Dissertation online

Regulation von Peroxiredoxinen in aktivierten
und infizierten murinen Makrophagen
Inauguraldissertation
zur
Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
vorgelegt von
Saskia Friederike Erttmann
geboren am 28.10.1982
in Kiel
Greifswald, 18. November 2010
Dekan: Prof. Dr. Klaus Fesser
1. Gutachter: Prof. Dr. Ivo Steinmetz
2. Gutachter: Prof. Dr. Hans-Willi Mittrücker
Tag der Promotion: 09. März 2011
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1
1.1 Das angeborene Immunsystem
1
1.1.1
Makrophagen und ihre Rolle bei der Abwehr bakterieller Infektionen
1
1.1.2
Intrazelluläre Signaltransduktion von Lipopolysaccharid und Interferon γ
2
1.1.3
Entstehung und Funktion reaktiver Sauerstoffspezies
8
1.1.4
Prostaglandine und ihre Biosynthese
9
1.1.5
Prostaglandin-vermittelte Signaltransduktion
12
1.2 Die Familie der Peroxiredoxine
14
1.2.1
Vorkommen, Klassifizierung und physiologische Funktion
14
1.2.2
Peroxiredoxin 6
16
1.2.3
Charakterisierung der Funktion von Prx 6
18
1.3 B. pseudomallei als intrazellulärer Modellorganismus
21
1.3.1
Burkholderia pseudomallei und Melioidose
21
1.3.2
Virulenzfaktoren von Burkholderia pseudomallei
24
1.3.3
Burkholderia pseudomallei und die angeborene Immunabwehr
27
1.4 Zielsetzung
30
2 Material und Methoden
31
2.1. Material
31
2.1.1
Geräte
31
2.1.2
Hilfsmittel und Verbrauchsmaterialien
32
2.1.3
Chemikalien
33
2.1.4
Fertiglösungen und Kits
34
2.1.5
Enzyme
34
2.1.6
Aktivatoren, Stimulatoren und Inhibitoren
34
2.1.7
Antikörper
36
2.1.7.1 Primärantikörper
36
2.1.7.2 Antikörperkonjugate
37
2.1.8
37
Oligonukleotide
2.1.8.1 Oligonukleotide für die Reverse Transkription
37
2.1.8.2 Oligonukleotide für die quantitative Real-Time PCR
37
2.1.9
39
Puffer und Lösungen
Inhaltsverzeichnis
2.1.9.1 Lösungen für Arbeiten mit Gesamt-RNA
39
2.1.9.2 Puffer und Lösungen zur Proteinextraktion mittels TRIzol® Reagent
39
2.1.9.3 Puffer und Gele für proteinbiochemische Arbeiten
40
2.1.9.4 Puffer für Immunfluoreszenz
42
2.1.9.5 Lösungen für Invasions- und Replikationsassay
42
2.1.10
42
Organismen und Kulturmedien
2.1.10.1 Mausstämme
42
2.1.10.2 Rechtliche Grundlagen
43
2.1.10.3 Bakterienstämme
44
2.1.10.4 Lösungen und Substanzen für die Zellkultivierung
44
2.1.10.5 Nährböden und Kulturmedien für Bakterienkulturen
44
2.1. Methoden
45
2.2.1
45
Bakterien- und Zellkultur
2.2.1.1 Herstellung von Bakterienstocklösungen
45
2.2.1.2 Präparation muriner Knochenmarkmakrophagen
45
2.2.1.3 Aussaat von Knochenmarkmakrophagen
46
2.2.1.4 Stimulation von Knochenmarkmakrophagen
46
2.2.1.5 Bakterielle Infektion von Knochenmarkmakrophagen
47
2.2.1.6 Invasions- und Replikationsassay
48
2.2.2
Arbeiten mit RNA
49
2.2.2.1 Isolation von Gesamt-RNA
49
2.2.2.2 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
50
2.2.2.3 Reverse Transkription
50
2.2.2.4 Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR)
51
2.2.3
53
Proteinbiochemische Arbeiten
®
2.2.3.1 Proteinpräparation mittels TRIzol Reagent
53
2.2.3.2 Proteinmengenbestimmung nach Bradford
53
2.2.3.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
54
2.2.3.4 Western Blot
54
2.2.4
55
Spektralphotometrische Messungen an Zellkulturüberständen
2.2.4.1 Nitrit-Messung nach Griess
55
2.2.4.2 Prostaglandin E2-Messung mittels Enzyme-linked immunosorbent
assay (PGE2-EIA)
55
Inhaltsverzeichnis
2.2.5
Bestimmung der Cytokin- bzw. Chemokinkonzentration in
Kulturüberständen mittels BDTM Cytometric Bead Array (CBA)
Mouse Inflammation Kit
57
2.2.6
Immunfluoreszenz
58
2.2.7
Graphische Darstellung und statistische Analyse
59
3 Ergebnisse und Diskussion
60
3.1 Regulation der Genexpression von Peroxiredoxinen
durch LPS und IFNγγ in primären Makrophagen
60
3.1.1
Die Genexpression von Prx 1, 2, 4, 5 und 6 wird durch LPS
und IFNγ induziert
61
TNFα und IFNγ wirken induzierend auf die Genexpression
von Prx 1 und 5
68
iNOS, aber nicht die NADPH-Oxidase, ist an der Erhöhung
des mRNA-Gehaltes von Prx 1 und 6 beteiligt
82
cPLA2 und COX-Enzyme spielen eine entscheidende Rolle
bei der LPS- und IFNγ-induzierten Genexpression von Prx 6
92
JAK2, PI3K, MAPKs und PKC sowie der Transkriptionsfaktor Nrf2
sind wichtige Signalmediatoren der LPS- und IFNγ-abhängigen
Genexpression von Prx 6
99
3.2 Regulation der Genexpression von Peroxiredoxinen durch
Prostaglandine in primären Makrophagen
127
3.2.1
Prostaglandine erhöhen die Genexpression von Prx 6
128
3.2.2
Die Adenylylzyklase, aber nicht die Proteinkinase A, ist an der
Erhöhung der Prx 6-Genexpression durch LPS und IFNγ sowie
PGD2 oder PGE2 beteiligt
139
JAK2, PI3K, p38 MAPK und PKC sowie Nrf2 vermitteln die
PGD2- oder PGE2-induzierte Genexpression von Prx 6
151
3.3 Regulation der Genexpression von Peroxiredoxinen durch
Infektion mit Burkholderia pseudomallei und Burkholderia
thailandenis in IFNγγ-aktivierten Knochenmarkmakrophagen
165
3.1.2
3.1.3
3.1.4
3.1.5
3.2.3
3.3.1
3.3.2
3.3.3
3.3.4
Infektion mit B. pseudomallei führt zur erhöhten Genexpression
von Prx 1, 5 und 6
166
iNOS und NADPH-Oxidase tragen zur Induktion der Genexpression
von Prx 6 nach Infektion mit B. pseudomallei bei
171
COX-Enzyme sind an der Regulation der B. pseudomallei-induzierten
Prx 6-Transkription beteiligt
178
Nrf2 spielt eine entscheidende Rolle bei der mRNA-Induktion von
Prx 1 und 6 nach Infektion mit B. pseudomallei
183
Inhaltsverzeichnis
3.3.5
IFNγ-aktivierte Knochenmarkmakrophagen zeigen eine höhere
Prx 6-mRNA-Expression nach Infektion mit virulentem
B. pseudomallei im Vergleich zu avirulentem B. thailandensis
187
4 Zusammenfassung
207
5 Abkürzungsverzeichnis
210
6 Literaturverzeichnis
218
Eidesstattliche Erklärung
Danksagung
Einleitung
1
Einleitung
1.1
Das angeborene Immunsystem
1.1.1
Makrophagen und ihre Rolle bei der Abwehr bakterieller
Infektionen
Das
mononukleäre
Phagozytensystem
umfasst
eine
Familie
von
Zellen
des
angeborenen Immunsystems, bestehend aus Vorläuferzellen des Knochenmarks,
Monozyten des Blutes und Gewebemakrophagen. Durch den Kontakt mit geschädigtem
Gewebe infiltrieren im Blut zirkulierende Monozyten in dieses Gewebe, in dem sie unter
Einfluss
bestimmter
Stimuli
wie
Cytokinen
oder
pathogenen
Substanzen
zu
Makrophagen differenzieren (van Furth et al., 1972; Auffray et al., 2009). Bezüglich des
infiltrierten Gewebes wird zwischen Makrophagen der Lunge (Alveolarmakrophagen),
der Milz (Milzmakrophagen), der Bauchhöhle (Peritonealmakrophagen), der Gelenke,
des Knochens (Osteoklasten), der Leber (Kupffer-Zellen), des Bindegewebes sowie der
Niere und des zentralen Nervensystems (Mikroglia) unterschieden. Diese Effektorzellen
des angeborenen Immunsystems spielen eine entscheidende Rolle bei der ersten
Antwort auf Pathogene. Durch die Beseitigung gealterter Zellen sind sie zudem für die
Homöostase von Geweben essentiell. Des Weiteren sind sie an der Koordinierung der
erworbenen
Immunantwort
Entzündungsprozessen
und
beteiligt
deren
und
erfüllen
Rückgang
sowie
wichtige
bei
der
Funktionen
bei
Behebung
von
Gewebeschädigungen.
Makrophagen können durch zwei unterschiedliche Mechanismen aktiviert werden. Die
klassische Aktivierung von Makrophagen (M1) wird durch Interferon γ (IFNγ) oder
Lipopolysaccharide (LPS) induziert und führt zu einer schnellen proinflammatorischen
Antwort, die für die Beseitigung intrazellulärer Pathogene notwendig ist. Demgegenüber
werden Makrophagen alternativ durch Interleukin- (IL-) 1β, IL-4, IL-10, IL-13, LPS
(Lipoploysaccharide), TGFβ (transforming growth factor β) oder Glucocorticoide aktivert
(M2) (Martinez et al., 2008; Martinez et al., 2009). Zur Erkennung der heterogenen
mikrobiellen Pathogene durch ihre hochkonservierten Musterstrukturen (pathogenassociated
molecular
patterns,
PAMPs),
zu
denen
LPS,
Peptidoglykane,
Lipoteichonsäuren, Mannane, Glukane, bakterielle DNA und doppelsträngige RNA
gehören, besitzen Makrophagen auf ihrer Oberfläche verschiedene Rezeptoren,
sogenannte PRRs (pattern-recognition receptors) (Aderem und Ulevitch 2000). Durch
die Bindung der PAMPs an PRRs kommt es zur Aktivierung intrazellulärer
Signalkaskaden mit der Folge der Freisetzung humoraler Faktoren. Zu diesen gehören
reaktive Sauerstoff- und Stickstoffverbindungen, Mediatoren wie Chemokine und
proinflammatorische Cytokine (z. B. MIF (macrophage migration inhibitory factor),
1
Einleitung
TNFα (tumor necrosis factor α), Interleukine wie IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18),
Opsonine sowie Faktoren der Gerinnungskaskade, des Komplementsystems und des
Arachidonsäurestoffwechsels (Janeway und Medzhitov 2002). Neben lokal begrenzten
Entzündungsprozessen können proinflammatorische Cytokine eine systemische AkutePhase-Reaktion bewirken. Diese umfasst eine Abfolge physiologischer Änderungen in
Antwort auf Entzündungen wie Fieber, Anorexie und die erhöhte Bildung von AkutePhase-Proteinen, die hauptsächlich in der Leber gebildet werden (Kushner 1982;
Heinrich et al., 1990; Gabay und Kushner 1999; Ruminy et al., 2001). Zu diesen
Proteinen gehören Antiproteasen, die die Zerstörung von Gewebe eingrenzen, und
Metallbindungsproteine, von denen angenommen wird, dass sie die Vermehrung von
Bakterien hemmen, sowie C-reaktives Protein, welches als Opsonin wirkt und so die
Phagozytose Organismus-fremder Partikel vorantreibt (Fey und Gaudie 1990; Schiff et
al., 1997; Dominioni et al., 1987).
1.1.2
Intrazelluläre Signaltransduktion von Lipopolysaccharid und
Interferon γ
Interferon γ (IFNγ) ist eines der wichtigsten endogenen Mediatoren der Immunität und
von Entzündungsprozessen. Es zählt zu den Typ II- oder immunaktiven Interferonen und
wird von aktivierten CD4-positiven T-Helfer-1-Zellen (T helper 1, Th1), CD8-positiven
zytotoxischen
T-Zellen,
natürlichen
Killerzellen
sowie
B-Zellen
und
anderen
Antigen-präsentierenden Zellen gebildet (Young 1996; Yoshimoto et al., 1998; Carnaud
et al., 1999; Flaishon et al., 2000; Frucht et al., 2001). IFNγ spielt eine Schlüsselrolle bei
der Aktivierung von Makrophagen, bei Entzündungen, der Wirtsabwehr intrazellulärer
Pathogene, der T-Helfer-1-Zellantwort sowie bei der Tumorkontrolle. Des Weiteren übt
IFNγ regulatorische Funktionen aus, um entzündungsassoziierte Schäden von Geweben
zu limitieren und die Differenzierung von Th- und regulatorischen T-Zellen zu modulieren
(Gessani und Belardelli 1998; Hu und Ivashkiv 2009). In die durch IFNγ-aktivierte
Signalkaskade, die zur transkriptionellen Aktivierung IFNγ-induzierbarer Gene führt, sind
vorwiegend die Januskinasen (JAK) und die Transkriptionsfaktoren STAT (signal
transducer and activator of transcription) involviert. Aktives IFNγ liegt als Homodimer vor
und bindet an der Zelloberfläche an den IFNγ-Rezeptor (IFNGR). Dieser besteht aus
einer Ligandenbindungskette (IFNGR1), die mit einer Signaltransduktionskette (IFNGR2)
assoziiert ist (Bazan 1990; Farrar und Schreiber 1993; Bach et al., 1997). Beiden
IFNGR-Ketten fehlt eine intrinsische Kinase-/Phosphatase-Aktivität, weshalb sie mit
anderen Mediatoren für die Signaltransduktion verknüpft sein müssen. Die intrazelluläre
Domäne von IFNGR1 besitzt Bindungsmotive für JAK1 und STAT. Die intrazelluläre
2
Einleitung
Region von IFNGR2 weist dagegen ein Bindungsmotiv für die Rekrutierung von JAK2
auf (Schroder et al., 2004). Durch die Bindung von aktivem IFNγ an den Rezeptor erfolgt
die Rezeptordimerisierung, die Aktivierung der Rezeptor-assoziierten JAK2 durch
Autophosphorylierung, gefolgt von der Transphosphorylierung von JAK1 (Briscoe et al.,
1996). Die Phosphorylierung eines Rezeptortyrosylrests erfolgt schließlich durch die
Januskinasen, an dem STATs mittels ihrer SH2-Domäne binden (Bach et al., 1996).
Durch die JAK-vermittelte Phosphorylierung einer Tyrosylgruppe entstehen auf der
Oberfläche der STATs Bindungsstellen für SH2-Domänen. Die STATs dissoziieren von
den Rezeptoren, wobei die Phosphotyrosine zweier STATs reziprok erkannt werden. Die
Bindung der SH2-Domäne eines STAT an den Phosphotyrosylrest eines anderen führt
zu einem aktiven Dimer, das in den Zellkern transloziert (Shuai et al., 1992; Shuai et al.,
1994). Dort bindet es als GAF (gamma-activated factor) an sogenannte GAS-Elemente
(gamma-activated sequence) und stimuliert die Transkription von STAT-Zielgenen
(Shuai et al., 1993; Decker et al., 1997).
Endotoxine, die aufgrund ihrer Struktur auch als Lipopolysaccharide (LPS) bezeichnet
werden, stellen den Hauptbestandteil der äußeren Zellmembran Gram-negativer
Bakterien dar. LPS ist in der Lage, die mikrobiziden Effektorfunktionen und die
Produktion proinflammatorischer Cytokine von Makrophagen zu aktivieren. Es besteht
aus einer hydrophoben Region, dem sogenannten Lipid A, einem O-Antigen bestehend
aus einem hydrophilen Poly- oder Oligosaccharid sowie einer Membranankerdomäne
(Rietschel et al., 1994; Raetz und Whitfield 2002). Toll-like-Rezeptoren (TLRs) sind
Schlüsselregulatoren der Immunantwort auf infektiöse Mikroorganismen (Iwasaki und
Medzhitov 2004). Sie erkennen unterschiedliche mikrobielle Moleküle wie bakterielle
Zelloberflächenkomponenten und virale Genome (Akira und Takeda 2004). Aufgrund
ihrer zellulären Lokalisation können die TLRs in zwei Gruppen unterteilt werden. Die
erste Gruppe befindet sich in der Membran des Cytoplasmas (TLR1, 2, 4, 5 und 6)
während die Mitglieder der zweiten Gruppe (TLR3, 7 und 9) intrazellulär lokalisiert sind.
Zudem verläuft die Signaltransduktion, die durch die intrazellulären TLRs vermittelt wird,
unabhängig von TIRAP (toll-interleukin 1 receptor domain containing adaptor protein),
weshalb vermutet wird, dass es eine Verbindung zwischen der Lokalisation und der
Verwendung von Adapterproteinen gibt (Horng et al., 2002; Yamamoto et al., 2002). Die
Erkennung von Lipid A erfordert die Expression des TLR4 auf der Zelloberfläche. Des
Weiteren ist das LPS-bindende Protein (LBP) für die Erkennung notwendig. Bei dem
LBP handelt es sich um ein Akute-Phase-Protein, das eine hohe Affinität zum Lipid A
von LPS aufweist (Tobias und Ulevitch 1993). Wird LPS durch LBP gebunden, wird es
durch LBP zu CD14-positiven Zellen wie Monozyten und Makrophagen transportiert
(Lamping
et
al.,
1996).
CD14,
das
ausschließlich
durch
einen
3
Einleitung
Glykosylphosphatidylinositol-Anker in der Membran befestigt ist und durch das Fehlen
einer Transmembrandomäne nicht direkt die Signaltransduktion beeinflussen kann
(Haziot et al., 1988), ist physikalisch mit dem TLR4 assoziiert, der daraufhin das LPS
erkennt und die intrazelluläre Signalkaskade auslöst (Poltorak et al., 1998; Qureshi et
al., 1999). Bei der Aktivierung von TLR4 durch LPS fungiert zudem das sekretierte
TLR4-assoziierte Glykoprotein MD-2 als extrazelluläres Adapterprotein. Es übernimmt
LPS von CD14 und assoziiert mit TLR4 über die Leucin-reiche, N-terminale
extrazelluläre Domäne von TLR4. Diese Bindung des MD-2/LPS-Komplexes an den
Rezeptor führt zur funktionell wichtigen Dimerisierung des TLR4 (Saitoh et al., 2004).
Die Ligandenbindung am Rezeptor bewirkt eine Umstrukturierung an der intrazellulären
TIR (Toll/IL-1R)-Domäne
des
TLR4,
wodurch
Bindungen
von
Adapterproteinen
ermöglicht werden (Nunez Miguel et al., 2007). Der durch LPS-aktivierte TLR4 kann
zwei Signalwege induzieren, die als MyD88 (Myeloid differentiation factor 88) -abhängig
und MyD88-unabhängig bezeichnet werden. (Akira und Takeda 2004). Während die
MyD88-unabhängige Signalgebung durch TRIF (TIR domain-containing adapterinducing interferon β) und TRAM (TRIF-related adaptor molecule) kontrolliert wird und
zur Induktion IRF3- (Interferon regulatory factor 3-) abhängiger Typ I Interferone führt
(Fitzgerald et al., 2003; Hoebe et al., 2003; Oshiumi et al., 2003; Yamamoto et al.,
2003a; Yamamoto et al., 2003b), benötigt der MyD88-abhängige Signalweg für die
Aktivierung von NFκB und die Bildung proinflammatorischer Cytokine sowohl MyD88 als
auch TIRAP (Horng et al., 2002; Yamamoto et al., 2003a; Yamamoto et al., 2003b).
Dabei kommt es an der regulatorischen TIR-Domäne des TLR4 zur Ausbildung eines
Rezeptor-Proteinkomplexes mit der TIR-Domäne des dimeren MyD88, wofür zusätzlich
das Adapterprotein TIRAP benötigt wird. Die Fähigkeit des membranständigen TIRAP,
MyD88 zum TLR4 zu rekrutieren, ist abhängig von TIR und benötigt zudem die
Phosphatidylinositol-(4,5)-Bisphosphat-Bindungsaktivität
von
TIRAP
(Kagan
und
Medzhitov 2006). Das an den Rezeptor gebundene MyD88 bewirkt im Anschluss die
Rekrutierung der IRAK1 (IL-1 receptor associated kinase) zum Rezeptorkomplex,
wodurch es zur Interaktion der Todesdomäne von MyD88 mit der Todesdomäne der
Serin/Threonin-Kinase kommt. Die IRAK1 wird durch die IRAK4, eine Kinase, die bereits
mit MyD88 assoziiert ist, phosphoryliert oder autogen phosphoryliert. Dadurch löst sich
die IRAK1 vom Rezeptorkomplex und bindet an das Adapterprotein TRAF6 (tumor
necrosis factor (TNF) receptor-associated factor 6) (Arch et al., 1998). An TRAF6 teilt
sich der Signaltransduktionsweg (s. Abb. 1). Einerseits kann der IRAK1/TRAF6-Komplex
zu einem membranlokalisierten präformierten Komplex aus TAB1, TAB2/TAB3 gelangen,
der die TAK1 (transforming growth factor β (TGFβ)-activated kinase 1) aktiviert.
Andererseits kann TRAF6 auch MEKK1 (mitogen activated protein kinase/extracellular
4
Einleitung
signal-regulated kinase kinase) aktivieren. TAK1 und/oder MEKK1 aktivieren den IKK(IκB-kinase-) Komplex, wodurch der Transkriptionsfaktor NFκB (nuclear factor κB)
freigesetzt wird (Zhang und Ghosh 2001). Über TAK1 und/oder MEKK1 kann es
außerdem zur Aktivierung von MAPKs (mitogen activated protein kinase) wie JNK/SARK
(c-Jun
NH2-terminal
kinase/stress-activated
protein
kinase),
p38 MAPK
und
p44/42 MAPK (extracellular signal-regulated kinase 1/2, ERK1/2) kommen. Die
MAPK-Signalkaskaden, die in allen eukaryotischen Zellen vorkommen, sind für die
Immunantworten
im
Wirt
entscheidend.
Die
Signalkaskaden
bestehen
aus
MAPK-Kinasen-Kinasen (MEKK), welche MAPK-Kinasen (MKK) phosphorylieren, die
ihrerseits wiederum MAP-Kinasen durch Phosphorylierung aktivieren (Widmann et al.,
1999). JNK und p38 MAPK regulieren die transkriptionelle Aktivität der AP-1- (activating
protein-1-) Familie, die aus Homo- und Heterodimeren der c-Jun-, c-Fos- und ATF-2(activating transcription factor 2-) Familie besteht (Rossi et al., 2000). Innerhalb des
AP-1-Signaltransduktionsweges
kontrollieren
JNK
und
p38 MAPK
überwiegend
Stressantworten wie Entzündungen und Apoptose (Lewis et al., 1998). Sie bestehen aus
MEKK1, MKK4/7 und JNK bzw. MEKK5, MKK3/6 und p38 MAPK, wobei GTP-bindende
Proteine der Roh-Familie wie Rac und Cdc42 an der Aktivierung der MEKKs beteiligt
sind. Im Gegensatz dazu reguliert die p44/42 MAPK hauptsächlich das Zellwachstum
und die Differenzierung (Lewis et al., 1998). Die p44/42 MAPK-Kaskade besteht aus
dem G-Protein Ras, der MEKK Raf, den MEK1/2 und p44/42 MAPK. Die einzelnen
Kaskaden sind untereinander sehr eng verknüpft und es findet ein ständiger
wechselseitiger Signalfluss zwischen den Kaskaden (crosstalk) statt (Schaeffer und
Weber 1999). Neben den MAPKs sind die Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K),
monomere und heterodimere G-Proteine, die p21-aktivierte Kinase 1 (PAK1) und
Mitglieder der Proteinkinase C-Familie weitere Signaltransduktionsmediatoren, die an
der LPS-induzierten Aktivierung von Makrophagen beteiligt sind (s. Abb.1; Alexander
und Rietschel 2001). Die PI3Ks sind Lipidkinasen, die für die Produktion von sekundären
Botenstoffen verantwortlich sind, indem sie die Phosphorylierung der 3‘-OH-Gruppe am
Inositolring der Inositolphospholipide, vorzugsweise jedoch von Phosphatidylinositol-4,5diphosphat zu Phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphat (PIP3), katalysieren. PIP3 kann zum
einen das GTP-bindende Protein Rac aktivieren, das darauf die JNK-Kaskade auslöst.
Zum anderen kann es auch PDK-1 (Phosphatidylinositol-3-abhängige Kinase-1)
aktivieren. Damit ist PIP3 ein wichtiges Signalmolekül des PI3K/Proteinkinase B- (PKBbzw. Akt-) Signaltransduktionsweges, der Auswirkungen auf die Homöostase der Zelle,
das Überleben, die Apoptose, die Proliferation und den Stoffwechsel zeigt (Coffer et al.,
1998).
5
Einleitung
Abbildung 1: Modell der Endotoxin-induzierten
Endotoxin
Genexpression proinflammatorischer Mediatoren
durch Toll-like-Rezeptor 4-vermittelte
vermittelte Signaltransduktionskaskaden zur Abwehr bakterieller
Pathogene. Die extrazelluläre Bindung von LPS durch LBP an TLR4 führt zur Bildung eines
eine intrazellulären
Komplexes bestehend aus TIRAP, MyD88, IRAK4 und IRAK1 an der TIR-Domäne
TIR Domäne des Rezeptors, wodurch
IRAK1 aktiviert wird und an TRAF6 bindet. TRAF6 kann einerseits durch einen TAK1/IKK/IκBα-Signalweg
TAK1/IKK/I
die Translokation von NFκB
B in den Zellkern und die Expression NFκB-regulierter
regulierter Gene vermitteln.
Andererseits kann TRAF6 die MAPKKK/MAPKK/MAPK-Signalkaskaden
MAPKKK/MAPKK/MAPK Signalkaskaden aktivieren und dadurch die nukleäre
Translokation der Transkriptionsfaktoren der AP-1-Familie
AP Familie bewirken, wodurch die Expression
Expr
AP-1-regulierterr Gene initiiert wird. Ebenfalls verzeichnet sind mögliche Crosstalks der einzelnen
Signalkaskaden sowie die Aktivierung der PKB und PKC durch PI3K. Verändert nach (Alexander und
Rietschel 2001; Roeder et al., 2004; Kagan und Medzhitov 2006).
2006)
6
Einleitung
Außerdem
spielt
PDK-1
eine
entscheidende
Rolle
bei
der
Aktivierung
der
Serin/Threonin-Kinase PKC (Le Good et al., 1998). Die PKC-Isoenzyme sind abhängig
von ihrer Homologie und Sensitivität gegenüber Aktivatoren in drei Gruppen geteilt
(Nishizuka 1984; 1988; 1992). Für die Aktivierung benötigen alle PKC-Isoenzyme
Phosphatidylserin. Klassische PKCs, bestehend aus α-, βI-, βII- und γ-PKC, besitzen in
ihrer regulatorischen Domäne eine C1- und C2-Region. Erstere fördert die Bindung von
Diacylgycerin (DAG) und Phorbolestern, letztere ist für die Ca2+-Bindung zuständig (Ono
et al., 1989). DAG und Ca2+ sind physiologische Stimulatoren, die die cPKC aktivieren,
indem sie die cPKC zur Membran translozieren. Da den neuen PKC- (nPKC-)
Isoenzymen, darunter δ-, ε-, η- und θ-PKC, die C2-Region fehlt, ist nur DAG ein potenter
physiologischer Aktivator der nPKCs (Ono et al., 1988; Osada et al., 1992; Hug und
Sarre 1993). Den atypischen PKCs (aPKC) ζ und ι/λ fehlt hingegen die C2-Region,
während die C1-Region nur eine cysteinreiche Schleife aufweist, weshalb aPKCs
insensitiv gegenüber DAG und Ca2+ sind (Ono et al., 1989; Selbie et al., 1993; Akimoto
et al., 1994; Newton 2001).
Die Vorbehandlung von Makrophagen mit IFNγ führt zu einer schnelleren und stärkeren
Antwort durch LPS (Jurkovich et al., 1991; Kamijo et al., 1993; Lorsbach et al., 1993)
sowie andere TLR-Agonisten wie z. B. unmethylierte CpG-Motive in bakterieller DNA
(Sweet et al., 1998). Die vorausgehende Behandlung mit IFNγ ist für die Induktion
einiger Gene wie der induzierbaren NO-Synthase notwendig. Bei anderen Genen kann
die IFNγ-Behandlung die Dosis-Wirkungskurve so verschieben, dass die Transkription
durch geringere Mengen an LPS induziert wird, wobei es zu einer superinduzierten
Transkription in IFNγ-aktivierten, LPS-stimulierten Zellen im Vergleich zu ausschließlich
mit LPS-stimulierten Zellen kommt. Des Weiteren beeinflusst IFNγ die Kapazität der
LPS-abhängigen Signaltransduktion, indem es sowohl Ligand-Rezeptor-Interaktionen
als
auch
stromabwärts-gelegene
Signalmechanismen
fördert.
Die
effiziente
LPS/TLR4-Interaktion benötigt MD-2 und CD14 sowie für die maximale Signalgebung
MyD88. In unterschiedlichen Studien wurde gezeigt, dass IFNγ die Transkription von
TLR4
als
auch
die
TLR4-Oberflächenexpression
positiv
reguliert,
und
die
LPS-Bindungsfähigkeit von Makrophagen erhöht (Darmani et al., 1994; Mita et al., 2001;
Bosisio et al., 2002). Darüber hinaus verhindert IFNγ die LPS-abhängige Abnahme der
TLR4-Oberflächenexpression, die in IFNγ-unbehandelten Zellen auftritt (Bosisio et al.,
2002). Es ist anzunehmen, dass die IFNγ-Stimulation die LPS-vermittelte Signalgebung
unterstützt, indem es die Expression von MD-2, MyD88 sowie IRAK fördert (AdibConquy und Cavaillon 2002; Bosisio et al., 2002).
7
Einleitung
1.1.3
Als
Entstehung und Funktion reaktiver Sauerstoffspezies
reaktive
Sauerstoffverbindungen
(reactive
oxygen
species,
ROS)
werden
radikalische und nichtradikalische Sauerstoffderivate bezeichnet, die eine höhere
Reaktivität als molekularer Sauerstoff aufweisen. Zu ihnen gehören das Superoxidanion
(·O2-), das Hydroxylradikal (·OH-), das Peroxylradikal (·ROO-), Singulettsauerstoff (1O2)
sowie Wasserstoffperoxid (H2O2). Diese werden sowohl von allen aeroben Organismen
gebildet als auch degradiert, was in physiologischen Konzentrationen normale
Zellfunktion gewährleistet, aber in exzessiven Konzentrationen zu oxidativem Stress
führt. Die Entstehung von ROS erfolgt durch Stoffwechselprozesse wie der
mitochondrialen Atmungskette, der Fettsäureoxidation in Peroxisomen sowie durch die
Xanthin-Oxidase oder die Arachidonsäure-5-Lipoxygenase (Finkel und Holbrook 2000;
Oktyabrsky und Smirnova 2007). Die intrazelluläre Bildung dieser Intermediate gefährdet
die Integrität einer Vielzahl von Biomolekülen wie z. B. der Proteine, Lipide, Lipoproteine
und DNA (Yla-Herttuala 1999; Marnett 2000; Stadtman und Levine 2000). Zudem
scheint oxidativer Stress beim Alterungsprozess eine Rolle zu spielen, indem er die
Schädigung mitochondrialer DNA fördert (Cadenas und Davies 2000; Finkel und
Holbrook 2000). Während ROS neben ihrer schädigenden Funktion auch als sekundäre
Botenstoffe fungieren (Thannickal und Fanburg 2000), werden ROS zudem von
aktivierten Phagozyten gebildet, um eindringende bakterielle Pathogene abzutöten
(Thomas et al., 1988). Dabei werden ROS prinzipiell durch die NADPH-Oxidase gebildet,
die O2 in ·O2- umwandelt (Babior 1999; Nauseef 1999). In Phagosomen wird das
Superoxid durch Superoxiddismutasen (SOD) zu H2O2 reduziert, das anschließend
durch die Myeloperoxidase zu Hypochloriger Säure (HOCl) umgesetzt werden kann, die
ihrerseits spontan zum Hydroxylradikal zerfällt. HOCl und ·OH- sind hoch toxisch für
phagosomale Bakterien, weshalb diese beiden Sauerstoffintermediate die eigentliche
direkte antimikrobielle Abwehr durch ROS darstellen (Rosen et al., 1990). Neben ROS
spielt Stickstoffmonoxid (NO) eine entscheidende Rolle, dass intrazellulär von der
NO-Synthase (NOS) durch Oxidation von L-Arginin zu L-Citrullin gebildet wird. Es gibt
drei Isoformen dieses Enzyms, die neuronale (nNOS), die endotheliale (eNOS) und die
induzierbare NOS (iNOS), die sich deutlich in ihrer entsprechenden Expression und
Aktivität unterscheiden (Andrew und Mayer 1999; Beck et al., 1999; Bredt 1999; Kroncke
et al., 2000). Unter physiologischen Bedingungen agiert NO hauptsächlich als
sekundärer Botenstoff, der die Guanylylzyklase und Proteinkinasen stimuliert. Zudem ist
NO membranpermeabel und kann daher ebenfalls Signale zu anderen Zellen übertragen
(Ignarro 1990). Wird NO durch Endotoxin- oder IFNγ-vermittelte iNOS-Induktion in
großen Mengen gebildet, übernimmt NO eine Funktion bei der Redoxkontrolle zellulärer
Prozesse, indem es durch Nitrosylierung von Proteinen die enzymatische Aktivität
8
Einleitung
reguliert (Stamler 1994; Arnelle und Stamler 1995; Wink und Mitchell 1998).
Entgegengesetzt dazu kann NO, wenn es gleichzeitig mit dem Superoxidanion gebildet
wird, zum cytotoxischen Peroxynitrit reagieren, das wiederum mit einer Vielzahl
verschiedener Biomoleküle interagieren kann (Beckman und Koppenol 1996).
Jeder Organismus besitzt zum Schutz vor antioxidativen Schäden ein komplexes
antioxidatives System. Bestandteile dieses Systems sind neben der SOD Enzyme wie
die Katalasen und Peroxidasen, die für die Eliminierung von H2O2 verantwortlich sind.
Nicht-enzymatische Antioxidantien stellen die intrazellulären Moleküle Glutathion und
Thioredoxin dar. Weitere Substanzen wie α-Tocopherol, Ascorbinsäure, β-Carotin sowie
sekundäre Pflanzenstoffe, die mit der Nahrung zugeführt werden (Sies 1997), reagieren
ebenfalls mit freien Radikalen und setzen die schädigende Wirkung von ROS herab.
1.1.4
Prostaglandine und ihre Biosynthese
Prostaglandine (PG) sind mehrfach ungesättigte, zyklische Fettsäurederivate. Da sie
20 Kohlenstoffatome aufweisen, werden sie zu den Eicosanoiden gezählt. In
Abhängigkeit von der ungesättigten Fettsäure, aus der sie hervorgehen, wird zwischen
Serie 1 – 3 der Prostaglandine unterschieden. Prostaglandine sind Lipidhormone, die
lokal begrenzt entweder autokrin oder parakrin wirken, wodurch es zur Induktion einer
Vielzahl
physiologischer
und
pathologischer
Antworten
kommt
(Smith
2008).
Prostaglandine der Serie 2 besitzen das chemische Grundgerüst der Postansäure und
leiten sich von der Arachidonsäure ab. Der Schlüsselschritt der Prostaglandinsynthese
wird durch die Cyclooxygenase-Isoenzyme COX-1 und COX-2 katalysiert, deren Aktivität
geschwindigkeitsbestimmend für die Prostaglandinsynthese ist (Smith et al., 2000;
Rouzer und Marnett 2009). Obwohl sich COX-1 und COX-2 strukturell und funktionell
sehr ähnlich sind, werden sie durch verschiedende Gene codiert, die unterschiedlich
reguliert werden, was wiederum unterschiedliche Expressionsmuster sowie biologische
Funktionen zur Folge hat. Während COX-1 in den meisten Geweben von Säugetieren
konstitutiv exprimiert wird (Xu et al., 1996; Xu et al., 1997), wird COX-2 in einigen
Geweben auf eine induzierbare und transiente Weise selektiv exprimiert (DeWitt und
Meade 1993; Perkins und Kniss 1997; Rich et al., 1998; Zaric und Ruegg 2005). COX-1
und COX-2 weisen eine Cyclooxygenase- (Dioxygenase-) Aktivität auf, die freie
Arachidonsäure zweifach oxidiert, die zuvor durch die Phospholipasen A2 von der
sn-2-Position der Membran-Glyerophospholipide freigesetzt wurden. Daraus resultiert
die Bildung des Hydroperoxids PGG2, das im Anschluss durch die Peroxidase-Aktivität
der COX-Enzyme zum instabilen PGH2 reduziert wird (Spencer et al., 1999; Kiefer et al.,
2000;
van
der
Donk
et
al.,
2002).
Schließlich
setzen
zellspezifische
9
Einleitung
Prostaglandinsynthasen PGH2 durch Isomerisierung oder Reduktion zu verschiedenen
biologisch
aktiven
Prostaglandinen
um
(s. Abb. 2).
Diese
regulieren
wichtige
homöostatische Funktionen wie die Aktivierung der angeborenen Immunität in Antwort
auf mikrobielle Infektionen, die Aufrechterhaltung der normalen kardiovaskulären
Funktion und die Regulation der weiblichen Fortpflanzungsbiologie (Funk 2001;
Kobayashi und Narumiya 2002; Smith 2008). Prostaglandine, die aufgrund einer
anormalen COX-2-Expression verändert synthetisiert werden, scheinen an vielen
pathologischen Prozessen wie chronischen Entzündungen, Fieber, der Angiogenese
sowie der Tumorgenese beteiligt zu sein (Zhang et al., 1997; Cao et al., 1998; Leahy et
al., 2002; Sinicrope 2006).
Anhand der Struktur des Fünfringes werden die konventionellen Prostaglandine mit
einem
Cyclopentanon,
namensgebenden
darunter
PGD2,
PGE1,
Cyclopentenon-Prostaglandinen
PGE2
wie
und
PGF2α,
PGA1,
von
PGA2
den
und
15-deoxy-∆12,14-PGJ2 unterschieden (Narumiya et al., 1999; Straus und Glass 2001).
PGD2 wird in Mastzellen, dendritischen Zellen und Makrophagen durch die
cytoplasmatische, hämatopoetische PGD-Synthase (H-PGDS) (Urade et al., 1989;
Urade et al., 1990) sowie durch die sekretorische Lipocalin-PGD-Synthase (L-PGDS)
des zentralen Nervensystems synthetisiert (Urade und Hayaishi 2000). Die Expression
der H-PGDS ist durch proinflammatorische Stimuli induzierbar, während die L-PGDS
konstitutiv exprimiert wird (Tajima et al., 2008).
Die Umsetzung von PGH2 zu PGE2 wird durch die PGE-Synthase (PGES) katalysiert
(s. Abb. 2). (Jakobsson et al., 1999; Kudo und Murakami 2005). Bis heute wurden drei
verschiedene PGE-Synthase-Enzyme identifiziert: Die cytosolische PGES (cPGES)
(Tanioka et al., 2000), die mikrosomale PGES Typ-1 (mPGES-1) (Jakobsson et al., 1999)
und die mikrosomale PGES Typ-2 (mPGES-2) (Tanikawa et al., 2002; Helliwell et al.,
2004). Die Expression der cPGES und der mPGES-2 scheint hauptsächlich konstitutiv
zu sein, wohingegen die mPGES-1-Expression in Antwort auf proinflammatorische
Stimulation induzierbar ist (Forsberg et al., 2000; Kudo und Murakami 2005). Zusätzlich
sind
die
PGES-Enzyme
unterschiedlich
mit
den
stromaufwärts-gelegenen
COX-Enzymen gekoppelt. So weist die mPGES-1 eine höhere Präferenz für die COX-2
und die cPGES für COX-1 auf. Dagegen ist die mPGES-2 gleichermaßen mit der COX-1
und COX-2 gekoppelt (Murakami et al., 2000; Tanioka et al., 2000; Murakami et al.,
2003).
Die Abspaltung von Wasser von PGE1 bzw. PGE2 führt zur Entstehung von PGA1 bzw.
PGA2 (Straus und Glass 2001). PGD2 wird in vivo und in vitro schnell durch
Dehydratisierung zu biologisch aktiven Prostaglandinen der Serie J2 wie PGJ2, ∆12-PGJ2
und 15-deoxy-∆12,14-PGJ2 umgewandelt (s. Abb. 2; Fitzpatrick und Wynalda 1983;
10
Einleitung
Kikawa et al., 1984; Hirata et al., 1988). Diese Prostaglandine werden durch ihre
reaktiven α, β-ungesättigten Ketone im Cytopentenonring charakterisiert und weisen ein
eigenes Spektrum biologischer Wirkungen auf. Dazu gehören unter anderen die
Zellzyklushemmung, die Induktion von Hitzeschockproteinen und eine antitumorale
Aktivität (Fukushima 1992) sowie antiinflammatorische Effekte wie die Hemmung von
NFκB durch Inhibition der IκB-Kinase (Rossi et al., 2000; Straus et al., 2000).
Abbildung 2: Biosynthesewege der Prostaglandine. Bildung der Prostaglandine (PG) der Serie 2,
untergliedert in konventionelle PGs PGD2, PGE1, PGE2 und PGF2α und Cyclopentenon-PGs PGA1, PGA2
und PGs der J-Serie. Die Phospholipase A2 (PLA2) katalysiert die hydrolytische Freisetzung der
Arachidonsäure aus Membranphospholipiden. Die Umsetzung der Arachidonsäure zu PGG2 und weiter zu
PGH2 erfolgt durch die PGH-Synthase. Die Bildung einzelner PGs aus PGH2 wird wie dargestellt durch
entsprechende
Synthasen katalysiert.
H-PGDS: Hämatopoetische PGD-Synthase;
L-PGDS:
Lipocalin-PGD-Synthase; PGFS: PGF-Synthase; cPGES: Cytosolische PGE-Synthase; mPGES-1/-2:
Mikrosomale PGE-Synthase-1 und -2; COX-1/-2: Cyclooxygenase-1 und -2. Verändert und erweitert nach
(Narumiya et al., 1999; Kim und Surh 2006).
11
Einleitung
1.1.5
Die
Prostaglandin-vermittelte Signaltransduktion
physiologischen
heterotrimere
Effekte
der
konventionellen
Guaninnukleotid-bindende
Prostaglandinrezeptoren
vermittelt,
die
Prostaglandine
Proteinzur
(G-Protein-)
Familie
werden
über
gekoppelte
Rhodopsin-ähnlicher
7-Transmembranrezeptoren gehören (Narumiya et al., 1999). Die Subfamilie der
Prostaglandinrezeptoren besteht aus den Vertretern DP, EP1 – 4 und FP, die nach dem
Prostaglandinliganden benannt sind, der die höchste Affinität zum jeweiligen Rezeptor
aufweist (Breyer et al., 2001). Zudem wurde kürzlich ein weiterer Rezeptor, CRTH2
(chemoattractant receptor homologous), entdeckt, der von Th2-Zellen exprimiert wird
und PGD2 bindet (Nagata et al., 1999; Hirai et al., 2001). Die Prostaglandinrezeptoren
sind mit der klassischen G-Protein-vermittelten Signaltransduktion gekoppelt, wobei die
Signalwege sehr komplex sind. So können Rezeptoren, die mit einem Gs-Protein
gekoppelt
sind,
den
intrazellulären
cAMP-Spiegel
erhöhen
und
dadurch
die
Proteinkinase A (PKA) aktivieren. Im Gegensatz zum Gs-Protein resultiert die Interaktion
des Rezeptors mit einem Gi-Protein in der Hemmung der PKA. Des Weiteren können
spezielle Rezeptoren ebenfalls Gq-Proteine aktivieren und dadurch die Freisetzung von
PIP3 und DAG bewirken, wodurch ein Anstieg des intrazellulären Ca2+-Gehaltes sowie
die PKC-Aktivierung hervorgerufen wird.
Die in der Literatur beschriebenen, diversen Wirkungen von PGE2 werden als Folge der
Expression vier verschiedener EP-Rezeptoren und ihrer Heterogenität hinsichtlich der
Verknüpfung mit intrazellulären Signaltransduktionswegen angesehen. Während EP1
den Ca2+-Einstrom mit Hilfe eines bis heute undefinierten G-Proteins reguliert (Funk et
al., 1993; Watabe et al., 1993) und die verschiedenen Splice-Varianten des
EP3-Rezeptors mit Gi-Proteinen interagieren, wodurch die Adenylylzyklase gehemmt
wird (Namba et al., 1993), führt die Aktivierung des EP2- oder EP4-Rezeptors durch
Gs-Proteine zur Aktivierung der Adenylylzyklase und Bildung von intrazellulärem cAMP
(Honda et al., 1993; Regan et al., 1994; Fujino et al., 2003). Die folgende Aktivierung
von PKA durch cAMP kann zur Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors CREB (CRE
binding protein) führen, das mit CREs (cAMP response element) interagiert und die
Expression cAMP responsiver Gene induziert (Mayr und Montminy 2001; Johannessen
et al., 2004). EP2 und EP4 erfüllen bei manchen Prozessen die gleiche Funktion. Zum
Beispiel vermitteln sie gemeinsam bei der Osteoklastogenese über cAMP die
PGE2-induzierte Expression von RANKL (receptor activator for NFκB ligand), einem
Mitglied der TNF-Familie (Li et al., 2000b; Ono et al., 2003). Demgegenüber kann EP4
im Vergleich zu EP2 auch cAMP/PKA-unabhängige Mechanismen aktivieren, indem
dieser Rezeptor die Aktivierung der p44/42 MAPK über die PI3K initiiert (Fujino et al.,
2002; Fujino et al., 2003; Pozzi et al., 2004).
12
Einleitung
DP1 ist der klassische PGD2-Rezeptor und wird ubiquitär exprimiert, wohingegen
CRTH2 von Th2-Zellen, sowie Eosinophilen und Basophilen exprimiert wird. Die Affinität
der beiden Rezeptoren für PGD2 ist nahezu identisch (Nagata et al., 1999; Hirai et al.,
2001). Wie in Tabelle 1 dargestellt, führt die Aktivierung des DP-Rezeptors zu einer
Gs-vermittelten Bildung von cAMP (Hirata et al., 1994; Boie et al., 1995), während
CRTH2 mit Hilfe eines Gi-Proteins die cAMP-Bildung hemmt und den intrazellulären
Ca2+-Gehalt in einer Vielzahl von Zellen erhöht (Sugimoto et al., 1997). Weiterhin besitzt
CRTH2 nicht nur für PGD2 eine hohe Affinität, sondern auch für dessen Metabolit
15d-PGJ2,
weshalb angenommen wird,
dass
PGD2-Metabolite unterschiedliche
Wirkungen durch CRTH2, aber nicht durch DP, ausüben können (Sawyer et al., 2002).
Tabelle 1: G-Protein-gekoppelte Prostaglandinrezeptoren und ihre Signaltransduktion. Verändert und
erweitert nach (Regan 2003; Hata und Breyer 2004).
Rezeptortyp
RezeptorSubtyp
G-Protein
EffektorEnzym
Sekundärer Signalweg
Botenstoff
DP
DP
Gs
AC ↑
cAMP ↑
PKA ↑
CRTH2
Gi
AC ↓
cAMP ↓
PKA ↓
EP1
Gq
PLCβ ↑
DAG, PIP3 ↑ PKC, Ca ↑
EP2
Gs
AC ↑
cAMP ↑
EP3
Gi
Gq
AC↓
PLCβ ↑
cAMP ↓
PKA ↓
2+
DAG, PIP3 ↑ PKC, Ca ↑
EP4
Gs
Gs
AC ↑
?
cAMP ↑
?
FP
Gq
PLCβ ↑
DAG, PIP3 ↑ PKC, Ca ↑
EP
FP
2+
PKA ↑
PKA ↑
PI3K, p44/42 MAPK ↑
2+
Abkürzungen: G-Protein: Guaninnuleotid-bindendes Protein; Gs: stimulierend; Gi: inhibierend; Gq: PLCβaktivierend; AC: Adenylylzyklase; PLCβ: Phospholipase β; PKC: Proteinkinase C; PKA: Proteinkinase A;
PI3K: Phosphatidylinositol-3-Kinase; p44/42 MAPK: p44/42 Mitogen-aktivierte Proteinkinase; cAMP:
cyclisches Adenosinmonophosphat; DAG: Diacylglycerin; PIP3: Phosphatidylinositol-1,4,5-triphosphat;
↑: Induktion der Enzymaktivität/Bildung sekundärer Botenstoffe; ↓: Hemmung der Enzymaktivität/Hemmung
der Bildung sekundärer Botenstoffe.
Für die Cyclopentenon-Prostaglandine wurden bis zum heutigen Tag keine spezifischen
Transmembranrezeptoren identifiziert. Jedoch lassen Untersuchungen annehmen, dass
es zwei zusätzliche Signalwege gibt, durch die Prostaglandine die Funktion von
Immunzellen modifizieren können, nämlich einerseits durch direkte Aktivierung von
nukleären
Rezeptoren
intrazellulären
und
Proteinen.
andererseits
15d-PGJ2
ist
durch
ein
inhibitorische
potenter
Agonist
Interaktionen
des
mit
Peroxisom-
Proliferator-aktivierten Rezeptors γ (PPARγ) (Khan 1995; Narumiya und FitzGerald
2001), bei dem es sich um einen Ligand-abhängigen transkriptionellen Regulator
handelt. Des Weiteren zeigten andere Studien, dass Cyclopentenon-Prostaglandine wie
15d-PGJ2 direkt die Aktivierung der IκB-Kinase (IKK) hemmen (Rossi et al., 2000; Straus
et al., 2000).
13
Einleitung
1.2
Die Familie der Peroxiredoxine
1.2.1
Vorkommen, Klassifizierung und physiologische Funktion
Die Familie der Peroxiredoxine (Prxs) ist eine evolutionär konservierte Gruppe von
Antioxidantien, die Zellen vor oxidativen Schäden schützen, indem sie die Reduktion
einer Vielzahl zellulärer Peroxide katalysieren. Peroxiredoxine sind kleine (22 – 27 kDA)
nicht-Selen-Peroxidasen, die auch als niedermolekulare Thiol-abhängige Peroxidreduktasen bezeichnet werden (Hofmann et al., 2002) und erstmals Anfang der 80er
Jahre fast zeitgleich in Bakterien und Hefen identifiziert wurden (Kim et al., 1988; Storz
et al., 1989; Tartaglia et al., 1990). In den darauffolgenden Jahren wurden sie ebenfalls
in Pflanzen und Säugetieren nachgewiesen (Chae et al., 1993; Chae et al., 1994b; Baier
und Dietz 1996). Alle Peroxiredoxine katalysieren die Peroxidreduktion von H2O2,
organischen Hydroperoxiden und Peroxynitrit zu Wasser und Alkohol (Rhee et al.,
2005a; Rhee 2006). Zudem sind Prxs an vielen zellulären Prozessen wie der oxidativen
Stressantwort, der Zellproliferation sowie der Differenzierung beteiligt (Fujii und Ikeda
2002; Immenschuh und Baumgart-Vogt 2005; Rhee et al., 2005a). Sie werden ubiquitär
exprimiert, wobei jedes Prx, wie in Tabelle 2 dargestellt, sowohl eine unterschiedliche
zelluläre Lokalisation als auch Gewebeexpression aufweist (Chae et al., 1999; Rhee et
al., 1999; Schroder et al., 2000). Zum einen unterscheiden sich Peroxiredoxine von den
klassischen
antioxidativen
Enzymen
wie
Katalase,
Superoxiddismutase
oder
Peroxidasen, indem sie keine Sequenzhomologie zu diesen aufweisen. Zum anderen
weisen Prxs im Gegensatz zu den klassischen antioxidativen Enzymen keine
prosthetische Gruppe auf und benötigen für ihren katalytischen Zyklus keine
anorganischen Kofaktoren wie Selen, Kupfer, Mangan, Eisen oder Zink (Rhee et al.,
1999; Hofmann et al., 2002). Die sechs verschiedenen Prx-Isoformen (Prx 1- 6) werden
in drei Subgruppen unterteilt: Typische 2-Cys-Prx-Proteine (Prx 1- 4), die einen aminound carboxyterminal-konservierten Cysteinrest besitzen, die sie für ihre katalytische
Funktion benötigen; atypische 2-Cys-Proteine (Prx 5), die nur das konservierte Cystein
im NH2-Terminus aufweisen, aber für ihre katalytische Aktivität einen weiteren, nicht
konservierten Cysteinrest benötigen; und 1 -Cys-Prx-Proteine (Prx 6), die nur das
konservierte NH2-terminale Cystein besitzen, das ausschließlich für die katalytische
Funktion erforderlich ist (Seo et al., 2000; Rhee et al., 2001). Die Aminosäuresequenzen
der typischen 2-Cys-Prxs weisen eine über 70 %-ige Homologie auf, wobei die
Homologien besonders in den Regionen um die konservierten Cysteinseitenketten
ausgeprägt sind. Im Gegensatz dazu teilt die Prx 5-Sequenz nur eine nahezu 10 %-ige
Sequenzidentität mit den typischen 2-Cys-Prxs, die zudem hauptsächlich in der
umliegenden Region des aminoterminal-konservierten Cysteinrests Cys47 auftritt (Seo
et al., 2000; Rhee et al., 2005a). Die C-terminale Region von Prx 5 ist kürzer als die der
14
Einleitung
typischen 2-Cys-Prxs (Lee et al., 2000). Sowohl die humane als auch die murine
Prx 5-Sequenz besitzt, zusätzlich zum Cys47, Cysteinreste an den Positionen 72 und
151 (Lyu et al., 1999). Zudem sind die Sequenzen um Cys72 und Cys151 nicht homolog
zu denen, die das carboxyterminale Cystein der typischen 2-Cys-Prxs umgeben (Rhee
et al., 2005a).
Tabelle 2: Isoformen und spezifische Charakteristika der bisher identifizierten Prxs bei Säugern.
Verändert und erweitert nach (Butterfield et al., 1999; Fujii und Ikeda 2002; Wood et al., 2003; Evrard et al.,
2004).
Klasse
Typische 2-Cys-Prxs
Atypische
2-Cys-Prxs
1-Cys-Prx
Isoform
Prx 1
Prx 2
Prx 3
Prx 4
Prx 5
Prx 6
Synonyme
HBP23 (r)
MSP23 (m)
NKEF A (h)
OSF-3 (m)
PAG (h)
NKEF B (h)
PRP (h)
TSA (h)
AOP1 (h)
MER5 (m)
SP22 (b)
AOE372 (h)
TRANK (h)
AOEB166 (h, r)
AOPP (h)
PMP20 (h, m)
AOP2 (h)
LTW4 (m)
ORF06 (h)
Molekulargewicht
[kDa]
22
22
28 (21)
31 (27)
22 (17)
25
Funktionelle
Untereinheit
Dimer
Dimer
Dekamer
Dimer
Dimer
Monomer
Dimer
Monomer
Intrazelluläre Cytosol
Cytosol
Lokalisation Zellkern
Zellkern
Mitochondrien
Peroxisomen
Mitochondrien Cytosol
Golgi
Lysosomen
sezerniert
Cytosol
Mitochondrien
Peroxisomen
Cytosol
Elektronendonor
Thioredoxin
Thioredoxin
Glutathion
Liponsäure
Cyclophilin
Thioredoxin
Thioredoxin
Thioredoxin
Abkürzungen: h: human; Mensch; m: Maus; r: Ratte b: bovine, Rind; kDa: Kilodalton.
Der aminoterminale Cysteinseitenrest (Cys-SH) wird durch Peroxide zu Sulfensäure
(Cys-SOH) oxidiert, wodurch es zur Hemmung der Peroxidaseaktivität kommt (Ellis und
Poole 1997b; 1997a). Im sich anschließenden Reaktionsschritt, der sich jedoch für die
verschiedenen Isoformen der Prxs unterscheidet, wird das instabile SulfensäureIntermediat zurückgebildet und Cys-SH regeneriert. Typische 2-Cys-Prxs bilden dabei
Homodimere, indem das zur Sulfensäure oxidierte Cystein eines Peroxiredoxins mit dem
C-terminal-konservierten
intermolekulare
Cysteinrest
Disulfidbrücke
eines
ausbildet.
anderen
Die
reagiert
Reduktion
der
und
sich
eine
intermolekularen
Disulfidbrücke und die damit einhergehende Regeneration der Peroxidaseaktivität ist für
die Disulfidoxidoreduktase Thioredoxin spezifisch, und kann nicht durch Glutathion oder
Glutaredoxin bewerkstelligt werden. Schließlich wird Thioredoxin selbst durch die
15
Einleitung
NADPH-abhängige Thioredoxinreduktase regeneriert (Chae et al., 1994a; Chae et al.,
1994b).
Im Fall des atypischen 2-Cys-Prxs (Prx 5) wird ebenfalls das Cys47 durch Peroxide
oxidiert. Daraufhin reagiert das oxidierte Cys47 mit der Sulfhydrylgruppe des Cys151
eines anderen Prx 5-Enzyms, wodurch es ebenfalls zu einer intermolekularen
Disulfidbrücke kommt. Durch Proteinkristallographie von Prx 5 wurde aufgedeckt, dass
während des katalytischen Mechanismus zuerst zwei intermolekulare Disulfidbindungen
entstehen, die anschließend neu zu intramolekularen Disulfidbrücken angeordnet
werden können (Seo et al., 2000; Evrard et al., 2004). Dieses ist deshalb möglich, weil
die zwei Disulfidbindungen des oxidierten Dimers, die ebenfalls durch Thioredoxin
reduziert werden, sehr nahe beieinander liegen. Entgegengesetzt dazu dient den
1-Cys-Prxs (Prx 6) nicht Thioredoxin als regenerierendes Enzym, sondern die
Elektronendonoren Gluthathion (GSH), Cyclophilin und Dithiothreitol (Kang et al., 1998;
Fisher et al., 1999; Lee et al., 2001; Manevich und Fisher 2005). Nach Behandlung mit
H2O2 wird die aminoterminale Sulfhydrylgruppe von Prx 6, das dem Cys47 des humanen
Prx 6 entspricht, sehr schnell oxidiert. Dabei bilden die entstandenen SulfensäureIntermediate jedoch keine Disulfidbindungen aus, da keine weiteren Sulfhydryl-Reste in
der Nähe verfügbar sind. Zur physiologischen Reaktivierung der oxidierten 1-Cys-Prxs
wird
die
Heterodimerisierung
mit
der
Glutathion-S-Transferase π
sowie
eine
anschließende Glutathionylierung des oxidierten Cys47 benötigt. Dabei dient die
Glutathion-S-Transferase π als Überträger des aktivierten Glutathions, das an die
G-Seite des Enzyms gebunden ist und die Bildung von gemischten Disulfiden katalysiert
(Manevich et al., 2004; Manevich und Fisher 2005).
1.2.2
Peroxiredoxin 6
Im Gegensatz zu den anderen Peroxiredoxinen ist Prx 6 ein bifunktionelles Enzym
sowohl mit Peroxidase- als auch Phospholipase A2-Aktivität. Es wurde erstmals 1990
aus dem Ziliarkörper eines Rinderauges isoliert (Shichi und Demar 1990) und wurde als
nicht-Selen-GSH-Peroxidase bezeichnet. Dasselbe Protein wurde kurze Zeit später aus
der Riechschleimhaut (Peshenko et al., 1996), wo es als GSH-Peroxidase beschrieben
wurde, und der Lunge von Ratten isoliert, wo seine Peroxidaseaktivität identifiziert wurde
(Kim et al., 1997). Vor der Festlegung der Nomenklatur wurde Prx 6 neben 1-Cys-Prx
auch antioxidant protein 2 (AOP2) (Phelan et al., 1998), Clara cell protein 26 (CC26)
(Power und Nicholas 1999) und p29 (Leavey et al., 2002) genannt, während das Gen
zusätzlich zu ORF6 (Nagase et al., 1995) als LTW4 (Iakoubova et al., 1997) und
keratinocyte
16
growth
factor
(KGF)-regulated
gene 1
bezeichet
wurde.
Einleitung
Expressionsuntersuchungen von Prx 6 auf mRNA- und Proteinebene zeigen eine breite
Verteilung in allen Organen und Zelltypen (Manevich und Fisher 2005). Die Expression
von Prx 6 ist in der Lunge am höchsten, gefolgt von ebenfalls hohen Konzentrationen im
Gehirn, den Hoden, der Niere und der Leber (Kim et al., 1998; Lee et al., 1999; Fujii et
al., 2001; Mo et al., 2003; Lehtonen et al., 2004). In Organen wird die höchste
Prx 6-Expression im Epithel wie den apikalen Regionen des Epithels der Atemwege und
der Hautepidermis verzeichnet (Novoselov et al., 1999). In der Lunge wird Prx 6 in
relativ hoher Konzentration in Typ II-Alveolarepithelzellen und in bronchiolaren
Clara-Zellen
exprimiert.
Eine
geringere
Expression
wird
hingegen
in
Alveolarmakrophagen und im mikrovaskulären Endothel gefunden (Kim et al., 1998;
Power und Nicholas 1999; Kinnula et al., 2002). Die Prx 6-Expression in Zellen ist
cytoplasmatisch.
Zudem
kommt
das
Protein
ebenfalls
in
Lysosomen
von
Lungenepithelzellen und Alveolarmakrophagen sowie in Lamellarkörpern der Lunge,
dem Surfactant-Speicher und sekretorischen Organell vor (Akiba et al., 1998; Wu et al.,
2006; Sorokina et al., 2009).
Die Sequenz, die das aktive Zentrum der Oxidase-Aktivität von Prx 6 umgibt, ist
PVCTTE und analog zu der umgebenden Sequenz FVCPTE von Prx 1 – 4. Zusätzlich
weist das Protein eine Sequenz an Position 30-34 auf, das als Lipase-Motiv (GXSXG)
bezeichnet
wird.
Dabei
stellt
das
Ser32
das
katalytische
Zentrum
der
Phospholipase A2-Aktivität dar, dass für die Hydrolyse einer Acyl- oder Alkylbindung an
der sn-2-Position von Phospholipiden durch eine saure Ca2+-unabhängige PLA2 (aiPLA2)
essentiell ist (Kim et al., 1997; Derewenda und Sharp 1993). Die katalytische Triade der
aiPLA2-Aktivität wird durch Ser32, His26 und Asp140 gebildet (Chen et al., 2000b;
Manevich et al., 2007). Da Ser32 distanziert vom Cys47 gelegen ist, ist eine Interaktion
der beiden katalytischen Zentren ausgeschlossen (Choi et al., 1998).
Wie andere Peroxiredoxine reduziert Prx 6 H2O2 und andere kurzkettige Hydroperoxide.
Zudem kann es Phospholipidhydroperoxide reduzieren, wobei sich die oxidierten
Phospholipide sowohl in Lösung als auch eingeschlossen in Lysosomen befinden
können (Fisher et al., 1999; Manevich et al., 2009). Diese Fähigkeit von Prx 6,
peroxidierte Membranphospholipide zu reduzieren, teilt es weder mit anderen
Peroxiredoxinen
noch
mit
der
GSH-Peroxidase
(GPx1).
Die
Reduktion
von
Phospholipidperoxiden erfordert die Bindung von Prx 6 an oxidierte Lipidsubstrate
(Manevich et al., 2009). Diese Phospholipidperoxid-Substrate werden von Prx 6 über
eine β-Schleife, die durch die Aminosäurereste His26, Ser32 und Trp33 gebildet wird,
gebunden (Manevich et al., 2007; Manevich et al., 2009). Bisher wird angenommen,
dass die Bindung der Kopfgruppe der Phospholipidperoxide wie Phosphorylcholin an
diese Bindungsstelle der Einführung der peroxidierten sn-2-Fettsäure in die hydrophobe
17
Einleitung
Tasche dient, wodurch die Nähe und die anschließende Interaktion mit Cys47
gewährleistet wird (Fisher 2010). Während Prx 6 sich frei im Cytosol aufhält, wenn keine
oxidierten Phospholipide vorliegen, zeigt es in sauren Organellen wie Lysosomen und
Lamellarkörpern andere funktionelle Eigenschaften. In den Organellen kann das Enzym
nach Bedarf des Phospholipidkatabolismus an nicht-oxidierte Phospholipide binden und
diese hydrolysieren (Manevich et al., 2007; Manevich et al., 2009).
1.2.3
Charakterisierung der Funktion von Prx 6
In Abhängigkeit vom Zelltyp wird die Expression von Prx 6 durch eine Vielzahl von
Stimulatoren reguliert. Die Expression von Prx 6 wird v. a. durch oxidativen Stress
erhöht. Im Stressmodell der Hyperoxie wurde festgestellt, dass die Prx 6-Expression in
Ratten- und Mäuselungen sowie in alveolaren Typ II-Ephitelzellen auf das Doppelte
ansteigt (Kim et al., 2003). Eine Prx 6-Induktion wurde ebenfalls im Lungenepithel und in
Leberzellinien durch H2O2- oder Paraquat-Behandlung nachgewiesen (Kim et al., 2003;
Sparling und Phelan 2003). Während Serumentzug die Transkription von Prx 6
vermindert (Munz et al., 1997; Sparling und Phelan 2003), stellt KGF (keratinocyte
growth factor) einen potenten Induktor der Prx 6-Expression in Leberzellen und
Keratinozyten dar (Frank et al., 1997). Darüber hinaus wird in spezifischen Zellen die
Prx 6-mRNA-Expression durch LEDGF (lens epithelium-derived growth factor) (Fatma et
al., 2001), GDF9 (growth differentiation factor 9) (Leyens et al., 2004) und TNFα (Kubo
et
al.,
2006)
erhöht.
Kürzlich
wurde
nachgewiesen,
dass
der
Anstieg
der
Prx 6-Expression in adulten Lungenzellen durch die Interaktion von Dexamethason mit
GRE (glucocorticoid response element) im Promotor des Prx 6-Gens reguliert wird
(Fisher 2010). Zudem enthält der proximale Promotor des Prx 6-Gens weitere potente
Bindungsstellen, wie zum Beispiel mehrere SP1- und zwei MYC-Bindungsstellen
(Phelan et al., 1998; Lee et al., 1999), sowie eine Konsensussequenz für SRF (serum
response factor), die möglicherweise für die Serum-regulierte Prx 6-Geninduktion
entscheidend
ist
(Gallagher
und
Phelan
2007).
Weitere
Analysen
der
Prx 6-Promotorregion zeigen neben anderen putative Bindungsstellen für SREBP (sterol
response element binding protein), USF (upstream stimulatory factor), NFκB, HSF (heat
shock factor) und c-Jun (Phelan et al., 1998; Lee et al., 1999; Gallagher und Phelan
2007). Außerdem wurde vor kurzem durch Chowdhury und Kollegen in der humanen
Lungenzellline A549 nachgewiesen, dass das ARE (antioxidant response element) im
Prx 6-Promotor ein Schlüsselregulator der basalen Transkription des Prx 6-Gens sowie
der Induzierbarbeit durch oxidativen Stress ist (Chowdhury et al., 2009).
