das erste und einzige Krebsmittel, welches nur die Krebszellen tötet
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EINLEITUNG: DAS ERSTE MEDIKAMENT, WELCHES NUR KREBSZELLEN TÖTET, ABER KEINE GESUNDEN Allgemeines über die Krebsbehandlung Operationen, Chemo‐, und Strahlentherapie sind die drei wichtigsten Arten der Krebsbehandlung. Jede hat aber ihre Beschränkungen und ist mit beträchtlichen Nebenwirkungen verbunden. Chirurgische Eingriffe sind die älteste von diesen Methoden und, wenn möglich, immer noch häufig die Methode der ersten Wahl. Leider sind heilende operative Eingriffe nur in wenigen Fällen möglich, der Resttumor bleibt meistens unerkannt, was zu Tumorrückfällen und Metastasierung führt. Dann kommt eine zusätzliche Behandlung infrage. Sowohl Strahlen‐ wie auch Chemotherapie haben keine selektive Wirkung gegen Krebszellen. Außerdem, sind sie kanzerogen (bewirken Tumorentstehung) und mutagen (verändern Erbgut). Bei einer Strahlentherapie wird ein Tumor durch radioaktive Strahlung in seinem Wachstum behindert. Die Bestrahlung ist mit verschiedenen Früh‐ sowie Spätreaktionen (Nebenwirkungen) verbunden. Die Geschichte der Chemotherapie hat begonnen, als Ärzte während des Ersten Weltkriegs feststellten, dass der Kampfstoff Senfgas wachstumshemmende Wirkung bei Tumoren hat. Später wurde die Substanz Mechlorethamin entwickelt und um 1942 als erstes Zytostatikum in der Medizin eingesetzt. Zytostatika stören die Stoffwechselvorgänge, die im Zusammenhang mit Zellwachstum oder Zellteilung stehen. Daher schädigen sie vor allem schnell wachsende Zellen wie Epithelzellen (unter anderem Haarwurzelzellen, Schleimhautepithel von Mund und Magen‐Darm‐Trakt) und Knochenmark (Taxol). Da Tumorzellen eine erhöhte Zellteilungsrate und eine eingeschränkte Reparaturkapazität haben, sind sie etwas empfindlicher gegenüber Zytostatika als gesunde Zellen. Dieser Unterschied ermöglicht erst die Therapie mit diesen häufig hochtoxischen Substanzen. Da die Giftwirkung auch gesunde Zellen beeinträchtigt, kommt es zu vielerlei negativen Begleiterscheinungen. Insbesondere die Schleimhaut des Magen‐Darmtraktes und das blutbildende Knochenmark sind betroffen. Fast alle Zytostatika verursachen in unterschiedlichem Ausmaß Haarausfall, Übelkeit und Erbrechen und eine Verminderung der weißen und/oder roten Blutkörperchen im Blut (Knochenmarksdepression). Darüber hinaus haben die einzelnen Wirkstoffgruppen noch weitere, unterschiedliche Nebenwirkungen. Um die Nebenwirkungen der Chemotherapie zu reduzieren, werden heutzutage komplexe Begleitbehandlungen eingesetzt, wie z. B. Kortisonpräparate, Medikamente, die Übelkeit und Brechreiz unterdrücken u.a. Trotzdem muss noch immer ein Teil der Therapien dosisreduziert, unterbrochen oder gar abgebrochen werden. Es ist klar, dass das Problem der immensen Nebenwirkungen der Chemotherapie auf gewöhnlichen Wegen nicht zu lösen ist. Dies könnte nur mit solchen Präparaten erreicht werden, die nur die Krebszellen töten, aber die gesunden Zellen nicht schädigen, mit anderen Worten, selektiv gegen Krebszellen wirken. 4 Man hat alle möglichen Varianten ausprobiert, um den wichtigsten Unterschied zwischen normalen und bösartigen Zellen zu finden, aber weder Nukleinsäuren noch Proteine haben zufriedenstellende Antworten geliefert. Man weiß, dass sich infolge genetischer Veränderungen (Mutationen) eine Krebszelle nach ihrem eigenen Rhythmus, eigentlich unkontrolliert, teilt, ohne dass eine Notwendigkeit von Seiten des Körpers besteht. Die Krebszelle löst sich von ihrem Ursprungsort und lässt sich an anderen Stellen nieder, wo sie als Tochtertumor ihr neues Leben beginnt – so entstehen die Metastasen. Mit der neuen Generation der Krebsmittel, den sogenannten „targeted agents“ – zielgerichteten Präparaten – wurde der Versuch unternommen, die Probleme der Krebstherapie mit anderen Methoden zu lösen. Man versucht, mit den speziell für eine oder andere Krebsart entwickelten Präparaten gezielt jene Enzyme oder Rezeptoren anzugreifen, welche bei dieser Krebsart stärker ausgeprägt sind. Wie unbefriedigend die heutigen Ergebnisse sind, zeigen zum Beispiel die Publikationen in der Spiegel‐Artikel und profil vom 15. Mai 2010 (http://www.spiegel.de/spiegel/print/d‐70501026.html). Täglich sterben weltweit etwa 20.000 Menschen an den Folgen einer Krebserkrankung. Somit ist klar, dass es immer schon der größte Wunsch aller Krebsforscher war, ein Präparat zu finden, welches nur die Krebszellen abtötet und die gesunden unbeschädigt lässt. Mit anderen Worten, ein Präparat mit der selektiven Wirkung nur gegen die Krebszellen und nicht gegen die gesunden. Alle Bemühungen der Wissenschafter auf der ganzen Welt waren erfolglos, was zur Verbreitung von Pessimismus in der Forschungsgemeinde geführt hat – man war fest überzeugt, dass der Unterschied zwischen einer gesunden und einer Krebszelle zu gering und darum das Problem unlösbar sei. Man kann Krebszellen töten, ohne die gesunden zu schädigen Beim 13. Internationalen Kongress für Chemotherapie in Wien im August‐September 1983 wurde ein neues Mittel – Thiophosphorsäure‐Derivat der Alkaloide aus dem Schöllkraut (NSC631570, Handelsname Ukrain) präsentiert (1). Die Entwicklung dieses Präparates war der erste sehr wesentliche Schritt auf dem Weg zur Entwicklung eines Präparates, welches nur die Krebszellen tötete, aber keine gesunden. Bei den Untersuchungen in vitro wurde ein unterschiedlicher Sauerstoffverbrauch bei normalen Leberzellen und aszitischen Zellen des Ehrlichschen Tumors festgestellt: nach anfänglichem Anstieg fiel der Sauerstoffverbrauch bei den Tumorzellen auf Null. Bei normalen Leberzellen normalisierte sich der Sauerstoffverbrauch und sie blieben unbeschädigt (38). Diese Studie lieferte erste Hinweise darauf, dass NSC631570 im Gegensatz zu seinen Ausgangsstoffen Thiotepa und Schöllkrautalkaloiden tatsächlich nur toxisch gegen Krebszellen und nicht gegen die normalen Zellen ist. Der zweite Hinweis wurde bei der klinischen Anwendung erhalten, wo NSC631570 keine nennenswerten Nebenwirkungen verursachte (21). Noch mehr ‐ dieses Präparat verbesserte den Allgemeinzustand der Patienten und ihren immunologischen Status, welcher infolge der vorhergehenden Chemotherapie beschädigt wurde (22). Den dritten Hinweis lieferte die Studie von der University of Miami (USA). Basierend auf den Daten aus dieser Studie wurde der therapeutische Index von NSC631570 als 1250 errechnet (26). Das ist ungewöhnlich hoch für ein Krebsmittel. Therapeutischer Index (TI) ist das 5 Verhältnis der toxischen Dosis zur therapeutischen und spiegelt die Sicherheit