Strukturanalyse der Methyltransferasen AviRa und AviRb aus
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Strukturanalyse der Methyltransferasen AviRa und AviRb aus Streptomyces viridochromogenes Tü 57 INAUGURALDISSERTATION zur Erlangung der Doktorwürde Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau vorgelegt von Diplom-Chemikerin Tanja G. Mosbacher Freiburg im Breisgau, November 2004 Tag der Bekanntgabe des Prüfungsergebnisses: 16.12.2004 Dekan: Prof. Dr. H. Hillebrecht Referent: Prof. Dr. G. E. Schulz Korreferent: Prof. Dr. T. Friedrich E hōnere korōria ki te atua He maunga ronga ki te whēnua He whakaro pai kinga tangata katua o te āo (Sprichwort der Maori) Wesentliche Teile dieser Arbeit wurden in folgenden Artikeln veröffentlicht: Mosbacher, T. G., Bechthold, A., Schulz, G. E. (2003). Crystal structure of the Avilamycin resistance-conferring methyltransferase AviRa from Streptomyces viridochromogenes. J. Mol. Biol. 329, 147-157. Mosbacher, T. G., Bechthold, A., Schulz, G. E. (2004). Structure and function of the antibiotic resistance-mediating methyltransferase AviRb from Streptomyces viridochromogenes. J. Mol. Biol. 345, 535-545. Koordinaten und Strukturfaktoren von AviRa und AviRb wurden in der Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/PDB/) unter folgenden Einträgen gespeichert: 1O9G Crystal structure of the rRNA methyltransferase AviRa (SeMet) from Streptomyces viridochromogenes at 1.5 Å resolution 1O9H Crystal structure of the rRNA methyltransferase AviRa (WT) from Streptomyces viridochromogenes at 2.4 Å resolution 1X7O Crystal structure of the SpoU methyltransferase AviRb from Streptomyces viridochromogenes 1X7P Crystal structure of the SpoU methyltransferase AviRb from Streptomyces viridochromogenes in complex with the cofactor AdoMet I Inhaltsverzeichnis 1 1.1 1.2 1.3 1.4 Einleitung .................................................................................................................. 1 Avilamycin aus Streptomyces viridochromogenes..................................................... 1 AdoMet-abhängige Methyltransferasen ..................................................................... 3 AviRa und AviRb aus Streptomyces viridochromogenes......................................... 10 Ziele der Arbeit......................................................................................................... 12 2 Materialien .............................................................................................................. 13 2.1 Geräte .......................................................................................................................13 2.2 Chemikalien, Enzyme und Kits ................................................................................ 14 2.3 Bakterienstämme und Vektoren ............................................................................... 16 2.4 Nährmedien, Lösungen und Puffer........................................................................... 16 2.4.1 Nährmedien ...................................................................................................... 16 2.4.2 DNA- und Proteinpräparation .......................................................................... 17 2.4.3 Proteincharakterisieruing.................................................................................. 19 2.4.4 Kristallisation ................................................................................................... 19 3 Methoden................................................................................................................. 21 3.1 Gentechnische Arbeitsmethoden .............................................................................. 21 3.1.1 Polymerasekettenreaktion................................................................................. 21 3.1.2 DNA-Spaltung mit Restriktionsendonucleasen................................................ 22 3.1.3 Agarose-Gelelektrophorese .............................................................................. 23 3.1.4 Ligation............................................................................................................. 23 3.1.5 Kompetente Zellen und Transformation........................................................... 24 3.1.6 Plasmidpräparation ........................................................................................... 24 3.1.7 DNA-Sequenzierung ........................................................................................ 25 3.2 Proteinpräparation .................................................................................................... 25 3.2.1 Bakterienkultivierung und Zellaufschluß ......................................................... 25 3.2.2 Proteinreinigung ............................................................................................... 27 3.3 Proteincharakterisierung........................................................................................... 32 3.3.1 Bestimmung der Proteinkonzentration ............................................................. 32 3.3.2 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese............................. 32 3.3.3 Elektroblotting und N-terminale Proteinsequenzierung ................................... 33 3.3.4 Molekularmassenbestimmung durch Massenspektrometrie............................. 33 3.3.5 Bestimmung der enzymatischen Aktivität........................................................ 34 3.3.6 Dynamische Lichtstreung ................................................................................. 35 3.4 Kristallisationsmethoden .......................................................................................... 36 3.4.1 Kristallisation von Proteinen ............................................................................ 36 3.4.2 Tränken von Kristallen ..................................................................................... 38 3.4.3 Kokristallisation mit Substrat ........................................................................... 38 3.4.4 Kristallmontage ................................................................................................ 39 II 3.5 Röntgenstrukturanalyse ............................................................................................ 41 3.5.1 Kristallgitter und Kristallsymmetrie................................................................. 41 3.5.2 Matthews-Parameter......................................................................................... 41 3.5.3 Theorie der Röntgenstreuung ........................................................................... 42 3.5.4 Reziproker Raum und Ewald-Konstruktion ..................................................... 45 3.5.5 Temperaturfaktoren .......................................................................................... 47 3.5.6 Kristallographische Datensammlung................................................................ 47 3.5.7 Prozessierung und Datenreduktion................................................................... 48 3.5.8 Phasierung durch multiplen isomorphen Ersatz (MIR).................................... 50 3.5.9 Phasierung durch multiple anomale Diffraktion (MAD) ................................. 53 3.5.10 Phasierung durch molekularen Ersatz (Molrep)............................................... 58 3.5.11 Bestimmung der nicht-kristallographischen Symmetrie .................................. 59 3.5.12 Dichtemodifikation........................................................................................... 60 3.5.13 Modellbau und Elektronendichtekarten............................................................ 62 3.5.14 Verfeinerung von Proteinstrukturen ................................................................. 63 3.6 Proteinstrukturen ...................................................................................................... 67 3.6.1 Proteinstrukturvorhersage................................................................................. 67 3.6.2 Validierung von Proteinstrukturen ................................................................... 68 3.6.3 Beschreibung von Proteinstrukturen ................................................................ 69 3.6.4 Proteinstrukturvergleiche ................................................................................. 70 3.6.5 Strukturmodelle: Enzym-Substrat-Komplexe .................................................. 70 4 Ergebnisse und Diskussion .................................................................................... 72 4.1 Strukturaufklärung von AviRa ................................................................................. 72 4.1.1 Expression, Reinigung und Kristallisation des Wildtyps ................................. 72 4.1.2 Entwicklung eines cryo-Protokolls................................................................... 76 4.1.3 Phasierungsversuche durch Molrep und MIR .................................................. 78 4.1.4 Darstellung und Charakterisierung der Methionin-Doppelmutanten ............... 81 4.1.5 Präparation und Kristallisation der SeMet-Mutanten....................................... 83 4.1.6 Phasierung durch MAD .................................................................................... 85 4.1.7 Modellbau und Strukturverfeinerung ............................................................... 88 4.1.8 Bestimmung der WT-Struktur .......................................................................... 90 4.1.9 Qualität der AviRa-Strukturen ......................................................................... 91 4.1.10 Kristallisationsansätze zur Strukturlösung von Enzym-Substrat-Komplexen.. 96 4.1.11 Struktur von AviRa-dehyd ............................................................................... 97 4.2 Strukturbeschreibung von AviRa ........................................................................... 101 4.2.1 Sekundär- und Tertiärstruktur ........................................................................ 101 4.2.2 Vergleich von AviRa-WT mit AviRa-dehyd ................................................. 103 4.2.3 Vergleich mit klassischen Methyltransferasen ............................................... 107 4.2.4 Strukturmodell der AdoMet-Bindestelle ........................................................ 109 4.2.5 Modell eines AviRa-rRNA-Komplexes ......................................................... 111 4.2.6 Reaktionsmechanismus .................................................................................. 112 III 4.3 Strukturaufklärung von AviRb ............................................................................... 117 4.3.1 Strukturvorhersage von AviRb....................................................................... 117 4.3.2 Expression und Reinigung von AviRb-pRSETb ............................................ 119 4.3.3 Präparation von N-terminaler und C-terminaler Domäne von AviRb ........... 122 4.3.4 Amplifizierung von AviRb-pGEX-4T1 ......................................................... 124 4.3.5 Expression und Reinigung von AviRb als GST-Fusionsprotein .................... 124 4.3.6 Kristallisation von AviRb............................................................................... 126 4.3.7 Darstellung und Kristallisation von Oberflächenmutanten ............................ 130 4.3.8 Phasierungsversuche durch Molrep und MIR ................................................ 131 4.3.9 Präparation und Kristallisation von AviRb-SeMet......................................... 133 4.3.10 Phasierung durch MAD .................................................................................. 136 4.3.11 Modellbau und Strukturverfeinerung ............................................................. 138 4.3.12 Bestimmung der Struktur von AviRb-AdoMet .............................................. 141 4.3.13 Qualität der AviRb-Strukturen ....................................................................... 142 4.3.14 Versuche zur Strukturlösung von Enzym-Substrat- Komplexen ................... 145 4.4 Strukturbeschreibung von AviRb ........................................................................... 147 4.4.1 Sekundär- und Tertiärstruktur ........................................................................ 147 4.4.2 Quartärstruktur ............................................................................................... 149 4.4.3 Kristallpackung............................................................................................... 151 4.4.4 Strukturvergleich ............................................................................................ 153 4.4.5 Proteinfaltung ................................................................................................. 159 4.4.6 Kofaktorbindung............................................................................................. 163 4.4.7 rRNA-Bindung und Katalyse ......................................................................... 166 5 Zusammenfassung und Ausblick ........................................................................ 171 6 Anhang................................................................................................................... 173 Sequenz von AviRa ................................................................................................ 173 Sequenz von AviRb ................................................................................................ 174 Vektorkarten ........................................................................................................... 175 Ortsgerichtete Mutagenese ..................................................................................... 176 Eichgeraden Gelpermeationschromatographie....................................................... 179 Sekundärstrukturvorhersagen SPOUT-Klasse ....................................................... 180 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 7 Literatur ................................................................................................................ 182 IV Abkürzungsverzeichnis A280 AdoHcy AdoMet AS ASU AviRa AviRa-SeMet AviRa-dehyd AviRb AviRb-Ndom AviRb-Cdom B-Faktor CV DMA DTT ESI-MS GPC GST GST-AviRb IEC IEP IPTG MAD MIR MolRep MTase MWCO NCS OD600 PDB PEG - X PMSF rpm RT SeMet SeqLab WT Absorption bei der Wellenlänge 280 nm S-Adenosyl-Homocystein S-Adenosyl-L-Methionin Aminosäuren asymmetrische Einheit (asymmetric unit) Avilamycin rRNA-Methyltransferase A AviRa-Mutante Ile11→Met-Leu239→Met mit SeMet statt Met dehydrierte AviRa-Struktur in der Raumgruppe P1 Avilamycin rRNA-Methyltransferase B N-terminale Domäne von AviRb (AS 1-117) C-terminale Domäne von AviRb (AS 118-287) kristallographischer Temperaturfaktor Säulenvolumen (column volume) 2'-desoxy-5-methyladenosin Dithiothreitol Elektronspray-Massenspektroskopie Gelpermeationschromatographie Glutathione-S-Transferase Fusionsprotein von GST und AviRb Ionenaustausch-Chromatographie (ion exchange chromatography) Isoelektrischer Punkt Isopropyl-β-D-Thiogalactosid multiple-Wellenlängen anomale Diffraktion (multiple wavelength anomalous diffraction) multipler isomorpher Ersatz (multiple isomorphous replacement) molekularer Ersatz (molecular replacement) Methyltransferase Molmassen-Grenze (molecular weight cut off) Nicht-kristallographische Symmetrie (non crystallographic symmetry) optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm Datenbank für Proteinstrukturen (Protein Data Bank) Polyethylenglycol mit einer mittleren Molekularmasse von X g/mol Phenylmethylsulfonylfluorid Umdrehungen pro Minute (rotations per minute) Raumtemperatur L-Selenomethionin Sequence Laboratories Göttingen GmbH Wildtyp Abkürzungen, die im European Journal of Biochemistry ohne Definition verwendet werden dürfen, sind nicht aufgeführt (Information for Authors (1996). Eur. J. Biochem. 235, 1-7). V Symbole und mathematische Zeichen r r r a , b , c , α, β, γ r r r a * , b* , c * , α*, β*, γ* Elementarzellparameter im realen Raum Å Ångström (1 Å = 10-10 m = 0.1 nm) d Netzebenenabstand f Atomformfaktor F Komplexer Strukturfaktor F Strukturfaktoramplitude Fcalc aus dem Modell berechnete Strukturfaktoramplituden Fobs gemessene (observierte) Strukturfaktoramplituden FP, FPH, FH Strukturfaktoren des Proteins, des Schweratomderivats, des Elementarzellparameter im reziproken Raum Schweratoms hkl, ( h k l ) Millersche Indices (Friedelpaare) i imaginäre Einheit (i² = –1) φ Phase des Strukturfaktors F φcalc berechnete Phase P(φ) Phasenwahrscheinlichkeit P(u, v, w) r r Pattersonfunktion Ortsvektor im realen Raum ρel, (ρobs, ρcalc) r s Elektronendichte (gemessen, berechnet) x, y, z Ortskoordinaten im realen Raum Ortsvektor im reziproken Raum VI Glossar alignment annealing blotting cryo-protectant cryo-loop frame / image high energy remote inflection point interface linker loop maximum likelihood on-column cleavage off-column cleavage overfitting peak pellet restrained screening simulated annealing Ausrichtung ähnlicher Proteinsequenzen unter Einführung von Lücken Tempern Transfer von DNA oder Protein auf eine Trägermembran Zusatz zum Aufbewahrungspuffer für Kristalle, der das Bilden von Eiskristallen beim Einfrieren verhindert Schleife zur Kristallmontage Bild bei der Messung von MAD-Daten: Wellenlänge, die in Bezug auf die Absorptionskante zu hohen Energien verschoben ist Wendepunkt einer Kurve Kontaktfläche Verbindungsstück(e) Schleife, Bereich ohne Sekundärstruktur Statistische Methode der Maximalen Wahrscheinlichkeit Spaltung eines Fusionsproteins während dieses an die Affinitätssäule gebunden ist Spaltung eines Fusionsproteins in Lösung, nicht auf der Säule gebunden Anpassen der Modellparameter an das experimentelle Rauschen Verteilungsspitzen in Elektronendichtekarten oder Chromatogrammen fester Bestandteil nach einer Zentrifugation eingeschränkt; eine Abweichung vom Idealwert wird nur eingeschränkt zugelassen Reihenexperiment (bei der Kristallisation) simuliertes Tempern bei der Verfeinerung von Proteinstrukturen 1 1 Einleitung 1.1 Avilamycin aus Streptomyces viridochromogenes Antibiotika sind Stoffe, die bereits in geringer Konzentration das Wachstum von Bakterien und Pilzen hemmen und daher bei der Therapie von Infektionskrankheiten von entscheidender Bedeutung sind. In der Natur werden Antibiotika von Mikroorganismen produziert, vor allem von Pilzen und Streptomyceten. Letztere sind Gram-positive Bakterien und gehören zur Klasse der Actinobakterien, welche bei der Bildung von Humus eine wichtige Rolle spielen. Actinomyceten sind Sporenbildner, ihre Filamente ähneln dem Mycelium aus Pilzen (Abbildung 1). Abbildung 1 Rasterelektronenmikroskopie von Streptomyces viridochromogenes, der das Antibiotikum Avilamycin produziert (Quelle: Schwartz et al., 1999). Das Oligosaccharid Avilamycin (Abbildung 2) aus Streptomyces viridochromogenes gehört ebenso wie das struktur- und wirkungsverwandte Evernimicin (ZiracinTM) aus Micromonospora carbonaceae zur Klasse der Orthosomycine (Buzetti et al., 1968). Beide Antibiotika werden gemäß ihrer Wirkungsweise den Translationshemmern zugeordnet. Sie inhibieren das Wachstum Gram-positiver Bakterien durch einen Angriff an der großen Untereinheit des Ribosoms. Die gemeinsame Bindestelle von Avilamycin und Evernimicin liegt im Bereich des zentralen loops der Domäne V in der Nähe der A-site der 23S-rRNA (Adrian et al., 2000; McNicholas et al., 2000; Kofoed & Vester, 2002). Im allgemeinen erfolgt die Translationsinhibition entweder durch Blockierung des Peptidyltransferasezentrums, durch Blockade der naszierenden Kette oder durch Behinderung der Bindung von Translationsfaktoren. Avilamycin dagegen inhibiert die Aktivität des Initiationsfaktors IF2, welcher im Bereich der Antibiotikabindestelle an die rRNA dockt (Heinmark et al., 1976), und verhindert somit vermutlich die Ausbildung des 70S Initiationskomplexes (Belova et al., 2001). 2 Einleitung Abbildung 2 Strukturformel von Avilamycin (oben) und Evernimicin (unten). Bakterien, die eine Resistenz gegenüber Avilamycin besitzen, weisen auch eine geringere Suszeptibilität gegenüber Evernimicin auf und umgekehrt (Kreuzresistenz). Diese wechselseitige Resistenz verhindert den Einsatz von beiden Antibiotika in unterschiedlichen Anwendungsgebieten. Da Avilamycine zur Wachstumsförderung in der Schweinezucht eingesetzt wurden und sich daher resistente Bakterienstämme entwickelt haben können, ist die Bedeutung von Evernimicin als mögliches Therapeutikum in der Medizin begrenzt (Aarestrup, 1998; Courvalin, 2000). Evernimicin befand sich bereits in der dritten klinischen Phase, welche jedoch von Schering-Plough abgebrochen wurde, da laut Pressemitteilung das Nutzen/Risiko-Verhältnis bei einer therapeutischen Anwendung keine Weiterentwicklung rechtfertigte. Das Auftreten von Resistenzen gegenüber eingesetzten Antibiotika stellt ein generelles Problem der pharmazeutischen Forschung dar. Neben der Entwicklung neuer Antibiotika ist die Aufklärung der Resistenzmechanismen in Bakterien von entscheidender Bedeutung. Sind Struktur und Wirkungsweise eines Enzyms, das für die verminderte Aktivität eines Antibiotikums verantwortlich ist, bekannt, können Inhibitoren entwickelt werden, um die Effektivität des Antibiotikums zu steigern. Jeder Organismus, der ein Antibiotikum produziert, besitzt ein System an Schutzfunktionen, das ihm Resistenz gegenüber der toxischen Wirkung des eigenen Produktes verleiht. In Streptomyces viridochromogenes existieren drei verschiedene Proteine, die für die Resistenzausbildung verantwortlich sind (Weitnauer et al., 2001). Ein ABC-(ATP-binding cassette)-Transporter schleust das synthetisierte Avilamycin aus dem Organismus und erniedrigt so dessen Konzentration in der Zelle. Außerdem wurden zwei Resistenz-vermittelnde rRNA-Methyltransferasen, AviRa und AviRb (Avilamycin rRNA 3 Einleitung Methyltransferase a und b) identifiziert. In anderen Organismen konnte die Resistenz gegenüber Antibiotika ebenfalls auf rRNA Methyltransferasen zurückgeführt werden. Die Bindung von Avilamycin kann alternativ durch Mutationen innerhalb des Peptidyltransferase-loops oder eine Punktmutation (I52S) des ribosomalen Proteins L16 verhindert werden (Adrian et al., 1999). 1.2 AdoMet-abhängige Methyltransferasen Die Übertragung von Methylgruppen ist eine Alkylierungsreaktion von zentraler Bedeutung. Als Methyldonor dient dabei für über 90% aller Methyltransferasen (MTasen) S-Adenosyl-L-methionin (AdoMet, Abbildung 3). Alternativ werden verschiedene Formen von Folaten (Bsp.: Thymidylatsynthase) oder seltener Betain (Bsp.: Homocystein S-Methyltransferase) als Methylierungsreagenz verwendet (Cheng & Blumenthal, 1999). O H2N NH2 N OH N S O + Me OH N N OH Abbildung 3 Strukturformel von S-Adenosyl-L-methionin (AdoMet). Die Händigkeit am Schwefel entspricht der natürlich vorkommenden Konfiguration. Die starke Verbreitung vom AdoMet ist vermutlich auf die hohe Reaktivität der am positiv geladenen Schwefelatom gebundenen Methylgruppe zurückzuführen. Die Hydrolyse von AdoMet zu Methanol und Adenosylhomocysteine (AdoHcy) ist stark begünstigt (∆G = -17 kcal/mol). Die Methylgruppe wird in einem SN2-ähnlichen Mechanismus auf Stickstoff-, Sauerstoff-, Kohlenstoff- oder Schwefelatome übertragen, wobei die erstgenannten Methylakzeptoren verstärkt auftreten. Die Vielfalt der AdoMetabhängigen MTasen wird an ihrem breiten Substratspektrum deutlich: es werden kleine organische Moleküle, Zucker, Proteine, Lipide, DNA oder RNA methyliert. In den letzten zehn Jahren wurden über 70 Methyltransferasen strukturell charakterisiert (Tabelle 1). Sie lassen sich anhand ihrer charakteristischen Faltung in verschiedene Klassen einteilen (Schubert et al., 2003). 4 Einleitung Tabelle 1 Strukturell charakterisierte MTasen (PDB-Datenbank, 26. Oktober, 2004) Klassische MTasen EC # 2.1.1.x 2.1.1.x 2.1.1.x 2.1.1.x Name rRNA Guanine N-MTase AviRa Monoethanolamine MTase Isoliquiritigenin 2'-O- MTase Protein N(5)-Glutamine MTase 2.1.1.x 2.1.1.x 2.1.1.x 2.1.1.x 2.1.1.x 2.1.1.x 2.1.1.x 2.1.1.x 2.1.1.x 2.1.1.x 2.1.1.x 2.1.1.2 Ftsj RNA MTase hypothetische MTase YecO hypothetische MTase Rv2188 hypothetische MTase Mraw hypothetische MTase Ph1374 hypothetische RNA MTase Mj0882 hypothetische RNA MTase Mj0697 Hnrnp Arginine N-MTase Carminomycin 4-O-MTase Protein Carboxy Phosphatase MTase rRNA Uridine MTase Guanidinoacetate N-MTase 2.1.1.5 2.1.1.6 2.1.1.8 2.1.1.20 2.1.1.28 2.1.1.37 2.1.1.43 2.1.1.46 2.1.1.48 Betaine homocysteine MTase Catechol O-MTase Histamine N-MTase Glycine N-MTase Phenylethanolamine N-MTase DNA-Cytosine C5-MTase Histone-Lysine N-MTase Isoflavone O4' MTase rRNA adenine N6-Di-MTase 2.1.1.51 2.1.1.63 rRNA (guanine-N1) MTase O6-Alkylguanine-DNA MTase 2.1.1.67 2.1.1.68 2.1.1.72 Thiopurine S-MTase Caffeate O-MTase DNA adenine N6-MTase 2.1.1.73 DNA cytosine C5-MTase Organismus S. viridochromogenes Methanosarcina barkeri Medicago sativa Thermatoga maritima Escherichia coli Escherichia coli Haemophilus influenzae Mycobacterium tuberculosis Thermotoga maritima Pyrococcus horikoshii Methanococcus jannaschii Methanococcus jannaschii Saccharomyces cerevisiae Streptomyces peucetius Saccharomyces cerevisiae Escherichia coli Rattus norvegicus Escherichia coli Homo sapiens Rattus norvegicus Homo sapiens Thermotoga maritima Rattus norvegicus PDB-code 1O9G 1O9H 1L2Q 1FP1 1NV8 1NV9 1T43 1EIZ 1IM8 1 I9G 1M6Y 1N2X 1IXK 1DUS 1FBN 1G6Q 1TW2 1TW3 1RJD 1UWV 1KHH 1XCL 1LT7 1VID 1JR4 1JQD 1JQE 1VLM 1BHJ 1D2H 1D2G 1XVA 1D2C Homo sapiens Mus musculus Homo sapiens Homo sapiens Homo sapiens Medicago sativa Bacillus subtilis Streptococcus pneumoniae Escherichia coli Escherichia coli Homo sapiens Escherichia coli Pseudomonas syringae Medicago sativa Thermus aquaticus Rhodobacter sphaeroides 1R74 Moraxella bovis Streptococcus pneumoniae Haemophilus aegyptius Haemophilus haemolyticus Mus musculus IG60 1R8X 1HNN 1N7I 1N7J 1G55 1NW3 1FP2 1FPX 1QAM 1QAN 1QAO 1QAQ 1YUB 1QYR 1P91 1EH6 1SFE 1PJZ 1KYW 1KYZ 1KNS 1L0U 1G38 1ADM 1AQI 1AQJ 1EG2 2DPM 10MH 1DCT 1FJX 1HMY 1MHT 2MHT 1KHC 5 Einleitung 2.1.1.77 Protein-L-isoaspartate(D-aspartate) O- Pyrococcus furiosus MTase Homo sapiens Sulfolobus tokodaii 2.1.1.79 Cyclopropane fatty acyl-phospholipid Mycobacterium tuberculosis synthase 2.1.1.80 Protein-glutatmate O-MTase Salmonella typhimurium 2.1.1.113 Cytosine N4-DNA-MTase Proteus vulgaris 2.1.1.125 Histone Arginine N-MTase Rattus norvegicus 1JG1 1JG2 1JG3 1JG4 2.1.1.132 Precorrine 6y C-MTase 1KXZ 1L9K 2.7.7.19 mRNA CAP (2'-O-) MTase-Domäne Methanobacterium thermoautotrophicum Vaccinia virus 2.7.7.48 mRNA CAP (2'-O-) MTase-Domäne Dengue virus type 2 1KR5 1VBF 1KP9 1AF7 1BC5 1BOO 1F3L 1OR8 1ORI 1ORH 7G6Q 1VPT 3MAG 1B42 1BKY 1EAM 1EQA 1JSZ 1JTE 1JTF 1P39 1V39 1VP3 1VP9 1VPT 2VP3 3MCT 4DCG SPOUT-MTasen SpoU 2.1.1.x 2.1.1.x Uracil 2'-O-rRNA MTase AviRb S. viridochromogenes Guanosin 2'-O-rRNA MTase Thermus thermophilus Escherichia coli Haemophilus influenzae pot. 2'-O-tRNA MTase Thermus thermophilus pot. rRNA MTase Bacillus subtilis Methanobact. thermoautotrophicum Haemophilus influenzae 1X7O 1X7P TrmD 2.1.1.x pot. MTase 1NS5 2.1.1.31 tRNA (m1G37)- MTase Escherichia coli Thermotoga maritima Haemophilus influenzae Aquifex aeolicus Escherichia coli Param. burs. chlorella virus Neurospora crassa Homo sapiens Schizosaccharomyces pombe Saccharomyces cerevisiae Pisum sativum 1N3J Methanosarcina barkeri Escherichia coli 1NTH Bacillus megaterium 1CBF 2CBF 2.1.1.x 2.1.1.x 1IPA 1GZO 1J85 1V2X 1VHK 1K3R 1NXZ 1O6D 1UAJ 1UAM 1OY5 1P9P SET-MTasen 2.1.1.x 2.1.1.43 2.1.127 Lysine H3 MTase, Histone Lysine N- MTase, Histone Lysine N- MTase, Rubisco 1ML9 1H3I 1MVH 1MVX 1U2Z 1MLV weitere MTasen Monomethylamine MTase Cobalamin-Dependent Methionine Synthase 2.1.1.133 Precorrin-4 C11- MTase 2.1.1.x 2.1.1.13 1MSK 1K98 6 Einleitung Neben den am häufigsten vorkommenden "klassischen MTasen" (Martin et al., 2002) sind mehrere Vertreter der Strukturklassen "SPOUT-MTasen" und "SET-DomänenMTasen" bekannt. Abbildung 4 zeigt die dreidimensionale Struktur sowie die Topologie je eines Vertreters der drei verschiedenen MTase-Klassen. Zusätzlich konnten drei Strukturen mit bisher einzigartigen Faltungen gelöst werden. (a) (b) (c) Abbildung 4 Tertiärstrukturen und Topologien der AdoMet-abhängigen Methyltransferaseklassen. Die Knotenstrukturen sind magenta dargestellt, hellviolette Helices sind weniger stark konserviert. (a) Klassische MTase-Faltung: über 50 Vertreter bekannt (MHaI; Kumar et al., 1992); (b) SPOUT-Familie der RNA MTasen (YibK; Lim et al., 2003); (c) SET-Familie der Lysin-MTasen (Set7; Wilson et al., 2002). Quelle: Schubert et al. (2003). 7 Einleitung Klassische Methyltransferasen Die meisten strukturell bekannten MTasen weisen trotz einer relativ niedrigen Sequenzidentität von meist unter 20% die klassische MTase-Faltung auf (Abbildung 4(a)). Bis 2001 waren lediglich zwei Methyltransferasen bekannt, die nicht dem typischen Faltungsmuster gehorchten. Gemeinsames Strukturmerkmal ist ein 7-strängiges β-Faltblatt (6↓ 7↑ 5↓ 4↓ 1↓ 2↓ 3↓) das einen zentralen topologischen Wechsel (switch) aufweist. Charakteristisch ist dabei ein antiparallel insertierter β-Strang am Ende des ansonsten parallelen Faltblattes. Das β-Faltblatt wird von beiden Seiten durch α-Helices flankiert. Diese Struktur wird üblicherweise auch als "AdoMet-abhängiger-MTase-fold" bezeichnet (Cheng & Roberts, 2001). Die Faltung ähnelt mit Ausnahme des Strangs β7 dem Rossmann-fold. In beiden Fällen befindet sich die Substratbindungsstelle am C-terminalen Ende von β1 und β4. Trotz der strukturellen Konservierung der katalytischen Domäne besteht eine große Variabilität innerhalb der Klasse. Obwohl die meisten klassischen MTasen als Monomer vorliegen, sind auch dimere und tetramere Vertreter bekannt. Einige MTasen besitzen zusätzliche N- oder C-terminale Domänen, die meist der Substraterkennung dienen. Sequenzvergleiche verschiedener DNA- und RNA-MTasen zeigen die Konservierung des Sequenzmotives hh(D/E)hgXGXG (h = hydrophobe AS, X = beliebige AS), welches sich im Bereich der AdoMet-Bindestelle finden läßt (Kagan et al., 1994). Im Abstand von 17-19 AS nach diesem Motiv findet sich ein Aspartat oder Glutamat in der Konsensussequenz hhXh(D/E). Somit ist bei unbekannter Struktur einer DNA- bzw. RNAMTase trotz der geringen allgemeinen Sequenzidentität eine Zuordnung zu dieser Klasse möglich. SPOUT- Methyltransferasen Die SPOUT-Klasse der RNA Methyltransferasen setzt sich aus der SpoU- und der TrmD-Familie zusammen. Bisher sind alle bekannten Vertreter beider Familien rRNAbzw. tRNA-MTasen, welche das Ribose 2'-O-Atom einer spezifischen RNA-Base methylieren. In vielen Fällen ist allerdings das Zielmolekül bzw. die genaue Methylierungsposition noch unbekannt. Die erste Kristallstruktur einer SPOUT-MTase wurde im Oktober 2002 gelöst (Michel et al., 2002). Seitdem konnten zwölf weitere SPOUT-MTasen strukturell charakterisiert werden, worunter sich acht Mitglieder der SpoU- und fünf der TrmD-Familie befinden (Tabelle 1). Alle Enzyme dieser Klasse liegen als Homodimer vor, an Substraterkennung und Katalyse sind Aminosäuren beider Untereinheiten beteiligt (Kurowski et al., 2003). In der 8 Einleitung Regel besteht jede Untereinheit aus einer variablen Substraterkennungsdomäne und einer strukturell konservierten, katalytischen Domäne, die gleichzeitig als DimerisierungsDomäne fungiert. Zentrales Faltungsmotiv der katalytischen Domäne ist ein paralleles, von α-Helices flankiertes β-Faltblatt, welches in der SpoU-Familie aus sechs Strängen und innerhalb der TrmD-Familie aus fünf Strängen besteht (Abbildung 5). Die ersten drei Stränge des β-Faltblattes der SpoU-MTasen liegen analog der ersten Hälfte des Rossmannfolds vor. Das aktive Zentrum befindet sich allerdings im zweiten, strukturell innerhalb der SPOUT-Klasse hoch konservierten Teil des Faltblattes (in Abbildung 5 eingerahmt). Das charakteristischste Merkmal der Faltung ist eine ungewöhnliche Knotenstruktur (Abbildung 4(b), in mangenta dargestellt). Die Knotenbildung ist dabei für die Dimerisierung und die korrekte Ausbildung des katalytisch aktiven Zentrums von entscheidender Bedeutung (Nureki et al., 2004). Die Bindungstasche des Kofaktors AdoMet wird von den am Knoten beteiligten loops gebildet. Abbildung 5 Topologie-Darstellung der beiden Familien der SPOUT-MTase-Klasse, (a) TrmDFamilie (b) SpoU-Familie. Die AdoMet-Bindestelle ist durch SAM markiert. Quelle: Schubert et al. (2003). Lediglich ein Vertreter der Klasse, TrmD aus Aquifex aeolicus, weist angeblich keine Knotenstruktur auf (Liu et al., 2003). Allerdings lassen schlechte kristallographische Daten im Rahmen der Strukturverfeinerung sowie eine beschleunigte Publikation unmittelbar nach Veröffentlichung der TrmD-Struktur aus Haemophilus influenzae (Ahn et al., 2003) Zweifel an der Korrektheit des fehlenden Knotens aufkommen. Zudem beträgt die Sequenzidentität zu anderen, Knoten-bildenden TrmD-MTasen in diesem Bereich mehr als 50%. Eine falsche Verknüpfung der Stränge ist daher nicht ausgeschlossen. Eine weitere Unterteilung innerhalb der beiden SPOUT-Familien ist anhand der Struktur der variablen Domäne oder auch anhand von Sequenzvergleichen möglich. Diese erlauben Rückschlüsse auf die Methylierungsziele. Innerhalb der katalytischen Domäne variiert die Sequenzidentität dabei von 18 bis 35%. Einige der SpoU-MTasen weisen drei charakteristische Sequenzmotive auf (Abbildung 6; Gustafsson et al., 1996; Anantharaman et al., 2002). 9 Einleitung Motiv I: Motiv II: Motiv III: G/P/A-X-N-X-G-X3-R h-X-h-G-X-E-X2-G-h h-P-X6-S-h-N-h-A/S Abbildung 6 Sequenzmotive der SpoU-MTase-Familie nach Gustafsson et al. (1996). X steht für eine beliebige, h für eine hydrophobe AS. SET - Methyltransferasen SET-Proteine besitzen meist neben einer katalytischen SET-Domäne (Suvar Enhancer of zeste, Trithorax) sowohl zusätzliche N- wie C-terminale Domänen. Bislang konnte die dreidimensionale Struktur von fünf Enzymen dieser Klasse bestimmt werden. Sequenzvergleiche sagen allerdings eine große Anzahl weiterer Mitglieder voraus (Doerks et al., 2002). Alle bisher bekannten SET-MTasen methylieren spezifische Lysine an flexiblen Enden von Histonen oder in Rubisco (Yeates, 2002). Die Struktur der SETDomäne besteht aus zehn gebogenen β-Strängen, die drei kleine β-Faltblätter bilden. Ähnlich der MTase Klasse IV liegt auch hier eine knotenförmige Struktur vor, die ebenfalls durch die C-terminale Helix gebildet wird. Allerdings ergibt sie sich aus einer vollkommen anderen Topologie. Die Bindung des Kofaktors AdoMet erfolgt in einer abgeknickten Konformation zwischen zwei β-Faltblättern im Bereich des N-terminalen Knoten (Jacobs et al., 2002). Weitere Methyltransferasen Drei MTasen lassen sich keiner dieser Klassen zuordnen. Sie weisen, so weit bekannt, eine einzigartige Faltung auf. Die AdoMet-bindende Domäne der Cobalamin(Vitamin B12) -abhängigen Methionin-Synthase MetH, welche die Synthese von Methionin aus Homocystein katalysiert, ist von einem langen, zentralen, antiparallelen β-Faltblatt dominiert. AdoMet bindet dabei in einer ungewöhnlichen, gestreckten Konformation in einer flachen Vertiefung an der Kante der β-Stränge (Dixon et al., 1996). Die homodimere Methyltransferase CibF ist bei der Cobalamin-Biosynthese beteiligt (Schubert et al., 1998). Beide Domänen des CibF Monomers weisen ein zentrales 5-strängiges β-Faltblatt auf, wobei der Kofaktor AdoMet in einer gebogenen Konformation zwischen den beiden Domänen gebunden wird. Eine weitere Gruppe von MTasen stellen die MethylaminMTasen dar, welche im Stoffwechsel methanogener Bakterien eine zentrale Rolle spielen. Bislang konnte lediglich die Struktur der Monomethylamin-MTase (MMA) aus M. bakeri bestimmt werden (Hao et al., 2002), welche eine TIM-barrel-Faltung aufweist. 10 Einleitung 1.3 AviRa und AviRb aus Streptomyces viridochromogenes Die beiden AdoMet-abhängigen rRNA-Methyltransferasen AviRa und AviRb aus Streptomyces viridochromogenes TÜ57 sind kleine, cytosolische Proteine welche zur Ausbildung der Avilamycin-Resistenz die ribosomale RNA methylieren. Die Methylierungspositionen beider Enzyme am Ribosom sind bekannt. Sie liegen im Bereich der Bindestelle des Antibiotikums Avilamycin innerhalb des Peptidyltransferase-loops der Domäne V der 23S-rRNA (Abbildung 7). AviRa ist eine N-MTase und monomethyliert spezifisch Guanin 2535 der rRNA-Helix-91 (E. coli Nomenklatur). AviRb dagegen überträgt eine Methylgruppe auf das 2'-O-Atom der 10 Å entfernten Base Uridin-2479 innerhalb der rRNA-Helix-89 (Treede et al., 2003). (a) (b) Abbildung 7 Methylierungspositionen der Methyltransferasen AviRa (Helix-91, Guanin-2535, blau) und AviRb (Helix-89, Uridin-2479, grün). (a) Darstellung der 50S Untereinheit des Ribosoms in der Standard-Orientierung. (b) Sekundärstruktur des Peptidyltransferase-loops der Domäne V. Die meisten rRNA-MTasen übertragen die Methylgruppe während der Faltung des Ribosoms. Die Methylierungspositionen sind nach vollständiger Assemblierung nicht mehr zugänglich. So liegt die Zielbase der gegenüber dem Antibiotikum Erythromycin Resistenz vermittelnde rRNA-MTase ErmC innerhalb des Tunnels der exit site (Schluckebier et al., 1999). Die Methylierung verhindert die Bindung des Antibiotikums Erythromycin, welches ansonsten den Ausgang für die nascierende Kette blockieren kann. Die Methylierungspositionen von AviRa und AviRb liegen dagegen an der Oberfläche des Ribosoms. Das Ribosom muß zur Substraterkennung allerdings nicht gefaltet sein. RNAMethylierung konnte in vitro sowohl an einer Mischung aus 16S- und 23S-rRNA sowie an 11 Einleitung kurzen Segmenten des Peptidyltransferase-loops nachgewiesen werden (Treede et al., 2003). Die Ausbildung der Sekundärstruktur der jeweiligen rRNA-Helices ist zur Erkennung der korrekten Methylierungsposition jedoch essentiell. AviRa ist ein monomeres Protein von 250 AS und einer Molekularmasse von 26'688 Da. Der berechnete pI liegt bei 9.96. Durch die positive Oberflächenladung des Proteins ist eine grundsätzliche Affinität zum negativ geladenen Phosphatrückgrat der rRNA gegeben. Durch Sequenzvergleiche konnte AviRa als klassische Methyltransferase identifiziert werden. Zwar lassen sich bei Datenbankrecherchen keinerlei homologe Proteine finden, welche eine Sequenzidentität von mehr als 17% aufweisen, das für klassische MTasen typische Sequenzmotiv ist jedoch vorhanden. Abbildung 8 zeigt den entsprechenden Ausschnitt aus der Sequenz von AviRa im Vergleich mit dem Konsensusmotiv. AviRa: Konsensus: LW D PCCGSG hh(D/E)hgXGXG X16 X13-15 VIAS D hhXh(D/E) (AS 55-84) Abbildung 8 Vergleich der AS-Sequenz von AviRa mit dem Konsensus-Motiv klassischer MTasen. X steht für eine beliebige, h für eine hydrophobe AS, g für ein weniger gut konserviertes Glycin. AviRb ist dagegen eine MTase der SPOUT-Klasse und liegt wie alle SPOUTMTasen als Dimer in Lösung vor (Kap. 1.2, Kap. 4.3.5). Jedes Protomer besteht aus 287 AS mit einer molekularen Masse von 31'215 Da, der pI eines Protomers wurde zu 6.14 berechnet. Innerhalb der zweiten Hälfte der Aminosäuresequenz konnten die drei Sequenzmotive der SpoU Familie identifiziert werden (Abbildung 9). Auch die Funktion von AviRb als 2'-O-rRNA-MTase deutet auf eine Zugehörigkeit zu dieser Familie hin. Motiv I: AviRb: Konsensus: P GNIGSIIR (G/P/A)XNXGXXXR (AS 137-144) Motiv II: AviRb: Konsensus: LLIGNETAGL hXhGXEXXGh (AS 229-238) Motiv III: AviRb: Konsensus: IPMAGSASSLNAA hP X6 ShNh(A/S) (AS 252-263) Abbildung 9 Vergleich der AS-Sequenz von AviRb mit den Sequenzmotiven der SpoU-MTasen. X steht für eine beliebige, h für eine hydrophobe AS. 12 Einleitung 1.4 Ziele der Arbeit Vorrangiges Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung der Kristallstrukturen der Methyltransferasen AviRa und AviRb aus Streptomyces viridochromogenes. Ausgangspunkt hierfür stellten die Arbeiten der vorangegangenen Diplomarbeit dar (Mosbacher, 2002). Für beide MTasen war bereits ein Expressionssystem, für AviRa zudem ein Reinigungsschema entwickelt worden. Im Fall von AviRa konnten initiale Kristallisationsbedingungen erhalten werden. Aufbauend auf diesen Ergebnissen sollten die erhaltenen Kristalle von AviRa verbessert, ein cryo-Protokoll entwickelt, das Phasenproblem gelöst und die Struktur der MTase ermittelt werden. Im Falle von AviRb sollte ein Reinigungsprotokoll entwickelt werden, welches zur Homogenität gereinigtes Enzym liefert. Anschließend sollten Kristallisationsbedingungen gefunden, die erhaltenen Kristalle vermessen und die dreidimensionale Faltung der MTase bestimmt werden. Da die Bindung des Kofaktors AdoMet innerhalb der Klasse der SPOUT-MTasen nicht in dem Maße gesichert ist wie bei der klassischen Faltung, sollten Komplexe von AviRb mit AdoMet strukturell charakterisiert werden. Mit Hilfe der erhaltenen Strukturen der beiden MTasen sollte jeweils die Funktion einzelner Aminosäuren des aktiven Zentrums durch Mutagenese aufgeklärt werden. Zusätzlich sollten Modelle der entsprechenden Protein-RNA-Komplexe erstellt werden, um Aussagen über den Reaktionsmechanismus der beiden unterschiedlichen Methyltransferaseklassen treffen zu können. Anhand der Strukturen von AviRa und AviRb läßt sich die Resistenz von S. viridochromogenes gegenüber dem endogenen Antibiotikum Avilamycin verstehen. 13 2 Materialien 2.1 Geräte Allgemeine Geräte Pipetten Reinwasseranlage Zentrifugen Waagen Photometer pH-Elektrode pH-Meter 2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL, 5000 µL Multipetten Research Pro 10 / 100 Milli-Q Gradient 5415 C, 5804 R, 5417 R AE 240, PE 3600 PR 2210 IJ44/Meteo 761 Calimatic Gilson Eppendorf Millipore Eppendorf Mettler Eppendorf GAT Knick Molekularbiologische Arbeiten Agarosegel-ElektrophoreseKammer Thermocycler GNA 100 PTC-200 Peltier Thermal Cycler Pharmacia MJ-Research Bakterienkultivierung Brutschrank Bakterienschüttler Küvetten Innova 4230 KS 125 Novotron K-Küvetten 407 1/1 New Brunswick Scientific Co., Inc. IKA Labortechnik Invors AG Eppendorf Modell 7100 Sorvall RC-2B Sorvall RC-5C Biofuge 28RS Sonorex RK 106 Super Vacuubrand 0.45 µm, steril Ismatec 15 mL, 0.5 mL (MWCO 30/50 kDa) Schläuche Knöpfe Measuring & Scientific Equipment DuPont DuPont Heraeus Bandelin Brand Renner GmbH Ismatec Vivaspin Serva Institutswerkstatt Proteinpräparation Ultraschallgenerator Zentrifugen Ultraschallbad Vakuumpumpe Einmal-Filterhalter Schlauchpumpe Konzentratoren Dialyse Chromatographie Säulen /-materialien Superdex-26 16/60 prep grade Source-30S Resource-Q Sephadex G25 NAP5 GSTrap FF Reactive-Blue-4 Pharmacia Pharmacia Pharmacia Pharmacia Pharmacia Sigma Chromatographieanlagen ÄKTA Purifier 100 ÄKTA Explorer 100 ÄKTA prime Mini-Protean II Pharmacia Pharmacia Pharmacia BioRad SDSGelelektrophoresapparatur Geltrockenrahmen Eigenbau Institutswerkstatt 14 Materialien Elektroblotten und Proteinsequenzierung Netzgerät Blotting-Apparatur Filterpapier PVDF-Membran Sequenator Power Supply ECPS 3000/150 Fastblot 150 L Whatman Paper Fluorbind Protein-Sequenzer 477A Pharmacia Biometra Whatman Serva Applied Biosystem Aktivitätstest Säulen /-materialien Szintillationszähler Sephadex NAP TM 5 Säulen TzriCarb 2100TR Liquid Szintillation Analyzer Amersham Bioscience Packard Kristallisation Deckgläser Kristallisationsboxen Mikroskope Temperierschränke Kristallaufnahmen ∅ 21 mm, Stärke 2 Linbro-Kultur-Boxen Crystal Clear Strips, 96er Stemi 2000 Laborlux-12 POL S Wine-cooler Cammedia C-3030 Zoom Hecht-Assistent Flow Laboratories Hampton Research Zeiss Leitz Bosch Olympus Röntgenographische Methoden Glaskapillaren Hartwachs cryo-loops Goniometerkopf Röntgengenerator Detektor Tieftemperaturgenerator ∅ 0.3, 0.5, 0.7 mm Deiberit 0.1-0.5 mm Huber RU200 B X 1000 600series W. Müller Glas Böhme, Bad Sachsa Hampton Research Hampton Research Rigaku Siemens Oxford Cryosystems 2.2 Chemikalien, Enzyme und Kits Allgemeine Chemikalien Gängige Laborchemikalien sind von den Firmen Fluka, Merck, Roth, Serva oder Pharmacia bezogen und hier nicht aufgeführt. Aminosäuren und Basen für das LeMaster-Medium waren von den Firmen Merck, Sigma und Riedel-de-Haën. Enzyme wurden von Roche, Amersham und New England Biolabs bezogen. Soweit nicht anders beschrieben, waren alle Chemikalien vom Reinheitsgrad p.a. β-Mercaptoethanol Acrylamid, research grade AdoHcy AdoMet AdoMet (Tritium markiert, 5µCi) Agar-Agar Agarose, research grade Ampicillin, Natriumsalz Ammoniumperoxodisulfat Bicine Bromphenolblau Serva Fluka Fluka Fluka Roth Gibco Fluka Sigma, Gerbu Merck Aldrich Serva 15 Materialien Casein Pepton (Pepton 140) Coomassie Brilliant Blue R-250 Diethylpyrocarbonat DTT Ethidiumbromid Glutathion Glycerin Hefeextrakt HEPES IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid) kb DNA-Längenstandard LMW-Längenstandard Lothiszintecoplua Universalcocktail MES PEG-200 PEG-300 PEG-400 PEG-3000 PEG-8000 PEG-20000 Phenol/Chloroform Ponçeau-S SDS L-Seleno-Methionin Silikonisierlösung TEMED Tris Gibco Serva Fluka Gerbu Merck Serva Serva Gibco Gerbu Gerbu New England Biolabs Pharmacia Roth Sigma Sigma Sigma Sigma Fluka Fluka Fluka Roth Fluka Fluka Acros Serva Merck Fluka Enzyme und Ribonucleinsäuren Xba I – Restriktionsendonuklease (10 U/µL) EcoR I – Restriktionsendonuklease (10 U/µL) Nde I – Restriktionsendonuklease (10 U/µL) BamHI - Restriktionsendonuklease (10 U/µL) Benzonase (250 U/µL) RNAse Block (80 U/µL) rRNA – Mix (16S/23S) 5S RNA, 0.8 µg/µL Thrombin Protease Calf Intestine Alkaline Phosphatase (10 U/µL) T↓CTAGA G↓AATTC CA↓TATG G↓GATTC MBI-Fermentas MBI-Fermentas MBI-Fermentas MBI-Fermentas Merck Stratagene Boehringer-Mannheim Boehringer-Mannheim Pharmacia MBI-Fermentas Kits QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit Pfu Turbo DNA-Polymerase, 10xReaktionspuffer,DPNI Restriktionsendonuklease, dNTP-Mix, EpicurianColi XL1-Blue superkompetente Zellen E.Z.N.A.Plasmid Miniprep Kit II Lösung-1, Lösung-2, Lösung-3, HB-Puffer, DNA-Waschpuffer, RNase Stratagene PeqLab QIAquick® Mini Plasmid Preparation Kit Puffer-P1, Puffer-P2, Puffer-N3, Puffer-PB, Puffer-PE, Puffer-EB, RNase I Qiagen QIAquick® Gel Extraction Kit Puffer-QG, Puffer-PE, Puffer-EB Qiagen Rapid DNA® Ligations Kit T4-DNA-Ligase, 5xPuffer MBI Fermentas Die Zusammensetzung der einzelnen Puffer und Lösungen kann den jeweiligen Produktbeschreibungen entnommen werden. 16 Materialien 2.3 Bakterienstämme und Vektoren Bakterienstamm E. coli XL1-Blue E. coli BL21 (DE3) E. coli B834 (DE3) Genotyp F',Tn10, proA+B+ , lacIq, ∆(lacZ9M15/recA1, endA1, gyrA96(NaIr), thi, hsdR17 (rK-mK-), supE44, relA1, lac E. coli B, F', ompT, hsdSB (rB-mB-), dcm+, gal λ(DE3) F', ompT, gal λ(DE3), met (rB-mB-) Vertreiber Stratagene Invitrogen Novagen Zur Erklärung der Genotyp-Symbole siehe Bachmann (1983). Vektor pRSET3b pGEX-4T1 pET3b Beschreibung Expressionsvektor, T7-Promoter, Ampicillinresistenz, (His)6-tag Expressionsvektor, tac-Promoter, Ampicillinresistenz, Glutathion-S-Transferase Expressionsvektor, T7-Promoter, Ampicillinresistenz Vertreiber Invitrogen Pharmacia Invitrogen 2.4 Nährmedien, Lösungen und Puffer 2.4.1 Nährmedien LB-Medium Caseinpepton Hefeextrakt NaCl LBA-Medium LB-Medium mit Ampicillin (steril filtriert) LB-Agar LB-Medium mit Agar-Agar LeMaster Medium (autoklavierbare Portion) L-Alanin L-Arginin·HCl L-Asparaginsäure L-Cystein L-Glutaminsäure L-Glutamin L-Glycin L-Histidin L-Isoleucin L-Leucin L-Lysin·HCl L-Phenylalanin L-Prolin L-Serin L-Threonin L-Tyrosin L-Valin Adenin Guanosin Monohydrat Thymin Uracil Natriumacetat Bernsteinsäure Ammoniumchlorid NaOH K2HPO4 10 g/L 5 g/L 10 g/L pH 7.5 100 µg/L 15 g/L 0.50 g/L 0.58 g/L 0.40 g/L 0.03 g/L 0.67 g/L 0.33 g/L 0.54 g/L 0.06 g/L 0.23 g/L 0.23 g/L 0.42 g/L 0.13 g/L 0.10 g/L 2.08 g/L 0.23 g/L 0.17 g/L 0.23 g/L 0.50 g/L 0.67 g/L 0.17 g/L 0.50 g/L 1.50 g/L 1.50 g/L 0.75 g/L 1.08 g/L 10.50 g/L pH 7.5 17 Materialien LeMaster Medium (Medienzusätze pro L autoklavierbarer Portion) Glucose (20% (w/v)) MgSO4 (1 M) FeSO4 7·H2O (6 g/L) Thiamin (5 g/L) Ampicillin (100 mg/mL) L-SeMet (10 mg/mL) 60 mL 1.3 mL 0.65 mL 1.0 mL 1.0 mL 2.5 mL SOC-Medium Hefeextrakt Bacto-Tryptone NaCl KCl MgCl2 Glucose 5 g/L 20 g/L 5 mM 2.5 mM 10 mM 20 mM pH 7.0 Alle verwendeten Medien und Medienzusätze wurden 20 min bei 120° C und 1 bar Überdruck dampfsterilisiert. 