18
Einleitung
Studien zur Auswirkung der Überexpression von Prx 6 zeigten, dass transfizierte
Lungenzellen einen höheren Schutz vor induzierter Peroxidation von Membranlipiden
und Apoptose durch oxidativen Stress aufweisen (Manevich et al., 2002). Damit
übereinstimmend resultiert der adenoviral-vermittelte Transfer von Prx 6 in Mäusen in
einem geringeren Gehalt peroxidierter Membranlipide (Wang et al., 2004b), wohingegen
die Suppression von Prx 6 die Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress erhöht und
den Zelltod fördert (Pak et al., 2002). Ferner bewirkt die transgene Überexpression von
Prx 6 eine Verminderung des intrazellulären H2O2-Gehaltes (Phelan et al., 2003) sowie
eine verstärkte Abwehr gegen Hyperoxie-induzierten Lungenschäden (Fisher et al.,
2005). Im Gegensatz dazu zeigen Prx 6-defiziente Mäuse eine deutlich erhöhte
Empfindlichkeit für toxische Wirkungen durch Hyperoxie und Paraquat (Wang et al.,
2003; Wang et al., 2004a; 2006a). Ebenso weisen Prx 6-defiziente primäre
Lungenepithelzellen
oder
peritoneale
Makrophagen
eine
verstärkte
Sensitivität
gegenüber Oxidantien im Vergleich zu Zellen des Wildtyps auf (Wang et al., 2003; Wang
et al., 2008). Mäuse mit einer Prx 6-Defizenz besitzen zudem eine um 95 % verminderte
Fähigkeit, Peroxide von Phospholipiden zu reduzieren (Wang et al., 2004a). Da die
Auswirkungen des Knockouts sehr gravierend sind, jedoch das Fehlen von Prx 6 die
Genexpression anderer Antioxidantien wie 2-Cys-Prxs, Katalasen, SOD, Glutaredoxinen,
Thioredoxinen und Glutathion-Peroxidasen nicht signifikant im Vergleich zum Wildtyp
beeinflusst (Wang et al., 2003), scheint es, dass andere Gene den Mangel an Prx 6
nicht kompensieren können, weshalb für Prx 6 eine einzigartige zelluläre Funktion
diskutiert wird.
Prx 6 spielt des Weiteren eine entscheidende Rolle beim Lipid-Turnover des Surfactants
(surface active agent) der Lunge. Beim Lungensurfactant handelt es sich um einen
Phospholipid:Proteinkomplex, der von alveolaren Lungenepithelzellen sekretiert wird.
Dieser
dient
der
Abnahme der Oberflächenspannung und erhöht
somit
die
Lungenstabilität während der Atmung (Van Golde et al., 1988). Außerdem wird vermutet,
dass Surfactant eine Rolle bei Abwehrmechanismen des Wirts und bei Immunfunktionen
der Lunge spielt (Tenner et al., 1989; Sherman und Ganz 1992; Yamada et al., 2006).
Dipalmitylphosphatidylcholin (DPPC), das die grundlegende Phospholipidkomponente
des Surfactants darstellt (Wu et al., 2003), wird von Epithelzellen mit Unterstützung
durch Alveolarmakrophagen aktiv recycelt, wobei PLA2s eine entscheidende Rolle
spielen (Jain et al., 2003). Untersuchungen zum Lungenphospholipid-Metabolismus in
Bezug auf die Prx 6-Expression zeigten, dass die Prx 6-Überexpression in Mäusen zu
einem erhöhten DPPC-Metabolismus führt (Fisher et al., 2006), während in
Prx 6 KO-Mäusen sowie in Tieren, die mit einem spezifischen aiPLA2-Inhibitor behandelt
wurden, ein signifikant verringerter DPPC-Abbau vorgefunden wird (Fisher und Dodia
19
Einleitung
2001; Fisher et al., 2005). Die Hemmung der aiPLA2 bzw. der Genkockout von Prx 6
führen zu einer verminderten Fähigkeit von Lungenepithelzellen, während des
Umbauvorgangs der Phospholipide Palmitat in DPPC einzubauen (Fisher und Dodia
1997; 2001). Übereinstimmend damit ist im Lungenparenchym und alveolaren Raum ein
Anstieg des Phospholipidgehalts mit fortschreitendem Alter der Prx 6-defizienten Mäuse
im Vergleich zum Wildtyp zu beobachten (Fisher et al., 2005).
20
Einleitung
1.3
B. pseudomallei als intrazellulärer Modellorganismus
1.3.1
Burkholderia pseudomallei und Melioidose
Burkholderia pseudomallei ist ein Gram-negativer, aerober Bacillus, der aufgrund
bipolarer Flagellen beweglich ist. Bei B. pseudomallei handelt es sich um einen
Nitratreduzierer, der Oxidase-positiv ist und aerob Glukose und Galaktose aber nicht
L-Arabinose spaltet (White 2003). Sein Wirtsspektrum umfasst neben zahlreichen
Tierarten auch den Menschen (White 2003). Demgegenüber besitzt die mit
B. pseudomallei nah verwandte Spezies Burkholderia thailandensis ein L-ArabinoseAssimilationsoperon, weist dasselbe Habitat wie B. pseudomallei auf, wird aber im
Gegensatz zu B. pseudomallei als avirulent beschrieben (Wuthiekanun et al., 1996; Brett
et al., 1997; Smith et al., 1997). Das Genom von B. pseudomallei besteht aus zwei
zirkulären Chromosomen mit einer Gesamtgröße von ca. 7 Mb, von denen das größere
die Gene aufweist, die für den Metabolismus und das Wachstum des Bakteriums
entscheidend sind. Das kleine Chromosom mit einer Größe von 3,17 Mb trägt die Gene,
die für die Virulenz sowie für das Überleben in Wirtszellen funktionell wichtig sind
(Holden et al., 2004). Unter aeroben Bedingungen kann B. pseudomallei bei 37°C
innerhalb von 24 bis 36 Stunden in vitro auf einer Vielzahl von Nährböden angezüchtet
werden (White 2003), wobei vorwiegend gelb-gräuliche Kolonien entstehen, die eine
morphologische Vielfalt aufweisen. In Abhängigkeit von der Inkubationsdauer weisen die
Kolonien zu Beginn eine glatte und muköse Oberfläche auf, die nach andauernder
Inkubation trocken und gerunzelt erscheint (Cheng und Currie 2005; Raja et al., 2005).
B. pseudomallei gilt als einer der widerstandsfähigsten Pathogene, da es extremen
Bedingungen wie sehr niedrigem pH-Wert (Dejsirilert et al., 1991), Dehydratisierung,
großen Temperaturschwankungen (Tong et al., 1996; Chen et al., 2003b) und
langanhaltendem Nährstoffmangel (Wuthiekanun et al., 1995) angepasst ist. Zudem
widersteht es antiseptischen Lösungen und Reinigungsmitteln (Sookpranee et al., 1989;
Gal et al., 2004), wird aber durch UV-Licht abgetötet (Tong et al., 1996).
B. pseudomallei-Infektionen sind als Ursache der Melioidose bekannt, die insbesondere
in
tropischen
und
suptropischen
Regionen
auftritt.
Diese
potentiell
tödliche
Infektionskrankheit wurde erstmals 1911 in Rangoon (Burma, heute Myanmar)
beschrieben. Dort wurde durch Sektionen festgestellt, dass als häufige Todesursache
morphiumabhängiger und mangelernährter Patienten pathologische Veränderungen
verantwortlich sind, die dem Krankheitsbild des Pferderotzes ähnlich sind (Whitmore und
Krishnaswami 1912; Whitmore 1913). Das isolierte Bakterium wurde in Anlehnung an
Burkholderia mallei, dem Erreger des Rotzes, Bacillus pseudomallei genannt. Der
Terminus Melioidose wurde 1921 durch Stanton und Fletcher für die von ihnen
beschriebene Infektionskrankheit geprägt, der bis heute Anwendung findet (Stanton und
21
Einleitung
Fletcher 1921). Nach mehrmaligen Neueinordnungen in taxonomisch unterschiedliche
Gattungen erfolgte 1992 die Umbenennung des zuvor als Pseudomonas pseudomallei
bezeichneten Pathogens in Burkholderia pseudomallei (Yabuuchi et al., 1992).
Gebiete, in denen Melioidose endemisch ist, liegen vor allem zwischen dem 20.
nördlichen und 20. südlichen Breitengrad (Dance 1991). Besonders häufig werden
Krankheitsfälle von Melioidose in Nordaustralien sowie südostasiatischen Ländern wie
Thailand, Vietnam, Malaysia, Myanmar und Laos verzeichnet (Cheng und Currie 2005).
Seltener treten Krankheitsfälle in China, Indien, Taiwan und Indonesien sowie Afrika und
Amerika auf (Dance 1991; Bharadwaj et al., 1995; Beeker et al., 1999; Yang 2000; Ben
et al., 2004; Miralles et al., 2004). In Ubon Ratchathani (Thailand) sind B. pseudomalleiInfektionen für ca. 20 % der ambulant erworbenen Bakteriämien verantwortlich
(Chaowagul et al., 1989). Weiterhin stellt dieses saphrophytische Pathogen im Royal
Darwin-Krankenhaus in Australien die Hauptursache tödlich-verlaufender ambulanterworbener bakteriämischer Pneumonien dar (Currie et al., 2000; Douglas et al., 2004).
Der Erreger kann leicht aus seinen ökologischen Nischen isoliert werden, bei denen es
sich vorwiegend um Reis- und Pflanzenplantagen, Oberflächenwasser, stehende
Gewässer und feuchte Erde handelt, die als primäre Infektionsquellen angesehen
werden (Ellison et al., 1969; Leelarasamee und Bovornkitti 1989). In den meisten Fällen
erfolgt eine Infektion perkutan über kleine Hautläsionen durch kontaminierte Böden oder
Wasser (Chaowagul et al., 1989; Leelarasamee und Bovornkitti 1989). Weitere
potentielle Infektionswege sind die Inhalation und Aspiration (Howe et al., 1971; Sanford
1990) sowie die orale Aufnahme (Chaowagul et al., 1989). Im Gegensatz dazu sind
Übertragungen der
Krankheit
zwischen
Tieren
und
Menschen
nicht
bekannt
(Leelarasamee und Bovornkitti 1989; Dance 1990; Kunakorn et al., 1991).
Als opportunistisches Pathogen ruft B. pseudomallei Manifestationen der Melioidose
hervor, die in akute, subakute und chronische Erkrankungsformen unterteilt werden
(Howe et al., 1971). Die Inkubationszeit beträgt in der Regel 1 bis 21 Tage, jedoch kann
Melioidose auch verzögert nach einer asymptomatischen Latenzphase auftreten, die
Wochen, Monate oder auch Jahre umfassen kann (Mays und Ricketts 1975;
Leelarasamee und Bovornkitti 1989). Die akute Form dieser Krankheit kann in zwei
weitere Subgruppen unterteilt werden: In die akute pulmonale und die akute
septikämische Form. Die Symptome der akuten pulmonalen Form treten schnell in
Erscheinung und sind durch hohes Fieber und Atemnot charakterisiert. Ohne Therapie
kommt es zur Bildung viszeraler Abszesse und im Verlauf weniger Tage zum Tod. Die
septikämische Form entsteht ebenfalls sehr schnell und zeichnet sich, wenn sie
unbehandelt bleibt, durch hohe Sterblichkeitsraten aus. Klinische Symptome sind unter
anderem Unwohlsein, Zellgewebsentzündungen und Meningitis sowie kutane und
22
Einleitung
subkutane Läsionen (Dance 1990; Sanford 1990). Die subakute Melioidose ist eine
anhaltende Fiebererkrankung, bei der die Bildung zahlreicher Abszesse der inneren
Organe beobachtet wird, aber selten Abszesse im Gehirn entstehen. In der Spätphase
der Krankheit kann das Pathogen sowohl aus Blut, Eiter und Urin als auch aus anderen
Körpergeweben und -sekreten kultiviert werden (Smith et al., 1987; Leelarasamee und
Bovornkitti 1989). Ohne klinische Behandlung führt diese Form der Melioidose in vielen
Fällen innerhalb von Wochen oder Monaten zum Tod. Im Gegensatz zur akuten oder
subakuten Form bleibt die chronische Erkrankung, die am häufigsten auftretende Form
der Melioidose, bis zu einem traumatischen Ereignis oder einer Obduktion der Gewebe
meistens undiagnostiziert (Weinberg und Heller 1997). Das durch B. pseudomalleiInfektion am häufigsten betroffene Organ ist die Lunge. Eine Pneumonie wird bei 50 %
der an Melioidose-erkrankten Patienten festgestellt (Cheng und Currie 2005).
Grundlegend ist B. pseudomallei als fakultativ intrazelluläres Bakterium fähig, in
verschiedenen Körperzellen wie zum Beispiel Makrophagen und Epithelzellen zu
überleben und sich dort zu vermehren (Jones et al., 1996). Zudem ist eine Absiedlung
von B. pseudomallei nach systemischer Ausbreitung in jedes Körperorgan möglich,
wobei B. pseudomallei die Bildung von Abszessen vornehmlich in der Leber, Milz, Niere,
der Skelettmuskulatur und der Prostata bewirkt (White 2003). Der Ausbruch der
Erkrankung hängt generell nicht nur von der Menge inokulierter Pathogene ab, sondern
auch vom Grad der Virulenz des eingedrungenen B. pseudomallei-Stammes (White
2003). Gründe für eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber B. pseudomallei-Infektion
sind verschiedene Risikofaktoren. Dazu zählt vor allem Diabetes mellitus (Chaowagul et
al., 1989), aber auch Lungen- und Niereninsuffizienz und cystische Fibrose sowie
physiologische
Veränderungen
durch
Alkohol-
und
Rauschgiftmissbrauch
(Suputtamongkol et al., 1999; Cheng und Currie 2005). Eine entscheidende Rolle spielt
zudem der Immunstatus einer Person. Eine beeinträchtigte zelluläre Immunität,
Leukämie, Lymphome oder HIV-Infektionen scheinen die Wahrscheinlichkeit, an
Melioidose zu erkranken, zu erhöhen (Brett und Woods 2000). Die Therapie Melioidoseerkrankter Patienten wird dadurch erschwert, dass klinische Isolate von B. pseudomallei
eine Resistenz gegenüber einer Vielzahl von antimikrobiellen Substanzen aufweisen.
Dazu zählen Cephalosporine, Penicilline, Rifampicine und Aminoglykoside. Weiter zeigt
B. pseudomallei eine relative Resistenz gegenüber Quinolonen und Makrolaktonen
(Cheng und Currie 2005; Holden et al., 2004; Livermore et al., 1987; Cheung et al.,
2002). Ceftazidim, die Carbapenem-Antibiotika Imipenem und Meropenem und zu einem
geringeren Anteil auch Amoxicillin-Clavulanat bilden die Grundlage der 10- bis
14-tägigen Anfangstherapie (Jenney et al., 2001; Cheng und Currie 2005). An die akute
intensive Therapiephase schließt sich eine zweite mehrwöchige Phase mit Trimethoprin
23
Einleitung
und
Sulfamethoxazol
an,
um
Rezidivfälle
zu
vermeiden.
Trotz
der
langen
Erhaltungstherapie beträgt die Rezidivrate bis zu 10 % (White 2003).
1.3.2
Virulenzfaktoren von Burkholderia pseudomallei
In den letzten Jahren wurden zahlreiche putative Virulenzfaktoren beschrieben, die in
die Pathogenese von B. pseudomallei involviert sind. Spezifische Funktionen der
bakteriellen Kapsel, des Lipopolysaccharids, des Typ III-Sekretionssystems 3 (T3SS3)
und T6SS, der Flagellen sowie verschiedender quorum-sensing-Moleküle konnten
bereits nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu scheinen andere Faktoren wie Pili,
regulatorische
Gene
und
sekretierte
Faktoren,
darunter
Proteasen,
Lipasen,
Lecithinasen, Hämolysine und Siderophore (Ashdown und Koehler 1990) eine moderate
bzw. geringe Rolle für die Pathogenese zu spielen (Adler et al., 2009). B. pseudomallei
kann
extrazelluläre
Kapselpolysaccharide
synthetisieren
(Smith
et
al.,
1987;
Leelarasamee und Bovornkitti 1989; Steinmetz et al., 1995), die z. B. die Bindung des
Komplementfaktors C3b an das Pathogen verhindern und dadurch die Opsonierung
sowie die Aufnahme und Eliminierung durch phagozytierende Zellen unterbinden
(Reckseidler-Zenteno et al., 2005). Des Weiteren bewirken Exopolysaccharide eine
herabgesetzte Antibiotikapenetration in das Bakterium (Haussler et al., 1998) und
scheinen das Pathogen vor bakteriziden Wirkungen im phagolysosomalen Milieu zu
schützen (Smith et al., 1987; Pruksachartvuthi et al., 1990). B. pseudomallei exprimiert
wie alle Gram-negativen bakteriellen Pathogene Lipopolysachcharid (Anuntagool et al.,
2000; Anuntagool et al., 2006), das eine schwächere pyrogene Aktivität in Nagetieren
als enterobakterielles LPS, aber eine stärkere mitogene Aktivität in murinen Splenozyten
besitzt (Matsuura et al., 1996). In vitro-Experimente belegen eine durch B. pseudomalleiLPS-verzögerte Aktivierung von murinen Makropagen gegenüber LPS von E. coli
(Utaisincharoen et al., 2000), was in Zusammenhang mit der langen Fettsäurekette vom
B. pseudomallei-LPS steht (Matsuura et al., 1996), da längere Fettsäureketten zu einer
verminderten Interaktion von LPS mit CD14 auf der Oberfläche von Makrophagen führen
(Utaisincharoen et al., 2000). Die Adhärenz an Wirtszellen ist ein entscheidender
Virulenzmechanismus, der durch Kohlenhydratmoleküle, Pilus- und nicht-Pilus-Adhäsine,
vermittelt wird. Typ IV-Pili sind bei einer Vielzahl von Gram-negativen Bakterien wichtig.
Die Infektion mit einer Mutante, in der pilA, ein putatives Pilus-Strukturprotein von
B. pseudomallei
(Essex-Lopresti
et
al.,
2005),
entfernt
wurde,
bewirkt
eine
herabgesetzte Adhärenz an humane Epithelzellen und zeigt eine geringere Virulenz im
murinen Modell der Melioidose (Essex-Lopresti et al., 2005). Des Weiteren werden die
24
Einleitung
B. pseudomallei-Flagellen, die an der Invasion und Motilität in der Wirtszelle beteiligt
sind, als putative Virulenzfaktoren angesehen (DeShazer et al., 1997; Chua et al., 2003).
Als fakultativ intrazelluläres Pathogen ist B. pseudomallei in der Lage, sowohl in
phagozytierende als auch nicht-phagozytierende Zellen aktiv einzudringen und sich in
den Zellen zu replizieren (Pruksachartvuthi et al., 1990; Jones et al., 1996). Obwohl die
genauen Mechanismen der Invasion noch weitgehend unbekannt sind, wurde bereits
gezeigt, dass die Hemmung der Aktinpolymerisierung die Invasionsrate vermindert
(Jones et al., 1996). Die Wiederherstellung des Aktinskeletts der Wirtszelle kann durch
das Effektorprotein BopE des Burkolderia-Sekretionsapparates (Bsa) T3SS3 beeinflusst
werden (Stevens et al., 2003). bopE-Mutanten zeigen in Epithelzellen eine verminderte
Invasion im Vergleich zum Wildtyp. Eine größere Beeinträchtigung der Invasion bewirkt
die
Mutation
von
bipD,
weshalb
angenommen
wird,
dass
mehrere T3SS3-
Effektorproteine an der Invasion beteiligt sind (Stevens et al., 2003).
Nach der zellulären Aufnahme befindet sich B. pseudomallei vorerst in Endosomen und
später im Cytoplasma, in dem es sich replizieren kann (Harley et al., 1994;
Kespichayawattana et al., 2000). Mutationen des T3SS3 bewirken einen Defekt des
endosomalen Austritts, was zu einer Verminderung der Aktinschweifbildung, des
intrazellulären Überlebens, der Cytotoxizität und der intrazellulären Ausbreitung führt
(Stevens et al., 2002; Stevens et al., 2004; Sun et al., 2005; Suparak et al., 2005).
B. pseudomallei ist aufgrund Aktin-vermittelter Fortbewegung durch Bildung von
Membranausstülpungen
zur
Ausbreitung
in
benachtbare
Zellen
fähig
(Kespichayawattana et al., 2000; Breitbach et al., 2003). Das autosekretierte Protein
BimA interagiert mit Aktinmonomeren, wodurch es zur Umlagerung der Monomere an
einem der Pole des Bakteriums, gefolgt von der Aktinschweifbildung kommt (Stevens et
al., 2005). Das Protein BipB erlaubt B. pseudomallei, von einer Zelle direkt zur nächsten
(cell-to-cell spreading) zu gelangen, indem es die Phagozytose der Pathogenenthaltenden Membranausstülpungen durch die Nachbarzelle fördert. Weiterhin ist es an
der Bildung von multinukleären Riesenzellen (multinuclear giant cells, MNGC) und der
Apoptose von infizierten Wirtszellen beteiligt (Suparak et al., 2005). Infolge der
intrazellulären Motilität von B. pseudomallei wird die Wirtszellfusion initiiert, die zur
Entstehung von MNGC führt (Kespichayawattana et al., 2000). Es scheint, dass dieser
Phänotyp durch den RNA-Polymerase σ-Faktor RpoS reguliert wird (Utaisincharoen et
al., 2006). Für infizierte Zellen, in denen eine ausreichende bakterielle Replikation erfolgt
ist, scheint die B. pseudomallei-stimulierte Bildung der MNGC für die intrazelluläre
Ausbreitung und den weiteren Verlauf der Infektion entscheidend zu sein (Adler et al.,
2009). Durch die Bildung von MNGC und die direkte Zell-zu-Zell-Verbreitung umgeht
B. pseudomallei den extrazellulären Raum und verhindert seine Eliminierung durch
25
Einleitung
Opsonierung oder andere antimikrobielle Abwehrmechanismen des Wirtes. Die
genannten molekularen und zellulären Mechanismen der Pathogenese der Melioidose
sind in Abbildung 3 dargestellt.
Abbildung 3: Schema zur molekularen und zellulären Grundlage der Pathogenese der Melioidose.
Burkholderia pseudomallei kann sich durch bakterielle Komponenten wie die Kapsel oder Typ IV-Pili an
Epithelzellen der Lunge oder der Haut anlagern. Bei der Invasion der Epithelzellen fördern die T3SS3Effektorproteine den Austritt des Bakteriums aus dem Endosom und eine BimA-vermittelte
Aktinpolymerisierung die intrazelluläre Motilität. T3SS3 spielt außerdem eine Rolle bei der Umgehung der
bakteriellen Eliminierung durch Autophagozytose. Die durch B. pseudomallei-LPS und Flagellen aktivierten
TLR2 und TLR4 rekrutieren Zellen der angeborenen Immuniät wie Neutrophile, Makrophagen und NK-Zellen,
die proinflammatorische Cytokine freisetzen, was mit einer erhöhten Wirtszellschädigung assoziiert ist, wie
es bei der akuten Melioidose auftritt. Erreicht die bakterielle Replikation in Makrophagen eine kritische
s
Grenze, die durch regulatorische Faktoren wie quorum-sensing-Moleküle und RpoS (σ ) festgelegt wird,
treten die Bakterien durch Induktion der Apoptose aus der Zelle aus. Eine zweite Ausbreitung kann über das
Lymphsystem, das B. pseudomallei wahrscheinlich innerhalb von Makrophagen passiert oder aber über
Kapillargefäße erfolgen, wobei die bakterielle Serumresistenz durch LPS und die bakterielle Kapsel
vermittelt wird. Während des Fortschreitens der B. pseudomallei-Infektion aktiviert der Wirt die adaptive
Immunantwort, wobei T-Zellen in Antwort auf die Freisetzung von IFNγ rekrutiert werden und es zur zellulärvermittelten Immunantwort und zu, durch B-Zellen gebildeten, Antikörpern kommt. Verändert nach (Adler et
al., 2009).
„Quorum
sensing“
Produktion,
ist
Freisetzung
Homoserinlakton
(AHL)
ein
Zelldichte-abhängiges
von
Kommunikationssystem
und
Detektion
Signalmolekülen
oder
N-Dekanoyl-Homoserinlakton
wie
(DHL),
durch
N-Acyl-
das
von
Gram-negativen Bakterien genutzt wird (Lazdunski et al., 2004; Ulrich et al., 2004).
Mutationen der Gene, die die Proteine für die Biosynthese von AHL oder deren
26
Einleitung
transkriptionelle Regulatoren codieren, bewirken eine signifikant höhere mittlere letale
Dosis und führen zu einem Anstieg der Überlebensdauer und einer verminderten
Organkolonisierung in verschiedenen Tiermodellen (Ulrich et al., 2004). Darüber hinaus
ist die Synthese von DHL, das in die Regulation einer Metalloprotease involviert ist, für
die vollständige Virulenz im Mausmodell essentiell (Valade 2004). Andere quorumsensing-kontrollierte Virulenzfaktoren wie Siderophore und Phospholipase C sowie die
Biofilmbildung
sind
von
einer
DHL-abhängigen
Multidrug-Efflux-Pumpe
von
B. pseudomallei, die ebenfalls für die Resistenz gegenüber Aminoglycosiden und
Makrolaktonen verantwortlich ist, abhängig (Chan und Chua 2005). Darüber hinaus ist
B. pseudomallei
resistent
gegenüber
dem
Komplement-aktivierten
Membran-
Angriffskomplex, lysosomalen Defensinen sowie kationischen Peptiden und bildet als
Antwort auf antibakterielle Produkte wie ROS Katalasen, SOD und Peroxidasen (Egan
und Gordon 1996; Woods et al., 1999; Gan 2005).
1.3.3
Burkholderia pseudomallei und die angeborene Immunabwehr
Wie bereits zuvor genannt, ist B. pseudomallei fähig, in professionellen Phagozyten,
darunter auch Monozyten und Makrophagen, zu überleben und sich zu replizieren
(Jones et al., 1996; Harley et al., 1998). Bisher ist nur wenig über die genaue
Lokalisation von B. pseudomallei im Rahmen von latenten Infektionen nach der ersten
Wirt-Pathogen-Interaktion sowie über die bakteriziden Mechanismen von Makrophagen
bekannt. Infektionen mit B. pseudomallei können unterschiedliche Verlaufsformen der
Melioidose hervorrufen, von denen angenommen wird, dass sie von der Immunantwort
des Wirtes bestimmt werden (Gan 2005). Bei Infektionen bilden die Signalmechanismen
der angeborenen Immunität die vorderste Front der Wirtsabwehr. Im murinen
Infektionsmodell von B. pseudomallei weisen Gewebe einen schnellen Eintritt von
neutrophilen Granulozyten und deren Aktivierung auf (Barnes et al., 2001). Werden
neutrophile Granulozyten entfernt, kommt es durch B. pseudomallei zur Ausbildung der
akuten Form der Melioidose in C57BL/6-Mäusen (Easton et al., 2007), was die
Notwendigkeit von Neutrophilen in der angeborenen Immunität widerspiegelt. Ebenfalls
essentiell für die Kontrolle einer B. pseudomallei-Infektion sind Makrophagen. Die
Depletion von Makrophagen in BALB/c- und C57BL/6-Mäusen bewirkt eine erhöhte
Mortalitätsrate (Breitbach et al., 2006; Barnes et al., 2008). Im Gegensatz zu Gesunden
wird in Makrophagen von Melioidose-Patienten eine verminderte Anzahl an lysosomalen
Fusionen festgestellt, wodurch es zu deutlich erhöhten intrazellulären Bakterienanzahlen
kommt (Puthucheary und Nathan 2006).
27
Einleitung
Bei der Erkennung von Pathogenen durch Immunzellen erfolgt die Aktivierung
verschiedener TLRs durch konservierte PAMPs, die die Translokation von NFκB und die
Induktion der proinflammatorischen Antwort vermitteln (Akira et al., 2001). Während
TLR4 in Assoziation mit CD14 und MD-2 die Lipid A-Komponente von LPS erkennt, wird
TLR2 zusammen mit TLR1 oder TLR6 durch bakterielle Lipopeptide und Peptidoglykane
der Zellwand aktiviert (Hajjar et al., 2005; Hawn et al., 2005; Hawn et al., 2006; Skerrett
et al., 2007). Als Gram-negatives Bakterium kann B. pseudomallei TLR2 und TLR4
aktivieren (Akira et al., 2001). Die Arbeitsgruppe um Wiersinga stellte fest, dass
Melioidose-Patienten, die einen septischen Schock erleiden, erhöhte Expressionen von
TLR1, TLR2 und TLR4 sowie CD14 aufweisen (Wiersinga et al., 2007). Die Mortalität
von TLR4 KO-Mäusen nach Infektion mit B. pseudomallei ist vergleichbar mit der des
Wildtyps. Demgegenüber zeigt sich eine geringere Mortalität bei TLR2- und
CD14-defizienten Tieren. Ebenso führt das Fehlen von TLR2 oder CD14 zu einer
geringeren Keimlast sowie zu einer eingeschränkten Entzündungsreaktion (Wiersinga et
al., 2007; Wiersinga et al., 2008). Als Folge der verminderten Rekrutierung und
Aktivierung von Neutrophilen, resultiert der Gendefekt des Adapterproteins MyD88 in
einer erhöhten Empfindlichkeit der Mäuse gegenüber B. pseudomallei-Infektionen
(Wiersinga et al., 2008).
Im Vergleich zu Infektionen mit E. coli oder S. enterica Serotyp Typhi bewirkt die
Exposition von Makrophagen mit B. pseudomallei eine geringere und zeitverzögerte
Expression von iNOS und TNFα (Utaisincharoen et al., 2000; Utaisincharoen et al.,
2001). Demgegenüber schlagen die regulatorischen Mechanismen während der akuten
Form der Melioidose fehl, wodurch ein exzessiver Entzündungprozess gefördert wird
(Gan
2005).
So
bilden
Patienten
mit
einer
akuten
Melioidose
verstärkt
proinflammatorische Cytokine wie IL-6, IL-12, IL-15, IL-18, TNFα und IFNγ (Wiersinga et
al., 2007). Im murinen Melioidose-Modell korreliert eine vermehrte Expression
inflammatorischer Cytokine eher mit einer erhöhten bakteriellen Last als mit der Höhe
der Virulenz eines Burkholderia-Stammes (Ulett et al., 2002). Im gleichen Modell wird die
essentielle Rolle von IFNγ für die angeborene Immunantwort gegen B. pseudomallei
deutlich. Das Pathogen stimuliert die Expression und Freisetzung von IFNγ,
infolgedessen es zur Aktivierung von T-Zellen und natürlichen Killerzellen (NK-Zellen)
kommt, die die zellvermittelte Immunantwort weiterleiten (Lauw et al., 2000). Bei
C57BL/6-Mäusen, die mit IFNγ-Antikörpern behandelt wurden, resultiert eine Infektion
mit subletalen Dosen aufgrund erhöhter intrazellulärer Keimzahlen in der Entstehung
einer akuten Melioidose (Breitbach et al., 2006; Easton et al., 2007). IFNγ-defiziente
Mäuse sind extrem empfindlich gegenüber B. pseudomallei-Infektionen, während Mäuse
mit einer Deletion von Lymphozyten eine mittlere Resistenz besitzen, wodurch die
28
Einleitung
Wichtigkeit der IFNγ-Produktion durch NK-Zellen deutlich wird (Easton et al., 2007). Im
Gegensatz zu IFNγ wird TNFα überwiegend von Makrophagen, aber auch von T-Zellen,
B-Zellen und Fibroblasten gebildet. Hohe systemische TNFα-Konzentrationen werden
generell beim septischen Schock festgestellt. Wie die Konzentrationen von IL-6 oder
IL-8 ist auch die systemische Konzentration von TNFα bei Melioidose mit hoher
Mortalität assoziiert. Des Weiteren ist TNFα für die Eingrenzung einer Infektion
notwendig. Die Neutralisierung von TNFα führt zu einer gesteigerten Anfälligkeit für
B. pseudomallei-Infektionen, wenn auch nicht im gleichen Maße wie die von IFNγ
(Santanirand et al., 1999). B. pseudomallei-infizierte TNFα- und TNF-Rezeptordefiziente Mäuse zeigen eine erhöhte Empfindlichkeit im Vergleich zum Wildtyp sowie
einen erhöhten auf neutrophilen Granulozyten-basierenden inflammatorischen Einstrom
und eine damit verbundene gesteigerte Nekrose (Barnes et al., 2008). Des Weiteren
erfüllen Makrophagen essentielle Funktionen in der Frühphase einer B. pseudomalleiInfektion von Mäusen (Breitbach et al., 2006). Neben unterschiedlichen bakteriellen
Virulenzfaktoren scheinen Wirtsfaktoren einen entscheidenden Einfluss auf den Verlauf
der
Erkrankung
zu besitzen.
Unterschiede in
der
Empfindlichkeit
gegenüber
B. pseudomallei-Infektionen wurden mehrfach bei BALB/c- und C57BL/6-Mäusen
beschrieben (Leakey et al., 1998; Hoppe et al., 1999; Liu et al., 2002). Innerhalb eines
Tages nach B. pseudomallei-Infektion können resistentere C57BL/6-Mäuse bakterielles
Wachstum in vielen Organen effizienter eingrenzen als empfindliche BALB/c-Mäuse
(Hoppe et al., 1999). Zudem zeigt der Vergleich der anti-B. pseudomallei-Aktivität von
Knochenmarkmakrophagen von C57BL/6- und BALB/c-Mäusen eine erhöhte bakterizide
Aktivität von C57BL/6-Makrophagen, insbesondere wenn diese zuvor mit IFNγ-aktiviert
wurden (Breitbach et al., 2006), weshalb vermutet wird, dass Effektormechanismen der
angeborenen Immunität für die Resistenz gegenüber B. pseudomallei-Infektionen
entscheidend sind. Aufgrund der hohen Virulenz von B. pseudomallei im Mausmodell
und der Verfügbarkeit verschiedener Mausmodelle sowie des Organtropismus für die
Leber und Milz in der Maus, der dem des Menschen sehr ähnlich ist, wird
B. pseudomallei
zur
Bearbeitung
immunologischer
Fragestellungen
als
Modellorganismus Gram-negativer Bakterien mit cytosolischer Lokalisation verwendet.
29
Einleitung
1.4
Zielsetzung
Peroxiredoxine (Prx 1 – 6) sind ubiquitär exprimierte Thiol-abhängige Peroxidreduktasen,
die
neben
anderen
Antioxidatien
einen
wichtigen
Bestandteil
des
zellulären
Abwehrsystems darstellen. Sie dienen dem Schutz von Zellen vor oxidativen Schäden
durch reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies und sind an grundlegenden zellulären
Prozessen wie der Regulation der Proliferation, Signaltransduktion und Apoptose
beteiligt.
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Genexpression von Prxs in murinen
Knochenmarkmakrophagen nach Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS) in Verbindung
mit dem proinflammatorischen Cytokin Interferon γ (IFNγ) sowie nach Behandlung mit
konventionellen oder Cyclopentenon-Prostaglandinen. Von besonderem Interesse war
hierbei, welche Signaltransduktionskaskaden an der Regulation der Genexpression von
Prxs, insbesondere von Prx 6, beteiligt sind. Mit Hilfe verschiedener Knockout-Mäuse
sowie
pharmakologischer
Inhibitoren
sollte
eine
mögliche
Involvierung
proinflammatorischer Cytokine, der induzierbaren NO-Synthase, NADPH-Oxidase und
Cyclooxygenase-Enzyme, sowie diverser Proteinkinasen und der Transkriptionsfaktoren
NFκB, CREB, PPARγ und Nrf2 analysiert werden.
Um die mögliche Beteiligung von Prxs an der zellulären Abwehr von bakteriellen
Infektionen und Entzündungsprozessen näher zu charakterisieren, sollten zudem
Infektionen mit primären Makrophagen durchgeführt werden, wobei Burkholderia
pseudomallei als Modellorganismus Gram-negativer, intrazellulärer Pathogene dienen
sollte. Neben der Analyse der molekularen Mechanismen, die die Transkription von Prxs
nach bakterieller Infektion vermitteln, sollte untersucht werden, ob Infektionen mit
verschiedenen Burkholderia-Spezies, virulenten B. pseudomallei- und avirulenten
B. thailandensis-Stämmen, die Genexpression von Prxs sowie die Expression
proinflammatorischer Mediatoren unterschiedlich beeinflussen.
30
Material und Methoden
2
Material und Methoden
2.1.
Material
2.1.1
Geräte
Analysenwaage AC210S Analytic
Sartorius mechatronics
CO2-Inkubator CB150
Binder Labortechnik
CO2-Inkubator US Autoflow
Nuaire
Einkanalpipetten
Brand
Einkanalpipetten, Proline mechanisch
Biohit
Filmkassetten
Kodak
Fluoreszenzmikroskop BZ-9000
Keyence
Inverses Mikroskop (Televal 3)
Carl-Zeiss-Jena
Inverses Mikroskop Axiovert 40CFL
Carl-Zeiss-Jena
LightCycler® 480 Instrument
Roche
Magnetrührer Variomag®
Thermo Scientific
Mehrkanalpipetten 8/12-fach
Brand
Mikrobiologischer Brutschrank B6420
Heraeus Holding GmbH
Mikroplatten-Photometer Multiskan®EX
Thermo Scientific
Mikroplattenschüttler Monomixer MM-1
Sarstedt
Netzgerät Unipack 250 Power Supply
Uniequip GmbH
Neubauer Zählkammer
Labor Optik
PCR-Mastercycler personal
Eppendorf Deutschland
pH-Meter Ultra Basic 5
Denver Instrument
Pipettierhilfen
Brand
Pipetus®
Hirschmann® Laborgeräte
Präparierbesteck: Fell-/Knochenschere, Pinzette
Schnorrenberg
Chirurgiemechanik GmbH
Präzisionswaage PT1200
Sartorius mechatronics
Proteinelektrophoresekammer Minigel Twin
Biometra
Semi-Dry Blotter
Armin Baack Labortechnik
Semi-Dry Elektroblotter PantherTM
Thermo Scientific (Owl)
Sicherheitswerkbank
Nunc InterMed; Biohit
®
Sicherheitswerkbank HERAsafe HS 12 und HS 12/2
Kendro Laboratory Products
Sicherheitswerkbank HERAsafe® KS 18
Thermo Scientific
Spektralphotometer GeneQuant
Pharmacia Biotech
Taumelschüttler Polymax 1040
Heidolph Instruments
31
Material und Methoden
Thermomixer compact 5432
Eppendorf Deutschland
Tischzentrifuge 5415R, 5417R und 5402
Eppendorf Deutschland
UV/VIS-Biophotometer
Eppendorf Deutschland
UV/VIS-Spektralphotometer Genesys 10
Thermo Scientific
UV-Lampe
Vilber Lourmat
Vakuumzentrifugen Univapo 150 H
Uniequip
Vortexer
VWR International
Wippschüttler SM
Sarstedt
Zentrifuge Multifuge 1L-R
Heraeus Holding GmbH
Zentrifuge MR1822 und GR422
Jouan
2.1.2
Hilfsmittel und Verbrauchsmaterialien
(Einmal-)Küvetten aus Polystyrol 1,5 ml
Roth®
(Einmal-)Küvetten aus Polystyrol 2 ml
Brand
6-, 12-, 24- und 48-Well-Platten
Greiner bio-one
Abstrichtupfer, steril
Unomedical
Deckgläser Ø13 mm
R. Langenbrinck
FACS Röhrchen
BD Biosciences
Filterpapier Whatman
Schleicher & Schuell
Filterspitzen, steril, RNAse-frei
Bio-Rad, Peqlab
Impfösen
Nerbe plus
Kanülen Nr. 20 27G x 3/4
Dispomed®
LightCycler® 480 Multiwell Plate 96, white
Roche
Nitrocellulose-Membran Protan®
Schleicher & Schuell
Objektträger
R. Langenbrinck
Petrischalen
Sarstedt
Pipettenspitzen
Sarstedt
Reaktionsgefäße (0,5 ml)
Eppendorf Deutschland
Reaktionsgefäße (1,5 ml, 2,0 ml)
Sarstedt
Röhrchen (15 ml, 50 ml)
Sarstedt, BD Biosciences
Röntgenfilme
Cea® (Deutschland) GmbH
Serologische Pipetten 5 ml, 10 ml
Sarstedt
Skalpellklingen mit Griff
Dahlhausen®
Spritzen 5 ml
BD Medical
UV-Küvetten UVette®
Eppendorf Deutschland
Zellkulturflaschen 75 cm²
Greiner bio-one
32
Material und Methoden
Zellschaber
2.1.3
TPP
Chemikalien
1-Brom-2-Chlorpropan
Sigma-Aldrich®
3-[(3-Cholamido-propyl)-dimethylammonio]propansulfonat (Chaps)
Roth®
Adenosintriphosphat (ATP)
Roth®
Ammoniumpersulfat (APS)
Roth®
Bromphenolblau
Feinchemie, K.-H. Kallies KG
BSA (100x Stammlösung)
New England Biolabs
BSA (Fraktion V)
Roth®
Coomassie brilliant blue G250
Fluka Chemie AG
Cytidintriphosphat (CTP)
Roth®
Diethylpyrocarbonat (DEPC)
Roth®
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Sigma-Aldrich®
Dinatriumhydrogenphosphat
Roth®
Dithiothreitol (DTT)
Roth®
Ethanol (Prima Sprit)
Uniapotheke Greifswald
Glycerol
Sigma-Aldrich®
Glycin
Roth®
Guanidinhydrochlorid
Stratagene®
Guanosintriphosphat (GTP)
Roth®
Harnstoff
Sigma-Aldrich®
Kaliumchlorid
Roth®
Kaliumdihydrogenphosphat
Roth®
Kanamycin
Sigma-Aldrich®
Lennox L
Broth Base®
Methanol
Roth®
N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED)
Roth®
Natriumazid
Merck
Natriumchlorid
Roth®
Natriumdodecylsulfat (SDS)
Roth®
Natriumhydroxid
Chemapol, Lachema
Phosphorsäure 85 %ig
Roth®
Ponceau S
Serva Electrophoresis
Salzsäure
Merk
33
Material und Methoden
Saponin
Sigma-Aldrich®
Tergitol
Fluka Chemie AG
Thioharnstoff
Merk
Trichloressigsäure
Roth®
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris)
Roth®
Tymidintriphosphat (TTP)
Roth®
Vergällter Ethanol
Uniapotheke Greifswald
2.1.4
Fertiglösungen und Kits
BD™ Cytometric Bead Array Mouse Inflammation Kit
BD Biosciences
Fluoprep
Biomérieux
Griess Reagent (modified)
Sigma-Aldrich®
LightCycler® 480 Probes Master
Roche
LumiGLO
TM
Reagent (20x) und Peroxide (20x)
Cell Signaling Technology®
M-MLV RT-Puffer (5x)
Promega
PageRuler, vorgefärbter Proteinmarker
Fermentas Life Sciences
Prostaglandin E2 Parameter Assay Kit
R&D Systems®
Röntgenfilmentwickler,- fixierer
Agfa
Roti®-Block (10x)
Roth®
Roti®-Blot K (10x)
Roth®
Rotiphorese® Gel 30
Roth®
TRIzol ReagentTM
InvitrogenTM
Tween®20
Sigma-Aldrich®
2.1.5
Enzyme
Reverse Transkriptase (M-MLV-RTase)
Promega
RNasin®
Promega
2.1.6
Aktivatoren, Stimulatoren und Inhibitoren
Falls nicht anders angegeben sind die Aktivatoren, Stimulatoren oder Inhibitoren in
DMSO gelöst.
15-Deoxy-12,14-PGJ2 in Methylacetat
Enzo® Life Sciences
8-pCPT-2‘-O-Me-cAMP in A. bidest
BioLog
34
Material und Methoden
AACOCF3
Enzo® Life Sciences
AG490
Enzo® Life Sciences
Aminoguanidin in A. bidest
Enzo® Life Sciences
BAY117082
Enzo® Life Sciences
CAPE
Enzo® Life Sciences
Ciglitazon
Enzo® Life Sciences
Dibutyryl-cAMP.Na
Enzo® Life Sciences
Forskolin
Enzo® Life Sciences
GW9662
Enzo® Life Sciences
Gö6796
Enzo® Life Sciences
H89.Dihydrochlorid
Enzo® Life Sciences
hIL-1β in PBS und 1 mg/ml BSA
Roche
IBMX
Enzo® Life Sciences
Ibuprofen
Enzo® Life Sciences
hIL-6 in PBS und 1 mg/ml BSA
Roche
Indomethacin
KT5720
Enzo® Life Sciences
L-NIL in A. bidest
Enzo® Life Sciences
L-NMMA in A. bidest
Enzo® Life Sciences
LPS (E. coli 055:B5) in OptiMEM®I
Sigma-Aldrich®
L-Sulforaphan
Sigma-Aldrich®
LY294002
Enzo® Life Sciences
MAFP
Enzo® Life Sciences
MDL12330A.Hydrochlorid
Enzo® Life Sciences
MG132
Enzo® Life Sciences
mIFNγ in PBS und 1 mg/ml BSA
Roche
mMCP-1 in A. bidest
PanTM Biotech GmbH
mTNFα in PBS und 1 mg/ml BSA
Roche
N6-Benzoyl-cAMP in A. bidest
BioLog
NS398
Enzo® Life Sciences
PD98059
PGA1
Enzo® Life Sciences
Enzo® Life Sciences
PGA2 in Methylacetat
Enzo® Life Sciences
PGD2
Calbiochem®
PGE1
Enzo® Life Sciences
PGE2
Enzo® Life Sciences
PGF2α
Enzo® Life Sciences
Calbiochem®
35
Material und Methoden
PP2
Enzo® Life Sciences
Resveratrol
Enzo® Life Sciences
Ro318220
Enzo® Life Sciences
SB202190
Enzo® Life Sciences
SC-560
Enzo® Life Sciences
SP600125
Enzo® Life Sciences
tBHQ
Enzo® Life Sciences
Troglitazon
Enzo® Life Sciences
2.1.7
Antikörper
2.1.7.1
Primärantikörper
COX-2
Acris Antibodies GmbH
1:2.000 in TBST/5 % BSA, Kaninchen
CREB
Cell Signaling Technology®
1:500 in TBST/5 % BSA, Kaninchen
Phospho-CREB (Ser133)
Cell Signaling Technology®
1:500 in TBST/5 % BSA, Kaninchen
GAPDH
AbFrontier
1:10.000 in TBST/5 % BSA, Kaninchen
iNOS
BD Transduction Laboratories™
1:10.000 in TBST/5 % BSA, Kaninchen
MAP-Kinasen:
Cell Signaling Technology®
1:1.000 in TBST/5 % BSA, Kaninchen
JNK/SAPK
phospho-JNK/SAPK (Thr183/Tyr185)
phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182)
phospho-p44/42 MAPK (Thr202/Tyr204)
phospho-PKB (Ser473)
PKB
Nrf2 (H-300)
36
Santa Cruz Biotechnology, Inc.
für Immunfluoreszenz
1:100 in IF-Puffer, Kaninchen
Material und Methoden
Prx 1
AbFrontier
1:2.000 TBST/5 % BSA, Kaninchen
Prx 2
AbFrontier
1:2.000 TBST/5 % BSA, Maus
Prx 3
AbFrontier
1:1.000 TBST/5 % BSA, Maus
Prx 4
AbFrontier
1:2.000 in TBST/5 % BSA, Kaninchen
Prx 5
AbFrontier
1:2.000 TBST/5 % BSA, Maus
Prx 6
AbFrontier
1:2.000 in TBST/5 % BSA, Maus
2.1.7.2
Antikörperkonjugate
Anti-Kaninchen-IgG,HRP-gekoppelt
Cell Signaling Technology®
1:10.000 in 1x Roti®-Block
Anti-Maus-IgG, HRP-gekoppelt
Cell Signaling Technology®
1:5.000 in 1x Roti®-Block
Anti-Kaninchen-CyTM2
Dianova
1:400 in IF-Puffer
2.1.8 Oligonukleotide
2.1.8.1
Oligonukleotide für die Reverse Transkription
Der Oligo-dT-Primer wurden von der Firma InvitrogenTM synthetisiert.
Oligo-dT
2.1.8.2
5’-TTT TTT TTT TTT TTT-3’
Oligonukleotide für die quantitative Real-Time PCR
Die Primer und TaqManTM Sonden wurden von der Firma Microsynth Laboratory designt
und synthetisiert. Dabei wurden die Sonden durch HPLC (high performance liquid
chromatography) und die Primer durch HPLC und Gelfiltration gereinigt.
37
Material und Methoden
IL-1β
IL-6
Prx 1
Prx 2
Prx 3
Prx 4
Prx 5
Prx 6
RPLP0
TNFα
38
Vorwärts
5’-CAG CAG CAC ATC AAC AAG AGC-3’
Rückwärts
5’-GGA AGG TCC ACG GGA AAG AC-3’
Sonde
FAM-TGC CAC AGC TTC TCC ACA GCC ACA-TAMRA
Vorwärts
5’-GCC AGA GTC CTT CAG AGA GAT AC-3’
Rückwärts
5’-AAG ATG AAT TGG ATG GTC TTG GTC-3’
Sonde
FAM-AGC CAC TCC TTC TGT GAC TCC AGC T-TAMRA
Vorwärts
5’-TGT TTC CCC AGC ATG TGT ACC -3’
Rückwärts
5’-TGC TCT TAT AGA AGA CCC AGG TTC-3’
Sonde
FAM-TCC CAG CAC CCA CAT GGT CCC AGG-TAMRA
Vorwärts
5’-TGT CTC TAC CCG TGT CTG GAC -3’
Rückwärts
5’-TAG TCC GAA AGC TTG ATT TCC TTG-3’
Sonde
FAM-AGG CAC CAT CCA CCA CCG CTG T-TAMRA
Vorwärts
5’-TCA GCC TTT AGC ACC AGT TCC-3’
Rückwärts
5’-TTG AAC TCT CCA TTG ACA ACA GC-3’
Sonde
FAM-TTC CAC ACC CCT GCT GTC ACC CAG-TAMRA
Vorwärts
5’-GGA TCA CTC CCT GCA TCT AAG C-3’
Rückwärts
5’-TCC CAC GAT AGT CAG TCA GTT TG-3’
Sonde
FAM-AAG CCA AGA TCT CCA AGC CAG CAC CT-TAMRA
Vorwärts
5’-CCG GAA AGA AGC AGG TTG GG-3’
Rückwärts
5’-AAC AGC TCT GCC AAG TTC ACC-3’
Sonde
FAM-CGG AGC CCG CAG CTT CAG CAG C-TAMRA
Vorwärts
5’-CAC CAA AAC CTT CTC GGG ATT C-3’
Rückwärts
5’-CAA AGA CCC TAC AGA GAC CTA AGG-3’
Sonde
FAM-CTG TGC CTT CGC CAG CAT TCT GCC-TAMRA
Vorwärts
5’-TGA GAT TCG GGA TAT GCT GTT GG-3’
Rückwärts
5’-TGT TCT GAG CTG GCA CAG TG-3’
Sonde
FAM-CCT CAC ACG GGG CGA TGG CAC C-TAMRA
Vorwärts
5’-GAC AAG GCT GCC CCG ACT AC-3’
Rückwärts
5’-ACG GCA GAG AGG AGG TTG AC-3’
Sonde
FAM-CTC CTC ACC CAC ACC GTC AGC CGA-TAMRA
Material und Methoden
2.1.9
Puffer und Lösungen
2.1.9.1
Lösungen für Arbeiten mit Gesamt-RNA
DEPC-A. bidest
0,1 % DEPC in A. bidest
24 h bei RT inkubieren
autoklavieren
dNTP (10 mM)
10 mM dATP
10 mM dCTP
10 mM dTTP
10 mM dGTP
2.1.9.2
Puffer und Lösungen zur Proteinextraktion mittels TRIzol® Reagent
PBS (1x)
140 mM NaCl
2,7 mM KCl
10 mM Na2HPO4 x 2H2O
1,8 mM KH2PO4
pH 7,4
2D-Lysispuffer
2 M Thioharnstoff
8 M Harnstoff
0,065 M Chaps
0,13 M DTT
0,079 M Tris
aliquotieren, Lagerung bei -80°C
Guanidinhydrochlorid
0,3 M Guanidinhydrochlorid
in 96 %-igem Ethanol
39
Material und Methoden
2.1.9.3
Puffer und Gele für proteinbiochemische Arbeiten
Proteinmengenbestimmung nach Bradford
Bradford-Reagenz
11,7 µM Coomassie brilliant blue G-250
5 Vol.-% 96 %-iger Ethanol
10 Vol.-% 85 %-ige Phosphorsäure
Lagerung lichtgeschützt bei RT
vor Gebrauch filtrieren
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
4x Proteinprobenpuffer
26 Vol.-% Sammelgelpuffer
23,4 Vol.-% 98 %-iges Glycerin
20,8 Vol.-% 20 %-iges SDS
1 mM DTT
eine Spatelspitze Bromphenolblau
aliquotieren, Lagerung bei -20 °C
Laufpuffer für SDS-PAGE
192 mM Glycin
24,8 mM Tris
0,1 % SDS
pH 8,3
Sammelgelpuffer
0,5 M Tris-HCl
pH 6,8
Trenngelpuffer
1,5 M Tris-HCl
pH 8,8
1x TBS
20 mM Tris
138 mM NaCl
pH 7,6
40
Material und Methoden
Trenngele (Angaben für ein Gel)
Sammelgel (Angaben für ein Gel)
Anodenpuffer 1
% Acrylamid
10 %
13,5 %
A. bidest
2 ml
1,40 ml
Trenngelpuffer
1,25 ml
1,25 ml
Rotiphorese® Gel 30
1,65 ml
2,25 ml
10 % SDS
50 µl
50 µl
10 % APS
50 µl
50 µl
TEMED
5 µl
5 µl
A. bidest
1,4 ml
Sammelgelpuffer
0,25 ml
Rotiphorese® Gel 30
0,8 ml
10 % SDS
25 µl
10 % APS
25 µl
TEMED
2,5 µl
300 mM Tris
20 % Methanol
pH 10,4
Anodenpuffer 2
25 mM Tris
20 % Methanol
pH 10,4
Blockierungspuffer
10 % Roti®-Block
Kathodenpuffer
10 % Roti®-Blot K (10x)
20 % Methanol
LumiGLOTM-Detektionslösung
5 % Reagenz A
5 % Reagenz B
Ponceau S-Lösung
2,63 mM Ponceau S
83 mM Trichloressigsäure
41
Material und Methoden
TBST/BSA-Antikörperlösung
0,1 % Tween 20
5 % BSA (Fraktion V)
in 1x TBS
TBS-Tween (TBST)
2.1.9.4
0,1 % Tween 20 in 1x TBS
Puffer für Immunfluoreszenz
IF-Puffer
0,2 % BSA
0,05 % Saponin
0,1 % Natriumazid
in PBS
pH 7,4, Lagerung bei 4 °C
2.1.9.5
Lösungen für Invasions- und Replikationsassay
Kanamycin
12,5 mg/ml in A. bidest
Lagerung bei -20°C
Tergitol
1 % Tergitol
in PBS (steril filtriert)
mit 0,5 % BSA
2.1.10
Organismen und Kulturmedien
2.1.10.1
Mausstämme
Charles River Laboratories (Sulzfeld, Deutschland)
BALB/cAnCrl
Inzuchtmausstamm
C57BL/6Ncrl
Inzuchtmausstamm
Jackson Laboratory (Bar Harbor/Maine, USA)
C57BL/6J
Inzuchtmausstamm
B6129SF2/J
F2-Hybrid
B6.129P2-Nos2tm1Lau/J
Kongener Maussstamm
(iNOS Knockout-Maus )
Wildtypstamm: C57BL/6J
(Laubach et al., 1995)
42
Material und Methoden
B6.129S6-Cybbtm1Din/J
phox
(gp91
Knockout-Maus)
Kongener Mausstamm
Wildtypstamm: C57BL/6J
(Pollock et al., 1995)
B6;129S-Tnftm1Gkl/J
Kongener Mausstamm
(TNFα Knockout-Maus)
Wildtypstamm: B6129SF2/J
(Pasparakis et al., 1996)
B6;129S-Tnfrsf1atm1ImxTnfrsf1btm1Imx/J
Kongener Mausstamm
(TNFR Knockout-Maus)
Wildtypstamm: B6129SF2/J
(Peschon et al., 1998)
Institut für Versuchstierkunde (Greifswald, Deutschland)
C57BL/6J
Inzuchtmausstamm
B6.129P2-Nos2tm1Lau/J
Kongener Maussstamm
Wildtypstamm: C57BL/6J
(Laubach et al., 1995)
B6.129S6-Cybbtm1Din/J
Kongener Mausstamm
Wildtypstamm: C57BL/6J
(Pollock et al., 1995)
Institut für Pharmakologie (Kiel, Deutschland)
C57BL/6/N
Inzuchtmausstamm
C57B/SV129
F2-Hybrid
C57B/SV129 Nrf2-/-
Kongener Mausstamm
(Nrf2 Knockout-Maus)
Wildtypstamm: C57/SV129
(Chan und Kan 1999)
2.1.10.2
Rechtliche Grundlagen
Für die Arbeit mit Versuchstieren wurde im Rahmen der Promotion an der Ernst-MoritzArndt-Universität Greifswald in der Abteilung für Versuchstierkunde eine entsprechende
Bescheinigung erworben. Der Lehrumfang umfasste den Weiterbildungsempfehlungen
für tierexperimentell tätiges Personal der FELASA-Kategorie B.
43
Material und Methoden
2.1.10.3
Bakterienstämme
Die Experimente mit B. pseudomallei und B. thailandensis erfolgten in einem
Sicherheitslabor der Stufe 3.
Burkholderia pseudomallei
E8
Umweltisolat aus Thailand
E203
Umweltisolat aus Thailand
E212
Umweltisolat aus Thailand
E237
Umweltisolat aus Thailand
K96243 (K9)
Patientenisolat aus Thailand
(vollständig sequenziertes Genom)
Burkholderia thailandensis
E264 (DSM13276, ATCC700388)
Umweltisolat aus Thailand
(vollständig sequenziertes Genom)
E27
Umweltisolat aus Thailand
E201
Umweltisolat aus Thailand
E205
Umweltisolat aus Thailand
E229
Umweltisolat aus Thailand
2.1.10.4
Lösungen und Substanzen für die Zellkultivierung
2-Mercaptoethanol (50 mM)
GIBCO® invitrogen
D-PBS
GIBCO® invitrogen
rmGM-CSF
PANTM Biotech GmbH
PANEXIN BMM®
PANTM Biotech GmbH
RPMI 1640
Biochrom AG
Trypsin-EDTA (10x)
PAA
2.1.10.5
Nährböden und Kulturmedien für Bakterienkulturen
Columbia Agar mit 5 % Schafsblut
BD Diagnostics
LB-Medium, Lennox
2 Gew.-% Lennox L
autoklavieren
Müller-Hinton Agar
3,8 Gew.-% Müller-Hinton Agar-Pulver
15 min bei 121°C autoklavieren
44
Material und Methoden
2.1.
Methoden
2.2.1
Bakterien- und Zellkultur
2.2.1.1
Herstellung von Bakterienstocklösungen
Die verwendeten Bakterienstämme wurden jeweils in 15 ml LB-Medium angeimpft und
über Nacht in einem Schüttelinkubator bei 140 rpm und 37°C angezogen und kultiviert.
Am Folgetag wurde die Flüssigkultur mit Glycerin versetzt, sodass der Glyceringehalt
20 Vol.-% entsprach. Daraus wurden Aliquote mit je 20 µl in 0,5 ml Reaktionsgefäßen
hergestellt, die bis zu ihrer Verwendung bei -70°C gelagert wurden.
2.2.1.2
Präparation muriner Knochenmarkmakrophagen
Die Präparation muriner Knochenmarkmakrophagen wurde nach dem Protokoll von
Eske
et
al.
durchgeführt
Knochenmarkstammzellen
(Eske
wurden
et
al.,
vorwiegend
2009).
Zur
weibliche
Tiere
Gewinnung
von
unterschiedlicher
Stämme (s. Abschnitt 2.1.10.1) im Alter von 8 bis 18 Wochen verwendet. Die durch
zervikale Dislokation getöteten Mäuse wurden auf dem Rücken liegend auf einer
Präparierunterlage an den Vorderläufen und dem Schwanzansatz fixiert. Darauf folgend
wurde der untere Bauchbereich und die hinteren Extremitäten mit Alkohol desinfiziert,
woraufhin die Haut über den Hinterläufen entfernt wurde und sowohl die Femora als
auch die Tibiae und Fibulae entnommen wurden. Das Muskelgewebe wurde mit Hilfe
eines Skalpells von den Knochen entfernt, wobei die Fibula jeweils verworfen wurde.
Danach wurden die gesäuberten Knochen für 10 min in 70 %-igem Ethanol und
anschließend
für
5 min
in
sterilem
PBS
inkubiert.
Nach
dem
Öffnen
der
Knochenmarkhöhle durch Abtrennung geringer Teile an den Knochenenden wurde das
Knochenmark mittels einer mit 5 ml PBS-gefüllten Spritze vorerst in eine Petrischale
ausgespült. Die Knochenmarksuspension wurde je Maus in einem 50 ml Röhrchen
gesammelt und für 15 min bei 150xg und 4°C zentrifu giert. Das Zellpellet wurde
anschließend in RPMI 1640 Medium mit 5 % PANEXIN BMM®, 2 ng/ml rmGM-CSF und
50 µM Mercaptoethanol resuspendiert und mit einem Endvolumen von 20 ml auf drei
75 mm2 Zellkulturflaschen verteilt. Die Kultivierung und Differenzierung der murinen
Knochenmarkstammzellen zu Makrophagen erfolgte über einen Zeitraum von 10 Tage
bei 37°C, 95 % relativer Luftfeuchte und 5 % CO 2. Am 5. sowie am 7. Tag des
Differenzierungsprozesses
wurden
10 ml
des
verbrauchten
Zellkulturmediums
abgenommen und durch 10 ml frisches Medium ersetzt.
45
Material und Methoden
2.2.1.3
Aussaat von Knochenmarkmakrophagen
Am 10. Tag des Differenzierungsprozesses wurden die zu Knochenmarkmakrophagen
differenzierten Zellen ausgesät. Dafür wurde zunächst das Medium vollständig entfernt
und die Zellen zweimal mit 5 ml PBS pro Zellkulturflasche gewaschen und anschließend
mit 1 ml 1x Trypsin-EDTA für 10 min bei 37°C, 95 % relativer Luftfeuchte und 5 % CO2
inkubiert. In zweimal 4 ml RPMI 1640 Medium pro Zellkulturflasche wurden die Zellen
mit Hilfe eines Zellschabers abgelöst und anschließend in ein 50 ml Röhrchen überführt
und 10 min bei 150xg und 4°C zentrifugiert. Nach vo rsichtiger Abnahme des
Überstandes wurde das Zellpellet in 5 ml RPMI 1640 Medium mit 5 % PANEXIN BMM®,
2 ng/ml rmGM-CSF und 50 µM Mercaptoethanol resuspendiert und die Zellzahl mittels
einer Neubauer-Zählkammer bestimmt.
Wie in Tabelle 3 dargestellt wurden die Knochenmarkmakrophagen in Abhängigkeit von
der verwendeten Methode in unterschiedliche Formate von Zellkultur-Well-Platten
ausgesät und für 18 h in RPMI 1640 Medium mit 5 % PANEXIN BMM®, 2 ng/ml
rmGM-CSF und 50 µM Mercaptoethanol bei 37°C, 95 % r elativer Luftfeuchte und 5 %
CO2 inkubiert.
Tabelle 3: Aussaatbedingungen
verwendeten Methode.
von
Knochenmarkmakrophagen in
Abhängigkeit
von
der
Plattenformat
Methode
Zellzahl/Well
Arbeitsvolumen [ml]
6-Well Platte
Präparation von Proteinen
625.000
4
12-Well Platte
Präparation von GesamtRNA und Proteinen
250.000
2
24-Well Platte
Immunfluoreszenz
125.000
1
48-Well Platte
Invasions- und
Replikationsassay
150.000
0,4
2.2.1.4
Stimulation von Knochenmarkmakrophagen
Nach der 18-stündigen Inkubation in RPMI 1640 Medium mit 5 % PANEXIN BMM®,
2 ng/ml rmGM-CSF und 50 µM Mercaptoethanol bei 37°C , 95 % relativer Luftfeuchte
und 5 % CO2 wurden die Knochenmarkmakrophagen direkt vor der Zugabe der
Stimulatoren gegebenenfalls 60 min mit verschiedenen Inhibitoren behandelt oder
ausschließlich
mit
Stimulatoren für
die
angegebenen Zeiträume inkubiert.
In
Abhängigkeit vom Stimulator und Inhibitor dienten unbehandelte Zellen oder mit dem
Lösungsmittel der Stimulatoren und/oder Inhibitoren behandelte Zellen als Kontrolle.
46
Material und Methoden
2.2.1.5
Bakterielle Infektion von Knochenmarkmakrophagen
Nach der 18-stündigen Inkubation in RPMI 1640 Medium mit 5 % PANEXIN BMM®,
2 ng/ml rmGM-CSF und 50 µM Mercaptoethanol bei 37°C , 95 % relativer Luftfeuchte
und 5 % CO2 wurden die Knochenmarkmakrophagen entweder für 24 h mit 300 U/ml
IFNγ stimuliert oder blieben unbehandelt.
Ca. 20 h vor der Infektion der Knochenmarkmakrophagen mit B. pseudomallei und
B. thailandensis wurden die entsprechenden Bakterienstämme auf einer Blutagarplatte
(Columbia Agar mit 5 % Schafsblut) angeimpft und bei 37°C inkubiert. Am Folgetag
wurden einzelne Bakterienkolonien mit Hilfe eines sterilen Abstrichtupfers von der
Blutagarplatte abgelöst und in 10 ml PBS suspendiert. Die optische Dichte der
Bakteriensuspension wurde mittels eines Photometers bei einer Wellenlänge von
650 nm gegen PBS als Leerwert bestimmt. Anhand des folgenden Diagramms
(Abbildung 4) ließ sich aus der gemessenen optischen Dichte die Anzahl der Bakterien
pro ml bestimmen.
1.0
0.9
Extinktion bei λ= 650 nm
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
6
Bakterienanzahl [10 /ml]
Abbildung 4: Darstellung der Extinktion bei 650 nm über der Bakterienanzahl pro ml zur
photometrischen Bestimmung der Bakterienanzahl einer Suspension von B. pseudomallei oder
B. thailandensis in PBS gegen PBS als Leerwert.
Durch die folgenden Gleichungen wurde das Volumen der Bakteriensuspension
bestimmt, das benötigt wurde, um ein Well einer 12-Well Platte mit 250.000 Zellen mit
einer gewünschten MOI (multiplicity of infection) zu infizieren:
Makrophagenanzahl pro Well · MOIgewünscht = Bakterienanzahlbenötigt
Bakterienanzahlbenötigt
= Suspensionsvolumen mit Bakterienanzahlbenötigt [ml]
Bakterienanzahlvorhanden/ml
47
Material und Methoden
Das Infektionsmedium mit der gewünschten MOI wurde hergestellt, indem RPMI 1640
Medium mit 5 % PANEXIN BMM® und 50 µM Mercaptoethanol mit dem ermittelten
Volumen der Bakteriensuspension versetzt wurde, sodass ein Endvolumen von 1 ml
erreicht wurde. Wurde Infektionsmedium für mehrere Wells benötigt, wurde das
Volumen
der
benötigten
Bakteriensuspension
sowie
das
Endvolumen
des
Infektionsmediums mit der Anzahl der zu infizierenden Wells multipliziert.
Für die Infektion der Knochenmarkmakrophagen wurde zuerst das Kulturmedium aus
den Wells der 12-Well Platten entfernt und die Zellen mit 1 ml PBS gewaschen.
Anschließend
wurden
die
für
die
Infektion
vorgesehenen
Wells
mit
1 ml
Infektionsmedium versehen. Knochenmarkmakrophagen, die als Kontrolle dienten,
wurden ausschließlich mit 1 ml RPMI 1640 Medium mit 5 % PANEXIN BMM® und 50 µM
Mercaptoethanol inkubiert. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37°C, 95 % relativer
Luftfeuchte und 5 % CO2 wurde das Kultur- bzw. Infektionsmedium entfernt und die
Zellen zweimal mit 1 ml PBS gewaschen. Dann erfolgte eine 18-stündige Inkubation der
Zellen in 2 ml RPMI 1640 Medium mit 5 % PANEXIN BMM®, 50 µM Mercaptoethanol
und 100 µg/ml Kanamycin, wobei das Kanamycin der Abtötung verbliebener
extrazellulärer Bakterien diente.
Wurden für bestimmte Experimente Inhibitoren verwendet, so erfolgte die einstündige
Vorbehandlung der Knochenmarkmakrophagen mit den Hemmstoffen direkt vor der
Zugabe des Infektionsmediums. Des Weiteren wurden die Hemmstoffe während der
18-stündigen Inkubation in 2 ml RPMI 1640 Medium mit 5 % PANEXIN BMM®, 50 µM
Mercaptoethanol und 100 µg/ml Kanamycin erneut zugesetzt.
