UNIVERSITÄTSKLINIKUM HAMBURG

UNIVERSITÄTSKLINIKUM HAMBURG-EPPENDORF
Institut für Klinische Pharmakologie und Toxikologie
Zentrum für Experimentelle Medizin
Direktor: Prof. Dr. med. Rainer H. Böger
Untersuchung zur Regulation der AT2-Rezeptor mRNA Expression im
Skelettmuskel durch Arzneistoffe der kardiovaskulären Prävention
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin
an der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg.
vorgelegt von:
Laurin Titze
aus Henstedt-Ulzburg
Hamburg 2014
Angenommen von der
Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg am: 10.09.2014
Veröffentlicht mit Genehmigung der
Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg.
Prüfungsausschuss, der Vorsitzende:
Professor Dr. Rainer Böger
Prüfungsausschuss, zweiter Gutachter:
Professor Dr. Ulrich Wenzel
Prüfungsausschuss, dritter Gutachter:
PD Dr. Dirk Westermann
2
Meiner Familie
3
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1.
2.
Einleitung ...........................................................................7
1.
Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System ......................7
2.
Die Angiotensin II Rezeptorsubtypen ...............................10
2.1.
Der AT1-Rezeptor ...................................................10
2.2.
Der AT2-Rezeptor ...................................................13
3.
Medikamentöse Eingriffe in das RAS ..............................17
4.
Der Glucosetransport in die Muskelzelle .........................19
5.
Die AMP-abhängige Proteinkinase (AMPK) ....................20
6.
Das Metabolische Syndrom ............................................22
7.
Diabetes mellitus und Insulinresistenz .............................24
7.1.
Diabetes mellitus .....................................................24
7.2.
Insulinresistenz........................................................26
8.
Einfluss des RAAS auf Diabetes und Insulinresistenz .....28
9.
Fragestellung und Zielsetzung .........................................29
Material und Methoden ...................................................30
1.
Zellbiologische Methoden ................................................30
1.1.
Verwendete Zelllinie ................................................30
1.2.
Kultivierung der Zellen ............................................30
1.3.
Ausdifferenzierung der L6 Myoblasten ....................31
2.
2-Deoxy-D-[1-3H] Glucoseaufnahme in L6 Myozyten .....32
3.
RNA-Analysen .................................................................33
4
Inhaltsverzeichnis
3.1.
Isolation von RNA....................................................33
3.2.
Umschreiben der RNA in cDNA ..............................34
3.3.
Quantitative rt-PCR .................................................35
4.
3.
Western-Blot ....................................................................36
4.1.
Proteingewinnung ...................................................36
4.2.
Proteinkonzentrationsbestimmung ..........................36
4.3.
SDS PAGE ..............................................................37
4.4.
Blotten der Proteine ................................................39
5.
Statistische Auswertungen ...............................................40
6.
Liste der Chemikalien ......................................................41
7.
Liste der Laborgeräte .......................................................42
8.
Liste der Verbrauchsmaterialien ......................................43
Ergebnisse ......................................................................45
1.
Einfluss des AT2-Rezeptors auf die 2-Deoxy-D-[1-3H]
Glucoseaufnahme ...........................................................45
1.1.
2-Deoxy-D-[1-3H] Glucoseaufnahme nach Langzeit
Stimulation von L6-Myozyten ..................................45
1.2.
2-Deoxy-D-[1-3H] Glucoseaufnahme nach fünfstündiger
Stimulation in L6-Myozyten .....................................49
1.3.
Dosis-Wirkungs-Kurve von Compound 21 ..............52
2.
Untersuchung der Regulation der AT2-Rezeptor mRNA
Expression mittels RT-PCR .............................................54
2.1.
AT2-Rezeptor mRNA Expression in L6-Myozyten nach
Behandlung mit AT1-Blockern und Compound 21 ..54
2.2.
AT2-Rezeptor mRNA Expression in L6-Myozyten nach
Behandlung mit Antidiabetika .................................56
5
Inhaltsverzeichnis
2.3.
3.
4.
AT2-Rezeptor mRNA Expression in L6-Myozyten nach
Behandlung mit Statinen .........................................58
Phosphorylierung der AMP-Kinase in L6-Myozyten, nach
fünfzehnminütiger Stimulation .........................................59
Diskussion .......................................................................62
1.
Erhöhte 2-Deoxy-D-[1-3H] Glucoseaufnahme durch AT2Rezeptor Agonisten .........................................................63
1.1.
2.
Stimulation des AT2-Rezeptors aktiviert die AMPK .64
Regulation der AT2-Rezeptor mRNA Expression ............65
2.1.
Sartane und Compound 21 .....................................66
2.2.
Glitazone und Metformin .........................................67
2.3.
Statine .....................................................................68
2.4.
Ausblick ...................................................................70
5.
Zusammenfassung .........................................................71
6.
Abkürzungsverzeichnis ..................................................73
7.
Literaturverzeichnis ........................................................76
8.
Eidesstattliche Erklärung ...............................................91
9.
Danksagung .....................................................................92
6
Einleitung
1.
Einleitung
1.1.
Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System
Ende des 19. Jahrhunderts wurde das Enzym Renin durch die finnischen
Physiologen Tigerstedt und Bergmann bei Versuchen mit Extrakten aus
Kaninchennieren entdeckt (Peart, 1975). Die Entdeckung des Renins war der
erste Schritt zur Erforschung des Renin-Angiotensin-System (RAS). Seit
diesen ersten Untersuchungen erkannte man, dass das RAS, bzw. das
Renin-Angiotensin-Aldesteron-System (RAAS) eine der Hauptrollen in der
Regulation des Blutdrucks sowie des Natriumhaushaltes spielt.
Das Enzym Renin wird in den Zellen des juxtaglomerulärem Apparats als
Prorenin synthetisiert und dort in sekretorischen Vesikeln gespeichert. Der
Sekretionsstimulus für Renin aus diesen Zellen ist ein verminderter
Natriumtransport zum distalen Tubulus, ein im vas afferens über
Pressorezeptoren gemessener verminderter Perfusionsdruck und ein
erhöhter Sympathikotonus über ein cAMP abhängigen Mechanismus
(Aktories et al., 2013).
Von dem in der Leber gebildeten inaktiven α2-Globulin Angiotensinogen wird
durch Renin in der Funktion als Protease das Dekapeptid Angiotensin I
(Ang I) abgespalten (Abb. 1). Durch die Abspaltung von zwei Aminosäuren
aus Ang I entsteht schließlich das Oktapeptid Angiotensin II (Ang II). Diese
Abspaltung wird katalysiert durch das Angiotensin Konversionsenzym (ACE,
Angiotensin-Converting-Enzyme). Das ACE wird außerdem als Synonym für
die Kininase II verwendet, durch die auch das vasodilatatorisch wirkende
Bradykinin gespalten und inaktiviert wird (Campbell, 1987; Yang et al., 1970).
Das ACE kommt an Oberflächen von Endothelzellen ubiquitär im Körper vor,
vermehrt aber im Gefäßendothel der Lunge und Niere.
7
Einleitung
Abb. 1: Schematische Abbildung der Bildung von Angiotensin II. Enzyme der jeweiligen
Reaktionsschritte. Aminosäurensequenzen von Angiotensinogen, Angiotensin I,
Angiotensin II. Quelle: Institut
Weitere Studien konnten zeigen, dass die Komponenten des RAS in Niere,
Nebenniere, im Herz, Gehirn, in Gefäßen und im Fettgewebe exprimiert
werden und diese Organe somit in der Lage sind, Ang II lokal zu produzieren
(Bader et al., 2001). Dem Fettgewebe kommt eine besondere Bedeutung bei
der Produktion der RAS Komponenten zu. Mit Zunahme des Fettgewebes,
wie im Falle der Adipositas, steigt die Produktion von Ang II und größere
systemische Auswirkungen sind hierdurch wahrscheinlich. So ist
anzunehmen, dass dem RAS im Fettgewebe eine große Bedeutung bei der
Entstehung von Insulinresistenz und Bluthochdruck zukommt.
Es gibt auch die Möglichkeit, dass Ang II direkt aus Angiotensinogen gebildet
werden kann. Grund hierfür sei die enzymatische Wirkung der
Serinproteasen von Kathepsin G, dem gewebespezifischen
Plasminogenaktivator (t-PA), Tonin und chymotrypsin- bzw. trypsinähnlicher
Enzyme (Gibbons und Dzau, 1994). Ungefähr 40 % der Gesamtmenge von
Ang II entsteht so im menschlichen Körper aus Ang I ohne die enzymatische
Umwandlung durch ACE (Hollenberg et al., 1998). Diese Serinproteasen sind
wahrscheinlich auch der Grund für das sogenannte „angiotensin escape“
Phänomen. Hierbei beobachtet man bei Patienten, die lange unter ACEInhibitoren Therapie stehen, einen Anstieg, bzw. sogar Überschreiten des
Ang II-Spiegels auf sein ursprüngliches Niveau. Gleichzeitig nimmt die
erwünschte Wirkung der ACE-Inhibitoren auf Remodeling des Herzens und
Verminderung der sympathischen Aktivität ab. Die therapeutische
Konsequenz aus dem „angiotensin escape“ Phänomen ist die Kombination
von ACE-Inhibitoren mit AT1-Rezeptorantagonisten (Aktories et al., 2013).
8
Einleitung
Dem Octapeptid Ang II kommt über die Wirkung an den Angiotensin II
Rezeptorsubtypen 1 und 2 (AT1-Rezeptoren und AT2-Rezeptoren) eine
wichtige Schlüsselrolle zu. Als wichtigster Ligand der AT-Rezeptoren besitzt
es auch die gleiche Affinität zu beiden Subtypen. Ang II reguliert hier unter
anderem das Blutvolumen und den vaskulären Widerstand (de Gasparo et
al., 2000). Die Geschwindigkeit der Produktion von Ang II ist abhängig von
der Renin-Konzentration (Lin and Frishman, 1996).
Neben der Wirkung über die Angiotensinrezeptorsubtypen auf die
Gefäßzellen (s.u.), ist Ang II neben der extrazellulären Kaliumkonzentration
einer der Hauptstimuli zur Freisetzung des Steroidhormons Aldosteron aus
der zona glumerulosa der Nebenniere. Dieser Stimulus reguliert dort über
den AT1-Rezeptor die Aldosteronbiosynthese (Aguilera, 1992). Die genaue
Funktion des AT2-Rezeptors, welcher auch in der zona glumerulosa
exprimiert wird ist unklar. Untersuchungen zeigen aber, dass eine erhöhte
AT2-Rezeptorexpression, bei AT1-Rezeptorantagonisierung zu einer
normalen Aldosteronbiosynthese führen kann (Peters et al., 2012).
Aldosteron bewirkt eine Erhöhung der Zahl von Natriumkanälen in der
luminalen Zellmembran der Epithelien des distalen Nephrons, der Lunge,
des Dickdarmes, sowie in Schweiß- und Speicheldrüse. Diese Kanäle führen
zu einem vermehrtem Einstrom von Natrium in die Zelle und einer
Steigerung der Natriumresorption (Aktiores et al., 2013). Eine vermehrte
Wasserrückresorption ist die Folge, es kommt zu einer Zunahme des
Extrazellulärvolumens, sowie einer Hypokaliämie. Erhöhte Aldosteronspiegel
können infolgedessen zu einer Hypertonie führen.
Doch Ang II besitzt auch eine direkte Wirkung auf die Natriumretention am
proximalen Tubulus des Nephrons (Abdel-Rahman et al., 2004).
Tabelle 1: Mögliche Effekte durch Ang II Stimulation.
AT1-Rezeptor
Aldosteron/Vasopressin ↑
Vasokonstriktion
Glomeruläre Filtration ↑
Proinflammatorisch
Antiapoption
Zellproliferation
Fibrose
AT2-Rezeptor
Antiinflammatorisch
Apoptose
Antiproliferation
Antifibrose
Regeneration
Differenzierung
9
Einleitung
Der Abbau von Ang II erfolgt durch sogenannte Angiotensinasen. Hierbei
werden von Ang II weitere Aminosäuren abgespalten und es entstehen
Angiotensin III (Ang III), Angiotensin IV (Ang IV) und Angiotensin 1-7. Diese
Derivate zeigen zwar immer noch eine biologische Wirkung, diese aber
deutlich abgeschwächter im Vergleich zum Ang II (Aktories et al., 2013).
1.2.
Die Angiotensin II Rezeptorsubtypen
Es sind beim Menschen mehrere Ang II Rezeptorsubtypen bekannt, von
denen dem AT1-Rezeptor und dem AT2-Rezeptor die größte Bedeutung
zukommt und über die Ang II hauptsächlich seine Wirkung entfaltet. Daneben
kommen auch ein Ang II Typ 3 Rezeptor (AT3-Rezeptor) und ein Ang II Typ 4
Rezeptor (AT4-Rezeptor) vor.
In Nagetieren existieren außerdem zwei Isoformen des AT1-Rezeptors, der
AT1A-Rezeptor und der AT1B-Rezeptor.
Bei den Rezptorsubtypen 1 und 2 handelt es sich um G-Protein-gekoppelte
Rezeptoren mit sieben hydrophoben transmembranen Segmenten, welche
eine α Helix in der Doppellipidschicht der Zellmembran bilden (de Gasparo et
al., 2000). Laut NC-IUPHAR (The International Union of Basic and Clinical
Pharmacology Committee on Receptor Nomenclature and Drug
Classification) gehören sie der A3 Rhodopsin-like Rezeptorenklasse an.
Beide unterscheiden sich wesentlich in der Art der Expression, den
physiologischen bzw. pathophysiologischen Effekten und der Art der
intrazellulären Signaltransduktion. Ihre Gensequenzen sind nur zu 34 %
homolog (de Gasparo et al. 2000), obwohl Ang II mit einer ähnlichen Affinität
an beide Subtypen bindet (Inagami et al. 1992). Interessanterweise kommen
beide Rezeptorsubtypen meist nicht zur gleichen Zeit im gleichen Gewebe
vor (Galliant et al., 2000). Grundsätzlich ist der AT1-Rezeptor charakterisiert
durch eine hohe Affinität zu Losartan, Irbesartan und Candesartan, sowie
einer erniedrigen Affinität zu PD 123,319 und PD 123,177. Der AT2-Rezeptor
zeigt dagegen eine höhere Affinität zu PD 123,319, PD 123,177 und
CGP 42112, sowie eine geringere Affinität zu Losartan und Candesartan
(Timmermans et al., 1993).
1.2.1.
Der AT1-Rezeptor
Beide Angiotensin Rezeptorsubtypen kommen ubiquitär im Organismus vor,
jedoch unterscheiden sie sich deutlich in ihrem Verteilungsmuster. Beim
gesunden Menschen überwiegt der Anteil des AT1-Rezeptors deutlich.
10
Einleitung
Der AT1-Rezeptor kommt vor allem in Geweben vor, welche Einfluss auf die
Regulation von Flüssigkeit und Blutdruck im Körper haben. Hierzu gehören
alle Blutgefäße, das Herz, die Lunge, die Niere und Nebenniere, das Gehirn
und die Hypophyse, die Harnblase und der Gastrointestinaltrakt, sowie das
Fettgewebe. Zudem kommt der AT1-Rezeptor im Reproduktionssystem beim
Mann im Hoden und bei der Frau im Endometrium, den endometrischen
Blutgefäßen und der Plazenta vor. Die Plazenta ist in der Lage zudem alle
anderen Komponenten des Renin-Angiotensin Systems zu bilden. Während
der Schwangerschaft findet man den AT1-Rezeptor im Synzytiotrophoblasten
und im Zytotrophoblast, sowie in den fetalen Endothelzellen der Gefäße
(Cooper et al., 1999). So steigen die AT1-Rezeptor mRNA Transkripte und
Rezeptorproteine in der Schwangerschaft an und haben ihr Maximum zum
Geburtstermin (Petit et al., 1996).
Im Fettgewebe des Menschen findet sich ein lokales Renin-Angiotensin
System. Dort zeigt sich die Expression von AT1-Rezeptor Genen,
Angiotensinogen und ACE (Engeli et al., 1999).
In der Niere wird der AT1-Rezeptor in den Gefäßen, den Glomeruli, den vasa
recta Bündeln der inneren Zone der Medulla exprimiert (Goldfarb et al.,
1994). Weitere Experimente zeigen, dass die Expression des AT1-Rezeptors
in transfizierten Zellinien der Fibroblasten, den COS-7 Zellen (Cercopithecus
aethiops, origin-defective SV-40) durch den EGF (epidermal groth factor,
Epidermaler Wachstums Faktor) erhöht werden kann (Guo und Inagami,
1994b). Anderseits wurde eine verminderte mRNA Expression des AT1Rezeptors in Herzzellen und Zellen der Aorta von Ratten gemessen,
nachdem sie mit AT1-Rezeptor Antagonisten behandelt wurden (Kitami et al.,
1992).
Eine Expressionssteigerung des AT1-Rezeptors in Muskelzellen des
Gefäßsystems lässt sich durch einen erhöhten Insulinspiegel über
posttranskriptionale Mechanismen erreichen (Nickening et al., 1998).
Hierdurch könnte erklärt werden, wie es bei Diabetes mellitus Typ II (DMT2)
zu Begleitkrankheiten, bzw. Folgekrankheiten wie Hypertonus, oder
Atherosklerose kommen kann. Douglas und Brown (1982) untersuchten
außerdem ein negatives Feedback von Ang II-Konzentration und Expression
des AT1-Rezeptors. So zeigten sie, dass eine hohe Ang II-Konzentrationen
zu einer Verringerung und niedrige zu einer Erhöhung der AT1Rezeptorendichte führen.
Der Aufbau des AT1-Rezeptors wurde detalliert untersucht. Er ist mit einem
Gq- und G12-Protein gekoppelt. Ang II führt nach Rezeptorbindung zur
Auslösung der Gq-Untereinheit, was in der Folge zu einer Aktivierung der
Phospholipase C-β (PLC-β) führt. PLC-β erstellt aus
Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) die beiden sekundären
11
Einleitung
Botschafter (second messenger), das 1,2-Diacylglycerol (DAG) und das
Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3). Das IP3 erhöht, durch Freisetzung von Ca2+
Ionen aus intrazellulären Speichern, die Ca2+-Konzentration in glatten
Muskelzellen. Das DAG aktiviert zu dem die Proteinkinase C (PKC) und
verstärkt den Kalziumeinstrom über Kalziumkanäle (L-Typ) (de Gasparo et
al., 2000). Durch diese Mechanismen kommt es zur Erhöhung der Ca2+Konzentration in der glatten Muskelzellen und damit zu einer
Vasokonstriktion. Der Gefäßtonus steigt (Aktiores et al., 2005; Schiffrin et al.,
2003).
Abb. 2: Signaltransduktions- und Funktionsmodell des AT1-Rezeptors (Dinh et al., 2001).
Abk.: DAG: Diazylglycerol, IP3: Inositol-1,4,5-Triphosphat, JAK: Januskinase, MAP: MitogenAktivierte Proteinkinase, PKC: Proteinkinase C, PLA2: Phospholipase A2, PLC:
Phospholipase C, PLD: Phospholipase D, STAT: signal transducers and activators of
transcription.
12
Einleitung
Die Funktion des AT1-Rezeptors ist relativ gut untersucht. Eine Stimulation
durch Ang II führt unter anderem zu einer Konstriktion der glatten
Gefäßmuskelzellen. Dieser Effekt ist besonders groß am vas efferens des
Glomerulus der Niere. Dort sorgt Ang II für eine erhöhte glomäruläre
Filtationsrate. Eine weitere entscheidende Wirkung ist die Natrium-Retention
über die Aldosteronfreisetzung aus der zona glomerulosa der Nebenniere.
Der proliferative Effekt der AT1-Rezeptor Aktivierung durch Ang II, könnte
durch die PKC vermittelte Expression von Protoonkogenen erklärt werden.
Neben diesen Effekten wurde in einigen Arbeiten auch eine Hemmung der
Adenylatcyclase, sowie die Stimmulation der Phospholipase A2 (PLA2) als
AT1-Rezeptor-gekoppelte Signaltransduktionswege beschrieben (Higuchi et
al., 2007). Erhöhte PLA2 Blutspiegel gelten als Entzündungsmarker und als
Risikowert für das Auftreten einer koronaren Herzkrankheit (Packard et al.,
2000). Der PLA2 Blutspiegel hat hierbei die selbe Aussagekraft wie erhöhte
Blutdruckwerte oder erhöhte LDL-Werte (low-density-lipoprotein, Lipoprotein
niedriger Dichte) (Rosenson et al., 2010).