eines Arzneimittels wider. Therapeutischer Index von den konventionellen zytostatischen Präparaten, zu welchen auch Thiotepa gehört, liegt im Bereich 1,4‐1,8 und darum kann ihre Überdosierung fatale Folgen haben. Wegen des sehr hohen TI‐Werts von 1250 besteht bei der NSC631570 Anwendung keine Gefahr der Überdosierung. Es war eine bahnbrechende Entdeckung. Das Präparat hat gezeigt, dass das oben beschriebene Problem der Entwicklung eines selektiven Krebsmittels lösbar ist und hat unsere Vorstellungen von gesunden und Krebszellen verändert. Die Präsentation beim Kongress hat sowohl Skepsis als auch ein großes Interesse hervorgerufen. Viele namhafte Forschungsinstitutionen, wie National Cancer Institute (USA), EORTC, University of Miami (USA), Rochester University (USA), Universität Tübingen (Deutschland) haben begonnen, das Präparat zu testen, um seine einzigartigen Eigenschaften und sein therapeutisches Potenzial besser zu untersuchen. Im Unterschied zu konventionellen zytostatischen Präparaten, von welchen jedes im Testmodell der NCI die Wachstumshemmung nur einiger weniger Krebszelllinien bewirkte, wie zum Beispiel Thiotepa, welches toxisch gegen MLI‐019 (Bronchialkarzinom) und UOK‐57LN (Nierenkarzinom) war (190), hat NSC631570 alle 60 getesteten Krebszelllinien, die 8 wichtigen menschlichen Tumore repräsentieren, abgetötet (190), einschließlich die Zelllinien, welche gegenüber dem damals stärksten bekannten Zytostatikum Cis‐Platin resistent waren. Das hat noch mehr Interesse in der wissenschaftlichen Fachwelt geweckt. Führende Forscher untersuchten NSC631570, jede Gruppe mit der für sie zugänglichen Methode. Dank dieser Vielfalt an Experimenten konnten die feinen Mechanismen der Wirkung von NSC631570 auf verschiedenen Ebenen entschlüsselt werden: zuerst auf zellulärer Ebene mit Sauerstoffverbrauch (Wirkung auf Mitochondrien; 38), dann auf der Ebene der Chromosome (Wirkung auf DNS und RNS; 58, 63), Zellorganellen und Molekülen (43, 62). Diese Untersuchungen haben äußerst interessante Ergebnisse gebracht und nicht nur die selektive Wirkung von NSC631570 mehrmals bestätigt, sondern auch alle Zweifel daran, dass es nur die Krebszellen tötet, aber den gesunden auf keine Weise schadet, gründlich beseitigt. Das bedeutet, NSC631570 kann zwischen gesunden und bösartigen Zellen unterscheiden – diese Eigenschaft bleibt den anderen bis jetzt entwickelten Krebsmitteln verwehrt. Das wissenschaftliche Interesse an NSC631570 wächst und die Forschung wird fortgesetzt (261‐ 266). Die Forscher der Wiener Universität für Bodenkultur haben die hemmende Wirkung von NSC631570 auf die Vermehrung von bösartigen und normalen Zellen verglichen. Um eine 50%‐Wachstumshemmung zu erreichen, musste bei normalen endothelialen Zellen eine zehnfache Konzentration von NSC 631570 im Vergleich zu einer menschlichen Osteosarkomzelllinie verwendet werden. Laserabtastungsmikroskopie zeigte ein hohes Aufnahmevermögen von NSC631570 in bösartigen Zellen, während die Aufnahme in normalen Zellen unter denselben experimentellen Bedingungen wesentlich niedriger war (36). In der Studie über die Wirkung von NSC631570 auf die Erythroleukemiezellen K‐562, durchgeführt in der St. John’s Memorial University (Newfoundland, Kanada) unter der Leitung von Prof. Andrejs Liepins, wurde herausgefunden, dass dieses Präparat einen bimodalen Krebszellentod bewirkt. Bei niedrigeren Konzentrationen von NSC631570 sterben 6 die malignen Zellen infolge Apoptose ab, bei höheren Konzentrationen wird die Mikroröhrchenbildung verhindert und entsteht Polyploidie (62). 1998 bewies die Gruppe um Anne Panzer die selektive Wirkung von NSC631570 auf molekularer Ebene. Die Wissenschafter der University of Pretoria, Südafrika haben in den Versuchen an menschlichen Zervixkarzinomzellen HeLa, Plattenepithelkarzinom WHCO5 und normalen Pferdelungenzelllinie erforscht, dass NSC631570 für Krebszellen selektiv toxisch ist, indem es einen Metaphaseblock verursacht, der durch eine anomale Chromosomenverteilung charakterisiert wird und auf die Bildung von Mikrokernen und in Apoptose hinausläuft. Die normalen Zellen wurden dabei nicht beeinflusst (139). Im Jahre 2000, bei Beurteilung der Zellproliferation nach der BrdU‐Aufnahme in den Zelllinien AsPC1, BxPC3, MiaPaCa2, Jurkat und THP‐1 und der Zellzyklusphasen mit Hilfe von Giemsa‐Färbung, haben die Ulmer Forscher festgestellt, dass 10 µg/ml NSC631570 nach 24 Stunden eine deutliche Ansammlung der Krebszellen in der Phase G2/M bewirkt. Interessanterweise zeigte sich kein Unterschied in der Apoptoserate von den mit NSC631570 behandelten normalen peripheren Mononuklearen verglichen mit den unbehandelten. Die blastogene Antwort von mitogen‐stimulierten Lymphozyten war sogar signifikant erhöht. Die Autoren zeigten, dass NSC631570 die Pankreaskrebszellen in Prophase blockiert, indem es die Tubulinpolymerisation hemmt (181). Diese Arbeit bestätigte, dass NSC631570 keinen Einfluss auf normale Zellen ausübt. Ebenso 2000 haben die Forscher der Rochester University (USA) an den Epidermoidkarzinomzelllinien ME180 und A431 sowie Prostatakrebszelllinie LNCaP die Wirkung von NSC 631570 auf die Konzentrationen von Cyclinen und Cyclin‐abhängigen Kinasen untersucht. Es wurden die Änderungen in den Konzentrationen von mitotischen Cyclinen A und B1 sowie CDK1 und CDK2 gefunden. Die Forscher haben auch eine erhöhte Expression des CDK‐ Inhibitors p27 in beiden Krebszelllinien beobachtet, was zur Anreicherung der Krebszellen, nicht aber von normalen Zellen in der G2/M‐Phase geführt hat (147, 149). In ihrer weiteren Arbeit unter dem Titel „NSC631570TM, a semisynthetic Chelidonium majus alkaloid derivative, acts by inhibition of tubulin polymerization in normal and malignant cell lines“ (Cancer Letters 160 (2000) 149‐157) haben die Forscher aus Südafrika entdeckt, dass NSC631570 die Polymerisation von Tubulin hemmt (185). Als normale Zelllinie haben die Autoren menschliche Fibroblasten verwendet (Link). Normale menschliche Fibroblasten wurden später auch von den Wissenschaftern der Eberhard‐ Karls‐Universität Tübingen (Deutschland) sowie des Instituto Nacional de Cancerologia (Mexiko City, Mexiko) in ihren Versuchen verwendet (184, 255). Beide Forschergruppen konnten keine toxische Wirkung von NSC631570 auf diese normalen Zelllinien feststellen. Außerdem bemerkten die Autoren um A. Panzer in ihrer Artikel selbst: „Both NSC631570TM and chelidonine had weak activity in this system…“ (185). 