Expression von Alix als Marker für Microvesicular Bodies und
Werbung
Diplomarbeit Expression von Alix als Marker für Microvesicular Bodies und dessen Rolle in der Tumorprogression von Astrozytomen eingereicht von Marlene Leoni 24.02.1984 zur Erlangung des akademischen Grades Doktorin der gesamten Heilkunde (Dr.med.univ.) an der Medizinischen Universität Graz ausgeführt am Institut für Pathologie unter der Anleitung von ao Univ. Prof. Dr. Reinhold Kleinert Sen. Scientist Dr. Martin Asslaber Graz, 14.03.2013 Marlene Leoni Eidesstattliche Erklärung Ich erkläre ehrenwörtlich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und ohne fremde Hilfe verfasst habe, andere als die angegebenen Quellen nicht verwendet habe und die den benutzten Quellen wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich gemacht habe. Graz, am 14.03.2013 Marlene Leoni 1 Danksagung Ich möchte mich hiermit für die Unterstützung bei meiner Diplomarbeit und natürlich auch bei meinem gesamten Medizinstudium bei zahlreichen Personen bedanken, die diesen Weg gemeinsam mit mir gegangen sind, und versucht haben mir einiges zu erleichtern. Besonderer Dank gilt meinem Betreuer OA Dr. Martin Asslaber, der den Grundgedanken dieser Arbeit lieferte und mir während des gesamten Zeitraumes der Diplomarbeit mit Rat und Tat zur Seite stand. Ein Dankeschön geht auch an ao Univ. Prof. Dr. Reinhold Kleinert, der die Entstehung dieser Arbeit möglich gemacht hat. Danken möchte ich auch den MTA`s der Pathologie, die mich immer tatkräftig bei Laborarbeiten unterstützt haben und den Mitarbeitern der Biobank der Medizinischen Universität Graz, im Besonderen Silvia Schauer für die große Hilfe bei der immunhistochemischen Färbung und die unkomplizierte Kooperation. Großer Dank geht auch an das Nachtexpress-Team, ohne dem der zeitliche Ablauf und die Finanzierung meines Studiums niemals in dieser Form gelungen wäre. Ein Dankeschön auch an meine Freunde/Kollegen Astrid Rösch und Nina Wolf die mich während meines gesamten Studiums in jeglicher Form unterstütz haben. Zuletzt geht noch ein großer Dank an meine Eltern Ing. Sepp Leoni und Marliese Leoni und meinem Lebensgefährten Rene Hatzl für die grenzenlose Geduld mit mir während des gesamten Studiums. Besonders meinem Vater, der maßgeblich an meinem Entschluss Medizin zu studieren beteiligt war, möchte ich für diese Inspiration danken. Vielen Dank für Eure Unterstützung!!!! 2 Inhaltsverzeichnis Eidesstattliche Erklärung…………………………………………………………………1 Danksagung………………………………………………………………........................2 Inhaltsverzeichnis………………………………………………………………………...3 Glossar und Abkürzungen…………………………………………….......................6 Abbildungsverzeichnis………………………………………………………………….7 Tabellenverzeichnis……………………………………………………………………...9 Abstract…………………………………………………………………………………...10 Zusammenfassung………………………………………………………....................11 Vorwort……………………………………………………………………………………12 1 Einleitung……………………………………………………………………….13 1.1 Astrozytome……………………………………………………...........14 1.1.1 WHO-Klassifizierung………………………………............15 1.1.2 Pilozytisches Astrozytom………………………………….17 1.1.3 Niedriggradiges diffuses Astrozytom…………………….18 1.1.4 Anaplastisches Astrozytom…..…………………………...20 1.1.5 Glioblastom……….………………………………………...21 1.2 Weitere gliale Tumorentitäten……………………………………....24 1.2.1 Pleomorphes Xanthoastrozytom……………………...….24 1.2.2 Gliosarkom………………………………………………….24 1.2.3 Oligodendrogliom…………………………………………25 3 1.2.4 Anaplastisches Oligodendrogliom……………………...25 1.3 Zellulärer Transport durch Mikrovesikel………………………….25 1.3.1 Mikrovesikel………………………………………………..25 1.3.2 ESCRT-System……………………………………………28 1.4 Alix (PDCD6ip)………………………………………………………29 1.4.1 Alix…………………………………………………………..29 1.4.2 Alix in Interaktion mit dem ESCRT-System……….........30 1.4.3 Alix in Interaktion mit weiteren Proteinen………………31 1.4.3.1 Alix in Interaktion mit ALG-2…………………...32 1.4.3.2 Alix in Interaktion mit SETA/Ruk……………...33 1.4.3.3 Alix in Interaktion mit Src…………………........34 1.4.3.4 Alix in Interaktion mit Endophilinen…….........34 1.4.4 Alix und Apoptose………………………………………...35 1.4.5 Alix in Verbindung mit Astrozytomen…………………. 36 1.5 Lipofuscin…………………………………………………………...36 2 Material und Methoden…………………………………………………….37 2.1 Literaturrecherche………………………………………………….37 2.2 Probensammlung………………………………………………….38 2.3 Färbemethode………………………………………………….......39 2.3.1 Färbeprotokoll……………………………………………40 2.4 Fotografische und immunhistochemische Auswertung……...41 2.5 Statistische Auswertung………………………………………….42 2.5.1 R-Studio………………………………………………….42 4 2.5.2 Statistische Testverfahren……………………………..41 2.6 Textverarbeitung………………………………………………….43 3 Ergebnisse………………………………………………………………….43 3.1 Vergleich Anzahl der Mikrovesikel in den unterschiedlichen Tumorgraden nach WHO-Klassifizierung…………………………………………..47 3.2 Vergleich Anzahl der Mikrovesikel in den unterschiedlichen Tumorarealen………………………………………………………….49 3.3 Anzahl der Mikrovesikel in den unterschiedlichen Tumorarealen bezogen auf die einzelnen Tumorgrade nach WHO-Klassifikation……….50 3.4 Anzahl der Mikrovesikel bei dem Zustand einer frischen Tumoreinblutung……………………………………………………...52 3.5 Lipofuscinablagerungen im Vergleich mit den unterschiedlichen Tumorgraden nach WHO-Klassifizierung…………………………53 3.6 Lipofuscinablagerungen im Vergleich mit den unterschiedlichen Tumorarealen…………………………………………………………54 4 Diskussion…………………………………………………………………55 Literaturverzeichnis………………………………………………………….60 Curriculum vitae……………………………………………………………...62 5 Glossar und Abkürzungen ALG-2- Apoptosis-linked gene-2 ALIX- ALG-2-interacting protein X ATP- Adenosintriphosphat Cbl- Casitas B- Lineage Lymphoma CHMP 4- Charged multivesicular body protein 4 EGF- Rezeptor- Epidermal Growth Factor ELISA- Enzym-linked immunosorbent assay ESCRT- Komplex- Endosomal sorting complex required for transport FFPE- Formalin fixed, paraffin embedded tissue GFAP- Glial fibrillary acidic protein K-ras- Kirsten rat sarcoma oncogene MDM2 Gen- Mouse double minute 2 homologe gene MVB- Microvesiculare Bodies PRM- Proline rich motif PRR- Proline rich region PTEN- Mutation- Phosphatase and tensin homolog gene-Mutation Ruk- Regulator of ubiquitous kinase Tsg 101- Tumor susceptibility gene 101 TNFα- Tumor Nekrose Faktor Alpha WHO- World Health Organisation ZNS- Zentralnervensystem 6 Abbildungsverzeichnis Bild 1: MRT-Bild von einem Astrozytom, links und mittig präoperativ, rechts postoperativ Quelle: http://www.neurochirurgie.uniklinikumjena.de/Krankheitsbilder/Gehirn/Hirntumor/Gliome/Astrozytom.html Stand: 07.01.2013, 15:40 Bild 2: Pilozytisches Astrozytom (WHO-Grad I) Quelle: Medizinische Universität Graz, Institut für Pathologie Bild 3: Niedriggradiges diffuses Astrozytom (WHO-Grad II) Quelle: Medizinische Universität Graz, Institut für Pathologie Bild 4: Anaplastisches Astrozytom (WHO-Grad III) Quelle: Medizinische Universität Graz, Institut für Pathologie Bild 5: Glioblastom (Makropräparat) Quelle: http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Datei:Glioblastoma_macro.jpg&filetimestamp=2007 1230194814 Stand: 08.01.2013, 15:00 Bild 6: Glioblastom (Histologisches Präparat) Quelle: Medizinische Universität Graz, Institut für Pathologie Bild 7- Immunhistochemisch markierte Mikrovesikel eines Glioblastoms Bild 8: Immunhistochemisch markierte Mikrovesikel eines anaplastischen Astrozytoms Bild 9: Immunhistochemisch markierte Mikrovesikel eines diffus infiltrierenden Astrozytoms 7 Bild 10: Immunhistochemisch markierte Mikrovesikel eines pilozytischen Astrozytoms Bild 11: Anzahl der Mikrovesikel im Vergleich zwischen Astrozytomen WHO-Grad I,II,III, und IV Bild 12: Vergleich Anzahl der Mikrovesikel mit den unterschiedlichen Tumorarealen Bild 13: Anzahl der Mikrovesikel in den unterschiedlichen Tumorarealen bezogen auf die einzelnen Tumorgrade nach WHO-Klassifikation Bild 14: Anzahl der Mikrovesikel in Abhängigkeit von einer frischen Tumoreinblutung Bild 15: Anzahl der Lipofuscinablagerungen im Vergleich zu den Tumorgraden nach WHO-Klassifizierung Bild 16: Anzahl der Lipofuscinablagerungen im Vergleich mit den unterschiedlichen Tumorarealen 8 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Histologisches Grading und genetische Charakteristika von Astrozytomen (modifiziert nach (Böcker/Denk/Heitz, 2001)) Tabelle 2: Zusammenfassung der Proteine, die mit Alix eine Bindung eingehen (Odorizzi, 2006) Tabelle 3: Tumorgrade und Anzahl der Fälle Tabelle 4: Anzahl der Mikrovesikel im Vergleich zwischen Astrozytomen WHO-Grad I,II,III, und IV Tabelle 5: Anzahl der Mikrovesikel im Vergleich mit den unterschiedlichen Tumorarealen Tabelle 6: Anzahl der untersuchten unterschiedlichen Tumorarealen bezogen auf die einzelnen Tumorgrade nach WHO-Klassifikation Tabelle 7: Mittelwerte der gezählten Mikrovesikel in untersuchten unterschiedlichen Tumorarealen bezogen auf die einzelnen Tumorgrade nach WHO-Klassifikation 9 Abstract Microvesiculare Bodies (MVB`s) are aggregations of singular vesicles, like exosomes, which are shed from many different cells, also from glioma cells. MVB`s from glioma cells were shown in cell cultures in former studies, but never with an immunhistochemic marker protein. This study is the first, in which MVB`s from glioma cells are visualized with an immunhistochemic marker protein on FFPE-tissuesamples. An essential protein-content of MVB`s is the protein Alix. Alix is a cytoplasmatic protein, which is charged in phagosomes an exosomes and interacts with ALG-2. ALG-2 is a calcium-binding protein, which plays a crucial role in apoptosis-signal way. These interactions, which induce apoptosis assume that Alix appears in its original native form with 2 binding-sites. If one of these two bindingsites is missing, the original Alix changes to a muted form, called “mutated Alix”, and now protects the cell from apoptosis. This study investigates the density of MVB`s in astrocytic tumors grade I , grade II, grade III and grad IV immunhistochemically labelled with an antibody against Alix and correlates the density of MVB`s qualitatively and quantitatively referring to the tumor progression according to WHOGrading-Standards. . 10 Zusammenfassung Multivesiculare Bodies (MVB`s) sind Zusammenschlüsse einzelner Vesikel, also Exosomen, die aus den Zellen, auch von Gliomzellen, ausgeschleust werden. Ein wesentlicher Proteinbestandteil in Multivesicular Bodies ist Alix. Alix ist ein zytoplasmatisches Protein, angereichert in Phagosomen und Exosomen, und interagiert mit ALG-2, einem Kalzium bindenden Protein, welches im ApoptoseSignalweg eine große Rolle spielt. Diese Interaktionen, die die Apoptose induzieren, setzen voraus, dass Alix in seiner Ursprungsform mit 2 Bindungsenden auftritt. Fehlt ein Bindungsende wird Alix zum sogenannten mutierten Alix, und dann schützt das Protein die Zellen vor der Apoptose. Diese Studie untersucht auf immunhistochemischer Ebene mit einem Antikörper gegen Alix die Expression von Multivesiculare Bodies in astrozytären Tumoren Grad I, Grad II, Grad III, und Grad IV und korreliert die Expression, qualitativ und quantitativ mit der Tumorprogression gemäß WHO-Grad. . 11 Vorwort Den Entschluss mich mit dem Thema Neuropathologie zu beschäftigen und auch diese Arbeit zu verfassen, fasste ich vor einiger Zeit im Zuge einer Famulatur am Institut für Pathologie der Medizinischen Universität Graz. Da ich mich schon sehr lange für dieses Fach interessiere und im Laufe des Studiums auch das Fach Neurologie für mich entdeckte, war dies die perfekte Gelegenheit diese zwei Disziplinen miteinander zu vereinen. Durch den Anstoß von OA Dr. Martin Asslaber war es mir möglich, mich intensiver mit dem Fach Neuropathologie, speziell mit Astrozytomen, auseinander zu setzen und meine Arbeit über den Mikrokosmos dieser Tumoren verfassen zu können. Zuerst begann ich mich, in die für mich damals noch neue Materie akribisch einzulesen, was meine Leidenschaft für diese Disziplin der Humanmedizin umso mehr entfachte. Nach den ersten Versuchen im Labor erkannte ich die Vielschichtigkeit der Grundlagenforschung erst recht und wurde jeden Tag, den ich mit der Arbeit an diesem Projekt verbrachte neugieriger. Da es zu dem speziellen Thema der Anfärbbarkeit von Mikrovesikeln aus Astrozytomzellen noch sehr wenig Literatur zu lesen gab und meine Literaturrecherche deshalb etwas schwieriger ausfiel als gedacht, war ich gezwungen eine Probe aufs Example zu statuieren. Als ich zum ersten Mal unter das Mikroskop blickte und meine Proben begutachtete war ich stolz, da es mir gelungen war Mikrovesikel immunhistochemisch in FFPE-Proben sichtbar zu machen. Dieses Ergebnis warf für mich einen weiteren Punkt auf, der das Thema noch viel interessanter machte, nämlich den Punkt einer neuen Therapieform, die vielleicht in ferner Zukunft eine Rolle in der Bekämpfung von malignen Tumoren des Zentralnervensystems spielen könnte. Die intensive Beschäftigung mit dem Thema Neuropathologie hat mir während der ganzen Zeit gezeigt, dass das Fach Pathologie an sich auch in Zukunft meinen beruflichen Lebensweg definieren wird, da ich die interdisziplinäre Zusammenarbeit mit sämtlichen Instituten und Kliniken sehr spannend finde und auch der Forschungsaspekt in diesem Fach nicht zu kurz kommt. 