Plasmaspiegel angiogener Faktoren zur

Aus der Universitäts-Augenklinik und der Universitäts-Kinderklinik der Albert-LudwigsUniversität Freiburg im Breisgau
Plasmaspiegel angiogener Faktoren zur
Risikoabschätzung der
Frühgeborenenretinopathie
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
Vorgelegt 2008
von Christiane Sophie Buschbeck
geboren in Stuttgart
1
Dekan
Prof. Dr. med. Christoph Peters
1. Gutachter
Prof. Dr. med. W. Lagrèze
2. Gutachter
PD Dr. med. M. Krüger
Jahr der Promotion
2008
2
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung
S. 4
1. Einleitung
- Physiologie des Gefäßwachstums
- Frühgeborenenretinopathie
- Epidemiologie
- Klassifikation der Frühgeborenenretinopathie
- Indikation zur Behandlung
- Prävention
- Beschreibung der Studie
S. 5
S. 5
S. 9
S. 10
S. 12
S. 15
S. 18
S. 18
2. Angiogene Faktoren
S. 20
- VEGF
- VEGF-Rezeptoren
- Tie-2
- E-Selectin
S. 20
S. 22
S. 23
S. 26
3. Material und Methoden
S. 27
4. Ergebnisse
S. 32
- Absolutwerte im Plasma
- Absolutwerte im Serum
- Mediane pro Woche Gestationsalter
- Mediane pro Woche Lebensalter
- Auswertung mit Kernel smoothing
- Statistische Auswertung
- Klinische Parameter
S. 33
S. 37
S. 39
S. 40
S. 41
S. 44
S. 46
5. Diskussion
S. 51
- Schlussfolgerung
S. 55
6. Quellenverzeichnis
S. 56
7. Danksagung
S. 61
8. Lebenslauf
S. 62
3
Zusammenfassung
Die Frühgeborenenretinopathie (ROP) ist eine der häufigsten Ursachen von Sehstörungen und
Blindheit im Säuglings- und Kleinkindesalter65. Bisher werden Frühgeborene, die vor der 32.
SSW geboren wurden beziehungsweise unter 1500g Geburtsgewicht haben, regelmäßig
untersucht. Liegt ein fortgeschrittenes Stadium der ROP vor, wird die periphere, avaskuläre
Netzhaut in Laserkoagulation verödet.
In der vorliegenden Studie wurden angiogene Faktoren in Plasma und Serum bestimmt und
mit dem klinischen Verlauf der Frühgeborenenretinopathie korreliert. Untersucht werden
sollte, ob eine Veränderung der Konzentrationen angiogener Faktoren nachweisbar ist, bevor
eine unkontrollierte Neovaskularisation sichtbar wird. Dadurch sollte die frühzeitige
Entscheidung zur Laser-Behandlung erleichtert und eine höhere Erfolgschance erzielt werden.
Testverfahren zur Messung von EDTA-Plasma- und Serumkonzentrationen von löslichem
VEFG (soluble (s) VEGF), löslichen VEGF-Rezeptoren (sVEGFR-1 und sVEGFR-2),
löslichem Angiopoietin-Rezeptor (sTie-2) und löslichem E-Selectin (sE-Selectin) wurden von
der Klinik für Tumorbiologie zur Verfügung gestellt.
Parallel zu den Untersuchungen über die Faktoren wurden auch klinische Daten über
Risikofaktoren für eine ROP erfasst.
Von 63 untersuchten Kindern hatten 42 keine ROP. 21 Kinder entwickelten eine ROP (1 Kind
Stadium 1, 10 Kinder Stadium 2, 10 Kinder Stadium 3, davon 4 gelasert).
Die Auswertung erfolgte mit der Methode des Kernel smoothing. Des Weiteren wurde eine
Subgruppenanalyse durchgeführt, in der die Werte der 32. Gestationswoche mit denen der 36.
Gestationswoche verglichen wurden.
Die Kinder mit ROP hatten im Vergleich zu den Kindern ohne ROP erhöhte Werte für
sVEGFR-2, sTie-2 und sE-Selectin. VEGFR-1 und VEGF waren annähernd gleich in beiden
Gruppen. Die Subgruppenanalyse ergab unabhängig vom Vorliegen einer ROP einen Anstieg
über die Zeit für Tie-2 (p=0,06). Im zeitlichen Verlauf ergab sich ein Unterschied für ESelectin zwischen den beiden Gruppen (p=0,03).
Nach unserem Wissensstand ist unsere Studie die erste, bei der angiogene Faktoren im Blut
von Frühgeborenen über einen längeren Zeitraum bestimmt wurden. Wir vermuten einen
Zusammenhang zwischen der Entwicklung einer ROP und erhöhten Spiegeln von sVEGFR-2,
sTie-2 und sE-Selectin. Eine weitere prospektive Studie wird aber nötig sein, um tatsächlich
eine prädiktive Bedeutung dieser Faktoren bestätigen zu können.
4
1. Einleitung
Physiologie des Gefäßwachstums
Vaskulogenese und Angiogenese
Die Bildung von Blutgefäßen läuft in zwei Stufen ab. Zuerst entsteht ein primitives Gefäßnetz
aus multipotenten mesenchymalen Vorläuferzellen während der Embryonalzeit. Dieser
Vorgang wird als Vaskulogenese bezeichnet und ist verantwortlich für die Bildung der
großen Gefäße und der Gefäße, die dem Endoderm entstammen. Aus den bereits
existierenden Gefäßen (sowohl beim Embryo als auch beim Erwachsenen) entstehen kapilläre
Aussprossungen, die zu neuen Gefäßen werden. Dies wird als Angiogenese bezeichnet. Sie
ist sowohl beim Embryo (Vaskularisation von ZNS und Nieren) als auch beim Erwachsenen
(z.B. Wundheilung, Menstruationszyklus) wichtig27,21.
In beiden Prozessen spielen Endothelzellen eine zentrale Rolle. Sie wandern, proliferieren und
schließen sich dann zu Schläuchen mit dichten Zellverbindungen zusammen, die Blut
enthalten. Periendotheliale Helferzellen werden zur Unterstützung hinzugezogen. Diese
Helferzellen sind in den kleinen Kapillaren Perizyten, in den größeren Gefäßen glatte
Muskelzellen und im Herzmuskel Herzmuskelzellen.
Die Bildung und Veränderung von Blutgefäßen wird mit Hilfe von Botenstoffen kontrolliert,
von denen viele an transmembranöse Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) binden und sie
verändern. Die meisten RTKs sind auf ähnliche Weise in die intrazelluläre
Signaltransduktionskaskade eingebunden und sind imstande, Zellproliferation zu induzieren21.
Abgesehen von den temporalen und peripheren Regionen ist die Vaskulogenese in der Retina
verantwortlich für die frühe Gefäßentwicklung des inneren Plexus. Sie geht von der Papille
aus und sorgt für die ersten Gefäßbildungen in den inneren Schichten. Danach entstehen
durch den Vorgang der Angiogenese weitere Gefäße in Richtung der äußeren Schichten. Im
Gegensatz zur Angiogenese ist die Vaskulogenese vom O2 -Bedarf unabhängig.
5
Abb. 1 Regulation von Gefäßentstehung, Erhaltung und Umgestaltung durch Rezeptortyrosinkinasen und ihre Liganden modifiziert nach21
Normale Entwicklung der retinalen Gefäße
Die normale Vaskularisation der Retina beginnt im vierten Schwangerschaftsmonat im
Sehnerv und ist um die 38. bis 40. Schwangerschaftswoche (SSW) abgeschlossen. Vor der 14.
SSW wird die Retina ausschließlich über die Aderhaut (Chorioidea) versorgt. Ab der 14.
SSW breiten sich vom Sehnervenkopf (Papille) ausgehend undifferenzierte mesodermale
Zellen (Spindelzellen) auf der inneren Netzhautoberfläche aus. Die Spindelzellen
differenzieren später zu Gefäßendothel aus und formen Zellstränge und Lumina, die ein
Synzytium aus einfachen Kapillaren bilden. Da der Sehnervenkopf nasal des
Netzhautzentrums, der späteren Makula, liegt, erreicht die Spindelzellfront zuerst den nasalen
Netzhautrand (um die 32. SSW). Der temporale Rand wird erst zum normalen Geburtstermin
erreicht (38.-40. SSW)65,76.
Die zeitgerechte normale Ausbildung des retinalen Kreislaufs ist wichtig, da die Netzhaut in
utero an Dicke zunimmt und ab einem gewissen Zeitpunkt die Sauerstoffversorgung der
inneren Netzhautschichten durch Diffusion aus dem Aderhautkreislauf nicht mehr
6
gewährleistet ist. Migration und Differenzierung der Spindelzellen werden hauptsächlich
durch den vascular endothelial growth factor (VEGF) gesteuert. VEGF wird von retinaler
Glia bei Hypoxie freigesetzt. Es besteht ein Regelkreis: VEGF fördert das Gefäßwachstum,
das Sauerstoffangebot steigt, und VEGF sinkt. Dieser Regelkreis ermöglicht ein geordnetes
Wachstum der Gefäße, solange die einzelnen Faktoren sich graduell ändern und die
Spindelzellen intakt bleiben.
Abb.2: Wechselwirkungen zwischen Sauerstoffangebot und VEGF-Expression
Pathologisches Gefäßwachstum und Frühgeborenenretinopathie (retinopathy of prematurity,
ROP)
Die Frühgeburt stellt einen Eingriff in den oben genannten Regelkreis O2/VEGF dar. Mit
Einsetzen der Lungenatmung und Verschluss der fetalen Shunts steigt der
Sauerstoffpartialdruck (PO2) im arteriellen Blut steil an. Für die Netzhaut eines
Termingeborenen ist das unproblematisch, denn die Ausbildung des retinalen Kreislaufs ist
bereits abgeschlossen. Beim Frühgeborenen hingegen erhöht sich der Sauerstoffpartialdruck,
bevor die Vaskularisationsfront den Netzhautrand erreicht hat. In dieser vulnerablen Phase
kann sich nun eine Frühgeborenenretinopathie (retinopathy of prematurity, ROP) entwickeln.
Der erhöhte PO2 lässt zum einen die geregelte Vaskularisation komplett sistieren, zum
anderen bringt er eine erhöhte Anzahl von Sauerstoffradikalen mit sich. Diese schädigen die
Spindelzellen44, die dadurch ihre Fähigkeit zur Migration verlieren. Elektronenmikroskopisch
sieht man, dass sie untereinander Gap junctions ausbilden45. Zunächst steht der Netzhaut im
noch nicht vaskularisierten Randbereich ausreichend Sauerstoff über die Aderhaut zur
Verfügung. In den Wochen nach der Geburt jedoch wird die Netzhaut im Rahmen ihrer
neuronalen Ausdifferenzierung dicker. Sauerstoffumsatz und Diffusionsstrecke nehmen
entsprechend zu, und es entsteht eine Hypoxie der inneren Netzhautschichten. Diese Hypoxie
7
ist circa 6 Wochen nach Frühgeburt so ausgeprägt, dass die VEGF-Produktion wieder
zunimmt. Als Antwort darauf kommt es zu einer überschießenden Angiogenese, die von der
Vaskularisationsfront ausgeht44. Die Gefäße wachsen in dieser zweiten Phase der Erkrankung
nicht auf der Netzhautoberfläche weiter, sondern in den Glaskörper hinein. Die neuen,
pathologischen Gefäße haben großenteils Shuntcharakter, wodurch sich der Blutfluss im
retinalen Kreislauf erhöht16. Morphologisches Korrelat dieser Flusssteigerung sind dilatierte,
geschlängelte Gefäße (Tortuositas vasorum) am gesamten Fundus, was als „plus disease“
(siehe unten) bezeichnet wird. Ferner scheint VEGF eine direkt vasodilatative Wirkung zu
haben.
Myofibroblasten, welche die neuen Gefäße begleiten15, können sich kontrahieren und so die
Netzhaut von ihrer Unterlage abziehen. Diese Ablösung wird weiter dadurch verstärkt, dass
das Auge noch wächst und die durch Myofibroblasten fixierte Netzhaut diesem Wachstum
nicht folgen kann.
Neuerdings wird die Rolle eines weiteren Wachstumsfaktors, des IGF 1 (insulin-like growth
factor 1), diskutiert24. Im Gegensatz zur normalen Entwicklung in utero haben Frühgeborene
oft einen IGF1-Mangel. Steigt der IGF-1-Spiegel nach der Geburt nicht schnell genug an (es
wird ein Schwellenwert von 30 ng/ml genannt), so begünstigt dies die Entstehung einer ROP
(im Mittel dauerte es bei den Kindern mit ROP 58 Tage bis zum Erreichen von 30 ng/ml).
Kinder, bei denen früh (im Mittel nach 19 Tagen) IGF-1-Spiegel von 30 ng/ml oder mehr im
Serum gemessen wurden, entwickelten keine ROP. Die Werte in der 34. Woche
Gestationsalter (der Zeitpunkt, zu dem am häufigsten eine ROP auftritt) lagen bei den
Kindern mit ROP im Mittel bei 25 ng/ml und bei den Kindern ohne ROP bei 43 ng/ml. Dies
deutet darauf hin, dass der anfängliche Mangel die VEGF-Produktion anregt und der spätere
Überschuss eine bestehende Neovaskularisation unterhält. Der Serum-IGF-1-Spiegel könnte
daher bei Frühgeborenen die Entwicklung einer ROP voraussagen und eine frühe Substitution
von IGF-1 bis zum Erreichen normaler Spiegel die Krankheit verhindern24.
Zusammenfassend ist die Hauptursache der ROP weniger eine zusätzliche postpartale
Sauerstoffgabe, sondern vielmehr der physiologische Sauerstoffanstieg bei der Geburt, der
manchmal durch eine zusätzliche Gabe von Sauerstoff unterstützt werden muss, damit das
Kind überlebt76.
8
Frühgeborenenretinopathie
Die Frühgeborenenretinopathie wurde erstmals 1942 von Terry82 als retrolentale Fibroplasie
beschrieben. Die retrolentale Fibroplasie entspricht dem am weitesten fortgeschrittenen
Stadium der Frühgeborenenretinopathie mit kompletter Ablösung der Netzhaut und ihrer
Verklebung hinter der Augenlinse.
In den 40er Jahren war es üblich, Frühgeborenen reichlich Sauerstoff (O2) zu geben, da dies
die Überlebenschancen steigerte. Ein Zusammenhang zwischen Sauerstoffgabe und ROP
wurde 1951 von Campbell et al9 erkannt. In den 40er und 50er Jahren war die ROP die
Hauptursache für Blindheit bei amerikanischen Kindern und auch in vielen europäischen
Ländern65.
In einer umfassenden Studie von Kinsey et al. 195641 wurde gezeigt, dass die Dauer der
Sauerstoffexposition einen wesentlichen Faktor zur Entstehung und Ausprägung einer ROP
darstellt. Die Höhe der Sauerstoffkonzentration hatte keinen Einfluss auf die Ausbildung und
den Schweregrad einer ROP. Alle Sauerstoffkonzentrationen, die die der Raumluft
überstiegen, waren mit einer erhöhten ROP-Inzidenz assoziiert. In der Folgezeit wurde die
Sauerstoffzufuhr stark eingeschränkt und die ROP-Rate dadurch gesenkt, was allerdings
aufgrund der geringeren Sauerstoffkonzentrationen zu einem Anstieg der Todesfälle und
neurologischen Schäden bei den Frühgeborenen führte55.
Dies führte zu einer erneuten großzügigen Sauerstoffgabe und in der Folge zum
Wiederanstieg der ROP-Inzidenz, welche bis heute nicht wesentlich gesunken ist. Dafür ist
allerdings auch die Tatsache verantwortlich, dass immer jüngere und leichtere Kinder
überleben.
Seit den 60er Jahren werden der Sauerstoffpartialdruck (PO2) im Blut sowie der
Augenhintergrund intensiver kontrolliert, doch die Hoffnung, dadurch die Rate von ROP zu
senken, wurde nicht erfüllt. Mitte der 70er Jahre versuchte man im Harvard Joint Program in
Neonatology vergeblich, den PO2 mit der Entwicklung der ROP zu korrelieren. Einzig die
Zeit, die die Kinder unter Sauerstoffzufuhr verbrachten, war entscheidend. Weder die Menge
noch Schwankungen in der Gabe schienen einen Einfluss auf die Krankheit zu haben. Den
größten Einfluss hatten geringes Geburtsgewicht und niedriges Gestationsalter65.
9
Epidemiologie
Inzidenz
Bei den meisten Frühgeborenen (ca. 85%) entwickeln sich die Blutgefäße auch nach der
Geburt normal weiter13,37,67. Die Inzidenz einer akuten ROP bei Risikokindern, d.h. bei denen
einer oder mehrere der unten genannten Risikofaktoren vorliegen, liegt bei 10-16%.
1988 lag die Inzidenz einer ROP (aller Schweregrade) bei Kindern mit einem Geburtsgewicht
zwischen 500g und 750g bei nahezu 100% (davon 30% schwer), bei Kindern mit einem
Geburtsgewicht zwischen 750g und 1000g bei fast 80% (davon 10% schwer)44! Nach neueren
Angaben ist die ROP-Inzidenz im Verhältnis zum Geburtsgewicht leicht gesunken und liegt
bei Kindern unter 750g bei ca. 90%, bei Kindern unter 1000g bei ca. 70%47. Insgesamt ist die
Inzidenz jedoch relativ gleich geblieben. Dies ist dadurch zu erklären, dass heute dank der
modernen neonatologischen Intensivmedizin viel jüngere und leichtere Frühgeborene
überleben als noch vor wenigen Jahrzehnten.