In der Niere werden von einigen Arbeiten Zusammenhänge zwischen der
Wirkung von Ang II über AT1-Rezeptoren und Nierenerkrankungen postuliert.
So sollen sich bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz eine
Verringerung der AT1-Rezeptor Expression in den Glumeruli zeigen (Wagner
et al., 1999). Des Weiteren hat man beobachtet, dass exprimierte AT1Rezeptoren in menschlichen, kultivierten Mesangiumzellen eine Ang IIinduzierte Hypertrophie und Proliferation auslösen. Dies könnte implizieren,
dass Ang II an der Pathogenese der Glomerulosklerose beteiligt ist (Orth et
al., 1995). Auch in glatten Muskelzellen der Lungen Arterie wurden ähnliche
Effekte beobachtet, die zu der Annahme führen, dass Ang II über den AT1Rezeptor zu einer Signaltransduktion führt, die zu Wachstum und
Remodeling in Zellen des menschlichen Gefäßsystems führt (Morrell et al.,
1999).
Hypertonie und negative kardiovaskuläre Effekte sind eine Konsequenz aus
einer pathologischen Überaktivierung des AT1-Rezeptors. Diese
Erkenntnisse stellt den AT1-Rezeptor als eine der Schlüsselfiguren zur
Bekämpfung chronischer Krankheiten da, wie das Metabolische Syndrom,
oder einen Diabetes Mellitus Typ II (de Gasparo et al., 2000). Eine
Blockierung des AT1-Rezeptors zeigt also bei diesen Krankheitsbildern
positive Auswirkungen auf den Krankheitsverlauf (Cole et al., 2010).
1.2.2.
Der AT2-Rezeptor
Der AT2-Rezeptor wird vor allem im fetalen Gewebe expremiert, wobei das
Verhältnis zum AT1-Rezeptor postnatal stark abnimmt. Das AT2-Rezeptorgen
13
Einleitung
befindet sich beim Menschen auf dem X Chromosom (Koike et al., 1994).
Diese höhere AT2-Rezeptorexpression im embryonalem Gewebe lässt
vermuten, dass ein Zusammenhang mit der embryonalen Entwicklung
besteht, konnte aber nicht bewiesen werden (Yamada et al. 1999). Im
ausgewachsenen Organismus zeigen sich erhöhte AT2-Rezeptorexpression
im Herzmuskel, Gefäßendothel, Gehirn, in der Nebenniere, sowie im Uterus
und den Ovarien (de Gasparo et al., 2000). Shao et al. (2013) fanden die
höchste AT2-Rezeptorexpression in den Insel- und Azinuszellen des
Pankreas bei adulten Ratten.
Mehrere intra- und extrazelluläre Faktoren sind für der Regulierung der
Expression des AT2-Rezeptors beteiligt (Galliant et al., 2000). So
beeinflussen Schwankungen der intrazellulären Natriumkonzentration und
des cAMP-Spiegels die AT2-Rezeptorexpression (Murasawa et al., 1996;
Tamura et al., 1999). Auf der extrazellulären Ebene haben
Wachstumsfaktoren Einfluss auf die AT2-Rezeptorexpression (Kambayashi et
al., 1996). Hierbei wird die Expression möglicherweise über die Transkription,
Posttranskription und über die Translation geregelt (Camp und Dudley,
1995). Weitere Studien zeigten den Einfluss von Steroidhormonen auf die
Regulation der Expression des AT2-Rezeptors. So steigert Östrogen diese in
der Hypophyse und im Uterus (Pawluczyk und Harris, 2012). Ebenso führe
eine vermehrte Stressbelastung, auch in Form ischämischer Vorgänge, zu
einer Steigerung der AT2-Rezeptorexpression (Leri et al., 2000). Mit Ang II
und mit dem AT2-Rezeptoragonist CGP-42112A konnte diese Steigerung bei
R3T3 Zellen, einer Fibroblasten Zelllinie der Maus, nachgewiesen werden
(Shibata et al. 1997; Dudley und Summerfelt, 1993).
Die Funktion, bzw. Wirkung des AT2-Rezeptors ist größtenteils unklar und
weniger erforscht als die des AT1-Rezeptors. Es ist nicht gänzlich geklärt, ob
die Signaltransduktion des AT2-Rezeptors auch über gekoppelte G-Proteine
verläuft. Man geht davon aus, dass eine Stimulation des AT2-Rezeptors unter
anderem die Phospholipase A2 aktiviert. Diese Stimulation führt zu einer
Freisetzung von Arachidonsäure, die durch eine Modifikation des Na+/HCO3Symporter-Systems den intrazellulären pH-Wert verändern können (Kohout
und Rogers, 1995). Dulin et al. beschreibt 1998 außerdem eine Aktivierung
der MAPK (Mitogen-activated protein-Kinase) durch
Arachidonsäuremetaboliten.
Eine AT2-Rezeptor Stimulation aktiviert außerdem verschiedene
Phosphatasen. Bisher wurden drei Phosphatasen gefunden (Nouet et al.,
2000), welche aktiviert werden:
1.
Die MKP-1 (Mitogen-Activated Protein (MAP) Kinase Phosphatase-1),
eine Tyrosin/Threonin Phosphatase
14
Einleitung
2.
3.
Die SHP-1 (SH2 Domain-Containing Thyrosin Phosphatase-1), eine
Tyrosin Phosphatase
Die PP2A (Protein Phosphatase 2A)
Jede dieser Phosphatasen führt zu einem eigenständigem Signalweg in der
Zelle, welcher verschiedene zelluläre und funktionale Antworten erzeugt
(Funke-Kaiser et al., 2009).
Weiter werden Effekte einer AT2-Rezeptor Aktivierung auf das NO/cGMP
System (Stickstoffmonoxid/cyclisches Guanosinmonophosphat) beschrieben.
Die hierdurch ausgelöste NO-Freisetzung wurde in Modellen in-vitro, wie
auch in vivo beschrieben. Der daraus folgende cGMP Anstieg ist vermutlich
Bradykinin abhängig (Steckelings et al., 2005).
Aber auch eine Verminderung der cGMP in der Zelle kann Folge einer
Stimulation des AT2-Rezeptors sein. In den Zellen der zona glumerulosa von
Ratten und in PC12W (Phäochromozytom Zellen) führt eine Stimulation über
den AT2-Rezeptor zur Aktivierung einer PTPase (Protein-TyrosinPhosphatase), welche eine Inhibierung der Guanylatcyclaseproduktion
bewirkt (Bottari et al., 1992).
15
Einleitung
Abb. 3: Signaltransduktions- und Funktionsmodell des AT2-Rezeptors (Dinh et al., 2001).
Abk.: ERK: Extrazellulär-Regulierte-Kinase, MKP-1: MAP-Kinase-Phosphatase 1, PLA2:
Phospholipase A2, PP2A: Serine/Threonin-Phosphatase 2A, PTP: Protein-TyrosinPhosphatase, SHP-1: SH2-Domain-Containing-Phosphatase-1.
Im gesunden Menschen spielt der AT2-Rezeptor im Vergleich zum AT1Rezeptor jedoch eine untergeordnetere Rolle (de Gasparo et al., 2000).
Untersuchungen zeigten, dass er bei pathologischen Veränderungen,
vermehrt exprimiert wird. So beschreiben Rosenstiel et al. (2002) eine
vermehrte Expression des AT2-Rezeptors unter pathologischen
Bedingungen, wie bei Herzinsuffizienz und inflammatorischen Prozessen.
Auch bei anderen pathologischen Prozessen wie dem „Remodeling“ nach
Herzinfarkt oder nach Gefäßverletzungen wird eine ansteigende Expression
beschrieben (Akishita et al., 2000).
Die Untersuchungen am AT2-Rezeptor zeigen, dass über ihn eine
antiinflammatorische und antiproliferatorische, sowie auch apoptotische
16
Einleitung
Wirkung vermittelt wird (de Gasparo et al., 2000). Außerdem beschreiben
einige Autoren eine über die AT2-Rezeptor Aktivierung vermittelte
Vasodilatation und Natriurese (Widdop et al., 2003, Siragy et al., 1999).
Eine AT2-Rezeptoraktivierung wirkt sich auf diese Weise positiv auf den
Verlauf kardiovaskuläreer Erkrankungen aus und könnte auch eine neue
Behandlungsmethode zur Verbesserung der systolischen und diastolischen
Funktion nach einem Herzinfarkt sein (Kaschina et al., 2008).
Die Auswirkungen einer AT2-Rezeptor Stimulation durch Ang II bestätigen
den AT2-Rezeptor als Gegenspieler des AT1-Rezeptors. Daugherty et al.
(2001) zeigen in diesem Zusammenhang an Mäusen, dass aortale
Aneurysma und Atherosklerose durch AT1-Rezeptorblocker unter Ang II Gabe
verhindert, bzw. abgeschwächt werden können, während die zusätzliche
Gabe des AT2-Rezeptorantagonisten PD 123,319 diese positive Effekte
wieder aufhebt.
Doch neben den antagonisierten ,klassischen‘ kardiovaskulären AT1Rezeptor vermittelten Effekten, wurde zusätzlich in vitro und in vivo gezeigt,
dass eine AT2-Rezeptor Stimulation neuronale Zelldifferenzierung,
Regeneration vom N. Ischiaticus und N. Opticus bewirkt, sowie
neurologische Defizite nach einem Schlaganfall reduzieren kann (Unger und
Dahlof, 2009). Das die Signalwege des AT2-Rezeptors im Detail noch relativ
unerforscht sind, verdeutlichen einigen Studien bei denen auch paradoxe
Effekte bei einer AT2-Rezeptor Stimulation beschrieben wurden (Ichihara et
al., 2002).
Auf eine bedeutungsvolle Rolle des AT2-Rezeptors zur Entstehung einer
Insulinresistenz weisen die Studien von Shao et al. (2013) hin. Bei ihren
Experimenten an Pankreaszellen adulter Ratten sprechen sie den
Funktionen des AT2-Rezeptors eine insulinotrope Rolle zu und führen ihn
sowie seine nachgeschalteten Signalwege als potentielle therapeutische
Ziele für eine Diabetes Therapie an.
1.3.
Medikamentöse Eingriffe in das RAS
Die in heutiger Zeit zugelassenen Medikamente, welche das RAS
beeinflussen, zielen hauptsächlich darauf ab einen Bluthochdruck zu
behandeln. Als Bluthochdruck gilt ein systolischer Blutdruck von ≥ 140 mmHg
und ein diastolischer Blutdruck von ≥ 90 mmHg (Deutsche Hochdruckliga
e.V., DHL). Die ältesten Medikamente, die in das RAS eingreifen, sind die
ACE Hemmer wie Captopril, Enalapril, Ramipril, etc. Seit 1995 steht mit den
spezifischen AT1-Rezeptorblockern, den Sartanen, eine weiteres Medikament
zur Bluthochdruckbehandlung zur Verfügung. Der jüngste Vertreter der
17
Einleitung
zugelassenen RAS Medikamente ist Aliskiren, ein Renin RezeptorAntagonist, welcher 2007 auf den Markt gebracht wurde.
Abb. 4: Schema des RAS, der Entstehung des Ang II und der Renin-Hemmung, der ACEInhibition, sowie den AT1-Rezeptorantagonisten. AT1, AT1-Rezeptor. AT2, AT2-Rezeptor.
Quelle: RAS blockade with ARB and ACE inhibitors: current perspective on rationale and
patient selection (Werner et al., 2008).
Alle genannten Medikamente zielen darauf ab, die negativen Folgen einer
AT1-Rezeptor Aktivierung zu verringern. Medikamente, welche zur
Behandlung am Menschen zugelassen sind, die zu einer direkten AT2Rezeptor Aktivierung führen, sind zur Zeit nicht erhältlich. Doch neuste
Forschungen zeigen, dass sie ein großes Potential für pharmakologische
Therapien besitzen (Murugaiah et al., 2012). Die meisten Untersuchungen
zum AT2-Rezeptor wurden über eine indirekte Aktivierung durchgeführt,
indem man selektiv den AT1-Rezeptor blockierte und über Ang II eine
Stimulierung durchführte. Die ersten entwickelten Substanzen, die einen
direkten Einfluss auf den AT2-Rezeptor haben, sind der AT2Rezeptorantagonist PD 123,319 und der AT2-Rezeptoragonist CGP-42112A .
Doch zeigen beide Substanzen eine gewisse Instabilität in in vivo und in vitro
Versuchen (Stoll et al., 1995). Weitere Methoden einer direkten AT2-Rezeptor
Untersuchung bestehen im genetischen KO Modell des AT1-Rezeptors.
2004 wurde mit dem Compound 21 (C21) zum ersten Mal ein selektiver,
nicht-peptischer AT2-Rezeptoragonist entdeckt, der eine akzeptable
Bioverfügbarkeit nach oraler Aufnahme aufzeigt (Wan et al., 2004; Murugaiah
et al., 2012). Durch diese pharmakologische Möglichkeit könnte die
agonistische Aktivität am Rezeptor um ein Vielfaches erhöht werden.
Deutlich höher, als es bisher mit dem natürlichen Liganden Ang II erreicht
werden konnte (Unger und Dahlof, 2009).
18
Einleitung
1.4.
Der Glucosetransport in die Muskelzelle
Glucose ist für eukaryotische Zellen die wichtigste Energiequelle.
Für die Regulierung der Glucosehomöostase im menschlichen Körper spielt
der Skelettmuskel eine der wichtigsten Rollen. Die insulinvermittelte
Glucoseaufnahme hat hierbei einen der größten Effekte auf die
Blutzuckerwerte.
Glucose, als wichtigste Energiequelle des Körpers, wird über die
Transportsysteme der Glucosetransporter-Familie (GLUT-Familie)
erleichternd in die Zelle transportiert (Aktories et al., 2013). Es sind dreizehn
GLUT bekannt, die in drei Klassen unterteilt werden. In der Klasse I befinden
sich GLUT1, GLUT2, GLUT3 und GLUT4, welche sich in den Aminosäuren
zu 51-64 % gleichen, sich aber in Gewebeverteilung, Transportkinetik und
Substratspezifität unterscheiden (Mohan et al., 2010). Die GLUT bestehen
aus vierhundert bis sechshundert Aminosäuren und durchspannen die
Plasmamembran der Zelle mit zwölf transmembranen Helices. Diese zwölf
transmembrane Helices bilden eine Pore für ihr jeweiliges Substrat (Boron et
al., 2005).
Abb. 5: Schematischer Aufbau des GLUT4 und seiner Lage in der Plasmamembran (LeRoith
et al., 2004). Die Abbildung zeigt die Aminosäurenanordnung und mögliche
Bindungsstrukturen.
19
Einleitung
Der Skelettmuskulatur kommt eine wichtige Bedeutung zu, da sie 75 % 80 % der insulininduzierten Glucoseaufnahme des gesamten menschlichen
Organismus übernimmt (Zierath, 1995).
Für die Glucoseaufnahme in Muskelzellen und Fettzellen ist der GLUT4
hauptverantwortlich. Er wird dort hauptsächlich exprimiert und sorgt während
der Belastung und Kontraktion im Muskel für eine ausreichende
Glucoseversorgung der Zellen. Die Translokation von GLUT4 aus dem
endoplasmatisches Retikulum (ER) und aus Speicher-Vesikeln erfolgt durch
die Insulinwirkung auf die Muskelzelle (Ishiki und Klip, 2005). Durch seine
dynamische Zirkulation in Fett- und Muskelzellen nimmt der GLUT4 eine
besondere Rolle ein. Verschiedene Arten von Vesikel, welche GLUT4
beinhalten wurden identifiziert. So besteht eine Art aus endosomalen
Vesikeln und Strukturen des trans-Golgi Netzwerkes, in denen GLUT4 sich in
ständiger Zirkulation befindet (Bryant et al., 2002). Bei einer anderen Art der
Vesikel, welche GLUT4 enthalten, handelt es sich um besondere
Vorratsvesikel, welche über Insulinstimulation direkt zur Plasmamembran der
Zelle transloziert werden (Li et al., 2004).
Ohne Insulin befinden sich fast mehr als 90 % der Transporter innerhalb der
Zelle. Durch die Wirkung von Insulin steigt die Exozytoserate der GLUT4 um
das Zehnfache, während parallel die Endozytoserate abfällt (Satoh et al.,
1993; Lee et al., 2000). Nach der Bindung von Insulin an den Insulinrezeptor
der Zelle verläuft die Translokation der GLUT4 zur Plasmamembran über
zwei bisher identifizierte, unabhänige Signalwege (Watson et al., 2004):
1.
2.
Über den Phosphoinositid-3-Kinase (PI3-Kinase) -Signalweg.
Über den CAP/Cbl abhängigen Signalweg.
Außerdem konnte nachgewiesen werden, dass im Skelettmuskel GLUT4
durch Muskelkontraktion, insulinunabhängig, zur Plasmamembran
transloziert werden kann (Lund et al., 1995).
1.5.
Die AMP-abhängige Proteinkinase (AMPK)
1973 wurde ein Enzym durch Carlson und Kim identifiziert, welches das
Schlüsselenzym der Fettsäurensynthese, die Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC)
Adenosinmonophosphat-abhängig (AMP-abhängig) inhibiert. Gleichzeitig
identifizierte Gibbson et al. ein Enzym, welches das Schlüsselenzym der
Cholesterinbiosynthese, die HMG-CoA-Reduktase (HMGCR) AMP-abhängig
inhibiert (Hardie, 2003). Erst nach vierzehn Jahren wurde erkannt, dass es
sich um ein und das selbe Enzym handelt (Carling et al. 1987; Hardie und
Carling, 1997).
20
Einleitung
Neuere Untersuchungen zeigten, dass die AMPK ein heterotrimerer Komplex
(αβγ) ist. Sie setzt sich aus einer katalytischen α-Untereinheit und zwei
regulatorischen β- und γ-Untereinheiten zusammen. Alle Untereinheiten
werden von mehreren Genen kodiert und kommen daher als Konglomerat
verschiedener Isoformen vor (Hardie, 2003).
Es kann eine Analogie geschaffen werden zwischen den ubiquitär
vorkommenden Nukleotiden in der Zelle, dem Adenosintriphosphat (ATP)
und dem Adenosindiphosphat (ADP) mit den chemischen Substanzen einer
Batterie. Typischerweise erhalten lebende Zellen eine hohes Verhältnis von
ATP zu ADP aufrecht (ca. 10 : 1). Mit diesem Energievorrat kann die Zelle
energieaufwändige Prozesse bewerkstelligen. Durch katabole Vorgänge
werden die Energiereserven aufgefüllt, indem ADP zu ATP phosphoryliert
wird. Die meisten Prozesse in der Zelle sind eher energieaufwändig, führen
also zu einer Hydrolyse von ATP zu ADP (s. Abb. 6). In den meisten Zellen
wird das Verhältnis von ATP zu ADP in sehr engen Grenzen gehalten, was
zeigt, dass der Grad des ATP Verbrauchs sich mit dem Grad der ATP
Synthese deckt. Forschungen zeigten, dass für diese Leistung der Zelle der
AMPK eine entscheidende Rolle zukommt (Hardie, 2004).
Abb. 6: Pysiologische Funktion der AMPK in der Zelle (Näheres s. Text) (Hardie, 2004).
Das intrazelluläre Verhältnis von ATP zu AMP ist der wichtigste Parameter für
die AMPK und sensitiver als das Verhältnis von ATP zu ADP (Hardie und
Hawley, 2001). Durch dieses feinabgestimmte System kann auch unter
Energiemangel das Überleben der Zelle gewährleistet werden.
Die Aktivierung der intrazellulären AMPK wird durch sämtliche Arten von
Stress ausgelöst, die zu einer Erhöhung des AMP Spiegels, bzw. zu einer
Erniedrigung des ATP-Spiegels führen. Dazu zählt der physiologische Stress,
wie Muskelkontraktion und Hypoxie, wie er bei Sport oder aber auch bei
Gewebsschädigung vorkommt, sowie der Stress durch Inhibitoren der
21
Einleitung
Atmungskette, Zellgifte, oxidativer Stress und Hitzeschock (Yamauchi et al.,
2002; Fisher et al., 2002; Hardie et al. 2003).
