Neuroprotektion retinaler Ganglienzellen : Gabapentin

Aus der Universitäts-Augenklinik der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
Neuroprotektion retinaler Ganglienzellen: Gabapentin-Laktam und die Neuropeptide NAP
und Activity-dependent neurotrophic factor-9 in Kulturen isolierter Ganglienzellen und
Netzhautexplantate der Ratte
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i.Br.
Vorgelegt 2005
von Amelie Pielen
geboren in Bonn
2
Dekan
Prof. Dr. J. Zentner
1. Gutachter
Prof. Dr. W. A. Lagrèze
2. Gutachter
Prof. Dr. H-D. Hofmann
Jahr der Promotion
2005
3
INHALT
I. Einleitung
5
1.1
Die Netzhaut der Ratte
7
1.2
Mechanismen der Neurodegeneration – Apoptose
8
1.3
Neuroprotektion und Neuroregeneration
10
1.4
Gabapentin-Laktam
11
1.5
Glibenclamid und 5-Hydroxydecanoat, Antagonisten am KATP Kanal
13
1.6
Ischämische Präkonditionierung – Agonisten am KATP Kanal
14
1.7
Neuropeptide NAP und Activity-dependent neurotrophic factor-9
15
1.8
Neurotrophe Faktoren CNTF und BDNF
17
1.9
Fragestellung
18
II. Material und Methoden
20
2.1
Versuchstiere
20
2.2
Kultur isolierter retinaler Ganglienzellen der neugeborenen Ratte
20
2.3
Kultur von Netzhautexplantaten der Ratte
23
2.4
Statistik
25
III. Ergebnisse
26
3.1
Neuroprotektiver Effekt von Gabapentin-Laktam
26
3.2
Neuroprotektiver Effekt der Peptide NAP und ADNF-9
30
3.3
Neuroregeneration
-
Neuritenwachstum
Explantaten
IV. Diskussion
4.1
nach
Axotomie
in
retinalen
34
37
Gabapentin-Laktam
37
4.1.1
Neuroprotektion
37
4.1.2
Wirkmechanismus
38
4.1.3
KATP-Kanal-Agonisten in vitro
39
4.1.4 Vergleich GBP-L und Gabapentin
39
4.1.5 Ausblick
40
4
4.2
Neuropeptide NAP und Activity-dependent neurotrophic factor-9
40
4.2.1
Neuroprotektion
40
4.2.2
Neuropeptide in vitro
41
4.2.3
Neuropeptide in vivo
43
4.2.4
Wirkmechanismus
44
Aufnahme
44
Aktivierung von Transkriptionsfaktoren
45
Mechanismen beim Schutz vor Neurotoxinen
46
Präkonditionierung
48
4.2.5
Neuroregeneration
48
4.2.6
Mitogene Aktivität – Wachstum und Genexpression
50
4.2.7
Applikation und Verteilung im Organismus
52
4.2.8
Ausblick
53
V. Zusammenfassung
55
VI. Literatur
56
VII. Dank
67
5
I. EINLEITUNG
Das Gemeinsame zahlreicher Erkrankungen des Sehnerven ist der Untergang der retinalen
Ganglienzellen (RGZ). Die Zellkörper dieser Nervenzellen liegen in der Retina und ihre
Axone bilden den Teil der Sehbahn, der von der Netzhaut zum Corpus geniculatum laterale
verläuft. Sie verbinden Auge und Gehirn. Bei den meisten Optikusneuropathien kommt es
initial zu einem Schaden der Axone durch Ischämie, Entzündung, Durchtrennung oder
Deformation. Schäden am optischen Nerven führen zum Zelltod der RGZ durch Apoptose.
Beispiele für degenerative Erkrankungen des Sehnerven sind traumatische, entzündliche und
hereditäre Optikusneuropathien, anteriore ischämische Optikusneuropathie (AION) und das
Glaukom (Quigley HA 1995; Kerrigan LA 1997; Katai N 1999). In Europa ist das Glaukom
die dritthäufigste Ursache für Blindheit, in den USA steht es an zweiter Stelle (Sommer A
1991; Trautner C 2003). In Deutschland ist das Glaukom die vierthäufigste Ursache für
Erblindung nach Makuladegeneration, Katarakt und Optikusatrophie (Trautner C 2003). Die
Glaukomtherapie beruht auf der Absenkung des intraokularen Drucks, da er der
Hauptrisikofaktor für das Glaukom ist.
In einer groß angelegten Studie, dem Early Manifest Glaucoma Trial (EMGT), wurde gezeigt,
dass bei primärem Offenwinkelglaukom die drucksenkende Therapie mit dem ß-Blocker
Betaxolol in Kombination mit einer Argon Laser Trabekuloplastik das Risiko für eine
Progression der Glaukomschäden halbiert im Vergleich zu der Patientengruppe, die keine
Therapie erhielt. Voraussagewerte für eine Glaukomprogression waren die Höhe des
intraokularen Drucks (je höher der Druck, desto höher das Risiko), das Vorliegen einer
Pseudoexfoliation, eine bilaterale Manifestation und ein höheres Alter. Die Höhe der
Drucksenkung zu Beginn der Therapie bestimmte wesentlich das Endergebnis.
Letztlich kommt es beim Glaukom zur Degeneration der Nervenfasern, so dass das Glaukom
als Optikusneuropathie betrachtet werden kann (Vorwerk CK 2002). Bislang gibt es keine
Therapie, die direkten Einfluss auf das Überleben der Ganglienzellen nimmt und so den
Erhalt des Sehvermögens fördern würde. Es liegen zahlreiche Untersuchungen vor, in denen
eine Reihe von Substanzen in vitro und in vivo getestet wurde, mit dem Ziel, den Untergang
der RGZ zu verhindern. Das Spektrum umfasst Antagonisten von exzitatorischen
Aminosäuren (Vorwerk CK 1996; Lagrèze WA 2001), Agonisten am ATP-sensitiven Kalium
Kanal (KATP-Kanal) (Lagrèze WA 2001), α2-Adrenorezeptorantagonisten (Lafuente MP
2002), Kaspase-Inhibitoren (Chen TA 2001), freie Sauerstoffradikalfänger (Klocker N 1998)
und neurotrophe Faktoren wie BDNF (Watanabe M 2002).
6
Vielversprechend verliefen Untersuchungen zur Neuroprotektion mit Gabapentin-Laktam
(GBP-L) und den Neuropeptiden NAP und Activity-Dependent-Neurotrophic-Factor-9
(ADNF-9). GBP-L ist ein Derivat des Antikonvulsivum Gabapentin. Es förderte das
Überleben von RGZ nach akuter Netzhautischämie (Lagrèze WA 2001) und verbesserte die
Leistung von Mäusen in einem Modell für chronische Neurodgeneration, dem M. Huntington
(Feuerstein TJ 2003). Die Neuropeptide NAP und Activity-Dependent-Neurotrophic-Factor-9
(ADNF-9) leiten sich von Activity-dependent Neurotrophic Factor (ADNF), respektive
Activity-dependent Neuroprotective Protein (ADNP) ab. NAP und ADNF-9 schützten in vitro
zentralnervöse Zellen gegen oxidativen Stress und förderten in vivo die motorischen
Fähigkeiten
sowie
die
Gedächtnisleistung
im
Tierexperiment
in
femtomolaren
Konzentrationen (Glazner GW 1999a; Brenneman DE 2000; Gozes I 2002).
Sowohl GBP-L als auch die Neuropeptide gelten als Kandidaten auf der Suche nach
Therapien chronischer neurodegenerativer Erkrankungen. In der vorliegenden Arbeit
untersuchte ich in Kulturen isolierter retinaler Ganglienzellen bei neugeborenen Ratten den
Effekt von GBP-L, NAP und ADNF-9 auf das Überleben der Neurone nach Durchtrennung
der Nervenfortsätze (Axotomie) und Entzug der trophischen Faktoren. Anschließend
untersuchte ich in Kulturen von Explantaten der Netzhaut bei älteren Ratten den Einfluss von
NAP und ADNF-9 auf die Regeneration und das Wachstum von Neuronen nach Axotomie.
7
1.1 Die Netzhaut der Ratte
Die Untersuchungen des Effektes auf das Überleben und die Regeneration von RGZ wurden
an Netzhautgewebe von Sprague-Dawley Ratten durchgeführt. Die Netzhaut der Ratte ist in
ihrer Struktur, der neuronalen Verschaltung und den biochemischen Prozessen weitgehend
vergleichbar mit der menschlichen Netzhaut (Sefton AJ 1995). Sie ist als Modell zur
Erforschung der Retina etabliert, da sie klar strukturiert, morphologisch wie funktionell gut
charakterisiert und experimentell gut zugänglich ist.
Abb. 1.1.1: Links: Nisslfärbung einer Primatenretina. Rechts: Immunhistochemische Färbung auf
Glutamat. Immunoreaktiv sind die Photorezeptoren, die Bipolarzellen und besonders die Ganglienzellen mit
ihren Axonen. Abkürzungen: OS Outer segments (der Photorezeptoren), IS Inner Segments, ONL Äußere
Körnerzellschicht, OPL Äußere plexiforme Schicht, INL Innere Körnerzellschicht, ACL Schicht der amakrinen
Zellen, IPL Innere plexiforme Schicht, GCL Ganglienzellschicht, NFL Nervenfaserschicht (Robin LN 1992)
8
Die Struktur der Retina gliedert sich von außen nach innen wie folgt in die äußeren und
inneren Segmente der Photorezeptoren, die äußere Körnerzellschicht (ONL), die äußere
plexiforme Schicht (OPL), die innere Körnerzellschicht (INL) mit Bipolar-, Amakrin- und
Horizontalzellen, die innere plexiforme Schicht (IPL) und die Ganglienzellschicht (GCL).
Während es in der menschlichen Netzhaut etwa 1.100.000 Ganglienzellen gibt, enthält die
Retina der Ratte ca. 100.000 Ganglienzellen (Perry 1979; Curcio CA 1990). Diese werden in
drei Gruppen I, II und III oder in large, medium und small cells eingeteilt nach den Kriterien
Somadurchmesser, Anzahl und Dicke der Dendriten und deren Verzweigungsradius.
1.2 Mechanismen der Neurodegeneration - Apoptose
Die Apoptose ist der progammierte Zelltod ohne eine entzündliche Begleitreaktion. Dieser
Prozess ermöglicht den Ausschluss einzelner Zellen oder eines Zellverbandes, wenn ihre
biologische Funktion beendet ist, es zu einem Zellschaden oder zu einer Mutation gekommen
ist.
T-Ligand
T-Rezeptor
Ca ++
Casp 8
Casp 3
Bcl -X
CI-V: ∆ pH , ∆Ψ Μ
K+
Casp 9
CytC
ROS
mito K ATP
Bcl -2
GSH
Enzyme des
Zytoskeletts
DNA- Reparaturenzyme
DNA-PK
Sterol -Biosynthese
e-
H+
Glu
Glu
Cys
Abb. 1.2.1: Apoptose, rezeptorvermittelt und mitochondrial. Abkürzungen: T-Ligand/ T- Rezeptor: TodesLigand/ Todes-Rezeptor, Casp: Caspase, Cyt C: Cytochrom C, mito KATP: mitochondrialer ATP abhängiger
Kalium Kanal, ROS: reaktive Sauerstoffspezies, GSH: Glutathion, BcL-X/ BcL-2: Transkriptionsfaktoren, H:
Wasserstoffion, K: Kaliumion, Ca: Kalziumion, Glu: Glucose, Cys: Cystein, ∆ψ: elektrischer Gradient, ∆pH:
pH Gradient. Abb. mit freundlicher Genehmigung von Prof. Feuerstein, Sektion Neuropharmakologie,
Universität Freiburg
Im Rahmen der Ontogenese ist die Apoptose physiologisch, sie kann aber auch gemeinsame
Endstrecke verschiedener pathophysiologischer Prozesse im Rahmen neuodegenerativer
9
Erkrankungen sein. Schäden am optischen Nerven durch Ischämie, Entzündung,
Durchtrennung oder Deformation münden im apoptotischen Untergang der RGZ. Man
unterscheidet zwei unabhängige Wege, die zur Apoptose führen (Petit PX 1997; Ashkenazi A
1999; Szewczyk A 2002), siehe Abbildung).
Der eine Weg wird durch einen sogenannten Todesrezeptor an der Zelloberfläche vermittelt
(Ashkenazi A 1999). Eine Kaskade von Kaspasen (Casp) wird intrazellulär angestoßen, die
zur Aktivierung von Proteasen führt und letztendlich zum Selbstverdau der Zelle.
Der zweite Weg führt über die Mitochondrien (Petit PX 1997; Szewczyk A 2002).
Verschiedene Faktoren, darunter reaktive Sauerstoffspezies, erhöhte mitochondriale
Kalziumspiegel oder fragmentierte DNS, z.B. durch UV- oder γ-Strahlung, gelten als Trigger
für die Bildung und Öffnung der permeability transition pore (PTP) in der mitochondrialen
Membran. PTP und das proapoptotische Protein Bax bilden einen Komplex in der
mitochondrialen Membran, durch den Cytochrom C und apoptosis-inducing factor (AIF) ins
Zytosol gelangen. Das antiapoptotische Protein Bcl-2 kann die Assoziation verhindern. Casp9
und konsekutiv weitere Enzyme der Kaspasefamilie werden aktiviert und führen zum
Untergang der Zelle.
Durch Bildung des PTP-Komplexes kollabieren der mitochondriale Ladungsgradient ∆ψ und
der pH-Gradient ∆pH. Die Energieproduktion entlang der Membrankomplexe der
Atmungskette kommt zum Erliegen und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) können nicht mehr
entgiftet werden. Als potente Trigger verstärken ROS den Apoptoseprozess.
ROS können von den Enzymen Superoxid-Dismutase, den Katalasen und der GlutathionDismutase entgiftet werden. Die Produktion von ROS kann auch durch eine partielle
Entkoppelung der Atmungskette verringert werden. Eine Änderung des Membranpotentials
senkt das Transmembranpotential ∆ψ und den Redoxstatus des Complex I der Atmungskette
(Skulachev 1996).
Eine solche Potenzialänderung verursacht das Öffnen der KATP-Kanäle an der inneren
Mitochondrienmembran.
Die
Permeabilität
für
Kaliumionen
wird
erhöht,
das
Transmembranpotential ∆ψ sinkt. Substanzen, die den KATP-Kanal öffnen oder schließen
beeinflussen das Transmembranpotatial und die Prozesse der Atmungskette und greifen damit
in den Apoptoseprozess ein. KATP-Kanal-Öffner könnten nach diesem Erklärungsmodell der
Apoptose entgegen wirken, indem sie zu einer Potentialänderung und Verringerung der ROS
Produktion führen, während KATP-Kanal-Blocker den Einfluss auf das Potential und den
stabilisierenden Effekt verringern würden.
10
1.3 Neuroprotektion und Neuroregeneration
Unter Neuroprotektion versteht man Maßnahmen, welche die Ursachen oder den Verlauf
degenerativer Nervenerkrankungen beeinflussen, so dass sie den Untergang von Neuronen
verhindern. Neuroregeneration bezeichnet Maßnahmen, die über das reine Überleben der
Neurone hinaus das Wachstum nach Schädigung oder Durchtrennung von Axonen fördern, so
dass sie zur Wiederherstellung des neuronalen Systems beitragen.
In der Augenheilkunde könnte die Neuroprotektion eine besondere Rolle spielen, da es bei
zahlreichen Krankheitsprozessen, wie beispielsweise dem Glaukom, Optikusneuropathien
oder Perfusionsstörungen der Netzhaut, zum Untergang der retinalen Ganglienzellen durch
Apoptose kommt (Quigley HA 1995; Kerrigan LA 1997; Katai N 1999). Vielversprechend
sind Substanzen, die in die oben geschilderten Abläufe bei der Apoptose eingreifen und auf
der gemeinsamen Endstrecke degenerativer Erkrankungen den neuronalen Zelltod eindämmen
könnten.
Bis heute sind die Versuche, wirksame Therapien zur Protektion der Ganglienzellen zu
entwickeln, leider enttäuschend verlaufen auf Grund zahlreicher Probleme. (1) Die Testung
bei Akuterkrankungen ist wenig sinnvoll. Bei akuten Gefäßverschlüssen der Netzhaut
beispielsweise könnten Patienten kaum rechtzeitig in der Klinik sein, um eine neuroprotektive
Therapie zu erhalten. Gerade bei diesen Erkrankungen ist das Zeitfenster für eine effektive
Therapie sehr klein. Folglich gilt es, den geeigneten Zeitraum für eine effektive Therapie in
Studien zu bestimmen. (2) Bei der Planung von kontrollierten, randomisierten klinischen
Studien zur Neuroprotektion tritt das Problem inhomogener Patientenkollektive auf. (3) Des
Weiteren sind die klinischen Parameter zur Beurteilung der Studien schlecht definiert. (4) In
der Regel sind die Fallzahlen gering, wenn ein definiertes Krankheitsbild untersucht werden
soll.
Seit kurzem liegen erste Daten zur klinischen Neuroprotektion mit Brimonidine (Alphagan),
einem α2-adrenozeptor-Agonisten vor (Gandolfi SA 2003; Gandolfi SA 2004). In einer
Kurzzeitstudie senkten
Brimonidine Augentropfen (0,2 %) den intraokularen Druck bei
Patienten mit Glaukom und Druckwerten kleiner oder gleich 18 mmHg (Gandolfi SA 2003).
In einer weiteren Studie untersuchten Gandolfi et al. den Effekt von Brimonidine auf die
Progression von Gesichtsfelddefekten unabhängig von der drucksenkenden Wirkung
(Gandolfi SA 2004). Patienten mit Offenwinkelglaukom erhielten entweder Brimonidine
Augentropfen (0,2 %) oder eine Argon Laser Trabekuloplastik über 360°. Dabei verringerte
11
Brimonidine das Fortschreiten der Gesichtsfelddefekte effektiver als eine LaserTrabekuloplastik, obwohl der intraokulare Druck unter Brimonidine schlecht kontrolliert war.