2.4.2 DNA- und Proteinpräparation Agarose-Gelelektrophorese 50xTAE-Puffer Tris Essigsäure EDTA Probenpuffer Tris EDTA Glycerin Bromphenolblau kb-Standard 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0, 10.0 kb 0.1 M 1M 100 mM pH 8.1 10 mM 1 mM 50 % (v/v) 0.05 % (w/v) pH 7.5 New England Biolabs Chromatographie IEC-AviRa Bicine MgCl2 NaCl 50 mM 10 mM 10 mM pH 8.8 GPC-AviRa Tris NaCl MgCl2 DTT 50 mM 200 mM 10 mM 1 mM pH 8.3 IEC-AviRb Tris Glycerin NaCl MgCl2 DTT GPC-AviRb Na-HEPES NaCl Glycerin DTT 50 mM 2.5 % 20 mM 10 mM 5mM pH 7.8 10 mM 500 mM 2.5 % 1 mM pH 7.5 18 Materialien GST-Lyse Na2HPO4 @ 2H20 KH2PO4 NaCl KCl Glycerin GST-Elution Tris Glutathion (reduziert) 10 mM 10 mM 500 mM 2.7 mM 2.5% pH 7.3 50 mM 20 mM pH 8.0 SDS-PAGE Acrylamid-Stammlösung Acrylamid Bisacrylamid 39 % (w/v) 1 % (w/v) Elektrophoresepuffer Tris Glycin SDS 50 mM 380 mM 0.1 % (w/v) pH 8.3 Sammelgelpuffer Tris SDS 0.5 M 0.4 % (w/v) pH 6.8 Sammelgel 6% (w/v) Acrylamid-Stammlösung Sammelgelpuffer deion. Wasser APS 10% (w/v) TEMED Trenngelpuffer Tris SDS Trenngel 12% (w/v) Acrylamid-Stammlösung Trenngelpuffer deion. Wasser APS 10% (w/v) TEMED SDS-Probenpuffer Sammelgelpuffer SDS 16 % (w/v) Glycerin Bromphenolblau 0.2% (w/v) Färbelösung Coomassie Brilliant Blue R-250 Ethanol Essigsäure Entfärbelösung Ethanol Essigsäure LMW-Längenstandard Phosphorylase B Rinderserumalbumin Ovalbumin Carboanhydrase Trypsin-Inhibitor α-Lactalbumin 0.375 mL 0.625 mL 1.5 mL 25 µL 2.5 µL 1.5 M 0.4 % (w/v) pH 8.8 1.5 mL 1.25 mL 2.25 mL 50 µL 5 µL 2 mL 2 mL 4 mL 1 mL pH 6.8 0.25 % (w/v) 30 % (v/v) 10 % (v/v) 30 % (v/v) 10 % (v/v) (94 kDa) (67 kDa) (43 kDa) (30 kDa) (20 kDa) (14 kDa) 64 µg/µL 83 µg/µL 147 µg/µL 83 µg/µL 88 µg/µL 121 µg/µL 19 Materialien 2.4.3 Proteincharakterisieruing Elektroblotten Blotting-Puffer Tris Glycin SDS Methanol 25 mM 200 mM 0.01 % (w/v) 20 % (v/v) pH 8.3 Ponçeau-S-Färber Ponçeau-S Methanol Essigsäure 2.5 % (w/v) 40 % (v/v) 15 % (v/v) Entfärbelösung Methanol Essigsäure 30 % (v/v) 10 % (v/v) Aktivitätstest RS-Puffer Tris MgSO4 @ 6 H2O NH4Cl DTT 10 mM 10 mM 50 mM 100 mM pH 8.0 10x Inkubationspuffer HEPES MgCl2 NH4Cl 250 mM 50 mM 250 mM pH 7.6 Acetatpuffer NaAc 3M pH 5.2 TE-Puffer Tris EDTA 10 mM 1 mM pH 7.6 ESI-Massenspektroskopie MS-Puffer 2.4.4 H2O/Acetonitril Trifluoressigsäure 80:20 0.05 % Kristallisation Dialysepuffer AviRa Kristallisationspuffer: AviRa Tris NaCl MgCl2 DTT 10 mM 10 mM 2 mM 1 mM pH 8.0 / 8.3 MES PEG-20'000 0.1 M 5-16 % pH 6.3 – 6.8 0.1 M 25 –35 % 2.5 – 5 % pH 5.6 - 6.0 AviRb MES PEG-200 PEG-3000 Renaturierungspuffer RNA HEPES KCL NaCL MgCl2 10 mM 100mM 100mM 5mM pH 7.5 20 Materialien Kristallisationskits: Crystal Screen I/II ™ 98 verschiedene Pufferlösungen zur Proteinkristallisation Wizard Screen I/II ™ 96 verschiedene Pufferlösungen zur Proteinkristallisation Wizard Cryo I/II ™ 96 verschiedene Pufferlösungen zur Proteinkristallisation JB Screen 1-10 je 24 verschiedene Pufferlösungen zur Proteinkristallisation Huber-Screen 96 verschiedene Pufferlösungen zur Proteinkristallisation Hampton Research Emerald Biostructures Emerald Biostructures Jena Bioscience eigene Herstellung 21 3 Methoden 3.1 Gentechnische Arbeitsmethoden 3.1.1 Polymerasekettenreaktion Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine Methode zur in vitro Amplifikation doppelsträngiger, linearer DNA-Fragmente. Ausgangspunkt ist ein dsDNA-Fragment, welches das zu amplifizierende Gen enthält (Templat). Zum Start der Reaktion sind zwei das Fragment flankierende primer notwendig, die mit den komplementären Strängen der Templat-DNA hybridisieren können. Nach thermischer Denaturierung der dsDNA binden die primer auf beiden Seiten des zu synthetisierenden Genabschnittes (annealing), so daß das gewünschte Fragment durch eine DNA-Polymerase synthetisiert werden kann (elongation). Durch eine zyklische Wiederholung dieser Reaktionsschritte nimmt die Menge an Genfragment exponentiell zu. Die primer können zusätzlich Spaltstellen von Restriktionsendonucleasen enthalten (Kap. 3.1.3), so daß das Fragment nach Verdau und Aufreinigung (Kap. 3.1.4) in einen Vektor mit den entsprechenden Schnittstellen ligiert werden kann (Kap. 3.1.5). Ortsgerichtete Mutagenese Eine Variante der PCR stellt die ortsgerichtete Mutagenese dar, welche sich zum gezielten Austauschen, Einfügen oder Entfernen einzelner Basenpaare plasmidischer DNA eignet. Hierzu werden komplementäre primer verwendet, welche die gewünschte Mutation enthalten. Um eine Amplifizierung der modifizierten DNA zu erreichen, werden die gleichen Zyklen wie bei der PCR durchlaufen. Anschließend wird die vom Wirtsorganismus methylierte Templat-DNA durch das Enzym DpnI verdaut. Die neusynthetisierte DNA bleibt intakt und kann transformiert werden. Zur Durchführung der ortsgerichteten Mutagenese wurde das QuikChangeTM-Kit verwendet. Als Templat dienten die Vektorsysteme AviRa-pRSETb bzw. AviRb-pRSETb sowie AviRb-pGEX-4T1 (Anhang 6.3). Tabelle 2 zeigt die typische Zusammensetzung eines QuikChangeTMAnsatzes. 22 Methoden Tabelle 2 Zusammensetzung eines QuikChangeTM -Ansatzes Templat-DNA (50 ng/µL) primer forward / reverse (10 µM) dNTP-Mix 10x Puffer Pfu Turbo-Polymerase dd H2O 1 µL je 1 µL 1 µL 5 µL 1 µL ad 50 µL Die Denaturierung der Templat-DNA erfolgte für 5 min bei 95°C, die Hybridisierung der primer für 30 sec bei 55-65°C, gefolgt von der Elongation bei 72°C für 10 min. Die neu gebildete dsDNA wurde durch Inkubation für 45 sec bei 95°C in ssDNA gespalten. Gegenüber dem Standardprotokoll wurden aufgrund des hohen G-C-Gehaltes der Streptomyceten-Gene von durchschnittlich 70% (Wright & Bibb, 1992) die Zeiten zur Denaturierung der dsDNA deutlich erhöht. Insgesamt wurden 18 Zyklen durchlaufen. Zum Verdau der Templat-DNA wurde 1 µL DpnI (10 U/µL) zugegeben und bei 37°C für 1 h inkubiert. Die amplifizierte DNA wurde gemäß Kapitel 3.1.6 in E. coli Zellen des Stammes XL1Blue transformiert. 3.1.2 DNA-Spaltung mit Restriktionsendonucleasen Restriktionsendonukleasen spalten DNA sequenzspezifisch. In der Gentechnik werden hauptsächlich Typ-II-Endonucleasen verwendet, welche unterschiedliche, meist palindrome Sequenzen von fünf bis acht Basenpaaren erkennen. Die plasmidische DNA wird dabei innerhalb der Erkennungssequenz durch Hydrolyse der Phosphodiesterbindung gespalten, so daß Fragmente mit überstehenden Enden (sticky ends) oder glatten Enden (blunt ends) gebildet werden (McClarin et al., 1986). Der Restriktionsverdau kann sowohl zu analytischen wie auch zu präparativen Zwecken verwendet werden. Die gebildeten Vektorfragmente werden dazu nach Größe voneinander getrennt, analysiert, gegebenenfalls isoliert und durch Ligation mit anderen Bruchstücken, welche entsprechende Schnittstellen aufweisen, kombiniert (Kap. 3.1.4 –3.1.5). Um optimale Bedingungen für die verschiedenen Restriktionsendonukleasen zu gewährleisten, wurden jeweils die vom Hersteller empfohlenen Inkubationspuffer verwendet. Verdaut wurde für 1 h bei 37°C. Die typische Zusammensetzung eines analytischen und eines präparativen Verdaus ist in Tabelle 3 gezeigt. 23 Methoden Tabelle 3 Zusammensetzung eines Restriktionsverdaus DNA –Lösung (150-200 ng/µL) 10x Restriktionsendonuklease-Puffer Restriktionsendonukleasen (10 U/µL) dd H2O 3.1.3 präparativ 10 µg 3 µL je 2 µl ad 30 µL analytisch 100 ng 1 µL je 1 µL ad 10 µL Agarose-Gelelektrophorese DNA-Fragmente können durch Agarose-Gelelektrophorese ihrer Größe nach aufgetrennt werden. Im alkalischen Milieu ist DNA pro Basenpaar zweifach negativ geladen und wandert somit im elektrischen Feld zur Anode. Dabei werden die einzelnen Fragmente aufgrund des Molekularsiebeffekts durch die porenartige Struktur der Agarose getrennt. Die Porengröße hängt dabei von der Agarosekonzentration ab. Zur Trennung von DNA-Fragmenten zwischen 200 bp und 10'000 bp werden in der Regel 1-2%ige Gele verwendet. Die Detektion erfolgt durch den Farbstoff Ethidiumbromid, der die Basenpaare der DNA interkaliert und einen bei 254 nm orange-fluoreszierenden Komplex bildet (Sharp et al., 1973). Die Größe der einzelnen Fragmente wird durch Vergleich mit einem Kilobasenstandard bestimmt. In vorliegender Arbeit wurden 1%ige Agarosegele verwendet. Die Agarose wurde hierzu in TAE-Puffer erhitzt, bis eine klare Lösung entstanden war. Diese wurde nach Abkühlen auf ca. 40°C mit Ethidiumbromid versetzt (0.5 µg/mL) und in einen Gelträger gegossen. Die DNA-Proben wurden mit 1/3 des Probenvolumens an Agaroseprobenpuffer versetzt und nach Erstarren des Gels in die Probentaschen pipettiert. Die Elektrophorese erfolgte bei 120 mA für 60-90 min. Die DNA-Fragmente wurden zu präparativen Zwecken mit dem QIAquick® Gel Extraction-Kit (Quiagen) aus dem Gel isoliert. Das zu isolierende DNA Fragment wurde zuerst mit einem Skalpell aus dem Gel ausgeschnitten und in einem Puffer hoher Ionenstärke aufgelöst. Zur Aufreinigung der DNA wird deren Affinität zu einer Silikatmatrix ausgenutzt. Es wurde nach Herstellerangaben vorgegangen, die Elution erfolgte mit 30 µL TE-Puffer (10 mM Tris, pH 7.6). 3.1.4 Ligation Als Ligation wird die durch eine Ligase katalysierte Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen einer 5'-Phosphatgruppe und einer 3'-Hydroxylgruppe doppelsträngiger DNA bezeichnet. Zwei unterschiedliche Vektorfragmente, die an ihrem Ende entsprechende überlappende Sequenzen aufweisen, können so miteinander kombiniert werden. In vorliegender Arbeit wurden die Enden eines durch PCR generierten 24 Methoden Genfragmentes und ein Vektor gemäß Kapitel 3.1.2 mit den gleichen Restriktionsendonucleasen geschnitten, durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt und anschließend das Genfragment in den Vektor ligiert. Um eine Selbstligation des Vektors zu verhindern, wurde dieser zunächst unter Verwendung der Calf-intestine-alkalinePhosphataseTM (CIAP) gemäß Herstellerangaben für 30 min bei 37°C dephosphoryliert. Zur Ligation wurde das Rapid-DNA® Ligations-Kit (MBI Fermentas) verwendet. Es wurden 100 ng Vektor eingesetzt, das Genfragment in einem 5- bis 10-fachen molaren Überschuß zugegeben und die Ligation nach Herstellerangaben für 30 min bei 22°C durchgeführt. 3.1.5 Kompetente Zellen und Transformation Bei der Transformation von Plasmiden in den E. coli Stamm XL1Blue wurden superkompetente Zellen der Firma Stratagene verwendet. Kompetente Zellen der Stämme BL21(DE3) und B834(DE3) wurden folgendermaßen hergestellt: Die entsprechenden Zellstämme wurden bei 37°C in 150 mL LB-Medium bis zu einer optischen Dichte von 0.4 kultiviert und durch Zentrifugation (5 min, 4000∗g) pelletiert. Die Zellen wurden zweifach mit kalter CaCl2-Lösung (15 mL, 80 mM) gewaschen und anschließend in 2 mL dieser Lösung resuspendiert. Nach Zugabe von 140 µL DMSO wurde die Zellsuspension portionsweise bei -80°C eingefroren. Die Plasmidtransformation erfolgte in allen Fällen nach der Hitzeschock-Methode, welche auf der erhöhten Permeabilität der Membran bei einer kurzzeitigen Temperaturerhöhung beruht (Hanahan, 1983). Die kompetenten Zellen wurden auf Eis aufgetaut, je 50-100 µL der Zellsuspension mit 100 ng plasmidischer DNA versetzt und 10 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Zellen für 30-45 sec einem Hitzeschock von 42°C ausgesetzt, so daß die Plasmide durch die Zellmembran gelangen konnten. Nach Zugabe von 400 µL vorgewärmtem SOC Medium wurde der Transformationsansatz mit einem Drygalski-Spatel auf LBA-Agarplatten plattiert (450 µL bei Ligationsansätzen, sonst 50-100 µL) und für 12 h bei 37°C inkubiert. Lediglich Zellen, die Plasmide aufgenommen haben, können aufgrund der plasmidkodierten Ampicillinresistenz Kolonien ausbilden. 3.1.6 Plasmidpräparation Die Isolierung plasmidischer DNA erfolgte mit dem E.Z.N.A.TM Plasmid Miniprep Kit II der Firma PeqLab. Das Funktionsprinzip des Kits beruht auf der alkalischen Extraktion nach Sambrook et al. (1989), welche die selektive Denaturierung Methoden 25 chromosomaler DNA bei pH-Werten zwischen 12 und 12.5 ausnutzt. Plasmidische DNA bleibt unter diesen Bedingungen in Lösung und kann durch Bindung an geeignete Säulenmaterialien isoliert und gereinigt werden. Die Plasmidpräparation wurde nach Herstellerangaben durchgeführt. Die Elution der plasmidischen DNA erfolgte mit 50 µL vorgewärmtem (65°C), autoklaviertem Reinstwasser. 3.1.7 DNA-Sequenzierung Alle DNA-Sequenzierungen wurden von der Firma Sequence Laboratories Göttingen GmbH (Seqlab) gemäß einer Variante der Didesoxymethode nach Sanger (1981) durchgeführt. Hierbei werden zur DNA-Polymerisation neben den Desoxynukleotiden statistisch fluoreszenzmarkierte Didesoxynukleotide eingebaut, wobei es zum Abbruch der Polymerisation kommt. Die einzelnen Fragmente werden anschließend elektrophoretisch aufgetrennt. Mit Hilfe der je nach Base unterschiedlichen Fluoreszensmarker der Didesoxynukleotide kann die Sequenz bestimmt werden. Es wurden jeweils 3 µg plasmidische DNA eingeschickt. Als primer der Polymerisation dienten der Standard T7 Polymerase- bzw. die Standard pGEX3' und pGEX5' primer. 3.2 Proteinpräparation 3.2.1 Bakterienkultivierung und Zellaufschluß Zur Bakterienkultivierung wurden 15 mL LBA-Medium mit einer Einzelkolonie von einer LBA-Agarplatte beimpft und bei 37°C bis zu einer OD600 von 0.8-1.0 kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (4500∗g, 5 min) geerntet und das Zellpellet in 400 µL LBA-Medium resuspendiert. Die Hauptkulturen (330 mL LBA-Medium, in 1 L Erlenmeyerkolben mit Schikane) wurden mit je 200 µL der Zellsuspension beimpft und bis zu einer OD600 von 0.6-0.7 kultiviert (37°C, 190 rpm). Die Induktion erfolgte mit einer Endkonzentration von 1 mM IPTG. Anschließend wurde die Wachstumstemperatur zur Verringerung der Menge an Einschlußkörpern auf 25°C bei AviRa bzw. 20°C bei AviRb gesenkt. Die Zellernte erfolgte nach 15 h durch Zentrifugation (13'000∗g, 10 min), die Zellpellets wurden bei -20°C bis zur Weiterverarbeitung eingefroren. Die tiefgefrorenen Zellpellets wurden aufgetaut und in 3 mL des entsprechenden Lysepuffers pro Gramm Pellet resuspendiert. Zum Abbau von DNA und RNA wurde Benzonase (10 U/µL, 1 µL/30 mL), zum Erhalt einer reduktiven Umgebung DTT (2 mM) hinzugegeben. Der Zellaufschluß erfolgte durch Ultraschall. Die eisgekühlte Zellsuspension 26 Methoden wurde dabei einem Puls von 5 sec ausgesetzt, welchem eine Pause von 12 sec folgte. Die Gesamtschallzeit betrug 45 sec pro Gramm Zellpellet. Unlösliche Zellbestandteile wurden durch Zentrifugation (SS34, 26'000∗g, 40 min) pelletiert. Der Überstand wurde filtriert und als Rohextrakt weiterverarbeitet. Inkorporation von Selenomethionin Zur Lösung des Phasenproblems der Kristallographie läßt sich das anomale Signal von Schweratomderivaten, deren Absorptionskante im Wellenbereich der Röntgenstrahlung liegt, ausnutzen (Kap. 3.5.9). Eine Möglichkeit zur Inkorporation eines solchen Elementes ist das Ersetzen der Aminosäure Methionin durch Selenomethionin (SeMet). Dies kann entweder durch die Inhibition der Methionin-Biosynthese (VanDuyne et al., 1993; Doublie & Carter, 1992) oder durch die Verwendung eines Methionin-auxotrophen Stammes (Cowie & Cohen,1957; Doublie, 1997) geschehen. In beiden Fällen wird das Protein unter Zugabe von SeMet exprimiert. Bei der Produktinhibition wird dem Medium bei Induktion zusätzlich eine Mischung aller AS der Pyruvat- und Aspartat-Familie zugesetzt, um die Synthese von Methionin im Organismus zu reprimieren. Bei der Verwendung des auxotrophen Stammes ist durch die Defizienz der Cystathionin-γ-Synthase eine vollständige Inkorporation von SeMet in das Protein garantiert. Allerdings muß die Bakterienkultivierung in einem aufwendig herzustellenden Medium, dem LeMaster Medium (Hendrickson et al., 1990), erfolgen. Zudem sinkt die Expressionsrate, da das Bakterienwachstum im LeMaster Medium deutlich gehemmt ist. Bei der Herstellung des Mediums werden zunächst sämtliche Basen und alle Aminosäuren bis auf Methionin einzeln eingewogen und zusammen mit den Puffersubstanzen (Kap. 2.4.1) autoklaviert. Das abgekühlte Medium kann dann mit den Medienzusätzen komplettiert werden. In vorliegender Arbeit wurde die Methode nach LeMaster gewählt. Im Vergleich zum WT wurde die Menge an Medium verdoppelt und zur Beimpfung der Kolben die zweifache Menge an Zellsuspension verwendet. Die Bakterienkultivierung und der Zellaufschluß erfolgten wie beschrieben. 27 Methoden 3.2.2 Proteinreinigung Folgendes Flußdiagramm (Abbildung 10) faßt die Proteinreinigung von AviRa und die beiden angewendeten Strategien zur Reinigung von AviRb zusammen. Die einzelnen Arbeitsschritte werden im folgenden näher erläutert. Reinigung von AviRa Reinigung von AviRb Kationenaustauschchromatographie Anionenaustauschchromatographie Affinitätschromatographie: GSTrapFF Dialyse + Konzentration Farbstoffsäule Gelpermeationschromatographie Kristallisation Gelpermeationschromatographie Konzentration Konzentration Kristallisation Kristallisation Abbildung 10 Flußdiagramm der Proteinreinigung von AviRa und AviRb. Ionenaustauschchromatographie Bei der Ionenaustauschchromatographie (IEC) werden Interaktionen zwischen geladenen Proteinmolekülen und einer entgegengesetzt geladenen Matrix ausgenutzt (Sternbach, 1991). An eine Agarose- oder Polystyrolmatrix sind hierzu über einen Linker geladene Gruppen wie quartäre Aminoalkylgruppen (Anionenaustauscher) oder Sulfonate (Kationenaustauscher) gebundenen. Ihre Bindungsaffinität zu verschiedenen Proteinen hängt von deren Nettoladung bei einem vorgegebenen pH-Wert ab. Zur Elution dient ein Salzgradient. Die Ionen konkurrieren dabei mit den Proteinmolekülen, so daß diese in Abhängigkeit ihrer Nettoladung eluiert werden. AviRa wurde mit Hilfe eines Kationenaustauschers gereinigt. Aufgrund des hohen pI von 9.9 ist AviRa auch bei einem pH von 8.8 noch positiv geladen und kann an die Sulfonat-Gruppen der verwendeten Source 30S binden. Die Reinigung von AviRb erfolgte aufgrund eines deutlich niedrigeren pI von 6.2 durch eine Anionaustauschchromatographie bei einem pH von 7.8. Die verwendeten Säulenmaterialien sind in Tabelle 4 zusammengestellt. Die proteinhaltigen Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE untersucht. Fraktionen, die AviRa bzw. AviRb enthielten, wurden vereinigt. 28 Methoden Tabelle 4 Parameter der verwendeten Ionenaustauscher Säulenmaterial Partikelgröße [µm] Säulen-∅ [mm] Säulenhöhe [mm] Säulenvolumen [mL] Equilibrierung [Vt] Auftragsfluß [mL/min] Waschvolumen [Vt] Salzgradient [mM] Flußrate [mL/min] Fraktionsvolumen [mL] Detektion [nm] Temperatur [°C] Kationenaustauscher Source-30S 30 32 66 53 3 3.0 3 10-1000 3.0 5.0 280/260 7 Anionenaustauscher Source-30Q 30 25 65 30 3 3.0 3 100-1000 3.0 3.0 280/260 7 Farbstoffsäulen Nukleotid-bindende Proteine zeigen vielfach eine hohe Affinität zu Textilfarbstoffen, die sich allerdings nur bedingt auf Ähnlichkeiten zwischen Farbstoff und Substrat bzw. Kofaktor zurückführen läßt (Hughes et al., 1982). Die Elution erfolgt wie bei der IEC durch Anlegen eines Salzgradienten. Bei der Reinigung von AviRb wurde als zweiter Reinigungsschritt nach der IEC eine Agarosematrix mit dem gebundenem Farbstoff Reactive-Blue-4 TM verwendet (Abbildung 11). Abbildung 11 Strukturformel des an Agarose gebundenen Farbstoffes Reactive-Blue-4 TM . Die AviRb-haltigen Fraktionen der IEC wurden hierzu vereinigt und die Salzkonzentration auf 150 mM NaCl eingestellt. Nach Auftrag auf die Farbstoffsäule wurden schlechter bindende Verunreinigungen bei einer Salzkonzentration von 250 mM abgetrennt. In einer zweiten Stufe erfolgte die Elution von AviRb durch einen Gradienten von 250 mM auf 1 M NaCl (2 CV). Die technischen Daten der verwendeten Säule sind in Tabelle 5 zusammengestellt. Die proteinhaltigen Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE untersucht. Fraktionen, die AviRb enthielten, wurden vereinigt. 29 Methoden Tabelle 5 Parameter der Reactive-Blue-4 TM-Säule Säulenmaterial Säulen-∅ [cm] Säulenhöhe [cm] Säulenvolumen [mL] Equilibrierung [Vt] Auftragsfluß [mL/h] Waschen [Vt] Salzgradient [mM] Fluß [ml/min] Fraktionsvolumen [mL] Temperatur [°C] Agarose 1.5 9.9 17.5 3 3 3 150-2000 4 2.5 7 Reinigung von Glutathion-S-Transferase-Fusionsproteinen Sind zur Stabilisierung des exprimierten Proteins hohe Salzkonzentrationen im Aufschlußpuffer notwendig, ist eine Reinigung mittels IEC bzw. Farbstoffsäulen nicht möglich, da das Protein bei hoher Ionenstärke nicht mehr an die Säulenmatrix bindet. Eine Alternative stellt die Expression und Reinigung als Fusionsprotein dar. Grundlage ist ein Vektorsystem (pGEX-4T1), welches am 5'-Ende der für das gewünschte Protein codierenden Sequenz die DNA-Sequenz für das Enzym Glutathion-S-Transferase (GST) enthält (Frangioni & Neel, 1993). Auf diese Weise wird ein Fusionsprotein zwischen GST und dem Zielprotein amplifiziert. Die Proteinreinigung durch Affinitätschromatographie beruht auf spezifischen Wechselwirkungen zwischen dem GST-Fusionsprotein und den Liganden der stationären Phase, in diesem Fall an Sepharose gebundenem Glutathion. Die Elution erfolgte mit reduziertem Glutathion. In vorliegender Arbeit wurde AviRb als GSTFusionsprotein exprimiert und gereinigt. Die technischen Daten der verwendeten GSTrapFF-Säule sind in Tabelle 6 enthalten. Tabelle 6 Parameter der GSTrapFF TM-Säule Säulenmaterial Säulen-∅ [cm] Säulenhöhe [cm] Säulenvolumen [mL] Equilibrierung [Vt] Auftragsfluß [mL/h] Waschen [Vt] Fluß [mL/min] Fraktionsvolumen [mL] Temperatur [°C] Agarose 1.6 2.5 5.0 5 2 30 4 2 7 30 Methoden Die Linkersequenz zwischen GST und Zielprotein enthält meist eine spezifische Proteasespaltstelle, so daß das Fusionsprotein nach erfolgter Reinigung gespalten werden kann. Im pGEX-4T1-System enthält der Linker eine für die Serinprotease Thrombin spezifische Spaltstelle (Pro-Arg-↓-Gly-Asn). Es wurden zwei verschiedene Methoden zur Thrombinspaltung angewendet. Schemata der beiden Reinigungsstrategien sind in Abbildung 12 einander gegenübergestellt. Rohextrakt: Elution mit Glutathion Dialyse ThrombinSpaltung Abtrennung GST Legende: Durchfluß: ThrombinSpaltung GST Waschen AviRb GST -AviRb Glutathion div. Proteine Abbildung 12 Schema der Reinigung von GST-Fusionsproteinen mit Thrombinverdau. Oberer Weg: off-column cleavage; unterer Weg: on-column cleavage. Bei der Methode der off-column cleavage (Abbildung 12, oben) wurde das Fusionsprotein durch Affinitätschromatographie gereinigt, mit Glutathion (20 mM) eluiert und für 4 h gegen Lysepuffer dialysiert. Zur Spaltung wurden 12 U Thrombin pro mg Fusionsprotein (2 mg/mL) amplifiziert und für 18 h bei 20°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von PMSF (10 µM), welches die Serinprotease irreversibel hemmt, beendet. Anschließend wurde GST und ungeschnittenes Fusionsprotein durch erneute Affinitätschromatographie mit der GSTrapFFTM-Säule abgetrennt. AviRb allein zeigt keinerlei Affinität zu Glutathion und befindet sich im Durchfluß. Zur Vereinfachung der Reinigung kann das Fusionsprotein auf der Affinitätssäule gespalten werden (on-column cleavage; Abbildung 12, unten). Hierzu wurde Thrombin (300 U) in Lysepuffer gelöst (6 mL) und auf die GST-Säule mit gebundenem Fusionsprotein aufgetragen. Um eine gleichmäßige Verteilung der Serinprotease zu gewährleisten, wurde eine Apparatur entwickelt, bei dem die Thrombin-haltige Lösung bei niedrigem Fluß (0.4 mL/min) ständig zirkulierte. Die Säule wurde nach der Spaltung (18 h, 31 Methoden 20°C) zuerst mit vier Säulenvolumen Lysepuffer gewaschen. Proteinhaltige Fraktionen wurden vereinigt und zur Vermeidung unspezifischen Verdaus ebenfalls PMSF (10 µM) zugegeben. Die Elution von GST erfolgte anschließend mit Glutathion (20 mM, 3 CV). Die Ausbeute an gereinigten Protein ist bei der Methode der on-column cleavage durch die Verringerung der Arbeitsschritte in der Regel höher. Allerdings läßt sich die zur Spaltung optimale Konzentration an Thrombin nicht genau bestimmen, da die Menge an Fusionsprotein lediglich abgeschätzt werden kann. Ein unvollständiger Verdau bzw. unspezifische Spaltung durch zu geringe bzw. zu große Mengen an Thrombin sind daher nicht auszuschließen. Gelpermeationschromatographie Bei der Gelpermeationschromatographie (GPC) werden Proteine aufgrund des Molekularsiebeffektes getrennt. In Abhängigkeit von ihrer Größe können Proteine unterschiedlich gut in die poröse Polydextranmatrix der stationären Phase eindringen. Kleinere Proteine haben eine längere Verweildauer und eluieren später. Durch den Vergleich der Elutionsdauer eines Proteins mit der von Eichproteinen läßt sich bei bekannter Molekularmasse der Oligomerisierungsgrad bestimmen. Unspezifische ProteinProtein-Wechselwirkungen und Interaktionen mit dem Säulenmaterial können durch einen salzhaltigen Puffer minimiert werden. Die GPC wurde bei der Reinigung von AviRb verwendet. Die Proben wurden mit Hilfe von Konzentratoren von VIVASPIN (15 mL, MWCO 50 kDa) auf 5-7 mg/mL konzentriert. Das Volumen der aufgetragenen Probe betrug maximal 1% des Säulenvolumens. Die Daten der verwendeten Dextransäulen sind in Tabelle 7 zusammengefaßt. Die einzelnen Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE untersucht. AviRbhaltige Fraktionen wurden vereinigt, konzentriert und kristallisiert. Tabelle 7 Parameter der verwendeten Superdex-Säulen 1 Säulenbezeichnung Säulenmaterial optimaler Trennbereich [kDa] Säulen-∅, -höhe [cm] Säulenvolumen [mL] Auftragsvolumen [mL] Fluß [mL/min] Fraktionsvolumen [mL] Detektion [nm] Temperatur [°C] 1 S200 16/60 Agarose mit Dextran 20-600 1.6 / 60 120 0.8-1.0 0.5 1.5 280 / 260 7 S75 16/60 Agarose mit Dextran 10-70 1.6 / 60 120 0.8-1.0 0.5 1.5 280 / 260 7 Die Eichgeraden der verwendeten Säulen befinden sich in Anhang 6.5. 32 Methoden 3.3 Proteincharakterisierung 3.3.1 Bestimmung der Proteinkonzentration Die Konzentration einer proteinhaltigen Lösung läßt sich durch Bestimmung der UV-Absorption bei 280 nm (A280) ermitteln. Nach dem Lambert-Beerschen Gesetz gilt: c = mit A280 ⋅ M r ε 280 ⋅ d Gleichung 1 d = Schichtdicke der Küvette, 1 cm Mr = Molekularmasse des Proteins ε280 = molarer dekadischer Extinktionskoeffizient des Proteins bei 280 nm Der molare dekadische Extinktionskoeffizienz läßt sich unter Kenntnis der Aminosäuresequenz und der Anzahl an Cystinen nach Gill und Hippel (1998) bestimmen. ε 280 = (nTrp ⋅ 5690 + nTyr ⋅ 1280 + nCystin ⋅ 120) ⋅ M −1cm −1 mit Gleichung 2 naar = Anzahl der entsprechenden Aminosäure im Protein In der Aminosäuresequenz von AviRa finden sich 2 Tryptophane und 5 Tyrosine; AviRb besitzt 5 Tryptophane und 4 Tyrosine. Aufgrund des reduktiven Milieus in der Zelle kommen bei cytosolischen Proteinen meist keine Disulfidbrücken vor. Die molekularen Extinktionskoeffizienten berechnen sich nach Gleichung 2 zu: ε280(AviRa) = 17'780 M-1 cm-1 3.3.2 ε280(AviRb) = 32'920 M-1 cm-1 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Der Verlauf der Präparation und der Reinheitsgrad der Proteinproben wurden mit diskontinuierlicher SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese kontrolliert. Die Nettoladung des Proteins wird dabei durch Zugabe des anionischen Detergenz SDS maskiert, das sich im Molekularmassenverhältnis von 1.4 : 1 an die Proteinoberfläche anlagert. Diese anionischen Mizellen wandern im elektrischen Feld zur Kathode und werden durch den Molekularsiebeffekt eines Geles aus Acrylamid (12%, pH 8.8) und quervernetzendem N,N'-Methylbisacrylamid ihrer Größe nach getrennt. Die Vorfokussierung der Banden erfolgt in einem 6%igen Sammelgel (Righetti et al., 1990). Die zu untersuchenden Proteinlösungen (3-10 µg) wurden mit 5-8 µL SDSProbenpuffer versetzt und durch zweiminütige Inkubation bei 100°C vollständig denaturiert. Die Elektrophorese erfolgte bei konstanter Stromstärke (45 mA) bis die Bromphenolblaubande die untere Gelkante erreicht hatte. Die Gele wurden mit Coomassie Brilliant Blue R-250 gefärbt. 33 Methoden 3.3.3 Elektroblotting und N-terminale Proteinsequenzierung Beim Elektroblot werden Proteine nach elektrophoretischer Trennung durch ein senkrecht zum Polyacrylamidgel angelegtes elektrisches Feld auf eine inerte Polyvinylidenfluoridmembran (PVDF) transferiert und dort immobilisiert (Abbildung 13). Einzelne Proteinbanden können zur N-terminalen Sequenzierung aus der Membran isoliert werden. Geblottet wurde bei einer Stromstärke von 150 mA und einer Leistung von 8 W für 60 min. Die PVDF-Membran wurde mit Ponçeau S gefärbt und die zu sequenzierende Bande aus der Membran ausgeschnitten. Abbildung 13 Schematische Darstellung des Aufbaus einer Blotting-Apparatur. WhatmanPapiere, PVDF-Membran und SDS-Gel sind mit Transferpuffer getränkt (Quelle: Lotspeich, 1998). Der Mechanismus der N-terminalen Proteinsequenzierung entspricht einer wiederholten Durchführung des Edman-Abbaus (Findlay & Geisow, 1989). Die Ausbeute pro abgespaltener Aminosäure beträgt 95%, es können daher maximal 30-40 Aminosäuren identifiziert werden. Verwendet wurde ein Gasphasensequenator (Applied Biosystem), an den zur Analyse der abgespaltenen Aminosäuren eine HPLC angeschlossen war. Die N-terminale Sequenzierung wurde in vorliegender Arbeit vor allem zur Analyse der Spaltprodukte des Thrombinverdaus bei der Präparation von AviRb angewendet. 3.3.4 Molekularmassenbestimmung durch Massenspektrometrie Die molekulare Masse von Proteinen läßt sich durch Elektronspray- Massenspektroskopie (ESI-MS) mit einer Genauigkeit von 0.02% bestimmen (Przybylski & Glockner, 1996). Hierzu werden die Proben zunächst über eine HPLC auf ein Puffergemisch aus Wasser und Acetonitril mit einem Trifluoressigsäurezusatz (TFA, 0.5%) umgepuffert (MS-Puffer). Die Zugabe an TFA dient der Signalverstärkung (Kuhlmann et al., 1995). Die Probenlösung wird nun direkt durch eine Mikrokapillare mit Metallspitze 34 Methoden gepumpt. Ein elektrisches Feld (2-5 kV) zwischen der Kapillarspitze und der Ionisierungskammer erzeugt geladene Aerosoltröpfchen. Durch schnelle Zerstäubung der Tröpfchen werden die Makromoleküle desolvatisiert und ionisiert (Abbildung 14). Abbildung 14 Schematische Darstellung der Bildung von Makro-Ionen (Quelle: Przybylski & Glockner, 1996). Die mehrfach geladenen, desolvatisierten Makro-Ionen werden im elektrischen Feld beschleunigt und ihr Verhältnis aus Masse und Ladung durch einen Quadrupol-Analysator bestimmt. Aus dem so erhaltenen charakteristischen Positivspektrum läßt sich ein Molekularmassen-Spektrum generieren. Die ESI-MS-Messungen wurden zur Überprüfung der Inkorporation von Selenomethionin bei der Präparation von AviRa und AviRb am Institut für Organische Chemie und Biochemie von Herrn Christian Warth durchgeführt. 3.3.5 Bestimmung der enzymatischen Aktivität Zum Nachweis der rRNA-Methyltransferase-Aktivität von AviRa und AviRb wurde Tritium-markiertes AdoMet mit einem Gemisch an 16S- und 23S-rRNA umgesetzt (Bechthold & Floss, 1994). Zur Vermeidung des Abbaus von RNA durch RNasen wurde RNase-Blocker zugegeben. Ein typischer Reaktionsansatz ist in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8 Zusammensetzung eines Reaktionsansatzes für den Aktivitätstest Enzymlösung (2 mg/mL) 16S- / 23S-rRNA (21 pmol, 4 µg/µL) AdoMet (Tritium markiert, 0.1 mM, 1 µCi/mL) RNase Blocker (40 U/µL) 10x Inkubationspuffer RS-Puffer 2 µL 8 µL 5 µL 2 µL 10 µL ad 100 µL Die Reaktionsansätze wurden für 30 min bei 37°C inkubiert. Danach wurde die Reaktion durch Zugabe von 100 µL Phenol/Chloroform beendet. Die Phasen wurden durch Zentrifugation (12'000∗g, 10 min) separiert, 80 µL der wäßrigen Oberphase abgenommen 35 Methoden und 10 µL Natriumacetat (3 M, pH 5.2) zugegeben. Die RNA wurde durch Ethanol (100%, 500 µL) bei -20°C innerhalb von 15 h präzipitiert. Nach Zentrifugation (14'000∗g, 60 min) wurde der Überstand verworfen und die rRNA mit Ethanol (70%, 500 µL) gewaschen. Die rRNA wurde erneut pelletiert (14'000∗g, 30 min), der Überstand verworfen und das Pellet in 1 mL TE-Puffer resuspendiert. Die rRNA-Reinigung erfolgte über NAP5-Säulen. Die Radioaktivität der methylierten RNA wurde nach der Aufreinigung in einem Szintillationszähler bestimmt. Die Proben wurden mit einem Szintillationscocktail (Lothiszintecopula Universalcocktail, 16 mL) versetzt. Dieser besteht aus einer Mischung von organischen Lösungsmitteln und Fluorophoren (Szintillatoren), die durch die Kernemission des β--Strahlers angeregt werden. Die Energie des Tritium wird dabei zunächst auf das Lösungsmittel übertragen, welches den primären Szintillator (2,5-Diphenoloxazol) anregt. Die vom Primärszintillator ausgesendeten, kurzwelligen Photonen werden vom Sekundärszintillator (1,4-Di-[2-(5-phenoloxazoyl)]-benzol) absorbiert. Dieser emittiert ein längerwelliges Licht, welches durch einen Photomultiplier detektiert werden kann (Abbildung 15). angeregtes Lösungsmittel angeregter primärer Szintillator angeregter sekundärer Szintillator Strahlung Detektion Lösungsmittel Abbildung 15 primärer Szintillator sekundärer Szintillator Darstellung der Energieübertragung des Szintillationsprozesses. Die Messung der Radioaktivität erfolgte in Meßintervallen von 10 sec über insgesamt 10 min. Jede Messung wurde mindestens dreifach durchgeführt, als Nullwert diente eine Probe ohne Protein, die analog behandelt wurde. 3.3.6 Dynamische Lichtstreung Die Dynamische Lichtstreuung (DLS) kann zur Bestimmung der Molekularmasse, Reinheit und Homogenität einer Proteinprobe verwendet werden. Die statistischen Bewegungen der Proteinmoleküle verursachen bei der Streuung von monochromatischem Licht Fluktuationen der Intensität, wodurch sich der Diffusionskoeffizient D bestimmen läßt (Burchard, 1995). Mit Hilfe der Stokes-Einstein-Beziehung ergibt sich daraus der hydrodynamische Radius (Gleichung 3). 36 Methoden RH = k ⋅T 6π ⋅ D ⋅ η mit Gleichung 3 RH = hydrodynamischer Radius k = Boltzmann Konstante [J·K-1] T = absolute Temperatur [K] η = Viskosität des Lösungsmittels [kg·m-1·s-1] D = Diffusionskoeffizient [m2·s-1] Aus dem hydrodynamischen Radius läßt sich unter Annahme eines globulären Partikels und Vernachlässigung von Lösungsmitteleffekten, die Molekularmasse bestimmen. Gleichung 4 4 M R = π ⋅ RH ⋅ ρ 3 mit ρ = Dichte des Partikels [g·cm-3], Proteine: 1.377 g·cm-3. Die DLS gibt zudem Aufschluß über die Homogenität und damit die Kristallisierbarkeit einer Probe (D'Arcy, 1994; Ferré-D'Amaré & Burley, 1997). Liegt ein Protein monomodal vor, ist die Wahrscheinlichkeit der Kristallbildung höher. Die Monomodalität wird in Form der sogenannten baseline angegeben, die im Idealfall 1.000 beträgt. Die DLS-Messungen erfolgten bei einer Proteinkonzentration von 0.5 mg/mL in GPC-Puffer. Um Schwebeteilchen abzutrennen, wurden die Proben vor der Messung zentrifugiert (16'000∗g, 20 min, 4°C). Es wurde eine Versuchsreihe mit 40 Messungen durchgeführt und mit der Auswerteprogramm DynaPro-801 (Fa. Protein Solutions) analysiert. 3.4 Kristallisationsmethoden 3.4.1 Kristallisation von Proteinen Zur Aufklärung von Proteinstrukturen durch Röntgendiffraktion sind hochgeordnete, dreidimensionale Proteinkristalle ausreichender Größe notwendig. Die Kristallisation von Proteinen ist der am wenigsten verstandene Prozeß der Röntgenstrukturanalyse. Die am häufigsten verwendeten Methoden zur Kristallisation beruhen auf dem langsamen Entzug von Lösungsmittel aus einer Proteinlösung, wodurch sich die Konzentration des zugesetzten Fällungsmittels erhöht. Wird die Löslichkeitsgrenze überschritten, können sich in der übersättigten Lösung Kristallkeime bilden. Durch das langsame Wachsen der Kristalle sinkt die Proteinkonzentration und das System geht im 37 Methoden Idealfall in die metastabile Phase über. In dieser Phase werden keine weiteren Kristallisationskeime gebildet, das Kristallwachstum schreitet jedoch fort. Dieser Prozeß hängt von vielen Faktoren, wie Art und Menge des Fällungsmittel, Proteinreinheit und -konzentration, pH-Wert, Zahl der Kristallisationskeime und Temperatur, ab (Gilliland & Ladner, 1996). Die Vorhersage von geeigneten Kristallisationsbedingungen ist daher unmöglich. Eine systematische Variation aller Parameter ist aufgrund des hohen Zeitaufwandes und der meist begrenzten Menge an verfügbarem, reinem Protein nicht durchführbar. Zum Auffinden initialer Kristallisationsbedingungen werden daher sogenannte "screenings" durchgeführt, bei denen die einzelnen Parameter in Schritten variiert sowie verschiedene Puffersysteme und Fällungsmittel kombiniert werden, damit ein möglichst breiter Bereich abgedeckt wird (Carter & Carter, 1979; Cudney et al., 1994). Außerdem werden bisher erfolgreiche Kristallisationsbedingungen statistisch analysiert und mit einbezogen (Jancarik & Kim, 1991). Verschiedene solcher Kristallisationskits sind mittlerweile kommerziell erhältlich. Als Fällungsmittel dienen dabei Salze, organische Lösungsmittel oder auch lösliche Polymere wie Polyethylenglycol (PEG). Proteinkristalle aus den initial erhaltenen Bedingungen können durch eine feinere Variation der Parameter optimiert werden. Zusätzlich kann die Kristallisation durch Einführung gezielter Mutationen an der Proteinoberfläche beeinflußt werden (Price & Nagai, 1995). Gasphasendiffusion, batch-Verfahren und die Dialysemethode sind die gängigsten Verfahren zur Proteinkristallisation (McPherson, 1990). In vorliegender Arbeit wurden zwei Varianten der Gasphasendiffusion angewendet, die hanging drop Methode und die sitting drop Methode. In beiden Fällen wird die Proteinlösung mit Kristallisationspuffer in einem Tropfen gemischt und über der Reservoirlösung an einem Deckplättchen aufgehängt bzw. auf ein Plateau gesetzt (Abbildung 16). Durch Abdichten mit Silikonöl bzw. durch Abkleben mit Crystal-Clear-TapeTM entsteht ein geschlossenes System. Abbildung 16 Schema der hanging drop Methode (links) und der sitting drop Methode (rechts). 38 Methoden Die Konzentration an Fällungsmittel ist im Kristallisationstropfen geringer als im Reservoir, so daß diesem durch Gasphasendiffusion bis zum Konzentrationsausgleich Wasser entzogen wird. Dadurch steigen Protein- und Fällungsmittelkonzentration im Tropfen langsam an und die Lösung erreicht die übersättigte Phase. Zur Durchführung der initialen Kristallisationsexperimente wurde vorwiegend die sitting drop Methode verwendet. In die 96er Crystal-Clear TM-Boxen der Firma Hampton Research wurde 60 µL Fällungsmittel pipettiert. Der Tropfen bestand aus je 1 µL Proteinlösung und Reservoirpuffer. Zur Verfeinerung der Bedingungen diente die hanging drop Methode. Das Reservoir in den verwendeten 24er Boxen enthielt 500 µL Puffer, der am silikonisierten Deckplättchen hängende Tropfen bestand aus 2.5-4 µL Protein und 2-4 µL Kristallisationspuffer. Die Kristallisationsboxen wurden bei 20°C gelagert. 3.4.2 Tränken von Kristallen Der Lösungsmittelgehalt von Proteinkristallen beträgt etwa 50%, es existiert ein verzweigtes Netzwerk von Lösungsmittelkanälen. Kleine organische Moleküle können durch diese Kanäle zu spezifischen Bindungsstellen im Kristall diffundieren. Isomorphe Schwermetallderivate oder Protein-Substrat-Komplexe können daher durch Tränken (soaking) von Kristallen in den entsprechenden Lösungen hergestellt werden (Petsko, 1985). Die Erzeugung von Schweratomderivaten dient der Lösung des Phasenproblems der Röntgenstrukturanalyse. Durch die Strukturlösung von Protein-Substrat-Komplexen können genauere Aussagen über den Reaktionsmechanismus gemacht werden. Die in Mutterlauge gelösten Schwermetall- bzw. Substratlösungen (0.5 bis 5 mM) wurden direkt in den Kristallisationstropfen pipettiert. Die Tränkzeit wurde zwischen einigen Minuten und mehreren Stunden variiert und die Stabilität der Kristalle in regelmäßigen Abständen untersucht. Intakte Kristalle von AviRa wurden bei Raumtemperatur, Kristalle von AviRb unter cryo-Bedingungen vermessen (Kap. 3.4.4). 3.4.3 Kokristallisation mit Substrat Eine Alternative zum Tränken von Kristallen stellt die Kokristallisation dar. Ist der Zugang zum aktiven Zentrum beispielsweise durch einen Kristallkontakt blockiert, kann das Substrat nachträglich nicht mehr im Kristall gebunden werden. Durch Zugabe von AdoMet und Substratanaloga zur gereinigten Proteinlösung sollten Kristalle von ProteinSubstrat-Komplexen erhalten werden. Die Proteinlösung wurde hierzu mit einem 2- bis 39 Methoden 10-fachen molaren Überschuß an AdoMet bzw. Adenosylhomocysteine (AdoHcy) versetzt. AviRa wurde alternativ mit Adenosin, Methionin, bzw. einer Mischung aus AdoHcy und Guanosin (2- bzw. 10-facher molarer Überschuß) kristallisiert. AviRb wurde mit AdoHcy und Uridinine-5'monophosphate (2- bzw. 10-facher molarer Überschuß) versetzt. Zudem wurde AviRb mit AdoMet bzw. AdoHcy (2-facher molarer Überschuß) und einem kurzen DNA- (UAUCG, 1.5-5-facher molarer Überschuß) bzw. RNA-Fragment (27 Basen, 1.05facher molarer Überschuß) der rRNA-Helix-89 des Ribosoms kokristallisiert. Das verwendete RNA-Fragment wurde von der Firma MWG Biotech synthetisiert, entsalzt und entschützt sowie per SDS-PAGE gereinigt. Die Renaturierung der lyophilisierten RNA erfolgte gemäß eines bereits etablierten Protokolls in RNA-Renaturierungspuffer (c[RNA] = 0.95 mM) für 15 min bei 60°C und anschließender langsamer Abkühlung auf Raumtemperatur (Treede et al., 2003). Aufgrund der Instabilität von AviRb bei hohen Konzentrationen und der geringen möglichen Konzentrationen sowohl an AdoHcy als auch an RNA, konnte keine Kokristallisation mit Inhibitor und aktivem RNA-Fragment durchgeführt werden. Statt dessen wurde anstelle der zu methylierenden RNA-Base Uridin-2479 ein 2'-desoxy-Uridin eingeführt. Alle Proben wurden für 15-30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Es wurde das Kristallisationsverhalten unter den initial erhaltenen Kristallisationsbedingungen des Apoenzyms untersucht, sowie nach weiteren Fällungsmitteln gesucht. 3.4.4 Kristallmontage Proteinkristalle sind aufgrund ihres hohen Solvensgehaltes sehr fragil und müssen während röntgenographischen Untersuchungen vor dem Austrocknen geschützt werden. Bei Raumtemperatur-Messungen geschieht dies durch Montage der Kristalle in einer silikonisierten Glaskapillare. Auf beiden Seiten des Kristalls wird ein Tropfen Puffer in die Kapillare gesaugt und beide Enden mit Hartwachs verschmolzen. Der Kristall steht so über die Gasphase mit der Mutterlauge in Kontakt (Abbildung 17). Abbildung 17 Flüssigkeitssäule Hartwachssiegel Kristall mit Resten von Mutterlauge Kapillare aus Quarzglas Kristallmontage in Glaskapillaren. 40 Methoden Ein Problem bei Raumtemperatur-Messungen stellt die Schädigung des Kristalls durch Röntgenstrahlung dar. Die Strahlenschäden können durch Absenkung der Temperatur auf 100 K minimiert werden (Rodgers, 1994). Hierzu wird der Kristall mit etwas Mutterlauge in einer vorgefertigten Nylonschleife, dem sogenannten cryo-loop, montiert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Durch die Oberflächenspannung des Lösungsmittels werden kleinere Kristalle dabei im cryo-loop gehalten. Die Messungen erfolgen anschließend im Stickstoffstrom bei 100 K (Abbildung 18). Abbildung 18 Kristallmontage im cryo-loop zur Messung bei 100 K. Zur Vermeidung von Eisbildung ist der Stickstoffstrom von einem Trockenluftstrom umgeben. Durch Bildung von Eiskristallen kann der Kristall beim Einfrieren zerstört werden. Zudem erzeugt ein geordnetes Eisgitter störende Röntgenreflexe. Der Mutterlauge werden daher Glasbildner (cryo-protectant), wie niedermolekulare PEG-Verbindungen oder Glycerin zugesetzt. Alternativ läßt sich das Lösungsmittel durch Überführung der Kristalle in verschiedene Öle, wie Paratone-N oder Paraffinöl, entfernen (Riboldi-Tunnicliffe & Hilgenfeld, 1999). In beiden Fällen kann es zu einer Verminderung der Kristallqualität kommen; oft wird ein Anstieg der Mosaizität beobachtet (Mitchell & Garman, 1994; Garman 1999). Dies kann meist durch eine sukzessive Erhöhung der Konzentration an Glasbildnern oder durch die Verwendung eines anderen cryo-protectant minimiert werden. Die Etablierung eines geeigneten cryo-Protokolls erfordet das Vorhandensein vieler Kristalle, da oft verschiedene Bedingungen getestet werden müssen. Zur Durchführung von cryo-kristallographischen Messungen bei AviRa-Kristallen wurde der Mutterlauge in zwei Schritten PEG-400 bis zu einer Endkonzentration von 5% zugesetzt. Die Kristalle wurden anschließend in eine Mischung aus Paratone-N und Paraffinöl (80:20) überführt und nach Entfernen des Solvens in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Lag die Mosaizität eines eingefrorenen AviRa-Kristalls über 0.8, wurde er verworfen. Kristalle von AviRb wurden direkt in eine Lösung aus 35% PEG-200 und 2.5% PEG-3000 (0.1 M MES, pH 6.0) überführt und im Stickstoffstrom eingefroren. 41 Methoden 3.5 Röntgenstrukturanalyse 3.5.1 Kristallgitter und Kristallsymmetrie Kristalle sind regelmäßige, dreidimensionale, periodische Anordnungen einer sich wiederholenden Grundeinheit, der Elementarzelle. Die Elementarzelle wird durch die drei r r r sie aufspannenden Einheitsvektoren a , b und c sowie deren eingeschlossene Winkel α, β und γ beschrieben. Neben der Translationssymmetrie existieren in Kristallen oft zusätzliche Symmetrieelemente, die verschiedene Moleküle innerhalb der Elementarzelle in Beziehung setzen. Der Teil einer Elementarzelle, aus dem man die gesamte Zelle durch Anwendung von Symmetrieoperationen erzeugen kann, nennt man asymmetrische Einheit. Kombiniert man alle erlaubten Symmetrieoperationen, so erhält man 230 Raumgruppen (International Tables for Crystallography, 1996). In Proteinkristallen treten aufgrund der Chiralität der Aminosäuren weder Inversionszentren noch Spiegelebenen auf, möglich sind daher nur 65 Raumgruppen (Drenth, 1999). Anhand der im Kristallgitter vorliegenden Symmetrie lassen sich die Raumgruppen sieben Kristallsystemen zuordnen, die durch ihre elementaren Symmetrieelemente charakterisiert werden: triklin, monoklin, orthorhombisch, tetragonal, trigonal, hexagonal und kubisch. Unterscheidet man desweiteren noch primitive, flächenund innenzentrierte sowie rhomboedrische Gitter, so ergeben sich 14 Bravais-Gittertypen. 3.5.2 Matthews-Parameter Die Packungsdichte von Proteinen im Kristall ist begrenzt. Zusätzlich ist in Proteinkristallen eine große Anzahl meist ungeordnet vorliegender Wassermoleküle vorhanden. Eine statistische Analyse des Verhältnisses zwischen der Molekularmasse M des Proteins und des Volumens VEZ der Elementarzelle führte zur Einführung des Packungsparameters VM nach Matthews (1968). VM = mit VEZ M⋅z ⋅ n Gleichung 5 VEZ = Volumen der Elementarzelle [Å3] M = Molekularmasse des Proteins [Da] z = Molekülanzahl in der asymmetrischen Einheit n = Zahl der asymmetrischen Einheiten pro Elementarzelle Im allgemeinen wird für cytosolische Proteine ein Packungsparameter von 1.7 bis 3 3.5 Å /Da erwartet, meist liegt er um 2.2 Å3/Da (Kantardjieff & Rupp, 2003). Ist die Molekularmasse eines Proteins und Raumgruppe des Kristalls bekannt, läßt sich die Zahl der Moleküle pro asymmetrischer Einheit eingrenzen. Die Kenntnis der Anzahl an 42 Methoden Molekülen in der Elementarzelle spielt bei der Bestimmung nicht-kristallographischer Symmetrie, bei der Suche nach Schweratomderivaten und bei der Phasenbestimmung durch molekularen Ersatz eine entscheidende Rolle. Unter Annahme einer mittleren Proteindichte von 1.35 g/cm3 läßt sich aus dem Packungsparameter der Solvensgehalt χ des Kristalls bestimmen (Gleichung 6). χ = 1− 1.23 VM Gleichung 6 Der Solvensgehalt von Proteinkristallen liegt zwischen 30% und 70%. Allgemein besteht eine Abhängigkeit zwischen dem Solvensgehalt eines Kristalls und der Molekularmasse des Proteins (Matthews, 1977). Der Solvensgehalt in Krsitallen von Proteinen hoher Molekularmasse ist in der Regel deutlich höher als bei kleinen Proteinen. Die Bestimmung des Lösungsmittelanteils ist eine wichtige Voraussetzung bei der Methode der Dichtemodifikation (Kap. 3.5.12). 3.5.3 Theorie der Röntgenstreuung Die Röntgenstrukturanalyse beruht auf der Wechselwirkung von Röntgenstrahlen mit Materie. Die für das Experiment benötigte Röntgenstrahlung wird beispielsweise generiert, wenn im elektrischen Feld beschleunigte Elektronen auf Materie auftreffen. Meist wird eine Kupferanode genutzt, die emittierte Cu-Kα-Strahlung besitzt eine Wellenlänge von 1.542 Å. Alternativ verwendete Synchrotronstrahlung entsteht durch die Ablenkung von Positronen oder Elektronen hoher Geschwindigkeit im Magnetfeld (Rosenbaum et al., 1971). Bei jeder Richtungsänderung wird Strahlung in einem breiten Frequenzbereich von sichtbarem Licht bis zu harter Röntgenstrahlung (0.01nm) emittiert. Die gewünschte Wellenlänge läßt sich durch Einkristalldiffraktion sehr genau einstellen. Trifft Röntgenstrahlung auf einen Kristall, werden die Elektronen des Streuers durch das oszillierende elektromagnetische Feld der Röntgenstrahlung in Schwingung versetzt und emittieren eine Sekundärstrahlung gleicher Wellenlänge und definierter Phasenbeziehung (elastische Streuung, Thomsonstreuung). Durch inelastische Streuung (Compton-Streuung) hervorgerufene Effekte können bei der Röntgenstrukturanalyse vernachlässigt werden. Die Röntgenstreuung an Kristallen entspricht nach Bragg (1913) vereinfacht der Reflexion eines unter dem Glanzwinkel θ mit der Wellenlänge λ einfallenden Strahls an den Gitterebenen des Kristalls (Abbildung 19). Die einzelnen Netzebenenscharen werden durch die Millerschen Indizes h, k und l beschrieben. 43 Methoden Abbildung 19 Schematische Darstellung der Röntgenstreuung nach dem Braggschen Gesetz. Röntgenstrahlen, die an benachbarten Gitterebenen mit dem Abstand dhkl gestreut werden, besitzen einen Gangunterschied von 2d sinθ. In Abhängigkeit der Phasendifferenz der einzelnen Streustrahlen tritt konstruktive bzw. destruktive Interferenz auf. Verstärken sich Strahlen gleicher Phasendifferenz, treten unter diskreten Winkeln zum Primärstrahl Intensitätsmaxima auf, andere Wellenzüge werden ausgelöscht. Weisen an benachbarten Netzebenen im Abstand dhkl reflektierte Wellenzüge eine Phasendifferenz auf, die einem ganzzahligen Vielfachen der Wellenlänge entspricht, kommt es zu konstruktiver Interferenz (Gleichung 7). nλ = 2d hkl sin Θ hkl Gleichung 7 Die Symmetrie des so erzeugten Reflexmusters steht dabei in direkter Beziehung zur Symmetrie des Kristallgitters. Die Intensität der Reflexe dagegen wird durch die Anordnung der Streuzentren im Kristall und damit von der Elektronendichteverteilung bestimmt. Der Streuvorgang kann auch anhand des in Abbildung 20 gezeigten Modells veranschaulicht werden, bei dem der einfallende Strahl als ebene Welle betrachtet wird. Abbildung 20 Schematische Darstellung der Röntgenstreuung an Materie. Der einfallende Strahl wird als ebene Welle angesehen. r Eine einfallende Welle läßt sich durch den Richtungsvektor k 0 der Länge 2π/λ, die r um den Winkel 2θ gestreute Welle durch einen Vektor k gleichen Betrages beschreiben. r Der Differenzvektor zwischen ein- und ausfallendem Strahl, wird als Streuvektor s 44 Methoden bezeichnet. Jeder beobachtete Reflex setzt sich aus den Streubeiträgen aller Atome der r Elementarzelle zusammen. Die Streuamplitude E am Ort R ergibt sich durch Integration r v über alle Volumenelemente d r des Streuers mit der Elektronendichte ρ el (r ) (Gleichung 8). vv vr v r E = konst ⋅ ei(ω⋅t − kR) ∫ ρ el (r ) ⋅ e 2π i r s dr Gleichung 8 Vol mit ω = 2πc/λ rt Kreisfrequenz ω und Wellenlänge λ der Röntgenstrahlung Zeit r v v Streuvektor 2π s = k - k 0 v Wellenvektor des gestreuten Strahls k = 2π/λ v Elektronendichte am Ort r sv k v ρ el ( r ) Die physikalischen Parameter der einfallenden Welle sind im Term vor dem Integral enthalten, das Integral beschreibt die Elektronendichteverteilung im Volumenelement und v wird als Strukturfakor F( s ) bezeichnet (Gleichung 9). v F (s ) = ∫ρ el vv v v (r ) ⋅ e 2 πis r dr Gleichung 9 Vol Mathematisch gesehen stellt das Integral eine Fourieranalyse dar. Die r Elektronendichte wird dabei vom realen Raum in den reziproken Raum der von s v abhängigen komplexen Strukturfaktoren F( s ) überführt. Bei der Röntgendiffraktion tritt positive Interferenz der gestreuten Strahlen lediglich auf, wenn die Phasendifferenz ein Vielfaches von 2π ist (Gleichung 7). Daraus resultieren die sogenannten Laue-Bedingungen (Gleichung 10). v v a⋅s = h v v b ⋅s = k v v c ⋅s = l Gleichung 10 h,k,l = ganze Zahlen, Millersche Indizes r Stellt man den Ortsvektor r in fraktionellen Koordinaten des realen Raums dar, so ergibt sich unter Berücksichtigung der Laue-Bedingungen für diskrete Reflexe der Strukturfaktor zu 1 F (hkl) = VEZ 1 1 ∫ ∫ ∫ρ el (x, y, z) ⋅ e 2 πi(hx + ky + lz) dxdydz Gleichung 11 x =0 y =0 z =0 Statt die Elektronendichte zur Berechnung der Streumusters heranzuziehen, läßt sich umgekehrt aus den Strukturfaktoren durch die entsprechende Rücktransformation (Fouriersynthese) die Elektronendichte berechnen. Das Integral wird dabei durch eine Summe ersetzt, da die Strukturfaktoren gemäß den Laue-Bedingungen nur für diskrete Reflexe ungleich Null sind (Gleichung 12). 