Dissertation elektronisch
Werbung
Aus dem Zentrum Physiologie und Pathophysiologie der Universität zu Köln Institut für Vegetative Physiologie Geschäftsführende Direktorin: Frau Universitätsprofessor Dr. med. G. Pfitzer Stopped Flow-Untersuchungen der Ca2+-kontrollierten Schaltkinetik von kardialem Troponin in Lösung und in Myofibrillen Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Eva Sierakowski aus Ahlen Promoviert am 19. Mai 2010 Hundt Druck Köln Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln, 2010 Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. J. Klosterkötter 1. Berichterstatterin: Frau Universitätsprofessor Dr. med. G. Pfitzer 2. Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. S. Herzig Erklärung Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne zulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskriptes habe ich Unterstützungsleistungen von folgenden Personen erhalten: Herrn Dr. J. Solzin Herrn Dr. R. Stehle Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Die Arbeit wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt und ist auch noch nicht veröffentlicht. Köln, 12.09.2009 Die in dieser Arbeit angegebenen Experimente sind nach entsprechender Anleitung durch Herrn Dr. rer. nat. J. Solzin von mir selbst ausgeführt worden. Die Expression und Isolation der Proteine wurden z. T. von Herrn Dipl. Biol. S. Zittrich durchgeführt. Die Plasmide zur Expression der Proteine wurden von Frau Dr. Blaudeck hergestellt. Diese Arbeit wurde im Rahmen des Forschungsprojektes „An- und Abschaltkinetik des Troponin-Komplexes in Kardiomyofibrillen und deren Beeinflussung durch Kardiomyopathie-assoziierte Mutationen des Troponins“ (Schwerpunktbereich A: Herz- und Gefäßerkrankungen) durch das ZMMK (Zentrum für molekulare Medizin Köln) gefördert. Danksagung Mein größter Dank gilt Frau Professor Dr. G. Pfitzer für die Überlassung des interessanten Themas dieser Dissertation, ihren hilfreichen Ideen und ihrer kompetenten und freundlichen Betreuung. Meinem Betreuer Herrn Dr. J. Solzin danke ich besonders für seine außergewöhnlich gute Betreuung, seine freundliche, unkomplizierte und stets zielorientierte Hilfe, die diese Arbeit ermöglicht hat. Ganz besonders danke ich Herrn S. Zittrich für die freundliche und geduldige Einführung in die Laborarbeit, seine ständige Hilfsbereitschaft und die Unterstützung bei der Expression und Isolation der Troponin-Untereinheiten. Frau P. Kulozik möchte ich für ihre stetige Diskussionsbereitschaft und die hilfreichen Beratungen danken. Allen Mitarbeitern der Vegetativen Physiologie danke ich für die freundliche Aufnahme in das Team und für alles, was ich von ihnen lernen konnte. Schließlich möchte ich meinen Eltern und meiner Schwester danken, deren vertrauensvolle Unterstützung mir zu jeder Zeit eine große Hilfe war und ist. Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG................................................................................................... 1 1.1 Grundlagen der Kontraktion des Herzmuskels ....................................................................... 1 1.1.2 Funktionsweise des Herzens........................................................................................... 1 1.1.3 Mikroskopische Anatomie des Herzens........................................................................... 1 1.1.4 Aufbau der Myofilamente ................................................................................................. 2 1.1.5 Der Troponinkomplex....................................................................................................... 3 1.1.6 Mechanismus der Muskelkontraktion .............................................................................. 6 1.2 Kinetische Untersuchungen am dünnen Filament ................................................................ 10 1.2.2 Kinetische Parameter..................................................................................................... 11 1.3 Familiäre hypertrophe Kardiomyopathie ............................................................................... 11 1.4 Zielsetzung ............................................................................................................................ 13 2 MATERIAL UND METHODEN ...................................................................... 15 2.1 Material.................................................................................................................................. 15 2.1.1 Chemikalien ................................................................................................................... 15 2.1.2 Lösungen ....................................................................................................................... 15 2.2 Methoden .............................................................................................................................. 25 2.2.1 Expression der humanen kardialen Troponin-Untereinheiten cTnC, cTnT und cTnI .... 25 2.2.2 Isolierung der cTn-Untereinheiten aus E.coli................................................................. 26 2.2.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ................................................... 29 2.2.4 Dialyse ........................................................................................................................... 30 2.2.5 Lyophilisation ................................................................................................................. 30 2.2.6 Fluoreszenzmarkierung von cTnC bzw. cTnI ................................................................ 30 2.2.7 Rekonstitution des cTn-Komplexes ............................................................................... 31 2.2.8 Präparation von cMF und cTn-Austausch ..................................................................... 32 2.2.9 Bestimmung der cMF-Dichte anhand der [S1] ............................................................... 34 2.2.10 Vorbereitung des cTn für Messungen am isolierten Komplex ..................................... 36 2.2.11 Prinzip des Stopped-Flow-Verfahrens ......................................................................... 36 2.2.12 Datenanalyse und Statistik .......................................................................................... 40 3. ERGEBNISSE.............................................................................................. 41 3.1 Isolation der Troponinuntereinheiten..................................................................................... 41 3.2 Inkorporation des hcTn in Meerschweinchen-cMF ............................................................... 46 3.3 Bestimmung der Kinetik der Konformationsänderung von cTn in Mausmyofibrillen im Vergleich zu isoliertem cTn-Komplex in Lösung mit unterschiedlichen Markierungsmethoden . 49 3.3.1 Effekt der Markierung des cTn-Komplexes auf die Kinetik............................................ 49 3.3.2 Effekt der spezifischen Markierung von TnI .................................................................. 55 3.3.3 Effekt der spezifischen Markierung von cTnC ............................................................... 60 3.3.4 Effekt der selektiven Markierung von cTnC................................................................... 63 2+ 3.4 Effekte der FHC-assoziierten hcTnI-Mutation R145G auf die Ca -induzierte An- und Abschaltkinetik des Troponins .................................................................................................... 72 Inhaltsverzeichnis 4. DISKUSSION ............................................................................................... 74 2+ 4.1. Entwicklung einer Methode zur Bestimmung der Ca -kontrollierten Schaltkinetik von cTn in Myofibrillen .................................................................................................................................. 74 4.1.1 Kontrollen des cTn-Austausches ................................................................................... 75 4.1.2 Wahl des Fluoreszenzfarbstoffes und des Markierungsortes........................................ 76 4.1.3 Vorteile der Verwendung von Meerschweinchenmyofibrillen gegenüber murinen Kardiomyofibrillen ................................................................................................................... 79 4.2 Interpretation des Fluoreszenzsignals .................................................................................. 80 (TnC-Cys84-NBD) 4.2.1 Anschaltkinetik von cTn ............................................................................. 80 (TnC-Cys84-NBD) 4.2.2 Abschaltkinetik von cTn .............................................................................. 82 2+ 4.3. Bedeutung der Ca -kontrollierten Schaltkinetik von cTn für die Kraftkinetik der cMF ........ 83 R145G 2+ 4.4 Effekt der FHC-assoziierten cTnI -Mutation auf die Ca -kontrollierte Schaltkinetik von (TnC-Cys84-NBD) cTn ........................................................................................................................... 85 5. ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................... 87 6. LITERATURVERZEICHNIS ......................................................................... 89 7. ERKLÄRUNG ZUR VORABVERÖFFENTLICHUNG ................................... 95 8. LEBENSLAUF.............................................................................................. 96 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Häufige Abkürzungen wurden im Text bei der ersten Erwähnung erklärt und dann als solche verwendet (z.B. cTnI: kardiales Troponin I). Die Aminosäuren wurden im Einbuchstaben-Code angegeben. Gängige Textabkürzungen (z.B., bzw. und andere) sind hier nicht erläutert. A anisotrop Abb. Abbildung ADP Adenosindiphosphat AEBSF 4-(2-Aminoethyl)-benzensulfonylfluorid ANS Anilinonaphthalensulfonsäure APS Ammoniumperoxisulfat ATP Adenosintriphosphat BAPTA 1,2-Bis (2-aminophenoxy)-ethan-N-N-N´-N´-tetraessigsäure BDM 2,3-Butandion-2-monoxim Ca2+ Kalzium [Ca2+] Kalziumkonzentration CaCl2 Kalziumchlorid cm Zentimeter cm-1 pro Zentimeter cMF kardiale Myofibrillen cTn kardialer Troponinkomplex (alle drei Untereinheiten) cTnC kardiales Troponin C cTnI kardiales Troponin I cTnT kardiales Troponin T Da Dalton ∆Abs Absorptionsänderung DEAE Diethylaminoethyl ∆F Fluoreszenzänderung der Amplitude ∆F(4,6) Fluoreszenzänderung der Amplitude bei sättigender [Ca2+] ∆F(9,4) Fluoreszenzänderung der Amplitude bei niedrigster [Ca2+] ∆F/∆F(4,6) Fluoreszenzamplitude normalisiert auf den größten pCa Abkürzungsverzeichnis ∆Fnorm normalisierte Fluoreszenzänderung der Amplitude ∆Ftotal absolute Fluoreszenzänderung in der Amplitude FRET Förster Resonance Energy Transfer DMF Dimethylformamin DTT 1,4-Dithio-DL-threitol DX Bestimmung der Abschaltkinetik (Double-Mixing) EDANS Ethylaminonaphthalensulfonsäure EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EGTA Ethylenglycol-bis-(2-aminoethyl)-tetraessigsäure F Flussrate F530nm Fluoreszenz bei einer Absorption von 530 nm F-Aktin fibrilläres Aktin FHC Familiäre hypertrophe Kardiomyopathie FPLC fast performance liquid chromatography fsTn schnelles skelettales Troponin (fast skeletal Troponin) g Gramm bzw. Normal-Fallbeschleunigung (9,81 ms-2) G-Aktin globuläres Aktin h Stunde(n) H Helix hcTn humaner kardialer Troponinkomplex H2O Wasser HCl Salzsäure HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-ethansulfonsäure I isotrop IAANS 2-(4'-(iodoacetamido)anilino)naphthalen-6-sulfonsäure IANBD N-((2-(Iodoacetoxy)ethyl)-N-methyl)amino-7-nitrobenz-2-oxa-1,3diazol IAEDANS 5((((2-Iodoacetyl)amino)ethyl)amino)naphthalen-1-sulfonsäure KCl Kaliumchlorid kDa Kilodalton kobs beobachtete Ratenkonstante der Anschaltkinetik kobs (4,6) beobachtete Ratenkonstante der Ca2+-Assoziation bei sättigender [Ca2+] Abkürzungsverzeichnis kobs (9,4) beobachtete Ratenkonstante der Ca2+-Assoziation bei niedrigster [Ca2+] koff Ratenkonstante der Abschaltkinetik KOH Kaliumhydroxid kon Ratenkonstante der Anschaltkinetik l Liter LB Luria-Bertani (Kulturmedium nach Luria und Bertani, modifiziert) M Molar (mol/l) M-1 pro Molar M1-3 Mischkammern der Stopped-Flow-Apparatur mA Milliampere mg Milligramm 2+ Mg Magnesium MgCl2 Magnesiumchlorid MHC schwere Kette des Myosins (Myosin heavy chain) µg Mikrogramm µl Mikroliter µm Mikrometer min Minute ml Milliliter mM Milimolar mm Millimeter MΩ Mega-Ohm MOPS 3-Morpholinopropansulfonsäure mS Millisiemens ms Millisekunde MW Molekulargewicht n Anzahl der Experimente Na2CrP Natriumkreatinphosphat NaCl Natriumchlorid NaN3 Natriumazid NaOH Natriumhydroxid NBD Nitrobenzoxadiazol NBD-cTn kardiales Troponin fluoreszenzmarkiert mit NBD Abkürzungsverzeichnis ng Nanogramm nH Hill-Koeffizient NH4HCO3 Ammoniumhydrogenkarbonat nm Nanometer NP EGTA Nitrophenyl Ethylenglycol-bis-(2-aminoethyl)-tetraessigsäure OD optische Dichte pCa negativer dekadischer Logarithmus der freien [Ca2+] pCa50 [Ca2+] bei halbmaximaler Bindung Pi anorganisches Phosphat PMSF Phenylmethansulfonylsäure rpm Umdrehungen pro Minute s Sekunde s -1 pro Sekunde S1 globuläre Kopfregion des Myosins [S1] Konzentration der S1-Köpfe S1-4 Spritzen 1 bis 4 der Stopped-Flow-Apparatur SDS Natriumdodecylsulfat ssTn langsames skelettales Troponin (slow skeletal Troponin) sTn skelettales Troponin SX Bestimmung der Anschaltkinetik (Single-Mixing) t Zeitpunkt Td Totzeit Tab. Tabelle TEMED N,N,N´,N´-Tretramethylethylendiamin UV ultraviolett V Volt bzw. Volumen VIS visible WT Wildtyp Xe/Hg Xenon/Quecksilber Einleitung 1 Einleitung 1.1 Grundlagen der Kontraktion des Herzmuskels 1.1.2 Funktionsweise des Herzens Das Herz aller höheren Wirbeltiere ist ein muskuläres Hohlorgan, das nach dem Prinzip einer Saug-Druck-Pumpe arbeitet. Die Pumpfunktion des Herzmuskels mit dem rhythmischen Wechsel von Relaxation (Diastole) und Kontraktion (Systole) der Herzmuskelfasern gewährleistet durch die Zirkulation des Blutes die lebenswichtige Versorgung der Organe. 1.1.3 Mikroskopische Anatomie des Herzens Die Herzmuskulatur ist ebenso wie die Skelettmuskulatur quergestreift. Während der Skelettmuskel allerdings aus vielkernigen unverzweigten Muskelfasern besteht, bilden die Herzmuskelzellen ein dreidimensionales Netz. Eine Herzmuskelzelle ist normalerweise 60 bis 140 µm lang und hat einen Durchmesser von 17 bis 25 µm. Sowohl die Herzmuskelzellen als auch die darin enthaltenen Myofibrillen verzweigen sich. Über charakteristische End-zuEnd-Zellkontakte, die Glanzstreifen (Disci intercalares), sind benachbarte Herzmuskelzellen verbunden und können so miteinander kommunizieren. Im Unterschied zum Skelettmuskel liegen die Zellkerne der Herzmuskelzellen nicht randständig, sondern wie bei der glatten Muskulatur eher zentral. Ein Großteil des Volumens der Herzmuskelzelle wird durch die kontraktilen Elemente des Muskels, die Myofibrillen, ausgefüllt. Die Myofibrillen sind aus kurzen parallel angeordneten Proteinfäden, den so genannten Myofilamenten zusammengesetzt, wobei man zwischen dünnen Aktinfilamenten (7 nm) aus Aktin, Tropomyosin und Troponin und dicken Myosinfilamenten (12 nm) unterscheidet. 1 Einleitung 1.1.4 Aufbau der Myofilamente Betrachtet man eine Muskelfaser unter dem Lichtmikroskop, wird die charakteristische Querstreifung sichtbar. Helle I- und dunkle A-Streifen wechseln sich ab. Inmitten des I-Streifens liegt der Z-Streifen, inmitten des AStreifens liegt die helle H-Zone, die von einem feinen dunklen M-Streifen durchzogen wird. Die Querstreifung wiederholt sich periodisch. Eine Periode, die von Z-Streifen zu Z-Streifen reicht, wird als Sarkomer bezeichnet. Die Myofilamente sind dabei auf eine Art und Weise angeordnet, dass hauptsächlich die dicken Myosinfilamente die A-Streifen der Myofibrille ergeben. Der I-Streifen wird zum größten Teil aus den Aktinfilamenten gebildet, sie ragen zwischen die Myosinfilamente. Die Aktinfilamente benachbarter Sarkomere sind im Z-Streifen verankert und werden an ihren Enden miteinander verknüpft. Wie bereits erwähnt, ragen sie zwischen die Myosinfilamente, berühren sich in der Mitte aber nicht, so dass die helle H-Zone innerhalb des A-Streifens nur aus Myosin besteht. Verbindungsstellen zwischen den Myosinfilamenten bilden innerhalb der H-Zone die dunkle M-Linie. Abb. 1.1: Anordnung der Myosin- und Aktinfilamente im entspannten Zustand. Skelettmuskelgewebe quergeschnitten nach Huxley, H. E. [20] 2 Einleitung 1.1.4.1 Das dicke Filament Myosin mit einem Molekulargewicht (MW) von 500 kDa ist das Motorprotein des Muskels, das sich aus zwei schweren und vier leichten Peptidketten zusammensetzt. Umeinander gewunden, bildet ein Großteil der beiden schweren Ketten den Schwanz des Myosins. An den N-terminalen Regionen hingegen befinden sich zwei globuläre Köpfchen, die Subfragment-1 (S1) genannt werden und an die je zwei leichte Ketten binden. Mehrere hundert Myosinmoleküle lagern sich an den Schwänzen zusammen und bilden auf diese Art und Weise das Rückgrat des dicken Filamentes. Die Köpfe ragen dabei nach außen und können daher bei der Muskelkontraktion an die Aktinmoleküle des dünnen Filamentes binden. Jedes Myosinköpfchen hat außerdem eine Bindungsstelle für ATP und kann dieses unter Energiefreisetzung spalten. 1.1.4.2 Das dünne Filament Aktin ist ein globuläres Protein mit einem Molekulargewicht von 47 kDa. Die Aktinmonomere (G-Aktin) bilden zwei Ketten, die sich zu einer Doppelhelix verdrillen, was als fibrilläres Aktin (F-Aktin) bezeichnet wird. In den Längsrinnen zwischen den Aktinketten liegt das Tropomyosin (Tm) wie ein Faden. Tm ist ein langgestrecktes Molekül, das als Homo- oder Heterodimer aus zwei α-helikalen Ketten besteht, die sich zu einer Superhelix (coiled-coil) zusammenlagern. Benachbarte Tm-Moleküle überlappen sich entlang des dünnen Filamentes in einer Kopf-zu-Schwanz (head-to-tail) Konfiguration. Der Troponinkomplex stabilisiert die flexible Assoziation des Tropomyosins mit dem Aktin und ist der Aktinkette in regelmäßigen Abständen von 40 nm angelagert. 7 Aktin- und jeweils ein Tm- und Tn-Molekül bilden eine strukturelle Einheit. 1.1.5 Der Troponinkomplex Das heterotrimäre Protein Troponin wurde 1963 von S. Ebashi [12] entdeckt und wird als Kalziumschalter der Myofibrille bezeichnet. Durch die Bindung von Ca2+-Ionen verändert das Troponinmolekül seine Konformation und ermöglicht so die Aktivierung des gesamten dünnen Filaments. Es gibt verschiedene Troponin-Isoformen. Unterschieden werden unter anderem kardiales Tn (cTn) und skelettales Tn (sTn). 3 Einleitung 1.1.5.1 Troponin C TnC (MW 18 kDa) gehört zur Familie der Ca2+-bindenden Proteine und ist der Ca2+-Sensor des Tn-Komplexes. Das hantelförmige Molekül besitzt zwei globuläre Domänen, eine N- und eine C-terminale, die durch eine lange zentrale Helix miteinander verbunden sind. Jede Domäne besteht aus einer kurzen α-Helix, einer Ca2+-bindenden Schleife sowie einer weiteren α-Helix und enthält je zwei Ca2+-Bindungsstellen. Man bezeichnet diese Anordnung als „helix-loop-helix“- oder auch als EF-Hand-Motiv. Ausgehend vom N-Terminus werden die α-Helices des Moleküls mit dem Buchstaben A-H gekennzeichnet. Die beiden Bindungsstellen der C-terminalen Domäne (III/IV) haben eine hohe Affinität für Ca2+ (~107 M-1), sind aber trotz ihrer geringeren Affinität für Mg2+ (~103 M-1) unter physiologischen Bedingungen mit Mg2+-Ionen besetzt. Diese Bindungsstellen scheinen für die Regulation der Muskelkontraktion nicht von Bedeutung zu sein, da der Austausch von Ca2+ an diesen Bindungsstellen viel zu langsam ist, um während eines Herzschlags abzulaufen [40].Ihre Aufgabe ist vielmehr struktureller Natur [16]. Sie verstärken die Interaktion von TnC und TnI und unterstützen zugleich die Bindung des TnC an das dünne Filament. Die Ca2+-Affinität der N-terminalen Bindungstellen (I/II) (~105 M-1) ist im Vergleich zu den C-terminalen Bindungsstellen geringer [45]. Sie binden selektiv Ca2+ und sind verantwortlich für die Aktivierung des dünnen Filaments, weshalb sie als regulatorische Ca2+-Bindungsstellen bezeichnet werden. Dabei ist zu beachten, dass die Ca2+-Bindungsstelle I des kardialen TnC (cTnC) aufgrund einer anderen Aminosäuresequenz inaktiviert ist und dementsprechend nur eine statt wie beim skelettalen TnC (sTnC) zwei der regulatorischen Ca2+-Bindungsstellen zur Verfügung stehen. Röntgenkristallographische Studien haben gezeigt, dass die C-terminale Domäne des TnC mit TnT interagiert. 