimeren
ist die
Entsprechend
wurde hierfür die
und
am
So
schnellsten
werden
repariert.
2'-Desoyuridinphotodimer weniger
destabilisiert und
Destabilisiemng
Reparaturrate.
des
als
DNA'DNA-Duplexe.
DNA»RNA-Hybrids
geringste Reparaturrate
gemessen.
noch
stark
Bei
geringer.
Kap.
5
104
5
Synthese
5.1
Flavinnukleosiden
von
Einleitung
Bei der
Reparatur
eines Elektrons
von
der DNA
7t-Stapel
einiger
Seit
Diese Abstraktion
5'-GG-3'-Doubletts auch
Auch
sind [489,490],
Thymidindimere
Reparaturrate
eines Drahts besitzt
Neuere
von
können über eine Distanz
werden
repariert
ob DNA die
von
nur
et
al.
möglich ist,
Guanin
zu
Guanin
wenn
möglich
hoch ist,
den
von
Da
die
Lösungsmittel
ergab
sich eine
eines Isolators oder
Eigenschaften
dass
Hüpfen
befinden, desto langsamer wird der Elektronentransfer.
Behandlung
dieser Studie wurde ein Elektron durch die
in
7C-Stapel
mit
kommt
Piperidin
Elektron in diese Lücke
des Elektrons
aber
Folgen
zu
zu
einem
Strangbruch.
In
des Vorläufermoleküls
Electron-hopping-Proztss
nur
in denen eine Elektronenlücke erzeugt wurde und ein
springen kann.
DNA-Photolyasen reparieren
Photodimer sondern durch
im Hinblick auf die
schneller
einer Oxidation eines
es
homolytische Spaltung
der DNA abstrahiert. Somit ist bisher der
Systemen nachgewiesen worden,
ein
ist. Je mehr A»T-Paare sich zwischen
Guanins und bei anschliessender
aus
zu
ein sogenanntes
Strang aufeinander,
(Abb. 9)
[491,492].
[494] weisen daraufhin,
zwei oder drei Guanine im selben
33
dem
26 A
von
für einen Elektronentransfer durch das
Frage,
Giese
Elektronentransfer in DNA
den G»C-Paaren
aus
[493].
Ergebnisse
(electron hopping)
Elektronen
der Interkalationsstelle entfernt
von
Wasser oder für eine Diffussions-kontrollierte Reaktion
interessante Diskussion über die
Rhodiumkomplexe
einer Oxidation des 5'-Guanins in
zu
37 A
zu
mit hoher Effizienz
Rhodium-(III)-komplexen
Oxidations- bzw. die
diese bis
wenn
Übertragung
entscheidender
von
Bestimmte
[487].
photochemisch
Elektronen führt
von
ist die
diskutiert, dass sich Elektronen
Zeit wird
können
bewegen
interkalieren in die DNA und abstrahieren
[488].
Photodimer
einem Flavinkofaktor auf das
Bedeutung (siehe Kapitel 4.1).
durch den
DNA-Photolyasen
DNA-Photoschäden durch
von
Photodimere nicht durch Abstraktion eines Elektrons
Übertragung
Frage
vom
eines Elektrons auf das Photodimer. Daher ist
der Evolution
von
DNA-Photolyasen interessant,
zu
es
unter¬
suchen, ob Elektronen in den 7i-Stapel abgegeben werden können und ob dann ebenfalls
ein schneller Elektronentransfer
beispielsweise
Sollte dies der Fall sein hätten die ersten
Photodimer
eingehen müssen,
durch den
Photolyasen
sondern hätten bereits
Elektrons in der Nähe des Photodimers auf die DNA die
Hopping-Proz&ss möglich
keinen direkten Kontakt
durch
die
Übertragung
Reparatur erreicht.
ist.
zum
eines
Kap.
105
Analogie
Als ein Elektronendonor könnte in
gebaut
von
einem
in
Cyclobutandimer
Oligonukleotide
Cyclobutandimere
nahezu
unabhängig
von
DNA»DNA-Duplexe
bzw.
werden könnte. Sollte ein schneller Elektronentransfer
DNA-Photolyase
ein
in unterschiedlicher Ent¬
Phosphoramiditbaustein
Flavinnukleosid dienen, das über einen
fernung
Flavinkofaktor der
zum
5
möglich sein,
ein¬
müssten die
der Distanz mit derselben Effizienz
repariert
werden können.
5.2
Vorgeschlagene Flavinnukleoside
Als Flavinnukleoside sollten
ursprünglich
bei denen das Flavin über einen
adenosin
geknüpft
wird. Diese
aus
unbekannten
Tosylat
(Schema 21).
[440]
aus
von
Da aber die
Hydroxygmppe
Flavinylethanols
176
zu
173
dem
von
2'-Desoxy-
8-Mercaptoadenin 174,
[440] in Analogie
Pieles
et
das in
[495], und dem bisher
al.
der
zu
Synthese
[496] dargestellt werden
Verbindung 176
weder
überführt werden konnte
[440],
der bekannten
zu
dargestellt werden,
die C-8-Position
Abgangsgruppe
die leichter
Typs
werden kann
2'-Deoxyadenosins
Möglichkeiten gesucht,
statt des
hätte
176
175 noch in eine andere
Tosylat
wurde nach
Verbindung
an
Flavinylethanols
175 des
eines Psoralen-modifizierten
in ihr
ethylthio-Linker
2'-Desoxyadenosin dargestellt
zwei Stufen
können
Nukleoside des
aktivierende Flavinaminosäure 177
verwenden.
OR
173
Schema 21:
174
Vorgeschlagene Darstellung
einem B-DNA-Modell
an
eignen sollte,
da beim Einbau dieser
mit einem
kommen sollte.
Gegenstrang
Die
zeigten,
dass sich die
Verbindung
das Flavin in der
Anordnung
=
Tos: 175
R
=
H:
176
des Flavinnukleosids 173.
Betrachtungen
Paamng
R
könnte
in
ein
Verbindung
Oligonukleotid
Hauptfurche
178 sehr gut
und
der B-DNA
dadurch stabilisiert werden,
dass
dessen
zu
die
liegen
freie
106
5
Kap.
Aminogruppe von 178
Phosphatrückgrat
zum
geladene Wasserstoffbrücke
der DNA eine
ausbildet.
Flavinaminosäure
der
Kupplung
durch
sollte
178
5-Aminomethyl-2'-desoxyuridin
179 [497]
177
[440]
dargestellt
werden
HO—<
ÖH
an
das
bekannte
(Schema 22).
NHo
O^ M^ M.
o VVW
o
HN
O^-N.J
H
o
à
'
HO~y
ÖH
Schema 22:
und
Vorschlag
Aus der Literatur sind für die
geht
des Flavinnukleosids 178.
Retrosynthese
Synthese eines Phosphoramidits
5.3
von
2'-Desoxyuridin
Durch einen
177
179
178
Darstellung
53
Wege
C(5)
180
an
dann das
Iod-Cyanaustausch wird
178
179 zwei
von
welches
aus,
von
zu
bekannt. Der erste
iodiert wird
[498,499].
181
dargestellt
5-Cyano-2'-desoxyuridin
(Schema 23), welches durch Hydrierung in 179 überführt wird [497],
Gesamtausbeute dieses
Der zweite
Weg geht
Weges beträgt
von
der
Methylgruppe
Hydroxygruppen
an
Austauschin das
Azidothymidin
Hydrierung
Gesamtausbeute
geeignetere
Beim
zu
des
4
zweiten
aus,
welches
Entschützung
Acetyhemng
Weges
ca.
(Schema 23).
179 erhalten
20%
der freien
Hieraus wird durch
[500].
schien
beträgt,
Da die berechnete
der
erste
Weg
der
sein.
Versuch, 2'-Desoxyuridin 53 in Gegenwart
iodieren [499], wurde eine Vielfalt
schwer
nach
selektiv bromiert und durch einen Bromid-Azid-
182 überführt wird
und die anschliessende
Die berechnete
50%.
ca.
Thymidin
Weg
chromatographisch
dargestellt [499].
Produkten
reinigen sind,
zu
5-Brom-2' -desoxyuridin 183
von
durch
Dieses konnte mit
umgesetzt werden (Schema 24).
von
Azid mit Iodmonochlorid
zu
Iod-Verbindungen
oft
gebildet.
wurde
Umsetzung
von
Kaliumcyanid
in
Da
das
ebenfalls
53
mit Natriumazid und NB S
Gegenwart
von
Literatur-bekannte
18-Krone-6
zu
181
Kap.
107
5
O
O
"f^
HY
ICl,NaN3,
O^N^
MeCN, RT,
KCN, DMF,
o^N
[5%-Rh/AI203],
DC-18-K-6,
ö
15%NH4OH,
psi, 1h,
40
RT,
72
Q'
h, 75%
70%
NH2
O
O
HN
O^N
à
1.
Ac2ö, Py, 81%
2.
NBS, CCI4, hv
3.
LiN3, DMF, 2h, 80°C,
(2 Stufen)
63%
'''«
OH
HO—/
1.
H2, Pd/C,
2.
NH4OH,
64%
68%
4
Schema 23
Bekannte
:
Synthesewege
hydroxidlösung
nur zu
von
führte.
Reinigung
in
Hydrierung
Ammonium¬
Daher wurden verschiedene
Am besten stellte sich die
Lösung
heraus.
179
konnte in
über einen Ionenaustauscher erhalten werden.
O
NaN3, NBS,
H2O/THF,
0°C-^60oC,
HN' ^
JJ
Zy^W
\\
]
KCN, DMF, 8-K-6,
40°C-»70°C,52%
\\
\
0^"N
à
*
HO-/
OH
O
O^N"'
90%
HO—f
[497]
Katalysator
in ammoniakalischer
O
T
179.
Bedingungen getestet (Tabelle 23).
Raney-Nickel
Ausbeute nach
80%-iger
als
20%igen Umsetzung
einer
und
Hydrierkatalysatoren
von
sich jedoch, dass die beschriebene
Rhodium/Aluminiumoxid
5%igem
Verwendung
Darstellung
Hydrierang zeigte
Bei der anschliessenden
mit
zur
53
'öH
183
Raney-Ni, H2,
5
bar, 1.5 h,
15%NH4OH,
80%
179
Schema 24:
Synthese
von
181
aus
53.
108
5
Kap.
Tab. 23:
Hydrierung
von
181
zu
179 unter verschiedenen
Lösungsmittel
Druck/ Zeit
Katalysator
Menge
Bedingungen.
Umsetzung
bzw.
Ausbeute
50 mg
25 mg
RI1/AI2O3
5 bar /1 h
50 mg
25 mg
Rh/Al203
5 bar / 24 h
15%
NH4OH
70%
15%
NH4OH
ca.
5 bar / 24 h
2 M
NH3
/ MeOH
Raney-Nickel
5 bar / 24 h
2 M
NH3
/ MeOH
450 mg
Raney-Nickel
5 bar / 50 h
2 M
NH3 /
400 mg
Raney-Nickel
5 bar / 2 h
Raney-Nickel
5 bar / 1.5 h
25 mg
50 mg
100 mg
1
g
RI1/AI2O3
25%
deren freie
10%
a)
a
70%
5%
MeOH
ca.
70%
80%
NH4OH
Hierzu wurde
sollte anschliessend mit der Flavinaminosäure umgesetzt werden.
179
20%
ca.
NH4OH
15%
[497]
Diese lässt sich mit
Aminogmppe mit der Allyloxycarbonylgruppe geschützt.
Pd(0) entschützen und wurde auch schon in der Oligonukleotidsynthese eingesetzt
Durch
[176,192].
177 mit
in
Umsetzung
konnte unter
erhalten
in
9%-iger Kaliumcarbonatlösung
Verwendung
187
zu
in DMF und
mit 179
Triethylamin
dimethoxytrityliert (Schema 25).
in einer Ausbeute
186
Bei dem Versuch
2-Cyanoethyl-A;,A/-diisoproplycMorophosphoramidit (CEDCI)
statt des
gewünschten Phosphoramidits
erhalten. Letzteres ist für die
Man kann davon
Oxidation des
beobachtet
ausgehen,
dass das Flavin in
in
der
Verbindung
diese
in
internen
Oxidationsstufe
Gegenwart
in der
Tritylassay
188 bis
zur
mit
wurde
Phosphoramidat
nicht verwendbar.
Gegenwart
Licht und Sauerstoff die
von
von
Frier et al.
Daher wurde die Reaktion nochmals unter Lichtausschluss und in mit
richtigen
Verbindung
nur
wurde
187
phosphitylieren,
Eine ähnliche Reaktion wurde
Argon gesättigten Lösungsmitteln wiederholt.
188
zu
gemäss 31P-NMR
188
Oligonukleotidsynthese
Phosphors katalysiert.
[501].
wurde 185
Benzotriazol-l-yloxy-tris(dimethylamino)phospho-
von
70% in das Flavin enthaltende Nukleosid 186 überführt werden.
anschliessend
war
der Aminosäure
(Schema 25).
niumhexafluorophosphat (BOP)
von
Trifluoressigsäuresalzes 184 [440]
Allyloxycarbonylchlorid (AocCl)
72%-iger Ausbeute
185
des
von
erhalten
werden.
Licht und Luft sehr schnell.
Oligonukleotidsynthese
konnte aber
Kupplung
Auf diese Weise konnte
nur
bereits
ein
zum
20%-iger
gemäss 31P-NMR
Allerdings
oxidierte
Dennoch wurde
einzusetzen.
Gemäss
Einbau erreicht werden.
Grossteil oxidiert.
die
versucht,
dem GeräteVermuthch
Kap.
109
5
o
X^^
0'
HN
NH3CFCO2
AocCI, K2C03,
H2Ö / DMF,
RT, 72%
r^
OH
OH
o
o
184
185
BOP, DMF,
NEt3, RT, 72%
179
HN
O^NJ
185
+
vOR'
RO—'~>~y
—
DMTrCl, py, DIEA, 75%
+
CEDCI, CH2CI2, DIEA, 54%
-*-
Schema 25:
5.4
Synthese
des
Phosphoramidits
Um die
Schwierigkeiten
Phosphotriester
weiterer Ansatz ist die
Aminogmppe
Da
DMTr, R'=H:187
R
=
DMTr, R'=P(N/Pr2)OCH2CH2CN:188
Flavin-enthaltenden
von
oder das
es
Phosphonat
nachträgliche
Aminosäuren einzuführen, wurde dieser
Die
nachträgliche Modifikation
des
5'-Aminomethyluracils
Prinzipiell kommen hier
eines
von
187
umgehen, gibt
durch
Kuppeln
Weg
werden.
werden.
des Flavins
im
Hierzu
an
Ein
die freie
synthetisierten
würde, verschiedenste
untersucht.
Ohgonukleotids
Schutzgmppen
es
der Amidit-Chemie
synthetisiert
Modifikation erlauben
mit einer selektiv
zwei
Verwendung
des Nukleosids 179
5'-Aminomethyluracil
eine
zu
Phosphonatmethode eingesetzt
oder die
Oligo¬
Modifikation
So kann statt der
nachträgliche Modifikation,
der Base
Oligonukleotid.
R
=
mit dem leicht oxidierbaren Amidit
Phosphotriestermethode
musste der
R'= H:186
=
nachträgliche
gmndsätzlich mehrere Lösungsansätze.
die
H
R
188 des Flavinnukleosids 178.
Versuch des Auf bau s
nukleotiden durch
*
H
setzt voraus,
dass die
Aminogmppe
in
abspaltbaren Schutzgmppe geschützt
Frage:
ist.
110
Kap. 5
•
abspalten
und wurde bereits
CPG-Trägermaterial
zur
entschützt
lässt
Schutzgmppe
Diese
Allyloxycarbonylgmppe:
Die
selektiv
sich
Oligonukleotiden eingesetzt,
Synthese
von
wurden,
ohne
Oligonukleotide
die
Pd(0)
mit
die
am
Harz
vom
abzuspalten [176,192].
•
Die
9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Schutzgruppe (Fmoc):
aus
der
dass
Peptidsynthese
sich mit
sie
Bedingungen
in der
zuerst
Verbindung
zu
O
H20, RT,
98%
mit
Durch
Umsetzung
(Schema 26).
HN
DMTrCl, py,
DIEA, RT, 71%
DMTrO^/
'öH
HO-v
179
umgesetzt. Diese
189
CEDCI wurde 191 erhalten
Hïl H
cr^u"
AocCI, K2C03,
zu
dimethoxytrityliert werden.
Phosphitylierungsreagenz
NH2
O
190
diesen
bereits bewährt hatte,
Verbindung
die
wurde
9%-iger Kahumcarbonatlösung
in
konnte anschliessend
190 mit dem
Hierzu
Unter
[502].
Oligonukleotidsynthese
untersucht.
Weg
dieser
besteht darin,
lässt.
entfernen
stabil sein
ist
Fmoc-Schutzgruppe
Fmoc-Schutzgruppe
Zeit
kurzer
sehr
Schutzgmppen
sollten die anderen
Allyloxycarbonylchlorid
von
in
Piperidin
Allyloxycarbonylgmppe
Da sich die
wurde
Der Vorteil der
bekannt.
Die
R
189
=
ÖR
H:190
CEDCI, CH2CI2,
DIEA, 54%
R
Schema 26:
Darstellung
Um die Methode der
zuerst
nur
die
Phosphoramiditbaustein
synthetisiert
konnte aber die freie
Nachweis freier
werden
nachträgliche
Ohgonukleotids
und als letztes Nukleotid 191
mit
(Schema 27).
Aminogmppe
P(N/Pr2)OCH2CH2CN:
für die
Modifikation eines
Allyloxycarbonylgmppe
Komplex abgespalten
zum
191 als
nachträglichen
ein Trimer
sollte
send
von
=
dem
Wegen
der
Umsetzung
zu
testen, wurde
gekuppelt.
Anschlies¬
niedrigen Beladungsdichte,
[503], der in der Peptidsynthese
verwendet wird, nicht
wurde versucht, durch anschliessende
Modifikation.
Palladium-(0)-Triphenylphosphin-
mit dem Kaiser-Test
Aminogruppen
191
mit der
nachgewiesen
geschützten
werden.
Daher
Flavinaminosäure
19349 in Gegenwart der Aktivierungsreagenzien 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) und
49
193
erhalten.
wurde durch
Umsetzung
von
177
mit
Phenyloxycarbonylchlorid
in
2-
Kahumcarbonatlösung
Kap.
Ill
(Benzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetramethyluronium-tetrafluoroborat (TBTU)
(Schema 27).
gruppe nachzuweisen
des
Trägermaterials
geschlossen werden,
Umsetzung
Nach der
Abspaltung
der
die freie Amino¬
und anschliessendem Waschen
Daraus
musste
Allyloxycarbonylgmppe
oder die
fluoreszierte
noch
gelb
blieb dies weder
dass entweder die
Umsetzung
5
es.
mit 193 nicht funktioniert hat.
°
S
0.\ M^ „N.
9 Y Y YY
1.Pd(PPh3)4,Bu3SnH,
CHCI3, N-Morpholin,
um^NsAw^n
HOAc,PPh3,15h
HOAc,PPh3,15h
n
Vf
....J<
2.
N
T
Hlf
O
J
TBTU, HOBT, 193,
DIEA, DMF, 15 h
7^
DMTrO-/
DMTrO^^Ö-d(CC)^CPG>
Vd(CC)~<CPCr)
Schema 27: Versuchte
nachträgliche Modifizierung
die mit der
Aminogruppe tragen,
Allyloxycarbonylgmppen am Trägermaterial
sich über die
179 mit
Lösung
zu
die
Allyloxycarbonylgmppe
195
des
UV-Absorption
zu
zu
Die
in DMF umgesetzt.
dimethoxytrityliert
wobei F das
20%-igen Lösung
zum
Piperidin
Deren
TBTU und der
Hünigs-Base
mehrfachem Waschen des
fluoreszierte im UV-Licht.
Flavinaminosäure 193
Synthese
Trägermaterial
Daraus wurde
stattgefunden hatte.
196
synthetisiert,
wurde mittels
mit der Pac-
Aktivierungsreagenzien
während drei Stunden umgesetzt
Trägermaterials
K2C03-
Fmoc-Schutzgruppe abgespalten.
wurde das
der
wurde
verwendet werden.
mit Pac-Amiditen
Nach der
in DMF die
bheb das
statt
194 wurde anschliessend
Oligonukleotide
darstellt.
Gegenwart
in 9%
die
lässt
Abspaltung
phosphityliert (Schema 28).
5'-FAACCC-3'
Trägermaterials
Flavinaminosäure 193 in
196
zu
Einbau in
Derivat 196
Nach mehrfachem Waschen des
geschützten
Fmoc-geschützte Verbindung
Sequenz
von
um
Abspaltungsproduktes verfolgen. Entsprechend
Standardbedingungen
Fmoc-geschützte
einzige
erreichen, wurde als zweite Variante
Fmoc-Schutzgruppe eingesetzt.
und abschliessend
Es wurde ein Hexamer der
eine
anspmchsvoll sind,
Fluorenylmethyloxycarbonyl-A^-hydroxysuccinimid (FmocOSu)
konnte unter
einer
die
Allyloxycarbonylgruppe geschützt ist.
wurde, dass die Palladium-Komplexe sterisch
Da vermutet
der
Oligonukleotiden,
von
(Schema 29).
Trägermaterial
geschlossen,
dass
HOBT und
intensiv
Nach
gelb
und
eine Reaktion mit der
Kap.
112
5
NH2
O
O
DMTrCl, py,
DIEA, RT, 57%
HO
NHFmoc
HN
X.
O-^N
DMTrO-V
R
OR
H:195
=
CEDCI, CH2CI2,
DIEA, 86%
R
Darstellung
Schema 28
von
196 als
Phosphoramiditbaustein
Anschliessend wurden wahrend sechs Stunden bei
hydroxidlosung
nen
am
gab,
am
5'-Ende bereits
abgespalten
die nicht fluoreszierten.
metnsch und
fur die
P(N/Pr2)OCH2CH2CN.
nachtragliche
Dabei
mit Ammonium-
Raumtemperatur
es einen
grossen Anteil
Die Fluoreszierende Fraktion wurde
UV-spektroskopisch untersucht.
und das
überraschte, dass die Dimethoxytntyl-
und dass
war
196
Modifikation
Oligonukleotid verbliebenen Schutzgmppen abgespalten
mittels HPLC gereinigt.
Oligonukleotid
gmppe
die
=
Neben einigen
an
Fraktio¬
massenspektro-
Vemnreinigungen
kleinerer
O
NH
O
O
NHFmoc
1. 20%
Pipendin,
DMF, 15
U
i
2.
0^"N
.&
DMTrO—/
Schema 29
JJ
DMTrO~>
0-d(AACCC)--^CPG^
Nachträgliche Modifizierung
Signal.
Die Pac
N
y
Masse zeigten die
tion bei 260
CT
°
—"
tragen, die
sivstes
Ä.
TBTU, HOBT, 193,
DIEA, DMF, 3 h
vyw
^
HN^
min
Q^ JVk .N.
nm
mit
der
die
am
mit
Aminogruppe
der erwarteten
Masse50 als
neben der fur Nukleobasen erwarteten
typischen Absorptionen
Flavin wurde nicht
die eine einzige
ist
Verbindung
UV-Spektmm zeigt
die fur Flavine
Schutzgruppe
Oligonukleotiden,
Fmoc-Gruppe geschützt
Massenspektren
Das
von
Q-d(AACCC)—^CPG>
abgespalten
bei 380 und 450
nm
inten¬
Absorp¬
(Abb 36).
Kap.
113
5
0.2-
0.1
-
0
_
200
Abb. 36:
der fluoreszierenden Fraktion des
UV-Spektrum
abschliessender Modifikation mit 193,
Die
Synthese
dieser kurzen
Oligonukleotide
mit Hilfe des
drastisch
Kupplungszeiten
bei der
Kupplung
während drei
leicht
und
gelb
nach der
450
nm
196
Abspaltung
dargestellt
der
Sequenz
Tage
Umsetzung
beobachtet.
dementsprechend
und
dass
der
mit
die
Sequenz
mit der Flavinaminosäure 193
5'-CCGFAACCCTCC-3'
eine Reaktion
werden
Fmoc-Gmppe
Bei
mussten.
wurde
erst
nach
einer
(CPG-Material bheb nach dem Waschen
Bei der
Analyse
stellte sich heraus, dass die
Entschützung
groben Reinigung.
5'-CCGFAACCCTCC-3'
12-mere
werden
erhöht
fluoreszierte)
hatte und
Vorläufers
Als diese nach
5'-CCGTAACCCFCC-3' konnte keinerlei
erreicht werden,
und einer
umgesetzt werden sollten, stellte sich heraus,
193
der Flavinaminosäure
beiden
dargestellt.
5'-CCGTAACCCFCC-3'
Entschützung
Fmoc-geschützten
die
wurden
Daher
können.
5'-FAACCC-3' nach
Ohgonukleotids
daraufhin, dass prinzipiell Flavin enthaltende
wies
Sequenz
600
500
400
300
dieser Reaktion mittels HPLC
Hauptfraktion
kein Flavin enthielt.
keine
Absorption
bei
Die beiden Versuche wurden
daher verworfen.
5.5 Diskussion
Die
Darstellung
von
Oligonukleotiden,
die
enthalten, erwies sich als komplizierter als
197 darzustellen,
von
197
gelingt
gegenüber
Deswegen
gelang
nur
ein Flavin
erwartet.
nicht,
mittels
der
Frier et al.
mittels der
beschrieben, die
Phosphoramiditchemie
Derivates auf die
am
einführen wollten.
Phosphonatmethode
aus
[501].
Die hohe Sensivität
schwer handhabbar.
Phosphoramiditchemie
5'-Ende eines
Position
Versuch, das Phosphoramidit
Phosphoramidit
aufzubauen, die das Flavinnukleosid 178 enthielten.
von
einer definierten
unter Licht und Sauerstoffausschluss.
Licht und Sauerstoff macht das
es
Der
an
Ahnliche
Oligonukleotide
Schwierigkeiten
Ohgonukleotids
Sie wichen
zur
wurden
ein Flavinderivat
Einführung
dieses
Kap.
114
5
In dieser Arbeit wurde stattdessen
versucht, das Flavin nachträglich einzuführen, in dem
eine Flavinaminosäure mit der freien Aminofunktion des
uridins 179
gekuppelt
aminosäure
verfolgt
an
die freie
werden.
Ausserdem
179
Aminomefhyl-2'-desoxyuridin
in
Hinderung
war
am
erwies sich die
sie
nur
5'-Ende des
dann
Kupplung
da diese Reaktion
problematisch,
als
einer Fmoc-
Abspaltung
erfolgreich,
Ohgonukleotids
durch benachbarte Basen
zu
der Flavin¬
schwer
nur
sich das 5-
wenn
befand.
Vermuthch
gross, als dass die Reaktion
guten Ausbeuten stattfinden könnte. Ein grössere Abstand zwischen Aminogruppe und
Base kann aber
198 und 199
konnten
am
zum
Erfolg führen,
(Abb. 37)
CPG-Träger
das Amin und
an
Allerdings
Aminogmppe
werden konnte.
ist sonst die sterische
Letztere konnte durch
werden sollte.
Gruppe gezielt freigesetzt
5-Aminomethyl-2'-desoxy-
aus
über die
durch
wie Kahl und
Phosphoramiditmethode
der
Abspaltung
Aktivierungsreagenz
der
vorgestellten
lichtempfindlichen Schutzgmppe
Abstandsabhängigkeit
Hauptfurche gebunden
Aminogruppe
Fall
Sie bauten
Oligonukleotide
am
mit Säuren in
ungünstig,
ein und
aus
Gegenwart
da das Flavin
198
Trägermaterial
BOP Modifikationen in exzellenten Ausbeuten ein
Diese Methode ist in dem
Untersuchung
in
199 die Säure freisetzen. Anschliessend führten sie
diesen Positionen durch Umsetzen der
dem
Greenberg zeigten [504].
von
[504].
dann
für die
des Elektronentransfers nicht starr genug in die
ist.
OCH
OCHq
OCHq
HO^
OH
198
Abb. 37:
199
Bausteine
von
Kahl
Oligonukleotiden [504].
und
Greenberg
zur
nachträglichen
Modifikation
von
Kap.
115
5.6
•
5
Zusammenfassung
Die
Synthese
von
Flavinnukleosiden stellen
Modellverbindungen dar,
die
zu
Vorexperimente
zum
Aufbau
neuartiger
einem besseren Verständnis des Elektronentransfers
in der DNA führen sollen.
•
Phosphoramidite der Flavinnukleoside sind
äusserst
oxidationsempfindlich
und daher
durch
Kupplung
schwer darstell- und handhabbar.
•
Die
nachträgliche
eines
Säurederivats
Desoxyuridin
enthaltender
179
Modifikation des
am
179
eines
Flavins
bildet
Oligonukleotide.
5'-Ende des
Ohgonukleotids
eine
an
die
am
CPG-Träger
Aminogruppe
Ausweichmöglichkeit
Diese Methode ist aber
Ohgonukleotids
befindet.
zur
nur
von
Aminomethyl-2'-
Darstellung
geeignet,
wenn
Flavin-
sich das
116
6
Kap.
Künstliche
6
experimenteller
Ein
Photolyasen:
Ausblick
Einleitung
6.1
komplexen Zusammenspiel
untersuchen.
Erste
Modellverbindungen nachzuahmen
Modellverbindungen
Elektronen-übertragende
[506-508].
wurden
Die
detailhert
gebunden
kovalent
ModeUverbindungen
konnte der Mechanismus der
detailliert untersucht werden. Ausserdem
[eis,syn]-Cyclobutandimere
sogar versucht mit einem
lichtabhängige Reparatur
Photolyase
nachzustellen [512].
möglich ist,
die
Ist dies aber auch in der DNA
sehr
DNA-Photolyase
erkennen
zu
von
Man hat
[510,511].
die
Indole enthielt,
gebundene
durch
Cyclobutandimeren
daraufhin, dass
Diese Arbeiten weisen
Photoreaktivierung
[509].
Arbeiten, in denen versucht wurde, die
der kovalent
Makrozyklus,
und
die
DNA-
prinzipiell
es
nachzuahmen.
Um diese
möglich?
Carell kleine, Kofaktor-enthaltende
stabile und stmkturell klar definierte
mittels
es
mit kleinen Molekülen
Erkennung
von
gibt
und
Kofaktoren
beide
enthalten neben der Dimereinheit sowohl ein Deazaflavin als auch ein Flavin
Anhand dieser
zu
Modellverbindungen synthetisiert,
berücksichtigen
Arbeiten
jüngsten
einem
diesen
versucht,
und
Thyminphotodimere
Uracil- und
an
auf
ein Indol statt eines Flavins als
nur
wurden
[505]. Später
Einheit
in denen ein oder zwei Flavine
enthielten
ahem
vor
Daher wurde
der Kofaktoren beraht.
kovalenten
in
Mechanismus
der
zugmnde,
ein Mechanismus
DNA-Photolyasen liegt
Den
Fragestellung
zu
Modellproteine dargestellt,
Komplexe
mit DNA
zu
untersuchen, wurden
die in der
Lage sind,
Diese Proteine sind
bilden.
und erlauben es, den Kofaktoren kovalent
Festphasensynthese zugänglich
an
das
Peptid zu binden.
6.2
Flavin-haltige Peptide
Carell
et
al.
[513] haben die Flavinaminosäure L-200 dargestellt und
Oligonukleotide
von
201 und 202
der DNA-bindenden
[514,515] abgeleitet,
Bei der
Synthese
der beiden
Peptide
[516].
Eigenschaften
Ala13^)
bis
Bindungsstelle
Das
Bisbromacetylbenzol Templat
DNA-bindenden
des
Region (Ala11^
der seine
Aminosäure L-200 ersetzt
mit dem
eingebaut (Abb. 38).
zu
Die
Sequenz
des
über das
204
203
dieser
Festphase
Peptide
Helix-loop-helix-Motiv
synthetisiert,
um
der über zwei Helices
in
wurde
erkennt.
Leu121 durch die Flavin-
wurde durch
erhöhen. Das Dimer 203
Transkriptionsfaktors MyoD nach,
der
Transkriptionsfaktors MyoD
wurde die Aminosäure
Peptid
an
Dimerisierung
über die
(Abb. 38)
an
von
202
Dimerbildung
ahmt die
die DNA bindet.
die
Bindung
Kap.
117
HoN
201
&XC
HN
H?N-
O^N'-N
.0
ICÄGAG
o
LEÄNAVÄKÄSj^FlARARARAEÄRAEATAAAAÄKARARADÄA,
202
SH
HpN-A ^COOH
N-. M^ ^P
O
Z.-200
Br
Br
I
I
i
y
204
203
Abb. 38: Die Flavinaminosäure L-200 und
Peptide,
die diese Aminosäure enthalten.
6
118
6
Kap.
Reparatur
6.3
Photoschäden mit Flavin-enthaltenden
von
Peptiden
Um
zu
untersuchen, ob die Flavineinheit innerhalb des Transkriptionsfaktor-Fragmentes
mit der eine saubere
funktionsfähige Einheit ist,
eine
und 203
201
Peptide
werden kann, wurden die
126 enthielt.
synthetische Oligonukleotid
DNA-Reparatur durchgeführt
wurden mit Stickstoff
Reaktionslösungen
Die
entgast und bei 4°C mit Tageslicht, oder mit Licht der Wellenlänge 366
Den
wurde EDTA zugesetzt,
Lösungen
Dadurch wird das Flavin in die auch im
wurde
Schaden sehr sauber
Bestrahlungszeiten,
zum
vermutlich die
Abhängigkeit
der
Peptides
und
Arginin-
151 umwandelt
(Abb. 39).
schwanken
mit dem
Oligonukleotid wichtig
mit
nur
Hierbei sind
ist.
Lysin-Phosphodiester Wechselwirkungen
Transkriptionsfaktor-Fragmente
Ergebnis zeigt,
der Salzkonzentration. Dieses
von
Die
Peptid-und Oligonukleotid-
nach verwendeter
je
Die sich bildenden Assoziate sind jedoch noch
Bedeutung.
eingebauten
vollständige Umwandlung benötigt werden,
zwischen einer und mehreren Stunden
dass die Assoziation des
photoreduzieren.
zu
mit dem
126
Oligonukleotid
das
bestrahlt.
nm,
voll reduzierte Form überführt. Es
reparierten Oligonukleotid
die für die
Konzentration und in
die Isoalloxazin-Einheit
Enzym aktive,
201
Peptid
dass das
gefunden,
um
die das
Lösung gegeben,
einer
zu
entscheiden¬
von
unstmkturiert, da ähnliche
Komplexe
definierte
Doppelstrang-DNA
ausbilden können [517].
Obwohl die sich bildenden Assoziate noch unstmkturiert sind, ist
keine
Strangbrüche
Das Resultat eines
(10
Bestrahlung
auftreten wie bei der
von
fast
nach 6 h
Bestrahlung
Die
vollständigen Reparatur.
151
Oligonukleotides
belegte
nach der
gebildet wird und
DNA mit Riboflavin
[518,519].
Abbildung
dargestellt
ist in
langen Bestrahlungsexperimentes
Bedingungen
wird unter diesen
zur
151 sehr sauber
reparierte Oligonukleotid
151, 20 \iM Flavin-Peptid 201). 75% Umwandlung
uM DNA
führt
das
Bestrahlung
während der
bemerken, dass
zu
erhalten.
von
31
126 nach 151
Die weitere
des
unabhängige Synthese
die ausschliessliche
Koinjektion
Bestrahlung
reparierten
Bildung
von
151.
Vorläufige Bestrahlungsexperimente
Oligopeptid
im
Vergleich
zu
mit dem
201 die
Peptid
Reparaturreaktion
substöchiometrischen Konzentration durchführt (1-2
Bestrahlung
Anwesenheit
der
DNA-Lösungen
von
Flavin
enthält,
beobachtet.
wurde
Diese
Flavin-Peptids
unter
zeigen,
und in
ansonsten
\iM Peptid,
Zersetzung
Gegenwart
identischen
Kontrollexperimente bestätigen,
dass
schneller und bei
mit Riboflavin oder mit dem
EDTA findet statt dessen eine
Bei Abwesenheit eines
203
des
des
10
die
diniere
niedrigeren,
|i,M DNA).
Peptid
201
statt.
das kein
Peptids 203,
keine
Bei
ohne die
Oligonukleotides
Bedingungen
dass
das
Reparatur
synthetisierten
Flavin-
Kap.
119
derivatisierten
primitive DNA-Reparatur
und 203
201
Transkriptionsfaktor-Fragmente
eine
Lage sind,
in der
6
Funktion durchzuführen.
151
14h
12.5
10
7.5
Retentionszeit
Abb
39
Darstellung
der fünf
Reaktionspuffer (12
wesenheit
250
20%
mm
20
von
Bestrahlung
10
von
0
h, b. 1 h,
uJVl
(iM Flavin-Oligopeptid
H2O,
0 IM
201
3 h,
pH
d
6 h,
126
Oligonukleotid
7
8)
14
e.
Losung
bei 4°C
in
Lichrosphere C18, 100Â,
Saule
Mobile Phase B: 80%
NEt3/HOAc
NEt3/HOAc. Gradient 0 bis 30%
0.1M
c
5 mM Tns, 5 mM EDTA, 6 mM NaOH,
Mobile Phase A
H2O,
[mm]
HPL-Chromatogramme (a:
wahrend der
gemessen
17.5
15
B
in
30
min.
h)
im
An¬
0 4
x
CH3CN,
Injektionsvolumen
20 ul
6.4 Diskussion
Bis
jetzt
lediglich
wurde die Reversion eines
mit Hilfe des Elektronen
komplexen durchgeführt.
die
Photoschädigung
komplexen
konnte
erzielt werden.
Allerdings
von
einer
DNA führt.
hingegen
Folglich
bemht diese
abgebenden Tripeptides Lys-Trp-Lys
In Fall des
Photoreparatur Strahlung
die
innerhalb eines
Pyrimidindimeren
Tripeptids
Wellenlänge
Mit den
Reparatur
traten in diesen
Reparaturreaktion
m
<
und mit Metall¬
wurde maximal 60% Umsatz erzielt, da
300
nm
benötigte [520],
die DNA interkaherenden
von
DNA-Stranges
Thymidinedimeren
Experimenten
auch keine
auf einer Abstraktion
von
die selber
zur
Rhodium-(III)-
bereits bei 400
Nebenprodukte
Elektronen
aus
nm
auf.
dem
120
6
Kap.
Komplexe die Photospaltung
Somit sind die
der Photodimeren
die ersten
Flavin-Peptide
DNA-Photolyasen bewerkstelligen
Flavinaminosäure als kovalent
künstlicher
DNA-Photolyasen
Mechanismus der
könnten
diese
Fragen
mit
in kovalenten
noch viele
des
Kokristallstmktur
Enzym
während der Reaktion
DNA-Polymerase möglich
6.5
•
ist
zu
Fragen
offen.
dass
werden,
es
Hingegen
Zum Teil
dem
mit
Enzyms
des
Nachahmung
Substrat
wenn es
gelingt,
beobachten, wie dies neuerdings in Kristallen der
[522].51
Zusammenfassung
Carell
zeigte,
dass sich mit der Flavonaminosäure L-200
denen als Kofaktor ein Flavin kovalent
•
einer
Anfang des Designs
in vitro nachzuahmen.
beantwortet werden. Andere können aber erst dann verstanden
das
mit
Modellverbindungen zeigt,
Enzyms
Substraterkennung
einer
vorgestellten Peptide
Kofaktor stehen den
den Mechanismus des
bleiben beim Verständnis der
vollständige Reparatur
lichtgetriebenen Reparaturprozesses
Die
können.
die eine
Der rasante Fortschritt in der
dar.
DNA-Photolyasen
prinzipiell möglich ist,
Verbindungen,
gebundenen
Zink-(II)-Cyclen-
dass
beschleunigen [521].
durch Simulation des
geschädigter Oligonukleotide
der
gezeigt,
Kürzlich wurde ausserdem
DNA-Strang [491,492].
Für
die
Peptide
201
und
203
Photoreduktion mit EDTA in der
Peptide
aufbauen lassen, in
gebunden ist.
konnte
nachgewiesen werden,
Lage sind, Oligonukleotide
zu
dass
sie
reparieren,
nach
die das
Formacetal-verbrückte Photodimer 108 enthalten.
•
51
Die beobachtete
Die
durch.
Arbeitsgruppe
Reparatur ist selektiv und
von
L. Beese führt derzeit
Sie konnte für beide
Allerdings gelang
es
Oligonukleotide
führt
zur
Untersuchungen
mit der
Spaltung des
mit dem
DNA-Polymerase
Photodimers.
Oligonukleotiden
146 und 147
eine Kokristallstruktur erhalten.
nicht, das Photodimer in das aktive Zentrum des Enzyms
zu
bringen.
7
Teil
Experimenteller
Allgemeine
7.1
7
Kap.
121
Arbeitsmethoden
Dünnschichtchromatogramme
wurden auf
60
Fertigplatten Kieselgel
der Firma
F254
Merck, sowie auf Fertigfolien Polygram Sil G/UV 254 der Firma Macherey-Nagel
ausgeführt.
Die Substanzen werden durch
Betrachtung
unter einer
UV-Lampe (254
nm,
nm) sichtbar gemacht und/oder durch Anfärben mit Anisaldehyd-Tauchreagenz
366
(10 ml Anisaldehyd, 10 ml konz. Schwefelsäure, 2 ml Essigsäure in 180 ml Ethanol).
HPL-Chromatographie
Analytische
HPLC
Pumpe 64,
Interface
wurde
auf
Knauer-Anlage (Knauer
einer
box, variabler Wellenlängen Monitor, Entgaser, dynamische
Mischkammer, manueller Injektor, Eurochrom 2000 HPLC Software) sowie auf einer
Merck-Hitachi-Axuage (L-7400 UV-Detektor,
System Manager, D-7500
Data File Conversion
RP HPLC wurden eine CC-250/4
Nucleosil 120-3 RP-18 Säule
wurde eine
mm)
von
Lichrospher
Machery-Nagel
Kieselgel-60 (Korngrösse
und
Reagentien
p.
a.
Lösungsmittel
oder purum
mm) der
0.040-0.063
Roth
Säulenchromatographie
waren
AbdestiUieren
und
Rotationsverdampfer
(13C)),
technischer
Einengen
von
Qualität und
Lösungsmittel
Varian Gemini 300
vor
Gebrauch destilliert.
wurde
vacuo
(!H),
(13C),
202
Klammem sind jeweils die
MHz
(31P)),
(13C)),
bei
Messfrequenz in MHz
chemische
Verschiebung Ô
angegeben.
Die
wurde
(Multiplett) abgekürzt.
einem
(13C),
(200 MHz (*H),
122 MHz
und Bruker AMX-500
(31P)),
(500
MHz
Raumtemperatur aufgenommen.
sowie das
in ppm und die
Multiplizität der Signale
mit
durchgeführt.
(300 MHz (lH), 75 MHz
(400 MHz (lH), 100 MHz
MHz
in
für Extraktionen und
wurden auf den Geräten Varian Gemini 200
Bruker AMX-400
125
wurden
Qualitäten
Fluka, Aldrich, Acros,
Lösungsmittel
der Firma Büchi im Wasserstrahlvakuum
Kernresonanzspektren
50 MHz
stammen von den Firmen
oder Peninsulab.
Der
angegeben.
wurden in den kommerziell erhältlichen
eingesetzt und
Sigma, Novabiochem,
m
verwendet.
(Pressluft, 0.3 bar Überdruck) durchgeführt.
Säulendurchmesser und das Laufmittel werden in Klammem
und
Für Ionenaustausch HPLC
Merck, Flash-Kieûzgel (0.063-0.1 mm) oder Kieselgel-H (Si-H) (0.005-0.040
der Firma Fluka unter Dmck
puriss.
analytische
Für
100-5 RP-18 Säule und eine CC-250/4
Machery-Nagel verwendet.
wurde mit
Module, D-7000 HPLC
Utility) durchgeführt.