45 Methoden ρ el (x, y, z) = 1 ∑ VEZ h ∑∑ k F(hkl) ⋅ e −2πi(hx +ky+lz) Gleichung 12 l Der Strukturfaktor stellt eine komplexe Zahl dar, welche durch Amplitude und Phase einer Welle beschrieben werden kann. Die Strukturfaktoramplituden sind proportional zur Wurzel aus der Intensität Ihkl der gemessenen Reflexe (Gleichung 13) und demnach experimentell zugänglich. I(hkl) ∝ F(hkl) 2 Gleichung 13 Die Phasen ϕhkl der Strukturfaktoren sind dagegen nicht meßbar und müssen indirekt bestimmt werden. Dies wird als Phasenproblem der Kristallographie bezeichnet. Bei kleineren Molekülen und atomarer Auflösung kann die Phasenbestimmung durch direkte Methoden erfolgen. Bei größeren Molekülen und mittleren Auflösungsgrenzen stehen drei Methoden zur Verfügung. Die Phasierung durch multiplen isomorphen Ersatz (Kap. 3.5.8) nutzt die spezifische Bindung von Schweratomen an Proteinmoleküle im Kristall aus. Bei der Phasierung durch MAD (Kap. 3.5.9) müssen anomale Streuer, wie beispielsweise Selen oder Brom vorhanden sein. Die Methode des molekularen Ersatzes (Kap. 3.5.10) wird bei Kenntnis einer homologen Proteinstruktur angewendet. 3.5.4 Reziproker Raum und Ewald-Konstruktion Bei der Streuung von Röntgenstrahlen an den durch die Millerschen Indices h, k und l beschriebenen Netzebenenscharen im Kristall entsteht bei positiver Interferenz ein r Reflex mit dem Streuvektor s . Der Streuvektor steht senkrecht auf der reflektierenden Gitterebene, seine Länge entspricht dem Netzebenenabstand dhkl. Ordnet man jedem Reflex einen Punkt P(hkl) an der Spitze des Streuvektors zu, so entsteht ein dreidimensionales r r Gitter im reziproken Raum. Dieses reziproke Gitter wird durch die Basisvektoren a ∗ , b ∗ r und c ∗ der Länge 1/dhkl aufgespannt. Sie stehen senkrecht auf den die Elementarzelle des realen Raumes begrenzenden Flächen. Aufgrund der Laue-Bedingungen sind die für die r Streuvektoren s erlaubten, diskrete Werte im reziproken Raum gemäß Gleichung 14 definiert. Sie stellen die Eckpunkte des reziproken Gitters dar. r r r r s = h ⋅ a ∗ + k ⋅b ∗ + l ⋅ c ∗ Gleichung 14 Aus der Definition des reziproken Gitters ergibt sich eine räumliche Beziehung zwischen den Basisvektoren des realen und des reziproken Raums (Gleichung 15). Im Fall eines rechtwinkligen Kristallsystems sind die Vektoren beider Systeme kolinear. 46 Methoden v v b ×c v* a = v v v a (b × c ) v v v c×a b* = v v v a (b × c ) v v a ×b v* c = v v v a (b × c ) Gleichung 15 Das Auftreten von Reflexen gemäß dem Braggschen Gesetz wird durch die EwaldKonstruktion in den reziproken Raum übertragen (Ewald, 1912; Abbildung 21). Die r einfallende Röntgenstrahlung ( k 0 ) wird an einem Kristall gestreut, der sich im Mittelpunkt r r der sogenannten Ewaldkugel mit dem Radius 1/λ (= k 0 = k ) befindet. Der Ursprung O des reziproken Gitters wird in den Austrittspunkt des Primärstrahls aus der Ewaldkugel r gelegt. Ein Reflex wird beobachtet, wenn der Endpunkt des Streuvektors s des reziproken Gitterpunktes P(hkl) mit der Ewaldkugel zusammenfällt. Unter diesen Bedingungen steht der Streuvektor senkrecht auf der reflektierenden Gitterebene, seine Länge ergibt sich zu 1/dhkl = 2 sinθhkl/λ; das Braggsche Gesetz (Gleichung 7) ist erfüllt. Abbildung 21 Ewaldkonstruktion zur Darstellung der Beziehung von realem und reziprokem Raum. Der Kristall befindet sich im Mittelpunkt der Kugel mit dem Radius 1/λ, der Ursprung des reziproken Gitters ist O. Ein Reflex tritt auf, wenn der Gitterpunkt P(hkl) an der Spitze des r Streuvektors s mit der Ewaldkugel zusammenfällt. Unter Vernachlässigung von anomaler Röntgenstreuung besitzt das reziproke Gitter im Bezug auf die Intensitäten der Reflexe ein zusätzliches Inversionszentrum. Die Intensität eines Reflexes hkl ist identisch mit der des invertierten Reflexes hkl . Anschaulich gesehen ist die Intensität eines Reflexes unabhängig davon, ob der Röntgenstrahl an der Ober- oder der Unterseite einer Gitterebene gestreut wird. Diese Eigenschaft wird durch das Friedelsche Gesetz beschrieben (Gleichung 16). 2 * F(hkl) = F (h k l) 2 Gleichung 16 Das Friedelsche Gesetz gilt jedoch nicht bei anomaler Diffraktion. Mit Hilfe von anomaler Streuung kann unter Ausnutzung der Intensitätsdifferenzen der einzelnen FriedelPaare das Phasenproblem gelöst werden (Kap. 3.5.9). 47 Methoden 3.5.5 Temperaturfaktoren Aufgrund der thermischen Bewegung der Atome und Fehlordnungen im Kristall kommt es zu einer Abweichung der Atome von ihrer Gleichgewichtsposition. Dies führt zu auflösungsabhängigen Veränderungen der Intensitäten (Debye, 1914), die durch einen Korrekturterm im Strukturfaktor Fhkl berücksichtigt werden (Gleichung 17). F(hkl) = n atom ∑ f ( s) ⋅ e j − 1 B s2 4 ⋅e vv 2 πi⋅s ⋅r j Gleichung 17 j Der Streufaktor fj(s) beschreibt das Atom im Ruhezustand. Der Temperaturfaktor B beschreibt die isotrope Versetzung und hängt direkt mit dem mittleren Verschiebungsquadrat u 2 der Atome aus ihrer Gleichgewichtslage zusammen (Gleichung 18). Gleichung 18 B = 8π 2 u 2 Ein mittlerer B-Faktor von 30 Ų entspricht einem mittleren Verschiebungsquadrat von 0.62 Å. Nach Wilson (1962) läßt sich der mittlere Temperaturfaktor in einem Auflösungsbereich kleiner 3 Å aus den gemessenen Intensitäten abschätzen (Gleichung 19). ln r I (s ) ∑ f i 2 ( s) = ln C − 2 B sin 2 Θ λ2 Gleichung 19 i Wird der natürliche Logarithmus des Quotienten aus den gemessenen mittleren Intensitäten und den berechneten mittleren Intensitäten der Atome im Ruhezustand gegen (sinθ/λ)2 aufgetragen, so lassen sich der Skalierungsfaktor C und der Temperaturfaktor B durch lineare Regression ermitteln. 3.5.6 Kristallographische Datensammlung Die exakte und vollständige Messung der Positionen und Intensitäten der Reflexe stellt die Grundlage der Röntgenstrukturanalyse dar. Der Verlauf der Strukturlösung und die Genauigkeit des Strukturmodells hängen maßgeblich von der Qualität der gemessenen Daten ab. Der Kristall wird hierzu auf einem Goniometerkopf montiert (Kap. 3.4.4) und während der Messung in kleinen Winkelintervallen ∆ϕ um eine Achse gedreht (Arndt et al., 1973). Zur Detektion der Reflexe werden zweidimensionale, ortsempfindliche Detektoren, wie image plates oder CCD-Detektoren (charge coupled devices) verwendet. Durch Ausnutzung von Kristallorientierung und -symmetrie läßt sich der zu vermessende Winkelbereich minimieren. Abbildung 22 zeigt eine schematische Darstellung der an der Hausanlage verwendeten Meßanordnung. 48 Methoden Abbildung 22 Schematische Darstellung der Meßanordnung an der Hausanlage. Die Röntgenstrahlung wurde durch eine Drehanode generiert, als Detektor diente eine image plate. Während der Messung wird der Kristall um den Winkel ϕ rotiert. Bei Messungen an der Hausanlage wurde zur Generation von Kupfer Kα-Strahlung eine Kupferdrehanode (RU200B; 44V, 118mA) verwendet. Zur Detektion diente eine image plate (30 cm und 34.5 cm Durchmesser, Marresearch). Die Belichtungszeit betrug je nach Streukraft der Kristalle 10 bis 20 min, pro Streubild (frame) wurden die Kristalle um einen Winkel von 1° gedreht. Synchrotronmessungen von AviRa-Kristallen wurden an der EMBL-Außenstation des DESY in Hamburg am Synchrotron-Meßplatz BW7A durchgeführt, AviRb-Kristalle wurden am Synchrotron-Meßplatz X06SA der Swiss Light Source (SLS) in Villigen, Schweiz, vermessen. Die Wellenlänge der verwendeten Röntgenstrahlung lag im Bereich von 0.9-1.0 Å, die Belichtungszeit betrug am DESY 1 min, an der SLS 1 sec. Der abgefahrene Winkelbereich lag bei 0.5-1.0° pro frame. Als Detektoren dienten jeweils CCD-Detektoren (16.5 cm Durchmesser, MAR Research). 3.5.7 Prozessierung und Datenreduktion Ziel der Datenprozessierung ist es, jedem Reflex hkl eine gemittelte Intensität zuzuordnen. Zunächst wird anhand starker Reflexe einiger frames durch Differenzvektoren die Orientierungsmatrix des Kristalls bestimmt und so einzelne Reflexe indiziert. Anschließend werden mittlere Reflexprofile starker Reflexe erstellt, an welche das Profil der übrigen Reflexe zur Bestimmung der gemessenen Intensitäten angepaßt wird (profile fitting). Die Rohintensitäten werden im Bezug auf Absorption, Lorentzpolarisation und Strahlungsschäden korrigiert, die Hintergrundstrahlung durch Mittelung über mehrere frames bestimmt. Zusätzlich wird die Partialität der einzelnen Reflexe ermittelt. 49 Methoden Detektorabstand und Kristallorientierung, sowie Elementarzellparameter und Mosaizität, die ein Maß für die räumliche Ausdehnung eines Reflexes darstellt, können anhand starker Reflexe verfeinert werden (postrefinement). Das Ergebnis der Prozessierung sind die Intensitäten der integrierten Reflexe sowie deren Standardabweichung. Zur Datenprozessierung wurden die Programme DENZO (Otwinowski & Minor, 1997) und XDS (Kabsch, 1993) verwendet. Da sich die experimentellen Bedingungen (schwankende Intensität des Röntgenstrahls, Strahlenschäden, Anisotropie des Kristalls etc.) während der Messung ändern, ist eine exakte, interne Skalierung der prozessierten Daten notwendig. Die Reflexintensitäten einer vorgegebenen Anzahl an frames werden dabei mit einem Skalierungsfaktor versehen, so daß die mittleren Intensitäten mehrfach gemessener Reflexe möglichst geringe Abweichungen voneinander aufweisen. Anschließend werden die Intensitäten von Friedelpaaren und von symmetrieverwandten Reflexen gemittelt. Die Skalierung erfolgte mit den Programmen XSCALE (Kabsch, 1993) und SCALEPACK (Otwinowski & Minor, 1997). Die erhaltenen Intensitäten wurden durch die Programme XDSCONV (Kabsch, 1993) bzw. TRUNCATE (French & Wilson, 1978) in Strukturfaktoramplituden umgerechnet. Die Qualität und Auflösungsgrenze eines gemessenen Datensatzes wird anhand der Vollständigkeit, des Signal-Rausch-Verhältnisses I/σ und des Rsym symmetrieverwandter Reflexe beurteilt. Der Rsym beschreibt Intensitätsabweichungen mehrfach gemessener, identischer Reflexe (Gleichung 20). Er wird entscheidend von der Multiplizität beeinflußt und kann durch die Einführung eines im Bezug auf die Redundanz gewichteten Rmeas korrigiert werden. Rsym = ∑ ∑ I(hkl) − I(hkl) ∑ ∑ I(hkl) hkl i i hkl i Gleichung 20 i Das Signal-Rausch-Verhältniss I/σ sollte im gesamten Auflösungsbereich des Kristalls größer 2 sein, der Rsym der letzten Auflösungsschale möglichst unter 50%. Im Zweifel empfiehlt es sich, auch Daten mit schlechteren Werten zur Strukturlösung miteinzubeziehen, da Dank immer besserer Computer und neuerer Programme auch aus ihnen noch wertvolle Informationen gewonnen werden können. 50 3.5.8 Methoden Phasierung durch multiplen isomorphen Ersatz (MIR) Die Methode des multiplen isomorphen Ersatzes (MIR) setzt die spezifische Bindung von Schwermetallatomen im Proteinkristall voraus, ohne daß dabei signifikante Veränderungen in der Proteinstruktur oder der Kristallpackung auftreten (Non-Isomorphie). Durch die Inkorporation elektronenreicher Schwermetalle kommt es zu Änderungen in den Intensitäten des Streubildes, welche zur Bestimmung initialer Phasen verwendet werden können (Crick & Magdoff, 1956). Zusätzlich zum Datensatz des nativen Proteins werden daher noch ein oder mehrere Datensätze von isomorphen Schweratom-Derivaten benötigt. Die Derivatisierung erfolgt üblicherweise durch Tränken von nativen Kristallen in Schwermetallösungen (Boggon & Sharpiro, 2000). Als initiales Kriterium für die erfolgreiche Bindung eines Schwermetalls dient der isomorphe R-Faktor Riso bei der Skalierung von nativem und Derivatdatensatz (Gleichung 21). Riso = 2 ⋅ ∑ ∑ hkl hkl F(hkl) der − F(hkl) nat Gleichung 21 F(hkl) der + F(hkl) nat Verwertbare Schweratomderivate besitzen in der Regel einen Riso von 10-30%. Liegt der Riso unter 10%, so ist eine erfolgreiche Schwermetallbindung unwahrscheinlich. Werte über 30% deuten auf eine starke Non-Isomorphie zwischen nativem und derivatisiertem Kristall hin. Eine Interpretation der Daten ist bei zu großer Non-Isomorphie unmöglich. Die Qualität eines Schweratomderivates läßt sich durch den Verlauf der isomorphen Differenzen <|Fder - Fnat|> in Abhängigkeit von der Auflösung abschätzen. Während die isomorphen Differenzen bei zunehmender Auflösung abnehmen, bleibt der non-isomorphe Anteil gleich oder erhöht sich (McRee, 1993). Zur Skalierung der Datensätze und zur Berechnung des Riso wurde das Programm SCALEIT (CCP4, 1994) verwendet. Bestimmung von Schweratompositionen Der erste Schritt zur Phasierung durch MIR stellt die Lokalisierung der gebundenen Schweratome dar. Zur Bestimmung der Bindungsstellen werden Differenz-PattersonFunktionen verwendet. Ist bereits Phaseninformation vorhanden, so kann die Phaseninformation weiterer Schwermetallderivate durch Differenz-Fourier-Funktionen berücksichtigt werden. Die Pattersonfunktion stellt eine Fouriersummation von Reflexintensitäten dar (Patterson, 1934). Sie ist eine Funktion der fraktionellen Koordinaten u, v, w und kann ohne Kenntnis der Phasen bestimmt werden (Gleichung 22). 51 Methoden P(u, v, w) = 1 VEZ F(hkl) ⋅ cos [2π (hu + kv + lw)] ∑ 2 hkl Gleichung 22 Die Maxima der Pattersonfunktion entsprechen den vektoriellen Abständen einzelner Atome in der Elementarzelle. Die Pattersonfunktion eines Systems aus N Atomen weist N·(N-1) Funktionsmaxima auf, da von jedem Atom N-1 Vektoren größer Null ausgehen können. Zusätzlich existieren N Vektoren von Atomen, die auf sich selbst weisen, und im sogenannten Ursprungs-peak zusammenfallen. Bei einfachen Strukturen können die Positionen der Atome direkt aus den Differenzvektoren bestimmt werden. In Proteinkristallen ist dagegen die Anzahl der Atome zu groß, um eine direkte Zuordnung der Differenzvektoren zu ermöglichen. Die Substruktur von Schweratomen in Derivaten kann jedoch bestimmt werden. Zwar können die Strukturfaktoramplituden der Schweratome nicht direkt gemessen werden, jedoch lassen sich ihre Quadrate näherungsweise aus der Differenz der Strukturfaktoramplituden des Derivates FPH und denen des nativen Datensatzes FP berechnen (Gleichung 23). ∆Fiso 2 2 = FPH − FP Gleichung 23 Die Differenz-Pattersonfunktion ∆P(u,v,w) mit den Koeffizienten |∆Fiso|2 liefert dann die Differenzvektoren zwischen den Schweratomen (Gleichung 24). ∆P(u, v, w) = 1 VEZ ∑ hkl ∆Fiso ⋅ cos [2π (hu + kv + lw)] 2 Gleichung 24 Die Pattersonraumgruppe besitzt gegenüber der Raumgruppe des Kristalls ein zusätzliches Inversionszentrum im Ursprung (Pattersonsymmetrie), da zwischen zwei Atomen immer zwei entgegengesetzte Vektoren existieren (von A noch B und umgekehrt). Die Differenzvektoren zwischen den Schwermetallatomen weisen ebenfalls Pattersonsymmetrie auf. Vektoren zwischen symmetrieverwandten Atompaaren kommen auf speziellen Ebenen, den sogenannten Harker-Ebenen, zu liegen (Harker, 1956). Aus diesen Funktionsmaxima lassen sich die Positionen der Schwermetallatome bestimmen. Sind bereits initiale Phasen bekannt, so können weitere Schweratompositionen durch die Differenz-Fourierfunktion (Gleichung 25) bestimmt werden. ∆ρ(x, y, z) = 1 VEZ ∑ (F PH − FP ) ⋅ e −i ϕ hkl ⋅ e − 2 π i (hx + ky + lz) Gleichung 25 hkl Differenz-Pattersonfunktionen und Differenz-Fourierfunktionen wurden mit dem Programm FFT (CCP4, 1994) berechnet, Karten der Harker-Ebenen wurden mit XCONTUR (McRee, 1993) dargestellt. 52 Methoden Die initial ermittelten Schweratompositionen sind noch relativ ungenau, so daß ein Fehler bei der Phasenbestimmung auftritt (lack of closure; Blow & Crick, 1959). Dieser Fehler kann durch die Verfeinerung von Schweratom-Koordinaten, Besetzungszahlen und Temperaturfaktoren minimiert werden (vergl. Kap. 3.5.9). Phasenbestimmung Nachdem die Positionen der Schweratome ermittelt wurden, lassen sich ihre Strukturfaktoren FH durch eine Fourieranalyse berechnen. Mit Hilfe der HarkerKonstruktion können anschließend auch die Phasen der Strukturfaktoren FP des nativen Proteins bestimmt werden. Die Streuung des Schweratomderivates setzt sich aus den Streubeiträgen des Proteins und der Schweratome zusammen (Gleichung 26). F PH = F P + F H oder umgeformt F P = − F H + F PH Gleichung 26 Die Strukturfaktoren werden in der Ebene komplexer Zahlen dargestellt (ArgandDiagramm). Dabei wird der Strukturfaktor des nativen Proteins im Zentrum O des Diagramms (Abbildung 23) aufgetragen, der Radius des Kreises entspricht seiner Amplitude, die Auslenkung des Vektors der zu bestimmenden Phase. Der Strukturfaktor FH des Schweratoms wird vom Zentrum aus negativ eingezeichnet, der Kreis um seinen Endpunkt besitzt den Radius FPH. Gemäß Gleichung 26 lassen sich die Phasen des nativen Proteins aus einem der Schnittpunkte der beiden Kreise bestimmen (Abbildung 23). Abbildung 23 Harkerkonstruktion zur Phasenbestimmung. (a) Phasierung durch SIR. OH und OG repräsentieren die beiden möglichen Lösungen für Fp. (b) Bestimmung von MIR-Phasen. Sind zwei isomorphe Schweratomderivate vorhanden, kann Fp eindeutig bestimmt werden (hier: OH). 53 Methoden Bei einem Schweratom (single isomorphous replacement = SIR, Abbildung 23(a)) ist die Phasierung demnach nicht eindeutig. Die Zweideutigkeit der Phasierung kann durch ein zweites Schweratomderivat aufgehoben werden (multiple isomorphous replacement = MIR, Abbildung 23(b)). Zudem können zusätzliche Phaseninformationen aus molekularem Ersatz, anomaler Streuung oder Dichtemodifikation erhalten werden. 3.5.9 Phasierung durch multi-Wellenlängen anomale Diffraktion (MAD) Anomale Streuung Bisher wurden die Elektronen bei der Röntgenstreuung als unabhängig vom Atomkern betrachtet. Diese Annahme verliert ihre Gültigkeit, wenn die verwendete Röntgenstrahlung in der Nähe der Absorptionskante eines Elementes liegt. Die durch Elektronen der inneren Schalen emittierte Strahlung unterscheidet sich von der einfallenden in Phase und Amplitude (Drenth, 1994). Bei diesen Atomen setzt sich der atomare Streufaktor aus dem normalen Anteil der Streuung (f 0) und dem anomalen ( f ′ + i f ′′ ) zusammen (Gleichung 27). f = f 0 + f ′ (λ) + i f ′′ (λ) mit Gleichung 27 f 0 wellenlängenunabhängiger Streufaktor f ′ realer Anteil der anomalen Streuung, abhängig von λ f ′′ imaginärer Anteil der anomalen Streuung, abhängig von λ Enthält ein Protein anomale Streuer, so unterscheiden sich die Strukturfaktoren + − F PH (hkl) und F PH (hkl) der Friedelpaare aufgrund der anomalen Streuung in Amplitude und Phase, das Friedelsche Gesetz (Gleichung 16) gilt nicht mehr. Sie setzen sich aus den Strukturfaktoren der "reinen" Proteinstruktur F P (hkl) , auf die das Friedelgesetz noch + − anwendbar ist, sowie den Strukturfaktoren der anomalen Streuer F H (hkl) bzw. F H (hkl) zusammen (Gleichung 28). + + − − F PH (hkl) = F P (hkl) + F H (hkl) Gleichung 28 F PH (hkl) = F P (hkl) + F H (hkl) Die Strukturfaktoren der anomalen Streuer bestehen gemäß Gleichung 27 aus einen wellenlängenunabhängigen Anteil und einen realen bzw. imaginären anomalen Anteil (Gleichung 29). Eine graphische Darstellung der Zusammensetzung der Strukturfaktoren + − der Friedelpaare F PH (hkl) und F PH (hkl) bei anomaler Streuung zeigt Abbildung 24. 54 Methoden + F H (hkl) = F H (hkl) + − F H (hkl) = F H (hkl) + mit f′ if ′′ F H (hkl) + 0 F H (hkl) 0 f f Gleichung 29 f′ if ′′ F H (hkl) − 0 F H (hkl) 0 f f FH(hkl) normaler Anteil der Strukturfaktoren der anomalen Streuer Abbildung 24 Graphische Darstellung der Zusammensetzung der Strukturfaktoren der + − Friedelpaare F PH (hkl) und F PH (hkl) bei anomaler Streuung im Argand-Diagramm. Die Strukturfaktoren der nicht-anomalen Streuer sind mit FP(hkl) bezeichnet, der nicht-anomale Anteil des anomalen Streuers mit FH(hkl). Die gestrichelten Linien beziehen sich auf das Spiegelbild des Friedelpaares. Der Anteil an anomaler Strahlung ist stark vergrößert dargestellt. Die Absorptionskanten der gängigsten in Proteinen vorkommenden Elemente liegen mit Ausnahme von Schwefel nicht im Bereich der Röntgenstrahlung. Das anomale Signal von Schwefel ist allerdings so gering, daß eine hohe Auflösung notwendig ist, um es zur Phasierung zu nutzen. In der Regel müssen stärkere anomale Streuer wie Hg, Br oder Se im Kristall vorhanden sein. Der Anteil der anomalen Streuung liegt selbst dann bei nur 3-5%. Die Datensammlung muß daher sehr akkurat sein, eine hohe Redundanz der gemessenen Daten ist erforderlich. Zudem muß ein größerer Winkelbereich vermessen werden, da sich die Friedelpaare unterscheiden und nicht mehr gemittelt werden können. MAD-Messungen Die Phaseninformation der anomalen Streuung kann zur Strukturlösung verwendet werden. Bei der SIRAS-Methode (single isomorphous replacement and anomolous scattering) wird das Signal eines anomalen Streuers im Kristall bei einer Wellenlänge detektiert und die Intensitätsdifferenzen der Friedelpaare zur Phasierung genutzt (anomale 55 Methoden Differenz). Eine zweite Möglichkeit stellt die anomale Diffraktion bei mehreren Wellenlängen (MAD) dar. Durch Verwendung von Synchrotronstrahlung, deren Wellenlänge sehr exakt einstellbar ist, können Messungen bei verschiedenen Wellenlängen an der Absorptionskante des anomalen Streuers durchgeführt werden. Für MADExperimente werden am häufigsten Hg (LIII-Kante bei 1.009 Å) und Se (K-Kante bei 0.9795 Å) als anomale Streuer verwendet. Selen wird dabei in der Regel in Form von Selenomethionin inkorporiert. Der reale und imaginäre Anteil der anomalen Streuung ist im Bereich der Absorptionskante stark von der Wellenlänge abhängig (Abbildung 26). Im Vergleich zur SIRAS Methode erhält man für jede Wellenlänge einen Satz anomaler Differenzen und kann zudem die Wellenlängen-Abhängigkeit des realen Anteils der anomalen Streuung ausnutzen (dispersive Differenz). Elektronen f ′′ f′ Wellenlänge [Å] Abbildung 25 Wellenlängenabhängiger Verlauf von f ′ und f ′′ am Beispiel von Selen. Um die unterschiedlichen Anteile von f ′ und f ′′ optimal auszunutzen, werden bei MAD-Experimenten drei Messungen durchgeführt: bei einer Wellenlänge, die dem Maximum der f ′′ - Kurve entspricht (peak), im Minimum der f ′ -Kurve, welches den Wendepunkt der f ′′ - Kurve darstellt (inflection point) und bei einer von der Absorptionskante weiter entfernten Wellenlänge (high energy remote). Die genaue Lage der Absorptionskante ist von der Umgebung des anomalen Streuers im Protein abhängig und muß für jeden Kristall durch einen Fluoreszenzscan bestimmt werden. Alle Datensätze werden dabei an einem Kristall gemessen, so daß praktisch keine Non-Isomorphie auftritt. 56 Methoden Phasenbestimmung bei MAD Anomale Streuung setzt sich gemäß Gleichung 29 aus einem realen und einem imaginären anomalen Anteil zusammen, welche bei MAD-Messungen beide zur Lösung des Phasenproblems herangezogen werden (Hendrickson & Ogata, 1997). Die Differenzen + − der Strukturfaktoren F PH (hkl) und F PH (hkl) der Friedelpaare, die auch anomale Differenzen oder Bijvoetdifferenzen genannt werden, resultieren aus den unterschiedlichen Vorzeichen des imaginären anomalen Anteils der Strukturfaktoren der anomalen Streuer. Sie können für jeden der drei aufgenommenen Datensätze bestimmt werden. Gleichung 30 + − ∆Fano = F PH (hkl) λ i - F PH (hkl) λ i + + mit F PH (hkl) λ i und FPH (hkl) λi Strukturfaktoramplituden der Friedelpaare bei der Wellenlänge λi Zusätzliche Phaseninformation kann aus dem realen Anteil der anomalen Streuung gewonnen werden. Diese sogenannten dispersiven Differenzen der anomalen Streuer weisen eine starke Abhängigkeit von der Wellenlänge auf und werden analog der Methode des isomorphen Ersatzes ausgenutzt (Gleichung 31). Gleichung 31 ∆Fdisp = F (λ i ) − F (λ j ) + − mit F(λ i ) Mittel von F PH (hkl) und F PH (hkl) bei der Wellenlänge λi F(λ j ) Mittel von F +PH (hkl) und F −PH (hkl) bei der Wellenlänge λj Zur Bestimmung der Positionen der anomalen Streuer mit Hilfe der DifferenzPattersonfunktion (Gleichung 24) können sowohl die anomalen als auch die dispersiven Differenzen herangezogen werden. Die Positionen der anomalen Streuer werden analog den Schweratompositionen verfeinert (Kap. 3.5.8). Aus der anomalen Substruktur lassen sich + − die Strukturfaktoren der anomalen Streuer F H (hkl) und F H (hkl) berechnen. Analog zu der Phasierung durch MIR können nun die Strukturfaktoren der reinen Proteinstruktur F P (hkl) durch die Harker-Konstruktion ermittelt werden (Abbildung 26). Da für den nichtanomalen Anteil der Streuung das Friedelgesetz gilt, ergeben sich die Phasen der reinen Proteinstruktur aus den Schnittpunkten der Kurven für − + + F PH (hkl) - F H (hkl) und − F PH (hkl) - F H (hkl) (vergl. Gleichung 26). Die Zweideutigkeit der Phasen bei einer Messung entfällt durch eine zusätzliche Messung bei einer anderen Wellenlänge. Die Strukturfaktoren der reinen Proteinstruktur sind im Gegensatz zu denen der anomalen Streuer wellenlängenunabhängig. Methoden 57 Abbildung 26 Harker-Konstruktion zur Phasierung mittels anomaler Streuung (a) Experiment bei einer Wellenlänge; die Schnittpunkte der Kreise stellen die beiden möglichen Lösungen für FP dar. (b) Experiment bei zwei Wellenlängen; FP kann nun eindeutig bestimmt werden. Bei der Strukturlösung von AviRa und AviRb wurde der anomale Streuer Selen in Form von Selenomethionin inkorporiert (Kap.3.2.1). Es wurden drei Datensätze von einem Kristall bei unterschiedlichen Wellenlängen (peak, inflection point und high energy remote) aufgenommen, der Fluoreszenzscan wurde in einem Winkel von 90° zur einfallenden Röntgenstrahlung durchgeführt. Die anomalen Differenzen der einzelnen Datensätze wurden mit Hilfe des Programms XPREP (Sheldrick et al., 2001) auflösungsabhängig abgeschätzt. Ein zur Phasierung ausreichendes anomales Signal ist bei einem Korrelationskoeffizienten größer 30% vorhanden. XPREP generiert neben der Analyse der anomalen Daten automatisch eine Datei, welche Anweisungen für das Programm SHELXD (Sheldrick et al., 2001) enthält. Die Se-Positionen wurden im Falle von AviRa sowohl automatisch mit SHELXD als auch anhand anomaler Pattersonkarten bestimmt. Die erhaltenen Koordinaten wurden mit MLPHARE (CCP4, 1994) verfeinert und zur Phasierung genutzt (Kap. 3.5.9). Bei der Strukturlösung von AviRb wurde ausschließlich das Programm SHELXD zur Bestimmung der Se-Koordinaten genutzt. Die Verfeinerung der Se-Positionen sowie die Phasierung erfolgte durch SHARP (de LaFortelle & Bricogne, 1997). Um die Qualität der Phasierung durch MLPHARE bzw. SHARP zu beurteilen, wurden die Kriterien Rcullis, Rano, figure of merit (FOM) und phasing power (PhP) genutzt. Der für zentrische Reflexe berechnete Rcullis und der Rano sind ein Maß für den durch das Schweratom bzw. den anomalen Streuer verursachten Anteil der Röntgenstreuung (Cullis et al., 1962). Der Rcullis sollte einen Wert zwischen 0.6 und 0.9 annehmen (McRee, 1992), der Rano sollte so klein wie möglich (< 0.8) sein. Die figure of merit entspricht dem gewichteten Mittel der Cosinusfunktion des 58 Methoden Phasenfehlers, die phasing-power (PhP) ist als Quotient aus der mittleren SchweratomStrukturfaktoramplitude und dem mittleren Fehler (lack-of-closure) definiert. Für brauchbare Derivate ist die FOM größer als 0.5, die PhP größer 0.4, sehr gute Derivate haben Werte von 0.9 bzw. 0.7. 3.5.10 Phasierung durch molekularen Ersatz (Molrep) Die Methode des molekularen Ersatzes (molecular replacement, Molrep) kann zur Strukturlösung verwendet werden, wenn eine dreidimensionale Struktur des gleichen oder eines ähnlichen Proteins bereits bekannt ist. Sind die Kristalle isomorph, kann das bekannte Molekül direkt übertragen werden, andernfalls muß zuerst die korrekte Position des Suchmodells in der asymmetrischen Einheit des unbekannten Kristalls ermittelt werden. Die Phasierung durch Molrep wird daher bei der Lösung zweier unterschiedlicher Probleme angewendet. Kristallisiert ein Protein in mehreren Raumgruppen kann - nach Bestimmung der Raumstruktur in einer Kristallform - durch Molrep die dreidimensionale Molekülanordnung im anderen Kristall ermittelt werden. Zum anderen kann ausgenutzt werden, daß Proteine welche eine Sequenzidentität von mehr als 30% aufweisen, mit hoher Wahrscheinlichkeit auch eine ähnliche Faltung besitzen (Sander & Schneider, 1991). Strukturen verwandter Proteine können so als Suchmodell bei der Strukturlösung eines bislang unbekannten Proteins dienen. Statistische Überlegungen zeigen, daß bei löslichen, globulären Proteinen die Zahl möglicher Faltungsmuster auf 500 bis 1000 begrenzt ist (Schulz, 1981; Benner et al., 1997). Da die Zahl gelöster Proteinstrukturen in den letzten Jahren stark angestiegen ist, wird es immer wahrscheinlicher, durch Sekundärstrukturvorhersagen und Sequenzvergleiche ein geeignetes Suchmodell zu finden. Ist eine Kristallstruktur als initiales Suchmodell gefunden, kann dieses durch Modifikationen von Sekundärstrukturelementen, wie der Entfernung von flexiblen loopBereichen, oder durch Verwendung eines Polyalaninmodells variiert werden. Die Schwierigkeit der Methode besteht neben der Wahl des geeigneten Suchmodells in der korrekten Plazierung des Modells in der asymmetrischen Einheit des unbekannten Kristalls. Es handelt sich dabei um ein 6-dimensionales Problem, das näherungsweise in eine Rotations- und eine Translationssuche unterteilt werden kann. Grundlegendes Prinzip ist der Vergleich der Pattersonfunktionen von Suchmodell und Zielmolekül. Das korrekt plazierte Molekül kann zur Berechnung von Phasen verwendet werden, die zusammen mit den gemessenen Strukturfaktoramplituden zur Berechnung der Elektronendichte verwendet 59 Methoden werden können. Hochsymmetrische Raumgruppen und eine große Anzahl von Molekülen in der asymmetrischen Einheit erschweren die Strukturlösung. In vorliegender Arbeit wurden für die Methode des molekularen Ersatzes die Programme AMoRe (Navaza, 1994; CCP4, 1994) und MOLREP (CCP4, 1994) verwendet. Der Auflösungsbereich für die Rotations- und Translationssuche betrug 10.0 bis 4.0 Å. Eine mögliche Lösung sollte einen Korrelationskoeffizienten (CC) größer 30% sowie einen Rcryst unter 50% aufweisen und sich deutlich von anderen Lösungen abheben. 3.5.11 Bestimmung der nicht-kristallographischen Symmetrie Enthält die asymmetrische Einheit mehrere identische Moleküle, so können diese durch eine lokale Symmetrieoperation, der nicht-kristallographischen Symmetrie (NCS), ineinander überführt werden. In Proteinkristallen findet man innerhalb der asymmetrischen Einheit häufig mehrere Peptidketten, wobei vor allem bei oligomeren Proteinen die einzelnen Untereinheiten meist durch eine n-zählige Rotation ohne Translation ineinander überführt werden können (proper symmetry). Die zugehörige Rotationsachse (NCS-Achse) kann durch die Polarwinkel κ, φ und ω beschrieben werden (Abbildung 27). Die Zähligkeit der Rotationsachse wird dabei durch 360°/κ bestimmt. Der Winkel ω gibt die Verkippung der NCS-Achse von der z-Achse des kartesischen Koordinatensystems in Richtung der x-Achse, der Winkel φ die Drehung um die z-Achse an. Abbildung 27 Definition der Polarwinkel κ, φ und ω zur Beschreibung einer nichtkristallographischen Symmetrieachse (Drenth, 1994). Die Bestimmung der NCS erfolgt ohne Phaseninformation aus den Strukturfaktoramplituden. Wird die Pattersonfunktion um den Ursprung rotiert, so zeigt r sich bei optimaler Überlagerung der ursprünglichen Pattersonfunktion P( u ) mit der durch r Rotation erhaltenen P(C u ) ein Maximum (Gleichung 32). Die Funktion R(α,β,γ) wird auch als Eigenrotations-Funktion (selfrotation function) bezeichnet (Rossmann & Blow, 1962). 60 Methoden Dabei werden nur Vektoren zwischen Atomen desselben Moleküls berücksichtigt (Selbstvektoren), deren Länge aufgrund der räumlichen Ausdehnung eines Moleküls deutlich geringer ist als bei Vektoren zwischen unterschiedlichen Molekülen (Kreuzvektoren). Sie liegen innerhalb einer Kugel deren Radius Rmax der maximalen Ausdehnung eines Moleküls entspricht. R max R(α,β,γ) = r r r ∫ P(u) ⋅ P(Cu) du Gleichung 32 R min Es ist nicht ungewöhnlich, daß die NCS-Achse parallel zu einer kristallographischen Achse gleicher oder höherer Zähligkeit zu liegen kommt. Im Fall einer solchen, rein translationalen Verschiebung der NCS Achse überlagern sich die in der EigenrotationsFunktion beobachteten Funktionsmaxima von kristallographischer und nicht- kristallographischer Achse. Zu Berechnung der Eigenrotations-Funktion wurde das Programm MOLREP (CCP4,1994) verwendet. Im Falle von AviRb wurde nach einer 2-zähligen Rotationsachse gesucht, κ betrug daher 180°. Die Auflösung wurde auf 20-4 Å beschränkt. 3.5.12 Dichtemodifikation Die initial erhaltenen Phasen sind in der Regel noch zu ungenau, um eine vollständige Interpretation der aus ihnen resultierenden Elektronendichte zu ermöglichen. Zur Verbesserung der Phasen (Dichtemodifikation) können allgemeine physikalische und chemische Eigenschaften von Proteinstrukturen herangezogen werden, die aus hochaufgelösten Kristallstrukturen ableitbar sind. Hieraus ergeben sich Einschränkungen für die Elektronendichte im realen Raum und damit auch für die möglichen Phasen. Die Kombination der observierten Strukturfaktoren und experimentell bestimmten Phasen mit der durch Dichtemodifikation erhaltenen Phaseninformation resultiert in einer verbesserten Elektronendichtekarte (Hendrickson & Lattmann, 1970). Zusätzlich können Informationen der nicht-kristallographischen Symmetrie (Kap. 3.5.11) mit einbezogen werden. Auf die so erhaltene Dichtekarte kann erneut die Methode der Dichtemodifikation angewendet werden. Durch dieses iterative Verfahren können die Phasen sogar über ihre ursprüngliche Auflösungsgrenze hin ausgedehnt werden (phase extension). In vorliegender Arbeit wurde mit Hilfe der Programme DM (CCP4 1994) bzw. RESOLVE (Terwilliger, 2000) die Methoden der Solvensglättung (solvent flattening) und der Histogramm-Anpassung (histogram matching) angewendet. RESOLVE nutzt zusätzlich lokale Muster von Proteinstrukturen aus (local pattern matching). Methoden 61 Solvensglättung Grundlage der Methode der Solvensglättung (solvent flattening) ist der relativ hohe Solvensgehalt (ca. 50%) in Proteinkristallen (Matthews, 1968). Solvensmoleküle, die nicht direkt an das Protein gebunden sind, liegen aufgrund ihrer thermischen Bewegung meist ungeordnet vor und tragen daher nur unwesentlich zur Röntgenstreuung bei. So ergeben sich definierte Solvensbereiche mit geringer Elektronendichte, die sich von den Bereichen der Proteinstruktur abgrenzen lassen, und auf einen konstant niedrigen Wert festgesetzt werden können. Dies führt zu Einschränkung der möglichen Phasen, wodurch die Elektronendichte im Proteinbereich maßgeblich verbessert werden kann. Die Abgrenzung von Solvens und Protein durch eine sogenannte Solvensmaske (solvent envelope) erfolgt durch einen von Wang (1985) und Leslie (1987) entwickelten, automatisierten Algorithmus. Dabei wird die Elektronendichte an jedem Gitterpunkt eines über die Elementarzelle gelegten Gitters (Gitterabstand ca. 0.5-1.0 Å) durch einen gewichteten Mittelwert der Elektronendichte in einem Radius von ca. 8 Å ersetzt. Anhand dieser Mittelwerte wird eine Proteinmaske erstellt. Durch die Annahme eines etwas zu niedrigen Solvensgehaltes verringert sich die Wahrscheinlichkeit, daß exponierte loop-Bereiche durch die Proteinmaske abgeschnitten werden. Die Methode der Solvensglättung ist um so effektiver, je höher der Solvensgehalt des Proteinkristalls ist. Histogrammanpassung Die Histogrammanpassung (histogram matching) wird in der Regel in Kombination mit der Solvensglättung angewendet, um die Phasen innerhalb der Proteinmaske zu verbessern. Es wird ausgenutzt, daß die Häufigkeit der beobachteten Elektronendichtewerte von der Atomsorte und den Abständen der Atome in der Elementarzelle abhängt. Da die relative Anzahl der einzelnen Atome sowie die interatomaren Abstände in allen Proteinen ähnlich sind, kann die Verteilung der Elektronendichtewerte einer unbekannten Proteinstruktur an ein ideales Dichtehistogramm angepaßt werden. Lokale Mustererkennung Das Programm RESOLVE erkennt zusätzlich lokale Muster innerhalb der Elektronendichte (Terwilliger, 2003). Das charakteristische Muster der Elektronendichteverteilung in einem Radius von 2.0 Å gibt dabei Aufschluß über die Elektronendichte im Zentrum dieser Kugel. Bereiche im Proteininnern unterscheiden sich in dieser Hinsicht maßgeblich von der Proteinoberfläche, Lösungsmittelbereiche weisen wiederum andere Muster auf. 62 Methoden 3.5.13 Modellbau und Elektronendichtekarten Modellbau Resultiert aus den initialen oder den dichtemodifizierten Phasen eine zumindest teilweise interpretierbare Elektronendichte, kann die Proteinkette in die Dichte eingebaut werden. In Abhängigkeit von der Auflösung erfolgt der Einbau der Proteinhauptkette sowie gegebenenfalls die Zuordnung einzelner Seitenketten automatisch. In vorliegender Arbeit wurden große Teile der Struktur von AviRa mit dem Programm ARP/wARP (Lamzin & Wilson, 1997; Perrakis et al., 1997) gebaut, welches vor allem bei einer Auflösungsgrenze von 1.2-2.2 Å angewendet werden kann. ARP/wARP fügt zuerst freie Atome mit einem Abstand von 1.1 Å in Bereiche hoher Elektronendichte ein, die anschließend unter Berücksichtigung der Peptidgeometrie zum Proteinrückgrat zusammengefügt werden. Der Modellbau mit Hilfe der built-Routine von RESOLVE erfolgt nach dem gleichen Grundprizip, ist aber für die Interpretation von Elektronendichtekarten mittlerer Auflösung (2.4 - 3.0 Å) optimiert. RESOLVE wurde daher beim Modellbau von AviRb verwendet. Bei ausreichender Qualität der Elektronendichte können beide Programme einzelne, voluminöse Seitenketten identifizieren, so daß unter Berücksichtigung der Aminosäuresequenz in einem abschließenden Schritt die vollständige Proteinkette gebaut werden kann. Bei der Verfeinerung bereits gebauter Strukturbereiche greifen beide Programme auf das Programm REFMAC (Murshudov et al., 1997) zurück. Zur Korrektur des automatisch erzeugten Modells und zum manuellen Einbau fehlender Aminosäuren wurden die interaktiven Graphikprogramme O (Jones et al., 1991) und XFIT (McRee, 1999) verwendet. Der manuelle Modellbau erfolgte dabei iterativ, wobei folgende Elektronendichtekarten verwendet wurden: (Fobs –Fcalc) - Elektronendichtekarte (Fobs–Fcalc) – Elektronendichtekarten werden entsprechend der Differenzfouriertransformation mit den Koeffizienten (Fobs-Fcalc)·exp(iϕcalc) gemäß Gleichung 25 berechnet. Diese Dichtekarten zeigen den Unterschied zwischen Modell und tatsächlicher Struktur. Fehlende Bereiche des Modells erscheinen mit positiver Differenzdichte, fehlerhaft positionierte Modellabschnitte mit negativer Differenzdichte. Die Differenzen sind ab einem Dichteniveau von ca. drei Standardabweichungen (3σ) der durchschnittlichen Elektronendichte signifikant. (Fobs–Fcalc) -Dichtekarten werden bei der Korrektur des Proteinmodells sowie für den Einbau von Liganden und Wassermolekülen verwendet. 63 Methoden (2Fobs –Fcalc) - Elektronendichtekarte Die (2Fobs–Fcalc) – Dichtekarte entspricht der Addition einer Differenzdichtekarte und der observierten Dichtekarte und wird mit den Faktoren (2Fobs-Fcalc)·exp(iϕcalc) berechnet. (2Fobs–Fcalc) – Karten werden bei einem Dichteniveau von 1σ dargestellt. Sie zeigen die Elektronendichte des Modells und die Differenzdichte in voller Höhe, sind allerdings stark vom Modell beeinflußt (model bias). Gewichtete Elektronendichtekarte Der Einfluß des Modells auf die Elektronendichtekarte läßt sich durch eine Gewichtung der Strukturfaktoren minimieren, so daß die Fehler des Strukturmodells einbezogen werden. Zur Gewichtung werden nach Read (1990) sogenannte σA-Terme herangezogen, welche die gemessenen Strukturfaktoramplituden mit den berechneten korrelieren. In vorliegender Arbeit wurden mit den Programmen CNS (Brünger et al., 1998) und REFMAC (CCP4, 1994) σA-gewichtete (2mFobs-DFcalc)- bzw. (mFobs-DFcalc) Elektronendichtekarten berechnet. 3.5.14 Verfeinerung von Proteinstrukturen Die auf der Grundlage eines initialen Modells errechneten Strukturfaktoren stimmen in der Regel nur schlecht mit den gemessenen Daten überein. Ziel der Verfeinerung des Proteinmodells ist es, durch Variation der Ortskoordinaten und B-Faktoren der Atome eine möglichst gute Übereinstimmung zwischen berechneten und gemessenen Strukturfaktoren zu erreichen. Ein Maß für den Grad an Übereinstimmung ist der kristallographische R-Faktor Rcryst (Gleichung 33). Eine zufällige Verteilung von Proteinatomen in der asymmetrischen Einheit resultiert in einem R-Faktor von ca. 59%, initiale Proteinmodelle weisen in der Regel einen R-Faktor von 40-50% auf. Rcryst = mit ∑ hkl Fobs (hkl) − k ⋅ Fcalc (hkl) ∑ Gleichung 33 F (hkl) hkl obs k = Skalierungsfaktor, auflösungsabhängig Bei der Verfeinerung sollte die Zahl der Observablen (gemessene Reflexe) die Zahl der zu verfeinernden Parameter (Variablen) nicht übersteigen. Die Anzahl der Röntgenreflexe wird durch die Auflösungsgrenze und Vollständigkeit der gemessenen Daten sowie durch die Raumgruppe des Kristalls begrenzt. Das Observablen-Variablen-Verhältnis kann durch die Einführung zusätzlicher Bedingungen (restraints) verbessert werden. Bei der 64 Methoden Verfeinerung werden die geometrischen Parameter von Proteinstrukturen (Bindungslängen und –winkel, Chiralität und Torsionswinkel) sowie die Ähnlichkeit der durch nicht-kristallographische Symmetrie verknüpften Moleküle innerhalb einer asymmetrischen Einheit berücksichtigt (Kleywegt & Read, 1997). Zu Beginn der Verfeinerung werden möglichst viele Parameter konstant gehalten, die Zahl der restraints ist hoch. Bei zunehmend verbessertem Modell können immer mehr Parameter freigegeben werden (Kleywegt & Jones, 1995). Allerdings besteht bei einer zu großen Anzahl an freien Parametern die Gefahr, experimentelles Rauschen zu modellieren (overfitting). Um dies zu vermeiden, werden ca. 3-5% der Reflexe (Testdatensatz) zufällig ausgewählt und nicht in die Verfeinerung einbezogen. Anhand dieser Reflexe wird analog zum kristallographischen R-Faktor Rcryst der freie R-Faktor Rfree berechnet (Gleichung 34, Brünger, 1992). Beim overfitting sinkt der Rcryst während der Rfree ansteigt. Rfree = mit ∑ hkl ∈T Fobs (hkl) − k ⋅ Fcalc (hkl) ∑ hkl ∈T Gleichung 34 Fobs (hkl) T = Testdatensatz Der freie R-Faktor korreliert mit dem mittleren Fehler der Modellphasen und dient daher als Maß für den Fortschritt der Verfeinerung (Kleywegt & Brünger, 1996). Die absoluten Werte von Rcryst und Rfree unterscheiden sich in der Regel um 3-6%, am Ende der Verfeinerung liegt Rcryst auflösungsabhängig zwischen 18 und 25%, Rfree bei 20-28%. Methode der maximalen Wahrscheinlichkeit Die Verfeinerung von Proteinstrukturen beruht auf der Methode der maximalen Wahrscheinlichkeit (maximum likelihood). Dabei werden die Parameter des Modells so verändert, daß die berechneten Reflexe mit höherer Wahrscheinlichkeit mit den Observablen übereinstimmen. In erster Näherung entsprechen die Abweichungen zwischen berechneten und observierten Strukturfaktoren einer Gaußverteilung, so daß die Quadrate der Differenzen von Fcalc und Fobs in der Funktion Q minimiert werden können (Drenth, 1994; Gleichung 35). Q = ∑ 1 σ 2 (hkl) ⋅ (Fobs (hkl) − Fcalc (hkl)) 2 Gleichung 35 hkl mit σ = Standardabweichung Die vereinfachte Annahme einer Gaußverteilung der Fehler wird als Methode des kleinsten quadratischen Fehlers (least squares refinement) bezeichnet und ist Grundlage vieler Verfeinerungsprogramme. Allerdings weist diese Methode lediglich einen 65 Methoden Konvergenzradius von 1 Å auf (Brünger, 1987), der durch die Annahme anderer Verteilungen, die der Realität exakter entsprechen, vergrößert werden kann. Kompliziertere Verteilungen berücksichtigen zur Berechnung der Modellfehler zusätzlich Kristalldefekte und Fehler bei der Datenmessung, die im voraus abgeschätzt werden müssen. In vorliegender Arbeit wurden das auf der least squares Methode basierende Programm von CNS (Brünger et al., 1990) sowie das maximum likelihood Programm REFMAC (Murshudov et al., 1997) verwendet. REFMAC besitzt zudem den Vorteil, daß die σA-Werte zur Gewichtung der Strukturfaktoren lediglich aus dem Testdatensatz abgeschätzt werden, wodurch sich der model bias deutlich verringert. Molekulardynamik-Simulation Bei der Molekulardynamik-Simulation (simulated annealing) werden allen Atomen der Polypeptidkette Geschwindigkeiten zugeordnet, die der molekularen Bewegung bei hohen Temperaturen (3000 K) entsprechen. Die Energie der einzelnen Atome ist dadurch so hoch, daß Energiebarrieren überwunden und lokale Minima verlassen werden können. Dabei werden vor allem Änderungen in den Torsionswinkeln der Polypeptidkette zugelassen (Kirkpatrick et al., 1983). Das aufgeheizte System wird in der Simulation schrittweise (50 K) auf Raumtemperatur abgekühlt. Diese Methode eignet sich vor allem in frühen Stadien der Strukturverfeinerung, da lokale Minima ohne manuelle Korrekturen überwunden werden können. Molekulardynamik-Simulationen wurden bei der Verfeinerung der AviRa-dehyd-Struktur sowie bei den Strukturen von AviRb-WT bzw. AviRb-AdoMet mit CNS (Brünger et al., 1990) durchgeführt. Verfeinerung von Temperaturfaktoren Die statistischen Fehlordnungen und thermischen Bewegungen der Atome im Proteinkristall werden gemäß Kapitel 3.5.5 durch den Temperaturfaktor (B-Faktor) beschrieben, der nach der maximum likelihood Methode verfeinert werden kann. Bei Strukturen geringerer Auflösung kann aufgrund der begrenzten Datenmenge und des daher schlechten Verhältnisses von Observablen zu Variablen lediglich ein mittlerer Temperaturfaktor für das ganze Protein angegeben werden. Im mittleren Auflösungsbereich werden die B-Faktoren gruppenweise, unterhalb von 2.5 Å individuell für jedes Atom bestimmt. Bei hochaufgelösten Strukturen kann die unterschiedliche Schwingung eines Atoms in die drei Raumrichtungen durch Temperaturfaktors bestimmt werden. eine anisotrope Beschreibung des 66 Methoden TLS-Modell Die TLS-Methode (Winn et al., 2001) erlaubt eine gruppenweise, anisotrope Bestimmung der B-Faktoren bei einer Auflösung von 1.5-2.5 Å und berücksichtigt die in der Regel anisotropen Bewegungen von ganzen Domänen, Sekundärstrukturelementen oder Seitenketten. Die Anzahl der freien Parameter wird durch die Verwendung von kollektiven Variablen für eine ganze Gruppe von Atomen (TLS-Gruppe) gegenüber einer anisotropen Verfeinerung aller Atome stark reduziert. Die TLS-Gruppen werden dabei als pseudo-starre Körper angesehen (Abbildung 28). Abbildung 28 Schematische Darstellung der anisotropen Schwingungen zweier pseudo-starrerKörper im TLS-Modell. Jede TLS-Gruppe schwingt dabei um ihren Schwerpunkt (Quelle: Winn et al., 2001). Die mittlere quadratische Verschiebung UTLS eines Atoms wird durch die drei Tensoren T (Translation), L (Libration) und S (Screw Rotation) beschrieben und in Abhängigkeit von seiner Entfernung r zum Schwerpunkt der TLS-Gruppe angegeben (Gleichung 36). U TLS ≡ uu T = T + S T × r T − r × S − r × L × r T Gleichung 36 T und L sind symmetrische Tensoren und durch je sechs Parameter definiert, S ist asymmetrisch und wird durch acht Parameter definiert. Insgesamt werden demnach pro Gruppe 20 zusätzliche Parameter eingeführt. Die Zahl der verwendeten TLS-Gruppen richtet sich nach der Auflösungsgrenze der gemessenen Daten. Bei einer maximalen Auflösung von 2.0 Å können zwei bis fünf TLS-Gruppen definiert werden, bei 1.5 Å bis zu 50. Die Zuordnung einzelner Atome zu Gruppen sollte sich an der Domänenstruktur bzw. an Sekundärstrukturelementen des Proteins orientieren. Die TLS Methode ist im Programm REFMAC implementiert. Bei der Verfeinerung der Struktur von AviRa-SeMet wurden 34 TLS-Gruppen definiert, wobei alle α-Helices, βStränge und loops jeweils einer separaten Gruppe zugeordnet wurden. Der N-terminale loop wurde ebenso wie der loop β4-α7 in drei TLS-Gruppen unterteilt, die sich an der Methoden 67 Verteilung der isotropen B-Faktoren in diesem Bereich orientierten. Aufgrund der geringeren Auflösung der AviRb Struktur wurden hier lediglich vier TLS-Gruppen definiert, die jeweils eine Domäne eines Protomers beinhalteten. Die erhaltenen TLSParameter wurden mit Hilfe des Programms TLSANL (Howlin et al., 1993) analysiert. TLSANL transformiert die TLS-Tensoren in allgemeine Schwingungsparameter und gibt für jedes Atom eine mittlere quadratische Abweichung an. Einbau von Wassermolekülen Wassermoleküle wurden mit dem Programm ARP/wARP (Lamzin et al., 1997) bei einem (2Fobs-Fcalc)-Dichteniveau von mehr als 0.9 σ automatisch in das Proteinmodell eingebaut. Dabei wurden nur solche Wassermoleküle akzeptiert, die mindestens 2.2 Å von allen anderen Atomen entfernt lagen und zusätzlich eine Wasserstoffbrücke (2.4 - 3.2 Å) zu einem Donor- oder Akzeptoratom des Proteins ausbilden konnten. 3.6 Proteinstrukturen 3.6.1 Proteinstrukturvorhersage Sekundärstrukturvorhersagen Anhand der Aminosäuresequenz eines Proteins lassen sich α-Helices und β-Stränge sowie loop-Bereiche voraussagen. Zudem kann über die Hydrophobie einer Aminosäure und ihrer Umgebung bestimmt werden, ob diese Aminosäure eher im hydrophoben Zentrum (core) eines Proteins oder an der hydrophileren Oberfläche zu liegen kommt. Die Seitenkette einer Aminosäure liegt im Proteinkristall mit einer höheren Wahrscheinlichkeit geordnet vor, wenn sie sich im Kern der Struktur befindet. Zur Strukturlösung von AviRa durch Se-MAD wurden verschiedene Leucine und Isoleucine auf DNA-Ebene durch Methionin ersetzt. Das zur Phasierung notwendige anomale Signal ist um so stärker, je unbeweglicher die Aminosäure ist. Es wurden daher Reste ausgewählt, die als verborgen vorhergesagt wurden. Bei der Wahl der Mutanten zur Verbesserung der AviRb-Kristallstruktur wurden dagegen Aminosäuren ausgewählt, die mit hoher Wahrscheinlichkeit an der Proteinoberfläche liegen. Die Sekundärstruktur sowie die Wahrscheinlichkeit, daß eine Aminosäure an der Proteinoberfläche zu finden ist, wurde mit dem Programm PREDICT PROTEIN (Columbia University Bioinformatics Center, 2003; Yang & Wang, 2002) vorhergesagt. 