Eine Aktivierung der AMPK hat verschiedene Auswirkungen. So konnte
gezeigt werden, dass die Aktivierung der AMPK zu einer Stimulation der
Glucoseaufnahme in die Skelettmuskelzelle führt und sie in den Hepatozyten
außerdem zu einer Reduzierung der Expression mehrerer Moleküle führt, die
in der Gluconeogenese eine wichtige Rolle spielen, wie die der G6Pase
(Glucose-6-Phosphatase) oder der PEPCK (PhosphoenolpyruvatCarboxykinase). Weitere Untersuchungen zeigten, dass eine aktivierte AMPK
eine Senkung des Blutzuckerspiegels in vivo zur Folge hat.
Zusammengefasst ist die AMPK maßgeblich an der Regulierung des
Glucosestoffwechsels und der Insulinsensitivität in vitro und in vivo beteiligt
(Yamauchi et al., 2002; Fisher et al., 2002). Man kann von einer engen
Verbindung zwischen einer Dysregulierung der AMPK und einer
Insulinresitenz ausgehen. So ist die Aktivität der AMPK im Fettgewebe von
adipösen, insulinresistenten Menschen vermindert. Diese Verminderung und
die damit verbundenen Veränderung auf zellulärer und genetischer Ebene,
können zu einem Metabolischem Syndrom führen (Ruderman et al., 2013).
1.6.
Das Metabolische Syndrom
In den letzten sechzig Jahren änderte sich, durch Nahrungsüberschuss und
Wohlstand der Lebensstil der westlichen Gesellschaft. Folgen dieses
Lebensstils waren unter anderem eine erhöhte Prävalenz der Erkrankungen
wie Fettleibigkeit (Adipositas), Störungen des Fettstoffwechsels
(Dyslipidämien), Bluthochdruck Erkrankungen (Hypertonie), Insulinresistenz,
bzw. Diabetes Mellitus Typ 2 (DMT2). 1980 tauchte erstmals der Ausdruck
des Metabolischen Syndroms in Deutschland auf (Wirth, 2007).
Im Allgemeinen spricht man von einem Metabolischem Syndrom, wenn
gleichzeitig Metabolische Risikofaktoren des DMT2 und kardiovaskulärer
Erkrankungen auftreten (Eckel et al., 2005). Andere Synonyme für das
Metabolische Syndrom sind: Syndrom X, Insulinresistenz Syndrom, oder
tödliches Quartett (Eckel et al., 2005).
Laut World Health Organization (WHO) liegt ein Metabolische Syndrom vor,
wenn die Risikofaktoren Diabetes mellitus, gestörte Glucosetoleranz,
Insulinresistenz, bzw. pathologischer Nüchternblutzucker vorliegen.
Außerdem müssen mindestens zwei der Erkrankungen wie Dyslipidämie,
Bluthochdruck oder viszerale Adipositas vorhanden sein.
Andere Organisationen wie das National Cholesterol Education Program
(NCEP), die International Diabetes Federation (IDF), die Group of the Study
of Insulin Resistence (EGIR) und die American Association of Clinical
22
Einleitung
Endocrinologists (AACE) definieren ähnlich (s. Tabelle 2), wenn auch mit
jeweils verschiedenen Schwerpunkten. Am verbreitetsten sind die Kriterien
zur Definition des Metabolischen Syndroms von der WHO und/oder der
EGIR. Bei beiden Organisationen liegt der Hauptfokus auf dem Vorkommen
einer Insulinresistenz, bzw. eines DMT2. Die jüngeren Klassifikationen der
AACE und IDF legen ihren Hauptfokus auf den Taillenumfang, bzw. den Body
Mass Index (BMI).
Tabelle 2: Fünf Definitionen des Metabolischen Syndroms (UpToDate®,2013).
NCEP: National Cholesterol Education Program; IDF: International Diabetes Federation; EGIR: Group
for the Study of Insulin Resistance; AACE: American Association of Clinical Endocrinologists; HDL:
high density lipoprotein; BMI: body mass index.
*
Most commonly agreed upon criteria for metabolic syndrome (any three of five risk
factors).
•
For South Asia and Chinese patients, waist ≥90 cm (men) or ≥80 cm (women); for
Japanese patients, waist ≥90 cm (men) or ≥80 cm (women).
Δ
Insulin resistance measured using insulin clamp.
◊
High risk of being insulin resistant is indicated by the presence of at least one of the
following: diagnosis of CVD, hypertension, polycystic ovary syndrome, non-alcoholic fatty
liver disease or acanthosis nigricans; family history of type 2 diabetes, hypertension of CVD;
history of gestational diabetes or glucose intolerance; nonwhite ethnicity; sedentary
lifestyle; BMI 25 kb/m2 or waist circumference 94 cm for men and 80 cm for women; and age
40 years.
§
Treatment with one or more of fibrates or niacin.
¥
In Asian patients, waist ≥90 cm (men) or ≥80 cm (women).
23
Einleitung
Die Entstehung des Metabolischen Syndroms ist multifaktoriell. Neben
genetischen, humoralen und endothelialen Funktionsstörungen spielen auch
ein Großteil von vermeidbaren Umwelteinflüssen eine große Rolle (Wirth,
2007). Die Gefahr des Metabolischen Syndroms ist, dass die Betroffenen
oftmals verkennen, welchem Risiko sie ausgesetzt sind. Gerade wegen der
weitestgehend symptomlosen Anfangszeit der Krankheit sehen die
Erkrankten keinen Grund zur Lebensstiländerung. Jedoch haben mehrere
Studien gezeigt, dass es eine starke Assoziation zwischen dem
Metabolischem Syndrom und dem Vorkommen von Schlaganfällen,
Herzinfarkten, Diabetes mellitus, sowie einer allgemein erhöhten
Gesamtmortalität gibt (Day, 2007; Khanam et al., 2011).
Die gängigsten Definitionen des Metabolischen Syndroms von der EGIR und
der WHO sehen die Insulinresistenz, bzw. einen DMT2 als zentralen Faktor
der Diagnose (Balkau und Charles, 1999; WHO, 1999). Im Folgenden wird
genauer auf diese beiden Komponenten eingegangen.
1.7.
Diabetes mellitus und Insulinresistenz
1.7.1.
Diabetes mellitus
Die Deutsche Diabetes Gesellschaft (DDG) definiert in ihren Leitlinien
Diabetes mellitus als den „Sammelbegriff für heterogene Störungen des
Stoffwechsels, deren Leitbefund die chronische Hyperglykämie ist. Ursache
ist entweder eine gestörte Insulinsekretion oder eine gestörte Insulinwirkung
oder auch beides“ (Kerner und Brückel, 2011).
Weiter wird die Krankheit in verschiedene Typen unterteilt, die sich in
pathobiochemischen und ätiologischen Gesichtspunkten von einander
unterscheiden (s. Tabelle 3).
Tabelle 3: Diabetes Typen und deren Pathomechanismus, nach den Leitlinien der DDG:
Diabetes Typ
Ursache, bzw. Ätiologie
Typ 1
Absoluter Insulinmangel, durch β-Zellzerstörung,
meist immunologisch verursacht
Typ 2
Relativer Insulinmangel, durch vorwiegende
Insulinresistenz und evtl. mit sekretorischem
Defekt
24
Einleitung
Diabetes Typ
Ursache, bzw. Ätiologie
andere spezifische
Typen
• Erkrankungen des exokrinen Pankreas
• Genetische Defekte der β-Zell-Funktion oder
der Insulinwirkung
• Endokrinopathien
• medikamentös-chemisch induziert
• seltene Formen eines autoimmun vermittelten
Diabetes
• Infektionen
Gestationsdiabetes
Erstmalig während einer Schwangerschaft
auftretende Glucosetoleranzstörung.
Die Anzahl der Menschen mit einem diagnostizierten Diabetes mellitus
belaufen sich aktuell auf mehr als 382 Millionen (IDF, 2014). 1980 waren es
noch ca. 153 Millionen, was mehr als einer Verdoppelung in den letzten
dreißig Jahren entspricht (Danaei et al., 2011). Der Vormarsch des Diabetes
mellitus wird heutzutage als „Diabetesepedemie“ bezeichnet (Zimmet et al.,
2001), von der besonders Indien, China und die USA betroffen sein werden
(King et al., 1998).
Weltweit ist der DMT2 der Häufigste. Laut WHO haben ca. 90 % aller
Menschen mit Diabetes einen DMT2 (WHO, 1999). In Deutschland sollen ca.
5 % der Gesamtbevölkerung an einem bekannten DMT2 leiden (Hauner und
Scherbaum, 2002).
Der DMT2 ist eine Erkrankung des Stoffwechsels, die durch eine Erhöhung
der Blut- und Urinzuckerwerte gekennzeichnet ist. Vor der Enddiagnose
kommt es zu gestörten Nüchternglucosewerten. Laut WHO liegt ein Diabetes
gesichert vor, wenn der Nüchternglucosewert zwei Mal in Folge über ≥ 126
mg/dL gemessen wird, oder aber, nach einer Gabe von 75 g Glucose der
Glucosewert in einem oralen Glucose Toleranz Test (oGTT) nach zwei
Stunden ≥ 200 mg/dL beträgt. Nach DDG gilt ein DMT2 außerdem als
gesichert, wenn der HbA1c Wert ≥ 6,5 % beträgt.
Doch neben dem gestörten Glucosestoffwechsel sind auch der Eiweiß- und
Fettstoffwechsel betroffen. Als Ursache gilt beim DMT2 die Insulinresistenz
und damit die unzureichende Insulinwirkung an Muskel-, Fett-, und
Leberzellen. Der DMT2 wurde früher auf Grund des Auftretens meist im
höheren Lebensalter, als sogenannter Altersdiabetes bezeichnet. Diese
Bezeichnung gilt aber als veraltet, da er sich immer mehr auch bei Menschen
in jüngeren Jahren manifestiert (American Diabetes Association 2013;
Reineher, 2013). Wichtigster Risikofaktor für die Entstehung eines DMT2 ist
25
Einleitung
der sogenannte „westliche“ oder auch „industrielle“ Lebensstil. Womit
übermäßige Ernährung und Bewegungsmangel gemeint sind, welche eine
Zunahme der Körperfettmasse zur Folge haben. Das Risiko an einem DMT2
zu erkranken korreliert sehr stark mit einem erhöhten Körpergewicht.
Zusätzlich hat die Dauer der Adipositas und das abdominelle
Fettverteilungsmuster einen großen Einfluss auf die Krankheit. Es gilt heute
als erwiesen, dass eine Gewichtszunahme das Risiko auf einen DMT2
erhöhen kann, und eine Gewichtsabnahme es entsprechend senken kann
(Hauner und Scherbaum, 2002).
DMT2, sowie seine Komplikationen, zählen zu den häufigsten unter den
chronischen Erkrankungen (Zimmet et al., 2001).
Der dauerhaft erhöhte Blutzucker führt zu einer Schädigung des
Gefäßendothels. Diese Schädigung bildet die Grundlage für die mit dem
Diabetes assoziierten Folgeerkrankungen, bzw. Spätkomplikationen. Die
Komplikationen betreffen zahlreich Organsysteme und sind der Grund dafür,
dass sich Mortalität und Morbidität erhöhen. Es kommt im Laufe der
Erkrankung vermehrt zu Mikroangiopathien, sowie Nephro-, Neuro- und
Retinopathien. Makroangiopathisch kommt es zu Erkankungen wie der
koronaren Herzkrankheit (KHK), der peripheren arteriellen
Verschlusskrankheit (pAVK) und zu zerebralen Durchblutungsstörungen,
sowie zum Schlaganfall (Hauner und Scherbaum, 2002). Diabetes mellitus
gilt heute als unabhängiger Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen,
obwohl er meist mit anderen Risikofaktoren wie Adipositas, Bluthochdruck,
oder Dyslipidämie auftritt. So ist das Risiko mit Diabetes eine
kardiovaskuläre Erkrankung zu erleiden bis zu 4,5 fach und die
Gesamtsterblichkeit bis zu 2,7 fach erhöht gegenüber Personen ohne
Diabetes (Unwin et al., 2002). Die Folgen für die Gesellschaft und das
Gesundheitssystem sind immens (Zimmet et al., 2001). In 2013 starben 5,1
Millionen Menschen an Diabetes. Die weltweit durch die Krankheit
entstandenen Kosten wurden 2013 auf 548 Milliarden US Dollar geschätzt
(IDF).
1.7.2.
Insulinresistenz
Mehrere epidemiologische Studien zeigen, dass einem Diabetes mellitus die
Bildung einer Insulinresistenz vorausgeht. Die Insulinresistenz bedeutet eine
nicht adäquate Antwort des peripheren Gewebes wie dem Fettgewebe oder
dem Skelettmuskel auf eine bestimmte Menge an Insulin. Die
insulinvermittelte Glucoseaufnahme in die Zelle ist gehemmt. Daneben
kommt es bei der Insulinresistenz auch zu einer verminderten Fähigkeit des
Insulins die Gluconeogenese in der Leber zu hemmen (Olefsky und Glass,
26
Einleitung
2010). Aufgrund der kompensatorischen Hypersekretion von Insulin durch
die β-Zellen des Pankreas verläuft die Insulinresistenz schleichend und meist
unentdeckt, da zu diesem Zeitpunkt noch ein normaler Blutzuckerspiegel
gemessen werden kann. Doch vermindert die Hyperinsulinämie auf Dauer
die Insulinwirkung an den Zielzellen. Außerdem erschöpft die dauerhafte
Insulinsekretion die β-Zellen. Sobald diese die erhöhte Insulinsekretion nicht
mehr aufrechterhalten können, kann sich ein DMT2 manifestieren.
Es gilt als gesichert, dass eine Insulinresistenz bei Menschen entsteht, die
zum einen genetisch prädispositioniert sind und zum anderen einen erhöhten
Körperfettanteil haben (Olefsky und Glass, 2010). Wie Abb. 7 zeigt werden
bei der Adipositas aufgrund eine erhöhte Nahrungsaufnahme und
Bewegungsmangel, vermehrt Triglyceride ins viszerale und subkutane
Fettdgewebe eingelagert (Shoelson et al., 2007). Die Adipozyten
hypertrophieren und es kommt zu einem stark herabgesetzten Ansprechen
der Adipozyten auf Insulin. Als Folge wird die Lipolyse in den Adipozyten
nicht mehr durch Insulin gehemmt (Stumvoll et al., 2005) und es werden
vermehrt freie Fettsäuren von den Adipozyten ins Blut abgegeben. Die Folge
ist eine Hyperlipidämie. Durch das Überangebot von Fetten steigt die
Aufnahme von Fettsäuren zum einen in die Skelettmuskulatur und zum
anderen in die Leber. Es resultiert zum einen eine nicht alkoholinduzierte
Fettleber und eine Fetteinlagerung in den Muskel (Shoelson et al., 2007).
Das erhöhte Angebot und die erhöhte Einlagerung von Fettsäuren führen zu
einer vermehrten Lymphozyten- und Makrophagenaktivierung, sowie
Einwanderung (Schenk et al., 2008). Diese Ereignisse führen schlussendlich
zu einer niedriggradig chronischen Enzündung, die systemische Folgen hat
(Zeyda und Stulnig, 2007). Es besteht eine enge Korrelation zwischen
Entzündungszeichen wie einem erhöhten C-reaktivem Protein (CRP), sowie
Interleukin-6 (IL-6) und der Entstehung von Insulinresistenz und Diabetes
(Shoelson et al., 2007). Man geht davon aus, dass pro-inflammatorischer
Zytokine wie der Tumornekrosefaktor-𝜶 (TNF-𝜶) und das IL-6 Einfluss auf die
Insulinwirkung haben, indem sie die Signaltransduktion des Insulins
unterdrücken (Dandona et al., 2004).
27
Einleitung
Abb. 7: Zusammenhang von Adipositas und Entzündung, sowie der Entstehung von
Artherosklerose und Insulinresistenz (Shoelson et al., 2007).
1.8.
Einfluss des RAAS auf Diabetes und Insulinresistenz
Die Hauptfunktion des RAAS ist die Regulation des Blutdruckes. Doch neben
dieser wichtigen Funktion zeigen jüngste Untersuchungen, dass es auch
einen großen Einfluss auf die Regulation des Glucosestoffwechsel ausübt.
Das RAAS ist der Knotenpunkt von Erkrankungen wie Diabetes mellitus,
Adipositas und dem Metabolischem Syndrom. So leiden bis zu 80 % der
Patienten mit einem Diabetes mellitus Typ II zusätzlich unter Bluthochdruck
(Kintscher, 2010) und umgekehrt findet sich bei 50 % der Patienten mit
Bluthochdruck eine Hyperinsulinämie (Zavaroni et al., 1992).
Untersuchungen zeigen das Ang II bedeutende Effekte auf die
Insulinempfindlichkeit und den Glucosestoffwechsel hat. Durch die von Ang II
ausgelöste Vasokonstriktion verringert sich der periphere Blutfluss. Dieser
Effekt hat einen wesentlichen Einfluss auf die Glucoseaufnahme in den
Skelettmuskel (Barrett et al., 2009). Weiter führt Ang II über mehrere
Signalkaskaden zu Entzündungsreaktionen in unterschiedlichen Endorganen
(Skurk, 2004), welche zu einer weiteren Verringerung der Insulinsensitivität
führen können. Außerdem wird diskutiert, ob Ang II eine Störung des
Glucosestoffwechsels verursacht, indem es die Expression des GLUT4
28
Einleitung
reduziert. Zusätzlich aktiviert Ang II Enzyme der Lipogenese wie die
Fettsäure Synthase (FAS), die eine Einlagerung von Triglyceriden in
Fettzellen und dadurch deren Wachstum fördert, sowie die Glycerol-3Phosphatase Dehydrogenase (GPD) (de Kloet et al., 2010).
Verschiedene klinische Studien konnten außerdem zeigen, dass AT1Rezeptorblockierung (CHARM-, LIFE-, VALUE-Studie) oder ACE-Hemmung
(ALLHAT-, CAPP-, HOPE- und SOLVD-Studie) positive Einflüsse auf
Mortalität und Morbidität bei kardiovaskulären Erkrankungen haben, sowie zu
einer Besserung der Stoffwechselsituation und Insulinempfindlichkeit führen
können. Es zeigten sich weniger Diabetes Folgeerkrankungen sowie weniger
Diabetes Neuerkrankungen bei Patienten mit Bluthochdruck. Im Vergleich zu
anderen Bluthochdruckmedikamenten wie Diuretika und Beta-Blocker fiel bei
den AT1-Rezeptorantagonisten und ACE-Inhibitoren die Inzidenz signifikant
am geringsten aus (Elliot und Meyer, 2007; Werner et al., 2008).
1.9.
Fragestellung und Zielsetzung
Die Funktionen des AT2-Rezeptors sind bis heute nur unzureichend geklärt.
Neuste Forschungen zeigen aber, dass in ihm große pharmakologische
Potentiale ruhen. Im Rahmen der Pathologie des Metabolischen Syndroms
spielt es eine wesentliche Rolle, weitere Wege der Glucoseaufnahme in die
Zelle zu beschreiben und zu entdecken. Das Metabolische Syndrom ist eine
multifaktorielle Erkrankung, welche in vielen Fällen auch mit
kardiovaskulären Erkrankungen einhergeht.
Ziel dieser Arbeit ist es, Arzneistoffe der kardiovaskulären Prävention zu
identifizieren, welche zu einer erhöhten Expression des AT2-Rezeptors im
Skelettmuskel führen. Nachfolgend soll die Auswirkung dieser
Expressionssteigerung auf die AT2-Rezeptor vermittelte Glucoseaufnahme
und den Glucosemetabolismus in Skelettmuskelzellen in vitro untersucht
werden. Wir erwarten, dass eine stärkere Expression des AT2-Rezeptors im
Skelettmuskel zu einer Steigerung der AT2-Rezeptor-vermittelten Effekte auf
die insulinabhängige und -unabhängige Glucoseaufnahme in
Skelettmuskelzellen in vitro führen wird.
29
Material und Methoden
2.
Material und Methoden
2.1.
Zellbiologische Methoden
2.1.1.
Verwendete Zelllinie
Die adhärent wachsende L6-Myoblastenzellinie wurden bei 37 °C und 5 %
CO2 kultiviert. Das Kultivieren erfolgte in DMEM Kulturmedium (Dulbecco’s
Modified Eagle’s Medium, Fa. Invitrogen; GlutaMAX™-I, 4,5 g/l D-Glucose,
Pyruvat) mit einem Zusatz von 10 % Fetal Calf Serum (FCS, Fa. Invitrogen)
und 1 % Pen-Strep-Lösung (Penicillin-Streptomycin, Fa. Invitrogen; 10.000
U/ml Penicillin G, 10.000 µg/ml Streptomycin). Das Pelletieren der Zellen
erfolgte bei Raumtemperatur (RT) für 5 min und 360 ⨯ g.
