und Hepatitis C-Virus assoziiertem hepatozellulären Karzinom

Aus dem Zentrum für Pathologie der Universität zu Köln
Allgemeine Pathologie und Pathologische Anatomie
Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. H. P. Dienes
Expressionsprofil ausgewählter micro-RNAs bei
Hepatitis B- und Hepatitis C-Virus assoziiertem
hepatozellulären Karzinom
Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde
der Hohen Medizinischen Fakultät
der Universität zu Köln
vorgelegt von
Maike Karoline Tscheuschler
aus Köln
promoviert am
18.Mai 2011
Dekan:
Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h. c. Th. Krieg
1.Berichterstatter: Privatdozentin Dr. rer. nat. M. Odenthal
2.Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Dr. h. c. H. Pfister
Erklärung
Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift ohne unzulässige
Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel
angefertigt habe. Die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen
Gedanken sind als solche kenntlich gemacht.
Bei der Auswahl des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskriptes habe ich Unterstützung
von Frau Dr. med. Heike Varnholt sowie Frau Privatdozentin Dr. rer. nat. Margarete Odenthal erhalten.
Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit
nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertationsschrift stehen.
Die Dissertationsschrift wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in
gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
Köln, den 01.12.2010
Maike Karoline Tscheuschler
Die dieser Arbeit zugrunde liegenden Experimente sind von mir nach technischer Anleitung durch
die medizinisch-technische Assistentin Frau Melanie Scheffler und durch den biologischtechnischen Assistenten Herrn Ali Manav durchgeführt worden.
Danksagung
Ich bedanke mich vielmals bei Frau Privatdozentin Dr. rer. nat. Margarete Odenthal für Ihr unerschöpfliches Engagement und Ihren stets nützlichen Rat während des gesamten Zeitraumes meiner
Dissertation. Weiterhin bedanke ich mich herzlich bei Frau Dr. Heike Varnholt, die trotz der gegen
Ende der Arbeit auf mehrere Tausend Kilometer angewachsenen räumlichen Distanz immer kontaktierbar war. Außerdem bedanke ich mich ganz herzlich bei Frau Melanie Scheffler und Herrn Ali
Manav, die sich stets Zeit für meine Fragen genommen haben und mich durch ihren unerschütterlichen Optimismus und ihre immer währende Geduld bei meiner Arbeit im Labor bestärkt und motiviert haben.
Vielen Dank!
Inhaltsverzeichnis
1. EINLEITUNG
1.1
Die Epidemiologie des hepatozellulären Karzinoms
S.
8
1.2
Chronische Virushepatitiden als wesentliche Ursache der Entwicklung
eines hepatozellulären Karzinoms
S.
9
Die Hepatitis B-Infektion
S.
9
1.2.1.1 Diagnostik und Krankheitsverlauf der Hepatitis B-Infektion
S.
11
1.2.1.2 Pathogenese der chronischen Hepatitis B-Infektion
S.
12
1.2.1.3 Prävention und Therapiemöglichkeiten der Hepatitis B-Infektion
S.
13
1.2.2
Die Hepatitis C-Infektion
S.
13
1.3
Risikofaktoren für die Entstehung eines hepatozellulären Karzinoms
S.
15
1.4
Diagnostik des hepatozellulären Karzinoms
S.
16
1.4.1
Histologische Kriterien zur Diagnose des hepatozellulären Karzinoms
S.
17
1.4.2
Prognose und bisherige Therapieansätze
S.
18
1.5
Zelluläre und molekulare Mechanismen der Entstehung des hepatozellulären
Karzinoms
S.
20
1.6
Biogenese von micro-RNA
S.
21
1.6.1
Die Bedeutung von micro-RNA bei malignen Erkrankungen
S.
22
1.6.2
Die Bedeutung von micro-RNA in der Hepatokarzinogenese
S.
24
S.
25
1.2.1
2. AUFGABENSTELLUNG
3. PATIENTEN UND METHODEN
3.1
Zusammenstellung des Untersuchungsmaterials
S.
26
3.1.1
Gewebeproben von HBV-positiven Patienten
S.
26
3.1.2
Das HCV-Kollektiv
S.
27
3.1.3
Makrodissektion von Tumor-und Peritumorgewebsarealen
S.
28
3.2
RNA-Extraktion von formalin-fixierten, paraffingebetteten
Microtomgewebeschnitten
S.
28
3.2.1
Photometrische Konzentrationsbestimmung der RNA-Gesamt-Extrakte
S.
29
3.3
Reverse Transkription und Real Time-PCR von micro-RNA
S.
29
3.3.1
Reverse Transkription und Real Time-PCR von micro-RNA
S.
30
3.3.1.1 Reverse Transkription mit einem Haarnadel-Primer
S.
30
3.3.1.2 Quantitative Real Time-PCR mit einer Minor-Groove-Binder-Sonde
S.
30
nach der Polyadenylierungsmethode
S.
32
3.3.2.1 Polyadenylierung und reverse Transkription
S.
32
nach der TaqMan-Methode
3.3.2
Reverse Transkription und Real Time-PCR von micro-RNA
5
3.3.2.2 Real Time-PCR der cDNA mit SybrGreen®
S.
34
4. ERGEBNISSE
4.1
Zusammenstellung des Patientenkollektivs
S.
35
4.2
Etablierung der miRNA-Analyse
S.
38
4.2.1
Detektion von miRNA in formalin-fixierten paraffingebetteten Geweben
und in nativen Hepatomazellen
S.
38
4.2.2
Etablierung von miRNA 122
S.
42
4.2.3
Aufbau von miRNA-Analysen
S.
44
4.3
micro-RNA-Profile im HBV-HCC-Kollektiv
S.
46
4.3.1
micro-RNA 122
S.
46
4.3.2
andere microRNA-Profile
S.
47
4.4
micro-RNA-Profile im HCV-HCC-Kollektiv
S.
50
4.4.1
Auswertung des HCV-Kollektivs
S.
51
S.
53
chronischer Hepatitis B-und Hepatitis C-Infektion
S.
54
5.2.1
Nachweis der leberspezifischen micro-RNA 122
S.
54
5.2.2
micro-RNA 198 und 145 in chronisch geschädigter Leber
von Hepatitis B-Patienten
S.
55
5.2.3
micro-RNA 29c nach chronischer Hepatitis B-Infektion
S.
57
5.3
Interaktion zwischen zellulärer und viraler micro-RNA-Expression
S.
57
5.4
micro-RNA 370 in hepatozellulären Karzinomen nach
S.
58
chronischer Hepatitis B-und C-Infektion
S.
58
micro-RNA 21 als Tumormarker in der hepatozellulären Karzinogenese
S.
59
6. ZUSAMMENFASSUNG
S.
62
7. LITERATURVERZEICHNIS
S.
63
8.1 ABBILDUNGENSVERZEICHNIS
S.
70
8.2 TABELLENVERZEICHNIS
S.
71
9. LEBENSLAUF
S.
72
5. DISKUSSION
5.1
Der micro-RNA Nachweis an einem FFPE-Gewebekollektiv
hepatozellulärer Karzinome
5.2
Expression verschiedener micro-RNAs in hepatozellulären Karzinomen nach
chronischer Hepatitis B-und C-Infektion
5.5
5.6
micro-RNA 299 5p in hepatozellulären Karzinomen nach
8. ANHANG
6
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
AFP
Alpha-Fetoprotein
bcl-2
B-cell lymphoma
CLL
chronische lymphatische Leukämie
CT
Computertomographie
FFPE
formalinfixiert, paraffingebettet
HBV
Hepatitis B-Virus
HCV
Hepatitis C-Virus
HCC
hepatozelluläres Karzinom
HGF
hepatocyte growth factor
IGF
insulin-like growth factor
MRT
Magnetresonanztomographie
PCR
polymerase chain reaction
TGF
transforming-growth factor
VEGF
vascular endothelial growth factor
7
1.
Einleitung
Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist weltweit die fünfthäufigste Krebserkrankung mit steigender
Inzidenz in westlichen Ländern. Zugrunde liegende Ursache ist meist die Leberzirrhose als Folge vor
allem der chronischen Hepatitis B- sowie der Hepatitis C-Infektion, toxischer Einflüsse wie Alkohol
oder Aflatoxin B1 und verschiedener Fettlebererkrankungen.
1.1
Die Epidemiologie des hepatozellulären Karzinoms
Die Zahl der Neuerkrankungen beträgt weltweit [7, 99] etwa eine Million pro Jahr [49, 53]. Entsprechend der engen ätiologischen Verknüpfung des HCCs mit der chronischen HBV-Infektion sind Gebiete mit hoher Prävalenz Ost- und Südostasien (Taiwan, Korea, Thailand, Malaysia) sowie Afrika
(s. Abbildung 1). Ebenfalls hohe Inzidenzraten werden in Kambodscha, Vietnam und Burma vermutet, aufgrund der mangelhaften Dokumentation ist die Datenlage jedoch nicht eindeutig. Durch die
zunehmende Prävalenz der HCV-Infektion in westlichen Ländern (USA, Kanada, Westeuropa) lassen sich jedoch zunehmend auch in diesen Regionen steigende Erkrankungszahlen nachweisen
[99].
Quelle: Leong, Epidemiology and carcinogensis of hcc, HPB, 2005
Abb. 1: Weltweite Inzidenz des hepatozellulären Karzinoms. Aufgrund der zum Teil schlechten Dokumentationslage lässt sich in einigen Ländern keine klare Aussage über die tatsächliche Inzidenz des HCCs
treffen.
8
1.2
Chronische Virushepatitiden als wesentliche Ursachen der Entwicklung eines
hepatozellulären Karzinoms
Die Hepatitis ist eine Entzündung des Leberparenchyms, die meistens durch eine Infektion mit einem der fünf Hepatitis-Viren A, B, C, D oder E verursacht wird. Andere hepatotrope Viren, die ebenfalls zu einer Hepatitis führen können, sind das Herpes-simplex-Virus, das Cytomegalievirus sowie
das Epstein-Barr-Virus; die akute Hepatitis kann darüber hinaus auch alkohol- oder medikamenteninduziert sein.
Die einzelnen Hepatitis-Virustypen unterscheiden sich voneinander in ihrem Übertragungsweg, ihrer
Inkubationszeit, der Prognose bzw. in Verlauf und Schwere der Erkrankung sowie in den angewandten therapeutischen Maßnahmen.
Von den genannten Virushepatitiden können in der Regel zwei zu einer chronischen Hepatitis führen: das Hepatitis B-Virus, welches am häufigsten chronifiziert [56], sowie das Hepatitis C-Virus.
Eine Ausnahme ist das Hepatitis D-Virus, das ausschließlich in Kombination mit dem Hepatitis BVirus auftritt und nur in diesem Rahmen an einer chronischen Hepatitis beteiligt sein kann.
Der Fokus dieser Arbeit liegt auf dem Hepatitis B- und dem Hepatitis C-Virus. Beide werden im Folgenden ausführlicher behandelt.
1.2.1 Die Hepatitis B-Infektion
Die Hepatitis B-Infektion entsteht durch eine Neuinfektion mit dem Hepatitis-B-Virus (im Folgenden
abgekürzt mit „HBV“). Das Virus gehört zur Gruppe der Hepadnaviren, die zu den DNA-tragenden
Viren gehören. Es besteht aus einem zirkulären, zum Teil doppelsträngigen DNA-Molekül, das etwa
3200 Basenpaare groß ist. Die DNA wird von einer Hülle aus einer zellulären Lipidmembran und
eingelagerten Oberflächenproteinen des Virus umgeben. Das DNA-Molekül enthält vier überlappende „offene Leseraster („open reading frames“), die für die Oberflächenproteine (HBsAg = „hepatitis-B-surface-antigen“), die virale Polymerase, das transaktivatorische HBX-Protein und die Kernproteine (HBcAg= HBV-Core-Antigen bzw. HBeAg) kodieren. Das HBV-e-Antigen („e“ steht hierbei
für exsekretorisch) ist die lösliche Form des HBV-Core-Antigens.
Gegenwärtig sind weltweit über 350 Millionen Menschen mit dem HBV infiziert [92]; insbesondere in
China, Südostasien, der Türkei und einem Großteil Afrikas ist die Prävalenz vergleichsweise hoch
(s. Abbildung 2). Insgesamt leben etwa 45% der Weltbevölkerung in Regionen mit hoher HBVPrävalenz [56].
Übertragen wird das Virus parenteral, also durch Umgehung des Gastrointestinaltraktes (hierbei vor
allem durch intravenösen Drogenabusus), perinatal (auch als Weg der „vertikalen Transmission“
bezeichnet) und ungeschützten sexuellen Kontakt („horizontale Transmission“) sowie durch Kontakt
mit infiziertem Blut oder anderen virushaltigen Körperflüssigkeiten. In Ländern mit hohen Infektions-
9
raten wird das Virus vor allem in der Kindheit oder perinatal übertragen; in Regionen mit mittlerer
und geringer Prävalenz dagegen eher über sexuellen Kontakt (bis zur Hälfte aller Infektionen) oder
aber über intravenösen Drogenabusus [34].
Zu den besonders gefährdeten Gruppen gehören medizinisches Personal, Patienten, die häufig Blut
bzw. Blutbestandteile übertragen bekommen, Intravenös-Drogenabhängige sowie Reisende mit
längerem Aufenthalt in Regionen mit hoher HBV-Prävalenz.
In Deutschland sind etwa 500.000 Menschen chronische Virusträger.
Quelle: Deutsche Zeitung für klinische Forschung
www.dzkfblog.de
Abb. 2: Hepatitis B-Prävalenz weltweit. Endemiegebiete sind vor allem Afrika und Asien.
Das HBV ist äußerst resistent gegenüber den Umweltbedingungen und ist in der Lage, außerhalb
des menschlichen Körpers relativ lange zu überleben. Es findet sich beim Infizierten nicht nur im
Blut, sondern auch in Speichel, Sperma, Vaginalsekret und, wenn auch in geringeren Mengen, in
Muttermilch, Tränenflüssigkeit und Urin.
Das Alter zum Zeitpunkt der Infektion spielt eine entscheidende Rolle: Nur ein geringer Anteil derer,
die sich im Erwachsenenalter mit dem Virus infizieren, entwickelt eine chronische Hepatitis, allerdings entwickeln 90% der Kinder, die sich im Alter von unter einem Jahr infizieren, eine chronische
Erkrankung [92]. Sowohl akute als auch chronische Infektionen verlaufen im Kindesalter in der Regel klinisch stumm.
10
1.2.1.1 Diagnostik und Krankheitsverlauf der Hepatitis B-Infektion
Da sich die akute HBV-Infektion klinisch nicht von anderen akuten Hepatitisvirus-Infektionen unterscheidet, ist die definitive Diagnosestellung abhängig von der serologischen Diagnostik. Das virale
Oberflächenprotein (HBsAg) existiert in drei unterschiedlich großen Formen (L-, M- und S-HBsAg).
Die akute Hepatitis B-Infektion lässt sich über den Nachweis des HbsAg im Serum sowie den Nachweis von Immunglobulinen der Klasse M (IgM anti-HBc) diagnostizieren. Weiterhin lässt sich bei
einer akuten Infektion im Serum auch HBeAg detektieren. Während der Vermehrung des HBV in
den Hepatozyten wird das HBV-e-Antigen (HBeAg) in die Blutbahn abgegeben.
Bei immunkompetenten Personen kommt es schließlich zur Produktion von Antikörpern (anti-HBs,
anti-HBc und anti-HBe) und zur Clearance von HbsAg sowie HbeAg (s. Abbildung 3). Bei der chronischen HBV-Infektion persistiert das HbsAg meist lebenslang [56]. Eine chronische Infektion liegt
definitionsgemäß bei einem Nachweis des HbsAg im Serum über einen Zeitraum von mindestens
sechs Monaten oder bei Nachweis des HbsAg bei gleichzeitigem Fehlen von IgM anti-HBc vor.
Abb. 3: Serologische Marker der akuten HBV-Infektion.
Solange das HBeAg nachgewiesen werden kann, läuft die Replikation des Virus ab; der Patient ist infektiös.
Etwa 4 Wochen nach der Infektion kann im Serum das HB-Oberflächen-Antigen (HbsAg) nachgewiesen werden. Etwa weitere 14 Tage später lassen sich Immunglobuline der Klasse M nachweisen; gleichzeitig beginnt
die Produktion von Antikörpern (anti-HBc) gegen das HB-Virus.
Der Nachweis von HBV-DNA hat in der Diagnostik der Hepatitis-Infektion nur begrenzte Bedeutung,
da sich sowohl bei der akuten als auch bei der chronischen Hepatitis HBV-DNA nachweisen lässt
[56]. Allerdings lässt sich über eine regelmäßige Kontrolle der im Serum vorhandenen DNA-Menge
bei der chronischen HBV-Infektion das Ansprechen auf die antivirale Therapie kontrollieren.
