Mikrobiologie der Fermentation in NawaRo
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Johannes Gutenberg-Universität Mainz Institut für Mikrobiologie und Weinforschung „Mikrobiologie der Fermentation in NawaRoBiogasanlagen unter besonderer Berücksichtigung des Abbaus von Propionsäure“ Dissertation Zur Erlangung des Grades Doktor der Naturwissenschaften Am Fachbereich Biologie Der Johannes Gutenberg-Universität Mainz vorgelegt von Kerstin Seyfarth geb. am 26.06.1981 in Offenbach am Main Mainz, November 2012 Die vorliegende Arbeit wurde von Februar 2008 bis Oktober 2012 am Institut für Mikrobiologie und Weinforschung der Johannes Gutenberg-Universität Mainz unter der Leitung von Herrn Univ.-Prof. Dr. Helmut König verfasst. Tag der mündlichen Prüfung: 18.01.2013 Teile der vorliegenden Arbeit wurden in folgenden Posterpräsentationen, Publikationen und Vorträgen veröffentlicht, eingereicht oder sind in Vorbereitung: Robbin Stantscheff, Kerstin SEYFARTH, Stefan Dröge, Michael Klocke, Helmut König. Culturable methanogenic microbiota from mesophilic corn-fed on-farm biogas plants and labscale biogas fermenters. In Vorbereitung. Pressemitteilung der Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e. V. am 29.03.2012. Propionsäure im Griff behalten – neue Forschungsergebnisse zur Vermeidung von Übersäuerungen in Biogasanlagen. URL: http://www.nachwachsenderohstoffe.de/presseservice/pressemitteilungen/aktuellemitteilungen/aktuelle-nachricht/archive/2012/march/article/propionsaeure-im-griff-behalten-neueforschungsergebnisse-zur-vermeidung-von-uebersaeuerungenin/?tx_ttnews[day]=29&cHash=197957e3cff3e7a54f561d0ff7a0a026 Kerstin SEYFARTH, Stefan Dröge, Helmut König. 2011. Abschlussbericht zum Verbundprojekt „Früherkennung und Behebung von Fehlgärungen zur Erhöhung der Prozesssicherheit und Schadensverhütung in Biogasanlagen unter besonderer Berücksichtigung der Propionsäurebildung“. URL: http://www.nachwachsenderohstoffe.de/index.php?id=948&tabelle=fnr_projekte&alles=1&status =Inhalt&zeitraum=formular&fkz=22004007&suchefkz=&sucheadresse=&von=01.04.1992&bis=2 9.03.2012&zeitraum=formular&untertitel=Bioenergie&was=&produktlinie=90&minz=240&maxz= 250&zurueck=Stichwort. 29.03.2012. R. Stantscheff, K. SEYFARTH, S. Dröge, M. Klocke, H. König. 2011. Isolation and characterisation of methanogenic Archea from on-farm biogas plants. Poster. GWP013. URL: www.vaam.uni-halle.de/pdf/VAAM_Tagungsband_2011.pdf (30.06.2012), BIOspektrum Tagungsband der VAAM-Jahrestagung 2011. Sonderausgabe 2011, ISSN 0947-0867, S. 157. Jahrestagung der Vereinigung für Allgemeine und Angewandte Mikrobiologie 2011, VAAM 2011, 03.-06.04.2011, Karlsruhe. Kerstin Isolierung SEYFARTH, und Robbin Stantscheff, Charakterisierung von Stefan Dröge, Methanbakterien aus Helmut König. Biogasanlagen. 2009. Poster. URL: http://www.lfl.bayern.de/biogasscience2009/postersession/ (30.06.2012) Charakterisierung der methanogenen Archaebakterien in landwirtschaftlichen NaWaRoBiogasanlagen. Internationale Wissenschaftskonferenz Biogas Science 2009 science meets practice, 02. - 04. Dezember, Erding. Kerstin SEYFARTH, Robbin Stantscheff, Stefan Dröge, Helmut König. 2009. Isolierung und Charakterisierung von Methanbakterien aus Biogasanlagen. Poster. Tag der Technologie BioTech in Rheinland-Pfalz. 26.10.2009, ZDF- Konferenzzentrum, Mainz. INHALTSVERZEICHNIS I Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ............................................................................................................................................. 1 1.1 Das Erneuerbare-Energien-Gesetz ............................................................................................... 1 1.2 Primärenergie- und Endernergieverbrauch in Deutschland bis 2011 ...................................... 5 1.3 Primärenergieverbrauch und Energie-Mix in Deutschland bis 2020 ...................................... 13 1.4 Potenziale der Biomassenutzung in Deutschland .................................................................... 17 1.4.1 Flächenverteilung in Deutschland .............................................................................................. 17 1.4.2 Debatte um die Flächennutzungskonkurrenz zwischen Nahrungs- und Energiepflanzen ....... 18 1.5 Energie aus Biomasse.................................................................................................................. 20 1.5.1 landwirtschaftliche Biogasanlagen ............................................................................................. 21 1.5.1.1 Verfahrenstechnik landwirtschaftlicher Biogasanlagen ......................................................... 24 1.5.1.2 Inputstoffe zur Biogasherstellung........................................................................................... 24 1.5.1.3 Mikrobielle Zusammensetzung in landwirtschaftlichen Biogasanlagen ................................ 26 1.5.2 Die Bildung von Biogas aus organischem Material in landwirtschaftlichen Biogasanlagen ..... 29 1.5.2.1 Hydrolyse ................................................................................................................................ 30 1.5.2.2 Primäre Fermentation............................................................................................................. 32 1.5.2.3 Sekundäre Fermentation........................................................................................................ 32 1.5.2.4 Methanogenese...................................................................................................................... 33 1.5.2.5 Zusammensetzung des Biogases.......................................................................................... 34 1.6 Propionsäure und seine Verwendung ........................................................................................ 36 1.7 Propionsäure in Biogasfermentern ............................................................................................ 37 1.7.1 Mikrobielle anaerobe Bildung von Propionsäure ....................................................................... 39 1.7.1.1 Methylmalonyl-CoA-Weg ....................................................................................................... 40 1.7.1.2 Acryloyl-CoA-Weg .................................................................................................................. 42 1.7.1.3 Succinat-Decarboxylierung .................................................................................................... 44 1.7.2 Mikrobieller anaerober Abbau von Propionsäure ...................................................................... 46 1.8 Die anaerobe Bildung von Acetat aus CO2 und H2 ................................................................... 52 1.8.1 Acetyl CoA Weg (Wood-Ljungdahl Weg) .................................................................................. 53 1.9 Ursprung und Kreislauf von Methan auf der Erde .................................................................... 57 1.9.1 Die natürliche Bildung von Methan ............................................................................................ 58 1.9.1.1 Methanogenese...................................................................................................................... 59 1.9.1.1.1 Hydrogenotrophe Methanogenese ........................................................................... 62 1.9.1.1.2 Acetoklastische Methanogenese .............................................................................. 64 1.9.1.1.3 Methylotrophe Methanogenese ................................................................................ 65 1.10 Ziele der vorgelegten Arbeit ........................................................................................................ 68 2 Material ............................................................................................................................................... 69 2.1 Geräte und Hilfsmittel ................................................................................................................... 69 INHALTSVERZEICHNIS II 2.2 Chemikalien ................................................................................................................................... 72 2.3 Biochemikalien, Enzyme und Kits .............................................................................................. 74 2.3.1 Biochemikalien ........................................................................................................................... 74 2.3.2 Enzyme....................................................................................................................................... 75 2.3.3 Kits .............................................................................................................................................. 75 2.4 Synthetische Oligonukleotide ..................................................................................................... 75 2.5 Puffer und Lösungen .................................................................................................................... 77 2.5.1 Klassische DNA-Isolierung......................................................................................................... 77 2.5.2 Agarose-Gelelektrophorese ....................................................................................................... 78 2.5.3 Denaturierende Gradienten Gel Elektrophorese ....................................................................... 79 2.5.4 Temperatur Gradienten Elektrophorese .................................................................................... 79 2.5.5 DAPI-Färbung............................................................................................................................. 80 2.5.6 HPLC-Puffer ............................................................................................................................... 80 2.5.7 DC-Puffer.................................................................................................................................... 80 2.6 Nährmedien.................................................................................................................................... 80 2.7 Organismen ................................................................................................................................... 87 3 Methoden ........................................................................................................................................... 92 3.1 Probenmaterial aus NawaRo-Biogasanlagen und Laborfermentern ..................................... 92 3.2 Probennahme aus NawaRo-Biogasanlagen .............................................................................. 93 3.3 Anaerobe Kultivierung von Mikroorganismen aus NawaRo-Biogasanlagen ........................ 94 3.3.1 Isolierung von Bakterien aus syntroph propionsäureoxidierenden Mischkulturen.................... 96 3.3.2 Anreicherung, Kultivierung und Isolierung methanogener Archaea.......................................... 97 3.4 Physiologische Charakterisierung von Eigenisolaten aus NawaRo-Biogasanlagen und Laborfermentern............................................................................................................................ 99 3.4.1 Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopie der Eigenisolate ............................................ 100 3.4.1.1 Titerbestimmung mithilfe der DAPI-Färbung ....................................................................... 100 3.4.1.2 Bestimmung des Titers methanogener Archaea ................................................................. 100 3.4.2 Bestimmung des Titers propionsäureabbauender Mikroorganismen mithilfe des MPNVerfahrens ................................................................................................................................ 101 3.4.3 Wachstumsuntersuchungen methanogener Eigenisolate mit unterschiedlichen Substraten 101 3.5 Molekularbiologische Identifizierung von Mikroorganismen aus NawaRoBiogasanlagen ............................................................................................................................. 102 3.5.1 Isolierung chromosomaler Gesamt-DNA aus Fermentern und Kulturen ................................ 104 3.5.2 Optimierte Amplifizierung bakterieller 16S rDNA aus chromosomaler DNA für Proben aus NawaRo-Biogasanlagen und daraus stammenden Kulturen .................................................. 105 3.5.3 Amplifizierung der 16S rDNA aus archaealer chromosomaler DNA....................................... 107 INHALTSVERZEICHNIS III 3.5.4 Amplifizierung verschiedener Teilsequenzen der chromosomalen DNA methanogener Archaea .................................................................................................................................... 108 3.5.5 Agarose-Gelelektrophorese ..................................................................................................... 109 3.5.6 Auftrennung von 16S rDNA-Fragmenten mit der Denaturierende Gradienten Gel Elektrophorese und der Temperatur Gradienten Gel Elektrophorese .................................... 110 3.5.7 Klonierung unterschiedlicher 16S rDNA Fragmente ............................................................... 111 3.5.8 Restriktionslängenpolymorphismus-Analyse von 16S rDNA Fragmenten zur Unterscheidung verschiedener Genera und Arten von Mikroorganismen .............................. 112 3.5.9 Reamplifizierung und Sequenzierung reiner 16S rDNA-Fragmente ....................................... 113 3.5.10 Phylogenetische Analysen partieller 16S rDNA aus eigenisolierten Reinkulturen und Klonen113 3.6 Chemische Analysen von Substraten und Produkten in Kulturen aus NawaRoBiogasanlagen ............................................................................................................................. 114 3.6.1 HPLC-Analysen des mikrobiellen anaeroben Propionsäureabbaus....................................... 114 3.6.2 Gaschromatographie der mikrobiellen Methanbildung............................................................ 117 3.7 Chemische Analyse des Reaktorfiltrats ................................................................................... 118 3.7.1 Dünnschichtchromatographie des Reaktorfiltrats .................................................................... 118 3.7.2 HPLC-Analysen des Reaktorfiltrats ......................................................................................... 119 4 Ergebnisse ....................................................................................................................................... 121 4.1 Isolierung von Mikroorganismen aus NawaRo-Biogasanlagen, Laborfermentern und propionsäureabbauenden Mischkulturen ................................................................................ 121 4.1.1 Isolierung von Bakterien aus propionsäureabbauenden Mischkulturen ................................. 121 4.1.2 Isolierung methanogener Archaea aus NawaRo-Biogasanlagen und Laborfermentern........ 121 4.2 Morphologie von Kulturen aus NawaRo-Biogasanlagen und Laborfermentern und anaerob propionsäureabbauender Mischkulturen ................................................................. 122 4.2.1 DAPI-Färbung syntroph propionsäureoxidierender Mischkulturen ......................................... 123 4.2.2 Fluoreszenzmikroskopie eigenisolierter Reinkulturen methanogener Archaea...................... 124 4.2.2.1 Fluoreszenzmikroskopie der eigenisolierten Reinkulturen der Art Methanobacterium formicicum ............................................................................................................................ 125 4.2.2.2 Fluoreszenzmikroskopie eigenisolierter Reinkulturen der Art Methanoculleus bourgensis 126 4.2.2.3 Fluoreszenzmikroskopie eigenisolierter Reinkulturen der Art Methanosarcina mazei ....... 127 4.2.2.4 Fluoreszenzmikroskopie der eigenisolierten Reinkultur HWS2.1 der Art Methanosarcina barkeri ................................................................................................................................... 128 4.2.2.5 Fluoreszenzmikroskopie der eigenisolierten Reinkultur LFP3.1 der Art Methanomethylovorans sp. .................................................................................................. 129 4.3 Titerbestimmung von Kulturen aus NawaRo-Biogasanlagen ............................................... 130 4.3.1 Titerbestimmung propionsäureabbauender Mikroorganismen in Mischkulturen .................... 130 4.3.2 Titerbestimmung eigenisolierter methanogener Archaea ....................................................... 130 INHALTSVERZEICHNIS IV 4.4 Physiologische Untersuchungen methanogener Eigenisolate mit unterschiedlichen Substraten .................................................................................................................................... 131 4.5 Systematik von Mikroorganismen aus NawaRo-Biogasanlagen .......................................... 132 4.5.1 Analysen bakterieller 16S rDNA aus NawaRo-Biogasanlagen ............................................... 133 4.5.1.1 Identifizierungsergebnisse bakterieller 16S rDNA aus dem Fermenter der NawaRoBiogasanlage BEG mit Etablierungsergebnissen der PCR-Methode ................................. 133 4.5.1.2 Identifizierung von Bakterien mit chromosomaler Gesamt-DNA aus den Fermentern weiterer NawaRo-Biogasanlagen und einem Nachgärer .................................................... 137 4.5.2 Identifizierung kultivierbarer Bakterien aus syntroph propionsäureoxidierenden Misch- und Unterkulturen ............................................................................................................................ 140 4.5.2.1 Identifizierung von Bakterien aus den Mischkulturen Fp1, Fp1a sowie Unterkulturen Fp1a1264, Fp1a520 und Fp1a63-L ..................................................................................... 141 4.5.2.2 Identifizierung von Bakterien aus der Mischkultur Wp1....................................................... 149 4.5.2.3 Identifizierung von Bakterien aus der Unterkultur Wp2a1264 ............................................. 151 4.5.2.4 Identifizierung von Bakterien aus der Mischkultur Gp1a und Unterkultur Gp1b1264 ......... 154 4.5.2.5 Identifizierung von Bakterien aus den Unterkulturen Ap1a1264 und Ap1a520 .................. 160 4.5.3 Zusammenfassung der identifizierten und isolierten Bakterien aus syntroph propionsäureoxidierenden Mischkulturen ................................................................................ 164 4.6 Identifizierung eigenisolierter methanogener Archaea aus NawaRo-Biogasanlagen ....... 165 4.6.1 Stammspezifische Identifizierung methanogener Archaea der Art Methanobacterium formicicum mit der SAPD-PCR ................................................................................................ 167 4.6.2 Artspezifische Identifizierung der Eigenisolate methanogener Archaea mit der DGGE......... 168 4.6.3 Artspezifische Identifizierung eigenisolierter Kulturen methanogener Archaea...................... 171 4.6.3.1 Artspezifische Identifizierung eigenisolierter Kulturen der Gattung Methanobacterium ..... 172 4.6.3.2 Artspezifische Identifizierung eigenisolierter Kulturen der Gattung Methanoculleus .......... 174 4.6.3.3 Artspezifische Identifizierung eigenisolierter Kulturen der Gattung Methanosarcina.......... 176 4.6.3.4 Artspezifische Identifizierung einer eigenisolierten Kultur der Gattung Methanosaeta....... 179 4.6.3.5 Artspezifische Identifizierung einer eigenisolierten Kultur der Gattung Methanomethylovorans........................................................................................................ 180 4.6.4 Zusammenfassung der identifizierten eigenisolierten methanogenen Archaea aus NawaRoBiogasanlagen.......................................................................................................................... 181 4.6.5 Phylogenetische Stammbäume bakterieller und archaealer 16S rDNA anaerober Mikroorganismen ...................................................................................................................... 189 4.6.5.1 Phylogenetische Stammbäume partieller 16S rDNA von Bakterien aus syntroph propionsäureoxidierenden Mischkulturen ............................................................................ 189 4.6.5.1.1 Phylogenetischer Stammbaum partieller 16S rDNA von aus der syntroph propionsäureoxidierenden Mischkultur Fp1 stammenden Bakterien....................... 190 INHALTSVERZEICHNIS V 4.6.5.1.2 Phylogenetischer Stammbaum partieller 16S rDNA von aus der syntroph propionsäureoxidierenden Mischkultur Wp2 stammenden Bakterien ..................... 191 4.6.5.1.3 Phylogenetischer Stammbaum partieller 16S rDNA von aus der syntroph propionsäureoxidierenden Mischkultur Gp1 stammenden Bakterien ...................... 192 4.6.5.1.4 Phylogenetischer Stammbaum partieller 16S rDNA von aus der syntroph propionsäureoxidierenden Mischkultur Ap1 stammenden Bakterien ...................... 193 4.6.5.2 Phylogenetische Stammbäume partieller 16S rDNA methanogener Archaea ................... 193 4.6.5.2.1 Phylogenetischer Stammbaum partieller 16S rDNA nach einer DGGE aus der Gesamt-DNA von Eigenisolaten methanogener Archaea ....................................... 194 4.6.5.2.2 Phylogenetischer Stammbaum partieller 16S rDNA aus der Gesamt-DNA von Eigenisolaten methanogener Archaea ................................................................... 195 4.7 Substrate und Produkte anaerober Mikroorganismen aus NawaRo-Biogasanlagen ........ 196 4.7.1 Propionsäureoxidation anaerober Anreicherungskulturen ...................................................... 196 4.7.1.1 Propionsäureoxidation der anaeroben Anreicherungskultur Fp1........................................ 197 4.7.1.2 Propionsäureoxidation der anaeroben Anreicherungskultur Gp1 ....................................... 198 4.7.1.3 Syntrophe Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkultur Gp1 mit der Reinkultur TAF1 ..................................................................................................................................... 199 4.7.1.4 Propionsäureoxidation der anaeroben Anreicherungskultur Ap1 ....................................... 200 4.7.1.5 Propionsäureoxidation der anaeroben Anreicherungskultur Ap3 ....................................... 200 4.7.2 Propionsäureoxidation anaerober Mischkulturen mit Zugabe von Fumarsäure und Bromoethansulfonsäure ........................................................................................................... 201 4.7.2.1 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkultur Fp1 mit Zugabe von Fumarsäure und Bromoethansulfonsäure ....................................................................................................... 202 4.7.2.2 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkultur Wp1 mit Zugabe von Fumarsäure und Bromoethansulfonsäure ....................................................................................................... 203 4.7.2.3 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkultur Wp2 mit Zugabe von Fumarsäure und Bromoethansulfonsäure ....................................................................................................... 204 4.7.2.4 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkultur Gp1 mit Zugabe von Fumarsäure und Bromoethansulfonsäure ....................................................................................................... 205 4.7.2.5 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkultur Ap1 mit Zugabe von Fumarsäure und Bromoethansulfonsäure ....................................................................................................... 206 4.7.2.6 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkultur Ap3 mit Zugabe von Fumarsäure und Bromoethansulfonsäure ....................................................................................................... 207 4.7.3 Propionsäureoxidation anaerober Mischkulturen nach Zugabe von Fumarsäure und Bromoethansulfonsäure ........................................................................................................... 208 4.7.3.1 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkulturen Fp1a und Fp1b ............................... 209 4.7.3.2 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkulturen Wp1a und Wp1b............................. 210 INHALTSVERZEICHNIS VI 4.7.3.3 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkulturen Wp2a und Wp2b............................. 211 4.7.3.4 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkulturen Gp1a und Gp1b .............................. 212 4.7.3.5 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkulturen Ap1a und Ap1b............................... 212 4.7.3.6 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkulturen Ap3a und Ap3b............................... 213 4.7.4 Substrate und Produkte definierter Mischkulturen anaerober Mikroorganismen und methanogener Archaea............................................................................................................ 214 4.7.4.1 Substrate und Produkte definierter Mischkulturen mit Clostridium sartargoformeT DSM1292 ................................................................................. 215 4.7.4.2 Substrate und Produkte definierter Mischkulturen mit Wolinella succinogenesT DSM1740217 4.7.4.3 Substrate und Produkte definierter Mischkulturen mit Aminobacterium colombienseT DSM12261 ......................................................................... 219 4.7.4.4 Substrate und Produkte methanogener Eigenisolate und Geovibrio thiophilusT DSM11263 (Negativkontrollen) ......................................................... 220 4.7.5 Methanbildung durch methanogene Archaea ......................................................................... 222 4.7.5.1 Methanbildung syntroph propionsäureoxidierender Mischkulturen..................................... 223 4.7.5.2 Methanbildung definierter Mischkulturen anaerober Bakterien mit methanogenen Archaea ................................................................................................................................ 224 4.7.5.3 Methanbildung eigenisolierter Reinkulturen und Typstämmen methanogener Archaea.... 226 4.7.5.3.1 Methanbildung des Typstamms Methanobacterium formicicumT DSM1535 ........... 226 4.7.5.3.2 Methanbildung des Eigenisolats Methanobacterium formicicum Stamm LFP4.1 .... 228 4.7.5.3.3 Methanbildung des Eigenisolats Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 ....... 230 4.7.5.3.4 Methanbildung des Eigenisolats Methanoculleus bourgensis Stamm TAF1.1 ........ 231 4.7.5.3.5 Methanbildung des Typstamms Methanosarcina mazeiT DSM2053 ....................... 233 4.7.5.3.6 Methanbildung des Eigenisolats Methanosarcina mazei Stamm BEG3 .................. 234 4.7.5.3.7 Methanbildung des Eigenisolats Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1............. 235 4.7.5.3.8 Methanbildung des Eigenisolats Methanosaeta concilii Stamm BEG4 ................... 236 4.8 Zusammensetzung des Reaktorfiltrats .................................................................................... 237 4.8.1 Pflanzenpartikel im Reaktorfiltrat.............................................................................................. 237 4.8.2 Acetat im Reaktorfiltrat ............................................................................................................. 238 4.8.3 Aminosäuren im Reaktorfiltrat .................................................................................................. 238 4.8.4 Zuckeralkohol im Reaktorfiltrat................................................................................................. 240 5 Diskussion ....................................................................................................................................... 241 5.1 Molekularbiologisch Identifizierte Bakterien und methanogene Archaea aus NawaRoBiogasanlagen und Laborfermentern ...................................................................................... 241 5.2 Mikroorganismen in syntroph propionsäureoxidierenden Mischkulturen .......................... 243 5.2.1 Bakterien und eigenisolierte Bakterien aus der syntroph propionsäureoxidierenden Mischkultur Fp1 ........................................................................................................................ 244 INHALTSVERZEICHNIS VII 5.2.2 Bakterien aus der syntroph propionsäureoxidierenden Mischkultur Wp1............................... 248 5.2.3 Bakterien aus der syntroph propionsäureoxidierenden Mischkultur Wp2............................... 250 5.2.4 Bakterien aus der syntroph propionsäureoxidierenden Mischkultur Gp1 ............................... 251 5.2.5 Bakterien und eigenisolierte Bakterien aus der syntroph propionsäureoxidierenden Mischkultur Ap1 ........................................................................................................................ 252 5.3 Titer der syntroph propionsäureoxidierenden Mischkulturen und Reinkulturen agglomerierender methanogener Archaea .............................................................................. 254 5.4 Isolierte und angereicherte methanogene Kulturen aus Laborfermentern ......................... 254 5.5 Chemisch analysierte Mischkulturen syntroph propionsäureoxidierender Mikroorganismen ........................................................................................................................ 255 5.6 Substrate und Produkte definierter Co-Kulturen .................................................................... 255 5.6.1 Co-Kulturen mit Aminobacterium colombienseT DSM12261 .................................................. 256 5.6.2 Co-Kulturen mit Wolinella succinogenesT DSM1740 .............................................................. 256 5.6.3 Co-Kulturen mit Clostridium sartagoformeT DSM1292 ............................................................ 257 6 Zusammenfassung ......................................................................................................................... 258 7 Ausblick............................................................................................................................................ 260 8 Literaturverzeichnis ........................................................................................................................ 261 9 Anhang ............................................................................................................................................. 300 9.1 Paarweise und multiple Alignierungen bakterieller partieller 16S rDNA Sequenzen aus propionsäureabbauenden Mischkulturen ................................................................................ 300 9.2 Paarweise und multiple Alignierungen archaealer partieller 16S rDNA Sequenzen aus archaealen Reinkulturen ............................................................................................................ 312 9.3 Verwendete Websites ................................................................................................................. 318 ABKÜRZUNGEN VIII Abkürzungen A Adenin AEE Agentur für Erneuerbare Energien AFLP amplifizierter Fragment Längenpolymorphismus AGEB AG Energiebilanzen e. V. AGEE-Stat Arbeitsgruppe Erneuerbare Energien-Statistik AKW Atomkraftwerk APS Ammoniumpersulfat ARDRA Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (amplifizierte ribosomale DNS Restriktionsanalyse) ATB Leibniz-Institut für Agrartechnik Potsdam-Bornim e.V. ATCC American Type Culture Collection BEE Bundesverband Erneuerbare Energien e. V. BfN Bundesamt für Naturschutz BGA Biogasanlage BLAST Basic Local Alignment Search Tool BMELV Bundesministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz BMWi Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie BMU Bundesministerium für Umwelt, Naturschutz und Reaktorsicherheit BRD Bundes Republik Deutschland BrES Bromoethansulfonsäure bp Basenpaare C Cytosin CH4 Methan CO2 Kohlenstoffdioxid Cy3 Fluoreszenzfarbstoff Indocarboxycyanin DABCO 1,4 Diazabicyclo-[2.2.2]oktan DAPI 4’,6-Diamidino-2-Phenylindol-Dihydrochlorid-Hydrat deion. Deionisiert DDR Deutsche Demokratische Republik DGGE Denaturierende Gradienten Gel Elektrophorese DMSO Dimethylsulfoxid dNTP Desoxynukleotidtriphosphat DNA Desoxyribonucleic acid (Desoxiribonukleinsäure) DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen EBI European Bioinformatics Institute EDTA Ethylendiamintetraacetat ABKÜRZUNGEN IX EEA European Environment Agency EMBL European Molecular Biology Laboratory EPS Exopolysaccharid EU Europäische Union FISH Fluoreszenz in situ Hybridisierung FNR Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e. V. G Guanin GC Guanin + Cytosin-Gehalt [%] GWh Gigawattstunden H2 Wasserstoff H2O Wasser, Dihydrogenoxid H2S Schwefelwasserstoff, Dihydrogensulfid ha Hektar HPLC High-performance liquid chromatography (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) IEA International Association for the Evaluation of Educational Achievement IMW Institut für Mikrobiologie und Weinforschung ITS Internal Transcribed Spacer Kap. Kapitel KBE Koloniebildende Einheiten kDa Kilodalton kWh Kilowattstunden L Liter kg Kilogramm M Molar mg Milligramm µg Mikrogramm Mrd. Milliarden NCBI National Center for Biotechnology Information min Minute Mio. Millionen mL Milliliter µL Mikroliter Na+ Natriumionen NCBI National Center of Biotechnology Information NawaRo Nachwachsende Rohstoffe nmol Nanomol OECD-FAO Organisation for Economic Co-operation and Development-Food and Agriculture ABKÜRZUNGEN X Organization of the United Nations PBS Phosphate Buffered Saline (Phosphatpuffer) PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerase-Kettenreaktion) PFGE Pulsfeldgelelektrophorese PFI Prüf- und Forschungsinstitut Pirmasens e.V. pmol Picomol PJ Peta Joule ppmv Parts per million r min-1 Revolutions per minute (Umdrehungen pro Minute) rDNA Ribosomal Desoxyribonucleic Acid (ribosomale Desoxyribonukleinsäure) RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA (Randomisiert amplifizierte polymorphe DNS) RFLP Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus RIU F.S.-1 Refractive Index Units per Full Scale RWI Essen Rheinisch-Westfälische Institut für Wirtschaftsforschung RT Raumtemperatur sec Sekunden SAPD Specifically Amplified Polymorphic DNA (Spezifisch amplifizierte polymorphe DNS) SCAR Sequence Characterized Amplified Region (Sequenzabhängige amplifizierte Region) SDS Sodiumdodecylsulfat SKE Steinkohleeinheit SNP Single Nucleotide Polymorphism (Einzelnukleotidpolymorphismus) SSR Simple Sequence Repeat (einfache Sequenzwiederholung) SSU Small Subunit (kleine Untereinheit) STR Short Tandem Repeat (Wiederholung in direkter Folge) T Thymin t Tonnen Tab. Tabelle TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer TEMED Tetramethylethylendiamin Tg Terragramm TGGE Temperatur Gradienten Gel Elektrophorese Tm [° C] Melting temperature (Schmelztemperatur) TRIS Tris-(hydroxymethyl)-Aminomethan Tween 80 Polyoxyethylen-Sorbitan-Monooleat TWh Terrawattstunden ABKÜRZUNGEN XI U Unit (Einheit) UNFCCC United Nations Framework Convention on Climate Change V Volt WBGU Wissenschaftlicher Beirat der Bundesregierung Globale Umwelveränderungen WI Wuppertal Institut für Klima, Umwelt, Energie GmbH X-Gal 5-Brom-4-Chlor-3-Indoxyl- -D-Galactopyranosid 1 EINLEITUNG 1 1 Einleitung Sicherheit, Gesundheit und Umwelt des Menschen bedürfen große Mengen von Energie und Abfallbeseitigung. Aufgrund von Energiegewinnung durch zum Beispiel fossile Brennstoffe und Atomenergie, kam es zu erhöhten Treibhausgas-Emissionen, insbesondere des Kohlenstoffdioxids (CO2). Daraus resultierte ein andauernder Klimawandel (UNFCCC 2012). Außerdem neigen sich die Ressourcen der fossilen Brennstoffe dem Ende zu und die Entsorgung des atomaren Mülls ist als ein großes Problem erkannt geworden. Aus diesen Gründen wächst das Interesse weltweit, alternative Wege zur Energiegewinnung einzuschlagen. Energie aus nachwachsenden Rohstoffen ist ein alternativer Weg. Dazu zählen Solarenergie, Windenergie, Wasserenergie, Bioenergie und seit 2009 die Geothermie. Energie aus nachwachsenden Rohstoffen kann nahezu CO2-Emissionsneutral hergestellt werden. Des Weiteren erschöpfen nachwachsende Rohstoffe, ökologisch genutzt, nicht. Und die Energetisierung nachwachsender Rohstoffe kann auch zur Abfallentsorgung beitragen. Die Biogasherstellung kombiniert beide Bedürfnisse des Menschen: Energie, also Strom und Wärme kann aus Biogas hergestellt und Biogas kann aus biologischen Abfällen produziert werden. Die Biogasherstellung ist ein Vorgang, bei dem Technologie und Mikrobiologie eng zusammenwirken. Biogas wird aus organischen Stoffen unter anaeroben Bedingungen mikrobiell hergestellt. Die technologische Entwicklung hat große Fortschritte gemacht, wobei technologische Entwicklung weiterhin nicht am Ende ist. Wie steht es um die mikrobiologische Entwicklung? Die Mikrobiologie in Klärschlämmen ist gut erforscht und die Abläufe bekannt. Doch verhalten sich die gleichen Mikroorganismen genauso in Biogasanlagen? Es besteht noch viel Entwicklungsbedarf bei den Erneuerbaren Energien, insbesondere bei der Herstellung von Biogas. Seit 1990 werden die Wege für Energie aus nachwachsenden Rohstoffen auch von politischer Seite begünstigt (BMU 1990, 2000, 2004, 2008a, b und 2011). Seitdem fand eine rasante Entwicklung unter anderem auch bei der Biogasherstellung statt. Um die Hintergründe der bisherigen Entwicklung in der Biogasherstellung aus nachwachsenden Rohstoffen zu erläutern folgt eine chronologische Aufführung der gesetzlichen Beschlüsse im Bereich Erneuerbare Energien. 1.1 Das Erneuerbare-Energien-Gesetz Strom aus Erneuerbaren Energien wurde hauptsächlich von kleinen Unternehmen hergestellt. Das Einspeisen von Strom aus Erneuerbaren Energien in das Verbundnetz wurde von großen Stromerzeugern stark erschwert. Daher wurde vom Bundestag das Gesetz über die Einspeisung von Strom aus Erneuerbaren Energien in das öffentliche Netz (Stromeinspeisungsgesetz) erlassen (BMU 1990), welches 1991 in Kraft trat. Es heißt im § 1 Anwendungsbereich: “ Dieses 1 EINLEITUNG 2 Gesetz regelt die Abnahme und die Vergütung von Strom, der ausschließlich aus Wasserkraft, Windkraft, Sonnenenergie, Deponiegas, Klärgas oder aus Biomasse im Geltungsbereich dieses Gesetzes gewonnen wird, durch öffentliche Elektrizitätsversorgungsunternehmen. …“ und ebnet mit Vergütungen den verpflichtenden Weg zur Einspeisung von Strom aus Erneuerbaren Energien in das Verbundnetz. Am 01.04.2000 tritt das Gesetz für den Vorrang Erneuerbarer Energien (Erneuerbare-EnergienGesetz – EEG, BMU 2000) in Kraft. In dessen Zielsetzung (§ 1 Ziel des Gesetzes) steht: „Ziel dieses Gesetzes ist es, im Interesse des Klima- und Umweltschutzes eine nachhaltige Entwicklung der Energieversorgung zu ermöglichen und den Beitrag Erneuerbarer Energien an der Stromversorgung deutlich zu erhöhen, um entsprechend den Zielen der Europäischen Union und der Bundesrepublik Deutschland den Anteil Erneuerbarer Energien am gesamten Energieverbrauch bis zum Jahr 2010 mindestens zu verdoppeln.“(BMU 2000). Im Erfahrungsbericht der Bundesregierung zum EEG 2002 (BMU 2002) heißt es in der Einführung unter anderem: „…Die Zielsetzung in Deutschland ist eingebettet in einen europäischen Rahmen. In der EURichtlinie zur Förderung der Stromerzeugung aus Erneuerbaren Energiequellen im Elektrizitätsbinnenmarkt vom 27. September 2001 hat sich Deutschland zu dem Ziel bekannt, bis zum Jahr 2010 den Anteil regenerativ erzeugten Stroms im heimischen Elektrizitätsmarkt auf rd. 12,5 % zu steigern. Trotz unverkennbarer Erfolge – nach einem Anteil der Erneuerbaren Energien am Netto- Stromverbrauch von 5,2 % im Jahr 1998 und von annähernd 7 % im Jahr 2000 gab es im Jahr 2001 einen Anstieg auf knapp 7,5 % – erfordert der weitere Ausbau Erneuerbarer Energien derzeit auf absehbare Zeit noch eine gezielte staatliche Unterstützung. Diese reicht von der Förderung von Forschung und Entwicklung im Bereich Erneuerbarer Energien über die Gewährung von Investitionsanreizen zur Nachfragestimulierung bis hin zu gesetzlichen Einspeise- und Vergütungsregelungen. ...“. Die Auswirkungen werden in Kapitel 1.2 erläutert. Das EEG wurde am 21.07.2004 zur Umsetzung der Richtlinie 2001/77/EG des Europäischen Parlaments und des Rates vom 27. September 2001 zur Förderung der Stromerzeugung aus Erneuerbaren Energiequellen im Elektrizitätsbinnenmarkt in das Gesetz zur Neuregelung des Rechts der Erneuerbaren Energien im Strombereich geändert. Im Zweck des Gesetzes Artikel 1, §1, Absatz 2 steht nun: “Zweck dieses Gesetzes ist ferner, dazu beizutragen, den Anteil Erneuerbarer Energien an der Stromversorgung bis zum Jahr 2010 auf mindestens 12,5 Prozent und bis zum Jahr 2020 auf mindestens 20 Prozent zu erhöhen.“ (BMU 2004). Hervorzuheben ist, dass mit der Neufassung des EEG 2004 mit § 8 Vergütung von Strom aus Biomasse Absatz 2 Nr. 1 eine Zusatzvergütung für Strom aus Nachwachsenden Rohstoffen von der Bundesregierung eingeführt wurde. Als Nachwachsende Rohstoffe wurden Pflanzen oder Pflanzenbestandteile definiert, die ausschließlich zur Nutzung in Biomasseanlagen angebaut und verarbeitet werden und Gülle beziehungsweise aus landwirtschaftlichen Brennereien anfallende 1 EINLEITUNG 3 Schlempe, für die keine anderweitige Verwendungspflicht besteht. Die Auswirkungen des EEG 2004 werden in Kapitel 1.2 und 1.4 erläutert. Der Anteil der Erneuerbaren Energien am Primärenergieverbrauch hat sich seit Inkrafttreten des EEG im Jahr 2000 von 2,6 % auf rund 5,8 % im Jahr 2006 und am gesamten Endenergieverbrauch von 3,8 % auf rund 8,0 % im Jahr 2006 mehr als verdoppelt (BMU 2007). Der Anteil der Erneuerbaren Energien am gesamten Bruttostromverbrauch hat sich laut BMU ebenfalls fast verdoppelt: von 6,3 % im Jahr 2000 auf rund 11,6 % im Jahr 2006. Für 2007 erwartete das BMU über 13 % erwartet, womit das Ausbauziel des EEG bis 2010 bereits 2007 überschritten werde. Bezüglich der Erneuerbaren Energien aus Biomasse schreibt das BMU (2007) in ihrem Erfahrungsbericht, dass die Stromerzeugung aus Biomasse (inklusive biogener Abfall) einen starken Aufwärtstrend zeigte, die sich von rund 8,0 Mrd. kWh im Jahr 2004 auf rund 15,6 Mrd. kWh 2006 steigern konnte, was einem Anteil von etwa 2,5 % am Bruttostromverbrauch entsprach. Der mit der Neufassung des EEG 2004 eingeführte „NawaRo-Bonus“ (Nachwachsende Rohstoffe-Bonus) hatte zur Folge, dass sich das Wachstum bei Biogasanlagen zwischen 2004 und 2006 vervierfachte, womit ein Trend zu größeren Anlagen einherging, so das BMU in seinem Erfahrungsbericht 2007. Das System des EEG gilt als das erfolgreichste im Klimaschutz und wird von mehr als 40 Ländern ähnlich durchgeführt (BMU 2007). Ebenfalls 2007 wird jedoch von verschiedenen Stellen unter anderem die Abschaffung des „NawaRo-Bonus“ gefordert: Aufgrund einer drohenden Flächenkonkurrenz zwischen dem Anbau von Energiepflanzen und Futter- und Nahrungsmittelproduktion würden die durch schlechte Ernten, zu geringen Vorräten und den Ausbau der Bioethanolproduktion erhöhten Preise von Agrarprodukten weiter in die Höhe getrieben (Genauere Erläuterungen siehe Kapitel 1.4). Am 01.01.2009 trat das neue EEG in Kraft. Im Teil I Allgemeine Vorschriften § 1 Zweck des Gesetzes steht: „(1) Zweck dieses Gesetzes ist es, insbesondere im Interesse des Klima- und Umweltschutzes eine nachhaltige Entwicklung der Energieversorgung zu ermöglichen, die volkswirtschaftlichen Kosten der Energieversorgung auch durch die Einbeziehung langfristiger externer Effekte zu verringern, fossile Energieressourcen zu schonen und die Weiterentwicklung von Technologien zur Erzeugung von Strom aus Erneuerbaren Energien zu fördern. (2) Um den Zweck des Absatzes 1 zu erreichen, verfolgt dieses Gesetz das Ziel, den Anteil Erneuerbarer Energien an der Stromversorgung bis zum Jahr 2020 auf mindestens 30 Prozent und danach kontinuierlich weiter zu erhöhen.“ Der Bonus für Strom aus nachwachsenden Rohstoffen wurde erhöht und eine Anlage 2 erzeugt, in der die Ausschließlichkeit der nachwachsenden Rohstoffe gestrichen wurde (BMU 2008b). Das bedeutet: Gülle wurde dem Einsatz von nachwachsenden Rohstoffen gleichgestellt. 1 EINLEITUNG Außerdem enthält Anhang 2 eine Positiv- (Ziffer III) und eine Negativliste (Ziffer IV), in den nachwachsende Rohstoffe beziehungsweise nicht nachwachsende Rohstoffe nach Ziffer I1.a definiert wurden. Diesen Listen nachgestellt ist eine Positivliste V, die einige als nicht nachwachsende Rohstoffe eingestufte, rein pflanzliche Nebenprodukte wie zum Beispiel Gemüseabputz, Glycerin aus der Verarbeitung von Pflanzenölen oder frischer, unbehandelter Obsttrester für den Einsatz in Biogasanlagen erlaubt. Zusätzlich wurde ein Gülle- (Ziffer VI 2.b) und ein Landschaftspflegebonus (Ziffer VI 2.c) eingeführt. Im Dezember 2011 wurde das EEG (BMU 2008a) im Bereich Biogasherstellung dahingehend geändert beziehungsweise ergänzt, dass aus überwiegend Biomasse-Abfällen (§ 27a) und Gülle (§ 27b) hergestelltes Biogas ebenfalls gestaffelt vergütet wird. Neu wurde eine Nachweispflicht (§ 27c) eingeführt, bei der Anlagenbetreiber dokumentieren müssen, aus welcher Biomasse wie viel Biogas beziehungsweise Strom hergestellt worden ist (BMU 2011). Die Beweggründe des Bundesministeriums sind im Kapitel 1.4 erläutert. Die oben erläuterten politischen Entscheidungen und neuen Gesetzgebungen haben den Energiemix in Deutschland beeinflusst. Die Energiegewinnung aus Erneuerbaren Rohstoffen ist gestiegen. Auf den Energiemix in Deutschland und dessen Veränderung wird daher im folgenden Kapitel 1.2 näher eingegangen. 4 1 EINLEITUNG 5 1.2 Primärenergie- und Endernergieverbrauch in Deutschland bis 2011 In den VDI-Richtlinien VDI 4661 (VDI 2003) und VDI 4608 (VDI 2005) Blatt 1 definieren die Primärenergie als Energie aus natürlichen Energieträgern. Dazu zählen zum Beispiel Stein- und Braunkohle, Mineralöl, Erdgas, Erneuerbare Energien und die Kernenergie. Die Endenergie wird beschrieben als die Energie, die zum Beispiel in Form von Brenn- beziehungsweise Treibstoffen oder elektrischer Energie beim Endverbraucher ankommt. Dabei hat die Endenergie einen großen Bestandteil an Sekundärenergie, welche aus der Umwandlung von Primärenergie entsteht (VDI 4661, VDI 4608 Blatt 1). Im Folgenden behandeln Abbildungen und Erläuterungen den Primärenergieverbrauch der Jahre 1990 bis 2011 (Abbildung 1, AGEB 2012) und des Primärenergie-Mixes 2011 in Deutschland (Abbildung 2, AGEB 2012). PJ a Abbildung 1: Entwicklung des Primärenergieverbrauchs in Deutschland 1990-2011 in Peta Joule [PJ] gegen die Zeit in Jahren [a]; Stand: Februar 2012; Quelle: Arbeitsgemeinschaft Energiebilanzen e. V. (AGEB 2012); Druckgenehmigung von Dr. H.-J. Ziesing (Arbeitsgemeinschaft Energiebilanzen e. V.) vom 29.09.2012. Der Primärenergieverbrauch in Deutschland verfolgt eine seit 1990 im Trend rückläufige Tendenz (Abbildung 1). 2009 sank Verbrauch infolge der Konjunkturkrise nach Einschätzung der AGEB auf den niedrigsten Stand seit Anfang der 1970er Jahre. der Verbrauch erholte sich 2010 laut der Pressemittelung der AGEB im Februar 2012 aufgrund des Konjunkturaufschwungs und der kälteren Witterung. Im vergangenen Jahr 2011 wurde der Verbrauch des Jahres 2009 1 EINLEITUNG 6 hauptsächlich aufgrund warmer Witterungsbedingungen und aufgrund des hohen Preisniveaus unterschritten. Sonstige einschließlich Außenhandel Strom – 1,7 (1,3) Erneuerbare – 10,8 (9,9) Mineralöl – 33,8 (33,4) Kernenergie – 8,8 (10,9) Braunkohle – 11,7 (10,7) Steinkohle – 12,6 (12,0) Erdgas – 20,6 (21,8) Abbildung 2: Energiemix 2011 mit leichten Verschiebungen, Struktur des Primärenergieverbrauchs in Deutschland, Anteile in Prozent (Vorjahr in Klammern), gesamt 13374 PJ oder 456,4 Mio. t Steinkohleeinheiten (SKE); Quelle nach: AG Energiebilanzen e. V. (AGEB); Druckgenehmigung von Dr. H.-J. Ziesing (Arbeitsgemeinschaft Energiebilanzen e. V.) vom 29.09.2012. In Abbildung 2 wird ein Rückgang der Kernenergie im Primärenergie-Mix im Vergleich zum Vorjahr gezeigt (AGEB 2012). Nach der AGEB wurde der gesunkene Anteil der Kernenergie zum einen durch Braunkohle und zum anderen durch Erneuerbare Energien aufgefangen. Die Erneuerbaren Energien steuerten einen erstmals zweistelligen Beitrag von 10,9 % zum Primärenergieverbrauch bei. Für das Jahr 2011 veröffentlichte das BMU im März 2012 Statistiken zum Anteil Erneuerbarer Energien am Endenergieverbrauch in Deutschland im Jahr 2011, welche in den folgenden Abbildungen graphisch mit Erläuterungen dargestellt sind. 1 EINLEITUNG 7 Gesamt: 8.685 PJ 1) Windenergie: 1,9 % Wasserkraft: 0,8 % Photovoltaik: 0,8 % Anteile EE 2011 12,2 % fossile Energieträger (Steinkohle, Braunkohle, Mineralöl, Erdgas) und Kernenergie: 87,8 % 2) Biomasse : 8,2 % Solarthermie, Geothermie: 0,5 % Abbildung 3: Anteil Erneuerbarer Energien am Endenergieverbrauch in Deutschland im Jahr 2011; 1) Quelle: Energy Environment Forecast Analysis (EEFA) GmbH & Co KG, PJ = Petajoule; 2) Feste und flüssige Biomasse, Biogas, Deponie- und Klärgas, biogener Anteil des Abfalls, Biokraftstoffe; Quelle: BMU-KI III 1 nach Arbeitsgruppe Erneuerbare Energien-Statistik (AGEEStat) und ZSW, unter Verwendung von Angaben der Arbeitsgemeinschaft Energiebilanzen e.V. (AGEB); EE: Erneuerbare Energien; 1 PJ = 1015 Joule; Abweichungen in den Summen durch Rundungen; Stand: März 2012; Angaben vorläufig; Druckzustimmung von D. Böhme, BMU Referat KI III 1 - Allgemeine und grundsätzliche Angelegenheiten der Erneuerbaren Energien vom 21.08.2012. Der Anteil der Erneuerbaren Energien am Endenergieverbrauch lag 2011 mit 12,2 % (Abbildung 3) höher als der Primärenergieverbrauch 2011 in Deutschland (Abbildung 2) aufgrund der Einberechnung der Sekundärenergie. Den größten Anteil des Endenergieverbrauchs aus Erneuerbaren Energien nahm die Biomasse mit 8,2 % ein. Der Endenergieverbrauch setzt sich aus der auf den gesamten Bruttostromverbrauch bezogenen Stromerzeugung, der gesamten Wärmebereitstellung und dem gesamten Kraftstoffverbrauch ohne Flugbenzin zusammen. Nach den Angaben des BMU betrug der Anteil Erneuerbarer Energien im Jahr 2011 an der Stromerzeugung 20,0 %, wovon 6,1 % aus Biomasse entstand. An der Wärmebereitstellung 2011 waren die Erneuerbaren Energien zu 10,4 % (9,5 % aus Biomasse) beteiligt und Biokraftstoffe wurden zu 5,6 % des gesamten Kraftstoffverbrauchs verwendet. Die Erneuerbaren Energieträger Wind, Wasser und Photovoltaik wurden ausschließlich zur Stromverwertung und Geo- sowie Solarthermie ausnahmslos zur Wärmeerzeugung eingesetzt. Biogene Kraftstoffe (Biodiesel, Bioethanol und Pflanzenöl) wurden 2011 nach der Bilanz des BMU beim Kraftstoffverbrauch verwendet. 1 EINLEITUNG 8 Gesamt: 294,6 TWh biogene Brennstoffe, Wärme: 42,9 % biogene Kraftstoffe: 11,6 % Geothermie: 2,2 % Wasserkraft: 6,6 % Solarthermie: 1,9 % Photovoltaik: 6,4 % biogene Brennstoffe, Strom: 12,5 % Windenergie: 15,8 % gesamte Biomasse*, einschl. biogene Kraftstoffe: 67 % Abbildung 4: Struktur der Endenergiebereitstellung aus Erneuerbaren Energien in Deutschland im Jahr 2011; * Feste und flüssige Biomasse, Biogas, Deponie- und Klärgas, biogener Anteil des Abfalls; 1 TWh = 1 Mrd. kWh; Abweichungen in den Summen durch Rundungen; Quelle BMU-KI III 1 nach Arbeitsgruppe Erneuerbare Energien Statistik (AGEE-Stat); Stand: März 2012; Angaben vorläufig; Druckzustimmung von D. Böhme, BMU Referat KI III 1 - Allgemeine und grundsätzliche Angelegenheiten der Erneuerbaren Energien vom 21.08.2012. Eine detailliertere Aufschlüsselung der Zusammensetzung der Endenergiebereitstellung aus Erneuerbaren Energien zeigt Abbildung 4. Hier wird deutlich, dass biogene Brennstoffe sowohl zur Herstellung von Strom als auch für Wärme mit insgesamt 55,4 % im Jahre 2011 verwendet wurden. Biomasse setzt sich aus Biogas, biogenen Festbrennstoffen in Haushalt, Industrie und aus Heiz- beziehungsweise Heizkraftwerken, biogene flüssige Brennstoffe, der biogene Anteil des Abfalls, Klärgas und Deponiegas zusammen und wird bei der Verstromung und der Generierung von Wärme in unterschiedlich verteilten Zusammensetzungen verwendet. 1 EINLEITUNG 9 140.000 120.000 Wasserkraft Windenergie Biomasse * Photovoltaik EEG: August 2004 100.000 [GWh] EEG: Januar 2009 EEG: April 2000 80.000 Novelle BauGB: November 1997 60.000 40.000 StromEinspG: Januar 1991 - März 2000 20.000 0 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 [a] Abbildung 5: Beitrag der Erneuerbaren Energien zur Strombereitstellung in den Jahren 19902010 [a] in Deutschland; * Feste und flüssige Brennstoffe, Biogas, Deponie- und Klärgas, biogener Anteil des Abfalls 1 GWh = 1 Mio. kWh; Aufgrund geringer Strommengen ist die Tiefengeothermie nicht dargestellt; StromEinsG = Stromeinspeisungsgesetz; BauGB = Baugesetzbuch; EEG = Erneuerbare-Energien-Gesetz; Quelle: BMU-KI III 1 nach Arbeitsgruppe Erneuerbare Energien Statistik (AGEE-Stat); Hintergrundbild: BMU / Christoph Edelhoff; Stand: März 2012; Angaben vorläufig; Druckzustimmung von D. Böhme, BMU Referat KI III 1 - Allgemeine und grundsätzliche Angelegenheiten der Erneuerbaren Energien vom 21.08.2012. Abbildung 5 stellt dar, dass die Strombereitstellung aus Erneuerbaren Energien stetig steigt. Sobald eine Gesetzesänderung in Kraft getreten ist, erfuhr der Beitrag an Erneuerbaren Energien einen Anstieg. Besonders seit der Einführung des Erneuerbaren Energien Gesetzes (EEG, siehe Kapitel 1.1) reagierte der Energiemarkt wiederholt mit sprunghaften Anstiegen der einen oder anderen Erneuerbaren Energie auf Novellierungen des EEG. Wasserkraft stieg dabei nicht an, da die natürlichen Vorkommen bereits ausgenutzt sind und keine weitere Steigerung zulassen. 1 EINLEITUNG 10 Gesamt: 121,9 TWh Windenergie: 38,1 % Wasserkraft: 16,0 % biogener Anteil des Abfalls: 4,1 % Deponiegas: 0,5 % Klärgas: 0,9 % Photovoltaik: 15,6 % Biogas: 14,4 % biogene flüssige 1) Brennstoffe : 1,1 % biogene Festbrennstoffe: 9,3 % Biomasseanteil 2): 30 % Abbildung 6: Struktur der Strombereitstellung aus Erneuerbaren Energien in Deutschland im Jahr 2011; 1) inklusive Pflanzenöl; 2) Feste und flüssige Biomasse, Biogas, Deponie- und Klärgas, biogener Anteil des Abfalls; aufgrund geringer Strommengen ist die Tiefengeothermie nicht dargestellt; 1 TWh = 1 Mrd. kWh; Abweichungen in den Summen durch Rundungen; Quelle BMU-KI III 1 nach Arbeitsgruppe Erneuerbare Energien Statistik (AGEE-Stat); Stand: März 2012; Angaben vorläufig; Druckzustimmung von D. Böhme, BMU Referat KI III 1 - Allgemeine und grundsätzliche Angelegenheiten der Erneuerbaren Energien vom 21.08.2012. Abbildung 6 zeigt eine genauere Darstellung der Strombereitstellung aus Erneuerbaren Energien. Nach der Windenergie und der Wasserkraft wurde die verstromte Biomasse (30 %) mit fast der Hälfte von Biogas mit 14,4 % angeführt. Dem Biogas folgten nach Anteilen geordnet biogene Festbrennstoffe, der biogene Anteil des Abfalls, biogene flüssige Brennstoffe, Klärgas und Deponiegas. 1 EINLEITUNG 11 160.000 Biomasse * Solarthermie Geothermie 140.000 120.000 [GWh] 100.000 80.000 60.000 40.000 Anteil der Biomasse an der EE-Wärme 2010: 91 % 20.000 0 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 [a] Abbildung 7: Wärmebereitstellung in Deutschland in den Jahren 1997 bis 2011; * Feste und flüssige Brennstoffe, Biogas, Deponie- und Klärgas, biogener Anteil des Abfalls 1 GWh = 1 Mio. kWh; EE = Erneuerbare Energien; Quelle: BMU-KI III 1 nach Arbeitsgruppe Erneuerbare Energien Statistik (AGEE-Stat); Hintergrundbild: BMU / Brigitte Hiss; Stand: März 2012; Angaben vorläufig; Druckzustimmung von D. Böhme, BMU Referat KI III 1 - Allgemeine und grundsätzliche Angelegenheiten der Erneuerbaren Energien vom 21.08.2012. Die Wärmeerzeugung unterliegt witterungsbedingten Schwankungen, da in milderen Wintern weniger geheizt wurde, wie es 2011 der Fall war. Wie bereits unter Abbildung 4 erwähnt, wurde im Jahr 2011 ein großer Teil der endverbrauchten Wärme aus Erneuerbaren Energien mit Biomasse (91 %) generiert (Abbildung 7). Die Wärmeerzeugung aus Biogas stieg im Vergleich zum Vorjahr neben der Geo- und Solarthermie. 1 EINLEITUNG 12 Gesamt: 138,4 TWh biogene Festbrennstoffe (Haushalte): 44,8 % biogene Festbrennstoffe (Industrie): 17,5 % oberflächennahe Geothermie: 4,3 % tiefe Geothermie: 0,2 % Solarthermie: 4,0 % biogener Anteil des Klärgas: Abfalls: 0,8 % 5,7 % Deponiegas: 0,2 % Biogas: 11,9 % biogene flüssige 1) Brennstoffe : 5,6 % biogene Festbrennstoffe (HW/HKW): 4,9 % 2) Biomasseanteil : 91 % Abbildung 8: Struktur der Wärmebereitstellung aus Erneuerbaren Energien in Deutschland im Jahr 2011; 1) Inklusive Pflanzenöl; 2) Feste und flüssige Biomasse, Biogas, Deponie- und Klärgas, biogener Anteil des Abfalls; 1 TWh = 1 Mrd. kWh; Quelle: BMU-KI III 1 nach Arbeitsgruppe Erneuerbare Energien-Statistik (AGEE-Stat); Abweichungen in den Summen durch Rundungen; Stand: März 2012; Angaben vorläufig; Druckzustimmung von D. Böhme, BMU Referat KI III 1 Allgemeine und grundsätzliche Angelegenheiten der Erneuerbaren Energien vom 21.08.2012. Der Biomasseanteil der Wärmebereitstellung 2011 aus Erneuerbaren Energien betrug 91 %. Neben Holzscheiten wurden nach Angaben des BMU zunehmend Holzpellets zur Wärmeerzeugung in Haushalten verwendet. Außer Biomasse wurden Oberflächennahe sowie tiefe Geothermie und Solarthermie zur Wärmebereitstellung verwendet. 1 EINLEITUNG 13 Deutschland im Jahr 2011 Gesamt: 126,5 TWh biogene Festbrennstoffe (Haushalte): 49,0 % biogene Festbrennstoffe (Industrie): 19,1 % biogener Anteil des Abfalls: 6,2 % Deponiegas: 0,2 % Klärgas: 0,9 % biogene flüssige Brennstoffe *: 6,1 % Biogas: 13,0 % biogene Festbrennstoffe (HW/HKW): 5,4 % Abbildung 9: Struktur der Wärmebereitstellung aus Biomasse in Deutschland im Jahr 2011; * Inklusive Pflanzenöl; HW/HKW = Heizwerke/Heizkraftwerke; Quelle: BMU-KI III 1 nach Arbeitsgruppe Erneuerbare Energien-Statistik (AGEE-Stat); 1 TWh = 1 Mrd. kWh; Abweichungen in den Summen durch Rundungen; Stand: März 2012; Angaben vorläufig; Druckzustimmung von D. Böhme, BMU Referat KI III 1 - Allgemeine und grundsätzliche Angelegenheiten der Erneuerbaren Energien vom 21.08.2012. Der Hauptbestandteil der zur Wärmebereitstellungen verwendeten Biomasse waren 2011 die biogenen Festbrennstoffe in Haushalt, Industrie und aus Heiz- beziehungsweise Heizkraftwerken (Abbildung 9). Auch bei der Bereitstellung für Wärme hatte Biogas einen Anteil von 13,0 %. 1.3 Primärenergieverbrauch und Energie-Mix in Deutschland bis 2020 Aufgrund einer Umweltkatastrophe in Japan ereigneten sich Unfälle bei den dortigen Atomanlagen (Fukushima I und II, Präfektur Fukushima, Japan) seit dem 11. März 2011. Die Bundesregierung reagierte mit einem Moratorium, also einer Aufschiebung der Laufzeitverlängerung der Atomkraftwerke und verfügte, die ältesten AKW vom Netz zu nehmen. Die Agentur für Erneuerbare Energien (AEE) veröffentlichte im März 2011 (AEE, 2011a, b, c) eine auf die Branchenprognose des Bundesverbandes Erneuerbarer Energie e. V. (BEE 2011) des selbigen Monats gestützt einige Zahlen zur Entwicklung des Primärenergieverbrauchs und des Energie-Mix in Deutschland unter Annahme des vollständigen Atomausstiegs Deutschlands. 1 EINLEITUNG 14 [TWh] [a] Abbildung 10: Anteil der Erneuerbaren Energien am Stromverbrauch in Deutschland bis 2020; Der Anteil Erneuerbarer Energien wächst auf 47 %; [TWh] = Terrawattstunden pro Jahr gegen [a] = Jahre; Quellen: BMU/AGEE-Stat., BMWi, BEE (Branchenprognose 2020), Berechnungen der AEE, Stand:03/2011; Druckgenehmigung von S. Kirrmann, Agentur für Erneuerbaren Energien vom 15.10.2012. Der Anteil der Erneuerbaren Energien wird laut der AEE von 17 % 2010 bis auf 47 % 2020 wachsen, wobei der Bruttostromverbrauch stagnieren wird (AEE 2011a). Der Ausbau der Erneuerbaren Energien bis 2020 berechnete die AEE ebenfalls (Abbildung 11). [TWh] [a] Abbildung 11: Stromerzeugung aus Erneuerbaren Energien in Deutschland bis 2020; [TWh] = Terrawattstunden gegen [a] = Jahre; Quellen: BMU/AGEE-Stat, BEE, Stand 03/2011; Druckgenehmigung von S. Kirrmann, Agentur für Erneuerbaren Energien vom 15.10.2012. Den größten Beitrag zur Stromerzeugung in Deutschland im Jahre 2020 wird die Windenergie leisten, nach der Prognose der AEE (2011b). Die Energie aus Biomasse erführe einen weiteren Ausbau und beträgt 2020 in Folge dessen 54 TWh in Deutschland. Ebenfalls kann die 1 EINLEITUNG 15 Photovoltaik ausgebaut werden. Energie aus Wasserkraft ist zum heutigen Zeitpunkt schon ausgeschöpft. Daher kann die Energiegewinnung nicht weiter erhöht werden. Eine andere Aufführung der AEE zeigt die Leistung, die aus Erneuerbaren Energien bis 2020 gewonnen werden kann. [GW] [a] Abbildung 12: Installierte Leistung zur Stromerzeugung aus Erneuerbaren Energien in Deutschland bis 2020; [GW] = Gigawatt gegen [a] = Jahre; Quellen: BMU/AGEE-Stat., BEE, Stand 03/2011; Druckgenehmigung von S. Kirrmann, Agentur für Erneuerbaren Energien vom 15.10.2012. Die meiste Leistung bringt die Windenergie, dicht gefolgt von der Photovoltaik, welche den größten Leistungsausbau erfahren wird (Abbildung 12). Bioenergie wird mit leichtem Leistungsgewinn 2020 auf 10,8 GW geschätzt. Der Strom-Mix in Deutschland wird 2020 von der AEE (2011c) wie folgt prognostiziert. 1 EINLEITUNG 16 Abbildung 13: Der Strom-Mix im Jahr 2020; Erneuerbare Energien stellen 47 % der Versorgung; TWh = Terrawattstunden; Quelle: Berechnungen der AEE auf Basis der Branchenprognose, BEE, Stand: 03/2011; Druckgenehmigung von S. Kirrmann, Agentur für Erneuerbaren Energien vom 15.10.2012. Der Vergleich des Strom-Mixes 2020 in Abbildung 13 mit dem Anteil der Erneuerbaren Energien am Stromverbrauch in Deutschland bis 2020 (Abbildung 10) zeigt deutlich, dass die Erneuerbaren Energien 2020 den gesamten Strom der Kernenergie (-22,4 %) ablösen und fast den gesamten Verlust der Braunkohle (-6,7 %) und des Erdgases (-2,8 %) kompensieren können. Nur einen geringen Prozentsatz (1,3 %) wird die Steinkohle bei einer solchen Entwicklung übernehmen. Auch der Kraftwerkpark kann sich nach der AEE (2011c) durch die Umstrukturierung des Energie-Mixes bis 2020 in Deutschland ändern. Abbildung 14: Prognostizierter Kraftwerkpark 2020 in Deutschland; 2020 werden weniger konventionelle Kraftwerke benötigt als geplant; Bestand 2020 im Vergleich zu 2009, x (rot) = Prognose abgeschalteter Werke (2009) und Prognose verworfener Bauplanungen (bis 2020); Quelle: BEE, BNetzA 2010, Stand 03/2011; Druckgenehmigung von S. Kirrmann, Agentur für Erneuerbaren Energien vom 15.10.2012. 1 EINLEITUNG 17 Abbildung 14 zeigt die Annahme der AEE (2011c), dass alle Atomkraftwerke und wenige Erdgas-, Braunkohle- und Steinkohlekraftwerke geschlossen werden und keine neuen Erdgasund Steinkohlekraftwerke gebaut werden, die bis 2020 geplant waren. Somit übernehmen die Erneuerbaren Energien 16,7 GW Leistung. Diese Annahme deckt sich mit den Berechnungen des BEE, dass die produzierte Strommenge ohne Kernenergie und mit geringerer Energiegewinnung aus Erdgas und Braunkohle im Jahr 2020 den Primärverbrauch deckt. [GW] Abbildung 15: Leistungsbilanz im Jahr 2020: Die Jahreshöchstlast ist gedeckt; Deutschland verfügt über 8,4 Gigawatt mehr gesicherte Leistung als benötigt; [GW] = Gigawatt; Quelle: Berechnung der AEE auf Basis der Branchenprognose 2020, BEE, Stand 03/2011; Druckgenehmigung von S. Kirrmann, Agentur für Erneuerbaren Energien vom 15.10.2012. Nach den Berechnungen der AEE (2011b) wird Deutschland mit der Erhöhung der Energie aus Erneuerbaren Rohstoffen 2020 über 8,4 GW mehr verfügen, als benötigt werden wird (Abbildung 15). 1.4 Potenziale der Biomassenutzung in Deutschland 1.4.1 Flächenverteilung in Deutschland Deutschland hat eine Fläche von 357050 km2. Die Aufteilung der Nutzung wird in Tabelle 1 prozentual erläutert. 1 EINLEITUNG 18 Tabelle 1: Prozentuale Verteilung der Fläche Deutschlands 1 Landwirtschaftlich genutzte Flächen Wald 53 % 1 29,8 % 4 Nationalparke und Biosphärenreservate 0,54 % 2b 3,7 % 2a Siedlungen 12,3 % 3 Sonstige Flächen 4,7 % 3 Statistisches Bundesamt 2006; 2a BfN 2011, 4 2b BfN 2012, 3 Statistisches 5 Bundesamt 2002, Statistisches Bundesamt 2005, Moss et al. 1996. Der Anteil der geschützten Landbiotope an der Gesamtfläche beträgt 8,3 %, weil ein Teil der Naturschutzgebiete sich mit Teilen der Biosphärenreservate und Nationalparke überschneidet (Moss et al. 1996). Die Hälfte der prozentualen Fläche Deutschlands wird landwirtschaftlich genutzt. Durch die in Kapitel 1.1 beschriebene Einführung von Gesetzen zur Erweiterung der Energiegewinnung aus erneuerbaren Rohstoffen, gingen Agrarwirte dazu über, in Deutschland vermehrt Nutzpflanzen anzubauen. So entstand eine Debatte über eine Flächennutzungskonkurrenz zwischen Futterund Nahrungsmittelpflanzen und Energiepflanzen. 1.4.2 Debatte um die Flächennutzungskonkurrenz zwischen Nahrungs- und Energiepflanzen Die Flächenstilllegungsregelung (Henning 2012) wurde von der EU 1992 beschlossen, um die Preise auf dem Agrarmarkt von politischer Seite stabil halten zu können. Zum einen durften auf stillgelegten Flächen Energiepflanzen angebaut werden, was die Landwirte in Deutschland aufgrund des EEG 2004 (Kapitel 1.1) stark nutzten. Zum anderen führten die Subventionen der Flächenstilllegungsregelung und andere Gründe dazu, dass Landwirte den Anbau einjähriger Pflanzen bevorzugten, die den Einsatz von viel Pestiziden und Dünger erforderlich machen. Das ökologisch nachhaltige Potenzial einjähriger Arten liegt etwa 30 % unter dem wirtschaftlichen Potenzial. Außerdem sind mehrjährige Pflanzen vorzuziehen, da sie geringere Düngermengen brauchen, ohne Pestizideinsatz auskommen und bei geringer Bodenbearbeitung höhere Energieerträge liefern als einjährige Pflanzen (Börjesson et al. 1997). Im Jahr 2007 stiegen die Preise für Argrarprodukte aufgrund von schlechten Ernten, zu geringen Vorräten und durch den Ausbau der Bioethanolproduktion weltweit (OECD-FAO 2007). Daher wurden Stimmen laut, die unter anderem die Abschaffung des „NawaRo-Bonus“ forderten aufgrund einer drohenden Flächennutzungskonkurrenz zwischen dem Anbau von Energiepflanzen und der Futter- und Nahrungsmittelproduktion in Deutschland (Breuer 2007). Der Wissenschaftliche Beirat der Bundesregierung Globale Umweltveränderungen (WBGU) 1 EINLEITUNG 19 schrieb 2008 in ihrem Bericht „Zukunftsfähige Bioenergie und nachhaltige Landnutzung“, dass Biogas, Rohgas und Biomethan weiter eingesetzt werden sollen. Vorzugsweise sollen Biogas, Rohgas und Biomethan in allen Regionen eingeführt werden, die einen hohen Kohleanteil in der Stromerzeugung aufweisen, so der WBGU (2008). Weiter empfiehlt der WBGU, dass der Einsatz biogener Abfälle und Reststoffe gefördert werden soll, so dass diese gegenüber der Stromerzeugung aus Energiepflanzen bevorzugt werden, um einer drohenden Flächennutzungskonkurrenz zu entgehen. Wenn die internationale Verbreitung von KraftWärme-Kopplung sowie Gas- und Dampfkraftwerken durch geeignete Klima- und energiepolitische Rahmenbedingungen sowie geeignete Förderansätze deutlich zunimmt, ließen sich Bioenergienutzungspfade mit hohen Effizienzgraden und somit global spürbaren Emissionseinsparungen erzielen, so der WBGU. Für das Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie fertigte 2008 das Wuppertal Institut für Klima, Umwelt, Energie GmbH (WI) und das Rheinisch-Westfälische Institut für Wirtschaftsforschung (RWI Essen) eine Studie an, die die Bedenken der Flächennutzungskonkurrenz aufgrund der Mehranpflanzung von Energiepflanzen besonders für Biokraftstoffe bestätigte. Die obligatorische Flächenstilllegung wurde 2007 in der EU zunächst für ein Jahr ausgesetzt und ab 2009 abgeschafft (EU 2008). Das Bundesministerium reagierte 2009 mit der Neuerung des EEG (BMU 2008a). Um den seit 2007 anhaltend hohen Preisen von Agrarprodukten entgegenzuwirken (Ausschuss für Umwelt, Naturschutz und Reaktorsicherheit 2008b), wurde vom Bundesministerium der Bonus für Strom aus nachwachsende Rohstoffen erhöht und eine Anlage 2 erzeugt, in der die Ausschließlichkeit der nachwachsenden Rohstoffe gestrichen wurde (BMU 2008b). Das Bundesministerium erlaubte den Biogasanlagenbetreibern in Anlage 2 Bonus für Strom aus nachwachsenden Rohstoffen, einige nicht den nachwachsenden Rohstoffen zugehörige Substrate in Biogasanlagen einzusetzen (siehe Kapitel 1.1). Der „Gülle-Bonus“ wurde eingeführt, um die Direktausbringung unbehandelter Gülle auf Felder zu reduzieren (Ausschuss für Umwelt, Naturschutz und Reaktorsicherheit 2008a, b). Durch die Einführung eines LandschaftspflegeBonus sollte nach dem Änderungsantrag der Fraktionen CDU/CSU und der SPD des Ausschusses für Umwelt, Naturschutz und Reaktorsicherheit (Ausschuss für Umwelt, Naturschutz und Reaktorsicherheit 2008c) der Flächennutzungskonkurrenz entgegengewirkt werden. 2011 veröffentlichte das Bundesministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz Referat Öffentlichkeitsarbeit, Internet (BMELV 2011) eine Broschüre, die mit einigen Daten und Fakten über den Anbau von Nutzpflanzen in Deutschland im Jahre 2009 informierte. 2012 veröffentlichte die AEE die Daten von 2011. 1 EINLEITUNG 20 Tabelle 2: Belegung der landwirtschaftlich genutzten Flächen in Deutschland 2009 (BMELV 2011) und 2011 (AEE 2012) Verwendung Anteil in % 1 1 Anteil in Mio. ha 2 2009 2011 20091 20112 Futtermittel 60,3 57 10,2 9,6 Nahrungsmittel 26,3 28 4,4 4,6 Bioenergie 10,2 12 1,7 2 Stoffliche Nutzung 1,6 2 0,3 0,3 Brachflächen 1,6 2 0,3 0,2 Gesamtfläche 100 101 16,9 16,7 Quelle: BMELV, FNR, eigene Berechnungen des BMELV (2011); 2 Quelle: BMELV, FNR, eigene Berechnungen der AEE (2012), Prozentangaben gerundet Sowohl der Anbau von Nahrungsmitteln als auch von Energiepflanzen sind 2011 im Vergleich zu 2009 gestiegen, wobei der Anbau an Futtermitteln gesunken ist (Tabelle 2). Zuletzt wurde das EEG im Dezember 2011 (BMU 2011, Kapitel 1.1) mit der Intension geändert, dem Maisanbau und der Flächennutzungskonkurrenz entgegenzuwirken (BMU 2012). 1.5 Energie aus Biomasse Biomasse kann energetisch zum einen „traditionell“ und zum anderen „modern“ genutzt werden. Der Wissenschaftliche Beirat der Bundesregierung Globale Umweltveränderungen (WBGU) schreibt 2003 in seinem Bericht „Welt im Wandel: Energiewende zur Nachhaltigkeit“, dass nach Angaben der Weltbank zu diesem Zeitpunkt der Anteil traditioneller Biomassenutzung 7,2 % des globalen Primärenergieeinsatzes betrug. Als traditionelle Biomassenutzung bezeichnet der WBGU (2003) unter anderem den Einsatz von Brennholz, Holzkohle und Dung zum Kochen und Heizen in privaten Haushalten, was hauptsächlich in Entwicklungsländern angewendet wird. Die Verwendung traditioneller Biomasse hat einen schlechten Ruf als veraltete Energiequelle aufgrund ihrer Nachteile für Umwelt und Gesundheit. Unter energetisch nutzbarer moderner Biomasse versteht der WBGU folgende nachwachsende Komponenten: zum Zweck der Energiegewinnung angebaute ein- oder mehrjährige Energiepflanzen landwirtschaftliche Reststoffe (z. B. Stroh, Dung, Reisspelzen), soweit ohne Nährstoffverluste der Ackerböden verwertbar Waldrest- und Schwachholz, soweit es nicht aus ökologischen Gründen im Wald verbleiben muss oder aus ökonomischen Gründen anderweitig verwendet wird Industrierestholz und Gebrauchtholz (ebenfalls unter ökonomischen Restriktionen) 1 EINLEITUNG Die energetische Nutzung von Biomasse ist von den Eigenschaften der eingesetzten Bioenergieträger abhängig. Verschiedene Technologien zur „modernen“ Erzeugung von Wärme beziehungsweise Strom werden weiter entwickelt. Eine Technologie ist die Stromerzeugung durch Vergasung fester Biomasse sowie eine Kopplung mit der Wasserstoffwirtschaft, so der WBGU 2003. Landwirtschaftliche Biogasanlagen (Kapitel 1.5.1) zählen zu den Technologien, in denen feste aber auch flüssige Biomasse vergast wird und mit dem gebildeten Biogas Wärme und Strom erzeugt werden kann (Kapitel 1.5.1). 