2002 untersuchten die Wissenschaftler der Eberhard‐Karls‐Universität Tübingen (Deutschland) die Wirkung von NSC 631570 alleine oder kombiniert mit der Bestrahlung auf das Zellüberleben, die Modifizierung des Zellzyklus und die Induktion der Apoptose in den exponentiell wachsenden menschlichen Tumorzelllinien MDA‐MB‐231 (Brustkrebs), PA‐TU‐8902 (Bauchspeicheldrüsenkarzinom), CCL‐221 (Dickdarmkrebs), U‐138MG (Glioblastom) und in den menschlichen Fibroblasten der Haut HSF1, HSF2 und der Lunge CCD32‐LU. Ohne Bestrahlung bewirkte NSC 631570 zeit‐ und dosisabhängige zytotoxische Wirkung, welche an Krebszellen mehr ausgeprägt war als an normalen Zellen. Kombiniert mit Bestrahlung, bewirkte NSC 631570 7 eine erhöhte Zytotoxizität gegenüber Dickdarmkrebs‐ und Glioblastomzelllinien, nicht aber gegenüber den Brustkrebs‐ und Pankreaskarzinomzelllinien. Mittels Durchflusszytometrie wurde gezeigt, dass NSC 631570 die toxische Wirkung von Bestrahlung auf diese menschlichen Krebszelllinien modulierte, indem es ihre Anreicherung in der Phase G2/M des Zellzyklus hervorrief. Seine protektive Wirkung auf die normalen menschlichen Fibroblasten spricht für einen sinnvollen Einsatz in der kombinierten Radiochemotherapie (184). 100 90 % cells in G2/M phase 80 70 60 NeoK 50 A431 40 ME180 30 20 10 0 0 3,5 7 17 35 Drug concentration, µM Fig. 1. Die Wirkung von verschiedenen Konzentrationen von NSC631570 auf die Population der G2/M‐ Zellen. Die Zellen wurden 24 Stunden mit NSC631570 in angegebenen Konzentrationen (0 – Kontrolle; 3,5; 7; 17; 35 µMol) inkubiert und anschließend auf DNA‐Inhalt mit Durchflusszytometrie analysiert. Die Daten repräsentieren Prozentsatz von NeoK (normale Keratinozyten), A431 und ME180 (epidermoide Karzinome) Zellen in der Phase G2/M. Aus Roublevskaia et al, 2000 (147). An einem Jurkat‐Lymphom‐Model wurde an der Universitätsklinik Tübingen (Deutschland) im Jahre 2005 die Fähigkeit von NSC631570 erforscht, die Apoptose zu induzieren. NSC631570 erwies sich als ein starker Apoptose‐Induktor. Vertiefte Untersuchungen haben gezeigt, dass es Depolarisierung von mitochondrialen Membranen und als Folge die Aktivierung von Caspasen hervorgerufen hat (246). 2006 stellten Forscher am Instituto Nacional de Cancerologia (Mexiko City, Mexiko) fest, dass NSC631570 in einer Reihe von Krebszelllinien (menschliche Zervixkarzinome HeLa, HeKB, HeKS32, HeBcll3, HeNFR und HelKK, Dickdarmkrebs SW480, Nierenkrebs HEK293, Osteosarkom MG 63) die Apoptose auslöst, indem es den inneren Zelltodweg aktiviert. Interessanterweise war die nichttransformierte Fibroblastenzelllinie hTERT diesem Medikament gegenüber unempfindlich (255). 8 1 0,9 0,8 Zellüberleben 0,7 0,6 R 0,5 R+U 0,4 0,3 0,2 0,1 0 CCL-221 U-138MG HSF1 HSF2 Zelllinien Fig. 2. Überleben der bestrahlten Zellen mit und ohne Behandlung mit NSC631570. R – Bestrahlung, 2 Gy; R + U – Bestrahlung, 2 Gy und Inkubation mit NSC631570. Zelllinien: CCL‐221 ‐ kolorektales Karzinom, U‐138MG ‐ Glioblastom, HSF1 und HSF2 ‐ normale Fibroblasten. Nach Cordes et al, 2002 (184). 100 90 80 % Viability 70 60 HeLa 50 hTERT 40 30 20 10 0 50 25 10 5 Cellular dencity, cells x 1000/cm2 Fig. 3. Die Wirkung von NSC631570 auf eine Krebszelllinie (HeLa) sowie auf eine Zelllinie normaler Fibroblasten (hTERT) ausgedrückt als Prozentsatz der lebenden Zellen nach 48 Stunden Inkubation mit NSC631570 40 µg/ml. Aus Mendoza et al, 2006 (255). Die zytotoxische Wirkung von NSC 631570 wurde an der Universität Pisa (Italien) an zwei primären Bauchspeicheldrüsenkrebszelllinien (PPTCC), Fibroblasten aus duktalen Pankreaskarzinomgewebeproben (F‐PDAC) und einer immortalisierten duktalepithelialen Pankreaszelllinie (HPNE) untersucht. Die Zytotoxizität wurde mittels CellTiter 96‐Satz erfasst. Modulierung der NSC 631570‐Aufnahme im Nährboden wurde mithilfe von Fluoreszenz von NSC 631570 mit AlphaDigiDoc‐Software im UV‐Licht bestimmt. Die zytotoxische Wirkung von 9 NSC 631570 in Pankreaskarzinomzelllinien war wesentlich höher als in den Fibroblasten und Epithelzellen (20% gegen 80% lebende Zellen). Außerdem hat der Fluoreszenz‐Test ergeben, dass PPTCC‐Zellen mehr Präparat aufgenommen haben als F‐PDAC‐ und HPNE‐Zellen. Diese Ergebnisse bestätigen auch die selektive Wirkung von NSC 631570 in den Pankreaskarzinomzellen, was auf verschiedene Transportsysteme oder auf eine höhere Metabolismusrate des Präparates in den PDAC‐Zellen hinweist (265). Wie man sieht, sind viele Aspekte der Wirkung von NSC631570 auf die verschiedenen Elemente der Krebs‐ sowie der gesunden Zellen bis jetzt erforscht worden. Trotzdem besteht die Möglichkeit, dass diese Effekte nur Folgeerscheinungen eines noch unbekannten Prozesses sind, welches NSC631570 in der Krebszelle, aber nicht in der gesunden Zelle hervorruft. Da NSC631570 in den Experimenten fast alle Krebszellen tötete, im Unterschied zu konventionellen Zytostatika, welche nur gegen eine kleine Gruppe von Krebszellen toxisch waren, gibt es den Hinweis darauf, dass bei der Entartung einer normalen Zelle in eine Krebszelle ein Element entsteht, auf welches die Wirkung von NSC631570 gerichtet wird. Wenn es gelingt, dieses Phänomen zu entschlüsseln, könnte es uns sehr wichtige Indizien für den wesentlichsten Unterschied zwischen normalen und Krebszellen liefern, auf die echte Ursache der Krebsentstehung hinweisen und ganz neue Perspektive für die Entwicklung von neuen Krebsmitteln öffnen, nicht nur für die Behandlung, sondern auch für den Einsatz in der Krebsvorbeugung. Diese Untersuchungen mit der selektiven Wirkung von NSC631570 haben überzeugend demonstriert, dass es durchaus möglich ist, die Krebszellen zu töten ohne dabei die gesunden zu schädigen. Der Wichtigkeit der Entdeckung völlig bewusst, habe ich mein Präparat nach dem Land genannt, wo die ersten Schritte seiner Entwicklung gemacht wurden ‐ Ukrain. Ähnliche Beispiele sind aus der Geschichte der Wissenschaft bekannt – 1879 wurde von Lars Fredrik Nilson ein neues Element entdeckt, welches er in Anlehnung an Skandinavien „Scandium“ nannte, 1886 nannte Clemens Winkler das von ihm entdeckte neue Element „Germanium“, und 1898 entdecktes Polonium wurde zu Ehren von Marie Curies Heimat Polen „Polonium“ genannt. Affinität von NSC 631570 zu den Krebszellen Bekanntlich haben alle lebenden Zellen ein Membranpotential von etwa ‐60 bis ‐100 mV. Das negative Zeichen des Membranpotentials deutet darauf, dass die innere Oberfläche der Zellmembran relativ mehr negativ geladen ist als die äußere Oberfläche. Noch im Jahre 1938 hat Dr. Paul Gerhardt Seeger postuliert, dass der Zerfall oder die Desaktivierung der Atmungsketteenzyme in den Mitochondrien in die Entstehung von Krebs involviert ist. 1948 haben die Wissenschafter um G.R. Mider gezeigt, dass Krebszellen negativer geladen sind als normale Zellen. Bei der Herstellung von NSC631570 bekommen Alkaloide des Schöllkrauts eine positive Ladung. Das erklärt eine hohe Affinität von NSC631570 zu den Krebszellen. 