68 Methoden Homologiemodelle Anhand von Sequenzvergleichen lassen sich vielfach Aussagen über Funktion und Faltung eines unbekannten Proteins machen, da funktionell und strukturell verwandte Proteine oft auch auf Sequenzebene Ähnlichkeiten aufweisen. Eine beliebige Sequenz kann mit Hilfe des Programms BLAST (Altschul et al., 1990) mit Einträgen von Sequenzdatenbanken verglichen werden. Ein Maß für die lokale Ähnlichkeit zweier Sequenzen wird dabei durch den sogenannten E-Wert angegeben, welcher für zwei beliebige Sequenzen 1.0 beträgt. Je niedriger der E-Wert, desto höher ist die Verwandtschaft zweier Sequenzen. Eng verwandte Sequenzen besitzen einen E-Wert von e-50 bis e-10, bei e-2 geht man von einer entfernten Verwandtschaft aus. Bei ausreichend hoher Sequenzidentität (> 25 %) zu einem strukturell bekannten Enzym ist es möglich, ein Homologiemodell des unbekannten Proteins zu berechnen. Grundlage des Modells ist eine Überlagerung der beiden Aminosäuresequenzen (alignment). SpoU-MTasen weisen im Gegensatz zu klassischen MTasen eine relativ hohe Sequenzidentität von bis zu 35% auf und eignen sich daher prinzipiell für die Erstellung von Homologiemodellen. Im Verlauf der strukturellen Untersuchungen an AviRb wurde mit dem Programm CLUSTALW (Higgins et al., 1996) zuerst ein Sequenzvergleich zwischen AviRb und der MTase RrmA (Nureki et al., 2002) durchgeführt, wobei die Grundeinstellungen (defaults) des Programms beibehalten wurden. Mit dem Programm SWISS MODEL (Schwede et al., 2003) konnte nun ein initiales Strukturmodell erstellt werden, das anschließend automatisch einer Energieminimierung und Optimierung der geometrischen Parameter unterzogen wurde. 3.6.2 Validierung von Proteinstrukturen Die Qualität der Strukturmodelle hängt maßgeblich von der Güte der gesammelten Daten ab. Die Modelle sind auch nach der Verfeinerung noch fehlerbehaftet, wobei die einzelnen Fehler verschieden schwer wiegen und sich zudem oft auf bestimmte Bereiche des Modells beschränken. Um die Qualität einer Proteinstruktur zu beurteilen, gibt es unterschiedliche Kriterien, die sich entweder auf die gesamte Struktur oder auf lokale Bereiche wie beispielsweise einzelne Aminosäuren beziehen (Dodson et al., 1998). Die Qualitätskriterien sollten unabhängig von der Verfeinerung sein und dürfen daher nicht als restraints in den entsprechenden Programmen vorhanden sein. Die mittlere quadratische Abweichung (rmsd) von idealen geometrischen Parametern (Bindungslängen und -winkel, Planarität der Peptidbindung) wird beispielsweise meist in der Verfeinerung berücksichtigt 69 Methoden und ist daher nur bedingt aussagekräftig. Wichtige Qualitätskriterien sind der freie R-Faktor (Kap. 3.5.14) sowie geringe positive bzw. negative Differenzdichte in den (Fobs-Fcalc)Elektronendichtekarten (Kap. 3.5.13). Aufgrund der stark eingeschränkten Bewegungsfreiheit der Atome innerhalb einer kovalenten Bindung sollten miteinander verbundene Atome zudem ähnliche Temperaturfaktoren besitzen (Kap. 3.5.5). Validierungsprogramme wie PROCHECK (Laskowski et al., 1993) oder WHATCHECK (Hooft et al., 1996) untersuchen neben der Bindungsgeometrie die Torsionswinkel φ und ψ der Polypeptidhauptkette. Wegen der sterischen Hinderung zwischen den Atomen der Haupt- und Seitenketten sind φ und ψ für alle Aminosäuren mit Ausnahme von Glycin stark eingeschränkt. Zur graphischen Veranschaulichung werden die Torsionswinkel aller Aminosäuren im Ramachandran-Diagramm gegeneinander aufgetragen (Ramachandran & Sasisekharan, 1968). PROCHECK teilt das Diagramm anhand statistischer Analysen hochaufgelöster Proteinstrukturen in "energetisch günstige", "erlaubte", "zusätzlich erlaubte" und "verbotene" Bereiche ein. Bei gut verfeinerten Proteinmodellen sollten bei einer Auflösung von 2.0 Å mehr als 90% der Aminosäuren den energetisch günstigen Bereichen zuzuordnen sein. Die Seitenkettenwinkel χ1 und χ2 von Leucinen und Isoleucinen besitzen ebenfalls bevorzugte Winkelkombinationen, da ungünstige sterische Wechselwirkungen vermieden werden. Diese Bereiche sind allerdings weniger stark begrenzt. 3.6.3 Beschreibung von Proteinstrukturen Analyse von Proteinstrukturen Sekundärstrukturelemente wie α-Helices und β-Faltblätter können anhand charakteristischer Wasserstoffbrücken zwischen Carbonyl- und Aminogruppen des Peptidrückgrates zugeordnet werden. Die Wasserstoffbrücken werden dabei durch eine Energiefunktion bestimmt, welche Abstand und relative Lage von Donor- und Akzeptoratomen berücksichtigt. Hierzu wurden die Programme DSSP (Kabsch & Sanders, 1983) sowie STRIDE (Frishman & Argos, 1995) verwendet. Kristall- und Dimerkontakte wurden mit den folgenden Programmen analysiert: Polare Wechselwirkungen zwischen Donor und Akzeptor wurden mit CONTACT (ccp4, 1994) bestimmt, wobei ein maximaler Abstand von 3.5 Å zugelassen wurde. Zur Analyse von Kontaktflächen nach der Lee & Richards Methode (1971) diente NACCESS (Hubbard & Thornton, 1993). Dabei wurden lediglich Aminosäurereste, deren solvenszugängliche Oberfläche im Kristallkontakt um mehr als 1.0 Å2 verringert ist, berücksichtigt. 70 Methoden Darstellung von Proteinstrukturen Aufgrund der Größe und Komplexität von Proteinstrukturen ist eine atomare Darstellung nur in kleinen Ausschnitten möglich. Zur Veranschaulichung werden daher Bändermodelle (ribbon plots) zur Darstellung der Sekundärstrukturelemente verwendet. Oberflächen wurden mit den Programmen GRASP (Nicholls et al., 1991) bzw. MSMS (Sanner, 1996) berechnet. Sämtliche Graphiken wurden mit den Programmen MOLSCRIPT (Kraulis 1991) und POVScript+ (Fenn et al., 2003) angefertigt. Zur photorealistischen Darstellung wurde RASTER3D (Merritt & Bacon, 1997) verwendet. 3.6.4 Proteinstrukturvergleiche Die meisten Proteine besitzen keine einzigartige Faltung, sondern lassen sich Strukturfamilien zuordnen. Die Einteilung der verschiedenen MTase-Klassen (Kap. 1.2) erfolgte beispielsweise aufgrund struktureller Merkmale innerhalb der einzelnen Klassen. Der strukturelle Vergleich erfordert eine möglichst exakte Überlagerung der zu vergleichenden Moleküle. Als Kriterium für die Ähnlichkeit zweier Strukturen dient die Anzahl sowie die mittlere quadratische Abweichung (rmsd) der überlagerten Atome (Maiorov & Crippen, 1994). Die Strukturdatenbank wurde mit Hilfe des Programms DALI (Holm & Sander, 1993) nach strukturell verwandten Proteinen durchsucht. Die MTasen, welche gemäß DALI den höchsten Z-score, der ein Maß für den Grad der strukturellen Übereinstimmung ist, aufwiesen, wurden anschließend mit dem Programm LSQMAN (Kleywegt & Jones, 1994; Kleywegt, 1999) überlagert. Dabei wurde eine maximale Abweichung der überlagerten Cα-Atome von 3 Å bei einer Mindestsegment-länge von drei AS zugelassen. 3.6.5 Strukturmodelle: Enzym-Substrat-Komplexe AviRa-AdoMet-Komplexe Das aktive Zentrum einer Gruppe funktionell verwandter Enzyme mit konservierter Faltung befindet sich in der Regel an der gleichen Stelle. Die Bindungsstellen von Substraten und Kofaktoren sind innerhalb einer solchen Enzymklasse konserviert. Ist die Struktur eines Apoenzyms bekannt, so läßt sich die Position eines Kofaktors durch Vergleich mit der Bindungsposition in strukturell und funktionell verwandten Enzymen ableiten. Innerhalb einer MTase-Klasse ist die Bindungsstelle des Methyldonors AdoMet hoch konserviert. Nach der Strukturlösung von AviRa wurde ein Modell des Kofaktors Methoden 71 AdoMet in seiner typischen Bindungstasche erstellt. Grundlage war die Orientierung des Kofaktors in der zu AviRa strukturell ähnlichsten MTase Rv2118. AdoMet wurde nach Überlagerung der aktiven Zentren der beiden Enzyme durch LSQMAN (Kap. 3.6.4) aus Rv2118 auf AviRa übertragen. Anschließend wurde mit dem Programm REFMAC (CCP4, 1994) eine Energieminimierung durchgeführt. AviRa/b-RNA-Komplexe Wechselwirkungen zwischen Proteinen und RNA sind mannigfaltig und lassen sich nur selten auf Wechselwirkungen bestimmter Sequenzmotive oder einzelner, konservierter Aminosäuren zurückführen (Nagai, 1996). Eine grundsätzliche Affinität zum Phosphatrückgrat der RNA entsteht durch eine positiv geladene Oberfläche des Proteins im Bereich der Bindungsstelle. Die genaue Bindungsstelle an der RNA wird primär anhand von Sekundärstrukturelementen erkannt (Nagai, 1996). Die Oberflächen von RNA und Protein müssen in diesem Bereich komplementär sein. Da die genaue Methylierungsposition von AviRa bzw. AviRb am Ribosom bekannt ist, konnten Modelle von Protein-RNA-Komplexen erstellt werden. Dazu wurden AviRa bzw. AviRb mit Hilfe des Graphikprogramms O (Jones et al., 1991) manuell so an die RNA gedockt, daß ein Methyltransfer auf die entsprechende Base möglich wird. Die Modelle wurden im Bezug auf Geometrie und Distanz zwischen Methyldonor und -akzeptor sowie positiver Wechselwirkungen zwischen RNA und Protein unter Vermeidung sterischer Konflikte analysiert und optimiert. Das Programm REFMAC wurde zur Energieminimierung der einzelnen Andock-Experimente verwendet, sterische Hinderungen und mögliche Wasserstoffbrücken zwischen Ribosom und Protein wurden durch WHATCHECK (Hooft et al., 1996) analysiert. 72 4 Ergebnisse und Diskussion 4.1 Strukturaufklärung von AviRa 4.1.1 Expression, Reinigung und Kristallisation des Wildtyps Zur Expression von AviRa wurde das Vektorkonstrukt pRSETb-AviRa (Anhang 6.3) in den E. coli Stamm BL21DE(3) eingebracht (Kap. 3.1.5). Der im Vektor pRSETb für einen N-terminalen (His)6-tag codierende Sequenzabschnitt war zuvor gentechnisch entfernt worden (Mosbacher, 2001). Die Präparation erfolgte gemäß einer leicht modifizierten, vereinfachten Variante eines bereits etablierten Protokolls (Kap. 3.2). Der Verlauf der Kationenaustauschchromatographie ist in Abbildung 29 zu sehen, die Analyse der proteinhaltigen Fraktionen per SDS-PAGE in Abbildung 30. Das Elutionsprofil der IEC weist nur eine signifikante Bande bei einem Elutionsvolumen von VE = 237 mL und einer Leitfähigkeit von 18 mS/cm auf. Die SDS-PAGE zeigt eine starke Anreicherung von AviRa in den peak-Fraktionen, Verunreinigungen sind nur noch in sehr geringem Maße enthalten. Nahezu alle anderen E. coli Proteine sind bei einem pH von 8.8 des IEC-Puffers negativ geladen und daher nicht in der Lage, an die ebenfalls negativ geladene Säulenmatrix zu binden. Abbildung 29 Elutionsprofil der Reinigung von AviRa mittels IEC (Source 30S). Die Elution erfolgte mit steigendem Salzgradienten. ▬▬ vereinigte Fraktionen (228-248 mL). 73 Ergebnisse und Diskussion LMW 97 kDa Bahn Bahn Bahn Bahn Bahn 66 kDa 45 kDa 30 kDa 1 2 3 4-8 9 Rohextrakt Durchfluß IEC LMW-Marker Fraktionen IEC (228-248 mL) LMW-Marker AviRa 20 kDa 1 Abbildung 30 Die 2 3 4 5 6 7 8 9 SDS-PAGE der chromatographischen Reinigung von AviRa mit einer Source 30S. geringen noch vorhandenen Verunreinigungen beeinflußten die Kristallisationsfähigkeit des Proteins nicht; daher wurde gegenüber des ursprünglichen Reinigungsprotokolls auf die GPC verzichtet. Die AviRa-haltigen Fraktionen (228-248 mL; durch ▬▬ gekennzeichnet) wurden vereinigt, gegen Niedrigsalzpuffer dialysiert und die Konzentration zur Kristallisation auf 4 mg/mL eingestellt. Die Ausbeute an gereinigtem Protein betrug 8-10 mg pro Liter Bakterienkultur. Kristallisation Die Kristallisation erfolgte nach der Hängetropfen-Methode unter den bereits etablierten Bedingungen von 6-8% PEG-20'000 bei einem pH von 6.7-6.9 (0.1 M MES; Kap. 3.4.1; Mosbacher, 2001). Kristallbildung trat innerhalb von 12 h auf, die Kristalle erreichten ihre maximale Größe nach zwei Tagen. Oftmals enthielten die Tropfen sehr viele, teilweise verwachsene Kristalle. Dies ist auf eine hohe Anzahl an Kristallisationskeimen zurückzuführen. Da AviRa bei höheren Konzentrationen (> 3 mg/mL) sehr instabil ist und innerhalb kurzer Zeit präzipitiert, wurden die Proteinproben unmittelbar vor Ansetzen der Kristallisationstropfen zentrifugiert. So konnten Schwebeteilchen und bereits präzipitiertes Protein entfernt werden. Abbildung 31 zeigt drei Tropfen welche ohne Zentrifugation, 30 min nach der Zentrifugation und direkt nach der Zentrifugation angesetzt wurden. 74 Ergebnisse und Diskussion (a) 150 µm Abbildung 31 (b) 150 µm (c) 200 µm Kristallisation von AviRa unter verschiedenen Bedingungen. (a) Tropfen ohne Zentrifugation angesetzt; [AviRa] = 4 mg/mL; Kristallisationspuffer: 0.1 M MES, pH 6.8, 8% PEG-20'000; max. 150 x 80 x 50 µm3. (b) Tropfen 30 min nach Zentrifugation angesetzt; [AviRa] = 4 mg/mL; Kristallisationspuffer: 0.1 M MES, pH 6.8, 9% PEG-20'000; max. 200 x 100 x 50 µm3. (c) Tropfen direkt nach Zentrifugation angesetzt; [AviRa] = 4 mg/mL; Kristallisationspuffer: 0.1 M MES, pH 6.9, 8% PEG-20'000; max. 300 x 200 x 150 µm3. Durch die späte Zentrifugation konnte zwar die Zahl der Kristallisationskeime vermindert werden, die erhaltenen Kristalle waren dennoch in 80-90% der Fälle in sich verwachsen und daher nicht röntgentauglich (Abbildung 32(a)). Veränderungen der Vorsättigung sowie Additive wie Glycerin, Phosphate oder Sulfate hatten keinen Einfluß auf die Kristallisation. Die Zahl der röntgentauglichen Kristalle war jedoch ausreichend hoch, so daß keine weitere Optimierung durchgeführt wurde. Allerdings waren sämtliche Kristalle extrem fragil. Es konnte kein Aufbewahrungspuffer gefunden werden, in welchen die Kristalle ohne Bildung von starken Rissen umgesetzt werden konnten. Dies erschwert die Etablierung eines cryo-Protokolls sowie die Derivatisierung mit Schwermetallen zur Strukturlösung. Daher wurde versucht, stabilere Kristalle zu erhalten. Durch Quervernetzung mit Glutaraldehyd (0.25%, 2.5 h) erhöhte sich die Kristallstabilität, allerdings verminderte sich die Streukraft der Kristalle maßgeblich. Die Auflösungsgrenze vor der Quervernetzung betrug ca. 2.5 Å, danach ca. 5 Å. Im folgenden wurde daher auf die Quervernetzung verzichtet. Alternativ wurde nach weiteren Kristallisationsbedingungen gesucht. Es konnten zwei weitere initiale Bedingungen gefunden werden: 1) 12% PEG-4000, 0.1 M HEPES, 0.1 M NaAc, pH 7.5 2) 15% PEG-8000, 0.1 M MES, 0.2 M NaAc, pH 6.5 75 Ergebnisse und Diskussion Die unter diesen Bedingungen erhaltenen Kristalle waren allerdings nicht einheitlich gewachsen und röntgenuntauglich (Abbildung 32(b) und (c)). Eine Verfeinerung der neu erhaltenen Bedingungen zeigte keine Abhängigkeit der Kristallbildung von pH-Wert oder PEG-Konzentration. Beide Kristallisationsbedingungen wurden daher nicht weiter verfolgt. Es gelang somit nicht, stabilere, röntgentaugliche Kristalle zu erhalten. (a) (b) 200 µm Abbildung 32 100 µm (c) 100 µm Röntgenuntaugliche Kristalle von AviRa unter verschiedenen Bedingungen. [AviRa] = 4 mg/mL (a) Kristallisationspuffer: 0.1 M MES, pH 6.8, 8% PEG-20'000; 300x180x50 µm3. (b) Kristallisationspuffer: 0.1 M HEPES, pH 7.5, 0.1 M NaAc, 12% PEG-4000; 200x100x 50 µm3. (c) Kristallisationspuffer: 0.1 M MES, pH 6.6, 0.2 M NaAc, 15% PEG-8000; 300x150x100 µm3. Charakterisierung der Kristalle Die erhaltenen WT-Kristalle konnten in einer Glaskapillare montiert (Kap. 3.4.4) und bei Raumtemperatur an der Hausanlage vermessen werden (Kap. 3.5.6). Sämtliche Kristalle ließen sich der primitiv monoklinen Raumgruppe P21 mit den bereits bekannten Zellparametern (a = 37.1 Å; b = 48,9 Å, c = 63.7 Å, α = γ = 90°, β= 99.1°) zuordnen (Mosbacher, 2001). Der Matthews-Parameter VM (Kap. 3.5.2) beträgt unter Annahme eines Moleküls pro asymmetrischer Einheit 2.17 Å3/Da, der Solvensgehalt des Kristalls errechnet sich nach Gleichung 6 zu 43% (v/v). Erstmals konnte ein relativ vollständiger Datensatz mit einer Auflösung von 2.4 Å erhalten werden (Tabelle 9). 76 Ergebnisse und Diskussion Tabelle 9 Charakterisierung des primären AviRa-WT-Datensatzes 1 Raumgruppe P21 Elementarzellparameter: a [Å] b [Å] c [Å] β [°] Mosaizität 0.6 Zahl der gemessenen Reflexe 2 Zahl der unabhängigen Reflexe 19'577 (1427) 2 Auflösung [Å] 8093 (921) 30–2.4 Rsym aller Daten [%] 2 5.7 (21.0) Vollständigkeit [%] 2 91 (83) Multiplizität I/σ 1 2 4.1.2 37.1 48.9 63.7 99.1 2 2 2.3 (1.5) 9 (3.2) Der Datensatz wurde bei Raumtemperatur an der Hausanlage gemessen. Werte in Klammern beziehen sich auf die letzte Auflösungsschale (2.53-2.4 Å). Entwicklung eines cryo-Protokolls Die Streukraft der AviRa-Kristalle ließ aufgrund von Strahlungsschäden im Verlauf einer Messung stark nach. Zur Verminderung der Beschädigung des Kristalls durch Röntgenstrahlung, sollten die Kristalle bei 100 K im Stickstoffstrom vermessen werden (Kap. 3.4.4). Dabei muß der Mutterlauge ein Glasbildner (cryo-protectant) zugesetzt werden, um die Bildung von störenden Eiskristallen zu verhindern. Die erfolgreiche Etablierung eines cryo-Protokolls ermöglicht zudem Messungen am Synchrotron, welche aufgrund der intensiven Strahlung immer bei 100 K durchgeführt werden, und stellt daher die Grundlage für eine Phasierung durch MAD dar. Aufgrund der hohen Fragilität der AviRa-Kristalle mußten verschiedene cryoprotectants getestet werden. Auftretende Risse im Kristall, verminderte Streukraft sowie eine erhöhte Mosaizität gegenüber dem bei RT gemessenen Datensatz dienten als Qualitätskriterium für die Eignung einer Lösung als cryo-protectant. Tabelle 10 zeigt eine Zusammenstellung der getesteten Reagenzien. Zusätzlich wurde untersucht, ob eine sukzessive Erhöhung des cryo-protectants (5%-Schritte, +S) einen Vorteil gegenüber der direkten Zugabe der gesamten erforderlichen Konzentration (-S) hatte und ob sich die Kristall in die entsprechenden Lösungen umsetzen ließ (+U) oder ob die Zugabe des cryoprotectants im Tropfen erfolgen mußte (-U). Die Veränderung von pH-Wert, Konzentration an PEG-20'000 sowie die Zugabe von NaCl zur Mutterlauge wurden ebenfalls getestet, hatten jedoch keinem Einfluß auf die Kristallstabilität. 77 Ergebnisse und Diskussion Tabelle 10 Getestete cryo-protectants bei AviRa-Kristallen. cryo-protectant Endkonz. Zugabemethode (v/v) Kristallstabilität Diffraktionsmuster Auflösung [Å] Mosaizität 2.5 0.4 - 0.5 Doppelspots 6 >2 4-5 1.5 6 - 2.0 – 2.2 1.4 4 - 3-4 >2 ohne, RT Glycerin 25% +U, ±S; −U, −S starke Risse 25% −U, +S mittelstarke Risse Doppelspots 50% ±U, −S starke Risse Streifen MDP 15% ±U , ±S starke Risse Streifen Ethylenglykol 20% ±U, ±S starke Risse - Inositol gesättigt +U, −S leichte Risse Eisringe Isopropanol 40% ± U, ± S starke Risse, ab 10% - PEG-200 20% ± U, ± S starke Risse, ab 10% - PEG-400 20% +U, ±S; −U, −S starke Risse leichte Risse ab 10% −U, +S - PEG-600 50% +U, −S starke Risse 30% +U, ±S; −U, −S starke Risse leichte Risse −U, +S Doppelspots Streifen Doppelspots Sucrose 25% −U, +S starke Risse, ab 10 % - PEG-400 + Ethylenglykol 10% + 10% −U, ±S starke Risse - Paratone-N 100% +U leichte Risse teilweise Eisringe 5 >2 Paraffinöl 100% +U leichte Risse Eisringe 3-4 >2 Paraffinöl Paratone-N 1:1, 1:2 2:1 +U leichte Risse teilweise Eisringe 3-4 >2 PEG-400 + Paraffinöl 10% + 100% −U, +S, +U leichte Risse teilweise Eisringe 2.0-4.0 1.2 - 2 PEG-400 + Paraffinöl / Paratone-N 10% + 80:20 −U, +S, +U gelegentlich Risse teilweise Eisringe, sehr schwach 2.5 –3.0 0.8 –1.0 Alle cryo-protectants enthielten 0.1 M MES, pH 6.7, und 6% PEG-400. Experimente, die zu einem identischen Ergebnis führten, sind zusammengefaßt und durch ";" getrennt. Legende: +U = Umsetzen des Kristalls in die entsprechenden Lösungen; −U = ohne Umsetzen des Kristalls, Zugabe des cryo-protectants im Tropfen bei konstantem Volumen; +S = sukzessive Zugabe in 5% Schritten; −S = direkte Zugabe der gesamten Menge an cryo-protectant. Die direkte Zugabe der gesamten erforderlichen Menge an cryo-protectant, sowie jegliche Versuche, den Kristall in einen anderen Tropfen umzusetzen, führten unabhängig vom gewählten Glasbildner zu starken Rissen im Kristall. Die sukzessive Zugabe des cryoprotectants im Kristalltropfen war in den meisten Fällen bis zu einer Konzentration von 10% möglich. Bei einer weiteren Erhöhung der Glasbildnerkonzentration traten Risse unterschiedlicher Stärke im Kristall auf, welche bei der Verwendung von PEG-400 am geringsten waren. Alternativ wurden verschiedene Öle getestet. Hierbei wurden stets 78 Ergebnisse und Diskussion Eisringe beobachtet. Die Kombination von einer niedrigen Konzentration an PEG-400 (10%, Zugabe in zwei Schritten ohne Umsetzen des Kristalls) und anschließender Transfer in eine Mischung aus Paraffinöl und Paratone-N im Verhältnis 80:20 (v/v) führte etwa bei jedem dritten getesteten Kristall zum Erfolg, so daß Daten geringer Mosaizität ohne Eisringe aufgenommen werden konnten. 4.1.3 Phasierungsversuche durch Molrep und MIR Molekularer Ersatz AviRa ließ sich durch Identifikation der Sequenzmotive im Bereich der AdoMetBindestelle den klassischen Methyltransferasen zuordnen (Kap. 1.3). Die Sequenzidentität innerhalb dieser MTase-Klasse ist sehr gering, Datenbankrecherchen fanden keinerlei Enzyme mit einer höheren Sequenzidentität als 17%. Dennoch ist die Faltung innerhalb der Klasse hoch konserviert, was eine Phasierung durch Molrep grundsätzlich möglich macht (Kap. 3.5.10). Grundlage der verwendeten Suchmodelle (Tabelle 11) waren die vier strukturell bekannten rRNA-MTasen ErmC' (Bussiere et al., 1998), ErmAM (Yu et al., 1997), FtsJ (Bügl et al., 2000) und Rv2118 (Gupta et al., 2001). Tabelle 11 Suchmodelle zur Strukturlösung von AviRa durch molekularen Ersatz Beschreibung AS des Modells ErmC' vollständiges Molekül 9-244 22.5 56.1 27.7 59.7 Polyalaninmodell 9-244 22.3 57.8 25.1 60.2 MTase-Domäne 9-179 28.8 52.5 28.9 59.7 MTase-Domäne ohne loop-Regionen 9-24, 33-83, 97158, 170-244 27.1 52.5 28.1 60.3 vollständiges Molekül 1-245 20.8 55.9 27.9 59.9 Polyalaninmodell 1-245 19.3 56.0 22.0 62.0 MTase-Domäne 15-179 20.4 54.1 26.5 60.7 MTase-Domäne ohne loop-Regionen 15-36, 45-56, 7680, 94-157, 169-179 17.7 53.0 27.2 60.3 vollständiges Molekül 30-209 20.4 52.1 27.2 60.0 Polyalaninmodell 30-209 20.6 52.8 27.7 59.9 vollständiges Molekül 4-267 21.4 56.2 25.1 59.4 Polyalaninmodell 4-267 21.9 56.3 24.2 60.1 MTase-Domäne 68-228, 254-267 28.5 52.7 27.9 60.6 MTase-Domäne ohne loop-Regionen 68-74, 85-159, 174228, 253-267 27.2 53.3 27.7 59.9 ErmAM FtsJ Rv2118 AMoRe CC / Rcryst MOLREP CC / Rcryst Suchmodell 79 Ergebnisse und Diskussion Die Rotations- und Translationssuche wurde mit den Programmen AMoRe (ccp4, 1994) und MOLREP (ccp4, 1994) durchgeführt. Keines der verwendeten Suchmodelle lieferte ein Ergebnis, welches das Qualitätskriterium für eine potentielle Lösung von einem Korrelationskoeffizient über 30% und einem R-Faktor unter 50% erfüllte. Dennoch wurden für alle vermeintlichen Lösungen die symmetrieverwandten Moleküle erzeugt und auf Kollisionen zwischen den einzelnen Molekülen getestet. Alle potentielle Lösungen wiesen große Bereiche mit erheblicher Kollision auf. Das Phasenproblem konnte daher nicht mittels molekularem Ersatz gelöst werden. Multipler isomorpher Ersatz Zur Phasierung durch multiplen isomorphen Ersatz müssen mindestens zwei zum Wildtyp isomorphe Schwermetallderivate vorhanden sein (Kap. 3.5.8). Hierzu wurden Kristalle von AviRa mit verschiedenen Schwermetallösungen in unterschiedlichen Konzentrationen versetzt (Kap. 3.4.2; Tabelle 12). Tabelle 12 Schwermetall-Tränkversuche zur Derivatisierung von AviRa-Kristallen Schwermetallverbindung Konzentration [mM] Tränkzeit Kristall[min] charakterisierung Auflösung / Diffraktionsmuster HgCl2 2 / 1 / 0.5 + 0.5 0.25 + 0.25 0.1 1-5 5-10 1200 starke Risse leichte Risse leichte Risse >8Å Doppelspots, ~ 3 Å MMA 2 / 1 / 0.2 1-5 starke Risse - K2PtCl6 2 / 1 / 0.2 1-5 starke Risse - K2PtCl4 2 / 1 / 0.2 1-5 starke Risse - cis (NH3)2Cl2Pt 2 / 1 / 0.2 1-5 starke Risse - UO2(OAc)2 2 / 1 / 0.2 1-5 starke Risse - Ta 6 Br122+ - fest, 1 Krümel < 360 1200 keine Risse, weiß leichte Risse, grünl. 3.3 Å Cluster Sämtliche Schwermetallösungen wurden aufgrund der hohen Instabilität der Kristalle beim Umsetzen direkt im Tropfen zugegeben. Der Dialysepuffer enthielt bei Kristallisationsansätzen für Schwermetall-Tränkexperimente kein DTT, welches mit dem Protein um das Schwermetall konkurrieren könnte. MMA steht für Methylquecksilberacetat. Alle Messungen wurden bei Raumtemperatur an der Hausanlage durchgeführt. Die meisten Kristalle wurden unabhängig von der Schwermetallverbindung bereits bei sehr geringen Konzentrationen und kurzer Inkubationszeit so stark beschädigt, daß keine Messung mehr möglich war. Lediglich gegenüber des oktaedrischen Ta-Clusters [Ta6Br12(H2O)6] 2+ (Knäblein et al., 1997) zeigten die Kristalle eine höhere Stabilität. Aufgrund seiner Größe (d Ta-Ta = 2.9 Å) bindet der Ta-Cluster in der Regel an die 80 Ergebnisse und Diskussion Proteinoberfläche. Die Anzahl der Bindungsstellen ist im Vergleich zu kleineren Schwermetallverbindungen deutlich geringer. Die Verbindung ist tiefgrün gefärbt; bindet sie im Kristall, weist auch dieser meist eine grüne Verfärbung auf. Im Fall von AviRa waren die Kristalle nach einer Inkubationszeit von 20 h grün gefärbt. Trotz leichter Risse konnte der Kristall bei Raumtemperatur vermessen und ein Datensatz erhalten werden (Tabelle 13). Tabelle 13 Charakterisierung des Ta 6 Br122+ -AviRa-Datensatzes 1 Raumgruppe P21 Elementarzellparameter 2 a [Å] b [Å] c [Å] β [°] 37.3 (37.1) 48.8 (48.9) 63.9 (63.7) 99.0 (99.1) Mosaizität 1.2 Auflösung [Å] 20 – 3.3 Rsym aller Daten [%] 3 15.4 (31.9) Rsym bis 5.5 Å [%] 12.0 Vollständigkeit [%] 3 92.8 (94.5) Multiplizität 3 2.4 (2.4) I/σ 3 4.0 (2.9) Riso [%] 13.6 1 2 3 Der Datensatz wurde bei Raumtemperatur an der Hausanlage gemessen. Werte in Klammern beziehen sich auf den WT-Datensatz (Tabelle 9). Werte in Klammern beziehen sich auf die letzte Auflösungsschale (3.5-3.3 Å). Die Elementarzelle des mit dem Ta-Cluster getränkten Kristalls weist gegenüber den WT-Kristallen eine isomorphe Differenz von weniger als 1% auf, was innerhalb der Toleranzgrenzen liegt. Erwartungsgemäß wurden die isomorphen Differenzen bis zu einer Auflösung von 5.5 Å stetig geringer. Der Riso zwischen nativem Datensatz und dem potentiellen Derivat liegt mit 13.6% im unteren Erwartungsbereich (10-30%). Allerdings ist die innere Konsistenz des Derivatdatensatzes mit einem Rsym von 12.0% gering. Idealerweise sollten die Fehler der einzelnen Datensätze im Vergleich zum Riso deutlich geringer sein. Dennoch wurde eine Differenzpattersonkarte bei 6 Å Auflösung berechnet (Kap. 3.5.8). Auf der Harkersektion (v = 0.5) konnten zwei symmetrieverwandte peaks mit einer Differenzhöhe von 4.2 σ beobachtet werden. Die fraktionellen Koordinaten ließen sich zu u = 0.2363, v = 0.5000, w = 0.6737 bzw. u = 0.7637, v = 0.5000 und w = 0.3263 bestimmen. Dies deutet auf die spezifische Bindung eines Ta-Clusters hin. Die geringe Höhe der beobachteten Funktionsmaxima und der etwas niedrige Riso könnten auf eine nicht 81 Ergebnisse und Diskussion vollständige Besetzung der Bindungsstelle zurückzuführen sein. Zusätzlich stellt die geringe Qualität des Ta-Datensatzes Probleme bei der Phasierung dar. Eine Phasenbestimmung mit MLPHARE gelang nicht, die PhP betrug bei einem Rcullis von 0.94 und einem FOM von 0.29 lediglich 0.30 (Kap. 3.5.9). Zur Phasierung mit SIR ist ein qualitativ besseres Schweratomderivat Voraussetzung, für MIR wären weitere Schweratomderivate notwendig. 4.1.4 Darstellung und Charakterisierung der Methionin-Doppelmutanten Eine Alternative zur Phasierung mit MIR stellt die Phasenbestimmung durch MAD dar (Kap. 3.5.9). Bei Proteinstrukturen eignet sich hierzu vor allem die Inkorporation des anomalen Streuers Selen in Form von Selenomethionin. Die Stärke des anomalen Signals hängt dabei von der Anzahl und Beweglichkeit der vorhandenen Selen-Atome sowie von der Auflösung der gemessenen Daten ab. Das anomale Signal nimmt bei steigender Auflösungsgrenze stark zu. Die PhP eines Selen-Atoms ist zudem um so höher, je weniger flexibel die entsprechende Seitenkette ist (Leahy et al., 1994). Um ein ausreichendes Signal zu erhalten, sollte ein Methionin pro 150 AS vorhanden sein (Drenth, 1999). Der durchschnittliche Anteil der anomalen Streuung an der insgesamt gemessenen Intensität beträgt dann bei einer Auflösung von 2.0 Å ca. 6%, bei 1.5 Å bereits 9% (BMSC, 2001). Parallel zu den Versuchen, geeignete Schwermetallderivate zu erhalten, sollten die Voraussetzungen für Se-MAD-Messungen geschaffen werden. Da die Sequenz von AviRa bis auf das N-terminale Methionin, welches während der Expression in E. coli abgespalten wird, kein Methionin enthält, mußten diese durch Mutation eingefügt werden. AviRa besitzt 250 Aminosäuren; um ein ausreichendes anomales Signal zu erhalten, wurden MethioninDoppelmutanten generiert. Statistische Sequenzanalysen zeigen, daß in der Natur am häufigsten Leu und Ile zu Met mutiert werden (Tabelle 14). Diese Mutationen haben meist keinen Effekt auf Funktion und Stabilität des Proteins (Bowie et al., 1990; Lim et al., 1992). Tabelle 14 Mutationswahrscheinlichkeitsmatrix nach Dayhoff 1 p (X → M) L I V T F Sonstige 2 1 2 35.0 25.3 20.2 12.3 1.8 1.5 Elemente der Mutationswahrscheinlichkeitsmatrix nach Dayhoff (1972). Mittlere Wahrscheinlichkeit für alle verbleibenden Aminosäuren. 82 Ergebnisse und Diskussion Zur Phasierung mit MAD sind Seitenketten, welche sich im Innern des Proteins befinden (buried) und daher in der Regel höher geordnet sind, besonders für eine Mutation geeignet. Zur Auswahl der Mutationsziele wurde eine Sekundärstrukturvorhersage (Kap. 3.6.1) durchgeführt (Abbildung 33). MSAYRHAVERIDSSDLACGVVLHSAPGYPAFPVRLATEIFQRALARLPGDGPVTLWDPCCGSGYLLTVLG HHHHHHHH EEEEEEE HHHHHHHHHHHHHHHH EEE HHHHHHHH eebb bbebbeeeebbbbbbbbbbee ebbbb bbb bb bbb beee ebbbb bbbeebbbbbbb 70 SEK ACC LLHRRSLRQVIASDVDPAPLELAAKNLALLSPAGLTARELERREQSERFGKPSYLEAAQAARRLRERLTA HHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHH bbb bb ebbbbe ebeb b bbbe bbbbbee b b ebee e beebe ebbbebb bb b e b 140 SEK ACC EGGALPCAIRTADVFDPRALSAVLAGSAPDVVLTDLPYGERTHWEGQVPAQPVAGLLRSLASALPAHAVI EEEEE HHHHHHHHH EEEE HHHHHHHHHHHHHHH EEEE beeebbbbbbbbebb e bbbbbbbee beebbbbeb ee ee b e bbbbbb bbbebbbbbbb 210 SEK ACC AVTDRSRKIPVAPVKALERLKIGTRSAVLVRAADVLEAGP EEE HHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHH bbbb ebbbbbbbbe be eb bbbbb bbebbee e 250 SEK ACC Abbildung 33 Vorhersage der AviRa-Sekundärstruktur mit PREDICT PROTEIN (Rost, 1996). Vorhergesagte α-Helices sind mit H, β-Faltblattstränge mit E gekennzeichnet (Zeile 2, SEK). Die vorhergesagte Zugänglichkeit (accessibility, ACC) der AS ist in Zeile 3 angegeben (b = buried, im Inneren des Proteins; e = exposed, an der Proteinoberfläche). AS, welche als Ziel für die Mutation ausgewählt wurden, sind grau unterlegt. Es wurden vier Leu und ein Ile, welche als verborgen vorausgesagt waren und sich nicht im Bereich des konservierten Sequenzmotives (AS 55-84) und damit der potentielle AdoMet-Bindestelle befinden, ausgewählt. Allerdings sind Sekundärstrukturvorhersagen oft fehlerbehaftet und stellen keine Garantie für die korrekte Auswahl der AS dar. Dies scheint auch bei AviRa der Fall zu sein, da lediglich fünf β-Stränge vorhergesagt wurden, wohingegen die klassische MTase-Faltung ein 7-strängiges β-Faltblatt aufweist. Zur Darstellung der Mutanten durch QuikChangeTM (Kap 3.1.1) wurden fünf primer entworfen und von der Firma MWG synthetisiert (Abbildung 34). I11M L99M L173M L239M L246M 5'-CCGTGGAGCGGATGGACAGTTCCGATCTCG-3' 5'-CGAAGAATCTCGCCATGCTCTCGCCGG-3' 5'-CCCGATGTCGTGATGGCCGACCTGCC-3' 5'-GCTCGGCCGTAATGGTCCGGGCAGCC-3' 5'-GGCAGCCGACGTGATGGAGGCAGGCC-3' Abbildung 34 Primer zur Darstellung der Met-Mutanten. Gezeigt ist jeweils der forward-primer in 5'-3'-Richtung. Das Basentriplett, das für die mutierte Aminosäure kodiert, ist hervorgehoben, die ausgetauschte Base ist unterstrichen. 83 Ergebnisse und Diskussion In einem ersten Schritt wurden sämtliche Einfach-Mutanten erzeugt. Die eingefügten Mutationen wurden durch DNA-Sequenzierung (Kap. 3.1.7, Firma SeqLab) bestätigt (Anhang 6.4). Anschließend wurden die drei Doppelmutanten L99M-L173M, L99M-L239M und L173M-L239M generiert, da sich in diesen Fällen die Mutationen am weitesten vom Nbzw. C-Terminus entfernt befanden. Die entsprechenden Plasmide wurden in E. coli BL21(DE3) transformiert (Kap. 3.1.5). Die Expression und Präparation erfolgte analog dem WT (Kap. 3.2) und lieferte in allen Fällen bei ähnlicher Ausbeute Protein vergleichbarer Reinheit. Alle Doppelmutanten zeigten eine dem WT analoge Aktivität (Kap. 3.3.5). Allerdings konnten weder für die Mutante L99M-L173M noch für L99M-L239M unter den Bedingungen des WT Kristalle erhalten werden. Die Mutante L173M-L239M lieferte bei einem pH von 6.9 (0.1 M MES) und 9% PEG-20'000 röntgenuntaugliche Mikrokristalle mit einer maximalen Größe von 30x5x5 µm3. Durch entsprechende Analyse der Einfachmutanten ließ sich die nicht vorhandene Kristallisierbarkeit auf die Mutationen L99M und L173M zurückführen. Die Einfachmutante L239M kristallisierte isomorph zum WT. Anschließend wurde die Expression und das Kristallisationsverhalten der beiden anderen Einzelmutanten I11M und L246M getestet. Beide Mutanten zeigten eine gute Überexpression, ließen sich zur Homogenität reinigen und kristallisierten unter den Bedingungen des WT. Basierend auf den drei kristallisierbaren Einzelmutanten wurden nun die Doppelmutanten I11M-L239M, I11M-L246M und L239M-L246M generiert, transformiert, exprimiert, gereinigt und kristallisiert. In allen drei Fällen konnten Kristalle erhalten werden, die Doppelmutante L239M-L246M kristallisierte allerdings im Vergleich zu den beiden anderen Doppelmutanten deutlich schlechter. 4.1.5 Präparation und Kristallisation der SeMet-Mutanten Zur Inkorporation des anomalen Streuers Selen in Form von Selenomethionin wurden die drei Mutanten I11M-L239M, I11M-L246M und L239M-L246M verwendet, welche zuvor positiv auf ihre Kristallisierbarkeit getestet worden waren (Kap. 4.1.4). Aufgrund der basalen Expression bei der Präparation von AviRa ist die Methode der Produktinhibition weniger geeignet. Die entsprechenden Plasmide wurden statt dessen in den Methionin-auxotrophen E. coli Stamm B834(DE3) transformiert. Die Expression in LeMaster-Medium und die Präparation erfolgten wie in Kapitel 3.2 beschrieben. Die Ausbeute an gereinigtem Protein waren mit 2 mg/L Bakterienkultur erwartungsgemäß deutlich geringer als bei der Expression in E. coli BL21(DE3)-Zellen in LB-Medium. 84 Ergebnisse und Diskussion Um die Inkorporation von Selen zu überprüfen, wurden von allen SeMet-Mutanten Massenspektren aufgenommen und mit den Spektren der entsprechenden MethioninMutanten verglichen. Abbildung 35 zeigt stellvertretend die beiden Massenspektren der Mutante I11M-L239M. Abbildung 35 ESI-MS Spektren der Doppelmutante I11M-L239M. oben: Expression im E. coli Stamm BL21(DE3) unten: Expression im Methionin-auxotrophen E. coli Stamm B834(DE3) zur Inkorporation von SeMet. Die Massendifferenz beträgt durch die Inkorporation von zwei SelenAtomen 94 Da. Die zusätzlichen Banden sind auf die Anlagerung eines Moleküls TFA (MW = 113 Da) an die positiv geladenen Proteinoberfläche zurückzuführen. 85 Ergebnisse und Diskussion Die molekulare Masse der Mutante I11M-L239M berechnet sich zu 25'526.6 Da. Bei vollständiger Inkorporation von zwei Selen-Atomen erhöht sich die erwartete Masse um 93.8 Da auf 26'620.4 Da. Das Massenspektrum bestätigt den vollständigen Einbau zweier Seleno-Methionine, die Massendifferenz zwischen Met-Mutante und SeMet-Mutante beträgt 94 Da. Die zusätzliche Bande bei einer um 112 bzw. 113 Da höheren Masse in beiden Massenspektrum ist auf die Anlagerung eines Moleküls Trifluoressigsäure (MW = 113 Da) des MS-Puffers an die positiv geladene Proteinoberfläche zurückzuführen (Apffel et al., 1995). Ein analoges Ergebnis wurde für die Präparation der Mutanten I11M-L246M und L239M-L246M in E. coli B834(DE3)-Zellen erhalten (Massenspektren nicht gezeigt). Alle drei SeMet-Doppelmutanten wurden unter den Kristallisationsbedingungen des AviRa-WT kristallisiert. Das Ergebnis der Kristallisationsexperimente ist in Tabelle 15 zusammengefaßt. Tabelle 15 Kristallisation der SeMet-Mutanten von AviRa 1 Mutation WT I11SeM/L239SeM 2 I11SeM/L246SeM L239SeM/L246SeM 1 2 Kristallgröße [µm3] 200x400x80 150x300x80 150x300x80 100x400x50 Kristallisationsbedingungen des AviRa-WT zur Strukturlösung verwendete Mutante Die erhaltenen Kristalle wurden gemäß des für den WT etablierten cryo-Protokolls in flüssigem Stickstoff eingefroren (Kap. 4.1.2). Die SeMet-Kristalle zeigten dabei eine geringfügig höhere Stabilität als der AviRa-WT. Ein Kristall der AviRa-Mutante I11SeML239SeM (AviRa-SeMet) wurde am Synchrotron in Hamburg (DESY) am Meßplatz BW7A vermessen. 4.1.6 Phasierung durch MAD Zur Strukturlösung mit MAD wurden drei Datensätze bei unterschiedlichen Wellenlängen am selben AviRa-SeMet-Kristall aufgenommen. Die einzelnen Wellenlängen wurden durch einen Fluoreszenzscan (Abbildung 36) bestimmt (Kap 3.5.9). Es wurde eine peak-Wellenlänge von 0.9774 Å ermittlt, für den inflection point ergab sich 0.9778 Å. Der dritte Datensatz wurde bei einer Wellenlänge von 0.9237 Å aufgenommen. Das anomale Signal ist bei einem maximalen Wert von f '', das heißt am sogenannten peak, am größten. 86 Ergebnisse und Diskussion Dieser Datensatz wurde daher zuerst vermessen, gefolgt vom inflection point-Datensatz und dem high energy remote Datensatz. Tabelle 16 zeigt die Statistiken der Datensammlung. Abbildung 36 Fluoreszenzscan des AviRa-SeMet-Kristalls, der für die Strukturlösung verwendet wurde. Das Maximum der Fluoreszenz ist bei 12.683 keV zu beobachten (λ = 0.9774 Å; peak), der Wendepunkt wurde zu 12.681 keV (λ = 0.9778 Å, inflection point) bestimmt. Tabelle 16 Statistiken der MAD-Datensammlung von AviRa-SeMet 1 Datensatz 2 Wellenlänge [Å] Auflösung [Å] Observierte Reflexe Unabhängige Reflexe 3,4 Vollständigkeit [%] 3,4 Rsym-I [%] 3,4 Multiplizität 3,4 I/σI 1 2 3 4 λ1 (peak) λ2 (inflection) λ3 (remote) 0.9774 25 –1.5 271'674 64'699 (1902) 97 (90) 3.9 (19) 4.1 (3.4) 37 (6.7) 0.9778 15 –1.5 289'006 64'711 (1482) 97 (90) 3.9 (20) 4.3 (3.4) 39 (6.6) 0.9237 12 –1.4 178'218 77'831 (1872) 97 (95) 4.7 (37) 2.2 (1.8) 17 (2.3) Die Datensätze wurde bei 100 K am DESY (BW7A) gemessen. Raumgruppe P21; a = 36.4 Å, b = 47.3 Å, c = 63.4 Å, β = 99.4° Friedelpaare wurden als unabhängige Reflexe getrennt skaliert. Werte in Klammern beziehen sich auf die höchste Auflösungsschale (1.51-1.50 Å bzw. 1.41-1.40 Å). Die Abschätzung der anomalen Differenzen der einzelnen AviRa-SeMet-Datensätze mit Hilfe des Programm XPREP zeigte ein zur Phasierung ausreichendes anomales Signal bis zu einer Auflösungsgrenze von 1.7 Å (Kap. 3.5.9 , Tabelle 17). 87 Ergebnisse und Diskussion Tabelle 17 Anomale Korrelationskoeffizienten1 [%] zwischen den einzelnen AviRaSeMet-Datensätzen Auflösungsgrenze [Å] 8 peak/inflection point 73.7 peak/remote 72.4 inflection point/remote 73.8 1 6 5 4 3.5 3.0 2.5 2.3 2.1 1.9 1.7 1.5 91.1 89.9 91.1 85.9 85.1 86.0 64.8 64.1 64.9 73.7 72.4 73.8 77.8 75.9 77.8 83.2 81.8 83.3 82.8 81.2 83.0 65.3 63.7 65.3 59.1 58.0 59.2 37.9 34.2 37.9 15.7 12.8 15.7 Die anomalen Korrelationskoeffizienten zwischen den einzelnen Datensätzen sollten in allen Auflösungsschalen über 30% liegen. Dies ist hier bis zu einer Auflösung von 1.7 Å gegeben. Die automatische Bestimmung der Positionen der anomalen Streuer mit SHELXD (Kap. 3.5.9) lieferte statt der erwarteten zwei Se-Positionen nur die Koordinaten eines Se-Atoms, welche zu x = 0.43 und z = 0.13 bestimmt wurden. Die y-Koordinate ist in der Raumgruppe P21 aufgrund der 21-Achse entlang y unbestimmt. Zur Bestätigung des Ergebnisses wurden mit dem Programm FFT anomale Differenzpattersonkarten berechnet (Kap. 3.5.9). Die Karten zeigten auf der Harkerebene (v = 0.5) zwei symmetrieverwandte Signale mit einer Höhe von 14.4 σ. Dies deutet ebenfalls auf das Vorhandensein eines einzigen anomalen Streuers hin. Die aus der Pattersonkarte erhaltenen Koordinaten stimmen mit den von SHELXD bestimmten Werten überein. Im späteren Verlauf der Strukturlösung wurde SeMet239 als phasierend identifiziert, das zweite Methionin (SeMet11) konnte entgegen der Sekundärstrukturvorhersage (Kap. 4.1.4) in einem stark flexiblen loop-Bereich lokalisiert werden. Die erhaltene Selenposition wurde mit dem Programm MLPHARE verfeinert (Kap. 3.5.9). Die Daten der Schweratomverfeinerung sind in Tabelle 18 zusammengefaßt, als Referenz diente der inflection point-Datensatz. Tabelle 18 Parameter der MAD-Phasierung mit MLPHARE peak/inflection remote/inflection Auflösungsbereich fraktionelle Koordinaten FOM Rcullis Rano PhPdisp PhPano 25 –1.7 x = 0.437 z = 0.125 0.51 0.89 0.88 0.65 0.82 0.35 0.42 0.49 0.43 Eine mit diesen Phasen berechnete Differenzfourierfunktion (Kap. 3.5.3) zeigte keine weiteren signifikanten Signale. Aus den erhaltenen initialen Phasen wurde eine Dichtekarte berechnet, in welcher sich Bereiche höherer und niederer Dichte erkennen ließen. Sekundärstrukturelemente konnten nicht identifiziert werden. Durch Dichtemodifikation (Kap. 3.5.12) konnten Phasen bis zu einer Auflösung von 1.5 Å erhalten werden, wobei der 88 Ergebnisse und Diskussion interne FOM des Dichtemodifikations-Programms DM von 0.1 auf 0.45 stieg. Die mit den modifizierten Phasen berechnete Elektronendichte erlaubte nicht nur die Zuordnung von Sekundärstrukturelementen, sondern es konnten in weiten Bereichen der Polypeptidkette Seitenketten eindeutig identifiziert werden. Abbildung 37 zeigt einen Ausschnitt aus der nach Dichtemodifikation erhaltenen Dichte. Abbildung 37 Stereodarstellung der initialen Elektronendichte nach Dichtemodifikation mit einem Ausschnitt des verfeinerten Modells von AviRa-SeMet. Das Konturniveau beträgt 1.0 σ. Als Ausschnitt wurde die Spitze der Helices α4 und α5 (AS 119-124; Sequenz: FGKPSY) gewählt. 4.1.7 Modellbau und Strukturverfeinerung Zum automatischen Einbau der Proteinkette in die nach Dichtemodifikation erhaltene Elektronendichte wurde das Programm ARP/wARP verwendet (Kap. 3.5.13). Die Routine warpNtrace konnte in einem ersten Schritt große Teile des Peptidrückgrates identifizieren, in einem zweiten Zyklus wurden mit Hilfe der Sequenzinformation 221 der insgesamt 250 Reste in fünf Teilstücken in die Elektronendichte eingebaut. Die Verfeinerung des initialen Modells (Kap. 3.5.14) wurde mit dem Programm REFMAC durchgeführt. Zur Berechnung des freien R-Faktors wurden 1288 Reflexe (entspricht 3.9% aller Reflexe) zufällig bestimmt und von der Verfeinerung ausgeschlossen. Zwischen den einzelnen Verfeinerungsrunden wurde das Modell manuell mit dem Programm O ergänzt bzw. korrigiert. Nach Verfeinerung der individuellen B-Faktoren wurden die Positionen von zunächst 213 Wassermolekülen durch das Programm ARP/wARP bestimmt. Anschließend konnte mit der TLS-Verfeinerung der B-Faktoren begonnen werden. Die Zahl der TLS-Gruppen wurde mit zunehmend vollständigerem Modell schrittweise erhöht. Im endgültigen Modell wurden 34 TLS-Gruppen in Abhängigkeit von 89 Ergebnisse und Diskussion den Sekundärstrukturelementen definiert. Zusätzlich wurden der ausgedehnte loop- Bereich des N-Terminus und der loop β4-α7 in je drei Gruppen unterteilt. Nachdem das Modell komplettiert worden war, wurden die Wassermoleküle erneut analysiert. Eine Zusammenfassung der einzelnen Verfeinerungsrunden zeigt Tabelle 19. Tabelle 19 Übersicht der Verfeinerung des AviRa-SeMet-Modells Art der Verfeinerung Modellumfang TLSGruppen Rfree Rcryst initiales Modell durch ARP/wARP 14-50, 53-86, 89-178, 187221, 223-248 0 28.4 25.4 individuelle B-Faktor – Verfeinerung REFMAC 14-86, 89-178, 187-248 0 26.2 23.8 Analyse der Wasserpositionen, ARP/wARP / REFMAC 14-86, 89-178, 187-248 213 Wasser 0 25.4 22.2 1. TLS-Verfeinerung, REFMAC 14-86, 89-178, 187-248 213 Wasser 24 22.7 19.8 2. TLS-Verfeinerung, Analyse der Wasser, REFMAC 2-250 334 Wasser 34 20.2 16.9 Das verfeinerte Modell von AviRa-SeMet beinhaltet mit Ausnahme des Startmethionins sämtliche Aminosäuren (AS 2-250), sowie 334 Wassermoleküle. Zwischen den Aminosäureresten Ala223 und Pro224 ist eine cis-Peptidbindung zu finden, welche durch die Elektronendichte eindeutig bestätigt wird. Cis-Peptidbindungen sind aufgrund ihrer energetisch ungünstigen Konformation selten und treten hauptsächlich vor Prolinen auf, da diese wegen der kovalenten Bindung zwischen dem Peptidstickstoff und dem Cδ-Atom leichter isomerisieren können (Schulz & Schirmer, 1979). Ein Ausschnitt aus der finalen (2Fobs –Fcalc)-Elektronendichtekarte ist in Abbildung 38 gezeigt. In den meisten Teilen der Struktur war die Dichte von vergleichbarer Qualität. Bereiche schlechterer Dichte waren in drei flexiblen loop-Regionen zu finden (AS 9-13, 87-89, 186-188). Diese Teile des Modells weisen auch deutlich erhöhte B-Faktoren auf (vergl. Abbildung 42). 90 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 38 Stereodarstellung eines Ausschnitts aus der finalen (2Fobs –Fcalc)-Elektronendichte der AviRa-SeMet-Struktur. Das σ-Konturniveau beträgt 1.0 σ. Als Ausschnitt wurde die Spitze der Helices α4 und α5 (AS 119-124; Sequenz: FGKPSY) gewählt. 4.1.8 Bestimmung der WT-Struktur Das verfeinerte Modell der AviRa-SeMet-Struktur diente als Templat zur Bestimmung der AviRa-WT-Struktur. Der WT-Datensatz wurde bei Raumtemperatur an der Hausanlage aufgenommen, und ist bereits in Kapitel 4.1.1 (Tabelle 13) charakterisiert worden. Der model bias wurde durch eine Verfeinerungsrunde mit simulated annealing in CNS reduziert (Kap. 3.5.14). Anschließend wurde analog der SeMet-Struktur mit REFMAC verfeinert. Die B-Faktoren wurden individuell bestimmt, aufgrund der geringeren Auflösung von 2.4 Å wurde allerdings keine TLS-Verfeinerung durchgeführt. Zudem konnten lediglich 29 geordnet vorliegende Wassermoleküle gefunden werden, was vor allem auf die Messung bei Raumtemperatur zurückzuführen ist. Die cis-Peptidbindung zwischen Ala223 und Pro224 ist auch in der WT-Struktur vorhanden. Zum Vergleich der AviRa-WT- und AviRa-SeMet-Struktur wurden die beiden verfeinerten Modelle mit LSQMAN überlagert (Kap. 3.6.4). Die mittlere quadratische Abweichung (rmsd) zwischen WT-Modell und SeMet-Modell ist mit 0.45 Å relativ gering, maximale Abweichungen von bis zu 1.1 Å sind vor allem in loop-Bereichen zu finden (Abbildung 39). Die Einführung der beiden Mutanten sowie die Inkorporation von Selen hatte demnach keinerlei Auswirkung auf die Gesamtstruktur von AviRa. 91 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 39 Mittlere quadratische Abweichung der Cα-Atome des AviRa-WT-Modells vom AviRa-SeMet-Modell in Abhängigkeit von der AS-Sequenz. Im Mittel beträgt die Abweichung 0.45 Å. Die Balken markieren die Kristallkontakte (obere Linie) sowie die Sekundärstrukturelemente im verfeinerten Proteinmodell. 4.1.9 Qualität der AviRa-Strukturen Die Qualität einer Proteinstruktur wird meist anhand der R-Faktoren sowie der Einhaltung der geometrischen Parameter beurteilt. Dabei muß berücksichtigt werden, daß einige dieser Parameter in den Zielfunktionen der Verfeinerungsprogramme enthalten sind und daher nur eine bedingte Aussagekraft über die Modellqualität besitzen (Kap. 3.6.2). Die Statistiken der beiden verfeinerten AviRa-Modelle sind in Tabelle 20 zusammengefaßt. Tabelle 20 Verfeinerungsstatistik der beiden AviRa-Modelle Datensatz AviRa-SeMet AviRa-WT Auflösung [Å] Anzahl der Reflexe Proteinatome Wassermoleküle mittlerer B-Faktor [Å2] (Hauptkette / gesamt ) Rcryst [%] Rfree [%] rmsd Bindungslängen [Å] / -winkel [°] 25 – 1.5 33212 1867 334 23 / 26 30 – 2.4 8093 1867 29 50 / 53 16.9 20.2 0.012 / 1.40 20.9 24.1 0.010 / 1.19 91.4 8.6 91.0 9.0 Ramachandran-Torsionswinkel im energetisch günstigen Bereich [%] 1 erlaubten Bereich [%] 1 1 Definition gemäß PROCHECK (Lakowski et al., 1993). 92 Ergebnisse und Diskussion Beide Strukturen von AviRa weisen für die jeweilige Auflösung gute R-Faktoren auf. Auch liegen die mittleren quadratischen Abweichungen (rmsd) der Bindungslängen und -winkel innerhalb der von Engh und Huber (1991) gefundenen Verteilungen. Die verfeinerten Modelle wurden mit den Programmen WHATCHECK und PROCHECK analysiert (Kap. 3.6.2). Sämtliche Parameter befanden sich dabei innerhalb der erwarteten Bereiche. Die Verteilung der Hauptketten-Torsionswinkel ϕ und ψ ergab in beiden Strukturen analoge Ergebnisse. Mehr als 90% der dihedralen Hauptwinkel befinden sich im energetisch günstigen Bereich, alle übrigen in erlaubten Bereichen des RamachandranDiagramms. Proline und Glycine wurden dabei gesondert betrachtet, da für sie andere Einschränkungen als für die übrigen AS gelten. Abbildung 40 zeigt das RamachandranDiagramm des AviRa-SeMet-Modells. Abbildung 40 Ramachandran-Diagramm des AviRa-SeMet-Modells. Die Positionen der Aminosäurereste sind durch Dreiecke (Glycine) und Quadrate (alle anderen Aminosäuren außer Prolin) symbolisiert. Die Schattierung des Hintergrunds markiert die energetisch unterschiedlich bevorzugten Bereiche des Diagramms (Laskowski et al., 1993). Die Hauptketten-Torsionswinkel der AviRa-Modelle liegen alle in energetisch günstigen bzw. erlaubten Bereichen. Neben den Hauptketten-Torsionswinkel ist die Verteilung der SeitenkettenTorsionswinkel ein Maß für die Qualität der Struktur. Die Aminosäuren Isoleucin und Leucin liegen aufgrund ihrer Hydrophobie meist im Innern des Proteins. Sie sind daher hoch geordnet und eignen sich besonders für die Analyse der Seitenketten-Torsionswinkel. Die Verteilung ist für das AviRa-SeMet-Modell in Abbildung 41 dargestellt. Ebenso wie beim WT-Modell (nicht gezeigt) liegen sämtliche Winkel mit Ausnahme der SeitenkettenTorsionswinkel von Leu229 in den statistisch bevorzugten Bereichen. Ergebnisse und Diskussion 93 Abbildung 41 Verteilung der Seitenketten-Torsionswinkel χ1 und χ2 der Aminosäuren Leucin und Isoleucin. Die Konformationen der einzelnen Aminosäuren sind durch Quadrate symbolisiert. Bevorzugte Bereiche im χ1 -χ2 -Diagramm sind grau schattiert. Helle Quadrate entsprechen dabei bevorzugten, graue weniger bevorzugten und schwarze einer nicht bevorzugten Konformation. Analyse der B-Faktoren Der Verlauf der B-Faktoren für das AviRa-WT-Modell und das AviRa-SeMetModell sind in Abbildung 42 dargestellt. Die Beweglichkeit der einzelnen Atome, und somit die B-Faktoren, sind im SeMet-Modell aufgrund der Messung bei 100 K und der damit verminderten Brownschen Molekularbewegung deutlich niedriger als im WT-Modell. Beide Kurven zeigen jedoch den gleichen Verlauf in Abhängigkeit von der AS-Sequenz. Die Struktur beinhaltet drei mobile loop-Bereiche (AS 9-13, 87-89, 186-188). SeMet11 liegt in einem solchen Bereich und lieferte daher aufgrund seiner Mobilität kein zur Phasierung ausreichendes Signal (Kap. 4.1.6). Abbildung 42 Verlauf der B-Faktoren des AviRa-SeMet-Modells (durchgezogene Linie) und des AviRa-WT-Modells (gepunktet) entlang der Hauptkette. Der Verlauf des isotropen B-Faktors ist für WT-Struktur deutlich höher aber analog der SeMet-Struktur. Die Balken markieren die Kristallkontakte (obere Linie) sowie die Sekundärstrukturelemente im verfeinerten Proteinmodell. 