Einfluss von Thrombin und Faktor Xa auf die RANTES
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Aus der Klinik und Poliklinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe (Direktor Univ.- Prof. Dr. med. Marek Zygmunt) der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald Thema: Einfluss von Heparin auf die Proliferation, Zytokinsekretion und Invasion humaner endometrialer Karzinomzelllinien Inaugural - Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Medizin (Dr. med.) der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald 2014 Vorgelegt von: Ulrike Schwarzig geboren am: 23.06.1987 in: Berlin Dekan: Prof. Dr. med. dent. Reiner Biffar 1. Gutachter: Prof. Dr. M. Zygmunt 2. Gutachter: Prof. Dr. Th. Strowitzki Ort, Raum: Greifswald, Universitätsmedizin N 0.03 Tag der Disputation: 12.03.2015 II Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis ................................................................................................................ VI Tabellenverzeichnis .................................................................................................................. VIII Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................................... IX 1 Einleitung ................................................................................................................................. 1 1.1 Das Endometriumkarzinom .............................................................................................. 1 1.1.1 Epidemiologie ........................................................................................................... 1 1.1.2 Einteilung und Klassifizierung .................................................................................. 1 1.1.3 Diagnostik ................................................................................................................. 2 1.1.4 Therapie ..................................................................................................................... 3 1.2 Einfluss von Hypoxie auf Karzinome .............................................................................. 4 1.3 Heparine............................................................................................................................ 6 1.3.1 Glykosaminoglykane ................................................................................................. 6 1.3.2 Aufbau ....................................................................................................................... 6 1.3.3 Gerinnungshemmung ................................................................................................ 7 1.3.4 Heparin und Karzinome ............................................................................................ 8 2 Zielstellung ............................................................................................................................ 12 3 Material .................................................................................................................................. 13 3.1 Laborgeräte ..................................................................................................................... 13 3.2 Verbrauchsmaterialien .................................................................................................... 14 3.3 Reagenzien und Chemikalien ......................................................................................... 19 3.3.1 Zellbiologische Arbeiten ......................................................................................... 19 3.3.2 Molekularbiologische Arbeiten ............................................................................... 21 3.3.3 Proteinchemische Arbeiten ..................................................................................... 22 3.4 Zelllinien ......................................................................................................................... 25 3.5 Primer ............................................................................................................................. 26 III Inhaltsverzeichnis 3.6 4 Programme...................................................................................................................... 28 Methoden ............................................................................................................................... 29 4.1 Zellbiologische Methoden .............................................................................................. 29 4.1.1 Zelllinien ................................................................................................................. 29 4.1.2 Kryokonservierung der Karzinomzellen ................................................................. 29 4.1.3 Präparation und Gewinnung von endometrialen Stromazellen ............................... 30 4.1.4 Kultivierung der Zellen ........................................................................................... 31 4.1.5 Zellaussaat für die Experimente .............................................................................. 33 4.1.6 Dezidualisierung endometrialer Stromazellen ........................................................ 33 4.1.7 Vitalitätsassay und Proliferationsbestimmung ........................................................ 34 4.1.8 Invasionsassay ......................................................................................................... 35 4.1.9 Zellzählung mittels Durchflusszytometer ............................................................... 36 4.2 Molekularbiologische Methoden .................................................................................... 37 4.2.1 4.3 Proteinchemische Methoden........................................................................................... 39 4.3.1 Gewinnung von Überständen .................................................................................. 39 4.3.2 Herstellung von Heparineluat.................................................................................. 39 4.3.3 Herstellung von Zelllysaten .................................................................................... 39 4.3.4 ELISA...................................................................................................................... 39 4.4 5 Real-time RT-PCR .................................................................................................. 37 Statistik ........................................................................................................................... 41 Ergebnisse .............................................................................................................................. 42 5.1 Einfluss von unfraktioniertem Heparin auf die Proliferation ......................................... 42 5.2 Einfluss von unfraktioniertem Heparin auf die Zytokinsekretion .................................. 45 5.2.1 Veränderung der MCP-1-, IL-8- und RANTES-Sekretion auf Proteinebene ......... 45 5.2.2 Kompartimentbestimmung Zytokine bei RL95-2 und HEC-1-A ........................... 53 5.2.3 Veränderungen der Zytokinsekretion auf mRNA-Ebene ........................................ 59 5.3 Einfluss von Thrombin und Faktor Xa auf die Zytokinsekretion ................................... 63 IV Inhaltsverzeichnis 6 5.4 Einfluss von verschiedenen Heparinen auf die Zytokinsekretion .................................. 65 5.5 Invasion gegenüber RANTES, MCP-1, IL-8 und HGF ................................................. 72 5.6 Einfluss von Heparin auf die HGF-Sekretion endometrialer Stromazellen ................... 75 Diskussion .............................................................................................................................. 78 Zusammenfassung ......................................................................................................................... 92 Literaturverzeichnis ....................................................................................................................... 94 Eidesstattliche Erklärung............................................................................................................. 102 Lebenslauf ................................................................................................................................... 103 Danksagung ................................................................................................................................. 104 V Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Darstellung der häufigsten repetitiven Disaccharideinheit von Heparin .................. 7 Abbildung 2: Neubauer Zählkammer ............................................................................................ 33 Abbildung 3: Schematische Darstellung der Boyden-Kammer .................................................... 35 Abbildung 4: Spontanproliferation aller fünf Zelllinien unter Normoxie bei den Bedingungen nicht behandelt (n.b.) vs. 0,8 U/ml und 6,4 U/ml Heparin. .................................... 43 Abbildung 5: Die Basalsekretion von MCP-1 in pg pro 1000 Zellen der Zelllinie HEC-1-A, RL95-2 und KLE unter unbehandelten Bedingungen ............................................ 47 Abbildung 6: Die Basalsekretion von IL-8 in pg pro 1000 Zellen der Zelllinien HEC-1-A, RL95-2 und KLE unter unbehandelten Bedingungen. ........................................... 48 Abbildung 7: Die Basalsekretion von RANTES in pg pro 1000 Zellen der Zelllinien ECC-1, RL95-2, HEC-1-A, AN3 CA und KLE unter unbehandelten Bedingungen ......... 49 Abbildung 8: Die Sekretion von MCP-1 unter verschiedenen Heparindosen bei der Zelllinie KLE ........................................................................................................................ 50 Abbildung 9: Die Sekretion von IL-8 unter verschiedenen Heparindosen bei der Zelllinie RL95-2 unter Normoxie. ........................................................................................ 50 Abbildung 10: Die Sekretion von IL-8 unter verschiedenen Heparindosen bei der Zelllinie KLE....................................................................................................................... 51 Abbildung 11: Die Sekretion von RANTES unter verschiedenen Heparindosen bei den Zelllinien RL95-2, HEC-1-A und AN3 CA sowohl unter Norm- als auch Hypoxie ........................................................................................................ 52 Abbildung 12: Beispielhafte Darstellung der gemessenen MCP-1-Konzentration in den Überständen von HEC-1-A sowohl unter Norm- als auch Hypoxie .................... 54 Abbildung 13: Übersicht der Verteilung von RANTES in den Zellkompartimenten von HEC-1-A und RL95-2 .................................................................................. 56 Abbildung 14: RANTES-Sekretion von HEC-1-A in den unterschiedlichen Zellkompartimenten .............................................................................................. 57 Abbildung 15: RANTES-Sekretion von RL95-2 in den unterschiedlichen Zellkompartimenten .............................................................................................. 58 VI Abbildungsverzeichnis Abbildung 16: mRNA-Gehalt von RANTES bei HEC-1-A für nicht behandelte (n.b.) und für mit 3,2 U/ml Heparin behandelte Zellen .................................................. 60 Abbildung 17: Der mRNA-Gehalt der Zytokine MCP-1 bzw. IL-8 bei KLE .............................. 60 Abbildung 18: mRNA-Gehaltes des Zytokins IL-8 der Zelllinien RL95-2 unter Normoxie........ 61 Abbildung 19: mRNA-Gehalt von RANTES in den Zelllinien RL95-2, HEC-1-A und AN3 CA ............................................................................................................... 62 Abbildung 20: Einfluss von Thrombin und Faktor Xa auf die MCP-1- sowie IL-8-Sekretion der Zelllinie KLE ......................................................................... 63 Abbildung 21: Einfluss von Thrombin und Faktor Xa auf die RANTES-Sekretion der Zelllinien RL95-2, HEC-1-A und AN3 CA ......................................................... 64 Abbildung 22: Einfluss verschiedener niedermolekularen Heparine sowie Fondaparinux auf die Sekretion von MCP-1 und IL-8 bei KLE unter Verwendung der gleichen antikoagulatorischen Aktivität wie Heparin von 0,05 U/ml .................. 66 Abbildung 23: Einfluss verschiedener niedermolekularen Heparine sowie Fondaparinux auf die Sekretion von MCP-1 und IL-8 bei KLE unter Verwendung des gleichen Molekulargewichts von 0,25 µg/ml ...................................................... 67 Abbildung 24: Einfluss verschiedener niedermolekularen Heparine sowie Fondaparinux auf die Sekretion von RANTES bei RL95-2, HEC-1-A und AN3 CA unter Verwendung der gleichen antikoagulatorischen Aktivität von 50 U/ml. ............. 69 Abbildung 25: Einfluss verschiedener niedermolekularen Heparine sowie Fondaparinux auf die Sekretion von RANTES bei RL95-2, HEC-1-A und AN3 CA unter Verwendung des gleichen Molekulargewichts von 250 µg/ml ............................ 71 Abbildung 26: Invasion der Zelllinien KLE gegenüber 10 und 100 ng/ml HGF ......................... 73 Abbildung 27: Invasionsverhalten der Zelllinien HEC-1-A, RL95-2 und KLE gegenüber 100 ng/ml HGF, 1 U/ml Heparin und deren Kombination ................................... 74 Abbildung 28: Veränderung der relativen Zellzahl unter 100 ng/ml HGF nach 48 h bei RL95-2 und HEC-1-A. ................................................................................... 75 Abbildung 29: Einfluss von TNF α, IL-6 und Heparin auf den Gehalt an HGF-mRNA in humanen endometrialen Stromazellen .................................................................. 77 VII Tabellenverzeichnis Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Klassifikation des Endometriumkarzinoms nach TNM und FIGO................................ 2 Tabelle 2: Zusammensetzung der für die jeweilige Zelllinie verwendeten Zellkulturmedien ...... 30 Tabelle 3: Angaben zu Zellzahl bzgl. der Zellaussaat, dem Einfrieren sowie den Experimenten mit den humanen endometrialen Karzinomzelllinien .................................................. 30 Tabelle 4: Flüssigkeitszugabe in µl pro Well in eine Zellkulturplatte .......................................... 33 Tabelle 5: Veränderung der Spontanproliferation in Abhängigkeit von der Inkubationszeit, Heparinkonzentration und Zelllinie ............................................................................. 44 Tabelle 6: Standardbeeinflussung der ELISAs durch 102,4 U/ml Heparin ................................. 46 Tabelle 7: Sekretion von Zytokinen bei unbehandelten und mit Heparin behandelten Zellen ..... 46 Tabelle 8: Zytokinsekretion in den einzelnen Kompartimenten der Zelllinien RL95-2 und HEC-1-A ...................................................................................................................... 54 VIII Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis bFGF Basic Fibroblast Growth Factor BSA Bovines Serumalbumin bspw. Beispielsweise bzgl. Bezüglich bzw. Beziehungsweise ca. Circa CAF Carcinom Associated Fibroblasts (Karzinom assoziierte Fibroblasten) CCL C-C-Motif Ligand CCR CC-Chemokinrezeptor cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid CO2 Kohlenstoffdioxid CTB CellTiterBlue® CXCL C-X-C-Motif Ligand DGGG Deutsche Gesellschaft für Gynäkologie und Geburtshilfe DKG Deutsche Krebsgesellschaft e.V. DMEM/F-12 Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F- 12 DMSO Dimethylsulfoxid DNA Deoxyribonucleic Acid (Desoxyribonukleinsäure) dNTP Desoxynucleoside Triphosphate (Desoxyribonukleosidtriphosphate) EDTA Ethylendiamintetraacetat EGF Epidermal Growth Factor ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay FACS Fluorescence Activated Cell Sorting FCS Fetal Calf Serum (fetales Kälberserum) FIGO International Federation of Gynaecology and Obstetrics IX Abkürzungsverzeichnis HGF Hepatocyte Growth Factor HIF Hypoxic Inducible Factor IGFBP-1 Insulin-like Growth Factor-binding Protein-1 IL Interleukin LMWH Low Molecular Weight Heparin (Niedermolekulare Heparine) MCP Monocyte Chemotactic Protein MEM Minimum Essential Medium MIP Macrophage Inflammatory Proteins MMP Matrixmetalloproteinase mRNA Messenger Ribonucleic Acid NAP Neutrophil-activating Protein ns Nicht signifikant n. b. Nicht behandelte Zellen O2 Sauerstoff PDGF Platelet-derived Growth Factor PBS Phosphate Buffer Solution PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerase Kettenreaktion) PTEN Phosphatase and Tensin homolog RANTES Regulated on Activation, Normal T cell Expressed and Secreted RNA Ribonucleic Acid (Ribonukleinsäure) RPMI Roswell Park Memorial Institute RT Reverse Transkriptase SHRP Streptavidin Meerrettichperoxidas TNF α Tumor Necrosis Factor alpha u. a. Unter anderem VEGF Vascular Endothelial Growth Factor v. a. Vor allem zzgl. zuzüglich z. B. Zum Beispiel X 1 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Das Endometriumkarzinom 1.1.1 Epidemiologie Das Endometriumkarzinom zählt zu den häufigsten gynäkologischen Malignomerkrankungen der Frau in der westlichen Welt. Jedes Jahr gibt es 81 500 Neuerkrankungen in der Europäischen Union. Es nimmt die siebente Stelle der karzinombedingten Todesfälle der Frau in Westeuropa ein und macht damit 1 – 2 % aller karzinombedingten Todesfälle aus. Das mediane Alter, bei dem das Karzinom diagnostiziert wird, beträgt 63 Jahre. Insgesamt sind > 90 % der Frauen älter als 50. Damit tritt das Endometriumkarzinom v. a. nach der Menopause auf (Plataniotis und Castiglione 2010). 2008 gab es 11 280 Neuerkrankungen in Deutschland. Damit hat es einen Anteil von 5,1 % bei allen bösartigen Neubildungen der Frau. Als vierthäufigstes Malignom der Frau steht es an erster Stelle der Karzinome im weiblichen Genitaltrakt. 2008 starben 2 420 Frauen in Deutschland an einem Endometriumkarzinom. Das mittlere Erkrankungsalter liegt bei 69 Jahren. Die relative 5-Jahres-Überlebensrate beträgt 79 %. Damit zählt das Endometriumkarzinom zu den prognostisch günstigen Krebserkrankungen. Zudem liegt bei Erstdiagnose in mehr als 70 % der Fälle ein T1-Stadium vor. Etwa 42 700 Frauen lebten 2008 in Deutschland, bei denen in den letzten fünf Jahren ein Endometriumkarzinom diagnostiziert wurde (Robert Koch Institut et al. 2012). 1.1.2 Einteilung und Klassifizierung Basierend auf der Histopathologie, dem molekularen Profil und dem klinischen Verlauf wird das Endometriumkarzinom in Typ I und II eingeteilt. Typ I sind meist low-grade Adenokarzinome. Sie sind die häufigsten Endometriumkarzinome, meist mit Östrogen assoziiert, werden früh diagnostiziert und haben eine gute Prognose. Bei ihnen findet man v. a. molekulare Veränderungen in K-ras, PTEN und ß-Cateninen sowie Mikrosatelliteninstabilität. Typ II Endometriumkarzinome sind hormonunabhängig. Sie sind vorwiegend Grad III endometrioide Adenokarzinome, papillär seröse Karzinome, Klarzellkarzinome sowie Karzinosarkome. Häufig weisen sie eine p53-Mutation sowie einen Verlust der Heterozygotie auf verschiedenen Chromosomenloci auf (Plataniotis und Castiglione 2010). Das Tumorstaging erfolgt nach der FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics)-Einteilung (Tabelle 1). Dabei werden sowohl chirurgische als auch pathologische Gesichtspunkte hinzugezogen. Folgende pathologische Merkmale fließen in die FIGO-Einteilung 1 1 Einleitung mit ein: Tiefe der myometrialen Invasion, Beteiligung der Cervix, Tumorgröße und – lokalisation, Ausbreitung des Tumors in die Tuben und Ovarien, Tumorgrad und histologischer Zellsubtyp, Invasion der Lymphgefäße sowie Lymphknotenstatus (Plataniotis und Castiglione 2010). Ebenfalls wird das Endometriumkarzinom zusätzlich nach TNM (Tabelle 1) klassifiziert (DKG und DGGG 2008). Tabelle 1: Klassifikation des Endometriumkarzinoms nach TNM und FIGO, Quelle: (DKG und DGGG 2008) TNM FIGO TX Primärtumor kann nicht beurteilt werden T0 Kein Anhalt für Primärtumor Tis 0 Carcinoma in situ T1 I Tumor begrenzt auf Corpus uteri T1a IA Tumor begrenzt auf Endometrium T1b IB Tumor infiltriert weniger als die Hälfte des Myometriums T1c IC Tumor infiltriert die Hälfte oder mehr des Myometriums T2 II Tumor infiltriert Zervix, breitet sich jedoch nicht jenseits des Uterus aus T2a IIA Lediglich endozervikaler Drüsenbefall T2b IIB Invasion des Stromas der Zervix T3 und / III Lokale und/ oder regionale Ausbreitung wie in T3a, b, N1 bzw FIGO oder N1 IIIA, B, C, beschrieben T3a IIIA Tumor befällt Serosa und/ oder Adnexe (direkte Ausbreitung oder Metastasen) und/ oder Tumorzellen in Aszites oder Peritonealspülung T3b IIIB Vaginalbefall (direkte Ausbreitung oder Metastasen) N1 IIIC Metastasen in Becken- und/ oder paraaortalen Lymphknoten T4 IVA Tumor infiltriert Blasen- und/ oder Rektumschleimhaut M1 IVB Fernmetastasen 1.1.3 Diagnostik Jede postmenopausale Blutung dient als Hinweis auf ein Endometriumkarzinom. Ebenfalls gilt eine unregelmäßige Blutung der perimenopausalen Frau als verdächtig. Es sollte eine vaginale 2 1 Einleitung Untersuchung sowie eine transvaginale Sonographie und zusätzlich eine Hysteroskopie mit fraktionierter Abrasio durchgeführt werden, um eine histologische Diagnose stellen zu können. Zusätzliche Untersuchungen vor Therapie sind der Röntgenthorax in 2 Ebenen, Sonographie des Abdomens sowie gegebenenfalls Rekto- und Zystoskopie, um das präoperative Staging zu komplettieren (DKG und DGGG 2008). 1.1.4 Therapie Operative Therapie Im Vordergrund steht die chirurgische Therapie. Die operative Therapie richtet sich dabei nach dem Tumorstadium. Meist wird eine abdominelle oder laparoskopische Hysterektomie mit Adnexektomie durchgeführt. Zusätzlich werden die pelvinen und paraaortalen Lymphknoten entfernt (fakultativ bei den Stadien IA und IB, wenn G1 oder G2). Ebenfalls sollte das Peritoneum gewaschen und eine Spülzytologie entnommen werden. Bei serösen oder klarzelligen Karzinomen werden neben der Hysterektomie mit Adnexen eine pelvine und paraaortale Lymphnodeektomie sowie zusätzlich eine Omentektomie und bei extrauteriner Manifestation maximales Tumordebulking vorgenommen. Darüber hinaus werden multiple peritoneale Biopsien entnommen. Bei inoperablen Patientinnen sollte eine primäre Strahlentherapie durchgeführt werden. Dabei handelt es sich meist um eine Tele-Brachytherapie (DKG und DGGG 2008). Adjuvante Therapie Als adjuvante Therapie findet v. a. die Radiotherapie Anwendung. Durch sie können die Lokalrezidive gesenkt werden. Für die Stadien pT1a, pT1b sowie pT2 scheint die Radiotherapie keine Einfluss auf das Gesamtüberleben zu haben. Im Stadium pT1c wird es dadurch hingegen verbessert. Für die Stadien pT3 sowie pT4 existieren hierzu keine großen prospektiven Studien (DKG und DGGG 2008). Der Stellenwert der Chemotherapie in der Behandlung des Endometriumkarzinoms ist noch nicht abschließend geklärt. Im optimal operierten Stadium III und IV wurde ein verlängertes Gesamtüberleben für die adjuvante Chemotherapie mit Adriamycin plus Cisplatin im Vergleich zur Ganzkörperbestrahlung mit paraaortalen und pelvinen Boost nachgewiesen. Als adjuvante Therapie kann die Gestagengabe nicht empfohlen werden (DKG und DGGG 2008). Palliative Therapie In der palliativen Situation sollten bei Progesteronrezeptor-positiven Karzinom sowie asymptomatischen Metastasen die endokrine Therapie versucht werden. Als Gestagenpräparate 3 1 Einleitung werden hierfür Medroxyprogesteronacetat und Tamoxifen verwendet. Eine palliative Chemotherapie kommt bei rezeptornegativer, symptomatischer und lebensbedrohlicher Tumormanifestationen in Betracht. Als Chemotherapeutika werden v. a. verschiedene Kombinationen von Adriamycin, Cisplatin, Carboplatin, Paclitaxel und Docetaxel verwendet. Jedoch hat die palliative Chemotherapie im Vergleich zur alleinigen symptomatischen Therapie keinen Vorteil hinsichtlich Lebensqualität und Symptomkontrolle bei fehlendem oder nur marginalen Effekt auf das Gesamtüberleben, so dass die Indikation hierfür streng gestellt werden sollte (DKG und DGGG 2008). Rezidive Im Verlauf der Erkrankung kommt es bei 25 % der Patientinnen zu einem Rezidiv. Dabei treten 70 – 90 % der Rezidive v. a. in den ersten beiden Jahren nach der Primärtherapie auf. Es finden sich zu 51 % Fernmetastasen, zu 32 % Beckenrezidive und zu 17 % vaginale Lokalrezidive. Rezidive der Vagina werden möglichst chirurgisch entfernt. Bei Inoperabilität kommt die Kombination aus perkutaner Strahlentherapie und Brachytherapie zum Einsatz. Handelt es sich um pelvine Rezidive, wird die Radiotherapie bevorzugt, sofern in der vorherigen Therapie keine Radiatio stattfand (DKG und DGGG 2008). Nachsorge Die Nachsorge besteht aus Spekulumeinstellung, der vaginalen und rektalen Untersuchung sowie gegebenenfalls Ultraschall. In den ersten 2 - 3 Jahren wird sie alle drei Monate durchgeführt. Wenn klinisch indiziert, kann eine weitere bildgebende Diagnostik hinzugezogen werden (DKG und DGGG 2008). 