12 1 Einleitung Das Zentralnervensystem ist aufgebaut aus vielen verschiedenen Zelltypen und Leitungsbahnen in denen chemische und elektrische Signale wechselseitig ineinander überführt werden. Eine Depolarisierung der Nervenzellmembran führt an der Synapse zur Ausschüttung von Neurotransmittern, die in Abhängigkeit von ihrer chemischen Natur in der nachgeschalteten Zelle über eine Bindung an Rezeptoren eine erregende oder hemmende Wirkung auslösen. Durch diesen Typ der Informationsübertragung kann sich der Organismus sehr kurzfristig auf neue Situationen einstellen. Die Zahl der Nervenzellen im ausgereiften, menschlichen Gehirn wird auf etwa geschätzt. Das Volumen der Nervenzellen und ihrer Fortsätze beträgt im ZNS etwa 60%. (Schröder, 1995, pp. 6-10) „Wird eine Nervenzelle oder eine Zelle des Stützgerüstes, eine sogenannte Gliazelle in ihrem Genom durch verschiedene Umstände verändert, ist sie mutiert und es kann daraus ein Tumor entstehen, der benigne oder auch maligne sein kann. Obwohl Hirntumoren nur etwa 2% aller menschlichen Tumoren ausmachen, spielen sie eine wichtige Rolle, da Menschen aller Altersstufen, auch Kinder, von ihnen betroffen sein können. Am häufigsten unter den bösartigen Hirntumoren sind maligne Gliome, vor allem des Großhirns. Da das Gehirn in den knöchernen Schädel eingeschlossen ist, können alle, also auch gutartige raumfordernde Prozesse, früher oder später zur Hirndrucksteigerung führen, und mit einer lebensbedrohlichen intrakraniellen Massenverschiebung einhergehen. Die klassischen Merkmale der Malignität, also infiltrativ-destruierendes Wachstum und Metastasierung, gelten nur eingeschränkt. Die Tumorinfiltration bleibt in der Regel auf das Hirnparenchym beschränkt und eine hämatogene Streuung in andere Organe ist sehr selten. Die Inzidenz intrakranieller Tumoren liegt in Europa bei 7-10 Neuerkrankungen pro 100000 Einwohner und Jahr und ist weitgehend konstant, außer einer Zunahme bei ZNS-Lymphomen.“ (Böcker/Denk/Heitz, 2001, pp. 313-314) Männer sind insgesamt etwas häufiger betroffen (Männer:Frauen=312:264 im Jahr 2008). (Statistik Austria, 2008) „Trotz ausgedehnter epidemiologischen Studien ist es bisher nicht gelungen 13 Umweltfaktoren zu identifizieren, die für die Entstehung von Hirntumoren verantwortlich sind. Gesichert ist allein die gelegentliche Induktion von Hirntumoren durch therapeutische Dosen ionisierender Strahlen, insbesondere bei Kindern.“ (Böcker/Denk/Heitz, 2001, p. 314) Im Zentrum dieser Arbeit stand die Fragestellung, ob sogenannte Multivesiculare Bodies, also Zusammenschlüsse einzelner Mikrovesikel, die durch Exozytose aus den Zellen ausgeschleust werden, einen Zusammenhang mit der Tumorprogression und/oder die Prognose von Astrozytomen aller WHO-Grade haben, da die Ergebnisse dieser Studie einen neuen Aspekt der Tumorprogression untermauern könnten. 1.1 Astrozytome „Die Astrozytome gehören zur großen Gruppe der Gliome. Ihr Ursprungsgewebe sind die Astrozyten der Glia des Gehirns (bzw. des Rückenmarks).“ (Fischer, 2005, p. 215) „Astrozytome werden nach der WHO-Klassifizierung in 4 Grade eingeteilt, wobei Astrozytome Grad IV auch als Glioblastome bezeichnet werden. Astrozytome nehmen etwa 10-15% der intrakraniellen Tumoren ein. Ihre histologische Zuordnung kann manchmal schwierig sein, da auch Mischformen mit Oligodendrogliomen möglich sind, wobei in Abhängigkeit des relativen Anteils einer oligozytären oder ganglionären Tumorkomponente von Mischgliomen gesprochen wird. Entsprechend ihrer in vielen Fällen meist gutartigen Wachstumstendenz, kann die Anamnese bei Astrozytomen sehr lange sein. Auch bei den bösartigeren Formen sind lange Anamnesen möglich, da es bei den Astrozytomen aus einer gutartigen Vorstufe heraus zu einer bösartigen Entwicklung kommen kann. Entsprechend ihrer Lokalisation im Großhirn überwiegen bei den funktionellen Störungen, die Astrozytome hervorrufen können, Großhirnstörungen. Bei den bösartigeren Formen häufiger als bei den gutartigeren sind Kopfschmerzen, motorische Ausfälle, Epilepsie, ebenso Wesensveränderungen und sonstige psychische Auffälligkeiten, die von der Lokalisation des Tumors im Großhirn abhängen, oft die ersten Symptome. Astrozytome, insbesondere WHO Grad I und WHO Grad II sind nach den Oligodendrogliomen die am häufigsten zu epileptischen Anfällen führenden intrakraniellen Tumoren.“ (Fischer, 2005, pp. 216-217) Der Nachweis von 14 Astrozytomen gelingt am leichtesten mit der Magnetresonanztomographie, wo die gutartigeren Formen kaum Kontrastmittel aufnehmen. Bösartigere Formen der Astrozytome, im speziellen Glioblastome weisen im MRT eine periphere Kontrastmittelaufnahme auf. Auch mittels Computertomographie ist der Nachweis von Astrozytomen nach Kontrastmittelgabe erbringbar. „Entsprechend ihrer Natur als hirneigene Tumore wachsen Astrozytome nicht abgegrenzt vom Hirngewebe sondern diffus infiltrierend, sodass ihre vollständige operative Entfernung praktisch nicht möglich ist. Möglicherweise ergeben sich sicherere Resektionsmöglichkeiten durch die präoperative Gabe von 5-Amino-Lävulinsäure (ALA). Auch wenn eine scheinbar vollständige Tumorentfernung in funktionell nicht bedeutsamen Arealen gelungen ist, rezidivieren Astrozytome in zeitlicher Abhängigkeit ihrer Dignität praktisch immer. Lediglich bei den pilozytischen Astrozytomen (WHO-Grad I) , die typischerweise im Kleinhirn und bei Kindern auftreten, kann nach radikaler operativer Entfernung von einer Heilung ausgegangen werden.“ (Fischer, 2005, p. 217) Bild 1: MRT-Bild von einem Astrozytom links und mittig präoperativ, rechts postoperativ 1.1.1 WHO-Klassifizierung Tumoren des ZNS unterscheiden sich in einigen Aspekten von denen anderer Organe. Um die Verständigung zwischen Pathologen, Neurochirurgen und Onkologen zu erleichtern, wird die biologische Wertigkeit von Tumoren des Nervensystems durch ein histologisches Grading standardisiert. Am weitesten verbreitet ist das Grading der WHO. 15 WHO-Grad WHO-Bezeichnung Histologie Genetische Alteration I Pilozytisches Bipolare, „piloide“ Deletion auf Chromosom Astrozytom Zellen, Rosenthal 17q (<20%), Akkumulation Fasern, eosinophile von P53-Protein (selten) Körperchen II Diffuses Geringe Kernatypien, Astrozytom fibrilläre Matrix Mutation p53 (>70%) (niedriggradig) III Anaplastisches Vermehrt Kernatypien, Mutation p53 (>70%), Astrozytom Mitosen Deletion Chromosom 19q (50%) IV Glioblastoma Kernatypien, Mitosen, Deletion Chromosom 10 multiforme (GBM) Nekrosen, und/oder (>60%) und 19q, Gefäßproliferationen De novo-GBM: EGFRezeptor Amplifikation und Überexpression (60%) PTEN-Mutation (30%), p16-Deletion (30%), MDM2-Amplifikation (<10%). Sekundäres GBM: p53Mutation (>70%) Tabelle 1: Histologisches Grading und genetische Charakteristika von Astrozytomen (modifiziert nach (Böcker/Denk/Heitz, 2001, p. 315) 16 1.1.2 Pilozytisches Astrozytom (WHO-Grad I) „Das pilozytische Astrozytom ist ein langsam wachsender astrozytärer Tumor des Kindesalters mit bevorzugter Lokalisation in den Mittellinienstrukturen des Gehirns. Epidemiologie: Neben dem Medulloblastom ist das pilozytische Astrozytom der häufigste Hirntumor des Kindesalters und manifestiert sich mit einem Altersgipfel um das 10.-13. Lebensjahr. Beide Geschlechter sind gleich häufig betroffen. Seltener treten pilozytische Astrozytome auch bei jungen Erwachsenen auf. Pilozytische Astrozytome umfassen ca. 5-6% aller Gliome. Lokalisation: Zu den bevorzugten Lokalisationen gehören die anatomischen Strukturen um die Mittellinie des Gehirns: Nervus opticus und Tractus opticus (Optikusgliom), Hypothalamus, Thalamus, Basalganglien, medialer Temporallappen, Kleinhirn und Rückenmark. Eine Lokalisation in den Großhirnhemisphären ist seltener. Morphologie: Makroskopisch handelt es sich um knollige, derbe Tumoren mit grauweißer Schnittfläche, oft mit wasserhellen Zysten. Der Tumor infiltriert langsam, unter Auftreibung der ortsständigen Strukturen. Histologisch handelt es sich um zellarme Tumoren mit abwechselnd faserreichen und faserarmen, mikrozystisch aufgelockerten Arealen. In den faserreichen Abschnitten sieht man längliche, bipolare Tumorzellen mit feinen, haarförmigen Fortsätzen. Charakteristisch sind eosinophile, kolbenartige Auftreibungen der Zellfortsätze (sog. RosenthalFasern) und intrazytoplasmatische Proteinablagerungen (sog. eosinophile Körperchen). Mitosen sind sehr selten (Proliferationsfraktion: 1-3%). Auch bei langjährigem Verlauf ist eine maligne Progression sehr selten. 17 Bild 2: Pilozytisches Astrozytom Klinisch-pathologische Korrelationen: Bei Optikusgliomen stehen Sehstörungen im Vordergrund, bei Lokalisation im Zwischenhirn hypothalamische Störungen und bei zerebellären Astrozytomen Gangunsicherheit und Ataxie, aber auch Endokrinopathien können als Symptome in Erscheinung treten. Ein Teil der Symptomatik wird durch die Raumforderung der Tumorzysten hervorgerufen und kann durch stereotaktische Punktion gemindert werden. Ein klinischer Verlauf über viele Jahre ist typisch. Das Kleinhirnastrozytom hat wegen seiner besseren operativen Zugänglichkeit eine günstigere Prognose. Wegen der geringen mitotischen Aktivität ist eine Radio- oder Chemotherapie nicht angezeigt.“ (Böcker/Denk/Heitz, 2001, p. 316) 1.1.3 Niedriggradiges diffuses Astrozytom (WHO-Grad II) „Astrozytome Grad II sind charakterisiert durch eine geringe Wachstumstendenz. Allerdings infiltrieren sie diffus in benachbarte Strukturen, so dass eine vollständige chirurgische Resektion nicht gelingt. Im Verlauf der typischerweise auftretenden Rezidive beobachtet man histologisch eine zunehmende Zellteilungsaktivität, das heißt Anaplasie, und eine Progression zum anaplastischen Astrozytom oder Glioblastom.“ (Böcker/Denk/Heitz, 2001, p. 316) 18 Epidemiologie: Die diffus infiltrierenden, niedriggradigen Astrozytome manifestieren sich bevorzugt bei jüngeren Erwachsenen, mit einem Altersgipfel zwischen dem 30. Und 40. Lebensjahr. Lokalisation: Diffus infiltrierende Astrozytome können in jeder Region des ZNS vorkommen. Gehäuft entstehen sie supratentoriell in den Frontal-und Temporallappen, aber auch der Hirnstamm und das Rückenmark sind Prädilektionsorte. Im Kleinhirn sind Astrozytome Grad II eher ungewöhnlich. (David N. Louis, 2007, pp. 25-29) „Morphologie: Makroskopisch handelt es sich um schlecht abgegrenzte Tumoren mit grauer, oft glasiger Schnittfläche. Wegen des infiltrativen, jedoch nicht destruierenden Wachstums resultiert eine Auftreibung benachbarter ortsständiger Strukturen (z.B. Großhirnrinde, Stammganglien). Im grobfibrillären Faserfilz entwickeln sich oft multiple kleine Pseudozysten mit wasserheller Flüssigkeit.“ (Böcker/Denk/Heitz, 2001, p. 316) Histologisch lassen sich drei Typen unterscheiden. Das fibrilläre Astrozytom zeigt eine geringere Zelldichte und besteht aus isomorphen neoplastischen Astrozyten mit kleinen, runden Zellen in einer kleinzystisch aufgelockerten Matrix. Das gemistozytische Astrozytom ist gekennzeichnet durch eine faserreiche Matrix und durch Tumorzellen mit großem, homogenem Zytoplasma und exzentrischen Kernen. (Böcker/Denk/Heitz, 2001, p. 316) Das protoplasmatische Astrozytom erscheint makroskopisch weicher und regelmäßiger von bereits makroskopisch erkennbaren kleinen Pseudozsyten durchsetzt. Mikroskopisch ist diese grob spongiöse bis klein zystische Gewebsumwandlung deutlicher als bei fibrillären Astrozytomen. Dementsprechend treten diese Faserstrukturen relativ zurück. Stattdessen sind die Perikarya breiter, wenn auch nicht so ausgeprägt wie bei den gemistozytischen Astrozyten. Die Zellfortsätze sind lichtmikroskopisch nur auf kurze Strecken verfolgbar. Intrazytoplasmatische Fibrillen sind nur im geringen Grade nachweisbar. (Remmele, 1984, p. 233) Die Tumorzellen exprimieren entsprechend ihres Ursprungsgewebes GFAP. Mitosen sind selten. 