Ein weiterer Wirkstoff in klinischer Erprobung ist Memantin, ein N-methyl-D-Aspartat
(NMDA) Antagonist, der in der Therapie der Alzheimerschen Erkrankung und bei vaskulär
bedingter Demenz eingesetzt wird. In vivo verringerte Memantin nach intraperitonealer
Applikation bei Ratten den Untergang von RGZ durch druckbedingte Netzhautischämie
(Lagrèze WA 1998). In vivo wurde die Wirksamkeit und Sicherheit von oraler MemantinGabe bei Primaten in einem Modell für chronische okuläre Hypertension untersucht (Hare
WA 2004). Die histologische Beurteilung zeigte eine Zunahme des Überlebens von RGZ
unter Memantine. Die Beurteilung der Papille anhand von konfokalen Laser Scans zeigte eine
geringere Progression von Papillenexkavation und Schwund des neuroretinalen Randsaums.
Damit schützte Memantin vor degenerativen Veränderungen, die mit erhöhtem intraokularen
Druck einhergehen, ohne eine drucksenkende Wirkung auszuüben. Zur Zeit läuft eine
multizentrische klinische Studie zur Beurteilung der Wirksamkeit und Sicherheit von
Memantine bei Patienten mit Offenwinkelglaukom und einem Progressionsrisiko (PA Sidoti,
New York Eye & Ear Infirmary). Dabei wird den Patienten täglich 20 mg oder 10 mg
Memantin oder ein Placebo oral verabreicht. In Zukunft könnte die drucksenkende
Glaukomtherapie sinnvoll durch eine neuroprotektive Therapie ergänzt werden.
1.4 Gabapentin-Laktam
Gabapentin-Laktam
(GBP-L;
8-aza-spiro[5,4]decan-9-on)
ist
ein
Derivat
des
Antikonvulsivum Gabapentin (Neurontin, Park-Davis, USA). Das Laktam wurde im Labor
von T.J. Feuerstein, Sektion klinische Neuropharmakologie der Universitätsklinik Freiburg
synthetisiert und wird von IBAM, Freiburg, hergestellt. Es unterscheidet sich von Gabapentin
durch einen Ringschluss zum Laktam, es gehört zur Familie der 2-Pyrrolidinone und hat ein
Molekulargewicht von 154 g/mol.
COOH
NH 2
C =O
NH
Abb. 1.4.1: links: Strukturformeln von Gabapentin, rechts: Gabapentin-Laktam
12
Nach der Entdeckung von GBP-L konnten in einer Reihe von Untersuchungen Eigenschaften
gezeigt werden, die auf eine neuroprotektive Wirkung schließen lassen. In vitro verringerten
GBP-L
und
Gabapentin
den
Hypoxie
bedingten
Anstieg
von
Glutamat
in
Superfusionsversuchen an Schnitten des Hippocampus (Jehle T 2000). Durch die Gabe von
Glibenclamid, ein Sulfonylharnstoff und Antagonist am ATP-abhängigen Kaliumkanal (KATPKanal), wurde der Effekt antagonisiert. Minoxidilsulfat, ein KATP-Kanal Agonist, imitierte die
Wirkung des Laktams. Dies war ein erster Hinweis auf den möglichen Wirkmechanismus von
GBP-L als Agonist am KATP-Kanal (Jehle T 2000).
In vivo zeigte GBP-L im Gegensatz zu seiner Ursprungssubstanz Gabapentin einen
neuroprotektiven Effekt im Tiermodell der akuten Netzhautischämie (Lagrèze WA 2001). Der
Ganglienzellverlust nach druckbedingter Ischämie und anschließender Reperfusion war unter
GBP-L deutlich verringert. Interessanter Weise traten bei den Ratten nach intraperitonealer
Gabe von GBP-L keinerlei Nebenwirkungen wie Sedierung oder Ataxie im Verlauf der
Untersuchung auf, während in der Epilepsietherapie mit Gabapentin über eine initiale
Sedierung der Patienten berichtet wird. In nachfolgenden Untersuchungen zeigte sich, dass
der protektive Effekt von GBP-L im akuten Ischämiemodell sowohl vor dem
Ischämieintervall als auch noch innerhalb eines Zeitraums von vier Stunden nach der
Reperfusion erzielt wurde. Diese Ergebnisse sind vielversprechend in Hinblick auf die
Entwicklung neuer Therapeutika, da es sich um ein vergleichsweise großes Zeitfenster
handelt (Lagrèze WA 2001).
Neben Modellen zur akuten Neurodegeneration wurde GBP-L auch in einem Modell
chronischer Neurodegeneration eingesetzt. In dem R6/2-Mausmodell verursacht der
Gendefekt, eine Repetition von CAG, bei den Mäusen die Symptome einer Huntingtonschen
Erkrankung (Margiarini L 1996). Transgene Mäuse, die mit GBP-L behandelt wurden, hatten
verbesserte motorische Fähigkeiten im Vergleich zu Kontrolltieren und den mit GBP
behandelten Tieren. Untersuchungen der Hirnschnitte zeigten nach GBP-L-Gabe eine
deutliche Verringerung der für Morbus Huntington charakteristischen intranukleären
Einschlüsse von Huntingtin und Ubiquitin in Größe und Anzahl (Feuerstein TJ 2003).
GBP-L wurde bisher noch nicht in Kulturen isolierter Ganglienzellen untersucht.
13
1.5 Glibenclamid und 5-Hydroxydecanoat - Antagonisten am KATP -Kanal
Durch den Einsatz von Glibenclamid und 5-Hydroxydecanoat (5-HD; beide Sigma,
Deisenhofen) sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden, ob der Effekt von GBP-L
auf die RGZ durch Blockade der KATP-Kanäle antagonisiert werden kann. In
vorausgegangenen Untersuchungen zu GBP-L blockierten KATP-Kanal-Antagonisten vom
Typ des Glibenclamid dessen Effekt (Jehle T 2000).
Cl
=
- C-NH (CH )-
OH
- S-NHCNH-
22
C H (C H ) -C H (C H ) C O OH
=
2
O
=
O
=
O
O
OCH
3
24
23
3
Abb. 1.5.1: links: Glibenclamid, rechts: 5-Hydroxydecanoat
Glibenclamid und 5-HD sind Antagonisten an den Adenosin-Triphosphat (ATP) sensitiven
Kaliumkanälen (KATP-Kanäle). Diese gehören zur Familie der sogenannten inwardly
rectifying Kalium Kanäle. Sie bestehen aus einer porenbildenden Untereinheit (Kir6.x) und
weisen eine Bindungsstelle für Sulfonylharnstoffe (SUR) auf, die regulatorische Funktion
besitzt und zur Familie der ATP-bindenden Rezeptoreinheiten gehört (Inagaki N 1995a;
Inagaki N 1995b; Ettaiche M 2001). Die ATP sensitiven Kanäle koppeln Zellmetabolismus
und Membranpotential (Ashcroft 1988; Ettaiche M 2001). Sie sind sowohl in der
Zellmembran als auch in der inneren Mitochondrienmembran vorhanden (Kubo Y 1993;
Inagaki N 1995a). Man findet sie im zentralen Nervensystem gehäuft im Hippocampus
(Dunn-Meynell AA 1998). In der Rattenretina werden die Kanäle im retinalen
Pigmentepithel, in der Schicht der inneren Segmente der Photorezeptoren und in der
Ganglienzellschicht exprimiert (Ettaiche M 2001). Die Kanäle sind dadurch charakterisiert,
dass sie von Sulfonylharnstoffen wie Glibenclamid und Glipizid inhibiert werden, welche aus
der Therapie des Diabetes mellitus bekannt sind. Durch Blockade der KATP-Kanäle in den ßZellen
des
Pankreas
wird
die
Ausschüttung
von
Insulin
gefördert
und
eine
blutzuckersenkende Wirkung erzielt. In Studien zur ischämischen Präkonditionierung am
Herzen konnte gezeigt werden, dass Glibenclamid sowohl an KATP-Kanälen der Zellmembran,
als auch an mitochondrialen KATP-Kanälen wirkt. 5-Hydroxydecanoat dagegen blockiert
selektiv die mitochondrialen KATP Kanäle (Tanno M 2001).
14
1.6 Ischämische Präkonditionierung – Agonisten am KATP -Kanal
Unter ischämischer Präkonditionierung versteht man ein Phänomen, das in verschiedenen
Organsystemen als Schutzmechanismus vor hypoxischen Schäden vorhanden ist. Es konnte
im Herzen, im Gehirn, dem Rückenmark, der Leber, der Lunge, der Skelettmuskulatur und in
der Retina nachgewiesen werden (Liu Y 1992; Caprioli J 1996; Roth S 1998; Ettaiche M
2001). Der Mechanismus beruht auf einer Stärkung der Ischämietoleranz von neuronalem
Gewebe durch kurze Ischämiephasen. In der Retina konnte durch ischämische Intervalle im
Sinne einer Präkonditionierung die Ischämietoleranz gegenüber erhöhtem intraokularen
Druck vergrößert werden (Ettaiche M 2001). In den Untersuchungen wurde gezeigt, dass der
Mechanismus eine frühe Aktivierung von KATP-Kanälen beinhaltet. KATP-Kanalöffner
imitierten den Effekt der Präkonditionierung und schützten vor der Degeneration von RGZ,
während KATP-Kanalblocker den protektiven Effekt durch die ischämische Präkonditionierung
verhinderten (Ettaiche M 2001).
Die ursprüngliche Hypothese zur Erklärung des Phänomens der Präkonditionierung ging von
einer Beteiligung derjenigen KATP-Kanäle aus, die in der Zellmembran liegen. Dagegen
werten neuere Studien die Rolle der mitochondrialen KATP-Kanäle als ursächlich (Garlid
2000; Szewczyk A 2002). In Studien zur kardioprotektiven Wirkung der KATP-Kanalöffner
konnte gezeigt werden, dass sie allein auf der Wirkung an mitochondrialen KATP-Kanälen
beruht (Garlid 2000; Szewczyk A 2002).
Als KATP-Kanalöffner wirken Cromacalim, Pinacidil und Diazoxid (O'Rourke 2000). In der
Literatur ist ihre neuroprotektive Wirkung belegt. Es konnte gezeigt werden, dass die
Aktivierung der KATP-Kanäle eine zentrale Rolle in der zerebralen Protektion spielt. KATPKanalöffner schützten Neuronen vor Schäden durch Exzitotoxizität und Ischämie (Abele AE
1990). Sie verhinderten die Ischämie-induzierte Expression von c-fos, c-jun, heat shock
protein und ß-Amyloid-Vorläufergen im Hippocampus der Ratte (Heurteaux C 1993; Ettaiche
M
2001).
Agonisten
am
KATP-Kanal
verringerten
den
neuronalen
Zelltod
bei
Vorderhirnischämie und imitierten das Phänomen der ischämischen Präkonditionierung im
ZNS, während der protektive Effekt durch KATP-Kanal-Antagonisten gehemmt wurde
(Heurteaux C 1993; Heurteaux C 1995).
Es wurden verschiedene Hypothesen aufgestellt, über welche Machanisman die Aktivierung
der mitochondrialen KATP-Kanäle zu einem Schutz der Zellen vor ischämischen Schaden
führen kann. Zunächst konnte gezeigt werden, dass KATP-Kanalöffner das mitochondriale
Membranpotential verändern, die Atmungskette und die ATP-Bildung beeinflussen und die
15
Kalziumbeladung der Mitochondrien verändern (Holmuhamedov EL 1998; Sato T 2000).
Damit greifen sie in den Zellstoffwechsel und die Prozesse bei der Apoptose ein (siehe oben).
Werden
die
mitochondrialen
KATP-Kanäle
geöffnet,
beobachtet
man
eine
Mitochondrienschwellung. Es wurde behauptet, dass dieses Phänomen die mitochondriale
ATP-Produktion oder den Verbrauch verbessern könnte (Garlid 2000). In Studien zur
Ischämie am Rattenherzen hielt Diazoxid, ein KATP-Kanalöffner, die Funktion der
Mitochondrien aufrecht: Unter Sauerstoffmangel beobachteten Garlid et al., dass sich der
mitochondriale Sauerstoffverbrauch auf 40 % reduzierte. Unter Diazoxid blieb der normale
Sauerstoffverbrauch trotz der Hypoxie erhalten. Darüber hinaus konnte ein Anstieg der ATP
Konzentration unter Diazoxid gemessen werden.
Crestanello et al. stellten die Hypothese auf, der protektive Effekt könnte auf eine verringerte
Kalziumbeladung der Mitochondrien zurück zu führen sein (Crestanello JA 2000). Erhöhte
Kalziumkonzentrationen wirken als Trigger für die Apoptoseprozesse (siehe oben).
Neben einer Beeinflussung der akuten Vorgänge, die durch eine Ischämie in Gang gesetzt
werden, könnten KATP-Kanäle auch eine Rolle auf einer anderen Ebene der ischämischen
Präkonditionierung spielen, indem sie zu einer erhöhten Expressionsrate protektiver Proteine
führten, die den Apoptoseprozess kontrollieren. Jakob et al. beobachteten eine gesteigerte
Expression von Bcl-2 und Bcl-XL bei Neuronen des Hippokampus, die mit KATP-Kanalöffnern behandelt wurden (Jakob R 2000b).
Das Phänomen der ischämischen Präkonditionierung ist komplex und vielschichtig.
Zahlreiche Beobachtungen sprechen dafür, dass KATP-Kanäle eine wichtige Rolle spielen.
Darunter scheinen die mitochondrialen KATP-Kanäle eine größere Bedeutung als die
zellmembrangebundenen KATP-Kanäle zu haben. Agonisten am KATP-Kanal haben in
zahlreichen Studien eine protektive Wirkung gezeigt, während KATP-Kanal-Antagonisten
protektive Effekte blockierten.
1.7 Neuropeptide NAP und ADNF-9
NAP (Kurzbezeichnung für ein Peptid mit der Aminosäuren-Sequenz NAPVSIPQ) und
ADNF-9 (Activity-dependent Neurotrophic Factor-9) sind synthetische Peptide, die sich von
den Proteinen Activity-dependent Neurotrophic Factor (ADNF) und Activity-dependent
Neuroprotective Protein (ADNP) ableiten. Diese werden von Gliazellen sezerniert nach
Stimulation durch vasoaktives intestinales Peptid (VIP) und vermitteln dessen neuroprotektive
16
Wirkung. Sie wurden für die vorliegenden Untersuchungen von dem Labor von I. Gozes, Tel
Aviv, zur Verfügung gestellt.
VIP hat neurotrophe und neuroprotektive Wirkung auf Neuronen im zentralen Nervensystem
und Wachstum fördernde Eigenschaften auf Embryonen (Brenneman DE 1985; Gressens P
1993), (Gozes I 1996). Der neuroprotektive Effekt von VIP ist von Gliazellen abhängig
(Brenneman DE 1987), welche spezifische, hoch affine VIP-Rezeptoren exprimieren (Gozes I
1991). Zu den Gliafaktoren, die das Überleben zentralnervöser Neurone fördern, gehören
Interleukin-1 (Brenneman DE 1992; Brenneman DE 1995), Protease Nexin-1 (Festoff BW
1996) und ADNF (Brenneman DE 1996). Der Name Activity-dependent neurotrophic factor
beruht auf der Beobachtung, dass ADNF Neurone vor Apoptose nach elektrischer Blockade
mit Tetrodotoxin schützte (Gozes I 1997).
In Untersuchungen zu ADNF zeigte sich, dass Peptidfragmente wie ADNF-9 im Vergleich
zum Protein ADNF gleichwertige Potenz und protektive Eigenschaften aufwiesen
(Brenneman DE 1996; Brenneman DE 1998). Mit Hilfe von Antikörpern gegen ADNF-9
wurden funktionell verwandte Proteine von ADNF geklont, darunter Activity-dependent
neuroprotective Protein (ADNP) (Bassan M 1999; Zamostiano R 2001). ADNP enthält die
Sequenz NAPVSIPQ (NAP), die als eigenständiges Fragment erfolgreich gegen oxidativen
Stress schützte (Offen D 2000; Steingart RA 2000). Es folgten Untersuchungen zu den
Fragmenten NAP und ADNF-9 in Tiermodellen zur Neuroprotektion bei Mäusen mit
ApolipoproteinE-Defizienz (Bassan M 1999), bei Ratten, die mit cholinergen Toxinen
behandelt wurden (Gozes I 2000) und bei Mäusen mit Schädel-Hirn Trauma (Beni-Adani L
2001).
Die Peptide bestehen aus acht (NAP; NAPVSIPQ; Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Glu) bzw.
neun Aminosäuren (ADNF-9; SALLRSIPA; Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala). Auf
Grund ihrer geringeren Größe können sie die Blut-Hirn-Schranke leichter passieren als
Proteine. In Tierexperimenten erwiesen sie sich als gut permeabel, sowohl nach Applikation
als Nasenspray, nach Inhalation als auch nach intraperitonealer Injektion (Gozes I 1996;
Bassan M 1999; Zamostiano R 1999). Dies macht sie zu vielversprechenden Substanzen in
der Neuropharmakologie (Gozes I 2001).
In vitro Studien zum Wirkmechanismus von ADNF-9 konnten verschiedene Interaktionen mit
antiapoptotischen Reaktionswegen zeigen. ADNF-9 führte zu einem Anstieg von heat shock
protein 60 bei kortikalen Neuronen der Ratte (Zamostiano R 1999). Es erhöhte die DNABindung von nuclear-faktor κB (Glazner GW 2000). ADNF-14, ein weiteres Fragment von
ADNF, aktivierte Proteinkinase C und die mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAP-
17
Kinase;(Gressens P 1999). Nach Inhibition von Proteinkinase A oder Blockade des
Transkriptionsfaktors
CREB
wurde
keine
Zunahme
des
Neuritenwachstums
bei
Ganglienzellen des Rückenmarks mehr beobachtet (White D 2000). NAP schützte in einem
Apoplex-Modell bei der Ratte gegen den Untergang der Nervenzellen (Leker RR 2002).