94 Ergebnisse und Diskussion Der mittlere B-Faktor liegt in beiden Fällen etwas höher als die durch die Wilsondiagramme der Datensätze erhaltenen Werte (Kap. 3.5.5). Für die Daten der WTStruktur läßt sich ein Wilson-B-Faktor von 47 Å2 berechnen, der mittlere B-Faktor des Modells liegt bei 53 Å2. Die SeMet-Struktur weist einen mittleren B-Faktor von 26 Å2 auf, der nach Wilson bestimmte Wert liegt bei 20 Å2. Allerdings lassen sich die mittleren B-Faktoren beider Modelle unter Vernachlässigung der stark mobilen loop-Bereiche, die in beiden Fällen trotz schlechter definierterer Elektronendichte hinzugefügt worden waren, auf einen niedrigeren Wert von 48 Å2 bzw. 20 Å2 korrigieren. Bei der Verfeinerung des AviRa-SeMet-Modells wurden die B-Faktoren im Rahmen der TLS-Verfeinerung (Kap. 3.5.5) gruppenweise anisotrop verfeinert. Die für jede der 34 TLS-Gruppen ermittelten 20 TLS-Parameter wurden mit dem Programm TLSANL analysiert und für jedes Atom ein anisotroper Verschiebungsparameter ermittelt. Jedes einzelne Atom kann somit als Ellipsoid dargestellt werden, welche durch das Verhältnis der Achsen C/A und B/A (längste Achse A, kürzeste Achse C) charakterisiert wird (Abbildung 43, Abbildung 44(a)). Ein Achsenverhältnis von C/A = B/A = 1 beschreibt eine Kugel und damit eine rein isotrope Schwingung. Abbildung 43 Darstellung der Stärke der Anisotropie der einzelnen AS (über alle Atome einer AS gemittelt) im AviRa-SeMet-Modell. Es wurden 34 TLS-Gruppen definiert, wobei alle α-Helices, βStränge und loops jeweils einer separaten Gruppe zugeordnet wurden, der N-terminale loop-Bereich wurde in drei TLS-Gruppen unterteilt. Die Stärke der Anisotropie drückt sich im Quotient der Ellipsenachsen C/A (gestrichelt) bzw. B/A (durchgezogene Linie) aus. Ergebnisse und Diskussion 95 Der Quotient aus der längsten Achse A und der kürzesten Achse C der einzelnen Ellipsoide liegt im Mittel zwischen 0.5 und 0.6, der Quotient aus B und A dagegen liegt mit 0.7 bis 0.8 im Mittel höher. Beide Werte liegen deutlich unter 1.0 und deuten somit auf eine starke Anisotropie der Schwingung hin. In Bereichen mit unterschiedlichen Achsenverhältnissen besitzen die Ellipsoide die Form einer Zigarre, sind die Quotienten C/A und B/A innerhalb der gleichen Größenordnung, so sind sie eher Diskus-ähnlich. Die Anisotropie ist vor allem im Bereich der Helix α5 (AS 122-140), welche der Substraterkennung dient (Kap. 4.2.5), stark ausgeprägt. Abbildung 44 veranschaulicht die anisotrope Bewegung dreier TLS-Gruppen welche die Helices α4 und α5 sowie den verbindenden loop beinhaltet. Erkennbar ist eine deutliche bevorzugte seitliche Schwingung, vor allem innerhalb der Seitenketten. Diese Bewegung könnte bei der Substraterkennung eine wichtige Rolle spielen. Abbildung 44 Veranschaulichung der TLS-Verfeinerung: (a) Ellipsoid. (b) Helices α4 und α5 des AviRa-SeMet-Modells. Das Modell ist um 90° gegenüber Abbildung 47 aus der Ebene gedreht mit Blick vom Solvens auf die maximale Substraterkennungsfläche. Die Abbildung beinhaltet drei TLSGruppen (AS: 104-119, 120-122, 123-141). Die Farbgebung erfolgte anhand der B-FaktorVerteilung, niedrige B-Faktoren sind in blau, Bereiche hoher B-Faktoren in rot dargestellt. Aufgrund ihrer anisotropen Schwingung sind die Atome als Ellipsoide dargestellt. Erkennbar ist eine deutliche seitliche Schwingung, vor allem innerhalb der Seitenketten. 96 Ergebnisse und Diskussion 4.1.10 Kristallisationsansätze zur Strukturlösung von Enzym-Substrat-Komplexen Neben der Struktur des Apoenzyms sind Strukturen von Enzym-Substrat-Komplexen bei der Interpretation eines möglichen Reaktionsmechanismus hilfreich. AviRa überträgt eine Methylgruppe vom Kofaktor AdoMet auf Guanin-2535, wobei die Ausbildung des Protein-RNA-Komplexes erst nach Bindung des Methyldonors AdoMet erfolgt. Daher wurde zunächst versucht, eine Kristallstruktur mit gebundenem AdoMet oder mit einem der Substratanaloga AdoHcy bzw. 2'-desoxy-5'-Methyl-Adenosin (DMA) zu erhalten (Borchardt et al., 1976). Die WT-Kristalle wurden mit verschiedenen Konzentrationen der drei genannten Reagenzien versetzt (Kap. 3.4.2). Sie zeigten sich nur gegenüber einer geringen Konzentration an AdoMet (< 2 mM) bei kurzen Tränkzeiten (< 40 min) stabil. Die getränkten Kristalle wurden vermessen und die erhaltenen Daten prozessiert. In keinem Fall konnte im aktiven Zentrum eine positive Differenzdichte bei den berechneten (Fobs-Fcalc)Dichtekarten beobachtet werden. Lediglich ein Kristall konnte bei einer höheren Konzentration (5 mM) für 30 min getränkt werden, ohne daß starke Risse auftraten. Der bis 2.45 Å Auflösung erhaltene Datensatz konnte jedoch nur bis zu einer Vollständigkeit von 65% vermessen werden (vergl. Kap. 4.1.11) und zeigte ebenfalls keine Differenzdichte. Analysen der Struktur des Holoenzyms zeigten, daß der Zugang zur Substratbindungsstelle aufgrund der Molekülpackung im Kristall blockiert ist. Daher wurde versucht, AdoMet bzw. die verschiedenen Substratanaloga gemeinsam zu kristallisieren (Kap. 3.4.3). Es wurden sowohl die Kristallisationsbedingungen des WT als auch sämtliche Kristallisationskits getestet (Tabelle 21). Tabelle 21 Kokristallisations-Experimente mit AviRa-WT Substrat molarer Überschuß AdoMet 2-, 5-, 10- fach Kristallisations- Substrat- andere bedingung bindung KristallisationsAviRa-WT bedingung keine Kristalle - AdoHcy 1-, 2-, 5- fach keine Kristalle DMA 1 5-, 10- fach 5- fach Kristalle isomorph WT keine Kristalle 5- fach keine Kristalle Adenosin 5-, 10- fach Methionin 5-, 10- fach Kristalle isomorph WT Kristalle isomorph WT AdoMet + Guanosin AdoMet + Guanosin-P 1 2 2 DMA = 2'-deoxy-5'-Methyl-Adenosin Guanosin-P = Guanosinmonophosphat - - - - - - Ergebnisse und Diskussion 97 In keinem der Experimente konnten neue Kristallisationsbedingungen gefunden werden. Kürzere Kofaktor-Fragmente wie Adenosin, Methionin oder DMA wurden auch bei 10-fachem molarem Überschuß nicht gebunden, sie werden vermutlich nicht als Substrat erkannt. Bei Zugabe von AdoMet bzw. AdoHcy wurden keine Kristalle unter den Bedingungen des WT erhalten. Die Bindung des Kofaktors führt offensichtlich zur Störung eines essentiellen Kristallkontaktes. Dies kann auf eine Konformationsänderung der loops im Bereich der Bindungstasche zurückzuführen sein. Es konnte eine Aminosäure, Arg 217, identifiziert werden, welche sich nur 3.5 Å vom aktiven Zentrum eines symmetrieverwandten AviRa-Moleküls entfernt befindet und unter Umständen mit dem Adeninring eines gebundenen AdoMet kollidiert. Daher wurden die beiden Mutanten R217N und R217S generiert (Kap. 3.1.1). Die Einführung der Mutation wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Beide Mutanten wurden analog dem WT exprimiert und gereinigt (Kap. 3.2). Trotz der Einführung der Mutation kristallisierte das Apoenzym unter den gleichen Bedingungen wie der WT. Die Kristalle waren allerdings noch fragiler und instabiler. Die Zugabe von AdoMet bzw. AdoHcy zu den Mutanten R217N und R217S verhinderte jedoch ebenfalls die Kristallisation. Es konnten keine alternativen Kristallisationsbedingungen erhalten werden. Eine potentielle Kollision von R217 mit dem gebundenem Substrat scheint daher nicht ausschlaggebend für die Störung des Kristallkontaktes. Die Struktur eines Substrat-Enzym Komplexes konnte demnach nicht erhalten werden. Aufgrund der hohen Konservierung der Kofaktorbindestelle innerhalb der klassischen MTasen war es allerdings möglich, ein Modell des AviRa-AdoMet-Komplexes zu erstellen (Kap. 4.2.3). 4.1.11 Struktur von AviRa-dehyd Datensammlung Im Rahmen der Tränkversuche zur Strukturlösung von AviRa-Substrat-Komplexen (Kap. 4.1.10) konnte bei einem mit AdoMet getränkten Kristall eine Kristallumwandlung während der Messung (RT, Hausanlage) beobachtet werden. Zu Beginn der Messung war der Kristall isomorph zum WT (Raumgruppe P21; a = 37.2, b = 49.1, c = 63.4 und β = 99°), Reflexe konnten bis zu einer Auflösung von 2.5 Å beobachtet werden. Nach 64 frames ließ die Streukraft nach, die detektierten Reflexe waren zunehmend verwischt und teilweise gespalten, eine Indizierung gelang nicht mehr. Fünf Aufnahmen später stieg die Auflösungsgrenze bei wieder gutem Reflexprofil auf 2.2 Å an. Eine erneute Indizierung 98 Ergebnisse und Diskussion ergab, unabhängig von gemessenem Kristallbereich und Meßwinkel, ein Kristallsystem mit deutlich kleineren Achsen, sowie eine Symmetrie-Erniedrigung von P21 auf P1 (a = 37.8, b = 44.6, c = 53.5, α = 90.1°, β = 80.1°, γ = 89.9°). Die Auslöschungsbedingungen für eine 21-Schraubenachse entlang y waren vor allem im höheren Auflösungsbereich nicht mehr erfüllt. Abbildung 45 zeigt drei frames vor, während und nach der Umwandlung. Abbildung 45 Darstellung der Kristallumwandlung eines AviRa-Kristalls. Alle frames wurden bei identischem Detektorabstand an der Hausanlage (RT) aufgenommen. (a) Streubild vor der Umwandlung (frame #1); Raumgruppe P21, Auflösungsgrenze ca. 2.5 Å. (b) Streubild während der Umwandlung (frame #65); Auflösungsgrenze ca. 4 Å, keine Indizierung möglich. (c) Streubild unmittelbar nach der Umwandlung (frame #76); Raumgruppe P1, Auflösungsgrenze ca. 2.0 Å. Untersuchungen der Glaskapillare zeigten, daß ein Ende nicht fest verschmolzen war, so daß im Laufe der Messung die in der Kapillare befindliche Mutterlauge verdampfen konnte. Dies führte zu einer Dehydrierung des Kristalls. Vor der Umwandlung betrug der Solvensgehalt 39%, nach der Umwandlung lediglich 29%, der Matthews-Parameter sank von 2.0 Å3/Da auf 1.7 Å3/Da. Solche Dehydrierungen und die damit verbundene Erhöhung der Streukraft konnten auch bei anderen Proteinkristallen beobachtet werden und stellen eine allgemeine Technik zur Erhöhung der Auflösungsgrenze dar (Heras et al., 2003). Es wurde ein vollständiger Datensatz des dehydrierten Kristalls aufgenommen (AviRa-dehyd). Aufgrund von Strahlungsschäden ließ die Streukraft jedoch während der Messung stark nach. Die mit der Dehydrierung verbundene Änderung der Zellparameter setzte sich in geringem Maße auch während der Messung fort, so daß der Datensatz zur Integration in drei Blöcke aufgeteilt werden mußte. Die Daten wurden getrennt prozessiert, die Zellparameter gemittelt und anschließend die drei Teil-Datensätze aufeinander skaliert. Tabelle 22 stellt die Parameter der beiden Datensätze des Kristalls vor bzw. nach der Umwandlung (AviRa-WT bzw. AviRa-dehyd) einander gegenüber. Die hohe Mosaizität des AviRa-dehyd-Datensatzes ist vermutlich auf eine uneinheitliche Umwandlung zurückzuführen. 99 Ergebnisse und Diskussion Tabelle 22 Statistiken der Datensammlung vor und nach der Dehydrierung 1 Datensatz AviRa -WT AviRa -dehyd. Raumgruppe P21 P1 Zellparameter a = 37.2, b = 49.1, c = 63.4, β = 99° a = 37.8, b = 44.6, c = 53.5, α = 90.3° β = 80.5° 2, γ = 89.8° 1.7 29 0.47 25-2.72 14352 8667 93.3 (95.1) 7.4 (22.5) 1.7 (1.6) 8.9 (5.3) Matthews-Parameter [Å3/Da] Solvensgehalt [%] Mosaizität Auflösung [Å] Observierte Reflexe Unabhängige Reflexe Vollständigkeit [%] 3 Rsym [%] 3 Multiplizität 3 I/σI 2 1 2 3 2.0 39 0.14 25-2.5 10223 5538 65.5 (65.9) 3.8 (20.5) 1.8 (1.7) 13.2 (4.2) Beide Datensätze wurden an einem Kristall bei RT an der Hausanlage gemessen. β ist in beiden Datensätzen in der gleichen Größenordnung. In P1 wird im Gegensatz zu P21 aufgrund der Konvention in den Kristallographie-Programmen der spitze Winkel angegeben . Werte in Klammern beziehen sich auf die höchste Auflösungsschale (2.5-2.6 Å, 2.72-2.8 Å). Phasierung und Strukturverfeinerung Die Phasierung der AviRa-dehyd-Struktur erfolgte durch molekularen Ersatz mit dem Programm AMoRe (Kap. 3.5.10), wobei das AviRa-SeMet-Modell als Templat diente. Als Suchmodell wurde das vollständige Modell sowie ein um den N-Terminus (AS 1-20) und zwei ausladende loop-Bereiche (AS 177-187, AS 216-223) verkürztes Modell verwendet. Beide Suchmodelle lieferten eine übereinstimmende Lösung. Bei Verwendung des verkürzten Modells waren die Korrelationskoeffizienten allerdings deutlich höher (46.1% gegenüber 38.7% beim vollständigen Modell) und die R-Faktoren niedriger (40.8% gegenüber 43.5%). Daher wurde die mit Hilfe des modifizierten Modells erhaltene Lösung zur Verfeinerung verwendet, die beiden Moleküle des asymmetrischen Einheit wurden dabei durch NCS miteinander verknüpft. Zur Verringerung des model bias wurden zunächst in CNS zwei Runden simulated annealing -Verfeinerung durchgeführt. Anschließend wurden σA-gewichtete Elektronendichtekarten berechnet (Kap. 3.5.12) und das Modell manuell korrigiert. Die abschließende Verfeinerung erfolgte mit REFMAC, die Statistiken des verfeinerten AviRa-dehyd-Modells zeigt Tabelle 23. Wassermoleküle wurden aufgrund der geringen Auflösung und des schlechten Parameter-zu-Observablen-Verhältnisses nicht eingebaut. Das Modell enthält die AS 18-176, 188-215 und 224-247. Der N-Terminus und die beiden loops β4-α7 bzw. β5-β6, welche bereits in der WT- und SeMet-Struktur eine hohe Beweglichkeit aufwiesen, sind 100 Ergebnisse und Diskussion stark ungeordnet. Obwohl die dehydrierte Struktur aus einem mit AdoMet getränkten Kristall erhalten wurde, war keine Elektronendichte im aktiven Zentrum zu finden. Die Umwandlung wurde demnach nicht durch die Bindung des Kofaktors initiiert. Tabelle 23 Statistiken des verfeinerten AviRa-dehyd-Modells Auflösung [Å] Anzahl der Reflexe Proteinatome AS des Modells mittlerer B-Faktor [Å2] Rcryst [%] Rfree [%] rmsd Bindungslängen [Å] /-winkel [°] Ramachandran-Torsionswinkel im energetisch günstigen Bereich [%] 1 erlaubten Bereich [%] 1 1 25 – 2.72 8666 3132 18-176, 188215, 224-247 19.1 24.1 28.7 0.011 / 1.35 85.1 14.9 Definition gemäß PROCHECK (Lakowski et al., 1993). Das resultierende Modell besitzt eine mittlere Qualität. Die Elektronendichte ist in weiten Teilen nicht klar definiert, vor allem Seitenketten an der Proteinoberfläche sowie ausgedehnte loop-Bereiche sind ungeordnet. Dies deutet auf eine uneinheitliche Umwandlung in diesen Bereichen hin. Einige Aminosäuren werden aufgrund von Kristallkontakten (Kap. 4.2.2) aus ihrer optimalen Konfiguration der Torsionswinkel in erlaubte Bereiche des Ramachandran-Diagramms verschoben. Ergebnisse und Diskussion 101 4.2 Strukturbeschreibung von AviRa 4.2.1 Sekundär- und Tertiärstruktur Sekundärstruktur Die Zuordnung der Sekundärstrukturelemente für das AviRa-WT- und das AviRaSeMet-Modell sowie der AviRa-dehyd-Struktur waren nahezu identisch. Abbildung 46 zeigt die Analyse des AviRa-SeMet-Modells mit den Programmen DSSP und STRIDE (Kap. 3.6.3). Die Sekundärstrukturzuordnung der beiden Programme unterscheidet sich nur geringfügig in der Länge einzelner α-Helices und β-Stränge. Da in der Proteindatenbank (Berman et al., 2002) die Zuordnung mit dem Programm DSSP erfolgt, wurden diese Angaben auch in vorliegender Arbeit verwendet. Insgesamt konnten sieben β-Stränge sowie acht α-Helices zugeordnet werden, der Strang β7 geht dabei direkt in Helix α8 über. Zusätzlich finden sich noch fünf 310-Helices, von denen drei die erste bzw. letzte Windung einer α-Helix bilden. Auf eine genaue Bezeichnung der 310-Helices wurde verzichtet. 10 20 30 40 50 60 70 | | | | | | | MSAYRHAVERMDSSDLACGVVLHSAPGYPAFPVRLATEIFQRALARLPGDGPVTLWDPCCGSGYLLTVLG TTT T 333 TTTTT TT HHHHHHHHHHHHHTTT T SSSSSTT TTTHHHHHHH TTTTTTT 333TTTTTT TT HHHHHHHHHHHHHH SSSSSTTTTTTHHHHHHH α1 β1 α2 80 90 100 110 120 130 140 | | | | | | | LLHRRSLRQVIASDVDPAPLELAAKNLALLSPAGLTARELERREQSERFGKPSYLEAAQAARRLRERLTA HHT333SSSSSSSST HHHHHHHHHHH333THHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHH333SSSSSSS HHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHH 310 β2 α3 α4 α5 150 160 170 180 190 200 210 | | | | | | | EGGALPCAIRTADVFDPRALSAVLAGSAPDVVLTDLPYGERYHWEGQVPGQPVAGLLRSLASALPAHAVI TTTT SSSSS TT 333HHHHHTT TSSSSS 333TTTTTT HHHHHHHHHHHHHHT TT SS SSSSS TTTT333HHHHHTTT TTSSSSS 333TTTTTT HHHHHHHHHHHHHH TTTTSS β3 310 α6 β4 310 α7 220 230 240 250 | | | | AVTDRSRKIPVAPVKALERLKIGTRSAVMVARADVLEAGP SSSSTTT TTT TSSSSSTTSSSSSSSHHHHHHT SSSS TTTT TTTTT SSSSSTTSSSSSSSHHHHHHH β5 β6 β7 α8 Abbildung 46 Zuordnung der Sekundärstruktur im AviRa-SeMet-Modell mit den Programmen DSSP (2. Zeile) und STRIDE (3. Zeile). Symbolik: H = α-Helix, 3 = 310-Helix, S = β-Strang und T = turn. Die in den Bändermodellen dargestellten Sekundärstrukturen (4. Zeile) orientieren sich vorwiegend an der Zuordnung mit DSSP. 102 Ergebnisse und Diskussion Tertiärstruktur AviRa ist ein globuläres, relativ kompaktes Protein mit einer einzigen Domäne (Abbildung 47). Aufgrund seiner Tertiärstruktur läßt sich AviRa eindeutig den klassischen MTasen zuordnen. Dies war bereits aufgrund des konservierten AdoMet-Bindungsmotivs vermutet worden (Kap. 1.3). Abbildung 47 Stereodarstellung des Bändermodells der AviRa-SeMet-Struktur. Der Kofaktor AdoMet wurde anhand einer Überlagerung der homologen MTase Rv2118 im aktiven Zentrum plaziert (Kap. 4.2.3). Das charakteristische, zentrale β-Faltblatt besteht aus fünf parallelen β-Strängen, angeordnet in der Reihenfolge β3, β2, β1, β4, β5 gefolgt von einem antiparallelen Paar β7 und β6. Es wird zu beiden Seiten von insgesamt fünf α-Helices flankiert. Zusätzlich sind zwischen α3 und β3 zwei relativ lange α-Helices, α4 (17 AS) und α5 (19 AS), insertiert, welche um ca. 30° gegenüber dem β-Faltblatt geneigt sind. Das aktive Zentrum befindet sich in einer Spalte am C-terminalen Ende von β1 und β4 (vergl. Kap. 4.2.4). Ein TopologieDiagramm der AviRa-Struktur ist in Abbildung 48 gezeigt. Im Unterschied zur Konsensusfaltung der klassischen MTasen fehlt bei AviRa die Helix zwischen β5 und β6, sowie die typischerweise vorhandene Helix nach β7. Einzigartig ist das zusätzliche Helixpaar α4/α5 (Kap. 4.2.3). Ergebnisse und Diskussion 103 Abbildung 48 Topologie-Diagramm von AviRa. α-Helices sind als Kreise, β-Stränge als Dreiecke symbolisiert. Die Konsensusfaltung der klassischen MTasen ist in Form von durchgezogenen Linien, Abweichungen der AviRa-Struktur gestrichelt dargestellt. Die Lage der konservierten AdoMetBindungsstelle (Methionin-, Ribose- und Adenin-Bindungsbereich) ist in Form von Ellipsen skizziert. 4.2.2 Vergleich von AviRa-WT mit AviRa-dehyd Tertiärstruktur Zum Vergleich der dehydrierten (Kap. 4.1.11) mit der nativen AviRa-Struktur (Kap. 4.1.7-4.1.9) wurden die Cα-Atome des AviRa-WT-Modells und des AviRa-dehyd-Modells mit dem Programm LSQMAN überlagert (Kap. 3.6.4). Die mittlere quadratische Abweichung (rmsd) der 211 überlagerten Cα-Atome beträgt 1.3 Å, im Bereich des loops zwischen α5 und β3 ist die Abweichung mit 4.43 Å maximal (Abbildung 49). Abbildung 49 Differenzen der durch LSQMAN überlagerten Strukturmodelle AviRa-dehyd und AviRa-WT. Die mittlere quadratische Abweichung beträgt 1.3 Å, mit einer maximale Abweichung im loop α5-β3. Der N-Terminus sowie die loops β4-α7 und β5-β6 fehlen im AviRa-dehyd-Modell. 104 Ergebnisse und Diskussion Die beiden Strukturen zeigen vor allem in loop-Bereichen und im Helixpaar α4/α5 große Abweichungen. Beide Helices weisen im AviRa-dehyd-Modell gegenüber dem zentralen Faltblatt des Proteins einen geringeren Winkel auf als in der WT-Struktur und sind zudem gegeneinander verdreht. Das zentrale β-Faltblatt ist dagegen mit Ausnahme des äußersten Stranges β6 nur geringfügig von der Umwandlung betroffen. Eine Stereodarstellung der Überlagerung ist in Abbildung 50 dargestellt. Abbildung 50 Stereodarstellung der Überlagerung der Strukturmodelle von AviRa-dehyd (rot) und AviRa-WT (blau). Abweichungen sind hauptsächlich im Helixpaar α4/α5 sowie in loop-Bereichen zu finden. Kristallpackung Während der Umwandlung des Kristalls kam es zu einer Verringerung der Zelldimensionen, vor allem die z-Achse schrumpfte um mehr als 15%. Die Packung der Moleküle in der dehydrierten Zelle ist daher deutlich dichter. Die kompaktere Anordnung kommt zum einen durch die Verkrümmung der Helix α4 des Helixpaares zu Stande. Zum anderen ist eine laterale Verschiebung der beiden Moleküle der asymmetrischen Einheit entlang z zu beobachten, so daß die Distanz zwischen den zentralen β-Faltblättern verkürzt wird (Abbildung 51). Ergebnisse und Diskussion 105 Abbildung 51 Quartärstruktur der AviRa-WT-Struktur (oben) und der AviRa-dehyd-Struktur (unten). Die Moleküle einer asymmetrischen Einheit sind jeweils in kräftigem Farbton (blau, bzw. blau und grün), die symmetrieverwandten Moleküle in den entsprechenden helleren Farbtönen dargestellt. links: Blick entlang der y-Achse rechts: Blick entlang der x-Achse. Im Rahmen der Umwandlung kommt es zum Bruch zahlreicher Kristallkontakte und zur Ausbildung neuer Wechselwirkungen zwischen den Molekülen. In Tabelle 24 sind die Wasserstoffbrücken innerhalb der Kristallkontakte der AviRa-dehyd-Struktur und der AviRa-WT-Struktur einander gegenübergestellt (Kap. 3.6.3). Bei der Umwandlung wurden alle bestehenden H-Brücken gebrochen. Sämtliche Kristallkontakte im Bereich der loops β4-α7 sowie β5-β6 der WT-Struktur werden nach der Umwandlung nicht mehr ausgebildet, so daß es zu einer starken Unordnung in diesen Bereichen kommt. Sowohl zwischen dem N-terminalen loop-Bereich und dem loop α1-β1 als auch im Bereich des C-Terminus sind in den Strukturen unterschiedliche Wasserstoffbrücken im Kristallkontakt vorhanden, was auf eine laterale Verschiebung dieser Kontakte zurückzuführen ist. Am auffälligsten ist der in der AviRa-dehyd-Kristallpackung neu entstandene, ausgeprägte Kristallkontakt der Helices 106 Ergebnisse und Diskussion α5 mit α3 sowie α4 mit β3, welcher insgesamt sechs Wasserstoffbrücken beinhaltet. Das Abknicken und die Krümmung der Helix α4 kann auf diese neugebildeten Wechselwirkungen zurückgeführt werden. Insgesamt ist die Zahl der an Kristallkontakten beteiligten Wasserstoffbrücken in der AviRa-dehyd-Struktur aufgrund der wesentlich dichteren Packung in dieser Kristallform deutlich höher als in der WT-Struktur. Tabelle 24 Wasserstoffbrücken im Kristallkontakt der AviRa-WT-Struktur und der AviRa-dehyd-Struktur Molekül 1 Position in der Struktur Molekül 2 Position in der Struktur Ser24-OG Pro26-O Arg5-NH2 Arg42-NH2 Arg42-NH2 Glu114-OE2 Ser116-O Glu117-O Arg118-O Gly120-O Gln129-OE1 Glu126-OE1 Arg158-NH2 Arg158-NH1 Gly179-O Thr182-O His183-NE2 Glu185-OE2 Glu180-OE1 Ser202-OG Ser202-OG N-term. loop N-term. loop N-term. loop α1 α1 α4 α4 α4 α4 loop α4-α5 α5 α5 α6 α6 loop β4 - α7 loop β4 - α7 loop β4 - α7 loop β4 - α7 loop β4 - α7 α7 α7 Asp50-O Gly49-N Glu247-O Glu247-OE1 Leu246-O Arg34-NH1 Arg150-NE Arg150-NH2 Arg150-NH2 Ile149-N Pro87-O Lys95-NZ Asp244-OD1 Asp244-OD2 Lys231-NZ Ser2-N Asp156-OD1 Arg241-NH1 Arg217-NH2 Lys225-NZ Leu227-O loop α1 - β1 loop α1 - β1 C-term. loop C-term. loop α8 α1 β3 β3 β3 β3 α3 α3 α8 α8 β6 N-term. loop loop β3 - α6 α8 loop β5 - β6 loop β5 - β6 β6 Distanz [Å] AviRa-WT Distanz [Å] AviRa-dehyd 3.1 2.9 2.6 3.3 2.9 3.2 2.8 2.9 - 3.2 3.1 2.8 3.3 3.1 3.3 2.8 3.0 3.1 2.8 3.1 2.9 2.9 Bei den in der AviRa-dehyd-Struktur observierten Abweichungen von der WT-Struktur handelt es sich vermutlich lediglich um durch die Kristallpackung induzierte Veränderungen ohne biologische Bedeutung. Festzuhalten bleibt lediglich, daß grundsätzlich eine Bewegung des Helixpaares α4/α5 möglich ist, welche auch bei der Bindung an die rRNA in Form eines induced fits stattfinden könnte. Ansonsten wurde dieses Modell bei sämtlichen folgenden Ausführungen nicht weiter berücksichtigt. 107 Ergebnisse und Diskussion 4.2.3 Vergleich mit klassischen Methyltransferasen Trotz der geringen Sequenzidentität ist die Tertiärstruktur innerhalb der klassischen MTasen hoch konserviert. Mit Hilfe des Programms DALI (Kap. 3.6.4) wurde die Proteinstrukturdatenbank nach Strukturhomologen durchsucht. Unter den 25 Strukturen mit dem höchsten Z-score befanden sich 24 MTasen, welche DNA, RNA oder kleine, organische Moleküle methylieren. Zusätzlich war der Transkriptionsfaktor Mtf1 vertreten. Von allen gefundenen Proteinen ist die potentielle rRNA-MTase Rv2118 (Gupta et al., 2001) mit einem Z-score von 13.8 AviRa strukturell am ähnlichsten. Die zehn mit AviRa am nächsten verwandten Proteine wurden mit dem Programm LSQMAN (Tabelle 25) überlagert (Kap. 3.6.4). Tabelle 25 Ergebnisse der DALI-Suche sowie Überlagerung durch LSQMAN Name DALI Z-score / # AS gesamt, % Identität rmsd rmsd #AS überlagert überlagerter AS Rv2118 13.8 / 2.8 264 / 159 16 1.8 Mj0882 13.6 / 2.6 194 / 157 15 1.75 Comt 11.8 / 3.1 214 / 161 11 1.95 Mj0697 11.4 / 2.7 230 / 152 11 1.82 Cher 11.1 / 3.6 275 / 156 14 2.0 Gnmt 11.0 / 3.1 293 / 156 13 1.64 Yeco 11.0 / 3.1 252 / 154 15 2.0 ErmC' 10.5 / 2.9 235 / 142 10 2.04 TaqI 10.5 / 3.0 386 / 143 14 1.80 FtsJ 9.8 / 3.5 180 / 152 14 2.04 1 LSQMAN Beschreibung #AS % Identität überlagert überlagerter AS 127 19.7 potentielle rRNA-MTase 120 13.3 homolog zu GrRNA-MTasen1 113 12.2 Catechol-OMTase 97 11.8 2-O'-rRNAMTase 116 15.0 Glutamat-O MTase 100 19.0 Glycin NMTase 112 15.2 small molecule MTase 102 9.8 rRNA-AdeninN6 MTase 97 19.6 DNA AdeninN6 MTase 99 17.1 rRNA-MTase Hierbei handelt es sich um die strukturell noch unbekannten Guanin-N2-rRNA-MTasen RsmC und RsmD (Bujnicki & Rychlewski, 2002). Unter den strukturhomologen Methyltransferasen befinden sich fünf etablierte bzw. potentielle rRNA-MTasen, welche einen Z-score von 9.8 bis 13.8 aufweisen. Alle weiteren rRNA-MTasen besitzen einen Z-score kleiner 5.0. Drei dieser MTasen, unter ihnen Rv2118, waren als Suchmodelle bei den Phasierungsversuchen durch Molrep verwendet worden (Kap. 4.1.3). Abbildung 52 Strukturbasierte Überlagerung von AviRa mit den fünf strukturell ähnlichsten rRNA-MTasen (Rv2118 (Gupta et al., 2001), Mj0882 (Hung et al., 2000), Mj0697 (Wang et al., 2000), FtsJ (Bügl et al., 2000), ErmC' (Schluckebier et al., 1999)). Die Überlagerung erfolgte mit LSQMAN. Gezeigt sind nur überlagerte Reste, das Symbol # steht für eine unspezifizierte Anzahl an ausgelassenen Resten. Als Referenz ist die Sekundärstruktur von AviRa gegeben, jeder 10. Rest von AviRa ist durch einen Punkt markiert. 108 Ergebnisse und Diskussion Ergebnisse und Diskussion 109 Abbildung 52 zeigt die strukturbasierte Überlagerung dieser fünf rRNA-MTasen mit AviRa. Während die MTasen im Bereich der katalytischen Domäne eine sehr hohe Ähnlichkeit aufweisen, besitzt keine der anderen rRNA-MTasen ein dem Helixpaar α4/α5 von AviRa analoges Strukturelement. Die spezifischen Strukturelemente der einzelnen MTasen spielen vermutlich bei der Substraterkennung eine wichtige Rolle. Abbildung 53 zeigt die Überlagerung der Cα-Atome von AviRa und ErmC'. Während die Abweichungen im zentralen β-Faltblatt relativ gering sind, finden sowohl die C-terminale Substraterkennungsdomäne von ErmC' als auch das Helixpaar α4/α5 von AviRa keinerlei Entsprechung. Abbildung 53 Stereodarstellung der Überlagerung von AviRa (rot) und ErmC' (blau) in Komplex mit dem Kofaktor AdoMet (Stabmodell). Die Strukturen der katalytischen Domänen weisen eine große Ähnlichkeit auf, spezifische Elemente zur Substraterkennung sind die C-terminale Domäne von ErmC' sowie das Helixpaar α4/α5 von AviRa. 4.2.4 Strukturmodell der AdoMet-Bindestelle Das aktive Zentrum funktionell verwandter Proteine, welche zudem eine konservierte Faltung aufweisen, befindet sich meist an der gleichen Stelle. So besitzen alle klassischen MTasen eine gemeinsame AdoMet-Bindestelle. Der Kofaktor bindet am C-terminalen Ende von β1 und β4 in einer Spalte, welche durch die charakteristische Anordnung der Stränge 110 Ergebnisse und Diskussion des β-Faltblattes hervorgerufen wird. Diese Anordnung ähnelt mit Ausnahme des antiparallel insertierten Strangs β7 dem Rossmann-fold und ist typisch für Dinukleotid- oder Mononukleotid-bindende Proteine (Schulz, 1992). Strukturbasierte Analysen von DNA-MTasen zeigten neun konservierte Motive, von denen vier für die Bindung von AdoMet, die restlichen für die Substraterkennung verantwortlich sind (Malone et al., 1995). Die bei der Kofaktorbindung beteiligten Motive lassen sich auch in anderen MTasen wiederfinden (Niemierzycka & Clarke, 1999) und konnten ebenso bei AviRa identifiziert werden (Abbildung 52). Lediglich Motiv I ist ohne strukturelle Information aus der Sequenz ersichtlich (Kap. 1.2; hh(D/E)hgXGXG (h = hydrophobe AS, X = beliebige AS)), und befindet sich bei allen MTasen im loop β1-α4. Das Aspartat bzw. Glutamat (Asp57 bei AviRa) und die beiden Glycine interagieren mit dem Methionin-Teil des AdoMet (vergl. Abbildung 54). Motiv II beinhaltet eine hoch konservierte, negativ geladene Aminosäure (Asp oder Glu) am C-terminalen Ende von β2 (Asp84 in AviRa), welche Wasserstoffbrücken zu den Hydroxylgruppen der AdoMet-Ribose bildet. Dieses Aspartat findet sich auch im Rossmann-fold bei der Bindung von Nukleotiden wieder. In klassischen MTasen folgt dem sauren Rest ein hydrophober (Val 85 in AviRa), der eine Wechselwirkung mit dem Adeninring des AdoMet eingeht. Das dritte Motiv ist am C-terminalen Ende von β3 lokalisiert und besteht aus einem Aspartat (Asp153 bei AviRa) gefolgt von einem hydrophoben Rest (Val 154 bei AviRa), die mit dem exocyclischen N6 bzw. dem N1 des Adenin wechselwirken. Der zentrale Bereich des AdoMet steht in Kontakt mit dem Peptidrückgrat des loops β4-α7, der in vielen MTasen das Sequenzmotiv DhP (Asp175-Leu176-Pro177 in AviRa) besitzt (Motiv IV). Asp175 ist vermutlich für die Abstraktion des bei der Methylierung frei werdenden Protons verantwortlich. Aufgrund der zahlreichen Übereinstimmungen mit der AdoMet-Bindung klassischer MTasen kann die Position des Kofaktors in AviRa aus der AdoMet-Komplex-Struktur einer anderen MTase abgeleitet werden. Hierzu wurden die katalytischen Domänen von AviRa und des nächsten Verwandten, Rv2118, überlagert und der Kofaktor aus seiner Position in Rv2118 auf AviRa übertragen. Anschließend wurde mit REFMAC eine Energieminimierung durchgeführt. Das resultierende AviRa-AdoMet-Modell ist in Abbildung 54 dargestellt. Der Kofaktor bildet in AviRa sämtliche Wechselwirkungen der Motive I-IV aus, ohne daß sterische Hinderungen auftreten. Allerdings zeigt die aktivierte Methylgruppe unter Annahme der natürlichen Konfiguration am Schwefel in das Innere des Proteins und ist von außen nicht zugänglich (vergl. Kap. 4.2.6). 111 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 54 Stereodarstellung der mutmaßlichen AdoMet-Bindungsstelle in AviRa. Das Modell wurde aus der Überlagerung des zentralen β-Faltblattes von AviRa und des AdoMet-Rv2118Komplexes, Übertragung des Kofaktors auf AviRa sowie anschließender Energieminimierung erhalten. Die innerhalb der Motive I-IV konservierten Aminosäurereste wechselwirken wie erwartet mit dem Kofaktor. Die aktivierte Methylgruppe zeigt ins Proteininnere. 4.2.5 Modell eines AviRa-rRNA-Komplexes AviRa methyliert Guanin-2535 (E. coli Nomenklatur) der Helix-91 des Peptidytransferase-loops der 23S-rRNA, vermutlich am exocyclischen N2 (Treede et al., 2003). Im Unterschied zu anderen Antibiotikaresistenz-vermittelnden MTasen wie beispielsweise ErmC' (Schluckebier et al., 1999) oder RlmA (Das et al., 2004) scheint AviRa in der Lage, die vollständig gefaltete 23S-rRNA Untereinheit zu methylieren (Weitnauer, 2002). Es wurde daher versucht, potentielle Andock-Positionen von AviRa am Ribosom zu ermitteln. Als Templat diente dabei die ribosomale Kristallstruktur aus einem mesophilen Eubakterium (Harms et al., 2001), da lediglich diese sämtliche der benachbarten ribosomalen Proteine enthält. Erste Andock-Versuche wurden manuell im Graphikprogramm O (Jones et al., 1991) durchgeführt. Um einen Methyltransfer zu ermöglichen, ist eine Minimierung der Distanz zwischen Zielbase und zu übertragender Methylgruppe notwendig. Das Phosphatrückgrat im Bereich von Guanin-2535 befindet sich an der Ribosom-Oberfläche in einer unsymmetrischen, verwinkelten Vertiefung. Aufgrund dieser Lage ist die prinzipielle Orientierung der MTase vorgegeben, bei welcher das Helixpaar α4/α5 in einer charakteristischen Ausbuchtung zu liegen kommt (Abbildung 55). Mit Hilfe der initial 112 Ergebnisse und Diskussion ermittelten Position wurde eine Energieminimierung durchgeführt, wobei der bewegliche Bereich des N-terminalen loops (AS 7-11) durch einen eingeführten B-Faktor-cutoff von 50 Å2 nur begrenzt berücksichtigt wurde. Das resultierende Modell ist frei von sterischen Hinderungen. Die ribosomalen Proteine L6, L14 und L16, welche im Bereich des Peptidyltransferase-loops binden, wechselwirken nicht mit AviRa. Zwischen den positiv geladenen Aminosäuren an der Oberfläche von AviRa und dem negativ geladenen Phosphatrückgrat der RNA können zahlreiche Wasserstoffbrücken ausgebildet werden. Die Bindung könnte zusätzlich durch eine leichte Bewegung des Helixpaares α4/α5 sowie der loops im Bereich der AdoMet-Bindestelle optimiert werden. Ein solcher induced fit ist gemäß der B-Faktor-Analyse (Kap. 4.1.9) und den Abweichungen zwischen SeMet- und WT-Struktur (Kap. 4.1.8) in diesem Bereich wahrscheinlich. Abbildung 55 Modell der Andock-Position von AviRa an der 50S Untereinheit des Ribosoms im Bereich des Peptidyltransferase-loops (Stereodarstellung). Die rRNA-Oberfläche ist grau, die Oberfläche von AviRa halbtransparant in hellgrün dargestellt. Das Helixpaar α4/α5 dient der Substraterkennung und insertiert in eine charakteristische Ausbuchtung der RNA. Der Komplex wird durch Wasserstoff-brücken zwischen den positiv geladenen Aminosäuren an der Oberfläche von AviRa und dem negativ geladenen Phosphatrückgrat der RNA stabilisiert. 4.2.6 Reaktionsmechanismus Nach Ausbildung des AviRa-rRNA-Komplexes wird die Methylgruppe vom Kofaktor AdoMet in einem SN2-ähnlichen Mechanismus auf Guanin-2535 übertragen. Die Distanz zwischen der Zielbase und dem Schwefel des AdoMet beträgt im Modell etwa 15 Å und kann aus sterischen Gründen nicht weiter verkürzt werden. Um einen Methyltransfer zu ermöglichen, muß daher die Zielbase aus der RNA-Doppelhelix herausgedreht werden (base flipping, Abbildung 56). Die Distanz zwischen dem N2 des Guanin-2535 und dem Schwefel von AdoMet würde sich auf ca. 4.5 Å verringern, so daß eine Methylierung möglich ist. Ergebnisse und Diskussion 113 (a) (b) Abbildung 56 (a) Stereodarstellung des AviRa-rRNA-Komplexes. Die Oberfläche der rRNA ist grau und halbtransparent, AviRa als Bändermodell und AdoMet bzw. die Zielbase Guanin-2535 (Pfeil) als Stabmodell dargestellt. Die Übertragung der Methylgruppe ist nur bei einem Herausdrehen der Zielbase möglich (base flipping). (b) Stereodarstellung des AviRa-rRNA-Komplexes mit herausgedrehter Base Guanin-2535. Ein solches base flipping ist bei der Methylierung von DNA ein weit verbreiteter Mechanismus (Cheng & Roberts, 2001) und konnte mittlerweile auch in RNA-bindenden Enzymen nachgewiesen werden (Cheng & Blumenthal, 2002). Der genaue Mechanismus der Basenerkennung ist noch unbekannt. Das Herausdrehen der Zielbase erfolgt wahrscheinlich gemäß eines sogenannten push-and-pull-Mechanismus (O'Gara et al., 1998; Larivière & Moréra, 2002). Dabei übt das DNA- bzw. RNA-bindende Protein zuerst eine Spannung auf das DNA/RNA-Rückgrat aus. Nach Initiierung der Rotation der Zielbase wird durch Insertion einiger Aminosäurereste in die Doppelhelix ein Zurückklappen verhindert. Die herausgedrehte Base wird anschließend im aktiven Zentrum stabilisiert. 114 Ergebnisse und Diskussion Zur Überprüfung der Übertragbarkeit dieses Mechanismus auf AviRa wurde die Mobilität der AviRa-Peptidkette untersucht. Die mobilen Bereiche, welche sich durch hohe B-Faktoren auszeichnen, befinden sich vorwiegend im Bereich der potentiellen AdoMetBindestelle am postulierten interface zwischen AviRa und Ribosom (Abbildung 57). Abbildung 57 Stereodarstellung des Cα-Rückgrates von AviRa-SeMet, farblich gemäß der Mobilität kodiert (B-Faktoren von 5-80 Å2 sind von blau nach rot eingefärbt). Die beiden SeMet sind als Kugeln dargestellt. Die mobilen Bereiche konzentrieren sich mit Ausnahme des N-terminalen loops im Bereich der AdoMet-Bindungsstelle, was auf einen induced fit beim Andocken an die rRNA hindeutet. Diese spezielle B-Faktor-Verteilung läßt auf hohe Beweglichkeiten und eine mögliche Konformationsänderung bei der Bindung am Ribosom schließen, welches im Einklang mit dem ersten Teil des angenommenen Mechanismus steht, bei dem das base flipping durch das Protein eingeleitet wird. Zudem befinden sich im loop β4-α7 mehrere aromatische und geladene Seitenketten, welche zur Insertion in die RNA geeignet sind. Guanin-2535 könnte im aktiven Zentrum durch die Aminosäuren Tyr28 und Tyr178 stabilisiert werden. Der Abstand der beiden aromatischen Ringe der Seitenketten beträgt in der Kristallstruktur ungefähr 8 Å, typische π-π-Wechselwirkungen treten in RNA und DNA ab einem Abstand von 3.5 - 4 Å auf. Die Zielbase könnte demnach zwischen die beiden Tyrosine insertieren und durch stacking-Wechselwirkungen im aktiven Zentrum stabilisiert werden. Eine analoge Stabilisierung wurde bei der RNA-MTase VP39 beobachtet (Hu et al., 1999) und ist auch bei ErmC' postuliert (Schluckebier et al., 1999). Zur Überprüfung dieser These wurden die Mutanten Y28A, Y178A sowie die Doppelmutante Y28A-Y178A gemäß 115 Ergebnisse und Diskussion Kapitel 3.1.1 dargestellt. Die verwendeten primer sind in Abbildung 58 dargestellt, die Einführung der Mutation wurde durch DNA-Sequenzierung überprüft (Anhang 6.4). Die Expression, Reinigung und Kristallisation der Mutanten erfolgte analog dem WT (Kap. 3.2). Ein Datensatz konnte allerdings aufgrund der hohen Instabilität der Kristalle nicht erhalten werden. Y178A 5' CCGACCTGCCGGCCGGCGAGCGCACG 3' Y28A 5' GCTCCACTCCGCGCCGGGTGCCCCCGCCTTCCCCG 3' Abbildung 58 Primer zur Darstellung der Tyr→Ala-Mutanten. Gezeigt ist jeweils der forward primer in 5'-3'. Das Basentriplett, das für die mutierte Aminosäure kodiert ist hervorgehoben, die ausgetauschten Basen ist unterstrichen. Die Aktivität der generierten Mutanten wurde mittels eines radioaktiven Methylierungsassays gemäß Kap. 3.3.5 bestimmt, wobei jeweils drei verschiedene Proben vermessen wurden und über die erhaltenen Ergebnisse gemittelt wurde. Tabelle 26 zeigt das Ergebnis des Aktivitätstests. Tabelle 26 Aktivität der Tyr-Mutanten von AviRa Aktivität [%] WT Y28A Y178A Y28A-Y178A 100 60 35 25 Die Aktivität der dargestellten Mutanten liegt deutlich unter der Methylierungsrate des Wildtyps. Beide Tyrosine können die Zielbase im aktiven Zentrum stabilisieren, wobei die Wechselwirkungen von Tyr178 mit Guanin-2535 stärker zu sein scheinen. Tyr178 befindet sich gegenüber Tyr28 in einer sterisch günstigeren Orientierung zur Ausbildung der π-π-stacking-Wechselwirkungen. Die Aktivität der Doppelmutante beträgt lediglich ein Viertel der Aktivität des Wildtyps. Diese Beobachtung steht in Einklang mit dem postulierten Mechanismus. Demnach wird auch ohne das Herausdrehen der Base ins aktive Zentrum eine wenn auch geringere Aktivität erwartet, da die auf das RNA-Rückgrat ausgeübte Spannung den entscheidenden Faktor darstellt. Abbildung 59 zeigt ein Modell des im aktiven Zentrum befindlichen Guanosin und die mögliche Stabilisierung durch Y28 sowie Y178. 116 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 59 Modell der Stabilisierung der Zielbase Guanin-2535 im aktiven Zentrum durch Tyr178 und Tyr28 (Stereodarstellung). Beide aromatischen Seitenketten können π-πWechselwirkungen mit Guanin-2535 eingehen. Im AviRa-AdoMet-Modell ragt die aktivierte Methylgruppe ins Proteininnere (Kap. 4.2.4). Auch bei der rRNA-MTase ErmC' ist die Methylgruppe bei der beobachteten, natürlichen S-Konformation am Schwefel des AdoMet nicht direkt zugänglich. Zur Übertragung gemäß eines SN2-ähnlichen Mechanismus sind mehrere Mechanismen denkbar. Der Zugang zur Methylgruppe wird in beiden MTasen durch den N-terminalen loop sowie den loop β4-α7 blockiert, welche die katalytisch aktiven Reste beinhalten. Bei ErmC' wurde eine Bewegung dieser loop-Bereiche postuliert. Auch bei AviRa könnte durch eine Bewegung der entsprechenden loops sowie die Rotation einiger Seitenketten die Zielbase in die notwendige Position gebracht werden. Dies ist aufgrund der erhöhten B-Faktoren in diesen Bereichen denkbar (vergl. Abbildung 57) und mit dem Modell des AviRa-rRNAKomplexes vereinbar. Alternativ ist eine Konformationsumkehr am positiv geladenen Schwefel gegenüber der natürlichen Konformation denkbar. Eine solche Mutarotation findet in Lösung (37°C) über einen trigonal bipyramidalen Übergangszustand mit einer ≠ =110 kJ ⋅ mol -1 ) statt (Uzar, 1986) und könnte Geschwindigkeit von ca. 2·10-6 s-1 ( ∆G298 durch das Enzym beim Andocken an die RNA katalysiert werden. Die Methylgruppe wäre somit gegenüber einer Übertragung auf andere Nukleophile wie etwa Wasser, geschützt und würde erst durch die Bindung am Methylakzeptor aktiviert werden. Außerdem besteht die Möglichkeit, daß der Kofaktor bei AviRa von vornherein in einer gegenüber der Bindung in Rv2118 leicht verdrehten Konformation gebunden wird. Eine Überlagerung sämtlicher strukturell bekannter MTase-AdoMet-Komplexe zeigt, daß die ansonsten einheitliche Konformation des Kofaktors im Methionin-Teil aufgrund einer Rotation der C5(Adenosin)S-Bindung deutlicher abweicht (Cheng & Blumenthal, 1996). Eine solche Rotation würde auch im Modell des AviRa-AdoMet Komplexes die Methylgruppe in die für eine SN2Transfer notwendige Konformation überführen. 117 Ergebnisse und Diskussion 4.3 Strukturaufklärung von AviRb 4.3.1 Strukturvorhersage von AviRb Sequenzvergleiche Aus dem Vergleich von Aminosäuresequenzen lassen sich wichtige Informationen über die Struktur und Funktion eines unbekannten Proteins erhalten. Die Funktion von AviRb als Methyltransferase war bereits aufgrund von Aktivitätstests bekannt (Weitnauer et al., 2002). Anhand der konservierten Sequenzmotive konnte eine vorläufige Zuordnung zur SpoU-Familie innerhalb der Klasse der SPOUT-MTasen gemacht werden (Kap. 1.3). Zusätzlich wurde mit Hilfe von BLAST (Kap. 3.6.1) die Sequenz von AviRb mit der Sequenzdatenbank verglichen. Insgesamt konnten mehr als 100 mit AviRb eng verwandte Sequenzen identifiziert werden. Unter den 50 besten Ergebnissen (E-Wert kleiner e-16) befanden sich 45 bestätigte bzw. potentielle rRNA- oder tRNA-MTasen sowie fünf Proteine unbekannter Funktion. Alle wiesen, ebenso wie AviRb, die drei konservierten Sequenzmotive der SpoU-MTasen auf. Dabei waren die Ähnlichkeiten lediglich in der C-terminalen Sequenzhälfte (AS 118 - AS 287) von AviRb vorhanden. Ein separater Sequenzvergleich der AS 1 – 117 ergab keinerlei Übereinstimmung mit einem E-Wert kleiner e-1. Viele Mitglieder der SpoU-Familie besitzen zwei Domänen, eine variable N-terminale Substraterkennungsdomäne und eine strukturell hoch konservierte C-terminale Kofaktorbindedomäne (SpoU-Domäne). Der Sequenzvergleich deutet auch bei AviRb auf das Vorhandensein zweier Domänen hin. Eine vorläufige Einteilung in N-terminale (AS 1 - 117) und C-terminale Domäne (AS 118 - AS 287) erfolgte aufgrund des Sequenzvergleichs (Abbildung 60). Die beiden Domänen von AviRb besitzen unterschiedliche elektrostatische Eigenschaften. Während der isoelektrische Punkt des gesamten Proteins mit 6.2 im mittleren Bereich liegt, wurde der pI der N-terminalen Domäne zu 10.3 berechnet, die C-terminale Domäne ist dagegen mit einem pI von 4.9 entgegengesetzt geladen. Die Anreicherung positiv geladener Aminosäuren an der Oberfläche der N-terminalen Domäne könnte der Bindung an das negativ geladene Phosphatrückgrat der rRNA dienen und deutet ebenso wie der Sequenzvergleich auf eine Rolle als Substraterkennungsdomäne hin. Zudem scheinen die gegensätzlichen Ladungen der beiden Domänen ein Grund für die bereits zuvor beobachtete hohe Instabilität des Proteins zu sein (Mosbacher, 2002), welche auch bei anderen SpoUMTasen beobachtet wurde (Michel et al., 2002). 118 Ergebnisse und Diskussion Strukturmodell von AviRb Die Sequenz von AviRb zeigt vor allem im Bereich der C-terminalen Domäne deutliche Homologien zu den funktionell verwandten SpoU-MTasen RrmA, RlmB, TrmH und YibK, welche alle 2'-O-Atome spezifischer RNA-Basen methylieren. Abbildung 60 zeigt den Sequenzvergleich mit AviRb (CLUSTALW). Die höchste Homologie ist zwischen AviRb und Rrma mit 31.5% Sequenzidentität insgesamt bzw. 35.4% in der SpoU-Domäne vorhanden. Die mit PREDICT PROTEIN durchgeführte Sekundärstrukturvorhersage (Kap. 3.6.1) von AviRb zeigt ebenfalls hohe Ähnlichkeiten zu den Sekundärstrukturelementen von RrmA. Innerhalb der N-terminalen Domäne von AviRb wird wie bei RrmA ein 4-strängiges, in der C-terminalen Domäne ein 6-strängiges β-Faltblatt vorhergesagt (Abbildung nicht gezeigt). AviRb RrmA RlmB MARSRGERT PAARRITSRN ARFQQWQALL GNRNKRTRAG EFLVMGVRPI SLAVEHGWPMRITSTAN PRIKELARLL -ERKHRDSQR RFLIEGAREI ERALQAGIEM SEMIYGIHAV QALLERAPER * 58 AviRb V-RTLLYDG- -QRELSKWAR ELLRTVRTEQ IAMAPDLLME L--GEKNEAP PEVVAVVEMP 113 RrmA LEQALVWEGG LNPEEQQVYA ALGRVGRLAL LEVSEAVLKK L--SVRDN-P AGLIALARMP RlmB FQEVFILKGR EDKRLLPLIH ALESQGVVIQ LANRQYLDEK SDGAVHQGII ARVKPGRQYQ TrmH MRERTEAR AviRb RrmA RlmB TrmH YibK | ADDLDRIPVR ERTLEEYRPS ENDLPDLIAS RRRIEEVLRR EDF-LGVLFD PDA-LILVAV LDQPFLLILD RQPDLTVLLE MLDIVLY RPTSPGNIGS GLEKPGNLGA GVTDPHNLGA NVHKPHNLSA EPEIPQNTGN * * * Motiv I IIRSADALGA VLRSADAAGA CLRSADAAGV ILRTCDAVGV IIRLCANTGF * ** * HGLIVAGHAA EAVLVAG-GV HAVIVPKDRS LEAHAVNPTG RLHLIEPLGF DVYDPKSVRS 162 DLYSPQVIRN AQLNATAKKV GV--PTFNET TWDDKRLRRS AviRb RrmA RlmB TrmH YibK STGSLFSLPA STGVVFSLRT ACGAAESVPL SGGSHKWVYL GLDYHEFAEI VRVPSPGEVM LAA-SESEVL IRVTNLARTM RVHPDLHEAF KRHKTFEAFL DWVEARRAAG DWIKQHN--RMLQEEN--RFLKERG--ESEKPKR--- TPIVLVGTDE --LPLVATTP --IWIVGTAG --FTVYATAL ----LFALTT HGDCDVFDFD HAEALYWEAN EADHTLYQSK REDARDFREV KGCPAHSQVK FTQPTLLLIG 232 LRPPVAIAVG MTGRLALVMG DYTKPTVLFG FKLGDYLMFG * AviRb RrmA RlmB TrmH YibK Motiv II NETAGLSNAPEHEGLRAAAEGEGMRRLAEKWGVSE-PETRGIPMSI * * -WRTLCDYTV -WLEAAQTQV -TREHCDELI -ALALADGAI LNEMPMEQKI Motiv III SIPMAGSASS LNAANAATAI RIPMQGQADS LNVSVSAALL SIPMAGSVSS LNVSVATGIC KIPMLGMVQS LNVSVAAAVI RIPMTANSRS MNLSNSVAVT *** * * ** * LYEAVRQRIS LYEALRQRLL LFEAVRQRS LFEAQRQRLK VYEAWRQLGY **** *** GRTATTP RDRLTKTHS 287 AGLYDRPRLD KGAVNLPEVK Abbildung 60 Sequenzvergleich von AviRb mit strukturell bekannten SpoU-MTasen. Hoch konservierte AS sind durch * markiert. Die drei von Gustafsson et al. (1996) definierten Sequenzmotive sind grau unterlegt. Die Domänengrenze ist durch einen senkrechten Strich gekennzeichnet. YibK und TrmH besitzen keine N-terminale Domäne. Aufgrund der strukturellen Konservierung innerhalb der SpoU-Familie und der signifikanten Sequenzhomologie läßt sich ein Modell von AviRb berechnen (Kap. 3.6.1). Das mit SWISS MODELL erstellte Modell besitzt im Bereich der SpoU-Domäne einen Ergebnisse und Diskussion 119 relativ hohen Zuversichtswert, welcher ein Maß für die Wahrscheinlichkeit der Übereinstimmung des Modells mit der tatsächlichen Struktur ist. Die Faltung der N-terminalen Domäne konnte nur mit geringer Wahrscheinlichkeit korrekt modelliert werden. Das Modell der AviRb-Struktur war Grundlage der generierten Oberflächenmutanten (Kap. 4.3.7). 4.3.2 Expression und Reinigung von AviRb-pRSETb Die Reinigung von AviRb sollte aufbauend auf den bereits durchgeführten Experimenten (Mosbacher, 2001) durch Kombination einer Ionenaustauschchromatographie und einer Farbstoffsäule etabliert werden. Die Transformation des Vektorkonstruktes pRSETb-AviRb (Anhang 6.3), welches analog zu pRSETb-AviRa eine Deletion des Nterminalen (His)6-tag aufwies (Kap. 4.1.1), erfolgte in den E. coli Stamm BL21DE(3) (Kap. 3.1.5). Zur Verringerung der Menge an Einschlußkörpern wurde bei niedrigen Temperaturen exprimiert (Kap. 3.2.1), zur Stabilisierung des Proteins enthielt der Aufschlußpuffer 5% Glycerin. Erster Reinigungsschritt war eine Anionenaustauschchromatographie (Abbildung 61). AviRb eluierte bei einem Elutionsvolumen von 220 mL und einer Leitfähigkeit von 20 mS/cm, entsprechend einem Salzgehalt von ca. 250 mM NaCl. Die AviRb-haltigen Fraktionen wurden nach Analyse durch SDS-PAGE (Abbildung 62) vereinigt. Abbildung 61 Elutionsprofil der Reinigung von AviRb mittels Anionenaustauschchromatographie (Source 30Q). Die Elution erfolgte bei pH 7.8 mit steigendem Salzgradienten. ▬▬ vereinigte Fraktionen (212-232 mL). Die Absorption zwischen 240 und 300 mL ist auf DNA bzw. RNA zurückzuführen. 