Gesicherte Risikofaktoren sind:
•
geringes Gestationsalter
•
geringes Geburtsgewicht
•
Dauer einer Sauerstoffgabe mit einem resultierenden PO2 > 89 mmHg
•
respiratorische Insuffizienz
•
Sepsis
Teixeira et al. untersuchten in ihrer Studie 135 Frühgeborene mit einem Gestationsalter von
32 Wochen und fanden hinsichtlich Gestationsalter, Geburtsgewicht und Apgarindex nach 5
Minuten signifikant niedrigere Werte bei Kindern mit ROP. Hinsichtlich der Surfactantgabe,
Apnoe-Bradykardie-Episoden, Tagen mit Sauerstoff, Beatmungstagen, Zahl der
Bluttransfusionen, Sepsisepisoden, systemischen Candidainfektionen und
Indomethazintherapie lagen die Zahlen bei den Kindern mit ROP deutlich über denen von
augengesunden Kontrollkindern. Nur das Geburtsgewicht und die Anzahl der Tage mit O2
bestätigten sich als unabhängige Variablen in der Multivarianzanalyse81.
10
Außer diesen Einflussfaktoren werden folgende Komponenten mit der Entstehung einer ROP
in Verbindung gebracht:
•
Hypoxie, auch in Abwechslung mit Hyperoxie
•
Bluttransfusionen
•
intraventrikuläre Blutungen
•
Apgar (Index, der Aussehen, Puls, Grimassieren beim Absaugen, Aktivität und
Respiration beurteilt) nach 5 Minuten
•
Surfactantgabe
•
systemische Candida-Infektionen
•
Indomethazin-Gebrauch
•
Apnoe- und Bradykardieepisoden
•
Hyper- und Hypokarbie
•
persistierender Ductus arteriosus
•
Prostaglandinverschiebungen
•
Azidose
•
Xanthingabe
•
bronchopulmonale Dysplasie
•
Anämie
•
Pneumothorax
•
perinatale Asphyxie
•
lange parenterale Ernährung.
Da aber all diese Faktoren auch darauf hindeuten, dass das Frühgeborene insgesamt sehr
krank ist, ist es schwierig, eine direkte Beziehung zwischen einer ROP und einzelnen
Faktoren darzustellen. Vielmehr spiegeln diese Faktoren den allgemeinen Krankheitszustand
des Frühgeborenen wider65. Kurz: Je unreifer das Frühgeborene, desto wahrscheinlicher und
schwerer die ROP64.
Prävalenz
In der Universitätskinderklinik Freiburg haben in den Jahren 1997 bis 2000 3 von 4 Kindern
mit einem Geburtsgewicht unter 500g eine ROP entwickelt (75%). Von 25 Kindern mit einem
11
Geburtsgewicht unter 750g bekamen 12 eine ROP (48%), von 65 Kindern unter 1000g
bekamen 19 eine ROP (29%), von 135 Kindern unter 1500g bekamen 26 eine ROP (19%)47.
Klassifikation der Frühgeborenenretinopathie
Um Studienergebnisse besser vergleichen und Therapieindikationen erarbeiten zu können,
wurde 1984 eine internationale Klassifikation der ROP veröffentlicht83. Die Klassifikation
umfasst 3 Kriterien:
-
Stadium der Erkrankung
-
Morphologie der retinalen Blutgefäße („ plus disease“)
-
betroffenes Netzhautareal.
Stadien
Es werden 5 Stadien unterschieden:
-
Stadium 1 liegt vor, wenn sich zwischen vaskularisierter und nicht vaskularisierter
Netzhaut eine Linie gebildet hat, die histologisch der Anhäufung von Spindelzellen
entspricht. Liegt keine Linie vor, so dokumentiert der Augenarzt „unreife Netzhaut
ohne ROP“.
-
In Stadium 2 hat sich die Linie zu einer Leiste verdickt.
-
In Stadium 3 sind auf der Leiste Neovaskularisationen sichtbar, die in den Glaskörper
einwachsen (extraretinale Vaskularisation).
-
In Stadium 4 ist die Netzhaut durch Zug der Blutgefäß-Myofibroblasten-Komplexe
teilweise abgelöst.
-
In Stadium 5 ist die Netzhaut komplett abgelöst.
Plus disease
Die Plus disease ist durch vermehrte Blutfülle und somit durch eine Dilatation der Gefäße
sowie durch einen geschlängelten Verlauf der retinalen Gefäße (Tortuositas vasorum)
gekennzeichnet.
12
Ebenfalls als plus disease werden Irisgefäßerweiterungen, Rigidität der Pupille (schlechte
Erweiterbarkeit) und Glaskörpertrübungen beziehungsweise Glaskörpereinblutungen
gewertet. Eine Plus disease kann ab Stadium 2 vorkommen und ist ein Warnsignal für eine
rasche Verschlechterung.
Das betroffene Netzhautareal
Die dritte zu dokumentierende Kategorie ist die Zone. Sie gibt Auskunft darüber, wie weit die
Vaskularisationsfront, an der sich die krankhaften Veränderungen zeigen, vorgedrungen ist.
Die Zonen sind gedachte konzentrische Kreise um den Sehnervenkopf, welcher der
Ausgangspunkt der Vaskularisation ist (siehe Abbildung 3). Zone I liegt zentral, ihr Radius
beträgt die zweifache Strecke zwischen Papille und Fovea. Peripher schließt sich Zone II an;
sie reicht bis an den nasalen Netzhautrand. Die anderen Netzhautränder sind in Zone II nicht
eingeschlossen, da die Papille nasal gelegen ist und die Vaskularisationsfront deshalb zuerst
den nasalen Rand erreicht. Es verbleibt ein temporaler sichelförmiger Bereich, die Zone III.
Am ungünstigsten ist eine ROP in Zone I. Eine ROP in Zone III ist in der Regel nicht
therapiebedürftig.
Abgesehen von den oben genannten 3 Hauptkriterien sollten folgende ROP-assoziierten
Nebenbefunde beachtet und dokumentiert werden:
-
Tunica vasculorum lentis (embryonales Gefäßhäutchen auf der Linse)
und
-
Rubeosis iridis (Neovaskularisationen auf der Irisvorderfläche)
13
Abb.3: Untersuchungsbogen der Augenklinik
14
Untersuchung
Die Netzhautbetrachtung erfolgt nach dem Weittropfen transpupillär mittels indirekter
Ophthalmoskopie, das heißt mit einer speziellen Pluslinse (meist 20 dpt), die vor das
Patientenauge gehalten wird, und einer Lichtquelle vor dem Untersucherauge, deren
Strahlengang koaxial mit der Beobachtungsblickrichtung verläuft. Zur Führung des Auges
und zur besseren Darstellung der peripheren Netzhautabschnitte wird die Netzhaut mit einem
speziellen Instrument eingedellt76.
Im Rahmen des ROP-Screenings werden Kinder, die vor der 32. Schwangerschaftswoche
geboren wurden und deren Geburtsgewicht unter 1500g liegt, ab der 5. Lebenswoche, nicht
jedoch vor einem postmenstruellen Alter von 31 Wochen, wöchentlich untersucht. Kinder mit
einem höheren postmenstruellen Alter bei Geburt werden dann gescreent, wenn sie mehr als 3
Tage Sauerstoff erhalten haben.
Liegt ein Stadium 3 vor, wird häufiger als wöchentlich, bei Stadium 1 in Zone II oder bei
Erreichen von Zone III nur noch zweiwöchentlich untersucht.
Bei einem deutlichen Rückgang der ROP, kompletter Retinavaskularisation sowie bei einem
postmenstruellen Alter von 45 Wochen wird das Screening beendet.
Indikation zur Behandlung
1988 wurde die CRYO-ROP-Studie10 durchgeführt, in deren Rahmen dann eine periphere
Netzhautvereisung (Kryotherapie) vorgenommen wurde, wenn die augenärztlichen
Untersuchungen ein Risiko von ca. 50% für eine Netzhautablösung ergaben. Dieser
Schweregrad wurde als „threshold“ (Schwelle) für die Behandlung der ROP bezeichnet und
wurde durch Proliferationen in mindestens 5 zusammenhängenden oder 8 nicht
zusammenhängenden Uhrzeiten von Stadium 3 in Zone 1 oder 2 in Anwesenheit von Plus
disease definiert. Eine Konsequenz dieser frühzeitigen Behandlung war die Zunahme von
operativen Eingriffen auch bei den Augen, bei denen sich die ROP eventuell spontan wieder
zurückgebildete hätte. Dies führte dazu, dass man versuchte, Auswahlkriterien für die
Behandlung nur der Augen zu finden, die das höchste Risiko für die Entwicklung einer
threshold-ROP oder für einen Verlust des Sehvermögens hatten.
15
Threshold ROP
Prethreshold ROP
Mindestens 5 zusammenhängende oder
- Zone I, jede ROP weniger als threshold
8 nicht zusammenhängende Abschnitte
- Zone II, Stadium 2 mit Plus disease
von Stadium 3 in Zone 1 oder 2 mit Plus
- Zone II, Stadium 3 ohne Plus disease
disease
- Zone II, Stadium 3 mit Plus disease, aber
weniger als 5 zusammenhängende oder 8
einzelne Läsionen.
In der ETROP-Studie von 199920 wurden Kinder, die eine prethreshold ROP entwickelten,
oder bei denen RM-ROP, ein Risikoanalyseprogramm, basierend auf natürlichen
Geschichtsdaten der CRYO-ROP-Studie, ein hohes Risiko für eine ungünstige Entwicklung
zeigte, zufällig in 2 Gruppen geteilt und verschieden behandelt: frühe periphere
Netzhautkoagulation oder konventionelle Behandlung.
Die Kinder mit Hochrisiko-prethreshold ROP profitierten hinsichtlich des Sehvermögens von
einer frühen Behandlung, verglichen mit den Kindern mit konventioneller Behandlung.
Allerdings hatten die behandelten Kinder mit Hochrisiko-prethreshold ROP öfter generelle
Komplikationen wie Apnoen, Bradykardien oder Notwendigkeit von Reintubation als die
behandelten Kinder mit herkömmlicher threshold ROP, möglicherweise wegen des geringeren
Gestationsalters beim Eingriff.
Nach der ETROP-Studie wurde die ROP in 2 Typen eingeteilt13:
Typ 1, der früh gelasert werden sollte:
•
Zone 1, jedes Stadium ROP mit plus disease
•
Zone 1, Stadium3 ROP mit oder ohne plus disease (in mindestens 2 Quadranten)
•
Zone 2, Stadium 2 oder 3 ROP mit plus disease (in mindestens 2 Quadranten)
Typ 2, der regelmäßig untersucht werden und nur im Falle eines Fortschreitens zu Typ 1 oder
zur threshold ROP gelasert werden soll:
16
•
Zone 1, Stadium 1 oder 2 ohne plus disease
•
Zone 2, Stadium 3 ohne plus disease
Die Einteilung der ETROP-Studie erwies sich als aussagekräftig, denn in der Gruppe mit
konservativer Behandlung entwickelten die Kinder, die eine Hochrisiko-prethreshold-ROP
hatten, viel häufiger eine threshold ROP als die Kinder mit geringem Risiko13.
Mittlerweile wird gemäß den Richtlinien, die der Überarbeitung der ETROP-Studie13
entstammen, im Falle einer behandlungsbedürftigen ROP meist eine Verödung der
avaskulären Retina mittels Laserphotokoagulation durchgeführt. Die früher durchgeführte
Verödung mittels Kryotherapie wird angesichts unerwünschter Nebenwirkungen nicht mehr
angewandt. Begleitende Sauerstofftherapien zeigten keinen Effekt. Bei Amotio (ROP IV- V)
kann eine Vitrektomie oder die Reparatur der abgelösten Retina vorgenommen werden,
allerdings meist mit sehr schlechten Ergebnissen für das Sehvermögen des Kindes70.
Laserindikationen bei ROP13 :
(grau unterlegt = Laserindikationen, weiß = beobachten)
I
II
III
Zone
Stadium
1
Tortuositas
2
Tortuositas
3
Tortuositas
Tortuositas
3 threshold
Abb.4: Graue Felder mit Tortuositas: Hier bestehen Laserindikationen nur bei Tortuositas der retinalen Gefäße.
Graue Felder ohne Tortuositas: Hier besteht eine Laserindikation auch ohne Tortuositas.
Für die threshold disease besteht unverändert Laserindikation. Neu als Laserindikation hinzugekommen ist die
high-risk prethreshold disease = die grauen Kästchen in den darüberliegenden 3 Zeilen.
17
Prävention
Die einzige Möglichkeit, die ROP-Häufigkeit absolut zu senken, liegt in der Vermeidung von
Frühgeburten. Dafür ist die pränatale gute Versorgung von Mutter und Kind sehr wichtig.
Nach der Geburt steht die intensivmedizinische Versorgung mit Vermeidung von
Sauerstoffschwankungen im Vordergrund. Therapieansätze mit Vitamin E (Tocopherol)-Gabe
oder Lichtabschirmung wurden versucht. Positive Effekte sind jedoch nicht gesichert69,11. Präund postnatale Dexamethasongabe zur Lungenreifung beziehungsweise zur Behandlung der
bronchopulmonalen Dysplasie hatte ein vermindertes Auftreten schwerer ROP-Stadien zur
Folge31,25.
Beschreibung der Studie
Die Gefäße der menschlichen Netzhaut entwickeln sich ab der 14. Schwangerschaftswoche
(SSW) und erreichen zum normalen Geburtstermin zwischen der 38. und 40. SSW die
äußerste Peripherie der Netzhaut. Es sind eine Reihe von Faktoren bekannt, die diesen
physiologischen Auf- und Umbau der retinalen Gefäße steuern: bei Hypoxie schütten retinale
Neurone den Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) aus, der über spezifische
Rezeptoren (VEGFR-1 und VEGFR-2) die Proliferation von Endothelzellen anregt. Die aus
den Zusammenschlüssen der Endothelzellen neu entstandenen Gefäßschläuche werden durch
die Wirkung des Angiopoietins und dessen spezifischen Rezeptor Tie-2 stabilisiert. Bei der
physiologischen Gefäßentwicklung sind der Sauerstoffbedarf des wachsenden Gewebes und
die Gefäßversorgung aufeinander abgestimmt. Nach der Geburt steigt der
Sauerstoffpartialdruck im Blut. Falls nötig, wird zusätzlich Sauerstoff verabreicht. Durch das
größere Sauerstoffangebot nimmt der Proliferationsanreiz für die Netzhautgefäße ab. Mit
weiterem Wachstum der Netzhaut verringert sich in den folgenden Wochen die relative
Gefäßdichte, was zur Hypoxämie führt. Die Folge ist eine reaktive überschießende
Gefäßproliferation und möglicherweise die Entwicklung einer Frühgeborenenretinopathie
(retinopathy of prematurity, ROP). Im ungünstigen Fall kann es durch Gefäße, die in den
Glaskörper einwachsen, zur Netzhautablösung kommen.
Die ROP ist eine der häufigsten Ursachen von Sehstörungen und Blindheit im Säuglings- und
Kleinkindesalter65. Bisher werden Frühgeborene, die vor der 32. SSW geboren wurden
beziehungsweise unter 1500g Geburtsgewicht haben, regelmäßig untersucht, unabhängig
18
davon, ob ihnen Sauerstoff zugeführt wurde oder nicht. Außerdem werden alle
Frühgeborenen der 32. bis 36. SSW gescreent, wenn länger als 3 Tage Sauerstoff gegeben
wurde76. Liegt ein fortgeschrittenes Stadium der ROP vor (Kriterien siehe unten), wird die
periphere, avaskuläre Netzhaut in Laserkoagulation verödet. In der Freiburger UniversitätsKinderklinik werden pro Jahr circa 90 Frühgeborene regelmäßig augenärztlich untersucht.
Rund 20% dieser Kinder haben eine ROP, etwa 10% (ca. 2-4) davon müssen gelasert werden.
In der vorliegenden Studie wurden angiogene Faktoren in Plasma und Serum bestimmt und
mit dem klinischen Verlauf der Frühgeborenenretinopathie korreliert. Untersucht werden
sollte, ob eine Veränderung der Konzentrationen angiogener Faktoren nachweisbar ist, bevor
eine unkontrollierte Neovaskularisation sichtbar wird. Dadurch sollte die frühzeitige
Entscheidung zur Laser-Behandlung erleichtert und eine höhere Erfolgschance erzielt werden.
Testverfahren zur Messung von EDTA-Plasma- und Serumkonzentrationen von löslichem
VEFG (soluble (s) VEGF), löslichen VEGF-Rezeptoren (sVEGFR-1 und sVEGFR-2),
löslichem Angiopoietin-Rezeptor (sTie-2) und löslichem E-Selectin (sE-Selectin) wurden von
der Klinik für Tumorbiologie zur Verfügung gestellt.