Dabei verringerte es die Anzahl Kaspase-3 positiver Zellen und die Menge fragmentierter
DNA. In anderen Studien steigerte NAP sowohl die Synthese von Nitridoxid (NO), als auch
die Level von zyklischen Guanosinmonophosphat (cGMP) (Ashur-Fabian O 1999; AshurFabian O 2001) und verhielt sich als Chaperon-bindendes Peptid, das eine Proteinaggregation
verhinderte (Ashur-Fabian O 2003). Es konnte gezeigt werden, dass NAP die
Plasmamembran überwindet und intrazellulär direkt mit Tubulin interagiert, indem es die
Reorganisation der Mikrotubuli induziert (Divinski I 2004). In Kortexschnitten des Huhns
und in Kulturen von cerebralen Kortexneuronen der Ratte beobachtete man eine Stimulation
der cAMP Produktion durch VIP (Ashur-Fabian O 1999; Nowak JZ 2003).
Für NAP und ADNF-9 liegen keine Untersuchungen zur Neuroprotektion am Auge vor.
1.8 Neurotrophe Faktoren CNTF und BDNF
Das Überleben von Neuronen ist unter physiologischen Bedingungen von einer
kontinuierlichen Versorgung mit neurotrophen Faktoren abhängig. Das Axonwachstum und
die Bildung von Synapsen werden von solchen Faktoren lokal und aus dem Zielgebiet
kontrolliert. Ciliary-Neurotrophic-Factor (CNTF) und Brain-derived Neurotrophic-Factor
(BDNF) sind zwei Faktoren, die entlang der Sehbahn produziert werden. CNTF wird von
Astrocyten im optischen Nerv und im Tektum gebildet (Stockli KA 1991). Die
Signaltransduktion erfolgt über einen heterotrimeren Rezeptorkomplex, bestehend aus dem
Glykoprotein 130-Zytokinrezeptor, sowie dem LIF (leukemia inhibitory factor)-Rezeptor ß
(Ip NY 1992). BDNF wird vom Tektum sezerniert (Johnson JE 1986). Retinale
Ganglienzellen sind während der Entwicklung und der Aufrechterhaltung ihrer Funktion von
diesen Faktoren abhängig und exprimieren die entsprechenden Rezeptoren (Cellerino A 1997;
Kirsch M 1997). BDNF und CNTF wurden in Kulturen von isolierten retinalen
Ganglienzellen von embryonalen und neugeborenen Ratten eingesetzt und zeigten einen
protektiven Effekt (Meyer-Franke A 1995). Die Kombination beider Faktoren diente in der
vorliegenden Arbeit als Positivkontrolle und dem Vergleich mit dem Effekt von GBP-L bzw.
den Neuropeptiden NAP und ADNF-9 auf die RGZ Kulturen.
18
1.9 Fragestellung
Hintergrund der vorliegenden Arbeit ist die Suche nach Möglichkeiten der Neuroprotektion
vor degenerativen Prozessen in der Retina und dem optischen Nerven. Einerseits sind fast alle
Optikusneuropathien mit einem Axonschaden der RGZ und dem konsekutiven Verlust der
Neuronen assoziiert. Andererseits ist belegt, dass die Axotomie bei RGZ zur Apoptose führt.
Damit ist die Axotomie ein experimentelles Modell, um Optikusneuropathien zu untersuchen.
Gabapentin-Laktam sowie die Peptide NAP, ADNF-9 und verwandte Substanzen haben unter
verschiedenen Bedingungen in vitro und in vivo einen neuroprotektiven Effekt in
unterschiedlichen Organsystemen und Tiermodellen gezeigt. Sie gelten als vielversprechende
Kandidaten für die Therapie akuter und chronischer neurodegenerativer Erkrankungen. Ich
habe in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob GBP-L, NAP und ADNF-9 protektiv und
regenerativ auf retinale Ganglienzellen bei der Ratte wirken. Bislang liegen für die Peptide
keine Untersuchungen zur Neuroprotektion am Auge vor, GBP-L ist in einem Modell der
okulären Ischämie untersucht worden. Ziel ist es, die Therapie von Augenerkrankungen, die
mit neuronaler Degeneration eingehen und letztlich auf dem Untergang der retinalen
Ganglienzellen beruhen, um Neuroprotektiva zu ergänzen.
Zunächst wurde der Effekt von GBP-L und den Neuropeptiden NAP und ADNF-9 auf RGZ
untersucht. Nach Durchtrennung des Nervus opticus bei der Enukleation neugeborener Ratten
wurden RGZ mit Hilfe von Antikörpern isoliert und in sogennantem minimal essential
medium kultiviert ((Meyer-Franke A 1995). Unter Entzug der natürlichen trophischen
Faktoren des umgebenden Gewebes und ohne den Schutz des Zellverbandes beobachtet man,
dass die isolierten RGZ nach Axotomie zu Grunde gehen (Quigley HA 1995).
Die erste Frage lautete, ob sich das Absterben der RGZ nach Axotomie und Isolation in
Kultur durch Zugabe von GBP-L oder von NAP oder ADNF-9 verringern ließe. Als
Negativkontrolle dienten RGZ, die in einfachem Kulturmedium gehalten wurden. Als
Positivkontrolle dienten Kulturen, denen BDNF und CNT zugesetzt wurden.
In einem zweiten Schritt wurde untersucht, ob sich der protektive Effekt von GBP-L auf die
isolierten
RGZ
antagonisieren
ließe.
Aus
der
Blockade
mit
Substanzen,
deren
Wirkmechanismus bekannt und gut untersucht ist, sollten Rückschlüsse auf den
Wirkmechanismus der Testsubstanz gezogen werden. In diesem Sinne wurden die KATPKanal-Antagonisten Glibenclamid und 5-HD eingesetzt, die in früheren Untersuchungen den
19
Effekt von GBP-L antagonisiert hatten. Die isolierten RGZ wurden mit Glibenclamid oder 5HD inkubiert, bevor GBP-L in das Kulturmedium kam oder alleine den isolierten RGZ
zugesetzt. Als Kontrolle dienten Kulturen von RGZ in einfachem Medium.
Zur Untersuchung der Neuroregeneration setzte ich die Peptide NAP und ADNF-9 in
Kulturen von Netzhautexplantaten der Ratte ein (Lucius R 1996a; Lucius R 1996b). Nach
Durchtrennung des Nervus opticus wurden Gewebsstanzen der Retina bei 10 bis 12 Tage
alten Ratten entnommen und kultiviert. In dem Modell kann die Regeneration der
Nervenzellen nach Axotomie anhand des Aussprossens von Neutriten am Rand des
Explantatgewebes untersucht werden.
Die Frage lautete, ob NAP oder ADNF-9 die Neuritenbildung positiv beeinflussen können. In
Kontrollkulturen verblieben die Explantete in einfachem Medium, in den Positivkontrollen
wurden BDNF und CNTF zugesetzt.
20
II. MATERIAL UND METHODEN
2.1. Versuchstiere
Retinales Gewebe wurde von Sprague-Dawley Ratten gewonnen. Ihr Alter wird in Tagen ab
der Geburt (p, post natum) gezählt und beginnt mit P0. Für die Kulturen isolierter
Ganglienzellen wurden neugeborene Tiere der Tage 0 bis 2 (P0 - P2) verwendet. Die
Explantatkulturen wurden von älteren Tieren P9 - P11 gewonnen. Die Experimente wurden in
Übereinstimmung mit dem Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision
Research der Association for Research in Vision and Ophthalmolgy und den Richtlinien der
Albert Ludwig Universität zum Umgang mit Tieren in der Forschung ausgeführt.
2.2 Kultur isolierter retinaler Ganglienzellen
Die retinalen Ganglienzellen (RGZ) wurden mit Hilfe eines immunologischen Verfahrens mit
Antikörpern gegen das Oberflächenantigen Thy 1.1 isoliert und in Serum-freiem Medium
kultiviert. In der Nagetierretina wird dieses Antigen ausschließlich von den Ganglienzellen
exprimiert. Das Verfahren wird als Immunopanning bezeichnet und wurde in der
vorliegenden Arbeit in Anlehnung an Meyer-Franke et al. angewendet (Meyer-Franke A
1995).
Zur Gewinnung isolierter Ganglienzellen wurden neugeborene Ratten dekapitiert, die Augen
enukleiert und in sterilem Präparationsmedium HBSS (Hank’s balanced salt solution; Gibco)
gesammelt. Die Präparation der Netzhäute erfolgte unter sterilen Bedingungen mit Sicht
durch ein Mikroskop. In der Regel wurden sechs Retinae präpariert, in HBSS gesammelt und
für 5 min bei 37°C inkubiert. HBSS wurde dann durch kalzium- und magnesiumfreies
Medium (Gibco) ersetzt und das Gewebe für 10 min bei 37°C inkubiert.
Die Dissoziation des Gewebes erfolgte in zwei Schritten, zunächst enzymatisch dann
mechanisch. Die Retina wurde in 0.125 % Trypsin in Dulbecco’s minimal essential medium
(DMEM) für 20 min bei 37°C inkubiert. Das Medium enthielt 2 mM L-alanyl-L-Glutamin,
als Puffer 10 mM Hepes, sowie Antibiotika (100 Units/ml Penicillin G und 100 µg/ml
Streptomycin). Die enzymatische Reaktion wurde gestoppt durch Ersatz der Trypsinlösung
durch DMEM mit 10 % Pferdeserum (Gibco), daran anschließende Zentrifugation für 2 min
21
bei 140 g und eine Waschung in gleichem Medium. Folge der Trypsinbehandlung war die
Lockerung der Zell-Zell-Verbindungen. Um eine Suspension einzelner Zellen zu erhalten,
erfolgte die mechanische Dissoziation, die Trituration. Das Gewebe wurde in Serum-haltigem
DMEM mehrfach durch eine eng-geschmolzene Glaspipette gezogen. Das Triturat wurde auf
die Antikörper beschichtete Panning-Platte gegeben, für 25 min im Brutschrank inkubiert und
alle 5 min sanft geschwenkt. Zählungen im Hemizytometer nach Neubauer ergaben, dass etwa
35 Millionen Zellen in 5 ml Medium gelöst waren.
Für das Panning wurde jeweils eine Petrischale (Falcon; Becton&Dickinson) mit 10 cm
Durchmesser sequenziell mit zwei Antikörpern beschichtet. Im ersten Schritt erfolgte die
Inkubation mit einem Antikörper gegen Mausprotein, goat-anti-mouse IgG (Sigma) in TrisHCl Puffer. Der pH-Wert des Puffers betrug 9,5, um die Bindung der Antikörper auf der
geladenen Oberfläche der Petrischale zu optimieren. Die Inkubation erfolgte bei 4-6° C über
Nacht. Nach diesem und allen folgenden Schritten wurde die Schale je drei Mal mit
Phosphatpuffer, pH 7,3 gespült. Die Inkubation mit dem Antikörper gegen Thy1.1 (mouse
anti-rat CD90; Serotec), erfolgte in Phosphatpuffer für 2 h bei 6° C. Um freie Valenzen auf
der Oberfläche der Petrischale abzudecken und eine unspezifische Bindung von Zellen oder
Protein im Folgenden zu verhindern, wurde die Platte bei Raumtemperatur für 20 min mit 2
mg/ml Serumalbumin vom Rind (bovines Serumalbumin; Gibco) in Phophatpuffer inkubiert.
Während der Inkubation im Brutschrank gingen die Ganglienzellen eine feste AntigenAntikörper-Bindung mit den auf der Platte verankerten Thy1.1-Antikörpern ein, während die
übrigen Zellen frei im Medium schwammen. Um die nicht haftenden Zellen zu entfernen,
wurde die Platte wiederholt mit Phosphatpuffer gewaschen. Jeder Schritt wurde unter dem
Mikroskop kontrolliert. Die gereinigten RGZ wurden in DMEM/10 % Pferdeserum mit einem
Cell Scraper mechanisch von der Platte gelöst. Nach Zentrifugation für 5 min bei 140 g
wurden die Zellen in zweifach konzentriertem N2 Kulturmedium gelöst. Das Kulturmedium
bestand aus DMEM und enthielt N2 (500 µg/ml Insulin, 10 mg/ml humanes Transferrin, 0,63
µg/ml Progesteron, 1611 µg/ml Selenit), 2 mM Glutamin, 10 mM Hepes, 100 Units/ml
Penicillin G und 100 µg/ml Streptomysin (Gibco) und 5 µM Forskolin (Tocris). Die Dichte
der RGZ wurde im Hemicytometer nach Neubauer bestimmt. Nach entsprechender
Verdünnung wurden 3000 RGZ pro well mit einem Pipettierrechen in die Kulturplatte gesetzt.
Die 96-well Platten (Falcon, Becton&Dickinson) waren zuvor mit Poly-L-Lysin (0,1 mg/ml)
und Laminin (0.94 µg/cm²) in DMEM beschichtet worden. Nach Zugabe der verschiedenen
Substanzen wurden die Zellen für 48 h inkubiert. Im Brutschrank herrschten optimale
Bedingungen bei 37° C mit einem Sauerstoffanteil von 95 % und einem CO2-Anteil von 5 %.
22
Nach zwei Tagen wurden die Kulturen mit 1 % Glutaraldehyd fixiert. Zur Auswertung wurde
die Kulturplatte mit demineralisiertem Wasser gespült. Am Phasenkontrastmikroskop wurde
für jedes well die Anzahl vitaler Ganglienzellen über den horizontalen und vertikalen
Durchmesser bei einer 400fachen Vergrößerung ermittelt (Lehwalder D 1989). Kriterien für
die Vitalität der Zellen waren ein unversehrter Zellkörper, der in der Phase hell leuchtetend
schien, sowie das Vorhandensein von mehreren Zellfortsätzen, die mindestens die Länge
einen Zelldurchmesser erreicht hatten.
Von Parallelkulturen wurden verschiedene Färbungen hergestellt, um die kultivierten Zellen
als retinale Ganglienzellen neuronalen Ursprungs zu identifizieren. Die Immunfluoreszenzfärbung mit einer pan-neurofilament-Antikörpermischung (Biomol, Hamburg) erfolgte nach
einem Standardprotokoll für Immunfluoreszenz mit Cy3-konjugierten Zweitantikörpern (Abb.
2.2.1a). Immunhistochemische Färbungen mit Antikörpern gegen Neurofilament (N52) und
MAP-2 (microtubule-associated protein-2) wurden mit biotinylierten Zweitantikörpern und
Avidin-Peroxidase-Komplex nach etablierten Protokollen durchgeführt (Abb. 2.2.1 b, c).
Abb. 2.2.1 Retinale Ganglienzellen nach 48 h in
Kultur.
a: Immunfluoreszenzfärbung gegen Neurofilament. Digitalfotografie von zwei Nervenzellen
mit langen Fortsätzen neben Zelldetritus.
Vergrößerung 400fach.
b: Immunhistochemische Färbung auf N52. Eine
RGZ mit langen Fortsätzen und Überreste von zu
Grunde gegangenen RGZ
c: Immunhistochemische Färbung gegen MAP-2.
Eine RGZ oberhalb von Überresten einer zu Grunde
gegangenen Zelle. Vergrößerung 400fach.
a
b
c
23
2.3 Kultur von Netzhautexplantaten der Ratte
Nach der Methode von Sievers und Lucius wurden Gewebsstanzen mit einer Hohlnadel
(Durchmesser 400 µm) an P9 – P11 Retinae entnommen und in einer dreidimensionalen
Matrix aus Fibrin für 72 h kultiviert (Lucius R 1996a). Die Nervenzellen, deren Zellkörper in
den Explantaten lagen, können nach Axotomie regenerieren und bilden Fortsätze über den
Explantatrand hinaus (Abb. 3.3.1). Nach 72 h Kulturzeit konnte das Neuritenwachstum unter
Zugabe der Neuropeptide im Vergleich zum Wachstum in Kulturmedium untersucht werden.
Abb. 2.3.1: Netzhaut Explantat nach
72 h in Kultur in Müller-Medium
(Kontrolle).
Digitalfotografie
Färbung
mit
nach
Sudanschwarz.
Vergrößerung 100fach.
Als Präparationsmedium diente Leibowitz L-15 Medium (Sigma), das 20 mM Hepes zur pHStabilisierung, 2 mM L-Alanyl-L-Glutamin und Antibiotika (100 units/ml Penicillin und 100
µg/ml Streptomycin, Gibco) enthielt. Unter dem Mikroskop erfolgte die Retinapräparation
unter sterilen Bedingungen in einem Schälchen mit L-15 auf einer Silikoneinlage. Zunächst
wurden durch einen zirkulärer Schnitt die vorderen Augenabschnitte entfernt. Die Spannung
des becherförmigen Gewebes wurde durch einen radiären Entlastungsschnitt verringert und
die Retina flächig abgelöst und behutsam ausgebreitet.
Die gespitzte Hohlnadel wurde auf eine 1ml Spritze (Injekt - H; Braun Melsungen AG) mit
Präprationsmedium aufgesetzt, um die Retinastanzen zu entnehmen. Dabei sollte das
Netzhautgewebe weder in Randnähe entnommen werden, weil dort die Dichte der RGZ
geringer ist als zentral, noch sollten sichtbare Gefäße getroffen werden. Die Explantate
wurden in L-15 gesammelt. Die Nadel wurde gegen eine Braunüle (Vasovix; Braun
Melsungen AG) ausgetauscht, um die Explantate in Kulturmedium umzusetzen. Bis zur
24
Weiterverarbeitung wurden sie in den Brutschrank (37° C) gestellt. Vor der Kultur in der
Fibrinmatrix wurden sie zurück in L-15 transferiert. Das Kulturmedium enthielt DMEM, 100
units/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin (Gibco) und 0,5 mg/ml ε-Aminocapronsäure
(Sigma) als Plasmininhibitor, um die Auflösung des Fibrin zu verhindern.