19 Bild 3: Niedriggradiges diffuses Astrozytom Klinisch-pathologische Korrelation: Das Leitsymptom sind cerebrale Krampfanfälle, aber auch Sprachprobleme, Sensibilitätsstörungen, Sehstörungen, oder motorische Ausfälle können bereits früh-anamnestisch auftreten. Bei Tumoren im Frontallappen sind Wesensveränderungen auffällig. (David N. Louis, 2007, pp. 48-49) 1.1.4 Anaplastisches Astrozytom (WHO-Grad III) „Dieser Tumor entwickelt sich häufig aus einem niedriggradigen Astrozytom, kann aber auch de-novo entstehen. Er unterscheidet sich von diesem morphologisch im Wesentlichen durch eine größere Zellteilungsaktivität, die sich klinisch durch ein rascheres Auftreten von Rezidiven manifestiert.“ (Böcker/Denk/Heitz, 2001, p. 316) Epidemiologie: Das anaplastische Astrozytom hat einen Altersgipfel bei ca. 45 Jahren mit einem Geschlechterverhältins von Männer:Frauen 1:6. Lokalisation: Das Astrozytom Grad III ist häufig gleich lokalisiert wie andere diffus infiltrierende Astrozytome, tritt jedoch bevorzugt in den Großhirnhemisphären auf. Morphologie: Gleich wie auch das Astrozytom Grad II hat auch dieser Tumor die Tendenz das umgebende Gewebe zu infiltrieren ohne Gewebe zu zerstören. Makroskopisch sieht man seltener Pseudozysten, jedoch häufig granuläre Areale von weicher Konsistenz. Histologisch bietet sich ein zelldichteres Bild als bei Astrozytom Grad II, ausgeprägtere Kernatypien, und mitotische Aktivität. Regionale und diffuse Hyperzellularität ist ein wichtiges diagnostisches Merkmal. Mikrovaskuläre Proliferationen und Nekrosen fehlen. 20 Bild 4: Anaplastisches Astrozytom Klinisch pathologische Korrelation: Die Symptome sind ähnlich wie beim Astrozytom Grad II. Im Falle einer Progression eines Astrozytoms Grad III treten zunehmend neurologische Defizite, cerebrale Krampfanfälle und Hirndruckzeichen auf. (David N. Louis, 2007, pp. 30-32) 1.1.5 Glioblastom (WHO-Grad IV) „Das Glioblastom ist ein hochmaligner glialer Tumor astrozytären Ursprungs, der sich bevorzugt im höheren Erwachsenenalter (50.-60. Lebensjahr) manifestiert. Es ist der häufigste astrozytäre Tumor und macht 15-20% aller Hirntumoren aus. Das Glioblastom kann sich aus einem niedriggradigen Astrozytom entwickeln, oder mit sehr kurzer klinischer Anamnese, de-novo entstehen.“ (Böcker/Denk/Heitz, 2001, p. 317) Ätiologie und Pathogenese: Die Ätiologie der Glioblastome ist unbekannt. Es lassen sich klinisch sowie molekulargenetisch zwei Glioblastomtypen unterscheiden. Das primäre Glioblastom manifestiert sich meist bei älteren Patienten nach kurzer Anamnese de-novo und ist genetisch charakterisiert durch Amplifikation und/oder Überexpression des EGF- Rezeptors, PTEN- Mutationen, p16- Deletionen und, seltener, eine Amplifikation des MDM2- Gens. Das sekundäre Glioblastom entwickelt sich durch Tumorprogression aus einem niedriggradigen oder anaplastischen 21 Astrozytom, betrifft meist Patienten im mittleren Lebensalter und enthält in mehr als 70% der Fälle eine Mutation des p53- Tumorsuppressorgens. (Böcker/Denk/Heitz, 2001, pp. 316-317) Lokalisation: Das Glioblastom ensteht am häufigsten in der subcorticalen weißen Substanz der Großhirnhemisphären. Zu den meist betroffenen Regionen zählen der Temporallappen (31%), der Parietallappen (24%), der Frontallappen (23%) und der Occipitallappen (16%). Vor allem die kombinierte fronto-temporale Erscheinungsform ist typisch. Das Kleinhirn und das Rückenmark sind als Tumorlokalisation eher selten. (David N. Louis, 2007, pp. 33-47) „Morphologie: Makroskopisch weisen Glioblastome eine charakteristische „bunte“ Schnittfläche auf mit gelblichen Nekrosen, Blutungen und grau- weißem Tumorgewebe. Das Glioblastom hat eine ausgeprägte Neigung zum diffusinfiltrativen Wachstum. Es breitet sich besonders rasch entlang kompakter Myelinbahnen aus. Typisch ist eine Ausdehnung über den Balken in die kontralaterale Hemisphäre, wodurch neuroradiologisch und makroskopisch das Bild bilateral symmetrischer Glioblastome entsteht (sogenanntes Schmetterlingsgliom). Histologisch handelt es sich um zellreiche, meist polymorphe Tumoren mit sehr hoher Mitoserate (Wachstumsfraktion: 8-25%). Typisch, aber nicht obligat, sind die mehrkernigen Riesenzellen. Für die Diagnose entscheidend ist das Vorkommen flächenhafter oder strichförmiger Nekrosen, um die sich die Tumorzellkerne radiär anordnen (Pallisadenstellung der Kerne). Weiteres typisches Merkmal sind ausgeprägte Gefäßproliferationen, insbesondere in der Infiltrationszone des Tumors. Sie werden durch ein von den Gliomzellen sezerniertes angiogenetisches Protein (VEGF) induziert. Immunhistochemisch lässt sich trotz fortgeschrittener Entdifferenzierung zumindest in einem Teil der Tumorzellen GFAP nachweisen.“ (Böcker/Denk/Heitz, 2001, pp. 316-317) 22 Bild 5: Glioblastom (Makro-Präparat) Bild 6: Glioblastom (histologisches Präparat) 23 Klinisch-pathologische Korrelation: Die klinische Anamnese ist beim Glioblastom meist kurz, in 50% der Fälle sogar unter 3 Monaten, außer es ist sekundär entstanden. Die führenden Symptome wie Kopfschmerzen, Übelkeit und Erbrechen, oder Papillenödeme sind auf die Hirndrucksteigerung zurückzuführen. Ein Drittel der Patienten erleiden einen epileptischen Anfall. Nicht neurologische Symptome wie Wesensveränderungen können ebenfalls auftreten. (David N. Louis, 2007, pp. 33-47) 1.2. Weitere gliale Tumorentitäten Neben den Astrozytomen gibt es noch andere gliale Tumoren des ZNS die in dieser Arbeit kurz erwähnt werden sollten. 1.2.1 Pleomorphes Xanthoastrozytom Das Pleomorphe Xanthoastrozytom wird definiert als eine astrozytäre Neoplasie mit pleomorphen Zellen und Lipideinlagerungen. Dieser Tumor wird histologisch als WHO-Grad II angesehen und tritt häufiger bei Kindern und im jungen Erwachsenenalter auf. Lokalisiert ist das pleomorphe Xanthoastrozytom bevorzugt in den Großhirnhemisphären einschließlich den Meningen. Aufgrund der oberflächlichen Lage dieses Tumors sind die Symptome häufig epileptische Anfälle mit langer Anamnese. Makroskopisch erscheinen diese Tumore typischerweise oberflächlich und in Kontakt mit den Meningen. Sie sind öfters begleitet von einer Zyste mit einer knotigen Zystenwand. Histologisch ist das pleomorphe Xanthoastrozytom vor allem durch das variable Erscheinungsbild geprägt. Es finden sich spindelige Zellen, wie auch ein-oder mehrkernige Riesen-Astrozyten die teilweise so dicht gepackt sind, dass ein epitheloider Charakter entsteht. Auch xanthomatöse Zellen mit Lipideinlagerungen sind Bestandteil dieses Tumors. Die Prognose dieser Entität ist günstig. (David N. Louis, 2007, pp. 22-24) 1.2.3 Gliosarkom Das Gliosarkom ist eine Variante des Glioblastoms, die durch ein biphasisches Gewebemuster mit alternierenden Arealen von glialer und mesenchymaler Differenzierung charakterisiert ist. Histologisch ist diese Tumorentität einem WHO24 Grad IV zuzuordnen. Lokalisiert ist das Gliosarkom bevorzugt in den Großhirnhemissphären, einschließlich des Temporal-, Frontal-, Parietal-, und Occipitallappens. Die klinischen Symptome sind ähnlich derer des Glioblastoms in Abhängigkeit von der Tumorlokalisation. Makroskopisch zeigt sich das Gliosarkom kompakt und gut umschrieben, die radiologisch mit den Charakteristika einer Metastase oder dem Erscheinungsbild eines Meningeoms einhergehen . Histologisch erscheint dieser Tumor mit einer Mischung aus glialem und sarkomatösem Gewebe. Die Prognose des Gliosarkoms ist mit der Prognose des Glioblastoms zu vergleichen. (David N. Louis, 2007, pp. 48-49) 1.2.4 Oligodendrogliom Das Oligodendrogliom ist ein diffus-infiltrierendes und gut differenziertes Gliom, welches bevorzugt im Erwachsenenalter auftritt. Histologisch wird dieser Tumor als WHO-Grad II klassifiziert. Bevorzugt lokalisiert ist das Oligodendrogliom in den Großhirnhemisphären, vor allem im Kortexbereich. Symptome des Oligondendroglioms sind häufig cerebrale Krampfanfälle, Kopfschmerzen und andere Zeichen des erhöhten Hirndrucks. Makroskopisch imponiert das Oligodendrogliom als weiche, gut definierte Tumormasse mit grau-rosa Farbe. Tumore mit mukoider Degeneration erscheinen gelatinös. Histologisch wird das Oligodendrogliom durch monomorphe Zellen mit einheitlichen runden Zellkernen und perinukleären Halos (sogenanntes Honigwabenmuster) charakterisiert. Typisch sind Mikrokalzifikationen, und ein dichtes Netzwerk von verzweigten Kapillaren. Es können auch mukoidzystische Degenerationen auftreten. Prognostisch haben Oligodendrogliome ein langsames Wachstum und die Patienten deshalb auch eine relativ lange Überlebenszeit. (David N. Louis, 2007, pp. 54-59) 1.2.5 Anaplastisches Oligodendrogliom Das anaplastische Oligodendrogliom ist ein Oligodendrogliom mit fokalen und diffusen histologischen Eigenschaften der Malignität. Histologisch wird es als WHOGrad III klassifiziert. Dieser Tumor tritt gehäuft im Erwachsenenalter mit einem Altersgipfel bei 45-50 Lebensjahren auf. Lokalisiert ist das anaplastische Oligodendrogliom vor allem im Frontallappen und im Temporallappen. Es entwickelt sich entweder de-novo, oder aus einem vorbestehenden Oligodendrogliom WHOGrad II. Als häufigstes Symptom treten cerebrale Krampfanfälle in Erscheinung. 25 Makroskopisch sieht das WHO-Grad III Oligodendrogliom ähnlich aus wie das WHOGrad II Oligodendrogliom mit dem Zusatz von Nekrosearealen. Histologisch zeigt dieser Tumor morphologische Variationen mit entrundeten, hyperchromatischen Zellkernen, perinukleäre Halos, und Mikrokalzifikationen. Auch Riesenzellen oder Spindelzellen können auftreten. Charakteristisch sind vor allem verzweigte Kapillaren. (David N. Louis, 2007, pp. 60-62) 1.3 Zellulärer Transport durch Mikrovesikel 1.3.1 Mikrovesikel Als Vesikel bezeichnet man im Allgemeinen membranbegrenzte Bläschen. Diese Bläschen bilden eigene Zellkompartments, in denen in der Regel unterschiedliche Prozesse auf zellulärer Ebene ablaufen. Es gibt verschiedene Arten von Vesikeln. Zum einen gibt es Vesikel, die in die Zelle eingeschleust werden, um Makromoleküle, Partikel, Mikroorganismen oder Zellen durch Phagocytose oder Pinocytose in das Innere der Zelle zu bringen. Diesen Vorgang nennt man Endocytose. Zum anderen gibt es Vesikel, die durch Exocytose Materialen wie Proteine, mRNA oder auch Neurotransmitter aus der Zelle herausschleusen. Dies geschieht, indem das austretende Material von internen Cytomembranen, meist vom Golgi-Apparat stammend, umschlossen und abgeschnürt wird. Die Exocytose wird lokal durch besondere Signalsubstanzen stimuliert. Vesikel entstehen dadurch, dass, nachdem eine Signalsubstanz ausgeschüttet wurde, an der Zelloberfläche Teile der Plasmamembran nach innen eingestülpt werden und diese so eine abschnürbare Form bildet. Dieses abgeschnürte Bläschen nennt man dann Exosom oder auch Mikrovesikel. Vesikel dienen also grundlegend dem zellulären Transport, indem sie nach der Exocytose durch den Interzellularraum wandern, um mit Membranen anderer Kompartimente zu fusionieren. Um sich fusionieren zu können, benötigen Vesikel gewisse Oberflächeneigenschaften, die durch eine Reihe von Proteinen, den sogenannten Oberflächenrezeptoren, gebildet werden. Diese Oberflächenrezeptoren sind dafür zuständig, dass die aufzunehmenden Vesikel an ihrer Oberflächenstruktur von Zellen erkannt werden, und mit der aufnehmenden Zelle eine Bindung eingehen können. Diesen Transportweg nennt man rezeptor-vermittelte Endocytose. 