Entwicklung eines Sensors zur spezifischen

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tm 5/2013
Entwicklung eines Sensors zur
spezifischen Proteindetektion am
Beispiel von Norovirus-Kapsidprotein
Development of a Sensor for Specific Protein Detection by the Example of Norovirus
Capsid Protein
Sandra Päßler∗, Winfried Vonau, Michael Mertig, Kurt-Schwabe-Institut für Mess- und Sensortechnik e. V.
Meinsberg, Waldheim,
Anja Henseleit, Philipp Quenzel, Elke Boschke, Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik, Technische
Universität Dresden,
Ada Lange, Katrin Jäger, Jacques Rohayem, Institut für Virologie, Technische Universität Dresden,
Andrea Pohl, Jörg Opitz, Fraunhofer Institut für Zerstörungsfreie Prüfverfahren Dresden,
Nora Haufe, Physikalische Chemie, Technische Universität Dresden
∗ Korrespondenzautor: [email protected]
Zusammenfassung Es werden die Ergebnisse zur Entwicklung von molekular basierten Prinzipien zur Detektion von Proteinen z. B. Virusproteinen dargestellt. Diese bestehen im Wesentlichen im Nachweis der spezifischen Interaktion der Aptamere mit Proteinen durch impedimetrische Messverfahren und
der Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie. Zudem werden die rekombinante Expression des Kapsidproteins des Norovirus und dessen Verwendung zur Selektion Norovirus-spezifi-
scher Aptamere beschrieben. Summary The results
of the development of molecular based principles for the detection of proteins are presented. These are essentially based on
the evidence of the specific interaction of aptamers with proteins
by means of impedimetric measurement methods and surface
plasmon resonance spectroscopy. Additionally, the recombinant
expression of the capsid proteins of noroviruses and their use
for the selection of norovirus specific aptamers are shown.
Schlagwörter Aptamer, Thrombin, Oberflächenplasmonenresonanz, elektrochemische Impedanzspektroskopie, SELEX, Norovirus
Keywords Aptamer, thrombin, surface plasmon resonance, electrochemical impedance spectroscopy, SELEX, norovirus
1 Einführung
Noroviren, zur Familie der Caliciviren zählend, sind
weltweit für die meisten Fälle viraler Gastroenteritiden
(Magen-Darm-Entzündungen) verantwortlich [1]. Sie
zeichnen sich durch ihre hohe Virulenz, die hohe Widerstandsfähigkeit des Viruspartikels und die Übertragbarkeit des Virus durch Schmierinfektionen auf fäkal-oralem
Weg aus. Dies führte in der Vergangenheit oft zu
endemischen Ausbrüchen in Zusammenhang mit Groß-
küchen und anderen Gemeinschaftseinrichtungen wie
Pflegeheimen, Krankenhäusern oder Kinderbetreuungseinrichtungen, so dass zuverlässige Nachweisverfahren
dringend notwendig sind. Zudem sind Noroviruserkrankungen in Deutschland gemäß §7 und §42 IfsG
meldepflichtig.
Bisher wird der Nachweis i. d. R. mit immunologischen Tests auf der Basis von Antikörpern, mit
Real-Time-PCR oder mit Hilfe der Elektronenmikro-
tm – Technisches Messen 80 (2013) 5 / DOI 10.1524/teme.2013.0025
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skopie durchgeführt. Diese Verfahren sind entweder
aufwendig und lassen sich nur von darauf spezialisierten
Labors durchführen oder sind hinsichtlich ihrer Sensitivität und Selektivität unzureichend [2]. Ziel des hier
vorgestellten Projektes ist die Erarbeitung zusätzlicher,
markierungsfrei arbeitender Methoden für den Virennachweis, so dass ein Vor-Ort-Einsatz der Messtechnik
realisiert werden kann. Ausgangspunkt ist zunächst
die Entwicklung eines Biosensors auf Grundlage der
Oberflächenplasmonenresonanz- (engl.: surface plasmon
resonance, SPR) und der elektrochemischen Impedanzspektroskopie (EIS). Diese beiden Methoden können
die Wechselwirkungen zwischen zwei Reaktionspartnern
labelfrei und in Echtzeit messen. Die Selektivität des
Sensors soll durch das Aufbringen spezifisch bindender
Aptamere auf der Sensoroberfläche gewährleistet werden. Die Verwendung von Aptameren ermöglicht die
mehrmalige Regenerierung des Sensors. Die Selektion
Norovirus spezifischer Aptamere erfolgt parallel zur Sensorentwicklung.