Für die Kultivierung der Explantate in einer dreidimensionalen Fibrinmatrix wurden
Deckgläschen (DG) zuerst mit 20 µl (entspricht 3 NIH-units) Thrombin (Topostasin,
Hoffmann la Roche) beschichtet, das bei Raumtemperatur eintrocknete. Die DG wurden in
eine 24-well Platte (Falcon, Becton&Dickinson) gesetzt. Als Zweites wurden 20 µl
Fibrinogen (3 mg/ml) (bovines Fibrinogen, Sigma) aufgebracht. In Kombination mit
Thrombin begann das Fibrinogen zu Fibrin zu gerinnen. In den gerinnenden Tropfen auf dem
DG wurden bis zu drei Explantate einzeln nacheinander mit der Braunüle gesetzt. Nach
Abschluss der Gerinnung erschien die Matrix milchig weiß. Anschließend wurde
Kulturmedium tropfenweise in die wells gegeben und die Platte im Brutschrank inkubiert. Die
verschiedenen Faktoren wurden in Kulturmedium vorverdünnt und zu den Kulturen gegeben.
Die Inkubation der Explantate erfolgte für 72 h bei 37° C mit einem Sauerstoffanteil von 95
und einem CO2-Anteil von 5 %.
Nach drei Tagen wurde 2 % Glutaraldehyd tropfenweise dem Medium zugesetzt, das
Gemisch entfernt durch reine Fixierlösung ersetzt. Die Fixation erfolgte entweder für 2 h bei
Raumtemperatur oder für 2 min bei 175 Watt Leistung in der Mikrowelle. Danach wurde
Glutaraldehyd abgenommen und die Präparate wurden in einer aufsteigenden Ethanolreihe
(30, 50, 70 %) entwässert. Ethanol wurde durch Sudanschwarz (1 %) ersetzt. Die Färbung
erfolgte entweder über Nacht bei Raumtemperatur oder für 2 min bei 175 Watt Leistung in
der Mikrowelle. Im letzten Fall mussten die Präparate abkühlen, bevor sie in einer
absteigenden Ethanolreihe (70, 90, 100, 90, 70, 50 und 30 %) rehydratisiert wurden. Die DG
wurden in destilliertem Wasser gesammelt und in Kaisers Gelatine auf Objekträgern
eingedeckelt.
Die gefärbten Explantate wurden unter einem Mikroskop mit Kamera lucida Projektion
untersucht, um das Neuritenwachstum zu beurteilen. Der Mikroskopaufsatz erlaubt es, Bilder
übereinander zu projizieren. Das Bild von konzentrischen Ringen mit gleichem Abstand
zueinander wurde über das Bild von jedem einzelnen Explantat projiziert. Dabei lag der
Mittelpunkt aller Kreise auf dem Mittelpunkt des Explantats. In den Explantaten der
25
Kontrollkulturen wurde die maximale Länge der Fortsätze ermittelt. In den behandelten
Kulturen wurde jeweils der längste Neurit bestimmt und die Mittelwerte aus den behandelten
Kulturen mit dem Mittelwert aus den Kontrollen verglichen, um das Wachstum zu messen.
2.4 Statistik
Als Kontrollen dienten in jeder Untersuchungsreihe Kulturen in Medium ohne Zusatz der
Testsubstanzen GBP-L, NAP, ADNF-9 oder CNTF/BDNF. Die Ergebnisse aus den
Kontrollen wurden normiert. Dies bedeutet, dass der Mittelwert für das Überleben in den
Kontrollkulturen in allen Untersuchungen den Wert 100 % erhielt. Die Überlebensrate in den
Substanz-behandelten Kulturen wurden mit der aus den Kontrollen verglichen. Die
Ergebnisse der Zellzählungen sind als Mittelwert in Prozent der Kontrollen mit ihrem 95 %
Konfidenzintervall (CI95, [Ober-, Untergrenze]) angegeben (Gardner MJ 1986; Altman 1991).
Die Ergebnisse aus den Kulturen isolierter RGZ, die mit GBP-L in fünf Konzentrationen
versetzt wurden, sind zur Darstellung der Konzentrations-Wirkungs-Kurve mit einer
nichtlinearen Regressionanalyse nach folgender Formel untersucht worden: y = 1 + Emax·
10log(c) / (10-pEC50 + 10log(c)). Die unabhängige Variable [c] ist die verabreichte Konzentration
[M] von GBP-L respektive Peptid. Die abhängige Variable [y] ist das Zellüberleben in
Prozent.
Als Parameter wurden Emax, pEC50 und pA2 bestimmt: Emax bezeichnet den maximalen
Effekt der zugesetzten Substanz. pEC50 ist der negative Logarithmus derjenigen
Konzentration von GBP-L oder Peptid, die zu einem halbmaximalen Effekt führt. In den
abgebildeten Konzentrations-Wirkungs-Kurven liegt der Wendepunkt der Kurve bei der
korrespondierenden
Konzentration
von
pEC50.
pA2
ist
eine
Maßzahl
für
die
pharmakologische Potenz eines Antagonisten und ist definiert als der negative Logarithmus
derjenigen Konzentration des Antagonisten, welche nötig ist, um eine Rechtsverschiebung der
Konzentrations-Wirkungskurve des Agonisten um das Zweifache zu verursachen. Der pA2
Wert für den Vergleich von Glibenclamid (Antagonist) und GBP-L (Agonist) wurde nach der
folgenden Formel berechnet: pA2 = log(10pIC50*
- pIC50
– 1) – log(Glibenclamid), wobei
pIC50* der negative Logarithmus der GBP-L Konzentration bei halbmaximalem Effekt in
Anwesenheit von Glibenclamid ist und pIC50 in Abwesenheit von Glibenclamid. Statistische
Unterschiede zwischen den Ergebnissen der Explantatkulturen wurden mit den ungepaarten tTests ermittelt.
26
III. ERGEBNISSE
3.1 Neuroprotektiver Effekt von Gabapentin-Laktam
Zur Untersuchung des Effekts von GBP-L auf isolierte RGZ, wurden Kulturen mit GBP-L in
fünf Konzentrationsstufen von 3,2 µM bis 320 µM behandelt. Zum Vergleich wurden in den
Kontrollen RGZ in N2 Medium ohne Zugabe von Faktoren kultiviert. Eine Vergleichsgruppe
erhielt die Wachstumsfaktoren BDNF und CNTF, beide in einer Konzentration von 50 ng/ml.
Nach 48 h wurde die Zahl vitaler Ganglienzellen in den GBP-L Kulturen erhoben und mit der
Anzahl vitaler Zellen in den Kontrollkulturen verglichen. Die Überlebensrate ist für jede
Gruppe in Prozent der Kontrollen angegeben.
Das Überleben der RGC lag unter GBP-L in Abhängigkeit von der Konzentration deutlich
über den unbehandelten Kontrollen (Abb. 3.1.1 a). Bei der Behandlung der RGZ-Kulturen mit
geringen Konzentrationen GBP-L lagen die Ergebnisse eng bei den Kontrollen. In
Konzentrationen von 32 µM, 100 µM und 320 µM steigerte GBP-L das Überleben signifikant
auf Werte von 145%, CI95 [134, 155], respektive 141%, CI95 [131, 151] und 140%, CI95 [130,
151]. Im Vergleich führte die Kombination von je 50 ng/ml BDNF und CNTF in den
Kulturen zu einer Steigerung der Überlebensrate auf 177%, CI95 [158, 196].
In einer zweiten Serie von Experimenten wurden die RGZ vor der Behandlung mit GBP-L für
15 min mit 1 µM des KATP-Kanalblockers Glibenclamid inkubiert. Die Inkubation mit
Glibenclamid wirkte dem Effekt von GBP-L entgegen und verringerte die Anzahl vitaler
Ganglienzellen in den Kulturen im Vergleich zu den Ergebnissen aus der ersten
Untersuchungsreihe (vergleiche Abb. 3.1.1 a und 3.1.1 b).
Wurde GBP-L in Konzentrationen von 3,2 µM, 10 µM und 32 µM zu den GlibenclamidKulturen gegeben, gab es keinen signifikanten Unterschied in der Zahl überlebender GRZ im
Vergleich zu den Kontrollkulturen. Die Überlebensrate bei 32 µM GBP-L sank von 145% in
den GBP-L Kulturen (Abb.3.1.1 a) unter Inkubation mit 1 µM Glibenclamid auf 112%, CI95
[100, 125] (Abb. 3.1.1 b). Der zuvor beobachtete Überleben-fördernde Effekt von 32µM
GBP-L wurde gehemmt. In den Kulturen, die mit hohen Konzentrationen von 100 µM und
320 µM GBP-L versetzt wurden, lag die Überlebensrate über dem Niveau der Kontrollen. Die
Überlebensraten stiegen auf 139 %, CI95 [116, 162] respektive 149 %, CI95 [135, 163].
27
b
175
150
150
320µM
100µM
0
32µM
0
10µM
25
3.2µM
25
320µM
50
100µM
50
75
32µM
75
100
10µM
100
125
3.2µM
125
Kontrollen
Überlebensrate [%]
175
Kontrollen
Überlebensrate [%]
a
Abb. 3.1.1 a: Überlebensrate retinaler Ganglienzellen (P0-P2) nach 48 h in Kultur in N2 Medium
(Kontrollen) und unter Zugabe von GBP-L in fünf Konzentrationen (3,2 µM - 320 µM). Ergebnisse als
Mittelwerte in Prozent der Kontrollen und CI95 angegeben. b: mit Glibenclamid alle Kulturen wurden mit 1 µM
Glibenclamid inkubiert vor der Zugabe von GBP-L in fünf Konzentrationen (3,2 µM - 320 µM).
Die Überlebensraten für 100 µM und 320 µM GBP-L erreichten trotz Inkubation mit
Glibenclamid das Niveau der Ergebnisse aus der ersten Serie ohne den KATP-Kanalblocker
(um 140 %).
Die Ergebnisse aus den beiden Serien a und b wurden mit einer nichtlinearen
Regressionanalyse untersucht und die Konzentrations-Wirkungskurven für GBP-L mit und
ohne Glibenclamid ermittelt. Trägt man den Logarithmus der GBP-L Konzentration gegen die
Überlebensrate (normalized cell count) als Vielfaches der Kontrollen auf, entstehen zwei
semilogarithmische Konzentrations-Wirkungskurven für das Überleben der RGZ unter GBPL (Abb. 3.1.2 durchgehende Linie) und das Überleben unter GBP-L nach Inkubation mit 1
µM Glibenclamid (gestrichelte Linie).
Überlebensrate RGZ
(1.0 = 100 %)
28
Konzentration GBP-L [log (µM)]
Abb. 3.1.2: Vergleich der Konzentrations-Wirkungs-Kurven von GBP-L mit und ohne Inkubation der
RGZ mit 1 µM Glibenclamid. GBP-L (■, durchgehende Linie) und GBP-L nach Gabe von Glibenclamid (□,
unterbrochene Linie). x-Achse: logarithmische Auftragung der GBP-L Konzentration [log(µM)], φ: Kontrollen
in N2 Medium, y-Achse: Überlebensrate der RGZ in Kulturen mit GBP-L mit und ohne Zugabe von
Glibenclamid verglichen mit Kontrollkulturen (Formel: y = absolute Zellüberlebensrate unter GBP-L ohne/mit
Glibenclamid / absolute Überlebensrate in Kontrollkulturen).
Der Kurvenverlauf für GBP-L zeigt eine Sättigung. Bei 32 µM wurde der maximale Effekt
auf die Überlebensrate beobachtet, höhere Konzentrationen führen zu keiner weiteren
Steigerung der Überlebensrate. Die Analyse der Daten für die Inkubation mit Glibenclamid
führt zu einer semilogarithmischen Konzentrations-Wirkungskurve, welche im Vergleich zur
GBP-L Kurve nach rechts verschoben ist (unterbrochene Linie). Es sind höhere
Konzentrationen GBP-L nötig, wenn die Kulturen mit Glibenclamid inkubiert wurden, um
denselben Effekt auf das Überleben der RGZ zu erzielen. In der Pharmakologie ist diese
Verschiebung der Kurven für kompetitive Agonisten und Antagonisten charakteristisch. Die
Analyse der Untersuchungsergebnisse spricht dafür, dass Glibenclamid als kompetitiver
Antagonist den Effekt von GBP-L verminderte.
Zum Vergleich der Konzentrations-Wirkungskurven betrachtet man die Wendepunkte der
Kurve und die Konzentration, die einen halbmaximalen Effekt bewirkt. Der Logarithmus
29
dieser GBP-L Konzentration, der pEC50 Wert, betrug für die GBP-L Kulturen 4,97, CI95
[4,71, 5,26]. Für die Ergebnisse unter GBP-L und Glibenclamid betrug der pEC50 4,11, CI95
[3,53, 4,66]. Damit ist eine signifikant höhere Konzentration GBP-L in Anwesenheit von
Glibenclamid nötig, um einen gleichwertigen Effekt zu erzielen. Anders ausgedrückt muss die
Konzentration an GBP-L um ein Vielfaches gesteigert werden, um den Effekt des
kompetetiven Antagonisten Glibenclamid auszugleichen. Der negative Logarithmus
derjenigen Konzentration des Antagonisten (Glibencalmid), welche nötig ist, um eine
zweifache Rechtsverschiebung der Konzentrations-Wirkungskurve des Agonisten (GBP-L) zu
verursachen ist definiert als der pA2 Wert. Er ist eine Maßzahl für die pharmakologische
Potenz des Antagonisten. Die Analysen ergaben für Glibenclamid den pA2 Wert 6,80, CI95
[5,88, 7,46].
In folgenden Untersuchungen wurde der zweite KATP-Kanalantagonist 5-HD eingesetzt.
Während Glibenclamid unspezifisch sowohl die an der Zellmembran lokalisierten KATPKanäle als auch die mitochondrialen KATP-Kanäle blockiert, wirkt 5-HD als selektiver
Blocker der mitochondrialen KATP-Kanäle. In der dritten Serie von Experimenten wurde das
Überleben der RGZ unter Behandlung mit 32 µM GBP-L mit und ohne die vorhergehende
Inkubation der Kulturen mit 100 µM 5-HD untersucht (Abb. 3.1.3 a).
Die Überlebensrate der RGZ stieg unter 32 µM GBP-L auf 151%, CI95 [136, 167]. Dieses
Ergebnis liegt im Vertrauensintervall der ersten Untersuchungen zu GBP-L (Abb.3.1.1 a).
Wurden die RGZ Kulturen mit 100 µM 5-HD inkubiert, bevor 32 µM GBP-L zugesetzt
wurde, sank die Überlebensrate auf das Niveau der Kontrollen (98%, CI95 [84, 113]). 5-HD
blockierte den protektiven Effekt von GBP-L vollständig, 151 % bei GBP-L versus 98% bei
GBP-L und 5-HD. Im Gegensatz dazu führte Glibenclamid zu einer Abnahme von 145% auf
117% bei 32 µM GBP-L (Abb. 3.1.1 a, b). Um einen toxischen Effekt von 5-HD auf die RGZ
auszuschließen, wurden Kulturen mit 100 µM 5-HD inkubiert. Die Überlebensrate lag auf
dem Niveau der unbehandelten Kontrollen mit 96%, CI95 [77, 114]. Die RGZ in den 5-HDKulturen wiesen keinen Unterschied zu den Kontrollen auf .
30
a
b
175
150
Überlebensrate [%]
125
100
75
50
25
125
100
75
50
GBP-L
0
GBP
5HD
GBP-L,5HD
GBP-L
25
Kontrolle
0
150
Kontrolle
Überlebensrate [%]
175
Abb. 3.1.3 a: Überlebensrate retinaler Ganglienzellen (P0-P2) nach 48 h in N2 Medium (Kontrolle), in
Anwesenheit von 32 µM GBP-L ohne (GBP-L) und mit Präinkubation (GBP-L, 5HD) der Kulturen mit 100 µM
5-HD und unter Zugabe von 100 µM 5-HD (5HD). b: Überlebensrate retinaler Ganglienzellen (P0-P2) nach
48 h in Anwesenheit von 32 µM Gabapentin (GBP) und 32 µMGBP-L im Vergleich zu Kontrollen. Alle
Ergebnisse sind in Prozent der Kontrollen mit ihrem CI95 angegeben.
In der letzten Serie wurde der Effekt von GBP-L auf die RGZ mit dem seiner
Ursprungssubstanz Gabapentin verglichen (Abb. 3.1.3 b). 32 µM GBP-L führten zu einer
Steigerung des Zellüberlebens auf 128%, CI95 [113, 143] verglichen mit den Kontrollen.
Gabapentin hatte in gleicher Konzentration (32 µM) keinen Effekt auf die Überlebensrate der
RGZ, sie lag auf dem Niveau der Kontrollen (95%, CI95 [82, 108]).
3.2 Neuroprotektiver Effekt der Peptide NAP und ADNF-9
Die Wirkung der Neuropeptide auf das Überleben der RGZ wurde in Kulturen mit NAP und
ADNF-9 in verschiedenen Konzentrationen untersucht. Die Peptide wurden in einer
Verdünnungsreihe im Verhältnis 1:20 vorbereitet, so dass die Konzentrationen in den
Kulturen von 1,56 aM bis 0,1 nM reichten (Tab. 3.2.1). In den Kontrollen wurden die RGZ in
N2 Medium kultiviert. Zum Vergleich dienten Kulturen, die mit je 50 ng/ml BDNF und
31
CNTF behandelt wurden. Sowohl NAP als auch ADNF-9 steigerten die Überlebensrate der
RGZ signifikant in Abhängigkeit von der Konzentration (Abb. 3.2.1 a-d).