19
2. Angiogene Faktoren
VEGF
Der Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) ist ein hochspezifisches Mitogen für
Gefäßendothelzellen und ein wesentlicher Faktor für die physiologische und pathologische
Angiogenese. Er gehört wie z.B. auch EGF (Epidermal Growth Factor), PDGF (PlateletDerived Growth Factor) und Insulin zu den Wachstumsfaktoren oder auch Zytokinen.
Es gibt im Wesentlichen fünf Isoformen, die aus einem Gen durch alternatives Splicing
hervorgehen. Es sind dies VEGF 121/120, VEGF 145/144, VEGF 165/164, VEGF 189/188
und VEGF 206/205.
Im fibrovaskulären Gewebe wird VEGF von Gliazellen exprimiert und produziert, die in der
normalen Entwicklung der Retinavaskularisation eine Schlüsselrolle spielen29. Außerdem
wurde das VEGF-Protein auch in Endothelzellen und in retinalem Pigmentepithel46 gefunden.
VEGF regt die Endothelzellproliferation an, treibt die Zellmigration voran und hemmt die
Apoptose. Die Expression des VEGF-Gens steigt als Antwort auf Hypoxie, Hypoglykämie,
aktivierte Onkogene und verschiedene andere Zytokine und Wachstumsfaktoren und fällt
unter hyperoxischen Bedingungen ab.
Abb.5: Regulation der VEGF-Expression
Factor
20
nach 33
; AGE: Vorstufen von Glykierungsendprodukten, IGF: Insulin-like Growth
Bei Patienten mit aktiver diabetischer Retinopathie fanden sich in der Glaskörperflüssigkeit
und im Plasma erhöhte VEGF-Spiegel2,1,53. Auch bei Frühgeborenen mit ROP Stadium 4 und
5 konnten erhöhte VEGF-Spiegel in subretinaler Flüssigkeit nachgewiesen werden.
In vivo induziert VEGF Angiogenese, ist wichtig für die Durchlässigkeit von Blutgefäßen und
spielt eine entscheidende Rolle in der Regulation der Gefäßentstehung. Deregulierte VEGFExpression trägt zur Entwicklung solider Tumoren bei, indem es die Tumorangiogenese
ankurbelt. Folglich kann durch Hemmung der VEGF-Wirkung die Entwicklung zahlreicher
Tumoren gehemmt werden62.
In einem Mausmodell zur ROP zeigte sich, dass besonders die Isoform VEGF 164 zum
Zeitpunkt der maximalen Neovaskularisation im Glaskörper am meisten gebildet wird58.
Ebenfalls im Tiermodell fiel ein Zusammenhang zwischen der VEGF-Expression und
retinaler Neovaskularisation auf. Hauptproduzenten waren Müller-Zellen, die Hauptgliazellen
der neuronalen Retina. In der Phase der relativen Hypoxie waren schon nach 6-12 Stunden die
retinalen VEGF-mRNA- und -Proteinspiegel stark erhöht und blieben bis zum Rückgang der
Neovaskularisation hoch66.
Sehr wahrscheinlich wird eine Hypoxie von Neurogliazellen, zuerst Astrozyten, dann
Müllerzellen, wahrgenommen. Diese setzen daraufhin VEGF frei, welches an den Gefäßen
angreift, und zwar über den VEGFR-2. Eine sauerstoffreiche Umgebung unterdrückt sowohl
das Gefäßwachstum als auch die endogene VEGF-Produktion78.
Im Gegensatz zu den normalen Regelmechanismen nahm in einem anderen Mausmodell zur
ROP die VEGF-Expression unter Östrogengabe während der hyperoxischen Phase nach der
(Früh-)geburt sowie in der anschließenden Phase der Normoxie (also der relativen Hypoxie)
zu und in Hypoxie ab. Damit entwickelten sich auch in der Phase der Hyperoxie weiterhin
Gefäße. Eine überschießende Neovaskularisation während der relativen Hypoxie konnte
verhindert werden. Aufgrund dessen könnte Östrogen möglicherweise ein wichtiges Mittel in
der Prophylaxe der ROP darstellen, wichtig ist jedoch die Gabe während der gesamten
hyperoxischen und der anschließenden relativen hypoxischen Phase60.
21
VEGF- Rezeptoren
In der Retina gibt es zwei funktionelle VEGFR-2 Typen, die von einem Gen durch
alternatives Splicing entstehen. Ebenso wie die Expression von VEGF wird auch die
Expression von VEGFR-1 und -2 durch Hypoxie beeinflusst, jedoch in geringerem Maße als
VEGF62.
Die beiden Rezeptoren VEGFR-1 (bzw. Flt1) und VEGFR-2 (bzw. Flk1/KDR) werden
hauptsächlich in Endothelzellen exprimiert. Zusätzlich kommt VEGFR-1 in
Trophoblastzellen, Monozyten und renalen Mesangiumzellen vor, VEGFR-2 in
hämatopoietischen Stammzellen87, Megakaryozyten und retinalen Vorläuferzellen. In den
Endothelzellen der normalen Retinagefäße finden sich geringe VEGFR-2-Spiegel, dafür aber
hohe Spiegel in proliferierenden Endothelzellen der neuen Blutgefäße nach
Sauerstoffexposition59. Die Expression von VEGR-1 wird durch VEGF gesteigert7. Beide,
VEGFR-1 und -2, werden auch in Tumorzellen, z.B. in denen des malignen Melanoms,
gefunden62.
Die Wirkung von VEGF auf die Rezeptoren ist unterschiedlich. Bindet er an VEGFR-1, so
kommt es zur Zellmigration, jedoch nicht zur Zellproliferation. Bindet er an VEGFR-2,
kommt es sowohl zur Zellproliferation als auch zur Zellmigration62 (siehe auch Abb.1).
Gemeinsam mit Neurophilin-1, einem Korezeptor für VEGF, beeinflusst die Expression von
VEGFR-2 die Gefäßdichte stark, während VEGFR-1 darauf keinen Einfluss hat29.
Zusammen mit der PI-3-Kinase und der Serin-Threonin-Kinase Akt (auch Protein-Kinase B)
kann VEGF am VEGFR-2 das Überleben von Zellen sichern, während hingegen VEGF am
VEGFR-1 nur über die PI-3-Kinase wirkt und hier das Überleben der Zellen nicht
gewährleistet17.
VEGFR-1 spielt auch eine wichtige Rolle bei der Erhaltung von Blutgefäßen in Hyperoxie,
wenn er vom placental growth factor-1 (PlGF-1), einem spezifischen Liganden, gebunden
wird. Dies könnte eine Möglichkeit darstellen, einer Sauerstoff-induzierten retinalen Ischämie
vorzubeugen, ohne eine Neovaskularisation hervorzurufen75.
Der lösliche Rezeptor sVEGFR-1 spielt eine wesentliche Rolle in der embryonalen
Vaskulogenese und in der adulten Angiogenese. Er wurde erstmals in Kulturen aus
menschlichen Endothelzellen aus Nabelvenen nachgewiesen39. Der heparinbindende
sVEGFR-1 hat die gleiche hohe Affinität zu VEGF wie der membrangebundene Rezeptor. Er
kann die Zellantwort auf VEGF unterdrücken, indem er diesen entweder in direkter
Konkurrenz zu den membrangebundenen Rezeptoren abfängt, oder durch Bindung und
22
Inaktivierung von membrangebundenem VEGFR-1 und -2. VEGFR-1 wurde sowohl in seiner
Rolle als Marker für Krankheitsprogression als auch als möglicher Inhibitor von
Tumorangiogenese untersucht84,23,39,19. Er ist auch bei der Pathogenese der Präeklampsie
beteiligt, wobei man von einer sekundären Hochregulation nach Hypoxie ausgeht68. Trotzdem
ist die pathophysiologische Bedeutung von sVEGFR-1 noch unsicher, und seine Rolle bei
ischämieinduzierten neovaskulären Erkrankungen wie der ROP bleibt unklar6. Die
funktionelle Bedeutung von sVEGFR-1 bei der VEGF-Signalübertragung ist bisher
unbekannt12.
VEGFR-2 treibt die Differenzierung und Proliferation von endothelialen Zellen voran. Seine
Expression wird durch Hypoxie erhöht und durch VEGF verstärkt62,78. Ein Zusammenhang
mit ischämieinduzierten proliferativen Erkrankungen wurde klar nachgewiesen74. Die lösliche
Form (sVEGFR-2) wurde als erstes von Ebos et al12 in menschlichem Plasma entdeckt. Ob sie
das Ergebnis von alternativem mRNA-Splicing, proteolytischer Spaltung des
membrangebundenen Rezeptors oder eines anderen Mechanismus ist, ist unbekannt. Ähnlich
wie sVEGFR-1 könnten endotheliale Zellen einer der Sekretionsorte sein.
Tie-2
Tie-2 ist eine Rezeptortyrosinkinase, die vorrangig von Endothelzellen, aber auch von einigen
hämatopoietischen Stammzellen und Neuronen gebildet wird. Tie-2 hat sowohl extrazelluläre
als auch intrazelluläre Bestandteile und spielt eine wichtige Rolle in der Gefäßentwicklung.
Die Liganden von Tie-2 sind die Angiopoietine (Ang) 1, 2, 3 und 4. Ang1, 2 und 4 kommen
beim Menschen vor, während Ang3 ein Ang4-ähnliches Molekül bei Mäusen ist.
Ang2 wird im Embryo weit verbreitet exprimiert, beim Erwachsenen in Uterus, Ovar und
Plazenta, also an Orten, an denen physiologischerweise Angiogenese stattfindet21.
Es konnte außerdem gezeigt werden, dass Ang2 im Gegensatz zu Ang1 und Tie-2, die
ubiquitär vorkommen, in großer Menge nur bei ischämischen Retinopathien exprimiert wird,
nicht jedoch bei nicht-ischämischen Retinopathien, und somit sicher eine wichtige Rolle bei
der pathologischen Angiogenese ischämieinduzierter Retinopathien spielt80.
Bei Mäusen kann Ang1/Tie-2 die Entsendung von hämatopoietischen Stammzellen in die
periphere Blutbahn bewirken, und wenn es mit VEGF kombiniert wird, ist es mit der
Induktion von Hämatopoiese und Angiogenese verbunden. Tie-2 wird auch in menschlichen
23
hämatopoietischen Stammzellen gebildet, und in vitro treibt Ang1/Tie-2 ihre Adhäsion an
Fibronectin voran73.
Ang1 und 2 sind in ihrer Struktur ähnlich, haben aber eine sehr unterschiedliche Wirkung auf
ihren Rezeptor. Ang1 ist ein positives Signal an Tie-2, Ang2 ein negatives.
Ang1 induziert die Autophosphorylierung von Tie-2 und beeinflusst positiv Migration,
Wachstum und Überleben von Endothelzellen. Der Ang1/ Tie-2 Kreislauf regelt die
Gefäßreifung von einfachen Endothelschläuchen zu komplizierten Gefäßstrukturen, die aus
verschiedenen Zelltypen zusammengesetzt sind und ist wichtig für die Erhaltung dieser
Gefäße via Zell-Zell- und Zell-Matrix-Verbindungen.
Ang2 wurde anfangs als kompetitiver Inhibitor des Ang1/Tie-2 Signals beschrieben, obwohl
es in gewissen Fällen die Aktivität von Tie-2 genauso stimulieren kann. Das Ang2/Tie-2
Signal führt zum Untergang und Rückzug der Endothelzellen. Die fokale Ang2-Expression
blockiert das Ang1/ Tie-2 Signal und führt so zur Lockerung der festen Gefäßstruktur und zur
Exposition der Endothelzellen an Angiogenese-induzierende Signale, z.B. VEGF. Sind VEGF
oder ein anderer Stoff präsent, werden die Endothelzellen jedoch zur Migration und
Proliferation angeregt und bilden so neue Kapillaren. Überwiegt Ang1 wieder, so kehrt eine
Balance zugunsten Ang1 ein, welche die Reifung und Stabilisierung der neuen Gefäße
erlaubt.
Bei hohen Ang2- Spiegeln ohne VEGF kommt es zu Ablösungen von der Matrix und den
anderen Zellen, meist gefolgt von Apoptose7.
Abb.6: Einfluss von Ang1/2 auf Tie-2 allein und in Kombination mit VEGF modifiziert
24
nach 21
Mehrere in vivo-Studien zeigen die wichtige Rolle von Tie-2 bei der Gefäßentwicklung. Tie2-knock-out Mäuse sterben durchschnittlich am 10,5. Embryonaltag und zeigen starke
Gefäßdefekte sowie abnormal weite Kopfgefäße, mangelndes Gefäßwachstum im
Neuroektoderm, zu wenig Herzgefäße und weniger Endothelzellen. Eine Tie-2 Mutation, die
eine 6- bis 10fach erhöhte Rezeptoraktivität bewirkt, ist beim Menschen mit einer
Gefäßdysmorphogenese vergesellschaftet5.
Bezüglich ischämischer Retinopathien wie der diabetischen Retinopathie oder der ROP
konnte gezeigt werden, dass das Angiopoietin/Tie-2-System eine wichtige Rolle bei
ischämieinduzierter retinaler Neovaskularisation spielt. Ang2 und Tie-2 waren bei
ischämischen Retinopathien im Gegensatz zu nicht-ischämischen Retinopathien deutlich
vermehrt in den proliferativen Membranen der Retina zu finden. Die Hemmung von Tie-2
unterdrückte zudem in vitro die hypoxieinduzierte retinale Angiogenese, vor allem in
Kombination mit einer Hemmung von VEGF. Hierin zeigt sich möglicherweise auch ein
wichtiger Therapieansatz zur Bekämpfung ischämischer Retinopathien wie der diabetischen
Retinopathie oder der ROP80.
Abb.7: Gefäßstabilisierung und Umbau im erwachsenen Organismus
nach 34
.
25
E-Selectin
E-Selectin (Endothelial Leukocyte Adhesion Molecule-1, ELAM-1, CD62E) ist ein 115 kDa
großes, transmembranöses Glykoprotein vom Typ I. Es ist ein zur Familie der Selectine
gehörendes Adhäsionsmolekül, das von Gefäßendothelzellen nach Aktivierung durch
entzündliche Zytokine (IL-1, TNF-alpha) oder durch Endotoxin gebildet wird.
Die Expression von E-Selectin ist zeitlich begrenzt, erreicht ca. 6 Stunden nach Stimulation
ihren Höhepunkt und fällt dann unter Ausschüttung der löslichen Form (sE-Selectin) ab.
Lösliches E-Selectin findet sich im Blut von gesunden Menschen, möglicherweise als Produkt
des oberflächenexprimierten Moleküls nach proteolytischer Spaltung.
Das Zelloberflächen-E-Selectin vermittelt die Anhaftung von Leukozyten an das Endothel
und ist wesentlich für den Gefäßaustritt der Leukozyten an der Entzündungsstelle
verantwortlich. Es spielt dadurch eine Schlüsselrolle in der lokalen Entzündungsreaktion.
Bei Gabe von Antikörpern gegen E- und P-Selectin kommt es im Falle eines
Antigenkontaktes (z.B. Endotoxin von Bakterien) bei alleiniger Anti-P-Selectingabe zu 37%,
bei Gabe von Antikörpern gegen beide, P- und E-Selectin, zu 61% weniger
Entzündungsreaktion86. Bei Patienten mit M. Behçet ist E-Selectin als Marker für
Endothelschädigung deutlich erhöht38. E-Selectin scheint die hämatogene Verbreitung von
Krebszellen und ein Tumorwachstum zu begünstigen. Krebszellen passen sich unter anderem
mit Hilfe von HIFs (Hypoxie-induzierbare Faktoren) an ihre hypoxische Umgebung an. In
Versuchen mit menschlichen Tumorzellen, die künstlich hypoxischen Bedingungen
ausgesetzt wurden, zeigte sich ein deutlicher Anstieg der Expression von Selectin- Liganden
auf der Krebszelloberfläche, die zu einem Anstieg der Adhäsion an endotheliales E-Selectin
und damit an Endothelzellen führte43.
Schließlich spielt E-Selectin auch bei Diabetes mellitus eine wichtige Rolle. Im Plasma von
DM Typ 2-Patienten scheint es Faktoren zu geben, die die Expression von E-Selectin in
Endothelzellen stimulieren, was wiederum zur Entwicklung einer diabetischen Retinopathie
beitragen kann42. Bei Diabetespatienten mit diabetischer Retinopathie wurden in den
Glaskörpern deutlich höhere Spiegel von E-Selectin und anderen Adhäsionsmolekülen
(ICAM (=intercellular adhesion molecule) und VCAM (=vascular cell adhesion molecule))
als bei Gesunden gefunden51.Ebenfalls bei Patienten mit diabetischer Retinopathie fiel in der
Retina eine verstärkte Expression von Adhäsionsmolekülen zusammen mit lokaler
Aktivierung von TNF-alpha auf, die eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der
proliferativen Phase der diabetischen Nephropathie spielen könnte51.
26
3. Material und Methoden
Unsere Studie wurde gemäß den Richtlinien der Erklärung von Helsinki durchgeführt und von
der Ethikkommission der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg genehmigt. Da eine
regelmäßige Blutentnahme nur zum Zweck der Blutgewinnung für unsere Studie nicht erlaubt
wurde, konnten nur EDTA-Plasma- und Serumproben aus Restblut verwertet werden. Die
Blutentnahmen erfolgten daher unregelmäßig und nicht standardisiert.