Die Hepatitis wird nicht durch das Virus selbst, sondern erst durch die Immunantwort des Organismus verursacht. Daran sind im Wesentlichen die CD8-positiven, zytotoxischen T-Killerzellen betei-
11
ligt. Sie erkennen HBV-Epitope und leiten die Viruselimination ein. Ob die Viruselimination komplett
abläuft oder unvollständig entscheidet darüber, ob die HBV-Infektion chronifiziert oder ausheilt.
Die akute HBV-Infektion kann sehr variabel verlaufen. In etwa 65 % der Fälle verläuft die Infektion
klinisch stumm. Sofern die Infektion nicht klinisch stumm verläuft, kommt es nach einer 2-6 wöchigen Inkubationszeit zu grippeähnlichen Symptomen wie Fieber und Gliederschmerzen sowie Appetitlosigkeit und Ikterus. Bei den meisten Patienten heilt die Infektion innerhalb einiger Wochen aus.
In seltenen Fällen (0,1-1 %) kann sie sich jedoch bis zur fulminanten Hepatitis mit Leberversagen
entwickeln. Wie bereits oben angeführt, spielt das Alter zum Zeitpunkt der Infektion eine entscheidende Rolle für den Krankheitsverlauf.
Etwa 10 % der im Erwachsenenalter Erkrankten entwickeln eine chronische Hepatitis B (s. Kapitel
1.2.1.2) mit den entsprechenden Komplikationen bis hin zum hepatozellulären Karzinom. Eine im
Erwachsenenalter erworbene Hepatitis geht deutlich seltener in eine chronische Hepatitis über als
eine im Kindesalter erworbene.
1.2.1.2 Pathogenese der chronischen Hepatitis B-Infektion
Die chronische Hepatitis B-Infektion lässt sich in vier Stadien einteilen [89].
Im ersten Stadium kommt es zu einer Immuntoleranz gegenüber dem persistierenden Virus; es besteht charakteristischerweise eine hohe HBV-Last. Im zweiten Stadium kommt es durch die Immunantwort zu einer Schädigung der Hepatozyten. Dieses Stadium kann bis zu 20 Jahre andauern;
Folge der Schädigung der Hepatozyten ist die Zirrhose.
Wenn infolge der immunologischen Prozesse die Anzahl der infizierten Hepatozyten reduziert wird,
geht die Infektion in das dritte Stadium über, in dem es lediglich zu einer geringen Virusreplikation
kommt und die Viruslast entsprechend niedrig ist. Weiterhin kommt es zu einer Normalisierung der
Aminotransferasen (Alaninaminotransferase (ALT) und Aspartataminotransferase (AST)).
Im vierten Stadium ist im Serum keine HBV-DNA mehr nachweisbar, wohl aber im Lebergewebe.
Unter bestimmten Therapien (beispielsweise unter Anwendung von Immunsuppressiva) kann es im
Stadium 4 zu einer Reaktivierung der Hepatitis kommen. Patienten mit einer reaktivierten Hepatitis
haben im Vergleich zu inaktiven Virusträgern ein höheres Risiko eine Zirrhose und ein HCC zu entwickeln [89].
Etwa 2 bis 10 % der Patienten mit chronischer HBV-Infektion entwickeln eine Leberzirrhose; von
diesen wiederum entwickeln 3 bis 5 % eine dekompensierte Zirrhose und potentiell ein HCC [98].
Die Zirrhose ist nicht reversibel; bei Eradikation des Virus jedoch kann ihre Progression gestoppt
werden.
Ohne Behandlung kommt es zur Dekompensation der Zirrhose, die sich durch ernste klinische
Komplikationen wie Aszites, innere Blutungen sowie hepatische Enzephalopathie auszeichnet.
Dementsprechend ist die Mortalität bei Patienten mit dekompensierter Zirrhose höher als bei Patienten mit kompensierter Zirrhose [25].
12
1.2.1.3 Prävention und Therapiemöglichkeiten der Hepatitis B-Infektion
Die Impfung gegen Hepatitis B ist die sicherste Methode, die Ausbreitung der Krankheit zu vermeiden. 1991 wurde von der WHO empfohlen, die Impfung in alle staatlichen Impfprogramme aufzunehmen. Elf Jahre später hatten 154 Länder die HBV-Impfung als Routineimpfung bei Kindern eingeführt. Seit 1996 existiert in Europa ein kombinierter Impfstoff gegen Hepatitis A und B.
Die wichtigsten Ziele bezüglich der Therapie einer chronischen Hepatitis B-Infektion sind die Suppression der HBV-Replikation sowie die Verhinderung des Übergangs in eine Zirrhose bzw. ein
HCC. Die Indikation zur Therapie der chronischen Hepatitis ist vor allem abhängig von der Höhe der
im Blut nachgewiesenen HBV-DNA und der Höhe der Transaminasen (vor allem der ALT). Gegenwärtig wird nach den therapeutischen Richtlinien eine Therapie bei einer HBV-DNA von > 20.000
IU/ml im Serum sowie einer um mehr als das Doppelte des oberen Grenzwertes erhöhte ALT über
mehr als drei Monate hinweg empfohlen [69].
Zur Therapie der chronischen Hepatitis B werden in der Regel Interferon oder das Nukleosidanalogon Lamivudin einzeln bzw. in Kombination (s.u.) sowie Adefovir eingesetzt.
Interferon-α (IFN α ) wirkt negativ auf das Wachstum von Tumoren, allgemein antiproliferativ, antiviral und immunmodulierend [57]. Interferone wirken nicht direkt auf Viren, sondern induzieren in der
infizierten Zelle eine spezifische RNS- und Proteinsynthese mit antiviralem und immunmodulatorischem Effekt. Dieser immunmodulatorische Effekt beruht dabei auf der Induktion und Aktivierung
von Makrophagen, zytotoxischen T-Zellen und der Modulation der Antikörperproduktion.
Pegyliertes Interferon zeichnet sich gegenüber IFN durch ein zusätzliches PolyethylenglycolPolymer-Molekül aus, welches an das IFN-Basismolekül angeheftet ist und gegenüber IFN den Vorteil einer längeren Halbwertszeit besitzt.
Lamivudin wird bei der DNA-Replikation analog für die Base Cytidin eingebaut, konkurriert als ein
„falsches Substrat“ mit den physiologischen Nukleosiden und führt, wenn es in die DNA eingebaut
wird, zum Abbruch der Synthese. Adefovir ist ein Nukleotidanalogon und konkurriert mit dem physiologischen Nukleotid Adenosinmonophosphat. Es hemmt die HBV-DNA-Polymerase und damit
die Virusreplikation.
In der Kombinationstherapie wird Lamivudin mit IFN α bzw. pegyliertem Interferon eingesetzt. In
beiden Fällen erhöht sich insbesondere die Serokonversionsrate von HBe-Ag [48, 76].
1.2.2 Die Hepatitis C-Infektion
Die weltweite Prävalenz von Hepatitis C beträgt etwa 1 % [92]. Besonders hohe Zahlen von Infektionen zeigen Asien sowie große Teile Afrikas (entsprechend der Prävalenz von Hepatitis B, s.a.
1.2.1, Abbildung 2). Die Transmission erfolgt ebenso wie die der Hepatitis B parenteral. Wichtigster
Übertragungsweg ist der intravenöse Drogenabusus, aber auch über kontaminierte Blutprodukte,
13
Nadelstichverletzungen sowie über sexuellen Kontakt kann das Virus übertragen werden. Letzterer
Fall tritt allerdings erheblich seltener auf als bei dem HBV [81].
Quelle: WHO/Deutsches grünes Kreuz
www.dgk.de
Abb. 4: weltweite Prävalenz von Hepatitis C. Besonders in Afrika und Asien finden sich Gebiete mit hohen
Prävalenzraten.
In Westeuropa sind etwa 5 Millionen Menschen chronische HCV-Träger. Noch ist zwar die chronische HBV-Infektion der wichtigste Risikofaktor, der zu der Entwicklung eines HCCs führt, aber insbesondere in der westlichen Welt gewinnt die chronische HCV-Infektion in Bezug auf die Entwicklung eines HCCs zunehmend an Bedeutung [99].
Ähnlich wie die akute Hepatitis B-Infektion verläuft auch die akute Hepatitis C-Infektion in den meisten Fällen asymptomatisch [5]; in dem Falle, dass Symptome auftreten, äußern diese sich entsprechend den Symptomen der Hepatitis B-Infektion (wie etwa grippeähnlichen Symptomen, Müdigkeit,
abdominellen Schmerzen).
Im Rahmen der Diagnostik der akuten Hepatitis C-Infektion wird neben dem Nachweis spezifischer
Antikörper auch der Nachweis der viralen RNA einbezogen, da-im Gegensatz zur Hepatitis BInfektion-bei der akuten Hepatitis C-Infektion erst relativ spät Antikörper gegen das Virus gebildet
werden [92] und der Nachweis dieser für eine eindeutige, frühzeitige Diagnose eher mäßig gut geeignet ist [74]. Durch den Nachweis der RNA lässt sich der Verdacht auf eine Hepatitis C-Infektion
bestätigen [79].
14
Wird die Infektion nicht adäquat behandelt, entwickelt sich nach Jahren bei der Mehrzahl der Infizierten eine chronische Hepatitis [14]. Etwa ein Drittel der infizierten Patienten entwickelt über eine
chronische Hepatitis C ernsthafte Einschränkungen der Leberfunktion. Etwa 20% entwickeln 20
Jahre nach der Infektion eine Leberzirrhose [92], auf deren Basis sich wiederum in etwa 1-4 % der
Fälle ein hepatozelluläres Karzinom entwickelt [14].
1.3
Risikofaktoren für die Entstehung eines hepatozellulären Karzinoms
Zwischen einer chronischen HBV- oder HCV-Infektion oder einer chronisch toxischen Schädigung
der Leber als wichtigste Risikofaktoren und der Entwicklung eines HCCs liegen häufig etwa 25 bis
30 Jahre [56]. Die Mechanismen, die letztendlich zur HCC-Entstehung führen, sind bislang nicht
eindeutig identifiziert; es besteht jedoch ein Konsens über wichtige Risikofaktoren, die die Progression zu einem HCC begünstigen (s. Tabelle 1) sowie über Theorien zur Entstehung des HCC.
Tab. 1: Risikofaktoren der Entstehung eines hepatozellulären Karzinoms
Die chronische HBV-Infektion ist der wichtigste Risikofaktor. Vor allem in der westlichen Welt gewinnt die
chronische HCV-Infektion zunehmend als Risikofaktor an Bedeutung (s. Kapitel 1.2.2). Als wichtiger Umweltfaktor ist die Aflatoxinaufnahme zu nennen.
Wirtsfaktoren
Umweltbedingungen
● chronische HBV-und HCV-Infektion
● Aflatoxin-Aufnahme (v.a. B1)
● Leberzirrhose
● Alkoholkonsum
● familiäre Polyposis coli
● Aufnahme von Nitriten, Hydrocarbon,
Lösungsmitteln
● hereditäre Tyrosinämie
● männliches Geschlecht
● Alter > 45 Jahre
● Hämochromatose
15
1.4
Diagnostik des hepatozellulären Karzinoms
Die Diagnostik des HCC umfasst die Kontrolle bestimmter Laborparameter, die Bildgebung sowie
die Leberbiopsie.
Als wichtigster Laborparameter ist das Alpha-Fetoprotein (AFP) anzuführen. AFP wird vornehmlich
in der embryonalen Leber gebildet. Nach der Geburt sinkt die Serumkonzentration rasch, die Produktion ist im Erwachsenenalter supprimiert. Patienten mit einer chronischen Lebererkrankung, insbesondere mit einer Erkrankung, die mit einer hohen Regenerationsrate der Hepatozyten einhergeht, zeigen pathologisch erhöhte Serumwerte von AFP [4]. Als diagnostischer Parameter hat AFP
den Vorteil einer hohen Spezifität, allerdings den Nachteil einer geringen Sensitivität [33]. AFP hat
inzwischen insbesondere in dem Falle, dass bereits ein Tumor nachgewiesen werden konnte, prognostische Bedeutung. Grizzi et al. zeigten, dass eine AFP-Konzentration > 400 ng/ml bei Patienten
mit einem HCC mit einer größeren Tumormasse, Invasion in die Vena porta sowie einem schlechteren Überleben assoziiert ist [32]. Sakata et al. unterstützten mit ihrer Studie den Zusammenhang
zwischen erhöhten AFP-Konzentrationen und vermehrter Gefäßinvasion [7].
Weitere Laborparameter, die im Rahmen der Diagnostik als prognostische Parameter angewandt
werden können, sind VEGF (vascular endothelial growth factor) sowie HGF (hepatocyte growth
factor). VEGF besitzt entscheidende Bedeutung für die Gefäßneubildung im Gewebe und wird als
prognostischer Marker bezüglich Metastasierungstendenz und Invasivität des Tumors eingesetzt
[29].
HGF wird von mehreren Organen produziert und nimmt unter anderem Einfluss auf die epitheliale
Karzinogenese [29]. Erhöhte Serumwerte (≥ 1 ng/ml) bei HCC-Patienten sind mit einem geringeren
Überleben assoziiert [88].
In der bildgebenden Diagnostik finden vor allem die CT bzw. die MPCT (multiphase helical CT), die
Sonographie sowie die MRT Anwendung, wobei die CT als Mittel der Wahl bezüglich Diagnostik
und Staging des HCC zu nennen ist [4].
Die Sonographie ermöglicht die Suche nach fokalen Läsionen in der Leber bzw. die Detektion kleiner Tumore (< 1 cm Durchmesser) [29]. Die MRT wird ebenfalls häufig in der Diagnostik eingesetzt,
allerdings ist ihre Sensitivität hinsichtlich der Detektion von HCC abhängig von der Tumorgröße
[29]. Ein Vorteil der MRT gegenüber der CT ist, dass sie weiterhin Aussagen über die vaskulären
Strukturen des Tumors sowie eine genauere Abgrenzung gegenüber dem nicht pathologisch veränderten Gewebe erlaubt [23].
Die Aussagekraft bzw. die Sensitivität der Angiographie ist ebenso wie die der MRT von der Tumorgröße abhängig, wobei bei Tumorgrößen zwischen 2 und 5 cm bezüglich der Detektion von
HCC zufrieden stellende Ergebnisse vorzuweisen sind [29]. Dennoch wird die Angiographie vornehmlich vor Chemoembolisation oder vor Resektion zur Darstellung der Gefäßarchitektur des HCC
genutzt [4, 29].
16
Bezüglich der Diagnostik wurden durch die EASL (European Association for the Study of the Liver)
die Kriterien zur Diagnosesicherung in einer Konsensuskonferenz zusammengetragen. Hierin wird
bei hepatischen Läsionen von 1-2 cm Größe eine Feinnadelaspiration zur histologischen Untersuchung, eine Biopsie oder beide Methoden zusammen empfohlen [29].
1.4.1 Histologische Kriterien zur Diagnose des hepatozellulären Karzinoms
Das hepatozelluläre Karzinom sowie seine Unterformen werden, wie in Kapitel 3.1.1 angeführt,
nach den Kriterien des AFIP (Armed forces Institute of Pathology) klassifiziert. Die in der Diagnostik
des HCC unterschiedenen HCC-Formen sind in Tabelle 2 zusammengetragen.
Tab. 2: Übersicht der verschiedenen Typen des hepatozellulären Karzinoms und entsprechende Merkmale
Tumortyp
1.
Charakteristika
hepatozelluläres Karzinom
ohne nähere Angaben
2.
fibrolamelläres Karzinom
meist bei jüngeren Pat.in nicht-zirrhotischer
Leber; bessere Prognose als 1.
3.
sklerosierendes Karzinom
4.
spindelzelliges Karzinom
massive Fibrose
4.- 6. sollten nur diagnostiziert werden, wenn
die jeweiligen Zellen > 50 % des Tumors
5.
klarzelliges Karzinom
6.
Riesenzellen- Karzinom
ausmachen
Zur histologischen Klassifikation des HCCs wird entweder die WHO-Klassifikation oder die Klassifikation nach Edmondson und Steiner [24] angewendet, wobei letztere deutlich auf histologische Besonderheiten fokussiert. Beide Klassifikationen berücksichtigen, dass in einem HCC sehr wohl mehrere Differenzierungsgrade vorliegen können und nach Möglichkeit alle berücksichtigt werden sollten. Zum Vergleich werden in Tabelle 3 beide Systeme gegenüber gestellt.