1.2 Einfluss von Hypoxie auf Karzinome In den meisten gesunden Geweben findet man einen Sauerstoffpartialdruck von 2,5 – 9 %. Pathologisches oder entzündliches Gewebe kann aber an Sauerstoff verarmen, so dass Sauerstoffpartialdrücke von weniger als 1 % erreicht werden (Imtiyaz und Simon 2010). In soliden Tumoren finden sich Regionen mit Hypoxie, wo der Sauerstoffpartialdruck zwischen 0,1 – 1 % liegt (Imtiyaz und Simon 2010). Tumorhypoxie ist häufig assoziiert mit Tumorprogression und Metastasierung, einer schlechten klinischen Prognose, eine erhöhte Invasivität der Zellen, einer verstärkten Resistenz gegenüber Chemo- und Strahlentherapie, einer vermehrten Angiogenese sowie genetischen Instabilität (Imtiyaz und Simon 2010; Finger und Giaccia 2010; Bosco et al. 2008; Koi und Boland 2011). Man findet zwei Arten von Hypoxie in soliden Tumoren: eine akute und eine chronische. Die akute dauert nur Minuten bis Stunden und ist gefolgt von einer Reoxygenierung. Sie wird hervorgerufen durch eine unregulierte 4 1 Einleitung Angiogenese, die eine veränderte Struktur, Verteilung und Funktion von Mikrogefäßen zur Folge hat (Koi und Boland 2011). Dadurch kommt es zeitweise zu einem nicht ausreichenden Blutfluss in den verschiedenen Regionen des Tumors. Die chronische Hypoxie dauert Tage und führt ebenfalls zu einer Reoxygenierung oder zum Zelltod. Sie ist diffusionslimitiert und steigt mit der Entfernung der Tumorzellen von dem Blutgefäß (Koi und Boland 2011). Der Wechsel von Hypoxie mit anschließender Reoxygenierung führt zu einer vermehrten Sauerstoffradikalfreisetzung, welche DNA, Proteine und Lipide schädigen kann. Dadurch kommt es zur Genmutation und gegebenenfalls Apoptose (Koi und Boland 2011). Ebenfalls sind unter Hypoxie einige DNA-Reparatursysteme vermindert, so dass vermehrt Mutationen (u. a. auch in Mikrosatellitenfrequenzen) auftreten können (Koi und Boland 2011). Des Weiteren beeinflusst Hypoxie einige Gene des Spindelapparates. Diese werden vorwiegend hochreguliert, wodurch wahrscheinlich eine Fehlverteilung der Chromosomen in der Zellteilung gefördert wird (Koi und Boland 2011). Die Anpassung der Zellen an Hypoxie wird u. a. durch den Transkriptionsfaktor HIF (hypoxic inducible factor) vermittelt (Imtiyaz und Simon 2010). HIF-1α wird unter Normoxie durch verschiedene Enzyme markiert und im Proteasom abgebaut. Sinkt der Sauerstoffpartialdruck, so nimmt die Aktivität dieser Enzyme ab und HIF kann in den Zellkern gelangen, wo er verschiedene Gene aktiviert, die eine Hypoxia-response-element in der Promotorregion haben (Imtiyaz und Simon 2010). HIF kann neben Hypoxie auch durch inflammatorische Zytokine (wie TNF α, IL-1ß und andere), Wachstumsfaktoren und bakterielle Produkte induziert werden (Imtiyaz und Simon 2010). Die HIF-1α-Expression nimmt vom inaktiven Endometrium über Hyperplasie bis zum endometrioiden Karzinom zu. Zu der Aussagekraft von HIF-1α als Prognosefaktor im endometrioiden Karzinom findet man jedoch widersprüchliche Daten (Seeber et al. 2010). Seeber et al zeigten, dass v. a. Nekrosen im endometrioiden Karzinom von prognostischer Bedeutung sind (Seeber et al. 2010). Außerdem schienen Tumoren mit perinekrotischen HIF-1α-Expression aggressiver als mit einer diffusen zu sein. Die Autoren vermuteten, dass die perinekrotische HIF-1α-Expression wahrscheinlich durch Hypoxie induziert wird (Seeber et al. 2010). Unterschiedliche Sauerstoffkonzentrationen spielen ebenfalls eine wichtige Rolle für die Monozytenmigration (Bosco et al. 2008). Unter Hypoxie werden vermehrt endotheliale Adhäsionsmoleküle sowie Chemokine exprimiert, die die Monozytenmigration beeinflussen. Außerdem wird die Chemokinexpression in den Monozyten durch Hypoxie beeinflusst (Bosco et al. 2008). Es werden v. a. Chemokine (wie CXCL-2, CXCL-3, CXCL-5, CXCL-6, CXCL-8 und 5 1 Einleitung andere) hochreguliert, die Neutrophile anlocken und die Angiogenese fördern (Bosco et al. 2008). Ebenfalls werden unter Hypoxie die Chemokinrezeptoren CCR-1 / -2 und -5 der Monozyten herunterreguliert. Dadurch sprechen sie weniger auf die chemotaktischen Moleküle CCL-2 und -5 an, wodurch ihre Migration vermindert wird (Bosco et al. 2008). Somit kommt es zu einer Akkumulation dieser Zellen unter Hypoxie, da sie zum einen durch den Sauerstoffgradienten angelockt, zum anderen durch Hypoxie in ihrer Migration vor Ort behindert werden (Bosco et al. 2008). Unter Hypoxie werden vermutlich Expressionsprogramme der tumorassoziierten Makrophagen aktiviert, die proangiogen, tumorwachstumsfördernd, prometastasisch und immunsuppressiv wirken (Imtiyaz und Simon 2010). Somit stellt Hypoxie einen wichtigen Einflussfaktor für die Tumorprogression dar. 1.3 Heparine 1.3.1 Glykosaminoglykane Glykosaminoglykane sind Polysaccharide, die aus repetitiven unverzweigten Disaccharideinheiten aufgebaut sind. Dabei besteht das Disaccharid aus einem Aminozucker und einer Uronsäure (Glucoronsäure oder Iduronsäure). Außerdem weisen die meisten Sulfatgruppen auf (Gandhi und Mancera 2008). Vertreter sind Keratan-, Chondroitin-, Heparansulfat und Heparin, Hyaluronsäure und Dermatansulfat. Mit Ausnahme der Hyaluronsäure sind die meisten Vertreter an core-Proteinen gebunden (Johnson et al. 2005; Gandhi und Mancera 2008). Alle sind Polyanionen und an verschiedenen biologischen Funktionen und Abläufen wie Kontrolle des Wachstums, Signaltransduktion, Zelladhäsion, Hämostase, Lipidmetabolismus, Entzündung, Krebs und anderen beteiligt (Johnson et al. 2005). 1.3.2 Aufbau Heparin gehört zu den Glukosaminoglykanen (Gandhi und Mancera 2008). Es ist ein lineares Polymer. Dabei bilden α-D-Glucosamin und Uronsäure (entweder ß-D-Glucoronsäure oder α-L-Iduronsäure) die repetitive Disaccharideinheit. Es liegt einen 1-4-glykosidische Bindung vor. Das Glucosamin kann entweder acetyliert oder sulfatiert sein, wobei beim Heparin weniger als 5 % der Glucosamine acetyliert sind (Dreyfuss et al. 2009). Heparin ist dem Heparansulfat im Aufbau sehr ähnlich (Li und Vlodavsky 2009), unterscheidet sich jedoch in der Menge der Acetylierung, Sulfatgruppen und der Art des core-Proteins. Es ist weniger acetyliert, stärker sulfatiert und negativer geladen als Heparansulfat (Dreyfuss et al. 2009; Gandhi und Mancera 2008; Engelberg 1999). Heparin kommt in Mastzellen vor (Gandhi und Mancera 2008). 6 1 Einleitung Abbildung 1: Darstellung der häufigsten repetitiven Disaccharideinheit von Heparin, (Gandhi und Mancera 2008) 1.3.3 Gerinnungshemmung McLean entdeckte 1916 eine gerinnungshemmende Substanz, die später Heparin genannt wurde (Hirsh et al. 2001). Der Name Heparin wurde aus dem griechischen Hepar für Leber abgeleitet, da diese Substanz erstmalig aus den Leberzellen isoliert wurde (Mousa 2010). In den 1930er Jahren wurde Heparin in die Klinik eingeführt (Ludwig 2009) Die gerinnungshemmende Wirkung ist mit Antithrombin III assoziiert. Heparin bindet an Antithrombin III und verursacht dann dort eine Konformationsveränderung, wodurch Antithrombin III stärker Thrombin und Faktor Xa inaktivieren kann (Hirsh et al. 2001). Darüber hinaus inaktiviert der Komplex aus Heparin und Antithrombin die Faktoren IXa, XIa, XIIa. Der Antithrombin III – Heparinkomplex weist v. a. eine starke Affinität zu Thrombin auf. Um diesen zu inaktivieren, muss Thrombin sowohl an Antithrombin als auch an Heparin binden. Derivate des Heparins mit weniger als 18 Saccharideinheiten können nicht gleichzeitig an Antithrombin III und Thrombin binden und sind somit nicht in der Lage, es zu inaktivieren. Um an Antithrombin III zu binden und den Faktor Xa zu inaktivieren, reicht ein Pentasaccharid aus (Hirsh et al. 2001). Um die Heparintherapie zu optimieren, nutzte man die Eigenschaft, dass der Faktor Xa unabhängig von Thrombin gehemmt werden kann. Es konnte gezeigt werden, dass die alleinige Hemmung des Faktors Xa für die Gerinnungshemmung ausreicht, gleichzeitig aber die Blutungsgefahr deutlich herabgesetzt wurde (Ludwig 2009). Dies führte auch zur Entwicklung von niedermolekularen Heparinen (LMWH), welche durch partielle Hydrolyse oder enzymatischen Abbau aus unfraktioniertem Heparin gewonnen werden (Mousa 2010). Bis heute wird Heparin aus dem Darm des Schweines gewonnen (Mousa 2010). Dies birgt jedoch die Gefahr der Kontamination mit Pathogenen. Diese und andere Überlegungen führten zur Entwicklung des synthetischen Gerinnungshemmer Fondaparinux. Dieses Pentasaccharid bindet ebenfalls mit hoher Affinität an Antithrombin III (Ludwig 2009) und ist ein selektiver Hemmer des Faktors Xa (Borensztajn et al. 2008). 7 1 Einleitung 1.3.4 Heparin und Karzinome Beeinflussung der Tumorprogression durch Heparin aufgrund von antikoagulatorischen Effekten Karzinome sind häufig von prothrombotischen Zuständen begleitet (Buller et al. 2007). So können idiopathische venöse Thrombembolien oft das erste Anzeichen einer malignen Erkrankung sein und sind noch zehn Jahre später mit einer erhöhten Inzidenz von Karzinomen verbunden (Castelli et al. 2004). Ebenfalls treten diese vermehrt bei Karzinompatienten auf (Castelli et al. 2004). Zur Behandlung dieser Thrombembolien bzw. zu deren Prophylaxe wurden diesen Patienten Gerinnungshemmer wie Heparine verabreicht. Dabei fiel auf, dass einige Patienten einen Überlebensvorteil durch die Heparinbehandlung erhielten, der jedoch unabhängig von dem Auftreten thrombembolischer Ereignisse war. In einigen Studien konnte zudem gezeigt werden, dass Heparine unabhängig von ihrer antikoagulatorischen Wirkung das Gesamtüberleben von Karzinompatienten erhöhten (Kakkar et al. 2004; Lebeau et al. 1994; Klerk et al. 2005). Mittlerweile existiert eine Reihe von klinischen Studien, die den Einfluss von Heparinen auf das Überleben untersuchten. Es wurden jedoch Heparine verschiedener Molekulargewichte, in unterschiedlicher Dosierung und in verschiedenen Patientenpopulationen (Lee 2010) verwendet. In Metaanalysen konnte gezeigt werden, dass LMWHs die EinjahresMortalität senken (Lee 2010). Die Verlängerung des Gesamtüberlebens scheint zu einem Teil auf die Gerinnungshemmung von Heparin zu beruhen. So ist für viele Tumoren ein prothrombotischer Zustand von Vorteil. Viele Tumorzellen exprimieren konstitutiv den Tissue Factor, welcher die Gerinnung aktivieren kann (Engelberg 1999; Mousa und Petersen 2009). Durch Auslösen der Gerinnung und der damit nachfolgenden Bildung von Plättchenaggregaten und Fibrin schützen sich die Tumorzellen vor der körpereigenen Immunabwehr (Engelberg 1999). Dadurch sind sie auch intravaskulär schwerer für natürliche Killerzellen (NK-Zellen) erreichbar (Engelberg 1999). Außerdem führt es zur Bildung von Mikrothromben (Engelberg 1999). Thrombin, ebenfalls ein aktivierter Gerinnungsfaktor, verstärkt ebenfalls die Expression des Tissue Factors, VEGF (vascular endothelial growth factor) sowie dessen Rezeptor, bFGF (basic fibroblast growth factor) und die für den Abbau der extrazellulären Matrix und damit für die Invasion wichtigen MMP (Matrixmetalloproteinasen). Somit fördert Thrombin die Migration als auch das Überleben des Tumors. Darüber hinaus aktiviert es die Plättchen, die wiederum bFGF, VEGF und PDGF freisetzen, wodurch die Angiogenese gefördert und die Apoptose gehemmt wird (Buller et al. 2007). Des Weiteren fördert Thrombin die Tumorzelladhäsion (Engelberg 1999). Heparin kann als Antikoagulanz die Blutgerinnung über bspw. Thrombininaktivierung 8 1 Einleitung hemmen. Somit könnte es einen Teil der Tumorprogression, die durch aktivierte Gerinnungsfaktoren hervorgerufen wird, vermindern. Beeinflussung der Tumorprogression durch Heparin unabhängig von der antikoagulatorischen Wirkung Es gibt jedoch auch viele Untersuchungen, die belegen, dass Heparine auch unabhängig von ihrer antikoagulatorischen Wirkung Antitumoreffekte besitzen. So hatten Patienten auch noch nach Absetzen der Antithrombosetherapie ohne weitere herabgesetzte Gerinnung einen Überlebensvorteil (Klerk et al. 2005; Zacharski und Lee 2008). Ebenfalls konnte in experimentellen Modellen gezeigt werden, dass nicht-gerinnungshemmende Heparinderivate die Metastasierung (Niers et al. 2007; Borsig 2010), Wachstumsfaktoren und Heparanase hemmen konnten sowie anti-inflammatorische Eigenschaften und vasoprotektive Effekte besaßen (Zacharski und Lee 2008). Es wurde jedoch auch festgestellt, dass einige der Heparineigenschaften bei den Derivaten verloren gehen bzw. verstärkt wurden (Zacharski und Lee 2008; Casu et al. 2008). In Tiermodellen konnte gezeigt werden, dass Heparin die Metastasierung von einigen Karzinomen (bspw. Zelllinien von Mammakarzinomen, Melanomen, Prostata- und Lungenkarzinomen) hemmt (Niers et al. 2007). Beim Metastasierungsprozess müssen die Tumorzellen an den Endothelzellen adhärieren, um aus dem Gefäß ins umliegende Gewebe zu gelangen. Die Adhäsion wird u. a. durch Selektine gewährleistet. Selektine werden von Leukozyten (L-Selektin), Thrombozyten (P-Selektin) und Gefäßendothel (E- und P-Selektin) exprimiert. Es handelt sich dabei um Rezeptoren, die bestimmte Kohlenhydratketten, u. a. SialylLewis-Epitope, erkennen und binden. Viele Tumorzellen exprimieren diese Kohlenhydratketten und können somit an Selektine binden. Heparine können die Bindung von L- und P-Selektinen an Sialyl-Lewis-Komponenten verhindern und so sowohl Inflammation als auch Metastasierung stören (Niers et al. 2007, Borsig 2010, Stevenson et al. 2005). Heparanase, eine Endoglycosidase, wird ebenfalls von vielen Tumorzellen vermehrt exprimiert. Sie verstärkt die Tumorinvasion durch Abbau der extrazellulären Matrix. Außerdem spaltet sie Heparansulfatgruppen von Proteoglycanen ab. Normalerweise sind diese in der extrazelluären Matrix vorhanden und sind an der Speicherung von Wachstumsfaktoren und als Kofaktoren für Rezeptoren beteiligt. Durch Abspaltung von Heparansulfatfragmenten wird die Aktivität der gebundenen Wachstumsfaktoren verstärkt (Niers et al. 2007). Einige Studien belegen, dass die Heparanase durch Heparin gehemmt und dadurch die Metastasierung herabgesetzt wurde (Niers et al. 2007; Mousa und Petersen 2009; Borsig 2010; Casu et al. 2008). 9 1 Einleitung Der ebenfalls von vielen Tumorzellen exprimierte Tissue Factor besitzt neben der Aktivierung der Gerinnungskaskade auch gerinnungsunabhängige tumorfördernde Effekte (Castelli et al. 2004; Mousa und Petersen 2009; Engelberg 1999). Er fördert u. a. die Angiogenese und reguliert die VEGF-Synthese (Castelli et al. 2004; Engelberg 1999). Heparine setzen den Tissue Factor pathway Inhibitor aus dem Endothel frei und können somit indirekt den Tissue Factor hemmen (Engelberg 1999; Mousa und Petersen 2009; Castelli et al. 2004). Chemokine, eine Untergruppe der chemotaktischen Zytokine (Kulbe et al. 2004), spielen v. a. bei der Immunantwort und der Inflammation eine Rolle, wo sie u. a. die Adhäsion fördern (Castelli et al. 2004; Kulbe et al. 2004; Hembruff SL 2009; Ludwig 2009). Viele Tumorzellen sezernieren Chemokine, die autokrin und parakrin wirken können, da sie gleichzeitig Chemokinrezeptoren besitzen. Durch diese kann das Wachstum, die Invasion sowie das Überleben der Tumoren gefördert werden (Kulbe et al. 2004). In endometrialen Adenokarzinomen ist die Sekretion u. a. von folgenden Chemokinen erhöht: CCL-2/ MCP-1, CXCL-1, CXCL5, CXCL-12, IL-1, IL-6, IL-8, TNF α (Wallace et al. 2010). Chemokine sind meist basisch und besitzen Bindungsdomänen für Glykosaminoglykanen (Johnson et al. 2005). Ebenfalls können sie an das stark negativ geladene Heparin binden, was mittels Heparin-Sepharose-Säulen experimentell gezeigt wurde (Ludwig 2009). Folgende Chemokine geordnet nach abnehmender Affinität binden unter anderen an Heparin: RANTES > Lymphotactin > MCP-3 > IL-8 > MCP-1 > NAP-2 > MIP-1α (Ludwig 2009). Das Chemokin IL-8 gehört zu den angiogenen Molekülen, welches die Proliferation, das Überleben sowie die Migration von Gefäßendothelzellen fördert (Waugh und Wilson 2008). Es scheint auch eine Rolle im Tumormikromilieu zu besitzen. Zum einen exprimieren sowohl die Tumorzellen, die Endothelzellen als auch die tumorassoziierten Makrophagen Rezeptoren für IL-8, zum anderen wird es von vielen Tumorzellen gebildet (Waugh und Wilson 2008). IL-8 fördert die Proliferation, die Migration sowie die Invasion der Tumorzellen (Waugh und Wilson 2008). Es kann durch Heparin gehemmt werden (Mousa 2010). Die zwei Chemokine RANTES (CCL-5) und MCP-1 (CCL-2) werden ebenfalls vermehrt von Tumorzellen gebildet. Sie fördern v. a. die Migration von Monozyten aus dem Blut zum Tumor, die dort als tumorassoziierte Makrophagen das Tumorwachstum und die Metastasierung fördern (Mishra et al. 2011; Soria und Ben-Baruch 2008). Diese Immunzellen setzen Faktoren frei, die die Angiogenese, den Abbau der extrazellulären Matrix sowie die Tumorzellproliferation fördern (Soria und Ben-Baruch 2008). Außerdem unterstützen diese beiden Chemokine die promalignen Eigenschaften dieser Immunzellen sowie des Tumors (Mishra et al. 2011; Soria und Ben-Baruch 10 1 Einleitung 2008). Ebenfalls verstärken MCP-1 und RANTES die Migration, Invasion sowie die Metastasierung von Mammakarzinomen (Soria und Ben-Baruch 2008). Heparin konnte die RANTES-vermittelte Migration und Invasion von humanen Hepatom-Zellen (Sutton et al. 2007) sowie die Zellrekutierung in einem Peritonealen-Zell-Chemotaxis-Modell hemmen (Johnson et al. 2005). HGF, ein multifunktionelles Zytokin, ist ein von Stromazellen stammender Wachstumsfaktor, der v. a. parakrin als ein Mitogen, Motogen und Morphogen auf viele Zellen wirkt (Desiderio 2007; Yoshida et al. 2002; Nakamura et al. 2011; Sugawara et al. 1997). Es spielt eine Rolle bei der Embryogenese und Gewebsreparatur und hat andere gewebespezifische Funktionen (Desiderio 2007; Sugawara et al. 1997; Nakamura et al. 2011). Im physiologischen Endometrium moduliert HGF die Regeneration während der Menstruation und fördert die Proliferation, Migration und Lumenformation von endometrialen Epithelzellen (Sugawara et al. 1997). Der HGF-Rezeptor ist das Protoonkogen c-Met (Castelli et al. 2004). Häufig ist der Rezeptor im Karzinom hochreguliert (Desiderio 2007; Yoshida et al. 2002). Einige Studien zeigten zudem, dass HGF die Proliferation und die Invasion von Karzinomen wie dem endometrialen Karzinom förderte (Yoshida et al. 2002). Außerdem sezernierten die Karzinome eine Reihe von Substanzen wie bFGF und TNF α, die die HGF-Produktion in Stromazellen erhöhten (Choi et al. 2009). HGF bindet mit hoher Affinität an Heparansulfatproteoglycan (Desiderio 2007). Heparin scheint die Bindung von HGF an dessen Rezeptor zu erleichtern (Kemp et al. 2006). Es ist jedoch auch beschrieben, dass Heparin in Glycosaminoglycan-defizienten Zellen die Oligomerbildung und Bindung an seinen Rezeptor förderte, wohingegen es in Wildtypzellen zu einer Verminderung der HGF-c-Met-Bindung kam (Sakata et al. 1996). Heparin kann somit auf unterschiedlichem Wege die Tumorprogression beeinflussen. Durch seine antikoagulatorische Wirkung kann es den prothrombotischen Zustand von Tumoren modulieren und somit bspw. die Metastasierung behindern. Darüberhinaus kann es unabhängig von seiner Wirkung als Antikoagulanz u. a. die Selektin-vermittelte Tumorzelladhäsion an den Gefäßendothelzellen, die proinvasive Heparanase des Tumors sowie verschiedene Wachstumsfaktoren und Chemokine hemmen. Ebenfalls scheint Heparin das HGF/ c-Met System beeinflussen zu können, wobei es sowohl die Bindung von HGF an dessen Rezeptor verstärken als auch abschwächen kann. Heparin kann somit in wichtige Prozesse der Karzinogenese wie Proliferation, Metastasierung und Zellinteraktion eingreifen und dadurch die Tumorprogression modulieren. 11 2 Zielstellung 2 Zielstellung In Studien konnte gezeigt werden, dass Heparin das Überleben von Karzinompatienten verlängerte. Dieser Effekt scheint dabei überwiegend unabhängig von der antikoagulatorischen Wirkung zu sein. Ein möglicher Ansatzpunkt ist die Interaktion von Heparin mit verschiedenen Chemokinen und Wachstumsfaktoren aufgrund seiner sterischen Eigenschaft als stark negativ geladenes Molekül. Dadurch könnte es das Tumormikromilieu sowie die Tumorprogression und Metastasierung beeinflussen. Um einen Einblick über die möglichen Angriffspunkte von Heparin auf das Endometriumkarzinom zu bekommen, wurden in der Arbeit folgende Fragen untersucht: Welchen Einfluss hat Heparin auf die Spontanproliferation von endometrialen Karzinomzellen? Moduliert Heparin die Zytokinsekretion der proinflammatorischen und protumorgenen Chemokine MCP-1, IL-8 und RANTES in endometrialen Karzinomzellen? Verändert Heparin das Invasionsverhalten endometrialer Karzinomzellen? Beeinflusst Heparin die HGF-Sekretion von endometrialen Stromazellen? Zur Beantwortung dieser Fragen wurden die fünf unterschiedlich differenzierten humanen endometrialen Karzinomzelllinien AN3 CA, ECC-1, HEC-1-A, KLE, RL95-2 und endometriale Stromazellen verwendet. Mittels verschiedener molekularbiologischer Methoden wurde dabei der Einfluss von Heparin auf diese Zelllinien in vitro untersucht. 