In einem prospektiven Studiendesign wurden von Januar 2002 bis September 2003 Proben
von 71 Kindern mit einem hohen Risiko für eine ROP (Gestationsalter unter der 32.
Schwangerschaftswoche und Geburtsgewicht unter 1500 g) untersucht.
71 Kinder gesamt
63 Kinder mit Proben
42 Kinder ohne ROP
2 Kinder ohne Untersuchung
1 Kind gestorben
5 Kinder mit hämolytischen Proben
21 Kinder mit ROP
1 Kind Stadium 1
10 Kinder Stadium 2
10 Kinder Stadium 3
4 Kinder gelasert
Abb.8: Von 71 Kindern starb eines, zwei wurden ohne augenärztlichen Befund entlassen, bei fünf Kindern konnten die
Blutproben wegen Hämolyse nicht ausgewertet werden. Von den 63 verbliebenen Kindern hatten 42 keine ROP. 21 Kinder
entwickelten eine ROP, davon ein Kind Stadium 1, 10 Kinder Stadium 2 und 10 Kinder Stadium 3. Vier Kinder mit Stadium
3 mussten gelasert werden. Bei den restlichen bildete sich die ROP spontan zurück.
Die Serumproben wurden sofort nach der Abnahme eingefroren. Die Plasmaproben wurden
bei +4 °C aufbewahrt und innerhalb von maximal 24 Stunden, meist innerhalb von ca. 9
Stunden nach Abnahme, mit 15 000 Umdrehungen pro Minute 10 Minuten lang zentrifugiert.
Anschließend wurde der Überstand abpipettiert und bei -20°C eingefroren.
27
Die Qualität der Plasmaproben war sehr unterschiedlich. Oft waren die Proben geringfügig,
oder, in wenigen Fällen (siehe Abb.9), stark hämolysiert. Verantwortlich hierfür können
Erkrankungen der Frühgeborenen oder auch abnahmebedingte Gründe sein.
Abb.9: Stark unterschiedliche Qualität der Proben. Teilweise blutig oder hämolysiert
Die Untersuchung der Proben fand von 2002 bis 2003 im Labor der Tumorbiologie statt.
Ein Teil der Proben musste gemischt werden, um die nötige Mindestmenge von 200 !l
(Serum) beziehungsweise 100 !l (Plasma) zu erzielen.
Ursprünglich wurden 509 einzelne Plasmaproben gesammelt, von denen 367 gemischt
werden mussten. 142 blieben rein. Nach dem Mischen blieben 131 Plasmaproben übrig, die
aus 2 bis 5 Proben mit einem maximalen Abstand von 15 Tagen zwischen der ersten und der
letzten Probe (durchschnittlich 6,6 Tage) entstanden. Insgesamt gab es nach dem Mischen
also noch 142+131= 273 Plasmaproben.
509 Plasma
367 gemischt
142 rein
bleiben 131
142
133 ohne ROP
136 mit ROP
Abb.10a: Verhältnis der gemischten und reinen Plasmaproben und deren Verteilung
28
149 Serumproben wurden gesammelt, von denen 107 Proben rein blieben, 42 wurden mit 2
bis 3 Proben mit einem maximalen zeitlichen Abstand der ersten zur letzten Probe von 17
Tagen gemischt (durchschnittlich 3,7 Tage). Nach dem Mischen blieben so 16 gemischte plus
107 reine= 123 Serumproben.
Da auch auf diese Weise einzelne gemischte Plasmaproben nicht die erforderliche Menge
aufwiesen, wurden die Ergebnisse der Proben mit einer Menge unter 100 !l entsprechend
hochgerechnet (z.B. ein Wert aus einer Probe mit 50 !l wurde mit 2 multipliziert).
149 Serum
42 gemischt
107 rein
bleiben 16
107
73 ohne ROP
50 mit ROP
Abb.10b: Verhältnis der gemischten und reinen Serumproben und deren Verteilung
Die Verteilung der Proben war folgendermaßen:
Es gab 133 Plasmaproben von Kindern ohne ROP, pro Kind zwischen 1 und 10 Proben (im
Mittel 3,2 Proben pro Kind). 136 Plasmaproben wurden von Kindern mit ROP gesammelt,
pro Kind zwischen 2 und 17 Proben (im Mittel 6,5 Proben pro Kind).
Es gab 73 Serumproben von Kindern ohne ROP, pro Kind zwischen 1 und 6 Proben (im
Mittel 2,3 Proben pro Kind). Von den Kindern mit ROP wurden 50 Serumproben gesammelt,
pro Kind zwischen 1 und 8 Proben (im Mittel 3,3 Proben pro Kind).
Das Lebensalter der Kinder bei Probenentnahme variierte stark, insgesamt wurden
Plasmaproben vom 2. Lebenstag bis zur 19. Lebenswoche entnommen, Serumproben vom 1.
Lebenstag bis zur 19. Lebenswoche.
Das durchschnittliche Alter der Kinder bei der ersten Probenentnahme betrug beim Plasma
32,85 (23,71-38,86) Wochen Gestationsalter bzw. 4,96 (0,29-8,14) Wochen Lebensalter. Die
Verteilung bei den Serumproben war ähnlich. In Tabelle 1 sind die Zahl der Messungen in
Plasma und Serum pro Kind und Faktor angegeben. Aufgrund der begrenzten Probenmenge
war nicht immer die Messung aller Faktoren in einer Probe möglich.
29
Plasma
Serum
ROP 0
ROP 1
ROP 0
ROP 1
VEGF
108
107
63
19
VEGFR-1
46
38
45
16
VEGFR-2
60
38
49
35
Tie-2
69
42
51
30
E-Selectin
56
33
61
37
Tabelle 1: Anzahl der Messungen der einzelnen Faktoren in Plasma und Serum für ROP 0 und ROP 1
Für die Messungen der einzelnen Faktoren wurden Kits der Firma R&D Systems® sowie der
Firma ProQinase® verwendet.
VEGF, VEGFR-2 und E-Selectin wurden mit der sandwich-enzym-immunoassay Technik mit
Kits der Firma R&D Systems® (Minneapolis, USA / Wiesbaden-Nordenstadt, Germany)
quantitativ ermittelt. Auf einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen befinden sich
faktorspezifische monoklonale Mausantikörper. Auf diese Platte werden eine Standardlösung
(rekombinanter humaner Faktor), die Proben, Kontrollen und schließlich ein weiterer,
enzymgebundener Antikörper gegen den Faktor aufgetragen, so dass jedes Molekül eines
Faktors zwischen dem unbeweglichen Antikörper auf der Platte und dem zweiten,
enzymgebundenen Antikörper gebunden wird. Ungebundene Substanzen und/ oder
Antikörper-Enzym-Verbindungen werden anschließend herausgewaschen und eine
Substratlösung, bestehend aus Tetramethylbenzidin, in die Vertiefungen gegeben, so dass sich
proportional zur gebundenen Faktormenge Farbe entwickelt. Nach Stoppen der
Farbentwicklung wird die Farbintensität mittels Nanometer gemessen.
Bei dem Enzym handelt es sich um Meerrettich-Peroxidase. Als Stopplösung wird eine Säure,
z.B. Schwefelsäure, verwendet.
VEGFR-1 und Tie-2 wurden nach dem ELISA-System von ProQinase® GmbH (Freiburg im
Breisgau, Germany) quantitativ ermittelt. Dafür wurden Mikrotiterplatten über Nacht mit
einem spezifischen Antikörper bei 8°C inkubiert. Nach dreimaliger Waschung mit PBST
wurde eine Stopppufferlösung hinzugegeben und 3 Stunden belassen. Die in Pufferlösung
verdünnten Serumproben wurden anschließend zugefügt und ebenfalls über Nacht inkubiert.
Nach erneuter Waschung erfolgte die Gabe von spezifischen Antikörpern und einer
30
Detektionslösung, so dass schließlich bei einer Wellenlänge zwischen 405 und 620 nm die
Ablesung erfolgen konnte.
Die Werte für sVEGF im Serum sind im Vergleich zum Plasma deutlich höher, da aktivierte
Thrombozyten VEGF ins Serum abgeben. Diese Verfälschung kann vermieden werden,
indem Zitrat-Plasma verwendet wird53.
31
4. Ergebnisse
Für die Auswertung unterteilten wir die Kinder in zwei Gruppen: Kinder mit ROP (ROP 1)
und Kinder ohne ROP (ROP 0). Dabei fielen in die Gruppe ROP 1 alle Kinder, die in
mindestens einem Augenbefund einen Grad der ROP hatten.
Serum
Plasma
Einheit Median Mittelwert
Einheit Median
Mittelwert
VEGF, ROP 0
pg/ml
814,57 980,73
VEGF, ROP 0
pg/ml
553,19
656,67
VEGF, ROP 1
pg/ml
610,20 913,09
VEGF, ROP 1
pg/ml
475,30
613,76
VEGFR-1, ROP 0
pg/ml
162,86 198,21
VEGFR-1, ROP 0
pg/ml
207,44
324,50
VEGFR-1, ROP 1
pg/ml
201,85 297,99
VEGFR-1, ROP 1
pg/ml
284,11
458,41
VEGFR-2, ROP 0
ng/ml
15,35
15,43
VEGFR-2, ROP 0
ng/ml
13,96
13,88
VEGFR-2, ROP 1
ng/ml
16,45
18,29
VEGFR-2, ROP 1
ng/ml
15,23
16,22
Tie-2, ROP 0
ng/ml
70,02
76,48
Tie-2, ROP 0
ng/ml
52,91
57,46
Tie-2, ROP 1
ng/ml
108,66 105,61
Tie-2, ROP 1
ng/ml
65,71
68,17
E-Selectin, ROP 0 ng/ml
80,73
103,65
E-Selectin, ROP 0
ng/ml
38,95
47,58
E-Selectin, ROP 1 ng/ml
104,36 139,08
E-Selectin, ROP 1
ng/ml
83,50
118,73
Tab.2: Mediane und Mittelwerte von allen Kindern der beiden Gruppen ROP 0 und ROP 1 in Serum und Plasma
Serum
min
max
ROP 0
ROP1 ROP0
ROP 1
VEGF (pg/ml)
26
30
2516
2531
VEGFR-1 (pg/ml)
49
49
1170
VEGFR-2 (ng/ml)
10
13
Tie-2 (ng/ml)
33
E-Selectin (ng/ml)
26
min
max
ROP 0
ROP 1 ROP0 ROP1
VEGF (pg/ml)
49
57
2614
2349
1751
VEGFR-1 (pg/ml)
48
64
2742
4914
24
36
VEGFR-2 (ng/ml)
8
12
25
32
43
151
169
Tie-2 (ng/ml)
26
31
98
152
49
430
613
E-Selectin (ng/ml)
6
19
209
495
Tab.3: Minimale und maximale Werte in Serum und Plasma
32
Plasma
Absolutwerte im Plasma
Code
BV 03
BV 03
BV 03
BV 04
BV 04
BV 04
EK 06
EK 06
EK 06
EK 06
EK 06
GS 10
GS 10
GS 10
GS 10
HL 11
HL 11
HL 11
HL 11
HS 12
HS 13
HS 13
KL 14
KL 14
KL 14
KL 14
KL 14
KL 14
CS 15
CS 15
CS 15
PT 17
PT 17
PT 17
PT 17
SE 20
SE 20
VM 22
VM 22
VM 22
HJ 24
HJ 24
HJ 24
PN 25
PN 25
WL 26
WL 26
WL 26
WM 27
WM 27
WM 27
EK 28
EK 28
WS 37
WS 37
ES 39
MS 42
ROP
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Gestalter
34,29
36,71
39,57
33,00
34,71
36,43
30,71
31,86
36,14
37,29
39,57
28,14
29,86
32,57
35,29
29,71
33,14
34,43
36,43
32,43
32,43
33,29
26,86
28,71
30,00
33,43
36,29
38,14
34,86
38,29
39,86
29,86
31,29
35,57
38,43
36,86
39,71
29,14
33,43
37,00
29,29
31,71
37,14
31,86
39,86
32,00
36,00
38,43
29,29
37,57
38,29
35,43
37,43
32,43
36,43
31,29
36,71
Lebalter
5,86
8,29
11,14
3,86
5,57
7,29
4,86
6,00
10,29
11,43
13,71
2,57
4,29
7,00
9,71
1,71
5,14
6,43
8,43
2,71
2,71
3,57
1,29
3,14
4,43
7,86
10,71
12,57
7,29
10,71
12,29
1,29
2,71
7,00
9,86
6,14
9,00
1,14
5,43
9,00
1,71
4,14
9,57
1,14
9,14
2,43
6,43
8,86
2,43
10,71
11,43
5,71
7,71
2,57
6,57
3,43
7,29
VEGF(pg/ml)
633,41
719,26
607,88
1241,31
779,58
1271,47
FLT-1(pg/ml)
209,58
1484,94
1793,53
1334,12
1366,60
828,31
174,34
76,43
622
738
596
556
795,82
184,42
2742,06
60,60
73,64
129,97
416
942
538,42
1197,23
647,33
1162,42
748
978
668
455
464,03
352,66
496,51
461,71
292,33
494
337
297
159
105
104,39
1431,57
1141,54
330,72
819,03
283,21
338,40
169,16
1087,82
436,68
583,40
121,64
123,37
88,62
271,44
1292,38
523,04
579,46
166,58
VEGFR2(ng/ml) Tie-2 (ng/ml)
14,42
15,36
16,00
9,01
11,37
11,79
14,67
16,98
11,3
10,63
10,42
48,48
24,57
20,37
46,86
44,82
37,75
38,27
39,63
10,64
12,4
11,76
36,96
20,62
33,19
46,70
35,55
17,27
15,59
346,46
122,73
E-Sel(ng/ml)
390,84
174,34
47,49
11,63
118,96
602,30
51,93
214,41
10,54
14,35
15,22
7,95
18,12
20,87
15,98
13,65
131,46
132,98
13,05
14,40
10,55
9,56
199,24
30,83
54,56
43,94
69,56
54,50
90,69
94,08
62,24
52,91
66,05
86,55
80,11
73,12
49,30
57,68
34,39
57,71
104,17
57,71
57,10
35,41
33
MS 42
MS 42
MS 42
MS 42
MA 43
MA 43
MA 43
ZB 46
ZB 46
ZL 47
ZL 47
ZL 47
ZS 48
ZS 48
ZS 48
ZS 48
SM 51
SM 51
BP 52
DI 53
DI 53
DI 53
DI 53
DI 53
DI 53
DI 53
DI 53
LL 54
LL 54
LL 54
GA 56
GA 56
GA 56
GA 56
KA 57
KA 57
KA 57
KL 58
KL 59
KL 59
KL 59
SM 60
SM 60
SM 60
SM 60
SM 61
SM 61
SM 61
SM 62
SM 62
SM 62
SM 62
SM 63
SM 63
SM 63
SM 63
VC 65
PA 66
PA 66
PA 66
34
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
37,29
38,71
39,43
40,57
37,29
38,86
40,71
28,00
30,43
33,14
35,00
42,57
32,71
35,29
37,43
38,71
38,86
40,00
34,57
34,86
35,86
36,57
38,29
39,71
40,00
41,14
43,14
37,71
29,00
34,43
32,43
33,43
35,43
38,00
29,71
32,29
35,29
33,29
32,29
33,71
35,14
30,57
32,29
35,14
37,14
30,43
32,57
33,57
29,00
32,00
34,00
39,14
32,43
35,14
37,29
39,14
30,29
27,43
29,14
31,14
7,86
9,29
10,00
11,14
7,86
9,43
11,29
0,57
3,00
7,14
9,00
16,57
6,71
9,29
11,43
12,71
6,71
7,86
6,14
3,29
4,29
5,00
6,71
8,14
8,43
9,57
11,57
9,57
0,86
6,29
1,71
2,71
4,71
7,29
1,29
3,86
6,86
3,14
2,14
3,57
5,00
0,43
2,14
5,00
7,00
0,29
2,43
3,43
0,29
3,29
5,29
10,43
3,71
6,43
8,57
10,43
0,29
1,00
2,71
4,71
266,60
258,90
253,82
693,95
132,53
9,22
9,12
12,80
12,02
12,15
141,63
10,91
101,24
113,92
242,28
212,76
169,16
233,31
229,57
323,57
217,44
10,80
19,93
19,36
114,78
13,97
13,95
156,32
325,58
53,76
1205,18
571,23
274,52
485,52
545,75
541,12
550,38
503,10
410,62
597,42
108,28
102,48
569,50
1136,28
779,72
120,40
423,63
381,18
375,12
262,92
502,47
583,27
593,44
726,86
13,97
12,41
14,76
15,77
17,75
16,16
15,26
15,50
14,88
18,74
51,99
52,33
62,45
57,52
90,10
79,48
83,24
58,18
45,13
61,40
76,68
44,87
52,26
60,49
55,22
44,13
46,07
34,14
80,11
97,59
96,05
87,47
88,47
90,19
73,91
83,03
17,20
15,76
19,65
29,27
41,40
42,78
27,63
14,13
19,24