4 Einleitung a b Abb. 1.2: Strukturmodelle von TnC. (a) zeigt die NMR-Struktur von cTnC (PDB 1AJ4) nach Sia et al. [53]. (b) zeigt die Röntgenstruktur von sTnC (PDB 2TN4) nach Houdusse et al.[19] Die Buchstaben kennzeichnen die Helices (A-H; N) von TnC. (Darstellung mit Cn3D.) 1.1.5.2 Troponin I TnI ist die inhibitorische Untereinheit des Tn-Komplexes, die ihren Namen aufgrund ihrer Fähigkeit, die Aktomyosin-ATPase zu inhibieren erhielt. Bei der Ca2+-Regulation des dünnen Filamentes nimmt TnI die Rolle eines molekularen Schalters ein und hält den Tn-Komplex durch die Bindung an Aktin, TnC und TnT zusammen. cTnI (MW 24 kDa) besteht aus 210 Aminosäuren, das sich von seiner skelettalen Isoform (sTnI) im Wesentlichen durch eine Verlängerung um 33 Aminosäuren am N-terminalen Ende des Moleküls unterscheidet. Obwohl der Tn-Komplex bereits in den 60er Jahren des vergangenen Jahrhunderts entdeckt wurde, gelang es Takeda et al. [61] erst über 40 Jahre später große Teile der kristallinen Struktur des Moleküls in seiner Ca2+gesättigten Form zu bestimmen. TnI besteht demnach aus den starren αHelices H1 (Reste 43-79) und H2 (Reste 90-135), die sich um die dritte Untereinheit TnT winden, sowie aus der inhibitorischen Region (Reste 137148), die H1/H2 von den α-Helices H3 (Reste 150-159) und H4 (Reste 164-188) trennt. Daran anschließend befindet sich die C-terminale Domäne (Reste 192210) des Moleküls. Die kristalline Struktur der inhibitorischen Region ist in der 5 Einleitung röntgenkristallographischen Studie Takedas nicht gut zu erkennen, was darauf hinweist, dass diese Verbindung zwischen H1/H2 und H3/H4 sehr flexibel ist. 1.1.5.3 Troponin T TnT (MW 36 kDa) ist ein asymmetrisches Molekül und verbindet den TnKomplex mit Tropomyosin (Tm). TnT besteht aus einer globulären C-terminalen „Kopf“-Domäne und aus einer langgesteckten N-terminalen „Schwanz“-Region. Erstere interagiert mit TnC, letztere bindet an die überlappende Region zweier Tm-Moleküle. Auf diese Art und Weise sorgen diese Verbindungen dafür, dass die Ca2+-induzierte Konformationsänderung von TnC über TnT auf Tropomyosin übertragen wird. 2+ 31-210 Abb. 1.3: Röntgenstruktur der cTn-Kerndomäne (52 kDa) cTnC·3Ca ·cTnI ·cTnT 183-288 (PDB 1J1E) (nach Takeda et al. [61]). H1-4 sind die Helices von cTnI. IR kennzeichnet die 2+ inhibitorische Region. Die drei gebundenen Ca -Ionen der Bindungsstellen II, III und IV sind durch graue Kugeln dargestellt. (Darstellung mit Cn3D.) 1.1.6 Mechanismus der Muskelkontraktion Erstmalig beschrieben wurde der Mechanismus der Muskelkontraktion im Jahre 1957 als „Gleitfilament-Theorie“ von H.E. Huxley. Die Aktinfilamente gleiten zwischen die Myosinfilamente, welche mit ihren Köpfen gewissermaßen „auf der Stelle laufen“ und dadurch die Aktinfilamente bewegen. Jedes Sarkomer, 6 Einleitung jede Muskelfaser und letztendlich der ganze Muskel wird verkürzt, wobei sich die Länge der Myofilamente selbst nicht verändert. 1.1.6.1 Der Querbrückenzyklus Für ein detailliertes Verständnis der „Gleitfilament-Theorie“ und der Interaktion von Aktin und Myosin, ist die Kenntnis des Querbrücken-Zyklus von essentieller Bedeutung. Bei physiologischer ATP-Konzentration (3-5 mM) bindet ATP sehr schnell und irreversibel an den Myosinkopf, wodurch sich dieser vom Aktinfilament löst. Im nächsten Schritt richtet er sich auf, so dass der Myosinkopf schließlich etwa senkrecht zum Aktinfilament steht. ATP wird zu ADP und anorganischem Phosphat hydrolysiert, wodurch die Bindung von Myosin an Aktin wieder möglich wird. Nach der Freisetzung von ADP+Pi kommt es zum Kraftschlag (Power-Stroke) und einer Flexion des Myosinkopfes, der schließlich in einem Neigungswinkel von 50° zum Akt in steht. Durch das Ineinandergleiten der Aktin- und Myosinfilamente kommt es zu einer Verkürzung der Muskelzelle (isotonische Kontraktion). Sind die Enden des Muskels fixiert, so dass er sich nicht verkürzen kann, wird die Kraft nach außen abgegeben (isometrische Kontraktion). Die Wechselwirkung zwischen Aktin und Myosin ermöglicht damit Muskelverkürzung und/oder Kraftentwicklung über den gleichen Grundmechanismus der Kontraktion. Erst wenn erneut ATP an den Myosinkopf bindet, erfolgt die Ablösung des Myosins vom Aktin. Kommt es, beispielsweise bei einem Kreislaufstillstand zu einer Unterbrechung der Versorgung des Muskels mit ATP, verharren die Myosinköpfe nach dem Kraftschlag in ihrer Position und bleiben starr mit dem Aktin verbunden. Dieser Zustand wird als Totenstarre oder Rigor mortis bezeichnet. 1.1.6.2 Ca2+-abhängige Regulation des Muskelkontraktion Der Ablauf des Querbrückenzyklus ist jedoch nicht nur an das Vorhandensein von ATP geknüpft. Vielmehr wird die zyklische Aktivität der Querbrücken unter physiologischen Bedingungen durch die [Ca2+] in der Muskelzelle reguliert. Das Signal zur Kontraktion wird im Herzmuskel von sogenannten Schrittmacherzellen generiert und in Form eines Aktionspotentials an das Arbeitsmyokard weitergeleitet. Während des Aktionspotentials kommt es zu einem Einstrom von Ca2+ aus dem Extrazellulärraum ins Zellinnere und einer 7 Einleitung nachfolgenden Freisetzung von Ca2+ aus dem Sarkoplasmatischem Retikulum, einem intrazellulären Ca2+ -Speicher. Bei sehr niedriger [Ca2+] (unter 10-7 mol/l) verhindert Tropomyosin durch seine Lage auf dem Aktinfilament eine starke Anheftung der Myosinquerbrücken, wodurch sich der Muskel im relaxierten Zustand befindet. Erhöht sich nun die [Ca2+] auf ~10-6-10-5 mol/l, verändert sich die Position des Tm, die Querbrücken sind in der Lage mit dem Aktin eine starke Bindung einzugehen und Kraft zu erzeugen. 1.1.6.3 Aktivierung des Tn-Komplexes Steigt die [Ca2+] in der Muskelzelle an und bindet Ca2+ an die regulatorischen Bindungstellen des TnC, führt dies zu einer Konformationsänderung in der Nterminalen Domäne des TnC-Moleküls. Die Helices B und C entfernen sich von der Helix D und legen auf diese Weise eine hydrophobe Region frei, an die die Helix 3 des TnI anschließend binden kann. Die Interaktion dieser beiden Regionen wiederum bewirkt eine Umstrukturierung der Proteine des dünnen Filamentes, so dass sich die inhibitorische Region und der C-terminale Teil des TnI vom Aktin und Tm wegbewegen. Tm gibt nun die Myosinbindungsstellen auf dem Aktin frei, das Myosin kann binden und der Muskel kontrahiert. Die Beschreibung dieses Vorganges gilt für die Aktivierung des fast skeletal Tn (fsTn) der Skelettmuskulatur. In Studien mit isoliertem cTnC führte die Bindung von Ca2+ an die einzige regulatorische Bindungstelle II nicht zu einer sofortigen Freilegung der hydrophoben Region in der N-terminalen Domäne des TnC. Die Exposition der hydrophoben Region erfolgte erst durch die Interaktion des TnC mit der Helix 3 des TnI [31]. 1.1.6.4 Zustandsmodelle des dünnen Filaments Die Regulation der Muskelkontraktion wird bislang kontrovers diskutiert und durch verschiedene Modelle erklärt. Ein weit verbreitetes Modell ist das „steric blocking model“, welches von zwei Zuständen des dünnen Filamentes (aktiviert = on oder inaktiviert = off) ausgeht. Es besagt, dass bei niedrigen [Ca2+] Tm die Myosinbindungstellen des Aktins verdeckt und so die Krafterzeugung verhindert [17, 21, 41]. Steigt die [Ca2+] an und bindet Ca2+ an TnC, so wird Tm durch die Konformationsänderung des Tn-Komplexes in die Rinne zwischen den beiden 8 Einleitung Aktinfilamenten gedrängt und gibt auf diese Art und Weise die Myosinbindungstellen am Aktin frei [62]. Neuere Studien weisen darauf hin, dass es nicht nur zwei Zustände des dünnen Filaments, sondern drei Zustände (blocked, closed und open) geben könnte [30, 37]: der blocked (B) Zustand des 3-Zustand-Modells beschreibt die Lage des Tm bei niedriger [Ca2+], das die Bindung der Querbrücken an das Aktin verhindert. In diesem Zustand befindet sich das dünne Filament in der „off“Position. Nach Ca2+-Bindung an Tn entsteht mit der Bewegung von Tm auf der Aktinoberfäche der closed (C) Zustand, der durch eine schwache Bindung der Myosinköpfe an Aktin gekennzeichnet ist. Eine starke Querbrückenbindung, die mit Krafterzeugung einhergeht, entsteht im darauf folgenden open (M) Zustand. Dieses Modell der Aktivierung des dünnen Filamentes geht von einem kooperativen Mechanismus aus, bei dem die krafterzeugenden Querbrücken eine weitere Bewegung von Tm und/oder Aktin induzieren, die für eine Ausbreitung der Aktivierung entlang des dünnen Filaments von Bedeutung ist. a b c Abb. 1.4: Schematische Darstellung der Interaktionen zwischen Troponin und den anderen Komponenten des dünnen Filamentes. (a) zeigt den „blocked“-Zustand des 2+ Filamentes, (b) zeigt den „closed“-Zustand nach Ca -Bindung an TnC, (c) zeigt den „open“Zustand. 9 Einleitung 1.2 Kinetische Untersuchungen am dünnen Filament 1.2.1 Fluoreszenzmarkierung Die Modifikation von Proteinen durch Markieren mit einem lumineszenten Reportermolekül besitzt große Bedeutung für das Studium molekularer Wechselwirkungen. Zur Untersuchung der Konformationsänderung von cTn bei steigender, bzw. sinkender [Ca2+] werden Fluoreszenzfarbstoffe als Reportermoleküle verwendet. Sie können spezifisch an cTn gekoppelt und mit Hilfe von Licht einer bestimmten Wellenlänge angeregt werden. Die Quantenausbeute des Fluoreszenzfarbstoffes verändert sich bei einer Konformationsänderung des Proteins, abhängig von der Änderung der Sterik oder Ladung der Umgebung. Zur selektiven Fluoreszenzmarkierung eignen sich thiolreaktive Farbstoffe, die durch einen nukleophilen Angriff an die Sulfhydrylgruppe von Cystein binden und einen chemisch stabilen Thioether bilden. Wichtig bei der Auswahl eines geeigneten Fluoreszenzmarkers sind seine optischen Eigenschaften. Neben der Detektion einer hohen Fluoreszenz ist es von Bedeutung, dass die Konformationsänderung zu einer möglichst großen Fluoreszenzänderung führt und damit zu einem großen Signal/Rausch-Verhältnis. Außerdem werden Fluoreszenzfarbstoffe bevorzugt, die nicht durch UV-Licht, sondern längerwelliges sichtbares Licht (VIS) angeregt werden, wodurch Lichtstreuung und Photobleichung vermieden werden. Gleichzeitig soll die Struktur des Proteins durch den gebundenen Fluoreszenzfarbstoff so wenig wie möglich beeinflusst werden. In der vorliegenden Arbeit wird der Fluoreszenzfarbstoff IANBD verwendet, der die angegebenen optischen Eigenschaften erfüllt. 10 Einleitung Abb. 1.5: Struktur des Fluoreszenzfarbstoffes IANBD (N-((2-(Iodoacetoxy)ethyl)-N- methyl)amino-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol 1.2.2 Kinetische Parameter Nimmt man für die Anschaltkinetik der Ca2+-kontrollierten Konformationsänderung von cTn im einfachsten Fall ein Zwei-Zustand-Modell an [54], wird die beobachtete Ratenkonstante kobs definiert durch kobs= kon + koff, wobei kon eine Ca2+-abhängige Ratenkonstante und koff eine feststehende, Ca2+-unabhängige Ratenkonstante darstellt, wie Studien an isoliertem Tn gezeigt haben [11, 48, 49]. Im Fall der Abschaltkinetik gibt die beobachtete Ratenkonstante direkt den Wert für koff an. Abb. 1.6: Zwei-Zustand-Modell der 2+ Ca -kontrollierten Kinetik der Konformationsänderung von cTn 1.3 Familiäre hypertrophe Kardiomyopathie Die familiäre hypertrophe Kardiomyopathie (FHC) ist mit einer Prävalenz von 200 pro 100.000 Einwohnern die häufigste genetisch-bedingte kardiovaskuläre Erkrankung [33, 50]. Sie wird autosomal-dominant mit inkompletter Penetranz vererbt, doch auch das Auftreten von Neumutationen wird beobachtet. 11 Einleitung Das klinische Bild der FHC ist sehr variabel und reicht von Symptomlosigkeit über Belastungsdyspnoe, Angina pectoris und Synkopen bis zum plötzlichen Herztod durch Herzrhythmusstörungen, der im Adoleszentenalter oft die erste Manifestation der FHC darstellt [52]. Auch bei Leistungssportlern ist die FHC eine der häufigsten Ursachen des plötzlichen Herztodes [35]. Verursacht wird die FHC durch die Mutation von Genen, die Proteine des kardialen Sarkomers kodieren. Charakteristisch ist die Aufhebung der normalen parallelen Anordnung der Herzmuskelzellen, das Ausbilden einer netzartigen Struktur und eine zunehmende interstitielle Fibrosierung. Makroskopisch erkennt man eine Hypertrophie des linken Ventrikels, wobei bei der echokardiographischen Untersuchung eine Wanddicke ≥ 15 mm als hypertroph definiert ist. Meist sind das interventrikuläre Septum und die linksventrikuläre Hinterwand verdickt (asymmetrische septale Hypertrophie) und die Relaxation des Ventrikels ist aufgrund seiner erhöhten Steifheit eingeschränkt (diastolische Dysfunktion). Durch die Hypertrophie des septalen Myokards kann es zu einer Obstruktion des linksventrikulären Ausflusstraktes und einer damit verbundenen Behinderung des Blutflusses in die Aorta kommen. Eine mangelnde Adaptation der Mitralklappensegel kann zusätzlich zu einer begleitenden Mitralklappeninsuffizienz führen. Abb. 1.7: Humanes Herz mit Zeichen kardialer Hypertrophie bei hypertropher Kardiomyopathie. Das Septum (VS) ist deutlich verdickt, der linke Ventrikel (LV) nur geringfügig hypertrophiert (aus [34]). 12 Einleitung Bislang sind etwa 300 Mutationen auf 12 verschiedenen Genen bekannt, die zur Ausprägung einer hypertrophen Kardiomyopathie führen können [14]: αund β-Myosin-Schwerkette, kardiales Myosin-bindendes Protein C, cTnT, cTnI und cTnC, regulatorische und essentielle Myosin-Leichtkette, α-Tropomyosin, Muscle LIM Protein, kardiales Aktin sowie Titin. Meist handelt es sich um missense-Mutationen, bei denen ein Aminosäurerest durch einen anderen ersetzt wurde. 50 dieser Mutationen sind auf den Genen, die für die verschiedenen TnUntereinheiten kodieren lokalisiert, von denen wiederum mehr als 15 Mutationen des cTnI-Moleküls bei an FHC erkrankten Patienten identifiziert worden sind. Die am intensivsten untersuchte FHC-assoziierte cTnI-Mutation ist cTnIR145G. Sie befindet sich in der inhibitorischen Region von cTnI und ist durch einen Austausch von polarem Arginin gegen apolares Glycin charakterisiert. Da diese Region sowohl mit Aktin als auch mit cTnC interagiert, ist es wahrscheinlich, dass dieser Ladungswechsel die regulatorischen Eigenschaften von cTnI beeinflusst. Der Effekt von cTnIR145G auf die Ca2+-kontrollierte Schaltkinetik von cTn, welches in kardiale Myofibrillen (cMF) inkorporiert wurde, wurde erstmals in dieser Arbeit bestimmt. 1.4 Zielsetzung Die Ca2+-kontrollierte Konformationsänderung von cTn ist von zentraler Bedeutung bei der Regulation der Kontraktion/Relaxation des Myokards. Die An- und Abschaltkinetik des Troponinkomplexes in der strukturellen Umgebung des Sarkomers wurde bislang noch nicht bestimmt. Daher ist auch nicht bekannt, inwieweit die Kinetik der Ca2+-kontrollierten Konformationsänderung von cTn ratenlimitierend und damit geschwindigkeitsbestimmend für die systolische Kontraktion, bzw. diastolische Relaxation ist. Studien mit isoliertem cTnC, isoliertem cTn und mit rekonstituierten Filamenten haben gezeigt, dass sich die Ca2+-kontrollierte Schaltkinetik von cTn abhängig von der Komplexität des untersuchten Systems verändert [7, 49]. Weiter ist nicht bekannt, welchen Einfluss Mutationen des Troponinkomplexes, die mit der familiären hypertrophen Kardiomyopathie (FHC) assoziiert sind, auf die Schaltkinetik haben. 13 Einleitung Übergeordnetes Ziel dieser Arbeit war es deshalb, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem diese Kinetiken in Myofibrillen untersucht werden können. Dazu wurden Cysteine des cTn fluoreszenzmarkiert und die Kinetiken sowohl des isolierten als auch des in Myofibrillen inkorporierten Komplexes mittels stopped flow untersucht. Sowohl cTnC als auch cTnI haben mehrere Cysteine, die markiert werden können. Daher wurde 1. untersucht, ob die Kinetik davon beeinflusst wird, ob entweder cTnC oder cTnI selektiv markiert wird und 2. welchen Einfluss die Markierung bestimmter Cysteine auf die Kinetik hat. Die mit dieser Methode bestimmten kinetischen Parameter für die Ca2+kontrollierte Schaltkinetik von cTn wurden dann mit bekannten Kinetiken der Kontraktion und Relaxation [28] in Beziehung gesetzt, um zu untersuchen, ob die Ca2+-kontrollierte Schaltkinetik ratenlimitierend ist. Nach Etablierung der Methode wurde exemplarisch an der FHC-assoziierten Mutation cTnIR145G untersucht, ob und in welcher Weise Mutationen des cTnI, die im Zusammenhang mit der FHC stehen, die Schaltkinetik verändern. 14 Material und Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Chemikalien Es wurden Chemikalien in p.A.-Qualität von den Firmen AppliChem (Darmstadt), Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), ROTH (Karlsruhe), Serva (Heidelberg), Sigma (Steinheim) und USB (Ohio, USA) bezogen. 2.1.2 Lösungen Soweit nicht anders angegeben, wurde für alle Puffer vollentsalztes H2O (18 MΩ, Reinstwasseranlagen MembraPure oder MilliQ) verwendet. 2.1.2.1 Isolierung von Troponin (cTn) 2.1.2.1.1 Homogenisation der geernteten Bakterien Homogenisationspuffer (100 ml) 25 mM Triethanolaminhydrochlorid 8M Harnstoff 1 mM EDTA 2 mM DTT 1 µg/ml Pepstatin A 600 µl Proteaseinhibitorcocktail (siehe 2.1.2.8) pH 7,5 (NaOH) 0,5 mM PMSF 15 Material und Methoden 2.1.2.1.2 cTnC-Reinigung mittels fast performance liquid chromatography (FPLC) cTnC-DEAE-Sepharosepuffer A (4000 ml) 25 mM Triethanolaminhydrochlorid 8M Harnstoff 2 mM EDTA 1 mM DTT pH 7,5 (NaOH) cTnC-DEAE-Sepharosepuffer B (800 ml) 1M NaCl in 800 ml cTnC-DEAE-Sepharosepuffer A cTnC-Dialysepuffer (4000 ml) 1 mM NH4HCO3 2.1.2.1.3 cTnT-Reinigung mittels FPLC cTnT-CM-Sepharosepuffer A (2000 ml) 50 mM tri-Natrium-Citratdihydrat 6M Harnstoff 1 mM EDTA 1 mM DTT pH 6,0 (HCl) cTnT-CM-Sepharosepuffer B (300 ml) 1M NaCl in 300 ml cTnT-CM-Sepharosepuffer A 16 Material und Methoden cTnT-DEAE-Sepharosepuffer A (2000 ml) 50 mM Tris 6M Harnstoff 1 mM EDTA 1 mM DTT pH 8,0 (HCl) cTnT-DEAE-Sepharosepuffer B (300 ml) 1M NaCl in 300 ml cTnT-DEAE-Sepharosepuffer A cTnT-Dialysepuffer (4000 ml) Siehe cTnC-Dialysepuffer 2.1.2.1.4 cTnI-Reinigung mittels FPLC cTnI-CM-Sepharosepuffer A (2000 ml) Siehe cTnC-DEAE-Sepharosepuffer A cTnI-CM-Sepharosepuffer B (400 ml) Siehe cTnC-DEAE-Sepharosepuffer B cTnI-Dialysepuffer (4000 ml) 1 mM HCl 2.1.2.2 SDS-Gelelektrophorese 2.1.2.2.1 SDS-Gel (Tris-Tricine) Die Tricine-Gele stammten ebenso wie der Tricine-Probenpuffer von der Firma Anamed (Darmstadt). 10x Tricine-Laufpuffer 1M Tris 1M Tricine 1% SDS 17 Material und Methoden 2.1.2.2.2 SDS-Gel (Tris/Glycin) 4x Tris/Glycin-Trenngelpuffer pH 8.8 2M Tris 20 % SDS pH 8,8 (HCl) 8x Tris/Glycin-Sammelgelpuffer pH 6.8 2M Tris 20 % SDS pH 6,8 (HCl) 10 % APS 440 mM Ammoniumperoxodisulfat 10x Tris/Glycin-Laufpuffer 250 mM Tris 1,9 M Glycin 20 % SDS 2x Laemmli-Probenpuffer (10 ml) 125 mM Tris-HCl, pH 6.8 20 % Glycerol 4% SDS 0,005 % Bromphenolblau 18 Material und Methoden Trenngel (12,5 %), für 4 Minigele (10 x 8 cm) (oder 1 großes Gel) Acrylamid (30/0,8) 12,18 ml 4x Trenngelpuffer, pH 8.8 7,5 ml Glycerin/Bidest (1:1) 1,5 ml MilliQ-Water 8,65 ml 10% APS 150 µl TEMED 15 µl Sammelgel (3,3 %), für 4 Minigele (10 x 8 cm) (oder 1 großes Gel) Acrylamid (30/0,8) 550 µl 8x Sammelgelpuffer, pH 6.8 625 µl MilliQ-Water 3770 µl 10% APS 50 µl TEMED 15 µl Tab. 2.1: Pipettierschema für SDS-Gele (Tris/Glycin) 2.1.2.3 cTnC-Fluoreszenzmarkierung Harnstoff-Reduktionspuffer (100 ml) 25 mM MOPS 200 mM NaCl 6M Harnstoff 0,5 mM CaCl2-Dihydrat 2 mM DTT pH 7,0 (NaOH) 19 Material und Methoden Harnstoff-Dialysepuffer (2000 ml) 25 mM MOPS 200 mM NaCl 6M Harnstoff 0,5 mM CaCl2-Dihydrat 0,1 mM DTT pH 7,0 (NaOH) 2.1.2.4 Rekonstitution des cTn-Komplexes MOPS-Grundpuffer (je 2000 ml) 25 mM MOPS 0,5 mM CaCl2- Dihydrat 1 mM DTT pH 7,0 (NaOH) MOPS-Puffer 1 1M NaCl in 2000 ml MOPS-Grundpuffer MOPS-Puffer 2 750 mM NaCl in 2000 ml MOPS-Grundpuffer MOPS-Puffer 3 500 mM NaCl in 2000 ml MOPS-Grundpuffer MOPS-Puffer 4 300 mM KCl in 2000 ml MOPS-Grundpuffer (pH einstellen mit KOH) 20 Material und Methoden 2.1.2.5 Präparation der kardialen Myofibrillen (cTn) und Austausch von cTn Rigor-Puffer 10 mM HEPES 132 mM NaCl 5 mM KCl 1 mM NaN3 1 mM MgCl2-Hexahydrat 5 mM EGTA pH 7,1 (NaOH) Skinning-Puffer (Häutungslösung) 10 mM Tris 10 mM NaCl 150 mM KCl 1 mM NaN3 1 mM MgCl2-Hexahydrat 5 mM EGTA 1% Triton X-100 pH 7,1 (NaOH) 2.1.2.6 Puffer für die Ca2+-induzierte Anschaltkinetik (Single-Mix) Stammlösung A (200 ml, 10-fach konzentriert) 100 mM Imidazol 30 mM MgCl2-Hexahydrat 477 mM Na2-Kreatinphosphat 10 mM ATP Der pH-Wert wurde bei Raumtemperatur mit HCl auf 7,5 eingestellt, dann wurde ATP zugegeben. Bei 10°C wurde der pH-Wert auf 7,0 eingestellt und das Volumen mit H2O auf 200 ml gebracht. Die Lösung wurde in Portionen von 2 ml aliquotiert und bei -20°C eingefroren. 