Von dem Infektionsmedium wurden zwei entsprechende Verdünnungsstufen in
zweifacher Ausführung als Dosiskontrolle auf Blutagarplatten plattiert und für 24 h bei
37°C inkubiert.
2.2.1.6
Invasions- und Replikationsassay
Der Invasions- und Replikationsassay diente der Bestimmung der extra- und
intrazellulären Keimzahlen (CFU: colony forming unit) von Knochenmarkmakrophagen
zu bestimmten Zeitpunkten nach Infektion mit Burkholderia pseudomallei oder
Burkholderia thailandensis. Für diesen Assay wurden 48-Well Platten verwendet, wobei
150.000 Knochenmarkmakrophagen pro Well in 400 µl Kulturmedium eingesät wurden.
Jedes Experiment umfasste dabei eine dreifache Ausführung pro Infektionsansatz. Die
Aktivierung der Makrophagen durch IFNγ sowie die Infektion mit B. pseudomallei oder
B. thailandensis erfolgte wie unter Abschnitt 2.2.1.5 beschrieben, jedoch wurde jeweils
ein Volumen von 400 µl zum Waschen der Zellen mit PBS und für die Infektion sowie die
anschließende Inkubation in Kanamycin-haltigem Medium verwendet.
48
Material und Methoden
Die intrazelluläre Keimzahl wurde jeweils 0 h und 18 h nach Ende der Infektionszeit
bestimmt, wobei der Zeitpunkt 0 h als 30 min nach Zugabe des Kanamycin-haltigen
Mediums definiert wurde. Zu jedem Zeitpunkt wurde der Kulturüberstand als Kontrolle
der extrazellulären Keimzahl verwendet, der entweder unverdünnt oder in einer
entsprechenden Verdünnung auf Müller-Hinton-Agar ausplattiert wurde. Nach Abnahme
des Kulturüberstandes wurden die Zellen zweimal mit 400 µl PBS gewaschen. Die sich
anschließende Zelllyse erfolgte durch Zugabe von 150 µl Tergitol pro Well und einer
10-minütigen Inkubation bei 37°C. Daraufhin wurden die Zellen mit Hilfe einer
Pipettenspitze vom Boden der Wells abgelöst und in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt.
Von den Zelllysaten wurde jeweils eine 1:100-Verdünnungsreihe in PBS hergestellt,
woraufhin von entsprechenden Verdünnungen jeweils zweimal 100 µl auf Müller-HintonAgar ausplattiert wurde. Nach einer Inkubationszeit von 48 h bei 37°C wurden die
Bakterienkolonien auf den Platten gezählt und die Keimzahlen wie folgt berechnet:
CFU/Wellextrazellulär = CFU/100 µlAuszählung · Verdünnungsfaktor · 4
CFU/Wellintrazellulär = CFU/100 µlAuszählung · Verdünnungsfaktor · 1,5
Dabei ergab sich der Verdünnungsfaktor aus den jeweilig ausplattierten Verdünnungen
der angefertigten Verdünnungsreihen des Kulturüberstandes oder des Zelllysates. Da
Volumen von jeweils 100 µl pro Agarplatte ausplattiert wurden, ergaben sich aus dem
Gesamtvolumen von 400 µl des Kulturüberstandes und 150 µl des Zelllysates die
Multiplikationsfaktoren 4 und 1,5.
2.2.2
Arbeiten mit RNA
2.2.2.1
Isolation von Gesamt-RNA
Die Isolation der Gesamt-RNA der Zellen wurde mit dem TRIzol® Reagent der Firma
InvitrogenTM durchgeführt. Das TRIzol® Reagent ermöglicht die gleichzeitige Präparation
von RNA, DNA und Proteinen.
Das Zellkulturmedium wurde abgenommen und die Zellen einmal mit 1 ml PBS
gewaschen. Anschließend wurden 200 µl TRIzol® Reagent auf die Zellen gegeben und
5 min bei RT inkubiert, woraufhin die Zellen mit Hilfe eines Zellschabers vom Boden des
Kulturwells abgelöst wurden. Es folgte die Homogenisierung der Probe durch Auf- und
Abpipettieren und das Überführen in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß. Dem Homogenisat
wurden 20 µl 1-Brom-3-Chlorpropan zugesetzt, der Ansatz durch 15-sekündiges
Vortexen gemischt und für 5 min bei RT inkubiert. Nach 15-minütiger Zentrifugation bei
12000xg und 4°C wurde die obere wässrige, RNA-halti ge Phase der Ansätze in neue
49
Material und Methoden
1,5 ml-Reaktionsgefäße überführt. Die Präzipitation der Gesamt-RNA erfolgte durch
Zugabe von 100 µl Isopropanol, 10-minütiger Inkubation bei RT und anschließender
10-minütiger Zentrifugation bei 12.000xg und 4°C. D araufhin wurde das RNA-Pellet mit
200 µl 75 %-igem Ethanol gewaschen und nochmals für 5 min bei 12.000xg und 4°C
zentrifugiert und 5 - 10 min luftgetrocknet. Abschließend wurde das RNA-Pellet in 20 µl
DEPC-A. bidest resuspendiert und die RNA-Konzentration spektralphotometrisch
bestimmt. Die isolierte Gesamt-RNA wurde für die Reverse Transkription verwendet.
2.2.2.2
Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
Die Nukleinsäurekonzentration wurde mittels eines Spektralphotometers bestimmt. Dafür
wurde die isolierte Gesamt-RNA 1:100 in einem Gesamtvolumen von 200 µl mit
A. bidest verdünnt und die Extinktion bei einer Wellenlänge von 260 nm gemessen,
wobei A. bidest als Leerwert diente. Die Konzentration (c) der RNA wurde mit Hilfe der
Formel, abgeleitet vom Lambert-Beer‘schen-Gesetz, bestimmt:
c [µg / ml ] = E 260nm ⋅ f ⋅ ε
Dabei entspricht E260nm der Extinktion bei 260 nm, f dem Verdünnungsfaktor und ε dem
molaren Extinktionskoeffizienten, der für RNA 40 entspricht.
2.2.2.3
Reverse Transkription
Das Enzym Reverse Transkriptase ist eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, die
entlang einer RNA-Matrize in 5‘→3‘-Richtung einzelsträngige DNA synthetisiert. Der
Poly-A-Schwanz am 3‘-Ende der mRNA hybridisiert mit einem Oligo-dT-Primer und
liefert so der Reversen Transkriptase eine freie 3’-Hydroxylgruppe. Die Reverse
Transkriptase synthetisiert mit Hilfe der dNTPs eine Kopie der mRNA, wodurch es zur
Bildung eines mRNA/DNA-Hybrids kommt. Vor der Zweitstrangsynthese wird die mRNA
aus dem mRNA/DNA-Hybridmolekül durch eine spezifische integrierte RNase H entfernt.
Für die Reverse Transkription wurden 1 µg Gesamt-RNA, 500 ng Oligo-dT-Primer und
DEPC-A. bidest zu einem Gesamtvolumen von 13,5 µl vereinigt, 5 min bei 70°C
denaturiert und sofort auf Eis inkubiert. Anschließend wurden 4 µl M-MLV 5x RTasePuffer, 0,01 µmol dNTPs, 20 U RNasin® sowie 200 U M-MLV-RTase hinzugefügt. Die
Reverse Transkription erfolgte für 1 h bei 42°C und wurde anschließend durch
10-minütige Inkubation bei 70°C gestoppt. Das Reakt ionsprodukt wurde auf ein Volumen
von 200 µl aufgefüllt und für Untersuchungen der relativen Expression verschiedener
Gene mittels qRT-PCR verwendet.
50
Material und Methoden
2.2.2.4
Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR)
Die Reverse Transkription gefolgt von einer PCR ist ein nützliches Hilfsmittel bei der
Detektion und Quantifizierung von mRNA. Die Real-Time PCR zeichnet sich durch ihre
hohe Sensitivität, gute Reproduzierbarkeit und weite Quantifizierungsbandbreite aus und
ist somit die sensitivste Methode für den Nachweis und die Quantifizierung von
Genexpressionsgehalten besonders bei sehr gering exprimierter mRNA.
Bei der quantitativen Real-Time PCR erfolgt am Ende des Elongationsschrittes jedes
Amplifikationszyklus die Quantifizierung der DNA mittels eines Fluoreszenzsignals in
Echtzeit. Hydrolysesonden wie die TaqManTM PCR-Sonden besitzen einen 5‘-ReporterFarbstoff wie z. B. 6-Carboxy-Fluorescein (FAM), den 3‘-Quencher-Farbstoff 6-Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA) und ein 3‘-blockierendes Phosphat zur Verhinderung der
Extension des 3‘-Endes während der PCR. Wird die intakte Sonde bei einer spezifischen
Wellenlänge (488 nm) zur Fluoreszenz angeregt, so wird die Fluoreszenz des ReporterFarbstoffes aufgrund der räumlichen Nähe zum Quencher durch einen FluoreszenzEnergietransfer (FET) unterdrückt. Während des Annealing-Schrittes kommt es zur
sequenzspezifischen
Anlagerung
der
Sonde
zwischen
den
Primern
an
den
Matrizenstrang, gefolgt von der Extension der Primer durch die Taq-Polymerase. Dabei
wird die Sonde durch die 5‘-3‘-Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase geschnitten
und verdrängt, wodurch die räumliche Nähe und damit auch der FET zwischen Reporter
und Quencher unterbrochen und das PCR-Produkt vollständig synthetisiert wird. Somit
steigt mit jedem PCR-Zyklus in Abhängigkeit von der Akkumulation des PCR-Produktes
und der Zahl freigesetzter Reportermoleküle das Fluoreszenzsignal an.
Die Intensität des entstandenen Fluoreszenzsignals am Ende jedes Zyklus wird über der
Zyklenzahl aufgetragen. Dadurch lässt sich der Verlauf der PCR in drei Phasen einteilen:
In eine frühe Phase, eine exponentielle Wachstumsphase (Log-Phase) und eine
Plateau-Phase. In der frühen Phase übertreffen Hintergrundsignale diejenigen des
PCR-Produktes.
In
Reaktionsansatz
Fluoreszenzsignale
Abhängigkeit
heben
des
sich
von
nach
PCR-Produktes
der
Ausgangsmenge
einer
bestimmten
statistisch
signifikant
der
Ziel-DNA
Zyklenanzahl
von
denen
im
die
des
Hintergrundes ab. Diese Schwelle wird als der sogenannte Ct-Wert (Cycle Threshold)
bezeichnet. Der mathematisch exakte Wert, der den Übergang von der frühen zur
exponentiellen Phase beschreibt, ist der Cp-Wert (Crossing Point), der dem ersten
Maximum der zweiten Ableitung des PCR-Verlaufs entspricht. Da die Effizienz der
Amplifikation von Lauf zu Lauf variieren kann, wurde bei jedem Experiment eine
Verdünnungsreihe bestehend aus dem cDNA-Pool, dessen 1:10- und 1:100Verdünnung sowie ein Leerwert (NTC, non target control) mitgeführt.
51
Material und Methoden
Die PCR-Effizienz (E) der qRT-PCR wird dabei aus der Steigung der Standardkurve
nach folgender Formel berechnet:
E = 10


1
 −

 Steigung 
  − 1   
  Steigung   
E (% ) =  10 
 − 1 ⋅ 100


 

qRT-PCR-Messungen von Genen mit einer Effizienz kleiner 90 % wurden nicht in die
Datenmengen aufgenommen. Zudem wurde von jeder cDNA in einer parallelen PCR ein
Referenzgen (RPLP0, ribosomal protein, large P0), das konstitutiv exprimert wird,
analysiert. Dadurch konnten die ermittelten Cp-Werte der untersuchten Gene
normalisiert und ein Einfluss durch Menge und Qualität der eingesetzten cDNA
weitgehend kompensiert werden. Von allen Proben wurden Duplikatmessungen
durchgeführt und daraus der Mittelwert der Cp-Werte gebildet.
Nach dem folgenden mathematischen Modell lässt sich die relative Expressionsrate (R)
eines Zielgens basierend auf der PCR-Effizienz (E) und der Cp-Differenz zwischen einer
unbekannten Probe und ihrer Kontrolle sowie im Vergleich zu einem Referenzgen
berechnen:
R=
(E
(E
)
)
∆CPZie lg en (Kontrolle −Pr obe )
Zie lg en
Re ferenzgen
∆CPRe ferenzgen (Kontrolle −Pr obe )
Dabei ist EZielgen die RT-PCR-Effizienz des Zielgentranskriptes, EReferenzgen die RT-PCREffizienz des Referenzgentranskriptes ∆CPZielgen die Cp-Differenz der Kontrolle und der
Probe des Zielgentranskriptes und ∆CPReferenzgen die Cp-Differenz der Kontrolle und der
Probe des Referenzgentranskriptes.
Für einen 10 µl-Reaktionsansatz der qRT-PCR in einer 96-Well Platte wurden pro Well
2 µl cDNA, 5 µl LightCycler® 480 Probes Master, 2 pmol TaqManTM Sonde, jeweils
5 pmol Vorwärts- und Rückwärtsprimer sowie 1,8 µl Wasser (PCR-Grad.) vereinigt.
Danach wurde die 96-Well Platte für 1 min bei 1.200xg und 20°C zentrifugiert. Die
qRT-PCR wurde mit dem LightCycler® 480 Instrument und dem in Tabelle 4
dargestellten Programm durchgeführt.
52
Material und Methoden
®
Tabelle 4: PCR-Programm für die qRT-PCR mit dem LightCycler 480 Instrument.
Hot start
Amplifikation
Cooling
Temperatur
[°C]
Zeit
[min]
Anstiegsrate
[°C/s]
Anzahl der
Zyklen
95
5:00
4,4
1
95
0:10
4,4
60
0:20
2,2
72
0:01
4,4
40
0:30
1,5
45
1
Abschließend wurden die Messungen wie oben beschrieben mit dem Advanced Modus
der relativen Quantifizierung der LightCycler® 480 Software Version 1.5 ausgewertet.
2.2.3
Proteinbiochemische Arbeiten
2.2.3.1
Proteinpräparation mittels TRIzol® Reagent
Parallel zur Isolation der Gesamt-RNA wurde die Proteinpräparation mit Hilfe des
TRIzol® Reagents durchgeführt. Nach dem Entfernen der RNA-haltigen Phase wurden
60 µl 100 %-iger Ethanol zu den unteren organischen Phasen der Ansätze gegeben,
2 - 3 min bei RT inkubiert und anschließend für 5 min bei 2.000xg und 4°C zentrifugiert,
wodurch die DNA ausgefällt wurde. Darauf folgend wurden die Überstände in neue
2 ml-Reaktionsgefäße überführt und die Proteine durch Zugabe von jeweils 300 µl
Isopropanol unter 10-minütiger Inkubation bei RT auf einem Wippschüttler präzipitiert.
Durch 10-minütige Zentrifugation bei 12.000xg und 4°C wurden die Proteine pelletiert.
Im Anschluss wurde der Überstand verworfen und die Proteine dreimal für 20 min mit
700 µl Guanidinhydrochlorid und abschließend 20 min mit 700 µl 100 %-igem Ethanol
gewaschen. Nach jedem Waschschritt erfolgte eine 5-minütige Zentrifugation bei
7.500xg und 4°C. Abschließend wurden die Proteinpel lets vakuumgetrocknet und je
nach Pelletgröße in 28 - 40 µl 2D-Lysispuffer mit Hilfe eines Eppendorf-Schüttlers gelöst.
2.2.3.2
Proteinmengenbestimmung nach Bradford
Die Kolorimetrie mit Hilfe der Bradford-Methode wurde zur Bestimmung des
Gesamtproteingehaltes einer Lösung verwendet. Die Bradford-Methode beruht auf der
Änderung des Absorptionsmaximums von 465 nm auf 595 nm durch die Komplexbildung
des Farbstoffes Coomassie brillant blue G-250 mit Proteinen.
Für die Messung wurden 2 µl der zu bestimmenden Proteinlösung mit 28 µl
2D-Lysispuffer, 70 µl A. bidest und 1,9 ml Bradford-Reagenz versetzt und für
53
Material und Methoden
mindestens 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Spätestens 30 min nach Zugabe des
Bradford-Reagenz wurde die Extinktion bei 595 nm gegen 2 µl A. bidest mit 28 µl
2D-Lysispuffer, 70 µl A. bidest und 1,9 ml Bradford-Reagenz als Leerwert gemessen.
Zur Berechnung des Proteingehalts wurde eine Standardkurve mit 1 - 20 µg BSA in
28 µl 2D-Lysispuffer und 70 µl A. bidest mitgeführt.
2.2.3.3
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die diskontinuierliche SDS-PAGE diente der Auftrennung der Proteine nach ihrem
Molekulargewicht. Zur näherungsweisen Bestimmung des Molekulargewichtes wurden
bei jeder Elektrophorese 5 µl eines vorgefärbten Proteinmarkers mitgeführt. In einem
Gesamtvolumen von 20 µl wurden 20 – 40 µg Protein mit 4x Proteinprobenpuffer und
A. bidest vereinigt und anschließend auf das Gel geladen.
Die Gelelektrophorese wurde zuerst 15 min bei einer Spannung von 120 V und folgend
100 min bei 160 V durchgeführt. Als Laufpuffer diente dabei 1x SDS-PAGE-Laufpuffer.
2.2.3.4
Western Blot
Mit Hilfe eines Semidry-Elektroblots wurden die durch SDS-PAGE aufgetrennten
Proteine für eine Stunde bei einer Stromstärke von 1 mA pro cm2 Gelfläche auf eine
Nitrocellulosemembran transferiert. Zu Beginn wurden das SDS-Gel und drei Lagen
Whatman-Filterpapier
in
Kathodenpuffer,
zwei
Lagen
Whatman-Filterpapier
in
Anodenpuffer 1 sowie die Nitrocellulosemembran und eine Lage Whatman-Filterpapier
in Anodenpuffer 2 äquilibriert. Eine Transfereinheit wurde wie nachfolgend beschrieben
geschichtet und durch Ausrollen von Luftblasen zwischen den Lagen befreit.
(+) Anode
2x Whatman-Filterpapier
Anodenpuffer 1
1x Whatman-Filterpapier
Anodenpuffer 2
Nitrocellulosemembran
Anodenpuffer 2
Gel
Kathodenpuffer
3x Whatman-Filterpapier
Kathodenpuffer
(-) Kathode
Nach dem Blotten wurde die Effizienz des Transfers durch Färbung der Proteine auf der
Membran mittels Ponceau S-Lösung überprüft. Nach der Entfärbung der Membran durch
A. bidest und 1x TBS wurden die unspezifischen Bindungsstellen der Membran durch
einstündige
Inkubation
mit
1x Roti®-Block
blockiert.
Um
spezifische
Proteine
nachzuweisen, wurde die Membran über Nacht bei 4°C mit dem Primärantiköper
54
Material und Methoden
inkubiert, anschließend dreimal 5 min mit TBST gewaschen, um ungebundene
Antikörper zu entfernen und darauf eine Stunde bei RT mit dem Peroxidase-gekoppelten
Sekundärantikörper inkubiert. Nach erneutem dreimaligen Waschen für 5 min mit TBST
wurde die Membran für 3 min in LumiGLOTM-Detektionslösung inkubiert. Dabei spaltete
die Peroxidase des Antikörperkonjugates das LumiGLOTM Reagenz, wodurch ermöglicht
wurde, dass die entstehende Chemolumineszenz durch die Exposition der Membran auf
einem Röntgenfilm detektiert werden konnte.
Um die Membran mit weiteren Antikörpern inkubieren zu können, wurde die Membran
nach der Exposition dreimal für 5 min mit TBST gewaschen und anschließend erneut für
30 - 60 min mit 1x Roti®-Block blockiert und zur Detektion verwendet.
2.2.4
Spektralphotometrische Messungen an Zellkulturüberständen
2.2.4.1
Nitrit-Messung nach Griess
Die Messung von Nitrit, einem stabilen Oxidationsprodukt von Stickstoffmonoxid,
erfolgte
kolorimetrisch
nach
der
Methode
von
Griess.
Dafür
wurden
in
2 ml-Reaktionsgefäßen 500 µl Zellkulturüberstand und 500 µl Griess Reagent gemischt,
15 min bei RT inkubiert und anschließend bei 540 nm gegen Kulturmedium als Leerwert
gemessen. Bei jeder Messung wurde eine Standardkurve mit 1,6 - 50 µM Natriumnitrit in
Kulturmedium mitgeführt.
2.2.4.2
Prostaglandin E2-Messung
mittels
Enzyme-linked
immunosorbent
assay (PGE2-EIA)
Die PGE2-Sekretion von Knochenmarkmakrophagen in Kulturüberstände wurde mit Hilfe
eines kompetitiven EIAs der Firma R&D Systems® bestimmt. Die Analyse basiert auf
einer, der Reihenfolge nach ablaufenden, kompetitiven Bindungsmethode, in der in einer
Probe
enthaltenes
PGE2
mit
einem
Meerrettich-Peroxidase-markierten
PGE2
(horseradish peroxidase-labeled PGE2, HRP-PGE2) um eine begrenzte Anzahl an
Bindungsstellen muriner monoklonaler Antikörper konkurriert. Während der ersten
Inkubation wird dem in der Probe enthaltenen PGE2 ermöglicht, an die Antikörper zu
binden. In der zweiten Inkubation werden die verbleibenden freien Bindungsstellen mit
dem
HRP-markierten
PGE2
gesättigt.
Nach
Waschschritten
zur
Beseitigung
ungebundenen Materials wird eine Substratlösung zugefügt, um die gebundene
Enzymaktivität zu bestimmen. Abschließend wird die Farbentwicklung gestoppt und die
Absorption bei 450 nm gemessen. Dabei ist die Intensität der Farbe umgekehrt
proportional zu der PGE2-Konzentration der Probe.
55
Material und Methoden
Für die PGE2-Messung wurden die zu untersuchenden Kulturüberstände 1:6 mit dem
Calibrator Diluent RD5-56 verdünnt. Zudem wurde der PGE2-Standard mit 1 ml A. bidest
auf eine Endkonzentration von 25.000 pg/ml gelöst, gut gemischt und 15 min bei RT
inkubiert. Folgend wurde der PGE2-Standard 1:10 mit dem Calibrator Diluent RD5-56
verdünnt und für die Standardkurve eine weitere 1:2-Verdünnungsreihe wie in Tabelle 5
gezeigt, hergestellt.
Tabelle 5: Verdünnungsschema des PGE2-Standards zur Erstellung der Standardkurve eines
PGE2-EIAs ausgehend von einer Konzentration von 25.000 pg/ml PGE2.
Well
Nummer
Volumen des Calibrator
Diluents RD5-56 [µl]
Volumen des PGE2Standards [µl]
Konzentration des
Standards [pg/ml]
1
900
100
2.500
2
500
500
1.250
3
500
500
625
4
500
500
312,5
5
500
500
156
6
500
500
78
7
1000
-
0
Sowohl 150 µl der verdünnten Proben als auch 150 µl der Verdünnungen des Standards
wurden jeweils in eines der Wells der 96-Well ELISA-Platte gegeben und anschließend
mit 50 µl der Lösung des primären Antikörpers auf einem Mikroplattenschüttler bei
500 rpm für 1 h bei RT inkubiert. Um Absorptionshintergründe durch den primären
Antikörper auszuschließen, wurde ein Well mit 200 µl Calibrator Diluent RD5-56 befüllt,
jedoch fand keine Inkubation mit der primären Antikörper-Lösung statt. Nach der
einstündigen Inkubation wurden 50 µl des PGE2-Konjugates zu jedem Well gegeben.
Darauf wurde die 96-Well Platte kurz geschwenkt und für 18 h bei 4°C inkubiert. Im
Anschluss wurde der Flüssigkeitsüberstand der Wells verworfen und die Platte viermal
mit 400 µl Waschpuffer pro Well gewaschen. Nach der gründlichen Beseitigung des
Waschpuffers nach dem vierten Waschschritt wurden zu jedem Well 200 µl
Substratlösung gegeben und die Platte 30 min bei RT im Dunkeln inkubiert.
Anschließend wurde jedes Well mit 100 µl Stopplösung versetzt und die Platte
geschwenkt, um eine gute Vermischung zu gewährleisten. Innerhalb der folgenden
30 min wurde die Extinktion bei Wellenlängen von 450 und 540 nm gemessen. Die
Messungen erfolgten unter Verwendung eines Multiskan®EX der Firma Thermo
Scientific. Zur Datenanalyse mittels der Ascent Software Version 2.6 (St. Johann in Tirol
Österreich) wurde die gemessene Extinktion bei 540 nm (Referenzwellenlänge) von der
bei 450 nm subtrahiert, um mögliche optische Fehler in der Platte zu korrigieren.
56
Material und Methoden
Weiterhin wurde die Extinktion des Ansatzes ohne primären Antikörper von den
Extinktionen sowohl der Proben- als auch der Standardansätze subtrahiert. Mit Hilfe
kubischer
Splines
wurden
die
jeweiligen
Angleichungen
der
Standardkurven
durchgeführt, die anschließend zur Bestimmung der PGE2-Konzentration der Proben
verwendet
wurde.
Es
wurden
ausschließlich
Duplikatmessungen
jeder
zu
Chemokinkonzentration
in
untersuchenden Probe vorgenommen.
2.2.5
Bestimmung
der
Cytokin-
bzw.
Kulturüberständen mittels BDTM Cytometric Bead Array (CBA)
Mouse Inflammation Kit
Um die Konzentration der in das Kulturmedium sekretierten Cytokine IL-12p70, TNF,
IFNγ, IL-10 und IL-6 sowie des Chemokins MCP-1 zu bestimmen, wurde der BDTM CBA
Mouse Inflammation Kit der Firma BD Biosciences verwendet. Durch die parallele
Nutzung von Beads unterschiedlicher Spezifität ermöglicht diese Analyse die
gleichzeitige Konzentrationsmessung verschiedener Cytokine bzw. Chemokine. Jedes
Bead besitzt nur Fangantikörper einer Spezifität. Jedoch unterscheiden sich die
Fluoreszenzintensitäten der Beads verschiedener Cytokin- bzw. Chemokinspezifität,
wodurch die einzelnen Cytokine bzw. Chemokine voneinander abgegrenzt werden. Die
Beads, die Phytoerythrin (PE)-gekoppelten Detektionsantikörper und die rekombinanten
Standards oder Proben werden zusammen inkubiert, um Sandwich-Komplexe zu bilden,
die durch Durchflusszytometrie mittels FACScan Cytometer der Firma Becton Dickinson
detektiert und anschließend mit Hilfe der CellQuest Pro Software dargestellt werden.
Zur Herstellung der Eichkurve wurde der lyophilisierte Mouse Inflammation Standard in
1 ml Assay Diluent mit einer Endkonzentration von 10.000 pg/ml gelöst und 15 min auf
Eis inkubiert. Anschließend wurde eine 1:2-Verdünnungsreihe hergestellt (Tabelle 6).
Kulturüberstande von Versuchsansätzen, die mit Burkholderia-Spezies infiziert wurden,
wurden vor der Verwendung für 10 min mit UV-Licht bestrahlt, um mögliche bakterielle
Kontaminationen zu unterbinden. Die zu analysierenden Kulturüberstände wurden 1:3
mit dem Assay Diluent verdünnt. Zur Messung wurden 40 µl einer 1:1-Lösung aus BeadMixtur und PE-Reagenz in FACS Röhrchen vorgelegt und je 20 µl Standard oder Probe
zugefügt. Nach einer zweistündigen Inkubation bei RT und Dunkelheit wurden die
Proben mit 200 µl Waschpuffer versetzt, 4 min bei 200xg und RT zentrifugiert und der
Überstand verworfen. Anschließend wurde das Beadpellet in 200 µl Waschpuffer
resuspendiert.
57
Material und Methoden
Tabelle 6: Verdünnungsschema des CBA-Standards.
FACS Röhrchennummer
Volumen des Assay
Diluents [µl]
Volumen des
Standards [µl]
Konzentration des
Standards [pg/ml]
1
-
75
10.000
2
75
75
5.000
3
75
75
2.500
4
75
75
1.250
5
75
75
625
6
75
75
312,5
7
75
75
156
8
75
75
80
9
75
75
40
10
75
75
20
11
75
-
0
Zudem wurden je 50 µl Setup-Beads in drei weitere FACS Röhrchen (A, B und C)
gegeben. In Röhrchen B und C wurden außerdem je 50 µl FITC- bzw. PE Positive
Control Detektor zugeführt. Diese drei Ansätze wurden daraufhin für 30 min im Dunkeln
bei RT inkubiert, anschließend mit Waschpuffer auf ein Gesamtvolumen von 500 µl
aufgefüllt und dienten so zur Kalibrierung des FACS-Gerätes. Im direkten Anschluss an
die Kalibrierung erfolgte die Messung der Standardreihe und der einzelnen Proben.
2.2.6
Immunfluoreszenz
Die indirekte Immunfluoreszenz dient der subzellulären Lokalisation von Proteinen in
Zellen. Dafür wurden 125.000 Zellen in 1 ml Kulturmedium pro Well einer 24-Well Platte
auf einem Deckglas (Ø 13 mm) ausgesät. Die Stimulation der Zellen erfolgte wie unter
Abschnitt 2.2.1.4 beschrieben. Nach einer Inkubationszeit von 240 min mit den
Stimulatoren wurde das Kulturmedium abgesaugt und die Zellen wurden einmal mit 1 ml
eiskaltem PBS gewaschen. Durch 10-minütige Inkubation bei -20°C in 1 ml eiskaltem
Methanol wurden die Zellen auf dem Deckglas fixiert. Darauf wurden die Zellen auf dem
Schüttler dreimal 5 min mit IF-Puffer gewaschen und anschließend die unspezifischen
Bindungsstellen 1 h bei RT in IF-Puffer blockiert, woraufhin die Zellen erneut dreimal
5 min mit IF-Puffer gewaschen wurden. Anschließend wurden die Zellen über Nacht bei
4°C in einer feuchten Kammer mit 200 µl des Primära ntikörpers inkubiert, anschließend
dreimal 5 min mit IF-Puffer gewaschen und für 1 h bei RT und im Dunkeln mit 200 µl des
Cy2-gekoppelten
58
Sekundärantikörpers
inkubiert.
Danach
wurden
die
Material und Methoden
Knochenmarkmakrophagen dreimal mit IF-Puffer gewaschen und mit Fluoprep
eingedeckt. Die Zellen wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop BZ-9000 der Firma
Keyence mittels der Software BZ-II-Viewer betrachtet und das Ergebnis mit Hilfe der
Software BZ-II-Analyser dokumentiert.
2.2.7
Graphische Darstellung und statistische Analyse
Die graphische Darstellung und die statistische Analyse der Ergebnisse erfolgte mit Hilfe
von GraphPad Prism Version 5.03 für Windows, GraphPad Software (San Diego
Californien USA). Für die statistische Analyse der Datenmengen wurden zwei
verschiedene Tests, einerseits one-way ANOVA mit anschließendem Bonferroni-Test als
Post hoc-Verfahren und andererseits Kruskal Wallis mit anschließendem Dunn’s Test als
Post hoc-Verfahren verwendet. Dabei entsprach *p<0,05, **p<0,01; ***p<0,001.
Mit einer einfaktoriellen Varianzanalyse (one-way analysis of variance, one-way
ANOVA) kann bei unabhängigen Stichproben, eine Hypothese überprüft werden, nach
der
die
Mittelwerte
einer
Variablen
in
verschiedenen
Fallgruppen
in
der
Grundgesamtheit gleich groß sind. Der einfaktorielle ANOVA wurde verwendet, weil
einer der wesentlichen Unterschiede der einfaktoriellen ANOVA gegenüber dem t-Test
bei unabhängigen Stichproben darin besteht, dass mit der ANOVA mehrere Mittelwerte
miteinander verglichen werden können, während der t-Test nur den Vergleich zweier
Mittelwerte zulässt. An die one-way ANOVA wurde ein Bonferroni-Test angeschlossen.
Dieser bietet die Möglichkeit, einzelne Datengruppen gleichzeitig miteinander zu
vergleichen und gewährleistet dabei, im Gegensatz zum multiplen Testen in derselben
Grundgesamtheit mittels t-Tests, die Neutralisierung der α-Fehler-Kumulierung bei
multiplen Paarvergleichen. Der Kruskal-Wallis Test, auch H-Test genannt, ist eine
Verallgemeinerung des U-Tests für den Vergleich von drei oder mehr ungepaarten
Gruppen. Der U-Test (Mann-Whitney-Wilcoxon Test) prüft über die Rangplatzsummen,
ob die Mittelwerte zweier Stichproben gleich sind. Sowohl der U-Test als auch der
H-Test werden eingesetzt, wenn keine Normalverteilung vorausgesetzt werden kann.
Der Kruskal-Wallis Test wurde dann verwendet, wenn die Effekte einer zeit- oder
konzentrationsabhängigen Stimulation statistisch erfasst werden sollten. Mit einem Post
hoc-Verfahren wurde überprüft, welche Gruppen sich signifikant unterschieden. Da die
Mittelwerte aller Gruppen dabei ausschließlich in Bezug auf die Mittelwerte einer
Kontrollgruppe statistisch ausgewertet werden sollten, wurde dazu der Dunn’s Test
herangezogen. Dieser vergleicht, basierend auf der Anzahl der Gruppen und ihrer
Größe, die Unterschiede der Rangplatzsummen zwischen zwei Gruppen.
59
Ergebnisse und Diskussion
3
Ergebnisse und Diskussion
3.1
Regulation der Genexpression von Peroxiredoxinen durch
LPS und IFNγγ in primären Makrophagen
Während einer Infektion durch eine Vielzahl von Pathogenen stellen Makrophagen
diejenigen
Immunzellen
vorherrschend
sind
und
dar,
die
folglich
direkt
am
Infektions-
Schlüsselfunktionen
bei
und
Entzündungsort
der
Regulation
der
Immunantwort und Entzündung erfüllen (Van Amersfoort et al., 2003). Makrophagen
können über den klassischen Weg durch IFNγ und alternativ durch TNFα,
Mikroorganismen oder mikrobielle Produkte wie LPS aktiviert werden (Mosser 2003). In
Antwort auf diese Stimuli wird von aktivierten Makrophagen ein vielseitiges Repertoir
inflammatorischer
Mediatoren
gebildet.
Dazu
zählen
beispielsweise
Cytokine,
Chemokine und Lipidmediatoren sowie Enzyme wie die induzierbare NO-Synthase
(iNOS), die NADPH-Oxidase und die Cyclooxygenase-2 (COX-2). Diese Enzyme sind in
der Lage, reaktive Sauerstoff- und Stickstoffintermediate zu bilden, die ihrerseits neben
regulatorischen Funktionen auch antimikrobielle Wirkungen besitzen (Bogdan et al.,
2000). Peroxiredoxine sind an einer Vielzahl zellulärer Prozesse wie der Antwort auf
oxidativen Stress, der Zellproliferation und Differenzierung beteiligt (Fujii und Ikeda 2002;
Immenschuh und Baumgart-Vogt 2005; Rhee et al., 2005a). Dabei wird ihre Expression
in verschiedenen Zellkulturmodellen durch unterschiedliche Stimulatoren wie Oxidantien,
Cytokine sowie mikrobielle Bestandteile beeinflusst.
Im ersten Abschnitt dieser Arbeit sollte analysiert werden, ob und gegebenenfalls durch
welche Signalmoleküle vermittelt, die Expression von Peroxiredoxinen in murinen
Knochenmarkmakrophagen durch die Behandlung mit LPS und IFNγ induziert wird.
Daher wurden vorerst die Genexpressionsmuster der Prxs nach Behandlung von
primären Makrophagen mit LPS und/oder IFNγ untersucht und folgend die Änderung der
Genexpression spezifischer Prxs näher analysiert. Um mögliche Mediatoren der
Signaltransduktion zu ermitteln, die zur Geninduktion der Peroxiredoxine nach LPS- und
IFNγ-Stimulation beitragen, wurde neben dem Einfluss von Cytokinen die Beteiligung
von iNOS, der NADPH-Oxidase und von COX-Enzymen untersucht. Des Weiteren
wurde eine mögliche Beteiligung der Januskinase-2, Phosphatidylinositol-3-Kinase, der
Mitogen-aktivierten
Proteinkinasen
und
Proteinkinase C
sowie
der
Transkriptionsfaktoren PPARγ und Nrf2 an der Regulation der Peroxiredoxine überprüft.
60
Ergebnisse und Diskussion
3.1.1
Die Genexpression von Prx 1, 2, 4, 5 und 6 wird durch LPS und
IFNγγ induziert
Kürzlich wurde gezeigt, dass die mRNA-Expression von Prx 1, 5 und 6 durch LPSund/oder IFNγ-Stimulation induziert wird, wenn Knochenmarkmakrophagen (bone
marrow-derived macrophages, BMM) von C57BL/6-Mäusen unter serumhaltigen
Bedingungen kultiviert werden (Diet et al., 2007). Daher sollte im ersten Abschnitt dieser
Arbeit die Genexpression von Prxs nach Stimulation mit LPS und/oder IFNγ in C57BL/6
und
BALB/c
BMM
untersucht
werden,
die
in
Anwesenheit
von
5%
des
Serumersatzstoffes PANEXIN BMM® kultiviert wurden. Dafür wurden BMM von
C57BL/6- und BALB/c-Mäusen für 18 h mit 100 ng/ml LPS und/oder 100 U/ml IFNγ
behandelt und die relative Genexpression von Prx 1 - 6 mit Hilfe der quantitativen
Real-Time PCR analysiert, wobei RPLP0 (ribosomal protein, large P0) als Referenzgen
diente. Unbehandelte BMM fungierten dabei als Kontrollen und wurden auf 1 normiert,
die wiederum in ein relatives Verhältnis zu den jeweiligen Stimulationsansätzen gesetzt
wurden. Abbildung 5C und Abbildung 6B zeigen, dass die Genexpression von Prx 1, 2, 5
und 6 durch Stimulation mit LPS induziert wird, wohingegen die Genexpression von
Prx 3 und 4 unverändert bleibt. Die Behandlung von C57BL/6 und BALB/c BMM mit IFNγ
führt zudem zu keiner Änderung der mRNA-Expression von Prx 1 – 6. Demgegenüber
resultierte die Kostimulation mit LPS und IFNγ in der stärksten Erhöhung der
Genexpression von Prx 1, 2, 4, 5 und 6, wobei die Transkription von Prx 4, 5 und 6 in
den BMM beider Mäusestämme signifikant stärker durch LPS und IFNγ anstieg als durch
alleinige LPS-Stimulation (Abb. 5C, 6B). Des Weiteren ergab die Nitritmessung von
Zellkulturüberständen mittels Griess Reagent, dass die NO-Bildung durch die
Stimulation mit LPS oder IFNγ sowohl in C57BL/6 (Abb. 5A) als auch BALB/c BMM
(Abb. 6A) nicht signifikant verändert wird, jedoch die Kostimulation zu einer deutlichen
Zunahme der Nitrit-Produktion führt. Damit korrelierend zeigte sich der Nachweis der
Proteinexpression von iNOS mittels Western Blots in C57BL/6 BMM in Abbildung 5B.
Durch
18-stündige
Kostimulation
wurde
ein
deutlicher
Anstieg
der
iNOS-Proteinexpression detektiert, wohingegen iNOS sowohl in unbehandelten als auch
in LPS- oder IFNγ-stimulierten C57BL/6 BMM nicht exprimiert wurde. Zudem konnte
gezeigt werden, dass die Proteinexpression von COX-2 sowohl in unbehandelten als
auch IFNγ-behandelten BMM nicht nachweisbar ist, jedoch durch LPS-Stimulation
geringfügig induziert wird und durch Stimulation mit LPS und IFNγ maximal ansteigt
(Abb. 5B).
61
Ergebnisse und Diskussion
A
B
iNOS
COX-2
GAPDH
-
+
LPS
-
-
+
-
+
+
IFNγ
-
-
+
-
+
+
+
-
+
-
-
+
LPS
+
+
IFNγ
C
-
+
-
+
+
+
LPS
IFNγ
Abbildung 5: Änderung der Genexpression von Prx 1 – 6 durch Stimulation von C57BL/6 BMM mit
LPS und/oder IFNγγ. C57BL/6 BMM wurden für 18 h mit 100 ng/ml LPS und/oder 100 U/ml IFNγ stimuliert.
Als Kontrolle dienten unbehandelte C57BL/6 BMM. (A) Die Nitritkonzentration in den Zellkulturüberständen
wurde kolorimetrisch mit dem Griess Reagent bestimmt. (B) Die Proteinexpression von iNOS und COX-2
wurde mittels Western Blots analysiert, wobei GAPDH als Ladungskontrolle diente. Der dargestellte Western
Blot ist repräsentativ für drei unabhängige Experimente. (C) Die relative Genexpression von Prx 1 – 6 wurde
durch quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) analysiert, wobei RPLP0 als Referenzgen verwendet wurde.
Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=5). Die statistische
Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni
post-Test.
62
Ergebnisse und Diskussion
A
-
+
-
+
+
+
-
+
-
+
+
+
LPS
IFNγ
B
-
+
-
+
+
+
LPS
IFNγ
Abbildung 6: Änderung der Genexpression von Prx 1 – 6 durch Stimulation mit LPS und/oder IFNγγ in
BALB/c BMM. BALB/c BMM wurden für 18 h mit 100 ng/ml LPS und/oder 100 U/ml IFNγ stimuliert. Als
Kontrolle dienten unbehandelte BALB/c BMM. (A) Die Nitritkonzentration in den Zellkulturüberständen wurde
kolorimetrisch mit dem Griess Reagent bestimmt. (B) Die relative mRNA-Menge von Prx 1 – 6 wurde durch
qRT-PCR ermittelt, wobei RPLP0 als Referenzgen verwendet wurde. Die Graphen repräsentieren den
Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=6). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der
Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
63
Ergebnisse und Diskussion
Um zu untersuchen, ob die erhöhte mRNA-Menge der Prxs in immunstimulierten
Knochenmarkmakrophagen außerdem zu einer Zunahme der Proteinexpression führt,
wurden C57BL/6 BMM wiederum für 18 h mit 100 ng/ml LPS und/oder 100 U/ml
IFNγ behandelt und die Gesamtproteinextrakte hergestellt. 20 µg Gesamtprotein wurden
mittels Immunoblots, die Proteinexpression von Prx 1- 6 betreffend, analysiert. Als
Referenzprotein diente dabei die konstitutiv exprimierte Glycerinaldehyd-3-phosphatDehydrogenase (GAPDH). Wie in Abbildung 7 dargestellt, konnte eine basale
Proteinexpression aller Prxs detektiert werden. Zusätzlich wurde eine unveränderte
Proteinexpression von Prx 1 – 4 durch Behandlung mit LPS und/oder IFNγ beobachtet,
während die von Prx 6 durch Stimulation mit LPS und IFNγ leicht erhöht wurde. Ähnlich
dem Expressionsmuster auf mRNA-Ebene führte die Stimulation mit LPS zu einem
deutlichen Anstieg der Prx 5-Proteinexpression, obgleich die Kostimulation mit LPS und
IFNγ in der stärksten Zunahme der Proteinexpression von Prx 5 resultierte (Abb. 7).
Prx 1
Prx 2
Prx 3
Prx 4
Prx 5
Prx 6
GAPDH
-
+
-
-
+
LPS
+
+
IFNγ
Abbildung 7: Änderung der Proteinexpression von Prx 1 – 6 durch Stimulation mit LPS und/oder
IFNγγ in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM blieben unbehandelt oder wurden für 18 h mit 100 ng/ml LPS
und/oder 100 U/ml IFNγ inkubiert. Jeweils 20 µg der Gesamtproteinextrakte wurden durch Western Blot mit
Hilfe spezifischer Antikörper gegen Prx 1 – 6 analysiert. Als Ladungskontrolle diente die Glycerinaldehyd-3phosphat-Dehydrogenase (GAPDH), die konstitutiv exprimiert wird. Der dargestellte Western Blot ist
repräsentativ für zwei unabhängige Experimente.
64
Ergebnisse und Diskussion
Nachdem gezeigt werden konnte, dass die 18-stündige LPS- und IFNγ-Stimulation in der
Induktion von Prx 1, 2, 4, 5 und 6 resultiert, sollte der Zeitverlauf der Erhöhung der am
stärksten induzierten Prxs, Prx 1, 5 und 6, näher untersucht werden. Dafür wurden
Knochenmarkmakrophagen von C57BL/6-Mäusen für 3, 6, 9, 12, 18 und 24 h mit
100 ng/ml
LPS
und
100 U/ml
IFNγ
stimuliert,
die
NO-Bildung
in
den
Zellkulturüberständen bestimmt und die Genexpression der Prxs mittels qRT-PCR
analysiert. Dabei begann die Nitritkonzentration nach 12-stündiger Kostimulation
anzusteigen, die im Untersuchungszeitraum ihr Maximum nach 24 h erreichte (Abb. 8).
Die Genexpression der drei untersuchten Prxs wurde zudem über die Zeit induziert,
jedoch zeigte sich für Prx 1, 5 und 6 jeweils ein unterschiedliches zeitabhängiges
Expressionsmuster. Die Genexpression von Prx 1 wurde durch Kostimulation mit LPS
und IFNγ sehr langsam aber kontinuierlich induziert und erreichte ihr Maximum nach
24 h. Hingegen wurde die Prx 5-mRNA frühzeitig induziert und erreichte bereits nach
6-stündiger
Stimulation
eine
4-fache
Erhöhung.
Die
stärkste
Induktion
der
Prx 5-Genexpression wurde nach 18 h mit einer Zunahme auf das 12-Fache erreicht
und blieb nach 24 h nahezu gleich stark erhöht (Abb. 8). Im Gegensatz zu Prx 5 wurde
beobachtet, dass die Transkription von Prx 6 zeitverzögert induziert wird, ein Anstieg
erst nach 18-stündiger Stimulation zu erkennen ist und das Maximum der
Prx 6-Induktion nach 24 h erreicht wird. Des Weiteren wurde festgestellt, dass die
basale Genexpression von Prx 1 und 6 zum 3 h-Zeitpunkt im Vergleich zum
24 h-Zeitpunkt erhöht ist, jedoch die von Prx 5 zu beiden Zeitpunkten nahezu identisch
ist. Mowbray et al. zeigten, dass Prxs durch Scherstress in Endothelzellen reguliert
werden. Die durch Scherstress-induzierte Expression von Prx 1 spielt dabei eine
entscheidende Rolle bei der Regulation von ROS, die durch Scherstress vermehrt
gebildet werden (Mowbray et al., 2008). Dieses könnte erklären, weshalb die basale
Genexpression von Prx 1 und möglicherweise auch von Prx 6 zum 3 h-Zeitpunkt höher
ist als zum späteren Zeitpunkt, während Prx 5 nicht durch mechanischen Stress
induzierbar scheint. Bei der Aussaat der primären Makrophagen wirken sowohl durch
die Ablösung der adhärenten Makrophagen vom Zellkulturflaschenboden mittels
Zellschabers als auch durch Resuspendierung der Zellen mäßige Scherkräfte, die die
Expression von Prxs zumindest kurzzeitig beeinflussen können.
65
Ergebnisse und Diskussion
3
-
3
6
24 24
-
3
-
3
6
12 18 24 24
LPS/IFNγ
3
-
3
6
9
12 18
LPS/IFNγ
3
-
3
6
9
12 18 24 24 Zeit [h]
LPS/IFNγ
9
9
12 18 24 24 Zeit [h]
LPS/IFNγ
Abbildung 8: Zeitabhängige Induktion der Genexpression von Prx 1, 5 und Prx 6 durch LPS- und
IFNγγ-Stimulation in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM blieben unbehandelt oder wurden für 3, 6, 9, 12, 18 und
24 h mit 100 ng/ml LPS und 100 U/ml IFNγ inkubiert. Die Nitritkonzentration in den Zellkulturüberständen
wurde mittels Griess Reagent bestimmt. Der relative mRNA-Gehalt von Prx 1, 5 und 6 wurde mittels
qRT-PCR bestimmt. Dabei diente RPLP0 als Referenzgen. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit
dem Fehler des Mittelwertes (n=5). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit
dem Kruskal-Wallis Test und anschließendem Dunn’s post-Test.
Übereinstimmend mit den hier dargestellten Daten (Abb. 5) zeigten Diet et al., dass die
18-stündige Behandlung von C57BL/6 BMM zu einer Induktion der Prx 1-, 5- und
6-Genexpression führt. Des Weiteren wurde eine erhöhte Proteinexpression von Prx 1
bzw. Prx 6 nach 20- bzw. 18-stündiger Stimulation mit LPS und IFNγ nachgewiesen. Im
Gegensatz zu den in Abbildung 5 präsentierten Daten wurde jedoch von der
Arbeitsgruppe um Diet eine nach 18-stündiger Inkubation mit LPS und IFNγ
unveränderte Prx 2- und verminderte Prx 4-mRNA-Expression detektiert (Diet et al.,
2007). Diese Unterschiede im Expressionsmuster der Prxs lassen sich möglicherweise
auf voneinander abweichende Kultivierungsbedingungen zurückführen. Während in
dieser Arbeit die Kultivierung der Makrophagen unter serumfreien Bedingungen mittels
des Serumersatzstoffes PANEXIN BMM® durchgeführt wurde, wurden bisher für
Untersuchungen
der
Genexpression
der
Prxs
in
Knochenmarkmakrophagen
ausschließlich serumhaltige Zellkultivierungsmethoden genutzt. Es ist allgemein bekannt,
dass Serum eine Vielzahl von Bestandteilen wie Cytokine, Glucocorticoide und andere
66
Ergebnisse und Diskussion
Hormone sowie Endotoxine beinhaltet. Diese sind nicht definiert bzw. standardisiert und
können stark zwischen einzelnen Serumchargen variieren, wodurch die Makrophagen
im Voraus unterschiedlich stark aktiviert und beeinflusst werden können. Trotzdem
zeigten dieser Arbeit vorangehende Untersuchungen der Genexpression der Prxs in
RAW264.7-Makrophagen nach LPS- und IFNγ-Behandlung, dass mit Hilfe der
standardisierten, serumfreien Kultivierung die Reproduzierbarkeit der einzelnen
Experimente gegenüber der serumhaltigen Kultivierung erhöht wird. Jedoch zeichneten
sich auch in diesem Fall Diskrepanzen in den Expressionsmustern der Prxs zwischen
beiden Kultivierungsweisen ab (Daten nicht dargestellt). Obwohl die Standardisierung
der serumfreien Kultivierung offensichtliche Vorteile mitsichbringt, ist zu beachten, dass
diese vereinfachten Kulturbedingungen mögliche Nachteile, wie das Fehlen bis heute
unbekannter,
aber
physiologisch
wichtiger
Inhaltsstoffe
birgt,
die
wiederum
experimentelle Unterschiede zum serumhaltigen System zur Folge haben.
67
Ergebnisse und Diskussion
3.1.2
TNFα
α und IFNγγ wirken induzierend auf die Genexpression von
Prx 1 und 5
Eine Vielzahl von Studien belegt eine durch LPS und IFNγ-Stimulation von Makrophagen
hervorgerufene Sekretion inflammatorischer Cytokine. Beispielsweise wurde in humanen
Alveolarmakrophagen gezeigt, dass die Sekretion von TNFα, IL-1β und IL-6 durch
Stimulation mit LPS induziert wird (Losa Garcia et al., 1999) oder die Behandlung von
humanen Kupfferzellen mit LPS eine Zunahme der IL-6-Expression zur Folge hat
(Callery et al., 1992). Des Weiteren wurde in der Makrophagenzelllinie RAW264.7 sowie
in
peripheren
Monozyten
nachgewiesen,
dass
auch
andere
bakterielle
Zellwandbestandteile wie Muramyldipeptid eine Induktion der TNFα-, IL-1β- und IL-6Sekretion bewirken (Adams und Czuprynski 1994).
Um zu untersuchen, ob inflammatorische Cytokine einen Einfluss auf die Genexpression
von Peroxiredoxinen haben, wurde zunächst die zeitabhängige Genexpression von
IL-1β, IL-6 und TNFα (Abb. 9) sowie die Sekretion des Chemokins MCP-1 und der
Cytokine IFNγ, IL-12, IL-6 und TNFα (Abb. 10) nach LPS- und IFNγ-Stimulation über
einen Zeitraum von 3 - 24 h bestimmt. Dabei nahm die mRNA-Expression von IL-1β,
IL-6 und TNFα bereits nach 3-stündiger Stimulation zu. Die IL-1β-Transkription erreichte
nach 12 h ihr Maximum, das mit einer 1500-fachen Erhöhung bis zum 24 h-Zeitpunkt
nahezu gleich blieb. Im Gegensatz dazu wurde sowohl die Genexpression von IL-6 mit
einer 4500-fachen als auch die von TNFα mit einer 90-fachen Erhöhung nach
6-stündiger LPS- und IFNγ-Stimulation maximal induziert. Anschließend nahm die
mRNA-Menge beider Cytokine im Zeitverlauf kontinuierlich ab. Die 24-stündige
Stimulation resultierte in einer Zunahme der IL-6-Transkription auf das 3000-Fache und
der von TNFα auf das 25-Fache (Abb. 9).
68
Ergebnisse und Diskussion
3
-
3
6
9
12 18 24 24
LPS/IFNγ
3
-
3
6
12 18 24 24 Zeit [h]
LPS/IFNγ
9
Abbildung 9: Zeitabhängige Induktion der Genexpression von IL-1β
β, IL-6 und TNFα
α durch LPS- und
IFNγγ-Stimulation in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM blieben unbehandelt oder wurden für 3, 6, 9, 12, 18 und
24 h mit 100 ng/ml LPS und 100 U/ml IFNγ inkubiert. Der relative mRNA-Gehalt von IL-1β, IL-6 und TNFα
wurde mittels qRT-PCR bestimmt. Dabei diente RPLP0 als Referenzgen. Die Graphen repräsentieren den
Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=5). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der
Gruppen mit dem Kruskal-Wallis Test und anschließendem Dunn’s post-Test.
Darüber hinaus zeigt Abbildung 10 die Sekretion von MCP-1, IFNγ, IL-12, IL-6 und TNFα.
Das Chemokin MCP-1 war in Kulturüberständen unbehandelter C57BL/6 BMM deutlich
nachweisbar, wohingegen die Sekretion der Cytokine IL-12 und IL-6 nicht nachweisbar
war und die von TNFα sehr gering ausfiel. Die Sekretion von IFNγ wurde durch
Kostimulation induziert, änderte sich jedoch über den gesamten Zeitverlauf nicht deutlich.
Eine ansteigende Freisetzung von MCP-1 und TNFα wurde bereits nach 3-stündiger
Kostimulation, die von IL-6 nach 6 h und die von IL-12 nach 9 h beobachtet. Das
Maximum der Sekretion von MCP-1, IL-12, IL-6 und TNFα wurde jeweils nach
18-stündiger Kostimulation detektiert (Abb. 10). Der zeitliche Verlauf der Sekretion von
IL-6 und TNFα durch LPS und IFNγ korreliert mit den Induktionen der Genexpression
dieser Cytokine, die deutlich früher ihre Maxima erreichten (Abb. 9).
69
Ergebnisse und Diskussion
3
-
3
6
9
12 18 24 24
LPS/IFNγ
3
-
3
6
9
12 18 24 24 Zeit [h]
LPS/IFNγ
Abbildung 10: Zeitabhängige Induktion der MCP-1-, IFNγγ-, IL-12-, IL-6- und TNFα
α-Sekretion durch
LPS- und IFNγγ-Stimulation in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM blieben unbehandelt oder wurden für 3, 6, 9,
12, 18 und 24 h mit 100 ng/ml LPS und 100 U/ml IFNγ inkubiert. Die Cytokin- bzw.
Chemokinkonzentrationen in den Zellkulturüberständen wurden mittels Durchflusszytometrie mit dem
TM
BD Cytometric Bead Array Mouse Inflammation Kit bestimmt. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert
mit dem Fehler des Mittelwertes (n=5). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit
dem Kruskal-Wallis Test und anschließendem Dunn’s post-Test.
70
Ergebnisse und Diskussion
Im Anschluss an den Nachweis der erhöhten Genexpression und Sekretion dieser
Cytokine durch Kostimulation mit LPS und IFNγ sollte nun analysiert werden, ob die
Behandlung von C57BL/6 BMM mit den proinflammatorisch wirkenden Cytokinen TNFα
und IL-6 sowie dem Chemokin MCP-1 die Genexpression der Prxs verändert. Dabei
wurde gezeigt, dass die 3 - 24-stündige Stimulation mit 10 ng/ml MCP-1 bzw. 100 U/ml
IL-6 keinen Einfluss auf die mRNA-Transkription der Prxs besitzt (Daten nicht
dargestellt). Verschiedene Arbeitsgruppen zeigten in unterschiedlichen Zelltypen eine
Erhöhung der Expression von Prxs nach TNFα-Behandlung wie zum Beispiel die
Zunahme der Prx 1-Genexpression in Kupfferzellen von Ratten sowie die Induzierbarkeit
der Prx 6-mRNA-Menge in Linsenepithelzellen oder Hepatozyten (Immenschuh et al.,
1999; Kubo et al., 2006; Gallagher und Phelan 2007). Da seit langem bekannt ist, dass
niedrige endogene Konzentrationen an TNFα, die durch Makrophagen gebildet werden,
mit IFNγ eine synergistische Aktivierung von Makrophagen bewirken (Ding et al., 1988;
Drapier et al., 1988), wurde die Nitritkonzentration und die Genexpression von Prx 1, 5
und 6 sowie IL-1β, IL-6 und TNFα nach 18-stündiger Stimulation mit 100 U/ml IFNγ
und/oder 100 ng/ml LPS bzw. 10 ng/ml TNFα in C57BL/6 und BALB/c BMM untersucht.
Abbildung 11A verdeutlicht, dass sowohl die IFNγ- und TNFα- als auch die
LPS-Stimulation in keiner Änderung der NO-Produktion von C57BL/6 oder BALB/c BMM
resultiert. Hingegen führte die Kostimulation mit LPS und IFNγ, jedoch nicht IFNγ und
TNFα, zu einer signifikant höheren Nitritkonzentration in Zellkulturüberständen von
C57BL/6 im Vergleich zu BALB/c BMM (Abb. 11A).
Des Weiteren wurde die Genexpression von Prx 1 und 6 durch LPS- und IFNγStimulation in C57BL/6 BMM stärker induziert als in BALB/c BMM (Abb. 11B),
wohingegen die relative Genexpression von Prx 5 in Knochenmarkmakrophagen beider
untersuchter Mausstämme nahezu identisch induziert nachgewiesen wurde. Zudem
wurde die Genexpression von IL-1β, IL-6 und TNFα durch LPS oder LPS und IFNγ in
C57BL/6 und BALB/c BMM erhöht. Dabei wurde durch die Kostimulation mit LPS und
IFNγ jeweils die stärkste Zunahme der Genexpression erzielt. Der mRNA Gehalt der drei
Cytokine wurde jeweils stärker in C57BL/6 BMM als in BALB/c BMM erhöht (Abb. 12).
Darüber hinaus resultierte die Behandlung mit TNFα in einem geringen, jedoch nicht
signifikanten Anstieg der mRNA-Transkription von Prx 1 und 5. Die Kostimulation mit
TNFα und IFNγ führte zu einer 3 - 4-fachen Erhöhung der Prx 1-Genexpression in
C57BL/6 und BALB/c BMM und zu einer 8-fachen Erhöhung der Prx 5-Genexpression in
C57BL/6 BMM, wohingegen der Prx 5-mRNA-Gehalt in BALB/c BMM nur auf das
5,5-Fache induziert wurde. Im Unterschied dazu bewirkte sowohl TNFα als auch die
71
Ergebnisse und Diskussion
Kombination aus TNFα und IFNγ nur eine geringfügige Änderung der Genexpression
von Prx 6 (Abb. 11B), IL-1β, IL-6 oder TNFα (Abb. 12).
A
-
+
-
+
-
+
+
-
C57BL/6
-
+
-
+
+
-
+
-
+
-
+
+
-
-
+
-
IFNγ
LPS
+
+
TNFα
BALB/c
Abbildung 11A: Einfluss der Stimulation mit IFNγγ und/oder LPS sowie TNFα
α auf den mRNA-Gehalt
von Prx 1, 5 und 6 in C57BL/6 und BALB/c BMM. BMM von C57BL/6- (schwarze Säulen) und BALB/c(weiße Säulen) Mäusen blieben unbehandelt oder wurden für 18 h mit 100 ng/ml LPS, 100 U/ml IFNγ oder
10 ng/ml TNFα sowie den Kombinationen aus IFNγ und LPS bzw. TNFα inkubiert. Die Nitritkonzentration in
den Zellkulturüberständen wurde mittels Griess Reagent bestimmt. Die statistische Auswertung erfolgte
durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
72
Ergebnisse und Diskussion
B
-
+
-
-
-
-
+
-
-
-
+
-
+
-
-
+
-
+
+
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-
-
+
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+
-
+
-
-
+
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+
+
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+
+
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+
-
-
C57BL/6
-
-
-
+
-
-
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+
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+
-
+
-
LPS
+
+
TNFα
-
+
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-
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IFNγ
+
-
+
+
-
+
-
+
-
+
-
-
+
-
+
+
IFNγ
LPS
TNFα
IFNγ
LPS
TNFα
BALB/c
Abbildung 11B: Einfluss der Stimulation mit IFNγγ und/oder LPS sowie TNFα
α auf den mRNA-Gehalt
von Prx 1, 5 und 6 in C57BL/6 und BALB/c BMM. BMM von C57BL/6- (schwarze Säulen) und BALB/c(weiße Säulen) Mäusen blieben unbehandelt oder wurden für 18 h mit 100 ng/ml LPS, 100 U/ml IFNγ oder
10 ng/ml TNFα sowie den Kombinationen aus IFNγ und LPS bzw. TNFα inkubiert. Die relative
Genexpression von Prx 1, 5 und 6 wurde durch qRT-PCR bestimmt, wobei RPLP0 als Referenzgen diente.
Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=6). Die statistische
Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem
Bonferroni post-Test.
73
Ergebnisse und Diskussion
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
IFNγ
-
-
-
-
-
+
-
-
+
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+
+
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LPS
TNFα
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+
-
+
+
-
-
C57BL/6
-
-
IFNγ
LPS
TNFα
IFNγ
LPS
TNFα
BALB/c
Abbildung 12: Einfluss der Stimulation mit IFNγγ und/oder LPS sowie TNFα
α auf die mRNA-Menge von
IL-1β
β, IL-6 und TNFα
α in C57BL/6 und BALB/c BMM. BMM von C57BL/6- (schwarze Säulen) und BALB/c(weiße Säulen) Mäusen blieben unbehandelt oder wurden für 18 h mit 100 ng/ml LPS, 100 U/ml IFNγ oder
10 ng/ml TNFα sowie den Kombinationen aus IFNγ und LPS bzw. TNFα inkubiert. Die relative
Genexpression von IL-1β, IL-6 und TNFα wurde durch qRT-PCR bestimmt, wobei RPLP0 als Referenzgen
diente. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=6). Die statistische
Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem
Bonferroni post-Test.
74
Ergebnisse und Diskussion
Um zu untersuchen, ob IL-1β eine Rolle bei der Induktion der Genexpression von Prx 1,
5 oder 6 spielt, wurden C57BL/6 BMM für 18 h mit 50 U/ml IL-1β und/oder 10 ng/ml
TNFα stimuliert. Wie in Abbildung 13 dargestellt, wurde weder die Nitritkonzentration
durch IL-1β- und/oder TNFα-Stimulation drastisch verändert, noch erfolgte eine
Induktion der Genexpression von Prx 1, 5 und 6 durch IL-1β. Bei der Induktion, die durch
IL-1β- und TNFα-Behandlung der BMM hervorgerufen wurde, ist zudem anzunehmen,
dass diese allein auf die Wirkung der TNFα-Stimulation zurückzuführen ist (Abb. 13).
-
+
-
+
-
+
-
+
IL-1β
-
-
+
+
-
-
+
+
TNFα
-
+
-
-
+
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-
+
IL-1β
+
+
-
+
-
+
+
TNFα
-
Abbildung 13: Einfluss der Stimulation mit IL-1β
β und/oder TNFα
α auf die Genexpression von Prx 1, 5
und 6 in C57BL/6 BMM. BMM von C57BL/6-Mäusen blieben unbehandelt oder wurden für 18 h mit 50 U/ml
IL-1β und/oder 10 ng/ml TNFα inkubiert. Die Nitritkonzentration in den Zellkulturüberständen wurde mittels
Griess Reagent bestimmt. Die relative Genexpression von Prx 1, 5 und 6 wurde durch qRT-PCR bestimmt,
wobei RPLP0 als Referenzgen diente. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des
Mittelwertes (n=4). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA
und anschließendem Bonferroni post-Test.
Infolge der Induzierbarkeit der Genexpression von Prx 1 und 5 durch TNFα- bzw. TNFαund IFNγ-Stimulation sowie der erhöhten Sekretion von TNFα durch LPS und IFNγ sollte
nachfolgend mit Hilfe von Knochenmarkmakrophagen von B6;129S-Tnftm1Gkl- (TNFα KO-)
und
B6;129S-Tnfrsf1atm1ImxTnfrsf1btm1Imx-
(TNF-Rezeptor (TNFR) KO-)
Mäusen
untersucht werden, ob die Sekretion von TNFα und der damit verbundene Signalweg
stromabwärts des TNF-Rezeptors für die LPS- und/oder IFNγ-induzierte Transkription
75
Ergebnisse und Diskussion
von Prxs entscheidend ist. Daher wurden BMM von TNFα KO- und TNFR KO-Mäusen
für 18 h mit 100 ng/ml LPS und/oder 100 U/ml IFNγ behandelt und anschließend sowohl
die NO-Bildung als auch die relative Genexpression von Prx 1, 5 und 6 analysiert. Dabei
wurden BMM des Wildtypstammes B6129SF2 der Knockout-Mäuse mitgeführt.
Außerdem wurden BMM von C57BL/6-Mäusen untersucht, um die Vergleichbarkeit zu
vorangegangenen Experimenten zu gewährleisten. Weder die Bestimmung der
Nitritkonzentration noch die Analyse der relativen Genexpression von Prx 1, 5 und 6
nach LPS- und/oder IFNγ-Stimulation zeigten signifikante Unterschiede zwischen
B6129SF2-Wildtyp und C57BL/6 BMM (Daten nicht dargestellt). Die Bestimmung der
Nitritkonzentration in Abbildung 14A belegt eine unveränderte NO-Bildung in
B6129SF2-Wildtyp, TNFR KO und TNFα KO BMM durch LPS oder IFNγ. Die
Kostimulation mit LPS und IFNγ bewirkte hingegen eine deutliche Zunahme der
NO-Bildung von BMM aller verwendeten Mausstämme, wobei die stärkste Zunahme von
TNFR KO BMM verzeichnet wurde (Abb. 14A).
A
-
+
-
+
B6129SF2
+
+
-
+
-
+
TNFR KO
+
+
-
+
-
+
+ LPS
+ IFNγ
TNF KO
Abbildung 14A: Auswirkungen des TNF- bzw. TNF-Rezeptor-Knockouts auf die Genexpression von
Prx 1, 5 und 6 durch LPS- und/oder IFNγγ-Stimulation in B6129SF2 BMM. BMM von B6129SF2-Wildtyp(dunkelgraue Säulen), TNF-Rezeptor-KO- (TNFR KO) (hellgraue Säulen) und TNF-KO- (anthrazitfarbene
Säulen) Mäusen blieben unbehandelt oder wurden für 18 h mit 100 ng/ml LPS und/oder 100 U/ml IFNγ
inkubiert. Die Nitritkonzentration in den Zellkulturüberständen wurde mittels Griess Reagent bestimmt. Die
Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=7). Die statistische Auswertung
erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
76
Ergebnisse und Diskussion
B
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+
-
-
+
-
-
+
-
+
+
+
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B6129SF2
+
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TNFR KO
+
+ LPS
+ IFNγ
-
+
LPS
+
+
IFNγ
-
+
+
LPS
+
IFNγ
TNF KO
Abbildung 14B: Auswirkungen des TNF- bzw. TNF-Rezeptor-Knockouts auf die Genexpression von
Prx 1, 5 und 6 durch LPS- und/oder IFNγγ-Stimulation in B6129SF2 BMM. BMM von B6129SF2-Wildtyp(dunkelgraue Säulen), TNF-Rezeptor-KO- (TNFR KO) (hellgraue Säulen) und TNF-KO- (anthrazitfarbene
Säulen) Mäusen blieben unbehandelt oder wurden für 18 h mit 100 ng/ml LPS und/oder 100 U/ml IFNγ
inkubiert. Die relative Genexpression von Prx 1, 5 und 6 wurde durch qRT-PCR ermittelt, wobei RPLP0 als
Referenzgen diente. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=7). Die
statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem
Bonferroni post-Test.