31,52
20,06
10,44
6,35
6,56
43,19
28,60
599,98
884,62
589,72
258,90
699,98
48,62
62,58
77,18
75,04
82,24
78,40
27,22
66,10
21,09
33,13
589,73
1456,50
1053,88
1343,66
452,31
2152,48
2367,14
2614,24
123,00
1494,96
1264,16
994,90
548,68
694,86
1235,96
1092,34
607,66
310,20
130.68
99,18
272,02
9,31
966,41
205,31
12,98
15,07
181,05
15,62
338,73
13,95
38,39
42,92
36,27
37,66
46,26
57,93
32,66
31,65
45,51
27,30
36,18
33,40
46,16
47,28
89,23
49,32
15,76
70,40
32,95
11,88
63,85
130,15
208,73
38,86
40,06
34,14
77,15
40,53
26,19
42,09
36,18
39,71
111,12
122,79
PA 66
PA 66
PA 66
FM 69
CN 74
CN 74
AK 01
AK 01
AK 01
BL 02
BL 02
BL 02
BL 02
BL 02
BL 02
BL 02
BL 02
BL 02
BL 02
BL 02
CC 05
CC 05
CC 05
CC 05
CC 05
CC 05
CC 05
CC 05
CC 05
EL 07
EL 07
EL 07
EL 07
EL 07
EL 07
EL 07
EL 07
EM 08
EM 08
SA 18
SA 18
SA 18
SA 18
SA 18
SA 18
SM 19
SM 19
SM 19
SM 19
SM 19
SM 19
SM 21
SM 21
SM 21
SM 21
SM 21
SM 21
WL 23
WL 23
WL 23
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
31,43
34,14
36,00
36,00
33,86
36,86
31,00
33,00
34,29
30,86
31,29
32,71
33,14
34,14
35,14
35,86
36,29
36,86
38,29
42,71
26,57
27,14
28,71
30,00
33,57
34,86
36,14
37,14
39,57
31,14
32,00
32,86
34,57
36,29
37,71
39,86
41,00
27,71
34,43
31,29
32,57
33,43
35,00
38,00
41,43
32,29
33,14
35,00
36,71
39,00
41,29
23,71
29,00
31,71
34,29
39,00
41,57
31,00
33,43
35,43
5,00
7,71
9,57
6,57
3,43
6,43
1,71
3,71
5,00
7,71
8,14
9,57
10,00
11,00
12,00
12,71
13,14
13,71
15,14
19,57
0,57
1,14
2,71
4,00
7,57
8,86
10,14
11,14
13,57
5,29
6,14
7,00
8,71
10,43
11,86
14,00
15,14
1,57
8,29
6,00
7,29
8,14
9,71
12,71
16,14
8,14
9,00
10,86
12,57
14,86
17,14
0,43
5,71
8,43
11,00
15,71
18,29
4,86
7,29
9,29
205,06
117,26
433,28
15,81
84,52
125,56
880
400
592
11,12
9,31
49,95
80,18
45,98
34,51
32,20
59,56
33,16
24,36
130
104
210
205
69
89
88
102
122
144
177,5
92
277
1284
923,33
1265
336
324,81
324,81
705,33
747
579
705
684
203,75
666
348
448
482,25
658,62
17,39
20,72
115,06
351,43
412
250
142,22
57
344
504
391
842
981
2103,33
908
1331,25
658
354,98
1051,05
14,14
14,78
14
18,57
15,53
503,47
452,43
151,20
1471,02
1320,2
1364,28
181,05
149,16
290,14
63,58
95,73
113,80
31,37
16,65
16,6
17,08
35
WL 23
BJ 30
BJ 30
BJ 30
BJ 30
BJ 30
LJ 31
LJ 31
LJ 31
LJ 31
DY 32
DY 32
DY 32
DY 32
DY 32
HJ 33
HJ 33
HJ 33
HJ 33
LJ 35
LJ 35
LJ 35
LJ 35
LJ 36
SM 40
SM 40
FM 44
FM 44
FM 44
FM 44
FM 44
BM 45
BM 45
BM 45
BM 45
BM 45
BM 45
BM 45
BM 45
BM 45
BM 45
MM 49
MM 49
MM 49
MM 50
MM 50
MM 50
MM 50
SK 55
SK 55
WE 64
WE 64
WE 64
WE 64
WE 64
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
38,29
29,86
33,00
34,86
37,57
40,29
31,43
40,86
41,57
42,71
28,00
36,57
38,86
39,43
41,43
31,71
36,43
39,57
40,29
32,29
37,43
39,00
39,43
41,43
28,00
29,86
25,43
26,86
29,71
31,57
32,71
29,57
30,86
31,57
32,14
32,57
32,86
33,86
34,57
35,29
39,86
31,29
33,43
35,29
30,14
32,57
34,29
37,43
31,43
35,00
31,00
33,71
34,71
36,29
40,43
12,14
6,14
9,29
11,14
13,86
16,57
6,57
16,00
16,71
17,86
4,29
12,86
15,14
15,71
17,71
4,57
9,29
12,43
13,14
7,00
12,14
13,71
14,14
16,14
3,00
4,86
1,43
2,86
5,71
7,57
8,71
3,00
4,29
5,00
5,57
6,00
6,29
7,29
8,00
8,71
13,29
5,14
7,29
9,14
4,00
6,43
8,14
11,29
3,71
7,29
4,29
7,00
8,00
9,57
13,71
Tab. 4: Absolutwerte im Plasma
36
385,14
573,08
1273,79
1104,42
477,95
751,74
1233,58
517,00
210,62
375,10
1015,82
66,04
56,96
722,40
135,82
1678,36
1227,40
1189,75
1020,64
2348,60
2042,24
1281,46
2112,32
243,05
971,04
929,34
425,60
699,98
1066,76
112,74
751,28
446,26
276,66
446,01
237,52
152,46
61,40
120,10
297,70
341,89
598,84
220,48
682,24
203,67
234,38
367,20
710,04
475,30
547,88
903,08
546,34
520,08
1105,40
411,98
1638,20
31,88
20,49
96,63
130,94
151,69
129,60
28,45
151,84
132,20
86,16
87,05
15,32
15,07
16,08
86,21
70,32
66,97
71,83
66,92
83,50
135,68
84,46
168,92
15,05
13,97
80,32
76,72
119,51
120,33
52,60
164,82
393,31
108,72
614,67
15,53
14,98
15,94
15,48
14,57
70,11
83,49
77,26
81,36
43,42
45,76
278,08
74,92
13,90
12,15
290,21
222,43
178,46
75,36
657,12
554,02
367,98
314,47
153,76
126,47
147,69
447,89
223,50
390,28
108,28
250,79
820,86
14,49
14,25
20,29
16,94
18,53
17,09
14,40
14,79
14,40
15,09
399,37
296,28
4914,45
344,79
293,24
14,31
13,86
15,15
16,97
32,02
37,93
49,21
47,47
43,97
32,82
48,96
45,39
43,58
58,23
64,06
68,47
50,19
59,52
61,07
79,39
47,77
64,46
62,08
62,91
81,28
76,63
79,60
74,92
84,75
84,46
58,53
60,58
43,80
25,18
222,13
344,22
280,92
494,64
362,97
179,13
74,67
18,84
77,49
66,63
94,69
41,26
44,22
35,48
18,98
Absolutwerte im Serum
Code
BV 03
BV 03
BV 03
BV 03
BV 04
BV 04
EK 06
EK 06
EK 06
GS 10
GS 10
HL 11
HS 12
HS 12
KL 14
PT 17
PT 17
PT 17
PT 17
PT 17
SE 20
SE 20
VM 22
VM 22
HJ 24
HJ 24
HJ 24
PN 25
WL 26
WM 27
WM 27
WM 27
WM 27
EK 28
LA 36
LA 36
WS 37
ES 39
ES 39
AL 41
AL 41
MS 42
MS 42
ZL 47
ZS 48
DI 53
DI 53
DI 53
DI 53
LL 54
LL 54
LL 54
LL 54
LL 54
GA 56
GA 56
KL 58
ROP
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Gest.alter
35,14
38,14
39,14
39,71
33,29
36,43
29,00
29,14
32,00
29,00
35,29
30,29
32,00
32,71
38,14
29,86
Lebensalter
6,71
9,71
10,71
11,29
4,14
7,29
3,14
3,29
6,14
37,43
37,86
38,57
38,71
41,71
34,86
37,00
28,71
34,57
37,57
41,00
42,00
35,00
37,00
38,00
38,29
38,57
32,86
34,00
32,71
33,14
36,14
34,57
36,57
37,29
37,71
30,57
30,57
33,71
34,57
36,86
37,71
29,14
31,43
32,29
35,57
41,29
33,14
34,57
32,29
8,86
9,29
10,00
8,00
VEGF(pg/ml)
596,28
484,91
617,17
452,43
1055,69
1389,81
2348,07
1320,2
1303,96
FLT-1(pg/ml)
379,19
102,27
129,97
94,72
2,29
2,29
2046,44
995,37
184,42
92,21
3,00
12,57
1,29
285,37
54,44
147,59
213,04
180,31
197,94
3,43
9,71
11,00
6,86
9,00
1,14
7,00
10,00
10,29
12,43
8,14
10,14
11,14
11,43
8,86
4,14
5,29
2,86
5,29
8,29
2,00
4,00
7,86
8,29
4,57
4,57
2,14
3,00
5,29
6,14
1,00
3,29
4,14
7,43
13,14
2,43
3,86
2,14
69,59
248,25
1770,33
993,96
675,17
476,45
525,37
294,89
668,06
154,90
227,48
125,28
26,35
63,31
1336,43
1377,74
1246,44
843,92
722,16
1164,65
814,57
509,07
550,38
426,44
465,84
122,02
1370,13
674,32
589,52
1166,82
668,88
574,30
730,85
236,18
1307,07
755,86
1603,88
155,14
49,41
135,57
117,38
126,91
172,40
65,82
272,02
VEGFR2(ng/ml) Tie-2 (ng/ml)
11,69
16,95
16,84
18,15
14,16
14,21
17,57
13,54
15,43
17,56
150,9
12,99
124,34
13,54
16,22
10,26
12,21
11,56
12,34
12,31
13,28
16,21
10,32
11,02
22,04
17,84
16,64
208,34
116,30
126,91
19,87
13,02
14,94
15,44
16,40
119,33
20,38
101,14
167,85
135,57
111,75
17,42
15,35
17,54
15,74
14,97
16,10
123,88
272,02
1169,58
302,34
17,06
390,28
181,05
211,37
146,62
284,15
159,82
125,59
129,94
131,60
123,12
124,50
E-Sel(ng/ml)
59,59
46,23
53,46
53,78
47,02
25,80
111,76
126,06
87,25
122,83
75,29
197,4
74,05
71,85
68,86
68,66
35,26
31,65
31,00
51,26
70,59
80,18
77,28
66,26
66,72
74,82
70,02
72,23
73,07
69,63
59,91
84,35
71,58
73,01
93,81
72,94
59,52
89,14
84,93
64,90
59,98
33,01
36,71
19,48
78,19
85,58
83,38
10,93
10,54
12,96
13,41
14,67
66,98
70,41
67,95
66,65
68,01
74,63
61,53
96,52
171,10
177,87
100,61
56,20
85,38
63,95
71,71
72,41
91,73
103,29
93,70
121,33
51,55
35,34
110,48
105,68
187,17
430,22
119,08
54,79
66,77
52,96
66,07
62,40
138,96
117,95
211,00
37
KL 58
KL 59
SM 60
SM 60
SM 60
SM 61
SM 61
SM 62
SM 62
SM 62
SM 62
SM 63
SM 63
FM 69
BL 02
BL 02
BL 02
BL 02
BL 02
CC 05
CC 05
EL 07
EL 07
EL 07
EL 07
EL 07
EM 08
EM 08
SA 18
SA 18
SM 19
SM 19
SM 19
SM 19
SM 21
SM 21
SM 21
BJ 30
BJ 30
BJ 30
BJ 30
LJ 31
LJ 31
LJ 31
HJ 33
LJ 35
LJ 35
LJ 35
LJ 35
FM 44
BM 45
BM 45
SK 55
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
33,29
32,29
28,71
30,43
33,86
28,86
30,43
32,14
35,57
36,86
37,71
32,14
35,14
32,86
33,00
34,71
35,00
35,43
36,86
37,14
40,00
31,86
35,14
35,71
37,71
40,00
27,43
35,57
32,00
38,00
30,29
31,29
37,14
38,57
30,00
39,43
42,29
23,71
26,29
30,29
34,86
41,57
41,71
42,71
36,43
32,14
34,00
34,43
37,43
29,71
32,29
34,00
32,86
3,14
2,14
0,43
2,14
5,57
0,57
2,14
3,43
6,86
8,14
9,00
3,43
6,43
3,43
9,86
11,57
11,86
12,29
13,71
11,14
14,00
6,00
9,29
9,86
11,86
14,14
1,29
9,43
378,18
111,35
54,14
51,87
53,24
208,34
328,56
13,00
14,43
6,71
16,14
19,00
0,00
2,57
6,57
11,14
16,71
16,86
17,86
9,29
6,86
8,71
9,14
12,14
5,71
5,71
7,43
5,14
222,72
338,74
502,54
610,20
890,95
326,42
135,07
635,18
1372,30
2531,26
1983,31
2037,67
1860,46
2216,22
29,61
148,38
1018,14
11,61
13,95
156,79
250,79
187,11
220,47
205,31
162,86
197,94
6,71
12,71
6,14
7,14
Tab.5: Absolutwerte im Serum
38
1808,27
2001,79
1263,58
2462,77
2516,04
1561,48
1604,96
1318,20
2272,76
2008,32
1329,90
1048,32
1492,98
624,31
24,33
23,22
21,82
14,95
16,61
13,24
14,17
16,11
22,58
26,26
15,60
14,99
18,16
15,97
14,83
14,54
15,53
49,41
137,53
21,05
17,74
19,54
21,75
16,49
16,06
15,97
18,98
22,21
1751,16
73,64
59,48
205,75
172,40
19,15
19,05
16,45
35,85
35,58
208
278,08
139,04
211,37
520,67
317,50
114,34
13,08
15,47
12,78
14,43
15,35
331,59
21,04
18,65
54,73
59,13
50,71
55,63
58,94
60,69
62,44
111,25
52,65
59,26
81,89
107,86
112,94
104,12
114,23
121,21
79,57
94,49
111,05
117,67
114,59
132,7
104,06
109,46
105,31
113,24
135,48
123,21
100,90
75,47
159,02
169,13
145,21
90,70
82,08
65,94
67,88
67,17
42,93
88,11
112,54
80,73
64,94
148,96
276,27
252,87
158,69
122,60
188,30
154,46
115,41
164,86
102,4
89,08
80,27
62,64
147,90
184,52
104,88
77,48
104,36
82,25
88,02
92,63
77,72
149,7
94,25
191,15
149,03
185,64
140,40
103,12
123,70
227,91
88,50
286,04
76,16
57,41
275,56
194,64
196,05
147,55
67,48
62,12
49,29
63,95
144,45
612,78
Mediane pro Woche Gestationsalter (aus den Werten aller Kinder)
VEGF(pg/ml)
Woche
Median
ROP 0
23
25
26
748
27
VEGFR- 1(pg/ml)
Median
ROP 0
Woche
355
23
23
426
25
25
396
26
26
314
27
27
28
800
1016
28
29
738
929
29
509
30
381
256
30
31
338
546
31
32
1071
367
33
866
34
706
35
ROP 1
VEGFR-2(ng/ml)
ROP 1
Woche
Median
ROP 0
ROP 1
14
15
28
278
29
14
15
251
251
30
11
15
76
224
31
17
14
32
205
368
32
13
17
601
33
123
340
33
11
15
592
34
300
345
34
13
15
297
343
35
175
128
35
15
17
36
486
264
36
199
293
36
15
15
37
450
477
37
144
482
37
12
17
38
353
265
38
174
1059
38
15
15
39
545
722
39
184
393
39
14
15
40
326
886
40
244
230
40
13
15
41
503
243
41
593
145
41
15
42
213
276
42
178
42
43
411
Tie-2 (ng/ml)
Woche
43
Median
ROP 0
727
E-Selectin (ng/ml)
ROP 1
Woche
23
23
25
25
26
26
26
58
43
28
29
35
46
29
30
45
46
30
16
31
43
60
31
117
96
32
43
49
32
80
281
33
42
61
33
46
67
34
42
64
34
43
65
35
75
77
35
46
58
36
73
85
36
35
19
37
58
67
37
47
38
73
86
38
24
72
39
54
77
39
33
90
40
70
84
40
19
136
41
74
74
41
7
130
42
83
43
19
ROP 1
28
43
16
20
Median
ROP 0
27
42
27
43
43
40
66
133
83
86
43
Tab.6: Mediane pro Woche (Gestationsalter) von allen Kindern im Plasma
39
Mediane pro Woche Lebensalter (aus den Werten aller Kinder)
VEGF(pg/ml)
Median
VEGFR-1(pg/ml)
Median
ROP 0
ROP 1
Woche
ROP 0
Woche
ROP 0
0
310
223
0
619
0
14
1
772
389
1
509
1
40
2
1054
992
2
152
2
89
3
836
497
3
327
507
3
52
222
4
668
926
4
257
200
4
85
136
5
780
592
5
133
416
5
55
179
6
568
367
6
170
341
6
30
363
7
455
682
7
261
293
7
34
53
8
546
458
8
543
246
8
24
75
108
19
9
283
696
9
217
10
506
265
10
178
11
509
475
11
137
12
292
385
12
13
828
652
13
14
213
1331
14
15
448
16
391
17
18
19
ROP 1
Median
Woche
VEGFR2(ng/ml)
ROP 1
9
31
10
33
482
11
37
108
1063
12
28
120
130
308
13
36
115
393
14
15
75
15
72
16
222
16
132
375
17
133
17
85
151
18
181
18
178
19
Median
19
Tie-2 (ng/ml)
Median
Woche
ROP 0
ROP
1
0
9
14
1
14
2
12
2
49
3
11
15
3
38
47
4
15
15
4
75
46
5
14
15
5
62
41
6
12
16
6
45
55
7
12
14
7
58
61
8
15
15
8
89
64
9
14
16
9
72
82
10
19
10
50
11
15
18
11
66
12
16
15
12
55
13
16
16
13
80
14
15
14
77
15
15
15
78
16
24
16
131
17
18
17
98
18
18
31
19
19
Woche
ROP 0
0
31
1
44
Tab.7: Mediane pro Woche (Lebensalter) von allen Kindern im Plasma
40
E-Sel(ng/ml)
ROP 1
63
75
59
Auswertung mit Kernel smoothing
Durch die Methode des Kernel smoothing (Kernglättungsverfahren) konnten Kurven für die
beiden Gruppen erstellt werden, die miteinander vergleichbar sind.