21 Material und Methoden Stammlösung B (200 ml, 10-fach konzentriert) 30 mM Na2-BAPTA Der pH-Wert wurde bei 10°C auf 7,0 eingestellt, das Volumen mit H2O auf 200 ml gebracht. Die Lösung wurde in Portionen von 2 ml aliquotiert und bei -20°C eingefroren. Zwischenlösung 2 ml Stammlösung A 2 ml Stammlösung B 6 ml H2O 40 mM DTT Relaxationslösung (pCa 9,38) 5 ml Zwischenlösung 5 ml H2O Aktivierungslösung (pCa 4,61) 5 ml Zwischenlösung 6 mM CaEGTA Das Volumen wurde mit H2O auf 10 ml gebracht. 2+ Abb. 2.1: Protokoll der Puffer für die Ca -induzierte Anschaltkinetik 22 Material und Methoden Herstellung der verschiedenen pCa-Werte pCa SX-Relaxationspuffer (%) SX-Aktivierungspuffer (%) 9,4 100 0 7,7 90 10 7,1 75 25 6,9 65 35 6,6 50 50 6,4 40 60 6,2 30 70 6,0 20 80 5,6 10 90 5,3 5 95 5,1 2,5 97,5 4,6 0 100 Tab. 2.2 Mischungsverhältnis (%) von Single-Mix (SX)-Relaxationspuffer und Single-Mix (SX)-Aktivierungspuffer für die verschiedenen pCa´s Die Ca2+-Konzentration der Puffer wurde mit dem Programm CHELATOR (T. Schoenmakers, Dept. of Animal Physiology, Nijmegen, Niederlande, 1992) berechnet. 2.1.2.7 Puffer für die Ca2+-kontrollierte Abschaltkinetik (Double-Mix) Zwischenlösung 2 ml Stammlösung A (s. 2.1.2.6) 0,4 ml Stammlösung B (s. 2.1.2.6) 7,6 ml H2O 40 mM DTT Relaxationslösung (pCa 8,68) 5 ml Zwischenlösung 5 ml H2O [BAPTA] = 0,6 mM 23 Material und Methoden Aktivierungslösung (pCa 4,97) 5 ml Zwischenlösung 1,2 mM CaEGTA Das Volumen wurde mit H2O auf 10 ml gebracht. [BAPTA] = 0,6 mM BAPTA-Lösung (pCa 7,9) 0,5 ml Stammlösung A 2 ml Stammlösung B 2,5 ml H2O 20 mM DTT 2+ Abb. 2.2: Protokoll der Puffer für die Ca -kontrollierte Abschaltkinetik 2.1.2.8 Proteaseinhibitorcocktail (Stammlösung 200-fach konzentriert) 0,5 mM AEBSF 14,7 µM Antipain 5 µg/ml Aprotinin 10 µM Leupeptin wurden in 5 ml 50 mM Imidazol (pH 7,0), 3 mM MgCl2 gelöst, in 150 µl Portionen aliquotiert und bei -20°C eingefroren. 24 Material und Methoden 2.1.2.9 Puffer für den Nachweis des cTn-Austauschs in cMF Reduktions- und Alkylierungspuffer 450 mM Tris pH 8,5 (HCl) 2.2 Methoden 2.2.1 Expression der humanen kardialen Troponin-Untereinheiten cTnC, cTnT und cTnI 2.2.1.1 Vorkultur Für die Expression des cTnC und cTnI wurde der Bakterienstamm BL21DE3 (Ampicillinresistenz; Stratagene, Kirkland, Washington, USA) benutzt, für cTnT ® BL21DE3 Codon Plus RP (Ampicillin- und Chloramphenicolresistenz). Für die Transformation der entsprechenden Untereinheiten wurden jeweils 100 µl kompetente Bakterien 20 min auf Eis aufgetaut. Es wurde 1 µl (≈ 100 ng) der entsprechenden Plasmid-DNA (zur Verfügung gestellt von Dr. N. Blaudeck) dazugegeben, vorsichtig gevortext und anschließend mindestens 20 min auf Eis inkubiert. Der Transformationsansatz wurde in einem Wasserbad mit 42°C inkubiert (heat shock), bei BL21DE3 45 s, bei BL21DE3 Codon Plus R RP 20 s. Nach 2 min Inkubation auf Eis wurden 800 µl LB-Medium (ROTH, 25 g Medium auf 1000 ml VE-Wasser, anschließend autoklaviert) zugegeben und 1 h bei 37°C geschüttelt, um die Zellmembran zu regeneriere n und die Antibiotikaresistenz, welche die Plasmide tragen, auszuprägen. Es wurde eine Vorkultur aus je 50 ml LB-Medium und 200 µl des jeweiligen Transformationsansatzes angesetzt und über Nacht bei 37°C und 200 rpm geschüttelt (Innova, New Brunswick Scientific, Nürtingen). Den Transformationsansätzen wurden jeweils 50 µg/ml Ampicillin einer 50 mg/mlStammlösung zugesetzt. Den Transformationsansätzen von cTnT (BL21DE3 Codon Plus R RP) wurden zusätzlich noch 50 µg/ml Chloramphenicol einer 50 mg/ml EtOH-Stammlösung zugesetzt. 25 Material und Methoden 2.2.1.2 Hauptkultur Jeweils 600 ml LB-Medium (siehe 2.2.1.1) wurden in Kulturkolben mit 4 Schikanen mit je 50 µg/ml Ampicillin (Stammlösung siehe 2.2.1.1) versetzt und bei 120 rpm im Schüttler (Innova) 30 min auf 37°C t emperiert. Anschließend wurden die Kulturkolben mit 2,5 % (15 ml) der Vorkultur angeimpft und weiterhin bei 37°C und 120 rpm (Innova) geschüttelt . Der beste Zeitpunkt, um die Proteinexpression zu induzieren, liegt in der exponentiellen Wachstumsphase. Das Bakterienwachstum wird anhand der optischen Dichte (OD, hier bei 600 nm gemessen) der Bakteriensuspension verfolgt. Bis zu einer OD von 0,4 ist die Bakteriendichte proportional zur Extinktion, danach muss sie verdünnt werden. Bei einer OD von 0,3 - 0,4 (unter oben genannten Bedingungen normalerweise nach ~ 45 min) war der Induktionszeitpunkt erreicht. Die Expression wurde mit 1 mM IPTG induziert. 3,5 h nach der Induktion wurde mit der Zellernte begonnen. Dazu wurden die Bakterien 15 min bei 4°C und 6000 g zentrifugiert, der Überstand ver worfen und die Pellets bei 80°C eingefroren. Zur späteren Überprüfung der Expression mittels SDS-Gel wurde unmittelbar vor und 3 h nach der Induktion (t = 0, t = 3) je 1 ml Bakterienlösung entnommen, zentrifugiert (3 min, 13000 rpm), mit 1x Laemmli-Probenpuffer (OD 100 in µl) versetzt, 5 min auf 95°C erhitzt und ans chließend bei -20°C eingefroren. 2.2.2 Isolierung der cTn-Untereinheiten aus E.coli Die gefrorenen Pellets wurden in Homogenisationspuffer resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen mittels Ultraschall (Branson Digital Sonifire, Heinemann, Schwäbisch Gemünd) auf Eis aufgeschlossen. Einstellung des Ultraschalls: max. Amplitude 45 % Beschallungszeit insgesamt 1:45 min max. Probentemperatur 37°C Puls ein 15 s Puls aus (Pause) 30 s 26 Material und Methoden Die aufgeschlossenen Zellen wurden mit 6 mM MgCl2-Hexahydrat und 40 µl Benzonase-Nuclease (Novagen, Wisconsin, USA) versetzt und bei RT 10 min gerührt. Sie wurden danach für 20 min bei 16°C und bei 22500 g zentrifugiert. Der Überstand wurde gegen 700-800 ml des für die jeweilige cTn-Untereinheit vorbereiteten Säulenpuffers A 2 bis 3 h dialysiert (SnakeSkin, molekulare Ausschlussgrenze 7000 Da, Pierce, PERBIO, Bonn). Danach wurde der pHWert auf den des jeweiligen Säulenpuffers A eingestellt und für 20 min bei 16°C und 24500 g erneut zentrifugiert. Der Überstand, der der Proteinlösung entspricht, wurde mit Spritzenfiltern (Rotilabo, PVDF, Porengröße 0,45 µm, ROTH) filtriert und war danach bereit für die Isolierung der entsprechenden cTn-Untereinheit mittels der fast performance liquid chromatography (FPLC). 2.2.2.1 Fast performance liquid chromatography (FPLC) Für die chromatographische Proteinreinigung wurde die FPLC-Anlage „FPLCSystem“ der Firma Amersham Biosciences (jetzt GE-Healthcare, München) bestehend aus der LCC-501 Kontrolleinheit, einem UV-Monitor und einem Leitfähigkeits-Monitor verwendet. Zur Isolation der cTn-Untereinheiten wurde als Anionen-Austauscher Diethylaminoethyl-SepharoseTM (DEAE-Sepharose) und als Kationen-Austauscher Carboyxmethyl-SepharoseTM (CM-Sepharose; Amersham Biosciences) benutzt. Die Ionenaustauscher-Materialien wurden in XK 16/40-Säulen (60 ml Füllungsvolumen) für cTnC bzw. XK 16/20-Säulen (25 ml Füllungsvolumen) für cTnT und cTnI eingesetzt. 2.2.2.2 Isolierung von cTnC cTnC wurde nach einem Protokoll von al-Hillawi et al. [1] isoliert. Um kontaminierende Nukleinsäuren und Proteine der Bakterienstämme aus der Proteinlösung (siehe 2.2.2) zu entfernen, wurde diese durch drei aufeinander folgende Reinigungsläufe über eine DEAE-Sepharosesäule in 8 M Harnstoff gereinigt. Die DEAE-Sepharosesäule wurde mit cTnC-DEAE-Sepharosepuffer A äquilibriert und mit der Proteinlösung beladen. Die mit 375 mM NaCl eluierten Fraktionen enthielten cTnC. Abschließend wurden die ebenfalls gebundenen Nukleotide mit 1 M NaCl (cTnC-Sepharosepuffer B) von der Säule gelöst. Auf diese Art und Weise wurde die Säule regeneriert und für einen weiteren Reinigungslauf vorbereitet. In einem zweiten Reinigungslauf eluierten die cTnC27 Material und Methoden haltigen Fraktionen während des graduellen Anstiegs der NaCl-Konzentration (in drei Stufen von 60 mM auf 175 mM, von 175 mM auf 280 mM und schließlich von 280 mM auf 375 mM) bei einer Leitfähigkeit von etwa 12-14,5 mS cm-1. Die Fließgeschwindigkeit betrug 5 ml/min. Die cTnC-haltigen Fraktionen aus dem zweiten Reinigungslauf wurden 3x je 3 h gegen 1 mM NH4HCO3 (cTnC-Dialysepuffer) dialysiert, filtriert (Rotilabo, PVDF, Porengröße 0,45 µm, ROTH), in flüssigem Stickstoff schockgefroren und anschließend über Nacht lyophilisiert (Details siehe 2.2.4 und 2.2.5). 2.2.2.3 Isolierung von cTnT cTnT wurde nach einem Protokoll von Potter [44] in zwei Schritten isoliert: Zunächst über Kationen-Austauscher-Chromatographie in 6 mM Urea bei pH 6, anschließend über Anionen-Austauscher-Chromatographie bei pH 8. Die CM-Sepharosesäule wurde mit cTnT-CM-Sepharosepuffer A äquilibriert und dann mit der Proteinlösung (siehe 2.2.2) beladen. Die NaCl-Konzentration wurde durch Hinzufügen von 28 % cTnT-CM-Sepharosepuffer B in einer Stufe von 0 mM auf 280 mM erhöht. cTnT eluierte beim Leitfähigkeitsanstieg von ~7,5 auf 21 mS cm-1. Für die anschließende Anionen-Austauscher-Chromatographie wurden die cTnT-haltigen Fraktionen in cTnT-DEAE-Sepharosepuffer A umgepuffert und auf eine DEAE-Sepharosesäule aufgetragen. In diesem Puffer wurde ein NaCl-Gradient (0 – 45 % cTnT-DEAE-Sepharosepuffer B, Fließgeschwindigkeit 5 ml/min) auf die DEAE-Sepharosesäule gegeben. Bei einer Leitfähigkeit von ~ 14,5-18,5 mS · cm-1 eluierte das reine cTnT. Anschließend wurden die cTnT-haltigen Fraktionen 3x je 3 h gegen 1 mM NH4HCO3 (cTnT-Dialysepuffer) dialysiert, filtriert (Rotilabo, PVDF, Porengröße 0,45 µm, ROTH), in flüssigem Stickstoff schockgefroren und lyophilisiert (Details siehe 2.2.4 und 2.2.5). 2.2.2.4 Isolierung von cTnI cTnI wurde nach einem modifizierten Protokoll von al-Hillawi et al. [1] über Kationen-Austauscher-Chromatographie isoliert. Die Proteinlösung wurde auf eine mit cTnI-CM-Sepharosepuffer A äquilibrierte CM-Sepharosesäule gebracht. Anschließend eluierte cTnI während einer von 50 mM auf 400 mM ansteigenden Konzentration des cTnI-CM-Sepharosepuffers B bei einer Leitfähigkeit von 10-14 mS cm-1 (Fließgeschwindigkeit 5 ml/min). Anschließend 28 Material und Methoden wurden die jeweiligen cTnI-haltigen Fraktionen 3x je 3 h gegen 1 mM HCl (cTnI-Dialysepuffer) dialysiert, filtriert (Rotilabo, PVDF, Porengröße 0,45 µm, ROTH), in flüssigem Stickstoff schockgefroren und lyophilisiert (Details siehe 2.2.5 und 2.2.6). 2.2.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 2.2.3.1 Reinheitsbestimmung der isolierten cTn-Untereinheiten Um zu überprüfen, Untereinheiten welche enthielten der FPLC-Fraktionen und wie rein diese die entsprechenden waren, wurde die Gelelektrophorese benutzt. Für cTnC wurden SDS-Gele (Tris/Tricine), Tricine-Probenpuffer und Laufpuffer der Firma Anamed verwendet. Alle Proben wurden zu gleichen Volumina mit Tricine-Probenpuffer versetzt. Als Marker für die Kontrolle des Molekulargewichts diente See Blue Plus 2 (Invitrogen, Kalifornien, USA). Es wurden je 30 µl der Proben und 7,5 µl des Markers aufgetragen. Das Gel lief bei 125 V für 90 min. Für cTnI und cTnT wurden SDS-Gele (Tris/Glycin; Hoefer-System, GEHealthcare) mit 12,5 %igem Sammelgel benutzt. Als Marker für die Kontrolle des Molekulargewichts dienten See Blue Plus 2 (Invitrogen). Außerdem wurden die bei der Überexpression kurz vor und 3 h nach der Induktion genommenen Proben (t=0, t=3; siehe 2.2.1.2) zum Nachweis der Expressionsbande aufgetragen. Alle Proben wurden 1:2 mit 2x Laemmli-Probenpuffer versetzt. Es wurden je 10 µl (cTnT) bzw.15 µl (cTnI) der Proben und 7,5 µl des verwendeten Markers aufgetragen. Die Proben liefen bei einer Stromstärke von 10-15 mA in das Sammelgel ein. Sobald sich die Proben im Trenngel befanden, wurde die Stromstärke auf 15-20 mA erhöht. 2.2.3.2 Nachweis des cTn-Austauschs in cMF Bei der Präparation der cMF und des nachfolgenden cTn-Austauschs wurden für den Austauschnachweis (siehe 2.2.8.2, gelagert bei -80°C) Proben genommen. Sie wurden aufgetaut und anschließend in 100 µl Reduktions- und Alkylierungspuffer resuspendiert. Anschließend wurden sie für 15 min in ein Ultraschallbad (Sonorex RK 52, Bandelin, Berlin) gestellt. Als Kontrolle wurden je 10 µl des jeweiligen ausgetauschten cTn-Komplexes, aufgetaut und mit 29 Material und Methoden Reduktions- und Alkylierungspuffer auf 100 µl aufgefüllt. Auf alle Proben wurde zur Reduktion 3 µl einer 1 M DTT-Lösung pipettiert und anschließend für 3 min bei 95°C inkubiert. So wurde vermieden, dass sich D isulfidbrücken im cTnKomplex ausbilden konnten. Um eine bessere Trennung von cTn und Meerschweinchen-cTn zu erreichen, wurden die Proben alkyliert. Dazu wurden jeweils 10 µl einer 800 mM Iodoacetamid-Lösung zu den Proben gegeben und anschließend wurde erneut für 1 min bei 95°C inkubi ert. Danach wurden sie durch Pufferaustausch mit Zeba Desalt Spin Columns (0,5 ml Volumen, Pierce, PERBIO) in Laemmli-Puffer (siehe 2.1.2.2) überführt und hinterher 1:10 mit Laemmli-Puffer verdünnt. Von den Austauschproben wurden je 10 µl auf ein großes, 12,5 %iges SDS-Gel (Tris-Glycin; siehe 2.1.2.2.2) aufgetragen, von den Kontrollen wurden jeweils 5 µl auf dieses Gel aufgetragen. Das Gel lief in einem Hoefer-System (SE 600 Series Electrophorese Unit) bei 4 mA 18 h über Nacht. Anschließend wurde es mit Coomassie R-250 (Blue R Tablets, SERVA) oder Silver-Staining (Silver Snap Kit II, nach beigefügtem Protokoll, Pierce, PERBIO) gefärbt. 2.2.4 Dialyse Die cTn-haltigen Fraktionen wurden dialysiert (SnakeSkin, molekulare Ausschlussgrenze 7000 Da, Pierce, PERBIO) und zwar 3x mindestens 3 h in jeweils 4 l jeweiligem Dialysepuffer im Kühlraum (4°C). Bei cTnI wurde nach der Dialyse als Reduktionsmittel TCEP in 10 M-Überschuss der erwarteten Proteinmenge zugegeben. Das Dialysat wurde mit Spritzenfiltern (Rotilabo, PVDF, Porengröße 0,45 µm, ROTH) filtriert und anschließend lyophilisiert. 2.2.5 Lyophilisation Die Proben wurden in 50 ml Falcon-Tubes gefüllt, jeweils 10 ml pro Tube, und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Dann wurden die Proben in der Lyophille (Alpha1-2, Christ, Osterode) für ~ 1 Tag gefriergetrocknet. Sie wurden bei -80°C gelagert. 2.2.6 Fluoreszenzmarkierung von cTnC bzw. cTnI cTn wurde entweder an cTnC (C35, C84) oder an cTnI (C80, C97) mit dem thiol-spezifischen Fluoreszenzfarbstoff N-((2-(Iodoacetoxy)Ethyl)-N- Methyl)Amino-7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol (IANBD) markiert. Dazu wurden 30 Material und Methoden 2,5 mg cTnC/ml, bzw. bei spezifischer Markierung von cTnI 1 mg cTnI/ml in Harnstoff-Reduktionspuffer gelöst und 2 h bei 4°C i n Dunkelheit langsam geschwenkt. Um das im Harnstoff-Reduktionspuffer enthaltene DTT zu entfernen, wurde danach mindestens 3 h gegen Harnstoff-Dialysepuffer dialysiert (mindestens 1 ml Proteinlösung/ 100 ml Puffer, SnakeSkin, molekulare Ausschlussgrenze 7000 Da, Pierce, PERBIO). Zwischenzeitlich wurde IANBD in 5-molarem Überschuss zur Proteinlösung in Dimethylformamin (DMF) gelöst. Diese IANBD-DMF-Lösung wurde tröpfchenweise zur Proteinlösung gegeben, wobei der DMF-Anteil an der Protein-Lösung weniger als 2 % betragen sollte. Anschließend wurde die Protein-Lösung 1 h bei 4°C in Dunkelheit inkubiert. Das Iodoacetamid (IA) wurde durch einen nukleophilen Angriff vom Nitrobenzoxadiazol (NBD) abgespalten und das verbleibende fluoreszierende NBD band an die Cysteinreste der zu markierenden Untereinheit. Um die Fluoreszenzfärbung zu beenden, wurden mindestens 10 mM DTT dazugegeben, wodurch das überschüssige NBD gebunden wurde. Das überschüssige NBD wurde mit ZEBA Desalt-Spincolumns (Pierce, PERBIO) entfernt. Anschließend wurde das cTnC mit Spritzenfiltern (Rotilabo, PVDF, Porengröße 0,45 µm, ROTH) filtriert. Die Fluoreszenzmarkierung von cTnI mit IAEDANS erfolgte auf die gleiche Art und Weise wie hier beschrieben. 2.2.7 Rekonstitution des cTn-Komplexes Die fluoreszenzmarkierte Untereinheit (cTnC oder cTnI) wurde nach einem Protokoll von Potter [44] mit den Untereinheiten cTnT und cTnI, bzw. cTnC, zu einem cTn-Komplex rekonstituiert. Dazu wurden cTnT (1 mg/ml) und cTnI (1 mg/ml), bzw. cTnC (2,5 mg/ml) zu der fluoreszenzmarkierten Untereinheit gegeben. Die Lösung wurde ca. 45 min auf Eis geschwenkt, bis sich die hinzugefügten Untereinheiten gelöst hatten. Die Rekonstitution des cTnKomplexes erfolgte durch Dialyse (SnakeSkin, molekulare Ausschlussgrenze 7000 Da, Pierce, PERBIO) der cTn-Untereinheiten gegen MOPS-Puffer I-IV mit absteigender NaCl-Konzentration (je Puffer 3x je 1,5 h bei 4°C, beginnend mit MOPS I). Nach den Dialysen wurde 20 mM DTT zugegeben, der cTn-Komplex wurde filtriert (Millex-HV Syringe Driven Filter Units, Porengröße 0,45 µm, 31 Material und Methoden Millipore, Massachuchets, USA), anschließend aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert. Wurde der gesamte cTn-Komplex mit IANBD markiert, wurde der Komplex zunächst rekonstituiert und erst im Anschluss fluoreszenzmarkiert. 2.2.8 Präparation von cMF und cTn-Austausch 2.2.8.1 Präparation von murinen cMF Für die Isolierung von kardialen Myofibrillen wurden erwachsene, männliche Mäuse (Stamm HIM:OF1) durch Genickbruch getötet und die noch schlagenden Herzen (~ 200 mg) zum Ausbluten in eine Lösung aus Rigor-Puffer und Proteaseinhibitorcocktail gegeben. Auf einem vorgekühlten Präparationsblock wurden die Herzen entlang des Septums aufgeschnitten und aufgeklappt, um zunächst die Vorhöfe, Blutgefäße, umgebendes Bindegewebe und Blutkoagel zu entfernen. Anschließend wurden sie mit Hilfe feiner Nadeln auf dem Präparationsblock fixiert und 1 h bei einer Temperatur von 4°C in Rigor-Puffer belassen. Die Herzen sollten so langsam in den Rigorzustand übergehen, ohne dass die cMF überkontrahierten. Dann wurden die Herzen in kleine Stücke geschnitten (~ 1 mm2) und in 3 ml Rigor-Puffer pro 200 mg Herz gegeben. Die Herzstückchen wurden für 5 s mit einem eisgekühlten Ultraturax (Ultraturax T25, Janke & Kunkel, Staufen) homogenisiert. Währenddessen wurde der cTn-Komplex auf Eis aufgetaut, 1 h bei 4°C 1:10 gegen Rigor dialysiert (Slide-A-Lyzer®, molekulare Ausschlussgrenze 7000 Da, Pierce, PERBIO) und anschließend filtriert (Millex-HV Syringe Driven Filter Units, Porengröße 0,45 µm, Millipore). Das Homogenisat wurde mit Skinning-Puffer verdünnt, so dass schließlich ~200 mg Herz in 8 ml der Lösung enthalten waren. Im Skinning-Puffer wurden die cMF für 1 h auf Eis auf dem Schüttler (SM, E. Bühler, Tübingen) belassen, um auf diese Art und Weise z.B. Fragmente der Zellmembranen zu entfernen. Nach dieser Zeit wurde die cMF-Suspension für 8 min mit 380 g bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet aus cMF wurde in gleichem Volumen Rigor-Puffer resuspendiert und für 10 s ein zweites Mal mit dem eisgekühlten Ultraturax homogenisiert. Aus dem Homogenisat der Herzstückchen wurden zu große Zellfragmente entfernt, indem in zwei Durchgängen filtriert wurde (40 µm und 20 µm Porengröße, 32 Material und Methoden Polyesterfilter). Dann wurde die cMF-Suspension für 12 min mit 380 g bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde in Rigor-Puffer und fluoreszenzmarkiertem cTn (1 mg/ml) für 1 h bei Raumtemperatur auf dem Schüttler inkubiert. Die Suspension wurde für die Bestimmung der Ca2+-induzierten Anschaltkinetik (SX) und für die Abschaltkinetik (DX) aliquotiert. Die cMF-Suspension wurde erneut zentrifugiert (12 min, 4°C, 380 g). Das Pell et wurde im jeweiligen Relaxationspuffer (SX oder DX) (siehe 2.1.2.6, 2.1.2.7) resuspendiert, so dass sich eine Endkonzentration von etwa 200 mg Herz/ml beim SX und 400 mg Herz/ml beim DX ergab. Zur Bestimmung der Sarkomerlänge im jeweiligen Relaxationspuffer, wurden die cMF unter dem Lichtmikroskop betrachtet. Die Sarkomerlänge der cMF sollte zwischen ~ 2,0 und ~ 2,4 µm betragen. 2.2.8.2 Präparation von Meerschweinchen-cMF Es wurden Meerschweinchen im Alter von 1 und 4 Monaten (350–800 g) verwendet. Vor der Exzision des Herzens wurde das Tier mit Isofluran tief narkotisiert, bis es auf Schmerzreize nicht mehr reagierte, aber das Herz noch schlug. Die folgenden Schritte wurden auf Eis oder bei 4°C durchgeführt. Unmittelbar nach der Exzision wurde das Herz (1,8 - 3,0 g) durch die Aorta mittels einer stumpfen Kanüle, die an ein Reservoir mit Rigor-Puffer gekoppelt war, retrograd perfundiert. Durch die Perfusion wurden die Koronararterien innerhalb weniger Sekunden blutleer, woraufhin sich das Herz blass-rosa färbte. Die Perfusion wurde über Nacht fortgesetzt. Anschließend wurde das Herz entlang des Septums aufgeschnitten und eventuelle Blutkoagel sowie Vorhöfe, Herzklappen und Herzbeutel entfernt. Es wurde in kleine Stücke geschnitten (~ 1 mm2) und in 1 ml Rigor-Puffer pro 100 mg Herz gegeben. Anschließend wurden die Herzstückchen für 5 s mit einem eisgekühlten Ultraturax homogenisiert. Währenddessen wurde der cTn-Komplex auf Eis aufgetaut, 1 h bei 4°C 1:10 gegen Rigor dialysiert und anschließend filtriert. Aus dem Homogenisat der Herzstückchen wurden zu große Zellfragmente entfernt, indem in zwei Durchgängen filtriert wurde (40 µm und 20 µm Porengröße, Polyesterfilter). Anschließend wurde die cMF-Suspension für 10 33 Material und Methoden min bei 4°C und 380 g zentrifugiert. Das Pellet aus cMF wurde in gleichem Volumen mit Skinning-Puffer resuspendiert und 5 min inkubiert. 