26 Mikrovesikel im speziellen sind ebenfalls Teile der Plasmamembran, und haben einen Durchmesser von zirka 50-100nm. Sie schleusen Zellbestandteile in Form von mißgefalteten Proteinen, Metabolisierungsprodukten, oder zelltoxische Substanzen aus der Zelle aus, und bilden auch einen wichtigen Teil in der Kette der interzellulären Kommunikation. Es gibt 3 verschiedene Wege wie Mikrovesikel aus der Zelle gelangen können. Sie können durch den oben beschriebenen Vorgang der Exocytose in den Extrazellularraum geschleust werden, durch das sogenannte „budding“, der Vesikel-Knospung direkt von der Plasmamembran aus der Zelle gelangen, oder auch durch den Vorgang der Apoptose durch das sogenannte „blebbing“ aus der zu Grunde gehenden Zelle austreten. Sie werden bei verschiedenen biologischen Prozessen freigesetzt, unter anderem auch während der Zelldifferenzierung. Weitere Prozesse, bei denen Mikrovesikel freigesetzt werden sind Stimulationen mit Zytokinen, Scherkräfte, Stress oder aktivierende Prozesse, die auf die Zellen einwirken, und auch Alterungsprozesse der Zellen. Da verschiedene Studien zu dem Ergebnis kamen, dass auch mRNA, microRNA , Proteine und sogar aktive Onkogene inhaltlicher Bestandteil von Mikrovesikeln sein können, die von unterschiedlichen Tumorzellen wie beispielsweise Gliomzellen ausgeschleust werden, wurde den Mikrovesikeln allmählich eine wichtige Rolle als Mediator in der Tumorprogression zugeschrieben. Mikrovesikel werden auch während der malignen Transformation der Zelle auf Grund von mutierten Onkogenen wie zum Beispiel K-ras und EGFR ausgeschleust und ebenso wegen der Aktivierung oder den Verlust des p53-Tumorsuppressorgenes in verschiedenen Tumor-Settings in Erscheinung treten. Mikrovesikel können auch an der Freisetzung von Angriffskomplexen des Komplementsystems teilnehmen oder an immunmodulierdenden Aktivitäten beteiligt sein. Es wurde auch festgestellt, dass der Inhalt von Mikrovesikeln nicht aus zufälligen Ansammlungen von Zellinhalten besteht, sondern dass die Inhalte durch einen hochselektiven Prozess zusammengestellt werden. Im endocytotischen Pathway spielt dabei der ESCRT-Komplex eine große Rolle. Wie genau dieser Prozess abläuft ist derzeit noch unklar. (Khalid Al-Nedawi, 2009, pp. 2014-2018) Multivesicular bodies sind also Zusammenschlüsse einzelner Mikrovesikel. Zu diesem Zusammenschluss kommt es ebenfalls unter anderem durch das ESCRTSystem. 27 1.3.2 ESCRT-System Zellen müssen sich ständig an ihre Umgebung anpassen, und das geschieht dadurch, indem spezifische Komponenten der Zelloberfläche neu hinzugefügt oder entfernt werden. Werden aktivierte Wachstumsfaktoren, wie zum Beispiel EGFR nicht abgebaut, führt das in der Regel zu verstärkter Zellteilung, und dies begünstigt die Krebsentstehung. Der Endosomal sorting complex required for transport, kurz auch ESCRT-Komplex genannt, ist grob gesagt ein molekularer Verpackungsautomat für Rezeptoren. Dieser Komplex ermöglicht die Membranspaltung, während der Bildung von MVB`s, das Budding von behüllten Viren, und spielt auch eine Rolle in der Cytokinese. Das ESCRT-System besteht aus 4 verschiedenen Komplexen, ESCRT- 0, -1, -2, und -3, die wiederrum aus zytosolischen Proteinen bestehen. Diese Komplexe werden benötigt für die Erkennung und die Sortierung von ubiquitin-modifizierten Cargo-Proteinen in die internalen Vesikeln von MVB`s. Als Cargo-Proteine bezeichnet man alle Proteine, die in den Vesikeln vorhanden sind, das heißt die Ladung der Vesikel an Proteinen. Das Sortieren benötigt ein oder mehrere Ubiquitin-Tags, die zu den cytosolischen Domänen der Membranproteine hinzugefügt werden. Ubiquitin ist ein Regulatorprotein, welches an Proteine bindet um sie zu den Proteasomen zu führen, die wiederrum ihrerseits Proteine abbauen und danach recyclen. Diese UbiquitinTags werden von der ESCRT-Maschinerie erkannt und der ESCRT-Komplex bindet sequentiell. Die einzelnen ESCRT-Komplexe arbeiten zusammen, um die CargoProteine von einem Komplex zum nächsten zu führen. Dabei sortieren sie durch eine Bindung die ubiquinierten Cargo-Proteine in Subregionen der endosomalen Membran. Von dort aus können sie dann schließlich in MVB`S inkludiert werden. (Alberts Bruce, 2008, pp. 795-797) ESCRT`s werden durch virusähnliche Proteine, die Proline rich motifs (PRM`s) die so genannte Late Domains enthalten, zu den Budding-Sites rekrutiert. PRM`s sind oft in großen Mengen zusammengruppiert, in so genannten Proline rich regions (PRR`s), mit bis zu 150 PRM`s. (Ren X, 2011, pp. 1282-1290) Zusammenfassend ist die ESCRT- Maschinerie für den Abbau der Oberflächenrezeptoren verantwortlich. Sie produziert kleine Container, in denen die Rezeptoren für den Transport in die Lysosomen, also den Ort ihres Abbaus, verpackt werden. Diese Container sind die oben beschriebenen MVB`s. Der eigentliche Verpackungsschritt wird vom ESCRT-328 Komplex gesetzt, der wahrscheinlich ein ringförmiges Proteinfilament als Kopiervorlage für die ca. 25 nm großen MVB`s bildet. (Teis D., 2010, pp. 871-883) 1.4 Alix (PDCD6ip= Programmed cell death 6-interacting protein) 1.4.1 Alix Alix, oder auch PDCD6ip genannt, ist ein zytosolisches Protein, welches aus 869 Aminosäuren besteht mit 2 Bindungsenden, dem C-Terminal und dem N-Terminal, zwischen denen eine Mittelregion liegt. PDCD6ip ist angereichert in Exosomen. Das C-Terminal dieses Proteins interagiert mit der Mehrheit der Proteine, die Alix mit biochemischen Prozessen in Verbindung bringen. Dieses Terminal bindet Endophiline, Cbl-Interacting proteine (= CIN 85) und Tsg 101. Endophilin ist ein SH3Domänen Protein, welches in der Clathrin mediierten Endocytose eine Rolle spielt. CIN85 ist ein Adapterprotein, welches ebenfalls an der Regulation verschiedener Signalübertragungswege bezüglich der Endocytose mitwirkt. (http://www.phosphosite.org/proteinAction.do?id=8642&showAllSites=true, 13.01.2013, 16:40) Tsg 101 ist ein Gen, welches für ein gleichnamiges Protein codiert, das zu einer Gruppe von inaktiven Homologen von ubiquitin-konjugierten Enzymen gehört. (Katzmann DJ, 2002, pp. 893-905) Die Mittelregion beinhaltet sogenannte coiled-coil motifs. Dieser Begriff bezeichnet eine stabile, lineare Domäne, die aus mindestens 2 Einzelhelices besteht, die umeinander gewunden sind, und potentielle Bindungsorte für zusätzliche PartnerProteine darstellen. (Pan, 2006, pp. 34640-34650) Das N-Terminal vermittelt die Lokalisierung von Endosomen. Dieses Terminal ist gleichzusetzten mit der sogenannten Bro1-Domäne und bindet CHMP4 (Charged multivesicular body protein 4). Die Bro1-Domäne ist eine Protein-Domäne, die in etwa 390 Aminosäuren lang ist und in verschiedenen eukaryoten Proteinen, unter anderem auch in Alix, zu finden ist. Diese Protein- Domäne wirkt dabei mit, Proteine gezielt in die Vesikel und Lysosomen zu transportieren. Unter anderem bindet die Bro1-Domäne von Pilz- wie auch von Säugetierproteinen an den oben beschriebenen ESCRT-Komplexen, genauer gesagt an den ESCRT-3-Komplex. Dies 29 hat zur Folge, dass Proteine, die eine Bro1-Domäne enthalten, dadurch zu den Endosomen geführt werden können und so in die Vesikel gelangen. (Sadoul, 2006, pp. 69-77) Zusätzlich wurde beobachtet, dass der Verlust der Funktion der Bro1Domäne in Hefe-Kulturen zu einer verminderten Expression von Oberflächenproteinen führt, welche normalerweise endocytotisch abgebaut werden und zu den Vesikeln transportiert werden. Die verschiedenen biologischen Funktionen von Alix sind im Wesentlichen von den Funktionen der Proteine, mit denen Alix interagiert abzuleiten. (Odorizzi, 2006, pp. 3025-3032) 1.4.2 Alix in Interaktion mit dem ESCRT-System Alix arbeitet in verschiedener Weise mit den ESCRT-Komplexen zusammen. Es interagiert mit dem ESCRT- 1-und ESCRT- 2-Komplex durch ubiquitin-bindende Domänen am C-Terminalen Ende. Dies geschieht über die Tsg101- Untereinheit im ESCRT-1-Komplex. Mit dem ESCRT-3-Komplex interagiert Alix in Form von CHMP4, einem Protein welches an der Membranspaltung wesentlich beteiligt ist, am NTerminalen Ende. Im Gegensatz zum ESCRT-1-Komplex fehlen dem ESCRT- 3Komplex Untereinheiten, die ubiquitin-bindende Domänen enthalten, deshalb rekrutiert der ESCRT-3-Komplex Alix und auch andere Proteine zu den Endosomen. Alix bindet an jede CHMP4-Protein Isoform, wobei dieses Protein den vorherrschenden Interaktionspartner für Alix darstellt, da das N-Terminal die gesamte Bro1-Domäne umfasst und so an alle 3 CHMP4-Isoformen die es gibt binden kann. Nach der Bro1-Domäne folgt an diesem Bindungsende eine Struktur namens VDomäne, welche der Bindungsort von LYPXnL-motif, und die eine sogenannte Late Domain für das Virus-Budding ist. Einige behüllte Viren codieren Proteine, die diese Late-Domains beinhalten, und die eine direkte Bindung mit Alix eingehen, wie zum Beispiel das EIAV, Murine Leukaemia Virus, oder HIV-1. Somit wurde festgestellt, dass auch Viren Alix benutzen um die ESCRT-Maschinerie zu rekrutieren, da erst durch Membrandeformationen das Virus-Budding ermöglicht wird. Der HI-Virus zum Beispiel, „entführt“ so zu sagen die ESCRT-Maschinerie um sich selbst an der Membran von infizierten Zellen zu verpacken und danach abzulösen. Dabei leitet Alix die Retroviren während des Budding-Vorganges zu den ESCRT-Komplexen durch eine Interaktion mit CHMP4 an der N-terminalen Bro1-Domäne. (Odorizzi, 2006, pp. 3025-3032) Danach folgt das C-Terminal mit der PRR. 30 Alix und die ESCRT-Maschinerie spielen auch eine Rolle bei der Regulation von Wachstumsfaktoren, wie dem EGFR. Durch den Anstieg von ESCRT-vermittelten Proteinsortierungsprozessen werden Wachstumsfaktoren durch Endocytose an der Plasmamembran herunter reguliert. Dieser Prozess verhindert eine weitere Zellteilung. Die spezifische Rolle von Alix im ESCRT-vermittelten Sortieren von Proteinen ist noch nicht ganz fassbar, jedoch hat man bereits festgestellt, dass die Bro1-Domäne in Hefe-Kulturen die Deubiquitinierung von MVB-Inhalten in Form von Proteinen unterstützt. (Odorizzi, 2006, pp. 3025-3032) 1.4.3 Alix in Interaktion mit weiteren Proteinen Alix interagiert mit einer Reihe von Proteinen, indem es mit ihnen eine Bindung eingeht. Wichtig bei diesen Vorgängen ist nicht nur an welchem Bindungsende Alix sich mit den jeweiligen Bindungspartnern einlässt, sondern auch um welches Protein es sich handelt. Alix-binding protein TSG101 (ESCRT-I) CHMP4* (ESCRT-III) Gag† SETA Alix-binding motif Binding site in Alix Cellular activity UEV domain Unknown P717SAP720 MVB sorting and viral budding Bro1 domain, Patch 1 Unknown P740TPAPR745 MVB sorting and viral budding Endophilin SH3 domain SH2 domain P755ARPPPP761 Src SH3 domain P752QPPAR757 ALG-2 Unknown PGY repeats (aa 802-813) Src YPxnL SH3 domain Phospho-Y319 Viral budding Growth factor receptor endocytosis; focal adhesion remodeling Growth factor receptor endocytosis Growth factor receptor endocytosis; focal adhesion remodeling Growth factor receptor endocytosis; focal adhesion remodeling Apoptosis Tabelle 2: Zusammenfassung der Proteine, die mit Alix eine Bindung eingehen 31 1.4.3.1 Alix in Interaktion mit ALG-2 Wie das Synonym Alix (ALG-2 interacting-protein X) bereits vermittelt, ist die Bindung, die Alix mit dem ALG-2 (Apoptosis-Linked Gene-2) eingeht besonders hervorzuheben. ALG-2 ist ein kalzium-bindendes Protein, welches im ApoptoseSignalweg eine große Rolle spielt. Alix wurde erstmals durch die Bindung mit ALG-2 identifiziert. Besonders bei neuroepithelialen Zellen ist die Bindung zwischen Alix und ALG-2 eine Voraussetzung um den Zelltod durch Apoptose zu induzieren. Im ZNS verursacht der kalzium-induzierte Zelltod, der in der Toxizität von Glutamat seinen Ursprung hat, eine massive Zunahme der endolysosomalen Aktivität. ALG-2 wurde als erstes als Protein in einer T-Zelllinie beschrieben, dessen Expression für die TZellrezeptor-, Fas-und Glukokortikoid-induzierte Apoptose benötigt wird. Die Korrelation der vermehrten Expression von Alix mit dem Zelltod wurde das erste Mal in vivo in Neuronen von Ratten-Hippocampi beobachtet. Den Ratten wurde bei diesem Versuch Kainsäure, eine pflanzliche Glutaminsäure, die excitotoxisch wirkt, intraperitoneal injiziert. Auf diese Injektionen hin wurde der Hippocampus geschädigt und es kam zu epileptischen Krampfanfällen. Die Regionen der Hippocampi, die am meisten vom Zelluntergang betroffen waren, zeigten einen Anstieg der Expression von Alix. Der Verlust der Neuronen wurde verursacht durch einen Kalziumeinstrom durch die Glutamatrezeptoren, der wiederrum von einer massiven Steigerung der Endocytose und Autophagie begleitet war. Somit wurde beobachtet, dass eine Überexpression von Alix notwendig ist, um die Apoptose in den Neuronen