Beim Kernel smoothing werden zur Auswertung nicht nur die Werte zum jeweiligen
Zeitpunkt, sondern auch benachbarte Punkte auf der Zeitachse herangezogen. Je näher die
Punkte am tatsächlichen Zeitpunkt liegen, desto stärker ist deren Einfluss. Es gibt
verschiedene Stärkefunktionen, z.B. den Dreieckskern oder die Normalverteilungskurve (hier
verwendet). Es wird über den benachbarten Punkten ein gewichtetes Mittel gebildet. Die
Stufen b=1 bis b=5 sind breiter werdende Kurven. Je breiter die Kurve, desto stärker werden
auch entferntere Punkte in die Auswertung miteinbezogen, desto glatter wird auch die Kurve.
Bei b=1 ist die Kurve steiler, bei b=5 flacher. B =5 schließt ein fünfmal so großes Zeitfenster
ein wie b=18. B=3 entspricht ungefähr einer Bandbreite von 2,1 Tagen (Standarddeviation).
Es wurden Kurven jeweils für das absolute Alter (Lebensalter, LA) und für das
Gestationsalter (GA) der Kinder bei Abnahme der Probe erstellt. Im Folgenden werden
beispielhaft an VEGF die Kurven b=1 und b=5 gezeigt. Später werden für alle Faktoren nur
die Kurven mit b=3 gezeigt, da sie unserer Meinung nach am besten die Tendenzen
repräsentieren.
Die roten, ausgefüllten Punkte und die rote Linie stehen für die Gruppe ROP 1, die blauen,
nicht ausgefüllten Punkte und die blaue Linie stehen für die Gruppe ROP 0.
Abb.11: VEGF Lebensalter mit b=1 und b=5
41
Abb. 12a VEGF
Bei der Auswertung der Plasmaspiegel von sVEGF zeigen sich keine wesentlichen Unterschiede zwischen ROP 1 und ROP 0
über den gesamten Zeitverlauf.
Abb.12b VEGFR-1
Für sVEGFR-1 zeigt sich in beiden Gruppen kein wesentlicher Unterschied. ROP 1 hat nur leicht erhöhte Werte im
Vergleich zu ROP 0. In keiner der beiden Gruppen zeigt sich eine erwähnenswerte Veränderung im Zeitverlauf.
42
Abb.12c VEGFR-2
Die sVEGFR-2-Spiegel sind konstant höher bei ROP 1 als bei ROP 0. Da die Konzentration bei ROP 1 ansteigt, bei ROP 0
jedoch gleich bleibt, nimmt der Unterscheid zwischen den beiden Gruppen mit der Zeit zu.
Abb.12d Tie-2
Die Plasmaspiegel von sTie-2 sind durchgehend höher bei ROP 1 als bei ROP 0.
43
Abb.12e
Die Plasmaspiegel von sE-Selectin sind durchgehend höher bei ROP 1 als bei ROP 0. Die Werte der Gruppe ROP 0 sinken
im Verlauf sogar ab, die Spiegel bei ROP 1 bleiben jedoch gleich.
Abb.12a-e: Kernel smoothing (b=3) für sVEGF, sVEGFR-1, sVEGFR-2, sTie-2, sE-Selectin
Statistische Auswertung
Aufgrund des Studiendesigns mit kleinem Kollektiv und unregelmässigen Blutabnahmen war
eine statistische Auswertung schwierig. Um die Daten trotzdem auswerten zu können,
wurden Untergruppen mit Wertepaaren gebildet. Da eine ROP meist um die 34. Woche
auftritt6, wurde jeweils die Messung eines Kindes, die am nächsten an der 32. Woche lag mit
der am nächsten an der 36. Woche verglichen. Wir verglichen innerhalb der Gruppen ROP 1
und ROP 0 sowie zwischen den Gruppen. Die Ergebnisse wurden mittels ANOVA mit
wiederholten Messungen statistisch ausgewertet.
Die absoluten Werte für alle Faktoren schwankten stark innerhalb der Gruppen ROP 1 und
ROP 0 sowie zwischen den Gruppen. Die Werte sind in Tabelle 4 und 5 aufgeführt. In Tabelle
8 werden die mittleren Werte sowie die Ober- und Untergrenzen für jede Woche in Bezug auf
das Gestationsalter bei ROP 1 und ROP 0 gezeigt.
44
Median (min-max) mit 32 Wochen Gestationsalter
Median (min-max) mit 36 Wochen Gestationsalter
ROP 0
ROP 1
ROP 0
ROP 1
VEGF-A
658 pg / ml (49-2138)
904 pg / ml (141.3-2344.2)
437 pg / ml (44.7-2398.3)
344 pg / ml (66.1-1349)
sVEGFR-1
261 pg / ml (52.5-416.9)
131 pg / ml (74.1-616.6)
181 pg / ml (49-478.6)
115 pg / ml (74.1-616.6)
sVEGFR-2
14 ng / ml (9.3-20.9)
14 ng / ml (12-16.6)
14 ng / ml (9.1-24.5)
15 ng / ml (7.9-31.6)
sTie2
44 ng / ml (28.8-81.3)
49 ng / ml (44.7-91.2)
68 ng / ml (31.6-97.7)
79 ng / ml (31.6-131.8)
sE-Selectin
89 ng/ml (11.88-362.97)
53 ng/ml (25.18-135.68)
38 ng/ml (14,13-115,06)
58 ng/ml (29.27-151.84)
Tab. 8: Mediane der Plasmakonzentrationen der Angiogenesefaktoren
Die jeweiligen Plasmaproben aller Kinder, die am nächsten bei 32 und 36 Wochen Gestationsalter lagen, wurden zwischen
den Kindern mit und denen ohne ROP gemittelt.
Die statistische Auswertung der Untergruppen (32. und 36. Woche) ergab für VEGF und
sVEGFR-1 keine signifikante Änderung der Plasmaspiegel zwischen der 32. und der 36.
Woche.
Der Anstieg der sVEGFR-2 Plasmaspiegel bei ROP 1 war im Vergleich mit ROP 0 in der 36.
Woche nicht relevant.
Ein deutlicher Anstieg zwischen der 32. und der 36. Woche wurde bei den sTie-2-Spiegeln in
beiden Gruppen beobachtet (p=0,03). Allerdings beschränkte sich dieser Anstieg nicht nur auf
die ROP 1-Gruppe, sondern zeigte sich auch bei ROP 0.
Ein statistisch signifikanter Unterschied (p=0,062)zwischen ROP 1 und ROP 0 konnte bei
sE-Selectin beobachtet werden.
45
Klinische Parameter
Parallel zu den Augenuntersuchungen wurden folgende klinische Parameter erfasst:
•
Gestationsalter bei Geburt
•
Geburtsgewicht
•
Geschlecht
•
Nabelschnur-pH
•
niedrigster pH in den ersten 72 Stunden
•
niedrigster MAD in den ersten 72 Stunden
•
Katecholamintherapie
•
Surfactantgabe
•
Sepsis in der ersten Lebenswoche
•
Beatmungszeit in Tagen
•
O2-Gabe >40% in Tagen während der ersten 4 Wochen
•
Bronchopulmonale Dysplasie (BPD)
•
Transfusionen (ml in der ersten Woche)
•
Medikamentöser (Indomethazin- und/oder Ibuprofengabe) oder operativer Verschluss des
Ductus arteriosus Botalli
•
Sättigungsabfälle/24h in den ersten 7 Tagen nach Extubation
•
Bradykardien/24h in den ersten 7 Tagen nach Extubation
•
Hirnblutung
•
NEC-OP
•
Outcome
Tabelle 9: Klinische Parameter
In unserer Studie wurden insgesamt 19 klinische Parameter erfasst. Hierbei zeigten sich
deutliche Unterschiede zwischen den Kindern mit und ohne ROP. Wie bereits in früheren
Studien waren die Kinder, die später eine ROP entwickelten, deutlich jünger, leichter und
kränker als die Kinder, die keine ROP entwickelten.
Die Kinder mit ROP kamen durchschnittlich früher (nach 25,8 vs. 28,71
Schwangerschaftswochen) und mit geringerem Geburtsgewicht (710g vs. 1090g) auf die Welt
46
als die Kinder ohne ROP. Sie waren länger beatmungspflichtig (16 vs 0,5 Tage) und hatten in
den ersten 24 Stunden nach Extubation mehr Sättigungsabfälle (11 vs. 5). In der ersten
Lebenswoche erhielten zudem die Kinder mit ROP Transfusionen, während die Kinder ohne
ROP keine Transfusionen brauchten (18 ml/kgKG versus 0 ml/kgKG).
Die Kinder, die eine ROP entwickelten, waren bei Geburt deutlich schwächer und unreifer,
was die höhere Katecholaminbedürftigkeit (52% vs. 17%) und die nötige Surfactantgabe
(81% vs. 36%) zeigt. 48% der ROP- Kinder hatten bei Geburt oder in der ersten Woche eine
Sepsis (vs. 15% der Kinder ohne ROP) und häufig einen offenen Ductus arteriosus (62%
medikamentös behandelt, 24% operiert versus 26% und 0%).
33% der Kinder mit ROP hatten als weitere Komplikation eine nekrotisierende Enterokolitis
(NEC) mit nachfolgender Operation, von den Kindern ohne ROP nur 4%.
ROP ja
n=21
min-max
Mittel
ROP nein
n=42
Median
min-max
Mittel
Median
Gestalter (Wo)
23,14-29,29 25,54
25,86
25,57-32,57
28,82
28,71
GeburtsGew (g)
450-1020
739
710
490-1990
1129
1090
NSpH
6,89-7,4
7,3
7,32
7,03-7,38
7,29
7,3
npH72
6,79-7,33
7,2
7,24
7,03-7,39
7,26
7,255
nMAD72
12,0-39
23,5
23
17-39
28
29
Intub(d)
0-82
26
16
0-28
3
0,5
O2>40%(d/4Wo)
0-14
2,7
1
0-7
1,1
0,5
SA/24h in7dpostextub
1,0-36
13
11
0-20
6,3
5
Brady/24h in7dpostextub 0-30
6,8
6
0-21
6,9
7
Trans1Wo(ml/kg)
19
18
0-50
6
0
ROP ja
ja
0-50
n=21
ROP nein
n=42
nein
% ja
ja
nein
% ja
Katecholamine 11
10
52
8
39
17
Surfactant
17
4
81
17
30
36
Sepsis
10
11
48
7
40
15
Ductus Medis
13
8
62
12
35
26
Ductus OP
5
16
24
0
47
0
NEC-OP
7
14
33
2
45
4
47
n=21
ROP ja
BPD(°)
n=42
nein
Grad 1 und 2
> Grad 3
nein
Grad 1 und 2
> Grad 3
9
8
6
35
10
2
12
2
42
5
0
Hirnblutung(°) 9
Geschlecht
ROP nein
ROP ja
n=21
ROP nein
n=42
männlich
weiblich
männlich
weiblich
13
8
18
29
Um die beiden Gruppen ohne den möglicherweise verfälschenden Effekt der
unterschiedlichen Gestationsalter und Geburtsgewichte besser miteinander vergleichen zu
können, wurden die Kinder ohne ROP, deren Gestationsalter bei Geburt höher als das des
ältesten Kindes mit ROP war (29,29 Wochen), herausgenommen. Hier zeigte sich ebenfalls
deutliche Unterschiede hinsichtlich des Gestationsalters, des Geburtsgewichtes, der
Beatmungszeit sowie weiterer Erkrankungen.
ROP ja
n= 21
ROP nein
min-max
Median min-max
Median
Gestalter (Wo)
23,14-29,29
25,86
25,57-29,14
27,86
GeburtsGW (g)
450-1020
710
610-1440
990
NSpH
6,89-7,4
7,32
7,03-7,37
7,30
npH72
6,79-7,33
7,24
7,13-7,39
7,24
nMAD72
Dez 39
23
18-37
25
Intub(d)
0-82
16
0-28
3
O2>40%(d/4Wo)
0-14
1
0-7
1
SA/24h in7dpostextub
13150,00
11
0-20
9,5
Bradyk/24hin 7dpostextub
0-30
6
0-21
7
ROP ja
n= 21
ja
nein
% ja
ja
nein
% ja
Katecholamine 11
10
52
7
18
28
Surfactant
17
4
81
13
12
52
Sepsis
10
11
48
4
21
16
Ductus Medis
13
8
62
8
17
32
Ductus OP
5
16
24
0
25
0
NEC-OP
7
14
33
0
25
0
48
ROP nein n=25
n=25
ROP ja
n= 21
ROP nein n=25
männlich
weiblich
männlich
weiblich
13
8
17
8
ROP ja
n= 21
ROP nein n=25
nein
ja,jeder Grad
nein
ja,jeder Grad
9
12
17
8
Hirnblutung(°) 9
12
22
3
Geschlecht
BPD(°)
Betrachtet man die 21 Kinder mit ROP näher und unterteilt sie in zwei Gruppen, eine mit
kränkeren, eine mit gesünderen Kindern, so fällt auf, dass die kränkeren Kinder deutlich
schwerwiegendere Augenbefunde aufweisen als die gesünderen Kinder.
„Krank” wird folgendermaßen definiert: Vorhandensein einer Sepsis und/oder Gabe von
Katecholaminen, mehr als 15 Tage Beatmung, mehr als 2 Tage mit mehr als 40% Sauerstoff
und eine BPD von mehr als Grad I.
Kranke Kinder
Gest.alter
Geb.gew
Katecholamin
23+1/7
500
Ja
26
890
Ja
25+6/7
980
25+2
450
24+1
620
Ja
23+2/7
490
23+5
Sepsis
TageIntub>15
TageO2>40%
BPD>1°(Grad)
Augenbefund
52
9
3
II und III,+d
Ja
82
9
Ja
20
1
2
II,keine +d
82
7
3
III,+d
Ja
70
14
4
III,++,Laser
Ja
Ja
40
4
4
I-II,+d
520
Ja
Ja
34
0
2
III,+d,Laser
23+5/7
630
Ja
Ja
37
0
3
I-II,keine +d
25+2/7
820
Ja
Ja
2
4
III,(+)d
24
790
Ja
40
1
2
III,keine +d
26+4
610
Ja
18
3
III,+d,Laser
26+5
640
16
1
III,keine+d,Laser
ja
III,+d
75% dieser kranken Kinder hatten eine ROP III, 33% der kranken Kinder sogar mit
Laserbehandlung. Die restlichen 25 % hatten eine ROP II. (+d= plus disease)
49
Weniger kranke Kinder
Gest.alter
Gebgew.
29+2
710
26+1
945
26+1
840
24+6
810
27+1
Katecholamine
TageIntub>15
TageO2>40%
0 (0)
0
0 (8)
0
0 (14)
2
II, keine+d
0 (6)
0
II, keine+d
1020
0 (3)
1
25
700
0(4)
0
Grad ?kein Laser
26+1
950
0 (7)
1
III,Leichte +d
26+1
950
0 (3)
1
II, keine+d
27+5
650
0 (0)
0
II, keine+d
Ja
Sepsis
Ja
ja
Ja
BPD>1°(Grad)
Augenbefund
II, keine+d
1
1
I, keine+d
II, keine+d
Die weniger kranken Kinder hatten überwiegend (zu 67 %) eine ROP II. Die restlichen
Kinder hatten eine ROP III (11%), eine ROP I (11%) bzw. keine Einteilung der ROP (11%).
Eine statistische Auswertung erfolgte nicht, da auch hierfür das Patientenkollektiv zu klein
war. Ein Zusammenhang zwischen der Höhe der Werte der Faktoren im Blut und den
klinischen Parametern konnte nicht eindeutig hergestellt werden, da zu viele mögliche
Einflussfaktoren eine Rolle spielen. Allerdings konnten wir die Ergebnisse früherer Studien
bestätigen, wo geringes Gestationsalter, geringes Geburtsgewicht, Dauer einer Sauerstoffgabe
mit einem resultierenden PO2> 89 mmHg, respiratorische Insuffizienz und Sepsis als
gesicherte Risikofaktoren für die Ausbildung einer ROP gefunden wurden.