10 Bereits in einer frühen Arbeit der Wissenschafter der Wiener Universität für Bodenkultur wurde herausgefunden, dass die menschlichen Osteosarkomzellen ein viel höheres Aufnahmevermögen von NSC631570 im Vergleich zu den normalen endothelialen Zellen aufweisen (36). Diese selektive Anreicherung von NSC631570 in den Krebszellen wird auch dank seiner einzigartigen Fähigkeit zur Autofluoreszenz im UV‐Licht bestätigt (5). Bei der Untersuchung der Wirkung von NSC631570 auf das elektrokinetische Potential (EKP) von malignen und gutartigen Zellen wurde festgestellt, dass EKP der Ehrlichschen Karzinomzellen nach der Inkubation mit NSC631570 sank viel stärker als das EKP von normalen Thymuszellen (221). In den Experimenten mit primären Bauchspeicheldrüsenkrebszelllinien wurde die Modulierung der NSC 631570‐Aufnahme im Nährboden mithilfe von Fluoreszenz von NSC 631570 mit im UV‐Licht bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Karzinomzellen viel mehr Präparat aufgenommen haben, als die Fibroblasten und normale Epithelzellen (265). Die selektive Anreicherung von NSC 631570 in den Krebszellen erklärt sein günstiges Sicherheitsprofil und den hohen therapeutischen Index von 1250. Immunmodulierende Eigenschaften Ungewöhnlich für ein Antikrebsmittel besitzt NSC631570 auch deutliche immunologische Eigenschaften (24, 44). Als erster hat Prof. A. Liepins (St. John’s Memorial University, St. John’s, Kanada) auf diese interessante Tatsache hingewiesen. In seiner Arbeit an den Mäusen C57BL/6 hat er gezeigt, dass NSC631570 ein wirksamer Modifikator der biologischen Reaktionen ist. Nach der Inkubation der Milzlymphozyten von alloimmunisierten Mäusen mit NSC631570 stieg ihre lytische Aktivität auf das 48fache (Fig. 4). Dieser Anstieg war am stärksten am 18. Tag nach der Alloimmunisation und ließ dann etwas nach (Fig. 5). Ebenso stieg die lytische Aktivität der mit Interleukin‐2 behandelten Milzzellen und der Lymphozyten aus dem peritonealen Exsudat (17). 80 Zytolytische Aktivität, % 70 60 50 SL 40 PL 30 20 10 0 0 0,59 1,18 2,36 4,72 9,45 18,9 37,8 µM Ukrain Fig. 4. Die Wirkung von NSC631570 auf die zytolytische Aktivität der Lymphozyten vom Milz (SL) und aus dem peritonealen Exsudat (PL). Aus Liepins et al, 1992 (17). 11 Die zytostatische Wirkung von NSC 631570 auf die Krebszelllinien M‐HeLa und Hep‐2/0‐6‐5 war stärker ausgeprägt im Vergleich zum synthetischen Präparat Oliphen (61). Im Experiment hat Ukrain das Wachstum von vier Ewing‐Sarkomzelllinien auf zeit‐ und dosisabhängige Weise gehemmt. In diesen Versuchen war seine Wirkung stärker ausgeprägt als jene von Thiotepa (243, diskutiert in 244). In einer Arbeit an Ehrlichschen Karzinomzellen und Lympholeukemie P‐388 haben die Autoren gezeigt, dass die Empfindlichkeit der malignen Zellen zu Ukrain stark von der Zellzyklusphase abhängt, wobei das erste Maximum der Empfindlichkeit auf das Ende der Phase G1 fällt und das zweite – auf die Phase G2 (148). In einer Studie wurde der Einfluss von Glukose, Bernsteinsäure, pH‐Wert und erhöhter Temperatur auf die Wirksamkeit von Ukrain gegen Krebszellen in vitro untersucht. Glukose verminderte die zytotoxische Wirkung von Ukrain, Bernsteinsäure verstärkte sie. Am stärksten war die Wirkung bei pH 7,3‐8,0, und die Temperatur von 41,5 C hatte keinen Einfluss auf die Wirkung von Ukrain (117). SELEKTIVE WIRKUNG VON NSC 631570 In Vergleichsstudien wurde Ukrain an 18 bösartigen und 12 normalen Zelllinien unter identischen Bedingungen getestet (36, 38, 63, 143, 147, 149, 181, 184, 190, 245, 255). Diese Experimente haben alle Zweifel hinsichtlich der selektiven Wirkung von UKRAIN aufgeräumt. Die zahlreichen Arbeiten haben bewiesen, dass Ukrain das erste und einzige Krebsmedikament ist, das toxisch für Krebszellen, jedoch nicht für gesunde Zellen ist. Das erklärt auch seine gute Verträglichkeit bei klinischer Anwendung. Erste Hinweise auf die selektive Wirkung von UKRAIN auf Krebszellen lieferte eine frühe Studie aus dem Jahre 1976 von der Bundesstaatlichen Anstalt für Experimentell‐ Pharmakologische und Balneologische Untersuchungen, welche einen unterschiedlichen Sauerstoffverbrauch durch normale Leberzellen und aszitische Zellen des Ehrlichschen Tumors nach der Inkubation mit UKRAIN feststellte (38). Etwa zur selben Zeit haben die Forscher der Wiener Universität für Bodenkultur die hemmende Wirkung von UKRAIN auf die Vermehrung von bösartigen und normalen Zellen verglichen. Um eine 50%‐Wachstumshemmung zu erreichen, musste bei normalen endothelialen Zellen eine zehnfache Konzentration von NSC 631570 im Vergleich zu einer menschlichen Osteosarkomzelllinie verwendet werden. Laserabtastungsmikroskopie zeigte ein hohes Aufnahmevermögen von UKRAIN in bösartigen Zellen, während die Aufnahme in normalen Zellen unter denselben experimentellen Bedingungen wesentlich niedriger war (36). 36 Der unterschiedliche Einfluss von Ukrain auf den Sauerstoffverbrauch in gesunden Zellen und Krebszellen Einfluss des Ukrain auf den Sauerstoffverbrauch Einfluss des Ukrain auf den Sauerstoffverbrauch in malignen (bösartigen) Zellen (Ehrlichsche in normalen Zellen (Sediment aus dem Mäuseaszites Tumor‐Suspension.) Homogenat der Leber eines Meerschweinchens.) Die Aufnahme von Ukrain in Melanom‐Zellen, verglichen mit normalen Zellen (in vitro) Ref: Hohenwarter O. et al. “Selective inhibition of in vitro cell growth by the anti‐tumour drug Ukrain” Drugs under Experimental Research (1992) S.1‐4 (36) 37 Diese selektive Wirkung von Ukrain auf die Krebszellen wurde in zahlreichen Studien an renommierten Universitäten und Forschungseinrichtungen bestätigt. In der Studie der European Organisation for Research and Treatment of Cancer (EORTC) wurden die Zellen der humanen Tumorxenograften (HTX) den Nacktmäusen transplantiert. Weiter wurden diese Tumorzellen mit verschiedenen Konzentrationen von NSC 631570 inkubiert. Folgende HTX wurden verwendet: Dickdarmkrebs CXF 1103/11, Magenkrebs GXF 217/17, Bronchialkarzinom LXFL 529/14, Brustkrebs MAXF 401/13, Melanom MEXF 276/10 und Eierstockkrebs OVXF 899/9. NSC 631570 war aktiv gegen OVXF 899/9 bei 10 µg/ml und in allen getesteten Kolonien bei 100 µg/ml mit der T/C‐Verhältnis („test to control“) 1/135 bei OVXF, 8/109 bei CXF, 10/98 bei GXF, 15/187 bei LXFL, 34/133 bei MAXF und 10/122 bei MEXF (64, 189). Beim 89. jährlichen Treffen der Amerikanischen Gesellschaft für Krebsforschung (American Association for