17
Tab. 3: Klassifikation des hepatozellulären Karzinoms in Abhängigkeit von seinem Differenzierungsgrad nach
Kriterien der WHO bzw. nach Kriterien von Edmondson und Steiner. In der WHO-Klassifikation entfällt der
Tumorgrad G4.
Klassifikation nach Edmondson u. Steiner
Klassifikation nach der WHO
G1
gut differenzierter Tumor, der in histologischen hochdifferenzierter Tumor, der aus Zellen
und zytologischen Merkmalen viel Ähnlichkeit besteht, die schwer von denen des hepatomit dem gesunden Ursprungsgewebe besitzt. zellulären Karzinoms zu unterscheiden
sind
G2
mäßig gut differenziert, weder G1 noch G3
zuzuordnen
Tumorzellen ähneln Hepatozyten, Nuclei
sind jedoch größer mit höherem Chromatingehalt
häufig azinäre Anordnung der Nuclei
G3
Tumor mit histologischen und zytologischen
Merkmalen, die kaum noch denen des gesunden Gewebes entsprechen
Nuclei größer und chromatinreicher als bei
G2, nehmen größeren Teil der Zellen ein,
häufiger Tumorriesenzellen
G4
nicht definiert
schlecht differenzierter Tumor mit stark
hyperchromatischen Nuclei, die den Großteil
der Zelle einnehmen, Trabekel schwer zu
identifizieren, spindelzellige und kleinzellige
Areale können vorkommen
1.4.2 Prognose und bisherige Therapieansätze
Die Prognose bezüglich der mittleren Überlebenszeit bei hepatozellulärem Karzinom ist trotz aller
Bemühungen, neue Therapiestrategien aufzuzeigen, bis dato weiterhin schlecht. Weltweit variieren
die Daten bezüglich der mittleren Überlebensdauer in Abhängigkeit von der Verfügbarkeit adäquater medizinischer Versorgung natürlich stark. Berücksichtigt man dies jedoch, beträgt auch nach
Leber(teil)resektion die mittlere Überlebensdauer weniger als 25 Monate; bei lediglich symptomatischer Therapie sogar weniger als 6 Monate [53]. Diese Zahlen zeigen deutlich, dass ein Bedarf an
neuen therapeutischen Optionen besteht.
Die gegenwärtige Therapie des HCC besteht aus fünf Komponenten [7]:
1. Chirurgische Intervention (Leber(teil)resektion, -transplantation)
2. perkutane Maßnahmen (Ethanolinjektion (PEI), Radiofrequenzablatio (RFA))
3. transarterielle Maßnahmen (Chemoembolisation)
4. Strahlentherapie
5. Medikamentöse Therapie
18
Welche Maßnahmen angewandt werden ist in erster Linie abhängig davon, wie weit der Krankheitsprozess bei Vorstellung des Patienten fortgeschritten ist und welche Komorbiditäten vorliegen.
Bei Patienten ohne Leberzirrhose und mit singulärer Leberläsion ist die Resektion der Läsion das
Mittel der Wahl [7]. Die Leberresektion mit nachfolgender Transplantation wird nach den aktuellen
Kriterien bei Patienten durchgeführt, die eine Läsion mit 5 cm Durchmesser oder maximal drei Läsionen mit einem Durchmesser < 3 cm aufweisen [7].
Maßnahmen wie die perkutane Ethanolinjektion (PEI) werden durchgeführt, wenn ein relativ kleines,
nicht resektables HCC vorliegt. Alternativ kann auch eine RFA durchgeführt werden [7], die PEI ist
hier jedoch Mittel der Wahl. Die RFA bietet den Vorteil, dass lediglich ein einmaliger Eingriff notwendig ist.
Transarterielle Maßnahmen wie die (Chemo-)Embolisation werden in der Regel bei Läsionen angewandt, die schlecht auf RFA oder PEI ansprechen. Zur Anwendung kommen bei der Chemoembolisation in der Regel Doxorubicin, Cisplatin oder Mitomycin. Die Substanzen werden mit Lipiodol
versetzt und arteriell in den Tumor injiziert. Bei der einfachen Embolisation wird auf den Zusatz der
oben genannten Substanzen verzichtet [7].
Mehr als 70% der Patienten befinden sich bei Diagnosestellung in einem fortgeschrittenen Stadium
der Krankheit [6, 96] und können so die potentiell kurativen Therapieoptionen, insbesondere die
Lebertransplantation, nicht mehr in Anspruch nehmen. Hier ist eine supportive Therapie die einzige
Therapiemöglichkeit. Für die Therapie des fortgeschrittenen HCCs gibt es bisher allerdings kaum
Erfolg versprechende Optionen; wohl aber befinden sich insbesondere in der Strahlen- [8, 26] und
der medikamentösen Therapie [96] mehrere Methoden bzw. Substanzen in klinischer Erprobung.
Für letztere Therapieoption sind unter anderem Zytostatika (z. B. Doxorubicin, Cisplatin, Mitoxantron) und Angiogeneseinhibitoren (z. B. Bevacizumab, Cetuximab) zu nennen. Ebenso wie in
der Strahlentherapie des HCC bestehen hier allerdings noch keine allgemein gültigen Empfehlungen bezüglich therapeutischer Strategien.
Insgesamt gibt es bislang noch keine Therapie, die eine effiziente Tumoreradikation ermöglicht.
Neuere Therapieformen zielen auf die Signalwege, die gerade im HCC von Bedeutung sind (s.a.
Kap.1.5), und so eine zielgerichtete Therapie erlauben. Ein Beispiel hierfür ist die gezielte Blockade
der Rezeptoren von Wachstumsfaktoren (wie z.B. VEGF) bzw. der assoziierten Signalwege (z.B.
den PI3/AKT/mTOR-Weg). Der PI3/AKT/mTOR-Signalweg ist einer der Signalwege, die im Rahmen
der Hepatokarzinogenese eine wichtige Rolle spielen. Substanzen, die bei der Blockade dieser Signalwege bzw. der entsprechenden Wachstumsfaktoren eingesetzt werden, sind monoklonale Antikörper oder (Tyrosin-)Kinase-Hemmer. Als Beispiele für Letzteres sind Sorafenib sowie Rapamycin
zu nennen [38].
19
1.5
Zelluläre und molekulare Mechanismen der Entstehung des hepatozellulären
Karzinoms
Noch sind die Prozesse, die zu einer malignen Transformation und damit zu der Entstehung eines
HCCs führen, nicht eindeutig geklärt. Bekannt ist, dass der chronische Entzündungsprozess über
eine Dysregulation während der Mitose zu zufälligen Chromosomen- und DNA-Schäden und damit
zu einer malignen Transformation [18] führt. Diskutiert wird auch ein Einfluss von Androgenen bzw.
der Androgen-Rezeptor-regulierenden Gene auf die Karzinomentstehung [10], da die HCC-Inzidenz
bei Männern drei- bis viermal höher ist als bei Frauen [59].
Da in der Regel alle Patienten, die ein HCC entwickeln, über Jahre hinweg an einer chronischen
Hepatitis erkrankt waren, wird derzeit davon ausgegangen, dass es unter der chronischen Virusinfektion zu einer Dysregulation diverser intrazellulärer Signalwege kommt, die zu einer veränderten
Genexpression und damit zu einer malignen Transformation führt [46].
Eine entscheidende Rolle in der Karzinogenese, die auf eine chronische HBV-Infektion zurückzuführen ist, scheint das HBx-Antigen zu spielen [101]. Dieses Antigen findet sich sowohl im Zytosol
der Hepatozyten als auch in deren Zellkern. HBx-Ag besitzt die Fähigkeit, die Expression von Genen zu regulieren, die an der Proliferation von Hepatozyten sowie an der Tumorgenese beteiligt
sind [55]. Weiterhin vermag es Einfluss auf viele Wege der Signaltransduktion innerhalb der Zelle
zu nehmen [30, 35].
Eine besondere Bedeutung besitzt das HBx-Ag durch seine Fähigkeit zur Regulation der Apoptose.
Es blockiert die Aktivierung von Caspase 3, einem Enzym, das entscheidend an der Initiation der
Apoptose beteiligt ist und verhindert so den Untergang pathologisch veränderter Zellen [30].
Darüber hinaus nimmt das HBx-Ag Einfluss auf das Protein Survivin. Dieses Protein verhindert die
Apoptose und zeigt in den meisten humanen Karzinomen eine erhöhte Expression [54]. HBx-Ag
kann eine vermehrte Expression von Survivin induzieren und somit die Apoptose der HCC-Zellen
beeinflussen [100]. Weiterhin nimmt es Einfluss auf die Karzinogenese durch die Erhöhung der
transskriptionalen Aktivität von Proto-Onkogenen (z. B. c-myc und N-myc; c-myc wird in 50 % aller
HCC vermehrt exprimiert) [82] sowie durch die Induktion einer vermehrten Angiogenese [75], was
dazu führt, dass das karzinomatöse Gewebe optimal mit Nährstoffen versorgt wird. Auch nimmt
HBx-Ag Einfluss auf den IGF (Insulin-like Growth Factor)-Signalweg, der eine wichtige Rolle bei der
Zellproliferation spielt. HBx-Ag bewirkt eine vermehrte Expression des Liganden IGF-II und darüber
eine übermäßige Proliferation maligner Zellen [46, 52].
Im Folgenden soll weiter auf die Theorien der veränderten Signaltransduktion eingegangen werden,
die gegenwärtig diskutiert werden. Als nächster sei der Weg über den Transforming-Growth Factor
β (TGF β) genannt. TGF β ist ein zytokinähnliches Molekül, das in der Zelldifferenzierung, -reifung
und der Apoptose eine wichtige Rolle spielt. In Serum und Urin von HCC-Patienten lassen sich höhere Spiegel an TGF β nachweisen als bei gesunden Patienten [83] und auch HCC zeigen eine
vermehrte Expression von TGF β [3].
20
Weitere Bedeutung kommt dem HGF (hepatocyte growth factor)-Signalweg zu. HGF nimmt ähnlich
dem TGF β Einfluss auf Proliferation und Reifung der Hepatozyten, weiterhin auf Angiogenese und
Zellregeneration. In HCC-Gewebe sezernieren Myofibroblasten vermehrt HGF und induzieren somit
eine vermehrte Invasion von Tumorzellen in noch gesundes Gewebe [66]. Auch der TGF αSignalweg ist in hepatozellulären Karzinomen verändert. TGF α wirkt auf Hepatozyten mitogen und
stimuliert die DNA-Synthese [46]. In HCC sowie in HCC-assoziierten Zelllinien ist die Expression
von TGF α erhöht [72]; TGF α führt damit zu vermehrter Reifung und Differenzierung der Tumorzellen [37].
Das veränderte Expressionsmuster verschiedener Gene während der HCC-Entstehung begünstigt
zum einen die chromosomale Instabilität bzw. Aberration und zum anderen die Aktivierung onkogener Signalwege. In jüngster Vergangenheit hat sich der Einfluss von miRNA auf die Genexpression
als ein Faktor mit hoher Bedeutung für die Aktivierung onkogener Signale in der Karzinogenese
herausgestellt.
1.6
Biogenese von micro-RNA
micro-RNAs (im Folgenden abgekürzt mit „miRNAs“) sind kleine, etwa zwischen 18-25 Nukleotide
lange RNAs. 1993 entdeckten Victor Ambros, Rosalind Lee und Rhonda Feinbaum bei Forschungen an Caenorhabditis elegans, einem Fadenwurm, das lin4-Gen, welches eine 22 Nukleotide lange miRNA codiert [51]. Diese miRNA verhindert die Translation einer weiteren RNA für bestimmte
Proteine, die bei der zeitlichen Steuerung der Entwicklung von C. elegans eine wichtige Rolle spielen.
miRNAs entstehen aus mehreren Hundert Basen langen, haarnadelförmigen RNA-Vorläufern, die
aus dem Genom transkribiert werden [20]. Sie werden durch das Enzym („Dicer“), welches auch für
die Entstehung der small-interferring-RNA aus Doppelstrang RNA verantwortlich ist, aus den RNAMolekülen synthetisiert.
21
nach Cowland et al, 2007
Abb. 5: Biosynthese der micro-RNA
Das mi-RNA-Primärtranskript (Pri-miRNA), das von der RNA-Polymerase II (Poli II) synthetisiert wird, bildet
nach der Polyadenylierung unter dem Einfluss der RNase Drosha und dem Co-Faktor Pasha eine haarnadelförmige Vorläufer-miRNA (Pre-miRNA), die durch Exportin-5 aus dem Zellkern ins Zytoplasma ausgeschleust
wird. Im Zyto-plasma wird die Pre-miRNA durch die RNase Dicer weiter bearbeitet und von einer Helicase
entwunden, so dass eine reife Einzelstrang-miRNA entsteht, die innerhalb des RNA-induzierten silencing
complex (RISC) eine enge Bindung mit dem Argonaut-Protein (Ago) eingeht. In dieser Verbindung kann die
miRNA mit ihren Ziel-RNAs interagieren.
miRNAs selbst kodieren nicht für Proteine und gehören daher zu der Gruppe der kleinen nichtcodierenden RNAs. miRNAs besitzen entscheidende Bedeutung, da sie massiv in die Genregulation eingreifen. Bisher sind einige Hundert miRNAs bekannt, die in Abhängigkeit von ihrem Expressionsmuster die Expression von Genen des jeweiligen Organismus entweder verstärken, hemmen
oder komplett ausschalten können. Damit besitzen sie enorme Bedeutung für Prozesse wie die
Zelldifferenzierung und -reifung [13], die Apoptose [15] sowie auch für die Regulation metabolischer
Prozesse [71].
Eine besondere Rolle spielen miRNAs in der Onkogenese: Der Verlust von miRNA kann zur verminderten Hemmung der Expression bestimmter Onkogene führen oder auch zur verstärkten Repression von Tumorsuppressorgenen. Diese Gendysregulation führt dazu, dass die physiologische
Zelldifferenzierung außer Kontrolle gerät und es zum unkontrollierten (Tumor-)Wachstum kommt.
1.6.1 Die Bedeutung von micro-RNA bei malignen Erkrankungen
Den ersten Hinweis auf den Einfluss von miRNAs während der Onkogenese erbrachten Calin et al.
in ihrer 2002 publizierten Arbeit über den Nachweis von miRNAs bei chronisch lymphatischer Leukämie [9]. Sie wiesen bei Patienten mit CLL eine verminderte Expression von miRNA 15a und miR-
22
NA 16-1 nach. Diese Dysregulation ist darauf zurückzuführen, dass es bei der CLL während der
Zellduplikation in 65 % der Fälle zu einem Verlust des langen Armes von Chromosom 13 (13q14)
kommt, auf welchem die beiden miRNAs lokalisiert sind, so dass sie nicht im physiologischen Umfang exprimiert werden können.
Der Pathomechanismus, der über die veränderte Expression von miRNA 15 und -16 zu malignen
Prozessen führt, wurde in der Arbeit von Cimmino et al [16] identifiziert. Sie entdeckten einen inversen Zusammenhang zwischen der Expression von miRNA 15 bzw.-16 und der Expression des Proteins bcl-2, das antiapoptotisch wirkt und in einer Reihe von menschlichen Tumoren vermehrt
exprimiert wird. Die verminderte Expression von miRNA 15 und -16 ist assoziiert mit der Überexpression von bcl-2. Anhand dieses Umstandes gelang es zu erklären, in wiefern die beiden miRNAs
Einfluss auf die Expression von bcl-2 nehmen können: in der Arbeit an CLL-Zelllinien konnte gezeigt werden, dass miRNA 15 und 16 die Expression von bcl-2 verringern können. Damit kommt es
über die Verringerung der antiapoptotischen Wirkung von bcl-2 zu einer verstärkten Apoptose.
Werden nun die beiden miRNAs-wie bei der CLL nachgewiesen-verrringert exprimiert, entfällt die
Kontrolle der Apoptose und Zellen, die maligne verändert sind, können weiter repliziert werden.
Weiterhin gelingt es einigen miRNAs, Einfluss auf das p53-Protein zu nehmen. p53 ist ein Tumorsuppressor-Protein und als solches ganz entscheidend an der Regulation der Abwehr von Stressoren beteiligt, die zur Karzinomentstehung beitragen können. miRNAs, die über diesen Signalweg
Einfluss auf die Genexpression nehmen können, sind unter anderem miRNA 34 a und let7 [85].
In mehreren auf die Arbeit von Calin et al. folgenden Studien konnten weitere miRNAs identifiziert
und ihrer potentiellen Funktion als Onkogene [41, 58, 91] bzw. Tumorsuppressoren [17] zugeordnet
werden.