12 3 Material 3 Material 3.1 Laborgeräte Gerät Abzug Gerätetyp Typ 2-453-GAHD Analysewaage MC1 Analytic AC 210P MLS-3750 AF 100 Autoklav Automatischer Flockeneisbereiter CO2 Inkubator O2/CO2 Inkubator FACS F-34-6-38 Festwinkelrotor FluoreszenzMikrotiterplatten-Leser Handdispenser Inkubationsbad Kühlsystem 4 °C -20 °C -20 °C -80 °C Hersteller Köttermann, Uetze/Hänigsen, Deutschland Sartorius AG, Göttingen, Deutschland Sanyo, Moriguchi, Japan Scotsman Europe, Mailand, Italien CytoGROW GLP Series CO2 , MCO-18 AIC MCO-18M Sanyo, Moriguchi, Japan BD FACSCantoTM 5804 727.002 BD Biosciences, Franklin Lakes, USA Eppendorf, Hamburg, Deutschland FLUOstar Optima BMG LABTECH, Ortenberg, Deutschland Eppendorf, Hamburg, Deutschland GFL, Burgwedel, Deutschland Multipipette®plus Inkubations/Inaktivierungsbad 1003 Sanyo, Moriguchi, Japan Premiere VKS 25046 Premiere Hausgerätetechnik, Ascheberg Deutschland MDF-U333 Sanyo, Moriguchi, Japan WKS 3200 Liebherr, Bulle, Schweiz MDF-U53V Sanyo, Moriguchi, Japan -190 °C Magnetrührer mit Heizplatte Mehrkanalpipette Mikroplatten Waschgerät Mikroskop ARPEGE 70 Modell MSH B PCR 7300 Real-Time PCR System 100 µl, 300 µl Asys Atlantis Nikon TMS Air Liquide, Düsseldorf, Deutschland IKA®-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Deutschland Eppendorf, Hamburg, Deutschland Biochrom Asys, Salzburg, Österreich Nikon Instruments, Düsseldorf, Deutschland Applied Biosystems/ Life Technologies, Carlsbad, USA 13 3 Material Gerät Pipetten Pipettierhilfe Reinstwassersystem Schüttelinkubator Gerätetyp 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl, 5000 µl pipetus®-akku Hersteller Eppendorf, Hamburg, Deutschland accu-jet®pro BRAND GmbH, Wertheim, Deutschland Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach, Deutschland Edmund Bühler GmbH, Hechingen, Deutschland Thermo Electron Corperation, Waltham, USA Eppendorf, Hamburg, Deutschland Synergy Polymax 1040 KS-15 CONTROL Sicherheitswerkbank HERAsafe KS9 Thermocycler Mastercycler® gradient Thermomixer 5437 Vortex Mixer Thermomixer VortexReagenzglasmischer Zählkammer Zentrifuge Neubauer Zählkammer Centrifuge 5810 R Centrifuge 5415 R Rotilabo®Mini-Zentrifuge Hirschmann Laborgeräte GmbH, Eberstadt, Deutschland Eppendorf, Hamburg, Deutschland neoLab, Heidelberg, Deutschland LO - Laboroptik, Lancing, England Eppendorf, Hamburg, Deutschland Eppendorf, Hamburg, Deutschland Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland 3.2 Verbrauchsmaterialien Produkt Abdeckfolie für ELISA für PCR Artikelnummer ArtikelBezeichnung Hersteller 100SEAL-PLT SealPlate®: 676 070 Excel Scientific, Victorville, USA 676 070 VIEWsealTM Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland 14 3 Material Produkt Artikelnummer ArtikelBezeichnung Hersteller Aufbewahrungsrack für PCR-Tubes 2-2603 für PCR-Strips 2-2604 Einfrierröhrchen 122 263 Cryo.s™ 2ml Einwegskalpell, steril ELISA Mikroplatte FACS-Röhrchen No.22 Feather Disposable Scalpel Clear Microplate DY990 551.579 Zellsieb 352340 352350 Bottle Top-Filter mit AC35.1 SFCA Membran, AC36.1 500ml Gestelle Acrylglasgestell 1-5136 2x12 Acrylglasgestell 1-5138 4x12 Acrylglasgestell 1-5139 6x12 neoRack®2-1630 Röhrchengestell 9x9 neoRack®2-1631 Röhrchengestell 7X7 Unwire™ Half5972-0430 Racks 3x3 40µm Pore 70µm Pore 0,22µm Pore 0,45µm Pore Gewindeflasche aus Borosilikatglas, 45 mm Gewinde X712.1 100ml X714.1 500ml X715.1 1000ml Hämozytometer Deckglas BAA26402223 neoLab, Heidelberg, Deutschland neoLab, Heidelberg, Deutschland Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland Feather Safety Razor Co., Osaka, Japan R&D Systems, Minneapolis, USA Sarstedt, Nürnbrecht, Deutschland BD Biosciences, Franklin Lakes, USA Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland Heidelberg, Deutschland neoLab Heidelberg, Deutschland neoLab Heidelberg, Deutschland neoLab Heidelberg, Deutschland neoLab Heidelberg, Deutschland neoLab NALGENE Labware/ Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland Armin Baack, Schwerin, Deutschland 15 3 Material Produkt Artikelnummer 0923.1 ArtikelBezeichnung Cryo-Gloves®, Größe : M KryoAufbewahrungsboxen Kryo-Einfriergerät 2-2700 mit Deckel 5100-0001 Mr. Frosty Kultivierungsflasche Laborglasflaschen 50 ml 100 ml 250 ml 2000 ml Magnetrührstäbchen 831813002 75 cm2 Handschuhe 21 801 17 5 21 801 24 5 21 801 36 5 21 801 63 5 442-4527 Hersteller Tempshield, Mount Desert, USA (Bezug: Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland) neoLab, Heidelberg, Deutschland NALGENE Labware/ Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA Sarstedt, Nürnbrecht, Deutschland DURAN Group GmbH, Wertheim/Main, Deutschland Zylindrisch 40x8mm VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland Messzylinder 100 ml 21 396 24 500 ml K851.1 Rotilabo®Messzylinder aus PP Parafilm PM-996 PCR Streifen 710980 Pechiney Plastic Packaging, Chicago, USA 8er-SoftStrips® mit Biozym Scientific GmbH, Single Cap, 0.2 ml Hessisch Oldendorf, Deutschland 96 Well Greiner Bio-One GmbH, Polypropylen Frickenhausen, Deutschland Microplatten Rotilabo®Carl Roth, Petrischale Karlsruhe, Deutschland Pinzette, neoLab, anatomisch Heidelberg, Deutschland PCR-Platte Petrischale 0690.1 Pinzette 1-1811 DURAN Group GmbH, Wertheim/Main, Deutschland Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland 16 3 Material Produkt Artikelnummer ArtikelBezeichnung Hersteller Pipettenspitzen 10 µl ohne Filter 72001 10 µl mit Filter 100 µl mit Filter 200 µl ohne Filter 780012 780102 70.760.002 Micro Tips Premium SafeSeal Tips Premium Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Deutschland 1000 µl ohne Filter 0030000-919 1000 µl mit Filter 076927300 5000 µl ohne Filter 0030.000.978 epT.I.P.S.® 0030069.234 022266306 022266403 022266501 Combitips® plus 022496085 022496107 022496123 Combitips Biopur® Eppendorf, Hamburg, Deutschland Direktverdrängerspitzen, unsteril 1 ml 2,5 ml 5 ml 10 ml Direktverdrängerspitzen, steril 2.5 ml 5 ml 10 ml Reaktionsgefäße 1,5 ml 72.690.001 2 ml 0030 123.344 Schaber 16cm, flexibel 83.1832 28cm 541070 Serologische Pipetten 5 ml 10 ml 25 ml 86.1253.001 86.1254.001 86.1685.001 epT.I.P.S.® Sarstedt, Nürnbrecht, Deutschland Eppendorf, Hamburg, Deutschland nerbe plus GmbH, Winsen/Luhe, Deutschland Eppendorf, Hamburg, Deutschland Eppendorf, Hamburg, Deutschland Sarstedt, Nürnbrecht, Deutschland Eppendorf, Hamburg, Deutschland Sarstedt, Nürnbrecht, Deutschland Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Sarstedt, Nürnbrecht, Deutschland 17 3 Material Produkt Artikelnummer P898.2 Steigeinsatz für Kryoboxen ThinCert™ 662638 Zellkultureinsätze für Multiwell Platten Vernichtungs-beutel 861.197 Zählkammer ArtikelBezeichnung 8,0 µm Poren, transluzent, 24 well-Format Neubauer Zählkammer Hersteller Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland Sarstedt, Nürnbrecht, Deutschland LO - Laboroptik, Lancing, England Zellkulturplatte 96-Well Mikrotiterplatte 167008 96-Well Mikrotiterplatte, U-Boden 48-Well Zellkulturplatte 650180 24-Well Zellkulturplatte 12-Well Zellkulturplatte Zentrifugenröhre 15 ml 353047 50 ml 352070 677180 353043 62.554.502 F26 MicroWell™ Plate nunc/ Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland BD Biosciences, Franklin Lakes, USA BD BiosciencesFranklin Lakes, USA Sarstedt, Nürnbrecht, Deutschland BD Biosciences, Franklin Lakes, USA 18 3 Material 3.3 Reagenzien und Chemikalien 3.3.1 Zellbiologische Arbeiten Chemikalien Artikel- und Reagenzien nummer Aktivkohle X865.2 BD Matrigel® Basement Membrane Matrix ß-Östradiol 356234 E2758 Sigma-Aldrich, St. Louis, USA CellTiter-Blue® Cell Viability Assay Dextransulfat-Natrium (Leuconostoc spp.) Dextran T70 G8081 Promega, Madison, USA Dimethylsulfoxid Ethanol 96 % D2438 Fetales Kälberserum (FCS) Gentamicin S0115 D6924 10,5 mg/ml 100 mg/ml 9228.1 vergällt mit Mercaptoethanol Händedesinfektion PZN: 3928180 975512 IL-6 (rekombinantes 50436 IL-8 (rekombinantes) 50448 Act rapid® Penfill® Produktangaben 80mg/2ml Sterillium® classic pure 100 I.E./ml Hersteller Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland BD Biosciences, Franklin Lakes, USA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Universitätsapotheke der ErnstMoritz-Arndt-Universität Greifswald Biochrome AG, Berlin, Deutschland Ratiopharm, Ulm, Deutschland BODE Chemie GmbH, Hamburg, Deutschland Biomol GmbH Hamburg, Deutschland Biomol GmbH Hamburg, Deutschland NovoNordisk A/S Denemark 19 3 Material Chemikalien und Reagenzien Heparine: Artikelnummer Produktangaben Hersteller Danaparoid-Natrium (Orgaran®) PZN: 88897 1250 U/ml Essex Pharma GmbH, München Deutschland Enoxaparin-Natrium (Clexane®) PZN: 7659558 10.000 U/ml 40 mg/0,4 ml Sanofi Deutschland GmbH, Frankfurt-Höchst, Deutschland Fondaprinux-Natrium (Arixtra ®) PZN: 2142187 3.500 U/ml 2,5 mg/0,5 ml, Heparin Natriumsalz H3149 9000 U/ml Galaxo Wellcome Production, Notre Dame de Bondeville, Frankreich Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Tinzaparin-Natrium (Innohep®) HGF (rekombinantes) PZN: 1581080 94893 20.000 U/ml MCP-1 (rekombinantes) Phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung (PBS, steril) Progesteron 94843 P8783 Sigma-Aldrich, St. Louis, USA RANTES (rekombinantes) TNF α (rekombinantes) Trypanblau Trypsin EDTA 1x 94866 Biomol GmbH Hamburg, Deutschland L1825 [-] Calcium, [-] Magnesium, niedriger Endotoxingehalt LEO Pharma GmbH, Neu-Isenburg, Deutschland Biomol GmbH Hamburg, Deutschland Biomol GmbH Hamburg, Deutschland Biochrome AG, Berlin, Deutschland PHC3015 T 8154 25200056 0,4% 0,25% Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Gibco/ Life Technologies, Carlsbad, USA FACS Accutase L11-007 BD FACS Flow Sheath Fluid BD FACS Clean Solution BD FACS Shutdown Solution 342003 PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich BD Biosciences, Franklin Lakes, USA 340345 334224 20 3 Material Kultivierungsmedien: Zellen Kultivierungsmedium Name Merkmale Artikel- Hersteller nummer ECC-1 RPMI 1640 Medium RL95-2, KLE und endometriale Stromazellen DMEM/ F-12 (1X) Medium HEC-1-A McCoy's 5A Medium 1x [+] 2,0 g/l NaHCO3, [+] stabiles Glutamin, niedriger Endotoxingehalt [+] L-Glutamin, [+] 15mM HEPES, ohne Phenolrot FG 1215 Biochrome AG, Berlin, Deutschland 11039047 Gibco/Life Technologies, Carlsbad, USA [+] L-Glutamin, [-] Serum 26600080 Gibco/Life Technologies, Carlsbad, USA AN3 CA MEM Earle‘s [+] 2,2 g/l NaHCO3, [+] stabiles Glutamin, niedriger Endotoxingehalt FG 0325 Biochrome AG, Berlin, Deutschland 3.3.2 Molekularbiologische Arbeiten Chemikalien und Reagenzien Artikelnummer Produktangaben Hersteller RNA Isolation Ethanol 9065.3 ROTIPURAN® ≥99,8 %, p.a. ROTIPURAN® ≥99 %, p.a. chemsolute®, min 99.7% Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland Th. Geyer GmbH & Co. KG, Renningen, Deutschland PEQLAB Biotechnologie GMBH, Erlangen, Deutschland Trichlormethan/ Chloroform 2-Propanol 3313.2 Trifast 30-2020 1.136.100 21 3 Material Chemikalien und Reagenzien RT-Reaktion High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit mit RNase Inhibitor PCR SYBR® Green PCR Master Mix Artikelnummer Produktangaben Hersteller 4374966 10x RT Random Primers, 10x RT Buffer, dNTP Mix (100 mM), RNase Inhibitor (2000 U, 20 U/μl), MultiScribe™ MuLV reverse transcriptase (50 U/μl) Applied Biosystems/ Life Technologies, Carlsbad, USA 4309155 SYBR Green 1 Farbstoff, AmpliTaq Gold® DNA Polymerase, dNTPs mit dUTP, Passive Referenz, Pufferkomponenten Applied Biosystems/ Life Technologies, Carlsbad, USA 3.3.3 Proteinchemische Arbeiten Chemikalien und Reagenzien TWEEN® 20 Artikelnummer P1379 Produktangaben Hersteller Sigma-Aldrich, St. Louis, USA PBS substanz Trocken- L 182-50 ohne Ca2+, Mg2+ Biochrom AG, Berlin, Deutschland 22 3 Material Chemikalien und Reagenzien ELISA Artikelnummer Produktangaben Hersteller Bovines Serumalbumin (BSA) Schwefelsäure A7030 lyophilisiertes Puder, ≥98% Sigma-Aldrich, St. Louis, 96% Fluka Analytical/ 17025 USA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA StreptavidinMeerrettichperoxidase DY998 Substrat Reagent Pack' DY999 ELISA Kits Human CCL2/ MCP-1 DuoSet R&D Systems, Minneapolis, USA DY279 Color Reagent A, (Wasserstoffperoxid) Color Reagent B, (Tetramethylbenzidine) R&D Systems, Fangantikörper: Maus anti-human MCP-1Antikörper (180 µg/ml) R&D Systems, Minneapolis, USA Minneapolis, USA Detektionsantikörper: biotinylierter Ziege antihuman MCP-1 Antikörper (18 µg/ml) Human CCL5/ RANTES DuoSet DY278 CCL2/MCP-1 Standard: rekombinantes humanes MCP-1 (130 ng/ml) Fangantikörper: Maus anti-human RANTES-Antikörper (360 µg/ml) Detektionsantikörper: biotinylierter Ziege antihuman RANTES Antikörper (7,2 µg/ml) R&D Systems, Minneapolis, USA CCL5/ RANTES Standard: rekombinantes humanes RANTES (120 ng/ml) 23 3 Material Chemikalien und Reagenzien ELISA Kits Human HGF DuoSet Artikelnummer Produktangaben Hersteller DY294 Fangantikörper: Maus anti-human HGFAntikörper (360 µg/ml) R&D Systems, Minneapolis, USA Detektionsantikörper: biotinylierter Ziege antihuman HGF Antikörper (36 µg/ml) Human IGFBP-1 DuoSet DY871 HGF Standard: rekombinantes humanes HGF (480 ng/ml) Fangantikörper: anti-human IGFBP-1Antikörper (720 µg/ml) R&D Systems, Minneapolis, USA Detektionsantikörper: biotinylierter anti-human IGFBP-1Antikörper )72 µg/ml) Human Prolaktin DuoSet DY682 IGFBP-1 Standard: rekombinantes humanes IGFBP-1 (125 ng/ml) Fangantikörper: anti-human ProlaktinAntikörper (144 µg/ml) R&D Systems, Minneapolis, USA Detektionsantikörper: biotinylierter anti-human Prolaktin Antikörper (36 µg/ml) Prolaktin Standard: rekombinantes humanes Prolaktin (200 ng/ml) 24 3 Material Chemikalien Artikelund Reagenzien nummer ELISA Kits HumanIL-8/ BMS204/ NAP-1 Matched 3MST Antibody Pairs Produktangaben Hersteller Fangantikörper: anti-human IL-8Antikörper (100 µg/ml) Bender MedSystems GmbH Vienna, Austria DFetektionsantikörper: biotinylierter anti-human IL-8 Antikörper (55 µg) Streptavidin-HRP (11µl) IL-8 Standard: rekombinantes humanes IL-8S (200 ng/ml) Lysatgewinnung M-Per® 78503 Mammalian Protein Extraction Reagent Protease Inhibitor 78410 Cocktail Kit mit EDTA Pierce/ Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA Pierce/ Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 3.4 Zelllinien Zelllinie AN3 CA ATTC® Nummer HTB-111 Beschreibung Lieferant American Type Culture Collection Manassas, USA ECC-1 CRL-2923 HEC-1-A HTB-112 endometriales Karzinom aus einer Lymphknotenmetastase endometriales Karzinom, gut differenziert endometriales Karzinom KLE CRL-1622 endometriales Karzinom RL95-2 CRL-1671 endometriales Karzinom (ATCC), 25 3 Material 3.5 Primer Die Primer wurden für folgende Gene verwendet: β-Aktin, HGF, RANTES, MCP-1 und IL-8. Alle Primer wurden von Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, USA bezogen. Human β-Aktin Vorwärtsprimer Sequenz: 5'-CCTGGCACCCAGCACAAT-3' Länge: 18 b Tm: 59 °C GC Gehalt: 61 % Lage: Exon 4 (876 - 1057) Rückwärtsprimer Sequenz: 5'-GCCGATCCACACGGAGTACT-3' Länge: 20 bp Tm: 59 °C GC Gehalt: 60 % Lage: Exon 5 (1058-10793) Human HGF Vorwärtsprimer Sequenz:5'-TTTGGCCATGAATTTGACCTCT -3' Länge: 22 bp Tm: 59 °C GC Gehalt: 40 % Lage: Exon 3 (499-523) Rückwärtsprimer Sequenz: 5'-ACTGTTCCCTTGTAGCTGCGTC -3' Länge: 22 bp Tm: 59 °C GC Gehalt: 54% Lage: Exon 4 (562-584) 26 3 Material Human CCL-2/ MCP-1 Vorwärtsprimer Sequenz: 5'-AAAGTCTCTGCCGCCCTTCT -3' Länge: 20 bp Tm: 59 °C GC Gehalt: 55 % Lage: Exon 1 (1-149) Rückwärtsprimer Sequenz: 5'-GATTGCATCTGGCTGAGCG -3' Länge: 19 bp Tm: 59 °C GC Gehalt: 58 % Lage: Exon 1und 2 (2:150-267) Human CCL-5/ RANTES Vorwärtsprimer Sequenz: 5'-CTCGCTGTCATCCTCATTGCT -3' Länge: 21 bp Tm: 59 °C GC Gehalt: 52 % Lage: Exon 1 (69-144) Rückwärtsprimer Sequenz: 5'-TGTGGTGTCCGAGGAATATGG -3' Länge: 21 bp Tm: 59 °C GC Gehalt: 52 % Lage: Exon 2 (145-156) 27 3 Material Human CXCL-8/ IL-8 Vorwärtsprimer Sequenz: 5'-TCTTGGCAGCCTTCCTGATT -3' Länge: 20 bp Tm: 58 °C GC Gehalt: 50 % Lage: Exon 1 (1-165) Rückwärtsprimer Sequenz: 5'-TTAGCACTCCTTGGCAAAACTG -3' Länge: 22 bp Tm: 58 °C GC Gehalt: 45 % Lage: Exon 2 (166-301) 3.6 Programme Programm Verwendung Hersteller 7300 System Sequence Datenerhebung Detection Software v1.4.0 Time-RT PCR BD FACSDiva™ Software v6.1.3 Citavi 3 GraphPad Prism 5.01 Microsoft Excel 2010 Paint (Windows 2007) Microsoft Word 2010 OPTIMA Software v2.10 Primer Express® Software Version 3.0 Real- Applied Biosystems/ Life Technologies, Carlsbad, USA Datenerhebung BD Biosciences, Franklin Durchflusszytometrie Lakes, New Jersey/USA Literaturverwaltung Swiss Academic Software GmbH, Wädenswil/Schweiz Statistische Auswertung, GraphPad Software Ins., San Grafiken Diego/ USA Datenverarbeitung Microsoft Co, Unterschleißheim, Deutschland Bildbearbeitung Microsoft Co, Unterschleißheim, Deutschland Textverarbeitung Microsoft Co, Unterschleißheim, Deutschland Datenerhebung ELISA BMG LABTECH GmbH, und CTB, Ortenberg, Deutschland Lumineszenz-Assay Primerdesign Applied Biosystems/ Life Technologies, Carlsbad, USA 28 4 Methoden 4 Methoden 4.1 Zellbiologische Methoden 4.1.1 Zelllinien Die Experimente wurden mit folgenden fünf humanen endometrialen Adenokarzinomzelllinien durchgeführt: AN3 CA, ECC-1, HEC-1-A, RL95-2 und KLE. Diese Zelllinien unterscheiden sich u. a. bezüglich ihres Differenzierungsgrades und Metastasierungsverhalten. Sie wurden über American Type Culture Collection (ATCC) bezogen. Bei den ECC-1 handelt es sich um eine gut differenzierte Adenokarzinomzelllinie. RL95-2 und HEC-1-A stellen moderat differenzierte Zelllinien epithelialen Ursprungs des Endometriums dar. HEC-1-A wurde 1968 aus einer Patientin mit Stadium IA eines Endometriumkarzinoms isoliert. Als Modell für ein schlecht differenziertes Endometriumkarzinom wurden die beiden Adenokarzinomzelllinien AN3 CA und KLE verwendet. AN3 CA stammt aus einer Lymphknotenmetastase. Alle Zelllinien sind ursprünglich aus Patientinnen mit einem Alter von 55 – 71 Jahren (über ECC-1 lagen keine Daten bzgl. des Alters vor) isoliert worden. Darüber hinaus wurden für einige Experimente humane endometriale Stromazellen verwendet. Dabei handelte es sich um Primärkulturen (siehe 4.1.3). 4.1.2 Kryokonservierung der Karzinomzellen Auftauen Zum Auftauen der kryokonservierten Karzinomzellen wurden pro Einfrierröhrchen 20 ml des jeweiligen Zellkulturmediums (Tabelle 2) hergestellt. Dieses wurde bei 37 °C im Wasserbad erwärmt. Das Reaktionsgefäß mit den eingefrorenen Zellen wurde aus dem Flüssigstickstoff geholt und für 2 min im Wasserbad bei 37 °C geschwenkt. Anschließend wurde das Reaktionsgefäß desinfiziert und die Zellsuspension wurde in 10 ml des angewärmten Mediums überführt. Danach wurde es für 10 min bei 130 g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgekippt und das Zellpellet mit dem Zellkulturmedium resuspendiert. Es wurde dann in eine Zellkulturflasche ausgesät. Einfrieren Zum Einfrieren wurde die gewünschte Zellzahl (Tabelle 3) in das Einfriermedium überführt. Das Einfriermedium bestand aus dem normalen Zellkulturmedium (Tabelle 2) sowie 5 % DMSO (außer ECC-1, diese erhielten 10 % DMSO). Anschließend wurde 1 ml dieser Suspension in 29 4 Methoden jedes Einfrierröhrchen überführt. Diese wurden dann über Nacht im Mr. Frosty bei -80 °C gelagert. Nach 24 Stunden konnten sie dann in Stickstoff bei -196 °C überführt werden. Tabelle 2: Zusammensetzung der für die jeweilige Zelllinie verwendeten Zellkulturmedien Zellen ECC-1 HEC-1-A RL95-2 Medium RPMI McCoy’s DMEM/F12 MEM 1640 5A Zusätze AN3 CA KLE Stromazellen DMEM/F12 DMEM/F12 Earle’s 10 % FCS 10 % depletiertes FCS 50 µg/ml Gentamycin 0,005 mg/ml Insulin Tabelle 3: Angaben zu Zellzahl bzgl. der Zellaussaat, dem Einfrieren sowie den Experimenten mit den humanen endometrialen Karzinomzelllinien AN 3 CA ECC-1 HEC-1-A KLE RL95-2 25.000 50.000 Angaben jeweils Zellen pro ml 40.000 Proliferationsversuche 25.000 0,3 Mio. Kompartimentbestimmung Gewinnung 40.000 von 0,2 Mio. 0,5 Mio. 0,2 Mio. 0,3 Mio. 0,15 Mio. 0,5 Mio. Überständen und mRNA Invasionsassay 0,4 Mio. 0,4 Mio. 0,4 Mio. 0,4 Mio. 0,4 Mio. Einfrieren 2 Mio. 2 Mio. 2 Mio. 2 Mio. 2 Mio. 4.1.3 Präparation und Gewinnung von endometrialen Stromazellen Die humanen endometrialen Stromazellen entstammen alle prämenopausaler Patientinnen, die sich aus benignen Gründen (z. B. wegen Myomen) einer Hysterektomie unterzogen. Alle Patientinnen wurden ausführlich aufgeklärt und stimmten der Probenentnahme schriftlich zu. 30 4 Methoden Das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission der Ärztekammer MecklenburgVorpommern geprüft und genehmigt. Es ist unter der folgenden Nummer registriert: Reg. Nr. III UV 67/06. Die Uteri wurden vom Pathologen präpariert und ein Teil des Gewebes wurde von ihm entnommen, welches zur Isolation der endometrialen Stromazellen diente. Dieses Gewebe wurde in PBS mit 50 µg/ml Gentamycin für den Transport überführt. Im Labor wurde das Gewebsstück in eine Petrischale gegeben. Dort wurde mittels eines Skalpells das Endometrium vom Myometrium, welches danach verworfen wurde, abgeschabt sowie das Endometrium anschließend in 1 mm³ große Stücke zerkleinert. Es wurden 5 ml DMEM/F12 mit 0,5 % Kollagenase für den Verdau dazugegeben. Die Petrischale wurde dann für 1 h in den Inkubator gelegt. Alle 15 Minuten wurde mit einer 5 ml serologischen Pipette aufund abpipettiert, um das Gewebe weiter zu zerkleinern. Anschließend wurde der Verdau mittels Zellkulturmedium (Tabelle 2) unterbrochen. Das Gewebe wurde dann durch einen 40 µm Filter in ein 50 ml Röhrchen gegeben. Das im Filter befindliche Material wurde verworfen. Der Gewebeverdau, der sich nun in den 50 ml-Röhrchen befand, wurde für 10 Minuten bei 300 g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgekippt und das Pellet im Zellkulturmedium (Tabelle 2) resuspendiert. Die Zellen mit einer Zellzahl von 1 Million Zellen pro ml wurden in 10 ml Medium in Zellkulturflaschen (75 cm2) ausgesät. Nach 45 Minuten erfolgte ein Mediumwechsel. Die endometrialen Stromazellen waren innerhalb dieses Zeitraum bereits adhärent, wohingegen Epithelzellen längere Zeit benötigen. Somit kann durch den Mediumwechsel Verunreinigung durch Epithelzellen sowie durch Leukozyten und Erythrozyten reduziert werden. Die Überprüfung der Reinheit der Zellkulturen erfolgte bereits stichprobenartig mittels Immunfluoreszenzfärbungen für Vimentin (Marker für Stromazellen) und pa-Zytokeratin (Marker für Epithelzellen) bei der Etablierung der Primärkultur (Fluhr et al. 2006). Für die Experimente mit endometrialen Stromazellen wurde immer eine Zellzahl von 1 Million Zellen pro ml verwandt. 4.1.4 Kultivierung der Zellen Alle Zellen wurden bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Ein Mediumwechsel mit dem entsprechenden zellkulturspezifischen Medium (Tabelle 2) erfolgte nach Bedarf aber spätestens alle sieben Tage. Darüber hinaus wurden den jeweiligen Medien 10 % FCS (fetales Kälberserum) sowie 50 µg/ml Gentamycin hinzugegeben. Des Weiteren erhielten die RL95-2 0,005 mg/ml Insulin ins Medium. Die humanen endometrialen Stromazellen erhielten Steroiddepletiertes FCS, um Störeinfluss durch bspw. im Serum enthaltene Hormone zu minimieren. 31 4 Methoden Subkultivierung Zur Subkultivierung wurden die Zellen zunächst mit 10 ml PBS gespült, um FCS-Rückstände komplett zu entfernen, die das Ablösen mittels Trypsin stören würden. Danach wurden 2 ml Trypsin-EDTA 0,25 % hinzugegeben und die Zellkulturflasche für 10 min in den Inkubator gelegt. Anschließend wurde der Verdau mittels Trypsin-Stopplösung, bestehend aus 8 ml PBS mit 2,5 % FCS und 50 µg/ml Gentamycin, abgestoppt und in ein 50 ml Röhrchen überführt. Danach wurden die Karzinomzellen bei 130 g bzw. die Stromazellen bei 300 g für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgekippt und die Zellen wurden mit dem Zellkulturmedium resuspendiert. Für die Karzinomzellen wurde die Zellzahl bestimmt. Es wurden 2 Millionen Zellen der Karzinomzelllinien pro Zellkulturflasche ausgesät. Zellzählung Um mit einer definierten Zellzahl arbeiten zu können, wurden die Zellen mit Hilfe der NeubauerZählkammer gezählt. Zuerst wurde wie bei der Subkultivierung eine Zellsuspension hergestellt. Daraus wurden 20 µl in 20 µl Trypanblau überführt. Das Trypanblau dient zum Anfärben von Zellen mir defekter Zellmembran, wie es bei nekrotischen Zellen auftritt. Es wurden nur die Zellen gezählt, die sich nicht blau anfärben ließen. Anschließend wurden aus dem TrypanblauZellgemisch 10 µl in PBS gegeben, um eine höhere Verdünnung zu erreichen. Dabei wurden die Zellen in so viel µl PBS verdünnt, dass man pro großes Quadrat in der Neubauer Zählkammer etwa 50 - 100 Zellen erhielt. Danach wurden 10 µl in die Neubauer-Zählkammer gegeben. Nun wurden die Zellen unter dem Mikroskop gezählt, wobei immer alle vier großen Quadrate der Neubauer Zählkammer ausgezählt wurden. Die Zellzahl X pro ml konnte dann folgendermaßen ermittelt werden: X = (Z / A) x 10^4 x N Z = In der Neubauerkammer gezählte Zellen A = Anzahl der gezählten Quadrate (großen) 10^4 = Faktor für die Neubauer-Zählkammer N = Verdünnung (setzt sich zusammen aus 1:2 für Trypanblau, zzgl. der Verdünnung mit PBS) 32 4 Methoden Abbildung 2: Neubauer Zählkammer, Quelle lo-laboroptik (http://www.lo-laboroptik.de/deutsch/info/neubauer.gif) 4.1.5 Zellaussaat für die Experimente Es wurde wie bei der Subkultivierung vorgegangen. Die Zellen wurden ebenfalls gezählt, so dass die gewünschte Zellzahl pro ml (Tabelle 3) ausgesät werden konnte. Alle Experimente wurden, sofern nicht anders angegeben, bei 1 % FCS für die AN3 CA, HEC-1-A, RL95-2 und KLE und bzw. bei 10 % FCS für die ECC-1 durchgeführt. Die Stromazellen wurden bei 10 % depletierten FCS ausgesät und nach Erreichen der Konfluenz mit 5 % depletierten FCS weiterbehandelt. Im Gegensatz zu Normoxie, welches Umgebungssauerstoff bedeutet, waren die Zellen unter Hypoxie einem Sauerstoffgehalt von 1 % ausgesetzt. Die CO2 Konzentration war bei beiden Bedingungen 5 %. Bei den Experimenten wurde pro Well einer Zellkulturplatte immer eine definierte Flüssigkeitsmenge verwandt (Tabelle 4). Tabelle 4: Flüssigkeitszugabe in µl pro Well in eine Zellkulturplatte Anzahl der Wells pro Platte Flüssigkeitszugabe in µl pro Well 96 100 48 250 24 500 12 1000 4.1.6 Dezidualisierung endometrialer Stromazellen Nach Erreichen der Konfluenz wurden die Stromazellen Tag 0 gesetzt. Anschließend erfolgte an den Tagen 0, 3, 6 sowie 9 ein Mediumwechsel, der das Zellkulturmedium mit 5 % FCS sowie 30 nM Östrogen und 1 µM Progesteron enthielt. Damit sollte die Dezidualisierung der 33 4 Methoden Stromazellen erreicht werden. Zusätzlich wurden parallel Stromazellen mit dem gleichen Medium behandelt, wobei anstelle der Hormone eine Solvenzkontrolle (Zellkulturmedium mit BSA und 0,01 % Ethanol (Lösungsmittel von Östrogen und Progesteron)) zugegeben wurde. Am Tag 9 wurden zusätzlich die Überstände abgenommen, um einen Anstieg der Expression von Prolaktin und IGFBP-1 und damit die Dezidualisierung mittels ELISA zu überprüfen. Als dezidualisiert galten die endometrialen Stromazellen, wenn sie mindestens doppelt so viel Prolaktin und IGFBP-1 im Vergleich zu den unbehandelten Stromazellen sezernierten. Es wurden für die Experimente sowohl dezidualisierte als auch undifferenzierte Zellen verwendet. 