77
Ergebnisse und Diskussion
Die Studien zur induzierten Genexpression von Prx 1, 5 und 6 zeigten, dass die
Transkription aller drei Prxs durch LPS sowie LPS und IFNγ wie in C57BL/6 BMM
(s. Abb. 1C) auch in B6129SF2-Wildtyp, TNFα KO und TNFR KO BMM induzierbar ist
(Abb. 14B) und es zudem keine Unterschiede in der LPS-induzierten Genexpression von
Prx 1, 5 und 6 in BMM der verschiedenen Mausstämme gibt. Während sich die relative
Geninduktion
von
Mausstämmen
Prx 1
nicht
durch
LPS
unterschied,
und IFNγ
wurde
zwischen
einerseits
Prx 5
den
verschiedenen
minimal
stärker
in
TNFα KO BMM gegenüber B6129SF2-Wildtyp BMM induziert und andererseits Prx 6
stärker in TNFα KO (4,5-fach) und TNFR KO BMM (4-fach) im Vergleich zu B6129SF2Wildtyp BMM (3-fach) erhöht. Neben dem anerkannten JAK/STAT1-Signalweg von IFNγ
stellte
die
Arbeitsgruppe
um
Abbas
fest,
dass
der
durch
LPS
induzierte
TLR4-/TRIF-abhängige Signalweg von Prx 5 durch TRAF6 oder RIP1 vermittelt wird
(Abbas et al., 2009). Übereinstimmend damit wurde kürzlich eine Verknüpfung des
IFNγ-Signalweges mit den TLR-Signalwegen in Makrophagen festgestellt (Schroder et
al., 2006). In der vorliegenden Arbeit ist zudem nachweisbar, dass die geringe Induktion
der Prx 5-Genexpression durch IFNγ in TNFα KO und TNFR KO BMM (1,5-fach) im
Vergleich zu B6129SF2-WIldtyp BMM (2,5-fach) vermindert ist (Abb. 14B, 15B). Dieses
steht in Korrelation zur Arbeit von Abbas et al., die annehmen, dass TNFα eine Rolle bei
der MyD88-abhängigen Induktion von Prx 5 spielt, da sowohl MyD88- als auch
TNF-defiziente Makrophagen nur eine sehr schwache Induktion der Prx 5-Gen- und
Proteinexpression nach IFNγ-Behandlung aufweisen (Abbas et al., 2009).
78
Ergebnisse und Diskussion
Die Behandlung von Knochenmarkmakrophagen von B6129SF2-Wildtyp-, TNFR KOund TNFα KO-Mäusen mit 10 ng/ml TNFα und/oder 100 U/ml IFNγ über einen Zeitraum
von 18 h ergab, dass sowohl die Transkriptionszunahme von Prx 1 als auch Prx 5 und 6
in Folge der Stimulation mit TNFα oder TNFα und IFNγ in TNFR KO BMM im Vergleich
zu B6129SF2-Wildtyp BMM unterdrückt bleibt (Abb. 15B). Des Weiteren führte die
Stimulation mit TNFα oder TNFα und IFNγ zu einer ähnlich starken Induktion von Prx 1
in TNFα KO und B6129SF2-Wildtyp BMM, während das Prx 5-Transkript sowohl durch
TNFα als auch durch TNFα und IFNγ-Stimulation signifikant höher in TNFα KO im
Vergleich zu B6129SF2-Wildtyp BMM exprimiert wurde. Außerdem wurde eine
schwache Geninduktion von Prx 6 durch diese Stimulatoren in TNFα KO BMM
beobachtet.
Abbildung 15A
verdeutlicht
weiterhin,
dass
die
Behandlung
von
TNFα-defizienten BMM mit TNFα und IFNγ in einer leichten Zunahme der NO-Bildung
resultiert, wohingegen keine Zunahme der NO-Freisetzung von BMM der anderen
Mausstämme festgestellt wurde (Abbildung 15A).
A
-
+
-
-
+
-
+
+
-
B6129SF2
+
-
-
+
-
+
+
-
TNFR KO
+
-
+
+ TNFα
+ IFNγ
TNF KO
Abbildung 15A: Auswirkungen des TNFα
α- bzw. TNF-Rezeptor-Knockouts auf die veränderte
Genexpression von Prx 1, 5 und 6 durch TNFα
α- und/oder IFNγγ-Stimulation in B6129SF2 BMM. BMM
von B6129SF2-Wildtyp- (dunkelgraue Säulen), TNF-Rezeptor-KO- (TNFR KO) (hellgraue Säulen) und TNFKO- (anthrazitfarbene Säulen) Mäusen blieben unbehandelt oder wurden für 18 h mit 10 ng/ml TNFα
und/oder 100 U/ml IFNγ inkubiert. Die Nitritkonzentration in den Zellkulturüberständen wurde mittels Griess
Reagent bestimmt. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=7). Die
statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem
Bonferroni post-Test.
79
Ergebnisse und Diskussion
B
-
-
-
+
-
+
-
+
-
-
-
+
+
+
-
+
-
+
+
-
-
+
-
+
+
-
B6129SF2
-
+
-
+
-
+
-
-
-
+
+
+
-
+
-
+
+
-
-
+
-
+
+
-
TNFR KO
-
+
-
+
-
+
-
+
+
+
+ TNFα
+ IFNγ
+ TNFα
+ IFNγ
+ TNFα
+ IFNγ
TNF KO
Abbildung 15B: Auswirkungen des TNFα
α- bzw. TNF-Rezeptor-Knockouts auf die veränderte
Genexpression von Prx 1, 5 und 6 durch TNFα
α- und/oder IFNγγ-Stimulation in B6129SF2 BMM. BMM
von B6129SF2-Wildtyp- (dunkelgraue Säulen), TNF-Rezeptor-KO- (TNFR KO) (hellgraue Säulen) und TNFKO- (anthrazitfarbene Säulen) Mäusen blieben unbehandelt oder wurden für 18 h mit 10 ng/ml TNFα
und/oder 100 U/ml IFNγ inkubiert. Die relative Genexpression von Prx 1, 5 und 6 wurde durch qRT-PCR
ermittelt, wobei RPLP0 als Referenzgen diente. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler
des Mittelwertes (n=7). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way
ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
80
Ergebnisse und Diskussion
Diese Untersuchungen lassen den Schluss zu, dass für die Geninduktion von Prx 1, 5
und 6 durch LPS und IFNγ die ebenfalls erhöhte Genexpression und Sekretion von
TNFα (s. Abb. 9, 10) keine Rolle spielt. Ähnliches gilt für die Stimulation mit LPS allein.
Weder der Knockout von TNFα noch der des TNF-Rezeptors hatten Auswirkungen auf
die Induktion der Prx 1-, 5- und 6-mRNA im Vergleich zu Knochenmarkmakrophagen
des Wildtypstammes. Unter serumhaltigen Bedingungen wurde bereits gezeigt, dass die
verminderte Prx 5-Expression durch Stimulation mit IFNγ in MyD88 KO oder TNF KO
BMM durch Zugabe von exogenem TNFα wieder vollständig hergestellt wird (Abbas et
al. 2009). Da die Genexpression von Prx 1 und 5 sowohl durch TNFα als auch durch
TNFα und IFNγ in B6129SF2-Wildtyp und C57BL/6 BMM induzierbar ist, die
TNFR-Defizienz die IFNγ-vermittelte Genexpression von Prx 5 vermindert, ist in
Übereinstimmung mit Abbas et al. anzunehmen, dass autokrines TNFα stromabwärts
von MyD88 eingreift und somit die IFNγ-induzierte Prx 5-Genexpression erhöht.
Untersuchungen einer anderen Arbeitsgruppe zeigten außerdem, dass in Makrophagen
die MyD88-vermittelte Geninduktion durch IFNγ von geringen Mengen TNFα abhängig
ist, das durch die Aktivierung von NFκB einen Selbstaktivierungsprozess auslöst, der
gemeinsam mit IFNγ die Genexpression beeinflusst (Shi et al., 2003). Des Weiteren
wurden durch Infektionsexperimente mit Mycobacterium tuberculosis nachgewiesen,
dass Makrophagen durch diese Infektion über MyD88-unabhängige Signalwege aktiviert
werden und MyD88 nicht essentiell für das Abtöten des Erregers ist. Die
Untersuchungen der Genregulation von Prxs nach LPS- und IFNγ-Stimulation, bei denen
TNFα als Mediator ausgeschlossen werden konnte, lassen korrelierend mit Shi et al.
annehmen, dass MyD88 eine dynamische Rolle in nicht aktivierten Makrophagen spielt,
die die IFNγ-abhängige Aktivierung unterstützt, wohingegen die Makrophagenantwort
auf mikrobielle Stimuli hauptsächlich durch andere Signalwege ausgelöst wird.
81
Ergebnisse und Diskussion
3.1.3
iNOS, aber nicht die NADPH-Oxidase, ist an der Erhöhung des
mRNA-Gehaltes von Prx 1 und 6 beteiligt
In den letzten Jahren wurde vielfach berichtet, dass die von Makrophagen als Antwort
auf inflammatorische Cytokine und bakterielle Produkte gebildeten reaktiven Sauerstoffund Stickstoffverbindungen als Effektormoleküle der angeborenen Immunantwort
fungieren (Nathan und Shiloh 2000). Des Weiteren wird vermutet, dass sowohl ROS, vor
allem H2O2, als auch NO Funktionen als Signalmoleküle erfüllen, indem sie eine Vielzahl
von Antworten wie Zellwachstum, Angiogenese und Apoptose vermitteln (Forman und
Torres 2001; Nathan 2004).
Vorangegangene Studien wiesen nach, dass die Behandlung von murinen Makrophagen
mit LPS oder IFNγ zu einer zeitabhängigen Erhöhung der iNOS-Expression führt (Weisz
et al., 1994). Des Weiteren wurde in RAW264.7-Zellen gezeigt, dass LPS und IFNγ die
NO-Produktion durch eine Zunahme der Expression der induzierbaren NO-Synthase
bewirken (Espey et al., 2000).
Nachdem in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, dass die Stimulation von
C57BL/6 BMM mit LPS und IFNγ die Nitritkonzentration zeitabhängig induziert (Abb. 8A)
und zudem die NO-Produktion von C57BL/6 BMM nach 18-stündiger Kostimulation
stärker induziert wird als in BALB/c BMM (Abb. 11A), sollte die Frage beantwortet
werden,
ob
die iNOS-vermittelte NO-Bildung
Einfluss
auf
die
Induktion
der
Genexpression von Prxs in C57BL/6 und BALB/c BMM hat. Die Arbeitsgruppe um
Immenschuh wies bereits eine Abhängigkeit der LPS-induzierten Prx 1-Expression in
Kupfferzellen der Ratte nach (Immenschuh et al., 1999). Außerdem ist seit Kurzem
bekannt, dass die LPS- und IFNγ-induzierte mRNA-Expression von Prx 1 und 6, jedoch
nicht die von Prx 5, in C57BL/6 BMM, die unter serumhaltigen Bedingungen kultiviert
wurden, durch NO reguliert wird (Diet et al., 2007; Abbas et al., 2008).
In diesem Abschnitt der Arbeit wurde einerseits die NO-Abhängigkeit der Genexpression
von Prx 1 – 6 analysiert und andererseits der Vergleich der mRNA-Transkription von
Prxs zwischen C57BL/6 und BALB/c BMM in Bezug auf die Beteiligung von iNOS an der
Induktion der Genexpression von Prxs untersucht. Dafür wurden C57BL/6 und
BALB/c BMM für 1 h mit den pharmakologischen iNOS-Inhibitoren L-NMMA (1 mM) oder
L-NIL (100 µM) vorinkubiert und anschließend für 18 h mit 100 ng/ml LPS und 100 U/ml
IFNγ behandelt (Abb. 16B, 17B, 18B, 19B). Zusätzlich wurden Makrophagen von
BALB/c-, C57BL/6- und iNOS KO-Mäusen für 18 h mit LPS und IFNγ stimuliert und die
Genexpression von Prxs in den drei Mausstämmen verglichen (Abb. 20D). Durch
Hemmung von iNOS mittels L-NMMA oder L-NIL wurde die Freisetzung von NO durch
LPS und IFNγ in BMM beider Mausstämme nahezu vollständig unterbunden (Abb. 16A,
82
Ergebnisse und Diskussion
17A, 18A, 19A), jedoch wurde weder die Proteinmenge von iNOS noch die von
Cyclooxygenase-2 durch beide Inhibitoren beeinflusst (Abb. 16A, Daten für L-NIL nicht
dargestellt). Darüber hinaus wurde die COX-induzierte PGE2-Sekretion durch LPS- und
IFNγ-Stimulation induziert, die auch durch iNOS-Inhibition unbeeinflusst blieb (Abb. 18B,
Daten für L-NMMA nicht dargestellt). Weiterhin wurde ein verminderter Anstieg der LPSund IFNγ-vermittelten Genexpression von Prx 1 und 6 in C57BL/6 (Abb. 16B, 18C) und
BALB/c BMM (Abb. 17B, 19B), sowie zusätzlich eine verringerte Induktion von Prx 2 und
4 in C57BL/6 BMM durch iNOS-Hemmung beobachtet. Übereinstimmend mit der Arbeit
von Santos et al. zeigt Abbildung 20B, dass kostimulierte BMM von C57BL/6-Mäusen im
Gegensatz zu BALB/c BMM eine stärkere NO-Freisetzung aufweisen und wie erwartet
iNOS KO-BMM nicht befähigt sind, NO zu bilden (Santos et al., 2006). Zudem wird iNOS
auf Proteinebene im Gegensatz zu BMM der beiden anderen verwendeten Mausstämme
nicht in iNOS KO BMM exprimiert, wohingegen das COX-2-Protein nahezu identisch
stark in BMM von iNOS KO- und C57BL/6- und geringfügig stärker in BALB/c BMM
durch LPS- und IFNγ-Stimulation exprimiert wird (Abb. 20A). Im Einklang damit stand die
Messung der PGE2-Sekretion, die an Kulturüberständen mittels EIA (enzyme
immunoassay) bestimmt wurde (Abb. 20C). Die PGE2-Sekretion wurde in allen drei
Mausstämmen durch LPS und IFNγ erhöht, wobei PGE2 am stärksten von BALB/c BMM
sekretiert wurde. Korrelierend mit den Ergebnissen der iNOS-Hemmung mittels
pharmakologischer Inhibitoren wurde in iNOS KO BMM im Vergleich zu C57BL/6 BMM
beobachtet, dass die LPS- und IFNγ-vermittelte Induktion der Genexpression von Prx 1,
2, 4 und 6 vermindert ist, wohingegen die erhöhte relative Genexpression von Prx 5
nahezu identisch in BMM beider Mausstämme ist (Abb. 20D). Interessanterweise wurde
mittels Western Blots festgestellt, dass die basale Proteinexpression von Prx 5 in
C57BL/6 BMM höher ist als in BALB/c BMM. Demnach unterscheidet sich die relative
Induktion der Prx 5-Transkription zwar nicht in BALB/c und C57BL/6 BMM (Abb. 20A),
doch besitzen Makrophagen unterschiedlicher Mausstämme damit bereits zu Beginn ein
unterschiedliches Repertoir in Bezug auf die Beseitigung von oxidativem und
nitrosativem Stress. Somit könnte nicht nur die stärkere Induktion der Prx 1-, 2-, 4und 6-Expression sich positiv auf die höhere Resistenz von C57BL/6-Mäusen im
Vergleich zu BALB/c-Mäusen, z.B. während bakteriellen Infektionen mit Burkholderia
pseudomallei, auswirken (Eske et al., 2009), sondern bereits erhöhte basale
Konzentrationen antioxidativer Enzyme wie Prx 5 entscheidende Schutzfunktionen
erfüllen.
83
Ergebnisse und Diskussion
A
B
iNOS
COX-2
GAPDH
-
+
-
+
+
+
-
+
-
+
+
-
-
+
-
+
+
+
LPS/IFNγ
L-NMMA
C
+
-
+
-
+
+
-
LPS/IFNγ
+
L-NMMA
Abbildung 16: Einfluss des iNOS-Inhibitors L-NMMA auf die LPS- und IFNγγ-induzierte Genexpression
von Prxs in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM wurden für 1 h mit 1 mM L-NMMA vorinkubiert und
anschließend für 18 h mit 100 ng/ml LPS und 100 U/ml IFNγ stimuliert. Als Kontrolle dienten unbehandelte
C57BL/6 BMM. (A) Die Nitritkonzentration in den Zellkulturüberständen wurde kolorimetrisch mit dem Griess
Reagent bestimmt. (B) 20 µg der Gesamtproteinextrakte wurden durch Western Blot mit Hilfe polyklonaler
Antikörper gegen iNOS, COX-2 und GAPDH analysiert. Der dargestellte Western Blot ist repräsentativ für
drei unabhängige Experimente. (C) Die relative Genexpression von Prx 1 - 6 wurde durch qRT-PCR
analysiert, wobei RPLP0 als Referenzgen verwendet wurde. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit
dem Fehler des Mittelwertes (n=4). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit
one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
84
Ergebnisse und Diskussion
A
-
+
-
+
-
+
+
-
+
-
+
+
-
LPS/IFNγ
L-NMMA
B
+
-
+
-
+
+
-
LPS/IFNγ
+
L-NMMA
Abbildung 17: Einfluss des iNOS-Inhibitors L-NMMA auf die LPS- und IFNγγ-induzierte Genexpression
von Prxs in BALB/c BMM. BALB/c BMM wurden für 1 h mit 1 mM L-NMMA vorinkubiert und anschließend
für 18 h mit 100 ng/ml LPS und 100 U/ml IFNγ stimuliert. Als Kontrolle dienten unbehandelte BALB/c BMM.
(A) Die Nitritkonzentration in den Zellkulturüberständen wurde kolorimetrisch mit dem Griess Reagent
bestimmt. (B) Die relative Genexpression von Prx 1 - 6 wurde durch qRT-PCR ermittelt, wobei RPLP0 als
Referenzgen verwendet wurde. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes
(n=5). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und
anschließendem Bonferroni post-Test.
85
Ergebnisse und Diskussion
B
A
+
+
-
-
-
+
-
+
-
+
-
+
+
+
-
+
-
LPS/IFNγ
-
+
-
+
+
L-NIL
-
+
-
+
+
+
LPS/IFNγ
L-NIL
C
Abbildung 18: Einfluss des iNOS-Inhibitors L-NIL auf die LPS- und IFNγγ-induzierte Genexpression
von Prxs in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM wurden für eine Stunde mit 100 µM L-NIL vorinkubiert und
anschließend für 18 h mit 100 ng/ml LPS und 100 U/ml IFNγ stimuliert. Als Kontrolle dienten unbehandelte
C57BL/6 BMM. Die (A) Nitrit- und (B) Prostaglandin E2-Konzentration in den Zellkulturüberständen wurde
mit dem Griess Reagent und EIA bestimmt. (C) Die relative Genexpression von Prx 1 – 6 wurde durch qRTPCR bestimmt, wobei RPLP0 als Referenzgen verwendet wurde. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert
mit dem Fehler des Mittelwertes (n=6). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit
one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
86
Ergebnisse und Diskussion
A
-
+
+
-
LPS/IFNγ
-
-
+
+
L-NIL
-
+
+
-
-
+
+
-
LPS/IFNγ
-
-
+
+
-
-
+
+
L-NIL
B
Abbildung 19: Einfluss des iNOS-Inhibitors L-NIL auf die LPS- und IFNγγ-induzierte Genexpression
von Prxs in BALB/c BMM. BALB/c BMM wurden für eine Stunde mit 100 µM L-NIL vorinkubiert und
anschließend für 18 Stunden mit 100 ng/ml LPS und 100 U/ml IFNγ stimuliert. Als Kontrolle dienten
unbehandelte BALB/c BMM. (A) Die Nitritkonzentration in den Zellkulturüberständen wurde kolorimetrisch
mit dem Griess Reagent bestimmt. (B) Die relative Genexpression von Prx 1 - 6 wurde durch qRT-PCR
bestimmt, wobei RPLP0 als Referenzgen verwendet wurde. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit
dem Fehler des Mittelwertes (n=6). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit
one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
87
Ergebnisse und Diskussion
Ergänzend kann das Signalmolekül NO, das für sich nur eine sehr geringe Toxizität
aufweist, mit dem radikalischen Superoxidanion zu Peroxynitrit reagieren, das einen
Risikofaktor für die Zellen darstellt. Aufgrund ihrer Peroxynitritreduktaseaktivität wird
angenommen, dass Peroxiredoxine, allen voran Prx 5, die Zellen vor NO-vermittelten,
toxischen Substanzen schützen (Abbas et al., 2009). Zusätzlich scheint das unter
physiologischen Bedingungen gebildete NO eine antioxidative Wirkung zu besitzen,
indem es beispielsweise die Expression einiger Prxs induziert (Abb. 20). Folgend könnte
der erhöhte Gehalt an Peroxiredoxinen eine negative Feedback-Schleife darstellen, die
schließlich einen Schutz vor exzessivem Stress bewirkt.
A
iNOS
COX-2
Prx 5
GAPDH
-
-
+
BALB/c
+
C57BL/6
-
+
LPS/IFNγ
iNOS KO
C
B
-
+
BALB/c
-
+
C57BL/6
-
+
iNOS KO
-
+
BALB/c
-
+
C57BL/6
-
+
LPS/IFNγ
iNOS KO
Abbildung 20A-C: Änderung der Genexpression von Prx 1 – 6 durch Stimulation mit LPS und IFNγγ in
BALB/c, C57BL/6 und iNOS KO BMM. BMM von BALB/c- (weiße Säulen), C57BL/6- (schwarze Säulen)
und iNOS-KO- (graue Säulen) Mäusen blieben unbehandelt oder wurden für 18 h mit 100 ng/ml LPS und
100 U/ml IFNγ stimuliert. (A) Die Gesamtproteinextrakte wurden durch Western Blot mit Hilfe von iNOS-,
COX-2-, Prx 5- und GAPDH-Antikörpern analysiert. Die (B) Nitrit- und (C) Prostaglandin E2-Konzentration in
den Zellkulturüberständen wurde mittels Griess Reagent und EIA bestimmt. Die Graphen repräsentieren den
Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=7). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der
Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
88
Ergebnisse und Diskussion
D
-
+
BALB/c
-
+
C57BL/6
-
+
iNOS KO
-
+
BALB/c
-
+
C57BL/6
-
+
LPS/IFNγ
iNOS KO
Abbildung 20D: Änderung der Genexpression von Prx 1 – 6 durch Stimulation mit LPS und IFNγγ in
BALB/c, C57BL/6 und iNOS KO BMM. BMM von BALB/c- (weiße Säulen), C57BL/6- (schwarze Säulen)
und iNOS-KO- (graue Säulen) Mäusen blieben unbehandelt oder wurden für 18 h mit 100 ng/ml LPS und
100 U/ml IFNγ stimuliert. Die relative Genexpression von Prx 1 - 6 wurde durch qRT-PCR analysiert, wobei
RPLP0 als Referenzgen diente. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes
(n=7). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und
anschließendem Bonferroni post-Test.
Pathophysiologische Zustände wie die Tumorgenese, Arteriosklerose, der Diabetes
mellitus sowie der Alterungsprozess scheinen mit oxidativem Stress assoziiert zu sein
(Ward 1991; Berlett und Stadtman 1997). Neben ihrer Funktion bei Zellschäden
scheinen ROS, insbesondere H2O2, an einer Vielzahl zellulärer Funktionen beteiligt zu
sein und können bei Rezeptor-vermittelter Signaltransduktion als intrazelluläre,
sekundäre Botenstoffe fungieren (Sundaresan et al., 1995; Lander et al., 1997).
Unterschiedliche Arbeiten belegen, dass verschiedene intrazelluläre Prozesse in
Makrophagen für
die
Bildung
von
reaktiven
Sauerstoffspezies
wie
z.B.
die
NADPH-Oxidase, die mitochondriale Atmung, Lipoxygenasen sowie Cyclooxygenasen
verantwortlich sind. Weiterhin ist bekannt, dass die vom NADPH-Oxidase-Komplex89
Ergebnisse und Diskussion
gebildeten ROS an der Beseitigung von Bakterien und anderen Invasoren beteiligt sind
(Babior 1999).
Neben dem Einfluss von iNOS sollte daher untersucht werden, ob die NADPH-Oxidase
eine Rolle bei der Regulation der LPS- und IFNγ-induzierten Genexpression von
Prx 1 - 6 spielt. Dafür wurden NADPH-Oxidase-Knockout- (gp91phox KO-) Mäuse
verwendet, bei denen die membranständige Untereinheit gp91phox fehlt, wodurch die
aktivierten cytosolischen Untereinheiten nicht mehr an die Membran des Plasmas oder
der Phagosomen binden können und damit die NADPH-Oxidase nicht aktiviert werden
kann. Die 18-stündige Stimulation von gp91phox KO und C57BL/6 BMM mit LPS und IFNγ
führte zu einer leicht verminderten Freisetzung von NO in gp91phox KO im Vergleich zu
C57BL/6 BMM
(Abb. 21A).
Des
Weiteren
ist
in
Abbildung
21B
die
relative
Genexpression von Prxs nach LPS- und IFNγ-Stimulation dargestellt. Die Transkription
von Prx 1, 2, 4, 5 und 6 wurde in gp91phox KO BMM nicht, wie vermutet, weniger stark
induziert als in BMM des Wildtypstammes, sondern wurde in beiden Mausstämmen
vergleichbar induziert oder sogar im Falle von Prx 5 signifikant stärker in gp91phox KO
BMM erhöht (Abb. 21B). Daraus ist zu folgern, dass durch die NADPH-Oxidasegebildete ROS nicht an der LPS- und IFNγ-induzierten Genexpression der Prxs beteiligt
sind oder möglicherweise der Mangel an ROS durch die NADPH-Oxidase-Defizienz
durch alternative Mechanismen kompensiert wird.
Während die cytosolisch lokalisierten Prxs wesentliche Faktoren bei der Kontrolle des
H2O2-Gehalts während der Signaltransduktion darstellen, wird angenommen, dass die
mitochondrialen Prxs vor allem in den Schutz der Zellen gegen oxidativen Stress
involviert sind (Rhee 2006; Trujillo et al., 2007). Gallagher et al. wiesen nach, dass
verschiedene Agenzien, die intrazellulär ROS bilden, zu einer Induktion der
Prx 6-Expression in Mausleberzellen führen (Gallagher und Phelan 2007). Des Weiteren
induzierte oxidativer Stress wie Hyperoxie, H2O2 und Paraquat die Transkription von
Prx 6 in Lungenepithelzellen von Ratten (Kim et al., 2003). Unterstützend dazu
demonstrierten Chowdhury et al. eine konzentrationsabhängige Zunahme der
Prx 6-mRNA-Expression durch 50 – 100 µM H2O2 in der humanen Lungenepithelzellline
A549 (Chowdhury et al., 2009). Im Gegensatz dazu zeigten Abbas et al., dass die
Behandlung von Makrophagen mit H2O2 den Proteingehalt von Prx 5 nicht induziert
(Abbas et al., 2009). Jenes korreliert mit Studien in humanen Zelllinien, die
demonstrierten, dass der oxidative Stressinduktor Menadion die Expression von Prx 5
nicht beeinflusst und H2O2 zudem ebenfalls keine Wirkung auf die Induktion von Prxs in
embryonalen Fibroblasten ausübt (Kropotov et al., 2006; Graves et al., 2009). Damit ist
in Übereinstimmung mit Abbas et al. anzunehmen, dass H2O2 in Säugetierzellen
90
Ergebnisse und Diskussion
vornehmlich als Signalmolekül fungiert und nicht wie in Prokaryoten als Stressmolekül
(Rhee et al., 2005b; Abbas et al., 2009).
A
-
+
-
+
-
+
-
+
LPS/IFNγ
B
-
+
-
+
LPS/IFNγ
Abbildung 21: Einfluss des NADPH-Oxidase-Knockouts auf die LPS- und IFNγγ-induzierte
phox
Genexpression von Prxs in C57BL/6 BMM. BMM von C57BL/6- (schwarze Säulen) und gp91 -KO(graue Säulen) Mäusen blieben unbehandelt oder wurden für 18 h mit 100 ng/ml LPS und 100 U/ml
IFNγ stimuliert. (A) Die Nitritkonzentration in den Zellkulturüberständen wurde mittels Griess Reagent
bestimmt. (B) Die relative Genexpression von Prx 1 – 6 wurde durch qRT-PCR analysiert, wobei RPLP0 als
Referenzgen diente. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=6). Die
statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem
Bonferroni post-Test.
91
Ergebnisse und Diskussion
3.1.4
cPLA2 und COX-Enzyme spielen eine entscheidende Rolle bei der
LPS- und IFNγγ-induzierten Genexpression von Prx 6
Nachdem gezeigt werden konnte, dass die Stimulation von C57BL/6 BMM mit LPS und
IFNγ die Proteinexpression von COX-2 induziert und zudem PGE2 verstärkt sekretiert
wird, sollte nun untersucht werden, ob diese Einfluss auf die induzierte Genexpression
von Prx 1, 5 und 6 besitzen. Zunächst sollte analysiert werden, ob cytosolische
Phospholipasen A2 (PLA2) an der Änderung der Transkription von Prx 1, 5 und 6 beteiligt
sind. PLA2s sind Esterasen, die die Hydrolyse von Acylgruppen an der sn-2-Position von
Glycerophospholipiden katalysieren und so freie Fettsäuren und lyso-Phospholipide
bilden (Six und Dennis 2000). Sie werden in Entzündungszellen wie Neutrophilen,
Eosinophilen, T-Zellen, Monozyten, Makrophagen sowie Mastzellen exprimiert und von
diesen gegebenenfalls freigesetzt (Triggiani et al., 2006). Die durch PLA2s-freigesetzte
Arachidonsäure ist ein Vorläufer der Eicosanoide wie der Prostanoide, die durch
Cyclooxygenasen, Lipoxygenasen oder Endoperoxidasen gebildet werden. Diese binden
wiederum
an
G-Protein-gekoppelte
Rezeptoren
und
kontrollieren
dadurch
Entzündungsprozesse sowie die Immunantwort (Anderson et al., 1994; Frasch et al.,
2007).
Zur Untersuchung der Beteiligung der PLA2s an der LPS- und IFNγ-induzierten
Genexpression von Prxs wurde zum einen der selektive Inhibitor der cytosolischen
Phospholipase A2 AACOCF3 (Riendeau et al., 1994; Rastogi und McHowat 2009) und
zum
anderen
Methylarachidonylfluorphosphonat
(MAFP)
verwendet,
das
einen
2+
selektiven, irreversiblen Inhibitor der cytosolischen PLA2 und der Ca -unabhängigen
PLA2 darstellt (Balsinde und Dennis 1996; Lio et al., 1996). Die Hemmung der
cytosolischen PLA2s durch die Inhibitoren AACOCF3 oder MAFP in C57BL/6 BMM hatte
keinen Einfluss auf die Höhe der Nitritkonzentration durch LPS- und IFNγ-Stimulation
(Abb. 22A, 23). Jedoch verminderte die Hemmung mittels AACOCF3 die LPS- und IFNγinduzierte PGE2-Sekretion (Abb. 22B). Des Weiteren wurde beobachtet, dass die LPSund IFNγ-induzierte Genexpression von Prx 5 und 6 durch die höchste verwendete
Konzentration von AACOCF3 oder MAFP um 50 % vermindert wird (Abb. 22C, 23).
Zusätzlich verringerten 100 µM MAFP, jedoch nicht 20 µM AACOCF3, die erhöhte
Transkription von Prx 1. Die Hemmung der cPLA2s hatte jedoch den stärksten Einfluss
auf die LPS- und IFNγ-vermittelte Erhöhung der Prx 6-Genexpression, da bereits geringe
Konzentrationen beider Hemmstoffe die Induktion der Prx 6-Transkription negativ
beeinflussten.
92
Ergebnisse und Diskussion
A
B
-
+
-
-
+
+
-
-
+
-
5
10
+
-
-
+
20
-
+
5
- LPS/IFNγ
+
10
20
AACOCF3 [µM]
C
-
+
-
-
+
+
-
-
+
-
5
10
20
+
-
-
+
5
-
+
10
- LPS/IFNγ
+
20
AACOCF3 [µM]
Abbildung 22: Einfluss der Hemmung der cPLA2 durch AACOCF3 auf die LPS- und IFNγγ-induzierte
Genexpression von Prx 1, 5 und 6 in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM wurden mit dem Lösungsmittel des
Inhibitors behandelt oder für 1 h mit dem cPLA2-Inhibitor AACOCF3 (5 – 20 µM) vorinkubiert und
anschließend für 18 h mit 100 ng/ml LPS und 100 U/ml IFNγ stimuliert. Die (A) Nitrit- und (B)
Prostaglandin E2-Konzentration in den Zellkulturüberständen wurde mittels Griess Reagent und EIA
bestimmt. (C) Die relative Genexpression von Prx 1, 5 und 6 wurde durch qRT-PCR analysiert, wobei
RPLP0 als Referenzgen diente. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes
(n=6). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und
anschließendem Bonferroni post-Test.
93
Ergebnisse und Diskussion
-
+
-
-
+
25
-
+
-
50
-
+
-
+
25
50
-
+
-
-
+
-
100
50
-
+
25
-
+
25
-
+
-
+
100
-
+
-
+
50
- LPS/IFNγ
100
-
+
+
+
MAFP [µM]
- LPS/IFNγ
100
MAFP [µM]
Abbildung 23: Auswirkung der Hemmung der cPLA2 durch MAFP auf die LPS- und IFNγγ-vermittelte
Genexpression von Prx 1, 5 und 6 in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM wurden mit dem Lösungsmittel des
Inhibitors behandelt oder für 1 h mit dem cPLA2-Inhibitor MAFP (25 – 100 µM) vorinkubiert und
anschließend für 18 h mit 100 ng/ml LPS und 100 U/ml IFNγ stimuliert. Die Nitritkonzentration in den
Zellkulturüberständen wurde mittels Griess Reagent bestimmt. Der relative mRNA-Gehalt von Prx 1, 5 und 6
wurde durch qRT-PCR analysiert, wobei RPLP0 als Referenzgen diente. Die Graphen repräsentieren den
Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=5). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der
Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
Lu und Wahl berichteten, dass H2O2 die Expression von COX-2 und die Sekretion von
PGE2 in LPS-stimulierten humanen Monozyten reguliert (Lu und Wahl 2005). Weiterhin
wurde gezeigt, dass die Behandlung von RAW264.7-Makrophagen mit oxidiertem LDL
die COX-2-Expression erhöht und damit einhergehend die 15d-PGJ2-, PGE2- und
PGD2-Bildung zunimmt (Taketa et al., 2008). Zu Beginn der vorliegenden Arbeit wurde
gezeigt, dass COX-2 in primären Makrophagen geringfügig durch LPS und deutlich
stärker durch die Kombination aus LPS und IFNγ induziert wird, während in
unbehandelten oder IFNγ-stimulierten Makrophagen keine Proteinexpression detektiert
werden kann (Abb. 5B). Um zu überprüfen, ob die LPS- und IFNγ-induzierte
COX-2-Expression stromabwärts der cPLA2 in C57BL/6 BMM für die Erhöhung der
Genexpression von Prxs von Bedeutung ist, wurde der selektive COX-2-Inhibitor NS398
verwendet (Masferrer et al., 1994). Die Vorbehandlung von C57BL/6 BMM mit 1 µM
NS398
94
hatte weder
Einfluss
auf
die
LPS-
und IFNγ-erhöhte COX-2-
oder
Ergebnisse und Diskussion
iNOS-Proteinexpression (Abb. 24A) noch auf die Freisetzung von NO (Abb. 24B).
Hingegen führte die Inhibition von COX-2 zu einer deutlichen Abnahme der durch die
Stimulatoren
hervorgerufenen
PGE2-Sekretion
(Abb. 24C).
Untersuchungen
der
relativen Genexpression von Prx 1, 5 und 6 verdeutlichten, dass im Gegensatz zu Prx 1
und 5 die erhöhte Transkription von Prx 6 durch die Hemmung mit NS398 um 50 %
vermindert wird (Abb. 24D).
A
iNOS
COX-2
GAPDH
-
+
-
+
-
LPS/IFNγ
+
+
NS398
C
B
-
+
-
+
-
-
+
+
-
+
-
+
-
LPS/IFNγ
+
+
NS398
Abbildung 24A-C: Einfluss der Hemmung von COX-2 durch NS398 auf die LPS- und IFNγγ-induzierte
Genexpression von Prx 1, 5 und 6 in C57BL/6 BMM. BMM von C57BL/6-Mäusen wurden entweder mit
dem Lösungsmittel des Inhibitors behandelt oder für 1 h mit 1 µM des COX-2-spezifischen Inhibitors NS398
vorinkubiert und folgend für 18 h mit 100 ng/ml LPS und 100 U/ml IFNγ stimuliert. (A) Jeweils 20 µg der
Gesamtproteinextrakte wurden durch Western Blot mit Hilfe von iNOS-, COX-2- und GAPDH-Antikörpern
analysiert. Die (B) Nitrit- und (C) Prostaglandin E2-Konzentration in den Zellkulturüberständen wurde mittels
Griess Reagent und EIA bestimmt. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des
Mittelwertes (n=5). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA
und anschließendem Bonferroni post-Test.
95
Ergebnisse und Diskussion
D
-
+
-
+
+
-
-
+
+
-
+
+
-
LPS/IFNγ
+
NS398
Abbildung 24D: Einfluss der Hemmung von COX-2 durch NS398 auf die LPS- und IFNγγ-induzierte
Genexpression von Prx 1, 5 und 6 in C57BL/6 BMM. BMM von C57BL/6-Mäusen wurden entweder mit
dem Lösungsmittel des Inhibitors behandelt oder für 1 h mit 1 µM des COX-2-spezifischen Inhibitors NS398
vorinkubiert und folgend für 18 h mit 100 ng/ml LPS und 100 U/ml IFNγ stimuliert. Die relative
Genexpression von Prx 1 - 6 wurde durch qRT-PCR ermittelt, wobei RPLP0 als Referenzgen diente. Die
Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=5). Die statistische Auswertung
erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
Anschließend wurde gezeigt, dass die Verwendung des selektiven COX-1-Inhibitors
SC560 (1 µM; Smith et al., 1998) und der beiden unspezifischen COX-Inhibitoren
Ibuprofen (100 µM; Jamali 1988) und Indomethacin (10 µM; Tanaka et al., 1991) die
LPS- und IFNγ-induzierte Proteinexpression von iNOS und die iNOS-vermittelte
NO-Produktion nicht beeinträchtigen (Abb. 25A, B), jedoch die PGE2-Sekretion von
C57BL/6 BMM verringern (Abb. 25C). Darüber hinaus bestätigt Abbildung 25D die
Abhängigkeit der Prx 6-mRNA-Induktion durch LPS und IFNγ von COX-Enzymen,
wohingegen weder die Hemmung von COX-1 noch die von COX-2 Einfluss auf die
Erhöhung der Prx 1- und 5-mRNA hat (Abb. 25D). Daher ist anzunehmen, dass an der
Regulation von Prx 6 in Antwort auf LPS und IFNγ sowohl Cyclooxygenasen als auch
deren gebildeten Produkte wie PGE2 beteiligt sind. Die Untersuchungen zeigten
außerdem, dass die Hemmung der COX-Enzyme nur die PGE2-Sekretion, jedoch nicht
die
Nitritkonzentration,
erniedrigt
(Abb. 24B, C,
25B, C)
und
umgekehrt
die
iNOS-Inhibition bzw. der iNOS-Knockout in C57BL/6 BMM nur die LPS- und
IFNγ-vermittelte
NO-Produktion,
aber
nicht
die
PGE2-Sekretion,
vermindert
(Abb. 18A, B, 20B, C). Daher ist zu vermuten, dass die mRNA-Expression von Prx 6 in
96
Ergebnisse und Diskussion
Antwort auf LPS und IFNγ sowohl durch iNOS als auch durch COX-Enzyme reguliert
wird, wobei beide Signalwege unabhängig voneinander sind.
A
iNOS
COX-2
GAPDH
-
-
+
+
-
-
-
+
SC
+
Ibu
-
LPS/IFNγ
Indo
B
C
-
+
-
+
SC
-
-
+
Ibu
+
-
Indo
-
+
-
+
SC
-
-
+
Ibu
+
- LPS/IFNγ
Indo
Abbildung 25A-C: Einfluss der Inhibition von COX-1 und COX-2 auf die LPS- und IFNγγ-induzierte
Genexpression von Prx 1, 5 und 6 in C57BL/6 BMM. BMM von C57BL/6-Mäusen wurden mit dem
Lösungsmittel der Inhibitoren behandelt oder für 1 h mit dem spezifischen COX-1-Inhibitor SC-560 (SC,
1 µM) oder den nicht-selektiven COX-Inhibitoren Ibuprofen (Ibu, 100 µM) und Indomethacin (Indo, 10 µM)
vorinkubiert und folgend für 18 h mit 100 ng/ml LPS und 100 U/ml IFNγ stimuliert. (A) Jeweils 20 µg der
Gesamtproteinextrakte wurden durch Western Blot mit Hilfe von iNOS-, COX-2- und GAPDH-Antikörpern
analysiert. Die (B) Nitrit- und (C) Prostaglandin E2-Konzentration in den Zellkulturüberständen wurde mittels
Griess Reagent und EIA bestimmt. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des
Mittelwertes (n=7). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA
und anschließendem Bonferroni post-Test.
97
Ergebnisse und Diskussion
D
-
+
-
-
+
SC
+
Ibu
-
+
-
Indo
-
+
-
+
SC
-
+
Ibu
-
+
- LPS/IFNγ
Indo
Abbildung 25D: Einfluss der Inhibition von COX-1 und COX-2 auf die LPS- und IFNγγ-induzierte
Genexpression von Prx 1, 5 und 6 in C57BL/6 BMM. BMM von C57BL/6-Mäusen wurden mit dem
Lösungsmittel der Inhibitoren behandelt oder für 1 h mit dem spezifischen COX-1-Inhibitor SC-560 (SC,
1 µM) oder den nicht-selektiven COX-Inhibitoren Ibuprofen (Ibu, 100 µM) und Indomethacin (Indo, 10 µM)
vorinkubiert und folgend für 18 h mit 100 ng/ml LPS und 100 U/ml IFNγ stimuliert. Die relative
Genexpression von Prx 1 – 6 wurde durch qRT-PCR analysiert, wobei RPLP0 als Referenzgen diente. Die
Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=7). Die statistische Auswertung
erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
Berichten mehrerer Arbeitsgruppen zufolge wird in LPS-stimulierten Makrophagen die
cPLA2-Aktivität durch Phosphorylierung mit Hilfe der p38 MAPK sowie p44/42 MAPK
reguliert. Dabei sind nanomolare Konzentrationen an Ca2+ für die Translokation der
cPLA2 zur Membran endscheidend, die dann Phospholipide hydrolysieren und somit die
Prostaglandinproduktion initiieren (Qi und Shelhamer 2005). Des Weiteren wurde in
RAW264.7-Makrophagen festgestellt, dass sowohl die p38 MAPK als auch die
p44/42 MAPK die LPS-induzierte COX-2-Expression vermitteln (Caivano und Cohen
2000). Allerdings liegen bisher keine Untersuchungen zur Regulation der Expression
von Prxs durch COX-Enzyme vor. Eine mögliche Regulation von Prxs mittels der
Prostaglandine zeigte bis jetzt ausschließlich die Arbeitsgruppe um Itoh. Diese wies
nach, dass 15d-PGJ2 in murinen Peritonealmakrophagen zu einer Nrf2-abhängigen
Zunahme der Prx 1-Genexpression führt (Itoh et al., 2004).
98
Ergebnisse und Diskussion
3.1.5
JAK2, PI3K, MAPKs und PKC sowie der Transkriptionsfaktor Nrf2
sind wichtige Signalmediatoren der LPS- und IFNγγ-abhängigen
Genexpression von Prx 6
Um die Mechanismen der Induktion der Prx 1-, 5- und 6-Genexpression durch LPS- und
IFNγ-Stimulation weiter zu charakterisieren, wurden pharmakologische Inhibitoren
verschiedener Proteinkinasen eingesetzt.
Da die Aktivierung von Makrophagen stromabwärts des Toll-like- und IFNγ-Rezeptors
oftmals in Zusammenhang mit der Phosphorylierung von Proteintyrosinkinasen steht,
sollte zunächst der Einfluss von Tyrosinkinasen bei der LPS- und IFNγ-induzierten
Transkription von Prx 1, 5 und 6 untersucht werden. Tyrosinkinasen sind fähig,
Tyrosinreste in Proteinen zu phosphorylieren und somit die Aktivierung dieser Proteine
positiv oder negativ zu regulieren. Die Rezeptor-Tyrosinkinasen, die vor allem an der
Stimulation
zellulärer
Wachstumsvorgänge
beteiligt
sind,
stellen
Zellmembran-
gebundene Rezeptoren dar, die eine intrinsische Tyrosinkinase-Aktivität besitzen
(Novogrodsky et al., 1994). Der in dieser Arbeit verwendete Tyrosinkinaseinhibitor
AG490
ist
ein
potenter
Inhibitor
der
Autophosphorylierung
der
epidermalen
Wachstumsfaktor-Rezeptorkinase und hemmt Tyrosinkinasen der Januskinase- (JAK-)
Familie (Levitzki 1990). In Abbildung 26 ist der Einfluss von AG490 auf die LPS- und
IFNγ-vermittelte NO- und PGE2-Freisetzung und die relative Genexpression von Prx 1, 5
und 6 dargestellt. Die Vorinkubation mit dem Tyrosinkinaseinhibitor AG490 hemmte mit
steigender Konzentration (10 – 40 µM) die LPS- und IFNγ-induzierte NO- und
PGE2-Produktion von C57BL/6 BMM (Abb. 26A, B). Des Weiteren wurde die in
aktivierten Makrophagen erhöhte Genexpression von Prx 5 und 6 im Gegensatz zur
Prx 1-Transkription deutlich verringert. Dabei wurde die relative Prx 6-mRNA-Expression
bereits durch 10 µM AG490 um zwei Drittel verringert. Da jedoch bei dieser
Konzentration von AG490 die NO- und PGE2-Konzentration nur leicht verringert wurde,
ist zu vermuten, dass die Prx 6-mRNA-Induktion neben iNOS und COX-Enzymen zudem
von JAK2 vermittelt wird. Zudem scheint die Prx 5-Geninduktion, die sowohl iNOS- als
auch COX-unabhängig vermittelt wird, zumindest teilweise durch Tyrosinkinasen
reguliert zu werden (Abb. 26C).
99
Ergebnisse und Diskussion
A
B
-
+
-
-
+
-
+
10
-
+
20
-
+
-
40
-
+
-
+
10
- LPS/IFNγ
+
20
40
AG [µM]
C
-
+
-
-
+
10
-
+
20
-
+
40
-
+
-
-
+
10
-
+
20
- LPS/IFNγ
+
40
AG [µM]
Abbildung 26: Einfluss der Hemmung von JAK2 durch AG490 auf die LPS- und IFNγγ-induzierte
Genexpression von Prx 1, 5 und 6 in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM wurden mit dem Lösungsmittel des
Inhibitors behandelt oder für 1 h mit dem JAK2-Inhibitor AG490 (AG, 10 - 40 µM) vorinkubiert und
anschließend für 18 h mit 100 ng/ml LPS und 100 U/ml IFNγ stimuliert. Die (A) Nitrit- und (B)
Prostaglandin E2-Konzentration in den Zellkulturüberständen wurde mittels Griess Reagent und EIA
bestimmt. (C) Die relative Genexpression von Prx 1, 5 und 6 wurde durch qRT-PCR bestimmt, wobei RPLP0
als Referenzgen diente. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=4).
Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem
Bonferroni post-Test.
Des Weiteren zeigen Untersuchungen zum Einfluss von Tyrosinkinasen der Src-Familie
durch den Inhibitor PP2 (Hanke et al., 1996; Lawrence und Niu 1998), auf die induzierte
Genexpression von Prxs, dass die Prx 1- und 5-mRNA-Induktion durch LPS und IFNγ
durch die höchste verwendete Konzentration an PP2 (10 µM) leicht erniedrigt wird
(Abb. 27C). Der mRNA-Gehalt von Prx 6 wurde jedoch durch keine verwendete
100
Ergebnisse und Diskussion
Konzentration vermindert, obwohl PP2, im Unterschied zur NO-Freisetzung, die LPSund IFNγ-erhöhte PGE2-Sekretion vollständig herabsetzte (Abb. 27A, B).
A
B
-
+
-
+
-
-
+
2,5
5
+
-
-
+
-
10
-
+
+
2,5
-
-
+
5
10
LPS/IFNγ
PP2 [µM]
C
-
+
-
+
2,5
-
-
+
5
-
+
10
-
+
-
-
+
2,5
-
+
5
+
- LPS/IFNγ
10
PP2 [µM]
Abbildung 27: Auswirkungen der Inhibition der Src-Tyrosinkinase durch PP2 auf die LPS- und IFNγγinduzierte Genexpression von Prx 1, 5 und 6 in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM wurden mit dem
Lösungsmittel des Inhibitors behandelt oder für 1 h mit dem Src-Tyrosinkinase-Inhibitor PP2 (2,5 - 10 µM)
vorinkubiert und anschließend für 18 h mit 100 ng/ml LPS und 100 U/ml IFNγ stimuliert. Die (A) Nitrit- und (B)
Prostaglandin E2-Konzentration in den Zellkulturüberständen wurde mittels Griess Reagent und EIA
bestimmt. (C) Der relative mRNA-Gehalt von Prx 1, 5 und 6 wurde durch qRT-PCR analysiert, wobei RPLP0
als Referenzgen diente. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=4).
Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem
Bonferroni post-Test.
Aufgrund der Involvierung von JAK2 in die Genregulation von Prx 5 und 6 sollte
nachfolgend untersucht werden, ob die Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) ebenfalls
eine Rolle bei der Induktion der Genexpression von Prxs in Antwort auf LPS und IFNγ
spielt, da JAK2 in verschiedenen Signaltransduktionskaskaden oftmals direkt an der
101
Ergebnisse und Diskussion
Aktivierung der PI3K beteiligt ist (Okugawa et al., 2003). Die PI3K katalysiert die Bildung
des sekundären Botenstoffes Phosphatidylinositol-3, 4, 5-triphosphat (PIP3), der die
PDK-1- (Phosphatidylinositol-3-abhängige Kinase-1-) Aktivierung initiiert. PDK-1 ist
ihrerseits wiederum in der Lage, die Proteinkinase B (PKB) und einige Isoformen der
Proteinkinase C (PKC) durch Phosphorylierung zu aktivieren (Fruman et al., 1998).
Der Western Blot in Abbildung 28 zeigt die zeitabhängige Phosphorylierung von PKB
durch LPS und IFNγ. Die 30-minütige Kostimulation von C57BL/6 BMM führte zu einer
deutlichen Aktivierung von PKB. Das Maximum der Phosphorylierung wurde nach
60 - 120-minütiger Kostimulation erreicht und nahm anschließend wieder ab (Abb. 28).
Durch den Nachweis der Aktivierung der PKB in immunstimulierten Makrophagen
scheint somit eine mögliche Beteiligung der PI3K sowie der PKB an der Genregulation
der Prxs möglich zu sein.
phospho-PKB
PKB
-
+
240 15
+
30
+
+
+
60 120 240
LPS/IFNγ
Zeit [min]
Abbildung 28: Zeitabhängige Aktivierung der Proteinkinase B durch LPS- und IFNγγ-Stimulation in
C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM blieben unbehandelt oder wurden für 15 – 240 min mit 100 ng/ml LPS und
100 U/ml IFNγ inkubiert. Jeweils 40 µg der Gesamtproteinextrakte wurden durch Western Blot mit Hilfe
polyklonaler Antikörper gegen phosphorylierte PKB und Gesamt-PKB analysiert. Der dargestellte Western
Blot ist repräsentativ für zwei unabhängige Experimente.
Um zu ermitteln, ob die PI3K an der induzierten Genexpression von Prx 1, 5 und 6
beteiligt ist, wurden C57BL/6 BMM für 1 h mit steigenden Konzentrationen (10 – 40 µM)
des selektiven PI3K-Inhibitors LY294002 behandelt, bevor die Makrophagen für 18 h mit
LPS und IFNγ inkubiert wurden. Die Hemmung der PI3K in BMM führte zu einer
konzentrationsabhängigen Abnahme an freigesetztem NO und PGE2 (Abbildung 29A, B).
Zudem wurde die LPS- und IFNγ-vermittelte mRNA-Induktion von Prx 1, 5 und 6
konzentrationsabhängig durch LY294002 vermindert. Dabei wurde die Induktion der
Prx 1-, 5- und 6-mRNA-Expression durch LPS und IFNγ durch 40 µM des PI3K-Inhibitors
nahezu vollständig unterbunden (Abb. 29C). Trotz der Hemmung der NO-Produktion
durch LY294002 ist die Beteiligung der PI3K an der LPS- und IFNγ-vermittelten
Induktion von Prx 1 und 6 nicht auszuschließen, da die Hemmung von iNOS im
Gegensatz zur PI3K-Inhibition nicht zu einer vollständigen Unterdrückung der
induzierten Prx 1- oder 6-Genexpression führte (Abb. 16, 18). Des Weiteren belegt eine
vorangegangene Studie der Arbeitsgruppe, dass die Zunahme der Prx 1-mRNA-Menge
102
Ergebnisse und Diskussion
in
Antwort
auf
LPS
durch
PI3K
und
Src
aber
nicht
durch
JAK2
in
RAW264.7-Makrophagen vermittelt wird (Bast et al., 2010). Die iNOS-unabhängige
Regulation der Prx 5-mRNA-Induktion betreffend, scheint die PI3K eine entscheidende
Rolle während der LPS- und IFNγ-induzierten Prx 5-Transkription zu erfüllen.
A
B
-
+
-
-
+
-
+
10
-
+
20
-
+
-
-
+
40
-
+
10
- LPS/IFNγ
+
20
40
LY [µM]
C
-
+
-
-
+
10
-
+
20
-
+
40
-
+
-
-
+
10
-
+
20
- LPS/IFNγ
+
40
LY [µM]
Abbildung 29: Einfluss der konzentrationsabhängigen Inhibition der PI3-Kinase durch LY294002 auf
die LPS- und IFNγγ-induzierte Genexpression von Prx 1, 5 und 6 in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM
wurden mit dem Lösungsmittel des Inhibitors behandelt oder für 1 h mit dem spezifischen PI3K-Inhibitor
LY294002 (LY, 10 – 40 µM) vorinkubiert und anschließend für 18 h mit 100 ng/ml LPS und 100 U/ml
IFNγ stimuliert. Die (A) Nitrit- und (B) Prostaglandin E2-Konzentration in den Zellkulturüberständen wurde
mittels Griess Reagent und EIA bestimmt. (C) Die relative Genexpression von Prx 1, 5 und 6 wurde durch
qRT-PCR ermittelt, wobei RPLP0 als Referenzgen diente. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit
dem Fehler des Mittelwertes (n=4). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit
one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
103
Ergebnisse und Diskussion
Mitogen-aktivierte Proteinkinasen (MAPKs) erfüllen entscheidende Funktionen bei der
Zellantwort auf eine Vielzahl von extrazellulären Stimuli wie z. B. inflammatorischen
Cytokinen (Kyriakis et al., 1994). Es ist bekannt, dass LPS in vielen Zelltypen wie
Makrophagen MAPKs aktiviert (Guha und Mackman 2001) und IFNγ eine starke
Aktivierung der p38 MAPK aber nicht der p44/42 MAPK oder JNK in primären
Makrophagen hervorruft, die wiederum die Induktion verschiedener Gene, die in die
angeborene Immunantwort involviert sind, bewirkt (Valledor et al., 2008). Zudem zeigten
kürzlich Untersuchungen von Abbas et al., dass die Genexpression von Prx 5 in
C57BL/6 BMM durch LPS oder IFNγ durch p38 MAPK und JNK vermittelt wird (Abbas et
al., 2009). Um zu zeigen, dass die MAPKs durch LPS und IFNγ auch unter serumfreien
Kultivierungsbedingungen in C57BL/6 BMM aktiviert werden, wurden die Makrophagen
für
15 - 240 min
mit
100 ng/ml
LPS
und
100 U/ml
IFNγ
inkubiert
und
die
Gesamtproteinextrakte hinsichtlich phosphorylierter und Gesamt-MAPKs untersucht. Der
Western Blot in Abbildung 28 zeigt die Zunahme der Phosphorylierung von p38 MAPK,
JNK und p44/42 MAPK nach 15- bis 30-minütiger Kostimulation, die ihr Maximum jeweils
nach 60 - 120 min erreicht und anschließend wieder abfällt, wohingegen sich die
Gesamt-p44/42 MAPK-Expression im Untersuchungszeitraum nicht ändert (Abb. 30).
phospho-p38 MAPK
phospho-JNK
phospho-p44/42 MAPK
p44/42 MAPK
-
+
+
+
+
+
240 15
30
60 120 240
LPS/IFNγ
Zeit [min]
Abbildung 30: Zeitabhängige Phosphorylierung von p38 MAPK, JNK und p44/42 MAPK durch LPSund IFNγγ-Stimulation in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM blieben unbehandelt oder wurden für 15 – 240 min
mit 100 ng/ml LPS und 100 U/ml IFNγ inkubiert. Jeweils 40 µg der Gesamtproteinextrakte wurden durch
Western Blot mit Hilfe polyklonaler Antikörper gegen phosphorylierte p38 MAPK, JNK und p44/42 MAPK
und Gesamt-p44/42 MAPK analysiert. Der dargestellte Western Blot ist repräsentativ für zwei unabhängige
Experimente.
Anschließend sollte nun untersucht werden, welche Rolle die p38 MAPK, p44/42 MAPK
oder die JNK neben Prx 5 bei der LPS- und IFNγ-induzierten Genexpression von Prx 1
und 6 in C57BL/6 BMM spielt. Dafür wurden BMM für 1 h mit jeweils steigenden
Konzentrationen der spezifischen Inhibitoren der p38 MAPK (SB202190; 1 – 4 µM), JNK
(SP600125; 5 – 20 µM) oder der MEK1/p44/42 MAPK (PD98059; 5 – 20 µM) inkubiert
104
Ergebnisse und Diskussion
und anschließend für 18 h mit LPS und IFNγ stimuliert (Alessi et al., 1995; Manthey et al.,
1998; Bennett et al., 2001). Die Messung der Nitritkonzentration in Zellkulturüberständen
ließ
erkennen,
dass
die
verwendeten
Konzentrationen
der
Inhibitoren
keine
entscheidende Wirkung auf die induzierte NO-Produktion ausüben (Abb. 31A, 32A, 33A).
Hingegen verringerten alle verwendeten MAPK-Inhibitoren bereits in der geringsten
verwendeten Konzentration signifikant die PGE2-Sekretion (Abb. 31B, 32B, 33B). Mit
Hilfe quantitativer RT-PCR-Analysen konnte nachgewiesen werden, dass die Hemmung
der p38 MAPK zu einer fast vollständigen Unterdrückung der LPS- und IFNγ−induzierten
Prx 6-Transkription führt. Zudem bewirkten bereits 2 µM SB202190 eine 50 %-ige
Abnahme der Prx 5-Geninduktion (Abb. 31C). Daher ist anzunehmen, dass die
p38 MAPK an der LPS- und IFNγ-vermittelten Erhöhung der Genexpression von Prx 5
und 6, jedoch nicht von Prx 1, beteiligt ist. Auf ähnliche Weise wurde auch durch JNKoder p44/42 MAPK-Hemmung die induzierte Genexpression von Prx 5 und 6 vermindert.
Im Gegensatz zum Prx 1-Transkript, das durch JNK- oder p44/42 MAPK-Inhibition nicht
beeinflusst wurde, führten 20 µM SP600125 oder PD98059 zu einer Reduktion der
Prx 5-Geninduktion durch LPS und IFNγ um 25 % und der von Prx 6 um 50 % (Abb. 32C,
33C).
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass alle drei MAPKs eine wichtige Funktion bei
der Induktion der Genexpression von Prx 5 und 6 erfüllen. Da zudem die verwendeten
Inhibitorkonzentrationen keinen Einfluss auf die erhöhte Nitritkonzentration hatten, aber
die induzierte PGE2-Sekretion massiv verminderten, ist anzunehmen, dass alle MAPKs
an der Regulation der Prostaglandinproduktion beteiligt sind, die wiederum für die LPSund IFNγ-vermittelte Induktion der Prx 6-Transkription mitverantwortlich ist. Obwohl in
dieser Arbeit die Inhibition der p38 MAPK keinen Einfluss auf die Nitritkonzentration
zeigte, belegen Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen, dass die LPS-induzierte
Genexpression von iNOS durch die p38 MAPK vermittelt wird (Huang et al., 2004; Kim
et al., 2004). Andererseits bewirkt Peroxynitrit in unterschiedlichen Zelltypen durch
verschiedene Mechanismen die Aktivierung der MAPKs (Ge et al., 2002; Tanno et al.,
2003). Zudem wurde in Alveolar-Typ II-Epithelzellen von Ratten nachgewiesen, dass
durch PMA-Stimulation die p38 MAPK und die p44/42 MAPK für die Phosphorylierung
von
Prx 6
verantwortlich
sind,
die
die
Aktivität
der
lysosomalen,
sauren
2+
Ca -unabhängigen Phospholipase A2-, nicht aber die Peroxidaseaktivität von Prx 6
regulieren
(Wu
et
al.,
2009).
Des
Weiteren
wurde
gezeigt,
dass
der
Raf-1/MEK/p44/42 MAPK-Signalweg weder an der LPS- noch an der PMA-induzierten
mRNA-Expression von Prx 1 in RAW264.7-Makrophagen beteiligt ist (Hess et al., 2003;
Bast et al., 2010).
105
Ergebnisse und Diskussion
A
B
-
+
-
-
+
-
+
1
-
+
2
-
+
-
-
+
4
-
+
1
- LPS/IFNγ
+
2
4
SB [µM]
C
-
+
-
-
-
+
1
-
+
2
-
+
4
-
+
-
-
-
+
1
-
+
2
- LPS/IFNγ
+
4
SB [µM]
Abbildung 31: Einfluss der konzentrationsabhängigen Inhibition der p38 MAPK durch SB202190 auf
die LPS- und IFNγγ-induzierte Genexpression von Prx 1, 5 und 6 in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM
wurden mit dem Lösungsmittel des Inhibitors behandelt oder für 1 h mit dem spezifischen p38 MAPKInhibitor SB202190 (SB, 1 – 4 µM) vorinkubiert und folgend für 18 h mit 100 ng/ml LPS und 100 U/ml IFNγ
stimuliert. Die (A) Nitrit- und (B) Prostaglandin E2-Konzentration in den Zellkulturüberständen wurde mittels
Griess Reagent und EIA bestimmt. (C) Die relative mRNA-Menge von Prx 1, 5 und 6 wurde durch qRT-PCR
bestimmt, wobei RPLP0 als Referenzgen diente. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler
des Mittelwertes (n=5). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit
one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
106
Ergebnisse und Diskussion
A
B
-
+
-
-
+
-
+
5
-
+
10
-
+
-
-
+
20
5
-
+
- LPS/IFNγ
+
10
20
SP [µM]
C
-
+
-
-
+
5
-
+
10
-
+
20
-
+
-
-
+
5
-
+
10
- LPS/IFNγ
+
20
SP [µM]
Abbildung 32: Einfluss der konzentrationsabhängigen Hemmung der JNK durch SP600125 auf die
LPS- und IFNγγ-induzierte Genexpression von Prx 1, 5 und 6 in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM wurden
mit dem Lösungsmittel des Inhibitors behandelt oder für 1 h mit dem spezifischen JNK-Inhibitor SP600125
(SP, 5 – 20 µM) vorinkubiert und anschließend für 18 h mit 100 ng/ml LPS und 100 U/ml IFNγ stimuliert. Die
(A) Nitrit- und (B) Prostaglandin E2-Konzentration in den Zellkulturüberständen wurde mittels Griess
Reagent und EIA bestimmt. (C) Die relative Genexpression von Prx 1, 5 und 6 wurde durch qRT-PCR
analysiert, wobei RPLP0 als Referenzgen diente. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler
des Mittelwertes (n=5). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit oneway ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
107
Ergebnisse und Diskussion
A
B
-
+
-
-
+
-
+
5
-
+
10
-
+
-
-
+
20
-
+
5
-
+
10
20
LPS/IFNγ
PD [µM]
C
-
+
-
-
+
5
-
+
10
-
+
20
-
+
-
-
+
5
-
+
10
-
+
20
LPS/IFNγ
PD [µM]
Abbildung 33: Einfluss der konzentrationsabhängigen Inhibition der p44/42 MAPK durch PD98059
auf die LPS- und IFNγγ-induzierte Genexpression von Prx 1, 5 und 6 in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM
wurden mit dem Lösungsmittel des Inhibitors behandelt oder für 1 h mit dem spezifischen p44/42 MAPKInhibitor PD98059 (PD, 5 – 20 µM) vorinkubiert und anschließend für 18 h mit 100 ng/ml LPS und 100 U/ml
IFNγ stimuliert. Die (A) Nitrit- und (B) Prostaglandin E2-Konzentration in den Zellkulturüberständen wurde
mittels Griess Reagent und EIA bestimmt. (C) Die relative mRNA-Menge von Prx 1, 5 und 6 wurde durch
qRT-PCR analysiert, wobei RPLP0 als Referenzgen diente. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit
dem Fehler des Mittelwertes (n=5). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit
one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
108
Ergebnisse und Diskussion
Zur Gewinnung weiterer Informationen über die Mechanismen, die an der Regulation der
Genexpression von Prx 1, 5 und 6 durch LPS und IFNγ beteiligt sind, sollte die mögliche
Beteiligung der Proteinkinasen C (PKCs) untersucht werden. Neben der PI3K sind auch
die Mitglieder der PKC-Familie in eine Vielzahl zellulärer Prozesse wie Zellwachstum,
Proliferation und Apoptose involviert (Mellor und Parker 1998). Die Superfamilie der
PKCs ist in drei Gruppen, klassische (PKCα, β, γ; cPKC), neue (PKCη, ε, δ, θ; nPKC)
und atypische PKC-Isoformen (PKCι, ξ; aPKC) untergliedert. Diese Gruppierung ergibt
sich einerseits aus der Sequenzhomologie und anderseits aus den Substraten, die für
die Aktivierung dieser PKC-Isoformen charakteristisch sind (Nishizuka 1984; 1988;
1992). Während neue PKCs neben einem Phospholipid, wie Phosphatidylserin,
Diacylglycerin (DAG) und klassische PKCs zudem Ca2+ benötigen (Nishizuka 1984;
1988; Ono et al., 1988; Ono et al., 1989; Nishizuka 1992; Hug und Sarre 1993), ist für
die Aktivierung der atypischen PKC-Isoformen weder DAG noch Ca2+ erforderlich
(Johnson et al., 1993; Newton 1997; 2001). Zusätzlich können einige PKC-Isoformen
durch andere Faktoren wie Fettsäuren, Lysophospholipide und Phosphatidsäure wie
Arachidonsäure, die durch PLA2s entstehen, aktiviert werden (Shinomura et al., 1991;
Nishizuka und Nakamura 1995; Shirai et al., 2000).