Cancer Research) in New Orleans, USA im Jahre 1998 präsentierten die Wissenschafter der University of Pretoria, Südafrika die Ergebnisse ihrer Arbeit über selektive Wirkung von UKRAIN an verschiedenen Krebszelllinien. Die Autoren stellten fest, „dass UKRAIN für Krebszellen selektiv toxisch ist, indem es einen Metaphasenblock verursacht, der durch eine anomale Chromosomenverteilung charakterisiert wird und auf die Bildung von Mikrokernen und in Apoptose hinausläuft“ (139). Diese Forschungsgruppe hat 2000 entdeckt, dass UKRAIN die Polymerisation von Tubulin hemmt (140). Wissenschafter der Eberhard‐Karls‐Universität (Tübingen, Deutschland) untersuchten den Effekt von UKRAIN auf das Zellüberleben, die Modifizierung des Zellzyklus und die Induktion der Apoptose ohne und in der Kombination mit Bestrahlung. UKRAIN modulierte die Schädlichkeit der Bestrahlung auf menschliche Tumorzelllinien und schützte normale Zellen vor den Strahlen. Die Kombination von UKRAIN mit ionisierenden Strahlen verstärkte die Toxizität gegenüber den Krebszelllinien CCL‐221 und U‐138MG, aber nicht gegenüber den MDA‐MB‐231 und PA‐TU‐8902. Eine strahlenschützende Wirkung wurde gegenüber den normalen menschlichen Haut‐ und Lungenfibroblasten gefunden (184). Die zytotoxische Wirkung von NSC 631570 wurde in zwei primären Bauchspeicheldrüsen‐ krebszelllinien (PPTCC), Fibroblasten aus duktalen Pankreaskarzinomgewebeproben (F‐ PDAC) und einer immortalisierten duktalepithelialen Pankreaszelllinie (HPNE) untersucht. Die Zytotoxizität wurde mittels CellTiter 96‐Satz erfasst. Die Methode basiert auf dem Zellmetabolism der Tetrasoliumsubstanz XTT, welche von lebenden Zellen reduziert wird um ein lösliches Formazanprodukt beim Vorhanden der Elektronen‐ankoppelnden Substanz Phenazinmethosulfat zu bekommen. Modulierung der NSC 631570‐Aufnahme im Nährboden wurde mithile von Fluoreszenz von NSC 631570 mit AlphaDigiDoc‐Software im UV‐Licht bestimmt. Die zytotoxische Wirkung von NSC 631570 in PPTCC war wesentlich höher als in F‐ PDAC‐ und HPNE‐Zellen (20% gegen 80% lebende Zellen). Außerdem hat der Fluoreszenz‐ Test ergeben, dass PPTCC‐Zellen mehr Präparat aufgenommen haben als F‐PDAC‐ und HPNE‐ Zellen. Diese Ergebnisse zeigen selektive Wirkung von NSC 631570 in den PPTCC‐Zellen, was auf verschiedene Transportsysteme oder auf eine höhere Metabolismrate des Präparates in den PDAC‐Zellen, und befürworten weitere Studien über mögliche Rolle von NSC 631570 in der Behandlung von Pankreaskarzinomen (265). 38 Induktion der Apoptose in den Krebszellen In der Studie über die Wirkung von Ukrain auf die Erythroleukemiezellen K‐562 wurde gefunden, dass dieses Präparat einen bimodalen Krebszellentod bewirkt. Bei niedrigeren Konzentrationen von Ukrain sterben die malignen Zellen infolge Apoptose ab, bei höheren Konzentrationen wird die Mikroröhrchenbildung verhindert und Polyploidie entsteht (56, 62). Die Forscher der Rochester University, USA haben gezeigt, dass UKRAIN die Anhäufung von Prostatakrebszellen sowie Epidermoidkarzinomzellen in der G2M‐Phase auslöste, nicht aber von normalen Zellen (149, 150). Die Wissenschafter der University of Pretoria, Südafrika haben in den Versuchen an menschlichen Zervixkarzinomzellen HeLa, Plattenepithelkarzinom WHCO5, normaler Nierenzelllinie Graham 293 und transformierter Nierenzelllinie Vero von afrikanischem grünen Affen erforscht, dass UKRAIN für Krebszellen selektiv toxisch ist, indem es einen Metaphaseblock verursacht, der durch eine anomale Chromosomenverteilung charakterisiert wird und auf die Bildung von Mikrokernen und in Apoptose hinausläuft (139). Wissenschafter der Eberhard‐Karls‐Universität (Tübingen, Deutschland) untersuchten den Effekt von UKRAIN auf das Zellüberleben, die Modifizierung des Zellzyklus und die Induktion der Apoptose ohne und in der Kombination mit Bestrahlung. Sie haben herausgefunden, dass die Kombination von UKRAIN mit ionisierenden Strahlen die Toxizität gegenüber den Krebszelllinien CCL‐221 und U‐138MG verstärkte. Gleichzeitig schützte Ukrain die normalen menschlichen Haut‐ und Lungenfibroblasten vor den ionisierenden Strahlen (184). Die tödliche Aktion des Ukrain (NSC 631570) gegen Krebszellen ‐ Einsetzen der Apoptose Apoptose 39 Bei Beurteilung der Zellproliferation nach der BrdU‐Aufnahme in den Zelllinien AsPC1, BxPC3, MiaPaCa2, Jurkat und THP‐1 und der Zellzyklusphasen – mit Hilfe von Giemsa‐ Färbung, haben die Autoren festgestellt, dass 10 µg/ml UKRAIN nach 24 Stunden eine deutliche Ansammlung der Krebszellen in der Phase G2M bewirkt. Die Apoptoserate in den peripheren Mononuklearen war bei den ähnlich inkubierten und Kontrollzellen gleich. Außerdem zeigten mitogen‐stimulierte Lymphozyten eine erhöhte blastogene Reaktion (181). Die Induktion der Apoptose durch UKRAIN wurde auch in den in vitro Versuchen an den Eierstockzellen der chinesischen Hamster bestätigt. In diesem Experiment waren die Wirkungen von NSC 631570 und Etoposid synergistisch (167). Inhibierung der Polymerisation von Tubulin durch NSC 631570 In den Versuchen mit Tubulin aus dem Rinderhirn haben die Forscher der Pretoria University entdeckt, dass NSC 631570 die Polymerisation des Proteins Tubulin hemmt (146). Der Wirkungsmechanismus von UKRAIN bei Bauchspeicheldrüsenkrebs wurde an den Zelllinien AsPC1, BxPC3, Capan1, MiaPaCa2 und Panc1 erforscht. Dabei zeigte sich, dass UKRAIN einen dosisabhängigen Zellzyklusstopp in der Phase G2M bewirkte. Serienversuche zeigten, dass die Wirkung von 10 µg/ml UKRAIN auf die Zellzyklusphasen nach 8 Stunden Inkubation irreversibel war. Experimente mit Tubulinpolymerisation haben gezeigt, dass UKRAIN die Tubulinmonomere stabilisiert und infolgedessen die Bildung von Mikrotubulinröhrchen hemmt (143). Aktivierung der mitochondrialen Kaspasen Caspasen sind die wichtigsten Enzyme der Apoptose, des programmierten Zelltods und spielen somit eine wichtige Rolle in den Mechanismen der Krebsbehandlung. Die Fähigkeit von Ukrain die Apoptose zu induzieren wurde an einem Jurkat‐Lymphoma‐ Model erforscht. Ukrain erwies sich als ein starker Apoptose‐Induktor. Vertiefte Untersuchungen haben gezeigt, dass es Depolarisierung von mitochondrialen Membranen und als folge die Aktivierung von Caspasen hervorgerufen hat (246). Caspasen bestehen aus zwei Klassen, Initiatoren und Effektoren. Die Initiator‐Caspasen 8 und 10 führen die Todfaktor‐abhängige, oder extrinsische Apoptose herbei, dahingegen vermittelt die Effektor‐Caspase 9 die intrinsische oder mitochondriale Apoptose. Forscher am Institut Nacional de Cancerologia, Mexiko City, Mexiko stellten fest, dass UKRAIN in einer Reihe von Krebszelllinien (menschliche Zervixkarzinome HeLa, HeKB, HeKS32, HeBcll3, HeNFR und HelKK, Dickdarmkrebs SW480, Nierenkrebs HEK293, Osteosarkom MG 63) die Apoptose auslöst, indem es den inneren Zelltodweg aktiviert. Interessanterweise war die nichttransformierte Fibroblastenzelllinie hTERT diesem Medikament gegenüber unempfindlich (255). 