4.1.7 Vitalitätsassay und Proliferationsbestimmung Als Vitalitätsassay wurde der CellTiterBlue®-Assay verwendet. Dabei wird Resazurin durch mitochondriale Enzyme in das fluoreszierende Produkt Resorufin umgesetzt. Nur vitale Zellen sind metabolisch aktiv und in der Lage diesen Stoff umzusetzen. Man geht davon aus, dass jede Zelle eine konstante Menge dieser Substanz in einem bestimmten Zeitraum verstoffwechselt. Damit kann man mit diesem Assay auch die relative Zellzahl bestimmen. Wenn man nun den Verlauf der relativen Zellzahl über einen längeren Zeitraum beobachtet, kann man diesen Assay auch als Proliferationsassay verwenden, da eine Zunahme der relativen Zellzahl über einen Zeitverlauf durch Proliferation hervorgerufen wird. Die Zellen wurden in eine 96 Well Zellkuturplatte mit einer definierten Zellzahl (Tabelle 3) ausgesät. Pro Bedingung wurden Quadruplikate verwendet. Über Nacht wuchsen sie unter normoxischen Bedingungen an und wurden anschließend in Hypoxie und Normoxie getrennt. Nach 24 h und damit 48 h nach der Aussaat wurden die Zellen mit den entsprechenden Stimuli inkubiert. Für die Stimulation mit 100 ng/ml HGF (siehe 5.5 Seite 72) bei den Zelllinien HEC-1-A, RL9-5 sowie KLE erfolgte die Messung nach 48 Stunden Inkubationszeit. Bei den Experimenten Einfluss von unfraktioniertem Heparin auf die Spontanproliferation (siehe 5.1 Seite 42) wurde nach 72 Stunden Inkubationszeit ein erneuter Mediumwechsel für die Platten mit den Messzeiten 96, 120 und 144 Stunden durchgeführt, der wieder die jeweiligen Stimuli enthielt. Es wurden dabei zu folgenden Zeiten Messungen vorgenommen: 24 h vor Stimulation (= -24 h, als die Normoxie und Hypoxie Platten getrennt wurden), 0 h parallel zur Stimulation, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h und 144 h nach Stimulation. Zur Messung wurden 20 µl des CellTiterBlue® in jedes Well gegeben und die Platten wurde nochmals für 1 h in den Inkubator gestellt. Anschließend wurden sie im FLUOstar OPTIMASystem bei 590 nm gemessen. 34 4 Methoden 4.1.8 Invasionsassay Als Modell für den Invasionsassay wurde die Boyden-Kammerr verwendet (Abbildung 3). Dabei wird in eine Zellkulturplatte ein mit Matrigel beschichtetes Insert eingehangen. Das Matrigel dient dabei als Modell für die Basalmembran. Anschließend werden in das Insert die Zellen gegeben. In das Well und damit in die untere Kammer wird der Stimulus gegeben. Die invadierenden Zellen bauen das Matrigel ab und gelangen durch die Poren im Insert an dessen Unterseite. Dort setzen sie sich als adhärente Zellen fest. Die Zellen, die sich an der Unterseite des Inserts befinden, entsprechen der invadierten Zellpopulation. Abbildung 3: Schematische Darstellung der Boyden-Kammer (eigene Darstellung) Vorbereitung, Beschichtung, Zellaussaat und Stimulation Das Matrigel wurde über Nacht bei 4°C auf Eis gelagert, damit es eine flüssige Konsistenz erhielt. Außerdem wurden die Inserts mit einer Porengröße von 8 µm in eine 24 Well Zellkulturplatte gehangen und zusammen mit sterilen Pipettenspitzen über Nacht in den Kühlschrank gestellt, da Matrigel bei 22 – 37 °C schnell eine gelige Konsistenz erhält. Das Matrigel wurde zu einer Konzentration von 0,5 mg/ml mit DMEM/F12 verdünnt und je 60 µl davon wurde auf jedes Insert gegeben. Anschließend wurden die Inserts für 2 h in den Brutschrank gestellt. Danach wurden die Inserts vorsichtig 2 x mit je 200 µl PBS gewaschen, wobei darauf geachtet wurde, die Membran nicht zu berühren. In einer neuen 24 Well Zellkulturplatte wurden in jedes Well 700 µl des für die jeweilige Zelllinie entsprechende Medium (Tabelle 2) gegeben. Anschließend wurden die Inserts in diese Platte überführt und 250 µl mit jeweils 100 000 Zellen (0,4 Mio./ml) in jedes Insert gegeben. Die Platten wurden dann in den Brutschrank entweder unter normoxischen oder hypoxischen Bedingungen gestellt. Nach 18 Stunden erfolgte dann die Stimulation, indem das Medium in den Wells erneuert wurde (+/- Stimulus). Dabei wurden für die Zytokine IL-8, MCP-1, RANTES und HGF eine 35 4 Methoden Konzentration von 100 ng/ml verwendet. Die Dosis für Heparin betrug 1 U/ml. Anschließend wurden die Zellen für 48 h inkubiert. Messung des Invasionsassays mittels CTB Das Medium wurde sowohl aus den Wells als auch aus den Inserts entfernt. Die Wells und damit auch die Unterseite des Inserts wurden mit 500 µl PBS gespült. Anschließend wurde 500 µl Trypsin hinzugegeben, wobei zusätzlich Trypsin in leere Wells gegeben wurde. Diese wurden im weiteren Verlauf genauso wie die anderen Wells behandelt und dienten später bei der Messung als blank-Kontrolle. Die Platten wurden zur Ablösung der Zellen durch Trypsin für 12 min in den Inkubator gestellt. Währenddessen erfolgte die Herstellung einer Stopplösung bestehend aus PBS und 20 % FCS. In jedes Well wurden 250 µl der Stopplösung hinzugegeben. Danach wurden die Zellen an der Unterseite der Inserts, die die Population der invadierten Zellen darstellten, mit Hilfe eines Schabers abgelöst und in die Wells überführt. Die Inserts wurden entfernt. Anschließend wurden jeweils 200 µl aus jedem Well verworfen. In jedes Well, in dem sich jetzt die von der Unterseite des Inserts abgelösten Zellen befanden, wurden 100 µl CTB hinzugegeben. Die Zellkulturplatten wurden dann für 1 h in den Inkubator gestellt. Anschließend wurden von der 24 Well Zellkulturplatte 200 µl in eine 96 Well Zellkuluturplatte überführt, damit es mittels des FLUOstar OPTIMASystem bei 590 nm gemessen werden konnten. 4.1.9 Zellzählung mittels Durchflusszytometer Die Zellzahl wurde aus einer 48 Well Zellkulturplatte mittels dem Durchflusszytometer bestimmt. Dabei wurden die Zellen mit derselben Zellzahl (Tabelle 3) wie für die Gewinnung der Überstände (siehe 3.4.1. Gewinnung von Überständen) ausgesät. Das gesamte Experiment Zellzählung wurde von den Bedingungen wie zur Gewinnung von Überständen (bzgl. der Zellzahl, der Anwachszeit, Zeit des Mediumwechsel, Inkubationszeit) durchgeführt. So sollte sichergestellt werden, dass die Ergebnisse von beiden Experimenten aufeinander bezogen werden konnten. Es wurde die Zellzahl der unbehandelten Zellen bestimmt. Die Zellen wuchsen über Nacht unter normoxischen Bedingungen an. Anschließend wurden die Platten in Norm- oder Hypoxie gestellt. Bei Konfluenz erfolgte ein Mediumwechsel. Nach 48 h wurde die Zellzählung durchgeführt. Zunächst wurden dazu die Überstände abgenommen. Dann wurden die Zellen mit 300 µl PBS gespült. Dies wurde ebenfalls verworfen. Anschließend wurden 100 µl Trypsin pro Well hinzugegeben und für 10 min in den Inkubator gestellt. Mittels FACS-Puffer wurde der Verdau beendet. Danach wurde alles in FACS-Röhrchen überführt. Nachdem die Proben kurz gevortext wurden, erfolgte die Messung mittels FACS. Dabei galt die Zeit (3 Minuten und 40 Sekunden) als limitierender Faktor, wobei solch eine Zeit gewählt 36 4 Methoden wurde, dass möglichst die gesamte Flüssigkeit aus dem Röhrchen vom Gerät zur Messung verwendet wurde. 4.2 Molekularbiologische Methoden 4.2.1 Real-time RT-PCR Die real time Reverse Transkriptase Polymerase Chain Reaction (real-time RT-PCR) dient zur Umschreibung von mRNA in cDNA und anschließender Vervielfältigung der DNA. Dabei soll eine spezifische mRNA nachgewiesen sowie deren relativer Anteil bestimmt werden. Es wird bei dieser semiquantitative Methode somit die Transkription eines Gens nachgewiesen. RNA Gewinnung Die Karzinomzellen wurden bei einer definierten Zellzahl (Tabelle 3) in eine 48 Well Zellkulturplatte ausgesät. Über Nacht wuchsen sie unter normoxischen Bedingungen an und wurden anschließend getrennt unter Hypoxie bzw. Normoxie weiterkultiviert. Nach Erreichen der Konfluenz wurden die Karzinomzellen mit 3,2 U/ml bzw. 0,05 U/ml Heparin stimuliert. Nach 2, 4, 12 und 24 Stunden wurde die mRNA gewonnen. Die endometrialen Stromazellen wurden bei einer Zellzahl von 1 Million Zellen pro ml in eine 48 Well Zellkuluturplatte ausgesät. Nach Erreichen der Konfluenz wurden sie zur Dezidualisierung mit Hormonen bzw. mit der Kontrollsubstanz behandelt (Siehe 4.1.6 Seite 33). Nach Abnahme der Überstände für den Dezidualisierungsnachweis erfolgte am Tag 9 die Stimulation mit 1 U/ml Heparin, 50 ng/ml IL-6 und 50 ng/ml TNFα sowie jeweils mit 50 ng/ml IL-6 oder TNF α in Kombination mit 1 U/ml Heparin. Nach 6 Stunden wurde die mRNA gewonnen. Nach Ende der Inkubationszeit wurde zuerst der Überstand der Zellen abgenommen. Anschließend wurde 250 µl Trifast pro Well hinzugegeben und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde es in 2 ml Gefäße überführt und für mindestens 24 h bei -80 °C gelagert. RNA Isolation Für die RNA-Isolation wurden zu den Proben 50 µl Chloroform gegeben. Dies wurde kurz gevortext und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde es bei 4 °C für 15 min bei 12 000 U/min zentrifugiert. Danach wurden 100 µl der oberen durchsichtigen Phase vorsichtig abgenommen und in neue Reaktionsgefäße überführt, der Rest wurde verworfen. Es wurde 125 µl Isopropanol dazugegeben und gründlich vermischt. Es folgte eine Zentrifugation für 10 min bei 12 000 U/min bei 4 °C. Danach wurden die Überstände dekantiert und 250 µl 37 4 Methoden 75 prozentiger Ethanol hinzugegeben. Es erfolgte eine erneute Zentrifugation bei 8 000 U/min für 6 min bei 4 °C. Anschließend wurden die Überstände abgezogen und das Pellet wurde bei Raumtemperatur für 10 min getrocknet. Es wurde dann mit 42 µl ddH20 (gekühlt 4 °C) resuspendiert und für 15 min bei 60 °C leicht geschüttelt (Thermomixer). Danach wurden die RNA-Proben auf Eis gestellt. Die RNA-Proben wurden bei -80 °C gelagert. Reverse Transkriptase Reaktion Für die Umschreibung der mRNA in cDNA verwendet man das Enzym Reverse Transkriptase. Die gewonnene cDNA unterscheidet sich von der im Zellkern vorhandenen DNA dadurch, dass sie Intron-frei ist. Für die RT-Reaktion wurden 16 µl des Master-Mixes, pro Reaktion bestehend aus 2 µl RT Buffer, 0,8 µl dNTPs, 2 µl Random Primer, 1 µl RNase Inhibitor, 1 µl MultiScribe RT und 9,2 µl ddH2O, in die PCR-Strips pipettiert. Anschließend wurden 4 µl Probe hinzugegeben und die RT-Reaktion gestartet. Bedingungen, die später in einer nachfolgenden PCR verglichen werden sollte, liefen gemeinsam in einer RT-Reaktion. Es wurde bei den Geräten das Programm RT ABI 2007 verwendet, welches folgenden Ablauf umfasst: 10 min 25 °C; 120 min 37 °C; 5 sec 85 °C und anschließend 4 °C Real-time RT-PCR Für die PCR wurde für jedes Primerpaar ein Master-Mix hergestellt. Dieser bestand pro Reaktion aus je 0,5 µl forward und reverse Primer (6 µM-stock), 5 µl SYBR Green PCR Master Mix und 1 µl dd H2O. In die 96 Well–PCR-Platte wurden pro Well 7 µl Master-Mix, sowie 3 µl cDNAProbe gegeben. Anschließend wurde die PCR-Reaktion gestartet. Bei jeder PCR wurde neben dem Primer für den zu untersuchenden Abschnitt zusätzlich noch die Primer für das housekeeping-Gen ß-actin verwendet, um den cDNA-Gehalt der einzelnen Proben festzustellen. Für jede Probe fand eine Doppelbestimmung statt. Es wurde das Programm ABI PRISM 7000 Standard verwendet. Die PCR lief bei folgenden Zyklen ab: 50 °C für 2min; 95 °C für 10 min; 40 x 95 °C für 15 sec und 60 °C für 1 min. Anschließend erfolgte eine Schmelzpunktanalyse, um Verunreinigungen durch DNA zu erkennen. Die Auswertung der PCR erfolgte mittels der delta-delta-ct-Formel nach Livak und Schmittgen (Livak und Schmittgen 2001): X = 2 -(mRNA-Gehalt des zu untersuchenden Gens – mRNA-Gehalt von ß-Aktin) 38 4 Methoden 4.3 Proteinchemische Methoden 4.3.1 Gewinnung von Überständen Die Gewinnung von Überständen diente dazu, im Verlauf die Konzentration einiger enthaltener Proteine mittels ELISA zu bestimmen. Die Zellen wurden mit einer definierten Zellzahl (Tabelle 3) in eine 48 Well Zellkulturplatte ausgesät. Pro Bedingung wurden Quadruplikate verwendet. Bei den Experimenten zur Kompartimentbestimmung wurden hingegen Triplikate sowie eine 12 Well Zellkulturlatte verwendet. Über Nacht konnten die Zellen bei normoxischen Bedingungen anwachsen und wurden anschließend in Hypoxie oder Normoxie gestellt. Nachdem die Zellen konfluent waren, erfolgte die Stimulation. Nach 48 h wurden die Überstände von den un- bzw. behandelten Zellen abgenommen und in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt. Sie wurden bei -80 °C gelagert. Parallel dazu wurde die gleiche Zellzahl in eine 96 Well Zellkulturplatte zu den gleichen Bedingungen ausgesät und stimuliert. Gleichzeitig erfolgte mit der Abnahme der Überstände dann die Ermittlung der relativen Zellzahl mittels CellTiterBlue® in der 96 Well Zellkulturplatte. 4.3.2 Herstellung von Heparineluat Nach der Abnahme der Überstände (Behandlung der Zellen siehe 4.3.1 Seite 39) wurde 1 ml PBS mit 2 U/ml Heparin in die Wells gegeben und auf dem Schüttler für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde der Überstand abgenommen und bei –80°C in 1,5 ml Reaktionsgefäße gelagert. 4.3.3 Herstellung von Zelllysaten Im Anschluss an die Herstellung von Heparineluat (siehe 4.3.2 Seite 39) wurde in die Wells 350 µl M-PERM, welches im Verhältnis von 1:100 mit Protease Inhibitor Cocktail Kit und EDTA Lösung versetzt wurde, gegeben. Die Zellkulturplatte lag dabei auf Eis. Anschließend wurden mit Hilfe von Zellkulturschabern die Zellen mechanisch aus der Platte gelöst. Danach wurde alles in 2 ml Reaktionsgefäßen überführt und kurz gevortext. Anschließend wurden sie auf Eis bei 100 rpm für 10 min geschüttelt. Sie wurden dann für 15 min bei 14 000 rcf bei 4°C zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand in neue 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt und bei -80 °C gelagert. Der Rest wurde verworfen. 4.3.4 ELISA Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wurden ELISAs (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) verwendet. Dabei wird mit Hilfe von enzymmarkierten Antikörpern die Konzentration von bestimmten Proteinen in einer Lösung ermittelt. Bei jedem ELISA wurde eine Standardreihe 39 4 Methoden in Doppelbestimmung mitgeführt, mit deren Hilfe die Proteinkonzentration bestimmt werden konnte. Die Messung der Proteinkonzentration erfolgte im FLUOstar OPTIMASystem bei 450 nm und, um die Hintergrundabsorption zu bestimmen, zusätzlich bei einer Referenzwellenlänge von 620 nm. Die Durchführung eines ELISAs dauerte 3 Tage. Alle Waschschritte erfolgten mittels ELISAWaschmaschine. Dabei wurde jedes Well pro Durchgang 3 x gewaschen. Zur Herstellung der Standardreihe wurde die höchste Konzentration mit Hilfe der Stocklösung hergestellt. Die anschließenden Konzentrationen erhielt man durch eine sequenzielle 1:2 Verdünnung. Die Substratarbeitslösung bestand aus Substrat A und B (Hydrogenperoxid und Tetramethylbenzidine), welche zu gleichen Anteilen gemischt wurden. Mit den jeweiligen ELISA konnten folgende minimale Proteinkonzentration in pg/ml gemessen werden: HGF 125 pg/ml, IGFBP-1 31,3 pg/ml, IL-8 15,6 pg/ml, MCP-1 15,6 pg/ml, Prolaktin 15,6 pg/ml sowie RANTES 1 pg/ml. ELISA der Firma R&D Systems Der Fangantikörper wurde 1:180 mit PBS verdünnt. Beim RANTES ELISA war die Verdünnung allerdings 1:360. Anschließend wurden 100 µl der Arbeitslösung des Fangantikörpers in die Wells gegeben. Die ELISA wurden dann über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Am nächsten Tag wurde dieser dann gewaschen. Es folgte eine einstündige Blockzeit bei Raumtemperatur mittels 200 µl Reagent Diluent pro Well. Nach erneutem Waschen wurden die Proben in entsprechender Verdünnung, so dass die Proteinkonzentration im mittleren Messbereich der Standardreihe lag, sowie die Standardreihe in Doppelbestimmung aufgetragen. Die Platten wurden über Nach bei 4 °C gelagert. Am nächsten Tag wurde der ELISA erneut gewaschen. Der Detektionsantikörper wurde in Reagent Diluent bei RANTES 1:360 sonst 1:180 verdünnt. Anschließend wurden 100 µl der Arbeitslösung des Detektionsantikörpers aufgetragen und für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erneutem Waschen wurden für 20 min lichtgeschützt 100 µl S-HRP-Arbeitslösung dazugegeben. Die S-HRP-Arbeitslösung setzte sich zusammen aus SHRP 1:200 in Reagent-Diluent. Nachdem wieder gewaschen wurde, erfolgte die Zugabe von 100 µl Substratarbeitslösung. Diese wurde ebenfalls lichtgeschützt inkubiert, bis der höchste Standard eine tiefblaue Färbung erhielt, was etwa 10 - 20 Minuten dauerte. Anschließend wurde der ELISA mit 50 µl 2 N Schwefelsäure abgestoppt und gemessen. 40 4 Methoden ELISA der Firma Bender MedSystems GmbH Der Markierungsantikörper wurde in PBS 1:20 verdünnt. 100 µl dieser Arbeitslösung des Markierungsantiköprers wurden in jedes Well gegeben und die ELISA-Platte wurde über Nacht bei 4 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurde gewaschen. Anschließend wurde der ELISA über Nacht bei 4 °C mit 200 µl Assay Buffer pro Well geblockt. Nach erneutem Waschen am nächsten Tag wurden die Proben in entsprechender Verdünnung, so dass die Proteinkonzentration im mittleren Messbereich der Standardreihe lag, sowie 100 µl der Standardreihe pro Well aufgetragen. Gleichzeitig wurden 50 µl Biotinarbeitslösung hinzugegeben. Die Biotinarbeitslösung enthielt den biotinkonjugierten Antikörper 1:1000 in Assay Buffer. Die ELISA-Platte wurde für 2 Stunden auf dem Schütteltisch bei 100 rpm inkubiert. Danach wurde sie wieder gewaschen, bevor 100 µl S-HRP-Arbeitslösung dazugegeben wurde. Die S-HRP-Arbeitslösung wurde aus dem S-HRP-stock 1:10000 in Assay Buffer hergestellt. Die ELISA-Platte wurde bei 100 rpm auf dem Schütteltisch lichtgeschützt für 1h inkubiert. Nach erneutem Waschen wurden 100 µl Substratarbeitslösung aufgetragen und lichtgeschützt inkubiert. Die Substrat-Reaktion wurde mit 50 µl 2 N Schwefelsäure abgestoppt, nachdem der höchste Standard eine tief blaue Farbe aufwies, was ca. 10 - 20 min dauern kann. Anschließend konnte der ELISA gemessen werden. 4.4 Statistik Alle Experimente wurden mindestens als Triplikate oder Quadruplikate durchgeführt. Bei den Karzinomzellen wurden jeweils 3 Durchgänge aus unterschiedlichen Passagen eingesetzt. Bei den Stromazellen wurden fünf Durchgänge von unterschiedlichen Patientinnen verwendet. Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Programm GraphPad Prism 5.01. Dabei wurden als statistische Test der one-way-Anova und Dunett als Post-Test verwendet. Zuvor wurden die Werte meist auf die unbehandelten Werte standardisiert. Waren nur zwei Gruppen vorhanden, so erfolgte die Auswertung mittels t-Test. Die Werte wurden als statistisch signifikant betrachtet, wenn p < 0,05 galt. 41 5 Ergebnisse 5 Ergebnisse 5.1 Einfluss von unfraktioniertem Heparin auf die Proliferation Zuerst wurde der Einfluss von unfraktioniertem Heparin auf die Spontanproliferation der fünf humanen endometrialen Karzinomzelllinien untersucht. Dazu wurden die Zellen über 6 Tage (144 h) mit verschiedenen Heparindosen inkubiert. Täglich wurde die relative Zellzahl mittels CellTiterBlue® (CTB) bestimmt. Über den Zeitverlauf nahm die Zellzahl bei allen Zelllinien und Bedingungen mit Ausnahme von AN3 CA kontinuierlich zu (Abbildung 4). Die Zellzahl veränderte sich im Verlauf in Abhängigkeit von der Dosis, der Zelllinie oder der Zeit. Eine Ausführliche Darstellung der signifikanten Veränderungen der Spontanproliferation durch Heparin ist der Tabelle 5 zu entnehmen. Heparin beeinflusste in Abhängigkeit der Dosis und der Zeit bei allen Zelllinien teilweise die Spontanproliferation, wobei es meist zu einer geringeren Zunahme der Zellzahl im Vergleich zu den unbehandelten Zellen kam. Bei AN3 CA beeinflusste Heparin nicht die Spontanproliferation mit Ausnahme nach 96 h bei einer Dosis von 6,4 U/ml, wo es zu einer geringeren Zunahme der Zellzahl im Vergleich zu unbehandelten Zellen kam. Ebenfalls hatte Heparin keinen Effekt auf die Spontanproliferation von RL95-2, außer bei der Dosis 0,2 U/ml nach 24 und 72 Stunden sowie bei 0,1 U/ml nach 72 Stunden, wo es zu einer größeren Zunahme der Zellzahl kam. Hohe Heparindosen (ab 3,2 U/ml) verlangsamten die Spontanproliferation von ECC-1. Bei KLE kam es unter Heparin zu einer geringeren Zunahme der Zellzahl. Nach 144 Stunden war unter jeder Heparindosis eine geringere Zunahme der Zellzahl als unter unbehandelten Bedingungen zu beobachten. Bei HEC-1-A nahm die Zellzahl in Abhängigkeit von der Inkubationszeit unter allen Heparindosen langsamer zu als unter unbehandelten Bedingungen. Dabei nahm der Effekt mit der Länge der Inkubationszeit zu. Orientierend wurde für jede Zelllinie ebenfalls ein Durchgang unter Hypoxie durchgeführt, wo meist ähnliche Ergebnisse beobachtbar waren. Somit hatte Heparin einen Einfluss auf die Spontanproliferation aller fünf Zelllinien, wobei dies abhängig von der Zeit und der Dosis war. Es war je nach Zelllinie ein Zu- oder Abnahme der Zellzahl durch Heparin beobachtbar. 42 5 Ergebnisse ECC-1 2 1 0 0 24 48 72 RL95-2 4 relative Einheiten relative Einheiten 3 96 120 3 2 1 0 144 0 24 Zeitverlauf in Stunden HEC-1-A 10 5 0 0 24 96 120 144 KLE 144 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0 24 48 72 96 120 144 Zeitverlauf in Stunden AN3 CA 6 relative Einheiten 48 72 96 120 Zeitverlauf in Stunden 72 2.5 relative Einheiten relative Einheiten 15 48 Zeitverlauf in Stunden 4 n.b. 0,8 U/ml Heparin 2 6,4 U/ml Heparin 0 0 24 48 72 96 120 144 Zeitverlauf in Stunden Abbildung 4: Spontanproliferation aller fünf Zelllinien unter Normoxie bei den Bedingungen nicht behandelt (n.b.) vs. 0,8 U/ml und 6,4 U/ml Heparin. Die Zellen wurden zum Zeitpunkt 0 Stunden mit den Heparindosen 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,6; 3,2 sowie 6,4 U/ml stimuliert und es erfolgte ein Mediumwechsel mit erneuter Stimuligabe nach 72 h für die Werte 96, 120 und 144 Stunden. Die relative Zellzahl wurde zu den jeweiligen Zeiten mittels CTB bestimmt. 