Nachdem bereits gezeigt werden konnte, dass die Hemmung der cPLA2 zu einer
deutlichen Abnahme der Induktion der Prx 5- und 6-Genexpression führt (Abbildung
22C, Abbildung 23B), wurden BMM von C57BL/6-Mäusen für 1 h mit steigenden
Konzentrationen entweder des allgemeinen PKC-Inhibitors Ro318220 (1 - 4 µM) oder
des für die klassischen PKC-Isoformen-spezifischen Inhibitors Gö6796 (0,5 - 2 µM)
inkubiert (Johnson et al., 1993; Martiny-Baron et al., 1993) und anschließend für 18 h mit
100 ng/ml LPS und 100 U/ml IFNγ behandelt. Dabei führten bereits die geringsten
verwendeten
Konzentrationen
beider
Hemmstoffe
zu
einer
fast
vollständigen
Unterbindung der LPS- und IFNγ-vermittelten NO-Produktion (Abb. 34, 35). Zudem
verringerte der allgemeine PKC-Inhibitor konzentrationsabhängig die erhöhte Prx 1-, 5und 6-Genexpression durch LPS und IFNγ. Dabei wurde die induzierte Prx 1- und
5-Transkription durch 1 µM Ro318220 um 50 % reduziert und durch 4 µM vollständig
blockiert. Hingegen wurde die Prx 6-mRNA-Induktion erst durch 4 µM Ro318220
signifikant um die Hälfte vermindert (Abb.34). Im Unterschied dazu führte die
Vorinkubation mit dem Inhibitor der klassischen PKC-Isoformen (α, β, γ) zu keiner
Änderung der durch LPS- und IFNγ-hervorgerufenen Erhöhung des Prx 6-Transkripts
(Abb. 35). Die mRNA-Erhöhung von Prx 1 sowie Prx 5 wurde hingegen durch diesen
Hemmstoff
um
25 – 50 %
vermindert.
Damit
übereinstimmend wurde für
die
PMA-induzierte Prx 1-Genexpression in RAW264.7-Makrophagen eine Regulation über
einen PKC/Ras/MEKK1/p38 MAPK-Signalweg festgestellt (Hess et al., 2003). Bei der
109
Ergebnisse und Diskussion
Regulation der Prx 6-mRNA-Induktion durch LPS und IFNγ in C57BL/6 BMM scheinen,
im Gegensatz zur Prx 1- und Prx 5-Geninduktion, nicht die klassischen, sondern die
Ca2+-unabhängigen PKC-Isoformen eine wichtige Rolle zu spielen (Abb. 34, 35).
-
+
-
-
+
1
-
+
-
1
2
-
+
-
4
-
+
-
1
2
Ro [µM]
4
-
+
- LPS/IFNγ
+
2
-
+
-
+
1
-
+
-
+
4
-
+
-
+
2
-
+
-
+
-
+
4
LPS/IFNγ
Ro [µM]
Abbildung 34: Einfluss des allgemeinen Proteinkinase C-Inhibitors Ro318220 auf den LPS- und IFNγγinduzierten mRNA-Gehalt von Prx 1, 5 und 6 in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM wurden mit dem
Lösungsmittel des Inhibitors behandelt oder für 1 h mit dem PKC-Inhibitor Ro318220 (Ro, 1 – 4 µM)
vorinkubiert und anschließend für 18 h mit 100 ng/ml LPS und 100 U/ml IFNγ stimuliert. Die
Nitritkonzentration in den Zellkulturüberständen wurde mittels Griess Reagent bestimmt. Die relative
Genexpression von Prx 1, 5 und 6 wurde durch qRT-PCR bestimmt. Dabei diente RPLP0 als Referenzgen.
Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=6). Die statistische
Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem
Bonferroni post-Test.
110
Ergebnisse und Diskussion
-
+
-
-
+
0,5
-
+
-
0,5
1
-
+
-
2
-
+
-
+
1
-
+
-
+
-
-
2
+
-
+
0,5
-
+
0,5
-
+
+
1
-
Gö [µM]
2
-
+
- LPS/IFNγ
+
1
-
+
2
LPS/IFNγ
Gö [µM]
Abbildung 35: Einfluss der konzentrationsabhängigen Hemmung der klassischen Proteinkinase CIsoformen durch Gö6796 auf die LPS- und IFNγγ-induzierte Genexpression von Prx 1, 5 und 6 in
C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM wurden mit dem Lösungsmittel des Inhibitors behandelt oder für 1 h mit dem
PKC-Inhibitor Gö6796 (Gö, 0,5 – 2 µM) vorinkubiert und anschließend für 18 h mit 100 ng/ml LPS und
100 U/ml IFNγ stimuliert. Die Nitritkonzentration in den Zellkulturüberständen wurde mittels Griess Reagent
bestimmt. Die relative Genexpression von Prx 1, 5 und 6 wurde durch qRT-PCR analysiert, wobei RPLP0
als Referenzgen diente. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=5).
Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem
Bonferroni post-Test.
Stromabwärts des TLR4 vermittelt LPS durch das Adapterprotein MyD88 und TRIF die
Aktivierung der Transkription von Genen, die die angeborene Immunabwehr regulieren
(Akira 2006). Für die Zunahme der Prx 5-Genexpression durch LPS in Makrophagen
wurde gezeigt, dass MyD88 nicht zwingend notwendig, jedoch TRIF essentiell ist (Abbas
et al., 2009). Der LPS-Stimulus kann außerdem dazu führen, dass stromabwärts von
TRIF der IRF3/IFNβ/STAT1-Signalweg aktiviert wird (Beutler 2004). Da die durch
IFNγ-initiierte Genexpression hauptsächlich über den JAK/STAT1-Signalweg vermittelt
wird, wird angenommen, dass der Crosstalk zwischen dem LPS- und dem
IFNγ-Signalweg
bei
der
Regulation
der
Prx 5-mRNA-Induktion
mit
Hilfe
der
STAT1-Signalübertragung erfolgt. Mittels Knochenmarkmakrophagen, die eine Defizienz
im IFNα-Rezeptor aufweisen, wurde nachgewiesen, dass der IFNβ/STAT1-Signalweg
nicht die LPS-abhängige Prx 5-mRNA-Induktion vermittelt. Weiterführend zeigten
Untersuchungen an TLR4 KO-Mäusen, dass die IFNγ-induzierte Genexpression von
111
Ergebnisse und Diskussion
Prx 5 TLR4-unabhängig, jedoch teilweise von MyD88 abhängig ist, das seinerseits für
die Aktivierung der p38 MAPK und die Stabilisierung von mRNA mit AU-reichen
Elementen in IFNγ-stimulierten Makrophagen notwendig ist (Sun und Ding 2006; Abbas
et al., 2009). Ein anderer Signalweg, der TRIF-abhängig ist, rekrutiert den TRAF6/TAK1Komplex oder RIP1, wodurch NFκB und MAPKs aktiviert werden (Akira 2003; CussonHermance et al., 2005; Festjens et al., 2007).
In Zellen des angeborenen Immunsystems führt die Bindung von LPS an CD14/TLR4
über die Signalkaskade MyD88/IRAK/TRAF6/TAK1/IKK/IκBα zur Translokation von
NFκB in den Zellkern (Zhang und Ghosh 2000). Zudem bewirkt LPS die Akkumulation
von ROS, die ebenfalls zur NFκB-Aktivierung führen (Ryan et al., 2004). Da die
proximalen Promotorregionen von Prx 1 und 6 NFκB-Konsensussequenzen besitzen
(Hess et al., 2003; Gallagher und Phelan 2007) und für den Prx 5-Promotor vermutet
wird, dass putative Bindungsstellen für LPS- und IFNγ-responsive Transkriptionsfaktoren
wie AP-1, NFκB, CREB und IRF-Proteine vorhanden sind (Liu et al., 2004; Abbas et al.,
2009), an die u. a. NFκB bindet, sollte die Abhängigkeit der LPS- und IFNγ-induzierten
Genexpression von Prx 1, 5 und 6 einerseits von der Proteasom-abhängigen
Degradierung und andererseits von der NFκB-Aktivierung untersucht werden. Das
Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) und die Autophagozytose stellen gegensätzlichregulierte Proteindegradierungssysteme dar. Wird das UPS durch den zellpermeablen,
selektiven Proteasominhibitor MG132 gehemmt (Rock et al., 1994), wird die
Autophagozytose verstärkt aktiviert (Wu et al., 2008). MG132 ist zudem in der Lage, in
der hier verwendeten Konzentration von 10 µM die NFκB-Aktivierung zu blockieren
(Read et al., 1995). Neben der einstündigen Vorinkubation von C57BL/6 BMM mit 10 µM
MG132 wurden Makrophagen mit 20 µM BAY117082 behandelt und anschließend für
18 h mit LPS und IFNγ stimuliert. BAY117082 wird einerseits als antiinflammatorische
Substanz und andererseits als Inhibitor der Cytokin-induzierten IκBα-Phosphorylierung
beschrieben,
der
Adhäsionsmolekülen
dabei
führt
zu
einer
(Pierce
verminderten
et
al.,
Expression
1997).
Die
von
NFκB
und
Hemmung
der
Proteasom-vermittelten Degradierung mittels MG132 verursachte eine Abnahme der
NO-Freisetzung von C57BL/6 BMM durch LPS- und IFNγ-Stimulation (Abb. 36). Die
basale Genexpression von Prx 1 und 5 wurde um 80 % im Vergleich zu unbehandelten
Makrophagen verringert, während die von Prx 6 unbeeinflusst blieb. Hingegen wurde die
induzierte Transkription sowohl von Prx 1 und 5 als auch von Prx 6 fast vollständig
unterbunden (Abb. 36). Die Blockade der IκBα-Degradierung durch BAY117082 führte
auch zu einer Abnahme der durch Kostimulation-induzierten NO-Bildung; diese wurde
jedoch weniger stark reduziert als durch den Proteasominhibitor (Abb. 37). Des Weiteren
112
Ergebnisse und Diskussion
führte die Hemmung der NFκB-Aktivierung weder zu einer Reduktion der induzierten
noch der basalen Genexpression der untersuchten Prxs, vielmehr wurde die LPS- und
IFNγ-induzierte und die basale mRNA-Expression von Prx 1 und 6 geringfügig, jedoch
nicht signifikant erhöht (Abb. 37).
-
+
-
+
+
-
+
-
+
+
-
-
-
+
-
-
-
+
-
+
-
+
+
+
-
+
+
+
LPS/IFNγ
MG132
-
LPS/IFNγ
+
MG132
Abbildung 36: Einfluss des Proteasominhibitors MG132 auf die LPS- und IFNγγ-induzierte
Genexpression von Prx 1, 5 und 6 in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM wurden mit dem Lösungsmittel des
Inhibitors behandelt oder für 1 h mit 10 µM des Proteasominhibitors MG132 vorinkubiert und anschließend
für 18 h mit 100 ng/ml LPS und 100 U/ml IFNγ stimuliert. Die Nitritkonzentration in den Zellkulturüberständen
wurde mittels Griess Reagent bestimmt. Die relative Genexpression von Prx 1, 5 und 6 wurde durch
qRT-PCR ermittelt, wobei RPLP0 als Referenzgen diente. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit
dem Fehler des Mittelwertes (n=3). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit
one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
113
Ergebnisse und Diskussion
-
+
-
+
+
-
+
-
+
+
+
+
-
+
-
+
+
+
LPS/IFNγ
BAY117082
-
+
-
+
+
-
LPS/IFNγ
+
BAY117082
Abbildung 37: Einfluss des NFκ
κB-Inhibitors BAY117082 auf die LPS- und IFNγγ-induzierte
Genexpression von Prx 1, 5 und 6 in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM wurden mit dem Lösungsmittel des
Inhibitors behandelt oder für 1 h mit 20 µM des NFκB-Inhibitors BAY117082 vorinkubiert und anschließend
für 18 h mit 100 ng/ml LPS und 100 U/ml IFNγ stimuliert. Die Nitritkonzentration in den Zellkulturüberständen
wurde mittels Griess Reagent bestimmt. Die relative mRNA-Menge von Prx 1, 5 und 6 wurde durch
qRT-PCR bestimmt, wobei RPLP0 als Referenzgen diente. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit
dem Fehler des Mittelwertes (n=3). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit
one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
Gallagher und Phelan zeigten ebenfalls eine Erhöhung der Prx 6-Basalexpression durch
NFκB-Inhibition in murinen Hepatozyten (Gallagher und Phelan 2007). Eine konstitutive
Expression von NFκB und Translokation in den Zellkern wurde außerdem sowohl in
unbehandelten RAW264.7-Makrophagen als auch in verschiedenen Zelllinien von
Monozyten wie HL60, U937, THP-1 und Mono Mac 1 und 6 nachgewiesen
(Frankenberger et al., 1994; Bast et al., 2010). Da die Hemmung von NFκB zu einer
leichten Erhöhung der Basalexpression von Prx 1 und 6 führt, ist anzunehmen, dass
eine geringe NFκB-Aktivität in unbehandelten primären Makrophagen für die
Suppression von Prx 1 und 6 verantwortlich ist. Dieses steht in Einklang mit der
Annahme, dass NFκB fähig ist, antioxidative Enzyme negativ zu regulieren. Des
Weiteren wurde in Rattenhepatozyten gezeigt, dass der Glykochenodeoxycholsäureinduzierte Zelltod zur Aktivierung von NFκB führt, es jedoch gleichzeitig zu einer
verminderten Genexpression von Prx 1 und 2 kommt (Chu et al., 2003). Sowohl in LPSoder
114
PMA-stimulierten
RAW264.7-Makrophagen
als
auch
in
LPS-stimulierten
Ergebnisse und Diskussion
Kupfferzellen konnte die Beteiligung des NFκB-Signalweges an der induzierten
Genexpression von Prx 1 ausgeschlossen werden (Immenschuh et al., 1999; Hess et al.,
2003; Bast et al., 2010), obwohl durch unterschiedliche Studien gezeigt wurde, dass der
NFκB-Signalweg eine regulatorische Funktion bei der PMA-initiierten Expression
verschiedener Gene ausübt (Baldwin 1996; Wang et al., 1997; Lee et al., 2002;
Majumdar et al., 2002).
PPARs (peroxisome proliferator-activated receptors) sind Transkriptionsfaktoren der
Superfamilie nukleärer Hormonrezeptoren, die über natürliche Liganden wie Fettsäuren,
Eicosanoide oder oxidierte Fettsäuren aktiviert werden (Michalik et al., 2006). Im
Gegensatz zu Steroidhormonrezeptoren, die als Homodimere wirken, ist für die
transkriptionelle
Regulation
durch
PPARs
die
Heterodimerisierung
mit
dem
Retinoid-X-Rezeptor (RXR) notwendig, der ebenfalls zur gleichen Rezeptorsuperfamilie
gehört (Keller et al., 1993; Kliewer et al., 1995). Das Heterodimer PPAR/RXR kann
bereits in Abwesenheit eines Liganden gebildet werden. Wird dieses Dimer jedoch
aktiviert, moduliert es durch Bindung an eine spezifische DNA-Sequenz, ein
sogenanntes peroxisome proliferator response element (PPRE), die Transkription
bestimmter Zielgene (Dreyer et al., 1992; Kliewer et al., 1995; Feige et al., 2005). Für die
Kontrolle der Genexpression durch PPAR/RXR-Heterodimere ist zusätzlich eine
Interaktion mit Koregulatorkomplexen notwendig, die entweder einen Koaktivator für die
Stimulation oder einen Korepressor zur Inhibition der Zielgenexpression darstellen
(Dowell et al., 1999; Stanley et al., 2003) (Michalik et al., 2006).
Die drei Subtypen von PPARs (PPARα, β/δ, γ) erfüllen essentielle Funktionen bei der
Regulation
metabolischer
Signalwege,
wie
der
Lipidbiosynthese
und
dem
Glukosemetabolismus. Außerdem spielen sie eine entscheidende Rolle bei der
Differenzierung, Proliferation sowie bei der Apoptose (Moraes et al., 2006). Kürzlich ist
zudem eine Involvierung von PPARs in Entzündungsprozessen nachgewiesen worden.
PPAR-Liganden, vor allem die von PPARα und PPARγ, hemmen die Aktivierung
inflammatorischer Gene und können negativ mit Signalwegen proinflammatorischer
Transkriptionsfaktoren in Entzündungszellen interferieren. In aktivierten Monozyten und
Makrophagen reguliert aktiviertes PPARγ die Synthese proinflammatorischer Cytokine
und die Induktion der iNOS, indem es negativ mit AP-1, NFκB oder STAT interagiert
(Jiang et al., 1998; Delerive et al., 1999; Chung et al., 2000).
Es gibt Hinweise darauf, dass COX-2 neben der Etablierung einer akuten Entzündung
durch die Bildung von 15d-PGJ2 während der Endphase einer Entzündung eine wichtige
antiinflammatorische Rolle spielt (Willoughby et al., 2000a; Willoughby et al., 2000b;
Cuzzocrea et al., 2002). 15d-PGJ2 kann sowohl als Aktivator als auch Repressor
115
Ergebnisse und Diskussion
signalübertragender Transkriptionsfaktoren wirken. Durch die Arbeitsgruppen um
Cernuda-Morollon und Rossi wurde gezeigt, dass 15d-PGJ2 die Aktivierung von NFκB
hemmen kann, indem es kovalent an die IκB-Kinase oder die p50-Untereinheit von
NFκB bindet (Rossi et al., 2000; Cernuda-Morollon et al., 2001). Außerdem wurde über
15d-PGJ2 berichtet, dass es einen natürlichen Liganden von PPARγ darstellt (Ricote et
al., 1998). Weiterhin resultierte die Behandlung mit PPARγ-Liganden in einem
Kolitis-Mausmodell in einer Abnahme der Schwere der Darmentzündung (Su et al.,
1999).
Aufgrund der Beteiligung von COX-Enzymen an der LPS- und IFNγ-induzierten
Genexpression von Prx 6 und der damit verknüpften Bildung von Prostaglandinen, sollte
untersucht werden, ob PPARγ an der Transkriptionsinitiation der Prxs beteiligt ist. Daher
wurden
zuerst
Makrophagen
Konzentrationen verschiedener
von
C57BL/6-Mäusen
für
18 h
mit
steigenden
PPARγ-Aktiviatoren, Troglitazon (5 – 20 µM)
und
Ciglitazon (5 – 20 µM) behandelt. Troglitazon und Ciglitazon sind Thiazolidindione, die
durch ihre antihyperglykämische Aktivität bekannt sind. Troglitazon senkt die
Blutglukosekonzentration
bei
Typ-2-Diabetes
mellitus
und
besitzt
zudem
antiinflammatorische und antitumorale Aktivität (Willson et al., 1996; Fujiwara und
Horikoshi 2000; Aljada et al., 2001). Untersuchungen der Genexpression von Prx 1, 5
und 6 zeigten, dass weder die Behandlung mit Troglitazon noch die mit Ciglitazon zu
einer Induktion der Genexpression der Prxs führt (Abb. 38A, B). Um zu bestätigen, dass
PPARγ, wie durch die Aktivatoren gezeigt, keinen Einfluss auf die mRNA-Expression
von Prx 1, 5 und 6 hat, wurden Makrophagen zudem für eine Stunde mit 2,5 – 10 µM
des potenten PPARγ-Antagonisten GW9662 vorinkubiert (Wright et al., 2000; Bendixen
et al., 2001) und anschließend für 18 h mit LPS und IFNγ behandelt. Die Hemmung von
PPARγ
mit steigenden
Konzentrationen
von GW9662 änderte die
induzierte
Genexpression von Prx 1, 5 und 6 nicht (Abb. 39). Da weder mit verschiedenen
PPARγ-Aktivatoren eine Induktion der mRNA der Prxs hervorgerufen wurde, noch durch
den PPARγ-Inhibitor die mRNA-Erhöhung durch LPS und IFNγ vermindert wurde, ist zu
schlussfolgern, dass PPARγ nicht für die Transkriptionsinitiation von Prx 1, 5 und 6
erforderlich ist.
116
Ergebnisse und Diskussion
A
B
-
5
10
20
Tro [µM]
-
5
10
20
Ci [µM]
Abbildung 38: Einfluss der PPARγγ-Aktivatoren Troglitazon und Ciglitazon auf die Genexpression von
Prx 1, 5 und 6 in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM wurden mit dem Lösungsmittel der Aktivatoren oder für
18 h mit 5 – 20 µM (A) Troglitazon (Tro) oder (B) Ciglitazon (Ci) behandelt. Die relative Genexpression von
Prx 1, 5 und 6 wurde mittels qRT-PCR analysiert. Dabei diente RPLP0 als Referenzgen. Die Graphen
repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=4). Die statistische Auswertung erfolgte
durch Vergleich der Gruppen mit dem Kruskal-Wallis Test und anschließendem Dunn’s post-Test.
117
Ergebnisse und Diskussion
-
+
-
-
+
2,5
-
+
5
-
+
-
+
-
-
+
10
-
+
2,5
5
-
+
10
LPS/IFNγ
GW [µM]
Abbildung 39: Einfluss des PPARγγ-Inhibitors GW9662 auf die LPS- und IFNγγ-induzierte
Genexpression von Prx 1, 5 und 6 in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM wurden mit dem Lösungsmittel des
Inhibitors behandelt oder für 1 h mit dem PPARγ-Inhibitor GW9662 (GW, 2,5 – 10 µM) vorinkubiert und
anschließend für 18 h mit 100 ng/ml LPS und 100 U/ml IFNγ stimuliert. Die relative Genexpression von Prx 1,
5 und 6 wurde durch qRT-PCR analysiert, wobei RPLP0 als Referenzgen diente. Die Graphen
repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=5). Die statistische Auswertung erfolgte
durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
Da gezeigt werden konnte, dass zwar die Hemmung des UPS die transkriptionelle
Erhöhung von Prx 1, 5 und 6 durch LPS und IFNγ unterbindet, jedoch der
NFκB-Signalweg nicht zur Induktion dieser Prxs beiträgt, stellt sich die Frage, welche
Mechanismen an der Regulation von Prxs beteiligt sind, die ebenfalls abhängig vom
UPS
sind.
Ein
möglicher
Signalmediator
stellt
daher
der
redox-sensitive
Transkriptionsfaktor Nrf2 (nuclear factor-erythroid 2p45 (NF-E2)-related factor 2) dar.
Nrf2 nimmt eine zentrale Rolle bei der Abwehr von oxidativem Stress durch die Induktion
antioxidativer
Enzyme,
wie
Hämoxygenase-1
und
Glutathionperoxidase
sowie
Stress-responsiver Proteine ein (Surh 2008; Surh et al., 2008; Surh et al., 2009) und
wird im Cytoplasma durch Keap1- (Kelch-like ECH-associated protein 1) abhängige
proteasomale Degradierung negativ reguliert (Stewart et al., 2003). Im Zellkern bindet
Nrf2 nach der Heterodimerisierung mit anderen Transkriptionsfaktoren wie Proteinen der
Maf-Familie an AREs (antioxidant response elements), wodurch die Genexpression der
Zielgene initiiert wird (Itoh et al., 1997; Bloom und Jaiswal 2003; Motohashi et al., 2004).
Oxidative oder elektrophile Stressoren können die PI3K, MAPKs oder die PKC aktivieren,
118
Ergebnisse und Diskussion
die ihrerseits Nrf2 phosphorylieren, was die Freisetzung von Keap1 bewirkt und die
Translokation von Nrf2 in den Zellkern erlaubt (Lee und Johnson 2004). Da der humane
Prx 6-Promotor an Position -415 eine Nrf2-Konsensussequenz besitzt, nahmen
Gallagher und Phelan bereits eine mögliche Beteiligung von Nrf2 bei der induzierten
Prx 6-Transkription an (Gallagher und Phelan 2007), jedoch konnte bis heute keine
direkte Regulation von Prx 6 durch Nrf2 nachgewiesen werden. Zudem wurden im
humanen Prx 1-Promotor mehrere putative Bindungsstellen für Nrf2 ermittelt (Kim et al.,
2007). In Übereinstimmung damit wurde in kultivierten Peritonealmakrophagen
Nrf2-defizienter Mäuse gezeigt, dass die Stimulation mit elektrophilen Substanzen,
Paraquat, einem H2O2-Donor oder Cadmiumchlorid, die in Makrophagen des Wildtyps
die Prx 1-Expression induzieren,
zu keiner Zunahme der
Prx-1-mRNA-
oder
Proteinmenge führt (Ishii et al., 2000).
Um zu überprüfen, ob Nrf2 an der induzierten Genexpression von Prxs beteiligt ist,
wurden C57BL/6 BMM vorerst für 18 h mit steigenden Konzentrationen verschiedener
Nrf2-Aktivatoren, Sulforaphan (5 – 20 µM), tert-Butylhydroquinon (tBHQ; 12,5 – 50 µM)
und Kaffeesäurephenethylester (CAPE; 10 - 40 µM) behandelt. Sulforaphan reagiert mit
einer spezifischen Cystein-reichen Region von Keap1 (Dinkova-Kostova et al., 2002).
Nach Bindung von Sulforaphan an Nrf2, ist Keap1 nicht mehr fähig, die Nrf2-Aktivität zu
hemmen. Ähnlich inhibiert tBHQ die Bindung von Keap1 an Nrf2. Zudem ist tBHQ in der
Lage, in verschiedenen Zelltypen Nrf2 zu stabilisieren und die Nrf2-Proteinsynthese zu
erhöhen. Die durch tBHQ-vermittelte Nrf2-Stabilisierung induziert die Expression
antioxidativer Gene, die wiederum zum Schutz vor H2O2-induziertem, apoptotischem
Zelltod in Neuroblastomazellen als auch vor nekrotischem Zelltod in humanen neuralen
Stammzellen beiträgt (Kraft et al., 2004). Im Gegensatz zu Sulforaphan und tBHQ wird
CAPE in der Literatur überwiegend als NFκB-Inhibitor beschrieben, der die Bildung
proinflammatorischer Cytokine wie z. B. TNFα und IL-1β
vermindert und in
Makrophagen Apoptose induziert (Natarajan et al., 1996; Fitzpatrick et al., 2001). Des
Weiteren stellt CAPE neben Curcumin einen neuen Nrf2-abhängigen Aktivator der
Hämoxygenase-1 (HO-1) dar (Scapagnini et al., 2002).
Durch die Stimulation mit den drei Nrf2-Aktivatoren wurde keine Änderung der
Nitritkonzentration in den Zellkulturüberständen im Vergleich zu unbehandelten BMM
nachgewiesen (Abb. 40, 41, 42). Die Inkubation mit Sulforaphan führte zu einer
Geninduktion von Prx 1, 5 und 6, wobei die Induktion von Prx 5 vernachlässigbar gering
(1,4-fach) im Vergleich zur LPS- und IFNγ-induzierten Erhöhung ausfiel (12-fach)
(Abb. 40). Die Prx 1-mRNA wurde durch 5 bzw. 10 µM Sulforaphan auf das 4-Fache
erhöht, wohingegen 10 bzw. 20 µM des Nrf2-Aktivators in einer 2,7-fachen Zunahme der
Prx 6-Genexpression resultierten. Übereinstimmend damit führte die Stimulation mit
119
Ergebnisse und Diskussion
12,5 - 50 µM tBHQ ebenfalls zur transkriptionellen Zunahme von Prx 1, 5 und 6, wobei
Prx 1 und 6 abermals deutlich stärker dosisabhängig induziert wurden als Prx 5
(Abb. 41).
Im
Gegensatz
dazu
führte
CAPE
zwar
zu
einem
Anstieg
der
Prx 1-Genexpression, der jedoch statistisch nicht signifikant war, beeinflusste aber die
Prx 5-mRNA-Menge nicht. Wie zuvor bereits Sulforaphan und tBHQ erhöhten
10 - 40 µM
CAPE
die
mRNA-Expression
von
Prx 6
konzentrationsabhängig.
Diesbezüglich bewirkte die Stimulation mit 40 µM CAPE eine 2,5-fache Zunahme der
Prx 6-Transkription (Abb. 42).
-
5
10
20
-
5
10
20
SR [µM]
-
5
10
20
-
5
10
20
SR [µM]
Abbildung 40: Konzentrationsabhängige Änderung der Genexpression von Prx 1, 5 und 6 durch den
Nrf2-Aktivator Sulforaphan in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM wurden mit dem Lösungsmittel des
Aktivators behandelt oder für 18 h mit 5 – 20 µM Sulforaphan (SR) stimuliert. Die Nitritkonzentration in den
Zellkulturüberständen wurde mittels Griess Reagent bestimmt. Die relative Genexpression von Prx 1, 5 und
6 wurde mittels qRT-PCR analysiert. Dabei diente RPLP0 als Referenzgen. Die Graphen repräsentieren den
Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=5). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der
Gruppen mit dem Kruskal-Wallis Test und anschließendem Dunn’s post-Test.
120
Ergebnisse und Diskussion
-
12,5
25
50
-
12,5
25
50
tBHQ [µM]
-
12,5
20
50
-
12,5
20
50
tBHQ [µM]
Abbildung 41: Konzentrationsabhängige Änderung der Genexpression von Prx 1, 5 und 6 durch den
Nrf2-Aktivator tert-Butylhydroquinon in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM wurden mit dem Lösungsmittel
des Aktivators behandelt oder für 18 h mit 12,5 – 50 µM tert-Butylhydroquinon (tBHQ) stimuliert. Die
Nitritkonzentration in den Zellkulturüberständen wurde mittels Griess Reagent bestimmt. Die relative
Genexpression von Prx 1, 5 und 6 wurde mittels qRT-PCR analysiert. Dabei diente RPLP0 als Referenzgen.
Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=5). Die statistische
Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit dem Kruskal-Wallis Test und anschließendem
Dunn’s post-Test.
Immenschuh et al. beschrieben eine gemeinsame Induktion von HO-1 und Prx 1 in
primären
Rattenhepatozyten
durch
Häm,
Okadainsäure
und
verschiedene
Schwermetalle (Immenschuh et al., 1995; Immenschuh et al., 1997; Immenschuh et al.,
2002; Immenschuh et al., 2003; Immenschuh et al., 2005) und vermuteten in der
koordinierten Induktion beider Enzyme eine adaptive Antwort der Zelle zum Schutz vor
oxidativem Stress (Immenschuh und Baumgart-Vogt 2005). Im Gegensatz zu den
meisten klassischen HO-1-Induktoren, die bei die Aktivierung der Transkription des
ho-1-Gens von ihrem oxidativen Potential abhängig sind, wirken Curcumin und CAPE
nicht nur antioxidativ, sondern besitzen zudem antitumorgene und antiinflammatorische
Wirkungen (Huang et al., 1996; Natarajan et al., 1996; Huang et al., 1997; Michaluart et
al., 1999). Weitere Untersuchungen zeigten eine stark eingeschränkte Expression
cytoprotektiver Gene nach Stimulation von Nrf2-Knockout-Mäusen mit Karzinogenen
(Ramos-Gomez et al., 2001). Außerdem wiesen Nrf2-defiziente Zellen eine erhöhte
Empfindlichkeit gegenüber oxidativen Schäden und Zelltod auf, was schlussfolgern lässt,
121
Ergebnisse und Diskussion
dass Nrf2 ein potenter, positiver Regulator des ho-1-Gens und anderer detoxifizierender
Enzyme ist (Alam et al., 1999; Ishii et al., 2000).
-
10
20
40
-
10
20
40
CAPE [µM]
-
10
20
40
-
10
20
40
CAPE [µM]
Abbildung 42: Konzentrationsabhängige Änderung der Genexpression von Prx 1, 5 und 6 durch den
Nrf2-Aktivator CAPE in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM wurden mit dem Lösungsmittel des Aktivators
behandelt oder für 18 h mit 10 – 40 µM Kaffeesäurephenethylester (CAPE) stimuliert. Die Nitritkonzentration
in den Zellkulturüberständen wurde mittels Griess Reagent bestimmt. Die relative Genexpression von Prx 1,
5 und 6 wurde mittels qRT-PCR analysiert. Dabei diente RPLP0 als Referenzgen. Die Graphen
repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=5). Die statistische Auswertung erfolgte
durch Vergleich der Gruppen mit dem Kruskal-Wallis Test und anschließendem Dunn’s post-Test.
Im
Anschluss
an
die Untersuchungen der
mRNA-Induktion
der
Prxs
durch
Nrf2-Aktivatoren, sollte überprüft werden, ob die Behandlung mit LPS und IFNγ sowie
mit Sulforaphan zur Aktivierung von Nrf2 in Knochenmarkmakrophagen führt. Die
Detektion der Aktivierung von Nrf-2 erfolgte mit Hilfe der Immunfluoreszenz. Dafür
wurden BMM von C57BL/6-Mäusen für 4 Stunden mit 100 ng/ml LPS und 100 U/ml IFNγ
bzw. 20 µM Sulforaphan behandelt. Als Kontrollen dienten dabei unbehandelte bzw.
DMSO-behandelte Makrophagen. Zur Detektion der subzellulären Lokalisation von Nrf2
wurde
ein
polyklonaler
Antikörper
gegen
Nrf2
und
das
grün-fluoreszierende
TM
Antikörperkonjugat Anti-Kaninchen-Cy 2 verwendet. Abbildung 43 zeigt, dass der
Transkriptionsfaktor Nrf2 in unbehandelten bzw. in DMSO-behandelten Makrophagen
sowohl im Cytosol als auch im Zellkern lokalisiert ist, was darauf schließen lässt, dass
Nrf2 eine Rolle bei der Regulation der Basalexpression von Proteinen spielt. Die
Translokation von Nrf2 in den Zellkern wurde durch die LPS- und IFNγ-Stimulation
122
Ergebnisse und Diskussion
verstärkt, jedoch führte die Stimulation der Makrophagen mit Sulforaphan zur stärksten
Translokation von Nrf2 (Abb. 43).
Kontrolle
DMSO
LPS/IFNγ
Sulforaphan
Abbildung 43: Translokation des Transkriptionsfaktors Nrf2 nach 4-stündiger LPS- und
IFNγγ-Stimulation bzw. Sulforaphan-Behandlung in C57BL/6 BMM. Knochenmarkmakrophagen blieben
unbehandelt, wurden mit dem Lösungsmittel des Nrf2-Aktivators behandelt oder wurden für 4 h mit
100 ng/ml LPS und 100 U/ml IFNγ bzw. 20 µM Sulforaphan stimuliert. Die subzelluläre Lokalisation von Nrf2
wurde mittels Immunfluoreszenz mit Hilfe eines polyklonalen Antikörpers gegen Nrf2 und dem
TM
grün-fluoreszierenden Antikörperkonjugat Anti-Kaninchen-Cy 2 analysiert. Die Dokumentation erfolgte mit
dem Fluoreszenzmikroskop BZ-9000 der Firma Keyence. Die dargestellten Immunfluoreszenzen sind
repräsentativ für drei unabhängige Experimente.
Da durch Balogun et al. gezeigt wurde, dass die CAPE-induzierte HO-1-Expression und
-Aktivität von der Aktivierung des Nrf2/ARE-Signalweges abhängig ist (Balogun et al.,
2003) und in dieser Arbeit nachgewiesen werden konnte, dass CAPE und andere
Nrf2-Aktivatoren die Genexpression von Prx 1 und 6 erhöhen (Abb. 40, 41, 42) und eine
verstärkte nukleäre Translokation von Nrf2 in murinen Knochenmarkmakrophagen durch
LPS- und IFNγ-Stimulation erfolgt (Abb. 43), sollte analysiert werden, ob der
Nrf2/ARE-Signalweg ebenfalls für die LPS- und IFNγ-induzierte mRNA-Expression von
Prxs verantwortlich ist. Dafür wurden BMM von C57B/SV129-Nrf2 KO- (Nrf2 KO-),
C57B/SV129-Wildtyp- und C57BL/6-Mäusen für 18 h mit 100 ng/ml LPS und/oder
100 U/ml IFNγ stimuliert. Die Analysen der Nitritkonzentration und der relativen
Genexpression von Prx 1, 5 und 6 ergaben keine Unterschiede in BMM von
C57B/SV129-Wildtyp- und C57BL/6-Mäusen (Abb. 44). Beide Stämme wurden in
diesem Experiment mitgeführt, da der Nrf2-Knockout auf dem genetischen Hintergrund
123
Ergebnisse und Diskussion
von
C57B/SV129-Mäusen
basiert
und
die
Vergleichbarkeit
der
Daten
mit
Untersuchungen in C57BL/6 BMM gewährleistet werden sollte. Die LPS- und
IFNγ-Stimulation führte in BMM aller drei Mausstämme zu einer nahezu identisch
starken Erhöhung der NO-Freisetzung, während die IFNγ-Behandlung zu keiner
Zunahme der Nitritkonzentration führte (Abb. 44A). Im Vergleich zum Wildtypstamm
wurde jedoch in BMM von Nrf2 KO-Mäusen die NO-Produktion durch alleinige
Stimulation mit LPS leicht induziert. Übereinstimmend mit den dargestellten Daten in
Abbildung 44A wurde in Nrf2-defizienten Mäusen eine erhöhte iNOS-Expression im
Vergleich zum Wildtypstamm festgestellt (Khor et al., 2006; Osburn et al., 2007), was
darauf hindeutet, dass Nrf2 ein negativer Regulator der iNOS-Expression und
Produktion von NO ist. Die Untersuchung der relativen Genexpression von Nrf2 KO und
C57B/SV129-Wildtyp BMM zeigte keine signifikanten Unterschiede in der mRNA-Menge
von Prx 1 und 6 nach alleiniger Stimulation mit LPS oder IFNγ. Dennoch wurde die
Tendenz einer geringeren Induktion der Prx 1-Genexpression durch LPS in Nrf2 KO
gegenüber C57B/SV129-Wildtyp BMM festgestellt. Des Weiteren führte die Stimulation
mit LPS oder LPS und IFNγ zu einer stärkeren Erhöhung der Prx 5-Transkription in
Nrf2 KO BMM im Vergleich zu C57B/SV129 BMM. Demgegenüber bewirkte die
Kostimulation eine deutlich verminderte Prx 6-mRNA-Induktion in Nrf2 KO BMM
gegenüber dem Wildtyp (Abb. 44B).
A
-
+
-
-
+
+
+
Nrf2 KO
-
+
-
-
+
+
+
C57B/SV129
-
+
-
-
+ LPS
+
+ IFNγ
C57BL/6
Abbildung 44A: Auswirkungen des Nrf2-Knockouts auf die induzierte Genexpression von Prx 1, 5
und 6 durch LPS- und/oder IFNγγ-Stimulation in C57B/SV129 BMM. BMM von Nrf2 KO- (hellgraue
Säulen), C57B/SV129-Wildtyp- (dunkelgraue Säulen) und C57BL/6- (schwarze Säulen) Mäusen blieben
unbehandelt oder wurden für 18 h mit 100 ng/ml LPS und/oder 100 U/ml IFNγ inkubiert. Die
Nitritkonzentration in den Zellkulturüberständen wurde mittels Griess Reagent bestimmt. Die Graphen
repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=6). Die statistische Auswertung erfolgte
durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
124
Ergebnisse und Diskussion
B
-
+
-
+
+
+
-
+
-
+
+
+
-
+
-
+
+ LPS
+ IFNγ
-
-
+
-
+
-
+
-
+
+
-
+
-
-
+
+
-
-
-
+
-
+ LPS
+ IFNγ
-
+
-
-
+
+
-
+
-
-
-
-
+
-
+
Nrf2 KO
+
C57B/SV129
+
+
+ LPS
+ IFNγ
C57BL/6
Abbildung 44B: Auswirkungen des Nrf2-Knockouts auf die induzierte Genexpression von Prx 1, 5
und 6 durch LPS- und/oder IFNγγ-Stimulation in C57B/SV129 BMM. BMM von Nrf2 KO- (hellgraue
Säulen), C57B/SV129-Wildtyp- (dunkelgraue Säulen) und C57BL/6- (schwarze Säulen) Mäusen blieben
unbehandelt oder wurden für 18 h mit 100 ng/ml LPS und/oder 100 U/ml IFNγ inkubiert. Die relative
Genexpression von Prx 1, 5 und 6 wurde durch qRT-PCR ermittelt, wobei RPLP0 als Referenzgen diente.
Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=6). Die statistische
Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem
Bonferroni post-Test.
Die Genexpressionsanalysen der Prxs von Nrf2 KO BMM lassen den Schluss zu, dass
Nrf2 bei der LPS- sowie LPS- und IFNγ-induzierten Induktion der Prx 5-mRNA als
negativer Regulator fungiert, während die LPS- und IFNγ-induzierte Transkription von
Prx 6 teilweise durch Nrf2 vermittelt wird. Neben einer erhöhten iNOS-Expression wurde
125
Ergebnisse und Diskussion
in Nrf2 KO-Mäusen
n durch die Arbeitsgruppen
Arbeitsgruppe um Khor
hor und Osburn eine verstärkte
vers
Expression von COX-2 während einer
Dextran
Dextran-Natriumsulfat-induzierten
induzierten Kolitis
nachgewiesen (Khor et al., 2006; Osburn et al., 2007).
2007) Die verstärkte iNOSiNOS und
COX-2-Expression in Nrf2-defizienten
defizienten Mäusen lässt vermuten, dass das Fehlen der
Nrf2-vermittelten Prx 6-Geninduktion
Geninduktion teilweise durch die iNOSiNOS und COX-2-vermittelte
COX
Signalübertragung
ragung kompensiert werden kann. Die folgende Abbildung stellt ein Modell
der Signaltransduktion der Regulation von Prx 6 durch LPS und IFNγ
IFN in murinen
Knochenmarkmakrophagen
chenmarkmakrophagen dar (Abb. 45).
Abbildung 45:: Signaltransduktionsmodell
Signaltransduktion
zur Regulation von Prx 6 durch LPS und IFNγ
IFNγ in murinen
Knochenmarkmakrophagen. AA: Arachidonsäure; CREB: cAMP response element binding protein; COX:
Cyclooxygenasen; iNOS: induzierbare
duzierbare NO-Synthase;
NO
JAK2: Januskinase 2; JNK: c-Jun
Jun-NH2-terminale
Kinase; MEKK: Mitogen-aktivierte
aktivierte Proteinkinase/extrazelluläre
Proteinkinase/
Signal-regulierte Kinase-Kinase;
Kinase; Nrf2: nuclear
factor-erythroid 2p45 (NF-E2)-related
related factor 2;
2 p38: p38 Mitogen-aktivierte
e Proteinkinase; p44/42:
p44/42 Mitogen-aktivierte
aktivierte Proteinkinase; PDK-1: Phosphatidylinositol-abhängige
abhängige Proteinkinase-1;
Protein
PG:
Prostaglandin; PI3K: Phosphatidylinositol-3-Kinase;
Phosphatidylinositol
PKB: Proteinkinase B; PKC: Proteinkinase C; cPLA2:
cytosolische Phospholipase A2; TLR4: Toll-like-Rezeptor
Toll
4.
126
Ergebnisse und Diskussion
3.2
Regulation der Genexpression von Peroxiredoxinen durch
Prostaglandine in primären Makrophagen
Prostaglandine regulieren wichtige homeostatische Funktionen wie die Aktivierung der
angeborenen Immunantwort durch bakterielle Infektionen, die Aufrechterhaltung der
kardiovaskulären Funktion, den Schmerzreiz sowie die Blutstillung (Zhang et al., 1997;
Funk 2001; Kobayashi und Narumiya 2002; Smith 2008). Die Schlüsselenzyme der
Prostaglandinsynthese sind die Cyclooxygenasen (COX). Unter physiologischen
Bedingungen wird fast ausschließlich das COX-1-Enzym exprimiert. Prostaglandine, die
aufgrund einer veränderten COX-2-Expression synthetisiert werden, spielen bei diversen
pathologischen Zuständen wie chronischen Entzündungen, Fieber, der Angiogenese
und der Tumorgenese eine entscheidende Rolle, wodurch COX-2 in den vergangenen
Jahren immer mehr in den Fokus therapeutischer Ansätze gelangt ist (Cao et al., 1998;
Dimberg et al., 1999; Samad et al., 2001; Leahy et al., 2002; Sinicrope 2006).
Im
ersten
Abschnitt
der
COX-2-Proteinexpression
vorliegenden
nach
Arbeit
LPS-
und
wurde
bereits
IFNγ-Behandlung
eine
erhöhte
in
murinen
Knochenmarkmakrophagen festgestellt. Im Verlauf der Untersuchungen wurde zudem
sowohl die Abhängigkeit der induzierten Prx 6-Genexpression von den COX-Enzymen
als auch von der stromabwärts liegenden cytosolischen Phospholipase A2 ermittelt. In
den letzten Jahren zeigten verschiedene Studien, dass Prx 6 entscheidende Funktionen
beim Schutz des Organismus vor oxidativen Schäden einnimmt (Wang et al., 2003;
Wang et al., 2004; 2006a; Kumin et al., 2006; Wang et al., 2006b; Kumin et al., 2007).
Des
Weiteren
wurde
2+
Ca -unabhängigen
Zellmembranintegrität
nachgewiesen,
dass
Phospholipase A2-Aktivität
beteiligt
ist,
indem
es
Prx 6
aufgrund
an
der
bei
der
seiner
sauren,
Aufrechterhaltung
Degradierung
der
oxidierter
Membranproteine mitwirkt. Zudem ist es am Lipid-Turnover des Lungensurfactants
beteiligt und dient so dem Schutz der Lunge vor äußeren schädigenden Einflüssen
(Schremmer et al., 2007). Daher scheint Prx 6 an der Aufrechterhaltung des
Redoxsystems beteiligt zu sein und zusätzlich antioxidative Wirkung zu besitzen.
Aufgrund der vorangegangen Untersuchungen sollte im zweiten Abschnitt dieser Arbeit
untersucht werden, ob die Behandlung mit Cyclopentenon- oder konventionellen
Prostaglandinen zu einer Änderung der Genexpression der Peroxiredoxine in primären
Makrophagen führt. Anschließend sollten die Mediatoren der Signaltransduktion ermittelt
werden, die in die induzierte Genexpression von Prx 6 durch Stimulation mit den
konventionellen Prostaglandinen PGE2 oder PGD2 involviert sind. Dabei sollte eine
mögliche Beteiligung der Adenylylzyklase und ihres Produktes cAMP sowie der
Proteinkinase A analysiert werden. Außerdem sollte untersucht werden, ob die
Januskinase-2, die Phosphatidylinositol-3-Kinase, die Mitogen-aktivierten Proteinkinasen
127
Ergebnisse und Diskussion
und Proteinkinase C sowie PPARγ und Nrf2 eine entscheidende Rolle bei der Regulation
der PGE2- oder PGD2-induzierten Prx 6-Transkription spielen.
3.2.1
Prostaglandine erhöhen die Genexpression von Prx 6
Um zu untersuchen, ob verschiedene Cyclopentenon-Prostaglandine die Genexpression
von
Prxs
beeinflussen,
wurden
vorerst
Knochenmarkmakrophagen
von
C57BL/6-Mäusen für 18 h mit 50 µM PGA1 oder PGA2 sowie 10 µM 15d-PGJ2 behandelt,
anschließend die relative Genexpression von Prx 1 – 6 mittels qRT-PCR untersucht
sowie die Nitritkonzentration an Zellkulturüberständen mit Hilfe des Griess Reagents
bestimmt.
Dabei
führte
die
Stimulation
mit
PGA1
zu
einer
Abnahme
der
mRNA-Expression von Prx 2, 3 und 4 und zu keiner signifikanten Änderung der
mRNA-Menge von Prx 1 und 5. Zudem wurde die Genexpression von Prx 1 – 5 durch
Inkubation mit PGA2 vermindert. Im Gegensatz dazu wurde das Prx 6-Transkript durch
PGA1 und PGA2 induziert. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass die Stimulation
mit 15d-PGJ2 zu einer Erhöhung der Prx 1- und 6-Genexpression führt, wohingegen die
von Prx 2 und 4 vermindert wird und die von Prx 3 und 5 unverändert bleibt (Abb. 46B).
Übereinstimmend damit zeigten Untersuchungen von Itoh et al., dass 15d-PGJ2 die
mRNA-Expression von Prx 1 in murinen Peritonealmakrophagen erhöht. Außerdem
beobachtete diese Arbeitsgruppe ebenfalls eine Erhöhung der Prx 1-Genexpression
durch PGA1-Stimulation (Itoh et al., 2004). Die Abbildung 46A verdeutlicht darüber
hinaus, dass die Stimulation mit den genannten Prostaglandinen zu keiner Änderung der
NO-Produktion im Vergleich zu den jeweils mit dem Lösungsmittel-behandelten
Makrophagen führte (Abb. 46A).
Analysen der Genexpression der proinflammatorischen Cytokine IL-6, IL-1β und TNFα
nach 18-stündiger Stimulation mit PGA1, PGA2 oder 15d-PGJ2 deuteten auf keine
signifikanten Änderungen der mRNA-Menge dieser Cytokine hin. Die Stimulation mit
PGA2 führte zu einer leichten Geninduktion von IL-6 (4-fach), diese ist jedoch im
Vergleich zu der 3000-fachen IL-6-mRNA-Induktion nach 18-stündiger LPS- und
IFNγ-Stimulation (Abb. 9) vernachlässigbar gering. Im Gegensatz zu PGA1 oder PGA2
bewirkte die Inkubation mit 15d-PGJ2 eine 75%-ige Abnahme der TNFα-Genexpression
(Abb. 46C). Dieser Effekt ist mit der kürzlich beschriebenen antiinflammatorischen
Wirkung von 15d-PGJ2 zu erklären (Kim und Surh 2006). 15d-PGJ2 besitzt die Fähigkeit,
die Expression proinflammatorischer Mediatoren in aktivierten Monozyten und
Makrophagen zu unterdrücken, indem es auf unterschiedlichen Wegen die Transkription
NFκB-abhängiger inflammatorischer Gene unterbindet (Castrillo et al., 2000; Straus et
al., 2000). Die Abnahme der TNFα-mRNA-Expression in C57BL/6 BMM nach
128
Ergebnisse und Diskussion
15d-PGJ2-Stimulation lässt daher auf eine negative Regulation der Aktivierung von
NFκB durch 15d-PGJ2 schließen.
A
K1
PGA1 PGA2 PGJ2
K2
B
-
PGA1
PGA2
PGJ2
-
PGA1
PGA2
PGJ2
Abbildung 46A-B: Änderung der Genexpression von Prx 1 – 6 durch Stimulation mit CyclopentenonProstaglandinen. C57BL/6 BMM wurden mit dem Lösungsmittel der Stimulatoren behandelt (K1=DMSO;
K2=Methylacetat) oder für 18 h mit 50 µM PGA1, PGA2 oder 10 µM 15d-PGJ2 stimuliert. (A) Die
Nitritkonzentration in den Zellkulturüberständen wurde mittels Griess Reagent bestimmt. (B) Die relative
Genexpression von Prx 1 – 6 wurde durch qRT-PCR ermittelt. Dabei diente RPLP0 als Referenzgen. Die
Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=6). Die statistische Auswertung
erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
129
Ergebnisse und Diskussion
C
-
PGA1
PGA2
PGJ2
-
PGA1
PGA2
PGJ2
Abbildung 46C: Änderung der Genexpression von IL-1β
β, IL-6 und TNFα
α durch Stimulation mit
Cyclopentenon-Prostaglandinen. C57BL/6 BMM wurden mit dem Lösungsmittel der Stimulatoren
behandelt oder für 18 h mit 50 µM PGA1, PGA2 oder 10 µM 15d-PGJ2 (PGJ2) stimuliert. Die relative
Genexpression von IL-1β, IL-6 und TNFα wurde durch qRT-PCR analysiert. Dabei diente RPLP0 als
Referenzgen. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=4). Die
statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem
Bonferroni post-Test.
Um die Konzentration der Cyclopentenon-Prostaglandine zu ermitteln, die zur stärksten
Zunahme der Prx 1- bzw. Prx 6-Genexpression führen, wurden C57BL/6 BMM für 18 h
mit 12,5 – 50 µM PGA1 oder PGA2 sowie 2,5 – 10 µM 15d-PGJ2 inkubiert. Dabei kam es
zu einer konzentrationsabhängigen Geninduktion von Prx 6 durch PGA1 und PGA2, die
ihr Maximum bei der Verwendung von 25 µM des jeweiligen Prostaglandins erreichte
und
durch
50 µM
unverändert
hoch
blieb.
Die
Stimulation
mit
steigenden
Konzentrationen an 15d-PGJ2 führte zu einer stetigen Zunahme der mRNA-Menge von
Prx 6, die ihr Maximum mit einer 4-fachen Erhöhung durch 10 µM 15d-PGJ2 erreichte
(Abb. 47). Im Gegensatz dazu induzierte 15d-PGJ2 die Genexpression von Prx 1, jedoch
wurde das Prx 1-Transkript durch 5 µM 15d-PGJ2 maximal auf das 5-Fache induziert
(Abb. 47). In murinen Peritonealmakrophagen wurde ebenfalls ein dosisabhängiger
Anstieg der Prx 1-Genexpression durch 15d-PGJ2 nachgewiesen. Dabei wurde aber bei
Konzentrationen von 0,5 - 10 µM 15d-PGJ2 eine maximale Zunahme des Prx-1-mRNAGehalts durch 10 µM 15d-PGJ2 festgestellt (Itoh et al., 2004).
130
Ergebnisse und Diskussion
-
12,5
25
50
PGA1 [µM]
-
12,5
25
50
PGA2 [µM]
-
2,5
5
10
PGJ2 [µM]
-
2,5
5
10
PGJ2 [µM]
Abbildung 47: Konzentrationsabhängige Induktion der Genexpression von Prx 1 und Prx 6 durch
ausgewählte Cyclopentenon-Prostaglandine. C57BL/6 BMM wurden mit dem Lösungsmittel der
Stimulatoren behandelt oder für 18 h mit 12,5 – 50 µM PGA1 und PGA2 oder 2,5 – 10 µM 15d-PGJ2 (PGJ2)
stimuliert. Die relative Genexpression von Prx 1 und Prx 6 wurde mittels qRT-PCR bestimmt. Dabei diente
RPLP0 als Referenzgen. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n≥5).
Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit dem Kruskal-Wallis Test und
anschließendem Dunn’s post-Test.
Nach
der
Bestimmung
der
Prx-maximal-induzierbaren
Konzentration
der
Cyclopentenon-Prostaglandine sollte der zeitabhängige Verlauf der Prx 1- und
Prx 6-mRNA-Induktion untersucht werden. Aus diesem Grund wurden Makrophagen für
9 bis 24 h mit den jeweils am stärksten-induzierbaren Konzentrationen an PGA1, PGA2
oder 15d-PGJ2 stimuliert. Dabei wurde beobachtet, dass die Inkubation mit allen drei
Cyclopentenon-Prostaglandinen
Prx 6-Genexpression
führt
zu
(Abb. 48).
einer
zeitabhängigen
Während
PGA1
und
Induktion
15d-PGJ2
der
die
Prx 6-mRNA-Menge maximal nach 18 h induzierten, führte die Stimulation mit PGA2 mit
einer Erhöhung auf das 10-Fache erst nach 24 h zur maximalen Induktion. Die
Genexpression von Prx 1 wurde durch 5 µM 15d-PGJ2 ebenfalls zeitabhängig induziert,
erreichte mit einer Zunahme auf das 4-Fache nach 18-stündiger Stimulation ihr
Maximum und blieb nach 24 h nahezu gleich stark erhöht (Abb. 48).
131
Ergebnisse und Diskussion
-
9
12
18
24
-
9
PGA1 [50 µM]
-
9
12
18
PGJ2 [10 µM]
12
18
24
Zeit [h]
24
Zeit [h]
PGA2 [50 µM]
24
-
9
12
18
PGJ2 [5 µM]
Abbildung 48: Zeitabhängige Induktion der Genexpression von Prx 1 und Prx 6 durch ausgewählte
Cyclopentenon-Prostaglandine. C57BL/6 BMM wurden mit dem Lösungsmittel der Stimulatoren behandelt
oder für 9, 12, 18 und 24 h mit 50 µM PGA1, PGA2, 5 µM oder 10 µM 15d-PGJ2 (PGJ2) stimuliert. Die
relative Genexpression von Prx 1 und Prx 6 wurde mittels qRT-PCR analysiert. Dabei diente RPLP0 als
Referenzgen. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n≥4). Die
statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit dem Kruskal-Wallis Test und
anschließendem Dunn’s post-Test.
Neben dem Einfluss ausgewählter Cyclopentenon-Prostaglandine sollte in dieser Arbeit
außerdem der Einfluss konventioneller Prostaglandine auf die Änderung der
Genexpression von Prxs analysiert werden. Daher wurde die Stimulation von C57BL/6
BMM mit 50 µM PGD2, PGE1, PGE2 sowie PGF2α für 18 h und anschließend die
Bestimmung sowohl der relativen Genexpression von Prx 1 – 6 als auch der
NO-Produktion in den Zellkulturüberständen durchgeführt. Abbildung 49A zeigt, dass die
Behandlung mit den ausgewählten konventionellen Prostaglandinen wie bereits zuvor
die Cyclopentenon-Prostaglandine keine Auswirkung auf die NO-Produktion von
C57BL/6 BMM hat (Abb. 49A). Darüber hinaus blieb die Genexpression von Prx 1 - 4
durch die Behandlung mit den konventionellen Prostaglandinen unverändert oder wurde
vermindert (Abb. 49B). Während der mRNA-Gehalt von Prx 5 durch Stimulation mit
PGD2 um 40 % reduziert wurde, bewirkte die Inkubation mit PGE1, PGE2 oder PGF2α
eine 1,7- bis 2-fache Induktion der Prx 5-Genexpression. Da jedoch in den
vorangegangenen Untersuchungen in BMM von C57BL/6-Mäusen eine 10-fache
132
Ergebnisse und Diskussion
Erhöhung des Prx 5-Transkripts durch Stimulation mit LPS und IFNγ nachgewiesen
werden konnte, ist die durch die Prostaglandine PGE1-, PGE2- oder PGF2α-vermittelte
Zunahme der Prx 5-Genexpression vernachlässigbar gering. Im Gegensatz zu Prx 1 - 5
wurde die Genexpression von Prx 6 durch die Stimulation mit allen verwendeten
konventionellen
Prostaglandinen
induziert
(Abb. 49B).
Während
PGD2
die
Prx 6-Geninduktion am stärksten auf das 7-Fache erhöhte, führte die Stimulation mit
PGE1 zu einem 3,5-fachen, PGE2 zu einem 4-fachen und PGF2α zu einem 2,5-fachen
mRNA-Anstieg.
Wie bereits genannt, setzen Makrophagen nach der Aktivierung durch LPS und IFNγ
zum einen reaktive Sauerstoff- und Stickstoffverbindungen und zum anderen
proinflammatorische Cytokine wie IL-6, IL-1β und TNFα frei (Janeway und Medzhitov
2002).
Infolgedessen
sollte
Cyclopentenon-Prostaglandinen
analysiert
werden,
(Abb. 46C)
ob
im
konventionelle
Gegensatz
zu
den
Prostaglandine
die
Expression dieser proinflammatorisch wirkenden Cytokine wesentlich beeinflussen. Die
Abbildung 49C zeigt, dass die 18-stündige Stimulation mit 50 µM PGE1 oder PGE2 im
Vergleich zur Stimulation mit 50 µM PGD2 oder PGF2α den deutlichsten Einfluss auf die
mRNA-Menge von IL-6 und IL-1β hat und eine Erhöhung der Genexpression von IL-6
auf das 50-Fache und der von IL-1β auf das 35-Fache bewirkt. Demgegenüber hatte die
Inkubation mit PGE1, PGE2 oder PGF2α keine Auswirkung auf die TNFα-Genexpression.
Außerdem
resultierte
die
Stimulation
mit
PGD2
in
einer
Verdopplung
des
TNFα-Transkripts. Ein interessanter Aspekt dabei ist jedoch die leichte Zunahme der
TNFα-Genexpression durch PGD2, wohingegen 15d-PGJ2, das stabile Produkt der
Hydrolyse aus PGD2, eine deutliche Abnahme der TNFα-mRNA-Menge bewirkte
(Abb. 46C, 49C).
133
Ergebnisse und Diskussion
A
-
PGE1 PGE2 PGD2 PGF2α
-
PGE1 PGE2 PGD2 PGF2α
B
-
PGE1 PGE2 PGD2 PGF2α
Abbildung 49A-B: Änderung der Genexpression von Prx 1 – 6 durch Stimulation mit konventionellen
Prostaglandinen. C57BL/6 BMM wurden mit dem Lösungsmittel der Stimulatoren behandelt oder für 18 h
mit 50 µM PGE1, PGE2, PGD2 und PGF2α stimuliert. (A) Die Nitritkonzentration in den Zellkulturüberständen
wurde mittels Griess Reagent bestimmt. (B) Die relative Genexpression von Prx 1 – 6 wurde durch qRTPCR analysiert. Dabei wurde RPLP0 als Referenzgen verwendet. Die Graphen repräsentieren den
Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=6). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der
Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
134
Ergebnisse und Diskussion
C
-
PGE1 PGE2 PGD2 PGF2α
-
PGE1 PGE2 PGD2 PGF2α
Abbildung 49C: Änderung der Genexpression von IL-1β
β, IL-6 und TNFα
α durch Stimulation mit
konventionellen Prostaglandinen. C57BL/6 BMM wurden mit dem Lösungsmittel der Stimulatoren
behandelt oder für 18 h mit 50 µM PGE1, PGE2, PGD2 und PGF2α stimuliert. Die relative Genexpression von
IL-1β, IL-6 und TNFα wurde mittels qRT-PCR analysiert. Dabei wurde RPLP0 als Referenzgen verwendet.
Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=4). Die statistische
Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem
Bonferroni post-Test.
Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass alle hier verwendeten Prostaglandine im
Gegensatz zur LPS- und IFNγ-Stimulation keinen entscheidenden Einfluss auf die
Freisetzung von IL-6, IL-1β und TNFα in primären Makrophagen besitzen (Abb. 9, 46C,
49C). Demgegenüber zeigten Fournier et al., dass die Stimulation von murinen
Makrophagen mit TNFα die Aktivität der PGE-Synthase verstärkt und zu einer erhöhten
Synthese von PGE2 führt (Fournier et al., 1997). Demzufolge führen zwar Mediatoren
wie proinflammatorische Cytokine oder Peroxynitrit zur Initiierung der Genexpression
von COX-2 und der anschließenden Synthese von Prostaglandinen, jedoch scheinen
diese vornehmlich negativ auf die Expression der proinflammatorischen Mediatoren zu
wirken, die dadurch möglicherweise den Entzündungsprozess dämpfen.
135
Ergebnisse und Diskussion
PGE2 stellt das Hauptprodukt der COX-Enzyme dar. Es wird angenommen, dass PGE2
das maßgebende Prostaglandin ist, dass am Entzündungsprozess beteiligt ist (MartelPelletier et al., 2004). Es gibt verschiedene Isoformen der PGE2-Synthase (PGES). Die
mikrosomale PGES-1 (mPGES-1) wird in vielen Geweben und Zelltypen unter
inflammatorischen Bedingungen induziert. Funk et al. stellten eine gemeinsame
Erhöhung
der
mikrosomalen
PGES-1
und
der
COX-2
während
eines
Entzündungsprozesses fest, die zum Anstieg der PGE2-Produktion führt (Funk 2001).
Mittels semiquantitativer RT-PCR-Analysen konnte in dieser Arbeit nach 18-stündiger
Stimulation mit LPS und IFNγ neben einer erhöhten COX-2-Genexpression ebenfalls ein
Anstieg der mPGES-1 in murinen Knochenmarkmakrophagen detektiert werden (Daten
nicht dargestellt). Da verschiedene Studien eine verminderte LPS-induzierte Sekretion
von PGE2 in Peritonealmakrophagen von mPGES-1-defizienten Mäusen belegen, ist
eine entscheidende Rolle der COX-2-assozierten mPGES-1 bei der Regulation der
PGE2-Sekretion durch LPS und IFNγ anzunehmen (Murakami et al., 2000; Kamei et al.,
2004). Weitere Expressionsanalysen in Knochenmarkmakrophagen nach LPS- und
IFNγ-Behandlung
zeigten
eine
konstitutive
Genexpression
von
COX-1,
der
mikrosomalen PGES-2 und der cytosolischen PGE2-Synthase. Der Nachweis der
konstitutiven
Expression
Untersuchungen
anderer
der
drei
Enzyme
Arbeitsgruppen,
in
C57BL/6
wobei
diese
BMM
der
korreliert
mit
Aufrechterhaltung
physiologischer Prostaglandinkonzentrationen dienen (Smith et al., 2000; Tanioka et al.,
2000; Ueno et al., 2001; Rouzer und Marnett 2003).
Im Gegensatz zu PGE2 wurde PGD2 als Hauptprodukt der COX-Enzyme in vielen
Rattengeweben unter physiologischen Bedingungen sowie in hohem Maße im Gehirn
und in Mastzellen nachgewiesen (Ujihara et al., 1988; Urade et al., 1989).
Semiquantitative RT-PCR-Untersuchungen zeigten, dass die hämatopoetische PGDSynthase durch LPS und IFNγ induziert wird, wohingegen keine Genexpression der
Lipocalin-PGD-Synthase, die überwiegend im Gewebe des zentralen Nervensystems
exprimiert
wird
(Nagata
et
al.,
1991;
Urade
und
Hayaishi
2000),
in
Knochenmarkmakrophagen von C57BL/6-Mäusen nachweisbar ist (Daten nicht
dargestellt).
Um
die
Induktion
der
Prx 6-Genexpression
durch
PGE2
und
PGD2
in
Knochenmarkmakrophagen von C57BL/6-Mäusen näher zu charakterisieren, wurden
BMM für 18 h mit steigenden Konzentrationen (12,5 – 50 µM) an PGE2 oder PGD2
inkubiert. Dabei wurde eine Zunahme der Prx 6-Genexpression in Abhängigkeit von der
Konzentration des jeweils verwendeten Prostaglandins beobachtet. 50 µM von PGE2
oder PGD2 bewirkten jeweils die stärkste Erhöhung des Prx 6-Transkripts (Abb. 50).
136
Ergebnisse und Diskussion
A
B
-
12,5
25
50
PGE2 [µM]
-
12,5
25
50
PGD2 [µM]
Abbildung 50: Konzentrationsabhängige Induktion der Genexpression von Prx 6 durch PGE2 und
PGD2. C57BL/6 BMM wurden mit dem Lösungsmittel der Stimulatoren behandelt oder für 18 h mit
12,5 - 50 µM PGE2 (A) oder PGD2 (B) stimuliert. Die relative Genexpression von Prx 6 wurde mittels
qRT-PCR analysiert. Dabei diente RPLP0 als Referenzgen. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit
dem Fehler des Mittelwertes (n=6). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit
dem Kruskal-Wallis Test und anschließendem Dunn’s post-Test.
Weitere Untersuchungen von C57BL/6 BMM, die für 9, 12, 18 und 24 h mit 50 µM PGE2
oder PGD2 stimuliert wurden, zeigten zudem eine zeitabhängige Geninduktion von Prx 6.
Der PGE2-vermittelte Anstieg des mRNA-Gehalts von Prx 6 nahm erst nach
18-stündiger Stimulation zu und erreichte mit einer Induktion auf das 4,5-Fache nach
24 h sein Maximum. Im Gegensatz dazu konnte bereits nach 9-stündiger Stimulation mit
PGD2 ein 2-facher Anstieg der Prx 6-Genexpression beobachtet werden. Die höchste
Prx 6-mRNA-Zunahme wurde hierbei mit einer Induktion auf das 6-Fache nach
18-stündiger Stimulation festgestellt, die jedoch nach 24 h wieder abnahm (Abb. 51).
B
A
-
9
12
18
PGE2 [50 µM]
24
-
9
12
18
24
Zeit [h]
PGD2 [50 µM]
Abbildung 51: Konzentrationsabhängige Induktion der Genexpression von Prx 6 durch PGE2 und
PGD2. C57BL/6 BMM wurden mit dem Lösungsmittel der Stimulatoren behandelt oder für 9, 12, 18 und 24 h
mit 50 µM PGE2 (A) oder PGD2 (B) stimuliert. Die relative Genexpression von Prx 6 wurde mittels qRT-PCR
analysiert. Dabei diente RPLP0 als Referenzgen. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler
des Mittelwertes (n=6). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit dem KruskalWallis Test und anschließendem Dunn’s post-Test.
Nachdem gezeigt werden konnte, dass die Behandlung von C57BL/6 BMM sowohl mit
PGE2 als auch mit PGD2 eine Zunahme der Prx 6-Genexpression bewirkt, sollte nun
137
Ergebnisse und Diskussion
analysiert werden, ob einhergehend mit der induzierten Genexpression ebenfalls die
Proteinexpression durch die beiden konventionellen Prostaglandine erhöht wird. Zu
diesem Zweck wurden BMM für 6 – 48 h mit 50 µM PGE2 bzw. 6 – 24 h mit 50 µM PGD2
stimuliert und anschließend die Gesamtproteinextrakte mittels Western Blots durch
Antikörper gegen Prx 6 und GAPDH analysiert. Der Western Blot in Abbildung 52A zeigt
die Erhöhung der Prx 6-Proteinmenge durch PGE2. Eine geringfügige Zunahme des
Prx 6-Proteins war bereits nach 24-stündiger Stimulation zu erkennen, jedoch wurde das
Maximum der Induktion erst nach 48-stündiger Inkubation erreicht (Abb. 52A). Zudem
stellt der Western Blot in Abbildung 52B die zeitabhängige Prx 6-Proteinexpression
durch PGD2 dar. Eine leichte Zunahme der Proteinexpression wurde nach 6-stündiger
Stimulation beobachtet, während das Maximum der Prx 6-Proteininduktion nach
12 - 18 h erreicht und nach 24-stündiger Stimulation wieder leicht vermindert wurde
(Abb. 52B).