2.1.2.
Kultivierung der Zellen
Alle 2 - 3 Tage wurden die Myoblasten in Abhängigkeit von der Zelldichte im
Verhältnis 1:5 bis 1:15 geteilt (Splitten). Die adhärent wachsenden Zellen
wurden dafür mit Phosphate Buffered Saline Buffer (PBS-Puffer, Fa.
Biochrom; 138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM Kaliumdihydrogenphosphat,
8,1 mM Dinatriumhydrogenphosphat ⨯ 2H2O) gewaschen und nach Zugabe
von 100 µl/cm2 Trypsin/Ethylendiamintetraacetat-Lösung (Trypsin/EDTALösung, Fa. Invitrogen; 0,05 % Trypsin, 0,02 % EDTA, 100 mM NaCl) 3 min
bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden durch leichtes Klopfen an den Rand
der Zellkulturflaschen (Fa. Sarstedt) abgelöst. Das Trypsin wurde mit dem
fünfachen Volumen des, FCS-haltigen Kulturmediums inaktiviert. Nach
Ermittlung der Zellzahl mittels Zählkammer (Fa. Assistent Glaswarenfabrik
Karl Hecht) wurden die Zellen erneut ausplattiert. Das Zellkulturmedium
wurde alle zwei Tage gewechselt.
Zum Einfrieren wurden die Zellen pelletiert und in 500 µl Kulturmedium auf
Eis resuspendiert. Zur Zellsuspension wurde 500 µl Einfriermedium (20 %
Medium, 60 % FCS und 20 % Dimethylsulfoxid, DMSO) dazugegeben und
gut vermischt. Die Zellen (106 Zellen/ml) wurden langsam durch Senkung der
Temperatur um 1 °C/min in einem Isopropanol-Einfriergefäß (Fa. Nalgene)
bei -80 °C eingefroren und nach 48 Stunden zur späteren Verwendung in
flüssigen Stickstoff überführt.
Das Auftauen erfolgte bei 37 °C im Wasserbad, bis nur noch ein kleiner
Eisrest vorhanden war. Die Zellsuspension wurde in 10 ml des vorgewärmten
Kulturmediums aufgenommen und zentrifugiert. Das Zellpellet wurde im
Kulturmedium resuspendiert und die Zellen anschließend ausplattiert.
30
Material und Methoden
2.1.3.
Ausdifferenzierung der L6 Myoblasten
Ab einer Zellkonfluenz von 60 - 70 % wurden die L6-Myoblasten in 6 Well
Platten (Fa. Sarstedt) zu 200.000 Zellen pro Well auspipettiert. Um die Zellen
vom Boden der Zellkulturflasche zu lösen und deren Anzahl zu bestimmen,
wurde wie beim Splitten vorgegangen. Ab einer Konfluenz von > 90 %
erfolgte ein Mediumwechsel zum DMEM Differenzierungsmedium (4,5 g/l DGlucose, Pyruvat) mit Zusatz von 2 % Horse Serum (Fa. Lonza, 500 ml) und
1 % Pen-Strep-Lösung. Hierfür wurden die Platten von allen vier Seiten
aneinander geschlagen, um die toten Zellen zu lösen. Anschließend wurde
der Überstand abgesaugt und jeweils 2 ml des neuen Mediums aufgetragen.
Am Folgetag wurde das Differenzierungsmedium erneuert und alle zwei Tage
gewechselt. Die Versuche wurden nach mikroskopischer Kontrolle (s. Abb. 8
- 10) am neunten Tag nach Beginn der Differenzierung durchgeführt.
8
9
Abb. 8: Muskelbildende Kolonien von L6 Myoblasten ausgehend, 19 Tage nach Plattierung
(Richler und Yaffe, 1970).
Abb. 9: Wie Abb. 8. Die höhere Auflösung von einer einzelnen Kolonie zeigt die interne
Organisation einer Kolonie (Richler und Yaffe, 1970).
Abb. 10: Differenzierte L6-Myotuben (100 fach). Quelle: Institut
31
Material und Methoden
2.2.
2-Deoxy-D-[1-3H] Glucoseaufnahme in L6 Myozyten
Um 100 ml Inkubationsmedium herzustellen, wurden 500 mg Bovine Serum
Albumin (BSA) abgewogen und in 88 ml Aqua bidest, 10 ml 10 ⨯ KRP und
2 ml Hepes aufgelöst. Für das Insulinstimulationsmedium wurde aus der
Insulinoriginallösung (10 mg/ml) mit Aqua bidest eine Verdünnung von 1 : 2
hergestellt und in einem Falkontube zusammen mit dem Inkubationsmedium
pipettiert. Die weiteren Stimulanzien, wie der AT1-Rezeptorantagonist
Losartan (Fa. Sequoia Research Products, 10-6 M), der AT2Rezeptorantagonist PD 123,319 (Fa. Sigma-Aldrich, 10-6 M) und Angiotensin
II (Ang II, Fa. Sigma-Aldrich) wurden mit Aqua bidest in ihre
Endkonzentrationen verdünnt und jeweils in ein Falkontube mit
Inkubationsmedium pipettiert. Der AT2-Rezeptoragonist Compound 21 wurde
in reinem Ethanol bis zu einer Konzentration von 10-3 M verdünnt. Die
weitere Verdünnung wurde mit Aqua bidest durchgeführt.
Auf die Zellen wurde zwölf Stunden vor dem Versuch Hungermedium
(DMEM Kulturmedium mit 1 % Glucose) aufgebracht.
In Phase 1 der 2-Deoxy-D-[1-3H] Glucoseaufnahme (DOG-Uptake) Versuche
wurde der Überstand der 6 Well Platten verworfen und mit 1 ml des
jeweiligen Inkubationsmediums gewaschen. Der Überstand wurde erneut
verworfen und anschließend 1 ml Inkubationsmedium für 20 min
aufgetragen.
In der Phase 2 der DOG-Uptake Versuche wurde nach den 20 min der
Überstand verworfen und 1 µl 2-Deoxy-D-[1-3H] Glucose (2-Deoxy-DGlucose, Fa. Amersham, Aqueous Solution 250 µCi, 250 µl, ca. 0.061 MBq),
mit 6 ml des jeweiligen Inkubationsmediums und 6 µl 2-Deoxy-D-Glucose (10
mM) auf die jeweilige 6-Well-Platte gegeben und für weitere 10 min inkubiert.
Darauf wurde der Überstand abpipettiert und die Zellen drei mal mit kaltem
PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit 1 ml 0,1 % SDS für
5-10 min pro Wells inkubiert. Der Überstand wurde abpipettiert und die Zellen
mit einem Zellschaber von den Böden der Platten abgelöst. Das Lysat wurde
in Eppendorf-Gefäße überführt und für 5 min bei 13.000 ⨯ g zentrifugiert. Ein
Überstand von 500 µl wurde in Szintillatormessröhrchen (Fa. Perkin Elmer,
Minature 6 ml Polyethylene vials) gegeben. Um die Radioaktivität im BetaCounter (Fa. Wallac/Perkin Elmer Freiburg, Wallac 1409 Liquid Scintillation
Counter) zu ermitteln, mussten die Proben mit Szintillatorflüssigkeit (Fa.
Zinsser Analytic, Quicksafe A, Flashpoint > 130 °C) auf 4 ml aufgefüllt
werden und gründlich gevortext werden, um eine optimale Durchmischung
zu erreichen. Hierbei verstärkt die Szintillatorfüssigkeit die Zählung um ein
Vielfaches. Die Proben wurden 5 min gemessen.
32
Material und Methoden
2.3.
RNA-Analysen
2.3.1.
Isolation von RNA
Die Isolierung der Gesamt-RNA aus den L6-Myozyten wurde nach einem
veränderten Protokoll des Herstellers mit RNAzol® (Fa. WAK-Chemie
Medical) durchgeführt.
Für die Isolierung wurde das Medium von den 6 Well Platten vorsichtig
abgesaugt und in 2 ml Eppendorf-Gefäße überführt. Die L6-Myozyten
wurden nach einmaligem Waschen mit kaltem PBS-Puffer in 0,8 ml RNAzol®
lysiert und nach Hinzugabe von 200 µl Chloroform für 30 sek gevortext. Auf
Eis wurden danach die Proben 15 min inkubiert und anschließend für 15 min
bei 12.000 ⨯ g und 4 °C zentrifugiert. Der wässrige Überstand wurde nach
dem Zentrifugieren in ein neues 2 ml Eppendorf-Gefäß pipettiert. Nachdem 1
ml gekühltes Isopropanol ebenfalls in das Eppendorf-Gefäß gegeben wurde,
wurde es kurz gevortext und die RNA daraufhin für 1 h im Gefrierschrank bei
-20 °C ausgefällt. Die RNA wurde für 30 min bei 12.000 ⨯ g und 4 °C
zentrifugiert und mit 70%igem gekühlten Ethanol gewaschen. Nachdem die
Proben 5 min bei RT getrocknet wurden, wurden sie in 15 µl RNase-freiem
Wasser (Fa. Qiagen; keine Angaben) aufgenommen. Anschließend wurde
die optische Dichte (OD260) bei λ = 260 nm der RNA-Konzentration
photometrisch im NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (Fa.
ThermoScientific) analysiert. Dabei entsprach die OD260 von 1 der RNAKonzentration von 40 µg/ml.
Zusätzlich zur photometrischen RNA-Konzentration Ermittlung, wurde die
RNA auf Intaktheit und Reinheit per Agarosegel überprüft. Hierzu wurde 1 µl
RNA-Lösung zusammen mit 1 µl Sample Buffer (Fa. Sigma-Aldrich) auf ein
1%iges Agarosegel (0,01 % Ethidiumbromid) aufgetragen. Das Gel lag in
einem Tris-Acetat-Puffer (TAE, Fa. Sigma Aldrich Chemie GmbH München)
und es wurde eine Spannung von 80 V über 45 min angelegt. Nach den 45
Minuten wurde das Gel mit dem ChemiGenius Bioimaging System (Fa.
Cycron) mit Hilfe eines Ethidiumbromidfilters abfotografiert. Ein Zeichen für
nicht abgebaute mRNA sind zwei deutlich abzugrenzende Banden, eine 28
S- und eine 18 S-rRNA Bande. Die 28 S-Bande sollte sich etwa zweifach
stärker fluoreszierend abbilden als die 18 S-Bande (s. Abb. 11).
33
Material und Methoden
→
28 S-Bande
→
18 S-Bande
Abbildung 11: 1%iges Agarosegel (0,01 % Ethidiumbromid) zur Überprüfung der RNAReinheit.
Die Lagerung der isolierten RNA erfolgte bis zur weiteren Verwendung bei
-80 °C.
2.3.2.
Umschreiben der RNA in cDNA
Mit Hilfe des Protokolls für das RevertAid™ H Minus First Stand cDNA
Synthesis Kit (Fa. Fermentas), wurde die RNA in cDNA umgeschrieben.
Dazu wurden pro Probe 4 µl 5 ⨯ Reaction Buffer (Fa. Fermentas), 1 µl
RiboLock™ RNase Inhibitor (Fa. Fermentas), 2 µl 10 mM dNTP Mix (Fa.
Fermentas) und 1 µl RevertAid™ Minus M-MuLV Reverse Transcriptase (Fa.
Fermentas, 200 u/µl) in ein autoklaviertes, auf Eis gestelltes EppendorfGefäß pippettiert. Nach Zugabe von 1 µl Random Hexamer Primer (Fa.
Fermentas), 1 µg der jeweiligen RNA Probe, aufgefüllt bis zu einem
Endvolumen von 12 µl mit RNase-freiem Wasser (Fa. Qiagen), wurde
vorsichtig anzentrifugiert und gemischt. Mit folgendem Temperatur- und
Zeitschema wurde umgeschrieben:
Tabelle 4: Temperatur- und Zeitschema für Umschreibung von RNA in cDNA.
Abschnitt:
Temperatur:
Dauer:
1.
25 °C
10 min
2.
42 °C
1h
3.
70 °C
5 min
34
Material und Methoden
Die cDNA wurde bei -20 °C bis zur weiteren, zeitnahen Verwendung
gelagert. Als Kontrolle diente eine Probe ohne Reverse Transkriptase.
2.3.3.
Quantitative rt-PCR
Die mRNA-Expression wurde mit der quantitativen Real Time-PCR (rt-PCR)
durch das ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System (Fa. Applied
Biosystems) entsprechend dem Herstellerhandbuch identifiziert. Um eine
Quantifizierung des Amplifikationsproduktes in Echtzeit zu erreichen wurden
die spezifische TaqMan®-Sonden verwendet, welche am 5’-Ende durch einen
Reporter-Fluoreszenzfarbstoff (6-Carboxyfluorescein; FAM) und am 3’-Ende
durch einen nicht-fluoreszierenden Quencher markiert wurden. Mit Hilfe der
5’-3’-Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase (AmpliTaq Gold®) wurde
zeitgleich zur Synthese des Gegenstranges die Sonde am 5'-Ende abgebaut.
Dadurch entfernen sich Quencher und Reporter voneinander und eine
vermehrte Reporter-Fluoreszenz konnte detektiert werden. Je mehr von dem
PCR-Produkt hierbei angehäuft wurde, desto stärker stieg die Floureszenz
mit jedem PCR-Zyklus an.
Die Menge des entstandenem AT2-Rezeptor mRNA-Produkts wurde mit Hilfe
der relativen Standardkurvenmethode bestimmt, wobei die
Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) als interner Standard
verwendet wurde. Um eine Vergleichbarkeit zu sichern, wurden das AT2Rezeptorgen und das GAPDH-Gen immer auf einer Platte analysiert.
Es wurde aus jeder cDNA-Probe das gleiche Volumen in ein EppendorfGefäß pipettiert, anschließend kurz gevortext und jeweils eine
Verdünnungsreihe (1:2, 1:4, 1:8, 1:16 und 1:32) mit Aqua bidest für das AT2Rezeptorgen und für das GAPDH-Gen angelegt. Von den
Verdünnungsreihen wurden 2 µl in die 384-Well Multiply® PCR-Platte (Fa.
Sarstedt) mit vorgelegten Master Mix gegeben.
Der Master Mix bestand aus 8 µl Maxima® Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)
(Fa. Fermentas), 1 µl der jeweiligen Sonde (Fa. Applied Biosystems, GAPDH
#Mm99999915_g1 250 µl, AGRT2 #Mm00431727_g1 250 µl) und 4 µl
Nuklease-freiem Wasser. Als Negativkontrolle wurde die cDNA durch Aqua
bidest ersetzt.
Die Amplifizierung der dazugehörenden Genabschnitte wurde nach
nachfolgendem Temperaturschema durchgeführt:
Tabelle 5: Temperatur- und Zeitschema zur quantitativen rt-PCR.
Abschnitt:
1.
Temperatur:
95 °C
Dauer:
10 min
35
Material und Methoden
Abschnitt:
Temperatur:
Dauer:
2.
95 °C
15 sek
3.
60 °C
30 sek
4.
72 °C
30 sek
5.
40 ⨯ ab Abschnitt 2. wiederholen
Für jede Messung wurde eine Doppelbestimmung durchgeführt. Diese
Messung wurde mit Hilfe der ABI PRISM 7900HT Sequence Detection
System Software, Version 2.1.2 analysiert. Die Menge der mRNA der
jeweiligen Proben wurde durch Interpolation aus der Standardkurve
entnommen und mit dem Internen Standard ins Verhältnis gesetzt.
2.4.
Western-Blot
2.4.1.
Proteingewinnung
Um eine Denaturierung der Proteine zu vermeiden, fand die gesamte
Proteingewinnung auf Eis statt. Nach dem Absaugen des Zellkulturmediums,
wurden die Zellen jeweils zwei Mal mit kaltem PBS gewaschen. Für jedes
Well wurden 80 µl Lysispuffer (+ Proteaseinhibitor 1:1.000) hinzugeführt und
mit dem Zellschaber abgeschabt. Danach wurde die Suspension in 1,5 ml
Eppendorf Tubes gegeben. Um eine optimale Durchmischung zu erreichen,
wurde mit einer 1 ml Spritze und einer 27´´G Kanüle die Suspension
sechsmal hoch- und runtergezogen und danach bei 12.000 ⨯ g und 4 °C für
zehn Minuten zentrifugiert. Der Überstand mit den Proteinen wurde vorsichtig
abgesaugt, aliquotiert und bei -80 °C eingefroren.
2.4.2.
Proteinkonzentrationsbestimmung
Um den Proteingehalt der Proben zu bestimmen, wurde die standardisierte
Methode nach Bradford angewandt und mit Hilfe des Protein Assay Dye
Reagent Concentrate (Fa. Bio-Rad) photometrisch bestimmt. Bei dieser
Methode kommt es zu einer Komplexbildung des Triphenylmethanfarbstoffes
Coomassie-Brilliant-Blau G-250 (CBBG) mit unpolaren und kationischen
Aminogruppen der zu untersuchenden Proteine. Durch die Komplexbildung
mit den Proteinen nimmt das Absorptionsmaximums des roten,
36
Material und Methoden
ungebundenen Bradford-Reagenz von 470 nm auf 595 nm des blauen
komplexierten Farbstoffes zu. Dabei kann die Zunahme der Absorption bei
595 nm gegen das freie Farbreagenz photometrisch gemessen werden und
zeigt damit den Anteil der Proteine in der Lösung an.
Zur Messung wurde eine Standardkurve mit Immunglobulin G (IgG) in den
Konzentrationen 3,45, 6,90, 10,35, 13,8 µg/ml und ein Leerwert mit 200 µl
Bradford-Reagenz sowie mit 800 µl Aqua bidest erstellt. In eine
Photometerküvette wurden 790 µl Aqua bidest pipettiert und die 10 µl
Standard IgG, bzw. Probe sowie 200 µl Bradford-Reagenz hinzugeführt. Alles
wurde mit einem Spatel gut vermischt und nach fünfzehnminütiger
Einwirkzeit bei 595 nm im Photometer Smart Spec 3000 (Fa. Bio-Rad)
gemessen.
2.4.3.
SDS PAGE
Die Analyse der Proteingemische wurde mit einer SDS-PAGE (sodium
dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis, NatriumdodecylsulfatPolyacrylamidgelelektrophorese) durchgeführt. Das SDS bindet an die
Proteine und überdeckt die Eigenladungen dieser. Die negativ geladenen
SDS-Protein-Komplexe migrieren nach Spannungsanlage zur Katode und
trennen sich ihrem Molekulargewicht nach auf. Das poröse Polyacrylamidgel
wirkt hierbei wie ein Sieb.
Aus dem Trenngel mit 10 % Acrylamidgehalt und dem Sammelgel mit 4 %
Acrylamidgehalt (s. Tabelle 6) wurde das Polyacrylamidgel hergestellt. Für
die Gele wurden die angegebenen Mengen SDS, Wasser, Bis-Acrylamid und
Tris-Puffer in einem Becherglas verrührt und anschließend
Tetramethylethylendiamin (TEMED) und Ammoniumpersulfat (APS)
hinzugefügt, um die Polymerisation zu starten. Zuerst wurde das Trenngel
hergestellt. Nachdem es in die Gelkammer gegossen wurde, wurde es mit
ca. 1 ml Isopropanol bedeckt, um einer Austrocknung entgegen zu wirken
und eine Glättung zu erreichen. Für die Polymerisation wurde es 1 h
gelagert. Während dieser Zeit wurde das Sammelgel erstellt (s. Tabelle 6).
Nach Ablauf der Zeit wurde das Isopropanol abgegossen und das Trenngel
anschließend mit Aqua bidest vier Mal abgespült. Als nächstes wurde das
Trenngel mit dem Sammelgel übergossen. Nach dem Übergießen wurden
noch im flüssigen Zustand in dieses die Gelkammern, mit Hilfe eines zehn
Taschen Gelkammes (Fa. Bio-Rad), eingebracht. Zur Polymerisation
brauchte das Sammelgel ca. 30 min.