1.5.1 landwirtschaftliche Biogasanlagen Die ersten landwirtschaftlichen Biogasanlagen wurden nach dem zweiten Weltkrieg in Deutschland gebaut (de Graaf und Fendler 2010). Ab 1950 verbesserte sich jedoch die Versorgung mit Kohle und Öl stetig, welche wesentlich günstiger war, als die Produktion von Energie durch Vergärung von Biomasse. So wurde der Betrieb der Biogasanlagen (50-70 Anlagen in BRD und DDR) wieder eingestellt. Ab der ersten Ölpreiskriese in den 1970er Jahren lebte der Bau von landwirtschaftlichen Biogasanlagen erneut auf. Bis in die 1980er wurden mehrere Hofanlagen mit geringer Energieeffizienz und auf niedrigem technischem Niveau hauptsächlich auf viehwirtschaftlichen Höfen betrieben, bevor erste Forschungsinstitute auf den Forschungsbedarf aufmerksam wurden. Übermäßiges Ausbringen von Gülle ließ die Gewässer unter anderem durch Nitratbelastungen verschmutzen. Daher wurde ab Mitte der 1980er Jahre die Entwicklung der Vergärung von Gülleabfällen verstärkt. Erst 1990 erlangte der Betrieb von Biogasanlagen einen bedeutenden Stellenwert in der Energiegewinnung aus alternativen Ressourcen mit der Einführung des Stromeinspeisungsgesetzes (StrEG, BMU 1990, Kapitel 1.1). 21 1 EINLEITUNG 22 Abbildung 16: Entwicklung der Anzahl Biogasanlagen und der gesamten installierten elektrischen Leistung in Megawatt [MW]; ©Fachverband Biogas e. V., Stand: 06/2013; Druckerlaubnis von Dr. S. Rauh, Referatsleitung Landwirtschaft/ Referatsleitung Mitgliederservice des Fachverband Biogas e. V. vom 24.08.2012. Seit 1992 stieg die Anzahl an Biogasanlagen in Deutschland kontinuierlich an (Abbildung 16), nachdem 1991 das Stromeinspeisungsgesetz (StrEG, BMU 1990, Kapitel 1.1) in Kraft getreten war. Die Einführung des EEG im Jahr 2000 (BMU 2000, Kapitel 1.1) erhöhte den jährlichen Zuwachs an Biogasanlagen im Verhältnis zu den Vorjahren. Mit der Novellierung des EEG 2004 (BMU 2004, Kapitel 1.1) wurde die Zuwachsrate erneut und seit der Erlassung des neuen EEG 2009 (BMU 2008a, b, Kapitel 1.1) wuchs die Zahl der Biogasanlagen jährlich um etwa 1000 Anlagen. Im Jahr 2011 betrug die Anzahl an Biogasanlagen in Rheinland-Pfalz 114 Anlagen, bei einer installierten elektrischen Leistung von 45 MW (Fachverband Biogas e. V. 2012). Für 2012 und 2013 wird ein weiterer Anstieg der Anzahl an Biogasanlagen in Deutschland mit im Vergleich zu den Vorjahren geringerer Zuwachsrate prognostiziert (Abbildung 16). In dieser Arbeit wurde mit Proben aus landwirtschaftliche NawaRo-Biogasanalgen (Tabelle 18) gearbeitet. 1 EINLEITUNG Abbildung 17: Schema 23 einer landwirtschaftlichen Biogasanlage; Quelle: Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e. V. (FNR 2012a); Druckerlaubnis von der Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.V. (FNR) vom 27.08.2012. Als Gärsubstrate können in einer landwirtschaftlichen Biogasanlage nachwachsende Rohstoffe wie Energiepflanzen und Reststoffe (Kapitel 1.5.1.2) mit Gülle beziehungsweise Mist in einem Fermenter mit Gasspeicher zur Biogasherstellung verwendet werden (Abbildung 17, brauner Pfeil). Gebildetes Biogas wird aus dem Gasspeicher abgeleitet (Gelber Pfeil). Die Gärrückstände (vergorenes organisches Material) werden in einen Nachgärer transportiert, aus dem ebenfalls Biogas abgeleitet wird (Gelber Pfeil). Das Biogas wird entweder aufbereitet und ins Erdgasnetz eingespeist (blauer Pfeil) oder in einem Blockheizkraftwerk zu Strom umgewandelt (grüner Pfeil). Die Abwärme des Blockheizkraftwerkes kann sowohl für die Ställe, Wirtschaftsgebäude oder Wohnhäuser auf dem Hof als auch als Nahwärme genutzt werden (roter Pfeil). Die Gärrückstände können vom Energiewirt aus einem dem Nachgärer nachgeschalteten Gärrestlager landwirtschaftlich verwertet werden (Pfeil, orange). 1 EINLEITUNG Drei Bereiche greifen bei der Herstellung von Biogas ineinander: 1. die Verfahrenstechnik 2. die Auswahl des organischen Materials (Inputstoffe) 3. die mikrobielle Zusammensetzung Bei Ausfall einer dieser drei Bereiche kann kein Biogas produziert werden. 1.5.1.1 Verfahrenstechnik landwirtschaftlicher Biogasanlagen Die Verfahrenstechnik, mit der Biogas in Biogasanlagen gebildet wird, kann mit verschiedenen Merkmalen durchgeführt werden. Im Folgenden sind einige grundlegende Merkmale aufgezählt und erläutert (Eder und Schulz 2007). Die kontinuierliche oder diskontinuierliche Beschickung eines Fermenters unterscheidet sich darin, dass das zu vergärende Substrat gleichmäßig oder in zeitlichen Abständen in den Fermenter gebracht wird, je nachdem, ob das Substrat im Durchflussverfahren oder Batchverfahren vergoren werden soll. Im Batchverfahren wird so weit gegangen, dass dem Fermenter kein neues Substrat nach einer Füllung zugegeben wird, bis alles vergoren ist, um den Fermenter komplett zu entleeren, so dass er wiederholt neu gefüllt werden kann. Weiter kann die Mischung des zu vergärenden Substrats variieren zwischen volldurchmischt, längs durchströmt oder wenn es sich um Feststoff handelt Berieselung bzw. Perkolation. Die Prozessstufen können einstufig, sowie zwei- und auch mehrstufig ablaufen. Die Konsistenz des Substrats reicht von pumpfähig (Trocken Substanz (TS) -Gehalt bis 15 %) beim Nassverfahren bis breiig und stapelbar (TS-Gehalt ab 25 %) im Feststoffverfahren. Die Fermentertemperatur kann sowohl mesophil (30 °C bis 45 °C) als auch thermophil (45 - 55 °C) gewählt werden. Die Bauformen der Fermenter sind entweder liegend, also längs durchströmt oder stehend und voll durchmischt möglich. Als Baustoffe sind Beton, Stahl, Stahlblechwickel und Plattenbauweise einsetzbar. Die Fermenter Bauweisen der NawaRo-Biogasanalgen sind in Tabelle 18 aufgeführt, die Proben für diese Dissertation zur Verfügung gestellt haben. Die Entwicklungen der Verfahrenstechnik sind weit fortgeschritten. Es wird weiterhin an einer Optimierung gearbeitet. Der Energiewirt muss nach dem Bau einer Biogasanlage aus verschiedenen Inputstoffen die für die Bauweise seiner Anlage optimale Zusammenstellung wählen, um den größten Methanertrag zu erhalten. 1.5.1.2 Inputstoffe zur Biogasherstellung In Biogasanlagen wird organisches Material zu Biogas vergoren. Zu organischen Abfällen aus der Landwirtschaft zählen Rinder- und Schweinegülle sowie Geflügelmist (Görisch und Helm 2007). Des Weiteren sind Landwirtschaftliche Abfälle aus der Produktion (z. B. Getreidestroh, 24 1 EINLEITUNG 25 Rübenblatt oder Kartoffelkraut) zu Biogas vergärbar (Scherer et al. 2003). Auch agroindustrielle Abfälle (Scherer in Kämpfer und Weißenfels 2001), wie zum Beispiel Obst- und Gemüseschlempen, Obsttrester, Molke oder Ölsaatenrückstände können in einer Biogasanlage verwertet werden. Separat getrennte Bioabfälle aus privaten Haushalten eignen sich ebenfalls zur Biogasherstellung. Einen vom Abfall getrennten Bereich bilden die nachwachsenden Rohstoffe als Inputstoffe für Biogasanlagen. Als nachwachsende Rohstoffe werden, Mais, Zuckerrüben, Getreide, Sonnenblumen, Sudangras, Ackergräser, Wildpflanzen und seit kurzem die durchwachsene Silphie verwendet (FNR 2012b). Gülle zählt im Sinne des EEG (BMU 2008) zu den nachwachsenden Rohstoffen. 1 Abbildung 18: Biogasausbeuten unterschiedlicher Substrate. 1 GPS = Ganzpflanzensilage. Quelle: Biogas Leitfaden, FNR (2010), © FNR 2011 (FNR 2012a). Druckerlaubnis von der Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.V. (FNR) vom 27.08.2012. Von den nachwachsenden Rohstoffen werden vor allem Maispflanzen verwendet (Weiland 2007), da sie den höchsten Biogasertrag liefern (Abbildung 18). Durchschnittliche Gaserträge der durchwachsenen Silphie sind bisher nicht erhältlich, da sich der Anbau dieser Energiepflanze noch in der Entwicklung befindet (Wilken und Benke 2012). Die Inputstoffe der in dieser Arbeit beprobten NawaRo-Biogasanalgen sind in Tabelle 18 aufgeführt. 1 EINLEITUNG 26 Die mikrobielle Zusammensetzung im Fermenter spielt bei der Biogasgewinnung eine essentielle Rolle, neben der Optimierung der Technik und der Auswahl der Inputstoffe. Mikroorganismen machen die Herstellung von Biogas erst möglich. 1.5.1.3 Mikrobielle Zusammensetzung in landwirtschaftlichen Biogasanlagen Unterschiedliche Mikroorganismen aus verschiedenen Phyla werden benötigt, um Biogas herzustellen. Aus einem mesophilen Fermenter einer Biogasanlage (betrieben mit Schweinemist) wurden verschiedene Bakterien und Archaea unterschiedlicher Klassen, Phyla und Gattungen molekularbiologisch identifiziert (Liu. 2009). Tabelle 3: Prozentuale Verteilung der Mikroorganismen in einem mesophilen Biogasfermenter Verteilung der Mikroorganismen [%] Domäne der Bacteria Phylum Firmicutes Klasse Bacilli Klasse Clostridia 47,2 1,7 45,5 Phylum Spirochaetes 13,2 Phylum Fibrobacteres 2,1 Phylum Bacteroidetes 35,4 Phylum Proteobacteria 0,5 Phylum Planctomycetes 0,5 Phylum Verrucomicrobia 1,1 Domäne der Archaea Phylum Euryarchaeota Ordnung Methanomicrobiales 63,3 Genus Methanogenium 9,1 Genus Methanoculleus 29,0 Genus Methanospirillum 17,2 unbekannte Methanomicrobiales 8,0 Ordnung Methanosarcinales 36,7 Genus Methanosarcina 33,0 Genus Methanosaeta unbekannte Methanosarcinales 0,5 3,2 In der Domäne der Bakterien wurden 7 Phyla identifiziert, mit dem dominierendem Phylum Bacteroidetes und der dominierenden Klasse Clostridia (Tabelle 3). Bei den Archaea wurde 1 1 EINLEITUNG 27 Phylum identifiziert, das von der Ordnung Methanomicrobiales dominiert wurde. Die Gattung Methanoculleus trat in der Klasse Methanomicrobiales am häufigsten auf. In der Ordnung Methanosarcinales wurden von Liu et al. (2009) hauptsächlich Archaea der Gattung Methanosarcinales identifiziert. Molekularbiologische Identifizierungen methanogener Archaea aus Fermentern landwirtschaftlicher Biogasanlagen zeigten hauptsächlich Arten der Gattung Methanoculleus aus der Ordnung Methanomicrobiales (Klocke et al. 2008). Arten aus der Ordnung Methanosarcinales waren nicht in allen Fermentern anwesend (Nettmann et al. 2010). In einem mesophilen Laborfermenter (CSTR) wurden ein molekularbiologische Analyse der mikrobiellen Diversität durchgeführt (Klocke et al. 2007). dieser Laborfermenter fasste 8 L und wurde mit Futterrübensilage betrieben. Tabelle 4: Prozentuale Verteilung der Mikroorganismen in einem completely stirred tank reactor (CSTR, Klocke et al. 2007, Druckerlaubnis von Elsevier vom 25.08.2012) Zahl der OTU (operational taxonomic units) Zahl der 16S rDNA Klone Domäne der Bacteria Phylum Proteobacteria 8 (13,3 %) 35 (23,8 %) Klasse Clostridia 21 (35,0 %) 33 (22,4 %) Klasse Bacilli 11 (18,3 %) 32 (21,8 %) Phylum Actinobacteria 1 (1,7 %) 5 (3,4 %) Phylum Spirochaetes 2 (3,3 %) 2 (1,4 %) Phylum Bacteroidetes 13 (21,7 %) 31 (21,1 %) 4 (6,7 %) 9 (6,1 %) Phylum Firmicutes Domäne der Archaea Phylum Euryarchaeota Während wie im Fermenter (Tabelle 3) bei den Archaea 1 Phylum molekularbiologisch identifiziert wurde, befanden sich Vertreter aus 5 bakteriellen Phyla im CSTR (Tabelle 4). In der Studie von Klocke et al. (2007) wurden keine Bakterien der Ordnung Syntrophobacteriales identifiziert, wohingegen im Granulat eines mit Saccharose und kurzkettigen Fettsäuren betriebener Laborfermenter Syntrophobacteriales identifiziert worden sind (Harmsen et al. 1996). In einer weiteren Studie wurde ein 200 L Tank mit Gülle abwechselnd mit Casein, Stärke und Rahm betrieben und die bakterielle Diversität molekularbiologisch bestimmt. In dieser Studie wurden, vergleichbar mit den Ergebnissen von Liu et al. (2009, Tabelle 3) hauptsächlich Bacteroidetes und Firmicutes molekularbiologisch identifiziert, wobei wenige acetogene Bakterien identifiziert wurden (Kampmann et al. 2012a). Bei der molekularbiologischen Identifikation der methanogenen Archaea ermittelten Kampmann et al. (2012b) 1 EINLEITUNG 28 Methanobrevibacter aus der Ordnung Methanobacteriales und Methanospirillum aus der Ordnung Methanomicrobiales als dominierende Gattungen. Der Vorgang der Biogasherstellung ist sehr komplex (Schattner und Gronauer 2000). Insbesondere, weil verschiedene Mikroorganismen unterschiedliche Generationszeiten haben können. Die Generationszeit g wird berechnet, indem die Teilungsrate durch 1 geteilt wird (Steinbüchel und Oppermann-Sanio 2003). = 1 Formel 1: Beziehung der Generationszeit g mit der Teilungsrate . Die Teilungsrate ist definiert als die Anzahl der Zellteilungen pro Stunde einer exponentiell wachsenden Kultur. Eine Zellteilung bedeutet eine Verdopplung. Daraus resultiert, dass eine Zellzahl N berechnet werden kann, indem die ursprüngliche Zellzahl N0 mit 2 mit der Anzahl der Generationen n als Exponent multipliziert wird (Madigan et al. 2000). = N = Zellzahl 2 N0 = ursprüngliche Zellzahl n = Anzahl der Generationen Formel 2: Berechnung einer Zellzahl N. Wenn die Anzahl der Generationen n unbekannt ist, ergibt sich für die Berechnung der Teilungsrate folgende Gleichung: = n = Anzahl der Zellteilungen = ln ln ln 2 ( ) N0 = ursprüngliche Zellzahl N = Zellzahl t = Zeitpunkt mit Zellzahl N t0 = ursprüngliche Zeit Formel 3: Berechnung der Teilungsrate . Die Generationszeiten von Mikroorganismengruppierungen, die theoretisch bei der Bildung von Biogas unter anderem auch in landwirtschaftlichen Biogasanlagen beteiligt sein können, sind in der folgenden Tabelle aufgeführt. Die Generationszeiten der unten aufgeführten Mikroorganismengruppen in landwirtschaftlichen Biogasanlagen sind bisher nicht bekannt. 1 EINLEITUNG 29 Tabelle 5: Generationszeiten [h] verschiedener Mikroorganismengruppen (Weiland 2001) Mikroorganismengruppe Generationszeit [h] Hydrolytische und acidogene Bakterien Bacterioides < 24 Clostridien 24 - 36 Acetogene Bakterien Syntrophobacter Syntrophomonas 40 - 60 72 - 132 Methanogene Archaea Methanobacterium 12 - 60 Methanosarcina 120 – 360 Methanococcus/ Methanosaeta 240 Limitierend für die Biogasherstellung können dabei die teilweise langen Generationszeiten der methanogenen Archaea (Tabelle 5) wirken, welche letztendlich Methan aus dem gebildeten CO2 und H2 beziehungsweise Acetat herstellen (Görisch und Helm 2007). Im folgenden Kapitel werden die komplex miteinander verschachtelt interagierenden Mikroorganismen während der Bildung von Biogas in landwirtschaftlichen Biogasanlagen theoretisch und in den Kapiteln 5.2, 5.5 sowie 5.6 mit Ergebnissen aus dieser Arbeit erläutert. 1.5.2 Die Bildung von Biogas aus organischem Material in landwirtschaftlichen Biogasanlagen Die Biogasbildung wird in vier Stufen unterteilt (Kaltschmitt und Hartmann 2001, Braun 1982, Kloss 1986), welche Hydrolyse, primäre Fermentation, sekundäre Fermentation und Methanogenese genannt werden. Auch die Bildung von Biogas erfolgt in landwirtschaftlichen Biogasanlagen stufenweise nach dem gleichen Schema. 1 EINLEITUNG 30 Polysaccharide, Proteine, Fette Hydrolyse Hydrolytische Bakterien Hydrolyse Monosaccharide, Aminosäuren, Fettsäuren, Glycerin Acidogenese Primäre Fermentation Acidogene Bakterien Propionat, Butyrat, Alkohole Acetogenese Sekundäre Fermentation Acetogene Bakterien Acetogenese H2, CO2 Acetat Acetatoxidation Methanogenese Methanogenese Methanogene Archaea CH4 + CO2 Abbildung 19: Schematische Darstellung der stufenweise ablaufenden Biogasherstellung.; links: mikrobielle Stoffwechselbezeichnungen; mittig: der Prozessname (grau unterlegt), ausgewählte Stoffwechselprodukte und mikrobielle Stoffwechselbezeichnungen auf der Stufe der Acetogenese/ sekundären Fermentation; rechts: Verantwortliche Bakteriengruppen. Die folgenden Kapitel 1.5.2.1 bis 1.5.2.4 behandeln die Stufen der Herstellung von Biogas im Einzelnen. 1.5.2.1 Hydrolyse Während der enzymatischen Hydrolyse wird polymeres, organisches Material zu dessen Monomeren zersetzt. Dabei werden Wassermoleküle in Hydroxidionen und Wasserstoffionen gespalten und mit den Spaltstücken verbunden. Diese Reaktion katalysieren Hydrolasen. 1 EINLEITUNG 31 Hydrolase RX + H2O ROH + HX Formel 4: allgemeine Reaktionsgleichung für eine enzymatisch katalysierte Hydrolyse. Von Bakterien werden zum Abbau von Polysacchariden, beispielsweise Cellulose und Stärke, Cellulasen und Amylasen, von Proteinen Proteasen und von Fetten Lipasen gebildet. Diese Enzyme kommen extrazellulär zum Einsatz. Einige anaerob Cellulose abbauende Mikroorganismen besitzen Cellulosome (Flint et al. 2008, Ölschläger 2007, Schwarz 2001). Cellulosome sind multienzyme Proteincomplexe, die für effiziente Degradation von Cellulose sorgen (Bayer et al. 1994). Ein Cellulosom besteht aus einem Gerüstprotein mit Cohesinen, die mit Dockerinen interagieren. Diese Dockerine sind mit Linkern verbunden, an denen katalytische Domänen zum Abbau von unter anderem Cellulose befestigt sind. Sie bieten den Mikroorganismen den Vorteil, dass die gebildeten Monomere direkt vom Mikroorganismus verwertet werden können, haben allerdings den Nachteil, dass die Mikroorganismen direkt auf den Polysacchariden sitzen müssen. Bei verschiedenen Clostridien wurden Cellulosome identifiziert: Clostridium cellulovorans (Kosugi et al. 2001, Murashima et al. 2002, Park et al. 2001), Clostridium thermocellum (Arai et al. 2001), Clostridium josui (Jindou et al. 2002), Clostridium thermocellum (Prates et al. 2001), Clostridium acetobutylicum (Nölling et al. 2001) und Clostridium cellobioparum (Lamed et al. 1987). Auch Butyrivibrio fibrisolvens ist befähigt, Cellulose mit Hilfe eines Cellulosoms abzubauen (Berger et al. 1990). Weitere Kandidaten mit Cellulosome als Adhäsionsapparate sind Ruminococcus albus (Miron et al. 2001b, Ohara et al. 2000) sowie Ruminococcus flavefaciens (Ding et al. 2001, Martin et al. 2001, Miron et al. 2001a, Rincón et al. 2003, 2004 und 2005). Bei Fibrobacter succinogenes wurden Zellfortsätze bei der Adhäsion des Mikroorganismus an Oberflächen beobachtet (Huang und Forsberg 1990), wobei der Nachweis einer Beteiligung eines Cellulosoms noch aussteht (Miron et al. 2001b). Unter anaeroben Pilzen existieren Spezies, die Cellulosom-artige Gebilde zur Adhäsion ausbilden (Béguin und Lemaire 1996, Chen et al. 1995, Dalrymple et al. 1997, Tsai et al. 2003). Polysaccharide (insbesondere Cellulose), Proteine und Fette werden in Oligo- bis Monosaccharide, Aminosäuren, Glycerin und langgettige Fettsäuren enzymatisch gespalten. Klocke et al. (2009b, 2007) wies in landwirtschaftlichen Biogasanlagen häufig Vertreter der Klassen Bacteroidetes, Clostridia, seltener der Spirochaetes, der Flavobacteria und der Proteobacteria molekularbiologisch nach. Zu den Klassen Bacteroidetes und Clostridia zählen bekannte Vertreter des anaeroben Abbaus langkettiger organischer Verbindungen, während Proteobacteria nachgeordnete Reaktionen wie die Umwandlung kurzkettiger Polysaccharide vollziehen (Boone et al. 2001). Flavobacteria hingegen sind bedeutende Destruenten organischer Biomasse in aquatischen Systemen (Kirchman 2002). Die Hydrolyse läuft gleichzeitig mit der Acidogenese ab (siehe Kapitel 1.5.2.2). 1 EINLEITUNG 32 1.5.2.2 Primäre Fermentation Primäre Fermentation bedeutet, dass die Mikroorganismen Energie erzeugen, die Stoffwechselwege also einen jeweils energetisch exergonen Ablauf haben. Die primäre Fermentation wird oft auch Acidogenese genannt. Beim Vorgang der Acidogenese werden Zucker, Aminosäuren und langkettige Fettsäuren beispielsweise von Bakterien der Gattungen Clostridium, Acetivibrio, Bacterioides und Butyrivibrio intrazellulär zu kurzkettigen Carbonsäuren wie Propionsäure (Kapitel 1.7.1), Buttersäure, Valeriansäure und Milchsäure vergoren und dabei Energie gewonnen. Bei der primären Fermentation entstehen auch Alkohole, Aldehyde, Essigsäure, Ameisensäure, Kohlenstoffdioxid können Wasserstoff bereits nach und dieser Kohlenstoffdioxid. Stufe sowohl Wasserstoff von und hydrogenotrophen methanogenen Archaea zu Methan (Kapitel 1.9.1.1.1) als auch von homoacetogenen Bakterien zu Essigsäure (Kapitel 1.8) umgesetzt werden. Einige hydrogenotrophe methanogene Archaea können auch Ameisensäure zu Methan verwerten (Kapitel 1.9.1.1.1). Die Essigsäure können acetoklastische methanogene Archaea verwenden, um Methan herzustellen (Kapitel 1.9.1.1.2). 1.5.2.3 Sekundäre Fermentation Die Bezeichnung sekundäre Fermentation bedeutet, dass die ablaufenden Stoffwechsel energetisch endergon sind. Das heißt, dass Energie dem Stoffwechsel zugeführt werden muss, um das Endprodukt zu bilden. Die sekundäre Fermentation wird auch Acetogenese genannt, da syntrophe Bakterien die in der primären Fermentation (Kapitel 1.5.2.2) gebildeten kurzkettigen Carbonsäuren Buttersäure, Propionsäure (Kapitel 1.7.2), Valeriansäure und Ameisensäure, Aminosäuren und Alkohole weiter zu Essigsäure oxidieren. Syntrophe Bakterien unterschiedlicher Gattungen wurden bisher identifiziert: Syntrophomonas, Syntrophobacter, Syntrophospora, Thermoanaerobium, Syntrophus, Syntrophobotulus, Thermosyntropha, Sporotomaculum, Thermoacetogenium, Pelobacter, Pelotomaculum, Desulfovibrio, Smithella und Clostridium. Wasserstoff und Kohlenstoffdioxid sind bei der sekundären Fermentation ebenfalls Produkte. Der gebildete Wasserstoff muss abgebaut werden, da bei zu hohem Wasserstoffpartialdruck die syntrophen Oxidationen endergon sind (Abbildung 20, Harper und Pohland 1986). Überwiegend hydrogenotrophe methanogene Archaea verbrauchen den gebildeten Wasserstoff (Kapitel 1.9.1.1.1). Die Kombination der syntrophen Oxidation und des Abbaus des Wasserstoffpartialdrucks wird Inter-Spezies-Wasserstoff-Transfer (Schink und Stams 2006) oder reverser Elektronentransport (Abbildung 25, Stams und Plugge 2009) genannt. Der Wasserstoff kann auch von homoacetogenen Bakterien zu Essigsäure (Kapitel 1.8) umgesetzt werden. Homoacetogene Bakterien produzieren auch Essigsäure aus Wasserstoff und Kohlenstoffdioxid (Kapitel 1.8). Die Essigsäure wird als Substrat von acetoklastischen methanogenen Archaea der Gattung Methanosarcina und Methanosaeta verwendet, um Methan 1 EINLEITUNG herzustellen (Kapitel 1.9.1.1.2). Gebildeter Wasserstoff und Kohlenstoffdioxid, fungieren hydrogenotrophen methanogenen Archaea (Kapitel 1.9.1.1.1) auch bereits während der sekundären Fermentation als Substrate für die Methanogenese (Kapitel 1.9.1.1). Einige Archaea der Gattung Methanobacterium verwerten auch Ameisensäure zur Methanbildung. Der durch die Methanogenese niedrig gehaltene Wasserstoffpartialdruck während der Methanogenese, wird von sekundär fermentierenden Bakterien benötigt, um den endergonen Abbau von Propionsäure (Kapitel 1.7.2), Valeriansäure, Buttersäure und Ameisensäure zu Essigsäure in großem Maß durchführen zu können. Wird der Wasserstoffpartialdruck nicht unter 9,2 Pa (Gourdon und Vermande 1987) oder 10-4 atm (Abbildung 20, Harper und Pohland 1986) gehalten, kommt es zur Anreicherung der Carbonsäuren beginnend mit Propionsäure, was die Methanogenese durch den absinkenden pH-Wert hemmt (< pH 7). Damit kommt der gesamte Prozess der Methanproduktion zum Erliegen. Man spricht hier von einer „Versäuerung“ des Fermenters (Kapitel 1.7). 1.5.2.4 Methanogenese Mackie und Bryant veröffentlichten 1981, dass Methan zu 70 % aus Acetat (acetoklastisch) und zu 30 % aus Wasserstoff und Kohlenstoffdioxid (hydrogenotroph) bei der Fermentation von verdünnten Milchkuh Fäkalien im Labormaßstab gebildet wird (Mackie und Bryant 1981, Ahring 2003). Diese Werte wurden zur Regel für die Klärschlammvergärung (Lettinga 1995) übernommen. In diesen Fermentern herrschen typischerweise lange Verweilzeiten (bis zu 70 d) der Mikroorganismen und eine vergleichsweise geringe Acetatbelastung (Bauer et al. 2009). In landwirtschaftlichen Biogasanlagen siedeln sich ebenfalls einige Arten methanogener Archaea an. In diesen Fermentern wurden zu einem hohen Anteil hydrogenotroph methanbildenden Archaea molekularbiologisch detektiert (Nettmann et al. 2010, Zhu et al. 2011). Bei noch höheren Raumbelastungen, wurden keine acetoklastischen Methanogenen nachgewiesen (Bauer et al. 2008, Lebuhn et al. 2008a). Ebenfalls keine acetoklastischen Archaea, sondern nur hydrogenotrophe Archaea wurden in versäuerten Fermentern nachgewiesen (Lebuhn et al. 2008b). Eine mögliche Erklärung ist, dass nicht Methan bildende Acetatoxidierer den Abbau des Acetats in Abwesenheit von acetoklastisch methanbildenden Archaea (Karakashev et al. 2006, Schnürer et al. 1999) beziehungsweise bei hohen Ammoniumkonzentrationen (Schnürer et al. 1994) übernehmen. Der biochemische Ablauf der Methanogenese wird in Kapitel 1.9.1.1 ausführlich behandelt. Da Biogas nur im Zusammenspiel unterschiedlicher Mikroorganismen gebildet wird, entstehen neben den Methanogenese-Produkten Methan, Kohlenstoffdioxid und Wasser auch andere Endprodukte, was im folgenden Kapitel 1.5.2.5 erläutert wird. 33 1 EINLEITUNG 34 1.5.2.5 Zusammensetzung des Biogases Die Bildung von Biogas ist ein anaerober, mikrobieller Prozess, der in der Natur ein weit verbreiteter Mechanismus ist (siehe dazu Kapitel 1.9.1). Dieser Prozess wird sich zur alternativen Energiegewinnung zu Nutze gemacht. Biogas entsteht bei der mikrobiellen Vergärung organischer Masse. Die Zusammensetzung von Biogas wird in der folgenden Tabelle 6 dargestellt. Tabelle 6: Durchschnittliche Zusammensetzung von Biogas aus einer Biogasanlage nach Eder und Schulz 2007 (Berechnung nach Boyle 1977 und Buswell 1939): Bestandteil Konzentration Methan (CH4) Kohlenstoffdioxid (CO2) 40-75 % 25-55 % Wasser (H2O) 0-10 % Schwefelwasserstoff (H2S) 50-5000 ppm Stickstoff (N2) 0-5 % Sauerstoff (O2) 2% Wasserstoff (H2) 0-1 % Schwefelverbindungen werden gleichzeitig in der Stufe der Methanogenese mikrobiell zu Schwefelwasserstoff (Dihydrogensulfid) umgesetzt (Polster et al. 2006). Dabei werden anorganische sowie organische Sulfatverbindungen zu Schwefelwasserstoff mit Wasserstoff anaerob reduziert. Diese Reduktion von Sulfatverbindungen wird von Sulfatreduzierern zur Energiegewinnung genutzt und wird dissimilatorische Sulfatreduktion genannt (Madigan et al. 2000). Oftmals koppeln Sulfatreduzierer die Reduktion von Sulfat an die Oxidation von Aminosäuren (zum Beispiel Desulfovibrio aminophilus, Tabelle 33) oder kurzkettigen Fettsäuren (beispielsweise Desulfovibrio oxamicus, Tabelle 41). Eine weitere Gruppe von Sulfatreduzierern oxidiert Acetat zu Kohlenstoffdioxid. Am Beispiel eines desulfurizierenden Bakteriums Desulfobacter sp. ist die Reduktion von Sulfat (SO42-) mit Acetat (3HC-COO-) und Wasserstoff ([H+]) als Elektronendonor zu Kohlenstoffdioxid (CO2), Dihydrogensulfid (H2S) und Wasser (H2O) von Madigen et al. (2000) beschrieben. Es folgt die Reaktionsgleichung mit der Kinetik ( G0‘). 3HC-COO + SO42- + 3 [H+] CO2 + H2S + H2O G0‘ = -57,5 kJ Reaktion-1 Formel 5: Reduktion von Sulfat durch Desulfobacter sp. mit freier Enthalpie G0‘. Mit dem Verbrauch von Wasserstoff steht die Sulfatreduktion hydrogenotrophen Methanogenese, wohingegen der gebildete in Konkurrenz zur Kohlenstoffdioxid von hydrogenotrophen methanogenen Archaea zur Methanbildung eingesetzt werden kann. Durch die Oxidation von Acetat zu Kohlenstoffdioxid kann Acetat nicht von acetoklastischen 1 EINLEITUNG 35 methanogenen Archaea verwendet werden. Jedoch die Bildung von Acetat aus der unvollständigen Oxidation von Aminosäuren oder kurzkettigen Fettsäuren ermöglicht den acetoklastischen methanogenen Archaea die Methanogenese. Ein zu hoher Gehalt von Schwefelwasserstoff in der Flüssigphase der Fermenter kann auf die methanogenen Archaea giftig wirken. In Abwässern wurde ermittelt, dass methanogene Archaea von 50 mg L-1 (13.000 ppm, Kroiss und Wabnegg 1982) bis zu 300 mg L-1 (60.000 ppm, Verink 1988) Schwefelwasserstoff beeinträchtigt werden. Diese Konzentrationen von Schwefelwasserstoff werden allerdings in NawaRo-Biogasfermentern nicht erreicht, da die Konzentration des löslichen Schwefelwasserstoffs in der Flüssigphase mit steigendem pH und steigender Temperatur sinkt (Polster et al. 2006). Ein Problem stellt der Gehalt von Schwefelwasserstoff erst im Biogas dar, wenn das Gas im AKW verbrannt oder ins Erdgasnetz eingespeist werden soll. Bei der Verbrennung von Dihydrogensulfid entsteht Schwefeldioxid, was ebenfalls giftig ist. Außerdem wirken sowohl Schwefelwasserstoff als auch Schwefeldioxid korrosiv, was den Motor beziehungsweise Gasrohre schädigt. Die Bildung von Dihydrogensulfid kann nicht unterdrückt werden, da auch die Methanogenese beeinträchtigt wird (Polster et al. 2006). Der Schwefelwasserstoffgehalt wird entweder im Fermenter niedrig gehalten, indem in der Flüssigphase gelöster Schwefelwasserstoff mit Eisensalzen zu elementarem Schwefel beziehungsweise Eisensulfid reagiert und ausgefällt (Urban et al. 2009). Dem Fermenter nachgeschaltet kann ein Biowäscher als biologisches Verfahren eingesetzt werden. Dabei wird der Schwefelwasserstoff aus dem Rohgas in leicht alkalischem Wasser gelöst und in einen Bioreaktor überführt, in dem Schwefelbakterien wie Thiobacillus und Sulfolobus das Dihydrogensulfid zu elementaren Schwefel beziehungsweise Schwefelsäure unter Anwesenheit von Sauerstoff umsetzen. Ebenfalls können dem Waschwasser Eisensalze zugegeben werden und zur Feinentschwefelung Aktivkohlefilter nachgeschaltet werden. Von einer Sauerstoffbelüftung des Rohgases raten Urban et al. 2009 ab, da der ebenfalls eingelagerte Stickstoff die Gasaufbereitung verteuere. Um die in Tabelle 6 aufgelistete Zusammensetzung des mikrobiell gebildeten Biogases zu erhalten, muss polymeres organisches Material zu Acetat, Formiat, Kohlenstoffdioxid und Wasserstoff abgebaut werden. Werden die Zwischenprodukte kurzkettige Fettsäuren und Aminosäuren nicht zu für methanogene Archaea verwertbare Substrate umgewandelt, tritt die Versäuerung ein. Dabei spielt die Propionsäure (Kapitel 1.7) eine wichtige Rolle, da sie anaerob nur endergon von syntrophen Mikroorganismen (Kapitel 1.7.2) abgebaut werden kann. Es folgt eine kurze Vorstellung der Propionsäure mit Erläuterungen über dessen industrielle Verwendung abseits der Herstellung von Biogas. 1 EINLEITUNG 36 1.6 Propionsäure und seine Verwendung Propionsäure (Propansäure) wurde als erstes von Johann Gottlieb (1844) beschrieben und hergestellt. Propionsäure ist eine natürliche Carbonsäure mit der chemischen Formel CH3CH2COOH und eine klare, stark riechende Flüssigkeit. Das Anion CH3CH2COO , wie auch die Salze und Ester sind bekannt als Propionat. Arpe (2007) schrieb, dass die industrielle Herstellung von Propionsäure (CH3CH2COOH) hauptsächlich durch eine Nickelcarbonyl-katalysierte Hydrocarboxylierung (Reppe- Carbonylierung) von Ethen (H2C=CH2) durchgeführt wird, was die folgende Reaktionsgleichung zeigt. NiC4O4 H2C=CH2 + H2O + CO CH3CH2COOH Formel 6: Nickelcarbonyl-katalysierte Hydrocarboxylierung von Ethen (Reppe-Carbonylierung). Die oben aufgeführte Reaktion (Formel 6) wird bei Drücken von 200 bis 240 bar und Temperaturen von 270 bis 320 °C durchgeführt, weil Kohlenstoffmonoxid nur bei diesen Bedingungen chemisch umgesetzt wird. Ebenfalls wird Propionsäure durch aerobe Oxidation von Propionaldehyd (CH3CH2CHO) chemisch hergestellt. In Anwesenheit von Cobalt- oder Manganionen, läuft die folgende Reaktion bei 40-50 °C ab. CH3CH2CHO + ½ O2 CH3CH2COOH Formel 7: aerobe Oxidation von Propionaldehyd. Propionsäure entsteht außerdem als Nebenprodukt bei der industriellen Herstellung von Essigsäure. Propionsäure wird ebenfalls als Intermediat zur Produktion verschiedener Polymere verwendet, wie zum Beispiel Cellulosepropionat oder Vinyl-Propionat (Arpe 2007). Propionsäureester haben einen blumigen Geruch und werden daher als Zusätze in Riechstoffen, Aromastoffen und Lösungsmitteln verwendet. Propionsäure wird biologisch als Coenzym A-Ester, Propionyl-CoA, beim Abbau von Zuckern und Aminosäuren gebildet. Beispielsweise produzieren Bakterien des Genus Propionibacterium oder einige des Genus Clostridium Propionat als Endprodukt ihres anaeroben Stoffwechsels (siehe Kapitel 1.7.1). Diese Bakterien sind hauptsächlich im Verdauungstrakt zu finden. Aber auch auf der Haut siedeln sich diese Bakterien an und sind maßgeblich für den sogenannten „Schweißgeruch“ verantwortlich. Propionsäure bildende Bakterien werden bei der Käseherstellung eingesetzt (Lück und Jager 1995). Propionsäure inhibiert das Wachstum verschiedener Pilz und einiger Bakterien ab 0,1 % (w/v). Daher wird Propionsäure oft als vorbeugender Futterzusatz gegen Ketoazidose bei Milchvieh eingesetzt und Propionat wird als 1 EINLEITUNG 37 Konservierungsstoff in Backwaren verwendet (Lück und Jager 1995). In Biogasfermentern ist übermäßig angereicherte Propionsäure unerwünscht, aufgrund des energetisch ungünstigen Abbaus im anaeroben Umfeld. 1.7 Propionsäure in Biogasfermentern Propionsäure ist mit anderen kurzkettigen organischen/flüchtigen (Fett)Säuren ein Zwischenprodukt während der Biogasherstellung in Biogasfermentern (Kapitel 1.5.2.5). Bei dem Start eines Biogasfermenters zum Beispiel mit Biomüll findet kurzfristig eine starke Akkumulation von Propionsäure statt, was den Neustart einer Anlage zu einem kritischen Vorgang werden lässt (Gallert und Winter 2008). Ebenfalls Überfütterung des Fermenters mit zum Beispiel Glukose hat eine inhibierende Wirkung auf die Biogasproduktion aufgrund der Akkumulation von flüchtigen Fettsäuren wie Propionsäure (Marchaim und Krause 1993). Ist der Säuregehalt in den Fermentern zu hoch, also der pH-Wert unter 5, kommt es zu einer Störung in der Biogasherstellung, da methanogene Archaea unter diesem pH-Wert kein Methan bilden. Die Problematik an einem zu hohen Gehalt von Propionsäure ist, dass der anaerobe Abbau von Propionsäure endergon ist. Daher kann diese Reaktion nur bei einem Wasserstoffpartialdruck unter 9,2 Pa (Gourdon und Vermande 1987) beziehungsweise circa 10-4 atm (Abbildung 20, Harper und Pohland 1986) ablaufen (siehe auch Kapitel 1.7.2). 1 EINLEITUNG Abbildung 20: Energetisches Fenster des anaeroben Abbaus von Propionsäure durch syntrophe Bakterien (türkises Dreieck); braun, Oxidation von Propionsäure zu Acetat; graugrün, Oxidation von Buttersäure zu Acetat; violett, Ethanol zu Acetat; rot, Lactat zu Acetat; hellblau, acetogene Respiration von Kohlenstoffdioxid (CO2); schwarz, methanogene Respiration von CO2; hellgrün, Respiration von Sulfat zu Sulfid; grün, Respiration von Sulfit zu Sulfid; schwarze Striche, methanogene Spaltung von Acetat; graue Striche, Spaltung von Acetat durch sulfatreduzierende Bakterien; Konzentrationen: Acetat, 25 mmol L-1; Propionsäure, Buttersäure, Lactat und Ethanol, 10 mmol L-1; Sulfat und Sulfit, 5 mmol L-1; CO2, 20 mmol L-1; Methan, 0,7 atm; nach Harper und Pohland (1986); Druckerlaubnis von John Wiley and Sons vom 24.08.2012. Die Werte des Wasserstoffpartialdrucks zwischen circa 10-4 bis knapp über 10-6 atm (Abbildung 20) bestätigt den von Gourdon und Vermande (1987) ermittelte Höchstwert des Wasserstoffpartialdrucks von 9,2 Pa, bei dem Propionsäure syntroph abgebaut werden kann. Daher ist es wichtig die flüchtigen Fettsäuren, insbesondere Propionsäure permanent zu kontrollieren (Nielsen et al. 2007), um für eine maximale Biogasproduktion im Rahmen der optimalen Konzentration von flüchtigen Fettsäuren zu bleiben (Amani et al. 2011) und möglichst schnell gegen eine drohende Akkumulation wirken zu können (Nielsen et al. 2007). Die anaerobe Bildung von Propionsäure durch Bakterien mit Erläuterung der Stoffwechselwege wird im folgenden Kapitel 1.7.1 beschrieben, bevor Wege des syntrophen Abbaus von Propionsäure in Kapitel 1.7.2 besprochen werden. 38 1 EINLEITUNG 39 1.7.1 Mikrobielle anaerobe Bildung von Propionsäure Je nach Bakterienart wird Propionsäure (CH3-CH2-COO-) anaerob aus Glukose (C6H12O6), Lactat (H3C-CHOH-COO-), Glycerin (H5C3-O3-H3), Succinat (-OOC-CH2-CH2-COO-) und verschiedenen Aminosäuren, wie Methionin, Cystein, Glutamat, Serin, Alanin und Threonin gebildet. Die anaerobe Bildung von Propionsäure ist ein Teil der primären Fermentation (Abbildung 19). Es sind drei verschiedene mikrobielle anaerobe Stoffwechselwege bekannt: Der MethylmalonylCoA-Weg (Rosner und Schink 1990), der Acrylyl-CoA-Weg (Johns 1952) und die SuccinatDecarboxylierung (Hilpert et al. 1984). Die folgende Reaktionsgleichung (Seeliger et al. 2002) zeigt den anaeroben Umsatz anhand des Lactats zu Propionat und Acetat der beiden erst genannten Stoffwechselwege. 3 H3C-CHOH-COO- 2 H3C-CH3-COO- + H3C-COO- + CO2 + H2O G°’ = -170 kJ 3 mol-1 Lactat Formel 8: Stöchiometrische Reaktionsgleichung des Methylmalonyl-CoA- und des Acryloyl-CoAWegs mit freier Enthalpie G°’ des Methylmalonyl-CoA-Wegs aus Lactat. Die Succinat-Decarboxylierung läuft mit der folgenden Gesamtgleichung ab (Janssen et al. 1996), wobei Succinat zu Acetat decarboxyliert wird: - OOC-H2C-CH2-COO- + H2O H3C-CH3-COO- + HCO3- G°’ = -20,6 kJ mol-1 Succinat Formel 9: Stöchiometrische Reaktionsgleichung mit freier Enthalpie G°’ der Succinat- Decarboxylierung. Selenomonas ruminantium (Bryant 1956, Paynter und Elsden 1970) und Selenomonas acidaminovorans bilden ebenfalls Propionat aus Monosaccariden oder Aminosäuren, wobei Selenomonas acidaminovorans (Guangsheng et al. 1992) Succinat zu Propionat über - Ketoglutarat decarboxyliert. In den folgenden Kapiteln 1.7.1.1 bis 1.7.1.3 werden die drei oben genannten Stoffwechselwege der Bildung von Propionsäure erläutert. 1 EINLEITUNG 1.7.1.1 Methylmalonyl-CoA-Weg Propionibacterium spp. (Allen et al. 1964, Leaver et al. 1955), Propionispira arboris (Schink et al. 1982, Thompson et al. 1984), Veillonella atypica, (Galivan und Allen 1968) und Veillonella parvula (Prévot 1933, Ng und Hamilton 1971, Veillon und Zuber 1898, Gronow et al. 2010) bilden aus Lactat über den Methylmalonyl-CoA-Weg Propionsäure, wobei Veillonella eine membrangebundene Methylmalonyl Coenzym A Decarboxylase besitzen und bei der Decarboxylierung einen Natriumgradienten aufbauen (Hoffmann et al. 1989). Durch den Aufbau des Gradienten wird keine Energiekonservierung in Form von ATP benötigt (Denger und Schink 1992). Anaerovibrio lipolyticus fermentiert Glycerol (Hobson 1965, Hungate 1966) und Arachnia propionica Glukose zu Propionsäure (Allen und Linehan 1977, Pine und George 1969). Bacteroides fragilis (Macy et al. 1978) bildet Propionsäure aus Ethanol und CO2. Pelotomaculum thermopropionicum (Imachi et al. 2002) bildet in Reinkultur Acetat und Propionsäure aus Pyruvat und Ethanol über den Methylmalonyl-CoA-Weg und oxidiert Propionsäure in Co-Kultur mit methanogenen Archaea über die in Abbildung 21 gezeigten Zwischenprodukte zu Acetat und Kohlenstoffdioxid (Kosaka et al. 2006). Pelobacter propionicus (Schink 1984) bildet Propionsäure aus Ethanol über den Methylmalonyl-CoA Weg (Schink et al. 1987). Desulfobulbus propionicus bildet und oxidiert Propionsäure ebenfalls über diesen Weg. (Stams et al. 1984). Durch Propionibakterien werden Glukose oder drei Lactat zu zwei Teilen Propionat und zu einem Teil Acetat über den Methylmalonyl-CoA-Weg (Succinyl-Propionyl-CoA-Weg, Allen et al. 1964) umgesetzt. Das folgende Schema zeigt den Stoffwechselweg, was darauffolgend erläutert wird. 40 1 EINLEITUNG 41 Abbildung 21: Schematische Darstellung des Methylmalonyl-CoA-Wegs mit Glukose in Propionibakterien; 1 Glycolyse; 2 Pyruvat Kinase; 3 Pyruvat Dehydrogenase; 4 Phosphotransacetylase; 5 Acetyl Kinase; 6 Methylmalonyl-CoA-Pyruvat-Transcarboxylase; 7 Malat Dehydrogenase; 8 Fumarase/ (S)-Malat Hydrolyase; 9 Fumarat Reduktase; 10 PropionylCoA-Transferase; Racemase; 13 11; (R)-Methylmalonyl-CoA Lactat ADP = Adenosindiphosphat; Dehydrogenase; Isomerase; (R)-Methylmalonyl-CoA CoASH = freies ATP = Adenosintriphosphat; Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid; 12 P = Phosphat; NADH = reduziertes Coenzym A; + NAD = oxidiertes Nicotinsäureamid-Adenin- Dinukleotid; aus Allen et al. (1964, generelle Druckerlaubnis in Dissertationen von der American Society for Microbiology). Über die Glykolyse wird in Propionibakterien Pyruvat aus Glucose gebildet (1 und 2 in Abbildung 21, Allen et al. 1964). Alternativ wird Lactat durch eine NAD-abhängige Lactat-Dehydrogenase (13 in Abbildung 21, Coquelle et al. 2007) zu Pyruvat oxidiert. Im oxidativen Zweig (Abbildung 21, rechts) wird ein Pyruvat durch eine Pyruvat:Ferredoxin-Oxidoreduktase (Astashkin et al. 2006), Phospho-Transacetylase (Rado und Hoch 1973) und Acetat Kinase (Schauppund Ljungdahl 1974) über die Zwischenstufen Acetyl~CoA und Acetyl~P zu Acetat decarboxyliert (3-5 in Abbildung 21). Dabei wird pro gebildetes Acetat ein ATP gewonnen. Im reduktiven Zweig (Abbildung 21, unten) werden zwei Pyruvat durch eine Methylmalonyl-CoA-PyruvatTranscarboxylase (Wood und Barden 1977) zu Oxalacetat carboxyliert (6 in Abbildung 21). Die Methylmalonyl-CoA-Pyruvat-Transcarboxylase enthält Biotin als C1-übertragendes Coenzym, welches den Kohlenstoff der Carboxylgruppe von (S)-Methylmalonyl~CoA übernimmt. (S)Methylmalonyl~CoA wird durch die Decarboxylierung der Carboxylgruppe zu Propionyl~CoA umgewandelt. Oxalacetat wird reduktiv als ein Teil des Tricarbonsäurekreislaufes zunächst zu 1 EINLEITUNG 42 Malat durch eine NADH-abhängige Malatdehydrogenase (7 in Abbildung 21, Goward und Nicholls 1994) reduziert. Eine Fumarase (Fumarat Hydratase, Ayres und Lara 1962)/ (S)-Malat Hydrolyase (Dreyer 1985) dehydratiert Malat zu Fumarat unter Abspaltung von Wasser (8 in Abbildung 21). Fumarat wird durch eine Menachinon(MQ)-abhängige Fumarat-Reduktase (9 in Abbildung 21, Lancaster et al. 1999) zu Succinat reduziert. Succinat wird weiter durch eine Propionyl-CoA-Transferase (10 in Abbildung 21, Stjernholm und Wood 1961) zu Succinyl~CoA aktiviert, wobei HSCoA aus Propionyl~CoA freigesetzt und der HSCoA-Donor dadurch zu Propionat umgewandelt wird. Eine Coenzym-B12- abhängige Methylmalonyl-CoA-Mutase (Mancia et al. 1996) wandelt Succinyl~CoA in (R)-Methylmalonyl~CoA um (11 in Abbildung 21), das durch eine Methylmalonyl-CoA-Epimerase (Bobik und Rasche 2004, McCarthy et al. 2001a, b, Leadlay 1981) zu (S)-Methylmalonyl~CoA regeneriert wird (12 in Abbildung 21), dem C1Donor für die Methylmalonyl-CoA-Pyruvat-Transcarboxylase (10 in Abbildung 21). 1.7.1.2 Acryloyl-CoA-Weg Megasphaera elsdenii (Elsden et al. 1956, Rogosa 1971) bildet Propionat, Acetat und Butyrat aus Lactat und bei einer Lactatkonzentration von 1-2 mmol L-1 Acetat und Butyrat aus Glukose (Hino et al. 1994). Clostridium propionicum (Cardon und Barker 1946) bildet Propionat und Acetat aus Aminosäuren (Hetzel et al. 2003) ebenfalls über den Acryloyl-CoA-Weg (Baldwin et al. 1965, Johns 1952, Kuchta und Abeles 1985). 3 Alanin + 2 H2O 3 NH+4 + CO2 + Acetat- + 2 Propionat- G°’ = -138 kJ (mol Acetat)-1 Formel 10: Stöchiometrische Reaktionsgleichung mit freier Enthalpie G°’ des Acryloyl-CoA- Wegs in Clostridium propionicum (Hetzel et al. 2003). Anhand der folgenden Abbildung wird der Stoffwechselweg schematisch beschrieben, bei dem Alanin zu Propionat, Acetat, Ammoniak und Kohlenstoffdioxid (Formel 10) umgesetzt wird. 1 EINLEITUNG 43 Abbildung 22: Schematische Darstellung des Acryloyl-CoA-Wegs mit Alanin in Clostridium propionicum. 1 Alanin-Aminotransferase (2-Og = 2-Oxoglutarat; Glu = (S)-Glutamat); 2 GlutamatDehydrogenase; 3 Pyruvat-Ferredoxin Oxidoreductase; 4 Phosphatacetyltransferase; 5 Acetat Kinase; CoA = Coenzym A; 6 (R)-Lactat Dehydrogenase; 7 Propionat-CoA Transferase; 8 Lactyl-CoA Dehydratase; 9 Acryloyl-CoA reductase; NAD+ = oxidiertes NicotinsäureamidAdenin-Dinukleotid; ATP = Adenosintriphosphat; NADH+H+ = reduziertes NicotinsäureamidAdenin-Dinukleotid; Fd = Ferredoxin; Fd- = reduziertes Ferredoxin; ETF = Elektronen transportierendes Flavoprotein; aus Hetzel et al. (2003); Druckerlaubnis durch John Wiley and Sons vom 14.09.2012. Eine Alanin: 2-Oxoglutarat-Aminotransferase (1 in Abbildung 22, Dumitru et al. 1970, Schweiger und Buckel 1984) transferiert die Aminogruppe des (S)-Alanins auf 2-Oxoglutarat. Das aus dem 2-Oxoglutarat entstandene (S)-Glutamat wird durch eine NADH+ abhängige GlutamatDehydrogenase (2 in Abbildung 22, Schweiger und Buckel 1984) wieder zu 2-Oxoglutarat regeneriert. Alanin wird dabei zu Pyruvat. Im oxidierenden Zweig des Stoffwechsels wird Pyruvat durch eine Pyruvat-Ferredoxin Oxidoreductase (3 in Abbildung 22, Selmer et al. 2002) zu Acetyl~CoA oxidiert. Dabei wird Ferredoxin reduziert und CO2 abgespalten. Coenzym A wird daraufhin durch ADP+P (nicht gezeigt) ersetzt, katalysiert durch eine Phosphatacetyltransferase (4 in Abbildung 22, Schweiger und Buckel 1984). Eine Acetat Kinase (5 in Abbildung 22, Schweiger und Buckel 1984) spaltet daraufhin Acetyl~P zu Acetat und dem energiereichen ATP. Im reduzierenden Zweig wird Pyruvat durch eine (R)-Lactat Dehydrogenase (6 in Abbildung 22, Schweiger und Buckel 1984, 1985) zu (R)-Lactat umgesetzt. Die Propionat-CoA Transferase (7 in Abbildung 22, Schweiger und Buckel 1984) überträgt Coenzym A von Propionyl~CoA auf das (R)-Lactat, wobei Propionat aus dem Zyklus ausscheidet. Das entstandene (R)-Lactyl~CoA wird 1 EINLEITUNG von der Lactyl-CoA Dehydratase (8 in Abbildung 22, Kuchta und Abeles 1985, Schweiger und Buckel 1984) unter Wasserabspaltung zu Acryloyl~CoA dehydriert, das wieder den Kreislauf schließend zu Propionyl~CoA reduziert wird. Eine Acryloyl-CoA reductase (9 in Abbildung 22, Hetzel et al. 2003) katalysiert diesen Schritt, das über ein Elektronen transportierendes Flavoprotein (ETF) in einer Untereinheit Elektronen von NADH+ bezieht. 1.7.1.3 Succinat-Decarboxylierung Ein weiterer Weg zur Bildung von Propionat ist die Succinat-Decarboxylierung, ausgehend von in die Zelle eingeschleustem Succinat. Dieser Weg wird zum Beispiel von Propionigenium modestum (Schink und Pfennig 1982) oder Propionigenium maris (Janssen und Liesack 1995) zur Energiegewinnung in Form von ATP angewendet (Abbildung 23, Dimroth und Schink 1998). Es folgt ein Schema der Succinat-Decarboxylierung mit anschließenden Erläuterungen. 44 1 EINLEITUNG 45 Abbildung 23: Succinat-Decarboxylierung CoA:CoA T = Succinat Mutase; Propionyl-CoA: CoA Mm-CoA R = Decarboxylase; durch Methylmalonyl-CoA Propionigenium modestum; Succ Prop- Transferase; Mm-CoA M = Methylmalonyl-CoA Racemase; Mm-CoA D = Methylmalonyl-CoA + Na ATPase = Natriumionenabhängige Adenosintriphosphatase; ADP +P = Adenosindiphosphat und Phosphat; ATP = Adenosintriphosphat; CoA = Coenzym A; gestrichelte Pfeile = Natriumionentransport; gepunktete Pfeile = Durchtritt von Succinat- und Propionat durch die Zellmembran; aus Dimroth und Schink (1998); Druckerlaubnis durch Springer vom 15.09.2012. Succinat wird von einer Succinat Propionyl-CoA: CoA Transferase (Hilpert et al. 1984) zu Succinyl~CoA aktiviert, wobei Propionat aus dem Zyklus ausscheidet (Abbildung 23, Dimroth und Schink 1998). Der Durchtritt von Succinat und Propionat ist noch unbekannt (Dimroth und Schink 1998). Aus einem Succinat entsteht ein Propionat (Formel 9). Succinyl~CoA wird zu (R)Methyl-malonyl~CoA von einer Methylmalonyl-CoA Mutase (Hilpert et al. 1984, Galivan und Allen 1968) umgewandelt. Durch eine Methylmalonyl-CoA Racemase (Hilpert et al. 1984, Methylmalonyl-CoA Epimerase, Bobik und Rasche 2004, McCarthy et al. 2001a, b, Leadlay 1981) wird (R)-Methylmalonyl~CoA zu (S)-Methylmalonyl~CoA umgesetzt. Aus (S)- Methylmalonyl~CoA wird Propionyl~CoA durch eine Methylmalonyl-CoA Decarboxylase (Huder und Dimroth 1993, Galivan und Allen 1968, Hoffmann et al. 1989) unter Abspaltung von CO2 umgewandelt. Gleichzeitig wird ein Natriumionen (Na+)-Gradient durch eine membranständige 1 EINLEITUNG 46 Na+-transportierende Methylmalonyl-CoA-Decarboxylase (Janssen et al. 1996) aufgebaut, was eine ebenfalls membranständige Adenosinetriphosphatase (ATPase, Hilpert et al. 1984, Laubinger und Dimroth 1988) durch den Einstrom von Na+-Ionen ATP herstellen lässt. 1.7.2 Mikrobieller anaerober Abbau von Propionsäure Mithilfe radioaktiv markierter Kohlenstoffe (C13) und Enzymaktivitätsnachweisen wurde von Houwen et al. (1987, 1990) ermittelt, dass Propionsäure von Syntrophobacter wolinii (Boone und Bryant 1980) anaerob mit einigen Enzymen des Methylmalonyl-CoA-Wegs (Abbildung 21) oxidiert wird. Auch andere Studien deuteten auf den Einsatz von Enzymen des MethylmalonylCoA-Wegs in propionsäureabbauenden Mischkulturen mit methanogenen Archaea hin (Robbins 1988, Schink 1985, Buswell et al. 1951, Koch et al. 1983, Tholozan et al. 1988). Es folgt die Umsatzgleichung nach Wallrabenstein et al. (1994). H3C-CH3-COO- + 2 H2O H3C-COO- +CO2 + 3 H2 G°’ = +76,0 kJ mol-1 Propionat Formel 11: Stöchiometrische Gesamtgleichung der Oxidation von Propionsäure durch Syntrophobacter wolinii unter Standardbedingungen mit der freien Enthalpie G°’. Dem positiven Wert der freien Enthalpie G°’ (Formel 11) ist zu entnehmen, dass dieser Prozess strikt endergon ist. Bei diesem Prozess entsteht zudem Wasserstoff. Um die Propionsäureoxidation energetisch günstig für die Mikroorganismen zu machen und den Partialdruck des Wasserstoffs gering zu halten, werden Wasserstoffabbauende Mikroorganismen wie zum Beispiel hydrogenotrophe methanogene Archaea benötigt, die den durch anaerobe Propionsäureoxidierer gebildeten Wasserstoff zu Methan umwandeln (Abbildung 20, Harper und Pohland 1986). Ab einem Wasserstoffpartialdruck von 9,2 Pa (Gourdon und Vermande 1987) beziehungsweise circa 10-4 atm (Abbildung 20, Harper und Pohland 1986) kommt die Propionsäureoxidation zum Erliegen, da die Reaktion im energetisch ungünstigen positiven Bereich liegt (Abbildung 20). Von Wallrabenstein et al. 1994 wurde Syntrophobacter wolinii mit Methanospirillum hungatei (Ferry et al. 1974) co-kultiviert, woraus folgende Gesamtgleichung resultierte. 4 H3C-CH3-COO- + 2 H2O 4 H3C-COO- + CO2 + 3 CH4 G°’ = -26,5 kJ mol-1 Propionat Formel 12: Stöchiometrische Gesamtgleichung der syntrophen Umsetzung von Propionat in Acetat durch Syntrophobacter wolinii und Methan durch Methanospirillum hungatei mit der freien Enthalpie G°’. 1 EINLEITUNG 47 Durch diese syntrophe Reaktion wird gewährleistet, dass bei der Propionsäureoxidation das Energieminimum von 20 kJ frei wird, um 1 ATP herstellen zu können. In der folgenden Abbildung ist der Stoffwechselweg von Syntrophobacter und Syntrophomonas spp. mit der Standardenthalpie G°’ und G’ bei 1 Pa (10-5 atm) Wasserstoffpartialdruck nach Thauer et al. (1977) für den gesamten Stoffwechselweg sowie für die einzelnen Schritte der anaeroben Propionsäureoxidation (Propionatoxidation) gezeigt. Abbildung 24: Oxidation von Propionat zu Acetat durch Syntrophobacter und Syntrophomonas spp.; [H] = reduziertes Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid (NADH); G°’ und G’ (bei 1 Pa -1 Wasserstoffpartialdruck) in [kJ mol ]; aus Stams und Plugge (2009), Druckerlaubnis von der Nature Publishing Group vom 24.08.2012. Die initiale Aktivierung von Propionat zu Propionyl~CoA verbraucht ATP (Abbildung 24). Syntrophobacter fumaroxidans (Harmsen et al. 1998) und Pelotomaculum thermopropionicum (Kosaka et al. 2006, 2008) beispielsweise aktivieren Propionat mit einer HS-CoA Transferase (Plugge et al. 1993). Dies ist ein von syntrophen Bakterien spezifisch verwendetes Enzym zur Aktivierung von Propionat. In anderen Mikroorganismen werden Carboxylsäuren häufig mit Kinasen oder Thiokinasen unter Verbrauch von ATP aktiviert, die bei den oben genannten Propionsäureoxidierern nicht gefunden wurden (Stams und Plugge 2009). Die endergone 1 EINLEITUNG 48 Carboxylierung von Propionyl~CoA zu Methylmalonyl~CoA wird von der exergonen Decarboxylierung des Oxalacetats zu Pyruvat energetisch aufgehoben (Abbildung 24, Harmsen et al. 1998, Stams et al. 1993). Die Hydrolyse des Succinyl~CoA zu Succinat bildet ATP, was die ATP verbrauchende Initialaktivierung von Propionat energetisch ausgleicht (Abbildung 24; Thauer et al. 1977). Malat wird zu Oxalacetat in einer NADH-abhängigen Reaktion umgewandelt. NADH wird gewöhnlich über Ferredoxin von einer Wasserstoff bildenden Hydrogenase oxidiert. Jedoch wurden in syntrophen Bakterien bisher keine NADH-abhängigen Hydrogenasen gefunden, so Stams und Plugge (2009). Der Schritt der Oxidation des Succinats in Fumarat (Abbildung 24) ist auch bei einem Wasserstoffpartialdruck von 1 Pa (10-5 atm) endergon. 2/3 ATP werden für diese Reaktion benötigt (Van Kuijk et al. 1998). Um der Reaktion Energie zuzuführen, muss ein Mechanismus existieren, der von außerhalb der Zelle Energie zuführt (reverser Elektronentransfer, rEt). Stams und Plugge (2009) schrieben in ihrem Review, dass Genom- und biochemische Analysen von Syntrophobacter fumaroxidans die Anwesenheit eines membranintegrierten Succinat Dehydrogenase Clusters mit Menaquinon und verschiedenen periplasmatischen Hydrogenasen und Formiat Dehydrogenasen zeigten. In Pelotomaculum thermopropionicum wurde ein Gencluster einer phylogenetisch verwandten Succinat Dehydrogenase gefunden. Möglich ist nach Stams und Plugge (2009), dass die Oxidation von Succinat zu Fumarat einen Protonengradienten über die Membran aufbaut. 1 EINLEITUNG 49 e Formiat Zytoplasma Abbildung 25: Theoretischer biochemischer Mechanismus eines reversen Elektornentransfers (rEt), um Energie in Form von ATP für die endergone Oxidation von Succinat zu Fumarat zuzuführen; FDH = Formiat Dehydrogenase; MK = Menaquinone; übersetzt aus Stams und Plugge (2009), Druckerlaubnis von der Nature Publishing Group vom 24.08.2012. Mit Einsatz von 2 /3 ATP werden Protonen ausgeschleust (Abbildung 25). Mit den über Menachinone nach außen transportierten Elektronen werden Formiat und Wasserstoff außerhalb der cytoplasmatischen Membran gebildet. Formiat und Wasserstoff können von einigen hydrogenotrophen methanogenen Archaea zur Methanbildung (Kapitel 1.5.2.4 und 1.9.1.1.1) verwendet werden. Ein weiterer Mechanismus der syntrophen Oxidation von Propionsäure in Acetat wurde in Smithella propionica (Liu et al. 1999) rekonstruiert (De Bok et al. 2001). In Abbildung 26 ist die von De Bok et al. (2001) postulierte Umsetzung von Propionat zu Acetat durch Smithella propionica gezeigt, was ebenfalls durch radioaktive Markierung der ersten beiden Methylgruppen des Propionats ermittelt wurde. 1 EINLEITUNG 50 Abbildung 26: Ablauf des Propionatabbaus durch Smithella propionica; 1 Verbindung der Carboxylgruppe eines Propionsäure Moleküls mit der zweiten Methylgruppe eines weiteren Propionsäure Moleküls unter Abspaltung des einen Sauerstoffs der Carboxylgruppe des ersten Propionsäure Moleküls; 2 Umstrukturierung der ersten Methylgruppe des zweiten Propionsäure Moleküls zwischen dessen zweite Methylgruppe und dessen Carboxygruppe und Umlagerung des verbliebenen Sauerstoffs auf die erste Methylgruppe des zweiten Propionsäure Moleküls; 3 Spaltung der 3-Ketohexansäure in Butyrat und Acetat; 4 syntrophische -Oxidation von Butyrat zu zwei Acetatmolekülen; o und x = radioaktive Markierung des C1 und C2 von Propionat; aus De Bok et al. (2001, generelle Druckerlaubnis von der American Society for Microbiology). Die für die in Abbildung 26 gezeigten Reaktionen verantwortlichen Enzyme sind bisher nicht bekannt (Stams und Plugge 2009). Stams et al. und Plugge et al. (1993) veröffentlichten, dass das eine aus einem Laborfermenter angereicherte Propionsäureoxidierende Mischkultur durch Zugabe von Fumarsäure (-OOC-HC=CH-COO-) ins Kulturmedium [3-13C] markierte Propionsäure ([3-13C]H3C-CH3-COO-) 1 EINLEITUNG 51 zu [2-13C] markierte Bernsteinsäure (Succinat, [2-13C]-OOC-H2C-CH2-COO-) carboxyliert. Dabei wurde die Methanogenese durch Bromoethansulfonsäure (BrES) inhibiert (Scholten et al. 2000, Zinder et al. 1984). BrES ist ein strukturell analoges Molekül zu 2-Mercaptoethansulfonsäure (Coenzym M, Smith und Mah 1981). BrES inhibiert die Reduktion von Methyl-S-CoM zu Methan (Kapitel 1.9.1.1) durch Bindung an HS-CoB. [3-13C]H3C-CH3-COO- + CO2 [2-13C]-OOC-H2C-CH2-COO- G°’ = +20,5 kJ mol-1 Formel 13: Carboxylierung von Propionsäure mit CO2 mit G°’. Die Carboxylierung von Propionsäure zu Succinat ist eine endergone Reaktion (Formel 13). Stams et al. (1993) schlossen aus den radioaktiv markierten Produkten, dass Fumarat gleichzeitig zu Acetat, Kohlenstoffdioxid und Protonen umgesetzt wird, was die Carboxylierung der Propionsäure zu Succinat energetisch ausgleicht. 1 -OOC-HC=CH-COO- 1 H3C-COO- + 2CO2 +4 [H+] G°’ = -30,5 kJ mol-1 Formel 14: Fumarsäureumsetzung zu Acetat und CO2. In Abwesenheit von Propionsäure und mit Inhibierung der Bildung von Methan (Kapitel 1.9.1.1) durch BrES wandelte die angereicherte Mischkultur Fumarat mit Protonen zu Succinat um. 2 -OOC-HC=CH-COO- + 4 [H+] 2 -OOC-H2C-CH2-COO- G°’ = -86,02 kJ mol-1 G‘ = -88,5 kJ mol-1 bei 1 Pa (10-5 atm) Wasserstoffpartialdruck Formel 15: Fumaratumsetzung mit Protonen zu Succinat mit G°‘ und G‘ bei 1 Pa -5 (10 atm) Wasserstoffpartialdruck. Das syntroph Propionsäureoxidierende Bakterium Syntrophobacter wolinii bildete in Cokultur mit Methanospirillum hungatei mit Propionsäure und Fumarat hauptsächlich Acetat, währenddessen M. hungatei Methan bildete (Stams et al. 1993). Mit M. hungatei und Fumarat in Abwesenheit von Propionsäure wurde ebenfalls hauptsächlich Acetat gebildet. Von der Cokultur Syntrophobacter wolinii in Cokultur Mit Desulfovibrio sp. wurde mit Fumarat sowie in An- und Abwesenheit von Propionsäure hauptsächlich Succinat gebildet. Die Cokultur Syntrophobacter wolinii und Desulfovibrio sp. mit Propionsäure setzte ohne Fumarat wenig Propionsäure in Acetat um. In Einzelkultur bildete Syntrophobacter wolinii Succinat aus Fumarat. Dieser Stoffwechselweg wird zum Beispiel auch von Propionibacterium freudenreichii angewendet (Rosner und Schink 1990). Desulfovibrio sp. in Cokultur mit M. hungatei bildete aus Fumarat 1 EINLEITUNG 52 mehr Acetat als Succinat, wohingegen Desulfovibrio sp. in Einzelkultur etwas mehr Succinat als Acetat bildete (Stams et al. 1993). Bei der anaeroben Oxidation von Propionsäure entstehen unter anderem Acetat, Kohlenstoffdioxid und Wasserstoff. Acetat kann anaerob auch aus Kohlenstoffdioxid und Wasserstoff gebildet werden. 1.8 Die anaerobe Bildung von Acetat aus CO2 und H2 Die Bildung von Acetat aus CO2 und H2 kann in einem Biogasfermenter eine Rolle während der anaeroben Phase der Biogasbildung spielen (Abbildung 19) und somit in Konkurrenz zur hydrogenotrophen Methanogenese (Kapitel 1.9.1.1.1) stehen. Acetoklastische methanogene Archaea der Gattung Methanosarcina verwenden hingegen selbst teilweise den Stoffwechselweg in entgegengesetzter Richtung (Abbildung 27), um Acetyl-CoA aus Acetat für die acetoklastische Methanogenese (Kapitel 1.9.1.1.2) zu erhalten (Ferry 1992, Gorrell et al. 2005, Ingram-Smith et al. 2005, Iyer et al. 2004). Acetat aus CO2 und H2 bildende Bakterien stammen aus 22 Gattungen (Drake et al. 2008). Die meisten Bakterien gehören zu dem Phylum Firmicutes. Sie werden auch homoacetogene Bakterien genannt. 2 CO2 + 4 H2 CH3COO + H+ 2 H2O G°’ = -95 kJ mol-1 Formel 16: Umsetzung von CO2 und H2 in Acetat mit G°’ (Ragsdale und Pierce 2008). Sie bilden Acetat mit dem Wood-Ljungdahl Weg (oder Acetyl CoA Weg). Isoliert wurden sie aus den unterschiedlichsten anaeroben Habitaten: Der Intestinaltrakt von Menschen, Tieren und Termiten (Breznak und Brune 1994, Chassard und Bernalier-Donadille 2006, Rieu-Lesme et al. 1995), Reisfelder (Rosencrantz et al. 1999), hypersalines Wasser (Ollivier et al. 1994), verschieden Böden (Peters und Conrad 1995) wie Tiefseeböden (Liu und Suflita 1993), Kläranlagen (Adrian und Arnett 2004) und Grundwasser (MacBeth et al. 2004). Der Acetyl-CoAWeg wird von homoacetogenen Bakterien in reduktiver Richtung zur Energieerhaltung und autotropher Kohlstoffassimilation verwendet (Abbildung 27). Die Bildung von Acetat durch homoacetogene Bakterien im Intestinaltrakt von Menschen, Tieren oder Termiten (Chassard und Bernalier-Donadille 2006, Greening und Leedle 1989, Tholen und Brune 1999) nützen dem Wirt sowie anderen Mikroorganismen in der direkten Umgebung als Nährstoff. In Termiten beispielsweise dominieren homoacetogene Bakterien (Pester und Brune 2007). Acetat dient den Termiten als Hauptnährstoff (Odelson und Breznak 1983). Befinden sich methanogene Archaea in der direkten Umgebung zu homoacetogenen Bakterien, sind methanogenen Archaea die dominierenden Mikroorganismen, da sie im Gegensatz zu homoacetogenen Bakterien eine höhere Affinität zu CO2 und H2 haben (siehe auch Abbildung 20, Le Van et al. 1998). außerdem 1 EINLEITUNG 53 ist der Energieertrag aus der Bildung von Methan (Formel 18) höher als der Energieertrag aus der Bildung von Acetat mit der Acetyl CoA Weg (Formel 16, Schink 1997, Schink und Stams 2006, Thauer et al. 1977). Sulfatreduzierer wurden ebenfalls neben acetogenen Bakterien und methanogenen Archaea aus Termitendärmen isoliert (Dröge et al. 2005). SO + 4 CH3COO + 2 H+ HS + 2 CO2 + 2 H2O G° = -57 kJ mol-1 Formel 17: Sulfatreduktion mit Oxidation von Acetat mit G°’ (Ragsdale und Pierce 2008) Manche dieser Sulfatreduzierer verwenden den Acetyl CoA Weg in entgegengesetzter Richtung und kombinieren die endergone Spaltung von Acetat in CO2 und H2 an die exergone Sulfatreduktion (Schauder et al. 1988, Spormann und Thauer 1998). 1.8.1 Acetyl CoA Weg (Wood-Ljungdahl Weg) Beim Acetyl CoA Weg ist der Kohlenstoffmonoxid Dehydrogenase/ Acetyl Coenzym A SynthaseKomplex (CODH/ACS, Ragsdale 2006, 2007, 2008, Volbeda und Fontecilla-Camps 2005, Darnault et al. 2003) das Schlüsselenzym. Im Folgenden ist der Acetyl CoA Weg (WoodLjungdahl Weg, Ljungdahl 2009, Menon und Ragsdale1996, Wood und Ljungdahl 1991) nach Erläuterungen von Ragsdale und Pierce (2008) sowie Bramlett et al. (2006) abgebildet und beschrieben. 1 EINLEITUNG Abbildung 27: Acetyl-CoA Weg in acetogenen Bakterien mit G°’ in kJ mol-1 (gelbe Boxen) und dem paramagnetischen Ausgangsintermediat NiP1+-CO des A-Clusters der Kohlenstoffmonoxid Dehydrogenase (CODH)/Acetyl Coenzym A Synthase (ACS) mit vermutlichen Mechanismen im A- sowie im C-Cluster der CODH/ACS; 1 Formiat Dehydrogenase; 2 10Formyl-H4-Folat Synthase; 3 5,10-Methenyl-H4Folat Cyclohydrolase; 4 5,10-Methylen-H4Folat Dehydrogenase; 5 5,10-Methylen-H4Folat Reduktase; 6 Methyl-H4Folat:CFeSP Methyl-Transferase; 7 CODH/ACS; 8 Phospho Transacetylase; 9 Acetat Kinase. Beginnend mit dem reduzierenden Methylzweig (Abbildung 27) wird Kohlenstoffdioxid durch eine Formiat Dehydrogenase (1 in Abbildung 27, Andreesen und Ljungdahl 1973, Li et al. 1966, Yamamoto et al. 1983) unter Bildung eines NADP+ zu Formiat dehydriert. Formiat wird daraufhin mit Tetrahydrogenfolat (H4-Folat) durch eine 10-Formyl-H4Folat Synthase (2 in Abbildung 27, Himes und Wilder 1968, McGuire und Rabinowitz 1978, Lovell et al. 1988, 1990, O'Brien et al. 1976) zu 10-Formyl-H4Folat verbunden. Das dritte Enzym in Abbildung 27 ist die 5,10-MethenylH4Folat Cyclohydrolase (Clark und Ljungdahl 1982). Dieses Enzym katalysiert die Ring schließende Reaktion, die das Kohlenstoffatom der Methylgruppe des 10-Formyl-H4Folat dreifach an das H4Folat bindet. Im Anschluss reduziert die 5,10-Methylen H4Folat Dehydrogenase (4 in Abbildung 27, Ragsdale und Ljungdahl 1984, Moore et al. 1974) 5,10Methenyl-H4Folat zu 5,10-Methylen-H4Folat mit Bildung eines NADPH. In Acetobacterium woodii (Balch et al. 1977) ist die 5,10-Methylen H4Folat Dehydrogenase ein sauerstoffsensitives Enzym (Clark und Ljungdahl 1984). Die 5,10-Methenyl-H4Folat Cyclohydrolase und die 5,10-Methylen H4Folat Dehydrogenase bilden ein bifunktionales Enzym (Parekh und Cheryan 1991, Fontaine et al. 1942) in Moorella thermoacetica (Pierce et al. 2008), wohingegen monofuktionale Enzyme in 54 1 EINLEITUNG Clostridium formicoaceticum (Andreesen et al. 1970, Clark und Ljungdahl 1982) und Acetobacterium woodii (Ragsdale und Ljungdahl 1984, Skerman et al. 1980) ermittelt wurden (Ragsdale und Pierce 2008). In acetogenen Bakterien wird der letzte Schritt des reduzierenden Methylzweigs mit dem sauerstoffsensitiven Enzym 5,10-Methylen-H4Folat-Reduktase (5 in Abbildung 27, Clark und Ljungdahl 1984) katalysiert, das reduziertes Ferredoxin als Elektronendonor verwendet. Wenn Wasserstoff als Elektronendonor verwendet wird, ergibt sich eine freie Enthalpie G°’ von 57,3 kJ mol-1 (Ragsdale und Pierce 2008). Die Methylgruppe des gebildeten Methyl-H4Folat wird durch eine Methyl-H4Folat:CFeSP Methyl-Transferase (6 in Abbildung 27) von H4Folat auf ein corronoides Eisen-Schwefel Protein (CFeSP, Lu et al. 1993) übertragen. Diese Transferierung der Methylgruppe von H4Folat auf CFeSP verbindet den reduzierenden Methylzweig mit dem oxidierenden Carbonylzweig der Acetyl CoA Wegs. CFeSP enthält Cobalamin (Zhao et al. 1995). Das im Zentrum des Cobalamins liegende Cobalt (Co) mit der Oxidationsstufe I initiiert den Transfer der Methylgruppe von H4Folat zu Methyl-Co3+-CFeSP. Das dabei gebildete H4Folat steht somit erneut zur Verfügung, Formiat im zweiten Schritt des reduzierenden Methylzweig zu binden. Das corronoide Eisen-Schwefel Protein wird durch die Übergabe der Methylgruppe auf ein mit einer Carbonylgruppe beladenes Nickel-Zentrum der Acetyl Coenzym A Synthase (7, A-Cluster in, Hegg 2004, Drennan und Peters 2003, Ito et al. 2009, Tan, X. et al. 2007) zu Co1+-CFeSP regeneriert. Dabei wird von einem paramagnetischen NiP1+-CO Intermediat (NiP, proximales Nickel) ausgegangen (Abbildung 27, Ragsdale 2004, Seravalli und Ragsdale 2008a, Doukov et al. 2002, Seravalli et al. 2002). Das proximale Nickel erhält durch die Bindung mit der Methylgruppe ein Elektron und ist somit zwei-fach positiv geladen. Die Carbonylgruppe und die Methylgruppe kondensieren daraufhin zu einer Acetylgruppe. Die Acetylgruppe wird mit Coenzym A vom proximalen Nickel abgespalten, wobei das Eisen-Schwefel-Nickel-Cluster ein Elektron abgibt. Das regenerierte NiP+1-Intermediat nimmt erneut ein Kohlenstoffmonoxyd auf, dass durch einen Verbindungstunnel (Doukov et al. 2008, Volbeda und Fontecilla-Camps 2004) aus der Bindetasche der Kohlenmonoxyd Dehydrogenase (CODH) stammt. Das aktive Zentrum der CODH enthält ein Nickel und ein Eisen, die mit Schwefelbrücken miteinander verbunden sind (7, C-Cluster in Abbildung 27, Kim et al. 2004, Kung et al. 2009, Shin et al. 1997). Nach der Abspaltung eines Kohlenmonoxyds sind beide Metalle zweiwertig positiv geladen. Die Ladung des Nickels wird über mehrere Schritte ausgeglichen, so dass an das Nickel das Kohlenstoff-Atom eines Kohlenstoffdioxids und an das Eisen ein Sauerstoffatom des selben Kohlenstoffdioxids gebunden werden kann (Abbildung 27, oben rechts). Bei der Regenerierung des Nickels wird ebenfalls über Zwischenschritte Ferredoxin reduziert. Der an das Eisen gebundene Sauerstoff wird von dem aktiven Zentrum benachbarten Aminosäuren (B1, B2, Abbildung 27) mit zwei Wasserstoffatomen versorgt, so dass Wasser und Kohlenstoffmonoxyd abgespalten werden können (Seravalli und Ragsdale 2008b). Das Kohlenstoffmonoxyd wird durch den Verbindungstunnel vom C-Cluster der CODH zum A- 55 1 EINLEITUNG 56 Cluster der ACS überführt, so dass die ACS erneut Acetyl~CoA bilden kann. Das von der ACS gebildete Acetyl~CoA wird durch eine Phospho-Transacetylase (8 in Abbildung 27, Drake et al. 1981) mit einer anorganischen Phosphatgruppe beladen. Der Finale Schritt des oxidierenden Carbonylzweigs wird durch eine Acetat Kinase (9 in Abbildung 27, Ingram-Smith et al. 2005, Gorrell et al. 2005) durchgeführt, die die Phosphatgruppe des Acetyl~P auf ADP überträgt und damit energiereiches ATP und Acetat als Endprodukt gebildet wird. Andere Studien schließen auf ein diamagnetisches NiP0-Intermediat im aktiven Zentrum der ACS, bei dem das Eisen-Schwefel-Cluster während der Bildung von Acetyl~CoA nicht direkt an der Katalyse teilnimmt (Lindahl 2002 und 2004, Barondeau und Lindahl 1997, Volbeda und Fontecilla-Camps 2005, Wilson und Lindahl 1999, Bramlett et al. 2006, Darnault et al. 2003, Russell et al. 1998, Tan, X. et al. 2006, Tan, X. S. et al. 2002). Abbildung 28: Bildung von Acetyl~CoA durch das A-Cluster der CODH/ACS ausgehend von einem diamagnetischen NiP0-Intermediat. Ausgehend von der Methylgruppenübertragung auf CFeSP wird die Methylgruppe als erste Gruppe an das ungeladene proximale Nickelatom (diamagnetisches NiP0-Intermediat) des AClusters der Acetyl-CoA Synthase (ACS) transferiert (Abbildung 28), das daraufhin zwei-fach positiv geladen ist. Als zweite Gruppe wird Kohlenstoffmonoxyd an das NiP2+ gebunden, das durch den Tunnel aus der Kohlstoffmonoxid Dehydrogenase (CODH) befördert wurde. Dabei erfährt das aktive Zentrum keinen weiteren Ladungswechsel. Durch eine Kondensation wird auch in diesem Weg Acetyl-Metall gebildet. Die Acetyl Gruppe wird ebenfalls mit Coenzym A verbunden und Acetyl~CoA verlässt das aktive Zentrum der ACS. Über die bereits in Abbildung 27 gezeigten Schritte wird Energie in Form von ATP und Acetat als Endprodukt gebildet. Die beiden Mechanismen werden kontrovers diskutiert (Evans 2005, Riordan 2004) und sind bisher nicht vollständig aufgeklärt. Wie bereits oben erwähnt, ist Acetat nicht das bevorzugte Produkt aus Kohlenstoffdioxid und Wasserstoff. Aus diesen beiden Molekülen wird Methan und Wasser gebildet, sobald hydrogenotrophe methanogene Archaea anwesend sind. Das Vorkommen und die Bildung von Methan auf der Erde werden im nächsten Kapitel beschrieben. 1 EINLEITUNG 57 1.9 Ursprung und Kreislauf von Methan auf der Erde Erste wissenschaftliche Beschreibungen (Volta 1776) eines brennbaren Gases, welches in beachtlichen Mengen aus Seen, Teichen und Flüssen entweicht, brachte die Wissenschaftler des 18. Jahrhunderts auf die Spur der einfachsten aller Kohlenwasserstoffverbindungen. Eine erste chemische Charakterisierung dieser Verbindung, welche aus einem Kohlenstoffatom und vier Wasserstoffatomen (CH4 = Methan) besteht, erfolgte im frühen 19. Jahrhundert durch William Henry. Béchamp wies 1868 den biogenen Ursprung von Methan nach (Lawrie und Pickett 1961). Methan (CH4, Ferry 1997) ist der einfachste Kohlenwasserstoff Verbindung. Die vier Wasserstoffatome umgeben das sp3-hybridisierte Kohlenstoffatom tetraedrisch. Aufgrund dieses Aufbaus und der apolaren C-H Bindungen ist Methan sehr stabil und reaktionsträge. Das einfachste Alkan ist farb- und geruchlos und aufgrund seines niedrigen Siedepunktes (-161,5 °C) bei Raumtemperatur gasförmig. Neben einigen anderen kurzkettigen aliphatischen Kohlenwasserstoffen (Ethan, Propan, Butan u.a.) ist Methan mit mindestens 75 % der Hauptbestandteil von Erdgas. In der frühen Erdgeschichte (vor etwa 2,7 Milliarden Jahren) war Methan vermutlich auch ein wesentlicher Bestandteil der Atmosphäre (Chang et al. 1983, Khalil und Rasmussen 1987, Harriss 1989). Mit der Zunahme der Sauerstoffkonzentration infolge der Photosynthese nahm der Methangehalt jedoch stark ab. In den letzten 3000 Jahren betrug die Methankonzentration in der Atmosphäre nur etwa 0,8 ppmv (Volumenmischungsverhältnis), bevor sie seit 250 bis 300 Jahren kontinuierlich um ca. 1 % pro Jahr auf den heutigen Wert von etwa 1,7 ppmv Anstieg (Blake und Rowland 1988; zitiert in Cicerone und Oremland 1988). Dies wird hauptsächlich auf menschlichen Einfluss zurückgeführt, unter anderem auf Methanemissionen aus der Industrie, der Viehhaltung und vor allem aus dem Reisanbau (Ehhalt 1974). Dieser kontinuierliche Anstieg scheint sich jedoch langsam wieder zu verringern (Etiope und Klusman 2002). 1 EINLEITUNG 58 Methan absorbiert die von der Erdoberfläche zurückstrahlende Infrarotstrahlung und trägt so zur globalen Erwärmung der Atmosphäre bei (Bolin et al. 1989). Aufgrund seiner Absorptionscharakteristik ist Methan ein 26-mal effektiveres Treibhausgas als CO2 (Lieleveld et al. 1992) und hat eine Verweilzeit von 12 Jahren (Solomon et al. 2007). Tabelle 7: Quellen von emittiertem Methan (aus Liu und Withman 2008; Druckerlaubnis von John Wiley and Sons vom 24.08.2012) Methanquellen Methanentstehung [Tg CH4 a-1] Natürliches Vorkommen Feuchtbiotope Prozentual [%] 92-237 15-40 Termiten 20 3 Ozeane 10-15 2-3 Methanhydrate 5-10 1-2 Zwischensumme 127-282 21-47 Anthropogenes Vorkommen Wiederkäuer 80-115 13-19 Energieherstellung 75-110 13-18 Reiskultivierung 25-100 7-17 Deponien 35-73 6-12 Verbrennung von Biomasse 23-55 4-9 Müllentsorgung 14-25 2-4 Zwischensumme 267-478 45-80 Summe 500-600 - Zurzeit werden jährlich schätzungsweise 600 Tg Methan auf der Erde produziert (Tabelle 7, Liu und Withman 2008). Mehr als 60 % davon gelangen nicht in die Atmosphäre, sondern werden vorher von Mikroorganismen oxidiert (Reeburgh 1996, Reeburgh et al. 1993). In der Atmosphäre werden wiederum 90 % des dort angelangten Methans durch Hydroxylradikale (•OH) chemisch oxidiert (Ehhalt 1974, Lieleveld et al. 1992). 