Peptidkonzentration
entspricht
in 1. Serie (1:20)
Peptidkonzentration entspricht
in 2. Serie (1:4)
10-10 M
0,1 nM
10-13 M
0,1 pM
5 · 10-12 M
5,0 pM
2,5 · 10-14 M
25,0 fM
2,5 · 10-13 M
0,25 pM
6,25 · 10-15 M
6,25 fM
1,25 · 10-14 M
12,5 fM
1,56 · 10-15 M
1,56 fM
6,25 · 10-16 M
0,625 fM
3,91 · 10-16 M
0,39 fM
3,125 · 10-17 M
31,25 aM
9,76 · 10-17 M
97,6 aM
1,56 · 10-18 M
1,56 aM
2,44 · 10-17 M
24,4 aM
Tabelle 3.2.1: Umrechnungstabelle der Konzentrationen von NAP und ADNF-9 in den beiden
Untersuchungsreihen. Abkürzungen: n = nano (10-9), p = pico (10-12), f = fempto (10-15), a = atto (10-18).
Der maximale Effekt von ADNF-9 lag bei 146% und wurde in den beiden höchsten
Konzentrationen von 5,0 pM, CI95 [123, 169], und 0,1 nM, CI95 [128, 163] beobachtet (Abb.
3.2.1 c). 0,25 pM ADNF-9 führten zu einem Anstieg der Überlebensrate auf 136%, CI95 [117,
154]. Wurde 12,5 fM ADNF-9 zugegeben, lag die Überlebsrate bei 123%, CI95 [107, 140].
Dieser Effekt ist genau halb so groß wie der maximale Effekt (146%), der unter 5,0 pM und
0,1 nM beobachtet wurde. Die Analyse aller Daten ergab für ADNF-9 eine EC50 von 10,9 fM
als Konzentration, die einen halbmaximalen Effekt bewirkt. Bei der Behandlung der Kulturen
mit ADNF-9 in Konzentrationen unter 12,5 fM gab es keinen signifikanten Unterschied zu
den Kontrollen. Im Vergleich lag der Effekt von der Kombination aus BDNF und CNTF bei
einer Überlebenrate von 170 %, CI95 [131, 209].
NAP führte zu ähnlichen Ergebnissen (Abb. 3.2.1 a). Der maximale Effekt betrug 167%, CI95
[125, 170] für 5,0 pM NAP und lag über dem von ADNF-9 in gleicher Konzentration (146%).
Die Analyse der NAP-Reihe führte zu einer EC50 von 6,1 fM. Im Vergleich zu ADNF-9
(EC50 10,9 fM) ist eine geringere Konzentration von NAP notwendig, um den gleichen
Effekt wie ADNF-9 zu erzielen. Die Kombination aus BDNF und CNTF bewirkte im
Vergleich zu NAP eine Zunahme des Überlebens auf 205 %.
32
Zellüberleben [%]
250
250
200
200
150
150
100
100
50
50
0
-20
-18
-16
-14
-12
-10
-8
Zellüberleben [%]
a. Kontrolle, NAP[logM], BDNF/CNTF
0
-20 -18 -16 -14 -12 -10
-8
b. Kontrolle, NAP[logM], BDNF/CNTF
250
300
200
250
200
150
150
100
100
50
0
-20 -18 -16 -14 -12 -10
50
-8
0
-20 -18 -16 -14 -12 -10
-8
c. Kontrolle ADNF-9[logM] BDNF/CNTF d. Kontrolle ADNF-9[logM] BDNF/CNTF
Abb. 3.2.1 a-d: Überlebensrate retinaler Ganglienzellen (P0-P2) nach 48 h Kultur in N2 Medium (Kontrolle),
unter Behandlung mit NAP (▲) oder ADNF-9 (▲) und mit 50 ng/ml BDNF und CNTF (■). x-Achse:
Logarithmus der Peptidkonzentration [M]. y-Achse: Zellüberleben in Prozent der Kontrollen. Die Fehlerbalken
geben das 95 % Confidenzintervall (CI95) an. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen zwei Ergebnissen
liegen vor, wenn sich die Intervalle nicht überlappen. Getestet wurden a) NAP (▲) und c) ADNF-9 (▲) in
jeweils sieben Konzentrationsstufen von 10-18 M bis 10-10 M. In einer zweiten Serie b) NAP (▲) und d) ADNF9 (▲) in sieben Konzentrationsstufen von 10-17 M bis 10-13 M. In allen Abbildungen sind zum Vergleich die
Ergebnisse aus den Kontrollkulturen (■, bei x = −19) und den Kulturen mit BDNF und CNTF (■, bei x = −9)
angegeben.
33
Die Untersuchung der Ergebnisse aus den Kulturen, denen NAP oder ADNF-9 in
Konzentrationen von 1,56 aM bis 0,1 nM zugesetzt wurden, erfolgte anhand einer
nichtlinearen Regressionsanalyse. Die Ergebnisse in Form von Konzentrations-WirkungsKurven für NAP und ADNF-9 zeigen den Effekt der Peptide auf das Überleben der RGZ
(Abb. 3.2.1 a, c schwarze Linien). Man beobachtet einen Anstieg der KonzentrationsWirkungs-Kurve hin zum maximalen Effekt und anschließend ein Plateau. Dies ist Ausdruck
einer Sättigung unter höheren Peptidkonzentrationen. Die EC50 liegt am Wendepunkt der
errechneten Kurve.
Der weite Konzentrationsrahmen von 1,56 aM bis 0,1 nM aus der ersten Serie wurde in einer
zweiten Reihe von Experimenten auf den Konzentrationsbereich fokussiert, in dem der
Wendepunkt der Konzentrations-Wirkungs-Kurve lag. Eine gleichmäßige Zunahme des
Effekts auf die Überlebensrate mit steigender Peptidkonzentration sollte in kleineren
Konzentrationsschritten reproduziert werden. Die Peptide wurden in einer Verdünnungsreihe
im Verhältnis 1:4 vorbereitet und in sieben Konzentrationsstufen von 24,4 aM bis 0,1 pM den
Kulturen zugesetzt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Zunahme der Überlebensrate nicht
sprunghaft oder unregelmäßig sondern sowohl für NAP als auch ADNF-9 in einem relativ
gleichförmigen Anstieg erfolgt (Abb. 3.2.1 b, d). In einer Konzentration von 0,39 fM steigerte
ADNF-9 das Überleben auf 135 %, CI95 [115, 155]. 6,25 fM ADNF-9 lagen kaum darüber mit
136%. Eine deutliche Zunahme der Überlebensrate auf 164 %, CI95 [140, 188] wurde unter
25,0 fM beobachtet. Dies entspricht der Stelle, an der zuvor in der ersten Untersuchungsreihe
der deutliche Anstieg der Überlebensrate bei 12,5 fM beobachtet wurde. Den maximalen
Effekt erzielte die höchste eingesetzte Konzentration von 0,1 pM ADNF-9 mit
einer
Überlebensrate von 177 %, CI95 [149, 204].
In den Experimenten mit ADNF-9 erreichten die Werte insgesamt ein höheres Niveau als in
der ersten Untersuchungsreihe (vergleiche Abb.3.2.1 c und d). Dies spiegelt sich auch in dem
Ergebnis der Behandlung mit CNTF und BDNF wider mit 276 %, CI95 [215, 336].
In der zweiten Untersuchungsreihe mit NAP lag das Gesamtniveau der Werte niedriger (Abb.
3.2.1 a und c). In der Vergleichsgruppe BDNF plus CNTF wurde ein Ergebnis von 165 %,
CI95 [151, 178] erzielt. Mit dem Anstieg der Konzentration von NAP konnte eine
kontinuierliche Zunahme des protektiven Effekts beobachtet werden (Abb. 3.2.1 b). Wie
zuvor führte NAP in Konzentrationen über 12,5 fM zu einer signifikanten Zunahme des
Überlebens. Für 6,25 fM lag die Überlebensrate bei 112%, 25,0 fM steigerten das Überleben
auf 134 %. Den maximale Effekt erzielten 0,1 pM NAP, er lag bei 147 %, CI95 [135, 160].
34
In ergänzenden Experimenten wurde ADNF-9 in einer Konzentration von 1 pM in
Kombination mit BDNF oder CNTF oder beiden eingesetzt. Es gab keinen signifikanten
Unterschied zwischen den Ergebnissen in den Kombinationen von CNTF oder BDNF oder
beiden mit ADNF-9 und den jeweiligen Werten ohne ADNF-9 (Ergebnisse nicht in
Abbildungen dargestellt).
3.3 Neuroregeneration - Neuritenwachstum nach Axotomie in retinalen Explantaten
In Explantatkulturen von Netzhautgewebe von Ratten (P9 – P11) wurde der Einfluss von
ADNF-9 und NAP auf das Aussprossen von Neuriten beobachtet. Die Peptide ADNF-9 und
NAP wurden in einer Konzentration von 1 µM zugesetzt. Die Wahl der höheren Dosierung im
Vergleich zu den Konzentrationen in den RGZ Kulturen beruhte auf der Überlegung, dass die
Substanzen durch das Fibrin diffundieren mussten und nur einmal zu Beginn der 72 h
Kulturzeit zugegeben wurden. Die Konzentration sollte über die gesamte Kulturzeit im
sättigenden Bereich liegen. Die tatsächliche Konzentration am Netzhautgewebe ließ sich nicht
ermitteln. In den Kulturen wurde während der 72 h das radiäre Wachstum von Neuriten
beobachtet, die ihren Ursprung an einem beliebigen Ort des Explantatgewebes nahmen und
über den Explantatrand hinaus in das Fibrin wuchsen (Abb. 3.3.1). Der genaue zelluläre
Ursprung eines Neuriten war nicht festzustellen, da Explantat und Fortsätze gleichmäßig
angefärbt wurden.
Die Peptide NAP und ADNF-9 bewirkten in den Explantatkulturen eine Zunahme des
Neuritenwachstums (Abb. 3.3.1, Abb. 3.3.2). Es wurden längere Fortsätze beobachtet im
Vergleich zu den Kontrollen in Kulturmedium. 1 µM NAP steigerte das Neuritenwachstum
auf 117%, CI95 [98, 137]. ADNF-9 erzielte in einer Konzentration von 1 µM eine Zunahme
des Neuritenwachstums auf 126 %, CI95 [118, 133]. Das längste Wachstum wurde unter
Zugabe von BDNF und CNTF beobachtet und lag bei 202 %, CI95 [191, 213].
35
Kontrolle
NAP
ADNF-9
BCF
Abbildung 3.3.1: Neuritenwachstum retinaler
Explantate (P9-P11) nach 72 h Kulturzeit in
Kulturmedium (Kontrolle), unter Zugabe von
1µM NAP, 1µM ADNF-9 und 50 ng/ml
BDNF,CNTF. Digitalfotografien nach Färbung
mit Sudanschwarz. Vergrößerung 200fach.
200
175
150
125
100
75
50
BDNF, CNTF
ADNF-9 1 µM
0
NAP 1 µM
25
Kontrollen
Neuritenwachstum [%]
225
Abb. 3.3.2: Neuritenwachstum retinaler
Explantate (P9-P11) nach 72 h Kulturzeit in
Kulturmedium (Kontrollen), unter Zugabe von
ADNF-9, NAP und 50 ng/ml BDNF,CNTF.
Verglichen wurde die Länge der aussprossenden
Neuriten von Explantatrand aus in den
behandelten Kulturen mit der Länge in den
Kontrollen. Ergebnisse als Mittelwert in Prozent,
die Fehlerbalken geben das Konfidenzintervall
CI95 an.
Die Dichte der aussprossenden Neuriten ließ sich schlecht standardisiert beurteilen, da das
Axonwachstum in mehreren Ebenen innerhalb der dreidimensionalen Fibrinmatrix erfolgte.
Damit treten bei der Auswertung Probleme auf, wenn bei einer Vergrößerung unter dem
36
Mikroskop mehrere Axone im Vergleich beurteilt werden sollen, die jedoch auf Grund der
geringen Schärfentiefe nur mit unterschiedlicher Fokussierung im einzelnen zu erkennen sind.
Festhalten kann man, dass sich die Dichte der aussprossenden Neuriten in den Peptidkulturen
im Vergleich zu den Kontrollen im subjektiven Vergleich nicht wesentlich veränderte. Unter
BDNF und CNTF war eine optische Zunahme der Neuritendichte um das Explantat herum zu
beobachten, die Anzahl der Neuriten in Explantatnähe aber zu hoch für eine genaue Zählung.
An den Enden der aussprossenden Neuriten konnte man bei hoher Vergrößerung die für
neuronale Regeneration typischen Wachstumskegel beobachten (Abb. 3.3.3).
Kontrolle
NAP
ADNF-9
BDNF/ CNTF
Abb. 3.3.3: Wachstumskegel der Neuriten retinaler Explantate (P9-P11) nach 72 h in Kulturmedium
(Kontrolle), unter Zugabe von NAP, ADNF-9 und BDNF/ CNTF. Digitalfotografien nach Färbung der
Explantate und der aussprossenden Fortsätze mit Sudanschwarz. Vergrößerung 400fach.
37
IV. DISKUSSION
4.1 Gabapentin-Laktam
4.1.1 Neuroprotektion
In der vorliegenden Arbeit wird zum ersten Mal ein positiver Effekt von GBP-L auf das
Überleben retinaler Ganglienzellen in vitro beschrieben. Die Wirkung von GBP-L wurde
unter minimal essentiellen Bedingungen in Kulturen gereinigter RGZ getestet, in denen
sowohl die trophischen Faktoren des Gewebes als auch die natürliche Stützfunktion des
Zellverbands (Netzwerk) fehlten. Die Behandlung der Kulturen mit 32 µM GBP-L steigerte
das Überleben auf 145 % im Vergleich zu den Kontrollen. Der Effekt war
konzentrationsabhängig. Das Ergebnis steht in Einklang mit einer früheren Untersuchung in
vivo, in welcher der neuroprotektive Effekt von GBP-L auf RGZ in einem Modell für
Netzhautischämie bei der Ratte getestet wurde (Lagrèze WA 2001). Vor einer einstündigen
Ischämie wurde GBP-L intraperitoneal appliziert. Die Untersuchung der Netzhautquerschnitte
zeigte, dass die Überlebensrate der RGZ von 28 % auf 70 % unter GBP-L stieg. Dabei wurde
eine Dosis von 75 mg/kg verabreicht, die Blutkonzentration wurde nicht ermittelt.
Der Vergleich von GBP-L mit CNTF und BDNF diente der Relation des neuroprotektiven
Effekts. Beide neurotrophen Faktoren versorgen Ganglienzellen unter physiologischen
Bedingungen (Johnson JE 1986; Stockli KA 1991). RGZ exprimieren die Rezeptoren für
CNTF und BDNF (Cellerino A 1997; Kirsch M 1997). In Kultur isolierter RGZ steigerte die
Kombination von CNTF und BDNF wirksam das Überleben sowohl von Zellen embryonaler
als auch neugeborener Ratten (Meyer-Franke A 1995). In der vorliegenden Arbeit stieg das
Überleben der RGZ unter Behandlung mit der Kombination auf 177 %. Der Effekt von BDNF
plus CNTF war größer als bei der Behandlung mit GBP-L allein. Dieses Ergebnis ist
schlüssig, wenn man bedenkt, dass eine einzelne Substanz mit der Kombination zweier
potenter Stoffe konkurrierte. Die Möglichkeit, dass GBP-L in Kombination mit BDNF oder
CNTF
oder
beiden
einen
größeren
Wirkmechanismen vermutet werden.
Effekt hervorruft,
besteht,
da
verschiedene
38
4.1.2 Wirkmechanismus
Der Wirkmechanismus von GBP-L war bislang unklar. Es wurde vermutet, dass GBP-L
KATP-Kanäle öffnet (Jehle T 2000). Diese Kanäle sind in der Zellmembran lokalisiert, liegen
aber auch in der inneren Mitochondrienmembran (Kubo Y 1993; Inagaki N 1995a; Inagaki N
1995b). Sinkt die ATP-Konzentration unter Energiemangel, führt das Öffnen der Kanäle zu
einer Hyperpolarisation der Zellmembran (Kersten JR 1998). Mehrere Untersuchungen
wiesen die Bedeutung von KATP-Kanälen bei kardialer und cerebraler ischämischer
Präkonditionierung nach (Liu Y 1992; Heurteaux C 1995; Liu Y 1999; Tanno M 2001).
Dieses Phänomen besteht darin, dass eine kurze Ischämie vor einer folgenden, längeren
Ischämie schützt. An dem Prozess sind Adenosin, die Aktivierung von Adenosin A1Rezeptoren und KATP-Kanälen beteiligt. KATP-Kanalöffner imitierten den Effekt der
ischämischen Präkonditionierung, wohingegen Antagonisten den Effekt verringerten
(Heurteaux C 1995; Tanno M 2001). Diese Ergebnisse stützen die These, dass KATP-Kanäle
eine bedeutende Rolle in dem Prozess der ischämischen Präkonditionierung spielen. So
verhindert die Gabe von KATP-Kanalöffnern das Absterben von Neuronen im Hippocampus
nach ischämischen Insulten. Dieser Effekt kann durch den KATP-Kanal-Antagonisten
Glipizide blockiert werden (Heurteaux C 1993).
Um die These zum Wirkmechanismus von GBP-L zu testen, wurden in der vorliegenden
Arbeit bekannte KATP-Kanalblocker eingestzt. Als erstes wurden die isolierten RGZ mit dem
KATP-Kanal-Antagonist Glibenclamid inkubiert, der sowohl an den Kanälen der Zellmembran
als auch an denen der Mitochondrien wirkt (Kersten JR 1998). Die Inkubation der RGZ mit
Glibenclamid verringerte den protektiven Effekt von GBP-L. Die Analyse der Ergebnisse
zeigte, dass Glibenclamid die Konzentrations-Wirkungs-Kurve von GBP-L nach rechts
verschob mit einem pA2 Wert von 6.8. Der pA2 ist ein Maß für die Potenz eines
Antagonisten. Andere Untersuchungen lieferten vergleichbare pA2 Werte für Glibenclamid
(Eltze 1989; Satoh K 1991; Freiman TM 2001). Die Ergebnisse legen nahe, dass
Glibenclamid als kompetitiver Antagonist von GBP-L gewirkt hat.