37
Material und Methoden
Tabelle 6: Zusammensetzung der SDS-PAGE Gele
Sammelgel (4 %)
Trenngel (10 %)
Bis Acrylamid 40%ig
0,6 ml
2,53 ml
Aqua bidest
3,8 ml
5,48 ml
2 M Tris (pH 8,8)
-
2,0 ml
0,5 M Tris (pH 6,8)
1,6 ml
-
SDS 20 %
30 µl
50 µl
10 % APS- Lösung
30 µl
50 µl
TEMED
3 µl
5 µl
Probenvorbereitung für das Gel:
Pro Tasche sollten 50 µg Proteinprobe aufgetragen werden. Dazu wurden die
Proteinproben auf Eis aufgetaut. Es wurden 50 µg Proteinprobe mit Wasser
auf 10 µl Volumen aufgefüllt und mit 10 µl Lämmli Puffer (Fa. Bio-Rad; mit
5 % Mercaptoethanol) versetzt. Nach gründlichem Mischen und kurzer
Zentrifugation (12.000 ⨯ g) wurden die Lösungen für 5 min auf 95 °C erhitzt.
Durch diese Denaturierung sollen die Proteine in ihrer Sekundär- und
Tertiärstruktur aufgebrochen werden. Anschließend wurden die Proben
wieder auf Eis gelegt. Gleichzeitig wurden die Gele senkrecht in eine
Gelkammer montiert und mit einem Liter Laufpuffer (s. Tabelle 7) aufgefüllt.
Nach weiterer Zentrifugation für 3 min bei 12.000 ⨯ g, wurden die Taschen
des Gels jeweils mit den 20 µl Puffer-Protein-Gemisch aufgefüllt. Es wurde
für 15 min eine elektrische Spannung von 80 V und für 1 h eine von 130 V
am Gel angelegt. Für den Molekulargewicht Standard wurde in eine
Geltasche ein Precision Plus Protein Standard® (Fa. Bio-Rad) Ladder (Leiter)
gegeben.
Tabelle 7: Zusammensetzung des Laufpuffers.
Tris
15 g
Glycin
72 g
38
Material und Methoden
SDS (20 %)
25 ml
•
ad 1 Liter destilliertes Wasser
•
Gebrauchspuffer: 200 ml 5 ⨯ Laufpuffer + 800 ml destilliertes Wasser
2.4.4.
Blotten der Proteine
Im Anschluss an die Elektrophorese wurde der Laufpuffer weggegossen und
das Gel von den Glasplatten abgelöst sowie das Sammelgel abgetrennt. Der
anschließende Transfer der Proteine auf eine Nitrocellulosemembran wurde
nach dem Prinzip des biochemischen Blottens durchgeführt. Die
verwendeten hydrophoben Membranen haben eine Porengröße von ca.
0,45 µm und haben eine hohe Kapazität Proteine zu binden. Die 10 %
Methanol des Transfer-Puffers sind für die Aktivierung der Bindungsstellen
der Nitrocellulosemembran nötig.
Bevor die einzelnen Elemente zusammengebaut wurden, wurden die
Schwämme, die Filterpapiere (Fa. Whatman) und die Nitrocellulosemembran
für fünf Minuten in Transferpuffer eingelegt. Daraufhin wurden nacheinander
luftblasenfrei ein Schwamm, ein Filterpapier, die Nitrocellulosemembran, das
Gel, das zweite Filterpapier und ein zweiter Schwamm in den Blothalter
geschichtet. Der Transfer-Stapel sowie ein Kühlakkumulator wurden in die
Blotkammer so eingesetzt, dass die Nitrocellulosemembran zur Anode
ausgerichtet war. Dann wurde die Kammer mit eiskaltem Transferpuffer (s.
Tabelle 8) aufgefüllt. Das Blotten erfolgte bei einer Spannung von 100 V für
1,5 h. Nachdem die Hälfte der Blottingzeit vorüber war, wurde der
Kühlakkumulator ausgetauscht.
Tabelle 8: Zusammensetzung des Transferpuffers
Tris
30,3 g
Glycin
144,2 g
SDS (20 %)
10 ml
•
ad 1 Liter Aqua bidest
•
Gebrauchspuffer: 100 ml 10 ⨯ Puffer + 100 ml Methanol ad 1 Liter Aqua
bidest
39
Material und Methoden
Die Überprüfung der auf der Nitrocellulosemembran gleichmäßig geblotteten
Proteine wurde mit einer unspezifischen Ponceaurot Proteinfärbung, deren
Nachweisgrenze sich ab 50 ng Protein pro Bande befindet, durchgeführt.
Nach 10 min Einwirkzeit mit der Ponceaurot Proteinfärbung wurde die
Nitrocellulosemembran mehrmals mit Aqua bidest abgewaschen und ein
Foto mit Hilfe des ChemiGenius Bioimaging System erstellt. Mit einem
Skalpell wurde anschließend die Membran nach der Höhe der gesuchten
Banden geschnitten. Um den Farbstoffe zu entfernen, wurde die
Nitrocellulosemembran für 5 min mit TBS-T (Tris Buffered Saline, Tween; Fa.
Sigma-Aldrich) abgewaschen. Nachdem fast 1 h die unspezifischen
Proteinbindungsstellen mit 5%iger TBS-T-Milch geblockt wurden, wurde die
Nitrocellulosemembran 12 h mit dem p-AMPK Antikörper (Phospho-AMPKα
(Thr172) Ab; Fa. Cell Signaling Technology) bei 4 °C behandelt. Für die
Ladungskontrolle wurde Beta-Aktin (β-Actin Ab; Fa. Cell Signaling
Technology) verwendet.
Nach Ablauf der 12 h wurden die Membranen vier Mal für 10 min mit TBS-T
abgewaschen. Hierdurch werden die Antikörper entfernt, welche nicht
gebunden haben. Anschließend wurde der Blot für 1,5 h bei RT mit den 2.
Antikörpern behandelt. Bei diesen handelte es sich um die Anti-RabbitHorseradish Peroxidase (Anti-Rabbit-HRP; Ab Goat; Fa. Jackson
ImmunoResearch Laboratories West Grove, USA), sowie um die Anti-MouseHRP (Ab Donkey; Fa. Jackson ImmunoResearch Laboratories West Grove,
USA). Beide Antikörper wurden jeweils in einer Verdünnung von 1 : 2000 mit
TBS-T und 1 % Milch verwendet. Durch die HRP-Konjugation konnten die
Targets über die Chemolumineszenzreaktion mit Luminol detektiert werden.
Anschließend wurde der Blot drei mal 15 min mit TBS-T abgewaschen,
danach einmal über 15 min mit TBS. Durch das SuperSignal West Dura
Extended Duration Substrate® (Fa. ThermoScientific©) wurde der Blot
eingefärbt. Hierfür wurde 1 ml Färbelösung aus dem 1 : 1 Gemisch der
beiden Lösungen des Kits hergestellt und anschließend die Membran damit
übergossen. Nach Ablauf von 4 min Einwirkzeit wurde mit dem ChemiGenius
Bioimaging System die durch die Oxidation des Luminol ausgelöste
Chemilumineszenz fotografiert. Hierfür wurde eine Belichtungszeit von
30 sek und 15 min gewählt.
2.5.
Statistische Auswertungen
Die Analysen wurden mit der GraphPad Software Version 5 durchgeführt. Die
Daten werden als arithmetischer Mittelwert±SD dargestellt. Die statistische
Auswertung zwischen zwei Gruppen erfolgte mittels zweiseitigen T-Tests. Für
40
Material und Methoden
Experimente mit mehr als zwei Gruppen wurde eine One-Way ANOVA
(analysis of variance) und anschließende Bonferroni Testung der einzelnen
Gruppen durchgeführt. Für alle Analysen wurde ein Konfidenzintervall von
95 % gewählt. Statistisch signifikant galt für alle Analysen ein p-Wert < 0,05.
2.6.
Liste der Chemikalien
-
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] 0,296 TBq/mmol, PerkinElmer, USA
40 % bis-Acrylamid Lösung, Bio-Rad Laboratories GmbH, München
5 % Trypsin, Trypsin-EDTA 10 ⨯, GIBCO Invitrogen, Darmstadt
Ammoniumpersulfat, BioRad, Deutschland
Angiotensin II, Sigma-Aldrich® Chemie GmbH, München
Candesartan, Sequoia Research Products Ltd., England
Compound 21, Syntagon
Diaminonaphthalin, Invitrogen, Darmstadt
Dimethylsulfoxid (DMSO), GIBCO Invitrogen, Darmstadt
DNase I (1 U/µl), Fermentas
Dulbecco’s modified eagle Medium (DMEM), GIBCO Invitrogen,
Darmstadt
Ethylendiamintetraacetat (EDTA), 25 mM
Ethanol, Apotheke Roth, Deutschland
Ethidiumbromidlösung 1 %, Fluka, Deutschland
Fluvastatin, LKT Laboratories, Inc., USA
Gelatine, Sigma, Deutschland
Geneticin, GIBCO, Invitrogen, Darmstadt
Glycerol, Merck, Deutschland
2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-Ethansulfonsäure HEPES, 1 M,
Invitrogen, Darmstadt
3-Isobutyl-2-methylxanthin (IBMX), Invitrogen, Darmstadt
Insulin, Merck, Deutschland
Irbesartan, Sanofi Winthrop Industrie
Isopropanol, J.T. Baker
Laemmli Sample Buffer, BioRad, Deutschland
Losartan, Sequoia Research Products Ltd., England
Mercaptoethanol, Merck, Deutschland
Metformin HCL, Sequoia Research Products Ltd., England
Methanol, Merck, Deutschland
Natriumchlorid, Merck, Deutschland
Natriumhydroxid, Merck KGaA, Darmstadt
PD 123,319, Sigma-Aldrich® Chemie GmbH, München
Ponceau S, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
41
Material und Methoden
- Precision Plus Protein Standard, Bio-Rad Laboratories GmbH,
München
- Protease Inhibitor Cocktail, Sigma-Aldrich® Chemie GmbH, München
- Protein Standard I (bovine gamma-globulin), Bio-Rad Laboratories
GmbH, München
- RNAzol® B, WAK-Chemie Medical, Steinbach/Ts.
- Rosiglitazone HCI, Sequoia Research Products Ltd., England
- Salzsäure, Rauchend, 37 %, Roth, Deutschland
- SDS, 20 % (Natriumdodecylsulfat)
- Simvastatin, Merck, Deutschland
- Telmisartan, Sequoia Research Products Ltd., England
- TEMED, Merck KgaA, Darmstadt
- Tris/Trizma® Base, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
- Tris-HCl, Promega, Madison, USA
- Troglitazone, Sequoia Research Products Ltd., England
- TurboFectTM in vitro transfection reagent, Fermentas GmbH, St. LeonRot
- Tween 20, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
2.7.
Liste der Laborgeräte
- Agarose Gel Electrophoresis Systems Sub-Cell® GT, Bio-Rad
Laboratories GmbH, München
- Autoklav, Wesarg, Medizintechnik, Deutschland
- BioRad Mini Transblot Cell, Bio-Rad Laboratories GmbH, München
- Bio Rad Power Pack Basic, Bio-Rad Laboratories GmbH, München
- Eppendorf Mastercycler gradient, Eppendorf AG, Hamburg
- Gel-Elektrophorese-System Horizon, Gibco/BRL, Invitrogen GmbH,
Karlsruhe
- Heraeus-Inkubator, Heraeus Holding GmbH, Hanau
- Heidolph MR3002 Magnetrührer, Heidolph Instrumeta GmbH & Co.
KG
- Ika - Combimag reo Magnetrührer, IKA®-Werke GmbH & CO. KG,
Staufen
- Isopropanol-Einfrierbox, Nalgene, USA
- Pipettierhilfe accu-jet, Brand GmbH & Co. KG, Wertheim
- Phosphor-Imaging-System, Fujifilm Photo Film Europe GmbH,
Düsseldorf
- Sartorius Laborwaage CP 225D, Sartorius AG, Göttingen
- Sartorius Laborwaage BP 3100S, Sartorius AG, Göttingen
- Sharp R212 Mikrowelle, Sharp Electronics (Europe) GmbH, Hamburg
42
Material und Methoden
2.8.
Lichtmikroskop, Carl Zeiss Jena GmbH, Jena
Zellkultur CO2-Inkubator, Binder GmbH, Tuttlingen
Analysenwaage, CP 225 D, Sartorius AG, Göttingen
Brutschrank, Heraeus B 5050 E, Heraeus Holding GmbH, Hanau
ChemiGenius2 Bio Imaging System, Syngene
Magnetrührer, Heidolph MR 3002, Heidolph Instruments GmbH & Co.
KG, Schwabach
Photometer SmartSpecTM 3000 Bio-Rad Laboratories GmbH,
München
Präzisionswaage, BP 3100 S, Sartorius AG, Göttingen
qRT-PCR-Gerät, ABI Prism® 7900 HAT Sequence Detection System,
Applied Biosystems Inc., Foster City, USA
Sicherheitswerkbank, HERAsafe HS 12, Thermo Electron LED GmbH,
Langenselbold
Spektrophotometer, NanoDropTM ND-1000, Thermo Fisher Scientific,
Wilmington, USA
Spektrophotometer Safire2 microplate reader, TECAN, Männerdorf,
Schweiz
Thermomixer Compact, Eppendorf AG, Hamburg
Tischzentrifuge, MC6, Sarstedt AG & Co., Nümbrecht
Ultrazentrifuge, OptimaTM MAX-XP, Beckman Coulter GmbH, Krefeld
Vortex, Heidolph Reax top, Heidolph Instruments GmbH & Co. KG,
Schwabach
Wasseraufbereitungssystem, Milli-Q plus, Millipore GmbH,
Schwalbach
Zählkammer, Neubauer, Karl Hecht GmbH & Co KG, Sondheim
Zentrifuge, Rotina 35 R, Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Tuttlingen
Zentrifugen, Centrifuge 5415 D, 5415 R, Eppendorf AG, Hamburg
Liste der Verbrauchsmaterialien
Petrischalen, 10 mm, Sarstedt, Nümbrecht
Pipettenspitzen, 10 µl, 100 µl, 1000 µl, Sarstedt, Nümbrecht
Küvetten, Sarstedt, Nümbrecht
Reaktionsgefäße, 1.5 ml, 2ml, Eppendorf, Hamburg
2x TaqMan® Universal PCR Master Mix, Applied Biosystems Inc,
Foster City, USA
- Einfrierröhrchen, Cryo.sTM 2 ml, Greiner-Bio One GmbH,
Frickenhausen
- Falcon/Zentrifugenröhrchen, 15, 50 ml, Sarstedt AG & Co.,
Nürnbrecht
-
43
Material und Methoden
-
Küvetten, Halb-Mikro-Küvette, Sarstedt AG & Co., Nümbrecht
Nitrocellulose-Membran, 0,45 µm Pore, Whatman GmbH, Dassel
Pasteur Pipetten, Brand GmbH & Co. KG, Wertheim
PCR-Klebefolien optisch klar, Sarstedt AG & Co., Nümbrecht
Pipetten 10, 100, 1000 µl, Eppendorf AG, Hamburg
Pipettenspitzen, Sarstedt AG & Co., Nümbrecht
Pipettierhelfer, accu-jet, Brand GmbH & Co. KG, Wertheim
Polycarbonatfilter, 8 µm Pore, Neuro Probe, Gaithersburg, USA
PolyFect® Transfection Reagent, Qiagen, Hilden
Protein Assay Dye Reagent Concentrate, Bio-Rad Laboratories
GmbH, München
Reaktionsgefäße, Eppendorf Safe Lock, 0,5, 1,5 und 2 ml, Eppendorf
AG, Hamburg
Reaktionsgefäße, Multiply®.µStripPro 0,1 ml PCR 8er-Kette, Sarstedt
AG & Co., Nümbrecht
RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas
GmbH, St. Leon-Rot
Serologische Pipetten 1, 2, 5, 10, 25 ml, Sarstedt AG & Co.,
Nümbrecht
Super Signal West Dura Extended Duration Substrate, Thermo
Scientific, Rockford, USA
Whatman-Papier, Whatman GmbH, Dassel
Zellkulturflaschen, 25 cm2, 75 cm2, Sarstedt AG & Co., Nümbrecht
Zellkulturplatten, 6-, 12-, 24-Well, Sarstedt AG & Co., Nümbrecht
Zellschaber, Sarstedt AG & Co., Nümbrecht
Zentrifugenröhrchen für Ultrazentrifuge, Polycarbonat, TL-100 (11 ⨯
34 mm), Beckman Coulter GmbH, Krefeld
44
Ergebnisse
3.
Ergebnisse
3.1.
Einfluss des AT2-Rezeptors auf die 2-Deoxy-D-[1-3H]
Glucoseaufnahme
3.1.1.
2-Deoxy-D-[1-3H] Glucoseaufnahme nach Langzeit
Stimulation von L6-Myozyten
Zur Untersuchung der Rolle des AT2-Rezeptors bei der Glucoseaufnahme
wurde eine Erhöhung der Glucoseaufnahme in die Muskelzellen durch
Stimulierung des AT2-Rezeptors angenommen. Zuerst wurden die Effekte
von AT1- und AT2-Rezeptoragonisten sowie -antagonisten auf die
Glucoseaufnahme in einer Langzeitstimulation untersucht.
Für die Langzeitstimulationsversuche mit L6-Myozyten wurden
vierundzwanzig Stunden vor dem Versuch, nach vorherigen Absaugen des
Kulturmediums, die jeweiligen Stimulanzien auf die Zellen gegeben. Die
Stimulanzien wurden mit DMEM (1 g / l Glucose) auf ein Volumen von 1, 5 ml
pro Well gebracht. Es wurden die in Tabelle 9 angegebenen Versuchsreihen
angefertigt.
Tabelle 9: Stimulanzien für DOG-Uptake Versuch, vierundzwanzig Stunden Inkubation.
Losartan (Fa. Sequoia Research Products Ltd.), Angiotensin II (Fa. Sigma-Aldrich®), PD
123,319 (Fa. Sigma-Aldrich®), Compound 21 (Fa. Syntagon).
Versuchsreihe:
Endvolumen: 1,5 ml DMEM (1 g/l Glucose)
1.
Kontrolle (DMEM,
1 g/l Glucose)
2.
Losartan (10-7 M)
3.
Losartan (10-7 M)
Angiotensin II (10-7 M)
4.
Losartan (10-7 M)
Angiotensin II (10-7 M)
5.
Losartan (10-7 M)
Compound 21 (10-8 M)
PD 123,319
(10-7 M)
Nachdem die L6-Myozyten vierundzwanzig Stunden mit oben genannten
Stimulanzien inkubiert wurden, wurde für den Versuch die in Tabelle 10
angegebenen Versuchsreihen erstellt.
45
Ergebnisse
Tabelle 10: Stimulanzien für DOG-Uptake.
Versuchsreihe:
Inkubationsmedium (s. 2.2.)
1.
Kontrolle (DMEM, 1 g/l Glucose)
2.
Insulin (5 mg/ml)
3.
Losartan (10-7 M)
4.
Losartan
(10-7 M)
Insulin (1 µg/ml)
5.
Losartan
(10-7 M)
Angiotensin II (10-7 M)
6.
Losartan
(10-7 M)
Angiotensin
II (10-7 M)
Insulin (1 µg/ml)
7.
Losartan
(10-7 M)
Angiotensin
II (10-7 M)
PD 123,319 (10-7 M)
8.
Losartan
(10-7 M)
Angiotensin
II (10-7 M)
PD 123,319
(10-7 M)
9.
Losartan
(10-7 M)
Compound 21 (10-8 M)
10.
Losartan
(10-7 M)
Compound
21 (10-8 M)
Insulin
(1 µg/ml)
Insulin (1 µg/ml)
Unmittelbar nach der Durchführung des Versuches wurde die Radioaktivität
der verbleibenden 2-Deoxy-D-[1-3H] Glucose gemessen. In der Gruppe mit
zusätzlicher Insulinstimulation, sowie auch in der Gruppe ohne Insulin,
wurden, wie erwartet, die meisten Counts bei einer AT2-Rezeptorstimulation
und gleichzeitiger AT1-Rezeptorblockade erreicht. So wurden in der
Versuchsreihe des AT1-Rezeptorantagonisten Losartan zusammen mit dem
AT2-Rezeptoragonisten Compound 21 die meisten Counts gezählt.
Zweithöchste Werte wurden erzielt bei der AT1-Rezeptorblockader durch
Losartan und der dadurch vergrößerten Wirkung von Angiotensin II am AT2Rezeptor.
Wie erwartet, zeigten die Gruppen, deren Zellen mit dem AT2Rezeptorantagonist PD 123,319 inkubiert wurden deutlich geringere Werte
46
Ergebnisse
von Radioaktivität und damit auch eine verminderte Glucoseaufnahme als
die Zellen ohne PD 123,319 Behandlung.