Bei der SPR erfolgt die Detektion der Brechungsindexänderung und damit der Anbindung des Zielmoleküls
innerhalb eines evaneszenten Feldes, welches sich an
der Grenzfläche zwischen einem Metall (Gold) und
einem Dielektrikum (zu untersuchendes Medium) ausbildet. Die EIS hingegen wird verwendet, um dielektrische
Volumen- und Grenzflächeneigenschaften zu analysieren
und dementsprechend hoch sensitiv Veränderungen an
einer Elektrodenoberfläche zu detektieren.
Für die Messung wird einer der beiden Reaktionspartner, der Ligand, auf der Sensoroberfläche immobilisiert
und mit dem zweiten, gelösten Reaktionspartner, dem
Analyten, in Kontakt gebracht. Dementsprechend ist für
die Entwicklung eines Norovirus-sensitiven Biosensors
das Vorliegen spezifisch bindender Liganden unabdingbar.
Der Nachweis toxischer, letaler oder schwach immunogener Substanzen gestaltet sich oft schwierig, da
passende Antikörper häufig nicht verfügbar sind. Alternativ lassen sich sogenannte Nukleotid-Aptamere, das sind
kurze einzelsträngige DNA- oder RNA-Moleküle, einsetzen. Abhängig von deren jeweiliger Sequenz können sie
komplexe dreidimensionale Strukturen ausbilden, die an
bestimmte Oberflächenstrukturen binden und dementsprechend für ein bestimmtes Zielmolekül spezifisch
sind [3]. In den vergangen Jahren konnten eine Vielzahl von Aptamersequenzen identifiziert werden, die ihr
Zielmolekül mit einer vergleichbaren oder sogar besseren
Selektivität, Spezifität und Affinität binden als Antikörper [4; 5]. Synthetisch hergestellt können sie einfach und
zielgerichtet chemisch modifiziert werden. Durch direkte
Immobilisierung von Aptameren über einen endständig gekoppelten Linker lässt sich auf einfache Art und
Weise eine spezifisch reaktive und gerichtete Sensorfunktionalisierung realisieren. Aptamer-basierte Sensorchips
sind strukturell meist wesentlich stabiler als Antikörperbasierte und lassen sich demnach leichter handhaben.
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Da die Aptamere für einen Norovirus-sensitiven Biosensor nicht kommerziell verfügbar sind, müssen sie
innerhalb eines komplexen Prozesses, der SELEX (engl.:
systematic evolution of ligands by exponential enrichment), hergestellt werden. Dabei werden Aptamere und
Target gemeinsam in einem repetitiven Prozess inkubiert, nicht gebundene Aptamere abgetrennt und die
gebundenen Liganden in einer PCR (engl.: polymerase
chain reaction) vervielfacht [6]. Für die Selektion von
Aptameren, die spezifisch Noroviren binden, wurden rekombinant hergestellte Norovirus-Kapsidproteine bzw.
die sich daraus bildenden Virus-like-Particles (VLPs) als
Target eingesetzt.
2 Nachweis der Aptamer-Target-Bindung
anhand des Modellsystems Thrombin
Zunächst wurden Protokolle für Aptamer-TargetInteraktionen anhand eines Modellsystems etabliert.
Dazu wurden Aptamere ausgewählt, die spezifisch
Thrombin binden.
2.1 Oberflächenplasmonenresonanz
Die Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie gehört zu den bevorzugt eingesetzten, optischen Methoden,
da sie Wechselwirkungen zwischen zwei Reaktionspartnern auf der Grundlage von Brechungsindexänderungen
in Echtzeit labelfrei messen kann. Die Detektion des Brechungsindex erfolgt dabei innerhalb eines evaneszenten
Feldes, welches sich an der Oberfläche eines Metalls (z. B.
Gold) ausbildet und somit ca. 200 nm in das darüber
liegende Dielektrikum (Puffer) hineinreicht.
