Die delta-pH Messtechnik

Die '-pH-M
esstec
hnik
-pH-Me
echnik
klun
zur FFor
or
g un
d En
g
und
Enttwic
wicklun
klung
orsschun
ung
Möglic
he An
wendun
gen
öglich
Anw
dung
L. Bucsis
Es wurde ein auf neuem Prinzip beruhender Enzym- oder Substratanalysator vorgestellt, und zwar das
Modell CL 10 SELECT der Firma Biocontrolsys. Eine ausführliche Systemdarstellung finden Sie im Internet
( www.schlag.de).
Enzym/Substrat-Umsetzungen sind meistens mit
pH-Änderungen verbunden, wobei Produktion oder
Verbrauch an Wasserstoff-Ionen für die Konzentration
des zu bestimmenden Analyten in der Probe typisch
ist. Ein mit kapillaren pH-Elektroden ausgerüstetes
Messinstrument misst den pH-Wert vor und nach der
Umsetzung. Aus der resultierenden pH-Differenz wird
auf die Enzymaktivität oder Substratkonzentration
geschlossen. Mit '-pH-Messungen können im Grunde
genommen alle enzymatischen Reaktionen, die mit pHÄnderungen gekoppelt sind, dargestellt werden.
Auf Grund der universellen pH-Änderung bei enzymatischen Umsetzungen dient die innovative '-pHMesstechnik als echte Alternative zu den bekannten UV/VIS-Methoden.
Insbesonders zu Erfassung geeignet sind:
ZZX
ZZX
NAD+ YZZ NADH , NADP+ YZZ NADPH - Umwandlungen
ZZX ADP YZZ
ZZX AMP - Übergänge, Phosphataseaktivitäten
ATP YZZ
Monitoren von Hydrolysen oder Veresterungen, Lipasenaktivitäten
Carboxylierungen oder Decarboxylierungen
Desaminationen
Mess-System
Der Enzym- und Substratanalysator CL10 SELECT besteht aus einem thermo-statisierbaren
Messblock mit zwei parallelgeschalteten Kapillarglaselektroden (die zur Messung von pH-Differenzen
von < 0,001 pH-Einheiten ausgelegt wurden), Reaktionskammer, Versorgungspumpen und einem
Mikroprozessor, der die Konzentration bzw. Enzymaktivität berechnet und das Gerät steuert. Die
systemeigene Software ist für Endpunktbestimmungen, Fixzeit sowie kinetische Messungen (mit variablem
Vorlauf und Ablese-intervallen) ausgelegt.
Messablauf
Die pH-Elektroden befinden sich in getrennten Messkammern, die zuerst mit Arbeitspuffer gefüllt werden.
Zum Abgleich der individuellen Spannungsschwankungen zwischen Mess- und Referenzelektrode wird,
durch einen Differenzverstärker, eine Einstellung auf ein konstantes Potential vorgenommen.
Nach Probenzugabe, Rühren und Auslösen des Messvorganges strömt die Hälfte des
Mischkammer-Inhaltes (Arbeitspuffer + Probe) in die beiden Messkammern. Die Elektroden messen
die pH-Differenz, die als Reagenzienleerwert (Offset) gespeichert wird.
-1-
Eine Pumpe fördert den Reaktionsstarter aus einem Vorratsbehälter in die Mischkammer. Nach
erneutem Mischen wird der restliche Kammerinhalt (Arbeitspuffer + Probe + Starter) nun an eine
der pH-Elektroden herangeführt. Die pH-Differenz zum Reagenzienleerwert beginnt zu steigen
(geeigneter Bereich zu kinetischen Messungen), bis sie am Reaktionsende konstant bleibt
(Endpunkt-Messung).
Die Software erlaubt das Anlegen und Speichern
individueller Messroutinen.
Zur besseren Vergleichbarkeit können die Kurvenverläufe aus verschiedenen Messungen auf einem
Bildschirm überlagert werden (die Abbildung
zeigt den Kurvenverlauf bei der Glucose Messung
- ohne Probenvorbereitung -- von Kirsch- und zwei
anderen Buntsäften). Der Datenexport in externe
Auswertesysteme ist gegeben.
Vorteile des Verfahrens
Da bei diesem Verfahren nicht die Lichtabsorption, sondern die pH-Differenz als Messgröße
dient, können grobsuspendierte Probenmaterialien direkt der enzymatischen Messung zugeführt
werden. Einbettungen wie z.B. Inhalte von Zellreaktoren, Vollblut, homogenisiertes/verflüssigtes
Gewebe, Milch, isolierte Zellen, trübe Fruchtsäfte usw. — Teilchengrößen bis zu 0,3 mm Durchmesser — stören nicht. Generell: die bei den UV-Methoden notwendige Probenvorbereitung
entfällt weitgehend!