40 Um die in vitro Zytotoxizität von NSC 631570 zu bestimmen, haben die Forscher von der Emory University (Atlanta, Georgia, USA) und Kennesaw State University (Kennesaw, Georgia, USA) murine (4T07 und TUBO) und humane (SKBR‐3) Brustkrebszelllinien verwendet. 4T07 und TUBO sind stark karzinogene nichtmetastasierende Tumorzelllinien abgeleitet von spontanen Karzinomen in BALB/cfC3H beziehungsweise BALB‐neuT Mäusen. Die TUBO und SKBR‐3 Zelllinien exprimieren konstitutiv das Onkogen HER‐2/neu, welches bei 30% der Brustkrebspatientinnen überexprimiert ist. Tumorzellen wurden nach dem Erreichen von 90‐95%‐tiger Konfluenz trypsinisiert und mit NSC 631570 in verschiedenen Konzentrationen inkubiert. Nach der 24, 48 und 72 h Inkubation mit NSC 631570 wurden die Zahl und das Überleben von Zellen mit der Trypanblaumethode bestimmt. Für die Beurteilung des Proliferationsvermögens der Zellen wurde die klonogene Methode angewendet. Die Zellen wurden in entsprechenden Verdünnungen ausgesät, um Kolonien innerhalb 2‐3 Wochen zu bilden. Die Kolonien wurden fixiert und mit Kristallviolett gefärbt, anschließend mikroskopisch gezählt. Schließlich wurde intrazelluläre Färbung auf die aktive Caspase‐3 durchgeführt. Die Autoren haben eine Dosis‐ und Zeit‐abhängige Hemmung des Tumorzellwachstums beobachtet. Bei so niedriger Konzentration wie 50 µg/ml bewirkte NSC 631570 eine signifikante Verminderung des Zellüberlebens im Vergleich zu den unbehandelten Zellen. Die klonogene Methode zeigte die Unfähigkeit der behandelten Zellen die Kolonien zu bilden und ihr Proliferationsvermögen wiederzuerlangen, wenngleich die unbehandelten Zellen mehrere Kolonien bildeten. Verglichen mit den unbehandelten Zellen, haben sie auch eine mehrfache Erhöhung der Caspase‐3‐Aktivität in den mit NSC 631570 behandelten Zellen beobachtet, was die Apoptose als den zytotoxischen Wirkungsmechanismus bestätigte. Diese Daten deuten darauf hin, dass Ukrain wirksam in der Behandlung vom Brustkrebs sein könnte, bedingt durch seine kurzfristige und auch langfristige hemmende Wirkung auf das Überleben und die Proliferation der Tumorzellen.1 Die Wirkung auf Cycline und Cyclin‐abhängige Kinasen Cycline sind Proteine, die eine Schlüsselrolle in der Steuerung des Zellzyklus spielen. Sie sind in der Lage, mit Cyclin‐abhängigen Kinasen (CDK) Komplexe zu bilden sowie deren Kinasefunktion zu aktivieren. Da die Cyclinkonzentration im Gegensatz zur Konzentration der CDK zellzyklusabhängig reguliert ist, fungieren diese Proteine ihrerseits auch als Regulatoren der Cyclin‐abhängigen Kinasen. Cycline können durch die Aktivierung verschiedener Cyclin‐ abhängiger Kinasen und einer damit verbundenen Phosphorylierung verschiedener Substrate eine Rolle in verschiedenen Teilen des Zellzyklus spielen. Steigende Konzentrationen von Cyclin A, z.B., leiten die Zelle in die G2‐Phase, während Cyclin B für den Start der Mitose essenziell ist. Die Forscher der Rochester University haben an den Epidermoidkarzinomzelllinien ME180 und A431 sowie Prostatakrebszelllinie LNCaP die Wirkung von NSC 631570 auf die Konzentrationen von Cyclinen und Cyclin‐abhängigen Kinasen untersucht. Es wurden die Änderungen in den Konzentrationen von mitotischen Cyclinen A und B1 sowie CDK1 und CDK2 gefunden. Die Forscher haben auch eine erhöhte Expression des CDK‐Inhibitors p27 in beiden Krebszelllinien beobachtet, was zur Anreicherung der Krebszellen, nicht aber von normalen Zellen in der G2/M‐ Phase führen kann (147, 149). 1 E.N. Bozeman, H. Mohammadi, R. Shashidharamurthy, D. Daniels, P. Selvaraj. Analysis of the short-term and long-term in vitro cytotoxic effects of the anticancer drug Ukrain in breast cancer models. American Association for Cancer Research 102nd Annual Meeting, April 2-6, 2011, Orlando, Florida, abs. 5433. 41 Die Wirkung von NSC 631570 auf die Expression von hENT1 und dCK Die Wechselwirkungen zwischen NSC 631570 und den molekularen Determinanten hENT1 und dCK, welche am Metabolismus von Gemcitabin beteiligt sind, wurden in vitro an pankreatischen Adenokarzinomzelllinien (PDAZ) untersucht. Zwei ATCC Zelllinien PL45 und MiaPaCa‐2 sowie zwei primäre Zelllinien PPTCC78 und PPTCC109 von Patienten mit PDAZ nach den Resektionen wurden verwendet. Die Zellen waren mit NSC 631570 im Konzentrationsbereich von IC50 für 48 Stunden behandelt. Alle Vervielfältigungen wurden nach der Normalisierung der Genexpression gegen das Glycerinaldehyd‐3‐phosphat‐Dehydrogenase (GAPDH) Haushaltskontrollgen ausgeführt und die quantitative Bestimmung wurde durchgeführt. NSC 631570 in der Dosierung IC50 hat die Expression von hENT1‐mRNA in allen PDAZ Zelllinien positiv moduliert (p<0,001). Die Analyse zeigte einen durchschnittlichen 2,8fachen Anstieg im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen (p=0,001). In den Zelllinien PL45 und MiaPaCa‐2 hat NSC 631570 auch die mRNA‐ Expression vom dCK‐Gen positiv beeinflusst (264). Von den früheren klinischen Daten ausgehend, erscheint die Kombination von NSC 631570 und Gemcitabin als ein viel versprechendes Protokoll. Die Ergebnisse dieser experimentellen Studie liefern die experimentelle Grundlage für weitere klinische Studien mit dieser Kombination in den PDAZ‐Patienten (Funel et al, ‘Molecular mechanisms underlying the synergistic interaction of the novel anticancer drug Ukrain with gemcitabine in preclinical models of pancreatic cancer’, 44th Annual Pancreas Club Meeting, New Orleans, USA 2010). Die Wirkung von NSC 631570 auf DNS‐ und Proteinsynthese Die Wirkung von NSC 631570 auf DNS‐ und Proteinsynthese in Krebszellen wurde in vitro erforscht. Es wurde gezeigt, dass NSC 631570 (1‐100 µg/ml) eine Dosis abhängige Inhibierung der DNA‐, RNA‐ und Proteinsynthese in Krebszellen bewirkt, was an einer Reihe von Zelllinien gezeigt wurde, einschließlich Mauslymphom, HeLa, Yoshida, Mausmyelom, menschliche WiDr‐Tumor, EB, EsB, YAC‐1 und P815. Bei gleichen Testbedingungen waren DNA‐, RNA‐ und Proteinsynthese in normalen Zellen (menschliche Mandelzellen und Leberzellen des Meerschweinchens) viel weniger gehemmt (58, 63). Unter vielen möglichen Mechanismen der Wirkung von UKRAIN wurde auch sein Einfluss auf die Endonukleasen der Rattenleber und auf die Topoisomerasen – Enzymen, die in dem DNA‐Stoffwechsel