Alle beschriebenen SPR-Experimente wurden am
lateral imaging surface plasmon resonance system (li SPRSystem, capitalis technology GmbH), dargestellt in Bild 1,
durchgeführt [7–9]. Es stellt ein miniaturisiertes System
dar, welches das simultane Charakterisieren einer Probe
mit zahlreichen Bindungspartnern ermöglicht [10–12],
und besteht aus einem Spektrometer mit dazugehöriger Software, einem Probenhandlingsystem sowie
Bild 1 Links: SPR-Spektrometer mit Sensorchip und On-ChipMikrofluidik. In Schwarz die Halterung zur Arretierung des Lab-ona-chip-Systems im Spektrometer. Rechts: Das Lab-on-a-chip-System
als Explosionsdarstellung: (1) Temperierung, (2) Vakuumanschlüsse,
(3) Fluidikanschlüsse, (4) Flusszelle, (5) Fluidikkanal, (6) Vakuumkammern, (7) Goldfläche und (8) SPR-Chip [7].
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einem Lab-on-a-chip-System, zusammengesetzt aus einer
temperierbaren On-Chip-Mikrofluidik und den entsprechenden Sensorchips.
Das li SPR-System misst Winkeländerungen bei einer konstanten Wellenlänge von 810 nm. Dabei wird
das Licht der LED kollimiert auf die Sensorchips geleitet und durch integrierte optische Elemente auf die
Unterseite der Goldfläche fokussiert, wodurch je nach
Brechungsindex des anliegenden Mediums bei einem bestimmten Einfallswinkel Oberflächenplasmonen angeregt
werden. Das reflektierte Licht wird über die integrierten
Linsensysteme wieder kollimiert und von einer Digitalkamera aufgenommen. Mittels Bildverarbeitung und
Fitting-Algorithmen wird die minimalste Reflektion für
jede Messfläche bestimmt. Das li SPR-Gerät verfügt über
drei separat ansteuerbare LEDs. Damit können bis zu drei
unterschiedliche Goldbereiche (9 × 0,8 mm2 ) gleichzeitig
vermessen werden [10; 11].
Mittels der in die On-Chip-Mikrofluidik eingebrachten Vakuumkammern wird der SPR-Chip vor der
Messung durch Unterdruck an der Messflusszelle aus Polydimethylsiloxan (PDMS) fixiert.
Die Sensorchips werden mittels Spritzguss aus
TOPAS® als objektträgergroße Einwegartikel (76 × 26 ×
4 mm3 ) gefertigt.
In der Mitte des Chips befindet sich eine 50 nm
dicke, 12 × 3 mm2 große, rechteckige Goldschicht, welche den sensitiven Bereich bildet. Die optischen Elemente
sind unterhalb der Goldfläche direkt in den Chip
integriert. Diese kompakte Bauweise ermöglicht eine
Justage-unkritische Kopplung zum Auslesegerät.
Der zu untersuchende Reaktionspartner kann über
inverses Mikrokontaktdrucken mit Hilfe einer 17-KanalFlusszelle aus PDMS auf die Goldschicht aufgebracht
werden. Für die Immobilisierung werden die Kanäle
mit je 5 μL Probe befüllt und unter den gewünschten
Bedingungen inkubiert. Eine weitere Möglichkeit zum
Aufbringen von Biomolekülen auf den Sensorchip bietet der Nano-PlotterTM (GeSiM mbH) [11; 12]. Dieser
in Bild 2 dargestellte piezoelektrische Dispenser spottet
präzise abgemessene, wenige Nanoliter große Tröpfchen
der Analysesubstanzen in einem definierten Array auf
Bild 2 Links: Piezoelektrische Mikropipette des Nano-PlotterTM beim
Spotten von Biomolekülen auf die Goldfläche der Sensorchips [12].
Rechts: Nano-PlotterTM (GeSiM mbH) mit eingelegten Sensorchips.
die Goldfläche, auf der so bis zu 180 Messflächen mit
kleinsten Probenvolumen realisiert werden können. Damit besteht die Möglichkeit, eine Vielzahl verschiedener
Liganden zeitgleich zu testen, was die Analysen erheblich
beschleunigt und die Kosten senkt.
Als Modellsystem wurde die Aptamer-ThrombinInteraktion gewählt. Das thiolisierte Anti-ThrombinAptamer (αTA: 5 -GGTTGGTGTGG TTGGT-C3 -biotinSH-3 ) wurde mit einer Kette von drei Kohlenstoffatomen
als Spacer und Biotin modifiziert. Zur Referenzierung der
Bindungssignale wurde eine zufällige Sequenz (RdO: 5 AGACGTCGAGT CCTAT-C3 -biotin-SH-3 ) mit gleicher
Länge und Modifizierung wie das αTA verwendet.