43 5 Ergebnisse Tabelle 5: Veränderung der Spontanproliferation in Abhängigkeit von der Inkubationszeit, Heparinkonzentration und Zelllinie. Für die Zelllinien AN3 CA, RL95-2 sowie ECC-1 sind nur die Zeiten sowie Heparinkonzentrationen dargestellt, für die eine signifikante Veränderung im Vergleich zu unbehandelten Zellen beobachtbar war, ns = nicht signifikant; p < 0,05, ↑ = signifikante Erhöhung der relativen Zellzahl im Vergleich zu unbehandelten Zellen; ↓ = signifikant verringerte Zellzahl im Vergleich zu unbehandelten Zellen ECC-1 RL95-2 Heparin in U/ml 3,2 6,4 Heparin in U/ml 0,1 Zeit in Zeit in Stunden Stunden 0,2 24 ↓ ↓ 24 ns ↑ 48 ns ns 72 ↑ ↑ 72 und 96 ns ↓ 120 und 144 ↓ ↓ AN3 CA Heparin in U/ml 6,4 Zeit in Stunden ↓ 96 KLE Heparin in U/ml 0,1 0,2 0,4 0,8 1,6 3,2 6,4 Zeit in Stunden 24 ↓ ns ↓ ns ns ↓ ns 48 ns ns ns ns ns ns ns 72 ↓ ↓ ↓ ↓ ns ↓ ↓ 96 ↓ ns ns ns ns ↓ ns 120 ns ns ns ↓ ↓ ns ns 144 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 44 5 Ergebnisse HEC-1-A Heparin in U/ml 0,1 0,2 0,4 0,8 1,6 3,2 6,4 Zeit in Stunden 24 ns ns ns ns ns ns ns 48 ↓ ↓ ns ns ns ↓ ns 72 ns ns ns ns ns ↓ ↓ 96 ns ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 120 und 144 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 5.2 Einfluss von unfraktioniertem Heparin auf die Zytokinsekretion 5.2.1 Veränderung der MCP-1-, IL-8- und RANTES-Sekretion auf Proteinebene Die drei proinflammatorischen Zytokine MCP-1, IL-8 und RANTES spielen eine wichtige Rolle in Tumorprogression, Metastasierung und Angiogenese (Ben-Baruch 2006; Hembruff SL 2009; Waugh und Wilson 2008). Deswegen wurden alle fünf Zelllinien hinsichtlich ihrer Sekretion von diesen mittels ELISA untersucht. Ebenfalls wurde ermittelt, ob unfraktioniertes Heparin in verschiedenen Dosen die Sekretion dieser drei Zytokine und damit das Tumormikromilieu beeinflusst. Parallel erfolgte eine relative Zellzahlbestimmung, um sicherzugehen, dass eine Veränderung der im ELISA gemessene Zytokinkonzentrationen durch eine veränderte Sekretion hervorgerufen und nicht durch eine veränderte Zellzahl bedingt wurde. Dabei wurde die gleiche Zellzahl pro ml in eine 96-Well-Platte ausgesät und der Vitalitätsassay wurde parallel zur Abnahme der Überstände gestartet. Die mittels ELISA gemessene Proteinkonzentration wurde auf die relative Zellzahl des Vitalitätsassays bezogen. Somit kann man davon ausgehen, dass veränderte Zytokinkonzentrationen im ELISA für eine Veränderung der Zytokinsekretion sprechen. Da Heparin als stark negativ geladenes Molekül v. a. in hohen Konzentrationen möglicherweise mit den ELISAs interferiert, wurde ebenfalls die Beeinflussung der verschiedenen ELISA Standards durch Heparin untersucht. Dabei wurde die höchste Heparin Konzentration (102,4 U/ml) verwendet. Es wurde jeweils die Proteinkonzentration für die Standardlösung des entsprechenden ELISAs ohne und mit Zugabe von Heparin verglichen. Bei allen drei ELISA verursachte die Zugabe von 102,4 U/ml Heparin eine Abnahme der messbaren 45 5 Ergebnisse Proteinkonzentration des betreffenden Chemokins um den Faktor 3 - 4 (Tabelle 6). Niedrige Dosierungen (0,05 und 2 U/ml Heparin) zeigten dagegen keine Interferenz. Tabelle 6: Standardbeeinflussung der ELISAs durch 102,4 U/ml Heparin, ↓ = signifikant erniedrigt, p < 0,05 MCP-1 102,4 U/ml Heparin IL-8 RANTES ↓, um etwa das 4- ↓, um etwa das 3- ↓, um etwa das 3fache fache fache Zytokinsekretion der unbehandelten Zellen Die Zelllinien HEC-1-A, RL95-2 und KLE sezernierten alle drei Zytokine sowohl unter normoxischen als auch unter hypoxischen Bedingungen. Dahingegen setzten AN3 CA und ECC-1 nur das Zytokin RANTES in messbaren Konzentrationen frei (Tabelle 7). Bei ECC-1 war das Chemokin jedoch nur unter Normoxie mittels ELISA bestimmbar. Tabelle 7: Sekretion von Zytokinen bei unbehandelten und mit Heparin behandelten Zellen, n.b. = nicht behandelt, ↔ = keine Beeinflussung, ↑ = erhöht, ↓ = erniedrigt MCP-1 ECC-1 IL-8 RANTES n.b. + Heparin n.b. + Heparin n.b. Nein ↔ Nein ↔ Ja + Heparin unter ↔ Normoxie HEC-1-A Ja ↔ Ja ↔ Ja ↑ RL95-2 Ja ↔ Ja ↑Normoxie, Ja ↑ ↔Hypoxie AN3 CA Nein ↔ Nein ↔ Ja ↑ KLE Ja ↓ Ja ↓ Ja ↔ Um die Zytokinsekretion zwischen den einzelnen Zelllinien sowie Sauerstoffkonzentrationen vergleichen zu können, erfolgte eine Zellzahlbestimmung mittels Durchflusszytometrie (siehe 4.1.9 Seite 36). Anschließend wurde die gemessene Proteinkonzentration auf die ermittelte Zellzahl bezogen, so dass man eine Aussage über die Sekretion in pg pro 1000 Zellen erhielt. Im Vergleich sah die Zytokinkonzentration für die einzelnen Zytokine unter unbehandelten Bedingungen wie folgt aus: Die Zelllinie KLE sezernierte am meisten von allen Zelllinien die 46 5 Ergebnisse Zytokine IL-8 und MCP-1, wohingegen RANTES am stärksten von HEC-1-A freigesetzt wurde (Abbildung 5, Abbildung 6, Abbildung 7). Wie in Abbildung 5 dargestellt, sezernietren KLE ca. 400 - 600 pg, HEC-1-A 5 - 10 pg und RL95 etwa 2 pg MCP-1 pro 1000 Zellen unter unbehandelten Bedingungen. Zwischen Normoxie und Hypoxie bestand bei den drei Zelllinien kein Unterschied. HEC-1-A 600 550 500 450 400 pg/1000 Zellen 10 5 ns 600 550 500 450 400 10 ns 5 yp o or m N H H xi e yp o ox ie N or m xi e 0 0 ox ie pg/1000 Zellen RL95-2 pg/1000 Zellen KLE 600 550 500 450 400 ns 10 5 ie yp ox H N or m ox ie 0 Abbildung 5: Die Basalsekretion von MCP-1 in pg pro 1000 Zellen der Zelllinie HEC-1-A, RL95-2 und KLE unter unbehandelten Bedingungen: KLE sezernierte das Chemokin am stärksten. Zwischen Normoxie und Hypoxie fandt sich bei allen drei Zelllinien kein signifikanter Unterschied. Nach Konfluenz der Zellen erfolgte ein Mediumwechsel. Nach 48 h wurden die Überstände abgenommen und die Zellzahl mittels FACS bestimmt. MCP-1 wurde mittels ELISA in den Überständen der unbehandelten Zellen detektiert. Die IL-8-Sekretion stellte sich bei den drei Zelllinien HEC-1-A, RL95-2 und KLE wie folgt dar: pro 1000 Zellen setzten KLE ca. 30 - 40 pg, HEC-1-A 15 - 30 pg und RL95-2 0,4 - 0,8 pg pro 1000 Zellen unter unbehandelten Bedingungen frei. Unter Hypoxie kam es bei HEC-1-A zu einer Reduktion der IL-8-Konzentration. Bei den anderen beiden Zelllinien hatten die unterschiedlichen Sauerstoffbedingungen keinen Einfluss (Abbildung 6). 47 5 Ergebnisse 40 30 30 10 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 ns * 20 ie m ox or N N H or yp ox m ox ie 10 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 ie 20 pg/1000 Zellen 40 ie pg/1000 Zellen HEC-1-A 50 H yp ox RL95-2 50 KLE ns 50 30 20 yp o H or m N xi e 10 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 ox ie pg/1000 Zellen 40 Abbildung 6: Die Basalsekretion von IL-8 in pg pro 1000 Zellen der Zelllinien HEC-1-A, RL95-2 und KLE unter unbehandelten Bedingungen: KLE sezernierte am meisten IL-8. Die Zelllinie HEC-1-A setzte unter Hypoxie signifikant (p < 0,05) weniger IL-8 frei, wohingegen es bei den anderen Zelllinien zwischen Normoxie und Hypoxie keinen Unterschied gab. Nach Konfluenz der Zellen erfolgte ein Mediumwechsel. Nach 48 h wurden die Überstände abgenommen und die Zellzahl mittels FACS bestimmt. IL-8 wurde mittels ELISA in den Zellüberständen gemessen. Wie oben bereits erwähnt sezernierten HEC-1-A am stärksten RANTES, wohingegen dieses Chemokin am wenigsten durch ECC-1 freigesetzt wurde. Unter Normoxie sezernierte HEC-1-A ca. 30 pg, KLE ca. 1,2 pg, RL95 ca. 0,1 pg, AN3 CA ca. 0,08 pg und ECC-1 ca. 0,025 pg pro 1000 Zellen. Dahingegen sah es unter Hypoxie folgendermaßen aus: HEC-1-A 10 pg, KLE 1 pg, AN3 CA 0,06 pg, RL95-2 0,05 pg pro 1000 Zellen und bei ECC-1 war die RANTESKonzentration mittels ELISA nicht messbar (Abbildung 7). Somit kam es bei den Zelllinien HEC-1-A, RL95-2 und AN3 CA zu einer signifikanten Abnahme der RANTES-Konzentration unter Hypoxie, wohingegen die verschiedenen Sauerstoffbedingungen keinen Einfluss auf die RANTES-Sekretion von KLE hatten. 48 40 30 20 10 1.50 ECC-1 pg/1000 Zellen pg/1000 Zellen 5 Ergebnisse 1.25 1.00 0.10 RL95-2 40 30 20 10 1.50 1.25 1.00 0.10 * 0.05 0.05 0.00 N H yp ox i or m ox i e m ox i 1.25 1.00 0.10 1.25 1.00 0.10 0.05 0.00 0.00 * m ox or N H N or m yp o ox ie xi e 0.05 ie pg/1000 Zellen * AN3 CA 40 30 20 10 1.50 ie HEC-1-A 40 30 20 10 1.50 H yp ox N or pg/1000 Zellen pg/1000 Zellen e e 0.00 KLE 40 30 20 10 1.50 ns 1.25 1.00 0.10 0.05 ie yp ox H N or m ox ie 0.00 Abbildung 7: Die Basalsekretion von RANTES in pg pro 1000 Zellen der Zelllinien ECC-1, RL95-2, HEC-1-A, AN3 CA und KLE unter unbehandelten Bedingungen: Die stärkste RANTES-Sekretion wies die Zelllinie HEC-1-A auf, ECC-1 hingegen die geringste. Die Zelllinie ECC-1 sezernierte nur unter Normoxie messbare Konzentration von RANTES. Bei HEC-1-A, RL95-2 und AN3 CA nahm unter Hypoxie die RANTESSekretion signifikant ab (p < 0,05). Bei KLE fand sich kein Unterschied zwischen Normoxie und Hypoxie. Nach Konfluenz der Zellen erfolgte ein Mediumwechsel. Nach 48 h wurden die Überstände abgenommen und die Zellzahl mittels FACS bestimmt. Die Proteinkonzentration von RANTES wurde aus den Überständen mittels ELISA gemessen. Sekretion von MCP-1 unter Heparin Wie oben bereits erwähnt, konnte MCP-1 in den Überständen der Zelllinien AN3 CA und ECC-1 mittels ELISA nicht detektiert werden. Dahingegen setzten sowohl HEC-1-A, RL95-2 als auch 49 5 Ergebnisse KLE dieses Chemokin in messbaren Konzentrationen frei. Die Sekretion von MCP-1 wurde nur in der Zelllinie KLE durch Heparin beeinflusst. Durch Heparin kam es bei dieser Zelllinie sowohl unter Norm- als auch Hypoxie zu einer signifikanten dosisunabhängigen Herunterregulation. Bereits bei einer Dosis von 0,05 U/ml Heparin wurde die Konzentration von MCP-1 um ca. 40 % erniedrigt (Abbildung 8). Normoxie 1.0 1.5 relative Einheiten * 0.5 Hypoxie 1.0 * 0.5 0.0 0, 0 0, 05 0, 1 0, 2 0, 4 0, 8 1, 6 3, 2 6, 4 12 ,8 25 ,6 51 10 , 2 2, 4 0.0 U/ml Heparin 0, 0 0, 05 0, 1 0, 2 0, 4 0, 8 1, 6 3, 2 6, 4 12 ,8 25 ,6 51 1 0 ,2 2, 4 relative Einheiten 1.5 U/ml Heparin Abbildung 8: Die Sekretion von MCP-1 unter verschiedenen Heparindosen bei der Zelllinie KLE. Es kam sowohl unter Normoxie als auch Hypoxie zu einer dosisunabhängig Herunterregulation um etwa 40 %. Die Zellen wurden für 48 h mit verschiedenen Heparindosen inkubiert. Anschließend wurde die MCP-1-Konzentration im Überstand mittels ELISA bestimmt. * = Signifikanz gegenüber 0,0 U/ml Heparin (p < 0,05) Sekretion von IL-8 unter Heparin In den Überständen von AN3 CA und ECC-1 war das Zytokin IL-8 durch ELISA nicht nachweisbar. Die Zelllinie HEC-1-A sezernierte dieses Zytokin in messbaren Konzentrationen, jedoch wurde die Sekretion durch Heparin nicht beeinflusst. Bei RL95-2 wurde die IL-8Sekretion durch 1,6 und 3,2 U/ml Heparin unter Normoxie um das 1,5 - 2 fache erhöht, nicht jedoch unter Hypoxie (Abbildung 9). relative Einheiten 2.5 2.0 * * 1.5 1.0 0.5 0, 0 0, 05 0, 1 0, 2 0, 4 0, 8 1, 6 3, 2 6, 4 12 ,8 25 ,6 51 10 ,2 2, 4 0.0 U/ml Heparin Abbildung 9: Die Sekretion von IL-8 unter verschiedenen Heparindosen bei der Zelllinie RL95-2 unter Normoxie. Durch eine Dosis von 3,2 U/ml Heparin kam es zu einer Hochregulation unter Normoxie. Die Zellen wurden für 48 h mit verschiedenen Heparindosen inkubiert. Anschließend wurde die IL-8-Konzentration im Überstand mittels ELISA bestimmt. * = Signifikanz gegenüber 0,0 U/ml Heparin (p < 0,05) 50 5 Ergebnisse Die IL-8-Sekretion von der Zelllinie KLE wurde durch Heparin sowohl unter Normoxie als auch unter Hypoxie signifikant herabgesetzt. Schon ab einer Konzentration von 0,05 U/ml Heparin wurde die IL-8-Konzentration im Vergleich zu den unbehandelten Zellen fast halbiert (Abbildung 10). Man muss jedoch anmerken, dass eine Heparin-Konzentration von 102,4 U/ml Heparin den Standard um etwa das 3-fache erniedrigte (Tabelle 6), wohingegen eine Heparin Konzentration von 0,05 U/ml Heparin den Standard nicht beeinflusste. Normoxie 1.0 * 0.5 0.0 1.5 relative Einheiten 1.0 Hypoxie * 0.5 0, 0 0, 05 0, 1 0, 2 0, 4 0, 8 1, 6 3, 2 6, 4 12 ,8 25 ,6 51 10 ,2 2, 4 0.0 U/ml Heparin 0, 0 0, 05 0, 1 0, 2 0, 4 0, 8 1, 6 3, 2 6, 4 12 ,8 25 ,6 51 10 ,2 2, 4 relative Einheiten 1.5 U/ml Heparin Abbildung 10: Die Sekretion von IL-8 unter verschiedenen Heparindosen bei der Zelllinie KLE. Durch Heparin wurde die IL-8-Konzentration im Überstand der Zelllinie KLE signifikant herabgesetzt. Die Zellen wurden für 48 h mit verschiedenen Heparindosen inkubiert. Anschließend wurde die IL-8-Konzentration im Überstand mittels ELISA bestimmt. * = Signifikanz gegenüber 0,0 U/ml Heparin (p < 0,05) Sekretion von RANTES Das Zytokin RANTES wurde von allen fünf untersuchten humanen endometrialen Karzinomzelllinien in messbaren Konzentrationen freigesetzt. Unfraktioniertes Heparin hatte keinen Einfluss auf die Sekretion dieses Zytokins durch ECC-1 und KLE, jedoch modulierte es die RANTES-Sekretion der Zelllinien RL95-2, HEC-1-A und AN3 CA. Es kam bei diesen drei zu einer dosisabhängigen signifikanten Hochregulation der RANTES-Sekretion sowohl unter norm- als auch unter hypoxischen Bedingungen. Eine Heparindosis von 102,4 U/ml erniedrigte den RANTES-Standard um das 3-fache (Tabelle 6), so dass man vermuten könnte, dass die eigentliche Hochregulation noch viel stärker ausfällt. Die RANTES-Konzentration wurde bei RL95-2, HEC-1-A und AN3 CA bei einer Konzentration von 102,4 U/ml Heparin etwa um den Faktor 3 (HEC-1-A), 15 - 20 (RL95-2) und 1,4 (AN3 CA) hochreguliert (Abbildung 11). Dabei modulierte Heparin die Sekretion in Norm- und Hypoxie sehr ähnlich. 51 5 Ergebnisse RL95-2 Normoxie 30 Hypoxie 30 20 * * 10 * * relative Einheiten 20 * 0 0, 0 0, 05 0, 1 0, 2 0, 4 0, 8 1, 6 3, 2 6, 4 12 ,8 25 ,6 51 10 , 2 2, 4 0, 0 0, 05 0, 1 0, 2 0, 4 0, 8 1, 6 3, 2 6, 4 12 ,8 25 ,6 51 10 , 2 2, 4 0 U/ml Heparin 4 HEC-1-A Normoxie 3 U/ml Heparin 4 * * * 2 1 3 * * * * 2 1 0 0, 0 0, 05 0, 1 0, 2 0, 4 0, 8 1, 6 3, 2 6, 4 12 ,8 25 ,6 51 10 ,2 2, 4 0, 0 0, 05 0, 1 0, 2 0, 4 0, 8 1, 6 3, 2 6, 4 12 ,8 25 ,6 51 10 ,2 2, 4 0 U/ml Heparin AN3 CA Normoxie * 1.5 * U/ml Heparin 2.0 * * 1.0 0.5 relative Einheiten relative Einheiten Hypoxie * * relative Einheiten relative Einheiten * 2.0 * 10 Hypoxie * * * * 1.5 1.0 0.5 0.0 0, 0 0, 05 0, 1 0, 2 0, 4 0, 8 1, 6 3, 2 6, 4 12 ,8 25 ,6 51 10 ,2 2, 4 0.0 U/ml Heparin 0, 0 0, 05 0, 1 0, 2 0, 4 0, 8 1, 6 3, 2 6, 4 12 ,8 25 ,6 51 10 ,2 2, 4 relative Einheiten * U/ml Heparin Abbildung 11: Die Sekretion von RANTES unter verschiedenen Heparindosen bei den Zelllinien RL95-2, HEC-1-A und AN3 CA sowohl unter Norm- als auch Hypoxie. Bei den abgebildeten Zelllinien kam es unter Heparin zu einer dosisabhängigen Hochregulation der RANTES-Sekretion. Die Zellen wurden für 48 h mit verschiedenen Heparindosen inkubiert. Anschließend wurde die RANTES-Konzentration im Überstand mittels ELISA bestimmt. * = Signifikanz gegenüber 0,0 U/ml Heparin (p < 0,05) Zusammenfassend kann man sagen, dass Heparin die Zytokinsekretion von MCP-1, IL-8 und RANTES zelllinien- und zytokinspezifisch modulierte, wobei es sowohl eine Hoch- als auch eine Herunterregulation hervorrufen konnte. Insgesamt stellten sich die Veränderungen sowohl unter Norm- als auch Hypoxie vergleichbar dar. 52 5 Ergebnisse 5.2.2 Kompartimentbestimmung Zytokine bei RL95-2 und HEC-1-A Zytokine können zum einen extrazellulär und ungebunden vorliegen, sie können auch außen an der Zellmembran sowie der extrazellulären Matrix gebunden sein, zum anderen können sie sich aber auch intrazellulär befinden und dort gespeichert sein. Um zu untersuchen, ob die Veränderung der Zytokinsekretion durch Heparin auf einer Umverteilung innerhalb der Kompartimente beruhte oder durch eine Mehrproduktion bedingt war, wurde nachfolgendes Modell verwendet: Die in den Zellüberständen enthaltene Proteinkonzentration stellt den extrazellulären ungebundenen Anteil der Zytokine dar. Nach Entfernen der Überstände wurden die Zellen mittels 2 U/ml Heparin für 20 Minuten gewaschen. Anschließend wurde in diesem Heparineluat ebenfalls die Proteinkonzentration bestimmt. Da sowohl RANTES, MCP-1 als auch IL-8 an Heparin-Sepharose Säulen binden können, kann davon ausgegangen werden, dass diese ebenfalls an Heparin binden. Damit stellt dieses Heparineluat den extrazellulären Anteil der Zytokine dar, der außen an der Zelle bzw. der extrazellulären Matrix gebunden ist und sich durch Heparin ablösen lässt. Nach Abnahme dieses Überstandes wurden die Zellen anschließend lysiert. Das dadurch gewonnen Lysat entspricht v. a. den Anteil der intrazellulären Zytokine. Für die Bestimmung des Kompartiments der einzelnen Zytokine wurden die moderat differenzierten Zelllinien HEC-1-A und RL95-2 verwendet, da sie zum einen alle drei Zytokine in messbaren Konzentrationen sezernierten und zum anderen ein ähnlicher Effekt durch Heparin bei der RANTES-Sekretion auftrat. In Tabelle 8 sieht man eine Zusammenfassung der Ergebnisse für die Zytokinverteilung. 53 5 Ergebnisse Tabelle 8: Zytokinsekretion in den einzelnen Kompartimenten der Zelllinien RL95-2 und HEC-1-A; n.b. = nicht behandelt, ↔ = keine Beeinflussung, ↑ = erhöht, ja = Zytokin mittels ELISA messbar, nein = Zytokin mittels ELISA nicht detektierbar MCP-1 RL95-2 HEC-1-A IL-8 RANTES n.b. + Heparin n.b. + Heparin n.b. + Heparin Überstände Ja ↔ Ja ↑Normoxie ↔Hypoxie Ja ↑ Heparineluat Nein ↔ Nein ↔ Ja ↑ Lysate Nein ↔ Nein ↔ Ja ↑ Überstände Ja ↔ Ja ↔ Ja ↑ Heparineluat Nein ↔ Nein ↔ Ja ↑ Lysate Nein ↔ Nein ↔ Ja ↑ Verteilung von MCP-1 und IL-8 in den einzelnen Kompartimenten Die Zytokine MCP-1 und IL-8 waren nur im Zellüberstand von HEC-1-A und RL95-2 und weder im Heparineluat noch im Lysat mittels ELISA nachweisbar (Abbildung 12). Normoxie Hypoxie 1.5 relative Einheiten 1.0 0.5 0.0 1.0 0.5 U/ml Heparin 6, 4 3, 2 1, 6 0, 8 0, 4 0, 2 0, 1 6, 4 3, 2 1, 6 0, 8 0, 4 0, 2 0, 1 0, 0 0.0 0, 0 relative Einheiten 1.5 U/ml Heparin Abbildung 12: Beispielhafte Darstellung der gemessenen MCP-1-Konzentration in den Überständen von HEC-1-A sowohl unter Norm- als auch Hypoxie. Die Zellen wurden für 48 h mit den unterschiedlichen Heparindosen inkubiert und anschließend wurde die Zytokinkonzentration im Überstand mittels ELISA ermittelt. 54 5 Ergebnisse Verteilung von RANTES in den einzelnen Kompartimenten Das Zytokin RANTES war in den beiden Zelllinien HEC-1-A und RL95-2 sowohl in den Zellüberständen als auch im Heparineluat und in den Lysaten mittels ELISA nachweisbar (Abbildung 13, Abbildung 14 und Abbildung 15). Die höchste Konzentration hatte RANTES jeweils in den Überständen, ausgenommen RL95-2 unter Normoxie, wo sich die höchste Konzentration in den Zelllysaten fand (Abbildung 13). Eine Umverteilung innerhalb der Kompartimente durch Heparin schien nicht stattzufinden. Durch Heparin kam es wie bereits oben beschrieben in den Zellüberständen dosisabhängig zu einer Zunahme der RANTESKonzentration in beiden Zelllinien. Bei HEC-1-A führte Heparin sowohl in den Lysaten als auch im Heparineluat zu einer Zunahme der RANTES-Konzentration (Abbildung 14). Insgesamt wurde die RANTES-Sekretion in allen drei Kompartimenten sowohl unter Normoxie als auch unter Hypoxie dosisabhängig hochreguliert (Abbildung 13). Ein glockenförmiger Verlauf zeigte sich bei der RANTES-Konzentration bei RL95-2 sowohl in den Lysaten als auch im Heparineluat. Es kam dabei zu einer Zunahme der RANTESKonzentration. Unter Normoxie wurde die RANTES-Konzentration im Heparineluat sowie in den Lysaten am meisten bei 1,6 U/ml Heparin erhöht. Unter Hypoxie war die Hochregulation hingegen unter 0,8 U/ml Heparin am stärksten (Abbildung 15). Betrachtet man nun den Einfluss von unfraktionierten Heparin auf die Gesamtkonzentration an RANTES, so zeigte sich, wie in Abbildung 13 dargestellt unter Normoxie bei RL95-2 ein glockenförmiger Verlauf. Das Maximum der RANTES-Konzentration lag bei einer Heparindosis von 1,6 U/ml. Unter Hypoxie findet sich wie bei HEC-1-A eine dosisabhängige Hochregulation der Gesamtkonzentration des Chemokins RANTES (Abbildung 13). 55 5 Ergebnisse RL95-2 Normoxie Hypoxie 3 relative Einheiten 2 1 1 U/ml Heparin HEC-1-A 2.0 1.5 relative Einheiten 1.0 0.5 4 6, 3, 2 1, 6 0, 8 1.5 1.0 0.5 Überstände 2 3, 4 6 1, 6, 8 0, 2 0, 4 1 0, U/ml Heparin 0, 0 2 3, 4 6 1, 6, 8 0, 2 0, 4 1 0, 0, 0 0.0 0, 0.0 Hypoxie 0, relative Einheiten U/ml Heparin Normoxie 2.0 0, 4 0, 2 0, 0 4 6, 3, 2 1, 6 0, 8 0, 4 0, 2 0, 1 0 0, 0 0 2 0, 1 relative Einheiten 3 U/ml Heparin Heparineluat Lysate Abbildung 13: Übersicht der Verteilung von RANTES in den Zellkompartimenten von HEC-1-A und RL95-2. Das Chemokin RANTES fand sich bei RL95-2 und HEC-1-A überwiegend im Zellüberstand, ausgenommen RL95-2 unter Normoxie, wo die höchste Konzentration im Zelllysat messbar war. Die Zellen wurden für 48 h mit den verschiedenen Heparindosen inkubiert und anschließend wurde die RANTES-Konzentration mittels ELISA bestimmt. 56 5 Ergebnisse Überstände Normoxie * 2.0 * 1.5 Hypoxie 2.0 * * 1.0 0.5 * relative Einheiten 1.0 0.5 U/ml Heparin 2.0 * * * * 1.0 0.5 relative Einheiten 1.5 * 6, 4 3, 2 1, 6 * * * * 1.0 0.5 Normoxie * 1.5 6, 4 3, 2 1, 6 0, 8 Hypoxie 1.5 * * * 1.0 0.5 * relative Einheiten 2.0 0, 4 0, 0 6, 4 3, 2 0, 8 0, 4 0, 2 0, 1 0, 0 1, 6 U/ml Heparin U/ml Heparin Lysate 0, 2 0.0 0.0 1.0 0.5 6, 4 3, 2 1, 6 0, 8 0, 4 0, 2 6, 4 3, 2 1, 6 0, 8 0, 4 0, 2 0, 1 0, 0 U/ml Heparin 0, 1 0.0 0.0 0, 0 relative Einheiten 0, 8 Hypoxie 0, 1 relative Einheiten * 0, 4 U/ml Heparin Heparineluat 2.0 Normoxie 1.5 0, 2 0, 0 6, 4 3, 2 1, 6 0, 8 0, 4 0, 2 0, 1 0.0 0, 0 0.0 * 1.5 0, 1 relative Einheiten 2.5 U/ml Heparin Abbildung 14: RANTES-Sekretion von HEC-1-A in den unterschiedlichen Zellkompartimenten. Durch Heparin kam es zu einer dosisabhängigen Hochregulation der RANTES-Konzentration in den einzelnen Kompartimenten der Zelllinie HEC-1-A. Die Konzentration von RANTES wurde in allen Kompartimenten mittels ELISA gemessen. * = Signifikanz gegenüber 0,0 U/ml Heparin (p < 0,05) 57 5 Ergebnisse Überstände 4 Hypoxie 4 Normoxie * * * 2 relative Einheiten * 1 * 2 * 2 4 3, 6, 2 0, 6 1 0, 1, 0 0, relative Einheiten 1 8 4 6, * * 0, 2 3, * 2 4 6 1, * * U/ml Heparin Hypoxie 2.5 * 3 0, 8 0, 2 0, 4 1 0, 0, 0 Heparineluat 4 Normoxie * 2.0 * * * 1.5 * 1.0 0.5 4 6, 2 2 0, 3, 1 0, 6 0 0, Hypoxie 2.0 * * * 1.0 0.5 * * 1.5 * 1.0 0.5 4 6, 2 0, 2 1 0, 3, 0 0, 6 4 6, 1, 2 3, 8 6 1, U/ml Heparin 0, 8 0, 2 0, 4 1 0, 0, 0 0.0 0, 0.0 relative Einheiten * 2.0 1.5 1, 4 6, * * 8 2 3, Normoxie 0, 6 1, U/ml Heparin Lysate 2.5 4 8 0, 2 0, 4 1 0, 0, 0 0, U/ml Heparin 0, 0.0 0 4 relative Einheiten * 1 U/ml Heparin relative Einheiten * * 0 0, 0 * 3 0, relative Einheiten 3 * U/ml Heparin Abbildung 15: RANTES-Sekretion von RL95-2 in den unterschiedlichen Zellkompartimenten. Die RANTESKonzentration der Zelllinie RL95-2 wurde durch Heparin in den Überständen dosisabhängig hochreguliert. In den Heparineluat und Lysaten zeigte sich jedoch eine glockenförmige Zunahme. Die RANTES-Konzentrationen wurden mittels ELISA bestimmt. * = Signifikanz gegenüber 0,0 U/ml Heparin (p < 0,05) Insgesamt lagen MCP-1 und IL-8 vorwiegend ungebunden extrazellulär vor, während RANTES in allen drei Kompartimenten in messbaren Konzentrationen vorkam. Durch Heparin wurde die RANTES-Sekretion in den Kompartimenten zelllinienspezifisch reguliert. Es trat sowohl eine dosisabhängige Hochregulation als auch ein glockenförmiger Verlauf bezogen auf die 58 5 Ergebnisse eingesetzten Heparinkonzentrationen auf (Abbildung 14; Abbildung 15, Abbildung 13). Dabei wurde die RANTES-Konzentration in allen Kompartimenten erhöht. 