eine wichtige Rolle spielen, untersucht. UKRAIN hat in diesen Versuchen sowohl die metallabhängigen Endonukleasen, als auch die Topoisomerase I inhibiert (166). Die Wirkung auf Proteine, welche am Umbau der extrazellulären Matrix beteiligt sind Eine italienische Forschungsgruppe von der Universität Mailand, verwendete RT‐PCR, Western‐Blot‐Methode und SDS‐Zymography, um die Wirkung von UKRAIN auf die Expression von Genen und Proteinen zu untersuchen, welche am Umbau der extrazellulären Matrix beteiligt sind (dieser Mechanismus ist mit der Tumor‐Invasion der menschlichen Glioblastomzellen verbunden). Es gab eine bedeutende dosisabhängige Abnahme in der Glioblastomzellproliferation und eine Tendenz zur Downregulation von SPARC („secreted 42 protein acidic cysteine‐rich“). Diese Studie lieferte die theoretischen Gründe für die Anwendung von UKRAIN bei solchen Tumoren. Die Forscher fassten zusammen: UKRAIN kann eine nützliche Therapie bei Gehirntumoren sein(245). Dies wurde bei klinischer Anwendung bestätigt (Siehe „Gehirntumore“). In ihrer weiteren Arbeit mit Glioblastomzelllinien haben die italienischen Forscher festgestellt, dass Ukrain die Expression vom sauren Gliafaserprotein (GFAP) erhöht. Die Expression des Connexin 43 war von Ukrain nicht beeinflusst (250). Die Wirkung von NSC 631570 auf die Modulierung einiger Schlüsselmarker der Tumorprogression in pankreatischen Karzinomen wurde an drei Zelllinien HPAF‐II, PL45 und HPAC untersucht. Die Zelllinien wurden mit NSC 631570 (5, 10 and 20 µM) für 48 Stunden behandelt oder unbehandelt gelassen. Die mRNS von Secreted protein acidic and rich in cysteine (SPARC) wurden mittels Echtzeit‐PCR bestimmt. Die Aktivitäten der Matrixmetalloproteinasen (MMP)‐2 und ‐9 wurden mit SDS‐Zymographie bemessen. Die Konzentrationen vom SPARC‐Protein in Zelllysaten und Überständen wurden mittels Western blot bestimmt. Zellzyklus wurde mit Durchflusszytometrie und Invasion mit Matrigel‐Invasionstest untersucht. NSC 631570 rufte Senkung von MMP‐2 und MMP‐9 hervor, was darauf hinweist, dass dieses Präparat die Invasion von Pankreaskrebszellen hemmen kann, was auch in Matrigel‐Invasionstest bestätigt wurde. Die Inhibierung von SPARC in den Überständen spricht für die Inhibierung des extrazellulären Remodelling des Matrix in der Tumormikroumgebung. Gleichzeitig weist die Erhöhung von SPARC‐mRNS und des Zellproteins darauf hin, dass NSC 631570 die Zellproliferation beeinflussen kann indem es einen G2/M‐Block in den Zellen bewirkt (266). An den Zelllinien Caki‐1, Caki‐2, and ACHN wurde untersucht, ob NSC 631570 (Ukrain) den malignen Phänotyp des klarzelligen Nierenkarzinoms (kzNK) moduliert. Die Marker des epithelial‐mesenchimalen Übergangs E‐Kadherin, β‐Katenin und Vimentin wurden mit Immunofluoreszenz bestimmt, Aktin, Tubulin, Matrixmetalloproteinase‐2 (MMP‐2) und MMP‐9 ‐ mittels SDS‐Zymographie, intrazellulärer und sekretierter SPARC ‐ mit Western‐ Blot‐Methode sowie Zellzyklus mittels Durchflusszytometrie. NSC 631570 induziert keine Immunreaktion von E‐Kadherin und β‐Katenin an den Zell‐Zell‐Grenze, obwohl es die kortikale Expression von Aktin in Caki‐2 und ACHN bestimmte. Ebenso beeinflusste NSC 631570 die Organisation von Vimentin nicht. Die Aktivität von MMP‐2 und MMP‐9 war signifikant vermindert nach 48 Stunden Inkubation mit 20 µmol/l NSC 631570. Zu diesem Zeitpunkt verringerte NSC 631570 signifikant die Migration und Invasion sowie verminderte SPARC‐Konzentration in den Zellsupernatanten in den Caki‐2‐Zellen bei allen Dosierungen und in den Caki‐1 und ACHN‐Zellen bei 20 µmol/l. Gleichzeitig war SPARC erhöht in allen kzNK‐Zellen, was darauf hinweist, dass NSC 631570 durch die Zellzyklushemmung auch die Zellproliferation beeinflussen kann, was mit der Zellzyklusanalyse unterstützt wird, da SPARC auch als Zellzyklushemmer wirkt. Diese Ergebnisse zeigen, dass NSC 631570 den Phenotyp von kzNK‐Zellen umschalten kann und die zwei wichtigen Aspekte der Nierenkarzinomprogression angreift: die tumorale Invasion und den Umbau der Mikroumgebung sowie die Zellproliferation (267). 43 Die Wirkung auf die Hitzeschockproteine In den Experimenten mit den humanen Lymphomzellen wurde die Wirkung von Ukrain auf die Zelllinien U‐937 und U‐937/hsp70, welche sich in der Expression der Hitzeschockproteine unterscheiden. Es stellte sich heraus, dass die Linie U‐937/hsp70 gegen die Wirkung von Ukrain mehr resistent war, was die Autoren auf die schützende Wirkung vom Hsp70 zurückführen (200). Die Beeinflussung des elektrokinetischen Potentials Es wurde untersucht, wie Ukrain das elektrokinetische Potential (EKP) von malignen und gutartigen Zellen beeinflusst. Das EKP der Ehrlichschen Karzinomzellen sank nach der Inkubation mit Ukrain. Die Verminderung des EKP von normalen Thymozyten war weniger ausgeprägt (221). DIE UNTERSUCHUNGEN IN VIVO Die antitumorale Wirkung der intravenösen Anwendung von NSC 631570 (4 g/Tag) wurde auch in den in vivo Studien an BALB/c Mäusen mit dem implantierten schnell wachsenden Mammakarzinom D1 DMBA‐3 demonstriert. In diesen Tests hat sich die intravenöse Verabreichung als die effektivste Art der Anwendung erwiesen. Die Autoren dieser Studien haben auch die Rolle der Makrophagen in der zytotoxischen Wirkung von NSC 631570 erforscht. Sie zeigten, dass dieses Präparat die zytotoxische Wirkung der Makrophagen wiederherstellen konnte (26, 43). Diese Wirkungsweise wurde in einer späteren Studie an den CBA‐Mäusen bestätigt. Wieder wurde hier seitens der Autoren die Rolle der Makrophagen in der Tumorbekämpfung unter der Wirkung von Ukrain hervorgehoben (120). In einer experimentellen Studie an Mäusen hat Ukrain das Wachstum und die Metastasierung des malignen Melanoms B‐16 gehemmt (107). In Experimenten mit Mäusen C57BL6 hat NSC 631570 das Wachstum der primären transplantierten Lewis‐Karzinome und ihre Metastasierung im Vergleich zur Kontrollgruppe gehemmt (219). Diese Wirkung von NSC 631570 wurde auch in einer anderen Studie bestätigt. Auch hier war die intravenöse Verabreichung am wirksamsten (254). Eine weitere Studie wurde mit 18 CBA Mäusen durchgeführt, welchen eine Mischung von 0,1 mg NSC 631570 und 10000 Krebs‐2 Karzinomzellen intramuskulär injiziert wurde. In der Kontrollgruppe wurden nur die Tumorzellen injiziert. Nach 11 Tagen wurde eine deutliche Tumorwachstumshemmung in der mit NSC 631570 behandelten Gruppe festgestellt. Ähnliche Effekte wurden auch an Mäusen mit implantierten aszitischen Hepatomzellen erreicht (118). In einer weiteren Studie haben die Forscher entdeckt, dass NSC 631570 signifikant die Konzentration von Prokathepsin