Abgesehen von ihrer Bedeutung für die Regulation intrazellulärer Prozesse insbesondere in der
Karzinogenese scheint den miRNAs in Zukunft eine weitere entscheidende Bedeutung beigemessen werden zu können: nämlich die als diagnostische Marker im Rahmen der Diagnose maligner
Prozesse. Darüber hinaus existieren bereits erste Arbeiten, die auf die Nutzung von miRNAs im
Rahmen therapeutischer Strategien fokussieren.
Lawrie et al. zeigten in ihrer Arbeit in den Seren von 60 Patienten mit malignem B-Zell-Lymphom im
Vergleich zu den Seren gesunder Kontrollprobanden signifikant erhöhte Werte von tumorassoziierten microRNAs [50]. Mitchell et al. wiesen ebenfalls miRNAs in menschlichem Serum nach und
zeigten am Beispiel von miRNA 141, dass ein erhöhter Serumspiegel der miRNA die Differenzierung zwischen Prostata-Karzinompatienten und gesunden Probanden erlaubt [63].
Bezüglich der Nutzung verschiedener miRNAs zu therapeutischen Zwecken gibt es bislang viel versprechende Ansätze. Generell stehen bei der Suche nach Anwendungsmöglichkeiten von miRNAs
in therapeutischen Strategien zwei Ansätze zur Verfügung: 1. der Versuch, über modifizierte
Signaltransduktion die Aktivität onkogener miRNAs auszuschalten und 2. die Aktivität der als Tumorsuppressoren agierenden miRNAs zu verstärken.
23
Akao et al. wiesen an DLD-1, einer Kolonkarzinom-Zellreihe, vermindertes Zellwachstum nach,
nachdem die Zellen mit der miRNA let-7a transfiziert worden waren [1]. Damit gelang den Autoren
zumindest in vitro der Nachweis, dass miRNAs potentiell therapeutischen Zwecken dienen könnten.
Chan et al. zeigten in ihrer Arbeit, dass sich in Zellkulturen aus Glioblastom- und MammakarzinomZellen durch Bearbeitung mit anti-miRNA-Oligonukleotiden, die die miRNA 21 zur Zielstruktur haben, die Apoptoserate erhöhen und damit das Wachstum der malignen Zellen verringern lässt [11,
67]. Ein weiterer bedeutsamer Effekt ist darüber hinaus, dass die Wirkung der anti-miRNA zu einer
Sensibilisierung der miRNA gegenüber Gemcitabin-einem Nukleosidanalogon, das zytostatisch
wirkt-führt.
Denkbar wäre also für zukünftige Therapien nicht nur eine Modifikation der Aktivität der miRNAs
selbst, sondern auch eine Kombinationstherapie aus Substanzen, die die Aktivität der miRNA direkt
beeinflussen und damit die therapeutische Wirksamkeit einer weiteren Substanz verstärken können.
Noch allerdings liegen zum jetzigen Zeitpunkt keine in vivo-Studien vor, die die Anwendbarkeit von
miRNAs zu therapeutischen Zwecken näher überprüfen. Dies wäre einer der nächsten Schritte auf
dem Weg zu neuen Therapien maligner Erkrankungen.
1.6.2 Die Rolle von micro-RNA in der Hepatokarzinogenese
Das Auftreten von miRNAs in HCC wurde in ersten Studien in jüngster Vergangenheit untersucht
[31, 44, 84, 87]. Insgesamt wurden dabei mehrere Hundert miRNAs identifiziert, die im HCC möglicherweise divergent exprimiert werden. Aber aufgrund der kleinen und häufig gering charakterisierten Patientenkohorten, die in die Studie einflossen, gibt es bislang noch keinen Konsens, welche
miRNA wichtig für die HCC-Initiation und -Progression sind. Die miRNAs let-7a (s.o.), miRNA 21
[86] und die miRNA 224 [64, 93, 94] wurden bereits vermehrt als potentielle onkogene miRNA in
anderen Tumoren beschrieben, so dass ihnen möglicherweise auch eine besondere Rolle in der
hepatozellulären Karzinogenese zukommt. Dagegen wird die im HCC supprimierte miRNA 145 [86,
94] und miRNA 199a [31, 64] als potentieller Tumorsuppressor in anderen Tumorentitäten beschrieben [62]. Über HCC-spezifische miRNA oder miRNA, die bei der HCC-Entstehung nach chronischer HCV- oder HBV-Infektion dysreguliert ist, ist bislang aber noch wenig bekannt.
24
2.
Aufgabenstellung
Als eines der häufigsten Karzinome weltweit mit immer noch nicht vollständig entschlüsseltem Pathomechanismus kommt dem hepatozellulären Karzinom (HCC) eine entscheidende Bedeutung zu.
Die chronische Hepatitis B- und die chronische Hepatitis C-Infektion gehören zu den Hauptursachen der HCC-Entstehung. Durch molekulargenetische Studien konnten Hinweise auf eine HCCassoziierte Dysregulation genetischer Netzwerke gewonnen werden. Da micro-RNAs während vielfältiger Differenzierungsprozesse und im Rahmen der Tumorgenese auftretender Gewebsumstrukturierungen an einem veränderten Genexpressionsprofil maßgeblich beteiligt sind, sollte in der vorgelegten Arbeit das Auftreten ausgewählter micro-RNAs in HCC untersucht werden.
Die Fragestellung sollte an archivierten, formalinfixierten und paraffingebetteten (FFPE-)Proben des
Institutes für Pathologie der Universitätsklinik Köln bearbeitet werden. Es sollte ein HBV-positives
Gewebekollektiv von dysplastischen Knoten und HCC unter Anleitung eines Pathologen histologisch klassifiziert und nach Differenzierungsgrad zusammengestellt werden. Für die Untersuchungen an einem HCV-positiven Kohort sollte auf ein bereits am Institut für Pathologie der Universitätsklinik Köln zusammengestelltes Kollektiv (N=56) zurückgegriffen werden.
Die Quantifizierung von micro-RNA an FFPE-Gewebe erfordert eine Überprüfung der PCRAmplikationsverfahren der einzelnen miRNA-Assays. Nach Etablierung der Nachweise sollte die
miRNA 122, die als die am höchsten exprimierte miRNA in der Leber gilt, auf ihr Expressionsprofil
in HBV-positiven HCC untersucht werden. Ein weiteres Ziel war es, die Verteilung der miRNA, für
die es in einer primären Sichtungsstudie der Laborgruppe Hinweise auf HCC-Dysregulation gab, in
HBV-und HCV-positiven dysplastischen Knoten, HCC und peritumoralen, nicht maligne verändertem Lebergewebe, das meist zirrhotisch war, sowie gesundem Lebergewebe zu analysieren. Für
diese Studien sollten die miRNA 145, miRNA 198, miRNA 29c, miRNA 299 5p, miRNA 370 und die
miRNA 21 herangezogen werden. Als Referenz-miRNA diente die miRNA 140, da diese als in HCC
wenig regulierte RNA beschrieben wurde. Inwieweit die Expressionsmuster der genannten miRNA
Hinweise ergeben, ob die miRNAs tumorsupprimierende oder onkogene Wirkung haben, sollte anschließend diskutiert werden.
25
3.
Patienten und Methoden
3.1
Zusammenstellung des Untersuchungsmaterials
In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Gewebekollektive benutzt. Zum einen wurde ein Untersuchungskollektiv zusammengestellt, das peritumorale, dysplastische und tumorale HCC-Läsionen
von HBV-positiven Patienten erfasste und zum anderen wurde ein HCV-positives Gewebekollektiv
aus Vorarbeiten [87] übernommen. Bei allen Proben handelte es sich um formalinfixiertes, paraffingebettetes Material.
3.1.1 Gewebeproben von HBV-positiven Patienten
Bei der Zusammenstellung des "HBV-Kollektivs" wurden ausschließlich Proben HBV-positiver Patienten berücksichtigt. Alle Gewebeproben stammten aus dem Gewebearchiv des Institutes für Pathologie der Kölner Universität. Es wurde angestrebt, Proben aller Zirrhose- und Tumorgrade
(jeweils Grad 1-3) in das Kollektiv aufzunehmen.
Folgende Kriterien mussten für den Einschluss in das Patientenkollektiv erfüllt sein:
1. es musste entweder zirrhotisches Gewebe, ein Vorläufer eines hepatozellulären Karzinoms
(ein dysplastischer Knoten) oder ein hepatozelluläres Karzinom vorliegen.
2. der Patient, dem das Gewebe entnommen worden war, musste
HBV-positiv sein. Zur Kontrolle wurden alle ausgewählten Proben vor Beginn der Versuchsreihe nochmals auf genomische HBV-DNA mittels nested-PCR getestet. Diese vorbereitenden Arbeiten wurden freundlicherweise von Herrn Ali Manav durchgeführt.
Nach Auswahl der Gewebeproben wurden histologische Schnittpräparate unter Anleitung von Frau
Dr. Heike Varnholt mikroskopisch untersucht. Es wurde nach typischen Malignitätskriterien (s. Tabelle 4) gesucht und den Schnitten die entsprechenden Tumor-und Zirrhosegrade 1-3 zugeordnet.
Dann wurden die Tumorareale auf dem Schnittpräparat für die spätere Makrodissektion eingezeichnet.
26
Tab. 4: Malignitätskriterien bei hepatozellulärem Karzinom. In Abhängigkeit der HCC-Grade 1 bis 3 kommen
verschiedene Kriterien des AFIP (Armed forces Institute of Pathology) zur Anwendung. Siehe hierzu auch
Abbildungen 9 und 12 in Kapitel 4.1.
Malignitätskriterien bei hepatozellulärem
Karzinom
• Polymorphe Zellkerne
• Prominente Nucleoli
• Kern-Zytoplasma-Relation zugunsten des Kerns
erhöht
• Gallenpigment in den Tumorzellen oder in dilatierten
Canaliculi
• Hyperchromatismus
• Eosinophiles Plasma
• Fehlen von retikulären Fasern
Die Klassifizierung der HCC erfolgte nach den Kriterien des AFIP (Armed forces Institute of Pathology). Abhängig von den vorliegenden, in Tabelle 4 aufgelisteten Malignitätskriterien erfolgte die
Zuordnung zu einem der HCC-Grade 1-3, wobei die unterschiedlichen Grade charakteristische
Merkmale tragen. Das HCC Grad 1 ist noch hoch differenziert, kann aber bereits ein gering zu
Gunsten des Zellkerns verschobenes Kern-Zytoplasma-Verhältnis zeigen. Im HCC Grad 2 erscheint
das Chromatin typischerweise verdichtet und dunkler als in gesunden Hepatozyten. In Grad 3 ist
das Kern-Zytoplasma-Verhältnis deutlich zu Gunsten des Kerns verschoben, der Chromatingehalt
der Zellen ist höher als in den Zellen eines Tumors mit Grad 2; auch liegen häufig TumorRiesenzellen vor.
3.1.2 Das HCV-Kollektiv
Das in der vorliegenden Arbeit verwendete HCV-Kollektiv war bereits für die Arbeit von Varnholt et
al.[87] zusammengestellt worden.
27
3.1.3 Makrodissektion von Tumor- und Peritumorgewebsarealen
Nach histologischer Begutachtung der Gewebeschnitte und Einzeichnen der für die Dissektion bestimmten Areale wurden die Mikrotomschnitte der formalinfixierten, in Paraffin gebetteten Gewebe
für die Makrodissektion angefertigt. Dafür wurden von den Paraffinblöcken jeweils drei 7,5 µm dicke
Schnitte abgehobelt und in Tumor- und Nicht-Tumoranteile getrennt nach dem Zeichenpräparat mit
einem Skalpell in ein Eppendorfgefäß überführt. Bei einem Teil der Proben war auf zwei Blöcken
getrennt nur Tumor bzw. nur zirrhotisches peritumorales Gewebe vorhanden. Hier konnten die
Schnittpräparate als Ganzes in ein Eppendorfgefäß aufgenommen werden.
3.2
RNA-Extraktion von formalin-fixierten, paraffingebetteten
Microtomgewebeschnitten
Der erste Schritt bestand hierbei in der Entparaffinierung des Gewebes. Hierzu wurden die in Eppendorf-Gefäße gegebenen Proben zunächst 5 Minuten bei 65 °C erhitzt. Als nächstes wurde je
Probe 500 µl Xylol zugegeben, die Proben wurden erneut für 5 Minuten bei 65 °C auf dem Schüttler
erhitzt und anschließend 2 Minuten bei 13000 Umdrehungen zentrifugiert. Danach wurde der XylolÜberstand abpipettiert. Dieser Zyklus wurde insgesamt dreimal durchgeführt. Im nächsten Schritt
wurden die Proben mit je 500 µl 100-prozentigem Ethanol versetzt und für 2 Minuten bei 13000
Umdrehungen zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand abzentrifugiert. Dieser Zyklus wurde ebenfalls insgesamt dreimal durchgeführt. Danach wurden die Proben für eine Stunde bei
37° im Brutschrank getrocknet.
Der zweite Schritt der RNA-Extraktion bestand im Proteinase-K-Verdau. Hierbei wurde je Probe 200
µl Proteinase-K-Mix (500 µg/ml frisch zugesetzte Proteinase K (Invitrogen) in 0,1 % SDS, 25 mM
TRIS pH 7.0 und 5mM EDTA) zugegeben. Alle Proben wurden kurz anzentrifugiert und über Nacht
bei 65 °C auf einem Schüttler inkubiert. Der Verdau wurde durch zehnminütiges Erhitzen der Proben auf 95 °C (und damit durch Denaturierung der Proteinase) gestoppt und die Proben danach
kurz anzentrifugiert.
Anschließend wurde die eigentliche Extraktion durchgeführt. Als erstes wurden pro Reaktionsgefäß
200 µl Phenol-Chloroform-Isoamylalkohollösung im Verhältnis von 1:1:0,04 Volumenanteilen sowie
20 µl 2-molare Natriumacetatlösung zugegeben, die Proben wurden vorsichtig geschüttelt und anschließend für 20 Minuten bei 13000 Umdrehungen zentrifugiert. Der wässrige Überstand, der die
RNA enthielt, wurde abpipettiert und jeweils in ein neues Eppendorfgefäß gegeben. Um die RNA
auszufällen wurden dann pro Probe 200 µl kaltes Isopropanol sowie 2 µl Glykogen (20 mg /ml) (Roche Diagnostics, Mannheim) zugegeben und die Proben für zwei Stunden bei -20 °C inkubiert. Danach wurden die Proben erneut 20 Minuten bei 13000 Umdrehungen zentrifugiert, der Überstand
wurde abpipettiert und verworfen. Anschließend wurde jeder Probe 500 µl kaltes Ethanol zugegeben und die Proben wurden 5 Minuten lang bei 13000 Umdrehungen zentrifugiert; auch hier wurde
der Überstand abpipettiert und verworfen. Dieser Schritt wurde noch zweimal wiederholt. Danach
28
wurden die Proben für 30 Minuten bei 37 °C im Brutschrank getrocknet und darauf folgend mit jeweils 25 µl DNAse-Mix (bestehend aus 20 µl H2O, 1 µl RNAse-Inhibitor, 3 µl DNAse und 1 µl Magnesiumchlorid) versetzt und dann zunächst für 30 Minuten bei 37°C im Thermomixer inkubiert. Nach
kurzem Zentrifugieren wurden die Proben dann 3 Minuten lang auf 95 °C erhitzt und nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur mit 1 µl RNAse-Inhibitor versetzt. Nach erneutem kurzen Zentrifugieren
wurden
die
RNA-Proben
schließlich
bei
-80°
C
bis
zur
weiteren
Verwendung
eingefroren.
3.2.1 Photometrische Konzentrationsbestimmung der RNA-Gesamt-Extrakte
Die Konzentrationsbestimmung der RNA-Extrakte erfolgte per Nanodrop-Messung. Hierbei wird die
Menge der extrahierten RNA mittels Messung der optischen Dichte der Extrakte bei einer definierten Wellenlänge bestimmt.
3.3
Reverse Transkription und Real Time-PCR von micro-RNA
Es gibt zwei Methoden der reversen Transkription, die in der unten stehenden Abbildung kurz dargestellt und im folgenden Text näher erläutert werden sollen.
A.
B.
polyadenylation
reverse transcription
with stem-loop primer
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
B
Q
R
reverse transcription
un
pr ive
i m rs
er
Oligo-dT –
adapter
primer
Real Time PCR
with MGB probes
Real Time PCR (SyBR Green)
Schmittgen et al. Nucleic Acids Res.: 2004;
Chen C et al. Nucleic Acids Res.: 2005
Shi & Chiang, Biotechniques 2005
Abb. 6: Methoden der reversen Transkription. A verdeutlicht die Haarnadel-Primer-Methode (Kap.3.3.1.1); B
die Polyadenylierungsmethode (Kap.3.3.2 sowie 3.3.2.1). Beide Verfahren werden in den entsprechenden
Kapiteln näher erläutert.