1000-8/77 Säule der Firma
Nucleogel Sax
Säulenchromatographie
Firma
L-7000 Interface
wurde mit
s
Lösungsmittel
vermerkt. Die
Kopplungskonstante (J)
(Singulett),
d
In
(Dublett),
t
in
Hz
(Triplett)
Kap. 7
122
Massenspektren
Massenspektren
wurden auf einem
alkohol als Matrix
7000
wurden durch den MS-Service der ETH-Zürich gemessen.
ZA52-5,Lrß-Spektrometer
VG
aufgenommen. ESI-Massenspektren wurden
(Probenkonzentration
Zerstäubergas N2)
10"5M
ca.
MeOH
in
oder
spannung im
M in
(0.1
Es werden die
Reflektron-Modus) aufgenommen.
25
ul/rnin,
wurden auf einem Bruker
M in
bei -20 kV
H2O), Negativ-Ionen-Modus
Finnigan TSQ
Fluss
REFLEX-Spektwm&tev (Matrix: 2,4,6-Trihydroxyacetophenon (0.5
moniumcitrat
3-Nitrobenzyl-
auf einem
MeCN,
MALDI-TOF-Massenspektren
gemessen.
mit
FAB-
/ Diam-
EtOH)
Beschleunigungs¬
wichtigsten Signale
in
m/z Einheiten angegeben, wobei die prozentualen Intensitäten bezüglich des Basispeaks in
Klammem vermerkt sind. Das Molekülion wird dabei mit M bezeichnet.
Infrarotspektren wurden
Die
wurden
Proben
Absorptionen
(stark),
m
als
mit einem Perkin Eimer 1600-FT
wurden in cm-1
(mittel)
und
w
angegeben
Kristallographie
ETH Zürich
wurden
Die
durchgeführt.
Dichroismus
Spektropolarimeter
Prof.
am
Dr. Volker Grämlich
Laboratorium für
experimentellen Details
wurden in offenen
(CD)-Spektren
verwendet.
(sehr stark),
s
Laboratorium
am
Organische
Chemie der
Anhang aufgeführt.
sind im
mit einem Büchi
Kapillaren
Reagentien
stammten
Smp
20
CPG-Träger
getrocknet.
hergestellt.
Synthese
von
von
1.5
(10 |imol-Ansatz heraufgesetzt).
Speed:
geschützte Phosphoramidite
Die
wurden bei Peninsulab
Bandwith
20 nm/min.
mit
stammten von
der natürlichen
normal
bezogen.
geschützten
Die verwendeten
Es wurde Acetonitril der Firma Roth AG mit einem
vor
natürlichen
auf 6 min
1 sec,
J-710
Schichtdicke
nm,
geschützte Phosphoramidite
der
Synthese
24 h über 4
Oligonukleotiden erfolgte
Gerätehersteller entwickelten Protokollen. Für den Einbau
Kupplungszeit
mm
CD, Range: 320-202
Pharmacia.
0.3 ppm verwendet und
Die
Jasco
auf einem Pharmacia Gene-Assembler Plus mit
Standard
von
einem
Es wurden Küvetten mit 10
der BASF AG), Pac
wurden selbst
Wassergehalt unter
erfolgte
Computer.
(Industriespende
Nukleosiden beladenen
auf
5, Sensitivity: 50 mdeg, Response:
Olivetti M 300 Personal
Desoxyribonukleoside
wurden
Data mode
Messparameter:
Oliogonukleotid-Synthese
sieb
von
bei 20°C gemessen.
1.0 nm, Accumulation:
Biorad
vs
Die
gemessen.
Circular
(Hellma)
und nach ihrer Intensität durch
und Dr. Paul Seiler
Schmelzpunkte (unkorrigiert)
Apparat
untersucht.
Substanz)
(schwach) charakterisiert. Schultern wurden mit sh angegeben.
Röntgenstrukturanalysen
für
0.3%
KBr-Presslinge (ca.
Spektrometer durchgeführt.
(1.3 umol-Ansatz)
von
und
Â-Molekular-
nach den
vom
Dinukleosiden wurde die
von
3
auf 20 Minuten
123
UV-Spektroskopie
Die
durchgeführt.
Kap.
wurde auf einem Varian
Cary
5 UV/Vis/NIR
Spectrophotometer
^
wurden im Konzentrationsbereich 0.5
Lösungen
7
OD26O
-
1-0
gemessen.
UV/VIS-Spektren
für
UV/VIS-Spektrophotometer
Transport Accessory
erfolgte
der Firma Varian mit
Schmelzkurven wurden Kuvetten mit 4
(Messvolumen 750
1000
-
mm
ul) sowie 10
320
Schmelzpunkte
im Konzentrationsbereich
bestimmt.
um
ein
mM
(150
Die
von
Lösungen
Schmelzpunkte (Tm)
Messung
zu
Strahlengang
Innendurchmesser und 1
mm
Strahlengang
0.5
von
-
In der
8.0
pJVI
Durch Ableiten des
(zweite Ableitung gleich Null).
wurden
Regel
und in
die
einem Tris/HCl-
Fluka))
von
Dimethylpolisiloxan überschichtet,
verhindern.
wurden
Oligonukleotidkomplexen
von
von
mm
einer
Die Schmelzkurve wurde mit
approximiert.
die
Temperatur
Innendurchmesser und 10
in der Kuvette wurden mit
des Wassers
3E
Messungen mit
NaCl, 10 mM Tris/HCl pH 7.4 (Microselct Qualität
Verdampfen
bestimmt.
|il)
der
Messung
Für
C/min.
Hellma verwendet.
280
Puffer
0.5°
mm
(Messvolumen
-
Die
Der Probenraum wurde während der
Temperaturgradient:
gespült.
Cary
Cary Temperature Controller, Sample
und Multi Cell Block gemessen.
in einer Referenzküvette.
Stickstoff
wurden auf einem
Schmelzkurvenmessungen
erhält
Polynoms
Dieser
Polynomfunktion
den
man
folgendermassen
neunter
Wendepunkt
dem
entspricht definitionsgemäss
Ordnung
der Kurve
Schmelzpunkt
Om).
Thermodynamische
(0.5
Konzentrationen
modifizierte
van
't
Parameter wurden
-
0.8 uM) bestimmten
2
mm:
wurden
Bei einer Schlitzbreite
3.4 nm; 3mm: 5.1 nm)
Bestrahlung
an
Messung
(SW)
Firma Perkin Eimer
(4x 4
mm
Extinktionskoeffizienten
bestimmt
von
durchgeführt.
wurde eine 500
den bei fünf verschiedenen
1-3
Als
mm
(Spex
Duplexes
über die
1680 0.22m double
(Bandbreite: 1
Lichtquelle
Xenon-Lampe
fll
eines
[472].
einem Fluorimeter
wurde eine Osram XBO OFR
verwendet. Zur
aus
Schmelzpunkten
Hoff Gleichung (Kap. 4.4.1)
Bestrahlungsexperimente
Spectrometer)
graphisch
mm:
1.7 nm;
für monochromatische
mit einer
Leistung
Semi Micro Cell Kuvette
aus
von
450 W
Quartzglas
der
Lichtweg) mit Magnetrührer verwendet.
von
Oligonukleotiden
bei
260
nm
wurden
durch
Addition der Extinktionskoeffizienten der einzelnen Basen (A: 15.4, C: 7.4, G: 11.5, T:
8.7, TfT (116): 17.4, UfU (115): 18.9) berechnet.[523]
Die anschliessende Tabelle
enthält die in dieser Arbeit verwendeten Extinktionskoeffizienten:
7
Kap.
124
Tab. 24:
Extinktionskoeffizienten
Nr.:
Sequenz
e26o [OD/(xmol]
126
5-d(CGCGTU=UTGCGC)-3
151
5'-d(CGCGTUfUTGCGC)-3
132
5'-d(CGACGT=TGCAGC)-3'
106
133
5'-d(CGACGU=UGCAGC)-3'
106
134
5
'
-d
(CGACGTfTGCAGC)
93
'
-3
112
'
124
'
136
5'-d(GCTGCAACGTCG)-3'
124
137
5'-r(GCUGCAACGUCG)-3'
125
138
5'-d(CGTATT=TATTCTGC)-3'
120
139
5'-d(CGTATU=UATTCTGC)-3'
120
140
5
'
-d(CGTATTfTATTCTGC)
-3
137
'
142
5'-d(GCAGAATAAATACG)-3'
175
143
5'-r(GCAGAAUAAAUACG)-3'
176
144
5'-d(CGAACGTT=TTCGTTCG)-3'
141
145
5'-d(CCGAACGTTTTCGT=TCGG)-3'
160
146
5'-d(TACT=TGGAGTCAGG)-3'
136
147
5
153
'
-d
(TACTfTGGAGTCAGG)
-3
'
Definitionen:
Unter
der
Beladungsdichte
eines
Nukleotidträgers
Nukleosid, welche pro Gramm Träger kovalent
der
Beladungsdichte erfolgte
abgespaltenen
Bedingungen
Aliquots Träger.
0.1
498
bestimmt. Die
M
diesen
an
des
Menge
p-Toluolsulfonsäure
suspendiert
berechnet sich dann nach
Gewicht
versteht
Temperaturerhöhung bezogen
Temperatur).
man
sauren
x
14.3
auf die minimale
in 5 resp.
bei
Formel:
[umol/l]
[|imol/g]
Einwaage [mg]
die relative
eines
Absorption
folgender
an
Bestimmung
der unter
und die
=
Hyperchromizität
Die
Menge (~5 mg) Träger
OD498nmx Volumen[ml]
Unter der
ist.
gebunden
Dimethoxytriphenylmethyl-Kations
in Acetonitril
Beladungsdichte
Beladungsdichte
jene Menge
man
VIS-spektroskopische Vermessung
Dazu wurde eine genau bekannte
10 ml
nm
über die
versteht
Änderung
Absorption (in
der
UV-Absorption bei
der
Regel
bei tiefster
Sie wird definiert als:
Abs
%Hyperchromizität
(T)
-
Abs(minimal)
x
100 %
Oligonukleotidlösung entspricht
deren
=
Abs(minmal)
Die
optische
einer
Dichte
(OD)
einer
gegebenen Wellenlänge bei
10
mm
Strahlengang. Optische
Absorption
Dichte wird
häufig
bei
auch
als
Oligonukleotid,
In diesem Fall
verwendet.
Mengenbezeichnung
die in 1 ml
gelöst,
die
entspricht
sie
entsprechende UV-Absorption
an
gekennzeichnet.
der Dinukleoside
Synthese
2'-Desoxyuridin
jener Menge
besitzt.
Bekannte Produkte wurden mit der Literaturstelle hinter dem Namen
7.2
7
Kap.
125
53
[421]
O
HO—'
ÖH
53
(50
Uridin
205 mmol,
g,
Molsieb) suspendiert
(50 ml)
1.0
wurde in Acetonitril
eq.)
und mit einer
33%-igen Lösung
Nach
zugetropft.
60°C erhitzt. Das
Zugabe
Lösungsmittel
Bromwasserstoff in
Acetylbromids
des
wurde in
eq)
Â
wurde
wurde für weitere drei Stunden auf
entfernt und der Rückstand in
vacuo
über 4
Essigsäure
671 mmol, 3.3
Acetylbromid (50 ml,
versetzt und auf 50°C erhitzt.
über 2 h
von
(1.25 1, getrocknet
Essigester
(EE) (500 ml) gelöst und mit ges. NaHC03-Lösung (lx 200 ml), mit Wasser (2x
200
ml) und mit ges. NaCl-Lösung (lx
100
extrahiert.
ml)
Phasen
zweimal
Toluol
mit
aus
über
MgS04
eingeengt
wurden
diese
1.6
323 mmol,
eq.)
(1 g) zugegeben und für 3 h auf 110°C erhitzt.
Nacht
abgekühlt.
Hexanphasen
wurde in
Lösungsmittel
(750 ml) gelöst
und mit Hexan
versetzt.
Die
Nach Entfernen des
(2x
100
suspension gegeben
aus
zur
ml) ausgeschüttelt.
Acetonitril
Ethanol
und
wurde über
Die
(3x 250 ml) extrahiert.
ml).
Die
vereinigten
Acetonitrilphasen
eingeengt.
(250 ml) gelöst und
250
gelöst
entfernt und der Rückstand in
vacuo
Der erhaltene Rückstand wurde für 48 h in mit Ammoniak
gerührt.
wurde
Anschliessend wurde
Reaktionslösung
wurden mit Acetonitril rückextrahiert (2x 125
wurden vereint und
Der Rückstand
eingeengt.
AIBN
Acetonitril
vereinigten
und anschliessend bei 60°C in 600 ml Toluol
n-Tributylzinnhydrid (85 ml,
Das
vereinigten wässrigen
Nach Trocknen der
Phasen wurden mit EE rückextrahiert (3x 100 ml).
organischen
Die
Lösungsmittels
Entfernung
Die
von
Hexanphasen
(400 ml)
umkristallisiert.
in
an
Zinnverbindungen
wurden
Die
Lösungsmittel
wurde der Rückstand in Methanol
vacuo
Resten
ml) rückextrahiert.
und das
in
gesättigtem Methanol (750 ml)
vorsichtig
Acetonitrilphase
vacuo
entfernt.
2'-Desoxyuridin
53
mit Hexan
(3x
abdekantiert und mit
wurde
zur
Das erhaltene
Methanol¬
Öl wurde
wurde in Form farbloser
126
7
Kap.
Kristalle erhalten
#f(CHCl3/MeOH 5:1)
0.26.
=
(200 MHz, d6-DMSO): S
H2-C(5'));
1
Aus
der
konnten nach
Mutterlauge
Ethanol nochmals 53
erhalten werden
Schmelzpunkt:
162-163°C. Lit.: 163°C
[416]. *H-NMR
2.04-2.11
2
aus
5%).
10.5 mmol,
g,
mmol, 65%).
und wiederholter Kristallisation
Einengen
(2.4
132
(30.21g,
3.72-3.81
(m,
1
=
(m,
(m,
2
H,
H, H-C(3')); 4.19-4.24 (m, 1 H, H-C(4')); 4.95-5.05 (s, br,
H, OH); 5.20-5.30 (s, br, 1 H, OH); 5.63 (d, 3/
d6-DMSO):
39.3
(C(4')); 86.99 (C(l')); 101.35 (C(5));
5'-0-Pivaloyl-2'-desoxyuridin
76
8.0 Hz, 1
=
6.8 Hz, 1 H, H-C(l')); 7.85 (d, 3/= 8.0 Hz, 1 H,
13C-NMR (50.3 MHz,
3.50-3.60
H2-C(2'));
H,
60.88
(C(6));
140.18
11.29 (s, br, 1 H,
H-C(6));
(C-C(2'));
H, H-C(5)); 6.15 (t, 3/
(C(5'));
150.04
70.02
=
H-N(3)).
(C(3*));
83.72
(C(2)); 162.74 (C(4)).
[422]
O
\O—'
M,
53
2'-Desoxyuridin
auf-20°C
(10.36
g, 45.5
76
mmol, 1.0 eq) wurde in Pyridin (25 ml) gelöst und
Lösungsmittels
in
vacuo
und
Säule mit einem Gradienten
3350 sh,
426
(m,
3189 m,
1399
m,
w.
2
aus
wurde
Nach
zugegeben.
Entfernung
5.60
3044 m,
1277 s,
(d, 37
8.1
d6-DMSO):
DCM/MeOH 50:1 nach DCM/MeOH 50:3
Smp.:
156-157°C.
2967 m,
1168
s,
1728
1110 m,
d6-DMSO):
s
Lit: 154-155°C
1689
(C=0),
gereinigt.
Es
[422].
vs(C=0),
IR
(KBr):
1622 sh,
1080 m, 871 w, 819 w, 760 w, 558 w,
ö= 1.11 (s, 9 H,
=
8.1
(CH3)3CCO);
Hz, 1 H, H-C(5)); 6.10 (t, 3/= 6.7 Hz, 1 H,
Hz, 1 H, H-C(6)); 11.32 (s, br, 1 H,
<5= 26.81
(C(3')); 83.85 (C(4'));
163.25
des
Toluol wurde über eine kurze
2.11-2.15
H, H2-C(2')); 3.87-3.92 (m, 1 H, H-C(3')); 4.12-4.20 (m, 3 H, H-C(4')
(d, 3/=
MHz,
m,
0.23.
!H-NMR: (300 MHz,
H2-C(5'));
7.56
eq)
(3 ml) gequenscht.
zweimahgem Einengen
von
1.1
(11.9 g, 38.9 mmol, 84%) als farblose Substanz erhalten.
Rf (CHCl3/MeOH 10:1):
1454
50.3 mmol,
abgekühlt. Pivaloylchlorid (6.2 ml,
Nach 3 h Rühren bei -20°C wurde mit MeOH
wurde 76
OH
((CH3)3CCO);
84.42
38.21
H-N(3)).
((CH3)3CCO);
u.
H-C(l'));
^onmr. (755
63.95 (C(5')); 70.11
(C(l')); 101.98 (C(5)); 140.46 (C(6)); 150.5 (C(2));
(C(4)); 177.54 ((CH3)3CÇO), (C(2')
(100, MH+), 201 (21,[M-Uracil])+.
verdeckt durch
DMSO). MS (FAB+): 313
Kap.
127
Generelle Vorschrift für die
7.2.1
Das Nukleosid
525 mmol,
(30 ml,
DEAD
bei
Rühren
Dünnschichtchromatographie
Triphenylphosphin (2.65
zugegeben.
Über
Lösungsmittel
wurde in
und mit
H2O (lx
eingeengt
FC
(5
und
aus
eq)
60°C
in THF
(100 ml)
wurde
die
die
wurde
Lösung
von
Reaktion
der
Nach
mittels
Reaktion wurde nochmals
unvollständiger
Reaktionslösung
entfernt und
150
3x
Acetonitril auf 20 g
auf
Rückstand
zum
ml) extrahiert.
Die
abgekühlt.
RT
Das
Et20 (300 ml) zugegeben
wässrigen
Phasen wurden
Das Produkt wurde mittels
Kieselgel aufgezogen.
gereinigt. Typischerweise
500 g, 0-10% MeOH:DCM)
cm,
eq)
zugetropft.
über 2 Stunden
Vollständigkeit
1.5
75 mmol,
g,
auf 60°C wurde eine
Suspension
Essigsäure
mmol, 0.2 eq) und DEAD (1.6 ml, 10 mmol, 0.2 eq)
vacuo
350 ml,
(300 ml) suspendiert.
Triphenylphosphin (19.7
kontrolliert. Bei
g, 10
Nacht
Mitsonobu-Veresterung
wurde in THF
und
eq.)
75 mmol, 1.5
(12 ml,
Stunde
einer
10.5
eq)
Nach Erwärmen der
zugegeben.
wurden
1.0
(50 mmol,
7
wurde die
acetyherte
in 80-85% Ausbeute als farbloses Pulver erhalten.
Verbindung
5'-0-Acetyl-2'-desoxyuridin
77
o
o*\r
Rf (CHCl3/MeOH 10:1)
1378
m,
1274 5, 1234
=
0.41.
sh, 1170
729 w, 601 w, 557 w, 532
CH3CO);
2.15-2.22
H, H-C(4')
6.17 (t, 3J
1 H,
u.
=
(m,
2
H2-C(5'));
Smp.:
m,
>
1100
DMSO);
107.06
145.53
(C(5));
951 w, 815
m,
d6-DMSO):
ÎH-NMR: (200 MHz,
w.
5.44
68.90
(C(6));
271.0941.
1045
<5
=
w,
768 w,
2.06 (s, 3 H,
H, H2-C(2')); 3.91-3.96 (m, 1 H, H-C(3')); 4.16-4.27 (m, 3
(FAB+): 541 (39, M2H+);
271.0930, gef.:
m,
(s, br, 1 H, OH); 5.68 (d, 3J
(d, 3/
=
(C(3'));
155.44
271
75.25
=
(C(5'));
25.63
88.74
HRMS
1.9 Hz, 1 H, H-C(5));
H-C(6));
(COCH3);
u.
(C(2)); 168.14 (C(4));
(100, MH+).
=
7.9 Hz, 1 H,
13C-NMR (50.3 MHz, CDC13): Ô
verdeckt durch
IR: 3419 m, 1694 vs, 1469 m,
(Zers.).
sh, 1089
6.6 Hz, 1 H, H-C(l')); 7.63
H-N(3)).
25
ber.
89.28
175.28
für
11.34
43.79
(C(4')
u.
(s, br,
(C(2'),
C(l'));
(OÇOCH3).
MS
[C11H14N206+H]+:
128
7
Kap.
5'-0~Acetylthymidin
Rf (CHCl3/MeOH 10:1)
2949 w,
2997 w,
=
0.35.
1738 s,
147
Smp.:
-
1406 w,
1442 w,
1478 w,
1136 w,
1200 w,
m,
IR: 3436 s, 3211 w, 3080 w,
150°C.
1660 s,
1115 s,
1269^, 1236
1301 w,
133 w,
[524]
78
1021 w,
1009 w,
1372 w,
961 w,
913 w, 866 w, 842 w, 1100 w, 1067 m, 1044 m, 789 w, 759 w, 729 w, 624 w,
558 w, 487 w, 422
2.07
3 H,
(s,
2.23-2.10
H3CCO);
4.28-4.19 (m, 3 H, H-C(3'),
H-C(l')); 7.45 (s,
d6-DMSO):
17.15
(C(3*)); 88.61,
168.71
307.2
H
1
N
2
88.80
25.63
5.43
(br,
114.77
285.2
MS
H, H3CC(5));
3
OH); 6.20 (t, 3/= 6.8 Hz,
1 H,
(CH3COO);
(C(l'), C(4'));
(s,
H, H2-C(2')); 3.94-3.88 (m, 1 H, H-C(4'));
43.57
1
H,
13C-NMR (50 MHz,
(C(2')); 68.93 (C(5'));
75.28
(C(5)); 140.93 (C(6)); 155.47 (C(4));
(FAB+): 591.4 (3, M2Na+); 569.4 (12, M2H+);
(100, MH+). Anal. ber. für C12H16N206 (284.27): C 50.70,
9.85; gef.: C 50.74, H 5.63, N 9.83.
Generelle Versuchsvorschrift
7.2.2
1.81
H, H-C(6)); 11.33 (br, 1 H, H-N(3)).
(C(2)); 175.25 (CH3COO).
5.67,
(m,
H2-C(5'));
(CH3-C(5));
(61, MNa+);
d6-DMSO):
iH-NMR (200 MHz,
w.
Einführung
zur
der
Methylthiomethylgruppe
Das
(26 ml)
Argon
und
stehen
(100 ml)
100
vacuo
gelassen.
Die
Lösung
ml) gewaschen.
Das
Die
Nach
und für 2
gerührt.
organische
Trocknung
Rohprodukt
Tage
wurde mit eiskalter
und eine Stunde
extrahiert.
entfernt.
werden.
(17 mmol, 1.0 eq) wurde in DMSO (36 ml), Acetanhydrid
Essigsäure (8.25 ml) gelöst
versetzt
(3x 100 ml)
(4x
Nukleosid
5'-geschützte
Die
Phase
über
Raumtemperatur
unter
Natriumhydrogencarbonatlösung
wässrige
wurde
MgSÛ4
konnte direkt in
bei
die
Phase
wurde
anschliessend
wurde das
mit
mit
EE
Wasser
Lösungsmittel
in
Kupplungsreaktion eingesetzt
Kap.
129
3'-0-Methylthiomethyl-5'-0-pivaloyl-2'-desoxyuridin
7
79
0
HN'
Zur
Charakterisiemng
und 79 als leicht
chromatographisch (FC:
wurde
gelbliches Öl (3.65
10.1
g,
EE/EE 1:2
—>
EE/EE
1:1) gereinigt
mmol, 58% eines 17.3 mmol-Ansatzes)
erhalten.
R{ (CHCl3/MeOH 10:1):
1109 m,
1072 m,
3044 w, 3187
1
w.
(m,
4.28
(m,
1 H,
H-C(4'));
1
1168 m,
(KBr): 426
1211m, 1399
w,
m,
558 w, 759 w,
819 w,
867 w,
1454 m, 1692 vs, 1727 s, 2915 w,
*H-NMR (400 MHz, CDC13): ö= 1.23 (5, 9 H, (CH3)3CCO); 2.04-
H, H2a-C(2')); 2.14 (s, 3 H, SCH3); 2.51-2.57 (m, 1 H, H2b-C(2')); 4.22-
2.10
OCH2bS);
IR
0.37.
2
H,
5.75
H-C(3'), H2a-C(5')), 4.32-4.37 (m,
4.60
(d,
2/ab=
1 H,
H, H2b-C(5')); 4.41-4.47 (m,
OCH2aS);
11.8 Hz, 1 H,
(d, 3/= 8.1 Hz,
1
4.69
H-C(5)); 6.22 (dd, 3J
(d,
=
2Jab=
7.0 Hz,
11.8 Hz, 1 H,
3J
=
6.2 Hz,
H, H-C(l')); 7.51 (d, 3/= 8.1 Hz, 1 H, H-C(6)); 9.39 (s, br, 1 H, H-N(3)).
NMR
(100.6 MHz, CDC13): ö=
38.77
((CH3)3ÇCO);
85.56 (C(l'));
102.54
63.50
(C(5'));
(SÇH3);
27.13
(0-ÇH2-S);
73.82
((CH3)3CCO);
75.13
(C(3'));
37.77
(C(2'));
82.23
(C(4'));
(C(5)); 139.07 (C(6)); 150.22 (C(2)); 163.37 (C(4));
((CH3)3CÇO). MS(FAB+):
HRMS ber. für
13.71
745
(43, M2H+),
373
13C-
177.94
(96, MH+), 261 (100, [M-Uracil]+).
[C16H24N206S+H+]: 373.1433, gef.:
373.1426.
5'-0-Acetyl-3'-0-methylthiomethyl-2'-desoxyuridin
80
O
wurde
Zur
Charakterisiemng
ein
farbloses, klebrige Substanz (7.22 g,
erhalten.
chromatographisch (FC:
22
Tol/EE
2:3) gereinigt und 80 als
mmol, 71% eines 31 mmol Ansatzes)
Kap.
130
7
0.63.
Rf (CHCl3/MeOH 10:1):
122 w,
678 w,
161
IR
(KBr):
1272 m, 1378 m, 1461 m,
1617
sA, 1689
w,
1233 m,
1111m,
1070 m,
1044 m,
967 w,
811 w,
w,
550 w, 600 w, 633
528 w,
417 w,
1744 s, 2922 w, 3067 w, 3222
V5,
w.
1H-NMR (200 MHz, CDC13): <5= 2.05-2.20 (m, 1 H, H2a-C(2')); 2.14 (s, 3 H, SCH3);
2.17
H,
3
(s,
H2-C(5')),
(d,
2/ab=
2.47-2.59 (m, 1 H,
CH3CO);
4.40-4.46 (m, 1 H,
H-C(4'));
OCH2S);
12.0 Hz, 1 H,
5.78
H2b-C(2'));
(d, 3/=
2/ab=
(d,
4.63
4.23-4.38 (m, 3 H,
12.0
H-C(3'),
Hz, 1 H, OCH2S); 4.70
H-C(5)); 6.24 (t, 3J
8.3 Hz, 1 H,
6.6
=
Hz, 1 H, H-C(l')); 7.52 (d, 3/= 8.3 Hz, 1 H, H-C(6)); 8.8 (s, br, 1 H, H-N(3)).
331
(FAB+): 661 (37, M2H+),
[MH-C4H4N202]+).
MS
(100, MH+), 253 (22, [MH-HOCH2SCH3]+), 219 (37,
HRMS ber. für
331.0973.
[C13H18N206S+H]+: 331.0964, gef.
5'-0-Acetyl-3'-0-methylthiomethylthymidin
81
o
Zur
wurde
Charakterisiemng
Tol/EE
3:2) und
81 als
gelbes Öl (16.931
Rf (CHCl3/MeOH 10:1)
aufgenommen):
1272 m,
3419
3057 w,
m,
g,
<
m,
1.92
(s,
3
1005 m,
910
0.69.
=
1694 5,
1737 m,
1025 m,
500g,
cm,
93% eines 53 mmol Ansatzes) erhalten.
0.72; R{ (CHCl3/Aceton 1:1)
1231m, 1048
(300 MHz, CDC13):
3
=
5
säulenchromatographisch gereinigt (FC:
IR
1467 w,
w,
821 w,
(wurde als
Film
1435 w,
1372 w,
761
!H-NMR
w.
H, H3C-C(5)); 2.04-2.09 (m, 1 H, H2a-C(2')); 2.12 (s,
H, H3CCO); 2.13 (s, 3 H, H3C); 2.49-2.41 (m, 1 H, H2b-C(2')); 4.22-4.19 (m, 1 H,
H-C(4')); 4.42-4.38 (m,
11.8 Hz, 1 H,
OCH2aS);
H2-C(5'));
2 H,
4.68
(d,
2Jah
=
4.70-4.57
11.8
(m,
Hz, 1 H,
1 H,
2Jah
H-C(3')); 4.59 (d,
OCH2bS);
6.24
(dd, 3J
Hz, 3/= 6.2 Hz, 1 H, H-C(l')); 7.26 (s, 1 H, H-C(6)); 9.38 (5, 1 H, H-N(3)).
NMR
(14),
13c.
(C(2'));
(C(3')); 75.81 (OCH2S); 82.12, 85.49 (C(l'), C(4'));
111.47
(C(5)); 135.20 (C(6)); 150.62 (C(4)); 164.10 (C(2));
689.2
7.5
37.60
(75 MHz, CDC13): 12.70 (CH3); 13.84 (CH3);
63.97 (C(5')); 74.10
=
=
20.89
170.70
(CH3COO);
(CH3ÇOO).
MS
(FAB+):
(19, M2H+), 367.0 (13, MNa+), 346.0 (17), 345.0 (91, MH+), 267.1 (37), 220.1
219.1
345.1108.
(100).
HRMS
(FAB+):
Ber. für
[C14H20N2O6S+H]+: 345.1120, gef.:
Kap.
131
Formacetalacceptoren
der
Darstellung
7.2.3
5'-0-Trityl-2'-desoxyuridin
7
83
[427]
o
£
O-h
53
(4.56
abs.
g, 20
in
mmol, 1.0 eq) und Tritylchlorid (6.13 g, 22 mmol, 1.1 eq) wurden in
ml) zugegeben
und für eine halbe Stunde
75
(3x
Wasser
und
ml)
MgS04 getrocknet.
Die
mit
Methylenchlorid (5 ml) gelöst
=
0.43.
3227 m, 3055 m, 1707
1088 m,
7488 m, 697
H, H2-C(2')
m,
u.
4.58 (m, 1 H,
und mit
Diethylether (20 ml)
wobei
Smp.:
83
wurde
und mit
und
gewaschen
über
Der Rückstand wurde in
Diese
verdünnt.
als farbloses Pulver
s
Lit.: 201-203°C
203-204°C.
(C=0), 1665
1042 m,
s
1001m,
631 w, 522
w.
(C=0), 1470
960 w,
Lösung
(6.79
g,
[427].
IR
(KBr):
3330 m,
1441 m, 1365 w, 1214 m,
m,
905 w,
'H-NMR (300 MHz,
873 w,
CDC13): Ô
814 m,
=
7769 m,
2.32-2.46 (m, 3
OH); 3.46-3.48 (m, 2 H, H2-C(5')); 4.02-4.04 (m, 1 H, H-C(3')); 4.53-
H-C(4')); 5.39 (d, 3/= 8.1 Hz, 1 H, H-C(5)); 6.31 (t, 3/
H-C(l')); 7.24-7.42 (m, 15 H, ArH), 7.77 (d, 3J
1 H,
Lösungsmittel
72%) ausfiel.
i?f(EE/H 3:1)
1118 m,
Das
(50 ml)
eingeengt.
Phase wurde
(11) eingetropft,
wurde in eiskaltes Hexan
14.4 mmol,
NaCl-Lösung
ges.
organische
gerührt.
Methylenchlorid (300 ml) aufgenommen
entfernt und der Rückstand in
vacuo
Es wurde
Raumtemperatur gerührt.
und für 40 Stunden bei
Pyridin (25 ml) gelöst
Methanol (1
-
=
8.1 Hz, 1 H,
=
6.2 Hz, 1 H,
H-C(6));
8.88
(s, br,
H-N(3)). 13C-NMR (75.5 MHz, CDC13): <5= 41.25 (C(2'V); 63.14 (C(5')); 71.52
(C(3')); 85.16 (C(4')); 86.07 (C(l'));
128.91
(Ar-CH),
140.41
(FAB+): 493 (MNa+, 4),
(470.52):
C
(C(6));
471
87.83
143.47
(CPh3),
(Ar-C);
102.47
150.5
(M+, 10), 243 (Ph3C+, 100).
(C(5)); 127.74
u.
128.32
(C(2)); 163.45 (C(4)).
Anal. ber. für
u.
MS
C28H26N205
71.48, H 5.57, N 5.95, O 17.00; gef.: C 71.33, H 5.38, N 5.85.
132
7
Kap.
84
3'-0-Benzyl-5'-0-trityl-2'-desoxyuridin
O
HÛ
6
0
0
83
(5.0
Suspension
einer
gegeben
und unter
Durch
gerührt.
wurde in abs. THF
55% in
62 mmol, 5.2 eq.,
g,
für
Argon
15.4
Benzylbromid (1.5 ml,
bei RT
eq.)
Tetrabutylammoniumiodid (50
von
Natriumhydrid (2.9
0°C
1.0
12.4 mmol,
g,
b
-
1 h
(25 ml) gelöst
Mineralöl)
von
ges.
und
bei
über Nacht
NaHC03-Lösung (1 ml)
wurde die
Reaktionslösung
wurde in
Die
und Wasser
NaHC03-Lösung (50 ml)
gegossen, mit ges.
eq.)
(25 ml)
in abs. THF
mmol, 1.2 eq.) zugegeben. Die Lösung wurde
langsames Zugeben
Methylenchlorid (200 ml)
0.01
mmol,
zu
Nach Abkühlen auf -20°C wurde
gerührt.
heftiger Gasentwicklung gequenscht.
Reaktion unter
0.13
mg,
vorsichtig
und
(50 ml) gewaschen. Nach Trocknen über MgS04 wurde das Lösungsmittel entfernt und
Dieser wurde in
ein oranger Schaum erhalten.
79.7%)
R{ (EE/H 3:4)
1710
727
=
sh, 1690
w,
699
m,
als farbloses Pulver
0.25.
vs
(C=0), 1489
632
1
1
IR
(KBr): 3200
1448 m,
'H-NMR (200 MHz,
w.
C(2')); 2.53-2.63 (m,
w,
Diethylether
Dabei fällt 84
(5.5g,
aus.
88-90°C.
Smp.:
mit
gelöst,
(700 ml) langsam eingetropft.
verdünnt und in eiskaltes Hexan
9.8 mmol,
DCM
wenig
w,
1377 w,
3057 w, 2933 w, 2867 w,
1272 m,
CDC13): <5
=
1194 w,
2.13-2.26
(m,
1074 m,
1
H, H2a-
H, H2b-C(2')); 3.44-3.46 (m, 2 H, H2-C(5')); 4.17-4.22 (m,
H, H-C(4')); 4.31-4.38 (m, 1 H, H-C(3')); 4.46-4.62 (AB-Muster, 2/= H.8 Hz, 2
H,
PH-CH2),
1 H,
5.37
(dd, 3J
=
20
H-C(l')); 7.29-7.39 (m,
(5, br,
1 H,
(C_H2Ph);
137.47
=
2.1 Hz 1 H,
H, Ar-H), 7.79 (d, 3J
71.67 (C(5')); 77.82 (C(3')) verdeckt durch
(BnC);
140.23
102.34
(TrC);
(FAB+): 583 (11, MNa+),
C35H32N205 (560.66):
H-C(5));
=
C
(C(5)); 127.63
143.37
561
u.
(C(6));
(23, MH+),
127.88
150.17
243
=
CDC13);
u.
(t, 3J
6.33
7.9 Hz, 1 H,
13C-NMR (50.3 MHz, CDC13): Ô
H-N(3)).
(C(l')); 87.64 (CPh3),
4.99.
7.9 Hz, 47
=
6.4 Hz,
H-C(6));
8.44
38.50
(C(2')); 63.30
84.18
(C(4')); 85.32
128.20
u.
128.84
(C(2)); 163.03
(Ph3C+, 100).
(Ar-CH);
(C(4)).
Anal.
ber.
MS
für
74.98, H 5.75, N 5.00, O 14.27; gef.: C 74.72, H 5.72, N
Kap.
133
3'-0-Benzyl-2'-desoxyuridin
7
[525]
82
o
HO-^
O
b
82
84
(5.9 g,
Triflouressigsäure (12 ml)
farbloser
Hexan
1.0
10.5 mmol,
war
die Reaktion
abgeschlossen
mit
und ein
Der Filterkuchen wurde mit
der abfiltriert wurde.
und im Hausvakuum bei 45°C
und
gelöst
Es wurde 82
getrocknet.
(2.47 g,
mmol, 74%) als farbloses Pulver erhalten.
7.8
Rf (EE)
=
0.27.
Smp.:
185-186°C.
3089 w,
3038 m,
1394
1324 w, 1274 m,
m,
2911 w,
Lit: 186°C
2866 w,
1265
m,
1700
1206
860 w, 763 w, 704 w, 560 w, 531 w, 442
2.03-2.19
H,
(36 ml)
n-Butanol
in
Nach 1 h
versetzt.
Niederschlag ausgefallen,
gewaschen
wurde
eq.)
[525].
w.
(C=0),
vs
1178
w,
IR
w,
(KBr): 3503
1684
vs
1102 m,
w,
3144 w,
(C=0),
1466 m,
!H-NMR (200 MHz,
d6-DMSO):
(m, 1 H, H2a-C(2')); 2.24-2.38 (m, 1 H, H2b-C(2')); 3.52 (d, V
4.00-4.06
H2-C(5'));
(m,
1
H,
H-C(4'));
(dd, 3J
5.09 (s, br, 1 H, OH), 5.64
2 H,
CH2Ph)
6.12
(dd, 3/= 5.8 Hz, 3/=
7.9 Hz, 1 H,
4.12-4.18
=
8.1
(m, 1 H,
Hz, 4/
=
1046
1073 m,
=
m,
8
=
3.5 Hz, 2
H-C(3')); 4.51 (s,
2.1 Hz, 1 H,
H-C(5));
H-C(l')); 7.27-7.39 (m, 5 H, ArH), 7.84 (d,
3/= 8.1 Hz, 1 H, H-C(6)); 8.44 (s, br, 1 H, H-N(3)).
13C-NMR (50.3 MHz, CDC13):
S= 36.60 (C(2')); 61.55 (CH2Ph); 70.09 (C(5')); 78.97 (C(3')), 84.31 (C(4')); 84.88
(C(l')); 101.95 (C(5)); 127.60
(C(6));
207
150.58
u.
127.66
(C(2)); 163.21 (C(4)).
(79, [M-Uracil]+).
MS
Anal. ber. für
u.
128.39
(Ar-CH);
138.27
(BnC); 140.52
(FAB+): 583 (11, MNa+), 319 (89, MH+),
C16H18N205 (318.33):
8.80, O 25.13; gef: C 60.41, H 5.51, N 8.74.
C
60.37, H 5.70, N
Kap.
134
7
Darstellung
3'-0-Acetyl-5'-0-trityl-2'-desoxyuridin
von
85
[427]
o
53
2'-Desoxyuridin
DIEA
(6.2 ml,
40
(8.3
g, 36
mmol,
mmol, 1.0 eq.) wurde in Pyridin (20 ml) gelöst und mit
1.1
eq)
Tritylchlorid (13
versetzt.
wurde in mehreren Portionen über 2 Stunden
Reaktionslösung
wurde die
Das
eingetropft.
ölige Präzipitat
eingeengt,
Aceton
mit Aceton
um
g, 31
wurde
d6-DMSO):
(2 1)
Rückstand
Der
Gradient: EE/HE 1:2 nach
Für die
aus
wurde
Es wurde 85
2:1).
Schmelzpunktbestimmung
=
0.24.
Smp.:
*H-NMR (200 MHz,
198-201°C Lit.: 195-196°C [427].
5= 2.01 (s, 3 H, COCH3); 2.30-2.40 (m, 2 H, H2-C(2')); 3.17-3.35 (m, 2
H2-C(5'),
H-C(3'));
verdünnt und in Eiswasser
Benzol/Cyclohexan umkristallisiert.
Rf (EE/HE 1:1)
H,
eq)
Nach Rühren über Nacht
entfernen.
mmol, 86%) als farbloses Pulver erhalten.
aus
1.3
abfiltriert, in Aceton gelöst und dreimal
zu
säulenchromatographisch gereinigt (FC:
(16
(250 ml)
wurde
Wasser
zugegeben.
47 mmol,
g,
unter
5.44
DMSO); 4.00-4.10 (m,
(d, 3/=
7.23-7.34 (m, 15 H,
1
H,
H-C(4'));
H-C(5)); 6.12 (t, 3J
7.9 Hz, 1 H,
ArH); 7.85 (d, 3J
=
7.9 Hz, 1 H,
~
5.15-5.28
7.0 Hz,
H-C(6));
11.35
1
(m,
H,
1 H,
H-C(l'));
(s, br, 1 H, H-
N(3)).
3'-0-Acetyl-2'-desoxyuridin
87
[427]
O
!*)
HO^
O
^
87
85 (15.4 g,
30
refluxiert erhitzt,
Niederschlag.
mmol,
dann
Die
1.0
eq.)
auf Eis
Suspension
wurde in
(500 g)
80%-iger Essigsäure (200 ml)
gegossen.
Es
bildete
sich
wurde durch Celite filtriert und das
für 10 min
ein
gelblicher
Lösungsmittel
bei
Kap.
135
40°C in
vacuo
Der Rückstand wurde zweimal
entfernt
Es kristallisierte 87
EE/MTBE umkristallisiert.
Substanz
(7
g,
Aceton
aus
26
eingeengt
aus
farblose
als
87%)
mmol,
und
aus.
i?f(CHCl3/MeOH 10:1):
0.26.
MHz, CDC13): 8
(s,
2.01
=
Lit: 187°C
188-191°C
Smp.:
iH-NMR (200
[427].
H, COCH3); 2.30-2.40 (m, 2 H, H2-C(2')); 3.17-3.24 (m,
3
2H, H2-C(5')); 4.0-4.1 (m, 1 H, H-C(4')); 5.2-5.3 (m, 1 H, H-C(3')); 5.44 (d, 3J
7.9 Hz, 1 H,
H-C(5)); 6.12 (t, 3J
H-C(6)); 11.35 (s,
35.01
6.8 Hz, 1 H,
~
(C(6));
3'-0-Acetylthymidin
=
7.9 Hz, 1 H,
82.37
(C(4*));
83.07
(C(l'));
(C(5));
100.43
(C(4)); 168.42 (OCOCH3).
161.47
(C(2));
148.89
H-C(l')); 7.60 (d, 3J
=
H-N(3)). 13C-NMR (50.3 MHz, CDC13): 0= 19.01 (COÇH3);
1 H,
(C(2')); 59.77 (C(5')); 73.00 (C(3'));
138.58
7
88
HO
^-•w°
{
88
Thymidin
4 (0.5 g,
Tritylchlorid (0.67
g,
Ar bei RT über 15 h
(0.75 ml,
4.8
mmol,
2.1
2.3
und
auf Eis
den Kühlschrank
gestellt.
Nach
gegeben
Reinigung
und über 5 h
versetzt und unter
Reaktionslösung Acetanhydrid
gerührt.
Stunde
zum
Sieden
Pyridin
wurde
80%-iger
AcOH
Das
erhitzt.
Danach
wurde
die
und über Nacht in
wurde abfiltriert und die
Lösung eingeengt.
Der
(1
=
Niederschlag
cm,
100 g, Tol/EE/MeOH
64% über drei
(380 mg,
R{ (CHCl3/MeOH 10:1)
zur
und mit
(100 ml) gegossen (gelblicher Niederschlag)
mittels FC
als farbloses Pulver
Pyridin (3 ml) suspendiert
Der resultierende Rückstand wurde mit
eine halbe
Reaktionslösung
wurde in
Anschliessend wurde
gerührt.
mmol, 2.2 eq)
versetzt
eq)
mmol, 1.1 eq) und Hünig-Base (0.1 ml)
azeotrop mit Wasser entfernt.