zu induzieren. Der Pro-apoptotische Effekt von Alix ist streng abhängig von der Bindung mit ALG-2, da man auch beobachtet hat, dass Alix-Proteine ohne einer gewissen Struktur, die für die Bindung mit ALG-2 notwendig ist, keinen negativen Effekt auf das Überleben der Zellen hat. Andererseits wurde auch in ovo (an einem Hühnerembryo) und in vivo gezeigt, dass Alix Caspase-Aktivitäten und den Zelltod blockieren kann, wenn eine verkürzte Version des Proteins dominant agiert. Die Hypothese in Bezug auf Alix und ALG-2 besagt also, dass ALG-2 auf abnormale Kalziumfluktuationen reagiert, indem es an Alix bindet, und eine Caspase aktiviert, deren Aktivität einen Teil der Endosomenmaschinerie darstellt. (Sadoul, 2006, pp. 69-77) Auch in anderen Studien wurde dargestellt, dass eine Überexpression von Alix in neuroepithelialen Zellen von Hühnerembryonen die Apoptose begünstigt, mit einer mutierten Expression des C-Terminals allerding genau das Gegenteil bewirkt, nämlich die Blockierung der ESCRT-Maschinerie und somit das Verhindern des natürlichen 32 Zelltodes. Die Deletion des Bindungsendes an Alix für ALG-2 setzt die proapoptotische Funktion von Alix außer Kraft und verwandelt das Protein in einen Hemmer des natürlichen Zelltodes. In dieser Studie wurde auch gezeigt, dass die antiapoptotischen Eigenschaften der Bindung, die Alix mit ALG-2 eingeht, blockiert werden, wenn die 4 Aminosäuren durch Mutationen verloren gehen, die für die Tsg101/ESCRT-1-Bindung notwendig sind. Deshalb geht man davon aus, dass die Proteine Alix und ALG-2 mit den ESCRT-Proteinen eine Bindung eingehen müssen um den Zelltod zu hemmen. (Mahul-Mellier, 2006, pp. 542-549) 1.3.3.2 Alix in Interaktion mit SETA/Ruk Das Kürzel SETA steht für ein Protein namens SH3-domain Expressed in Tumorigenic Astrocytes. Ein Synonym für SETA ist auch das Kürzel Ruk, welches Regulator of ubiquitous kinase bedeutet. Es ist ein Adaptorprotein, welches eine SH3-Domäne beinhaltet und eine wesentliche Rolle in der EGFR-Signalkaskade spielt. Eine Expression von SETA wurde sowohl in Rattengliomen, als auch in humanen Astrozytomen Grad II, III, und IV, sowie auch in Oligendendrogliomen und Oligoastrozytomen verglichen. Die Expression von SETA wird unter anderem mit dem Grad der malignen Entartung von Astrozyten assoziiert. Die Überexpression von SETA-Proteinen, die fähig sind mit Alix eine Bindung einzugehen, macht Astrozyten empfindlich für den UV-Licht-induzierten Zelltod. (Chatellard-Causse, 2002, pp. 29108-29115) Alix und SETA wurden in fokalen Adhäsionen von Astrozyten gefunden, und es wurde festgestellt, dass Alix mit der Tyrosinkinase Pyk2 (phosphotyrosin kinase-2) eine Bindung eingehen kann. Diese Interaktion reguliert die Zelladhäsion negativ, und nachdem Alix auch mit Endophilin interagiert, wurde auch der direkte Effekt von Alix auf Tyrosinkinaserezeptoren untersucht. Das Ergebnis war, dass Alix nur dann an EGFR binden kann, wenn es auch mit SETA eine Bindung eingegangen ist. (Schmidt, 2004, pp. 3414-3425) Die Zelladhäsion wird nicht nur durch das Zusammenspiel von Alix und SETA sondern auch durch die negative Regulation von Alix durch Src beeinflusst. Src ist ein Proto-Onkogen, welches für eine Tyrosinkinase codiert, und gehört zur Familie der Non-ReceptorTyrosinkinasen. Diese Proteinkinase wird durch die Stimulation von EGFR aktiviert. Alix antagonisiert aber auch die EGFR-Endocytose durch eine Interaktion von SETA mit Cbl. Cbl ist eine E3 Ubiquitin-Protein-Ligase, die im Zellsignalweg und der 33 Protein-Ubiquitinierung eine Rolle spielt. Das geschieht, indem eine Überexpression von Alix verhindert, dass der SETA-Endophilin-Komplex an Cbl bindet. Dies führt folglich zu einer Reduktion der endocytotischen Aufnahme von EGFR. (Odorizzi, 2006, pp. 3025-3032) 1.4.3.3 Alix in Interaktion mit Src Wie oben bereits beschrieben ist Scr eine Proteinkinase, die in der Zellentwicklung und im Zellwachstum eine Rolle spielt. Die Entdeckung dieser Proteinkinase trug maßgeblich zum modernen Verständnis von Krebs bei. Alix wird in einem zweiteiligen Prozess durch Scr negativ reguliert. Zuerst bindet die SH2-Domäne von Src an einen Phosphotyrosin-Rest an der Bro 1-Domäne von Alix. Danach bindet die SH3-Domäne von Scr an ein anderes Prolin-based-motif am C-terminalen Ende von Alix. Aufgrund dieser Interaktion hyperphosphoriliert Scr Alix und schafft so erst die Grundlage, dass Alix auch mit SETA interagieren kann. Zusätzlich verursachen diese Bindungen, dass SETA wieder ins Cytosol transferriert wird und neutralisieren die negative Auswirkung von Alix auf die Rezeptor-Endocytose von EGFR. (Odorizzi, 2006, pp. 3025-3032) 1.4.3.4 Alix in Interaktion mit Endophilinen Endophiline sind SH3-Domänen Proteine, welche in der Clathrin mediierten Endocytose eine Rolle spielen. Es gibt verschieden Typen von Endophilinen, die alle samt essentielle Elemente für den Proteinverkehr zwischen den Zellen sind. Sie haben einen maßgeblichen Beitrag in der Vesikel-Endocytose, Apoptose, im Rezeptor-Trafficking und an anderen Prozessen, bei denen die Membran-Struktur umgebaut wird. Alix bindet an Endophiline und bewirkt auch mit dieser Bindung die cytoplasmatische Vakuolisierung. Alix interagiert mit 3 Proteinen, die als Endophiline oder EEN-Proteine bekannt sind, nämlich SH3p4, SH3p8 und SH3p13. Diese 3 Proteine teilen sich alle beinahe identische SH3-Domänen und sind dafür bekannt, die Regulation der Membran-Form während der Endocytose zu regulieren. Möglicherweise geschieht dies durch ihre lysophosphatische Acyltransferasenaktivität oder durch regulierende Proteine mit denen sie durch ihre SH3-Domäne interagieren. Es wurde auch beobachtet, dass das C-Terminale Ende von Alix, welches ja im Falle einer Überexpression für die Blockierung der Apoptose 34 verantwortlich ist, die Produktion eines tubulovesikularen cytoplasmatischen Kompartments, welches Proteine beinhaltet, die im Endoplasmatischen Retikulum vorkommen, induziert. Wenn das gleiche C-terminale Ende von Alix mit Endophilinen co-exprimiert wird, werden die Vakuolen drastisch vergrößert und können sogar einen Durchmesser von bis zu einigen Mikrometern erlangen. (Chatellard-Causse, 2002, pp. 29108-29115) 1.4.4 Alix und Apoptose Die Fähigkeit von Alix die Apoptose zu induzieren hängt, wie bereits vorher schon beschrieben, strikt von der Bindung zu ALG-2 ab. Die Expression von Alix wird durch die Bindung mit ALG-2 gesteigert und triggert die Caspase-Aktivierung und die Apoptose ohne pro-apoptotische Signale. Wenn die Bro-1 Domäne von Alix funktionslos ist, schützt Alix allerdings die Zellen vor der Apoptose („mutated alix“). Deshalb vermutet man, dass Endosomen die Plattform für diverse Signalwege sind, die den Alix-ALG-2–Komplex beinhalten. (Odorizzi, 2006, pp. 3025-3032) Diese Interaktion zwischen Alix und ALG-2 korreliert mit dem natürlichen Zelltod in vivo auch in Neuronen. Es wurde entdeckt, dass zu Grunde gehende Neuronen Caspase8 und Alix beinhalten. Dafür geht Alix nicht nur eine Bindung mit ALG-2 sondern auch mit der pro-Caspase-8 ein. Dieser Komplex an gebundenen Proteinen geht seinerseits wiederrum eine Bindung mit dem Komplex des TNFα-Rezeptor-1 ein. Dieser Schritt ist allerdings von der Bindungskapazität des Komplexes an den ESCRT-Proteinen abhängig. Also ist auch der ESCRT-Komplex ein wichtiges Glied in der Kette der Protein-Interaktionen bis zum natürlichen Zelltod. Die Endocytose des TNFα-Rezeptor-1 ist nur möglich, wenn dieser vorher an TNFα gebunden hat. Die Endocytose dieses Zytokines ist ein notwendiger Schritt für die Aktivierung der Caspasen und folglich auch für die konsequente Apoptose. (Mahul-Mellier, 2008, pp. 34954-34965) Zusammenfassend kann man sagen, dass für den Zelltod die Verbindung von Alix, ALG-2 und den ESCRT-Komplexen eindeutig notwendig ist. Alix induziert nur dann die Apoptose, wenn es in seiner ganzheitlichen Form vorhanden ist. Fehlt die funktionelle Bro-1-Domäne zum Beispiel durch Mutation, schützt das Protein die Zellen vor dem programmierten Zelltod. 35 1.4.5 Alix in Verbindung mit Astrozytomen Exosomen, oder auch Mikrovesikel beinhalten einige Marker-Proteine wie zum Beispiel Alix oder auch Tsg101, die im endosomalen-lysosomalen Sortierungsprozess eine Rolle spielen. Astrozytome und Glioblastome setzen unter anderem Alix als Marker-Protein für ihre Exosomen frei. Dass Alix ein MarkerProtein für Astrozytome und Glioblastome ist, wurde durch eine Western-BlotAnalyse bereits bewiesen. Diese Exosomen können mitochondriale Proteine beinhalten, und auch mitochondriale DNA, kurz mtDNA, wurde in den Exosomen als inhaltlicher Bestandteil entdeckt. In bereits gemachten Versuchen stellte sich heraus, dass Mitochondrien von einer Zelle in die benachbarten Zellen durch sogenannte Nano-Tubes wandern können. In diesem Kontext ist es besonders interessant die Rolle des exosomalen Proteintransfers und RNA-Transfers, besonders von dem postsynaptischen auf das präsynaptische Terminal zu beobachten, da dieser Transfer möglicherweise eine Rolle bezüglich der synaptischen Plastizität von Neuronen spielen könnte. Da Exosomen bzw. Mikrovesikel an dem interzellulären Transport maßgeblich beteiligt sind, könnte diese Erkenntnis von enormem physiologischem und auch pathologischem Interesse sein. (Guescini, 2009, pp. 1-4) Da Alix auch mit dem oben beschriebenen Protein SETA eine Verbindung über ALG2 in Astrozytomen eingeht und mit dieser Interaktion unter anderem die Zelladhäsion negativ beeinflussen kann, hat Alix eine negative Reaktion bezüglich des Zellwachstums in entartetem glialem Gewebe gezeigt. Die Literatur zum Thema Alix und Astrozytome ist zum Gegenwärtigen Zeitpunkt sehr begrenzt, sodass mit diesem Protein im Bereich der Neurowissenschaften sicherlich noch großer Forschungsbedarf besteht. 1.5 Lipofuscin „Lipofuscine oder Chromolipoide sind gelbliche bis bräunliche, körnige, eisenfreie endogene Pigmente, die zu einer Gruppe zusammengefasst werden, die chemisch schlecht zu definieren ist. Sie fehlen noch bei Neugeborenen, können indes unter Umständen schon im Kindesalter in gewissen Nervenzellen auftreten. Ihre Menge und Verbreitung nimmt in den meisten Fällen erst mit dem Alter wesentlich zu z.B. in 36 den Ganglienzellen, deshalb wird dieses Pigment auch Abnutzungspigment, oder Alterspigment genannt. Pathologisch vermehrt findet man Lipofuscin in atrophischen Organen.“ (Otto Bucher, 1997, p. 77) „Differentialdiagnostisch ist das Lipofuscin vom Hämosiderin durch die Berliner-Blau-Reaktion abzugrenzen und ist primär in Lysosomen zu finden.“ (Thomas, 2001, p. 14) In dieser Arbeit war es wichtig Lipofuscinablagerungen von Mikrovesikeln unterscheiden zu können, da sich beide Strukturen ohne spezifische Färbemethode in ihrer Form ähnlich sind. Daher wurde dem Antikörper noch ein hochsensitives Visualisierungsystem in 2 Schritten hinzugefügt, mit dem ausschließlich MVB`s rot gefärbt wurden. Lipofuscin, falls vorhanden, erscheint nun in allen Gewebeproben als braune, runde Strukturen, während MVB`s als rote, runde Strukturen in Erscheinung treten. 2 Material und Methoden Das Fundament dieser Diplomarbeit zur Erfassung und Evaluierung der MVB`s mittels Immunhistochemie mit einem Antikörper gegen Alix in Astrozytomen Grad I, II, III, und Grad IV an Hand einer retrospektiven Studie, beinhaltet eine Reihe von wissenschaftlichen Arbeitsschritten, Materialen und Methoden. Diese Arbeitsschritte, Materialen und Methoden gliedern sich in eine umfassende Literaturrecherche, das Sammeln von geeigneten Proben, das Anwenden einer geeigneten Färbemethode, die Befundung der angefärbten histologischen Gewebeproben und die fotografische sowie statistische Auswertung derselben. 