120 Ergebnisse und Diskussion LMWStandard 97 kDa Bahn Bahn Bahn Bahn Bahn 66 kDa 45 kDa 1 2 3 4 5 Rohextrakt Durchfluß LMW-Marker Fraktionen (190-200 mL) Fraktionen (220-230 mL) AviRb 30 kDa 1 Abbildung 62 2 3 4 5 SDS-PAGE der Anionaustauschchromatographie zur Reinigung von AviRb. Um eine Bindung des Enzyms an die nachfolgende Reactive-Blue-4TM-Farbstoffsäule zu ermöglichen, wurde die Konzentration an NaCl auf 150 mM erniedrigt (Kap. 3.2.2). Die meisten Verunreinigungen konnten durch einen zweistufigen Salzgradienten abgetrennt werden. AviRb eluierte im zweiten Elutionsschritt ab einer Leitfähigkeit von ca. 25 mS/cm (VE = 215 mL, Abbildung 63) Die Analyse der proteinhaltigen Fraktionen durch SDS-PAGE ist in Abbildung 64 dargestellt. Durch anschließende GPC sollten letzte Verunreinigungen abgetrennt werden. Allerdings zeigte AviRb eine hohe Instabilität und präzipitierte bei Konzentrationen größer 2 mg/mL, so daß eine Reinigung durch GPC sowie eine Kristallisation nicht möglich war. Zudem betrug die Ausbeute an gereinigtem AviRb lediglich 0.4 mg/L Kultur, was auf die große Menge an Einschlußkörpern bei der Expression und auf Proteinpräzipitation während der Reinigung zurückzuführen war. 121 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 63 Elutionsprofil der Reinigung von AviRb mit der Farbstoffsäule Reactive-Blue-4TM. Die Elution erfolgte mit steigendem Salzgradienten. ▬▬ vereinigte Fraktionen (202-228 mL). LMWStandard Bahn Bahn Bahn Bahn Bahn 97 kDa 66 kDa 45 kDa 1 2 3 4-6 7-11 Rohextrakt Durchfluß LMW-Marker Fraktionen (100-130 mL) Fraktionen (200-228 mL) AviRb 30 kDa 1 Abbildung 64 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 SDS-Gel der Farbstoffsäulen-Affinitätschromatographie zur Reinigung von AviRb. Stabilitätsuntersuchungen zeigten, daß weder die Zugabe von Detergenzien noch eine Erhöhung der Glycerinkonzentration einen Einfluß auf die Proteinstabilität hatten. Bei einer höheren NaCl-Konzentration (0.5 bis 1.0 M) konnte die gereinigte AviRb-Lösung dagegen auf 6-8 mg/mL konzentriert werden. Eine Präzipitation wurde auch nach mehreren Stunden nicht beobachtet. Die hohe Salzkonzentration wirkte sich ebenso beim Zellaufschluß positiv aus, die Menge an löslichem AviRb im Rohextrakt betrug in etwa das 4-fache (SDS-PAGE nicht gezeigt). Eine Reinigung mittels Anionaustauschchromatographie oder Farbstoffsäule ist bei solch hohen Salzkonzentrationen allerdings unmöglich, da AviRb unter diesen Bedingungen nicht an die entsprechenden Säulen bindet. Alternativen stellen eine Reinigung durch (His)6-tag-Affinitätschromatographie oder die Expression als GST-Fusionsprotein dar. Da ein N-terminaler (His)6-tag die Löslichkeit von AviRb stark vermindert hatte 122 Ergebnisse und Diskussion (Mosbacher, 2001), wurde das Gen von AviRb in einen GST-Expressionsvektor umkloniert (Kap. 4.3.4). Parallel wurde versucht, die beiden AviRb-Domänen getrennt zu exprimieren und zu reinigen. 4.3.3 Präparation von N-terminaler und C-terminaler Domäne von AviRb Die geringe Stabilität von AviRb bei hohen Konzentrationen ist vermutlich auf intermolekulare, elektrostatische Wechselwirkungen zwischen den beiden entgegengesetzt geladenen Domänen des Proteins zurückzuführen. Durch getrennte Expression, Reinigung und Kristallisation der beiden Domänen sollte dieses Problem vermieden werden. N-terminale Domäne Zur Präparation der N-terminalen Domäne von AviRb (AviRb-Ndom, AS 1-117, 13.4 kDa) wurde das entsprechende Genfragment ausgehend vom Vektorkonstrukt pRSETbAviRb mittels PCR amplifiziert (Kap. 3.1.1) und durch Agarose-Gelelektrophorese (Kap. 3.1.2) gereinigt. Der forward-primer enthielt zur Klonierung in den Vektor pET3b eine NdeI-, der reverse-primer eine BamHI-Schnittstelle. Zusätzlich wurde im AviRb-Gen ein Stop-Codon nach Leu117 eingefügt. Der Erfolg der Umklonierung wurde durch analytischen Verdau und DNA-Sequenzierung überprüft (Anhang 6.3). Expressionstests im E. coli Stamm BL21(DE3) zeigten eine gute Überexpression, jedoch lagen über 90% des Proteins in Form von Einschlußkörpern vor. Die Reinigung (Kap. 3.2.2) sollte aufgrund des hohen pI von 10.3 der AviRb-Ndom durch Kationenaustauschchromatographie erfolgen. Nach Zellaufschluß (Puffer AviRa-IEC mit 5% Glycerin) wurde der lösliche Anteil von AviRb-Ndom mittels IEC (Source 30S) gefolgt von einer GPC (S75 16/60) gereinigt (Chromatogramme nicht gezeigt). Nach der IEC war noch eine große Zahl an Verunreinigungen vorhanden, die teilweise durch die GPC abgetrennt werden konnten (Abbildung 65). Die Molekularmasse von AviRb-Ndom wurde mittels GPC zu 14.2 ± 0.6 kDa bestimmt (VE =101.4 mL). Die N-terminale Domäne liegt demnach in Lösung als Monomer vor. Elektroblotting und anschließende N-terminale Sequenzierung (Kap. 3.3.3) bestätigten, daß es sich bei dem aufgereinigten Protein um die N-terminale Domäne von AviRb handelt. Der berechnete IEP der Domäne von 10.3 konnte mittels isoelektrischer Fokussierung bestätigt werden (pI = 9.9 ± 0.5). LMW 97 kDa 66 kDa 45 kDa 30 kDa 20 kDa 123 Ergebnisse und Diskussion Bahn Bahn Bahn Bahn Bahn Bahn 1 2 3 4-6 7 8-10 Rohextrakt Durchfluß IEC LMW-Marker Fraktionen IEC LMW-Marker Fraktionen GPC AviRb-Ndom 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Abbildung 65 SDS Gel der Reinigung von AviRb-Ndom mittels IEC (Source 30S) und GPC (S75 16/60). Aufgrund der stark positiven Ladung von AviRb-Ndom ist die zugehörige Bande bei einer höheren relativen Molekularmasse zu finden als erwartet. Die Ausbeute an gereinigtem Protein betrug lediglich 0.5 mg pro Liter Bakterienkultur, zudem war AviRb-Ndom ähnlich instabil wie das vollständige Protein. Dies läßt sich auf Wechselwirkungen der einzelnen Domänen eines Multidomänen-Proteins zurückführen. Der Kontakt zwischen den Domänen besteht teilweise aus hydrophoben Bereichen, welche bei Expression einer einzelnen Domäne solvensexponiert sind, so daß die Präzipitationsneigung eines Proteins stark erhöht werden kann. Aufgrund der hohen Instabilität von AviRb-Ndom wurde nicht weiter versucht, diese Domäne getrennt zu exprimieren und zu reinigen. C-terminale Domäne Das für die C-terminale Domäne (AviRb-Cdom) kodierende Genfragment wurde ebenfalls aus dem Ausgangsvektor pRSETb-AviRb durch PCR amplifiziert. Der eingesetzte forward-primer enthielt am 3'-Ende der bereits im Gen vorhandenen BamH1-Schnittstelle eine zusätzliche Base (C). Dies erlaubte eine direkte Klonierung des Konstruktes über die Schnittstellen der Restriktionsendonucleasen BamH1 und EcoR1 in den GST-Fusionsvektor pGEX-4T1 (Anhang 6.3). Die Umklonierung wurde durch analytischen Doppelverdau, die Einführung der zusätzlichen Base durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Das Vektorkonstrukt wurde in den E. coli Stamm BL21DE(3) transformiert und exprimiert (Kap. 3.2.1). Das Fusionsprotein GST-AviRb-Cdom konnte jedoch nur in unlöslicher Form erhalten werden. Durch die Einführung der Oberflächenmutation F178K mittels QuikChangeTM (Kap. 3.1.1, Anhang 6.4) sollte die Löslichkeit erhöht werden. Gemäß dem Strukturmodell des AviRb-Dimers (Kap. 4.3.1) trägt Phe178 mit 100 Å2 den größten Anteil (> 15%) an der 124 Ergebnisse und Diskussion Kontaktfläche zwischen den beiden Domänen. Trotz einer Erhöhung der Hydrophilie in diesem Bereich konnte die Stabilität nicht verbessert werden, auch die Mutante F178K lag weiterhin in Form von Einschlußkörpern vor. Aufgrund der unlöslichen Expression der Cterminalen Domäne und des Erfolgs der parallel durchgeführten Reinigung von AviRb als GST-Fusionsprotein, wurden die Arbeiten mit dieser Domäne eingestellt. 4.3.4 Amplifizierung von AviRb-pGEX-4T1 Zur alternativen Reinigung von AviRb als GST-Fusionsprotein (GST-AviRb, Kap. 3.2.2) wurde das Gen von AviRb durch PCR amplifiziert und in den Fusionsvektor pGEX-4T1 kloniert. Hierzu wurden zu beiden Seiten des Gens eine EcoRI Schnittstelle eingefügt. Der korrekte Einbau des Genfragments wurde durch Doppelverdau mit PstI und SacI bestätigt (Gel nicht gezeigt, Anhang 6.3). Das erhaltene Konstrukt codiert für ein Fusionsprotein aus GST und AviRb, die Linkerregion zwischen den beiden Proteinen enthält eine Thrombinschnittstelle (Abbildung 66). GST-AviRb: WT: L V P R9G S P E F A R S G E R T M A R S G E R T Abbildung 66 Aminosäuresequenz der Linkerregion zwischen GST und AviRb mit Thrombinschnittstelle (9) für das erhaltene Fusionsprotein im Vergleich mit der AviRb-WT-Sequenz. 4.3.5 Expression und Reinigung von AviRb als GST-Fusionsprotein Die Expression des GST-AviRb-Fusionsproteins (Kap. 3.2.1) erfolgte im E. coli Stamm BL21(DE3), die Reinigung durch GST-Affinitätschromatographie. Beim anschließenden Thrombinverdau wurde sowohl die Strategie der off-column cleavage als auch der on-column cleavage verfolgt (Kap. 3.2.2). Bei der Methode der off-column cleavage wurde das Fusionsprotein per GSTAffinitätschromatographie gereinigt, mit Glutathion eluiert (Abbildung 67) und anschließend durch Thrombin verdaut. Die Spaltung in GST und AviRb erfolgte unter den gewählten Bedingungen zu mehr als 90% (Abbildung 68). Die Untersuchung der erhaltenen Spaltprodukte durch N-terminale Sequenzierung zeigten eine homogene Spaltung an der gewünschten Stelle. Nach Erniedrigung der Glutathion-Konzentration wurde GST und ungeschnittenes Fusionsprotein durch erneute Applikation auf die GST-Säule abgetrennt (Chromatogramm nicht gezeigt); AviRb befindet sich im Durchfluß. 125 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 67 Elutionsprofil des ersten Schrittes der Reinigung des Fusionsproteins GST-AviRb mittels GST-Affinitätschromatographie (off-column cleavage). Die Elution erfolgte durch Glutathion (20 mM). ▬▬ vereinigte Fraktionen (96-108 mL). Die alternative Reinigung der on-column cleavage stellt eine deutliche Vereinfachung dar. Nachdem die Menge an exprimiertem Protein reproduzierbar und somit die einzusetzende Konzentration an Thrombin abzuschätzen war, konnte das Fusionsprotein direkt auf der Säule gespalten werden. Die Ausbeute an gereinigtem AviRb ließ sich durch die vereinfachte Prozedur von 1.5 mg auf 2 mg pro Liter Kultur steigern. Die Analyse der Proben durch SDS-PAGE zeigten noch eine geringe Menge an GST sowie Verunreinigungen im höhermolekularen Bereich (Abbildung 68). Diese konnten weitgehend durch eine GPC abgetrennt werden. Abbildung 68 zeigt die SDS-PAGE der gesamten Reinigung. LMW 97 kDa 66 kDa GST-AviRb 45 kDa AviRb 30 kDa GST 20 kDa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Abbildung 68 SDS-PGAE der Reinigung von AviRb als GST-Fusionsprotein: GST-Säule, Thrombinspaltung, erneute GST-Säule und anschließende GPC. Bahn Bahn Bahn Bahn 1 2 3-4 5 LMW-Marker Rohextrakt Fraktionen GST-Säule 1 Thrombinspaltung Bahn Bahn Bahn Bahn 6-7 8 9 10-13 Durchfluß GST-Säule 2 Elution GST-Säule 2 LMW-Marker Fraktionen GPC (48/78/82/88 mL) 126 Ergebnisse und Diskussion Das Elutionsprofil der GPC (Abbildung 69) zeigt eine Hauptbande bei einem Elutionsvolumen von 80 mL, welcher auf AviRb zurückzuführen ist. Die Nebenbande (VE = 88 mL) wird durch dimeres GST hervorgerufen. Ein Elutionsvolumen von 80 mL entspricht bei der verwendeten Säule einer Molekularmasse von 66 ± 5 kDa (Anhang 6.5). Die Molekularmasse von AviRb beträgt 31.6 kDa. Die MTase liegt demnach wie alle Vertreter der SpoU-Familie als Dimer in Lösung vor. Abbildung 69 Elutionsprofil der GPC von AviRb. Die Elution erfolgte bei einem Volumen von 80 mL, welches einer Molekularmasse von ca. 66 kDa entspricht. AviRb liegt erwartungsgemäß als Dimer vor. ▬▬ vereinigte Fraktionen (77-84 mL). Die Dimerisierung wurde durch dynamische Lichtstreuung (DLS) bestätigt, die ermittelte Molekularmasse lag bei 68 ± 10 kDa. Zudem konnte mittels DLS der Reinheitsgrad der Proben bestimmt werden (Kap. 3.3.6). Die Basislinie lag bei einem Wert von 1.01. Dies deutet auf eine polydisperse Lösung hin, die sich in der Regel nicht besonders gut zur Kristallisation eignet. Verglichen mit dem entsprechenden Wert von 1.10 nach Reinigung durch IEC und Reactive-Blue-4TM-Säule konnte jedoch eine deutlich Verbesserung erzielt werden. Die AviRb-haltigen Fraktionen wurden daher vereinigt, konzentriert und für Kristallisationsansätze verwendet . 4.3.6 Kristallisation von AviRb Erste Kristallisationsversuche wurden bei zwei verschiedenen Proteinkonzentrationen (3.5 und 5 mg/mL) sowohl mit und ohne Zugabe des Kofaktors AdoMet durchgeführt (Kap. 3.4.1, Kap. 3.4.3). Unter je einer Kristallisationsbedingung konnten initiale Kristalle von Apo- bzw. Holoenzym erhalten werden. (Abbildung 70(a)). Die identisch aussehenden, 127 Ergebnisse und Diskussion oktaederförmigen Kristalle erschienen nach 4-6 Wochen, waren allerdings aufgrund ihrer geringen Größe (maximal 20x40x20 µm3) röntgenuntauglich. Eine Änderung der Vorsättigung sowie Optimierung von pH-Wert und Protein- bzw. FällungsmittelKonzentration lieferte in beiden Fällen Kristalle hinreichender Größe (200x100x50 µm3; Abbildung 70(b)). Kristalle des AviRb-Apoenzyms konnten bei einer Proteinkonzentration von 4 mg/mL und einem Reservoirpuffer aus 25-35% PEG-200, 3.75% PEG-3000, bei einem pH von 6.8-6.9 (0.1 M MES) erhalten werden. Die Vorsättigung betrug 1.25 µL Proteinlösung auf 1 µL Reservoirpuffer. Die Lösung aus AviRb und AdoMet kristallisierte bei gleicher Proteinkonzentration und Vorsättigung mit einem Reservoirpuffer aus 35-40% PEG-300, 2.5% PEG-3000 und einem pH von 4.6 (0.1 M NaAc). Unter den optimierten Bedingungen erschienen neben der oktaedrischen Form immer wieder röntgenuntaugliche Kristalle, welche in Form einer doppelseitigen Krone verwachsen waren (Abbildung 70(c)). Zudem war die Reproduzierbarkeit der Kristalle nicht besonders gut, lediglich in 5% der angesetzten Tropfen konnten Kristalle erhalten werden. (a) 50 µM (b) 100 µM (c) 100 µM Abbildung 70 Kristallisation von AviRb (Apoenzym). Kristalle des Holoenzyms waren trotz unterschiedlicher Kristallisationsbedingungen von identischem Aussehen und sind nicht gezeigt. (a) (b)/(c) initiale Kristallisationsbedingung: [AviRb] = 3.5 mg/mL; Kristallisationspuffer: 30% PEG-200, 5% PEG-3000, pH = 6.0 (0.1 M MES), maximal 20 x 40 x 20 µm3. verfeinerte Kristallisationsbedingungen: [AviRb] = 4 mg/mL; Kristallisationspuffer: 25-35% PEG-200, 3.75% PEG-3000, pH = 6.8-6.9 (0.1 M MES), maximal 350 x 150 x 100 µm3. Charakterisierung der Kristalle Bei den vorliegenden Kristallisationsbedingungen dient PEG-200 bzw. PEG-300 als Fällungsmittel. Dieses Reagenz stellt gleichzeitig ein cryo-protectant dar, so daß die erhaltenen Kristalle direkt aus der Mutterlauge in flüssigem Stickstoff eingefroren werden konnten (Kap. 3.4.4). Messungen an der Hausanlage zeigten sowohl bei Apo- als auch bei Holoenzym-Kristallen lediglich eine Auflösung von 7-8 Å. Bei Verwendung von Synchrotronstrahlung an der SLS in Villigen (CH) konnten dagegen jeweils Datensätze mit 128 Ergebnisse und Diskussion einer maximalen Auflösung von 2.4 Å aufgenommen werden. Die unter den beiden Bedingungen erhaltenen Kristalle sind nahezu isomorph und gehören der tetragonalen Raumgruppe P41212 an. Eine Unterscheidung zwischen den Raumgruppen P41212 und P43212 ist aufgrund von Auslöschungsbedingungen nicht möglich. Die endgültige Zuordnung zur Raumgruppe P41212 erfolgte daher erst während der Strukturlösung. Tabelle 27 faßt die Parameter der beiden Datensätze zusammen. Tabelle 27 Charakterisierung der AviRb- und AviRb-AdoMet-Datensätze1 AviRb AviRb-AdoMet P41212 P41212 a [Å] = b [Å] 76.6 76.9 c [Å] 209.1 209.8 0.17 0.30 56 54 165'123 201'842 24'453 (2587) 21'375 (2870) 25 – 2.41 25 – 2.55 5.6 (38.1) 7.6 (42.4) 98.7 (93.4) 99.9 (100.0) 6.8 (3.7) 9.4 (9.7) 20.7 (3.9) 18.8 (5.5) Raumgruppe Elementarzellparameter Mosaizität 2 Wilson B-Faktor [Å ] Zahl der gemessenen Reflexe Zahl der unabhängigen Reflexe 2 Auflösung [Å] Rsym aller Daten [%] Vollständigkeit [%] Multiplizität I/σ 1 2 2 2 2 2 Beide Datensätze wurden an der SLS (Villigen, CH) bei 100 K aufgenommen. Werte in Klammern beziehen sich auf die letzte Auflösungsschale (2.41-2.51 Å bzw. 2.55-2.68 Å). Der Matthews-Parameter VM (Kap. 3.5.2) beträgt unter Annahme von zwei Molekülen pro asymmetrischer Einheit 2.5 Å3/Da. Der Solvensgehalt der Kristalle errechnet sich nach Gleichung 6 zu 49% (v/v). Beide Datensätze weisen außerordentlich hohe Wilson B-Faktoren (> 50 Å2) auf, was auf eine hohe Flexibilität der Moleküle innerhalb der Kristalle hindeutet. Bestimmung der nicht-kristallograpischen Symmetrie Die interne Symmetrieachse eines Homooligomers fällt in Proteinkristallen nicht unbedingt mit einer kristallographischen Achse zusammen. Oft beinhaltet die ASU mehrere Protomere, welche durch nicht-kristallographische Rotationsachsen miteinander verknüpft sind (Kap. 3.5.11). Da AviRb als Dimer in Lösung vorliegt, ist es relativ wahrscheinlich, daß Ergebnisse und Diskussion 129 es sich bei den beiden Molekülen der asymmetrischen Einheit um die beiden Protomere handelt. Zur Bestimmung der vermuteten 2-zähligen NCS-Achse wurde eine EigenrotationsFunktion mit κ gleich 180° berechnet (Kap. 3.5.11). Zur Verringerung störender Signale durch Kreuzvektoren wurde ein maximaler Integrationsradius von 22 Å gewählt. Bei einem Winkel von ω = 90° zeigt die Eigenrotations-Funktion dominante Maxima, welche auf die beiden kristallographischen, zweizähligen Achsen der Raumgruppe P41212 zurückzuführen sind (Abbildung 71). Die 2-zählige Schraubenachse kommt entlang der x-Achse zu liegen, die 2-zählige Rotationsachse befindet sich im tetragonalen System entlang der Diagonalen der x-y-Ebene. Beide Achsen werden durch die vierzählige Rotationsachse, welcher das Funktionsmaximum bei ω = 0° entspricht, vervielfältigt. Es konnte kein zusätzliches, eindeutig auf die NCS zurückzuführendes Funktionsmaximum beobachtet werden. Zwar läßt sich bei ω = 45° und ϕ = 0° ein schwaches Maximum erkennen, allerdings wird dieses Signal aufgrund seiner geringen Höhe vermutlich nicht durch die NCS hervorgerufen. Das Fehlen eines NCS-peaks tritt bei einer rein translationalen Verschiebung der NCS-Achse gegenüber einer vorhandenen Rotationsachse gleicher oder höherer Ordnung auf. Dann überlagern sich das durch die NCS in der Eigenrotations-Funktion hervorgerufene Signal und das Signal der kristallographischen Symmetrie. Abbildung 71 Bestimmung der nicht-kristallographischen Symmetrie durch die EigenrotationsFunktion. Dargestellt ist die Projektion der Integrationskugel in die x-y-Ebene bei κ = 180°. Die Höhe der Funktionsmaxima ist durch Höhenlinien gekennzeichnet. Die beobachteten Funktionsmaxima sind auf die 4-zählige (ω = 0°) sowie die beiden 2-zähligen (ω = 90°) kristallographischen Achsen der Raumgruppe P41212 zurückzuführen. Die später gefundene NCSAchse liegt parallel zur 2-zähligen Rotationsachse. 130 Ergebnisse und Diskussion Nach der Strukturlösung konnte die Rotationsfunktion, welche die beiden Protomere der ASU aufeinander abbildet, bestimmt werden. Dabei stellte sich heraus, daß die NCSAchse tatsächlich fast parallel zur kristallographischen zweizähligen Achse verlief (vergl. Abbildung 86). Bei einem κ von 180°, entsprechend einer 2-zählige Rotationsachse, wurden ω zu 90.8° und ϕ zu 140.3° bestimmt. Die NCS-Achse ist damit gegenüber der kristallographischen Achse um 5.3° in der x-y-Ebene sowie um 0.8° aus dieser Ebene verdreht (Abbildung 71). 4.3.7 Darstellung und Kristallisation von Oberflächenmutanten Ziel der Darstellung von Oberflächenmutanten bei AviRb war es, die Proteinstabilität und Ausbeute während der Reinigung zu erhöhen. Außerdem besteht die Möglichkeit, daß durch Oberflächen-Mutationen Kristallkontakte verstärkt oder neu ausgebildet werden, so daß eine besser reproduzierbare Kristallform mit geringerer innerer Flexibilität erhalten werden kann. Die ausgewählten Reste befanden sich an der Oberfläche des Strukturmodells und wurden zudem als solvenszugänglich vorhergesagt (Kap. 4.3.1). Ersetzt wurden die beiden basischen Reste Lys72 und Arg82 der N-terminalen Domäne durch Glutamat, sowie Asp193 und Cys216 der C-terminalen Domäne durch Tyrosin bzw. Serin. Der Ladungsaustausch innerhalb der beiden stark gegensätzlich geladenen Domänen diente vor allem der Erhöhung der Proteinstabilität, an der Oberfläche befindliche Cysteine können die Kristallisation negativ beeinflussen. Die erfolgreiche Einführung der Mutationen durch ortsgerichtete Mutagenese (Kap. 3.1.1) wurde durch Sequenzanalyse bestätigt (Anhang 6.4). Sämtliche Mutanten wurden analog dem WT präpariert, auf ihre Stabilität getestet und bei einer Konzentration von 4 bzw. 8 mg/mL Kristallisationsversuche durchgeführt (Kap. 3.2, Kap. 4.3.6). Dabei wurden sowohl die Bedingungen des WT getestet als auch nach neuen Kristallisationsbedingungen gesucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 28 zusammengefaßt. Tabelle 28 Charakterisierung der Oberflächenmutanten von AviRb max. Konz. [mg/mL] Kristallform P41212 Wilson BFaktor [Å2] neue Kristallform WT 5 + 50-55 - K72E 8 - - - R82E 10 - - - D193Y 5 Mikrokristalle nicht meßbar - C216S 5 + 50-55 - Mutation 131 Ergebnisse und Diskussion Der Ladungsaustausch der beiden positiv geladenen Reste Lys72 und Arg82 durch Glutamat resultierte in einer erhöhten Stabilität des Proteins. Während die Mutante D193Y die Bildung der Kristallform P41212 verschlechtert, konnten im Falle von L72E und R82E keinerlei Kristallbildung unter den Bedingungen des WT beobachtet werden. Diese Beobachtungen ließen sich nach erfolgter Strukturlösung erklären. Asp193 ist in einem Kristallkontakt gelegen, der lediglich in einem der beiden Moleküle der asymmetrischen Einheit auftritt. Lys72 und Arg82 befinden sich dagegen in einem essentiellen Kristallkontakt beider Protomere (vergl. Abbildung 75). Die Mutante C216S hatte weder Einfluß auf die Stabilität noch auf die Kristallisation des Proteins. Die erhaltenen Kristalle zeigten einen ähnlich hohen B-Faktor und besaßen ebenfalls die Raumgruppe P41212. Eine neue Kristallform konnte bei keiner der dargestellten Mutanten erhalten werden. 4.3.8 Phasierungsversuche durch Molrep und MIR Molekularer Ersatz Alle SpoU-MTasen besitzen eine identische Faltung der katalytischen Domäne (Kap. 1.2), so daß eine Phasierung durch molekularen Ersatz denkbar ist (Kap. 3.5.10). Es wurden verschiedene Suchmodelle auf Grundlage des erstellten AviRb-Modells (Kap. 4.3.1) sowie der Strukturen der bis zu diesem Zeitpunkt bekannten SpoU-MTasen mit der höchsten Sequenzidentität (RrmA, RlmB und YibK) generiert (Tabelle 29). Sämtliche Rechnungen wurden in beiden möglichen Raumgruppen, P41212 und P43212 (Kap 4.3.6), gegen beide AviRb-Datensätze (WT und WT-AdoMet) durchgeführt. Tabelle 29 Suchmodelle bei der versuchten Strukturlösung von AviRb durch Molrep Suchmodell AviRbModell Beschreibung vollständiges Molekül 12-280 Polyalaninmodell 12-280 beide Domänen ohne loop-Regionen SpoU-Domäne SpoU-Domäne ohne loop-Regionen RrmA AS des Modells 12-51, 58-96, 106-111, 125198, 207-252, 263-280 120-280 125-198, 207-252, 263-280 vollständiges Molekül 1-263 Polyalaninmodell 1-263 SpoU-Domäne SpoU-Domäne ohne 112-263 112-195, 207-235, 246-263 132 Ergebnisse und Diskussion loop-Regionen RlmB YibK vollständiges Molekül 2-243 Polyalaninmodell 2-243 SpoU-Domäne 95-243 vollständiges Molekül 1-156 Polyalaninmodell 1-156 Bei keinem der verwendeten Modelle konnten mit den Programmen AMoRe oder MOLREP Lösungen der Rotations- bzw. Translationsfunktion gefunden werden, welche einen Korrelationskoeffizienten größer 25% bzw. einen R-Faktor kleiner 55% aufweisen. Diese Werte werden als Qualitätskriterium herangezogen und liegen bei tatsächlichen Lösungen in der Regel über 35% bzw. unter 50% (Kap. 3.5.10). Eine Lösung des Phasenproblems durch molekularen Ersatz gelang somit nicht. Ein Vergleich des Homologiemodells von AviRb mit der später erhaltenen Struktur zeigt große Ähnlichkeiten innerhalb der Sekundärstruktur. Es konnten 85 Reste der N-terminalen Domäne (104 Reste) bzw. 144 Reste der C-terminalen Domäne (167 Reste) mit einer mittleren quadratischen Abweichung (rmsd) von 1.6 Å bzw. 1.5 Å überlagert werden, wobei Abweichungen des Modells von der Struktur hauptsächlich in loop-Bereichen auftraten. Allerdings weist die N-terminale Domäne des Homologiemodells im Vergleich zu der tatsächlichen Struktur eine Rotation von 15° gegenüber der SpoU-Domäne auf, so daß eine Lösung durch Molrep auf Grundlage des vollständigen Moleküls nicht gelingen konnte. Die um die loop-Bereiche verkürzte SpoU-Domäne scheint dagegen einen zu geringen Teil der Gesamtstruktur zu umfassen, um als Suchmodell zum Erfolg zu führen. Zudem erschwerte die hochsymmetrische Raumgruppe der AviRb-Kristalle eine Phasierung durch molekularen Ersatz. Multipler isomorpher Ersatz Eine weitere Möglichkeit zur Phasierung stellt die Methode des multiplen isomorphen Ersatzes dar, bei welcher die Streukraft eingefügter Schwermetallatome ausgenutzt wird (Kap. 3.5.8). Hierzu wurden Kristalle von AviRb in ihrer Mutterlauge mit verschiedenen Schwermetallösungen versetzt (Tabelle 30). In mehreren Fällen wiesen die Kristalle schon bei kurzer Inkubationszeit und niedrigen Schwermetallkonzentrationen starke Schäden auf. Nach der Zugabe von Quecksilberdichlorid bzw. Ga-EAAS (siehe Tabelle 30) konnten auch nach 1.5 bzw. 2 Stunden keine Risse im Kristall beobachtet werden. Die Streukraft hatte jedoch stark nachgelassen, so daß kein Datensatz aufgenommen wurde. Von den mit dem Ta 6 Br122+ - 133 Ergebnisse und Diskussion Cluster bzw. K2PtCl4 getränkten Kristallen konnten Daten minderer Qualität an der SLS (Villigen, Schweiz) aufgenommen werden. In beiden Fällen war eine starke Non-Isomorphie gegenüber den WT-Kristallen zu beobachten. Vor allem im Fall der K2PtCl4-Zugabe hatten sich die Zellachsen im Vergleich zum WT (a = b = 76.4 Å, c = 208.6 Å), so stark verändert, daß eine Skalierung auf die nativen Daten nicht möglich war. Der Riso, der ein Maß für die Non-Isomorphie darstellt, sollte für ein gutes Derivat zwischen 0.1 und 0.3 liegen (Kap. 3.5.8), bei den Ta 6 Br122+ - bzw. K2PtCl4 - Derivaten beträgt er dagegen 0.5 bzw. 0.9. Dennoch wurden Patterson-Karten der Harkersektionen berechnet, welche allerdings keine eindeutigen peaks aufwiesen. Es handelte sich daher nicht um brauchbare Derivate. Tabelle 30 Schwermetallverbindung HgCl2 Schwermetall-Tränkexperimente zur Derivatisierung von AviRb Konzentration [mM] 2/1 Tränkzeit Kristallcharak- Auflösung [min] terisierung [Å] / Rsym 120 90 leichte Risse keine Risse >8 Zellachsen a = b, c [Å] - MMA 2/1 1-5 starke Risse - K2PtCl6 2/1 20 starke Risse - K2PtCl4 2/1 120 keine Risse 4.2 / 19.3 72.8, 210.9 Doppelspots cis-(NH3)2Cl2Pt 2/1 20 starke Risse - Ga-EAAS 5 120 keine Risse > 10 - Ta 6 Br122+ - fest, 1 Krümel 45 leichte Risse, grünlich 3.6 / 20.9 75.5, 207.7 2/1 2 starke Risse - Cluster NH4-metaWolframat Riso 0.9 0.5 Der GPC-Puffer enthielt bei Kristallisationsansätzen für Schwermetall-Tränkexperimente kein DTT, welches mit dem Protein um das Schwermetall konkurrieren könnte. MMA steht für Methylquecksilberacetat, GaEAAS für Gadolinium-triethyl-tetramine-hexaacetate-trisodium Pentahydrat. Alle Röntgendaten wurden bei 100 K an der SLS (Villigen, CH) aufgenommen. 4.3.9 Präparation und Kristallisation von AviRb-SeMet Zur Inkorporation des anomalen Streuers Selen wurde das GST-AviRb-Plasmid analog der Präparation von AviRa-SeMet in den Methionin-auxotrophen E. coli Stamm B834(DE3) eingebracht. Die Expression erfolgte in LeMaster-Medium (Kap. 3.2.1), die Reinigung als GST-Fusionsprotein entsprechend dem WT. Die Ausbeute an gereinigtem AviRb-SeMet betrug mit 0.5 mg pro Liter Bakterienkultur lediglich 25% der Expression im E. coli Stamm BL21(DE3). Eine derart stark verminderte Expressionsrate im LeMaster- 134 Ergebnisse und Diskussion Medium ist aufgrund der schlechteren Wachstumsbedingungen der Zellen nicht ungewöhnlich (Hendrickson, 1990). Die Inkorporation von SeMet wurde durch Massenspektroskopie überprüft (Kap. 3.3.4; Abbildung 72). Bei vollständigem Ersatz aller sechs in der Sequenz von AviRb vorhandenen Methionine, beträgt die Massendifferenz zwischen WT (31'602 Da) und AviRb-SeMet 282 Da. Das Massenspektrum des WT zeigt eine Hauptbande bei 31'594 Da, die Masse von AviRb-SeMet ist mit 31'879 Da um 285 Da größer. Dies bestätigt den Ersatz sämtlicher Methionine durch SeMet. Die zusätzlichen Banden in beiden Massenspektrum sind auf die Anlagerung eines bzw. mehrerer Moleküle Trifluoressigsäure (MW = 113 Da) des MS-Puffers an die positiv geladene Proteinoberfläche zurückzuführen (Apffel et al., 1995). Ergebnisse und Diskussion 135 Abbildung 72 ESI-MS Spektren von AviRb. oben: Expression in E. coli BL21(DE3) unten: Expression im Methionin-auxotrophen E. coli Stamm B834(DE3) zur Inkorporation von SeMet. Die Massendifferenz der Hauptbanden liegt durch die Inkorporation von sechs Selen-Atomen bei 285 Da. Die zusätzlichen Banden sind auf die Anlagerung eines bzw. mehrerer Moleküle TFA (MW = 113 Da) an die positiv geladenen Proteinoberfläche der C-terminalen Domäne zurückzuführen. AviRb-SeMet kristallisierte unter den Bedingungen des Wildtyps. Die Kristalle erschienen nach 4-6 Wochen und erreichten eine maximale Größe von 150x100x50 µm3. Sämtliche erhaltene Kristalle waren isomorph zum Wildtyp. Ein Kristall wurde an der Swiss Light Source, Villigen (Schweiz), vermessen. 136 Ergebnisse und Diskussion 4.3.10 Phasierung durch MAD Zur Strukturlösung durch MAD (Kap. 3.5.9) wurden an einem AviRb-SeMet Kristall drei Datensätze bei unterschiedlichen Wellenlängen aufgenommen, welche analog der Strukturlösung von AviRa durch einen Fluoreszenzscan bestimmt wurden (Abbildung nicht gezeigt). Es wurde zunächst ebenfalls bei der peak-Wellenlänge (λ = 0.9791 Å), welche das größte anomale Signal mit einem maximalen f '' aufweist, gemessen. Anschließend wurde je ein Datensatz am Wendepunkt der Kurve bei minimalem f ' (λ = 0.9793Å) sowie im high energy remote Bereich (λ = 0.9611 Å) aufgenommen. Die Daten der Messung sind in Tabelle 31 zusammengefaßt. Der Riso gegenüber dem WT-Datensatz beträgt bei allen Datensätzen 0.18. Tabelle 31 Statistiken der MAD-Datensammlung von AviRb-SeMet 1 Wellenlänge [Å] Auflösung [Å] Observierte Reflexe Unabhängige Reflexe 2,3 Vollständigkeit [%] 2,3 Rsym-I [%] 2,3 Multiplizität 2,3 I/σI 2,3 1 2 3 peak inflection point remote 0.9791 25 – 2.37 310'660 48'034 (2365) 99.6 (100.0) 5.1 (36.2) 6.5 (6.5) 23.6 (5.4) 0.9793 25 – 2.4 300'322 46'341 (4842) 99.8 (100.0) 5.6 (39.2) 6.5 (6.4) 21.0 (5.1) 0.9611 25 – 2.45 235'150 43'542 (4943) 99.7 (99.7) 5.6 (40.9) 5.4 (5.3) 18.6 (4.4) Alle Datensätze wurden an einem AviRb-SeMet-Kristall bei 100 K an der SLS (Villigen, CH) aufgenommen; Raumgruppe P41212, a = b = 76.6 Å, c = 208.9 Å. Friedelpaare wurden als unabhängige Reflexe betrachtet und getrennt skaliert. Werte in Klammern beziehen sich auf die höchste Auflösungsschale. Zur Analyse der anomalen Differenzen der Datensätze wurde das Programm XPREP verwendet (Tabelle 32). Das anomale Signal ist bis zu einer Auflösung von 3.0 Å zur Phasierung ausreichend, die Korrelationskoeffizienten liegen in diesem Bereich über dem Richtwert von 30%. Tabelle 32 Anomale Korrelationskoeffizienten1 [%] der AviRb-SeMet-Datensätze Auflösungsgrenze [Å] peak/inflection point inflection point/remote peak/remote 8 6 5 4 3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 2.8 2.6 93.2 91.5 85.5 78.8 69.8 64.7 55.3 49.3 44.0 25.9 16.7 73.6 90.3 83.0 71.9 66.5 56.5 46.3 43.5 28.7 16.5 9.2 78.6 93.2 87.8 81.5 73.5 69.7 61.3 55.7 43.3 27.0 19.0 2.4 6.4 4.9 8.1 137 Ergebnisse und Diskussion 1 Die anomalen Korrelationskoeffizienten zwischen den einzelnen Datensätzen sollten in allen Auflösungsschalen über 30% liegen. Dies ist hier bis zu einer Auflösung von 3.0 Å gegeben. Die von XPREP berechneten Strukturfaktoren der Selen-Substruktur dienten zur initialen Bestimmung der Se-Positionen mit SHELXD (Sheldrick et al., 2001). Es konnten alle zwölf Selen-Positionen der asymmetrischen Einheit, welche zwei Moleküle AviRb beinhaltet, bestimmt werden. Die erhaltenen Koordinaten wurden durch SHARP (de La Fortelle & Bricogne, 1997) verfeinert und zur Phasierung genutzt. Die Daten der Phasierung sind in Tabelle 33 zusammengefaßt. Als Referenz diente der peak-Datensatz, welcher die höchste Auflösung aufwies. Tabelle 33 Statistiken der Phasierung durch Se-MAD zur Strukturlösung von AviRb inflection point / peak Auflösungsbereich [Å] FOM PhPdisp PhPano Rcullis Rano remote / peak 25-3.0 0.414 0.31 2.29 0.88 0.85 0.62 1.70 0.88 0.79 Mit Hilfe der initialen Phasen wurde eine Dichtekarte berechnet, welche Bereiche hoher und niedriger Dichte erkennen ließ. Zur Verbesserung der Phasen wurde eine Dichtemodifikation inklusive Phasenerweiterung auf 2.4 Å mit dem Programm RESOLVE (Terwilliger, 2003) durchgeführt, wobei ein Solvensgehalt von 50% angenommen wurde (Kap. 3.5.12). Abbildung 73 zeigt eine Projektion der Elektronendichte auf die x-y-Ebene vor und nach der Dichtemodifikation. Die durch die Dichtemodifikation zusätzlich gewonnene Phaseninformation führte zu einer erheblichen Verbesserung der Qualität der Dichtekarten, so daß bereits Sekundärstrukturelemente und einzelne Seitenketten zu erkennen waren. Die auf diese Weise erhaltene Elektronendichtekarte war Grundlage für den Modellbau. 138 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 73 Projektion der initialen Elektronendichte bei einem Konturniveau von 1.5 σ entlang z (0-1.5 Å) vor (links) und nach (rechts) Dichtemodifikation mit RESOLVE (Terwilliger, 2003). Vor der Dichtemodifikation sind lediglich Bereiche hoher und niederer Dichte zu erkennen, danach lassen sich Sekundärstruktur-elemente und einzelne Seitenketten zuordnen. 4.3.11 Modellbau und Strukturverfeinerung Erste Teile des Modells wurden mit der AUTO-BUILD Routine des Programms RESOLVE gebaut (Kap. 3.5.13). In mehreren Zyklen wurden ca. 70% des Peptidrückgrates des Protomers A in mehreren Teilstücken in die Elektronendichte eingefügt. Das zweite Protomer (B) konnte nur unvollständig gebaut werden, lediglich 40% der Peptidkette wurde modelliert. Nach mehreren Verfeinerungszyklen mit REFMAC (Kap. 3.5.14) konnten bei 80% des vorhandenen Modells Seitenketten hinzugefügt werden. Zur Berechnung des freien R-Faktors wurden dabei 1214 Reflexe (entspricht 5.1% aller Reflexe) zufällig bestimmt und von der Verfeinerung ausgeschlossen. Das resultierende Modell wurde anschließend manuell in XFIT (McRee, 1999) korrigiert und ergänzt. Die Beschränkungen durch die nichtkristallographische Symmetrie zwischen den beiden Protomeren der ASU konnten zunehmend gelockert und nach Vervollständigung des Modells aufgehoben werden. Nach Verfeinerung der individuellen B-Faktoren wurden die Wassermoleküle analysiert. Abschließend wurden vier TLS-Gruppen definiert, welche jeweils eine Protomer-Domäne umfaßten. Die einzelnen Verfeinerungsrunden sind in Tabelle 34 zusammengefaßt. Das finale Modell umfaßt die Aminosäuren 18 bis 284 des Protomers A, im Protomer B sind neben den N- und C-Termini zwei loops (AS 67-69, AS 97-102) ungeordnet. Zusätzlich konnten 129 Wasser eingebaut werden, was einem Wassermolekül pro 4.2 Aminosäuren entspricht. Ein Ausschnitt aus der finalen (2Fobs –Fcalc)Elektronendichte ist in Abbildung 74 gezeigt. Dargestellt ist ein Bereich des zentralen β-Faltblattes der C-terminalen Domäne des Protomers A. Ergebnisse und Diskussion Tabelle 34 139 Übersicht der Verfeinerung des Strukturmodells von AviRb-SeMet Art der Verfeinerung Modellumfang Rcryst WasserTLSmoleküle Gruppen Protomer A Protomer B initiales Modell durch 414 Reste, davon 347 mit 0 0 35.8 RESOLVE / REFMAC Seitenketten korrigiertes Modell, 18-67, 71-93, 39-64, 72-88, 0 0 33.3 CNS annealing 102-201, 204- 104-198, 204255, 259-279 237, 241-254, 261-280 vervollständigtes Modell, 18-283 19-66, 70-96, 0 0 30.3 CNS annealing 103-211,215-283 Verfeinerung B-Faktoren, 18-283 19-66, 70-96, 0 0 28.5 CNS 103-211,215-283 Analyse Wassermoleküle, 18–283 19–66, 70-96, 134 0 27.6 ARP/wARP / REFMAC 103-283 TLS-Verfeinerung, 18–284 19–66, 70-96, 129 4 24.9 REFMAC 103-284 Rfree 37.8 30.6 26.3 25.0 24.1 20.6 Abbildung 74 Ausschnitt aus der finalen (2Fobs –Fcalc)-Elektronendichte. Das Konturniveau beträgt 1.0 σ. Als Ausschnitt wurden die β-Stränge β5 (AS 127-131, Sequenz: LGVLF) und β6 (AS 153157, Sequenz: HGLIV) des Protomers A gewählt. Die Modelle der beiden Protomere der asymmetrischen Einheit wurden mit LSQMAN überlagert (Kap. 3.6.4). Die mittlere quadratische Abweichung (rmsd) beträgt 0.87 Å, größere Abweichungen von maximal 2.8 Å sind in loop-Bereichen und am C-Terminus zu finden (Abbildung 75). Überlagert man lediglich die C-terminalen Domänen der beiden Protomere, so sinkt die mittlere quadratische Abweichung (rmsd) für diese Domäne auf 0.65 Å. Dabei ist eine Rotation der N-terminalen Domäne von ca. 4° in Richtung des katalytischen Zentrums des zweiten Protomers zu beobachten (Abbildung 76). 140 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 75 Distanz der Cα-Atome der beiden AviRb-Protomere der asymmetrischen Einheit nach Überlagerung mit LSQMAN (AviRb-SeMet-Modell). Die mittlere quadratische Abweichung beträgt 0.87 Å. Die Balken markieren die Dimer- und Kristallkontakte (obere Linie; orange: Dimerkontakt, schwarz bzw. rot: Kristallkontakte Protomer A bzw. B) Darunter sind die Sekundärstrukturelemente im verfeinerten Proteinmodell angegeben. Abbildung 76 Stereodarstellung der beiden AviRb-Protomere A (blau) und B (orange) bei Überlagerung der C-terminalen SpoU-Domäne. Die zu beobachtende Rotation der N-terminalen Domäne von ca. 4° könnte bei der rRNA-Bindung eine Rolle in Form eines induced fit spielen. Die Bewegung der N-terminalen Domäne läßt darauf schließen, daß die beiden Domänen durch ein Gelenk miteinander verbunden sind, das eine gewisse Rotationsfreiheit erlaubt. Vermutlich ist die tatsächlich im Kristall beobachtete Orientierung der N-terminalen Domäne zumindest teilweise von der Kristallpackung beeinflußt. Die relative Bewegungs- Ergebnisse und Diskussion 141 freiheit der beiden Domänen könnte bei der rRNA-Bindung eine Rolle in Form eines induced fit spielen (vergl. Kap. 4.4.7). 4.3.12 Bestimmung der Struktur von AviRb-AdoMet Die verfeinerte AviRb-SeMet-Struktur diente als Modell bei der Strukturlösung der Komplexstruktur von AviRb mit AdoMet. Die Statistiken des AviRb-AdoMet-Datensatzes wurden bereits in Tabelle 27 gezeigt. Da die Kristalle des Holo- und Apoenzyms isomorph sind, konnten ausgehend vom AviRb-SeMet-Modell initiale Phasen berechnet werden. Der model bias wurde durch simulated annealing in CNS reduziert. Die weitere Verfeinerung erfolgte anschließend analog des AviRb-SeMet-Modells (Kap. 4.3.11). Im Bereich des aktiven Zentrums war in beiden Protomeren negative Differenzdichte vorhanden, in welche der Kofaktor AdoMet eingefügt werden konnte (vergl. Kap. 4.4.6). Das Strukturmodell konnte bei einer Auflösung von 2.55 Å bis zu einem Rcryst von 20.5 und einem Rfree von 25.6 verfeinert werden (vergl. Tabelle 35). Das resultierende Modell beinhaltet die Reste 18-282 des Protomers A, die Reste 19-65, 69-94 und 103-282 des Protomers B, je eine Molekül AdoMet pro Protomer sowie 83 Wassermoleküle. Die mittlere quadratische Abweichung (rmsd) zwischen den beiden Protomeren der asymmetrischen Einheit beträgt wie in der AviRb-SeMet-Struktur 0.87 Å und zeigt einen analogen Verlauf (Abbildung nicht gezeigt). Auch hier konnte eine Rotation der N-terminalen Domäne gegenüber der SpoU-Domäne von 4° beobachtet werden (vergl. Kap. 4.3.11). Dies deutet darauf hin, daß die relative Orientierung der beiden Domänen durch die Kofaktorbindung nicht beeinflußt wird. Zum Vergleich der Strukturen von Holound Apoenzym wurden beide Modelle mit LSQMAN überlagert (Kap. 3.6.4). Abbildung 77 zeigt die Abweichungen der beiden Protomere in Abhängigkeit von der Aminosäuresequenz. Abbildung 77 Distanz der Cα-Atome des Holoenzyms vom Apoenzym in Abhängigkeit von der AS-Sequenz (schwarz: Protomer A, rot: Protomer B). Die mittlere quadratische Abweichung beträgt 142 Ergebnisse und Diskussion 0.39 Å. Ein maximale Abweichung von 2.62 Å ist im Protomer B bei His212 vorhanden. Die Balken markieren die Dimer- und Kristallkontakte (orange: Dimerkontakt, schwarz bzw. rot: Kristallkontakte der Protomere A bzw. B). Darunter sind die Sekundärstrukturelemente im verfeinerten Proteinmodell angegeben. Die mittlere quadratische Abweichung (rmsd) zwischen den beiden Strukturen beträgt 0.39 Å. Eine maximale Änderung ist im Bereich des aktiven Zentrums im loop β8-β9 vorhanden. Hierbei ist eine Verschiebung der Aminosäure Glu212 um 1.1 Å im Protomer A bzw. 2.62 Å im Protomer B zu beobachten. Die unterschiedliche Bewegung ist darauf zurückzuführen, daß Glu212 im Protomer A an einem Kristallkontakt beteiligt ist, der im Protomer B nicht vorhanden ist. Die tatsächliche Bewegung des loops in Lösung dürfte eher der beobachteten Verschiebung im Protomer B entsprechen. Durch diese Anpassung werden die Wechselwirkungen zwischen Protein und Substrat verstärkt (Kap. 4.4.6). 4.3.13 Qualität der AviRb-Strukturen Die Qualität der Strukturmodelle wurde während der Verfeinerung anhand der R-Faktoren sowie der Abweichung von geometrischen Parametern analysiert (Kap. 3.6.2). Tabelle 35 faßt die entsprechenden Parameter der erhaltenen Modelle zusammen. Beide Strukturmodelle wurden für die jeweilige Auflösung zu guten R-Faktoren verfeinert. Die geometrischen Parameter liegen im Bereich der statistischen Verteilungen (Eng & Huber, 1991). Zudem befinden sich sämtliche Werte bei der Modellanalyse mit den Programmen WHATCHECK und PROCHECK innerhalb der Toleranzgrenzen. Tabelle 35 Verfeinerungsstatistik der AviRb-Strukturmodelle AviRb-SeMet Auflösung [Å] Vollständigkeit des Modells Protomer A Protomer B Wassermoleküle AdoMet Wilson-B-Faktor [Å2] mittlerer B-Faktor [Å2] Protomer A (Hauptkette / gesamt ) Protomer B (Hauptkette / gesamt ) Rcryst [%] Rfree [%] rmsd Bindungslängen [Å] /-winkel [°] Ramachandran-Torsionswinkel im energetisch günstigen Bereich [%] 1 AviRb-AdoMet 25 – 2.37 25 – 2.55 18–284 19–66, 70-96, 103-284 129 58.5 18–282 19-65, 69-94, 103-282 83 54 55.6 55.2 / 56.8 69.5 / 72.1 20.6 24.9 0.013 / 1.33 45.4 / 46.6 64.4 / 73.0 20.5 25.6 0.012 / 1.43 91.5 90.0 143 Ergebnisse und Diskussion erlaubten Bereich [%] 1 zusätzlich erlaubten Bereich [%] 1 1 8.1 0.4 8.9 1.1 Definition gemäß PROCHECK (Laskowski et al., 1993). In beiden Strukturen liegen mindestens 90% der dihedralen Hauptkettentorsionswinkel ϕ und ψ in den erlaubten Bereichen des Ramachandran-Diagramms (Abbildung 78). Lediglich zwei Reste der SeMet-Struktur bzw. sechs in der AdoMet-Struktur, welche ausschließlich in loop-Bereichen zu finden sind, liegen im zusätzlich erlaubten Bereich. Ebenso besitzen sämtliche Seitenketten-Torsionswinkel der Aminosäuren Isoleucin und Leucin, welche aufgrund ihrer Hydrophobie und der damit verbundenen Lage im Proteininnern besonders für diese Analyse geeignet sind, bevorzugte Konformationen (Abbildung nicht gezeigt). Abbildung 78 Ramachandran-Diagramm des AviRb-SeMet-Modells. Innerhalb des (ϕ, ψ)Diagramms sind die Positionen der Aminosäurereste durch Dreiecke (Glycine) und Quadrate (alle anderen Aminosäuren außer Prolin) symbolisiert. Die Schattierung des Hintergrunds markiert die energetisch unterschiedlich bevorzugten Bereiche des Diagramms (Laskowski et al., 1993). Über 90% der Hauptkettentorsionswinkel liegen in energetisch günstigen Bereichen, lediglich Ala102 und Glu95 liegen an der Grenze zu den zusätzlich erlaubten Bereichen. Analyse der B-Faktoren Die Beweglichkeit innerhalb der Packung der AviRb-Kristalle ist relativ hoch. Strukturmodelle mit hohen B-Faktoren werden in der Kristallographie immer häufiger beobachtet (Bulletin Board der ccp4-suite, 2004), da modernere Röntgenanlagen und verbesserte Computerprogramme mittlerweile auch die Vermessung von Kristallen schlechterer Ordnung erlauben. Die Wilson-B-Faktoren, welche eine Abschätzung der 144 Ergebnisse und Diskussion Beweglichkeit der Atome aus den Reflexintensitäten erlauben, liegen bei beiden AviRbDatensätzen über 50 Å2. In Einklang mit diesen Beobachtungen liegen auch die B-Faktoren der Modelle in diesem Bereich. Innerhalb des Protomers B ist die Beweglichkeit dabei höher als im Protomer A, da Protomer B eine deutlich geringere Anzahl an Kristallkontakten eingeht (vergl. Kap. 4.4.3). Die B-Faktor-Verläufe der Strukturen von Apo- und Holoenzym (Abbildung 79) zeigen einen analogen Verlauf. Allerdings erhöht sich die innere Stabilität der C-terminalen Domäne vor allem im Protomer B durch die Bindung des Kofaktors AdoMet maßgeblich. Abbildung 79 B-Faktor-Verlauf des AviRb-SeMet-Modells (oben) sowie des AviRb-AdoMetModells (unten) entlang der Hauptkette der beiden Protomere der asymmetrischen Einheit (schwarz: Protomer A, rot: Protomer B). Die Domänengrenze ist durch ein Dreieck symbolisiert. Die Balken zwischen den Diagrammen markieren die Kristallkontakte (obere Linien; orange: Dimerkontakt, schwarz bzw. rot: Kristallkontakte im Protomer A bzw. B). Darunter sind die Sekundärstrukturelemente im verfeinerten Proteinmodell gezeigt. Eine Stabilisierung durch Bindung des Kofaktors ist vor allem innerhalb der C-terminalen Domäne des Protomers B zu beobachten. Ergebnisse und Diskussion 145 4.3.14 Versuche zur Strukturlösung von Enzym-Substrat- Komplexen Um genaue Aussagen über den Mechanismus der Methylierung des 2'-O-Atoms der Base Uridin-2479 der 23S-rRNA durch AviRb treffen zu können, wurde versucht, Komplexe des Enzyms mit Kofaktor und RNA-Fragmenten zu kristallisieren (Kap. 3.4.3). Bei der Kristallisation von RNA-Protein-Komplexen stellt die Wahl des RNA-Fragmentes den kritische Faktor dar. In der Regel müssen bis zu 30 RNA-Fragmente unterschiedlicher Länge und Sequenz konstruiert und auf ihre Bindungseigenschaften getestet werden (Hoggan et al., 2003). Ziel ist es, ein möglichst kleines als Substrat erkanntes Fragment zu finden, welches dann meist unter mehreren Bedingungen kristallisiert (Garber et al., 2002). Ein solcher Ansatz war in vorliegender Arbeit aus Kostengründen nicht möglich. Kurze RNA Fragmente mit weniger als 40 Basen können aufgrund ihrer Länge gar nicht oder nur in zu geringer Ausbeute und Reinheit durch in vitro Transkription dargestellt werden, und mußten daher synthetisiert werden. Es wurde ein RNA-Fragment der Helix-89 synthetisiert (MWG Biotech), welches bei möglichst kurzer Länge eine ausreichende Zahl an Basenstapel-Wechselwirkungen zur Ausbildung der Sekundärstruktur eingehen kann (Abbildung 80). Um eine Methylierung durch AviRb zu verhindern, enthielt das RNA-Fragment anstelle der Zielbase Uridin-2479 ein 2'-desoxy-Uridin (Kap. 3.4.3). Eine Kokristallisation mit RNA und dem Inhibitor AdoHcy anstelle des Kofaktors AdoMet ist aufgrund der schlechten Löslichkeit von AdoHcy und der geringen Konzentration des RNA-Fragments nicht möglich. Abbildung 80 Zur Kristallisation verwendetes Fragment der rRNA-Helix-89 des Peptidyltransferase-loops der 23S-rRNA. Um eine Methylierungsreaktion zu verhindern, wurde anstelle der Base Uridin-2479 ein 2'-desoxy-Uridin eingeführt. Eine Bindung des verwendeten RNA-Fragmentes an AviRb konnte weder durch GPC noch durch einen Electrophoretic mobility shift assay (EMSA; Neurath et al., 1997) nachgewiesen werden. Dies könnte auf eine inkorrekte Faltung des Fragmentes oder auf die fehlende 2'-OH-Gruppe der Zielbase Uridin-2479 zurückzuführen sein. Letztere bildet im AviRb-RNA-Modell eine für die Substratbindung möglicherweise essentielle Wasserstoff- 146 Ergebnisse und Diskussion brücke zu Arg145 aus (Kap. 4.4.7). Obwohl keine Bindung des RNA-Fragmentes an AviRb nachgewiesen werden konnte, wurden Kristallisationsversuche unternommen (Kap. 3.4.3). Als Substratanaloga wurden in separaten Versuchen neben dem RNA-Fragment ein hoher Überschuß an Uridin-5'-monophosphate und ein fünf Basen umfassendes DNAOligonukleotid (UAUCG) verwendet. Im Fall von Uridin-5'-monophosphat wurde der Inhibitor AdoHcy anstelle des Kofaktors eingesetzt, um eine mögliche Reaktion zu vermeiden. Bei der Kokristallisation wurden sowohl die Bedingungen des Wildtyps als auch andere Fällungsmittel getestet. Außer bei der Verwendung der RNA-Fragmentes wurden zudem Tränkversuche (je 5- bzw. 10-facher molarer Überschuß) der Reagenzien durchgeführt (Kap. 3.4.2). Bei allen Kokristallisations-Experimenten bildeten sich nach 6-12 Wochen unter den Bedingungen des WT dem Holoenzym isomorphe Kristalle, die an der SLS, Villigen (Schweiz), bei 100K vermessen wurden. Unter keiner der anderen getesteten Bedingungen konnten Kristalle erhalten werden. Die mit Substratlösung getränkten Kristalle waren auch nach mehreren Stunden stabil und wurden ebenfalls röntgenographisch untersucht. Es wurden jeweils Datensätze bis 2.6-2.7 Å Auflösung aufgenommen. In allen Fällen war im aktiven Zentrum lediglich Differenzdichte für den Kofaktor bzw. Inhibitor, nicht aber für eines der Substratanaloga vorhanden. Durch Aktivitätstests konnte bei Verwendung verschiedener RNA-Fragmente nachgewiesen werden, daß zur Substraterkennung die Ausbildung der Sekundärstruktur der rRNA-Helix-89 notwendig ist (Bechthold, persönliche Mitteilung). Dies erklärt die fehlende Elektronendichte im Fall von Uridin-5'-monophosphat und des DNA-Oligonukleotids. Das RNA-Fragment wurde entsprechend der Voruntersuchungen in Lösung auch im Kristall nicht gebunden. Zur erfolgreichen Kristallisation eines AviRb-RNA-Komplexes müßten verschiedene andere RNA-Fragmente auf ihre Bindungseigenschaften untersucht werden. Eine unterschiedliche Fragmentlänge, sowie die Einführung eines 3'- bzw. 5' Überhanges oder einzelner gezielter Mutationen in RNA bzw. Protein könnten dabei zum Ziel führen (Hoggan et al., 2003). Zum anderen sollte die Stabilität von AviRb erhöht werden, so daß das Enzym auf höhere Konzentrationen eingestellt werden kann. Dies könnte eine Kokristallisation von aktiver RNA und dem Inhibitor AdoHcy ermöglichen. Alternativ ist die Darstellung von Aktivitätsmutanten von AviRb, die RNA binden, aber nicht umsetzen, denkbar. Diese Experimente wurden in vorliegender Arbeit aus finanziellen und zeitlichen Gründen nicht durchgeführt. Ergebnisse und Diskussion 147 4.4 Strukturbeschreibung von AviRb 4.4.1 Sekundär- und Tertiärstruktur Sekundärstruktur Analog der AviRa-Struktur wurden die Sekundärstrukturelemente der AviRbStrukturen mit Hilfe der Programme DSSP und STRIDE analysiert (Kap. 3.6.3). Die Zuordnungen für die AviRb-SeMet- und AviRb-AdoMet-Modelle waren nahezu identisch, die Sekundärstrukturelemente der Protomere A und B stimmten in beiden Fällen überein. Abbildung 81 zeigt die Analyse des Protomers A des SeMet-Modells. Die endgültige Zuordnung der Sekundärstrukturelemente erfolgte entsprechend den Vorgaben der Proteindatenbank mit DSSP. Insgesamt konnten zehn β-Stränge sowie zehn α-Helices zugeordnet werden. Zusätzlich enthält die Struktur noch drei 310-Helices, auf deren genauere Bezeichnung verzichtet wurde. 