(20 ml)
1.0
0.37.
Stufen)
Smp.: 164-167°C,
3:3:0.1) wurde das Produkt 8 8
erhalten.
Lit: 176°C.
IR: 3474 m, 3189 m,
3117 w, 3078 m, 3030 w,
2922 w, 2898 w, 2826 w, 2360 m,
1476 m, 1464 m,
1408 m,
1440 w,
1367 m, 1336 w,
1306 m,
1709 5,
1664 5,
1288 m,
1256 5,
1200 m, 1128 m, 1098 s, 1061 m, 1022 m, 983 m, 956 m, 938 w, 883 w, 833 w,
789 w, 111
w,
674 w, 650
(200 MHz, d6-DMSO):
(m,
2 H,
1.79
w,
(s,
3
H-C(2')); 3.65-3.63 (m,
626
w,
602 w, 567 w, 495 w, 430
w.
iH-NMR
H, H3C-C(5)); 2.08 (s, 3 H, H3CCOO); 2.40-2.12
2
H, H2-C(5')); 4.00-3.98 (m, 1 H, H-C(4')); 5.25-
136
Kap.
7
5.22
(m,
2 H, OH,
H-C(3')); 6.20 (dd, 3/= 6.2 Hz, 3J
(s, 1 H, H-C(6)); 11.34 (s,
(ÇH3-C(5));
21.04
171.05 (COO). MS (FAB+): 591.3 (2,
5.67, N 9.85; gef.: C 50.53, H 5.63,
des Formacetaldonors und (7.8 mmol,
Entfernung
von
Wasser in trockenem Acetonitril
THF
(60 ml) gelöst,
gerührt
das in
und auf 0°C
unter
Argon
Kupplungskomponenten gegeben.
die
Reaktion
sulfatlösung (50 ml),
gewaschen.
Diese
versetzt.
1.2
Lösung
Die
wurde
MgS04
THF
(4Â,
wurde in abs. THF
zu
den beiden
Nach drei Minuten
rot.
wurde
filtriert
und
und mit Wasser
(100 ml)
eingeengt.
R{ (Tol/EE 1:5):
0.23.
Smp.:
89
er
EE/HE wurde 89
Elementaranalyse
mit
Phase wurde mit 1 M Natriumthio-
b
89
Pulver erhalten. Zur
g)
Cr
o\
aus
0.8
ob
o
Ij
Durch Umkristalhsation
(2x
Öl in abs.
5'-0-Pivaloyl-2'-desoxyuridyl-3',5'-methylen-3'-benzyl-2'-desoxyuridin
A
wurden
Acceptors
wurde sofort
Reaktionslösung
organische
eq)
Lösung
Bicarbonatlösung (100 ml)
Nach Trocknen über
des
ml) und in abs.
100
(2x
Dabei färbte sich die
verdünnt. Die
mit ges.
50.70, H
C
Dinukleoside
l.eq)
(2.14 g, 9.5 mmol,
abgeschlossen.
Methylenchlorid (200 ml)
(100, MNa+);
über aktiviertem Molekularsieb
für 1 h
NIS
abgekühlt.
307.1
entfernt wurde. Anschliessend wurde das
vacuo
(28 ml) gelöst und mit TfOH (50 |il)
war
M2H+);
N 9.85.
eq.)
ml) aufgenommen,
(C(3')); 85.23,
C12H16N206 (284.27):
1.2
(9.5 mmol,
50
569.3 (9,
12.61
(C(4)); 163.92 (C(2));
150.70
Darstellung Formacetal-verknüpfter
7.2.4
zur
M2Na+);
Anal. ber. für
(82, MH+); 284.1 (12, M+).
d6-DMSO):
74.83
(C(5'));
(C(l'), C(4')); 114.65 (C(5)); 136.51 (C(6));
86.15
285.1
62.71
37.25 (C(2'));
(Ç_H3COO);
H-C(l')); 7.75
8.3 Hz, 1 H,
13C-NMR (50 MHz,
H, H-N(3)).
1
=
(3.91
g,
wurde nochmals
118-119°C.
IR
6.1 mmol,
aus
78%) als farbloses
Ethanol umkristallisiert.
(KBr): 3411
w,
3167 sh,
2975 m,
2811 w, 2699 vs, 1622 w, 1464 m, 1433 w, 1384 m, 1278 m, 1260 m, 1161 w,
1125 m,
1099 m,
IH-NMR (500 MHz,
1066 m,
894 w,
d6-DMSO):
834 w,
702 w,
8= 1.12 (s, 9 H,
633 w,
(CH3)3CCO);
556 w,
533
vw.
2.16-2.26 (m, 2 H,
137
H2a-C(A2'), H2a-C(B2'));
2
7
3.65-3.70 (m,
H2b-C(A2'), H2b-C(B2'));
H, H2-C(B5')); 4.11-4.15 (m, 3 H, H-C(B3'), H-C(A4'), H-C(B4')); 4.16-4.20 (m,
H2-C(A5'));
2H,
3/5.6
( 2 d,
=
8.1
4.73-4.76 (AB-Muster,
Hz,
8.1 Hz, 1 H,
=
d6-DMSO):
13C-NMR (125.8 MHz,
36.57
(C(2')); 38.19 ((CH3)3ÇCO); 63.76
79.02
(C(3')), 81.65
C(6));
u.
150.30
u.
1928
(FAB+):
82.53
u.
OCH20);
C^H^N^!! (642.67):
57.94,
C
=
u.
u.
26.79
5.63
5.64
u.
3J5_6
((CH3)3CCO);
84.60
H-
H-N(A3),
36.07
94.36
(C(l'));
(C(2'));
u.
(0-£H2-0);
137.96 (Ar-C); 140.19 (2x
u.
162.99 (C(4)); 177.18
5.96, N 8.72; gef.: C 57.86,
H
8.1
=
(C(5')); 70.25 (CH2Ph); 76.78
128.24
u.
11.34 (s, 2 H,
MS
((CH3)3CÇO).
(30, M2H+), 643 (100, MH+).
1285
M3H+),
8
68.17
u.
127.54
u.
150.38 (C(2)); 162.97
(3,
7.1 Hz, 2 H,
H-C(6));
84.37
(C(4'));
127.51
(C(5));
102.02
=
H-C(l')); 7.25-7.35 (m, 5 H, ArH); 7.58 (d,
3J5_6
Hz, 1 H, H-C(6)); 7.66 (d,
101.96
2Ja_h
11.9
H, H-C(A5), H-C(B5)); 6.09 CT, 1 H, H-C(l')), 6.13 (dd, 3J
2
6.0 Hz, 3/= 8.2 Hz, 1 H,
N(B3)).
%_h=
4.26-4.30 (m, 1 H, H-C(A3')); 4.49-4.55 (AB-Muster,
OCH2Ph);
Hz, 2 H,
=
2.31-2.35 (m, 2 H,
Kap.
H
Anal.
ber.
für
6.01, N 8.63.
5'-0-Pivaloyl-2'-desoxyuridyl-3',5'-methylen-3'-acetyl-2'-desoxyuridin 90
Aus einem 27 mmol-Ansatz wurde 20 g
Erhitzen
gelöst
kristallisierte 90
eingeengt
wurde.
(6.6
Beim Abkühlen wurde
11.1 mmol,
und über eine Säule
wurde nochmals 90
nochmals
g,
aus
0.38.
2977 m, 2809 w, 1704 sh
954
w,
1397 m,
DCM/Aceton 8:1 nach
1380 5,
149°C.
Smp.:
1263 5,
Zur
aus.
unter
Es
Das Filtrat wurde
1:1) gereinigt.
Hieraus
Elementaranalyse
IR
wurde
1162 m,
3430 w, 3169 m, 3100 m,
(KBr):
vs
1124 m,
(C=0), 1618
1098 5,
(s,
(m, 4H, H-C(A2'), H-C(B2'));
9
1470 m,
m,
1050 5,
890 w, 836 m, 766 w, 640 w, 558 w, 640 w, 558 m, 446
1.10
(300 ml)
umkristallisiert.
(C=0), 1729 sh (C=0), 1746
(300 MHz, d6-DMSO): 8=
2.31
41%) als farbloses Pulver
(Si-H,
Aceton/Cyclohexan
das in EE
Cyclohexan (200 ml) zugegeben.
(4.2 g, 7.1 mmol, 27%) erhalten.
R{ (Aceton/CHCl3 1:1):
1436 w,
Rohprodukt erhalten,
m.
1004 w,
iH-NMR
H, (CH3)3CCO); 2.03 (s, 3 H, CH3CO); 2.22-
3.70
(d, 3J
=
3.5 Hz, 2 H,
H2-C(5'));
4.10-4.20
(m, 4 H, H2-C(5'), H-C(A4'), H-C(B4')); 4.22-4.30 (m, 1 H, H-C(A3')); 4.74 (AB-
Kap.
138
7
Muster, 2/-7.3 Hz, 2 H, OCH20); 5.10-5.18 (m, 1 H, H-C(B3')); 5.63 ( "t", 2 H,
H-C(A5), H-C(B5)); 6.05-6.15 (m,
H, H-C(l')); 7.57 (d, 3J
2
7.65 (d, 3J= 8.1 Hz, 1 H, H-C(6)); 11.35 (s, 2 H, H-N(A3), H-N(B3)).
(125 MHz, d6-DMSO): 8
=
H-C(6));
8.1 Hz, 1 H,
=
iH-NMR
20.68; 26.73; 36.00; 36.50; 38.13; 63.72; 67.77; 74.23;
76.65; 81.64; 82.36; 84.12; 84.56; 94.23; 101.89; 102.11; 140.03; 140.13; 150.22;
150.31; 162.87; 162.90; 169.87; 177.11.
(FAB+): 1189.2 (35, M2H+), 595 (100,
MS
MH+). Anal. ber. für C26H34N4012 (594.58): C 52.52,
5.76, N 9.42, O 32.29; gef:
H
C 52.47, H 5.97, N 9.45.
5'-0-Acetyl-2'-desoxyuridyl-3',5'-methylen-3'-acetyl-2'-desoxyuridin
A
o
ob
"f\
(r
Cr
^O
N
N
Aus einem 8.0 mmol-Ansatz wurde 5.4 g
Rohprodukt erhalten,
(100 g SiO2-60, EE/MeOH 100:1 nach 100:5) gereinigt
7.6 mmol, 94%) als farblose Substanz erhalten.
aus
91
Zur
wurde.
das über eine Säule
Es wurde 91
Elementaranalyse
(4.2 g,
wurde nochmals
Ethanol umkristallisiert.
0.59.
Rf (EE/MeOH 10:1):
Rf (Aceton/CHCl3 1:1):
3156 w, 3111 w, 3014 m, 1811 w, 1744 s,
1436 w,
1379 m, 1261 m, 1234
883 w, 834
2, 764
DMSO): 5
2.04
=
w,
m,
Smp.:
w,
141-142°C.
IR
(KBr):
1686 vs, 1618 w, 1470 m,
1700 vs,
1128 w,
639 w, 557 m, 537
0.32.
1094
m,
444
w.
1047 m,
1035 m, 953
w,
iH-NMR (500 MHz, d6-
(s, 3 H, CH3CO); 2.06 (s, 3 H, CH3CO); 2.24-2.38 (m, 4 H,
H-C(A2'), H-C(B2'));
3.73
(d, 3J
=
4.1 Hz, 2
H, H2-C(B5')); 4.09-4.15 (m, 2 H,
H-C(A4'), H-C(B4'));
4.20
(d, 3J
=
4.8 Hz, 2
H,
H-C(A3')); 4.76 (d, 2/~
7.1 Hz, 1 H,
5.16-5.19 (m, 1 H, H-C(B3')); 5.68
OCH2aO);
(rf, 3/=
("t", 3/~ 6.9 Hz, 1 H, H-C(l')); 6.16 (dd, 3J
(d, 3/=
8.1 Hz, 1 H,
N(A3), H-N(B3)).
H-C(6)); 7.69 (d, 3J
iH-NMR (125 MHz,
=
4.78
H2-C(A5'));
(d, 2J -1.1 Hz,
8.1 Hz, 2
=
8.1
4.28-4.32
8.2, 3/
1
(m, 1 H,
H, OCH2bO);
H, H-C(A5), H-C(B5)); 6.12
=
6.2 Hz, 1 H,
H-C(l')); 7.63
Hz, 1 H, H-C(6)); 11.34 (s, 2 H, H-
d6-DMSO):
8
=
20.46; 20.68; 36.00; 36.36;
63.68; 67.74; 74.24; 76.71; 81.63; 82.37; 84.09; 84.40; 94.21; 102.02; 102.12; 140.07;
140.32; 150.27; 150.32; 162.88; 162.91; 169.90; 170.05.
MS
(FAB+):
553 (100,
Kap.
139
Anal. ber. für
MH+).
C
gef:
C23H28N4012 (552.50):
C 50.00, H 5.11, N 10.14, O
7
34.75;
49.89, H 4.97 N 9.99. e260: 18.9 lxmrnoHxcnr1.
5'-0-Acetyl-thymidinyl-3',5'-methylen-3'-acetyl-thymidin
OB
O
A
92
fr"
HIIHI
er
Rohprodukt
Das
eines 12.4 mmol-Ansatzes wurde mittels FC
Elementaranalyse
wurde
Rf (CHCl3/MeOH 10:1)
IR:3197w, 3067
=
aus
H3CCO);
3 H,
3.71-3.73
2 H,
2.03
956
889 w,
m,
(s,
3
=
778 w,
Smp.: 98-101°C.
556
iH-NMR
w.
(s, 3 H, H3CCO); 2.21-2.47 (m, 4 H, H-C(A2'), H-C(B2'));
4.32-4.34
H, H-C(A4'), H-C(B4')); 4.17-4.20
2
(m, 1 H, H-C(A3')); 4.74-4.80 (m, 2 H, 0-CH2-0);
(s, 1 H, H-C(6)); 11.31 (5,
7.51
0.29.
606 w,
5.14-5.16 (m, 1 H, H-C(B3')); 6.09-6.12 (m, 2 H, H-C(Al'),
H-C(6));
96%).
H, H3C-C(5)); 1.76 (s, 3 H, H3C-C(5)); 2.01
(m, 2 H, H2-C(B5')); 4.04-4.10 (m,
H2-C(A5'));
g,
2944 w, 2822 w, 1144 s, 1694 5, 1467 m, 1367 m, 1278 m,
w,
(300 MHz, d6-DMSO): 8= 1.75
(m,
EE/MeOH
cm, 500 g,
Wasser umkristallisiert.
0.54; Rf (CHCl3/Aceton 1:1)
1028 m,
1100 m,
1233 m,
(5,
(5
4:1) gereinigt. Man erhielt das Produkt 92 als farbloses Pulver (6.936
40:1 bis
Für die
er isr
n
2
H-C(Bl'));
7.41
(s,
1
H,
13C-NMR (75
H, H-N(A3), H-N(B3)).
MHz,
d6-DMSO):
35.81
(C(2')); 36.24 (C(2')); 63.76; 67.93; 74.31; 77.09; 81.70; 82.33; 83.89; 84.14;
94.51
(0-CH2-0);
12.06
(CH3);
12.12
(13,
M2H+);
C25H32N4012
gef:
7.3
C
•
0.25
20.70
(CH3COO);
581.3
(100,
H20 (580.55
+
170.23
MH+);
0.25
(COO); 170.34 (COO).
580.3
H20):
C
(14,
M+).
MS
Anal.
(FAB+):
ber.
für
51.32, H 5.60, N 9.58, O 33.50;
51.36, H 5.42, N 9.61.
Belichtung
Bei der
(CH3COO);
109.90 (C(5)); 109.98 (C(5)); 135.83 (C(6)); 135.96 (C(6)); 150.57
(C(4)); 150.64 (C(4)); 163.84 (2x C(2));
1161.5
20.47
(CH3);
Belichtung
Methode A: Eine
15-minütigem
von
Dinukleosiden
der Dinukleoside wurden zwei verschiedene Verfahren
Lösung
Durchleiten
des Dinukleosids
von
eingesetzt.
(1.0-1.2 g) in Aceton (350 ml) wurde nach
Stickstoff für 1.5 h unter
Kühlung
und Durchleiten
von
140
7
Kap.
Stickstoff in einer
wurde
Lösungsmittel
in
vacuo
290-600
bei
Pyrex-Apparatur
der
und
entfernt
mit
nm
150 Watt bestrahlt.
Rückstand
Das
Ansätze
mehrerer
säulenchromatographisch getrennt.
(0.5-0.6 g)
Methode B: Das Dinukleosids
und mit
mit
Acetophenon (0.85 ml)
N2 gespült
Apparatur
Diese
H20/Acetonitril (350 ml, 2:1) gelöst
Reaktionslösung
und Durchleiten
Kühlung
und 4 h unter
bei 290-600
versetzt.
wurde in
mit 150 Watt bestrahlt.
nm
entfernt und der Rückstand mehrerer Ansätze
Das
von
Lösungsmittel
Pyrex-
wurde in
vacuo
säulenchromatographisch getrennt.
von
Die entstandenen Produkte des nach Methode A in Portionen
3.9 mmol,
g,
1.0
CHCl3/MeOH
RrWerte
in
Die drei
Hauptprodukte
Verbindungen
(5 à 0.5 g) bestrahlten 8 9
säulenchromatographisch getrennt (75
wurden
eq)
Gradient DCM/MeOH 100:0.5 nach
A:
Stickstoff in einer
S'-O-Pivaloyl^'-desoxyuridyl-S'^'methylen-3'-benzyl-2'-desoxyuridin 89
Belichtung
7.3.1
(2.5
wurde dann über 0.5 h
100:8).
Die drei Produkte wiesen die
Si-H,
g
folgenden
0.33, C:0.26
12:1 auf: A: 0.37, B:
wurden isoliert und mittels
ROESY-NMR-Spektren
als
die
93 (A), 94 (B) und 95 (C) erkannt.
5A-(R),5B-(R),6A-(R),6B-(R)-[trans,syn-ll]-cyclobutandimer
93 des 5'-0-
Pivaloyl-2 '-desoxyuridyl-3 ',5'-methylen-3 '-benzyl-2'-desoxyuridins
O
A
Ausbeute: 310 mg
(0.48 mmol, 12.4%) eines farblosen Pulvers.
Rf (CHCl3/MeOH 12:1):
0.37.
3100 w,
2963 w, 2867 w,
1161
1096 m,
972 w,
Zuordnung erfolgte
(CH3)3CCO);
Hz, 1 H,
150°C-153°C (Zers.).
Smp.:
3222 w,
m,
OB
756 w,
1707
699
w.
s
(C=0),
H2a-C(B2'));
(ddd,
2JB2a.B2h~
2.37-2.43
1454 m,
(KBr):
1363 m,
13.6 Hz,
ROESY): 8
3/B1,B2,a~
3422 w,
1269
d6-DMSO,
iH-NMR (500 MHz,
mittels H,H-COSY, H,C-COSY und
2.17-2.23
IR
=
8.1 Hz,
1.14
Die
(s, 9 H,
3/B3,_B2,a~
(m, 1 H, H2a-C(A2')); 2.60-2.66 (ddd,
m,
5.5
2JBza-B2b~
Kap.
141
7
3/B3,_B2.b~ 7.4 Hz, 3JBV-B2'b~ 3-7 Hz, 1 H, H2a-C(B2')); 2.88-2.93 (ddd,
2^A2'a-A2'b~ 13.8 Hz, 3/A2,b.A3,~ 7.2 Hz, 3/A1,A2.b~ 5.0 Hz, 1 H, H2b-C(A2')); 3.233.25 (m, 1 H, H-C(A5)); 3.25-3.27 (m, 1 H, H-C(B5)); 3.62 (dd, 2/B5'a-B5'b~ H-° Hz>
13.6 Hz,
3/B4'-B5'a~
7-2 Hz> l H'
H-C(A4')), 3.81-3.87(m,
3.75-3.78 (m, 1 H,
H2a-C(B5'));
2
3JB4'.Bya~ 7.2 Hz, 3/B4,.B3,~ 7.0 Hz, 3/B4,_B5,a~
1.9 Hz, 1 H, H-C(B4')), 4.05 (dd, 2/A5'a-A5'b~ 12.0 Hz, 3JM.B5,a~ 5.2 Hz, 1 H,
H2a-C(A5')); 4.16 (dd, 2JA5VA5,b~ 12.0 Hz, 3/B4,_B5,b~ 3.8 Hz, 1 H, H2b-C(A5'));
4.22-4.26 (m, 1 H, H-C(A6)); 4.30-4.34 (m, 1 H, H-C(B3')); 4.46 (AB-Muster, 2/a_b~
H, H-C(A3'), H2b-C(B5')); 4.01 (ddd,
12.1 Hz, 2 H,
4.50-4.54
(dd,
Hz,
OCH2Ph) überlappt
3/Br-B2'a~
3/Ar_A2.b~
10.7
N(A3));
3JBV.BTh~
8-1 Hz,
H-N(B3)).
1 H,
H-C(Al'), H-C(Bl')
u.
(AB-Muster,
(AB-Muster,
2/a_b=
6.5 Hz, 1 H,
6.5 Hz, 1 H,
OCH2aO);
OCH2bO);
Hz, 1 H, H-C(Bl')); 5.32 (dd,
3.7
=
26.86
5.32
3/Al'-A2'a~
1
H-C(Bl')
mit
((CH3)3CCO);
u.
8.0
H, H-
ROESY-Kreuzkopplungen: H-C(A6)
Relevante
H-C(B2'); H-C(B6)
(125.8 MHz, d6-DMSO): 8
2Ja_b=
H-C(Al')); 7.26-7.36 (m, 5 H, ArH); 10.5 (s,
5.0 Hz, 1 H,
(s,
4.95
H-C(B6));
H,
1
(m,
mit 4.47
mit
13C-NMR
H-C(Al')).
(C(A2*)); 37.48 (C(B2'));
36.71
38.18
(C(A5));
38.60
(C(B5)); 39.76 ((CH3)3CCO); 53.63 (C(A6)); 60.86 (C(B6));
62.99
(C(A5'));
70.23
(C(B5'));
(C(A4')); 82.15 (C(Al'));
127.58
170.08
643
u.
128.20
(C(4));
u.
177.23
84.00
138.20
70.73
(ÇH2Ph);
77.97
(C(A3')); 79.14 (C(B3*)); 79.27
(C(B4')); 91.39 (C(Bl')); 97.07 (0-CH2-0); 127.47
(Ar-C); 150.63 (C(2)); 151.70 (C(2)); 169.34 (C(4));
((CH3)3CÇO).
(FAB+): 1285 (9, M2H+), 665 (14, MNa+),
MS
(100, MH+), 537 (81, [MH2-C7H70]+, 535 (50, [M-C7H70]+).
C31H38N4On
56.66, H 6.36,
B:
•
H20 (642.67
u.
+
H20):
C
56.36,
H
Anal. ber. für
6.10, N 8.48, O 29.06; gef: C
N 8.32.
5A-(S),5B-(S),6A-(S),6B-(S)-[trans,syn-l]-cyclobutandimer
94 des 5'-0-
Pivaloyl-2'-desoxyur\dyl-3\5'-rr\e\hylen-3'-benzyl-2'-desoxy uridins
O
OB
NH
HN
T-m-^W,
ri^Kx-A
cr^N
!
/^n^o
--
H
H
l
°6 °6
Ausbeute: 360 mg
analyse
(0.56 mmol, 14.4%)
wurde nochmals
Rf (CHCl3/MeOH 12:1):
3100 w,
2971 m,
aus
eines farblosen Pulvers.
Für die Elementar¬
Ethanol urnkristallisiert.
0.33.
1730 sh
Smp.:
151-159°C
(C=0), 1714
vs
(KBr): 3411
(Zers.).
IR
(C=0),
1455 m,
w,
1400 m,
3250 m,
1361m,
Kap.
142
7
1279 5, 1217 m, 1160 m, 1094 m, 1061 m, 1028 m, 753 w, 694
MHz,
d6-DMSO,
Die
Zuordnung erfolgte
mittels
iH-NMR (500
w.
H,H-COSY, H,C-COSY und ROESY):
2/A2'a-A2'b~
13.5 Hz, 3/Ar.A2.a~ 5.1 Hz, 1 H, H2a-C(A2')); 3.23 (ddd, 2JATa-A2'b~ 13-5 Hz, 3JAV_
9.9 Hz,
4.7 Hz, 1 H, H2b-C(A2')); 3.42 (ddd, 3JB5.B6
10.2 Hz, 3/A2,b.A3,
A2.b~
3/A5_B5 4.4 Hz, 4/A6_B5 1-2 Hz, 1 H, H-C(B5)); 3.53 (ddd, 3/A5.A6 10.5 Hz,
3/A5_B5~4.4 Hz, 4/A5.B6~ 1-3 Hz, 1 H, H-C(A5)); 3.77-3.87 (m, 3 H, H-C(B4'),
H2-C(B5')); 3.93 (dd, 3JM.A5<h 7.4 Hz, 3/A4,_A5,a~ 5.2 Hz, 1 H, H-C(A4')); 3.98
(dd, 2/A5.a.A5.b 11.2 Hz, 3/A4..A5,a~ 5.2 Hz, 1 H, H2a-C(A5')); 4.11 (dd, 2/A5'a-A5'b
4.7 Hz,
7.4 Hz, 1 H, H2b-C(A5')); 4.22 (d, 1 H, 3JA2'h-A3'
11.2 Hz,3/A4,.A5-b
10-5 Hz> 3/A6H-C(A3')); 4.26-4.29 (m, 1 H, B-3') überlappt mit 4.29 (ddd, 3JA5-A6
1.2 Hz, 1 H, H-C(A6)); 4.43 (ddd, 3JB5_B6
9.9 Hz, 3/A6_B6
6.4 Hz, 4/A6_B5
B6
11.9 Hz, 2 H,
6.4 Hz, 47A5_B6~ 1.3 Hz, 1 H, H-C(B6)); 4.51 (AB-Muster, 2Ja_b
8.2 Hz, 1 H,
8.2 Hz, 1 H, OCH2aO); 4.82 (d, 2Ja„h
OCH2Ph); 4.70 (d, 2Ja_h
OCH2bO); 5.29 (dd, 3JAV-A2,b~ 10.2 Hz, 3/Ar_A2.a~ 5.1 Hz, 1 H, H-C(Al')); 5.61 ("t",
8= 1.13 (s, 9 H,
(CH3)3CCO);
H-C(B2'));
1.93-1.95 (m, 2 H,
(dd,
2.54
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
3J~ 7.6 Hz, 1 H, H-C(Bl')); 7.27-7.37 (m, 5 H, ArH); 10.45 (s, 1 H, H-N(3)); 10.71
(s,
1
H-N(3)).
H,
H-C(B6)
mit
ROESY-Kreuzkopplungen: H-C(A6)
Relevante
H-C(Al')
u.
13C-NMR (125.8 MHz,
H-C(B2').
mit
H-C(Al'),
d6-DMSO):
8
=
26.78
((ÇH3)3CCO);
31.62 (C(A2')); 33.35 (C(B2')); 37.81 (C(A5)); 38.16 (C(B5)); 39.76
((CH3)3ÇCO);
53.71
75.21
(ÇH2Ph);
(C(B6));
60.38
81.31
(C(B3'));
(C(A6));
63.52
81.36
(C(B4'));
(C(Bl')); 90.01 (C(Al')); 94.76 (0-CH2-0); 127.49
70.53
(C(A4')); 82.36 (C(A3'));
83.20
u.
127.53
u.
(C(2)); 168.38 (C(4)); 169.25 (C(4));
128.24
138.13
(Ar-
150.62
MS
(FAB+): 1285 (7, M2H+), 665 (70, MNa+), 643 (100, MH+), 641 (66, [M-H]+),
431
535 (43,
[M-C7H70]+),
inklusive
Formacetal, B5'-0
•
H20 (642.67):
177.16
u.
Ç);
(C(2));
152.23
(C(A5')); 66.73 (C(B5'));
((CH3)3CÇO).
(79, [M-CnH1604]H+ (Bern.: Abspaltung des 5'-Zuckers
und Al-N werden
protoniert).
C 56.36 H 6.10 N 8.48 O 29.06
gef.:
Anal. ber. für
C^H^N^u
C 56.57 H 6.07 N 8.57.
5A-(R),5B-(S),6A-(R),6B-(S)-[cis,syn]-cyclobutandimer
95 des
5'-0-Pivaloyl-2'-desoxyuridyl-3',5'-methylen-3'-benzyl-2'-desoxyuridins
A
HN'
O^N'
0~/
B
o
o
NH
V
l
0
(
o
95
N
^O
o
~h
143
Ausbeute:
1.12 g
(1.33 mmol, 34%)
aus
(1.74 mmol,
44.7%),
Kap.
nach Umfallen
eines farblosen Pulvers.
Für die
Diethylether:
aus
Elementaranalyse
7
0.854 g
wurde nochmals
Ethanol umkristallisiert.
Rf (CHCl3/MeOH 12:1):
0.26.
148-150°C
Smp.:
3238 m, 3089 w, 2972 m, 1725 sh
(C=0),
1712
IR (KBr): 3444
Zersetzung.
(C=0), 1455
vs
1166 m, 1100 5, 1065 s, 1028 s, 900 w, 756 w, 700
m,
s, 1372 m, 1270 s,
iH-NMR: (500 MHz, d6-
w.
DMSO, Die Zuordnung erfolgte mittels H,H-COSY, H,C-COSY und ROESY): 5= 1.14
(5, 9 H, (CH3)3CCO); 1.98-2.12 (m,
3.60-3.70 (m, 3 H,
OCH2Ph);
33.45
(m,
4.69-4.76 (AB-Muster,
mit
7.27-7.37
Relevante
H-N(A3)).
H-C(B6)
4.00-4.15
H-C(A6), H-C(B6));
H-C(Al'), H-C(Bl'));
H,
H, H-C(B2')); 2.40-2.51 (m, 2 H, H-C(A2'));
H-C(A5), H-C(B5), H2a-C(B5')); 3.80-3.90 (m,
H-C(A4'), H-C(B4'));
4.45 (m, 2 H,
2
H-C(B2').
4
H,
H, H2b-C(B5'),
H-C(A3'), H-C(B3'), H2-C(A5'));
4.48-4.55
2/a_b=
3
(AB-Muster,
7.3 Hz, 2 H,
OCH2aO);
(m, 5 H, ArH); 10.50 (s,
11.9
=
5.77
u.
Hz, 2 H,
5.82
(m,
2
H,
H, H-N(B3)); 10.53 (s, 1
1
ROESY-Kreuzkopplungen:
13C-NMR (125.8 MHz,
2Ja_h
4.40-
H-C(A6)
d6-DMSO):
8
=
mit
26.78
H-C(A2'),
((CH3)3CCO);
(C(B2')); 34.10 (C(A2')); 38.13 ((CH3)3CCO); 38.72 (C(B5)); 40.63 (C(A5));
51.331
(C(B6)); 53.17 (C(A6)); 63.55 (C(B5')); 65.12 (C(A5')); 70.38 (CH2Ph); 76.14
(C(B3')); 77.87 (C(A3')); 78.95 (C(A4')); 80.97
(C(Bl')); 93.85 (0-CT2-0); 127.45
(C(2));
u.
127.63
u.
(C(B4'));
128.20
u.
84.77
(C(Al')); 85.61
138.00
(Ar-ÇJ; 152.74
(C(2)); 162.95 (C(4)); 167.26 (C(4)); 177.15 ((CH3)3CCO).
153.38
MS
(FAB+): 1285 (7, M2H+), 665 (23, MNa+), 643 (100, MH+), 535 (70, [M-C7H70]+).
Anal. ber. für
C31H38N4Ou
•
0.5
H20 (642.67):
C 57.14 H 6.03 N 8.60 O 28.23
gef:
C 57.09 H 6.08 N 8.58.
7.3.2
Das
Belichtung
S'-O-Pivaloyl^'-desoxyuridyl-S'^'methylen-S'-acetyl^'-desoxyuridin 90
Rohprodukt
von
des nach Methode A bestrahlten Dinukleosids 90
1.0
eq)
drei
Hauptprodukte wurden
wurde
säulenchromatographisch getrennt (40
g
0.47
g,
2
mmol,
Si-H, DCM/Aceton 4:1).
isoliert.
Rf (Aceton/CHCl3 1:1): A(98): 0.53; B(100):
(1.2
C(102): 0.28.
Die
Kap.
144
7
5A-(R),5B-(R),6A-(R),6B-(R)-[trans,syn-ll]-cyclobutandimer
A:
98 des 5'-0-
Pivaloyl-2'-desoxyuridyl-3',5'-methylen-3'-benzyl-2'-desoxyuridins
0o.oO
a
HN
B
NH
o
98
160 mg
Ausbeute:
(16%)
Aceton/Diethylether/Cyclohexan:
nochmals
aus
farblosen
eines
110 mg
(11%)
Für
Nach
die
Umfallen
Elementaranalyse
aus
wurde
Ethanol umkristallisiert.
Rf (Aceton/CHCl3 1:1):
0.53.
170-173°C
Smp.:
3100 w, 2967 m, 2878 w, 1728 sh
d6-DMSO,
Die
8= 1.14 (5, 9 H,
(Zers.).
(C=0), 1706
1322 m, 1272 5, 1239 s, 1161 s, 1100 5,
MHz,
Pulvers.
vs
IR
(KBr): 3511
(C=0), 1478 sh, 1450
1028 s, 983 m, 761
2.01
s,
1367 s,
iH-NMR (500
w.
Zuordnung erfolgte mittels H,H-COSY, H,C-COSY
(CH3)3CCO);
m, 3244 m,
und
(s, 3 H, CH3CO); 2.21-2.27 (ddd,
ROESY):
2/B2'a-B2'b~
3/Br.B2-a~
3/B2'a-B3(ddd,
H2a-C(B2'));
13.9
8.1
7.5
1
Hz, 3/Ar_A2,a~
Hz, 3/A2.a.A3.
Hz,
H, H2a-C(A2')); 2.702^A2'a-A2'b~
2.76 (ddd, 2/B2'a-B2'b~ 14.0 Hz, 3/B2-b-B3'
7.5 Hz, 3/Bi,BTb
3-5 Hz, 1 H,
H2b-C(B2')); 2.91-2.96 (ddd, 2JA2<a-ATb~ 13-9 Hz, 3/A2.b_A3. 7.3 Hz, 3/Ar.A2,b~ 4.8
Hz, 1 H, H2b-C(A2')); 3.24-3.27 (m, 2 H, H-C(A5), H-C(B5)); 3.67 (dd, 2JB5<a_B5<h~
10.7 Hz, 3/B4'_B5'a~ 7.5 Hz, 1 H, H2a-C(B5')); 3.74-3.77 (m, 1 H, H-C(B4')); 3.793.83(m, 1 H, H-C(A3')); 3.92 (dd, 2JB5-a.B5'h~ 10.7 Hz, 3/B4'_B5-b~ 1-8 Hz, 1 H,
H2b-C(B5')); 4.03 (ddd, 3/B4._B5'a~ 7-5 Hz, 3/B3._B4. 4.6 Hz, 3/B4..B5'b~ 1-8 Hz, 1 H,
12-0 Hz, 3/A4..A5'a~ 5.1 Hz, 1 H, H2a-C(A5')); 4.17
H-C(B4')); 4.06 (dd, 2/A5'a-A5'b
12-0 Hz, 3/A4._A5.b
3.5 Hz, 1 H, H2b-C(A5')); 4.21-4.25 (m, 1 H,
(dd, 27A5'a-A5'b
H-C(A6)); 4.47 (d, 2Ja_h 6.6 Hz, 1 H, OCH2aO); 4.53-4.57 (m, 1 H, _H-C(B6)); 4.97
(d, 2/a.b 6.6 Hz, 1 H, OCH2bO); 5.26-5.31 (m, 1 H, H-C(B3')); 5.36 (dd, 3/Br.B2a~
8.1 Hz, 3/Br.B2'b~ 3-5 Hz, 1 H, H-C(Bl')); 6.03 (dd, 3JAV_ATa
8.1 Hz, 3JAV.ATh
14.0
8.1 Hz,
Hz,
5-6 Hz>
1 H>
2.34-2.40
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
4.8 Hz, 1 H,
d6-DMSO):
38.18
H-C(Al')); 10.62 (s,
8= 20.73
((CH3)3ÇCO);
(ÇH3CO);
38.56
(C(B6)); 62.93 (C(A5*));
(C(A4')); 81.94 (C(Al'));
(C(2));
151.69
((CH3)3CCO).
(C(2));
MS
2 H,
26.87
H-N(A3), H-N(B3)).
((Œ3)3CCO);
36.75
~
13C-NMR (125.8 MHz,
(C(A2'));
37.08
(C(B2'));
(C(5));
verdeckt durch DMSO:
70.08
(C(B5')); 74.79 (C(B3')); 77.85 (C(A3'));
83.81
169.33
(C(B4'));
(C(4));
91.28
170.09
(C(5));
53.62
(C(A6)); 60.98
79.03
(C(Bl')); 97.12 (0-CH2-0); 150.89
(C(4));
177.16
(CH3CO);
177.25
(FAB+): 1783 (2, M3H+), 1189 (16, M2H+), 595 (100, MH+), 535
145
(39, [M-OCOCH3]+). Anal. ber.
51.74 H
B:
5.84, N 9.28,
für
C26H34N4012
33.13; gef: C 51.62,
O
7
Kap.
•
H20 (594.58
0.5
+
0.5
H20):
C
H 5.88 N 9.11.
5A-(S),5B-(S),6A-(S),6B-(S)-[trans,syn-l]-cyclobutandimer
100 des
5'-0-Pivaloyl-2'-desoxyuridyl-3',5'-methylen-3'-acetyl-2'-desoxyuridins
B
o
170 mg
Ausbeute:
eines
(17%)
Aceton/Diethylether/Cyclohexan:
Für die
Elementaranalyse
Rf (Aceton/CHCl3 1:1):
33466 m,
1405 5,
3100 w,
1367 5,
0.47.
Hz,
aus
1216
1249 5,
Nach
Umfallen
aus
Ethanol umkristallisiert.
185-191°C (Zers.).
Smp.:
sh,
vs
IR
(KBr): 3522
(C=0), 1712
1103
Ulis,
vs
ja,
w, 3422 w,
(C=0), 1459
1047 m,
5,
755 m,
iH-NMR (500 MHz, d6-DMSO, Die Zuordnung erfolgte
H,C-COSY): 8=
3/Br.B2.a~
Pulvers.
(12%).
2911m, 287'8 sh, 1738
699 w, 593 w, 522 w, 412.
BZb~ 13.2
120 mg
wurde nochmals
1279 5,
mittels H,H-COSY,
farblosen
4.0 Hz, 1 H,
1.13
(s, 9 H, (CH3)3CCO); 1.84-1.89 (dd,
H2a-C(B2'));
2JATa-A2<b~
2.04
3
(s,
2JBTa_
H, CH3CO); 2.09-2.16
3/Ar_A2,a~ 5.0 Hz, 1 H,
H2a-C(A2')); 3.24-3.31 (m, 1 H, H2b-C(A2')); 3.42 (dd, 3JB5_B6 9.8 Hz, 3/A5B5
4.4 Hz, 1 H, H-C(B5)); 3.54 (dd, 3/A5_A6
10.5 Hz, 3/A5_B5
4.4 Hz, 1 H, H-C(A5));
3.80-3.84 (m, 3 H, H-C(B4'), H2-C(B5')); 3.93 (dd, 3/A4-_A5'b
7.4 Hz, 3/A4LA5-a~
5.3 Hz, 1 H, H-C(A4')); 3.93 (dd, 2JA5<a_A5<h
11.2 Hz, 3/A4'_A5.a~ 5.3 Hz, 1 H,
H2a-C(A5')); 4.12 (dd, 2JA5^A5<h H-2 Hz, 3/A4,.A5,b 7.4 Hz, 1 H, H2b-C(A5'));
4.24 (d, 3/A2'b-A3'
4.6 Hz, 1 H, H-C(A3')); 4.29 (dd, 3JA5_A6
10.5 Hz, 3/A6_B6
6.5 Hz, 1 H, H-C(A6)); 4.47 (dd, 3/B5_B6
9.8 Hz, 3/A6.B6
6.5 Hz, 1 H, H-C(B6));
4.71 (d, 2/a_b
8.2 Hz, 1 H, OCH2aO); 4.85 (d, 2Ja_h
8.2 Hz, 1 H, OCH2bO); 5.19
(m, 1 H, H-C(B3')); 5.28 (dd, 3/Ar_A2'b~ 10.0 Hz, 3/A1LA2'a~ 5.0 Hz, 1 H, H-C(Al'));
5.58 (dd, 37Br.B2b~ 9.1 Hz, 3/B1,_B2,a
4.0 Hz, 1 H, H-C(Bl')); 10.46 (5, 1 H, Hi3C-NMR (125.8 MHz, d6-DMSO): 8
20.73
N(3)); 10.74 (s, 1 H, H-N(3)).
(m, 1 H, H2b-C(B2')); 2.56 (dd,
13-5 Hz,
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
=
(CH3CO);
26.78
((CH3)3CCO);
31.56
(C(A2')); 33.68 (C(B2')); 37.78 (C(A5)); 38.00
(C(B5)); 38.16 ((CH3)3CCO); 53.66 (C(B6)); 60.35 (C(A6)); 63.50 (C(A5')); 66.31
(C(B5'));
70.53
(C(B3'));
80.40
(C(B4')); 81.36 (C(A4'));
82.33
(C(A3'));
83.06
Kap.
146
7
89.94
(C(Bl'));
(C(Al')); 94.62 (0-CH2-0); 150.65 (C(2)); 152.27 (C(2));
(C(4)); 169.26 (C(4));
((CH3)3CÇO).
MS
protoniert).
Anal. ber. für
51.74 H 5.84, N 9.28, O 33.13;
C26H34N4012
gef:
C
0.5
•
383
H20 (594.58
1784
(100,
(2,
[M-
0.5
+
H20):
C
51.58, H 5.79 N 9.11.
5A-(R),5B-(S),6A-(R),6B-(S)-[cis,syn]-cyclobutandimer
C
(FAB+):
des 5'-Zuckers inklusive Formacetal, B5'-0 und Al-N
C^H^O/JH4" (Bern.: Abspaltung
werden
177.16
(CH3ÇO);
(14, M2H+), 617 (42, MNa+), 595 (86, MH+),
1189
M3H+),
170.21
168.32
102 des
5'-0-Pivaloyl-2'-desoxyuridyl-3',5'-methylen-3'acetyl-2'-desoxyuridins
a
OB
o
H
HN"
H
^
^NH
y
fr £
P
o
102
Ausbeute:
410 mg
Aceton/Diethylether:
Für die
eines
(41%)
250 mg
Elementaranalyse
Rf (Aceton/CHCl3 1:1):
wurde nochmals
0.28.
Smp.:
(ddd,
Nach
>
aus
210°C
(Zers.).
(C=0), 1678
vs
IR
(KBr): 3400
(C=0), 1449
vs
m.
~
13.3
Hz, 3J
2.25-2.29 (m, 1 H,
COCH3);
aus
s,
~
3214 m,
m,
1384 s, 1277 s,
766 m,
880' w,
iH-NMR: (500 MHz, d6-DMSO, Die Zuordnung
mittels H,H-COSY, H,C-COSY: 8= 1.14
2yB2.a.B2'b
Umfallen
Ethanol umkristallisiert.
1164 5, 1086 s, 1050 s, 994 s, 950 w, 930 m, 896 w,
711 w, 591 w, 529 m, 426
erfolgte
Pulvers.
(25%).