100 µl dieser Lösung wurden für den Austauschnachweis abgenommen und 20 s in der Tischzentrifuge zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt und das Pellet bei –80°C eingefroren. Der Rest der cMF-Susp ension wurde mit 380 g bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde mit R igor-Puffer, 150 µl Proteaseinhibitorcocktail und fluoreszenzmarkiertem cTn (1 mg/ml) für 1 h bei Raumtemperatur auf dem Schüttler inkubiert. Nach der Inkubation wurde 10 mM BDM (2,3-Butandion-2-Monoxim, ein Aktomyosin-ATPase-Inhibitor) zugegeben, um eine Überkontraktion der cMF zu vermeiden. Unter dem Lichtmikroskop wurde die Sarkomerlänge der cMF im Rigor-Puffer bestimmt. Erneut wurden 100 µl dieser Lösung für den Austauschnachweis abgenommen und 20 s in der Tischzentrifuge zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt und das Pellet bei -80°C eingefroren. Die Suspension wurde für die Bestimmung der Ca2+-induzierten Anschaltkinetik (SX) und für die Abschaltkinetik (DX) aufgeteilt. Die cMF-Suspension wurde zentrifugiert (10 min, 4°C, 380 g). Das Pellet wurd e im 3-fachen Volumenüberschuss des jeweiligen Relaxationspuffers (SX oder DX) mit 10 mM BDM resuspendiert und erneut zentrifugiert (10 min, 4°C, 380 g). Anschließend wurde der Überstand verworfen und das Pellet erneut in 3-fachem Volumenüberschuss des SX- oder DX-Relaxationspuffers ohne BDM resuspendiert. Wieder wurde zentrifugiert (10 min, 4°C, 380 g) und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 0,5-fachem Volumenüberschuss des Ausgangsvolumens in SX- oder DX-Relaxationspuffer resuspendiert. Um zu bestimmen, ob die cMF im jeweiligen Relaxationspuffer überkontrahiert waren, wurde die Sarkomerlänge unter dem Lichtmikroskop bestimmt. Sie sollte zwischen ~ 2,0 und ~ 2,4 µm betragen. 2.2.9 Bestimmung der cMF-Dichte anhand der [S1] Um sicherzustellen, dass die Messungen mit einer reproduzierbaren cMFDichte durchgeführt werden, wurde vor den Messungen die Konzentration der Myosinköpfe ([S1]) bestimmt. Über diese kann indirekt auf die cMF-Dichte zurück geschlossen werden. Dazu wurden nach der Bestimmung der Sarkomerlänge 100 µl der cMF-Suspension abgenommen und ~ 20 s bei ~ 12000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde vollständig verworfen und das 34 Material und Methoden Pellet in 1 oder 2 ml 2 % SDS-Puffer gelöst (Verdünnung von 1:10, bzw. 1:20). Als Null-Wert diente 2 %-iger SDS-Puffer. Es wurde ein Absorptionsspektrum der in SDS gelösten cMF zwischen 200 nm und 700 nm gemessen. Abb. 2.3: Beispiel einer [S1]-Konzentrationsbestimmung. Die gestrichelte vertikale Linie hat eine Länge von 1,2 cm. Dieser Wert wird durch die Länge der y-Achse (7,6 cm) geteilt und mit 1,5 multipliziert. Es ergibt sich ∆Abs von 0,24. In [Gleichung 1] eingesetzt ergibt sich eine [S1] von 12,34 µM (Verdünnungsfaktor 1:20). Anfangs- und Endpunkt des Absorptionsmaximums bei ~ 260 nm wurden - wie in Abb. 2.9 gezeigt - durch eine Gerade verbunden. Zwischen dieser Geraden und dem Absorptionsmaximum wurde eine Vertikale gezeichnet, deren Länge (in cm) auf die Länge zwischen der Absorption 0 und 1 normalisiert wurde (∆Abs). ∆Abs wurde zur Korrektur mit 1,5 multipliziert, und anhand dieses Wertes wurde mittels des Lambert-Beer´schen Gesetzes ∆Abs = - log I/I0 = c · α · L [Gleichung 1] die [S1] berechnet. I ist das transmittierte Licht, I0 das einfallende Licht, L die Weglänge des Lichtes durch die Probe (1 cm), c die zu bestimmende Konzentration in µM und α der Absorptionskoeffizient (2,6 µm · cm, [59]). Anhand der so berechneten [S1] konnte die cMF-Suspension mit SX- oder DXRelaxationspuffer auf die gewünschte [S1] von 3 µM bei der Ca2+-induzierten Anschaltkinetik und von 6 µM bei der Abschaltkinetik verdünnt werden. 35 Material und Methoden 2.2.10 Vorbereitung des cTn für Messungen am isolierten Komplex Der cTn-Komplex wurde auf Eis aufgetaut. Für die Messung der Anschaltkinetik wurde cTn 1 h 1:100 gegen Rigor-Puffer und danach zweimal je 1 h 1:10 gegen den SX-Relaxationspuffer dialysiert (Slide-A-Lyzer® Mini Dialysis Units, molekulare Ausschlussgrenze 7000 Da, Pierce, PERBIO). Der cTn-Komplex wurde filtriert (Millex-HV Syringe Driven Filter Units, Porengröße 0,45 µm, Millipore) und auf die benötigte Konzentration mit SX-Relaxationspuffer (150 µg/ml) verdünnt. Für die Messung der Abschaltkinetik wurde cTn dreimal je 1 h 1:10 gegen DX-Relaxationspuffer dialysiert (Slide-A-Lyzer® Mini Dialysis Units, molekulare Ausschlussgrenze 7000 Da, Pierce, PERBIO), anschließend filtriert (Millex-HV Syringe Driven Filter Units, Porengröße 0,45 µm, Millipore) und auf die benötigte Konzentration mit DX-Relaxationspuffer (300 µg/ml) verdünnt. 2.2.11 Prinzip des Stopped-Flow-Verfahrens Das Stopped-Flow-Verfahren ermöglicht es, den Zeitverlauf chemischer Reaktionen im Millisekunden- bis Sekundenmaßstab zu untersuchen [25]. Durch dieses Verfahren lassen sich Flüssigkeiten innerhalb kürzester Zeit, d.h. im Millisekundenbereich mischen. Der Flüssigkeitsstrom wird in einer Beobachtungskammer angehalten, um den zeitlichen Verlauf der Reaktion beobachten zu können. Diese Beobachtung kann z.B. auf optischem, kalorimetrischem oder elektrischem Wege durchgeführt werden. Die Methode wird als Stopped-Flow-Modus [15] bezeichnet und in dieser Arbeit verwendet. Wie schnell eine Reaktion beobachtet werden kann, nachdem die Reaktanden gemischt wurden, hängt sowohl von der Flussrate (F) der Reaktanden als auch von dem zu durchfließenden Volumen (V) zwischen Mischkammer und Beobachtungskammer in der Apparatur ab. Für die Zeitspanne zwischen dem Start der Reaktion und dem Beginn ihrer Beobachtung (Totzeit; Td) ergibt sich: Td (s) = V (ml) / F (ml/s) Durch Veränderung der Flussgeschwindigkeit oder des Volumens zwischen Misch- und Beobachtungskammer kann eine Reaktion zu verschiedenen Zeitpunkten beobachtet werden. 36 Material und Methoden 2.2.11.1 Aufbau der Stopped-Flow-Apparatur Die Ca2+-kontrollierte Konformationsänderung von cTn in cMF wurde mit Hilfe einer SFM-400/S-Stopped-Flow-Apparatur der Firma BioLogic (Claix, Frankreich) durchgeführt. Ihr Aufbau ist schematisch in Abb. 2.4 gezeigt. Abb. 2.4: Schematische Darstellung der Stopped-Flow-Apparatur. Das Kernstück der Stopped-Flow-Apparatur ist das SMF-400/S-Modul, das vier 10 ml-Spritzen (S1, S2, S3 und S4) enthält. Die Spritzen können jeweils über ein Ventil durch externe Eingänge mit den zu mischenden Flüssigkeiten gefüllt werden (gezeigt für S4). Die Stempel der Spritzen lassen sich durch Schrittmotoren steuern. Die Flussgeschwindigkeiten beim Single-Mixing betragen mit den 10 ml-Spritzen maximal 14 ml/s. Die Schrittmotoren werden durch einen Personal-Computer (Pentium III, 450 mHz Prozessor, Theis Computer) über eine Steuerungseinheit (MPS-60, Microprocessor unit, BioLogic) gesteuert. Als Steuerungssoftware dient die BioKine32 Software (Version 4.27). Die Flüssigkeiten werden in 3 Mischkammern (M1 bis M3) vermischt. Die Mischkammern sind in Abb. 2.10 als Kreise dargestellt. Zwischen den Mischkammern können bei Bedarf zwei Reaktionskammern (aging-lines I, II) mit unterschiedlichen Volumina installiert werden. Die Reaktionskammern sind in spezielle Kunststoffblöcke gebohrt, die in unterschiedlichen Kombinationen in das Röhrensystem eingebaut werden können. Diese Blöcke sind in der Abb. als graue, die Reaktionskammern I und II 37 Material und Methoden als weiße Rechtecke dargestellt. Als Beobachtungskammer für den Zeitverlauf der Reaktion wurde hinter M3 eine Quarzküvette (TC 100/10F) mit 30 µl Reaktionsvolumen und einer Td von 2,2 ms (bei einer Flussrate von 14 ml/s) eingebaut. Um nach dem schnellen Mischen Schwankungen der Flüssigkeitssäule und damit des Messsignals zu verhindern, wird direkt nach der Injektion der Flüssigkeiten in die Messküvette das hinter der Küvette liegende sogenannte hard-stop-Ventil geschlossen. Das Ventil wird über die Steuerungssoftware der Stopped-Flow-Apparatur angesteuert. Es hat ein valvelead von 2,8 ms. Die Stopped-Flow-Apparatur wurde um ein Messsystem erweitert, welches es ermöglicht, die Fluoreszenz in der Küvette zu messen. 2.2.11.2 Aufbau der Anlage für Fluoreszenzmessungen Als Quelle für das Anregungslicht des fluoreszenzmarkierten cTn dient eine 150 Watt Xe/Hg-Lichtbogenlampe (Hamamatsu, Japan). Die Lampe wurde an einen Monochromator gekoppelt, dessen Wellenlänge auf 490 nm eingestellt wurde. Die Schlitzblende am Eingang des Monochromators wurde maximal geöffnet (10 mm an der Mikrometerschraube), um eine maximale Lichtintensität und somit eine maximale Anregung von NBD-markiertem cTn zu gewährleisten. Die Schlitzblende am Ausgang wurde ebenfalls maximal (auf 10 mm) geöffnet, um die Bandbreite des Anregungslichtes auf ~ 18 nm einzustellen. Das Licht aus dem Monochromator wurde an einen Lichtleiter gekoppelt und darüber auf die Messküvette fokussiert. Um möglichst viel von dem Fluoreszenzlicht aufzunehmen und so ein optimales Signal/Rausch-Verhältnis zu erreichen, wurden zwei Photomultiplier benutzt. Damit nur das Fluoreszenzlicht und nicht das an den cMF gestreute Anwendungslicht auf die Photomultiplier gelangen konnte, wurden verschiedene Filter zwischen Küvette und Photomultiplier eingesetzt. Vor dem einen Photomultiplier wurde ein FITCE Interferenzfilter installiert, vor dem anderen ein OG 515 nm cut-off-Filter und ein 530/40 bandpass-Filter in Kombination. Die beiden Photomultiplier wurden beidseitig jeweils im rechten Winkel zum Strahlengang des Anregungslichtes angeordnet. Wenn nicht anders angegeben, wurde für die Messungen eine Spannung von 500 V (inkorporiertes cTn) und 400 V (isoliertes cTn) an die Photomultiplier angelegt. Die Temperatur der Stopped-Flow-Apparatur wurde mittels eines Thermostates (Haake/Fisons, Karlsruhe) auf 10°C ± 1°C eingestell t und konstant gehalten. 38 Material und Methoden 2.2.11.3 Durchführung der Fluoreszenzmessungen an inkorporiertem cTn In der Stopped-Flow-Apparatur konnten bis zu vier verschiedene Lösungen gemischt werden. Zur Messung der Ca2+-induzierten Anschaltkinetik (SingleMixing) wurden die Spritzen S3 und S4 benutzt. Die cMF in SXRelaxationspuffer wurden in S3 gefüllt und die SX-Aktivierungspuffer mit den unterschiedlichen pCa´s (s. Tab. 2.2, S. 23) in S4. Die beiden Flüssigkeiten wurden in der Mischkammer M3 gemischt. Pro Schuss wurden je Spritze 75 µl verbraucht, also ein Gesamtvolumen von 150 µl. Bei einer eingestellten Flussrate von 14 ml/s ergab sich eine Td von 2,2 ms. Zur Messung der Abschaltkinetik (Double-Mixing) wurden die Spritzen S1, S3 und S4 benutzt. S3 wurde wieder mit cMF in DX-Relaxationspuffer befüllt. Diese wurden 1:2 mit 180 µl DX-Aktivierungspuffer aus S1 gemischt (Phase1, siehe Spritzenprogramm in Tab. 2.3) und für 91,2 ms in der aging-line belassen (Phase 2). Danach wurde die Ca2+-aktivierten cMF 1:2 mit 75 µl BAPTA-Lösung (S4) gemischt, um das freie Ca2+ zu chelieren und somit die [Ca2+] auf pCa 8,7 zu erniedrigen (Phase 3). Die Ca2+-aktivierten cMF wurden dabei mit 75 µl DXAktivierungspuffer aus der aging-line gedrückt. Somit konnte der Verbrauch von cMF verringert werden. Bei der Flussrate von 14 ml/s ergab sich eine Td von 2,2 ms. Phase 1 Phase 2 Zeit (ms) 25,8 S1 180 µl 91,2 Phase 3 10,8 75 µl S2 S3 S4 180 µl 75 µl Tab. 2.3: Spritzenprogramm für das Double-Mixing 2.2.11.4 Durchführung der Fluoreszenzmessungen an isoliertem cTn Die Messungen der An- und Abschaltkinetik an isoliertem cTn wurden wie unter 2.2.11.3 beschrieben durchgeführt. Statt mit cMF wurde S3 jeweils mit cTn gefüllt. 39 Material und Methoden 2.2.12 Datenanalyse und Statistik Die Fluoreszenzänderungen wurden mittels der BioKine Software (Version V4.27, Bio-Logic) aufgenommen, gemittelt und anschließend monoexponentiell oder biexponentiell gefittet. Bei der Bestimmung der Anschaltkinetik wurden pro pCa-Wert jeweils 3-5 Spuren gemittelt, bei der Messung der Abschaltkinetik wurden ebenfalls 3-5 Spuren gemittelt. Die weiteren Auswertungen und die Darstellung der Daten wurden mit GraphPad-Prism (Version 4.01, GraphPad Software, Kalifornien, USA) durchgeführt. Alle Werte sind, soweit nicht anders angegeben, Mittelwerte ± Standardfehler (SEM) aus n Experimenten. 40 Ergebnisse 3. Ergebnisse 3.1 Isolation der Troponinuntereinheiten Die Untereinheiten des rekombinanten humanen kardialen Troponinkomplexes hcTnC, hcTnT und hcTnI wurden durch die in Kapitel 2.2.2 (Material und Methoden) vorgestellten chromatographischen Verfahren isoliert. Abb. 3.1 zeigt zwei typische Elutionsprofile einer Chromatographie für cTnC. a b [ Abb. 3.1: Chromatogramme der Isolierung von cTnC mittels FPLC. Gezeigt sind zwei aufeinander folgende DEAE-Sepharose-Reinigungsläufe. (a) zeigt den ersten Reinigungslauf. -1 cTnC eluiert ab einer Leitfähigkeit von etwa 10 mS cm (Fraktionen 49 bis 58). (b) zeigt den zweiten Reinigungslauf, bei dem die cTnC-haltigen Fraktionen aus (a) (49 bis 58) aufgetragen 41 Ergebnisse wurden. Die cTnC-haltigen Fraktionen (50 bis 61) eluierten bei einer Leitfähigkeit von 12 bis -1 14,5 mS cm . Die beiden Leitfähigkeitsanstiege zu Beginn des zweiten Laufes sind bedingt durch die hohe NaCl-Konzentration der Proteinlösung beim Beladen der DEAE- Sepharosesäule. Zur Bestimmung der TnC-haltigen Fraktionen der Reinigungsläufe und um die Reinheit von cTnC zu kontrollieren, wurden Proben der jeweiligen Fraktionen auf ein SDS-Gel (Tris/Tricine) aufgetragen und anschließend mit Coomassie gefärbt. a Abb. b 3.2: SDS-Gele (Tris/Tricine) von cTnC nach den verschiedenen DEAE- Reinigungsläufen. (a) ist das Kontroll-Gel zum in Abb. 3.1.a gezeigten Reinigungslauf. Fraktion 49 enthält bereits wenig cTnC, ist aber noch stark verunreinigt. Die nachfolgenden Fraktionen enthalten immer reineres cTnC. (b) ist das Kontroll-Gel zum in Abb. 3.1.b gezeigten Reinigungslauf. Die Fraktionen 5, 17, 31, 33 und 38 sind beispielhaft für den Vorlauf, der nicht an die Säule bindet. Im Gegensatz zu den beiden Fraktionen 53 und 57, welche beispielhaft für das Absorptionsmaximum der Protein-haltigen Fraktionen 50 bis 61 aufgetragen worden sind, enthalten sie kein cTnC. Neben den Proben der Fraktionen der Reinigungsläufe und dem Molekulargewichts-Marker (See Blue Plus 2) wurde zusätzlich ein cTnC-Standard aufgetragen. Von allen Proben wurden je 30 µl, vom Marker 7,5 µl und vom cTnC-Standard je 10 µl auf das Gel aufgetragen. In den Abb. 3.2.a und b ist zu erkennen, dass das apparente Molekulargewicht des isolierten cTnC jeweils ~ 18 kDa beträgt. Die Banden auf anderer Laufhöhe 42 Ergebnisse in Abb. 3.2.a (Fraktionen 49, 51, 53, 55) zeigen an, dass cTnC noch durch andere Proteine verunreinigt ist. In Abb. 3.3 sind beispielhaft Reinigungsläufe von cTnT dargestellt. a b Abb. 3.3: Chromatogramme der Isolierung von cTnT mittels FPLC. In (a) ist der Reinigungslauf über die CM-Sepharosesäule Leitfähigkeitsanstieg von 7,5 auf 21 mS cm -1 gezeigt, cTnT eluiert bei einem (Fraktionen 42 bis 46). (b) Die cTnT-haltigen Fraktionen des ersten Reinigungslaufes (42 bis 46) wurden nach Umpuffern auf eine DEAESepharosesäule aufgetragen. cTnT eluiert bei einer Leitfähigkeit von 14,5 bis 18,5 mS cm (Fraktionen 24 bis 28). 43 -1 Ergebnisse Proben der cTnT-haltigen Fraktion (Fraktion 44) aus dem ersten Reinigungslauf über die CM-Sepharosesäule und Proben (Fraktion 25 und 28) aus dem zweiten Reinigungslauf über die DEAE-Sepharosesäule wurden auf ein SDSGel (Tris/Glycin) aufgetragen und mit Coomassie gefärbt, um sicherzustellen, dass die richtigen Fraktionen verwendet wurden und die Reinheit von cTnT zu überprüfen. Abb. 3.4: SDS-Gel (Tris/Glycin) von cTnT nach der Isolierung via FPLC. Das Kontroll-Gel zeigt die Proben der vor (t = 0 h) und nach (t = 3 h) Überexpression von cTnT, Fraktionen des ersten Reinigungslaufes über die CM-Sepharosesäule (7, 20, 44) und des zweiten Reinigungslaufs über die DEAE-Sepharosesäule (5, 19, 25, 28). cTnT ist sehr sauber in den Fraktionen 24 bis 28 des zweiten Reinigungslaufes enthalten (aufgetragen sind beispielhaft Fraktion 25 und 28). Als Marker wurde See Blue Plus 2 verwendet. Von allen Proben der Reinigungsläufe wurden je 10µl auf das Gel aufgetragen, von den Proben der Überexpression 15µl und vom Marker 7,5µl. Auf dem Gel ist zu erkennen, dass cTnT nach dem zweiten Reinigungslauf über die DEAE-Sepharosesäule sehr rein ist. Das apparente Molekulargewicht beträgt ~ 40 kDa. 44 Ergebnisse In Abb. 3.5 ist beispielhaft ein Reinigungslauf von cTnI gezeigt. Abb. 3.5: Bsp. Chromatogramm der Isolierung von cTnI via FPLC. Reinigungslauf von cTnI über eine CM-Sepharosesäule. Die cTnI-haltigen Fraktionen (18 bis 20) eluierten bei einer -1 Leitfähigkeit von 10 bis 14 mS cm . Proben der jeweiligen cTnI-haltigen Fraktionen wurden auf ein SDS-Gel (Tris/Glycin) aufgetragen und mit Coomassie gefärbt, um nachzuweisen, dass die richtigen Fraktionen verwendet wurden und um ihre Reinheit zu überprüfen. Abb. 3.6: SDS-Gel (Tris/Glycin) von cTnI nach der Isolierung via FPLC. Das Kontroll-Gel zeigt, dass Fraktion 18 cTnI enthält. t = 0 h und t = 3 h sind Proben zum Nachweis der Überexpression von cTnI. Als Marker wurde See Blue Plus 2 verwendet. Von allen Proben wurden je 15 µl auf das Gel aufgetragen, vom Marker 7,5 µl. 45 Ergebnisse Auf dem Gel ist zu erkennen, dass das apparente Molekulargewicht von cTnI ~25 kDa beträgt. 3.2 Inkorporation des hcTn in Meerschweinchen-cMF Für die Bestimmung der Ca2+-kontrollierten Konformationsänderung wurde zuerst das endogene cTn der Meerschweinchen-cMF mit einem ~ 10-fachen Überschuss an exogenem humanem cTn ausgetauscht. Wie Abb. 3.7 zeigt, konnte der Austausch mittels SDS-PAGE nachgewiesen und densitometrisch quantifiziert werden, weil humanes TnI (hcTnI) (linke Spur) ein geringeres apparentes Molekulargewicht hat als Meerschweinchen-cTnI (mittlere Spur) und TnT, das beim Meerschweinchen in zwei Isoformen vorkommt, nur noch in einer Isoform vorliegt. Abb. 3.7: Nachweis des Austausches von Meerschweinchen-cTn gegen hcTn mittels SDS-PAGE. Links wurde isoliertes humanes cTn aufgetragen, in der Mitte native Meerschweinchen-cMF und rechts die mit humanem cTn ausgetauschten MeerschweinchencMF. cTnC konnte auf dieser Abbildung nicht dargestellt werden. 46 Ergebnisse Im Fall des Meerschweinchen-cTnT (mittlere Spur) sind zwei Banden zu erkennen, die zwei verschiedene cTnT-Isoformen darstellen. Beim hcTnT (linke Spur) gibt es keine unterschiedlichen Isoformen, weshalb auch nur eine Bande zu sehen ist. Dies ist ein weiterer Beweis für den funktionierenden Austausch, da nach der Inkorporation des hcTn in die Meerschweinchen-cMF (rechte Spur) nur noch eine Bande für das hcTnT zu erkennen ist. cTnC konnte mittels dieser SDS-PAGE nicht dargestellt werden. Es ist jedoch bekannt, dass sich die elektrophoretische Mobilität des endogenen Meerschweinchen-cTnC nicht von der des hcTnC unterscheidet, so dass anhand des cTnC grundsätzlich keine Aussage bezüglich des Austausches gemacht werden kann. Um die optimale Inkubationszeit für den Austausch des endogenen Meerschweinchen-cTn gegen das humane cTn zu ermitteln, wurde die Kinetik des Austauschs bestimmt. Dazu wurden cMF zuerst mit NBD-hcTn (1mg/ml) für eine Stunde inkubiert. Anschließend folgte eine zweite Inkubation der ausgetauschten cMF mit hcTn (1mg/ml), welches nicht fluoreszenzmarkiert war (Abb. 3.8). Während dieser Inkubation wurde das fluoreszenzmarkierte NDBhcTn durch das nicht markierte hcTn kompetitiv von seinen Bindungsstellen verdrängt. Die cMF wurden nach unterschiedlich langen Inkubationszeiten zentrifugiert, so dass anhand der Fluoreszenz des Überstandes indirekt die Konzentration des aus den cMF verdrängten NBD-Tn bestimmt werden konnte. F530nm (V) 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0 10 20 30 40 50 60 Zeit (min) Abb. 3.8: Zeitverlauf des hcTn-Austausches in Meerschweinchen-cMF. Die Myofibrillen wurden für 1h bei RT mit NBD-hcTn (1 mg/ml) inkubiert. Anschließend wurde das inkorporierte NBD-hcTn durch eine zweite Inkubation mit hcTn (1 mg/ml), welches nicht fluoreszenzmarkiert war, verdrängt. Während der zweiten Inkubation wurden zu verschiedenen Zeitpunkten Aliquots der Myofibrillen entnommen und zentrifugiert. Die Fluoreszenz des NBD-hcTn wurde zu den 47 Ergebnisse angegebenen Zeitpunkten im Überstand bestimmt (graue Punkte). Für die Kontrolle (weiße Punkte) wurde mit den Myofibrillen ebenso verfahren, ohne jedoch während der zweiten Inkubation unmarkiertes hcTn hinzuzufügen. Die Austausch-Daten wurden mittels einer monoexponentiellen Funktion gefittet. Abb. 3.8 zeigt, dass die Fluoreszenz im Überstand in Abhängigkeit der Zeit monoexponentiell zunimmt. Das fluoreszierende NBD-Tn wurde also gegen das unmarkierte Tn ausgetauscht, wobei der Austausch nach ~ 10 min halbmaximal ist und nach ~ 30 min eine Sättigung erreicht. Eine einstündige Inkubationszeit erlaubt dementsprechend einen maximalen Austausch. 