1.9.1 Die natürliche Bildung von Methan Nur ein geringer Teil des weltweit vorkommenden Methans entsteht aus Kohlenstoffquellen nicht biologischer Herkunft (Kapitel 1.9) als Folge geothermischer (thermogener) Prozesse (Parkes et al. 2000, Nikolskaya et al. 2001). Vorwiegend wird Methan aus organischem Material biologischen Ursprungs gebildet: zu etwa 20 % durch geochemische und zu 80 % durch mikrobielle Prozesse (Schoell 1988, Bréas et al. 2001). Die dafür verantwortlichen Mikroorganismen gehören zum Reich der Archaea (Fox et al. 1977, Woese und Fox 1977, Woese et al. 1990). Methanogene Archaea sind die einzige bekannte Organismengruppe, die Methan als Endprodukt ihres Energiestoffwechsels produziert (Balch et al. 1979). Bekannt sind 1 EINLEITUNG derzeit 59 fünf verschiedene Ordnungen: Methanobaceriales, Methanosarcinales, Methanomikrobiales, Methanococcales und Methanopyrales (Woese 1977). Typische Habitate für Methanogene sind Sumpfgebiete (Zellner et al. 1989), Reisfelder (Sakai et al. 2007) und Mägen von Wiederkäuern (Paynter und Hungate 1968). Hier werden mehr als 70 % des mikrobiologisch produzierten Methans gebildet (Ehhalt 1974; Bréas et al. 2001). Auch in Termitendärmen (Tokura et al. 2000), heißen Quellen (Pagaling et al. 2012) und Kläranlagen (Bryant und Boone 1987b) leben methanogene Archaea und tragen zur Methanemission bei. Ein geringerer Anteil von Methan wird mikrobiologisch in Mülldeponien produziert und entsteht durch die Verbrennung von Biomasse. Neben diesen Quellen der rezenten Methanbildung wird zusätzlich in Kohleminen und durch Erdgasaustritte eingelagertes Methan freigesetzt (Reeburgh 1996). Aufschluss über die Entstehung des Methans kann das Verhältnis der stabilen Isotope des Kohlenstoffs 12C und 13C geben, welches als 13 C-Wert im Vergleich zu dem Pee Dee Belemnit- Standard (Schramm 1999) angegeben wird. Mikrobiologische Prozesse diskriminieren aufgrund des kinetischen Isotopeneffekts gegen das schwerere Isotop. Die daraus resultierende Anreicherung an 12 C führt zu sehr negativen 13 C-Werten (-110 ‰ bis -50 ‰). Thermogen entstandenes Methan liegt dagegen bei -50 ‰ bis -20 ‰ (Whiticar 1999). Die Bestimmung des Anteils von Deuterium (Whiticar et al. 1986) im Wasserstoff des Methans ( D-Wert) kann weiteren Aufschluss über den Entstehungsprozess des Methans durch Methanogenese (Bapteste et al. 2005) vorzugweise aus H2/ CO2 oder Acetat geben. Anhand des Anteils des instabilen 14 C-Isotops lässt sich auch das Alter des Methans bestimmen (Cicerone und Oremland 1988). 1.9.1.1 Methanogenese Bei der Methanogenese fungieren Carbonate, wie Kohlenstoffdioxid (CO2) oder Acetat (CO2, CH3COO-) und in selteneren Fällen Methanol (CH3OH), Methylamine und Methylsufide als Elektronenakzeptor, H2 als Elektronendonor. Während der Methanogenese sind neben spezifischen Enzymen einige ungewöhnliche und speziell in der Methanogenese verwendete Cofaktoren (Abbildung 29) beteiligt. 1 EINLEITUNG Methanofuran Tetrahydromethanopterin F430 F420 Coenzym B (CoB) Coenzym M (CoM) Methanophenazin (Elektronencarrier, Tietze 2000) Abbildung 29: Bei der Methanogenese beteiligte Cofaktoren. Es wird zwischen hydrogenotropher, methylotropher und acetoklastischer Methanogenese unterschieden. Die folgende Abbildung 30 zeigt eine schematische Darstellung der 60 1 EINLEITUNG 61 Methanogenese mit verschiedenen Substraten, direkt beteiligten Enzymen und Cofaktoren (Bapteste et al. 2005). Abbildung 30: Methanogenese (Schema); Pfeile = hydrogenotroph; unterbrochene Pfeile = acetoklastisch; gepunktete Pfeile = methylotroph; 1 Formyl-MF Dehydrogenase; 2 Formyl-MF:H4MPT Formyltransferase; 3 Methenyl-H4MPT Cyclohydrolase; 4 F420 oder H2 reduzierende Methylen-H4MPT Dehydrogenase; 5 Methylen-H4MPT Reduktase; 6 MethylH4MPT Methyltransferase; 7 Methyl-Coenzym M Reduktase I oder II; 8 H2:CoB-S-S-CoMOxidoreduktase; 9 Heterodisulfidreduktase; 10 Acetatkinase; 11 Phospho Transacetylase; 12 Kohlenmonoxid-Dehydrogenase/Acetyl-CoA-Synthase (CODH/ACS); 13 Carboxyldehydrogenase; 14 Methyltransferase; 15 F420-abhängige Formiat Dehydrogenase; 16 Methyl-H4MPT-CoM-Methyltransferase MF = Methanofuran; H4MPT = Methanopterin; F420 und F430 = Elektronen-überträger Faktor 420 Fdred = reduziertes Fdox = oxidiertes Ferredoxin; ADP = Adenosindiphosphat; und 430; CoM = Coenzym M, CoB = Coenzym B; ATP = Adenosintriphosphat; Druckerlaubnis von Creative Commons). Ferredoxin; nach B12 = Cofaktor Bapteste et al. B12; (2005, 1 EINLEITUNG 62 Die Bildung von ATP erfolgt durch Aufbau eines Protonen- beziehungsweise Natriumgradienten. Während endergonen Prozessen erfolgt ein Einstrom von Natriumionen oder Protonen und bei exergonen Reaktionen strömen Natriumionen oder Protonen ein. Die hydrogenotrophe Methanogenese kann als anaerobe Atmung gesehen werden, die sich Carbonatatmung nennt. Die acetoklastische Methanogenese kann auch als Gärung betrachtet werden, denn das Substrat ist sowohl Elektronendonor wie auch -akzeptor. Der Stoffwechsel der Methanogenese ist komplexer als bei den meisten anderen anaeroben Atmungen z. B. durch die hohe Zahl komplexer Cofaktoren. Folgend werden die hydrogenotrophe, acetoklastische sowie die methylotrophe Methanogenese unter anderem anhand des in Abbildung 29 gezeigten Schemas beschrieben. 1.9.1.1.1 Hydrogenotrophe Methanogenese Zu hydrogenotrophen methanogenen Archaea zählen die Familien Methanobacteriaceae, Methanococcaceae und Methanomicrobieae. Die folgende Gleichung gilt für die Bildung von Methan aus Wasserstoff (H2) und Kohlenstoffdioxid (CO2). CO2 + 4 H2 CH4 + 2 H2O G°’ = -135 kJ mol-1 CH4 G’ = -17 kJ mol-1 CO2 bei 10-5 bar Wasserstoffpartialdruck Formel 18: Bildung von Methan aus Wasserstoff (H2) und Kohlenstoffdioxid (CO2) mit der freien Enthalpie G°’ (Liu und Whitman 2008) und G’ bei 10-5 bar Wasserstoffpartialdruck (Schlegel und Fuchs 2007). Einige Arten der Gattungen Methanobacterium und Methanospirillum sind befähigt, Methan aus Formiat (HCOO-) zu bilden. 4 HCOO- + 4 [H]+ CH4 + 3 CO2 + 2 H2O G°’ = -130 kJ mol-1 CH4 Formel 19: Bildung von Methan, Kohlenstoffdioxid und Wasser aus Formiat und Wasserstoffionen mit der freien Enthalpie G°’ (Liu und Whitman 2008). Formiat wird durch eine Cofaktor F420-abhängige Formiat Dehydrogenase zu Kohlenstoffdioxid oxidiert (Ferry und Wolfe 1976, Schauer und Ferry 1982). Dieses Kohlenstoffdioxid durchläuft den Stoffwechselweg der hydrogenotrophen Methanogenese (schwarze Pfeile, Abbildung 30). Methanothermobacter thermautotrophicus (Zeikus und Wolfe 1972), Methanosarcina barkeri (Bryant und Boone 1987a, Daniels et al. 1977, Krzycki et al. 1982) und Methanosarcina acetivorans (Rother und Metcalf 2004, Galagan et al. 2002) wachsen auf Kohlenstoffmonoxid (CO) und bilden daraus Methan (Oelgeschläger und Rother 2008). 1 EINLEITUNG 63 4 CO + 2 H2O CH4 + 3 CO2 G°’ = -130 kJ mol-1 CH4 Formel 20: Bildung von Methan und Kohlenstoffdioxid aus Kohlstoffmonoxid und Wasser mit der freien Enthalpie G°’ (Liu und Whitman 2008). Methanoculleus thermophilum (Maestrojuán et al. 1990, Rivard und Smith 1982), Methanogenium organophilum (Widdel 1986), Methanobacterium palustre (Berk und Thauer 1997, Bleicher und Winter 1991, Zellner et al. 1989), Methanogenium liminatans (Berk und Thauer 1997, Bleicher und Winter 1991, Zellner et al. 1990), Methanobacterium bryantii M. o. H. G. (Bleicher et al. 1989) Methanospirillum hungatei (Ferry et al. 1974) und Methanobacterium bryantii (Balch et al. 1979) verwerten auch zweiwertige Alkohole als Wasserstoffdonoren. Beispielsweise wird 2-Propanol (C3H8O) durch eine Co-Faktor F420-abhängige sekundäre Alkohol Dehydrogenase zu Aceton (C3H6O) oxidiert, wobei der gebildete Wasserstoff auf den Co-Faktor F420 übertragen wird. Bei Standardbedingungen ist die Umsetzung von 2-Propanol zu Aceton und Wasserstoff endergon ( G°’ = + 24,8 kJ mol-1, Widdel 1986). Diese Reaktion ist exergon, wenn sie an die Methanbildung aus Kohlenstoffdioxid gekoppelt ist (Widdel und Wolfe 1989). CO2 + 4 C3H8O CH4 + 4 C3H6O + 2 H2O G°’ = = -37 kJ mol-1 CH4 Formel 21: Bildung von Methan, Aceton und Wasser aus Kohlenstoffdioxid und 2-Propanol mit der freien Enthalpie G°’ (Liu und Whitman 2008). Methanogenium organophilum (Widdel 1986, Frimmer und Widdel 1989, Widdel et al. 1988), Methanobacterium palustre (Bleicher et al. 1989) wachsen zudem mit Ethanol als Wasserstoffdonor. Beide methanogenen Archaea besitzen eine dafür NADP+-abhängige sekundäre Alkohol Dehydrogenase und eine F420-abhängige NADP Reductase (Berk und Thauer 1997). Die NADP+-abhängige sekundäre Alkohol Dehydrogenase oxidiert Ethanol über Acetaldehyd zu Acetat. Das oxidierte NADP+ wird durch die F420-abhängige NADP Reductase mit dem Co-Faktor F420 reduziert. Der reduzierte Co-Faktor F420 stammt aus dem Schritt der Dehydrierung des Methenyl-H4MPT zu Methylen-H4MPT (Abbildung 30, Hendrickson und Leigh 2008, Hartzell et al. 1985) und wird somit wieder oxidiert, so dass er in einem weiteren Durchgang der Methanogenese eingesetzt werden kann. Eingeleitet wird die hydrogenotrophe Methanogenese (siehe schwarze Pfeile, Abbildung 30), indem Kohlenstoffdioxid in Form von Formaldehyd an Methanofuran (MF, Jones et al. 1985) fixiert und enzymatisch von der membranständigen Formylmethanofuran-Dehydrogenase (1 in Abbildung 30, Jablonski et al. 1990) unterstützt, reduktiv als Formyl-Methanofuran (Formyl-MF) gebunden wird. In der Formylmethanofuran-Dehydrogenase ist ein Molybdän-Cofaktor (beziehungsweise Wolfram bei beispielsweise Methanothermobacter thermoautotrophicus) 1 EINLEITUNG enthalten. 64 Die Aktivität der Formylmethanofuran-Dehydrogenase bewirkt einen Natriumioneneinstrom in die Zelle, der mit einem Natriumionenausstrom aus der Zelle durch den Cofaktor B12 der Methyl-H4MPT-Transferase (6 in Abbildung 30) gekoppelt ist. Eine FormylMethanofuran-Tetrahydromethanopterin-Formyltransferase (2 in Abbildung 30, Jablonski et al. 1990) überträgt die Formylgruppe vom Formyl-Methanofuran auf Tetrahydromethanopterin (H4MPT, Jones, et al. 1985). Die Formylgruppe des 5-Formyl-H4MPT wird schrittweise zum Methylrest reduziert. Eine Methenyl-H4MPT-Cyclohydrolase (3 in Abbildung 30, Jablonski et al. 1990) bindet ein Wassermolekül an die Formylgruppe des Formyl-H4MPT’s. Das entstandene Methenyl-H4MPT wird von einem Cofaktor F420-H2 zu Methylen-H4MPT reduziert. Der Cofaktor F420-H2 (Eirich et al. 1979) wird von einer F420-reduzierenden-Methylen-H4MPT-Dehydrogenase (4 in Abbildung 30, Hendrickson und Leigh 2008) bereitgestellt. Eine Methylen-H4MPTReduktase (5 in Abbildung 30, Jablonski et al. 1990) katalysiert den zweiten Reduktionsschritt mithilfe des Cofaktors F420-H2 zu Methyl-H4MPT. Die Methylgruppe des Methyl-H4MPT wird mithilfe des oben erwähnten Natriumionenausstroms über den Cofaktor B12 auf CoM-SH übertragen. Die Methyl-H4MPT-Methyltransferase (6 in Abbildung 30, Becher et al. 1992) katalysiert diesen Schritt. Die Methyl-CoM-Reduktase (7 in Abbildung 30, Thauer und Shima 2007, Ellermann et al. 1988, Ermler et al. 1997) ermöglicht die HS-CoB-abhängige Reduktion des Methyl-S-CoM zu Methan und CoM-S-S-CoB mithilfe des Nickel enthaltenden Cofaktors F430. Methan wird aus der Zelle entlassen und CoM-S-S-CoB dient der H2:CoB-S-S-CoMOxidoreduktase (8 in Abbildung 30, Deppenmeier et al. 1990) als terminaler Elektronenakzeptor. Die exergone Reaktion der H2:CoB-S-S-CoM-Oxidoreduktase regeneriert die Cofaktoren HSCoB und HS-CoM, welche an die Reduktion von Ferredoxin gekoppelt ist (Thauer et al. 2008). Bei Methanobacteriales, Methanococcales, Methanopyrales und Methanomicrobiales wird eine ATP-Synthase von einem Natriumioneneinstrom betrieben, die ATP aus ADP und Pi bildet. 1.9.1.1.2 Acetoklastische Methanogenese CH3COO- + [H+] CH4 + CO2 G°’ = -33 kJ mol-1 Acetat Formel 22: Bildung von Methan aus Acetat und Wasserstoff (acetoklastische Methanogenese) mit der freien Enthalpie G°’ (Liu und Whitman 2008). Acetoklastische methanogene Archaea gehören ausschließlich der Familie Methanosarcinaceae an. Methanosarcina sind befähigt 0,2-1,2 mmol L-1 und Methanosaeta 7-70 µmol L-1 Acetat zu verwenden (Jetten et al. 1990). Acetat gelangt in die Zelle und wird zunächst über den umgekehrten Acetyl-CoA-Weg (Kapitel 1.8) zu Acetyl-CoA umgesetzt (Ragsdale 2008). Acetat wird als Erstes unter ATP-Hydrolyse von einer Acetatkinase (10 in Abbildung 30, Ding et al. 2005, Ingram-Smith et al. 2005; Gorrell et al. 2005) zu Acetyl~P aktiviert. Eine 1 EINLEITUNG 65 Phosphotransacetylase (11 in Abbildung 30, Iyer et al. 2004) katalysiert die Übertragung der aktivierten Acetylgruppe auf den Cofaktor HSCoA. Eine bifunktionale Carboxyl- Dehydrogenase/Acetyl-CoA-Synthase (12 in Abbildung 30, M. barkeri, Gong et al. 2008, M. thermophila, Grahame et al. 2005) ist das Schlüsselenzym des Wood-Ljungdahl-Wegs, welches insgesamt fünf aktive Zentren mit jeweils Nickel und Eisen-Schwefel-Clustern enthält. Die AcetylCoA-Synthase in Methanosarcina spaltet schrittweise Acetyl-CoA zu CoA, wobei eine Carboxylgruppe übergangsweise am Nickel des A-Clusters und eine Methylgruppe gebunden werden. Die gebundene Carboxylgruppe wird auf eine Carboxyl-Dehydrogenase (13 in Abbildung 30) übertragen und dort unter Beteiligung von Wasser und Ferredoxin zu CO2 oxidiert. Die freigesetzten Elektronen werden vom Ferredoxin auf ein membranständiges Methanophenazin (Beifuss et al. 2000) übertragen. Die an der Acetyl-CoA-Synthase gebundene Methylgruppe wird durch membranständige Methyltransferasen (14 in Abbildung 30) zunächst auf Tetrahydromethanopterin und weiter durch eine weitere Methyltransferase (6 in Abbildung 30) auf CoM übertragen. Beim Methyltransfer wird Energie in Form eines Protonenbeziehungsweise Na+-Gradienten konserviert. Die weiterführenden Schritte der acetoklastischen Methanogenese (gestrichelte Pfeile, Abbildung 30) sind identisch zu den Reaktionen der Methanbildung aus H2 und CO2. Die Heterodisulfidreduktase (9 in Abbildung 30) bei Methanosarcina ist im Gegensatz bei Methanobacteriales, Methanococcales, Methanopyrales und Methanomicrobiales membranständig und mit dem Aufbau eines transmembranen Protonengradienten mithilfe von Methanophenazin verbunden, welcher eine ATP-Synthase zur Herstellung von ATP bewegt. 1.9.1.1.3 Methylotrophe Methanogenese Manche der zu den Gattungen Methanosarcina und Methanosphaera zähligen disproportionieren Methanol, Methylamide beziehungsweise Methylsulfid zu Methan. Im Folgenden sind die Reaktionsgleichungen mit freier Enthalpie G°’ (Liu und Whitman 2008) aufgeführt. 4 CH3OH 3 CH4 + CO2 + 2 H2O G°’ = -105 kJ mol-1 Formel 23: Bildung von Methan aus Methanol mit der freien Enthalpie G°’ 4 CH3-NH2 + 2 H2O 3 CH4 + CO2 + 4 NH3 G°’ = -75 kJ mol-1 Formel 24: Bildung von Methan aus Methylamin und Wasser mit der freien Enthalpie G°’ 2 (CH3)2-NH + 2 H2O 3 CH4 + CO2 + 2 NH3 1 EINLEITUNG 66 G°’ = -73 kJ mol-1 Formel 25:Bildung von Methan, Kohlenstoffdioxid und Ammoniak aus Dimethylamin und Wasser mit der freien Enthalpie G°’ 4 (CH3)3-N + 6 H2O 9 CH4 + 3 CO2 + 4 NH3 G°’ = -74 kJ mol-1 Formel 26: Bildung von Methan, Kohlenstoffdioxid und Ammoniak aus Trimethylamin und Wasser mit der freien Enthalpie G°’. 4 CH3NH3Cl + 2 H2O 3 CH4 + CO2 + 4 NH4Cl G°’ = -74 kJ mol-1 Formel 27: Bildung von Methan, Kohlenstoffdioxid und Ammoniumchlorid aus Methylammoniumchlorid und Wasser mit der freien Enthalpie G°’ (Liu und Whitman 2008). 2 (CH3)2-S + 2 H2O 3 CH4 + CO2 + 2 H2S G°’ = -49 kJ mol-1 Formel 28: Bildung von Methan aus Dimethylsulfid und Wasser mit der freien Enthalpie G°’. Methanosphaera cuniculi (Biavati et al. 1988), Methanosphaera stadtmaniae (Miller und Wolin 1985, Fricke et al. 2006) und Methanimicrococcus blatticola (Sprenger et al. 2000) bilden Methan aus Methanol mit Wasserstoff als Elektronendonor, wobei Methanimicrococcus blatticola auch Methan aus Methylaminen bilden kann (Formel 24 bis Formel 27). CH3OH + H2 CH4 + H2O G°’ = -113 kJ mol-1 Formel 29: Bildung von Methan aus Methanol und Wasserstoff mit der freien Enthalpie G°’ (Liu und Whitman 2008). Der Ablauf der methylotrophen Methanogenese wird am Beispiel des Methanols erklärt (siehe gestrichelte Pfeile in Abbildung 30). Eine membranständige Methyl-H4MPT-CoM- Methyltransferase (16 in Abbildung 30) überträgt als Erstes die Methylgruppe eines Methanols auf HS-CoM. Der Stoffwechsel spaltet sich an dieser Stelle in einen reduktiven und einen oxidativen Zweig auf. Methyl-S-CoM wird analog zur hydrogenotrophen Methanogenese Methyl-CoM-Reduktasekatalysiert (7 in Abbildung 30) auf HS-CoB übertragen und Methan aus dem Stoffwechsel entlassen. Die folgende Reduktion des Heterodisulfids erfolgt ebenfalls mit einer HeterodisulfidReduktase (9 in Abbildung 30). 1 EINLEITUNG Der zweite Teil beginnt mit einem Methyltransfer auf Tetrahydromethanopterin durch die membranintegrale Methyl-H4MPT-CoM-Methyltranferase (6 in Abbildung 30). Darauf folgt die Oxidation entlang des umgekehrten Wegs der Methanogenese bis zum Kohlenstoffdioxid. Die bei der Oxidation des Methylrests anfallenden Reduktionsäquivalente werden auf das Coenzym F420 übertragen. Die Oxidation von F420H2 mithilfe der membranständigen F420H2-Dehydrogenase ist über Elektronenüberträger innerhalb der Membran mit der Reduktion des Heterodisulfids CoM-S-SCo-B gekoppelt. Diese exergone Reaktion ist wiederum mit dem Aufbau eines Protonengradienten verbunden, der zur ATP-Synthese genutzt wird. 67 1 EINLEITUNG 68 1.10 Ziele der vorgelegten Arbeit In dieser vorliegenden Dissertation sollten anaerobe Bakterien identifiziert und isoliert werden, die bei der syntrophen Oxidation von Propionsäure beteiligt sein können. Zu einem Teil sollte gezeigt werden, inwieweit Mikroorganismen aus NawaRo-Biogasanlagen und propionsäureoxidierender Anreicherungskulturen kultivierbar sind und zum anderen Teil mögliche syntrophe Beziehungen zwischen diesen Mikroorganismen ermittelt werden. Für CoKultivierungen mit möglicherweise an dem anaeroben Abbau von Propionsäure beteiligten Bakterien sollten aus NawaRo-Biogasanlagen methanogene Archaea isoliert werden. Auf einer im Rahmen des vom Bundesministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz (BMELV) über den Projektträger Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.V. (FNR) geförderten Forschungsvorhabens mit dem Thema ‚Früherkennung und Behebung von Fehlgärungen zur Erhöhung der Prozesssicherheit und Schadensverhütung in Biogasanlagen unter besonderer Berücksichtigung der Propionsäurebildung‘ wurden Propionsäure abbauende Mischkulturen vom Forschungsprojektpartner angereichert basierend auf einem theoretisch Propionsäure versäuerten System. Diese Anreicherungskulturen sollten in dieser Arbeit analysiert werden, um Anhaltspunkte für definierte Co-Kulturen zur Regulierung von mit Propionsäure versäuerten Biogasanlagen zu erhalten. Durch Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopie sollten die Zellmorphologie und die Zellzahl mit mikrobiologischen Methoden bestimmt werden. Die Physiologie von Mischkulturen und methanogener Reinkulturen sollten mithilfe des Angebots unterschiedlicher Substrate chemisch mit HPLC und GC Messungen analysiert werden. Syntrophe Beziehungen zwischen einzelnen Mikroorganismen sollten durch chemische Analysen gezielter Mischkulturen ermittelt werden. Bakterielle und archaeale chromosomale 16S rDNA aus NawaRo-Biogasanlagen sowie eigenisolierter Kulturen sollten mithilfe molekularbiologischer Methoden mit PCR-Methoden mit bakteriellen- als auch tdPCR-Methoden mit archaealen Oligonukleotiden vervielfältigt werden. Daraus erhaltene 16S rDNA Fragmente sollten über gelchromatographische Methoden wie DGGE/TGGE und RFLP aufgetrennt respektive eingruppiert und die Arten durch Sequenzierung identifiziert werden. Im Zuge der molekularbiologischen Analyse sollte außerdem gezeigt werden, ob die DNAFingerprintmethode SAPD-PCR (Fröhlich und Pfannebecker, 2006, 2007) geeignet ist, um Stämme methanogener Archaea voneinander zu unterscheiden. 2 MATERIAL 69 2 Material 2.1 Geräte und Hilfsmittel Agarose-Gelelektrophorese-Einheit Gelkammer, Sub Cell Model 96 Bio-Rad, München Spannungsgeräte Power Pac Basic Bio-Rad, München Power Source VWR International GmbH, Darmstadt E122 Consort, Parklaan, Belgien Gene Power Supply GPS 200/400 Pharmacia, Berlin Agarplattendruckbehälter IMW Eigenbau IMW, Mainz Anaerobenkulturröhrchen mit Butylstopfen und Loschschraubdeckeln Ochs, Bovenden/ Lenglern AnaerobenzeltCoy Laboratory Products Inc., USA Autoklaven Tecnomara Tecnomara, Fernwald BildbearbeitungssoftwareIrfanView Microsoft Deutschland GmbH, Unterschleißheim Begasungsanlage Drägerwerk AG und Co. KGaA, Lübeck Cellulosefilter, 0,2 µm VWR International GmbH, Darmstadt Dauerkultursystem IMW Eigenbau IMW, Mainz Schutzhaube mit Wanne IMW Eigenbau Gasdichte Schläuche Ochs, Bovenden/ Lenglern Verbindungsstücke, Rückschlagventile Roth, Karlsruhe DGGE-Elektrophorese-Einheit (D Gene™ System) Bio-Rad, München Gel-Gießstand Elektrophoreseapparatur Gradientenmischer IMW Eigenbau IMW, Mainz Einmalimpfösen VWR International GmbH, Darmstadt Einmalkanülen, 0,65 x 30 mm (blau) Ochs, Bovenden/ Lenglern 2 MATERIAL 70 Fluoreszenzmikroskopie Carl ZeissLichtfilter 01 Carl Zeiss, Oberkochen KeyanceBIOZERO BZ8000 Keyence, Neu-Isenburg Lichtfilter435 nm SoftwareBZ Viewer Gaschromatograph GC-2014 Shimadzu, Duisburg InjektorDINJ (manuell) Shimadzu, Duisburg SäuleCarbosieve SII: 3 mm, Sigma, München 100/120 µm, 250 °C Wäremleitfähigkeitsdetektor Shimadzu, Duisburg TrägergasHelium [He] Shimadzu, Duisburg SoftwareLab Solution GC Shimadzu, Duisburg HPLC-System (organische Säuren) Shimadzu, Duisburg Automatischer Probengeber,SIL-20A HT Shimadzu, Duisburg Entgaser,DGU-20A3 Shimadzu, Duisburg Pumpen A und B,LC-20AD Shimadzu, Duisburg Controller,CBM-20A Shimadzu, Duisburg Vorsäule (in Ofen), Prontosil C18SH Sigma, München Ionentauscher-Säule (in Ofen), Sigma, München Prontosil C8SH UV-VIS Detektor,SPD-10A VP Shimadzu, Duisburg RI-Detektor,ERC-7515B Shimadzu, Duisburg Rechner,DELL Optiplex X620 Dell, Frankfurt Software,LC-Solution Shimadzu, Duisburg HPLC-System (Aminosäuren) Shimadzu, Duisburg Automatischer Probengeber,SIL-20AC HT Shimadzu, Duisburg Entgaser,DGU-20A3 Shimadzu, Duisburg Pumpen A und B,LC-20AD Shimadzu, Duisburg Controller,CBM-20A Shimadzu, Duisburg Säule (in Ofen), Prontosil NC (250x4,6 mm), Spheribond ODS 1 5,0 µm Sigma, München Fluoreszenzdetektor,RF-535 Shimadzu, Duisburg Rechner,DELL Optiplex X620 Dell, Frankfurt Software,LC-Solution Shimadzu, Duisburg 2 MATERIAL 71 HPLC-System (Zucker) Shimadzu, Duisburg Automatischer Probengeber, Shimadzu, Duisburg SIL-10ADVP PumpeCC-10ADVP Shimadzu, Duisburg Säule (in Ofen),Aminex HPX-87H, 300 mm x 7.8 mm Bio-Rad Laboratories, München RI-Detektor, 156 Beckmann DruckerC-R8A Shimadzu, Duisburg Inkubatoren 2736 Köttermann, Uetze/ Hänigsen Modell 400 Memmert GmbH+Co KG, Schwabach Innova 4360 New Brunswick Scientific, Nürtingen Modell G25 New Brunswick Scientific, Nürtingen Excella E24 New Brunswick Scientific, Nürtingen Insulinspritzen 1 mL, 10 mL Ochs, Bovenden/ Lenglern Phasenkontrastmikroskop Carl Zeiss, Oberkochen Phylogenetische Analysen arb Technische Universität München blastn (online tool) National Center for Biotechnology Information (NCBI), National Library of Medicine, Bethesda USA ClustalW (online tool) European Bioinformatics Institute, Cambridge, UK GeneDoc Nicholas und Nicholas, 1997 Mega 4.1 (beta) Tamura et al., 2007, Center for Evolutionary Functional Genomics, Tempe, USA Tree View 1.6.6 Roderic, D. M. Page, Division of Environmental and Evolutionary Biology, Glasgow, UK WU-BLAST (online) European Bioinformatics Institute, Cambridge, UK Polycarbonat-Membranrundfilter (25 mm Durchmesser, 0,2 µm Porenweite Sartorius, Göttingen PräsentationsbearbeitungssoftwarePowerpoint Microsoft Deutschland GmbH, Unterschleißheim Serumflschen 1 L, 0,5 L, 0,1 L Ochs, Bovenden/ Lenglern TabellenkalkulationssoftwareExcel Microsoft Deutschland GmbH, Unterschleißheim 2 MATERIAL TGGE System 72 Biometra, Göttingen Gelgießstand Elektrophorese Apparatur Thermocycler Mastercycler gradient Eppendorf, Hamburg MJ Mini Bio-Rad, München Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg Wirbelmixer Vibrofix VF1 Electronic Ika Labortechnik, Staufen Wasserbäder GFL, Burgwedel Typ 1083 Typ1003 Vakuumisiergeräte Eppendorf, Hamburg Speedvac Membranpumpe VWR International GmbH, Darmstadt Ultraschallbad, Sonorex Bandelin, Berlin Zentrifugen Zentrifuge 5415 D Eppendorf, Hamburg Cryofuge 5000 Heraeus, Hanau Rotor 5260 Zentrifugationsfilter PES-Membran, Porengröße: 3K VWR International GmbH, Darmstadt 2.2 Chemikalien Acrylamid/ Bisacrylamid (40 %) Roth, Karlsruhe Agar Hartge, Hamburg Agarose: peqGold Standard-Agarose Peqlab, Erlangen Ammoniumpersulfat Roth, Karlsruhe -Mercaptoethanol Roth, Karlsruhe Borsäure Roth, Karlsruhe Butanol Roth, Karlsruhe Chloroform Merck, Darmstadt Cycloheximid Sigma, München Cysteinhydrochlorid Monohydrat Roth, Karlsruhe DABCO (1,4-Diazabicyclo(2,2,2)Oktan) Sigma, München Dansylchlorid (1-Dimethylaminonaphtalin-5-sulfonylchlorid) Sigma, München DAPI (4 ,6-Diamidin-2-phenylindol) Fluka, Neu-Ulm 2 MATERIAL 73 DEPC-Wasser Roth, Karlsruhe Di-Ammoniumhydrogencitrat Merck, Darmstadt Di-Kaliumhydrogenphosphat Roth, Karlsruhe Di-Natriumhydrogenphosphat Roth, Karlsruhe Dimethylformamid Sigma, München Dimethylsulfoxid Roth, Karlsruhe EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) Roth, Karlsruhe Essigsäure 100 % (Eisessig) Roth, Karlsruhe Ethanol Roth, Karlsruhe Ethidiumbromid 98 % Roth, Karlsruhe Formamid Sigma, München Formiergas 95/5 Westfalen AG, Münster Fumarat (rans-Ethylendicarbonsäure) Roth, Karlsruhe Glukose Roth, Karlsruhe Harnstoff Roth, Karlsruhe Hefeextrakt (Typ 900) Hartge, Hamburg Isoamylalkohol Merck, Darmstadt Isopropanol (2-Propanol) Roth, Karlsruhe Kaliumchlorid Roth, Karlsruhe Kaliumdihydrogenphosphat Roth, Karlsruhe Kohlenstoffdioxid Westfalen AG, Münster Magnesiumsulfat Roth, Karlsruhe Mangansulfat Roth, Karlsruhe Methanol Roth, Karlsruhe Natriumacetat Roth, Karlsruhe Natriumchlorid Roth, Karlsruhe Natriumdodecylsulfat Roth, Karlsruhe Natriumdisulfid Nonahydrat Sigma, München Natronwasserglas 35 % Roth, Karlsruhe Phenol Roth, Karlsruhe Phosphorsäure 80 % Merck, Darmstadt Pepton aus Casein (tryptisch verdaut) Hartge, Hamburg Resazurin (7-Hydroxy-3H-phenoxazin-3-on-10-oxid) Roth, Karlsruhe Sorbitol Roth, Karlsruhe Stickstoff Westfalen AG, Münster TEMED (Tetramethylethylendiamin) Roth, Karlsruhe Trinatriumcitrat Roth, Karlsruhe TRIS (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol) Roth, Karlsruhe 2 MATERIAL 74 TritonX®-100 (Polyethylenglycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-Phenylether) Merck, Darmstadt Tween 80 (Polyoxyethylen(20)-sorbitan-monooleat) Merck, Darmstadt Wasser (deion.): Milli RO Plus 30 Millipore, Eschborn Wasser (doppelt deion.): Milli-Q Plus 185 Millipore, Eschborn Wasserstoff (80 %), Kohlenstoffdioxid (20 %) Westfalen AG, Münster 2.3 Biochemikalien, Enzyme und Kits 2.3.1 Biochemikalien Ampicillin Sigma, München Bacitracin Serva, Heidelberg Colistinsulfat Roth, Karlsruhe DNA-Längenstandard (0,5 µg µL-1) Fermentas, St. Leon-Rot GeneRuler™ DNA Ladder Mix SM0331 dNTP-Mix (je 10 mmol L-1) Peqlab, Erlangen dATP, dCTP, dGTP, dTTP Gentamycin Sigma, München -1 Magnesiumchlorid-Lösung (25 mmol L ) Peqlab, Erlangen MassRuler™ (6 x) Loading Dye Solution Fermentas, St. Leon-Rot Oligonukleotide (100 M): Eurofins-MWG, Ebersberg PCR-Primer (100 pmol) MWG-Operon, Köln PCR-Puffer (10 x) Peqlab, Erlangen Rifampicin Roth, Karlsruhe Tetracyclin Serva, Heidelberg Valinomycin Roth, Karlsruhe Vancomycin Roth, Karlsruhe X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indoxyl- -D-galactopyranosid) Roth, Karlsruhe 2 MATERIAL 75 2.3.2 Enzyme Lysozym aus Hühnereiweis (75,579 U) Sigma, München Proteinase K (>600 mAU mL-1) Qiagen, Hilden -1 Taq-Polymerase (5 U L ) Peqlab, Erlangen HaeII/ BsuRI (20000 U) New England Biolabs, Massachusetts HaeIII (10000 U) New England Biolabs, Massachusetts 2.3.3 Kits DNA-Isolierung DNeasy® Blood and Tissue Kit Qiagen, Hilden GeneMATRIX Soil Purification Kit Roboklon GmbH, Berlin GeneMATRIX Stool Purification Kit Roboklon GmbH, Berlin ® QIAamp DNA Stool Mini Kit Qiagen, Hilden Klonierung TOPO TA Cloning® Kit for Sequencing Invitrogen GmbH, Karlsruhe PCR-Produktaufreinigung QIAquick® PCR Purification Kit Qiagen, Hilden 2.4 Synthetische Oligonukleotide Zur Berechnung der mittleren Schmelztemperatur (Tm) der synthetischen Oligonukleotide (Primer) wurde die Anzahl (n) an Adenin (A), Tymin (T), Guanin (G) und Cytosin (C) berücksichtigt. Dabei ist s die Menge aller Nukleoside der Sequenz. Formeln zur Tm-Berechnung (Eurofins MWG Operon, Köln). Oligonukleotid kleiner als 15 Basen: Tm [ C] 2 nA nT 4 nG n C 2 MATERIAL 76 Oligonukleotid größer als 15 Basen: TM [ C] 69.3 41(n G n C ) 650 s-( ) s Tabelle 8: Zur Sequenzierung bakterieller 16S rDNA verwendete synthetische Oligonukleotide Oligonukleotid 100 pmol Sequenz (5’ 3’) bp GC [%] Tm [°C]a BSF81 (forward) AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 20 50 57,3 BSR1541 (reverse) AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA 20 60 61,4 Eubac5 (forward) AGA GTT TGA TCM TGG CT 16 50 54,1 Eubac3 (reverse) AGA AAG GAG GTG ATC C 17 44 53,5 Eub519fGC (forward) [CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CGG CCG CC] CAG 55 CAG CCG CGG TAA TA 78 88,5 Eub519f (forward) CAG CAG CCG CGG TAA TA 17 59 50 Eub1070r (reverse) AGC TGA CGA CAG CCA T 16 56 46 1 1 Coton und Coton 2005, Wilmotte et al. 1993 a Mittlere Schmelztemperaturen laut Angaben des Herstellers. Tabelle 9: Zur Sequenzierung der 16S rDNA methanogener Archaea verwendete synthetische Oligonukleotide Oligonukleotid 100 pmol Sequenz (5’ 3’) bp GC [%] Tm [°C]a Ar1000f1 (forward) AGT CAG GCA ACG AGC GAG A 19 57,9 62,32 GCAr1000f (forward) [CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CGG CCG CC] AGT 57 CAG GCA ACG AGC GAG A 40,4 91,37 Ar1500r1 (reverse) GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 19 42,1 55,85 Met86f (forward) GCT CAG TAA CAC GTG G 16 56,25 56,71 Met1340r2 (reverse) CGG TGT GTG CAA GGA G 16 62,5 59,28 2 a Mittlere Schmelztemperaturen laut Angaben des Herstellers, 1 Yanagita et al. 2000, Tatsuoka et al. 2007, 2 Wright und Pimm 2003 2 MATERIAL 77 Tabelle 10: Zur SAPD-PCR verwendete synthetische Oligonukleotide Oligonukleotid 100 pmol Sequenz (5’ 3’) bp GC [%] Tm [° C]a A-Not AGC GGC CGC A 10 80 47,6 C-Not AGC GGC CGC C 10 90 51,8 G-Not AGC GGC CGC G 10 90 51,8 T-Not AGC GGC CGC T 10 80 47,6 SAPD-PCR Primer a: Mittlere Schmelztemperaturen laut Angaben des Herstellers (Fröhlich und Pfannebecker 2006, Pfannebecker und Fröhlich 2008). 2.5 Puffer und Lösungen 2.5.1 Klassische DNA-Isolierung Tabelle 11: Zur klassischen DNA-Isolierung benötigte Lösungen Lösung Zusammensetzung Lagerung Phenol Phenol Lagerung bei 4 °C Phenol/ Chloroform 1:1 Lagerung bei 4 °C, die Lösung ist für 4 Wochen stabil Chloroform/ Isoamylalkohol 24:1 Lagerung bei 4 °C, die Lösung ist für 4 Wochen stabil 3 M Natriumacetat 3 M Natriumacetat, pH 5,2 Lagerung bei 4 °C 30 minütigem Autoklavieren nach TE-Puffer 10 mmol L-1 Tris - HCl (pH 7,4) Lagerung bei 4 °C 1 mmol L-1 EDTA (pH 8,0) 30 minütigem autoklavieren nach Zelllyse-Puffer TRIS, pH 8,0 20 mmol L-1 EDTA 2 mmol L-1 Triton X®-100 1,2 % Deion. Wasser ad 50 mL Lysozym (kurz vor Gebrauch lösen) 20 mg mL-1 2 MATERIAL 78 2.5.2 Agarose-Gelelektrophorese Agarose 1,0 %, 1,5 %, 2,5 % (w/v) Natronwasserglas 35 % 0,1 % (v/v) 1 x TBE-Puffer (pH 8,3) APS-Lösung (1 M) Ammoniumpersulfat 0,228 g deion. Wasser ad 1 mL DNA-Färbelösung Ethidiumbromid (10 mg mL-1) deion. Wasser 35 L 500 mL TAE-Elektrophoresepuffer (50 x, pH 7,4) TRIS Essigsäure EDTA 2 H2O Deion. Wasser 121,00 g 28,55 g 9,30 g ad 500,00 mL TBE-Elektrophoresepuffer (10 x, pH 8,3) TRIS 890 g Borsäure 890 g EDTA 2 H2O Natriumhydroxid Deion. Wasser 20 g 0,1 % ad 1000 mL 2 MATERIAL 79 2.5.3 Denaturierende Gradienten Gel Elektrophorese Tabelle 12: Zusammensetzung eines denaturierenden Gels für eine Gradienten Gel Elektrophorese (DGGE) Agenzien Lösung A 30 % Lösung B 70 % Lösung A 40 % Lösung B 60 % denaturierend denaturierend denaturierend denaturierend Harnstoff [g] 2,14 5,00 2,85 4,29 Formamid [mL] 2,04 4,76 2,72 4,08 TAE 50fach pH 7,4 [mL] 0,34 0,34 0,34 0,34 Acrylamid/ Bisacrylamid [mL] 2,77 2,77 2,77 2,77 Doppelt deion. W asser [mL] 10,15 5,17 9,6 6,9 1 M APS [µL] 11 100 100 100 TEMED [µL] 4 4 4 4 Summe [mL] 15 15 15 15 2.5.4 Temperatur Gradienten Elektrophorese Tabelle 13: Zusammensetzung eines Maxi-Gels für eine Temperatur Gradienten Elektrophorese (TGGE) Agenzien Harnstoff [g] 50 mL 24,32 TAE (1 x) [mL] 5,00 Polyacrylamid [mL] 7,50 Glycerol [mL] 2,50 Formamid [mL] 10,00 1 M APS [µL] 0,04 TEMED [µL] 0,045 Gel 2 MATERIAL 80 2.5.5 DAPI-Färbung 1 mg mL-1 DAPI-StammlösungLagerung bei -20 °C, lichtempfindlich DABCO-LösungAntibleichmittel, Lagerung bei -20 °C 2.5.6 HPLC-Puffer Messung organischer Säuren Puffer A50 mmol L-1 Phosphorsäure Puffer B100 % Methanol Messung von Zuckern Puffer0,013 N H2SO4 Messung von Aminosäuren Puffer A50 mmol L-1 Natriumacetat, pH 6,3 Puffer B25 % Methanol 2.5.7 DC-Puffer Verhältnis Butanol, reinst 4 100 % Essigsäure (Eisessig) 1 doppelt deionisiertes Wasser 1 2.6 Nährmedien Die in dieser Arbeit verwendeten komplexen Nährmedien wurden den digital archivierten Angaben der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ 2012, Braunschweig) entnommen und teilweise den Bedürfnissen der Mikroorganismen angepasst, außer die Zusammensetzung der Media PI und PIII. Diese Medien wurden von Herrn Dr. Dröge übernommen. Ohne Modifikationen wurden DSMZ Medium 157 für Wolinella succinogenesT DSM1740, DSMZ Medium 846 für Aminobacterium colombienseT DSM12261 und DSMZ Medium 520, sowie DSMZ Medium 1264 zur Kultivierung der propionsäureabbauenden Mischkulturen mit alternativen Substraten verwendet. 1 L des DSMZ Mediums 110 Clostridium 2 MATERIAL 81 sartargoformeT DSM1292 für wurde mit 175 g Fleischextrakt statt 500 g basisch angelöstem Pferde-Hackfleisch, ohne Haeminlösung, sowie ohne K1- beziehungsweise K3-Lösung hergestellt. DSMZ Medium 63 wurde mit 2 g Acetat statt Lactat und mit einer Atmosphäre aus 80 % H2/ 20 % CO2 hergestellt. Für den Plattenguss wurde jedem Nährmedium 15 g L-1 BactoAgar zugegeben. Alle Nährmedien wurden 30 min im Ultraschallbad entgast. Darauf wurden die Medien in eine Anaerobenkammer eingeschleußt und eine kleine Spatelspitze Dithionit eingerührt. Im Zelt wurden die Medien in anaerobe Kulturgefäße aliquotiert und mit Butylstopfen verschlossen, welche mit Schraubdeckeln beziehungsweise Aluminiumkappen fixiert wurden. Aus dem Zelt ausgeschleußt, wurden die Medien mit dem dafür vorgesehenen Gasgemisch (N2, 80 % N2/ 20 % CO2 oder 80 % H2/ 20 % CO2) 15 min bei 121 °C autoklaviert. Einigen Medien wurden Spurenelement- und Vitaminlösung zugesetzt. Diese Spurenelement- und Vitaminlösung wurden durch sterile 0,2 µm Cellulosefilter steril filtriert und sind folgend aufgelistet. 1 L Vitaminlösung (DSMZ 2012) Biotin 2,0 mg Folsäure 2,0 mg Pyridoxin-Hydrochlorid 10,0 mg Thiamin-Hydrochlorid x 2 H2O 5,0 mg Riboflavin 5,0 mg Nikotinsäure (Vitamin B3) 5,0 mg Panthotensäure (Vitamin B5) 5,0 mg Cobalamin (Vitamin B12) 0,1 mg p-Aminobenzoesäure 5,0 mg Liponsäure 5,0 mg deion. Wasser 1000,0 mL 2 MATERIAL 82 1 L Spurenelementlösung (DSMZ 2012) Nitrilotriessigsäure (NTA) 12,80 g FeCl3 x 6 H2O 1,35 g MnCl2 x 4 H2O 0,10 g CoCl2 x 6 H2O 24,00 mg CaCl2 x 2 H2O 0,10 g ZnCl2 0,10 g CuCl2 x 2 H2O 25,00 mg H3BO3 10,00 mg Na2MoO4 x 2 H2O 24,00 mg NaCl 1,00 g NiCl2 x 6 H2O 0,12 g Na2SeO3 x 5 H2O 26,00 mg deion. Wasser 1000,00 mL Zuerst wurde NTA in 200 mL deionisiertem H2O gelöst und mit 1 N KOH auf pH 6,5 eingestellt, danach alle Mineralien dazugegeben. Oben aufgeführte Spurenelement- und Vitaminlösungen wurden für alle Medien außer dem lysogeny broth-Medium (unten) und dem DSMZ Medium 334 (Seite) verwendet. Auf den nächsten Seiten sind die modifizierten Medien aufgeführt. 1 L modifiziertes lysogeny broth-Medium (LB-Medium, Bertani 1951) Hefeextrakt 5,0 g Pepton aus Casein (tryptisch verdaut) 10,0 g NaCl 10,0 g deion. Wasser 1000,0 mL Für selektive Agarplatten wurden 100 µg L-1 Ampicillin und 40 µg L-1 x-Gal (40 mg mL-1 in Dimethylformamid) steril filtriert zugegeben. 2 MATERIAL 83 1 L Medium PI zur Kultivierung Autoklavieren, Dr. Dröge) KH2PO4 Propionsäureabbauer 7 H2O NaCl vor 0,4 g 0,4 g 2 H2O 50,0 mg NH4Cl 0,3 g NaHCO3 4,0 g FeSO4 x 7 H2O 2,0 mg Propionsäure 1,5 g (w/v) 1 Reaktorfiltrat 100,0 mL Resazurin 1,0 mg Cystein 0,5 g Spurenelementlösung (siehe Seite 82) 2,5 mL Vitaminlösung (siehe Seite 81) 2,5 mL deion. Wasser 1 (pH 6,8 0,5 g MgSO4 CaCl2 anaerober 900,0 mL Gewonnen durch Zentrifugation (Cryofuge 5000, Rotor 5260, 1500 min-1 (500 g)) Filtration von Fermenterinhalt aus Praxisbiogasanlagen durch sterile 0,2 µm Cellulosefilter. Für das Anreicherungsmedium PIII wurde zusätzlich 0,5 g L-1 Hefeextrakt und 1 g L-1 Formiat zugegeben. Während ständigem Rühren wurden Medien PI und PIII im Anaerobenzelt 9 mL beziehungsweise 4,5 mL in 15 mL Anaerobenkultuvierungsröhrchen und 18 mL in 100 mL Serumflaschen portioniert. Die Atmosphäre wurde vor dem Autoklavieren mit 80 % N2 + 20 % CO2 (0,5 bar Überdruck) ausgetauscht. Für Untersuchungen des Substratverhaltens der propionsäureabbauenden Mischkulturen, wurden dem Medium 40 mmol L-1 Fumarsäure und 5 mmol L-1 Bromoethansulfonsäure zugesetzt. 2 MATERIAL 84 1 L Medium 287 modifiziert (pH 6,8 vor Autoklavieren, DSMZ 2012) K2HPO4 0,3 g KH2PO4 0,3 g (NH4)2SO4 0,3 g NaCl 0,5 g CaCl2 x H2O 0,1 g MgSO4 x 7 H2O 0,1 g Spurenelementlösung (siehe Seite 82) 10,0 mL Vitaminlösung (siehe Seite 81) 10,0 mL Reaktorfiltrat 1 50,0 mL NH4Cl 2,0 g Natriumacetat 2,0 g Resazurin 1,0 mg NaHCO3 4,0 g L-Cysteinhydrochlorid Monohydrat 0,5 g Na2S x 9 H2O 0,5 g deion. Wasser 930,0 mL 1 Gewonnen durch Zentrifugation (Cryofuge 5000, Rotor 5260, 1500 min-1 (500 g)) Filtration von Fermenterinhalt aus Praxisbiogasanlagen durch sterile 0,2 µm Cellulosefilter. Während ständigem Rühren wurde Medium 287 im Anaerobenzelt 4,5 mL beziehungsweise 9 mL in 15 mL Anaerobenkultuvierungsröhrchen und 18 mL in 100 mL Serumflaschen aliquotiert. Die Atmosphäre wurde vor dem Autoklavieren mit 80 % H2 + 20 % CO2 (1 bar Überdruck) ausgetauscht. Für Substrattests wurden dem modifizierten Nährmedium 287 2,0 g L-1 Formiat (287F), 10 mL L-1 2-Propanol (287I), 10 mL L-1 Ethanol (287Et) oder 10 mL L-1 Essigsäure (287E) statt 2,0 g L-1 Acetat zugegeben. Für gaschromatographische Messungen wurde dieses Medium ohne Acetat hergestellt. Außerdem wurde ein Minimalmedium (287P) ohne Reaktorfiltrat hergestellt. 2 MATERIAL 85 1 L Medium 318 modifiziert (pH 6,8 vor Autoklavieren, DSMZ 2012) KH2PO4 0,30 g NaCl 0,60 g MgCl2 x 6 H2O 0,10 g CaCl2 x 2 H2O 0,08 g NH4Cl 1,00 g Reaktorfiltrat 1 Methanol 50,00 mL 5,00 mL Spurenelementlösung (siehe Seite 82) 10,00 mL Vitaminlösung (siehe Seite 81) 10,00 mL KHCO3 2,00 g L-Cysteinhydrochlorid Monohydrat 0,30 g Na2S x 9 H2O 0,30 g Resazurin 1,00 mg deion. Wasser 1 930,00 mL Gewonnen durch Zentrifugation (Cryofuge 5000, Rotor 5260, 1500 min-1 (500 g)) Filtration von Fermenterinhalt aus Praxisbiogasanlagen durch sterile 0,2 µm Cellulosefilter. Während ständigem Rühren wurde das Medium 318 im Anaerobenzelt 9 mL beziehungsweise 4,5 mL in 15 mL Anaerobenkultuvierungsröhrchen und 18 mL in 100 mL Serumflaschen portioniert. Die Atmosphäre wurde vor dem Autoklavieren mit 80 % N2 + 20 % CO2 (0,5 bar Überdruck) ausgetauscht. 2 MATERIAL 86 1 L Medium 334 modifiziert (pH 6,8 vor Autoklavieren, DSMZ 2012) KH2PO4 0,30 g NaCl 0,60 g MgCl2 x 6 H2O 0,10 g CaCl2 x 2 H2O 0,08 g NH4Cl 1,00 g Reaktorfiltrat 1 Natriumacetat 50,00 mL 6,80 g Spurenelementlösung (siehe unten) 10,00 mL Vitaminlösung (siehe unten) 10,00 mL KHCO3 2,00 g L-Cysteinhydrochlorid Monohydrat 0,30 g Na2S x 9 H2O 0,30 g Resazurin 1,00 mg Deion. Wasser 1 930,00 mL Gewonnen durch Zentrifugation (Cryofuge 5000, Rotor 5260, 1500 min-1 (500 g)) Filtration von Fermenterinhalt aus Praxisbiogasanlagen durch sterile 0,2 µm Cellulosefilter. Während ständigem Rühren wurde Medium 334 im Anaerobenzelt 9 mL beziehungsweise 4,5 mL in 15 mL Anaerobenkultuvierungsröhrchen und 18 mL respektive 45 mL in 100 mL Serumflaschen aliquotiert. Die Atmosphäre wurde vor dem Autoklavieren mit 80 % N2 (0,5 bar Überdruck) ausgetauscht. 1 L Vitaminlösung für Medium 334 (DSMZ 2012) Biotin 2,0 mg Folsäure 2,0 mg Pyridoxin-Hydrochlorid 10,0 mg Thiamin-Hydrochlorid x 2 H2O 5,0 mg Riboflavin 5,0 mg Nikotinsäure (Vit. B3) 5,0 mg Panthotensäure (Vit. B5) 5,0 mg Cobalamin (Vit. B12) 0,1 mg p-Aminobenzoesäure 5,0 mg Liponsäure 5,0 mg Deion. Wasser 1000,0 mL 2 MATERIAL 87 1 L Spurenelementlösung für DSMZ Medium 334 (DSMZ 2012) Nitrilotriessigsäure (NTA) 12,80 g FeCl3 x 6 H2O 1,35 g MnCl2 x 4 H2O 0,10 g CoCl2 x 6 H2O 24,00 mg CaCl2 x 2 H2O 0,10 g ZnCl2 0,10 g CuCl2 x 2 H2O 25,00 mg H3BO3 10,00 mg Na2MoO4 x 2 H2O 24,00 mg NaCl 1,00 g NiCl2 x 6 H2O 0,12 g Na2SeO3 x 5 H2O deion. Wasser 26,00 mg 1000,00 mL Zuerst wurde NTA in 200 mL deionisiertem H2O gelöst und mit 1 N KOH auf pH 6,5 eingestellt, danach wurden alle Mineralien dazugegeben. 2.7 Organismen In dieser vorliegenden Arbeit wurden eigenisolierte Bakterien (Tabelle 16) aus von Herrn Dr. Dröge (PFI, Pirmasens) zur Verfügung gestellten syntroph propionsäureoxidierenden Anreicherungskulturen (Tabelle 14) aus laufenden NawaRo-Biogasanlagen (Tabelle 18), eigenisolierten methanogenen Archaea (Tabelle 16) aus laufenden NawaRo-Biogasanlagen (Tabelle 18) und Anreicherungskulturen (Tabelle 15) aus Laborfermentern (Klocke et al. 2007, 2009a, b, Nettmann et al. 2010) des Leibniz-Instituts für Agrartechnik Potsdam-Bornim e.V. (ATB) Abteilung Bioverfahrenstechnik AG Molekularbiologie und Stämmen von der Stammsammlung der DSMZ (Tabelle 17) verwendet. 2 MATERIAL 88 Tabelle 14: anaerobe Anreicherungs- und Mischkulturen aus NawaRo-Biogasanlagen (BGA) Kultur a Herkunft, Betreiber (Ort) Ap1 Ap1P Fermenter, Biogasanlage Arenrath GmbH & Co KG (Arenrath) Ap1, IMW (Mainz) Ap1F Ap1, IMW (Mainz) Ap1FB Ap1, IMW (Mainz) a Ap1a Ap1F, IMW (Mainz) Ap1b Ap1FB, IMW (Mainz) Ap1a63-L Ap1a, IMW (Mainz) Ap1a520 Ap1a, IMW (Mainz) Ap1a1264 Ap1a, IMW (Mainz) a Ap3 Fermenter, Biogasanlage Arenrath GmbH & Co KG (Arenrath) Ap3P Ap3, IMW (Mainz) Ap3F Ap3, IMW (Mainz) Ap3FB Ap3, IMW (Mainz) Ap3a Ap3F, IMW (Mainz) Ap3b Ap3FB, IMW (Mainz) a Fp1 Fermenter, Theo & Ingrid & Alexander Friedrich GbR (Hochdorf-Assenheim) Fp1P Fp1, IMW (Mainz) Fp1F Fp1, IMW (Mainz) Fp1FB Fp1, IMW (Mainz) a Fp1a Fp1F, IMW (Mainz) Fp1b Fp1FB, IMW (Mainz) Fp1a63-L Fp1a, IMW (Mainz) Fp1a520 Fp1a, IMW (Mainz) Fp1a1264 Fp1a, IMW (Mainz) a Gp1 Fermenter, BioEnergie Glahn (Zweibrücken) Gp1 Gp1, IMW (Mainz) Gp1F Gp1, IMW (Mainz) Gp1FB Gp1, IMW (Mainz) Gp1a Gp1F, IMW (Mainz) a Gp1b Gp1FB, IMW (Mainz) Gp1b63-L Gp1b, IMW (Mainz) Gp1b520 Gp1b, IMW (Mainz) Gp1b1264 Gp1b, IMW (Mainz) a Kulturen wurden zur Hinterlegung in der institutseigenen Stammsammlung (IMW) übergeben. 2 MATERIAL 89 Fortsetzung Tabelle 14 Kultur Herkunft, Betreiber (Ort) a Wp1 Wp1P Fermenter, Hubert Wagner und Sohn GbR (Steinweiler) Wp1, IMW (Mainz) Wp1F Wp1, IMW (Mainz) Wp1FB Wp1, IMW (Mainz) Wp1a Wp1F, IMW (Mainz) Wp1b Wp1FB, IMW (Mainz) Wp2a63-L Wp2a, IMW (Mainz) Wp2a 520 Wp2a, IMW (Mainz) Wp2a 1264 Wp2a, IMW (Mainz) Wp2a Fermenter, Hubert Wagner und Sohn GbR (Steinweiler) Wp2 Wp2, IMW (Mainz) Wp2F Wp2, IMW (Mainz) Wp2FB Wp2, IMW (Mainz) a Wp2a Wp2F, IMW (Mainz) Wp2b Wp2FB, IMW (Mainz) a Kulturen wurden zur Hinterlegung in der institutseigenen Stammsammlung (IMW) übergeben. Tabelle 15: anaerobe Anreicherungskulturen aus Laborfermentern Kultur Herkunft, Betreiber (Ort) mesophiler Laborfermenter, ATB Abteilung Bioverfahrenstechnik AG Molekularbiologie (Potsdam) mesophiler Laborfermenter, ATB Abteilung Bioverfahrenstechnik AG Molekularbiologie LFP2a (Potsdam) a thermophiler Laborfermenter, ATB Abteilung Bioverfahrenstechnik AG Molekularbiologie LFP3 (Potsdam) thermophiler Laborfermenter, ATB Abteilung Bioverfahrenstechnik AG Molekularbiologie LFP4a (Potsdam) a Kulturen wurden zur Hinterlegung in der institutseigenen Stammsammlung (IMW) übergeben. LFP1a 2 MATERIAL 90 Tabelle 16: Eigenisolierte Bakterien und methanogene Archaea aus Biogasanlagen (BGA) und Laborfermentern Speziesa Clostridium sartagoforme Stamm Ap1a520 Methanobacterium formicicum Stamm BEG1 Methanobacterium formicicum Stamm HWS1 Methanobacterium formicicum Stamm LFP4.1 Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 Methanoculleus bourgensis Stamm TAF1.1 Methanoculleus bourgensis Stamm BEGN Methanoculleus bourgensis Stamm HWS1.1 Methanomethylovorans sp. Stamm LFP3.1 Methanosaeta concilii Stamm BEG4 Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 Methanosarcina mazei Stamm BEG3 Methanosarcina mazei Stamm LFP2.1 Methanosarcina mazei Stamm TAF1.2 Methanosarcina siciliae Stamm BEGN2 Proteiniphilum acetatigenes Stamm Fp1a520 a Eigenisolate wurden zur Hinterlegung in der Herkunft (Ort) Isoliert aus 1 Arenrath Fermenter 2 Zweibrücken Fermenter Steinweiler3 Fermenter 4 Potsdam Laborfermenter Hochdorf-Assenheim5 Fermenter Hochdorf-Assenheim5 Fermenter Zweibrücken2 Nachgärer Steinweiler3 Fermenter 4 Potsdam Laborfermenter 2 Zweibrücken Fermenter Steinweiler3 Fermenter 2 Zweibrücken Fermenter 4 Potsdam Laborfermenter Hochdorf-Assenheim5 Fermenter Zweibrücken2 Nachgärer Hochdorf-Assenheim5 Fermenter institutseigenen Stammsammlung (IMW) übergeben. 1 Biogasanlage Arenrath GmbH & Co KG = A, 2 BioEnergie Glahn = BEG, 3 Hubert 4 Wagner und Sohn GbR = HWS, Laborfermenter (Klocke et al., 2007, 2009a, b, Nettmann et al. 2010) des Leibniz-Instituts für Agrartechnik Potsdam-Bornim e. V. (ATB) Abteilung Bioverfahrenstechnik AG Molekularbiologie = LFP, GbR = TAF 5 Theo & Ingrid & Alexander Friedrich 2 MATERIAL 91 Tabelle 17: Verwendete Stämme aus der Stammsammlung der DSMZ (Braunschweig) Stamma Spezies Herkunft Medium (DSMZ 2012) DSM12261 DSM1292T Aminobacterium colombiense Clostridium sartagoforme DSMZ DSMZ DSMZ 846 DSMZ 110, modifiziert DSM11263T Geovibrio thiophilus DSMZ DSMZ 63, modifiziert Methanobacterium formicicum DSMZ DSMZ 287, modifiziert T T DSM1535 T Methanoculleus bourgensis DSMZ DSMZ 287, modifiziert T Methanomethylovorans hollandica DSMZ DSMZ 318, modifiziert T DSM17232 Methanomethylovorans thermophila DSMZ DSMZ 318, modifiziert DSM2139 Methanosaeta concilii Opficon DSMZ DSMZ 344, modifiziert Methanosarcina barkeri DSMZ DSMZ 318, modifiziert Methanosarcina mazei DSMZ DSMZ 318, modifiziert Wolinella succinogenes DSMZ DSMZ 157 DSM3045 DSM15978 T DSM800 T DSM2053 T DSM1740 T = Typstamm; a Stämme wurden zur Hinterlegung in der institutseigenen Stammsammlung (IMW) übergeben. 3 METHODEN 92 3 Methoden In Biogasanlagen stellt Propionsäure ein besonderes Problem dar, weil diese kurzkettige Fettsäure anaerob nur endergon und mit einem Wasserstoffpartialdruck unter 9,2 Pa (Gourdon und Vermande 1987) oder 10-4 atm (Abbildung 20, Harper und Pohland 1986) abgebaut wird (Kapitel 1.7.2). In den folgenden Kapiteln des Methodenteils werden die Durchführungen der in dieser Dissertation angewendeten Methoden zur Kultivierung, Charakterisierung und Identifizierung von Mikroorganismen aus NawaRo-Biogasanlagen beschrieben, die bei dem Abbau von Propionsäure beteiligt sein können. 3.1 Probenmaterial aus NawaRo-Biogasanlagen und Laborfermentern propionsäureoxidierende Anreicherungskulturen (Tabelle 14) wurden aus den vier verschiedenen NawaRo-Biogasanlagen (Tabelle 18) von Herrn Dröge in komplexe Medien PI und PIII (Kapitel 2.6) angereichert und für diese Dissertation bereitgestellt. Diese Anreicherungskulturen wurden nach Überimpfung bei 4 °C gelagert. Proben mit einem Volumen von 0,5 - 1 L aus NawaRo-Biogasanlagen (Tabelle 18) wurden dauerkultiviert (Kapitel 3.3), um aus den Dauerkulturen methanogene Archaea zu isolieren (Kapitel 3.3.2). Des Weiteren wurden Proben in 5 mL DSMZ-Medium 287 (circa 2 % Inokulum, Tabelle 15) aus Laborfermentern des Leibniz-Instituts für Agrartechnik Potsdam-Bornim e.V. (ATB) Abteilung Bioverfahrenstechnik AG Molekularbiologie (Klocke et al., 2007, 2009a, b, Nettmann et al. 2010) bereitgestellt, um die kultivierbare Diversität methanogener Archaea aus Laborfermentern mit der aus NawaRoBiogasanlagen zu vergleichen. Die Laborfermenterproben wurden nach Überimpfung (10 % Inokulum) in die DSMZ-Medien (DSMZ 2012) 287 für Methanobacterium (Inkubationstemperatur 39 °C) sowie Methanoculleus (Inkubationstemperatur 30 °C), Medium 318 mit Methanol für Methanosarcina (Inkubationstemperatur 39 °C) sowie Medium 334 für Methanosaeta (Inkubationstemperatur 39 °C) überimpft (Kapitel 3.3.2) und die restlichen Laborfermenterproben bei 4 °C gelagert. Das folgende Pfeildiagramm stellt Durchführung der Anreicherung, Kultivierung und Isolierung sowie morphologische und physiologische Charakterisierung von Mikroorganismen aus NawaRo-Biogasanlagen Laborfermentern und Anreicherungskulturen in chronologischer Reihenfolge dar. 3 METHODEN 93 Probennahme aus Fermentern und Nachgärern verschiedener NawaRo-Biogasanlagen (Tabelle 18) Laborfermentern (Klocke et al., 2007, 2009a, b, Nettmann et al. 2010) und propionsäureabbauender Anreicherungskulturen Anreicherungskulturen in für verschiedene Mikroorganismengruppen abgestimmte synthetische Medien (Kapitel 2.6, 3.3.1 und 3.3.2) Vereinzelung verschiedener Bakterien mit Verdünnungsreihen, Ausplattierungen und Substratwechseln (Kapitel 3.3.1), beziehungsweise bei methanogenen Archaea unter Zugabe von Antibiotika (Kapitel 3.3.2) Morphologische und physiologische Kombination verschiedener methanogener Charakterisierung angereicherter (Tabelle 14) Archaea mit propionsäureabbauenden und isolierter (Tabelle 16) Mikroorganismen Anreicherungskulturen beziehungsweise (Kapitel 3.4) einzelner kultivierbarer Vertreter aus diesen Anreicherungskulturen (Kapitel 3.3.1 und 3.3.2) Anreicherung der effizientesten propionsäureabbauenden Anreicherungskultur im up scalingVerfahren für den Einsatz in NawaRo-Biogasanlagen (Kapitel 3.3.1) Abbildung 31: Pfeildiagramm der chronologischen Durchführung der Anreicherung, Kultivierung und Isolierung sowie die morphologische und physiologische Charakterisierung. Die einzelnen Arbeitsschritte werden in den folgenden Kapiteln erläutert. 3.2 Probennahme aus NawaRo-Biogasanlagen Die Probennahmen für die Anreicherungskulturen propionsäureabbauender Mikroorganismen erfolgten aus den Biogasanlagen Theo & Ingrid & Alexander Friedrich GbR (TAF, HochdorfAssenheim), Hubert Wagner und Sohn GbR (HWS, Steinweiler), BioEnergie Glahn (BEG, Zweibrücken) Biogasanlage Arenrath GmbH & Co KG (Arenrath). Drei der Biogasanlagen (TAF, HWS und BEG) wurden in dieser Arbeit zusätzlich beprobt, um zu analysieren, welche methanogene Archaea aus den Fermentern kultivierbar sind. Tabelle 18 zeigt einige technische Daten der Biogasanlagen zum Zeitpunkt der Probennahmen. 3 METHODEN 94 Tabelle 18: Anlagenparameter der untersuchten Biogasanlagen (BGA) zur Zeit der Beprobung BGA TAF1 BGA HWS2 BGA BEG3 BGA Arenrath4 Fermenter Rührkessel Rührkessel Rührkessel Rührkessel Rührung LARW5/TMRW6 Zentralrührwerk LARW5/TMRW6 LARW5/TMRW6 Vbrutto [m3] 2 x 1260 2 x 1000 1 x 1260 1 x 1.400 Nachgärer Rührkessel Rührkessel Rührkessel Rührkessel Rührung TMRW 6 LARW5 TMRW 6 TMRW 6 Vbrutto [m3] 1 x 1260 1000 1 x 1260 1 x 1400 550 Pel [kW] 380 Pel [kW] 370 Pel [kW] 345 Pel [kW] Fest [t d-1] MS7 [33] MS7/GPS11 [20/2] MS7 [18] Flüssig [m3 d-1] SG10 [6] SG10 [5] SG10 [5] RG9 [10] pH-Wert12 7,2-7,5 7,2-7,6 7,5-7,7 7,3-7,5 40 °C 39 °C 41 °C 40 °C 1400-1500 2000-2500 1800-2000 1500-1700 1000-4500 500-2000 < 250 Leistung 12 Inputstoffe Temperatur 12 -1 NH4-N [mg kg ] -1 Gesamtsäure [mg kg ] 1000-2500 1 TAF = Theo & Alexander Friedrich 3 BEG = BioEnergie 5 LARW = Langachsrührwerk, 8 GS = Grassilage, 12 Glahn, 9 4 2 GbR, HWS = Hubert Wagner und Sohn GbR, Arenrath = Biogasanlage 6 Arenrath TMRW = Tauchmotorrührwerk, RG = Rindergülle, 10 MS7/GS8 [12/8] SG = Schweinegülle, 11 GmbH 7 & Co KG MS = Maissilage, GPS = Ganzpflanzensilage; Spektrum im Betrachtungszeitraum Die Probennahme erfolgte aus Ablassrohren am unteren Teil der Fermenter in 1 L bis 2 L Plastikflaschen mit weitem Hals, die zur Hälfte befüllt wurden. Nach direktem Transport ins Labor wurden die Fermenterproben umgefüllt und als Dauerkultur (Abbildung 32) kultiviert. 3.3 Anaerobe Kultivierung von Mikroorganismen aus NawaRo-Biogasanlagen Direkt nach Überführung der Proben aus NawaRo-Biogasanlagen im Labor wurden 0,5-1 L Serumflaschen bis zur Hälfte mit Fermenterinhalt befüllt und mit einem Metallröhrchen durchstochenen Stopfen verschlossen. Die folgende Abbildung zeigt den Aufbau der Dauerkulturen aus Fermentern und Nachgärern. A 3 METHODEN 95 4 3 5 1 2 B Abbildung 32: Aufbau der temperierten Dauerkulturen mit Schlauchsystem (Eigenbau) zur Abführung des gebildeten Gases; A 1 L Serumflschen mit einem Stahlröhrchen durchstoßenem (Eigenbau) und mit einem Schraubdeckel fixiertem Gummistopfen B 1 Dauerkulturen aus Fermentern und Nachgärern in Serumflschen; 2 temperierbares Wasserbad (39 °C Lagertemperatur); 3 Schutzhaube mit Wanne aus Acrylglas (IMW-Eigenbau); 4 Schlauchsystem (Eigenbau) mit Rückschlagventilen (Roth, Karlsruhe) zur Abführung des gebildeten Gases; 5 Gasabführungsrohr aus Stahl. Metallröhrchen im Stopfen von Serumflaschen fungierten als Auslass für Gas, das von in Serumflaschen befindlichen Dauerkulturen gebildet wurde (Abbildung 32 A). Die Stopfen wurden mit Lochdeckeln fixiert. Diese Kulturen wurden bei 39 °C in Wasserbädern (2 in Abbildung 32 B) dauerkultiviert. Die Röhrchen der Serumflaschendeckel wurden mit je einem gasdichten Schlauch mit einem Schlauchsystem (4 in Abbildung 32 B) verbunden. Der Schlauch war mit einem Einwegventil unterbrochen. Das Einwegventil war gerichtet eingebaut, so dass entstandenes Gas in einen dickeren Schlauch ausströmte und sich nicht über der Dauerkultur sammelte. Der Schlauch endete an einem Stahl-Rohr (5 in Abbildung 32 B). Dieses Rohr ragte durch die Außenwand des Gebäudes, so dass gebildetes Gas ausströmte. Aus den Dauerkulturen aus Biogasanlagen wurden zur Anreicherung methanogener Archaea verschiedene Volumina entnommen und geeignete Medien (Kapitel 2.6) in Anaerobenkulturröhrchen (Balch et al. 1979) mit 5 % und 10 % Inokulum beimpft. Dabei wurden die Gefäße der Dauerkulturen immer in einem Anaerobenzelt mit einer Gasmischung 95 % N2/ 5 % H2 (Formiergas) geöffnet. In alle anaeroben Medien wurde der Farbstoff Resazurin (Sabnis 2007, Twigg 1945) zugegeben. Der Farbstoff reagiert neben dem pH-Wert auf den Redox-Wert einer Lösung. Diese Eigenschaft wurde in anaeroben Medien ausgenutzt, um indirekt die Abwesenheit von Sauerstoff zu 3 METHODEN 96 detektieren. Resazurin ist in oxidiertem Zustand blau gefärbt. Wird Resazurin zu Resofurin reduziert, wandelt sich der blaue der Farbstoff zu pink. Dieser Schritt ist irreversibel. Wird Resofurin reversibel zu Dehydroresofurin reduziert, wechselt die pinke Farbe zu farblos, da der Redox-Wert sinkt. Bei jeder Überimpfung von Kulturen wurde entweder im Anaerobenzelt gearbeitet oder die zu überimpfenden Volumina mit Spritzen mit Gummistempeln (Insulinspritzen) zügig aufgenommen und direkt in das frische Medium überführt, so dass der Indikator Resazurin nicht umschlug. 3.3.1 Isolierung von Bakterien aus syntroph propionsäureoxidierenden Mischkulturen Die von Herrn Dr. Dröge erhaltenen propionsäureabbauenden Anreicherungskulturen (Tabelle 14) aus vier beprobten Biogasanlagen (Tabelle 18) wurden in jeweils 9 mL PI- und PIII-Medium (Kapitel 2.6) mit 10 % Inokulum überimpft und bei 39 °C kultiviert. Die Mischkultur mit dem reproduzierbarsten Abbau von Propionsäure wurde ausgewählt, um propionsäureabbauende Mikroorganismen im up scaling-Verfahren über 18 mL und 180 mL bis zu einem Volumen von 500 mL in PI-Medium zu kultivieren. Für chemisch-analytische Messungen wurden die Mischkulturen in dieser Arbeit in 9 mL PI-Medium und PI-Medium ohne Reaktorfiltrat (PIP) mit 10 % Inokulum bei 39 °C kultiviert. Nach Stams et al. (1993) wurden die propionsäureabbauenden Mischkulturen außerdem mit 40 mmol L-1 Fumarsäure im PI-Medium kultiviert, um den propionsäureabbauenden Mikroorganismen einen weiteren Nährstoff anzubieten, so dass die Möglichkeit bestand, ohne Syntrophie mit anderen Mikroorganismen Propionsäure abzubauen. 5 mmol L-1 Bromoethansulfonsäure wurde zugegeben, um das Wachstum der methanogenen Archaea zu hemmen. Die propionsäureabbauenden Mischkulturen wurden parallel in Medien mit anderen Substraten anstatt Propionsäure mit 10 % Inokulum bei 39 °C kultiviert, um unterschiedliche Bakterien aus den Mischkulturen anzureichern und zu isolieren. Dafür wurden die DSMZ Medien 1264 für Spirochäten, das DSMZ-Medium 520 modifiziert für Clostridien, modifiziertes DSMZ-Medium 63 für Desulfovibrio sp., DSMZ-Medium 846 für Aminobacterium colombiense und DSMZ-Medium 157 für Wolinella succinogenes verwendet (Kapitel 2.6, DSMZ 2012). 3 METHODEN 97 1 2 Abbildung 33: Gas befüllbarer Druckbehälter aus Stahl (IMW Eigenbau) zur Kultivierung von Reinigungsaustrichen anaerober Mikroorganismen aus Biogasanlagen; 1 Manometer von -1 bar bis 3 bar; 2 verschließbares Ventil zur Be- und Entgasung. Anaerobe Bakterien aus den propionsäureabbauenden Mischkulturen Fp1a, Wp2a, Gp1b und Ap1a (Tabelle 14) wurden zur Isolierung im Anaerobenzelt auch auf Agarplatten mit den DSMZMedien 63 (modifiziert), 520 und 1264 (Kapitel 2.6, DSMZ 2012) mithilfe von Einmalimpfösen ausplattiert. Inkubiert wurden die Platten in Druckbehältern aus Stahl (Abbildung 33). Die Druckbehälter wurden für anaerobe Bakterien mit 0,5 bar Überdruck N2 befüllt und bei 39 °C in einem Inkubationsschrank kultiviert. Der Druck wurde täglich über die Anzeige des Manometers (1 in Abbildung 33)kontrolliert und die Gasphase wöchentlich über das Ventil (2 in Abbildung 33) mit einer Begasungsanlage ausgetauscht. Einzelne Kolonien der Mischkulturen Fp1a und Ap1a auf DSMZ-Medium 520-Agarplatten wurden im Anaerobenzelt in flüssiges DSMZ-Medium 520 überimpft. Wöchentlich wurde die Gasphase dieser Flüssigkulturen ausgetauscht und alle zwei bis drei Wochen mit jeweils 10 % Inokulum in frisches DSMZ-Medium 520 überimpft. Die Reinheit der anaeroben Bakterienkulturen wurde durch Phasenkontrastmikroskopie und Analyse der 16S rDNA überprüft. 3.3.2 Anreicherung, Kultivierung und Isolierung methanogener Archaea Aus drei verschiedenen NawaRo-Biogasanlagen (Tabelle 18) wurden Proben (Kapitel 3.2 und 3.3) aus Fermentern verwendet, um in dieser Arbeit methanogene Archaea zu kultivieren und isolieren (Miller und Wolin 1974, Sowers und Noll 1995). Volumina von 50-100 µL wurden aus 3 METHODEN 98 den Fermenterproben (Kapitel 3.2 und 3.3) genommen, um für methanogene Archaea modifizierte komplexe Medien (287, 318, 334 Kapitel 2.6) in Anaerobenkulturgefäßen zu beimpfen. Das Inokulum betrug jeweils 1 - 10 %. Aus diesen Anreicherungskulturen wurden Verdünnungsreihen bis zum Verdünnungsgrad 10 -8 erstellt. Mit den von Herrn Dr. Klocke zur Verfügung gestellten Anreicherungskulturen aus Laborfermentern (Klocke et al., 2007, 2009a, b, Nettmann et al. 2010) wurde ebenso verfahren. Zusätzlich wurden den Kulturen unterschiedliche Antibiotika (Tabelle 19) gegen bakterielle Verunreinigungen zugegeben. Die Antibiotika wurden entweder einzeln oder in Kombination von zwei unterschiedlich wirkenden Antibiotika verwendet, wie zum Beispiel Vancomycin/Tetracyclin oder Ampicillin/Valinomycin. Tabelle 19: Zur Isolierung methanogener Archaea verwendete Antibiotika in alphabetischer Reihenfolge mit Wirkungsweise, verwendeten Konzentrationen und besonderen Eigenschaften Verwendete Konzentration und besondere Eigenschaften Antibiotikum Wirkungsweise Ampicillin Hemmt die Transpeptidierung (Zellwandsynthese) in wachsenden Bakterien; gegen Gram positive und negative Keime, insbesondere gegen Enterokokken (Sambrook und Russel 2001) Stammlösung: 100 mg mL-1 in ddH2O Arbeitslösung: 100 µg mL-1 Bacitracin Greift in die bakterielle Murein-Bio-synthese ein; wirkt als Komplexbildner mit Undecaprenol-diphosphat (Renneberg und Sussbier 2009) Stammlösung: 15 mg mL-1 in ddH2O Arbeitslösung: 15 µg mL-1 in ddH2O Colistinsulfat Reagiert mit Phospholipid-Komponenten der Zytoplasmamembran von Bakterien und macht sie permeabel. Durch Efflux essentieller Komponenten bakterizide Wirkung auch auf nicht proliferierende Keime; Reduktion der antibakteriellen Wirkung durch zweiwertige Ionen (Fe2+, 2+ 2+ 2+ Mn , Ca , Mg ), ungesättigte Fett-säuren und Polyphosphate; wirkt gegen Gram negative Keime und nicht proliferierende Keime (Mortensen et al. 2009) Stammlösung: 50 mg mL-1 in ddH2O Arbeitslösung: 50 µg mL-1 Lösungen von 10 mg mL-1 stabil bei +4 °C über 10 - 14 Tagen; Stabilität: gut bei pH-Werten zwischen 2 und 6; Bei pHWerten über 6,0 langsame Inaktivierung (pH 9 nach 24 Stunden 50 % inaktiviert); bei pH 2 innerhalb 24 Stunden nur 1 % Inaktivierung; ist mit Polymyxin E identisch; cyclisches Pentapeptid mit einer PentapeptidSeitenkette Gentamycin Hemmt die Proteinsynthese durch Bindung an das L6-Protein der ribosomalen 30 SUntereinheit. (Baron 1996) Stammlösung: 10 mg L -1in H20, bei –20 °C lagern Arbeitslösung: 10 g mL-1 löslich in Wasser bis 200 mg mL-1; unlöslich in 50 % Ethanol; giftig Kanamycin Hemmt die Proteinsynthese (Translokation); Gram positive, -negative Kokken und Bakterien (Dingermann et al. 2002) Stammlösung: 100 mg mL-1 in ddH2O Arbeitslösung: 100 µg mL-1 3 METHODEN 99 Fortsetzung Tabelle 19: verwendete Konzentration und besondere Eigenschaften Antibiotikum Wirkungsweise Rifampicin Hemmt die RNA Polymerase, durch Bindung an eine Untereinheit der Polymerase und somit Verhinderung der initialen Bindung der Polimerase an die DNA. (Baron 1996) Stammlösung: 50 mg/mL Stammlösung in Methanol. um Rifampicin vom Boden zu lösen, gründlich vermischen. ~5 Tropfen 10 N NaOH mL-1 zugeben und vermischen. 2 mL in 1 L Medium geben, um die Arbeitslösung 100 µg mL-1 zu erreichen. Alternativ 50 mg mL-1 in DMSO durch wirbelmixen lösen. Keine Natriumhydroxid-Zugabe. Lagerung bei 20 °C. lichtempfindlich Tetracyclin Hemmt die Proteinsynthese durch Verhinderung der Bindung der AminoacyltRNA an die A-Stelle im Ribosom (Baron 1996) Stammlösung: 15 mg mL-1 in 50 % EtOH Arbeitslösung: 15 µg mL-1 lichtempfindlich; für Minimalmedien untauglich Valinomycin Hemmt die Bildung von Membranen (Lars und Jenkins 2007) Stammlösung: 1 mg mL-1 in DMSO Arbeitslösung: 1 µg mL-1 Giftig Vancomycin Hemmt den Zellwandaufbau (Baron 1996) Stammlösung: 50 mg mL-1 in ddH2O Arbeitslösung: 50 µg mL-1 Die Reinheit der methanogenen Eigenisolate wurde durch Kultivierung ohne Antibiotika und anschließender Kontrolle durch Fluoreszenzmikroskopie und Analyse der 16S rDNA überprüft. Archaeale Eigenisolate (Tabelle 16) wurden kombiniert mit syntroph propionsäureoxidierenden Mischkulturen (Tabelle 14) in PI-Medium inkubiert. Dabei wurde jeweils 10 % Inokulum verwendet. Die Kultur LFP3.1 (Tabelle 16) wurde 4 Wochen bei 39 °C und bei 55 °C in DSMZ-Medium 318 (DSMZ 2012) inkubiert, um Unterschiede der wachstumsbedingten Trübung zu ermitteln und eine Zuordnung zu den Typstämmen Methanomethylovorans hollandica DSM15978T oder Methanomethylovorans thermophila DSM17232T (Tabelle 17) zu ermöglichen. 3.4 Physiologische Charakterisierung von Eigenisolaten aus NawaRo-Biogasanlagen und Laborfermentern Die physiologische Charakterisierung von Eigenisolaten aus NawaRo-Biogasanlagen wurde klassisch vorgenommen. Eigenisolate wurden mithilfe eines Phasenkontrastmikroskops morphologisch analysiert. Hierbei wurde das Wachstum bei 400facher Vergrößerung regelmäßig überprüft und Gestalt und Größe der Mikroorganismen bei 1000facher Vergrößerung bestimmt. Bei Bedarf wurden Zellen mit dem DNA-interkalierenden Farbstoff DAPI angefärbt und fotografisch festgehalten. Einige methanogene Eigenisolate haben eine autofluoreszierende 3 METHODEN Eigenschaft durch einen bei der hydrogenotrophen Methanogenese beteiligten Kofaktor F420 (Kapitel 1.5.2.4). Diese Eigenschaft wurde zur genaueren Einordnung methanogener Archaea und zur regelmäßigen Überprüfung des Kulturzustandes verwendet. Mit den methanogenen Eigenisolaten wurden Wachstumsversuche mit unterschiedlichen Substraten durchgeführt, um die Stämme zusätzlich substratbezogen einzuordnen. 3.4.1 Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopie der Eigenisolate Mit einem Phasenkontrastmikroskop (Carl Zeiss) wurde das Wachstum aller in dieser Arbeit bearbeiteten Kulturen regelmäßig überprüft und der visuelle Eindruck schriftlich dokumentiert und gegebenenfalls fotografiert. Zusätzlich wurden die Kulturen methanogener Archaea mit einem Fluoreszenzmikroskop (Keyence) überprüft, welche durch den Kofaktor F420 befähigt waren, eine Autofluoreszenz auszubilden. Unter Einwirkung von gefiltertem Licht (435 nm) wurde die Anregung der Autofluoreszenz provoziert, der Zustand der Kultur bestimmt und bei Bedarf fotografiert. Zur Autofluoreszenz befähigte Stämme wurden in frisches Medium überführt, sobald die Fluoreszenz nachließ oder nicht mehr dauerhaft aufrechterhalten wurde. 3.4.1.1 Titerbestimmung mithilfe der DAPI-Färbung Durch Färbung mit dem Fluoreszenzfarbstoff DAPI (4´,6-Diamidino-2-phenylindol) wurde die Gesamtzahl (Titer) der Mikroorganismen mikroskopisch bestimmt. DAPI bindet an Nukleinsäuren und färbt folglich alle Zellen an. Aus der Anzahl der gefärbten Zellen kann die Gesamtzellzahl pro mL berechnet werden. Dazu wurde 1 mL Probe (gegebenenfalls eine entsprechende Verdünnung in steriler 0,9 % NaCl-Lösung) mit 1 µL DAPI-Stammlösung (Kapitel 2.5.5) versetzt und gemischt. Danach wurde die Probe 5 min im Dunkeln inkubiert. Circa 5 mL destilliertes Wasser wurde auf die Filterfläche vorgegeben, die Probe anschließend zugegeben und kurz mit der Pipette vermischt. Mittels einer Filtrationseinheit wurde die Probe durch einen Polycarbonatfilter gesaugt. Der Polycarbonatfilter wurde daraufhin ausgebaut und im Dunkeln trocknen gelassen. Der getrocknete Filter wurde auf einen Objektträger gelegt, mit einer gekürzten Pipettenspitze 50 µl DABCO-Lösung auf den Filter gegeben und ein Deckglas aufgelegt. Mit dem Fluoreszenzmikroskop (Zeiss) wurde unter UV-Anregung (Filter 01) mikroskopiert. Zur Ermittlung der Zellzahl können 3 Großquadrate ausgezählt werden. Aus der Anzahl der fluoreszierenden Bakterien pro Großquadrat, der effektiven Filterfläche, der OkularGroßquadratfläche, dem verwendeten Volumen und dem Verdünnungsfaktor kann die Gesamtkeimzahl pro mL berechnet werden. 3.4.1.2 Bestimmung des Titers methanogener Archaea Die Keimzahl eigenisolierter methanogener Archaea-Stämme wurde mithilfe einer ThomaZählkammer durchgeführt. Die Schichtdicke der Kammer betrug 0,02 mm und der 100 3 METHODEN 101 Brechungsindex hatte den Wert 0,0025 mm2. Die Mikroorganismen in 4 Großquadraten, bestehend aus 16 Kleinquadraten einer Zählkammer wurden manuell gezählt und die Werte durch die Anzahl der Kleinquadrate geteilt. Dieser Mittelwert der gezählten Mikroorganismenanzahl wurde mit der vorliegenden Verdünnung multipliziert und durch die mit dem Brechungsindex multiplizierte Schichtdicke dividiert. Gesamtzellzahl Zellen = mm Zellzahl in 4x16 Kleinquadraten Verdünnungsfaktor Schichtdicke Brechungsindex Formel 30: Berechnung der Gesamtzellzahl mit einer Toma-Kammer; Schichtdicke = 0,02 mm; Brechungsindex = 0,0025 mm2. Mit Formel 30 wurde die Gesamtzellzahl in Zellen (mm3)-1 berechnet. Durch Addition von 106 wurde die Gesamtzellzahl in Zellen L-1 erhalten. 3.4.2 Bestimmung des Titers propionsäureabbauender Mikroorganismen mithilfe des MPN-Verfahrens Das Verfahren der Titerbestimmung mit der most propable number (MPN, Breitig und Trümping 1982) wurde verwendet, um die Zellzahlen der kultivierbaren syntrophen Bakterien in den untersuchten Anlagen mit dem Medium PI zu bestimmen. Zur Durchführung der MPN-Versuche wurde aus 8-12 Wochen alten propionsäureabbauenden Mischkulturen Ap1a, Fp1a, Gp1b und Wp2a (Tabelle 14) jeweils 1 mL Fermentersubstrat steril entnommen und in Anaerobenkulturröhrchen mit 9 mL des Mediums PI (Kapitel 2.6) verdünnt. Hiervon ausgehend erfolgte eine serielle Verdünnung in Zehnerschritten im fünffachen Parallelansatz. Sämtliche Proben wurden bei 40 °C für 10 Wochen im Dunkeln inkubiert. Der Abbau von Propionsäure wurde mittels HPLC-Analyse (Kapitel 3.6.1) nachgewiesen. Für die Ermittlung der MPN-Zahl wurden die bewachsenen Röhrchen der drei höchsten Verdünnungsstufen gezählt. Eine dreistellige Zahlenfolge resultierte daraus. Die erste Ziffer gab die Anzahl bewachsener Röhrchen der dritthöchsten positiven Verdünnungsstufe, die zweite diejenige der zweithöchsten und die dritte die der höchsten positiven Verdünnungsstufe wieder. Aus einer MPN-Tabelle für fünf Kulturröhrchen (Andrew 1980) wurde die zugehörige MPN-Zahl abgelesen und mit dem Reziprokwert der mittleren der drei herangezogenen Verdünnungsstufen multipliziert (nach Sass 1997). 3.4.3 Wachstumsuntersuchungen methanogener Eigenisolate mit unterschiedlichen Substraten Für Substrattests wurden dem oben beschriebenen DSMZ-Medium 287 statt des Reaktorfiltrats und Acetat verschiedene Substrate als einzige C-Quelle zugesetzt: Auf einen Liter Medium wurden 2,0 g Acetat, 2,0 g Formiat, 10 mL 2-Propanol, 10 mL Ethanol, je 5,0 g Mono-, Di- oder 3 METHODEN Trimethylamin beziehungsweise 40 mL Essigsäure zugegeben. Die Substratmengen wurden aus speziellen Medien für bestimmte Mikroorganismen aus der digitalen Datenbank der Deutschen Stammsammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig) übernommen. Die Atmosphäre über den Medien wurde mit Stickstoff begast. Die mit eigenisolierten Reinkulturen beimpften Medien wurden vier Wochen im Inkubator bei 39 °C inkubiert. Das Wachstum wurde regelmäßig fluoreszenzmikroskopisch überprüft. 3.5 Molekularbiologische Identifizierung von Mikroorganismen aus NawaRo-Biogasanlagen Die molekularbiologische Analyse von Mikroorganismen aus den Fermentern, sowie aus Kulturen wurde hauptsächlich mit Fragmenten partieller 16S rDNA durchgeführt. Um Kontaminationen vorzubeugen, wurde in dieser Arbeit unter sterilen Bedingungen und mit sterilem Arbeitsmaterial gearbeitet, wie beispielsweise mit käuflich erworbenem DEPC-Wasser (Roth, Karlsruhe). Im ersten Schritt wurde chromosomale DNA aus Fermenterinhalt sowie aus Kulturen isoliert. Dies wurde zum einen auf klassischem Weg mit der Phenol/Chloroform-Fällung (Kapitel 3.5.1) und zum anderen mit DNA-Isolierungskits (Kapitel 2.3.3) durchgeführt. Im zweiten Schritt wurde die isolierte chromosomale DNA mithilfe der Polymerase-KettenReaktion (PCR, Kleppe et al. 1971, Mullis et al. 1986) amplifiziert, um Fragmente der 16S rDNA zu erhalten (Kapitel 3.5.2 und 3.5.3). Dafür wurde doppelt deionisiertes Wasser durch einen 0,2 µm Filter steril filtriert, daraufhin 2 h mit UV-Licht bestrahlt und zuletzt 21 min bei 121 °C feucht autoklaviert (PCR-Wasser). Spezifische synthetische Oligonukleotide (Tabelle 8 und Tabelle 9) wurden verwendet, um die16S rDNA zu vervielfältigen. Bei der Analyse von archaealer DNA wurde ein PCR-Programm gewählt, das beim Anlagerungsschritt zunächst einige Zyklen eine Temperaturverminderung vollzieht, um mehr Amplifikat zu erhalten (Kapitel 3.5.3). Des Weiteren wurde in dieser Arbeit die Eignung der SAPD-PCR (Pfannebecker und Fröhlich 2008) zur Unterscheidung archaealer Stämme anhand der chromosomalen DNA gezeigt. Sequenzierungen führen zu zuverlässigen Ergebnissen, wenn die zu sequenzierende DNA zu einem Mikroorganismus gehört. Wenn aus Fermentern isolierte gesamt DNA, also keine Reinkulturen, analysiert wurden, wurde ein Zwischenschritt durchgeführt, bei dem amplifizierte 16S rDNA aufgetrennt wurde, die von mehreren Arten stammen kann. Hierzu wurden drei Methoden verwendet: Die Methode der Denaturierenden-Gradienten-Gel-Elektrophorese (DGGE, Kapitel 2.5.4), der Temperatur-Gradienten-Gel-Elektrophorese (TGGE, Kapitel 2.5.4) und der Klonierung. Bei den ersten beiden Methoden wurden 500 bp große 16S rDNAFragmente nach ihrer Kodierung elektrophoretisch aufgetrennt und eluiert. Eine weitere Methode zur Auftrennung von DNA verschiedener Mikroorganismen war das Klonieren. Hier wurde mit dem TOPO TA Cloning® Kit for Sequencing (Invitrogen GmbH, Karlsruhe) gearbeitet. Mit dieser 102 3 METHODEN 103 Methode wurden längere 16S rDNA-Fragmente als mit den vorher beschriebenen Methoden unterschieden. Prinzipiell wird bei der Klonierungsmethode immer ein Fragment in Escherichia coli kloniert, was gewährleistet, dass jede Zelle nur ein Fragment einer Art aufnimmt. Mit den Klonen wurde eine Kolonie-PCR vorgenommen, bei der ein Abstrich aus jeweils einer KlonKolonie als DNA-Vorlage fungierte. Um die Zellen aufzubrechen und die darin enthaltene DNA freizusetzen, wurde der Initiale denaturierende Schritt zeitlich verlängert. Die Diversität der Klone wurde vorsortiert, indem der Restriktionslängenpolymorphismus (RFLP) genutzt wurde. Die Amplifikate der Kolonie-PCR wurden mit DNA-schneidenden Enzymen (Kapitel 2.3.2) verdaut und die verschiedenen Schnittmuster nach einer Gelelektrophorese miteinander verglichen. Jeweils ein Fragment jedes Musters wurde daraufhin reamplifiziert und sequenziert. Die erhaltenen Sequenzen wurden mittels einer Internetdatenbank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) mit dort eingetragenen Sequenzen verglichen, um die Art zu ermitteln. Da diese Datenbank eine freie Datenbank ist und darin fehlerhafte Sequenzen enthalten sein können, wurden die Sequenzen zusätzlich mit Sequenzen von in der Deutschen Stammsammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig) registrierten Typstämmen verglichen. Folgend ist zur Veranschaulichung des mikrobiologischen und molekularbiologischen Arbeitsvorganges ein Pfeildiagramm (Abbildung 34) in chronologischer Reihenfolge gezeigt. 