A
Prx 6
GAPDH
-
+
+
+
+
+
+
PGE2 [50 µM]
48
6
12
18
24
36
48
Zeit [h]
B
Prx 6
GAPDH
-
+
+
+
+
PGD2 [50 µM]
48
6
12
18
24
Zeit [h]
Abbildung 52: Zeitabhängige Induktion der Proteinexpression von Prx 6 durch PGE2 und PGD2.
C57BL/6 BMM wurden mit dem Lösungsmittel der Stimulatoren behandelt oder für 6, 12, 18, 24, 36 und
48 h mit 50 µM PGE2 (A) bzw. für 6, 12, 18 und 24 h mit 50 µM PGD2 (B) stimuliert. Jeweils 20 µg der
Gesamtproteinextrakte wurden durch Western Blot mit Hilfe von Antikörpern gegen Prx 6 und GAPDH
analysiert. Die dargestellten Western Blots sind repräsentativ für mindestens zwei unabhängige
Experimente.
138
Ergebnisse und Diskussion
3.2.2
Die Adenylylzyklase, aber nicht die Proteinkinase A, ist an der
Erhöhung der Prx 6-Genexpression durch LPS und IFNγγ sowie
PGD2 oder PGE2 beteiligt
Konventionelle Prostaglandine wie PGE2 und PGD2 interagieren auf der Oberfläche ihrer
Zielzelle mit spezifischen Gs-Protein-gekoppelten Rezeptoren wie EP2, EP4 oder DP.
Dadurch kommt es zur Dissoziation des Gs-Komplexes vom Rezeptor und zur
anschließenden Anbindung an die Membran-gebundene Adenylylzyklase, die die
Umsetzung von ATP zu cAMP katalysiert (Boie et al., 1995; Narumiya et al., 1999; Tilley
et al., 2001). Assoziiert nun cAMP mit der Proteinkinase A (PKA), bewirkt diese die
Spaltung des inaktiven Holoenzyms und führt zur Initiation der Phosphorylierung
stromabwärts-gelegener Moleküle wie die des Transkriptionsfaktors CREB (cAMP
response element binding protein) bis hin zur Änderung der Transkription spezifischer
Zielgene (Lalli und Sassone-Corsi 1994; Boie et al., 1995).
Um tiefere Einblicke in die Regulation der Genexpression von Prxs zu erhalten, sollte
zuerst die mögliche Beteiligung der Adenylylzyklase an der LPS- und IFNγ- bzw. PGE2oder PGD2-induzierten Genexpression von Prx 6 untersucht werden. Daher wurden
primäre Makrophagen für 1 h mit 25 – 100 µM MDL12330A, einem spezifischen
Hemmstoff der Adenylylzyklase (Lippe und Ardizzone 1991), vorinkubiert und für 18 h
mit 100 ng/ml LPS und 100 U/ml IFNγ bzw. 50 µM PGE2 oder PGD2 stimuliert. Die
Bestimmung der Nitritkonzentration von Zellkulturüberständen ergab, dass die
steigenden Konzentrationen des Adenylylzyklaseinhibitors die erhöhte Nitritfreisetzung
durch LPS und IFNγ nicht beeinflusst (Abb. 53A). Des Weiteren wurde durch den
Adenylylzyklaseinhibitor
eine konzentrationsabhängige Abnahme der
LPS-
und
IFNγ-induzierten Prx 6-Genexpression hervorgerufen. Dabei verringerten 100 µM
MDL12330A die Erhöhung der Prx 6-Transkription um 75 % (Abb. 53B). Darüber hinaus
wurde die PGE2- oder PGD2-abhängige Geninduktion von Prx 6 durch den
Adenylylzyklaseinhibitor dosisabhängig vermindert. Während die durch PGE2-erhöhte
Prx 6-Genexpression durch die höchste verwendete Konzentration an MDL12330A um
50 % reduziert wurde, resultierte die Vorinkubation mit der gleichen Konzentration des
Inhibitors in einer Abnahme der PGD2-induzierten mRNA-Expression von Prx 6 um 75 %
(Abb. 53C, D).
139
Ergebnisse und Diskussion
A
B
-
+
-
-
+
-
+
+
- LPS/IFNγ
-
25
50
+
-
MDL [µM]
100
C
-
+
-
+
25
50
+
100
- LPS/IFNγ
MDL [µM]
D
-
+
-
-
-
+
25
-
+
50
+
- PGE2
100
MDL [µM]
-
+
-
-
-
+
25
-
+
50
+
100
- PGD2
MDL [µM]
Abbildung 53: Konzentrationsabhängige Hemmung der LPS- und IFNγγ-, PGD2- oder PGE2-induzierten
Prx 6-Genexpression durch den Adenylylzyklaseinhibitor MDL12330A. C57BL/6 BMM wurden mit dem
Lösungsmittel des Inhibitors behandelt oder für 1 h mit MDL12330A (MDL, 25 - 100 µM) vorinkubiert und
anschließend für 18 h mit dem Lösungsmittel der Stimulatoren oder mit 100 ng/ml LPS- und 100 U/ml IFNγ,
50 µM PGE2 oder PGD2 stimuliert. (A) Die Nitritkonzentration in den Zellkulturüberständen wurde mit Hilfe
des Griess Reagents bestimmt. Die relative Genexpression von Prx 6 nach (B) LPS und IFNγ-, (C) PGE2oder (D) PGD2-Stimulation wurde durch qRT-PCR analysiert. Dabei diente RPLP0 als Referenzgen. Die
Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n≥4). Die statistische Auswertung
erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
Neben dem Adenylylzyklaseinhibitor wurde außerdem der Aktivator der Adenylylzyklase
Forskolin
in
Anwesenheit
des
nicht
spezifischen
Phosphodiesteraseinhibitors
Isobutylmethylxanthin (IBMX, 100 µM) verwendet. Forskolin bewirkt die Aktivierung der
Adenylylzyklase, was den Anstieg des intrazellulären cAMP-Spiegels zur Folge hat. Die
gleichzeitige Behandlung der Zellen mit IBMX unterbindet dabei den vorzeitigen Abbau
von cAMP durch Phosphodiesterasen (Seamon und Daly 1986; Tomes et al., 1993).
Abbildung 54 zeigt die durch 18-stündige Inkubation mit 10 – 100 µM Forskolin und
100 µM IBMX unveränderte NO-Bildung von C57BL/6 BMM sowie die relative
Genexpression von Prx 1, 5 und 6. Während die Prx 1-Genexpression durch Forskolin
und IBMX leicht verringert und die von Prx 5 unbeeinflusst blieb, wurde die Transkription
von Prx 6 in Abhängigkeit von der Forskolinkonzentration induziert (Abb. 54B). Durch die
Stimulation mit 100 µM Forskolin wurde eine 2,5-fach erhöhte Genexpression von Prx 6
erreicht. Des Weiteren zeigte die 9- bis 24-stündige Inkubation mit 100 µM Forskolin in
140
Ergebnisse und Diskussion
Kombination mit IBMX eine zeitabhängige Zunahme des Prx 6-Transkripts mit einer
maximalen Induktion nach 24 h (Abb. 55).
-
10
50
100
-
10
100 µM IBMX
-
10
50
100
100 µM IBMX
50
100
Forsk [µM]
100 µM IBMX
-
10
50
100
Forsk [µM]
100 µM IBMX
Abbildung 54: Änderung der Genexpression von Prx 1, 5 und 6 durch den Adenylylzyklaseaktivator
Forskolin. C57BL/6 BMM wurden mit den entsprechenden Lösungsmitteln des Adenylylzyklaseaktivators
und des Phosphodiesteraseinhibitors behandelt oder für 18 h mit 10 – 100 µM des Adenylylzyklaseaktivators Forskolin (Forsk) stimuliert. Gleichzeitig erfolgte eine Inkubation mit 100 µM des
Phosphodiesteraseinhibitors IBMX. Die Nitritkonzentration in den Zellkulturüberständen wurde mittels Griess
Reagent bestimmt. Die relative Genexpression von Prx 1, 5 und 6 wurde durch qRT-PCR analysiert. Dabei
diente RPLP0 als Referenzgen. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes
(n=5). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit dem Kruskal-Wallis Test und
anschließendem Dunn’s post-Test.
141
Ergebnisse und Diskussion
-
+
+
+
+
-
+
+
+
+
Forsk/IBMX
-
9
12
18
24
-
9
12
18
24
Zeit [h]
Abbildung 55: Zeitabhängige Änderung der Genexpression von Prx 1, 5 und 6 durch den
Adenylylzyklaseaktivator Forskolin. C57BL/6 BMM wurden mit den entsprechenden Lösungsmitteln des
Adenylylzyklaseaktivators und des Phosphodiesteraseinhibitors behandelt oder für 9, 12, 18 und 24 h mit
100 µM des Adenylylzyklaseaktivators Forskolin (Forsk) und mit 100 µM des Phosphodiesteraseinhibitors
IBMX stimuliert. Die relative Genexpression von Prx 1, 5 und 6 wurde mittels qRT-PCR analysiert. Dabei
diente RPLP0 als Referenzgen. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes
(n=5). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit dem Kruskal-Wallis Test und
anschließendem Dunn’s post-Test.
Im Anschluss an den Nachweis der Beteiligung der Adenylylzyklase an der LPS- und
IFNγ- bzw. PGE2- oder PGD2-induzierten Genexpression von Prx 6 und der
Geninduktion von Prx 6 durch einen Adenylylzyklaseaktivator sollte analysiert werden,
ob ein Anstieg der intrazellulären cAMP-Konzentration mit einer Erhöhung der
Prx-Genexpression
einhergeht.
Dafür
wurden
Knochenmarkmakrophagen
von
C57BL/6-Mäusen für 18 h mit 100 – 400 µM des cAMP-Analogons Dibutyryl-cAMP
behandelt (Hei et al., 1991). Die Stimulation mit 400 µM Dibutyryl-cAMP führte zu einer
Abnahme der Prx 1-Genexpression. Im Gegensatz dazu wurde der mRNA-Gehalt von
Prx 5 durch 200 und 400 µM Dibutyryl-cAMP verdoppelt. Zugleich wurde die
Genexpression von Prx 6 durch Dibutyryl-cAMP erhöht. Die maximale Zunahme auf das
2,5-Fache wurde bei einer Konzentration von 200 µM beobachtet (Abb. 56) Die
Inkubation mit 200 µM Dibutyryl-cAMP für 9 bis 24 h resultierte in einer zeitabhängigen
Zunahme der Prx 6-Transkription, wobei ein signifikanter Anstieg der Prx 6-mRNA nach
18 h und das Maximum der Induktion (2,8-fach) nach 24-stündiger Inkubation
nachgewiesen wurde (Abb. 57).
142
Ergebnisse und Diskussion
-
100
200
400
-
100
200
400
DB [µM]
Abbildung 56: Konzentrationsabhängige Änderung der Genexpression von Prx 1, 5 und 6 durch
Dibutyryl-cAMP. C57BL/6 BMM wurden mit dem Lösungsmittel behandelt oder für 18 h mit 100 – 400 µM
Dibutyryl-cAMP (DB) stimuliert. Die Nitritkonzentration in den Zellkulturüberständen wurde mittels Griess
Reagent bestimmt. Die relative Genexpression von Prx 1, 5 und 6 wurde durch qRT-PCR analysiert. Dabei
diente RPLP0 als Referenzgen. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes
(n=6). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit dem Kruskal-Wallis Test und
anschließendem Dunn’s post-Test.
-
+
+
+
+
-
9
12
18
24
DB [200 µM]
Zeit [h]
Abbildung 57: Zeitabhängige Änderung der Genexpression von Prx 6 durch Dibutyryl-cAMP.
C57BL/6 BMM wurden mit dem Lösungsmittel behandelt oder für 9, 12, 18 und 24 h mit 200 µM DibutyrylcAMP (DB) stimuliert. Die relative Genexpression von Prx 6 wurde mittels qRT-PCR analysiert. Dabei diente
RPLP0 als Referenzgen. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=5).
Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit dem Kruskal-Wallis Test und
anschließendem Dunn’s post-Test.
143
Ergebnisse und Diskussion
Durch die Arbeitsgruppe um Perez wurde gezeigt, dass Dibutyryl-cAMP durch intra- und
extrazelluläre Esterasen zu Butyrat umgesetzt wird. Interessanterweise führte die
Stimulation mit Butyrat in Kupfferzellen zu einem Anstieg der PLA2-Aktivität und zu einer
erhöhten PGE2-Produktion (Perez et al., 1998). Korrelierend mit dem 2-fachen Anstieg
der Prx 5-Genexpression durch PGE2-Stimulation ist daher anzunehmen, dass der
2-fache Anstieg der Prx 5-mRNA durch Dibutyryl-cAMP durch den Butyrat-vermittelten
Anstieg der PGE2-Produktion hervorgerufen wird. Zusätzlich ist es möglich, dass die
verstärkte
PGE2-Sekretion
durch
Butyrat
an
der
Prx 6-mRNA-Induktion
durch
Dibutyryl-cAMP beteiligt ist.
Da gezeigt werden konnte, dass sowohl durch die Adenylylzyklase-gebildetes cAMP als
auch exogen zugeführtes cAMP die Genexpression von Prx 6 in Makrophagen erhöht,
sollte anschließend die Rolle der cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) bei der LPSund IFNγ- bzw. PGE2- oder PGD2-induzierten Prx 6-mRNA untersucht werden, da eine
Erhöhung der intrazellulären cAMP-Konzentration einerseits zur Aktivierung von
Ionenkanälen und andererseits zur Aktivierung der PKA und folgend von CREB führen
kann. Dafür wurden BMM für 1 h mit steigenden Konzentrationen (25 – 100 µM) des
selektiven PKA-Inhibitors H89 (Chijiwa et al., 1990) vorinkubiert und anschließend für
18 h mit LPS und IFNγ, PGE2 oder PGD2 stimuliert. In Folge der Hemmung der PKA
wurde die erhöhte Nitritkonzentration durch LPS und IFNγ nicht verändert (Abbildung
58A). Parallel dazu wurde die erhöhte Genexpression von Prx 6 nur durch 20 µM H89
leicht,
jedoch
nicht
signifikant,
vermindert
(Abb. 58B).
Während
die
erhöhte
Prx 6-Genexpression durch PGE2 durch 20 µM H89 signifikant um 25 % verringert
wurde, kam es ebenfalls zu einer leichten, aber nicht signifikanten Abnahme der
PGD2-induzierten Prx 6-mRNA-Menge (Abb. 58C, D). Neben H89 wurde zudem der
PKA-Inhibitor, KT5720 (Cabell und Audesirk 1993), verwendet. Dieser zusätzliche
Inhibitor der PKA bestätigte die Ergebnisse der Regulationsuntersuchung mit H89
hinsichtlich der LPS- und IFNγ- bzw. PGE2- oder PGD2-induzierten Genexpression von
Prx 6 (Daten nicht dargestellt) und zeigte ebenfalls keinen bzw. nur einen sehr
schwachen Einfluss auf die induzierte Genexpression von Prx 6.
144
Ergebnisse und Diskussion
A
B
-
+
-
-
-
+
+
5
-
+
10
- LPS/IFNγ
20
-
+
-
-
+
H89 [µM]
C
-
-
+
+
10
5
- LPS/IFNγ
20
H89 [µM]
D
-
+
-
-
-
+
5
-
+
10
- PGE2
+
20
H89 [µM]
-
+
-
-
-
+
5
-
+
10
- PGD2
+
20
H89 [µM]
Abbildung 58: Einfluss der Proteinkinase A-Hemmung durch H89 auf die LPS- und IFNγγ-, PGE2- oder
PGD2-induzierte Prx 6-Genexpression. C57BL/6 BMM wurden mit den entsprechenden Lösungsmitteln
behandelt oder für 1 h mit H89 (25 - 100 µM) vorinkubiert und anschließend für 18 h mit 100 ng/ml LPS und
100 U/ml IFNγ, 50 µM PGE2 oder PGD2 stimuliert. (A) Die Nitritkonzentration in den Zellkulturüberständen
wurde mittels Griess Reagent bestimmt. Die relative Genexpression von Prx 6 nach (B) LPS- und IFNγ-, (C)
PGE2- oder (D) PGD2-Stimulation wurde durch qRT-PCR analysiert. Dabei diente RPLP0 als Referenzgen.
Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n≥4). Die statistische
Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem
Bonferroni post-Test.
Um zu untersuchen, ob die Stimulation mit PGE2 oder PGD2 in C57BL/6 BMM in der
Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors CREB resultiert, wurden immunchemische
Analysen durchgeführt. Dazu wurden Knochenmarkmakrophagen für 15 bis 240 min mit
50 µM PGE2 oder PGD2 inkubiert und anschließend die Gesamtproteinextrakte mit Hilfe
polyklonaler Antikörper gegen Gesamt-CREB und phosphoryliertes CREB analysiert.
Die Western Blots in Abbildung 59 zeigen die zeitabhängige Phosphorylierung von
CREB in primären Makrophagen durch Stimulation mit PGE2 bzw. PGD2. Beide
Prostaglandine bewirkten eine Zunahme der Phosphorylierung von CREB nach
15-minütiger Stimulation. Diese Zunahme blieb im Fall von PGE2 über 60 min (Abb. 59A)
und hinsichtlich PGD2 über 30 min (Abb. 59B) erhalten und sank zu späteren
Zeitpunkten wieder auf den basalen Gehalt, während sich die Menge an Gesamt-CREB
im Untersuchungszeitraum nicht änderte.
145
Ergebnisse und Diskussion
A
phospho-CREB
CREB
-
+
+
240
15
30
+
+
+
60 120 240
PGE2 [50µM]
Zeit [min]
B
phospho-CREB
CREB
-
+
+
+
240
15
30
60 120 240
+
+
PGD2 [50 µM]
Zeit [min]
Abbildung 59: Zeitabhängige Phosphorylierung von CREB nach Stimulation mit PGE2 oder PGD2.
C57BL/6 BMM wurden mit dem Lösungsmittel behandelt oder für 15 – 240 min mit 50 µM (A) PGE2 oder (B)
PGD2 inkubiert. Jeweils 40 µg der Gesamtproteinextrakte wurden durch Western Blot mit Hilfe polyklonaler
Antikörper gegen phosphoryliertes CREB und Gesamt-CREB analysiert. Die dargestellten Western Blots
sind repräsentativ für mindestens zwei unabhängige Experimente.
Da mittels PKA-Inhibitoren keine eindeutige Beteiligung der PKA an der Regulation der
Prx 6-Geninduktion nachgewiesen werden konnte, wurde zur näheren Untersuchung der
Beteiligung der PKA an der Geninduktion von Prxs in Knochenmarkmakrophagen der
PKA-Agonist N6- Benzoyladenosin-3', 5'-cAMP (6-Bnz) verwendet (Sorol et al., 2001). In
Folge der 18-stündigen Stimulation mit 10 – 100 µM 6-Bnz konnte jedoch weder ein
Anstieg der Nitritkonzentration im Zellkulturüberstand von C57BL/6 BMM (Abb. 60A)
noch eine Änderung der Genexpression von Prx 1, 5 oder 6 beobachtet werden
(Abb. 60B).
146
Ergebnisse und Diskussion
-
10
50
100
-
10
50
100
6-Bnz [µM]
-
10
50
100
-
10
50
100
6-Bnz [µM]
Abbildung 60: Konzentrationsabhängige Änderung der Genexpression von Prx 1, 5 und 6 durch den
6
PKA-Agonisten N - Benzoyladenosin-3', 5'-cAMP. C57BL/6 BMM blieben unbehandelt oder wurden für
6
18 h mit 10 – 100 µM N -Benzoyladenosine-3', 5'-cAMP (6-Bnz) stimuliert. Die Nitritkonzentration in den
Zellkulturüberständen wurde mittels Griess Reagent bestimmt. Die relative Genexpression von Prx 1, 5 und
6 wurde mittels qRT-PCR analysiert. Dabei diente RPLP0 als Referenzgen. Die Graphen repräsentieren den
Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=5). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der
Gruppen mit dem Kruskal-Wallis Test und anschließendem Dunn’s post-Test.
Da die Behandlung von Knochenmarkmakrophagen mit dem PKA-Agonisten 6-Bnz die
Genexpression von Prx 6 nicht initiierte und zudem die beiden verwendeten
PKA-Inhibitoren keinen entscheidenden Einfluss auf die Induktion der Prx 6-mRNA
zeigten, ist anzunehmen, dass PKA für die induzierte Genexpression der Prxs durch
LPS und IFNγ bzw. PGE2 oder PGD2 keine Bedeutung hat. Die schwache Reduktion der
PGE2-vermittelten Prx 6-Transkription durch Verwendung von 20 µM des PKA-Inhibitors
H89 (Abb. 58C) ist möglicherweise darauf zurückzuführen, dass H89 in höheren
Konzentrationen nicht nur PKA, sondern zudem andere Proteinkinasen wie PKCµ
hemmt (Johannes et al., 1995). Zudem zeigten andere Studien, dass neben PKA sowohl
MAPKs als auch PKCs fähig sind, CREB zu aktivieren (Xie und Rothstein 1995; Xing et
al., 1996; Deak et al., 1998; Arthur 2008). In kultivierten Hepatozyten von Wistar-Ratten,
jedoch nicht in Kupfferzellen, wurde durch Stimulation mit Okadasäure (OA) eine
erhöhte HO-1-Genexpression festgestellt, die durch Dibutyryl-cAMP verstärkt erhöht
wurde, während die Behandlung mit Dibutyryl-cAMP die OA-induzierte Genexpression
von
Prx 1
verminderte.
Im
Unterschied
zur
PKA-unabhängigen
induzierten
Prx 6-Genexpression in Makrophagen, wurde die HO-1-Expression durch OA über einen
147
Ergebnisse und Diskussion
AC/cAMP/PKA/CREB-Signalweg vermittelt (Immenschuh et al., 2002). Da durch die
Hemmung der Adenylylzyklase mittels MDL12330A sowohl die LPS- und IFNγ- als auch
die PGE2- oder PGD2-induzierte Genexpression von Prx 6 dosisabhängig erniedrigt
wurde (Abb. 50B, C, D), ist anzunehmen, dass die Prx 6-Genexpression zwar über
AC/cAMP, aber nicht über PKA/CREB initiiert wird. Es scheinen anstelle von PKA
andere Signalmediatoren an der induzierten Prx 6-Genexpression beteiligt zu sein, die
stromabwärts von AC/cAMP die Prx 6-Transkription induzieren.
Neben der PKA wurden bis jetzt zwei weitere intrazelluläre PKA-unabhängige
cAMP-Akzeptoren beschrieben: Zum einen die cAMP-sensitiven CNG-Kanäle (cyclic
nucleotide-gated) und zum anderen Proteine wie Epac1 und 2 (exchange protein directly
activated by cAMP), die direkt von cAMP aktiviert werden können (Serezani et al., 2008).
Epac-Proteine
besitzen
wie
die
regulatorische
cAMP-Bindungsdomäne.
PKA
und
Epac
Untereinheit
können
neben
der
PKA
antagonistischer
eine
und
agonistischer Wirkung auch voneinander unabhängige Funktionen ausüben. Nach
Bindung von cAMP kann Epac die kleinen GTPasen Rap1 und Rap2 aktivieren, die
wiederum in verschiedene Signalkaskaden regulierend eingreifen. Dabei wurde die
Funktion von Epac in Zusammenhang mit der Sekretion, Phagozytose, Proliferation,
Apoptose und Genexpression beschrieben (Enserink et al., 2002; Hattori und Minato
2003; Cheng et al., 2008; Huang et al., 2008).
Nach dem Ausschluss der Beteiligung der PKA an der induzierten Genexpression von
Prx 6 sollte daher untersucht werden, ob die Signalwirkung von cAMP über Epac eine
Rolle bei der Induktion der Genexpression von Prxs in C57BL/6 BMM spielt. Wie in
Abbildung
61
dargestellt,
zeigte
die
18-stündige
Inkubation
mit
steigenden
Konzentrationen (10 - 100 µM) von 8-pCPT-2‘-O-Me-cAMP (pCPT), einem spezifischen
Agonisten von Epac mit einer extrem geringen Fähigkeit, PKA zu aktivieren (Vliem et al.,
2008), keinen Einfluss auf die Bildung von NO in C57BL/6 BMM (Abb. 61). Des Weiteren
konnte durch Stimulation mit dem Epac-Aktivator keine Änderung der Prx 1-, 5- oder
6-Genexpression festgestellt werden (Abb. 61).
148
Ergebnisse und Diskussion
-
10
50
100
-
10
50
100 pCPT [µM]
-
10
50
100
-
10
50
100 pCPT [µM]
Abbildung 61: Einfluss des selektiven Epac-Agonisten 8-pCPT-2‘-O-Me-cAMP auf die Genexpression
von Prx 1, 5 und 6. C57BL/6 BMM blieben unbehandelt oder wurden für 18 h mit 10 - 100 µM 8-pCPT-2‘-OMe-cAMP (pCPT) stimuliert. Die Nitritkonzentration in den Kulturüberständen wurde mittels Griess Reagent
bestimmt. Die relative Genexpression von Prx 1, 5 und 6 wurde mittels qRT-PCR analysiert. Dabei diente
RPLP0 als Referenzgen. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=5).
Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit dem Kruskal-Wallis Test und
anschließendem Dunn’s post-Test.
Der cAMP-Signalweg ist ein funktionell wichtiger Mechanismus bei der Regulation von
Entzündungsprozessen und der Immunantwort. Beispielsweise wird cAMP eine
entscheidende Rolle bei der Aktivierung der IL-6-Genexpression in Fibroblasten und
Peritonealmakrophagen sowie bei der Aktivierung der iNOS-Genexpression in
Mesangialzellen, Peritonealmakrophagen und glatten Gefäßmuskelzellen zugeschrieben
(Zhang et al., 1988; Imai et al., 1994; Kunz et al., 1994; Sowa und Przewlocki 1994;
Williams und Shacter 1997). In murinen Makrophagen konnte gezeigt werden, dass
exogenes PGE2 die NO-Freisetzung nicht beeinflusst. Im Gegensatz dazu resultierte die
Behandlung von J774-Makrophagen mit PGE2 in Kombination mit LPS sowohl in einer
konzentrationsabhängigen Zunahme der NO-Bildung als auch iNOS-Expression. Daher
wird angenommen, dass exogenes PGE2 die cAMP-Bildung induziert, die wiederum für
die proinflammatorische Antwort entscheidend ist (Lin et al., 1999). Korrelierend mit den
Untersuchungen von Lin et al. zeigte die Arbeitsgruppe um Chio, dass das
cAMP-Analogon Dibutyryl-cAMP die Freisetzung von iNOS-gebildetem NO sowie die
IL-6-Sekretion in J774-Makrophagen induziert (Chio et al., 2004). Des Weiteren wurde
die Induktion der NO- und IL-6-Sekretion durch Dibutyryl-cAMP durch einen
149
Ergebnisse und Diskussion
PKA/PKC/p38 MAPK-Signalweg
vermittelt
nachgewiesen.
In
murinen
Knochenmarkmakrophagen konnte hingegen durch die Stimulation mit Dibutyryl-cAMP
oder
6-Bnz-cAMP
keine
Zunahme
der
Nitritkonzentration
festgestellt
werden
(Abb. 56, 60). Zudem wurde die Induktion der NO-Freisetzung durch LPS und IFNγ nicht
durch
die
Hemmung
von
PKA
herabgesetzt,
was
eine
PKA-vermittelte
iNOS-Genexpression ausschließt (Abb. 58A). Darüber hinaus scheint die Induktion von
Prx 6 durch Prostaglandine unabhängig vom NO-vermittelten Signaltransduktionsweg zu
sein, da die Behandlung von murinen Makrophagen mit den verschiedenen
Prostaglandinen keine Erhöhung der Nitritkonzentration zur Folge hat. Außerdem
beeinflussten weder Inhibitoren der COX-Enzyme die iNOS-Expression und NO-Bildung
(Abb. 24A, B, 25A, B), noch hatte die Hemmung von iNOS Auswirkungen auf die LPSund IFNγ-induzierte COX-2-Expression und PGE2-Freisetzung (Abb. 16B, 18B, 20A, C).
Ergänzend wies die Arbeitsgruppe um Kojima eine Aktivierung von Rap1 durch PGE2 in
rheumatoiden synovialen Fibroblasten nach. Diese Aktivierung von Rap1 wurde
ebenfalls durch 6-Bnz-cAMP sowie durch 8-pCPT-2‘-O-Me-cAMP hervorgerufen.
Demnach scheint die PGE2-induzierte Aktivierung von Rap1 über die EP2- und
EP4-Rezeptoren in Fibroblasten sowohl über Epac als auch über PKA vermittelt zu
werden (Kojima et al., 2009). Demgegenüber wurde in der vorliegenden Arbeit
festgestellt, dass die Aktivierung sowohl der Epac-Proteine als auch der PKA durch
PGE2 oder PGD2 keine Rolle bei der Geninduktion von Prx 6 spielt. Vielmehr scheinen
andere Mediatoren wie zum Beispiel cAMP-abhängige CNG-Kanäle beteiligt zu sein und
die von den Rezeptoren EP2-, EP4- oder DP-ausgehende Signalwirkung von der
Adenylylzykase und cAMP weiterzuleiten.
150
Ergebnisse und Diskussion
3.2.3
JAK2, PI3K, p38 MAPK und PKC sowie Nrf2 vermitteln die PGD2oder PGE2-induzierte Genexpression von Prx 6
Aufgrund der fehlenden Beteiligung der Proteinkinase A an der Prostaglandininduzierten Prx 6-Genexpression sollte im Anschluss untersucht werden, ob andere
Proteinkinasen in die Regulation der Prx 6-Genexpression involviert sind. Da bereits
nachgewiesen werden konnte, dass die Tyrosinkinase JAK2 eine entscheidende Rolle
bei der Regulation der LPS- und IFNγ-induzierten Genexpression von Prx 6 spielt
(Abb. 26C), wurden erneut BMM von C57BL/6-Mäusen für 1 h mit steigenden
Konzentrationen des JAK2-Inhibitors AG490 inkubiert, jedoch anschließend für 18 h mit
50 µM PGE2 oder PGD2 stimuliert. Analysen der relativen Genexpression von Prx 6
zeigten, dass die Behandlung mit AG490 die induzierte Transkription von Prx 6 durch
PGE2 oder PGD2 vermindert (Abb. 62). Dabei reduzierte AG490 in allen verwendeten
Konzentrationen die PGE2-vermittelte Prx 6-Geninduktion um nahezu 40 % (Abb. 62A),
wohingegen die PGD2-induzierte mRNA-Expression von Prx 6 mit
steigenden
Konzentrationen von AG490 abnahm (Abb. 62B). Während 10 µM AG490 die
Prx 6-Geninduktion um 50 % verminderten, führte die Vorinkubation mit 40 µM AG490
zu einer vollständigen Unterdrückung der durch PGD2-vermittelten mRNA-Zunahme von
Prx 6.
A
B
-
+
-
-
+
10
-
+
20
- PGE2
+
40
AG [µM]
-
+
-
-
+
10
-
+
20
- PGD2
+
40
AG [µM]
Abbildung 62: Konzentrationsabhängige Hemmung der PGE2- oder PGD2-induzierten Genexpression
von Prx 6 durch den JAK2-Inhibitor AG490. C57BL/6 BMM wurden mit den entsprechenden
Lösungsmitteln behandelt oder für 1 h mit AG490 (AG, 10 - 40 µM) vorinkubiert und anschließend für 18 h
mit 50 µM PGE2 oder PGD2 stimuliert. Die relative Genexpression von Prx 6 nach (A) PGE2- oder (B) PGD2Stimulation wurde mittels qRT-PCR analysiert. Dabei diente RPLP0 als Referenzgen. Die Graphen
repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=4). Die statistische Auswertung erfolgte
durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
151
Ergebnisse und Diskussion
Zur Charakterisierung der Funktion der PI3K bei der Regulation der Prostaglandinabhängigen Genexpression von Prx 6 wurden Knochenmarkmakrophagen für 1 h mit
verschiedenen Konzentrationen des PI3K-Inhibitors LY294002 (10 – 40 µM) vorinkubiert
und anschließend für 18 h mit 50 µM PGE2 oder PGD2 stimuliert. Es konnte gezeigt
werden, dass nicht nur die LPS- und IFNγ-induzierte Genexpression von Prx 6 von der
PI3K abhängig ist (Abb. 29C), sondern auch die PGE2- oder PGD2-induzierte
Genexpression von Prx 6 durch Hemmung der PI3K dosisabhängig vermindert wird. Die
höchste verwendete Konzentration des Hemmstoffes der PI3K führte dabei einerseits zu
einer vollständigen Unterbindung der Induktion der Prx 6-mRNA durch PGE2 (Abb. 63A)
und andererseits zu einer Abnahme der Prx 6-mRNA durch PGD2 um 70 % (Abb. 63B).
A
B
-
+
-
-
+
10
-
+
20
- PGE2
+
40
-
+
-
LY [µM]
-
+
10
-
+
20
- PGD2
+
40
LY [µM]
Abbildung 63: Konzentrationsabhängige Hemmung der PGE2- oder PGD2-induzierten Genexpression
von Prx 6 durch den PI3-Kinase-Inhibitor LY294002. C57BL/6 BMM wurden mit den entsprechenden
Lösungsmitteln behandelt oder für 1 h mit LY294002 (LY, 10 - 40 µM) vorinkubiert und für 18 h mit 50 µM
PGE2 oder PGD2 stimuliert. Die relative Genexpression von Prx 6 nach (A) PGE2- oder (B) PGD2Stimulation wurde durch qRT-PCR bestimmt. Dabei diente RPLP0 als Referenzgen. Die Graphen
repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n≥4). Die statistische Auswertung erfolgte
durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
Weiterführend wurde mittels Western Blot-Analysen festgestellt, dass die 15- bis
240-minütige Behandlung von C57BL/6 BMM mit 50 µM PGD2 oder PGE2 keine
Phosphorylierung von PKB bewirkt (Daten nicht dargestellt), die jedoch durch
30-minütige LPS- und IFNγ-Stimulation deutlich detektiert werden konnte (Abb. 28).
Daher
ist
eine Beteiligung
der PI3K an der
PGE2-
oder
PGD2-induzierten
Prx 6-Genexpression anzunehmen. Jedoch wird hier nicht die PKB durch den
PI3K/PDK-1-Signalweg phosphoryliert, sondern es werden anscheinend andere
stromabwärts der PI3K-gelegene Signalmoleküle aktiviert, die die Geninduktion von
Prx 6 vermitteln.
152
Ergebnisse und Diskussion
Um die Beteiligung der Regulation der MAP-Kinasen p44/42 MAPK, JNK und p38 MAPK
an der PGE2- und PGD2-induzierten Genexpression von Prx 6 zu untersuchen, wurden
Knochenmarkmakrophagen für 1 h mit 20 µM PD98059, 20 µM SP600125 oder 4 µM
SB202190 vorinkubiert und für 18 h mit 50 µM PGE2 oder PGD2 stimuliert.
Anschließende Genexpressionsanalysen von Prx 6 zeigten, dass sowohl die Hemmung
der p44/42 MAPK durch PD98059 als auch die Hemmung der JNK durch SP600125 die
Geninduktion von Prx 6 durch PGE2 oder PGD2 nicht beeinflusst. Allerdings bewirkte die
p38 MAPK-Inhibition mittels SB202190 eine Abnahme der PGE2- bzw. PGD2-induzierten
mRNA-Menge von Prx 6 um 40 % bzw. 75 % (Abb. 64). Des Weiteren wurde unter
Verwendung von Western Blot-Analysen gezeigt, dass bereits die 15-minütige
Stimulation von C57BL/6 BMM mit PGE2 oder PGD2 die Phosphorylierung der
p38 MAPK bewirkt, die jedoch im weiteren Zeitverlauf über 60 min wieder abnimmt
(Daten nicht dargestellt).
A
B
-
+
-
+
PD
-
+
SP
-
+
SB
- PGE2
-
+
-
+
PD
-
+
SP
+
- PGD2
SB
Abbildung 64: Einfluss der Hemmung von p44/42 MAPK, JNK oder p38 MAPK auf die PGE2- und
PGD2-induzierten Prx 6-Genexpression. C57BL/6 BMM wurden mit den entsprechenden Lösungsmitteln
behandelt oder für 1 h mit 20 µM des MEK1-Inhibitors PD98059, 20 µM des JNK-Inhibitors SP600125 oder
4 µM des p38 MAPK-Inhibitor SB202190 stimuliert und anschließend für 18 h mit 50 µM PGE2 oder PGD2
inkubiert. Die relative Genexpression von Prx 6 nach (A) PGE2- oder (B) PGD2-Stimulation wurde durch
qRT-PCR bestimmt. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=5). Die
statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem
Bonferroni post-Test.
Im Gegensatz zur LPS- und IFNγ-induzierten Genexpression von Prx 6, an der sowohl
die JNK, die p44/42 MAPK als auch die p38 MAPK beteiligt sind (Abb. 31C, 32C, 33C),
konnte ausschließlich die p38 MAPK als signalübertragende MAPK identifiziert werden,
die für die PGE2- und PGD2-induzierte Transkription von Prx 6 entscheidend ist. Lee et
al. stellten fest, dass die Hemmung der p38 MAPK in J774-Makrophagen in einer
Abnahme der HO-1-Induktion durch 15d-PGJ2 resultiert (Lee et al., 2003). Des Weiteren
wurde in glatten Gefäßmuskelzellen nachgewiesen, dass die 15d-PGJ2-induzierte
HO-1-Expression durch die p38-MAPK und Nrf2 vermittelt wird (Lim et al., 2007).
Darüber hinaus berichtete die Arbeitsgruppe um Kitzmann, dass Arsenat in primären
153
Ergebnisse und Diskussion
Rattenhepatozyten die HO-1-Genexpression durch JNK sowie p38γ MAPK, jedoch nicht
durch Raf-1 und ERK induziert (Kietzmann et al., 2003).
Analog zur Stimulation von C57BL/6 BMM mit LPS und IFNγ sollte die Beteiligung der
PKCs an der Regulation der PGE2- bzw. PGD2-induzierten Genexpression von Prx 6
analysiert werden. Dabei führte die Hemmung mit steigenden Konzentrationen des
allgemeinen PKC-Inhibitors Ro813220 (1 – 4 µM) zu einer deutlichen Abnahme der
PGE2- sowie der PGD2-induzierten Genexpression von Prx 6. Während die durch
PGE2-erhöhte Prx 6-mRNA durch 1 µM Ro318220 nahezu vollständig inhibiert wurde
(Abb. 65A), nahm die Prx 6-Geninduktion durch PGD2 mit steigender Konzentration von
Ro318220 kontinuierlich ab und wurde durch 4 µM Ro318220 um 80 % vermindert
(Abb. 65B).
A
B
-
+
-
-
+
1
-
+
- PGE2
+
2
4
-
Ro [µM]
+
-
-
+
-
+
1
2
- PGD2
+
4
Ro [µM]
Abbildung 65: Konzentrationsabhängige Hemmung der PGE2- oder PGD2-induzierten Genexpression
von Prx 6 durch den allgemeinen PKC-Inhibitor Ro318220. C57BL/6 BMM wurden mit den
entsprechenden Lösungsmitteln behandelt oder für 1 h mit Ro318220 (Ro, 1 - 4 µM) vorinkubiert und
anschließend für 18 h mit 50 µM PGE2 oder PGD2 stimuliert. Die relative Genexpression von Prx 6 nach (A)
PGE2- oder (B) PGD2-Stimulation wurde mittels qRT-PCR analysiert. Dabei diente RPLP0 als Referenzgen.
Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=5). Die statistische
Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem
Bonferroni post-Test.
Weiterführend zeigte die Untersuchung von C57BL/6 BMM, die mit 0,5 – 2 µM des
Inhibitors der klassischen PKC-Isoformen, Gö6796, inkubiert und für 18 h mit PGE2 oder
PGD2 stimuliert wurden, dass die PKC-Isoformen α, β und γ keinen oder nur einen sehr
geringen
Einfluss
auf
die
Regulation
der
PGE2-
bzw.
PGD2-induzierten
Prx 6-Genexpression besitzen (Abb. 66). Dabei wurde die erhöhte Prx 6-Transkription
durch PGE2 durch 2 µM Gö6796 um ca. 25 % vermindert (Abb. 66A), wohingegen die
durch PGD2 leicht erhöht wurde bzw. unverändert blieb (Abb. 66B).
154
Ergebnisse und Diskussion
A
B
-
+
-
+
0,5
-
-
+
- PGE2
+
1
2
-
+
-
Gö [µM]
-
+
-
+
0,5
- PGD2
+
2
1
Gö [µM]
Abbildung 66: Einfluss der konzentrationsabhängigen Hemmung der klassischen Proteinkinase CIsoformen durch Gö6796 auf die PGE2- oder PGD2-induzierte Genexpression von Prx 6. C57BL/6 BMM
wurden mit den entsprechenden Lösungsmitteln behandelt oder für 1 h mit Gö6796 (Gö, 0,5 - 2 µM)
vorinkubiert und anschließend für 18 h mit 50 µM PGE2 oder PGD2 stimuliert. Die relative Genexpression
von Prx 6 nach (A) PGE2- oder (B) PGD2-Stimulation wurde mittels qRT-PCR analysiert. Dabei diente
RPLP0 als Referenzgen. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=5).
Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem
Bonferroni post-Test.
Dieses lässt darauf schließen, dass die Proteinkinase C-Superfamilie nicht nur bei der
LPS- und IFNγ-induzierten Genexpression von Prx 6 einen wichtigen Bestandteil der
Regulation darstellt, sondern auch bei der PGE2- bzw. PGD2-vermittelten Geninduktion
von Prx 6. Zusätzlich kann davon ausgegangen werden, dass nicht die klassischen,
sondern die neuen oder atypischen PKC-Isoformen, die nicht durch Ca2+ aktiviert
werden, bei der Regulation der Prx 6-Genexpression eine entscheidende Rolle spielen.
Übereinstimmend damit wurde in murinen Hepatozyen durch den allgemeinen
PKC-Inhibitor Staurosporin eine Abnahme der durch TNFα- oder KGF-induzierten
Prx 6-Genexpression beobachtet (Gallagher und Phelan 2007). Des Weiteren wurde in
murinen Osteoblasten festgestellt, dass die Induktion der Prx 1-mRNA durch
Natriumarsenat durch PKCδ vermittelt wird (Li et al., 2002). Durch den Nachweis der
Beteiligung der Ca2+-unabhängigen PKC-Isoformen am Signaltransduktionsweg, der die
Prx 6-Geninduktion
vermittelt,
ist
außerdem
die
durch
den
PKA-Inhibitor
H89-hervorgerufene Abnahme der PGE2-induzierten Genexpression von Prx 6 zu
erklären (Abb. 58), da die höchste verwendete Konzentration von H89 neben PKA
ebenfalls eine moderate Hemmung der PKCµ bewirkt (Chijiwa et al., 1990; Johannes et
al., 1995) .
155
Ergebnisse und Diskussion
Um weitere Einblicke in die Signalkaskade zu bekommen, die die PGE2- oder
PGD2-induzierte Genexpression von Prx 6 vermittelt, sollte die Beteiligung ausgewählter
Transkriptionsfaktoren untersucht werden. Obwohl die Behandlung von Makrophagen
mit den PPARγ-Aktivatoren Troglitazon oder Ciglitazon keine Auswirkungen auf die
mRNA-Expression von Prx 1, 5 und 6 zeigte (Abb. 38), wurde die Auswirkung der
PPARγ-Hemmung auf die Prx 6-mRNA-Induktion durch PGE2 und PGD2 analysiert.
Dabei
wurde
festgestellt,
dass
die
durch
18-stündige
Stimulation
induzierte
Genexpression von Prx 6 durch steigende Konzentrationen des PPARγ-Inhibitors
GW9662 (2,5 – 10 µM) unverändert bleibt (Abb. 67). Dieses korreliert mit den
Untersuchungen der relativen Genexpression der Prxs nach Hemmung von PPARγ und
der Stimulation mit LPS und IFNγ (Abb. 39). Folglich ist eine Beteiligung des
Transkriptionsfaktors PPARγ an der mRNA-Erhöhung von Prx 6 durch LPS und IFNγ
bzw. PGE2 oder PGD2 auszuschließen. Übereinstimmend damit stellten Lim et al. neben
einer erhöhten ROS- und NO-Bildung eine Zunahme der HO-1-Expression in Zellen der
glatten Gefäßmuskulatur durch 15d-PGJ2 fest. Die durch 15d-PGJ2-hervorgerufene
HO-1-Induktion wurde dabei ebenfalls nicht durch PPARγ sondern durch ROS und
p38 MAPK vermittelt (Lim et al., 2007). Zudem vermutet die Arbeitsgruppe um Lim, dass
15d-PGJ2 die HO-1-Expression in Antwort auf ROS durch einen Signalweg überträgt,
der von Nrf2 abhängig ist.
A
B
-
+
-
+
2,5
-
-
+
5
+
10
- PGE2
GW [µM]
-
+
-
+
2,5
-
-
+
5
- PGD2
+
10
GW [µM]
Abbildung 67: Einfluss der konzentrationsabhängigen Hemmung von PPARγγ durch GW9662 auf die
PGE2- oder PGD2-induzierte Genexpression von Prx 6. C57BL/6 BMM wurden mit den entsprechenden
Lösungsmitteln behandelt oder für 1 h mit GW9662 (GW, 2,5 - 10 µM) vorinkubiert und anschließend für
18 h mit 50 µM PGE2 oder PGD2 stimuliert. Die relative Genexpression von Prx 6 nach (A) PGE2- oder (B)
PGD2-Stimulation wurde mittels qRT-PCR analysiert. Dabei diente RPLP0 als Referenzgen. Die Graphen
repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=4). Die statistische Auswertung erfolgte
durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
Vorangegangene Studien der Arbeitsgruppe um Itoh zeigten, dass 15d-PGJ2 Nrf2
aktiviert, indem es mit Keap1 ein Addukt bildet, das zu einer Nrf2-abhängigen Induktion
der HO-1- und Prx 1-Genexpression in murinen Peritonealmakrophagen führt (Itoh et al.,
156
Ergebnisse und Diskussion
2004). Deshalb sollte in Knochenmarkmakrophagen analysiert werden, ob der
Signalweg, der die Erhöhung der Prx 1-, 5- und 6-Genexpression durch verschiedene
konventionelle
und
Cyclopentenon-Prostaglandine
bewirkt,
ebenfalls
Nrf2
als
Signalmediator benötigt. Vorerst sollte die Aktivierung von Nrf2 durch Translokation in
den Zellkern mit Hilfe der Immunfloureszenzmikroskopie nachgewiesen werden, wofür
BMM von C57BL/6-Mäusen für 4 h mit 50 µM PGD2, PGE1, PGE2, PGF2α, PGA1, PGA2
oder mit 10 µM 15d-PGJ2 stimuliert wurden. Wie bereits in Abbildung 43 gezeigt, weisen
unbehandelte sowie DMSO- oder Methylacetat-behandelte Makrophagen sowohl eine
cytosolische als auch nukleäre Lokalisation des Transkriptionsfaktors Nrf2 auf, was eine
funktionelle Rolle von Nrf2 unter physiologischen Bedingungen annehmen lässt
(Abb. 43, 68). Im Gegensatz dazu zeigten Itoh et al. in der Rattenhepatozytenzelllinie
RL34, dass Nrf2 in unbehandelten Zellen überwiegend cytosolisch lokalisiert ist,
wohingegen Nrf2 durch Stimulation mit 15d-PGJ2 aktiviert und in den Zellkern
transloziert wird (Itoh et al., 2004). In der vorliegenden Arbeit konnte nicht nur eine
verstärkte Translokation von Nrf2 durch die 4-stündige 15d-PGJ2-Stimulation, sondern
auch durch Stimulation mit den Cyclopentenon-Prostaglandinen PGA1 und PGA2 sowie
mit den konventionellen Prostaglandinen PGD2, PGE1, PGE2 oder PGF2α, gezeigt
werden (Abb. 68). Die Behandlung von Knochenmarkmakrophagen mit PGF2α, PGA1
oder PGA2 resultierte in einer geringen Erhöhung der nukleären Lokalisation von Nrf2,
während
Nrf2
durch
die
Stimulation
mit
PGE1,
PGE2,
PGD2
oder
seinem
Hydrolyseprodukt 15d-PGJ2 stärker aktiviert und in den Zellkern transloziert wurde
(Abb. 68). Entgegen den Untersuchungen von Itoh und Kollegen konnte in dieser Arbeit
durch
die
Stimulation
von
primären
Makrophagen
mit
15d-PGJ2,
weiteren
Prostaglandinen, Nrf2-Aktivatoren oder LPS und IFNγ keine vollständige nukleäre
Translokation des Transkriptionsfaktors Nrf2, sondern nur ein Anstieg der subzellulären
Lokalisation im Zellkern nachgewiesen werden (Abb. 43, 68, Itoh et al., 2004).
Nachdem
nachgewiesen
werden konnte,
dass
die
Behandlung
von
murinen
Makrophagen sowohl mit konventionellen als auch Cyclopentenon-Prostaglandinen eine
Aktivierung von Nrf2 bewirkt, sollte analysiert werden, ob die Prostaglandin-vermittelte
transkriptionelle Aktivität von Nrf2 bei der Regulation der Prx 1-, 5- und 6-Genexpression
eine Rolle spielt. Dafür wurden BMM von C57B/SV129-Nrf2 KO- (Nrf2 KO-),
C57B/SV129-Wildtyp-, und C57BL/6-Mäusen zunächst für 18 h einerseits mit 50 µM
PGA1 oder PGA2 und andererseits mit 10 µM 15d-PGJ2 behandelt.
157
Ergebnisse und Diskussion
DMSO
Methylacetat
PGD2
PGE1
PGE2
PGF2α
PGA1
PGA2
15d-PGJ2
Abbildung 68: Nukleäre Translokation des Transkriptionsfaktors Nrf2 nach Stimulation mit
konventionellen und Cyclopentenon-Prostaglandinen in C57BL/6 BMM. Knochenmarkmakrophagen
wurden einerseits mit dem Lösungsmittel der Stimulatoren behandelt oder andererseits für 240 min mit
50 µM PGD2, PGE1, PGE2, PGF2α, PGA1, PGA2 oder mit 10 µM 15d-PGJ2 stimuliert. Die subzelluläre
Lokalisation von Nrf2 wurde mittels Immunfluoreszenz mit Hilfe eines polyklonalen Antikörpers gegen Nrf2
TM
und dem grün-fluoreszierenden Antikörperkonjugat Anti-Kaninchen-Cy 2 analysiert. Die Dokumentation
erfolgte mit dem Fluoreszenzmikroskop BZ-9000 der Firma Keyence. Die dargestellten Immunfluoreszenzen
sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente.
Die Genexpressionsanalyse zeigte, dass die Stimulation mit den drei CyclopentenonProstaglandinen zu einem sehr ähnlichen Prx 1-Expressionsmuster in den BMM aller
verwendeten Mausstämme führt. Die Prx 1-Genexpression blieb durch PGA1- und
PGA2-Stimulation nahezu unbeeinflusst, wohingegen das Prx 1-Transkript durch
15d-PGJ2 in BMM aller Mausstämme auf das 3-Fache erhöht wurde (Abb. 69).
Demgegenüber wurde die Genexpression von Prx 5 durch die Behandlung mit den
Cyclopentenon-Prostaglandinen nicht signifikant verändert. Während die Prx 5-mRNAExpression durch PGA1-Stimulation in C57B/SV129-Wildtyp BMM leicht vermindert
wurde, führte die gleiche Stimulation in Nrf2 KO BMM zu keiner Abnahme der
Genexpression von Prx 5, was vermuten lässt, dass Nrf2 die Genexpression von Prx 5
durch PGA1 negativ reguliert. Des Weiteren wurde beobachtet, dass die Behandlung mit
PGA1 oder PGA2 die relative Genexpression von Prx 6 stärker in C57BL/6 BMM als in
158
Ergebnisse und Diskussion
C57B/SV129-Wildtyp BMM induziert, wohingegen 15d-PGJ2 die Prx 6-mRNA in BMM
beider Mausstämme gleich stark auf das 3-Fache erhöht (Abb. 69).
-
-
+
-
-
+
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
-
+
-
+
-
-
-
-
+
-
-
-
+
-
+
-
-
-
-
+
-
+
-
-
+
-
Nrf2 KO
+
-
-
-
-
+
-
+
-
-
-
-
+
-
-
-
+
-
+
-
-
-
-
+
-
+
-
-
+
-
C57B/SV129
+
-
-
-
PGA 1
+
-
-
PGA2
+
PGJ 2
-
-
PGA1
+
-
-
PGA2
+
PGJ2
-
PGA1
+
PGJ 2
+
-
PGA2
C57BL/6
Abbildung 69: Auswirkungen des Nrf2-Knockouts auf die Genexpression von Prx 1, 5 und 6 durch
die Cyclopentenon-Prostaglandine PGA1, PGA2 oder 15d-PGJ2 in C57B/SV129 BMM. BMM von
Nrf2 KO- (hellgraue Säulen), C57B/SV129-Wildtyp- (dunkelgraue Säulen) und C57BL/6- (schwarze Säulen)
Mäusen wurden mit dem jeweiligen Lösungsmittel behandelt oder für 18 h mit 50 µM PGA1 sowie PGA2 oder
10 µM 15d-PGJ2 stimuliert. Die relative Genexpression von Prx 1, 5 und 6 wurde durch qRT-PCR bestimmt,
wobei RPLP0 als Referenzgen diente. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des
Mittelwertes (n=6). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA
und anschließendem Bonferroni post-Test.
159
Ergebnisse und Diskussion
Vergleiche der Prx 6-Transkriptionsinduktion in BMM der Nrf2-defizienten Mäuse und
Mäusen des Wildtypstammes zeigten deutlich, dass die Induktion der Genexpression
von Prx 6 fast vollständig in Anwesenheit von PGA1, PGA2 oder 15d-PGJ2 in
Nrf2 KO BMM unterdrückt ist, während die Prx 6-mRNA durch PGA1 oder PGA2 auf das
5,5-Fache und durch 15d-PGJ2 auf das 3-Fache in C57B/SV129-Wildtyp-Makrophagen
zunimmt (Abb. 69). Dieses spricht für eine essentielle Funktion des Transkriptionsfaktors
Nrf2 bei der Regulation der Prx 6-Geninduktion durch Cyclopentenon-Prostaglandine. Im
Gegensatz zu anderen Arbeitsgruppen, die bereits einen Nrf2-abhängigen Signalweg
beschreiben, über den 15d-PGJ2 die Genexpression von Prx 1 und der HO-1 in murinen
Peritonealmakrophagen und humanen Mesangialzellen induziert, konnte in der
vorliegenden Arbeit die Abhängigkeit der 15d-PGJ2-induzierten Prx 1-Genexpression
von Nrf2 in murinen Knochenmarkmakrophagen nicht bestätigt werden (Itoh et al., 2004;
Zhang et al., 2004).
Im Anschluss an die Untersuchung der Nrf2-Abhängigkeit bei der Geninduktion von
Prx 1, 5 und 6 durch Cyclopentenon-Prostaglandine sollte analysiert werden, ob Nrf2
ebenfalls
eine
Änderung
der
Genexpression
der
Prxs
durch
konventionelle
Prostaglandine bewirkt. Aus diesem Grund erfolgte eine 18-stündige Stimulation der
Makrophagen von Nrf2 KO-, C57B/SV129-Wildtyp- und C57BL/6-Mäusen mit 50 µM
PGE1, PGE2, PGD2 oder PGF2α. Wie in Abbildung 70 dargestellt, wurde die
Genexpression von Prx 1 durch keines der konventionellen Prostaglandine in BMM der
drei Mausstämme verändert. Weiterhin wurde die mRNA-Expression von Prx 5 zwar
durch PGE1, PGE2 und PGF2α leicht induziert und durch PGD2 vermindert, jedoch
wurden keine Unterschiede im Prx 5-Genexpressionsmuster zwischen den einzelnen
Mausstämmen detektiert. Zudem wurde die Prx 6-Transkription durch die einzelnen
konventionellen Prostaglandine sehr ähnlich in C57B/SV129-Wildtyp und C57BL/6 BMM
induziert. Während die Prx 6-Genexpression in BMM von C57B/SV129-Wildtyp-Mäusen
durch PGE1 oder PGE2 auf das 3-Fache, durch PGD2 auf das 6-Fache und durch PGF2α
auf das 2-Fache zunahm, bewirkte die Nrf2-Defizienz in C57B/SV129-Wildtyp BMM eine
fast vollständige Hemmung der Prx 6-mRNA-Erhöhung (Abb. 70).
Es wurde bereits vielfach gezeigt, dass das antiinflammatorisch wirkende Prostaglandin
15d-PGJ2 ein natürlicher Ligand von Nrf2 ist. Unter den Enzymen, die durch Nrf2
induziert werden, besitzt die HO-1 sowohl antiinflammatorische als auch antioxidative
Eigenschaften. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass die HO-1 einen wichtigen
Regulator sowohl der angeborenen Immunität als auch von Entzündungsprozessen
darstellt. Beispielsweise wurde eine erhöhte HO-1-Expression und -Aktivität bei akuten
Entzündungserkrankungen beobachtet. Zudem scheint die gebildete HO-1 in Monozyten
antiinflammatorische Wirkungen zu übertragen, um vor Zell- und Gewebeschäden durch
160
Ergebnisse und Diskussion
oxidativen Stress und proinflammatorischen Cytokinen zu schützen (Yachie et al., 2003).
Des Weiteren verhindert die erhöhte Expression der HO-1 die Entzündungsantwort im
Modell des endotoxischen Schocks, im Mucus der Atemwege und im Gefäßendothelium
sowie im Kolon und Gehirn (Tamion et al., 2002; Almolki et al., 2008; Cuadrado und
Rojo 2008; Horvath et al., 2008; Lin et al., 2008; Syapin 2008).
Nrf2-aktivierende Substanzen wie 15d-PGJ2 bewirken die Hemmung der Aktivierung der
redox-sensitiven Transkriptionsfaktoren NFκB und AP-1, die in die Regulation
entzündungsvermittelter zellulärer Funktionen involviert sind (Manna et al., 2000; Zhu et
al., 2004; Kim und Surh 2006; Na und Surh 2006; Gopalakrishnan und Tony Kong 2008).
Dabei spiegelt sich die antiinflammatorische Wirkung von 15d-PGJ2 darin wieder, dass
es die Bildung von Entzündungsmediatoren wie proinflammatorischen Cytokinen sowie
die Expression von iNOS und COX-2 in aktivierten Makrophagen, Mikrogliazellen und
dendritischen Zellen herabsetzt (Jiang et al., 1998; Ricote et al., 1998; Faveeuw et al.,
2000; Chawla et al., 2001). Darüber hinaus ist bekannt, dass 15d-PGJ2 seine
antiinflammatorische Wirkung dadurch ausübt, dass es über den Nrf2/ARE-Signalweg
die Genexpression bestimmter Zielgene wie HO-1 und Prx 1 initiiert. Bis heute wurde
jedoch
nicht
gezeigt,
dass
sowohl
konventionelle
als
auch
Cyclopentenon-
Prostaglandine, darunter auch 15d-PGJ2, die Genexpression von Prx 6 in Makrophagen
induzieren. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit zum ersten Mal gezeigt, dass nicht nur
Cyclopentenon-Prostaglandine
die
Genexpression
von
Zielgenen
Nrf2-vermittelt
induzieren, sondern auch konventionelle Prostaglandine dazu in der Lage sind
(Abb. 69, 70).
Eine
mögliche
Erklärung
dafür
ist
die
Dehydratation
des
Cyclopentanon-Ringes der konventionellen Prostaglandine, wodurch es zur Entstehung
von Cyclopentenon-Prostaglandinen kommt, die folgend Nrf2 aktivieren können. Im
Gegensatz zu 15d-PGJ2 ist die Funktion und Wirkung der anderen Cyclopentenon- als
auch konventionellen Prostaglandine während eines Entzündungsprozesses noch
weitgehend ungeklärt.
Die inflammatorische Antwort nutzt die koordinierte Verknüpfung von verschiedenen
Signalwegen wie Cyclooxygenasen, NO und Cytokinen (Vane 1971; Nathan 2002).
COX-2 ist das vorherrschende COX-Enzym in Entzündungszellen und -geweben, das
während akuten Entzündungsprozessen verstärkt exprimiert wird (Seibert et al., 1994).
Des
Weiteren
ist
PGE2
das
am
stärksten
vertretende
Prostaglandin
bei
Entzündungsprozessen, dass jedoch vielmehr durch seine immunsuppressive Wirkung
in der Tumorgenese bekannt ist (Milanovich et al., 1995; Stichtenoth et al., 2001; Kojima
et al., 2002). Da COX-2 auch in der Spätphase einer Entzündung exprimiert wird, wird
angenommen, dass dieses Enzym sowohl an der Beseitigung als auch der Etablierung
einer akuten Entzündungsantwort beteiligt ist (Gilroy et al., 1999).
161
Ergebnisse und Diskussion
-
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Nrf2 KO
-
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- +
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-
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-
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-
+
-
+
- PGE1
- PGE2
- PGD 2
-
-
-
-
+ PGF2α
-
+ - - + - - +
- - -
+ PGF2α
- PGE1
- PGE
2
- PGD 2
-
+
-
+
-
-
-
-
+
-
-
-
+ - +
- -
+
-
-
C57B/SV129
-
+
-
- PGE1
- PGE2
- PGD2
+ PGF2α
C57BL/6
Abbildung 70: Auswirkungen des Nrf2-Knockouts auf die Genexpression von Prx 1, 5 und 6 durch
die konventionellen Prostaglandine PGE1, PGE2, PGD2 oder PGF2α in C57B/SV129 BMM. BMM von
Nrf2-KO- (hellgraue Säulen), C57B/SV129-Wildtyp- (dunkelgraue Säulen) und C57BL/6- (schwarze Säulen)
Mäusen wurden mit dem Lösungsmittel behandelt oder für 18 h mit 50 µM PGE1, PGE2, PGD2 oder PGF2α
stimuliert. Die relative Genexpression von Prx 1, 5 und 6 wurde durch qRT-PCR bestimmt, wobei RPLP0 als
Referenzgen diente. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=6). Die
statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem
Bonferroni post-Test.
162
Ergebnisse und Diskussion
Kürzlich wurde gezeigt, dass PGE2 über einen Adenylylzyklase- und cAMP-vermittelten
Signalweg das Überleben von Monozyten und Makrophagen durch Aktivierung
antiapoptotischer Mediatoren unter nitrosativem Stress erhöht. Dabei eliminieren
Makrophagen Peroxynitrit, indem sie verschiedene Signalwege aktivieren, die durch
stromabwärts-gelegene Produkte des Arachidonsäure-Metabolismus vermittelt werden
(Tommasini et al., 2008). Neben der Aktivierung antiapoptotischer Mediatoren durch
PGE2
scheint
die
durch
Prostaglandine-vermittelte
Expression
sowohl
antiinflammatorischer als auch antioxidativer Enzyme wie Prxs eine entscheidende Rolle
während eines Entzündungsprozesses zu spielen. Es ist anzunehmen, dass die sowohl
durch NO- als auch durch COX-Enzyme-vermittelte Erhöhung der Prx 6-Expression in
immunstimulierten Makrophagen sich cytoprotektiv auswirkt. Wang et al. wiesen nach,
dass die adenoviral-vermittelte Überexpression von Prx 6 in der Lunge das Überleben
von Mäusen bei Hyperoxie erhöht und oxidative Schäden der Lunge vermindert (Wang
et al., 2004b). Im Gegensatz dazu zeigen Prx 6-defiziente Makrophagen im Vergleich
zum
Wildtyp
erhöhte
Wasserstoffperoxidgehalte
t-Butylhydroperoxid-Behandlung.
Des
Weiteren
nach
sind
die
Paraquat-,
H2O2-
und
Überlebensraten
von
Prx 6 KO-Mäusen gegenüber dem Wildtypstamm nach Paraquat-Stimulation oder
Behandlung mit 100 % Sauerstoff deutlich herabgesetzt. Außerdem weisen Mäuse mit
einer Prx 6-Defizienz zahlreiche Gewebeschäden und höhere Proteinoxidationsgehalte
auf (Wang et al., 2003; Wang et al., 2004a). Daraus folgernd lässt sich schließen, dass
die Induktion von Prx 6 durch die Beseitigung von reaktiven Sauerstoff- und
Stickstoffintermediaten Zellen vor oxidativen Schäden wie Proteinoxidation und
Phospholipidperoxidation schützt und somit die Zellintegrität aufrechterhält. Die
Signaltransduktionwege der LPS- und IFNγ- sowie PGE2- oder PGD2-induzierten
Genexpression von Prx 6 in murinen Knochenmarkmakrophagen sind in Abbildung 71
zusammengefasst.
163
Abbildung 71: Signaltransduktionsmodell zur Regulation von Prx 6 durch LPS und IFNγγ sowie PGE2 oder PGD2 in murinen
Knochenmarkmakrophagen. AC: Adenylylzyklase; cAMP: cyclisches Adenosinmonophosphat; DAG: Diacylglycerin; Gs:
Guaninnucleotid-bindendes (stimulierendes) Protein; IP3: Inositol-1,4,5-triphosphat; JAK2: Januskinase 2; MEKK: Mitogen-aktivierte
Proteinkinase/extrazelluläre Signal-regulierte Kinase Kinase; Nrf2: nuclear factor-erythroid 2p45 (NF-E2)-related factor 2; p38:
p38 Mitogen-aktivierte Proteinkinase; PDK-1: Phosphatidylinositol-abhängige Proteinkinase-1; PG: Prostaglandin; PI3K:
Phosphatidylinositol-3-Kinase; PKC: Proteinkinase C; PLC: Phospholipase C.
164
Ergebnisse und Diskussion
3.3
Regulation der Genexpression von Peroxiredoxinen durch
Infektion mit Burkholderia pseudomallei und Burkholderia
thailandenis in IFNγγ-aktivierten Knochenmarkmakrophagen
Gegenwärtig ist nur sehr wenig über die Expression und Funktion der Peroxiredoxine
während einer Infektion mit bakteriellen Pathogenen bekannt. Kürzlich beschrieb die
Arbeitsgruppe um Yanaka, dass die Infektion von Mäusen mit Helicobacter pylori, die die
Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies und Peroxynitrit verstärkt und somit zu
Gewebeschäden durch oxidativen Stress führt, die Expression von Prx 1 in der
Magenschleimhaut
erhöht.
Zudem
resultierte
die
Infektion
mit
H. pylori
in
Prx 1-defizienten Mäusen gegenüber Wildtypmäusen in einer schwerwiegenden
Gastritis, vermehrten oxidativen DNA-Schäden sowie in einer erhöhten Apoptoserate
(Sato et al., 2008). Darauf basierend wird vermutet, dass Prx 1 für den Schutz der
Magenschleimhaut vor oxidativen Schäden durch H. pylori verantwortlich ist. Um die
relative Genexpression der Peroxiredoxine in murinen Makrophagen während der
Frühphase einer bakteriellen Infektion zu untersuchen, wurde für den letzten Abschnitt
der
Arbeit
Burkholderia
pseudomallei
als
Modellorganismus
Gram-negativer,
intrazellulärer Pathogene verwendet. B. pseudomallei ist ein Umweltsaprophyt, der in
den tropischen Regionen Südostasiens und Nordaustraliens endemisch ist (Chaowagul
et al., 1989). Infektionen mit diesem Pathogen führen zur Melioidose, einer infektiösen
Krankheit, deren Manifestationen sich von lokalen Gewebeschädigungen über
fulminante Septikämie bis zu chronischen Erkrankungen erstrecken (Leelarasamee
1998; Raja 2003; Koszyca et al., 2004). Die Untersuchungen zur Expression der
Peroxiredoxine nach bakterieller Infektion sollten die Analyse der Genexpressionsprofile
der Prxs in nicht-aktivierten und IFNγ-aktivierten Makrophagen der gegenüber
B. pseudomallei
relativ
resistenten
C57BL/6-Mäuse
und
der
empfindlichen
BALB/c-Mäuse einschließen. Des Weiteren sollte die Frage beantwortet werden, ob
iNOS-gebildetes NO, durch die NADPH-Oxidase-gebildete ROS oder der COX-1und -2-nachgeschaltete Mediatoren sowie der Transkriptionsfaktor Nrf2 an der
B. pseudomallei-induzierten mRNA-Expression von Prx 1, 5 und 6 in IFNγ-aktivierten
BMM beteiligt sind. Ferner sollte analysiert werden, ob Peroxiredoxine in IFNγ-aktivierten
Knochenmarkmakrophagen unterschiedlich stark durch Infektion mit der virulenten
Spezies B. pseudomallei gegenüber der avirulenten Spezies B. thailandensis exprimiert
werden. Unter gleichen Versuchsbedingungen sollte ebenfalls die proinflammatorische
Antwort der Makrophagen mittels Messung der relativen Genexpression sowie Sekretion
ausgewählter Cytokine bestimmt werden.