Zu Beginn eines SPR-Experiments wird die Goldfläche des Sensorchips wie folgt vorbereitet: (i) Reinigen
der Goldfläche mit rauchender Salpetersäure (65%). (ii)
Inkubation des Sensorchips in Neutralisationslösung (ein
Teil 25% Ammoniak, ein Teil 30% Wasserstoffperoxid,
fünf Teile ddH2 O) für 2 min bei Raumtemperatur (RT).
(iii) Spülen mit ddH2 O und Trocknen mittels Stickstoffgas.
Für alle durchgeführten SPR-basierten Experimente
wurde die 17-Kanal-Funktionalisierungsflusszelle zur Immobilisierung genutzt. Für das untersuchte Modellsystem
wurde folgendes Immobilisierungsprotokoll erarbeitet:
(i) Inkubieren von 19 nM Streptavidin für 1 h bei 4 ◦ C.
(ii) Spülen der Fläche mit Bindungspuffer. (iii) Inkubieren von 10 μM Aptamer (αTA bzw. RdO) für 1 h bei RT.
(iv) Spülen der Fläche mit Bindungspuffer. (v) Blockung
mit 7,2 μM Bovines Serumalbumin (BSA) für 30 min bei
RT. (vi) Spülen der Fläche mit Bindungspuffer.
Die SPR-Messungen wurden bei einer Fließrate
von 5,06 μL/s als Doppelbestimmung wie folgend beschrieben durchgeführt: (i) Spülen der Fläche mit
Bindungspuffer. (ii) Injektion von 60 μL Thrombin. (iii)
Spülen der Fläche mit Bindungspuffer. (iv) Regeneration
mit 60 μL 1 M NaCl. (v) Spülen der Fläche mit Bindungspuffer.
Zur Abschätzung der Spezifität der detektierten Signale
ist ein Referenzkanal unabdingbar. Ein Referenzaptamer,
das keine Affinität zu dem entsprechenden Antigen oder
den Serumbestandteilen besitzt, wurde auf die gleiche
Weise wie das Anti-Thrombin-Aptamer immobilisiert.
Zur Ermittlung einer Nachweisgrenze und zur
Erstellung von Kalibrierungskurven wurden ThrombinKonzentrationen von 0 nM bis 420 nM auf zuvor
nach dem erarbeiteten Immobilisierungsprotokoll funktionalisierten Chips injiziert. Da während des Regenerationsscoutings ermittelt wurde, dass die sensitive
Bindungsfläche maximal sechsmal mit 1 M NaCl regeneriert werden kann, ohne größere Abweichungen zu
riskieren, wurde die Konzentrationsreihe geteilt und auf
mehreren Sensorchips vermessen. Die Sensorgramme
sind in Bild 3 dargestellt.
Das Detektionslimit des li SPR-Systems liegt bei etwa
drei Pixeln. Folglich ist die Thrombin-Konzentration von
26 nM die Nachweisgrenze. Mit Hilfe des Modellsystems
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Bild 3 Sensorgramm der Thrombin-Konzentrationsreihe (von unten
nachoben: 0 nM, 26 nM, 39 nM, 53 nM, 79 nM, 105 nM, 158 nM, 210 nM,
315 nM und 420 nM) auf mit Anti-Thrombin-Aptamer funktionalisierten Flächen. Die Signale des Referenzaptamers wurden von den
Bindungssignalen abgezogen [7].
konnte ein Protokoll für Aptamer-Target-Interaktionen
erfolgreich etabliert werden, welches als Startpunkt für
folgende Aptamer-basierte Studien dient [9].
Bild 4 Verlauf des Betrages der Impedanz bei 10 mHz in Abhängigkeit
von der Beschichtung der Sensoroberfläche.
2.2 Elektrochemische Impedanzspektroskopie
Die elektrochemische Impedanzspektroskopie ist eine indirekte analytische Methode, die in den hier vorgestellten
Untersuchungen eingesetzt wurde, um den Zustand der
Elektrode, d. h. die Beschichtung der Elektrodenoberfläche zu charakterisieren [13; 14].
Die impedanzspektroskopischen Messungen wurden mit einer Drei-Elektroden-Anordnung in einem
Messgefäß mit einem Puffervolumen von 5 mL durchgeführt. Durch einen entsprechenden Gefäßdeckel kann
gewährleistet werden, dass die Abstände der Elektroden zueinander genau definiert sind. Es wurden
eine auf Dickschichtgold-basierende Arbeitselektrode,
eine Ag/AgCl-Referenzelektrode und ein Platinblech
als Gegenelektrode eingesetzt. Die Impedanzspektren
wurden mit einem VMP2 Multichannel Potentiostat
(Princeton Applied Research) über einen Frequenzbereich von 10 mHz bis 100 kHz aufgenommen.