5.2.3 Veränderungen der Zytokinsekretion auf mRNA-Ebene Die Veränderung der Zytokinsekretion kann einerseits auf einer Veränderung der Neuproduktion beruhen, anderseits könnte es zu einer Verschiebung innerhalb der obengenannte Kompartimente kommen. So könnten gespeicherte Zytokine vermehrt bzw. vermindert abgegeben werden. Wie oben bereits beschrieben, konnte keine Veränderung der Verteilung der Zytokine innerhalb der Kompartimente in den zwei Zelllinien HEC-1-A und RL95-2 nachgewiesen werden. Somit ist zu vermuten, dass die Veränderungen der Zytokinkonzentrationen durch Neuproduktion (also durch Transkription und Translation) hervorgerufen wurden und somit mit einer Veränderung des mRNA-Gehaltes für das spezifische Gen einhergehen. Um zu klären, ob es zu einer Regulation auf Genebene kam, wurde für alle Zelllinien, bei denen ein Effekt auftrat, der mRNA-Gehalt für das betreffende Zytokin mittels real-time RT-PCR ermittelt. Es wurden dabei keine Heparindosen über 10 U/ml verwendet, da in unserer Arbeitsgruppe beobachtet wurde, dass es bei Heparinkonzentrationen von über 10 U/ml zu einer Interferenz mit der PCR kam. Somit wurde für die RANTES-PCR deshalb nicht die Heparinkonzentration mit dem höchsten Effekt sondern 3,2 U/ml Heparin verwendet. Für die IL-8-PCR wurde die Zelllinie RL95-2 ebenfalls mit 3,2 U/ml Heparin inkubiert, da bei diesen Konzentrationen die Effekte auftraten. Bei KLE wurde sowohl für die IL-8- als auch für die MCP-1-PCR die Konzentration von 0,05 U/ml Heparin gwählt, da hierunter Heparin bereits einen Einfluss auf die Sekretion zeigte. Der mRNA-Gehalt des betreffenden Zytokins wurde zu den Zeitpunkten 2, 4, 8 und 24 Stunden nach der Stimulation ermittelt. Exemplarisch für solch einen Zeitverlauf sind die Ergebnisse der RANTES-PCR für HEC-1-A unter Normoxie (Abbildung 16) abgebildet. In den anderen Abbildungen wird sonst nur jeweils ein Zeitpunkt dargestellt. Heparin regulierte die Sekretion der Zytokine MCP-1 und IL-8 in der Zelllinie KLE (vergleiche Abbildung 8 und Abbildung 10) herunter. Mittels real-time RT-PCR sollte nun genauer untersucht werden, ob es zu einer verminderten Ausschüttung oder einer verringerten Produktion der betreffenden Zytokine kam. In Abbildung 17 ist gezeigt, dass es bereits nach 4 h zu einer Herunterregulation um etwa 10 – 20 % bei MCP-1 und um etwa 50 % bei IL-8 bei einer Heparin Konzentration von 0,05 U/ml kam. Unter Norm- und Hypoxie zeigten sich dabei vergleichbare Ergebnisse. 59 5 Ergebnisse relative Einheiten 250 * * 200 * * 150 n.b. 3,2 U/ml Heparin 100 50 0 0 5 10 15 20 25 Zeitverlauf in Stunden Abbildung 16: mRNA-Gehalt von RANTES bei HEC-1-A für nicht behandelte (n.b.) und für mit 3,2 U/ml Heparin behandelte Zellen. Es kam zu einem zeitabhängigen Anstieg des mRNA-Gehaltes von RANTES unter Heparin. Der RANTES-mRNA-Gehalt für HEC-1-A wurde unter Normoxie für die Zeiten 2, 4, 8 und 24 Stunden mittels real-time RT-PCR bestimmt. * = Signifikanz gegenüber unbehandelten Zellen (p < 0,05) Normoxie Hypoxie 100 * 50 relative Einheiten 0 100 * 50 in ep H H n. b. ep ar in n. b. 0 ar relative Einheiten IL-8-mRNA MCP-1-mRNA Hypoxie 100 * 50 relative Einheiten 100 * 50 n ep ar i H H ep ar in . n. b b. 0 0 n. relative Einheiten Normoxie Abbildung 17: Der mRNA-Gehalt der Zytokine MCP-1 bzw. IL-8 bei KLE. Durch 0,05 U/ml Heparin kam es zu dem Zeitpunkt 4 h zu einer Abnahme des mRNA-Gehaltes für die Zytokine MCP-1 und IL-8. Der mRNA-Gehalt wurde nach einer Inkubationszeit von 4 h mittels real time RT-PCR ermittelt. n.b. = nicht behandelte Zellen, * = Signifikanz gegenüber nicht behandelten Zellen (p < 0,05) 60 5 Ergebnisse RL95-2 zeigte für IL-8 auf Proteinebene eine leichte Hochregulation nur unter Normoxie (Abbildung 9), wohingegen kein Effekt unter Hypoxie sichtbar war. Deshalb wurden entsprechend nur Proben unter Normoxie bezüglich ihres Gehaltes an IL-8-mRNA untersucht. Wie auf Proteinebene kam es auch auf mRNA-Ebene zu einer Zunahme der IL-8-mRNA. Dabei kam es zu einer Hochregulation um etwa 60 % zu dem Zeitpunkt 4 h (Abbildung 18). 200 relative Einheiten * 150 100 50 n ep ar i H n. b. 0 Abbildung 18: mRNA-Gehaltes des Zytokins IL-8 der Zelllinien RL95-2 unter Normoxie. Der mRNA-Gehaltes des Zytokins IL-8 wurde durch 3,2 U/ml Heparin zum Zeitpunkt 4 h unter Normoxie hochreguliert. Nach einer Inkubationszeit von 4 h wurde der mRNA-Gehalt mittels real time RT-PCR bestimmt. n.b. = nicht behandelte Zellen, * = Signifikanz gegenüber nicht behandelten Zellen (p < 0,05) Die RANTES-mRNA wurde ebenfalls bei 3,2 U/ml Heparin in den drei Zelllinien HEC-1-A, RL95-2 und AN3 CA hochreguliert (Abbildung 16, Abbildung 19). Bei dem Zeitpunkt 8 h kam es bei allen drei Zelllinien zu einer Hochregulation – bei RL95-2 um etwa 20 %, bei HEC-1-A um etwa 60 % und bei AN3 CA um etwa 40 %. Unter Normoxie und Hypoxie zeigten sich dabei vergleichbare Ergebnisse. 61 5 Ergebnisse RL95-2 150 Normoxie Hypoxie 150 * relative Einheiten 100 50 0 100 50 n n. b. ar in n. b. 0 HEC-1-A 200 H H ep ep ar i relative Einheiten * Normoxie * Hypoxie 200 150 relative Einheiten 100 50 100 50 AN3 CA 200 ep H H ep ar in n. b. 0 n. b. 0 150 ar in relative Einheiten * Normoxie Hypoxie 200 150 * relative Einheiten 100 50 100 50 0 in ar ep H H ep ar in n. b. 0 150 n. b. relative Einheiten * Abbildung 19: mRNA-Gehalt von RANTES in den Zelllinien RL95-2, HEC-1-A und AN3 CA. Der mRNAGehalt für RANTES wurde in den Zelllinien RL95-2, HEC-1-A und AN3 CA durch 3,2 U/ml Heparin hochreguliert. Mittels real time RT-PCR erfolgte ein Messung zu dem Zeitpunkt 8 h. n.b. = nicht behandelte Zellen, * = Signifikanz gegenüber nichtbehandelten Zellen (p < 0,05) Für alle Zelllinien, bei denen durch Heparin die Zytokinkonzentration im ELISA verändert war, ließ sich ein Effekt auf mRNA-Ebene nachweisen. 62 5 Ergebnisse 5.3 Einfluss von Thrombin und Faktor Xa auf die Zytokinsekretion Die beiden Gerinnungsfaktoren Thrombin und Faktor Xa stellen wichtige Angriffspunkte für Heparin dar. Deswegen wurde die MCP-1- sowie IL-8-Konzentration für KLE sowie die RANTES-Konzentration für RL95-2, HEC-1-A und AN3 CA unter Einfluss von Thrombin und Faktor Xa bestimmt, da dort unter Heparin Effekte auftraten. Die Zytokinkonzentration wurde dabei auf die relative Zellzahl bezogen, um mögliche Effekte, die durch eine veränderte Zellzahl bedingt sind, auszuschließen. Die MCP-1-Sekretion bei KLE wurde durch Thrombin und Faktor Xa nicht beeinflusst. Die IL-8-Konzentration wurde hingegen nur durch Faktor Xa unter Hypoxie leicht herunterreguliert, wobei der Effekt weniger stark ausgeprägt war als durch unfraktioniertes Heparin. MCP-1 Protein 1.5 Normoxie relative Einheiten 1.0 0.5 0.5 relative Einheiten 0.5 rX a 1.0 * 0.5 a rX Fa kt o Th ro m bi n . a rX Fa kt o n. b Th ro m bi n 0.0 . 0.0 Fa kt o Hypoxie 1.5 1.0 Th ro m bi n . n. b rX a Fa kt o Th ro m bi n n. b IL-8 Protein Normoxie 1.5 relative Einheiten 1.0 0.0 . 0.0 Hypoxie n. b relative Einheiten 1.5 Abbildung 20: Einfluss von Thrombin und Faktor Xa auf die MCP-1- sowie IL-8-Sekretion der Zelllinie KLE. Die MCP-1- sowie IL-8-Sekretion der Zelllinie KLE wurden durch 1 U/ml Thrombin und 0,5 U/ml Faktor Xa kaum beeinflusst. Die Zellen wurden mit den Substanzen für 48 h inkubiert. Danach wurde die Zytokinkonzentration mithilfe ELISA bestimmt. n.b. = nicht behandelte Zellen, * = Signifikanz gegenüber nicht behandelten Zellen (p < 0,05) 63 5 Ergebnisse Die RANTES-Sekretion wurde bei RL95-2 und HEC-1-A durch Thrombin und Faktor Xa unter Normoxie und Hypoxie herunterreguliert, wobei Faktor Xa unter Hypoxie keinen Einfluss bei RL95-2 hatte (Abbildung 21). Bei AN3 CA zeigte sich hingegen kein Effekt. RL95-2 * * relative Einheiten 1.0 * 0.5 X Fa k Th ro Fa to r n. b. X a kt or m bi n Th ro n. b. a 0.0 0.0 m bi n relative Einheiten 1.0 0.5 Hypoxie 1.5 Normoxie 1.5 HEC-1-A Normoxie 1.5 1.0 * * 0.5 relative Einheiten * * 0.5 relative Einheiten a 1.0 0.5 a X kt or Fa m bi n Th ro a X kt or Fa Th ro m bi n 0.0 n. b. 0.0 X Hypoxie 1.5 0.5 Fa kt or Th ro Normoxie 1.0 m bi n n. b. a X Fa kt or m bi n Th ro AN3 CA 1.5 relative Einheiten 1.0 0.0 n. b. 0.0 Hypoxie n. b. relative Einheiten 1.5 Abbildung 21: Einfluss von Thrombin und Faktor Xa auf die RANTES-Sekretion der Zelllinien RL95-2, HEC-1-A und AN3 CA. Durch die beiden Gerinnungsfaktoren Thrombin (1 U/ml) und Faktor Xa (0,5 U/ml) kam es teilweise zu einer Abnahme der RANTES-Sekretion bei RL95-2 und HEC-1-A. Bei AN3 CA hatten sie keinen Einfluss auf die RANTES-Konzentration. Die Zellen wurden für 48 h mit den Substanzen inkubiert und anschließend wurde die RANTES-Konzentration mittels ELISA gemessen. n.b. = nicht behandelte Zellen, * = Signifikanz gegenüber nicht behandelten Zellen (p < 0,05) 64 5 Ergebnisse 5.4 Einfluss von verschiedenen Heparinen auf die Zytokinsekretion Anschließend wurde nun der Einfluss von verschiedenen niedermolekularen Heparinen sowie von Fondaparinux, einem selektiven Faktor-Xa-Hemmer (Borensztajn et al. 2008), auf die Zytokinsekretion der endometrialen Karzinomzelllinien im Vergleich zu unfraktioniertem Heparin untersucht. Dabei wurden die folgenden niedermolekularen Heparine verwendet, die sich hinsichtlich ihrer Molekülgröße unterscheiden: Dalteparin, Enoxaparin und Reviparin (aufgelistet nach abnehmender Molekülgröße). Zum einen wurden diese Stoffe in der gleichen Dosierung hinsichtlich ihrer antikoagulatorischen Stärke (Verwendung von 0,05 bzw. 50 U/ml wie Heparin) und zum anderen in der gleichen Dosierung hinsichtlich des Molekulargewichtes und somit ihrer Ladung (Verwendung von 0,25 bzw. 250 µg/ml wie Heparin) verwandt. Dadurch sollte geklärt werden, welche Eigenschaft (antikoagulatorische Aktivität, Molekulargewicht und damit Ladung oder Molekülgröße) von Heparin für die Regulation der Zytokinsekretion verantwortlich war und ob diese Effekte auch durch andere niedermolekulare Heparin sowie Fondaparinux auslösbar waren. Es wurden die Zytokine IL-8 und MCP-1 für die Zelllinie KLE sowie RANTES für die Zelllinien RL95-2, HEC-1-A und AN3 CA untersucht. Parallel dazu wurde ebenfalls mittels Vitalitätsassay die relative Zellzahl bestimmt. Die Zytokinkonzentration wurde anschließend auf die relative Zellzahl bezogen, um mögliche Effekte aufgrund einer veränderten Zellzahl auszuschließen. Bei der Zelllinie KLE hatten, wie in Abbildung 22 zu sehen ist, auch teilweise die anderen niedermolekularen Heparine sowie Fondaparinux einen Einfluss auf die MCP-1- sowie IL-8Sekretion, wenn man sie in der gleichen Dosis von 0,05 U/ml bezüglich ihrer antikoagulatorischen Stärke wie Heparin einsetzte. Unter allen verwendeten niedermolekularen Heparine kam es zu einer Herunterregulation von MCP-1, die jedoch teilweise schwächer ausfiel als unter Heparin, obwohl für alle 0,05 U/ml und somit die gleiche antikoagulatorische Aktivität angewandt wurde. Fondaparinux zeigte nur unter Normoxie eine Herunterregulation von MCP-1. Unter Normoxie hatten Enoxaparin, Reviparin sowie Fondaparinux einen vergleichbaren Einfluss auf die MCP-1-Sekretion, wohingegen unter Hypoxie Dalteparin und Enoxaparin vergleichbare Effekte wie Heparin aufwiesen. Die IL-8-Konzentration wurde unter Hypoxie bei der Zelllinie KLE durch alle niedermolekularen Heparine sowie Fondaparinux abgesenkt. Einen ähnlichen Einfluss wie Heparin auf die IL-8 Sekretion hatten unter Hypoxie alle niedermolekularen Heparine. Unter Normoxie kam es nur durch unfraktioniertes Heparin zu einer Herunterregulation von IL-8. 65 5 Ergebnisse MCP-1 Protein Normoxie # 1.5 * * * * 1.0 Hypoxie 2.0 * 0.5 relative Einheiten 0.0 # 1.5 * 1.0 * 0.5 ep n. b. ep ar in D al te pa ri En n ox ap ar in R ev ip Fo ar in nd ap ar in ux H H n. b. 0.0 IL-8 Protein Normoxie # # 2.5 Hypoxie 2.5 2.0 relative Einheiten 1.5 * 1.0 0.5 # * 2.0 1.5 * * * * 1.0 0.5 ux ar in ri n ip a nd ap Fo ev ar in R ap in En ox te pa r al D H ep ux ar in ri n ip a nd ap Fo ev ar in R En ox ap in n D al te pa r ri ep a H n. b. ar in 0.0 0.0 n. b. relative Einheiten * * ar in D al te pa ri En n ox ap ar in R ev ip Fo ar in nd ap ar in ux relative Einheiten 2.0 Abbildung 22: Einfluss verschiedener niedermolekularen Heparine sowie Fondaparinux auf die Sekretion von MCP-1 und IL-8 bei KLE unter Verwendung der gleichen antikoagulatorischen Aktivität wie Heparin von 0,05 U/ml. Die verschiedenen niedermolekularen Heparine sowie Fondaparinux hatten teilweise ebenfalls einen Einfluss auf die Sekretion von MCP-1 und IL-8, wenn man sie in der gleichen antikoagulatorischen Aktivität wie Heparin von 0,05 U/ml einsetzte. Auf die MCP-1-Konzentration hatte unter Normoxie Enoxaparin, Reviparin sowie Fondaparinux einen ähnlichen Effekt wie Heparin, wohingegen unter Hypoxie Dalteparin und Enoxaparin ähnliche Effekte zeigten. Alle niedermolekularen Heparine zeigten unter Hypoxie vergleichbare Ergebnisse auf die IL-8Sekretion wie Heparin, wohingegen sie unter Normoxie keinen Einfluss hatten. Die MCP-1- und IL-8Konzentration wurden nach einer Inkubationszeit von 48 h mit der jeweiligen Substanz mithilfe ELISA ermittelt. n.b. = nicht behandelte Zellen, * = Signifikanz gegenüber nichtbehandelten Zellen, # = Signifikanz gegenüber Heparin, (p < 0,05) Setzte man hingegen die niedermolekularen Heparine sowie Fondaparinux mit dem gleichen Molekulargewicht wie Heparin von 0,25 µg/ml ein, so hatten diese ebenfalls teilweise einen Einfluss auf die MCP-1- und IL-8-Sekretion (Abbildung 23). Die MCP-1-Konzentration wurde durch alle verwendeten Substanzen herunterreguliert. Die niedermolekularen Heparine und Fondaparinux zeigten ähnliche Effekte wie Heparin, wobei bei Fondaparinux unter Normoxie sogar ein stärkerer Effekt auftrat als bei Heparin. Ebenfalls zeigten sich ähnliche Ergebnisse unter Normoxie und Hypoxie. Des Weiteren wurde die Sekretion von IL-8 unter Hypoxie durch 66 5 Ergebnisse alle verwendeten Substanzen herabgesenkt, wobei alle einen ähnlichen Effekt wie Heparin zeigten. Dahingegen hatte unter Normoxie nur Dalteparin einen Einfluss auf die IL-8Konzentration, der vergleichbar mit dem von Heparin war. MCP-1 Protein 2.0 Normoxie # 1.5 * * * 1.0 * * 0.5 relative Einheiten Hypoxie 1.5 * 1.0 * * 0.5 n. b. ep ar in al te pa ri En n ox ap ar in R ev ip Fo ar in nd ap ar in ux D H D H ep n. b. in al te pa ri En n ox ap ar in R ev ip Fo ar in nd ap ar in ux 0.0 0.0 IL-8 Protein Normoxie # 2 * * 1 Hypoxie 2.5 relative Einheiten 3 1.5 * 1.0 * * * * 0.5 ux ar in ri n ip a nd ap Fo ev R ap a ri n in En ox D al te pa r in ar ep H ux ar in nd ap Fo ev ip a ri n ri n R ap a En ox te pa r al D H ep ar in in 0.0 n. b. 0 2.0 n. b. relative Einheiten * * ar relative Einheiten 2.0 Abbildung 23: Einfluss verschiedener niedermolekularen Heparine sowie Fondaparinux auf die Sekretion von MCP-1 und IL-8 bei KLE unter Verwendung des gleichen Molekulargewichts von 0,25 µg/ml. Die verschiedenen niedermolekularen Heparine sowie Fondaparinux hatten zum Teil einen Einfluss auf die MCP-1Sekretion, wenn man sie mit dem gleichen Molekulargewicht von 0,25 µg/ml (entsprechen 0,05 U/ml Heparin) einsetzte. Dabei hatten alle verwendeten Substanzen einen vergleichbaren Einfluss auf die MCP-1-Sekretion wie Heparin. Die IL-8-Konzentration wurde durch Dalteparin und unter Hypoxie zusätzlich durch alle anderen niedermolekularen Heparine und Fondaparinux ähnlich wie durch Heparin beeinflusst. Die Zellen wurden mit der jeweiligen Substanz für 48 h inkubiert. Anschließend wurde die entsprechende Zytokinkonzentration mittels ELISA bestimmt. n.b. = nicht behandelte Zellen, * = Signifikanz gegenüber nicht behandelten Zellen, # = Signifikanz gegenüber Heparin, (p < 0,05) Für die drei Zelllinien RL95-2, HEC-1-A und AN3 CA wurde der Einfluss der verschiedenen niedermolekularen Heparine sowie Fondaparinux auf die RANTES-Sekretion untersucht (Abbildung 24). Zunächst wurde die gleiche antikoagulatorische Aktivität von 50 U/ml wie von unfraktioniertem Heparin verwandt. Bei dieser Konzentration trat unter unfraktioniertem Heparin eine deutliche Hochregulation der RANTES-Konzentration auf. Die RANTES67 5 Ergebnisse Sekretion von RL95-2 und HEC-1-A wurde durch alle verwendeten niedermolekularen Heparine hochreguliert. Bei AN3 CA war dieser Effekt nur unter Normoxie bei Reviparin und Fondaparinux beobachtbar. Bei Hypoxie zeigte keine der verwendeten Substanzen bei AN3 CA eine Hochregulation. Es kam sogar unter Enoxaparin zu einer Absenkung der RANTESKonzentration. Ansonsten hatte Fondaparinux bei allen drei Zelllinien keinen Einfluss auf die Zytokinkonzentration. Durch Reviparin und unter Normoxie zusätzlich auch durch Dalteparin kam es bei HEC-1-A zu einer stärkeren Hochregulation als durch unfraktioniertes Heparin. Ansonsten zeigte unfraktioniertes Heparin bei den untersuchten Zelllinien die größten Effekte. Dalteparin zeigte bei RL95-2 einen vergleichbaren Effekt wie Heparin, bei HEC-1-A hingegen nur unter Hypoxie. Reviparin verhielt sich unter normoxischen Bedingungen bei AN3 CA ähnlich dem unfraktioniertem Heparin. 68 5 Ergebnisse RL95-2 Normoxie 1.5 Hypoxie 1.5 # * 1.0 relative Einheiten * * * 0.5 0.5 H ep ar in al te pa ri En n ox ap ar in R ev ip Fo ar in nd ap ar in ux n. b. D D al te Hypoxie Normoxie # # 1.5 1.5 * relative Einheiten * 1.0 * * * 0.5 * * 1.0 * 0.5 ux ar in ri n ip a Fo nd ap ev ar in # * * * 0.5 relative Einheiten # 1.0 R Hypoxie 1.5 # En ox te pa r D al ep H al D Normoxie 1.5 ap in n. b. te pa ri En n ox ap ar in R ev ip Fo ar in nd ap ar in ux in ep ar H n. b. AN3 CA in 0.0 0.0 * 1.0 * 0.5 ri nd n ap ar in ux Fo R ev ip a ar in ap in En ox te pa r D al ep a H ri nd n ap ar in ux Fo ev ip a ar in R ap in En ox te pa r ri n D al ep a H n. b. ri n 0.0 0.0 n. b. relative Einheiten * * pa ri En n ox ap ar in R ev ip Fo ar in nd ap ar in ux n ar i H ep HEC-1-A relative Einheiten * 0.0 n. b. 0.0 * 1.0 ar relative Einheiten # Abbildung 24: Einfluss verschiedener niedermolekularen Heparine sowie Fondaparinux auf die Sekretion von RANTES bei RL95-2, HEC-1-A und AN3 CA unter Verwendung der gleichen antikoagulatorischen Aktivität von 50 U/ml. Die verschiedenen niedermolekularen Heparine riefen teilweise ebenfalls eine Hochregulation der RANTES-Sekretion hervor. Fondaparinux hatte außer bei AN3 CA unter Normoxie keinen Einfluss. Die Zellen wurden für 48 h mit der jeweiligen Substanz inkubiert. Die RANTES-Konzentration wurde anschließend mittels ELISA bestimmt. n.b. = nicht behandelte Zellen, * = Signifikanz gegenüber nicht behandelten Zellen, # = Signifikanz gegenüber Heparin, (p < 0,05) 69 5 Ergebnisse Wie in Abbildung 25 dargestellt, wurde anschließend für die verschiedenen niedermolekularen Heparine und Fondaparinux dasselbe Molekulargewicht von 250 µg/ml verwandt, was etwa unfraktioniertem Heparin mit einer Aktivität von 50 U/ml entsprach. Alle eingesetzten niedermolekularen Heparine beeinflussten die RANTES-Sekretion von RL95-2 und HEC-1-A. Bei AN3 CA zeigte nur Dalteparin unter Normoxie eine Hochregulation. Fondaparinux erhöhte ebenfalls die RANTES-Sekretion der RL95-2 und HEC-1-A unter normoxischen Bedingungen. Es zeigte jedoch keinen Effekt bei den beiden eben genannten Zelllinien unter Hypoxie. Durch Fondaparinux kam es bei den AN3 CA zu einer Herunterregulation der RANTES-Konzentration. Bei beiden Zelllinien RL95-2 und AN3 CA hatte unfraktioniertes Heparin den größten Einfluss, wobei Dalteparin ähnlich Ergebnisse bei RL95-2 unter Normoxie hervorrief. Die niedermolekularen Heparine verhielten sich bei HEC-1-A ähnlich dem unfraktionierten Heparin. 70 5 Ergebnisse RL95-2 Normoxie 1.5 Hypoxie 1.5 # * 1.0 * * * 0.5 * relative Einheiten * * * 0.5 Normoxie 1.5 Hypoxie # * * 1.0 1.5 # * * * 0.5 relative Einheiten * pa ri En n ox ap ar in R ev ip Fo ar in nd ap ar in ux D al te H ep ar i n. b. pa ri En n ox ap ar in R ev ip Fo ar in nd ap ar in ux D H al te ep ar i n n. b. HEC-1-A n 0.0 0.0 0.0 * * 1.0 * 0.5 ux ar in ri n da p ip a ev Fo n R ap ar in in En ox D al H te pa r n n. b. in En ox ap ar in R ev ip Fo ar in nd ap ar in ux D al H ep te pa r ar in n. b. 0.0 ri relative Einheiten * 1.0 ep a relative Einheiten # AN3 CA Normoxie 1.5 Hypoxie 1.5 * 1.0 # * * 0.5 0.0 relative Einheiten * 1.0 * 0.5 te pa ri En n ox ap ar in R ev ip Fo ar in nd ap ar in ux n D al ar i ep H pa ri En n ox ap ar in R ev ip Fo ar in nd ap ar in ux al te D H ep ar in n. b. 0.0 n. b. relative Einheiten # Abbildung 25: Einfluss verschiedener niedermolekularen Heparine sowie Fondaparinux auf die Sekretion von RANTES bei RL95-2, HEC-1-A und AN3 CA unter Verwendung des gleichen Molekulargewichts von 250 µg/ml. Durch die niedermolekularen Heparine kam es teilweise ebenfalls zu einer Hochregulation der RANTES-Sekretion. Fondaparinux zeigte in Abhängigkeit von der jeweiligen Zelllinie bzw. Sauerstoffkonzentration eine Hochregulation, keine Beeinflussung oder eine Herunterregulation. Die Zellen wurden mit den verschiedenen Substanzen für 48 h inkubiert und anschließend wurde die RANTES-Konzentration mittels ELISA bestimmt. n.b. = nicht behandelte Zellen, * = Signifikanz nicht behandelten Zellen, # = Signifikanz gegenüber Heparin, (p < 0,05) 71 5 Ergebnisse Zusammenfassend hatten sowohl die niedermolekularen Heparine als auch Fondaparinux teilweise einen Einfluss auf die Zytokinsekretion. Dabei zeigten sich eine Hoch-, eine Herunterregulation oder gar keine Beeinflussung des entsprechenden Zytokins in Abhängigkeit von der jeweiligen Zelllinie, der verwendeten Dosis und der Sauerstoffkonzentration. 5.5 Invasion gegenüber RANTES, MCP-1, IL-8 und HGF Die Boyden-Kammer dient als Modell, um das Invasionsverhalten von Karzinomzellen zu untersuchen. Für unser Labor musste diese Methode zunächst etabliert werden. Zuerst wurde eine Literaturrecherche durchgeführt. In der Literatur fanden sich verschiedene Angaben hinsichtlich der Matrigelkonzentration, der Anwachszeit bis zur Stimuluszugabe, der Inkubationszeit, der FCS-Konzentration und der anschließenden Durchführung der Zellzahlbestimmung. Anschließend wurden verschiedene Möglichkeiten zur Durchführung eines Invasionsassays mittels Boyden-Kammer getestet. So wurde dann sowohl die Matrigelkonzentration von 0,5 mg/ml als auch von 5 mg/ml verwendet. Die Zellen wurden entweder nach 18 h Anwachszeit oder sofort dem Stimulus in der unteren Kammer ausgesetzt und für 48 h oder 72 h inkubiert. Es wurden sowohl 1 % als auch 10 % FCS verwendet. Auch das Lösen der Zellen von der Insertunterseite erfolgte zum einen nur mittels Trypsin, zum anderen wurde ein flexibler Zellschaber verwendet, um ausreichend Zellen zu lösen. Der CellTiterBlue® (CTB) wurde zu den Zeiten 1 h, 1 h 30 min und 2 h gemessen. Ebenfalls wurde in einem Versuch getestet, ob das Abtrypsinieren, die Zugabe der Stopplösung und das Überführen der Zellen die CTB-Werte von den Zellen im Vergleich zu adhärierten Zellen mit normalem Medium veränderten. Die CTB-Werte wurden durch diesen Vorgang maximal um das 1,5 fache gesenkt. Durch Bae-Jump et al (Bae-Jump et al. 1999) und Yoshida et al (Yoshida et al. 2002) war bekannt, dass die Zelllinien HEC-1-A und KLE durch HGF in ihrer Invasivität verstärkt wurden. Diese Ergebnisse sollten nun als Vergleichsgrundlage dienen, ob unsere Methode bereits ermittelte Ergebnisse reproduzieren konnte. So wurde die Zelllinie KLE für die Etablierung verwendet. Als Stimulus dienten dabei 10 ng/ml und 100 ng/ml HGF, da in diesem Konzentrationsbereich bei dieser Zelllinie in der Literatur die größten Effekte beschrieben worden waren. Wie in Abbildung 26 dargestellt, verstärkte eine HGF-Konzentration von 100 ng/ml die Invasivität der Zelllinie KLE, wohingegen 10 ng/ml HGF keinen Einfluss hatte. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden danach folgende Parameter für die Methode ausgewählt und für alle nachfolgenden Experimente beibehalten: 0,5 mg/ml Matrigelkonzentration, 18 h Anwachszeit und anschließend 48 h Inkubationszeit bei 1 % FCS, Lösen der Zellen von der Insertunterseite mittels Trypsin und zusätzlich Zellschaber und Messung des CTB jeweils nach 1 h. 72 5 Ergebnisse Normoxie Hypoxie 4 3 * 2 1 * 3 2 1 m lH ng / 10 0 10 ng /m l H G F . n. b m lH ng / 10 0 10 ng /m l H G F . n. b G F 0 G F 0 relative Einheiten relative Einheiten 4 Abbildung 26: Invasion der Zelllinien KLE gegenüber 10 und 100 ng/ml HGF. 100 ng/ml HGF führte zu einer signifikanten Steigerung der invadierten Zellen. Die relative Zellzahl wurde nach der 48 stündigen Inkubation mit HGF mittels CTB bestimmt. n.b. = nicht behandelte Zellen, *= Signifikanz gegenüber nicht behandelten Zellen (p < 0,05) Die Zytokine RANTES, MCP-1 und IL-8 sowie HGF stellen für einige Tumorzellen ebenfalls Invasionsstimuli dar (Vaday et al. 2006; Bae-Jump et al. 1999; Ben-Baruch 2006). Deswegen wurde nachfolgend das Invasionsverhalten der fünf Zelllinien AN3 CA, HEC-1-A, RL95-2, ECC-1 und KLE unter Stimulation mit diesen Zytokinen untersucht. Weder IL-8, MCP-1 noch RANTES hatten einen Einfluss auf das Invasionsverhalten. Aus der Literatur war bereits bekannt, dass HEC-1-A und KLE gegenüber HGF eine gesteigerte Invasivität aufwiesen (Yoshida et al. 2002; Bae-Jump et al. 1999), was für KLE sowie für HEC-1-A nur unter Hypoxie signifikant nachweisbar war (Abbildung 27). Die anderen Zelllinien zeigten keine signifikant gesteigerte Invasivität unter HGF. Unfraktioniertes Heparin alleine hatte keinen Einfluss auf das Invasionsverhalten der fünf Zelllinien. Die Kombination aus HGF und Heparin hatte bei AN3 CA und ECC-1 keine Auswirkungen. Gleichzeitige Gabe von HGF und Heparin verstärkte die Invasivität von RL95-2 und HEC-1-A (Abbildung 27) im Vergleich zu HGF allein. Bei KLE war der Effekt durch die Kombination von unfraktioniertem Heparin und HGF dem durch HGF allein vergleichbar. 