3085 m, 2956 m, 2877 w, 1720
1250 5,
farblosen
4.7 Hz,
3J
~
H2b-C(B2'));
(s, 9 H, (CH3)3CCO); 1.89-1.94
1.5 Hz, 1 H,
H2a-C(B2'));
2.40-2.48 (m, 2 H,
2.04
H2-C(A2'));
(s, 3 H,
3.60-3.68
(m, 3 H, H-C(A5), H-C(B5), H2a-C(B5')); 3.82-3.89 (m, 3 H, H2b-C(B5'), H-C(A4'),
H-C(B4')); 4.02-4.12 (m,
2JaAi
H, H-C(A3'), H2-C(A5')); 4.42-4.48 (m, 2 H, H-C(A6),
H-C(B6));
4.71
OCH2bO);
5.09-5.12 (m, 1 H,
10.51 (5,
H, H-N(3)); 10.53 (s, 1 H, H-N(3)).
=
20.67
1
(d,
3
(COCH3);
((CH3)3CCO);
38.75
=
26.78
7.4 Hz,
1 H,
H-C(B3'));
OCH2aO);
5.75
((ÇH3)3CCO);
(C(B5));
40.58
5.80
(m,
(d,
2
2Ja_b
=
7.4
(C(B2'));
51.42
77.99
Hz, 1 H,
H, H-C(Al'), H-C(Bl'));
13C-NMR (125.8 MHz,
33.49
(C(A5));
(C(A5')); 64.69 (C(B5')); 71.54 (C(B3'));
-
4.78
34.18
d6-DMSO):
(C(A2'));
(C(B6)); 53.09 (C(A6));
8
38.14
63.55
(C(A3')); 78.94 (C(A4')); 80.39
(C(B4')); 84.71 (C(Al')); 85.48 (C(Bl')); 93.85 (0-CH2-0); 152.73 (C(2)); 153.48
(C(2)); 166.95 (C(4));
167.22
(C(4)); 170.08 (COCH3); 177.15 ((CH3)3CÇO).
MS
Kap.
147
Anal. ber. für
OCOCH3]+).
gef:
C26H34N4012 (594.58):
C 52.52 H 5.76 N 9.42 O
[M-
32.29;
C 52.38, H 5.73 N 9.27.
S'-O-Acetyl^'-desoxyuridyl-S1^1methylen-3'-acetyl-2'-desoxyuridin 91
Belichtung
7.3.3
Das
(100, MH+), 535 (39,
595
(16, M2H+),
1189
(FAB+): 1784 (6, M3HH+),
7
Rohprodukt
4 mmol,
1.0
von
des nach Methode A bestrahlten Dinukleosids 91
Flashchromatographie (150g Si-60,
wurde mittels
eq)
DCM/MeOH 100:0 nach
100:6.5)
(Rf (CHCl3/MeOH 10:1)
dukte mit höherem
Produkt
das
#rWert (Rf (CHCl3/MeOH 10:1)
druckchromatographie getrennt (Aceton/DCM 1:2).
Charakterisiemng
aus
von
i?rWert
=
0.44
Die drei
+
mittels Mittel-
0.38)
wurden
Hauptprodukte
zur
Ethanol umkristallisiert.
Rf (Aceton/CHCl3 1:1):
A:
kleinsten
dem
mit
Gradient
Anschliessend wurden die beiden Pro¬
0.25) abgetrennt.
=
(4 Portionen à 1.1 g,
(99): 0.57; B(101): 0.48; C(103):
A
0.27.
5A-(R),5B-(R),6A-(R),6B-(R)-[trans,syn-l]-cyclobutandimer
99 des 5'-0-
Acetyl-2'-desoxyuridyl-3',5'-methylen-3'-acetyl-2'-desoxyuridins
A
O
OB
X?
H
X
Hlrl—l^H
O^N^ ^N^O
l
#
p—'
H
H
l
yip
b-f
(
b
o
99
Ausbeute: 670 mg
500 mg
aus
Ethanol:
(11.4%).
Rf (Aceton/CHCl3 1:1):
3100 w,
2966
1322 w,
1267
MHz,
eines farblosen Pulvers. Nach Umkristallisieren
(15.2%)
w,
5,
d6-DMSO):
0.57.
Smp.:
1740 sh
>
(C=0),
172 °C
1699
Zersetzung.
vs
(C=0),
IR
1478
(KBr): 3577
sh,
1237 s, 1161 w, 1100 m, 1032 s, 978 m, 761
5=2.01 (s, 3 H,
CH3CO);
2.03
(s,
3
w, 3242 m,
1453 m,
1365 m,
iH-NMR (500
w.
H, CH3CO); 2.16-2.36 (m, 2
H, H2a-C(A2'), H2a-C(B2')); 2.72-2.79 (m, 1 H, H2b-C(B2')); 2.95-3.02 (m, 1 H,
H2b-C(A2'));
3.23-3.28
H2a-C(B5'));
3.82-3.86
2.1 Hz, 1 H,
(m,
(m,
H2b-C(B5'));
2
1
H, H-C(A5), H-C(B5)); 3.67-3.74 (m,
H, H-C(A3')); 3.93 (dd,
4.01-4.08
2JB5<a_B5<h~
2
10.8
H, H-C(A4'),
Hz,
37B4LB5-b~
(m, 2 H, H-C(B4'), H2a-C(A5')); 4.22-4.32 (m, 2
H, H2b-C(A5'), H-C(A6) od. H-C(B6)); 4.43 (d,
2Ja_h
~
6.5 Hz, 1 H,
OCH2aO);
4.54-
Kap.
148
7
2Ja_b 6.5 H z, 1 H, OCH2bO);
5.31 (m, 1 H, H-C(B3')); 5.40 (dd, 3JBV-B2a~ 8-4 Hz, 3/Br.B2'b~ 3.1 Hz,
3.6 Hz, 1 H, H-C(Al'));
H-C(Bl')); 6.06 (dd, 3/A1._A2a~ 8.6 Hz, 3/Ar_A2'b
4.59 (m, 1 H,
H-C(B6)
od.
H-C(A6));
(d,
4.97
~
(s,
H-N(A3), H-N(B3)). 13C-NMR (125.8 MHz, d6-DMSO): 8
2 H,
26.87
(ÇH3CO);
((ÇH3)3CCO);
verdeckt durch DMSO
C(B5*));
u.
75.70
92.34
170.26
171.17
(62.8, MNa+),
365
(C(A4)
553 (98,
B:
(C(A6)
C(B6)); 62.85
(21, [M-C8Hn05]+.
u.
H,
10.54
21.64
(C(5));
40.81
71.38
(C(A5')
C(A3')); 79.97 (C(A4')); 82.55 (C(Al')); 84.88
u.
C(B4)); 171.27
u.
u.
1
u.
21.41
=
39.44
C(B2'));
u.
151.82
171.28
u.
152.53
(C(A2)
(CH3ÇO).
MS
u.
MH+), 493 (100, [M-OCOCH3]+),
49.20, H 5.21, N 9.98,
C
(C(B3')
61.86
u.
(C(A2')
37.99
u.
(C(Bl')); 98.26 (0-ÇH2-0);
(C(B4'));
u.
(C(5)); 53.88
77.80
u.
37.84
5.26-
~
Anal. ber. für
C23H28N4012
•
383
0.5
u.
C(B2));
(FAB+): 575
(22, [MH-C8H10O4]+),
H20 (552.50
0.5
+
H20):
35.62; gef.: C 49.32, H 5.21, N 9.91.
O
5A-(S),5B-(S),6A-(S),6B-(S)-[trans,syn-l]-cyclobutandimer
101 des
5'-0-Acetyl-2'-desoxyuridyl-3',5'-methylen-3'-acectyl-2'-desoxyuridin
o
A
0
N
p-y
,.
o
..
B
Af°
H
{
o
o-
o
101
Ausbeute: 750 mg
520 mg
(17%) eines farblosen Pulvers. Nach Umkristallisieren
1730 5,
2944 w,
0.48.
1704 vs,
iH-NMR (500 MHz,
2.56
>
174°C
1450 m,
d6-DMSO,
1
(m,
Zersetzung.
1370 m,
Reinheit
~
IR
1244 5,
(KBr): 3258
3.51-3.55
3/A2.b.A3.
(m,
~
4.7
1
1
600
w.
H, H2a-C(B2'));
H, H2b-C(B2')); 2.50-
1
H, H-C(A5)); 3.78-3.81 (m, 3 H, H-C(B4'), H2-C(B5'));
2Ja_b
4.70
OCH2bO);
5.19 (dd, 3J
(d,
3/Ar.A2.a~
4.0 Hz, 1 H,
H2a-C(A5'));
4.11-4.17
(m,
1 H,
H2b-C(A5'));
4.25
(d,
Hz, H-C(A3')); 4.26-4.30 (m, 1 H, H-C(A6)); 4.46-4.49 (m, 1 H,
H-C(B6));
10.1 Hz,
756 w,
1042 m,
90%): 8= 1.83-1.86 (m,
3100 w,
m,
H, H2a-C(A2')); 3.23-3.28 (m, 1 H, H2b-C(A2')); 3.39-3.42 (m, 1 H,
3.93-3.96 (m, 2 H, H-C(A4'),
H,
Smp.:
(5, 3 H, CH3CO); 2.02 (s, 3 H, CH3CO); 2.08-2.15 (m,
H-C(B5));
1
Ethanol:
(12%).
Rf (Aceton/CHCl3 1:1):
2.00
aus
5.0
~
~
8.2 Hz,
7.4 Hz,
1
3J
H, OCH2aO); 4.83 (d,
8.2
Hz, 1 H,
Hz, 1 H, H-C(B3')); 5.27 (dd,
Hz,
3JAv.ATb~
3JBV_BTa
H, H-N(3)); 10.71 (s, 1 H, H-N(3)).
13C-NMR
~
4.2
Hz, 1 H, H-C(Al')); 5.57 (dd,
H-C(Bl')); 10.44 (s,
(125.8 MHz, d6-DMSO): 8
=
20.62
1
2/a_b
(CH3CO);
20.73
3/Br_B2b
(CH3CO);
~
~
H-l
31.54
~
(C(A2')); 33.64
Kap.
149
7
(C(B2')); 37.75 (C(A5)); 37.97 (C(B5)); 53.66 (C(B6)); 60.43 (C(A6)); 63.79 (C(A5'));
66.39
(C(B5'));
70.49
(CH3ÇO);
170.12
(C(4)); 169.30 (C(4));
150.64 (C(2));
(0-ÇH2-0);
94.82
(C(Bl')); 90.13 (C(Al'));
(C(B4')); 81.47 (C(A4*));
80.38
(C(B3'));
83.01
(C(2)); 168.33
152.29
(FAB+): 575 (41,
MS
(CH3ÇO).
170.20
(C(A3'));
82.43
MNa+), 553 (61, MH+), 413 (31, [M-C10H14O3]H+ (Bern.: Abspaltung des 5'-Zuckers,
und
OCH2OR
Abspaltung
C23H28N4012
•
0.5
[M-CnH1604]H+ (Bern.:
(100,
Formacetal, B5'-0 und Al-N werden protoniert).
des 5'-Zuckers inklusive
Anal. ber. für
383
protoniert).
werden
Al-N
H20 (552.50
0.5
+
H20):
C 49.20, H 5.21, N 9.98,
35.62; gef: C 49.32, H 5.12, N 9.90.
O
5A-(R),5B-(S),6A-(R),6B-(S)-[cis,syn]-cyclobutandimer
C:
103 des
5'-0-Ace\.y\-2'-desoxyuridyl-3',5'-fr\e\hylen-3'-ace\yl-2'-desoxyuridins
f VH
0
H' T
°
à à
pS
(
b
o
"o
o
103
Ausbeute: 1.95 g
(44.0%)
Wasser 1:1: 1.1 g
1730
0.27.
Smp.:
H2a-C(A2')),
H2b-C(A2'));
3.32
(5,
2
2.03
2.43-2.46
>180 °C
1453 5,
(C=0, vs),
1100 m, 1032 5, 978 m, 761
1 H,
Nach Umkristallisieren
1322 w,
1392 m,
iH-NMR (500 MHz,
w.
(KBr): 3578
1261s,
m, 3201 m,
1161 w,
1231s,
d6-DMSO):
8= 1.89-1.93 (m,
("t",
3JBV.B2a
~
3/Br.B21)
6.0 Hz,
~
6.0 Hz, 2 H,
H-C(B2'));
H, H20); 3.62-3.67 (m, 3 H, H-C(A5), H-C(B5), H2a-C(B5')); 3.80-3.89
2JA5^Ayb~
11.7 Hz,
3/A4,_A5,a~
Hz, 1 H, H2a-C(A5')); 4.09-4.13 (m, 2 H, H-C(A3'), H2b-C(A5')); 4.43-4.49 (m, 2
2/a.b
~
7.4 Hz, 1 H,
OCH2aO);
4.83
(d,
2Ja_h
~
7.4 Hz,
H, OCH2bO); 5.10-5.12 (m, 1 H, H-C(B3')); 5.76-5.82 (m, 2 H, HA-1', H-C(Bl'));
10.51 (5, 1 H,
=
Ethanol-
(s, 3 H, CH3CO); 2.04 (s, 3 H, CH3CO); 2.16-2.30 (m, 1 H,
H, H-C(A6), H-C(B6)); 4.71 (d,
1
IR
Zersetzung.
(m, 3 H, H-C(A4'), H-C(B4'), H2b-C(B5')); 4.00 (dd,
5.8
aus
(25%).
Rf (Aceton/CHCl3 1:1):
3088 w,
eines farblosen Pulvers.
20.51
unter
H-N(3));
(COÇH3);
10.56
20.67
(s,
1
H, H-N(3)).
(COŒ3);
13C-NMR (125.8 MHz,
33.45 (C(B2')); 34.17 (C(A2'));
d6-DMSO):
8
39.52 (C(B5),
DMSO); 40.43 (C(A5)); 51.53 (C(B6)); 52.67 (C(A6)); 63.65 (C(A5')); 64.68
77.83
71.47
(C(B3'));
(C(Al'));
85.50
(C(Bl')); 93.89 (0-£H2-0); 152.81 (C(2)); 153.50 (C(2)); 167.07
(C(4)); 167.19 (C(4));
170.09
(C(A3'));
(2x COCH3).
79.07
MS
(C(A4*));
80.41
(C(B4')); 84.67
(C(B5'));
(FAB+): 575 (12, MNa+), 553 (100,
150
7
Kap.
MH+), 493 (24, [M-OCOCH3]+), 463 (34, [M-OCOCH3-OCH2]+).
C23H28N4012
H
•
H20 (552.50
+
H20):
C 48.42 H
5.30, N 9.82,
O
36.46; gef: C 48.28,
5.16, N 9.73.
S'-O-Acetyl-thymidinyl-S'jö1methylen-3'-acetyl-thymidin 92
Belichtung
7.3.4
Das
Rohprodukt
von
wurde mittels FC
(3
von
nach Methode A bestrahltem Dinukleosid 92
cm, 50 g
Silica
(658
einen
Rf von
Ausbeuten
Das
wurde
Hauptprodukte
von
Später
FC
(3
erhielt
wird.
man
werden
Silica
H,
0-10%
als farbloses Pulver:
das Edukt 92 hat
(588
1.0
mg,
Als
MeOH/DCM) aufgetrennt.
Rf (EE/MeOH 13.5:1): A(105): 0.79;
dass
7 mg
(1%); 104: 81 mg (14%); 106: 235 mg (40%).
nach dem Entfernen des
LSM
in
vacuo,
106
kann, indem das farblose Produktgemisch mit wenig Aceton
Dabei lösen sich
leicht
versetzt
92, 105, 104 und alle Nebenprodukte auf, lediglich 106 bleibt
Niederschlag zurück,
man
eq)
0.37.
(Methode B): 105:
wiederholt, erhält
A:
50 g
cm,
wurde entdeckt,
abgetrennt
Haupt¬
(1%); 104: 400 mg (61%).
nach Methode B bestrahltem Dinukleosid 92
B(104): 0.72; C(106):
Ausbeuten
105 7 mg
(Methode A):
mittels
Die
eq)
(EE/MeOH 13.5:1).
0.48
Rohprodukt
1.0
mg,
H, 0-10% MeOH/DCM) aufgetrennt.
produkte waren: R{(EE/MeOH 13.5:1): A(105): 0.79; B(104): 0.72;
als
Anal. ber. für
der abfiltriert werden kann.
als iH-NMR sauberes Produkt
Wird diese Prozedur
cis,syn
einmal
106.
5A-(R),5B-(R),6A-(R),6B-(R)-[trans,syn-ll]-cyclobutandimer
105 des
5'-0-Acetyl-thymidinyl-3',5'-methylen-3'-acetyl-thymidins
A
O
OB
ÏÏ Me Me y
HN
p~J
H
NH
b
'o-Y
(
o
o
105
Rf (EE/MeOH 13.5:1)
1110 s,
1487 m,
=
0.72.
1452 m,
Smp.:
163-166°C.
1401m, 1378
5,
IR: 3252 m,
1354 m,
1305 m,
3100 w,
2938 w,
1293 m,
1222 m,
1162 m, 1039 m, 944 m, 900 m, 876 w, 852 w, 826 w, 802 w, 756 m, 732 w,
Kap.
151
689
H3C);
2.74
Hz,
583
w,
2.04
2Jab
3Ja2<-av
(dd,
H3CCO);
3 H,
(s,
=
=
2.05
Hz,
10-3
H,
4.19
H, 0-CH2a-0); 4.80
1 H,
H-N(3));
(ÇH3COO);
34.33
20.81
3
H, H3C); 1.48 (s, 3 H,
1.98-2.07
H3CCO);
H,
(s,
(m, 2 H, H-C(B2'));
4.5 Hz, 1 H,
(ddd,
3.27
H2a-C(A2'));
=
=
=
=
3JAy.AT
8.3
(d, 2/ab
(d,
=
3JBV_B2<
8.87
(s,
1
2
4.09-4.15 (m, 2
2Jab 8.3 Hz, 1
7.1 Hz,
Hz, 1 H, OCH2bO); 5.33 (dd, 3JBy_B2<
4.5 Hz, 1
10.3 Hz, 37Ar.A25.41 (dd, 3JAV.AT
4.2 Hz, 1 H, H-C(Bl')); 8.53
10.93 Hz, 3/Br.B2.
H-C(A3')); 4.69 (d,
4.8 Hz, 1 H,
=
=
=
=
=
"C-NMR (125 MHz,
H, H-N(3)).
(Ç_H3COO);
H2b-C(B5'));
H, H-C(A4'),
=
=
H, H-C(Al')); 5.74 (dd,
(s,
1.43
2Jah 13.6
6.9
4.8 Hz, 1 H, H2b-C(A2')); 3.69 (d, 3JA6.B6
(m, 2 H, H-C(B4'), H2a-C(B5')); 3.97 (d, 3/A6_B6
=
3.9 Hz, 1 H, H-CÇB3'));
=
3
H-C(A6)); 4.02-4.05 (m,
H2-C(A5'));
3/B3,_B4,
(5,
3/A2,.Ar
3JA2,.A3.
13.6 Hz,
Hz, 1 H, H-C(B6)); 3.88-3.92
6.9 Hz, 1 H,
d6-DMSO):
iH-NMR (500 MHz,
w.
7
21.49
33.08
(ÇH3C(5));
21.94
(CH3C(5));
d6-DMSO):
20.77
(C(A2'));
(C(B2')); 45.67 (C(5)); 46.42 (C(5)); 60.05 (C(B6)); 63.80 (C(A5')); 65.50
81.23
(C(B4*));
70.64
(C(B3'));
(C(A3')); 82.92 (C(Bl'));
90.13
(C(Al')); 94.86 (OCH20); 150.09 (C(4));
66.51
(C(4)); 168.87, 169.08, 170.58, 170.67 (2xÇOOCH3,
C(2)).
2x
MS
441.0
82.42
(C(A4'));
81.72
(C(B5'));
(C(A6));
152.04
(FAB+), 1161.2
424.0
(7, M2H+),
581.0
(38, MH+), 580.0 (16, M+),
412.0
(22),
411.0
(100).
H20):
C
B:
5A -(S), 5B-(S), 6A-(S), 6B-(S)-[trans, syn-l]-cyclobutandimer 104 des
442.0
(11),
C25H32N4012
Anal. ber. für
•
0.25
(33),
H20 (580.55
+
(11),
0.25
51.32, H 5.60, N 9.58, O 33.51; gef.: C 51.56, H 5.61, N 9.29.
5'-0-Acetyl-thymidinyl-3',5'-methylen-3'-acetyl-thymidins
B
cr
N
l
'-
N
'
H
H
o
1
°H
H
r\
p
CM
o
104
Rf (EE/MeOH 13.5:1):
0.79;
1289 m,
428
1H-NMR (500 MHz,
H3CC(5));
2.01
1
H,
H-C(A6));
1
H2b-C(A2'));
3.93
d6-DMSO):
3089 w,
1.13
(s, 3 H, H3CCOO); 2.06 (s,
C(B2')); 2.30-2.24 (m,
(m,
3239 m,
2944 w,
1709 5,
1452 m,
1225 5, 1094 m, 1032 m, 889 w, 761 w, 639 w, 600 w, 533 w,
1378 m,
w.
IR:
(dd,
2/ab
3
(s,
3
H, H3CC(5)); 1.22 (5, 3 H,
H, H3CCOO); 2.22-2.16 (m, 1 H, H2a-
H, H2a-C(A2')); 2.91-2.86 (m, 1 H, H2b-C(B2')); 3.10-3.05
3.78-3.70
=
10.7 Hz,
(m,
4
3/B5-_B4'
H,
=
H-C(A3'),
2.0
H-C(A4'),
H2a-C(B5'),
Hz, 1 H, H2b-C(B5')); 4.06-4.02
(m, 1 H, H-C(B4')); 4.20-4.10 (m, 2 H, H2-C(A5')); 4.22 (d,
3/A6_B6
=
8.0 Hz, 1 H,
152
7
Kap.
(d,
2Jah
6.3 Hz,
H-C(B6));
4.40
OCH2bO);
5.31-5.27 (m, 1 H,
=
1
H,
4.97
OCH2aO);
3/Br.B2'
H-C(B3')); 5.44 (dd,
2Jab
(d,
=
8.6 Hz,
=
6.3
Hz, 1 H,
3/Br_B2'
=
3.1
Hz, 1 H, H-C(Bl')); 6.01-5.99 (m, 1 H, H-C(Al')); 10.66 (s, 2 H, H-N(A3), H-
N(B3)). i3C-NMR (125 MHz, d6-DMSO):
19.28
(CH3C(5));
19.32
(ÇH3C(5));
20.34
(2x £H3COO); 36.31 (C(B2')); 37.63 (C(A2')); 45.47 (C(5)); 46.97 (C(5)); 57.04
(C(A6)); 61.99 (C(A5'));
64.51
(C(B6)); 70.46 (C(B5')); 74.55 (C(B3')); 76.36,
78.98
(C(A3'), C(A4')); 81.67 (C(Al')); 83.89 (C(B4')); 91.24 (C(Bl')); 97.31 (OCH20);
150.60 (C(4)); 151.30 (C(4)); 170.17, 170.18, 170.45, 171.04
MS
(2xÇOOCH3,
2x
C(2)).
(FAB+): 1161.2 (6, M2H+), 603.1 (12, MNa+), 582.0 (30), 581.0 (100, MH+),
580.1
(19, M+), 522.1 (20), 521.0 (54, M
(14), 345.0 (11),
339.2
(12), 338.2
411.0
H3CCOO),
-
HRMS
(45).
(19),
für
ber.
393.0
(13),
391.1
(C25H32N4012H+):
581.2095, gef: 581.2097.
5A-(R),5B-(S),6A-(R),6B-(S)-[cis,syn]-cyclobutandimer
C:
106 des
5'-0-Acetyl-thymidinyl-3',5'-methylen-3'-acetyl-thymidins
A
OB
o
ÏÏ Me Me ÏÏ
HN
NH
<XK.A
kMAv
H
I
H
1
j6 fi,
p—S
Of
o
o-
o
106
Rf (EE/MeOH 13.5:1)
3100 w,
2978
14515, 1412
0.37.
2911 w,
w,
m,
=
756 m, 738
454
w.
1122 s,
1104 s,
1669 5,
1290 5,
1266 5,
1228 5,
1628 m,
1195 m,
1468 5,
1152 m,
1024 s, 994 m, 977 m, 939 m, 886 w, 840 w, 805 m,
640 w,
622 w,
604 m,
570 w,
538 w,
502 w,
472 w,
(m, 1 H, H2a-C(B2')); 2.04 (s, 3 H, H3CCO); 2.05 (s, 3 H, H3CCO); 2.27-
(m, 1 H, H2a-C(A2')); 2.39 (ddd,
6.8 Hz, 1 H,
H2b-C(B2'));
3/B5._B4<
2/ab= 9.9 Hz,
Hz,
699 w,
s,
IR: 3646 m, 3536 m, 3243 m,
iH-NMR (500 MHz, DMSO-d6): 1.31 (s, 3 H, H3C); 1.38 (s, 3 H, H3C);
1.88-1.92
2.33
w,
1146
229°C (Zers.).
1370 m,
1388 m,
1110 m, 1066 5, 1048 s,
Smp.:
=
3.3 Hz, 1 H,
1 H,
12.9 Hz,
=
2.67-2.72 (m, 1 H,
H2a-C(B5'));
H2b-C(B5'));
2Jab
1 H, OCH2bO); 5.14 (dd, 3JBy_BT
10.4 Hz, 3JB1,.B2,
(dd, 3/Br_B2.
Hz, 1 H, H-C(B6)); 4.71 (d,
3JB2'_Br
H2b-C(A2'));
3.75-3.78 (m, 1 H,
=
10.4
3.67
Hz,
(dd, br,
H-C(A4'));
3/B2'.B1.
2Jab 9.9
=
=
3.84
(d, br,
3JA6.B6 6.6
3 H, H-C(A3'), H2-C(A5')); 4.29 (d, 3/B6_A6
6.6
7.2 Hz, 1 H, OCH2aO); 4.74 (d, 2Jab
7.2 Hz,
6.8 Hz, 3/B31_B4,
1.7 Hz, 1 H, H-C(B3')); 5.77
4.8 Hz, 1 H, H-C(Bl')); 5.94 (t, 3JAV-A2<= 6.2 Hz,
3.90
Hz, 1 H, H-C(A6)); 4.05-4.15 (m,
=
2Jah
(br,
1
H,
H-C(B4'));
4.05
(d,
=
=
=
=
=
=
=
Kap.
153
1
H,
H-C(Al')); 10.48 (s,
d6-DMSO):
MHz,
(CH3COO);
57.31
1
H-N(3)); 10.55 (s,
H,
(CH3-C(B5));
17.09
1 H
(CT3C(A5));
17.90
13C-NMR (125
H-N(3)).
20.63
63.41
(C(A5'));
(C(A4')); 80.66 (C(B4'));
(C(B6));
(C(B5')); 72.06 (C(B3')); 76.80 (C(A3*)); 79.03
65.33
85.62
(C(Al'));
84.22
20.77
(ÇH3COO);
33.65 (C(B2')); 34.54 (C(A2')); 46.23 (C(5)); 49.63 (C(5)); 55.22
(C(A6));
7
(C(Bl'));
94.07
(OCH20);
152.86
MS
(C(4)); 153.46 (C(4)); 169.96, 170.18, 170.20, 170.92 (2x ÇOOCH3, C(2)).
(FAB+): 1183.3 (12, M2Na+), 1161.2 (25, M2H+), 603.1 (100, MNa+), 581.1 (68,
580.1
MH+),
(580.55
(16, M+),
H20):
+
C
521.1
Hydrolyse
Je 50 mg der
der Struktur
halbe Stunde auf 100°C erhitzt.
dabei schwarze Flocken aus,
Cyclobutanring
am
vacuo
wurden in
95
aus
der
Hydrolysen
erhalten.
Hydrolyse
von
93
je
Aus den Reaktionen der
aus
der Reaktion der
10 ml
•
H20
durch
4 N Salzsäure für eine
Verbindungen
Verbindung
95
von
und 94
95
Die Produkte wurden mittels
u.
94 fielen
nicht.
Die
aufgenommen.
Der
Methanol
gewaschen.
bzw.
9 mg
10 mg
eines
Es
Aus den
eines farblosen Pulvers erhalten.
19 mg
wurden
warmen
93
hingegen
entfernt und der Rückstand in Methanol
unlösliche Bestandteil wurde abfiltriert und dreimal mit
wurde
C25H32N4012
des Zuckers
Verbindungen 93, 94,
Salzsäure wurde in
Anal. ber. für
(68).
491.1
50.17, H 5.73, N 9.36, O 34.76; gef.: C 50.42, H 5.81, N 9.26.
Zuordnung
7.3.5
(68),
gelblichen
Pulvers
lH-NMR-Spektroskopie (200 MHz, d6-DMSO)
untersucht.
[trans syn] -Uracilcyclobutandimer 96: Produkt
H
H
H
von
93:
h
96
iH-NMR (200 MHz,
2
d6-DMSO):
8= 3.22 (d, 3J -8.3 Hz, 2 H, H-C(5)); 3.82-3.89 (m,
H, H-C(6)); 8.02 (d, 3J -2.1 Hz, 2 H, H-N(l)), 10.23 (s, 2 H, H-N(3)).
(200 MHz, d6-DMSO
durch HOD.
+
D20): <5=
3.22
13C-NMR (50.3 MHz,
(C(2)); 168.80 (C(4)).
(d, 3J
-8.3
d6-DMSO):
iH-NMR
Hz, 2 H, H-C(5)); H-C(6) verdeckt
8= 35.29 (C(5)); 51.77 (C(6)), 150.48
Kap.
154
7
[trans,syn] -Uracilcyclobutandimer
96: Produkt
O
HN
von
94:
O
KIAX NH
Ö
'Nr.
J
H
H
H
N
H
96
iH-NMR (200 MHz,
2
d6-DMSO):
8= 3.22 (d, 3/~7.9 Hz, 2 H, H-C(5)); 3.82-3.89 (m,
H, H-C(6)); 8.02 (d, 3J -2.1 Hz, 2 H, H-N(l)); 10.23 (s, 2 H, H-N(3)).
(200 MHz, d6-DMSO
+
D20):
8= 3.22 (J, 3J -8.3 Hz, 2 H, H-C(5)); H-C(6) verdeckt
13C-NMR (50.3 MHz,
durch HOD.
iH-NMR
d6-DMSO):
8= 35.29 (C(5)); 51.77 (C(6)); 150.48
(C(2)); 168.80 (C(4)).
[eis, syn] -Uracilcyclobutandimer 97: Produkt
von
O
HN^nA
O^N
rN
H
95:
O
H
H
NH
O
H
97
iH-NMR (200 MHz,
3.85-3.95 (m, 2 H,
d6-DMSO):
H-C(6)); 7.60 (s,
(200 MHz, d6-DMSO
H-C(5));
3.92
d6-DMSO):
7.4
(2 d,
8= 3.48 (2 d, 3J -3.7 Hz, 3J -3.3 Hz, 2 H, H-C(5));
+
D20): 8
3/56
-3.3
=
Hz,
2
3.51
3J56
H, H-N(l)), 10.0 (s, 2 H, H-N(3)).
(2 d,
-3.7
3J5_6
-
3.3
Hz, 3J
Hz, 2 H, H-C(6)).
5_6
-
3.7
iH-NMR
Hz, 2 H,
13C-NMR (50.3 MHz,
8= 35.29 (C(5)); 51.77 (C(6)), 150.48 (C(2)), 168.83 (C(4)).
Überführung
der
Belichtungsprodukte
in die
Phosphoramidite
7.4.1
Verseifung
der Photodimere und
Dinukleoside
5A-(R),5B-(S),6A-(R),6B-(S)-[cis,syn]-cyclobutandimer
uridyl-3',5'-methylen-3'-benzyl-2'-desoxyuridins
107 des
2'-Desoxy-
155
95
(355 mg, 0.55 mmol)
und 1 N NaOH
und
Bu4NBr (16
mg,
0.05
2933 w,
0.18.
(280
Smp.:
3 h wurde das Solvent in
IR
1702
(C=0),
(m,
2
2
(m,
2
107
3443 m, 3222 m,
1455 s,
lH NMR: (500 MHz, d6-
w.
H, H-C(B2')); 2.39-2.41 CT,
1372 m,
2
H, H-C(A2')); 3.40-3.46
H, H2-C(A5')); 3.61-3.65 (m, 4 H, H-C(A5), H-C(B4'), H-C(B5), H2a-C(B5'));
3.82-3.83
(m,
1.96-2.10
(KBr):
(C=0),
vs
1274 5, 1189 w, 1094 s, 1024 s, 756 w, 733 w, 700
DMSO): 8=
vacuo
mmol, 91%).
174°C (Zers.).
>
1739 sh
2878 w,
mg, 0.5
7
(9 ml)
chromatographisch gereingt (FC: CHCl3/MeOH 10:1).
wurde als farbloser Schaum erhalten
Rf (CHCl3/MeOH 10:1):
wurden in THF
mmol)
(3 ml) gelöst. Nach heftigem Rühren für
entfernt und der Rückstand
3078 w,
Kap.
(m, 1 H, H B-4'); 3.89 (d,
2/gem
=
10.1 Hz, 1 H,
H2b-C(B5'));
4.11-4.16
H, H-C(A3'), H-C(B3')); 4.40-4.54 (m, 4 H, OCH2Ph, H-C(A6), H-C(B6));
4.69 and 4.74 (2d,
HO-C(A5'));
2/gem
=
8.0 Hz, 2 H,
5.76-5.79 and 5.80-5.83
OCH20);
4.81
-
4.83
(t, 3J
5.9 Hz,
=
1
H,
(m, 2 H, H-C(Al'), H-C(Bl')); 7.27-7.37 (m, 5
H, Ar-H); 10.43 (s, 1 H, H-N(B3); 10.50 (s, 1 H, H-N(A3)); 13C NMR (125.8 MHz,
d6-DMSO):
51.31
77.29
8= 33.46 (C(2')); 34.22 (C(2')); 39.11 (C5,
(C(6)); 52.89 (C(6)); 60.75 (C(5')); 65.00 (C(5'));
(C(3*));
(OCH20);
80.95
127.44
(C(4'));
82.54
(C(4')); 84.51
unter
70.42
DMSO); 40.47 (C(5));
76.04 (C(3'));
(CH2Ph);
(C(l')); 85.49
(C(l'));
93.74
(3 Ar-C); 128.18 (2 Ar-C); 138.04 (Ar-C); 152.98 (C(2)); 153.39
(C(2)); 167.16 (C(4)); 167.28 (C(4)); MS (FAB+): m/z (%): 1139 (17) [M2++Na], 581
(100)
[M++Na], 559
(44)
[M++1],
431
[M+-C7H1304+Na],
(14)
C26H31N4O10
([M+H]+). HRMS ber. für (C26H30N4O10H+): 559.2040; gef. 559.2050.
5A-(R),5B-(S),6A-(R),6B-(S)-[cis,syn]-cyclobutandimer
108 des
2'-Desoxyuridyl-3',5'-methylen-2'-desoxyuridins
108
Methode A
(aus 102):
Ballon verschlossenen
0.65 g
(1.09 mmol,
Apparatur
in
Wasser für 3 h auf 80°C erhitzt. Nach
30 ml
1.0
eq)
102
25%-iger Ammoniumhydroxidlösung
Einengen
der
Reaktionslösung
Essigsäure aufgenommen
und zweimal mit
Methylenchlorid
Phase wurde
der Rückstand
in Wasser
eingeengt,
wurde in einer mit einem
aus
gelöst
wurde in
geschüttlet.
und bis
zur
Die
in
10%-iger
wässrige
beginnenden
156
7
Kap.
farbloses, mikrokristallines Pulver
Ultraschallbehandlung
mmol,
1.37
g,
Rückstand
Der
Methanol
gesättigem
gelöst
Niederschlags gelagert.
Der
getrocknet.
5 ml
und
aufgenommen
Methanol
0.00.
154-144° C
Smp.:
Filtrat wurde
-20°C
der
zur
farblosen
2875 w,
2933 w,
(Zers.).
(KBr): 3522 sh, 3459
1708
(C=0), 1678
12815, 1256
vs
1446 5,
1070 m,
1018 5, 978 w, 948 w, 882 w, 854 w, 788 w, 774 w,
1410 5,
1372 m,
iH-NMR (500 MHz,
m.
Niederschlag
bei
80 mg
weitere
Auf diese Weise konnten
Das
1479 m,
474 w, 420
und für 10 h
Reaktionslösung
Die
Niederschlag.
und im Hochvakuum
in
2954 w,
3061 w,
m,
des
wurde unter Rühren und
eq)
(0.16 mmol, 10%).
Substanz erhalten werden
Rf (CHCl3/MeOH 5:1):
1.0
mmol,
81%) wurde mit einer Glasfilternutsche abfiltriert, mit wenig
Kristallisation aufbewahrt.
3259
1.7
mg,
Alterang
zur
gewaschen
eiskaltem Methanol
eingeengt.
(970
in 50 ml mit Ammoniak
wurde über Nacht bei -20°C
(0.666
aus.
Dabei bildete sich ein farbloser
gerührt.
bei 0°C
103
(aus 103):
Methode B
108 als
(0.64 mmol, 59%)
Es kristallisierten 300 mg
mit Ethanol versetzt.
Trübung
d6-DMSO):
2.38-2.40
10992 5,
756 w, 636 w,
8= 1.74-1.79(m, 1 H,
3JAV.AT
(C=0),
vs
1134 m,
1192 m,
m,
s,
H2a-C(B2'));
5.9 Hz, 2 H,
H-C(A2'));
2.03-2.09
(m,
1
H,
3.38-3.47
(m,
2
H, H2-C(A5')); 3.56-3.58 (m, 1 H, H-C(B4')); 3.59-3.64 (m, 4 H,
H2b-C(B2'));
(t,
2/B5,a_B5,b
H-C(A4'), H2a-C(B5'), H-C(A5), H-C(B5)); 3.87 (d,
H2b-C(B5'));
od.
4.13-4.17
H-C(B6));
4.5-4.49
-
9.9
~
1
Hz,
H,
(m, 2 H, H-C(A3'), H-C(B3')); 4.34-4.49 (m, 1 H, H-C(A6)
(m,
1
2Ja_b
3/A5'_A5'_oh
H, H-C(A6) od. H-C(B6)); 4.70 (d,
-
7.4 Hz, 1 H,
5.4 Hz, 1 H,
2Ja_b 7.4 Hz, 1 H, OCH2bO); 4.82 (t,
4.8
C(A5')-OH); 5.21 (d, 3/B3..B3..0H 4-8 Hz, 1 H, C(B3')-OH); 5.77 ("t", 37Ar.A26.0 Hz, 1 H, H-C(Bl'));
8.4 Hz, 3/Br_B2'a
Hz, 1 H, H-C(Al')); 5.85 (dd, 3/Br.B2'b
OCH2aO);
4.74
(d,
-
~
~
-
-
10.43
i3C-NMR (125.8 MHz,
(5, 2 H, H-N(A3), H-N(B3)).
(C(A2'V); 36.72 (C(B2')); 38.93
(C(B6));
60.85
(C(A4'));
83.10
153.27 (C(A2)
(MNa+).
u.
C(B2)); 167.23
Zur Kristallstruktur:
u.
C19H24N4O10
H
mm
Methoden
und
C(B5)); 51.15
u.
53.15
34.13
=
(C(A6))
5 mg
•
(C(A4)
Kantenlänge.
H20 (468.42
& Daten siehe
108 in 0.5 ml
Gewichten
MS
C(B4)).
+
H20):
C
82.72
u.
(MALDI): 491.4
46.91,
H
5.39, N
Anhang)
Wasser wurde nach der
Die Kristallstruktur
(SHELXTL PLUS) gelöst
experimentellen
u.
u.
5.19, N 11.38.
(ORTEPPLOT
von
167.44
methode Ethanol eindiffundiert. Dabei entstanden
0.05
u.
8
(C(B4')); 84.73 (C(Al')); 85.09 (C(Bl')); 93.84 (0-CH2-0); 153.08
Anal. ber. für
Lösung
40.63 (C(A5)
u.
d6-DMSO):
(C(A5')); 64.98 (C(B5')); 67.80 (C(B3')); 77.26 (C(A3'));
11.52, O 36.18; gef: C 46.68,
In eine
-
Dampfdiffusions¬
quadratische Plättchen
wurde
und mit voller
von
Dr.
P.
von
0.1
x
0.1
x
Seiler mit direkten
Matrix, kleinsten Fehlerquadraten
(Schweratome anisotrop,
H-Atome reitend und
isotrop
157
fixiert) verfeinert. C19H24N4Oio
1.54 g
cm-3,
104.38
(1), y
2659
Z
=
=
2,
a
=
90.00°, V
(2), b
9.398
=
H20, Mr
•
=
Variable und 2425 als beobachtet
7
486.4; monoklin, Raumgruppe P2^ pber.:
=
9.886 (1),
c
R-Werte
(R(F)
Â,
11.647(1)
=
À3, MoKa-Struktur (k
1048.2 (2)
unabhängige Reflexe; endgültige
Kap.
a
0.71073
=
0.026, wR(F)
=
eingestufte Reflexe (F >
3.0
=
=
ß
90.00,
Â),
20
0.033)
<
=
28°,
für 346
a(F)).
5A-(R), 5B-(R), 6A-(R), 6B-(R)-[trans, syn-ll]-cyclobutandimer
111 des
2'-Desoxyuridyl-3',5'-methylen-2'-desoxyuridins
A
OB
o
111
99
(400
mg,
0.72
1.0
mmol,
wurde in mit Ammoniak
eq)
(10 ml) gelöst und bei 0 °C gerührt.
entfernt und der Rückstand
aus
Nach 24 h wurde das
90%-tigem
als ein farbloses, mikrokristallines Pulver
Rf (CHCl3/MeOH 5:1):
1457 m,
761
2.05
w.
1372 m,
0.25.
1322 w,
iH-NMR (500 MHz,
1
(m,
H,
H2b-C(B2'));
H-C(B5));
Smp.:
2.81-2.86
3.40-3.45
1211 w,
d6-DMSO,
H2a-C(B2*));
(160 mg,
enthält noch
2.26-2.32 (m,
(m,
1
0.33 mmol,
H,
1
H,
ca.
3.17-3.21
(m, 1 H, H2a-C(A5')); 3.50-3.52 (m,
1698
s,
vs
1033 m,
2.56-2.61
Hz,
37B4._B5.b=
4.49
(m,
3
H-C(B6));
1.8
(m,
1 H,
2
H,
1
H,
H-C(A5),
H-C(A4')); 3.59-3.56
2Ja.b
=
Hz, 1 H, H2b-C(B5')); 4.14-4.18 (m, 1 H, H-C(A3')); 4.37-
H, OCH2aO, H-C(A6) od. H-C(B6), H-C(B3')); 4.70 (m, 1 H, H-C(A6) od.
4.89-4.93 (m, 2 H,
OCH2bO, C(A5')-OH);
3/Br_B2.a
(^,37A1..A2.a~8.2Hz,3/A1,.A2,b~
C(B3')-OH);
5.28
(dd,
10.61 (5, 1 H, H-N(3)).
Reste): 8=
968 w,
(m,
(m, 2 H, H2b-C(A5'), H2a-C(B5')); 3.73-3.76 (m, 1 H, H-C(B4')); 3.86 (dd,
11.0
(C=0),
Ethanol-Reste): 8= 1.98-
H2a-C(A2'));
H2b-C(A2'));
vacuo
46%).
1092 m,
20%
in
Es kristallisiert 111
(KBr): 3436
1161 w,
Methanol
Lösungsmittel
Ethanol umkristallisiert.
>194° C (Zers.).
1274 m,
gesättigtem
18.45
-
8.5
Hz,
3.1
3/Br.BZb
-
5.05
3.3
(d, 3J
-
5.1
Hz,
1
H,
Hz, 1 H, H-C(Bl')); 5.95
Hz, 1 H, H-C(Al')); 10.39 (s, 1 H, H-N(3));
i3C-NMR (125.8 MHz, d6-DMSO, enthält
noch Ethanol-
(EtOH); 37.68; 38.75; (beide C(5) verdeckt durch DMSO);
52.25;
55.92 (EtOH); 59.29; 60.92; 69.88; 70.71; 75.91; 81.92; 82.96; 86.17; 91.26; 97.03;
150.31; 151.70; 169.71; 170.01.