Vor der Immobilisierung der Dickschichtgoldelektroden wurden diese chemisch gereinigt (10-minütige
Behandlung in Piranha-Lösung) und einer cyclovoltammetrischen Untersuchung in 0,5 M Schwefelsäure
unterzogen. Anschließend wurde die auf Gold basierende
Messfläche (i) für 30 min mit dem Anti-ThrombinAptamer (5 -HS-C6 -GGTTGGTGTGGTTGGT-3 ), welches über eine Thiolgruppe an die Goldoberfläche bindet,
immobilisiert, (ii) mit 1 mM Tween 20 für 1 h geblockt
und (iii) mit 1 M NaCl-Lösung behandelt. Es folgte (iv)
die Bindung von Thrombin und (v) die Regeneration
mit 1 M NaCl. Nach jedem Schritt wurde eine Doppelbestimmung in Kaliumphosphatpuffer bei Raumtemperatur
durchgeführt, wobei im niedrigen Frequenzbereich z. B.
bei 10 mHz die deutlichsten Unterschiede zwischen den
verschiedenen Bindungsschritten bzw. Elektrodenzuständen festgestellt wurden.
Aufgrund der mehrmaligen Wiederholung der Analytbindung konnten in verschiedenen Versuchsreihen ab
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Bild 5 Verlauf der Phase bei 10 mHz in Abhängigkeit von der Beschichtung der Sensoroberfläche.
der zweiten Thrombinbeschichtung (Bindungsschritt 5)
nahezu übereinstimmende Ergebnisse sowohl im Betrag
der Impedanz (Bild 4) als auch in der Phase (Bild 5) ermittelt werden.
Der erste Regenerationsschritt nach erfolgter Aptamerimmobilisierung und Blockung ruft bei beiden Parametern eine deutliche Veränderung hervor. Hier ist
mit hoher Wahrscheinlichkeit von einem Konditionierungseffekt auszugehen. Die mehrmalige wiederholte
Thrombinbindung ist anhand der Impedanzmesswerte
gut zu identifizieren, da die Bindungsschritte 5, 7 und
9 nahezu identisch sind. Der Wechsel zwischen Analytbindung und Regeneration (Analytabwesenheit) ist
besonders deutlich im Phasenverlauf zu erkennen.
Des Weiteren wurde die Spezifität des verwendeten
Aptamers untersucht. Dazu wurde ein Referenzaptamer
(5 -AGACGTCGAGT CCTAT-C3 -biotin-SH-3 ), welches
eine ähnliche Struktur und Größe wie das AntiThrombin-Aptamer aufweist, eingesetzt und auf gleicher
Weise auf der Elektrodenoberfläche immobilisiert.
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Bild 8 TEM-Aufnahmen der VLPs (Norovirus Genotyp II.4 Cluster
Grimsby), generiert durch Expression in E. coli. Die VLPs wurden zur
Abbildung negativ mit Uranylacetat gestaint.
Bild 6 Einfluss des untersuchten Aptamers auf den Verlauf des Betrages
der Impedanz bei 10 mHz.
Bild 7 Einfluss des untersuchten Aptamers auf den Verlauf der Phase
bei 10 mHz.
Sowohl anhand des Betrages der Impedanz in Bild 6,
als auch anhand der Phase in Bild 7 sind deutliche
Unterschiede zwischen den verwendeten Aptameren zu
erkennen. Der Kurvenverlauf der Elektrode mit dem
nicht-spezifischen Aptamer zeigt im Vergleich zu dem
Graphen der Elektrode mit dem spezifischen AntiThrombin-Aptamer wie erwartet kaum Veränderungen
aufgrund der Thrombinbindung bzw. der Regeneration.
Daraus lässt sich schlussfolgern, dass das eingesetzte AntiThrombin-Aptamer den Analyten spezifisch bindet.