Abbildung 12 a zeigt eine Steigerung der Glucoseaufnahme um ca. 47 % der
mit Insulin vorbehandelten Zellen im Vergleich zur Kontrolle.
Abb. 12 a: DOG-Uptake in L6-Myozyten nach vierundzwanzigstündiger Vorbehandlung mit
Insulin (5 mg/ml). * p < 0,05 vs. Kontrolle.
In den Gruppen ohne zusätzliche Insulinvorbehandlung (Abb. 12 b) führt die
Inkubation mit Losartan und Compound 21 zu einer um ca. 76 %
gesteigerten Glucoseaufnahme in die L6-Myozyten im Vergleich zur
Kontrollgruppe. Losartan zusammen mit Angiotensin II steigern die
Glucoseaufnahme um ca. 53 %. Die gleiche Gruppe mit dem Zusatz von PD
123,319 erreicht im Vergleich zu den Kontrollzellen nur noch eine Steigerung
der Glucoseaufnahme von ca. 28 %. Bei den L6-Myozyten, die mit Losartan
und Angiotensin II behandelt wurden, bewirkte der Zusatz von PD 123,319
eine Abnahme der Glucoseaufnahme um ca. 16 %.
47
Ergebnisse
Abb. 12 b: DOG-Uptake in L6-Myozyten nach vierundzwanzigstündiger Vorbehandlung mit
Los (Losartan, 10-7 M), Ang II (Angiotensin II, 10-7 M), PD (PD 123,319 10-7 M), C21
(Compound 21, 10-8 M) und deren Kombinationen. * p < 0,05 vs. Kontrolle in Abb. 12 a.
Im Vergleich zu den Zellen mit alleiniger Insulin Vorbehandlung (Abb. 12 a)
fand bei den Zellen, welche mit Losartan, Compound 21 und Insulin
vorbehandelt wurden (Abb. 12 c) eine Steigerung der Glucoseaufnahme um
ca. 41 % statt. Losartan, Ang II zusammen mit Insulin erzielten eine
Steigerung von ca. 33 %. Der Zusatz von PD 123,319 führte sogar zu einer
Abnahme der Glucoseaufnahme von ca. 3 % im Vergleich zu den nur mit
Insulin behandelten Zellen. In den Zellgruppen mit der Insulin Vorbehandlung
wurden im Vergleich zu den Zellen ohne PD 123,319 Zusatz ca. 27 % mehr
Glucose aufgenommen als mit Zusatz des AT2-Rezeptorantagonisten.
48
Ergebnisse
Abb. 12 c: DOG-Uptake in L6-Myozyten nach vierundzwanzigstündiger Vorbehandlung wie
in Abb 5b und dem Zusatz von Insulin (5 mg/ml). ** p < 0,05 vs. Insulin in Abb. 12 a.
3.1.2.
2-Deoxy-D-[1-3H] Glucoseaufnahme nach fünfstündiger
Stimulation in L6-Myozyten
Auch bei einer kürzeren Vorinkubation der L6-Myozyten zeigten sich
deutliche Effekte auf die spätere Glucoseaufnahme. Wie bei den Versuchen
mit einer längeren Inkubationszeit war auch bei diesen Experimenten das
Ziel, eine erhöhte Glucoseaufnahme durch Stimulation des AT2-Rezeptors
darzustellen.
Für die DOG-Uptake Experimente mit einer fünfstündigen Vorinkubation
wurden vor dem Versuch die L6-Myozyten fünf Stunden mit Insulin, Ang II,
dem AT1-Rezeptorantagonisten Losartan und dem AT2-Rezeptorantagonisten
PD 123,319 nach folgendem Schema inkubiert:
49
Ergebnisse
Tabelle 11: Stimulanzien für DOG-Uptake Versuche mit fünf Stunden Inkubationszeit.
Versuchsreihe:
Endvolumen: 1,5 ml DMEM (1 g/l Glucose)
1.
Kontrolle (DMEM, 1 g/l Glucose)
2.
Insulin (1 µg/ml)
3.
Angiotensin II (10-7 M)
4.
Angiotensin II
(10-7 M)
Losartan (10-7 M)
5.
Angiotensin II
(10-7 M)
Losartan
(10-7 M)
6.
Angiotensin II
(10-7 M)
PD 123,319 (10-7 M)
PD 123,319
(10-7 M)
Nach der Inkubationszeit mit den in Tabelle 11 genannten Substanzen,
erfolgten die Versuche wie unter Punkt 2.2. beschrieben. Anschließend
wurde die verbleibende Radioaktivität gemessen. Erwartet wurde eine
erhöhte Glucoseaufnahme bei erhöhter Stimulation des AT2-Rezeptors.
Die meisten Counts wurden in der Gruppe von Angiotensin II zusammen mit
Losartan gezählt. Im Vergleich zur Kontrolle zeigte sich eine um ca. 51 %
erhöhte Glucoseaufnahme. Diese Effekte nahmen, wenn der AT2-Rezeptor
durch den Zusatz von PD 123,319 blockiert wurde, um ca. 15 % ab.
Abbildung 13 zeigt die Ergebnisse:
50
Ergebnisse
Abb. 13: DOG-Uptake nach fünfstündiger Stimulation mit Insulin (5 mg/ml), Ang II
(Angiotensin II, 10-7 M), Los (Losartan, 10-7 M) und PD (PD 123,319, 10-7 M), sowie deren
Kombinationen. * p < 0,05 vs. Kontrolle.
Weitere Experimente mit fünfstündiger Inkubationszeit wurden mit dem AT2Rezeptoragonisten Compound 21, Losartan und PD 123,319 durchgeführt:
Tabelle 12: Stimulanzien für DOG-Uptake Versuche mit fünf Stunden Inkubationszeit
Versuchsreihe:
Endvolumen: 1,5 ml DMEM (1 g/l Glucose)
1.
Kontrolle (DMEM, 1 g/l Glucose)
2.
Compound 21 (10-8 M)
3.
Compound 21
(10-8 M)
Losartan (10-6 M)
4.
Compound 21
(10-8 M)
Losartan (10-6 M)
5.
PD 123,319 (10-6 M)
PD 123,319
(10-6 M)
51
Ergebnisse
Versuchsreihe:
6.
Endvolumen: 1,5 ml DMEM (1 g/l Glucose)
Losartan (10-6 M)
Nach den DOG-Uptake Versuchen wurde die verbleibende Radioaktivität
gemessen. Es zeigten sich bei diesen Experimenten die meisten Counts in
der Compound 21 mit Losartan Gruppe mit einer prozentualen Erhöhung der
Glucoseaufnahme um ca. 85 %, sowie in der Losartan Gruppe, mit einer
Glucoseaufnahmeerhöhung um ca. 50 % im Vergleich zu der Kontrollgruppe.
Abbildung 14 veranschaulicht die Ergebnisse:
Abb. 14: DOG-Uptake nach fünfstündiger Inkubation mit C21 (Compound 21, 10-8 M), Los
(Losartan, 10-6 M) und PD (PD 123,319, 10-6 M) sowie deren Kombinationen. * p < 0,05 vs.
Kontrolle.
3.1.3.
Dosis-Wirkungs-Kurve von Compound 21
Für die Dosis-Wirkungs-Kurve des AT2-Rezeptoragonisten Compound 21 im
Hinblick auf die Deoxy-D-[1-3H] Glucoseaufnahme wurden fünf Stunden vor
den Experimenten die L6-Myozyten mit verschiedenen Compound 21
Konzentrationen inkubiert. Als Kontrolle diente zum einen DMEM (1 g/l
52
Ergebnisse
Glucose), zum andern Insulin (1 µg/ml). Tabelle 13 zeigt die verwendeten
Versuchsreihen:
Tabelle 13: Substanzien für DOG-Uptake Versuche mit unterschiedlichen Compound 21
Konzentrationen.
Versuchsreihe:
Endvolumen: 1,5 ml DMEM (1 g/l Glucose)
1.
Kontrolle (DMEM, 1 g/l Glucose)
2.
Insulin (1 µg / ml)
3.
Compound 21 (10-8 M)
4.
Compound 21 (10-9 M)
5.
Compound 21 (10-10 M)
6.
Compound 21 (10-11 M)
7.
Compound 21 (10-12 M)
Nach Ablauf der fünfstündigen Inkubationszeit wurden die 2-Deoxy-D-[1-3H]
Glucoseaufnahme durchgeführt und anschließend die Radioaktivität
gemessen. Wir registrierten eine deutliche Zunahme der Counts bei den mit
Insulin vorbehandelten L6 Myozyten um ca. 34 % im Vergleich zur
Kontrollgruppe. Eine ca. 2%ige Abnahme der Counts im Vergleich zur
Insulingruppe registrierten wir bei der Compound 21 Konzentration von 10-8
M. Bei einer Konzentration von 10-9 M wurden 7,5 % weniger Counts
verzeichnet als in der Insulingruppe. Bei 10-10 M stiegen die Counts wieder
an, so dass die signifikant meisten Counts bei den Compound 21
Konzentrationen von 10-10 M mit ca. 35 % höherer Glucoseaufnahme und bei
10-11 M, mit ca. 40 % mehr 2-Deoxy-D-[1-3H] Glucoseaufnahme in die Zelle
im Vergleich zur Kontrollguppe registriert wurden. Im Vergleich zur
Insulingruppe steigerte sich die Deoxy-D-[1-3H] Glucoseaufnahme um ca.
3 % bei 10-10 M und ca. 5 % bei 10-11 M. Ab einer Konzentration von 10-12 M
fiel die Glucoseaufnahme ab, so dass sie 4 % weniger als die Insulingruppe
und 29 % mehr Counts als die Kontrollgruppe verzeichnete.
Abbildung 15 zeigt die Ergebnisse der Dosis-Wirkungs-Kurve:
53
Ergebnisse
Abb. 15: Dosis-Wirkungs-Kurve von Compound 21 in Hinblick auf die Glucoseaufnahme.
DOG-Uptake mit Insulin als Positivkontrolle sowie verschiedenen Compound 21
Konzentrationen (10-8 - 10-12 M). *p < 0,05 vs. Kontrolle.
3.2.
Untersuchung der Regulation der AT2-Rezeptor mRNA
Expression mittels RT-PCR
3.2.1.
AT2-Rezeptor mRNA Expression in L6-Myozyten nach
Behandlung mit AT1-Blockern und Compound 21
Zur Untersuchung der Regulation der AT2-Rezeptor mRNA Expression im
Skelettmuskel durch Arzneistoffe der kardiovaskulären Prävention wurden
zuerst verschiedene Sartane und Compound 21 über zwölf Stunden mit
ausdifferenzierten L6-Myozyten inkubiert. Ziel war es, eine Erhöhung der
AT2-Rezeptor mRNA Expression durch die Substanzen zu erreichen. Tabelle
14 veranschaulicht die jeweiligen Versuchsreihen und deren
Konzentrationen.
54
Ergebnisse
Tabelle 14: Stimulanzien für AT2-Rezeptor mRNA Expression Untersuchung mit
Candesartan (Fa. Sequoia Research Products Ltd.), Irbesartan (Fa. Sanofi Winthrop
Industrie), Telmisartan (Fa. Sequoia Research Products Ltd.), Losartan und Compound 21.
Versuchsreihe:
Endvolumen: 1,5 ml DMEM (1 g/l Glucose) +
2 % Horseserum
1.
Kontrolle (DMEM, 1 g/l Glucose)
2.
Candesartan (10-7 M)
3.
Irbesartan (10-7 M)
4.
Telmisartan (10-7 M)
5.
Losartan (10-7 M)
6.
Compound 21 (10-8 M)
Nach der zwölfstündigen Inkubationszeit wurde die mRNA isoliert und in
cDNA umgeschrieben (s. 2.3.1. und 2.3.2.). Die Expression des AT2Rezeptors in den L6 Myozyten wurde mit einem kommerziell erhältlichen
TaqMan® Gene Expression Assays (Fa. Applied Biosystems,
#Mm00431727_g1) untersucht. Das Referenz-Gen GAPDH wurde ebenfalls
durch einen kommerziell erhältlichen TaqMan® Gene Expression Assays (Fa.
Applied Biosystems, #Mm99999915_g1) quantifiziert. Beide Assays haben
exonübergreifende Sonden und lassen daher nur die Detektion von
umgeschriebener mRNA zu. Zur Kontrolle auf eventuelle Verunreinigung der
eingesetzten mRNA mit DNA dienten bei allen Assays Proben (-RT-Proben),
bei denen bei der cDNA-Synthese statt dem Enzym Reverse Transkriptase
nur Wasser eingesetzt wurde.
Bei den Zellen, die mit den Sartanen Telmisartan und Losartan sowie mit
dem AT2-Rezeptoragonisten Compound 21 behandelt wurden, trat eine
erhöhte Expression des AT2-Rezeptors auf (s. Abb. 16), wohingegen die
Zellen unter Candesartan und Irbesartan, sowie die unbehandelten KontrollZellen erst ein Signal nach dem 35. Zyklus zeigten. Da in diesem
Zyklusbereich die Nachweisgrenze für die quantitative RT-PCR liegt, kann
man hier von einer sehr geringen Expression des AT2-Rezeptors in den L6
Myozyten ausgehen.
55
Ergebnisse
Abb. 16: Ergebnisse der RT-PCR. Prozentuale AT2-Rezeptor mRNA Expression, bezogen
auf die Kontrolle in L6-Myozyten, nach zwölfstündiger Inkubation mit Sartanen (10-7 M) und
Compound 21 (10-8 M).
3.2.2.
AT2-Rezeptor mRNA Expression in L6-Myozyten nach
Behandlung mit Antidiabetika
Um die Beeinflussung der Regulation der AT2-Rezeptor mRNA Expression
durch Antidiabetika in Skelettmuskelzellen zu untersuchen, wurden
ausdifferenzierte L6-Myozyten mit Metformin HCI (Fa. Sequoia Research
Products Ltd.), Rosiglitazon HCI (Fa. Sequoia Research Products Ltd.) und
Troglitazon (Fa. Sequoia Research Products Ltd.) über zwölf Stunden
inkubiert. Tabelle 15 erläutert die einzelnen Konzentrationen:
Tabelle 15: Stimulanzien für AT2-Rezeptor mRNA Expression Untersuchung mit Metformin,
Rosiglitazon und Troglitazon.
Versuchsreihe:
Endvolumen: 1,5 ml DMEM (1 g/l Glucose) +
2 % Horseserum
1.
Kontrolle (DMEM, 1 g/l Glucose)
56
Ergebnisse
Versuchsreihe:
Endvolumen: 1,5 ml DMEM (1 g/l Glucose) +
2 % Horseserum
2.
Metformin (10-3 M)
3.
Rosiglitazon (10-3 M)
4.
Troglitazon (10-3 M)
Die mRNA wurde nach zwölf Stunden isoliert und in cDNA umgeschrieben (s.
2.3.1. und 2.3.2.). Auch bei diesen Versuchen wurde, wie unter 3.2.1.
beschrieben, die Expression des AT2-Rezeptors mit Hilfe TaqMan® Gene
Expression Assays quantifiziert. Als Referenz-Gen wurde GAPDH
verwendet. Wie in Abbildung 17 zu sehen ist, führte die Vorbehandlung mit
Metformin zu einer relativ kleinen, aber keiner signifikanten Erhöhung der
mRNA Expressionen des AT2-Rezeptors. Hingegen zeigten sich die höchste
mRNA Expression in den mit Troglitazone vorbehandelten Zellen. Zu den
zweithöchsten Werten führte die Vorbehandlung mit Rosiglitazon. Beide
Ergebnisse waren statistisch signifikant.
Abb. 17: Ergebnisse der RT-PCR. Prozentuale AT2-Rezeptor mRNA Expression, bezogen
auf die Kontrolle, nach zwölfstündiger Inkubation mit Metformin (10-3 M), Rosiglitazon
(10-3 M) und Troglitazon (10-3 M). * p < 0,05 vs. Kontrolle.
57
Ergebnisse
3.2.3.
AT2-Rezeptor mRNA Expression in L6-Myozyten nach
Behandlung mit Statinen
Für die Untersuchung eines eventuellen Einflusses von Satinen auf die AT2Rezeptor mRNA Expression wurden L6-Myozyten zwölf Stunden vor der
RNA-Isolation mit Fluvastatin (Fa. LKT Laboratories, Inc., 10-3 M) und
Simvastatin (Fa. Merck, 10-3 M) inkubiert (s. Tabelle 16).
Tabelle 16: Stimulanzien für AT2-Rezeptor mRNA Expression Untersuchung mit Fluvastatin
und Simvastatin.
Versuchsreihe:
Endvolumen: 1,5 ml DMEM (1 g/l Glucose) +
2 % Horseserum
1.
Kontrolle (DMEM, 1 g/l Glucose)
2.
Fluvastatin (10-3 M)
3.
Simvastatin (10-3 M)
Nach der zwölfstündigen Inkubation wurde die mRNA isoliert und in cDNA
umgeschrieben (s. 2.3.1. und 2.3.2.). Mit Hilfe des TaqMan® Gene
Expression Assays wurde die Genexpression des AT2-Rezeptors quantifiziert
(s. 3.2.1.). Als Kontrollgen diente das Referenz Gen GAPDH. Nach der
Auswertung zeigte sich, wie Abb. 18 verdeutlicht, eine signifikante Zunahme
der Genexpressionen des AT2-Rezeptors unter dem Einfluss von Fluvastatin.
Unter dem Einfluss von Simvastatin erhöhte sich die mRNA Expression nur
leicht und nicht signifikant.
58
Ergebnisse
Abb. 18: Ergebnisse der RT-PCR. Prozentuale AT2-Rezeptor mRNA Expression, bezogen
auf die Kontrolle, nach zwölfstündiger Inkubation mit Fluvastatin (10-3 M) und Simvastatin
(10-3 M). * p < 0,05 vs. Kontrolle.
3.3.
Phosphorylierung der AMP-Kinase in L6-Myozyten, nach
fünfzehnminütiger Stimulation
Um die Aktivierung der AMPK unter dem Einfluss von AT1-Antagonisten
sowie AT2-Agonisten und -Antagonisten in L6-Myozyten zu untersuchen,
wurden die Zellen fünfzehn Minuten vor der Durchführung des Western
Blotes mit Losartan (10-7 M), Compound 21 (10-8 M) und PD 123,319 (10-7 M)
stimuliert (s. Tabelle 17).
Tabelle 17: Stimulanzien für die fünfzehnminütige Inkubation vor dem Western Blot.
Versuchsreihe:
Endvolumen: 1,5 ml DMEM (1 g/l Glucose) + 2 %
Horseserum
1.
Kontrolle
2.
Compound 21 (10-8 M)
3.
Losartan (10-7 M)
4.
PD 123,319 (10-7 M)
59
Ergebnisse
Versuchsreihe:
Endvolumen: 1,5 ml DMEM (1 g/l Glucose) + 2 %
Horseserum
5.
Compound 21
(10-8 M)
Losartan (10-7 M)
6.
Compound 21
(10-8 M)
Losartan (10-7 M)
PD 123,319
(10-7 M)
Nach der fünfzehnminütigen Inkubation mit den oben aufgeführten
Versuchsreihen wurde ein Western Blot durchgeführt (s. 2.4.). Verwendet
wurde der Antikörper Phosphor-AMPKα, Threonin 172 (Thr172) Rabbit mAb
(Fa. Cell Signaling Technology, Inc.). Als Beladungskontrolle diente BetaAktin.
Zur vollständigen Aktivität benötigt die AMPK unter anderem die
Phosphorylierung der alpha-Untereinheit an Thr 172. Daher kann diese
spezifische Phosphorylierung als „Aktivierungsmarker“ verwendet werden.
Welche der Versuchsreihen einen Einfluss auf die AMPK-Aktivität hat, wurde
durch Test auf die aktivierungsassoziierte Phosphorylierung mittels Western
Blot überprüft (s. Abb. 19 und 20).
Kontrolle
C21
Los
PD
C21 + Los +
PD
C21 + Los
Abb. 19: Obere Banden: AMPK Phosphorylierung an Threonin 172. Bild des Western Blotes
nach fünfzehnminütiger Vorbehandlung mit: (v. l. n. r., jeweils zwei Banden) Kontrolle, C 21
(Compound 21, 10-7 M), Los (Losartan (10-7 M), PD (PD 123,319, 10-7 M), C 21 (Compound
21, 10-7 M) + Los (Losartan (10-7 M) + PD (PD 123,319, 10-7 M), C 21 (Compound 21, 10-7
M) + Los (Losartan (10-7 M). . Untere Banden: Beta-Aktin als Beladungskontrolle.