MS
(MALDI):
491
(27, MNa+); 469 (100, MH+).
158
7
Kap.
Anal. ber. für
C19H24N4O10
•
H20 (468,42
+
C
H20):
46.91, H 5.39, N 11.52, O
36.18; gef: C 46.75, H 5.53, N 11.45.
5A-(S),5B-(S),6A-(S),6B-(S)-2'-[trans,syn-l]-cyclobutandimer
112 des
2l-Desoxyuridyl-3',5'-methylen-2'-desoxyuridins
112
101
(450
mg,
0.72
mmol,
1.0
wurde in mit Ammoniak
eq)
(10 ml) gelöst und bei 4°C gerührt. Nach
und
der
Rückstand
0.75 ml
aus
24 h wurde das
Wasser
und
gesättigtem
Lösungsmittel
5 ml
Ethanol
in
Methanol
vacuo
entfernt
umkristallisiert.
Es
kristallisiert 112 als ein farbloses, mikrokristallines Pulver (247 mg, 0.53 mmol, 73%).
Das NMR der
Verbindung
Rf (CHCl3/MeOH 5:1):
konnte nicht
0.25. MS
interpretiert
werden.
(FAB+): 469 (10, MH+); 338 (100, [M-C6H10O3]+.
5A-(R),5B-(S),6A-(R),6B-(S)-[cis,syn]-cyclobutandimer
110 des
5'-0-Thymidinyl-3\5'-methylen-thymidins
Me
B
O
O
MejT
NH
110
106
RT,
(933
mg,
1.61
mmol) wurde in
unter Ar über Nacht
gerührt.
auf. Das Produkt 110 erhielt
man
vacuo
und Trocknen
wenig
Wasser auskristallisiert.
am
NH3/MeOH (130 ml) suspendiert
und bei
Während der Reaktion löste sich das Edukt
langsam
in
ges.
quantitativer Ausbeute
HV über Nacht. Für die
nach
Entfernung
des LSM in
Röntgenstmkturanalyse wurde
110
aus
159
Rf (EE/MeOH 13.5:1)
2865 w,
0.03; Rf (DCM/MeOH 10:1)
=
3463 m,
IR: 3547 m,
1448 m,
1389 m,
Smp.:
0.04.
=
3195 m,
3257 m,
3414 m,
1683 5,
1112 s,
Kap.
3083 w,
2971 w,
1220 m,
1294 m,
231°C
7
(Zers.).
2910 w,
1102 m,
1170 m,
1087 m, 1024 m, 990 m, 951 m, 844 w, 816 w, 785 w, 763 w, 651 w, 615 w,
540 w, 462
H3CC(5));
3H,
1.77-1.81
2.19-2.24 (m, 1 H,
2
(m,
1.30
3
(s,
H3CC(5));
H,
1.37
(s,
H, H2a-C(B2')); 2.08-2.14 (m, 1 H, H2b-C(B2'));
1
(m,
H2a-C(A2'));
3.50-3.56
H2a-C(A5'));
d6-DMSO):
iH-NMR (500 MHz,
w.
2.68-2.73 (m, 1 H,
H, H-C(A4')
u.
3.41-3.44
H2b-C(A2'));
3.60-3.63
H2b-C(A5'));
(m,
(m,
1
1 H,
H, B-4');
3/B5<a_B4' 4.3 Hz, 1 H, H2a-C(B5')); 3.87 (d, 2Jah 11.1
6.6 Hz, 1 H, H-C(6)); 4.21-4.15 (m, 2 H,
Hz, 1 H, H2b-C(B5')); 4.13 (d, 2Jah
7.2 Hz,
6.6 Hz, 1 H, H-C(6)); 4.70 (d, 2Jab
H-C(A3') u. H-C(B3')); 4.23 (d, 2Jah
7.2 Hz, 1 H, OCH2bO); 4.86-5.88 (m, 1 H, C(A5')1 H, OCH2aO); 4.72 (d, 2Jab
3.65
2Jab
(dd,
11.1
=
Hz,
=
=
=
=
=
=
OH); 5.18 (d, 3J
5.91
(m,
1
=
4.8 Hz, 1 H,
C(B3')-OH); 5.84-5.87 (m,
1
H-C(Bl')); 5.89-
H,
H, H-C(Al')); 10.38 (s, 1 H, H-N(3)); 10.48 (s, 1 H, H-N(3)).
13C-NMR
(125 MHz, d6-DMSO): 16.95; 17.62; 34.67; 37.24; 46.12; 49.74; 54.90; 57.29; 60.25;
65.92; 68.17; 75.64; 82.54; 83.30; 84.14; 84.97; 94.11; 153.07; 153.14
171.12.
(26),
+
MS
1015.1
(FAB+):
(2, M2Na+),
497.1 (100, MH+), 496.1 (14, M+).
H20):
C 49.03,
H
993.2
Anal. ber. für
C21H28N4O10
Aus einer
von
Kantenlänge)
5 mg
110
Lösungsmittels
Methoden (SHELXTL PLUS)
und
experimentellen
fixiert) verfeinert.
(k
=
À,
0.71073
a
=
À),
0.0312, wR(F)
=
Wasser kristallierte
in Form farbloser Kristalle
gelöst
Gewichten
90.00°, ß
2°
H20 (496.48
<
d
0.0756)
<
1.51 g
=
Dr.
von
und mit voller
V.
(0.5
durch
X
0.5
Grämlich
langsames
x
mit
0.5
mm
direkten
Matrix, kleinsten Fehlerquadraten
(Schweratome anisotrop, H-Atome reitend und isotrop
C21H28N4O10
Raumgruppe P212121: pber:
17.620 (5)
110
in 0.5 ml
Die Kristallstruktur wurde
aus.
•
498.1
5.88, N 10.89, O 34.21; gef: C 49.13, H 5.79, N 10.87.
(ORTEPPLOT und Daten siehe Anhang)
Verdunsten des
170.03;
(7, M2H+), 519.1 (27, MNa+),
Zur Kristallstruktur:
Lösung
;
•
H20, Mr
cm"3,
90.00°, y
=
Z
=
4,
=
a
90.00°, V
496.48
=
=
9.787
+
H20; orthorhombisch,
(4),
b
2263.7 (13)
=
13.127
(4),
c
À3, MoKa-Struktur
33°, 4576 unabhängige Reflexe; endgültige R-Werte (R(F)
für 446 Variable und 4576 als beobachtet
=
eingestufte
Reflexe.
=
Kap.
160
7
114 des
5A-(S),5B-(S),6A-(S),6B-(S)-[trans,syn-l]-cyclobutandimer
5'-0
-
Thymidinyl-3', 5'-methylen-thymidins
OB
o
ÏÏ Me Me
A
HN"^f—V"
^NH
110
104 (0.941 g, 1.62
Nacht bei RT
mmol)
vacuo
Rf (EE/MeOH 13.5:1)
=
und unter Ar über
NH3/MeOH (60 ml) gelöst
Das Produkt 114 erhielt
gerührt.
Entfernen des LSM in
wurde in ges.
und Trocknen
am
in
man
quantitativer
Ausbeute nach
HV über Nacht.
0.19; Rf (DCM/MeOH 10:1)
0.18.
=
Smp.:
221°C
(Zers.).
IR: 3485 m, 3327 m, 3005 w, 2972 w, 2937 w, 1732 s, 1708 5, 1687 s, 1481 m,
1449 m, 1400 m, 1379 m,
1072 m,
1094 m,
1132 m,
464 w, 422
1.58
1030 5, 964 w, 950 w, 918 w, 899 w, 875 w,
1050 m,
694 w, 629 w, 611 w,
853 w, 762 m, 753 m, 711 w,
iH-NMR (300 MHz,
w.
d6-DMSO):
(m, 1 H, H2a-C(2')); 2.05-2.16 (m,
1
C(B5'));
2
(m,
547 w,
1.55-
H, H2b-C(2')); 2.55-2.69 (m, 1 H,
H2a-
3
3.81-3.86
H, H-C(A4'), H2-C(A5'));
(m,
2
H-C(A6), H2b-
H,
(m, 1 H, H-C(B4')); 4.17-4.27 (m, 2 H, H-C(B6), H-C(B3'));
4.03-4.05
4.63-4.79 (m, 3 H,
563 w,
H3CC(5));
H2a-C(B5'));
H, H-C(A3'),
590 w,
1.24 (s, 6 H, 2x
C(2')); 3.02-3.10 (m, 1 H, H2b-C(2')); 3.37-3.45 (m,
3.74-3.77
1171 m,
1189 m,
1228 m,
1283 m,
1358 m, 1303 m,
OCH20, HO-C(A5'));
5.16-5.19
(m,
2
H, C(B3')-OH, H-C(Bl'));
5.15-5.57 (m, 1 H, H-C(Al')); 10.44 (s, 1 H, H-N(3)); 10.69 (s, 1 H, H-N(3)).
13C-
NMR(75 MHz, d^-DMSO): 20.27; 22.59; 32.62; 36.14; 43.70; 46.19; 57.84; 62.04;
65.49; 66.35; 66.49; 82.96; 83.03; 83.34; 84.73; 90.57; 95.76; 150.51; 152.45; 169.84;
170.28.
MS
(FAB+, Glyzerin): 519.1 (13, MNa+), 498.1 (39), 497.1 (100, MH+).
HRMS ber. für
([C2iH28N4O10]+): 497.1883; gef.
Zur Kristallstmkmr:
(ORTEPPLOT und
Aus einer
von
Lösung
Verdunsten des
Kantenlänge)
Methoden
und
Lösungsmittels
114
114
in 0.5 ml
Anhang):
Wasser kristallierte
in Form farbloser Plättchen
Die Kristallstmkmr
aus.
wurde
von
V.
Dr.
(0.5
durch
x
0.4
Grämlich
langsames
x
0.2
mit
mm
direkten
(SHELXTL PLUS) gelöst und mit voller Matrix, kleinsten Fehlerquadraten
experimentellen
fixiert) verfeinert.
P2i: pber:
5 mg
Daten siehe
497.1881.
1.22 g
Gewichten
(Schweratome anisotrop,
C2iH28N4O10
cm"3,
Z
=
2,
a
•
H20, Mr
=
11.601
=
496.48
(9),
b
=
+
H-Atome reitend und
isotrop
H20; monoklin, Raumgmppe
6.847
(3),
c
=
146.26
(9)
Â,
a
=
Kap.
161
90.00°,
ß
Â),
6< 50°, 1291
=
3
<
=
100.30
(5)°, y
90.00°, V
=
=
1143.1
(12)
unabhängige Reflexe; endgültige
Ä3, CuKa-Struktur (X
R-Werte
(R(F)
=
7
1.54178
0.0497, wR(F)
=
0.1283) für 327 Variable und 1291 als beobachtet eingestufte Reflexe (F > 1.0 o(F)).
5A-(R),5B-(R),6A-(R),6B-(R)-[trans,syn-ll]-cyclobutandimer
113 des
5'-0-Thymidinyl-3',5'-methylen-thymidins
A
o
y
OB
Me Me ÏÏ
113
105
(-20 mg)
wurde in ges.
NH3/MeOH (10 ml) gelöst und unter
Nach entfernen des LSM in
gerührt.
höchst wahrscheinlich das Produkt 113.
Ausbeutebestimmung
und
Röntgenstruktur zu züchten,
und Trocknen
vacuo
Aufgmnd
Charakterisiemng
der
am
Ar über Nacht bei RT
HV über Nacht erhielt
geringen Menge
verzichtet
hierfür wurde das Produkt in
um
wenig
man
wurde auf eine
Kristalle
für
heissem Wasser
eine
gelöst.
Es konnten aber keine Kristalle erhalten werden.
2 '-Desoxyuridyl-3', 5 '-methylen-2 '-desoxyuridin 115
A
OB
o
HN
HN'
]|
O^N'
O^N^
U
WO—S
Ù
/
v-b
o
OH
115
91
(1.8
g, 3
in 50 ml
mmol, 1.0 eq) wurde in einer mit einem Ballon verschlossenen Apparatur
25%-iger Ammoniumhydroxidlösung
in Wasser für 3 Stunden auf 80°C erhitzt
Nach Abkühlen wurde dreimal mit Chloroform
wurde
Das
eingengt,
der Rückstand in Ethanol
Reaktionsprodukt
wurde
und auf 2.5 g
Die
wässrige
Phase
Kieselgel aufgezogen.
säulenchromatographisch (DCM/MeOH 10:1) gereinigt.
wurde 115 als farbloses Pulver
Methanol umkristallisiert.
gelöst
ausgeschüttelt.
(1.2 g, 2.6 mmol, 85%) erhalten.
Dieses wurde
Es
aus
7
Kap.
162
Ausbeute: 880 mg
(1.88 mmol, 62.7%) 115.
Rf (CHCl3/MeOH 5:1):
0.27.
3056 w,
2935 w,
2867 w,
1433 w,
1384 m,
1279 5,
944 m, 860 w,
DMSO): 8
816
1711
140-142° C.
(C=0), 1674
vs
1193 m,
3
(m,
37A5..A4.
H,
3420 m, 3267 m, 3100 w,
IR(KBr):
1169 w,
(C=0),
vs
1106
1620 sh,
1467 s,
1056 5,
10315,
1072 5,
5,
767 w, 558 m, 529 w, 421
m,
2.08-2.21
=
Smp.:
iH-NMR (500 MHz, d6-
w.
H2a-C(A2'), H2-C(B2'));
2.26-2.33
(m,
1
H,
2/B5-a_A5'b
10.9 Hz, 3/B5-a-B4'
5.0 Hz, H2a-C(B5')); 3.69 (dd, 1 H, 2/B5-a-A5'b
10-9 Hz, 3/B4,
3.9 Hz, H2b-C(B5')); 3.89-3.92 (m, 1 H, H-C(B4')); 3.95 (dd, 3JAy.M'
6.3
B5.b
3.6 Hz, 1 H, H-C(A4')); 4.20-4.30 (m, 1 H, H-C(B3')); 4.31-4.32 (m,
Hz, 3/A4lA5'
1 H, H-C(A3')); 4.74 u. 4.76 (2 d, 2Ja_b
7.0 Hz, 2 H, OCH20); 5.11 (s, br, 1 H,
3.57
H2b-C(A2'));
(d,
~
3.6 Hz,
H, H2-C(A5')); 3.63 (dd, 1 H,
2
~
~
~
-
-
-
~
5.34
C(A5')-OH);
B6
-
1 H,
A6
-
8.1
2
Hz,
(s, br,
H, C(B3')-OH); 5.64
1
H, H-C(A5), H-C(B5));
3/Br_B2'
H-C(Al')); 6.17 ("t",
8.1
Hz,
6.12
3/B5_B6
-
8.1
13C-NMR (125.8 MHz,
(dd,
u.
5.65
3JA5.A6 8.1
8.0 Hz, 3/Ar.A2'
(2 d,
3JAV-A2<
~
6.8 Hz, 1 H, H-C(Bl')); 7.67
-
7.84
u.
u.
85.04 (C(A4')
C(B5)); 140.23
u.
C(B4)).
ber. für
u.
d6-DMSO):
u.
140.27
C(B4'));
(C(A6)
MS (FAB+): 937
C19H24N4O10
0.5
•
3/B5.
6.0 Hz,
~
(2 d,
3/A5_
Hz, je 1 H, A6, B6); 11.3 (s, br, 2 H, H-N(A3), H-N(B3)).
8
=
38.92
(C(A2'));
39.02
(C(B2'));
(C(A5')); 67.81 (C(B5')); 70.53 (C(B3')); 76.51 (C(A3')); 84.06 (C(Al')
84.99
Hz,
~
u.
93.70
(0-CH2-0);
101.81
C(B6)); 150.32 (C(A2)
u.
u.
101.86
u.
C(B1'));
(C(A5)
0.5
+
H20):
C
u.
C(B2)); 162.96 (C(A4)
(10, M2H+), 491 (13, MNa+); 469 (100, MH+).
H20 (468.42
61.15
Anal,
47.8, H 5.28, N 11.74, O
35.19; gef: C 48.04, H 5.26, N 11.44.
2l-Thymidinyl-3',5,-methylen-2'-thymidin
A
[399]
116
OB
O
tVtV
°A ix
HO—/
/
0
OH
116
92
(1.00 g, 1.73 mmol) wurde in ges. NH3/MeOH (60 ml) gelöst und
Nacht bei RT
gerührt.
Entfernen des LSM in
vacuo
Rf (EE/MeOH 13.5:1)
d6-DMSO):
1.73
(s,
Das Produkt 116 erhielt
3
=
und Trocknen
am
man
in
quantitativer
unter Ar über
Ausbeute nach
HV über Nacht.
0.06; R{ (DCM/MeOH 10:1)
=
0.20.
iH-NMR (300 MHz,
H, H3CC(5)); 1.74 (s, 3 H, H3CC(5)); 1.95-2.23 (m, 4 H,
163
Kap.
H-C(A2'), H-C(B2')); 3.55-3.71 (m,
4
H, H2-C(A5'),
H-C(A4'), H-C(A3')); 4.18-4.30 (m,
2
H, H-C(A3'), H-C(B3')); 4.72 (d, 1 H,
7.2 Hz,
4.75
(d,
OH); 6.08-6.27 (m,
1 H,
1
OCH2aO);
1 H,
2/ab
=
H2-C(B5'));
OCH2bO);
7.2 Hz,
5.09
3.84-3.91
(br,
2
(m,
7
H,
2Jab
=
H, OH); 5.31 (br,
1
H, H-C(Al'), H-C(Bl')); 7.49 (s, 1 H, H-C(6)); 7.66 (s,
2
l3C-NMR (75 MHz,
H, H-C(6)); 11.26 (br, 2 H, H-N(A3), H-N(B3)).
d6-DMSO):
12.14, 12.17 (2x CH3); 36.89 (2x C(2')); 61.24 (C(5')); 67.97 (C(5')); 70.65 (C(3'));
(C(3')); 83.82, 83.85, 85.05,
76.95
109.62
85.08
(2x C(l'),
2x
(C(5)); 109.71 (C(5)); 136.04 (C(6)); 136.09 (C(6));
C(3')); 94.06 (OCH20);
150.62
(2x C(4)); 163.90
(2x C(6)).
7.4.2
Einführung
der
Dimethoxytritylgruppe
5A-(R),5B-(S),6A-(R),6B-(S)-[cis,syn]-cyclobutandimer
117 des
5'-0-Dimethoxytrityl-2'-desoxyuridyl-3',5'-methylen-2'-desoxyuridins
B
W V
CT
~.
O—S
MeO
/
-N' ^O
(
o
OH
-O
OMe
108
(150
mg, 0.32
(0.58 mmol,
mit 0.1 ml
400 mg
(1.1 mmol,
Argon gerührt.
Einengen
mmol, 1.0 eq) wurde
aus
Nach
1.8
3.7
117
unter
Argon
DIEA versetzt.
eq)
eq) Dimethoxytritylchlorid zugegeben
Entfernung
Toluol wurde
des
Pyridins
in
DCM/MeOH/NEt3 100:10:1) gereinigt.
wenig
gelöst
(207
mg, 0.27
eingetropft.
und über 15 h
bei 40°C und
vacuo
chromatographisch (FC:
und in Hexan
Pyridin gelöst
und
Anschliessend wurde in Portionen
100:2:1 nach
DCM
in 3 ml abs.
20
g
unter
zweimahgem
Si02, DCM/MeOH/NEt3
Das erhaltene
gelbliche Öl
Dabei wurde ein leicht
wurde in
gelbliches
Pulver
mmol, 88%) erhalten.
Gemäss NMR enthielt das Produkt nach dem Trocknen noch
Spuren
an
Triethylamin
und
Hexan.
Rf (CHCl3/MeOH 10:1):
3076 w,
2933 w,
sh,
1254 5,
1300
1707
0.24.
vs
1178 m,
Smp.:
154-156°C
(C=0), 1605
1094 w,
w,
(Zers.).
1509 m,
1067 w,
IR(KBr):
3434 m, 3244 w,
1467 m,
1447 m,
1034 m,
828 w,
790 w,
1378 w,
760 w,
583
164
7
Kap.
-
A2.a
6.6 Hz,
B5.b
(ddd,
H2b-C(B2'));
3.17
-
10.5 Hz,
3^B4'-B5'b
-
3jA2,a_A3.
2.94
H2a-C(B2'));
1 H,
d6-Aceton):
IH-NMR (500 MHz,
w.
6.5 Hz,
~
VB2'a-B2'b
(t, 3J
37B4,B5,a
3-3 Hz, 1
-
B5-A6)
~
~
2/A2'a-A2'b
H, H2b-C(A2'),
2
3/B2,b_B3,
6-5 Hz,
~
2.0 Hz, 1 H,
(dd,
3.41
3J(A5_A6
od.
2/B5'a.B5'b
B5.B6)
~
4.2 Hz,
2JB5<a_
10-5 Hz,
9.2 Hz,
~
37A5.B5
H-C(A5) od. H-C(B5)); 3.70-3.72 (m,
1.8 Hz, 1 H,
H2b-C(A5'));
7.0
=
1
4.00
4.48-4.52 (m, 1 H,
2Ja_b
H-C(A3')); 4.57-4.64 (m, 2 H, H-C(B3'), H-C(A6) od. H-C(B6)); 4.65 (d,
2Ja.b
-
OH-C(B3'), H-C(B4'), H2a-C(A5'), OCH3);
H.4Hz,3/A4LA5lb~
Hz, 1 H, OCH2aO); 4.67 (d,
3/Ar
13.3 Hz,
~
H, H-C(A5) od. H-C(B5)); 3.20 (dd,
H, H2b-C(B5')); 3.64 (ddd,
4/(A5.B6 od.
2/A5'a-A5'b
3/Bi'-B2'b
H2a-C(B5'));
3.6 Hz, 1 H,
H, H-C(A4')); 3.76-3.80 (m, 9 H,
W
13-35 Hz,
~
8.8 Hz, 1
~
(ddd,
2.09
=
H, H2a-C(A2')); 2.30-2.41 (m,
4.7 Hz, 1
-
8
3/(A5_A6
Hz, 1 H, OCH2bO); 4.97 (ddd,
=
7.0
od
B5.
2.0 Hz, 1 H, H-C(A6) od.
3JA6.B6 5.9 Hz, 4/(A5_B6 od B5_A6)
6.6 Hz, 1 H, H-C(Al')); 6.18
7.4 Hz, 3/Ar.A2'a
H-C(B6)); 6.08 (dd, 3JAV.ATb
(dd, 3/Bl'-B2'a 1Ä Hz> ^Bl'-BZb 4-1 Hz> 1 H, H-C(Bl')); 6.89 (2d, 3J 9.0 Hz, 4
-
B6)
8.8 Hz,
-
-
~
~
-
~
~
H, DMTr-H); 7.25-7.35 (m, 7 H, DMTr-H); 7.46 (2d, 3J~ 8.4 Hz, 2 H, DMTr-H); 9.35
(5,
2
H, H-N(A3), H-N(B3)).
38.69
(C(A2')); 39.36
55.57
(OCH3),
63.64
u.
43.77
13C-NMR (125.8 MHz, Aceton): 8
(C(A5)
u.
C(B5));
51.99
u.
113.96 (C3-DMTr); 127.90
u.
131.04
DMTr); 154.13
u.
154.38 (C(A2)
304
+
u.
C(B4)).
MS
(26.5, DMTrH+),
H20):
C 60.91 H
(FAB+):
303
(C4'-DMTr);
(C2-DMTr); 136.59
DMTr); 131.02
(C(A4)
35.89 (C(B2'));
(C(A6)
u.
C(B6));
(C(B5')); 65.87 (C(A5')); 69.56, (C(B3')); 75.69 (C(A3'));
(C(A4')); 84.29 (C(B4')); 85.81 (C(Al')); 86.38 (C(Bl'));
CH2-0);
54.98
=
u.
793
C(B2));
u.
128.68
(C-DMTr), 94.97 (O129.17
(C3'-
136.64 (Cl-DMTr); 146.01
(Cl'-
(C2'-DMTr);
(C4-DMTr); 166.71
159.81
(10.6, MNa+),
87.09
771
(13.9, MH+),
C
118 des
5'-0-Dimethoxytrityl-2'-thymidinyl-3',5'-methylen-2'-thymidins
OB
O
ÏÏ Me Me y
A
HN^N—KSjH
s
ß p.
O—S
ö
S
O
OMe
•
60.72, H 5.73, N 7.04.
5A-(R),5B-(S),6A-(R),6B-(S)-[cis,syn]-cyclobutandimer
MeO
770
(100, DMTr+). Anal. ber. für C40H42N4O12
5.62, N 7.10, O 26.37; gef:
82.21
118
OH
u.
168.28
(17.4, M+),
H20 (770.79
Kap.
165
110
(790
gelöst
wurde unter Ar über Nacht bei RT
Reaktionslösung
Nach
vacuo
und DMTrCl
entfernt und das restliche
gerührt.
Pyridin azeotrop
mittels FC (3 cm, 100 g, 0-9%
Reinigung
(719 mg,
(960
Rf (EE/MeOH 13.5:1)
0.28; Rf (DCM/MeOH 10:1)
1388 m,
1368
1176 m,
0.46.
=
0.94
(s,
3
(3x
20
entfernt.
ml)
man
Smp.:
1607 m,
das Produkt
151°C
(Zers.).
1448 m,
1509 m,
1057 m,
1097 m,
903 w, 829 w, 790 w, 754 w, 701 w, 583 w, 527 w, 457
d6-DMSO):
Die
Anschliessend wurde das
mit Toluol
1718 5,
2928 w,
1202 m,
1252 5,
m,
versetzt.
75.6%).
mg,
3063 w,
3214 m,
IR:3467w,
eq)
MeOH/DCM) erhielt
118 als farbloses Pulver
=
1.3
Pyridin (5 ml)
in
Pyridin (5 ml) eingeengt,
aus
Hünig-Base (0.5 ml)
und mit
LSM in
wurde
1.59 mmol)
mg,
7
1032 5,
959 m,
iH-NMR (500 MHz,
w.
H, H3CC(5)); 1.25 (s, 3 H, H3CC(5)); 1.80-1.84 (m,
1
H, H2a-
C(B2'V); 2.06-2.12 (m, 1 H, H2b-C(B2')); 2.33-2.39 (m, 1 H, H2a-C(A2')); 2.65-2.70
(m,
1
H,
C(A5'));
3.20
(dd,
2Jab
(dd,
3.01
H2b-C(A2*));
=
2Jab
10.4 Hz,
3JA4<.A5'a
10.4 Hz,
=
3/A4'_A5'b
=
2.8 Hz, 1
=
4.6 Hz,
1 H,
H2a-
H, H2b-C(A5')); 3.57-3.59
(m, 1 H, H-C(B4')); 3.66-3.69 (m, 1 H, H2a-C(B5')); 3.71-3.73 (m, 1 H, H-C(A4'));
3.74
(s, 6 H,
2x
OCH3);
H, H-C(6)); 4.12 (d,
3.80-3.88
3/A6.B6
=
=
4
8.2
Hz,
H, OCH2bO); 5.27 (d,
3/Bl-B2'
=
6-3 Hz,
H, DMTr-H); 7.21-7.38 (m,
1
H, H2b-C(B5')); 4.06 (d,
6.6 Hz, 1 H,
H-C(6));
(d,
(m,
1
=
6.6 Hz, 1
H, H-C(B3'));
=
=
=
H-C(Bl')); 5.98-6.01 (m,
9
4.22-4.25
3/A6.B6
2Jab 7.1 Hz, 1 H, OCH2aO); 4.63 (d, 2Jab
37H0-B3 4-8 Hz> 1 H, OH); 5.91 (dd, 1 H, 3/Br.B2'
4.26-4.30 (m, 1 H, H-C(A3')); 4.54
7.1 Hz, 1
(m,
H, H-C(Al')); 6.87-6.89 (m,
1
H, DMTr-H); 10.54 (s, 1 H, H-N(3)); 10.56 (s, 1 H,
H-N(3)). 13C-NMR(125 MHz, d6-DMSO): 16.92; 17.51; 34.75; 36.92; 54.95; 55.07;
57.22; 63.30; 65.09; 75.87; 80.83; 82.89; 84.06; 84.72; 85.39; 93.75; 113.03; 126.80;
127.69; 127.76; 129.67; 129.72; 135.08; 135.26; 144.49; 152.87; 153.04;
158.08;
169.78; 170.64. MS (FAB+): 822.5 (27), 821.4 (42, MNa+), 799.5 (19, MH+), 798.4
(25, M+), 732.6 (11),
ber. für
721.3
(14), 691.4 (26),
([C^H^^j2]+): 798.3112; gef.
304.2
(26),
303.2
(100, DMTr+). HRMS
798.3110.
5'-0-Dimethoxytrityl-2'-desoxyuridyl-3',5'-methylen-2'-desoxyuridin
A
OB
O
HN^
HN'
MeO
OMe
119
119
166
7
Kap.
(650
115
mmol, 1.0 eq) wurde
mg, 1.4
mit DIEA
(0.3 ml, 1.74 mmol,
1.24
Dimethoxytritylchlorid (750mg,
Argon gerührt
Nach
Einengen
Toluol
aus
wenig
wurde in
in
bei 40°C und
vacuo
chromatographisch
mit
und
verdünnt
Diethylether
unter
zweimaligem
(FC:
gereinigt
gelbiche Öl
Das erhaltene
EE/MeOH/NEt3 100:10:1).
gelöst,
und über 15 h
eq) zugegeben
Produkt
das
Nach 1 h bei -20°C wurde das
eingetropft.
und in
Aceton
Pyridins
des
wurde
1.5
und
Anschliessend wurde in Portionen
versetzt.
mmol,
2.1
Entfernung
100:0:2 nach
EE/MeOH/NEt3
eq)
Pyridin (5 ml) gelöst
in abs.
Argon
unter
bei
0°C in
Hexan
mit einer Fritte abfiltriert
gelbliche Präzipitat
getrocknet.
vacuo
Gemäss NMR enthielt
es
nach dem Trocknen noch
Spuren
Hexan.
an
Ausbeute: 888 mg, 1.15 mmol, 82.3%.
IR(KBr):
3203 w,
1380 w,
1273 m,
555 w, 413
od.
3059 w,
1251 s,
H2b-C(A2')
od.
2.52
2/2.a_2'b
(ddd,
1177 m,
2.25-2.30
H2a-C(B2'));
2J5<a_5<b
(dd, 2/5,a.5.b
(dd,
H2b-C(A2'));
3.39
H2a-C(B5'));
3.46
H2b-C(B5'));
3.75-3.81
8
(m,
~
13.5
Hz, 3J
~
10.5 Hz,
Hz, 3J
6.2
~
od.
H2a-C(B2')
-
3J4^a
3/4>_5'b
10.5 Hz,
1461m,
1509 m,
m,
(Zers.).
8= 2.16-2.24 (m, 1 H, H-2aC(A2')
Hz, 3J
6.1
-
110°C
>
1032 5, 828 m, 761 w, 703 w, 585 w,
d6-Aceton):
-
Smp.:
(C=0), 1610
2.35-2.41 (m, 1 H,
Hz, 3J
13.8
vs
1075 m,
2JTa.Tb
(ddd,
H2b-C(B2'));
~
1691
2945 w,
iH-NMR (500 MHz,
w.
0.30.
Rf (CHCl3/MeOH 10:1):
0.38.
Rf (EE/MeOH 20:1):
~
~
3.2
Hz,
1
3.7
Hz,
4.1 Hz,
-
Hz, 1 H,
3.3
H2a-C(A2'));
2.48-
od.
H2b-C(B2')
H,
H, H2a-C(A5') od.
1
H2b-C(A5')
1 H,
od.
H, OCH3, H2-C(A5') od. H2-C(B5')); 4.06 (dd, 3J~1.2
Hz, 3/~ 3.8 Hz, 1 H, H-C(A4') od. H-C(B4')); 4.18 (dd, 3J
-
3J
7.2 Hz,
3.8 Hz, 1
-
H, H-C(A4') od. H-C(B4')); 4.19-4.41 ("q", 1 H, H-C(A3') od. H-C(B3')); 4.58-4.60
1
("q",
2/a_b
=
H, H-C(A3') od. H-C(B3')); 4.83 (d,
7.0 Hz, 1
H-C(B5));
3
-
7.3
5.56
Hz, 3/
-
3/(A5.A6 od. B5_B6)
=
7.0 Hz, 1 H,
3/(A5.A6 od. B5_B6)
H, OCH2bO); 5.37 (d,
(d,
2/a_b
8.1
~
OCH2aO);
4.87
(d,
H, H-C(A5) od.
8.1 Hz, 1
-
Hz, 1 H, H-C(A5) od. H-C(B5)); 6.25 (dd,
6.3 Hz, 1 H, H-C(Al') od. H-C(Bl')); 6.29
(dd,
3
-
7.4 Hz, 3J
~
6.3
Hz, 1 H, H-C(Al') od. H-C(Bl')); 6.90-6.93 (m, 4 H, DMTr-H); 7.23-7.36 (m, 1 H,
DMTr-H); 7.32-7.36 (m, 6 H, DMTr-H); 7.46-7.48 (m,
A6 od.
B5-B6)
~
8-1 Hz, 1 H,
H-C(A6)
od.
H-C(B6));
Hz, 1 H, H-C(A6) od. H-C(B6)); 9.96 (s,
Aceton): 8=
u.
38.88
C(B5')); 72.46
C(B4')
u.
C(Al')
u.
40.88
(C(A2')
u.
78.37 (C(A3')
u.
C(Bl') (zwei Signale
u.
u.
131.04
(C2-DMTr);
136.44
u.
136.55
7.73
(J,3/(A5-A6
u.
85.75
fallen bei 85.75
(C(A5)
(C2'-DMTr);
u.
u.
u.
129.03
u.
B5-B6)
~
69.32
8.1
aufeinander);
u.
87.57
114.07
(C3'-DMTr);
140.92
(C(A5')
86.7 (C(A4')
C(B5)); 114.06
(Cl-DMTr); 140.87
od.
(d,3J(A5_
13C-NMR (125.8 MHz,
H, H-N(3)).
C(B3')); 85.03
102.72
DMTr); 127.76 (C4'-DMTr); 128.75
H, DMTr-H); 7.71
C(B2')); 55.56 (OCH3); 64.42
u.
DMTr); 95.77 (0-CH2-0); 102.63
2
2
(C(A6)
(C(C3-
131.01
u.
u.
u.
C(B6));
167
145.85
(Cr-DMTr); 151.24 (C(A2)
163.44
u.
163.53
(C(A4)
u.
C(B2) liegen übereinander); 159.75 (C4-DMTr);
u.
(FAB+): 1541 (4.9, M2H+);
MS
C(B4)).
(33.4, MH+), 770 (47.7, M+), 304 (31.5, DMTrH+),
771
[C40H42N4O12+H]+: 771.2878; gef.
ber. für
7
Kap.
303
(8.6, MNa+),
793
(100, DMTr+). HRMS
771.2877.
5'-0- Dimethoxytrityl-2'-thymidinyl-3', 5'-methylen-2'-thymidin 120
a
OB
o
ïYtY
/r~^
MeO
OMe
116
1.65 mmol)
(814 mg,
Pyridin (7 ml) gelöst
1.2
eq)
versetzt.
wurde
und mit
Die
Reaktionslösung
entfernt.
ml)
120
wurde
vacuo
nach
Rf (EE/MeOH 13.5:1)
=
3200 1V,
IR:3444w,
ml,
lx 6
2.1
eq)
und DMTrCl
und das restliche
mg,
68%)
2929 w,
Pyridin azeotrop
mittels
(683
FC
(3
cm,
in
mg,
gerührt.
mit Toluol
100 g,
(3x
0-9%
erhalten.
0.27; Rf (DCM/MeOH 10:1)
3056 w,
ml) eingeengt,
wurde unter Ar über Nacht bei RT
Reinigung
MeOH/DCM) als farbloses Pulver (892
10
Pyridin (lx
Hünig-Base (0.6 ml,
Anschliessend wurde das LSM in
15
aus
120
1689 5,
0.42.
=
1606 m,
Smp.:
1508
119-123°C.
m,
1466 m,
1367 w, 1272 m, 1251 m, 1176 m, 1073 m, 1031 m, 956 m, 912 w, 829 m, 792
w,
750 w, 667 w, 583 w, 559 w, 488 w, 417
1.42
2.39
H3C-C5));
3 H,
(5,
2
(m,
H2-C(B5'));
1.72
H, H-C(A2'));
3.73
(s, 6 H,
2x
(s,
3
H, H3C-C5);
3.18-3.27
OCH3);
(m,
2
iH-NMR (500 MHz,
w.
2.02-2.12
H,
(m,
2
d6-DMSO):
H, H-C(B2')); 2.27-
H2-C(A5')); 3.61-3.68 (m,
3.85-3.88 (m, 1 H,
2
H,
H-C(B4')); 4.05-4.07 (m,
1
H, H-C(A4'));4.14-4.15 (m, br, 1 H, H-C(B3')); 4.44-4.47 (m, 1 H, H-C(A3')); 4.74
(d,
2/ab
=
4.1 Hz,
7.0
Hz, 1 H, OCH2aO); 4.79 (d,
1 H,
OH); 6.11-6.19 (m,
DMTr-H); 7.21-7.38 (m, 9 H,
H-C(6));
11.29
(br,
2
2
2/ab
=
7.0 Hz, 1 H,
OCH2bO);
5.31
(d, 3J
=
H, H-C(Al'), H-C(Bl')); 6.87-6.89 (m, 4 H
DMTr-H);
7.45
H, H-N(A3), H-N(B3)).
(s,
1 H,
H-C(6)); 7.50 (s,
13C-NMR (125 MHz,
1 H
d6-DMSO)
11.56; 12.12; 37.01; 38.85; 54.93; 54.95; 63.47; 68.09; 70.62; 77.07; 83.16; 83.74
84.91; 85.95; 94.18; 109.43; 109.64; 113.17; 127.54; 127.82; 129.61; 135.11; 135.21
135.42; 135.67; 144.53; 150.26; 150.29; 158.08; 158.11; 163.51; 163.54. MS (FAB+)
798.4
gef.
168
7
Kap.
HRMS ber. für
(14, M+), 303.1 (100, DMTr+).
([C42H46N4012]+): 798.3112;
798.3119.
7.4.3
Überführung
Phosphoramidite
in die
5A-(R),5B-(S),6A-(R),6B-(S)-[cis,syn]-cyclobutandimer
122 des
2-Cyanoethyl-
H,N-diisoproyl-(5'-0-dimethoxytrityl-2'-desoxyuridyl-3',5'-methylen-2'desoxyuridylj-phosphoramidits
A
OB
o
Il
H
O^^^VTl
.
°
N
CN
ß P s,
(o'Kl
-Sh
MeO
'—o
OMe
117
(150 mg, 0.195 mmol,
(67 ul,
mit DIEA
1.0
0.39 mmol, 2.0
0.24 mmol, 1.2
eq) zugegeben
Lösungsmittels
in
wurde
eq)
unter
wenig Methylenchlorid aufgenommen und in
(95
mg, 0.1 mmol,
0.36
u.
(C=0), 1608
w,
Rf (EE/HE/NEt3 5:1:0.12):
2966
1714
m,
1179 5, 1078
585 w,
528
vs
sh, 1036
iH-NMR
w.
N[CH(CH3)2]2);
2.12-2.43
3.23-3.43
2
(m,
N[CH(CH3)2]2, H2b-C(A5'));
H-C(B4'),
H-C(B6));
H2a-C(B5'));
4.56-4.69
(m,
H-C(A6)); 6.09-6.12 (m,
(2 d, 3/
-
8.7
IR(KBr): 3400
w,
1365 m,
1447 5,
H,
H-C(B5),
(m,
1
H,
H2a-C(A5'));
3067 w,
ja,
1254 vs,
1300
w,
756
u.
2.67
w,
700
w,
12
H,
(m,
(2 t, 3J~ 6.2
3.05-3.09
3.53-3.65
1
(m,
(m,
3
H,
H,
OCH3, OCH2CH2CN, H-C(A4'),
H2b-C(B5'));
H, H-C(A3'), H-C(B3'), OCH20);
1 H,
3233 w,
1.18-1.21
=
H, H2b-C(B2'));
3.70-3.95 (m, 11 H,
4.08-4.12
4
8
CDC13):
1
(m,
g
Dabei fiel 122
eingetropft.
(m, 3 H, H-C(A2'), H2a-C(B2')); 2.63
Hz, 2 H, OCH2CH2CN); 2.75-2.88
H-C(A5));
0.45.
MHz,
des
aus.
1509 5,
(500
Entfernung
Fraktionen wurden in
eingeengten
980 m, 952 w, 889 w, 830 w, 789
s,
(67 ul,
chromatographisch gereinigt (5
eiskaltes Hexan
51%)
Nach
Argon gerührt.
Die
Triethylamin).
(5 ml) gelöst und
in abs. THF
Anschliessend wurde CEDCI
versetzt.
bei 40°C wurde das Produkt
vacuo
als farbloses Pulver
Argon
und über 4 h unter
HE/EE 1:2 mit 2%
SiO2-60,
eq)
122
H-C(Al')); 6.18-6.27 (m,
1
H,
4.27-4.32
(m,
4.92-4.99
(m,
1
1
H,
H,
H-C(Bl')); 6.82-6.85
Hz, 4 H, DMTr-H); 7.22-7.37 (m, 9 H, DMTr-H); 8.91 (s, 2 H, H-
N(A3), H-N(B3)).
13C-NMR (125.8 MHz,
CDC13):
8
=
20.39, 20.54 (2 d,
3/p
-
7.4
Kap.
169
7
Hz, OCH2ÇH2CN); 24.51, 24.53, 24.57, 24.60, 24.62, 24.68 (N[CH(ÇH3)2]2); 35.59
u.
(C(B2')); 37.41
35.83
(C(B5));
(C(A6));
53.29
-
u.
55.33
70.89
2Jp
(d;
12.6 Hz,
(OCH3);
16.4 Hz,
~
(C(A2')); 39.12
57.83
61.92
(d,
(A5');
u.
(OCH2CH2£N);
(C3'-DMTr);
DMTr);
158.79
130.21
144.34
u.
127.37
u.
(34.6, MH+),
gef.
970.3881.
113.22
51.52
52.83
(d,
2/p
-
81.61
u.
u.
58.03
14.8 Hz,
(C(A4'));
u.
u.
135.32
166.33
u.
u.
u.
135.37
153.71
u.
HRMS ber. für
u.
2/p
(d;
C(B3'))
82.34
u.
u.
118.00
u.
128.47
u.
135.43 (Cl-
(C(A2)
167.26
42.27
86.53 (C-DMTr);
117.71
(C3-DMTr);
lH-entkoppelt, CDC13): 148.6;
(100, DMTr+).
(C(B6));
OCT2CH2CN)
153.57
u.
158.84 (C4-DMTr); 166.09
303
u.
127.95 (C2'-DMTr); 128.43
u.
152.81
u.
(C(A5)); 41.69
(C(Al')); 86.550
85.57
127.94
u.
70.45
(B5');
(C2-DMTr); 135.29
C(B4)). 31p-NMR(202.5 MHz,
971
u.
(C4'-DMTr);
(Cl'-DMTr); 152.67
158.81
19.7 Hz,
-
64.24
u.
113.20
130.25
u.
51.34
C(B3')); 73.72 (C(A3')); 81.55
(OÇ_H20);
94.32
2/p
39.72
u.
N[ÇH(CH3)2]2);
(C(B4')); 84.78 (C(Bl')); 85.54
94.23
u.
-
Hz, OÇH2CH2CN);
19.3
82.70
2/p
(d,
43.32
37.64
u.
C(B2));
u.
167.67
u.
149.5.