165
Ergebnisse und Diskussion
3.3.1
Infektion mit B. pseudomallei führt zur erhöhten Genexpression
von Prx 1, 5 und 6
Im Anschluss an die Untersuchungen zur Regulation der Genexpression von
Peroxiredoxinen durch IFNγ und rekombinantes E. coli-LPS sollte analysiert werden, ob
die Infektion mit Burkholderia pseudomallei oder die Aktivierung von Makrophagen durch
IFNγ gefolgt von der B. pseudomallei-Infektion die Genexpression von Peroxiredoxinen
beeinflusst.
Aus
diesem
Grund
blieben
Knochenmarkmakrophagen
von
C57BL/6-Mäusen entweder unbehandelt oder wurden mit 300 U/ml IFNγ stimuliert. Im
Anschluss an die 24-stündige IFNγ-Aktivierung der Makrophagen erfolgte eine
30-minütige Infektion mit dem B. pseudomallei-Stamm E8 mit einer angestrebten
Infektionsdosis (MOI: multiplicity of infection) von 30:1, woraufhin die Zellen für 18 h in
Kanamycin-haltigem Medium inkubiert wurden. Anschließend wurde die Gesamt-RNA
isoliert, die zur Analyse der relativen Genexpression von Prx 1- 6 mittels qRT-PCR
verwendet wurde. Abbildung 72 zeigt, dass die Genexpression einiger Prxs durch
B. pseudomallei-Infektion bzw. durch IFNγ-Aktivierung der Makrophagen gefolgt von der
B. pseudomallei-Infektion induziert wird. Die alleinige Aktivierung der Makrophagen
durch
300 U/ml
IFNγ
resultierte
dabei
in
einer
leichten
Zunahme
der
Prx 4-Genexpression auf das 1,5-Fache und einer Induktion der Prx 5-mRNA auf das
2,5-Fache. Im Gegensatz dazu führte die Stimulation mit 100 U/ml IFNγ zu keiner
Änderung der Genexpression von Prx 1 – 6 (Abb. 5C). Des Weiteren bewirkte die
Infektion mit B. pseudomallei eine Induktion der Prx 1-, 5- und 6-Transkripte, wobei
Prx 1 und 6 auf das 3,5-Fache und Prx 5 auf das 5-Fache erhöht wurden, während die
Genexpression von Prx 2, 3 und 4 unbeeinflusst blieb (Abb. 72). Außerdem wurde
nachgewiesen, dass die IFNγ-Aktivierung gefolgt von der B. pseudomallei-Infektion zu
einem Anstieg der mRNA-Expression von Prx 1, 4, 5 und 6 führt. Die Induktion von Prx 4
war sehr gering und lässt sich auf die IFNγ-Stimulation zurückführen. Interessanterweise
wurde die Prx 5-mRNA deutlich stärker durch IFNγ-Stimulation und Infektion induziert
(8-fach) als durch die Infektion mit B. pseudomallei alleine. Hingegen wurde für die
induzierte Genexpression von Prx 1 und 6 kein signifikanter Unterschied zwischen
alleiniger Infektion und IFNγ-Aktivierung gefolgt von der Infektion beobachtet (Abb. 72).
166
Ergebnisse und Diskussion
-
+
-
-
+
-
+
+
-
+
-
-
+
IFNγ
+
+
E8
Abbildung 72: Änderung der Genexpression von Prx 1 – 6 durch IFNγγ-Aktivierung und anschließende
Infektion mit dem Burkholderia pseudomallei-Stamm E8 in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM blieben
unbehandelt oder wurden für 24 h mit 300 U/ml IFNγ vorinkubiert, gefolgt von einer 30-minütigen Infektion
mit dem B. pseudomallei-Stamm E8 (MOI 30:1) und einer anschließenden 18-stündigen Inkubation. Als
Kontrolle dienten unbehandelte Makrophagen. Die relative Genexpression von Prx 1 - 6 wurde durch qRTPCR analysiert, wobei RPLP0 als Referenzgen verwendet wurde. Die Graphen repräsentieren den
Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=5). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der
Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
Um festzustellen, ob die veränderte Genexpression von Peroxiredoxinen während einer
B. pseudomallei-Infektion mit anderen Pathogenen bestätigt werden kann, wurden
Genexpressionsanalysen der Prxs von sowohl IFNγ-aktivierten als auch nicht-aktivierten
C57BL/6 BMM durchgeführt, die für 1 h mit verschiedenen Staphylococcus aureusStämmen infiziert und anschließend für 18 h in Kulturmedium inkubiert wurden.
Staphylokokken sind für eine Vielzahl von Krankheiten durch Infektion verschiedener
Organe verantwortlich. Im Gegensatz zu B. pseudomallei handelt es sich bei S. aureus
um ein Gram-positives, fakultativ anaerobes, überwiegend unbekapseltes Pathogen.
Erkrankungen der Haut durch Staphylokokken resultieren normalerweise in einer lokalen
167
Ergebnisse und Diskussion
Eiterbildung, bekannt als Abszesse, Blutgeschwüre oder Furunkel. In den Blutkreislauf
eingedrungene Staphylokokken können hohes Fieber, Schüttelfrost und verminderten
Blutdruck hervorrufen, und zudem bei schweren Krankheitsverläufen zu Pneumonie,
Endokarditis, zum Toxischen Schock-Syndrom oder zur Sepsis führen (Projan und
Novick 1997; Lowy 1998). Die Fähigkeit von S. aureus, eine solche Vielfalt von
Krankheiten
auszulösen,
basiert
auf
der
Expression
vieler
verschiedener
Virulenzfaktoren wie Oberflächen-assoziierten Adhäsinen, der Polysaccharidkapsel und
einer Reihe extrazellulärer Cytotoxine, Proteasen, DNasen sowie Enterotoxinen (Iandolo
1990; Novick 1990; Foster und Hook 1998).
Zur Untersuchung der Genexpression von Prxs nach S. aureus-Infektion wurden die
Stämme Newman, Cowan und RN6390 verwendet, die jeweils in verschiedenen
Tiermodellen eine hohe Virulenz aufwiesen (Duthie und Lorenz 1952; Cheung et al.,
1994; Booth et al., 1997;
C57BL/6-Mäusen
konnte
Novick
nach
2003). In Knochenmarkmakrophagen von
S. aureus-Infektion
jeweils
ein
Anstieg
der
Genexpression von Prx 1, 5 und 6 festgestellt werden (Daten nicht dargestellt). Die
mRNA-Expression von Prx 1 stieg dabei sowohl in IFNγ-aktivierten als auch
nicht-aktivierten Makrophagen auf das 2,5-Fache und die von Prx 6 auf das 4 - 5-Fache
an. In keinem Fall konnten Unterschiede in der Stärke der Prx-Geninduktion hinsichtlich
der verschiedenen S. aureus-Stämme detektiert werden. Wie bereits bei der
B. pseudomallei-Infektion beobachtet, resultierte die vorangegangene Aktivierung der
Makrophagen gefolgt von der S. aureus-Infektion in einer stärkeren Induktion der
Prx 5-Genexpression (4,5-fach) als die Infektion unbehandelter Makrophagen (3,5-fach)
(Daten nicht dargestellt). Daher ist anzunehmen, dass die Erhöhung der Expression von
Prx 1, 5 und 6 in Makrophagen eine generelle Antwort des angeborenen Immunsystems
auf bakterielle Infektionen ist. Aus diesem Grund erscheinen nähere Erkenntnisse über
die Regulation und Funktion der Peroxiredoxine hilfreich, um die zellulären
Mechanismen von Makrophagen während der bakteriellen Abwehr besser verstehen zu
können.
Diverse
Studien
belegen
Unterschiede
in
der
Empfindlichkeit
verschiedener
Inzuchtmausstämme gegenüber einer Vielzahl infektiöser Agenzien. Die Empfindlichkeit
hat oftmals eine genetische Grundlage, die häufig durch einen einzelnen Genlocus mit
Einfluss weniger anderer Gene kontrolliert wird (Plant und Glynn 1976; Skamene et al.,
1982; Yoshida et al., 1991; Lai et al., 1993). Bisherige Untersuchungen zeigten, dass
BALB/c-Mäuse eine höhere Empfindlichkeit während der Infektion mit virulentem
B. pseudomallei aufweisen, wohingegen C57BL/6-Mäuse eine relative Resistenz bei
gleicher Infektion zeigen (Jeddeloh et al., 2003). Während der Verlauf der Infektion bei
BALB/c Mäusen ähnlich dem der akuten Infektion durch B. pseudomallei im Menschen
168
Ergebnisse und Diskussion
ist, scheint die gleiche Infektion in C57BL/6-Mäusen eher die chronische Melioidose
widerzuspiegeln.
Die
intravenöse
Infektion
mit
B. pseudomallei
resultierte
in
BALB/c-Mäusen sowohl in einer höheren Keimlast der Milz und Leber als auch in einer
schnell fortschreitenden Bakteriämie, gefolgt vom Wirtstod innerhalb von 96 h,
wohingegen sich C57BL/6-Mäuse bis zu 6 Wochen asymptomatisch zeigten (Leakey et
al., 1998; Hoppe et al., 1999). Ähnliches gilt für intranasale Infektionen. Auch dabei
wiesen C57BL/6-Mäuse eine deutlich höhere Resistenz gegenüber B. pseudomallei auf
als BALB/c-Mäuse (Liu et al., 2002). Leakey et al. vermuten aufgrund der größeren
mikrobiziden Effizienz von C57BL/6- im Vergleich zu BALB/c-Mäusen während
B. pseudomallei-Infektionen, dass die unterschiedliche Empfindlichkeit durch nichtspezifische, zelluläre Mechanismen verursacht wird (Leakey et al., 1998).
Kürzlich wurde durch die Depletion von Makrophagen in C57BL/6- und BALB/c-Mäusen
ihre essentielle Funktion während der Frühphase einer Infektion nachgewiesen. Des
Weiteren
ließ
der
Vergleich
der
anti-B. pseudomallei-Aktivität
von
Knochenmarkmakrophagen von C57BL/6- und BALB/c-Mäusen auf eine erhöhte
bakterizide Aktivität von C57BL/6-Makrophagen schließen, die besonders in den
Vordergrund trat, wenn die Makrophagen zuvor durch IFNγ aktiviert wurden (Breitbach et
al., 2006). Aufgrund dieser vorangegangenen Untersuchungen sollte analysiert werden,
ob die Infektion mit B. pseudomallei mit und ohne vorherige IFNγ-Aktivierung der
Makrophagen zu unterschiedlichen Expressionsmustern der Peroxiredoxine in C57BL/6
und BALB/c BMM führt. Die Infektion von Makrophagen beider Mausstämme bewirkte
eine deutliche Induktion von Prx 1, 5 und 6, wohingegen die Genexpression von Prx 2, 3
und 4 nur leicht induziert wurde oder unverändert blieb (Abb. 73). Die relative
Genexpression von Prx 5 wurde sowohl in nicht-aktivierten als auch aktivierten
Makrophagen von C57BL/6- und BALB/c-Mäusen gleichermaßen stark induziert.
Hingegen wurde die mRNA-Expression von Prx 1 in BALB/c BMM weniger erhöht
(2,5-fach) als in C57BL/6 BMM (3-fach). Ein deutlicher Unterschied wurde jedoch bei der
Prx 6-Geninduktion
beobachtet.
Während
die
Prx 6-mRNA
durch
B. pseudomallei-Infektion auf das fast 4-Fache in C57BL/6 BMM zunahm, bewirkte die
Infektion nur einen 2-fachen Anstieg der Prx 6-Genexpression in BALB/c-Makrophagen
(Abb. 73). Dieses korreliert mit den Daten in Abbildung 20D, die verdeutlichen, dass die
18-stündige LPS- und IFNγ-Stimulation in einer stärkeren Zunahme der Prx 1- und 6aber auch Prx 2- und 4-Genexpression in C57BL/6 BMM gegenüber BALB/c BMM
resultiert, während die Prx 5-mRNA-Transkription in Makrophagen beider Mausstämme
ähnlich stark zunimmt.
169
Ergebnisse und Diskussion
-
+
-
-
+
C57BL/6
+
-
+
+
-
-
+
BALB/c
+
-
+
+
-
-
+
+
-
+
-
+ IFNγ
+
-
-
+
+ E8
C57BL/6
BALB/c
Abbildung 73: Änderung der Genexpression von Prx 1 – 6 durch IFNγγ-Aktivierung und anschließende
Infektion mit dem Burkholderia pseudomallei-Stamm E8 in C57BL/6 und BALB/c BMM. C57BL/6
(schwarze Säulen) und BALB/c (weiße Säulen) BMM blieben unbehandelt oder wurden für 24 h mit
300 U/ml IFNγ vorinkubiert, gefolgt von einer 30-minütigen Infektion mit dem B. pseudomallei-Stamm E8
(MOI 30:1) und einer weiteren 18-stündigen Inkubation. Als Kontrolle dienten unbehandelte Makrophagen
des jeweiligen Mausstammes. Die relative Genexpression von Prx 1 - 6 wurde durch qRT-PCR analysiert,
wobei RPLP0 als Referenzgen verwendet wurde. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler
des Mittelwertes (n=5). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way
ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
Die durch bakterielle Infektion stärker induzierte Genexpression von Prx 1 und 6 sowie
die deutlich erhöhte basale Proteinexpression von Prx 5 in C57BL/6 gegenüber
BALB/c BMM (Abb. 20A) führt zu der Hypothese, dass Peroxiredoxine neben anderen
Mechanismen der angeborenen Immunität einen entscheidenden Beitrag zur erhöhten
Resistenz von Makrophagen gegenüber Pathogenen leisten.
170
Ergebnisse und Diskussion
3.3.2
iNOS
und
NADPH-Oxidase
tragen
zur
Induktion
der
Genexpression von Prx 6 nach Infektion mit B. pseudomallei bei
Obwohl die Untersuchungen zur Interaktion von Wirtszellen mit B. pseudomallei
fortschreiten, sind die Mechanismen, die Pathogene vor der Abtötung durch
Makrophagen schützen bzw. die Makrophagenabwehr durch bakterielle Invasion
aktiviert, bisher ungeklärt. In der Regel wird die Wirtsabwehr gegen Infektionen mit
intrazellulären Bakterien hauptsächlich durch zelluläre Immunmechanismen vermittelt
(Raupach und Kaufmann 2001). Sobald Mikroorganismen in die Zellen eindringen,
werden verschiedene mikrobizide Mechanismen, darunter die Bildung von reaktiven
Stickstoff- und Sauerstoffintermediaten,
die vorwiegend durch iNOS und die
NADPH-Oxidase gebildet werden, aktiviert. Unter den antimikrobiellen Mechanismen
von Makrophagen spielt NO eine entscheidende Rolle bei der intrazellulären Beseitigung
von Bakterien. Es wurde gezeigt, dass Zelllinien, die relativ resistent gegenüber
bakteriellem Wachstum sind, oftmals eine hohe iNOS-Expression und NO-Produktion
aufweisen (MacMicking et al., 1997). In vitro-Experimente demonstrierten, dass
B. pseudomallei eine von Escherischia coli und Salmonella typhi abweichende
Aktivierungsaktivität aufweist. In RAW264.7-Makrophagen, die mit niedrigen Dosen
(MOI≤10:1) von B. pseudomallei infiziert wurden, konnte keine Expression von iNOS
detektiert werden, wohingegen E. coli- oder S. typhi-infizierte Makrophagen bereits bei
einer MOI von 1:1 eine erhöhte iNOS-Expression aufwiesen (Utaisincharoen et al.,
2001). Im Gegensatz dazu wiesen Utaisincharoen et al. nach, dass Zellen die zuvor mit
IFNγ aktiviert wurden, über eine erhöhte iNOS-Expression durch Infektion mit
B. pseudomallei verfügen. Dabei korreliert die durch IFNγ-Aktivierung hervorgerufene
Makrophagenaktivität mit der Abnahme des intrazellulären Überlebens der Bakterien
(Utaisincharoen et al., 2001).
Da bereits gezeigt wurde, dass die Infektion mit B. pseudomallei die Genexpression
einiger Peroxiredoxine induziert (Abb. 72) und zudem eine Abhängigkeit der Induktion
von Prx 1-, 2-, 4- und 6-Genexpression in C57BL/6-Makrophagen von iNOS-gebildetem
NO durch LPS- und IFNγ-Stimulation festgestellt wurde (Abb. 20D), sollte analysiert
werden, ob die durch B. pseudomallei-induzierte Genexpression der Prxs ebenfalls NO
als Signalmolekül benötigt. Aus diesem Grund wurden Knochenmarkmakrophagen von
iNOS KO- und C57BL/6-Wildtyp-Mäusen mit und ohne 24-stündige Vorinkubation mit
IFNγ für 30 min mit dem B. pseudomallei-Stamm E8 infiziert und nach der Entfernung
extrazellulärer Bakterien für weitere 18 h inkubiert.
171
Ergebnisse und Diskussion
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+ IFNγ
-
-
+
+
-
-
+
+
-
-
+
+
-
-
+
+ E8
C57BL/6
iNOS KO
C57BL/6
iNOS KO
Abbildung 74: Einfluss des iNOS-Knockouts auf den mRNA-Gehalt von Prx 1 – 6 durch IFNγγAktivierung und anschließende Infektion mit dem Burkholderia pseudomallei-Stamm E8 in C57BL/6
BMM. C57BL/6 (schwarze Säulen) und iNOS KO (graue Säulen) BMM blieben unbehandelt oder wurden für
24 h mit 300 U/ml IFNγ vorinkubiert, gefolgt von einer 30-minütigen Infektion mit dem B. pseudomalleiStamm E8 (MOI 30:1) und einer weiteren 18-stündigen Inkubation. Als Kontrolle dienten unbehandelte
Makrophagen des jeweiligen Mausstammes. Die relative Genexpression von Prx 1 - 6 wurde durch
qRT-PCR ermittelt. Dabei diente RPLP0 als Referenzgen. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit
dem Fehler des Mittelwertes (n=5). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit
one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
Abbildung 74 zeigt, dass die gering veränderte Genexpression von Prx 2 – 4 sich nicht
signifikant in BMM beider Mausstämme unterscheidet. Ähnliches gilt für die starke
Induktion der Prx 5-Genexpression sowohl in IFNγ-aktivierten als auch nur infizierten
BMM. Diese Beobachtung ist in Übereinstimmung mit den Daten der Prx 5-Geninduktion
durch LPS und IFNγ, die ebenfalls durch iNOS-Hemmung oder den Genknockout
unbeeinflusst
blieb
(Abb. 20).
Des
Weiteren
wurde
für
die
Induktion
der
mRNA-Expression von Prx 1 und 6 kein Unterschied in B. pseudomallei-infizierten
172
Ergebnisse und Diskussion
Makrophagen von iNOS KO- und C57BL/6-Mäusen verzeichnet. Demgegenüber führte
die iNOS-Defizienz zu einem um 50 %-geringeren Anstieg des Prx 1-Transkripts in
IFNγ-aktivierten und B. pseudomallei-infizierten Makrophagen. Zudem wurde die
Prx 6-Genexpression weniger stark in iNOS KO BMM gegenüber C57BL/6 BMM
induziert, jedoch wurde dieser Unterschied nicht als statistisch signifikant nachgewiesen
(Abb. 74).
Um die Ergebnisse der verminderten Geninduktion von Prx 1 und Prx 6 durch den
iNOS Knockout zu bestätigen, wurden IFNγ-aktivierte C57BL/6 BMM eine Stunde vor
der Infektion mit zwei verschiedenen iNOS-Inhibitoren vorinkubiert. Dafür wurden
100 µM L-NIL und 2 mM Aminoguanidin (AmG) verwendet, die zudem erneut nach der
Infektion für die 18-stündige Inkubation zugesetzt wurden. Die Genexpressionsanalyse
bestätigte, dass die Genexpression von Prx 5 unabhängig von iNOS-gebildetem NO
induziert wird (Abb. 75). Des Weiteren wurde die induzierte mRNA-Expression von Prx 1
und Prx 6 deutlich durch die Hemmung der NO-Bildung vermindert. Während die
Prx 1-Induktion um 50 % reduziert wurde, zeigte sich zusätzlich eine signifikante
Abnahme der Prx 6-Genexpression um 40 %.
Somit scheint die Induktion der Prx 1- und Prx 6-Genexpression durch B. pseudomalleiInfektion in IFNγ-aktivierten Makrophagen teilweise durch NO vermittelt zu werden. Da
jedoch dieser Effekt der verminderten Prx 6-Transkription in iNOS-defizienten BMM nicht
deutlich nachweisbar war, ist anzunehmen, dass die Zunahme der Prx 6-Genexpression
eine wichtige funktionelle Bedeutung während der bakteriellen Abwehr hat. Somit
scheinen
andere
Mechanismen
in
iNOS KO-Makrophagen
den
Mangel
der
Prx 6-Induktion zu kompensieren, währenddessen der Einfluss der spontanen
Hemmung von iNOS auf die NO-vermittelte Transkriptionsinitiation im Wildtypstamm
nicht kompensiert wird. Das Phänomen der Kompensation eines Genknockouts wurde
bereits an unterschiedlichen Modellen in Bezug auf die funktionelle Notwendigkeit der,
durch das fehlende Gen, regulierten Genexpression diskutiert (Rossant und Nagy 1995;
Nagy und Rossant 1996; Lobe und Nagy 1998). Andere Studien belegen zudem, dass
iNOS-defiziente
Mäuse
keine
kompensatorischen
Antworten
durch
andere
NO-Synthasen aufweisen (De Sanctis et al., 1999; Wang et al., 2001). Daher ist
anzunehmen, dass die Prx 6-Induktion in iNOS KO BMM durch NOS-unabhängige
Mechanismen wie die Beteiligung der NAPDH-Oxidase und der COX-Enzyme reguliert
und kompensiert wird.
173
Ergebnisse und Diskussion
-
+
+
-
+
+
+
-
L-NIL
+
+
+
-
-
AmG
+
+
-
+
+
+
+
-
+
L-NIL
+ IFNγ
- E8
AmG
Abbildung 75: Einfluss der iNOS-Inhibitoren L-NIL und Aminoguanidin auf die induzierte Prx 1-, 5und 6-Transkription nach Infektion mit dem Burkholderia pseudomallei-Stamm E8 in IFNγγ-aktivierten
C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM blieben unbehandelt oder wurden für 24 h mit 300 U/ml IFNγ vorinkubiert.
Nach einer einstündigen Vorinkubation mit 100 µM L-NIL oder 2 mM Aminoguanidin (AmG) folgte die
30-minütige Infektion mit dem B. pseudomallei-Stamm E8 (MOI 30:1) und eine weitere 18-stündige
Inkubation mit erneuter Zugabe der Inhibitoren. Die relative Genexpression von Prx 1, 5 und 6 wurde durch
qRT-PCR ermittelt. Dabei diente RPLP0 als Referenzgen. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit
dem Fehler des Mittelwertes (n=4). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit
one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
Im Gegensatz zu Makrophagen aus iNOS KO-Mäusen wurde für IFNγ-aktivierte
gp91phox-defiziente BMM gezeigt, dass ihre Fähigkeit, intrazelluläre Bakterien zu
beseitigen, gegenüber Zellen des Wildtypstammes eingeschränkt ist (Breitbach et al.,
2006). Des Weiteren zeigten Mäuse mit fehlender NADPH-Oxidase-Aktivität eine
erhöhte
Empfindlichkeit
gegenüber
einer
B. pseudomallei-Infektion,
wohingegen
iNOS KO-Mäuse im Vergleich zum Wildtypstamm keine erhöhte Empfindlichkeit
aufwiesen. Die durch die NADPH-Oxidase- und die iNOS-gebildeten reaktiven
Sauerstoff- und Stickstoffspezies sind insbesondere bei der Abwehr intrazellulärer
Pathogene wie Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium und Mycobacterium
tuberculosis von großer Bedeutung (Chan et al., 1992; Eriksson et al., 2000; Myers et al.,
2003). Außerdem werden sie als Ursache der bakteriziden Aktivität gegenüber
B. pseudomallei in IFNγ-aktivierten J774.1-Makrophagen angesehen (Miyagi et al.,
1997). Darüber hinaus wurde durch Guzik et al. der Nachweis erbracht, dass die
intrazelluläre ROS-Bildung eine Schlüsselfunktion bei der Modulation der Freisetzung
174
Ergebnisse und Diskussion
von Entzündungsmediatoren einnimmt (Guzik et al., 2000; Guzik et al., 2002; Guzik et
al., 2004). Dabei können die durch die NADPH-Oxidase-entstandenen ROS die
Expression von Adhäsionsproteinen an endothelialen und inflammatorischen Zellen
regulieren, wodurch die Rekrutierung von Zellen zum Entzündungsursprung beeinflusst
wird (Niu et al., 1994; Fraticelli et al., 1996). Gleichzeitig führen sie zum Anstieg der
Chemokin- und Cytokinexpression (Brzozowski et al., 2003; Kimura et al., 2003). Diese
Effekte werden zumindest zum Teil durch ROS als sekundäre Botenstoffe, vor allem
durch H2O2, hervorgerufen, indem MAPKs aktiviert werden, die anschließend zur
Aktivierung verschiedener Transkriptionsfaktoren führen.
Im Folgenden sollte untersucht werden, welche Rolle die NAPDH-Oxidase bei der
Induktion der Prx-Genexpression durch B. pseudomallei-Infektion spielt. Dazu wurden
IFNγ-aktivierte oder unbehandelte Knochenmarkmakrophagen aus gp91phox KO- und
C57BL/6-Wildtyp-Mäusen für 30 min mit dem B. pseudomallei-Stamm E8 (MOI 30:1)
infiziert und für weitere 18 h inkubiert. Die Genexpressionsanalyse der Peroxiredoxine
zeigte dabei keine Unterschiede in der relativen Genexpression von Prx 1 – 4 in
Makrophagen
beider
Mausstämme
(Abb. 76),
weshalb
eine
Regulation
der
Genexpression dieser Prxs durch die NADPH-Oxidase ausgeschlossen werden kann.
Gleiches trifft für die B. pseudomallei-induzierte mRNA-Expression von Prx 5 und 6 zu,
wobei ebenfalls keine signifikanten Unterschiede in der Stärke der Induktion zwischen
gp91phox-/- und C57BL/6-Wildtyp BMM detektiert wurden. Im Gegensatz dazu führte die
Infektion von IFNγ-aktivierten Makrophagen zu einer geringeren Transkription von Prx 5
und 6 in gp91phox-defizienten Makrophagen gegenüber den BMM des Wildtypstammes
(Abb. 76).
Hierbei
umfasste
die
Abnahme
der
Geninduktion
durch
den
phox
gp91
-Knockout ca. 40 % für das Prx 5- und ca. 35 % für das Prx 6-Transkript.
Während die Genexpression von Prx 5 in aktivierten C57BL/6-Makrophagen durch
Infektion auf das 7-Fache und in nicht aktivierten Makrophagen auf das 4,5-Fache
erhöht wurde, schien dieser durch die IFNγ-Aktivierung auftretende Unterschied in der
Prx 5-mRNA-Induktion durch die gp91phox-Defizenz nahezu aufgehoben zu sein.
Demgegenüber wurde in dieser Arbeit bereits nachgewiesen, dass die durch
E. coli-LPS- und IFNγ-Stimulation-induzierte Geninduktion von Prx 5 und 6 von den
durch die NADPH-Oxidase-gebildeten ROS unabhängig reguliert wird (Abb. 21). Dieses
kann jedoch auf unterschiedliche Mechanismen der Signaltransduktion zu Beginn der
Wirtsabwehr gegenüber bakteriellen Infektionen zurückgeführt werden.
175
Ergebnisse und Diskussion
-
+
-
-
+
-
+
+
-
C57BL/6
+
gp91
-
+
-
+
+
-
phox
KO
+
-
-
+
-
+
+
-
C57BL/6
+
gp91
+
phox
+ IFNγ
+ E8
KO
Abbildung 76: Einfluss des NADPH-Oxidase-Knockouts auf den mRNA-Gehalt von Prx 1 – 6 durch
IFNγγ-Aktivierung und anschließende Infektion mit dem Burkholderia pseudomallei-Stamm E8 in
phox
KO (graue Säulen) BMM blieben unbehandelt
C57BL/6 BMM. C57BL/6 (schwarze Säulen) und gp91
oder wurden für 24 h mit 300 U/ml IFNγ vorinkubiert, gefolgt von einer 30-minütigen Infektion mit dem
B. pseudomallei-Stamm E8 (MOI 30:1) und einer weiteren 18-stündigen Inkubation. Als Kontrolle dienten
unbehandelte Makrophagen des jeweiligen Mausstammes. Die relative Genexpression von Prx 1 - 6 wurde
durch qRT-PCR bestimmt. Dabei diente RPLP0 als Referenzgen. Die Graphen repräsentieren den
Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=8). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der
Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
Zusammen mit den Proteinen CD14 und MD-2 erkennt TLR4 die Lipid A-Komponenten
von LPS der meisten Gram-negativen Organismen (Rietschel et al., 1994; Raetz und
Whitfield 2002; Gangloff und Gay 2004). Im Gegensatz dazu wird TLR2 gemeinsam mit
TLR1
oder
TLR6
durch
bakterielle
Zellwand-Lipopeptide,
-Teichonsäuren
und -Peptidoglycane aktiviert (Aderem und Ulevitch 2000; Akira et al., 2001). Die
Stimulation mit rekombinanten E. coli-LPS führt ausschließlich zur Aktivierung des TLR4.
Als Gram-negatives Bakterium hat B. pseudomallei hingegen putative Liganden sowohl
für TLR2 als auch TLR4 (Akira et al., 2001). Wiersinga et al. wiesen eine erhöhte mRNA176
Ergebnisse und Diskussion
und Proteinexpression von TLR2 und TLR4 in Monozyten und Granulozyten von
Melioidosepatienten nach und bestätigten die Aktivierung beider Rezeptoren durch
B. pseudomallei mit Hilfe von in vitro-Experimenten (Wiersinga et al., 2007). Studien an
Zellen der humanen embryonalen Nierenzelllinie HEK293, die mit TLRs, CD14 und MD2 transfiziert wurden, zeigten außerdem, dass durch Hitze-abgetötete B. pseudomallei
sowohl TLR2 in Kombination mit TLR1 oder TLR6 als auch TLR4 aktivieren (West et al.,
2008). Zudem gibt es weitere Beispiele der kooperativen TLR2- und TLR4-Signalgebung
während der Wirtsabwehr (Trinchieri und Sher 2007; Hirata et al., 2008).
Unterschiedliche Arbeitsgruppen zeigten, dass die NADPH-Oxidase in Makrophagen für
die frühe Kontrolle während der Infektion mit B. pseudomallei, B. cepacia oder
Chromobacterium violaceum essentiell ist, während iNOS dafür nicht benötigt wird
(Segal et al., 2003; Breitbach et al., 2006). Korrelierend damit ist die Prx 5-Geninduktion
durch B. pseudomallei-Infektion unabhängig von iNOS, jedoch scheinen ROS eine
entscheidende Rolle bei der Zunahme der Genexpression von Prx 5 zu spielen.
Interessanterweise wurde die Prx 5-mRNA im Gegensatz zu Prx 1 und 6 in aktivierten
C57BL/6-Makrophagen bereits 3 h nach Infektion auf das 3,5-Fache erhöht und nahm
im Zeitverlauf bis 18 h kontinuierlich weiter zu. Hingegen stieg die Prx 1- und
6-Genexpression 9 h nach Infektion nur auf das 1,5-Fache an und wurde erst 18 h nach
B. pseudomallei-Infektion deutlich verstärkt exprimiert (Daten nicht dargestellt). Dieses
steht in Einklang mit einer verzögerten NO-Bildung im Vergleich zur ROS-Freisetzung.
Eine mögliche Schlussfolgerung ist, dass die verschiedenen Peroxiredoxine während
einer Infektion unterschiedliche Funktionen erfüllen. So ist es möglich, dass die frühe
mRNA-Induktion für eine Beteiligung von Prx 5 während der frühen Kontrolle einer
Infektion spricht, wohingegen Prx 1 und 6 gegebenenfalls im weiteren Verlauf der
Infektion ihre cytoprotektive Wirkung ausüben.
177
Ergebnisse und Diskussion
3.3.3
COX-Enzyme sind an der Regulation der B. pseudomalleiinduzierten Prx 6-Transkription beteiligt
Die Aktivierung von Makrophagen zur Hemmung des bakteriellen Wachstums ist ein
essentieller Abwehrmechanismus gegen Infektionen durch intrazelluläre Pathogene.
Neben Cytokinen sind Eicosanoide wie Prostaglandine und Leukotriene dafür bekannt,
die Funktion von Makrophagen zu beeinflussen (Nathan et al., 1983; Bogdan und
Nathan 1993). Wie in dieser Arbeit gezeigt, führt die Stimulation mit LPS zur Expression
von COX-2 in Makrophagen (Abb. 5B), die wiederum durch MAPKs reguliert wird (Guan
et al., 1998; Chen et al., 1999). Die Arbeitsgruppe um Jaworek zeigte an einem Modell
der LPS-induzierten Pankreatitis, dass eine geringe Konzentration von NO zusammen
mit der COX-abhängigen Prostaglandinsynthese zum Schutz vor schwerwiegenden
Gewebeschäden beiträgt (Jaworek et al., 2000; Jaworek et al., 2001). Des Weiteren
wurde nachgewiesen, dass die Infektion von J774-Makrophagen mit Salmonella enterica,
einem Gram-negativen, fakultativ intrazellulären Bakterium, die Expression von COX-2
induziert und in einer erhöhten PGE2- und PGI2-Produktion resultiert (Uchiya und Nikai
2004). Da bereits in Knochenmarkmakrophagen durch LPS- und IFNγ-Stimulation eine
Abhängigkeit der Prx 6-Geninduktion von COX-1 und COX-2 detektiert werden konnte
(Abb. 24D, 25D), sollte untersucht werden, ob bei der Regulation der mRNA der Prxs
durch B. pseudomallei-Infektion ebenfalls COX-Enzyme beteiligt sind. Um dieses zu
prüfen, wurden IFNγ-aktivierte C57BL/6 BMM eine Stunde vor der Infektion mit
B. pseudomallei mit 1 µM des COX-2-Inhibitors NS398 vorinkubiert, der erneut nach der
Infektion für die 18-stündige Inkubation zugegeben wurde. Wie in Abbildung 77B
dargestellt, wird die iNOS- und COX-2-Proteinexpression durch die Infektion von
aktivierten Makrophagen induziert, die durch den Hemmstoff von COX-2 unbeeinflusst
bleibt (Abb. 77B). Darüber hinaus wurde die B. pseudomallei-induzierte Genexpression
von Prx 1 und 5, wie zuvor bei der LPS- und IFNγ-Behandlung, nicht durch die
COX-2-Hemmung
beeinträchtigt.
Demgegenüber
wurde
die
Zunahme
des
Prx 6-Transkipts um 50 % vermindert (Abb. 77A).
Zur Analyse der Beteiligung von COX-1 an der erhöhten Genexpression von Prxs
wurden aktivierte Makrophagen 1 h vor der Infektion entweder mit dem selektiven
COX-1-Inhibitor SC-560 (1 µM) oder den beiden unspezifischen COX-Inhibitoren
Ibuprofen (100 µM) und Indomethacin (10 µM) behandelt, anschließend infiziert und mit
den
entsprechenden
Inhibitoren
für
weitere
18 h
in
Kulturmedium
inkubiert.
Abbildung 78A zeigt deutlich, dass die unterschiedlichen COX-Hemmstoffe keine
Auswirkung auf die induzierte COX-2-Expression haben, aber die iNOS-Expression
geringfügig vermindern (Abb. 78A). Außerdem bewirkte die Hemmung von COX-1 bzw.
beider COX-Enzyme keine Reduktion der erhöhten Genexpression von Prx 1 und 5.
178
Ergebnisse und Diskussion
Hingegen wurde die B. pseudomallei-induzierte mRNA-Zunahme von Prx 6 durch die
COX-Hemmung supprimiert. Während SC-560 und Ibuprofen eine Abnahme der
Prx 6-mRNA
um
ca.
30 – 40 %
bewirkten,
wurde
die
durch
Indomethacin-
hervorgerufene geringe Reduktion der Prx 6-mRNA-Induktion als nicht statistisch
signifikant verzeichnet (Abb. 78B). Es ist anzunehmen, dass die Abnahme der
Prx 6-Geninduktion
durch
die
COX-Inhibitoren
nicht
durch
die
verminderte
iNOS-Expression hervorgerufen wird, da in diesem Fall zusätzlich eine abgeschwächte
Prx 1-Genexpression zu erwarten wäre.
A
B
COX-2
iNOS
GAPDH
-
+
-
+
-
+
+
A
-
IFNγ/E8
NS398
+
-
+
-
+
+
IFNγ/E8
NS398
A
-
+
-
+
+
-
-
+
-
+
-
+
-
IFNγ/E8
+
+
NS398
Abbildung 77: Einfluss des COX-2-Inhibitors NS398 auf die induzierte Genexpression von Prx 1, 5
und 6 durch IFNγγ-Aktivierung und anschließende Infektion mit dem Burkholderia pseudomalleiStamm E8 in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM blieben unbehandelt oder wurden für 24 h mit 300 U/ml IFNγ
vorinkubiert. Nach einer einstündigen Vorinkubation mit 1 µM NS398 folgte die 30-minütige Infektion mit
dem B. pseudomallei-Stamm E8 (MOI 60:1) und eine weitere 18-stündige Inkubation unter erneuter Zugabe
des Inhibitors. (A) Die relative Genexpression von Prx 1, 5 und 6 wurde durch qRT-PCR ermittelt. Dabei
diente RPLP0 als Referenzgen. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes
(n=4). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und
anschließendem Bonferroni post-Test. (B) Die Gesamtproteinextrakte wurden mittels Western Blot mit Hilfe
polyklonaler Antikörper gegen iNOS, COX-2 und GAPDH analysiert. Der dargestellte Western Blot ist
repräsentativ für drei unabhängige Experimente.
179
Ergebnisse und Diskussion
A
iNOS
COX-2
GAPDH
-
+
+
-
+
+
+
-
+
+
SC
+
+
+
-
Ibu
+
-
IFNγ
E8
Indo
B
-
+
+
+
+
-
+
-
+
-
+
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
+
-
+
-
+
-
+
SC
Ibu
Indo
SC
+
Ibu
+
+
+ IFNγ
- E8
Indo
Abbildung 78: Einfluss der COX-1- bzw. COX-2-Hemmung auf die induzierte Prx 1-, 5und 6-Transkription durch IFNγγ-Aktivierung und anschließende Infektion mit dem Burkholderia
pseudomallei-Stamm E8 in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM blieben unbehandelt oder wurden für 24 h mit
300 U/ml IFNγ vorinkubiert. Nach einer einstündigen Vorinkubation mit dem COX-1-spezifischen Inhibitor
SC-560 (SC, 1 µM) oder den COX-unspezifischen Inhibitoren Ibuprofen (Ibu, 100 µM) und Indomethacin
(Indo, 10 µM) folgte die 30-minütige Infektion mit dem B. pseudomallei-Stamm E8 (MOI 60:1) und eine
weitere 18-stündige Inkubation unter erneuter Zugabe der entsprechenden Inhibitoren. (A) Die
Gesamtproteinextrakte wurden mittels Western Blot mit Hilfe polyklonaler Antikörper gegen iNOS, COX-2
und GAPDH analysiert. Der dargestellte Western Blot ist repräsentativ für drei unabhängige Experimente. (B)
Die relative Genexpression von Prx 1, 5 und 6 wurde durch qRT-PCR ermittelt. Dabei diente RPLP0 als
Referenzgen. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=8). Die
statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem
Bonferroni post-Test.
Sowohl die Funktion der COX-2-Induktion als auch die Bildung von PGE2 bei
Entzündungsprozessen werden in der Literatur kontrovers diskutiert. Es wird
180
Ergebnisse und Diskussion
angenommen, dass PGE2 als Gegenspieler inflammatorischer Mediatoren wirkt, indem
es
die
Entzündungsantwort
moduliert
und
an
der
Wiederherstellung
der
Gewebehomöostase beteiligt ist. Zum Beispiel wird berichtet, dass PGE2 die
Proliferation von T-Zellen unterdrückt, die Cytokinproduktion von Makrophagen und
Dendritischen Zellen hemmt und die Antigenpräsentation beeinflusst, indem es die
Expression von MHC II-Molekülen vermindert (Goodwin et al., 1977; Snyder et al., 1982;
Goodwin 1989; van der Pouw Kraan et al., 1995; Kalinski et al., 2001). Des Weiteren
wurde durch Tatano et al. gezeigt, dass die in vivo-Behandlung von Mäusen mit PGE2
auf der einen Seite vor Leberschäden nach E. coli-Infektionen schützt, aber auf der
anderen Seite den Infektionsrückgang negativ beeinträchtigt. Zudem verminderte PGE2
bei der murinen E. coli-Infektion die Abnahme der Keimlast in der Niere und Leber sowie
im Peritonealraum (Takano et al., 1998). Durch die verminderte Bildung von
radikalischen NO- und Sauerstoffverbindungen sowie durch die induzierte Expression
antiinflammatorischer Cytokine wird ebenfalls eine immunsupprimierende Funktion von
PGE2 während der Wirtsabwehr gegen Infektionen mit verschiedenen Pathogenen
angenommen (Marotta et al., 1992; Wheeldon und Vardey 1993; Strassmann et al.,
1994; Milano et al., 1995). Weiterführend zeigte die Hemmung der durch SalmonellaInfektion-induzierten COX-2-Expression mittels eines selektiven Inhibitors sowohl eine
signifikant inhibitorische Wirkung auf die PGE2- und PGI2-Produktion als auch auf das
intrazelluläre
Überleben
von
Salmonella
in
Makrophagen.
Außerdem
zeigten
Salmonella-infizierte Mäuse erhöhte Überlebensraten, wenn COX-2 durch Indomethacin
gehemmt wurde (Uchiya und Nikai 2004). Damit übereinstimmend wurde berichtet, dass
Pseudomonas aeruginosa sehr viel effektiver in der Lunge von EP2- oder
COX-2-defizienten Mäusen als von Mäusen des Wildtypstammes eliminiert werden
(Sadikot et al., 2007), weshalb vermutet wird, dass der COX-2-Signalweg eine
entscheidende Rolle bei der Etablierung systemischer Infektionen spielt.
Andere Untersuchungen fokussieren die Beteiligung von COX-2 und PGE2 an der
Induktion der Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO). IDO ist das Schlüsselenzym, das den
initialen, limitierenden Schritt des Tryptophanabbaus zu N-Formylkynurenin katalysiert.
Es wird angenommen, dass die verstärkte IDO-Expression in bakteriell-infizierten Zellen
aufgrund des Mangels der essentiellen Aminosäure eine Abnahme des bakteriellen
Wachstums bewirkt. In Dendritischen Zellen führte die PGE2-Behandlung zu einer
Induktion der IDO-Expression, wenn die Zellen durch LPS- oder Cytokin-Stimulation zur
Reifung gebracht wurden. Dagegen wurde IDO durch Stimulation mit TNFα oder LPS
sowie durch die Infektion mit dem S. aureus-Stamm Cowan I nicht induziert (Braun et al.,
2005; Krause et al., 2007). Unter einer Vielzahl von Mediatoren der IDO-Induktion spielt
IFNγ eine markante Rolle (Takikawa et al., 1991; Puccetti 2007). Dabei scheint die
181
Ergebnisse und Diskussion
Fähigkeit
von
IFNγ,
IDO
zu
induzieren,
ein
entscheidender
Faktor
der
antiinflammatorischen Aktivität von IFNγ zu sein (Grohmann et al., 2003; Wood-Allum et
al., 2006). Im Gegensatz dazu wurde kürzlich in Dendritischen Zellen gezeigt, dass
PGE2 die LPS-induzierte Expression von IDO vermindert und dadurch zur Hemmung der
Expression von Oberflächenmolekülen wie CD86 und MHC I und der Produktion von
proinflammatorischen Cytokinen beiträgt (Jung et al., 2010).
Aufgrund der vielseitigen Wirkung von COX-2 bzw. der durch die COX-2-gebildeten
Produkte wird es erschwert, die Bedeutung der Regulation der Prx 6-Induktion durch
COX-1 und -2 nach B. pseudomallei-Infektion abzuschätzen. Die durch COX-Enzyme
induzierte Prx 6-Genexpression kann möglicherweise ein Grund für die durch
COX-Enzyme-vermittelte Reduktion von ROS und NO sein. Da die Expression von
COX-1 hauptsächlich in Zusammenhang mit der Homöostase steht, ist zudem
anzunehmen, dass Prx 6 einen Beitrag zur Wiederherstellung der Homöostase während
bakteriellen Infektionen leistet, indem es beispielsweise durch seine Phospholipase A2Aktivität zum Schutz der Membranintegrität beträgt.
182
Ergebnisse und Diskussion
3.3.4
Nrf2 spielt eine entscheidende Rolle bei der mRNA-Induktion von
Prx 1 und 6 nach Infektion mit B. pseudomallei
Zusätzlich zum Schutz vor oxidativem und elektrophilem Stress wurde kürzlich in
mehreren Studien nachgewiesen, dass Nrf2 durch proinflammatorische Stimuli aktiviert
wird und somit Zellen und Gewebe vor entzündungsbedingten Schäden bewahrt (Braun
et al., 2002; Cho et al., 2002; Chen et al., 2003; Cho et al., 2004; Chen et al., 2006;
Arisawa et al., 2007). Demzufolge entwickeln Nrf2-defiziente Mäuse komplexe
pathogene Erscheinungsformen. Diese schließen das Lupus-ähnliche Autoimmunsyndrom
ein,
das
durch
inflammatorische
Multiorganläsionen,
intravaskuläre
Ablagerungen von Immunglobulin-Komplexen sowie durch den frühzeitigen Tod
aufgrund der schnellen Entstehung einer glomerulären Nephritis charakterisiert wird (Ma
et al., 2006). Wie durch Kwan et al. beschrieben, reguliert Nrf2 die Expression der
Akute-Phase-Proteine in der Lunge (Kwak et al., 2003), deren Plasmakonzentrationen
abhängig vom Stadium der Entzündung variieren. Daher wird vermutet, dass Nrf2 als
entscheidender Mediator der zellulären Adaptation in Antwort auf proinflammatorische
und andere schädigende Stimuli fungiert.
In der vorliegenden Arbeit wurde bereits nachgewiesen, dass der Anstieg der
Genexpression von Prx 6 durch LPS und IFNγ sowie durch verschiedene konventionelle
und Cyclopentenon-Prostaglandine durch den redox-sensitiven Transkriptionsfaktor Nrf2
vermittelt wird (Abb. 44B, 69, 70). Aus diesem Grund sollte analysiert werden, ob Nrf2 im
Modell der B. pseudomallei-Infektion von Knochenmarkmakrophagen ebenfalls einen
Beitrag zur Geninduktion von Peroxiredoxinen leistet. Daher wurden nicht-aktivierte und
über
24 h mit
IFNγ-aktivierte
BMM
von
Nrf2 KO-,
C57B/SV129-Wildtyp-
und
C57BL/6-Mäusen für 30 min mit dem B. pseudomallei-Stamm E8 mit einer angestrebten
MOI von 50:1 infiziert, worauf sich eine 18-stündige Inkubation in Kulturmedium
anschloss.
Die Genexpressionsanalyse von Prx 1, 5 und 6 zeigte, dass sich die B. pseudomalleivermittelte Induktion von Prx 1 und 5 in IFNγ-aktivierten und nicht-aktivierten
Makrophagen von C57B/SV129-Wildtyp- und C57BL/6-Mäusen nicht unterscheidet,
wohingegen die relative mRNA-Expression von Prx 6 leicht verstärkt in C57B/SV129Wildtyp gegenüber C57BL/6 BMM vorgefunden wird (Abb. 79). Weiterhin stellt
Abbildung 79 dar, dass die Prx 5-Transkription in Nrf2-defizienten Makrophagen im
Vergleich zu Makrophagen von C57B/SV129-Wildtyp-Mäusen stärker erhöht wird. Dabei
führte die B. pseudomallei-Infektion von Nrf2 KO BMM zu einer 7-fachen Induktion
gegenüber einer 5-fachen Induktion in C57B/SV129-Wildtyp BMM. Die Infektion von
aktivierten Makrophagen resultierte in einem Anstieg der Prx 5-Genexpression auf das
183
Ergebnisse und Diskussion
10-Fache in Nrf2 KO BMM sowie in einer 8-fachen Induktion in Makrophagen des
Wildtypstammes (Abb. 79).
-
+
-
-
+
-
-
-
+
-
+
+
+
-
+
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+
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+
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Nrf2 KO
+
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-
+
+
-
+
-
-
+
+
+
+
-
-
-
-
+
-
-
+
-
C57B/SV129
-
+
-
+
+
+
+ IFNγ
+ E8
+ IFNγ
+ E8
+ IFNγ
+ E8
C57BL/6
Abbildung 79: Einfluss des Nrf2-Knockouts auf die induzierte Genexpression von Prx 1, 5 und 6
durch IFNγγ-Aktivierung und anschließende Infektion mit dem Burkholderia pseudomallei-Stamm E8
in C57B/SV129 BMM. BMM von Nrf2-KO- (hellgraue Säulen), C57B/SV129-Wildtyp- (dunkelgraue Säulen)
und C57BL/6- (schwarze Säulen) Mäusen blieben unbehandelt oder wurden für 24 h mit 300 U/ml IFNγ
vorinkubiert, gefolgt von einer 30-minütigen Infektion mit dem B. pseudomallei-Stamm E8 (MOI 50:1) und
einer weiteren 18-stündigen Inkubation. Als Kontrolle dienten unbehandelte Makrophagen des jeweiligen
Mausstammes. Die relative Genexpression von Prx 1, 5 und 6 wurde durch qRT-PCR bestimmt, wobei
RPLP0 als Referenzgen diente. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes
(n=5). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und
anschließendem Bonferroni post-Test.
184
Ergebnisse und Diskussion
Dieses korreliert mit den Daten der Genexpressionsanalyse nach LPS- und
IFNγ-Stimulation, wobei die Defizienz von Nrf2 in Makrophagen ebenfalls eine stärkere
Prx 5-mRNA-Induktion hervorrief als in Makrophagen von C57B/SV129-Wildtyp-Mäusen.
Daher lässt sich schlussfolgern, dass Nrf2 die Geninduktion von Prx 5 sowohl nach
LPS- und IFNγ-Stimulation als auch nach B. pseudomallei-Infektion negativ reguliert. In
einer kürzlich veröffentlichen Arbeit wurde hingegen gezeigt, dass die durch
Mutation-vermittelte Inaktivierung aller potentiellen Bindungsstellen für Nrf2 im humanen
Prx 5-Promotor eine 80 %-ige Abnahme der basalen Promotoraktivität bewirkt. Daher
vermuten Usmanova et al., dass die basale Expression des humanen Prx 5-Gens durch
Nrf2 reguliert wird (Usmanova et al., ; Kropotov et al., 2007).
Im Gegensatz zur induzierten Genexpression von Prx 5 führte die Infektion mit
B. pseudomallei zu einer geringeren Zunahme der mRNA von Prx 1 und 6 in
Nrf2 KO BMM als in C57B/SV129-Wildtyp-Makrophagen. Der Genknockout von Nrf2
führte zu einer Reduktion der B. pseudomallei-vermittelten mRNA-Zunahme von Prx 1
um 85 % und Prx 6 um 55 %. In IFNγ-aktivierten Nrf2-Makrophagen wurde die
B. pseudomallei-induzierte Genexpression von Prx 1 um 75 % und die von Prx 6 um
83 % vermindert gegenüber der in C57B/SV129-Wildtyp BMM detektiert (Abb. 79).
Somit
konnte
nachgewiesen
werden,
dass
der
Transkriptionsfaktor
Nrf2
als
entscheidender Signaltransduktionsmediator der Prx 1- und 6-Genexpression nach
B. pseudomallei-Infektion fungiert.
Weitere Studien belegen, dass die Abwesenheit von Nrf2 in einer verminderten basalen
sowie
induzierten
Expression
von
Mediatoren
verschiedener
Signalwege
der
Stressantwort resultiert, die während der Zellreparatur für die Beseitigung reaktiver
Elekrophile entscheidend sind (Cho et al., 2006). Die Anfälligkeit der Lunge für
bakterielle Infektionen kann durch vorangegangene Hyperoxämie erhöht werden. Reddy
et al. und Cho et al. berichteten, dass der Genknockout von Nrf2 in Mäusen die
Empfindlichkeit gegenüber Hyperoxie-induzierten akuten Lungenschäden erhöht (Cho et
al., 2002; Cho et al., 2004; Reddy et al., 2007; Reddy et al., 2008). Des Weiteren
sterben Nrf2 KO-Mäuse im Gegensatz zu Mäusen des Wildtypstammes durch subletale
Sauerstoff-Präexposition während der Genesung nach einer Pseudomonas aeruginosaInfektion. In diesem Modell führt das Fehlen von Nrf2 zu einer persistenten bakteriellen
Last in der Lunge und erhöht die Anzahl infiltrierender Entzündungszellen sowie die
Bildung von Lungenödemen. Neben langanhaltendem, oxidativem Stress und einer
erhöhten Expression inflammatorisch wirkender Cytokine bewirkte der Mangel an Nrf2 in
primären Alveolarmakrophagen verminderte Konzentrationen antioxidativer Enzyme wie
der γ-Glutamylcystein-Synthase, die essentiell für die Glutathionbiosynthese ist (Reddy
et al., 2009). In Nrf2 KO-Makrophagen führte Hyperoxie zu einer deutlichen Abnahme
185
Ergebnisse und Diskussion
der antibakteriellen Aktivität und verstärkte die Expression inflammatorischer Cytokine.
Hingegen blieb die antibakterielle Aktivität der Nrf2-defizienten Makrophagen erhalten
und die Expression der Cytokine reduziert, wenn zusätzlich während der Hyperoxämie
Glutathion zugeführt wurde (Reddy et al., 2009). Somit scheint die Abwesenheit von
Nrf2 die angeborene Immunität der Lunge zu beeinträchtigen und zusätzlich die
Empfindlichkeit
gegenüber
bakteriellen
Infektionen,
zumindest
nach
Hyperoxiebehandlung, zu begünstigen. Da in dieser Arbeit nachgewiesen werden
konnte, dass die Induktion der Genexpression von Prx 1 und Prx 6 durch
B. pseudomallei-Infektion zu einem großen Teil durch Nrf2 vermittelt wird, ist
anzunehmen,
dass
neben
anderen
antioxidativen
Enzymen
der
Mangel
an
Peroxiredoxinen die Erhöhung des oxidativen Stresses in Nrf2-defizienten Makrophagen
fördert. Des Weiteren scheint übermäßiger oxidativer Stress das bakterizide Potential
von Makrophagen zu minimieren, weshalb eine verstärkte Expression antioxidativer
Enzyme wie der Peroxiredoxine während bakterieller Infektionen unerlässlich ist, um das
Überleben des Organismus zu gewährleisten.
186
Ergebnisse und Diskussion
3.3.5
IFNγγ-aktivierte Knochenmarkmakrophagen zeigen eine höhere
Prx 6-mRNA-Expression
nach
Infektion
mit
virulentem
B. pseudomallei im Vergleich zu avirulentem B. thailandensis
Bis heute gibt es nur wenige vergleichende Untersuchungen zu B. pseudomallei und
B. thailandensis sowie zur Wirtsantwort nach Infektion mit den beiden BurkholderiaSpezies.
B. thailandensis
ist
ein
avirulenter
Umweltsaprophyt,
der
genetisch,
biochemisch und immunologisch eng verwandt mit B. pseudomallei ist (Wuthiekanun et
al., 1996; Smith et al., 1997; Brett et al., 1998). Unterschiedliche Eigenschaften von
B. thailandensis gegenüber B. pseudomallei beinhalten die Fähigkeit der Assimilation
von L-Arabinose, 5-Ketogluconat und Adonitol und die Unfähigkeit Erythritol und Dulcitol
als alleinige Kohlenstoffquellen zu nutzen (Wuthiekanun et al., 1996). Da beide
Organismen in ihrer phenotypischen Charakteristik
sehr
ähnlich sind,
wurde
B. thailandensis vorerst als ein Biotyp von B. pseudomallei eingeordnet (Brett et al.,
1998). B. thailandensis ist im Gegensatz zu B. pseudomallei nicht für den Menschen
pathogen. Zudem ist die Infektionsdosis in Tiermodellen signifikant höher als die von
B. pseudomallei (Brett et al., 1997; Smith et al., 1997). Kim et al. stellten fest, dass die
Virulenz-assoziierte Bsa (Burkholderia secretion apparatus) TTSS- (type III secretion
system)
kodierende
Region
zwischen
B. pseudomallei
und
B. thailandensis
hochkonserviert ist (Kim et al., 2005). TTSSs sind spezialisierte Transportmechanismen,
die unter spezifischen Bedingungen aktiviert werden, um virulente Proteine der
Bakterien ins Cytoplasma der Wirtszelle einzuschleusen. Während des Wachstums in
Medium, das L-Arabinose beinhaltet, wird das B. thailandensis Bsa TTSS negativ
reguliert, weshalb angenommen wird, dass das Bsa TTSS zumindest teilweise für die
verminderte Pathogenität von B. thailandensis verantwortlich ist (Moore et al., 2004).
Zudem trägt das Fehlen anderer bakterieller Faktoren wie ein Gencluster, das in die
Produktion kapsulärer Polysaccharide involviert ist, zur geringeren Virulenz von
B. thailandensis gegenüber B. pseudomallei bei (Reckseidler et al., 2001).
Zum heutigen Zeitpunkt liegen jedoch nur wenige Untersuchungen zur unterschiedlichen
Wirkung der beiden Burkholderia-Spezies auf die angeborene Immunität von Wirtszellen
vor. Aus diesem Grund sollte, basierend auf der Tatsache der unterschiedlich hohen
Virulenz von B. pseudomallei und B. thailandensis, in dieser Arbeit untersucht werden,
ob die Infektion mit den beiden Burkholderia-Spezies Unterschiede in der relativen
Geninduktion von Peroxiredoxinen in primären Makrophagen bewirkt. Dazu wurden
vorerst die B. pseudomallei-Stämme E8 und K9 sowie die B. thailandensis-Stämme
E264 und E205 für die Infektion verwendet. In diesem Experiment wurden
C57BL/6 BMM für 24 h mit 300 U/ml IFNγ aktiviert, anschließend für 30 min mit einer
angestrebten MOI von 50:1 mit der jeweiligen Burkholderia-Spezies infiziert, worauf sich
187
Ergebnisse und Diskussion
eine 18-stündige Inkubation in Kulturmedium anschloss. Mit Hilfe des Immunoblots von
Gesamtproteinextrakten der BMM wurde die Proteinexpression von iNOS und COX-2
detektiert, wobei GAPDH als Ladungskontrolle verwendet wurde. Wie in Abbildung 80
dargestellt, wird die Proteinexpression von iNOS und COX-2 durch Infektion mit beiden
Burkholderia-Spezies in aktivierten Makrophagen induziert (Abb. 80A). Die Infektion mit
den beiden B. pseudomallei-Stämmen führte aber zu einem stärkeren Anstieg der iNOSund COX-2-Genexpression als die Infektion mit einem der B. thailandensis-Stämme. Die
Genexpressionsanalyse der Peroxiredoxine zeigte, dass die Transkription von Prx 1
und 5 gleichermaßen durch die Infektion mit den B. pseudmallei-Stämmen E8 und K9
und den B. thailandensis-Stämmen E264 und E205 induziert wird. Im Gegensatz dazu
resultierte die Infektion mit den B. pseudomallei-Stämmen in einer stärkeren
Prx 6-Genexpression als die Infektion mit den beiden B. thailandensis-Stämmen
(Abb. 80B). Während die Infektion mit den virulenten Burkholderia-Stämmen die
Prx 6-Genexpression nahezu auf das 7-Fache induzierte, erfolgte nur eine ca. 5-fache
Induktion nach Infektion mit den beiden B. thailandensis-Stämmen.
A
iNOS
COX-2
GAPDH
-
+
-
-
+
E8
+
+
+
K9 E264 E205
IFNγ
B.p/B.t.
Abbildung 80A: Einfluss der B. pseudomallei- und B. thailandensis-Infektion auf die Genexpression
von Prx 1, 5 und 6 in IFNγγ-aktivierten C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM blieben unbehandelt oder wurden für
24 h mit 300 U/ml IFNγ vorinkubiert, gefolgt von einer 30-minütigen Infektion mit dem B. pseudomalleiStamm E8 oder K9 bzw. dem B. thailandensis-Stamm E264 oder E205 (MOI 50:1) und einer weiteren
18-stündigen Inkubation. Die Gesamtproteinextrakte wurden durch Western Blot mit Hilfe von Antikörpern
gegen iNOS, COX-2 und GAPDH analysiert. Der dargestellte Western Blot ist repräsentativ für drei
unabhängige Experimente.
188
Ergebnisse und Diskussion
B
-
+
-
+
+
E8
K9
+
+
E264 E205
-
+
-
+
+
E8
K9
+
+
IFNγ
E264 E205 B.p./B.t.
Abbildung 80B: Einfluss der B. pseudomallei- und B. thailandensis-Infektion auf die Genexpression
von Prx 1, 5 und 6 in IFNγγ-aktivierten C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM blieben unbehandelt oder wurden für
24 h mit 300 U/ml IFNγ vorinkubiert, gefolgt von einer 30-minütigen Infektion mit dem B. pseudomalleiStamm E8 oder K9 bzw. dem B. thailandensis-Stamm E264 oder E205 (MOI 50:1) und einer weiteren
18-stündigen Inkubation. Die relative Genexpression von Prx 1, 5 und 6 wurde durch qRT-PCR ermittelt,
wobei RPLP0 als Referenzgen diente. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des
Mittelwertes (n=6). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA
und anschließendem Bonferroni post-Test.
Um eine allgemeingültige Aussage hinsichtlich der Burkholderia-Spezies-abhängigen
Induktion der Prx-mRNA treffen zu können, sollte die Genexpression der Peroxiredoxine
nach
Infektion
mit
weiteren
B. pseudomallei-
und
B. tailandensis-Stämmen
in
IFNγ-aktivierten Knochenmarkmakrophagen analysiert werden. Bei gleichbleibender
experimenteller Durchführung wurden hierfür die B. pseudomallei-Stämme E8, E203,
E212 und E237 sowie die B. thailandensis-Stämme E27, E201 und E229 verwendet.
Mittels Western Blot-Analysen, dargestellt in Abbildung 81A, wurde nachgewiesen, dass
die Infektion mit den B. pseudomallei-Stämmen E8 oder E203 die stärkste Induktion der
iNOS- und COX-2-Proteinexpression in IFNγ-aktivierten C57BL/6 BMM bewirkt.
Demgegenüber führte die Infektion von Makrophagen mit den B. pseudomallei-Stämmen
E212 oder E237 sogar zu einer geringeren Proteinexpression von iNOS sowie zu einer
nahezu identisch starken Expression von COX-2 im Vergleich zu B. thailandensisinfizierten Makrophagen (Abb. 81A). Die relative Genexpression der Prxs betrachtend
zeigte sich, dass ebenso wie in Abbildung 80B die Genexpression von Prx 1 und 5 durch
alle verwendeten Stämme beider Burkholderia-Spezies induzierbar ist, aber keine
Unterschiede
in
der
Intensität
der
Induktion
vorliegen
(Abb. 81B).
Für
die
189
Ergebnisse und Diskussion
Prx 6-Genexpression
wurden
wiederum
Unterschiede
in
der
Intensität
der
Transkriptionsinduktion nachgewiesen. Während die Infektion mit den B. pseudomalleiStämmen E8 und E203 die Prx 6-mRNA-Expression am stärksten erhöhte, wurde die
Prx 6-mRNA durch Infektion sowohl mit den B. pseudomallei-Stämmen E212 oder E237
als auch mit allen verwendeten B. thailandensis-Stämmen um nahezu 50 % geringer
induziert (Abb. 81B).
A
iNOS
COX-2
GAPDH
-
+
+
+
+
+
+
+
IFNγ
B.p/B.t.
E8 E203 E212 E237 E27 E201 E229
B
-
+
+
+
+
+
+
+
E8 E203 E212 E237 E27 E201 E229
-
+
+
+
+
+
+
+
E8 E203 E212 E237 E27 E201 E229
IFNγ
B.p./B.t.
Abbildung 81: Einfluss der B. pseudomallei- und B. thailandensis-Infektion auf die Genexpression
von Prx 1, 5 und 6 in IFNγγ-aktivierten C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM blieben unbehandelt oder wurden für
24 h mit 300 U/ml IFNγ vorinkubiert, gefolgt von einer 30-minütigen Infektion mit dem B. pseudomalleiStamm E8, E203, E212 oder E237 bzw. dem B. thailandensis-Stamm E27, E201 oder E229 (MOI 50:1) und
einer weiteren 18-stündigen Inkubation. (A) Die Gesamtproteinextrakte wurden durch Western Blot mit Hilfe
von Antikörpern gegen iNOS, COX-2 und GAPDH analysiert. Der dargestellte Western Blot ist repräsentativ
für drei unabhängige Experimente. (B) Die relative Genexpression von Prx 1, 5 und 6 wurde durch qRT-PCR
ermittelt, wobei RPLP0 als Referenzgen diente. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler
des Mittelwertes (n=5). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way
ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
190
Ergebnisse und Diskussion
Wie bereits in dieser Arbeit nachgewiesen, wird die durch B. pseudomallei-induzierte
Prx 6-Genexpression in IFNγ-aktivierten Makrophagen durch iNOS-gebildetes NO sowie
durch COX-2 bzw. stromabwärts des COX-Signalweges-gebildete Metabolite reguliert
(Abb. 74, 75, 77, 78). Die Infektion mit den B. pseudomallei-Stämmen E8, K9 oder E203
führte in IFNγ-behandelten Makrophagen zu einer um ein Vielfaches-erhöhten
Proteinexpression von iNOS und COX-2 gegenüber der Infektion mit E212 oder E237
sowie der mit B. thailandensis-Stämmen. Korrelierend damit wurde die Transkription von
Prx 6 ebenfalls durch die Infektion mit E8, K9 oder E203 am intensivsten induziert.
Infolgedessen ist anzunehmen, dass die erhöhte iNOS- und COX-2-Expression in
Zusammenhang mit dem stärkeren Anstieg der Prx 6-mRNA-Expression steht. Somit
scheint die antibakterielle Aktivität von Makrophagen als Antwort auf bakterielle
Infektionen, die sowohl die Expression von iNOS als auch von COX-2 einschließt, nicht
nur unterschiedlich stark zwischen den beiden Burkholderia-Spezies ausgeprägt zu sein,
sondern auch zwischen einzelnen Stämmen von B. pseudomallei zu variieren. Die
Differenzen der Wirtsantwort auf die Invasion dieser Pathogene sind möglicherweise
entscheidende Folgen der unterschiedlich hohen Virulenz zwischen den BurkholderiaSpezies, sowie zwischen einzelnen Stämmen der gleichen Spezies.