2.1 Literaturrecherche Die grundlegende Fragestellung dieser Arbeit war vorerst, durch Literaturrecherche ein Markerprotein für Mikrovesikel zu finden, um die Expression von Mikrovesikeln astrozytärer Tumore abhängig vom WHO-Grad zu evaluieren. Nach länger andauernder Literatursuche wurden 2 verschiedene Markerproteine gefunden, Alix und CD9, deren „Marker-Eigenschaften“ von Mikrovesikeln in Zellkulturen in einigen Studien an diversen Tumoren gezeigt wurden. Es konnte im Rahmen der Diplomarbeit aber nur ein Protein untersucht werden, da sonst der 37 Rahmen dieses Projektes gesprengt worden wäre. Deshalb musste nun eine Entscheidung zwischen den 2 gefundenen Proteinen getroffen werden, und die Entscheidung fiel auf Alix. Die wissenschaftlichen Publikationen, die dieser Arbeit als Grundlage dienen, wurden auf Forschungsportalen und Datenbanken wie Pubmed, Ovid, und Cochrane-Database gesucht und auch von dort entnommen. Man hat als ordentlicher Student/in der Medizinischen Universität Graz mit einem Login freien Zugriff auf diese Forschungsportale. Die Literaturrecherche zu dem Thema spezifisches Markerprotein für MVB`s aus Astrozytomen gestaltete sich durchaus schwierig, da genau zu diesem Thema zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht viel Literatur vorhanden ist. Deshalb wurde in der Literaturrecherche vorerst ein besonderes Augenmerk auf das Protein Alix selbst gelegt, um das Protein in all seinen Facetten besser kennen zu lernen und so auch ein besseres Verständnis für seine Funktionen zu bekommen. Die verwendeten Publikationen sind alle in Englisch verfasst und wurden in dieser Arbeit durch Zitate mit den Zitierregeln nach Harvard kenntlich gemacht. 2.2 Probensammlung Die Gewebeproben, die in dieser Arbeit zur immunhistochemischen Färbung verwendet worden sind, wurden nach postivem Ethikvotum (EK-Nummer 24-053 ex 11/12) mit freundlicher Genehmigung aus dem Archiv der der Biobank der Medizinischen Universität Graz zur Verfügung gestellt. Die Proben gliedern sich auf in 19 pilozytische Astroyztome WHO-Grad I, 24 diffuse Astrozytome WHO-Grad II, 18 anaplastische Astrozytome WHO-Grad III, und 13 Glioblastome WHO-Grad IV. Diese FFPE-Gewebeproben stammen aus Tumoren von bereits verstorbenen Patienten/innen, deren Identität für dieses Projekt unkenntlich gemacht wurde. Die Auswahl der anonymisierten Tumorproben wurde anhand der Kriterien getroffen, dass Patienten/innen mit Rezidivtumoren bzw. präoperativer radio-und/oder chemotherapeutischer Behandlung von der Studie ausgeschlossen wurden. Somit wurden als Gewebeproben nur chirurgisch resezierte Primärtumore verwendet. Die histopathologischen Gewebeproben wurden vor und nach immunhistochemischer Färbung von 2 Untersuchern ( Sen.Scientist Dr. med. univ. Martin Asslaber und cand. med. Marlene Leoni) auf folgende Parameter hin analysiert: 38 Tumortyp gemäß der aktuellen WHO-Klassifikation Differenzierungsgrad gemäß der aktuellen WHO-Klassifikation Vorhandensein von Tumoreinblutungen Vorhandensein von Nekrobiosezonen Vorhandensein von Palisadenstellungen im Randbereich von Tumornekrosen Vorhandensein von tumorfreien Arealen 2.3 Färbemethode Die Tumorproben, die bei diesem Projekt verwendet wurden, wurden nach Selektion am Hämatoxilin-Eosin-gefärbten Schnitt ausnahmslos mit der Methode der Immunhistochemie angefärbt. Immunhistochemie im Allgemeinen, ist eine Methode um spezifische Antigene in Geweben oder Zellen nachzuweisen, die auf der AnitgenAntikörper-Reaktion basiert. Diese Methode nutzt die Spezifität der Bindung, die ein Antigen mit seinem Antikörper eingeht aus, um diese Reaktion lichtmikroskopisch sichtbar zu machen und ist seit den 1990er Jahren eine Standard-Färbemethode auf dem Gebiet der Pathologie. Nachdem sich die Methode der Immunhistochemie etabliert hatte, wurde ihre Verwendung im Bereich der diagnostischen Pathologie immer größer. Die Identifikation und Demonstration von prognostischen und auch prädiktiven Markern mit dementsprechenden Anforderungen für semi-quantitative Auswertungen der Ergebnisse wurde durch die Immunhistochemie möglich gemacht. Das Grundprinzip der Immunhistochemie ist die scharfe und genaue visuelle Lokalisation von Zielkomponenten in Zellen und/oder Geweben basierend auf einer zufriedenstellenden signal-to-noise-ratio. Immunhistochemie bietet die Möglichkeit eines Gewebe-basierten Immuntests mit der Reproduzierbarkeit und dem quantitativen Charakter eines ELISA-Verfahrens, welches nicht nur die Präsenz eines Proteins oder Antigens erfasst, sondern auch die exakte und verlässliche Messung der relativen oder realen Menge desselben. Ein Antikörper ist ein Molekül, das die Eigenschaft besitzt, spezifisch an ein zweites Molekül, das Antigen, zu binden. Antikörper sind Immunoglobine, die aus zwei Basiseinheiten bestehen, nämlich einem Paar aus Leichtketten (entweder einer Kappa oder einer Lambda-Kette) und einem Paar aus schweren Ketten (Gamma, Alpha, µ, Delta oder Epsilon). Als Antigen bezeichnet man jedes Molekül, welches 39 ausreichend komplex ist um ein relativ rigides dreidimensionales Profil aufrecht zu erhalten. Die Bewertung eines Antikörpers basiert auf 2 Hauptpunkten, der Sensitivität und der Spezifität der Antikörper-Antigen-Reaktion in der Immunhistochemie. Monoklonale Antikörper garantieren keine Antigen-Spezifität, besitzen aber eine exzellente praktische Spezifität in der Immunhistochemie. Polyklonale Antikörper enthalten eine Reihe von Epitopen von Antikörpern, die auch variierende Spezifitäten gegen die verschiedenen Antigene besitzen, was mitunter eine höhere nicht-spezifische Hintergrundreaktion bedingt. Dies bedeutet zusammenfassend, dass polyklonale Antikörper mehr Sensitivität aber weniger Spezifität aufweisen, als monoklonale Antikörper. Die meisten monoklonalen Antikörper entstammen zur Zeit Maus-Klonen. (Dabbs, 2010, pp. 1-3) 2.3.1 Färbeprotokoll In diesem Projekt wurde der polyklonale Antikörper Anti-PDCD6ip (Alix) zur immunhistochemischen Färbung der FFPE-Proben verwendet. Die Leer-Schnitte wurden über Nacht angetrocknet und danach bei 60° für 30 min. in den Brutschrank gelegt. Anschließend wurde in einer absteigenden Alkoholreihe entparaffiniert und rehydriert. Nun wurde eine Vorbehandlung der Schnitte im Druckkochtopf Pascal Dako (Dako, Dänemark) mit Natrium Citratpuffer pH 6.0, 0,01 molar aus der Apotheke bei 120°C für 2 min 50 sec durchgeführt. Die Schnitte wurden anschließend für 20 min zur Seite gestellt um sie abkühlen zu lassen. Dann wurde die endogene Peroxidaseaktivität durch eine 15 minütige Einwirkzeit in 3% H2O2 in Methanol und anschließendem 3 maligem, 5 minütigem Spülen mit einer Peroxidase Blocking Solution blockiert. Nun wurde 100µl in einer Verdünnung von 1:500 von dem polyklonalen Hasen-Antikörper Anti-PDCD6ip (Sigma, Prestige AK, HPA011905) auf die histologischen Gewebeproben aufgetragen und 1 Stunde bei Raumtemperatur in dem Dako REALTM Antibody Diluent (S2022) inkubiert. Danach wurden die Schnitte wieder 3 mal 5 min mit Peroxidase Blocking Solution gespült. Nach dem Auftragen des ersten Antikörpers wurde in einem zweiten Schritt des Färbevorganges HRP Dako Real EnVision (Dako K5007) appliziert, um nichtspezifische Färbeergebnisse abhängig von Avidin-Biotin-Aktivitäten zu reduzieren. Die Proben wurden wieder bei Raumtemperatur 30 min im Dako REALTM Antibody 40 Diluent (S2022) inkubiert und anschließend 3 mal 5 minütig mit Peroxidase Blocking Solution gespült. Um die Immunreaktion zu detektieren wurde AEC Substrat (DakoCytomation AEC Substrate Chromogen Ready-to-Use, K3464) aufgetragen. Die Immunreaktion wurde unter dem Mikroskop überprüft und die Detektion mit Peroxidase Blocking Solution gestoppt. Nach einer 1 minütigen Gegenfärbung mit Hämalaun nach Mayer wurden die Schnitte in heißem Leitungswasser gebläut und mit Aquatex eingedeckelt. 2.4 Fotografische und immunhistochemische Auswertung Für die fotografische Datenauswertung wurde in diesem Projekt das Computerprogramm NIS-Elements D Version 3.21.04 der Firma Nikon verwendet. Mit diesem Programm wurden alle Gewebeproben mit jeweils 4 Arealen mit maximaler MVB-Dichte lichtmikroskopisch in einer 60-fachen Vergrößerung erfasst und fotografisch festgehalten. An Hand dieser digital gespeicherten Bilder wurden die mit dem Antikörper und durch das zusätzliche Detektionssystem rot angefärbten Mikrovesikel per Hand gezählt und von den bräunlichen Lipofuscinablagerungen durch ihre Immunreaktivität unterschieden. Die Immunreaktivität wurde als positiv gewertet, wenn sich die als Mikrovesikel angenommenen Strukturen durch die Färbereaktion rundlich und rot darstellten. Als Mikrovesikel wurden nur runde, Strukturen mit einem Durchmesser von minimal 50 nm bis zu maximal 100 nm gezählt. Farbniederschläge wurden bei der Zählung nicht berücksichtigt. Den einzelnen Tumorarealen wurden anschließend verschiedene Eigenschaften zugeordnet, die lichtmikroskopisch am Diskussionsmikroskop beurteilt wurden. Die Eigenschaften der einzelnen Areale gliedern sich auf in vitales Tumorgewebe, Infiltrationszone, Tumorpalisaden, Tumornekrobiosezonen, Einblutungszonen, und tumorfreie Zonen (nicht neoplastisches Neuropil). Anhand dieser Einteilung der Gewebeproben und der sichtbar gemachten MVB`s wurde mit Hilfe der digital gespeicherten Fotos die Zählung der MVB`s durchgeführt. Diese Daten wurden für die grafische und rechnerische Analyse tabellarisch erfasst 41 2.5 Statistische Auswertung Für die statistische Datenauswertung wurde in diesem Projekt das Programm R (R Development Core Team, 2011) verwendet. Die tabellarisch erfassten Daten wurden an Hand von Box and whisker plots mittels dem Zusatzpaket Lattice in R grafisch dargestellt. 2.5.1 R R ist eine Programmiersprache und Programm-Umgebung für Statistikanwendungen. R-Studio bietet dem Benutzer eine Arbeitsfläche für das Statistikprogramm R, indem es die Verwaltung, Bearbeitung und Ausführung des Programmes erleichtert. Die Software R und R-Studio ist im Internet frei zugänglich. Der Funktionsumfang von R kann durch viele Pakete erweitert werden. Dieses Programm wird vielseitig zum Beispiel auch auf den Gebieten der Epidemiologie, Ökonomie für statistische Fragestellungen angewandt. R kann auch an spezifische statistische Fragestellungen an Hand dieser Zusatzpakete angepasst werden. Ein Zusatzpaket für grafische Anwendungen ist zum Beispiel „Lattice“, mit dem auch in dieser Arbeit Grafiken erstellt wurden. Die Eingabe der gewünschten Befehle läuft in R-Studio über eine Kommandozeile. (Dalgaard, 2002, pp. 1-10) (R Development Core Team, 2011) 2.5.2 Statistische Testverfahren Zur statistischen Analyse der Untersuchungsergebnisse wurde der Kruskal-WallisTest angewandt. Mit Hilfe dieses statistischen Testverfahrens wurde der Unterschied von der Anzahl der Mikrovesikel in den verschiedenen Tumorgraden nach WHOKlassifikation, der Unterschied von der Anzahl der Mikrovesikel in den einzelnen Tumorarealen, sowie auch der Unterschied der Anzahl der Mikrovesikel in den Tumorarealen bezogen auf die einzelnen Tumorgrade nach WHO-Klassifikation errechnet. Der Kruskal-Wallis-Test ist ein statistisches Testverfahren, welches parameterfrei ist und mit dem im Rahmen der Varianzanalyse getestet wird, ob unabhängige Stichproben hinsichtlich einer ordinalskalierten Variable einer gemeinsamen Population entstammen. Der Kruskal-Wallis-test ist dem MannWhitney-U-test sehr ähnlich und basiert wie dieser auf Rangplatzsummen, nur dass 42 der Kruskal-Wallis-Test bei dem Vergleich von mehr als zwei Gruppen angewandt werden kann. (Kruskal W.H, 1952, pp. 583-621) Die Korrelation der Anzahl der Mikrovesikel mit frischen Tumoreinblutungen, den Vergleich der Anzahl der Mikrovesikel und Anzahl der Lipofuscinablagerungen bezogen auf die Tumorgrade, wie auch auf die verschiedenen Tumorareale wurde ebenfalls mit dem Kruskal-Wallis-Test errechnet. 2.6 Textverarbeitung Die Eingabe und das Layout dieser Diplomarbeit wurden mit Hilfe des Textverarbeitungsprogrammes Microsoft® Word 2010 für Windows 8 durchgeführt. Das Literaturverzeichnis und die Zitate wurden mit dem integrierten Zitierprogramm von Microsoft® Word 2010 verwaltet. Tabellen und Diagramme wurden wie oben beschrieben mit R bzw. R-Studio erstellt und mit Hilfe von Microsoft® Excel 2010 bearbeitet und in den Word-Text eingefügt. 3 Ergebnisse Um die Expression von Alix als Oberflächenprotein von MVB`s, die von den Tumorzellen von Astrozytomen ausgeschleust werden, zu untersuchen, wurden als Gesamtkollektiv 74 Astrozytome WHO-Grad I-IV untersucht. Davon wurden 19 Astrozytome WHO-Grad I, 24 Astrozytome WHO-Grad II, 18 Astrozytome WHO-Grad III, und 13 Astrozytome WHO-Grad IV immunhistochemisch mit dem Antikörper AntiPDCD6ip gefärbt. Um die Mikrovesikel als solche erkennbar zu machen und sie von andern Strukturen abgrenzen zu können, wurde ein zusätzliches Detektionssystem appliziert. Die verwendeten chirurgisch resezierten Tumorproben wurden innerhalb eines Zeitraumes von 10 Jahren gewonnen. Die histologischen FFPE- Proben wurden aus dem Archiv der Biobank der Medizinischen Universität Graz entnommen. 