MS
(C(A4)
(FAB+):
(C49H59N6013P+): 971.3878;
5A-(R),5B-(S),6A-(R),6B-(S)-[cis,syn]-cyclobutandimer
123 des
2-Cyanoethyl-
N, N -diisoproyl-(5'-0 -dimethoxytrityl-thymidinyl-3',5'-methylen-thymidinyl)-
O
O
phosphoramidits
A
ÏÏ
OOB
Me Me
HN
O'"" "N'N'TV
^s
H
-CN
j
fi-
o~y^ o
MeO
"n" "-"O
l
I[H
?
(
"o-R
N'
o
OMe
118
(966
mg, 1.21
in abs. THF
Base
(12 ml) gelöst.
(0.85 ml,
eines farblosen
Mit
Argon
mmol) wurde
4.0
eq)
10%
K2C03 (3x
das
Lösungsmittel
Entfernen des
10
abs. THF
(3 mal 15 ml) eingeengt und
klaren, leicht gelblichen Lösung gab
und CEDCI
Niederschlag)
ges. EE
gereinigt (FC:
Zur
aus
123
(0.55 ml,
wurde der
2
eq).
Niederschlag
man
unter Ar
dann
Nach 3 h Rühren bei RT
abfiltriert und das Filtrat
Hünig-
(Bildung
eingeengt.
(50 ml) wurde der Rückstand aufgenommen und mit eisgekühlter
ml) extrahiert.
Die org. Phase wurde über
im Vakuum entfernt
3 cm, 50 g, mit 3%
Lösungsmittels
in
Der Rückstand wurde
Et3N/EE gepackt,
vacuo
MgS04 getrocknet
chromatographisch
mit EE/MeOH 40:1
wurde das Produkt in DCM
und
eluiert).
Nach
(3 ml) gelöst und in
Kap.
170
7
eisgekühlte Pentanlösung getropft (farbloser Niederschlag).
(755
farbloses Pulver erhalten
Rf (EE/MeOH 13.5:1)
2872 m, 2835 w,
=
mg,
63%).
IR: 3407 w, 3227
0.58.
1608 m,
1719 5,
m
br,
1509 5,
1582 w,
1365 m, 1252 s, 1200 s, 1178 s, 1035 s, 978 m, 903
756 m,
727 m,
d6-DMSO):
0.98
636 w,
703 m,
("d",
3 H,
Das Produkt 123 wurde als
524 w,
584 m,
465
3081 w, 2966 m, 2929 m,
1447 5,
m,
886 m, 830
790
m,
m,
iH-NMR (500 MHz,
w.
1.14-1.15 (m, 12 H, 2x
H3C(5));
1387 m,
1414 m,
CH(CH3)2);
1.26
("d",
3
H, H3C(5)); 1.90-2.02 (m, 1 H, H2a-C(B2')); 2.19-2.25 (m, 1 H, H2b-C(B2')); 2.372.44
1 H,
(m,
OCH2CH2CN);
3.55-3.81
H2a-C(A2'));
2.62-2.67 (m, 1 H,
3.15-3.17
2.74-2.81
(m,
1
(m,
2
H,
H, H2b-C(A5'));
(m, 13 H, 2x OCH3 (s, 6 H bei 3.75), OCH2CH2CN, N(CHMe2)2, H-
C(A4'), H-C(B4'), H2a-C(B5'));
OCH20);
H2a-C(A5'));
2.98-3.06 (m, 1 H,
H2b-C(A2'));
3.83-3.89
1
(m,
H,
H2b-C(B5'));
4.07-4.11
2
(m,
H,
4.21-4.25 (m, 1 H, H-C(3')); 4.46-4.48 (m, 1 H, H-C(3')); 4.57-4.61 (m, 1
H, H-C(6)); 4.63-4.66 (m, 1 H, H-C(6)); 5.91 (dd, 3J
H-C(l')); 5.96 (t, 3J
=
=
8.9 Hz,
3J
=
5.8 Hz,
1 H,
6.2 Hz, 1 H, H-C(l')); 6.86-6.88 (m, 4 H, DMTr-H); 7.22-7.38
(m, 9 H, DMTr-H); 10.54-10.57 (m,
d6-DMSO): 16.98; 17.64; 19.67;
2
19.72;
2x
H,
H-N(3)).
i3C-NMR (125 MHz,
19.77; 21.62; 24.09; 24.13; 24.15; 24.19;
24.21; 24.27; 34.88; 35.56; 39.70; 39.87; 42.49; 42.59; 46.61; 46.71; 48.86; 49.03;
54.94 (2
CH30); 55.28; 55.36; 57.09; 57.18; 58.08; 58.16; 58.22; 58.30; 63.62; 64.45;
70.13; 70.27; 70.48; 70.62; 76.66; 80.87; 81.82; 82.05; 84.12; 84.15; 84.99; 85.03;
85.42; 93.77; 113.05 (4
arom.
C); 118.85; 118.89; 126.73; 127.70; 129.62; 129.68;
135.19; 135.34; 144.57; 152.78; 153.15; 158.05; 169.96; 170.01; 170.38; 170.44. 31p.
NMR:
(121 MHz, CDC13): 149.04; 149.99. MS (FAB+): 1998.6 (2, M2H+), 1021.2 (6,
MNa+), 999.3 (19, MH+),
304.1
(42),
(C51H63N6013PH+): 999.4269, gef:
(100,
303.1
DMTr+).
HRMS
ber.
999.4254.
2-Cyanoethyl-H, N -diisoproyl-(5'0 -dimethoxytrityl-2'-desoxyuridyl-3',5'-
methylen-2'-desoxyuridyl)-phosphoramidit
A
124
QB
o
H&rS|
HN'
MeO
OMe
124
für
Kap.
171
(771
124
mmol, 1.0 eq) wurde
1
mg,
Nach
des
Entfernung
Die
Diethylether
in
Lösungsmittels
chromatographisch gereinigt (SiO2-60
Trietylamin).
1694
2950 w,
2965 w,
u.
0.31.
bei
40°C
wenig
wurde
Aceton
das
Produkt
mit
aufgenommen,
Dabei fiel 124
eingetropft.
(700
mg,
aus.
93-102°C.
Smp.:
1606 m,
(C=0),
vs
Argon gerührt.
und über 4 h unter
vacuo
verdünnt und in eiskaltes Hexan
0.27
Anschliessend wurde
versetzt.
Fraktionen wurden in
eingeengten
Rf (EE/H/NEt3 5:1:0.12):
eq)
Methylenchlorid (8 ml)
Merck, HE/EE 2:1 nach HE/EE 1:10 mit 2%
von
mmol, 72.1%) als farbloses Pulver
0.721
2.2
eq) zugegeben
1.1
1.1 mmol,
(0.25 ml,
CEDCI
mmol,
2.2
und mit DIEA (0,38 ml,
gelöst
in abs.
Argon
unter
7
3211 w, 3056 w,
IR(KBr):
14615,
1509 5,
1379 m,
1272 5,
1179 5, 1067 sh, 1032 s, 978 s, 878 w, 828 m, 806 m, 761 w, 726 w,
1251 5,
700 w, 585 w, 555 w, 522 w, 420
iH-NMR (500 MHz, CDC13): 8= 1.15-1.22
w.
H, N[CH(CH3)2]2); 2.12-2.25 (m, 2 H, H2a-C(A2'), H2a-C(B2')); 2.44-2.53
(m,
12
(m,
2 H,
2.58-2.63
H2b-C(A2'), H2b-C(B2'));
(m, 2 H, OCH2CH2CN); 3.37 (dd,
^A5'a-A5'b 10.5 Hz, 3/A4..A5.a~ 3.1 Hz, 1 H, H2a-C(A5')); 3.44 (dd, 2JA5^A5>b
3.3 Hz, 1 H, H2b-C(A5')); 3.56-3.87 (m, 12 H, OCH2CH2CN,
10.5 Hz, 3/A4LA5'b
-
~
~
6
N[CH(CH3)2]2, H2-C(B5'), OÇH3 (s,
H-C(A4'), H-C(B4')); 4.36-4.40 (m,
4.75
B6)
(d,
8.1
-
4 H,
H, OCH20); 5.41 (2 d,
2
Hz,
1
H, H-C(B5));
1 H,
3/(A5_A6)
~
~
8.1
39.63
39.67
u.
55.29
N[Ç_H(CH3)2]2);
u.
73.47
ÇT
(C(A4'));
84.33
84.43
85.15, 85.18, 85.36
(OÇH20);
117.69
102.39
d,
2
=
(C(A2')
(d,
u.
2Jp
3/p
85.43
-
-
(C(A6));
144.24
u.
u.
24.63
lH-entkoppelt, CDC13):
58.10
2/p
-
C(B1'));
u.
24.65
(m,
8.1 Hz, 1
-
43.33
(d,
58.13
u.
18.6 Hz,
u.
87.07
(C(B5));
150.21,
163.19 (C(A4)
(2
78.00
3/p
2Jp
d, 4/p
12.3
-
-
4.2
Hz,
Hz,
(C(A3')); 84.29
3.5 Hz,
-
(C-DMTr); 95.45
150.27
u.
(C2'-DMTr
u.
u.
C(B4)).
139.83
150.29
u.
C(B4'));
95.56
(C3-DMTr); 117.68
128.12
u.
3/p
(2 d,
20.47
OÇH2CH2CN); 73.22,
113.35
u.
u.
(q, N[CH(CH3)2]2);
135.28 (Cl-DMTr); 139.78
(Cl'-DMTr); 150.15,
u.
3J(B5_
6.83-6.86
3/(B5.B6)
(2 d,
20.37, 20.41, 20.43
(C4'-DMTr); 128.05
C(B2)); 158.78 (C4-DMTr); 163.08
MHz,
(d,
102.62
u.
DMTr); 130.08 (C2-DMTr); 135.13
139.97
H-C(Bl'));
6.5 Hz, C(B4')); 84.82 (d,
(C(Al')
127.23
7.48
16.8 Hz, C(B3')); 77.85
(C(A5)); 102.56
(OCH2CH2CN);
68.13
u.
u.
C(B2'));
u.
(OCH3); 57.95, 57.98,
C(B5')); 63.04 (C(A5')); 67.98
73.36
=
OCH2CH2CN); 24.49, 24.56, 24.60,
39.04,
39.01,
H,
Hz, 1 H, H-C(A6)); 9.07 (s, br, 2 H, H-N(A3),
H-N(B3)). i3C-NMR (125.8 MHz, CDC13): <S
7.2 Hz,
2
(m,
H-C(A5)); 5.65 (2 d,
8.1 Hz, 1 H,
6.24-6.28 (m, 2 H, H-C(Al'),
3J(A5_A6)
4.12-4.21
H-C(A3')); 4.45-4.50 (m, 1 H, H-C(B3'));
DMTr-H); 7.24-7.37 (m, 9 H, DMTr-H); 7.46
H, H-C(B6)); 7.72 (2 d,
-
8 =3.79));
bei
H
u.
u.
C3'-
(C(B6));
(C(A2)
u.
3lP.NMR(202.5
149.4; 149.5. MS (FAB+): 971 (44.0, MH+), 303 (100,
DMTr+). Anal. ber. für C49H59N6013P (971.02):
3.19; gef: C 60.35, H 6.19, N 8.52, P 3.18.
C
60.61, H 6.12, N 8.65, O 21.42,
P
Kap.
172
7
2-Cyanoethyl-H,N-diisoproyl-(5l-0-dimethoxytrityl-thymidinyl-3',5'-methylen125
thymidinyl)-phosphoramidit
OB
O
A
OMe
120
(805
in abs.
mg, 1.01
3.9
eq)
aus
Zur
(12 ml) gelöst.
THF
(0.85 ml,
wurde
mmol)
und CEDCI
Mit Ar ges. EE
10
K2C03 (3x
das
(0.45 ml,
des
Niederschlag.
(50 ml) wurde
in
2
Lösungsmittels
in
Pulver erhalten
(558
mg,
Rf (EE/MeOH 13.5:1)
1509 m,
1032 5, 977 m,
H3CC(5));
3.51
(m,
2
aufgenommen
(m,
2
und mit
wurde über
Der Rückstand wurde
DIEA
Umsatz nach 3 h
Bei der Reaktion
eingeengt.
eisgekühlter
MgS04 getrocknet
10%
und
chromatographisch gereinigt
mit EE/MeOH 40:1
eluiert). Nach Entfernen
(3 ml) gelöst und in eisgekühlte
Das Produkt 125
wurde als farbloses
0.57.
901 w,
1407 w,
829 m,
d6-DMSO):
1.71-1.73
2
IR:
1365 m,
794 w,
1.12-1.20
1274 m,
758 w,
(m,
2968 m, 2929 m,
3062 w,
3184 w,
12
12515, 1179
727 w,
702 w,
1690 5,
1126 m,
m,
582 w,
560
w.
H, ((H3C)2CH)2N); 1.41-1.42 (m,
(m, 3 H, H3CC(5)); 2.15-2.37
(m, 4 H,
H-C(A2'),
H, OCH2CH2OCN); 3.18-3.29 (m, 2 H, H2-C(A5')); 3.42-
H, OCH2CH2OCN); 3.53-3.59 (m, 2 H, N(CHMe2)2); 3.64-3.71 (m, 2 H,
H2-C(B5'));
4.46
man
55%).
=
H-C(B2')); 2.73-2.77 (m,
unvollständigem
wurde das Produkt in DCM
1466 m,
iH-NMR (500 MHz,
und unter Ar
Dieser wurde abfiltriert und das Filtrat
Et3N/EE gepackt,
vacuo
ml) eingeengt
(0.2 ml, 0.9 eq) zugegeben.
Pentanlösung getropft (farbloser Niederschlag).
3 H,
mal 15
Bei
eq).
der Rückstand
entfernt
vacuo
cm, 50 g, mit 3%
1607 w,
(3
ml) extrahiert. Die organische Phase
Lösungsmittel
(FC: 3
abs. THF
klaren, leicht gelblichen Lösung gab
Rühren bei RT wurde nochmal CEDCI
bildete sich ein farbloser
125
3.73
(s, 6 H,
H3CO);
3.97-4.11
(m, 2 H, H-C(A4'), H-C(B4')); 4.39-
H, H-C(A3'), H-C(B3')); 4.73-4.80 (m, 2 H, OCH20); 6.14-6.19 (m, 2 H,
H-C(Al'), H-C(Bl')); 6.86-6.89 (m, 4 H, DMTr-H); 7.21-7.38 (m, 9 H, DMTr-H);
7.45 (5, 1 H,
H-C(6));
7.49 (s, 1 H,
H-C(6));
11.30
(br,
2 H, 2x
H-N(3)).
"C-NMR
(125 MHz, d6-DMSO): 11.55; 12.07; 12.10; 13.79; 19.23; 19.29; 19.66; 19.72; 21.63;
22.50; 22.52; 22.54; 23.86; 24.04; 24.09; 24.17; 24.20; 24.22; 24.25; 33.41; 37.07;
37.18; 37.77; 39.54; 39.70; 39.87; 0.04; 42.52; 42.62; 44.34; 44.44; 54.93; 54.94;
173
Kap.
7
56.45; 58.05; 58.09; 58.21; 58.25; 63.44; 67.57; 67.75; 73.34; 73.45; 73.59; 77.15
77.47; 83.11; 83.19; 83.56; 83.61; 83.69; 83.86; 83.92; 85.96; 94.20; 94.44; 109.55
109.62; 109.64; 113.15; 118.46; 118.84; 126.74; 127.53; 127.80; 128.58;
129.59
135.09; 135.22; 135.36; 135.63; 135.72; 144.51; 150.25; 158.09; 158.11; 163.50. 31p_
NMR
(121 MHz, CDC13): 149.64;
149.70.
MS
(FAB+): 1998.4 (14, M2H+),
1015.2
(10), 1000.3 (18), 999.2 (33, MH+), 998.1 (7, M+), 304.1 (25), 303.1 (100, DMTr+).
HRMS ber. für
7.5 Mit Pac-Nukleosiden
Für sehr milde
999.4268.
(C51H63N6013PH+): 999.4269, gef:
Entschützungen
für die
Oligonukleotidsynthese
beladen
war.
Oligonukleotiden
von
zu
isobutyryl-2'-desoxycytidin
dargestellt und mit
Aktivester des
notwendig Trägermaterial
war es
verwenden, das mit Pac-geschützten Nukleosiden
Hierzu wurde nach
128
CPG-Trägermaterial
beladenes
Schulhof
synthetisiert.
al. [436]
et
5'-0-Dimethoxy-trityl-/V(4)-
Anschliessend wurde der Aktivester 129
CPG-Material umgesetzt.
5'-0-Dimethoxy-trityl-N(4)-isobutyryl-2'-desoxycytidins
129
O
128
aus
130
(275
mg, 0.46 mmol,
Pyridin eingengt (2x
(1.9 g,
Hochvakuum
4.8
Lösungsmittel
mit
vacuo
Nach
Argon
entfernt.
gelbliche
mit dem
Substanz erhalten
(253
mg)
von
—»
0.48
mmol, 1.0 eq)
Reagentienmischung
10
Minuten
Pyridin (3 ml) gelöst.
(ca.
Einengen
1
aus
g)
zugegeben
Toluol
DCM/Aceton 50:9). 129
0.29 mmol,
64%).
Die
(lx
2
0.3. MS
(FAB+): 863.5 (2, MH+),
303
im
Nach 2
und
ml)
das
und
wurde als leicht
Verbindung
wurde direkt
CPG-Trägermaterial umgesetzt.
Rf (DCM:Aceton=9:l):
wurden
Dinitropimelinsäureester [438,439]
und Celite
Nach
DCM
mg,
die
(60 mg,
belüftet und in abs.
300
chromatographisch gereinigt (FC:
Zugabe
wurde
eq)
NaHC03 (ca.
in
und DMAP
eq)
ml).
10
mmol,
getrocknet,
Stunden wurde
2
1.0
(100, DMTr+).
Kap.
174
7
(5'-0-Dimethoxy-trityl-N(4)-isobutyryl-2'-desoxycytidinyl)-CPG-Träger
o
DMTrO
Träger (1.5 g)
getrocknet
2.9
10
mit
Trägermaterial
gewaschen.
eq)
Das
geschüttelt.
129
und
und mit
mmol,
und
Nach
belüftet.
abs.
Pyridin (70 (il,
(lx 5 ml),
DMF
(20 ml)
und
geschüttelt.
von
60
5-Bromo-2'-desoxyuridin
wurden in Wasser
Abkühlen der
Lösung
bildete sich ein
zur
Anschliessend wurde
eine
(3 ml),
DMF
mmol,
3
in abs.
DIEA
DCM
(500 u.1,
für
abfiltriert
und
(3x 10 ml)
Hochvakuum
wurde
eq)
Glasfritte
Trägermaterial
72
und
h
das
(3x 10 ml)
und
Pyridin (4 ml)
Trocknen
am
HV
Trägermaterial
ergab
1.4 g
Träger
mit
mit
(imol/g.
183
Nukleotide
[499]
eq)
und
2'-Desoxyuridin
(30 ml) gelöst und mit
auf 0 °C wurde NBS
Niederschlag
über Nacht wurde
von
am
Nach erneuter Filtration wurde das
Natriumazid (7.82 g, 12.0 mmol, 4.0
eq)
wurden
eq)
mmol) resuspendiert und mit DMAP (25 mg,0.25 mmol)
7.6 Flavin-enthaltende
1.0
über
Et20 (20 ml) gewaschen.
Beladungsdichte
1
0.87
MeOH
Anschliessend wurde das
4.2
mmol,
Zugabe
wurde
CPG-
ml) und Et20 (30 ml) gewaschener
0.29
mg,
Lösungsmittel
versetzt und 3 Stunden
einer
(253
Argon
Acetanhydrid (0.4 ml,
MeOH
10
(10 ml), MeOH:NEt3 (1:1,
Mit MeOH
und die
(6.42
Lösung
Vervollständigung
THF
g, 3.6
wurde
53
(6.42
(120 ml)
g, 3.0 mmol,
versetzt.
Nach
mmol, 1.2 eq) zugegeben. Es
gelblich.
Nach Auftauen auf RT
der Reaktion für 2 h auf 50-60°C erhitzt.
Kieselgel-60 (20 g) zugegeben
und das
Lösungsmittel
in
vacuo
Kap.
175
entfernt. Das Produkt wurde
chromatographisch gereinigt (FC:
wurde als farbloser Schaum
(8.44
wurde
aus
Ethanol mit einer Ausbeute
0.59.
i?f (CHCl3/MeOH 4:1):
747 w,
658 w, 596 w, 544
^S'a-S'b
~
H-C(4'));
3/r_2.
-
3.58
-
H-C(l'));
8.38
(s,
4.25
1
(2
6.6 Hz,
2 H,
5,
H2a-C(5'));
Hz, 1 H,
-
u.
d6-DMSO):
iH-NMR (400 MHz,
(d,
(m, 1 H, H-C(3')); 4.24
6.5 Hz, 1 H,
1600 5,
1664 vs,
1121 vs,
1150 w, 999 m, 970 w, 950 w, 889 w, 839 w,
2J5'a^b 11.5
H2b-C(5')); 3.80 (dd, 3/3, 4,
1L5 Hz' ! H>
4.24
60% umkristallisiert.
von ca.
478 w, 433 2.
w,
H2-C(2'));
2.11-2.15 (m, 2 H,
mmol, 90%) erhalten. Zur Charakterisiemng
3044 w, 2911 w,
1264 s, 1194 w,
1434 m,
1463 m,
183
20:1).
178-179°C. Lit: 175-179°C [499], 173.5-175.5°C
Smp.:
3407 5, 3189 w,
IR(KBr):
[526].
g, 2. 7
DCM/MeOH
7
3/4,
5<a
~
<5
=
3.80
(d,
3.3 Hz, 1
H,
5'-0-H, 3'-0-H); 6.11 (t,
H, H-C(6)); 11.77 (s, br, 1 H, H-N(3)).
13C-
NMR(100MHz, d6-DMSO): 8= 40.08; 60.72; 69.87; 84.74; 87.47; 95.56; 140.16;
149.65; 156.07.
MS
[MNa»CH3OH]+);
(ESI,
MeOH
(95,
MNa+
331
C9HnN305Br (307.10):
H
C
+
NH4OAc):
(Br79)),
329
637 (32,
(100,
361
M2Na+),
MNa+
(Br8!)).
u.
363
(je 37,
AnaL ber. für
35.20, H 3.61, N 9.12, O 26.05, Br 26.02; gef: C 35.20,
3.43, N 9.09, Br 26.03.
5-Cyano-2 '-desoxyuridin
181
[497]
o
Kaliumcyanid (358
mg,
wurden in DMF (10
(307
mg,
1
5.5 mmol,
ml) suspendiert.
5.5
und 18-Krone-6
eq)
Nach
Zugabe
von
auf 70 °C führten in 6 h
zu
wurde mit Dichlormethan
100%
3.8
eq)
5-Bromo-2'-desoxyuridin 183
zu ca.
70%
Umsetzung.
waren ca.
Erhitzen
Umsetzung (beurteilt mittels DC). Die Reaktionslösung
(10 ml) verdünnt
Dabei bildete sich ein
Fritte abfiltriert und in Methanol
wurde über
3.8 mmol,
mmol, 1.0 eq) wurde auf 40 °C erhitzt. Nach Rühren über 7 h
20% umgesetzt. Erhitzten auf 50°C über Nacht führten
eingetropft.
(lg,
und bei 0
°C in
gelbhcher Niederschlag.
(20 ml) gelöst.
aus
Dieser wurde mittels einer
Nach Aufziehen auf
chromatographisch gereinigt (FC: 10g Si02,
Produkt enthaltenden Fraktionen wurden
Diethylether (300 ml)
DCM/MeOH
Ethanol umkristallisiert.
farbloses Pulver erhalten (130 mg, 0.52 mmol, 52%).
Kieselgel-60 (lg)
10:1).
Die das
Dabei wurde ein
Kap.
176
7
IR(KBr): 3533
°C [527].
161
1469 5,
1619 5,
1053 w, 988
965 w, 872
w,
IH-NMR (400 MHz,
2/5,a.5,b
-
H-C(4'));
3.5 Hz, 1 H,
3Jr_2<
H); 6.02 (t,
-
4.23
M2H+),
d6-DMSO):
149.53; 160.08.
87.86; 114.41; 148.95;
(58, MNa+),
271
8
=
MS
~
5'-0-H, 3'-0-
H-C(6)); 11.98 (s, br,
1
H,
40.31; 60.19; 69.00; 85.81; 87.73;
(ESI,
MeOH
529
NH4OAc):
+
C10HnN3O5 (253.21):
Anal. ber. für
(30, MNH4+).
3/4,_5,a
7.2 Hz,
-
(48,
(28, [MNH4»CH3OH]+), 292 (20, MK+), 276
303
(100, [MNa*CH3OH]+);
308
3JyA*
5.25 (2 s, 2 H,
u.
w.
H, H2-C(2')); 3.63 (dd,
5.8 Hz, 2
H, H2-C(5')); 3.82 (dd,
1100 5,
561 w, 437
599 w,
w,
1686 vs,
1200 w,
1276 5,
6.0 Hz, 1 H, H-C(l')); 8.82 (s, 1 H,
13C-NMR (100 MHz,
H-N(3)).
646
-
H-C(3')); 5.21
1 H,
(m,
3JV_T
<5= 2.20 (t,
3.5 Hz, 2
~
1296 m,
1350 w,
[497,498],
1732 vs,
2239 m,
3071 w,
766 w, 757 w,
w,
d6-DMSO):
3j4,.5,a
12.0 Hz,
3483 5,
m,
1410 w,
1435 w,
Lit: 170-172 °C
Smp.: 153-154°C (Zers.).
0.49.
i?f(CHCl3/MeOH 4:1):
C 47.43, H
4.38, N 16.59, O 31.59; gef: C 47.48, H 4.28, N 16.42.
179
5-Aminomethyl-2'-desoxyuridin
o
HO^S
OH
179
In einem 100 ml Rundkolben wurde
1.0
in
eq)
verdünnt.
einer
25%
Nach
Amoniumhydroxidlösung (30 ml) gelöst
Zugabe
von
abfiltriert und mit Wasser
(2x
von
5
Rückstand in Wasser (20 ml)
ml) gewaschen.
aufgenommen
Form, Dowex 50/4) aufgetragen.
260
nm
64%)
aus
hydriert.
Nach
Der
Einengen
Aus
der
Kristallisation eine zweite Fraktion
i?f 0-PrOH/EE/NH4OH 5:1:1):
176°C [500].
IR(KBr):
1283 w,
von
0.22.
g,
3.9 mmol,
(10 ml)
mit Wasser
(2 ml) wurde
nun
des Filtrats wurde der
mit Wasser
solange
unter
wurde
Raney-Nickel
und auf einen Ionenaustauscher
Nach Entfernen des
Mutterlauge
(1
(NH4+bis die
gespült,
Anschliessend wurde das Produkt mit 1%-
war.
eluiert.
und
Lösungsmittels
Ethanol umkristallisiert und 179 als farbloses Pulver
erhalten.
1333 w,
Es wurde
verschwunden
tiger Ammoniumhydroxidlösung
wurde
5 bar für 2 h
181
in Wasser
Raney-Nickel-Suspension
Wasserstoffatmossphäre
Absorption bei
5'-Cyano-2'-desoxyuridin
konnten
179
Smp.:
nach
(650
Einengen
mg,
und
in
2.5
vacuo
mmol,
wiederholter
(170 mg, 0.6 mmol, 17%) isoliert werden.
172-173°C.
Lit: 184-186 °C
[497], 173-
3333 m, 3179 m, 1687 s, 1617 w, 1537 s, 1462 s, 1389 w,
1185 w,
1110 m,
1063 5,
1000 w,
960 w,
906 w,
780 w,
Kap.
177
617 w, 560
3.32
(s, 2 H,
IH-NMR (500 MHz,
w.
NH2);
3JT.y
3/r_2,
6.19 (t,
H-N(3)).
3.52-3.60 (m, 2 H,
NH2-CH2-C5);
H, H-C(4')); 4.24 (t,
=
2.05-2.14
3.76
H2-C(5'));
H-C(l')); 7.69 (s,
d6-DMSO):
13C-NMR (100 MHz,
8
8
=
1
(26,
223
[MH-NH3]+),
H, H2-C(2'));
3J4^
-
Hz, 1
3.0
H, 3'-OH, 5'-OH,
4
38.50;
(verdeckt
39.33
MS
DMSO);
unter
(ESI, H20
0.01%
(32, MNa+), 258 (100, MH+), 241 (32,
280
142
[MH-NH3-H20]+),
125
[MH-C5H803]+),
(30,
(50,
(110, [C5H903]+). Anal. ber. für C10H15N3O5 (257.25): C
117
[MH-C5H803-NH3]+),
2
H, H-C(6)); 11.98 (s, br, 1 H,
61.31; 70.37; 83.82; 87.23; 115.81; 135.73; 150.43; 163.35.
TFA): 537 (25, M2Na+), 515 (23, M2H+),
(m,
(d,
H-C(3')); 4.5-5.5, ( br,
2.5 Hz, 1 H,
-
6.8 Hz, 1 H,
-
d6-DMSO):
7
46.69, H 5.88, N 16.33, O 31.10. gef: C 46.55, H 5.70, N 16.14.
10-N-(N-Allyloxycarbonyl-2'-aminoethyl)-8-N-carboxymethylflavin
185
o
185
184
(500
mg,
1.0
1.09 mmol,
K2C03-Losung (20 ml)
wurde in DMF
eq)
verdünnt.
und mit
(1ml) gelöst
Allyloxycarbonylchlorid (0.3 ml)
Nach 2 h wurde mit Dichlormethan (2x 30 ml) extrahiert. Die
wurde
wässrige
Citronensäure angesäuert und mit Chloroform (10x 30 ml) extrahiert.
Chloroformphasen
gelöst
und in
konnte 185
wurden direkt
Diethylether
(346
bei -20°C
mg, 0. 8 mmol,
Smp.:
3299 w,
1750 w,
1694 5,
1648 5,
1410 w,
1350 w,
1317 w,
1271m, 1230
878 w, 812 w, 736 w,
224-226°C
1620 w,
m,
1213 m,
700 w, 594 w, 575 w, 501
3
H, C(7)-CH3); 2.50 (s, 3 H
(s, br, 2.5 H,
+
H20);
5.3 Hz, 2 H,
OCH2CHCH2);
CH2-CH2-NH);
OCH2CHCH2);
H-C(6)).
5.09-5.16
7.35
(t, 3J
~
3.46
-
3.50
+
-
wenig
Aceton
über Nacht
IR(KBr): 3478
vs,
1460 w,
w,
1430 w,
1015 m, 933 w,
iH-NMR (500 MHz, d6-
H, C(8)-CH3+DMSO); 3.32
(m, 2 H, N(10)-CH2-CH2-NH); 4.39 (d, 3J
N(3)-CH2C02H);
(m,
H,
6.1 Hz, 1 H,
13C-NMR (125 MHz,
1
vereingigten
werden.
1170 w,
w.
4.56 (s,
2
Die
Präzipitats
(Zers.).
15815, 1544
DMSO): 8=2.41 (s,
COOH
des
Alterung
72%) als gelbes Pulver abfiltriert
0.38.
Rf (EE/MeOH/AcOH 10:1:1):
Nach
gefällt.
zugegeben.
Phase wurde mit
Der Rückstand wurde in
eingeengt.
9%-tiger
4.72
OCH2CHCH2);
NH); 7.86 (s,
d6-DMSO):
<5
=
1
(t, 3J
-
-
6.0 Hz, N(10)-
5.73-5.81
(m,
1
H,
H, H-C(9)); 7.97 (s, 1 H,
18.64; 37.16; 43.75; 64.36; 116.03;
116.83; 130.99; 131.47; 133.35; 134.32; 135.46; 1136.06; 146.98; 149.04; 154.15;
Kap.
178
7
156.25; 159.11; 169.23. MS (FAB+): 855 (10, M2H+), 428 (100, MH+). HRMS ber.
(C20H2iN5O6H+): 428.1570, gef:
für
428.1577.
10-N-(N-Allyloxycarbonyl-2'-
186 des
(5-Aminomethyl-2'-desoxyuridinyl)amid
aminoethyl)-8-N-carboxymethylflavins
192
5-Aminomethyl-2'-desoxyuridin
über 4
(4 ml, getrocknet
halbstündigem
1.3
 Molsieb) gelöst und
in
enfernt.
vacuo
Lösung
Es wurde
Produkt
Das
wurde
Es wurde 186 als
Diethylether gefällt.
185
wurde in DMF
eq)
(225
0.87 mmol,
mg,
und das
säulenchromatographisch
Die
10:1).
Nach
versetzt.
Nach einer halben Stunde
Kieselgel (2 g) zugegeben
Gradient DCM nach DCM/MeOH
Kieselgel-60,
von
1.0
(675 mg)
mit BOP
Tropfen Triethylamin zugegeben.
Edukt 192 verschwunden.
mmol,
0.7
mg,
Rühren bei 25 °C wurde eine
und ein
eq)
(300
war
das
Lösungsmittel
(15
gereinigt
Hauptfraktionen
wurden
g
aus
Pulver isoliert
orange-gelbes, hygroskopisches
(339 mg, 0.51 mmol, 71.5%).
Rf (CHCl3/MeOH 5:1)
3067
2933
w,
1325 w,
806
w,
C(2')),
w,
1270 m,
(5,
3.56 (m, 2 H,
3
0.42.
1640-1720
1230 m,
556 w, 500
2.42
=
vs,
194-197°C.
1582 5,
1210 w,
IR(KBr): 3433
1547 vs,
1161 w,
1456 m,
m,
3304 m,
1405 w,
1350 w,
1022 w,
1089 m,
928 w,
iH-NMR (500 MHz, d6-DMSO): 8= 2.07-2.16 (m,
w.
H,
Smp.:
C(7")-CH3),
2.50
N(10")-CH2-CH2-NH),
(s, überlagert
mit
3.56-3.64 (m, 2 H,
844 w,
2
H, H2-
DMSO, C(8")-CH3), 3.46-
H2-C(5')),
3.76-3.79 (m, 1
H, H-C(4')), 3.90 (d, 2 H, 3/~ 5.4 Hz, C(5)-CH2-NH), 4.27-4.30 (m, 1 H, H-C(3')),
4.41
(d, 3/~
2Jah
4.52 {d,
4.88
(t, 3J
-
5.4 Hz, 2 H,
~
5.3
3.3 Hz, 1
7.8 Hz, 37
7.69
(5,
1
-
4.50
(d,
2Jah
Hz, C(5')-OH),
5.16
(dd, 3J
-
5.11
(dd, 3J
17.2 Hz, 4/- 1.7
-
10.4
6.0, N(3")-CH2a-CO),
~
6.0, N(3")-CH2b-CO), 4.71-4.74 (m, 2 H,
COCH2CHCH2a),
(d, 3/-
COCH2CHCH2),
N(10")-CH2-CH2-NH),
Hz, 4J
-
1.5
Hz,
1
H,
Hz, 1 H, COCH2CHCH2b), 5.24
H, C(3')-OH), 5.74-5.82 (m, 1 H, COCH2CHCH2), 6.18 (dd, 3J
6.2 Hz, 1 H,
H-C(l')),
7.34
(t, 3J
-
6.1 Hz, 1 H,
-
N(10")-CH2-CH2-NH),
H, H-C(6)), 7.88 (s, 1 H, H-C(9")), 7.98 (s, 1 H, H-C(6")), 8.33 (t, 3J
~
179
5.4 Hz,
C(5)-CH2-NH),
11.39
(s,
1 H,
Kap.
H-N(3)). 13C-NMR (100 MHz, d6-DMSO): 8
18.60; 20.75; 35.20; 37.18; 39.10 (verdeckt
unter
7
=
DMSO); 43.53; 43.65; 61.51; 64.39;
70.56; 83.87; 87.35; 110.57; 116.03; 116.86; 130.97; 131.28; 133.35; 134.15; 135.88;
136.04; 137.54; 146.82; 148.97; 150.17; 154.46; 156.28; 159.39; 162.65; 166.86.
(FAB+,
M ber.:
666.24):
[MH-C10H14N3O5]+),
H20 (666.65
+
1.5
1333
410
H20):
(10, M2H+), 689 (12, MNa+), 667 (100, MH+), 411 (22,
(26, [M-C10H14N3O5]+).
C
MS
Anal. ber. für
C30H34N8O10
1.5
•
51.95, H 5.38, N 16.16, O 26.52; gef: C 51.78, H 5.34,
N 16.09.
187 des
(5'-0-Dimethoxy-5-aminomethyl-2'-desoxyuridinyl)amid
10-N-(N-
Allyloxycarbonyl-2'-aminoethyl)-8-N-carboxymethylflavins
MeO—<f
\
OMe
186 (210 mg, 0.32 mmol,
und
in
abs.
Pyridin
1.0
(2 ml)
Dimethoxytritylchorid (150 mg)
nicht
abgeschlossen
war
Pulver
Zugabe
die Reaktion
Pyridin (2 ml) eingeengt
DIEA
von
gerührt.
(350
und
u.1)
Da die Reaktion noch
Dimethoxytritylchlorid (200 mg) zugegeben.
abgeschlossen.
Das
Lösungsmitel
chromatographisch gereinigt (DCM/MeOH
Das Produkt enthielt noch sehr viel
wurde in
100:0
—>
186 wurde als
Triethylamin.
(327 mg, Reinheit 70%, 0.24 mmol, 75%) erhalten.
Rf (CHCl3/MeOH 10:1)
=
0.48.
H, H2-C(2')), 2.42 (5, 3 H,
iH-NMR (300 MHz,
C(7")-CH3),
N(10")-CH2-CH2-NH, H2-C(5')),
C(5)-CH2-NH),
CH2-NH),
Nach
abs.
aus
wurde für 10 Stunden
entfernt und der Rückstand
100:5, 0.1% NEt3).
gelbes
gelöst.
war, wurde nochmals
Nach Rühren über Nacht
vacuo
wurde zweimal
eq)
(m,
3
H,
H-C(3')),
<5
=
2.28-2.46
(s, C(8")-CH3), 3.40-3.60 (m,
3.64 (5, 6 H,
3.95-4.02 (m, 1 H,
4.52-4.6
2.56
d6-DMSO):
OCH3),
4.40
-
3.8-3.9
(m,
4.46 (m, 1 H,
3
(m,
4
2
H,
H, H-C(4'),
N(10")-CH2a-
COCH2CHCH2, N(10")-CH2b-CH2-NH),
4.68-4.82
180
7
Kap.
(m, 3 H, C(3')-OHi N(3")-CH2-CO), 5.17-5.32 (m, 2 H, COCH2CHCH2), 5.76-5.94
(m,
1 H,
N(10")-CH2-CH2-NH),
7.0-7.08 (m, 1 H,
5 H,
DMTr); 7.38-7.42 (m,
1 H,
H-C(9")), 7.98 (s,
MS
6.12-6.20 (m, 1 H, H-C(l')), 6.68-6.74 (m, 4 H, DMTr);
COCH2CHCH2),
(FAB+,
DMTr+),
(87,
DMTr); 7.24-7.32 (m,
2 H,
H, DMTr); 7.56 (5, 1 H, H-C(6)), 7.84
H-C(6")), 9.16 (s, br, C(5)-CH2-NH),
12.1
(s,
1
HNEt3+).
HRMS
H,
(100,
303
(C51H52N8012+): 968.3704, gef.:
für
ber.
1
(s,
H, H-N(3)).
968.37): 1070.5 (86, MNEt3H+), 969.4 (45, MH+),
M ber.:
102
2
(m,
7.12-7.20
968.3703.
Phosphoramidit
188
von
obiger Verbindung
O
NH
O
°ynyn
o
N
\
MeO—^
188
OMe
187
(170 mg) wurde in Methylenchlorid (1 ml) gelöst.
gesättigt.
Nach
zugegeben.
Zugabe
Nach 3 h
von
war
DIEA
(100 (il) wurde
die Reaktion
Dunkeln direkt auf eine Silica-H-Säule
(DCM
nach 5%
MeOH) gereinigt.
/MTBE in Pentan
Die
=
gefällt.
abgeschlossen.
aufgetragen
188 wurde als
gelbes
Lösung
wurde mit
Lichtausschluss CEDCI
Die
Reaktionslösung
Argon
(60 ul)
wurde im
und das Produkt mit einem Gradienten
Das Eluat wurde
Charakterisiemng erfolgte über 31P-NMR:
0.25)
unter
Die
eingeengt
Pulver
(110
und nochmals
mg,
149.32 149.43.
54%)
aus
DCM
isoliert.
Rf (CHCl3/MeOH 15:1)
Das Produkt oxidierte unter Licht sehr schnell. Dabei veränderete sich das 31-P-
NMR-Spektum: 7.43,
7.35.
R{ (CHCl3/MeOH 15:1)
=
0.2.
Kap.
181
189
N-Allyloxycarbonyl-5-aminomethyl-2'-desoxyuridin
179
(600
mg,
9%tiger Kahumcarbonatlösung (15 ml)
und das
zugegeben
(30 g)
189
2.29 mmol,
(781mg,
EE
für 1 h
in
Wasser
chromatographisch gereinigt (FC:
Allyloxycarbonylchlorid (350 |il)
wurde mit
eq)
1.0
2.33 mmol,
als
eine
direkt
wurde
Produkt
Das
100:7). Die Hauptfraktionen ergaben
EE/MeOH
—>
98%)
entfernt.
vacuo
in
Kieselgel
Anschliessend wurde
gerührt.
7
und
hygroskopische
farblose,
ölige
Verbindung.
181
Variante:
3.95 mmol,
(lg,
1.0
Raney-Nickel
Nach
(25 ml) gelöst.
zugegeben
Hauptfraktionen ergaben
und
m,
1122
0.28.
=
m,
3.90-3.95
1274
(q,
1467
s,
Kahumcarbonatlösung
wurde für 1
pH
(FC:
mmol,
EE
—»
EE:MeOH
96.4%)
h
Kieselgel (5g)
wurde
6.0
=
eine
als
100:7).
farblose,
-
5.87-6.00
=
2.20-2.30
3.97
5.4 Hz Hz,
2
(m,
1
H-C(l')), 7.91 (s, 1 H, H-C(6)).
H,
=
0.26.
IR(KBr): 983
w,
1050
1533 m, 1690 sh, 1724 vs, 2944 m, 3431
m,
H-C(4'));
1 H,
H, H-C(3')); 4.54 (d, 3J
OCH2CHCH2),
3.81
(1.3 g,
von
und in 9%
Rf (CHCl3/MeOH 10:1)
iH-NMR (200 MHz, CD30D): 8
H2-C(5'));
isoliert
Zugabe
Anschliessend wurde
auf
(8 ml)
konz.
aus
ölige Verbindung.
Rf (EE/MeOH 20:1)
1094
189
Nach
gelöst.
Allyloxycarbonylchorid (0.6 ml)
von
säulenchromatographisch
und 189
hygroskopische
m,
Zugabe
eingeengt
Nach Ansäuern mit 2 M HCl
gerührt.
Die
abfiltriert und das Filtrat
Mischung
hydriert.
bei 5 bar
wurde 2 h
Raney-Nickel-Suspension (2 ml)
einer
in
(8 ml)
und Wasser
Ammoniumhydroxidlösung (30 ml)
das
wurde
eq)
(m,
(s,
H,
2
s.
H, H2-C(2')); 3.73-3.77 (t, 2 H,
2 H,
C5-CH2NH);
OCH2CHCH2),
OCH2CHCH2),
6.28
4.36-4.423 (m, 1
5.15-5.35
(t, 3J
-
13C-NMR (50 MHz, CD3OD): <5
6.6
=
(m,
Hz,
2
H,
1
H,
36.98; 39.83;
61.61; 65.16; 70.94; 85.22; 87.64; 111.25; 116.30; 133.12; 138.52; 150.90; 157.40;
164.0.
MS
(FAB+,
M
ber.:
(C14H20N3O7+): 342.1301, gef:
341.12):
342.1295.
342
(100,
MH+).
HRMS
ber.
für
Kap.