20 30 40 50 60 70 80 | | | | | | | RNARFQQWQALLGNRNKRTRAGEFLVMGVRPISLAVEHGWPVRTLLYDGQRELSKWARELLRTVRTEQIA HHHHHHHHTTT HHHHHHH SSSSS HHHHHHHHHTT SSSSSSSTT HHHHHHHHHT TSSSS HHHHHHHHH HHHHHHH SSSSS HHHHHHHHHH SSSSSSSTTT HHHHHHHHH SSSS α1 α2 β1 α3 β2 α4 β3 90 100 110 120 130 140 150 | | | | | | | MAPDLLMELGEKNEAPPEVVAVVEMPADDLDRIPVREDFLGVLFDRPTSPGNIGSIIRSADALGAHGLIV S HHHHTTTTTTTT TSSSSSS 333T TT SSSSSST T HHHHHHHHHHHHHTT SSSS S HHHHHTTTTTTT TTSSSSSS 333 TTTTSSSSSSTT HHHHHHHHHHHHHH SSSS α5 β4 β5 α6 β6 160 170 180 190 200 210 220 | | | | | | | AGHAADVYDPKSVRSSTGSLFSLPAVRVPSPGEVMDWVEARRAAGTPIVLVGTDEHGDCDVFDFDFTQPT STTTT TTTHHHHHHTTT333TT SSSSTTHHHHHHHHHHHHHHT SSSSS TT 333 TTT S STT TTTTHHHHHHHTT333 SSSS HHHHHHHHHHHHHH TTTSSSSSTTTT 333 TTT E α7 β7 α8 β8 230 240 250 260 270 280 | | | | | | LLLIGNETAGLSNAWRTLCDYTVSIPMAGSASSLNAANAATAILYEAVRQRISGRT SSSS TTT HHHHHH TSSSS TTTT HHHHHHHHHHHHHHHHTT SSSS TTT HHHHHHTTSSSS TTTT HHHHHHHHHHHHHHHHTTT β9 α9 β10 α10 Abbildung 81 Zuordnung der Sekundärstrukturelemente im AviRb-SeMet-Modell (Protomer A) mit den Programmen DSSP (2. Zeile) und STRIDE (3. Zeile). Symbolik: H = α-Helix, 3 = 310-Helix, S = β-Strang und T = turn. Die in den Bändermodellen dargestellten Sekundärstrukturelemente orientieren sich an der Zuordnung mit DSSP. 148 Ergebnisse und Diskussion Tertiärstruktur Die dreidimensionale Struktur eines AviRb-Protomers ist in Abbildung 82 gezeigt, das Topologie-Diagramm in Abbildung 83. Jedes Protomer besteht, wie bereits aufgrund von Sequenzvergleichen vermutet (Kap. 4.3.1), aus zwei Domänen. Abbildung 82 Tertiärstruktur von AviRb (Protomer A). Der Bereich des Knotens ist markiert, die 36 C-terminalen Reste sind violett eingefärbt. Der Kofaktor AdoMet ist als Stabmodell dargestellt. Abbildung 83 Topologie-Diagramm von AviRb. α-Helices sind in Form von Kreisen, β-Stränge als Dreiecke dargestellt. Die AdoMet-Bindestelle ist durch eine Ellipse gekennzeichnet. Die N-terminale Domäne (AS 1-117) besteht aus einem 4-strängigen β-Faltblatt, welches zu beiden Seiten von insgesamt fünf Helices flankiert wird, die C-terminale Domäne (AS 118-287) weist eine charakteristische SpoU-Faltung auf. Die erste Hälfte der C-terminalen Domäne ähnelt dabei dem Rossmann-fold, welcher für Nukleotid-bindende Proteine typisch ist. Der zweite Teil der Domäne beinhaltet die ungewöhnliche Knotenstruktur. Der Knoten wird dabei von den 36 C-terminalen Resten (Abbildung 82, violett eingefärbt) gebildet, welche unter dem loop zwischen β8 und β9 hindurchgefädelt Ergebnisse und Diskussion 149 sind. Eine solch ausgeprägte Knotenbildung ist sehr selten und erfordert eine spezielle Faltungsabfolge während der Proteinsynthese (Kap. 4.4.5). Der Bereich des Knotens spielt eine wichtige Rolle, da er sowohl an der Dimerisierung beteiligt ist, als auch einen Teil des aktiven Zentrums beinhaltet. Die Kontaktfläche zwischen den beiden Domänen beträgt ca. 700 Å2 und wird hauptsächlich durch hydrophobe und aromatische Seitenketten im Bereich des loops α2-β1 und α7 gebildet. Die aromatischen Reste stehen dabei vorwiegend senkrecht aufeinander und bilden CH-π-Wechselwirkungen aus. Ein solch schwacher Kontakt erlaubt eine relative Bewegung der beiden Domänen zueinander (Kap. 4.4.7). Bereits bei der Überlagerung der beiden AviRb-Protomere der asymmetrischen Einheit war eine Rotation der N-terminalen Domäne gegenüber der SpoU-Domäne von 4° beobachtet worden (vergl. Abbildung 76). 4.4.2 Quartärstruktur Sämtliche bekannte Vertreter der SpoU-MTasen liegen in Lösung als Dimer vor. Anhand von DLS und GPC konnte gezeigt werden, daß auch AviRb dimerisiert (Kap. 4.3.5). Im Kristall beinhaltet jede asymmetrische Einheit ein funktionelles C2-symmetrisches AviRb-Dimer. Die NCS-Achse liegt dabei fast parallel zur 2-zähligen kristallographischen Achse (vergl. Abbildung 86), so daß in der Eigenrotations-Funktion kein zusätzliches Maximum auftritt (Kap. 4.3.6). Dabei handelt es sich um keine strikte NCS, Abweichungen finden sich vor allem in loop-Bereichen und bezüglich der relativen Lage der N-terminalen Domänen. Die dreidimensionale Struktur des AviRb-Dimers ist in Abbildung 84 gezeigt. Abbildung 84 Stereodarstellung der Struktur des AviRb-Dimers (Blick in etwa entlang der 2zähligen NCS-Achse). Das Protomer A ist blau, B orange eingefärbt. Der Kofaktor AdoMet ist als Stabmodell dargestellt. Ungeordnete loop-Bereiche im Protomer B wurden analog Protomer A ergänzt und sind gepunktet eingezeichnet. 150 Ergebnisse und Diskussion Das Dimer-interface wird ausschließlich von der C-terminalen Domäne gebildet und beinhaltet eine Fläche von ca. 1300 Å2 pro Protomer. Tabelle 36 faßt die im Dimerkontakt vorhandenen Wechselwirkungen zusammen (Kap. 3.6.3). An der Kontaktfläche sind hauptsächlich Aminosäurereste der ersten Helix der C-terminalen Domäne (α6), der loop-Region zwischen β10 und α10 sowie der C-terminalen Helix (α10) beteiligt. Tabelle 36 Aminosäurereste A: 145-146, 148-149, 218-219, 255, 258-262, 265, 268-269, 272-273, 276, 282 B: 142, 145-146, 148149, 176, 218-219, 254255, 259-262, 265, 268269, 272-273, 276, 282283 Dimer- interface der AviRb-Protomere Polare Wechselwirkungen Protomer A ··· Protomer B Arg145-NE ··· Ser260-O Arg145-NH2 ··· Ser260-OG Ala149-O ··· Ala255-N Ala255-N ··· Ala149-O Ser259-OG ··· Ser176-OG Ser260-OG ··· Arg145-NH2 Ser260-OG ··· Arg145-NE Asn265-OD1 ··· Ser142-OG Tyr272-OH ··· Glu273-OE1 Glu273-OE1 ··· Tyr272-OH Arg282-NH2 ··· Thr283-OG1 Distanz [Å] 3.1 3.2 2.8 2.8 3.3 3.0 3.1 3.0 2.7 2.8 3.0 Die Helix α6 wechselwirkt mit dem ausgedehnten loop β10-α10 des jeweils anderen Protomers, welcher einen Teil der Knotenstruktur darstellt. Der Kern des Dimer-interface wird durch die beiden symmetrieverwandten C-terminalen Helices gebildet, die einem Winkel von ungefähr 40° einschließen. Die Aminosäurereste Tyr272, Glu273 und Arg276 bilden ein Wasserstoffbrückennetz aus, wobei zwischen den Guanidinium-Gruppen der beiden Arginine zusätzlich π-π-Wechselwirkungen auftreten (Abbildung 85). Die konservierte Aminosäure Ala269 ermöglicht eine optimale Annäherung der beiden Helices. Abbildung 85 Wasserstoffbrückennetz der konservierten Reste Tyr272, Glu273 und Arg276 im Dimerkontakt der C-terminalen Helices. Das Protomer A ist hellblau, B orange eingefärbt. Ala269 ermöglicht eine optimale Annäherung der beiden Helices. Ergebnisse und Diskussion 4.4.3 151 Kristallpackung Die Elementarzelle der Raumgruppe P41212 enthält acht asymmetrische Einheiten (z.B.: 0 ≤ x ≤ 1; 0 ≤ y ≤ 1; 0 ≤ z ≤ 1/8). Neben der 4-zähligen Schraubenachse entlang der z-Achse treten eine zweizählige Schraubenachse parallel zur x- bzw. y-Achse in unterschiedlicher Höhe (1/8 bzw. 3/8) sowie eine 2-zählige Rotationsachse entlang der Diagonalen der x-y-Ebene auf (Abbildung 86). Abbildung 86 Kristallpackung von AviRb. Links: beide Protomere, rechts: Protomer A. Die Protomere A sind blau, B orange eingefärbt. Je ein Protomer ist farblich hervorgehoben. Oben: Blick entlang der z-Achse. Unten: Blick entlang der x-Achse. Kristallographische Achsen sowie die 2-zählige NCS-Achse sind eingezeichnet. 152 Ergebnisse und Diskussion Innerhalb des Kristallgitters bildet das Protomer A ein eigenständiges, dreidimensional verknüpftes Gitter aus (Abbildung 86, rechts). Dabei stehen sowohl die Nterminale als auch die C-terminale Domäne mit mindestens drei symmetrieverwandten Molekülen in Kontakt. Die Kontaktfläche (Kap. 3.6.3) der Protomere A untereinander beträgt mit 1514 Å2 pro Protomer 12% der Proteinoberfläche (12'872 Å2). Protomer B bildet dagegen wesentlich weniger Kristallkontakte aus (Tabelle 37). Neben dem Dimerkontakt (Kap. 4.4.2) bestehen im Bereich der Helix α4 und des C-Terminus Kristallkontakte zum Protomer A mit einer Gesamtfläche von 880 Å2. Innerhalb der Protomere B besteht lediglich ein schwacher Kontakt (307 Å2) zwischen N-Terminus und loop β4-β5 zweier durch eine 21-Schraubenachse verknüpfter Moleküle. Die so ausgebildeten zickzackförmiger Ketten sind untereinander nicht verbrückt. Tabelle 37 Protomer Kristallkontakte der AviRb-Protomere 2 Fläche [Å ] Aminosäurereste Polare Wechselwirkungen Distanz [Å] A-A 1514 31,33-34,3738,60, 67-68,7576, 79,82-83, 160, 212-217, 235, 257-258, 282 Asn31-ND2 Asn33-OD1 Lys34-NZ Thr36-O Arg37-NH1 Arg37-NH2 Arg60-NH2 Arg68-N Arg75-NH2 Glu76-OE1 Arg79-NH1 Arg79-NH2 His160-ND1 ··· ··· ··· ··· ··· ··· ··· ··· ··· ··· ··· ··· ··· Asp215-O Gly214-O Asp215-OD2 Arg82-NE His213-O Asp215-OD2 Arg82-O Arg282-NH1 Thr235-O Arg47-NE Glu212-OE2 Ser257-O Asp217-OD2 3.1 3.3 3.2 3.0 3.2 3.1 3.0 3.3 3.0 3.2 3.0 2.8 3.1 A-B 880 A: 47, 76, 123, 133, 193, 220, 236, 245 Arg47-NE Arg47-NE Arg47-NH2 Glu76-OE1 Arg133-NE Arg133-NH2 Arg133-NH2 Asp193-OD1 ··· ··· ··· ··· ··· ··· ··· ··· Arg79-NH2 Glu76-OE2 Arg79-NH2 Arg47-NE Ser280-O Ser280-O Arg282-NE Arg123-NH1 3.0 3.3 3.1 3.2 2.8 3.0 3.0 3.4 Asn19-OD1 Asn19-N Asn19N ··· Asp116-OD1 ··· Asp116-OD2 ··· Asp118-OD2 3.2 3.1 3.3 B: 47, 76, 79, 280, 282 B-B 307 19, 116, 118 Insgesamt sind 19% der Oberfläche des Protomers A und lediglich 9% des Protomers B an einem Kristallkontakt beteiligt. Die deutlich geringere Zahl an Wechselwirkungen des Protomers B erklärt seine höhere Flexibilität (Kap. 4.3.13). Ergebnisse und Diskussion 4.4.4 153 Strukturvergleich Ein Vergleich mit der Proteindatenbank (Kap. 3.6.4) ergab, daß die beiden Domänen von AviRb strukturell und funktionell von unterschiedlichen Vorläufern abstammen. Die N-terminale Domäne gleicht zwei ribosomalen Proteinen, die C-terminale Domäne ist mit der AdoMet-Bindungsdomäne der SPOUT-Klasse eng verwandt. N-terminale Domäne von AviRb Die beiden ribosomalen Proteine L7Ae aus H. marimortui (Ban et al., 2000; Z-score 6.9, 80 Cα Reste überlagert, 10.5% Sequenzidentität) sowie L30 aus S. cerevisiae (Mao et al., 1999; Z-score 6.5, 81 Cα Reste überlagert, 15.5% Sequenzidentität) zeigen trotz geringer Sequenzidentität strukturelle Ähnlichkeiten mit der N-terminalen Domäne von AviRb. Die strukturbasierte Überlagerung von AviRb und L30 ist in Abbildung 88 gezeigt. Ebenso wie die beiden ribosomalen Proteine besitzt die N-terminale Domäne von AviRb mit 10.3 einen sehr hohen pI (Kap. 4.3.1). Dies unterstützt die Hypothese, daß diese Domäne eine Rolle bei der generellen Substraterkennung spielt und AviRb an die gewünschte Stelle am Ribosom dirigiert. Aufgrund der Ähnlichkeit der Substratbinderegionen von L7Ae und L30, liegt die Vermutung nahe, daß auch AviRb mit der entsprechenden Oberflächenregion an die RNA bindet. Dieser Bereich befindet sich gegenüber der AdoMet-Bindestelle des jeweils anderen Monomers. Die rRNA-Helix-89 des Peptidyltransferase-loops könnte demnach in der breiten Spalte zwischen den beiden Untereinheiten gebunden werden (Kap. 4.4.7). Diese Spalte kann dabei durch eine gewisse Rotation der N-terminalen Domäne (Kap. 4.3.11) zur Bindung der RNA geöffnet oder geschlossen werden. Einteilung der SPOUT-MTasen Innerhalb der letzten zwei Jahren konnten 13 Vertreter der SPOUT-Klasse strukturell charakterisiert werden (Kap. 1.2). Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Einteilung der einzelnen Strukturmodelle inklusive AviRb in die Unterklassen SpoU bzw. TrmD durchgeführt. Ausschlaggebend für die Einteilung war dabei das Fehlen des dritten β-Stranges des zentralen β-Faltblattes in der TrmD-Domäne im Vergleich mit der SpoUDomäne (vergl. Kap. 1.2). Unter den 13 SPOUT-MTasen befinden sich demnach acht SpoUMTasen sowie fünf TrmD-MTasen. Eine weitere Unterteilung erfolgte anhand zusätzlicher Strukturelemente unter Berücksichtigung von Funktion und Sequenzkonservierung. Die einzelnen TrmD- und SpoU-MTasen unterscheiden sich abhängig von ihrem jeweiligen 154 Ergebnisse und Diskussion Methylierungsziel vor allem durch ihre Substraterkennungsdomäne, so daß eine diesbezügliche Einteilung sinnvoll erscheint (Abbildung 87). Einige SPOUT-MTasen besitzen ebenso wie AviRb zusätzliche Domänen zur Substraterkennung. Die rRNA-SpoU MTasen Rrma (Nureki et al., 2002) und RlmB (Michel et al., 2002) haben ebenfalls L30-Typ Domänen. Bei der strukturbasierten Überlagerung dieser Proteine (Kap. 3.6.4) läßt sich eine Rotation der L30-Domänen um 20° bzw. 26° gegenüber AviRb beobachten. Der Rotationsgrad dient vermutlich der Anpassung an das jeweilige Methylierungsziel. RlmB und RrmA bilden zusammen mit AviRb die L30Unterklasse. Drei weitere, potentielle RNA-MTasen der SpoU-Familie (Mt001 (Zarembinski et al., 2003), YggJ (Forouha et al., 2003) und Yqeu (PDB-code 1vhk, ohne Zitat)), deren genaue Methylierungsposition noch nicht ermittelt wurde, besitzen eine Substraterkennungsdomäne, welche strukturell dem ribosomalen Protein L5 gleicht und eher eine β-barrel-ähnliche Faltung aufweist (L5-Unterklasse). Im Fall von YggJ und Yqeu ist die L5-Typ Domäne N-terminal, im Fall von Mt001 als Insertionsdomäne zu finden. Die beiden tRNA-SpoU-MTasen TrmH (Nureki et al., 2004) und YibK (Lim et al., 2003) dagegen weisen keine zusätzliche Substraterkennungsdomäne auf. Im Fall von TrmH ist lediglich eine einzelne, stark positiv geladene N-terminale α-Helix vorhanden, bei YibK fehlt ein solches Element vollständig (single-Domänen-Unterklasse). Innerhalb der TrmD-Familie sind Ybea (PDB-code 1ns5, ohne Zitat) und Tm0844 (PDB-code: 1o6d, ohne Zitat) Ein-Domänen Proteine, die Strukturmodelle der tRNAMTasen TrmD aus H. influenzae (Ahn et al. 2003), E. coli (Elkins et al., 2003) und A. aeolicus (Liu et al., 2003) besitzen eine C-terminale, α-helikale Domäne, welche eine hohe Ähnlichkeit mit dem Trp-Repressor aufweist. Abbildung 87 Übersicht über die bislang strukturell bekannten Vertreter der SPOUT-Klasse (Stand: Oktober 2004). In Klammern ist die Zahl der Mitglieder der jeweiligen Familie und Unterklasse bzw. der PDB-code der einzelnen MTasen angegeben. 155 Ergebnisse und Diskussion C-terminale Domäne von AviRb Die C-terminale Domäne von AviRb ist charakteristisch für die SpoU-Familie. Die katalytischen Domänen der einzelnen SpoU-MTasen unterscheiden sich dabei trotz gleicher Topologie geringfügig voneinander. Durch eine strukturbasierte Überlagerung mit LSQMAN (Kap. 3.6.4) sollte überprüft werden, ob die Einteilung der SpoU-MTasen in Unterfamilien anhand der Substraterkennungsdomäne mit der Verwandtschaft ihrer katalytischen Domäne korrespondiert. Hierzu wurden die Zahl der überlagerten Reste sowie der Sequenzidentität innerhalb des überlagerten Bereiches bestimmt (Tabelle 38). Tabelle 38 AviRb Rrma RlmB TrmH YibK YggJ Yqeu 1 Überlagerung der einzelnen SpoU-MTasen mit LSQMAN 1 Rrma RlmB TrmH YibK Yggj Yqeu Mt001 140 36.1 139 37.4 135 31.8 129 24.0 97 11.3 94 21.0 98 17.3 145 28.3 137 33.6 116 27.6 101 8.9 106 16.0 86 16.3 134 35.8 121 23.0 103 10.6 95 17.8 95 17.9 118 26.3 103 13.6 110 12.7 99 18.2 98 10.2 101 10.9 93 12.9 122 35.0 108 13.9 87 10.8 Angegeben ist die Zahl der in der SpoU-Domäne überlagerten Reste (oben) sowie der Prozentsatz der darunter enthaltenen identischen Reste (unten). Die drei 23S-rRNA-MTasen der L30-Unterklasse besitzen bei ca. 140 überlagerten Resten eine Sequenzidentität von 28-37% innerhalb des überlagerten Bereiches und sind demnach mit Ausnahme von TrmH untereinander ähnlicher als zu den anderen Unterklassen der SpoU-Familie. Ihre strukturbasierte Überlagerung ist in Abbildung 88 gezeigt. Zum Vergleich wurde je ein Vertreter der anderen Unterklassen ebenfalls überlagert. Abbildung 88 Strukturbasierte Überlagerung von AviRb mit den ribosomalen Proteinen L30,und L7Ae, den rRNA-MTasen Rrma und RlmB der L30-Unterklasse sowie je eines Vertreters der anderen SPOUT-Unterklassen. Die Überlagerung erfolgte mit LSQMAN, strukturell überlagerte Bereiche sind unterstrichen, konservierte Aminosäurereste farblich markiert. Kleinbuchstaben stehen für ungeordnete Bereiche. Die von Gustafsson et al. (1996) definierten Sequenzmotive I-III sowie das im Rahmen dieser Arbeit neu definierte Motiv IV sind eingezeichnet. Das Symbol #x steht für x ausgelassene Reste. Als Referenz ist die Sekundärstruktur von AviRb gegeben, jeder 10. Rest von AviRb ist durch einen Punkt markiert. 156 Ergebnisse und Diskussion 157 Ergebnisse und Diskussion Die beiden tRNA-SpoU-MTasen YibK und TrmH, welche keine Substraterkennungsdomäne aufweisen, sind deutlich näher mit der L30-Unterklasse als mit der L5-Unterklasse verwandt. Dies zeigt sich in einer höheren Anzahl an überlagerten Resten innerhalb der SpoU-Domänen dieser beiden Familien, welche zudem eine signifikante Sequenzidentität aufweisen (Tabelle 38, Rahmen gepunktet). Beim Vergleich dieser MTasen mit der L5-Unterklasse konnten wesentlich weniger Reste überlagert werden, die Sequenzidentität liegt deutlich unter 20% (Tabelle 38, Rahmen gestrichelt). Eine weitere Aufspaltung der L5-Unterklasse sowie der single-Domänen-Unterklasse wäre anhand der Überlagerung möglich, ist aber aufgrund der geringen Anzahl der bislang strukturell bekannten Vertreter nicht sinnvoll. Die Verwandtschaftsgrade konnten bei einer detaillierteren Sequenzanalyse bestätigt werden. Sowohl die L30-Typ MTasen als auch YibK und TrmH (single-Domänen-SpoUMTasen) weisen die drei bereits bekannten Sequenzmotive für Kofaktorbindung und Katalyse auf (Kap. 1.2, Gustafsson et al., 1996). Zusätzlich findet sich ein viertes Motiv im Bereich der C-terminalen Dimerisierungshelix (Abbildung 89). Es ist nicht nur in den bekannten Strukturen sondern darüber hinaus in mehr als 150 potentiellen bzw. nachweislichen SpoU-MTasen vorhanden. Im Rahmen der Analysen von Gustafsson et al. (1996) konnte dieses vierte Sequenzmotiv nicht erkannt werden, da die untersuchten Sequenzen durch ein Abschneiden des C-Terminus auf eine einheitliche Länge gebracht worden waren, wobei dieser Bereich verloren ging. L/h F/Y EhhRQR Motiv IV: Abbildung 89 Sequenzmotiv im Bereich der C-terminalen Helix. h steht für eine hydrophobe AS. Hervorgehobene Aminosäurereste sind stärker konserviert und kamen in mindestens 95% der untersuchten Sequenzen vor, alle anderen Reste in mindestens 80% der Fälle. Innerhalb der weniger eng mit AviRb verwandten L5-Unterklasse der SpoU-MTasen und den TrmD-MTasen sind diese vier Sequenzmotive nicht vorhanden (vergl. Abbildung 88). Abbildung 90 veranschaulicht die Konservierung der an der Proteinoberfläche gelegenen Reste unter Berücksichtigung der beiden SpoU-Unterklassen, welche die Sequenzmotive aufweisen. Die Sequenzen der einzelnen MTasen wurden hierzu mit AviRb überlagert (Kap. 3.6.4) und anschließend die AviRb-Oberfläche nach Konservierungsgrad eingefärbt. Die konservierten Aminosäuren befinden erwartungsgemäß vor allem im Bereich des aktiven Zentrums und des Dimerkontaktes. sich 158 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 90 Konservierung von Aminosäuren an der Proteinoberfläche innerhalb der SpoUUnterklassen, welche keine bzw. eine L30-Domäne zur Substraterkennung aufweisen. Protomer A ist als Oberflächenmodell (Sanner et al., 1996), Protomer B als Drahtmodell dargestellt. Das aktive Zentrum und die Position des neu definierten, vierten Sequenzmotivs sind markiert. Der Grad der Konservierung (gemäß dem Q-Wert in CLUSTALW) ist im Protomer A farblich von weiß (nicht Ergebnisse und Diskussion 159 konservierte Bereiche) nach dunkelrot (hoch konservierte Bereiche) markiert. Hoch konservierte Bereiche finden sich vor allem im Bereich des aktiven Zentrums und des Dimerkontaktes. 4.4.5 Proteinfaltung Allgemeiner Faltungsprozeß Die Faltung von Polypeptiden zu Proteinen stellt ein komplexes, noch wenig verstandenes Problem dar. Da die Permutation aller möglichen Konformationen des ungefalteten Zustandes bei einem 30 kDa Protein weit länger als das Erdzeitalter dauern würde, muß ein Faltungsweg vorliegen (Levinthal, 1968). Zur Erklärung der hohen Faltungsgeschwindigkeit von weniger als einer Sekunde wurden mehrere Modelle entwickelt (Nolting, 2000; Daggett & Fersht, 2003; Abbildung 91). Abbildung 91 Gegenüberstellung der drei gängigen Modelle zur Proteinfaltung. Im FrameworkModell bilden sich zunächst die Sekundärstrukturelemente aus, das zweite Modell basiert auf dem initialen Kollaps hydrophober Bereiche während das Nukleation-Kondensations-Modell beide Modelle vereint. Sekundärstrukturelemente werden hier durch die Ausbildung der Tertiärstruktur in hydrophoben Nuklei stabilisiert. Im Framework-Modell bilden sich zunächst die Sekundärstrukturelemente unabhängig von ihrer Tertiärstruktur aus und lagern sich dann durch Diffusion und Kollision zur dreidimensionalen Struktur zusammen. Das zweite Modell geht davon aus, daß zunächst ein einheitlicher Kollaps des Proteinmoleküls aufgrund des hydrophoben Effektes stattfindet, bevor es zur Ausbildung von Sekundärstrukturelementen kommt. Diese beiden, älteren Modelle setzen das Vorhandensein von Faltungszwischenstufen voraus. Allerdings konnte nachgewiesen werden, daß einige Proteine ohne Zwischenstufe in einem sogenannten "two-state" Faltungsprozeß assemblieren. Diese Beobachtung ist mit dem momentan favorisierten Nukleation-Kondensation-Modell vereinbar (Fersht, 1997). Zunächst kommt es zur Zusammenlagerung einiger, meist hydrophober oder aromatischer Reste, welche bereits 160 Ergebnisse und Diskussion teilweise ausgebildete, jedoch noch instabile Sekundärstrukturelemente wie β-hairpins oder α-Helices aufweisen (Dosztanyi et al., 1997). Diese Reste sind meist innerhalb einer Proteinfamilie konserviert (Shakhnovich et al., 1996). Im so gebildeten Nukleus werden die Sekundärstrukturelemente unter Ausbildung der Tertiärstruktur stabilisiert. Bei starken Wechselwirkungen kann in manchen Proteinen ein Übergangszustand beobachtet werden. Es wird angenommen, daß die einzelnen Domänen von Multidomänen-Proteinen unabhängig voneinander falten und sich anschließend zusammenlagern. Experimentell können Faltungsprozesse bei kleinen Proteinen durch die Untersuchung der Entfaltung, durch Messungen des zirkularen Dichroismus (CD), NMR und Molekulardynamik-Rechnungen analysiert werden. Modell zur Knotenfaltung in AviRb Knoten wie bei AviRb werden in Proteinstrukturen äußerst selten beobachtet und erfordern eine besondere Faltungssequenz, da ein einfaches Durchfädeln einer 36 Aminosäuren langen α-Helix durch einen 12 AS langen loop entropisch extrem ungünstig ist (Schulz & Schirmer 1979; Taylor, 2000). Bisher wurde noch kein Mechanismus vorgeschlagen, welcher die Faltung des Knotens in den SPOUT-MTasen erklärt. Zur Untersuchung der Knotenbildung bei AviRb wurde lediglich die C-terminale Domäne betrachtet, da sich einzelne Domänen gemäß des Nukleation-Kondensation-Modells unabhängig voneinander falten. Zunächst wurde untersucht, welche Teile des Peptids am wahrscheinlichsten stabile Sekundärstrukturelemente ausbilden. Die Wahrscheinlichkeit, daß ein Sekundärstrukturelement sehr früh gebildet wird, ist um so größer, je deutlicher seine Strukturvorhersage ist (Schulz et al., 1974). Daher wurden Sekundärstrukturvorhersagen der Aminosäuresequenzen sämtlicher SPOUT-Domänen durchgeführt. Die strukturbasierte Überlagerung der relevanten Bereiche ist in Anhang 6.6 gezeigt. In der ersten Hälfte der SPOUT-Domäne wurden vor allem β5 und α6 korrekt vorhergesagt. Im Bereich der Knotenstruktur scheint sich die C-terminale Helix sehr früh zu formen, gefolgt von β9. Diese Sekundärstrukturelemente wurden in fast allen Sequenzen mit einem hohen Wahrscheinlichkeitswert vorhergesagt. Zudem wurde in der Kristallstruktur nach hydrophoben Bereichen gesucht, welche als Nuklei bei der Proteinfaltung dienen könnten. Dabei wurde vor allem die Knotenregion untersucht. In den Kristallstrukturen der SPOUT-MTasen konnten zwei ausgedehnte hydrophobe Bereiche innerhalb der Knotenregion mit einer Kontaktfläche von 400 Å2 (Kontakt 1) bzw. 460 Å2 (Kontakt 2) identifiziert werden (Tabelle 39, Abbildung 92). Die 161 Ergebnisse und Diskussion beiden Bereiche werden durch einen kleineren, hydrophoben Kontakt (3) verbrückt (Abbildung 93 (5)). Tabelle 39 Analyse der verschiedenen Kontaktregionen in AviRb maßgeblich Fläche [Å2] gesamt / hydrophob beteiligte Reste L127, V129, L229, 490 / 400 L231, A267, L271 V208, V218, F221, 560 / 360 V250, I252 # Charakterisierung der Kontaktregion 1 α10 - β9, β5, α6 2 β8, β10 - loop β8-β9 3 α10 - loop β8-β9 140 / 110 4 β9 - β5 (6 H-Brücken) 325 / 230 5 β9 - β8 (5 H-Brücken) 200 / 150 F223, I270 farbliche Darstellung violett rot grün Kontakt 1 (violett dargestellt) besteht dabei zwischen der C-terminalen Helix α10 und den β-Strängen β9 bzw. β5 sowie der Helix α6, welche gemeinsam eine Furche zur Bindung der C-terminalen Helix formen. Die hydrophobe Oberfläche der Furche beträgt in AviRb ca. 490 Å2. Ein zweiter hydrophober Bereich (rot) befindet sich zwischen den β-Strängen β8 und β10 sowie dem loop β8-β9. Die beiden Kontaktflächen werden durch einen zusätzlichen, kleineren hydrophoben Bereich (110 Å2) von α10 mit Aminosäuren des loops β8-β9 (Kontakt 3, grün) verstärkt. Diese hydrophoben Bereiche sind in allen SPOUT-MTasen konserviert, was aus der strukturbasierten Überlagerung aller SPOUT-MTasen ersichtlich wird (Abbildung 92). Neben dem zentralen Kontakt 1 (violett) sind auch die hydrophobe Bereiche der Kontakte 2 (rot) und 3 (grün) in allen SPOUT-MTasen vorhanden. Allerdings ist der loop β8-β9 in der Klasse der SPOUT MTasen von unterschiedlicher Länge, einige MTasen besitzen in diesem Bereich sogar eine zusätzliche α-Helix. Die an den jeweiligen Kontakten beteiligten Aminosäuren sind in Abbildung 92 markiert. Abbildung 92 Strukturbasierte Überlagerung der SPOUT-MTasen mit AviRb im Bereich der zweiten Hälfte der C-terminalen Domäne. Überlagerte Bereiche sind unterstrichen. Die einzelnen an den hydrophoben Kontakten beteiligten Aminosäuren sind koloriert. Kontakt 1: violett, Kontakt 2: 162 Ergebnisse und Diskussion rot, Kontakt 3: grün. Legende: (a) AviRb; (b) Rrma; (c) Rlmb; (d) TrmH; (e) YibK; (f) Yqeu; (g) YggJ; (h) Mt001; (i) TrmD; (j) Ybea; (k) Tm0884. Neben den hydrophoben Clustern, welche als Faltungsnuklei dienen können, lassen sich aus den Strukturen der SPOUT-MTasen weitere Informationen für einen möglichen Faltungsmechanismus gewinnen. Normalerweise weisen alle β-Stränge eines β-Faltblattes eine typische Verdrillung (twist) auf und sind gegenüber ihren Nachbarn um einen Winkel von 10-30° verdreht. Innerhalb der Klasse der SPOUT-MTasen ist diese Verdrillung zwischen β8 und β10 besonders stark ausgeprägt. Der Winkel ist mit 30° doppelt so groß wie im restlichen Faltblatt. Diese Neigung von β10 bevorzugt das Kreuzen des loops β8-β9 über den loop α10-β10, welches in der Bildung des hydrophoben Kontaktes 2 (rot) resultiert. Zusätzlich wird durch die Verdrillung sowie durch ein konserviertes Prolin am Ende von β10 die C-terminale Helix in eine Position unterhalb des β-Strang-Paares β8-β10 gebracht (Abbildung 93, (1)-(2)). Unter Berücksichtigung dieser Beobachtungen konnte ein Faltungsmodell für den Knotenbereich in AviRb entwickelt werden (Abbildung 93). Der Faltungsprozeß der Knotenregion wurde dabei in mehrere Schritte eingeteilt, wobei die einzelnen Stufen keine stabilen Übergangszustände darstellen sollen. Das Modell erfordert zudem kein striktes Aufeinanderfolgen der einzelnen Schritte. Es wird dagegen angenommen, daß es sich zumindest partiell um einen kooperativen Prozeß handelt. Als zentraler Nukleus für die Faltung dient Kontakt 1 (violett), da er lediglich Strukturelemente beinhaltet, welche in den Vorhersagen mit sehr hohen Zuversichtswerten korrekt vorausgesagt wurden. In einem ersten Schritt (Abbildung 93 (1)→ (2)) erfolgt die Bildung der Furche zur Bindung der C-terminalen Helix α10 durch die Zusammenlagerung von β9 mit β5 und α6. Eine Anlagerung von β9 an β5 ist dabei aufgrund der größeren hydrophoben Interaktion zwischen den beiden Strängen wahrscheinlicher als an β8 (Tabelle 39). Eine Zusammenlagerung von β9 mit β5 würde zudem zwingend das Durchschleusen der C-terminalen Helix durch den zu kleinen loop β8-β9 erforden, was aus entropischen Gründen bereits ausgeschlossen wurde. Ohne die Anlagerung von β8 an das zentrale Faltblatt ist der loop fast doppelt so groß, so daß statt eines Durchfädelns ein Durchklappen ermöglicht ist. Die Faltung des restlichen Teils der ersten Hälfte der SPOUT-Domäne hat keinen Einfluß auf die korrekte Knotenbildung und wurde daher nicht weiter berücksichtigt. Die vollständige Ausbildung des Nukleus (Kontakt 1, violett) erfolgt nun durch die Anlagerung der C-terminalen Helix, welche bereits durch den Kontakt 3 (grün) in der richtigen Orientierung und Position vorfixiert wurde (Abbildung 93 (3a)). Dadurch muß die Ergebnisse und Diskussion 163 Helix durch den noch ungeordnet vorliegenden, weiten loop zwischen α8 und β9 klappen. Anschließend kann sich der hydrophobe Kontakt 2 (rot) durch die Anlagerung der β-Stränge β8 und β10 ausbilden (Abbildung 93 (4)), was ohne die Knotenbildung nicht möglich wäre. Eine Anlagerung der Helix α10 in die Bindungsfurche ohne Ausbildung des Knoten (Abbildung 93 (3b)) ist demnach aufgrund der Vororientierung durch die Verdrillung, der Fixierung durch Kontakt 3 und der fehlenden Stabilisierungsenergie durch die Bildung von Kontakt 2 unwahrscheinlich. Durch ein Umklappen der beiden noch nicht am zentralen β-Faltblatt fixierten β-Stränge β8 und β10 kann nun die native Struktur komplettiert werden. Abbildung 93 Schematische Darstellung des vorgeschlagenen Faltungsmechanismus der Knotenregion in AviRb. Die hydrophoben Regionen sind als Ellipsen dargestellt und farblich wie in Abbildung 92 markiert. Zur Übersicht wurden die einzelnen Sekundärstrukturelemente auch vor der Faltung als Pfeile (β-Stränge) sowie Zylinder (α-Helices) dargestellt, selbst wenn ihre Ausbildung gemäß des Nukleation-Kondensation-Modells erst konzertiert mit der Formation der Tertiärstruktur erfolgt. Die Knotenregion ist durch einen Stern (() markiert. Zur Verifizierung dieses Mechanismus müßten durch Einführung von Mutationen, durch CD-Messungen während der Entfaltung oder durch NMR-Messungen experimentelle Daten gesammelt werden. Aufgrund der hohen Instabilität von AviRb in Lösung dürfte dies allerdings mit einigen Schwierigkeiten verbunden sein. Eine Analyse der Entfaltung durch molekulardynamische Rechnungen ist aufgrund der Proteingröße momentan nicht möglich. 4.4.6 Kofaktorbindung Die Struktur von AviRb wurde mit und ohne Kofaktor bei vergleichbarer Auflösung und Modellqualität bestimmt (Kap. 4.3.12). Durch die Bindung des Kofaktors werden nur geringe konformelle Änderungen induziert. Eine maximale Abweichung von 2.6 Å konnte bei Glu212 im loop β8-β9 festgestellt werden (Kap. 4.3.13). Durch eine Annäherung dieses 164 Ergebnisse und Diskussion loops an das aktive Zentrum wird die Bindung zum Kofaktor verstärkt. Weitere Konformationsänderungen wie eine Bewegung des loops β10-α10, die bei der SpoU-MTase YibK beobachtet worden war (Lim et al., 2003), traten bei AviRb nicht auf. Eine Überlagerung der C-terminalen Domänen von Apo- und Holoenzym ließ weder eine Veränderung im Dimerkontakt noch in der Lage der N-terminalen Domänen erkennen (Kap. 4.3.12). Dies deutet darauf hin, daß die Orientierung der N-terminalen Domänen nicht durch die AdoMet-Bindung beeinflußt wird. Beide Untereinheiten scheinen unabhängig voneinander zu funktionieren. AdoMet nimmt im aktiven Zentrum eine geknickte Konformation ein, in welcher der Methionin-Teil des Kofaktors relativ nah am Adenin-Teil zu liegen kommt. Der Ribosering befindet sich in einer 3'-endo-Konformation. In klassischen MTasen wie AviRa erfolgt dagegen die AdoMet-Bindung bei einer 2'-endo-Stellung der Ribose in einer elongierten Konformation (Abbildung 94). In beiden Fällen liegt eine S-Konfiguration am Schwefel vor. Abbildung 94 Überlagerung von AdoMet in AviRa (grau) und AviRb (türkis). In AviRa befindet sich die Ribose in einer 2'-endo Konformation, so daß der Kofaktor elongiert vorliegt. In AviRb dagegen nimmt der Kofaktor bei einer 3'-endo Stellung der Ribose eine geknickte Konformation ein. Die Wechselwirkungen zwischen Kofaktor und Protein bestehen in der AviRbAdoMet-Struktur hauptsächlich zwischen dem Adenosin-Teil des Kofaktors und dem Peptidrückgrat. Beteiligt sind dabei vor allem Aminosäuren der Sequenzmotive I und III. Der Methionin-Teil dagegen wird nur sehr schwach gebunden, so daß er in der Struktur relativ flexibel ist. Sichere Dichte der (Fo-Fc)-Dichtekarten ist daher bei einem σ-Niveau von 3σ nur bis zum Schwefel vorhanden, der Methionin-Teil des Kofaktors ist jedoch bei einem niedrigeren σ-Niveau definiert (Abbildung 95). Der loop β9-α9, welcher durch die Wasserstoffbrücken zwischen Glu234 und dem Rückgrat von Thr135 stabilisiert wird, zwingt dabei AdoMet in seine abgeknickte Position, indem er eine Plattform für den Methionin-Teil bildet. Ergebnisse und Diskussion 165 Abbildung 95 Stereodarstellung der AdoMet-Bindung in AviRb im Bereich des Knotens (oben rechts). Aminosäurereste, welche mit AdoMet wechselwirken, sind als Stabmodell dargestellt. Die (Fo-Fc)-Elektronendichte ist bei einem Dichteniveau von 3 σ (grün) und 1.5 σ (rot) dargestellt. Die zu transferierende Methylgruppe zeigt in Richtung der breiten Bindungsspalte, welche wahrscheinlich für die Bindung der rRNA-Helix-89 verantwortlich ist (Kap. 4.4.4, Kap. 4.4.7). In diesem Bereich befinden sich die konservierten Reste Asn139, Glu234 und Asn262 von der selben Untereinheit sowie Arg145' von der anderen Untereinheit, welche für die Katalyse wichtig zu sein scheinen. 166 Ergebnisse und Diskussion 4.4.7 rRNA-Bindung und Katalyse Katalytische Effizienz von AviRb-Mutanten Zur Überprüfung der funktionellen Relevanz einiger konservierter Aminosäurereste in der potentiellen RNA-Bindungsspalte wurden sieben Aktivitätsmutanten generiert (Tabelle 40, Anhang 6.4). Keine der eingefügten Mutationen hatte einen Einfluß auf Expression, Reinigung oder Dimerisierung von AviRb. Anhand von Aktivitätsmessungen (Kap. 3.3.5) konnte gezeigt werden, daß Asn139, Arg145 sowie Asn262 eine entscheidende Rolle bei der Katalyse spielen, da die entsprechenden Alanin-Mutanten im Rahmen der Genauigkeit des Aktivitätstests keine Aktivität aufwiesen. Die Mutation von Glu234 zu Alanin reduzierte die Aktivität auf ein fünftel, was auf eine Teilnahme dieser Aminosäure bei der Methylierung hinweist. Da eine Mutation zu Glutamin die Aktivität allerdings lediglich auf 70% reduziert, dürfte Glu234 nicht als Base an der Reaktion teilnehmen. Tabelle 40 1 Aktivität der AviRb-Mutanten 1 Mutante Aktivität [%] WT T135V N139A R145A E234A E234Q N262A N262Q 100 110 ± 20 <5 <5 20 ± 10 70 ± 20 <5 60 ± 10 Der Grenzwert des Aktivitätstests liegt bei einer minimalen Aktivität von 5% des WT. Der durchgeführte Aktivitätstest (Kap. 3.3.5) ermöglicht eine relative Bestimmung der Aktivität, die Messung kinetischer Konstanten wie KM oder kcat ist nicht möglich. Daher konnte nicht differenziert werden, welche Aminosäuren an Substratbindung oder Katalyse beteiligt sind. Ein alternativer Aktivitätstest beruht auf der Umsetzung des Produktes AdoHcy und Nachweis der Spaltprodukte. Zunächst wird dabei die Bindung zwischen Adenin und Ribose durch die AdoHcy-Nukleosidase gespalten. Das entstehende S-Ribosylhomocystein wird dann durch LuxS in Ribose und Homocystein hydrolysiert, so daß ein Nachweis der entstandenen SH-Gruppe durch Ellmans Reagenz möglich ist (Hendricks et al., 2004). Dieser Test ermöglicht eine Bestimmung der kinetischen Parameter, ist allerdings bei rRNA-MTasen nicht anwendbar, da die notwendigen Ergebnisse und Diskussion 167 Substratmengen im millimolaren Bereich liegen. Die RNA-Synthese durch in vitro Transkription liefert dagegen maximal µ-molare Mengen an RNA. Modell eines AviRb-RNA-Komplexes und mechanistische Implikationen AviRb methyliert das 2'-O-Atom der Ribose von Uridin-2479 innerhalb der Helix-89 im Peptidyltransferase-loop der 23S-rRNA (Kap. 1.3). Es konnte gezeigt werden, daß AviRb kleine RNA-Fragmente erkennt, solange die Tertiärstruktur der rRNA-Helix-89 ausgebildet werden kann (Treede et al., 2003). Das vollständig assemblierte Ribosom kann dagegen nicht methyliert werden. Bei Einhaltung der für einen SN2-Transfer notwendigen Stereokonfiguration käme es zu erheblichen sterischen Hinderungen zwischen AviRb und der rRNA sowie den ribosomalen Proteinen L11 und L6 (Abbildung 96). Abbildung 96 Potentielles Andocken von AviRb am vollständig assemblierten Ribosom (Standardorientierung). Die Ribosomoberfläche ist in grau, Helix-89 in dunkelgrau, Uridin-2479 in rot, Proteine in gelb und AviRb als Bändermodell dargestellt. Die Orientierung von AviRb entspricht in etwa der Konfiguration bei einen SN2 Angriff des Protomers A (blau). Eine ausreichende Verkürzung der Distanz von AdoMet und 2'-O-Uridin-2479 ist ohne erhebliche sterische Hinderungen nicht möglich, AviRb kann das native Ribosom nicht methylieren. Die ribosomalen Proteine L30 und L7Ae sind der N-terminalen Domäne von AviRb am ähnlichsten (Kap. 4.4.4). Beide Proteine erkennen die rRNA mit übereinstimmenden Oberflächenbereichen, welche den loops β1-α3 sowie β2-α4 in AviRb entsprechen (Abbildung 97). Ähnliche Protein-RNA-Wechselwirkungen werden daher auch in AviRb erwartet. Unter Berücksichtigung dieser RNA-Bindungsstelle sowie der notwendigen Stereokonfiguration der Base für einen SN2-Methyltransfer, konnte die rRNA-Helix-89 manuell an AviRb gedockt werden. Hierzu wurde die Ribosom-Struktur aus einem mesophilen Eubakterium verwendet (Harms et al., 2001), die unter den bekannten Strukturen 168 Ergebnisse und Diskussion der großen ribosomalen Untereinheit die größte Sequenzidentität zur rRNA von S. viridochromogenes in diesem Bereich besitzt. Im vorliegenden Modell wird die rRNA-Helix-89 in der breiten Spalte zwischen der AdoMet-Bindestelle der einen Untereinheit und der N-terminalen Domäne der anderen Untereinheit gebunden (Abbildung 97). Bei der Bindung besteht dabei durch die mögliche Rotation der L30-Typ Domäne (Kap. 4.4.1) ein gewisser Spielraum für einen induced fit. Damit die Methylgruppe übertragen werden kann, muß die Base Uridin-2479 aus der rRNAHelix herausgedreht werden. Ein solches base flipping ist weit verbreitet und wurde bei DNA-MTasen (Cheng & Roberts, 2001) sowie bei RNA-bindenden und -modifizierenden Enzymen wie der Pseudouridin-Synthase in Komplex mit tRNA beobachtet (Hoang & FerréD'Amaré, 2001). Auch bei AviRa scheint ein Herausdrehen der Base ins aktive Zentrum notwendig (Kap. 4.2.6). Abbildung 97 Stereodarstellung der Bindung von AviRb an die ribosomale Helix-89 (grau, halbtransparent). Ein Methyltransfer ist nur nach Herausdrehen der Zielbase Uridin-2479 (Stabmodell) aus dem rRNA-Rückgrat möglich. Die Erkennung der Helix erfolgt durch die Nterminale Domäne der jeweils anderen Untereinheit. Die mutmaßlichen rRNA-Bindungsstellen liegen in der Abbildung hinter der rRNA-Helix-89 und sind violett gefärbt. Ein detailliertes Modell des aktiven Zentrums ist in Abbildung 98 dargestellt. Das 2'-O-Atom der Ribose von Uridin-2479 wurde dabei so plaziert, daß die für eine SN2Reaktion notwendige Stereokonformation eingehalten wird. Eines der freien Elektronenpaare des 2'-O-Atoms kann das zu übertragende Cε Atom des Kofaktors unter einem Winkel von 180° angreifen. Die Distanz zum Cε von AdoMet beträgt im Modell 2.8 Å und kann durch geringe Änderungen in den flexiblen loop-Regionen von AviRb weiter verkürzt werden. 169 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 98 Modell der Methylierungsreaktion in AviRb. Das Modell wurde durch Aktivitätsmessungen an Mutanten unterstützt. Das 2'-O-Atom von Uridin-2479 befindet sich in der korrekten Position für einen SN2-Methyltransfer. Aktivitätsmessungen zeigten, daß Asn139, Arg145 sowie Asn262 eine entscheidende Rolle bei der Katalyse spielen (Tabelle 40). Im vorliegenden Modell binden die beiden Asparagine die Uracil-Base während Arg145' der anderen Untereinheit eine Wasserstoffbrücke zum 2'-O-Atom der Ribose von Uridin-2479 bildet. Die Funktion von Arg145' entspricht dabei der von Lys175 im Komplex der klassischen MTase VP39 mit RNA (Hodel et al., 1998). Dieser Rest hat ebenfalls die Aufgabe, die zu methylierende Ribose in die korrekte Position für den Methyltransfer zu bringen (Kurowski et al., 2003; Li et al., 2004). Basenkatalyse bei der Methylierung Bei der enzymatischen Methylierung einer Hydroxylgruppe wird das freiwerdende Proton in der Regel durch eine benachbarte Base aufgefangen. In der Struktur von AviRb ist Glu234 die einzige in der Nähe des Cε von AdoMet befindliche Base. Durch die Einführung eines Glutamin an der entsprechenden Stelle wurde der basische Charakter der Aminosäure zerstört. Dennoch zeigt die E234Q Mutante eine deutliche Aktivität von 70% des Wildtyps. Glu234 fungiert demnach nicht als Base. Wahrscheinlich fixiert Glu234 statt dessen loop β9-α9, welcher an der Bindung des Kofaktors AdoMet beteiligt ist (Kap. 4.4.6), indem es zwei Wasserstoffbrücken zu Thr135 im loop β5-α6 ausbildet. Eine ähnliche Interpretation ist für das entsprechende Glutamat in TrmH vorgeschlagen worden (Nureki et al., 2004). Innerhalb der Klasse der AdoMet-abhängigen MTasen wurden verschiedene Mechanismen für die Protonenabstraktion vorgeschlagen. Das Proton kann statt von einer basischen Aminosäure auch von einem an Mg2+ gebunden Hydroxylion, wie bei der 170 Ergebnisse und Diskussion klassischen MTase COMT (Vidgren et al., 1994), oder einem strukturellen Wasser, wie im Fall von YecO, gebunden werden (Lim et al., 2001). Beides ist in AviRb, ebenso wie in vielen anderen Methyltransferasen, wie beispielsweise der Klasse der N6mA MTasen, nicht vorhanden. Bei anderen MTasen konnte ein dem "charge-relay-System" von Serinproteasen ähnlicher Deprotonierungsmechanismus gefunden werden. Das abstrahierte Proton kann hier über ein Serin oder Histidin auf ein Aspartat oder Glutamat übertragen werden (Gong et al., 1995; Zubieta et al. 2001). Eine ähnliche Anordnung von Aminosäureresten konnte auch bei AviRb - ebenso wie bei RrmA - beobachtet werden. Das entsprechende Serin (Ser260) ist in allen SpoU-MTasen hoch konserviert, als Base könnte bei AviRb Glu212 im loop β8-β9 fungieren. Hierzu wäre allerdings eine Rotation der Seitenkette des Serins gegenüber der gefundenen Position notwendig. Ob ein Protonentransfer tatsächlich über diese Kaskade erfolgt, konnte nicht eindeutig geklärt werden. Eine weitere Alternative stellt das Auffangen des freiwerdenden Protons von einem Wassermolekül des Solvens dar. Wasser stellt zwar keine besonders starke Base dar, jedoch muß die Base zur Abstraktion des Protons bei einer freien Enthalpie von 17 kcal/mol der Methylierungsreaktion (Kap. 1.2) nicht besonders effizient sein. Zusammenfassung und Ausblick 171 5 Zusammenfassung und Ausblick In dieser Arbeit wurden die dreidimensionalen Strukturen der Methyltransferasen AviRa und AviRb aus S. viridochromogenes Tü57 aufgeklärt und analysiert. Beide Enzyme übertragen eine Methylgruppe des Kofaktors S-Adenosyl-L-methionin (AdoMet) auf jeweils eine spezifische Base im Peptidyltransferase-loop der 23S-rRNA und verhindern so die Bindung des Antibiotikums Avilamycin in diesem Bereich. Ausgehend von einem Reinigungs- und Kristallisationsprotokoll für AviRa wurde für die erhaltenen, fragilen Kristalle zunächst ein Puffersystem für cryo-kristallographische Messungen entwickelt. Anschließend wurde auf verschiedene Weisen versucht, das Phasenproblem der Kristallographie zu lösen. Aufgrund zu geringer Sequenzidentität der Suchmodelle gelang die Lösung durch Molrep nicht. Eine Derivatisierung mit Schwermetallen schlug wegen der hohen Fragilität der Kristalle fehl. Zur Phasierung durch MAD sollte Selenomethionin inkorporiert werden. Da die Sequenz von AviRa kein Methionin enthält, wurden verschiedene Methionin-Doppelmutanten generiert. Die Struktur konnte mit einer Auflösung von 1.5 Å gelöst werden. Zudem wurden - induziert durch Röntgenstrahlung - Kristalle mit einer niedrigeren Symmetrie erhalten, welche deutlich geringere Zellparameter und einen um 10% verringerten Solvensgehalt aufwiesen. Die Struktur dieser neuen Kristallform konnte durch molekularen Ersatz gelöst werden. Zur Strukturlösung von AviRb wurde zunächst basierend auf einem bestehenden Expressionssystem eine Reinigung durch Ionenaustausch- und Affinitätschromatographie aufgebaut. Die hohe Instabilität des Proteins erforderte die Zugabe von 0.5 M NaCl zu sämtlichen Pufferlösungen, so daß eine alternative Reinigung als GST-Fusionsprotein etabliert wurde. Es konnten unter verschiedenen Bedingungen isomorphe, röntgentaugliche Kristalle des Apoenzyms und eines Komplexes mit AdoMet erhalten werden, welche am Synchrotron Daten bis zu einer Auflösung von 2.4 bzw. 2.55 Å lieferten. Die Lösung des Phasenproblems gelang wie im Fall von AviRa durch SeMet-MAD. AviRa besitzt die typische Faltung der klassischen Methyltransferasen, während AviRb zur SpoU-Familie innerhalb der Klasse der SPOUT-Methyltransferasen zählt. AviRa ist ein monomeres Ein-Domänen Protein mit einem zentralen, 7-strängigen β-Faltblatt, welches von α-Helices flankiert wird und Ähnlichkeiten mit dem Rossmannfold aufweist. Der Kofaktor AdoMet konnte in die typische Nukleotidbindestelle modelliert werden. Zusätzlich besitzt AviRa ein Helixpaar, welches vermutlich der Substraterkennung dient. Es konnte ein Modell des AviRa-rRNA-Komplexes erhalten werden, so 172 daß unter Annahme eines base flipping-Mechanismus ein Methyltransfer auf die Zielbase Guanin-2535 möglich ist. Das Modell wurde durch Aktivitätsmutanten gestützt. AviRb liegt als Dimer in Lösung vor und besteht aus einer N-terminalen Substraterkennungsdomäne, welche dem ribosomalen Protein L30 ähnelt, und einer C-terminalen katalytischen SpoU-Domäne. Während die erste Hälfte der C-terminalen Domäne ebenfalls an den Rossmann-fold erinnert, beinhaltet die zweite Hälfte eine ungewöhnliche Knotenstruktur. Dabei sind 36 Reste der C-terminalen Helix unter einem loop hindurchgefädelt. Der Knotenbereich spielt eine wichtige Rolle für die Katalyse und Dimerisierung. Es gelang, Strukturmodelle des Apoenzyms und eines Komplexes von AviRb mit AdoMet, jedoch nicht mit RNA zu erhalten. Gestützt durch Sequenzvergleiche und Mutationsstudien konnte ein Modell zur Bindung der rRNA entwickelt und ein Mechanismus zur Katalyse vorgeschlagen werden. Die rRNA-Helix-89 wird dabei in einer breiten Spalte zwischen N- und C-terminaler Domäne unterschiedlicher Protomere gebunden. Strukturelle Vergleiche mit sämtlichen bekannten SPOUT-Methyltransferasen ermöglichten eine Einteilung der einzelnen Enzyme in verschiedene Unterklassen. Zusätzlich wurde ein viertes Sequenzmotiv für die Familie der SpoU-Methyltransferasen identifiziert. Außerdem wurde ein Vorschlag für die Faltung der ungewöhnlichen Knotenstruktur entwickelt. Anhand der Strukturen der beiden Methyltransferasen konnte die Resistenz von S. viridochromogenes gegenüber Avilamycin näher verstanden werden. Zur genaueren Untersuchung der Substraterkennung könnten verschiedene RNA-Fragmente, bei denen einzelne bzw. mehrere Basen im Erkennungsbereich ausgetauscht sind, auf ihre Eignung als Substrat getestet werden. Um detaillierte Aussagen über die Wechselwirkungen mit der rRNA machen zu können, wäre eine Kokristallisation von AviRa mit dem Ribosom bzw. AviRb mit anderen RNA-Fragmenten nützlich. Zur experimentellen Untersuchung des Faltungsmechanismus bei AviRb müßten einzelne hydrophobe Aminosäuren ausgetauscht und die Auswirkungen auf die korrekte Assemblierung des Enzyms untersucht werden. Möglicherweise ließen sich durch Anbringen verschiedener Fluoreszenzmarker und Messung des Fourier-Energie- Transfers bei der Denaturierung weitere Aufschlüsse über die Reihenfolge der Faltung gewinnen. 173 6 Anhang 6.1 Sequenz von AviRa (250 AS, 26'636 Da) 1 - ATGAGTGCGTACCGCCACGCCGTGGAGCGGATCGACAGTTCCGATCTCGCCTGCGGTGTC - 60 M S A Y R H A V E R I D S S D L A C G V 61 - GTGCTCCACTCCGCGCCGGGTTACCCCGCCTTCCCCGTCCGCCTGGCGACCGAGATCTTC - 120 V L H S A P G Y P A F P V R L A T E I F 121 - CAGCGGGCCCTCGCCCGCCTCCCCGGCGACGGTCCGGTGACGCTGTGGGACCCGTGCTGC - 180 Q R A L A R L P G D G P V T L W D P C C 181 - GGCAGCGGTTACCTCCTGACGGTGCTGGGGCTGCTGCACCGGCGCTCGCTGCGGCAGGTG - 240 G S G Y L L T V L G L L H R R S L R Q V 241 - ATCGCCTCCGATGTGGACCCCGCCCCGCTGGAGCTCGCGGCGAAGAATCTCGCCCTGCTC - 300 I A S D V D P A P L E L A A K N L A L L 301 - TCGCCGGCCGGGCTGACCGCGCGCGAGCTCGAACGGCGTGAGCAGAGCGAGCGTTTCGGC - 360 S P A G L T A R E L E R R E Q S E R F G 361 - AAGCCCTCCTATCTGGAGGCCGCGCAGGCCGCCCGCCGGCTGCGGGAGCGCCTGACGGCG - 420 K P S Y L E A A Q A A R R L R E R L T A 421 - GAGGGCGGTGCGCTGCCGTGCGCCATCCGCACCGCGGACGTCTTCGATCCGCGTGCGCTG - 480 E G G A L P C A I R T A D V F D P R A L 481 - TCCGCCGTCCTCGCCGGGTCCGCGCCCGATGTCGTGCTGGCCGACCTGCCGTACGGCGAG - 540 S A V L A G S A P D V V L A D L P Y G E 541 - CGCACGCACTGGGAAGGGCAGGTGCCCGCGCAGCCGGTGGCGGGCCTGCTGCGCTCGCTC - 600 R T H W E G Q V P A Q P V A G L L R S L 601 - GCGTCGGCGCTGCCCGCGCATGCGGTGATCGCCGTCACCGACCGCAGCCGTAAGATCCCG - 660 A S A L P A H A V I A V T D R S R K I P 661 - GTGGCTCCCGTAAAGGCCCTGGAGCGGCTGAAGATCGGCACCCGCTCGGCCGTACTGGTC - 720 V A P V K A L E R L K I G T R S A V L V 721 - CGGGCAGCCGACGTGCTGGAGGCAGGCCCCTGA - 753 R A A D V L E A G P * 174 Anhang 6.2 Sequenz von AviRb (287 AS, 31'215 Da) 1 - ATGGCAAGATCACGTGGAGAGCGGACGCCGGCGGCTCGGCGGATCACCTCACGCAACGCT - 60 M A R S R G E R T P A A R R I T S R N A 61 - CGTTTCCAGCAGTGGCAGGCACTGCTCGGCAACCGCAACAAGCGCACGCGCGCCGGTGAG - 120 R F Q Q W Q A L L G N R N K R T R A G E 121 - TTCCTGGTGATGGGAGTCCGCCCGATCTCGCTCGCGGTGGAGCACGGCTGGCCCGTACGC - 180 F L V M G V R P I S L A V E H G W P V R 181 - ACGCTCCTCTACGACGGACAGCGGGAGCTGTCGAAGTGGGCGCGGGAGCTTCTTCGTACG - 240 T L L Y D G Q R E L S K W A R E L L R T 241 - GTGCGGACGGAGCAGATCGCGATGGCCCCGGACCTGCTGATGGAGCTGGGGGAGAAGAAC - 300 V R T E Q I A M A P D L L M E L G E K N 301 - GAGGCCCCGCCCGAGGTCGTCGCCGTCGTGGAGATGCCCGCCGACGACCTCGACCGGATC - 360 E A P P E V V A V V E M P A D D L D R I 361 - CCGGTCCGGGAGGACTTCCTGGGCGTACTGTTCGACCGGCCGACCAGTCCGGGGAACATC - 420 P V R E D F L G V L F D R P T S P G N I 421 - GGCAGCATCATTCGCTCGGCGGATGCCCTGGGCGCGCACGGGCTGATCGTGGCGGGGCAC - 480 G S I I R S A D A L G A H G L I V A G H 481 - GCCGCCGACGTCTACGACCCGAAATCGGTCCGGTCGAGCACCGGCTCGCTGTTCTCCCTG - 540 A A D V Y D P K S V R S S T G S L F S L 541 - CCCGCCGTCCGGGTGCCGTCACCGGGCGAGGTGATGGACTGGGTGGAGGCCCGCCGGGCC - 600 P A V R V P S P G E V M D W V E A R R A 601 - GCCGGCACGCCGATCGTCCTGGTCGGTACGGACGAGCACGGCGACTGCGATGTGTTCGAC - 660 A G T P I V L V G T D E H G D C D V F D 661 - TTCGACTTCACCCAGCCGACCCTGCTGCTGATCGGCAATGAGACAGCCGGGCTCAGCAAC - 720 F D F T Q P T L L L I G N E T A G L S N 721 - GCCTGGCGTACGTTGTGCGACTACACGGTCAGCATCCCGATGGCCGGCTCCGCGAGCTCG - 780 A W R T L C D Y T V S I P M A G S A S S 781 - CTGAACGCGGCGAACGCCGCGACCGCGATCCTCTACGAAGCGGTACGGCAGCGGATCAGC - 840 L N A A N A A T A I L Y E A V R Q R I S 841 - GGAAGAACCGCAACAACTCCCTGA - 864 G R T A T T P * 175 Anhang 6.3 Vektorkarten NdeI (99) NdeI (99) SacI (375) BamHI (456) SacI (429) AviRa pRSETb - AviRa EcoRI (854) AviRb SacI (878) pRSETb - AviRb 3625 3514 b EcoRI (965) Hind III (861) HindIII (972) GST BamHI (931) EcoRI (940) BamHI (1298) pGEX-4T1 AviRb AviRb 5836 SacI (1720) EcoRI (1807) Pst I (2790) NdeI (462) GST AviRb N-Dom Bam HI (931) Bam HI (819) pET3b N-Dom-AviRb HindIII (1300) 4959 pGEX-4T1 C-Dom-AviRb 5470 Sac I (1354) EcoRI (1331) Pst I (2087) AviRb C-Dom EcoRI (1441) Pst I (2424) 176 Anhang 6.4 Ortsgerichtete Mutagenese Im Laufe dieser Arbeit wurden verschiedene Mutationen durch ortsgerichtete Mutagenese in die Gene von AviRa und AviRb eingefügt. Folgende Abbildungen zeigen die Chromatogramme der von der Firma SeqLab (Göttingen) durchgeführten Sequenzierungen. Dargestellt ist jeweils der Ausschnitt der eingesetzten primer mit den flankierende Basentripletts. Das Basentriplett, welches für die eingefügte Mutation kodiert, ist unterstrichen. Mutationen im Gen von AviRa Methionin-Mutanten I11M L239M L99M L246M L173M Aktivitätsmutanten Y28A Y178A 177 Anhang Mutationen im Gen von AviRb Oberflächenmutanten K72E R82E D193Y C216S F178K Aktivitätsmutanten N139A N139Q T135A R145A 178 Anhang E234A E234Q N262A N262Q 179 Anhang 6.5 Eichgeraden Gelpermeationschromatographie Chromatographiesäule: S200 16/60 5,4 5,2 y = - 0.031· x + 7.30 5,0 log [Mr] 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 65 70 75 80 85 90 95 100 105 Elutionsvolumen [mL] Chromatographiesäule: S75 16/60 4,9 4,8 4,7 y = - 0.028 · x + 6.73 log [Mr] 4,6 4,5 4,4 4,3 4,2 4,1 4,0 65 70 75 80 85 90 95 Elutionsvolumen [mL] Die Eichgeraden der GPC-Säulen S200 16/60 sowie S75 16/60 wurden anhand der Retentionszeiten der Proteine BSA (67kDa), Ovalbumin (43 kDa), Chymotrypsin (25 kDa) und Cytochrom C (12.3 kDa) in GPCAviRb Puffer ermittelt. 