73 5 Ergebnisse RL95-2 80 Normoxie * 60 40 20 relative Einheiten Hypoxie * 60 40 20 0 in F ep ar G H H + F G H H G F + H H ep ep ar in n. b. in F G H H ep ar in n. b. 0 ar relative Einheiten 80 HEC-1-A 5 Normoxie * 80 relative Einheiten 60 40 20 * 4 3 * 2 1 in F ep ar G H H + F H G KLE H G F + H H ep ar in n. b. in F G H H ep ar in 0 n. b. 0 Hypoxie ep ar relative Einheiten 100 Normoxie * * 2 1 * 2 1 in F ep ar G in ar ep H H + F G H H G F + H H in ep ar G H in ar H ep F 0 n. b. 0 * 3 n. b. relative Einheiten Hypoxie 4 relative Einheiten 3 Abbildung 27: Invasionsverhalten der Zelllinien HEC-1-A, RL95-2 und KLE gegenüber 100 ng/ml HGF, 1 U/ml Heparin und deren Kombination. Die relative Zellzahl wurde nach einer Inkubationszeit von 48 h mittels CTB ermittelt. n.b. = nicht behandelte Zellen, * = Signifikanz gegenüber nicht behandelten Zellen (p < 0,05) Die gestiegene Anzahl an invadierten Zellen bei RL95-2, HEC-1-A und KLE gegenüber HGF könnte verschiedene Ursachen haben. So wurde möglicherweise gar nicht die Invasivität der Zellen erhöht, sondern es kam vielleicht zu einer erhöhten Proliferation unter HGF. Um das 74 5 Ergebnisse auszuschließen, wurde die relative Zellzahl unter 100 ng/ml HGF mittels Vitalititäsassay untersucht. Bei RL95-2 war nach 48 Stunden eine geringere relative Zellzahl im Vergleich zu unbehandelten Zellen detektierbar, bei HEC-1-A unter Normoxie eine erhöhte (Abbildung 28). Auf die Zellzahl hatte HGF keinen Einfluss bei KLE sowie unter Hypoxie bei HEC-1-A. RL95-2 1.5 Normoxie 1.0 * 0.5 0.0 n.b. HGF relative Einheiten relative Einheiten 1.5 Hypoxie * 1.0 0.5 0.0 n.b. HGF HEC-1-A relative Einheiten 1.5 Normoxie * 1.0 0.5 0.0 n.b. HGF Abbildung 28: Veränderung der relativen Zellzahl unter 100 ng/ml HGF nach 48 h bei RL95-2 und HEC-1-A. Bei RL95-2 kam es zu einer Abnahme der relativen Zellzahl, wohingegen es bei HEC-1-A unter Normoxie zu einer Zunahme im Vergleich zu unbehandelten Zellen kam. Die relative Zellzahl wurde nach 48 Stunden Inkubationszeit mittels Vitalitätsassay bestimmt. n.b = nicht behandelten Zellen, * = Signifikanz gegenüber nicht behandelten Zellen (p < 0,05) Somit konnte HGF die Invasivität von einigen Zellinien verstärken. Heparin hatte alleine keinen Einfluss auf die Invasivität. In Kombination mit HGF schien Heparin hingegen die Anzahl der invadierten Zellen bei RL95-2 und HEC-1-A zu erhöhen. 5.6 Einfluss von Heparin auf die HGF-Sekretion endometrialer Stromazellen Da HGF eine Rolle beim Invasionsprozess zu spielen scheint, stellte sich die Frage, ob es von den Karzinomzellen selbst gebildet wird. HGF war in den fünf Karzinomzelllinien weder auf Protein- noch auf mRNA-Ebene nachweisbar. Aus der Literatur war bekannt, dass endometriale Stromazellen HGF produzieren und die Produktion durch TNF α und IL-6 verstärkt wird (Choi et al. 2009; Khan et al. 2005). TNF α und IL-6 sollen von Karzinomzellen sezerniert werden und parakrin auf die Stromazellen wirken. Aus unserer Arbeitsgruppe war bekannt, dass Heparin den TNF α-Signalweg in den Stromazellen beeinflussen konnte (Spratte et al. 2013). Aus diesem 75 5 Ergebnisse Grund wurde der mRNA-Gehalt von HGF in endometrialen Stromazellen gegenüber TNF α und IL-6 mit bzw. ohne Heparin untersucht. Sowohl dezidualisierte als auch undifferenzierte Stromazellen produzierten HGF. Wie in Abbildung 29 dargestellt, wurde der mRNA-Gehalt von HGF durch TNF α signifikant auf mehr als das 3- bis 6-hundertfache hochreguliert. IL-6 erhöhte den HGF-mRNA-Gehalt nur bei den nicht dezidualisierten Stromazellen signifikant. Durch Heparin alleine kam es zu keiner Veränderung des mRNA-Gehaltes von HGF. Gab man jedoch IL-6 bzw. TNF α jeweils in Kombination mit Heparin, so ließ sich die beobachtete Hochregulation signifikant auf ein Niveau vermindern, so dass kein signifikanter Unterschied mehr zu den unbehandelten Zellen bestand. Somit konnte Heparin die durch TNF α und IL-6 hervorgerufene Hochregulation von HGF wieder auf das Ausgangsniveau absenken. 76 5 Ergebnisse nicht dezidualisiert dezidualisiert 200 250 # relative Einheiten 100 50 0 200 150 100 50 H + -6 IL IL -6 + H H ep ep ar in IL -6 in n. b. ep ar in IL -6 H ep ar in n. b. 0 ar relative Einheiten * 150 nicht dezidualisiert 500 * 600 relative Einheiten 400 200 400 * 300 200 100 ar in F H ep TN in ar ep + F TN ep H + F TN H ar in F TN in ar H ep 0 n. b. 0 # n. b. relative Einheiten dezidualisiert # 800 Abbildung 29: Einfluss von TNF α, IL-6 und Heparin auf den Gehalt an HGF-mRNA in humanen endometrialen Stromazellen. Durch 50 ng/ml TNF α und 50 ng/ml IL-6 kam es zu einer Hochregulation des Gehaltes an HGF-mRNA in humanen endometrialen Stromazellen. Dieser Effekt war durch 1 U/ml Heparin antagonisierbar. 1 U/ml Heparin hatte alleine keinen Einfluss auf den HGF-mRNA-Gehalt. Die Zellen wurden für 6 h mit dem jeweiligen Stimulus inkubiert. Danach wurde der HGF-mRNA-Gehalt mittels real-time RT-PCR bestimmt. n.b. = nicht behandelte Zellen, * = Signifikanz gegenüber nicht behandelten Zellen (p < 0,05), # = Signifikanz gegenüber TNFα bzw. IL-6 (p < 0,05) 77 6 Diskussion 6 Diskussion Heparin konnte sowohl die Spontanproliferation, die Zyotkinsekretion als auch die Invasion der untersuchten endometrialen Karzinomzellen beeinflussen. Die Effekte waren dabei zelllinienspezifisch. Somit ist ein Einfluss von Heparin auf die Tumorprogression in Abhängigkeit von den jeweiligen zellspezifischen Eigenschaften denkbar. Heparin und Proliferation Unfraktioniertes Heparin hatte einen geringen Einfluss auf die Spontanproliferation der fünf untersuchten endometrialen Adenokarzinomzelllinien AN3 CA, ECC-1, HEC-1-A, KLE und RL95-2, wobei die Zelllinie, die Inkubationszeit sowie die Heparindosis wichtige Einflussgrößen darstellten. In vielen Studien hatte Heparin keinen Einfluss auf das lokale Wachstum von subkutanen und intramuskulären Tumoren (Castelli et al. 2004). Jedoch konnte Heparin die Proliferation von verschiedenen Zellen wie Gefäßmuskelzellen, Fibroblasten und einigen Epithelien hemmen. Diese Effekte traten zusammen mit einer verminderten Expression der Protoonkogene c-myc und c-fos auf. Gleichzeitig kam es zu einer Beeinflussung des Proteinkinase-C-Signalweges (Castelli et al. 2004). In einer Literaturübersicht von Niers et al (Niers et al. 2007) wurde das Volumen des Primärtumors nur in 4 von 17 Tierstudien durch Heparin signifikant verringert. Dabei schien eine Heparingabe mit langer Dauer und hoher Konzentration erforderlich zu sein. Vannucchi et al (Vannucchi et al. 1991) zeigten, dass das Zellwachstum der Zelllinie A431, eine humane epidermoide Karzinomzelllinie, durch hoch- und niedermolekulare Heparine gehemmt werden konnte. Ebenfalls beschrieben Udea et al (Ueda et al. 2009), dass Heparin in drei von vier oralen Plattenepithelzelllinien die Proliferation verminderte sowie die Apoptose verstärkte. Dies war gleichzeitig verbunden mit einer Verminderung der phosphorylierten Form der Proteinkinase Akt. Wu et al (Wu et al. 2006) zeigten jedoch, dass eine Magenkarzinomzelllinie unter Heparin verstärkt proliferierte. Auch bei primären Darmepithelzellen konnte Heparin die Proliferation fördern (Flint et al. 1994). Insgesamt ist damit für Heparin in der Literatur beschrieben, dass es sowohl die Proliferation verstärken als auch hemmen kann. Darüber hinaus zeigten die meisten in vivo und in vitro Studien, dass Heparin v. a. die Metastasierung und weniger das Primärwachstum beeinflusste bzw. verminderte. Dies würde auch erklären, warum Patienten mit limitierter Erkrankung im Gegensatz zu Patienten mit Erkrankungen im Endstadium in klinischen Studien v. a. von Heparin profitierten (Niers et al. 2007). 78 6 Diskussion Hypoxie In den Proliferationsexperimenten riefen die verschiedenen Sauerstoffbedingungen meist ähnliche Ergebnisse hervor. Um das Sauerstoffmilieu in soliden Tumoren nachzuahmen, wurde in der vorliegenden Arbeit als Modell eine Sauerstoffkonzentration von 21 % (Normoxie, atmosphärische Sauerstoffkonzentration) und von 1 % (Hypoxie) verwendet. In der Literatur werden häufig als Modell zur Simulation von Hypoxie verschiedene Sauerstoffkonzentrationen ab etwa < 5 % verwendet. Koi et al (Koi und Boland 2011) beschrieben in ihrem review eine Sauerstoffkonzentration von < 0,01 % als starke Hypoxie, 1 % als mäßige und 3 % als milde Hypoxie. Weiterhin wurde noch chronische Hypoxie (> 48 h) erwähnt. Insgesamt wurde somit ein in der Literatur anerkanntes Modell zur Simulation von Hypoxie verwendet, jedoch müssen nachfolgende Einschränkungen berücksichtigt werden: So fand man in gesunden Gewebe einen Sauerstoffpartialdruck von 4 - 20 mmHg (Bosco et al. 2008) und damit von 2,5 – 9 % (Imtiyaz und Simon 2010). Damit waren diese Werte niedriger als die in der vorliegenden Arbeit verwendete Sauerstoffkonzentration für Normoxie. Alle Experimente, die unter der Bedingung Hypoxie durchgeführt wurden, waren nur während der Zeit im Inkubator der Sauerstoffkonzentration von 1 % ausgesetzt. Während der verschiedenen Schritte im Experiment wie Aussaat, Stimulation, Mediumwechsel, Abnahme der Überstände und ähnliches wurde unter Raumluft und damit bei einer Sauerstoffkonzentration von 21 % gearbeitet. Dadurch waren die Zellen einem starken Wechsel zwischen zwei sehr unterschiedlichen Sauerstoffkonzentrationen ausgesetzt, wodurch es zwischenzeitlich immer wieder zu einer Reoxygenierung kam. Durch die Reoxygenierungsphasen könnte es zu vermehrter Sauerstoffradikalbildung und damit oxidativen Stress gekommen sein. Dies könnte nachfolgend zu DNA-, Protein- sowie Lipidschäden und Mutationen geführt haben (Koi und Boland 2011). Somit stellt sich die Frage, inwieweit die Ergebnisse durch diese Reoxygenierungsphasen beeinflusst wurden. Außerdem spiegelte somit das Modell nicht Hypoxie sondern viel mehr den Wechsel zwischen Reoxygenierung und Hypoxie wieder, wobei in der Reoxygenierungsphase Sauerstoffkonzentrationen (Raumluft, 21 % Sauerstoff) erreicht wurden, die im eigentlichen Gewebe deutlich geringer wären. Jedoch sollte, wie oben bereits erwähnt, nicht vergessen werden, dass dieses Modell trotz der ebengenannten Limitierungen in der Literatur allgemein anerkannt ist (Koi und Boland 2011). Eine weitere Methode zur Schaffung eines Hypoxie-ähnlichen Milieus ist, zu 21 % Sauerstoff CoCl2 hinzuzugeben. Dies soll Hpyoxieeffekte nachahmen, indem es die Stabilisierung von HIF α induziert (Pennacchietti et al. 2003). 79 6 Diskussion Heparin und Chemokine in Tumoren Im Prozess der Karzinogenese scheint Inflammation eine wichtige Rolle zu spielen (Allavena et al. 2011; Hembruff SL 2009; Sansone und Bromberg 2011). Durch verschiedene proinflammatorische Zytokine wie bspw. TNF α, IL-1ß, IL-6, IL-8, MCP-1 und VEGF wird die Tumorprogression und Metastasierung gefördert sowie ein Tumor-günstiges Mikromilieu in der Umgebung geschaffen (Sansone und Bromberg 2011). Dabei sind die Chemokine und deren Rezeptor direkte Ziele von Onkogenen oder werden durch Wegfallen von Tumorsuppressorgenen moduliert. Häufig sind auch Transkriptionsfaktoren, die normalerweise die Chemokinproduktion kontrollieren, dereguliert (Allavena et al. 2011). Im Vergleich zum Ausgangsgewebe sezernieren Karzinomzellen außerdem häufig vermehrt proinflammatorische Zytokine (Culig 2011; Hembruff SL 2009; Soria et al. 2011; Wallace et al. 2010). Auch in der vorliegenden Arbeit konnte man nachweisen, dass die gut differenzierte Zelllinie ECC-1, die auch als Modell für endometriales Epithel verwendet wird, nur das Zytokin RANTES in messbaren Konzentrationen sezernierte, wohingegen fast alle anderen Zelllinien sowohl IL-8, MCP-1 als auch RANTES freisetzten. Die Zelllinie KLE, die zu den schlecht differenzierten endometrialen Karzinomzelllinien zählt, sezernierte im Vergleich zu den anderen am stärksten die Zytokine IL-8 und MCP-1. Die Zelllinie AN3 CA verhielt sich jedoch ähnlich wie ECC-1. Bei dieser war nur RANTES mittels ELISA detektierbar, obwohl man bei dieser undifferenzierten Karzinomzelllinie eine erhöhte Zytokinsekretion erwartet hätte. Die Expression des Chemokins RANTES war in verschiedenen Tumoren wie Mamma- (Soria und Ben-Baruch 2008; Zhang et al. 2009), Prostata- (Vaday et al. 2006) und endometrialen Adenokarzinom (Wallace et al. 2010) erhöht. Auch die von uns untersuchten Adenokarzinomzelllinien sezernierten alle RANTES. Durch Heparin kam es zu einer dosisabhängigen Hochregulation in AN3 CA, HEC-1-A und RL95-2, die sowohl auf Protein- als auch auf mRNA-Ebene nachweisbar war. In einigen Karzinomen schien RANTES die Proliferation und Invasion der Karzinomzellen zu verstärken (Khin et al. 2003; Vaday et al. 2006). Khin et al (Khin et al. 2003) zeigten für die endometrialen Karzinomzelllinien HEC-1-A und ISHIKAWA, dass es unter RANTES zu einer dosisabhängigen Proliferation kommt. Beim Prostatakarzinom war hingegen bei einer Konzentration von 100 ng/ml RANTES bereits kein Effekt mehr auf die Proliferation nachweisbar, jedoch war die Invasivität der Prostatakarzinomzellen bei dieser Konzentration erhöht (Vaday et al. 2006). In der vorliegeneden Arbeit zeigte RANTES keinen Einfluss auf das Invasionsverhalten der Karzinomzelllinien. In anderen Karzinomen wie dem Mamma- und Zervixkarzinom korrelierte ein erhöhtes Plasma-RANTES-Level jedoch mit dem Tumorstadium und der Tumorprogression 80 6 Diskussion (Niwa et al. 2001), während ein erhöhtes RANTES-Expressionslevel mit einem verbesserten Überleben im Stadium I des Lungenadenokarzinoms einherzugehen schien (Moran et al. 2002). Bei einer murinen Sarkomzelllinie konnten Mulé et al (Mulé et al. 1996) eine Verminderung der Tumorprogression durch RANTES zeigen. Sie transfizierten ein schwach immunogenes murines MCA-205 Sarkoma, damit dieses RANTES bildete. Die RANTES-Sekretion hatte keinen Einfluss auf das Tumorwachstum, jedoch verloren die murinen Tumorzellen ihre tumorgene Kapazität in vivo (Mausmodell). Dabei war der Effekt abhängig von Makrophagenmigration und T-Zellfunktion. Somit wirkte sich die RANTES-Sekretion vorwiegend auf Immunzellen und nicht auf die Tumorzellen selbst aus und verminderte die Tumorprogression vorwiegend aufgrund der Immunzellen. Damit könnte eine Mehrsekretion von RANTES, zum einen eine Anti-Tumor-Antwort induzieren (Mulé et al. 1996; Kutubuddin et al. 1999), zum anderen aber auch mit Tumorprogression korrelieren (Niwa et al. 2001). Ebenfalls müssen weitere Untersuchungen durchgeführt werden, ob das vermehrt gebildete RANTES überhaupt als ein funktionelles Molekül vorliegt. Da RANTES stark an Heparin binden kann (Ludwig 2009), ist es möglich, dass es an Heparin gebunden vorliegt und somit womöglich nicht mehr mit seinem Rezeptor interagieren kann. In der Literatur existiert folgendes Modell, um zu überprüfen, ob das gebildete RANTES funktionell aktiv ist: Dabei wird das Migrationsverhalten von murinen T-Zellen gegenüber RANTES in einem Migrationsassay genutzt. In die obere Kammer werden die murinen T-Zellen und in die untere Kammer die entsprechende Überstände und Kontrollen gegeben. Anschließend wird das Migrationsverhalten der Zellen gegenüber den entsprechenden Zellüberständen und Kontrollen verglichen (Mulé et al. 1996; Kutubuddin et al. 1999). Die Expression von MCP-1 ist im Endometriumkarzinom erhöht (Wallace et al. 2010). Von den untersuchten Endometriumkarzinomzelllinien exprimierten nur drei (von fünf) auf Proteinebene MCP-1. Im Überstand der Zelllinie AN3 CA war mittels ELISA kein MCP-1 nachweisbar, obwohl sie zu den schlecht differenzierten und bereits metastasierten endometrialen Karzinomzelllinien zählt. Somit hätte man eher eine erhöhte Expression vermutet. Durch Heparin kam es bereits in geringen Dosen bei KLE zu einer Abnahme der MCP-1-Expression auf Protein und mRNA-Ebene. MCP-1 hatte keinen Einfluss auf die Invasion der untersuchten Zelllinien. Im Mammakarzinom fördert das Chemokin MCP-1 die Tumorprogression. Dabei wird ihm u. a. eine wesentliche Rolle bei der Chemotaxis von Monozyten zugesprochen. Diese tumorassoziierten Makrophagen setzen dann verschiedene Faktoren frei, die die Tumorproliferation und Invasion fördern (Ben-Baruch 2006). Außerdem rekrutieren MCP-1 und IL-8 mesenchymale Stammzellen und fördern deren Differenzierung zu karzinomassoziierten Fibroblasten, die dann Faktoren wie VEGF, HGF, EGF, MMPs und andere freisetzen (Sansone 81 6 Diskussion und Bromberg 2011). Darüber hinaus kann MCP-1 die Angiogenese begünstigen, in dem es die Expression von proangiogenen Faktoren (wie VEGF und IL-8) fördern kann (Ben-Baruch 2006). Durch Heparin konnte die Sekretion von MCP-1 der Zelllinie KLE fast halbiert werden, so dass möglicherweise einige protumorgene Eigenschaften von MCP-1 wie Monozyten- und mesenchymale Stammzellrekrutierung mit nachfolgender Faktorenfreisetzung sowie die proangiogenen Eigenschaften abgeschwächt werden könnten. Somit könnte Heparin die Tumorprogression beeinflussen. Das Zytokin IL-8 fördert die Migration und Invasion und spielt eine Rolle bei der Angiogenese (Ben-Baruch 2006, Culig 2011). Auf das Invasionsverhalten hatte es bei den von uns untersuchten Karzinomzelllinien keinen Einfluss. Es wurde jedoch von drei Zelllinien sezerniert. Hypoxie hatte keinen Einfluss auf die Sekretionsrate bei RL95-2 und KLE, jedoch kam es zu einer Abnahme der messbaren Zytokinsekretion bei HEC-1-A. Es ist in der Literatur beschrieben, dass die Expression von IL-8 unter hypoxischen Bedingungen zunehmen kann (Culig 2011; Waugh und Wilson 2008), was bei den untersuchten endometrialen Karzinomzelllinien jedoch nicht festgestellt werden konnte. Wysoczynski et al (Wysoczynski et al. 2010) beobachteten, dass Rhabdomyosarkome unter Hypoxie (1 % Sauerstoff) vermehrt IL-8 bildeten, jedoch war dieser Effekt für verschiedene andere Zelllinien (Lungen- und Mammakarzinom und Neuroblastom) nicht nachweisbar. Dieser Unterschied wurde durch eine bereits bestehend hohe Basissekretion von IL-8 unter Normoxie bei den anderen Zelllinien im Vergleich zu dem Rhabdomyosakromen begründet, da diese möglicherweise nicht mehr steigerbar sei. Die bei Wysoczyniki et al (Wysoczynski et al. 2010) gemessene IL-8 Proteinkonzentration wurde leider nicht auf die Zellzahl oder den DNA-Gehalt standardisiert, so dass man die Basissekretionsrate nicht mit den von uns verwendeten Zellen vergleichen kann. Heparin erhöhte bei einer Konzentration von 3,2 U/ml die Sekretion von IL-8 bei RL95-2 unter Normoxie. Bei den KLE hingegen kam es schon bei sehr geringen Heparindosen zu einer deutlichen Abnahme dieser Zytokinsekretion. Rezeptoren für IL-8 besitzen neben vielen Karzinomzellen auch Neutrophile, Endothelzellen und tumorassoziierte Makrophagen (Waugh und Wilson 2008). Durch dieses Zytokin werden Neutrophile in die Tumorumgebung rekrutiert und in den Gefäßendothelzellen Proliferation, Überleben, Migration und Formung von Blutgefäßen gefördert, wodurch IL-8 ein wesentlicher Einfluss bei der Angiogenese zugeschrieben wird (Ben-Baruch 2006; Culig 2011; Waugh und Wilson 2008; Wysoczynski et al. 2010). Durch Heparin konnte die IL-8 Freisetzung in den KLE negativ beeinflusst werden. Möglicherweise kann Heparin dadurch bei bestimmten Karzinomzellen die Angiogenese abschwächen und so das Tumorwachstum verlangsamen. 82 6 Diskussion Heparin-Mechanismus Insgesamt hatte Heparin einen Einfluss auf die Sekretion und Expression aller drei untersuchten Zytokine, der jedoch zelllinienspezifisch war. Damit kann Heparin das Tumormikromilieu modulieren. Es besteht jedoch die Frage, wie Heparin die Expression der Zytokine regulierte. Thrombin und Faktor Xa stellen die klassischen Interaktionspartner für Heparin in vivo dar. Heparin inaktiviert als Antikoagulanz Thrombin und Faktor Xa (Hirsh et al. 2001). Dadurch könnte es die Effekte von Thrombin und Faktor Xa beeinflussen und auf diesen Weg möglicherweise die Zytokinsekretion regulieren. In einigen Zelllinien werden bspw. IL-8, MCP-1 und RANTES durch Thrombin und zum Teil auch durch Faktor Xa vermehrt freigesetzt (Borensztajn et al. 2008; Hirano et al. 2002; Petäjä 2011). In der von uns untersuchten Zelllinie KLE erniedrigte nur unter hypoxischen Bedingungen Faktor Xa die Freisetzung von IL-8. Ansonsten hatten weder Thrombin noch Faktor Xa einen Einfluss auf die MCP-1- und IL-8Sekretion dieser Zellen. Damit konnte die Herunterregulation dieser beiden Zytokine bei KLE durch Heparin nicht auf eine Antagonisierung der Effekte von Thrombin und Faktor Xa beruhen. Das Zytokin RANTES wurde teilweise ebenfalls durch Thrombin und Faktor Xa je nach Zelllinie und Sauerstoffkonzentration herunterreguliert. Da diese Zytokine durch Heparin hochreguliert wurden, könnte ein Teil des Effektes auf der Antagonisierung dieser Gerinnungsfaktoren beruhen. In vivo kommen Thrombin und Faktor Xa als Vorstufen im Plasma vor (Tsopanoglou und Maragoudakis 2004; Borensztajn et al. 2008) oder werden von einigen Zellen (bspw. von manchen Karzinomen) gebildet und sezerniert (Borensztajn et al. 2008; Tsopanoglou und Maragoudakis 2004). In den in vitro Experimenten wurden nur FCS, die entsprechenden Medien sowie die Stoffe für die Stimulation hinzugegeben. Es ist davon auszugehen, dass keine dieser Substanzen Thrombin oder Faktor Xa enthielt. Möglicherweise hafteten diese beiden Gerinnungsfaktoren aber an den Zellen oder wurden von den Zellen selbst gebildet. Dabei handelte es sich dann wahrscheinlich aber um sehr geringe Konzentrationen. Außerdem kam es je nach Zelllinie und Sauerstoffkonzentration nur zu einer leichten bis zu gar keiner Herunterregulation der RANTES-Sekretion durch diese beiden Substanzen. Dadurch könnte man vermuten, dass die Antagonisierung dieser beiden Gerinnungsfaktoren nur einen geringen bis gar keinen Anteil an der Hochregulation der RANTES-Konzentration durch unfraktioniertes Heparin hatte und andere Mechanismen alleine oder hauptsächlich dafür verantwortlich waren. Insgesamt hatten die beiden Gerinnungsfaktoren somit einen Einfluss auf die Zytokinsekretion, wobei der Effekt abhängig von den Zelllinien, dem Zytokin sowie der Sauerstoffkonzentration war. Dies scheint aber nicht ausreichend den Einfluss des unfraktionierten Heparins auf die Zytokinsekretion zu erklären. 