3 Generierung rekombinanter
Norovirus-Kapsidproteine bzw. VLPs
Das Noroviruskapsid besteht aus 90 Dimeren des
Kaspidproteins VP1. Wird dieses Protein im BaculovirusExpressionssystem rekombinant exprimiert, kommt es
zu einer spontanen Assemblierung von VLPs. Da Noroviren bisher weder in der Zellkultur anzüchtbar sind,
noch aus infizierten Zellen gewonnen werden können,
bilden diese VLPs die Grundlage für die Selektion der
Norovirus-spezifischen Aptamere. Da die Verwendung
des Baculovirus-Expressionssystem teuer und zeitaufwändig ist, wurde nach einer Alternative z. B. einer Expression
in Escherichia coli (E. coli) gesucht.
Nach einer phylogenetischen Analyse von 507 VolleLänge-Sequenzen des Noroviruskapsidproteins aus der
GenBank (NCBI) wurden die sieben häufigsten Genogruppen und Cluster für die Synthese der Kapsidsequenz
ausgewählt. Das jeweilige Kapsidprotein VP1 wurde
durch Fermentation in E. coli exprimiert und anschließend durch His-Tag-Affinitäts- und Gelfiltrationschromatographie gereinigt. Es folgte die Charakterisierung
mittels Gelelektrophorese. Dabei wurden CoomassieFärbung, Western-Blot und mikroskopische Verfahren
genutzt. Die Ausbeute des gereinigten Kapsidproteins betrug zwischen 0,1 und 2,3 mg/L E. coli Kultur. Mittels
Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) konnte die
Assemblierung des VP1 zu VLPs bei allen sieben ausgewählten Genotypen bzw. Clustern nachgewiesen werden.
In Bild 8 sind beispielhaft TEM-Aufnahmen von VLPs,
erkennbar an ihrer ringförmigen Struktur, gezeigt.
Daraus kann geschlussfolgert werden, dass die Produktion von VLPs in E. coli erstmals erfolgreich durchgeführt
werden konnte und somit eine einfache, effektive Alternative zum Baculovirus-Expressionssystem darstellt.
4 Selektion und Herstellung
Norovirus-spezifischer Aptamere
SELEX-Experimente wurden gegen VP1-Kapsidproteine
verschiedener Norovirus-Cluster durchgeführt. Die
SELEX erfolgte bei pH 6, der nahe dem isoelektrischen
Punkt des VP1-Proteins liegt. Damit kann eine elektrostatische Abstoßung von Aptamer und Targetprotein
minimiert werden.
Aptamere (erste Runde 2 nmol, folgende Runden
0,1 nmol, Aptamerdesign 5 GCCTG TTGTG AGCCT
CCTAA C-N49 -CATGC TTATT CTTGT CTCCC 3 )
wurden mit 10 μg Norovirusprotein im Bindepuffer
(100 mM NaCl, 17 mM Na2 HPO4 , 3 mM KH2 PO4 , 5 mM
KCl, 2 mM MgCl2 , 1 mM CaCl, 0,02%Vol Tween 20,
pH 6) für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Kapsidproteine wurden anschließend über ihren His-Tag auf
Nickel-Sepharosebeads (His SpinTrap, GE Healthcare)
immobilisiert und dort achtmal gewaschen (Binde-
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Bild 9 Sensorgramm der Bindung freier Aptamere an immobilisiertes
Norovirus-Kapsidprotein VP1. Die Kontrolle ist eine zufällig gewählte
Sequenz mit dem selben Anteil A, C, G und T wie im selektierten Aptamer.
Die Signale sind referenziert gegen das Bindesignal der Aptamere an die
Polymerase des murinen Norovirus.
puffer mit 0,2% w/v BSA). Die Elution der Proteine
erfolgte bei pH 4, die auf den eluierten Proteinen verbliebenen Aptamere wurden in einer PCR amplifiziert
(25 Runden, Annealingtemperatur 58 ◦ C). Der bei der
PCR verwendete Reverseprimer trug am 5 -Ende ein
Hexaethylenglykol-T20 , so dass die bei der PCR gebildeten Gegenstränge länger als die Aptamerstränge sind. Die
Einzelstranggenerierung erfolgte durch Gelelektrophorese
in einem denaturierenden Polyacrylamidgel (10%ig, 7 M
Harnstoff) und Ausschneiden der entsprechenden Banden.
Eine zusätzliche Negativ-Selektion erfolgte ab der
dritten SELEX-Runde durch eine der Selektion nachgeschaltete Inkubation der eluierten, neutralisierten
Aptamere gegen Nickel-Sepharosebeads mit 10 μg immobilisierter Polymerase des murinen Norovirus.