182
7
190
5'-0-Dimethoxytrityl-N-allyloxycarbonyl-5-aminomethyl-2'-desoxyuridin
MeO
190
OMe
189
Entfernung
Zugabe
Ar
von
von
Wasser auf 5 ml
Bei
mg, 2.4
mg, 1.2
Argon
aufgenommen
aus
Toluol
mmol, 1.4 eq) wurde über Nacht
unter
von
wurden nochmals
DIEA
Dimethoxytritylchorid
Nach weiteren 4 Stunden
wenig
Der Rückstand wurde in
eingengt.
Es
vollständig abgeschlossen.
chromatographisch gereinigt.
und direkt
zur
und
Zugabe
die Reaktion nahezu
war
und zweimal
eingeengt
Dabei wurde 190
mmol, 71%) als farbloses Pulver erhalten.
Rf (CHCl3/MeOH 10:1)
=
0.42.
3066 w, 2966 m, 1715 vs, 1680
1251 5,
mg, 2.4
und
(0.3 ml)
Nach
eingeengt.
mmol, 1.4 eq) und DIEA (0.3 ml) zugegeben.
Dichlormethan
(780
Pyridin (15 ml) gelöst
wurde in abs.
unvollständiger Umsetzung
Rühren bei RT unter
wurde
eq)
Dimethoxytritylchorid (600
gerührt.
(200
1.0
1.7 mmol,
(581mg,
66-75°C
Smp.:
sh, 1607
m,
(Zers.).
IR(KBr):
3343 w, 3187
w,
1509 s, 1464 s, 1395 w, 1380 w, 1365 w,
1179 5, 1121 w, 1077 m, 1033 s, 930 m, 826 m, 726 w, 700 w,
584
w.
iH-NMR (200 MHz, CDC13): 5=2.19-2.51 (m, 3 H, H2-C(2'), CH2-NH-CO), 3.43 (d,
3/
-
4.02
4.1 Hz, 2 H,
(q, 3/
~
CH2-N),
9.9 Hz, 3J
-
OCH2CHCH2),
5.16-5.37
OCH2CHCH2),
6.30 (t, 3J
6.91-7.46
NMR
3.72
(d, 3J
5.8 Hz, 2 H,
-
5.8 Hz, 1 H,
(m,
-
3
H,
6.6 Hz,
(m, 9 H, DMTr-H), 7.66 (s,
H2-C(5')),
H-C(4')), 4.50 (d, 3J
-
3.81
(s, 6 H, OMe),
3-OH,
5.8 Hz, 3 H,
H-C(3'), OCH2CHCH2), 5.78-5.96 (m,
1 H,
1
H-C(l')), 6.84-6.89 (m,
4
1
H,
H, DMTr-H),
H, H-C(6)), 8.83 (s, br, 1 H, H-N(3)). 13C-
(50 MHz, CDC13): 8= 35.58; 38.12; 52.82; 61.16; 63.10; 69.83; 82.75; 83.35;
84.53; 109.09; 111.00;
115.25;
124.74;
125.70;
136.01; 142.17; 147.63; 153.69; 156.42; 160.77.
(14, MNa+), 644 (79, MH+),
303
(100, DMTr+).
125.79;
MS
127.79;
(FAB+,
130.52;
M ber.:
133.19;
643.25):
666
183
Kap.
7
2-Cyanoethyl-N,N-diisoproyl-(5'-Odimethoxytrityl-N-allyloxycarbonyl-5-aminomethyl-2'-desoxyuridinyl)-phosphoramidit
191
MeO
OMe
190 (490 mg, 0.75 mmol, 1.0
Zugabe
Ar
von
gerührt.
1:2 nach
DIEA (0.3
Die
=
OCH2CH2CN);
3.69 (m, 4 H,
Methylenchlorid (2 ml) gelöst.
Nach
(0.2 ml) langsam zugetropft und für 1 h
wurde direkt
chromatographisch gereinigt (FC:
unter
EE/HE
0.13
u.
0.21.
iH-NMR (500 MHz, CDC13): 8
2.25-2.32 (m, 1 H,
2.46-2.58
H2a-C(2'));
2.44
u.
1.06-1.18 (m, 12 H,
2.62
=
(2
t,
3J
-
6.3 Hz, 2 H,
(m, 1 H, H2b-C(2')); 3.34-3.44 (m, 2 H, H2-C(5')); 3.52-
C5-CH2-N, N[CH(CH3)2]2);
3.79
u.
3.78 (2 s, 6 H,
OCH3);
4.13-4.17
H, H-C(4')); 4.47 (m, 2 H, OCH2CHCH2); 4.56-4.61 (m, 1 H, H-C(3*)); 5.16-
6.27 (m, 3 H,
6.30
wurde CEDCI
Reaktionslösung
N[CH(CH3)2]2);
1
wurde in abs.
3:1). Es wurde 191 (176 mg, 0.2 mmol, 27%) als farbloses Pulver erhalten.
Äf (EE/HE 1:1)
(m,
ml)
eq)
CH2NHCO, OCH2CHCH2);
(m, 1 H, H-C(l')); 6.83-6.85 (m,
7.41-7.43
(m,
2
H, DMTr-H); 7.70
u.
4
(m,
1
H,
OCH2CHCH2);
6.25-
H, DMTr-H); 7.20-7.33 (m, 7 H, DMTr-H);
7.67
N(3)). 13C-NMR (125 MHz, CDC13): 8
5.85-5.87
=
(2
s,
1
H, H-C(6)); 8.62 (s, br, 1 H,
H-
20.18; 20.23; 20.38; 20.43; 24.47; 24.51
24.51; 24.53; 24.56; 24.60; 24.61; 24.65; 38.03; 39.90; 39.99; 43.22; 43.28; 43.32
43.38; 55.23; 55.26; 58.18; 58.33; 63.09; 63.23; 65.44; 73.12; 73.26; 73.55; 73.69
85.24; 85.31; 85.33; 85.38; 85.65; 85.67; 86.80; 111.37; 111.44; 113.19; 113.30
113.37; 117.39; 117.49;
117.56; 127.03; 127.07; 127.79; 127.86; 127.98;
128.04
128.19; 128.24; 130.15; 130.17; 130.22; 132.93; 135.46; 135.60; 138.25;
144.46
149.86;
149.90;
155.84;
lH-entkoppelt, CDC13):
158.67;
158.69;
163.00.
31P.NMR(202.5
MHz,
149.52, 149.21. MS (FAB+): 844 (22, MH+), 626 (57, [MH
OPO(NiPr2)OCH2CH2C]+),
843.3608, gef: 843.3613.
303
(100, DMTr+).
HRMS ber. für
-
(C44H54N5O10P+):
Kap.
7
184
N-(O-Fluorenylmethoxycarbonyloxy)
-
5-aminomethyl-2'-desoxyuridin
194
o
179 (340 mg,
und THF
1.77
1.32 mmol,
bei 0°C
(5 ml)
mmol,
1.34
eq.)
beiO°C wurde mit
extrahiert.
Die
Essigsäure
MgS04 getrocknet.
(FC:
gelöst
in THF
vereinigten
Die
eq.) wurde
1.0
9%-iger Kahumcarbonatlösung (5 ml)
in
und mit einer
(5 ml)
Lösung
wässrige Lösung
EE-Phasen wurden mit ges.
DCM/MeOH 20:1 nach
wurde
eingeent
194
10:1).
FMOC-OSu
unter starkem Rühren versetzt.
neutralisiert und die
Lösung
von
(280
(600
mit EE
(3x 50 ml)
NaCl-Lösung gewaschen
und 194
mg,
Nach 1 h Rühren
und mit
chromatographisch gereinigt
mg, 0.583 mmol,
44%)
wurde als farb¬
loses Pulver isoliert.
Rf (CHCl3/MeOH 10:1)
=
0.22.
C(5)-CH2-NH-CO, H2-C(2'));
CH2-NH, C(5')-OH);
1
H, C(3')-OH); 5.2
7.26-7.52
-
iH-NMR (200 MHz,
3.5-3.6 (s, br, 2 H,
4.18-4.28 (m, 4 H,
5.3
7.6 Hz, 2 H, Ar-Fmoc); 11.4 (5, 1 H,
479.17):
Fmoc-CH2),
8= 2.0-2.2 (m, 3 H,
3.7-3.9
7.7
(m,
3
H, C(5)-
H-C(3'), H-C(4'), H2-C(5')); 4.9-5.0 (s, br,
(5, br, 1 H, Fmoc-CH); 6.18 (t, 1 H, 3J
(m, 5 H, Ar-Fmoc, H-C(6)),
480
d6-DMSO):
(d, 3J
H-N(3)).
=
8.1 Hz, 2 H,
MS
(FAB+,
=
6.5 Hz,
Ar-Fmoc);
M ber. für
H-C(l'));
7.9
(d, 3J
=
C25H25N307:
(100, MH+).
5'-Dimethoxytrityl-N-(0-fluorenylmethoxycarbonyloxy)-5-aminomethyl-2'-desoxy uridin 195
MeO
OMe
194 (270 mg, 0.56 mmol, 1.0
anschliessend in abs. DMF
eq)
wurde 2 mal
(2 ml) gelöst.
aus
abs.
Pyridin (2 ml) eingeengt
Dimethoxytritylchlorid (410 mg)
und
wurde in
185
Portionen
zugegeben,
Reaktion
wurde
bis das Edukt
das
vollständig
Lösungsmittel
säulenchromatographisch (SiO2-60,
noch
war, wurde
vemnreinigt
es
in
=
0.15.
(5,
8
2.37-2.44
nochmals
=
gelöst und
Rf (CHCl3/MeOH 10:1)
2
Rückstand
Da
es
=
aus
Hexan
iH-NMR (500 MHz, CDC13):
0.40.
=
gefällt.
2.22-2.35
(m, 2 H, C(5)-CH2-NH-CO,
=
3J
7.8 Hz,
=
2
H, Fmoc-CH2), 3.7
3.9 Hz,
1
H, H-C(3'));
H, H2-C(5')); 4.46 (s, 1 H, 3'-OH); 5.5 (m, 1
H); 7.15-7.31 (m, 9 H, DMTr-H); 7.39 (m,
1
dem
20:1) das Produkt isoliert.
H, Fmoc-CH); 6.27 (t, 1 H, 3J= 6.5 Hz, H-C(l')); 6.81 (d, 3J
Ar-Fmoc); 7.66 (s,
aus
(m, 1 H, H2b-C(2')); 3.40 (d, 3/= 3.9 Hz,
(m, 1 H, H-C(4')); 4.28 (d,
Nach Abschluss der
war.
und
7
säulenchromatographisch gereinigt (SiO2-60,
H, C(5)-CH2-NH, 0-CH3); 3.99 (q, 3J
4.12-4.16
entfernt
vacuo
(Das Spektmm enthielt noch Hexanreste.) 8
H2a-C(2'));
verschwunden
DCM:MeOH
EE/HE 2:1). Der Rückstand wurde in EE
Rf (HE/EE 1:2)
Kap.
4 H,
H, H-C(6)); 7.73 (d, 3J
=
H-N(3)). 13C-NMR (125.8 MHz, CDC13): 8
=
8.8 Hz, 4 H, DMTr-
Ar-Fmoc), 7.52 (d, 3J
7.6 Hz, 2 H,
=
=
8.1
Hz, 2 H,
Ar-Fmoc); 9.00 (s,
1 H,
38.08; 40.64; 47.15; 55.21; 63.59;
66.78; 72.23; 85.19; 85.81; 86.89; 111.37; 113.33; 119.95; 125.10; 125.13; 127.03;
127.68; 128.01; 130.11;
135.51; 135.57; 138.52; 141.28; 143.91; 143.94;
150.03; 156.15; 158.67; 163.27.
MS
(FAB+,
M ber. für
144.52;
C46H43N309: 781.30): (804,
5, MNa+); (782, 6, MH+); (764, 9, MH-H20+); (460, 20, MH+); 303 (100, DMTr+).
2-Cyanoethyl-N,N-diisoproyl-(5'-dimethoxytrityl-N-(0-fluorenylmethoxycarbonyloxy)-5-aminomethyl-2'-desoxyuridinyl)-phosphoramidit
196
MeO
196
OMe
195 (200 mg, 0.26 mmol,
1.0
eq.)
abs. THF
gelöst (1.5 ml).
zugegeben
und für 2 h bei RT unter
ein farbloser
und mit THF
mit
Nach
Niederschlag gebildet.
gewaschen.
wurde
Zugabe
gewaschen.
von
DIEA
eingeengt (3x
(200 ul)
5
ml)
wurde CEDCI
und in
(100 ul)
Bereits nach 15 Minuten hatte sich
Dieser wurde nach 2 h mit einer Glasfritte abfiltriert
Das Filtrat wurde in
Die
abs. THF
Argon gerührt.
Argon gesättigtem EE (15 ml) gelöst
(3x 5 ml)
aus
vacuo
eingeengt.
und mit eiskalter
organische
Phase wurde
Der Rückstand wurde in
9%iger Kahumcarbonatlösung
über
MgS04 getrocknet
und
Kap.
186
7
Es wurde ein farbloser Schaum erhalten.
eingeengt.
Dieser wurde in Toluol
gelöst
(3 ml) und in Pentan (150 ml) eingetropft. Es bildete sich ein farbloser Niederschlag,
der abfiltirert und über
CaCl2
in
vacuo
getrocknet
wurde.
Ausbeute: 220 mg, 0.224 mmol, 86%.
Rf (HE/EE 1:2)
0.50
=
0.63.
+
Smp.:
84-89°C (Zers.).
IR
(KBr):
3411 w, 2956 m,
1715 vs, 1683 sh, 1000 w, 1509 s, 1461 m, 1250 s, 1172 m, 1078 m, 1027 m, 978 m,
iH-NMR (400 MHz, CDC13): 8
828 w, 756 w,
738
N[CH(CH3)2]2);
2.25-2.77 (m, 4 H, H-C(2),
w.
=
OCH2CH2CN),
1.04-1.29
3.31-3.82 (m,
H2-C(5'), C(5)-CH2-N, N[CH(CH3)2]2, OCH3, OCH2CH2CN),
H-C(4'), CH2NHCO), 4.24-4.29 (m,
CH), 6.18-6.30 (m,
2
H,
Fmoc-CH2),
(m, 12 H,
4.11-4.19
(m,
5.30-5.38 (m, 1 H,
Fmoc), 7.73-7.78 (m,
MK+),
7.7
H, H-C(6), Ar-Fmoc).
Fmoc-
2
H, Ar-
31P-NMR(121.5 MHz, lH-entkoppelt,
C44H54N5O10P: 981.41):
1020.8
(42,
(100, MNa+), 982.6 (20, MH+).
Oligonukleotidsynthese
vom
Gerätehersteller
mitgelieferten
im 1.3 umol-Massstab
Säulen wurden mit der
(50 mg) des gewünschten Trägermaterials gefüllt.
Oligomeren
verfuhr
man
Dinukleosid enthaltenden
stehende
DMT-Gmppe
trockengesaugt
7.7.2
s.
nicht
Sequenzen,
von
in die
der
Standard
suspendiert
Entschützen
Im Falle
von
von
Synthesen
Herstellers,
von
im
Am Ende der
Synthese
wurde die
Die Säulen wurden
natürlichen
Falle
von
verwendet,
am
am
5'-Ende
Vakuum
Entschützungslösung gegeben.
synthetisierten Oligonukleotide
CED-geschützten Sequenzen (Entschützung A)
Cyanoethylphosphoramiditen (CED) synthetisiert
wurden für die basische
und unter
entsprechenden Menge
verlängerte Kupplungszeit
abgespalten (DMT-ON).
ungeöffnet
die mit Standard
wurde eine
Anhang).
Entschützung
Entschützen
waren,
und
Für die
gemäss den Protokollen des
Sequenzen,
(modifiziertes Programm:
Entschützung
gelegentlichem
in
(ges. NH3/H20)/EtOH
3:1
worden
(3 ml)
Schütteln für 16 Stunden bei 55°C belassen.
Pac-geschützten Sequenzen (Entschützung B)
sogenannten Pac-geschützten Oligonukleotiden
(N(6)-Phenoxyacetyl-dA,
N(6)-Isobutyryl-dC, N(2)-Isopropylphenoxyacetyl-dG) erfolgte
zung
H,
Oligonukleotidsynthese
7.1 A
Die
3
149.78, 149.51. MS (ESI+, M ber. für
1004.7
2
H, H-C(l')), 6.80-6.85 (m, 4 H, DMTr-H), 7.16 -7.20 (m, 1 H,
1
DMTr-H), 7.24-7.42 (m, 13 H, DMTr-H, Ar-Fmoc, 5-NH), 7.51-7.54 (m,
CDC13):
14 H,
((ges. NH3/H20)/EtOH
3:1
(3 ml)) innerhalb
von
die basiche Entschüt¬
zwei Stunden bei 70°C.
187
Wasserfreies Entschützen
7
Pac-geschützten Sequenzen (Entschützung C)
von
Pac-geschützten Oligonukleotide
Kap.
wurde in frisch
kalischen Methanol bei 4°C über 16 h unter
mit Wasser versetzt wurde, wurde
die
zubereitetem, wasserfreiem, ammonia-
gelegentlichem
Schütteln entschützt.
Entschützungslösung vorsichtig
am
Bevor
Vakuum
entfernt.
7.7.3
Die
2
Reinigung
Ammoniaklösung
min)
der
aus
Entschützung
Als
wurde
abpipetiert
Säule entfernt.
A und
vacuo
Die
eingeengt.
Reste durch
Zentifugation (1000
wurde nochmals
Entschützungslösung
Rohprodukt
Das
mit Wasser
und die
rpm,
(nur bei
Waschlösung
wurde in Wasser oder Puffer
gereinigt.
HPLC
wurde eine
HPLC-System
und
Die Säule
B) gewaschen.
wurden vereint und in
gelöst mittels
Oligonukleotide
der
aus
zwei
Pumpen (Knauer 0064),
die über ein Interface
(Knauer Proj. 50) gesteuert wurden, einer Mischkammer (von Knauer), einem Detektor
mit Schreiber
bestehende
Bei
Anlage eingesetzt.
präparativen Injektionen
Es wurden
O
(von Knauer) und einem Injektionsventil mit einer 2 ml-Probenschleife
folgende
Vydac
wurde bei 280
wurde bei 260
nm
eingesetzt:
mm, 5 um
Porengrösse
A: 0.1 M
Triethylammoniumacetat
in
H20 pH 7.0,
05% MeCN.
B: 0.1 M
Triethylammoniumacetat
in
H20 pH 7.0,
80% MeCN.
ml/min, 0
Nucleogel
Sax
->
45% B in 30 min.
1000-8/46, 50x7.5
mm von
A: 0.2 M
NaCl, 0.01 M NaOH pH12.0.
B: 1.0 M
NaCl, 0.01
M NaOH
->
B: 0.1 M
Machery&Nagel.
pH12.0.
70% B in 32 min.
Nucleosil 120-5 C18, 250x5 mm, 5 |i
A: 0.1 M
detektiert.
detektiert.
nm
2011P10, 250x10
Fluss: 2 ml/min 20
©
analytischen Injektionen
Säulen und Laufmittel
RP-C18
Fluss: 5
©
Bei
Porengrösse
Triethylammoniumacetat
in
H20, pH
Triethylammoniumacetat
in
H20,
von
Machery&Nagel.
7.0.
80% MeCN
pH
7.0.
Fluss: 5 ml/min 5 ->10% B in 10 min, 10 -»25% B in 30 min.
Kap.
7
188
Nucleosil 120-5 C18, 250x5 mm, 5 [i
0
A: 0.1 M
B: 0.1 M
Porengrösse
Triethylammoniumacetat
in
H20, pH
Triethylammoniumacetat
in
H20,
von
Machery&Nagel.
7.0.
80% MeCN
7.0.
pH
Fluss: 5 ml/min 0 -»12% B in 30 min.
©
Nucleosil 120-5 C18, 250x5 mm, 5 \i
Porengrösse
AI: 0.1 M
H20, pH
Triethylammoniumacetat
A2: Wasser
(Zum Wechseln
von
in
von
7.0
AI auf A2 wurde
Machery&Nagel
Auftragen.
zum
gepurgt).
B: 80% MeCN.
Fluss: 3 ml/min, 3 min AI, 5 min A2, 0
Die DMTr-ON
synthetisierten Oligonukleotide wurden
und
(Tab. 25)
Entfernen
des
Lösungsmittels
HCOOH/H20 (3 ml) detrityliert.
nochmals
->
in
90% B in 30 min.
nach der
Reinigung
durch
vacuo
Aufnahme
Nach Entfernen der Ameisensäure in
chromatographisch (Methode
© oder Methode
über HPLC
©) gereinigt und
in
vacuo
50%
wurde
direkt entsalzt
(Methode ©).
Anschliessend
an
die
Reinigung
per HPLC
war
erfolgte entweder
per HPLC
SEP-PAK® C-18 Säulen (Waters
Millipore)
entsalzen.
Dies
wurden die
Säulen, die
und dann mit 0.1 M
Auf die
mit Wasser
der
die
Oligonukleotide
oder unter
Verwendung
mit den Dimensionen 10x9
wurden,
Triethylammoniumcarbonat (5 ml)
erst mit
oder Wasser
noch
mm.
zu
von
Dazu
Acetonitril (5 ml)
(5 ml) gewaschen.
wässrige Oligonukleotidlösung aufgetragen
und
(10 ml) gewaschen. Mit 30%iger Acetonitrillösung (10-20 ml) wurde das
Oligonukleotid
nach
(Methode ©)
stets nur einmal verwendet
vorbereitete Säule wurde die
so
nötig
es
eluiert.
selben
Wässrige
Prozedur
Fraktionen die noch
nochmals
entsalzt.
Oligonukleotid
Die Acetonitril
enthielten wurden
und
Oligonukleotid
enthaltenden Fraktionen wurden für den weiteren Gebrauch verwendet.
7.7.4
Reinigung
Die
Xeragon
von
zur
von
Verfügung gestellten RNA-Sequenzen
Rohprodukt (DMTr-OFF)
Sephadex-Säule
RNA Flow
©
gereingt
RNA
erhalten.
Zur
Reinigung
Cutoff MW 1000 entsalzt.
3.0, Wasser
zum
Regerieren
und mit Methode © entsalzt.
der
137 und 143
wurde sie erstmals
wurde als
mittels
einer
(Fluss 1.0 ml, Wasser, Nach Elution der
Säule).
Anschliessend wurde mit Methode
189
desoxy,
Tab. 25: d:
Uridin,
110,
T=T:
ribo,
f
:
Formacetal,
A:
126
(imol
3
5'-d(CGCGTU=UTGCGC)-3'
5'-d(CGCGTU=UTGCGC)-3'-
Verunreinigung
151
5
'
Adenin,
C:
Cytosin,
Guanin,
G:
Reini-
0^260
Masse
gung
(Ausbeute)
(MALDI)
A
O
3
A
O
-3
'
3
A
O
5'-d(CGACGT=TGCAGC)-3'
10
B
©& ©
132
5'-d(CGACGT=TGCAGC)-3'
10
B
©&©
133
5'-d(CGACGU=UGCAGC)-3'
2.5
C
o
3.5
B
o&©
134
5
136
5'-d(GCTGCAACGTCG)-3'
10
A
0
137
5'-r(GCUGCAACGÜCG)-3'
1.5
-a)
o
138
5'-d(CGTATT=TATTCTGC)-3'
3
A
o&©
138
5'-d(CGTATT=TATTCTGC)-3'
10
A
o&©
139
5'-d(CGTATU=UATTCTGC)-3'
2.9
C
©
2.9
B
©
5'-d(GCAGAATAAATACG)-3'
10
A
©&©
5'-r(GCAGAAUAAAUACG)-3'
1.5
_a)
o
5'-d(CGAACGTT=TTCGTTCG)-3'
2.9
A
©
5'-d(CCGAACGTTTTCGT=TCGG)-3'
3.0
A
©&©
5'-d(TACT=TGGAGTCAGG)p-3'
1.5
B
©
3
B
©
140
142
143
144
145
146
147
5
5
'
'
-d
-d
U:
-zung
126
von
-d(CGCGTUfUTGCGC)
-d
Thymidin,
Entschüt
132
'
T:
7
U=U: 108
Sequenz
Nr.:
131
r:
Kap.
(CGACGTfTGCAGC)
-3
(CGTATTfTATTCTGC)
(TACTfTGGAGTCAGG)
'
-3
-3
'
'
15
3549.4
(ber.)
(5%)
3548.6
(gef.)
(9%)
3564.6
(gef.)
24
117
3549.4
(ber.)
(35%)
3547.9
(gef.)
(ber.)
(gef.)
40
3595.5
(4%)
3596.1
90
3595.5
(8%)
3595.1
(ber.)
(gef.)
36
3567.4
(14%)
3567.9
(ber.)
(gef.)
150
3595.5
(ber.)
(35%)
3596.4
(gef.)
(ber.)
(gef.)
213
3645.4
(17%)
3645.1
28.8
3809.4
(15%)
3810.8
25
4168.8
(7%)
4168.3
(ber.)
(gef.)
(ber.)
(gef.)
147
4168.8
(13%)
4167.2
(ber.)
(gef.)
55.6
4140.8
(ber.)
(16%)
4140.0
(gef.)
(ber.)
(gef.)
100
4168.8
(26%)
4170.5
147
4303.9
(9%)
4302.8
(ber.)
(gef.)
37.6
4499.8
(ber.)
(14%)
4500.4
(gef.)
(ber.)
(gef.)
53
4812.2
(13%)
4812.9
26.4
5430.6
(6%)
5432.6
31.8
4347.9
(13%)
4347.8
141
4267.9
(31%)
4268.2
a) Wurde bereits entschützt von der Firma Xeragon freundlicherweise zur Verfürung gestellt.
b) Berechnete Massen sind als Durchschnittsmasse (average mass) angegeben.
(ber.)
(gef.)
(ber.)
(gef.)
(ber.)
(gef.)
Kap. 7
7.8
190
Nachträgliche
Mit den
Phosphoramidten 196
erfolglos.
Trägermaterial
Schritte
für
Lösung
Das
in
Piperidinlösung
15 min
viermal
keinen
TBTU
das
sollten
nachträglich
dargestellte Oligonukleotiden
dagegen
konnte
bei
20%-igen
RT
blieb
modifiziert werden.
wurde mit DMF
wiederholt.
Anstieg
in der
Bei
Nach
Im
Oligonukleotid
in
Zentrifiigation
aufgmnd
nm
einem
der
vierten
mit DMF
nm
1.5 ml-
wurde
zeigte
und mit 193
(7 mg), HOBT (6 mg) und DIEA (5 ul) in DMF (1 ml) für
Nach
Abspaltung
(ges. NH3/H20)/EtOH
und
3:1
=
Entschützung
(1 ml),
war
das
war
des
die
mehr.
gewaschen (6x1 ml)
(3x1 ml)
die
Diese beiden
Wiederholung
bei 260
am
abgespaltenen
des
gewaschen (2x1 ml).
UV-Absorption
Trägermaterial
wurde das
Piperidinlösung
geschüttelt.
Nach Waschen mit DMF
und fluoreszierte.
Nacht in
mit 191
entfernt (Sie absorbierte bei 260
Anschliessend wurde das
geschüttelt.
einer
Trägermaterial
wurden
(5.2 mg),
von
Oligonukleotidsynthese (DMTr-ON)
(27 mg)
Reaktionsgefäss
Fluorens).
dargestellte Oligonukleotide
die verwendete Prozedur beschrieben:
Nach Abschluss der
überstehende
Oligonukleotiden
von
Oligonukleotid 5'-FAACCC(3')
Das
folgenden ist
und 191
Die Modifikation
modifiziert werden.
RT
Modifikation
Trägermaterial
Ohgonukleotids
die überstehende
3 h
noch
bei
gelb
bei RT über
Lösung
aber auch
Trägermaterial gelb.
Die überstehende
© isoliert
zeigte
Lösung
wurde
(keine gute Trennung,
die
eingeengt
und die fluoreszierende Fraktion mit Methode
ein Gemisch
typische Flavinabsorption
bei
von
450
mehreren
nm
im
Sequenzen).
UV
(Abb.
Diese Fraktion
37)
und
wurde
massenspektroskopisch untersucht.
MALDI: ber: 2209.5;
7.9
gef:
2210.2
Enzymatische
(100), 2194.7 (27), 1921.1 (63), 1896.9 (33).
Studien
Methode I:
In
Pyrex
Glassröhrchen wurden
Lösungen (200 fil) vorbereitet,
die 126
(5 nmol),
0.1 M
NaCl, 10 mM KH2P04 pH 7.0, 5 mM DTT und DNA-Photolyase (25 pmol in den
Fällen
von
enthielten.
A. nidulans und N.
Die
Assaylösungen
nm
Enzyme
wurden
crassa
wurden
resp.
250 umol im Falle
abschliessend
gemischt und bei
435
nm
im
von
Dunkeln
(A. nidulans), 405
(P. tridactylis) bestrahlt (Spex 1680 Fluorolog, 0.22
m
P.
tridactylis)
zugegeben.
nm
Die
(N. crassa)
380
Doppel Spektrometer,
ausgestattet mit einer 450 W Hg/Xe Lampe und einem doppelt grating Monochromator).
Die
Messungen
(5 |il)
wurden bei RT
entnommen und
durchgeführt.
Für
Essigsäure (5 ui) zugegeben,
jeden Zeitpunkt
um
die
wurde ein
Enzymreaktion
zu
Aliquot
stoppen.
191
Kap.
Die Proben wurden bei -20°C aufbewahrt bis eine
durchgeführt
Analyse
mit
7
lonenchromatographie
wurden.
Methode II:
In einer Mikrokuvette mit
Magnetrührer
geschädigte Oligonukleotid (5
5 mM DTT und
Lösung ohne
abgekühlt,
Dunkeln kurz
gemischt,
1680
Lampe
(20 (II)
vor
Beginn
0.22
Sax
NaCl, 10 mM KH2P04 pH7.0,
uM) enthielten.
annellieren. DTT und
equilibriert
Dabei wurde die
langsam
Die
Assaylösungen
1000-8/46, 50x7.5
oder 0.1
Die
mm
Proben
von
wurde ein
M HOAc
wurden
(10 ul)
mit
Machery&Nagel,
auf 0°C
wurden im
DNA-Photolyase
und bei 15°C bei 435
jeden Zeitpunkt
Für
(60 ul)
zugegeben.
B: 1.0 M
0.025
die das
den DNA- oder
wurden
bestrahlt
nm
Doppel Spektrometer, ausgestattet mit einer 450
und 8 N Harnstoff
Aliquot
zum
W
(Spex
Hg/Xe
entnommen
Stoppen
der
Ionenchromatographie
A: 0.2 M
NaCl, 0.01 M
NaCl, 0.01 M NaOH pH12.0, Fluss: 2 ml/min, 0-^6 min:
6^23 min: 0% B^51% B,
23.5^25 min:
RP-C18-Chromatographie (Nucleosil
Fluss: 0.7
100%B, 25.1^30 min: 0%B.)
120-3 C18, 250x4 mm,
3
u,
Porengrösse,
ml/min, A: 20 mM CH3C02NH4, B: 50% MeCN, 50% A (v/v), 0^20 min:
6—»16% B)
bei
m
0.1 M
Reparaturstudie zugegeben.
und einem Monochromator).
NaOHpH12.0,
oder
der
fünf Minuten auf 15°C
(Nucleogel
eq),
für 5 Minuten auf 80°C erhitzt und
Oligonukleotide zu
Photolyasereaktion
0%B,
Photolyase
die
Fluorolog,
eq) und gegebenenfalls
DNA-Photolyase (A.nidulans,
DTT und
um
bzw. 1 uM, 1.0
bzw. 1.3 uM, 1.3
RNA-Gegenstrang (6.5
Lösungen (750 (il) vorbereitet,
wurden
analysiert (Injektonsvolumen:
Denaturiemng mit HOAc).
70 ul bei
Denaturierang
mit Harnstoff, 20 ul
Kap.
8
192
7
Abkürzungsverzeichnis
5,10-MTHF
5,10-Methylentetrahydrofolat
8-HDF
8-Hydroxydeazaflavin
abs.
absolut
AcOH
Essigsäure
Anal.
Elementaranalyse
Aoc
Allyloxycarbonyl
AP
Apyrimidine/Apurine
Ar
Argon
ArH
aromatische Wasserstoffe
ber.
berechnet
Bn
Benzyl
BOP
Benzotriazol-l-yloxy-tris(dimethylamino)phosphonium-
Stelle
hexafluorophosphat (Castro's Reagenz)
bp
Basenpaar
br.
breit
bzw.
beziehungsweise
c
Konzentration
ca.
circa, ungefähr
CD
Circular Dichroismus
CPG
controlled pore
d
Dublett
DBU
l,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en.
DC
Dünnschichtchromatogramm
DCM
Dichlormethan
DEAD
Azodicarbonsäure-diethylester
DIEA
Ethyldiisopropylamin (Hünigs-B ase)
DMAP
Dimethylaminopyridin
DMF
Dimethylformamid
DMTr
Dimethoxytrityl
DNA
Desoxyribonukleinsäure (deoxyribonucleic acid)
DNase
Desoxyribonuklease
drib
2'-Desoxyribose
ds-DNA
doppelsträngige DNA
DTT
Dithiothreitol
EE
Essigester
glass
Kap.
193
ESI
Elektrosprayionisierung
Et20
Diethylether
etc.
et cetera
EtOH
Ethanol
FAB
fast atom bombardement
FADH"
Flavinadenindinukleotid
FC
Flashchromatographie
Fmoc
9-Fluorenylmethoxycarbonyl
FmocOSu
Fluorenylmethyloxycarbonyl-N-hydroxysuccinimid
gef.
gefunden
ges.
gesättigt
GST
Glutation-S-transferase
h
Stunden
HE
Hexan
HOAc
Essigsäure
HOBT
1-Hydroxybenzotriazol
HRMS
Hochauflösendes
TAT
Ionenaustausch
J
Kopplungskonstante
kDa
kilo Dalton
M
molar
M
Molmasse
m
Multiplett
MALDI
matrix assisted
MeOH
Methanol
min
Minuten
MM
Molecular
MS
Massenspektrum
MTBE
Methyl-fôrt-butylether
n.
a.
nicht
n.
i.
nicht isoliert
Massenspektrum
layer desorption
ionisation
Modelling
angegeben
NB S
Af-Bromsuccinimid
NIS
N-Iodsuccinimid
NMR
Kernresonanzspektrum (nucleo magnetic
Pac
Phenoxyacetyl
Ph
Phenyl
PNA
Peptidnukleinsäure(n)
resonanz
spectroscopy)
8
Kap.
194
7
PPI13
Triphenylphoshin
PRE
Photoreaktiviemngsenzym
Py
Pyridin
RF
Retentionsfaktor
RMS
Root Mean
RNA
Ribonukleinsäure
RNase
Ribonuklease
RP
Umkehrphase (reversed phase)
RT
Raumtemperatur
s
Sekunden
s
Singulett
Si-H
Süica-H
Smp.
Schmelzpunkt
ss-DNA
einzelsträngige DNA
t
Triplett
TB TU
2-(B enzotriazol-1 -yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-tetrafluoroborat
TFA
Triflouressigsäure
TfOH
Frifluormethansulfonsäure
THF
Tetrahydrofuran
TOF
Flugzeit (time offlight)
Tr
Trityl
u.
und
UV
ultraviolett
Zers.
Zersetzung
Square (Kleinstes Fehlerquadrat)
(Ribonucleic acid)
Kap.
195
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Travers, A. und Drew, H., Biopolymers 1991, 44, 423-433.
11598.
59.
Crystal
Richmond, T.J.,
2.8 A resolution.
and nucleosome
58.
251-260.
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The
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T4
1-18.
Structural
RNA
Site-Specifically Modified Oligodeoxynucleotides
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synthesis
catalysed
ligase
oligo deoxy ribonucleotides and
80.
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a
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Stepwise
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Potential
82.
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The
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200
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Reduced RNA
synthesis
levels in isolated
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[(H20)(NH3)5Ru(II)]2+.
92.
Marx, K.A., Krüger, R., und Clarke, M.J., Mol Cell Biochem 1989, 86, 155162.
core
93.
Binding of
the transition metal ion
Photochemical
Epoxidation of Aflatoxin B]
of guanine containing
quantitative
induction
of
DNA adducts
Sterigmatocystin: Synthesis
by aflatoxin
BI and its
implications
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covalent cross-link adduct between
100.
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between
Mitomycin
Cullinane, C,
van
4632-4638. Does
102.
Verdine,
G.L.,
structure
und
of
a
C and DNA.
Isolation and Characterization
of
Major
a
Adduct
C and DNA.
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adriamycin
induce interstrand cross-links in DNA?
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Chemical
Configurationally
103.
mitomycin
J.,
Isolation and
Tomasz, M., Lipman, R., McGuinness, B.F., und Nakanishi, K., /. Am. Chem.
Soc.
101.
Pawlak,
1204-1208.
Characterization
Isomeric
of
DNA
Adducts
Derived
from
the
Benzo[c]phenanthrene-3,4-diol 1,2 Epoxides.
Chadha, A., Sayer, J.M., Yeh, H.J.C, Yagi, H., Cheh, A.M., Pannell, L.K., und
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Nucleoside Adducts Formed from Adenine, Guanine, and
and
the
Optically
Dibenz[a,j]anthracene.
Active
Bay-Region
Cytosine
3,4-Diol
Bases
of DNA
1,2-Epoxides
of
201
104.
Kap.
9
Cheng, S.C, Prakash, A.S., Pigott, M.A., Hilton, B.D., Roman, J.M., Lee, H.,
Characterization
105. Jerina, D.M.,
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oxazadiazabicyclononene
adducts
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with
containing
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Cross-Linking Agents
H. und
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Structure
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of
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Nucleotide
Predominant
Cross-Link
DNA
Sequence Preference
Formed
in
and
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Oligonucleotides.
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methyldeoxythymidine
polymerase
in
I
can
use
1983, 80,
02-methyldeoxythymidine
place of deoxythymidine
in
4884-
or
04-
primed poly(dA-dT).poly(dA-
dT) synthesis.
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in poly(dA-dT) all lead to transitions upon
-isopropyl
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or
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on
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Deoxyhexanucleotide containing
a
vinyl
chloride induced DNA lesion,
1 ,N°-ethenoadenine:
synthesis, physical characterization,
duplex bacteriophage
Ml3 genome
as
part of
an
and
amber codon.
incorporation
into
a
202
Kap.
9
117.
Li, B.F.L., Reese, C.B., und Swann, P.F., Biochemistry 1987, 26, 1086-1093.
Characterization
and
Synthesis
Oligodeoxynucleotides
of
containing
4-0-
Methylthymine.
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Campbel, CR., Biochemistry 1994, 33, 11364-11371.
Synthesis of Oligodeoxynucleotides Containing Analogs of 0(6)-Methylguanine and
Reaction with 0(6)-Alkylguanine-DNA Alkyltransferasen.
Spratt,
und
T.E.
119. Kuzmich, S.,
alkylated
Specifically
3404.
und Jones, R.A., Nucleic Acids Res.
Marky, L.A.,
characterization
and
Synthesis
fragments.
DNA
1983, 11, 3393-
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Synthesis of 0-6 Alkylated Deoxyguanosine Nucleosides.
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Gaffney, B.L., Marky, L.A.,
5691.
physical
ofd[CGC(06Me)GCG] and d[CGT(06Me)GCG].
und
Jones, R.A., Biochemistry 1984, 23, 5686-
and characterization
Synthesis
2253-2256.
of
a
set
of four dodecadeoxyribonucleoside
undecaphosphates containing 0(6)-methylguanine opposite adenine,
guanine, and thymine.
122.
cytosine,
Langouët, S., Mican, A.N., Müller, M., Fink, S.P., Marnett, L.J., Mühle, S.A.,
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Guengerich, F.P., Biochemistry 1998, 37,
Nucleotides
opposite
Escherichia Coli,
Five-Membered
Polymerases
5148-5193.
Exocyclic Ring
in Vitro and in Vivo:
Tetrahydro-9-oxoimidazo[1,2-a]purine,
and
Misincorporation of
Guanine
Derivatives
l,N^-Etheno guanine,
by
5,6,7,9-
5,6,7,9-Tetrahydro-7-hydroxy-9-
oxomidazo[l,2-a]purine.
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Chenna, A. und Singer, B., Chem. Res. Toxicol. 1997, 10, 165-171.
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a
Synthesis
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site-specific incorporation
124. Chenna, A. und
synthesis
deoxyadenosine
oligonucleotides.
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Singer, B.,
of
into DNA
p-benzoquinone-2'-deoxy cytidine
and
adducts
incorporation
and
their
site-specific
Large
scale
p-benzoquinone-2'into
DNA
oligonucleotides.
125. Casale, R. und
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Hydrocarbon
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Containing an N(6)-Deoxyadenosine Addukt of a Bay-Region Diol Epoxide.
128. Kobertz, W.R. und
Total
Synthesis
monoadduct.
of
and
Essigmann, J.M.,
a
cis-syn
/. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 7101-7107.
2-carbomethoxypsoralen furan-side
thymidine
203
129. Kobertz, W.R. und
Kap.
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Essigmann, J.M.,
Solid-phase synthesis of oligonucleotides containing
9
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Essigmann, J.M.,
130. Kobertz, W.R. und
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Soc.
oligonucleotide containing
deoxyguanosine adductpyrimido[l,2-l]purin(3H)-one.
Synthesis of
133.
the alkaline labile
an
malondialdehyde-
Geacintov, N.E., Cosman, M., Hingerty, B.E., Amin, S., Broyde, S., und Patel,
Chem. Res.
D.J.,
Toxicol.
stereoisometric covalent
1997, 10, 111-146.
polycyclic
NMR
solution
structures
carcinogen-DNA adduct:
aromatic
of
principles,
patterns, and diversity.
134. Yeh,
H.J.,
solution
Sayer, J.M.,
structure
adduct derived
from
( 7R, 8S, 9S, 1 OR)
an
unusual syn
of a
-
ai, Biochemistry 1995, 34, 13570-13581.
et
nonanucleotide
trans
addition
duplex
of
a
with
a
dG mismatch
glycosidic
angle
torsion
135. Schurter, E.J.,
at
the
modified
a
10S
group to
(+)-
opposite
deoxyadenosine N6-amino
7,8-dihydroxy-9,10- epoxy- 7,8,9,10-
NMR
tetrahydrobenzofajpyrene:
dA.
hara, T., Yeh, HJ., Yagi, H., Luxon, B.A.,
Sayer, J.M.,
Jerina, D.M., und Gorenstein, D.G., Biochemistry 1995, 34, 9009-9020. Nuclear
magnetic
Oh
resonance
solution
complementary thymidine base opposite
deoxyadenosine N(6)-amino
of
structure
a
an
undecanucleotide
10R adduct derived from
duplex
trans
with
a
addition
of
(-)-(7R,8S,9R,10S)-7,8-dihydroxy- 9,10epoxy- 7,8,9,10-tetrahydrobenzo[a]pyrene.
a
group to
136. Schurter, E.J., Yeh, HJ.,
Sayer, J.M., Lakshman, M.K., Yagi, H., Jerina, D.M.,
NMR solution
Gorenstein, D.G., Biochemistry 1995, 34, 1364-1375.
structure of a nonanucleotide duplex with a dG mismatch opposite a 10R adduct
und
derived
from
addition
deoxyadenosine N(6)-amino group to (-)(7S,8R,9R, 10S)-7,8-dihydroxy-9,10-epoxy-7,8,9,10- tetrahydrobenzofajpyrene.
137. de los
trans
of
a
Santos, C, Cosman, M., Hingerty, B.E.,
Ibanez, V., Margulis, L.A.,
Geacintov, N.E., Broyde, S., und Patel, D.J., Biochemistry 1992, 31, 52455252.
of
Influence of benzo[a]pyrene
DNA
covalent
comparison
138.
with the
Cosman, M., de los
1918.
Solution
benzofajpyrene
adducts:
Santos, C,
epoxide
conformation of
et
the
on
solution
(-)-trans-anti-[BP]G.C adduct
conformations
structure
and
enantiomer.
ai, Proc. Natl. Acad. Sei. 1992, 89, 1914-
major adduct between
the
carcinogen (+)-anti-
and DNA.
