Funktionelle Korrelation von Zytoskelett und Gap junctions am

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5. Zusammenfassung
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine mögliche funktionelle
Korrelation zwischen dem Zellskelett und der Interzellulären-Kommunikation via
Gap junctions am Modelsystem der Linsenepithelzelle zu untersuchen.
Obwohl bereits mögliche Hinweise auf morphologische Zusammenhänge
dieser Zellelemente existierten, fehlten bis jetzt Daten, die eindeutig eine
funktionelle Abhängigkeit zeigen konnten. Aufgrund immunhistochemischer
Untersuchungen am konfokalen Laserscanning Mikroskop und elektronenmikroskopischer Darstellungen erschienen uns Aktin-Filamente und Mikrotubuli
diejenigen zytoskelettalen Elemente zu sein, die durch enge Assoziationen mit der
Zellmembran möglicherweise Einfluss auf die Gap junctions haben konnten. Um
eine funktionelle Abhängigkeit zu prüfen wurden in der vorliegenden Arbeit AktinFilamente und Mikrotubuli selektiv inhibiert, indem sie mit spezifischen Giften
behandelt wurden. In weiteren Versuchen wurde das Aktinzytoskelett zusätzlich
durch Mikroinjektion von anti-Aktin-Antikörpern gehemmt. Anschließend wurde
sowohl die Zellkommunikation mittels Mikroinjektion der Gap junction permeablen
Substanz Neurobiotin untersucht, als auch die Verteilung der Gap junctionProteine, der Connexine, innerhalb der Zelle mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie
dargestellt.
In der immunhistochemischen Darstellung des Aktinzytoskeletts mittels der
konfokalen Mikroskopie zeigten sich prominente Aktin-Fasern, die über die
gesamte Zelle hinweg bis in die Nähe der Zellmembran darstellbar waren. Diese
Beobachtungen wurden durch die Elektronenmikroskopie gestützt, wo sich
Anreicherungen zytoskelettaler Elemente unterhalb der Zellmembran darstellen
ließen, bei denen es sich um Aktin-Filamente handelt. Mikotubuli bilden in
Linsenepithelzellen ein verzweigtes Netzwerk, welches hauptsächlich perinukleär
ausgebildet ist aber mit einzelnen Filamenten auch bis an die Zellmembran reicht.
1. Funktionell zeigte sich sowohl durch Inkubation mit der Aktindepolimerisierenden Substanz Cytochalasin D für 30 Minuten als auch nach
Mikroinjektion spezifischer anti-Aktin-Antikörper eine signifikante Reduktion der
Zellkommunikation um 3/4 beziehungsweise 2/3 des Ausgangswertes. Durch eine
Regenerationsstudie ließ sich nachweisen, dass die Giftwirkung die Zellen nicht
irreversibel schädigte. Die spezifische Wirkung der anti-Aktin-Antikörper konnte
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durch Mikroinjektion irrelevanter Kontrollantikörper dargestellt werden. Auch die
Verteilung von Connexin43, welches typisch für Linsenepithelzellen ist, änderte
sich nach Inkubation in mit Cytochalasin D versetztem Medium. Im Gegensatz zu
den Kontrollen, wo es sich membranständig nachweisen ließ, wurde nach
Cytochalasin-Exposition Connexin43 nun vermehrt zytoplasmatisch dargestellt.
Auch die Connexin-Verteilung normalisierte sich nach der Regeneration.
2. In der vorliegenden Arbeit wurden Mikrotubuli durch Inkubation mit der
zytoskelettalen Droge Taxol inhibiert. Die Zellkommunikation konnte hierdurch
signifikant gehemmt werden, wobei die Reversibilität dieses Effekts ebenfalls
mittels einer Regenerationsstudie nachgewiesen wurde. Die in den Kontrollen
gezeigte Assoziation von Connexin 43 mit der Zellmembran wurde unter TaxolEinfluss
weitestgehend
aufgehoben
und
zugunsten
einer
vermehrten
Anreicherung dieser Connexine innerhalb des Zytoplasmas verschoben. Es zeigte
sich demnach, dass beide zytoskelettalen Elemente, Aktin-Filamente und
Mikrotubuli, für eine ungestörte Gap junction-Kommunikation eine wichtige Rolle
spielen.
Abschließend werden die Ergebnisse der Mikroinjektionsstudien und der
veränderten Connexin-Expression im Kontext des Gap junction Metabolismus
diskutiert, wobei die spezifischen Interaktionen der zytoskelettalen Elemente
untereinander
und
mit
den
Gap
junctions
aufgezeigt
werden.
Die
Zellkommunikation via Gap junctions wird nicht nur direkt durch Interaktionen
zytoskelettaler Elemente beeinflusst, sondern scheint primär indirekt von
zytoskelettalen Transportmechanismen der Gap junctions zur Zellmembran
abhängig zu sein. Hierbei sind sowohl ein intaktes Aktin-Zytoskelett als auch
Mikrotubuli von entscheidener Bedeutung.