48 Ergebnisse 3.3 Bestimmung der Kinetik der Konformationsänderung von cTn in Mausmyofibrillen im Vergleich zu isoliertem cTn-Komplex in Lösung mit unterschiedlichen Markierungsmethoden 3.3.1 Effekt der Markierung des cTn-Komplexes auf die Kinetik 3.3.1.1 cTn(NBD) in Mausmyofibrillen Zur Bestimmung der Ca2+-induzierten Konformationsänderung wurde zunächst der gesamte Tn-Komplex mit NDB markiert, in murine cMF inkorporiert und die Fluoreszenzänderung gemessen. a 4.6 6.1 6.3 6.4 6.6 6.8 140 130 120 7.2 110 400 300 200 100 9.4 100 600 500 kobs (s-1) 150 F530nm (%) b pCa 160 0 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 8 Zeit (s) 6 5 4 pCa [M] c d 1.2 600 1.0 500 kobs (s-1) F/Fmax 7 0.8 0.6 0.4 0.2 400 300 200 100 0.0 10 9 8 7 6 5 0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 4 ∆F/∆ ∆F(4,6) pCa [M] 2+ Abb. 3.9: Ca -induzierter Fluoreszenzanstieg von in murine cMF inkorporiertem cTn (NBD) . 2+ (a) Die cMF (pCa 9,4) wurden zum Zeitpunkt t=0 s mit unterschiedlichen [Ca ] (als pCa = -log 2+ [Ca ] dargestellt) gemischt. Die Fluoreszenzsignale (grau) wurden mit Hilfe einer monoexponentiellen Funktion gefittet (schwarz). Die Fluoreszenzänderung ist in Prozent der auf 100% normalisierten Basalfluoreszenz (pCa 9,4) angegeben. (b) Ratenkonstante kobs in Abhängigkeit des pCa (n=3) (c) Normalisierte Fluoreszenzamplitude der monoexponentiellen 49 Ergebnisse Fits in Abhängigkeit des pCa (n=3). (d) Abhängigkeit der Mittelwerte von kobs von den Mittelwerten der normalisierten Fluoreszenzänderung In Abb. 3.9a ist zu erkennen, dass Ca2+ einen Fluoreszenzanstieg hervorruft. Die Amplitude nimmt mit steigender [Ca2+] (also mit abnehmendem pCa) zu. Bei maximaler [Ca2+] (pCa 4,6) besteht das Fluoreszenzsignal aus zwei Phasen. Die erste, schnelle Phase findet während der Totzeit der Stopped-Flow Apparatur statt und kann selbst durch Verwendung einer sogenannten MikroKüvette, mit der man eine Totzeit von 250 µs erreicht, zeitlich nicht aufgelöst werden. Die Ratenkonstante kobs muss deshalb > 2000 s-1 sein. Die zweite, langsame Phase kann mit Hilfe einer monoexponentiellen Funktion gefittet werden. Die Ratenkonstante kobs beträgt bei maximaler [Ca2+] 323 ± 124 s-1 (±SEM) (n=3). Der Standardfehler des Mittelwertes von kobs ist bei pCa 4,6 so groß, da die Kinetik mit steigender [Ca2+] immer schneller wird, wodurch die Amplitude des zeitlich auflösbaren Signals immer kleiner wird. Dies bedeutet, dass auch das Signal/Rausch-Verhältnis immer kleiner wird. Das kleine Signal/Rausch-Verhältnis führt zu ungenaueren Kurvenanpassungen (Fit) und auf diese Weise zu einer höheren Variabilität von kobs. Mit sinkender [Ca2+] nimmt die Ratenkonstante der schnellen Phase ab, so dass bei niedrigen [Ca2+] nahezu der gesamte Zeitverlauf aufgenommen werden kann. Die Abhängigkeit von kobs vom pCa (Abb. 3.9b) zeigt einen sigmoidalen Verlauf. Sie kann mittels der Hill-Funktion kobs (9,4) + kobs (4,6) - kobs (9,4) (pCa50 pCa) · nH (1 + 10 ) [Gleichung 1] gefittet werden. Bei pCa ≥ 5,3 erreicht kobs ein Maximum von 402 ± 161 s-1, bei pCa >6,8 nähert sich kobs einem Minimum von ~ 50 s-1. Die Fluoreszenzamplitude zeigt ebenfalls eine sigmoidale Abhängigkeit vom pCa. Sie kann mit der Hill-Funktion ∆F (9,4) + ∆ F (4,6) - ∆ F (9,4) (pCa50 pCa) · nH (1 + 10 ) 50 [Gleichung 2] Ergebnisse gefittet werden (Abb. 3.9c), wobei der pCa50 bei 6,8 ± 0,1 und der HillKoeffizient nH bei 1,3 ± 0,2 liegt. In Abb. 3.9d ist die Abhängigkeit der Mittelwerte von kobs von den Mittelwerten der normalisierten Fluoreszenzänderung (∆F/∆F(4,6)) dargestellt. Es ist zu erkennen, dass kobs mit zunehmender Amplitude exponentiell ansteigt. Solzin et al. [54] haben gezeigt, dass man die Abhängigkeit von kobs mit einem ZweiZustand-Modell beschreiben kann, welches durch die folgende Gleichung nach Poggesi et al. [43] definiert ist: koff kobs = 1- kobs (4.6) ∆F (kobs (4.6) + koff ) ∆F(4.6) [Gleichung 3] Das Fitten der Daten ergibt einen Wert von kobs(4,6) = 136 ± 10 s-1 (n=3), wohingegen der experimentell bestimmte Wert für kobs (4,6) = 323 ± 124 s-1 (n=3) beträgt. Während der Messung der Fluoreszenzsignale war meistens eine Drift der Basalfluoreszenz zu beobachten (Abb. 3.10). Sie beträgt bis zu 25% des maximalen Ca2+-induzierten Fluoreszenzanstiegs. Die Ursache für diese Drift ist unklar. Sie wirkt sich auf die Abhängigkeit der Fluoreszenzamplitude vom pCa aus und verändert den pCa50 um maximal 0,1 pCa-Einheiten und den nH um maximal 0,5. 4.6 Ende 4.6 Beginn 170 F530nm (%) 160 150 140 130 120 110 9.4 Ende 100 9.4 Beginn 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 Zeit (s) Abb. 3.10: Beispiel für die Drift der Fluoreszenz im Verlauf einer Messung. Die grauen Kurven stellen jeweils die Fluoreszenzsignale zu Beginn der Messung dar. Die schwarzen Kurven zeigen die Fluoreszenzsignale am Ende. 51 Ergebnisse Nach der Bestimmung der Anschaltkinetik wurde die Ratenkonstante koff der Abschaltkinetik bestimmt. Dazu wurden die cMF zunächst für ~100 ms mit Ca2+ (pCa 5,0) vollständig aktiviert, jedoch ohne dabei überzukontrahieren [54]. Anschließend wurde die [Ca2+] mit Hilfe des Ca2+-Chelators BAPTA auf pCa 8,7 gesenkt und die cMF somit inaktiviert. pCa F530nm (%) 125 5.0 120 115 110 105 8.7 100 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 Zeit (s) Abb. 3.11: Abschaltkinetik von in murine cMF inkorporiertem cTn 2+ wurde zunächst für ~100 ms bei pCa 5,0 mit Ca (NBD) . Der Tn-Komplex 2+ aktiviert, bevor mit dem Ca -Chelator BAPTA gemischt wurde (pCa 8,7). (Details siehe Material und Methoden). Das schwarze Signal ist die Kontrolle bei pCa 5,0, die Fluoreszenzabnahme (graues Signal) wurde mit einer monoexponentiellen Funktion [Gleichung 4] gefittet (schwarze Linie) und ergab die -1 Ratenkonstante koff = 28 s . Die Verringerung der [Ca2+] bis zu pCa 8,7 führt zu einer exponentiellen Fluoreszenzabnahme (Abb.3.11). Das Signal kann mit folgender Gleichung monoexponentiell gefittet werden: Fluoreszenz = Amplitude · exp (-k · Zeit) + Plateau [Gleichung 4] Während der so ermittelte Wert für koff etwa 24 s-1 (n=2) beträgt, liegt der durch das Zwei-Zustand-Modell bestimmte -1 Abschaltkinetik koff bei etwa bei 31 s (n=2). 52 Wert der Ratenkonstante der Ergebnisse 3.3.1.2 Nachweis der Fluoreszenzmarkierung von cTnC und cTnI Die in Abb. 3.9 gezeigten Messungen der Anschaltkinetik mit inkorporiertem cTn weisen eine komplexe Kinetik auf, die aus mindestens zwei verschiedenen Phasen besteht. cTnC (Cys35 und Cys84) wie auch cTnI (Cys80 und Cys97) besitzen je zwei Cysteine, die beide theoretisch mit dem thiolreaktiven Fluoreszenzfarbstoff NDB markiert sein könnten. Aus diesem Grund wäre es möglich, dass die schnelle Phase z.B. von einem an cTnC gekoppelten NBDMolekül herrührt und deshalb die Ca2+-Bindung darstellt, wohingegen die langsame Phase von einem an cTnI gebundenen NBD-Molekül herrührt, das die regulatorische Konformationsänderung des TnI anzeigt. Um festzustellen, inwieweit der cTn-Komplex tatsächlich an beiden Untereinheiten markiert wurde, wurden die Untereinheiten des cTn-Komplexes mittels Gelelektrophorese aufgetrennt. Abb. 3.12: Fluoreszenz- und Coomassieaufnahme von SDS-Tricinegel mit cTn (NBD) . Die Anregung des Gels mit UV-Licht zeigt eine deutliche Fluoreszenz sowohl der cTnI- als auch der TnC-Bande (Abb. 3.12), was die Markierung beider Untereinheiten beweist. 3.3.1.3 Isoliertes cTn(TnI-NBD) Da bei der ersten Messung mit inkorporiertem cTn(NBD) sowohl cTnC als auch cTnI markiert wurden, stellt sich die Frage, von welcher Markierungsstelle das Fluoreszenzsignal herrührt. Daher wurde cTnI vor der Rekonstitution des Komplexes selektiv fluoreszenzmarkiert. Zunächst wurden die Messungen mit isoliertem Troponin durchgeführt, um erstens an einem methodisch einfacheren und weniger aufwendigen Modell als an cMF zu arbeiten und zweitens um 53 Ergebnisse Einflüsse der cMF auf die Komplexität der Schaltkinetik (z.B. die Querbrückenbildung) ausschließen zu können. a 150 140 4.6 160 5.6 150 6.0 130 6.2 120 7.0 110 0.00 0.05 0.10 0.15 4.6 5.6 140 6.0 130 6.2 120 7.0 110 9.4 100 pCa 170 F530nm (%) 160 F530nm (%) b pCa 170 9.4 100 0.0 0.20 0.5 1.0 1.5 2.0 Zeit (s) Zeit (s) c 1.2 F/Fmax 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 10 9 8 7 6 5 4 pCa [M] 2+ Abb. 3.13: Ca -induzierter Fluoreszenzanstieg von isoliertem cTn (TnI-NBD) . (a) Tn (pCa 9,4) 2+ wurde zum Zeitpunkt t=0 s mit unterschiedlichen [Ca ] gemischt. Zeitskala 0,2 s (b) wie (a), 2+ aber Zeitskala = 2 s.(c) Ca -Abhängigkeit der normalisierten Fluoreszenzamplitude (n=1). Wie bei den Messungen am unspezifisch fluoreszenzmarkierten Tn-Komplex zeigt auch diese Messung (Abb. 3.13a und b) ein Signal, das aus einer ersten schnellen und einer zweiten langsamen Phase besteht. Diese zweite Phase ist im Vergleich zum unspezifisch markierten Tn langsamer und ist darüber hinaus bei niedrigen [Ca2+] gar nicht zu erkennen. Dementsprechend kann sie nicht gefittet werden. Die schnelle Phase ist zu schnell, um noch zeitlich aufgelöst werden zu können. Des Weiteren kommt eine sehr langsame dritte Phase hinzu, die erst auf einer Zeitskala über 2 s zu erkennen ist (Abb. 3.13 b). Trägt man die Fluoreszenzamplitude in Abhängigkeit vom pCa auf (Abb. 3.13c), so folgt sie einer Hill-Funktion mit einem pCa von 5,9 ± 0,2 und einem HillKoeffizienten nH von 0,7 ± 0,2. 54 Ergebnisse 3.3.2 Effekt der spezifischen Markierung von TnI 3.3.2.1. cTn(TnI-NBD) in Mausmyofibrillen Nachdem gezeigt wurde, dass mit isoliertem cTn(TnI-NBD) eine Fluoreszenzänderung registriert werden kann, sollte als nächstes die Kinetik der Konformationsänderung von inkorporiertem cTn(TnI-NBD) gemessen werden. Abb. 3.14 a zeigt jedoch keine Fluoreszenzänderung. Um auszuschließen, dass dies durch die Markierung mit NBD bedingt ist, wurde die gleiche Messung mit dem Fluoreszenzfarbstoff EDANS wiederholt. Da auch mit diesem Farbstoff kein deutlicher Fluoreszenzanstieg zu erkennen war (Abb 3.14b), hängt die Messbarkeit des Signals vermutlich nicht vom Farbstoff sondern von der gewählten Markierungsposition ab. Die markierten Cysteine des hcTnI liegen in den Helices 1 (Cys80) und 2 (Cys97), die an der regulatorischen Konformationsänderung nicht direkt beteiligt sind. Messungen mit skelettalem Tn haben gezeigt, dass bei der Fluoreszenzmarkierung des TnI-Cys133 (regulatorische Domäne, H3) eine deutliche Fluoreszenzänderung registriert werden kann [4]. HcTnI hat an homologer Stelle ein Serin (Ser166). Um eine Fluoreszenzmarkierung an Position 166 zu ermöglichen, wurde Ser gegen Cys ausgetauscht. Des Weiteren wurden die beiden anderen Cysteine des cTnI durch Serine ersetzt, so dass Cys166 selektiv fluoreszenzmarkiert werden konnte. Da der Austausch von Serin gegen Cystein eine stille Mutation darstellt, sollten diese Punktmutationen wenn überhaupt, im Vergleich zu einer Markierung mit NBD, nur eine geringere Auswirkung auf die Struktur von TnI haben. 55 Ergebnisse a b pCa 115 105 F490nm (%) F530nm(%) 110 4.6 100 104 4.6 102 100 9.4 9.4 98 95 0.00 pCa 106 0.05 0.10 0.15 0.0 0.20 0.5 1.5 2.0 Zeit (s) Zeit (s) pCa c d 4.6 104 pCa 101 100 102 F490nm (%) F530nm (%) 1.0 9.4 100 9.4 99 98 98 96 0.00 97 0.00 4.6 0.25 0.50 0.75 1.00 Zeit (s) 0.25 0.50 0.75 1.00 Zeit (s) 2+ Abb. 3.14: Bestimmung der Ca -Abhängigkeit der Fluoreszenzänderung anhand von cTn (TnI) , welches in cMF inkorporiert wurde und isoliertem cTn (TnI-NBD) unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen. (a) cTn (TnI-Ser166Cys) mit je zwei in murinen cMF. Die cMF (pCa 9,4) wurden zum Zeitpunkt t=0 s mit Aktivierungslösung (pCa 4,6) gemischt. Die Fluoreszenzsignale (TnI- konnten aufgrund des schlechten Signal-Rausch-Verhältnisses nicht gefittet werden. (b) cTn EDANS) (TnI-Ser166CysNBD) in murinen cMF, (c) isoliertes cTn (TnI-Ser166Cys-EDANS) , (d) isoliertes cTn Die Abb. 3.14 c und d zeigen, dass weder die Fluoreszenzmarkierung von Cys166 mit NBD, noch mit EDANS zu einer messbaren Fluoreszenzänderung führt. Im Vergleich zur Basalfluoreszenz bei pCa 9,4 ist auch bei maximaler Ca2+-Aktivierung (pCa 4,6) kein deutlicher Anstieg (NBD), bzw. keine deutliche Abnahme (EDANS) der Fluoreszenz zu erkennen. Aus diesem Grund erwies sich die Markierung des Cys166 mit NBD oder EDANS (Abb. 3.14 c und d) für die Bestimmung der Ca2+-induzierten Konformationsänderung als ungeeignet. Auf eine Inkorporation der cTn(TnI-Ser166Cys)-Mutation in cMF wurde vor dem Hintergrund der erfolglosen Messungen mit dem isolierten cTn(TnI-Ser166Cys) verzichtet. 56 Ergebnisse 3.3.2.2 Isoliertes cTn(TnC-NBD) Die Messungen mit TnI Konformationsänderung haben sowohl gezeigt, dass mit Hilfe die Bestimmung der der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe als auch der unterschiedlichen Markierungspositionen nicht möglich ist. Da an der regulatorischen Konformationsänderung auch TnC beteiligt ist, war es nahe liegend als nächstes zu untersuchen, ob die Messung der Konformationsänderung mit einer Fluoreszenzmarkierung des TnC möglich ist. Das TnC-Molekül hat an den Positionen 35 und 84 Cysteine. Ersteres befindet sich in der beim cTnC inaktiven Ca2+-Bindungsstelle I der N-terminalen Domäne. Das Cys84 hingegen liegt in der regulatorischen Region (Helix D), die nach der Ca2+-Bindung an die Ca2+-Bindungsstelle II mit dem TnI interagiert und somit an der Konformationsänderung beteiligt ist. a pCa 4.6 5.6 6.0 6.4 6.6 6.8 F530nm (%) 190 170 150 130 b 120 100 kobs (s-1) 210 7.0 7.6 110 80 60 40 20 9.4 90 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0 8 Zeit (s) 6 5 4 pCa [M] c d 1.2 120 1.0 100 kobs (s-1) F/Fmax 7 0.8 0.6 0.4 0.2 80 60 40 20 0.0 10 9 8 7 6 5 0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 4 ∆F/∆ ∆F(4,6) pCa [M] 2+ Abb. 3.15 Ca -induzierter Fluoreszenzanstieg von isoliertem cTn 2+ (TnC-NBD) (a) Tn (pCa 9,4) wurde zum Zeitpunkt t=0 s mit unterschiedlichen [Ca ] gemischt. (b) Ratenkonstante kobs. in 57 Ergebnisse Abhängigkeit des pCa (c) Normalisierte Fluoreszenzamplitude in Abhängigkeit des pCa. (d) Abhängigkeit von kobs von der normalisierten Fluoreszenzänderung Abb. 3.15a zeigt ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis. Wie bei den Messungen mit isoliertem cTn(TnI-NBD) (Abb. 3.7) ist mit zunehmender [Ca2+] ein deutlicher Anstieg der Fluoreszenzamplitude erkennbar. Das Signal ist ebenfalls biphasisch, wobei nur die langsame Phase bei allen [Ca2+] zeitlich aufgelöst werden kann. Das Fitten mit einer monoexponentiellen Funktion ergibt bei pCa 4,6 eine Ratenkonstante kobs von 121 s-1 (n=1) (Abb. 3.15b), bei sehr niedriger [Ca2+] nähert sich kobs einem Wert von 26 s-1. Die schnelle Phase ist wiederum zeitlich nicht auflösbar. Die Fluoreszenzänderung in Abhängigkeit von der [Ca2+] (Abb. 3.15c) wurde mit einer Hill-Funktion gefittet, wobei der pCa50 bei 6,8 ± 0,1 und der Hill-Koeffizient nH bei 1,2 ± 0,3 liegt. Abb. 3.15d zeigt die Abhängigkeit von kobs von der normalisierten Fluoreszenzänderung. Das Modell ergibt koff = 22 s-1, während der experimentell bestimmte Wert koff = 22 s-1 (je n=1) beträgt. Für kobs (4,6) ergibt sich aus dem Modell ein Wert von 94 s-1, der experimentell ermittelte Wert beläuft sich auf kobs (4,6) = 121 s-1 (je n=1). Im Vergleich der experimentell bestimmten Werte mit den Daten, die mit Hilfe des Modells berechnet wurden, zeigt sich sowohl für die Anschalt- als auch für die Abschaltkinetik kein relevanter Unterschied. Dabei ist jedoch zu beachten, dass es sich jeweils nur um ein einziges Experiment handelt. 58 Ergebnisse F530nm (%) Die folgende Abbildung zeigt die Abschaltkinetik von isoliertem cTn(TnC-NBD). 135 pCa 130 5.0 125 120 115 110 105 8.7 100 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 Zeit (s) Abb. 3.16: Abschaltkinetik von isoliertem cTn 2+ ~100 ms bei pCa 5,0 mit Ca (TnC-NBD) Der Tn-Komplex wurde zunächst für 2+ aktiviert, bevor mit dem Ca -Chelator BAPTA gemischt wurde (pCa 8,7). Das schwarze Signal ist die Kontrolle bei pCa 5,0, die Fluoreszenzabnahme (graues Signal) wurde mit einer monoexponentiellen Funktion gefittet (schwarze Linie) und ergab koff = -1 22 s . Die Fluoreszenz fällt nach dem Verringern der [Ca2+] bei 0 s biphasisch ab. Wie bei der Anschaltkinetik kann die erste schnelle Phase nicht aufgelöst werden und wird gefolgt von einer zweiten langsameren Phase. Die Amplitude des nicht auflösbaren Signals beträgt ~50%. Die zweite Phase kann mit einer monoexponentiellen Funktion gefittet werden und liefert einen Wert koff=22 s-1 (n=1). 59 Ergebnisse 3.3.3 Effekt der spezifischen Markierung von cTnC 3.3.3.1 cTn(TnC-NBD) in Mausmyofibrillen Der markierte Komplex wurde anschließend in cMF inkorporiert und der Fluoreszenzanstieg nach Aktivierung des Tn-Komplexes durch Ca2+ gemessen. F530nm (%) pCa 150 4.6 4.6 150 140 140 6.2 130 120 6.6 6.8 7.0 110 7.6 100 9.4 0.0 b pCa 160 F530nm (%) a 0.1 0.2 0.3 0.4 6.2 130 6.6 6.8 7.0 120 110 100 0.0 0.5 7.6 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Zeit (s) Zeit (s) Abb. 3.17: Beispiel für die Notwendigkeit der Basalliniensubtraktion bei der Bestimmung 2+ des Ca -induzierten Fluoreszenzanstiegs von in murine inkorporiertem cMF cTn (TnC-NBD) . (a) Durch die Darstellung des Graphs auf einer längeren Zeitskala von 0 bis 500 ms, soll der 2+ Verlauf der Kurven, insbesondere der Basalfluoreszenz (pCa 9,4) deutlicher werden. (b) Ca Abhängigkeit der Kinetik der Konformationsänderung nachdem die Basalfluoreszenz subtrahiert wurde. In Abb 3.17a ist zu sehen, dass die Fluoreszenz innerhalb der ersten 50 ms zunächst stark zunimmt um anschließend wieder abzusinken und dann das Niveau zu halten. Dieser Verlauf ist auch bei einem pCa von 9,38 (Basalfluoreszenz) zu erkennen. Vermutlich handelt es sich daher bei diesem Phänomen um ein Artefakt, das durch das schnelle Mischen der cMF in der Stopped-Flow-Apparatur verursacht wurde. Bevor die Kurven mit Hilfe einer monoexponentiellen Funktion gefittet wurden, wurde die Basalfluoreszenz von den anderen Fluoreszenzsignalen subtrahiert (Abb. 3.17b). In der folgenden Abbildung ist die Auswertung solch korrigierter Signale zu sehen. 60 Ergebnisse a b 140 130 200 4.6 5.6 6.0 150 kobs (s-1) F530nm (%) 150 pCa 6.4 6.6 120 100 7.0 50 7.6 100 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0 110 8 7 6 Zeit (s) c d 1.2 4 0.75 1.00 250 200 0.8 kobs (s-1) F/Fmax 1.0 0.6 0.4 150 100 50 0.2 0.0 10 5 pCa [M] 9 8 7 6 5 0 0.00 4 0.25 0.50 ∆F/∆ ∆F(4,6) pCa [M] 2+ Abb. 3.18: Ca -induzierter Fluoreszenzanstieg von in murine cMF inkorporiertem cTn NBD) (TnC- 2+ . (a) Die cMF (pCa 9,4) wurden zum Zeitpunkt t=0 s mit unterschiedlichen [Ca ] gemischt. (b) Ratenkonstante kobs. in Abhängigkeit des pCa (n=3) (c) Normalisierte Fluoreszenzamplitude der monoexponentiellen Fits in Abhängigkeit des pCa (n=3). (d) Abhängigkeit der Mittelwerte von kobs von den Mittelwerten der normalisierten Fluoreszenzänderung (jeweils n=3). Abb. 3.18a zeigt eine deutliche Ca2+-Abhängigkeit der Kinetik und der Amplituden. Die Kinetik ist jedoch bei den pCa-Werten 5,6 und 4,6 so schnell, dass auch die zweite, langsame Phase hier nicht mehr zeitlich aufgelöst und deshalb auch nicht gefittet werden kann. Mit sinkender [Ca2+] wird die Kinetik langsamer, die zweite Phase kann deshalb wieder monoexponentiell gefittet werden. Bei pCa 6,0 beträgt die Ratenkonstante kobs 175 s-1. In Abb. 3.18b ist kobs in Abhängigkeit vom pCa aufgetragen. Die Datenpunkte stellen jeweils den Mittelwert aus drei Messungen dar. kobs (4,6) ist allerdings kein Mittelwert, da bei zwei Messungen das Signal bei pCa 4,6 nicht gefittet werden konnte (s.o.). Der Wert für die Ratenkonstante liegt hier bei 199 s-1. 