Als zweite Substanz wurde 5-HD verabreicht. 5-HD ist ein spezifischer Antagonist der
mitochondrialen KATP-Kanäle (Liu Y 1992; Hu H 1999; Liu Y 1999; Kicinska A 2000). In
meinen Versuchen blockierten 100 µM 5-HD vollständig den Effekt von GBP-L in
sättigender Konzentration von 32 µM. Dieses Ergebnis stützt die Vermutung, dass GBP-L als
39
KATP-Kanal-Agonist an den mitochondrialen Kanälen wirkte. Aus beiden Untersuchungen
kann man schließen, dass der protektive Effekt von GBP-L auf die isolierten RGZ auf das
Öffnen von KATP-Kanälen zurückzuführen ist.
4.1.3 KATP-Kanal-Agonisten in vitro
Es stellt sich die Frage, auf welche Weise das Öffnen von mitochondrialen KATP-Kanälen zur
Protektion beiträgt [zur Übersicht siehe (Szewczyk A 1999; O'Rourke 2000; Szewczyk A
2002)]. Mitochondrien sind die Energielieferanten der Zelle und synthetisieren ATP. Der
Transport von Protonen ins Cytoplasma entlang der Atmungskette führt zum Aufbau des
transmembranären Potentials und des pH-Gradienten über die mitochondriale Membran. Die
Aufrechterhaltung dieser Gradienten ist grundlegend für die Funktion der Organellen. KATPKanalöffner erhöhen die Permeabilität für Kalium an der inneren Mitochondrienmembran und
senken das transmembranäre Potential (Kicinska A 2000; Szewczyk A 2002). Es wird
vermutet,
dass
die
Potenzialverringerung
die
Mitochondrien
entlastet,
da
der
Energieverbrauch abnimmt, wenn einer anstelle von zwei Gradienten aufrechterhalten werden
muss. Die Abnahme des Potenzials führt durch eine partielle Entkopplung der Atmungskette
zu einer verminderten Produktion freier Sauerstoffradikale (Skulachev 1996). Weitere Studien
zeigten, dass die Produktion von ATP durch KATP-Kanalöffner steigt (Wang Y 1999; Garlid
2000). Vermutet wurde, dass der protektive Effekt auf einer Senkung der mitochondrialen
Calciumüberladung beruhe (Crestanello JA 2000). Die Beteiligung von KATP-Kanälen an
Anti-Apoptoseprozessen wurde auch auf dem Niveau der Genexpression nachgewiesen.
Untersuchungen zeigten, dass KATP-Kanalöffner die Ischämie induzierte Expression von cfos, c-jun, heat shock protein und ß-Amyloid Vorläufergenen verhinderten (Heurteaux C
1993) und in hippokampalen Neuronen zu einer gesteigerten Expression der antiapoptotischen Proteine Bcl-2 und Bcl-X führten (Jakob R 2000a).
4.1.4 Vergleich GBP-L und Gabapentin
Im Vergleich zu GBP-L erzielte Gabapentin in derselben Konzentration keinen Effekt auf das
Überleben der RGZ. Eine Erklärung dafür könnte sein, dass es in der gewählten
Konzentration von 32 µM nicht den erforderlichen Wirkspiegel in den RGZ Kulturen
erreichte, während GBP-L bei 32 µM den maximalen Effekt erzielte. Eine andere Möglichkeit
40
ist, dass die isolierten RGZ Gabapentin nicht metabolisieren können. In vivo wirkte GBP-L
bei Untersuchungen zur Netzhautischämie neuroprotektiv, nicht jedoch Gabapentin (Lagrèze
WA 2001). Es wurde vermutet, dass Gabapentin in eine wirksame Form umgewandelt werden
muss, bevor es neuroprotektiv wirkt. Betrachtet man den Wirkmechanismus auf zellulärer
Ebene, mag die Ursche darin liegen, dass GBP-L seine Wirkung vor allem an mitochondrialen
KATP-Kanälen entfaltet, während Gabapentin an den sarkolemmalen Kanälen angreift.
Elektrophysiologische Untersuchungen zeigten, dass GBP-L mitochondriale KATP-Kanäle
aktivierte und das Membranpotential senkte, während Gabapentin kaum einen Effekt auf das
mitochondriale Potential hatte (Jehle T 2000). In Hinblick auf eine Pharmokotherapie ist das
Laktam dem Gabapentin in einer weiteren Hinsicht überlegen, da es die Blut-Hirn-Schranke
und die Blut-Retina-Schranke besser penetriert.
4.1.5 Ausblick
Die vorliegende Arbeit zeigt den protektiven Effekt von GBP-L auf isolierte RGZ in vitro. In
folgenden Studien sollte der Effekt von GBP-L in Hinblick auf Änderungen des
mitochondrialen Stoffwechsels genauer untersucht werden. In vivo sollten sich Studien zum
Effekt z.B. nach intravitrealer Injektion bei Läsion des Sehnerven oder in Glaukommodellen
anschließen, um die Einsatzmöglichkeiten von GBP-L in der Therapie akuter und chronischer
Erkrankungen der Retina zu untersuchen.
4.2 Neuropeptide NAP und Activity-dependent neurotrophic factor-9 (ADNF-9)
4.2.1. Neuroprotektion
Die Untersuchungen zeigen einen positiven Effekt der Neuropeptide NAP und ADNF-9
sowohl auf das Überleben von isolierten Ganglienzellen in Kultur als auch auf die
Regeneration von Neuriten in Explantaten der Netzhaut. In den Kulturen isolierter
Ganglienzellen bei neugeborenen Ratten reduzierten NAP und ADNF-9 in Abhängigkeit von
der Konzentration den Zelluntergang. Eine Wirkung wurde bei beiden Peptiden schon bei
41
Konzentrationen um 10-14 M beobachtet. Maximale Effekte wurden jeweils bei 0,1 nM
beobachtet. NAP steigerte das Zellüberleben auf bis zu 177 % verglichen mit den Kontrollen.
4.2.2. Neuropeptide in vitro
In vitro schützte NAP in vergleichbaren Konzentrationen vor der Degeneration durch
verschiedene Neurotoxine in Kulturen cerebraler Kortexneurone und in gemischten
Astrozyten-Neuronen-Kulturen des Kortex von neugeborenen Ratten (Bassan M 1999): Im
Einzelnen wirkte NAP gegen die natürliche Degeneration der Neurone in Kultur und gegen
Zelltod durch elektrische Blockade mit Tetrodotoxin in Konzentrationen von 10-18 M bis 10-14
M und gegen ß-Amyloid Toxizität in Konzentration von 10-16 M bis 10-14 M. NAP (10-16 M
bis 10-8 M) verhinderte den durch das exzitotoxische N-methyl-D-Aspartat (NMDA)
induzierten Zelltod und bot Schutz vor dem toxischen Effekt von Glykoprotein 120 (gp120),
eines der Hüllproteine des human immundeficiency virus (HIV), in Konzentrationen von 10-15
M bis 10-10 M. Wie für andere Neuropeptide und Wachstumsfaktoren wurde für NAP und
ADNF-9 mehrfach ein umgekehrt U-förmiger Verlauf der Konzentrations-Wirkungs-Kurve
aufgezeichnet. Der wirksame Bereich war meist ungewöhnlich breit und erstreckte sich
beispielsweise für NAP über sechs Zehnerpotenzen.
ADNF-9 schützte vor dem Neurotoxin ß-Amyloid in Kulturen von Neuronen des cerebralen
Kortex der Ratte (Zamostiano R 1999). Dosiswirkungsstudien ergaben EC50 von 10-15 M. Der
Effekt war in gemischten Glia- und Neuronenkulturen und in isolierten Neuronenkulturen zu
beobachten. ADNF-9 schützte Kulturen embryonaler Neurone aus dem Hippokampus der
Ratte vor Schäden durch oxidativen Stress, vor FeSO4-induzierter Apoptose und vor Schäden
durch Entzug trophischer Faktoren (Glazner GW 1999a). 1 pM und 1 nM ADNF-9
verringerten den FeSO4–induzierten Zelltod auf Kontrollwerte. Es wurde auch eine geringere
Akkumulation von ROS in den Mitochondrien beobachtet. In einer weiteren Studie wurde der
Effekt von VIP, ADNF-9 und NAP in Kulturen von Phäochromozytomzellen der Ratte
(PC12), menschlichen Neuroblastomzellen und cerebellären Körnerzellen der Ratte
untersucht, die durch die Toxine Dopamin, 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) und 1-methyl-4phanylpyrimidinium Ionen (MPP+) geschädigt wurden (Offen D 2000). ADNF-9 und NAP
schützten die Nervenzellen in Konzentrationen von 10-18 M bis 10-10 M gegen Dopamin und
6-OHDA. ADNF-9 induzierte in picomolaren Konzentrationen die Aktivierung von NF-kB in
42
Neuronen und schützte gegen oxidativen Stress und Degeneration durch Entzug trophischer
Faktoren (Glazner GW 2000). In Kulturen von sensorischen Ganglienzellen aus dem
Rückenmark verdoppelte ADNF-14 (0,1 fM) den Anteil der Neurone in Kultur, die Neuriten
ausbildeten (White D 2000). NAP verhinderte den Zelluntergang durch ß-Amyloid Toxizität
und Glucose-Deprivation in Kulturen isolierter Neurone des Kortex bei neugeborenen Ratten
(Zemlyak I 2000). Dabei lag die Konzentration, um einen maximalen Effekt nach 24 h
Toxinexposition zu erzielen, bei 10-12 M NAP, bei einer Inkubationszeit von 5 Tagen mit ßAmyloid und einmaliger Applikation von NAP zu Beginn lag sie bei 10-10 M. In einem
Modell für oxidativen Stress führte H2O2 zu einer Abnahme des Zellüberlebens von bis zu 50
% (Steingart RA 2000). ADNF-9 und NAP, die vor oder während der H2O2-Gabe zu den
Kulturen gegeben wurden, verringerten das Absterben der Zellen und führten zu einer
Steigerung der Überlebensrate auf 80 - 90 %. NAP schützte PC12 Zellen gegen TNF-αToxizität in Abhängigkeit von der Konzentration; maximale Effekte wurden bei 10-14 M
beobachtet (Beni-Adani L 2001). In Kulturen von cerebralen Kortexneuronen der Ratte führte
NAP (10-16 M bis 10-7 M) zu einem Anstieg des intrazellulären Gehalts an cGMP (AshurFabian O 2001). In einer Konzentration von 10-10 M steigerte NAP den extrazellulären
Spiegel von Stickoxid (NO) um 60 %.
Bei ADNF-9 wurde in gemischten Kulturen von Neuronen und Gliazellen ein Abschwächung
des neuroprotektiven Effektes bei hohen Konzentrationen beobachtet, während in isolierten
Nervenzell-Kulturen keine Minderung des Effekts auch bei hohen Konzentrationen von
ADNF-9 beobachtet wurde (Brenneman DE 1998). Verschiedene Erklärungen lassen sich
prinzipiell für die erste Beobachtung heranführen: 1) Rezeptor Downregulierung, 2)
Stimulation eines anderen Rezeptors mit entgegengesetzter Funktion, 3) partielle Aktivität als
Agonist und Antagonist und 4) Selbstassoziation bei hohen Konzentrationen. Es wird
vermutet, dass ADNF-9 sowohl mit Neuronen als auch mit Gliazellen interagiert in der
Weise, dass ADNF-9 nicht-neuronale Zellen zur Sekretion modulatorischer Substanzen
stimuliert, welche den Effekt bei höheren Konzentrationen möglicherweise vermindern. Es
könnte sich dabei um eine generelle Charakteristik von Neuropeptiden handeln. Sie zeigen in
gemischten Kulturen häufig einen umgekehrt U-förmigen Verlauf der KonzentrationsWirkungs-Kurve, die durch das Modell der modulativen, interaktiven Zellantwort erklärt
würde.
43
4.2.3. Neuropeptide in vivo
Ein neuroprotektiver Effekt von NAP und ADNF-9 ist in einigen in vivo Untersuchungen
beobachtet worden. Zur Induktion einer Alzheimer-Erkrankung wurde Ratten ein cholinerger
Blocker intracerebroventriculär appliziert (Gozes I 1996). Es kam zum Untergang cholinerger
Neurone, und die Tiere entwickelten Symptome im Sinne einer Alzheimerschen Erkrankung.
Die intranasale Applikation von SNV verhinderte die Beeinträchtigung des räumlichen
Lernens und Defizite in der Gedächtnisleistung. NAP zeigte bei normalen Tieren eine
neuroprotektive, Gedächtnis fördernde Wirkung (Gozes I 2002). Gesunde Tiere, die NAP
inhalierten, hatten eine verbesserte Leistung im Training des Kurzzeitgedächtnis im Vergleich
zu Placebo behandelten gesunden Ratten. NAP wurde Apolipoprotein-E (ApoE) defizienten
Mäusen
injiziert.
Sie
bildeten
schneller
als
die
unbehandelten
Kontrolltiere
entwicklungsbedingte Reflexe aus und waren vor Defiziten im Kurzzeitgedächtnis geschützt
(Bassan M 1999). Als Maß für neurodegenerative Prozesse wurde die Aktivität der CholinAcetyl-Transferase gemessen, die bei ApoE-defizienten Mäusen verringert ist. Unter NAP lag
sie auf dem Niveau gesunder Kontrolltiere. Im Unterschied zu NAP konnte ADNF-9 die
Aktivität nicht signifikant erhöhten. Dies kann auf unterschiedlichen Wirkmechanismen von
NAP und ADNF-9 oder einer Differenz in der Effektivität beruhen. In einem Modell für
geschlossenes Schädelhirntrauma bei Mäusen senkte NAP, subkutan injiziert, die Mortalität
und beschleunigte die klinisch-neurologische Rehabilitation (Beni-Adani L 2001).
Untersuchungen des Hirngewebes zeigten eine Reduktion des Hirnödems um 70 % bei NAP
behandelten
Tieren.
Das
Ausmaß
Magnetresonanztomographie-Aufnahmen
des
beurteilt.
Schädelhirntraumas
Die
Bilder
wurde
demonstrierten
in
einen
Rückgang der morphologischen Schäden unter NAP. In einem Modell für das fetale
Alkoholsyndrom verursachte die intraperitoneale Injektion von Alkohol bei schwangeren
Mäusen den intrauterinen Tod sowie eine Verlangsamung von Entwicklung und Wachstum
(Spong CY 2001). Sowohl Tod als auch Retardierung beruhten auf den schweren oxidativen
Schäden durch den Alkohol. Die Kombination von ADNF-9 und NAP verhinderte den Tod.
Die Peptide verringerten gemeinsam die Rate an Wachstumsanomalitäten, während jedes
Peptid für sich allein keine Besserung brachte. Dies ist ein Hinweis darauf, dass NAP und
ADNF-9 eine additive Wirkung entfalten, die auf unterschiedlichen Reaktionswegen der
Peptide beruhen könnte. In einem Schlaganfallmodell bei hypertensiven Ratten wurde NAP
intravenös appliziert und reduzierte die Infarktgröße sowie die motorische Beeinträchtigung
sowohl kurz nach dem Infarkt als auch im Verlauf von 30 Tagen (Leker RR 2002). Die
44
Injektion von NAP bewirkte eine deutliche Abnahme der Apoptose, wie TUNEL- (terminal
deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling) und Kaspase-3-Färbungen
zeigten (Leker RR 2002). In einem Mausmodell für geschlossenes Schädelhirntrauma zeigte
NAP einen Langzeitschutz vor Defekten (Romano J 2002). 15 min nach der Verletzung
wurde den Tieren entweder NAP oder die Vehikelsubstanz subkutan injiziert, eine dritte
Gruppe erlitt kein Trauma. Anhand einer neurologischen Skala wurde die Leistung zu
unterschiedlichen Zeitpunkten bis zu 45 Tage post Trauma bestimmt. In Ergänzung wurde die
prophylaktische Gabe von NAP in einem Modell für Schädelhirntrauma bei Mäusen
untersucht (Zaltzman R 2003). NAP wurde in den ersten drei Lebenswochen verabreicht und
das Schädelhirntrauma erfolgte im Alter von vier Monaten. Nach dem Trauma wurden die
Mäuse auf motorische Fähigkeiten, Gleichgewichtssinn und Wachheit (Alertness) untersucht.
Vergleiche zeigten eine schnellere und bessere Rehabilitation der Tiere, die mit NAP
behandelt wurden.
4.2.4. Wirkmechanismus
Die Untersuchungen in vitro und in vivo demonstrieren die neuroprotektive Potenz der
Peptide NAP und ADNF-9, geben aber keinen Aufschluss über den genauen
Wirkmechanismus.
Aufnahme
Es ist nicht bekannt, ob Rezeptoren für ADNF oder die Peptide auf der Zelloberfläche von
Neuronen vorhanden sind oder ob sie retrograd axonal transportiert werden können.
Untersuchungen legen nahe, dass die Rezeptor-vermittelte Endozytose an der Aufnahme von
ADNF oder ADNF-9 beteiligt sein könnte (Brenneman DE 1998). Es handelt sich um einen
universellen Mechanismus zur Aufnahme von Makromolekülen in die Zelle (Goldstein JL
1979). Die Aktivierung der Rezeptoren induziert die Internalisierung der Ligand-RezeptorKomplexe in Endosomen. Für die Endosombildung ist die H+-ATPase besonders wichtig, sie
generiert ein saures Milieu innerhalb der Endosomen (Yocum SA 1995). Bafomycin A1 ist
ein spezifischer Inhibitor der H+-ATPase und führt zu Zelltod, Wachstumsstopp und der
Kondensation von Chromatin. Es gilt als Inhibitor der Rezeptor-vermittelten Endozytose. In
Nervenzellkulturen inhibierte Bafomycin A1 den protektiven Effekt von ADNF-9 gegen
45
Tetrodotoxin (TTX). Die Schlussfolgerung ist, dass die Aufnahme von ADNF-9 via Rezeptor
vermittelter Endozytose geschehen könnte.