29
3.3.1
Reverse Transkription und Real Time-PCR von miRNA nach der TaqManMethode (ABI)
Durch einen Haarnadel-Primer, der spezifisch an bestimmte miRNA-Spezies bindet, wird die reverse Transkription gestartet und die cDNA verlängert.
3.3.1.1 Reverse Transkription mit einem Haarnadel-Primer
Es wurden der geplanten Untersuchung der acht miRNA-Typen (miRNA 140 zur Referenz, miRNA
122a, miRNA 145, miRNA 198, miRNA 21, miRNA 29c, miRNA 299 5p sowie miRNA 370) entsprechend acht cDNA-Synthesen bei jeweils allen RNA-Proben durchgeführt. Zu Beginn der c-DNASynthese wurde eine Probe bestimmt, anhand derer die später für die PCR-Läufe benötigten Standardverdünnungsreihen durchgeführt werden sollten (Probe B 28). Die c-DNA-Synthese dieser
Probe wurde entsprechend zusätzlich für jede der acht miRNA-Typen durchgeführt.
Für die c-DNA-Synthesen wurden die Proben, die zuvor bei -80 °C gelagert wurden, zunächst auf
Eis aufgetaut. Währenddessen wurde die zur c-DNA-Synthese benötigte Lösung (bestehend aus
dNTP (Desoxy-Ribonukleosid-Triphosphaten), reverser Transkriptase, Puffer, dem Inhibitor, dem
Primer sowie H2O) angesetzt. Um bei allen Proben die gleiche RNA-Konzentration zu erhalten,
wurde für jede Probe die individuell benötigte Wassermenge berechnet. Diese Menge wurde als
erstes in das für die jeweilige Probe bestimmte well einer 96 well-c-DNA-Syntheseplatte pipettiert.
Anschließend wurde der Probenmix in jedes well zu der jeweiligen Wassermenge dazu pipettiert
und als letztes die aus den einzelnen Proben (die nach dem Auftauen noch einmal kurz zentrifugiert
wurden) extrahierte RNA dazugegeben. Anschließend wurde die bearbeitete Platte mit einer Spezialfolie verschlossen und für 3 Minuten zentrifugiert. Dem benötigten Cycler-Programm entsprechend wurde die Platte im ersten Programmschritt für 30 Minuten auf 16° C, im zweiten Schritt für
weitere 30 Minuten auf 42° C und anschließend für weitere 5 Minuten auf 85° C erhitzt. Dann wurden die Proben etwa 5 weitere Minuten auf 4° C abgekühlt; die Platte wurde anschließend bis zur
weiteren Verwendung bei -20 °C eingefroren.
3.3.1.2 Quantitative Real Time-PCR mit einer Minor-Groove-Binder-Sonde
Die bei dem hier erläuterten Verfahren verwendete MGB-Sonde ist mit einer chemischen Verbindung („Quencher“) und einem Fluoreszenzfarbstoff konjugiert. Der Quencher unterdrückt die Reporterfluoreszenz bis nach Abbau der MBG-Sonde durch die Taq-Polymerase. Dann stehen Quencher
und Reporter nicht mehr in energetischem Zusammenhang und die Fluoreszenz zeigt den erfolgreichen Amplifikationsschritt an.
Im ersten Arbeitsschritt der Herstellung einer Real Time-PCR-Platte wurden die Verdünnungen für
die Standardreihe hergestellt. Benötigt wurden jeweils Konzentrationen von 100 ng, 50 ng, 25
30
ng, 12,5 ng, 6,25 sowie 3,13 ng cDNA. Die Standardreihe wurde entsprechend unten abgebildetem
Plattenlayout pipettiert.
Für die Standardreihe sowie für die zu untersuchenden Proben wurde entsprechend Abbildung 7
jeweils ein Ansatz mit den aufgeführten Reagenzien hergestellt.
Platte:
Durchgeführt von:
A
B
C
D
E
F
G
H
1
100ng
6,25ng
B2
B6
B9
NTC
B16
B19●
2
100ng
6,25ng
NTC
B6
B9
B13
B16
B19
3
100ng
6,25ng
B3
B6
B10
B13
NTC
B19
4
50ng
3,13ng
B3
NTC
B10
B13
B17
B19
5
50ng
3,13ng
B3
B7
B10
B14
B17
NTC
6
50ng
3,13ng
B4
B7
NTC
B14
B17
B20
7
25ng
NTC
B4
B7
B11
B14
B18
B20
8
25ng
B1
B4
B8
B11
NTC
B18
B20
9
25ng
B1
NTC
B8
B11
B15
B18
B21
10
12,5ng
B1
B5
B8
B12
B15
NTC
B21
11
12,5ng
B2
B5
NTC
B12
B15
B19●
B21
12
12,5ng
B2
B5
B9
B12
B16
B19●
NTC
Abb. 7: Beispiel einer 96 well Real Time-PCR-Platte. In die wells A1 bis B6 wird die Standardreihe pipettiert.
In die restlichen wells werden der Probenmix (12 µl) sowie die cDNA der jeweiligen Probe B1-B21(jeweils 3
µl) pipettiert. Nach jeweils zwei Tripletts wird eine Leerkontrolle (NTC) eingefügt.
Nach der Herstellung der Verdünnungsreihen wurden die entsprechenden Eppendorfgefäße zunächst auf Eis gelagert. Anschließend wurde der Probenmix für die Real Time-PCR hergestellt.
Dieser bestand pro well aus 6,0 µl Eppendorf Master Mix, 1 µl Primer sowie 5 µl Wasser. Daraus
ergab sich für jedes well eine Menge von 12 µl Probenmix. Danach wurden die Standardreihen in
die entsprechenden wells pipettiert. Im nächsten Schritt wurde zu den mit dem Probenmix vorbereiteten wells die jeweilige c-DNA zugefügt (3 µl pro Well). Jede Probe wurde als Triplett pipettiert und
nach jeweils zwei Tripletts eine Leerkontrolle (NTC, s. Abbildung 7) eingefügt. In diese wurde statt
cDNA 3 µl Wasser zu dem Probenmix pipettiert. Nach vollständiger Belegung der Platte wurde diese mit Folie verschlossen und kurz zentrifugiert. Nach Positionierung in dem Cycler wurde das Real
Time-Programm gestartet, das sich in folgende Schritte unterteilte:
1. Erhitzen auf 95° C, zweiminütiger Lauf
2. dreißigsekündiger Lauf bei gleicher Temperatur
3. einminütiger Lauf bei 60° C, Wiederholung 54mal
Nach Beendigung der PCR-Läufe wurde mit der Auswertung der Daten begonnen.
31
3.3.2 Reverse Transkription und Real Time-PCR von micro-RNA nach der
Polyadenylierungsmethode
In anderen Ansätzen wurde die cDNA-Synthese nicht durch einen Haarnadelprimer gestartet, sondern mit polyadenylierter Gesamt-RNA und einem oligo-dT-Primer, der mit einer UniversPrimersequenz verlängert war, durchgeführt. Die Univers-Sequenz diente als Ansatzsequenz für
einen Univers-Primer, der dann mit einem miRNA-spezifischen Primer zur PCR-Amplifikation eingesetzt wurde. Sowohl Polyadenylierung und reverse Transkription als auch die Real Time PCRAmplifikation wurde mit Reagenzien der Firma Qiagen (Hilden) nach Herstellerangaben durchgeführt.
3.3.2.1 Polyadenylierung und reverse Transkription
Die Reverse Transkription wurde mit Hilfe des miScript Reverse Transcription Kit (Qiagen, Hilden)
durchgeführt. Der Mix enthält eine optimierte Mischung aus poly(A)-Polymerase und reverser
Transkriptase. Der zugehörige miScript RT-Puffer enthält eine Mischung aus MgCl2+, dNTPs, oligodT Primer sowie random Primer für eine optimale Aktivität beider Enzyme. Alle RNAs werden durch
die poly(A) Polymerase polyadenyliert. Die polyadenylierte RNA wird dann durch die Reverse
Transkriptase zu cDNA umgeschrieben. Die verwendeten oligo-dT Primer enthalten an ihrem 5’Ende eine Universalsequenz, die eine Amplifikation in der Real Time-PCR ermöglicht (siehe Abbildung 8)
32
Quelle: miScript System Handbook, Qiagen
Abb. 8: Polyadenylierung von miRNA/mRNA. miRNAs und andere RNA werden durch eine poly(A) Polymerase polyadenyliert und anschließend durch eine Reverse Transkriptase-Reaktion mit Oligo-dT Primern in cDNA
umgeschrieben. mRNAs werden durch eine reverse Transkriptase mit beidem, Oligo-dT and random Primern,
umgeschrieben.
Folgender Ansatz wurde zur Durchführung der cDNA-Synthese verwendet:
20μl Reaktionsansatz für maximal 1µg Gesamt-RNA:
5x miScript RT Puffer
5,0µl
miScript Reverse Transkriptase
1,0µl
RNA
RNase-freies H2O
x µl
ad 15,0µl
Bei größeren umzuschreibenden RNA-Mengen vergrößert sich der Ansatz entsprechend um ein
Vielfaches.
Zur Verdünnung der cDNA auf die gewünschte Konzentration wurde DNAse-freies Wasser verwendet.
33
3.3.2.2 Real Time-PCR der cDNA mit SybrGreen®
Nach der reversen Transkription wurde der Univers-Primer und ein miRNA-spezifischer Primer für
die PCR-Amplifikation verwendet. Real Time-PCR Ansätze mit SybrGreen® wurden mit dem Power
SybrGreen® PCR MasterMix (Applied Biosystems, Foster City, USA) durchgeführt. Die PCRAmplifikation von miRNA erfolgte mit folgendem Ansatz:
Reaktionsansatz:
Power SybrGreen® PCR Real Time-MasterMix
12,5µl
Universal Primer
1,0µl
Spezifischer miRNA Primer
1,0µl
cDNA
1,0µl
DNAse-freies Wasser
9,5µl
Die verwendete Gesamt-cDNA wurde auf eine Konzentration von 10ng/µl mit DNAse freiem Wasser
verdünnt.
Temperaturprofil zur Bestimmung von miRNA:
95°C
10min
95°C
15sek
55°C
30sek
70°C
45sek
50 Zyklen
45° C-95° C
Schmelzkurve
Die Real Time-PCR wurde auf Cyclern der Marke Stratagene bzw. Biorad durchgeführt. Für die
anschließende statistische Auswertung wurde das Programm SPSS 17.0 verwendet.
Die Darstellung der nachgewiesenen miRNA-Menge innerhalb der einzelnen Subgruppen des Kollektivs erfolgte im Rahmen einer Boxplotanalyse. Die Werte waren bei einem Niveau von
p< 0,05 signifikant. Die Signifikanztestung erfolgte anhand des ANOVA-Testes.
34
4.
Ergebnisse
4.1
Zusammenstellung des Patientenkollektivs
Das Patientenkollektiv wurde nach den in 3.1.1 genannten Kriterien zusammengestellt. Eingeschlossen wurden Proben, die HBV-positiv waren und bei denen ein hepatozelluläres Karzinom, ein
dysplastischer Knoten als Vorläufer des hepatozellulären Karzinoms und/oder eine Zirrhose vorlag.
Als Referenzmaterial diente normales, nicht signifikant pathologisch verändertes Lebergewebe.
Dieses stammte aus Lebern mit Steatose beziehungsweise von einem Patienten mit nichtmetastasiertem Lungenkarzinom.
Nach histologischer Begutachtung wurden 12 HBV-positive dysplastische Knoten beziehungsweise
hepatozelluläre Karzinome für eine primäre Studie der miRNA-Expression ausgewählt.
Abbildung 9 veranschaulicht die histopathologischen Kriterien der ausgewählten dysplastischen
Knoten und hepatozellulären Karzinome.
Abb. 9: Hämalaun-Eosin gefärbte
Leberbiopsiepräparate mit hepatozellulären Atypien
A und B zeigen normale Lebern, die
nicht pathologisch verändert sind.
C zeigt ein HCC Grad 1; D zeigt ein
HCC Grad 3. Deutlich verändert ist
die Form der Nuclei sowie die Relation zwischen Nuclei und Zytoplasma. Die Nuclei sind polymorph (Pfeile in C); die Relation zwischen Nuclei
und Zytoplasma ist deutlich zugunsten der Nuclei erhöht (Pfeile in D).
Die Knoten bzw. Tumore wurden durch Makrodissektion für die RNA-Aufarbeitung freigelegt. Von
sechs Geweben war es möglich, auch Nicht-Tumoranteile zu gewinnen. Diese waren teilweise zirrhotisch und wurden als Vergleichsgruppe in das zu bearbeitende Kollektiv eingeschlossen. Abbildung 10 zeigt die Probenverteilung im HBV-Kollektiv.
35
18 HBV-positive Leberproben
dysplastische Knoten
N=2
Zirrhosen
N=6
hepatozelluläre Karzinome
N = 10
Grad 1
N=2
Grad 2
N=8
Abb. 10: Probenverteilung im HBV-Kollektiv. Zusammenstellung der HBV-positiven HCC-Präparate, die nach
den angewandten Kriterien (vergl. Text und Kapitel 3.1.1) zur miRNA-Analyse ausgewählt wurden.
Es konnte zusätzlich ein entsprechendes Kollektiv von HCV-positiven Läsionen übernommen werden, das in einer Studie zur miRNA bereits von Varnholt et al. bearbeitet worden war. Abbildung 11
zeigt die Zusammenstellung dieses HCV-positiven Kollektivs.
56 HCV-positive Leberproben
Zirrhosen
N= 6
dysplastische Knoten
high grade
N=5
low grade
N =2
hepatozelluläre Karzinome
N= 43
Grad 1
N=7
Grad 2
N = 30
Grad 3
N=6
Abb. 11: Zusammenstellung der HCV-positiven HCC-Präparate, die in der miRNA-Analyse eingesetzt wurden.
Die HCC-Gewebe wurden anschließend histologisch vertiefend begutachtet und der Tumorgrad
festgehalten. In Abbildung 12 sind die Tumorgrade des hepatozellulären Karzinoms Grad 1 bis
Grad 3 repräsentativ dargestellt.
36
Abb. 12: Dysplastischer Knoten und hepatozelluläres Karzinom Grad 1-3 im HBV-positiven Gewebekollektiv:
A) hochgradig dysplastischer Knoten (HGDN); B) HCC Grad 1; C) HCC Grad 2 und D) HCC Grad 3. Von den
formalinfixierten und paraffineingebetteten Geweben wurden 3 µm dicke Mikrotomschnitte angefertigt und
eine Hamalaun-Eosinfärbung durchgeführt. Die Malignitätskriterien während der Progression vom hochgradig
dysplastischen Knoten (HGDN) zum HCC Grad 3 wie Kern-Zytoplasma-Verhältnis, Deformierungen des
Kerns sowie Verdichtung des Chromatins sind mit Pfeilen hervorgehoben und im Weiteren im Text beschrieben.
Für die Einstufung der HCC wurden die Kriterien nach dem AFIP (Armed forces Institute of Pathology) herangezogen. In Abbildung 12 A ist deutlich erkennbar, dass die Malignitätskriterien bei
dysplastischen Knoten noch nicht erfüllt sind: die Nuclei sind weitestgehend rund bzw. homogen
geformt, es besteht ein normales Kern-Zytoplasma-Verhältnis. Dahingegen zeigt ein HCC Grad 1
(Abbildung 12 B) schon deutliche Veränderungen: die Zellkerne sind leicht heterogen (schwarze
Pfeile), die Nucleoli erscheinen prominent (weisse Pfeile) und die Zytoplasmaanteile der Zelle sind
im Vergleich zum Nucleus verringert. Im HCC Grad 2 (Abbildung 12 C) erscheint das Chromatin
verdichtet und farbintensiv („Hyperchromatismus“), was als ein charakteristisches Kennzeichen eines HCC Grad 2 zu werten ist [43]. In dem HCC Grad 3 (Abbildung 12 D) fällt insbesondere der
Kernpolymorphismus auf; zusätzlich sind die bereits erwähnten Malignitätskriterien zu beobachten
(Pfeile: Kern-Zytoplasma-Relation deutlich zu Gunsten des Kerns). Weiterhin kommt es im Rahmen
der Progression zu einem Verlust an festen, retikulären Fasern im Gewebe.