61 Ergebnisse Die Hill-Funktion, mit der die Daten in Abb. 3.18c gefittet werden konnten, wird durch einen pCa50 von 6,7 ± 0,1 und einen nH von 1,0 ± 0,1 beschrieben. Diese Werte sind vergleichbar mit den Ergebnissen der Messung mit isoliertem cTn(TnC-NBD) (pCa50: 6,8 ± 0,1, nH:1,2 ± 0,3, siehe auch Tab. 3.1, S. 70). Abb. 3.18d zeigt die Abhängigkeit der Mittelwerte von kobs von den Mittelwerten der normalisierten Fluoreszenzänderung. Das Modell ergibt koff = 34 ± 5 s-1 (n=3), während der experimentell bestimmte Wert koff = 23 ± 2 s-1 (n=2) beträgt. Für kobs (4,6) ergibt sich aus dem Modell ein Wert von 210 ± 53 s-1 (n=3), der experimentell ermittelte Wert beläuft sich auf kobs (4,6) = 199 s-1 (n=1). Die folgende Abbildung zeigt die Abschaltkinetik von in murine cMF inkorporiertem cTn(TnC-NBD). pCa 125 5.0 F530nm (%) 120 115 110 105 8.7 100 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 Zeit (s) Abb. 3.19: Abschaltkinetik von cTn (TnC-NBD) , welches in murine cMF inkorporiert wurde. 2+ Der Tn-Komplex wurde zunächst für ~100 ms bei pCa 5,0 mit Ca aktiviert, bevor mit dem 2+ Ca -Chelator BAPTA gemischt wurde (pCa 8,7). Das schwarze Signal ist die Kontrolle bei pCa 5,0, die Fluoreszenzabnahme (graues Signal) wurde mit einer monoexponentiellen Funktion -1 gefittet (schwarze Linie) und ergab koff = 21 s . Die Fluoreszenz fällt nach dem Verringern der [Ca2+] bei 0 s biphasisch ab. Wie bei der Messung der Abschaltkinetik mit isoliertem cTn(TnC-NBD) (Abb. 3.16) kann die erste schnelle Phase, welche gefolgt wird von einer zweiten langsameren Phase, nicht aufgelöst werden. Die Amplitude des nicht auflösbaren Signals beträgt auch hier ~50%. Die zweite Phase kann mit einer monoexponentiellen 62 Ergebnisse Funktion gefittet werden und liefert einen Wert für die Ratenkonstante koff ~ 23 s-1 (n=2). 3.3.4 Effekt der selektiven Markierung von cTnC 3.3.4.1. cTn(TnC-Cys84Ser-NBD) und -(Cys35Ser-NBD) in Meerschweinchenmyofibrillen Um auszuschließen, dass es sich bei den beiden Phasen der Anschaltkinetik um die Fluoreszenzsignale der beiden verschiedenen NBD-Moleküle (Cys84NBD und Cys35NBD) handelt, wurden zwei TnC-Mutationen hergestellt, bei denen jeweils ein Cystein durch ein Serin ersetzt wurde. Wie schon für TnI beschrieben, sollte durch die Markierung nur eines Cysteins die strukturelle Beeinträchtigung durch die Fluoreszenzfarbstoff minimiert werden. Wegen der Verfügbarkeit von Mausmodellen für Mutationen des cTn wurde die Schaltkinetik in den vorangegangenen Messungen in Mausmyofibrillen untersucht. Die Myosin-ATPase und die Kontraktions-/Relaxationskinetik ist in der Maus 10 mal schneller als im Menschen. Das Meerschweinchenmyokard hingegen hat eine ähnliche Kinetik wie der Mensch. Daher wurden die folgenden Untersuchungen mit Myofibrillen des Meerschweinchens durchgeführt. b pCa a pCa 150 105 4.6 F530nm (%) F530nm (%) 140 4.6 100 9.4 130 120 110 100 95 0.00 0.05 0.10 0.15 0.00 0.20 9.4 0.05 0.10 Zeit (s) Abb. 3.20: Vergleich von in Meerschweinchen-cMF inkorporiertem cTn inkorporiertem cTn (TnC-Cys35Ser-NBD) 0.15 0.20 Zeit (s) (TnC-Cys84Ser-NBD) und 2+ . Die cMF (pCa 9,4) wurden zum Zeitpunkt t=0 s mit Ca (pCa 4,6) gemischt. (a) TnC wurde am Cys35 mit NBD fluoreszenzmarkiert. (b) TnC wurde an Cys84 mit NBD fluoreszenzmarkiert. 63 Ergebnisse Abb. 3.20 zeigt die beiden inkorporierten TnC-Mutationen im Vergleich. Die Cys84Ser-Mutation (Abb. 3.20a) zeigt auch bei maximaler [Ca2+] keine Änderung der Fluoreszenzintensität, wohingegen die Cys35Ser-Mutation (Abb. 3.20b) einen deutlichen Anstieg der Fluoreszenzamplitude erkennen lässt. 3.3.4.2 Isoliertes cTn(TnC-Cys35Ser-NBD) Nachdem gezeigt wurde, dass die Kinetik der Konformationsänderung mit cTn(TnC-Cys35Ser-NBD) in cMF gemessen werden kann, wurde untersucht, ob dies mit isoliertem cTn(TnC-Cys35Ser-NBD) ebenso möglich ist. Anschließend wurden diese Messungen mit denen des inkorporierten cTn(TnC-Cys35Ser-NBD) in Beziehung gesetzt, um eventuelle Einflüsse der myofibrillären Umgebung nach der Inkorporation von cTn(TnC-Cys35Ser-NBD) in cMF registrieren zu können. pCa 170 4.6 5.6 160 6.0 b 60 150 140 6.4 130 110 6.9 7.1 7.6 100 9.4 120 80 70 kobs (s-1) F530nm (%) a 50 40 30 20 10 0 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 8 7 Zeit (s) 5 4 pCa [M] c d 1.2 80 70 1.0 60 0.8 kobs (s-1) F/Fmax 6 0.6 0.4 50 40 30 20 0.2 10 0.0 10 9 8 7 6 5 0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 4 ∆F/∆ ∆F(4,6) pCa [M] 2+ Abb. 3.21: Ca -induzierter Fluoreszenzanstieg von isoliertem cTn (TnC-Cys35Ser-NBD) . (a) Tn 2+ (pCa 9,4) wurde zum Zeitpunkt t=0 s mit unterschiedlichen [Ca ] gemischt. (b) Ratenkonstante kobs. in Abhängigkeit des pCa (n=6) (c) 64 Normalisierte Fluoreszenzamplitude der Ergebnisse monoexponentiellen Fits in Abhängigkeit des pCa (n=6). (d) Abhängigkeit der Mittelwerte von kobs von den Mittelwerten der normalisierten Fluoreszenzänderung (jeweils n=6). Abb. 3.21a verdeutlicht, dass die Biphasizität der Kinetik fortbesteht, obwohl hier nur noch ein NBD-Molekül pro Tn-Molekül vorhanden ist. Nachfolgende Messungen [54] haben ergeben, dass es sich bei der schnellen Phase um die Ca2+-Bindung an TnC handeln muss, bei der langsamen Phase um die regulatorische Konformationsänderung. Die Datenpunkte in Abb. 3.21b folgen dem Verlauf einer sigmoidalen Funktion. kobs steigt bei einem pCa von 5,0 nicht mehr an, erreicht bei maximaler [Ca2+] einen Wert von 58 ± 6 s-1 und nähert sich bei sehr niedrigen [Ca2+] einem Wert von 13 ± 3 (n=6). Abb. 3.21c zeigt wie die Messungen zuvor eine sigmoidale Abhängigkeit des Fluoreszenzanstiegs von der [Ca2+]. Der pCa50 beträgt 6,7 ± 0,1, der HillKoeffizient nH liegt bei 0,9 ± 0,1. Abb. 3.21d zeigt die Abhängigkeit der Mittelwerte von kobs von den Mittelwerten der normalisierten Fluoreszenzänderung. Das Modell ergibt koff = 14 ± 1 s-1 (n=6), während der experimentell bestimmte Wert koff = 23 ± 5 s-1 (n=3) beträgt. Für kobs (4,6) ergibt sich aus dem Modell ein Wert von 47 ± 5 s-1 (n=6), der experimentell ermittelte Wert beläuft sich auf kobs (4,6) = 58 ± 6 s-1 (n=6). Vergleicht man die experimentell bestimmten Werte mit den Daten, die mit Hilfe des Modells berechnet wurden, zeigt sich sowohl für die Anschalt- als auch für die Abschaltkinetik kein relevanter Unterschied. 65 Ergebnisse In der folgenden Abbildung ist die Fluoreszenzabnahme von isoliertem cTn(TnCCys35Ser-NBD) nach Zugabe von BAPTA dargestellt. pCa 135 5.0 F530nm (%) 130 125 120 115 110 105 100 8.7 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 Zeit (s) Abb. 3.22: Abschaltkinetik von isoliertem cTn 2+ zunächst für ~100 ms bei pCa 5,0 mit Ca (TnC-Cys35Ser-NBD) Der Tn-Komplex wurde 2+ aktiviert, bevor mit dem Ca -Chelator BAPTA gemischt wurde (pCa 8,7). Das schwarze Signal ist die Kontrolle bei pCa 5,0, die Fluoreszenzabnahme (graues Signal) wurde mit einer monoexponentiellen Funktion gefittet -1 (schwarze Linie) und ergab koff = 32 s . (Abb. stammt von D. Gomez Alcazar) Die Fluoreszenz fällt nach dem Verringern der [Ca2+] bei 0 s biphasisch ab. Die erste schnelle Phase kann nicht aufgelöst werden und wird gefolgt von einer zweiten langsameren Phase. Die Amplitude des nicht auflösbaren Signals beträgt ~55%. Die zweite Phase kann mit einer monoexponentiellen Funktion gefittet werden und liefert einen Wert koff=23 ± 5 s-1 (n=3). 66 Ergebnisse 3.3.5 cTn(TnC-Cys35Ser-NBD) in Meerschweinchenmyofibrillen Die vorangegangenen Messungen mit einer Fluoreszenzmarkierung von TnC an Cys84 haben gezeigt, dass die Ca2+-abhängige Schaltkinetik mit einem guten Signal-Rausch-Verhältnis sowohl des isolierten als auch des in das Sarkomer inkorporierten Tn gemessen werden kann. b pCa 180 4.6 170 160 5.3 150 140 6.0 130 120 6.6 110 7.0 100 9.4 90 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 kobs (s-1) F530nm (%) a 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 8 7 Zeit (s) c 6 5 4 pCa [M] d 1.2 400 kobs (s-1) F/Fmax 1.0 0.8 0.6 0.4 300 200 100 0.2 0.0 10 9 8 7 6 5 0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 4 ∆F/∆ ∆F(4,6) pCa [M] Abb. 3.23: 2+ Ca -induzierter inkorporiertem cTn Fluoreszenzanstieg (TnC-Cys35Ser-NBD) von in Meerschweinchen-cMF . (a) cMF (pCa 9,4) wurden zum Zeitpunkt t=0 s mit 2+ unterschiedlichen [Ca ] gemischt. (b) Ratenkonstante kobs. in Abhängigkeit des pCa (n=4) (c) Normalisierte Fluoreszenzamplitude der monoexponentiellen Fits in Abhängigkeit des pCa (n=4). (d) Abhängigkeit der Mittelwerte von kobs von den Mittelwerten der normalisierten Fluoreszenzänderung (jeweils n=4). Wie bei der Messung des isolierten cTn(TnC-Cys35Ser-NBD) ist auch die Kinetik des inkorporierten cTn biphasisch. Im Unterschied zu Abb. 3.22a ist in Abb. 3.23a aber eine schnellere Kinetik zu sehen. Die Geschwindigkeit der Ratenkonstante 67 Ergebnisse kobs beträgt hier bei maximaler [Ca2+] (pCa 4,6) 304 ± 78 s-1 (Abb. 3.23b), wohingegen kobs bei der Messung des isolierten cTn(TnC-Cys35Ser-NBD) mit einem Wert von 58 ± 6 s-1 (Abb. 3.22b) deutlich kleiner ist. Die Amplitude in Abb 3.23c lässt sich mit einer Hill-Funktion fitten, wobei der pCa50 6,2 ± 0,2 und der Hill-Koeffizient nH 0,9 ± 0,3 ist. Der pCa50 des isolierten cTn(TnC-Cys35Ser-NBD) beträgt 6,7 ± 0,1, der nH 0,9 ± 0,1 (Abb. 3.22c). In Abb. 3.23d ist die Abhängigkeit der Mittelwerte von kobs von den Mittelwerten der normalisierten Fluoreszenzänderung dargestellt. Das Fitten der Daten ergibt einen Wert von koff = 28 ± 5 s-1 (n=4), wohingegen der experimentell bestimmte Wert für koff = 33 ± 3 s-1 (n=3) beträgt. Während der durch das Modell bestimmte Wert von kobs(4,6) bei 294 ± 37 s-1 (n=4) liegt, beträgt der experimentell ermittelte Wert für kobs (4,6) = 304 ± 78 s-1 (n=4). Nach der Bestimmung der Anschaltkinetik wurde die Ratenkonstante koff der F530nm (%) Abschaltkinetik bestimmt. 130 pCa 125 5.0 120 115 110 105 8.7 100 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 Zeit (s) Abb. 3.24: Abschaltkinetik von cTn (TnC-Cys35Ser-NBD) , in Meerschweinchen-cMF inkorporiert. 2+ Der Tn-Komplex wurde zunächst für ~100 ms bei pCa 5,0 mit Ca aktiviert, bevor mit dem 2+ Ca -Chelator BAPTA gemischt wurde (pCa 8,7). Das schwarze Signal ist die Kontrolle bei pCa 5,0, die Fluoreszenzabnahme (graues Signal) wurde mit einer monoexponentiellen Funktion -1 gefittet (schwarze Linie) und ergab koff = 30 s . 68 Ergebnisse Die Fluoreszenz fällt nach dem Verringern der [Ca2+] bei 0 s biphasisch ab. Die erste schnelle Phase kann nicht aufgelöst werden und wird von einer zweiten langsameren Phase gefolgt. Die Amplitude des nicht auflösbaren Signals beträgt ~45%. Abb. 3.24 zeigt, dass die Fluoreszenz monoexponentiell mit einer Ratenkonstante koff von 33 ± 3 s-1 (n=3) abnimmt. 69 Ergebnisse Die nachfolgende Tabelle zeigt eine Zusammenstellung aller experimentell ermittelten Daten sowie die Werte der Ratenkonstanten der An- und Abschaltkinetik, die mit Hilfe des Zwei-Zustand-Modells [43] berechnet wurden (alle Daten sind ± SE(M) angegeben). Experimentelle Daten 2-Zustands1 Modell* kobs UE - AS - FS koff (pCa 4,6) (s ) -1 isolierter Tn-Komplex (s ) TnI-C79,C97- ∆F pCa50 nH n -1 kon -1 (pCa 4,6) koff -1 (s ) (s ) (%) - - 66 5,9 ± 0,2 0,7 1 - - 121 22 113 6,8 ± 0,1 1,2 1 94 22 69 ± 6 6,7 ± 0,1 0,9 6 47 ± 5 14 ± 1 3 136 ± 10 31 ± 4 3 210 ± 53 34 ± 5 4 294 ± 37 28 ± 5 NBD TnCC35,C84NBD TnC-C84- (n=1) 58 ± 6 NBD 22 ± 5 (n=3) ± 0,1 TnCinkorporierter Tn-Komplex C35,C84NBD 323 24 ± 4 ± 124 (n=2) 59 ± 3 6,8 ± 0,1 1,3 ± 0,2 TnI-C79,C97NBD (Maus) TnCC35,C84- 199* 2 NBD (Maus) 23 ± 2 43 ± 5 6,7 ± 0,1 (n=2) TnC-C84- 304 33 ± 3 NBD (Meer- ± 78 (n=3) 1,0 ± 0,1 53 ± 5 6,2 ± 0,2 0,9 ± 0,3 schweinchen) Tab. 3.1: Übersicht experimentelle Daten und Daten des Zwei-Zustand-Modells, berechnet nach Poggesi et al. [43] Abkürzungen: AS (Aminosäure), FS (Farbstoff), UE (Untereinheit) 1 * Die Werte für die Ratenkonstante kobs, mit denen das Zwei-Zustand-Modell erstellt wurde, 2+ sind die Mittelwerte ± SE von kobs, die durch das Fitten der Ca -Titrationskinetiken dreier Messungen bestimmt wurden. 2 * Dieser Wert ergibt sich aus nur einer Messung, da die langsamen Phasen der beiden 2+ anderen Messungen bei hohen [Ca ] nicht gefittet werden konnten. n gibt die Anzahl der jeweils durchgeführten Experimente der Anschaltkinetik an, die Anzahl der Experimente der Abschaltkinetik ist den Tabellenzeilen der koff-Werte zu entnehmen. 70 Ergebnisse Die Fluoreszenzsignale konnten bei der Messung mit dem cTnI-NBD nicht gefittet werden, weshalb die Werte für kobs in der Tabelle (Tab. 3.1) fehlen. Auch die Abschaltkinetik wurde nicht bestimmt. Vergleicht man die Ergebnisse der Messungen mit isoliertem TnC-NBD, inkorporiertem Tn-NBD sowie inkorporiertem TnC-NBD miteinander, so ist die Tendenz zu erkennen, dass die Kinetik der Ca2+-induzierten Konformationsänderung des inkorporierten cTn schneller ist als die des isolierten cTn. Bei der Abschaltkinetik hingegen ist bezüglich der experimentell ermittelten Daten kein Unterschied zwischen isoliertem und inkorporiertem cTn zu sehen. Beim Vergleich der Messungen mit isoliertem cTn, fällt auf, dass die Anschaltkinetik des nicht mutierten TnC-NBD, welches zwei NBD-markierte Cysteine besitzt, schneller ist, als die Anschaltkinetik des selektiv am C84 markierten TnC. 71 Ergebnisse 3.4 Effekte der FHC-assoziierten hcTnI-Mutation R145G auf die Ca2+-induzierte An- und Abschaltkinetik des Troponins Nachdem erstmals die Ca2+-kontrollierte Schaltkinetik von cTn in cMF charakterisiert werden konnte, sollte nun in einer ersten Messung der Effekt der FHC-assoziierten hcTnI-Mutation R145G auf die Schaltkinetik des cTn untersucht werden. a 200 5.3 4.6 150 150 140 kobs (s-1) F530nm (%) b pCa 160 6.0 130 6.6 120 110 50 7.6 9.4 100 100 0 90 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 8 7 c 6 5 4 pCa [M] Zeit (s) d 1.2 200 0.8 kobs (s-1) F/Fmax 1.0 0.6 0.4 100 50 0.2 0.0 10 150 9 8 7 6 5 0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 4 ∆F/∆ ∆F(4,6) pCa [M] 2+ Abb. 3.25: Ca -induzierter Fluoreszenzanstieg der hcTnI-Mutation R145G, welche in cMF 2+ inkorporiert wurde. (a) cMF (pCa 9,4) wurden zum Zeitpunkt t=0 s mit unterschiedlichen [Ca ] gemischt. (b) Ratenkonstante kobs. in Abhängigkeit des pCa (c) Normalisierte Fluoreszenzamplitude in Abhängigkeit des pCa (n=1). (d) Abhängigkeit von kobs von der normalisierten Fluoreszenzamplitude. Die Mutation wurde am TnC Cys84 mit NBD fluoreszenzmarkiert und in Meerschweinchen-cMF inkorporiert. Ebenso wie beim WT-cTn(TnC-Cys35Ser-NBD) besteht die Kinetik der hcTnI-Mutation R145G aus einer schnellen, zeitlich nicht auflösbaren und einer langsamen Phase (Abb. 3.25a). Der monoexponentielle Fit der langsamen Phase ergibt eine Ratenkonstante kobs (4,6) = 140 s-1 (Abb. 3.25b). 72 Ergebnisse Die Ca2+-Abhängigkeit des normalisierten Fluoreszenzanstiegs (Abb. 3.25c) ergibt einen pCa50 von 6,5 ± 0,2 und einen Hill-Koeffizienten nH von 0,7 ± 0,3. Abb. 3.25d zeigt die Abhängigkeit von kobs von der normalisierten Fluoreszenzänderung. Nach dem Zwei-Zustand-Modell [43] ergibt koff = 16 ± 5 s-1, während der experimentell bestimmte Wert koff = 27 (je n=1) beträgt. Für kobs (4,6) ergibt sich aus dem Modell ein Wert von 87 ± 12 s-1, wohingegen sich der experimentell ermittelte Wert auf kobs (4,6) = 140 s-1 (je n=1) beläuft. Zukünftige Messungen müssen zeigen, ob das Zwei-Zustandsmodell auch auf Mutationen des TnI anwendbar ist. pCa 125 5.0 F530nm (%) 120 115 110 105 100 8.7 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 Zeit (s) Abb. 3.26: Abschaltkinetik der hcTnI-Mutation R145G, welche in cMF inkorporiert wurde. 2+ Der Tn-Komplex wurde zunächst für ~100 ms bei pCa 5,0 mit Ca aktiviert, bevor mit dem 2+ Ca -Chelator BAPTA gemischt wurde (pCa 8,7). Das schwarze Signal ist die Kontrolle bei pCa 5,0, die Fluoreszenzabnahme (graues Signal) wurde mit einer monoexponentiellen Funktion -1 gefittet (schwarze Linie) und ergab koff = 27 s . Abb. 3.26 zeigt die Bestimmung der Abschaltkinetik. Die Ratenkonstante koff beträgt 27 s-1 ist und ist damit im Vergleich zum WT ~ 20% langsamer (siehe Tab. 3.2). Hier ist zu bedenken, dass es sich nur um eine Einzelmessung handelt. 73 Diskussion 4. Diskussion 4.1. Entwicklung einer Methode zur Bestimmung der Ca2+kontrollierten Schaltkinetik von cTn in Myofibrillen Die kinetischen Eigenschaften des Troponin-Tropomyosin-Komplexes (Tn:TM) sind mit isolierten Proteinen in Lösung detailliert untersucht worden. Rosenfeld et al. [49] haben in einer biochemischen Studie mit skelettalem (s)Tn gezeigt, dass die Rekonstitution von sTn mit Tropomyosin (TM), rekonstituiertem dünnen Filament (sTn:TM:Aktin) sowie dünnem Filament und Myosin-S1 die Ca2+-kontrollierte Schaltkinetik von sTn in Abhängigkeit des Systems verändert. Ob die Schaltkinetik durch die Struktur verändert wird, ist nicht bekannt. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, eine Methode zur Bestimmung der Ca2+kontrollierten Schaltkinetik von cTn in der strukturellen Umgebung des Sarkomers zu entwickeln. In dieser Studie wurden kardiale Myofibrillen (cMF) verwendet, weil sie im Vergleich zu rekonstituierten Filamenten, die in biochemischen Studien Verwendung finden, ein vollständiges kontraktiles System darstellen und damit den Bedingungen in situ am ähnlichsten sind. Zur Bestimmung der Kinetik des dünnen Filamentes wurden in einigen Studien gehäutete Muskelfasern verwendet [4, 46], die ebenfalls Messungen in der strukturellen Umgebung des Sarkomers ermöglichen. Im Gegensatz zu gehäuteten Muskelfasern sind Myofibrillen aufgrund ihres kleineren Durchmessers (~1 µm) nicht diffusionslimitiert, was die Bestimmung von schnellen Kinetiken ermöglicht. Kinetiken können also in der Stopped-Flow Apparatur durch rasches Mixen (<1 ms) ermittelt werden. Die Faser ist dagegen diffusionslimitiert. Hier wird das Problem durch „caged compounds“ umgangen. Bei „caged compounds“ wird Ca2+ durch Photolyse mittels eines Lichtblitzes aus einem Ca2+-Chelator freigesetzt. Dabei ist es jedoch nicht möglich, die Konzentration des freigesetzten Ca2+ genau zu definieren. Ein weiterer Nachteil bei der Bestimmung der Anschaltkinetik ist die hohe Ca2+-Affinität der Chelatoren, da das freigesetzte Ca2+ bei der Ca2+-Aktivierung z. B. mittels des Ca2+-Chelators NP EGTA nach der Photolyse sofort wieder an diesen gebunden wird. Bei der Abschaltkinetik mit dem caged Ca2+-Chelator Diazo-2 hingegen ist die 74 Diskussion Pufferkapazität der photolysierten Substanz zu gering, um sämtliche Ca2+-Ionen zu chelatieren und damit die Muskelfaser vollständig zu relaxieren. Ein weiteres Problem stellt die geringe Quantenausbeute dar, die es erschwert, eine ausreichende Menge des caged compound zu photolysieren, weshalb eine maximale Aktivierung/Inaktivierung schwierig ist. Wir hingegen können bei unseren Experimenten eine genaue Ca2+Konzentration angeben und erreichen bei pCa 4,6 eine maximale Aktivierung des dünnen Filamentes. 4.1.1 Kontrollen des cTn-Austausches cTnNBD wurde nach einer Methode von Brenner et al. [5] in cMF inkorporiert, indem das endogene cTn als ganzer Komplex gegen das exogene fluoreszenzmarkierte humane cTnNBD (hcTnNBD) ausgetauscht wurde. Der Zeitverlauf des Austausches ist nicht allein von der langsamen Diffusion des exogenen cTn in die cMF abhängig, sondern wird vermutlich vor allem durch eine langsame Dissoziation des endogenen cTn limitiert [51]. Mittels SDS-PAGE konnte gezeigt werden, dass ~60% des cTn ausgetauscht wurden, was gut mit Ergebnissen an gehäuteten Fasern übereinstimmt [38]. Ein Grund für den inkompletten Austausch könnte sein, dass unter Rigor-Bedingungen hauptsächlich das cTn in der Überlappungsregion von Aktin- und Myosinfilamenten ausgetauscht wird [51]. Die kinetischen Parameter der Kraftentwicklung und -relaxation von cTnNBDausgetauschten cMF zeigten im Vergleich zu unausgetauschten cMF bei weiteren Messungen keine signifikanten Unterschiede, mit Ausnahme einer Abnahme der Kraft/Querschnittsfläche um ~ 1/3 [54]. Eine solche Abnahme der Kraft wurde ebenso an gehäuteten Muskelfasern beobachtet [38, 60]. Die in dieser Arbeit bestimmte Schaltkinetik von cTn wird durch eine Abnahme der Kraft der cMF aber nicht beeinflusst, da die Stopped flow-Messungen unter nicht isometrischen Bedingungen durchgeführt werden und sich daher nur wenige Querbrücken in Kraft-generierenden Zuständen befinden [55]. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass der Austausch und der an das cTn gekoppelte Fluoreszenzfarbstoff NBD keinen maßgeblichen Einfluss auf die Kinetik der myofibrillären Kontraktion und Relaxation haben. 