Aktivierung von Transkriptionsfaktoren
Betrachtet man den Langzeiteffekt von ADNF-9 in vitro (z.B. Protektion für 4 Tage nach nur
2 h Inkubation), scheint es wahrscheinlich, dass die Wirkung der Peptide auf intrazellulären
Verstärkungsmechanismen beruht. ADNF und ADNF-9 könnten die Regulation der
Proteinsynthese durch Aktivierung von Transkriptionsfaktoren beeinflussen oder selbst als
Transkriptionsfaktoren an DNA binden (Brenneman DE 1998). Untersuchungen, in denen die
Aktivierung unterschiedlicher intrazellulärer Faktoren beobachtet wurde, stützen diese
Vermutungen: (1) ADNF-9 verringerte die Reduktion von hsp60 durch ß-Amyloid (siehe
unten; (Zamostiano R 1999). (2) ADNF-9 induzierte eine gesteigerte DNA-Bindungsaktivität
von NF-kB (Glazner GW 2000). NF-kB wird in weiten Teilen des Nervensystems exprimiert
und man beobachtet eine schnelle Aktivierung unter ischämischen Bedingungen, sowie auf
Stimulation von Glutamat-Rezeptoren und TNF-Rezeptoren hin. In Modellen für den
entwicklungsbedingten Untergang von Neuronen durch Apoptose und in Modellen für M.
Alzheimer, M. Parkinson, Schlaganfall, Amyotrophe Lateralsklerose und Epilepsie konnte die
kritische Rolle von NF-kB im Schutz vor neuronalem Untergang gezeigt werden. Dies wäre
ein plausibler Mechanismus für die neuroprotektive Wirkung der Peptide, deren Effekt unter
anderen auf der Aktivierung von NF-kB beruht. (3) ADNF und ADNF-14 aktivierten
Proteinkinase A und den Transkriptionsfaktor CREB (White D 2000). Dabei bleibt unklar, ob
ADNF direkt oder über Zwischenschritte den Reaktionsweg Proteinkinase A – Phosphorylierung von CREB anstößt. Die Aktivierung von CREB führt aller Wahrscheinlichkeit nach zu
einem Anstieg von regulatorischen Proteinen, die sich auf das Wachstum der Neurone
auswirken. Untersuchungen haben gezeigt, dass CREB die Entwicklung und Plastizität der
Dendriten bei Neuronen des Hippokampus beeinflusst. (4) NAP stimulierte die Produktion
von cyclischem Guanosinmonophosphat (cGMP), einem intrazellulären second messenger,
und erhöhte extrazellulär die Konzentration von Stickoxid (NO) (Ashur-Fabian O 1999;
Ashur-Fabian O 2001). NAP Konzentrationen, die einen cGMP Anstieg hervorriefen,
stimmen mit neuroprotektiven Konzentrationen aus anderen Untersuchungen überein. Der
NO-Anstieg konnte nur bei höheren Konzentrationen beobachtet werden. Es wurde vermutet,
dass cGMP den neuroprotektiven Effekt vermittelte, während NO einen Teil zu den Zell-ZellInteraktionen und der natürlichen Aktivität von VIP, SNV und NAP im Gewebe beiträgt.
46
Mechanismen beim Schutz vor Neurotoxinen
Es gibt differenzierte Hinweise auf die intrazellulären Mechanismen, die am Schutz gegen
den Zelltod durch Neurotoxine beteiligt sind. Zu den Neurotoxinen zählen Tetrodotoxin, das
zu einer elektrischen Blockade führt, ß-Amyloid, das mit der Alzheimerschen Erkrankung in
Verbindung gebracht wird, das exzitotoxische N-methyl-D-Aspartat (NMDA) und
Glykoprotein 120 (gp120), Hüllprotein des human immundeficiency virus (HIV).
(1) Zemlyak et al. berichteten über Neuroprotektion von NAP vor toxischem ß-Amyloid in
Kulturen isolierter Neurone des Kortex bei neugeborenen Ratten (Zemlyak I 2000). Sie
stellten die These auf, dass NAP durch Beeinflussung des Glucosemetabolismus vor Toxizität
durch ß-Amyloid schützt, da gleiche Reaktionswege für ß-Amyloidtoxizität und GlucoseDeprivation aufgezeigt wurden. ß-Amyloid induziert in menschlichen Neuronen eine
Verringerung der Expression des antiapoptotischen Proteins Bcl-2 und steigert die Expression
von Bax, einem Protein, das den apoptotischen Zelltod fördert (Paradis E 1996). ß-Amyloid
führt zur Bildung freier Sauerstoffradikale, in der Folge zu Lipidperoxidation und verringert
den Glucosetransport. Unter ß-Amyloid treten Mutationen und mitochondriale Dysfunktion
auf (Schapira 1996). Schutz vor ß-Amyloid Toxizität durch die Peptide zeigt, dass ADNF-9
und NAP in die genannten Prozesse eingreifen und den Zelluntergang verhindern könnten.
(2) In Kulturen von Neuronen des cerebralen Kortex der Ratte konnte in Northern und
Western Blot Analysen gezeigt werden, dass ß-Amyloid die Menge an intrazellulärem hsp60
reduzierte (Zamostiano R 1999). ADNF- 9 steigerte die Expression hsp60 und inhibierte den
Effekt von ß-Amyloid. Hsp60 ist ein Stressprotein, das eine Rolle bei der Faltung von
Proteinen spielt und wichtig für das Zellüberleben ist. Auch erhöhte Temperaturen (42° C)
führten bei Neuronen zur hsp60 Produktion. Die Untersuchungen zeigen, dass extrazelluläres
ADNF-9 die Bildung von hsp60 intrazellulär steigert beziehungsweise die Abnahme durch ßAmyloid verhinderte und dadurch die Resistenz der Neurone gegen Toxine stärkt.
(3) Oxidativer Stress ist ein wichtiger Trigger der Neurodegeneration. Reaktive
Sauerstoffspezies (ROS) tragen zu akuten Prozessen wie Apoplex und Schädelhirntrauma und
chronischen Prozessen wie Amyotrophe Lateralsklerose, M. Huntington oder M. Alzheimer
bei (Satoh T 1996). ROS sind führen zur Zerstörung von Proteinen, Lipiden und DNA und
erzeugen toxische Abbauprodukte. FeO4 induziert die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies und
führt zum Zelltod. ADNF-9 schützte Kulturen embryonaler Neurone aus dem Hippokampus
47
der Ratte vor Schäden durch oxidativen Stress, vor FeSO4 induzierter Apoptose und Schäden
durch den Entzug trophischer Faktoren (Glazner GW 1999a). VIP, SNV, ADNF-9 und NAP
schützten PC12 Zellen vor oxidativem Stress durch H2O2 (Steingart RA 2000). Die
Inkubation von VIP führte zu einem Anstieg der mRNA für VIP, während die Inkubation mit
NAP nicht zu einer Änderung der Expressionsrate führte, so dass unterschiedliche
Reaktionswege für VIP und NAP postuliert werden sollten. Dahingegen verhinderte die
Zugabe von Antikörpern gegen ADNF-9 die Wirkung von VIP, so dass hier vermutet werden
kann, dass der Effekt von VIP zumindest zum Teil von ADNF-9 vermittelt wird.
Charkteristisch für den Schutz vor oxidativem Stress ist der Erhalt der mitochondrialen
Funktion und die verminderte intrazelluläre Ansammlung von ROS (Glazner GW 1999a;
Steingart RA 2000). ADNF-9 wirkte der FeSO4-Toxizität entgegen und inhibierte die
Akkumulation von ROS in den Mitochondrien. Der Entzug trophischer Faktoren kann zum
Untergang von Neuronen führen und beruht letztlich auf der Akkumulation von ROS. Es
kommt zur Lipidperoxidation, einer verminderten Funktion der Mitochondrien und dem
Verlust der Kalzium-Homeostase (Kane DJ 1993). Die Ergebnisse der Studien legen nahe,
dass ADNF-9 und NAP antioxidative Schutzmechanismen aktivieren und damit bei einer
Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen protektiv wirken könnten.
Die gleichen Prozesse konnten auch in einem Genmutationsmodell beobachtet werden (Guo
Q 1999). Hippokampale Neuronen mit der Mutantion PS1 zeigen eine erhöhte Produktion von
ß-Amyloid und eine erhöhte Empfindlichkeit gegen Exzitotoxizität. Dabei ist die Antwort auf
Glutamat in der Weise verändert, dass es zu einem Anstieg von Kalzium kommt, vermehrt
ROS gebildet werden und die Funktion der Mitochondrien gestört wird. ADNF stabilisierte
den intrazellulären Kalziumspiegel, unterbrach die ROS-Produktion und verhinderte die
mitochondriale Dysfunktion. Damit konnte gezeigt werden, dass neurotrophe Faktoren im
Stande sind, neurodegenerative Kaskaden zu unterbrechen.
Der Schaden, den Dopamin in einem Modell für M. Parkinson hervorruft, hängt vom
Reduktions- /Oxidations- (red/ox) Status des Glutathion (GSH) ab (Offen D 2000). In vitro
wurde bei Neuroblastomzellen die GSH-Synthese durch Buthioninsuloximin blockiert, so
dass der GSH-Gehalt vermindert war und das Überleben um 70 - 90 % abnahm. Sowohl VIP
als auch ADNF-9 und NAP verhinderten diesen Rückgang und wirkten neuroprotektiv. Die
Ergebnisse legen nahe, dass VIP upstream, also im Stoffwechselweg vor den GSH-bildenden
Substanzen wirken könnte und so noch ein breiteres Spektrum an Schutzmechanismen
48
aktiviert als andere Substanzen. Es war bereits bekannt, dass Substanzen, die in den GSHStoffwechsel eingreifen, gegen Dopamintoxizität schützen können. Die Anwendung war auf
Grund der mangelnden Penetranz der Blut-Hirn-Schranke limitiert. VIP, SNV und die kurzen
Peptide NAP und ADNF-9 zeigten eine gute Penetranz und wirken in sehr geringen
Konzentrationen. In vivo beeinflusste NAP den red/ox-Status der Zellen und führte zu einem
messbaren Anstieg von GSH (Spong CY 2001).
(4) Schädelhirntraumata führten zu einem Anstieg des neurotoxisch wirkenden TNF-α (BeniAdani L 2001). NAP verringerte den Schaden durch die Traumata, so dass man vermutet, dass
NAP die Bildung oder den Effekt von TNF-α inhibiert. Die Langzeit-Akkumulation von
TNF-α ist mit der Neurodegeneration bei AIDS-Demenz, M. Alzheimer und M. Parkinson in
Verbindung gebracht worden und das Schädelhirntrauma ist als Risikofaktor für M.
Alzheimer postuliert worden. Damit könnte NAP nicht nur bei akuten Schäden sondern auch
bei
chronischen
degenerativen
Erkrankungen
des
Nervensystems
eine
Bedeutung
beigemessen werden.
Präkonditionierung
Nervengewebe kann durch verschiedene Mechanismen gegen Ischämie präkonditioniert
werden. Darunter fallen Episoden subletaler Ischämie, moderate Hypoglykämie und Hitze. Es
konnte beobachtet werden, dass SNV, das lipophile Analogon zu VIP, das Phänomen der
Präkonditionierung bei PC12 Zellen imitierte (Sigalov E 2000). Unter Bedingungen einer
eingeschränkten Glykolyse, regulierte SNV die ADNP Synthese. Studien zur ischämischen
Präkonditionierung legten eine direkte Interaktion zwischen Zytoskelett und Mitochondrien
nahe (Baines CP 1999). Dies könnte einen Hinweis auf den Wirkmechanismus von NAP
liefern, da gezeigt wurde, dass NAP in vitro direkt mit Tubulin, einem wichtigen Baustein des
Zytoskeletts interagierte (Divinski I 2004).
4.2.5. Neuroregeneration
Meine Ergebnisse zeigen neben dem neuroprotektiven Effekt auf isolierte RGZ neugeborener
Ratten den Einfluss der Peptide auf das Neuritenwachstum in retinalem Gewebe älterer Tiere.
Es konnte gezeigt werden, dass die Fähigkeiten der RGZ zu neuronalem Wachstum zum
Zeitpunkt P9 bis P12 denen bei adulten Tieren vergleichbar sind (Allcutt D 1984a; b). Sowohl
49
ADNF-9 als auch NAP stimulierten das Neuritenwachstum in den Netzhautexplantaten bis zu
134 %. Da nur eine Konzentration getestet wurde, lässt sich keine Aussage über eine
Konzentrationsabhängigkeit treffen. Diese ist aber wahrscheinlich, betrachtet man die
Ergebnisse an den isolierten RGZ, deren Charakteristik unter anderen das Wachstum von
Zellfortsätzen war, und die Ergebnisse vorausgegangener Peptid-Studien, die eine
Konzentrationsabhängigkeit beobachten.
Die stärkste Wirkung erzielten in den Explantatkulturen BDNF und CNTF, so wie auch in den
Ganglienzellkulturen. Die Kombination dieser beiden neurotrophen Faktoren konnte das
Neuritenwachstum im Vergleich zu den Kontrollen etwa verdoppeln. In der Literatur sind
vergleichbare Effekte auf das Überleben und die Regeneration von RGZ nach Schädigung des
Sehnerven und retrograder Markierung der Nervenzellen beschrieben (Mey J 1993; MansourRobaey S 1994). Auch Meyer-Franke et al. beschreiben maximale Effekte in
Ganglienzellkultur unter BDNF und CNTF (Meyer-Franke A 1995). Die Kombination ist den
einzelnen Peptiden überlegen. NAP und ADNF-9 wurden nicht zusammen an den
Explantatkulturen getestet.
Die Ergebnisse aus den Retinaexplantaten stehen in Einklang mit anderen Beobachtungen.
Sowohl NAP als auch ADNF-9 stimulierten das Neuritenwachstum in Kulturen von Neuronen
des Hippokampus und des Kortex der Ratte (Smith-Swintosky VL 2000). White et al. zeigten,
dass ADNF und ADNF-14 einen positiven Effekt auf das Neuritenwachstum in Kulturen
sensorischer Neurone des Rückenmarks haben (White D 2000). Der protektive Effekt wurde
in pico- und femtomolaren Konzentrationen erreicht. Die Studie zeigt, dass Proteinkinase A
und CREB zum Neuritenwachstum unter NAP und ADNF-9 beitragen. CREB ist generell an
Prozessen der Neuroregeneration, dem Neuritenwachstum und der Signaltransduktion von
Wachstumsfaktoren beteiligt. Es fördert die Entwicklung und Plastizität der Dendriten bei
Neuronen. An Kulturen von Neuronen des Hippokampus wurde demonstriert, dass VIP
mittels ADNF und ADNF-9 die Differenzierung von Neuronen und Bildung von Synapsen
fördert (Blondel O 2000). ADNF-9 stimulierte die Synapsenbildung embryonaler Neurone in
Abhängigkeit von der Konzentration (Emax bei 10-16 M). Zellzahl sowie Länge und Anzahl
der Dendriten nahmen bei den hippokampalen Neuronen zu. Die Untersuchungen zeigten,
dass ADNF-9 direkt auf Neurone Einfluss nimmt. Die Tatsache, dass ADNF-9 in sehr
geringen
Konzentrationen
wirkt,
ist
ein
Hinweis
darauf,
dass
ein
potentes
Amplifikationssystem auf das Signal folgt. Man vermutet, dass über den neuro-glialen
50
Reaktionsweg von VIP über ADNF und NT-3 von einem frühen embryonalen Stadium an die
Entwicklung und Ausbildung der Synapsen exzitatorischer Neurone beeinflusst wird. ADNF9 stimuliert und reguliert die Sekretion von NT-3. Untersuchungen mit Antiserum gegen
ADNF-14 und ADNF-9 zeigten, dass ein endogener VIP-ähnlicher Faktor im Gewebe
vorliegt und die natürliche Ausbildung der Synapsen reguliert. Diese These wird dadurch
gestützt, dass VIP von den untersuchten Neuronen des Hippokampus exprimiert wird
(Blondel O 2000).
Studien zu NAP zeigen in vitro und in vivo Eigenschaften, die neuronale Plastizität bei der
Entwicklung und bei Lernprozessen umfassen (Bassan M 1999). Die Ergebnisse legen nahe,
dass NAP direkt oder indirekt an der Ausbildung und Aktivität von Synapsen beteiligt ist. In
vivo zeigten sich im Modell für Neurodegeneration durch Apolipoprotein E Unterschiede in
den kognitiven Funktionen bei defizienten Mäusen mit und ohne NAP-Applikation.
Ergänzend wurden Unterschiede zwischen unbehandelten Kontrolltieren und NAPbehandelten gesunden Mäusen beobachtet. Dies bedeutet, dass NAP nicht nur einen
protektiven Effekt bei den defizienten Mäusen ausübt, sondern auch die Funktion gesunder
Tiere verbessert. Damit müssen ergänzende Prozesse neben der Zunahme der Anzahl und
Aktivität der Synapsen eine Rolle spielen. Die Stimulation der Synaptogenese könnte den
Effekt von VIP, ADNF-9 und NAP auf Lern- und Gedächtnisleistungen erklären.
4.2.6. Mitogene Aktivität – Wachstum und Genexpression
Die Tatsache, dass NAP die neuronale Plastizität und die Synaptogenese beeinflusst, aber
bislang keine mitogene Aktivität beobachtet wurde, ist ein klarer Pluspunkt bei der Suche
nach einem potenten Neuroprotektivum (Gozes I 2003). Andere neurotrophe Faktoren wie
Nerve growth factor (NGF) sind potentiell mitogen und können zu Tumorwachstum führen.
Durch Genanalysen konnte gezeigt werden, dass NAP in dem Schädelhirntrauma-Modell ein
spezifisches Gen beeinflusste (Romano J 2002). Das Glykoprotein Mac-1 (CD11B Antigen),
ein Oberflächenprotein von Macrophagen und Mikrogliazellen und damit ein Marker für
Entzündungsprozesse, war in den Läsionsgebieten des Gehirns nach Trauma erhöht und NAP
verringerte die Zunahme. Die Autoren vermuten, dass Mac-1 einen Marker für
Langzeitergebnisse nach Schädelhirntrauma darstellt und ein Ziel von NAP sein könnte. Eine
gleichsinnige Reduktion der mRNA Expression von Mac-1 durch NAP wurde bei
51
neugeborenen Mäusen beobachtet, die postnatal prophylaktisch NAP erhielten und nach vier
Monaten ein Schädelhirntrauma erlitten (Zaltzman R 2003).