3 METHODEN 104 DNA-Isolierung aus Fermentern und Kulturen (Kapitel 3.5.1) PCR zur Amplifizierung der 16S rDNA aus isolierter chromosomaler DNA (Kapitel 3.5.2 und 3.5.3) Klonierung von PCR-Produkten in chemisch kompetenten Escherichia coli (Kapitel 3.5.7) Auftrennung von 500 bp großen Fragmenten Kolonie-PCR mit verschiedenen Klonen mittels DGGE beziehungsweise TGGE (Kapitel 3.5.6) Verdau mit DNA-schneidenden Enzymen (RFLP, Kapitel 3.5.8) Reamplifizierung und Aufreinigung der unterschiedlichen 16S rDNA Fragmente (Kapitel 3.5.9) Sequenzierung der Fragmente (Kapitel 3.5.9) BLAST und Alignierung der 16S rDNA Sequenzen zur Ermittlung der Art (Kapitel 3.5.9) Erstellung phylogenetischer Stammbäume aus 16S rDNA Sequenzen (Kapitel 3.5.10) Abbildung 34: Pfeildiagramm des Ablaufs der molekularbiologischen Identifizierung von Mikroorganismen. 3.5.1 Isolierung chromosomaler Gesamt-DNA aus Fermentern und Kulturen Die Isolierung chromosomaler Gesamt-DNA aus Fermentern, Anreicherungs- und Reinkulturen wurde in dieser Arbeit klassisch mit Phenol-Chloroform, sowie mit DNA Isolierungskits (Kapitel 2.3.3) durchgeführt. Für eine klassische DNA-Isolierung wurden 5-10 mL flüssiger Fermenterinhalt beziehungsweise Zellkultur für 5 min bei 5000 x g zentrifugiert und der 3 METHODEN entstandene Zellniederschlag in 0,5 mL TE-Puffer aufgenommen. 0,5 mL Phenol wurden der Suspension zugegeben und durch Auf- und Ab pipettieren gut durchmischt. Für 10 min wurde bei 15000 x g zentrifugiert. Bei der DNA Isolierung wurde darauf geachtet, dass der pH-Wert des Phenols über 7,8 lag, da DNA bei niedrigeren pH-Werten zum großen Teil in die organische Phenolphase eindringt und die Menge an isolierter DNA damit erheblich vermindert wird. Die obere wässrige Phase wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt, 0,3 mL Phenol/ Chloroform (1:1) zugeben, gut durchmischt und 10 min bei 15000 x g zentrifugiert. Wässrige Phasen (oben) wurden mit weiteren Spitzen abgenommen. Durch eine offenere Spitze werden Scherkräfte vermindert, die ein Zerbrechen der DNA zur Folge hätten. Nach einer Wiederholung des letzten Schritts wurde die Probe zunächst mit 0,4 mL Chloroform/ Isoamylalkohol (24:1), dann mit 55 µL einer 3 M Natriumacetatlösung pH 5,2 und 1 mL Isopropanol behandelt, wie im ersten Phenol/Chloroform-Schritt. Der daraus resultierende Niederschlag wurde in 1 mL 70 %igen Ethanol aufgenommen, für 30 min bei -20 °C gelagert und anschließend für 5 min bei 15000 x g zentrifugiert. Der DNA enthaltende Überstand wurde in ein frisches Reaktionsgefäß überführt und die gesamte Flüssigkeit 30 min in einer Vakuumzentrifuge (Speedvac, Eppendorf, Hamburg) verdampft. Die DNA wurde in 20 µL TE-Puffer aufgenommen und wurde bei Bedarf bei -20 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert. Zum anderen wurde chromosomale DNA sowohl aus Fermentern als auch aus Kulturen mithilfe verschiedener Kits isoliert, welche in Kapitel 2.3.3 aufgeführt sind. Der Vorteil der Verwendung der Kits bestand bei gleicher Ausbeute weniger Ausgangsmaterial zu benötigen und Zeit zu sparen. Bei der Durchführung der DNA-Isolation mit Kits, wurde nach Anleitung des Herstellers gearbeitet. 3.5.2 Optimierte Amplifizierung bakterieller 16S rDNA aus chromosomaler DNA für Proben aus NawaRo-Biogasanlagen und daraus stammenden Kulturen Nach der Isolierung chromosomaler DNA aus Fermentern, Anreicherungs- Misch- und Reinkulturen (Kapitel 3.5.1) wurde die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR, Kleppe et al. 1971, Mullis et al. 1986) verwendet, um Fragmente der 16S rDNA zu amplifizieren. Für die Amplifizierung 500 bp großer Fragmente bakterieller 16S rDNA wurden die synthetischen Oligonukleotide 519GCf und 1070r (Tabelle 8) für eine DGGE verwendet. Für die Erhaltung eines PCR-Produkts der fast gesamten bakteriellen 16S DNA wurden die Oligonukleotide BSF8 und BSR1541r (Tabelle 8) verwendet. Mithilfe einer Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR, Tabelle 21) wurden sowohl die Teilsequenz als auch fast die gesamte 16S rDNA aus der isolierten chromosomalen DNA vervielfältigt. Die dafür benötigten Volumina der einzelnen Reagenzien für einen Ansatz ist in Tabelle 20 aufgeführt. 105 3 METHODEN 106 Tabelle 20: PCR-Ansatz (50 µL) für bakterielle DNA Reagenz 1 Ansatz [µL] DNA Je nach Konzentration dNTP´s 1 High Y Puffer 5 Beschleuniger (Enhancer) 5 ad 50 µL PCR-H2O Vorwärts-Oligonukleotid 1 Rückwärts-Oligonukleotid 1 Taq Polymerase (1:5 verd.) 2 Zunächst wurde mit dem PCR-Programm nach Coton und Coton (2005) gearbeitet, bei der die Anlagerungstemperatur 52 °C beträgt. Dies führte jedoch zu ungenügenden Sequenzierungsergebnissen (siehe Kapitel 4.5.1). Daher wurde mittels einer Gradienten-PCR eine Anlagerungstemperatur (Tabelle 21) ermittelt, um zuverlässige Sequenzierungsergebnisse zu erhalten. Ein Thermocycler (Eppendorf) wurde beim Anlagerungsschritt mit einem Temperaturgradient von 52,7 °C bis 62,4 °C pro Reaktionsgefäßstellplatz programmiert. Tabelle 21: Reaktionsbedingungen einer PCR bakterieller 16S rDNA Temperatur [°C] Zeit [min] Zyklen Initiale Denaturierung 95 5 1 Denaturierung 94 1 35 Anlagerung 62,4 1 35 Elongation 72 1,5 35 Abschließende Extension 72 10 1 Gesamt-Zyklen 35 Die initiale Denaturierung erhöhte die Chance, dass möglichst viel einsträngige DNA zur Amplifizierung vorlag. Sie wurde einmalig zu Beginn einer jeden PCR durchgeführt. Am Beginn jedes weiteren Zyklus wurde eine kürzere Denaturierung vollzogen, um die angelagerten Oligonukleotide und Polymerasen von der DNA zu lösen. Auf die Denaturierung folgte die Anlagerung der Oligonukleotide. Jeder Zyklus schloss mit einer Elongation. Die Elongationsdauer wurde so gewählt, dass jede eingesetzte Polymerase ein Duplikat der DNA herstellte. Nach Abschluss der Zyklen wurde eine finale Extension programmiert, in der die Polymerase die bereits entstandenen Fragmente mehrfach zu vervielfältigen. Der Erfolg jeder PCR wurde durch eine Agarosegelelektrophorese (Kapitel 3.5.5) überprüft. 3 METHODEN 107 3.5.3 Amplifizierung der 16S rDNA aus archaealer chromosomaler DNA Nach der DNA-Isolierung aus methanogenen Kulturen sowie methanogenen Reinkulturen wurde die touch-down Polymerase-Ketten-Reaktion (td-PCR, Don et al. 1991) gewählt, um die Ausbeute des Amplifikats zu erhöhen. Mithilfe der touch-down-PCR wurde sowohl eine Teilsequenz als auch fast die gesamte 16S rDNA aus isolierter chromosomalen DNA vervielfältigt. 500 bp große Fragmente der archaealen 16S-rDNA wurden mithilfe der synthetischen Oligonukleotide GCAr1000f und Ar1500r (Tabelle 9) amplifiziert. Die daraus resultierenden Sequenzen ließen eine Zuordnung zu einer Gattung zu. Artspezifisch wurden die Mikroorganismen aus Fermentern und methanogener Reinkulturen mit bis zu 1245 bp langen Sequenzen zugeordnet, da die 1245 bp langen Fragmente fast die gesamte archaeale 16S rDNA umfassten. Diese Fragmente wurden mit dem Oligonukleotidpaar Met86f und Met1340r (Tabelle 9) amplifiziert. Der Mastermix für einen td-PCR-Ansatz ist in Tabelle 22 aufgeführt. Tabelle 22: Mastermix für einen td-PCR-Ansatz (50 µL) Reagenz 1 Ansatz [µL] DNA Je nach Konzentration dNTP´s 2 High Y Puffer 5 BSA 1 ad 50 µL PCR-H2O Vorwärts-Oligonukleotid 2 Rückwärts-Oligonukleotid 2 Taq Polymerase 0,3 Tabelle 23: Reaktionsbedingungen einer td-PCR zu Charakterisierung archaealer 16S rDNA Temperatur [°C] Zeit [min] Zyklen Initiale Denaturierung 96 5 1 Denaturierung 96 1 35 Anlagerung 1 57-53 1 15 Anlagerung 2 53 1 20 Elongation 72 1,5 35 Abschließende Extension 72 10 1 Gesamt-Zyklen 35 Innerhalb der ersten 15 Zyklen verringerte sich die Temperatur um 0,267 °C pro Zyklus. Dieser touch down bewirkte eine immer größer werdende Wahrscheinlichkeit, dass sich die Oligonukleotide an die Ziel-Fragmente anlagerten, wobei darauf geachtet wurde, dass die 3 METHODEN 108 Spezifität nicht sank. Die restlichen Zyklen lag die Anlagerungstemperatur bei 53 °C. Der weitere Ablauf der td-PCR araealer 16S rDNA erfolgte wie in Kapitel 3.5.2 beschrieben, wobei die jeweiligen Oligonukleotide für archaeale 16S rDNA (Tabelle 9) verwendet wurden. 3.5.4 Amplifizierung verschiedener Teilsequenzen der chromosomalen DNA methanogener Archaea In dieser Arbeit wurde die verschachtelte speziell amplifizierten polymorphen DNA (nested SAPD)-PCR (Pfannebecker und Fröhlich 2008, Fröhlich und Pfannebecker 2006) verwendet, um die Eignung der Methode mit archaealer chromosomaler DNA zu zeigen, da dies bisher noch nicht überprüft worden war. Die nested SAPD-PCR ist eine molekularbiologische Methode, um Stämme gleicher Art voneinander unterscheiden zu können oder Arten zu charakterisieren, über die weiter nichts bekannt ist. Die nested SAPD-PCR basiert auf der Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD)-PCR (Williams et al. 1990). Die SAPD-PCR funktioniert mit der Amplifizierung chromosomaler DNA durch willkürlich gewählte synthetische Oligonukleotide. Die Oligonukleotide (10-mere, 11-mere) enthielten hauptsächlich eine 8 bp lange palindrome Erkennungssequenz der Not I-Restriktionsendonuklease (5´-GCGGCCGC-3´) mit einer dahinter geschalteten Base (A, C, G oder T, Tabelle 10). Zur SAPD-PCR wurden Reaktionsansätze mit einem Gesamtvolumen von 25 L in 200 L-Reaktionsgefäßen hergestellt. Bei einer SAPD-PCR wurde ein Oligonukleotid eingesetzt. Die Gehaltsangaben der einzelnen Reagenzien eines Reaktionsansatzes sind in Tabelle 24 und das SAPD-PCR-Programm in Tabelle 25 aufgeführt. Tabelle 24: Mastermix für einen SAPD-PCR-Ansatz (25 µL) Reagenz DNA dNTP´s High Y Puffer MgCl2 Doppelt deionisiertes Wasser Primer (Not A, C, G oder T) Taq Polymerase 1 Ansatz [µL] Je nach Konzentration 1 2,5 2 ad 25 µL 1 0,15 3 METHODEN 109 Tabelle 25: Reaktionsbedingungen einer SAPD-PCR zur Unterscheidung verschiedener Stämme einer Art Temperatur [°C] Zeit [min] Zyklen Initiale Denaturierung 95 5 1 Denaturierung 95 1 35 Anlagerung 1 35 1 35 35 (+ 0,5) 0,2 15 42,5 1 15 52,5 (+ 1,5) 0,2 19 72 5 35 Rampe (Temperatur Inkrement) Anlagerung 2 Rampe (Temperatur Inkrement) Elongation Gesamt-Zyklen 35 Zur Reduktion der Variabilität enthielt das SAPD-PCR-Programm Temperaturrampen. Die Rampen beschrieben einen schrittweisen Temperaturanstieg zwischen der Anlagerung des Oligonukleotids an die chromosomale DNA und der Elongation der Fragmente. Die Dauer der Rampe bewirkte eine reproduzierbare Bindung des Oligonukleotids an die DNA-Matrize. Nach der SAPD-PCR wurde ein charakteristisches Fingerprint-Bandenmuster verschiedener Stämme einer Spezies Agarose-gelelektrophoretisch aus dem Gesamtgenom generiert, wobei hierbei sowohl konservierte als auch individuelle Banden aus Fragmenten entstanden. 3.5.5 Agarose-Gelelektrophorese Jeder Amplifizierung (Kapitel 3.5.2, 3.5.3 und 3.5.4) und RFLP (Kapitel 3.5.8) wurde eine Agarose-Gelelektrophorese nachgeschaltet, um den Erfolg einer PCR zu überprüfen. Gearbeitet wurde mit verschieden konzentrierten Agarosegelen. Eine niedrige Agarosekonzentration hatte zur Folge, dass große Fragmente bis zu chromosomaler Länge diskret aufgetrennt wurden und eine hohe Agarosekonzentration trennte kleine Fragmente bis zu 100 bp diskret auf. Die Agarose wurde in 1x TBE-Puffer (pH 8,3) durch Aufkochen, unter Rühren gelöst und das Gel handwarm in dafür vorbereitete Schlitten gegossen. Um eine bessere Bandenschärfe zu erreichen wurde 0,1 % einer 35 %igen Natronwasserglaslösung zugegeben. Für Gele zur Überprüfung des Erfolgs einer bakteriellen PCR (Kapitel 3.5.2) und einer archaealen td-PCR (Kapitel 3.5.3) wurden Gele mit 1 % Agarose verwendet. 5 µL der Amplifikate wurden 1:6 mit Ladepuffer MassRuler™ (6 x) Loading Dye Solution (Fermentas St. Leon-Rot) vermischt und in jeweils eine Tasche gegeben. Die aufzutrennenden Proben wurden zunächst mit 80 V ins Gel und daraufhin bei 110 V gefahren, bis der lila Farbstoff des Ladepuffers etwa 1,5 cm vor dem unteren Rand des Gels positioniert war. So wurde gewährleistet, dass der GeneRuler™ DNA Ladder Mix SM0331 (Fermentas St. Leon-Rot) aufgetrennt worden war. Der SAPD-PCR (Kapitel 3.5.4) nachgeschaltete Agarose-Gelelektrophoresen wurden mit 1,5 %igen Agarose-Gelen durchgeführt, 10 µL Amplifikat mit 2 µL Ladepuffer in entsprechend große Taschen pipettiert und 3 METHODEN bei 50 V gefahren bis der lila Farbstoff des Ladepuffers ebenfalls etwa 1,5 cm vor dem unteren Gelrand stand. Für RFLP’s (Kapitel 3.5.8) wurden 2,5 %ige Agarosegele hergestellt, den jeweiligen gesamten Restriktionsansatz mit 2 µL Ladepuffer in entsprechend große Taschen überführt und zunächst bei 60 V eingefahren. Darauf wurde die Stromstärke auf 80 V erhöht und gefahren, bis der lila Farbstoff des Ladepuffers 1 cm vor dem Gelende positioniert war. Nach dem Lauf wurden die Gele mit Ethidiumbromid (35 µL/500 mL Wasser) gefärbt, mit UV-Licht angeregt und mit einer computerautomatisierten Fotostation in Graustufen fotografiert. Die Gelbilder wurden digital mit einer der Fotostation angeschlossenen Software (Vision), gespeichert mit einer Bildbearbeitungssoftware (IrfanView) umgewandelt und mit einer Präsentationsbearbeitungssoftware (Powerpoint) beschriftet. 3.5.6 Auftrennung von 16S rDNA-Fragmenten mit der Denaturierende Gradienten Gel Elektrophorese und der Temperatur Gradienten Gel Elektrophorese Die Denaturierende Gradienten Gel Elektrophorese (DGGE) und die Temperatur Gradienten Gel Elektrophorese (TGGE) sind molekularbiologische Methoden, die verschiedene DNA Sequenzen gleicher Länger nach ihrem GC-Gehalt entlang eines Gradienten voneinander trennen. Die Trennung verschiedener Sequenzen bei einer DGGE erfolgte in einem Polyacrylamidgel, in das ein Gradient denaturierender Agenzien (Harnstoff und Formamid) vorhanden ist (Muyzer et al. 1993). Je höher der GC-Gehalt der Sequenzen ist, desto weiter wandern sie im denaturierenden Harnstoffgradienten. Zwei Glasplatten wurden gespült, mit doppelt deioniesiertem Wasser gewaschen und mit Ethanol trocken gewischt. Darauf wurden die Glasplatten in den dafür vorgesehenen Ständer mit Platzhaltern zwischen den Glasplatten und Halterungen zusammengeschraubt. Lösung A und B wurden unter dem Abzug hergestellt (Zusammensetzung des denaturierenden Gels siehe Tabelle 12). Wurden viele unterschiedliche Kodierungen mit großer Ähnlichkeit in den Amplifikations-Produkten vermutet, wurde ein Gel mit einem kleineren Gradienten gegossen. Ein kleinerer Gradient spreitet die unterschiedlichen Sequenzen weiter auseinander. Lösungen A und B wurden in den Gradientenmischer gegeben und gerührt. Nachdem TEMED und APS zugegeben waren, wurde der Rührer gestoppt und sofort das Gel gegossen. Dazu war der Gradientenmischer durch einen Schlauch mit einer Kanüle verbunden, die zwischen die Glasplatten gehalten wurde. War der Zwischenraum der Glasplatten ausgefüllt, wurde ein Kamm aufgesteckt, der die Probentaschen formte. Das Gel benötigte etwa 2 h zum Polymerisieren. Während diesen zwei Stunden wurde der 1x TAE-Laufpuffer in den Elektrophoresebehälter gefüllt und von der Elektrophoreseapparatur auf 60 °C erwärmt. Nach Auspolimerisierung des Gels, wurde das Gel in die Elektrophoreseapparatur eingebaut und der Kamm entfernt. Die PCR-Produkte wurden 1:6 mit Ladepuffer MassRuler™ (6 x) Loading Dye Solution (Fermentas 110 3 METHODEN 111 St. Leon-Rot) versetzt. Die Taschen wurden direkt vor dem Beladen von Harnstoffrückständen mit Laufpuffer befreit. Maximal 40 µL PCR-Produkt wurden in die Taschen gefüllt. Die Auftrennung erfolgte entweder 5 h bei 200 V oder über Nacht bei 50 V. Das Gel wurde nach dem Lauf mit Ethidiumbromid angefärbt und mit UV-Licht angeregt. Nach der Fotographie wurden die Banden ausgeschnitten und über Nacht in 200 µL doppelt deionisiertes und steril filtriertes Wasser bei 4 °C für eine Reamplifizierung (Tabelle 21 und Tabelle 20 für bakterielle 16S rDNA, Tabelle 22 und Tabelle 23 für archaeale 16S rDNA) eluiert. Bei einer TGGE werden in einem Polyacrylamidgel unterschiedliche Sequenzen gleicher Länge ebenfalls nach ihrem GC-Gehalt aufgetrennt. Hierbei wandern die Sequenzen entlang eines Temperaturgradienten bis zu ihrer spezifischen Denaturierungstemperatur. Für eine TGGE wurde das Biometra TGGE System verwendet. Beim Aufbau, der Herstellung von Lösungen und bei der Durchführung der Methode wurde nach Beschreibung des Herstellers gearbeitet. Zum Formen der Taschen wurde ein Silikon Streifen verwendet, statt Glasplatten mit Taschenformern. Als Laufpuffer wurde 1fach TAE-Puffer und Ladepuffer verwendet. Der Temperaturgradient belief sich von 33 °C bis 47 °C. Bei der TGGE wurden keine Banden ausgeschnitten. 3.5.7 Klonierung unterschiedlicher 16S rDNA Fragmente Klonierung ist ebenfalls eine molekularbiologische Methode, die verschiedene DNA Sequenzen eines Amplifikats trennt. Prinzipiell, wird bei dieser Methode jeweils ein Fragment in ein für Escherichia coli geeignetes spezielles Plasmid kloniert und durch Vermehrung der Zellen vervielfältigt. In dieser Arbeit wurde das TOPO TA Cloning® Kit for Sequencing (Invitrogen, Karlsruhe) mit one shot chemokompetenten Escherichia coli TOP-10 verwendet. Es wurde nach Anleitung des Herstellers gearbeitet. Der hier verwendete TOPO Vektor 4,0 kb hat mehrere Eigenschaften codiert: ein Resistenzgen gegen Ampicillin, das Gen der -Galaktosidase und eine virale Eigenschaft der häufigen Vervielfältigung wurden verwendet. Die Ampicillinresistenz wurde eingesetzt zur Selektion der transformierten Zellen auf mit Ampicillin versetzten Agarplatten. Das Gen der -Galaktosidase bildet die multiple-cloning-site des Vektors in die das DNA Fragment ligiert wird. Die Galaktosidase hydrolysiert 5-Brom-4-Chlor-3-Indoxyl- -D-Galactopyranosid ( - X-Gal) zu Galaktose und 5-Brom-4-chlor-3-hydroxyindol. Sauerstoff oxidiert 5-Brom-4-chlor-3hydroxyindol zu dem blauen Farbstoff 5,5'-Dibrom-4,4'-dichlor-indigo. Wurde das Fragment in den Vektor ligiert, wird die -Galaktosidase nicht mehr exprimert und der blaue Farbstoff kann nicht hergestellt werden. Dies wurde als qualitativer Indikator verwendet, ob die Ligation des Fragments in den Vektor erfolgreich war. Der virale Teil des Vektors bewirkte, dass das eingebrachte Fragment in großer Menge in einer Zelle kopiert wurde, was ermöglichte, eine 3 METHODEN 112 Kolonie-PCR durchzuführen, ohne die transformierten Zellen in Flüssigkulturen zusätzlich zu vervielfältigen. Die Klone wurden auf LB-Agarplatten mit 100 µg L-1 Ampicillin und 40 µg L-1 X-Gal ausgestrichen und 24 h bei 37 °C inkubiert. Einige weiße Kolonien wurden jeweils in 50 µL ddH2O suspendiert und 2 µL von der Zellsuspension in eine Kolonie-PCR eingesetzt. Der PCR-Ansatz unterscheidet sich nicht zu den in Tabelle 20 (Kapitel 3.5.2) und Tabelle 21 (Kapitel 3.5.3) aufgeführten PCR-Ansätzen. Die PCR-Programme wurden bis auf die Initiale Denaturierung übernommen. Dieser Schritt wurde auf 15 min verlängert, um die Zellen aufzubrechen und die DNA freizusetzen. 3.5.8 Restriktionslängenpolymorphismus-Analyse von 16S rDNA Fragmenten zur Unterscheidung verschiedener Genera und Arten von Mikroorganismen Der Restriktionslängenpolymorphismus (RFLP, Saiki et al. 1985), genauer die amplifizierte ribosomale DNA Restriktionsanalyse (ARDRA, Vaneechoutte et al. 1993), wurde in der vorliegenden Arbeit dazu verwendet, um eigenisolierte Reinkulturen und Gesamt-DNA aus Fermentern von Biogasanlagen molekularbiologisch zu analysieren. Restriktionsenzyme sind DNA an spezifischen Stellen schneidende Endonukleasen (Voet und Voet 1990). Die meisten Restriktionsenzyme erkennen spezifisch Palindrom-Sequenzen. Restriktions-Endonukleasen des Typ-II schneiden DNA an einer spezifischen Schnittstelle innerhalb ihrer Erkennungssequenz wie zum Beispiel HaeII (Stein et al. 1998, Slatko et al 1988) und HaeIII (BsuRI, Slatko et al. 1988) aus Haemophilus aegyptius (Pittman und Davis 1950). HaeII hat die Erkennungssequenz 5‘-RGCGCY-3‘ und schneidet zwischen den Basen C und Y auf dem 5‘Strang und zwischen Y und C auf dem 3‘-Strang, was kohäsive Enden der geschnittenen DNA Fragmente zur Folge hat. HaeIII schneidet in der Erkennungssequenz 5‘-GGCC-3‘ zwischen den Basen G und C auf beiden Strängen, was stumpfe Enden der restringierten DNA ergibt. Amplifikate der 16S rDNA (Tabelle 20, Kapitel 3.5.2 und Tabelle 21, Kapitel 3.5.3) wurden unabhängig mit HaeII und HaeIII geschnitten, um Unterschiede in der hoch konservierten 16S rDNA aufzuzeigen. Für einen Restriktionsansatz wurde das Amplifikat mithilfe des PCRPurification Kits (Qiagen, Hilden) in 30 µL doppelt deionisiertem, steril filtrierten Wasser aufgereinigt und jeweils 10 µL der aufgereinigten Fragmente mit 1,5 µL Restriktionspuffer (ungeschnittene Negativkontrolle), 10 U HaeII mit 1,5 µL Restriktionspuffer und 10 U HaeIII mit 1,5 µL Restriktionspuffer zugefügt. Inkubiert wurde entweder 2 h bei 37 °C oder über Nacht bei 4 °C. Agarose-gelelektrophoretisch wurden die entstandenen Restriktionsfragmente aufgetrennt. Auf diese Weise wurde zum Beispiel nach einer Klonierung (Kapitel 3.5.7) eine Vorselektion vorgenommen, indem jeweils ein Exemplar eines jeden Schnittmusters statt jeder Klon zur Sequenzierung versendet wurde. 3 METHODEN 113 3.5.9 Reamplifizierung und Sequenzierung reiner 16S rDNAFragmente Die aus den DGGE-Gelen in deionisiertes und steril filtriertes Wasser eluierten 500 bp Fragmente wurden erneut amplifiziert (Tabelle 21 und Tabelle 23). Hierbei wurde das Oligonukleotid Ar1000f verwendet, da der bei der DGGE/TGGE benötigte GC-Anhang von GCAr1000f bei der Sequenzierung das Ergebnis verkürzte. Bei einer Kolonie-PCR nach einer Klonierung wurden die in Tabelle 21 und Tabelle 23 aufgeführten PCR-Parameter der initialen Denaturierung auf 15 min erhöht. Die Erhöhung der Dauer des Initialen Schrittes bewirkte das Aufbrechen der als Vorlage von Agarplatten abgestrichenen Zellen, so dass die Plasmide austreten konnten, in welche zuvor die Ziel-DNA kloniert und die durch Zellvermehrung vervielfältigt worden sind. Die Reamplifikate beider oben beschriebenen Methoden wurden mit dem QIAquick® PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden) aufgereinigt. Die Aufgereinigten Fragmente wurden zum Sequenzieren an Eurofins mwg Operon (Ebersberg) beziehungsweise LGC Genomics (Berlin) versendet. Die digital erhaltenen DNA-Sequenzen wurden mittels einer frei zugänglichen Internetdatenbank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) mit dort hinterlegten Sequenzen verglichen, um die Art zu ermitteln. Da diese Datenbank eine freie Datenbank ist kann sie fehlerbehaftet sein. Daher wurden die eigenen Sequenzen zusätzlich mit digital hinterlegten Sequenzen der Typstämme verglichen, die in der Deutschen Stammsammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig) registriert sind. 3.5.10 Phylogenetische Analysen partieller 16S rDNA aus eigenisolierten Reinkulturen und Klonen Zur phylogenetischen Analyse wurden die Softwares Mega 4.1 (Center for Evolutionary Medicine and Informatics, USA) oder Phylip 3.65 (Felsenstein 1989) verwendet. Für multiple Alignierungen wurde das JavaScript unterstützte online tool ClustalW2 (EBI, UK) genutzt. Es wurden ausschließlich Alignierungspositionen berücksichtigt, bei denen die Sequenzen mindestens 50 % identisch waren (50 % Gewichtung). Zwei verschiedene Stammbäume wurden mit den Modellen Neighbor Joining (Saitou und Nei 1987) und Maximum Parsimony (Sober 1983) berechnet. Zur statistischen Absicherung wurden Bootstrap-Analysen (Efron und Tibshirani 1994, Efron 1979) durchgeführt. Der Bootstrap-Wert gibt für jede Verzweigung an, wie oft die einzelnen Positionen der Sequenzen aus den Datensätzen stabil berechnet werden konnten. Es wurden jeweils 100 Baumkonstruktionen berechnet. Als out-group wurden die in der NCBI-Datenbank hinterlegten 16S rDNA Sequenzen Stammbaumerstellung der von Methanobacterium Bacteria und formicicumT Methanopyrus DSM1535 T kandleri DSM6324 für für die die 3 METHODEN 114 Stammbaumerstellung der Archaea angegeben. Die phylogenetischen Stammbäume wurden teilweise mit TreeView (by Roderic D. M. Page, UK, 1996) visualisiert. 3.6 Chemische Analysen von Substraten und Produkten in Kulturen aus NawaRo-Biogasanlagen Die Umsetzung von Substraten, wie Propionsäure durch propionsäureverwertende Mikroorganismen wurde in dieser Arbeit mithilfe der high-performance liquid chromatography (HPLC, Kapitel 3.6.1) nachvollzogen. Die Produktion von Methan durch methanogene Archaea wurde mit der Gaschromatographie (GC, Kapitel 3.6.2) nachgewiesen. Bei diesen chemischanalytischen Methoden wurden Stoffeigenschaften ausgenutzt, um Stoffwechselprodukte aufzutrennen und ihre Konzentration zu messen. Damit wurden Umsetzungsraten und Produktionsmaxima errechnet (Kapitel 4.7.1 und 4.7.5). 3.6.1 HPLC-Analysen des mikrobiellen anaeroben Propionsäureabbaus Substrate und Produkte des mikrobiell bedingten anaeroben Propionsäureabbaus wurde mithilfe eines computerautomatisierten high-performance liquid chromatography (HPLC)-Systems (Kapitel 2.1, Seite 70) gemessen. Die propionsäureabbauenden Anreicherungs- und Mischkulturen wurden in PI-Medium (Kapitel 2.6, Seite 83) und PIP-Medium, ohne Reaktorfiltrat, sowie in PI-Medium mit 40 mmol L-1 Fumarat beziehungsweise 5 mmol L-1 Bromoethansulfonsäure (BrES) 1:10 mit Kulturen in stationärer Phase (stagnierter Propionsäureabbau) überimpft und im Dunkeln bei 39 °C inkubiert. Die Konzentrationen von Propionat, Acetat, Fumarat und Succinat wurden anhand zuvor bestimmter Referenzwerte mit der den Analyse-Systemen angeschlossenen Analysesoftwares mit der Masse pro Liter m in [g L-1] berechnet und mit einer Tabellenbearbeitungssoftware (Excel, Microsoft) mit der Molaren Masse M [g mol-1] (für Propionsäure = 47,08 g mol-1 und Acetat = 60,05 g mol-1) in die Stoffmenge n [mmol L-1] umgerechnet. n= n = Stoffmenge pro Liter Medium [mmol L-1] 1000 M m = Masse [g L-1] M = Molare Masse [g mol-1] Formel 31: n = Stoffmenge pro Liter Medium [mmol L-1] aus m = Masse [g L-1] dividiert durch M = Molare Masse [g mol-1]. 3 METHODEN 115 Bei den Messungen wurde davon ausgegangen, dass das automatisierte HPLC-System eine maximale Systemungenauigkeit von 5 % erzeugt. Daher wurden zwei-fach Messungen einer Probe durchgeführt, solange die Messwerte unterhalb der 5 % Systemungenauigkeit (Standardabweichung ( )) lagen. Sobald die Messwerte um über 5 % Systemungenauigkeit differierten, wurden drei-fach Messungen einer Probe durchgeführt. Die Standardabweichung wurde aus dem Mittelwert der Messwerte x und der Anzahl der Messwerte N mit folgender Gleichung von einer Tabellensoftware (Excel, Microsoft) berechnet. = = Standardabweichung (x N x) N = Anzahl der Messwerte x = Mittelwert der Messwerte Formel 32: Standardabweichung Messwerte N. aus dem Mittelwert der Messwerte x und der Anzahl der Für die HPLC-Messungen der organischen Säuren Propionat und Acetat wurde ein externer Standard mit 1 g L-1 Acetat und 2 g L-1 Propionsäure in doppelt deionisiertem Wasser bestimmt und für die Probenmessungen als Referenzkonzentrationen in die Analysesoftware (LCSolutions, Shimadzu) eingespeichert. In wöchentlichem beziehungsweise zweiwöchentlichem Turnus wurden je 600 µL Probe aus den propionsäureabbauenden Anreicherungs- und Mischkulturen mit einer Insulinspritze abgezogen. Diese Proben wurden 30 min bei 13,0 r min-1 zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand durch ein Filterzentrifugationsröhrchen mit 3K PES-Membran 15 min in 1,5 mL Reaktionsgefäße zentrifugiert, um nicht vorher abzentrifugierte Partikel aus dem Zentrifugationsüberstand herauszufiltern und mindestens über Nacht bei -20 °C eingefroren. Das Einfrieren bewirkte einen weißen Niederschlag, der direkt vor der Messung 30 min abzentrifugiert wurde. Daraufhin wurden die Proben in Gewindeflaschen ND8 mit Schraubkappe G8-L/Dichtscheibe-1,3 überführt und in den automatischen Probengeber des HPLC-Systems zur Messung des Propionsäuregehalts im Kulturüberstand gestellt. Der Propionsäure-, und Essigsäuregehalt der propionsäureabbauenden Anreicherungskulturen in PI-Medium (Kapitel 2.6, Seite 83) wurde mithilfe eines UV-Vis Detektors gemessen. Dazu wurde zuvor ein externer Standard mit 1 g L-1 Essigsäure und 2 g L-1 Propionsäure in doppelt deionisiertem Wasser bestimmt und als Maß für alle Messungen mit dem UV-Vis Detektor verwendet. Die für die Messung organischer Säuren verwendeten Puffer sind tabellarisch in Kapitel 2.5.6 aufgeführt. 20 µL Injektionsvolumen wurden durch den automatischen Probengeber in das HPLC-System gespritzt. Das injizierte Volumen wurde mit einem 20 minütigen Programm zur Auftrennung des Mediums über eine Ionentauscher-Säule aufgetrennt und mit dem UV-VIS Detektor bei 210 nm 3 METHODEN 116 erfasst. Bei einem folgenden Waschprogramm lief innerhalb 2 min ein automatisierter Pufferwechsel über einen Gradienten ab. Die Säule wurde 10 min mit 90 % Methanol und 10 % 50 mmol L-1 H3PO4-Puffer gewaschen. Zum Schluss wurde die für das Messprogramm notwendige Pufferzusammensetzung innerhalb 2 min wieder hergestellt und die Säule 5 min equilibriert. Die Programmparameter für die Messungen des Propionsäuregehalts in den Medien PI mit einem UV-Vis Detektor sind in Tabelle 26 zusammengefasst. Tabelle 26: Programmparameter der UV-Vis Messungen des Propionsäuregehalts im Medium PI Zeit [min] 50 mmol L-1 H3PO4- Puffer [%] 99,9 % Methanol [%] Probenauftrennung 20 100 0 Gradient 2 100-10 0-90 Waschen 10 10 90 Equilibrierung 2 10-100 90-0 Nachlauf 5 100 0 Programmabfolge Die Durchflussrate des Puffers und des Methanols betrug während den Arbeitsschritten 1 mL min-1. Das HPLC-System wurde nach spätestens 24 h Laufzeit über Nacht mit 99,9 % Methanol mit einer Flussrate von 0,2 mL min-1 gespült, um die Säule vollständig von Mediumrückständen zu befreien. Um das Substratverhalten der propionsäureabbauenden Kulturen näher zu untersuchen, wurde dem PI-Medium 40 mmol L-1 Fumarsäure zugegeben. Der Propionsäure-, Acetat-, Fumarsäure-, und Bernsteinsäuregehalt (Succinat) wurde mithilfe eines RI Detektors gemessen, da Fumarsäure aufgrund seiner Doppelbindung ein zu starkes Signal bei Wellenlänge von 210 nm erzeugt und somit ein UV-Vis Detektor ungenaue Messdaten lieferte. Hierzu wurde ein externer Standard von 0,5 und 1 g L-1 Essigsäure, 0,5 und 1 g L-1Fumarsäure, 0,5 und 1 g L1 Bernsteinsäure und 0,5 und 2 g L-1 Propionsäure in doppelt deionisiertem Wasser bestimmt. Eine Dreipunkt-Standardgerade wurde mit den Konzentrationswerten der Standards in die HPLC-Analysesoftware eingespeichert. Die Empfindlichkeit des Brechungsindex-Detektors wurde auf 0,5 · 10-5 RIU F.S.-1 und die Temperatur der Messzelle auf 45 °C gestellt. 20 µL Injektionsvolumen wurden durch den automatischen Probengeber in das HPLC-System gespritzt. Eine Probe wurde innerhalb 12 min über die Ionentauscher-Säule aufgetrennt und die organischen Säuren mit dem RI Detektor erfasst. Die Proben wurden direkt hintereinander gemessen. Das Waschen der Säule erfolgte nach spätestens 10 h Messzeit über Nacht mit 90 % Methanol und 10 % H3PO4-Puffer bei einer Durchflussrate von 0,2 mL·min-1, um die Säule vollständig von Mediumrückständen zu befreien. Am nächsten Messtag wurde die Säule wieder durch 100 % 50 mmol L-1 H3PO4-Puffer mit einer Durchflussrate von 1 mL pro min equilibriert. Die einzelnen Messungen wurden digital von der Rechnersoftware (LC-Solutions, Shimadzu) anhand der eingespeicherten Parameter des externen Standards ausgewertet. Die Ergebnisse 3 METHODEN wurden digital gespeichert und teilweise mithilfe eines Tabellenkalkulationsprogramms (Excel, Microsoft) für diese Arbeit visualisiert. 3.6.2 Gaschromatographie der mikrobiellen Methanbildung Zur Bestimmung der Methanbildungsrate von Eigenisolaten aus Fermentern von NawaRo-BiogasAnlagen wurde der Methangehalt in den gasförmigen Kulturüberständen gaschromatographisch gemessen. Die Parameter des verwendeten Gaschromatographen sind in Kapitel 2.1, Seite 70 tabellarisch aufgelistet. Der Injektor, der Vordetektor, sowie der Wärmeleitdetektor wurden auf 200 °C erhitzt. Die Empfindlichkeit des Detektors wurde auf 40 mA Stromstärke eingestellt. Die Carbosieve SII Säule wurde auf 199 °C erhitzt. Diese Säule gehört zu den Carbon Molecular Sieves (CMS), welche aus einem porösen Netzwerk von Bruchstücken pyrolysierter Kohlenstoff-Polymere bestehen. Aufgrund der sehr kleinen Poren können mit diesem Packmaterial sehr kleine Moleküle aufgetrennt werden. Die Durchflussrate des Trägergases Helium betrug während den Messungen 20 mL min-1. Für die quantitativen Messungen des Methans über Kulturen wurde ein Standard aus 0,5 mL 100 % Methan ermittelt (Abbildung 109, n = 5) und zur Berechnung des Methangehalts von Proben verwendet. Dazu wurde Methan in 100 mL Serumflaschen mit 1 bar Überdruck geleitet und auf 40 °C im Inkubator temperiert. Als Standardprobe dienten 0,6 mL mit einer Insulinspritze genommenes Gas, von denen 0,5 mL in das GC-System über den Injektor manuell eingespritzt wurde, nachdem durch Drücken den Stempels direkt über dem Injektor der GC das Volumen um 0,1 mL reduziert worden war. Ein Volumen von ebenfalls je 0,6 mL wurde mit einer 1 mL Insulinspritze der Gasphase über anaeroben Kulturen entnommen und 0,5 mL in den Gaschromatographen injiziert. Daraufhin wurde die Messung sofort gestartet. Eine Messung dauerte 9 Minuten. Zur längerfristigen Equilibrierung der Säule, wurde diese über Nacht auf 199 C erhitzt. Der Durchlauf des Heliums betrug 8 mL min-1. Wurde der Gaschromatograph länger als über Nacht nicht benötigt, wurden der Injektor, Vordetektor, sowie der Detektor auf 170 °C und die Säule auf 150 °C erhitzt. So wurde gewährleistet, dass sich keine Ablagerungen im System bilden konnten. Auch bei den gaschromatischen Messungen wurde bei einer Standardabweichung (Kapitel, 3.6.1, Formel Seite 115) über 5 % dreifach-Messungen statt Doppelbestimmungen durchgeführt. Die Messungen wurden digital von der Rechnersoftware (GC-Solutions, Shimadzu) anhand des eingespeicherten Standardmittelwertes ausgewertet. Die Ergebnisse wurden digital gespeichert. Mithilfe eines Tabellenkalkulationsprogramms (Excel, Microsoft) wurden die gemessenen Werte begründend auf der allgemeinen Gasgleichung idealer Gase mit dem Druck p, dem Volumen V, der Gaskonstanten R und der Temperatur T in die Stoffmenge n pro Liter [mmol L-1] umgerechnet. 117 3 METHODEN 118 n = V R T Formel 33: Nach der Stoffmenge n [mmol L-1] umgeformte allgemeine Gasgleichung; Druck, p = 101325 Pa; Volumen, V = 0,001 m3; Gaskonstante, R = 8,3144621 J mol-1 K-1; Temperatur, T = 313,15 K. In dieser Arbeit wurde diese Gleichung (Formel 33) zur Errechnung der Stoffmenge des Methans gewählt, da sich die Gasproben in der Kanüle in einem nahezu offenen System befunden hatten, bis sie in die GC eingebracht wurden. Aus fünf Methanstandardproben wurde von der GC-Software ein Mittelwert gebildet (Abbildung 109) und gleich 100 % gesetzt. Anhand dieses Mittelwertes wurden die Messwerte von Proben analysiert. Mithilfe einer Tabellensoftware (Excel, Microsoft) wurde die allgemeine Gasformel idealer Gase nach der Stoffmenge n aufgelöst (Formel 33) und der Methangehalt des gasförmigen Kulturüberstandes in mmol L-1 mit Standardabweichung (Formel 32) berechnet. Der Standardmethangehalt von 100 % entsprach bei 1 bar Überdruck und 40 °C somit 38,9 mmol L-1 Methan. In dieser Arbeit wurden Doppelbestimmungen der Methangehalte eines Messzeitpunktes gemessen. Bei einer Abweichung der Messwerte um mehr als 5 %, wurde eine dritte Messung durchgeführt. 3.7 Chemische Analyse des Reaktorfiltrats Als Zusatz zu vielen synthetischen Medien (Kapitel 2.6) wurden verschiedene Konzentrationen eines Reaktorfiltrats verwendet, um den Mikroorganismen eine möglichst gewohnte Umgebung bereit zu stellen. Dieses Reaktorfiltrat wurde durch Zentrifugation bei 5000 r·min-1 (Cryofuge 5000, Haraeus) und Steril Filtration durch 250 mL fassende 0,2 µm Cellulose-Filtereinheiten (vwr, Darmstadt) des Reaktorinhalts gewonnen. Eine schwarz-braune Flüssigkeit war das Ergebnis der Reaktorfiltratextraktion. Es stellte sich die Frage, welche Stoffe in diesem flüssigen Filtrat vorhanden sind. Dieser Frage wurde chemisch-analytisch nachgegangen, indem zum einen die Aminosäurezusammensetzung und zum anderen die Zuckerzusammensetzung des Reaktorfiltrats untersucht wurden. Dazu wurden Aliquots des Filtrats teilweise durch 3 K Zentrifugationsfiltereinheiten (vwr, Darmstadt) filtriert, um restliche Partikel aus der Flüssigkeit zu entfernen und für die Aminosäure- und Zuckerdetektion vorbereitet. 3.7.1 Dünnschichtchromatographie des Reaktorfiltrats Bei der Dünnschichtchromatographie (DC, Randerath 1965) werden Wechselwirkungen organischer Substanzen einer Probe mit einer Festphase und einer Flüssigphase ausgenutzt. Jede organische Substanz hat eine individuelle Geschwindigkeit bei dem Übergang von der 3 METHODEN 119 Festphase in die Flüssigphase. Die mit der Flüssigphase durch die Festphase diffundierenden organischen Substanzen haben aufgrund ihrer individuellen Übergangseingenschaften von fest in flüssig eine Auftrennung der organischen Substanzen zur Folge. Die Dünnschichtchromatographie ermöglichte in der vorliegenden Arbeit eine qualitative Analyse der Aminosäurezusammensetzung des Reaktorfiltrats und wurde in einer vertikalen DC-Kammer durchgeführt. Hierzu wurde als stationäre Phase eine kieselgelbeschichtete Aluminiumplatte (Merck, Darmstadt) und als flüssige Phase Butanol, Eisessig und H2O im Verhältnis 4:1:1 verwendet. Zur sulfonylchlorid Visualisierung (Dansylchlorid) der Aminosäuren eingesetzt. wurde Dansylchlorid 1-Dimethylaminonaphtalin-5verbindet sich mit seiner Schwefelgruppe an die freie Aminogruppe einer jeden Aminosäure unter Abspaltung von HCl (Voet und Voet 1990) zu Dansyl-Amid, welches mit UV-Licht angeregt werden kann und gelbes Licht emittiert. 100 µL ungefiltertes, wie 3000 K-gefiltertes Reaktorfiltrat wurden mit 100 µL NaHCO3-Lösung (0,1 g mL-1 in doppelt deionisiertem Wasser) und 100 µL Dansylchlorid-Lösung (1,5 mg mL-1 Aceton) gemischt und bei 37 °C für 1 h inkubiert. Danach wurde die Dansylchloridreaktion mit 800 µL 10% Formiatlösung gestoppt und 10 µL dieses Gemischs punktweise auf den untersten Zentimeter einer DC-Platte aufgetropft. Als Laufmittel wurde ein Gemisch aus Butanol, Eisessig und H2O (Verhältnis 4:1:1) gewählt (Randerath; 1965). Nach der Entwicklung wurde die Lauffront der Platte markiert und daraufhin unter dem Abzug getrocknet. Der Retentions (Rf)-Faktor wurde anhand des Verhältnisses der Wanderungsstrecke des Substanzflecks (S) zur Wanderungsstrecke des Lösemittels (L) errechnet. Rf = Retentionsfaktor R = S L S = Substanzfleck L = Lösemittel Formel 34: Verhältnis der Wanderungsstrecke des Substanzflecks; Rf = Retentionsfaktor; S = Substanzfleck; L = Lösemittel. Auf einem UV-Tisch wurden die Aminosäuren des Reaktorfiltrats visualisiert und mit einer tragbaren Digitalkamera fotografiert. 3.7.2 HPLC-Analysen des Reaktorfiltrats Die Detektion von Aminosäuren und Zuckern im Reaktorfiltrat wurde chemisch-analytisch mithilfe der high-performance liquid chromatography (HPLC) -Systeme (Kapitel 2.1, Seite 70 und 71) durchgeführt. Dafür wurde Reaktorfiltrat durch 3K-Filter 15 min zentrifugiert. Für die Detektion von Aminosäuren wurde die Interaktion von Dansylchlorid mit Aminosäuren ebenfalls verwendet und mit der Probenvorbereitung so verfahren, wie in Kapitel 3.7.1 3 METHODEN 120 beschrieben. Es wurde 1:10 verdünntes Reaktorfiltrat (3 K-filtriert) als Probe verwendet. Die in HPLC Flaschen (Kapitel 3.6.1) abgestoppte Lösung wurde in den automatischen Probengeber des computerautomatisierten HPLC-Systems (Kapitel 2.1, HPLC-System Aminosäuren) platziert. 3 µL der Probe wurden automatisch in das System gespritzt und die Aminosäuren mit einer Flussrate von 1 mL pro Minute (Puffer siehe Kapitel 0) mit dem in Tabelle 27 aufgelisteten Programm mit einem Puffergradienten aufgetrennt. Tabelle 27: Programmablauf zur RF-Messung von Aminosäuren im Reaktorfiltrat Programmabfolge Zeit [min] 50 mmol L-1 Na-Acetat-Puffer, pH 6,3 [%] 25 % Methanol [%] Vorlauf 10 100 0 Gradient 45 100-50 0-50 Waschen 13 50-10 50-90 Equilibrierung 2 10-100 90-0 Nachlauf 15 100 0 Der Fluoreszenz-Detektor nahm die Signale der Aminosäuren bei einer Extinktion von 340 nm und einer Emission von 530 nm, mit den Einstellungen range 8, response medium und einer hohen Sensivität auf. Mit der Software wurden die Messungen aufgezeichnet und ausgewertet. Parallel wurden Aminosäurestandards (etwa 10 mg mL-1 Wasser) in doppelt deionisiertem Wasser gemessen, um herauszufinden um welche Aminosäuren und in Etwa welchen Gehalt es sich im Reaktorfiltrat handelt. Wie bei den Messungen organischer Säuren wurden dreifachMessungen statt Doppelbestimmungen bei einer Standardabweichung über 5 % (Kapitel, 3.6.1, Formel Seite 115) durchgeführt. Die Ergebnisse wurden digital gespeichert und teilweise mithilfe eines Tabellenkalkulationsprogramms (Excel, Microsoft) für diese Arbeit visualisiert. Zucker im Reaktorfiltrat wurden mit einem weiteren automatisierten HPLC-System (Kapitel 2.1, HPLC-System Zucker) gemessen. Dazu wurde 10 %, 3 K filtriertes Reaktorfiltrat verwendet. 5 µL Probe wurde vom automatischen Probengeber in das System gespritzt. Der 0,013 N H2SO4Puffer (0, Zucker) hatte während des gesamten Laufs jeder Probe eine Flussrate von 0,6 mL pro Minute. Der Brechungsindex-Detektor wurde auf eine mittlere Sensivität eingestellt. Der an das System angeschlossene Drucker hatte einige Zucker mit Konzentrationen gespeichert, die es ermöglichten, die Zucker im Reaktorfiltrat zu benennen und deren Gehalt in g L-1 zu bestimmen. Auch bei den Messungen von Zuckern wurden Doppelbestimmungen durchgeführt und eine Standardabweichung (Kapitel, 3.6.1, Formel Seite 115) ermittelt. Die ausgedruckten Ergebnisse wurden archiviert. 4 ERGEBNISSE 121 4 Ergebnisse 4.1 Isolierung von Mikroorganismen aus NawaRoBiogasanlagen, Laborfermentern und propionsäureabbauenden Mischkulturen 4.1.1 Isolierung von Bakterien aus propionsäureabbauenden Mischkulturen In dieser Arbeit wurden aus den propionsäureabbauenden Mischkulturen Ap1a und Fp1a (Tabelle 14) anaerobe Bakterien (Tabelle 16) in DSMZ-Medium 520 (DSMZ 2012) mit der in Kapitel 3.3.1 beschriebenen Durchführung isoliert. Tabelle 28: Eigenisolierte anaerobe Bakterien aus den anaerob propionsäureoxidierenden Mischkulturen Ap1a und Fp1a Speziesa Herkunft (Ort) DSMZ-Medium 1 Clostridium sartagoforme Stamm Ap1a520 Arenrath 520 Proteiniphilum acetatigenes Stamm Fp1a520 Hochdorf-Assenheim2 520 a Eigenisolate wurden zur Hinterlegung in der institutseigenen Stammsammlung (IMW) übergeben. 1 Biogasanlage Arenrath GmbH & Co KG; 2 Theo & Ingrid & Alexander Friedrich GbR Die Identifizierung der isolierten Bakterien erfolgte über die Analyse der partiellen 16S rDNA (Kapitel 3.5.1, 3.5.2, 3.5.5 und 3.5.9). Die Ergebnisse der 16S rDNA-Analyse werden in Kapitel 4.5.2 besprochen. 4.1.2 Isolierung methanogener Archaea aus NawaRo-Biogasanlagen und Laborfermentern Aus NawaRo-Biogasanlagen-Proben (Kapitel 3.1) und Proben (Tabelle 15) aus Laborfermentern (Klocke et al., 2007, 2009a, b, Nettmann et al. 2010) wurden in dieser Arbeit methanogene Archea aus fünf unterschiedlichen Gattungen eigenisoliert (Tabelle 16), wovon die Kulturen BEGN und LFP2.1 bis zum Ende des praktischen Teils der Arbeit bakteriell und BEG2N archaeal kontaminiert waren. Die Isolierung wurde durchgeführt, wie bereits in Kapitel 3.3.2 beschrieben wurde. 4 ERGEBNISSE 122 Tabelle 29: Eigenisolierte methanogene Archaea aus NawaRo-Biogasanlagen und Laborfermentern Speziesa Herkunft (Ort) DSMZ-Medium 1, 1a 4 Methanobacterium formicicum Stamm BEG1 Zweibrücken 287/ 287P 5 Methanobacterium formicicum Stamm HWS11, 1a Steinweiler 287/ 287P Methanobacterium formicicum Stamm LFP4.11, 1a Potsdam6 287/ 287P 1, 1a 7 Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 Hochdorf-Assenheim 287/ 287P Methanoculleus bourgensis Stamm TAF1.11 Hochdorf-Assenheim7 287 1 4 Methanoculleus bourgensis Stamm BEGN Zweibrücken 287 1 5 Methanoculleus bourgensis Stamm HWS1.1 Steinweiler 287 Methanomethylovorans sp. Stamm LFP3.13 Potsdam6 318 2 4 Methanosaeta concilii Stamm BEG4 Zweibrücken 334 1, 2, 3 5 Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 Steinweiler 318/ 318P Methanosarcina mazei Stamm BEG3 1, 2, 3 Zweibrücken4 318/ 318P Methanosarcina mazei Stamm LFP2.11, 2, 3 Potsdam6 318/ 318P 1, 2, 3 7 Methanosarcina mazei Stamm TAF1.2 Hochdorf-Assenheim 318/ 318P Methanosarcina siciliae Stamm BEGN21, 2, 3 Zweibrücken4 318 a Eigenisolate wurden zur Hinterlegung in der institutseigenen Stammsammlung (IMW) übergeben. 1 Substrat H2/CO2, 1a Formiat 2 Substrat Acetat, 3 Substrat Methanol, 4 BioEnergie Glahn = BEG, Hubert Wagner und Sohn GbR = HWS, 6 5 Laborfermenter des Leibniz-Instituts für Agrartechnik Potsdam-Bornim e. V. (ATB) Abteilung Bioverfahrenstechnik AG Molekularbiologie = LFP (Klocke et al., 2007, 2009a, b, Nettmann et al. 2010), 7 Theo & Ingrid & Alexander Friedrich GbR = TAF Die Zusammensetzungen der verwendeten Medien sind in Kapitel 2.6 aufgeführt. Die Identifizierung der methanogenen Eigenisolate erfolgte über die Analyse der archaealen 16S rDNA (Kapitel 3.5.1, 3.5.3, 3.5.5 und 3.5.7-3.5.9), deren Ergebnisse in Kapitel 4.6.3 besprochen werden und durch die Fluoreszenmikroskopie (Kapitel 3.4.1, Ergebnisse siehe Kapitel 4.2.2). 4.2 Morphologie von Kulturen aus NawaRo-Biogasanlagen und Laborfermentern und anaerob propionsäureabbauender Mischkulturen Propionsäure abbauende Mischkulturen und deren Unterkulturen (Tabelle 14) sowie die Eigenisolate methanogener Archaea aus NawaRo Biogasanlagen (Tabelle 18) und Laborfermenterproben (Tabelle 15) wurden regelmäßig phasenkontastmikroskopisch überprüft und der visuelle Eindruck schriftlich dokumentiert. 4 ERGEBNISSE 123 4.2.1 DAPI-Färbung syntroph propionsäureoxidierender Mischkulturen Im Phasenkontrast waren einige Mikroorganismen aufgrund ihrer Morphologie nicht von Partikeln des zugesetzten Reaktorfiltrats unterscheidbar (nicht gezeigt). Die Zellen der propionsäureabbauenden Mischkulturen wurden mit dem Fluoreszenzfarbstoff DAPI angefärbt (Kapitel 3.4.1.1), der an DNA bindet und bei Anregung mit ultraviolettem Licht blau fluoresziert. Kultur Ap1a wurde auf diese Weise behandelt und mit einem Fluoreszenzmikroskop (Keyence) visualisiert. Die digital aufgenommenen Fotos unterschiedlicher Verdünnungen der anaerob propionsäureoxidierenden Mischkultur Ap1a sind im Folgenden gezeigt. A B C D Abbildung 35: Fluoreszensmikroskopische Aufnahme der mit DAPI angefärbten propionsäureabbauenden Kultur Ap1a in PI-Medium und unbeimpftes, steriles PI-Medium; A unverdünnt; B 1:10 verdünnt; C 1:100 verdünnt; D unbeimpftes Medium; 400fache Vergrößerung; Größenmaß (weiß, unten rechts im Bild) = 5 µm. In Abbildung 35 sind in den Teilabbildungen A bis C Verdünnungen in Zehner-Schritten der Kultur Ap1a aus der BGA Arenrath GmbH & Co KG visualisiert. Unterschiedliche Morphologien sind erkennbar. Kokken in Tetraden (zum Beispiel Abbildung 35 B, roter Kreis), kurze Stäbchen in Ketten (Abbildung 35 A bis C, rote Ellipse in B) kurze, gewölbte Stäbchen in Paaren (Abbildung 35 C) und 4 ERGEBNISSE 124 vermutlich gerade, einzelne Stäbchen (Abbildung 35 C, rote Pfeile). Eine Darstellung der Population der Kultur Ap1a in einer Ebene ist bei einer Verdünnung von 1:100 (Abbildung 35 C) gezeigt. Abbildung 35 D zeigt mit DAPI behandeltes, unbeimpftes, steriles Medium PI. Runde sowie längliche Gebilde in vergleichbarer Größe und Gestalt von Mikroorganismen wurden mit DAPI angefärbt. Es handelte sich bei den Partikeln somit um Pflanzenreste aus dem Reaktorfiltrat, deren DNA ebenfalls mit dem Farbstoff angefärbt wurde. 4.2.2 Fluoreszenzmikroskopie eigenisolierter Reinkulturen methanogener Archaea Mit dem Fluoreszenzmikroskop wurde die Autofluoreszenz des von methanogenen Archaea gebildeten Cofaktors F420 (Abbildung 29) in eigenisolierten Reinkulturen methanogener Archaea (Kapitel 3.3.2) aus Biogasanlagen (Tabelle 18) und Laborfermentern (Klocke et al. 2007, 2009 a, b, Nettmann et al. 2010) mit gefiltertem Licht angeregt, fotografiert und mit der zugehörigen Software die Bilder entrauscht und ein Größenmaß eingefügt. Im Folgenden sind Fotografien von Zellen eigenisolierter methanogener Archaea nach Gattungen geordnet gezeigt. 4 ERGEBNISSE 125 4.2.2.1 Fluoreszenzmikroskopie der eigenisolierten Reinkulturen der Art Methanobacterium formicicum A B D C E Abbildung 36: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme der eigenisolierten Reinkulturen der Art Methanobacterium formicicum Stämme A TAF1 (Theo, Ingrid & Alexander Friedrich GbR), B HWS1 (Hubert Wagner und Sohn GbR), C BEG1 (BioEnergie Glahn), D LFP4.1 (Laborfermenter, Klocke et al. 2007, 2009 a, b, Nettmann et al. 2010) und der Typstamm E Methanobacterium formicicumT DSM1535; Bilder digital entrauscht; Größenstandard = 5 µm, weiß. In Abbildung 36 sind fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Art Methanobacterium formicicum eigenisolierter Kulturen (Kapitel 3.3.2) aus drei verschiedenen BGA’s (Abbildung 36 A, B, C) und einer Laborfermenterprobe (Abbildung 36 D) gezeigt. Die geraden Stäbchen hatten eine Größe von 3 µm bis 4,5 µm und waren unbeweglich. Damit glichen Eigenisolate morphologisch sowohl dem Typstamm Methanobacterium formicicumT DSM1535 (Abbildung 36 E) als auch untereinander. 4 ERGEBNISSE 126 A Abbildung 37: Zu B Aggregat zusammengelagerte Zellen der Reinkultur Methanobacterium formicicum LFP4.1, A Hellfeldaufnahme, B Fluoreszenzaufnahme; Bilder digital entrauscht; Größenstandard = 5 µm A schwarz, B weiß. Nach Einsetzen des Wachstums lagen die Mikroorganismen in Ketten beziehungsweise in mit dem Auge erkennbaren Aggregaten vor, wie Abbildung 37 zeigt. Die im Hellfeld erkennbaren, unscharfen Mikroorganismen lagen in den Ebenen hinter dem Aggregat und sind im Fluoreszenzbild nicht erkennbar, da ihre Autofluoreszenz nicht ausreichte, um die Leuchtkraft des Aggregats zu überlagern. 4.2.2.2 Fluoreszenzmikroskopie eigenisolierter Reinkulturen der Art Methanoculleus bourgensis Abbildung 38: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme der eigenisolierten Kultur Methanoculleus bourgensis BEGN (BioEnergie Glahn); Bilder digital entrauscht; Größenstandard = 5 µm, weiß. Die archaeale Reinkultur (Kapitel 3.3.2) Methanoculleus bourgensis BEGN wurde in dieser Arbeit aus dem Nachgärer der BGA BioEnergie Glahn eigenisoliert. Das Archaeon wies eine Morphologie von unregelmäßigen und unbeweglichen Kokken auf, die unter Anregung autofloureszierten 4 ERGEBNISSE 127 (Abbildung 38). Methanoculleus bourgensis TAF1.1 bildete die gleiche Morphologie aus, wie in Abbildung 38 gezeigt. 4.2.2.3 Fluoreszenzmikroskopie eigenisolierter Reinkulturen der Art Methanosarcina mazei A B Abbildung 39: Fluoreszenzmikroskopische C Aufnahme der eigenisolierten Reinkulturen Methanosarcina mazei A Stamm TAF1.2 (Theo & Ingrid & Alexander Friedrich GbR), B Stamm BEG3 (BioEnergie Glahn) und Typstamm C Methanosarcina mazeiT DSM2053; Bilder digital entrauscht; Größenstandard = 5 µm, weiß. Die Stämme TAF1.2 und BEG3 mit dem zugehörigen Typstamm Methanosarcina mazeiT DSM2053 (Mah 1980) wurden exemplarisch abgebildet. Die Stämme Methanosarcina siciliae Stamm BEGN2 aus dem Nachgärer der BGA BioEnergie Glahn und Methanosarcina mazei Stamm LFP2.1 aus dem Laborfermenter zeigten die gleiche Morphologie und Wachstumsweise, wie in Abbildung 39 gezeigt. 4 ERGEBNISSE 128 4.2.2.4 Fluoreszenzmikroskopie der eigenisolierten Reinkultur HWS2.1 der Art Methanosarcina barkeri A B Abbildung 40: Mikroskopische Aufnahmen der eigenisolierten Reinkultur Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 A Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme B Phasenkontrast; Bilder digital entrauscht; Größenstandard = 10 µm, weiß. Abbildung 40 A und B wurden mit dem Fluoreszenmikroskop von Schott erstellt, mit der zugehörigen Software entrauscht und der Größenstandard eingefügt. Die Morphologie gleicht der in Abbildung 39 C gezeigten Wachstumsweise von Kokken in Clustern der Stämme der Art Methanosarcina mazei. 4 ERGEBNISSE 129 4.2.2.5 Fluoreszenzmikroskopie der eigenisolierten Reinkultur LFP3.1 der Art Methanomethylovorans sp. A B C D Abbildung 41: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen A der eigenisolierten Reinkultur Methanomethylovorans sp. Stamm LFP3.1 (Laborfermenter, Klocke et al. 2007); B Cluster und den Typstämmen Methanomethylovorans hollandicaT DSM15978 (C) und Methanomethylovorans thermophilaT DSM17232 (D); Bilder digital entrauscht; Größenstandard = 5 µm, weiß. Autofluoreszierende Kokken in Tetraden zeigt Abbildung 41 A und B diese Tetraden in Clustern zusammengelagert, welche der aus einem Laborfermenter reinisolierte Stamm Methanomethylovorans sp. Stamm LFP3.1 bildete. Die Morphologie entsprach sowohl dem Wachstumsverhalten des Typstammes Methanomethylovorans hollandicaT DSM15978 (Abbildung 41 C) als auch Methanomethylovorans thermophilaT DSM17232 (Abbildung 41 D). 4 ERGEBNISSE 130 4.3 Titerbestimmung von Kulturen aus NawaRoBiogasanlagen 4.3.1 Titerbestimmung propionsäureabbauender Mikroorganismen in Mischkulturen Der Titer syntroph propionsäureabbauender Mikroorganismen in den Mischkulturen Fp1a, Wp2a, Gp1b und Ap1a (Tabelle 14) aus den in Tabelle 18 beschriebenen BGA’s in fünffacher Wiederholung wurden mit dem MPN-Verfahren (Kapitel 3.4.2) ermittelt. Dabei wurde die Anwesenheit anaerob propionsäureabbauender Mikroorganismen über die chemische Analyse des Substrats Propionsäure in den Kulturüberständen bestimmt. Der Propionsäuregehalt wurde am Tag der Beimpfung und nach 10 Wochen mit der HPLC (Kapitel 3.6.1) gemessen. Die Differenz der beiden Messwerte bildete den Propionsäureumsatz in den Kulturmedien. Ein negativer Umsatz wurde qualitativ dem Wachstum der propionsäureabbauenden Mikroorganismen gleichgesetzt. Die Zahlenfolgen aus verwendeter Tabelle (siehe dazu Kapitel 3.4.2) ergaben mit dem Reziprokwert der mittleren Verdünnung folgende Zellzahlen pro Milliliter in der Ausgangskultur. Tabelle 30: Titer propionsäureabbauender Mikroorganismen in PI-Mischkulturen mit dem MPNVerfahren Kultur1 Titer [Zellen L-1] 1 Fp1a 7 103 Wp2a 3,5 104 Gp1b 5 102 Ap1a 3,5 104 Inkubationszeit betrug 10 Wochen Die ermittelten Zellzahlen propionsäureabbauender Mikroorganismen in den Mischkulturen Fp1a, Wp2a, Gp1b und Ap1a (Tabelle 14) lagen in einem Bereich, bei dem die untere Erfassungsgrenze von 1 104 Zellen (Ziesing et al. in Hahn et al. 2008) einer mikroskopischen Charakterisierung unterschritten wird. Daher wurden molekularbiologische und chemische Charakterisierungsmethoden (Kapitel 4.5 und 4.7) angewendet. 4.3.2 Titerbestimmung eigenisolierter methanogener Archaea Zellen eigenisolierter methanogener Archaea wurden mithilfe einer Toma-Kammer (Kapitel 3.4.1.2) und einem Phasenkontrastmikroskop gezählt und der Titer pro Liter Kulturmedium berechnet (Formel 30). Der Titer bei frisch überführten Kulturen des Archaeons Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 aus der BGA Theo & Ingrid & Alexander Friedrich GbR lag bei durchschnittlich 4 ERGEBNISSE 131 1010 Zellen L-1 und der von Kulturen des Mikroorganismus Methanobacterium formicicum Stamm LFP4.1 aus einem Laborfermenter (Klocke et al. 2007, 2009 a, b, Nettmann et al. 2010) bei durchschnittlich 1011 Zellen L-1. Zellen des Stamms Methanoculleus bourgensis TAF1.1 wurden während der Wachstumsphase gezählt, um eine Korrelation zwischen dem Zellwachstum und der Methanproduktion herauszuarbeiten (Abbildung 119). 4.4 Physiologische Untersuchungen methanogener Eigenisolate mit unterschiedlichen Substraten Eigenisolierte methanogene Archaea wurden mit unterschiedlichen Substraten H2/CO2 und Formiat als Substrate für die hydrogenotrophe Methanogenese (Kapitel 1.9.1.1.1), Acetat und Essigsäure für die acetoklastische Methanogenese (Kapitel 1.9.1.1.2), Methanol als Vertreter der methylotrophen Methanogenese (Kapitel 1.9.1.1.3) und 2-Propanol als Vertreter für die Methanogenese aus zweiwertigen Alkoholen (Zellner und Winter 1987) kultiviert. Medien mit Substraten in der flüssigen Phase wurden mit N2 und das Medium mit 2-Propanol mit CO2 begast. Das Wachstum mit H2/CO2 als Substratmix wurde durch die Druckveränderung sowie visuell durch die Trübung oder mit dem Auge sichtbare Clusterbildung des Mediums und auch fluoreszenzmikroskopisch bestimmt und schriftlich dokumentiert. 4 ERGEBNISSE 132 Tabelle 31: Wachstumsverhalten methanogener Eigenisolate mit unterschiedlichen Substraten Stamm Methanobacterium formicicum Stamm BEG1 Methanobacterium formicicum Stamm HWS1 Methanobacterium formicicum Stamm LFP4.1 Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 Methanoculleus bourgensis Stamm BEGN Methanoculleus bourgensis Stamm TAF1.1 Methanomethylovorans sp. Stamm LFP3.1 Methanosaeta concilii Opficon Stamm BEG4 Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 Methanosarcina mazei Stamm LFP2.1 Methanosarcina mazei Stamm TAF1.2 Methanosarcina siciliae Stamm BEGN2 Methanosarcina mazei Stamm BEG3 H2/CO2 Acetat Essigsäure Formiat Methanol 2-Propanol + - - + - - + - - + - - + - - + - n. a. a + - - + - - + - - - - - + - - - - - - n. a.a n. a.a n. a.a + n. a.a - + - n. a.a - n. a.a + (+) - - + n. a. a + (+) - - + n. a.a + (+) - - + n. a.a + (+) - - + n. a.a + + - - + n. a.a a n. a. = nicht analysiert; + Wachstum; (+) geringes Wachstum; - kein Wachstum Stämme, welche der Gattung Methanosarcina zugehörten, wuchsen im Medium mit Acetat als Substrat zu vergleichsweise kleinen mit dem Auge gerade noch sichtbaren Clustern und zeigten nach der Inkubationszeit keine Autofluoreszenz mehr, was wahrscheinlich auf den restlosen Verbrauch des Acetats zurückzuführen ist. Hauptsächlich Stämme der Gattung Methanoculleus wurden in Medium mit 2-Propanol und CO2 überführt, da einige Vertreter zweiwertige Alkohole zu Methan umsetzen können (Garcia et al. in Falkow et al. 2006). Die Stämme Methanoculleus bourgensis TAF1.1 und BEGN wuchsen nicht ohne Acetat im Medium, ebenso wenig wie mit Acetat als einzige C-Quelle. Keiner der methanogenen Archaea wuchs mit Essigsäure, was den Grund hatte, dass der pH-Wert unter dem pH-Optimum der methanogenen Archaea lag. 4.5 Systematik von Mikroorganismen aus NawaRoBiogasanlagen Bakterielle Gesamt-DNA aus Fermenter- und Nachgärerproben sowie syntroph propionsäureoxidierende Anreicherungs-, Mischkulturen und Unterkulturen mit alternativen 4 ERGEBNISSE 133 Substraten aus NawaRo-Biogasanlagen wurden molekularbiologisch auf ihre mikrobielle Zusammensetzung untersucht, nachdem die polymerase-chain-reaction (engl. PCR, Kapitel 3.5.2) für bakterielle 16S rDNA aus Fermenter- und Nachgärerproben in dieser Arbeit optimiert und etabliert wurde. Bakterielle und methanogene Eigenisolate aus NawaRo-Biogasanlagen und Laborfermentern wurden ebenfalls mit molekularbiologischen Methoden identifiziert. Die GesamtDNA wurde zunächst isoliert (Kapitel 3.5.1) und daraufhin die bakterielle und bei Kulturen archaeale 16S rDNA mit spezifischen synthetischen Oligonukleotiden (Kapitel 2.4) amplifiziert (Kapitel 3.5.2 und 3.5.3). Nach unterschiedlichen Aufreinigungsmethoden (Kapitel 3.5.6-3.5.8) wurden die 16S rDNA-Fragmente reamplifiziert und extern sequenziert (Kapitel 3.5.9). Zudem wurde gezeigt, dass die molekularbiologische Methode der SAPD-PCR (Kapitel 3.5.4) auch mit Gesamt-DNA methanogener Archaea angewendet werden kann. Aus den erhaltenen Sequenzen bakterieller, sowie archaealer 16S rDNA aus Kulturen und Fermentern wurden mit der Phylogenie Software MEGA 4.0 Stammbäume mit Sequenzen von benachbarten Stämmen aus eigenanalysierter 16S rDNA von Typstämmen von der Deutschen Stammsammlung (DSMZ) beziehungsweise in einer Datenbank (NCBI) hinterlegten 16S rDNA Sequenzen erstellt. 4.5.1 Analysen bakterieller 16S rDNA aus NawaRo-Biogasanlagen Bakterielle DNA wurde aus Fermenterproben der in Tabelle 18 aufgeführten Biogasanlagen Theo & Ingrid & Alexander Friedrich GbR (TAF, F), Hubert Wagner und Sohn GbR (HWS, W), Arenrath GmbH & Co KG (A), BioEnergie Glahn (BEG, G) sowie des Nachgärers der BGA BioEnergie Glahn (GN) nach den in Kapiteln 3.5.1, 3.5.2, 3.5.5 und 3.5.7 bis 3.5.9 beschriebenen Methoden molekularbiologisch identifiziert. Für die Methodenetablierung der polymerase-chain-reaction (engl. PCR) für bakterielle 16S r DNA aus Biogasanlagen und Kulturen (Tabelle 14) in PI-Medium (Kapitel 2.6) wurde bakterielle chromosomale DNA aus der NawaRo-BGA BEG verwendet. Nach jeder Amplifizierung erfolgte eine Agarose-Gelelektrophorese (Kapitel 3.5.5). Diese sind in dieser Arbeit nicht gezeigt, da sie lediglich zur Überprüfung des Erfolgs jeder Amplifizierung genutzt wurden. 4.5.1.1 Identifizierungsergebnisse bakterieller 16S rDNA aus dem Fermenter der NawaRo-Biogasanlage BEG mit Etablierungsergebnissen der PCR-Methode Für Amplifizierungen isolierter chromosomaler DNA aus einer Fermenterprobe der NawaRo-BGA BEG (Tabelle 18) wurden jeweils 0,2 µL DNA eingesetzt und mit den bakteriellen Oligonukleotiden BSF8 und BSF1451 (Tabelle 8, Coton und Coton 2005) verfahren, wie in Kapitel 3.5.2 beschrieben. Es folgen die Ergebnisse der Methodenetablierung der PCR für Proben aus Biogasanlagen und Kulturen (Tabelle 14) in PI-Medium (Kapitel 2.6). 4 ERGEBNISSE 134 Abbildung 42: Temperaturgradienten-PCR bakterieller 16S rDNA aus einer Gesamt-DNA Isolierung des Fermenters BEG (BioEnergie Glahn); 5 µL Amplifikat pro Geltasche eines 1 %igen Agarosegel mit 0,1 % einer 0,035 %igen Ethidiumbromidlösung; Farben Natronwasserglaslösung, invertiert; schwarze angefärbt mit einer 7 %igen Pfeile = unerwünschte Bande; M = 2,5 µg GeneRuler™ DNA Ladder Mix SM0331. In Abbildung 42 sind jeweils 5 µL Amplifikat gezeigt. Der Schleier in den Spuren über den erwarteten Banden auf der Höhe der 1500 bp Markierung gründet auf einer beabsichtigten Überladung des Agarosegels mit Amplifikat. Durch die Überladung ist nach der Amplifizierung bei 52,7 °C bis 54,7 °C ist jeweils eine unerwünschte Bande knapp unter der 300 bp Markierung erkennbar (schwarze Pfeile). Das meiste Amplifikat mit gewünschter Fragmentgröße wurde bei einer Anlagerungstemperatur von 57,1 °C produziert. Zum Vergleich der Zuverlässigkeit der PCR wurden die Amplifizierungs-Produkte mit 52,7 °C („52“) und 62,4 °C („62“) Oligonukleotidanlagerungstemperatur kloniert (Beschreibung siehe Kapitel 3.5.7). Im Folgenden ist die Auftrennung einer Kolonie-Amplifizierung in einem 1 %igen Agarosegel gezeigt, die mit je 5 µL von 30 Klonen mit einer Anlagerungstemperatur bei 52,7 °C, sowie 30 Klonen mit einer Anlagerungstemperatur bei 62,4 °C durchgeführt worden war. 4 ERGEBNISSE 135 Abbildung 43: Kolonie-PCR bakterieller 16S rDNA aus je 2 µL Zellsuspension mit einem in E. coli transformierten Plasmid 4,0 des Fermenters BEG (BioEnergie Glahn); je 5 µL Amplifikat in einem 1 %igen Agarosegel mit 0,1 % einer 0,035 %igen Natronwasserglaslösung, angefärbt mit einer 7 %igen Ethidiumbromidlösung; Buchstaben: grün = für RFLP geeignete Menge Amplifikat; rot = misserfolgte Klonierung; schwarz = zu wenig Amplifikat für RFLP; schwarze Pfeile = unerwünschte Bande; M = 5 µL GeneRuler™ DNA Ladder Mix SM0331 (0,5 µg µL-1, Fermentas); Farben invertiert. Die Agarose-Gelelektrophorese in Abbildung 43 von je 5 µL einer Kolonie-PCR zeigte, dass die Klonierung einer Amplifizierung mit dem verwendeten Oligonukleotidpaar BSF8/ BSR1451 bei einer Anlagerungstemperatur von 62,4 °C zuverlässiger war als eine Klonierung einer 16S rDNAVervielfältigung mit einer Anlagerungstemperatur bei 52,7 °C. Eine Anlagerungstemperatur von 52,7 °C lieferte 19 (schwarze und grüne Buchstaben, erste Reihe der Abbildung 43) erfolgreiche Klonierungen von insgesamt 30 analysierten Klonen, wovon 8 Amplifikate (schwarze Buchstaben) eine zu geringe DNA-Konzentration für eine weiterführende RFLP oder Sequenzierung lieferten. Außerdem waren in 12 von 30 Spuren (grüne wie auch schwarze Buchstaben) jeweils eine unerwünschte Bande auf der Höhe von 300 bp erkennbar (schwarze Pfeile). Bei 62,4 °C Anlagerungstemperatur - abgebildet in der zweiten Reihe der Abbildung 43 - waren 24 (schwarze und grüne Buchstaben) von 30 analysierten Klonierungen erfolgreich, wobei 8 (grüne Buchstaben) 4 ERGEBNISSE 136 von diesen 24 Amplifikaten genug Produkt lieferten, um eine RFLP durchführen zu können. Mit 4 µL Zellsuspension der Klone, die nicht genügend DNA für eine RFLP lieferten, wurde erneut eine Kolonie-Amplifizierung durchgeführt (Agarose-Gelelektrophorese nicht gezeigt). Folgend sind die Agarose-gelelektrophoretisch aufgetrennten Restriktionen von jeweils 10 µL der erfolgreichen Kolonie-PCR-Amplifikate (1533 bp) verdaut mit jeweils 5 U des Restriktionsenzyms HaeIII abgebildet. A B Abbildung 44: Restriktionsmuster bakterieller 16S rDNA-Klone aus einer Probe des Fermenters BEG (BioEnergie Glahn); je 10 µL in einem 2,5 %igen Agarosegel mit 0,1 % einer 0,035 %igen Natronwasserglaslösung, angefärbt mit einer 7 %igen Ethidiumbromidlösung; A = erste Amplifikate; B = zweite Amplifikate; Buchstaben = 10 µL Kolonie-PCR-Amplifikat (1533 bp) geschnitten mit 5 U HaeIII; Zahlen = Schnittmuster; M = 5 µL GeneRuler™ DNA Ladder Mix SM0331 (0,5 µg µL-1, Fermentas); Farben invertiert. Die Restriktion der 20 Klone aus der ersten Kolonie-PCR ergab 15 verschiedene Schnittmuster (Abbildung 44 A). Dabei wurden 12 verschiedene Muster bei den Klonen, die mit 52,7 °C Anlagerungstemperatur amplifiziert worden waren und 6 verschiedene von 8 Mustern mit einer 4 ERGEBNISSE 137 Anlagerungstemperatur von 62,4 °C erzeugt. 5 Muster der Klone „62“ glichen 5 Mustern der Klone „52“. Muster 1 wiederholte sich insgesamt 3 Mal, wobei dieses 2 Mal bei den Klonen „62“ auftrat. Muster 9 trat ebenfalls insgesamt 3 Mal auf, wobei es sich 2 Mal allein bei den Klonen „62“ wiederholte. Muster 11 wurde 1 Mal bei den Klonen „52“ und 1 Mal bei den Klonen „62“ erzeugt. Die Klone der zweiten Kolonie-PCR, ergaben ein weiteres Muster (16, Abbildung 44 B), wobei in den Spuren „52“ü, „62“c und „62“h jeweils eine zusätzliche Bande in verschiedenen Höhen entstanden ist. Die Ergebnisse der RFLP bakterieller 16S rDNA-Fragmente aus dem Fermenter der Biogasanlage Biogasenergie Glahn (BEG, G) wurden in dieser Arbeit bei der molekularbiologischen Analyse durch Restriktion mit dem Enzym Hae III von 16S rDNA-Fragmenten anaerober Mikroorganismen aus der propionsäureabbauenden Mischkultur Gp1a und dessen Unterkulturen zum Vergleich der Muster zugezogen (Abbildung 53). Fragmente mit den Mustern 1-8, 10 und 1315 wurden nicht sequenziert, da sich diese Arbeit auf die kultivierbaren propionsäureabbauenden Mischkulturen konzentrierte. 4.5.1.2 Identifizierung von Bakterien mit chromosomaler Gesamt-DNA aus den Fermentern weiterer NawaRo-Biogasanlagen und einem Nachgärer Die bakterielle Gesamt-DNA der Fermenter der Biogasanlagen Theo & Ingrid & Alexander Friedrich GbR (TAF, F), Hubert Wagner und Sohn GbR (HWS, W) und Arenrath GmbH & Co KG (A) und des Nachgärers der Biogasanlage BioEnergie Glahn (BEG, GN) wurden ebenfalls molekularbiologisch analysiert (Tabelle 18). Die chromosomale Gesamt-DNA wurde auch hier zunächst mit den Oligonukleotiden BSF8 und BSR1541 (Tabelle 8) amplifiziert und daraufhin kloniert. Jeweils 25 bis 30 Klone wurden einer Kolonie-PCR ausgesetzt und das Amplifikat mit dem Restriktionsenzym HaeIII verdaut. Die folgende Abbildung 45 zeigt die Restriktionsmuster der erfolgreichen Amplifizierungen beziehungsweise der in ausreichender Menge vorhandenen Produkte aus der Kolonie-PCR der Fermenter Theo & Ingrid & Alexander Friedrich GbR (F), Hubert Wagner & Sohn GbR (W), Arenrath GmbH & Co KG (A) und dem Nachgärer der Biogasanlage BioEnergie Glahn (GN). 4 ERGEBNISSE 138 Abbildung 45: Restriktionsmuster bakterieller 16S rDNA-Klone aus den Fermentern F (Theo & Ingrid & Alexander Friedrich GbR), W (Hubert Wagner und Sohn GbR), A (Arenrath GmbH & Co KG) und dem Nachgärer GN (BioEnergie Glahn); je 10 µL in einem 2,5 %igen Agarosegel mit 0,1 % einer 0,035 %igen Natronwasserglaslösung, angefärbt mit einer 7 %igen Ethidiumbromidlösung; Kolonie-Amplifizierungs-Produkt Buchstaben = Schnittmuster; (1533 bp) = 10 µL grüne geschnitten Spurenbezeichnung über mit 5U HaeIII; Gelbeladungstasche = zur Sequenzierung verwendetes Reamplifikat; rot = Reamplifizierung nicht möglich; M = 2,5 µg GeneRuler™ DNA Ladder Mix SM0331; Farben invertiert. Aus den Fermentern F wurden drei verschiedene Muster festgestellt und aus W wurde eine Restriktion durchgeführt, welche eine weitere Restriktionsmustervariante ergab. Beim Vergleich der Abbildung 45 mit der Abbildung 44 B fällt auf, dass das Muster 16 in den Restriktionen der KlonAmplifikate des Nachgärers GN sowie Fermenter A wiederholt auftauchten. Reamplifikate der in Abbildung 45 grünen Musterzahlen wurden zur Sequenzierung versendet. Die digital erhaltenen Sequenzen wurden mit Datenbanken verglichen, um den Mikroorganismus zu identifizieren. In Tabelle 32 ist eine erste Übersicht der Sequenzierungsergebnisse der bakteriellen Gesamt-DNA aus den Fermentern F, W, A und des Nachgärers GN dargestellt. Die für den Sequenzvergleich verwendeten Sequenzen sind auf der ‚RohdatenCD/Molbiol_Analysen/Molbiol_Analysen_Fermenter/Molbiol_Analysen_Fermenter_Bac‘ einsehbar. 4 ERGEBNISSE 139 Tabelle 32: Systematische Zuordnung bakterieller partieller 16S rDNA-Sequenzen aus Fermentern F, W und A sowie Nachgärer GN BGA Muster Beschreibung des Mikroorganismus mit größter Sequenzlänge [Häufigkeit] Übereinstimmung aus digitaler Datenbank F3 17 [1/3] % [bp] 8581 Clostridium sp. 6-31 89 2 (773/34/871) 18 [1/3] 7801 Clostridium sp. 6-31 87 2 (663/26/761) W4 19 [1/3] Firmicutes 20 [1/1] Clostridium sp. 6-31 8671 (n. a.)2 8851 89 87 2 (768/35/883) GN5 11 [1/11] 16 [10/11] 3811 (n. a.)2 Clostridia Musterzuordnung zu Muster 16 aus BGA A: 85 Muster 16 aus Escherichia coli K-12 Unterstrang MDS42 BGA A: 5281 99 (528/0/529)2 A6 16 [16/17] 5281 Escherichia coli K-12 Unterstrang MDS42 99 2 (528/0/529) 16a [1/17] 4291 (n. a.)2 Firmicutes 1 Gesamtsequenzlänge; 2Übereinstimmung/Lücken/verglichene Sequenzlänge; 4 3 84 Theo & Ingrid & 5 Alexander Friedrich GbR, Hubert Wagner & Sohn GbR, Arenrath GmbH & Co KG; 6 Nachgärer der Biogasanlage BioEnergie Glahn; n. a.: nicht auswertbar Tabelle 32 zeigt eine Übersicht über die ausgewerteten Sequenzen aus NawaRo-Biogasanlagen. Mithilfe der digitalen Datenbank der NCBI wurden die erhaltenen Sequenzen identifiziert. Die Sequenz mit dem in Nachgärer GN, sowie Fermenter A häufig auftretenden Muster 16 wurden dem Organismus Escherichia coli zugeordnet. Die Sequenzen mit den Mustern 17 und 18 aus Fermenter F und auch die Sequenz mit Muster 20 aus Fermenter W wiesen Übereinstimmungen bis zur Gattung Clostridium vor. Die Sequenz aus dem Nachgärer GN mit aus der RFLP des Fermenters G bekanntem Muster 11 (Abbildung 44 A und Abbildung 45) wurde der Klasse Clostridia zugeordnet. Die Sequenzen mit Muster 19 aus Fermenter F und Muster 16a aus Fermenter A wurden beim Phylum Firmicutes eingeordnet. Mit diesen Ergebnissen, war es möglich, einige in den Fermentern vorhandene Bakterien zu identifizieren. Die Restriktionsmuster wurden für den Vergleich mit Mustern aus propionsäureabbauenden Mischkulturen und deren Unterkulturen verwendet. 4 ERGEBNISSE 140 4.5.2 Identifizierung kultivierbarer Bakterien aus syntroph propionsäureoxidierenden Misch- und Unterkulturen Syntroph propionsäureoxidierenden Mischkulturen (Tabelle 14) aus den NawaRo-BGA’s Theo & Ingrid & Alexander Friedrich GbR, Hubert Wagner und Sohn GbR, BioEnergie Glahn und Arenrath GmbH & Co KG (Analgenparameter siehe Tabelle 18) wurde zur Identifizierung nach den in Kapiteln 3.5.1, 3.5.2, 3.5.5, 3.5.6 sowie 3.5.7 bis 3.5.9 beschriebenen molekularbiologischen Methoden verfahren. Die Kulturen wurden nach jeweils 6 wöchiger Inkubation dafür verwendet, da in den Mischkulturen der Abbau des Propionsäuregehalts chemisch analytisch messbar war (Kapitel 4.7.1). Basierend auf den Sequenzierungsergebnissen der propionsäureabbauenden Mischkulturen Fp1a (Tabelle 34) und Gp1a (Tabelle 41) wurden die propionsäureabbauenden Mischkulturen Ap1a, Fp1a Gp1a, Gp1b, Wp1a, und Wp2a (Tabelle 14) zusätzlich in Kulturmedien mit anderen Substraten 1:10 (v/v) verdünnt überimpft, um eine Selektion einzelner Bakterienarten zu erreichen. Es wurden die DSMZ-Medien 1264 für den Genus Spirochaeta, 520 für den Genus Clostridium und 63 modifiziert für den Genus Desulfovibrio verwendet (Kapitel 2.6). 