75 Diskussion 4.1.2 Wahl des Fluoreszenzfarbstoffes und des Markierungsortes Konformationsänderungen von Proteinen können mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen detektiert werden, die spezifisch an das Proteinmolekül gekoppelt werden. Im Folgenden werden die verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffe und Markierungsorte, die in dieser Arbeit verwendet wurden, vorgestellt: 4.1.2.1 cTnNBD Brenner et al. [5] haben skelettales TnI (sTnI) mit dem Fluoreszenzfarbstoff NBD markiert und auf diese Art und Weise den Aktivierungszustand des dünnen Filamentes in gehäuteten Psoas-Fasern bestimmt. Wir haben analog zu Brenner [5] zunächst den gesamten Tn-Komplex markiert und fanden einen biphasischen Fluoreszenzanstieg bei sättigender [Ca2+] (pCa 4,6). Die Biphasizität könnte dadurch bedingt sein, dass sowohl TnI als auch TnC mit dem Fluoreszenzfarbstoff markiert werden, was mittels einer mit UVLicht angeregten SDS-PAGE bestätigt wurde (s. Ergebnisse, Abb. 3.12). Die erste Phase der hier bestimmten Kinetik könnte daher die Ca2+-Bindung an TnC, die zweite Phase die regulatorische Konformationsänderung von TnI darstellen (s. 4.2.2). Daher wurde im Folgenden TnI bzw. TnC vor Rekonstitution des Komplexes markiert und durch Mutation von Cysteinen in Serine ganz spezifische Aminosäuren markiert. Diese Messungen mit Monocysteinmutanten (siehe Ergebnisse, 3.3.8) zeigten aber, dass die Kinetik mit nur einem Farbstoffmolekül an cTnC ebenfalls biphasisch ist 4.1.2.2 cTn(TnI-NBD) Da es ein langfristiges Ziel war, den Einfluss von familiäre hypertrophe Kardiomyopathie (FHC)-assoziierten Mutationen von TnI auf die Schaltkinetik zu untersuchen, wurde nach einer Methode gesucht, TnI selektiv zu markieren. Da die Konformationsänderung von cTn in erster Linie TnI involviert, wurde TnI selektiv mit NBD markiert. Es ist bisher keine Studie bekannt, in der cTnI selektiv markiert wurde, um die Kinetik der Konformationsänderung zu bestimmen. Es wurde lediglich mit Hilfe von Förster Resonance Energy Transfer (FRET) die Ca2+-induzierte Konformationsänderung des Gesamtkomplexes untersucht. In diesen Experimenten wurde der FRET von 76 Diskussion einem an cTnI gebundenen fluoreszierenden Donor auf einen an cTnC gekoppelten nicht fluoreszierenden Akzeptor beobachtet. Durch Bestimmung des sich verändernden Donor-Akzeptor Abstandes konnten auf diese Weise Konformationsänderungen während des An- und Abschaltens von cTn untersucht werden [47].Um zu untersuchen, ob mittels selektiver Markierung des cTn-Komplexes an cTnI überhaupt ein Fluoreszenzsignal detektiert werden kann, wurde zuerst nur isoliertes cTn verwendet, weil es im Vergleich zu cTn, welches in cMF inkorporiert wurde, ein weniger komplexes System darstellt. Auch diese Messungen zeigten ein biphasisches Signal. Des Weiteren kam eine sehr langsame dritte Phase hinzu. Sie ist deutlich langsamer als die cMFKontraktion [57], so dass es sich dabei nicht um die regulatorische Konformationsänderung handeln kann. Denkbar wäre, dass die dritte Phase den langsamen Austausch von Mg2+ gegen Ca2+ an den C-terminalen Bindungsstellen III und IV von TnC darstellt [8, 48]. Anschließend wurde cTn in cMF inkorporiert. Hier war bei pCa 4,6 jedoch nur ein Fluoreszenzanstieg von ~ 2% zu sehen, was zu einem unbrauchbaren Signal-Rausch-Verhältnis führte. Ein vergleichbarer Effekt wurde von Putkey et al. [46] in einer Studie mit cTn für den Fluoreszenzfarbstoff ANS beobachtet. Hierbei war der Cysteinrest 35 von cTnC selektiv mit ANS markiert und die Fluoreszenz des cTn-Komplexes anschließend nach Aktivierung mit Ca2+ gemessen worden. Es zeigte sich eine Ca2+-abhängige Fluoreszenzabnahme. Nachdem der cTn-Komplex in gehäutete Herzmuskelfasern inkorporiert worden war, konnte auch bei maximaler [Ca2+] keine Fluoreszenzänderung mehr beobachtet werden. Da die geringe Fluoreszenzänderung bei unseren Messungen durch die spezifischen Fluoreszenzeigenschaften von NBD bedingt sein konnte, folgte ein zweites Experiment mit dem Fluoreszenzfarbstoff EDANS. Es zeigte sich aber, dass die Kinetik der Ca2+-induzierten Konformationsänderung auch mit Hilfe von cTn(TnI-EDANS) nicht bestimmt werden konnte, da das Signal-Rausch-Verhältnis wie bei der Messung mit ANS sehr klein war. cTnI hat zwei intrinsische Cysteine, die markiert werden können: Cys80 auf Helix 1 und Cys97 auf Helix 2. Beide Helices sind jedoch nicht direkt an der regulatorischen Konformationsänderung von cTnC beteiligt. Brenner et al. [5] haben fast skeletal TnI (fsTnI) an Cys133 markiert, das sich auf Helix 3 befindet 77 Diskussion und auf diese Weise Kinetiken bestimmt. Das sogenannte “switch peptide“ auf Helix 3 von TnI nähert sich in Anwesenheit von Ca2+ der N-terminalen Domäne von TnC und bindet an sie. An homologer Stelle hat cTnI Ser166. Um diese Position wie Brenner et al. mit einem Fluoreszenzfarbstoff markieren zu können, wurde Serin mittels ortsspezifischer Mutagenese durch Cystein ersetzt. Die beiden anderen Cysteine wurden gegen Serine ausgetauscht, so dass weder durch diese stille Mutation [26], noch durch Bindung weiterer Farbstoffmoleküle strukturelle Veränderungen von TnI zu erwarten waren. Es zeigte sich aber, dass auch durch die Markierung von Cys166 mit NBD, bzw. mit EDANS keine Ca2+-induzierte Fluoreszenzänderung detektiert werden konnte. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die Kinetik der Konformationsänderung von cTn, anders als in Experimenten mit fsTn, mit Hilfe der hier entwickelten Methode zur selektiven Fluoreszenzmarkierung von cTnI aufgrund der geringen Fluoreszenzänderung nicht bzw. nur unzureichend bestimmt werden kann. 4.1.2.3 cTn(TnC-NBD) Im Gegensatz zur Markierung von cTnI, war bei Markierung der beiden intrinsischen Cysteine Fluoreszenzänderung Cys35 mit und Cys84 biphasischer mit Kinetik NBD nach eine deutliche Ca2+-Aktivierung erkennbar, was mit Beobachtungen von Hazard et al. [18] übereinstimmt. Da diese Autoren in einer biochemischen Studie mit isoliertem cTnC vom Huhn zeigten, dass Farbstoffmolekül die Markierung zu einer von cTnC mit Verlangsamung einem zweiten ANS- der Kinetik der Konformationsänderung führt (kon: 210 s-1, bzw.120 s -1; koff: 260 s-1, bzw. 90 s-1, 4°C), stellten wir zwei Monocysteinmutanten her. So konnte cTnC selektiv an nur einem Cystein markiert werden. Bei Messungen mit Tn(TnC-C35-NBD), welches in cMF inkorporiert wurde und dessen Cystein in der nicht-funktionellen Ca2+Bindungsstelle-I liegt, konnte keine Fluoreszenzänderung registriert werden, was mit Ergebnissen von Putkey et al. [46] und Dong et al. [9] übereinstimmt. Cys84 hingegen befindet sich am C-terminalen Ende von Helix D, die in Anwesenheit von Ca2+ mit Helix 3 in der regulatorischen Region von TnI interagiert [61]. 78 Diskussion 4.1.2.4 cTn(TnC-Cys84-NBD) Wie in den vorangegangen Messungen war die anhand von cTn(TnC-Cys-84-NBD) bestimmte Ca2+-induzierte Anschaltkinetik biphasisch. Sowohl für isoliertes als auch für inkorporiertes cTn(TnC-Cys84-NBD) zeigte sich eine erste Phase, die zu schnell war, um mit Hilfe der Stopped-Flow Apparatur aufgelöst zu werden sowie eine langsamere Phase. Betrachtet man die Werte für die Ratenkonstante der Ca2+-induzierten Anschaltkinetik für isoliertes (kobs = 58 s-1) und inkorporiertes cTn (kobs =304 s-1), wird deutlich, dass die Ratenkonstante kobs der langsamen Phase bei Inkorporation von cTn in cMF ~ 5x größer ist als kobs der Kinetik von isoliertem cTn. Die schnellere Kinetik in cMF könnte durch eine Verringerung der für das Anschalten benötigen Aktivierungsenergie bedingt sein, wenn cTn in seine natürliche Umgebung inkorporiert wird. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass der ähnliche biphasische Verlauf der Kinetiken von isoliertem und inkorporiertem cTn auf einen ähnlichen kinetischen Mechanismus hindeutet, sich die Ratenkonstanten der Anschaltkinetik aber deutlich unterscheiden. Biochemische Studien mit isoliertem cTn bilden die Situation in vivo nur unvollständig ab und sind für die Bestimmung der Schaltkinetik von cTn demnach nicht geeignet. 4.1.3 Vorteile der Verwendung von Meerschweinchenmyofibrillen gegenüber murinen Kardiomyofibrillen Zu Beginn der Methodenentwicklung erfolgten die Messungen anhand muriner Kardiomyofibrillen. Im Verlauf erwies sich die Verwendung muriner cMF jedoch als ungünstig. Aus folgenden Gründen wurde der Umstieg auf Meerschweinchen-cMF beschlossen: Da für Mutationen des TnI Mausmodelle vorliegen [28] und das langfristige Ziel war, zu untersuchen, ob die Schaltkinetik für die Kontraktionskinetik ratenlimitierend ist. Andererseits sind Myofibrillen vom Meerschweinchen dem menschlichen Herzen näher. Beispielsweise findet man im Ventrikel von Mäuse- und Rattenherzen mehr Meerschweinchenventrikel V1-Myosin (αα-Schwerkette), V3-Myosin (ββ-Schwerkette), während wie auch im beim Menschen [32, 39], vorherrscht. Zusätzlich zeigte sich, dass die mit 79 Diskussion Meerschweinchen-cMF gemessenen Kinetiken im Vergleich mit murinen cMF eine geringere Variabilität haben. Auch technische Gründe sprechen für die Verwendung von Meerschweinchenmyofibrillen. Für die Bestimmung einer kompletten Ca2+abhängigen Anschaltkinetik wurden etwa zehn Mäuseherzen (Gewicht pro Herz ~180 mg) benötigt, wohingegen nur ein einziges Meerschweinchenherz (~2 g) für die gesamte Messung ausreichte. Aufgrund der Größe eines Meerschweinchenherzens, ist es möglich dieses zu perfundieren. Durch den gleichmäßigen Perfusionsdruck bleibt die Sarkomerlänge der cMF optimal. Im Gegensatz zu den murinen cMF sind unter dem Lichtmikroskop keine überkontrahierten cMF mehr zu erkennen. Denkt man an eine Weiterentwicklung der in der vorliegenden Arbeit entwickelten Methode, ist die Verwendung von Meerschweinchen-cMF vorteilhaft, da Meerschweinchen-Kardiomyozyten aufgrund der oben genannten Eigenschaften für eventuell folgende Messungen an der ganzen Herzmuskelzelle besser geeignet sind als murine Kardiomyozyten. 4.2 Interpretation des Fluoreszenzsignals 4.2.1 Anschaltkinetik von cTn (TnC-Cys84-NBD) Die Ca2+-kontrollierte Anschaltkinetik von cTn besteht aus zwei Phasen, einer schnellen und einer langsamen Phase. Die Aktivierung mit hohen [Ca2+] ruft einen Anstieg der Fluoreszenzamplitude hervor, der innerhalb der Totzeit der Stopped-Flow Apparatur stattfindet. Da es selbst mit Hilfe einer Mikroküvette (Totzeit 250 µs) nicht gelang, die schnelle Phase zeitlich aufzulösen, muss die Ratenkonstante dieser kinetischen Phase >2000 s-1 betragen. Die Rate dieser schnellen Phase ist damit ~ 6-30x schneller als die Rate der langsamen Phase mit 304 s-1/ 58 s-1 (für inkorporiertes, bzw. isoliertes cTn). Hazard et al. [18] haben für die Ca2+-Bindung an isoliertes cTnC eine Ratenkonstante zweiter Ordnung von 2-4 x 108 µM-1s-1 bestimmt. Geht man davon aus, dass die Ratenkonstante der Ca2+-Bindung an cTnC wie bei einer diffusionslimitierten Reaktion linear mit der [Ca2+] zunimmt [24], ergibt sich bei pCa 4,6 eine Ratenkonstante von 2500-5000 s-1. Dies ist ein weiterer Hinweis darauf, dass es sich bei der schnellen Phase um die Ca2+-Bindung handelt. 80 Diskussion Von Gomez (unveröffentlichte Ergebnisse) wurde der Einfluss von Rigorquerbrücken auf die Schaltkinetik untersucht. Im Rigorzustand ist das dünne Filament sogar im Ca2+-freien Zustand angeschaltet. Auch unter diesen Bedingungen wurde durch Ca2+ eine sehr schnelle Phase innerhalb der Totzeit der Apparatur ausgelöst. Dies zeigte sich in einem Sprung der Fluoreszenzamplitude im Vergleich zur Basalfluoreszenz, welche ohne Ca2+ gemessen wurde. Es ist daher anzunehmen, dass es sich bei der schnellen Phase, die wir bei unseren Kinetiken beobachten, um die Ca2+-Bindung handelt. Eine langsame Phase, wie sie in dieser Arbeit beobachtet wurde, fehlte. Da cTn durch die Rigor-Querbrücken bereits angeschaltet war, stellt die langsame Phase wahrscheinlich die Konformationsänderung bei Aktivierung von cTn mit Ca2+ dar. Verschiedene Gruppen haben vor allem in biochemischen Studien an isolierten Proteinen Ratenkonstanten nach Aktivierung von cTnC [18, 23, 58], bzw. cTn [10] mit Ca2+ bestimmt, deren Bedeutung kontrovers diskutiert wird. So haben Dong et al. [10] cTn an Cys35 von cTnC mit ANS markiert und damit wie in dieser Arbeit eine biphasische Anschaltkinetik nach Aktivierung mit Ca2+ gemessen. Sie haben die schnelle Phase ihrer Kinetik mit einer Ratenkonstante von 30-40 s-1 (4°C) als Ca 2+-Bindung an cTnC interpretiert. Verglichen mit den Daten in dieser Arbeit stimmt diese Ratenkonstante kinetisch mit der Ratenkonstante der langsamen Phase von 58 s-1 (10°C) für das isolierte cTn überein. In einer Studie mit inkorporiertem cTn haben Bell et al. [3] die Anschaltkinetik von cTn mit Rhodamin-markiertem cTnC in gehäuteten Herzmuskeltrabekeln mittels Fluoreszenzpolarisation untersucht. Sie erkannten ebenfalls zwei kinetische Phasen. Die schnelle Phase interpretierten sie als die Ca2+-Bindung oder als einen damit eng verknüpften Schritt. Wie in der Studie von Dong et al. ähnelte die Ratenkonstante der schnellen Phase unserer langsamen Phase. Da Bell et al. bei ihren Experimenten mit gehäuteten Muskelfasern auf die Verwendung von caged-Ca2+ angewiesen waren, konnten sie nicht bei sättigender [Ca2+] messen. Bei ~2/3 der maximalen Ca2+-Aktivierung betrug ihre Ratenkonstante 100 s-1, die mit dem in dieser Arbeit bestimmten kobs der langsamen Phase von 70 s-1 bei 64% Aktivierung mit inkorporiertem cTn korreliert. 81 Diskussion Zusammenfassend hängt die in dieser Arbeit beobachtete schnelle Phase der Ca2+-induzierten Anschaltkinetik direkt oder zumindest sehr eng mit einem nahezu diffusionskontrollierten Ca2+-Bindungsprozess zusammen, wohingegen die Ratenkonstanten der schnellen Phasen in den Studien von Dong et al. [10] und Bell et al. [3] den Werten für die hier bestimmte langsame Phase ähneln. So scheint es sehr wahrscheinlich, dass sich alle drei auf dieselbe globale Konformationsänderung von cTn beziehen. 4.2.2 Abschaltkinetik von cTn(TnC-Cys84-NBD) Zur Bestimmung der Abschaltkinetik wurde der in MF inkorporierte cTnKomplex zunächst mit Ca2+ aktiviert, bevor mit dem Ca2+-Chelator BAPTA gemischt wurde (pCa 8,7). Die schnelle Verringerung der [Ca2+] induziert einen monoexponentiellen Abfall des Fluoreszenzsignals. Da die Amplitude dieser langsamen kinetischen Phase kleiner ist als die Differenz des Fluoreszenzniveaus bei pCa > 8 und pCa = 5 (s. Ergebnisse, Abb 3.10) zu erwarten wäre, kann nicht ausgeschlossen werden, dass - wie bei der Anschaltkinetik - der langsamen Phase eine schnelle Phase vorangeht. Indem Rigor-Querbrücken Tropomyosin (TM) in der „on“-Position halten, bleibt cTn auch in Abwesenheit von Ca2+ im angeschalteten Zustand. Die Mg-ATPinduzierte Ablösung der Myosinköpfe von Aktin hingegen ermöglicht TM die Rückkehr in die „off“-Position. Diese Konformationsänderung wird von TM auf cTnT übertragen und hat schließlich das Abschalten des cTn-Komplexes zur Folge. Solzin et al. [54] beobachteten nach dem Mischen von Rigor-cMF mit Mg-ATP eine monophasische Kinetik, die eine ähnliche Ratenkonstante (koff=31 s-1) hatte wie die langsame Phase nach Reduktion der [Ca2+] bei Bestimmung der Abschaltkinetik von inkorporiertem cTn (koff=39 s-1). Dies ist ein Hinweis darauf, dass die langsame Phase der Abschaltkinetik die 2+ Konformationsänderung von cTn und nicht die Ca -Dissoziation von cTnC darstellt. Die Ratenkonstante koff der in dieser Arbeit bestimmten Ca2+-kontrollierten Abschaltkinetik von cTn, welches in cMF inkorporiert wurde, beträgt koff = 33 ± 3 s-1 (n=3), koff der Abschaltkinetik von isoliertem cTn ist koff = 22 ± 5 s-1 (n=3). Wie für die Anschaltkinetik zeigt sich für die Abschaltkinetik, dass die Ratenkonstante bei Inkorporation von cTn in cMF zunimmt. Folgender molekularer Mechanismus kann dem zugrunde liegen: es ist bekannt, dass die 82 Diskussion Assoziation von cTnC Konformationsänderung der mit cTnI die Abschaltkinetik Ratenkonstante gegenüber koff Messungen der mit isoliertem cTnC um den Faktor 10-20 verlangsamt [10]. Das Hinzufügen von cTnT zu cTnI-cTnC veränderte die Kinetik in dieser Studie von Dong et al. nicht weiter. Daher könnte die schnellere Abschaltkinetik bei Inkorporation von cTn durch eine Schwächung der cTnC-cTnI Interaktion durch Bindung von cTnI an Aktin erklärt werden. Die Schwächung der cTnI-cTnC Interaktion könnte zur Folge haben, dass cTn schneller abschalten kann, wodurch die Ratenkonstante koff der Konformationsänderung zunimmt. Hazard et al. [18] haben die Ratenkonstanten der Ca2+-kontrolllierten Abschaltkinetik nach Reduktion der [Ca2+] anhand von isoliertem cTnC vom Huhn bestimmt. Sie konnten zeigen, dass die Ratenkonstante der mittels eines Ca2+-Chelators direkt gemessenen Ca2+-Dissoziation (700-800 s-1 bei 4°C) etwa 3x schneller ist, als die Ratenkonstante der Konformationsänderung (260 s-1 bei 4°C), die anhand von cTnC Cys84-ANS bestimmt wurde. Die von Hazard et al. bestimmte Ratenkonstante der Konformationsänderung ist viel höher als der in dieser Arbeit bestimmte Wert für den isolierten cTn-Komplex (58 s-1 bei 10°C), was bei Hazards Messungen mit isoliertem cTnC wahrscheinlich durch das Fehlen der cTnC-cTnI Interaktion bedingt ist. Die Interaktion dieser beiden Untereinheiten verlangsamt die Kinetik der Konformationsänderung um den Faktor 10-20 [10]. 4.3. Bedeutung der Ca2+-kontrollierten Schaltkinetik von cTn für die Kraftkinetik der cMF Simultane Messungen der Kraft und der intrazellulären [Ca2+] in intakten kardialen Herzmuskeltrabekeln haben gezeigt, dass die Rate des myoplasmatischen Ca2+-Anstiegs bzw. der –Abnahme keinen ratenlimitierenden Einfluss auf die Kraftentwicklung oder Relaxation hat [2, 22]. Bislang ist jedoch nicht bekannt, wie sich die Rate der Ca2+-kontrollierten Schaltkinetik von cTn, welches in cMF inkorporiert wurde, auf den Zeitverlauf der myofibrillären Kontraktion oder Relaxation auswirkt. Prinzipiell könnten zwei Mechanismen ratenlimitierend sein: (1) die Schaltkinetik von cTn oder (2) die Kinetik des Querbrückenzyklus. 83 Diskussion Ratenkonstanten, die für die Querbrückenkinetik bestimmt wurden, lieferten Hinweise darauf, dass die Querbrückenkinetik den Zeitverlauf der Herzmuskelkontraktion und- relaxation determiniert [3, 36, 39, 42, 56]. Daher wurde bislang angenommen, dass die An- und Abschaltkinetik von cTn schnelle Prozesse sind, die keinen ratenlimitierenden Einfluss auf Kontraktion und Relaxation haben. Unsere langsame Phase, von der wir annehmen, dass sie die Ca2+-abhängige Konformationsänderung von cTn darstellt, ist ~ 300x schneller als die Kinetik der Ca2+-induzierten myofibrillären Kraftentwicklung (kACT = 1 s-1) [56]. Selbst die von Bell et al. [3] beschriebene schnelle Phase, die von den Autoren als schnelle Ca2+-Bindung an cTn interpretiert wird oder zumindest als ein Schritt, der damit in engem Zusammenhang steht, ist 20x schneller als die Ca2+induzierte Kraftentwicklung. Beide Studien zeigen, dass die Kinetik der Konformationsänderung von cTn zu schnell ist, um den Zeitverlauf der Kraftentwicklungsraten zu limitieren. Zusätzlich zu der schnellen Phase haben Bell et al. [3] eine sehr langsame Phase mit einer Ratenkonstante von ~ 5 s-1 detektiert, die identisch ist mit der von ihnen simultan gemessenen Rate der Kraftentwicklung. Diese Phase weist darauf hin, dass die Querbrückenbindung das dünne Filament aktivieren kann und zwar über das Niveau der Aktivierung durch Ca2+ hinaus. Bei den Messungen in dieser Arbeit konnte diese Phase nicht beobachtet werden, vermutlich weil die Experimente unter lastfreien Bedingungen stattfanden. Bei der lastfreien Verkürzung der cMF sind nur sehr wenige Querbrücken stark an Aktin gebunden [55]. Aus diesem Grund ist der Beitrag der Querbrücken zur Aktivierung des dünnen Filamentes unter unseren Bedingungen vernachlässigbar, weshalb ein Feedbackmechanismus der Querbrücken unter isometrischen Bedingungen nicht ausgeschlossen werden kann. Die in dieser Arbeit entwickelte Methode hat jedoch den Vorteil, auf diese Weise die intrinsische Rate der Schaltkinetik von cTn, ohne Einfluss der Querbrückenkinetik, bestimmen zu können. Für die Relaxationskinetik der Kraft, die von Solzin et al. bestimmt wurde [54], ergibt sich folgendes Bild: die Verringerung der [Ca2+] induziert eine biphasische Kinetik. Eine langsame lineare Phase mit einer Ratenkonstante kLIN = 0,4 s-1, während der die Sarkomere isometrisch bleiben, geht einer schnellen 84 Diskussion exponentiellen Relaxationsphase mit einer Ratenkonstante kREL = 3,1 s-1 voraus, die durch eine sequentielle Verlängerung einzelner Sarkomere hervorgerufen wird. KLIN ist demnach ~ 80x langsamer, kREL ~ 10x langsamer als die Abschaltkinetik von cTn. Die Korrelation der Abschaltkinetik mit der Kraftabnahme zeigt außerdem, dass das Abschalten von cTn innerhalb der ersten 150 ms der langsamen Phase kLIN stattfindet. Die intrinsische Abschaltkinetik von cTn ist also sehr viel schneller als die Kinetik der Kraftabnahme während der myofibrillären Relaxation und ist für diese unter lastfreien Bedingungen nicht ratenlimitierend. 