Nach zwölf SELEX Runden wurden die verbliebenen
Aptamere durch Klonierung vereinzelt (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen) und sequenziert (GATC Biotech
AG).
In den SELEX-Experimenten gegen mehrere Norovirus VP1-Kapsidproteine wurde die Anreicherung
verschiedener Aptamersequenzen beobachtet. Alle diese
angereicherten Sequenzen enthielten das Sequenzmotiv GGAGG(A/-)TGGTCCGGG(G/T)CCC, unabhängig
von dem in der SELEX verwendeten Norovirus-Cluster.
Eine Anbindung selektierter Aptamere an immobilisiertes
VP1-Protein konnte mit Hilfe von Fluoreszenzassays und
ersten SPR-Messungen nachgewiesen werden (Bild 9).
5 Zusammenfassung und Ausblick
Ein SPR-Protokoll zur stabilen und funktionellen Immobilisierung von Aptameren über Streptavidin/Biotin
auf Goldoberflächen wurde entwickelt, optimiert und
erfolgreich etabliert. Da das entwickelte Funktionalisierungsprotokoll die Regenerierung der Sensoroberfläche
erlaubt, konnte eine weitere Effizienzsteigerung erzielt
werden.
Des Weiteren konnte anhand des Modellproteins Thrombin auch ein geeignetes Protokoll für den
Nachweis der Aptamer-Target-Bindung mittels Impedanzspektroskopie erarbeitet werden. Zudem ist die
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Spezifität des verwendeten Aptamers und die mehrmalige
Regenerierbarkeit der Sensoroberfläche durch Verwendung von Natriumchlorid gezeigt worden.
Die Norovirus-Kapsidproteine bzw. VLPs wurden erfolgreich durch Expression in E. coli generiert. Die VLPs
dienten in SELEX-Experimenten als Selektionstarget,
wobei erste Aptamersequenzen, die die Kapsidproteine binden, gewonnen werden konnten. Mit Hilfe von
SPR-Messungen konnte die Interaktion zwischen den
Norovirus-Proteinen und den hergestellten Aptameren
nachgewiesen werden. Weitere Aptamersequenzen sind
zu testen, um die am besten geeignete Sequenz zu finden.
Die anhand des Modellsystems Thrombin erarbeiteten Funktionalisierungs- und Messprotokolle sollen in
weiterführenden Arbeiten auf das Norovirussystem übertragen und optimiert werden. Zudem soll die Eignung
des Protokolls in Realmedien untersucht werden.
Des Weiteren sollen die labelfreien Prinzipien SPR und
EIS kombiniert werden, so dass ein simultaner Analytnachweis ermöglicht wird. Aufgrund der Verwendung
zweier voneinander unabhängiger Messverfahren wird
eine deutliche Erhöhung der Nachweissicherheit erwartet.
Danksagung
Das Projekt wurde finanziert aus Mitteln der Europäischen Union und des Freistaates Sachsen (SAB)
unter den Projektnummern 14218/2465, 14250/2465 und
14251/2465. Die Autoren danken für die finanzielle Unterstützung.
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Nr. 2, S. 126–131.
Adresse: Technische Universität Dresden, Fakultät Maschinenwesen, Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik, Lehrstuhl Bioverfahrenstechnik, 01062 Dresden, E-Mail: [email protected]
Dipl.-Ing. Philipp Quenzel ist wissenschaftlicher Mitarbeiter am Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik der TU Dresden.
Hauptarbeitsgebiete sind Aptamerselektion und Phage-Display.
Adresse: Tonbergstraße 19, 01157 Dresden,
E-Mail: [email protected]
Privatdozentin Dr. rer. nat. habil. Elke Boschke ist Leiterin der Arbeitsgruppe Biomonitoring am Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik der TU Dresden. Neben der Biosensorik (z. B. SPR,
QCM) liegt ihr Augenmerk auf der Detektion und Beschreibung von
Biofilmen.
Adresse: Technische Universität Dresden, Institut für Lebensmittel- und
Bioverfahrenstechnik, Lehrstuhl Bioverfahrenstechnik, 01062 Dresden,
E-Mail: [email protected]
Dipl.-Biol. Ada Lange ist Doktorandin am Institut für Medizinische
Mikrobiologie und Hygiene der TU Dresden. Schwerpunkte Ihrer Arbeiten sind die Herstellung und Charakterisierung von VLP’s.