43 Tumorgrad Anzahl der Fälle Grad I 19 Grad II 24 Grad III 18 Grad IV 13 Tabelle 3: Tumorgrade und Anzahl der Fälle Die Mikrovesikel wurden erfolgreich immunhistochemisch mit dem durch Literaturrecherche evaluierten Antikörper gefärbt und kenntlich gemacht. Nun konnten die MVB`s lichtmikroskopisch erfasst, fotografiert und die Bilder digital gespeichert werden. Die Anzahl der Mikrovesikel wurde anhand dieser digitalen Fotografien der FFPE-Proben durch das Zählen der Strukturen erhoben. Bild 7: Immunhistochemisch markierte Mikrovesikel eines Glioblastoms (12x10µm) 44 Bild 8: Immunhistochemisch markierte Mikrovesikel eines anaplastischen Astrozytoms (12x10µm) Bild 9: Immunhistochemisch markierte Mikrovesikel eines diffus infiltrierenden Astrozytoms (12x10µm) 45 Bild 10: Immunhistochemisch markierte Mikrovesikel eines pilozytischen Astrozytoms (12x10µm) 46 3.1 Vergleich Anzahl der Mikrovesikel in den unterschiedlichen Tumorgraden nach WHO-Klassifizierung Für den Vergleich der Anzahl der markierten Mikrovesikel zwischen den einzelnen Astrozytomgraden nach WHO-Klassifizierung wurde eine Tabelle erstellt. Die grafische Darstellung erfolgte an Hand eines Box and whisker plots. Vesikelanzahl 0 1 2 3 4 5 6 7 8 10 11 12 13 14 16 17 18 20 23 24 33 43 45 51 54 72 Grad I Grad II 18 20 12 7 8 4 2 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 Grad III 61 5 9 4 3 4 3 1 1 0 2 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 Grad IV 12 27 13 7 4 1 3 1 2 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 16 4 4 3 4 3 0 2 1 0 1 2 1 1 2 0 0 0 1 1 2 1 0 1 1 1 Tabelle 4: Anzahl der Mikrovesikel im Vergleich zwischen Astrozytomen WHO-Grad I,II,III, und IV 47 Bild 11: Anzahl der Mikrovesikel im Vergleich zwischen Astrozytomen WHO-Grad I,II,III, und IV An Hand der Grafik sieht man, dass die Anzahl der Mikrovesikel in Astrozytomen vom Tumorgrad nach WHO-Klassifzierung abhängig ist. Mit zunehmender maligner Transformation werden mehr Vesikel abgeschnürt. Bei pilozytischen Astrozytomen WHO-Grad I finden sich vereinzelt Mikrovesikel, und auch in diffusen Astrozytomen WHO-Grad II sind Mikrovesikel lichtmikroskopisch erkennbar. In anaplastischen Astrozytomen WHO-Grad III werden bereits mehr Mikrovesikel erkennbar. Im Astrozytom WHO-Grad IV, dem Glioblastom sind mit Abstand die meisten Mikrovesikel zu sehen. Die durch den Kruskal-Wallis-Test mit den Parametern Tumorgrad und Anzahl der Mikrovesikel errechneten Ergebnisse entsprechen einem Chi-Quadrat-Wert von 28,9586 und einem p-Wert von 2, 285e-06. Das Ergebnis ist somit als statistisch signifikant zu werten. 48 3.2 Vergleich Anzahl der Mikrovesikel in den unterschiedlichen Tumorarealen Für den Vergleich der verschiedenen Tumorareale mit der Anzahl der dort exprimierten Mikrovesikel wurde eine Tabelle erstellt. Die grafischen Ergebnisse wurden wieder mittels Box and whisker plots dargestellt. Tumorareal Min. Infiltrationszone Tumor vital Tumorfrei Tumornekrobiose Tumorpalisaden 0 0 0 2 5 1. Quartile Median Mittelwert 3. Quartile Max. 0 0 1,68 1 0 1 2,562 3 0 1 2,781 2 9,25 14,5 17,67 22 15 33 35 52,5 11 45 33 43 72 Tabelle 5: Anzahl der Mikrovesikel im Vergleich mit den unterschiedlichen Tumorarealen Bild 12: Vergleich Anzahl der Mikrovesikel mit den unterschiedlichen Tumorarealen 49 Der Box and whisker plot zeigt, dass es deutliche Unterschiede zwischen den einzelnen Tumorarealen in Bezug auf die Expression von Mikrovesikel gibt. Die Grafik veranschaulicht, dass die meisten Mikrovesikel in den Tumorpalisaden und der Tumornekrobiose von den Zellen exprimiert werden. Doch auch in Bereichen des vorerst nicht näher spezifizierten vitalen Tumorgewebes (Tumorgrade I-IV) werden einige Mikrovesikel abgeschnürt. Die Tumorpalisaden und die Tumornekrobiose sind Areale, die nur in Astrozytomen WHO-Grad IV vorkommen. Dieses Ergebnis stützt die Hypothese, dass höhergradige Tumoren mehr Mikrovesikel exprimieren als niedriggradige. Bei der malignen Transformation könnte die Rolle des ESCRTSystems eine große Rolle spielen, da das Zytoplasma durch die Exozytose von Mikrovesikel reduziert wird. Auch in den tumorfreien Arealen von Astrozytomen WHO-Grad IV wurden Mikrovesikel gezählt. Dies liegt vermutlich daran, dass die MVB`s durch die Interzellularsubstanz wandern, und so auch in den tumorfreien Arealen zu sehen sind. Weniger Mikrovesikel wurden in der Infiltrationszone beobachtet (Details siehe Kapitel 3.3). 3.3 Anzahl der Mikrovesikel in den unterschiedlichen Tumorarealen bezogen auf die einzelnen Tumorgrade nach WHO-Klassifikation Die Anzahl an Mikrovesikeln in den unterschiedlichen Tumorarealen bezogen auf die einzelnen Tumorgrade nach WHO-Klassifikation wurde ebenfalls tabellarisch und grafisch mittels Box whisker plots dargestellt. 50 Bild 13: Anzahl der Mikrovesikel in den unterschiedlichen Tumorarealen bezogen auf die einzelnen Tumorgrade nach WHO-Klassifikation (Trellis-Grafik) Tumorgrad Grad I Grad II Grad III Grad IV Infiltrationszone 0 14 11 0 Tumor vital Tumorfrei Tumornekrobiose Tumorpalisaden 76 0 0 0 69 13 0 0 47 14 0 0 34 5 6 7 Tabelle 6: Anzahl der untersuchten unterschiedlichen Tumorarealen bezogen auf die einzelnen Tumorgrade nach WHO-Klassifikation 51 Tumorareale Infiltrationszone Tumor vital Tumorfrei Tumornekrobiose Tumorpalisaden Grad I NA Grad II 2,5 2,2 0,5 2,6 NA NA NA Grad III NA NA Grad IV 0,6 NA 2,7 1,9 NA NA 2,8 11 17,7 35 Tabelle 7: Mittelwerte der gezählten Mikrovesikel in untersuchten unterschiedlichen Tumorarealen bezogen auf die einzelnen Tumorgrade nach WHO-Klassifikation Hierbei ist zu erkennen, dass sich die Anzahl der Mikrovesikel, die exprimiert wurden in den Astrozytomen WHO-Grad IV vor allem in den Regionen mit Tumorpalisaden erhöht präsentiert. Auch Regionen mit Tumornekrobioszonen enthalten eine hohe Anzahl an Mikrovesikeln. Interessant ist auch die Beobachtung, dass in den tumorfreien Arealen des Astrozytom WHO-Grad IV viele Mikrovesikel zu finden waren. Die durch den Kruskal-Wallis-Test mit den Parametern Tumorgrad, Tumorareal und Anzahl der Mikrovesikel errechneten Werte ergeben für das Astrozytom WHO-Grad II einen Chi-Quadrat-Wert von 2,9222 und einen p-Wert von 0,232. Für das Astrozytom WHO-Grad III ergibt der Chi-Quadrat-Wert 11,3784 und der p-Wert von 0.003382. Für das Astrozytom WHO-Grad IV wurde ein Chi-Quadrat-Wert von 23,1556 und ein p-Wert von 3,748e-05 errechnet. Der Chi-Quadrat-Wert und der p-Wert für das Astrozytom WHO-Grad I konnte rechnerisch mit dem Kruskal-Wallis-Test auf Grund fehlender unklassifizierbarer Parameter nicht errechnet werden. Die Anzahl der Mikrovesikel in den unterschiedlichen Tumorarealen bezogen auf die einzelnen Tumorgrade wurde für jeden Tumorgrad einzeln mit dem Kruskal-Wallis-Test berechnet. Die Ergebnisse sind also für das Astrozytom WHO-Grad IV als statistisch signifikant anzusehen. 3.4 Anzahl der Mikrovesikel bei dem Zustand einer frischen Tumoreinblutung Ein weiterer Punkt war es auch den Zusammenhang zwischen einer frischen Einblutung in den Tumor und der Anzahl der Mikrovesikel zu ermitteln. 52 Einblutung Keine Einblutung Bild 14: Anzahl der Mikrovesikel in Abhängigkeit von einer frischen Tumoreinblutung Die durch Kruskal-Walllis-Test mit den Parametern Anzahl der Mikrovesikel und frische Tumoreinblutung errechneten Werte ergeben einen Chi-Quadrat-Wert von 5e-04 und einen p-Wert von 0,9815. Aus diesem Ergebnis kann man schließen, dass die Anzahl der Mikrovesikel unabhängig von einer frischen Einblutung in den Tumor ist. 3.5. Lipofuscinablagerungen im Vergleich mit den unterschiedlichen Tumorgraden nach WHO-Klassifizierung Da zu Beginn dieses Projektes auch per se braun gefärbte Lipofuscinablagerungen beobachtet wurden, wurden die Mikrovesikel in der Immunhistochemie rot markiert um eine eindeutige Unterscheidung bezüglich der Verifizierung der immunhistochemisch angefärbten Strukturen als Mikrovesikel möglich zu machen. Deshalb war es wichtig auch die Anzahl der Lipofuscinablagerungen im Vergleich zu der Anzahl der Mikrovesikeln statistisch zu erheben. Somit konnte eine Verwechslung sicher ausgeschlossen werden. 53 Bild 15: Anzahl der Lipofuscinablagerungen im Vergleich zu den Tumorgraden nach WHOKlassifizierung Durch diese Grafik wird veranschaulicht, dass die Anzahl der Lipofuscinablagerungen keinen Unterschied in den verschiedenen Tumorgraden laut WHO-Klassifizierung aufweist. Die durch den Kruskal-Wallis-Test mit den Parametern Anzahl der Lipofuscinablagerungen und Tumorgrad errechneten Werte ergeben für den Chi-Quadrat-Wert 3,1344 und für den p-Wert 0,3714. Schlußfolgernd kann davon ausgegangen werden, dass Mikrovesikel und Lipofuscinablagerungen zwei unterschiedliche Strukturen in den immunhistochemisch angefärbten FFPE-Proben darstellen. 3.6 Lipofuscinablagerungen im Vergleich mit den unterschiedlichen Tumorarealen Um sicher zu gehen, dass die Anzahl der Lipofuscinablagerungen in den immunhistochemisch angefärbten FFPE-Proben auch in den unterschiedlichen Tumorarealen nicht vergleichbar ist, wurde auch hier eine Grafik erstellt und der Kruskal-Wallis-Test mit den Parametern Anzahl der Lipofuscinablagerungen und Tumorareale angewandt. 54 Bild 16: Anzahl der Lipofuscinablagerungen im Vergleich mit den unterschiedlichen Tumorarealen Die Anzahl der Lipofuscinablagerungen korreliert auch nicht mit den unterschiedlichen Tumorarealen. In Die meisten Lipofuscinablagerungen finden sich in den vitalen Tumorarealen, gefolgt von den Infiltrationszonen und den tumorfreien Arealen. Der errechnete Chi-Quadrat-Wert beträgt 3,4272 und der errechnete p-Wert beträgt 0,489. Das Ergebnis ist somit als nicht statistisch signifikant zu werten. 4 Diskussion Erkrankungen mit malignen Hirntumoren sind gefürchtet, da die Therapieversuche meistens keinen kurativen Ansatz mit sich bringen, sondern im Idealfall nur zur relativ begrenzten Lebensverlängerung beitragen können. Zur Zeit stellen der Tumorgrad nach WHO-Klassifizierung basierend auf der Histopathologie und die Radikalität der operative Resektion, sowie Erfolg von Chemo-und Radiotherapie den Standard für die Aussagekraft der Prognose von Astrozytom-Patienten/innen dar. Da die Überlebenszeit von Menschen die an einem Astrozytom höheren Grades erkranken, nach wie vor sehr gering ist (weniger als 20% der Patienten/innen überleben mehr als 1 Jahr, weniger als 3% der Patienten/innen überleben länger als 3 Jahre) (David N. Louis, 2007, p. 44) , sind viele Forschungsfragen auf dem Gebiet der 55 Tumorprogression noch offen. Trotz aduvanter Chemotherapie mit dem Zytostatikum Temozolomid oder Therapien mit angiogenesehemmenden Substanzen, wie dem monoklonalen Antikörper Bevacizumab in Kombination mit Bestrahlungstherapie, ist der Therapieerfolg gering. Deshalb ist es von besonderem Interesse in der medizinischen Forschung die Tumorprogression von Astrozytomen verstehen zu lernen und so in Zukunft dem lokalen Fortschreiten maligner Hirntumore rechtzeitig entgegen wirken zu können. Als zusätzlicher Prognosefaktor könnte das Verständnis der Tumorprogression Therapieansätze reformieren und eine individuell abgestimmte Behandlung ermöglichen. Es wurde in den letzten Jahren viel auf dem Gebiet der spezifischen Markerproteine für Mikrovesikel geforscht, jedoch wurde bis jetzt für Mikrovesikel von Astrozytomen noch kein standardisiertes Markerprotein gefunden. Vor allem die Funktion der MVB`s ist zur Zeit Forschungsschwerpunkt, da über die Rolle der Mikrovesikel in der Tumorprogression noch nicht allzu viel bekannt ist. Fest steht bereits, dass MVB`s in der interzellularen Kommunikation eine große Rolle spielen. Neuere Studien zeigten, dass Mikrovesikel sogar die Weitergabe von infektiösen Agenzien von einer Zelle in die Nächste begünstigen könnten. Es wurde beobachtet, dass Exosomen, die von mit Mycobacterium tuberculosis oder Toxoplasma gondii infizierten Zellen isoliert wurden, mikrobielle Komponenten beinhalten, die die Antigenpräsentation und die Aktivierung von Makrophagen begünstigen können. (Jeffrey S. Schorley, 2008, pp. 871-881) Es wurde bereits herausgefunden, dass MVB`s nicht nur abzubauende Zellbestandteile aus den Zellen herausschleusen, sondern dass auch ein Teil der Tumor-DNA Inhalt der Vesikel ist. Tumorzellen von Glioblastomen exprimieren Mikrovesikel, die mRNA, miRNA und angiogenetische Proteine beinhalten. Diese Mikrovesikel wurden dann von auch nicht neoplastischen Zellen, wie mikrovaskulären Endothelzellen im Gehirn aufgenommen. Indem mRNA-Teile für ein Reporter-Protein in die Mikrovesikel aufgenommen wurde, wurde auch gezeigt, dass genetische Informationen, die von Mikrovesikel überbracht werden, von empfangsbereiten Zellen translatiert werden. Nachdem diese Mikrovesikel auch angiogenetische Proteine enthalten, stimulieren sie auch die Bildung von neuen Gefäßen durch Endothelzellen. Weiters stimulieren die Mikrovesikel, die von Glioblastomen exprimiert werden, die Proliferation einer humanen Gliom-Zelllinie. 