180 Anhang 6.6 Sekundärstrukturvorhersagen SPOUT-Klasse Im Rahmen der Entwicklung eines Faltungsmechanismus für die Knotenregion in AviRb wurden Sekundärstrukturvorhersagen sämtlicher SPOUT-MTasen mit dem Programm Predict Protein (Yang & Wang, 2002) durchgeführt. C steht für coil, H für Helix und E für einen β-Strang. AviRb I V L V G T D E H G D E E E E E E C C C C C 0.71 0.90 0.94 0.92 0.85 0.66 0.50 0.74 0.83 0.81 0.66 Q P F L L I L D G V T D P H N L G A C L R S A D A A G V H A V I V P K I W I V G T A G E A D C D V F D F D F E E E E E C C C 0.52 0.64 0.66 0.59 0.51 0.58 0.79 0.79 H T L Y Q S K M D F L S G S S β5 V L S F S D S R P T S P G H N H I H G H S H H α6 I I H R H S H A H D H A H L H G A H S G S L S β6 I S V S A S S S β8 S S RlmB C C E E E E E E C C C C C C C C C E H H H H H H H H C C C E E E E C 0.97 0.78 0.68 0.79 0.80 0.87 0.75 0.50 0.67 0.80 0.86 0.90 0.88 0.83 0.73 0.62 0.49 0.46 0.63 0.54 0.53 0.44 0.65 0.68 0.68 0.50 0.71 0.79 0.69 0.70 0.87 0.89 0.69 0.54 C C E E E E E E C C C C C C C C C H H H H H H H H H C C C E E E E C C C E E E E E E C C C C 0.97 0.77 0.86 0.93 0.93 0.94 0.86 0.56 0.59 0.73 0.84 0.90 0.88 0.80 0.71 0.63 0.44 0.44 0.47 0.62 0.58 0.71 0.82 0.81 0.75 0.52 0.76 0.85 0.65 0.74 0.88 0.86 0.57 0.67 0.81 0.53 0.85 0.92 0.92 0.88 0.77 0.57 0.65 0.84 0.85 0.80 C E E E E E C C 0.58 0.58 0.67 0.67 0.60 0.48 0.63 0.77 RrmA D A L I L V A V G L E K P G N L G A V L R S A D A A G A E A V L V A G L P L V A T T P H A E A L Y W E A N L C C E E E E E E C C C C C C C H H H H H H H H H H C C C E E E E E E E C C C E C C C C C C H C C H H H C C C 0.95 0.50 0.85 0.92 0.92 0.91 0.83 0.64 0.45 0.70 0.81 0.89 0.89 0.87 0.78 0.48 0.60 0.72 0.73 0.71 0.68 0.64 0.51 0.44 0.46 0.42 0.49 0.41 0.46 0.61 0.66 0.65 0.59 0.52 0.41 0.96 0.80 0.55 0.51 0.51 0.68 0.80 0.82 0.71 0.56 0.43 0.37 0.34 0.40 0.44 0.44 0.45 0.72 0.83 Yqeu P I K V Y I A S G L P K G D K L E W I I Q K G T E L G A H A F I P F Q K C V V A Y E E S S K Q G E I S A F S A I V S S L P K C C E E E E E E E C C C C C H H H H H H H H H H H H C H H H H H H H H C C E E E C C C H H H C C C C C H C H H H H H C C C C 0.87 0.67 0.68 0.80 0.88 0.89 0.84 0.82 0.67 0.60 0.83 0.87 0.81 0.76 0.66 0.83 0.89 0.92 0.95 0.96 0.95 0.92 0.87 0.84 0.78 0.55 0.65 0.56 0.73 0.72 0.70 0.56 0.68 0.72 0.64 0.91 0.48 0.68 0.71 0.58 0.56 0.61 0.56 0.49 0.55 0.46 0.63 0.80 0.78 0.53 0.51 0.47 0.47 0.57 0.64 0.69 0.68 0.54 0.56 0.83 0.89 0.88 TrmH D L T V L L E N V H K P H N L S A I L R T C D A V G V L E A H A V C E E E E E C C C C C C C C C E E E E E C H H H H C C E E E E E C 0.94 0.68 0.85 0.88 0.76 0.56 0.47 0.57 0.77 0.86 0.89 0.88 0.86 0.83 0.69 0.52 0.71 0.80 0.75 0.68 0.54 0.41 0.55 0.59 0.69 0.71 0.61 0.66 0.84 0.90 0.87 0.71 0.50 N F T V Y A T A L R E D C C E E E E E E E C C C 0.75 0.76 0.80 0.89 0.89 0.85 0.72 0.60 0.47 0.70 0.78 0.79 A R D F R E V D Y C C E E C C C C C 0.67 0.46 0.50 0.44 0.42 0.43 0.58 0.75 0.85 YibK M L D I V L Y E P E I P Q N T G N I I R L C A N T G F R L H L I E C C E E E E E C C C C C C C C C C H H H H H H H C C C C E E E E C 0.96 0.65 0.73 0.87 0.89 0.86 0.58 0.70 0.85 0.90 0.93 0.91 0.90 0.90 0.84 0.80 0.55 0.36 0.50 0.49 0.46 0.47 0.48 0.37 0.54 0.75 0.77 0.60 0.61 0.71 0.70 0.51 0.60 K R L F A L T T K G C C E E E E E E C C C C 0.85 0.84 0.93 0.93 0.92 0.85 0.60 0.62 0.80 0.84 0.80 P A H S Q V K F C C C C C C C C 0.73 0.71 0.61 0.60 0.54 0.55 0.61 0.73 YggJ K I H L G Q V I S R G E R X E F T I Q K S V E L G V N V I T P L C E E E E E E C C C C C C H H H H H H H H H H H C C H H H C H H 0.88 0.74 0.86 0.89 0.88 0.85 0.62 0.58 0.78 0.84 0.84 0.82 0.50 0.49 0.64 0.79 0.91 0.95 0.96 0.95 0.92 0.90 0.83 0.59 0.72 0.63 0.55 0.51 0.43 0.37 0.45 0.51 W S A L K L N L H P R A H H H C C C E C C C C C C C Y S I K T L P T I C C C C C C C C C TrmD Tm0844 M W I G V I S L F C C E E E E E C C 0.95 0.58 0.65 0.75 0.75 0.73 0.54 0.46 0.73 S L R V R I A V I G K L D G C E E E E E E E E C C C C C 0.76 0.63 0.78 0.85 0.91 0.91 0.88 0.87 0.75 0.47 0.69 0.76 0.71 0.68 M K L Q L V A V G T K X C E E E E E E E C C C C 0.93 0.58 0.84 0.88 0.91 0.90 0.89 0.68 0.63 0.76 0.80 0.84 P E M F K A I T H H H H H H H H 0.63 0.65 0.62 0.47 0.64 0.69 0.65 0.51 F I K E G I K L D H H H H H H H H H 0.51 0.70 0.80 0.77 0.65 0.84 0.90 0.86 0.85 P D W V Q T G I K H H H H H H H H H 0.49 0.66 0.71 0.76 0.82 0.80 0.79 0.70 0.80 #13 #13 #13 0.53 0.44 0.92 0.64 0.46 0.47 0.58 0.68 0.82 0.71 0.61 0.57 0.69 L K V E C W A K V I Y L S P Q G R E E E E E C C E E E E E C C C C C 0.62 0.85 0.85 0.72 0.55 0.53 0.84 0.84 0.94 0.94 0.93 0.75 0.64 0.84 0.91 0.87 0.80 0.79 0.67 0.57 0.50 0.44 0.50 0.56 0.54 0.61 K L D N G G V T E L A Q C C C H H H H H H H H H 0.55 0.61 0.83 0.67 0.76 0.85 0.91 0.91 0.89 0.86 0.77 0.55 V L E I K R S F V M V M D K R G E E V S S E E F A D F L K D L E M K E E E E C C C E E E E E E C C C C C C C H H H H H H H H H H H H H C Ybea 0.52 0.59 0.55 0.44 0.52 0.47 0.88 0.80 0.88 0.89 0.88 0.80 0.51 0.67 0.89 0.91 0.91 0.90 0.91 0.88 0.80 0.90 0.93 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.94 0.85 0.66 0.85 F E L I E I P N R I V T L D I P G K P W D T P Q L A A E L E R W K L D C E E E E C C C C E E E E C C C C C C C C C H H H H H H H H H H H C C 0.55 0.57 0.83 0.87 0.71 0.60 0.79 0.95 0.56 0.82 0.89 0.88 0.76 0.54 0.75 0.90 0.92 0.91 0.91 0.91 0.90 0.58 0.86 0.91 0.94 0.94 0.95 0.95 0.95 0.94 0.92 0.86 0.71 0.50 0.88 181 Anhang AviRb RlmB RrmA T Q P T L L L I G N E T A G L S N A W R T L C C C C E E E E E E C C C C C C C H H H H H H C 0.79 0.76 0.58 0.80 0.92 0.94 0.94 0.87 0.56 0.69 0.85 0.84 0.87 0.88 0.82 0.70 0.77 0.78 0.81 0.80 0.72 0.61 0.59 T G R L A L V M G A E G E G M R R L T R E H C C C C E E E E E E C C C C C C C H H H H H H C 0.83 0.81 0.64 0.82 0.93 0.95 0.95 0.89 0.58 0.67 0.86 0.85 0.88 0.91 0.90 0.85 0.73 0.77 0.80 0.81 0.77 0.64 0.56 R P P V A I A V G P E H E G L R A A W L E A A C C C E E E E E C C C C C C C C H H H H H C C 0.88 0.88 0.82 0.53 0.86 0.92 0.91 0.72 0.65 0.80 0.86 0.80 0.86 0.88 0.82 0.71 0.60 0.58 0.63 0.55 0.54 0.49 0.61 D Y S T S V S β10 S S I S P M A G S A S S L N A A H N H A H A H T H A H I H L H Y H α10 E A H V H R H Q H R H I H S H G H R C C E E E E E E C C C C C C C C H H H H H H H H H H H H H H H H C C C C 0.74 0.49 0.68 0.86 0.90 0.86 0.71 0.53 0.49 0.53 0.51 0.46 0.49 0.45 0.38 0.38 0.36 0.39 0.58 0.70 0.74 0.85 0.87 0.90 0.93 0.93 0.93 0.93 0.92 0.91 0.87 0.76 0.49 0.84 0.94 0.95 D E L I S I P M A G S V S S L N V S V A T G I C L F E A V R Q R S C C E E E E E C C C C C C E E C H H H H H H H H H H H H H H C C C 0.78 0.49 0.77 0.89 0.91 0.83 0.60 0.53 0.74 0.83 0.78 0.63 0.47 0.42 0.44 0.46 0.48 0.63 0.84 0.88 0.90 0.92 0.91 0.92 0.91 0.89 0.90 0.89 0.84 0.68 0.57 0.90 0.97 Q T Q V R I P M Q G Q A D S L N V S V S A A L L L Y E A L R Q R L L R D C C C E C C C C C C C C C C C C C C H H H H H H H H H H H H H H C C C C 0.54 0.51 0.44 0.48 0.52 0.53 0.58 0.61 0.69 0.81 0.82 0.83 0.86 0.81 0.71 0.58 0.47 0.45 0.77 0.84 0.89 0.94 0.94 0.95 0.94 0.93 0.91 0.86 0.78 0.67 0.50 0.41 0.40 0.66 0.82 0.93 S S S β9 S S S H H H H α9 H H H Yqeu G S S L L I V F G P E C C E E E E E E C C C 0.89 0.75 0.64 0.88 0.93 0.94 0.92 0.79 0.54 0.81 0.88 G G L T E A E V E R L T E Q D G V T C G L G P R I C C C C H H H H H H H H H C C C E E E E E C C C E 0.90 0.91 0.91 0.88 0.74 0.81 0.91 0.95 0.95 0.95 0.93 0.90 0.73 0.68 0.90 0.88 0.50 0.78 0.77 0.54 0.68 0.85 0.80 0.53 0.38 L R T E T A P L Y A L S A I S Y Q T E L L R E C C C C H H H H H H H H H H H H H H H H C 0.44 0.46 0.49 0.59 0.58 0.63 0.84 0.90 0.92 0.93 0.94 0.94 0.94 0.94 0.93 0.93 0.92 0.88 0.78 0.69 0.53 0.94 TrmH YibK T K P T A V L F G A E K W G V S S E A L A L A C C C E E E E E E C C C C C C C H H H H H H H 0.87 0.82 0.59 0.81 0.92 0.93 0.93 0.85 0.53 0.67 0.85 0.84 0.87 0.91 0.91 0.86 0.80 0.84 0.87 0.89 0.86 0.74 0.50 K L G D Y L M F G P E T R G I P M S I L N E M C C C C E E E E E C C C C C C C H H H H H H C 0.82 0.84 0.82 0.55 0.83 0.92 0.92 0.83 0.52 0.68 0.85 0.81 0.86 0.90 0.90 0.82 0.78 0.78 0.82 0.84 0.76 0.57 0.79 D G A I K I P M L G M V Q S L N V S V A A A V I L F E A Q R Q R L K A G C C E E E E E C C C C C C C E C H H H H H H H H H H H H H H H H H C C C 0.77 0.53 0.68 0.86 0.89 0.81 0.58 0.54 0.74 0.83 0.78 0.63 0.50 0.39 0.42 0.48 0.44 0.63 0.84 0.89 0.92 0.94 0.94 0.94 0.93 0.92 0.93 0.94 0.94 0.92 0.90 0.79 0.60 0.56 0.87 0.96 P M E Q K I R I P M T A N S R S M N L S N S V A T V V Y E A W R Q L G Y K G C C C C E E E E E C C C C C C C E C C C H H H H H H H H H H H H H H C C C C 0.85 0.68 0.75 0.67 0.63 0.82 0.87 0.83 0.59 0.52 0.66 0.76 0.78 0.72 0.64 0.44 0.40 0.45 0.55 0.48 0.73 0.81 0.89 0.93 0.94 0.94 0.94 0.93 0.93 0.92 0.90 0.89 0.78 0.55 0.67 0.90 0.93 0.96 YggJ TrmD Tm0844 G K D I T I L I G G P Y C 0.73 Y E C 0.74 G G C 0.84 L I C 0.68 D C 0.66 N E C 0.46 E R E 0.41 E L E 0.58 I I E 0.63 F Q E 0.62 A T E 0.59 K E E 0.56 A P A G G V R L L I G S E G G L S A Q E I A Q T E Q Q C C C C E E E E E C C C C C C C H H H H H H H H H C 0.74 0.85 0.86 0.69 0.78 0.92 0.94 0.93 0.84 0.48 0.80 0.87 0.89 0.92 0.92 0.88 0.78 0.82 0.91 0.94 0.95 0.95 0.94 0.89 0.73 0.63 N Q K L I L V C G R C C C E E E E E C C G F T E I L L G K C C C E E E C C C 0.87 0.88 0.56 0.69 0.71 0.57 0.64 0.83 0.76 I D E E W S I G D E E E E E E E C E 0.54 0.56 0.62 0.77 0.84 0.81 0.63 0.48 0.56 R V L R T E T A S L A A I S A L Q I C F G D L G E C E E C C C H H H H H H H H H H H H H H H C C C C 0.53 0.48 0.50 0.46 0.49 0.57 0.56 0.80 0.89 0.93 0.94 0.95 0.95 0.95 0.95 0.94 0.92 0.90 0.84 0.71 0.49 0.56 0.66 0.87 0.96 Y V L T G G E L P A M T L I D A V A R F I P G V L E E E C C C C H H H H H H H H H H H H H H C C C C 0.79 0.84 0.64 0.70 0.82 0.75 0.61 0.56 0.67 0.76 0.84 0.88 0.90 0.93 0.94 0.93 0.91 0.89 0.87 0.81 0.59 0.61 0.81 0.88 0.95 G R D V S L L I G G P E C C E E E E E E C C C C 0.94 0.88 0.63 0.90 0.95 0.93 0.90 0.69 0.63 0.86 0.90 0.91 0.77 0.85 0.91 0.94 0.95 0.95 0.94 0.92 G L S P A C K A A A C C C H H H H H H H 0.92 0.89 0.82 0.72 0.75 0.86 0.90 0.88 0.83 0.82 H H H H H H H H C 0.90 0.88 0.86 0.79 0.68 0.54 0.51 0.47 0.62 E Q S W S L S A L H H H H H H C H C 0.82 0.82 0.81 0.77 0.67 0.53 0.53 0.47 0.62 C C C H H H H H H H H H H H H H H H H H C C C 0.78 0.85 0.71 0.56 0.68 0.79 0.89 0.92 0.94 0.95 0.95 0.96 0.96 0.96 0.95 0.93 0.93 0.93 0.85 0.68 0.49 0.82 0.96 T L P H P L V R V L V A E S L Y R A W S I T T C C C H H H H H H H H H H H H H H H H H C C C 0.74 0.82 0.79 0.63 0.72 0.75 0.82 0.86 0.87 0.88 0.88 0.93 0.94 0.93 0.90 0.83 0.82 0.76 0.61 0.41 0.57 0.79 0.94 C C E E E E E E C C C C C C 0.94 0.89 0.62 0.90 0.95 0.94 0.90 0.74 0.61 0.85 0.89 0.87 0.90 0.90 C H H H H H H H H R V F S L S K M T F T H G M T V L I V L E Q I F R A F K I I H 0.79 0.88 0.72 0.79 0.93 0.96 0.95 0.82 0.50 0.72 Ybea 182 7 Literatur Aarestrup, F. M. (1998). Association between decreased susceptibility to a new antibiotic for treatment of human diseases, everninomicin (SCH 27899), and resistance to an antibiotic used for growth promotion in animals, avilamycin. Microb. Drug Resist. 4, 137-141. Adrian, P. V., Zhao, W., Black, T. A., Shaw, K. J., Hare, R. S. & Klugman, K. P. (2000). Mutations in ribosomal protein L16 conferring reduced susceptibility to evernimicin (SCH27899): Implications for mechanism of action. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 732-738. Ahn, H. J., Kim, H.-W., Yoon, H.-J., Lee, B. I., Suh, S. W. & Yang, J. K. (2003). Crystal Structure of tRNA(M(1)G37)Methyltransferase: Insights Into tRNA Recognition Embo J. 22, 2593-2603. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. & Lipman, D. J. (1990). Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215, 403-410. Anantharaman, V., Koonin, E. V. & Aravind, L. (2002). SPOUT: A class of methyltransferases that includes spoU and trmD RNA methylase superfamilies, and novel superfamilies of predicted prokaryotic RNA methylases. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 4, 71-75. Apffel, A., Fischer, S., Goldberg, G., Goodley, P. C. & Kuhlmann, F. E. (1995). Enhanced sensitivity for peptide mapping with electrospray liquid chromatography-mass spectrometry in the presence of signal suppression due to trifluoroacetic acid-containing mobile phases. J. Chromatogr. A. 712, 177-90. Arndt, U. W., Champness, J. N., Phizackerly, R. P. & Wonacott, A. J. (1973). A single-crystal oscillation camera for large unit cells. J. Appl. Cryst. 6, 457-463. Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. & Steitz, T. A. (2000). The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science 289, 905-920. Bechthold, A. & Floss, H. G. (1994). Overexpression of the thiostrepton-resistance gene from Streptomyces azureus in Escherichia coli and characterization of recognition sites of the 23S rRNA A1067 2'-methyltransferase in the guanosine triphosphatase center of 23S ribosomal RNA. Eur. J. Biochem. 224, 431-437. Belova, L., Tenson, T., Xiong, L., McNicholas, P. & Mankin, A. (2001). A novel site of antibiotic action in the ribosome: Interaction of evernimicin with the large ribosomal subunit. PNAS 98, 3726-3731. Benner, S. E., Chothia, C. & Hubbard, T. J. (1997). Population statistics of protein structures: Lessons from structural classifications. Curr. Opin. Struct. Biol. 7, 369-376. Berman, H. M., Battistuz, T., Bhat, T. N., Bluhm, W. F., Bourne, P. E., Burkhardt, K., Feng, Z., Gilliland, G. L., Iype, L., Jain, S., Fagan, P., Marvin, J., Padilla, D., Ravichandran, V., Schneider, B., Thanki, N., Weissig, H., Westbrook, J. D. & Zardecki, C. (2002). The protein data bank. Acta Crystallog. Sect. D 58, 899-907. Biomolecular Structure Center (BMSC), University of Washington, Seattle, USA; (2001). Forms interface to calculate the expected signal in a MAD diffraction experiment; http://www.bmsc.washington.edu Blow, D. M. & Crick, F. H. C. (1959). The treatment of errors in the isomorphous replacement method. Acta Crystallog. 12, 794-802. Boggon, T. J. & Shapiro, L. (2000). Screening for phasing atoms in protein crystallography. Structure 8, R143-149. Borchardt, R. T., Shiong, Y., Huber, J. A. & Wycpalek, A. F. (1976). Potential inhibitors of Sadenosylmethionine-dependent methyltransferases. Structural modifications of Sadenosylmethionine. J. Med. Chem. 9, 1104-1110. Literatur 183 Bowie, J. U., Reidhaar-Olson, J. F., Lim, W. A. & Sauer, R. T. (1990). Deciphering the message in protein sequences: Tolerance to amino acid substitutions. Science 247, 1306-1310. Bragg, W. H. & Bragg, W. L. (1913). The reflection of X-rays by crystals: I. Proc. Roy. Soc. (London) A 88, 428-438. Brünger, A. T. (1987). Crystallographic R-factor refinement by molecular dynamics. Science 235, 458-460. Brünger, A. T. (1992). Free R value: A novel statistical quantity for assessing the accuracy of crystal structures. Nature 355, 472-475. Brünger, A. T., Adams P. D., Clore G. M., Delano W. L., Gros P., Grosse-Kunstleve R. W., Jiang J.-S., Kuszewski J., Nilges N., Pannu N. S., Read R. J., Rice L. M., Simonson T. & Warren G. L. (1998). Crystallography and NMR System: A new software suite for macromolecular structure determination, Acta Crystallogr. Sec. D 54, 905-21. Brünger, A. T., Krukowsky, A. & Ericson, J. (1990). Slow-cooling protocols for crystallographic refinement by simulated annealing. Acta Crystallogr. Sect. A 46, 585-593. Bügl, H., Fauman, E. B., Staker, B. L., Zheng, F., Kushner, S. R., Saper, M. A., Bardwell, J. C. A. & Jakob, U. (2000). RNA methylation under heat shock control. Molec. Cell 6, 349-360. Bujnicki, J. M. & Rychlewski, L. (2002). RNA-(guanine-N2) methyltransferases RsmC/RsmD and their homologs revisited - bioinformatic analysis and prediction of the active site based on the uncharacterized Mj0882 protein structure. BMC Bioinformatics 3, 10-21. Burchard, W. (1985). New aspects of polymer characterization by dynamic light scattering. Chimica 39, 10-18. Bussiere, D. E., Muchmore, S. W., Dealwis, C. G., Schluckebier, G., Nienaber, V. L., Edalji, R. E., Walter,K. A., Ladror, U. S., Holzman, T. F. & Abad-Zapatero C. (1998). Crystal structure of ErmC', an rRNA methyltransferase which mediates antibiotic resistance in bacteria. Biochemistry 37, 7103-7112. Buzzetti, F., Eisenberg, F., Grant, H., Keller-Schierlein, W., Voser, W. & Zahner, H. (1968). Avilamycin. Experientia 24, 320-324. Carter, A. P., Clemons, W. M. Jr., Brodersen, D. E., Morgan-Warren, R. J., Hartsch, T., Wimberly, B. T. & Ramakrishnan, V. (2001). Crystal structure of an initiation factor bound to the 30S ribosomal subunit. Science 291, 498-501. Carter, C. W. Jr. & Carter, C. W. (1979) Protein crystallization using incomplete factorial experiments. J. Biol. Chem. 254, 12219-12223. CCP4, Collaborative Computing Project Member 4 (1994). The CCP4 suite: Programs for protein crystallography. Acta Crystallog. Sect. D 50, 760-763. Cheng, X. & Blumenthal, R. M. (2002). Cytosines do it, thymines do it, even pseudouridines do it base flipping by an enzym that acts on RNA. Structure 10, 127-130. Cheng, X. & Blumenthal, R. M. (eds.). S-adenosylmethionine-dependent methyltransferases: Structures and functions, World Scientific Publ., Singapore, 1999. Cheng, X. & Roberts, R. J. (2001). AdoMet-dependent methylation, DNA methyltransferases and base flipping. Nucleic Acids Res. 29, 3784-3795. Courvalin, P. (2000). Will avilamycin convert ziracine into zerocine? Emerg. Infect. Dis. 6, 558558. Cowie, D. B. & Cohen, G. N. (1957). Biosynthesis by Escherichia coli of active altered proteins containing selenium instead of sulphur. Biochim. Biophys. Acta 26, 252-261. 184 Literatur Crick, F. H. C. & Magdoff, B. S. (1956). The theory of the method of isomorphous replacement for protein crystals I. Acta Crystallogr. 9, 901-908. Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K. & Newhouse, Y. (1994). Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth. Acta Crystallogr. Sect. D 50, 414-423. Cullis, A. F., Muirhead, H., Perutz, N. F., Rossmann, M. G. & North, A. T. C. (1962). A threedimensional Fourier synthesis at 5.5 Å resolution. Determination of the phase angles. Proc. Roy. Soc. London Ser. A 265, 15-38. Daggett, V. & Fersht, A. (2003). The present view of the mechanism of protein folding. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4, 497-502. D'Arcy, A. (1994). Crystallizing proteins – a rational approach? Acta Crystallogr. Sect. D 50, 414423. Das, K., Acton, T., Chiang,Y. Shih, L., Arnold, E. & Montelione, G. (2004). Crystal structure of RlmA': Implications for understanding the 23S rRNA G745/G748-methylation at the macrolide antibiotic-binding site. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 4041-4046. Dayhoff, M. O., Schwartz, R. M. & Orcutt, B. C (1972) "Atlas of Protein Sequence and Structure." Biomedical Research Foundation, Vol.5, 345-352, Washington D. C. de LaFortelle, E. & Bricogne, G. (1997). Maximum-likelihood heavy-atom parameter refinement for multiple isomorphous replacement and multiwavelength anomalous diffraction methods. Methods Enzymol. 276, 472-494. Debye, P. (1914). Interferenz von Röntgenstrahlen und Wärmebewegung. Annal. Phys. 43, 49-95. Dixon M., Huang S, Matthews R. & Ludwig, M. (1996). The structure of the C-terminal domain of methionine synthase: Presenting S-adenosylmethionine for reductive methylation of B12. Structure 4, 1263-75. Dodson, E. J., Davies, G. J., Lamzin, V. S., Murshudov, G. N. & Wilson, K. S. (1998). Validation tools: Can they indicate the information content of macromolecular crystal structures? Structure 6, 685-690. Doerks, T., Copley, R. R., Schultz, J., Ponting, C. P. & Bork, P. (2002). Systematic identification of novel protein domain families associated with nuclear functions. Genome Res. 12, 47-56. Dosztanyi, Z., Fiser, A. & Simon, I. (1997). Stabilization centers in proteins: Identification, characterization and predictions. J. Mol. Biol. 272, 597-612. Doublie, S. & Carter, C. W. (1992). Preparation of selenomethionyl protein crystals, in: Ducruix, A., and Giege, R. (Eds.) Crystallization of Nucleic Acids and Proteins. A Practical Approach, Oxford University Press. Doublie, S. (1997). Preparation of selenomethionyl proteins for phase determination. Methods Enzymol. 276, 523-530. Drenth, J. (1999). Principles of protein x-ray crystallography. 2nd edn., Springer Verlag. Elkins, P. A., Watts, J. M., Zalacain, M., van Thiel, A., Vitazka, P. R., Redlak, M., Andraos-Selim, C., Rastinejad, F. & Holmes, W. M. (2003). Insights into catalysis by a knotted TrmD tRNA methyltransferase. J. Mol. Biol. 333, 931-949. Engh, R. A. & Huber, R. (1991). Accurate bond and angle parameters for X-ray protein structure refinement. Acta Crystallog. Sect. A 47, 392-400. Ewald, P. P. (1921). Das "reziproke" Gitter in der Strukturtheorie. Z. Kristallogr. 56, 129-156. Fenn, T. D., Ringe, D. & Petsko, G. A. (2003). POVScript+: A program for model and data Literatur 185 visualization using persistence of vision ray-tracing. J. Appl. Cryst. 36, 944-947. Ferré-D'Amaré, A. R. & Burley, S. K. (1997). Dynamic light scattering in evaluating crystallizability of macromolecules. Methods Enzymol. 276, 157-166. Fersht, A. R. (1997). Nucleation mechanisms in protein folding. Curr. Opin. Struct. Biol. 7, 3-9. Findlay, J. B. C. & Geisow, M. J. (1998). Protein Sequencing. A Practical Approach, IRL Press. Forouhar, F., Shen, J., Xiao, R., Acton, T. B., Montelione, G. T. & Tong, L. (2003). Functional assignment based on structural analysis: Crystal structure of the yggJ protein (HI0303) of Haemophilus influenzae reveals an RNA methyltransferase with a deep trefoil knot. Proteins: Struct. Funct. Genet. 53, 329-332. Frangioni, J. V. & Neel, B. G. (1993). Solubilization and purification of enzymatically active glutathione S-transferase (pGEX) fusion proteins. Anal. Biochem. 210, 179-187. French, G. S. & Wilson, K. (1978). On the treatment of negative intensity observations. Acta Crystallogr. Sect. A 34, 517-525. Frishman, D. & Argos, P. (1995). Knowledge-based secondary structure assignment. Proteins: Struct. Funct. Genet. 23, 566-579. Garber, M., Gongadze, G., Meshcheryakov, V., Nikonov, O., Nikulin, A., Perederina, A., Piendl, W., Serganov, A. & Tishchenko, S. (2002). Crystallization of RNA/protein complexes. Acta Crystallog. Sec. D 58, 1664-1669. Garman, E. (1999). Cool data: Quantity AND quality. Acta Crystallogr. Sect. D 55, 1641-1653. Gill, S. C. & von Hippel, P. H. (1989). Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal. Biochem. 182, 319-326. Gilliland, G. L. & Ladner, J. E. (1996). Crystallization of biological macromolecules for X-ray diffraction studies. Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 595-603. Gong, W., O'Gara, M., Blumenthal, R. M. & Cheng, X. (1997). Structure of pvu II DNA-(cytosine N4) methyltransferase, an example of domain permutation and protein fold assignment. Nucleic Acids Res. 25, 2702-2715. Gupta, A., Kumar, P. H., Dineshkumar T. K., Varshney, U. & Subramanya, H. S. (2001). Crystal structure of Rv2118c: An AdoMet-dependent methyltransferase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv. J. Mol. Biol. 312, 381-391. Gustafsson, C., Reid, R., Greene, P. J. & Santi, D. V. (1996). Identification of new RNA modifying enzymes by iterative genome search using known modifying enzymes as probes. Nucleic Acids Res. 24, 3756-3562. Hanahan, D. (1983). Studies on transformations of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580. Hao, B., Gong, W., Ferguson, T. K., James, C. M., Krzycki, J. A. & Chan, M. K. (2002). A New UAG-encoded residue in the structure of a methanogen methyltransferase Science 296, 14621466. Harker, D. (1956). The determination of the phases of the structure factors of noncentrosymmetric crystals by the method of double isomorphous replacement. Acta Crystallog. 9, 1-9. Harms, J., Schluenzen, F., Zarivach, R., Bashan, A., Gat, S., Agmon, I., Bartels, H., Franceschi, F. & Yonath, A. (2001). High resolution structure of the large ribosomal subunit from a mesophilic eubacterium. Cell 107, 679–688. Heinmark, R. L., Hershey, J. W. B. & Traut, R. R. (1976). Crosslinking if inition factor IF2 to proteins L7/L12 in 70S ribosomes of E. coli. J. Biol. Chem. 251, 7779-7784. Hendricks, C. L., Ross, J. R., Pichersky, E., Noel, J. P. & Zhou, Z. S. (2004). An enzyme-coupled colorimetric assay for S-adenosylmethionine-dependent methyltransferases. Anal. Biochem. 326, 186 Literatur 100-105. Hendrickson, W. & Ogata C. M. (1997). Phase determination from multiwavelength anomalous diffraction measurements. Methods Enzymol. 276, 494-523. Hendrickson, W. A. & Lattman, E. E. (1970). Representation of phase probability distributions for simplified combination of independent phase information. Acta Crystallog. Sect. B 26, 136-143. Hendrickson, W. A., Horton, J. R. & Le Master, D. M. (1990). Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): A vehicle for direct determination of three-dimensional structure. EMBO J. 9, 1665-1672. Heras, B., Edeling, M. A., Byriel, K. A., Jones, A., Raina, S. & Martin, J. L. (2003). Dehydration converts DsbG crystal diffraction from low to high resolution. Structure 2, 139-145. Higgins, D. G., Thompson, J. D. & Gibson, T. J. (1996). Using CLUSTAL for multiple sequence alignments. Methods Enzymol. 266, 383-402. Hoang, C. & Ferré-D'Amaré, A. R. (2001). Cocrystal Structure of a tRNA ψ55 pseudouridine synthase: Nucletide flipping by an RNA-modifying enzyme. Cell 107, 929-939. Hodel, A., Gershon, P. & Quiocho, F. (1998). Structural basis for sequence-nonspecific recognition of 5'-capped mRNA by a cap-modifying enzyme. Molec. Cell 1, 443-447. Hoggan, D. B., Chao, J. A., Prasad, G. S., Stout, C. D. & Williamson, J. R. (2003). Combinatorial crystallization of an RNA-protein complex. Acta Crystallog. Sect. D 59, 466-473. Holm, L. & Sander, C. (1993). Protein structure comparison by alignment of distance matrices. J. Mol. Biol. 233, 123-138. Hooft, R. W. W., Vriend, G., Sander, C. & Abola, E. E. (1996). Errors in protein structures. Nature 381, 272-272. Howlin, B., Butler, S. A., Moss, D. S., Harris, G. W. & Driessen, H. P. C. (1993). TLSANL: TLS parameter-analysis program for segmented anisotropic refinement of macromolecular structures. J. Appl. Cryst. 26, 622-624. Hu, G., Gershon, P. D., Hodel, A. E. & Quiocho, F. A. (1999). mRNA cap recognition: Dominant role of enhanced stacking interactions between methylated bases and protein aromatic side chains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 7149-7154. Hubbard, S. J. & Thornton, J. M. (1993). 'NACCESS', Computer Program, Department of Biochemistry and Molecular Biology, University College London. Hughes, P., Lowe, C. R. & Sherwood, R. F. (1982). Metal ion-promoted binding of proteins to immobilized triazine dye affinity adsorbents. Biochim. Biophys. Acta 700, 90-100. Hung, L. W., Huang, L., Kim, R. & Kim, S.-H. (2000). Crystal structure and functional analysis of the hypothetical protein Mj0882 from Methanococcus jannashii. Code 1DUS, Protein Data Bank, Rutgers University, USA. International Tables for Crystallography (1996). Vol. A, Space-Group Symmetry, 4th corrected edition, (Hahn, T., ed.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. Jacobs, S. A., Harp, J. M., Devarakonda, S., Kim, Y., Rastinejad, F. & Khorasanizadeh, S. (2002). The active site of the SET domain domain is constructed on a knot. Nat. Struct. Biol. 9, 833-838. Jancarik, J. & Kim, S. H. (1991). Sparse matrix sampling: A screening method for crystallization of proteins. J. Appl. Cryst. 24, 409-411. Jones, D. T., Taylor, W. R. & Thornton, J. M. (1992). The rapid generation of mutation data matrices from protein sequences. Comp. Appl. Bioscience 8, 275-282. Jones, T. A., Zou, J.-Y., Cowan, S. W. & Kjeldgaard, M. (1991). Improved methods for building Literatur 187 protein models in electron density maps and the location of errors in these models. Acta Crystallog. Sect. A 47, 110-119. Kabsch, W. & Sander, C. (1983). Dictionary of protein secondary structures: Pattern recognition of hydrogen-bonded and geometrical features. Biopolymers 22, 2577-2637. Kagan, R. & Clarke, S. (1994). Widespread occurence of three sequence motifs in diverse Sadenosyl-L-methionine-dependent methyltransferases suggest a common structure for these enzymes. Arch. Biochem. Biophys. 2, 417-427. Kantardjieff, K. & Rupp, B. (2003). Matthews coefficient probabilities: Improved estimates for unit cell contents of proteins, DNA and protein-nucleic acid complex crystals. Protein Sci. 12, 18651871. Kirkpatrick, S., Gelatt, C. D. & Vecchi, M. P. (1983). Optimization by simulated annealing. Science 220, 671-680. Kleywegt, G. J. & Brünger, A. T. (1996). Checking your imagination: Applications of the free R value. Structure 4, 897 904. Kleywegt, G. J. & Jones, T. A. (1994). A superposition. ESF/CCP4 Newsletter 31, 9-14. Kleywegt, G. J. & Jones, T. A. (1995). Where freedom is given, liberties are taken. Structure 3, 535-540. Kleywegt, G. J. & Read, R. J. (1997). Not your average density. Structure 5, 1557-1569. Kleywegt, G. J. (1999). Experimental assessment of differences between related protein crystal structures. Acta Crystallog. Sect. D 55, 1878-1884. Knäblein, J., Neuefeind, T., Schneider, F., Bergner, A., Messerschmidt, A., Löwe, J., Steipe, B. & Huber, R. (1997). Ta6 Br12, a tool for phase determination of large biological assemblies by Xray crystallography. J. Mol. Biol. 270, 1-7. Kofoed, C. & Vester, B. (2002). Interaction of avilamycin with ribosomes and resistance caused by mutations in 23S rRNA. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 3339-3342. Kraulis, P. J. (1991). MOLSCRIPT – a program to produce both detailed and schematic plots of proteins structures. J. Appl. Cryst. 24, 946-950. Kuhlmann, F. E., Apffel, A., Fischer, S. M. Goldberg. G. & Goodley P. C. (1995). Signal enhancement for gradient reverse-phase high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry analysis with trifluoroacetic and other strong acid modifiers by postcolumn addition of propionic acid and isopropanol. J. Amer. Soc. Mass Spect. 6, 1221-1225. Kumar S., Horton, J. R., Jones, G. D., Walker, R. T., Roberts, R. J. & Cheng, X. (1992). DNA containing 4'-thio-2'-deoxycytidine inhibits methylation by HhaI methyltransferase. Nucleic Acids Res. 25, 2773-83. Kurowski, M. A., Sasin, J. M., Feder, M., Debski, J. & Bujnicki, J. M. (2003). Characterization of the cofactor-binding site in the SPOUT-fold methyltransferases by computational docking of Sadenosylmethionine to three crystal structures. BMC Bioinformatics 4, 9-20. Lamzin, V. S. & Wilson, K. S. (1993). Automated refinement of protein models. Acta Crystallog. Sect. D 49, 129-147. Lamzin, V. S. & Wilson, K. S. (1997). Automated refinement for protein crystallography. Methods Enzymol. 277, 269-305. Larivière, L. & Moréra, S. (2002). A base flipping mechanism for the T4-phage βglycosyltranferase and identification of a transition state analog. J. Mol. Biol. 324, 483-490. Laskowski, R. A., MacArthur, M. W., Moss, D. S. & Thornton J. M. (1993). PROCHECK: A program to check the stereochemical quality of protein structures. J. Appl. Cryst. 26, 283-291. 188 Literatur Leahy, D. J., Erickson, H. P., Aukhil, I., Joshi, P. & Hendrickson, W. A. (1994). Crystallization of a fragment of human fibronectin: Introduction of methionine by site-directed mutagenesis to allow phasing via selenomethionine. Proteins: Struc. Func. Genet. 19, 48-54. Lee, B. & Richards, F. M. (1971) The interpretation of protein structures: Estimation of static accessibility. J. Mol. Biol. 14, 379-400. Leslie, A. G. W. (1987). A reciprocal-space method for calculating a molecular envelope using the algorithm of B. C. Wang. Acta Crystallog. Sect. A 43, 134-136. Levinthal, C. (1968). Are there pathways for protein folding? J. Chem. Phys. 85, 44-45. Li, C., Xia, Y., Gao, X. & Gershon, P. D. (2004). Mechanism of RNA 2'-O-methylation: Evidence that the catalytic lysine acts to steer rather than deprotonate the target nucleophile. Biochemistry 43, 5680-5687. Lim, K., Zhang, H., Tempczyk, A., Bonander, N., Toedt, J., Howard, A., Eisenstein, E. & Herzberg, O. (2001). Crystal structure of YecO from Haemophilus influenzae (HI0319) reveals a methyltransferase fold and a bound S-adenosylhomocysteine. Proteins: Struc. Func. Genet. 45, 397-407. Lim, K., Zhang, H., Tempczyk, A., Krajewski, W., Bonander, N., Toedt, J., Howard, A., Eisenstein, E. & Herzberg, O. (2003). Structure of the YibK methyltransferase from H. influenzae (HI0766): A cofactor bound at a site formed by a knot. Proteins: Struc. Func. Genet. 51, 56-67. Lim, W. A., Farruggio, D. C. & Sauer, R. T. (1992). Structural and energetic consequences of disruptive mutations in a protein core. Biochemistry 31, 4324-4333. Liu, J., Wang, W., Shin, D. H., Yokota, H., Kim, R. & Kim, S. H. (2003). Crystal structure of tRNA (M1G37) methyltransferase from aquifex aeolicus at 2.6 Å resolution: A novel methyltransferase fold. Proteins: Struct. Funct. Genet. 53, 326-328. Maiorov, V. N. & Crippen, G. M. (1994). Significance of root-mean square deviation in comparing three-dimensional structures of globular proteins. J. Mol. Biol. 235, 625-634. Malone, T., Blumenthal, R. M. & Cheng, X. (1995). Structure-guided analysis reveals nine sequence motifs conserved among DNA amino-methyltransferases, and suggests a catalytic mechanism for these enzymes. J. Mol. Biol. 253, 618-632. Mao, H. & Williamson, J. R. (1999). Local folding coupled to RNA binding in the yeast ribosomal protein L30. J. Mol. Biol. 292, 345-359. Martin, J. L. & McMillan, F. M. (2002). SAM (dependent) I am: The S-adenosylmethioninedependent methyltransferase fold. Curr. Opin. Struct. Biol. 12, 783-793. Matthews, B. W. (1968). Solvent content of protein crystals. J. Mol. Biol. 33, 491-499. Matthews, B. W. (1977). X-ray structure of proteins. The Proteins. (Neurath, H. & Hill, R. L., eds.), 3rd edition, pp. 404-590, Academic Press, New York, USA. McClarin, J. A., Frederick, C. A., Wang, B.-C., Green, P., Boyer, H. W., Grable, J. & Rosenberg, J. M. (1986). Structure of the DNA-EcoR I endonuclease recognition complex at 3 Å resolution. Science 234, 1526-1541. McNicholas, P. M., Najarian, D., Mann, P., Hesk, D., Hare, R., Shaw, K. & Black, T. (2000). Evernimicin binds exclusively to the 50S ribosomal subunit and inhibits translation in cell-free systems derived from both gram-positive and gram-negative bacteria. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 1121-1126. McPherson, A. (1990). Current approaches to macromolecular crystallisation. Eur. J. Biochem. 189, 1-23. Literatur 189 McRee, D. E. (1992). A visual protein crystallographic software system for X11/XView. J. Mol. Graph. 10, 44-46. McRee, D. E. (1993). Practical Protein Crystallography. Academic Press, San Diego. McRee, D. E. (1999). XtalView/Xfit—A versatile program for manipulating atomic coordinates and electron density. J. Struct. Biol. 125, 156-165. Merritt, E. A. & Bacon, D. J. (1997). Raster3D: Photorealistic molecular graphics. Methods Enzymol. 277, 505-524. Michel, G., Sauve, V., Larocque, R., Li, Y., Matte, A. & Cygler, M. (2002). The structure of the RlmB 23S rRNA methyltransferase reveals a new methyltransferase fold with a unique knot. Structure 10, 1303-1315. Mitchell, E. P. & Garman, E. F. (1994). Flash freezing of protein crystals: Investigation of mosaic spread and diffraction limit with variation of cryoprotectant concentration. J. Appl. Cryst. 27, 1070-1074. Mosbacher, T. G. (2001). Expression und Reinigung der rRNA-Methyltransferasen AviRa und AviRb sowie Kristallisation von AviRa aus Streptomyces viridochromogenes Tü57. Diplomarbeit, Albert-Ludwigs-Universität, Freiburg. Murshudov, G. N., Vagin, A. A. & Dodson, E. J. (1997). Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallog. Sect. D 53, 240-255. Nagai, K. (1996). RNA-protein complexes. Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 53-61. Navaza, J. (1994). AMORE: An automated package for molecular replacement. Acta Crystallog. Sect. A 50, 157-163. Neurath, M., Ma, X. & Pettersson, S. (eds.). DNA/Protein-Interaktionen, Spektrum Verlag, Heidelberg, 1997. Nicholls, A., Sharp, K. A. & Honig, B. (1991). Protein folding and association: Insights from the interfacial and thermodynamic properties of hydrocarbons. Proteins: Struct. Funct. Genet. 11, 281-296. Niewmierzycka, A. & Clarke, S. (1999). S-Adenosylmethionine-dependent methylation in Saccharomyces cerevisiae. Identification of a novel protein arginine methyltransferase. J. Biol. Chem. 274, 814-824. Nolting, B. & Andert, K. (2000). Mechanism of protein folding. Proteins: Struct. Funct. Genet. 41, 288-298. Nureki, O., Shirouzu, M., Hashimoto, K., Ishitani, R., Terada, T., Tamakoshi, M., Oshima, T., Chijimatsu, M., Takio, K., Vassylyev, D.G., Shibata, T., Inoue, Y., Kuramitsu, S. & Yokoyama, S. (2002). An enzyme with a deep trefoil knot for the active-site architecture. Acta Crystallog. Sect. D 58, 1129-1137. Nureki, O., Watanabe, K., Fukai, S., Ishii, R., Endo, Y., Hori, H. & Yokoyama, S. (2004). Deep knot structure for construction of active site and cofactor binding site of tRNA modification enzyme. Structure 12, 593-602. O'Gara, M., Horton, J. R., Roberts, R. J. & Cheng, X. (1998). Structures of HhaI methyltransferase complexed with substrates containing mismatches at the target base. Nat. Struct. Biol. 5, 872877. Otwinowski, Z. & Minor, W. (1997). Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods Enzymol. 276, 307-326. Patterson, A. L. (1934). A Fourier series method for the determination of the components of interatomic distances in crystals. Phys. Rev. 46, 372-376. Perrakis, A., Sixma, T. K., Wilson, K. S. & Lamzin, V. S. (1997). wARP: Improvement and extension of crystallographic phases by weighted averaging of multiple refined dummy atomic 190 Literatur models. Acta Crystallog. Sect. D 53, 448-455. Petsko, G. A. (1985). Preparation of isomorphous heavy-atom derivatives. Methods Enzymol. 114, 147-156. Price, S. R. & Nagai, K. (1995). Protein engineering as a tool for crystallography. Curr. Opin. Biotechnol. 6, 425-430. Proteros Biostructures GmbH (2003). Target-gerichtete Proteinstrukturanalyse mit Hilfe der FreeMounting-Technologie; Martinsried; http://www.proteros.de/tech/tech.htm Przybylski, M. & Glockner, M. O. (1996). Electrospray-mass spectrometry of biomolecular complexes with noncovalent interactions – new analytical perspectives for supramolecular chemistry and molecular recognition processes. Angew. Chem. Int. Ed.. 35, 806-826. Ramachandran, G. N. & Sasisekharan, V. (1968). Conformation of polypeptides and proteins. Adv. Prot. Chem. 23, 283-437. Read, R. J. (1990). Structure factor probabilities for related structures. Acta Crystallog. Sect. A 46, 900-912. Riboldi-Tunnicliffe, A. & Hilgenfeld, R. (1999). Cryocrystallography with oil - an old idea revived. J. Appl. Cryst. 32, 1003-1005. Righetti, P. G., Gianazza, E., Gelfi, C. & Chiari, M. (1990). Gel electrophoresis of proteins: A practical approach. 2nd edn., pp. 149-214, Oxford University Press, Oxford. Rodgers, D. W. (1994). Cryocrystallography. Structure 2, 1135-1140. Rosenbaum, G., Holmes, K. G. & Witz, J. (1971). Synchrotron radiation as a source for X-ray diffraction. Nature 230, 434-437. Rossmann, M. G. & Blow, D. M. (1962). The detection of sub-units within the crystallographic asymmetric unit. Acta Crystallog. 15, 24-31. Rost, B. (1996). PHD: Predicting one-dimensional protein structure by profile-based neural networks. Methods Enzymol. 266, 525-539. Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T., (1989). Molecular cloning: A laboratory manual . 2nd edn., Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour. Sander, C. & Schneider, R. (1991). Database of homology-derived protein structures and the structural meaning of sequence alignment. Proteins: Struct. Funct. Genet. 9, 56-68. Sanger, F. (1981). Determination of nucleotide sequences in DNA. Science 214, 1205-1210. Sanner, M. F., Olson, A. J. & Spehner, J. C. (1996). Reduced surface: An efficient way to compute molecular surfaces. Biopolymers 38, 305-320. Schluckebier, G., Zhong, P., Stewart, K., Kavanaugh, T. & Abad-Zapatero, C. (1999). The 2.2 Å structure of the rRNA methyltransferase ErmC' and its complexes with cofactor and cofactor analogs: Implications for the reaction mechanism. J. Mol. Biol. 289, 277-291. Schubert, H. L., Wilson, K. S., Raux, E., Woodcock, S. C. & Warren, M. J. (1998). The X-ray structure of a cobalamin biosynthetic enzyme, cobalt-precorrin-4 methyltransferase. Nat. Struct. Biol. 5, 585-592. Schubert, H., Blumenthal, R. & Cheng, X. (2003). Many paths to methyltransfer: A chronicle convergence. TiBS 28, 329-335. Schulz, G. E. & Schirmer, R. H. (1979). Principles of protein structure. Springer Verlag, New York. Schulz, G. E. (1981). Protein Differenzierung: Entwicklung neuartiger Proteine im Laufe der Evolution. Angew.Chem. 93, 143-151. Literatur 191 Schulz, G. E. (1992). Binding of nucleotides by proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 2, 61-67. Schulz, G. E., Barry, C. D., Friedman, J., Chou, P. Y., Fasman, G. D., Finkelstein, A. V., Lim, V. I., Pititsyn, O. B., Kabat, E. A., Wu, T. T., Levitt, M., Robson, B. & Nagano, K. (1974). Comparison of predicted and experimentally determined secondary structure of adenyl kinase. Nature 250, 140-142. Schwartz, D., Kaspar, S., Kienzlen, G., Muschko, K. & Wohlleben, W. (1999). Inactivation of the tricarboxylic acid cycle aconitase gene from Streptomyces viridochromogenes Tü494 impairs morphological and physiological differentiation. J. Bacteriol. 181, 7131-7135. Schwede, T., Kopp, J., Guex, N. & Peitsch, M. C. (2003). SWISS-MODEL: An automated protein homology-modeling server. Nucleic Acids Res. 31, 3381-3385. Shakhnovich, E., Abkevich, V. & Ptitsyn, O. (1996). Conserved residues and the mechanism of protein folding. Nature 379, 96-98. Sharp, P. A., Sugden, B. & Sambrook, J. (1973). Detection of two restriction endonuclease activities in Haemophilus parainfluenzae using analytical agarose ethidium bromide electrophoresis. Biochemistry 12, 3055-3063. Sheldrick, G. M., Hauptman, H. A., Weeks, C. M., Miller, R. & Usón, I. (2001) Int. Tables for Crystallography, edited by M. G. Rossmann & E. Arnold, Vol. F, pp. 333-345. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. Sternbach, H. (1991). Chromatographische Methoden in der Biochemie. Thieme, Stuttgart. Taylor, W. (2000). A deeply knotted protein structure and how it might fold. Nature 406, 916-919. Terwilliger, T. C. (2000). Maximum likelihood density modification. Acta Crystallog. Sect. D 56, 965-972. Terwilliger, T. C. (2003). Statistical density modification using local pattern matching. Acta Crystallog. Sect. D 59, 1688-1701. Treede, I., Jacobsen, L., Kirpekar, F., Vester, B., Weitnauer, G., Douthwaite, S. & Bechthold, A. (2003). The avilamycin resistance genes AviRa and AviRb of Streptomyces viridochromogenes Tü57 encode two rRNA methyltransferases that target in G2535 and U2479 in domain V of 23S rRNA. Molec. Microbiol. 49, 309-318. Uzar, H. C. (1986). Konfigurative Stabilität von S-Adenosylmethionin - Mutatrotation ohne Pseudorotation. Liebigs Ann. Chem. 607-610. VanDuyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L. & Clardy, J. (1993). Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin. J. Mol. Biol. 229, 105-124. Vidgren, J., Svensson, L. A. & Liljas, A. (1994). Crystal structure of catechol O-methyltransferase. Nature 368, 354-358. Wang, B. C. (1985). Resolution of phase ambiguity in macromolecular crystallography. Methods Enzymol. 115, 90-112. Wang, H., Boisvert, D., Kim, K. K., Kim, R. & Kim, S.-H. (2000). Crystal structure of a fribrillarin homologue from Methanococcus jannaschii, a hyperthermophile, at 1.6 Å resolution. EMBO J. 19, 317-323. Weitnauer, G. (2002). Methyltransfer in Streptomyces viridochromogenes Tü57 – kleine Veränderung, bedeutender Effekt. Dissertation, Eberhard-Karls Universität Tübingen. Weitnauer, G., Gaisser, S., Trefzer, A., Stockert, S., Westrich, L., Quiros, L., Mendez, C., Salas, J. & Bechthold, A. (2001). An ATP-binding cassette transporter and two rRNA methyltransferases are involved in resistance to avilamycin in the producer organism Streptomyces viridochromogenes Tü57. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 690-695. 192 Literatur Wilson, J. R., Jing, C., Walker, P. A., Martin, S. R., Howell, S. A., Blackburn, G. M., Gamblin, S. J. & Xiao, B. (2002). Crystal structure and functional analysis of the histone methyltransferase SET7/9. Cell 111, 105-115. Winn, M., Isupov, M. & Murshudov, G. N. (2001). Use of TLS parameters to model anisotropic displacements in macromolecular refinement. Acta Crystallog. Sect. D 57, 122-133. Wright, B. & Bibb, M. J. (1992). Codon usage in the G-C rich Streptomyces genome. Gene 113, 5565. Yang, A. S. & Wang, L. Y. (2002). Local structure-based sequence profile database for local and global protein structure predictions. BMC Bioinformatics 18, 1650-1657. Yeates, T. O. (2002). Structures of SET domain proteins: Protein lysine methyltransferases make their mark. Cell 111, 5-7. Yu, L., Petros, A. M., Schnuchel, A., Zhong, P., Severin, J. M., Walter, K., Holzman, T. F. & Fesik, S. W. (1997). Solution structure of an rRNA methyltransferase (ErmAM) that confers macrolidelincosamide-streptogramin antibiotic resistance. Nat. Struct. Biol. 6, 483-489. Zarembinski, T. I., Kim, Y., Peterson, K., Christendat, D., Dharamsi, A., Arrowsmith, C. H., Edwards, A. M. & Joachimiak, A. (2003). Deep trefoil knot implicated in RNA binding found in an archaebacterial protein. Proteins: Struct. Funct. Genet. 50, 177-183. Zubieta, C., He, X., Dixon, R. & Noel, J. (2001). Structures of two natural product methyltransferases reveal the basis for substrate specifity in plant O-methyltransferasen. Nat. Struct. Biol. 8, 271-279. Danksagung Die vorliegende Arbeit wurde im Arbeitskreis von Prof. Dr. Georg E. Schulz am Institut für Organische Chemie und Biochemie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau angefertigt. Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Georg E. Schulz für die Vergabe des vielseitigen und interessanten Themas sowie für seine stete Diskussionsbereitschaft und Betreuung während der gesamten Doktorarbeit. Ebenso danke ich Herrn Prof. Dr. Andreas Bechthold, der die Gene für AviRa und AviRb zur Verfügung stellte, und damit die Grundlage für diese Arbeit geschaffen hat. Bei Gabriele Weitnauer und Irina Treede bedanke ich mich für die großzügige Bereitstellung von Geräten und Materialien zur Durchführung des rRNAMethyltransferase-Assays. Dem gesamten Arbeitskreis danke ich für die stete Hilfsbereitschaft und eine äußerst angenehme Atmosphäre. Vor allem Hanna Fritzsche und Daniel Kloer standen mir stets mit Rat und Tat zur Seite. Mein besonderer Dank gilt Dirk Reinert für seine unschätzbare Hilfsbereitschaft und seine konstruktive Kritik in vielen anregenden Diskussionen. Außerdem wäre ohne die viele Arbeit der Computer- und Systemadministratoren bei Verwaltung und Betreuung der PC's sowie bei den ständig auftauchenden Computerproblemen vieles unmöglich gewesen. Bei Linda Böhm und Helmut Hamacher möchte ich mich für ihr großes Engagement für den Arbeitskreis und für die vielen aufmunternde Gespräche bedanken. Vielen Dank an Bärbel Dirr für die Hilfe bei der Präparation der AviRbOberfächenmutanten, an Verena Rombach und Thomas Pohl für ihr Engagement während ihrer Mitarbeiterpraktika. Meinen Eltern und meinem Bruder Christian danke ich für ihr Verständnis und den nötigen Rückhalt während meines gesamten Studiums. Besonders herzlich möchte ich Simon Kohler für die vielen verständnisvollen und motivierenden Worte, seine uneingeschränkte Unterstützung und seine unermüdliche Geduld danken.