37
4.2
Etablierung der miRNA-Analyse
Für die miRNA-Analyse standen formalin-fixierte, paraffineingebettete Proben (FFPE) zur Verfügung. Bei den dysplastischen Läsionen und bei HCCs, die auch Nichttumoranteile beinhalteten,
wurde eine Makrodissektion durchgeführt. Anschließend wurde die Gesamt-RNA isoliert. In einem
ersten Schritt wurde die Zugänglichkeit der miRNA in dem FFPE-Material für die Nachweismethode
und die Amplifizierbarkeit im Vergleich zu miRNA aus nativen Hepatomazellen dargelegt. In einem
nächsten Schritt wurden dann im HBV-Kollektiv die Expressionsprofile der miRNA 122, 145, 21,
29c, 198, 299 5p sowie 370 und danach im HCV-Kollektiv das Expressionsprofil der miRNA 370, 21
sowie miRNA 299 5p erhoben.
4.2.1 Detektion von miRNA in formalin-fixierten paraffingebetteten Geweben
und in nativen Hepatomazellen
Zunächst wurde überprüft, ob die miRNA-Quantifizierung von RNA-Isolaten aus FFPE im Vergleich
zu RNA-Präparationen, die aus nativem Zellmaterial erhalten wurden, effizient und sicher durchgeführt werden konnte. Wie bereits in 3.3 angeführt, existieren für die Detektion bzw. die miRNAQuantifizierung zwei Methoden: zum einen die reverse Transkription und Real Time-PCR nach der
Taqman-Methode und zum anderen nach der Polyadenylierungsmethode. Es wurden beide Methoden am HBV-Kollektiv getestet. Beide Methoden sind für die Detektion von miRNA geeignet (s. Abbildung 13):
A
38
B
Abb. 13: Amplifikationsverläufe der Real Time-PCR für micro-RNA 140 in FFPE-Gewebe
A zeigt den Amplifikationsverlauf nach der ABI-Methode, B nach der Polyadenylierungsmethode. Es wird
ersichtlich, dass beide Methoden zur Detektion von miRNA erfolgreich angewendet werden können.
Bei der Entscheidung zwischen beiden Methoden war Ausschlag gebend, dass die Effizienz beider
Methoden zwar annähernd gleich gut ist (wobei die ABI-Methode, wie aus Abbildung 13 ersichtlich,
etwas sensitiver ist), die Polyadenylierungsmethode jedoch zusätzlich den Vorteil eines geringeren
Bearbeitungsaufwandes bietet. Daher wurde die Entscheidung zu Gunsten dieser Methode gefällt.
Für die Testreihen wurden RNA-Extrakte aus nativen Hepatomazellen herangezogen. Anhand der
unten dargestellten Real Time-PCR Läufe (Abbildung 14) lässt sich zeigen, dass das Paraffingewebe zur Detektion von miRNA geeignet ist. Für die Evaluierung der miRNA-Quantifizierung wurde die
miRNA 140 ausgewählt, weil diese als stabile, wenig in HCC regulierte miRNA beschrieben wurde
[87], sowie die miRNA 122, weil sie die höchst exprimierte miRNA in der Leber ist.
Gezeigt werden in Abbildung 14 A und C die einzelnen Proben, Abbildung B und D zeigen die dazugehörenden Standardkurven, die für die Effizienzanalyse benötigt wurden. Das Verfahren zur
Herstellung der für die Standardkurven benötigten Verdünnungsreihen wurde in Kapitel 3.3.1.2 erläutert.
39
A
B
C
40
D
Abb. 14: Amplifikationsverläufe der Real Time-PCR-Ansätze zur Detektion und Quantifizierung der miRNA
140 (A) und 122 (C); miRNA 140 wird zur Normalisierung eingesetzt. B und D zeigen die zugehörigen Verdünnungsreihen, die zur Effizienzevaluierung benötigt werden (vergl. Text).
Anhand der Kurvenverläufe der Nachweise von miRNA 140 bzw. miRNA 122 in Abbildung 14 lässt
sich das unterschiedliche Verhalten der miRNAs zeigen: der Verlauf der Kurve von miRNA 140 ist
insgesamt homogen (A). Verglichen mit der miRNA 122 (als leberspezifische RNA) lassen sich einige Unterschiede beschreiben: miRNA 122 lässt sich in den untersuchten Proben bereits nach
einer geringeren Zahl von Amplifikationszyklen nachweisen als miRNA 140 (C). Auffällig ist, dass
sich ein zweigeteilter Kurvenverlauf darstellen lässt: ein geringer Anteil der Proben benötigt deutlich
mehr Amplifikationszyklen bis zum Nachweis der miRNA. Dieser Anteil ist in Abbildung 15 nochmals gesondert dargestellt.
HCC Grad 2
HGDN
POP 10
normale Leber
SK Hep 1
Hep G2
41
Abb. 15: Amplifikationsverhalten der Real Time-PCR von miRNA 122 am Beispiel ausgewählter Proben
Die Abbildung zeigt, dass der Nachweis von miRNA 122 in allen vorliegenden FFPE-Geweben gelingt. Im
vorliegenden Versuch werden für den Nachweis der miRNA in gesundem Lebergewebe mehr Amplifikationszyklen benötigt als für den Nachweis in HCC, den Hepatomazellen sowie in dem dysplastischen Knoten. Das
bedeutet, dass sich hier in normalem Lebergewebe weniger miRNA 122 nachweisen ließ (s. a. 4.2.1, Abbildung 14) als in pathologisch verändertem Gewebe.
4.2.2 Etablierung von miRNA 122
Nachdem bereits gezeigt werden konnte, dass sich miRNA 122 effizient im FFPE-Material nachweisen ließ, wurde in einem nächsten Schritt die Qualität des Nachweises überprüft. Hierzu wurden
Schmelzkurven angefertigt, welche zeigten, ob nur ein Amplifikat entstanden war oder ob Ungenauigkeiten in der Amplifikation vorhanden waren. Da das FFPE-Untersuchungsmaterial des HBV-und
HCV-Kollektives große Unterschiede aufwies und von einigen makrodissezierten Proben sowie einigen Biopsien nur wenige Hundert Zellen zur RNA-Isolierung vorlagen, während andere Proben
sehr viel Material beinhalteten, wurden die Schmelzkurven an unterschiedlichen cDNAEinsatzmengen getestet (Abbildung 16). Im Vergleich zu den Nachweisen an FFPE-Materialien
werden zusätzlich noch längere Amplifikate durch einen zweiten Peak bei höherer Schmelztemperatur dargestellt. Abbildung 16 C und D zeigen die Standardkurven bzw. -geraden. Aus D lässt sich
entnehmen, dass der PCR-Lauf mit optimaler Effizienz abgelaufen ist. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass FFPE-Material für die Nachweise von miRNA geeignet ist.
A
42
Hep G2
SK Hep 1
POP 10
B
C
D
43
Abb. 16: Verhalten der miRNA 122
Dargestellt ist in A das Amplifikationsverhalten der jeweiligen Proben; A wurde in 4.2.1 bereits kurz erläutert.
Auffällig ist der zweigeteilte Kurvenverlauf. In B sind die Schmelzkurven der einzelnen Proben gezeigt. Auffallend ist das abweichende Verhalten der miRNA-Nachweise von RNA-Extrakten aus nativen Hepatomazellen.
4.2.3 Aufbau von miRNA-Analysen
Entsprechend der Qualitätskontrolle des miRNA-Nachweises von miRNA 122 wurden die Nachweise für miRNA 145, 198, 370, 140, 21, 29c sowie 299 5p auf Sensitivität und Spezifität geprüft. In
Abbildung 17 sind exemplarisch die Amplifikationsverläufe von miRNA 140 (A.1 u. A.2) und 21 (B.1
u. B.2) dargestellt.
A.1
A.2
44
B.1
B.2
Abb. 17 zeigt exemplarisch für miRNA 140 (A) sowie 21 (B) jeweils in A.1 und B.1 die Standard- sowie in A.2
und B.2 die zu den jeweiligen miRNAs gehörenden Schmelzkurven. Es lässt sich zeigen, dass sich die miRNAs in den verschiedenen Proben des Kollektivs nachweisen ließen, allerdings in unterschiedlichen Mengen.
45
A
B
Abb. 18 zeigt in A den Amplifikationsverlauf der Real Time-PCR der Proben des HBV-Kollektivs für
miRNA 21. B zeigt die entsprechende Abbildung für miRNA 299 5p.
4.3
micro-RNA-Profile im HBV-HCC-Kollektiv
4.3.1 micro-RNA 122
Aus der folgenden Abbildung (Abbildung 19 B) lässt sich die Menge an miRNA 122 (in Nanogramm)
entnehmen, die in den einzelnen Proben der untersuchten Gewebsarten, also normaler Leber, zirrhotischer Leber, dysplastischen Knoten sowie hepatozellulären Karzinomen enthalten war.
46
Im Rahmen der ersten Auswertung (Abbildung 19 A) wurde das Kollektiv unterteilt in normales Gewebe, Hepatoma-Zelllinien, zirrhotisches Gewebe, dysplastische Knoten und hepatozelluläre Karzinome Grad 1 und 2. In Abbildung 19 B wurden die HCC zusammengefasst.
Es wird deutlich, dass die durchschnittliche Menge an miRNA 122 in den HCC im Vergleich zu normalem Lebergewebe erhöht ist. Auffällig ist jedoch die breite Streuung der Werte; insbesondere der
Werte, die auf die normalen Proben entfallen.
A
B
Abb. 19: micro-RNA-Expression im HBV-Kollektiv am Beispiel der micro-RNA 122. Skalierung der Ordinate in
Nanogramm.
Es lässt sich in den HCC-Proben eine im Vergleich zu den normalen Proben erhöhte miRNA-Menge nachweisen. Auffällig ist, dass sich auch in den zirrhotischen Lebern eine Erhöhung der miRNA-Menge detektieren,
sich in den dysplastischen Knoten jedoch weniger miRNA 122 als in den normalen Lebern nachweisen lässt.
4.3.2 andere micro-RNA-Profile
Nachdem miRNA 122 erfolgreich nachgewiesen werden konnte, wurden für die im HBV-Kollektiv
untersuchten miRNAs weitere etablierte Nachweise durchgeführt (Abbildung 20).
47
A
B
C
D
E
F
48
G
H
I
J
K
L
Abb. 20: Expression der weiteren im HBV-Kollektiv untersuchten micro-RNAs in den einzelnen Gewebsarten.
Skalierung der Ordinate in Nanogramm.
A und B: miRNA 145, C und D: miRNA 198, E und F: miRNA 299 5p, G und H: miRNA 29 c; I und J: miRNA
21, K und L: miRNA 370.
49
In B, D, F, H, J und L sind Low-und High Grade dysplastische Knoten zum einen sowie alle HCC verschiedener Differenzierungsgrade zum anderen zusammengefasst
Die Abbildungen A und B in Abbildung 20 zeigen, dass die Menge an miRNA 145 in normalem Gewebe im Vergleich zum HCC erhöht ist. Es ist ersichtlich, dass die Werte der Proben, die zirrhotisches Gewebe enthielten, deutlich streuen.
In C und D ist dargestellt, wieviel miRNA 198 in den verschiedenen Geweben detektiert werden
konnte. Auch hier ist der Gehalt an miRNA in den HCC-Proben im Vergleich zu den normalen Proben verringert. Hier betrifft die Streuung der Werte-ebenso wie bei der miRNA 122-die Proben der
normalen Lebern.
E und F zeigen die Menge an nachgewiesener miRNA 299 5p in den jeweiligen Proben. Trotz der
Streuung der Werte lässt sich eine deutliche Verringerung der nachgewiesenen miRNA ausgehend
von den normalen Proben über Zirrhosen und dysplastischen Knoten zu den HCCs erkennen.
Einen ähnlichen Trend erkennt man im Verhalten der miRNA 29c (G und H), trotz der Tatsache,
dass hier die Werte der zirrhotischen Proben stark streuen. Keine eindeutige Aussage erlaubt die
Analyse von miRNA 21 (I und J): es lässt sich keine klare Tendenz der Werte erkennen. Die zirrhotischen Proben zeigen eine erhöhte Menge an nachgewiesener miRNA, dagegen lässt sich verglichen mit diesen Proben in den dysplastischen Knoten eine geringere Menge an miRNA nachweisen. In den HCC-Proben wiederum ist die nachgewiesene Menge an miRNA 21 höher als in den
HGDN. Insgesamt ergibt sich dadurch ein diffuses Bild. K und L zeigen den Nachweis der miRNA
370: es lässt sich sowohl in den dysplastischen Knoten als auch in den HCC eine geringere Menge
der miRNA als im normalen Gewebe nachweisen.
Zusammenfassend zeigen die Daten, dass sich die untersuchten miRNAs des HBV-Kollektivs (mit
Ausnahme der miRNA 122 sowie der miRNA 21, bei der sich kein eindeutiges Expressionsmuster
nachweisen ließ) in den dysplastischen Knoten und in den hepatozellulären Karzinomen in geringerer Menge als im normalen Lebergewebe detektieren ließen, jedoch wurde in keinem der Nachweise Signifikanz erreicht.
4.4
micro-RNA-Profile im HCV-HCC-Kollektiv
In einem weiteren Ansatz wurden die miRNA 299 5p, 21 sowie 370 am HCV-Kollektiv analysiert.
Da die miRNA 122 bereits in der Arbeit von Varnholt et al. analysiert wurde, wird im vorliegenden
Ergebnisteil nicht erneut darauf eingegangen.
50
4.4.1 Auswertung des HCV-Kollektivs
Die folgende Abbildung 21 zeigt in A bis F die in den Proben des HCV-Kollektives nachgewiesene
Menge an miRNA 299 5p, miRNA 370 sowie miRNA 21 in Abhängigkeit von der histologischen Diagnose.
A
B
C
D
E
F
51
Abb. 21: miRNA-Expression der miRNA 299 5p (A, B), der miRNA 370 (C, D) sowie der miRNA 21 (E, F) im
HCV-positiven HCC-Kollektiv. In B, D und F sind Low-und High Grade dysplastische Knoten zum einen sowie
alle HCC verschiedener Differenzierungsgrade zum anderen zusammengefasst.
In A und B der Abbildung 21 ist das Verhalten von miRNA 299 5p gezeigt. Hier fällt auf, dass sich
entgegen des Trends (sowohl in den Zirrhosen als auch in den dysplastischen Knoten lassen sich
deutlich erhöhte Mengen der miRNA nachweisen) in den HCC-Proben eine im Vergleich zu den
normalen Proben lediglich sehr gering erhöhte Menge an miRNA findet.
Ähnlich verhält sich miRNA 370 (C und D). Auch hier zeichnen sich die zirrhotischen Proben und
die dysplastischen Knoten durch eine im Vergleich zu den HCC deutlich erhöhte Menge an miRNA
aus; in den HCCs dagegen findet sich eine im Vergleich dazu verringerte Menge und im Vergleich
mit den normalen Proben ebenfalls eine leicht verringerte Menge an miRNA. Aufgrund des Trends
wäre eine erhöhte Menge zu erwarten gewesen.
Die miRNA 21 (E und F) zeigt einen bedeutenden Unterschied bezüglich der nachgewiesenen
Menge in normalem Lebergewebe im Vergleich zu den Proben, bei denen ein HCC vorlag (s. Tabelle 5); die Menge an miRNA ist in den HCC-Proben signifikant erhöht. Tabelle 5 zeigt die Signifikanztestung zwischen den einzelnen Gruppen von Geweben.
Tab. 5: Signifikanztestung der miRNA 21 im HCV-Kollektiv
Mehrfachvergleiche
miR21
Dunnett-T3
(I)
Differenz
ierung2
(J)
Differenz
ierung2
normal
Zirrhose
Standardfehler
Signifikanz
Untergrenze
Obergrenze
-6343,705
1871,340
,085
-13693,46
1006,05
-45166,753
36875,788
,768
-180293,73
89960,23
*
-7392,240
1808,156
,001
-12371,31
-2413,17
6343,705
1871,340
,085
-1006,05
13693,46
-38823,048
36923,240
,856
-173885,52
96239,42
HCC
-1048,535
2602,180
,999
-8723,16
6626,09
normal
45166,753
36875,788
,768
-89960,23
180293,73
Zirrhose
38823,048
36923,240
,856
-96239,42
173885,52
HCC
37774,513
36920,092
,869
-97291,89
172840,91
normal
7392,240*
1808,156
,001
2413,17
12371,31
Zirrhose
1048,535
2602,180
,999
-6626,09
8723,16
-37774,513
36920,092
,869
-172840,91
97291,89
DN
HCC
Zirrhose
normal
DN
DN
HCC
95%-Konfidenzintervall
Mittlere
Differenz (I-J)
DN
*. Die Differenz der Mittelwerte ist auf dem Niveau 0.05 signifikant.
52
5.