1533 bp der Gesamt-16S rDNA aus den Unterkulturen Ap1a1264, Fp1a1264, Gp1b1264 und Wp2a1264 in DSMZ Medium 1264 (Tabelle 14, DSMZ 2012) wurden molekularbiologisch analysiert. Die Methode wurde durchgeführt, wie bereits bei der Analyse der Gesamt-DNA aus Fermentern (Kapitel 3.5.1) beschrieben worden ist. Es wurden zwei Klonierungsdurchgänge durchgeführt, da die extern durchgeführte Sequenzierungsreaktion des ersten Durchgangs auf Grund von Signalüberlappungen respektive fehlenden Signalen nicht zu den erwünschten Sequenzen führten. Die in dieser Arbeit durch die extern durchgeführten Sequenzierungsreaktionen erhaltenen eindeutigen Restriktionsmuster des ersten Klonierungsdurchganges wurden bei der Auswertung des zweiten Klonierungsdurchganges zum Vergleich der Muster berücksichtigt. Propionsäureoxidierende Mischkulturen überimpft in DSM-Medium 520 für den Genus Clostridium wurden ebenfalls molekularbiologisch analysiert. Hierfür wurde Gesamt-DNA aus den Kulturen Fp1a520 und Ap1a520 mit dem synthetischen Oligonukleotidpaar 519fGC/1070r (Tabelle 8) amplifiziert und daraufhin eine Denaturierende Gradienten Gel Elektrophorese (DGGE, Kapitel 3.5.6) durchgeführt. Die aufgetrennten Banden wurden manuell ausgeschnitten und die DNA-Fragmente eluiert. Mit dem Oligonukleotidpaar 519f/1070r (Tabelle 8) erhaltene Reamplifikate dieser Fragmente wurden zum Sequenzieren versendet. Aus den propionsäureabbauenden Mischkulturen Fp1a, Wp1a und Gp1a wurden Unterkulturen in modifiziertem DSMZ-Medium 63 mit den Bezeichnungen Fp1a63-L, Wp1a63-L und Gp1a63-L kultiviert. Isolierte Gesamt-DNA aus den Unterkulturen Fp1a63-L und Gp1a63-L wurde wie oben beschrieben molekularbiologisch analysiert. Von jeweils 20 KlonReamplifikaten der Unterkulturen in modifiziertem DSMZ-Medium 63 wurden drei aus jeder Kultur mit den höchsten DNA-Fragment-Gehalten zur Sequenzierung versendet und eine Sequenz aus der Kulturen Fp1a63-L und Gp1a63-L erhalten. 4 ERGEBNISSE 141 Eine molekularbiologische Analyse der Kulturen Fp1b, Wp2a, Gp1b, Ap1a, Ap1b, Ap3a und Ap3b wurde nicht durchgeführt, da aufgrund einer zu hohen Partikelanzahl im Medium keine DNAIsolierung aus den Kulturen in PI-Medium möglich war. In den folgenden Kapiteln sind die Ergebnisse der Identifizierungen der Mischkultur Fp1a und dessen Unterkulturen Fp1a1264 (F), Fp1a520 (F520) und Fp1a63-L, der Mischkultur Wp1, der Unterkultur Wp2a1264 (W), der Mischkultur Gp1a, dessen Unterkulturen Gp1b1264 (G), Gp1a63-L, sowie Unterkulturen Ap1a1264 (A) und Ap1a520 (A520) in angegebener Reihenfolge dargestellt und erläutert. 4.5.2.1 Identifizierung von Bakterien aus den Mischkulturen Fp1, Fp1a sowie Unterkulturen Fp1a1264, Fp1a520 und Fp1a63-L Mit der mehrfach überimpften Mischkultur Fp1 aus der NawaRo-BGA Theo & Ingrid & Alexander Friedrich GbR (Analgenparameter siehe Tabelle 18) wurde nach der Isolierung der chromosomaler Gesamt-DNA (Kapitel 3.5.1) eine Identifizierung der partiellen bakteriellen 16S rDNA über eine Denaturierende Gradienten Gel Elektrophorese durchgeführt (DGGE, Kapitel 2.5.3 und 3.5.6). Abbildung 46: DGGE des Amplifikats aus Kultur Fp1 (Tabelle 14); Denaturierender Gradient: 70/30; angefärbt mit einer 7 %igen Ethidiumbromidlösung; grüne Zahlen = zur Sequenzierung versendete Reamplifikate; schwarze Zahlen = zu wenig Reamplifikat für eine Sequenzierung; Farben invertiert. Die Spur eines DGGE-Gels in Abbildung 46 zeigt sechs unterschiedlich weit gelaufenen DNABanden verschieden codierter DNA aus der Kultur Fp1. Zur Sequenzierung wurden zwei Eluate reamplifiziert DNA-Fragmente und versendet (Abbildung 46, grüne Zahlen). Die weiteren eluierten Fragmente (Abbildung 46, schwarze Zahlen) erbrachten zu wenig Amplifikat aufgrund zu geringer Menge Ausgangs-DNA. 4 ERGEBNISSE 142 Tabelle 33: Molekularbiologisch analysierte Sequenzen der 16S rDNA-Fragmente aus der propionsäureabbauenden Mischkultur Fp1 (Tabelle 14) Kultur Sequenzlänge [bp] % Desulfovibrio aminophilusT DSM12254 3821 378/1/3822 99 Spirochaeta sp. 443 433/0/4372 Bande Mikroorganismus Fp5 Fp6 Fp1 1 99 1 Gesamtsequenzlänge; 2Übereinstimmung/Lücken/verglichene Sequenzlänge Eine Art der Gattung Spirochaeta wurde mit der DGGE zu 99 % identifiziert (Tabelle 33). Bei den beiden zur Sequenzierung versendeten 16S rDNA-Fragmente (500 bp) aus der DGGE von Kultur Fp1 trat neben der Sequenz eines Spirochaeata sp. die Sequenz mit 99 %iger Übereinstimmung mit dem Mikroorganismus Desulfovibrio aminophilusT DSM12254 auf. Die nach der Inkubation mit Fumarat (Abbildung 83) erhaltene syntroph propionsäureabbauende Kultur Fp1a (Abbildung 94) wurde ebenfalls molekularbiologisch analysiert. Die isolierte GesamtDNA aus Kultur Fp1a wurde die gesamte 16S rDNA mit dem Oligonukleotidpaar Eubac5/Eubac3 (Tabelle 8) amplifiziert und kloniert. Von 25 Klonen wurden 24 Klon-Fragmente der gesamten bakteriellen 16S rDNA aus Kultur Fp1a wurden für eine RFLP (Kapitel 3.5.8) mit den Restriktionsenzymen HaeII und HaeIII (Kapitel 2.3.2) verwendet. 4 ERGEBNISSE 143 A B Abbildung 47: RFLP von 24 16S rDNA-Klon-Fragmenten aus Kultur Fp1a (Tabelle 14); 10 µL Plasmid-Amplifizierungs-Produkt ungeschnitten (A) und geschnitten mit jeweils 5 U HaeII (II) und HaeIII (III); A Klone 1-17, grüne Klonbezeichnung = zur Sequenzierung verwendetes Reamplifikat; B Klone 18-24 in Natronwasserglaslösung, einem angefärbt Buchstaben = Schnittmuster; Sequenzierung; 2,5 %igen schwarze grüne Agarosegel mit einer 7 %igen Zahlen Beschriftung über über mit 0,1 % einer 0,035 %igen Ethidiumbromidlösung; griechische Spuren = Versand Spuren = nicht des genügend Fragments zur Reamplifikat für Sequenzierung; rote Diagonalbalken = zu geringe Amplifikatkonzentration für RFLP; M = 2,5 µg GeneRuler™ DNA Ladder Mix SM0331; Farben invertiert. In den Spuren einiger Restriktionen - zum Beispiel bei Klon Fp1a24 in Abbildung 47 dunkel dargestellte Schatten - wurden über den diskreten Banden angefärbt. Dies deutet auf eine Überladung des Agarosegels mit DNA hin, die sich aufgrund der Menge nicht in einer Bande konzentrieren lies. Muster (Abbildung 47) ergaben 9 Restriktionen von 24 Klon-Fragmenten bakterieller 16S rDNA aus der Mischkultur Fp1a. Ein dem Schnittmuster Muster mit einer Bande weniger als bei Muster durch HaeIII ähnliches entstand bei 7 von 24 Klonen, mit dem zusätzlichen Unterschied, dass HaeII kein- oder einmalig geschnitten hat. Muster Restriktion des Klons Fp1a9. Ebenfalls Einmal trat Muster entstand bei der 2 auf, was in der mit HaeIII 4 ERGEBNISSE 144 geschnittenen DNA-Spur des Klons Fp1a20 eine hohe Ähnlichkeit mit Muster aufwies und ebenfalls zwei Mal vom Restriktionsenzym HaeII geschnitten wurde. von 24 Amplifikaten wiesen 6 eine zu geringe DNA-Konzentration auf, dass sie unter die Visualisierungsgrenze der Färbung von DNA mit Ethidiumbromid fielen. Die 16S rDNA-Fragmente der Klone Fp1a1, Fp1a2, Fp1a7, Fp1a9, Fp1a10, Fp1a14 und Fp1a18 wurden nach Aufreinigung der Reamplifikate zur Sequenzierung versendet. Mit den restlichen Klon-Fragmenten war eine Reamplifizierung auch mit variierender Konzentration der DNA-Vorlage nicht möglich (Daten nicht gezeigt). Tabellarisch sind die Identifizierungsergebnisse der erhaltenen Sequenzen aus der propionsäureabbauenden Kultur Fp1a nach Klonen geordnet aufgeführt. Tabelle 34: Molekularbiologische Analyse der klonierten 16S rDNA-Fragmente aus der Mischkultur Fp1a (Tabelle 14) Muster [Häufigkeit/ Gesamtklone] Klon Mikroorganismus Sequenzlänge [bp] % Fp1a1 (9/24) Spirochaeta caldariaT DSM7334 5721 (503/16/572)2 88 Fp1a2 (9/24) Spirochaeta caldariaT DSM7334 9301 (816/31//921)2 89 Fp1a7 (9/24) Spirochaeta caldariaT DSM7334 8091 (692/26/796)2 87 Fp1a9 (1/24) T Gracilibacter thermotolerans DSM17427 T 7181 (646/19/713)2 91 2 Clostridium clariflavum DSM19732 (646/26/711) Fp1a10 (9/24) Spirochaeta caldariaT DSM7334 5551 2 (476/17/540) 88 Fp1a14 (9/24) Spirochaeta caldariaT DSM7334 6601 2 (577/23/664) 87 Fp1a18 (9/24) unzureichende Signalstärke bei der Sequenzierung n.a. n.a. 1 Gesamtsequenzlänge; 2Übereinstimmung/Lücken/verglichene Sequenzlänge; n. a.: nicht auswertbar Die Klonsequenzen mit Muster haben die höchste Übereinstimmung mit dem Typstamm Spirochaeta caldariaT DSM7334 mit nah beieinanderliegender Wertigkeiten von 87 bis 89 %. Ein multipler Sequenzvergleich mit Erstellung einer Konsensussequenz (662 bp, Clustal 2.1, EBI, siehe Abbildung 128) und einen erneuten Abgleich mit der NCBI-Datenbank wurde durchgeführt. Zu 87 % (Übereinstimmung: 581 bp, Lücken: 25 bp, verglichene Sequenzlänge: 666 bp) stimmte die Konsensussequenz ebenfalls mit Spirochaeta caldariaT DSM7334 überein. Die Sequenzen mit Muster wurden dem Genus Spirochaeata zugeordnet. Dieses Sequenzierungsergebnis bedeutet, 4 ERGEBNISSE 145 dass die Kultur Fp1a nach der Inkubation mit Fumarat Spirochäten enthält, wie Kultur Fp1 (Tabelle 33). Die Signalstärke der farbmarkierten 16S rDNA-Fragmente des Klons Fp1a18 war zur Bestimmung der Abfolge der DNA-Basen zu gering. Klon Fp1a9 mit dem Restriktionsmuster hatte die höchste Übereinstimmung mit dem Typstamm Gracilibacter thermotoleransT DSM17727, dicht gefolgt von dem der gleichen Ordnung zugehörigen Clostridium clariflavumT DSM19732, was in beiden Fällen auf eine Übereinstimmung von jeweils 91 °% hinauslief. Daher wurde diese Klonsequenz zur Ordnung Clostridiales zugeordnet. Aufgrund der Häufigkeit des Spirochäten-Musters (Abbildung 47) und der enthaltenen Clostridiales-Sequenz (Klon Fp1a9, Tabelle 34) wurde Spirochäten-Medium 1264 und ClostridienMedium 520 (Kapitel 2.6) der DSMZ 1:10 mit der syntroph Propionsäureoxidierende Kultur Fp1a beimpft. Außerdem wurde Kultur Fp1a in modifiziertem DSMZ-Medium 63 ohne Lactat (Kapitel 2.6) überimpft, um nachzuprüfen, ob sulfatreduzierende Mikroorganismen in Kultur Fp1a enthalten sind, die mit molekularbiologischen Identifizierungsmethoden bisher nicht erfasst worden waren. Folgend sind die Identifizierungsergebnisse der Unterkulturen Fp1a1264, Fp1a520 und Fp1a63-L aufgeführt. A B Abbildung 48: RFLP der Klon-Amplifikate aus Unterkultur Fp1a1264 (F, Tabelle 14); A erster Klonierungsdurchgang, B zweiter Klonierungsdurchgang; in einem 2,5 %igen Agarosegel mit 0,1 % einer 0,035 %igen Natronwasserglaslösung, angefärbt mit einer 7 %igen Ethidiumbromidlösung; jeweils 8 µL Klon-Amplifikat (1533 bp) geschnitten mit 5 U HaeIII; Buchstaben: Restriktionsmuster; grün: zur Sequenzierung versendetes Reamplifikat; rot: Reamplifizierung nicht erfolgreich; M = 2,5 µg GeneRuler™ DNA Ladder Mix SM0331; Farben invertiert. Beim ersten Klonierungsdurchgang der Kultur Fp1a1264 enthielten 13 von 15 Klonen genügend Amplifikat, um eine Restriktion durchführen zu können (Abbildung 48 A). Im zweiten Durchgang wurden ebenfalls 15 Klone einer Kolonie-PCR unterzogen. Danach wurden 9 Amplifikate restringiert (Abbildung 48 B). Eine Übersicht über die molekularbiologische Analyse der Unterkultur Fp1a1264 ist im Folgenden alphabetisch nach Mustern geordnet aufgeführt. Die auswertbaren Sequenzen der 4 ERGEBNISSE 146 Klon-Fragmente befinden sich digital auf der Rohdaten CD unter ‚/Molbiol_Analysen/ Molbiol_Analysen_Ukulturen/Molbiol_Analysen_Ukulturen1264‘. Tabelle 35: Molekularbiologisch analysierte Sequenzen der klonierten 16S rDNA-Fragmente aus der Unterkultur Fp1a1264 (Tabelle 14) Klon Muster [Häufigkeit/ Gesamtklone] Bemerkung Sequenzlänge [bp] % Fm a (6/22) Sequenzierung ohne Ergebnis n. a. n. a. F15 a? (1/22) Sequenzierung ohne Ergebnis n. a. n. a. Fd b (3/22) Sequenzierung ohne Ergebnis n. a. n. a. F10 b2 (1/22) Proteiniphilum acetatigenesT DSM18083 5331 (495/11/531)2 93 F14 c (2/22) Sequenzierung ohne Ergebnis n. a. n. a. F6 d (2/22) Aminobacterium colombiense DSM12261 3861 (366/2/381)2 96 F9 d2 (1/22) Sphaerochaeta globus Stamm Buddy Fk e (1/22) Fn F12 99 Sequenzierung ohne Ergebnis n. a. n. a. f (1/22) Sequenzierung ohne Ergebnis n. a. n. a. q (1/22) Reamplifizierung nicht möglich n. a. n. a. F5 u (2/22) Escherichia coli K-12 Unterstrang MDS42 Fh - (1/22) Reamplifizierung nicht möglich 1 1 799 (787/2/798)2 Gesamtsequenzlänge; 2 Übereinstimmung/Lücken/verglichene 1 500 (499/0/500)2 99 n. a. n. a. Sequenzlänge; n. a.: nicht auswertbar Die Sequenzierung des Musters ‚b2‘ aus der Unterkultur Fp1a1264 (Tabelle 35) ergab nach dem Vergleich mit der NCBI-Datenbank eine Übereinstimmung zu gleichen Verhältnissen mit der 16S rDNA-Sequenz des Mikroorganismus Proteiniphilum acetatigenesT DSM18083 und mit der Sequenz eines Mikroorganismus Ruminobacillus xylanolyticum. Bei Ruminobacillus xylanolyticum handelt es sich um einen unveröffentlichten Stamm aus dem Pansen, von dem nur eine partielle Sequenz aus der 16S rDNA in der offenen Datenbank bekannt ist. Er wurde daher bei der Auswertung nicht weiter berücksichtigt und diese Sequenz dem Genus Proteiniphilum zugeordnet. Die Sequenz mit Muster ‚d‘ wurde der Gattung Aminobacterium zugeordnet. Muster d2 gehört nach den Informationen der NCBI-Datenbank zu einer Art des Genus Sphaerochaeta. Neben diesem Mikroorganismus wurden in der Kultur Fp1a1264 keine Spirochaeta identifiziert. Mit der Sequenz des Klons F5 wurde ein weiteres Muster sequenziert, welches mithilfe der digitalen Datenbank der NCBI zu 99 % Escherichia coli K-12 zugeordnet wurde. Ein visueller Vergleich des 4 ERGEBNISSE 147 Restriktionsmusters ‚u‘ des Klons F5 (Abbildung 48) mit dem Muster 16 aus Fermenter der BGA Arenrath GmbH & Co KG (Abbildung 45) zeigte, dass die Restriktionsmuster die gleiche Bandenverteilung vorwiesen. Restriktionen des bakteriellen 16S rDNA-Fragments mit diesem Muster wurden dem Bakterium Escherichia coli K-12 zugeordnet und Muster ‚u‘ genannt. Aus den obigen Sequenzierungsergebnissen der Kultur Fp1a1264 und mit Berücksichtigung der nachstehend identifizierten Sequenzen aus den anderen Unterkulturen in DSMZ-Medium 1264 ergab sich folgende bakterielle Diversität nach alphabetischer Reihenfolge der Restriktionsmuster geordnet für Kultur Fp1a1264. Tabelle 36: Bakterielle Diversität der Kultur Fp1a1264(Tabelle 14) Kultur Fp1a1264 1 Muster [Häufigkeit/ Gesamtklone] Bemerkung a (6/22) Musterzuordnung zur Sequenz des UnterkulturKlons G13: Aminobacterium colombienseT DSM12261 a? (1/22) Sequenzierung ohne Ergebnis b (3/22) Sequenzlänge [bp] % G13: 8621 (836/9/864)2 97 n. a. n. a. Musterzuordnung zur Sequenz des UnterkulturKlons A10: Proteiniphilum acetatigenesT DSM18083 A10: 7851 (734/15/786)2 93 b2 (1/22) Proteiniphilum acetatigenesT DSM18083 533 (495/11/531)2 93 c (2/22) Sequenzierung ohne Ergebnis n. a. n. a. d (2/22) Aminobacterium colombienseT DSM12261 386 (366/2/381)2 96 d2 (1/22) Sphaerochaeta globus Stamm Buddy 7991 2 (787/2/798) 99 e (1/22) Musterzuordnung zur Sequenz des UnterkulturT DNA-Klons W12: Wolinella succinogenes DSM1740 W12: 546 (533/0/535)2 99 f (1/22) Sequenzierung ohne Ergebnis n. a. n. a. q (1/22) Reamplifizierung nicht möglich n. a. n. a. u (2/22) Escherichia coli K-12 Unterstrang MDS42 5001 (499/0/500)2 99 / (1/22) n. a. n. a. n. a. Gesamtsequenzlänge; auswertbar 2 Übereinstimmung/Lücken/verglichene Sequenzlänge; n. a.: nicht 4 ERGEBNISSE 148 Mit mehrfacher Überimpfung in flüssigem DSMZ-Medium 520 wurde Proteiniphilum acetatigenes Stamm Fp1a520 aus der Mischkultur Fp1a isoliert. Die Identifizierung des Mikroorganismus wurde mithilfe der DGGE (Kapitel 2.5.3 und 3.5.6) durchgeführt. Abbildung 49:DGGE-Gel der partiellen bakteriellen 16S rDNA (500 bp) aus Kultur Fp1a520 (F520, Tabelle 14); Denaturierender Gradient: 70/30; angefärbt mit einer 7 %igen Ethidiumbromidlösung; grüne Zahl = zur Sequenzierung versendetes Reamplifikat; schwarze Zahl = zu wenig Reamplifikat für eine Sequenzierung; Farben invertiert. Die in Abbildung 49 gezeigte DGGE-Spur der Unterkultur Fp1a520 wies zwei Banden auf, die ausgeschnitten und eluiert wurden. Zur Sequenzierung wurde das Reamplifikat der ersten Bande versendet. Die zweite Bande erbrachte zu wenig Reamplifikat für eine Sequenzierungsreaktion, was darauf hindeutete, dass diese Bande aus degradierten DNA-Fragmenten der Fragmente bestand, die oben als Bande 2 separiert worden waren. 4 ERGEBNISSE 149 Tabelle 37: Molekularbiologisch analysierte Sequenz der 16S rDNA-Fragmente aus der Unterkultur Fp1a520 Kultur DGGE Bande Fp1a520 1 Bemerkung Proteiniphilum acetatigenesT DSM18083 2 1 Gesamtsequenzlänge; zu wenig Reamplifikat 2 Übereinstimmung/Lücken/verglichene Sequenzlänge [bp] % 4781 (463/2/474)2 98 n. a. n. a. Sequenzlänge; n. a.: nicht auswertbar Aus Unterkultur Fp1a520 wurde mithilfe der DGGE-Methode der Mikroorganismus Proteiniphilum acetatigenesT eindeutig identifiziert (Tabelle 37), was die bereits erfolgte Zuordnung des Restriktionsmusters ‚b2‘ (Abbildung 48 B) des Klons F10 (Tabelle 35) aus der Unterkultur Fp1a1264 zum Genus Proteiniphilum bestätigte. Aus der propionsäureoxidierenden Mischkultur Fp1a wurde über den Wechsel des Substratangebots und Verdünnungsreihen in Medium 520 Proteiniphilum acetatigenes Stamm Fp1a520 isoliert. Die partielle 16S rDNA Sequenz ist mit der accession number JQ955659 in der NCBI-Datenbank hinterlegt. Eine 521 bp lange Sequenz (siehe ‚RohdatenCD/Molbiol_Analysen/Molbiol_Analysen_Ukulturen‘) des Klon-Fragments Fp1a63-L11 stimmte zu 94 % mit der Sequenz des Sulfat reduzierenden Mikroorganismus Geovibrio thiophilusT DSM11263 überein (Übereinstimmung von 492 bp mit 4 Lücken bei einer verglichenen Sequenzlänge von 523 bp). Diese Identifizierung bestätigte beispielsweise das Ergebnis der Sequenzierung des Klons G10 mit Muster ‚ß‘ der Unterkultur Gp1b1264 (Abbildung 53 B, Tabelle 42), dass Bakterien des Genus Geovibrio in propionsäureabbauenden Mischkulturen enthalten sind. Eine fortführende Kultivierung in Medium 63-L kann den Mikroorganismus von bakteriellen Kontaminanten isolieren. Eine Übersicht der aus der syntroph propionsäureoxidierenden Mischkultur Fp1a identifizierten Bakterien bietet die phylogenetische Aufarbeitung der Sequenzierungsergebnisse (Abbildung 72). 4.5.2.2 Identifizierung von Bakterien aus der Mischkultur Wp1 Mit der syntroph propionsäureoxidierenden Mischkultur Wp1 aus der NawaRo-BGA Hubert Wagner und Sohn GbR (Tabelle 18) wurde eine DGGE (Kapitel 2.5.3 und 3.5.6) durchgeführt. 4 ERGEBNISSE 150 Abbildung 50: DGGE des Amplifikats der Kultur Wp1 (Tabelle 14); Denaturierender Gradient: 70/30; angefärbt mit einer 7 %igen Ethidiumbromidlösung; grüne Zahlen = zur Sequenzierung versendete Reamplifikate; schwarze Zahlen = zu wenig Reamplifikat für eine Sequenzierung; rote Zahl = keine Reamplifizierung möglich; Farben invertiert. Zwei Teilsequenzen wurden aus Kultur Wp1 zum Sequenzieren versendet (grüne Zahlen, Abbildung 50). Auch hier gelten die bei der DGGE der Kultur Fp1 erläuterten Bemerkungen zu der unterschiedlichen Ausprägung der Banden. Tabelle 38: Molekularbiologisch analysierte Sequenzen der 16S rDNA-Fragmente aus der propionsäureabbauenden Mischkultur Wp1 (Tabelle 14) Kultur Sequenzlänge [bp] % Wolinella succinogenes DSM1740 4541 2 446/0/446 100 Tepidanaerobacter acetatoxydansT DSM21804 452 447/0/4492 Bande Bemerkung Wp1.1 Wp1.2 T Wp1 1 99 1 Gesamtsequenzlänge; 2Übereinstimmung/Lücken/verglichene Sequenzlänge Die DGGE der Kultur Wp1 trennte ein DNA-Fragment auf (Bande 1, Abbildung 50), welches zu 100 % als Wolinella succinogenesT DSM1740 identifiziert wurde. Das zweite sequenzierte Fragment hatte zu 99 % eine eindeutige Übereinstimmung mit Tepidanaerobacter acetatoxydansT DSM21804. Die Mischkultur Wp1 wurde nicht weiterführend analysiert, da sie auch mit Zugabe von Fumarat keinen Abbau der Propionsäure zeigte (Tabelle 53). 4 ERGEBNISSE 151 4.5.2.3 Identifizierung von Bakterien aus der Unterkultur Wp2a1264 Eine weitere syntroph Propionsäureoxidierende Mischkultur (Wp2) aus der NawaRo-BGA Hubert Wagner und Sohn GbR (Tabelle 18) wurde mit Fumarat inkubiert (Abbildung 86) und die weiterhin Propionsäure abbauende Mischkultur Wp2a (Abbildung 96 A) in die Medien 1264, 520 und 63-L (Kapitel 2.6) überimpft. Die Unterkulturen wurden molekularbiologisch analysiert. Zunächst sind die Restriktionsmuster der 16S rDNA-Fragmente aus der Unterkultur Wp2a1264 abgebildet und erläutert. A B Abbildung 51: RFLP der Klon-Amplifikate aus Unterkultur Wp2a1264 (W, Tabelle 14); A erster Klonierungsdurchgang, B zweiter Klonierungsdurchgang; in einem 2,5 %igen Agarosegel mit 0,1 % einer 0,035 %igen Natronwasserglaslösung, angefärbt mit einer 7 %igen Ethidiumbromidlösung; jeweils 8 µL Klon-Amplifikat (1533 bp) geschnitten mit 5 U HaeIII; Buchstaben: Restriktionsmuster; grün: zur Sequenzierung versendetes Reamplifikat; M = 2,5 µg GeneRuler™ DNA Ladder Mix SM0331 ; Farben invertiert. Von insgesamt 30 Klonen wurden 15 im ersten Klonierungsdurchgang restringiert und im zweiten Durchgang wurden 12 Klon-Fragmente verdaut. Die aufgetrennten Restriktionsfragmente sind in 4 ERGEBNISSE 152 Abbildung 51 visualisiert. Die Restriktion der Unterkultur Wp2a1264 zeigte ein sich häufig wiederholendes Muster ‚a‘, welches sich im ersten Klonierungsdurchgang (Abbildung 51A) 10fach wiederholte und im zweiten Klonierungsdurchgang 4 Mal von 12 Klonen bakterieller 16S rDNAFragmente durch Restriktion entstand. Muster ‚x‘ zeigte sich ebenfalls in beiden Klonierungen, sowie Muster ‚z‘. Muster ‚t‘ und ‚y‘ erschienen nur im ersten Klonierungsdurchgang. Nach Durchführung der zweiten Klonierung traten Muster ‚a2‘, ‚e‘ und ‚z2‘ auf. Im Folgenden sind die Zuordnungen der erhaltenen Sequenzen zu Mikroorganismen alphabetisch nach Mustern geordnet aufgeführt. Die dafür verwendeten Sequenzen sind auf der ‚RohdatenCD/Molbiol_Analysen/ Molbiol_Analysen_Ukulturen/Molbiol_Analysen_Ukulturen1264‘ hinterlegt. Tabelle 39: Molekularbiologisch analysierte Sequenzen der klonierten 16S rDNA-Fragmente aus der Unterkultur Wp2a1264 (Tabelle 14) Muster [Häufigkeit/ Gesamtklone] Bemerkung W5 a2 (1/27) W12 Sequenzlänge [bp] % Aminobacterium colombienseT DSM12261 7891 (787/1/789)2 99 e (1/27) Wolinella succinogenesT DSM1740 5461 (533/0/535)2 99 Wd t (1/27) n. a. n. a. n. a. W7 x (3/27) Wolinella succinogenesT DSM1740 6681 (663/1/665)2 99 Wn y (1/27) n. a. n. a. n. a. Klon W2 8021 (791/0/794)2 Thermotogaceae bacterium SulfLac1 z (5/27) T Petrotoga mobilis SJ95 W1 1 z2 (1/27) Gesamtsequenzlänge; 2 91 (723/23/796) 1 a Aminobacterium colombienseT DSM12261 204 (202/0204)2 b Aminobacterium colombienseT DSM12261 724 (657/18/721)2 Übereinstimmung/Lücken/verglichene 99 2 Sequenzlänge; 99 1 n. 91 a.: nicht auswertbar Tabelle 39 zeigt, dass die Sequenz des Klons W5 mit Muster ‚a2‘ dem Mikroorganismus Aminobacterium colombienseT DSM12261 zu 99 % zugeordnet wurde. Die Sequenz des Klons W1 mit Muster ‚z2‘ wurde mit Sequenz der Länge 204 bp (W1a) zu 99 % Aminobacterium colombienseT DSM12261, jedoch mit der längeren Sequenz von 724 bp nur zu 91 % Aminobacterium colombienseT DSM12261 zugeordnet, da die Signale mit Zunahme der Sequenzlänge überlagerten. Eine paarweise Sequenzalignierung mit der Online-Software Clustal 2.1 (EBI) der Sequenzen (W1a, W1b, Abbildung 131) mit Muster ‚z2‘ (Klon W1) bestätigte mit 99 %iger Übereinstimmung 4 ERGEBNISSE 153 (203 bp von 204 bp vergleichbaren Basenpaaren) des ersten Teils der längeren Sequenz, dass diese Sequenz Aminobacterium colombienseT DSM12261 zugehört . Der paarweise Vergleich der Sequenzen der Klone W5 und W1b (613 bp von 679 bp vergleichbaren Basenpaaren mit 19 Lücken, Abbildung 133) untermauerte das Ergebnis der vorangegangenen paarweisen Alignierung des Klons W1a mit Klon W1b. Die Sequenzen der Muster ‚e‘, sowie ‚x‘ wurden Wolinella succinogenesT DSM1740 zugeordnet, obwohl sich die Muster der beiden Fragmente unterschieden (Abbildung 51B). Der Paarweise Sequenzvergleich der W12 und W7 (Abbildung 134) zeigte, dass die Sequenzen zu 99 % (460 bp von 452 bp vergleichbaren Basenpaaren ohne Lücke) übereinstimmten und bestätigten somit das Sequenzierungsergebnis der partiellen 16S rDNA aus Kultur Wp1 (Tabelle 38), das in der NawaRo-BGA HWS Wolinella succinogenes enthalten ist. Die Sequenz mit Restriktionsmuster ‚z‘ (Klon W2) wurde einem Mikroorganismus der Familie Thermotogaceae beziehungsweise der Gattung Petrotoga zugeordnet. Die Sequenzierungen der Klone Wd mit Muster ‚t‘ und Wn mit Muster ‚y‘ aus dem ersten Klonierungsdurchgang schlugen aufgrund zu geringer Signalstärke bei der Sequenzierung fehl. Daher war keine Zuordnung dieser Restriktionsmuster zu Mikroorganismen möglich. 4 ERGEBNISSE 154 Mit der Musterzuordnung des Restriktionsmusters ‚a‘ zu nachstehend identifizierter Sequenz des Klons G13 (Tabelle 42) mit gleichem Muster wurde Tabelle 39 wie folgt vervollständigt. Tabelle 40: Bakterielle Diversität der Kultur Wp2a1264 (Tabelle 14) Muster [Häufigkeit/ Gesamtklone] Kultur Wp2a1264 Bemerkung Sequenzlänge [bp] % a (14/27) Musterzuordnung zur Sequenz des Unterkultur-Klons G13: Aminobacterium colombienseT DSM12261 G13: 3191 (273/2/285)2 96 a2 (1/27) Aminobacterium colombienseT DSM12261 7891 (787/1/789)2 99 e (1/27) Wolinella succinogenesT DSM1740 5461 (533/0/535)2 99 t (1/27) n. a. n. a. n. a. x (3/27) Wolinella succinogenesT DSM1740 6681 (663/1/665)2 99 y (1/27) n. a. n. a. n. a. 8021 (791/0/794)2 Thermotogaceae bacterium SulfLac1 z (5/27) T z2 (1/27) 1 Gesamtsequenzlänge; 2 99 Petrotoga mobilis SJ95 (723/23/796) 91 Aminobacterium colombienseT DSM12261 7241 (657/18/721)2 91 2 Übereinstimmung/Lücken/verglichene Sequenzlänge; n. a.: nicht auswertbar Auch für Unterkultur Wp2a1264 ist in Abbildung 73 ein phylogenetischer Stammbaum dargestellt. 4.5.2.4 Identifizierung von Bakterien aus der Mischkultur Gp1a und Unterkultur Gp1b1264 Mit isolierter Gesamt-DNA aus der propionsäureoxidierenden syntrophen Kultur Gp1a (aus der NawaRo-BGA Biogasanlage BioEnergie Glahn, Tabelle 18) wurde ebenfalls eine molekularbiologische Analyse durchgeführt. Amplifiziert wurde mit dem Oligonukleotidpaar BSF8/BSR1541 (Tabelle 8) und weiterführend wie bei der in Kapitel 4.5.2 beschriebenen Analyse der Klone verfahren. 20 von 25 16S rDNA-Fragmente aus Kultur Gp1a wurden restringiert. Mit Klon Gp1a29 wurde ein eindeutiges Muster generiert. 4 ERGEBNISSE 155 Abbildung 52: RFLP des Plasmid-Amplifikats Gp1a aus der propionsäureabbauenden Mischkultur Gp1a (Tabelle 14); 10 µL Plasmid-Amplifizierungs-Produkt ungeschnitten (A) und geschnitten mit jeweils 5 U HaeII (II) und HaeIII (III) in einem 2,5 %igen Agarosegel mit 0,1 % einer 0,035 %igen Natronwasserglaslösung, angefärbt mit einer 7 %igen Ethidiumbromidlösung; griechischer Buchstaben = Schnittmuster; grüne Klonbezeichnung über 3 Gelbeladungstaschen = zur Sequenzierung verwendetes Reamplifikat; M = 2,5 µg GeneRuler™ DNA Ladder Mix SM0331; Farben invertiert. Eine zu geringe DNA-Konzentration wiesen 7 Amplifikate von insgesamt 20 Klonen auf. 12 Restriktionen zeigten mit HaeIII geschnitten keine diskreten Bandenmuster, so dass mit diesen Klonen keine Bandenauswertung durchgeführt wurde (Daten nicht gezeigt). Einschließlich Gp1a29 (Abbildung 52) wurden vier 16S rDNA Fragmente mit der höchsten Amplifikat-Ausbeute zum Sequenzieren verschickt. Mit Zwei Fragmenten wurde ein zufriedenstellendes Ergebnis erhalten (Tabelle 41). Die digital erhaltenen Sequenzen befinden sich auf ‚Rohdaten_CD/ Molbiol_Analysen/Molbiol_Analysen_Propkulturen‘. Tabelle 41: Molekularbiologische Analyse der klonierten 16S rDNA-Fragmente aus der Mischkultur Gp1a (Tabelle 14) Klon Gp1a6 Gp1a29 1 Muster [Häufigkeit/ Gesamtklone] n. a. (1/20) Sequenzlänge [bp] % Desulfovibrio oxamicusT DSM1925 8161 (791/7/810)2 98 Desulfovibrio oxamicusT DSM1925 9011 (886/6/901)2 98 Bemerkung Gesamtsequenzlänge; 2Übereinstimmung/Lücken/verglichene Sequenzlänge; n. a.: nicht auswertbar 4 ERGEBNISSE 156 Zwei Sequenzen aus der propionsäureabbauenden Mischkultur Gp1a zeigten die größte Übereinstimmung mit Desulfovibrio oxamicusT DSM1925 (Tabelle 41). Ein paarweiser Vergleich (Clustal 2.1, EMBL, siehe Abbildung 129) der beiden Sequenzen wurde durchgeführt. Auch die aus der paarweisen Alignierung ermittelten Konsensussequenz (798 bp, Abbildung 130) stimmte zu 98 % (Übereinstimmung: 798 bp, Lücken: 12 bp, verglichene Sequenzlänge: 805 bp) mit Desulfovibrio oxamicusT DSM1925 überein. Weiteren Aufschluss gaben die Restriktionen von Klonen der partiellen bakteriellen 16S rDNA aus Unterkultur Gp1b1264 mit anschließender Sequenzierung. A B Abbildung 53: RFLP Klonen der partiellen bakteriellen 16S rDNA aus Unterkultur Gp1b1264 (G, Tabelle 14); A erster Klonierungsdurchgang, B zweiter Klonierungsdurchgang; in einem 2,5 %igen Agarosegel mit 0,1 % einer 0,035 %igen Natronwasserglaslösung, angefärbt mit einer 7 %igen Ethidiumbromidlösung; jeweils 8 µL Klon-Amplifikat (1533 bp) geschnitten mit 5 U HaeIII; Buchstaben: Restriktionsmuster; grün: zur Sequenzierung versendetes Reamplifikat; M = 2,5 µg GeneRuler™ DNA Ladder Mix SM0331; Farben invertiert. Aus den jeweils 15 Klonen wurden nach der ersten Klonierung 11 und nach der zweiten Klonierung 12 Amplifikate mit HaeIII verdaut. Der erste, wie auch der zweite Klonierungsdurchgang ergaben von 23 restringierten Klonfragmenten 7 das Restriktionsmuster ‚g‘, zu dem bei der Restriktion der zweiten Klonierung zwei sehr ähnliche Muster auftraten, ‘g2‘ und ‚g3‘ genannt (Abbildung 53 B). Ebenfalls eine bereits im Fermenter der BGA BioEnergie Glahn nachweisbare Dichte wiesen die 16S rDNA-Fragmente mit den Mustern ‚g‘ und ‚g2‘ der Unterkultur Gp1b1264 (Abbildung 53 A, B) auf, da diese Muster bei der zuvor erfolgten Restriktion der 16S rDNA des gesamten Fermenters (Abbildung 44) als Muster ‚12‘ respektive dreifach als Muster ‚9‘ benannt auftauchten. Klone mit Restriktionsmuster a, bereits bekannt aus der Restriktion der Klone der Unterkultur Wp2a1264 (Abbildung 51), tauchten insgesamt 6 Mal bei beiden Klonierungen der Unterkultur Gp1b1264 auf. Einzig im ersten Klonierungsdurchgang zeigten sich Restriktionsmuster ‚h‘, ‚i‘ und ‚j‘, welche sich nicht zuordnen ließen, da die Sequenzierungen ohne Ergebnis blieben. Bei der Restriktion der 16S 4 ERGEBNISSE 157 rDNA-Fragmente des zweiten Klonierungsdurchgangs entstanden neue Muster, die ‚ß‘, ‚v‘, ‚w‘ und ‚y2‘ benannt wurden. Letzt genanntes Muster wies eine Ähnlichkeit zu Muster ‚y‘ von Klon Wn (Abbildung 51) auf. Die Restriktion des Klons G6 zeigte das bereits bekannte Muster ‚u‘, welches zu Escherichia coli K-12 zugeordnet wurde. Auch aus Unterkultur Gp1b1264 wurden die Klone in Abbildung 53 mit in grünen Buchstaben markierten Mustern zur Sequenzierung versendet. Wie oben bereits beschrieben, lieferten die Sequenzierungen des ersten Klonierungsdurchgangs keine Ergebnisse. Auf der ‚RohdatenCD/Molbiol_Analysen/Molbiol_Analysen_Ukulturen/ Molbiol_Analysen_Ukulturen1264‘ sind die verwendeten Sequenzen hinterlegt, die zur Identifikation dienten. Tabelle 42: Molekularbiologisch analysierte Sequenzen der klonierten 16S rDNA-Fragmente aus der Unterkultur Gp1b1264 (Tabelle 14) Muster [Häufigkeit/ Gesamtklone] Bemerkung G13 a (6/23) Aminobacterium colombienseT DSM12261 Gf h (1/23) n. a. Klon G11 G2 G14 g (7/23) g2 (1/23) g3 (1/23) Sequenzlänge [bp] % 8621 (836/9/864)2 97 n. a. n. a. Peptostreptococcaceae bacterium SK031 8171 (756/10/801)2 94 Parvimonas micraT ATCC 33270 (742/20/809)2 92 Peptostreptococcaceae bacterium SK031 8521 (783/15/830)2 94 Parvimonas micraT ATCC 33270 (765/23/837)2 92 Peptostreptococcaceae bacterium SK031 8111 2 (679/12/815) 94 Parvimonas micraT ATCC 33270 (749/18/818)2 92 Gh i (1/23) n. a. n. a. n. a. Gm j (1/23) n. a. n. a. n. a. G10 ß (1/23) Geovibrio thiophilusT DSM11263 8471 (814/4/842)2 97 G3 v (1/23) Aminobacterium colombienseT DSM12261 6781 (675/1/678)2 99 G5 G8 1 w (1/23) y2 (1/23) Gesamtsequenzlänge; auswertbar 2 Anaerobic bacterium MO-CFX2 7311 (647/32/724)2 Aminobacterium colombienseT DSM 12261 (610/42/722) 84 Spirochaeta bajacaliforniensisT DSM16054 7651 2 (507/27/592) 86 Übereinstimmung/Lücken/verglichene 89 2 Sequenzlänge; n. a.: nicht 4 ERGEBNISSE 158 Die in Tabelle 42 aufgelisteten Sequenzierungsergebnisse des Klons G13 mit Muster ‚a‘ wurde als Aminobacterium colombienseT DSM12261 identifiziert, ebenso wie die Sequenz des Klons G3 (Muster ‚v‘), auch wenn sich die Restriktionsmuster voneinander unterschieden (Abbildung 53B). Eine paarweise Sequenzalignierung dieser beiden Klon-Fragmente (663 bp von 881 bp vergleichbaren Basen mit 5 Lücken) zeigte signifikante Übereinstimmungen (99 %). Die Übereinstimmung mit Klon F6 (Muster ‚d‘ ähnlich Muster ‚a‘) betrug beim paarweisen Vergleich mit Klon G3 (366 bp von 381 bp verglichenen Basen mit 2 Lücken) sowie G13 (362 bp von 377 bp und keiner Lücke) mit 96 % aus. Die Sequenz der Klone G2, G11 und G14 zeigten, dass die drei Sequenzen mithilfe der NCBI-Datenbank der Familie der Peptostreptococcaceae zugeordnet wurden, obwohl sich ihre Muster unterschieden. Die Sequenzen der Muster ‚g‘, ‚g2‘ und ‚g3‘ (Abbildung 53) zeigten eine Übereinstimmung von 99 % (multipler Sequenzvergleich siehe Abbildung 136). Die Muster ‚h‘, ‚i‘ und ‚j‘ tauchten beim zweiten Klonierungsdurchgang nicht erneut auf, weshalb die Sequenzen mit diesen Mustern nicht identifiziert wurden. Klon-Fragment G10 mit Muster ‚ß‘ (Abbildung 53) wurde Geovibrio thiophilusT DSM11263 zugeordnet. Die Sequenz des Klons G8 mit Muster ‚y2‘ ließ keine eindeutige Zuordnung zu einer Art zu. Diese Klon-Sequenz gehört zur Gattung Spirochaeta. Keine artspezifische Zuordnung wurde bei Klon G5 (Muster ‚w‘) aufgrund von Signalüberlagerungen bei der Sequenzierung vorgenommen. 4 ERGEBNISSE 159 Tabelle 43: Bakterielle Diversität der Kultur Gp1b1264 (Tabelle 14) Kultur Gp1b1264 Muster [Häufigkeit/ Gesamtklone] Sequenzlänge [bp] % 8621 (836/9/864)2 97 n. a. n. a. Peptostreptococcaceae bacterium SK031 8171 (756/10/801)2 94 Parvimonas micraT ATCC33270 (742/20/809)2 92 Bemerkung a (6/23) Aminobacterium colombienseT DSM12261 h (1/23) n. a. g (7/23) 1 g2 (1/23) Peptostreptococcaceae bacterium SK031 852 (783/15/830)2 94 Parvimonas micraT ATCC33270 (765/23/837)2 92 1 g3 (1/23) Peptostreptococcaceae bacterium SK031 T Parvimonas micra ATCC33270 94 92 i (1/23) n. a. n. a. n. a. j (1/23) n. a. n. a. n. a. ß (1/23) Geovibrio thiophilusT DSM11263 8471 (814/4/842)2 97 u (1/23) Musterzuordnung zur Sequenz des Unterkultur-Klons F5: Escherichia coli K-12 Unterstrang MDS42 5001 (499/0/500)2 99 v (1/23) Aminobacterium colombienseT DSM12261 6781 (675/1/678)2 99 w (1/23) 7311 (647/32/724)2 Anaerobic bacterium MO-CFX2 T y2 (1/23) 1 811 (679/12/815)2 (749/18/818)2 Gesamtsequenzlänge; 2 2 89 Aminobacterium colombiense DSM12261 (610/42/722) 84 Spirochaeta bajacaliforniensisT DSM16054 7651 2 (507/27/592) 86 Übereinstimmung/Lücken/verglichene Sequenzlänge; n. a.: nicht auswertbar Eine Sequenz aus der Unterkultur Gp1a63-L wurde zu 97 % der Art Tissierella creatininiT DSM9508 zugeordnet (Übereinstimmung von 456 bp mit 4 Lücken bei einer verglichenen Sequenzlänge von 469 bp). Bereits in der molekularbiologischen Analyse des Fermenters sowie des Nachgärers aus der NawaRo-BGA BEG zeigte sich, dass Mikroorganismen der Klasse Clostridia bei der Biogasbildung beteiligt sind (Muster 11, Abbildung 44 A und Abbildung 45). 4 ERGEBNISSE 160 In Abbildung 74 ist eine Übersicht der molekularbiologischen Identifizierungsergebnisse der den ursprünglich aus Kultur Gp1 stammenden Bakterien in Form eines phylogenetischen Stammbaums dargestellt. 4.5.2.5 Identifizierung von Bakterien aus den Unterkulturen Ap1a1264 und Ap1a520 Zunächst wurde mit 16S rDNA-Klonen aus Unterkultur Ap1a1264 die Restriktionsmethode angewendet und darauffolgend eine Sequenzierungen ausgewählter Klon-Fragmente durchgeführt. Jeweils 15 Klone wurden für eine RFLP amplifiziert, von denen jeweils 12 Amplifikate eine ausreichende Menge 16S rDNA-Fragmente für eine RFLP enthielten. A B Abbildung 54: RFLP der Klon-Amplifikate aus Unterkultur Ap1a1264 (A, Tabelle 14); A erster Klonierungsdurchgang, B zweiter Klonierungsdurchgang; in einem 2,5 %igen Agarosegel mit 0,1 % einer 0,035 %igen Natronwasserglaslösung, angefärbt mit einer 7 %igen Ethidiumbromidlösung; jeweils 8 µL Klon-Amplifikat (1533 bp) geschnitten mit 5 U HaeIII; Buchstaben: Restriktionsmuster; grün: zur Sequenzierung versendetes Reamplifikat; M = 2,5 µg GeneRuler™ DNA Ladder Mix SM0331; Farben invertiert. Die RFLP der partiellen bakteriellen 16S rDNA aus Unterkultur Ap1a1264 zeigte insgesamt zwei neue Muster, ‚k‘ und ‚l‘ und zwei bereits bekannte Muster ‚b‘ und ‚u‘ (Abbildung 54). Im Folgenden sind die Zuordnungen der erhaltenen Sequenzen nach Mustern alphabetisch geordnet aufgezählt. Die verwendeten Sequenzen sind auf der ‚RohdatenCD/Molbiol_Analysen/ Molbiol_Analysen_Ukulturen/Molbiol_Analysen_Ukulturen1264‘ hinterlegt. 4 ERGEBNISSE 161 Tabelle 44: Molekularbiologisch analysierte Sequenzen der klonierten 16S rDNA-Fragmente aus der Unterkultur Ap1a1264(Tabelle 14) Klon Muster [Häufigkeit/ Gesamtklone] Bemerkung A10 b (5/24) A1 A13 Sequenzlänge [bp] % Proteiniphilum acetatigenesT DSM18083 7851 (734/15/786)2 93 k (13/24) Clostridium sartagoformeT DSM1292 863 (859/7/867)2 99 l (4/24) Proteiniphilum acetatigenesT DSM18083 8351 (754/27/833)2 90 1 1 Gesamtsequenzlänge; 2Übereinstimmung/Lücken/verglichene Sequenzlänge Die Sequenz des Klons A1 zeigte eine eindeutige Übereinstimmungen mit der 16S rDNA-Sequenz von Clostridium sartagoformeT DSM1292 aus der digitalen Datenbank der NCBI zu 99 % (Tabelle 44). Klon A10 mit Muster ‚b‘ ließ sich nicht eindeutig einer Art zuordnen, wie Klon F10 (Tabelle 41) mit ähnlichem Muster ‚b2‘ (Abbildung 48). Ebenfalls wurde Klon A13 mit Muster ‚l‘ zum Genus Proteiniphilum wie Klone A10 und F10 eingruppiert. Eine multiple Sequenzalignierung (Abbildung 138) der Sequenzen der drei Klone wurde durchgeführt. Dieser Vergleich zeigte hohe Übereinstimmungen der Sequenzen der Klone A10, A13 und F10 zu 99 % beziehungsweise zu 98 %, was die zuvor erfolgte Einordnung zum Genus Proteiniphilum bestätigte. Außerdem zeigte die Sequenz des Klons A13 eine zusätzliche Schnittstelle des Restriktionsenzyms HaeIII, die ein 186 bp großes Fragment verursacht. A10_BSF8 A13_BSF8 F10_BSF8 TTTGTTAAAGATTTTTTTCGGTAGAAGATGGGCATGCGTTCCATTAGCTAGTTGGTTGAG 135 GTAATTAAAGGAGTAATCCGCTATAAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGT-GAG 177 TTTGTTAAAGATTTTTTTCGGTAGAAGATGGGCATGCGTTCCATTAGCTAGTTGGTTGAG 180 * ****** * * ** ** ********* *** *************** *** A10_BSF8 A13_BSF8 F10_BSF8 GTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGGATAGGGGAACTGAGAGGTTTATCCCCCACACTGG 195 GTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGGATAGGGGAACTGAGAGGTTTATCCCCCACACTGG 237 GTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGGATAGGGGAACTGAGAGGTTTATCCCCCACACTGG 240 ************************************************************ A10_BSF8 A13_BSF8 F10_BSF8 TACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGAG 255 TACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGAG 297 TACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGAG 300 ************************************************************ A10_BSF8 A13_BSF8 F10_BSF8 GCAACTCTGAACCAGCCACGTCGCGTGAAGGATGACGGCCCTACGGGTTGTAAACTTCTC 315 GCAACTCTGAACCAGCCACGTCGCGTGAAGGATGACGGCCCTACGGGTTGTAAACTTCTT 357 GCAACTCTGAACCAGCCACGTCGCGTGAAGGATGACGGCCCTACGGGTTGTAAACTTCTT 360 *********************************************************** Abbildung 55: Ausschnitt aus der multiplen Sequenzalignierung des Klons F10 (533 bp) aus der Unterkultur Fp1a1264 mit der Sequenz des Klons A10 (785 bp) und A13 (835 bp) aus der Unterkultur Ap1a1264 (Tabelle 14) Diese zusätzliche Schnittstelle ist für das unterschiedliche Restriktionsmuster des Klons A13 (Muster ‚l‘) zu Muster ‚b‘ des Klons A10 verantwortlich (Abbildung 54). Das Bandenmuster ‚b‘ (Klon A10) zeigt eine Bande bei etwa 400 bp und keine bei Muster ‚l‘ (Klon A13). Dafür ist bei Muster ‚l‘ 4 ERGEBNISSE 162 (Klon A13) eine zusätzliche Bande über der 200 bp-Markierung zu sehen. Die Bande knapp unter der 200 bp-Markierung von Muster ‚l‘ (Klon A13) ist stärker als die des Musters ‚b‘(Klon A10). Eine Sequenzen mit Muster ‚u‘ wurde zuvor bereits identifiziert (Klon F5, Tabelle 35), so dass aus Kultur kein Fragment mit Muster b zur Sequenzierung versendet wurde. Tabelle 45: Bakterielle Diversität der Kultur Ap1a1264 (Tabelle 14) Kultur Ap1a1264 Muster [Häufigkeit/ Gesamtklone] Bemerkung Sequenzlänge [bp] % 93 b (5/24) Proteiniphilum acetatigenesT DSM18083 7851 (734/15/786)2 k (13/24) Clostridium sartagoformeT DSM1292 863 (859/7/867)2 99 l (4/24) Proteiniphilum acetatigenesT DSM18083 8351 (754/27/833)2 90 u (2/24) Musterzuordnung zur Sequenz des Unterkultur-Klons F5: Escherichia coli K-12 Unterstrang MDS42 F5: 5001 (499/0/500)2 99 1 Gesamtsequenzlänge; 2 Übereinstimmung/Lücken/verglichene 1 Sequenzlänge; n. a.: nicht auswertbar Wie bereits beschrieben wurde auch für Unterkultur Ap1a520 eine Identifizierung über eine DGGE durchgeführt. Abbildung 56: DGGE des 500 bp Amplifikats der Kultur Ap1a520 (A520, Tabelle 14); Denaturierender Gradient: 70/30; angefärbt mit einer 7 %igen Ethidiumbromidlösung; grün = zur Sequenzierung versendete Reamplifikate; schwarz = zu wenig Sequenzierung; rot = keine Reamplifizierung möglich; Farben invertiert. Reamplifikat für eine 4 ERGEBNISSE 163 In der Spur der Amplifikate der Unterkultur Ap1a520 (Abbildung 56) wurden vier Banden durch die DGGE aufgetrennt. Diese vier Banden wurden ebenfalls ausgeschnitten und eluiert. Genügend Reamplifizierungsprodukt für eine Sequenzierung lieferten Banden 1 und 2 der Unterkultur Ap1a520, welche ebenfalls versendet wurden. Die erhaltenen Sequenzen der Banden 1 aus Unterkultur Fp1a520 sowie der Banden 1 und 2 aus Unterkultur Ap1a520 wurden mit Sequenzen in der NCBI-Datenbank verglichen, um sie Mikroorganismen zuzuordnen. Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse. Tabelle 46: Molekularbiologisch analysierte Sequenzen der 16S rDNA-Fragmente aus der Unterkultur Ap1a520 (Tabelle 14) in DSM-Medium 520 Kultur DGGE Bande Ap1a520 1 Clostridium sartagoformeT DSM1292 447 (439/0439)2 2 Clostridium sartagoformeT DSM1292 445 (442/0/442)2 100 3 zu wenig Reamplifikat n. a. n. a. 4 kein Reamplifikat n. a. n. a. 1 Gesamtsequenzlänge; Sequenzlänge [bp] Bemerkung 2 Übereinstimmung/Lücken/verglichene 1 % 100 1 Sequenzlänge; n. a.: nicht auswertbar Die beiden sequenzierten Fragmente aus den signifikantesten DGGE-Banden der Unterkultur Ap1a520 wurden jeweils zu 100 % als Clostridium sartagoformeT identifiziert. A520 1 434 A520 2 435 GCATGGCTTCCC |||||| ||||| GCATGG-TTCCC 445 445 Abbildung 57: Ausschnitt aus der paarweisen Alignierung (Abbildung 140) der partiellen 16S rDNA Sequenzen A520 1 mit A520 2 aus Unterkultur Ap1a520 (Tabelle 14), Deletion im Strang A520 2 hellblau markiert. Eine paarweise Alignierung (Abbildung 140) zeigte eine Deletion (blaue Markierung Abbildung 57) in der Sequenz des Fragments A520 2 zwischen den Basen 441 und 442, was das andere Laufverhalten im DGGE-Gel (Abbildung 49) begründen kann. Diese Sequenzierungsergebnisse bestätigten außerdem die bereits eindeutigen Ergebnisse aus der 16S rDNA-Analyse von Klonen aus Ap1a1264 (Tabelle 44) mit Muster ‚k‘ (Abbildung 54 A, B) mit dem Unterschied, dass es sich hier um eine bakterielle Reinkultur aus der anaerob propionsäureoxidierenden Mischkultur Ap1a handelte, die durch Wechsel des Substratangebots isoliert wurde. Beide partiellen 16S rDNASequenzen aus dieser Kultur sind in der NCBI-Datenbank mit den accession numbers JQ955660 und JQ955661 hinterlegt. 4 ERGEBNISSE 164 4.5.3 Zusammenfassung der identifizierten und isolierten Bakterien aus syntroph propionsäureoxidierenden Mischkulturen Bei der Bildung von Biogas wurden Bakterien unterschiedlicher Ordnungen aus syntroph propionsäureoxidierenden Mischkulturen (Tabelle 14) identifiziert und teilweise durch Substratwechsel und darauffolgende Überimpfungen in flüssigen teilweise artspezifischen Medien (Kapitel 2.6) isoliert. Muster ‚a‘ trat 6 Mal von 22 Mustern aus der Unterkultur Fp1a1264 (Abbildung 48 A,B), 14 Mal von 27 Mustern aus Wp2a1264 (Abbildung 51 A, B), und 6 Mal von 23 Mustern aus Gp1a1264 (Abbildung 53 A, B) auf und wurde mit der Sequenz des Klons G13 (Tabelle 42) aus Gp1a1264 artspezifisch zu Aminobacterium colombienseT DSM12261 zugeordnet. Ebenfalls als Aminobacterium colombienseT DSM12261 wurden die Sequenzen mit in Kultur Fp1a1264 2fach auftretendem Muster ‚d‘ (Abbildung 48 A, B), mit Muster ‚a2‘ (Abbildung 51 A, B) aus Kultur Wp2a1264 sowie mit Muster ‚v‘ (Abbildung 53 A, B) aus Kultur Gp1a1264 identifiziert. Auf Grund von Signalüberlagerungen bei der extern durchgeführten Sequenzierung wurden die Sequenzen mit Muster ‚z‘ (Abbildung 51 A, B) aus Kultur Wp2a1264 und mit Muster ‚w‘ (Abbildung 53 B) aus Kultur Gp1a1264 lediglich zu 91 % beziehungsweise 84 % dem Genus Aminobacterium zugeordnet. Eine Anreicherung von Aminobacterium colombiense wurde in DSMZ-Medium 846 erzielt. Muster ‚d2‘ wurde der Art Sphaerochaeta globus Stamm Buddy zugeordnet, von dem das Gesamtgenom in der NCBI-Datenbank bekannt ist. Die Sequenzen mit Muster ‚b‘ (5 von 24 Restriktionen, Abbildung 54 A, B) aus der Unterkultur Ap1a1264 sowie Fp1a1264 (3 von 22 Restriktionen, Abbildung 48 A, B), Muster ‚b2‘ (1 von 22 Restriktionen, Abbildung 54 A, B) und Muster ‚l‘ aus Unterkultur Ap1a1264 (4 von 24 Restriktionen, Abbildung 54 A, B) wurden dem Genus Proteiniphilum zugeordnet. Proteiniphilum acetatigenes Stamm Fp1a520 wurde in dieser Arbeit durch Wechsel des Substrats und Verdünnungsreihen in DSMZ-Medium 520 isoliert. Durch die eindeutige molekularbiologische Identifizierung des Bakteriums (Abbildung 49 und Tabelle 37) wurde die Reinkultivierung in dieser Arbeit belegt. 13 von 24 Restriktionen der Unterkultur Ap1a1264 ergaben das Muster ‚k‘ (Abbildung 54 A, B). Aus dieser Sequenz wurde eindeutig Clostridium sartagoformeT DSM1292 identifiziert. Muster ‚k‘ und Muster 11 aus dem Fermenter (Abbildung 44) sowie Nachgärer (Abbildung 45) der BGA Glahn zeigten identische Muster. Clostridium sartagoforme hatte somit in dieser Biogasanlage zur Zeit der Probennahme eine Populationsdichte, die ausreichte, um die Anwesenheit dieses Bakteriums mit der molekularbiologischen Analyse der bakteriellen Gesamt-16S rDNA des Fermenter- und Nachgärerinhaltes zu zeigen (Abbildung 44 A, Abbildung 45 und Tabelle 32). Mit einem Substratwechsel und mehreren Überimpfungen in DSMZ-Medium 520 wurde der Stamm Clostridium sartagoforme Stamm Ap1a520 in dieser Dissertation molekularbiologische Analysen gezeigt wurde (Abbildung 56 und Tabelle 46). isoliert, was durch 4 ERGEBNISSE 165 Die Sequenzen mit jeweils einmalig auftretenden Mustern ‚e‘ in Unterkultur Fp1a1264 und Wp2a1264 sowie das in Unterkultur Wp2a1264 dreifach auftretende Muster ‚x‘ (3/27) wurden zu 99 % Wolinella succinogenesT DSM1740 zugeteilt. In dieser Arbeit wurden die von der DSMZ erstandenen Kulturen des Typstamms Wolinella succinogenes in DSMZ-Medium 157 überimpft, um den Mikroorganismus anzureichern. Das Substratverhalten dieses Stamms in mit Propionsäure versetzten PI-Medium und in Co-Kultur mit eigenisolierten methanogenen Archaea sowie Geovibrio thiophilusT DSM11263 analysiert, was in Kapitel 4.7.4.2 besprochen wird. Geovibrio thiophilusT DSM11263 wurde ebenfalls in dieser Arbeit verwendet, da die Sequenz mit Muster ‚ß‘ aus Unterkultur Gp1b1264 zu 97 % mit diesem Mikroorganismus übereinstimmte (Tabelle 42). In Kultur Fp1a63-L wurde der Mikroorganismus außerdem aus der Mischkultur Fp1a angereichert (Tabelle 34). Muster ‚u‘ tauchte zweifach in Unterkulturen Fp1a1264 und Ap1a1264 sowie einfach in Unterkultur Gp1b1264 auf. Der durch Sequenzanalyse identifizierte Vertreter der Art Escherichia coli mit Muster ‚u‘ war mit dem mit der Zahl ‚16‘ versehenen Muster aus der Restriktionsanalyse der Gesamt-16S rDNA aus Fermentern der BGA Glahn (G, Abbildung 44) und Arenrath sowie dem Nachgärer der BGA Glahn (A, GN, Abbildung 45) identisch. Dieser typische Darmkeim wurde bei der weiterführenden Analyse der in propionsäureabbauenden Mischkulturen wachsenden Mikroorganismen nicht berücksichtigt. Die Typstämme Aminobacterium colombienseT DSM12261, Clostridium sartagoformeT DSM1292, Wolinella succinogenesT DSM1740 und Geovibrio thiophilusT DSM11263 wurden aufgrund der Sequenzierungsergebnisse von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) bestellt und für chemische Analysen in PI-Medium (Kapitel 3.6.1 und 4.7.1) verwendet. Um mögliche syntrophe Stoffwechsel der bei der Biogasbildung beteiligten Bakterien chemisch zu analysieren wurden in dieser Dissertation methanogene Archaea aus NawaRoBiogasanlagen kultiviert, angereichert und isoliert. Diese Kulturen wurden auch molekularbiologisch Identifiziert. 4.6 Identifizierung eigenisolierter methanogener Archaea aus NawaRo-Biogasanlagen 16S rDNA von archaealen Eigenisolaten (Tabelle 16) aus den NawaRo-Biogasanlagen (BGA, Tabelle 18) BioEnergie Glahn (BEG), Huber Wagner und Sohn GbR (HWS) und Theo & Ingrid & Alexander Friedrich GbR (TAF) sowie Laborfermentern des Leibniz-Instituts für Agrartechnik Potsdam-Bornim e.V. (LFP, mesophil sowie thermophil, Klocke et al. 2007) wurden mithilfe von touch down Amplifizierungen (td-PCR, Kapitel 3.5.3) mit den synthetischen Oligonukleotiden (Tabelle 8) Ar1000f/ Ar1500r beziehungsweise Met86f/ Met1340r vervielfältigt, welche 500 bp große 4 ERGEBNISSE sowie 1254 bp 166 große DNA-Fragmente ergaben. Mit den Aufreinigungsmethoden Denaturierende/Temperatur Gradienten Gel Elektrophorese (D/TGGE, Kapitel 3.5.6) wurden die 500 bp großen Fragmente aufgetrennt. Die 1254 bp großen Fragmente aus Kulturen methanogener Archeae wurden zur Charakterisierung mit dem Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus (RFLP, Kapitel 3.5.8) verwendet. Die archaealen 16S rDNA Fragmente wurden nach Reamplifizierung zur Sequenzierung versendet (Kapitel 3.5.9). Digital erhaltene Sequenzen wurden wie bereits beschrieben mit den in der offenen NCBI-Datenbank hinterlegten Sequenzen verglichen und Mikroorganismen zugeordnet. Sequenzen von archaealen Reinkulturen wurden in der NCBIDatenbank eingetragen. Paarweise und multiple Alignierungen dienten zur Bestätigung der Identifizierungen von methanogenen Archaea und zur Erstellung von Stammbäumen (Kapitel 3.5.10). Tabelle 47: Eigenisolierte (Rein)Kulturen methanogener Archaea Speziesa Isoliert aus accession numberb Methanobacterium formicicum Stamm BEG11, 1a NawaRo-Fermenter AN JN243320 Methanobacterium formicicum Stamm HWS11 NawaRo-Fermenter AN JN243318 1, 1a Methanobacterium formicicum Stamm LFP4.1 Laborfermenter AN JN566059 1, 1a Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 NawaRo-Fermenter AN JN243315 Methanoculleus bourgensis Stamm BEGN1 NawaRo-Nachgärer AN JX943602 Methanoculleus bourgensis Stamm HWS1.11 NawaRo-Fermenter 1 Methanoculleus bourgensis Stamm TAF1.1 NawaRo-Fermenter AN JN243316 Methanomethylovorans sp. Stamm LFP3.13 Laborfermenter AN JN566058 2 Methanosaeta concilii Stamm BEG4 NawaRo-Fermenter AN JN243322 Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.11, 2, 3 NawaRo-Fermenter AN JN243319 Methanosarcina mazei Stamm BEG3 1, 2, 3 NawaRo-Fermenter AN JN243321 1, 2, 3 Methanosarcina mazei Stamm LFP2.1 Laborfermenter Methanosarcina mazei Stamm TAF1.21, 2, 3 NawaRo-Fermenter AN JN243317 Methanosarcina siciliae Stamm BEGN21, 2, 3 NawaRo-Nachgärer AN JX943603 a Alle Eigenisolate wurden zur Hinterlegung in der institutseigenen Stammsammlung (IMW) übergeben; b Reinkulturen; 1 Substrat H2/CO2, 1a Formiat 2 Substrat Acetat, 3 Substrat Methanol Die Kulturen Methanoculleus bourgensis Stamm HWS1.1, Methanosarcina mazei Stamm LFP2.1 haben keine accession number bei der Datenbank der NCBI, da diese Kulturen zum Abschluss der praktischen Arbeit dieser Dissertation mit anderen methanogenen Archaea kontaminiert waren (siehe dazu Abbildung 63 und Abbildung 66). Nach einer td-PCR chromosomaler DNA der propionsäureabbauenden Mischkulturen Ap1a, Fp1a, Gp1b und Wp2a (Tabelle 14) mit dem archaealen Oligonukleotidpaar Met86f/ Met1340r (Tabelle 9) wurde mit der Agarose Gel Elektrophorese der Kulturen Ap1a und Fp1a geringe Mengen archaealer 16S rDNA mit Ethidiumbromid angefärbt. Aus Gp1b und Wp2a wurde mittels Agarose Gel Elektrophorese keine archaealen Amplifikate detektiert (Agarose Gel Elektrophorese nicht gezeigt). Eine weiterführende Identifizierung der archaealen 16S rDNA Fragmente aus den 4 ERGEBNISSE 167 syntroph propionsäureabbauenden Mischkulturen Ap1a und Fp1a wurde nicht durchgeführt, da die td-PCR zu geringe Mengen Amplifikat lieferte. 4.6.1 Stammspezifische Identifizierung methanogener Archaea der Art Methanobacterium formicicum mit der SAPD-PCR Mit einzelnen methanogenen Reinkulturen der Art Methanobacterium formicicum wurde in dieser Arbeit die Anwendbarkeit der SAPD-PCR (Kapitel 3.5.4) gezeigt. Abbildung 58:SAPD-PCR der chromosomalen archaealen 16S rDNA aus den Kulturen HWS1 und BEG1; M = 2,5 µg GeneRuler™ DNA Ladder Mix SM0331 ; rote Ellipse = eindeutiger Unterschied des Bandenmusters; 1,5 %iges Agarosegel mit 0,1 % einer 0,035 %igen Natronwasserglaslösung, angefärbt mit einer 7 %igen Ethidiumbromidlösung; Fotografie in Graustufen. In Abbildung 58 sind aus vier gleichzeitig durchgeführten SAPD-PCRs mit vier verschiedenen synthetischen Oligonukleotiden (Tabelle 10) entstandenen Bandenmuster der Kulturen HWS1 (aus BGA Huber Wagner und Sohn GbR, Tabelle 18) und BEG1 (aus BGA BioEnergie Glahn, Tabelle 18) dargestellt. Mit chromosomaler DNA aus den Kulturen HWS1 sowie BEG1 wurde mit Oligonukleotid Not G (rote Ellipse) Bandenmuster mit dem deutlichsten Unterschied amplifiziert. Mit dieser SAPD-PCR wurde eine geringere Anzahl Banden produziert, was die Banden diskreter voneinander trennte. Die SAPD-PCR stellt eine Möglichkeit dar, methanogene Kulturen anhand chromosomaler DNA voneinander zu unterscheiden. Diese Methode wurde nicht weiterführend angewandt, da weitreichende Modifikationen der Methode zur Optimierung auf archaeale DNA nötig sind. 4 ERGEBNISSE 168 4.6.2 Artspezifische Identifizierung der Eigenisolate methanogener Archaea mit der DGGE Das hintere Drittel der archaealen 16S rDNA eigenisolierter Kulturen methanogener Archaea, zu denen auch archaeale Reinkulturen zählen, wurden unter anderem mit der Methode der DGGE (Kapitel 2.5.3 und 3.5.6) analysiert. Die Auftrennung von 500 bp großen 16S rDNA Amplifikaten (Oligonukleotidpaarung: Ar1000f/ Ar1500GC, Tabelle 8) mit der DGGE gab Aufschluss über die Reinheit der Kulturen durch anschließende externe Sequenzierung der Reamplifikate (Oligonukleotidpaarung: Ar1000f/ Ar1500, Tabelle 8) aus den eluierten Banden. Abbildung 59:Denaturierende Gradienten Gel Elektrophorese 500 bp großer 16S rDNA-Fragmente aus Eigenisolaten methanogener Archaea (Spuren von rechts nach links) TAF1 (Banden a, b, c), TAF1.1, TAF1.2 (Banden a, b), HWS1 (Banden a, b), BEG1 (Banden a, b, c), BEG3 (Banden a, b, c), BEG4 (Banden a, b, c), LFP2.1 (Banden a, b, c), LFP4.1, Typstämme Methanobacterium formicicumT DSM1535, Methanoculleus bourgensisT DSM3045, Methanosarcina mazeiT DSM2053, Methanosarcina barkeriT DSM800, Methanosaeta concilii DSM2139; weiße Buchstaben = zur Sequenzierung versendete Reamplifikate; roter Buchstabe = misserfolgte Reamplifizierung; rote Ellipse = nicht ausgeschnittener, angefärbter Bereich; Denaturierender Gradient: 60/40; angefärbt mit einer 7 %igen Ethidiumbromidlösung; Fotografie in Graustufen. In den Spuren (Abbildung 59) der 16S rDNA Fragmente aus den Kulturen TAF1 (aus BGA Theo & Ingrid & Alexander Friedrich GbR, Tabelle 18) und BEG1 (aus BGA BioEnergie Glahn, Tabelle 18) sind drei diskrete Banden aufgetrennt worden (a, b, c), welche auf gleicher Höhe lagen. In der Spur 4 ERGEBNISSE 169 TAF1 wurde Bande TAF1c am stärksten angefärbt und in der Spur des Stamms BEG1 dominierte Bande BEG1b. Die Spur der Kultur HWS1 (aus BGA Hubert Wagner und Sohn GbR, Tabelle 18) wies zwei Banden auf (a, b), die auf gleicher Höhe mit den Banden b und c der anderen beiden Kulturen TAF1 und BEG1 zum Stillstand gekommen sind, wobei Bande HWS1b die stärkere von beiden gewesen ist. Ein mit einer roten Ellipse gekennzeichneter mit Ethidiumbromid angefärbter Bereich im Gel wurde aufgrund geringer Diskretion nicht zur weiteren Analyse verwendet. Die Banden TAF1 c sowie BEG c als auch HWS1 b hatten im Vergleich zu der Bande des Typstamms Methanobacterium formicicumT DSM1535 einen etwas längeren Weg im DGGE-Gel zurückgelegt. Die einzige Bande des 16S rDNA Fragments der Kultur LFP4.1 (thermophiler Laborfermenter, Klocke et al. 2007) wurde in gleicher Höhe mit der Bande des Typstamms Methanobacterium formicicumT DSM1535 abgegrenzt. Die einzige Bande der Spur, Kultur TAF1.1 kam auf der gleichen Höhe sie die Spur des Typstamms Methanoculleus bourgensisT DSM3045 zum Stillstand. Die untersten Banden der Spuren TAF1.2 b, BEG3 c und LFP2.1c liefen im Gel bis zur gleichen Höhe des Typstamms Methanosarcina mazeiT DSM2053. Bande TAF1.2a hatte einen mit Bande LFP2.1b vergleichbaren Lauf. Spur BEG3 wies mit Bande b eine Bande vor, welche sich auf gleicher Höhe mit der Bande des DSMZ-Stamms Methanosaeta concilii DSM2139 befand. Ebenfalls auf gleicher Höhe wurde die Bande BEG4b aufgetrennt, einer weiteren aus dem gleichen Fermenter wie BEG3 stammenden Kultur. Bande BEG3a, BEG4a befanden sich auch auf gleicher Höhe wie auch Bande a der Kultur LFP2.1. Bande LFP2.1a ergab kein Reamplifikat, da der DNAGehalt für eine weitere td-PCR zu gering war. Auf separaten Gelen wurden die mit dem Oligonukleotidpaar Ar1000f/ Ar1500rGC amplifizierte 16S rDNA Fragmente der Kulturen HWS2.1 und LFP3.1 mit der DGGE-Methode aufgetrennt. 4 ERGEBNISSE 170 A B Abbildung 60:DGGE 500 bp großer 16S rDNA-Fragmente aus Kulturen A HWS2.1, Methanosarcina barkeriT DSM800 (Msa. b.), Methanosarcina mazeiT DSM2053 (Msa. m.), Methanoculleus bourgensisT DSM3045 (Mc. b.), Methanosaeta concilii DSM2139 (Mst. c.), Methanobacterium formicicumT DSM1535 (Mb. f.); Pfeile = separierte Verunreinigung B Methanomethylovorans sp. Stamm LFP3.1 (2te Spur rechts), Methanobacterium formicicumT DSM1535, Methanomethylovorans hollandicaT DSM15978 (Mmv. h.), Methanomethylovorans thermophilaT DSM17232 (Mmv. t.), Methanosarcina barkeriT DSM800 (Msa. b.), Methanosarcina mazeiT DSM2053 (Msa. m.), Pfeile = aus der linken Nachbartasche übergelaufene Probe; Denaturierender Gradient: 60/40; angefärbt mit einer 7 %igen Ethidiumbromidlösung; Buchstaben = zur Sequenzierung versendete Reamplifikate; Fotografie in Graustufen, Farben invertiert. Abbildung 60 A zeigt die Auftrennung des 500 bp großen 16S rDNA Amplifikats aus Kultur HWS2.1 im Vergleich zu Amplifikaten verschiedener Typstämme. Bande HWS2.1b wurde zwischen die Höhe der Banden der Typstämme Methanosarcina barkeriT DSM800 und Methanosarcina mazeiT DSM2053 separiert. Aus der Spur der Kultur HWS2.1 wurde Bande b für die Reamplifizierung zur Sequenzierung ausgeschnitten und die DNA eluiert. Bande a hatte einen zu indiskreten Bereich. Die Abbildung 60 A begrenzenden Pfeile zeigen eine Verunreinigung, welche durch die Methode der DGGE abgetrennt worden ist. In Abbildung 60 B ist die Auftrennung der Kultur LFP3.1 mit unterschiedlichen Typstämmen dargestellt. Die Auftrennungshöhe des einzigen 16S rDNA Fragments aus Kultur LFP3.1 ist nicht mit der Höhe der Banden der angrenzenden Typstämme vergleichbar. Die Pfeile in Abbildung 60 B deuten auf während der Probenauftragung aus der jeweils links gelegenen Tasche gelaufene Probenflüssigkeit, welche während der DGGE mit in die 4 ERGEBNISSE 171 Spur gezogen worden ist. Aus diesem Grund wurden die daraus entstandenen Teilbanden bei der weiteren Analyse nicht berücksichtigt. Die ausgeschnittenen DGGE-Banden der Kulturen sowie der Typstämme wurden eluiert und mit dem Oligonukleotidpaar Ar1000f/ Ar1500r reamplifiziert. Die von extern erhaltenen Sequenzen sind auf der Rohdaten CD unter dem Pfad ‚\Molbiol_Analysen\Molbiol_Analysen_Methanogene\ DGGE_Methanogene‘ digital dieser Arbeit beigefügt. Die durch Vergleich mit der offenen Datenbank NCBI beziehungsweise mit den Sequenzen der Typstämme erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 48 zusammengefasst. 4.6.3 Artspezifische Identifizierung eigenisolierter Kulturen methanogener Archaea Die oben bereits vorgestellten eigenisolierten Kulturen methanogener Archaea (Tabelle 47) wurden zusätzlich mit dem Oligonukleotidpaar Met86f/ Met1340r amplifiziert. Ein Teil des Amplifikats wurde aufgereinigt und zur Sequenzierung versendet. Die von extern digital erhaltenen Sequenzen sind auf der Rohdaten CD (‚\Molbiol_Analysen\Molbiol_Analysen_Methanogene‘) einsehbar. Die verbliebenen Aufreinigungen der 16S rDNA-Amplifikate wurden in gleiche Volumina aufgeteilt und mit den Enzymen HaeII und HaeIII sowie ohne Enzym für eine Restriktion inkubiert. Die so behandelten DNA-Fragmente der methanogenen Kulturen wurde in der Reihenfolge Marker, ungeschnittenes Amplifikat, restringiert mit HaeII und restringiert mit HaeIII in Taschen von 2,5 %igen Agarosegelen aufgetragen und mit Gelelektrophoresen aufgetrennt. 4 ERGEBNISSE 172 4.6.3.1 Artspezifische Identifizierung eigenisolierter Kulturen der Gattung Methanobacterium A B C D Abbildung 61:RFLP der partiellen 16S rDNA-Fragmente aus den Kulturen methanogener Archaea A TAF1, B BEG1 und C LFP4.1 sowie dem Typstamm Methanobacterium formicicumT DSM1535 (D); 10 µL Plasmid-Amplifizierungs-Produkt ungeschnitten (A) mit Artefaktbanden bei 200 bp und 100 bp bei D und geschnitten mit jeweils 5 U HaeII (II) und HaeIII (III), M = 5 µL GeneRuler™ DNA Ladder Mix SM0331 (0,5 µg/µL, Fermentas); 2,5 %iges Agarosegel mit 0,1 % einer 0,035 %igen Natronwasserglaslösung, angefärbt mit einer 7 %igen Ethidiumbromidlösung; Fotografie in Graustufen, Farben invertiert. Die Bandenmuster der mit dem Oligonukleotidpaar Met86f/ Met1540r partiell amplifizierten Gesamt16S rDNA aus den Kulturen TAF1, BEG1 und LFP4.1 (Abbildung 61 A, B, C) glichen den Bandenmustern des Typstamms Methanobacterium formicicumT DSM1535 (Abbildung 61 D) in Spur II sowie Spur III. Trotz mehrerer Banden im DGGE-Gel (Abbildung 59) zeigten die längeren Fragmente aus den Kulturen TAF1 und BEG1 ein eindeutiges dem Typstamm Methanobacterium formicicumT DSM1535 gleichendes Bandenmuster. Das ebenfalls eindeutige Restriktionsmuster des Fragments aus Kultur LFP4.1 bestätigte das Ergebnis der DGGE (Abbildung 59) mit einer einzelnen Bande auf der Höhe des Typstamms Methanobacterium formicicumT DSM1535. 4 ERGEBNISSE 173 A B C Abbildung 62:RFLP der partiellen 16S rDNA-Fragmente aus der Kultur methanogener Archaea A HWS1 sowie den Typstämmen Methanobacterium formicicumT DSM1535 (C) und Methanoculleus bourgensisT DSM3045 (C) zum Vergleich; 10 µL Plasmid-Amplifizierungs-Produkt ungeschnitten (A) mit Artefaktbanden bei 200 bp und 100 bp außer bei B und geschnitten mit jeweils 5 U HaeII (II) und HaeIII (III), M = 5 µL GeneRuler™ DNA Ladder Mix SM0331 (0,5 µg/µL, Fermentas); 2,5 %iges Agarosegel mit 0,1 % einer 0,035 %igen Natronwasserglaslösung, angefärbt mit einer 7 %igen Ethidiumbromidlösung; Fotografie in Graustufen, Farben invertiert. Die in Abbildung 62 A gezeigten Bandenmuster aus der methanogenen Kultur HWS1 wiesen in der Spur II und bis auf die zusätzliche Bande bei 200 bp in Spur III Übereinstimmungen der stärkeren Banden mit dem Typstamm Methanobacterium formicicumT DSM1535 (Abbildung 63 C) auf. Die helleren Banden in den Spuren II und III entsprachen dem Restriktionsmuster des Typstamms Methanoculleus bourgensisT DSM3045 (Abbildung 63 D). Daher wurde diese Kultur wurde zum einen in Minimalmedium 287 (Seite 84) ohne Reaktorfiltrat kultiviert, um Methanobacterium zu isolieren (siehe dazu Abbildung 36 B und Tabelle 31) und zum anderen in Medium 287 mit Acetat kultiviert um Methanoculleus anzureichern. 4 ERGEBNISSE 174 4.6.3.2 Artspezifische Identifizierung eigenisolierter Kulturen der Gattung Methanoculleus A B C D Abbildung 63: RFLP der Amplifikate aus der Kultur methanogener Archaea HWS1.1 (A), zum Vergleich HWS1 (B) sowie den Typstämmen Methanobacterium formicicumT DSM1535 (C) und Methanoculleus bourgensisT DSM3045 (D) zum Vergleich; 10 µL Plasmid-Amplifizierungs-Produkt ungeschnitten (A) mit Artefaktbanden bei 200 bp und 100 bp außer bei B und geschnitten mit jeweils 5 U HaeII (II) und HaeIII (III), M = 5 µL GeneRuler™ DNA Ladder Mix SM0331 (0,5 µg µL-1, Fermentas); 2,5 %iges Agarosegel mit 0,1 % einer 0,035 %igen Natronwasserglaslösung, angefärbt mit einer 7 %igen Ethidiumbromidlösung; Fotografie in Graustufen, Farben invertiert. Das Bandenmuster der aus Kultur HWS1 entstandenen Kultur HWS1.1 zeigte mehr Banden, die mit dem Typstamm Methanoculleus bourgensisT DSM3045 übereistimmten (Abbildung 63 A). Allerdings waren in Spur II wie in Spur III weitere Banden auf der Höhe von 700 bp zu sehen, die zu keinem der restringierten Typstämme passten. Die in Abbildung 63 D entstandene etwas größere Bande als die Markerbande 1200 bp in der Spur II des Typstamms Methanoculleus bourgensisT DSM3045 rührte vom nur partiellen Verdau des Restriktionsenzyms HaeII aufgrund von zu hohem DNA-Gehalt in der Probe. 4 ERGEBNISSE 175 A B C Abbildung 64:RFLP der Amplifikate aus den Kulturen methanogener Archaea A TAF1.1 B GEGN sowie dem Typstamm Methanoculleus bourgensisT DSM3045 (C) ; 10 µL Plasmid-AmplifizierungsProdukt ungeschnitten (A) mit Artefaktbanden bei 200 bp und 100 bp und geschnitten mit jeweils 5 U HaeII (II) und HaeIII (III), M = 2,5 µg GeneRuler™ DNA Ladder Mix SM0331; 2,5 %iges Agarosegel mit 0,1 % einer 0,035 %igen Natronwasserglaslösung, angefärbt mit einer 7 %igen Ethidiumbromidlösung; Fotografie in Graustufen, Farben invertiert. Die Bandenmuster der Kulturen TAF1.1 (Abbildung 64 A) und BEGN, einer methanogenen Kultur aus dem Nachgärer der BGA BioEnergie Glahn, (Abbildung 64 B) stimmten mit dem Muster des Typstamms Methanoculleus bourgensisT DSM3045 (Abbildung 64 C) exakt überein. Dieses Ergebnis bestätigte die Laufweite der einzigen Bande der Kultur TAF1.1 im DGGE-Gel (Abbildung 59), die vergleichbar weit wie die Bande des Typstamms Methanoculleus bourgensisT DSM3045 aufgetrennt wurde. 4 ERGEBNISSE 176 4.6.3.3 Artspezifische Identifizierung eigenisolierter Kulturen der Gattung Methanosarcina A B C Abbildung 65:RFLP der Amplifikate aus den Kulturen methanogener Archaea A TAF1.2, B BEGN2 im direkten Vergleich mit dem Muster des Typstamms Methanosarcina mazeiT DSM2053 (B); 10 µL Plasmid-Amplifizierungs-Produkt ungeschnitten (A) mit Artefaktbanden bei 200 bp und 100 bp außer bei A und geschnitten mit jeweils 5 U HaeII (II) und HaeIII (III), M = 2,5 µg GeneRuler™ DNA Ladder Mix SM0331; 2,5 %iges Agarosegel mit 0,1 % einer 0,035 %igen Natronwasserglaslösung, angefärbt mit einer 7 %igen Ethidiumbromidlösung; Fotografie in Graustufen, Farben invertiert. Das Bandenmuster des Eigenisolats TAF1.2 in Spur III der Abbildung 65 A entsprach dem Muster der Typstamms Methanosarcina mazeiT DSM2053 (Abbildung 65 C), wobei aufgrund eines höheren DNA-Gehalts in der Probe noch eine weitere Bande unter 100 bp zu sehen war. Aus dem gleichen Grund bildete sich in den Spuren ein gleichmäßiger Schatten aus, besonders in Spur II zu sehen. Aus dem Nachgärer der BGA BioEnergie Glahn wurde eine weitere methanogene Kultur isoliert, BEGN2. Die RFLP dieser Kultur (Abbildung 65 B) wies ebenfalls das gleiche Bandenmuster auf wie der Typstamm Methanosarcina mazeiT DSM2053 (Abbildung 65 C). 4 ERGEBNISSE 177 A B C Abbildung 66: RFLP der Amplifikate aus der Kultur methanogener Archaea A LFP2.1 im Vergleich zu dem Typstamm Methanosarcina mazeiT DSM2053 (B) und Methanobacterium formicicumT DSM1535 (C); 10 µL Plasmid-Amplifizierungs-Produkt ungeschnitten (A) mit Artefaktbanden bei 200 bp und 100 bp und geschnitten mit jeweils 5 U HaeII (II) und HaeIII (III), M = 2,5 µg GeneRuler™ DNA Ladder Mix SM0331; 2,5 %iges Agarosegel mit 0,1 % einer 0,035 %igen Natronwasserglaslösung, angefärbt mit einer 7 %igen Ethidiumbromidlösung; Fotografie in Graustufen, Farben invertiert. Die RFLP der Kultur LFP2.1 (Abbildung 66 A) aus einem mesophilen Laborfermenter hatte die größte Ähnlichkeit mit dem Bandenmuster des Typstamms Methanosarcina mazeiT DSM2053 (Abbildung 66 B). Allerdings zeichnete sich auch ein weiteres schwaches Bandenmuster ab, das dem Typstamm Methanobacterium formicicumT DSM1535 ähnelte. Dieses nicht eindeutige Bandenmuster sowie die zwei Banden in der DGGE (Abbildung 59) deuteten darauf hin, dass zum Zeitpunkt der durchgeführten DGGE und RFLP 16S rDNA mit unterschiedlichen Basenfolgen in dieser Kultur vorlagen. 4 ERGEBNISSE 178 A B C Abbildung 67: RFLP der Amplifikate aus der Kultur methanogener Archaea A HWS2.1 sowie den Typstämmen Methanosarcina barkeriT DSM800 (B) und Methanosarcina mazeiT DSM2053 (C); 10 µL Plasmid-Amplifizierungs-Produkt ungeschnitten (A) mit Artefaktbanden bei 200 bp und 100 bp und geschnitten mit jeweils 5 U HaeII (II) und HaeIII (III), M = 2,5 µg GeneRuler™ DNA Ladder Mix SM0331; 2,5 %iges Agarosegel mit 0,1 % einer 0,035 %igen Natronwasserglaslösung, angefärbt mit einer 7 %igen Ethidiumbromidlösung; Fotografie in Graustufen, Farben invertiert. Das in Abbildung 67 A dargestellte Bandenmuster des 16S rDNA Fragments aus Kultur HWS2.1 in Spur III glich der Bandenverteilung des Musters von Typstamm Methanosarcina mazeiT DSM2053 (Abbildung 67 C) allerdings mit den Bandenstärken des Typstamms Methanosarcina barkeriT DSM800 (Abbildung 67 B). Die Banden in den Spuren II haben die gleiche Größe wie die nicht restringierte DNA in den Spuren A (Abbildung 67 A, B, C). 4 ERGEBNISSE 179 4.6.3.4 Artspezifische Identifizierung einer eigenisolierten Kultur der Gattung Methanosaeta A B Abbildung 68: RFLP der -Amplifikate aus der Kultur methanogener Archaea A BEG4 sowie dem DSMZ-Stamm Methanosaeta concilii DSM2139 (B); 10 µL Plasmid-Amplifizierungs-Produkt ungeschnitten (A) mit Artefaktbanden bei 200 bp und 100 bp und geschnitten mit jeweils 5 U HaeII (II) und HaeIII (III), M = 2,5 µg GeneRuler™ DNA Ladder Mix SM0331; 2,5 %iges Agarosegel mit 0,1 % einer 0,035 %igen Natronwasserglaslösung, angefärbt mit einer 7 %igen Ethidiumbromidlösung; Fotografie in Graustufen, Farben invertiert. Abbildung 68 zeigt das Bandenmuster der Kultur BEG4 (A) im Vergleich zu dem DSMZ-Stamm Methanosaeta concilii DSM2139. Außer der fehlenden Bande auf der Höhe von etwa 350 bp entsprach das Muster der Spur III dem des DSMZ-Stamms Methanosaeta concilii DSM2139. 4 ERGEBNISSE 180 4.6.3.5 Artspezifische Identifizierung einer eigenisolierten Kultur der Gattung Methanomethylovorans A B C Abbildung 69: RFLP der Amplifikate aus der Kultur methanogener Archaea A LFP3.1 und die Typstämme Methanomethylovorans hollandicaT DSM15978 (B), Methanomethylovorans thermophilaT DSM17232 (C); 10 µL Plasmid-Amplifizierungs-Produkt ungeschnitten (A) mit Artefaktbanden bei 200 bp und knapp über 100 bp und geschnitten mit jeweils 5 U HaeII (II) und HaeIII (III), M = 2,5 µg GeneRuler™ DNA Ladder Mix SM0331; 2,5 %iges Agarosegel mit 0,1 % einer 0,035 %igen Natronwasserglaslösung, angefärbt mit einer 7 %igen Ethidiumbromidlösung; Fotografie in Graustufen, Farben invertiert. Spur III in Abbildung 69 A zeigt Banden auf der Höhe von 500 bp, knapp über 200 bp sowie 100 bp, die den Banden der Typstämme Methanomethylovorans hollandicaT DSM15978 (Abbildung 69 B), Methanomethylovorans thermophilaT DSM17232 (Abbildung 69 C) entsprachen. Die Spuren von HaeIII verdauter 16S rDNA der Typstämme zeigten jeweils eine Bande bei zwischen 800 bp und 900 bp. Diese Bande entstand durch partielle Restriktion aufgrund zu großer Mengen DNA in den Ansätzen. Da weniger DNA in den Ansätzen der 1155 bp langen Fragmente aus Kultur LFP3.1 enthalten war, entstand kein Restriktionsfragment zwischen den Markierungen 800 bp und 900 bp (Abbildung 69 A). Offenbar existierte keine Schnittstelle, die ein Restriktionsfragment mit einer vergleichbaren Länge ergab (multiple Alignierung, siehe Abbildung 144). Vermutlich gründeten die Banden auf der Höhe von 200 bp und bei etwa 150 bp (Abbildung 69 A) auf einer für HaeIII schnittstellenbringenden Mutation der 16S rDNA aus Kultur LFP3.1 und somit keine Bande zwischen den Markierungen 300 bp und 400 bp in dem Eigenisolat existierte (siehe dazu Abbildung 71). 