60
Ergebnisse
Abb. 20: Graphische Auswertung des Western-Blotes der phosphorylierten AMPK (Thr 172).
C21 (Compound 21), Los (Losartan), PD (PD 123,319). * p < 0,05
Abbildung 19 und 20 zeigen die Aktivierung der AMPK durch den AT1Rezeptorblocker Losartan und den AT2-Rezeptoragonist Compound 21, bzw.
deren Kombination. Die Vorbehandlung mit Compound 21 führt zu einer
Steigerung der AMPK Phosphorylierung um den Faktor 3,7 im Vergleich zur
Kontrollgruppe. Die Vorbehandlung mit Losartan zeigt eine statistisch
signifikante Steigerung um den Faktor 6 und in Kombination mit Compound
21 um den Faktor 7,1, im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Erhöhung der
Phosphorylierung durch die Kombination von Losartan und Compound 21,
führt, durch den Zusatz des AT2-Rezeptorantagonisten PD 123,319, zu einer
Abnahme um den Faktor 3,5. Eine alleinige Inkubation steigert die
Phosphorylierung der AMPK um den Faktor 3,6, ohne statistische
Signifikanz.
61
Diskussion
4.
Diskussion
Das RAS ist ein fein abgestimmtes, komplexes System, in dem Ang II, über
Bindung an zelluläre Rezeptoren wie den AT1- und den AT2-Rezeptor, seine
Wirkung entfaltet. Neben den allgemein bekannten Wirkungen des RAS auf
die kardiovaskulären Homöostase und den Blutdruck verstärkt sich immer
mehr das Interesse an Ang II und seinen Rezeptorsubtypen in Bezug auf ihre
Rolle in der Pathogenese und den Verlauf von Diabetes, Insulinresistenz,
des Metabolischen Syndroms sowie deren Folgeerkrankungen (Wolf,
2004;.Sourris et al., 2010).
Die am weitesten verbreiteten Therapieformen für diese Erkrankungen sind
eine Anwendung von ACE-Inhibitoren (Lewis et al., 1993), oder von AT1Rezeptorblockern (Brenner et al., 2001), oder die Kombination von beiden
(Mogensen et al., 2000). Obwohl diese Therapien sehr wirkungsvoll sind,
können sie die Erkrankungen oder die Folgen nur abmildern, bzw. verzögern,
sie aber nicht völlig verhindern. Gegenwärtig leiden weltweit mehr als 371
Millionen Menschen unter einem Diabetes mellitus und die Anzahl der
Neuerkrankungen steigt stetig (IDF, 2013). Patienten, die an einem DMT2
und an dessen Folgeerkrankungen leiden, weisen eine extrem erhöhte
Mortalität im Vergleich zu Gesunden auf. Zusätzlich sind die entstehenden
Kosten für das Gesundheitssystem und die Gesellschaft beträchtlich (Wolf,
2004).
Um Neuerkrankungen und Fortschreiten des Diabetes und der möglichen
Folgeerkrankungen zu verhindern, nimmt die Entdeckung und Entwicklung
neuer Angriffspunkte für eine medikamentösen Therapie eine entscheidende
Bedeutung ein. Einer dieser vielversprechenden Angriffspunkte einer
Therapie könnte der AT2-Rezeptor sein. Klinische Studien deuten darauf hin,
dass dem AT2-Rezeptor ein eigener antidiabetischer Effekt zugeordnet
werden kann (Shiuchi et al., 2004). Im ersten Teil dieser Arbeit zeigen wir die
enge Verknüpfung des AT2-Rezeptors mit der Glucoseaufnahme in den
Skelettmuskel anhand Untersuchungen mit 2-Deoxy-D-[1-3H] Glucose, sowie
den Einfluss des AT2-Rezeptors und seiner Signaltransduktion auf die
Regulierung der Aktivität der AMPK.
Eine Möglichkeit für einen der neuen Angriffspunkte einer medikamentösen
Therapie ist die Erhöhung der AT2-Rezeptorexpression auf den
Skelettmuskelzellen und die damit verbundene gesteigerte insulinabhängigeund insulinunabhängige Glucoseaufnahme sowie ein verbesserter
Glucosestoffwechsel. Angesichts der nur geringen Expression des AT2Rezeptors auf Skelettmuskelzellen im adulten Organismus (Mukoyama et al.,
1993; de Gasparo et al., 2000) war das zentrale Ziel dieser Arbeit,
Substanzen zu finden, welche die Expression der mRNA des AT2-Rezeptors
in vitro signifikant erhöhen. Verschiedene Arzneistoffe der kardiovaskulären
62
Diskussion
Prävention, der antidiabetischen Therapie sowie Statinen wurden untersucht
um diese Erhöhung zu bewirken.
4.1.
Erhöhte 2-Deoxy-D-[1-3H] Glucoseaufnahme durch AT2Rezeptor Agonisten
In diesen Experimenten sollte untersucht werden, inwieweit sich die
Glucoseaufnahme nach Vorbehandlung mit verschiedenen AT-Rezeptor
Stimulantien (s. 3.1.) in Skelettmuskelzellen modifiziert.
Um die erwartete Steigerung der Glucoseaufnahme durch vermehrte
Stimulation des AT2-Rezeptorsubtypes zu zeigen, behandelten wir die L6Myozyten zuerst vierundzwanzig Stunden vor der 2-Deoxy-D-[1-3H]
Glucoseaufnahme mit verschiedenen Versuchsreihen aus Losartan,
Compound 21, Ang II und PD 123,319. Als Kontrolle wurden Zellen ohne
Vorbehandlung und mit Insulinstimulation verwendet.
Bei Sartanen, wobei Telmisartan den größten Effekt hat, deuten Studien
darauf, dass sie die Anzahl der GLUT4 in der Plasmamembran von
Adipozyten erhöhen und dadurch den Glucose Uptake erhöhen (Furukawa et
al., 2011). Außerdem wurde von verschiedenen Autoren in vivo beschrieben
(Shiuchi et al., 2004; Rompe et al., 2010), dass eine vermehrte Stimulation
des AT2-Rezeptors den Glucose-Uptake von Skelettmuskelzellen steigert.
Unser Ziel war es daher, in vitro eine eindeutige Abhängigkeit der erhöhten
Glucoseaufnahme und der AT2-Rezeptorstimulation aufzuzeigen. Des
Weiteren wollten wir einen Zusammenhang der, durch die vorangegangenen
Untersuchungen zur mRNA Expression des AT2-Rezeptors, erhöhten
Expression und eines veränderten Glucose-Uptake aufzeigen.
In unseren Experimenten zeigte sich die erwartete Erhöhung der 2-Deoxy-D[1-3H] Glucoseaufnahme im Vergleich zu unbehandelten Myozyten bei
alleiniger Blockierung des AT1-Rezeptors durch Losartan und eine weitere
Erhöhung bei zusätzlicher Stimulation des AT2-Rezeptors durch Ang II. Diese
Effekte ließen sich in einer weiteren Versuchsreihe, durch zusätzliche
Vorbehandlung mit dem AT2-Rezeptorantagonisten PD 123,319,
abschwächen. Die stärkste 2-Deoxy-D-[1-3H] Glucoseaufnahme sahen wir
jedoch bei der Versuchsreihe, in der der AT1-Rezeptor durch Losartan
geblockt wurde und gleichzeitig der AT2-Rezeptor selektiv durch C21
stimuliert wurde. Dies sind deutliche Indizien für die Beeinflussung der
Glucoseaufnahme durch den AT2-Rezeptor.
Auch die Untersuchungen mit nur fünfstündiger Vorbehandlung zeigen
ähnliche Effekte (s. 3.2.). Der Zusatz von Insulin zu den Versuchsreihen und
den zu den Untersuchungen mit vierundzwanzigstündiger Vorbehandlung
63
Diskussion
analogen Ergebnissen verdeutlicht, dass es sich größtenteils um
insulinunabhängige Modulationen der Glucoseaufnahme in die Zelle handelt.
Unsere Ergebnisse werden durch mehrere in vivo Studien bestärkt, die eine
vermehrte AT2-Rezeptor Stimulation untersuchen, welche den
Glucosemetabolismus in Adipozyten (Jing et al., 2013) und in Myozyten
(Chai et al., 2011) verbessert. Li et al. (2012) untersuchte zudem die
verbesserte Insulinsensitivität in Skelettmuskelzellen, welche Telmisartan
über den Peroxisomen-Proliferator-aktivierten Rezeptor γ (PPARγ) erreichen
soll. Weitere Studien haben gezeigt, dass Telmisartan im Vergleich zu
anderen AT1-Rezeptorblockern am stärksten den PPARγ beeinflusst und
dadurch maßgeblich Einfluss auf den Glucosestoffwechsel und den
Fettstoffwechsel nimmt (Kintscher und de la Sierra, 2010).
Bei fünfstündiger und bei vierundzwanzigstündiger Vorbehandlung mit den
Substanzen konnte die höchste Differenz zur Kontrolle bei der 2-Deoxy-D[1-3H] Glucoseaufnahme mit dem AT2-Rezeptoragonist Compound 21
registriert werden. Um eine optimale Konzentration für C21 zu finden,
erstellten wir eine Dosis-Wirkungs-Kurve. Mehrere Studien verwenden für
ihre Versuche Compound 21 Konzentrationen von 0,1 nM - 1 µM (Wan et al.,
2004; Murugaiah et al., 2012). In dieser Arbeit vorliegende Versuchsreihe zur
Dosis-Wirkungs-Kurve, wurden Konzentrationen von 10-12 - 10-8 M
untersucht. Als Kontrolle dienten zum einen unbehandelte und zum anderen
mit Insulin behandelte L6-Myozyten. Unsere Ergebnisse zeigen eine
deutliche Zunahme der Counts bei den Compound Konzentrationen 10-8 M,
10-10 M und 10-11 M. Bei 10-8 M zeigten sich ca. gleich viele Counts wie bei
der Insulingruppe. Bei 10-9 M und 10-12 M registrierten wir eine leichte
Abnahme der Counts. Dieses Phänomen deutet darauf hin, dass die
dosisabhängige Wirkung von Compound 21 bei einer Konzentration von
10-8 M zu gleichen Effekten bei der Glucoseaufnahme in Skelettmuskelzellen
führt, wie bei einer Insulinstimulation. Diese Ergebnisse können hilfreich für
weitere Experimente am AT2-Rezeptor mit Compound 21 sein.
4.2.
Stimulation des AT2-Rezeptors aktiviert die AMPK
Die AMPK ist entscheidend an der Regierung des Glucosestoffwechsels
beteiligt (Yamauchi et al., 2002). Ein Indiz für einen erhöhten
Glucosemetabolismus ist eine gesteigerte Aktivität der AMPK (Fisher et al.,
2002).
Durch unseren Western-Blot wollten wir die Regulation, bzw. Abhängigkeit
einer AMPK Aktivierung durch eine AT2-Rezeptor Stimulation in Myozyten
untersuchen. Deji et al. (2012) zeigten ein Indiz für diese Abhängigkeit, in
64
Diskussion
ihren in vivo Experimenten an Mäusen nach einer Hoch-Fett Diät. Ihre
Ergebnisse zeigten, dass erhöhte Ang II Spiegel zu einer Verminderung der
AMPK Aktivität in der Niere führen. Diese Verminderung konnte durch eine
zweiwöchige Behandlung mit Losartan wieder aufgehoben werden.
Weitere Hinweise auf eine vermehrte Aktivierung der AMPK bei AT2-Rezeptor
Stimulation lieferten unsere Ergebnisse.
So stellte sich die höchste AMPK Aktivität bei einer Vorbehandlung mit dem
AT2-Rezeptoragonist C21 und gleichzeitiger Blockierung des AT1-Rezeptors
mit Losartan dar. Wiederum konnte dieser Effekt durch den Zusatz des AT2Rezeptorantagonisten PD 123,319 deutlich vermindert werden. Die
zweithöchste Aktivität konnten wir bei alleiniger AT1-Rezeptor Blockade durch
Losartan registrieren.
Zusammengefasst verdeutlichen unsere Ergebnisse den Einfluss des AT2Rezeptors auf die Steuerung der AMPK. Sie geben Hinweise darauf, über
welche weiteren Signalwege der AT2-Rezeptor den Glucosestoffwechsel und
auch den Fettstoffwechsel beeinflussen kann.
Die enge Verknüpfung von einer Dysregulierung der AMPK und dem
Vorhandensein einer Insulinresistenz, bzw. eines Metabolischen Syndroms,
wurde in Kapitel 1.5. besprochen. Ungeklärt ist die Frage, ob ein Abfall der
AMPK das primäre Ereignis ist, welches zu einer Insulinresistenz und mit
dem Metabolischem Syndrom assoziierten Krankheiten führt, oder ob der
Abfall ein Bestandteil einer adaptierten Antwort auf Insulinresistenz,
oxidativen Stress und Entzündung ist (Ruderman et al., 2013). Da alle diese
Stressfaktoren einen Abfall der AMPK Aktivität verursachen können und im
Gegenzug eine gesteigerte Aktivität diese Faktoren erniedrigen kann, ist es
besonders vielversprechend, den therapeutischen Nutzen einer AMPK
Aktivierung zu erforschen. In Hinblick auf die Prävention und Therapie der
mit dem Metabolischem Syndrom assoziierten Krankheiten kann, wie unsere
Ergebnisse veranschaulichen, der AT2-Rezeptor eine große Rolle spielen.
4.3.
Regulation der AT2-Rezeptor mRNA Expression
Um eine vermehrte mRNA Expression des AT2-Rezeptors in
Skelettmuskelzellen zu erreichen, behandelten wir die ausgewachsenen
Myozyten der Ratte mit Medikamenten aus der kardiovaskulären Prävention
sowie Antidiabetika und Statinen. Ziel war es, durch eine Erhöhung der
mRNA Expression des AT2-Rezeptors ein Indiz für eine Erhöhung der
Rezeptorenanzahl auf der Zelloberfläche zu erhalten, welche zu den
positiven Effekten des AT2-Rezeptors in Bezug auf die Glucoseaufnahme,
bzw. den Glucosemetabolismus führen kann.
65
Diskussion
4.3.1.
Sartane und Compound 21
In den ersten Untersuchungen der vorliegenden Arbeit wurden die L6Myozyten mit den Sartanen Candesartan, Irbesartan, Telmisartan, Losartan,
und dem AT2-Rezeptoragonisten Compound 21 zwölfstündig behandelt.
Einige Studien deuten darauf hin, dass eine AT1-Rezeptorblockade Einfluss
auf die AT2-Rezeptorexpression haben kann. So zeigt Armando et al. (2001)
dieses bei Ratten, welche einem erhöhten Stresslevel ausgesetzt waren. Bei
ihren Versuchen wurden die Tiere über dreizehn Tage mit Candesartan
vorbehandelt. Dies führte zu einer Steigerung der mRNA Expression des
AT2-Rezeptors in der zona glumerulosa der Nebenniere. Ein weiterer Hinweis
auf den Zusammenhang zwischen AT1-Rezeptorblockierung und
Expressionsregulation zeigen die Untersuchungen an HepG2 Zellen, einer
menschliche Zellelinie aus Leberkarzinomzellen. Miura et al. (2010)
untersuchten an ihnen unter anderem die AT1- und AT2-Rezeptor Expression
nach Inkubation mit Telmisartan und PD 123,319. Unter Behandlung mit 1
µM Telmisartan konnte eine Abnahme der AT1-Rezeptor Expression und eine
Zunahme der AT2-Rezeptor Expression nach acht Stunden nachgewiesen
werden. Nach vierundzwanzig Stunden erreichte die Expression von beiden
Rezeptoren wieder das basale Level. Die Inkubation der HepG2 Zellen mit
PD 123,319 hatte keinen Einfluss auf die Expression der Rezeptoren.
In unseren Untersuchungen wurde die mRNA nach Isolation in cDNA
umgeschrieben, wodurch mit Hilfe der rt-PCR die AT2-Rezeptor mRNA-Level
gemessen werden konnten (Schefe et al., 2006).
Bei den gemessenen rt-PCR Ergebnissen zeigte sich eine fast gleich
gesteigerte mRNA Expression des AT2-Rezeptors unter Einfluss der Sartane
Telmisartan und Losartan, jedoch ohne statistische Signifikanz zur
Kontrollgruppe. Einen noch geringere Steigerung im Vergleich zur
Kontrollgruppe wurde bei den L6-Myozyten gemessen, welche mit
Candesartan und Irbesartan vorbehandelt wurden. Die weitaus größte
Steigerung der AT2-Rezeptorexpression konnten wir in dieser Versuchsreihe
bei dem AT2-Rezeptoragonist Compound 21 erzielen. Hier zeigten sich um
das ca. Vierfache erhöhte Werte im Vergleich zur Kontrollgruppe. Aber auch
hier zeigte sich keine statistische Signifikanz.
Die Ergebnisse deuten auf eine vermehrte mRNA Expression des AT2Rezeptors nach Vorbehandlung mit Sartanen und Compound 21 hin. Unsere
Erwartungen wurden aber nicht vollends erfüllt. Wir hatten eine größere
Steigerung erwartet und einen noch statistisch signifikanteren Unterschied
zur Kontrollgruppe. Gründe für die unzureichenden Ergebnisse könnten im
Alter, bzw. der zu hohen Splitting-Rate der L6 Zellline, sowie in der
Inkubationszeit der Stimulantien gesucht werden.
66
Diskussion
4.3.2.
Glitazone und Metformin
In unseren zweiten Versuchsreihen mit den Glitazonen Rosiglitazon und
Troglitazon, sowie mit dem Biguanid Metformin, wurden die L6-Myozyten
zwölf Stunden vor RNA Isolation mit den Substanzen inkubiert.
Die sogenannten „Insulin-Sensitizer“ Rosiglitazone und Troglitazon sind
PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptors vom Typ γ)-Agonisten,
die zu der Zellkern-Rezeptorfamilie der ligandenabhängigen
Transkriptionsfaktoren gehören. Diese Rezeptoren sollen eine wichtige Rolle
bei der Entstehung der Adipositas und des Metabolischen Syndroms haben
(Plutzky, 2000). Neben ihren „Insulin-sensitivierenden“ Eigenschaften sollen
sie starke anti-inflammatorische Eigenschaften besitzen (Plutzky, 2001). In
mehreren Studien wurde gezeigt, dass PPARγ-Agonisten deutlich die
kardiale Hypertrophie, atherosklerotische Verletzungen reduzieren, sowie
kardioprotektive Einflüsse nach Ischämie haben (Collins et al., 2001; Sakai et
al., 2002; Yue et al., 2001). Es ist noch nicht ausreichend untersucht, wie
PPARγ Agonisten das RAS modifizieren. Einige Studien deuten darauf hin,
dass PPARγ-Agonisten die Effekte des Ang II inhibieren, indem sie den durch
Ang II ausgelösten Signalweg unterdrücken. Dadurch haben die PPARγAgonisten einen positiven Einfluss gegen Atherosklerose und Re-Stenose
(Goetze et al., 1999). Weiter zeigten Ren et al. (2011) in ihren
Untersuchungen von glatten Muskelzellen in Gefäßen, dass Rosiglitazon
deren, durch Ang II induzierte, Proliferation in vitro und zusätzlich die Bildung
von frühen atherosklerotischen Plaques bei Mäusen mit einer
cholesterinreichen Diät, verhindern kann. Diese Effekte führen sie darauf
zurück, dass PPARγ-Agonisten das Lipidprofil verbessern, die lokale
Gewebskonzentration von Ang II vermindern und die Expression des AT1Rezeptors vermindern, sowie die Expression des AT2-Rezeptors steigern.
Auch Molavi et al. (2006) führen in ihren in vivo Untersuchungen an Ratten
die kardioprotektive Wirkung von Rosiglitazon auf eine gesteigerte
Expression des AT2-Rezeptors und eine gleichzeitig verringerte Expression
des AT1-Rezeptors zurück.
Die dritte Substanz in dieser Versuchsreihe, das Biguanid Metformin, wird als
gängige antidiabetische Therapie bei Patienten mit DMT2 verwendet. Das
Medikament wird seit 1957 verwendet und ist das einzige Buguanid, das in
Deutschland als orales Antidiabetikum eingesetzt wird (Aktories et al., 2013).