Die Messzeiten liegen im Bereich von 40 - 120 Sekunden und es sind meistens 10 - 20 μl
Probenmaterial ausreichend.
Bei geschickter Auswahl der Versuchsbedingungen kann sowohl Substratkonzentration als auch
die Enzymaktivität bei derselben Umsetzung manifest dargestellt werden.
Bei geeigneter Kombination der Messparameter ist es möglich, in einem Messvorgang auch zwei
Analyten zu erfassen.
Für die folgend angeführte Methoden bzw. Vorschlägen liegen teils veröffentliche Literatur
bzw. ansatzweise betriebsinterne Erfahrungen vor.
Applikation Medizin
Bestimmungen von:
ACHE („echte”) von zellwandimmobilisiertem Enzym an Erythrozyten
Aktivität von Glucose-6-phospat-Dehydrogenase(G6PD) und 6-Phospogluconat-Dehydrogenase
(6PGD) in Vollblut. Gleichzeitige Messung.
Aktivität von 6-Phospoglucose-Dehydrogenase in Vollblut
ATP in roten Blutzellen
ß-Galaktosidase in Zellkulturen
Biologische Vorgänge die mit ATP-Verbrauch/Produktion gekoppelt sind
Erythrozytärer Pyruvatkinase
Ethanol in Vollblut
Harnstoff in Vollblut, Plasma und in Dialyseflüssigkeiten
Hemmung von derselben durch Medikamente
Lactat direkt in Vollblut
L-Carnitin, Fructose und Citrat in Ejakuat
-2-
Lipasenaktivität in Serum, Plasma, Duodenalflüssigkeit durch Erfassung von freisetzten
Fettsäuren, direkt
Monitoring von Trypsin und Pepsin
Nucleinsäuren in μg Bereich mittels Nukleasen (acide Phosphorsäuren werden freigesetzt).
Pyruvatkinase in Vollblut
Urease bei Helicobacter pylori Infektionen
Visualisierung von Enzymkinetik, Temperaturabhängigkeit
Applikation Lebensmittel
Bestimmungen von:
Acetaldehyd in Wein und Most und Getränken
Aciditätsmessungen
Alkalische Phosphatase in Fleisch- und Milchprodukten
Anthocyanglykoside in Wein und Fruchtsäften
Ammoniak in Milch
Apfelsäure in Wein und Most (oder Sauerteigen)
Ascorbinsäure in diversen Biomaterialien
ATP/Glycerinkinase in Wein
ATP-Messung zu Keimzahlbestimmung
Carnitin Gehalts-bestimmungen in Nahrungsmittelergänzungen
Citronensäure in Milch (oder Sauerteigen)
CO2-Messungen in Bier, Schaumweinen und Getränken in der Milchwirtschaft
Essigsäure in Wein und Most (oder Sauerteigen)
Glycerin mittels Gluconat mittels ATP/Gluconatkinase in Lebensmitteln
Glutamin-Glutaminsäre in Bioreaktoren und Hefeextrakten
Ketonkörper (Acetessigsäure und Hydroxybutyrat) in Milch
Gesamtkreatin/-kreatinin in Fleischextrakten, Fleischbrühen
Glucose und Fruktose, Bestimmung der beiden Werte in einem Messvorgang
Lactose: enorm schnelle zeitsparende Hydrolyse, (Lactose in Sauerteigen)
Lactulose in Milch, Lactose in Lebensmitteln
Harnstoff in Wein
Oligofruktosen Monitoring
Penicillin Rückstände in Milch und anderen Gewebematerialien
Saccharose in diversen Lebensmitteln
Schnelle Messung von Lab-Aktivitäten
Sorbit bzw. Sorbit und Xylit zusammen in Lebensmitteln und Zellkulturen
Harnstoff in Wein
Grundsätzlich alle enzymatischen Methoden bei denen NAD+/NADH bzw. NADP+ /NADPH
Übergänge stattfinden.
Möglich wird die Differenzierung zwischen der freien exprimierten Enzymaktivität im aufgereinigten
Fermenterinhalt und nach Zellaufschluss, auf der Zelloberfläche immobilisierten Enzymaktivität.
Gleiches Prinzip gilt auch für das freie Substrat und Substrat in Zellinneren.
Autor:
Dr. Dipl.-Chem. Lorant Bucsis, Wissenschaftlicher Berater bei Dr. Berthold G. Schlag Wissenschaftliche
Meßinstrumente GmbH, Bergisch Gladbach
www.schlag.de
-3-