4 ERGEBNISSE 181 4.6.4 Zusammenfassung der identifizierten eigenisolierten methanogenen Archaea aus NawaRo-Biogasanlagen Die aufgereinigten Fragmente methanogener Gesamt-16S rDNA wurden an externe Firmen versendet, um von ihnen Sequenzierungen durchführen zu lassen. Die erhaltenen Sequenzen befinden sich in der Rohdaten CD ‚\Molbiol_Analysen\Molbiol_Analysen_Methanogene‘ beziehungsweise ‚…\DGGE_Methanogene‘. Im Folgenden sind die Ergebnisse der paarweisen Alignierungen mit den Sequenzen der NCBI-Datenbank nach NawaRo-BGA’s geordnet aufgeführt und erläutert. Tabelle 48: Molekularbiologisch analysierte Sequenzen der 16S rDNA-Fragmente aus den Reinkulturen methanogener Archaea aus den Fermentern der BGA Theo & Ingrid & Alexander Friedrich GbR (TAF) Kultur TAF1 TAF1.1 TAF1.2 DGGE Bande Bemerkung Sequenzlänge [bp] % 99 - Methanobacterium formicicumT DSM1535 7951 (793/1/976)2 TAF1a Methanobacterium formicicumT DSM1535 318 (317/0/318)2 99 TAF1b Methanobacterium formicicumT DSM1535 3181 (315/0/315)2 100 TAF1c Methanobacterium formicicumT DSM1535 3581 (334/0/335)2 99 - Methanoculleus bourgensisT DSM3045 491 2 (478/0/484) 99 TAF1.1 Methanoculleus bourgensis DSM3045 3701 (278/0/278)2 100 T 1 1 1 - Methanosarcina mazei DSM2053 872 (867/1/868)2 99 TAF1.2a Methanosarcina mazeiT DSM2053 3631 (323/0/324)2 99 TAF1.2b Methanosarcina mazeiT DSM2053 365 (327/0/327)2 T 1 100 1 Gesamtsequenzlänge; 2Übereinstimmung/Lücken/verglichene Sequenzlänge Die Identifizierungsergebnisse lieferten die Sequenzen der archaealen 16S rDNA Fragmente aus den Kulturen TAF1, TAF1.1 und TAF1.2 aus dem Fermenter der BGA Theo & Ingrid & Alexander Friedrich GbR (Tabelle 48). Die unterschiedlichen DGGE-Banden in Spuren der Kulturen TAF1 und TAF1.2 resultierten vermutlich durch Punktmutationen in einzelnen Fragmenten, welche nicht in den 4 ERGEBNISSE 182 digital erhaltenen Sequenzen liegen (multiple Alignierung TAF1a-c siehe Abbildung 141). Für Kultur TAF1.2 lieferten die Sequenzen die bereits angenommene Punktmutation. TAF1.2a_Ar1000f TAF1.2b_Ar1000f Ms.mazeiT_DSM2053 CTCCGTGCCGTGTTCGAACCTGTGCTTTGCAAGGGGGGTTAAGTCGTACCAG 363 CTTCGTGCCGTGTTCGAACCTGTGCTTTGCAAGGGGGGTTAAGTCG-ACCAG 365 CTTCGTGCCGTGT--------------------------------------- 373 ** ********** Abbildung 70: Ausschnitt aus der multiplen Alignierung (Abbildung 142) der partiellen DGGESequenzen a und b aus Kultur TAF1.2 mit dem Typstamm Methanosarcina mazeiT DSM2053; Zeile der Punktmutation in partieller Sequenz TAF1.2a hellgrün markiert. In einer multiplen Alignierung der DGGE-Sequenzen aus Kultur TAF1.2 (Abbildung 142) wurde eine Punktmutation zwischen zwei Pyrimidin-Basen von Thymin zu Cytosin ermittelt (Abbildung 70). Diese Punktmutation war vermutlich an dem im Vergleich zu den Fragmenten mit den Sequenzen TAF1.2b und des Typstamms Methanosarcina mazeiT DSM2053 kürzeren Lauf im DGGE-Gel (Abbildung 59) beteiligt. Die partiellen Sequenzen erreichten Übereinstimmungen von 99 bis 100 % und wurden somit der jeweilig gleichen Art zugeordnet. Wachstumstests mit unterschiedlichen Substraten (Tabelle 31) und fluoreszenzmikroskopische Überprüfungen (TAF1: Abbildung 36 A, TAF1.1: wie Abbildung 38, TAF1.2: Abbildung 39 A) bestätigten die Sequenzierungsergebnisse. Diese Kulturen aus der BGA Theo & Ingrid & Alexander Friedrich GbR waren somit eigenisolierte archaeale Reinkulturen. Die Sequenzen der partiellen 16S rDNA wurden daher in die NCBI-Datenbank eingetragen (TAF1: AN JN243315, TAF1.1: AN JN243316, TAF1.2: AN JN243317). Tabelle 49: Molekularbiologisch analysierte Sequenzen der 16S rDNA-Fragmente aus der eigenisolierten methanogenen Kultur HWS1 und Reinkultur HWS2.1 aus den Fermentern der BGA Hubert Wagner und Sohn GbR (HWS) Kultur HWS1 DGGE Bande Bemerkung % 99 - Methanobacterium formicicum DSM1535 9681 2 (966/1/969) HWS1a Methanobacterium formicicumT DSM1535 370 (348/1/349)2 HWS1b Methanoculleus bourgensisT DSM3045 359 (265/0/266)2 T HWS2.1 - T Methanosarcina barkeri DSM800 T Methanosarcina mazei DSM2053 HWS2.1 1 Sequenzlänge [bp] T Methanosarcina barkeri DSM800 1 99 1 8391 (824/1/838)2 2 99 98 (825/5/842) 3561 (346/2/352)2 Gesamtsequenzlänge; 2Übereinstimmung/Lücken/verglichene Sequenzlänge 98 4 ERGEBNISSE 183 Die Sequenzierungsergebnisse der Fragmente aus dem DGGE Gel (Abbildung 59) bestätigten die RFLP der Kultur HWS1 (Abbildung 63 A), dass es sich bei dieser Kultur um eine Mischkultur der Arten Methanobacterium formicicum (Abbildung 63 C) und Methanoculleus bourgensis (Abbildung 63 D) handelte. Trotz dieses Umstands lieferte die 1254 bp lange Sequenz aus Kultur HWS1 die höchste Übereinstimmung mit dem Typstamm Methanobacterium formicicumT DSM1535 (Tabelle 49). Dieser Mikroorganismus war somit die vorherrschende Art in der Kultur, welche mit fortgeführter Kultivierung in Minimalmedium rein isoliert wurde. In dieser Dissertation wurde mit Kultur HWS1.1 keine erneute molekularbiologische Analyse durchgeführt, da regelmäßige fluoreszenzmikroskopische Kontrollen eine stetig sinkende Kontamination mit fluoreszierenden Stäbchen bis zum Abschluss der praktischen Arbeiten zeigten. Vergleichbar mit den Ergebnissen aus der Laufweite im DGGE-Gel (Abbildung 60 A) und der RFLP (Abbildung 67 A) war das Sequenzierungsergebnis der aus dem 1254 bp langen Fragment erhaltenen partiellen Sequenz der vorderen 2/3 der 16S rDNA aus der Kultur HWS2.1. Die Identität der Kultur lag zwischen zwei der Gattung Methanosarcina zugeordneten Arten mit gleicher prozentualer Übereinstimmung (Tabelle 49). Die 500 bp lange Sequenz aus dem DGGE-Gel (Abbildung 60 A) schloss auf, dass es sich bei dem methanogenen Archaeon in Kultur HWS2.1 um die Art Methanobacterium barkeri handelte, da die Basenfolge des letzten Drittels der 16S rDNA im Vergleich zu den ersten 2 Dritteln weniger konserviert war. Die Sequenzen der partiellen 16S rDNA wurden in die NCBI-Datenbank eingetragen (HWS1: AN JN24318, HWS2.1: AN JN243319), da sowohl die Überprüfung mit dem Fluoreszenzmikroskop (HWS1: Abbildung 36 B, HWS2.1: Abbildung 40 A) als auch die Substrattests die erwarteten Wachstumsverhalten ergaben (Tabelle 31). 4 ERGEBNISSE 184 Tabelle 50: Sequenzierungsergebnisse der 16S rDNA-Fragmente aus den eigenisolierten Reinkulturen BEG1, BEG3, BEG4 aus dem Fermenter und eigenisolierten Kulturen BEGN und BEGN2 aus dem Nachgärer der BGA BioEnergie Glan (BEG) Kultur BEG1 BEG3 BEG4 BEGN DGGE Bande Bemerkung % 99 - Methanobacterium formicicumT DSM1535 3561 (346/2/352)2 BEG1a Methanobacterium formicicumT DSM1535 328 (318/1/321)2 99 BEG1b Methanobacterium formicicumT DSM1535 3161 (305/0/308)2 99 BEG1c Methanobacterium formicicumT DSM1535 3541 (333/0/334)2 99 Methanosarcina mazeiT DSM2053 864 (862/0/862)2 100 BEG3a Methanosaeta concilii DSM2139 3541 (343/0/348)2 99 BEG3b Methanosarcina mazeiT DSM2053 3551 (313/3/316)2 99 BEG3c Methanosarcina mazeiT DSM2053 356 (314/2/316)2 99 - Methanosaeta concilii DSM2139 4081 (398/2/408)2 98 BEG4a Methanosaeta concilii DSM2139 3561 (342/0/348)2 98 BEG4b Methanosaeta concilii DSM2139 3571 (347/0/351)2 99 BEG4c Methanosaeta concilii DSM2139 3541 2 (342/2/350) 98 Methanoculleus bourgensisT DSM3045 604 (597/0/598)2 - - 1 1 1 Methanosarcina siciliae DSM3028 Methanosarcina mazeiT DSM2053 (743/0/752)2 T - 1 7521 (745/0/752)2 BEGN2 T Methanosarcina barkeri DSM800 1 Sequenzlänge [bp] 2 (736/0/747) Gesamtsequenzlänge; 2Übereinstimmung/Lücken/verglichene Sequenzlänge 99 99 4 ERGEBNISSE 185 Die Sequenzen der DGGE Fragmente aus Kultur BEG1 (Tabelle 50) zeigten, dass es sich bei den drei unterschiedlich separierten Banden um Mutationen der 16S rDNA derselben Art handelte, wie bei Kultur TAF1 (Tabelle 48). Die DGGE Bande BEG3a (Abbildung 59) aus der Kultur BEG3 wurde der Art Methanosaeta concilii mit höchster Übereinstimmung zugeordnet. Die Identifizierungen des 1254 bp langen Fragments aus Kultur BEG3 und der anderen beiden 500 bp zeigten, dass die hauptsächlich in dieser Kultur existierende Art Methanobacterium mazei war, was die geringe Stärke der Bande BEG3a im DGGE-Gel (Abbildung 59) bestätigte. Die Sequenzierungsergebnisse der Kultur BEG4 ergaben eindeutig, dass diese Kultur eine Reinkultur der Art Methanosaeta concilii war. Kultur BEGN aus dem Nachgärer der BGA BioEnergie Glahn wurde eindeutig als ein Stamm der Art Methanoculleus bourgensis identifiziert. Bei der ebenfalls aus dem Nachgärer der BGA stammenden Kultur BEGN2 wurde die Sequenz mit prozentual nicht differenzierbaren Unterschieden dem Typstamm Methanosarcina siciliaeT DSM3028 zugeordnet. Sowohl fluoreszenzmikroskopisch (BEG1: Abbildung 36 C, BEG3: Abbildung 39 B, BEGN: Abbildung 38) als auch im Substrattest (Tabelle 31) wurden Eigenschaften der jeweiligen methanogenen Archaea ermittelt. Die Sequenzen der partiellen 16S rDNA der Stämme BEG1 (AN JN243320), BEG3 (AN JN243321), BEG4 (AN JN243322), BEGN (AN JX943602) und BEGN2 (AN JX943603) worden somit auch in die NCBI-Datenbank eingetragen, da es sich bei diesen eigenisolierten Kulturen um Reinisolate handelte. Die Sequenz der Kultur BEGN2 wurde nicht in die NCBI-Datenbank eingetragen, da weitere molekularbiologische Analysen mit der gesamten 16S rDNA durchgeführt werden müssen, um die Art der eigenisolierten Kultur BEGN2 eindeutig zu bestimmen. 4 ERGEBNISSE 186 Tabelle 51: Sequenzierungsergebnisse der archaealen 16S rDNA-Fragmente aus den eigenisolierten Reinkulturen LFP3.1 und LFP4.1 aus einem thermophilen Laborfermenter und der eigenisolierten Kultur LFP2.1 aus einem mesophilen Laborfermenter Kultur DGGE Bande Sequenzlänge [bp] Bemerkung 1 LFP2.1 - 317 (312/0/317)2 T Methanosarcina mazei DSM2053 T LFP2.1a kein Reamplifikat LFP2.1b LFP2.1c - 1 (312/0/317) n. a. n. a. Methanosarcina mazeiT DSM2053 3591 (313/1/315)2 99 Methanosarcina mazeiT DSM2053 3591 (314/1/315)2 99 Methanomethylovorans hollandicaT DSM15978 9941 (974/1/995)2 98 Methanomethylovorans hollandicaT DSM15978 3581 (347/1/354)2 Methanomethylovorans thermophilaT DSM17232 (347/1/354)2 - Methanobacterium formicicumT DSM1535 9651 (963/1/966)2 99 LFP4.1 Methanobacterium formicicumT DSM1535 3661 (330/0/330)2 100 LFP3.1 LFP4.1 98 2 Methanosarcina barkeri DSM800 LFP3.1 % Gesamtsequenzlänge; 2 Übereinstimmung/Lücken/verglichene Sequenzlänge; n. 98 a.: nicht auswertbar Aus dem mesophilen Laborfermenter (Klocke et al. 2007, 2009 a, b, Nettmann et al. 2010) wurde die Kultur LFP2.1 isoliert. Die Sequenz der ersten zwei Drittel dieser Kultur zeigte die gleich Übereinstimmung mit den Typstämmen Methanosarcina mazeiT DSM2053 und Methanosarcina barkeriT DSM800. Die Sequenzen der 500 bp langen Fragmente aus dem DGGE-Gel (Abbildung 59) ermöglichten eine eindeutige Zuordnung der Kultur LFP2.1 zum Typstamm Methanosarcina mazeiT DSM2053, da diese Sequenz den hinteren, weniger konservierten Bereich der 16S rDNA kodierte. Aufgrund von fluoreszenmikroskopisch erkennbaren Kontaminationen der Kokken mit fluoreszierenden Stäbchen (nicht gezeigt) und dem nicht eindeutigen Bandenmuster der RFLP (Abbildung 66 A), wurde die Sequenz der Kultur LFP2.1 in dieser Arbeit nicht in die NCBIDatenbank eingetragen, auch wenn die Substrattests (Tabelle 31) ein Wachstumsverhalten wie die Gattung Methanosarcina zeigten. Bei Kultur LFP3.1 aus einem thermophil betriebenen Laborfermenter führte die Sequenz der ersten zwei Drittel im Gegensatz zu den Identifizierungen der Kulturen HWS2.1 (Tabelle 48) und LFP2.1 der 16S rDNA zu einer eindeutigen Zuordnung des 4 ERGEBNISSE 187 reinkultivierten Mikroorganismus zum Typstamm Methanomethylovorans hollandicaT DSM15978 (Lomans et al. 1999). Die Sequenz des einzigen Fragments aus dem DGGE-Gel (Abbildung 60 B) enthielt eine Kodierung, die den gleichen Abstand zu den beiden bekannten Typstämmen der Gattung Methanomethylovorans einnahm, was die andere Laufweite des DNA Fragments erklärte. Folgend ist ein Ausschnitt der multiplen Alignierung (siehe Abbildung 144) der Sequenzen aus verschiedenen Fragmenten der 16S rDNA aus Kultur LFP3.1 mit den partiellen Sequenzen der Typstämme Methanomethylovorans hollandicaT DSM15978 und Methanomethylovorans thermophilaT DSM17232 gezeigt. Mit Sequenz ‚LFP3.1_Ar1000f_1‘ wurde die Identifizierung des Mikroorganismus anhand der NCBI-Datenbank (Tabelle 51) durchgeführt. LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_rev_compl HaeIII -CTG--------GGGACAATGGGCCCCTACCCCGAAAGGGGACGGTAATC GCTACAATGACTGGGACAATGGGCCCCTACCCCGAAAGGGGACGGTAATC GCTACAATGACTGGGACAATGGGCCCCTACCCCGAAAGGGGACGGTAATC GCTACAATGACTGGGACAATGGGCTCCTACCCCGAAAGGGGATGGTAATC GCTACAATGACTGGGACAATGGGCTCCTACCCCGAGAGGGGATGGTAATC -------------------------------------------------GCTACAATGACTGGGACAATGGGCCCCTACCCCGAAAGGGGACGGTAATC **. ************ **********.****** ******* 41 145 141 1200 1143 183 Abbildung 71: Ausschnitt aus der multiplen Alignierung (Abbildung 144) der Sequenzen aus Reinkultur LFP3.1 mit den Typstämmen Methanomethylovorans hollandicaT DSM15978 und Methanomethylovorans thermophilaT DSM17232; durch Punktmutation entstandene Schnittstelle für HaeIII in den Sequenzen aus Kultur LFP3.1 hellgrün markiert. Die multiple Alignierung der 16S rDNA Sequenzen aus Kultur LFP3.1 mit den in der NCBIDatenbank hinterlegten partiellen 16S rDNA Sequenzen der bekannten Typstämme des Genus Methanomethylovorans zeigte eine Punktmutation in der Basenfolge der Sequenzen der Kultur LFP3.1 auf (Abbildung 71). Diese Punktmutation hatte zur Folge, dass das Restriktionsenzym HaeIII eine weitere Schnittstelle erhielt, die zwei 205 bp und 182 bp große Fragmente hervorrief (Abbildung 69 A). Mithilfe der in der NCBI-Datenbank hinterlegten Sequenz des Typstamms Methanomethylovorans hollandicaT DSM15978 wurden die Restriktionsfragmentlängen der Typstämme sowie des Fragments aus Kultur LFP3.1 ermittelt. Mit den erhaltenen Sequenzen der partiellen archaealen 16S rDNA wurde nicht aufgeklärt, welche Mutationen in den Fragmenten für die unterschiedlichen Laufweiten in den DGGE-Gelen (Abbildung 59 und Abbildung 60 A, B) verantwortlich waren. Die Sequenz LFP3.1 wurde in die NCBI-Datenbank als Methanomethylovorans sp. (AN JN566058) eingetragen, da der Unterschied der 16S rDNA zu den beiden bekannten Arten der Gattung Methanomethylovorans für eine Bestimmung einer neuen Art zu gering war. 4 ERGEBNISSE 188 Tabelle 52: Schnittstellen des Enzyms HaeIII in der partiellen 16S rDNA der Reinkultur LFP3.1 und daraus resultierende Restriktionsfragmentlängen, ermittelt anhand der in der NCBI-Datenbank hinterlegten Sequenz des Typstamms Methanomethylovorans hollandicaT DSM15978 Schnittstellen LFP3.1 Restriktionsfragmentlänge Schnittstellen RestriktionsDSM 15978 fragmentlänge 611 > 611 231 > 292 > 292 120 > 412 > 41 > 12 > 503 > 205 > 13192 1319 Sequenz des 351 182 2 1 503 968 1137 > 12 465 968 > 41 453 465 > 120 412 453 > 231 Oligonukleotids Met86f bei 61 bp des ungeschnittenen Fragments, 2 Erkennungssequenz des Oligonukleotids Met1340r bei 1319 bp (siehe multiple Alignierung in Abbildung 144) Die in Tabelle 52 aufgeführten, anhand der Sequenz des in der NCBI-Datenbank hinterlegten Typstammes Methanomethylovorans hollandicaT DSM15978 berechneten Restriktionsfragmentlängen stimmten mit den in Abbildung 69 A-C dargestellten Mustern im Vergleich zum Längenmarker überein. 4 ERGEBNISSE 189 4.6.5 Phylogenetische Stammbäume bakterieller und archaealer 16S rDNA anaerober Mikroorganismen Phylogenetische Stammbäume geben visuell Aufschluss über die Beziehungen von Mikroorganismen untereinander innerhalb eines Systems wie syntroph propionsäureoxidierenden Mischkulturen beziehungsweise methanogenen Archaea aus NawaRo-BGA’s (Tabelle 18). Mit den durch molekularbiologischen Methoden erhaltenen Sequenzen (Kapitel 4.5) wurden multiple Alignierungen mit einer Auswahl in der NCBI-Datenbank hinterlegten Sequenzen und einem entfernten Mikroorganismus als out-group durchgeführt, um auch kleine Unterschiede in den Sequenzen herauszuheben. Dafür wurde in dieser Dissertation das JavaScript unterstützte online tool ClustalW2 (EBI, UK) genutzt. Alignierungspositionen, die mit weniger als 50 % durch Sequenzen belegt waren, wurden manuell aus der Alignierung eliminiert (50 % Gewichtung). Für die Berechnung der Stammbäume wurde die Software Mega 4.1 (Center for Evolutionary Medicine and Informatics, USA) verwendet. Stammbäume wurden mit der Methode Maximum Parsimony (Sober 1983) berechnet. Zur statistischen Absicherung wurden Bootstrap-Analysen (Efron und Tibshirani 1994, Efron 1979) durchgeführt, welche in % an den Verzweigungen angegeben sind. Jeweils 100 Baumkonstruktionen wurden dafür berechnet. 4.6.5.1 Phylogenetische Stammbäume partieller 16S rDNA von Bakterien aus syntroph propionsäureoxidierenden Mischkulturen Multiple Alignierungen mit den Oligonukleotidpaarungen Eubac5/ Eubac3 beziehungsweise BSF8/ BSR1541 reamplifizierten ersten zweidritteln der 16S rDNA Sequenzen aus den propionsäureabbauenden Mischkulturen Fp1a, Wp2a, Gp1 und Ap1a beziehungsweise deren Unterkulturen und einer Auswahl in der NCBI-Datenbank hinterlegten Sequenzen durchgeführt, auf welche die Zuordnungen der bakteriellen Klon-Sequenzen fielen. Den Alignierungen partieller bakterieller 16S rDNA Sequenzen wurde die in der NCBI-Datenbank hinterlegten 16S rDNA Sequenz von Methanobacterium formicicumT DSM1535 zugefügt (out-group), um die Beziehung nah verwandter Sequenzen herauszuheben. 4 ERGEBNISSE 190 4.6.5.1.1 Phylogenetischer Stammbaum partieller 16S rDNA von aus der syntroph propionsäureoxidierenden Mischkultur Fp1 stammenden Bakterien Abbildung 72: Phylogenetischer Stammbaum der Klonsequenzen mit unterschiedlichen Restriktionsmustern aus der bakteriellen Gesamt-DNA der propionsäureabbauenden Mischkultur Fp1a und dessen Unterkulturen aus der BGA Theo & Ingrid & Alexander Friedrich GbR und in der NCBI-Datenbank hinterlegte Sequenzen; multiple Alignierung: online tool ClustalW2 (EBI, UK); Phylogenie Software: Mega 4.1 (Center for Evolutionary Medicine and Informatics, USA); Berechnung: Maximum Parsimony (Sober 1983), 100 Baumkonstruktionen mit 50 % Regelung; Statistische Absicherung: Bootstrap (Efron und Tibshirani 1994, Efron 1979), 100 Baumkonstruktionen; Differenzmaßstab in %. In der propionsäureabbauenden Kultur Fp1a wurde mit den ersten zweidritteln der partiellen bakteriellen 16S rDNA-Sequenzen phylogenetisch (Abbildung 72) herausgehoben, dass in dieser Anreicherungskultur Vertreter der Ordnungen Clostridiales, Synergistales, Spirochaetales und Bacteroidales sowie der Klassen Delta- und Gammaproteobacteria lebten. Das zuvor erhaltene Ergebnis der sequenziell im gesamten Fermenter dominierenden Ordnung Clostridiales beziehungsweise des Phylums Firmicutes (Tabelle 32) wurde durch die molekularbiologischen Analysen der Mischkultur (Klone Fp1a1 bis Fp1a14, Abbildung 72) bestätigt und unter anderem durch die Analysen der Unterkulturen ( Klone F5 bis F10 und Klon Fp1a63-L 11, Abbildung 72) erweitert. Der reinkultivierte zur Ordnung der Bacteroidales zugehörige Vertreter Proteiniphilum 4 ERGEBNISSE 191 acetatigenes Stamm Fp1a520 (Tabelle 46) wurde ebenfalls nicht mit den Oligonukleotidpaarungen BSF8/ BSR1541 erfasst. 4.6.5.1.2 Phylogenetischer Stammbaum partieller 16S rDNA von aus der syntroph propionsäureoxidierenden Mischkultur Wp2 stammenden Bakterien Abbildung 73: Phylogenetischer Stammbaum der Klonsequenzen mit unterschiedlichen Restriktionsmustern aus der Gesamt-DNA der Unterkultur Wp2a1264 aus der BGA Hubert Wagner und Sohn GbR und in der NCBI-Datenbank hinterlegte Sequenzen; multiple Alignierung: online tool ClustalW2 (EBI, UK); Phylogenie Software: Mega 4.1 (Center for Evolutionary Medicine and Informatics, USA); Berechnung: Maximum Parsimony (Sober 1983), 100 Baumkonstruktionen mit 50 % Regelung; Statistische Absicherung: Bootstrap (Efron und Tibshirani 1994, Efron 1979), 100 Baumkonstruktionen; Differenzmaßstab in %. Obwohl durch die molekularbiologische Analyse der bakteriellen 16S Gesamt-rDNA des Fermenters Hubert Wagner & Sohn GbR (Tabelle 32) eine Klon-Sequenz des Genus Clostridium identifiziert wurde, enthielt Unterkultur Wp2a1264 aus der propionsäureabbauenden Mischkultur Wp2a keine Mikroorgansimen der Ordnung Clostridiales(Abbildung 73). Stattdessen wurden Arten der Ordnungen Synergistales und Thermotogales sowie der Klasse der Epsilonproteobacteria (Tabelle 40) angereichert. 4 ERGEBNISSE 192 4.6.5.1.3 Phylogenetischer Stammbaum partieller 16S rDNA von aus der syntroph propionsäureoxidierenden Mischkultur Gp1 stammenden Bakterien Abbildung 74: Phylogenetischer Stammbaum von Klonsequenzen partieller 16S rDNA der aus den ursprünglich aus der propionsäureabbauenden Anreicherungskultur Gp1 (BGA BioEnergie Glahn) stammenden Bakterien und ausgewählter in der NCBI-Datenbank hinterlegter Sequenzen; multiple Alignierung: online tool ClustalW2 (EBI, UK); Phylogenie Software: Mega 4.1 (Center for Evolutionary Medicine and Informatics, USA); Berechnung: Maximum Parsimony (Sober 1983), 100 Baumkonstruktionen mit 50 % Regelung; Statistische Absicherung: Bootstrap (Efron und Tibshirani 1994, Efron 1979), 100 Baumkonstruktionen; Differenzmaßstab in %. Die vorherrschende Gruppierung in der propionsäureabbauenden Mischkultur Gp1a gehörte zu den Deltaproteobacteria (Klone Gp1a6 und Gp1a29, Abbildung 74). In der Unterkultur Gp1b1264 dominierten die Vertreter der zu den Clostridiales zähligen Familie Peptostreptococcaceae (Klone G2, G8, G11 und G14, Abbildung 74). Die 16S rDNA Sequenzen dieser Mikroorganismen wurden im Fermenter (Abbildung 44) sowie in der Unterkultur Gp1b1264 molekularbiologisch (Abbildung 53) identifiziert. Des Weiteren wurden Mikroorganismen der Ordnung Synergistales (Klone G3, G5 und G13, Abbildung 74) und der Klasse der Deltaproteobacteria (Klon G10, Abbildung 74) in Unterkultur Gp1b1264 angereichert. In DSMZ-Medium 63-L wurde ein weiterer Vertreter der Clostridiales (Klon Gp1b63-L, Abbildung 74) angereichert und identifiziert. 4 ERGEBNISSE 193 4.6.5.1.4 Phylogenetischer Stammbaum partieller 16S rDNA von aus der syntroph propionsäureoxidierenden Mischkultur Ap1 stammenden Bakterien Abbildung 75: Phylogenetischer Stammbaum der Klonsequenzen mit unterschiedlichen Restriktionsmustern aus der jeweiligen Gesamt-DNA der Unterkultur Ap1a1264 aus der BGA Arenrath GmbH & Co KG und in der NCBI-Datenbank hinterlegte Sequenzen; multiple Alignierung: online tool ClustalW2 (EBI, UK); Phylogenie Software: Mega 4.1 (Center for Evolutionary Medicine and Informatics, USA); Berechnung: Maximum Parsimony (Sober 1983), 100 Baumkonstruktionen mit 50 % Regelung; Statistische Absicherung: Bootstrap (Efron und Tibshirani 1994, Efron 1979), 100 Baumkonstruktionen; Differenzmaßstab in %. Die Unterkultur Ap1a1264 zeigte im Vergleich zu den anderen Unterkulturen (Abbildung 72 bis Abbildung 74) die geringste Mikroorganismendiversität aus zwei verschiedenen Ordnungen: Clostridiales (Klon A1, Abbildung 75) und Bacteroidales (Klone A10 und A13, Abbildung 75), von welchen das zur Ordnung der Clostridiales zugehörige Bakterium Clostridium sartagoforme Stamm Ap1a520 reinisoliert wurde (Tabelle 46). 4.6.5.2 Phylogenetische Stammbäume partieller 16S rDNA methanogener Archaea Die verwandtschaftlichen Beziehungen der eigenisolierten Kulturen methanogener Archaea wurden ebenfalls phylogenetisch analysiert. Die Durchführung glich der mit bakteriellen Sequenzen bis auf die Zufügung der in der NCBI-Datenbank hinterlegten Sequenz des Typstamms Methanopyrus kandleriT DSM5324, um die nahe Verwandtschaft der eigenisolierten methanogenen Archaea aus NawaRo-Biogasanlagen zu verdeutlichen. 4 ERGEBNISSE 194 4.6.5.2.1 Phylogenetischer Stammbaum partieller 16S rDNA nach einer DGGE aus der Gesamt-DNA von Eigenisolaten methanogener Archaea Abbildung 76: Phylogenetischer Stammbaum der DGGE-Sequenzen aus der jeweiligen 16S rDNA eigenisolierter Kulturen methanogener Archaea, deren Typstämme und teilweise in der NCBIDatenbank hinterlegten Typstamm-Sequenzen; multiple Alignierung: online tool ClustalW2 (EBI, UK); Phylogenie Software: Mega 4.1 (Center for Evolutionary Medicine and Informatics, USA); Berechnung: Maximum Parsimony (Sober 1983), 100 Baumkonstruktionen mit 50 % Regelung; Statistische Absicherung: Bootstrap (Efron und Tibshirani 1994, Efron 1979), 100 Baumkonstruktionen; Differenzmaßstab in %. Die Stammbaumberechnung (Abbildung 76) der mit der Oligonukleotidpaarung Ar1000f/ Ar1500r reamplifizierten insgesamt 500 bp großen DGGE-Fragmente spiegelte die Zuordnungen der eigenisolierten methanogenen Archaea mit der NCBI-Datenbank auch im Fall der Reinkultur LFP3.1 (Tabelle 51) wieder. Der hintere Teil der partiellen 16S rDNA des methanogenen Archaeons 4 ERGEBNISSE 195 wurde in gleicher Übereinstimmung den beiden Typstämmen des Genus Methanomethylovorans zugeordnet. 4.6.5.2.2 Phylogenetischer Stammbaum partieller 16S rDNA aus der Gesamt-DNA von Eigenisolaten methanogener Archaea Abbildung 77: Phylogenetischer Stammbaum der Sequenzen aus der jeweiligen partiellen 16S rDNA eigenisolierter Kulturen methanogener Archaea und in der NCBI-Datenbank hinterlegte Typstamm-Sequenzen; multiple Alignierung: online tool ClustalW2 (EBI, UK); Phylogenie Software: Mega 4.1 (Center for Evolutionary Medicine and Informatics, USA); Berechnung: Maximum Parsimony (Sober 1983), 100 Baumkonstruktionen mit 50 % Regelung; Statistische Absicherung: Bootstrap (Efron und Tibshirani 1994, Efron 1979), 100 Baumkonstruktionen; Differenzmaßstab in %. Die mit der Oligonukleotidpaarung Met86f/ Met1340r amplifizierten partiellen 16S rDNA-Sequenzen wurden mit eindeutigen Übereinstimmungen von bis zu 100 % Arten methanogener Archaea zugeordnet (Kapitel 4.6), was die Berechnung des Stammbaums methanogener Archaea (Abbildung 77) bis auf zwei Sequenzen bestätigte. Die archaeale partielle 16S rDNA aus Kultur BEGN2 wurde beim Vergleich mit der NCBI-Datenbank Methanosarcina siciliaeT DSM3028 zugeordnet, wohingegen die Stammbaumberechnung die größte Übereinstimmung der partiellen Sequenz mit Methanosarcina barkeriT DSM800 zeigte. In der paarweisen Alignierung (Tabelle 51) 4 ERGEBNISSE 196 wurde die partielle 16S rDNA-Sequenz des insgesamt 1254 bp langen Fragments aus der Reinkultur LFP3.1 geringfügig näher dem Typstamm Methanomethylovorans hollandicaT DSM15978 zugeordnet. Bei der auf einer multiplen Alignierung beruhenden Berechnung des Stammbaums zu Methanomethylovorans thermophilaT DSM17232 (Abbildung 77). 4.7 Substrate und Produkte anaerober Mikroorganismen aus NawaRo-Biogasanlagen Der Umsatz der organischen Säuren, Propionsäure (Propionat), Fumarsäure (Fumarat), Bernsteinsäure (Succinat) und Essigsäure (Acetat) der von Herrn Dr. Dröge (PFI) zur Verfügung gestellten propionsäureabbauenden Anreicherungskulturen (Tabelle 14) aus laufenden NawaRoBiogasanlagen (Tabelle 18) sowie Stämmen von der Deutschen Stammsammlung (DSMZ, Tabelle 17) wurden mit der high-performance liquid chromatography (HPLC, Kapitel 3.6.1) gemessen. Die Produktion von Methan durch eigenisolierte methanogene Archaea wurde gaschromatographisch (GC, Kapitel 3.6.2) detektiert. 4.7.1 Propionsäureoxidation anaerober Anreicherungskulturen Die Konzentrationen von Propionat und Acetat im zellfreien Kulturüberstand propionsäureabbauender Anreicherungskulturen Fp1, Gp1, Wp1, Wp2, Ap1 und Ap3 (Tabelle 14) wurden mit einem HPLC-System (Kapitel 2.1, Seite 70) mit einem UV-Vis-Detektor gemessen. Die Kulturen mit dem deutlichsten Abbau von Propionsäure sind in Abbildung 78 bis Abbildung 82 graphisch aufgeführt und erläutert. Die Rohdaten der graphisch gezeigten Messungen sind digital auf der Rohdaten CD ‚Dissertation Kerstin Seyfarth\Chemische Analyse\HPLC Messungen Propionsaeure\Propionsaeureabbauende Kulturen2\Fp1, …Gp1, …Ap1 und …Ap3‘ einsehbar. 4 ERGEBNISSE 197 Substratkonzentration [mmol L-1] 4.7.1.1 Propionsäureoxidation der anaeroben Anreicherungskultur Fp1 25,0 22,5 20,0 17,5 15,0 12,5 10,0 7,5 5,0 2,5 0,0 Acetat Propionat 0 1 2 3 4 5 Zeit [7d] 6 7 8 9 10 Abbildung 78: Propionsäure- (braun) und Acetatgehalt (orange) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus Anreicherungskultur Fp1 in PI-Medium über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen. Anreicherungskultur Fp1 (Abbildung 78) aus einem Fermenter der BGA Theo & Ingrid & Alexander Friedrich GbR (Tabelle 18) zeigte während den ersten sechs Inkubationswochen einen gleichmäßigen Abbau der dem Medium PI (Kapitel 2.6, Seite 83) zugesetzten Propionsäure (19,9 mmol L-1) auf 14,0 mmol L-1 in Woche 6, bei erwarteter Anreicherung (Kapitel 1.7.2) von Acetat von 4,4 mmol L-1 auf 10,8 mmol L-1. Zwischen Woche 7 und 8 stagnierte der Propionsäureabbau, wurde ab Woche 7 wieder aufgenommen (Endkonzentration Propionsäure 8,9 mmol L-1), wobei Acetat ab Woche 6 (10,8 mmol L-1) nicht im gleichen Maß akkumulierte sondern der Gehalt sich auf 9,6 mmol L-1 verringerte. Die Kultur Fp1 in PI-Medium ohne Reaktorfiltrat (Fp1P) zeigte keine Reduktion von Propionsäure im zellfreien Kulturüberstand. Die Messungen wurden daher vorzeitig abgebrochen (siehe Rohdaten CD \Chemische Analyse\HPLC Messungen Propionsaeure\Propionsaeureabbauende Kulturen2\Fp1P). 4 ERGEBNISSE 198 Substratkonzentration [mmol L-1] 4.7.1.2 Propionsäureoxidation der anaeroben Anreicherungskultur Gp1 25,0 22,5 20,0 17,5 15,0 12,5 10,0 7,5 5,0 2,5 0,0 Acetat Propionat 0 1 2 3 4 5 Zeit [7d] 6 7 8 9 10 Abbildung 79: Propionsäure- (braun) und Acetatgehalt (orange) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus Anreicherungskultur Gp1 in PI-Medium über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen. Die in Abbildung 79 dargestellten Konzentrationen in Abhängigkeit der Inkubationszeit von Propionat und Acetat der Kultur Gp1 aus der BGA BioEnergie Glahn (Tabelle 18) zeigen, dass die Erhöhung des Acetatgehalts mit Woche 4 einsetzte, obwohl seit der Beimpfung der Anreicherungskultur Gp1 in PI-Medium (Kapitel 2.6, Seite 83) die Propionatkonzentration von 20,5 mmol L-1 auf 17,8 mmol L-1 in Woche 4 gesunken war. Daher ergänzen sich die Graphen der beiden organischen Säuren nicht deckungsgleich. Obwohl Propionsäure weiterhin von Woche 8 (12,3 mmol L-1) bis zum Ende des Messzeitraums von der Kultur Gp1 auf 8,6 mmol L-1 abgebaut wurde, sank der Acetatgehalt von 12,3 mmol L-1 auf 9,9 mmol L-1. Kultur Gp1P zeigte ohne Reaktorfiltrat im Medium keine Aktivität beim Propionsäureabbau. Die Messreihe wurde daher vorzeitig beendet (siehe Rohdaten_CD\Chemische_Analyse \HPLC_Messungen_Propionsaeure\Propionsaeureabbauende_Kulturen2\Gp1P). 4 ERGEBNISSE 199 4.7.1.3 Syntrophe Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkultur Gp1 mit der Reinkultur TAF1 17,5 Propionsäure [mmol L-1] 15,0 12,5 10,0 7,5 Gp1 Gp1 + TAF1 Gp1 + TAF1 nach zwei Wochen TAF1 (Negativkontrolle) 5,0 2,5 0,0 0 1 2 3 4 5 Zeit [7d] Abbildung 80: Propionsäuregehalt [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus Anreicherungskultur Gp1 (grün), mit Methanobacterium formicicum TAF1 (pink), mit Zuimpfung von Methanobacterium formicicum TAF1 (orange) nach 2 Wochen Inkubation (Pfeil) und Methanobacterium formicicum TAF1 (schwarz) in PI-Medium über einen Messzeitraum von 5 Wochen [7d]. Zugabe des Eigenisolats Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 zur propionsäureabbauenden Mischkultur Gp1 erzielte eine Verstärkung des Abbaus der Propionsäure (Abbildung 80) im Vergleich zur Mischkultur ohne ein zusätzliches methanogene Archaeon. Eine Zuimpfung des hydrogenotroph Methan produzierenden Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 nach 2 Wochen bewirkte keinen bedeutenden Unterschied zur Beimpfung direkt zu Beginn der Inkubation der anaerob propionsäureabbauenden Mischkultur Gp1. Zur Kontrolle wurde Methanobacterium formicicum TAF1 einzeln in PI-Medium inkubiert, wobei ein stabiler Propionsäuregehalt ermittelt wurde (schwarze Linie in Abbildung 80). 4 ERGEBNISSE 200 Substratkonzentration [mmol L-1] 4.7.1.4 Propionsäureoxidation der anaeroben Anreicherungskultur Ap1 25,0 22,5 20,0 17,5 15,0 12,5 10,0 7,5 5,0 2,5 0,0 Acetat Propionat 0 1 2 3 4 5 Zeit [7d] 6 7 8 9 10 Abbildung 81: Propionsäure- (braun) und Acetatgehalt (orange) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus Anreicherungskultur Ap1 in PI-Medium über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen. Anreicherungskultur Ap1 aus der BGA Arenrath GmbH & Co KG baute relativ regelmäßig über den gesamten Messzeitraum Propionsäure von 19,1 mmol L-1 auf 5,6 mmol L-1 ab. Der Abbau von Propionsäure von Woche 8 bis zum Ende der Messungen bewirkte keinen äquivalenten Anstieg des Acetats im filtrierten Medium der Kultur. Der Acetatgehalt fiel zunächst in Woche 8 von dem Wert 16,4 mmol L-1 auf 13,7 mmol L-1 und stieg bis Woche 10 wieder auf den Gehalt von 15,5 mmol L-1. Kultur Ap1 baute das Acetat nicht konstant ab wie Kultur Gp1. Substratkonzentration [mmol L-1] 4.7.1.5 Propionsäureoxidation der anaeroben Anreicherungskultur Ap3 25,0 22,5 20,0 17,5 15,0 12,5 10,0 7,5 5,0 2,5 0,0 Acetat Propionat 0 1 2 3 4 5 Zeit [7d] 6 7 8 9 10 Abbildung 82: Propionsäure- (braun) und Acetatgehalt (orange) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus Anreicherungskultur Ap3 in PI-Medium über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen. Abbildung 82 stellt den Verlauf des Propionsäure- und Acetatgehalts des Kulturüberstandes der Kultur Ap3 dar. Der Acetatgehalt fiel in Woche 6 mit 21,0 mmol L-1 auf 19,0 mmol L-1 in Woche 7 und stagnierte um die 19 mmol L-1, sobald der Propionsäuregehalt in Woche 7 auf 2,5 mmol L-1 4 ERGEBNISSE 201 gesunken war. Die Messungen der Kultur Ap3 wurden in Woche 9 abgebrochen. Das Abbauverhalten der Anreicherungskultur Ap3 wies in den Grundzügen ein vergleichbares mit Anreicherungskultur Ap1 auf. Propionsäure wurde gleichmäßig abgebaut und der Acetatgehalt blieb nach dem Abbau einer bestimmten Menge Propionat auf einem Level. Der Unterschied zwischen den Kulturen Ap1 und Ap3 kam durch die höhere Aktivität der letztgenannten Kultur zustande. Die Kulturen Wp1, Wp1P und Wp2P aus der BGA Hubert Wagner und Sohn GbR zeigten keine Aktivität und sind daher nicht weiter erläutert (Rohdaten siehe unter RohdatenCD‚\Chemische Analyse\HPLC_Messungen_Propionsaeure\Propionsaeureabbauende_ Kulturen1\Wp1, ...\Wp2, ...\Wp1P und ...\Wp2P) 4.7.2 Propionsäureoxidation anaerober Mischkulturen mit Zugabe von Fumarsäure und Bromoethansulfonsäure Zur weiteren Prüfung des Substratverhaltens der propionsäureabbauenden Mischkulturen wurden etwa 10 Wochen alte Kulturen Fp1, Wp1, Wp2, Gp1 Ap1 und Ap3 in PI-Medium mit 40 mmol L-1 Fumarsäure (Kulturenbenennung = KulturnameF), sowie 40 mmol L-1 Fumarsäure und 5 mmol L-1 Bromoethansulfonsäure (BrES Kulturenbenennung = KulturnameBF) (Kapitel 3.3.1) mit jeweils 10facher Verdünnung angeimpft. Mit den Proben wurde verfahren wie bei den vorherigen Messungen. Gemessen wurden diese Proben mit dem gleichen HPLC-System (Kapitel 2.1, Seite 70) mit einem RI-Detektor (Einstellungen siehe Kapitel 3.6.1). Auf den folgenden Seiten sind die Konzentrationen [mmol L-1] während der 10wöchigen Messung der organischen Säuren Propionsäure (Propionat), Fumarsäure (Fumarat), Bernsteinsäure (Succinat) und Acetat graphisch dargestellt und erläutert (Rohdaten [g L-1] siehe Rohdaten CD\Chemische Analyse\HPLC Messungen Propionsaeure\ Propionsaeureabbauende Kulturen3\‘entsprechende Kultur‘). 4 ERGEBNISSE 202 4.7.2.1 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkultur Fp1 mit Zugabe von Fumarsäure und Bromoethansulfonsäure 25,00 22,50 20,00 17,50 15,00 12,50 10,00 7,50 5,00 2,50 0,00 Substratkonzentration [mmol L-1] Acetat Fumarat 0 2 Succinat Propionsäure 4 6 Zeit [7d] 8 10 Abbildung 83: Propionat (braun), Acetat (orange), Fumarat (hellblau) und Succinat (pink) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus Mischkultur Fp1 in PI-Medium mit Fumarsäure (Fp1F) über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen. In Kultur Fp1F nahm innerhalb der ersten Zwei Wochen des Messzeitraums der Gehalt des Fumarats um die Hälfte ab (Abbildung 83). Zu welchem Produkt Fumarat anaerob umgesetzt wurde, ließ sich mit diesen Messungen nicht verdeutlichen, da sich nicht wie erwartet (Kapitel 3.3.1) Succinat im Medium anreicherte. Der Propionsäuregehalt war in Woche 2 leicht angestiegen. Der Substratkonzentration [mmol L-1] Gehalt an Propionsäure verringerte sich ab Woche 5, wobei der Acetatgehalt invers stieg. 25,00 22,50 20,00 17,50 15,00 12,50 10,00 7,50 5,00 2,50 0,00 Acetat 0 2 Fumarat 4 6 Zeit [7d] Propionat 8 10 Abbildung 84: Propionat (braun), Acetat (orange) und Fumarat (hellblau) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus Mischkultur Fp1 in PI-Medium mit Fumarsäure und BrES (Fp1FB) über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen. Succinat wurde in Mischkultur Fp1FB nicht detektiert, da Bromoethansulfonsäure (BrES) zur gleichen Retentionszeit wie Succinat ein Signal im RI-Detektor erzeugte und somit das Signal des Succinats überlagerte. Aufgrund der Konzentrationen der organischen Säuren Propionat, Fumarat und Acetat in Abbildung 84 wies Kultur Fp1FB ein zur Kultur Fp1F (Abbildung 83) vergleichbares Substratverhalten auf. Innerhalb der ersten zwei Wochen nahm der Fumaratgehalt im filtrierten 4 ERGEBNISSE 203 Medium auf etwa den gleiche Gehalt (11,0 mmol L-1) wie in Kultur Fp1F (10,3 mmol L-1) ab. Auch hier war der Propionsäuregehalt in Woche 2 leicht gestiegen. In Woche 8 war der Fumaratgehalt auf 8,2 mmol L-1 gesunken als der Abbau von Propionsäure einsetzte. Entsprechend hatte der Fumaratgehalt der Kultur Fp1F einen Fumaratgehalt von 8,0 mmol L-1 als der Abbau von Propionsäure in Woche 5 einsetzte. 4.7.2.2 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkultur Wp1 mit Zugabe von Fumarsäure und Bromoethansulfonsäure Kultur Wp1F wies keinen Substratabbau auf. Die Kultur wurde daher nicht weiter berücksichtigt. In Tabelle 53 sind die errechneten Werte der Einfachmessung in mmol L-1 aufgeführt. Tabelle 53: Acetat, Succinat, Fumarat und Propionat [mmol L-1] (Mittelwerte) der Kultur Wp1F in PIMedium mit Fumarsäure als Zusatz während des Messzeitraums über 10 Wochen [7d] Woche Acetat [mmol L-1] Succinat [mmol L-1] Fumarat [mmol L-1] Propionat [mmol L-1] 0 1,05 0,00 13,27 18,14 2 n. d. 0,00 12,11 20,14 4 1,19 0,00 12,81 19,42 5 0,00 0,00 11,50 19,31 6 0,87 0,00 11,14 18,57 7 1,17 0,00 10,45 18,03 8 1,11 0,00 11,85 19,20 9 1,15 0,00 12,00 18,73 10 0,60 0,00 11,33 18,70 n. d. = nicht detektierbar Der Gehalt der Propionsäure in Kultur Wp1F schwankte in Woche 2 gering nach oben, um in Woche 4 in Etwa wieder auf die Ausgangskonzentration zu sinken. Diese Schwankungen wurden im Rahmen dieser Arbeit oft während Lag-Phasen Propionsäure abbauender Kulturen beobachtet. 204 Substratkonzentration [mmol L-1] 4 ERGEBNISSE 25,00 22,50 20,00 17,50 15,00 12,50 10,00 7,50 5,00 2,50 0,00 Acetat 0 2 Fumarat 4 6 Zeit [7d] Propionat 8 10 Abbildung 85: Propionat (braun), Acetat (orange) und Fumarat (hellblau) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus Mischkultur Wp1 in PI-Medium mit Fumarsäure und BrES (Wp1FB) über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen. Auch in Mischkultur Wp1FB wurde kein Succinat detektiert, da die Bromoethansulfonsäure (BrES) zur gleichen Retentionszeit wie Succinat ein Signal im RI-Detektor erzeugte und das Signal des Succinats überlagerte. Während des 10-wöchigen Messzeitraums wurde von Kultur Wp1FB keine Propionsäure Abgebaut (Abbildung 85). Genauso erfuhr der Gehalt des Acetats keine signifikanten Änderungen. Ab Woche 5 setzte der Fumaratabbau ein. Es zeigte sich in Kultur Wp1FB wieder ein leichter Anstieg des Propionsäuregehalts von der Beimpfung des Mediums bis zur zweiten Woche. 4.7.2.3 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkultur Wp2 mit Zugabe von Substratkonzentration [mmol L-1] Fumarsäure und Bromoethansulfonsäure 25,00 22,50 20,00 17,50 15,00 12,50 10,00 7,50 5,00 2,50 0,00 Acetat Fumarat 0 2 4 6 Zeit [7d] Succinat Propionat 8 10 Abbildung 86: Propionat (braun), Acetat (orange), Fumarat (hellblau) und Succinat (pink) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus Mischkultur Wp2 in PI-Medium mit Fumarsäure (Wp2F) über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen. Wie bei Kultur Wp1FB (Abbildung 85) wurde in Kultur Wp2F keine Propionsäure abgebaut, was in Abbildung 86 dargestellt ist. Zwischen Woche 2 und 4 wurde Fumarat bis zu einem Minimum abgebaut, was keine Auswirkungen auf den Succinatgehalt hatte. Der Acetatgehalt (orange) schwankte während der Inkubationszeit ohne Tendenz zwischen Abbau und Akkumulation. 205 Substratkonzentration [mmol L-1] 4 ERGEBNISSE 25,00 22,50 20,00 17,50 15,00 12,50 10,00 7,50 5,00 2,50 0,00 Acetat Fumarat 0 2 4 6 Zeit [7d] Succinat Propionat 8 10 Abbildung 87: Propionat (braun), Acetat (orange), Fumarat (hellblau) und Succinat (pink) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus Mischkultur Wp2 in PI-Medium mit Fumarsäure und BrES (Wp2FB) über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen. Der zellfreie Kulturüberstand der Mischkultur Wp2FB zeigte ab Woche 4 den in Kapitel 3.3.1 beschriebenen Propionsäureabbau mit Succinatbildung, nachdem Fumarat bis Woche 4 zu einem Minimum abgebaut worden war (Abbildung 87). Acetat akkumuliert in geringem Maß im Medium PI mit Fumarsäure und Bromoethansulfonsäure. Auch in Kultur Wp2FB stieg der Propionsäuregehalt bis Woche 2 geringfügig an. 4.7.2.4 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkultur Gp1 mit Zugabe von Substratkonzentration [mmol L-1] Fumarsäure und Bromoethansulfonsäure Acetat Fumarat 24,5 22,0 19,5 17,0 14,5 12,0 9,5 7,0 4,5 2,0 -0,5 0 2 4 6 Zeit [7d] Succinat Propionat 8 10 Abbildung 88: Propionat (braun), Acetat (orange), Fumarat (hellblau) und Succinat (pink) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus Mischkultur Gp1 in PI-Medium mit Fumarsäure (Gp1F) über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen. Der Wert des Propionsäuregehalts (Abbildung 88) stieg auch in Kultur Gp1F bis Woche 2 leicht und sank bis Woche 4 wieder auf den Ausganswert. Die Zugabe von Fumarat bewirkte bei Kultur Gp1F, dass keine Propionsäure abgebaut, sondern Fumarat bis Woche 4 vollständig abgebaut wurde. Dabei akkumulierten in den ersten zwei Wochen Succinat und Acetat im PI-Medium. Der Acetatgehalt blieb ab Woche 2 stabil. Zwischen Woche 2 und 4 stieg der Succinatgehalt so lange, 4 ERGEBNISSE 206 bis Fumarat vollständig abgebaut worden war und reicherte sich bis zum Ende der Messungen nicht Substratkonzentration [mmol L-1] weiter deutlich an. 25,0 22,5 20,0 17,5 15,0 12,5 10,0 7,5 5,0 2,5 0,0 Acetat Fumarat 0 2 4 6 Zeit [7d] Succinat Propionat 8 10 Abbildung 89: Propionat (braun), Acetat (orange), Fumarat (hellblau) und Succinat (pink) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus Mischkultur Gp1 in PI-Medium mit Fumarsäure und BrES (Gp1FB) über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen. Kultur Gp1FB baute bis Woche 2 Fumarat auf ein Minimum ab, wobei im Gegensatz zu Kultur Gp1F die Succinatkonzentration im Medium PI, jedoch nicht der Gehalt von Acetat stieg (Abbildung 89). Es wurde über den gesamten Zeitraum keine deutliche Veränderung der Propionsäurekonzentration gemessen. 4.7.2.5 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkultur Ap1 mit Zugabe von Substratkonzentration [mmol L-1] Fumarsäure und Bromoethansulfonsäure Acetat Fumarat 25,00 22,50 20,00 17,50 15,00 12,50 10,00 7,50 5,00 2,50 0,00 0 2 4 6 Zeit [7d] Succinat Propionat 8 10 Abbildung 90: Propionat (braun), Acetat (orange), Fumarat (hellblau) und Succinat (pink) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus Mischkultur Ap1 in PI-Medium mit Fumarsäure (Ap1F) über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen. In Abbildung 90 ist das Substratverhalten von Kultur Ap1F graphisch dargestellt. Während des gesamten Messzeitraums wurde Fumarat stetig abgebaut. Dabei reicherte sich bis Woche vier Acetat im Medium PI an, welches nach einer weiteren Woche wieder abgebaut wurde und bis zur 4 ERGEBNISSE 207 letzten Messung der Woche 10 auf dem Niveau verblieb. Sobald Acetat in Woche 5 abgebaut war, setzte ein geringer Anstieg Succinatakkumulation ein. Nach einer Anreicherung von Propionsäure bis Woche 2 wurde Propionsäure parallel zum einsetzenden Acetatabbau ab Woche 4 von Kultur Substratkonzentration [mmol L-1] Ap1F innerhalb fünf Wochen (bis Woche 7) vollständig abgebaut. Acetat Fumarat 25,00 22,50 20,00 17,50 15,00 12,50 10,00 7,50 5,00 2,50 0,00 0 2 4 6 Zeit [7d] Succinat Propionat 8 10 Abbildung 91: Propionat (braun), Acetat (orange), Fumarat (hellblau) und Succinat (pink) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus Mischkultur Ap1 in PI-Medium mit Fumarsäure und BrES (Ap1FB) über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen. Propionsäure wurde parallel zu Fumarat durch Kultur Ap1FB abgebaut (Abbildung 91), wobei die Aktivität geringer ausfiel als die von Kultur Ap1F. Gleichzeitgig akkumulierte Acetat bis Woche 8 und der Gehalt stagnierte bis zum Ende des Messzeitraums. Der Gehalt von Succinat konnte ab der zweiten Woche nicht mehr detektiert werden, da das Signal der Bromoethansulfonsäure das Signal des Succinats überlagerte. 4.7.2.6 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkultur Ap3 mit Zugabe von Substratkonzentration [mmol L-1] Fumarsäure und Bromoethansulfonsäure 25,00 22,50 20,00 17,50 15,00 12,50 10,00 7,50 5,00 2,50 0,00 Acetat Fumarat 0 2 4 6 Zeit [7d] Succinat Propionat 8 10 Abbildung 92: Propionat (braun), Acetat (orange), Fumarat (hellblau) und Succinat (pink) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus Mischkultur Ap3 in PI-Medium mit Fumarsäure (Ap3F) über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen. 4 ERGEBNISSE 208 Kultur Ap3F baute innerhalb der ersten fünf Wochen Fumarat ab (Abbildung 92). Der Fumaratabbau stagnierte ab Woche 5 bis Woche 10. Zu keiner Zeit wurde Propionsäure abgebaut Substratkonzentration [mmol L-1] und keine deutliche Anreicherung von Acetat sowie Succinat wurde im Medium detektiert. 25,00 22,50 20,00 17,50 15,00 12,50 10,00 7,50 5,00 2,50 0,00 Acetat Fumarat 0 2 4 6 Zeit [7d] Succinat Propionat 8 10 Abbildung 93: Propionat (braun), Acetat (orange), Fumarat (hellblau) und Succinat (pink) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus Mischkultur Ap3 in PI-Medium mit Fumarsäure und BrES (Ap3FB) über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen. Kultur Ap3FB zeigte ein vergleichbares Substratverhalten wie Ap3F. Keine Änderungen des Gehalts von Propionsäure durch Kultur Ap3FB wurden detektiert. Der Fumaratgehalt sank über die gesamte Messdauer. Acetat erfuhr wie Propionat keine Konzentrationsänderungen während der 10wöchigen Inkubation der Kultur Ap3FB. Succinat wurde nur in Woche 2 gemessen, da das Signal der übrigen Messpunkte von Bromoethansulfonsäure überlagert wurde. Um die effektivsten Kulturen auszuwählen, wurden die oben erläuterten Mischkulturen mit Fumarat beziehungsweise Fumarat und Bromoethansulfonsäure nach den HPLC Messungen in 9 mL frisches PI-Medium (Kapitel 2.6, Seite 83) 1:10 überimpft und das Substratverhalten wie zuvor beschrieben erneut über 10 Wochen ermittelt. 4.7.3 Propionsäureoxidation anaerober Mischkulturen nach Zugabe von Fumarsäure und Bromoethansulfonsäure Die Kulturen wurden zum besseren Verständnis von ‚Kultur‘F und ‚Kultur‘FB in ‚Kultur‘a und ‚Kultur‘b umbenannt (Tabelle 14). Es folgen die Graphen der Substratkonzentrationen der Nachfolgerkulturen in PI-Medium mit Propionsäure als einzige C-Quelle (Abbildung 94 bis Abbildung 99) nach Inkubation mit Fumarat beziehungsweise Fumarat und Bromoethansulfonsäure (Rohdaten [g L-1] siehe Rohdaten CD Dissertation Kerstin Seyfarth\Chemische Analyse\HPLC Messungen Propionsaeure\Propionsaeureabbauende Kulturen4\‘entsprechende Kultur‘). 4 ERGEBNISSE 209 Acetat Fumarat 25,0 22,5 20,0 17,5 15,0 12,5 10,0 7,5 5,0 2,5 0,0 0 A 2 4 6 Zeit [7d] Substratkonzentration [mmol L-1] Substratkonzentration [mmol L-1] 4.7.3.1 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkulturen Fp1a und Fp1b Succinat Propionat 8 10 Acetat Fumarat 25,0 22,5 20,0 17,5 15,0 12,5 10,0 7,5 5,0 2,5 0,0 0 2 B 4 6 Zeit [7d] Succinat Propionat 8 10 Abbildung 94: Propionat (braun), Acetat (orange), Fumarat (hellblau) und Succinat (pink) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus den Mischkulturen A Fp1a und B Fp1b in PI-Medium über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen. Im filtrierten Medium der Kultur Fp1a (Abbildung 94 A) wurde Propionsäure von Woche 4 (20,1 mmol L-1) bis Woche 8 (12,5 mmol L-1) umgesetzt. Der Propionsäuregehalt stabilisierte sich bis Woche 10 bei 12,8 mmol L-1. Keine des Propionatabbaus gleichförmige Akkumulation von Acetat wurde festgestellt. Der Acetatgehalt stieg von 2,8 mmol L-1 auf 5 mmol L-1 über den Messzeitraum von 10 Wochen. Abbildung 94 B zeigt die im Vergleich zu Fp1a (Abbildung 94 A) weniger aktive Kultur Fp1b. Diese Kultur baute Propionat von Woche 2 bis Woche 8 von 18,5 mmol L-1 auf durchschnittlich 16,4 mmol L-1 ab. Der Propionsäuregehalt stieg von Woche 8 zu Woche 10 auf 16,5 mmol L-1. Die Acetatkonzentration erhöhte sich ab der Beimpfung bis Woche 4 von 2,4 mmol L-1 auf 6,8 mmol L-1, was sich nicht mit dem zeitlichen Ablauf des Propionsäureabbaus deckte. Im weiteren Verlauf pendelte sich der Acetatgehalt auf 7,1 mmol L-1 in Woche 10 ein. In beiden Kulturen (Abbildung 94 A und B) wurden keine Veränderungen in den Konzentrationen von Fumarat und Succinat detektiert. 4 ERGEBNISSE 210 A 25,0 22,5 20,0 17,5 15,0 12,5 10,0 7,5 5,0 2,5 0,0 Acetat Fumarat 0 2 4 6 Zeit [7d] Substratkonzentration [mmol L-1] Substratkonzentration [mmol L-1] 4.7.3.2 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkulturen Wp1a und Wp1b Succinat Propionat 8 10 25,0 22,5 20,0 17,5 15,0 12,5 10,0 7,5 5,0 2,5 0,0 Acetat Fumarat 0 B 2 4 6 Zeit [7d] Succinat Propionat 8 10 Abbildung 95: Propionat (braun), Acetat (orange), Fumarat (hellblau) und Succinat (pink) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus den Mischkulturen A Wp1a und B Wp1b in PI-Medium über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen. Der Propionsäuregehalt der Mischkultur Wp1a (Abbildung 95 A) steigerte sich bis Woche 4 von anfänglich 17,5 mmol L-1 auf 20,9 mmol L-1und verringerte sich bis Woche 8 auf 16,9 mmol L-1. Mit dem Ende der Messperiode hatte das filtrierte Medium der Mischkultur Wp1a einen Propionsäuregehalt von 16,6 mmol L-1, der unwesentlich niedriger lag als der Ausganswert. Acetat stieg nur geringfügig von 1,9 mmol L-1 auf 3,3 mmol L-1 in Woche 4 und verringerte sich wieder auf 1,9 mmol L-1. Der Propionsäuregehalt im Medium der Kultur Wp1b (Abbildung 95 B) senkte sich von Woche 4 auf Woche 6 von 20,8 mmol L-1 auf 17,4 mmol L-1 und stieg bis Woche 8 auf 19,5 mmol L-1. Der Gehalt von Acetat veränderte sich nicht wesentlich im Vergleich zur Ausgangskonzentration von 2,3 mmol L-1. Am Ende der Messungen betrug die Konzentration 2,6 mmol L-1. Die Fumarat- und Succinatwerte erfuhren in beiden Kulturen keine Veränderungen während der 10-wöchigen Inkubation. 4 ERGEBNISSE 211 25,0 22,5 20,0 17,5 15,0 12,5 10,0 7,5 5,0 2,5 0,0 A Acetat Fumarat 0 2 4 6 Zeit [7d] Substratkonzentration [mmol L-1] Substratkonzentration [mmol L-1] 4.7.3.3 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkulturen Wp2a und Wp2b Succinat Propionat 8 10 25,0 22,5 20,0 17,5 15,0 12,5 10,0 7,5 5,0 2,5 0,0 Acetat Fumarat 0 B 2 4 6 Zeit [7d] Succinat Propionat 8 10 Abbildung 96: Propionat (braun), Acetat (orange), Fumarat (hellblau) und Succinat (pink) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus den Mischkulturen A Wp2a und B Wp2b in PI-Medium über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen. Mischkulturen Wp2a (Abbildung 96 A) und Wp2b (Abbildung 96 B) verhielten sich mit einem Ähnlichen Muster bei der Umsetzung der kurzkettigen organischen Säure Propionat, wobei Kultur Wp2a aktiver war als Wp2b. Kultur Wp2a baute das meiste Propionat von Woche 4 auf Woche 6 ab (von 20,4 mmol L-1 auf 16,5 mmol L-1). Bis zum Schluss verringerte sich der Propionsäuregehalt auf 15,7 mmol L-1. Bei Betrachtung der Acetatkurve, fällt auf, dass die Acetatkonzentration nicht äquivalent zum Propionsäureabbau stieg. Der Acetatgehalt schwankte ab der Beimpfung bis Woche 4 von 2,8 mmol L-1 auf 4,1 mmol L-1 und von Woche 4 bis zur letzten Messung in Woche 10 auf 2,1 mmol L-1. Kultur Wp2b (Abbildung 96 B) verringerte in den Wochen 6 bis 8 20,8 mmol L-1 auf 16,5 mmol L-1, zwei Wochen später als Kultur Wp2a (Abbildung 96 A). Der Acetatgehalt wuchs unabhängig vom Propionsäureabbau wie im filtrierten Medium der Kultur Wp2a bis Woche 4 von 3,1 mmol L-1 auf 4,8 mmol L-1 und verkleinerte sich bis Woche 10 auf 3,6 mmol L-1. Bei beiden Kulturen wurden keine signifikanten Veränderungen im Succinatgehalt und zu keiner Zeit Fumarat detektiert. 4 ERGEBNISSE 212 25,0 22,5 20,0 17,5 15,0 12,5 10,0 7,5 5,0 2,5 0,0 Acetat Fumarat 0 2 A 4 6 Zeit [7d] Substratkonzentration [mmol L-1] Substratkonzentration [mmol L-1] 4.7.3.4 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkulturen Gp1a und Gp1b Succinat Propionat 8 10 25,0 22,5 20,0 17,5 15,0 12,5 10,0 7,5 5,0 2,5 0,0 Acetat Fumarat 0 2 B Succinat Propionat 4 6 Zeit [7d] 8 10 Abbildung 97: Propionat (braun), Acetat (orange), Fumarat (hellblau) und Succinat (pink) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus den Mischkulturen A Gp1a und B Gp1b in PI-Medium über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen. Durch die HPLC-Messungen des filtrierten Mediums von Mischkultur Gp1a (Abbildung 97 A) wurde gezeigt, dass Propionsäure nach einer kurzzeitigen Anreicherung von 17,2 mmol L-1 zu Beginn auf 20,7 mmol L-1 in Woche 2 zwischen den Wochen 4 bis 8 von 20,5 mmol L-1 auf 15,9 mmol L-1 dezimiert wurde. Acetat akkumulierte dabei nicht. Mischkultur Gp1b (Abbildung 97 B) baute Propionsäure von Woche 2 bis Woche 8 von 20,0 mmol L-1 auf 14,1 mmol L-1 unter Anreicherung von Acetat im PI-Medium (Kapitel 2.6, Seite 83) von 3,7 mmol L-1 auf 8,3 mmol L-1 ab. Der Succinatgehalt änderte sich über den Messzeitraum in beiden Kulturen nicht deutlich. Fumarat wurde auch hier in beiden Kulturen bei keiner Messung detektiert. A 25,0 22,5 20,0 17,5 15,0 12,5 10,0 7,5 5,0 2,5 0,0 Acetat Fumarat 0 2 4 6 Zeit [7d] Substratkonzentration [mmol L-1] Substratkonzentration [mmol L-1] 4.7.3.5 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkulturen Ap1a und Ap1b Succinat Propionat 8 10 25,0 22,5 20,0 17,5 15,0 12,5 10,0 7,5 5,0 2,5 0,0 Acetat Fumarat 0 B 2 4 6 Zeit [7d] Succinat Propionat 8 10 Abbildung 98: Propionat (braun), Acetat (orange), Fumarat (hellblau) und Succinat (pink) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus den Mischkulturen A Ap1a und B Ap1b in PI-Medium über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen. Ein gleichmäßiger Propionsäureabbau durch Mischkultur Ap1a wird in Abbildung 98 A dargestellt. Von Woche 2 bis Woche 10 verringerte sich der Propionsäuregehalt von 19,1 mmol L-1 auf 8,1 mmol L-1. Eine Anreicherung von Acetat wurde nicht gemessen. Stattdessen reduzierte sich der 4 ERGEBNISSE 213 Gehalt von Acetat von anfänglich 1,8 mmol L-1 über 2,7 mmol L-1 in Woche 2 auf null bis Woche 4. Im filtrierten Medium der Mischkultur Ap1b (Abbildung -1 98 B) verkleinerte sich der -1 Propionsäuregehalt von Woche 2 18,8 mmol L auf 15,6 mmol L in Woche 6. Die Konzentration von Acetat wurde bis Woche 4 von 2,5 mmol L-1 zu Beginn auf 7,8 mmol L-1L erhöht. Ab Woche 6 fiel der Acetatgehalt auf 4,3 mmol L-1 in Woche 10, wobei der Propionsäuregehalt stabil auf der Konzentration von Woche 6 blieb. Succinat, sowie Fumarat verweilten auf ihren Anfangswerten während der 10-wöchigen Inkubation. 25,0 22,5 20,0 17,5 15,0 12,5 10,0 7,5 5,0 2,5 0,0 Acetat Fumarat 0 A 2 4 6 Zeit [7d] Substratkonzentration [mmol L-1] Substratkonzentration [mmol L-1] 4.7.3.6 Propionsäureoxidation der anaeroben Mischkulturen Ap3a und Ap3b Succinat Propionat 8 10 25,0 22,5 20,0 17,5 15,0 12,5 10,0 7,5 5,0 2,5 0,0 Acetat Fumarat 0 B 2 4 6 Zeit [7d] Succinat Propionat 8 10 Abbildung 99: Propionat (braun), Acetat (orange), Fumarat (hellblau) und Succinat (pink) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus den Mischkulturen A Ap3a und B Ap3b in PI-Medium über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen. Der Propionsäuregehalt verringerte sich im filtrierten Medium der Mischkultur Ap3a (Abbildung 99 A) am Stärksten zwischen Woche 6 und Woche 8 von 19,0 mmol L-1 auf 14,1 mmol L-1. Bis Woche 10 sank die Konzentration von Propionsäure gering bis auf 13,8 mmol L-1. Der Acetatgehalt stieg ohne deutlichen Propionsäureabbau ab der Beimpfung (Messpunkt 0) bis Woche 4 von 2,1 mmol L1 auf 5,7 mmol L-1 und erreichte sein Maximum in Woche 6 mit 6,4 mmol L-1. In Woche 10 sank der Acetatgehalt auf einen Wert von 5,6 mmol L-1. Mischkultur Ap3b (Abbildung 99 B) wies eine schwächere Aktivität beim Propionsäureabbau auf als Kultur Ap1a. Propionsäure wurde ab Woche 6 von 20,7 mmol L-1 auf 16,9 mmol L-1 (Messpunkt Woche 10) abgebaut. Der Acetatgehalt stieg im Vergleich zur Kultur Ap3a (Abbildung 99 A) geringer von anfänglich 2,5 mmol L-1 auf 3,8 mmol L-1 in Woche 4 und verringerte sich ab Woche 8 bis zum letzten Messpunkt vom Maximalwert 4,0 mmol L1 zu 3,5 mmol L-1. Die effektivsten propionsäureabbauenden Mischkulturen Fp1a und Wp2a wurden in PI-Medium (Kapitel 2.6, Seite 83) in bis zu 200 mL Medium und Gp1b und Ap1a bis zu 500 mL Medium kultiviert. Die anderen Mischkulturen wurden verworfen. 4 ERGEBNISSE 214 Aufgrund der molekularbiologischen Analysen der propionsäureabbauenden Kulturen (Kapitel 4.5.1) wurden Stämme von der Deutschen Stammsammlung (DSMZ, Braunschweig) bestellt, die in den propionsäureabbauenden Mischkulturen häufig identifiziert worden waren. 4.7.4 Substrate und Produkte definierter Mischkulturen anaerober Mikroorganismen und methanogener Archaea Bei den von der DSMZ erstandenen Mikroorganismen handelte es sich um Clostridium sartargoformeT DSM1292, welcher in Unterkulturen von Ap1a in DSMZ-Medium 1264 (Tabelle 44) molekularbiologisch identifiziert und in Medium 520 eigenisoliert (Tabelle 46) worden war, Wolinella succinogenesT DSM1740, der sowohl in Kultur Wp1 (Tabelle 38) als auch Wp2a (Tabelle 39) in DSMZ-Medium 1264 identifiziert worden war, Aminobacterium colombienseT DSM12261 der in den Unterkulturen, Fp1a (Tabelle 34), Wp2a (Tabelle 39) und Gp1b (Tabelle 43) in DSMZ-Medium 1264 molekularbiologisch nachgewiesen worden war und der in Unterkultur Gp1b1264 identifizierte und in Kultur Fp1a63-L angereicherte Geovibrio thiophilusT DSM11263 (Tabelle 42 und Kapitel 4.5.2.1). Jeweils 9 mL PI-Medium (Kapitel 2.6, Seite 83) wurde mit in der stationären Phase befindlichen Kulturen von Clostridium sartargoformeT DSM1292, T beziehungsweise Aminobacterium colombiense Wolinella succinogenesT DSM1740 DSM12261 5-fach 1:10 beimpft, um das Substratverhalten mit Propionsäure als einzige Kohlenstoff-Quelle zu erforschen. Bei jeweils einer der Einzel-Beimpfungen wurde die Gasphase wöchentlich während der Versuchslaufzeit mit einer Begasungsanlage (Dräger) mit 0,5 bar Überdruck N2 ausgetauscht, bei der zweiten EinzelBeimpfung nicht. Den weiteren Beimpfungen wurden jeweils einer der beiden Eigenisolate Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 und Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 beziehungsweise Geovibrio thiophilusT DSM11263 (nicht gezeigt) ebenfalls aus der stationären Phase 1:10 zugeimpft, um den Wasserstoffpartialdruck in den Kulturen gering zu halten. Um die Wasserstoff verwertenden Mikroorganismen zu unterstützen, wurden die Gasphasen der CoKulturen mit frischem N2 (0,5 bar Überdruck) gespült. Als Negativkontrollen wurden 2-fach Geovibrio thiophilusT DSM11263, sowie die Eigenisolate Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 und Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 je 10-1 verdünnt in PI-Medium geimpft. Dabei wurden die Gasphasen über den Negativ-Kulturen der zweiten Beimpfung ebenfalls wöchentlich ausgetauscht. Die Probenvorbereitungen für die HPLC-Messungen der organischen Säuren Acetat, Fumarat, Succinat und Propionat wurden durchgeführt wie in Kapitel 3.6.1 beschrieben. Es wurde das gleiche HPLC-System (Kapitel 2.1, Seite 70) verwendet, wie bei den vorherigen Messungen. Die Gemessenen Werte wurden wie oben mit einem Tabellenbearbeitungsprogram (Excel, Microsoft) von g L-1 in mmol L-1 umgerechnet und graphisch visualisiert. Es folgen die graphischen Darstellungen der Ergebnisse der HPLC-Messungen der bakteriellen Typstämme und deren CoKulturen sowie der Negativkontrollen mit Erläuterungen (Rohdaten in g L-1 siehe Rohdaten CD 4 ERGEBNISSE 215 Dissertation Kerstin Seyfarth\Chemische Analyse\HPLC Messungen Propionsaeure\Typstaemme in PI-Medium\‘entsprechende Kultur‘). 4.7.4.1 Substrate und Produkte definierter Mischkulturen mit A Acetat Fumarat 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 0 2 4 6 Zeit [7d] Substratkonzentration [mmol L-1] Substratkonzentration [mmol L-1] Clostridium sartargoformeT DSM1292 Succinat Propionat 8 10 B Acetat Fumarat 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 0 2 4 6 Zeit [7d] Succinat Propionat 8 10 Abbildung 100: Propionat (braun), Acetat (orange), Fumarat (hellblau) und Succinat (pink) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus der Kultur Clostridium sartargoformeT DSM1292 in PI-Medium über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen; A Gasphase nicht ausgetauscht, B Gasphase ausgetauscht. Die Konzentrationen der organischen Säuren Fumarat, Succinat und Propionat schwankten in der Kultur Clostridium sartargoformeT DSM1292 ohne Gasphasenaustausch während der gesamten Messzeit um ihre Ausgangswerte (Abbildung 100 A). In Abbildung 100 B wird eine leichte Steigerung des Acetatgehalts in Woche 6 von 5,7 mmol L-1 auf 7,9 mmol L-1 gezeigt, der bis Woche 10 stagnierte. Der Gehalt von Propionsäure stieg von 16,9 mmol L-1 in Woche 6 bis 17,9 mmol L-1 in Woche 8 leicht und sank bis Woche 10 auf 16,7 mmol L-1. 4 ERGEBNISSE 216 Die Co-Kultur Clostridium sartargoformeT DSM1292 mit Geovibrio thiophilusT DSM11263 zeigte 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 Acetat Fumarat 0 2 A 4 6 Zeit [7d] Substratkonzentration [mmol L-1] Substratkonzentration [mmol L-1] keinen Umsatz der organischen Säuren und ist daher nicht gezeigt. Succinat Propionat 8 10 B Acetat Fumarat 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 0 2 4 6 Zeit [7d] Succinat Propionat 8 10 Abbildung 101: Propionat (braun), Acetat (orange), Fumarat (hellblau) und Succinat (pink) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus der Co-Kultur Clostridium sartargoformeT DSM1292 in PI-Medium über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen; A mit Eigenisolat Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1, B mit Eigenisolat Methanobacterium formicicum Stamm TAF1. Die Co-Kultivierung von Clostridium sartargoformeT DSM1292 mit Eigenisolat Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1, sowie mit Eigenisolat Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 bewirkte eine Anreicherung von Acetat von 10,5 mmol L-1 und 6,7 mmol L-1 in Medium PI (Abbildung 101 A, B) auf Maximalwerte von 30,6 mmol L-1 und 28,1 mmol L-1. Die Konzentrationen von Propionat, Fumarat und Succinat änderten sich in Co-Kultur Clostridium sartargoformeT DSM1292 mit Eigenisolat Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 (Abbildung 101 A) nicht. In Co-Kultur Clostridium sartargoformeT DSM1292 mit Eigenisolat Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 wurden Fumarat, wie auch Succinat bis Woche 2 des Messzeitraums von (Abbildung 101 B) vollständig abgebaut. 4 ERGEBNISSE 217 4.7.4.2 Substrate und Produkte definierter Mischkulturen mit A 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 Acetat Fumarat 0 2 4 6 Zeit [7d] Substratkonzentration [mmol L-1] Substratkonzentration [mmol L-1] Wolinella succinogenesT DSM1740 Succinat Propionat 8 10 Acetat Fumarat 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 B 0 2 Succinat Propionat 4 6 Zeit [7d] 8 10 Abbildung 102: Propionat (braun), Acetat (orange), Fumarat (hellblau) und Succinat (pink) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus der Kultur Wolinella succinogenesT DSM1740 in PIMedium über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen; A Gasphase nicht ausgetauscht, B Gasphase ausgetauscht. Die Konzentrationen von Acetat, Fumarat und Succinat veränderten sich, sowohl in Kultur Wolinella succinogenesT DSM1740 ohne Gasaustausch (Abbildung 102 A) als auch in Kultur Wolinella succinogenesT DSM1740 mit Gasaustausch (Abbildung 102 B) über den gesamten Messzeitraum nicht. Propionat wurde in beiden Kulturen nicht abgebaut. In Kultur Wolinella succinogenesT DSM1740 ohne Gasaustausch erhöhte sich der Propionsäuregehalt leicht zwischen Woche 6 und 8 und sank bis Woche 10 wieder auf die Ausgangskonzentration. Keine Abbildung der Co-Kultur Wolinella succinogenesT DSM1740 mit Geovibrio thiophilusT DSM11263 wird gezeigt, da kein Substratumsatz anhand der vier Säuren detektiert wurde. 218 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 Acetat Fumarat 0 A 2 4 6 Zeit [7d] Substratkonzentration [mmol L-1] Substratkonzentration [mmol L-1] 4 ERGEBNISSE Succinat Propionat 8 10 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 Acetat Fumarat 0 2 Succinat Propionat 4 6 Zeit [7d] B 8 10 Abbildung 103: Propionat (braun), Acetat (orange), Fumarat (hellblau) und Succinat (pink) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus der Co-Kultur Wolinella succinogenesT in PIMedium über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen; A mit Eigenisolat Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1, B mit Eigenisolat Methanobacterium formicicum Stamm TAF1. Propionsäure, Fumarat und Succinat wurden weder in der in Abbildung 103 A gezeigten Co-Kultur Wolinella succinogenesT DSM1740 mit Eigenisolat Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 noch in der in Abbildung 103 B gezeigten Kultur Wolinella succinogenesT DSM1740 mit Eigenisolat Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 umgesetzt. Die Graphen der organischen Säuren verlaufen wie die in Abbildung 102 A und B dargestellten Graphen der Kultur Wolinella succinogenesT DSM1740 mit Gasaustausch. In der Co-Kultur Wolinella succinogenesT DSM1740 mit dem Eigenisolat Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 stieg der Acetatgehalt von 2,3 mmol L-1 bis Woche 4 auf 5,9 mmol L-1 leicht an, akkumulierte bis Woche 8 auf 25,2 mmol L-1 im Medium PI und stagnierte bis Woche 10 (durchschnittlich 24,0 mmol L-1) in etwa der Konzentration von Woche 8. Bei Co-Kultur Wolinella succinogenesT DSM1740 mit dem Eigenisolat Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 verlief der Acetatgehalt wie in Kultur Wolinella succinogenesT DSM1740 mit Gasaustausch (Abbildung -1 Ausgangskonzentration des Acetats von 5,8 mmol L . 102 B) bei einer höheren 4 ERGEBNISSE 219 4.7.4.3 Substrate und Produkte definierter Mischkulturen mit 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 Acetat Fumarat 0 2 A Succinat Propionat 4 6 Zeit [7d] 8 Substratkonzentration [mmol L-1] Substratkonzentration [mmol L-1] Aminobacterium colombienseT DSM12261 10 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 0 2 B Acetat Fumarat Succinat Propionat 4 6 Zeit [7d] 8 10 Abbildung 104: Propionat (braun), Acetat (orange), Fumarat (hellblau) und Succinat (pink) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus der Kultur Aminobacterium colombienseT DSM12261 in PI-Medium über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen; A Gasphase nicht ausgetauscht, B Gasphase ausgetauscht. Die Kulturen Aminobacterium colombienseT DSM12261 mit und ohne Gasaustausch setzten kein Propionat (durchschnittliche Ausgangskonzentrationen 17,3 mmol L-1), Fumarat und Succinat um (Abbildung 104 A und B). Acetat (1,2 mmol L-1 und 1,4 mmol L-1 Ausgangskonzentrationen) reicherte sich bis Woche 6 leicht an auf 6,4 mmol L-1 und 5,2 mmol L-1 und nahm bis Woche 10 wieder ab auf 3,6 mmol L-1 und 3,3 mmol L-1. Die Co-Kultur Aminobacterium colombienseT DSM12261 mit Geovibrio thiophilusT DSM11263 zeigte einen mit den Einzelkulturen vergleichbaren Substratumsatz (Abbildung 104) und ist daher Acetat Fumarat 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 0 2 A Succinat Propionat 4 6 Zeit [7d] 8 Substratkonzentration [mmol L-1] Substratkonzentration [mmol L-1] nicht abgebildet. 10 Acetat Fumarat 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 0 2 B 4 6 Zeit [7d] Succinat Propionat 8 10 Abbildung 105: Propionat (braun), Acetat (orange), Fumarat (hellblau) und Succinat (pink) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus der Co-Kultur Aminobacterium colombienseT DSM12261 in PI-Medium über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen; A mit Eigenisolat Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1, B mit Eigenisolat Methanobacterium formicicum Stamm TAF1. 4 ERGEBNISSE 220 In Abbildung 105 A und B sind die Graphen des Acetat-, Fumarat-, Succinat- und Propionatgehalts von Co-Kultur Aminobacterium colombienseT DSM12261 mit Eigenisolat Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1, sowie mit Eigenisolat Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 über 10 Wochen Messzeitraum gezeigt. Der Konzentrationsverlauf der organischen Säuren entsprach dem Verlauf der Kulturen Aminobacterium colombienseT DSM12261 mit und ohne Gasaustausch, wobei die Ausgangskonzentration des Acetats im Medium PI der Co-Kulturen mit 5,4 mmol L-1 und 2,4 mmol L-1 höher lagen und die des Propionats etwas niedriger (15,6 mmol L-1 und 15,7 mmol L-1) angesetzt waren. 4.7.4.4 Substrate und Produkte methanogener Eigenisolate und Acetat Fumarat 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 0 2 A Substratkonzentration [mmol L-1] Substratkonzentration [mmol L-1] Geovibrio thiophilusT DSM11263 (Negativkontrollen) Succinat Propionat 4 6 Zeit [7d] 8 10 Acetat Fumarat 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 0 B 2 4 6 Zeit [7d] Succinat Propionat 8 10 Abbildung 106: Propionat (braun), Acetat (orange), Fumarat (hellblau) und Succinat (pink) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes des Eigenisolats Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 in PI-Medium über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen; A Gasphase nicht ausgetauscht, B Gasphase ausgetauscht. In der eigenisolierten Reinkultur Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 ohne Gasaustausch befand sich bei der Beimpfung 6,0 mmol L-1 Acetat im Medium (Abbildung 106 A). Bis Woche 6 reicherte sich der Acetatgehalt auf 8,8 mmol L-1 an und wurde bis zum Ende der Messungen auf 7,0 mmol L-1 verringert. Zu keiner Zeit wurde die Anwesenheit von Fumarat und Succinat nachgewiesen. Der Graph der Propionsäure beschreibt ein leichtes Fallen über den gesamten Messzeitraum von 10 Wochen von anfänglich 17,1 mmol L-1 auf 15,1 mmol L-1 am Ende der Messungen, was nicht auf einen Abbau zurückgeführt wurde. Abbildung 106 B zeigt das Substratverhalten des Eigenisolats Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 mit Gasaustauch, welches Vergleichbar mit dem Substratverhalten der in Abbildung 106 A ist. Ebenfalls wurde weder Fumarat, noch Succinat detektiert und die Propionsäure beschreibt einen ähnlich fallenden Graphen während des Messzeitraums von 17,1 mmol L-1 auf 15,3 mmol L-1. Die Ausgangskonzentration des Acetats im Medium der Kultur Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 mit Gasaustauch lag bei vergleichbaren 6,4 mmol L-1. Acetat stieg bis Woche 6 auf 9,2 mmol L-1 und wurde bis zum Ende der Messungen auf 7,1 mmol L-1 dezimiert. 221 Acetat Fumarat 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 A 0 2 4 6 Zeit [7d] Succinat Propionat 8 Substratkonzentration [mmol L-1] Substratkonzentration [mmol L-1] 4 ERGEBNISSE 10 Acetat Fumarat 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 B 0 2 4 6 Zeit [7d] Succinat Propionat 8 10 Abbildung 107: Propionat (braun), Acetat (orange), Fumarat (hellblau) und Succinat (pink) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes des Eigenisolats Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 in PI-Medium über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen; A Gasphase nicht ausgetauscht, B Gasphase ausgetauscht. Der Gehalt von Propionsäure fiel im Medium PI der Kultur des Eigenisolats Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 ohne Gasaustausch (Abbildung 107 A) wie in den Kulturen Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 mit und ohne Gasaustausch (Abbildung 106 A und B) von 17,3 mmol L-1 auf 15,3 mmol L-1. Acetat erfuhr eine leichte Erhöhung bis Woche 6 auf 6,1 mmol L-1, wobei die Ausganskonzentration von 2,6 mmol L-1 niedriger lag als bei den Kulturen Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 mit und ohne Gasaustausch. Mit wöchentlichem Austausch der Gasphase über Kultur Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 schwankte der Gehalt der Propionsäure um die Ausgangskonzentration von 19,1 mmol L-1 auf maximal 20,3 mmol L-1 in Woche 2 und minimal 18,2 mmol L-1 in Woche 8 (Abbildung 107 B). Auch die Konzentration von Acetat stieg nur unwesentlich von 1,4 mmol L-1 auf 3,3 mmol L-1 bis Woche 6 und verweilte auf dem Stand bis Woche 10 (3,4 mmol L-1). Auch in dieser Kultur waren weder Fumarat noch Succinat im Medium vorhanden. 