Adresse: E-Mail: [email protected]
Katrin Jäger arbeitet in der Forschungsabteilung der Riboxx GmbH.
Hauptarbeitsgebiete sind die Proteinchemie und Molekularbiologie.
Manuskripteingang: 16. Januar 2013, zur Veröffentlichung angenommen: 28. Februar 2013
Dipl.-Nat. Sandra Päßler ist wissenschaftliche Mitarbeiterin am KurtSchwabe-Institut für Mess- und Sensortechnik e. V. Meinsberg. Hauptarbeitsgebiete sind die Entwicklung bzw. der Einsatz chemischer Sensorik in biologischen Medien sowie miniaturisierte Sensorik und die
Biosensorik.
Adresse: Kurt-Schwabe-Institut für Mess- und Sensortechnik e. V.
Meinsberg, Kurt-Schwabe-Straße 4, 04736 Waldheim,
E-Mail: [email protected]
Prof. Dr. rer. nat. Winfried Vonau ist stellvertretender Direktor des
Kurt-Schwabe-Instituts für Mess- und Sensortechnik e. V. Meinsberg.
Hauptarbeitsgebiete sind die Entwicklung chemischer Sensoren, die
Sensormaterialentwicklung und die analytische Chemie.
Adresse: Kurt-Schwabe-Institut für Mess- und Sensortechnik e. V.
Meinsberg, Kurt-Schwabe-Straße 4, 04736 Waldheim,
E-Mail: [email protected]
Prof. Dr. rer. nat. et Ing. habil. Michael Mertig hat den Lehrstuhl für
Physikalische Chemie, Mess- und Sensortechnik an der Technischen
Universität Dresden inne und ist wissenschaftlicher Direktor des KurtSchwabe-Instituts für Mess- und Sensortechnik e. V. Meinsberg.
Adresse: Kurt-Schwabe-Institut für Mess- und Sensortechnik e. V.
Meinsberg, Kurt-Schwabe-Straße 4, 04736 Waldheim,
E-Mail: [email protected]
Dipl.-Ing. Anja Henseleit ist Doktorandin am Institut für Lebensmittelund Bioverfahrenstechnik der TU Dresden. Schwerpunkt Ihrer Arbeiten
ist die Surface Plasmon Resonance.
Adresse: Riboxx GmbH, Pharmapark Radebeul, Meissner Strasse 191,
01445 Radebeul, E-Mail: [email protected]
Privatdozent Dr. med. habil. Jacques Rohayem ist Geschäftsführer der
Riboxx GmbH. Ein Schwerpunkt der Arbeiten bei Riboxx stellt die Entwicklung und Herstellung neuartiger RNA-Moleküle dar.
Adresse: Riboxx GmbH, Pharmapark Radebeul, Meissner Strasse 191,
01445 Radebeul, E-Mail: [email protected]
Dipl.-Biol. Andrea Pohl arbeitet als wissenschaftliche Mitarbeiterin am
Fraunhofer Institut für Zerstörungsfreie Prüfverfahren in Dresden. Die
Schwerpunkte ihrer Arbeit liegen auf der chemischen Modifikation von
Nanodiamanten und deren Kopplung mit Biomolekülen, Infrarotspektroskopie und Oberflächenplasmonenresonanz.
Adresse: Fraunhofer-Institut für Zerstörungsfreie Prüfverfahren IZFP,
Institutsteil Dresden, Maria-Reiche-Straße 2, 01109 Dresden,
E-Mail: [email protected]
Dr. rer. nat. Jörg Opitz promovierte 2002 an der TU Dresden auf dem
Gebiet der Theoretischen Physik. Seit 2007 arbeitet er am Fraunhofer
Institut für Zerstörungsfreie Prüfverfahren in Dresden, wo er seit 2012
die Hauptabteilung Zustandsdiagnose leitet.
Adresse: Fraunhofer-Institut für Zerstörungsfreie Prüfverfahren IZFP,
Institutsteil Dresden, Maria-Reiche-Straße 2, 01109 Dresden,
E-Mail: [email protected]
Dr. rer. nat. Nora Haufe arbeitet seit 2012 in einer Nachwuchsforschergruppe an der TU Dresden. Sie beschäftigt sich mit Transmissionselektronenmikroskopie, biogener Wasserstofferzeugung und der Gasanalytik.
Adresse: Physikalische Chemie, Mess- und Sensortechnik, Technische
Universität Dresden, 01062 Dresden, E-Mail: [email protected]
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