Metformin wirkt positiv gegen einen hohen Blutzuckerspiegel, ohne die
Insulinsekretion zu erhöhen, zu einer Gewichtszunahme zu führen, oder
Hypoglykämien zu verursachen (Stumvoll et al., 1995; Wu et al., 1990). Über
eine mäßige Hemmung der Atmungskette senkt Metformin die oxidative
Phosphorylierung und führt somit zu einem Abfall der zytosolischen AMPKonzentration. Der Abfall bewirkt eine vermehrte Aktivität der AMPK.
67
Diskussion
Metformin aktiviert somit indirekt die AMPK (Aktiores et al., 2013). Diese
Wirkung von Metformin erklärt zum einen die herabgesetzte
Glucoseproduktion in der Leber (Stumvoll et al., 1995) und zum anderen den
erhöhten Glucose-Uptake in Skelettmuskelzellen (Hundal et al., 1992). Auch
die Wirkung auf den Fettstoffwechsel sind, wie Zhou et al. (2001)
untersuchten, der Grund einer erhöhten Aktivität der AMPK in der Leber.
Diese erhöhte Aktivierung führt zu einer Inhibierung der ACC und einer
Aktivierung der Fettsäurenoxidation. Außerdem unterdrückt Metformin durch
die indirekte AMPK Aktivierung die Expression von Enzymen, die an der
Fettsäuresynthese beteiligt sind. Weitere Untersuchungen zeigen in diesem
Zusammenhang positive Effekte zur Reduzierung einer Fettleber (Lin et al.,
2000).
Um weitere Möglichkeiten der Signalwege aufzudecken, untersuchten wir in
unseren Versuchsreihen den Einfluss auf die AT2-Rezeptor mRNA
Expression durch Metformin.
Nach der rt-PCR Auswertung zeigte sich nach Behandlung mit 10-3 M
Metformin eine Steigerung der mRNA Expression des AT2-Rezeptors um fast
das Dreifache im Vergleich zur Kontrollgruppe, jedoch ohne statistische
Signifikanz (s. Abb. 17). Bei den Glitazonen wurde für 10-3 M Rosiglitazon
eine vierfache und für 10-3 M Troglitazon eine fast sechsfach erhöhte,
signifikante Steigerung der Expression gemessen. Diese Ergebnisse deuten
darauf hin, dass Rosiglitazon und Troglitazon großen Einfluss auf die AT2Rezeptor Expression nehmen und PPARγ Signalweg eng mit dem des AT2Rezeptors verknüpft ist.
4.3.3.
Statine
In der dritten Versuchsanordnung untersuchten wir die Regulation der
mRNA Expression des AT2-Rezeptors durch die Statine Fluvastatin und
Simvastatin.
Statine werden heute weitverbreitet als Cholesterinsenker zur Therapie bei
Fettstoffwechselkrankheiten eingesetzt. Ihre Wirkung beruht auf der
kompetitiven Hemmung der HMGCR (HMG-CoA-Reduktase), vor allem in
der Leber. Die HMGCR, welche die Konversion von HMG-CoA zu Mevalonat
katalysiert, ist das geschwindigkeitsbestimmende Enzym der
Cholesterinbiosynthese (Aktories et al., 2013). Durch die reduzierte
endogene Bereitstellung von Cholesterin muss die Zelle vermehrt
Cholesterin aufnehmen. Dies geschieht, indem die Zahl der LDL (low density
lipoprotein)-Rezeptoren auf der Zelloberfläche erhöht wird. Als Resultat sinkt
der Cholesterinblutspiegel. Da fast zwei Drittel des täglichen
Cholesterinbedarfes endogen hergestellt werden, sind Statine eine effektive
68
Diskussion
Methode zur Bekämpfung einer Hypercholesterinämie (Slater und
MacDonald, 1988). So führt die Einnahme eines HMGCR Inhibitors zu einer
dosisabhängigen Reduktion von LDL- und Gesamtcholesterin im Plasma um
bis zu fünfzig Prozent. Nicht nur die Zahl der LDL-Partikel sinkt, sondern
auch deren Inhalt. Weiter kann die Einnahme zu einer bis zu 25%igen
Senkung der Triglyzeride führen (Aktories et. al. 2013).
Hypercholesterinämie und Hyperlipidämie sind die größten Risikofaktoren
der Atherosklerose, welche durch Statine behandelt, bzw. verzögert werden
können. Auch bei Patienten mit KHK konnte gezeigt werden, dass eine
Langzeittherapie zu einer Reduzierung der Plaquegröße sowie zu einem
langsameren Fortschreiten der Krankheit führen kann (Corti et al., 2001;
Schartl et al., 2001). Statine sollen zusätzlich oder in Verbindung mit der
lipidsenkenden Wirkung antiinflammatorisch wirken (Albert et al., 2001),
sowie die endotheliale Funktion verbessern können (Hernández-Perera et
al., 1998).
Mehrere Studien untersuchen die Effekte, welche Statine neben einer
Hemmung der HMGCR auf zelluläre Funktionen haben. So beschreibt
Vaughan et al. 1996 den antiproliferativen Effekt von Fluvastatin auf glatte
Muskelzellen der Gefäße.
Diese vielfachen zellulären Modifikationen, wie besonders die
antiinflammertorischen Effekte, lassen auf eine möglich AT2-Rezeptor
Involvierung schließen. Um hier einen möglichen Zusammenhang
aufzudecken, untersuchten wir die Veränderung der mRNA Expression des
AT2-Rezeptors bei L6-Myozyten nach zwölfstündiger Vorbehandlung mit 10-3
Fluvastatin und 10-3 Simvastatin. Die Ergebnisse zeigten eine ca. dreifache
Steigerung der mRNA Expression durch Fluvastatin, signifikant im Vergleich
zur Kontrollgruppe, und eine fast doppelte mRNA Steigerung durch
Simvastatin, ohne statistische Signifikanz. Die Ergebnisse zeigen einen
deutlichen Einfluss der beiden Statine auf die Expression des AT2-Rezeptors.
Der Unterschied zwischen Fluvastatin und Simvastatin könnte
möglicherweise durch die unterschiedliche Synthese, bzw. den
unterschiedlichen molekularen Aufbau erklärt werden. Während Simvastatin
zu den Typ 1 Statinen zählt, wird Fluvastatin zu den vollsynthetischen Typ 2
Statinen gezählt. Diese besitzen längere Seitenketten am HMG-Modul, die
mehr oder weniger hydrophob sind (Aktories et al., 2013). Eventuell hat
diese Eigenschaft einen größeren Einfluss auf die AT2-Rezeptor mRNA
Expression.
Die Hypothese, dass durch die von Statinen gesteigerte mRNA Expression
die positiven Effekte des AT2-Rezeptors auf den Glucosemetabolismus
verstärkt werden können, sollte weiter untersucht werden. Denn auch wenn
der AT2-Rezeptor, wie unsere Ergebnisse veranschaulichen, durch Statine
beeinflusst wird, zeigte die JUPITER Studie (Ridker et al. 2008), dass Statine
69
Diskussion
zwar einen positiven Einfluss auf das Outcome bei kardiovaskulären
Erkrankungen haben, aber gleichzeitig das Risiko für Diabetes
Neuerkrankungen erhöhen können. Allerdings sollten die Prinzipe der
zellulären Abläufe weiter untersucht werden.
4.4.
Ausblick
Die aufgeführten Experimente wurden alle in vitro durchgeführt. Sie zeigen
eine deutliche Beeinflussung der mRNA Expression des AT2-Rezeptors durch
Medikamente der kardiovaskulären Prävention, Antidiabetika und Statine.
Die mRNA kann durch viele posttranskriptionelle Schritte modifiziert werden,
welche die Proteinexpression beeinflussen können (Vogel und Marcotte,
2012). Daher ist eine Erhöhung der mRNA Expression nicht zwangsläufig
gleichzusetzen mit einer vermehrten Anzahl funktionstüchtiger AT2Rezeptoren auf der Plasmamembran der Zelle. Unsere aussichtsreichen
Ergebnisse sollten daher mit Hilfe eines Western-Blots auf Proteinebene
verifiziert werden.
Weitere Erkenntnisse würde die Umsetzung der beobachteten Ergebnisse
auf Experimente in vivo erbringen. Informativ wäre, wie stark sich die
beschriebenen Effekte der untersuchten Arzneistoffe auf eine Erhöhung der
AT2-Rezeptor mRNA Expression in adulten und/oder insulinresistenten
Individuen auswirken. Im Anschluss daran müsste man den Effekt einer
pharmakologischen AT2-Rezeptor Stimulation auf die Glucoseverwertung
untersuchen. Denkbar wären Versuche, in denen man die Arzneistoffe,
welche in vitro signifikante Ergebnisse auf die Steigerung der Expression
erzielten, sieben Tage lang in adulte Mäuse appliziert und anschließend die
Expression der AT2-Rezeptor mRNA in Gewebe wie Skelettmuskel,
Fettgewebe und Leber untersucht. Sollte in vivo eine Expressionssteigerung
die Folge sein, würde man nachfolgend Mäuse mit dem entsprechenden
Arzneistoff behandeln und anschließend zur Untersuchung der
Glucoseverwertung einen Glucosetoleranztest durchführen.
70
Zusammenfassung
5.
Zusammenfassung
Im Rahmen des Metabolischen Syndroms kommt es zu einer erschwerten
Glucoseaufnahme in insulinabhängige Gewebe wie in das Fettgewebe oder
in den Skelettmuskel. Die daraus resultierenden erhöhten InsulinPlasmakonzentrationen führen zu einer weiteren Verschlechterung der
Glucoseverwertung dieser Gewebe aber auch der Leber. Bei prädisponierten
Menschen kann in der Folge ein Diabetes Mellitus Typ 2 entstehen.
Das Renin-Angiotensin-System (RAS) bildet eines der wichtigsten Systeme
im Körper zur Regulation der kardiovaskulären Homöostase und des
Blutdruckes. Das Angiotensin II (Ang II) wirkt über zwei heptahelikale
Rezeptorsubtypen, den AT1-Rezeptor und den AT2-Rezeptor. Ang II
beeinflusst die Glucoseaufnahme in vivo und in vitro, wobei dieser Effekt
voraussichtlich über den AT2-Rezeptor verübt wird.
In dieser Arbeit wurde eine deutliche Steigerung der Glucoseaufnahme
infolge der AT2-Rezeptorstimulation aufgezeigt, direkt durch Compound 21
und indirekt durch AT1-Rezeptorblockade mit gleichzeitiger Ang II Applikation.
Außerdem zeigten wir die Verstärkung der insulinabhängigen
Glucoseaufnahme in den Skelettmuskel durch eine AT2-Rezeptorstimulation.
Von großer Bedeutung für den Glucosemetabolismus und bei der Entstehung
des Metabolischen Syndroms ist die Regulation der AMPK. Eine vermehrte
Aktivierung wirkt sich positiv auf die Prävention und den Verlauf aus. Die von
uns erhobenen Daten veranschaulichen, dass der AT2-Rezeptor eine große
Rolle in der Regulierung der AMPK Aktivierung spielt. So zeigten wir, dass
eine vermehrte AT2-Rezeptorstimulation zu einer gesteigerten AMPK
Aktivierung führt.
Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten klar darauf hin, dass der AT2-Rezeptor
eine wichtige positive metabolische Funktion ausübt und ein mögliches
pharmakologisches Ziel für die Behandlung der Insulinresistenz und mit dem
Metabolischem Syndrom assoziierten Krankheiten darstellt.
Eine Möglichkeit für ein pharmakologisches Ziel ist die Erhöhung der AT2Rezeptorexpression auf den Skelettmuskelzellen und die damit verbundene
gesteigerte insulinabhängige und insulinunabhängige Glucoseaufnahme
sowie ein verbesserter Glucosestoffwechsel. Da im Skelettmuskel der AT2Rezeptor fast ausschließlich während der Neonatalphase und der
Adoleszenz exprimiert wird, während im adulten Organismus die Expression
auf kaum detektierbare Werte abfällt, versuchten wir mit Arzneistoffen aus
der kardiovaskulären Prävention, Antidiabetika und Statinen eine Steigerung
zu erreichen. Wir erzielten die stärkste Expression mit Telmisartan, Losartan
und Compound 21 sowie den Glitazonen und Fluvastatin.
71
Zusammenfassung
Die Auswirkung einer gesteigerten Expression des AT2-Rezeptors auf die
Insulinresistenz und das Metabolische Syndrom und ob diese therapeutisch
nutzbar sowie klinisch einsetzbar ist, müssen zukünftige Studien zeigen.
72
Abkürzungsverzeichnis
6.
Abkürzungsverzeichnis
AACE
Abb
ACC
ACE
ADP
AMP
AMPK
Ang I
Ang II
APS
AT1-Rezeptor
AT2-Rezeptor
ATP
BMI
BSA
C21
cAMP
Cbl
cDNA
cGMP
CoA
CRP
DAG
DDG
DHL
DMEM
DMSO
DMT2
DNA
DOG-Uptake
EDTA
EGF
EGIR
ER
ERK
FAS
FCS
g
American Association of Clinical Endocrinologists
Abbildung
Acetyl-CoA-Carboxylase
Angiotensin-Converting Enzyme, AngiotensinKonversionsenzym
Adenosindiphosphat
Adenosinmonophosphat
AMP-abhängige Proteinkinase
Angiotensin I
Angiotensin II
Ammoniumpersulfat
Angiotensin II Rezeptorsubtyp 1
Angiotensin II Rezeptorsubtyp 2
Adenosintriphosphat
Body Mass Index
Bovine Serum Albumin
Compound 21
cyclisches Adenosinmonophosphat
Casitas B-lineage Lymphoma
Complementary Desoxyribonukleinsäure
cyclisches Guanosinmonophosphat
Coenzym A
C-reaktives Protein
Diacylglycerol
Deutsche Diabetes Gesellschaft
Deutsche Hochdruckliga
Dulbecco’s Modified Eagle Medium
Dimethylsulfoxid
Diabetes mellitus Typ 2
Desoxyribonukleinsäure
2-Deoxy-D-[1-3H] Glucoseaufnahme
Ethylendiamintetraacetat
Epidermal Growth Factor, epidermaler Wachstums
Faktor
Group of the Study of Insulin Resistence
endoplasmatisches Retikulum
Extracellular-Signal Regulated Kinase
Fettsäure Synthase
Fetal Calf Serum
Erdschwerebeschleunigung
73
Abkürzungsverzeichnis
G6Pase
GAPDH
GLUT1-4
GPD
h
HbA1c
HDL
Hepes
HMG
HMGCR
HRP
IDF
IgG
IL-6
IP3
JAK
KHK
KO
LDL
Los
M
MAPK
min
MKP-1
mmHg
mRNA
oGTT
N
NC-IUPHAR
NCEP
NO
OD
pAVK
PBS
PCR
PEPCK
Pen-Strep
Glucose-6-Phosphatase
Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
Glucosetransporter 1-4
Glycerol-3-Phosphatase Dehydrogenase
Stunde
Glykohämaglobin
High Density Lipoprotein, Lipoprotein hoher Dichte
4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure
3-Hydroxy-3-Methylglutaryl
HMG-CoA-Reduktase (3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoAReduktase)
Horseradish Peroxidase
International Diabetes Federation
Immunglobulin G
Interleukin-6
Inositol-1,4,5-triphosphat
Januskinase
koronare Herzkrankheit
Knockout
Low Density Lipoprotein, Lipoprotein niedriger Dichte
Losartan
Mol/l
Mitogen-Activated Protein Kinase
Minute
Mitogen-Activated Protein (MAP) Kinase Phosphatase-1
Millimeter Quecksilbersäule
Messenger Ribonukleinsäure
oraler Glucosetoleranz-Test
Anzahl
The International Union of Basic and Clinical
Pharmacology Committee on Receptor Nomenclature
and Drug Classification
National Cholesterol Education Program
Stickstoffmonoxid
optische Dichte
periphere arterielle Verschlusskrankheit
Phosphate Buffered Saline, phosphatgepufferte
Salzlösung
Polymerase Chain Reaction, Polymerasen KettenReaktion
Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase
Penicillin-Streptomycin
74
Abkürzungsverzeichnis
PIP2
PKC
PLA2
PLC
PLD
PP2A
PPARγ
RAS
RAAS
RNA
RT
rt-PCR
SD
SDS-PAGE
sek
SHP-1
STAT
Taq
TBS
TEMED
TNFα
t-PA
U
WHO
Phosphatidylinositol-4,5-biphosphat
Proteinkinase C
Phospholipase A2
Phospholipase C
Phospholipase D
Protein Phosphatase 2A
Peroxisomen-Proliferator-aktivierter Rezeptor gamma
Renin-Angiotensin-System
Renin-Angiotensin-Aldosteron-System
Ribonukleinsäure
Raumtemperatur
Real Time-PCR, Echtzeit-PCR
Standard Deviation, Standardabweichung
sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel
electrophoresis, Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese
Sekunde
SH2 Domain-Containing Protein Tyrosine Phosphatase-1
signal transducers and activators of transcription
Thermus aquaticus
Tris Buffered Saline, Tris-gepufferte Salzlösung
Tetramethylethylendiamin
Tumor Necrosis Factor-Alpha
tissue-type plasminogen activator,
gewebespezifische Plasminogenaktivator
Unit, Enzymeinheit
World Health Organisation
Klinische Studien:
ALLHAT
Antihypertensive and Lipid-Lowering Treatment to Prevent Heart Attack
Trial
CAPPP
Captopril Prevention Project
CHARM
Candesartan in Heart Failure-Assessment of Reduction in Mortality and
Morbidity
HOPE
Heart Outcomes Prevention Evaluation
JUPITER
Justification for the Use of statins in Prevention: an Intervention Trial
Evaluating Rosuvastatin
LIFE
Losartan Intervention For Endpoint Reduction in hypertension study
SOLVD
Studies Of Left Ventricular Dysfunction
VALUE
Valsartan Antihypertensive Long-term Use Evaluation
75
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90
Eidesstattliche Erklärung
163.
Eidesstattliche Erklärung
Ich versichere ausdrücklich, dass ich die Arbeit selbständig und ohne fremde
Hilfe verfasst, andere als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel
nicht benutzt und die aus den benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich
entnommenen Stellen einzeln nach Ausgabe (Auflage und Jahr des
Erscheinens), Band und Seite des benutzten Werkes kenntlich gemacht
habe.
Ferner versichere ich, dass ich die Dissertation bisher nicht einem
Fachvertreter an einer anderen Hochschule zur Überprüfung vorgelegt oder
mich anderweitig um Zulassung zur Promotion beworben habe.
Ich erkläre mich einverstanden, dass meine Dissertation vom Dekanat der
Medizinischen Fakultät mit einer gängigen Software zur Erkennung von
Plagiaten überprüft werden kann.
Unterschrift: ......................................................................
91
Danksagung
164.
Danksagung
Herrn Prof. Dr. Rainer H. Böger möchte ich besonders danken für die
Vergabe der Promotionsarbeit sowie für die umfassende Betreuung und
Unterstützung während der Erstellung. Außerdem dafür, dass er mir die
Möglichkeit gab, im Institut für Klinische Pharmakologie und Toxikologie
diese Arbeit anzufertigen.
Zudem möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Ralf Benndorf für die interessante
Aufgabenstellung und die intensive Betreuung vor allem während der
Anfangszeit der Arbeit bedanken.
Allen aktuellen und ehemaligen Mitarbeitern des Instituts für klinische
Pharmakologie und Toxikologie möchte ich für die kollegiale
Zusammenarbeit, das ausgezeichnete Arbeitsklima und die ständige
Hilfsbereitschaft danken.
Für die hervorragende Arbeitsatmosphäre im Labor bedanke ich mich
herzlich bei Cornelia Woermann, die mich bei den DOG-Uptake Versuchen
geduldig unterstützte und immer ein offenes Ohr für mich hatte. Außerdem
besonders bei Anna Steenpaß, die mir unter anderem sehr mit den PCR
Untersuchungen half, sowie für die hilfreichen und motivierenden Gespräche.
Auch bei Sandra Maak und Mariola Kastner möchte ich mich für ihre
Unterstützung im Labor bedanken.
Bei Dr. Maike Anderssohn möchte ich mich für ihre freundliche Beratung und
Einarbeitung in die zellbiologische Arbeit bedanken.
Für sein beharrliches und gewissenhaftes Korrekturlesen bedanke ich mich
herzlich bei dem Germanist und Freund Arne Lotze.
Besonderer Dank gebührt meiner Familie. Ich danke Euch für die
Unterstützung, mit der Ihr nicht nur diese Arbeit sondern meinen bisherigen
Lebensweg überhaupt ermöglicht habt.
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