222 Acetat Fumarat 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 0 A 2 4 6 Zeit [7d] Substratkonzentration [mmol L-1] Substratkonzentration [mmol L-1] 4 ERGEBNISSE Succinat Propionat 8 10 Acetat Fumarat 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 0 2 B 4 6 Zeit [7d] Succinat Propionat 8 10 Abbildung 108: Propionat (braun), Acetat (orange), Fumarat (hellblau) und Succinat (pink) [mmol L-1] des zellfreien Kulturüberstandes aus der Kultur Geovibrio thiophilusT DSM11263 in PIMedium über einen Messzeitraum von 10 Wochen [7d] mit Standardabweichungen; A Gasphase nicht ausgetauscht, B Gasphase ausgetauscht. Die Kulturen Geovibrio thiophilusT DSM11263 mit und ohne Gasaustausch setzten während der HPLC-Messungen keine Propionsäure um (Abbildung 108 A und B). In Abbildung 100 B stieg der Propionsäuregehalt kurzzeitig von 18,9 mmol L-1 auf 20,1 mmol L-1 bis Woche 2 und fiel wieder bis Woche 4 auf 18,4 mmol L-1, worauf sich der Propionsäuregehalt bis zum Ende der Messungen stabil hielt. Wieder wurden kein Fumarat und kein Succinat im filtrierten Medium PI der Kultur gemessen. Der Acetatgehalt erhöhte sich bis Woche 6 geringfügig von 1,6 mmol L-1 mmol L-1 und 1,5 mmol L-1 auf 2,5 mmol L-1 und 2,1 mmol L-1 und verringerte sich bis Woche 10 wieder auf jeweils 1,1 mmol L-1. 4.7.5 Methanbildung durch methanogene Archaea Das Methanbildungsverhalten Methan bildendender Archaea, wurde in dieser Arbeit mit einem Gaschromatographie-System (Kapitel 3.6.2) ermittelt. Ebenfalls wurde das Wachstum Methan bildender Archaea mit diesem System regelmäßig kontrolliert. Auch die Methanproduktion in propionsäureabbauenden Mischkulturen und in den definierten Co-Kulturen bakterieller DSMZ Typstämme mit methanogenen Archaea wurde überprüft. Das Messsystem wurde auf einen externen Standard eingestellt, der aus gasförmigem Methan bestand. Rohdaten siehe ‚Rohdaten_CD\Chemische_Analyse\GC_Messungen\Methanstandards‘. 4 ERGEBNISSE 223 Methangehalt 1 Methangehalt 4 399990 Methangehalt 2 Methangehalt 5 349990 Methangehalt 3 Ø Methangehalt CH4 Intensität 299990 249990 199990 149990 99990 49990 O2; N2 -10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Zeit [60 s] Abbildung 109: Gemittelter Methanstandard (Ø Methangehalt; schwarze Punkte) aus der Intensität von fünf Methanmessungen mit reinem Methan (Methangehalt 1-5) gegen die Messdauer in Minuten. Aus den Messwerten der Proben wurden Mittelwerte gebildet, anhand Formel 33 die Methankonzentrationen berechnet und die Standardabweichungen (Formel 32) bestimmt. 4.7.5.1 Methanbildung syntroph propionsäureoxidierender Mischkulturen Propionsäureabbauende Kulturen wurden nach 10 Wochen Inkubation auf ihren Methangehalt gaschromatographisch analysiert (‚Rohdaten_CD\Chemische_Analyse\GC_Messungen\ P_abbauer‘). Ø Methangehalt [mmol L-1] Ø Methangehalt nach 10 Wochen Inkubation 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Ap1a Wp2a Gp1b Abbildung 110: Durchschnittlicher Methangehalt nach 10 Wochen Inkubation ohne Gasaustausch in [mmol L-1] der Kulturen Ap1a, Wp2a und Gp1b mit Standardabweichung. 4 ERGEBNISSE 224 Methanmessungen von propionsäureabbauenden Kulturen zeigten einen geringen Methangehalt (Abbildung 110). Mischkultur Ap1a wies den höchsten Methangehalt vor, was die hohen Ergebnisse der Umsetzung von kurzkettigen Fettsäuren (Kapitel 4.7.1) im Vergleich zu den anderen propionsäureabbauenden Kulturen bestätigte. Auch in den Mischkulturen Wp2a und Gp1b waren geringe Mengen Methan gaschromatographisch detektierbar, obwohl in DNA-Analysen keine archaeale 16S rDNA amplifiziert wurde (Kapitel 4.6). 4.7.5.2 Methanbildung definierter Mischkulturen anaerober Bakterien mit methanogenen Archaea Kulturen der DSMZ Typstämme colombienseT Aminobacterium T DSM12261, Wolinella T succinogenes DSM1740 und Clostridium sartagoforme DSM1292, sowie definierte Co-Kulturen dieser Typstämme mit eigenisolierten methanogenen Archaea Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 sowie Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 beziehungsweise Geovibrio thiophilusT DSM11263 wurden ebenfalls gaschromatographisch auf den Methangehalt analysiert. Die Rohdaten befinden sich auf der Rohdaten CD mit dem Pfad ‚Chemische_Analyse\ GC_Messungen\bakT_CoKult‘. Methangehalt 3te Inkubationswoche Methangehalt [mmol L-1] 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Abbildung 111: Methangehalt [mmol L-1] der 3ten Inkubationswoche der bakteriellen DSMZTypstämme Aminobacterium colombienseT DSM12261, Wolinella succinogenesT DSM1740 und Clostridium sartagoformeT DSM1292 einzeln beziehungsweise in Co-Kultur mit den Eigenisolaten Methanobacterium formicicum Stamm TAF1, Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 sowie Geovibrio thiophilusT DSM11263 in PI-Medium vor dem Gasaustausch. 4 ERGEBNISSE 225 In der 3ten Inkubationswoche der definierten Co-Kulturen von DSMZ Typstämmen mit eigenisolierten methanogenen Archaea wurde innerhalb einer Woche produziertes Methan in geringen Mengen gaschromatographisch ermittelt (Abbildung 111). Dabei waren die Co-Kulturen des bakteriellen Typstammes Aminobacterium colombienseT DSM12261 mit eigenisolierten methanogenen Archaea in Woche 3 im Vergleich zu den Co-Kulturen der DSMZ Typstämme Wolinella succinogenesT DSM1740 sowie Clostridium sartagoformeT DSM1292 um mehr als 15fach weniger aktiv. Dies bestätigte die geringen Werte des Stoffwechsels kurzkettiger Fettsäuren der Kulturen mit Aminobacterium colombienseT DSM12261, die mit dem HPLC-System gemessen wurden (Abbildung 105). Die Gasphasen der Kulturen ohne methanogene Archaea enthielten kein Methan. Ebenfalls digital sind die Rohdaten der Methanmessungen der Kulturen Methanobacterium formicicum Stamm TAF1, Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 und Geovibrio thiophilusT DSM11263 in PI-Medium dieser Arbeit beigefügten CD digital gespeichert (‚Rohdaten_CD \Chemische_Analyse\GC_Messungen\bakT_CoKult\G_ther …\ HWS2_1_in_PI …\TAF1_in_PI‘). Methangehalt [mmol L-1] Methangehalt nach 3 Wochen Inkubation ohne Gasaustausch Methangehalt 3te Inkubationswoche 0,020 0,015 0,010 0,005 0,000 DSM11263 TAF1 HWS2.1 Abbildung 112: Methangehalt nach 3 Wochen Inkubationszeit (blaugrüne Säulen) sowie in der 3ten Inkubationswoche (türkise Säulen) in [mmol L-1] der Kulturen Geovibrio thiophilusT DSM11263, Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 und Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 in PIMedium. Abbildung 112 zeigt, dass die produzierten Methanmengen der Kulturen Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 respektive Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 im Vergleich zu den definierten Co-Kulturen mit Aminobacterium colombienseT DSM12261 um eine Potenz geringer waren (Abbildung 111). Der mit wöchentlichem Gasaustausch behandelte hydrogenotrophe Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 bildete innerhalb der dritten Woche den größten Teil Methan, was der Methangehalt der Kultur des gleichen Stamms innerhalb der 3 wöchigen Gesamtdauer der Inkubation zeigte. TAF1 in PI-Medium zeigte zudem innerhalb einer Woche einen 4 ERGEBNISSE 226 höheren Stoffwechsel als der hydrogenotroph/acetoklastisch/methylotrophe Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 (türkise Säulen in Abbildung 112). Der gasförmige Kulturüberstand des Typstamms Geovibrio thiophilusT DSM11263 enthielt in beiden Fällen kein Methan. 4.7.5.3 Methanbildung eigenisolierter Reinkulturen und Typstämmen methanogener Archaea Methanogene Eigenisolate sowie Typstämme wurden für gaschromatographische Messungen in 100 mL Serumflaschen mit durch Aluminiumkappen fixierten Butylstopfen in 18 mL Medium (Kapitel 2.6, Seite 84) ohne Acetat 1:10 verdünnt beimpft und inkubiert. Das Gasgemisch aus 80 % H2 und 20 % CO2 diente als Substratquelle für die hydrogene Methanogenese, außer für die Kultur Methanosaeta concilii BEG4, welche ausschließlich auf acetoklastischem Weg Methan herstellte (Kapitel 4.4). Der Titer bei frisch beimpften Kulturen des Archaeon Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 lag durchschnittlich bei 1010 Zellen L-1 und der von Kulturen des Mikroorganismus Methanobacterium formicicum Stamm LFP4.1 durchschnittlich bei 1011 Zellen L-1. Um das Substratverhalten von H2 und CO2 unterschiedlicher methanogener Stämme in Abhängigkeit der Inkubationszeit zu charakterisieren, wurden die täglich maximale Methanproduktion pro Liter sowie der maximale Methangehalt pro Liter als vergleichbare Werte herangezogen. Um die Anzahl der Detektionswerte ‚n‘ abzugrenzen, wurde ‚k‘ als die Anzahl der verwendeten Tagesmittelwerte zur Berechnung des gemittelten Maximalwerts der Methanproduktion eingeführt. Messwerte der Methanproduktion verschiedener Kulturen gleicher Stämme in Abhängigkeit der Inkubationszeit wurden nicht zusammengefasst analysiert, da das zeitlich abhängige Produktionsverhalten der einzelnen Kulturen zu große Unterschiede zeigte (Abbildung 116). Die tägliche Methanproduktion pro Zelle wurde bei der hydrogenotrophen Kultur Methanoculleus bourgensis Stamm TAF1.1 (Abbildung 119) bestimmt, da aufgrund des Vorliegens einzelner Zellen bei dieser Kultur das Zählen der Zellen in einer Toma-Kammer durchgeführt wurde (Kapitel 3.4.1.2). Dabei wurde ‚l‘ als die Anzahl der Zellen bestimmt, welche zu unterschiedlichen Zeitpunkten während der stationären Phase gezählt worden waren. 4.7.5.3.1 Methanbildung des Typstamms Methanobacterium formicicumT DSM1535 Eine Kultur des Typstamms Methanobacterium formicicumT DSM1535 wurde beimpft und die Gasphase nach der Erreichung des Maximalgehalts von Methan nach den Messungen ausgetauscht (‚Rohdaten_CD\Chemische_Analyse\GC_Messungen\Mb_formicicum\Mb_f‘). 4 ERGEBNISSE 227 Ø Methanbildung pro Tag Ø Methangehalt 7,0 40 5,0 30 4,0 20 3,0 2,0 10 1,0 Ø Methangehalt Gas aufgepresst [mmol L-1] Ø Methanproduktion [(mmol L-1) d-2] 6,0 0 0,0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 Zeit [d] Abbildung 113: Durchschnittliche Methanbildung in mmol pro Liter pro Tag (Säulen) mit dem durchschnittlichen Methangehalt [mmol L-1] (Rauten mit Standardabweichung) der Kultur Methanobacterium formicicumT DSM1535 gegen die Inkubationszeit in Tagen. Die Kultur Methanobacterium formicicumT DSM1535 produzierte zwischen Inkubationstag 17 und 24 durchschnittlich 3,54 ± 0,398 mmol L-1 (k = 2) hydrogenotroph Methan pro Tag (Abbildung 113). Ab dem Zeitpunkt, seit dem die Gasphase nach jeder Messung ausgetauscht wurde, produzierte die Kultur durchschnittlich 6,02 ± 0,399 mmol L-1 (k = 5) Methan am Tag. Die Methanmenge in der Gasphase lag an den entsprechenden Messtagen durchschnittlich bei 12,04 ± 0,8 mmol L-1. Die Substrate CO2 und H2 für die hydrogenotrophe Methanogenese (Kapitel 1.9.1.1.1) des Typstammes lagen somit im Überschuss vor. Kulturen des Typstamms Methanobacterium formicicumT DSM1535 wurden parallel inkubiert. Bei einer Kultur des Typstamms wurde die Gasphase nach jeder Messung mit einem Gasgemisch aus 80 % H2 und 20 % CO2 ausgetauscht und bei der anderen Kultur nicht. Zunächst täglich beziehungsweise alle zwei Tage wurden gaschromatographische Messungen durchgeführt (siehe ‚Rohdaten_CD\Chemische_Analyse\GC_Messungen\Mb_formicicum\Mb_f_parallel‘). 4 ERGEBNISSE 228 Gas aufgepresst Gas ausgetauscht a 2,8 30 2,3 1,8 20 1,3 0,8 10 0,3 Ø Methangehalt Gas aufgepresst [mmol L-1] Ø Methanbildung [(mmol L-1) d-2] 3,3 Gas ausgetauscht b Gas aufgepresst 40 0 -0,2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Zeit [d] Abbildung 114: Durchschnittliche Methanbildung in mmol pro Liter pro Tag (Säulen) mit dem durchschnittlichen Methangehalt [mmol L-1] (Rauten mit Standardabweichung) der Kultur Methanobacterium formicicumT DSM1535 gegen die Inkubationszeit in Tagen; Gas ausgetauscht a (türkise Balken) Abbruch der Messungen nach 16 Tagen; Gas ausgetauscht b (helltürkise Balken); Abbruch der Messungen nach 14 Tagen. Die Kultur, die keinen Gasaustausch nach jeder Messung erfuhr (Abbildung 114, türkise Säulen), bildete nach einer 4 tägigen Ruhephase und einer darauffolgenden 8 tägigen Anlaufphase kontinuierlich Methan mit einer durchschnittlichen Methanproduktion von 3,1 ± 0,16 mmol L-1 (k = 4) bis zum 20ten Inkubationstag. Dieser durchschnittliche Maximalwert der Methanbildung bestätigte den Wert der Kultur gleichen Stamms in Abbildung 113. Aufgrund der zunehmenden Sättigung der Gasphase (Abbildung 113) mit Methan verringerte sich daraufhin die Methanproduktion pro Tag. An Tag 30 wurde dieses Experiment beendet, da in der Gasphase der Kultur nur noch Methan vorlag. Die Parallelkultur, welche nach jeder Messung einem Gasaustausch unterzogen wurde, zeigte eine rückläufige Methanproduktion, weshalb die Inkubation nach 16 Tagen beendet und die Kultur verworfen wurde. Der parallel kultivierten Typstämme Methanobacterium formicicumT DSM1535 nachgeschaltet, wurde eine weitere Kultur beimpft und mit dem Gasaustausch nach jeder Messung behandelt. Auch diese zeigte keine steigende Methanproduktion, woraufhin auch diese Kultur nach 14tägiger Inkubation verworfen wurde. 4.7.5.3.2 Methanbildung des Eigenisolats Methanobacterium formicicum Stamm LFP4.1 Während der Inkubation einer aus einem Laborfermenter (Klocke et al. 2007) eigenisolierte Kultur Methanobacterium formicicum Stamm LFP4.1 wurde nach jeder Messung die Gasphase ausgetauscht. Der Auswertung zu Grunde liegende Daten befinden sich auf der Rohdaten CD ‚\Chemische_Analyse\GC_Messungen\LFP4_1\LFP4_1gasausgetauscht‘. 4 ERGEBNISSE 229 Ø Methanbildung pro Tag Ø Methangehalt theoretischer Ø Methangesamtgehalt 30,0 Ø Methanbildung [(mmol L-1) d-2] 25,0 3,0 20,0 15,0 2,0 10,0 1,0 5,0 0,0 0,0 0 1 2 3 4 5 6 Ø Methangehalt [mmol L-1] 4,0 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Zeit [d] Abbildung 115: Durchschnittliche Methanbildung in mmol pro Liter pro Tag (Säulen) mit dem durchschnittlichen Methangehalt [mmol L-1] (Rauten mit Standardabweichung) und den daraus errechneten Werten des theoretischen Methangesamtgehalts (gepunktete Linie mit Berechnungswertpunkten) der Kultur Methanobacterium formicicum Stamm LFP4.1 gegen die Inkubationszeit in Tagen. In Abbildung 115 ist der durchschnittliche Methangehalt (Rauten) der Kultur Methanobacterium formicicum Stamm LFP4.1 und die daraus resultierende Methanproduktion pro Tag (Balken) gezeigt. Nach jeder Messung wurde die Gasphase über der Kultur durch ein Gasgemisch aus 80 % H2 und 20 % CO2 ersetzt. Die methanogene Kultur LFP4.1 zeigte zu Beginn der Messreihe eine Ruhe-Phase von 2 Tagen. Beginnend mit dem 3ten Inkubationstag befand sich die Kultur in einer 5 tägigen Anlaufphase und bildete vom 6ten bis zum 10ten Inkubationstag konstant durchschnittlich 4,3 ± 0,12 mmol L-1 (k = 3) Methan. Bis Tag 14 verringerte sich die Methanproduktion der Kultur stetig, daher wurde die Messreihe mit diesem Tag beendet und die Kultur in frisches Medium überimpft. Zwei weitere Kulturen des Mikroorganismus Methanobacterium formicicum Stamm LFP4.1 wurden zu unterschiedlichen Zeiten inkubiert und der Methangehalt zu unterschiedlichen Zeitpunkten gaschromatographisch überprüft (‚Rohdaten_CD\Chemische_Analyse\GC_Messungen\LFP4_1‘). 230 9,5 44,8 8,0 39,8 34,8 6,5 Ø Methanbildung pro Tag 1 Ø Methanbildung pro Tag 2 Ø Methangehalt 1 Ø Methangehalt 2 5,0 3,5 29,8 24,8 19,8 14,8 2,0 9,8 0,5 4,8 Ø Methangehalt [mmol L-1] Ø Methanbildung [(mmol L-1) d-2] 4 ERGEBNISSE -0,2 -1,0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Zeit [d] Abbildung 116: Durchschnittliche Methanbildung in mmol pro Liter pro Tag (blaugrüne Säulen, erste Kultur LFP4.1; helltürkise Säulen, zweite Kultur LFP4.1) mit dem durchschnittlichen Methangehalt der Kulturen [mmol L-1] (Rauten mit Standardabweichung, erste Kultur LFP4.1; mit Quadrate mit Standardabweichung, zweite Kultur LFP4.1) der Kulturen des Mikroorganismus Methanobacterium formicicum Stamm LFP4.1 gegen die Inkubationszeit in Tagen; Ende der Inkubation Tag 27, erste Kultur LFP4.1, Tag 66, zweite Kultur LFP4.1. Das Methanproduktionsverhalten der beiden über unterschiedliche Zeitinterwalle inkubierten Kulturen des Mikroorganismus Methanobacterium formicicum Stamm LFP4.1 wurde in Abbildung 116 graphisch zusammengefasst. Kultur 1 wies eine 6 tägige Ruhephase der Methanproduktion nach der Überimpfung auf, wohingegen Kultur 2 ohne Ruhephase direkt nach der Überimpfung die Methanproduktion steigerte. Die erste Kultur Methanobacterium formicicum Stamm LFP4.1 produzierte täglich höchstens 8,4 mmol L-1 Methan zwischen dem 6ten und 9ten Tag, wobei die zweite Kultur des Stamms eine tägliche Höchstproduktion mit 9,1 mmol L-1 innerhalb 2 Tagen zwischen dem 3ten und 5ten Inkubationstag erzielte. Die Messreihe der ersten Kultur wurde aus diesem Grund nach 27 Tagen beendet und die Kultur in frisches Medium überimpft. Kultur 2 wurde weiterführend inkubiert, bis sich der Methangehalt der Gasphase dieser Kultur dem bei 1 bar Überdruck maximal möglichen Wert angenähert hatte. Im Gegensatz zum Methanbildungsverhalten des Typstammes Methanobacterium formicicumT DSM1535 lag die tägliche maximale Methanbildungsrate des Stamms LFP4.1 höher als die Gasphase nicht nach jeder Messung ausgetauscht wurde. 4.7.5.3.3 Methanbildung des Eigenisolats Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 Eine Reinkultur des Eigenisolats Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 aus dem ersten Fermenter der BGA Theo & Ingrid & Alexander Friedrich GbR (Tabelle 18) wurde 21 Tage mit begleitenden Methanmessungen (alle 3 Tage) inkubiert (‚Rohdaten_CD\Chemische_Analyse\ GC_Messungen\TAF1‘). 4 ERGEBNISSE 231 Methanbildung pro Tag Ø Methangehalt 50,0 6,0 Ø Methanbildung [(mmol L-1) d-2] 40,0 4,0 35,0 30,0 3,0 25,0 2,0 20,0 1,0 15,0 10,0 0,0 5,0 Ø Methangehalt [mmol L-1] 45,0 5,0 0,0 -1,0 0 2 4 6 8 10 12 Zeit [d] 14 16 18 20 22 Abbildung 117: Durchschnittliche Methanbildung in mmol pro Liter pro Tag (Säulen) mit dem durchschnittlichen Methangehalt [mmol L-1] (Rauten mit Standardabweichung) der Kultur Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 gegen die Inkubationszeit in Tagen. Nach einer Ruhephase der Methanproduktion von 3 Tagen nach Beimpfung der Kultur Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 wurde pro Tag durchschnittlich 5,84 ± 0,24 mmol L-1 (k = 2) bis einschließlich Tag 9 produziert. Die maximale Methanproduktionsrate der Kultur TAF1 lag somit zwischen den Werten des Typstammes (Abbildung 113 und Abbildung 114) und des Stammes LFP4.1 (Abbildung 116). 4.7.5.3.4 Methanbildung des Eigenisolats Methanoculleus bourgensis Stamm TAF1.1 Die aus der Kultur Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 entstandene hydrogenotrophe Reinkultur Methanoculleus bourgensis Stamm TAF1.1 wurde mit einer Zellzahl von 1,3 1010 Zellen L-1 beimpft und parallel die Zellzahl und der Methangehalt bestimmt. Die Auswertung gründet auf den Messdaten, welche sich auf der ‚\Chemische_Analyse\GC_Messungen\TAF1_1‘ befinden. Rohdaten CD unter dem Pfad 4 ERGEBNISSE 232 Methanbildung pro Tag 2,0 Ø Methangehalt 50,0 Ø Methanbildung [(mmol L-1) d-2] 40,0 1,4 30,0 1,1 0,8 20,0 0,5 10,0 0,2 Ø Methangehalt [mmol L-1] 1,7 0,0 -0,2 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 Zeit [d] Abbildung 118: Durchschnittliche Methanbildung in mmol pro Liter pro Tag (Säulen) mit dem durchschnittlichen Methangehalt [mmol L-1] (Rauten mit Standardabweichung) der Kultur Methanoculleus bourgensis Stamm TAF1.1 gegen die Inkubationszeit in Tagen. Die Methanproduktion durch die Reinkultur Methanoculleus bourgensis Stamm TAF1.1 verlief nach einer 2 tägigen Ruhephase, gefolgt von einer 20 tägigen Anlaufphase diskontinuierlich bis zur Erreichung des maximal mögliche Methangehalt über der Kultur an Tag 71 (Abbildung 118). Nachdem der maximale Methangehalt erreicht war, wurde auch hier die Gasphase ausgetauscht. Diese Maßnahme erbrachte nach kurzem Anstieg der Methanproduktion wieder eine Verringerung der Methanherstellung, daher wurde das Experiment nach Tag 76 beendet und die Kultur in frisches Medium überführt. Unter Einbeziehung der Zellzahl der Kultur Methanoculleus bourgensis Stamm TAF1.1 über die Inkubationszeit, wurde die Methanproduktion pro Zelle berechnet. 4 ERGEBNISSE 233 Tägliche Methanbildung in fmol Methan pro Zelle Gesamtzellzahl pro Liter 1,0E+13 2,3 1,0E+12 1,8 1,3 1,0E+11 0,8 Gesamtzellzahl [Zellen L-1] Methanbildung [(fmol Zelle-1) d-2] 2,8 0,3 -0,2 1,0E+10 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 Zeit [d] Abbildung 119: Durchschnittliche Methanbildung pro Zelle am Tag der Kultur Methanoculleus bourgensis Stamm TAF1.1 (Säulen) mit Zellzahl pro Liter (Dreiecke) gegen die Inkubationszeit in Tagen. Abbildung 119 zeigt, dass sich die tägliche Methanproduktion pro Zelle (blaugrüne Säulen) und die Steigerung der Gesamtzellzahl Methanoculleus bourgensis Stamm TAF1.1 (mit schwarzer Linie verbundene Dreiecke) gegenläufig zueinander verhalten. Während des Wachstums der Kultur (Messpunkte 2, Tag 4 und 4, Tag 21), wurde weniger Methan gebildet als bei Stagnation der Zellzahl (Messpunkte 3, Tag 8, 5, Tag 28 und 6, Tag 35). Zellen in geringerer Dichte (Messpunkte 3, Tag 8, 2,4 1010 fmol Zelle-1) wiesen mit 2,99 fmol Zelle-1 eine höhere Methanproduktion auf im Vergleich zu den Zellen mit finaler Zelldichte (ab Messpunkt 4, 21ter Inkubationstag, durchschnittlich 1,06 1012 ± 8,8 1010 Zellen, l = 9). Die Kultur befand sich ab dem 4ten Messpunkt (Tag 21) in der stationären Phase des Zellwachstums. Die berechnete Teilungsrate (Kapitel 1.5.1.3) zwischen -1 Beimpfung und stationärer Phase betrug durchschnittlich 0,029 h , woraus eine durchschnittliche Generationszeit g (Kapitel 1.5.1.3) von umgerechnet 1,44 d für den Stamm Methanoculleus bourgensis Stamm TAF1.1 resultierte. Der Maximalwert der täglichen Methanproduktion pro Zelle in der stationären Phase betrug 1,81 fmol Zelle-1 am 6ten Messpunkt (Tag 35). Wie in Abbildung 118 ist auch in dieser graphischen Darstellung (Abbildung 119) die diskontinuierliche Methanproduktion der Kultur TAF1.1 zu sehen. Der Austausch der Gasphase nach den Methanmessungen ab Messpunkt 10 (Tag 71) induzierte kein weiteres Zellwachstum. 4.7.5.3.5 Methanbildung des Typstamms Methanosarcina mazeiT DSM2053 Der Typstamm Methanosarcina mazeiT DSM2053 wurde ebenfalls in Medium ohne Acetat und mit dem Gasgemisch aus 80 % H2 und 20 % CO2 als Substratquelle für die hydrogene Methanogenese kultiviert und der Methangehalt zunächst wöchentlich gemessen. Das Gasgemisch wurde nach 4 ERGEBNISSE 234 jeder Messung bis auf einen Überdruck von 1 bar aufgepresst, um den Substratgehalt im Überschuss zu gewährleisten. 0,50 Ø Methanbildung pro Tag Ø Methangehalt Ø Methanbildung [(mmol L-1) d-2] 0,40 6,0 5,0 0,30 4,0 0,20 3,0 2,0 0,10 1,0 Ø Methangehalt [mmol L-1] 7,0 0,0 0,00 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 Zeit [d] Abbildung 120: Durchschnittliche Methanbildung in mmol pro Liter pro Tag (Säulen) mit dem durchschnittlichen Methangehalt [mmol L-1] (Rauten mit Standardabweichung) des Typstamms Methanosarcina mazeiT DSM2053 gegen die Inkubationszeit in Tagen. Während 42 tägiger Inkubationsdauer produzierte der Typstamm Methanosarcina mazeiT DSM2053 mit schwankender Rate Methan (Abbildung 120). Nach einer Ruhe- beziehungsweise geringen Anlaufphase zeigte der Typstamm eine Methanproduktionsrate von 0,3 mmol L-1 zwischen den Inkubationstagen 7 bis 14. In der darauffolgenden Woche stagnierte die Methanproduktion bis Tag 21 (Messpunkt 4) und steigerte sich zunächst leicht bis Messtag 28 und bis Tag 36 wieder verstärkt mit einer durchschnittlichen Maximalproduktion von 0,46 mmol L-1 Methan pro Tag. Aufgrund erneutem Abfall der täglichen Methanproduktionsrate bis Messtag 42 und Verringerung der Autofluoreszenz der Zellen (Kapitel 3.4.1) wurde die Messreihe beendet und die Kultur in frisches Medium überimpft. Der finale Methangehalt im Gasüberstand der Kultur betrug 7,57 ± 0,012 mmol L-1, was deutlich unter dem berechneten maximal möglichen Methangehalt (100 % Methan) von 38,9 mmol L-1 lag. 4.7.5.3.6 Methanbildung des Eigenisolats Methanosarcina mazei Stamm BEG3 Der Stamm BEG3 des Mikroorganismus Methanosarcina mazei aus dem Fermenter der BGA BioEnergie Glahn (Tabelle 18) wurde ebenfalls hydrogenotroph mit nach jeder Messung aufgepresstem Substrat kultiviert. Die gaschromatographischen Messdaten befinden sich digital archiviert auf der Rohdaten CD ‚\Chemische_Analyse\GC_Messungen\BEG3‘. 4 ERGEBNISSE 235 Ø Methanbildung pro Tag Ø Methangehalt 45,0 4,85 Ø Methanbildung [(mmol L-1) d-2] 35,0 3,35 30,0 2,60 25,0 1,85 20,0 15,0 1,10 10,0 0,35 5,0 Ø Methangehalt [mmol L-1] 40,0 4,10 0,0 -0,40 0 5 10 15 20 25 Zeit [d] 30 35 40 Abbildung 121: Durchschnittliche Methanbildung in mmol pro Liter pro Tag (Säulen) mit dem durchschnittlichen Methangehalt [mmol L-1] (Rauten mit Standardabweichung) der Kultur Methanosarcina mazei Stamm BEG3 gegen die Inkubationszeit in Tagen. Nach der Beimpfung ruhte die Kultur Methanosarcina mazei Stamm BEG3 bis zum 6ten Inkubationstag (Messpunkt 3, Abbildung 121). Zwischen Inkubationstag 15 und 18 produzierte die Reinkultur nach einer unregelmäßigen Anlaufphase innerhalb von 3 Tagen durchschnittlich 4,75 mmol L-1, was die maximal mögliche Produktionsrate dieser Kultur darstellte. Im Vergleich zu der maximalen Produktionsrate des Typstamms Methanosarcina mazeiT DSM2053 (0,46 mmol L-1, Abbildung 120) lag die Rate dieses Eigenisolats gleicher Art aus einer Biogasanlage um ein 10faches höher. Auch die Produktionsgeschwindigkeit der Kultur BEG3 war höher als die des dazugehörigen Typstamms. Die tägliche Methanproduktionsrate flachte aufgrund der Anreicherung des Methangehalts in der Gasphase über der Kultur bis zum finalen Wert von 42,628 ± 0,647 mmol L-1 Methan (Messtag 42) ab. 4.7.5.3.7 Methanbildung des Eigenisolats Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 Aus dem Fermenter der BGA Hubert Wagner & Sohn GbR (Tabelle 18) wurde in dieser Arbeit unter anderen die Kultur Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 isoliert. Diese Kultur wurde über 57 Tage mit 80 % H2 und 20 % CO2 als Substrat für gaschromatographischen Messungen mit Aufpressen des Gasgemisches nach jeder Messung auf 1 bar Überdruck inkubiert (Rohdaten siehe ‚Rohdaten_CD\Chemische_Analyse\GC_Messungen\HWS2_1‘). 4 ERGEBNISSE 236 Ø Methanbildung pro Tag Ø Methangehalt 1,7 15,0 1,1 12,5 0,8 10,0 0,5 7,5 0,2 5,0 -0,2 2,5 Ø Methangehalt [mmol L-1] 17,5 1,4 Ø Methanbildung [(mmol L-1) d-2] 20,0 0,0 -0,5 0 5 10 15 20 25 30 35 Zeit [d] 40 45 50 55 Abbildung 122: Durchschnittliche Methanbildung in mmol pro Liter pro Tag (Säulen) mit dem durchschnittlichen Methangehalt [mmol L-1] (Rauten mit Standardabweichung) der Kultur Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 gegen die Inkubationszeit in Tagen. Die hydrogenotroph wachsende Kultur Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 hielt nach der Beimpfung eine 8 tägige Ruhephase mit geringer Methanproduktion ein, bevor die Methanherstellung gesteigert wurde (Abbildung 122). Zwischen den Inkubationstagen 12 und 15 erreichte die Kultur ihren täglichen Maximalwert der Methanproduktion von 1,56 mmol L-1, welche aufgrund des langsameren Stoffwechsels (Tabelle 5) niedriger lag als die maximalen Produktionsraten der hydrogenotroph wachsenden Kulturen (Abbildung 113 bis Abbildung 119). Am Inkubationstag 26 war ein Maximalmethangehalt von 17,35 ± 0,49 mmol L-1 erreicht. Dieser Maximalgehalt lag niedriger als der theoretisch maximal mögliche Gehalt an Methan (38,9 mmol L-1) jedoch höher als der des zur gleich Gattung zugeordneten Typstamms Methanosarcina mazeiT DSM2053. 4.7.5.3.8 Methanbildung des Eigenisolats Methanosaeta concilii Stamm BEG4 Eine weitere Reinkultur aus dem Fermenter der BGA BioEnergie Glahn , Methanosaeta concilii Stamm BEG4 (Tabelle 18), wurde mit gaschromatographischen Messungen begleitet (Rohdaten siehe ‚Rohdaten CD\Rohdaten_CD\Chemische_Analyse\GC_Messungen\BEG4‘). Diese Kultur wurde im modifizierten Medium 287 (Kapitel 2.6, Seite 84) mit Acetat als Quelle für die acetoklastische Methanogenese (Kapitel 1.9.1.1.2) kultiviert, da Methanosaeta concilii Stamm BEG4 kein Wachstum mit anderen Substraten zeigte (Tabelle 31). 237 0,25 0,23 0,20 0,18 0,15 0,13 0,10 0,08 0,05 0,03 0,00 Ø Methanbildung pro Tag Ø Methangehalt 14,0 12,0 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 Ø Methangehalt [mmol L-1] Ø Methanbildung [(mmol L-1) d-2] 4 ERGEBNISSE 0,0 0 10 20 30 40 50 60 Zeit [d] 70 80 90 100 Abbildung 123: Durchschnittliche Methanbildung in mmol pro Liter pro Tag (Säulen) mit dem durchschnittlichen Methangehalt [mmol L-1] (Rauten mit Standardabweichung) der Kultur Methanosaeta concilii Stamm BEG4 gegen die Inkubationszeit in Tagen. Mit stetig steigender Rate produzierte die eigenisolierte Reinkultur Methanosaeta concilii Stamm BEG4 Methan (Abbildung 123). Zwischen den Inkubationstagen 49 und 68 erreichte die Kultur ihre maximale Methanproduktionsrate von täglich 0,215 ± 0,001 mmol L-1 (k = 2). Insgesamt bildete Methanosaeta concilii Stamm BEG4 11,4 ± 0,143 mmol L-1 Methan, was nach Berücksichtigung der Reaktionsgleichung der acetoklastischen Methanogenese (Kapitel 1.9.1.1.2) der eingesetzten Menge Acetat (Kapitel 2.6, Seite 86) entsprach. 4.8 Zusammensetzung des Reaktorfiltrats Reaktorfiltrat wurde im PI-Medium (Kapitel 2.6) benötigt, um Propionsäure durch propionsäureabbauende Mischkulturen zu reduzieren (Kapitel 4.7.1, Seiten 197 und 201). Einigen Medien für methanogene Archaea wurde Reaktorfiltrat als Wachstumsbeschleuniger zugegeben (Kapitel 3.3.2). Um gelöste Nährstoffe zu identifizieren, wurde die liquide Phase des Reaktorfiltrats mit Dünnschichtchromatographie (Kapitel 2.5.7 und 3.7.1) und einem HPLC-System (Kapitel 2.5.6 und 3.7.2) auf die Anwesenheit von kurzkettigen organischen Säuren, Aminosäuren und mit einem weiteren HPLC-System (Kapitel 2.5.6 und 3.7.2) auf Zucker und Zuckerderivate überprüft. 4.8.1 Pflanzenpartikel im Reaktorfiltrat Mikroskopisch visualisierbare Pflanzenpartikel (Abbildung 35 D) enthielt das Reaktorfiltrat, die unlösliche Cellulose enthalten. Lösliche Stoffe dienen ebenfalls als Nähstoffe. 4 ERGEBNISSE 238 4.8.2 Acetat im Reaktorfiltrat Messungen kurzkettiger organischer Säuren im unbeimpften beziehungsweise frisch beimpften PIMedium (Kapitel 2.6, Seite 83) zeigten einen Acetatgehalt von circa 1-7 mmol L-1 (Abbildung 81, Tabelle 53). Dieses Acetat stammte aus dem Reaktorfiltrat (10 %), da dem PI-Medium (Kapitel 2.6, Seite 83) kein Acetat zugegeben wurde. Dies ergab einen Acetatgehalt von 10-70 mmol L-1 in unverdünntem Reaktorfiltrat. 4.8.3 Aminosäuren im Reaktorfiltrat Das Reaktorfiltrat (Kapitel 2.6) wurde in verschiedenen Verdünnungen zum einen unfiltriert und zum anderen durch einen 3000 K-PES-Filter zentrifugiert auf eine Silikaplatte (Merck, Darmstadt) aufgetragen und einer Dünnschichtchromatographie unterzogen (Kapitel 3.7.1). A B Abbildung 124: Dünnschichtchromatographische Auftrennung des Reaktorfiltrats in verschiedenen Verdünnungen [%], blau = Dansylchlorid, gelb = Aminosäure, A unfiltriertes Reaktorfiltrat, B filtriertes Reaktorfiltrat, Farbfotografie unter UV-Licht. Die Lauffront betrug 13,7 cm. Das Dansylchlorid lief bei 6,0 cm (blau, Abbildung 124). Im Reaktorfiltrat ist eine Aminosäure enthalten, sofern keine andere Aminosäure bei dieser eindimensionalen Dünnschichtchromatographie das gleiche Laufverhalten aufwies. Die mit Dansylchlorid markierte Aminosäure lief 9,0 cm (gelb, Abbildung 124). Aus der Laufstrecke der Aminosäure dividiert durch die Lauffrontstrecke wurde der RF-Wert dieser Aminosäure der 4 ERGEBNISSE 239 angewendeten Dünnschichtchromatographie (Kapitel 3.7.1) von 0,657 berechnet. Beim Vergleich der Intensitäten wies das unfiltrierte Reaktorfiltrat eine höhere Leuchtkraft auf als die Proben des filtrierten Reaktorfiltrats. Die Filtration durch einen 3000K PEP-Filter hielt also kleine lösliche Moleküle teilweise zurück, was die Konzentration der Aminosäure jedoch nicht unter die Empfindlichkeitsgrenze dieser chemischen Analyse sinken ließ. Mit aufsteigender Konzentration des Reaktorfiltrats in der Probe, stieg auch die Intensität der Aminosäure, wobei die Leuchtkraft des Dansylchlorids entsprechend zurückging (Abbildung 124). Um weiterführend die Identität der Aminosäure zu ermitteln, wurde auf die chemische Analysemethode der HPLC zurückgegriffen, da mit der Methode der Dünnschichtchromatographie kein exaktes qualitatives Ergebnis ermittelt wurde. Durch einen 3000 K-PES-Filter zentrifugiertes Reaktorfiltrat wurde mit Dansylchlorid inkubiert und mit einem HPLC-System für Aminosäuren (Kapitel 2.5.6, Seite 70 und 3.7.2) die nach den Ergebnissen der Dünnschichtchromatographie im Reaktorfiltrat befindliche Aminosäure identifiziert. Aminosäure Phenylalanin Leucin Isoleucin Tryptophan Methionin Valin Prolin Arginin Histidin Tyrosin Threonin Glycin Serin Glutamin Asparagin Cystein Asparaginsäure Reaktorfiltrat 2 Reaktorfiltrat 1 0 4 Dansylchlorid 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 Retentionszeit [min] Abbildung 125: Retentionszeiten [min] von Aminosäuren (weiß) und Reaktorfiltraten im Vergleich zu den Retentionszeiten von Dansylchlorid (hellblau). Zur Überprüfung der Messgenauigkeit wurden die Retentionszeiten des für die Aminosäureanalyse benötigten Dansylchlorids aller gemessenen Proben herangezogen (Abbildung 125, hellblaue Balken). Der Mittelwert der Retentionszeiten des Dansylchlorids betrug 32,93 min ± 0,208 (k = 19), was für stabile Messungen sprach. Die Reaktorfiltratproben erzeugten neben dem Peak des Dansylchlorids einen weiteren Peak, was die Vermutung aufgrund der Ergebnisse aus der Dünnschichtchromatographie (Abbildung 124) bestätigte, dass sich im Reaktorfiltrat eine 4 ERGEBNISSE Aminosäure 240 befindet. Der Mittelwert der Retentionszeiten der chemisch analysierten Reaktorfiltratproben (n = 2, Abbildung 125) betrug 51,27 min ± 0,115. Dieser Wert war der Retentionszeit des Valins mit 51,4 min am nächsten. 4.8.4 Zuckeralkohol im Reaktorfiltrat Verschiedene Konzentrationen des Reaktorfiltrats wurden auf den Gehalt von Zuckern und Zuckerderivaten chemisch analysiert (n = 2; Kapitel 2.5.6 Seite 71 und 3.7.2). 25,0 Glycerolgehalt [mmol L-1] 22,5 20,0 17,5 15,0 12,5 10,0 7,5 5,0 2,5 0,0 1 5 10 Reaktorfiltrat [%] 20 30 Abbildung 126: Glycerolgehalt in verschieden konzentriertem Reaktorfiltrat [%]. Mit dem in dem Schreiber der HPLC einprogrammierten internen Standard wurde mit der Retentionszeit 13,3 min (± 0,0078, k = 10) Glycerol nachgewiesen. Neben dem Zuckeralkohol Glycerol wurden keine Monosaccaride nachgewiesen. Aufgrund der zwischen den Verdünnungen unverhältnismäßigen Glycerolwerte (Abbildung 126) wurde keine quantitative Auswertung des Glycerolgehalts im unverdünnten Reaktorfiltrat durchgeführt. 5 DISKUSSION 241 5 Diskussion In syntroph propionsäureoxidierenden Mischkulturen (Tabelle 14) aus unterschiedlichen NawaRoBiogasanlagen (Tabelle 18) wurden in dieser Arbeit erstmals anaerobe Bakterien angereichert und reinisoliert (Kapitel 4.5.2). Bisher wurde die bakterielle und archaeale Vielfalt in NawaRoBiogasanlagen molekularbiologisch analysiert (Kapitel 1.5.1.3, Liu et al. 2009, Klocke et al. 2007, 2008, Nettmann et al. 2010), jedoch nicht unter Berücksichtigung der syntroph ablaufenden anaeroben Propionsäureoxidation, wie in dieser Arbeit. Aus der syntroph propionsäureoxidierenden Mischkultur Fp1 wurde in dieser Arbeit Proteiniphilum acetatigenes Stamm Fp1a520 isoliert (Tabelle 37). Aus der propionsäureoxidierenden Mischkultur Ap1 wurde Clostridium sartagoforme Stamm Ap1a520 isoliert (Tabelle 46). In dieser Dissertation wurden aus unterschiedlichen NawaRoBiogasanlagen (Tabelle 18) verschiedene Stämme methanogener Archaea der Gattungen Methanobacterium, Methanoculleus, Methanosarcina und Methanosaeta isoliert (Kapitel 4.6.3, Tabelle 47). Aus zwei thermophilen Laborfermenterproben (Laborfermenter siehe Klocke et al. 2007, 2009a, b, Nettmann et al. 2010) wurden die methanogenen Archaea Methanomethylovorans sp. Stamm LFP3.1 und Methanobacterium formicicum Stamm LFP4.1 isoliert. Aus einer weiteren mesophilen Laborfermenterprobe wurde Methanosarcina mazei Stamm LFP2.1 angereichert (Kapitel 4.6.3, Tabelle 47). Im Gegensatz zu den molekularbiologischen Identifizierungen von Kampmann et al. (2012b) und Liu et al. (2009) wurden Methanobrevibacter aus der Ordnung Methanobacteriales und Methanospirillum aus der Ordnung Methanomicrobiales in den in dieser Arbeit beprobten NawaRo-BGAs und den Laborfermentern weder molekularbiologisch identifiziert noch kultiviert. Der analysierte Fermenter von Liu et al. (2009) wurde mit Schweinemist betrieben und der Fermenter von Kampmann et al. (2012b) mit Gülle und spezieller Befütterung aus Casein, Stärke und Rahm im Wechsel. In den beprobten NawaRo-BGAs wurde hauptsächlich Mais respektive Grassilage verwendet, was mit Schweinegülle beziehungsweise Rindergülle angeimpft wurde (Tabelle 18). Eine Begründung für die nicht identifizierten Gattungen Methanobrevibacter und Methanospirillum könnte die unterschiedliche Befütterung der Fermenter sein, auch wenn Nettmann et al. (2010) mit molekularbiologischen Methoden keine direkte Korrelation der Population methanogener Archaea mit der Befütterung ermittelten. 5.1 Molekularbiologisch Identifizierte Bakterien und methanogene Archaea aus NawaRo-Biogasanlagen und Laborfermentern Die molekularbiologische Identifizierung von Bakterien und methanogenen Archaea wurde mit 16S rDNA Sequenzen über die unterschiedlichen Separierungsmethoden DGGE/TGGE (Kapitel 5 DISKUSSION 242 2.5.3, 2.5.4 und 3.5.6) und Klonierung (Kapitel 3.5.7) durchgeführt. Verschiedenartige Ausprägungen der Banden einer DGGE (Abbildung 46, Abbildung 49, Abbildung 50, Abbildung 56, Abbildung 59, Abbildung 60) und auch der Agarose-Gelelektrophorese (Kapitel 2.5.2 und 3.5.5) geben nicht zwangsläufig einen Hinweis auf die Zellanzahl eines Mikroorganismus in einer Kultur (Liesack et al. 1991). Verschiedene Gründe können dabei vorliegen. Ein Grund ist, dass die 16S rDNA unterschiedlicher Mikroorganismen in verschiedener Anzahl im Genom vorliegen kann (Farrelly et al. 1995). Die 16S rDNA hat eine hoch konservierte Sequenz (Woese et al. 1975), weshalb sie für molekularbiologische Identifizierungen von Arten verwendet wird (Woese und Fox 1977, Fox et al. 1977). Diese Sequenz kann partiell in der chromosomalen DNA auch an Stellen auftreten, die nicht zur 16S rDNA zählen (Liesack et al. 1991). Mit synthetischen Oligonukleotiden für die 16S rDNA werden diese partiellen DNA-Sequenzen aus der chromosomalen DNA ebenfalls reamplifiziert. Somit entstehen Fragmente, die sich von der 16S rDNA in einzelnen Basenpaarungen unterscheiden. Diese Fragmente lassen sich in manchen Fällen durch eine Agarose Gel Elektrophorese separieren. Zusätzlich können diese Fragmente während der Anlagerung eines jeden Zyklus der PCR mit der 16S rDNA partielle Basenpaarungen ausbilden, wodurch die Polymerase ohne Anlagerung eines synthetischen Oligonukleotids das Fragment reamplifiziert. Diese Fragmente werden chimäre Fragmente genannt. Ein weiterer Grund ist, dass mit steigender Anzahl der Amplifikate die PCR inhibiert wird, da die Anlagerung der Amplifikate aneinander effizienter ist als die Anlagerung der synthetischen Oligonukleotide an die Amplifikate (Suzuki und Giovannoni 1996). Außerdem denaturiert G+C reiche DNA bei höheren Temperaturen als DNA mit geringerem G+C-Gehalt und steht somit der PCR weniger zur Verfügung (Reysenbach et al. 1992). Liegt der zuletzt genannte Fall vor, kann dem PCR-Mix 5 % (w/v) Acetamid zugeben werden, da Acetamid die Denaturierung der doppelsträngigen DNA mit hohem G+C-Gehalt erhöht. Bei den propionsäureabbauenden Mikroorganismen in den Mischkulturen (Kapitel 4.7.1 bis 4.7.3) könnte es sich um bisher unbekannte oder bisher noch nicht als Propionsäureabbauer identifizierte anaerobe Bakterien handeln. Dazu müssen die Isolierung möglichst aller Bakterien aus den Mischkulturen fortgeführt, molekularbiologische Sequenzanalysen durchgeführt und reinisolierte Bakterien mit hydrogenotrophen methanogenen Archaea co-kultiviert werden, um über chemisch analytische Bestimmung der Substrat- und Produktkonzentrationen die für die syntrophe Oxidation von Propionsäure verantwortlichen Mikroorganismen zu identifizieren. Außerdem deuten die Titer der propionsäureabbauenden Bakterien in den Mischkulturen (Tabelle 30) von 5 102 Zellen L-1 (Mischkultur Gp1) bis zu 3,5 104 Zellen L-1 (Mischkulturen Wp2a und Ap1a) darauf hin, dass diese Titer unterhalb der Nachweisgrenze einiger molekularbiologischen Methoden zur Identifizierung von Bakterien und Archaea liegen. In Mischkultur Wp2a wurde Acetat abgebaut (Abbildung 96 A), obwohl kein acetatverwertendes Bakterium beziehungsweise Archaeon molekularbiologisch identifiziert wurde. Sowohl in Mischkultur Gp1b als auch in Wp2a wurde Methan detektiert (Abbildung 110), obwohl keine archaeale 16S rDNA amplifiziert wurde (Kapitel 4.6). Um diese 5 DISKUSSION 243 Hinweise zu belegen, können die unteren Nachweisgrenzen von Identifizierungsmethoden experimentell für die propionsäureabbauenden Mischkulturen bestimmt werden. Beispielsweise mit der Verwendung der real time PCR (Lueders et al. 2004) kann diese Nachweisgrenze bestätigt werden, da mit der real time PCR teilweise eine Zelle identifiziert werden kann. In den Medien 520 und 63-L (DSMZ, 2012), beimpft mit den Kulturen Wp2a und Gp1b, wurde Wachstum anaerober Bakterien durch eine sich einstellende Trübung und einem entstehenden partikulären Niederschlag beobachtet (nicht gezeigt), jedoch aufgrund dieses starken Niederschlags wurde keine DNA-Isolierung durchgeführt. Durch eine Optimierung der DNA-Isolierung aus speziell diesen partikulär verunreinigten Kulturen können zukünftig auch Mikroorganismen aus Kulturen in den Medien 520 und 63-L mit starkem Niederschlag identifiziert werden. 5.2 Mikroorganismen in syntroph propionsäureoxidierenden Mischkulturen Im Kulturüberstand der Mischkulturen Fp1 (Abbildung 78), Gp1 (Abbildung 79), Ap1 (Abbildung 81) und Ap3 (Abbildung 82) akkumulierte Acetat bei gleichzeitig sinkendem Propionatgehalt. Diese chemisch analytische Beobachtung des Substrats Propionsäure und des Produktes Acetat deckte sich mit der Veröffentlichung von Wallrabenstein et al. (1994), in der Syntrophobacter wolinii nach Formel 11 und Formel 12 Propionsäure zu Acetat umsetzte (Kapitel 1.7.2). Der Stoffwechselweg kann in den Kulturen dieser Arbeit identisch zu der von Stams und Plugge (2009) zusammenfassten Oxidation von Propionsäure zu Acetat ablaufen (Abbildung 24). Die Kulturen Wp1a (Abbildung 95 A), Wp2a und Wp2b (Abbildung 96) sowie Ap3a und Ap3b (Abbildung 99) bauten ebenfalls unter anaeroben Bedingungen Propionsäure ab. Die Zusammenhänge der Substratumsätze mit den identifizierten Mikroorganismen der syntroph propionsäureoxidierenden Kulturen werden auf den folgenden Seiten für die Kulturen Fp1, Wp1, Wp2, Gp1 und Ap1 diskutiert. 5 DISKUSSION 244 5.2.1 Bakterien und eigenisolierte Bakterien aus der syntroph propionsäureoxidierenden Mischkultur Fp1 Kultur Fp1b zeigte nach der Inkubation mit Bromoethansulfonsäure (BrES) im PI-Medium eine Akkumulation von Acetat (Abbildung 94 B) im Gegensatz zu Fp1a (Abbildung 94 A). Der Anstieg des Acetatgehalts in Kultur Fp1b deutet auf eine Dezimierung acetoklastischer methanogener Archaea durch BrES hin, da Acetat in der ohne BrES inkubierten Kultur Fp1a nicht im Medium angereichert wurde (Abbildung 94 A). Eine Sequenzierung archaealer 16S rDNA (Kapitel 4.6) könnte diese Vermutung belegen. Keine Anreicherung von Succinat wurde mit Kultur Fp1F (Abbildung 83) gezeigt. Hier könnte ein reverser Elektronentransport (Stams und Plugge 2009) in Form einer intrazellulären Oxidation von Succinat zu Fumarat und Wasserstoff (Abbildung 25) dieses Substratverhalten erklären. Eine zusätzliche chemische Analyse des Formiatgehalts im Medium könnte diese Vermutung bestätigen, wenn dieser anstiege. Begleitend könnte die mögliche Anwesenheit einer Succinat Dehydrogenase ermittelt werden, wie sie in Syntrophobacter fumaroxidans oder Pelotomaculum thermopropionicum (Kosaka et al. 2008) vorliegt (Stams und Plugge 2009), um den reversen Elektronentransport zu belegen. Aus der syntroph propionsäureoxidierenden Mischkultur Fp1 und deren Unterkulturen wurden unterschiedliche Bakterien identifiziert (Tabelle 33 bis Tabelle 37) und Proteiniphilum acetatigenes Stamm Fp1a520 eigenisoliert (Abbildung 49). Proteiniphilum sp. wurde bereits auf Genusebene in der Unterkultur Fp1a1264 (Tabelle 36) identifiziert. Der Typstamm dieser Art wurde zuerst in einem Abwasseraufbereitungstank einer Brauerei gefunden (Chen und Dong 2005b). Proteiniphilum acetatigenesT DSM18083 beschleunigt den syntrophen Abbau von Propionsäure, wenn man ihn einer syntrophen Mischkultur aus Syntrophobacter sulfatireducens und beispielsweise Methanobacterium formicicum zusetzt (Chen und Dong 2005a, b). Der Mechanismus ist noch unbekannt. Daher ist eine Co-Kultivierung des Eigenisolats Proteiniphilum acetatigenes Stamm Fp1a520 mit einem propionsäureabbauenden Bakterium mit radioaktiv markierter Propionsäure als Substrat interessant, um dem Mechanismus dieser Interaktion herauszuarbeiten. Gegebenenfalls ist eine Tri-Kultivierung von Proteiniphilum acetatigenes Stamm Fp1a520 mit einem propionsäureabbauenden Bakterium mit einem zusätzlichen methanogenen Archaeon wie Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 oder Methanosarcina mazei Stamm HWS2.1 bei der Auflösung des Interaktionsmechanismus behilflich, da diese Archaea eventuell hemmende Produkte wie H2 oder Acetat zu Methan verarbeiten können. 5 DISKUSSION 245 Tabelle 54: Bakterien aus der syntroph propionsäureabbauenden Mischkultur Fp1 aus der NawaRo-Biogasanlage Theo & Ingrid & Alexander Friedrich GbR Kultur Bakterium Identifizierungsmethode Desulfovibrio aminophilusT DSM12254 Fp1 DGGE, Tabelle 33 Spirochaeta sp. Gracilibacter sp. Fp1a Klonierung, Tabelle 34 Spirochaeta sp. Aminobacterium colombienseT DSM12261 Escherichia coli K-12 Unterstrang MDS42 Proteiniphilum sp. Fp1a1264 Klonierung, Tabelle 36 Sphaerochaeta globus Stamm Buddy Wolinella succinogenesT DSM1740 Fp1a520 Proteiniphilum acetatigenesT DSM18083 DGGE, Tabelle 37 Fp1a63-L Geovibrio sp. Klonierung, Kapitel 4.5.2.1 Desulfovibrio aminophilusT DSM12254 (Beana et al. 1998) wurde in der propionsäureabbauenden Kultur Fp1 (Tabelle 33) mithilfe der bakteriellen 16S rDNA identifiziert (Tabelle 54). Der Mikroorganismus oxidiert Aminosäuren gekoppelt an die Sulfatreduktion, darunter auch Valin (Baena et al. 1998). Valin wurde in dieser Arbeit als einzige Aminosäure bei der chemischen Analyse von Aminosäuren im Reaktorfiltrat detektiert (Abbildung 125). Valin ist eine essentielle Aminosäure und wird daher unter anderem dem Futter für Nutztiere beigemischt (Jakubke und Jeschkeit 1982). Desulfovibrio aminophilus könnte aufgrund des im Reaktorfiltrats enthaltenen Valins angereichert worden sein. Mit dem Zusatz von Valin und Sulfat könnte Desulfovibrio aminophilus isoliert werden und gleichzeitig den vermuteten Grund der Anreicherung im PI-Medium experimentell beweisen. In den Kulturen Fp1 und Fp1a wurden verschiedene Sequenzen dem Genus Spirochaeta zugeordnet. Der Konsensussequenz (Abbildung 128) nächstverwandte Art T Spirochaeta caldaria DSM7334 (Tabelle 34) fermentiert Glukose neben einigen anderen Monosaccariden zu H2, CO2, Acetat und Lactat (Pohlschroeder et al. 1994). Der Mikroorganismus zählt zu den thermophilen Spirochäten mit einer Wachstumstemperaturuntergrenze von 25 °C. Mit Cellulose als einzige Kohlstoffquelle wächst Spirochaeta caldariaT DSM7334 nicht, da der Mikroorganismus keine cellulolytischen Enzyme besitzt. Der Spirochät bewirkt einen schnelleren Abbau von Cellulose in Co-Kultur mit Clostridium thermocellum, indem der Spirochät Disaccharide (Cellobiose) verwertet, die vom Clostridium extrazellulär aus Cellulose gebildet wurden (Pohlschroeder et al. 1994). Nach Kultivierung in stärkehaltigem Spirochäten-Medium 1264 wurde in dieser Arbeit die Art Sphaerochaeta globus Stamm Buddy molekularbiologisch in Kultur Fp1a1264 identifiziert. Sphaerochaeta globosaT DSM22777 (Stamm Buddy) fermentiert Monosaccharide zu Ethanol, Acetat und Formiat, wächst aber auch mit löslicher Stärke (Ritalahti et 5 DISKUSSION 246 al. 2012). Damit kann dieser Mikroorganismus ebenfalls zur Acetatproduktion aus Monomeren während der ersten Fermentationsstufe beitragen. Mit löslicher Stärke wurde in dieser Arbeit Sphaerochaeta globosa aus der syntroph propionsäureoxidierenden Kultur Fp1a angereichert. Mit Glukose statt Stärke im Medium könnte Spirochaeta caldaria aus dieser Kultur angereichert werden. In Tabelle 54 ist gezeigt, dass ein Bakterium der Gattung Gracilibacter in der syntroph propionsäureoxidierenden Unterkultur Fp1a durch Klonierung identifiziert wurde. Die höchste Übereinstimmung (91 %, Tabelle 34) hatte das Fragment mit der Sequenz von Gracilibacter thermotoleransTDSM17427 (Lee et al. 2006). Gracilibacter thermotoleransT DSM17427 fermentiert Glukose neben anderen Monosaccariden zu Acetat, Lactat und Ethanol, womit der Mikroorganismus bei der primären Fermentationsstufe der Biogasproduktion beteiligt ist, acetoklastischen Methanbildnern Substrat in Form von Acetat zu liefern. Die Monosaccaride könnten in der propionsäureabbauenden Kultur Fp1a aus der Spaltung von Polysacchariden während der Inkubation stammen, da im Reaktorfiltrat keine Monosaccaride detektiert wurden (siehe dazu Abbildung 126). Mikroorganismen der Gattung Gracilibacter haben hohe Ähnlichkeiten zu Clostridien, was in dieser Arbeit durch die molekularbiologische Analyse des Musters aus der Unterkultur Fp1a1264 (Tabelle 34) bestätigt wurde. Isolieren ließe sich der Mikroorganismus durch Erhöhung der Inkubationstemperatur auf 45 °C. Der Mikroorganismus Aminobacterium colombienseT DSM12261 wurde in der Unterkultur Fp1a1264 (Tabelle 36) molekularbiologisch nachgewiesen. Aminobacterium colombiense kann Aminosäuren sowohl primär als auch sekundär fermentieren und Acetat und H2 beziehungsweise in Co-Kultur mit dem hydrogenotrophen methanogenen Archaeon Methanobacterium formicicum syntroph hauptsächlich Isobutyrat und ein wenig Acetat bilden (Baena et al. 1998). Messungen des Acetatgehalts im Kulturüberstand der Co-Kultur Aminobacterium colombienseT DSM12261 mit dem Eigenisolat Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 (Abbildung 105 B) zeigten nicht eindeutig, dass Acetat akkumulierte, da der Acetatgehalt im Verhältnis vergleichbar mit dem der Einzelkulturen (Abbildung 104) sowie in Co-Kultur mit Methanosarcina mazei Stamm HWS2.1 (Abbildung 105 A) war. Aufschluss könnten Messungen des potenziellen Substrats Valin und des angenommenen Produktes Isobutyrat im Kulturüberstand der Co-Kultur Aminobacterium colombienseT DSM12261 mit Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 bringen. Außerdem könnte so geklärt werden, ob sich Aminobacterium colombiense (Tabelle 35) aufgrund des Gehalts von Valin im Reaktorfiltrat (Abbildung 125) anreicherte, wie bereits bei Desulfovibrio aminophilus (Tabelle 33) vermutet wurde. Eine Inkubation mit radioaktiv markiertem Valin könnte Aufschluss über den syntrophen Stoffwechselweg geben. Escherichia coli wurde in der Unterkultur Fp1a1264 (Tabelle 35), wie auch in den Unterkulturen Gp1b1264 (Tabelle 43) und Ap1a1264 (Tabelle 45) identifiziert. Escherichia coli ist unter anderem befähigt, Fumarat zu Succinat fermentieren, um Energie mit einer protomotorischen Kraft 5 DISKUSSION 247 herzustellen (Kröger et al. 1992). Diese Fähigkeit von Escherichia coli könnte einen Einfluss auf die in dieser Arbeit ermittelten Substratkonzentrationen in Abbildung 83 und Abbildung 84 gehabt haben. Dharmadi et al. (2006) zeigte, dass Escherichia coli Glycerol hauptsächlich zu Ethanol, Succinat aber auch zu Acetat, CO2 und H2 fermentiert. Glycerol wird der Biomasse im Fermenter häufig als leistungssteigernder Zusatz zugegeben (Department für Nachhaltige Agrarsysteme, Institut für Landtechnik, 2004). Die Anwesenheit von Glycerol im Reaktorfiltrat (Abbildung 126) kann ein Grund für die Anreicherung von Escherichia coli in den Mischkulturen sein. Chemisch analytische Messungen des Gehalts des angenommenen Substrats Glycerol und das daraus gebildete Hauptprodukt Ethanol können zum Nachweis dieses Anreicherungsgrundes führen. In der Unterkultur Fp1a1264 (Tabelle 36) war Wolinella succinogenesT DSM1740 anwesend. Dieser Mikroorganismus reduziert gleichzeitig Fumarat zu Succinat, Nitrat zu Nitrit und Nitrit zu Ammoniak mit H2 oder Formiat als Elektronen Donoren (Kern und Simon 2009, Kröger et al. 1992 und 2002, Simon 2002). Bei Anwesenheit von Schwefel reduziert Wolinella succinogenesT DSM1740 ausschließlich Schwefel mit Sulfid zu Polysulfid. Polysulfid hemmt die Umsetzung von Fumarat und Nitrat (Lorenzen et al. 1993). In Cokultur von Wolinella succinogenes mit Geobacter sulfurreducens oxidiert G. sulfurreducens Acetat (Cord-Ruwisch et al. 1998) mit Cystein als Elektronenüberträger (Kaden et al. 2002). Der Umsatz des alternativen Substrats Fumarat in Kultur Fp1 wurde in dieser Arbeit gezeigt (Abbildung 83 und Abbildung 84), dabei werden Wolinella succinogenesT DSM1740 und der ebenfalls in Kultur Fp1a1264 identifizierte Escherichia coli maßgeblich beteiligt gewesen sein. Wolinella succinogenes war außerdem daran beteiligt, den Wasserstoffpartialdruck gering zu halten, unterstützt von möglich anwesenden hydrogenotrophen methanogenen Archaea (archaeale 16S rDNA in Mischkultur Fp1a, siehe Kapitel 4.6, Methangehalt der Unterkulturen nicht gezeigt). Geovibrio sp. wurde in der Unterkultur Fp1a63-L auf Genusebene zu Geovibrio thiophilusT DSM11263 zugeordnet und in Unterkultur Gp1b1264 identifiziert(Tabelle 42). Geovibrio thiophilusT DSM11263 ist befähigt, Acetat zu CO2 zu oxidieren (Janssen et al. 2002). Dabei werden Fumarat zu Succinat, Nitrat über Nitrit zu Ammoniak oder DMSO zu Dimethylsulfid reduziert. Im Beisein von Schwefel wird dieser mit H2 zu Sulfid reduziert, wobei Formiat oder Acetat zu CO2 reduziert werden. Acetat reicherte sich nicht im Kulturüberstand der Mischkultur Fp1a an, obwohl der Propionatgehalt sank (Abbildung 94 A). Mit Geovibrio thiophilus lebt ein Mikroorganismus in Mischkultur Fp1, der in versäuerten Fermentern den Abbau von Acetat von übernehmen kann, wenn keine acetoklastischen methanogenen Archaea anwesend sind (Kapitel 1.5.2.4, Karakashev et al. 2006, Schnürer et al. 1999). Ob dieser Fall auch auf Mischkultur Fp1a zutrifft, kann durch Sequenzierung der bereits in dieser Arbeit in kleinen Mengen amplifizierter archaealen 16S rDNA (Kapitel 4.6) gezeigt werden. 5 DISKUSSION 248 5.2.2 Bakterien aus der syntroph propionsäureoxidierenden Mischkultur Wp1 Auch in der syntroph propionsäureoxidierenden Mischkultur Wp1 (Tabelle 38) wurde das Wasserstoff verbrauchende Bakterium Wolinella succinogenesT DSM1740 identifiziert, das bereits in Kapitel 5.2.1 diskutiert wurde. In Abbildung 85 ist gezeigt, dass die Fumaratkonzentration ab der 5ten Inkubationswoche abnahm. Daran kann Wolinella succinogenes beteiligt gewesen sein. Tabelle 55: kultivierte Bakterien aus der ersten syntroph propionsäureabbauenden Mischkultur Wp1 aus der NawaRo-Biogasanlage Hubert Wagner und Sohn GbR Kultur Bakterium Identifizierungsmethode T Wolinella succinogenes DSM1740 Wp1 T Tepidanaerobacter acetatoxydans DSM21804 DGGE, Tabelle 38 Tepidanaerobacter acetatoxydansT DSM21804 (Westerholm et al. 2011) wurde bei den molekularbiologischen Analysen in der Mischkultur Wp1 (Tabelle 38) identifiziert. Dieser obligat anaerobe Mikroorganismus bildet Endosporen (nicht gezeigt). Tepidanaerobacter acetatoxydans setzt Monosaccaride und Fettsäuren zu Acetat um (Westerholm et al. 2011). Tepidanaerobacter acetatoxydans ist bei der Bildung von Biogas beim ersten Fermentationsschritt (Abbildung 19) beteiligt, in dem Acetat gebildet wird. Außerdem verstoffwechselt Tepidanaerobacter acetatoxydans Glycerol zu Acetat. In dieser Dissertation wurde Glycerol im Reaktorfiltrat detektiert (Abbildung 126). Durch Modifikation der im Institut möglichen Detektionsmethoden sollte quantitativ ermittelt werden können, ob und in welchen Mengen Glycerol als Nährstoff von den syntroph propionsäureoxidierenden Kulturen verwendet wird. Einen Ansatz zur Glycerol Verwertung beschreibt Dinkel et al. (2010). Hier wird die Verwertung von Glycerol durch acidogene Bakterien mit Unterstützung von Sulfatreduzierern ohne Anwesenheit methanogener Archaea erläutert. Zunächst verwerten acidogene Bakterien (XA) Glycerol (C3H8O3) zu Acetat (CH3COOH). Die freie Enthalpie ( G0) wurde für T = 25 °C berechnet. XA C3H8O3 + 2 H2O CH3COOH + 3 H2 + H2CO3 G0 = -59 kJ · mol-1 Daraufhin verwenden sulfatreduzierende Bakterien (XSRB) das Acetat zur Sulfatreduktion, in dem sie das Acetat oxidieren. Diese Reaktion steht in Konkurrenz zur acetoklastischen Methanogenese (Kapitel 1.9.1.1.2). XSRB C3H8O3 + 0,75 SO4 2– G0 = -143 kJ · mol-1 CH3COOH + 0,75 HS– + 0,75 OH– + H2CO3 + 0,25 H2O 5 DISKUSSION 249 Der von den acidogenen Bakterien produzierte Wasserstoff wird ebenfalls von Sulfatreduzierern verwertet. Diese Reaktion steht ebenfalls in Konkurrenz zur hydrogenotrophen Methanogenese (Kapitel 1.9.1.1.1). XSRB 4H2 + SO4 2– HS– + 3H2O + OH– G0 = -112 kJ mol-1 Die Bruttoreaktion sieht ohne Berücksichtigung der konkurrierenden Methanogenese wie folgt aus. XSRB 2– C3H8O3 + 1,25 SO4 0,5 CH3COOH + 1,5 H2CO3 + 1,25 HS– + 0,75 OH– + 0,25 H2O + 0,5 HCO–3 Die Ausführungen (Dinkel et al. 2010) übertragen auf das in dieser Arbeit bearbeitete Biogas herstellende System, könnten gezielte Tri- oder Co-Kulturen die Funktion des leistungssteigernden Zusatzes von Glycerol mikrobiologisch erklären. Mit einer Tri-Kultur aus Tepidanaerobacter acetatoxydans DSM21804 als Glycerol verwertender Mikroorganismus, Geovibrio thiophilus DSM11263 – oder wahlweise Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 - als Acetat verwertender Mikroorganismus und dem hydrogenotroph Methan produzierenden Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 könnte dies gezeigt werden. Parallel besteht die Möglichkeit die Glycerolverwertung im Biogas Fermenter mit einer Co-Kultur aus Tepidanaerobacter acetatoxydans mit Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 zu belegen, da dieses methanogene Archaeon sowohl acetoklastisch als auch hydrogenotroph Methan produziert. Tepidanaerobacter acetatoxydans oxidiert außerdem syntroph Acetat zu CO2 in Co-Kultur mit hydrogenotroph methanogenen Archaea mithilfe der Formyltetrahydrofolat Synthetase (FTHFS, Westerholm et al. 2011) aus dem Wood-Ljungdahl-Weg (Acetyl-CoA-Weg, Kapitel 1.8) und wird somit zu den syntroph Acetat oxidierenden Bakterien (SAOB) gezählt. Damit deckt Tepidanaerobacter acetatoxydans eine weitere Möglichkeit ab, Substrat für hydrogenotrophe methanogene Archaea zu bilden (Kapitel 1.9.1.1.1), zu denen Vertreter der Gattungen Methanobacterium, Methanoculleus sowie Methanosarcina zählen (Tabelle 31). Die Acetatoxidation steht in Konkurrenz zur acetoklastischen Methanogenese (Kapitel 1.9.1.1.2, Lee und Zinder 1988), welche von Methanosaeta aber auch von Methanosarcina (Tabelle 31) durchgeführt wird. Tepidanaerobacter acetatoxydans fermentiert sowohl primär Monosaccaride und Fettsäuren zu Acetat als auch sekundär Acetat mit syntropher Bildung von CO2. 5 DISKUSSION 250 5.2.3 Bakterien aus der syntroph propionsäureoxidierenden Mischkultur Wp2 Die aus Unterkultur Wp2a1264 identifizierten Bakterien spiegeln einen Teil der in Wp2 lebenden Bakterien wieder. Tabelle 56: unterkultivierte Bakterien aus der zweiten syntroph propionsäureabbauenden Mischkultur Wp2 aus der NawaRo-Biogasanlage Hubert Wagner und Sohn GbR Kultur Bakterium Identifizierungsmethode T Aminobacterium colombiense DSM12261 T Wp2a1264 Wolinella succinogenes DSM1740 Klonierung, Tabelle 40 Thermotogaceae bacterium SulfLac1 Petrotoga mobilisT SJ95 Aminobacterium colombienseT DSM12261, der Acetat- und H2-Produzent, wurde in Unterkultur Wp2a1264 (Tabelle 39) identifiziert. Eine Beteiligung dieses Mikroorganismus an der Umsetzung von Aminosäuren kann weiterführend wie in Kapitel 5.2.1 beschrieben experimentell bewiesen werden. Die molekularbiologische Identifikation der Unterkultur Wp2a1264 (Tabelle 39) wies Wolinella succinogenesT DSM1740 vor. In dieser Arbeit wurde die Umsetzung von Fumarat in Kultur Wp2F anhand der Inkubation mit dem alternativen Nährstoff Fumarat gezeigt (Abbildung 86 und Abbildung 87), wobei Wolinella succinogenesT DSM1740 beteiligt gewesen sein wird (siehe dazu Kapitel 5.2.1). Ein Bakterium der Familie Thermotogaceae (Stamm SulfLac1) wurde in Kultur Wp2a1264 (Tabelle 39) molekularbiologisch identifiziert. Vertreter dieser Familie leben thermophil bis hyperthermophil fermentativ und werden für gewöhnlich in hydrothermalen Quellen gefunden (Dahle et al. 2011). Auf Grund der Thermophilie könnte dieses Bakterium angereichert und isoliert sowie auf Artebene identifiziert werden. 5 DISKUSSION 251 5.2.4 Bakterien aus der syntroph propionsäureoxidierenden Mischkultur Gp1 Die bakterielle 16S rDNA der Unterkulturen Gp1a (Tabelle 41) und Gp1b1264 (Tabelle 42) aus der syntroph propionsäureabbauenden Mischkultur Gp1 (Tabelle 14) wurde identifiziert. Tabelle 57: kultivierte Bakterien aus einer syntroph propionsäureabbauenden Mischkultur aus der NawaRo-Biogasanlage BioEnergie Glahn Kultur Bakterium Identifizierungsmethode Gp1a Desulfovibrio oxamicus DSM1925 T Klonierung, Tabelle 41 T Aminobacterium colombiense DSM12261 Parvimonas sp. Gp1b1264 Geovibrio thiophilusT DSM11263 Klonierung, Tabelle 43 Escherichia coli Spirochaeta sp. Desulfovibrio oxamicusT DSM1925 wurde in der Kultur Gp1a (Tabelle 41) angereichert. Der Mikroorganismus oxidiert kurzkettige Fettsäuren und Alkohole in Verbindung mit der Sulfatreduktion teilweise unvollständig zu Acetat (López-Cortés et al. 2006). Von der Sulfatreduktion unabhängig, wächst der Mikroorganismus auf Cholin und Pyruvat (Postgate und Campbell 1966). Cholin wird in Futtermitteln zugesetzt (Deutscher Verband Tiernahrung e. V. 2012), da Cholin den Abbau von Lipiden im Dünndarm unterstützt. Cholin im Reaktorfiltrat könnte eine weitere attraktive Nährstoffquelle für anaerob Cholin verwertende Mikroorganismen wie Desulfovibrio oxamicus darstellen, daher sollte weiterführend der Cholin Gehalt des Reaktorfiltrats chemisch analysiert werden. Mit Cholin als einziger Substratquelle einem Medium ohne Reaktorfiltrat könnte Desulfovibrio oxamicus aus der propionsäureabbauenden Mischkultur Gp1b isoliert werden. Mit dieser Isolationsmethode könnte der Grund der Anreicherung von Desulfovibrio oxamicus in der propionsäureabbauenden Mischkultur Gp1b gezeigt werden. Mit weiter führenden definierten CoKultivierungen kann die Aufgabe dieses Sulfatreduzierers im Konsortium mit begleitenden chemischen Analysen ermittelt werden. In Unterkultur Gp1b1264 (Tabelle 43) war Aminobacterium colombienseT DSM12261 (Beschreibung siehe Kapitel 5.2.1.) ebenfalls anwesend. Gp1b1264 ist neben Fp1a1264 (Tabelle 54) und Wp2a1264 (Tabelle 56) die dritte Unterkultur aus unterschiedlichen Biogasanlagen (Tabelle 18), was ihn zu einem interessanten Mikroorganismus bei der Bildung von Biogas macht. In dieser Arbeit wurden Sequenzen aus Unterkultur Gp1b1264 mit den Mustern g, g2 und g3 (Abbildung 53) der Gattung Parvimonas (Tabelle 42, Prévot 1933, Tindall und Euzéby 2006) zugeordnet. Zwei mit dem Restriktionsmuster ‚g‘ und ‚g2‘ aus der Unterkultur übereinstimmende Muster (Muster 12 und 9, Abbildung 44 A) wurden bereits im Fermenter der BGA BioEnergie Glahn 5 DISKUSSION 252 gezeigt. Parvimonas sp. sind nah mit den Clostridiaceae verwandt (Murdoch und Shah 1999). Mikroorganismen der Gattung Parvimonas fermentieren hauptsächlich Pepton und Aminosäuren größtenteils zu Acetat, aber auch zu Succinat und Lactat. Mikroorganismen der Gattung Parvimonas können somit ebenfalls eine Rolle zur Produktion von Acetat aus fermentativen Stoffwechselprodukten für die Methanbildung übernehmen. Für die Kultur Gp1 wurde die Fumaratreduktion vermutlich durch Geovibrio thiophilus in Abbildung 88 und in Abbildung 89 mit Inhibierung der Methanogenese gezeigt. Die beispielsweise in Abbildung 89 (Gp1FB) gezeigte verhältnismäßig geringe Akkumulation von Acetat in Bezug auf den Abbau von Fumarat deutet auf einen Abbau von Acetat hin. Der in Kultur Gp1b1264 identifizierte Geovibrio thiophilus könnte diese Aufgabe übernommen haben, da durch die Zugabe von BrES die Methanogenese gehemmt wurde, so dass keine acetogen methanproduzierenden Archaea wachsen konnten (Kapitel 4.6). Tri-Kulturen in PI-Medium (eventuell auch ohne Propionsäure) mit beispielsweise Clostridium sartagoformeT Stamm Ap1a520 und jeweils einem eigenisolierten hydrogenotroph Methanogenese betreibenden Archaeon könnten durch chemische Analysen des Acetatgehalts im Medium und des Gehalts von Methan in der Gasphase über der Kultur Aufschluss bieten, ob Geovibrio thiophilusT DSM11263 ein geeigneter CO2 Produzent aus den von Clostridium sartagoforme Stamm Ap1a520 gebildeten Acetat und H2 für die Methanogenese aus CO2 und H2 ist. Falls die chemischen Analysen diese Theorie bestätigen, könnte eine solche Tri-Kultur eingesetzt werden, um einen mit Cellulosefasern belasteter oder Acetat versäuerter Biogasfermenter zur Biogasherstellung zu remobilisieren (Schürer et al. 1994). Escherichia coli wurde in der Unterkultur Gp1b1264 (Tabelle 43), wie auch in den Unterkulturen Fp1a1264 (Tabelle 35) und Ap1a1264 (Tabelle 45) identifiziert. Die möglichen Aufgaben von Escherichia coli wurden in Kapitel 5.2.1 bereits diskutiert. Weitere partielle Sequenzen der 16S rDNA aus Gp1b1264 (Tabelle 42) wurden der Gattung Spirochaeta zugeordnet (siehe auch Kultur Fp1a, Tabelle 33). Spirochaeta sp. könnten aufgrund von Cellobiose oder Stärke im Reaktorfiltrat des PI-Mediums angereichert worden sein. Der Gehalt von Cellobiose oder Stärke wurde bisher nicht im Reaktorfiltrat nachgewiesen (Kapitel 4.8.4). Die Gehaltsbestimmung von Cellobiose und Stärke klärt ob diese Di- beziehungsweise Polysaccharide als Substrate in syntroph propionsäureoxidierenden Kulturen verwendet werden. Mit Stärke im DSMZ-Medium 1264 wurden Spirochaeta in Kultur Gp1b1264 (Tabelle 42) angereichert. 5.2.5 Bakterien und eigenisolierte Bakterien aus der syntroph propionsäureoxidierenden Mischkultur Ap1 In DSMZ-Medium 520 wurde Clostridium sartagoforme Stamm Ap1a520 (Tabelle 46) aus der syntroph propionsäureoxidierenden Kultur Ap1a (Abbildung 98 A) reinisoliert (Abbildung 56). Bereits 5 DISKUSSION 253 in der Unterkultur Ap1a1264 (Tabelle 44) wurde der primär fermentierende Mikroorganismus Clostridium sartagoformeT DSM1292 identifiziert. Tabelle 58: kultivierte und isolierte Bakterien aus einer syntroph propionsäureabbauenden Mischkultur aus der NawaRo-Biogasanlage Arenrath Kultur Ap1a1264 Bakterium Identifizierungsmethode T Clostridium sartagoforme DSM1292 Escherichia coli Klonierung, Tabelle 45 Proteiniphilum sp. Ap1a520 Clostridium sartagoformeT DSM1292 DGGE, Tabelle 46 Clostridium sartagoformeT DSM1292 ist ein obligat anaerobes Bodenbakterium, welches Sporen terminal mit einer pfannenförmigen Ausbuchtung bildet (Partansky und Henry 1935). Dieser Mikroorganismus wurde in Unterkultur Ap1a1262 (Tabelle 44) aus der propionsäureabbauenden Mischkultur Ap1a identifiziert und in DSMZ-Medium 520 isoliert (Stamm Ap1a520, Tabelle 46). Kultur Ap1 zeigte einen stetigen Abbau von Fumarat (Abbildung 90 und Abbildung 91). Durch Kultivierung des Isolates Clostridium sartagoforme Stamm Ap1a520 mit Fumarat in PI-Medium als zusätzlichen Nährstoff, ließe sich zeigen, ob dieser Mikroorganismus Fumarat umsetzt, wie einige mit ihm verwandten Clostridien (Matthies et al. 1993). Dabei sollte zusätzlich der Pyruvatgehalt im Medium detektiert werden, da in der Kultur Ap1F kaum Succinat im Medium akkumulierte (Abbildung 90). Bei hohem H2-Partialdruck bilden Spezies der Gattung Clostridium vorzugsweise Ethanol und Lactat (Almarsdottir et al. 2010) beispielsweise aus Cellulose. Cellulose ist ein Bestandteil von Pflanzen. Pflanzliche Partikel waren im Reaktorfiltrat mikroskopisch sichtbar (Abbildung 35 D). Diese pflanzlichen Partikel könnten zur Anreicherung von Clostridium sartagoforme in Kultur Ap1a geführt haben. Escherichia coli wurde in der Unterkultur Ap1a1264 (Tabelle 45) wie auch in den Unterkulturen Fp1a1264 (Tabelle 35) und Gp1b1264 (Tabelle 43) identifiziert. Dieser Mikroorganismus kann ebenfalls zum Abbau des Fumarats in den Kulturen Ap1F (Abbildung 90) und Ap1FB (Abbildung 91) beigetragen haben (Kröger et al. 1992). Aus den HPLC-Messungen der Unterkulturen Ap1F (Abbildung 90) und Ap1FB (Abbildung 91) ging hervor, dass in Kultur Ap1F Acetat ab Woche 4 abgebaut wurde und in Kultur Ap1FB akkumulierte, wobei in beiden Kulturen Propionsäure abgebaut wurde. Dies deutet auf Anwesenheit acetoklastisch methanogener Archaea hin. In Kultur Ap1FB wurde Propionsäure abgebaut und Acetat reicherte sich im Medium an, da acetoklastische methanogene Archaea durch BrES inhibiert wurden (Kapitel 1.7.2 und 3.3.1). Propionsäure wurde in Ap1FB weiterhin abgebaut, da möglicher Weise Escherichia coli den beim Abbau von Propionsäure entstandenen Wasserstoff durch den Abbau von Fumarat verbrauchte oder eventuell anwesende hydrogenotrophe methanogene Archaea (Kapitel 4.6) zu Methan umsetzen. 5 DISKUSSION 254 5.3 Titer der syntroph propionsäureoxidierenden Mischkulturen und Reinkulturen agglomerierender methanogener Archaea Sowohl die Bestimmung der Gesamtkeimzahl der syntroph propionsäureabbauenden Anreicherungskulturen als auch der Titer der meisten methanogenen Archaea wurden nicht bestimmt. Die Mikroorganismen aus den Anreicherungskulturen unterschieden sich in der Gestalt nicht von Pflanzenbestandteilen (Abbildung 35). Methanogene Archaea agglomerierten zu Knäulen (Abbildung 37) aus Ketten zusammenhängenden Mikroorganismen oder Paketen (Abbildung 40). Klocke et al. (2009a) entwickelte eine Methode, bei der ein enzymatischer Verdau von Exopolysacchariden und eine Behandlung mit Ultraschall kombiniert wurden. Basierend auf dieser Methode kann in Zukunft die Trennung von Bakterien und Partikeln und insbesondere der acetoklastischen Archaea voneinander optimiert werden, um so die Möglichkeit zu erhalten den Titer wie bei Methanoculleus bourgensis Stamm TAF1.1 (Abbildung 119) zu bestimmen. 5.4 Isolierte und angereicherte methanogene Kulturen aus Laborfermentern Aus einem mesophilen Laborfermenter wurden von Klocke et al. (2007) zwei Klonsequenzen zu 97 % bis 98 % zu Methanosarcina acetivorans C2A, Methanosarcina mazei DSM 9195 und zu Methanosarcina barkeriT DSM 800 molekularbiologisch zugeordnet. Andere Klonsequenzen hatten die höchste Übereinstimmung (86 %) mit Methanobacterium formicicumT DSM 1535. Eine Klonsequenz wurde zu 93 % Methanosaeta concilii zugeordnet. In dieser Arbeit wurden aus zwei thermophilen Laborfermenterproben einer anderen Studie des Leibniz-Instituts für Agrartechnik Potsdam-Bornim e.V. (ATB) Abteilung Bioverfahrenstechnik AG Molekularbiologie (Laborfermenter siehe Klocke et al. 2007, 2009a, b, Nettmann et al. 2010) die hydrogenotrophe Kultur Methanobacterium formicicum Stamm LFP4.1 (Abbildung 36 D, Abbildung 37, Abbildung 59, Abbildung 61 C, Tabelle 51) und das methylotrophe Archaeon Methanomethylovorans sp. Stamm LFP3.1 reinisoliert (Abbildung 41, Abbildung 69, Abbildung 71, Tabelle 51 und Tabelle 52). Eine Anreicherung eines Mikroorganismus der Gattung Methanomethylovorans wurde von de Bok et al. (2006) aus einer mit Methanthiol versetzten Probe einer Kläranlage einer Papierfabrik beschrieben. Um die Charakterisierung dieser molekularbiologisch nicht eindeutig identifizierbaren Reinkultur fortzuführen, kann Methanomethylovorans sp. Stamm LFP3.1 ebenfalls Methanthiol zugegeben werden, um Wachstum auf diesem Substrat zu ermitteln. Stamm Methanosarcian mazei LFP2.1 der Gattung Methanosarcina wurde aus einer mesophilen Laborfermenterprobe eines Laborfermenters 5 DISKUSSION 255 des Leibniz-Instituts für Agrartechnik Potsdam-Bornim e.V. (ATB) Abteilung Bioverfahrenstechnik AG Molekularbiologie angereichert. Durch weitere Kultivierung in Medium 318 mit Methanol als einzigem Substrat kann auch dieser Mikroorganismus reinkultiviert werden. Somit wurden in dieser Arbeit zwei der vier von Klocke et al. (2007) molekularbiologisch identifizierten Gattungen (Methanobacterium und Methanosarcina) und ein molekularbiologisch nicht erfasstes Archaeon des Genus Methanomethylovorans bis auf Methanosarcina reinkultiviert. 