B in der aszitischen Flüssigkeit erhöht, wobei die Konzentration 44 THE SELECTIVE EFFECT OF NSC 631570 AGAINST CANCER CELLS W. Nowicky, A. Nowicky, B. Nowicky, Ukrainian Anticancer Institute, Vienna, Austria First indications on the selective effect of NSC 631570 on the cancer cells were provided in an early study when different oxygen consumption by normal liver cells and Ehrlich’s tumor ascitic cells after the incubation with NSC 631570 was revealed. In the tests on the Jurkat lymphoma model, NSC 631570 has been proven to be a strong apoptosis inductor. Profound research showed NSC 631570 brought about the depolarisation of mitochondrial membranes and consequently the activation of caspases. Ukrain induced apoptosis in a panel of cancer cell lines (cervical cancer HeLa, HeKB, HeKS32, HeBcl3, HeNFR and HeIKK, human colon cancer SW480, human renal carcinoma HEK293, human osteosarcoma MG-63) by activating the caspases of the intrinsic cell death pathway. Interestingly, nontransformed fibroblasts (hTERT) cell line was insensitive to the drug (255). In the tests on human cervix carcinoma cells HeLa, squamous carcinoma cells WHCO5, normal kidney cell line Graham 293, and transformed kidney cell line Vero from African green monkey, NSC 631570 inhibited the tubulin polymerisation and caused a metaphase block in cancer cells which is characterised by abnormal chromosomal distribution, and results in the formation of micronuclei and in apoptosis. The effects of NSC 631570 on cell survival, alteration of the cell cycle and induction of apoptosis without and in combination with ionising radiation (IR) were investigated on the exponentially growing human tumor cells MDA-MB231 (breast), PA-TU-8902 (pancreas), CCL-221 (colon), U-138MG (glioblastoma), and human skin and lung fibroblasts HSF1, HSF2 and CCD32-LU. Without IR, NSC 631570 exerted a time- and dose-dependant cytotoxic effect, more pronounced against the cancer cells. The combination of NSC 631570 plus IR enhanced toxicity in CCL-221 and U-138MG cells with their accumulation in the G2/M phase, but not in MDA-MB-231 and PATU-8902 cells. A radio protective effect was found in normal human fibroblasts. NSC 631570 caused the accumulation of prostate cancer cells as well as epidermoid carcinoma cells in the G2/M phase, however, not of normal cells. The cytotoxic effects of NSC 631570 were evaluated in primary pancreatic cancer cell lines (PPTCC), fibroblasts derived from pancreatic ductal adenocarcinoma specimens (F-PDAC), and an immortalized epithelial ductal pancreatic cell line HPNE. Cytotoxic effects of NSC 631570 in PPTCCs were significantly higher than those observed in F-PDAC and HPNE cells. Furthermore, it was revealed that PPTCCs cells consumed more drug than FPDAC and HPNE cells. This selective effect of Ukrain in PPTCCs may be related to a different transport system or higher metabolism of the drug in PDAC. Altogether, in comparative studies NSC 631570 has been tested on 18 cancer and 12 benign cell lines at identical conditions so far. In all these experiments the selective effect of NSC 631570 against cancer cells was confirmed. This selective effect of NSC 631570 against cancer cells explains its good tolerability in clinical use. Panc1 - 48 hours Fig. 1 Greater celandine (Chelidonium majus L.) Panc1 - 48 hours Fig. 2. NSC-631570 leads to accumulation of pancreatic cancer cells in prophase of mitose Year Autor Mechanism 1983 Brüller Oxygen consumption Measurement of oxygen consumption Ehrlich mouse ascites tumor cells Guinea pig liver homogenate 1992 Hohenwarter Uptake Cell growth inhibition, fluorescence microscopy Human osteosarcoma and melanoma normal endothelial cells 1998 Panzer Metaphase block, anomal chromosome distribution, apoptosis Spectrophotometrical analysis of DNA content, flow cytometry, cell morphology, cell cycle phases Human cervix carcinoma cell line HeLa, squamous cell carcinoma WHCO5 normal equine lung cell line 2000 Ramadani Apoptosis, cell cycle phases Cell cycle analysis, proliferation assay, Western blotting, Giemsa staining with following mitose sub-phase analysis Fluorescence immunostaining In-vitro polymerisation of monomeric tubulin Pancreas carzinoma cell White blood cells lines AsPC1, BxPC3, MiaPaCa2, THP-1, and Jurkat 2000 Roublevskaya Cyclin A, B1, CDK1, CDK2 Flow cytometric cell cycle analysis Gel electrophoretic analysis of DNA Western blotting Human epidermoid cancer cell lines A431, ME180 Primary human keratinocytes 2000 Panzer Inhibition of the tubulin polymerisation Cell growth studies Indirect immunofluorescence Flow cytometric cell cycle analysis Tubulin polymerisation assay Cell morphology HeLa (human cervical carcinoma), WHCO5 (human squamous cancer); Transformed cell lines Graham 293 (transformed human kidney), Vero (transformed African green monkey kidney) Hs27 (human skin fibroblast), normal monkey kidney cells 2002 Cordes Cell cycle phases, TP53, p21 Combined with irradiation Cell growth Flow cytometry Protein extraction with spectral photometry (TP53) Western blotting Flow cytometric analysis of apoptosis by annexin-V staining Human cancer cells:MDA-MB-231 (breast), PA-TU-8902 (pancreas), CCL-221 (colorectal), U-138MG (glioblastoma) Human fibroblasts HSF1, HSF2 (skin), CCD32-LU (lung) 2006 Mendoza Apoptosis (intrinsic pathway), mitochondria, caspases Cellular viability, nuclear staining Western blotting Gene reporter analysis Human fibroblasts HeLa cells in various hTERT modifications: HeKB, HeKS32, HeBcl3, HeNFR and HeIKK, colon cancer SW480, Human renal carcinoma HEK293, human osteosarcoma MG-63 2010 Funel Uptake Cytotoxity detection Uptake by fluorescence Primary pancreatic cancer cell lines References. Roublevskaia IN, Polevoda BV, Ludlow JW, Haake AR. Induced G2/M arrest and apoptosis in human epidermoid carcinoma cell lines by semisynthetic drug Ukrain. Anticancer Res. 2000 Sep-Oct;20(5A):3163-7. Cordes N, Plasswilm L, Bamber M, Rodemann HP. Ukrain®, an alkaloid thiophosphoric acid derivative of Chelidonium majus L. protects human fibroblasts but not human tumour cells in vitro against ionizing radiation. Int J Radiat Biol 2002, vol. 78, No. 1, 17-27. 10 µg/ml Ukrain control Gagliano N, Moscheni C, Torri C, Magnani I, Bertelli A, Nowickz W, Gioia M. Effect of Ukrain on matrix metalloproteinase-2 and Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine (SPARC) expression in human glioblastoma cells. Anti-Cancer Drugs 2006, 17:189-194. Method Used cell lines cancer non-cancer Fibroblasts derived from PDAC, immortalized epithelial ductal pancreatic cell line HNPE