50
5. Diskussion
Dies ist die erste klinische Studie, in der über mehrere Wochen nach Geburt Messungen von
löslichen Angiogenesefaktoren aus Plasma und Serum von Frühgeborenen durchgeführt
wurden und nach einer möglichen Korrelation mit einer ROP gesucht wurde. Kinder mit ROP
hatten höhere Plasmaspiegel für löslichen VEGFR-2 (sVEGFR-2), lösliches Tie-2 (sTie-2)
und lösliches E-Selectin (sE-Selectin) als Kinder ohne ROP. Die löslichen VEGF- und
VEGFR-1- Spiegel (sVEGF bzw. sVEGFR-1) waren in beiden Gruppen ähnlich. Der Spiegel
von löslichem Tie-2 stieg zwischen der 32. und 36. Woche Gestationsalter unabhängig von
der Entwicklung einer ROP in beiden Gruppen signifikant an. Beim löslichen E-Selectin
zeigte sich ein signifikant höherer Plasmaspiegel bei den Kindern mit ROP im Vergleich zu
den Kindern ohne ROP.
Die Diskussion bezieht sich auf die Ergebnisse der Plasmauntersuchungen, da im Vergleich
zum Serum mögliche Verfälschungen durch Freisetzung (vor allem von VEGF) aus
aktivierten Thrombozyten53 vermieden werden. Die Ergebnisse aus Plasma und Serum
stimmen jedoch weitestgehend überein. Geringe Unterschiede zwischen Plasma- und
Serumspiegeln bei löslichem VEGFR-1 und löslichem E-Selectin führen wir auf
Messungenauigkeiten zurück, die aufgrund der geringen Probenanzahl nicht ausreichend
ausgeglichen werden konnten.
Bisher wurden Plasmaspiegel von Angiogenesefaktoren bei Neugeborenen nur für sVEGF
und sE-Selectin beschrieben.
Die sVEGF-Plasmaspiegel von termingeborenen Kindern variierten zwischen 200 und 450
pg/ml während den ersten Lebenswochen, um dann innerhalb weniger Monate nach der
Geburt schnell auf Erwachsenenwerte von 10-110 pg/ml abzufallen26. Unmittelbar nach der
Geburt steigt der sVEGF-Spiegel bei neugeborenen Kindern signifikant an. Dies lässt sich am
ehesten durch die physiologische Gefäßentwicklung zu diesem Zeitpunkt erklären56. Auch
könnten eine vorübergehende Hypoxie bei der Geburt oder plötzliche hämodynamische
Schwankungen nach der Geburt wie die Zunahme der pulmonalen Durchblutung zu diesem
Anstieg beitragen49. Die hohen sVEGF-Werte verdeutlichen möglicherweise die zunehmende
Anpassung des Körpers an das extrauterine Leben57.
Interessanterweise fanden sich im Vergleich dazu bei Frühgeborenen nach der Geburt relativ
niedrige und stabile Plasmaspiegel für sVEGF von 48+-6 pg/ml während der ersten sieben
51
Lebenstage49. Im Vergleich zu den beschriebenen Werten von frühgeborenen und
termingeborenen Kindern waren die mittleren sVEGF- Plasmaspiegel der Frühgeborenen in
unserer Studie unabhängig von der Entwicklung einer ROP höher und zeigten große
Schwankungsbreiten. Sie bewegten sich zwischen 48,62 und 2614,24 pg/ml mit einem
Median von 553,19 pg/ml (Kinder ohne ROP) bzw. 56,96 und 2348,60 pg/ml mit einem
Median von 475,30 pg/ml (Kinder mit ROP). Dabei muss allerdings beachtet werden, dass die
Messungen über einen Zeitraum von 8 bis 16 Wochen ab der Geburt erfolgten, nicht nur in
der ersten Lebenswoche. Auffällig ist, dass es sowohl bei Kindern mit als auch ohne ROP
relativ konstante sVEGF-Verläufe auf hohem Wertniveau gab. Ebenso gab es Kinder, die
durchgehend niedrigere Werte hatten. Die physiologische Erhöhung der Plasma-sVEGFSpiegel während der ersten Lebenswochen könnte eine mögliche zusätzliche pathologische
Erhöhung aufgrund der Entwicklung einer ROP verdecken.
Erhöhte sE-Selectin-Spiegel im Nabelschnurblut bei Frühgeborenen wurden in einer Studie
über bronchopulmonale Dysplasie (BPD) bei denjenigen gemessen, die später eine BPD
entwickelten40. In unserer Studie lagen die Plasmaspiegel der Kinder mit ROP ab der Geburt
deutlich über denen der Kinder ohne ROP (19 bis 495 ng/ml, Median 83,50 ng/ml versus 6 bis
209 ng/ml, Median 38,95). Ein weiterer Anstieg im Verlauf blieb jedoch in beiden Gruppen
aus. Plasmakonzentrationen der VEGF-Rezeptoren und Tie-2 wurden bisher bei Kindern
nicht gemessen.
Bei gesunden Erwachsenen wurden sVEGF-Plasmaspiegel zwischen 10 und 110, im Mittel
11 pg/ml61 und VEGFR-1-Spiegel zwischen 0 und 0,310 ng/ml6 bzw. zwischen 4 und 140
(im Mittel 14) ng/ml61 beschrieben. Die mittleren sVEGFR-2-Spiegel liegen bei 8,264 pg/ml
+-1,52512, die mittleren sTie-2-Spiegel zwischen 10 und 12 (im Mittel 10,8) ng/ml61. Die
sE-Selectinspiegel bei gesunden Erwachsenen liegen zwischen 43 und 80 ng/ml (Median 58
ng/ml)3.
Im Vergleich dazu waren in unserer Studie unabhängig von einer ROP jeweils die mittleren
Plasmakonzentrationen von sVEGF, sVEGFR-1, sVEGFR-2 und sTie-2 deutlich erhöht.
Diese Unterschiede lassen generell höhere Plasmaspiegel bei Neugeborenen als bei
Erwachsenen vermuten, ähnlich wie bei sVEGF. Die gleiche postnatale Hochregulation und
der spätere Abfall auf Werte wie bei Erwachsenen, die für sVEGF beschrieben wurde, könnte
bei seinen Rezeptoren vorliegen.
52
Bei sE-Selectin liegen die Werte der Kinder mit ROP deutlich über denen von gesunden
Erwachsenen, die Werte der Kinder ohne ROP jedoch eher darunter, so dass hier tatsächlich
ein Unterschied aufgrund der ROP vermutet werden kann.
Bisher sind beim Menschen Wachstumsfaktoren in Bezug auf eine hypoxiebedingte
Retinopathie besonders bei Patienten mit diabetischer Retinopathie untersucht worden. Die
Parallelen zur ROP haben wesentlich zum Entwurf dieser Studie beigetragen.
Die sVEGF-Plasmawerte von Patienten mit proliferativer diabetischer Retinopathie (im
Mittel 350 (200-581) pg/ml) lagen deutlich über denen von gesunden Kontrollpersonen (im
Mittel 50 (16-133) pg/ml)53,54.
Für sVEGFR-1 wurden bei Diabetikern mit einer proliferativen Retinopathie weder vor noch
nach einer Lasertherapie signifikant höhere Plasmawerte gefunden als bei Diabetikern ohne
Retinopathie oder gesunden Kontrollpersonen53. Über sVEGFR-2 bei diabetischer
Retinopathie liegen bisher keine Daten vor.
Bei Untersuchungen der sTie-2-Plasmaspiegel bei Patienten mit verschiedenen Stadien einer
diabetischen Retinopathie fanden sich deutlich niedrigere Werte bei den Diabetikern als bei
den gesunden Kontrollpersonen54.
Bei Patienten mit NIDDM wurden vor Beginn einer intensivierten Insulintherapie signifikant
höhere Serumwerte für sE-Selectin gemessen (63-115 ng/ml, Median 87 ng/ml) als bei
gesunden Kontrollpersonen (43-80 ng/ml, Median 58 ng/ml). Nach 15 Tagen Therapie waren
die Werte signifikant abgefallen (48-85 ng/ml, Median 64 ng/ml) und lagen damit im Bereich
der gesunden Personen3. Innerhalb einer Patientengruppe war vor allem bei denjenigen mit
proliferativer diabetischer Retinopathie ein hoher Serum-sE-Selectinspiegel zu messen63.
Die Rolle von membranständigem VEGF, seinen Rezeptoren und Tie-2 wurde bisher meist an
Tiermodellen studiert. Wiederholte Sauerstoffschwankungen zwischen 10% und 50% ließen
die retinale VEGF- Expression bei Mäusen ansteigen. Von den verschiedenen Isoformen
wurde vor allem die pathologische Form VEGF 164 exprimiert58.
VEGF und VEGFR-2 konnten vermehrt in Blutgefäßen, Ganglienzellen und der inneren
Kernschicht der Retina bei Ratten mit ROP73 sowie bei neugeborenen Katzen77 nachgewiesen
werden, wohingegen VEGFR-1 nicht besonders erhöht war73. Ähnlich zeigte sich in einem
Mausmodell für ischämieinduzierte retinale Neovaskularisation, dass in der hypoxischen
Retina in den Gefäßen nahe den avaskularisierten Gebieten VEGFR-2 weiter verbreitet und
53
deutlich höher war als bei Kontrolltieren, während die Konzentration und Ausbreitung von
VEGFR-1 praktisch keinen Unterschied zu den Kontrolltieren79 aufwies.
Die VEGFR-2 Expression scheint überwiegend mit pathologischer Neovaskularisation und
weniger mit der physiologischen Gefäßentwicklung nach der Geburt einherzugehen30,59. Dies
könnte bedeuten, dass die Bestimmung von VEGFR-2 sensitiver wäre, um eine ROP
vorauszusagen als die von VEGF selbst.
In einem Mausmodel für ischämieinduzierte Retinopathie wurde Tie-2 an der Basis der neu
geformten Blutgefäße und in der unmittelbaren Umgebung in Retina und Chorioidea
exprimiert. Nach Hemmung der Tie-2-Wirkung konnte die retinale Neovaskularisation
deutlich vermindert werden22. Tie-2 war zudem erhöht bei induzierter ROP bei Ratten73.
Über E-Selectin liegen bisher keine Daten aus ROP-Tiermodellen vor.
Angiogenesefaktoren in menschlichen Augenflüssigkeiten wurden bisher nur bei
fortgeschrittenen Stadien der ROP untersucht. Eine Studie fand heraus, dass VEGF in
subretinaler Flüssigkeit bei ROP Stadium 4 erhöht war (44.16 ± 18.72 ng/ml), in Stadium 5
jedoch deutlich reduziert (14,77 ± 14,01 ng/ml)48. In einer anderen Studie war bei 38 Fällen
von ROP Stadium 5 die VEGF- Immunreaktivität in den vaskularisierten Zonen der
fibrovaskulären Membranen zum Zeitpunkt der Vitrektomie dort deutlich erhöht, wo VEGF
mit Tie-2 zusammen gebildet wurde. Die Autoren schlossen daraus, dass VEGF und
Angiopoietin2-Tie-2 Interaktionen eine wichtige Rolle in der Pathogenese der ROP spielen85.
Eine Hochregulation von Tie-2 wurde auch in menschlichen epiretinalen Membranen von
Augen mit ischämischen Retinopathien gefunden80.
In Übereinstimmung mit Studien über ROP bei Tiermodellen und Augenflüssigkeiten bei
proliferativen Retinopathien konnten wir eine Erhöhung der Plasmaspiegel von sVEGFR-2,
sTie-2 und sE-Selectin bei Kindern mit ROP zeigen. Unsere Ergebnisse über nicht erhöhte
VEGFR-1- Plasmaspiegel bei ROP unterstützen die Ergebnisse früherer Studien, wo weder
membrangebundener noch freier VEGR-1 bei ROP-Tiermodellen bzw. im Plasma von
Patienten mit proliferativer diabetischer Retinopathie signifikant erhöht waren. Unter
Berücksichtigung der verschiedenen Mechanismen der VEGF-Rezeptor-Expression wird
daher nur eine untergeordnete pathophysiologische Bedeutung des VEGFR-1 vermutet53.
Die Rolle des E-Selectin bei entzündlichen bzw. neoproliferativen Prozessen, vorbeschrieben
bei der bronchopulmonalen Dysplasie, wird durch die erhöhten sE-Selectinspiegel bei
Kindern mit ROP unterstrichen.
54
Die erwartete Erhöhung des Plasma-sVEGF bei Kindern mit ROP im Vergleich zu Kindern
ohne ROP konnten wir nicht nachweisen. Ein Grund dafür könnte die physiologische
Erhöhung des VEGF während der ersten Lebenswochen sein, welche eventuelle
pathologische Anstiege verschleiern könnte. Möglicherweise ist aber auch der Grad der ROP
bei unseren Patienten zu niedrig, um eine Erhöhung des Plasmaspiegels zu zeigen, zumal nur
4 von 21 Kindern eine threshold ROP hatten und gelasert werden mussten. Da VEGF nicht
nur bei ROP exprimiert wird, sondern auch von anderen Faktoren wie der BPD oder
zusätzlicher Sauerstofftherapie verstärkt und beeinflusst wird77, könnte man auch vermuten,
dass beide Gruppen von Frühgeborenen pathologisch erhöhte sVEGF-Plasmawerte hatten und
daher ein signifikanter Unterschied fehlte.
In den untersuchten klinischen Daten zeigte sich, dass die Kinder, die eine ROP entwickelten,
durchweg früher und leichter auf die Welt kamen und wesentlich häufiger und ernsthafter
krank waren als die Kinder ohne ROP. In Übereinstimmung mit früheren
Untersuchungen64,14,81 konnten auch bei uns geringes Gestationsalter, geringes
Geburtsgewicht, Dauer einer Sauerstoffgabe mit einem resultierenden PO2 > 89 mmHg,
respiratorische Insuffizienz und Sepsis als Risikofaktoren bestätigt werden.
Schlussfolgerung
Diese erste Studie über Angiogenesefaktoren im Plasma und Serum von Frühgeborenen lässt
einen Zusammenhang zwischen der ROP und Plasmakonzentrationen von angiogenen
Faktoren im Blut vermuten. Die Ergebnisse zeigen, dass Plasma-sVEGFR-2, -sTie-2 und -sESelectin bei der ROP wohl sensitivere Marker einer pathologischen Angiogenese sind als z.B.
sVEGF, welches in den ersten Wochen allein durch die Frühgeburtlichkeit stark erhöht zu
sein scheint. Aufgrund der unregelmäßigen Blutabnahmen und der meist sehr niedrigen
Mengen an Einzelproben, bedingt durch die Bindung an Restblut von bereits erfolgten
Blutabnahmen, sind die Auswertungen nur bedingt aussagekräftig. Ein weniger
eingeschränktes Studiendesign mit regelmäßigen, standardisierten Blutabnahmen wird nötig
sein, um einen möglichen prädiktiven Wert für die Entwicklung einer ROP bestätigen zu
können.
55
6. Quellenverzeichnis
1
Adamis et al, Am J Ophthal, Oct 1994, 118: 445-450: Increased vascular endothelial growth factor levels in the
vitreous of eyes with proliferative diabetic retinopathy
2
Aiello et al, New Engl J of Med, Dec 1994, Vol. 331:1480-1487: Vascular endothelial growth factor in ocular
fluid of patients with diabetic retinopathy and other retinal disorders
3
Albertini et al, Diabetes Care, June 1998, Vol. 21 No.6: Elevated Concentrations of Soluble E-Selectin and
Vascular cell Adhesion Molecule-1 in NIDDM
4
Aus der Einleitung zum E-Selectin Assay Nr. BBE2B von R&D Systems Europe
5
Aus der Einleitung zum Tie-2 Assay Nr. DTE 200 von R&D Systems Europe
6
Barleon B et al, Angiogenesis 2001, 4(2):143-54: Soluble VEGFR-1 secreted by endothelial cells and
monocytes is present in human serum and plasma from healthy donors
7
Barleon B et al, Cancer Research 1997, 57(23):5421-5: Vascular endothelial growth factor up-regulates its
receptor fms-like tyrosine kinase 1 (FLT-1) and a soluble variant of FLT-1 in human vascular endothelial cells
8
Betensky RA, Stat Med 1997, 16(21):2429-45: Local estimation of smooth curves for longitudinal data
9
Campbell K, Med J Aust 2, 1951: Intensive oxygen therapy as a possible cause of retrolental fibroplasia: a
clinical approach
10
Cryotherapy for Retinopathy of Prematurity Cooperative Group. Multicenter Trial of Cryotherapy for ROP,
Arch Ophthalmol. 2001, 119:1110-1118: Ophthalmological outcomes at 10 years
11
Dale et al, Pediatrics April 1987, Vol.79 No.4, 489-500: Tocopherol Efficacy and Safety for Preventing
Retinopathy of Prematurity: A Randomized, Controlled, Double-Masked Trial
12
Ebos et al, Mol Cancer Res 2004, 2(6): Angiogenesis, Metastasis, and the cellular microenvironment. A
naturally occurring soluble form of vascular endothelial growth factor receptor 2 detected in mouse and human
plasma
13
ETROP Group, Arch Ophthalmol. 2003, 121:1684-1696: Revised Indications for the Treatment of
Retinopathy of Prematurity
14
Fomina et al, St. Petersburg, Russia, Abstract zum Vortrag bei EPOS 2003 in Portugal. Keine
Veröffentlichung: The main risk factors for IV-V Stages of retinopathy of prematurity
15
Foos RY Graefes Arch Klin Ophthalmol 1975, 195:620-629): Acute retrolental fibroplasia
16
Gaynon MW et al, Comment on: Pediatrics 2000 Feb; 105(2): 295-310. Pediatrics 105: 420-421: What can we
learn from STOP-ROP and earlier studies?