Diskussion
In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression ausgewählter miRNA-Spezies in verschiedenen
Stufen der Hepatokarzinogenese im Vergleich zu normalen Lebergeweben sowie tumorfreien, aber
zirrhotischen Gewebsarealen untersucht. Für diese Studien wurde ein HBV-positives Probenkollektiv aus dysplastischen Knoten und hepatozellulären Karzinomen mit unterschiedlichen Differenzierungsgraden zusammengestellt. Das HCV-positive Kollektiv, das in einem zweiten Schritt für die
Studien herangezogen wurde, existierte bereits.
Die innerhalb des HBV-Kollektivs untersuchten miRNAs waren-mit Ausnahme der miRNA 122-in
den Karzinomproben im Vergleich zum gesunden Gewebe geringer vertreten. Innerhalb der maligne veränderten Proben des HCV-Kollektivs zeigte miRNA 370 eine verminderte Expression, miRNA
21 und 299 5p dagegen wurden in den hepatozellulären Gewebeproben im Vergleich zu den gesunden Proben verstärkt exprimiert.
5.1
Der micro-RNA-Nachweis an einem FFPE-Gewebekollektiv hepatozellulärer
Karzinome
In der hier vorgelegten Studie zu miRNA-Profilen in hepatozellulären Karzinomen wurde auf FFPEMaterial zurückgegriffen. Im Vergleich zu RNA-Extrakten aus nativen Hepatomazellen wurde festgestellt, dass Gesamt-RNA-Extrakte aus FFPE-Geweben sich durchaus für miRNA-Analysen eignen (s. Abbildung 13 in 4.2.1). Die Formalinfixierung bietet viele Vorteile im Prozedere der pathologischen Routinediagnostik, wie etwa, dass die Morphologie sehr lange gut erhalten bleibt und die
Proben über viele Jahre aufbewahrt werden können [39]. Nachteil der Formalinfixierung ist jedoch,
dass sie zu Fragmentierung von Nukleinsäuren und zum Verlust an Sensitivität von DNA- und RNANachweisen [73] führen kann. Ähnlich wie in der hier vorgelegten Studie wurde ebenfalls von Ribeiro-Silva et al. [73] und in anderen Arbeiten der jüngsten Vergangenheit erfolgreich miRNA aus
FFPE-Gewebe isoliert. Zhang et al. zeigten, dass hinsichtlich der Extraktion und Hybridisierung von
miRNA aus gefrorenem Material im Vergleich zu FFPE-Gewebe Erfolg mit beiden Methoden erreicht werden konnte [102]. Hui et al. wiesen miRNA in maligne verändertem, formalinfixierten
Brustdrüsengewebe nach [40], ebenso wie Hasemeier et al. [36]. Siebolts et al. wiesen in 86 FFPEProben im Vergleich zu gefrorenem Gewebe von Knochenmark, Leber-, Brust-, Kolon- und lymphatischen Gewebe erfolgreich miRNA nach und zeigten, dass die Formalinfixierung nicht zu einem
Qualitätsverlust führt [80].
Um sicher zu stellen, dass nur reiner Tumor- bzw. reiner Nichttumoranteil des FFPE-Gewebes in
die Studie einging, wurde eine Makrodissektion durchgeführt. Dass diese möglichst exakt durchgeführt wird ist ein ganz wesentlicher Aspekt für die Ergebnisse der in-vitro Testung von miRNA. Fließen bei einigen Proben-aufgrund unterschiedlich hoher Kontamination des peritumoralen Gewebes-
53
miRNA-Spezies des Nicht-Tumors ein, so verfälscht dies das Ergebnis bezüglich des miRNA-Profils
des Tumors.
Nachdem miRNAs als mögliche Marker für den Tumor durch die hier verwendete Methodik GesamtRNA-Extraktion, Reverse Transkription und Quantifizierung durch Real Time-PCR identifiziert wurden, könnte man den Umstand der Makrodissektion umgehen, indem man diese miRNA-Marker
durch in situ-Hybridisierung darstellt [21, 90]. Diese Methode hat jedoch den Nachteil, dass miRNAs
damit zwar lokalisiert, nicht aber quantifiziert werden können. Um eine Quantifizierung zu ermöglichen wurde in der vorliegenden Arbeit eine Real Time-PCR durchgeführt und die miRNA aus definierten, makrodissezierten Tumor-Arealen im Vergleich zu tumorfreien Arealen untersucht. De Bruin
et al. griffen ebenfalls auf dieses Verfahren zurück. Die Autoren verglichen in ihrer Arbeit Möglichkeit und Verlässlichkeit der RNA-Detektion nach Makrodissektion und laserassoziierter Mikrodissektion. Das Verfahren der Makrodissektion erwies sich dabei als ebenso verlässlich wie das der
Mikrodissektion [19].
Ein Aspekt, der bei der Auswertung der Ergebnisse zu den Expressionsspiegeln der einzelnen microRNAs mit einbezogen werden sollte, ist die relativ geringe Kollektivgröße des HBV-Kollektivs.
Für die Zusammenstellung des HBV-positiven Kollektivs konnten nach den angewandten Kriterien
lediglich zehn HBV-positive hepatozelluläre Karzinome und zwei Gewebeproben mit Dysplasien
rekrutiert werden. Anzumerken ist jedoch, dass auch in früheren Studien zur miRNA-Expression
häufig ebenfalls nur begrenzt Untersuchungsmaterial zur Verfügung stand [31, 47, 87]. Dies gründet
vor allem darauf, dass in den ersten Studien zur miRNA-Analyse natives Gewebe eingesetzt wurde.
Native klinische Proben stehen aber natürlich nur sehr begrenzt zur Verfügung, auch wenn aktuelle
Bestrebungen in klinischen-vor allem onkologischen Zentren-vorhanden sind, Kryogewebe in so
genannten zentralen Biobanken bzw. zentralen Gewebebanken zu sammeln.
In primären Studien zu miRNA-Profilen in HCC wurden aufgrund der mangelnden Nativproben dann
häufig Hepatoma-Zelllinien hinzugezogen, um erste Aussagen über das Auftreten von miRNA nach
Hepatozyten-Transformation machen zu können [4].
5.2
Expression verschiedener micro-RNAs in hepatozellulären Karzinomen nach
chronischer Hepatitis B- und Hepatitis C-Infektion
5.2.1 Nachweis der leberspezifischen micro-RNA 122
miRNA 122 wird vor allem in der Leber exprimiert und ist hier die am höchsten exprimierte miRNA
[28]. miRNA 122 kommt damit hier hinsichtlich der Beeinflussung intrazellulärer Prozesse eine entscheidende Rolle zu.
54
Die Real Time-PCR zeigte, dass sich in den HCC-Proben des HBV-Kollektivs insgesamt mehr
miRNA 122 detektieren ließ als in normalem Lebergewebe. In den Zelllinien, die zum Vergleich hinzugezogen wurden, war der Gehalt an miRNA 122 allerdings geringer als in den normalen Lebern.
Damit ist das Ergebnis zumindest in Bezug auf die HCC-Proben nicht übereinstimmend mit den
Ergebnissen von Gramantieri et al: hier wurden 17 HCC und 21 zirrhotische Lebern mittels Real
Time-PCR in Hinblick auf die Expression von miRNA 122 untersucht. Die Expression von miRNA
122 war in 70 % der HCC-Proben signifikant geringer als in den normalen Proben. Der Gehalt an
miRNA 122 in den Proben der Zelllinien war jedoch ebenfalls, entsprechend den vorliegenden Ergebnissen, im Vergleich zum gesunden Lebergewebe verringert [31].
Wichtig ist anzumerken, dass in der Arbeit von Gramantieri et al. jedoch kein reines HBV-Kollektiv
vorlag-von den insgesamt 60 HCCs waren lediglich fünf ätiologisch auf eine chronische HBVInfektion zurückzuführen.
Kutay et al. zeigten in HCC-Gewebe männlicher Fischer-Ratten ebenfalls eine im Vergleich zu normalem Gewebe verminderte miRNA 122-Expression. Auch hier bestanden Unterschiede hinsichtlich der Ätiologie: die Ratten hatten eine folsäure-, methionin- und cholinarme Diät bekommen, um
die Tumorgenese zu beeinflussen [47].
Die Arbeit von Varnholt et al. dagegen zeigt der vorliegenden Arbeit entsprechende Ergebnisse:
hier wurden 43 HCC-Proben sowie 16 Proben zirrhotischer Lebern untersucht. Alle Proben waren
HCV-positiv. Der Gehalt an miRNA 122 war in den HCC-Proben im Vergleich zu den normalen Proben signifikant erhöht; in den zirrhotischen Proben ließ sich ebenfalls ein höherer Gehalt an miRNA
nachweisen als in gesundem Gewebe [87]. Insofern entsprechen sich die Ergebnisse dieser Arbeit
und der vorliegenden Arbeit. Allerdings gibt es auch zwischen diesen beiden Arbeiten Unterschiede
hinsichtlich der Ätiologie, da hier jeweils ein reines HCV-bzw. HBV-HCC-Kollektiv miteinander verglichen wurde. Zu beachten ist weiterhin, dass bei beiden Kollektiven das gleiche Normal-Kollektiv
benutzt wurde. In der Laborgruppe Odenthal wurde an zwei unabhängigen Kollektiven von jeweils
etwa 100 Proben mit unterschiedlichen Entzündungsgraden und unterschiedlichen Fibrosestadien
gezeigt, dass miRNA 122 nach Leberparenchymschädigung herunterreguliert wird. Daher könnten
die zur Literatur konträren Daten an dem hier gewählten und auch von Varnholt et al. herangezogenen Vergleichskollektiv herrühren.
5.2.2 micro-RNA 198 und 145 in chronisch geschädigter Leber von Hepatitis BPatienten
Ebenso wie miRNA 370 ist die miRNA 198 bislang noch wenig untersucht, so gibt es nur vereinzelte
Aussagen über die Expression von miRNA 370 bzw. miRNA 198 in der Leber. Zum gegenwärtigen
Zeitpunkt existieren lediglich drei Studien an soliden Tumoren, innerhalb derer die Expression von
miRNA 198 untersucht wurde [87, 97, 103].
55
Zhao et al. zeigten in Probenmaterial von Retinoblastomen eine erhöhte Expression von miRNA
198 [103]. Wong et al. wiesen in Gewebeproben, die aus Karzinomen der Zunge gewonnen wurden, ebenfalls eine erhöhte Menge der miRNA nach [97]. Problematisch bei dieser Arbeit ist allerdings, dass das Kollektiv sehr klein war; die Autoren untersuchten lediglich vier Karzinom-Proben.
In der dritten Arbeit [87] wurden entsprechend der vorliegenden Arbeit hepatozelluläre Karzinome
im Vergleich zu gesundem Gewebe hinsichtlich der Expression von miRNA 198 untersucht. Anders
als in der vorliegenden Arbeit bestand initial jedoch keine chronische HBV- sondern eine HCVInfektion. Die Ergebnisse zeigen hinsichtlich der Expression von miRNA 198 in gesunden Lebergewebe verglichen mit Probenmaterial aus hepatozellulären Karzinomen einen relevanten Unterschied: im pathologisch veränderten Material ist die Menge an miRNA 198 signifikant verringert.
Damit entspricht diese Arbeit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit: auch hier wurde in den
HCC-Proben eine verringerte Expression von miRNA 198 im Vergleich zu gesundem Gewebe gezeigt (s.a. Abbildung 20 C, D in 4.3.2).
Ätiologisch grenzen sich die beiden Arbeiten deutlich von den Arbeiten von Wong et al. und Zhao et
al. ab, da bei diesen beiden Arbeiten die Karzinogenese nicht auf eine chronische Virusinfektion,
sondern auf exogene Noxen [97] bzw. eine Mutation im Retinoblastom-Gen zurückzuführen ist
[103]. Auf die Bedeutung dieses ätiologischen Unterschiedes wird in Kapitel 5.3 näher eingegangen.
Die vorliegenden Ergebnisse bezüglich der Expression der miRNA 145 zeigten eine in den HCCProben im Vergleich zu den normalen Lebern verminderte Expression (s. 4.3.2, Abbildung 20 A, B).
Auch das zirrhotische Gewebe wies eine geringere Menge an miRNA 145 auf als gesundes Lebergewebe. Diese Ergebnisse entsprechen den Ergebnissen von Varnholt et al.: auch hier konnte innerhalb des HCV-HCC-Kollektivs eine kontinuierliche Reduktion der Menge der miRNA 145 von
normaler Leber über zirrhotisches Gewebe bis zum HCC nachgewiesen werden.
Darüber hinaus wiesen Michael et al., die den ersten Artikel über dysregulierte miRNA in soliden
Tumoren publizierten, eine Reduktion von miRNA 145 (sowie miRNA 143) in colorektalen Adenokarzinomen im Vergleich zu gesundem Gewebe nach [62].
Iorio et al. zeigten zwei Jahre später, dass die Menge an miRNA 145 in Mamma-Karzinomen ebenfalls verringert ist [41] sowie in einer weiteren Studie, dass sich miRNA 145 auch bei OvarialKarzinomen entsprechend verhält [42].
Der Nachweis der Reduktion von miRNA 145 in mehreren Tumoren verschiedener Entitäten lässt
am ehesten darauf rückschließen, dass miRNA 145 normalerweise als Tumorsuppressor agieren
könnte-und dementsprechend in Tumoren vermindert exprimiert wird.
Es bleibt abzuwarten, ob weitere Arbeiten entsprechende Ergebnisse zeigen werden.
56
5.2.3 micro-RNA 29c nach chronischer Hepatitis B-Infektion
Ebenso wie bei miRNA 198 existieren bezüglich der Expression von miRNA 29c in Tumoren bislang
nur wenige Studien. Die Ergebnisse sind widersprüchlich: in der Arbeit von Chang et al. wurde in
Plattenepithelkarzinomen eine erhöhte Expression von miRNA 29 c gezeigt [12]. Sengupta et al.
dagegen zeigten in ihrer Studie an Proben von Nasopharynxkarzinomen eine verminderte Expression von miRNA 29c [78].
Dies entspricht dem Ergebnis der vorliegenden Arbeit: in den HCC-Proben des HBV-Kollektivs
konnte eine im Vergleich zu den normalen Proben verringerte Expression von miRNA 29c nachgewiesen werden.
Bemerkenswert ist, dass in diesen-sich in den Ergebnissen entsprechenden-Arbeiten eine (chronische) Virusinfektion als Ursache für die Entstehung eines Karzinoms zu Grunde liegt: Sengupta et
al. wiesen bei allen in ihrer Studie untersuchten Karzinomen eine Epstein-Barr-Virus (EBV)-Infektion
nach [77, 78]. So könnte also auch hier die virale miRNA entscheidend zu der gezeigten miRNAExpression im Gewebe und damit zu der Karzinogenese beigetragen haben. Auf diesen Aspekt soll
im folgenden Abschnitt der Diskussion noch einmal explizit eingegangen werden.
5.3
Interaktion zwischen zellulärer und viraler micro-RNA-Expression
In mehreren Arbeiten konnte inzwischen nachgewiesen werden, dass auch Viren in der Lage sind,
miRNA zu exprimieren [22, 27, 65].
Das Epstein-Barr-Virus ist das Virus, an dem zum ersten Mal die Existenz viraler miRNA nachgewiesen werden konnte [70]. Bis heute sind 141 virale miRNAs identifiziert worden [27], darunter
befinden sich als miRNA-exprimierende Viren unter anderem das Humane Immundefizienz-Virus,
das Herpes-simplex-Virus und das Cytomegalievirus. Viren, die eigene miRNA synthetisieren, besitzen hinsichtlich der Gefahr, durch den Organismus eliminiert zu werden, einen entscheidenden
Vorteil: sie sind in der Lage, sich über die durch ihre miRNA beeinflussten Signalwege vor der antiviralen Abwehr der Wirtszelle zu schützen-beispielsweise durch Unterdrückung einer adäquaten
Antwort der Wirtszelle auf eine Interferon-Gabe [27]-und die Genexpression in der Zelle zu ihrem
Vorteil zu nutzen [27]. Noch allerdings sind nicht alle Wege, auf denen die Viren über ihre miRNA in
Prozesse innerhalb der Wirtszelle eingreifen können, bekannt. Die weitere Identifizierung scheint
auch hinsichtlich therapeutischer Strategien von enormer Relevanz zu sein.
Jin et al. gelang es, die Fähigkeit zur miRNA-Synthese auch bei dem Hepatitis B-Virus nachzuweisen [45]. Diese Fähigkeit scheint in bedeutsamen Maße an der Beantwortung der Frage, weshalb
die chronische HBV-Infektion der wichtigste Risikofaktor für die Entstehung eines hepatozellulären
Karzinoms ist, beteiligt zu sein-denn über seine virale miRNA vermag das Virus direkt Einfluss auf
die hepatozelluläre miRNA zu nehmen und entsprechende Signalwege anders zu beeinflussen als
zum Beispiel Noxen.