5.5 Chemisch analysierte Mischkulturen syntroph propionsäureoxidierender Mikroorganismen Die syntroph ablaufende sekundäre Fermentation (Kapitel 1.5.2.3) ist von „Inter-SpeciesElektronentransfers” (Stams und Plugge 2009) abhängig. Bei diesem Vorgang werden Elektronen zwischen sehr unterschiedlichen Mikroorganismen übertragen. Syntrophe Bakterien und methanogene Archaea leben nicht weiter als wenige Mikrometer voneinander entfernt (Klocke et. al. 2009b). Ein Elektronentransfer kann über den Nitrat- und Sulfatzyklus oder die Methanogenese (Weimer und Zeikus 1977, Smiti et al. 1986) mithilfe von Wasserstoff (Schink 2006, Boone et al. 1989, Dong und Stams 1995, Schmidt und Ahring 1995), Formiat (De Bok et al. 2004) oder auch Cystein (Schink und Stams 2006) als Elektronenüberträger stattfinden. Die anaerobe Oxidation von Propionsäure ist eine sekundäre Fermentation, die nur syntroph abläuft. Mit Kultur Gp1 und dem Eigenisolat Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 wurde gezeigt, dass die Propionsäureoxidation durch das hydrogenotrophe methanogene Archaeon verbessert wurde (pinke Linie, Abbildung 80). Diese Versuchsreihe zeigte auch, dass methanogene Archea nachträglich einem Propionsäure übersäuerten System zugesetzt den Abbau von Propionsäure ebenfalls begünstigen (orange Linie, Abbildung 80). Weitere mögliche Inter-Species- Elektronentransfers werden im Folgenden mit unterschiedlichen in dieser Arbeit identifizierten und teilweise eigenisolierten anaeroben Mikroorganismen besprochen. 5.6 Substrate und Produkte definierter Co-Kulturen Die bakteriellen Typstämme von Mikroorganismen, die häufig oder in unterschiedlichen syntroph propionsäureoxidierenden Kulturen identifiziert worden sind, wurden in definierte Co-Kulturen mit eigenisolierten methanogenen Archaea inkubiert, um zu ermitteln, ob sich das Substratverhalten der anaeroben Bakterien in Co-Kultur im Vergleich zur Einzelkultivierung unterscheidet und eventuell ein „Inter-Species-Elektronentransfer“ zwischen den Mikroorganismen vorliegt. 5 DISKUSSION 256 5.6.1 Co-Kulturen mit Aminobacterium colombienseT DSM12261 Die chemischen Analysen des kultivierten Aminobacterium colombiense DSM12261 mit (Abbildung 105) und ohne methanogenen Eigenisolaten (Abbildung 104) zeigten geringfügige Anstiege der Konzentrationen von Acetat in den Medien, welche bei der Co-Kultivierung mit den methanogenen Eigenisolaten von der syntrophen Oxidation des im Reaktorfiltrat vorhandenen Valins (Abbildung 125, Baena et al. 1998) herrühren könnte. Messungen des Valin- und des Isobutyratgehalts während der Inkubation von Aminobacterium colombienseT DSM12261 mit und ohne hydrogenotroph Methanbildenden Archaea können den Hinweis eines „Inter-Species- Elektronentransfers“ chemisch analytisch bestätigen. 5.6.2 Co-Kulturen mit Wolinella succinogenesT DSM1740 Co-Kultivierung von Wolinella succinogenesT DSM1740 mit Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 zeigte eine Akkumulation von Acetat (Abbildung 103 B). Zur Herstellung von Acetat wird unter anderem der Enzymkomplex Kohlenmonoxid Dehydrogenase/ Acetyl-CoA Synthase (CODH/ ACS) benötigt. Dieser Enzymkomplex bildet das Schlüsselenzym des Acetyl-CoA-Wegs (Kapitel 1.8). In Wolinella succinogenes wurde durch Sequenzierung des Gesamtgenoms eine Acetyl-CoA Synthetase gefunden jedoch keine CO Dehydrogenase (CODH) und keine Acetat Kinase (Baar et al. 2003). Für Methanobacterium formicicum ist bisher ebenfalls nicht bekannt, dass dieses methanogene Archaeon einen CODH/ ACS Komplex besitzt. Methanosarcina barkeri verwendet die bifunktionale Carboxy-Dehydrogenase/Acetyl-CoA-Synthase, welche sowohl die Aktivierung von Acetat für die Methanproduktion katalysiert (Kapitel 1.9.1.1.2) als auch bei der CO2 Fixierung über Acetyl-CoA beteiligt sein kann. Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 baut Acetat ab (Abbildung 103 A), da Acetat nicht wie in der Co-Kultur von Wolinella succinogenesT DSM1740 mit Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 angereichert wird (Abbildung 103 B). Es besteht die Möglichkeit, dass die Methanogenese von Methanosarcina barkeri aufgrund von Nitrat (3 mmol L-1, Klüber und Conrad 1998), Nitrit (50 µmol L-1, Klüber und Conrad 1998), Stickstoffmonoxid (0,9 µmol L-1, Klüber und Conrad 1998), Distickstoffmonoxid (130 µmol L-1, Klüber und Conrad 1998) oder Ammoniak (176 mmol NH3-N L-1, Angelidaki und Ahring 1993, 117 mmol NH3-N L-1, Sawayama et al. 2004) gehemmt sein sollte, könnte die Energiegewinnung ausgehend von AcetylCoA über phosphoryliertes Acetat zu Acetat durchgeführt werden. Die Voraussetzung dafür ist, dass die Methanogenese nicht auch die Produktion von Acetat gehemmt wird, wie Westermann et al. (1989) mit 2-Bromoethansulfonsäure ermittelten. Auch kann die Methanbildung von Methanobacterium formicicum durch flüchtige Fettsäuren oder Ammoniak gehemmt werden (Hobson und Shaw 1976). Wolinella succinogenesT DSM1740 sollte erneut mit Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 sowie Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 co-kultiviert werden, da 5 DISKUSSION 257 ermittelt werden sollte, ob eine Hemmung der Methanogenese durch erhöhte Konzentrationen von Nitrat, Nitrit oder Ammoniak im Medium vorliegt, gebildet durch Wolinella succinogenesT DSM1740. 5.6.3 Co-Kulturen mit Clostridium sartagoformeT DSM1292 Co-Kulturen von Clostridium sartagoformeT DSM1292 mit Methanobacterium formicicum Stamm TAF1 beziehungsweise Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 zeigten in dieser Arbeit eine erhöhte Produktion von Acetat (Abbildung 101 A, B). Das Acetat wurde von Methanosarcina barkeri Stamm HWS2.1 abgebaut (Abbildung 101 A), da Methan gebildet wurde (Abbildung 111). Bei CoKultivierung thermophiler Vertreter der Gattung Clostridium wurde von Weimer und Zeikus (1977) und Smiti et al. (1986) beschrieben, dass in einer anaeroben Kultur mit methanogenen Archaea ein durch die von H2 und CO2 ausgehende Methanogenese erhöhter Elektronengehalt zur Verfügung steht. Mit Clostridium tyrobutyricum wurde eine pH-Abhängigkeit der Produkte ermittelt (Jo et al. 2008)Dies war der Grund, dass bei dem Clostridium eine Verschiebung der Umsetzung des AcetylCoA von Ethanol zu Acetat vollzogen wurde. Dies könnte auch der Fall in der hier Co-Kultivierten Art Clostridium sartagoformeT DSM1292 mit den eigenisolierten methanogenen Archaea gewesen sein. Die Annahme untermauern könnten zukünftige Messungen des Ethanol und Butyrat Gehalts in Abhängigkeit der Inkubationsdauer der definierten Mischkulturen. 6 ZUSAMMENFASSUNG 258 6 Zusammenfassung Die vorgelegte Dissertation behandelte die Aufklärung des Populationsmix anaerober Bakterien mit Beteiligung an der sekundären Fermentation der Biogasherstellung in Nachwachsende Rohstoffe- (NawaRo) Biogasanlagen und den Einfluss methanogener Archaea auf syntrophe Substratumsätze bei einem mit Propionsäure versäuerten Ausgangsszenario. Die sekundäre Fermentation der Biogasherstellung wird hauptsächlich von syntrophen Stoffwechseln zwischen den unterschiedlichsten anaeroben Bakterien bestimmt. Wasserstoff, Kohlenstoffdioxid und Acetat werden bei der sekundären Fermentation in Biogasanlagen gebildet, welche methanogene Archaea zu Methan in der die Biogasherstellung abschließende Methanogenese umsetzen. Indem hydrogenotrophe methanogene Archaea den Wasserstoff-Partialdruck gering halten, begünstigen sie den Abbau energetisch unattraktiver Substrate durch Inter-SpeziesElektronentransfers. In einem durch Überfütterung nicht ausgeglichenen Fermenter einer Biogasanlage kann eine bakteriell bedingte Versäuerung durch unerwünschte kurzkettige Fettsäuren auftreten, beispielsweise durch die Akkumulation von Propionsäure. Aufgrund der Anreicherung von Propionsäure wird die Methanogenese energetisch gehemmt. Somit kann der gesamte Prozess der Herstellung von Biogas zum Erliegen kommen, was Agrarwirte im schlimmsten Fall finanziell ruiniert. Um die mikrobiellen Auswirkungen der Versäuerung durch Propionsäure zu analysieren, wurden vom Prüf und Forschungsinstitut Pirmasens e. V. propionsäureabbauende Anreicherungskulturen aus vier NawaRo Biogasanlagen im Rahmen eines durch finanzielle Unterstützung des Bundesministeriums für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz (BMELV) über die Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.V. als Projektträger des BMELV für das Förderprogram „Nachwachsende Rohstoffe“ für diese Dissertation zur Verfügung gestellt. Durch Analyse der bakteriellen 16S rDNA mithilfe der Denaturierenden Gradienten Gel Elektrophorese und dem Restriktions Längen Polymorphismus aus diesen in dieser Arbeit stabilisierten propionsäureabbauenden Mischkulturen und Fermentern wurde ermittelt, dass sich unter den Bakterien hauptsächlich Clostridiales aber auch Bacterioides, - - sowie -Proteobakterien, Spirochäten, Synergistales und ungewöhnlicher Weise Thermotogales befinden. Aus propionsäureabbauenden Mischkulturen und aus Fermentern von mesophilen NawaRo-Biogasanlagen wurden anaerobe Bakterien und methanogene Archaea durch mikrobiologische Verdünnungstechniken und alternativen Substratangeboten angereichert und isoliert. Die bakteriellen Kulturen Clostridium sartagoforme Stamm Ap1a520 und Proteiniphilum acetatigenes Stamm Fp1a520 wurden aus den propionsäureabbauenden Mischkulturen reinisoliert, indem ihnen alternative Substrate angeboten wurden. Sowohl aus Fermentern und Nachgärern von drei NawaRo-Biogasanlagen als auch aus zwei Laborfermentern des Leibniz-Instituts für Agrartechnik Potsdam-Bornim e.V. (ATB) Abteilung Bioverfahrenstechnik AG Molekularbiologie wurden Reinkulturen der Arten 6 ZUSAMMENFASSUNG Methanobacterium 259 formicicum, Methanoculleus bourgensis, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina mazei, Methanosarcina sp., Methanosaeta concilii und Methanomethylovorans sp. isoliert. Damit wurden in dieser Arbeit unter anderem alle typischen bisher durch molekularbiologische Methoden identifizierten Genera methanogener Archaea aus unterschiedlichen Fermentern kultiviert. Bei der molekularbiologischen Analyse archaealer chromosomaler DNA wurde gezeigt, dass die specifically amplified polymorphic DNA-PCR (SAPD-PCR) eine geeignete Methode darstellt, Stämme der gleichen Art methanogener Archaea voneinander zu unterscheiden. Die Methanproduktion der reinkultivierten methanogenen Archaea wurde gaschromatographisch analysiert und zeigte, dass die hydrogenotrophe Methanogenese der zeiteffizientere und ergiebigere Weg zur Bildung von Methan ist. Des Weiteren wurde durch Bestimmung der Zellzahl des Stamms Methanoculleus bourgensis Stamm TAF1.1 bei gleichzeitiger Messung der Methanproduktion gezeigt, dass die Methanbildung nicht zwangsläufig mit dem Wachstum korreliert. Gezielte Mischkulturen von bei der sekundären Fermentation beteiligten Bakterien mit methanogenen Archaea bewiesen einen energetisch begünstigenden Einfluss der Bakterien durch hydrogenotroph Methan bildenden Archaea mithilfe der high performance liquid chromatography (HPLC) der kurzkettigen Fettsäuren Acetat, Fumarat, Succinat und Propionat im Medium und Gaschromatographie der Produktion von Methan im gasförmigen Kulturüberstand in Abhängigkeit der Inkubationsdauer, da Bakterien Produkte abbauten beziehungsweise bildeten, die sie unter den gegebenen Bedingungen ohne hydrogenotrophe Archaea nicht umsetzten. Neben Pflanzenfasern beinhaltete für Kultivierungen eigen hergestelltes Reaktorfiltrat Acetat, eine essentielle Aminosäure Valin und den Zuckeralkohol Glycerol, was ebenfalls mit der HPLC ermittelt wurde. 7 AUSBLICK 7 Ausblick In dieser Arbeit wurden im Rahmen einer Kooperationsarbeit erstmals stabile Konsortien syntroph Propionsäure abbauender Bakterien bis zu einem Volumen von 500 mL kultiviert, deren Stoffwechselverhalten mit unterschiedlichen Substraten analysiert und Bakterien aus diesen Konsortien identifiziert. Das up-scaling der Kulturgrößen sollte weitergeführt werden, um die Konsortien kommerziell einsetzen zu können. Gleicher maßen sollte die in dieser Arbeit begonnene Isolierung der an der syntrophen Oxidation von Propionsäure beteiligten Bakterien fortgeführt werden um die Charakterisierung und Identifizierung der am syntrophen Abbau von Propionsäure beteiligten Mikroorganismen aus NawaRo-Biogasanlagen zu vervollständigen. Erstmals wurden in dieser Arbeit methanogene Archaea aus mesophilen Fermentern laufender NawaRo-Biogasanlagen und mesophilen sowie thermophilen Laborfermentern reinisoliert, die bisher nur molekularbiolgisch in Biogasanlagen identifiziert worden sind. Zur Unterscheidung unterschiedlicher Stämme gleicher Arten methanogener Archaea erwies sich die specifically amplified polymorphic DNA-PCR (SAPD-PCR) als geeignet. Nach einer methodischen Optimierung kann die SAPD-PCR für methanogene Archaea zu einer dienstleistungsfähigen Methode zur Identifizierung methanogener Archaea in Biogasfermentern entwickelt werden. Außerdem wurde die Bedeutung von Inter-Spezies-Elektronentransfers zwischen Bakterien aus der primären und sekundären Fermentation und methanogener Archaea durch gezielte CoKultivierung der Bakterien mit eigenisolierten methanogenen Archaea herausgestellt. Aufgrund der Erkenntnisse aus den gezielten Co-Kultivierungen und der in dieser Arbeit identifizierten fermentativen Bakterien sollte das Fernziel angestrebt werden, neben den bereits stabilen Konsortien gezielte Co-Kulturen für den kommerziellen Einsatz zur Stabilisierung von Biogasanlagen zu entwickeln. Des Weiteren ist der biochemische Mechanismus auf welche Weise Proteiniphilum acetatigenes die syntrophe Oxidation von Propionsäure begünstigt nicht bekannt. Mit dem Eigenisolat Proteiniphilum acetatigenes Stamm Fp1a kann mit definierten CoKulturen unter Verfolgung radioaktiv markierter Substrate der Mechanismus ermittelt werden. 260 8 LITERATURVERZEICHNIS 261 8 Literaturverzeichnis Abschlussbericht zum Verbundprojekt 22004007 und 22003008. 2011. Früherkennung und Behebung von Fehlgärungen Schadensverhütung in zur Biogasanlagen Erhöhung unter der Prozesssicherheit besonderer Berücksichtigung und der Propionsäurebildung. Im Auftrag der Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.V. (FNR). 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Auflage: 6., komplett überarbeitete Auflage Springer Verlag Berlin Heidelberg, ISBN-13: 978-3540463597. 9 ANHANG _300 9 Anhang 9.1 Paarweise und multiple Alignierungen bakterieller partieller 16S rDNA Sequenzen aus propionsäureabbauenden Mischkulturen Fp1a2_Eubak5 Fp1a14_Eubac5 Fp1a10_Eubac5 Fp1a7_Eubac5 Fp1a1_Eubac5 -------------------------------------------------TCCCCCATAGA ---------------------------------------------------ACCCATAGA --------------------------------------------------ATCATAAAGA -------------TCTTAAGCATGCAAGTTGAGCGGCAAGGGGGAGCGATCCCCCCTAGA ACGCTGGCGGCGTGTCTTAGCATGCAAGTTGAGCGGCAAGGGGGAGCGATCCCCCCTAGA * *** 11 9 10 47 60 Fp1a2_Eubak5 Fp1a14_Eubac5 Fp1a10_Eubac5 Fp1a7_Eubac5 Fp1a1_Eubac5 GCGGCGGACTGGTGAGTAACACGTGGATGATCTACCCGAGGCATGGGGATAGTCACTAGA GCGGCGGACTGGTGAGTAACACGTGGATGATCTACCCGAGGCATGGGGATAGTCACTAGA GCGGCGGACTGGTGAGTAACACGTGGATGATCTACCCGAGGCATGGGGATAGTCACTAGA GCGGCGGACTGGTGAGTAACACGTGGATGATCTACCCGAGGCATGGGGATAGTCACTAGA GCGGCGGACTGGTGAGTAACACGTGGATGATCTACCCGAGGCATGGGGATAGTCACTAGA ************************************************************ 71 69 70 107 120 Fp1a2_Eubak5 Fp1a14_Eubac5 Fp1a10_Eubac5 Fp1a7_Eubac5 Fp1a1_Eubac5 AATAGTGGGTAATACCGAATACGGTGCGCATCGTGAGGGTGCGCAAGAAAGGTGCTACGG AATAGTGGGTAATACCGAATACGGTGCGCATCGTGAGGGTGCGCAAGAAAGGTGCTACGG AATAGTGGGTAATACCGAATACGGTGCGCATCGTGAGGGTGCGCAAGAAAGGTGCTACGG AATAGTGGGTAATACCGAATACGGTGCGCATCGTGAGGATGCGCAAGAAAGGTGCTACGG AATAGTGGGTAATACCGAATACGGTGCGCATCGTGAGGATGCGCAAGAAAGGTGCTACGG ************************************** ********************* 131 129 130 167 180 Fp1a2_Eubak5 Fp1a14_Eubac5 Fp1a10_Eubac5 Fp1a7_Eubac5 Fp1a1_Eubac5 CACCGGCCTAGGATGAGTCTGCGTCCCATTAGCTGGTTGGTGAGGTAAGAGCCCACCAAG CACCGGCCTAGGATGAGTCTGCGTCCCATTAGCTGGTTGGTGAGGTAAGAGCCCACCAAG CACCGGCCTAGGATGAGTCTGCGTCCCATTAGCTGGTTGGTGAGGTAAGAGCCCACCAAG CACCGGCCTAGGATGAGTCTGCGTCCCATTAGCTGGTTGGTGAGGTAAGAGCCCACCAAG CACCGGCCTAGGATGAGTCTGCGTCCCATTAGCTGGTTGGTGAGGTAAGAGCCCACCAAG ************************************************************ 191 189 190 227 240 Fp1a2_Eubak5 Fp1a14_Eubac5 Fp1a10_Eubac5 Fp1a7_Eubac5 Fp1a1_Eubac5 GCGATGATGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGTACGGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCC GCGATGATGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGTACGGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCC GCGATGATGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGTACGGCCACACTGGGACTGAAATACGGCCC GCGATGATGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGTACGGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCC GCGATGATGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGTACGGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCC ************************************************** ********* 251 249 250 287 300 Fp1a2_Eubak5 Fp1a14_Eubac5 Fp1a10_Eubac5 Fp1a7_Eubac5 Fp1a1_Eubac5 AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGCTAAGAATATTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGC AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGCTAAAAATATTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGC AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGCTAAGAATATTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGC AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGCTAAAAATATTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGC AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGCTAAGAATATTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGC ************************** ********************************* 311 309 310 347 360 Fp1a2_Eubak5 Fp1a14_Eubac5 Fp1a10_Eubac5 Fp1a7_Eubac5 Fp1a1_Eubac5 GACGCCGCGTGGATGAAGAAGGCCGAAAGGTTGTAAAGTTCTTTTGTTGGGGAAGAATAA GACCCCCCGTGGATGAAGAAGGCCGAAAGGTTGTAAAGTTCTTTTGTTGGGGAAGAATAA GACCCCGCGTGGATGAAAAAGGCCCAAAGGTTGTAAAGTTCTTTTGTTGGGGAAGAATAA GACGCCGCGTGGATGAAGAAGGCCGAAAGGTTGTAAAGTTCTTTTGTTGGGGAAGAATAA GACGCCCCGTGGATGAAAAAGGCCGAAAGGTTGTAAAGTTCTTTTGTTGGGGAAGAATAA *** ** ********** ****** *********************************** 371 369 370 407 420 Fp1a2_Eubak5 Fp1a14_Eubac5 Fp1a10_Eubac5 Fp1a7_Eubac5 Fp1a1_Eubac5 CCATGGGAGGGAATGCCCGTGGGATGACATGAACCGACGAATAAGCCCCGGCTAACTACG CCATGGGAGGGAATGCCCGTGGGATGACATGAACCGACGAATAAGCCCCGGCTAACTACG CCATGGGAGGGAATGCCCGTGGGATGACATGAACCGACAAATAAGCCCCGGCTAACTACG CCATGGGAGGGAATGCCCGTGGGATGACATGAACCGACGAATAAGCCCCGGCTAACTACG CCATGGGAGGGAATGCCCGTGGGATGACATGAACCGACAAATAAGCCCCGGCTAACTACG ************************************** ********************* 431 429 430 467 480 9 ANHANG _301 Fp1a2_Eubak5 Fp1a14_Eubac5 Fp1a10_Eubac5 Fp1a7_Eubac5 Fp1a1_Eubac5 TGCCAGCAGCCGCGGTAACACGTAGGGGGCGAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAG TGCCAGCAGCCGCGGTAACACGTAGGGGGCGAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAG TGCCAGCAGCCGCGGTAACACGTAGGGGGCGAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAG TGCCAGCAGCCGCGGTAACACGTAGGGGGCGAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAG TGCCAGCAGCCGCGGTAACACGTAGGGGGCGAGCGTTGTTCCGAATTACTGGGCGTAAAG ***************************************** ****************** 491 489 490 527 540 Fp1a2_Eubak5 Fp1a14_Eubac5 Fp1a10_Eubac5 Fp1a7_Eubac5 Fp1a1_Eubac5 GGCATGTAGGCGGTCTTGTAAGCTTGGCGTGAAAGACCACGGCTCAACCGTGGGATTGCG GGCATGTAGGCGGTCTTGTAAGCTTGGCGTGAAAGACCACGGCTCAACCGTGGGATTGCG GGCATGTAGGCGGTCTTGTAAGCTTGGCGTGAAAGACCACGGCTCAACCGTGGGATTGCG GGCATGTAGGCGGTCTTGTAAGCTTGGCGTGAAAGACCACGGCTCAACCGTGGGATTGCG GGCATGTAAGCGGTCTTGTAAGCTTGGCCTGA---------------------------******** ******************* *** 551 549 550 587 572 Fp1a2_Eubak5 Fp1a14_Eubac5 Fp1a10_Eubac5 Fp1a7_Eubac5 Fp1a1_Eubac5 TTGAGAACTGCGAGGCTTGAGTGACGGAGAGGGAGCTAGAATTCCTGGTGTAGGGGTGGA TTGAGAACTGCGAGGCTTGAGTGACGGAGAGGGAGCTAGAATTCCTGGTGTAGGGGTGGA TTGAG------------------------------------------------------TTGAGAACTGCGAGGCTTGAGTGACGGAGAGGGAGCTAGAATTCCTGGTGTAGGGGTGGA ------------------------------------------------------------ 611 609 555 647 Fp1a2_Eubak5 Fp1a14_Eubac5 Fp1a10_Eubac5 Fp1a7_Eubac5 Fp1a1_Eubac5 ATCTGTAGAGATCAGGAAGAATACCAATGGCGAAGGCAAGCTCCTGGCCGATGACTGACG 671 ATCTGTAGAGATCAGGAAGAATACCAATGGCGAAGGCGAGCTCCTGGCGGA--------- 660 -----------------------------------------------------------ATCTGTAGAGATCAGGAAGAATACCAATGGCGAAGGCAAGCTCCTGGCCGATGACTGACG 707 ------------------------------------------------------------ Fp1a2_Eubak5 Fp1a14_Eubac5 Fp1a10_Eubac5 Fp1a7_Eubac5 Fp1a1_Eubac5 CTGAGGTGCGAAAGTGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCC-TGGTAGTCCACACTGTA 730 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------CTGAGGTGCGAAAGTGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCCTGGTAGTCCACACTGTA 767 ------------------------------------------------------------ Fp1a2_Eubak5 Fp1a14_Eubac5 Fp1a10_Eubac5 Fp1a7_Eubac5 Fp1a1_Eubac5 AACGATGTGCACTAGGTGCTGGTACGGATGTATCAGTGCCGTAGCTAACGTGATAAGTGC 790 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AACGATGTGCACTAGGTGCTGGTACGGATGTATCAGTGCCCG------------------ 809 ------------------------------------------------------------ Fp1a2_Eubak5 Fp1a14_Eubac5 Fp1a10_Eubac5 Fp1a7_Eubac5 Fp1a1_Eubac5 ACCGCCTGGGGAGTATGCTCGCAAGGGTGAAACTCAAAGGAATTGACAGGGGCCCGCACA 850 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Fp1a2_Eubak5 Fp1a14_Eubac5 Fp1a10_Eubac5 Fp1a7_Eubac5 Fp1a1_Eubac5 AGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGGTACGCGAGGAACCTTACCTGGGTTTGACAT 910 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Fp1a2_Eubak5 Fp1a14_Eubac5 Fp1a10_Eubac5 Fp1a7_Eubac5 Fp1a1_Eubac5 ACAGCGTAATAGGGCAGAGA 930 ----------------------------------------------------------------------------- Abbildung 127: Multipler Sequenzvergleich (CLUSTAL 2.1, European Bioinformatics Institute) der 16S rDNA Fragmente der Klone Fp1a1, Fp1a2, Fp1a7, Fp1a10 und Fp1a14 aus der propionsäureabbauenden Kultur Fp1a. 9 ANHANG _302 >Consensus_Fp1a1_2_7_10_14/1-662 TCCCCCATAGAGCGGCGGACTGGTGAGTAACACGTGGATGATCTACCCGAGGCATGGGGATAGTCACTAGAA ATAGTGGGTAATACCGAATACGGTGCGCATCGTGAGGGTGCGCAAGAAAGGTGCTACGGCACCGGCCTAGGA TGAGTCTGCGTCCCATTAGCTGGTTGGTGAGGTAAGAGCCCACCAAGGCGATGATGGGTAGCCGGCCTGAGA GGGTGTACGGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGCTAAGAATATTCCGC AATGGACGAAAGTCTGACGGAGCGACGCCGCGTGGATGAAGAAGGCCGAAAGGTTGTAAAGTTCTTTTGTTG GGGAAGAATAACCATGGGAGGGAATGCCCGTGGGATGACATGAACCGACGAATAAGCCCCGGCTAACTACGT GCCAGCAGCCGCGGTAACACGTAGGGGGCGAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGCATGTAGGCGG TCTTGTAAGCTTGGCGTGAAAGACCACGGCTCAACCGTGGGATTGCGTTGAGAACTGCGAGGCTTGAGTGAC GGAGAGGGAGCTAGAATTCCTGGTGTAGGGGTGGAATCTGTAGAGATCAGGAAGAATACCAATGGCGAAGGC AAGCTCCTGGCCGA Abbildung 128: Konsensussequenz (Clustal 2.1, EBI) 16S rDNA Fragmente der Klone Fp1a1, Fp1a2, Fp1a7, Fp1a10 und Fp1a14 aus der propionsäureabbauenden Kultur Fp1a im fastaFormat. Gp1a6_BSF8 7 Gp1a29_BSF8 1 Gp1a6_BSF8 67 Gp1a29_BSF8 61 Gp1a6_BSF8 127 Gp1a29_BSF8 121 Gp1a6_BSF8 187 Gp1a29_BSF8 181 Gp1a6_BSF8 247 Gp1a29_BSF8 241 Gp1a6_BSF8 307 Gp1a29_BSF8 301 Gp1a6_BSF8 367 Gp1a29_BSF8 361 Gp1a6_BSF8 427 Gp1a29_BSF8 421 Gp1a6_BSF8 487 Gp1a29_BSF8 481 Gp1a6_BSF8 547 Gp1a29_BSF8 541 Gp1a6_BSF8 607 Gp1a29_BSF8 601 Gp1a6_BSF8 667 Gp1a29_BSF8 661 CTAGAGTAAAGCGGCGCACGGGTGAGTAACGCGTGGATGATCTGCCCATGAGTTGGGGAT ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| || CTAGAGTAAAGCGGCGCACGGGTGAGTAACGCGTGGATGATCTGCCCATGAGTTGGGAAT 66 AACGGCTGGAAACGGTCGCTAATACCGAATACGCTCCGATTTCGACGTTCGGGGGAAAGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||| AACGGCTGGAAACGGTCGCTAATACCGAATACGCTCCGATTTCGACATTCGGGGGAAAGG 126 AGGCCTCTGCTTGCACGCTTCCGCTCATGGATGAGTCCGCGTCCCATTAGCTTGTTGGCG ||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGGCCTCTGCTTGCAAGCTTCCGCTCATGGATGAGTCCGCGTCCCATTAGCTTGTTGGCG GGGTAATGGCCCACCAAGGCGACGATGGGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGGTAATGGCCCACCAAGGCGACGATGGGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACT GGGACTGGAACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGGACTGGAACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGG GCGAAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGAAGGCCTTCGGGTCGTAAACCTCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCGAAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGAAGGCCTTCGGGTCGTAAACCTCT GTCAGGAGGGAAGAACCGCCTGGGTGCTAATCAGCCTGGGTCTGACGGTACCTCCAAAGG |||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTCAGGAGGGAAGAACCGCCCAGGTGCTAATCAGCCTGGGTCTGACGGTACCTCCAAAGG AAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCG GAATCACTGGGCGCAAAGCGCACGTAGGCTGTTTGGTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGCGG ||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAATCACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCTGTTTGGTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGCGG CTCAACCGCGGAATTGCCCTTGATACTGCTGGACTTGAGTCCGGGAGAGGGTGGCGGAAT ||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||| CTCAACCGCGGAATTGCCCTTGATACTGCTGGACTCGAGTCCGGGAGAGGGTGGCGGAAT TCCAGGTGTAGGAGTGAAATCCGTAGATATCTGGAGGAACATCAGTGGCGAAGGCGGCCC ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCCAGGTGTAGGAGTGAAATCCGTAGATATCTGGAGGAACATCAGTGGCGAAGGCGGCCA CCTGGACCGGTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTGGACCGGTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCC 60 120 186 180 246 240 306 300 366 360 426 420 486 480 546 540 606 600 666 660 726 720 9 ANHANG _303 Gp1a6_BSF8 727 Gp1a29_BSF8 721 Gp1a6_BSF8 787 Gp1a29_BSF8 781 TGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGGATGCTAGGTGTCGGGGCCTTGAGCTTCGGTGCCGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGGATGCTAGGTGTCGGGGCCTTGAGCTTCGGTGCCGC AGCTAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGCGGG |||||||||||||||||||||||||| ||| AGCTAACGCGTTAAGCATCCCGCCTG-GGG 786 780 816 809 Abbildung 129: Paarweise Sequenzalignierung der Klone Gp1a6 (816 bp) und Gp1a29 (901 bp) aus der propionsäureabbauenden Mischkultur Gp1a; Übereinstimmung: 801 bp/ 810 bp (99 %); Lücken: 1 bp/ 810 bp (1 %); Strangrichtung: Plus/Plus >ConsensusGp1a6_26/1-798 CTAGAGTAAAGCGGCGCACGGGTGAGTAACGCGTGGATGATCTGCCCATGAGTTGGG-ATAACGGCTGGAAA CGGTCGCTAATACCGAATACGCTCCGATTTCGAC-TTCGGGGGAAAGGAGGCCTCTGCTTGCA-GCTTCCGC TCATGGATGAGTCCGCGTCCCATTAGCTTGTTGGCGGGGTAATGGCCCACCAAGGCGACGATGGGTAGCCGA CCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGGAACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAAT ATTGCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGAAGGCCTTCGGGTCGTAAACCTCT GTCAGGAGGGAAGAACCGCC--GGTGCTAATCAGCCTGGGTCTGACGGTACCTCCAAAGGAAGCACCGGCTA ACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATCACTGGGCG-AAAGCGCACG TAGGCTGTTTGGTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGCGGCTCAACCGCGGAATTGCCCTTGATACTGCTGGACTGAGTCCGGGAGAGGGTGGCGGAATTCCAGGTGTAGGAGTGAAATCCGTAGATATCTGGAGGAACATCAGTGG CGAAGGCGGCC-CCTGGACCGGTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCC TGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGGATGCTAGGTGTCGGGGCCTTGAGCTTCGGTGCCGCAGCTAACGCGTT AAGCATCCCGCCTG Abbildung 130: Konsensussequenz (Clustal 2.1, EBI) 16S rDNA Fragmente der Klone Gp1a6, und Gp1a29 aus der propionsäureabbauenden Kultur Gp1a im fasta-Format. W1b 6 W1a 3 W1b 66 W1a 63 W1b 126 W1a 123 W1b 186 W1a 183 TTCGGAGTGGTGGATATATTTGTTTAGTAGCGGACGGGTGAGTAATGCATGAGAACCTGC |||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||| TTCGGAGTGGTGGATATATTTGTTTAATAGCGGACGGGTGAGTAATGCATGAGAACCTGC 65 CCTTCAGAGGGGGACAACAGTTGGAAACGGCTGCTAATACCCCATATGCCGAGAGGTGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTTCAGAGGGGGACAACAGTTGGAAACGGCTGCTAATACCCCATATGCCGAGAGGTGAA 125 AGGAGCGATCCGCTGAAGGAGAGGCTCATGTCCTATCAGCTAGTTGGTGAGGTAAGTGCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGGAGCGATCCGCTGAAGGAGAGGCTCATGTCCTATCAGCTAGTTGGTGAGGTAAGTGCT 185 CACCAAGGCGATGACGGGTAGCCG |||||||||||||||||||||||| CACCAAGGCGATGACGGGTAGCCG 62 122 182 209 206 Abbildung 131: Paarweise Sequenzalignierung der Klone W1a (206 bp) und W1b (724 bp) (Muster ‚z2‘) aus der Unterkultur Wp2a1264; Übereinstimmung: 203 bp/ 204 bp (99 %); Lücken: 0 bp/ 204 bp (1 %); Strangrichtung: Plus/Plus 9 ANHANG W1a 44 W5 1 W1a 103 W5 61 W1a 163 W5 121 _304 GTAAT-GCATGAGAACCTGCCCTTCAGAGGGGGACAACAGTTGGAAACGGCTGCTAATAC ||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTAATAGCATGAGAACCTGCCCTTCAGAGGGGGACAACAGTTGGAAACGGCTGCTAATAC 102 CCCATATGCCGAGAGGTGAAAGGAGCGATCCGCTGAAGGAGAGGCTCATGTCCTATCAGC ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||| CCCATATGCCGAGAGGTGAAAGGAGCGATCCGCTGAAGGAGTGGCTCATGTCCTATCAGC 162 TAGTTGGTGAGGTAAGTGCTCACCAAGGCGATGACGGGTAGCCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TAGTTGGTGAGGTAAGTGCTCACCAAGGCGATGACGGGTAGCCG 60 120 206 164 Abbildung 132: Paarweise Sequenzalignierung des Klons W1a (560 bp) mit der Sequenz des Klons W5 (789 bp) aus der Unterkultur Wp2a1264; Übereinstimmungen: 162 bp/ 164 bp (99 %); Lücken: 1 bp/ 164 bp (1 %); Strangrichtung: Plus/Plus W1b 47 W5 1 W1b 106 W5 61 W1b 166 W5 121 W1b 226 W5 181 W1b 286 W5 241 W1b 346 W5 301 W1b 406 W5 361 W1b 465 W5 421 W1b 521 W5 478 W1b 579 W5 535 W1b 637 W5 593 W1b 697 W5 652 GTAAT-GCATGAGAACCTGCCCTTCAGAGGGGGACAACAGTTGGAAACGGCTGCTAATAC ||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTAATAGCATGAGAACCTGCCCTTCAGAGGGGGACAACAGTTGGAAACGGCTGCTAATAC 105 CCCATATGCCGAGAGGTGAAAGGAGCGATCCGCTGAAGGAGAGGCTCATGTCCTATCAGC ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||| CCCATATGCCGAGAGGTGAAAGGAGCGATCCGCTGAAGGAGTGGCTCATGTCCTATCAGC 165 TAGTTGGTGAGGTAAGTGCTCACCAAGGCGATGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TAGTTGGTGAGGTAAGTGCTCACCAAGGCGATGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACC GGCCACACTGGAACTGAGATACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGCCACACTGGAACTGAGATACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATT GGGCAATGGGCGGAAGCCTGACCCAGCGACGCCGCGTGAGGGAAGAAGGCCTTTGGGTCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGGCAATGGGCGGAAGCCTGACCCAGCGACGCCGCGTGAGGGAAGAAGGCCTTTGGGTCG TAAACCTCTGTTGTATGGGAAGAAGGAAGTGACGGTACCATACGAGGAAGTCCCGGCTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TAAACCTCTGTTGTATGGGAAGAAGGAAGTGACGGTACCATACGAGGAAGTCCCGGCTAA CTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACGTAGGGG-CAAGCGTTACCCGGAATTACTGGGCG ||||||||||||||||||||||| ||||||||| | |||||| |||||||||||||||| CTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGACGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCG TAAGGGG-GCGTAGGCGG-TAAAAGAAGTCATCTGTGAAAACCTATTG-CTCAACG-ATA ||| ||| ||| |||||| || |||||| |||| ||| | || | |||||| || TAAAGGGCGCGCAGGCGGATATTT-AAGTCAGCTGTTAAAGTC-ATGGGCTCAACTCATGGCTAGCGGATGAAACTGAAT-TACTTGAGGGCACCAGAGGTAGACGGAATTACCCGA-G || | |||| |||||||| | | || ||| || |||||||| ||||||| |||| | GGAT-GCGGTTGAAACTGGGTAT-CTAGAGTGCTGGAGAGGTAGGCGGAATT-CCCGGTG TAGGGGTGAAATCCGCAGATA-CGGGTAGGAACGCCGGTGGAGAAGTCGGTCT-ACTGGG ||| |||||||| || ||||| |||| || ||| || |||| |||| ||| || || || TAGCGGTGAAATGCGTAGATATCGGGAAG-AACACCAGTGGCGAAGGCGG-CTTACCGGC GTGCACCAGACGCTGGGGCCCGAAAGCTAGGGGAGCAAACCGGATTAGATACCCCGGGTA ||| | ||||||| ||| ||||||| |||||||| ||| |||||||||||||||| || CAGCAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCCAGGGGAGCGAACGGGATTAGATACCCCGG-TA GTCCTAGCCGTAAACGATG ||||| ||||||||||||| GTCCTGGCCGTAAACGATG 60 120 225 180 285 240 345 300 405 360 464 420 520 477 578 534 636 592 696 651 715 670 Abbildung 133: Paarweise Sequenzalignierung des Klons W1b (724 bp) aus der Unterkultur Wp2a1264 mit der Sequenz des Klons W5 (789 bp) aus der Unterkultur Wp2a1264; Übereinstimmungen: 613 bp/ 679 bp (90 %), Lücken: 19 bp/ 679 bp (0 %); Strangrichtung: Plus/Plus 9 ANHANG W7 8 W12 4 W7 68 W12 64 W7 128 W12 124 W7 188 W12 184 W7 248 W12 244 W7 308 W12 304 W7 368 W12 364 W7 428 W12 424 _305 CTGCTGACGAGTGGCGCACGGGTGAGTAATGCATAGGTTATGTGCCCCATAGTCTGGAAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGCTGACGAGTGGCGCACGGGTGAGTAATGCATAGGTTATGTGCCCCATAGTCTGGAAT 67 AGCCACTGGAAACGGTGATTAATACCGGATATTCCCGAGAGGGGAAAGTTTTTCGCTATG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||| AGCCACTGGAAACGGTGATTAATACCGGATATTCCCGAGAGGGGAAAGTTTTTCGCGATG 127 GGATCAGCCTATGTCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCTATGACGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGATCAGCCTATGTCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCTATGACGG 187 GTATCCGGCCTGAGAGGGTGATCGGACACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTATCCGGCCTGAGAGGGTGATCGGACACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTAC 247 GGGAGGCAGCAGTAGGGAATATTGCTCAATGGGCGAAAGCCTGAAGCAGCAACGCCGCGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGGAGGCAGCAGTAGGGAATATTGCTCAATGGGCGAAAGCCTGAAGCAGCAACGCCGCGT 307 GGAGGATGAAGGTCTTCGGATTGTAAACTCCTTTTCTAAGAGAAGATTATGACGGTATCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGAGGATGAAGGTCTTCGGATTGTAAACTCCTTTTCTAAGAGAAGATTATGACGGTATCT 367 TAGGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCG ||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TAGGAATAAACACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCG 427 TTACTCGGAATCACTGGGCGTAAAGAGCACGTAGGCGGCCTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTACTCGGAATCACTGGGCGTAAAGAGCACGTAGGCGGCCTT 63 123 183 243 303 363 423 469 465 Abbildung 134: Paarweise Sequenzalignierung des Klons W7 (560 bp) aus der Unterkultur Wp2a1264 mit der Sequenz des Klons W12 (465 bp) aus der Unterkultur Wp2a1264; Übereinstimmungen: 460 bp/ 452 bp (99 %), Lücken: 0 bp/ 462 bp (0 %); Strangrichtung: Plus/Plus G13 69 G3 1 G13 129 G3 61 G13 188 G3 120 G13 248 G3 180 G13 308 G3 240 G13 368 G3 300 G13 428 G3 360 G13 488 G3 420 G13 547 G3 479 TCCTTCAGAGGGGGACAACAGTTGGAAACGGCTGCTAATACCCCATATGCCGAGAGGTGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCCTTCAGAGGGGGACAACAGTTGGAAACGGCTGCTAATACCCCATATGCCGAGAGGTGA 128 AAGGAGTAATCCGCTGAAGGAGGGGCTCATGTCCTATCAGTTAGTTGGTGAGGTAAAG-G |||||| |||||||||||||| ||||||||||||||||| ||||||||||||| ||| | AAGGAGCGATCCGCTGAAGGAGAGGCTCATGTCCTATCAGCTAGTTGGTGAGGT-AAGTG 187 CTTACCAAGGCGATGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACATTGGAACTGAG || |||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||| |||||||||| CTCACCAAGGCGATGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGAACTGAG ATACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGGCAATGGGCGCAAGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| ATACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGGCAATGGGCGGAAGCC TGACCCAGCGACGCCGCGTGAGGGAAGAAGGCCTTTGGGTCGTAAACCTCTGTTGTATGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGACCCAGCGACGCCGCGTGAGGGAAGAAGGCCTTTGGGTCGTAAACCTCTGTTGTATGG GGAGAAGGAAGTGACGGTACCATACGAGGAAGTCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGC | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAAGAAGGAAGTGACGGTACCATACGAGGAAGTCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGC GGTAATACGTAGGGGACGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGCGCGCAGGCGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGTAATACGTAGGGGACGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGCGCGCAGGCGG ATATTTAAGTCAGCTGTAAAAGG-CATGAGCTCAACTCATGTATGCGGTTGAAACTGGGT ||||||||||||||||| |||| |||| |||||||||||| |||||||||||||||||| ATATTTAAGTCAGCTGT-TAAGGTCATGGGCTCAACTCATGGATGCGGTTGAAACTGGGT ATCTAGAGTGCTGGAGAGGTAGGCGGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATCTAGAGTGCTGGAGAGGTAGGCGGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATC 60 119 247 179 307 239 367 299 427 359 487 419 546 478 606 538 9 ANHANG G13 607 G3 539 G13 667 G3 599 G13 727 G3 659 _306 GGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTGGCCAGCAACTGACGCTGAGGCGCGAAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTGGCCAGCAACTGACGCTGAGGCGCGAAA GCCAGGGGAGCGAACGGGATTAGATACCCCGGTAATCCTGGCCGTAAACGATGAATGCTA |||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||| GCCAGGGGAGCGAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCTGGCCGTAAACGATGAATGCTA GGTGTGGGTGTCGAGAGGCAT | ||||||||||||||||||| G-TGTGGGTGTCGAGAGGCAT 666 598 726 658 747 678 Abbildung 135: Paarweise Sequenzalignierung des Klons G3 ( bp) aus der Unterkultur mit der Sequenz des Klons G13 ( bp) aus der Unterkultur Gp1b1264; Übereinstimmungen: 663 bp/ 681 bp (99 %), Lücken: 5 bp/ 681 bp (1 %); Strangrichtung: Plus/Plus 9 ANHANG _307 G2_BSF8 G11_BSF8 G14_BSF8 TGGAAACTTCGGTGGAAACAGATAGGAGGAAAGTGGCGAACGGGTGAGTAACGCGTGAGC 60 ----------GGTAGAAACAGATAAGAGGAAAGTGGCGAACGGGTGAGTAACGCGTGAGC 50 --------------------------------------------TAAGTAACGCGTGAGC 16 * ************** G2_BSF8 G11_BSF8 G14_BSF8 AACCTGCCTTACACAAAGGGATAGCCTCGGGAAACCGGGATTAATACCGTATGAGACCCC 120 AACCTGCCTTACACAAAGGGATAGCCTCGGGAAACCGGGATTAATACCATATGAGACCCC 110 AACCTGCTTTACACAAAGGGATAGCCTCGGGAAACCGGGATTAATACCATATGAGACCCC 76 ******* **************************************** *********** G2_BSF8 G11_BSF8 G14_BSF8 GTTGGCGAGTGCCAAAGAGGTTAAAGATTTATCGGTGTAAGATGGGCTCGCGTCTGATTA 180 ATTGGCGAGTGCCAAAGAGGTTAAAGATTTATCGGTGTAAGATGGGCTCGCGTCTGATTA 170 GTTGGCGAGTGCCAAAGAGGTTAAAGATTTATCGGTGTAAGATGGGCTCGCGTCTGATTA 136 *********************************************************** G2_BSF8 G11_BSF8 G14_BSF8 GCTAGTTGGTGGGATAAAAGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAACCGGCTTGGGAGAGTGA 240 GCTAGTTGGTGGGATAAAAGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAACCGGCTTGAGAGAGTGA 230 GCTAGTTGGTAGGATAAAAGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAACCGGCTTGAGAGAGTGA 196 ********** **************************************** ******** G2_BSF8 G11_BSF8 G14_BSF8 ACGGTCACATTGGAACTGAGACACGGTCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATA 300 ACGGTCACATTGGAACTGAGACACGGTCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATA 290 ACGGTCACATTGGAACTGAGACACGGTCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATA 256 ************************************************************ G2_BSF8 G11_BSF8 G14_BSF8 TTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGCGAAGAAGGTTTTCGAAT 360 TTGCACAATGGGGGGAACCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGCGAAGAAGGTTTTCGAAT 350 TTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGCGAAGAAGGTTTTCGAAT 316 ************** ********************************************* G2_BSF8 G11_BSF8 G14_BSF8 CGTAAAGCTCTGTCCTTGGAGAAGATAATGACGGTAACCAAGGAGGAAGCACCGGCTAAA 420 CGTAAAGCTCTGTCCTTGGAGAAGATAATGACGGTAACCAAGGAGGAAGCACCGGCTAAA 410 CGTAAAGCTCTGTCCTTGGAGAAGATAATGACGGTAACCAAGGAGGAAGCACCGGCTAAA 376 ************************************************************ G2_BSF8 G11_BSF8 G14_BSF8 TACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTATGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGT 480 TACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTATGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGT 470 TACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTATGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGT 436 ************************************************************ G2_BSF8 G11_BSF8 G14_BSF8 AAAGGGTACGTAGGCGGTTTAGCAAGTCAGATGTTAAAGCGTGGGGCTCAACCCCATAAA 540 AAAGGGTACGTAGGCGGTTTAGCAAGTCAGATGTTAAAGCGTGGGGCTCAACCCCATAAA 530 AAAGGGTACGTAGGCGGTTTAGCAAGTCAGATGTTAAAGCGTGGGGCTCAACCCCATAAA 496 ************************************************************ G2_BSF8 G11_BSF8 G14_BSF8 GCATTTGAAACTGTTAGACTTGAGTAGTGGAGAGGAAAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGT 600 GCATTTGAAACTGTTAGACTTGAGTAGTGGAGAGGAAAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGT 590 GCATTTGAAACTGTTAGACTTGAGTAGTGGAGAGGAAAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGT 556 ************************************************************ G2_BSF8 G11_BSF8 G14_BSF8 GAAATGCGTAGATATTAGGAGGAATACCAGTTGCGAAGGCGACTTTCTGGACACAAACTG 660 GAAATGCGTAGATATTAGGAGGAATACCAGTTGCGAAGGCGACTTTCTGGACACAAACTG 650 GAAATGCGTAGATATTAGGAGGAATACCAGTTGCGAAGGCGACTTTCTGGACACAAACTG 616 ************************************************************ G2_BSF8 G11_BSF8 G14_BSF8 ACGCTGAGGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCCGGTAGTCCACGCCG 720 ACGCTGAGGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCG 710 ACGCTGAGGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCG 676 ********************************************* ************** G2_BSF8 G11_BSF8 G14_BSF8 TAAACGATGAATGCTAG-CGTTGGGGGTCAAACCTCGGTGCCGAAGTTAACACATTAAGC 779 TAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGGGGTCAAACCTCGGTGCCGAAGTTAACACATTAAGC 770 TAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGGGGTCAAACCTCGGTGCCGAAGTTAACACATTAAGC 736 ***************** ***************************************** G2_BSF8 G11_BSF8 G14_BSF8 ATTCCGCCTGGGGAGTACGGTGGCAACACTGAAACTCAA-GGAATTGACGGGGACCGCAC 838 ATTCCGCCTGGGGAGTACGGTGGCAACACTGAAACTCAATGGAATTG------------- 817 ATTCCGCCTGGGGAGTACGGTGGCGACACTGAGACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCA 796 ************************ ******* ****** ******* G2_BSF8 G11_BSF8 G14_BSF8 AAGCAGCGGAGCAT- 852 --------------CAAGCAGCGGAGCAT 811 Abbildung 136: Multiple Sequenzalignierung (Clustal 2.1, EBI) der 16S rDNA- Fragmentsequenzen der Klone G2 (852 bp), G11 (817 bp) und G14 (811 bp) aus der Unterkultur Gp1a1264 9 ANHANG _308 F6_BSF8 G3_BSF8 G13_BSF8 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ATTACTACTTTTCGGAGGAGAGATGATGTGTTCTTAGTAGCGGACGGGTGAGTAATGCAT 60 F6_BSF8 G3_BSF8 G13_BSF8 --------------------------------------------------------------------TCCTTCAGAGGGGGACAACAGTTGGAAACGGCTGCTAATACCCCATATGCC 51 GAGAACCTGTCCTTCAGAGGGGGACAACAGTTGGAAACGGCTGCTAATACCCCATATGCC 120 F6_BSF8 G3_BSF8 G13_BSF8 --GAAGTAAAAGGAGTAATCCGCTGAGGGAGGGGCTCATGTCCTATCAGCTAGTTGGTAA 58 GAGAGGTGAAAGGAGCGATCCGCTGAAGGAGAGGCTCATGTCCTATCAGCTAGTTGGTGA 111 GAGAGGTGAAAGGAGTAATCCGCTGAAGGAGGGGCTCATGTCCTATCAGTTAGTTGGTGA 180 ** ** ******* ********* **** ***************** ******** * F6_BSF8 G3_BSF8 G13_BSF8 GGTAACGGCTTACCAAGGCGAAAACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGATCGGCCACACTG 118 GGTAAGTGCTCACCAAGGCGATGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTG 171 GGTAAAGGCTTACCAAGGCGATGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACATTG 240 ***** *** ********** ********************** ** ******** ** F6_BSF8 G3_BSF8 G13_BSF8 GAACTGAGATACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGGCAATGGG 178 GAACTGAGATACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGGCAATGGG 231 GAACTGAGATACCGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGGCAATGGG 300 ************ *********************************************** F6_BSF8 G3_BSF8 G13_BSF8 CGGAAGCCTGACCCAGCGACGCCGCGTGAGGGAAGAAGGCCTTTGGGTCGTAAACCTCTG 238 CGGAAGCCTGACCCAGCGACGCCGCGTGAGGGAAGAAGGCCTTTGGGTCGTAAACCTCTG 291 CGCAAGCCTGACCCAGC----CC------------------------------------- 319 ** ************** ** F6_BSF8 G3_BSF8 G13_BSF8 TTGTATGGGAAGAAGGAAGTGACGGTACCATACGAGGAAGTCCCGGCTAACTACATGCCA 298 TTGTATGGGAAGAAGGAAGTGACGGTACCATACGAGGAAGTCCCGGCTAACTACGTGCCA 351 ------------------------------------------------------------ F6_BSF8 G3_BSF8 G13_BSF8 GCAGCCCCGGTAATACGTATGGGACAAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGCGC 358 GCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGACGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGCGC 411 ------------------------------------------------------------ F6_BSF8 G3_BSF8 G13_BSF8 GCAGGCGGATATTTAAGTCAGCTGTTAA-------------------------------- 386 GCAGGCGGATATTTAAGTCAGCTGTTAAGGTCATGGGCTCAACTCATGGATGCGGTTGAA 471 ------------------------------------------------------------ F6_BSF8 G3_BSF8 G13_BSF8 -----------------------------------------------------------ACTGGGTATCTAGAGTGCTGGAGAGGTAGGCGGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGT 531 ------------------------------------------------------------ F6_BSF8 G3_BSF8 G13_BSF8 -----------------------------------------------------------AGATATCGGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTGGCCAGCAACTGACGCTGAGG 591 ------------------------------------------------------------ F6_BSF8 G3_BSF8 G13_BSF8 -----------------------------------------------------------CGCGAAAGCCAGGGGAGCGAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCTGGCCGTAAACGATG 651 ------------------------------------------------------------ F6_BSF8 G3_BSF8 G13_BSF8 --------------------------AATGCTAGTGTGGGTGTCGAGAGGCAT 678 --------------------------- Abbildung 137: Multiple Sequenzalignierung (Clustal 2.1, EBI) des Klons F6 (386 bp) aus der Unterkultur Fp1a1264 mit den Sequenzen der Klone G3 und G13 (678 bp, 862 bp) aus der Unterkultur Gp1a1264 9 ANHANG _309 A10_BSF8 A13_BSF8 F10_BSF8 ---------------------------------------------CCAACCTTCCACAGG 15 -TGAGATGTAACCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTACCTTATAGAGG 59 ACTAGATGGTGGCGACCGGCGCACGGGTGAGTAACACGTATGCAACCTACCTTCCACAGG 60 ** ***** * *** A10_BSF8 A13_BSF8 F10_BSF8 AGAATAACCCGTTGAAAAACGGACTAATACTCCATAATACAGGGGTCCCGCATGGGAATA 75 GGAATAGCCTTCCGAAAGGGAGATTAATACCGCATAACATTACATTTTCGCATGAAGA-A 118 AGAATAACCCGTTGAAAAACGGACTAATACTCCATAATACAGGGGTCCCGCATGGGAATA 120 ***** ** **** ** ****** ***** * * ****** * * A10_BSF8 A13_BSF8 F10_BSF8 TTTGTTAAAGATTTTTTTCGGTAGAAGATGGGCATGCGTTCCATTAGCTAGTTGGTTGAG 135 GTAATTAAAGGAGTAATCCGCTATAAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGT-GAG 177 TTTGTTAAAGATTTTTTTCGGTAGAAGATGGGCATGCGTTCCATTAGCTAGTTGGTTGAG 180 * ****** * * ** ** ********* *** *************** *** A10_BSF8 A13_BSF8 F10_BSF8 GTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGGATAGGGGAACTGAGAGGTTTATCCCCCACACTGG 195 GTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGGATAGGGGAACTGAGAGGTTTATCCCCCACACTGG 237 GTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGGATAGGGGAACTGAGAGGTTTATCCCCCACACTGG 240 ************************************************************ A10_BSF8 A13_BSF8 F10_BSF8 TACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGAG 255 TACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGAG 297 TACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGAG 300 ************************************************************ A10_BSF8 A13_BSF8 F10_BSF8 GCAACTCTGAACCAGCCACGTCGCGTGAAGGATGACGGCCCTACGGGTTGTAAACTTCTC 315 GCAACTCTGAACCAGCCACGTCGCGTGAAGGATGACGGCCCTACGGGTTGTAAACTTCTT 357 GCAACTCTGAACCAGCCACGTCGCGTGAAGGATGACGGCCCTACGGGTTGTAAACTTCTT 360 *********************************************************** A10_BSF8 A13_BSF8 F10_BSF8 TTATACAGGAATAAAGTGAGTCACGTGTGACTTTTTGCATGTACTGTATGAATAAGGATC 375 TTATACAGGAATAAAGTGAGTCACGTGTGACTTTTTGCACGTACTGTATGAATAAGGATC 417 TTATACAGGAATAAAGTGAGTCACGTGTGACTTTTTGCATGTACTGTATGAATAAGGATC 420 *************************************** ******************** A10_BSF8 A13_BSF8 F10_BSF8 GGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATCCAAGCGTTATCCGGATTTAT 435 GGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATCCAAGCGTTATCCGGATTTAT 477 GGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATCCAAGCGTTATCCGGATTTAT 480 ************************************************************ A10_BSF8 A13_BSF8 F10_BSF8 TGGGTTTAAAGGGCGCGCAGGCGGAAGATTAAGTCGGCGGTGAAATTTTGCAGCTCAACT 495 TGGGTTTAAAGGGTGCGCAGGCGGAAGATTAAGTCGGCGGTGAAATTTTGCAGCTCAACT 537 TGGGTTTAAAGGGTGCGCAGGCGGAAGATTAAGTCGGCGGTGAAATTTTGCAG------- 533 ************* *************************************** A10_BSF8 A13_BSF8 F10_BSF8 GTAAAAGTGCCATCGATACTGGTTTTCTTGAGTGTGGATGAAGTAGGCGGAATTTGTGGT 555 GTAAAAGTGCCATCGATACTGGTTTTCTTGAGTGTGGATGAAGTAGGCGGAATTTGTGGT 597 ------------------------------------------------------------ A10_BSF8 A13_BSF8 F10_BSF8 GTAGCGGTGAAATGCATAGATATCACGAGGAACTCCGATTGCGCAGGCAGCTTACTAGGC 615 GTAGCGGTGAAATGCATAGATATCACGAGGAACTCCGATTGCGCAGGCAGCTTACTAGGC 657 ------------------------------------------------------------ A10_BSF8 A13_BSF8 F10_BSF8 CATAACTGACGCTCAGGCACGAAGGCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGT 675 CATAACTGACGCTCAGGCACGAAGGCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGT 717 ------------------------------------------------------------ A10_BSF8 A13_BSF8 F10_BSF8 CCACGCAGTAAACGATGATTACTCGCTGTTTGCGATACACAGTAAGCGGCTTAGCGAAAG 735 CCACGCAGTAAACGATGATTACTCGCTGTTTGCGATACACAGTAAGCGGCTTAGCGAAAG 777 ------------------------------------------------------------ A10_BSF8 A13_BSF8 F10_BSF8 CGTTAAGTAATCCACCTGGGGAGTACGTTCGCAAGAATGAAACTCAAAGA-------- 785 CGTTAAGTAATCCACCTGGGGAGTACGTTCGCAAGAATGAAACTCAAAGGAATTGACG 835 ---------------------------------------------------------- Abbildung 138: Multiple Sequenzalignierung des Klons F10 (533 bp) aus der Unterkultur Fp1a1264 mit der Sequenz des Klons A10 (785 bp) und A13 (835 bp) aus der Unterkultur Ap1a1264 9 ANHANG A12 78 F5 1 A12 138 F5 61 A12 198 F5 121 A12 258 F5 181 A12 318 F5 241 A12 378 F5 301 A12 438 F5 361 A12 498 F5 421 _310 CTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCGGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCGGA 137 TGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTA 197 GCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGG AGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTA TGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAATA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAATA CCTTTGCTCATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTTTGCTCATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGC GGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGG TTTGTTAAATCAGATGTGAAATCCCCGGGCTC |||||||| ||||||||||||||||||||||| TTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTC 60 120 257 180 317 240 377 300 437 360 497 420 529 452 Abbildung 139: Paarweise Sequenzalignierung des Klons F5 (500 bp) aus der Unterkultur Fp1a1264 mit der Sequenz des Klons A12 (529 bp) aus der Unterkultur Ap1a1264; Übereinstimmungen: 451 bp/ 452 bp (99 %), Lücken: 0 bp/ 452 bp (0 %); Strangrichtung: Plus/Plus 9 ANHANG A520 1 1 A520 2 2 A520 1 61 A520 2 62 A520 1 121 A520 2 122 A520 1 181 A520 2 182 A520 1 241 A520 2 242 A520 1 301 A520 2 302 A520 1 361 A520 2 362 A520 1 421 A520 2 422 _311 CAACTTGGGTGCTGCATTTCAAACTGGAAGTCTAGAGTGCAGGAGAGGAGAGTGGAATTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAACTTGGGTGCTGCATTTCAAACTGGAAGTCTAGAGTGCAGGAGAGGAGAGTGGAATTC 60 CTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTAGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTAGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTC 120 TGGACTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGGACTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTG 180 GTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATACTAGGTGTAGGGGTTGTCATGACCTCTGTGCCGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATACTAGGTGTAGGGGTTGTCATGACCTCTGTGCCGC 240 CGCAAACGCATTAAGTATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGCAAACGCATTAAGTATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAA 300 TTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAAC 360 CTTACCTAGACTTGACATCTCCTGAATTACTCTTAATCGAGGAAGTCCCTTCGGGGACAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTTACCTAGACTTGACATCTCCTGAATTACTCTTAATCGAGGAAGTCCCTTCGGGGACAG 420 GAAGACAGGTGGTGCATGGCTTCCC ||||||||||||||||||| ||||| GAAGACAGGTGGTGCATGG-TTCCC 61 121 181 241 301 361 421 445 445 Abbildung 140: Paarweise Sequenzalignierung der Sequenzen der DGGE-Banden A520 1 (447 bp) aus Unterkultur Ap1a520 mit der Sequenz A520 2 (445 bp) aus selbiger Unterkultur, A; Übereinstimmungen: 444 bp/ 445 bp (99 %), Lücken: 0 bp/ 445 bp (0 %); Strangrichtung: Plus/Plus 9 ANHANG _312 9.2 Paarweise und multiple Alignierungen archaealer partieller 16S rDNA Sequenzen aus archaealen Reinkulturen TAF1b_Ar1000f TAF1c_Ar1000f TAF1a_Ar1000f Mb_f_DSM1535 -----------------------GCAGGGCACACTAAGGGGACCGCCAGTGATAAACTGG ---------------------ATGCAGGGCACACTAAGGGGACCGCCAGTGATAAACTGG ----------------------TGCAGGGCACACTAAGGGGACCGCCAGTGATAAACTGG GTTACCAGCGGATCCTTCGGGATGCCGGGCACACTAAGGGGACCGCCAGTGATAAACTGG ** ********************************** 37 39 38 60 TAF1b_Ar1000f TAF1c_Ar1000f TAF1a_Ar1000f Mb_f_DSM1535 AGGAAGGAGTGGACGACGGTAGGTCCGTATGCCCCGAATCCCCTGGGCTACACGCGGGCT AGGAAGGAGTGGACGACGGTAGGTCCGTATGCCCCGAATCCCCTGGGCTACACGCGGGCT AGGAAGGAGTGGACGACGGTAGGTCCGTATGCCCCGAATCCCCTGGGCTACACGCGGGCT AGGAAGGAGTGGACGACGGTAGGTCCGTATGCCCCGAATCCCCTGGGCTACACGCGGGCT ************************************************************ 97 99 98 120 TAF1b_Ar1000f TAF1c_Ar1000f TAF1a_Ar1000f Mb_f_DSM1535 ACAATGGTTAGGACAATGGGTTCCGACACTGAAAGGTGGAGGTAATCTCCTAAACCTGGC ACAATGGTTAGGACAATGGGTTCCGACACTGAAAGGTGGAGGTAATCTCCTAAACCTGGC ACAATGGTTAGGACAATGGGTTCCGACACTGAAAGGTGGAGGTAATCTCCTAAACCTGGC ACAATGGTTAGGACAATGGGTTCCGACACTGAAAGGTGGAGGTAATCTCCTAAACCTGGC ************************************************************ 157 159 158 180 TAF1b_Ar1000f TAF1c_Ar1000f TAF1a_Ar1000f Mb_f_DSM1535 CTTAGTTCGGATTGAGGGCTGTAACTCGCCCTCATGAAGCTGGAATGCGTAGTAATCGCG CTTAGTTCGGATTGAGGGCTGTAACTCGCCCTCATGAAGCTGGAATGCGTAGTAATCGCG CTTAGTTCGGATTGAGGGCTGTAACTCGCCCTCATGAAGCTGGAATGCGTAGTAATCGCG CTTAGTTCGGATTGAGGGCTGTAACTCGCCCTCATGAAGCTGGAATGCGTAGTAATCGCG ************************************************************ 217 219 218 240 TAF1b_Ar1000f TAF1c_Ar1000f TAF1a_Ar1000f Mb_f_DSM1535 TGTCATAACCGCGCGGTGAATACGTCCCTGCTCCTTGCACACACCGCCCGTCACGCCACC TGTCATAACCGCGCGGTGAATACGTCCCTGCTCCTTGCACACACCGCCCGTCACGCCACC TGTCATAACCGCGCGGTGAATACGTCCCTGCTCCTTGCACACACCGCCCGTCACGCCACC TGTCATAACCGCGCGGTGAATACGTCCCTGCTCCTTGCACACACCGCCCGTCACGCCACC ************************************************************ 277 279 278 300 TAF1b_Ar1000f TAF1c_Ar1000f TAF1a_Ar1000f Mb_f_DSM1535 CAAAAAGGGTTTGGATGAGGCCATAGTCTTTGGTTATGGTC------------------CAAAAAGGGTTTGGATGAGGCCATAGTCTTTGGTTATGGTCGAATCTAGGTTCTTTGAGG CAAAAAGGGTTTGGATGAGGCCATAGTCTTTGGTTATGGT-------------------CAAAAAGGGTTTGGATGAGGCCATAGTCTTTGGTTATGGTCGAATCTAGGTTCTTT---**************************************** 318 339 318 356 TAF1b_Ar1000f TAF1c_Ar1000f TAF1a_Ar1000f Mb_f_DSM1535 ------------------AGGGCGAAGTCGTAAAAAG 358 ------------------------------------- Abbildung 141: Multiple Sequenzalignierung der DGGE-Sequenzen TAF1a-c mit dem Typstamm Methanobacterium formicicumT DSM1535 9 ANHANG _313 TAF1.2a_Ar1000f TAF1.2b_Ar1000f Ms.mazeiT_DSM2053 -------------------------------------------------CCGGGACGATG 11 ----------------------------------------------CCTCCGGGACGATG 14 TAAGTCAGGCAACGAGCGAGACCCGTGCCCACTGTTACCAGCATGTCCTCCGGGACGATG 60 *********** TAF1.2a_Ar1000f TAF1.2b_Ar1000f Ms.mazeiT_DSM2053 GGTACTCTGTGGGGACCGCCGATGTTAAATCGGAGGAAGGTGCGGGCCACGGTAGGTCAG GGTACTCTGTGGGGACCGCCGATGTTAAATCGGAGGAAGGTGCGGGCCACGGTAGGTCAG GGTACTCTGTGGGGACCGCCGATGTTAAATCGGAGGAAGGTGCGGGCCACGGTAGGTCAG ************************************************************ TATGCCCCGAATCTCCCGGGCTACACGCGGGCTACAATGGATGGGACAATGGGTCCCTCC TATGCCCCGAATCTCCCGGGCTACACGCGGGCTACAATGGATGGGACAATGGGTCCCTCC TATGCCCCGAATCTCCCGGGCTACACGCGGGCTACAATGGATGGGACAATGGGTCCCTCC ************************************************************ TAF1.2a_Ar1000f TAF1.2b_Ar1000f Ms.mazeiT_DSM2053 71 74 120 131 134 180 TAF1.2a_Ar1000f TAF1.2b_Ar1000f Ms.mazeiT_DSM2053 CCTGAAAAGGGCTGGTAATCTCACAAACCCATTCGTAGTTCGGATCGAGGGCTGTAACTC 191 CCTGAAAAGGGCTGGTAATCTCACAAACCCATTCGTAGTTCGGATCGAGGGCTGTAACTC 194 CCTGAAAAGGGCTGGTAATCTCACAAACCCATTCGTAGTTCGGATCGAGGGCTGTAACTC 240 ************************************************************ TAF1.2a_Ar1000f TAF1.2b_Ar1000f Ms.mazeiT_DSM2053 GCCCTCGTGAAGCTGGAATCCGTAGTAATCGCGTTTCAATATAGCGCGGTGAATACGTCC 251 GCCCTCGTGAAGCTGGAATCCGTAGTAATCGCGTTTCAATATAGCGCGGTGAATACGTCC 254 GCCCTCGTGAAGCTGGAATCCGTAGTAATCGCGTTTCAATATAGCGCGGTGAATACGTCC 300 ************************************************************ TAF1.2a_Ar1000f TAF1.2b_Ar1000f Ms.mazeiT_DSM2053 CTGCTCCTTGCACACACCGCCCGTCAAACCACCCGAGTGAGGTATGGGTGAGGGCACGGA 311 CTGCTCCTTGCACACACCGCCCGTCAAACCACCCGAGTGAGGTATGGGTGAGGGCACGGA 314 CTGCTCCTTGCACACACCGCCCGTCAAACCACCCGAGTGAGGTATGGGTGAGGGCACGGA 360 ************************************************************ TAF1.2a_Ar1000f TAF1.2b_Ar1000f Ms.mazeiT_DSM2053 CTCCGTGCCGTGTTCGAACCTGTGCTTTGCAAGGGGGGTTAAGTCGTACCAG 363 CTTCGTGCCGTGTTCGAACCTGTGCTTTGCAAGGGGGGTTAAGTCG-ACCAG 365 CTTCGTGCCGTGT--------------------------------------- 373 ** ********** Abbildung 142: Multiple Sequenzalignierung der DGGE-Sequenzen TAF1.2a und b mit dem Typstamm Methanosarcina mazeiT DSM2053 9 ANHANG _314 Mb.f_Ar1000f TAF1c_Ar1000f BEG1c_Ar1000f TAF1b_Ar1000f TAF1a_Ar1000f BEG1b_Ar1000f Mb_f_DSM1535 BEG1a_Ar1000f ----------------------TGCAGGGCACACTAAGGGGACCGCCAGTGATAAACTGG ---------------------ATGCAGGGCACACTAAGGGGACCGCCAGTGATAAACTGG ----------------------TGCAGGGCACACTAAGGGGACCGCCAGTGATAAACTGG -----------------------GCAGGGCACACTAAGGGGACCGCCAGTGATAAACTGG ----------------------TGCAGGGCACACTAAGGGGACCGCCAGTGATAAACTGG ----------------------TGCAGGGCACACTAAGGGGACCGCCAGTGATAAACTGG GTTACCAGCGGATCCTTCGGGATGCCGGGCACACTAAGGGGACCGCCAGTGATAAACTGG --------AGGATC-TTCGGGATGCCGGGCACACTAAGGGGACCGCCAGTGATAAACTGG ** ********************************** 38 39 38 37 38 38 1080 51 Mb.f_Ar1000f TAF1c_Ar1000f BEG1c_Ar1000f TAF1b_Ar1000f TAF1a_Ar1000f BEG1b_Ar1000f Mb_f_DSM1535 BEG1a_Ar1000f AGGAAGGAGTGGACGACGGTAGGTCCGTATGCCCCGAATCCCCTGGGCTACACGCGGGCT AGGAAGGAGTGGACGACGGTAGGTCCGTATGCCCCGAATCCCCTGGGCTACACGCGGGCT AGGAAGGAGTGGACGACGGTAGGTCCGTATGCCCCGAATCCCCTGGGCTACACGCGGGCT AGGAAGGAGTGGACGACGGTAGGTCCGTATGCCCCGAATCCCCTGGGCTACACGCGGGCT AGGAAGGAGTGGACGACGGTAGGTCCGTATGCCCCGAATCCCCTGGGCTACACGCGGGCT AGGAAGGAGTGGACGACGGTAGGTCCGTATGCCCCGAATCCCCTGGGCTACACGCGGGCT AGGAAGGAGTGGACGACGGTAGGTCCGTATGCCCCGAATCCCCTGGGCTACACGCGGGCT AGGAAGGAGTGGACGACGGTAGGTCCGTATGCCCCGAATCCCCTGGGCTACACGCGGGCT ************************************************************ 98 99 98 97 98 98 1140 111 Mb.f_Ar1000f TAF1c_Ar1000f BEG1c_Ar1000f TAF1b_Ar1000f TAF1a_Ar1000f BEG1b_Ar1000f Mb_f_DSM1535 BEG1a_Ar1000f ACAATGGTTAGGACAATGGGTTCCGACACTGAAAGGTGGAGGTAATCTCCTAAACCTGGC ACAATGGTTAGGACAATGGGTTCCGACACTGAAAGGTGGAGGTAATCTCCTAAACCTGGC ACAATGGTTAGGACAATGGGTTCCGACACTGAAAGGTGGAGGTAATCTCCTAAACCTGGC ACAATGGTTAGGACAATGGGTTCCGACACTGAAAGGTGGAGGTAATCTCCTAAACCTGGC ACAATGGTTAGGACAATGGGTTCCGACACTGAAAGGTGGAGGTAATCTCCTAAACCTGGC ACAATGGTTAGGACAATGGGTTCCGACACTGAAAGGTGAAGGTAATCTCATAAACCTGGC ACAATGGTTAGGACAATGGGTTCCGACACTGAAAGGTGGAGGTAATCTCCTAAACCTGGC ACAATGGTTAGGACAATGGGTTCCGACACTGAAAGGTGAAGGTAATCTCATAAACCTGGC ************************************** ********** ********** 158 159 158 157 158 158 1200 171 Mb.f_Ar1000f TAF1c_Ar1000f BEG1c_Ar1000f TAF1b_Ar1000f TAF1a_Ar1000f BEG1b_Ar1000f Mb_f_DSM1535 BEG1a_Ar1000f CTTAGTTCGGATTGAGGGCTGTAACTCGCCCTCATGAAGCTGGAATGCGTAGTAATCGCG CTTAGTTCGGATTGAGGGCTGTAACTCGCCCTCATGAAGCTGGAATGCGTAGTAATCGCG CTTAGTTCGGATTGAGGGCTGTAACTCGCCCTCATGAAGCTGGAATGCGTAGTAATCGCG CTTAGTTCGGATTGAGGGCTGTAACTCGCCCTCATGAAGCTGGAATGCGTAGTAATCGCG CTTAGTTCGGATTGAGGGCTGTAACTCGCCCTCATGAAGCTGGAATGCGTAGTAATCGCG CTTAGTTCGGATTGAGGGCTGTAACTCGCCCTCATGAAGCTGGAATGCGTAGTAATCGCG CTTAGTTCGGATTGAGGGCTGTAACTCGCCCTCATGAAGCTGGAATGCGTAGTAATCGCG CTTAGTTCGGATTGAGGGCTGTAACTCGCCCTCATGAAGCTGGAATGCGTAGTAATCGCG ************************************************************ 218 219 218 217 218 218 1260 231 Mb.f_Ar1000f TAF1c_Ar1000f BEG1c_Ar1000f TAF1b_Ar1000f TAF1a_Ar1000f BEG1b_Ar1000f Mb_f_DSM1535 BEG1a_Ar1000f TGTCATAACCGCGCGGTGAATACGTCCCTGCTCCTTGCACACACCGCCCGTCACGCCACC TGTCATAACCGCGCGGTGAATACGTCCCTGCTCCTTGCACACACCGCCCGTCACGCCACC TGTCATAACCGCGCGGTGAATACGTCCCTGCTCCTTGCACACACCGCCCGTCACGCCACC TGTCATAACCGCGCGGTGAATACGTCCCTGCTCCTTGCACACACCGCCCGTCACGCCACC TGTCATAACCGCGCGGTGAATACGTCCCTGCTCCTTGCACACACCGCCCGTCACGCCACC TGTCATAACCGCGCGGTGAATACGTCCCTGCTCCTTGCACACACCGCCCGTCACGCCACC TGTCATAACCGCGCGGTGAATACGTCCCTGCTCCTTGCACACACCGCCCGTCACGCCACC TGTCATAACCGCGCGGTGAATACGTCCCTGCTCCTTGCACACACCGCCCGTCACGCCACC ************************************************************ 278 279 278 277 278 278 1320 291 Mb.f_Ar1000f TAF1c_Ar1000f BEG1c_Ar1000f TAF1b_Ar1000f TAF1a_Ar1000f BEG1b_Ar1000f Mb_f_DSM1535 BEG1a_Ar1000f CAAAAAGGGTTTGGATGAGGCCATAGTCTTTGGT-TATGGTCGAATCTAGGTTCTTTGAG CAAAAAGGGTTTGGATGAGGCCATAGTCTTTGGT-TATGGTCGAATCTAGGTTCTTTGAG CAAAAAGGGTTTGGATGAGGCCATAGTCTTTGGT-TATGGTCGAATCTAGGTTCTTTGAG CAAAAAGGGTTTGGATGAGGCCATAGTCTTTGGT-TATGGTC-----------------CAAAAAGGGTTTGGATGAGGCCATAGTCTTTGGT-TATGGT------------------CAAAAAGGGTTTGGATGAGGCCATAGTCTTATGTGTAT---------------------CAAAAAGGGTTTGGATGAGGCCATAGTCTTTGGT-TATGGTCGAATCTAGGTTCTTT--CAAAAAGGGTTTGGATGAGGCCATAGTCT------TATG------TGTA----------***************************** *** 337 338 337 318 318 316 1376 328 Mb.f_Ar1000f TAF1c_Ar1000f BEG1c_Ar1000f TAF1b_Ar1000f TAF1a_Ar1000f BEG1b_Ar1000f Mb_f_DSM1535 BEG1a_Ar1000f GAGGGCGAAGTCGTAAAAA- 356 GAGGGCGAAGTCGTAAAAAG 358 GAGGGCGAAGTCGTAAA--- 354 ------------------------------------------------------------------------------------------------ Abbildung 143: Multiple Sequenzalignierung der DGGE-Sequenzen TAF1a-c und BEG1a-c mit dem Typstamm Methanobacterium formicicumT DSM1535 9 ANHANG _315 LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_rev_compl ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------CTGCTATCGGTGTTCGACTAAGCCATGCGAGTCAAATGTTCTTCGTGAAC 50 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_rev_compl ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ATGGCGTACTGCTCAGTAACACGTGGATAACCTGCCCTTAGGTCTGGCAT 100 -------ACGGCTCAGTAACACGTGGATAACCTGCCCTTAGGACTGGCAT 43 --------------------------------------------------------------------------------------------------- LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_rev_compl ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AACCCCGGGAAACTGGGGATAATTCCGGATAGATCATGGATGCTGGAATG 150 AACCCCGGGAAACTGGGGATAATTCCGGATAGTTCATGGTAGCTGGAATG 93 ---CCCGG-GAACTGGGGATAATTCCGGATAGATCATAGATGCTGGAATG 46 -------------------------------------------------***** .**********************:****.*::********* LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f_LGC Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_LGC_rev_compl ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------CACCGTGGTCGAAAGCTTTTGTGCCTAAGGATGGGTCTGCGGTCTATCAG 200 CTCCATGATCGAAAGCTATTGCGCCTAAGGATGGGTCTGCGGTCTATCAG 143 CGCTGTGGTCCAAAGCTATTGCGCCTAAGGATGGGTCTGCGGTCTATCAG 96 -------------------------------------------------* * .**.** ******:*** **************************** LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_rev_compl ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GTTGTAGTGGGTGTAACGTACCTACTAGCCTACGACGGATACGGGTTGTG 250 GTAGTAGTGGGTGTAATGTACCTACTAGCCGACGACGGATACGGGTTGTG 193 GTCGTAGTGGGTGTAATGTACCTACTAGCCTACGACGGATACGGGTTGTG 146 -------------------------------------------------** ************* ************* ******************* LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_rev_compl ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GGAGCAAGAGCCCGGAGATGGATTCTGAGACATGAATCCAGGCCCTACGG 300 GGAGCAAGAGCCCGGAGATGGATTCTGAGACATGAATCCAGGCCCTACGG 243 GGAGCAAGAGCCCGGAGATGGATTCTGAGACATGAATCCAGGCCCTACGG 196 -------------------------------------------------************************************************** LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_rev_compl ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GGTGCAGCAGGCGCGAAAACTTTACAATGCGGGAAACCGCGATAAGGGGA 350 GGCGCAGCAGGCGCGAAAACTTTACAATGCGGGAAACCGCGATAAGGGGA 293 GGCGCAGCAGGCGCGAAAACTTTACAATGCGGGGAACCGCGATAAGGGGA 246 -------------------------------------------------** ******************************.**************** LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_rev_compl ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------CACCGAGTGCCAGCATCCTATGTTGGCTGTCCATATGTATAAATAACATG 400 CACCGAGTGCCAGCATCTTATGTTGGCTGTCCGCATGTATAAATCACATG 343 CACCGAGTGCCAGCATCCTATGTTGGCTGTCCATATGTCTAAATCGCATA 296 -------------------------------------------------***************** **************. ****.*****..***. 9 ANHANG _316 LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_rev_compl ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------TGTTAGCAAGGGCCGGGCAAGACCGGTGCCAGCCGCCGCGGTAACACCGG 450 TGTTAGCAAGGGCCGGGCAAGACCGGTGCCAGCCGCCGCGGTAACACCGG 393 TGTTAGCAAGGGCCGGGCAAGACCGGTGCCAGCCGCCGCGGTAACACCGG 346 -------------------------------------------------************************************************** LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_rev_compl ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------CGGCCCGAGTGGTGGCCACTATTATTGGGTCTAAAGGGTCCGTAGCCGGT 500 CGGCCCGAGTGGTGGCCACTATTATTGGGTCTAAAGGGTCCGTAGCCGGT 443 CGGCCCGAGTGGTGGCCACTAATATTGGGTCTAAAGGGTCCGTAGCCGGC 396 -------------------------------------------------*********************:*************************** LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_rev_compl ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------TTGGTCAGTCTTCCGGGAAATCTGACGGCTTAACCGTTAGGCTTTCGGGG 550 TTGGTCAGTCTTCCGGGAAATCTGACGGCTTAACCGTTAGGCTTTCGGGG 493 TTGGTCAGTCTTCCGGGAAATCTGACGGCTTAACCGTTAGGCTTCCGGGG 446 -------------------------------------------------******************************************** ***** LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_rev_compl ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GATACTGCCAGGCTTGGGACCGGGAGAGGTAAGAGGTACTACGGGGGTAG 600 GATACTACCAGGCTTGGGACCGGGAGAGGTAAGAGGTACTACGGGGGTAG 543 GATACTACCAGGCTTGGGACCGGGAGAGGTAAGAGGTACTACGGGGGTAG 496 -------------------------------------------------******.******************************************* LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_rev_compl ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GAGTGAAATCTTGTAATCCCTGTGGGACCACCAGTGGCGAAGGCGTCTTA 650 GAGTGAAATCTTGTAATCCTCGTGGGACCACCAGTGGCGAAGGCGTCTTA 593 GAGTGAAATCTTGTAATCCCCGTGGGACCACCAGTGGCGAAGGCGTCTTA 546 -------------------------------------------------******************* ***************************** LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_rev_compl ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------CCAGAACGGGTCCGACGGTGAGGGACGAAAGCTGGGGGCACGAACCGGAT 700 TCAGAACGGGTCCGACGGTGAGGGACGAAAGCTGGGGGCACGAACCGGAT 643 CCAGAACGGGTCCGACGGTGAGGGACGAAAGCTGGGGGCACGAACCGGAT 596 -------------------------------------------------************************************************* LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_rev_compl ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------TAGATACCCGGGTAGTCCCAGCCGTAAACTATGCTCGCTAGGTGTCAGGG 750 TAGATACCCGGGTAGTCCCAGCCGTAAACTATGCTCGCTAGGTGTCAGGG 693 TAGATACCCGGGTAGTCCCAGCCGTAAACTATGCTCGCTAGGTGTCAGGG 646 -------------------------------------------------************************************************** LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_rev_compl ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ACGGTGCGACCGTTTCTGGTGCCGTAGGGAAGCCGTGAAGCGAGCCACCT 800 ACGGTGCGACCGTTTCTGGTGCCGCAGGGAAGCCGTGAAGCGAGCCACCT 743 ACGGTGCGACCGTTTCTGGTGCCGCAGGGAAGCCGTGAAGCGAGCCACCT 696 -------------------------------------------------************************ ************************* 9 ANHANG _317 LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_rev_compl ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GGGAAGTACGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGGCGGGGGAGCAC 850 GGGAAGTACGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGGCGGGGGAGCAC 793 GGGAAGTACGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGGCGGGGGAGCAC 746 -------------------------------------------------************************************************** LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_rev_compl ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------TACAACGGGTGGAGCCTGCGGTTTAATTGGACTCAACGCCGGAAAACTCA 900 TACAACGGGTGGAGCCTGCGGTTTAATTGGACTCAACGCCGGAAAACTCA 843 TACAACGGGTGGAGCCTGCGGTTTAATTGGACTCAACGCCGGAAAACTCA 796 -------------------------------------------------************************************************** LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_rev_compl ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------CCGGGGGCGACAGCAATATGTAGGTCAAGCTAAAGACTTTACCAGAATCG 950 CCGGGGGCGACAGCAATATGTAGGTCAAGCTAAAGACTTTACCAGAATCG 893 CCGGGGGCGACAGCAATATGTAGGTCAAGCTAAAGACTTTACCAGAATCG 846 -------------------------------------------------************************************************** LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_rev_compl ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------CTGAGAGGAGGTGCATGGCCGTCGTCAGTTCGTACTGTGAAGCATCCTGT 1000 CTGAGAGGAGGTGCATGGCCGTCGTCAGTTCGTACTGTGAAGCATCCTGT 943 CTGAGAGGAGGTGCATGGCCGTCGTCAGTTCGTACTGTGAAGCATCCTGT 896 -------------------------------------------------************************************************** LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_rev_compl ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------TAAGTCAGGCAACGAGCGAGACCCGTGCCCACTGTTGCCAGCATGTCCTT TAAGTCAGGCAACGAGCGAGACCCGTGCCCACTGTTGCCAGCATATCCTT TAAGTCAGGCAACGAGCGAGACCCGTGCCCACTGTTGCCAGCATGTCCTT -----------------GAGACCCGTGCCCACTGTTGCCAGCATGTCCTT ********************************************.***** LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_rev_compl ------------------------------------------------------ATGTGGGTACTCTGTGGGGACCGCCGATGCTAAATCGGAGGAAGG ---------GGGTACTCTGTGGGGACCGCCGATGCTAAATCGGAGGAAGG CGGGATGATGGGTACTCTGTGGGGACCGCCGATGCTAAATCGGAGGAAGG TGGGATGATGGGTACTCTGTGGGGACCGCCGATGCTAAATCGGAGGAAGG CGGGATGATGGGTACTCTGTGGGGACCGCCGATGCTAAATCGGAGGAA-CGGGATGATGGGTACTCTGTGGGGACCGCCGATGCTAAATCGGAGGAAGG !*********************************************** LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f_ Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_rev_compl -------------------------------------------------TGCGGGCTACGGTAGGTCAGTATGCCCCGAATCTCCCGGGCTACACGCGG TGCGGGCTACGGTAGGTCAGTATGCCCCGAATCTCCCGGGCTACACGCGG TGCGGGCTACGGTAGGTCAGTATGCCCCGAATCTCCCGGGCTACACGCGG TGCGGGCTACGGTAGGTCAGTATGCCCCGAATCTCCCGGGCTACACGCGG -------------------------------------------------TGCGGGCTACGGTAGGTCAGTATGCCCCGAATCTCCCGGGCTACACGCGG LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500_rev_compl -CTG--------GGGACAATGGGCCCCTACCCCGAAAGGGGACGGTAATC GCTACAATGACTGGGACAATGGGCCCCTACCCCGAAAGGGGACGGTAATC GCTACAATGACTGGGACAATGGGCCCCTACCCCGAAAGGGGACGGTAATC GCTACAATGACTGGGACAATGGGCTCCTACCCCGAAAGGGGATGGTAATC GCTACAATGACTGGGACAATGGGCTCCTACCCCGAGAGGGGATGGTAATC -------------------------------------------------GCTACAATGACTGGGACAATGGGCCCCTACCCCGAAAGGGGACGGTAATC **. ************ **********.****** ******* 1050 993 946 33 45 41 1100 1043 994 83 95 91 1150 1093 133 41 145 141 1200 1143 183 9 ANHANG _318 LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_rev_compl TCATAAACCCAGCCGTAGTTCGGATCGAGGGCTGAAACCCGCCCTCGTGA TCATAAACCCAGCCGTAGTTCGGATCGAGGGCTGAAACCCGCCCTCGTGA TCATAAACCCAGCCGTAGTTCGGATCGAGGGCTGAAACCCGCCCTCGTGA TCATAAACCCAGCCTTAGTTCGGATCGAGGGCTGTAACCCGCCCTCGTGA TCATAAACCCAGCCGTAGTTCGGATCGAGGGCTGTAACCCGCCCTCGTGA -------------------------------------------------TCATAAACCCAGCCGTAGTTCGGATCGAGGGCTGAAACCCGCCCTCGTGA ************** *******************:*************** 91 195 191 1250 1193 LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_rev_compl AGCTGGAATCCGTAGTAATCGCGTTTCAACATAGCGCGGTGAATACGTCC AGCTGGAATCCGTAGTAATCGCGTTTCAACATAGCGCGGTGAATACGTCC AGCTGGAATCCGTAGTAATCGCGTTTCAACATAGCGCGGTGAATACGTCC AGCTGGAATCCGTAGTAATCGCGTTTCAACATAGCGCGGTGAATACGTCC AGCTGGAATCCGTAGTAATCGCGTTTCAACATAGCGCGGTGAATACGTCC -------------------------------------------------AGCTGGAATCCGTAGTAATCGCGTTTCAACATAGCGCGGTGAATACGTCC ************************************************** 141 245 241 1300 1243 LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_rev_compl CTGCTCCTTGCACACACCGCCCGTCAAACCACCCGAGTGAGGTATGGGTG CTGCTCCTTGCACACACCGCCCGTCAAACCACCCGAGTGAGGTATGGGTG CTGCTCCTTGCACACACCGCCCGTCAAACCACCCGAGTGAGGTATGGGTG CTGCTCCTTGCACACACCGCCCGTCAAACCACCCGAGTGAGGTATGGGTG CTGCTCCTTGCACACACCGCCCGTCAAACCACCCGAGTGAGGTATGGGTG -------------------------------------------------CTGCTCCTTGCACACACCGCCCGTCAAACCACCCGAGTGAGGTATGGGTG ************************************************** 191 295 291 1350 1293 LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_rev_compl AGGGCATGGACATTGTGCTGTGCTCGAACCTAAATTTTGCAAGGGGGGTT AGGGCATGGACATTGTGCTGTGCTCGAACCTAAATTTTGCAAGGGGGGTT AGGGCATGGACATTGTGCTGTGCTCGAACCTAAATTTTGCAAGGGGGGTT AGGGCATAGACATTGTGCTGTGTTCGAACCTAAATTTTGCAAGGGGGGTT AGGGCATGGACAATGTGCTGTGTTCGAACCTAAATTTTGCAAGGGGGGTT -------------------------------------------------AGGGCA-------------------------------------------****** 241 345 341 1400 1343 LFP3.1_Ar1000f_2 LFP3.1_Ar1000f_1 LFP3.1_Ar1000f Mmv.hollandicaT_DSM15978 Mmv.thermophilaT_DSM17232 LFP3.1_Met86f LFP3.1_Ar1500r_rev_compl AAGTCGTACCAA------------------------------------AAGTCGTACCAGC-----------------------------------AAGTC-------------------------------------------AAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGGAATCTGCGGCTGGATCACCTCCT AAGTCGTAACAAGGTAGCCG----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 233 283 333 339 253 358 346 1449 1363 Abbildung 144: Multiple Sequenzalignierung der Sequenzen aus Kultur LFP3.1 mit den Typstämmen Methanomethylovorans hollandicaT DSM15978 und Methanomethylovorans thermophilaT DSM17232, Sequenz der Oligonukleotide Met86f (hellblau), Ar1000f (gelb) und der Oligonukleotide Ar1500r (pink) und partielle Anlagerungssequenz Met1340r (blau) 9.3 Verwendete Websites http://www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/ http://www.dsmz.de/ http://watcut.uwaterloo.ca/watcut/watcut/template.php?act=restriction_new Eidesstattliche Erklärung Hiermit erkläre ich, dass die vorliegende Arbeit von mir selbst angefertigt wurde und ich keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe. Krefeld, den 02.11.2012 Lebenslauf Name Kerstin Seyfarth Geburtsdatum 26. Juni 1981 Geburtsort Offenbach am Main Akademischer Werdegang Februar 2008 - November 2012 Dissertation am Institut für Mikrobiologie und Weinforschung, September 2005 - Mai 2006 Johannes Gutenberg-Universität Mainz Diplomarbeit am Institut für Mikrobiologie und Genetik, Oktober 2000 - Mai 2005 technische Universität Darmstadt Studium der Biologie, technische Universität Darmstadt Schwerpunkte: Mikrobiologie, Biochemie, Entwicklungsbiologie Schulischer Werdegang August 1991 - April 2000 Leibnizschule Gymnasium der Stadt Offenbach August 1987 - Juni 1991 Mathildenschule Offenbach am Main