17
Gerber et al, J Biol Chem Nov 1998, Vol. 273, Issue 46, 30336-30343: Vascular endothelial growth factor
regulates endothelial cell survival trough the phosphatidylinositol 3´-Kinase/ Akt signal transduction pathway
18
Ghilardi et al, J Cardiovasc Surg April 2004, 45(2):143-7: Ser 128 Arg gene polymorphism for E-Selectin and
severity of atherosclerotic arterial disease
19
Goldman CK et al, Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95(15):8795-800: Paracrine expression of a native soluble
vascular endothelial growth factor receptor inhibits tumor growth, metastasis, and mortality rate
20
Good WV et al, Ophtalmology 2001, 108:1013-1014: The multicenter study of early treatment of posterior
retinopathy of prematurity (ETROP)
56
21
Hanahan D, Science July 1997, vol.277: Signaling Vascular Morphogenesis and Maintenance
22
Hangai et al, Hum Gene Ther. Jul 1 2001, 12(10):1311-21: Systemically expressed soluble Tie2 inhibits
intraocular neovascularization
23
Harris AL et al, Clin Cancer Res 2001, 7(7):1992-7: Soluble Tie2 and Flt1 extracellular domains in serum of
patients with renal cancer and response to antiangiogenic therapy
24
Hellstrom A et al, PNAS, May 2001, vol 98 no.10, 5804-5808: Low IGF-1 suppresses VEGF-survival
signaling in retinal endothelial cells: direct correlation with clinical retinopathy of prematurity
25
Higgins et al, Archives of Ophtalmology, May 1998, 116(5):601-5: Antenatal dexamethasone and decreased
severity of retinopathy of prematurity
26
Himeno et al, Pediatr.Cardiol.: Increased angiogenic growth factor in cyanotic congenital heart disease
27
Hughes et al, Invest. Opht., April 2000, Vol 41 no.5: Vascularization of the Human Fetal Retina : Roles of
Vasculogenesis and Angiogenesis
28
Hughes et al, Br J Ophtalmol., April 2004; 88(4):444-5: Vascular leucocytes adhesion molecules unaltered in
the human retina in diabetes
29
Ishida et al, Investigate Opthalmology & Visual Science, June 2000: Coexpression of VEGF Receptors VEGF-
R2 and Neurophilin-1 in Proliferative Diabetic Retinopathy
30
Ishihama et al, Invest Ophthalmol Vis Sci 2001; 42:1172-1178: Colocalization of Neurophilin-1 and Flk-1 in
Retinal Neovascularization in a Mouse Model of Retinopathy
31
Jacobs et al, Journal of Perinatal Medicine 1998, 26(1):13-6: The incidence of retinopathy of prematurity and
steroid therapy for broncho-pulmonary dysplasia
32
Joint Program in Neonatology von 1975 bis 1984
33
Joussen et al, Der Ophthalmologe 5/2003: Diabetische Retinopathie
34
Joussen et al, Der Ophthalmologe 4/2003: Molekulare Mechanismen der Vaskulogenese und Angiogenese
35
Juarez et al, European Journal of Ophthalmology Jan-Mar 2000, 10(1):51-9: Experimental retinopathy or
prematurity: angiostatic inhibition by nimodipine, ginkgo-biloba, and dipyridamole, and response to different
growth factors
36
Kado et al, Tokyo Medical University, Ibaraki, Japan: Circulating intercellular adhesion molecule-1 vascular
cell adhesion molecule-1 and E-selectin in patients with type 2 diabetes mellitus
37
Kalina RE et al, Opthalmology 1982, 89:91-95: Retrolental fibroplasia: Experiance over two decades in one
institution
38
Karakuzu et al, J Int Med Res. Jan-Feb 2002; 30(1):85-8: Serum E-Selectin and beta 2-microglobulin levels in
Behcet´s disease
39
Kendall RL et al, Biochem Biophys Res Commun 1996; 226(2):324-8: Identification of a natural soluble form
of the vascular endothelial growth factor receptor, FLT-1, and its heterodimerization with KDR
40
Kim et al, J Perinat Med.2004; 32(3):282-7: Increase in cord blood soluble E-selectin and tracheal aspirate
neutrophils at birth and the development of new bronchopulmonary dysplasia
41
Kinsey Ph. D. et al, Ophtalmology July 1956: Retrolental Fibroplasia and the Use of Oxygen
42
Knudsen et al, Am J Physiol Endocrinol Metab. Jan 2003, 284(1):E1-6, Epub 2002 Aug 13: E-selectin-
inducing activity in plasma from type 2 diabetic patients with maculopathy
43
Koike et al, Aichi Cancer Center, Nagoya, Japan: Hypoxia induces adhesion molecules on cancer cells: A
missing link between Warburg effect and induction of selectin-ligand carbohydrates
57
44
Kretzer FL et al Arch Dis Child 1988, 63: 1151-1167: Retinopathy of prematurity: clinical implications of
retinal development
45
Kretzer FL et al Birth Defects 1988, 24: 147-168: Spindle cells and retinopathy of prematurity: interpretations
and predictions
46
Kwad et al, Invest. Ophtalmology Sept.2000, Vol. 41, No.10: VEGF is major stimulator in model of
choroideal neovascularization
47
Lagrèze W, Uni Freiburg: Vorlesungsskript ROP 5/2000
48
Lashkari et al, Am J Path, April 2000, Vol. 156, No. 4, 1337-1344: Vascular endothelial growth factor and
hepatocyte growth factor levels are differentially elevated in patients with advanced retinopathy of prematurity
49
Lassus et al, Am J Respir Crit Care Med May 1999, Vol 159, nr 5, 1429-1433: Vascular endothelial growth
factor in human preterm lung
50
Li et al, Xi Bao Yu Fen Zi Min Yi Xue Za Zhi Mar 2004, 20(2):219-21: Changes of intercellular adhesion
molecule-1 and E-Selectin levels in Plasma of uremic patients treated with maintaining hemoldialysis
51
Limb et al, Br J Ophthalmol. Feb 1996, 80(2):168-73: Distribution of TNF alpha and its reactive vascular
adhesion molecules in fibrovascular membranes of proliferative diabetic retinopathy
52
Limb et al, Invest Ophthalmol Vis Sci., Sep 1999, 40 (10):2453-7: Vascular adhesion molecules in vitreous
from eyes with proliferative diabetic retinopathy
53
Lip et al, Inv. Opht. July 2000 Vol 41 No.8: Plasma VEGF and Soluble VEGF Receptor FLT-1 in Proliferative
Retinopathy: Relationship to Endothelial Dysfunction and Laser Treatment
54
Lip et al, Br J Ophthalmol. Dec 2004; 88(12):1543-6: Plasma VEGF, Ang-2 and soluble angiopoietin receptor
tie-2 in diabetic retinopathy: effects of laser photocoagulation and angiotensin receptor blockade
55
Lucey JF et al, Pediatrics 1984, 73:82-96: A reexamination of the role f oxygen in retrolental fibroplasias
56
Malamitsi-Puchner et al, Pediatr. Res. 1999, 45:877-80
57
Malamitsi-Puchner et al, J Soc Gynecol Investg 2000, 7: 309-12: Changes in Serum Levels of Vascular
Endothelial Growth Factor in Males and Females throughout life
58
McColm et al, Mol Vision 2004; 10:512-20: VEGF isoforms and their expression after a single episode or
hypoxia or repeated fluctuations between hyperoxia and hypoxia: Relevance to clinical ROP
59
McLeod et al, Invest Ophthalmol Vis Sci 2002; 43:474-482: Localization of VEGF Receptor-2 (KDR/Flk-1)
and Effects of Blocking it in Oxygen-Induced Retinopathy
60
Miyamoto et al, Invest Ophthalmol Vis Sci.2002; 43:2007-2014: Contrasting effect of estrogen on VEGF
induction under different oxygen status and its role in murine ROP
61
Mohan et al, Br J Ophthalmol. Jul 2005, 89(7):815-9: The angiopoietin/Tie- system in proliferative sickle
retinopathy: relation to vascular endothelial growth factor, its soluble receptor Flt-1 and von Willebrand factor,
and to the effects of laser treatment
62
63
Neufeld et al, “The FASEB Journal”, 1/99: Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors
Olson et al, Diabetologia Oct 1997, 40(10):1166-71: Soluble leucocyte adhesion molecules in diabetic
retinopathy stimulate retinal capillary endothelial cell migration
64
Palmer et al, Ophthalmology 98: 1628-1640: Incidence and early course of retinopathy of prematurity. The
Cryotherapy for Retinopathy of Prematurity Cooperative Group
65
Peterson et al: Historical background. In: Retinopathy of Prematurity
58
66
Pierce et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Jan 1995, Vol. 92, pp.905-909: Vascular endothelial growth
factor/vascular permeability factor expression in a mouse model of retinal neovascularization
67
Purohit DM et al, Pediatrics 1985, 76:339-344: Risk factors for retrolental fibroplasia: Experience with 3,025
premature infants. National Collaborative Study on Patent Ductus Arteriosus in Premature Infants
68
Rajakumar et al, Biol Reprod 2001; 64(2):499-506: Selective overexpression of the hypoxia-inducible
transcription factor, HIF-2alpha, in placentas from women with preeclampsia
69
Raju et al, Journal of Pediatrics Dec 1997, 131(6):844-50: Vitamin E prophylaxis to reduce retinopathy of
prematurity: a reappraisal of published trials
70
71
Reynolds JD, Paediatr Drugs 2001; 3(4):263-72: The management of retinopathy of prematurity
Robinson et al, Medical Sciences 5/96 Vol. 93, 4851-4856: Oligodeoxynucleotides inhibit retinal
neovascularization in a murine model of proliferative retinopathy
72
Rota R et al, J Gene Med. Sep 2004; 6(9):992-1002: Marked inhibition of retinal neovascularization in rats
following soluble-flt-1 gene transfer
73
Sarloset al, Am Journal of Path. 2003,Vol. 163: Retinal angiogenesis is mediated by an interaction between the
angiotensin type 2 receptor, VEGF, and angiopoietin
74
Shalaby F et al, Nature 1995; 376(6535):62-6: Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-
deficient mice
75
Shih et al, The Journal of Clin.Invest. July 2003, Vol.112 No.1, 50-57: Selective stimulation of VEGFR-1
prevents oxygen-induced retinal vascular degeneration in retinopathy of prematurity
76
Staubach F et al, Monatsschr. Kinderheilkd 3-2002: Frühgeborenenretinopathie
77
Stone et al, Invest.Opht.&Vis.Sci., Feb.1996, Vol.37 No.2: Roles of Vascular Endothelial Growth Factor and
Astrocyte Degeneration in the Genesis or Retinopathy of Prematurity
78
Stone et al, Journal of Neuroscience Jul 1995, 15 (7 Pt 1):4738-47: Development of retinal vasculature is
mediated by hypoxia-induced vascular endothelial growth factor (VEGF) expression by neuroglia
79
Suzuma et al, Microvasc Res. Nov 1998; 56(3): 183-91: Increased expression of KDR/Flk-1 (VEGFR-2) in
murine model of ischemia-induced retinal neovascularization
80
Takagi et al, Invest Ophthalmol Vis Sci 2003; 44:393-402: Potential Role of the Angiopoietin/Tie-2 System in
Ischemia-Induced Retinal Neovascularization
81
Teixeira et al, Abstract zum Vortrag bei EPOS 2003 in Portugal No.3, Sep 2003, 879-87: Retinopathy of
prematurity: a retrospective case-control study in a neonatal intensive care unit
82
Terry TL Am J Opthalmol 1942, 25:203-204: Extreme prematurity and fibroplastic overgrowth of persistent
vascular sheath behind each crystalline lens
83
The Committee for the Classification of Retinopathy of Prematurity, Arch Ophthalmol 1984, 102:1130-1134
An international classification of retinopathy of prematurity
84
Toi M et al, Int J Cancer 2002; 98(1):14-8: Significance of vascular endothelial growth factor (VEGF)/soluble
VEGF receptor-1 relationship in breast cancer
85
Umeda et al, Ophthalmic Res. Jul-Aug 2003; 35(4): 217-23: Colocalization of Tie2, angiopoietin 2 and
vascular endothelial growth factor in fibrovascular membrane from patients with retinopathy of prematurity
86
Whitcup et al, Clin Immunol Immunopathol. Apr 1997; 83(1):45-52: Blocking both E-selectin and P-selectin
inhibits endotoxin-induced leukocyte infiltration into the eye
59
87
Yang C et al, The Journal of Neuroscience, Oct 1996, 6089-6099: Flk-1, a Receptor for VEGF, is expressed by
retinal progenitor cells
88
Yu et al, Proc Natl Acad Sci USA May 25 2004; 101(21):8005-10, Epub May 17 2004: E-selectin is required
for the antiangiogenic activity of endostatin
60
7. Danksagung
Ganz herzlichen Dank möchte ich richten an
Frau Dr. med. Christina Pieh für die sehr gute Betreuung, die intensive Mithilfe und ständige
Unterstützung bei der Doktorarbeit weit über das übliche Maß hinaus
Meine Eltern, die immer für mich da waren und da sind und mich jederzeit unterstützen
Herrn Prof. Dr. med. Wolf Lagrèze für die Möglichkeit, diese Studie durchzuführen und für
die freundliche Betreuung der Doktorarbeit
Herrn PD Dr. med. Markus Krüger für die gute Betreuung der Doktorarbeit im Bereich der
Neonatologie
Frau Dr. med. Ute Zirrgiebel und ihren Mitarbeitern für die Durchführung der Messungen im
Labor der Firma Prokinase® in der Tumorbiologie Freiburg
Herrn PD Dr. med. Hansjürgen Agostini für den Antrag beim Ethikrat
Herrn Prof. Dr. Jürgen Schulte-Mönting für die Auswertung der Daten und die Unterstützung
und Beratung in statistischen Fragen
Frau A. Mattes und ihren Mitarbeitern im zellbiologischen Labor der UniversitätsAugenklinik
Den Mitarbeitern des hämatologischen Labors der Universitäts-Kinderklinik
61
Lebenslauf
Name
Christiane Sophie Buschbeck
Geburtsdatum
16.01.1978
Geburtsort
Stuttgart
Familienstand
ledig
Konfession
evangelisch
Schulbildung
1984-1988
Hirschberggrundschule Ludwigsburg
1988-1997
Goethe-Gymnasium Ludwigsburg
Studium
1997-2004
Studium der Humanmedizin, Universität Freiburg im Breisgau
Abschluss mit 3.Staatsexamen im April 2004
2000-2001
Studium der Humanmedizin an der Universität Perugia im Rahmen des
EU-Austauschprogrammes „Erasmus“
2003-2004
Praktisches Jahr
- Universitätskinderklinik Freiburg (Pädiatrie)
- Universitätsklinik Perugia (Chirurgie)
- Universitätsklinik Freiburg ( Innere Medizin)
Praktische Tätigkeit
1999-2004
Nachtwachen an der Uniklinik Freiburg
2000
4-wöchige Famulatur Innere Medizin am Klinikum Ludwigsburg
2001
6-wöchige Famulatur Neurologie und 4-wöchige Famulatur Urologie an
der Uniklinik Perugia
2002
2-wöchige Praxisfamulatur Gynäkologie bei Dr. med. G. Birmelin,
Freiburg, 2-wöchige Praxisfamulatur Innere Medizin und
Allgemeinmedizin bei Dres. med. D. und F. Buschbeck, Asperg
62
seit Oktober 2004
Tätigkeit als Assistenzärztin in der Abteilung Innere Medizin am
Kreiskrankenhaus Rheinfelden
Zusatzqualifikationen
Zusatzbezeichnung Notfallmedizin (Tätigkeit als Notärztin seit 6/2007)
Fachkunde Röntgendiagnostik beantragt
Sonstige Interessen
Musik
1984-1997
Unterricht in Klavier und Violoncello
Mitglied in verschiedenen Jugendorchestern, zweimal erfolgreiche
Teilnahme beim Wettbewerb „Jugend musiziert“ als Klavierbegleiterin
1997-2004
Mitglied des Studentenorchesters der Katholischen Hochschulgemeinde
(KHG) Freiburg, von 1998-2000 als Vorstandsmitglied. 2003
Organisation einer Konzertreise nach Perugia, Italien.
2000-2001
Mitglied im Orchester der Universität Perugia
Seit 2003
Mitglied der Camerata academica Freiburg
Diverse Kammermusikprojekte
Sprachen
Italienisch, Französisch, Englisch, Spanisch
Sport
Wandern, Reiten, Skifahren u.a.
63