139. Cosman, M., Fiala, R., et al,
the
epoxide chirality
(+)-trans-anti-[BP]G.C
conformation of
diol
diol
the
Biochemistry 1993, 32,
12488-12497.
(+)-trans-anti-[BPh]dA adduct opposite dT in
a
DNA
Solution
duplex:
Kap. 9
204
intercalation
of the covalently
adduct site without
140.
disruption of the
Übersichtsartikel: Sagi, J., Chenna, A., Hang, B.,
Toxicol.
1998,
destabilize
141.
a
11,
DNA
329-334.
the
Chem. Res.
Singer, B.,
can
oligonucleotide duplex.
structures
of psoralen monoadducted
Spielmann, H.P., Biochemistry 1998, 37,
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by
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Preston, B.D., Singer, B., und Loeb, L.A., /. Biol. Chem. 1987, 262, 1382113827.
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Comparison of
specifically Incorporated
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Preston, B.D., Singer, B., und Loeb, L.A., Proc. Natl. Acad. Sei. 1986, 83,
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145.
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oligomers by NMR spectroscopy and restrained molecular dynamics.
damaged DNA
144.
the 5'-side
Spielmann, H.P., Dwyer, T.J., Hearst, J.E., und Wemmer, D.E., Biochemistry
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143.
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to
single cyclic p-benzoquinone adduct
A
1995, 34, 12937-12953. Solution
142.
benzofcjphenanthrene
modified base pair.
attached
to
Potential
in vivo Determined
by
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223.
224.
of a duplex
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strongly dependent
duplex
DNA
DNA with
are
Pathway from Sunlight
Ravishankara, A.R., Hancock, G.,
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a
dA tract.
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The solution
structure
und
in
oligo-
Kaptein, R.,
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and polynucleotides.
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intramolecular
photoproduct of d(TpA)
Kap.
211
derived with the
9
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a
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A
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und
Block
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into
/. Am.
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a
und
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of d(CGCGAAT[]TCGCG)
thymine photodimer
246. Pearlman, D.A., Holbrook, S.R.,
227,
247'.
into
a
Dyn.
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9
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a
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structure
Cis-syn thymine cyclobutane dimer,
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of
the
a
DNA
major
J. Mol Biol.
dodecamer
UV
duplex
photoproduct of
DNA.
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und
van
changes
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the
oligonucleotide
formation of a cis-syn thymine
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Solution
structure
of
a
nucleic
acid
213
Kap.
9
photoproduct of deoxyfluorouridylyl-(3'-5')-thymidine monophosphate (d-FpT)
determined by NMR and restrained molecular dynamics: structural comparison of
two sequence isomerphotoadducts (d-U5p5Tand d-T5p5U).
263. Cadet, J., Voituriez, L., Hruska, F.E.,
Crystal
897-903.
thymidine cyanoethyl
264.
of
structure
und Grand, A.,
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cis-syn photodimer of thymidylyl (3'-5')
the
ester.
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Contrasting
structural
impacts
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266.
Rycyna,
R.E. und
irradiation
implication
analysis of the
by cis-syn cycbutane
in
mutagenesis
and
dimer and
of
thymidylyl(3'
'6-4 lesion
268.
DNA
'
formation, purification
and solution
duplex-decamer
Hwang, G.S., Kim, J.K.,
365.
NMR
UV
conformational
of dTpdT.
5')thymidine by NMR
—>
adduct
repair activity.
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structure
(6-4)
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nucleic acids:
of
induced
und
structural studies
the
containing
The solution
(6-4)
and relaxation matrix
photoproduct
refinement.
of
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of
DNA
decamer
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Demple, B.,
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Crystal
DNA
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Harrison, S.C, Cell 1992, 71,
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DNA
X-ray
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Ellenberger, T.E., Brandi, C.J., Stmhl, K.,
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The
the GCN4-bZIP bound to ATF/CREB site DNA shows the
as
a
dimer
complex.
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polymerase
3.3 A
at
resolution.
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RNA
polymerase complexed
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Structure
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polymerase
the
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transcriptional
und Steitz, T.A.,
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sliding
DNA
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A
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Crystal
structure
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DNA
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t4 Endonuclease V: An excision
X-ray
of
pyrimidine dimer.
structure
Ariyoshi, M.,
repair
specific for
enzyme
a
363. Morikawa, K.,
Ariyoshi, M., Vassylyev, D.G., Matsumoto, O., Katayanagi, K.,
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Crystal structure of a
und
pyrimidine dimer-specific
at
1.45 A and
repair
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364. Mol, CD., Kuo,
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CF.,
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374,
T4:
refinement
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Structure
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und
Tainer, J.A.,
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crystal
recognition
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of extra-helical
human DNA
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van
van
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395.
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Binding Properties of
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,
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van
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Marel, G.A., Kuyl-Yeheskiely, E.,
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An Alternative Route
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the
AcetalLinkedDi- and Trinucleosides.
Quaedflieg, P.J.L.M., Pikkemaat, J.A.,
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The Formacetal and 3 '-Thioformacetal Internucleoside
Quaedflieg, P.J.L.M., Timmers, CM.,
und
und
of
van
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Marel, G.A.,
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Kuyl-Yeheskiely,
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Approach
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9
222
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-
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T
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Enzymatic
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photolyase (Escherichia coli) recognizes and
DNA strand of a DNA/PNA hybrid duplex.
DNA
the
4SI.
reverses
a
dimers in
DNA helix.
Arkin, M.R., Stemp, E.D.A., Holmlin, R.E., Barton, J.K., Hörmann, A., Olson,
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Oxidative
charge transfer
bases in DNA assemblies
DNA: insulator
494.
containing tethered metallointercalators.
thymine
dimer
or
in the DNA helix.
repair
Priyadarshy, S.,
493. Beratan, D.N.,
repair thymine dimers and damage guanine
To
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a
target sequence.
Kap.
229
497.
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Design of Species-
Thymidine
Thymidine
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on
9
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Imides.
Complexation of Thymine
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230
9
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511. Goodman, M.S. und Rose, S.D., J. Am.
Molecular
by
a
Recognition of a Pyrimidine
Dimer and Photosensitized Dimer
Splitting
Macrocyclic Bis(diaminopyridine).
512. Goodman,
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M.S.
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S.D.,
Rose,
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Photosensitized Pyrimidine Dimer Splitting by
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Dl
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518. Peak, J.G.,
713-716.
two
embriogenesis.
Modelloligonukleotide
am
und
breakage
DNA
naturally occuring
caused
by
334-nm
light
ultraviolet
enhanced
is
by
nucleic acid components and nucleotide coenzymes.
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in double-stranded DNA
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C.
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UV Radiation with
Photochem.
Charlier, M.,
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Photosensitized splitting
of pyrimidine
tryptophane-containing oligopeptides
521. Aoki, S.,
Sugimura, C,
5^thymidine
Dimer
by
and Promotion
Dimeric
391, 304-307.
Photobiol.
dimers
Visualizing
1977,
indole
by
25,
derivatives
429-434.
and
by
Photo
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[2+2]cycloaddition of Thymidinyl(3'the
cis-syn-Cyclobutane Thymine
Zinc(II)-Cyclen Complexes Containing
DNA
sequences
and proteins.
of Photosplitting of
522. Kiefer, J.R., Mao, C, Braman,
of 5'-GG-3'
riboflavin.
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Efficient Inhibition of
10102.
the 5'site
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synthesis of poly
interaction with polyinosinic acid.
XIV.
The
10
Kap.
10
232
Anhang
Röntgenstrukturdaten
von
108
030
Table
1.
Crystal
Crystal
Data
and Details
of
the
Structure
Data
Empirical Formula
C19
Formula
486.4
Weight
H24
N4
Crystal System
Monoclinic
Space Group
P21
a,
b,
V
[Angstrom]
c
Alpha,
[Deg]
Gamma
Beta,
O10
(No.
9.398(2)
[Ang**3]
H20
4)
9.886(1)
90.00
104.38(1)
11.647(1)
90.00
1048.2(2)
Z
2
D(calc)
F(000)
[g/cm**3]
1.54
[Electrons]
512.
Mu(MoKa)
[
/mm]
Crystal Size
0.13
[mm]
-0.3
Data
Collection
CAD4
Diffractometer
Temperature
in
MoKa
Theta Max
[Deg]
28.0
Scan Type
Unique
0.3
x
0.2
100
[Angstrom]
Angle
x
(with Graphite Monochromator)
(K)
Radiation
Scan
Determination
0.7107
Qmega/Theta
[Deg]
0.80
Data
Observed Data
2659
[I
>
3.0
sig.(I)]
2425
+
0.35
Tan(Theta)
233
Kap.
Refinement
Full-Matrix Least-Squares
(SHELXTL PLUS)
Nref,
Npar
2425,
R(F),
wR(F)
0.026,
Exp.
mod.
Max.
and Av.
Min.
and Max.
Table
2.
weight factor
(Ang**2)
r
0.033
5.
Shift/Error
res.
346
0.016,0.007
[e/Ang**3
dens.
Final atomic coordinates
-0.18,
(xl0**4)
isotropic displacement parameters
0.29
equivalent
and
(xl0**3)
U(eq)
Atom
[Ang**2]
N(l)
3766(1
-1268(2
653(1)
10(1)
C(2)
3456(2
-40(2
125(1)
10(1)
N(3)
2226(2
47(2
-846(1)
11(1)
C(4)
1207(2
-949(2
-1280(1)
11(1)
C(5)
1428(2
-2238(2
-589(1)
9(1)
C(6)
2959(2
-2509(2
241(1)
9(1)
C(7)
2135(2
-3133(2
1141(1)
8(1)
C(8)
738(2
-2364(2
498(1)
8(1)
C(9)
570(2
-1024(2
1068(1)
10(1)
N(10)
1349(1
-855(2
2215(1)
11(1)
C(ll)
2206(2
-1825(2
2951(1)
10(1)
N(12)
2611(1
-2934(2
2408(1)
9(1)
C(13)
3383(2
-3978(2
3209(1)
10(1)
C(14)
3647(2
-5320(2
2656(1)
10(1)
C(15)
4835(2
-5926(2
3672(1)
11(1)
C(16)
5739(2
-4666(2
4197(1)
10(1)
0(17)
4842(1
-3497(2
3746(1)
13(1)
C(18)
7154(2
-4566(2
3803(1)
12(1)
0(19)
7887(1
-3334(2
4263(1)
13(1)
C(20)
8906(2
-2886(2
3633(1)
12(1)
0(21)
8195(1
-2490(2
2463(1)
11(1)
C(22)
7690(2
-1098(2
2274(1)
10(1)
C(23)
6560(2
-1119(2
1090(1)
10(1)
C(24)
5181(2
-1496(2
1496(1)
9(1)
0(25)
5268(1
-746(2
2550(1)
11(1)
C(26)
6806(2
-567(2
3138(1)
10(1)
C(27)
7030(2
939(2
3397(1)
13(1)
0(28)
6674(1
1739(2
2345(1)
15(1)
0(29)
4175(1
988(2
430(1)
14(1)
O(30)
208(1
-756(2
-2156(1)
16(1)
0(31)
-248(1
-147(2
537(1)
15(1)
0(32)
2543(1
-1656(2
4021(1)
14(1)
0(33)
4098(1
-6523(2
4472(1)
15(1)
Ow(l)
852(2
3263(1)
23(1)
U(eq)
=
1/3
of
the
1634
trace
of
the
orthogonalized
U
Tensor
10
Kap.
10
Table
3.
234
lengths
Bond
(Angstrom)
N(l)-C(2)
1
359
(3)
N(l)-C(6)
1.460
(3
N(l)-C(24)
1
461
(2)
C(2)-N(3)
1.405
(2
C(2)-0(29)
1
223
(3)
N(3)-C(4)
1.379
(3
C(4)-C(5)
1
494
(3)
C(4)-O(30)
1.218
(2
C(5)-C(6)
1
544
(2)
C(5)-C(8)
1.565
(2
C(6)-C(7)
1
575
(2)
C(7)-C(8)
1.540
(2
C(7)-N(12)
1
445
(2)
C(8)-C(9)
1.507
(3
CO)-N(IO)
1
365
(2)
C(9)-0(31)
1.221
(2
N(10)-C(ll)
1
400
(2)
C(ll)-N(12)
1.366
(3
C(ll)-0(32)
1
219
(2)
N(12)-C(13)
1.458
(3
C(13)-C(14)
1
521
(3)
C(13)-0(17)
1.439
(2
C(14)-C(15)
1
532
(2)
C(15)-C(16)
1.546
(3
C(15)-0(33)
1
421
(2)
C(16)-0(17)
1.450
(3
C(16)-C(18)
1
513
(3)
C(18)-0(19)
1.436
(3
O(19)-C(20)
1
414
(2)
C(20)-O(21)
1.416
(2
0(21)-C(22)
1
455
(3)
C(22)-C(23)
1.518
(2
C(22)-C(26)
1
547
(3)
C(23)-C(24)
1.531
(2
C(24)-0(25)
1
419
(2)
0(25)-C(26)
1.448
(2
C(26)-C(27)
1
523
(3)
C(27)-0(28)
1.427
(2
Table
angles
4.
Bond
(degrees)
C(2)-N(l)-C(6)
124
C(2)-N(l)-C(24)
119
C(6)-N(l)-C(24)
113 .8(2 )
N(l)-C(2)-N(3)
117 .4(2)
N(l)-C(2)-0(29)
124
N(3)-C(2)-0(29)
117
C(2)-N(3)-C(4)
127 .5(2 )
N(3)-C(4)-C(5)
114 .9(1)
N(3)-C(4)-O(30)
121 .0(2 )
C(5)-C(4)-O(30)
124 .1(2)
C(4)-C(5)-C(6)
117 .9(2 )
C(4)-C(5)-C(8)
118 -3(2)
89 .3(1 )
C(6)-C(5)-C(8)
N(l)-C(6)-C(7)
C(6)-C(7)-C(8)
•
•
5(1 )
7(1 )
.9(2)
9(2)
N(l)-C(6)-C(5)
112
8(2)
114
3(1 )
C(5)-C(6)-C(7)
87
KD
89
123
2(1)
1(1 )
C(6)-C(7)-N(12)
C(8)-C(7)-N(12)
116
1(2
C(5)-C(8)-C(7)
87
6(1)
C(5)-C(8)-C(9)
113
3(2
C(7)-C(8)-C(9)
112
9(1)
C(8)-C(9)-N(10)
116
7(2
C(8)-C(9)-0(31)
121
6(1)
N(10)-C(9)-O(31)
121
7(2
C(9)-N(10)-C(ll)
127
0(2)
N(10)-C(ll)-N(12)
116
8(1
N(10)-C(ll)-O(32)
119
7(2)
N(12)-C(ll)-0(32)
123
5(2
C(7)-N(12)-C(ll)
122
0(2)
C(7)-N(12)-C(13)
122
4(2
C(ll)-N(12)-C(13)
115
KD
N(12)-C(13)-C(14)
117
0(1
N(12)-C(13)-0(17)
108
3(2)
C(14)-C(13)-0(17)
103
5(1
C(13)-C(14)-C(15)
100
3(1)
C(14)-C(15)-C(16)
102
4(2
C(14)-C(15)-0(33)
106
8(1)
C(16)-C(15)-0(33)
112
6(1
C(15)-C(16)-0(17)
106
6(1)
C(15)-C(16)-C(18)
111
7(2
0(17)-C(16)-C(18)
108
3(2)
C(13)-0(17)-C(16)
107
4(2
C(16)-C(18)-0(19)
108
6(2)
C(18)-O(19)-C(20)
113
3(1
O(19)-C(20)-O(21)
111
6(1)
C(20)-O(21)-C(22)
117
8(2
0(21)-C(22)-C(23)
104
7(2)
0(21)-C(22)-C(26)
115
5(2
C(23)-C(22)-C(26)
103
2(1)
0(1)
C(22)-C(23)-C(24)
100
2(1
N(l)-C(24)-C(23)
117
N(l)-C(24)-0(25)
110
3(1
C(23)-C(24)-0(25)
105
6(1)
C(24)-0(25)-C(26)
108
0(1
C(22)-C(26)-0(25)
106
5(1)
0(25)-C(26)-C(27)
106
6(2)
C(22)-C(26)-C(27)
113
0(2
C(26)-C(27)-0(28)
112.
4(1)
h-1
H"
M
H"
H1
h-4
H1
M
M
P->
M
P->
M
P->
P->
PJ
M
M
M
P-1
P-1
M
H-
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^^-^
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ooooooonooonoooooonoooaoaoonnooaos
Kap.
10
Table
6.
236
H-Atom
coordinates
(xl0**4)
displacement parameters
Atom
x
y
and
isotropic
(xl0**3)
zu
[Ang**2]
H(3A)
2092
843
-1232
H(5A)
1135
-2991
-1115
6(2
H(6A)
3524
-3161
-67
7(2
H(7A)
1990
-4082
980
7(2
H(8A)
-134
-2910
345
14(2
15(2
H(10A)
1298
-31
2532
13(2
H(13A)
2871
-4141
3814
12(2
H(14A)
3997
-5190
1957
19(2
H(14B)
2778
-5869
2469
20(2
H(15A)
5423
-6576
3385
12(2
H(16A)
5949
-4690
5047
10(2
H(18A)
6945
-4570
2953
15(2
H(18B)
7774
-5325
4097
16(2
H(20A)
9586
-3581
3523
18(2
H(20B)
9444
-2123
4065
8(2
H(22A)
8486
-500
2251
20(2
18(2
H(23A)
6791
-1789
568
H(23B)
6463
-251
708
8(2
H(24A)
5245
-2439
1698
10(2
H(26A)
7053
-1077
3862
15(2
H(27A)
8039
1096
3798
35(2
H(27B)
6434
1218
3915
9(2
H(28A)
5924
1402
1867
41(2
-7088
4911
24(2
H(33A)
4666
Hw(l)
1350(20)
1774(21)
3936(19)
38(2
Hw(2)
641(19)
2353(20)
2964(17)
20(2
237
Röntgenstrukturdaten
von
Kap.
110
0(28)
0(32)
C(18)
1.
Table
Crystal data and
Identification
refinement
structure
code
1.
csttoh
Empirical formula
C21
Formula weight
514.49
H30
N4
Oil
Temperature
293(2)
Wavelength
0.71073
Crystal system
Orthorhombic
Space
P2(l)2(l)2(l)
group
Unit cell dimensions
Volume
K
A
a
=
9.787(4)
b
=
13.127(4)
A
beta
=
90
deg
c
=
17.620(5)
A
gamma
=
90
deg
2263.7(13)
Z
alpha
A
!90
=
deg.
A"3
4
Density
(calculated)
1.510
Mg/m~3
Absorption coefficient
0.123
imtT-1
F(000)
1088
Crystal size
Theta
0.5
for
range
data
collection
Index ranges
Reflections
4576
correction
Refinement method
restraints
Goodness-of-fit
Final R indices
indices
Absolute
on
FA2
(all data)
0<=k<=:19,
[R(int)
parameter
4576
/
0
/
0<=1<==26
=
0 .0000]
0.938
=
0.0312,
wR2
=
0.0756
Rl
=
0.0374,
wR2
=
0.0768
0.2(7)
0.0138(11)
Largest diff.
0.346
and hole
446
Rl
Extinction coefficient
peak
mm
deg.
Full-matrix least-squares
/ parameters
[I>2sigma(I)]
structure
0.5
4576
None
/
x
32.57
to
0<=h<=14,
collected
Independent reflections
Data
0.5
x
1.93
Absorption
R
for
and -0.175
e.A^-3
on
F^2
10
onnoooooonnonnnooonoonnnanaoonnnnana
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M
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m
>
Pj
PH
w
OO
£
239
Table
3.
Bond
lengths
[A]
Kap.
and angles
[deg]
for
1.
N(l)-C(2)
1.366(2)
C(ll )-N(12
1.363(2)
N(l)-C(6)
1.463(2)
N(12 )-C(13
1.467(2)
N(l)-C(24)
1.468(2)
C(13 )-0(17
1.436(2)
C(2)-0(29)
1.228(2)
C(13 )-C(14
1.534(2)
1.530(2)
C(2)-N(3)
1.385(2)
C(14 )-C(15
N(3)-C(4)
1.361(2)
C(15 )-0(33
1.406(2)
C(4)-O(30)
1.218(2)
C(15 )-C(16)
1.517(2)
C(4)-C(5)
1.506(2)
C(16 )-0(17)
1.437(2)
C(5)-C(34)
1.533(2)
C(16 )-C(18)
1.499(2)
C(5)-C(6)
1.555(2)
C(18 )-0(19)
1.438(2)
C(5)-C(8)
1.582(2)
0(19 )-C(20)
1.407(2)
C(6)-C(7)
1.563(2)
C(20 )-0(21)
1.416(2)
C(7)-N(12)
1.445(2)
0(21 )-C(22)
1.441(2)
C(7)-C(8)
1.538(2)
C(22 )-C(23)
1.517(2)
C(8)-C(9)
1.521(2)
C(22 )-C(26)
1.529(2)
C(8)-C(35)
1.526(2)
C(23 )-C(24)
1.519(2)
C(9)-0(31)
1.221(2)
C(24 )-0(25)
1.432(2)
CO)-N(IO)
1.364(2)
0(25 )-C(26)
1.453(2)
N(10)-C(ll)
1.392(2)
C(26
-C(27)
1.519(2)
C(ll)-0(32)
1.219(2)
C(27
-0(28)
1.415(2)
C(2)-N(l)-C(6)
121 .58(11)
0(32 )-C(ll
-N(10)
119 .15(13)
C(2)-N(l)-C(24)
119 .53(11)
N(12 )-C(ll
-N(10)
116 .61(12)
C(6)-N(l)-C(24)
111 .68(10)
C(ll
-N(12
-C(7)
120 .38(11)
0(29)-C(2)-N(l)
124 .04(12)
C(ll
-N(12
-C(13)
117
0(29)-C(2)-N(3)
118 .22(12)
C(7) -N(12) -C(13)
122 .33(11)
N(l)-C(2)-N(3)
117
61(12)
0(17
-C(13
-N(12)
110 .15(12)
C(4)-N(3)-C(2)
128
04(12)
0(17
-C(13
-C(14)
105
51(12)
O(30)-C(4)-N(3)
120
14(13)
N(12
-C(13
-C(14)
114
24(12)
.12(11)
O(30)-C(4)-C(5)
123
61(14)
C(15
-C(14
-C(13)
102
87(12)
N(3)-C(4)-C(5)
116
25(12)
0(33
-C(15
-C(16)
110
58(13)
C(4)-C(5)-C(34)
109 .85(12)
0(33
-C(15
-C(14)
114 .10(14)
C(4)-C(5)-C(6)
116
54(11)
C(16
-C(15
-C(14)
98
84(12)
C(34)-C(5)-C(6)
111
33(12)
0(17
-C(16
-C(18)
111
09(13)
C(4)-C(5)-C(8)
115
26(11)
0(17
-C(16
-C(15)
102
82(11)
C(34)-C(5)-C(8)
113
95(12)
C(18
-C(16
-C(15)
119
74(14)
26(11)
C(6)-C(5)-C(8)
88
60(10)
C(13
-0(17
-C(16)
108
N(l)-C(6)-C(5)
114
07(11)
0(19
-C(18
-C(16)
112
61(13)
N(l)-C(6)-C(7)
116
30(11)
C(20
-0(19
-C(18)
112
78(13)
C(5)-C(6)-C(7)
86
71(10)
0(19
-C(20
-0(21)
110
32(14)
N(12)-C(7)-C(8)
117
52(11)
C(20
-0(21 -C(22)
116
27(13)
N(12)-C(7)-C(6)
124
59(11)
0(21
-C(22
-C(23)
113
40(12)
89
95(10)
0(21
-C(22
-C(26)
106
69(12)
C(9)-C(8)-C(35)
107
90(14)
C(23
-C(22
-C(26)
103
29(11)
C(9)-C(8)-C(7)
110
04(11)
C(22
-C(23
-C(24)
100
79(11)
C(35)-C(8)-C(7)
118
34(13)
0(25
-C(24
-N(l)
110
69(11)
C(9)-C(8)-C(5)
113
11(11)
0(25) -C(24 -C(23)
105
71(11)
C(35)-C(8)-C(5)
119
55(13)
N(D--C(24)--C(23)
115
55(11)
86
62(10)
C(24) -0(25) -C(26)
108
48(10)
C(8)-C(7)-C(6)
C(7)-C(8)-C(5)
O(31)-C(9)-N(10)
121
03(14)
0(25) -C(26) -C(27)
109
49(12)
0(31)-C(9)-C(8)
122
59(14)
0(25) -C(26
-C(22)
106
30(11)
N(10)-C(9)-C(8)
116
32(12)
C(27) -C(26) -C(22)
114
53(13)
C(9)-N(10)-C(ll)
128
64(13)
0(28) -C(27) -C(26)
113
8(2)
0(32)-C(ll)-N(12)
124
23(13)
10
10
Kap.
Table
Anisotropie displacement parameters
4.
anisotropic displacement
The
-2
240
piA2
hA2
[
a*A2
Uli
+
...
+
2
(AA2
exponent takes
factor
h
k a*
b*
U12
10*3)
x
the
for
1.
form:
]
Uli
U22
U33
N(l)
21(1 )
26(1)
17(1)
C(2)
26(1 )
25(1)
19(1)
N(3)
31(1 )
34(1)
16(1)
-4(1)
2(1
8(1
C(4)
29(1
27(1)
18(1)
KD
Kl
2(1
U23
U13
U12
0(1)
-Kl )
3(1
-3(1)
-Kl )
4(1
C(5)
24(1 )
22(1)
18(1)
KD
Kl )
3(1
C(6)
22(1 )
19(1)
16(1)
-KD
Kl )
0(1
C(7)
22(1 )
18(1)
18(1)
KD
2(1 )
Kl
C(8)
24(1
26(1)
20(1)
2(1)
-3(1 )
C(9)
30(1
28(1)
23(1)
-2(1)
N(10)
38(1
21(1)
24(1)
C(ll)
30(1
21(1)
24(1)
N(12)
29(1
19(1)
19(1)
C(13)
30(1
24(1)
C(14)
27(1
32(1)
C(15)
35(1
C(16)
0(1
-5(1
-6(1
-4(1)
2(1
-2(1
-KD
2(1
Kl
0(1)
3(1
-1(1
20(1)
0(1)
5(1
-3(1
24(1)
-4(1)
5(1
3(1
25(1)
24(1)
-3(1)
2(1
3(1
38(1
28(1)
18(1)
-KD
3(1
1(1
0(17)
40(1
27(1)
26(1)
-3(1)
-6(1
7(1
C(18)
43(1
39(1)
20(1)
KD
-4(1
0(1
0(19)
35(1
28(1)
30(1)
4(1)
-2(1
3(1
C(20)
38(1
36(1)
29(1)
-10(1)
-9(1
2(1
0(21)
50(1
34(1)
19(1)
0(1)
-5(1
13(1
C(22)
24(1
29(1)
23(1)
0(1)
-6(1
1(1
C(23)
30(1
25(1)
21(1)
2(1)
-4(1
-4(1
C(24)
23(1
25(1)
16(1)
Kl)
-1(1
2(1
0(25)
27(1
23(1)
28(1)
Kl)
-8(1
-1(1
C(26)
23(1
26(1)
25(1)
3(1)
-3(1
1(1
C(27)
31(1
38(1)
42(1)
-5(1)
-3(1
8(1
0(28)
31(1
81(1)
42(1)
6(1)
5(1
12(1
0(29)
31(1
47(1)
24(1)
-4(1)
2(1
16(1
0(30)
44(1
52(1)
20(1)
8(1)
1(1
16(1
0(31)
71(1
42(1)
23(1)
-7(1)
-5(1
-13(1
0(32)
61(1
23(1)
31(1)
5(1)
6(1
-1(1
0(33)
68(1
37(1)
47(1)
-19(1)
-6(1
17(1
C(34)
38(1
23(1)
31(1)
5(1)
4(1
8(1
C(35)
26(1
53(1)
42(1)
14(1)
-7(1
3(1
O(IW)
61(1
66(1)
44(1)
14(1)
20(1
29(1
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ui
Pl
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Kap.
10
242
Röntgenstrukturdaten
von
114
0(30)
C(35)
0(32)
0(29)
0(28)
0(33)
C(20)
Table
1.
Crystal data and
Identification
refinement
structure
code
C21
Formula weight
514.49
N4
H30
Temperature
293(2)
Wavelength
1.54178
Crystal system
Monoclinic
Space
P2(l)
group
cell
dimensions
Oil
K
A
a
=
11.601(9)
b
=
6.847(3)
c
=
14.626(9)
Volume
1143.1(12)
Z
2
Density (calculated)
Absorption coefficient
1.222
Mg/m~3
0.559
mm^-l
F(000)
450
Crystal size
Theta range
0.5
for
data
collection
Index ranges
Reflections
0.4
x
3.07
x
-ll<=h<=ll,
collected
Refinement method
Full-matrix
restraints
Goodness-of-fit
Final
R
R
indices
indices
on
/
parameters
F~2
[I>2sigma(I)]
(all data)
1291
1291
/
0
deg.
100.30(5)
=
90
deg.
mm
deg.
0<=1<=14
/
=
0.0000]
least-squares
327
1.056
Rl
=
0.0497,
wR2
=
0.1283
Rl
=
0.0497,
wR2
=
0.1285
0.0(4)
Extinction coefficient
0.017(3)
Largest diff.
0.322
and hole
0.2
0<=k<=6,
[R(int)
Absolute structure parameter
peak
gamma
=90
=
1291
None
/
beta
A
49.95
to
alpha
A
A
A~3
Independent reflections
Absorption correction
Data
1.
tsloh
Empirical formula
Unit
for
and
-0.330
e.A^-3
on
F~2
deg.
243
Table
2.
Atomic
coordinates
displacement parameters
as
one
third
of
the
trace
x
(
(AA2
x
x
equivalent isotropic
U(eq) is defined
orthogonalized Uij tensor.
10^4)
10^3)
the
of
Kap.
y
and
for
1.
z
U(eq)
0(33)
7856(3)
2254
7072(2)
46(1)
N(12)
10795(3)
4743(8)
6007(2)
30(1)
0(21)
10061(3)
10045(8)
8861(2)
38(1)
0(32)
9657(3)
5469(9)
4604(2)
52(1)
0(17)
9347(3)
6320(8)
6695(2)
38(1)
0(25)
12591(3)
9903(9)
8392(2)
44(1)
N(10)
11599(3)
5091(11)
4653(2)
44(1)
O(30)
15508(3)
3421(10)
7044(2)
65(1)
0(19)
8862(3)
7263(8)
8624(2)
41(1)
N(l)
12926(3)
6799(10)
7814(2)
44(1)
C(8)
12919(4)
3675(10)
5973(3)
30(1)
0(28)
13456(3)
9225(9)
10439(2)
54(1)
0(31)
13281(3)
3707(10)
4421(2)
61(1)
C(7)
11974(4)
4439(10)
6514(3)
29(1)
C(15)
8644(4)
3714(10)
7515(3)
34(1)
C(16)
8350(4)
5770(10)
7103(3)
34(1)
N(3)
14627(3)
4880(11)
8116(3)
50(1)
C(ll)
10619(4)
5116(11)
5062(3)
35(1)
C(14)
9828(4)
3270(10)
7268(3)
32(1)
C(5)
13786(4)
5287(11)
6476(3)
33(1)
C(24)
12051(4)
8077(10)
8102(3)
37(1)
C(13)
9761(4)
4495(9)
6397(3)
28(1)
C(6)
12746(4)
6218(11)
6836(3)
30(1)
C(27)
13100(4)
11008(11)
9967(4)
47(2)
C(26)
12119(4)
10691(11)
9150(3)
37(1)
C(22)
11160(4)
9296(10)
9314(3)
35(1)
0(29)
14032(3)
6527(10)
9265(2)
62(1)
CO)
12629(4)
4114(10)
4941(3)
38(1)
44(2)
C(18)
8079(4)
7342(12)
7738(3)
C(4)
14698(4)
4423(11)
7213(3)
44(2)
C(23)
11496(4)
7378(11)
8903(3)
41(1)
C(34)
14423(5)
6583(11)
5878(4)
58(2)
C(20)
9091(4)
9081(11)
9082(3)
44(2)
49(2)
C(2)
13844(4)
6112(13)
8435(4)
C(35)
13249(5)
1541(11)
6106(4)
0(1W)
15667(16)
9690(35)
8400(15)
47(2)
354(12)
10
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Kap.
10
246
Table 5.
Hydrogen coordinates (
displacement parameters (A*2 x 10*3)
x
y
x
10*4)
for
and
isotropic
1.
z
U(eq)
H(33A)
7157(3)
2625
7074(2)
69
H(10A)
11567(3)
5832(11)
4140(2)
66
H(28A)
13632(3)
8394(9)
H(7A)
11950(4)
10054(2)
81
3600(10)
7036(3)
44
H(15A)
8682(4)
3739(10)
8176(3)
51
H(16A)
7687(4)
5633(10)
6610(3)
51
15164(3)
4312(11)
8556(3)
75
9889(4)
1907(10)
7131(3)
48
H(14B)
10475(4)
3653(10)
7738(3)
48
H(24A)
11437(4)
8296(10)
7579(3)
56
H(13A)
9161(4)
3968(9)
5924(3)
42
H(3A)
H(14A)
H(6A)
12468(4)
7322(11)
6455(3)
46
H(27A)
13755(4)
11553(11)
9736(4)
71
H(27B)
12866(4)
11925(11)
10396(4)
71
H(26A)
11763(4)
11932(11)
8972(3)
55
H(22A)
11166(4)
9150(10)
9968(3)
52
H(18A)
8150(4)
8592(12)
7457(3)
66
H(18B)
7285(4)
7210(12)
7834(3)
66
H(23A)
12046(4)
6658(11)
9346(3)
62
H(23B)
10823(4)
6576(11)
8691(3)
62
H(34A)
14789(29)
7651(34)
6245(9)
87
H(34B)
13872(7)
7083(47)
5363(16)
87
H(34C)
15010(23)
5830(18)
5650(22)
87
H(20A)
8415(4)
9904(11)
8923(3)
65
H(20B)
9217(4)
8865(11)
9741(3)
65
5831(20)
70
H(35A)
12598(11)
744(11)
H(35B)
13449(28)
1258(15)
6758(4)
70
H(35C)
13909(19)
1269(15)
5814(20)
70
247
Kap.
10
Protokolle der Methoden
Kopplung eines Formacetal-verbrückten Dinukleotids im 1.3 jJmol Masstab:
Kopplungszeit 6 min, 120 (J.1 Phosphoramiditlösung pro Kopplungsschritt, 2 Minuten
tritylierungszeit
0.00
CALL METHOD
2.00
POS
2.1
3.20
POS
2.3
3.40
INTEGRATE
0
4.20
ml/min
0.00
DETRIT
4.80
STEP VALVE
4.80
END
4.85
ml/min
10.85
ml/min
0.00
10.85
STEP VALVE
3
2.50
OF
3
LOOP
2.50
4.20
LOOP
2
10.90
ml/min
4.20
POS
1.6
11.20
ml/min
4.25
ml/min
1.00
11.20
LOOP
4.35
ml/min
0.00
11.20
POS
2.5
4.35
POS
1.3
11.30
POS
2.6
TIMES
1.00
TIMES
15
4.40
ml /min
0.60
11.40
END
4.50
ml/min
0.00
11.40
POS
2.3
4.50
POS
1.6
11.40
ml /min
2.50
4.55
ml/min
1.00
11.70
POS
2.4
4.65
ml/min
0.00
12.30
POS
2.3
4.65
END
12.80
ml/min
4.65
POS
1.1
12.80
LOOP
TIMES
7
4.70
ml/min
1.00
12.80
STEP
VALVE
3
4.80
ml/min
0.00
12.80
END
4.80
LOOP
7
OF
LOOP
TIMES
OF
OF
LOOP
0.00
LOOP
Kopplung von Pac-Amiditen von Pharmacia im 1.3 Umol Masstab: Kopplungszeit 2 min,
120 ul Phosphoramiditlösung pro Kopplungsschritt, 2 Minuten Detritylierungszeit
0.00
CALL
4.80
STEP
2.00
POS
2.1
4.80
END
METHOD
DETRIT
VALVE
OF
3
LOOP
3.20
POS
2.3
4.85
ml /min
3.40
INTEGRATE
0
6.85
ml/min
4.20
ml/min
0.00
6.85
STEP
4.20
LOOP
2
6.90
ml/min
4.20
POS
1.6
7.20
ml/min
4.25
ml/min
1.00
7.20
LOOP
4.35
ml/min
0.00
7.20
POS
4.35
POS
1.3
7.30
POS
4.40
ml/min
0.60
7.40
END
4.50
ml/min
0.00
7.40
POS
4.50
POS
1.6
7.40
ml/min
2.50
4.55
ml/min
1.00
7.70
POS
2.4
2.3
TIMES
4.65
ml/min
4.65
END
4.65
POS
1.1
4.70
ml/min
1.00
4.80
ml/min
0.00
4.80
LOOP
7
OF
0.00
LOOP
TIMES
2.50
0.00
VALVE
3
2.50
1.00
TIMES
15
2.5
2.6
OF
LOOP
2.3
8.30
POS
8.80
ml /min
8.80
LOOP
0.00
TIMES
7
8.80
STEP VALVE
3
8.80
END
OF
LOOP
De¬
Kap.
10
248
Methode
Detritylierang im
für die
/Jmol
Masstab
0.00
POS
1.1
1.10
INTEGRATE
0.00
POS
2.1
1.10
PS
0.00
STEP VALVE
3
4.00
POS
0.00
ml/min
2.50
6.00
ml/min
0.00
1.00
PORT
9.1
6.00
POS
2.7
1.00
POS
2.2
6.00
PS
1.10
PORT
9.0
6.00
HOLD
6.00
ml/min
2.50
6.00
POS
2.2
SET
SET
1.10
CLEAR DATA
1.10
MONITOR
1
1.10
LEVEL%
4.0
Endetritylierung im
1.3
ßmol
CALL
1
DETR-RET
2.1
CALL
0
Masstab
0.00
CALL
3 .30
ml/min
0. 00
0.40
POS
2.1
3 .30
LOOP
TIMES
7
1.40
POS
2.3
3 .30
STEP VALVE
3
1.70
INTEGRATE
0
3 .30
END
Kopplung
20
1.3
min,
METHOD
DETRIT
eines Formacetal-verbrückten Dinukleotids
400
ul
Phosphoramiditlösung
pro
im 10
Kopplungsschritt,
OF
LOOP
Umol Masstab:
Kopplungszeit
4 Minuten Detrit¬
ylierungszeit
0.00
CALL
4.00
VALVE
POS
2.1
5.20
VALVE
POS
2.3
6.20
INTEGRATE
0
8.20
ml/min
0.00
28 .85
4
1.6
METHOD
8.20
LOOP
8.20
VALVE
8.25
ml/min
TIMES
8.35
ml/min
8.35
VALVE
8.40
8.50
8.50
VALVE
8.55
ml/min
POS
10DETRIT
8 .80
STEP VALVE
8 .80
END
8 .85
ml/min
28 .85
ml/min
0..00
STEP VALVE
3
28 .90
ml/min
2..50
29 .40
ml /min
0.75
29 .40
LOOP
OF
3
LOOP
2 .50
1. .00
TIMES
20
0.00
29 .40
VALVE
POS
2..5
1.7
29..50
VALVE
POS
2..6
ml /min
1.00
29..60
END
ml/min
0.00
29..60
VALVE
1.6
29..60
ml/min
0.75
30..10
0.00
8.65
ml/min
8.65
END
8.65
VALVE
OF
POS
POS
LOOP
POS
2,.3
VALVE
POS
2..4
31..10
VALVE
POS
2..3
32..60
ml/min
0..00
1.1
32..60
LOOP
TIMES
7
3
LOOP
POS
OF
2..50
8.70
ml/min
1.00
32..60
STEP VALVE
8.80
ml/min
0.00
32..60
END
8.80
LOOP
7
TIMES
OF
LOOP
249
Kopplung
von
Pac-Amiditen
(Xl Phosphoramiditlösung
von
pro
Pharmacia
im
10
Kopplungsschritt,
Kap.
ßmol
4
Masstab:
Kopplungszeit 6 min,
400
Minuten Detritylierungszeit
0.00
CALL METHOD
4.00
VALVE
POS
2.1
5.20
VALVE
POS
2.3
8..85
ml/min
6.20
INTEGRATE
0
14 .85
ml/min
0..00
8.20
ml/min
0.00
14 .85
STEP
3
4
14..90
ml/min
1.6
15..40
ml /min
0.75
15,.40
LOOP
8.20
LOOP
8.20
VALVE
8.25
ml/min
8.35
ml/min
8.35
VALVE
8.40
ml /min
TIMES
POS
POS
8.50
ml/min
8.50
VALVE
8.55
8.65
8.65
END OF
8.65
VALVE
8.70
8.80
8.80
Methode
für
10DETRIT
8..80
STEP VALVE
8 .80
END
OF
3
LOOP
2 .50
VALVE
2,.50
1..00
TIMES
20
0.00
15..40
VALVE
POS
2..5
1.7
15..50
VALVE
POS
2.,6
1.00
15..60
END
OF
LOOP
0.00
15..60
VALVE
1.6
15..60
ml/min
ml/min
0.75
16..10
VALVE
POS
2.,4
ml/min
0.00
17.,10
VALVE
POS
2.,3
18..60
ml/min
1.1
18..60
LOOP
ml/min
1.00
ml/min
0.00
LOOP
7
die
POS
LOOP
POS
TIMES
Detritylierang
im
10
Umol
POS
2..3
2..50
0.,00
TIMES
7
18.,60
STEP VALVE
3
18.,60
END
OF
LOOP
Masstab
0.00
POS
1.1
1.60
INTEGRATE
0.00
POS
2.1
1.60
PS
0.00
STEP VALVE
3
4.50
POS
0.00
ml/min
2.50
6.50
ml /min
0.00
1.50
PORT
9.1
6.50
POS
2.7
1.50
POS
2.2
6.50
PS
1.60
PORT
9.0
6.50
HOLD
6.50
ml/min
2.50
6.50
POS
2.2
SET
SET
1.60
CLEAR
1.60
MONITOR
1
1.60
LEVEL%
4.0
DATA
Endetritylierung im
10 Umol
CALL
2.1
Mas stab
0..00
CALL
4.00
LOOP
TIMES
1..50
POS
2.3
4.00
STEP
VALVE
1 .70
INTEGRATE
0
4.00
END
4,.00
ml/min
0.00
METHOD
10DETRIT
1
DETR-RET
CALL
OF
LOOP
10
0
Curriculum
Vitae
Geboren
1970
1976
1980
Jan.
-
-
-
Volksschule
1989
Gymnasium Starnberg
März 1986
-
14. Mai 1970 in München
1980
24. Juni 1989
1989
am
-
März 1994
Dez. 1994
-
School
Scunthorpe
Abitur
Feb. 1994
Praktikum bei ECOTEC in München
Juni 1994
Praktikum bei MILES INC. in West Haven, USA
Juni 1995
-
Comprehensive
Studium der Chemie, Universität München
1995
Dez. 1993
Münsing
Diplomarbeit bei
Prof.
Plückthun, Universität Zürich
"Monomere und diniere MHC-Klasse I
Proteinkomplexe
Diplom in
Juni 1995
1990
-
1995
seit Nov. 1995
aus
E. Coli"
Chemie
Stipendiat der Studienstiftung
des Deutschen Volkes
Doktorand bei Dr. T. Carell und Prof. Dr. F. Diederich
der
Eidgenössischen
Technischen Hochschule Zürich
Aufgaben: Betreuung
von
Übungen in organischer Chemie,
einer Auszubildenden und zwei
Juni 1996
-
Dez. 1998
Zürich, im Mai 1999
Jens Butenandt
Stipendiat
des
an
Diplomanden
Boehringer Ingelheim
Fonds
Zugehörige Unterlagen
Genetik
Genetik
2. Vorlesung Die DNA - Das Genetische Material
2. Vorlesung Die DNA - Das Genetische Material
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