Einige Studien charakterisierten die Virulenz von B. pseudomallei-Stämmen und
klassifizieren dadurch die einzelnen Stämme in gering- und hochvirulent (Hoppe et al.,
1999; Gauthier et al., 2000; Ulett et al., 2002). In Infektionsmodellen mit anderen
intrazellulären Pathogenen wurde festgestellt, dass die Cytokinantworten abhängig von
der Höhe der Virulenz der verwendeten Stämme sind (Caron et al., 1994; Sarmento und
Appelberg 1995; Sarmento und Appelberg 1996; Boland und Cornelis 1998; Silver et al.,
1998; Revelli et al., 1999). Weiterhin ist bekannt, dass bestimmte Cytokine
entscheidende immunregulatorische Faktoren der Pathogenese und des Verlaufes von
Krankheiten darstellen. Diesbezüglich zeigten einige Untersuchungen mit einer Vielzahl
verschiedener intrazellulärer Pathogene wie Listeria, Leishmania, Yersinia spp. oder
Mycobakterien, dass IFNγ, TNFα und verschiedene Interleukine für die Ausprägung der
angeborenen Resistenz des Wirtes entscheidend sind (Brett und Butler 1986; Scott
1991; Ehlers et al., 1992; Bohn et al., 1994; Heinzel et al., 1998). Diese Cytokine
regulieren die antimikrobielle Aktivität von Makrophagen und beeinflussen die Interaktion
zwischen Makrophagen und Lymphozyten, die für die effiziente anti-B. pseudomalleiAktivität entscheidend ist (Ulett et al., 1998).
Aufgrund der
Notwendigkeit
inflammatorischer
Cytokine
während
der
Abwehr
bakterieller Pathogene, sollte in dieser Arbeit in IFNγ-aktivierten Makrophagen neben
dem
Genexpressionsprofil
der
Peroxiredoxine
die
relative
Genexpression
der
proinflammatorischen Cytokine IL-1β, IL-6 und TNFα nach Infektion mit den
191
Ergebnisse und Diskussion
B. pseudomallei-Stämmen
E8,
K9,
E203,
E212
oder
E237
sowie
mit
den
B. thailandensis-Stämmen E264, E205, E27, E201 oder E229 analysiert werden.
Abbildung 82 stellt die relative Genexpression von IL-1β, IL-6 und TNFα nach Infektion
mit den Burkholderia-Stämmen E8, K9, E264 und E205 dar. Es ist zu erkennen, dass
die Genexpression aller drei Cytokine durch die Infektion mit den vier verschiedenen
Burkholderia-Stämmen in aktivierten Makrophagen induziert wird. Jedoch liegen sehr
starke Differenzen in der Intensität der mRNA-Induktion der Cytokine in Abhängigkeit
von den verwendeten Bakterienstämmen vor.
-
+
-
+
+
E8
K9
+
+
E264 E205
-
+
-
+
+
E8
K9
+
+
IFNγ
E264 E205 B.p./B.t.
Abbildung 82: Einfluss der B. pseudomallei- und B. thailandensis-Infektion auf die Genexpression
von IL-1β
β, IL-6 und TNFα
α in IFNγγ-aktivierten C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM blieben unbehandelt oder
wurden für 24 h mit 300 U/ml IFNγ vorinkubiert, gefolgt von einer 30-minütigen Infektion mit dem
B. pseudomallei-Stamm E8 oder K9 bzw. dem B. thailandensis-Stamm E264 oder E205 (MOI 50:1) und
einer weiteren 18-stündigen Inkubation. Die relative Genexpression von IL-1β, IL-6 und TNFα wurde durch
qRT-PCR ermittelt, wobei RPLP0 als Referenzgen diente. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit
dem Fehler des Mittelwertes (n=6). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit
one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
Die Infektion mit E8 resultierte in der stärksten Zunahme der Genexpression dieser
Cytokine, wobei IL-1β auf das 1200-Fache, IL-6 auf das 1800-Fache und TNFα auf das
20-Fache erhöht wurde. Leicht vermindert gegenüber der E8-Infektion führte die
Infektion mit dem B. pseudomallei-Stamm K9 zu einer 700-fachen IL-1β-, einer
900-fachen IL-6- sowie einer 15-fachen TNFα-mRNA-Induktion in C57BL/6 BMM. Im
Gegensatz zu den Infektionen mit den beiden B. pseudomallei-Stämmen bewirkte die
Infektion mit dem Stamm E264 oder E205 von B. thailandensis nur einen sehr geringen
192
Ergebnisse und Diskussion
Anstieg der Transkription der proinflammatorischen Cytokine (Abb. 82). Die Infektion mit
dem Stamm E264 oder E205 erhöhte die IL-1β-Genexpression ca. 200 - 250-fach, die
von IL-6 100 – 200-fach sowie die von TNFα 7-fach. Somit scheinen beim Vergleich
dieser vier Burkholderia-Stämme die B. pseudomallei-Stämme eine deutlich verstärkte
Cytokinantwort in Makrophagen zu bewirken als die B. thailandensis-Stämme, auch
wenn zudem deutliche Differenzen in der Induktion der Cytokinexpression zwischen
Makrophagen festgestellt wurden, die mit den jeweiligen B. pseudomallei-Stämmen
infiziert wurden.
Genexpressionsanalysen von IL-1β, IL-6 und TNFα nach Infektion von Makrophagen mit
den
B. pseudomallei-Stämmen
E8,
E203,
E212
oder
E237
sowie
den
B. thailandensis-Stämmen E27, E201 oder E229 zeigten, dass die Infektion mit E8 in der
höchsten Geninduktion von IL-1β und IL-6 gegenüber allen weiteren verwendenten
Stämmen resultiert. Zudem nahm die mRNA-Induktion von IL-1β, IL-6 und TNFα durch
E8 signifikant stärker zu als die durch B. thailandensis-induzierte Genexpression
(Abb. 83). Während die Infektion von aktivierten Knochenmarkmakrophagen mit E203
ebenfalls zu einer deutlichen Zunahme der IL-1β- und TNFα-mRNA, jedoch nur zu einer
geringen Zunahme der IL-6-Genexpression führte, bewirkte die Infektion mit E212 eine
nahezu identisch intensive Zunahme der TNFα-Transkription wie die Infektion mit E8
oder E203. Im Gegensatz dazu löste die Infektion mit den B. thailandensis-Stämmen
einen deutlich verminderten Anstieg des IL-1β-mRNA-Gehalts aus als die Infektion mit
E8 oder E203, während Makrophagen, die mit den beiden B. pseudomallei-Stämmen
E212 und E237 infiziert wurden, ähnlich geringe IL-1β-mRNA-Mengen wie nach
B. thailandensis-Infektion aufzeigten. Jenes gilt auch für die IL-6-Genexpression. Die
IL-6-mRNA wurde nur durch E8-Behandlung der Makrophagen signifikant erhöht.
Zudem
wurde
durch
die
Infektion
mit
E203
eine
leichte
Zunahme
der
IL-6-Genexpression detektiert. Demgegenüber induzierten E212 und E237 die
Genexpression von IL-6 gleichermaßen gering wie die B. thailandensis-Stämme. Die
TNFα-mRNA-Induktion betrachtend resultierte die Infektion mit E8, E203 oder E212 in
einer 15 – 18-fachen Induktion, während die Infektion mit E237 nur zu einem 10-fachen
Anstieg führte. Die induzierte TNFα-mRNA-Expression wurde durch die Infektion mit
E27, E201 oder E229 leicht vermindert gegenüber der durch E237-induzierten
nachgewiesen. Jedoch ähnelt das durch die Infektion mit E237-hervorgerufene
Genexpressionsmuster von IL-1β, IL-6 und TNFα eher dem Expressionsmuster durch
B. thailandensis-Infektion als dem durch E8-, K9- oder E203-Infektion.
193
Ergebnisse und Diskussion
-
+
+
+
+
+
+
+
E8 E203 E212 E237 E27 E201 E229
-
+
+
+
+
+
+
+
E8 E203 E212 E237 E27 E201 E229
IFNγ
B.p./B.t.
Abbildung 83: Einfluss der B. pseudomallei- und B. thailandensis-Infektion auf die Genexpression
von IL-1β
β, IL-6 und TNFα
α in IFNγγ-aktivierten C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM blieben unbehandelt oder
wurden für 24 h mit 300 U/ml IFNγ vorinkubiert, gefolgt von einer 30-minütigen Infektion mit dem
B. pseudomallei-Stamm E8, E203, E212 oder E237 bzw. dem B. thailandensis-Stamm E27, E201 oder E229
(MOI 50:1) und einer weiteren 18-stündigen Inkubation. Die relative Genexpression von IL-1β, IL-6 und
TNFα wurde durch qRT-PCR ermittelt, wobei RPLP0 als Referenzgen diente. Die Graphen repräsentieren
den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=5). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich
+
+++
der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test ( p<0,05, p<0,001 relativ zu
E203).
Um zu untersuchen, ob korrelierend mit der Genexpressionszunahme der Cytokine
durch Infektion mit Burkholderia ebenfalls die Sekretion einiger ausgewählter Cytokine
bzw. Chemokine ansteigt, wurde an Kulturüberständen B. pseudomallei- oder
B. thailandensis-infizierter, zuvor durch IFNγ-aktivierter Makrophagen die Konzentration
von MCP-1, IFNγ, IL-12, IL-6 und TNFα mittels des BDTM Cytometric Bead Array Mouse
Inflammation Kits bestimmt. Abbildung 84 stellt die Sekretion des Chemokins MCP-1
und der genannten Cytokine von IFNγ-aktivierten C57BL/6 BMM dar, die für 30 min mit
E8, K9, E264 oder E205 mit einer MOI von 50:1 infiziert und anschließend für 18 h in
Kulturmedium inkubiert wurden. Es ist ersichtlich, dass die jeweilige Infektion mit allen
hier verwendeten Stämmen eine zumindest geringe Zunahme der Sekretion von MCP-1
sowie der Cytokine nach sich zieht (Abb. 84). Die Sekretion von MCP-1 und IFNγ wurde
durch die Infektion aller Burkholderia-Stämme nahezu gleich stark induziert, obwohl eine
minimal stärkere Sekretion von Makrophagen verzeichnet wurde, die mit den
B. pseudomallei-Stämmen inkubiert wurden. In Übereinstimmung mit der Zunahme der
relativen Genexpression wurde die stärkste Sekretion von IL-6 und TNFα sowie von
194
Ergebnisse und Diskussion
IL-12 nach E8-Infektion detektiert, die signifikant gegenüber den Sekretionen durch K9,
E264 und E205 erhöht war. Die nächst geringeren Sekretionskonzentrationen wurden
durch die Infektion mit K9 erreicht, die ebenfalls als statistisch signifikant gesteigert
gegenüber denen durch B. thailandensis-Infektion nachgewiesen wurden. Die Infektion
mit den B. thailandensis-Stämmen führte zu einer geringeren Sekretion von IL-12 um
mindestens 60 %, von IL-6 um 70 % sowie von TNFα um 65 % gegenüber der Sekretion
von Makrophagen, die mit E8 infiziert wurden (Abb.84).
IFNγγ
-
+
-
+
+
E8
K9
+
+
E264 E205
-
+
-
+
+
E8
K9
+
+
IFNγ
E264 E205 B.p./B.t.
Abbildung 84: Einfluss der B. pseudomallei- und B. thailandensis-Infektion auf die Sekretion von
MCP-1, IFNγγ, IL-12, IL-6 und TNFα
α in IFNγγ-aktivierten C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM blieben unbehandelt
oder wurden für 24 h mit 300 U/ml IFNγ vorinkubiert, gefolgt von einer 30-minütigen Infektion mit dem
B. pseudomallei-Stamm E8 oder K9 bzw. dem B. thailandensis-Stamm E264 oder E205 (MOI 50:1) und
einer weiteren 18-stündigen Inkubation. Die Cytokin- bzw- Chemokinkonzentrationen wurden mittels
TM
Durchflusszytometrie mit dem BD
Cytometric Bead Array Mouse Inflammation Kit an Zellkulturüberständen bestimmt. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=6).
Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem
Bonferroni post-Test.
195
Ergebnisse und Diskussion
Ebenso wurde die Chemokin- bzw. Cytokinsekretion von IFNγ-aktivierten Makrophagen
nach Infektion mit den B. pseudomallei-Stämmen E8, E203, E212 und E237 sowie mit
den B. thailandensis-Stämmen E27, E201 und E229 bestimmt (Abb. 85).
-
+
+
+
+
+
+
+
E8 E203 E212 E237 E27 E201 E229
-
+
+
+
+
+
+
+
E8 E203 E212 E237 E27 E201 E229
IFNγ
B.p./B.t.
Abbildung 85: Einfluss der B. pseudomallei- und B. thailandensis-Infektion auf die Sekretion von
MCP-1, IFNγγ, IL-12, IL-6 und TNFα
α in IFNγγ-aktivierten C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM blieben unbehandelt
oder wurden für 24 h mit 300 U/ml IFNγ vorinkubiert, gefolgt von einer 30-minütigen Infektion mit dem
B. pseudomallei-Stamm E8, E203, E212 oder E237 bzw. dem B. thailandensis-Stamm E27, E201 und E229
(MOI 50:1) und einer weiteren 18-stündigen Inkubation. Die Cytokin- bzw. Chemokinkonzentrationen in den
TM
Zellkulturüberständen wurden mittels Durchflusszytometrie mit dem BD Cytometric Bead Array Mouse
Inflammation Kit bestimmt. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes
(n=5). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und
+
++
+++
anschließendem Bonferroni post-Test ( p<0,05, p<0,01; p<0,001 relativ zu E203).
Dabei zeigten sich nach Infektion mit allen verwendeten Stämmen keine signifikanten
Unterschiede in der Sekretion von MCP-1 und IFNγ (Abb. 85). Wie bereits bei der
Genexpression von IL-6 und TNFα beobachtet wurde, führte die Infektion mit E8 ebenso
zur stärksten Sekretion dieser beiden Cytokine. Gleichzeitig wurde IL-12 am intensivsten
durch E8-Infektion sekretiert. Darüber hinaus war die Freisetzung von IL-6 und TNFα
196
Ergebnisse und Diskussion
durch E203 deutlich gegenüber der induzierten Sekretion durch die B. pseudomalleiStämme E212 und E237 sowie die B. thailandensis-Stämme erhöht, wohingegen die
IL-12-Freisetzung durch die Infektion mit allen verwendeten Stämmen, ausgenommen
E8, kaum induziert wurde. Des Weiteren wurden keine entscheidenden Unterschiede in
der Sekretion von IL-6 und TNFα durch Makrophagen festgestellt, die mit E212, E237,
E27, E201 oder E229 infiziert wurden.
Die angeborene Resistenz von Mausstämmen wie die der C57BL/6-Mäuse gegenüber
einer Vielzahl intrazellulärer Pathogene wird mit einer erhöhten Aktivität der Th1-Zellen
sowie mit einer starken Th1-Cytokinantwort assoziiert (Brett und Butler 1986; Scharton
und Scott 1993; Autenrieth et al., 1994; Heinzel et al., 1998). Im Gegensatz dazu wird
die angeborene Empfindlichkeit der BALB/c-Mäuse mit einer IFNγ-Hypoproduktion, einer
bevorzugten Th2-Cytokinproduktion sowie einer erhöhten Aktivität von Th2-Zellen in
Verbindung gebracht. Dieses basiert darauf, dass Th1-Cytokine hauptsächlich die
zellvermittelte Immunität stimulieren, was entscheidend für die Resistenz gegenüber
intrazellulären Pathogenen ist. Hingegen werden Th2-Cytokine in der Regel als
antiinflammatorisch wirkend angesehen, und sind in die humorale Immunität involviert,
die, wie es scheint, wichtig für die Resistenz gegen extrazelluläre Pathogene ist (Hsieh
et al., 1993; Autenrieth et al., 1994). Jedoch belegen einige Studien, dass die Induktion
von Cytokinen durch intrazelluläre Bakterien keinem eindeutigen Expressionsmuster
folgt (Bohn et al., 1994; Pie et al., 1996). Wiersinga et al. stellten in Patienten mit
Melioidose eine erhöhte Genexpression von IL-6, IL-1β, IL-10 und TNFα fest (Wiersinga
et al., 2007a) und beobachteten ebenfalls eine Zunahme dieser Cytokine in der Lunge
während des Verlaufs der experimentellen Melioidose im Mausmodell (Wiersinga et al.,
2008). Des Weiteren wurde gezeigt, dass die Infektion mit B. pseudomallei in BALB/cund
C57BL/6-Mäusen
mit
dem
Anstieg
der
TNFα-,
IL-1β-,
IL-6-
und
IL-10-Genexpression assoziiert ist (Ulett et al., 2000b; 2000a). Zudem beschrieben Sun
und Kollegen, dass der durch B. pseudomallei-induzierte Zelltod von Makrophagen in
Zusammenhang mit der IL-1β-Expression steht (Sun et al., 2005). Bei einer Sepsis wird
die
vorherrschende
entgegengesetzten
proinflammatorische
regulatorischen
Antwort
durch
Mechanismen
die
wie
Aktivierung
der
von
Freisetzung
antiinflammatorischer Cytokine ausgeglichen (Cohen 2002). So wurden bei der
humanen Melioidose sowohl erhöhte Konzentrationen von IL-6 als auch von IL-10
detektiert (Simpson et al., 2000). In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch keine
Zunahme der IL-10-Serektion von Knochenmarkmakrophagen detektiert werden, die im
Gegensatz zu Zellen, die als Kontrolle dienten, entweder mit unterschiedlichen
B. pseudomallei-
oder
B. thailandensis-Stämmen
infiziert
wurden
(Daten
nicht
dargestellt). Daher ist in Übereinstimmung mit Wiersinga et al. anzunehmen, dass die
197
Ergebnisse und Diskussion
Produktion
antiinflammatorischer
proinflammatorischen
Cytokine
Auswirkungen
der
relativ
ineffizient
Sepsis
durch
ist,
um
den
B. pseudomallei
entgegenzuwirken (Wiersinga et al., 2007a). Kürzlich wurde durch Charoensap et al.
gezeigt, dass die Infektion von humanen Makrophagen mit dem B. pseudomallei-Stamm
844 bzw. mit dem B. thailandensis-Stamm UE5 mit einer MOI von 1:1 einen nahezu
identisch starken Anstieg der TNFα- aund IL-10-Sekretion nach sich zieht. Hingegen
wurden Unterschiede in der Wachstumskinetik der beiden Burkholderia-Spezies in
Makrophagen festgestellt. Gegenüber dem B. pseudomallei-Stamm 884 war die
Replikation des B. thailandensis-Stammes UE5 in Makrophagen signifikant herabgesetzt
(Charoensap et al., 2009). In der vorliegenden Arbeit wurden Unterschiede der
proinflammatorischen Antwort von murinen Makrophagen nach Infektion mit den
B. pseudomallei-Stämmen E8, K9 und E203 gegenüber den B. thailandensis-Stämmen
E27, E201, E205, E229 und E264 nachgewiesen (Abb. 82-85). Zudem resultierte die
Infektion mit E8, K9 oder E203 in einer signifikant höheren Genexpression von Prx 6 in
IFNγ-aktivierten Makrophagen als die Infektion mit den B. thailandensis-Stämmen
(Abb. 80B, 81B). Demgegenüber führte die Infektion mit den B. pseudomallei-Stämmen
E212 und E237 zu einer nahezu gleichstarken mRNA- und Proteinexpression
proinflammatorischer Cytokine sowie Prx 6-Genexpression wie die Infektion mit den
verschiedenen Stämmen von B. thailandensis. Diese Diskrepanz der Wirtsantwort
scheint
somit
eine
Folge
unterschiedlich
hoher
Virulenz
der
verschiedenen
B. pseudomallei-Stämme zu sein, und wurde bereits in einer Arbeit von Ulett und
Kollegen diskutiert (Ulett et al., 2002).
B. pseudomallei kann sowohl an eine Vielzahl von Säugetierzellen adhärieren als auch
in diese eindringen (Jones et al., 1996; Kespichayawattana et al., 2004). Im Allgemeinen
sind die Wirtszelladhäsion und die folgende Invasion essentielle Schritte in der
Pathogenese der bakteriellen Infektion. Durch störende Eingriffe in diese Prozesse
können die Verbreitung und der Schweregrad der Krankheit vermindert werden
(Kaufmann 1993). Frühere Studien zeigten, dass beide Spezies, B. pseudomallei und
B. thailandensis, sowohl in phagozytierende als auch nicht-phagozytierende Zellen
eindringen können und anschließend ins Cytosol austreten (Jones et al., 1996;
Kespichayawattana et al., 2000; Kespichayawattana et al., 2004). Um zu untersuchen,
ob möglicherweise eine unterschiedliche Invasion oder Replikation der B. pseudomalleiund B. thailandensis-Stämme für die unterschiedlich ausgeprägte Induktion der
Cytokinexpression bzw. Prx 6-Genexpression der Makrophagen verantwortlich ist,
wurden Invasions- und Replikationsassays durchgeführt. Dafür wurden C57BL/6 BMM
für 24 h mit 300 U/ml IFNγ aktiviert und anschließend für 30 min mit einer MOI von 50:1
zum einen mit den B. pseudomallei-Stämmen E8, K9, E203, E212 oder E237 und zum
198
Ergebnisse und Diskussion
anderen mit den B. thailandensis-Stämmen E27, E201, E205, E229 oder E264 infiziert.
30 min (0 h-Wert) und 18 h nach Ende der Infektionen wurde die intrazelluläre Keimlast
bestimmt. Abbildung 86 stellt die Invasion und Replikation der Burkholderia-Stämme E8,
K9, E264 sowie E205 dar. Die Invasion betreffend zeigte sich, dass sowohl nach
Infektion mit den beiden B. pseudomallei-Stämmen E8 und K9 als auch dem
B. thailandensis-Stamm E264 nahezu identische Keimzahlen in den Makrophagen
vorliegen. Im Gegensatz dazu resultierte die Infektion mit E205 in einer um den
Faktor 3-verminderten Invasion (Abb. 86). 18 h nach der Infektion wurde für jeden
Burkholderia-Stamm eine verminderte intrazelluläre Keimlast der Zellen gegenüber dem
Invasionswert festgestellt, jedoch lagen in Abhängigkeit vom Infektionsstamm deutliche
Unterschiede der Keimzahl in den Makrophagen vor. Während die intrazelluläre
Bakterienzahl nach K9-Infektion um eine logarithmische Stufe gegenüber der nach
E8-Infektion erhöht war, nahm die Keimzahl 18 h nach B. thailandensis-Infektion deutlich
ab und wurde bereits eine logarithmische Stufe vermindert gegenüber der E8-Infektion
nachgewiesen.
E8
K9
E264
IFNγ
E205
E8
K9
E264
E205
B.p./B.t.
IFNγ
Abbildung 86: Vergleich der Invasion und intrazellulären Replikation der B. pseudomallei-Stämme E8
und K9 sowie der B. thailandensis-Stämme E264 und E205 in IFNγγ-aktivierten C57BL/6 BMM. BMM
von C57BL/6-Mäusen wurden 24 h mit 300 U/ml IFNγ behandelt und anschließend für 30 min einerseits mit
dem B. pseudomallei-Stamm E8 oder K9 und andererseits mit dem B. thailandensis-Stamm E264 oder E205
(MOI 50:1) infiziert. 30 min (0 h-Wert) und 18 h nach Infektion wurden die intrazellulären Keimlasten
bestimmt. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=3). Die statistische
Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem
Bonferroni post-Test.
Die Infektion der Knochenmarkmakrophagen mit den B. pseudomallei-Stämmen E8,
E203, E212 oder E237 sowie den B. thailandensis-Stämmen E27, E201 oder E229
resultierte in einer etwa gleich starken Invasion der Bakterien der Stämme E8, E203 und
E237. Im Gegensatz dazu war der Invasionswert von Makrophagen, die mit dem
B. pseudomallei-Stamm E212 oder mit den unterschiedlichen B. thailandensis-Stämmen
infiziert wurden, um den Faktor 2,8 vermindert (Abb. 87). 18 h nach Infektion wurde
wiederum ein Rückgang der intrazellulären Keimzahl aller Bakterienstämme festgestellt.
199
Ergebnisse und Diskussion
Hierbei wurde die geringste Abnahme der Keimzahl nach der Infektion mit E212
beobachet, die statistisch signifikant erhöht gegenüber der intrazellulären Keimzahl nach
Infektion mit allen weiteren B. pseudomallei- und B. thailandensis-Stämmen war. Auch
wenn die Unterschiede beim Vergleich zu den durch B. pseudomallei-Infektionen
hervorgerufenen intrazellulären Keimlasten nicht als statistisch signifikant verzeichnet
wurden, wurde 18 h nach B. thailandensis-Infektion eine geringere Bakteriendichte in
den Makrophagen festgestellt (Abb. 87).
E8 E203 E212 E237 E27 E201 E229
E8 E203 E212 E237 E27 E201 E229
IFNγ
B.p./B.t.
IFNγ
Abbildung 87: Vergleich der Invasion und intrazellulären Replikation der B. pseudomallei-Stämme E8,
E203, E212 und E237 sowie der B. thailandensis-Stämme E27, E201 und E229 in IFNγγ-aktivierten
C57BL/6 BMM. BMM von C57BL/6-Mäusen wurden 24 h mit 300 U/ml IFNγ behandelt und anschließend für
30 min mit dem B. pseudomallei-Stamm E8, E203, E212 oder E237 bzw. mit dem B. thailandensis-Stamm
E27, E201 oder E229 (MOI 50:1) infiziert. 30 min (0 h-Wert) und 18 h nach Infektion wurden die
intrazellulären Keimlasten bestimmt. Die Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des
Mittelwertes (n=3). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA
+++
#
p<0,001 relativ zu E203; p<0,05,
und anschließendem Bonferroni post-Test (***p<0,001 relativ zu E8;
##
§§§
p<0,01 relativ zu E212; p<0,001 relativ zu E237).
Es scheint, dass die hier verwendeten B. thailandensis-Stämme, mit Ausnahme von
E264, eine verminderte Invasion gegenüber einer Vielzahl von B. pseudomalleiStämmen wie E8, K9, E203 und E237 aufweisen. Des Weiteren bewirkten
B. thailandensis-Infektionen
eine
abgeschwächte
Genexpression
und
Sekretion
proinflammatorischer Cytokine. Trotz geringer proinflammatorischer Antwort scheinen
Makrophagen befähigt, das intrazelluläre Wachstum von B. thailandensis einzugrenzen
und die intrazellulären Pathogene in kurzer Zeit fast vollständig zu eliminieren. Obwohl
E264 eine nahezu identische Invasionsrate wie beispielsweise E8 oder K9 aufwies,
wurde der Erreger deutlich schneller durch Makrophagen beseitigt, obwohl die
proinflammatorische Antwort auf E264 deutlich schwächer ausfiel als die auf E8- oder
K9-Infektion. Im Gegensatz zu E264 war der Invasionswert des B. pseudomalleiStammes E212 signifikant gegenüber dem der anderen B. pseudomallei-Stämme
vermindert. Des Weiteren fiel die Wirtsantwort auf die Infektion mit E212 in Form der
Cytokinausschüttung, iNOS- und COX-2-Proteinexpression und der Prx 6-Geninduktion
200
Ergebnisse und Diskussion
minimal aus. Interessanterweise wurde jedoch 18 h nach der Infektion mit diesem
Stamm die höchste intrazelluläre Keimzahl in Makrophagen festgestellt. Dies führt zu
der
Vermutung,
dass
E212
durch
die
Unterdrückung
der
induzierten
Effektormechanismen der Makrophagen sein eigenes Überleben gewährleistet. Jedoch
kann diese Annahme nicht auf weitere, hier verwendete B. pseudomallei-Stämme
ausgeweitet werden, da beispielsweise die Infektion mit E237 ebenfalls nur eine
moderate Makrophagenantwort bewirkte, jedoch E237 effizienter von Makrophagen an
seiner Ausbreitung gehindert wurde. Somit ist nicht eindeutig festzustellen, ob eine
Infektion mit einem Pathogen hoher Virulenz in jedem Fall eine starke Wirtsantwort nach
sich zieht. Kürzlich wurde im murinen Melioidosemodell nachgewiesen, dass die
Infektion mit dem invasionsdefizienten Mutantenstamm AJ1D8, der eine um 90 %verminderte Invasion gegenüber dem Wildtypstamm 1026b in der Epithelzelllinie A549
zeigt (Jones et al., 1997), keine Zunahme der Überlebensrate der Tiere gegenüber der
Infektion
mit
dem
B. pseudomallei-Stamm
1026b
bewirkt.
Zudem
wurden
proinflammatorischen Cytokine wie IL-6 und TNFα gleichermaßen stark durch die
Infektion mit beiden Stämmen freigesetzt (Wiersinga et al., 2008). Daher scheint
ebenfalls die Invasionsrate eines Pathogens nicht unbedingt entscheidend für die
Schwere des Krankheitsverlaufes zu sein. Hingegen wird angenommen, dass die
Freisetzung übermäßig hoher Konzentrationen entzündungsfördernder Cytokine mit der
Entstehung und Entwicklung klinisch manifester Erkrankungen nach Infektion mit
B. pseudomallei assoziiert ist. In dieser Arbeit wurde dann eine stärkere Zunahme der
Prx 6-Genexpression gegenüber anderen in IFNγ-aktivierten Makrophagen festgestellt,
wenn der jeweilige B. pseudomallei-Stamm ebenfalls eine relativ ausgeprägte
Expression proinflammatorischer Cytokine sowie eine sehr starke Proteinexpression von
iNOS und COX-2 bewirkte, weshalb angenommen werden kann, dass Prx 6 weniger
eine direkte bakterizide Funktion ausübt, sondern eher aktiv an der Aufrechterhaltung
der Zellfunktionalität beteiligt ist, indem es der übermäßigen Entzündungsantwort
entgegenwirkt.
In der Literatur wird beschrieben, dass B. thailandensis eine um den Faktor 10 geringere
Invasion gegenüber B. pseudomallei-Stämmen aufweist. In der vorliegenden Arbeit
wurde gezeigt, dass die Invasion der meisten hier verwendeten B. thailandensisStämme in murine Knochenmarkmakrophagen um etwa den Faktor 2,8 - 3 geringer ist,
als die von den B. pseudomallei-Stämmen E8, K9 und E205. Außerdem wurde in
IFNγ-aktivierten Makrophagen die Induktion der Prx 6-mRNA durch E8, K9 und E205
ebenfalls deutlich gegenüber der durch B. thailandensis erhöht. Daher sollte im
Anschluss untersucht werden, ob die Intensität der Prx 6-Genexpression von der
Infektionsdosis abhängig ist, weshalb zunächst nicht-aktivierte und IFNγ-aktivierte
201
Ergebnisse und Diskussion
C57BL/6 BMM für 30 min mit steigenden Dosen des B. pseudomallei-Stammes E8 mit
MOIs von 10:1, 30:1 und 50:1 infiziert wurden, woraufhin die Makrophagen weitere 18 h
in Kulturmedium inkubiert wurden. Der Western Blot in Abbildung 88A zeigt die Induktion
der iNOS- und COX-2-Proteinexpression in Abhängigkeit von der eingesetzten
Infektionsdosis. Es ist deutlich zu erkennen, dass IFNγ-unbehandelte Zellen auch mit
steigender bakterieller Last kein iNOS oder COX-2 exprimieren. Im Gegensatz dazu
führte bereits die Infektion mit einer MOI von 10:1 zu einem deutlichen Anstieg des
iNOS-Proteins, währenddessen COX-2 nur sehr schwach translatiert wurde. Mit
steigender MOI nahm zudem die iNOS- und COX-Proteinexpression kontinuierlich weiter
zu (Abb. 88A). Des Weiteren wurde festgestellt, dass die induzierte Genexpression von
Prx 1 und 5 in ihrer Intensität nicht von der Infektionsdosis abhängig ist, sondern für
einen weiteren Anstieg der Prx 5-mRNA-Induktion ausschließlich die IFNγ-Aktivierung
der Makrophagen entscheidend ist (Abb. 88B). Im Unterschied zu Prx 1 und 5 wurde
das Prx 6-Transkript sowohl in nicht-aktivierten als auch aktivierten Makrophagen
zunehmend durch steigende MOIs induziert. Während die Infektion mit der
Infektionsdosis von 10:1 zu einer 5-fachen Zunahme der Prx 6-mRNA führte, wurde das
gleiche Transkript durch eine MOI von 50:1 auf das 8-Fache erhöht (Abb. 88B).
A
iNOS
COX-2
GAPDH
-
+
-
-
+
10:1
30:1
+
-
+
50:1
IFNγ
E8 [MOI]
Abbildung 88A: Einfluss verschiedener Infektionsdosen des B. pseudomallei-Stammes E8 auf die
Genexpression von Prx 1, 5 und 6 in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM blieben vorerst unbehandelt oder
wurden für 24 h mit 300 U/ml IFNγ vorinkubiert, gefolgt von einer 30-minütigen Infektion mit dem
B. pseudomallei-Stamm E8 mit MOIs von 10:1, 30:1 oder 50:1 und einer weiteren 18-stündigen Inkubation.
Als Kontrolle dienten unbehandelte Makrophagen. Jeweils 20 µg der Gesamtproteinextrakte wurden durch
Western Blot mit Hilfe polyklonaler Antikörper gegen iNOS, COX-2 und GAPDH analysiert. Der dargestellte
Western Blot ist repräsentativ für drei unabhängige Experimente.
202
Ergebnisse und Diskussion
B
-
+
-
-
+
-
+
-
+
-
10:1
30:1
50:1
+
-
-
+
10:1
-
+
30:1
-
+ IFNγ
50:1
E8 [MOI]
Abbildung 88B: Einfluss verschiedener Infektionsdosen des B. pseudomallei-Stammes E8 auf die
Genexpression von Prx 1, 5 und 6 in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM blieben vorerst unbehandelt oder
wurden für 24 h mit 300 U/ml IFNγ vorinkubiert, gefolgt von einer 30-minütigen Infektion mit dem
B. pseudomallei-Stamm E8 mit MOIs von 10:1, 30:1 oder 50:1 und einer weiteren 18-stündigen Inkubation.
Als Kontrolle dienten unbehandelte Makrophagen. Die relative Genexpression von Prx 1, 5 und 6 wurde
durch qRT-PCR bestimmt, wobei RPLP0 als Referenzgen diente. Die Graphen repräsentieren den
Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=4). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der
Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
Da, wie Abbildung 88B ersichtlich, eine MOI-abhängige Induktion der Genexpression
von Prx 6 in Makrophagen durch B. pseudomallei nachgewiesen wurde, sollte
abschließend analysiert werden, ob ebenfalls steigende Infektionsdosen eines
B. thailandensis-Stamms zu einer Zunahme der Prx 6-Genexpression führen. Neben der
relativen Genexpression von Prx 1, 5 und 6 wurde zudem die Wirkung steigender
B. thailandensis-Infektionsdosen auf die Genexpression von IL-1β, IL-6 und TNFα
bestimmt.
Für die Versuchsdurchführung wurde der B. thailandensis-Stamm E264 verwendet, da
dieser keine signifikante Invasionsdefizienz im Vergleich zum B. pseudomallei-Stamm
E8 in Knochenmarkmakrophagen aufwies. IFNγ-aktivierte BMM wurden entweder mit
einer MOI von 50:1 mit E8 oder mit MOIs von 50:1, 125:1, 250:1 oder 500:1 mit E264
infiziert. Die Genexpressionsanalyse von Prx 1, 5 und 6 zeigte, dass keine Unterschiede
in der relativen Höhe der induzierten mRNA von Prx 1 in Makrophagen vorhanden sind,
die entweder mit verschiedenen Infektionsdosen von E264 behandelt oder mit E8 oder
E264 infiziert wurden (Abb. 89). Die Induktion der Prx 5-Genexpression unterschied sich
203
Ergebnisse und Diskussion
ebenfalls nicht in Abhängigkeit von den verschiedenen Infektionen. Jedoch wurde eine
leichte Zunahme der Prx 5-mRNA durch steigende MOI von B. thailandensis
hervorgerufen. Während die Prx 6-Transkription durch Infektion mit E8 auf das
4,5-Fache und durch E264 mit einer MOI von 50:1 auf das 3,5-Fache induziert wurde,
bewirkte die Infektion mit E264 eine kontinuierliche Zunahme der Prx 6-Genexpression
in Abhängigkeit von der MOI. Dabei führte die E264-Infektion aktivierter Makrophagen
mit einer MOI von 250:1 bereits zu einer 5-fachen Prx 6-Geninduktion, die durch die MOI
von 500:1 auf das 6-Fache gesteigert wurde (Abb. 89).
-
+
+
50:1
50:1
E8
+
+
+
125:1 250:1 500:1
E264
-
+
+
50:1
50:1
E8
+
+
+
125:1 250:1 500:1
IFNγ
MOI
E264
Abbildung 89: Einfluss verschiedener Infektionsdosen des B. thailandensis-Stammes E264 auf die
Genexpression von Prx 1, 5 und 6 in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM blieben unbehandelt oder wurden für
24 h mit 300 U/ml IFNγ vorinkubiert, gefolgt von einer 30-minütigen Infektion mit dem B. pseudomalleiStamm E8 mit einer MOI von 50:1 oder mit dem B. thailandensis-Stamm E264 mit MOIs von 50:1, 125:1,
250:1 oder 500:1 und einer weiteren 18-stündigen Inkubation. Die relative Genexpression von Prx 1, 5 und 6
wurde durch qRT-PCR bestimmt, wobei RPLP0 als Referenzgen diente. Die Graphen repräsentieren den
Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=4). Die statistische Auswertung erfolgte durch Vergleich der
Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
Des Weiteren zeigt die Abbildung 90 die relative Genexpression von IL-1β, IL-6 und
TNFα nach E8- bzw. E264-Infektionen mit steigender MOI. Die Infektion der
Makrophagen mit einer MOI von 50:1 von E8 oder E264 resultierte in einer geringeren
Genexpression aller drei proinflammatorischen Cytokine nach E264- gegenüber der
E8-Infektion. Zudem führten steigende MOIs von E264 zu einer verstärkten
mRNA-Expression dieser Cytokine. Während die E264-Infektion mit einer MOI von 125:1
204
Ergebnisse und Diskussion
noch eine schwächere IL-1β−, IL-6- und TNFα-Genexpression bewirkte als die
E8-Infektion, führte bereits die Infektion mit einer Infektionsdosis von 250:1 zu einer
minimal höheren Transkription dieser Gene. Statistisch signifikante Unterschiede in der
Intensität der Genexpression wurden für IL-1β und IL-6 in Makrophagen verzeichnet, die
zum einen mit einer MOI von 500:1 des B. thailandensis-Stammes E264 und zum
anderen mit einer MOI von 50:1 des B. pseudomallei-Stammes E8 infiziert wurden
(Abb. 90).
-
+
+
50:1
50:1
E8
+
+
-
+
125:1 250:1 500:1
-
E264
+
+
50:1
50:1
E8
+
+
+
125:1 250:1 500:1
E264
IFNγ
MOI
B.p./B.t.
Abbildung 90: Einfluss verschiedener Infektionsdosen des B. thailandensis-Stammes E264 auf die
Genexpression von IL-1β
β, IL-6 und TNFα
α in C57BL/6 BMM. C57BL/6 BMM blieben unbehandelt oder
wurden für 24 h mit 300 U/ml IFNγ vorinkubiert, gefolgt von einer 30-minütigen Infektion mit dem
B pseudomallei-Stamm E8 mit einem MOI von 50:1 oder mit dem B. thailandensis-Stamm E264 mit MOIs
von 50:1, 125:1, 250:1 ode 500:1 und einer weiteren 18-stündigen Inkubation. Die relative Genexpression
von IL-1β, IL-6 und TNFα wurde durch qRT-PCR bestimmt, wobei RPLP0 als Referenzgen diente. Die
Graphen repräsentieren den Mittelwert mit dem Fehler des Mittelwertes (n=5). Die statistische Auswertung
erfolgte durch Vergleich der Gruppen mit one-way ANOVA und anschließendem Bonferroni post-Test.
Verschiedene Stämme von B. pseudomallei variieren im gleichen Tiermodell stark in
ihrer Virulenz. Zudem kann derselbe Stamm von B. pseudomallei eine unterschiedliche
Virulenz für den Wirt in Abhängigkeit von der Tierspezies aufweisen (Tamrakar und
Haas 2008). Im Vergleich zu B. pseudomallei ist B. thailandensis >105-fach weniger
virulent im Syrischen Hamster und >107-fach weniger virulent in BALB/c-Mäusen (Brett
et al., 1997; Smith et al., 1997; Brett et al., 1998). Kürzlich wurde durch Wiersinga et al.
gezeigt,
dass
C57BL/6-Mäuse,
die
mit
dem
B. thailandensis-Stamm
E264
205
Ergebnisse und Diskussion
intranasal-infiziert wurden, 24 h nach Infektion ein markant reduziertes bakterielles
Wachstum in der Lunge, der Niere sowie im Blut aufweisen als Mäuse, die mit dem
B. pseudomallei-Stamm 1026b infiziert wurden. Zudem konnte 48 h nach der Infektion
B. thailandensis nicht mehr nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurden 24 h nach
der Infektion mit E264 erhöhte IL-6-, TNFα- sowie MCP-1-Konzentrationen im
Homogenisat der Lungen nachgewiesen, die bereits weitere 24 h später nicht mehr
erhöht vorgefunden wurden. Hingegen wurde 48 h nach B. pseudomallei-Infektion noch
eine vermehrte IL-6- und MCP-1-Sekretion im Lungenhomogenisat festgestellt
(Wiersinga et al., 2008). Durch die Arbeitsgruppe um Harley wurde beschrieben, dass
B. thailandensis fast genauso potent ist wie B. pseudomallei, die Zellfusion und die
Bildung von multinukleären Riesenzellen nach Invasion phagozytierender Zellen zu
induzieren (Harley et al., 1998). Außerdem scheint B. pseudomallei effektiver bei der
Invasion in und der Adhäsion an die Zellen der humanen Epithelzellline A549 zu sein als
B. thailandensis. Demgegenüber wurde jedoch kein Unterschied im Überleben und der
Replikation
in
den
A549-Zellen
der
Burkholderia-Spezies
nachgewiesen
(Kespichayawattana et al., 2004). Studien zum Überleben von Mäusen nach intranasaler
Infektion mit den beiden Burkholderia-Spezies verdeutlichten, dass durch eine CFU von
103
B. pseudomallei-infizierte
Tiere
innerhalb
von
96 h
sterben,
während
B. thailandensis-Infizierte überleben. Die Erhöhung der Infektionsdosis auf 106 führte
jedoch auch bei B. thailandensis-infizierten Tieren innerhalb von 96 h zum Tod. Zudem
wurden die Cytokin- bzw. Chemokinkonzentrationen wie 48 h nach der B. pseudomalleiInfektion in der Leber, Niere und im Blut als deutlich erhöht verzeichnet, weshalb
vermutet wird, dass B. thailandensis-Stämme möglicherweise nicht so avirulent sind, wie
zuvor angenommen wurde (Wiersinga et al., 2008). Somit wird deutlich, dass sehr hohe
Infektionsdosen von B. thailandensis ebenfalls eine starke proinflammatorische Wirkung
der Wirtszellen auslösen, was in Übereinstimmung mit den in Abbildung 90 dargestellten
Genexpressionsprofilen von IL-1β, IL-6 und TNFα nach Infektion mit steigenden MOI
von E264 ist. Da in der vorliegenden Arbeit, wie ebenfalls in einer Arbeit von Wiersinga
et al. beschrieben, hohe Infektionsdosen von B. thailandensis die angeborene Immunität
vergleichbar
intensiv
modulieren
wie
Infektionen
mit
niedrigeren
Dosen
von
B. pseudomallei (Wiersinga et al., 2008), und parallel ein MOI-abhängiger Anstieg der
Prx 6-Genexpression beobachtet wurde, wird die Hypothese bestärkt, dass Prx 6 eine
essentielle Funktion während akuten Entzündungsprozessen erfüllt, indem es
übermäßige RNS und ROS beseitigt und durch seine Phospholipase A2-Aktivität zur
Aufrechterhaltung der Membranfluidität und dadurch zur Zellintegrität beiträgt.
206
Zusammenfassung
4
Zusammenfassung
Makrophagen spielen eine essentielle Rolle bei Entzündungsprozessen sowie bei der
Aktivierung von Abwehrmechanismen gegenüber bakteriellen Infektionen. Als Antwort
auf
inflammatorische
Cytokine
und
bakterielle
Produkte
setzen
Makrophagen
Stickstoffmonoxid (NO) und reaktive Sauerstoffverbindungen (ROS) frei, die sowohl
redox-sensitive Signaltransduktionswege vermitteln als auch Zellschäden induzieren.
Ein wichtiger Bestandteil des zellulären Abwehrsystems stellen unter anderem die
ubiquitär exprimierten Peroxiredoxine (Prxs) dar. Sie bilden eine Familie von sechs
Thiol-abhängigen Peroxidasen, die Wasserstoffperoxid, organische Peroxide sowie
reaktive Stickstoffverbindungen reduzieren können. Neben ihrer antioxidativen Funktion
sind sie in die Regulation der Zellproliferation, Signaltransduktion sowie Apoptose
involviert.
In
der
vorliegenden
Arbeit
wurde
gezeigt,
dass
Peroxiredoxine
in
Knochenmarkmakrophagen (bone marrow-derived macrophages; BMM) von BALB/cund
C57BL/6-Mäusen
konstitutiv
exprimiert
werden
und
die
Stimulation
mit
Lipopolysaccharid (LPS) und Interferon γ (IFNγ) zu einer Änderung der Genexpression
von Prxs führt. Während in C57BL/6 BMM die Induktion der Genexpression von Prx 1, 2,
4 und 6 durch LPS und IFNγ von der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) abhängig war,
konnte in BALB/c BMM nur
eine iNOS-abhängige Induktion der Prx 1-
und
Prx 6-Genexpression nachgewiesen werden. Die durch LPS- und IFNγ-verminderte
Genexpression von Prx 3 sowie die erhöhte mRNA-Menge von Prx 5 wurde hingegen in
BMM beider Mausstämme nicht durch NO-vermittelt. Mit Hilfe von BMM von
gp91phox KO-Mäusen
konnte
hingegen
keine
Involvierung
der
durch
die
NADPH-Oxidase-gebildeten ROS in die Regulation der Genexpression von Prxs durch
LPS
und
IFNγ
nachgewiesen
werden.
Untersuchungen
zur
Beteiligung
von
Proteinkinasen an der Regulation der Prx 1-, 5- und 6-Genexpression durch LPS und
IFNγ zeigten, dass die Hemmung der Tyrosinkinase JAK2 die induzierte Genexpression
von Prx 5 und Prx 6, jedoch nicht von Prx 1, vermindert, wohingegen die Hemmung der
Tyrosinkinase
der
Src-Familie
in
einer
geringen
Abnahme
des
Prx 1-
und
Prx 5-Transkriptes resultiert, während die Prx 6-mRNA-Induktion unverändert bleibt.
Durch die Verwendung eines Phosphatidylinositol-3-Kinase- (PI3K-) Inhibitors wurde der
LPS-und IFNγ-vermittelte Anstieg der Prx 1-, 5- und 6-Transkription fast vollständig
unterdrückt. Ebenso wurde die Involvierung der Proteinkinase C-Isoenzyme in die LPSund IFNγ-induzierte Genexpression von Prx 1, 5 und 6 nachgewiesen, wobei für die
Prx 6-Geninduktion eine Beteiligung der klassischen α-, β- und γ-Isoformen der PKC
ausgeschlossen werden konnte. Pharmakologische Inhibitoren der p44/42 MAPK,
207
Zusammenfassung
p38 MAPK oder c-Jun-NH2-terminalen Kinase (JNK) bewirkten eine deutliche Prx 6- und
eine schwächere Prx 5-Abnahme der LPS- und IFNγ-induzierten Genexpression,
während die mRNA-Induktion von Prx 1 durch diese Inhibitoren unbeeinflusst blieb.
Außerdem führte die Hemmung des Transkriptionsfaktors NFκB (nuclear factor κB)
sowie die Inhibition des Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptors γ (PPARγ) zu
keiner Beeinflussung der Prx 1-, 5- und 6-mRNA-Induktion durch LPS und IFNγ,
wohingegen erstmals gezeigt werden konnte, dass die Genexpression von Prx 6 durch
Nrf2- (nuclear factor-erythroid 2p45 (NF-E2)-related factor 2-) Aktivatoren induzierbar ist
und zudem der Genknockout von Nrf2 die LPS- und IFNγ-vermittelte Induktion von Prx 6
in Makrophagen herabsetzt.
Des Weiteren war die cytosolische Phospholipase A2 (cPLA2) in die Regulation der LPSund IFNγ-induzierten Transkription von Prx 5 und Prx 6 involviert. Die Hemmung der
stromabwärts der cPLA2-gelegenen Cyclooxygenase-Enzyme (COX) führte zu einer
signifikanten Abnahme der Prostaglandin (PG) E2-Sekretion sowie der Genexpression
von Prx 6. Im Gegensatz dazu resultierte exogen zugeführtes PGD2, PGE1, PGE2,
PGF2α,
PGA1,
PGA2
oder
15-deoxy-∆12,14-PGJ2
in
einer
konzentrations-
und
zeitabhängigen Zunahme des Prx 6-Transkriptes. Mit Hilfe spezifischer Aktivatoren und
Inhibitoren konnte festgestellt werden, dass an der Regulation der PGD2- und
PGE2-induzierten Prx 6-Genexpression die Adenylylzyklase und durch sie generiertes
cAMP beteiligt sind, aber die durch cAMP-aktivierbare Proteinkinase A sowie Epac
(exchange protein directly activated by cAMP) keine essentielle Bedeutung für die
Prx 6-Genregulation besitzen. Die Regulation der PGE2- oder PGD2-induzierten
Prx 6-Transkription beinhaltete dagegen die Beteiligung der JAK2, PI3K sowie
p38 MAPK und einiger Isoenzyme der PKC, wohingegen eine regulatorische Funktion
von p44/42 MAPK, JNK und der klassischen PKC-Isoformen ausgeschlossen werden
konnte. Im Gegensatz zu den Transkriptionsfaktoren CREB (cAMP response element
binding protein) und PPARγ, die nicht zur Regulation der Prx 6-Genexpression durch
PGE2 oder PGD2 beitrugen, wurde in Nrf2-defizienten Makrophagen im Vergleich zum
Wildtyp keine signifikante Induktion der Prx 6-Genexpression durch konventionelle und
Cyclopentenon-Prostaglandine festgestellt.
In dieser Arbeit wurde zudem der Nachweis erbracht, dass durch die Infektion mit dem
Pathogen Burkholderia pseudomallei, das als Modellorganismus Gram-negativer,
intrazellulärer Erreger dient, die Genexpression von Prx 1, 5 und 6 in IFNγ-aktivierten
Makrophagen
von
C57BL/6-
und
BALB/c-Mäusen
induziert
wird,
wobei
die
mRNA-Induktion von Prx 1 und Prx 6 stärker in C57BL/6 als in BALB/c BMM erhöht wird.
In IFNγ-aktivierten und B. pseudomallei-infizierten Makrophagen zeigte sich durch
Verwendung
208
iNOS-defizienter
BMM
bzw.
spezifischer
iNOS-Inhibitoren
eine
Zusammenfassung
NO-abhängige
Verwendung
Induktion
der
Prx 1-
phox
gp91
-defizienter
und
BMM
Prx 6-Transkription
eine
Abhängigkeit
sowie
der
durch
Prx 5-
die
und
Prx 6-Genexpression von der NADPH-Oxidase-gebildeten ROS. Die Hemmung von
COX-1 und/oder COX-2 verminderte zudem die durch B. pseudomallei-erhöhte
mRNA-Expression von Prx 6, wohingegen die COX-Inhibitoren keinen Einfluss auf die
induzierten Prx 1- und Prx 5-Transkripte ausübten. IFNγ-aktivierte Makrophagen, die mit
Stämmen der virulenten Burkholderia-Spezies pseudomallei infiziert wurden, verfügten
in den meisten Fällen über eine verstärkte Geninduktion von Prx 6, sowie iNOS- und
COX-2-Proteinexpression gegenüber Makrophagen, die mit Stämmen der avirulenten
Burkholderia-Spezies thailandensis infiziert wurden. Darüber hinaus zeichneten sich
B. thailandensis- im Vergleich zu B. pseudomallei-infizierte BMM überwiegend durch
eine geringere Genexpression und Sekretion verschiedener proinflammatorischer
Cytokine wie IL-1β, IL-6 und TNFα aus.
Mit der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die durch LPS- und IFNγ- oder
B. pseudomallei-Infektion-veränderte
Expression
der
Peroxiredoxine
durch
ein
Zusammenspiel unterschiedlicher Enzyme wie iNOS, NADPH-Oxidase und/oder
Cyclooxygenasen sowie verschiedener Signaltransduktionsmediatoren reguliert wird.
Die
Vielzahl
der
Mechanismen,
die
an
der
Regulation
der
Peroxiredoxine,
möglicherweise in Abhängigkeit von der Pathogenität des Erregers, beteiligt sind, lässt
vermuten, dass die Peroxiredoxine, allen voran Prx 6, wichtige Funktionen wie die
Eingrenzung von Entzündungsprozessen während bakterieller Infektionen erfüllen.
Dabei ist anzunehmen, dass die Peroxiredoxine vorwiegend dem Schutz der Wirtszelle
dienen, indem sie pathologisch hohe, die Zelle schädigende reaktive Sauerstoff- und
Stickstoffspezies reduzieren und somit die Zellintegrität aufrechterhalten.
209
Abkürzungsverzeichnis
5
Abkürzungsverzeichnis
15d-PGJ2
15-deoxy-∆12,14-PGJ2
6-Bnz
N6- Benzoyladenosin-3', 5'-cAMP
8-pCPT-2‘-O-Me-cAMP
(pCPT)
8-(4-Chlorophenylthio)-2'-O-methyladenosine-3', 5'cyclic monophosphate
A. bidest
Aqua bidest
AA
Arachidonsäure
AACOCF3
Arachidonyltrifluormethylketon
Abb.
Abbildung
AC
Adenylylzyklase
AmG
Aminoguanidin
AG490 (AG)
Tyrphostin
AHL
N-Acyl-Homoserinlakton
aiPLA2
saure Ca2+-unabhängige PLA2
AOE372
antioxidant enzyme 372
AOEB166
antioxidant enzyme B166
AOP
antioxidant protein
AOPP
advanced oxidation protein products
AP-1
activating protein-1
aPKC
atypische PKC-Isoformen
APS
Ammoniumpersulfat
Asp
Aspartat
ATF-2
activating transcription factor-2
ATP
Adenosintriphosphat
b
bovine, Rind
BAY117082
(E)-3-(4-Methylphenylsulfonyl)-2-propenenitril
BimA
Burkholderia intracellular motility A
BipD
Burkholderia pseudomallei invasion protein D
BMM
Knochenmarkmakrophagen, bone marrow-derived
macrophages
BopE
GEF-Protein des Typ III-Sekretionsapparates von
Burkholderia pseudomallei
Bsa
Burkholderia-Sekretionsapparat
BSA
bovine serum albumin
cAMP
cyklisches Adenosinmonophosphat
CAPE
Kaffeesäurephenethylester, caffeic acid phenethyl
ester
210
Abkürzungsverzeichnis
CBA
Cytometric Bead Array
CC26
Clara cell 26 kDa protein
CD
cluster of differentiation
Cdc42
cell division control protein 42 homolog
CFU
colony forming unit
Chaps
3-[(3-Cholamido-propyl)-dimethylammonio]propansulfonat
CNG
cyclic nucleotide-gated
COX
Cyclooxygenase
Cp
Crossing Point
CpG
Cytosin-phosphatidyl-Guanin
cPKC
klassische PKC-Isoformen
CRE
cAMP response element
CREB
CRE binding protein
CRTH2
chemoattractant receptor homologous
Ct
Cycle Threshold
CTP
Cytidintriphosphat
Cys
Cystein
Cys-OH
Sulfhydrylgruppe
Cys-SOH
Sulfensäuregruppe
DAG
Diacylglycerin
DB
Dibutyryl-cAMP
DD
death domain
DEPC
Diethylpyrocarbonat
DHL
N-Dekanoyl-Homoserinlakton
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
desoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure
dNTP
Desoxynukleosidtriphosphat
DP
PGD-Rezeptor
DPPC
Dipalmitylphosphatidylcholin
DTT
Dithiothreitol
EIA
enzyme-linked immunosorbent assay
eNOS
endotheliale NO-Synthase
EP
PGE-Rezeptor
Epac
exchange protein directly activated by cAMP
et al.
und andere (lat. Et alteri)
FACS
fluorescence activated cell sorting
211
Abkürzungsverzeichnis
FAM
6-Carboxy-Fluorescein
FELASA
Federation of Laboratory Animal Science Associations
FET
Fluoreszenz-Energietransfer
FITC
Fluoreszeinisothiocyanat
Forsk
Forskolin
FP
PGF-Rezeptor
GAF
gamma-activated factor
GAPDH
Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase
GAS
gamma-activated sequence
GDF9
growth differentiation factor 9
GEF
guanine-nucleotide exchange factor
Gi
G-Protein inhibierend
Gö6796 (Gö)
5,6,7,13-Tetrahydro-13-methyl-5-oxo-12H-indolo[2,3-a]
pyrrolo[3,4-c]carbazole-12-propanenitrile
gp91phox
membranständige NADPH-Oxidase-Untereinheit, Nox2
G-Protein
Guaninnucleotid-bindendes Protein
Gq
G-Protein PLCβ-aktivierend
Gs
G-Protein stimulierend
GSH
Glutathion
GTP
Guanosintriphosphat
GW9662 (GW)
2-Chloro-5-nitro-N-phenylbenzamide
h
human
H2O2
Wasserstoffperoxid
H89
[N-[2-(p-Bromocinnamylamino)ethyl-]-5isoquinolinesulfonamide. 2 Hydrogenchlorid]
HBP23
heme-binding protein 23
His
Histidin
HIV
humanes Immundefizienz-Virus
HO-1
Häm-Oxygenase-1
HOCl
Hyprochlorige Säure
H-PGDS
Hämatopoetische PGD-Synthase
HPLC
high performance liquid chromatography
HRP
horseradish peroxidase
HSF
heat shock factor
H-Test
Kruskal-Wallis Test
IBMX
Isobutylmethylxanthin
Ibu
Ibuprofen
212
Abkürzungsverzeichnis
IDO
Indolamin-2,3-Dioxygenase
IF
Immunfluoreszenz
IFNGR
IFNγ-Rezeptor
IFNγ
Interferon γ
Ig
Immunglobulin
IKK
IκB-Kinase
IL
Interleukin
Indo
Indomethacin
iNOS
induzierbare NO-Synthase
IRAK
IL-1R-associated kinase
IRF3
Interferon regulatory factor 3
IκB
inhibitor of NF-κB
JAK
Januskinase
JNK/SARK
c-Jun NH2-terminal kinase/stress-activated protein
kinase
K
Kontrolle
kDa
Kilodalton
KEAP1
kelch-like ECH-associated protein 1
KGF
keratinocyte growth factor
KO
Knockout
KT5720
(9R,10S,12S)-2,3,9,10,11,12-Hexahydro-10-hydroxy9-methyl-1-oxo-9,12-epoxy-1H-diindolo[1,2,3-fg:3',2',1'kl]pyrrolo[3,4-i][1,6]benzodiazocine-10-carboxylic acid,
hexyl ester
LBP
LPS-bindendes Protein
LEDGF
lens epithelium-derived growth factor
L-NIL
N6-(1-Iminoethyl)-L-Lysine
L-NMMA
NG-Monomethyl-L-arginine
L-PGDS
Lipocalin-PGD-Synthase
LPS
Lipopolysaccharid
LTW4
liver 20.000-30.000 MW protein 4
LY294002 (LY)
2-(4-Morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one
m
Maus
MAFP
Methylarachidonylfluorphosphonat
MAPK
mitogen activated protein kinase
Mb
Megabasen
MCP-1
Monocyte chemoattractant protein-1
MDL12330A
[cis-N-(2-Phenylcyclopentyl)azacyclotridec-1-en-2213
Abkürzungsverzeichnis
amine . HCl]
MEKK
MAPK-Kinase-Kinase
MEKK1
mitogen activated protein kinase/extracellular signalregulated kinase kinase
MER5
gene preferentially expressed in murine
erythroleukemia cells
MG132
N-[(Phenylmethoxy)carbonyl]-L-leucyl-N-[(1S)-1formyl-3-methylbutyl]-L-leucinamide
MHC
major Histocompatibility Complex
MIF
macrophage migration inhibitory factor
MKK
MAPK-Kinase
M-MLV RT
Moloney Murine Leukemia Virus-Reverse
Transcriptase
MNGC
Multinukleäre Riesenzellen, multinuclear giant cells
MOI
multiplicity of infection
mPGES
mikrosomale PGE-Synthase
mRNA
messenger RNA
MSP23
mouse stress-inducible 23-kDa protein
MYC
Transkriptionsfaktor der MYC-Familie mit Helix-loophelix- und Leucin-Zipper-Domäne
MyD88
myeloid differentiation factor 88
n
Anzahl unabhängiger Experimente
NADPH
nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
(reduced form)
NFκB
nuclear factor κB
NK
natürliche Killerzellen
NKEF
natural killer cell enhancing factor
nNOS
neuronale NO-Synthase
NO
Stickstoffmonoxid
NOS
NO-Synthase
nPKC
neue PKC-Isoformen
Nrf2
nuclear factor-erythroid 2p45 (NF-E2)-related factor 2
NS398
N-[2-Cyclohexyloxy-4-nitrophenyl]methanesulfonamide
NTC
non target control
OD
optische Dichte
one-way ANOVA
einfaktorielle Varianzanalyse, one-way analysis of
variance
ORF06
open reading frame 06
214
Abkürzungsverzeichnis
OSF-3
osteoblast specific factor-3
p38 MAPK
p38 mitogen activated protein kinase
p44/42 MAPK
extracellular signal-regulated kinase 1/2, ERK1/2
PAG
proliferation- associated gene product
PAGE
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PAK1
p21-aktivierte Kinase 1
PAMP
pathogen-associated molecular pattern
PBS
phosphate buffered saline
PCR
Polymerasekettenreaktion, polymerase chain reaction
PD98059 (PD)
2-(2-Amino-3-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one
PDK-1
Phosphatidylinositol-3-abhängige Kinase-1
PE
Phytoerythrin
PG
Prostaglandin
PGDS
Prostaglandin D-Synthase
PGES
Prostaglandin E-Synthase
PGFS
Prostaglandin F-Synthase
PGHS
Prostaglandin H-Synthase
PI3K
Phosphatidylinositol-3-Kinase
pilA
putatives Pilus-Strukturprotein
PIP3
Phosphatidylinositol-1, 4, 5,-triphosphat
PKA
Proteinkinase A
PKB
Proteinkinase B
PKC
Proteinkinase C
PLA2
Phospholipase A2
PLC
Phospholipase C
PMP20
peroxisomal membrane protein 20
PP2
3-(4-chlorophenyl) 1-(1,1-dimethylethyl)-1H-pyrazolo
[3,4-d] pyrimidin-4-amine
PPARγ
Peroxisom-Proliferator-aktivierender Rezeptor γ
PRP
protector protein
PRR
pattern-recognition receptor
Prx(s)
Peroxiredoxin(e)
qRT-PCR
Quantitative Real-Time PCR
QS
quorum-sensing
r
Ratte
RANKL
receptor activator for NFκB ligand
Rap
Ras-like small GTPase
215
Abkürzungsverzeichnis
Ras
kleine GTPase (rat sarcoma)
RIP1
Rezeptor-interagierende Proteinkinase 1
RNA
ribonucleic acid, Ribonukleinsäure
RNS
reactive nitrogen species
Ro318220 (Ro)
3-[3-[2,5-Dihydro-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-2,5-dioxo1H-pyrrol-3-yl]-1H-indol-1-yl]propyl carbamimidothioic
acid ester
ROS
reactive oxygen species
RPLP0
ribosomal protein, large P0
rpm
rounds per minute
Rpos
RNA-Polymerase σ-Faktor
RT
Raumtemperatur
RTase
reverse Transkriptase
RT-PCR
reverse Transkriptase-PCR
RXR
Retinoid-X-Rezeptor
SB202190 (SB)
4-[4-(4-Fluorophenyl)-5-(4-pyridinyl)-1H-imidazol2-yl]phenol
SC-560 (SC)
5-(4-Chlorophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-3(trifluoromethyl)-1H-pyrazole
SDS
Natriumdodecylsulfat
Ser
Serin
SH2-Domäne
Src-homology 2 domain
SOD
Superoxiddismutase
SP1
Transkriptionsfaktor der Sp/KLF-Familie
SP22
22 kDa substrate protein for a mitochondrial
ATP-dependent protease
SP600125 (SP)
Anthra[1-9-cd]pyrazol-6(2H)-one
Src
Tyrosinkinase (sarcoma)
SREBP
sterol response element binding protein
SRF
serum response factor
STAT
signal transducer and activator of transcription
Surfactant
surface active agent
T3SS3
Typ III-Sekretionssystem 3
T6SS
Typ VI-Sekretionssystem
TAB
TAK1-binding protein
TAK1
TGFβ-activated kinase 1
TAMRA
6-Carboxy-tetramethylrhodamin
tBHQ
tert-Butylhydroquinon
216
Abkürzungsverzeichnis
TBS
Tris buffered saline
TBST
Tris buffered saline Tween
TEMED
N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin
TGFβ
transforming growth factor β
Th1
T helper 1
Th2
T helper 2
TIR
Toll/IL-1R domain
TIRAP
Toll-interleukin 1 receptor domain containing adaptor
protein
TLR
Toll-like-Rezeptor
TNF
tumor necrosis factor
TNFR
TNF-Rezeptor
TNFα
tumor necrosis factor α
TRAM
TRIF-related adaptor molecule
TRANK
thioredoxin peroxidase-related activator of NFκB and
JNK
TRIF
TIR domain-containing adapter-inducing interferon β
Tris
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
Trp
Tryptophan
TSA
thiol-specific antioxidant enzyme
TTP
Thymidintriphosphat
U
units, Einheiten
USF
upstream stimulatory factor
U-Test
Mann-Whitney-Wilcoxon Test
UV
ultraviolett
217
Literaturverzeichnis
6
Literaturverzeichnis
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254
Eidesstattliche Erklärung
Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass diese Arbeit bisher von mir weder an der MathematischNaturwissenschaftlichen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald noch
einer anderen wissenschaftlichen Einrichtung zum Zwecke der Promotion eingereicht
wurde.
Ferner erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbständig verfasst und keine anderen als die
darin angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.
Danksagung
Danksagung
Meinen besonderen Dank möchte ich an die Herrn Professoren Dr. Walther und Dr.
Steinmetz für die Möglichkeit der Bearbeitung des Themas und die wissenschaftliche
Betreuung der Arbeit richten. Des Weiteren möchte ich mich für die außerordentliche
Förderung und die gute Kooperation bedanken.
Ganz herzlich danke ich Frau Dr. Antje Bast für die Unterstützung, den Rückhalt, die
konstruktive Kritik, die endlosen wissenschaftlichen Diskussionen und die Freundschaft,
ohne die die letzten Jahre wirklich trostlos gewesen wären.
Vom Institut für Medizinische Molekularbiologie und Biochemie danke ich vor allem Frau
Gabi Würtz, die mein Leben lang „meine beste Technische Assistentin“ bleiben wird,
und Julia Seidel, die maßgeblich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen und zudem die
Arbeitsatmosphäre erfrischt und im wahrsten Sinne des Wortes versüßt haben.
Weiterhin danke ich allen Mitarbeitern der Forschungsgruppe des Friedrich-LoefflerInstituts für Medizinische Mikrobiologie für die stetige Hilfsbereitschaft und die herzliche
Laboratmosphäre sowie der Abteilung für Immunologie für die Bereitstellung des
FACS-Geräts.
Meinen Freunden und meiner Familie, besonders meiner Mutter, die mir immer Rückhalt
gegeben hat, aber auch aus verschiedenen Gründen meinen Schwestern, bin ich sehr
zu Dank verpflichtet. Einen ganz speziellen Dank richte ich an meinen Vater, der mich
von Kindesbeinen an gefördert und mich immer begleitet hat.
Die Arbeiten zur Promotion wurden durch ein Stipendium des Graduiertenkollegs
„Wechselwirkungen zwischen Erreger und Wirt bei generalisierten bakteriellen
Infektionen“ gefördert.