4.4 Effekt der FHC-assoziierten cTnIR145G-Mutation auf die Ca2+kontrollierte Schaltkinetik von cTn(TnC-Cys84-NBD) Kobayashi et al. zeigten für rekonstituierte dünne Filamente, dass sich z.B. die Ca2+-Affinität bei steady-state Messungen mit FHC-assoziierten cTn-Mutationen im Vergleich zum Wildtyp-cTn verändert [27]. Bei Messungen am isolierten cTn war jedoch kein Effekt der Tn-Mutationen zu erkennen. Daher war es ein Ziel dieser Arbeit, erstmals den Effekt der mit FHC-assoziierten Mutation cTnIR145G auf die Schaltkinetik von cTn, welches in cMF inkorporiert wurde, zu untersuchen. Die cTnTnI R145G -Mutation ist in der inhibitorischen Region von cTnI (Aminosäurereste 137-148) lokalisiert, die für die Inhibition der AktomyosinATPase verantwortlich ist. Sie ist die bislang am intensivsten untersuchte FHCassoziierte Mutation auf dem TnI-Gen (TNNI3). Verschiedene Studien zeigten, dass die Mutation kontraktions- und relaxationsbestimmende Parameter beeinflusst: Messungen mit rekonstituierten Filamenten [13, 27] und gehäuteten Muskelfasern [6, 29, 60] ergaben eine verminderte Inhibition der AktomyosinATPase bei niedrigen [Ca2+], die mit einer Schwächung der cTnI-Aktin Interaktion assoziiert ist. Eine der bedeutendsten funktionellen Störungen, von denen Individuen mit familiärer hypertropher Kardiomyopathie (FHC) betroffen sind, ist die diastolische Dysfunktion. Vor diesem Hintergrund stellt sich die Frage, ob dieser Befund eine direkte Auswirkung einer veränderten Ca2+-kontrollierten Schaltkinetik von cTn darstellt. Kruger et al. [28] beobachteten in Messungen mit murinen cMF, in denen das endogene murine cTn gegen humanes cTnTnI 85 Diskussion R145G ausgetauscht worden war, eine verlangsamte Relaxationskinetik. Die Ratenkonstante kREL der zweiten schnellen exponentiellen Phase der Kraftabnahme verringerte sich im Vergleich zum cTn-WT um ~60-70%. Die Ratenkonstante kLIN der vorangehenden langsamen linearen Phase wurde durch die Mutation nicht signifikant beeinflusst, was jedoch zu erwarten wäre, falls die Abschaltkinetik von cTnTnI R145G einen ratenlimitierenden Einfluss auf die Kinetik der Kraftabnahme hätte. Erste Messungen in dieser Arbeit zeigten, dass die Abschaltkinetik von cTnTnIR145G, welches in cMF inkorporiert wurde, im Vergleich zum cTn-WT um ~20% verlangsamt ist (koff-WT = 33 s-1, koff-TnTnIR145G: 27 s-1). Die verlangsamte Ratenkonstante koff der Abschaltkinetik von cTnTnI R145G ist damit aber immer noch zu schnell, um auf die Kinetik der myofibrillären Kraftabnahme einen direkt ratenlimitierenden Einfluss zu haben. Eine mögliche Folge der cTnTnI R145G-Mutation ist eine gestörte Bindung von TnI an Aktin bei Verringerung der [Ca2+]. Die Destabilisierung des abgeschalteten Zustands führt zu einer verminderten Inhibition kraftgenerierender Querbrücken: durch die verlangsamte Rate des Abschaltens verschiebt sich das on/offGleichgewicht von cTn, was den Querbrücken ermöglicht, sogar bei sehr niedrigen [Ca2+] während der Relaxation erneut an Aktin zu binden und so eine langsamere myofibrilläre Kraftabnahme zur Folge hat. Die verlangsamte Abschaltkinetik hat also einen ratenmodulierenden Einfluss auf die Relaxationskinetik und könnte auf diese Weise ungünstig auf die diastolische Funktion des Herzmuskels wirken. Zusammenfassend zeigt diese erste Einzelmessung am Beispiel der cTnTnI R145G -Mutation, dass die in der vorliegenden Arbeit entwickelte Methode erstmals ermöglicht, Effekte von TnI- Mutationen auf die Ca2+-kontrollierte Schaltkinetik von cTn zu erfassen. 86 Zusammenfassung 5. Zusammenfassung Die Erregungskontraktionskopplung der Herzmuskelzellen ist eine mehrstufige Reaktion, für die folgende Schritte ratenlimitierend sein könnten: 1) Der Ca2+Transient, 2) die Schaltkinetik von cTn oder 3) die Kinetik des Querbrückenzyklus. In dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, die erstmals die Bestimmung der Kinetik der Ca2+-kontrollierten Schaltkinetik von humanem kardialem Troponin (cTn) in der intakten kontraktilen Einheit der Kardiomyofibrille (cMF) ermöglicht. Zudem wurde in einer exemplarischen Messung gezeigt, dass es mit dieser Methode möglich ist, Effekte von FHC-assoziierten Mutationen des TnI auf die Schaltkinetik zu detektieren. Für diese Messungen wurden die drei cTn-Untereinheiten cTnC, cTnI und cTnT separat exprimiert, anschließend gereinigt und zum funktionellen cTn-Komplex rekonstituiert. Es wurde die Kinetik bei verschiedenen Markierungsverfahren untersucht: (i) Markierung aller zugänglichen Cysteine des Tn-Komplexes, (ii) selektive Markierung von TnI bzw. TnC, (iii) Markierung von nur einem Cystein in TnC. Nach der Markierung wurden sie in cMF inkorporiert. Zur Bestimmung der Anschaltkinetik wurden sowohl die so markierten Myofibrillen als auch der isolierte cTn-Komplex mit Hilfe einer Stopped-Flow Apparatur innerhalb von < 2 ms mit unterschiedlichen [Ca2+] oder - um die Rate der Abschaltkinetik zu messen - mit dem Ca2+-Chelator BAPTA gemischt. Mit dieser Methode konnte erstmals gezeigt werden, dass die An- und Abschaltkinetik von cTn durch die strukturelle Umgebung des Sarkomers beeinflusst und deutlich schneller als die des isolierten Komplexes ist. Die Geschwindigkeit und die Amplitude des Fluoreszenzanstiegs während der Ca2+-Aktivierung war abhängig von der [Ca2+] und verlief bei hohen [Ca2+] biphasisch mit einer initialen schnellen Phase, die nicht aufgelöst werden konnte und vermutlich die Ca2+-Bindung widerspiegelt und einer langsamen Phase, die als Ausdruck der Konformationsänderung interpretiert wird. Bei der Bestimmung der Abschaltkinetik fiel die Fluoreszenz nach dem Verringern der [Ca2+] biphasisch ab. Wie bei der Anschaltkinetik konnte die erste schnelle Phase nicht aufgelöst werden und wurde von einer zweiten langsameren Phase gefolgt, die wahrscheinlich die Konformationsänderung 87 Diskussion darstellt. Die so ermittelte Ratenkonstante der Abschaltkinetik ist ~5 mal schneller als die Kinetik der Kontraktion und Relaxation und kann somit nicht ratenlimitierend für den Kraftanstieg bzw. –abfall sein. Mit dieser Methode ist es nun auch möglich, den Einfluss von Mutationen des cTn, wie sie bei der familiären hypertrophen Kardiomyopathie gefunden wurden, auf die Schaltkinetik zu untersuchen. Exemplarische Messungen zeigten, dass die Rate der Abschaltkinetik durch die hcTnTnI welche bei Patienten mit FHC gefunden 88 wurde, R145G -Mutation, verlangsamt wird. Literaturverzeichnis 6. Literaturverzeichnis 1. al-Hillawi, E., S.D. Minchin, and I.P. Trayer, Overexpression of human cardiac troponin-I and troponin-C in Escherichia coli and their purification and characterisation. Two point mutations allow high-level expression of troponin-I. Eur J Biochem, 1994. 225(3): p. 1195-201. 2. Backx, P.H., W.D. Gao, M.D. Azan-Backx, and E. Marban, The relationship between contractile force and intracellular [Ca2+] in intact rat cardiac trabeculae. J Gen Physiol, 1995. 105(1): p. 1-19. 3. Bell, M.G., E.B. Lankford, G.E. Gonye, G.C. Ellis-Davies, D.A. Martyn, M. Regnier, and R.J. Barsotti, Kinetics of cardiac thin-filament activation probed by fluorescence polarization of rhodamine-labeled troponin C in skinned guinea pig trabeculae. Biophys J, 2006. 90(2): p. 531-43. 4. Brenner, B. and J.M. Chalovich, Kinetics of thin filament activation probed by fluorescence of N-((2-(Iodoacetoxy)ethyl)-N-methyl)amino-7nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazole-labeled troponin I incorporated into skinned fibers of rabbit psoas muscle: implications for regulation of muscle contraction. Biophys J, 1999. 77(5): p. 2692-708. 5. Brenner, B., T. Kraft, L.C. Yu, and J.M. Chalovich, Thin filament activation probed by fluorescence of N-((2-(Iodoacetoxy)ethyl)-Nmethyl)amino-7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazole-labeled troponin I incorporated into skinned fibers of rabbit psoas muscle. Biophys J, 1999. 77(5): p. 2677-91. 6. Burton, D., H. Abdulrazzak, A. Knott, K. Elliott, C. Redwood, H. Watkins, S. Marston, and C. Ashley, Two mutations in troponin I that cause hypertrophic cardiomyopathy have contrasting effects on cardiac muscle contractility. Biochem J, 2002. 362(Pt 2): p. 443-51. 7. Davis, J.P., C. Norman, T. Kobayashi, R.J. Solaro, D.R. Swartz, and S.B. Tikunova, Effects of thin and thick filament proteins on calcium binding and exchange with cardiac troponin C. Biophys J, 2007. 92(9): p. 3195-206. 8. Dong, W., S.S. Rosenfeld, C.K. Wang, A.M. Gordon, and H.C. Cheung, Kinetic studies of calcium binding to the regulatory site of troponin C from cardiac muscle. J Biol Chem, 1996a. 271(2): p. 688-94. 9. Dong, W.J., C.K. Wang, A.M. Gordon, and H.C. Cheung, Disparate fluorescence properties of 2-[4'-(iodoacetamido)anilino]-naphthalene-6sulfonic acid attached to Cys-84 and Cys-35 of troponin C in cardiac muscle troponin. Biophys J, 1997a. 72(2 Pt 1): p. 850-7. 89 Literaturverzeichnis 10. Dong, W.J., C.K. Wang, A.M. Gordon, S.S. Rosenfeld, and H.C. Cheung, A kinetic model for the binding of Ca2+ to the regulatory site of troponin from cardiac muscle. J Biol Chem, 1997b. 272(31): p. 19229-35. 11. Dong, W.J., C.K. Wang, A.M. Gordon, S.S. Rosenfeld, and H.C. Cheung, A kinetic model for the binding of Ca2+ to the regulatory site of troponin from cardiac muscle. J Biol Chem, 1997. 272(31): p. 19229-35. 12. Ebashi, S., Third Component Participating in the Superprecipitation of 'Natural Actomyosin'. Nature, 1963. 200: p. 1010. 13. Elliott, K., H. Watkins, and C.S. Redwood, Altered regulatory properties of human cardiac troponin I mutants that cause hypertrophic cardiomyopathy. J Biol Chem, 2000. 275(29): p. 22069-74. 14. Elliott, P. and W.J. McKenna, Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet, 2004. 363(9424): p. 1881-91. 15. Gibson, Q.H., Stopped-Flow Apparatus for the Study of Rapid Reactions. Angewandte Chemie, 1954. 66: p. 719-720. 16. Gordon, A.M., E. Homsher, and M. Regnier, Regulation of contraction in striated muscle. Physiol Rev, 2000. 80(2): p. 853-924. 17. Haselgrove, J.C., X-ray evidence for a conformational change in actincontaining filaments of vertebrate striated muscle. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1972. 37: p. 341-352. 18. Hazard, A.L., S.C. Kohout, N.L. Stricker, J.A. Putkey, and J.J. Falke, The kinetic cycle of cardiac troponin C: calcium binding and dissociation at site II trigger slow conformational rearrangements. Protein Sci, 1998. 7(11): p. 2451-9. 19. Houdusse, A., M.L. Love, R. Dominguez, Z. Grabarek, and C. Cohen, Structures of four Ca2+-bound troponin C at 2.0 A resolution: further insights into the Ca2+-switch in the calmodulin superfamily. Structure, 1997. 5(12): p. 1695-711. 20. Huxley, H.E., Fifty years of muscle and the sliding filament hypothesis. Eur J Biochem, 2004. 271(8): p. 1403-15. 21. Huxley, H.E., Structural changes in actin- and myosin-containing filaments during contraction. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1972. 37: p. 361-76. 22. Janssen, P.M., L.B. Stull, and E. Marban, Myofilament properties comprise the rate-limiting step for cardiac relaxation at body temperature in the rat. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2002. 282(2): p. H499-507. 23. Johnson, J.D., S.C. Charlton, and J.D. Potter, A fluorescence stopped flow analysis of Ca2+ exchange with troponin C. J Biol Chem, 1979. 254(9): p. 3497-502. 90 Literaturverzeichnis 24. Johnson, J.D., R.J. Nakkula, C. Vasulka, and L.B. Smillie, Modulation of Ca2+ exchange with the Ca(2+)-specific regulatory sites of troponin C. J Biol Chem, 1994. 269(12): p. 8919-23. 25. Johnson, K.A., Rapid kinetic analysis of mechanochemical adenosinetriphosphatases. Methods Enzymol, 1986. 134: p. 677-705. 26. Kluwe, L., K. Maeda, and Y. Maeda, E. coli expression and characterization of a mutant troponin I with the three cysteine residues substituted. FEBS Lett, 1993. 323(1-2): p. 83-8. 27. Kobayashi, T. and R.J. Solaro, Increased Ca2+ affinity of cardiac thin filaments reconstituted with cardiomyopathy-related mutant cardiac troponin I. J Biol Chem, 2006. 281(19): p. 13471-7. 28. Kruger, M., S. Zittrich, C. Redwood, N. Blaudeck, J. James, J. Robbins, G. Pfitzer, and R. Stehle, Effects of the mutation R145G in human cardiac troponin I on the kinetics of the contraction-relaxation cycle in isolated cardiac myofibrils. J Physiol, 2005. 564(Pt 2): p. 347-57. 29. Lang, R., A.V. Gomes, J. Zhao, P.R. Housmans, T. Miller, and J.D. Potter, Functional analysis of a troponin I (R145G) mutation associated with familial hypertrophic cardiomyopathy. J Biol Chem, 2002. 277(14): p. 11670-8. 30. Lehman, W., V. Hatch, V. Korman, M. Rosol, L. Thomas, R. Maytum, M.A. Geeves, J.E. Van Eyk, L.S. Tobacman, and R. Craig, Tropomyosin and actin isoforms modulate the localization of tropomyosin strands on actin filaments. J Mol Biol, 2000. 302(3): p. 593-606. 31. Li, M.X., L. Spyracopoulos, and B.D. Sykes, Binding of cardiac troponin-I147-163 induces a structural opening in human cardiac troponin-C. Biochemistry, 1999. 38(26): p. 8289-98. 32. Lompre, A.M., J.J. Mercadier, C. Wisnewsky, P. Bouveret, C. Pantaloni, A. d’Albis, and K. Schwartz, Species- and age-dependent changes in the relative amounts of cardiac myosin isoenzymes in mammals. Developmental Biology, 1981(84): p. 286—290. 33. Maron, B.J., J.M. Gardin, J.M. Flack, S.S. Gidding, T.T. Kurosaki, and D.E. Bild, Prevalence of hypertrophic cardiomyopathy in a general population of young adults. Echocardiographic analysis of 4111 subjects in the CARDIA Study. Coronary Artery Risk Development in (Young) Adults. Circulation, 1995. 92(4): p. 785-9. 34. Maron, B.J., I. Olivotto, P. Spirito, S.A. Casey, P. Bellone, T.E. Gohman, K.J. Graham, D.A. Burton, and F. Cecchi, Epidemiology of hypertrophic cardiomyopathy-related death: revisited in a large nonreferral-based patient population. Circulation, 2000. 102(8): p. 858-64. 35. Maron, B.J., J. Shirani, L.C. Poliac, R. Mathenge, W.C. Roberts, and F.O. Mueller, Sudden death in young competitive athletes. Clinical, demographic, and pathological profiles. Jama, 1996. 276(3): p. 199-204. 91 Literaturverzeichnis 36. Martin, H., M.G. Bell, G.C. Ellis-Davies, and R.J. Barsotti, Activation kinetics of skinned cardiac muscle by laser photolysis of nitrophenylEGTA. Biophys J, 2004. 86(2): p. 978-90. 37. McKillop, D.F. and M.A. Geeves, Regulation of the interaction between actin and myosin subfragment 1: evidence for three states of the thin filament. Biophys J, 1993. 65(2): p. 693-701. 38. Neulen, A., N. Blaudeck, S. Zittrich, D. Metzler, G. Pfitzer, and R. Stehle, Mn2+-dependent protein phosphatase 1 enhances protein kinase A-induced Ca2+ desensitisation in skinned murine myocardium. Cardiovasc Res, 2007. 74(1): p. 124-32. 39. Palmer, S. and J.C. Kentish, Roles of Ca2+ and crossbridge kinetics in determining the maximum rates of Ca2+ activation and relaxation in rat and guinea pig skinned trabeculae. Circ Res, 1998. 83(2): p. 179-86. 40. Pan, B.S. and R.J. Solaro, Calcium-binding properties of troponin C in detergent-skinned heart muscle fibers. J Biol Chem, 1987. 262(16): p. 7839-49. 41. Parry, D.A. and J.M. Squire, Structural role of tropomyosin in muscle regulation: analysis of the x-ray diffraction patterns from relaxed and contracting muscles. J Mol Biol, 1973. 75(1): p. 33-55. 42. Piroddi, N., A. Belus, B. Scellini, C. Tesi, G. Giunti, E. Cerbai, A. Mugelli, and C. Poggesi, Tension generation and relaxation in single myofibrils from human atrial and ventricular myocardium. Pflugers Arch, 2007. 454(1): p. 63-73. 43. Poggesi, C., C. Tesi, and R. Stehle, Sarcomeric determinants of striated muscle relaxation kinetics. Pflugers Arch, 2005. 449(6): p. 50517. 44. Potter, J.D., Preparation of troponin and its subunits. Methods Enzymol, 1982. 85 Pt B: p. 241-63. 45. Potter, J.D. and J. Gergely, The calcium and magnesium binding sites on troponin and their role in the regulation of myofibrillar adenosine triphosphatase. J Biol Chem, 1975. 250(12): p. 4628-33. 46. Putkey, J.A., W. Liu, X. Lin, S. Ahmed, M. Zhang, J.D. Potter, and W.G. Kerrick, Fluorescent probes attached to Cys 35 or Cys 84 in cardiac troponin C are differentially sensitive to Ca(2+)-dependent events in vitro and in situ. Biochemistry, 1997. 36(4): p. 970-8. 47. Robinson, J.M., W.J. Dong, J. Xing, and H.C. Cheung, Switching of troponin I: Ca(2+) and myosin-induced activation of heart muscle. J Mol Biol, 2004. 340(2): p. 295-305. 48. Rosenfeld, S.S. and E.W. Taylor, Kinetic studies of calcium and magnesium binding to troponin C. J Biol Chem, 1985. 260(1): p. 242-51. 92 Literaturverzeichnis 49. Rosenfeld, S.S. and E.W. Taylor, Kinetic studies of calcium binding to regulatory complexes from skeletal muscle. J Biol Chem, 1985. 260(1): p. 252-61. 50. Seidman, J.G. and C. Seidman, The genetic basis for cardiomyopathy: from mutation identification to mechanistic paradigms. Cell, 2001. 104(4): p. 557-67. 51. She, M., D. Trimble, L.C. Yu, and J.M. Chalovich, Factors contributing to troponin exchange in myofibrils and in solution. J Muscle Res Cell Motil, 2000. 21(8): p. 737-45. 52. Shirani, J., R. Pick, W.C. Roberts, and B.J. Maron, Morphology and significance of the left ventricular collagen network in young patients with hypertrophic cardiomyopathy and sudden cardiac death. J Am Coll Cardiol, 2000. 35(1): p. 36-44. 53. Sia, S.K., M.X. Li, L. Spyracopoulos, S.M. Gagne, W. Liu, J.A. Putkey, and B.D. Sykes, Structure of cardiac muscle troponin C unexpectedly reveals a closed regulatory domain. J Biol Chem, 1997. 272(29): p. 18216-21. 54. Solzin, J., B. Iorga, E. Sierakowski, D.P. Gomez Alcazar, D.F. Ruess, T. Kubacki, S. Zittrich, N. Blaudeck, G. Pfitzer, and R. Stehle, Kinetic mechanism of the Ca2+-dependent switch-on and switch-off of cardiac troponin in myofibrils. Biophys J, 2007. 93(11): p. 3917-31. 55. Stehle, R. and B. Brenner, Cross-bridge attachment during high-speed active shortening of skinned fibers of the rabbit psoas muscle: implications for cross-bridge action during maximum velocity of filament sliding. Biophys J, 2000a. 78(3): p. 1458-73. 56. Stehle, R., M. Kruger, and G. Pfitzer, Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid ca(2+) changes. Biophys J, 2002b. 83(4): p. 2152-61. 57. Stehle, R., M. Kruger, P. Scherer, K. Brixius, R.H. Schwinger, and G. Pfitzer, Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level. Basic Res Cardiol, 2002a. 97 Suppl 1: p. I127-35. 58. Strasburg, G.M., P.C. Leavis, and J. Gergely, Troponin-C-mediated calcium-sensitive changes in the conformation of troponin I detected by pyrene excimer fluorescence. J Biol Chem, 1985. 260(1): p. 366-70. 59. Sutoh, K. and W.F. Harrington, Cross-linking of myosin thick filaments under activating and rigor conditions. A study of the radial disposition of cross-bridges. Biochemistry, 1977. 16(11): p. 2441-9. 60. Takahashi-Yanaga, F., S. Morimoto, K. Harada, R. Minakami, F. Shiraishi, M. Ohta, Q.W. Lu, T. Sasaguri, and I. Ohtsuki, Functional consequences of the mutations in human cardiac troponin I gene found 93 Literaturverzeichnis in familial hypertrophic cardiomyopathy. J Mol Cell Cardiol, 2001. 33(12): p. 2095-107. 61. Takeda, S. and Y. Maeda, [Crystal structure of the core domain of troponin and the mechanism of muscle regulation]. Seikagaku, 2003. 75(12): p. 1540-5. 62. Vibert, P., R. Craig, and W. Lehman, Steric-model for activation of muscle thin filaments. J Mol Biol, 1997. 266(1): p. 8-14. 94 Erklärung zur Vorabveröffentlichung von Ergebnissen 7. Erklärung Ergebnissen zur Vorabveröffentlichung von Solzin, J., Iorga, B., Sierakowski, E., Gomez Alcazar, D. P., Ruess, D. F., Kubacki, T., Zittrich, S., Blaudeck, N., Pfitzer, G., Stehle, R. (2007) “Kinetic mechanism of the Ca2+-dependent switch-on and switch-off of cardiac troponin in myofibrils.” Biophys J 93, 3917-31 95 Lebenslauf 8. Lebenslauf Mein Lebenslauf wird aus Gründen des Datenschutzes in der elektronischen Fassung meiner Arbeit nicht veröffentlicht. 96