Andererseits sind für VIP und ADNF mitogene Effekte beschrieben. Sie stimulierten die
Mitoseaktivität und beschleunigten embryonales Wachstum (Glazner GW 1999b). In
Kulturen von Mäuseembryos nahm die Anzahl an Somiten unter ADNF zu, der Proteingehalt
und die DNA-Menge stiegen. ADNF-Antiserum inhibierte das embryonale Wachstum und die
Beschleunigung des Wachstums durch VIP. Im gleichen Sinne verhinderte VIP-Antiserum
das Wachstum und die Zunahme durch ANDF. Wachstum und Proliferation unter VIP
wurden an Glioblastomzellen untersucht (Sharma A 2001). Ein VIP-Rezeptor Antagonist
verringerte konzentrationsabhängig das Wachtum der Glioblastomzellen und inhibierte die
Proliferation in vitro. Dabei wurden auf zellulärer Ebene geringere Spiegel von cAMP und
freiem Kalzium im Zytosol beobachtet. In vivo unterband der VIP-Rezeptor Antagonist die
Proliferation von Xenotransplantaten bei Nacktmäusen (Sharma A 2001). In einer
Colonkarzinom Zelllinie, die VIP-Rezeptoren exprimierte, konnten einzelne Gene bestimmt
werden, deren Expression von VIP beeinflusst wird (Steingart RA 2002). Das VIP-Analogon
stimulierte die Expression von HOX A4 und verringerte die Expression von Oct-3. Es handelt
sich um Homeoboxgene, die als ‚Mastergene’ die Expression zahlreicher anderer Gene
regulieren und damit eine zentrale Funktion bei der Determinierung der gewebespezifischen
Entwicklung spielen.
Zamostiano et al. beschreiben die Ergebnisse nach Clonierung und Charakterisierung des
menschlichen ADNP-Gens und seiner mRNA (Zamostiano R 2001). Die mRNA selbst kann
auf Grund der molekularen Struktur DNA binden oder andere DNA-bindende Proteine
regulieren. Die ADNP-mRNA besitzt eine Sequenz, die charakteristisch für die Aktivität als
Thiotransferase (Reduktion von Glutathion) ist und damit Einfluss auf den red/ox-Status der
Zelle nehmen kann. Dies könnte einen Beitrag zum neuroprotektiven Effekt leisten. Der Ort
auf Chromosom 20 (20q12-13.2), an dem ADNP lokalisiert ist, wird in verschiedenen
Tumorgeweben amplifiziert, darunter Tumoren von Brust, Blase, Ovar, Pankreas und Colon.
Die Expression von ADNP und die des Tumorsuppressorgen p53 scheinen umgekehrt
zueinander zu korrelieren. Bei einer Abnahme von ADNP wurde eine Zunahme von p53
beobachtet. Die Autoren folgern, dass ADNP an der Aufrechterhaltung der Zellintegrität
beteiligt ist und dies möglicherweise über eine Modulation von p53 geschieht (Zamostiano R
2001). ADNP wird nicht im Gewebe von Herz, Skelettmuskulatur, Nieren und Plazenta
exprimiert. Endothel und Astrocyten sind besonders VIP-responsiv und exprimieren VIP-
52
Rezeptoren. Es ist möglich, dass ADNP-Nukleinsäuren zur Erkennung von proliferierenden
Zellen eine Rolle spielen und Antisense-ADNP-Nukleotide in die antitumoröse Therapie
Einzug halten könnten (Zamostiano R 2001).
4.2.7. Applikation und Verteilung im Organismus
Aus pharmakologischer Sicht sind die Möglichkeiten der Applikation einer Substanz bei der
Entwicklung eines neuen Wirkstoffes interessant. In den Studien zur Neuroprotektion wurden
NAP und das lipophile SNV sowohl intranasal appliziert (Gozes I 1996), inhaliert (Gozes I
2002) als auch subkutan (Romano J 2002), intraperitoneal (Beni-Adani L 2001; Spong CY
2001), intravenös (Leker RR 2002) und intracerebroventrikulär injiziert (Gozes I 2001; Gozes
I 2002; Gozes I 2003). Studien zur Verteilung mit radioaktiv markiertem SNV ([StNle17]VIP) zeigten, dass intaktes SNV nach intranasaler Applikation die Blut-Hirn-Schranke
überwand und im Kortex angereichert wurde (Gozes I 1996). Nach intraperitonealer Gabe
bestand eine ausreichende Bioverfügbarkeit, wie Untersuchungen mit radioaktiv markiertem
NAP zeigten (Spong CY 2001). Für NAP lag sie bei 10 nM, was im Bereich der effektiven
neuroprotektiven Konzentrationen in den vorausgegangenen in vitro Studien liegt. Leker et al.
untersuchten die Penetration des Hirngewebes nach Injektion von NAP bei ischämischem
Hirnschaden durch Gefäßverschluss (Leker RR 2002). NAP-assoziierte Radioaktivität konnte
schon nach 15 min im Gehirn detektiert werden und verblieb wenigstens 1h lang im
ischämischen Gewebe, so dass man von einer Akkumulation ausgehen kann. Nach
intravenöser Applikation von radioaktiv markiertem NAP wurde Radioaktivität im
Hippokampus und Mittelhirn gemessen, 30 min nach Injektion lag eine homogene Verteilung
vor. Die Penetration von NAP zeigte in Abhängigkeit von der Konzentration eine beinahe
lineare Zunahme in Kortex und Cerebellum (Leker RR 2002). Nach intranasaler Applikation
fand sich radioaktiv markiertes NAP nach 30 min in der Leber und im Magendarmtrakt
(Gozes I 2003). Im Gehirn lag die Intensität bei 10 bis 20 % der Werte, die im
Magendarmtrakt gemessen wurden. Die Ergebnisse nach intraperitonealer Applikation waren
denen nach intranasaler Injektion vergleichbar.
Es gibt kaum Untersuchungen zum Zeitfenster, in dem NAP oder ADNF-9 gegen
neurodegenerative oder neurotoxische Schäden wirken. In dem Modell des fetalen
Alkoholsyndrom wurden NAP und ADNF-9 30 min vor Alkoholinjektion und bis zu 1 h
53
danach verabreicht (Spong CY 2001). Bei Administration 3 h nach Alkoholinjektion konnte
der protektive Effekt nicht mehr beobachtet werden. In derselben Studie wurde auch ein
protektiver Effekt beobachtet, wenn die Behandlung mit den Peptiden der Injektion 10 Tage
vorausging. Dies weist auf die Möglichkeit eines prolongierten Schutzes hin. In dem
Schlaganfallmodell verminderte NAP die Infarktgröße und motorische Defizite, wenn es 1 h
oder 4 h nach dem Insult appliziert wurde, nicht jedoch nach 6 h (Leker RR 2002). Die
Applikation bei gesunden neugeborenen Tieren führte zu verbesserten Lern- und
Gedächtnisleistungen und zeigt den Erfolg einer prophylaktischen Gabe (Gozes I 2002). Die
prophylaktische Gabe von NAP wurde bei Schädel-Hirn-Trauma an neugeborenen Mäusen
untersucht (Zaltzman R 2003). NAP wurde in den ersten 3 Lebenswochen verabreicht und das
Schädel-Hirn-Trauma erfolgte im Alter von vier Monaten. Die prophylaktische Behandlung
mit NAP führte bei dem Vergleich der Fähigkeiten 1h nach dem Trauma und nach 1 Woche
zu einer signifikant besseren Leistung der Tiere.
In vitro Untersuchungen zur Wirkungsdauer von ADNF-9 zeigten, dass der Effekt in
Zellkulturen nach Exposition für 2 h für vier darauffolgende Tage anhielt (Brenneman DE
1998). Die Aktivität von ADNF-9 in den Kulturen war schon nach 15 min erloschen. Dieses
prompte Verschwinden beruht möglicher Weise auf einem schnellen Abbau oder der
Aufnahme des Peptids in die Zellen. Wurde das Medium nach 15 min ausgetauscht, konnte
nicht die volle neuroprotektive Wirkung beobachtet werden. Das bedeutet, die Wirkung des
Peptids ist komplex und beruht neben einer direkten intrazellulären Wirkung auch auf
Prozessen in den Neuronen und Gliazellen, die zur Produktion von ergänzenden Faktoren im
Medium und einer Amplifikation des Effektes führen.
4.2.8 Ausblick
Die vorliegende Arbeit zeigt den protektiven Effekt von NAP und ADNF-9 auf isolierte RGZ
und auf Netzhautexplantate in vitro. In folgenden Studien sollte der Effekt von NAP und
ADNF-9 in Hinblick auf den genauen Wirkmechanismus und Signaltransduktionsweg
untersucht werden. In vitro könnte man nach Antagonisten der Peptide suchen, um
Rückschlüsse auf den Machanismus zu ziehen. Interessant wäre es, Dosis-Wirkungs-Studien
bei den Explantaten anzuschließen und die Kombination von NAP und ADNF-9 in
unterschiedlichen Konzentrationen zu testen. Die Ergebnisse anderer Untersuchungen legen
einen additiven Effekt nahe. In vivo sollten sich Studien zum Effekt bei Läsion des Sehnerven
54
oder in Glaukommodellen anschließen, um die Einsatzmöglichkeiten von NAP und ADNF-9
in der Therapie akuter und chronischer Erkrankungen der Retina zu untersuchen. Da die
Peptide bereits auf zahlreichen Wegen erfolgreich appliziert wurden, könnte man bei
neurodegenerativen Erkrankungen am Auge eine systemische Gabe (intraperitoneal oder
intranasal)
einer
lokalen
Applikation
(Augentropfen
oder
intravitreale
Injektion)
gegenüberstellen. Besonders interessant ist die gute Bioverfügarkeit und der nachweisliche
neuroprotektive Effekt nach intranasaler Applikation. Denn die intravitreale Injektion ist als
interventionelle Methode mit einem nicht zu vernachlässigenden Risiko behaftet.
Augentropfen müssen sowohl die Hürde des Tränenfilms als auch der vorderen
Augenabschnitte überwinden, bevor die Substanzen den Wirkort in der Retina erreichen
können. Die Ergebnisse der Untersuchungen stehen in Einklang mit zahlreichen Studien. Sie
rechtfertigen die Hoffnung auf einen Einsatz der Peptide als Neuroprotektiva.
55
V. ZUSAMMENFASSUNG
GBP-L, das sich von Gabapentin ableitet, besitzt neuroprotektive Eigenschaften in vivo,
vermutlich über das Öffnen mitochondrialer KATP-Kanäle. In der vorliegenden Arbeit
untersuchte ich diese Hypothese an Kulturen isolierter retinaler Ganglienzellen (RGZ).
RGZ neugeborener Ratten (P0 - P2) wurden mit Thy-1-Immunopanning isoliert und 48 h
kultiviert. Das Überleben wurde durch Zählung vitaler RGZ am Phasen-Kontrast-Mikroskop
quantifiziert. RGZ wurden mit GBP-L (3,2 – 320 µM) behandelt mit und ohne vorherige
Inkubation der Kulturen mit 1 µM Gibenclamid, welches plasmalemmale und mitochondriale
KATP-Kanäle blockiert, oder mit 100 µM 5-Hydroxydecanoat (5-HD), spezifischer Antagonist
mitochondrialer KATP-Kanäle. Zum Vergleich wurden RGZ mit 32 µM Gabapentin inkubiert.
Als Positivkontrolle diente CNTF plus BDNF (je 50 ng/ml).
GBP-L steigerte das Zellüberleben konzentrationsabhängig auf bis zu 145 %. Glibenclamid
verringerte den protektiven Effekt von GBP-L im Sinne eines kompetitiven Antagonisten. Der
spezifische KATP-Kanal-Blocker 5-HD hemmte den Effekt. Gabapentin zeigte keine Wirkung
auf das Überleben. CNTF plus BDNF führte zu einer Überlebensrate von 177 %.
Die Ergebnisse zeigen, dass GBP-L im Unterschied zu Gabapentin das Überleben der RGZ
fördert, wahrscheinlich indem es mitochondriale KATP-Kanäle öffnet.
Aktuelle Studien demonstrieren den neuroprotektiven Effekt der Peptide ADNF-9 und NAP.
Im gleichen Kultursystem testete ich die Wirkung der Neuropeptide auf isolierte RGZ und
untersuchte nachfolgend das Neuritenwachstum in Kulturen von Netzhautexplantaten.
RGZ wurden mit NAP oder ADNF-9 (10-18 M bis 10-10 M) behandelt. Netzhautexplantate von
älteren Ratten (P9-P11) wurden in einer Fibrinmatrix (72 h) kultiviert und mit 1 µM NAP
oder ADNF-9 behandelt. Die aussprossenden Neuriten wurden nach Sudanschwarz-Färbung
am Mikroskop beurteilt und die Wachstumsrate im Vergleich zu den Kontrollen bestimmt.
Beide Peptide erhöhten die Überlebensrate der isolierten RGZ, ADNF-9 (0,1 pM) auf 177 %,
NAP (5 pM) auf 167 %. In den Explantatkulturen steigerten sie das Neuritenwachstum im
Vergleich zu den Kontrollen, ADNF-9 führte zu 126 %, NAP zu 117 %.
Die Peptide fördern nicht nur das Überleben isolierter Nervenzellen sondern auch das
Neuritenwachstum bei Netzhautexplantaten. Weitere Untersuchungen in vitro und in vivo
sind nötig, um GBP-L oder NAP und ADNF-9 als neuroprotektive Pharmaka in der Therapie
von Erkrankungen der Retina und des optischen Nervs einsetzen zu können.
56
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VII. DANK
Mein besonderer Dank gilt Herrn Professor Wolf A. Lagrèze, der mein neurologischophthalmologisches Interesse gefördert hat, für die Überlassung des Themas und die
engagierte Betreuung während der Dissertation.
Herrn Professor Hans-Dieter Hofmann danke ich für die freundliche Betreuung im Labor, die
anregenden Diskussionen und seinen ansteckenden Optimismus.
Herrn Privatdozent Matthias Kirsch möchte ich ganz herzlich danken. Er hat mir die
Methoden der Zellkultur beigebracht. Er hatte immer Zeit für meine Fragen und zahlreiche
konstruktive Vorschläge parat.
Herrn Professor Thomas Feuerstein danke ich dafür, dass er mich motiviert und in
statistischen und pharmakologischen Fragen beraten hat.
Herrn Professor Ralph Lucius vom Anatomischen Institut der Universität Kiel möchte ich
herzlich für die Hospitation in seinem Labor danken. Bei ihm habe ich gelernt,
Netzhautexplantate zu entnehmen und zu kultivieren. Mein besonderer Dank gilt dabei Frau
Sibille Piontek für die freundliche Hilfe bei der technischen Durchführung.
Mein herzlicher Dank gilt allen Mitarbeitern und Mitdoktoranden im Labor der
Neuroanatomie, die das positive Umfeld meiner Arbeit geprägt haben. Im Einzelnen danke
ich Frau Birgit Egle für ihre Hilfe bei immunhistochemischen Färbungen und Frau Gabriele
Kaiser und Frau Simone Zenker für technischen Rat und Tipps im Labor.
Meiner Familie und meinen Freunden gilt besonders großer Dank für ihre unermüdliche
Unterstützung meiner Arbeit. Sie waren jederzeit für mich da und haben in Nähe und Ferne
über Enttäuschungen hinweg geholfen und die Freude über Erfolge geteilt.
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Lebenslauf
Amelie Pielen
Geburtsdatum:
Geburtsort:
Eltern:
31.05.1978
Bonn
Hartfried Pielen, Mathematiker und Informatiker
Christa Pielen, Lehrerin für Geographie und Französisch
Ausbildung:
1984 – 1988
1988 – 1997
Juni 1997
Besuch der Robert-Koch-Schule, Bonn
Besuch des ev. Amos-Comenius-Gymnasium, Bonn
Abitur (Note 1,3)
1997 – 2000
2001 – 2004
Herbst 2003
Herbst 2004
Medizinstudium an der Rheinischen Friedrich Wilhelms Universität
Bonn
Ärztliche Vorprüfung (Note 2)
1. Teil der Ärztlichen Prüfung (Note 2)
Auslandsstudium im Rahmen des Sokrates-Programm an der Universitá
degli Studi di Perugia, Italien
Medizinstudium an der Albert-Ludwig-Universität Freiburg
2. Teil der Ärztlichen Prüfung (Note 2,6)
3. Teil der Ärztlichen Prüfung (Note 2)
17.11.2004
ab 1.3.2005
Approbation als Ärztin
Assistenzärztin an der Universitäts-Augenklinik Freiburg
Herbst 1999
Herbst 2000
2000 – 2001
wissenschaftlicher Werdegang:
2001 – 2004
April 2003
Mai 2003
„Neuroprotektion retinaler Ganglienzellen“, Sektion Neuroophthalmologie der Augenklinik und Anatomisches Institut I der
Albert-Ludwig-Universität Freiburg
Posterpräsentation Neurex - Annual Meeting, Basel, Schweiz
Posterpräsentation ARVO - Meeting 2003, Florida, USA
Publikationen:
1. Pielen A, Kirsch M, Hofmann HD, Feuerstein TJ, Lagrèze WA. Retinal ganglion cell
survival is enhanced by gabapentin-lactam in vitro: evidence for
involvement of mitochondrial KATP channels. Graefes Arch Clin Exp
Ophthalmol. 2004 Mar;242(3):240-4.
2. Lagrèze WA, Pielen A, Steingart R, Hofmann HD, Gozes I, Kirsch M. The Peptides
ADNF-9 and NAP increase cell survival and neurite outgrowth of rat
retinal ganglion cells in vitro. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005
Mar;46(3):933-8.