57
Auch wenn nicht davon ausgegangen werden kann, dass virale miRNA unterschiedlicher Viren zelluläre miRNA gleichsinnig beeinflusst (wie sich ja in der vorliegenden Arbeit an dem zum Teil differierenden Verhalten gleicher miRNA in den beiden verschiedenen Kollektiven zeigen lässt), könnte
in dem Einfluss viraler miRNA möglicherweise der Unterschied hinsichtlich der unterschiedlichen
Expression von miRNAs in Karzinomen unterschiedlicher Ätiologie begründet sein.
5.4
micro-RNA 370 in hepatozellulären Karzinomen nach chronischer Hepatitis Bund Hepatitis C-Infektion
Wie bereits oben erwähnt liegen über die miRNA 370 bisher nur wenige Studien vor [21, 61]. Da
entsprechend bisher kaum Referenzliteratur existiert, ist die Rolle dieser miRNA noch nicht vollständig geklärt.
In der vorliegenden Arbeit zeigten sowohl die HCC-Proben des HCV- als auch des HBV-Kollektivs
einen geringeren Gehalt an miRNA 370 als die normalen Proben. Meng et al. zeigten in ihrer Arbeit
von 2008 eine Verringerung der Menge an miRNA 370 in Gallengangskarzinomen in Abhängigkeit
von einer erhöhten Menge an Interleukin 6 (IL 6) in den jeweiligen Proben [61]. IL 6 ist ein Zytokin,
dessen erhöhte Expression eine wichtige Rolle bei der Karzinogenese zu spielen scheint [2, 95],
interessanterweise insbesondere bei HCC [2]. Die in der vorliegenden Arbeit gezeigten Ergebnisse
unterstützen die gegenwärtige Annahme, dass es durch den chronischen Entzündungsprozess innerhalb der Hepatozyten über eine erhöhte Expression von IL 6 zur Verringerung der miRNA (hier
bzw. in der Referenzliteratur zur miRNA 370) kommt. Insofern würde diese Arbeit die hier gezeigten
Ergebnisse hinsichtlich der HCC-Proben bestätigen.
5.5
micro-RNA 299 5p in hepatozellulären Karzinomen nach chronischer Hepatitis
B-und Hepatitis C-Infektion
miRNA 299 5p ist die in der vorliegenden Arbeit untersuchte miRNA, über die bislang die wenigsten
Referenzen vorliegen. Bisher existiert lediglich eine Studie bezüglich des Verhaltens von miRNA
299 5p in soliden Tumoren [87].
In der vorliegenden Arbeit zeigte die miRNA 299 5p in den HCC-Proben des HBV-und des HCVKollektivs unterschiedliche Expressionsmuster: In den HCC-Proben des HBV-Kollektivs fand sich
eine im Vergleich zum gesunden Lebergewebe verringerte miRNA-Menge. Ebenso fand sich in den
zirrhotischen Lebern eine verringerte Menge an miRNA 299 5p. In den HCC-Proben des HCVKollektivs dagegen ließ sich eine im Vergleich zu den normalen Proben leicht erhöhte Menge an
miRNA 299 5p nachweisen. Auch in den zirrhotischen Proben des HCV-Kollektivs zeigte sich im
Vergleich zu den normalen Lebern eine erhöhte Menge an miRNA.
58
Als bislang einzige als Referenz, in der die Expression von miRNA 299 5p in soliden Tumoren untersucht wurde, ist hier die Arbeit von Varnholt et al. heranzuziehen [87]. Hier ließ sich in den HCCProben eine verringerte Menge an miRNA 299 5p nachweisen.
Weiterhin ist die Arbeit von Padgett et al. zu erwähnen: in ihrer Arbeit wurde das Verhalten mehrerer miRNAs, so auch der miRNA 299 5p, an Leberproben von Patienten mit primärer biliärer Zirrhose untersucht. Als Referenzmaterial diente gesundes Lebergewebe. Das Ergebnis der Arbeit entsprach insofern den vorliegenden Ergebnissen bezüglich des HCV-Kollektivs, dass sich in den zirrhotischen Proben eine erhöhte Menge an miRNA 299 5p nachweisen ließ [68].
Die bisher verfügbaren Ergebnisse sind also widersprüchlich und ermöglichen bislang keine eindeutige Zuordnung einer bestimmten Funktion zu der miRNA 299 5p. Ausgehend von den Ergebnissen
von Padgett et al. und den Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bezüglich des HCV-Kollektivs müsste man bislang am ehesten davon ausgehen, dass miRNA 299 5p die Rolle eines Onkogens besitzt.
Auch wenn Padgett et al. lediglich Zirrhosen und keine Tumoren untersucht haben, lässt sich eine
Leberzirrhose doch als entscheidende Vorstufe eines Karzinoms definieren. Somit erscheint das
Ergebnis der vorliegenden Arbeit im Vergleich dazu plausibel.
Fokussiert man dagegen auf die Ergebnisse des HBV-Kollektives in der vorliegenden Arbeit sowie
auf die Ergebnisse von Varnholt et al., müsste man der miRNA 299 5p eine Rolle als Tumorsuppressor zusprechen. Hinzu kommt der Umstand, dass die Reduktion der miRNA 299 5p im
HBV-Kollektiv deutlicher nachweisbar war als die Erhöhung der Menge in den HCC-Proben des
HCV-Kollektivs. Zusammenfassend muss man daher eher davon ausgehen, dass miRNA 299 5p
als Tumorsuppressor wirkt.
Fraglich bleibt weiterhin, inwiefern die Ätiologie der HCC Einfluss auf die unterschiedliche miRNAExpression Einfluss nimmt. Wie bereits in 5.3 angeführt ist es durchaus möglich, dass HBV und
HCV über ihre virale miRNA die zelluläre miRNA der Hepatozyten unterschiedlich beeinflussen und
dies in Abhängigkeit von der Ätiologie des hepatozellulären Karzinoms zu unterschiedlichen Expressionsmustern der zellulären miRNA führt.
5.6
miRNA 21 als Tumormarker in der hepatozellulären Karzinogenese
Die miRNA 21 ist bereits Gegenstand mehrerer Studien geworden [11, 60, 91]. In der vorliegenden
Arbeit zeigt miRNA 21 im HBV-Kollektiv ein zu den Ergebnissen des HCV-Kollektivs sowie dem
gegenwärtigen Stand der Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen kontrastierendes Verhalten: die Menge ist in den HCC-Proben im Vergleich zu den normalen Proben verringert. Allerdings ist bei dieser
Analyse einzuwenden, dass sich insgesamt ein diffuses Bild zeigt (s. Abbildung 20 I, J in Kapitel
4.3.2). Die Aussagen bezüglich des miRNA-Gehaltes in den untersuchten Gewebearten erscheinen
widersprüchlich, da der Gehalt an miRNA 21 in den zirrhotischen Proben im Vergleich zum norma-
59
len Gewebe erhöht ist, dagegen in den Proben, die von den dysplastischen Knoten stammen, erniedrigt ist, um dann bei den HCC-Proben erneut anzusteigen.
Im HCV-Kollektiv dagegen ist die Menge an miRNA 21 in den Karzinom-Proben im Vergleich zu
den normalen Proben signifikant erhöht (p= 0,001; s. Tabelle 5 in 4.4.1).
Dieses Verhalten entspricht den gegenwärtigen Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen, die bezüglich
miRNA 21 vorliegen. Volinia et al. zeigten 2006 in einer Studie an soliden Tumoren, dass der Gehalt an miRNA 21 in sechs verschiedenen Karzinomen deutlich erhöht war. Chan et al. zeigten entsprechendes Verhalten an Proben aus Glioblastomen sowie sechs entsprechenden Zelllinien [11,
91].
Meng et al. belegten ebenfalls eine Überexpression von miRNA 21 und identifizierten PTEN
(phosphatase and tensin homolog) als Zielstruktur der miRNA [60]. PTEN kann durch Induktion der
Apoptose als Tumorsuppressor dienen. miRNA 21 kann die Expression von PTEN beeinflussen und
somit Einfluss auf die durch PTEN vermittelten Signalwege nehmen. Die vorliegenden Ergebnisse
hinsichtlich des Verhaltens von miRNA 21 im HCV-Kollektiv, also die Überexpression in den HCCProben, erscheinen daher sehr plausibel.
Wie oben bereits angeführt ergeben sich aus den vorliegenden Ergebnissen sowie den entsprechenden Referenzen deutliche Hinweise auf die vielfältigen Funktionen von miRNAs. In Tabelle 6
sind zur Veranschaulichung die bereits im Text erläuterten Ergebnisse bezüglich der unterschiedlichen Expression der untersuchten miRNAs aufgelistet.
60
Tab. 6: Zusammenfassung der Ergebnisse der Expressionsanalysen
In unten stehender Tabelle ist das Expressionsmuster der in der vorliegenden Arbeit im HBV- bzw. HCVKollektiv untersuchten miRNA-Spezies noch einmal zusammenfassend aufgelistet (↓= miRNA ist herunterreguliert; ↑= miRNA ist hochreguliert; ?= kein eindeutiges Expressionsmuster erkennbar; N= im Vergleich zu
normalen Transplantatlebern, Z= im Vergleich zu zirrhotischem peritumoralen Gewebe). Die entsprechenden
Referenzen sind vermerkt.
miRNASpezies
eigene Daten
HBVHCVHCC
HCC
122 ↑
Referenzen
Referenzen
HCC
↑
anderer Läsionen
[87]
145 ↓
↓
↓
[31]
[87] ↓
[41, 42, 62]
198 ↓
↓
[87] ↑
[97, 103]
29c ↓
↑
[87] ↓
↑
[78]
[12]
↑
[87] ↓
[61]
↑ (N),↓ (Z) ↓
[87] ↑
[68]
↑
[11, 60, 91]
370 ↓
299 5p
↓
21 ?
↓
↑
Nach allen bisher vorliegenden Ergebnissen und den entsprechenden Referenzen lassen sich den
in der vorliegenden Arbeit analysierten zellulären microRNAs über ihre Expressionsmuster solche
essentiellen Funktionen wie die als Onkogene bzw. Tumorsuppressoren zuordnen. Auch wenn hier
die komplexen Interaktionen zwischen zellulärer und viraler miRNA nicht vollständig geklärt werden
konnten, so konnten doch die Interaktionen als mögliche entscheidende Prozesse für die Entstehung des hepatozellulären Karzinoms herausgestellt werden.
61
6.
Zusammenfassung
Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist weltweit eines der häufigsten Karzinome. Inzwischen sind
eine Reihe von ätiologisch wesentlichen Faktoren für die Entwicklung eines HCCs bekannt, unter
denen die chronische Hepatitis B-Virus (HBV)- und die Hepatitis C-Virus (HCV)-Infektion eine herausragende Bedeutung haben. Die hepatozelluläre Karzinogenese ist mit einer genetischen Dysregulation verbunden. Da miRNAs als kleine, ca. 22 basengroße RNA-Moleküle posttranskriptionell
die Genexpression entscheidend beeinflussen, stellt sich die Frage, inwieweit miRNAs an der genetischen Dysregulation während der Karzinogenese beteiligt sind.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, das Auftreten von miRNA in HBV- und HCV-positiven
HCC
zu
analysieren.
Die
Studie
wurde
an
formalin-fixierten
paraffingebetteten
(FFPE)Gewebekollektiven durchgeführt. Dafür wurden Proben aus der Tumorbank des Institutes für
Pathologie der Universität Köln herangezogen und nach histologischer Klassifizierung ein HBVpositives Untersuchungskollektiv aus zwei dysplastischen Knoten und zehn HCC zusammengestellt. Für die miRNA-Analysen an den HCV-positiven Geweben stand ein Kollektiv aus sieben
dysplastischen Knoten und dreiundvierzig HCC zur Verfügung [87]. Es wurden Mikrotomschnitte
angefertigt und nach Makrodissektion der Tumorläsionen die Gesamt-RNA isoliert.
Durch verschiedene Real Time-PCR-Techniken konnte die Zugänglichkeit der miRNA im FFPEBiopsiematerial erfolgreich nachgewiesen werden. Neben der leberspezifischen miRNA 122 wurden
die miRNA 145, miRNA 198, miRNA 299 5p, miRNA 29c, miRNA 21 sowie miRNA 370 für die Studie ausgewählt, da sie in ersten Sichtungsarbeiten der Laborgruppe als potentiell während der Hepatokarzinogenese dysregulierte miRNA identifiziert worden waren. Bevor das Auftreten der miRNA
in den Kollektiven untersucht wurde, wurden die Real-Time-PCR-Assays für die einzelnen miRNAs
etabliert.
Während die miRNA 122 verstärkt in HBV-positiven dysplastischen Knoten und HCC vertreten war,
war die Menge an miRNA 145, 198, miRNA 29c sowie miRNA 370 in diesen Proben verringert.
Aufgrund der geringen Fallzahl wurde keine Signifikanz erreicht. Die Menge an miRNA 299 5p war
ebenso wie die Menge an miRNA 370 sowohl in den HCC des HCV- wie auch des HBV-Kollektivs
im Vergleich zum zirrhotischen Peritumorgewebe erniedrigt. Bezüglich der miRNA 21 konnte im
kleinen HBV-Kollektiv keine eindeutige Aussage getroffen werden; im größeren HCV-Kollektiv konnte dagegen eine signifikant erhöhte Menge der miRNA 21 festgestellt werden. Die miRNA 21 gilt
auch in anderen Tumoren als hochregulierte onkogene miRNA, die die Expression von Tumorsuppressoren wie PTEN verringert.
Die dargelegten Ergebnisse zeigen die differentiellen miRNA-Profile in HBV- bzw. HCV-assoziierter
Hepatokarzinogenese auf und schaffen die grundlegenden Voraussetzungen, die Rolle der induzierten miRNAs als onkogene miRNAs sowie der reduzierten miRNAs als Tumorsuppressoren in
der viralen Hepatokarzinogenese detailliert zu untersuchen.
62
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69
8. ANHANG
8.1 ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abb. 1: Weltweite Inzidenz des hepatozellulären Karzinoms
S.
8
Abb. 2: Hepatitis B-Prävalenz weltweit
S.
10
Abb. 3: Serologische Marker der HBV-Infektion
S.
11
Abb. 4: Weltweite Prävalenz von Hepatitis C
S.
14
Abb. 5: Biosynthese der micro-RNA
S.
22
Abb. 6: Methoden der reversen Transkription
S.
29
Abb. 7: Beispiel einer 96 well Real Time-PCR-Platte
S.
31
Abb. 8: Polyadenylierung von miRNA/mRNA
S.
33
Abb. 9: Hämalaun-Eosin gefärbte Leberbiopsiepräparate mit zellulären Atypien S.
35
Abb.10: Probenverteilung im HBV-Kollektiv
S.
36
Abb.11: Zusammenstellung des HCV-Kollektivs
S.
36
S.
37
S.
38
S.
40
S.
41
Abb. 16: Verhalten der miRNA 122
S.
42
Abb. 17: Standard- und Schmelzkurve von micro-RNA 140 und micro-RNA 21
S.
44
Abb. 18: Amplifikationsverlauf der Real Time-PCR von micro-RNA 21 u.299 5p S.
46
Abb.12: Dysplastischer Knoten und hepatozelluläres Karzinom Grad 1-3
im HBV-positiven Kollektiv
Abb.13: Amplifikationsverläufe der Real Time-PCR der micro-RNA 140
in FFPE-Gewebe
Abb.14: Amplifikationsverläufe der Real Time-PCR micro-RNA 140 und 122
Abb.15: Amplifikationsverhalten der Real Time-PCR der miRNA 122
am Beispiel einiger ausgewählter Proben
Abb. 19: micro-RNA-Expression im HBV-Kollektiv
am Beispiel der micro-RNA 122
S.
47
S.
48
S.
51
Abb. 20: Expression der weiteren im HBV-Kollektiv untersuchten miRNAs
in den einzelnen Gewebsarten
Abb. 21: micro-RNA-Expression im HCV-Kollektiv
70
8.2 TABELLENVERZEICHNIS
Tab. 1: Risikofaktoren der Entstehung eines hepatozellulären Karzinoms
S.
15
Tab. 2: Übersicht der verschiedenen Typen des hepatozellulären Karzinoms
S.
17
Tab. 3: Klassifikation des hepatozellulären Karzinoms
S.
18
Tab. 4: Malignitätskriterien bei hepatozellulärem Karzinom
S.
27
Tab. 5: Signifikanztestung der micro-RNA 21 im HCV-Kollektiv
S.
52
Tab. 6: Zusammenfassung der Ergebnisse der Expressionsanalysen
S.
61
71
Mein Lebenslauf wird aus Gründen des Datenschutzes in der elektronischen Fassung meiner Arbeit nicht veröffentlicht.
72