83 6 Diskussion Um weiter zu untersuchen, welche Eigenschaft (antikoagulatorische Aktivität, Molekulargewicht und damit Ladung oder Molekülgröße) von Heparin die Zytokinsekretion beeinflussten, wurden in der vorliegenden Arbeit verschiedene Heparine sowie Fondaparinux (ein Faktor-Xa-Hemmer) in gleicher antikoagulatorischen Stärke oder mit gleichem Molekulargewicht wie Heparin verwendet. Dabei war es zelllinien- und zytokinspezifisch, welche der obengenannten Einflussfaktoren für den Effekt der Heparine auf die Zytokinsekretion am stärksten mitverantwortlich war. Bei der Zelllinie KLE schienen am ehesten ähnliche Effekte für die MCP-1-Konzentration wie unter Heparin aufzutreten, wenn man das gleiche Molekulargewicht und damit die gleiche Molekülladung verwendete. Auch unter Verwendung der gleichen antikoagulatorischen Aktivität zeigten sich für die meisten Substanzen ähnliche Effekte auf die MCP-1-Sekretion wie Heparin. Somit scheint die Herunterregulation von MCP-1 durch Heparin am ehesten mit dessen Molekulargewicht, der damit verbundenen Ladung sowie mit dessen antikoagulatorischen Eigenschaft zusammenzuhängen. Dabei schien die Molekülgröße eine untergeordnete Rolle zu spielen, da selbst Fondaparinux, ein fünfach Zucker, ähnliche Effekte wie unfraktioniertes Heparin auslösen konnte, wenn man dasselbe Molekulargewicht verwendete. Betrachtet man hingegen die IL-8-Sekretion bei KLE, so scheinen die niedermolekularen Heparine und Fondaparinux einen größeren Einfluss zu haben, wenn man sie unter Hypoxie einsetzte. Unabhängig davon ob man die verwendeten Substanzen mit der gleichen antikoagulatorischen Aktivität oder mit dem gleichen Molekulargewicht wie Heparin verwendete, zeigte nur Dalteparin vergleichbare Effekte wie Heparin unter Normoxie. Somit scheinen weder die antikoagulatorische Aktivität noch das Molekulargewicht und damit verbunden die Ladung die Herunterregulation von der IL-8-Sekretion durch Heparin ausreichend zu erklären. Möglicherweise spielt die Molekülgröße ebenfalls eine wichtige Rolle, da die Substanzen mit abnehmender Molekülgröße einen geringeren bis gar keinen Einfluss mehr auf die IL-8-Sekretion hatten. Darüber hinaus war die Sauerstoffkonzentration ein wichtiger Einflussfaktor, da die niedermolekularen Heparine und zum Teil Fondaparinux nur unter Hypoxie die Zytokinsekretion ähnlich wie unfraktioniertes Heparin beeinflussten. Bei den Zelllinien RL95-2 und AN3 CA kann der Einfluss von unfraktioniertem und niedermolekularen Heparinen sowie Fondaparinux weder alleine über die antikoagulatorische Aktivität noch über das Molekulargewicht und somit auch nicht über die Ladung erklärt werden, da trotz der gleichen Aktivität bzw. des gleichen Gewichtes eine unterschiedlich starke Beeinflussung der RANTES-Sekretion stattfand. Jedoch scheint die Molekülgröße eine wichtige 84 6 Diskussion Rolle zu spielen. So kam es mit abnehmender Molekülgröße zu einem verminderten bis gar keinen Effekt auf die RANTES-Sekretion. Bei HEC-1-A scheint ebenfalls die antikoagulatorische Aktivität den Effekt auf die RANTESSekretion nicht erklären zu können. Jedoch wurde bei Verwendung des gleichen Molekulargewichtes sowohl von unfraktioniertem als auch von niedermolekularen Heparinen die RANTES-Konzentration in gleicher Weise beeinflusst, wobei auch Substanzen mit geringer Molekülgröße den gleichen Effekt hervorriefen. Fondaparinux, die Substanz mit der kleinsten Molekülgröße von fünf Zuckermolekülen, zeigte keine vergleichbare Hochregulation wie die Heparine. Insgesamt scheint v. a. das Molekulargewicht und damit die Ladung entscheidend für die Beeinflussung der RANTES-Sekretion bei der Zelllinie HEC-1-A zu sein. Ebenfalls spielt die Molekülgröße eine Rolle, da sehr geringe Molekülgrößen einen geringeren bis keinen Effekt mehr auslösten. Zusammenfassend waren somit Molekulargewicht bzw. Molekülladung sowie Molekülgröße die Eigenschaften, die vorwiegend für die Regulation der Zytokinsekretion verantwortlich waren. Dagegen schien die antikoagulatorische Eigenschaft nur eine eingeschränkte Rolle zu spielen. In einer Arbeit von Fluhr et al (Fluhr et al. 2011) konnte ebenfalls gezeigt werden, dass Heparine die Zytokinsekretion endometrialer Stromazellen abhängig von ihrer Molekülgröße und negativen Ladung aber unabhängig von der Eigenschaft als Antikoagulanz beeinflussten. Stevenson et al (Stevenson et al. 2005) zeigten in einem Metastasierungsassay im Mausmodell, dass Heparin und Tinzaparin die Metastasenbildung reduzierten, wobei Fondaparinux keinen Einfluss hatte. Ebenfalls konnte Heparin die Tumorzellbindung an Selektinen am stärksten hemmen, wohingegen LMWHs (Tinzaparin dabei besser als Dalteparin und Enoxaparin) nur einen geringeren und Fondaparinux gar keinen Einfluss bei gleicher Anti–Xa-Aktivität aufwiesen. Bei weiteren Untersuchungen verglich diese Arbeitsgruppe den Inhalt der einzelnen Heparinfragmente zwischen den niedermolekularen Heparinen. Dabei stellten sie fest, dass Enoxaparin ein geringeres Molekulargewichtprofil bezüglich der Heparinfragmente als Tinzaparin und Dalteparin aufwies. Die beiden Heparine Tinzaparin und Dalteparin hatten im Durchschnitt das gleiche Molekulargewicht. Tinzaparin beinhaltete aber im Gegensatz zu Dalteparin zusätzlich eine geringe Anzahl von höheren molekulargewichtigen nichtantikoagulatorischen Molekülen, die nicht in Dalteparin vorhanden waren. Somit vermuteten die Autoren, dass die Moleküllänge unabhängig von der antikoagulatorischen Eigenschaft wahrscheinlich der wichtige Faktor ist, der die hemmende Eigenschaft hervorruft (Stevenson et al. 2005). Ebenfalls konnte in Studien gezeigt werden, dass modifizierte Heparine mit wenig oder keiner antikoagulatorischen Aktivität antimetastasische Eigenschaften besaßen (Borsig 85 6 Diskussion 2010; Niers et al. 2007). Des Weiteren hatte Fondaparinux, ein Antikoagulanz, in einigen Studien keinen Effekt auf die Metastasierung (Borsig 2010). In der vorliegenden Arbeit beeinflusste Heparin neben der Zytokinsekretion auch die -expression. Jedoch ist fraglich, wie Heparin diese regulieren konnte. Flint et al (Flint et al. 1994) zeigten, dass radioaktiv markiertes Heparin sowie fluoreszenzmarkiertes Dextransulfat von epithelialen und mesenchymalen Rattenzellen (aus dem Darm isoliert) ins Zytoplasma aufgenommen werden konnte. Ebenfalls zeigten Spratte et al (Spratte et al. 2013), dass radioaktiv markiertes Heparin direkt in endometriale Stromazellen gelangen konnte. Dabei schien Heparin die Aktivität von NF-κB zu beeinflussen. Somit könnte Heparin direkt oder indirekt die DNA-Expression beeinflussen, indem es mit zytoplasmatischen und intranukleären Molekülen oder mit der DNA selbst interagiert. Es bleibt in nachfolgenden Experimenten zu klären, ob Heparin ebenfalls in die endometrialen Karzinomzelllinien gelangen kann und über welche Moleküle es die Zytokinexpression beeinflusst. Heparin und HGF Der etablierte Invasionsassay führte zu vergleichbaren aus der Literatur bekannten Ergebnissen. Die durch den Invasionsassay erhaltenen Resultate sind jedoch kritisch zu betrachten, da die Werte großen Schwankungen unterworfen waren und teilweise im nicht messbaren Bereich sowohl für die unbehandelten als auch für die stimulierten Zellen lagen. Dies könnte darauf beruhen, dass nicht alle Zellen komplett beim Trypsinieren oder beim Schaben abgelöst werden konnten und ein Teil beim Überführen inder Ausganszellkulutrplatte verblieb. So war die Zellzahl vielleicht dann nicht ausreichend, um mittels CTB bestimmt zu werden. Möglicherweise war der CTB aber auch nicht sensitiv genug, um schon kleine Veränderungen in der Zellzahl zwischen den unterschiedlichen Bedingungen zu detektieren, so dass man bei der Auswertung keine Unterschiede im Invasionsverhalten durch verschiedene Stimuli ermitteln konnte. Jedoch konnte man mittels CTB bei einigen Zelllinien einen deutlichen Unterschied zwischen unbehandelten und mit HGF inkubierten Zellen feststellen. Um diese Fehlerquellen zu überprüfen, könnte man die invadierten Zellen mittels Lichtmikroskop auszählen. Dazu müssten die Zellen nach Ende der Inkubationszeit fixiert und die Zellen an der Insertoberseite entfernt werden. Anschließend würde das Insert herausgeschnitten und auf einem Objektträger fixiert werden. Danach werden bspw. fünf (Choi et al. 2009) Gesichtsfelder unter dem Mikroskop ausgezählt. Damit würde man den möglichen Zellverlust beim Trypsinieren, Abschaben und Überführen vermeiden. Eine andere Methode, bei der man diese Fehlerquelle ebenfalls umgehen 86 6 Diskussion würde, wäre das Anfärben der Zellen mit einem fluoreszierenden Vitalfarbstoff. Dazu würde ein Farbstoff in das Well gegeben werden und die Zellen würden damit inkubiert werden. Anschließend würden die Zellen aus der Insertoberseite entfernt werden. Danach könnte die Fluoreszenzintensität ermittelt werden. Im Invasionsassay zeigten alle untersuchten Zelllinien keine vermehrte Invasivität durch die Zugabe der Zytokine IL-8, MCP-1 oder RANTES. Jedoch wurde durch HGF der Anteil der invadierten Zellen der Zelllinien HEC-1-A und KLE erhöht. Dieses Ergebnis bezüglich beider Zelllinien findet man ebenfalls in der Literatur (Bae-Jump et al. 1999; Choi et al. 2009; Yoshida et al. 2002). Die unterschiedlichen Sauerstoffpartialdrücke hatten bei KLE keinen Einfluss auf das Invasionsverhalten, wohingegen es bei HEC-1-A nur unter Hypoxie zu einer Zunahme der invadierten Zellen gegenüber HGF kam. In anderen Studien konnte für verschiedene Karzinomzelllinien gezeigt werden, dass Hypoxie über die Induktion des HGF-Rezeptors c-Met den proinvasiven Effekt von HGF verstärken konnte (Eckerich et al. 2007; Pennacchietti et al. 2003). HGF kann über verschiedene Angriffspunkte die Migration und Invasion von Zellen steigern. Bspw. kann es durch die verminderte Expression von Adhäsionsmolekülen wie E-Cadherin und die vermehrte Expression von MMP-9 die Invasivität von Zellen fördern (Desiderio 2007). Außerdem aktiviert es die fokale Adhäsionskinase (FAK), die in der Regulation von Integrinen eine Rolle spielt (Choi et al. 2009). Ebenfalls induziert HGF in Karzinomzellen wie HEC-1-A und RL95-2 Mig-7 mRNA, die notwendig für die Zellmigration (Scattering) ist (Crouch et al. 2004). Darüber hinaus interagiert HGF mit seinem Rezeptor c-Met, der in verschiedenen Geweben Zellproliferation und Migration reguliert. Im Karzinom scheint das HGF/ c-MetSystem die Zellinvasion und Metastasierung zu fördern (Nakamura et al. 2011). Bae-Jump et al (Bae-Jump et al. 1999) zeigten, dass die Zelllinien KLE, RL9-5 und HEC-1-A c-Met, den Rezeptor für HGF, exprimieren. Für die Zelllinien ECC-1 und AN3 CA fanden sich hierfür in der Literatur keine Angaben. Orian-Rousseau et al (Orian-Rousseau et al. 2002) fanden heraus, dass die Isoform CD44v6 des Transmembranprotein CD44 für einige Zellen notwendig war, um c-Met zu aktivieren. So exprimierten einige Zellen zwar c-Met, konnten es aber erst durch Transfektion mit der Isoform aktivieren (Orian-Rousseau et al. 2002). Es gab aber auch Zelllinien, die CD44 unabhängig c-Met aktivieren konnten, da sie selbst kein CD44 exprimierten (Orian-Rousseau et al. 2002). Somit könnte ein Fehlen von c-Met oder den entsprechenden Interaktionspartnern eine fehlende Zunahme der Invasivität unter HGF erklären. Ebenfalls wird c-Met in vielen Karzinomzellen autokrin oder parakrin durch HGF oder unabhängig von HGF (z. B. durch Genmutation oder posttranskriptionale Mechanismen) aktiviert (Desiderio 2007; 87 6 Diskussion Nakamura et al. 2011), so dass diese Zellen möglicherweise auf eine exogene HGF-Zufuhr nicht noch zusätzlich reagieren. In den Experimenten der vorliegenden Arbeit verstärkte die Zugabe von Heparin die Invasivität gegenüber HGF von HEC-1-A und RL95-2. HGF gehört zu den Wachstumsfaktoren, die an Heparansulfatproteoglykane binden können (Desiderio 2007). Jedoch ist es nicht notwendig für die Rezeptoraktivierung (Desiderio 2007). Es ist aber beschrieben, dass die Bindung von HGF an dessen Rezeptor durch Heparin erleichtert werden konnte (Kemp et al. 2006). Dies könnte ein möglicher zu Grunde liegender Mechanismus für die vermehrte Invasivität der Zelllinien HEC-1-A und RL95-2 unter Kostimulation mit HGF und Heparin sein. Es wurde jedoch ebenfalls beobachtet, dass Heparin die HGF-Bindung an dessen Rezeptor verhindern konnte (Sakata et al. 1996). Um weitere mögliche Angriffspunkte auf das HGF-Met-System zu finden, muss seine Rolle im Tumormikromilieu besser beleuchtet werden. Normalerweise bilden Zellen mesenchymalen Ursprungs HGF und Epithelzellen exprimieren den Rezeptor c-Met (Desiderio 2007). Jedoch bilden einige Karzinomzellen selbst HGF (Desiderio 2007) und aktivieren so den Rezeptor autokrin (Desiderio 2007). In den fünf untersuchten humanen endometrialen Karzinomzellen war jedoch keine HGF-mRNA nachweisbar. Dies war für die RL95-2, HEC-1-A und KLE auch aus der Literatur bekannt (Choi et al. 2009; Crouch et al. 2004; Yoshida et al. 2002). Jedoch produzieren endometrialen Stromazellen HGF (Choi et al. 2009; Yoshida et al. 2002), was auch die von uns untersuchten taten. Dabei konnte die HGF-Bildung in Stromazellen durch konditioniertes Medium von Tumorzellen erhöht werden (Desiderio 2007; Yoshida et al. 2002). Die HGF-Expression konnte dabei durch Faktoren wie bFGF (Yoshida et al. 2002), IL-6 und TNF α in endometrialen Stromazellen verstärkt werden (Choi et al. 2009; Khan et al. 2005). Jedoch konnten einige keinen Effekt von IL-6 und TNF α nachweisen (Nasu et al. 1999; Yoshida et al. 2002). Die untersuchten humanen endometrialen Stromazellen exprimierten sowohl im nicht als auch im dezidualisierten Zustand HGF. Dabei erhöhte TNF α die HGF Produktion. Dies war für IL-6 nur in den nicht dezidualisierten Zellen nachweisbar. TNF α und IL-6 könnte von den Karzinomzellen produziert werden. In unserer Arbeitsgruppe (unveröffentlichte Daten) konnte gezeigt werden, dass die fünf humanen endometrialen Karzinomzelllinien kein TNF α jedoch IL-6 in mittels ELISA messbaren Konzentrationen sezernierten. Choi et al (Choi et al. 2009) wiesen auf mRNA-Ebene nach, dass TNF α von den Zelllinien KLE und HEC-1-A in Kokultur mit Stromazellen exprimiert und durch Östrogen induziert wurde (Choi et al. 2009). Möglicherweise ist somit die Kokultur mit Stromazellen notwendig, um TNF α in messbaren 88 6 Diskussion Konzentrationen nachzuweisen oder der verwendete ELISA war nicht sensitiv genug, um die TNF α-Sekretion in den Zelllinien zu erfassen. Wie oben bereits erwähnt, verstärkte IL-6 und TNF α die HGF-Expression in endometrialen Stromazellen. Spratte al (Spratte et al. 2013) konnten ebenfalls zeigen, dass TNF α in endometrialen Stromazellen weitere Zytokine induzierte, die Kombination aus TNF α und Heparin diese jedoch modulierte (Spratte et al. 2013). Für Heparin beschrieben Sakiyama et al (Sakiyama et al. 2007), dass es in einigen Zellen HGF induzieren konnte. In den Stromazellen führte Heparin zu keiner Veränderung der HGF-Produktion. Durch Heparin wurde jedoch die TNF α und IL-6 verstärkte HGF-Expression auf das Ausgangsniveau abgeschwächt. Somit beeinflusste Heparin auch die Zytokinexpression von endometrialen Stromazellen. Damit könnte Heparin indirekt die Tumorprogression hemmen, indem es die Zytokinfreisetzung von den Stromazellen moduliert. Ein weiterer möglicher Angriffspunkt für Heparin im HGF-System wäre seine Eigenschaft als Antikoagulanz, da im Aktivierungsweg von HGF Thrombin eine Rolle spielt. Stromazellen sezernierten u. a. pro-HGF (Choi et al. 2009), was bspw. durch den HGFAktivator (HGF-A) in die aktive Form überführt wird. HGF-A selbst liegt ebenfalls in einer inaktiven Form vor und wird bspw. durch Thrombin in die aktive Form überführt und kann anschließend HGF aktivieren (Nakamura et al. 2011). Somit könnte Heparin die Aktivierung von HGF indirekt abschwächen, indem es die Thrombinbildung verhindert. Da die Zellen mit der bereits aktivierten Form inkubiert wurden, wäre dieser mögliche Einfluss von Heparin zu überprüfen. Allgemein scheinen Stromazellen eine wichtige Rolle in der Tumorprogression zu spielen. Im Tumormikromilieu findet man häufig so genannte karzinomassoziierte Fibroblasten (CAF) (Mishra et al. 2011). Diese unterscheiden sich von normalen Fibroblasten durch eine vermehrte Proliferation, erhöhte Kollagenproduktion (von Kollagen III und IV) sowie die Expression von glattmuskulären Proteinen (wie Aktin, Vimentin, glattes Muskelmyosin, Calponin, Tenascin, Desmin) (Felix et al. 2010, Tlsty und Hein 2001). Deswegen werden die CAF u. a. als eine Art Myofibroblasten bezeichnet (Tlsty und Hein 2001). Die CAF können durch onkogene Signale die Umwandlung von nicht-Tumorzellen in Tumorzellen fördern. Anfangs ist der Tumor dabei von den Signalen der CAF abhängig, wird jedoch unabhängig durch z. B. Veränderungen seines Phänotyps. Außerdem können Karzinogene die Gene sowohl der Stroma- als auch der Epithelzellen verändern, so dass diese dann die Tumorprogression fördern (Tlsty und Hein 2001). Die CAF kommen entweder aus lokalen Fibroblasten, wandeln sich aus Epithelzellen oder Endothelzellen um oder stammen von rekrutierten mesenchymalen Stammzellen ab (Mishra et al. 2011). Die Rekrutierung und Aktivierung der CAF erfolgt dabei durch Zytokine aus den 89 6 Diskussion Karzinomzellen. Diese setzen dann Zytokine mit promaligner Aktivität frei, welche das Tumorwachstum und Metastasierung direkt durch Stimulation der Tumorzellen und indirekt durch die Beeinflussung Endometriumkarzinom ist des ein Mikromilieus wichtiges fördern (Mishra Ligand-Rezeptor-Paar et das al. 2011). bereits Im erwähnte HGF/ c-Met-System, das einen Einfluss auf die Interaktion von CAF und Karzinom hat. Dabei bildeten karzinomassoziierte endometriale Stromazellen vergleichsweise mehr HGF als normale Stromazellen (Yoshida et al. 2002). Ebenfalls können die Stromazellen Aromatase und 17-ßHydroxysteroid-Dehydrogenase vermehrt exprimieren, welches Androgene und inaktive Östrogene zum metabolisch aktiven Östrogen umwandelt, wobei Patienten mit Aromatasepositiven Stromazellen ein schlechteres Überleben zeigten (Felix et al. 2010). In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Heparin auf humane endometriale Karzinomzellen sowie eingeschränkt auf Stromazellen untersucht. Dabei wurde jeder Teil für sich getrennt betrachtet. Die Stromazellen stammten von Nicht-Karzinompatientinnen und lassen somit keine Aussage über das Verhalten der normalerweise im Tumormikromilieu vorkommenden CAF zu. Ebenfalls bleibt die Frage, welche Rolle Heparin im HGF / c-Met-System hat, da es im Invasionsassay die Invasivität gegenüber HGF teilweise verstärkte, die TNF α und IL-6 induzierte Bildung von HGF in Stromazellen jedoch abschwächen konnte. Möglicherweise beeinflusst Heparin die endometriale Karzinomzellen vorwiegend indirekt, indem es in die Interaktion von Karzinom und Stroma durch selektive Modulierung der Chemokinsekretion eingreift. Somit müssten weitere Untersuchungen in Kokulturexperimenten erfolgen. Die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente waren allesamt in vitro Zellkulturexperimente. Diese stellen ein etabliertes Modell, welches einen Ausschnitt aus dem menschlichen Organismus repräsentieren soll, als Grundlage der zellbiologischen Forschung dar. Jedoch bieten in vitro Experimente nur begrenzte Möglichkeiten, um die Komplexität des menschlichen Organismus wiederzuspiegel. Deswegen werden häufig anschließden Tierexperimente und später klinische Studien durchgeführt (Senatskommission für tierexperimentelle Forschung et al 2004). Ein Beispiel für die typische Reihenfolge Zellkultur-, Tierexperimente, klinische Studien und Zulassung als Medikament stellt der Antikörper Trastuzumab dar (Baselga et al. 1998; Goldenberg 1999), der heute aus der Behandlung des HER2/neu positiven Mammakarzinoms nicht mehr wegzudenken ist. Die Charakterisierung der Interaktion einer Substanz innerhalb ihres biologischen Mileus mittels in vitro Experimente wie in der vorliegenden Arbeit durchgeführt stellt somit eine wichtige Grundlage zur Entwicklung neuer Therapieansätze dar. Heparine sind als Antikoagulanzien in der Klinik schon lange im Einsatz und werden auch bei Krebspatienten zur Verhinderung von thromboembolischen Ereignissen verwendet. Somit wäre 90 6 Diskussion auch ein Einsatz der Heparine in Tierexperimenten und in klinischen Studien denkbar, um einen besseren Einblick auf den Einfluss von Heparin auf die Tumorprogression des Endometriumkarzinom zu erhalten. 91 Zusammenfassung Zusammenfassung Klinische Studien haben gezeigt, dass Heparin das Überleben von Karzinompatienten unabhängig von seiner antikoagulatorischen Wirkung verlängern konnte. Aufgrund seiner Eigenschaften wie die stark negative Ladung ist eine Interaktion mit vielen Molekülen möglich. Zytokine, zumeist positiv geladen, spielen eine wichtige Rolle im Tumormikromilieu. Sie können die Proliferation, die Invasion sowie das Überleben von Tumorzellen fördern. Die Tumorprogression wird bspw. durch die Zytokine IL-8, RANTES, MCP-1 und HGF verstärkt. Für diese Moleküle ist eine Bindung bzw. Interaktion mit Heparin beschrieben. Ebenfalls werden IL-8, RANTES und MCP-1 vermehrt von endometrialen Adenokarzinomzellen sezerniert, wohingegen HGF vorwiegend von Stromazellen freigesetzt wird. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Heparin auf die Spontanproliferation, Zytokinsekretion und Invasion von humanen endometrialen Adenokarzinomzelllinien untersucht. Die fünf unterschiedlich differenzierten humanen endometrialen Adenokarzinomzelllinien AN3 CA, ECC-1, HEC-1-A, KLE sowie RL95-2 wurden mit verschiedenen Dosen unfraktioniertem Heparin inkubiert. Es erfolgte die Bestimmung der relativen Zellzahl mit Hilfe des Vitalitätsassays CellTiterBlue®, der Zytokinsekretion mittels ELISA sowie der Zytokinexpression mithilfe der real-time RT-PCR. Ebenfalls wurde der Einfluss von verschiedenen niedermolekularen Heparinen und Fondaparinux auf die Zytokinsekretion mittels ELISA untersucht. Des Weiteren wurde das Invasionsverhalten der Zelllinien gegenüber Heparin und Zytokinen im Invasionsassay ermittelt. Der Einfluss von TNF α, IL-6 und Heparin auf die HGF-mRNA in endometrialen Stromazellen wurde mittels real time RT- PCR bestimmt. Die Experimente wurden meist sowohl unter Normoxie (21 % Sauerstoff) als auch unter Hypoxie (1 % Sauerstoff) durchgeführt. Heparin hat einen geringen Einfluss auf die Spontanproliferation, der abhängig von der Zelllinie, Heparinkonzentration sowie Dauer der Inkubationszeit war. Ebenfalls beeinflusste es die Zytokinsekretion auf Protein- und Genebene zelllinien- sowie zytokinspezifisch. Bei RL95-2, HEC-1-A und AN3 CA kam es zu einer dosisabhängigen Hochregulation der RANTES Sekretion, wohingegen bei KLE eine Abnahme der MCP-1 und IL-8-Sekretion schon bei der geringsten Dosis nachweisbar war. Diese Effekte waren sowohl unter Normoxie als auch Hypoxie gleichermaßen nachweisbar. Die niedermolekularen Heparine sowie Fondaparinux beeinflussten ebenfalls die Zytokinsekretion.In Abhängigkeit von der jeweiligen Zelllinie, der verwendeten Dosis und der Sauerstoffkonzentration zeigte sich eine Hoch-, eine Herunterregulation oder gar keine Beeinflussung des entsprechenden Zytokins. HGF erhöhte die 92 Zusammenfassung Invasivität von KLE sowie unter Hypoxie von HEC-1-A. Die Kombination von HGF und Heparin erhöhte die Anzahl der invadierten Zellen bei HEC-1-A und RL95-2 im Vergleich zu unbehandelten Zellen. TNF α und IL-6 konnten die HGF-Sekretion in endometrialen Stromazellen teilweise erhöhen, wohingegen Heparin alleine keinen Einfluss hatte. Dahingegen konnte Heparin den durch TNF α und IL-6 erhöhten HGF mRNA-Gehalt in endometrialen Stromazellen auf das Ausgangsniveau wieder absenken. Heparin konnte sowohl die Spontanproliferation, die Zytokinsekretion und die Invasivität endometrialer Adenokarzinomzelllinien zelllinienspezifisch modulieren. Ebenfalls konnte es den mRNA-Gehalt endometrialer Stromazellen regulieren. Dadurch kann Heparin das Tumormikromilieu beeinflussen und so in wichtige Prozesse der Karzinogenese wie Wachstum sowie Metastasierung eingreifen. Da dem umliegende Gewebe wie karzinomassoziierte Fibroblasten und Makrophagen eine wesentliche Rolle in der Tumorprogression zukommt, müssen weitere Untersuchungen in Kokulturexperimenten erfolgen, um die Bedeutung von Heparin auf das Tumormikromilieu besser zu verstehen. Diese Beobachtung zeigt die Fähigkeit Heparins neben seiner Rolle als Antikoagulanz in wichtige Prozesse der Tumorinitiation und –progression einzugreifen und macht somit seine Anwendung in weiteren Gebieten neben der Antikoagulation vorstellbar. 93 Literaturverzeichnis Literaturverzeichnis Allavena, Paola; Germano, Giovanni; Marchesi, Federica; Mantovani, Alberto (2011): Chemokines in cancer related inflammation. In: Exp. Cell Res 317 (5), S. 664–673. Bae-Jump, V.; Segreti, E. 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Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und dass eine Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt. Datum: 23.05.2014 Unterschrift 102 Lebenslauf Lebenslauf 103 Danksagung Danksagung 104