56 Mutationen der Messenger-RNA und der mi-RNA, die charakteristisch für Gliome sind, wurden in Mikrovesikel im Serum von Glioblastom-Patienten bereits nachgewiesen. Auch der tumorspezifische EGFRvIII wurde in Mikrovesikel aus dem Serum nachgewiesen. (Johan Skog, 2008, pp. 1470-1476) Diese Ergebnisse lassen nun eine Bandbreite an neuen Hypothesen der Tumorprogression offen. Die Bestätigung der Theorie, dass niedriggradige Astrozytome durch MVB`s in höhergradigere Tumore transformiert werden könnten, würde eine komplett neue Sichtweise der Tumorprogression und/oder auch des Metastasierungspotentials peripherer Tumore eröffnen. Dadurch würden sich wahrscheinlich auch neue diagnostische Möglichkeiten durch eine einfache Blutabnahme bieten. Auch neue Therapiemöglichkeiten würden sich ergeben, die dem Patienten nicht nur höhere Überlebenschancen einbringen könnten, sondern auch eine individuell angepasste Therapie ermöglichen würden. Ein Schritt in diese Richtung wurde bereits mit der Anwendung von sogenannten Anti-Tumor-Impfstoffen getan. Der Inhalt der Mikrovesikel und ihre biologische Funktion hängen in der Regel von ihrem Zellursprung ab und können auch von benignen Zellen exprimiert werden. Mikrovesikel die von B-Zellen und dendritischen Zellen ausgeschleust werden, haben potente immunostimulierende Effekte und wirken damit indirekt gegen den Tumor in vivo. Deshalb wurden sie für die Herstellung der Anti-Tumor-Impfstoffe herangezogen. Mikrovesikel die zum Beispiel von B-Zellen oder dendritischen Zellen exprimiert werden, beinhalten nämlich co-stimulatorische Proteine, die notwendig für die T-Zell-Aktivierung sind, während Mikrovesikel, die von Tumorzellen ausgeschleust werden die Immunantwort des Körpers unterdrücken und so indirekt das Tumorwachstum und auch das invasive Tumorwachstum begünstigen. (Johan Skog, 2008, pp. 1470-1476) Diese Tatsache hätte vor allem für GlioblastomPatienten eine Bedeutung, da deren Immunsystem oft supprimiert ist. Nachdem gezeigt wurde, dass Mikrovesikel, die von Gehirntumoren ausgeschleust werden, einzigartige Eigenschaften, wie zum Beispiel die EGFRvIII-Expression, ein Protein welches eine mutierte Variante von EGFR darstellt, oder die TGF-Expression besitzen, ist die Annahme von immunmodulierenden Eigenschaften der Mikrovesikel berechtigt. Mikrovesikel können auch über bestimmte Signalwege die Blut-HirnSchranke überwinden. Der Erfolg der Immuntherapie bezüglich Astrozytomen oder Hirntumoren im Allgemeinen, ist trotz vieler groß angelegter Studien aber noch nicht bewiesen. (Michael W. Graner, 2009, pp. 1541-1557) 57 Gegenstand dieses Projektes war es zuerst ein geeignetes Markerprotein für Mikrovesikel, die aus Astrozytomen aller 4 WHO-Grade ausgeschleust werden, zu finden. Nach immunhistochemischer Färbung mit diesem spezifischen Markerprotein sollten die Tumorproben auf die Expression von Mikrovesikel untersucht werden. Nachdem die Färbung mit dem spezifischen Antikörper gelungen war, mussten jedoch vorerst andere, per se braune Strukturen wie die oben erwähnten Lipofuscinablagerungen von den Mikrovesikeln unterschieden werden, damit es bei der Evaluierung der Mikrovesikel nicht zu Verwechslungen kommen würde. Nachdem dies durch die zusätzliche rote Färbung gelungen war und der Unterschied zwischen den Mikrovesikeln und den Lipofuscinablagerungen farblich kenntlich gemacht wurde, konnte nun die Anzahl der Mikrovesikel durch Abzählen, in den jeweils in 4 Arealen unterteilten FFPE-Proben, erhoben werden. Aus den Ergebnissen der Untersuchungen dieses Projektes kann man schließen, dass die Expression von Mikrovesikel aus Astrozytomen WHO-Grad I, II, III, und IV abhängig vom Tumorgrad ist. Die Untersuchungen zeigten, dass die meisten Mikrovesikel von Astrozytomen WHO-Grad III und IV exprimiert wurden, Astrozytome WHO-Grad II und I zwar auch vereinzelt Mikrovesikel ausschleusten, jedoch in geringerer Anzahl. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass nicht nur der Tumorgrad das ausschlaggebende Kriterium der gesteigerten Expression von Mikrovesikel ist, sondern auch in welchem Verhältnis die Zellen zueinander stehen. Dort wo der Tumor prominentere Malignitätskriterien zeigt, wie die Ausrichtung der Zellen in Palisadenstellung oder die Tumornekrobiose wurden die meisten Mikrovesikel exprimiert. Dies lässt den Schluss zu, dass die Tumorzellen dort, wo sich die meiste Malignität zeigt, versuchen an Zellvolumen zu verlieren. Das Abschnüren der MVB`s führt also zu einem geringeren Zellvolumen und damit zum Funktionsverlust der Zelle und begünstigt gleichzeitig die neoplastische Entartung. Regulatorische Mechanismen der Zellteilung begünstigen damit die maligne Transformation der Zellen. Was genau mit den Mikrovesikeln im Interzellularraum passiert und ob ihr Inhalt an Tumor-DNA vielleicht zur Progression des Primärtumors beisteuert, ist zur Zeit noch Gegenstand der Forschung. Es wurde durch dieses Projekt auch gezeigt, dass die Anwesenheit und die Anzahl von Mikrovesikel nicht mit dem Vorhandensein von Einblutungen in den Tumor korreliert. Daraus kann man schließen, dass die immunhistochemisch detektierten Strukturen als Mikrovesikel definiert werden und bei genauerer Untersuchung kein 58 großes Verwechslungspotential mit anderen Strukturen, wie dem endogenen Pigment Lipofuscin, oder Eisenablagerungen wie Hämosiderin bieten. Der Literaturbestand zum Thema Mikrovesikel und deren spezifische Markerproteine in Verbindung mit Astrozytomen ist zum gegenwärtigen Zeitpunkt kaum vorhanden. Während zum Thema Mikrovesikel an sich mäßig Literatur vorhanden ist, sind in Bezug auf Mikrovesikel und deren immunhistochemische Marker von/für Astrozytome keine Publikationen oder Fachliteratur bekannt. Das Thema der Expression von Mikrovesikeln und deren Markerproteine bezüglich glialen Tumoren ist in sämtlichen Online-Literaturdatenbanken trotz intensiver Suche mit variablen Suchkriterien sehr mühsam und beinahe nicht erfolgreich. Die Methoden, mit denen die MVB`s in diversen Studien detektiert wurden beschränken sich auf die Methode der Western Blottings, ELISA-Verfahren und NTA (Nano Tracking Analysis). Immunhistochemische Marker speziell für Mikrovesikel, die von glialen Tumoren exprimiert werden, sind nicht beschrieben. Alles in allem kann man daraus schließen, dass Mikrovesikel für die Erforschung der Tumorprogression einen zunehmend wichtigeren Aspekt darstellen, da viele ihrer Funktionen noch nicht bekannt sind. Aus dem bereits gewonnen Wissen über MVB`s kann man aber vermuten, dass diese Zellkompartments in der Entstehung und der Transformation von malignen Tumorzellen eine große Rolle spielen und in Zukunft immer wichtiger für das Verständnis von Neoplasien und deren Folgen sein werden. 59 Literaturverzeichnis Alberts Bruce, A. J. J. L. M. R. K. R. P. W., 2008. Molecular Biology of the Cell. 5. Hrsg. New York: Garland Science. Austria, S., 2008. s.l.: s.n. Böcker/Denk/Heitz, 2001. Pathologie. 2. Auflage Hrsg. München: Urban&Fischer. Chatellard-Causse, B. M. S., 2002. Alix (ALG-2-interactin Protein X), a protein involved in apoptosis binds to endophilins and induces cytoplasmatic vacuolization. The Journal of Biological Chemistry, 28 Mai, pp. 29108-29115. Dabbs, D. J., 2010. Diagnostic Immunohistochemistry. 3. Edition Hrsg. Philadelphia, USA: Saunders Elsevier. Dalgaard, P., 2002. Introductory Statistics with R. Kopenhagen, Dänemark: Springer Verlag. David N. Louis, H. O. O. D. W. K. C., 2007. WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System. Lyon: WHO. Fischer, M., 2005. Neurochirurgie. 10. Auflage Hrsg. München: Urban&Fischer. Guescini, G., 2009. Astrocytes and Glioblastoma cells release exosomes carrying mtDNA. Journal of Neural Transmission, 13 August, pp. 1-4. http://www.neurochirurgie.uniklinikumjena.de/Krankheitsbilder/Gehirn/Hirntumor/Gliome/Astrozytom.html, 07.01.2013, 15:40. MRT Astrozytom, s.l.: s.n. http://www.phosphosite.org/proteinAction.do?id=8642&showAllSites=true, 13.01.2013, 16:40. s.l.: s.n. Jeffrey S. Schorley, S. B., 2008. Exosome Function: From Tumor Immunology to Pathogen Biology. Traffic, September, pp. 871-881. Johan Skog, T. W. v. R. H. M. L. G. M. S.-E. T. C. J. B. S. C. M. K. O. B., 2008. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumor growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology, 16. November, pp. 14701476. Katzmann DJ, O. G. E. S., 2002. Receptor downregulation and multivesicular body sorting. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 3. Dezember, pp. 893-905. Khalid Al-Nedawi, B. M. J. R., 2009. Microvesicles-Messengers an mediators of tumor progression. Cell Cycle Journal, Vol 8(13), pp. 2014-2018. Kruskal W.H, W. W., 1952. Use of ranks in one-criterion variance analyses. Journal of the American Statistical Association, Issue Vol.47, pp. 583-621. 60 Mahul-Mellier, H. S., 2006. Alix, making a link between Apoptosis-linked Gene-2, the Endosomal Sortin Complex Required for Transport and neuronal death in vivo. The Journal of Neuroscience, 11 Januar, Issue 26, pp. 542-549. Mahul-Mellier, S. P. C.-C., 2008. Alix and ALG-2 are involved in Tumor Necrosis FActor Receptor 1-induced cell death. The Journal of Biological Chemistry, 20 Oktober, Issue 283, pp. 34954-34965. Michael W. Graner, O. A. M. D. D. K. H. S. A. M. D. B., 2009. Proetomic and immunologic analyses of brain tumor exosomes. The FASEB Journal-Research Communication, Mai, pp. 1541-1557. Odorizzi, G., 2006. The multiple personalities of Alix. Journal of Cell Science, 1 Juni, Issue 119, pp. 3025-3032. Otto Bucher, H. W., 1997. Cytologie, Histologie und mikroskopische Anatomie des Menschen. 12l Hrsg. Bonn: Verlag Hans Huber. Pan, W., 2006. Involvement of the conserved adaptor protein Alix in Actin cytoskeleton assembly. Journal of Biological Chemistry, 10 November, Issue 281, pp. 34640-34650. R Development Core Team, 2011. A language and environment for statistical computing. Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org/. Remmele, W., 1984. Pathologie 4, Neuropathologie, Sinnesorgane, Muskulatur. Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo: Springer Verlag. Ren X, H. J., 2011. Proline-rich regions and motifs in trafficking: From ESCRT interaction to viral exploitation. Medline, Oktober, Issue 10, pp. 1282-1290. Sadoul, R., 2006. Do Alix and ALG-2 really control endosomes for better or for worse?. Biology of the cell, Issue Volume 98 (1), pp. 69-77. Schmidt, D., 2004. Src Phosphorylation of Alix/AIP1 modulates its interaction with binding partners and antagonizes its activities. The Journal of Biological Chemistry, 4 Februar, Issue 5, pp. 3414-3425. Schröder, J. S. 6.-1., 1995. Neuropathologie. 2. Auflage Hrsg. Heidelberg: Springer. Teis D., S. S. J. B. E. S. E. J., 2010. ESCRT II coordinates the assembly of ESCRT III filaments for cargo sorting and multivesicular body vesicle formation. EMBO Journal, 4. Februar, pp. 871-883. Thomas, C., 2001. Histopathologie. 13. Hrsg. Stuttgart: Schattauer. 61 Curriculum vitae Name: Marlene Leoni Anschrift: Jakoministraße 28/11, 8010 Graz, Austria Geburtsdatum: 24.02 1984 Staatsangehörigkeit: Österreich Familienstand: ledig, keine Kinder Schulische und universitäre Ausbildung: 1990-1994 Volksschule Kapfenberg Stadt 1994-2002 BG/BRG Kapfenberg (Abschluss mit Abitur 2002) 2002-2012 Diplomstudium der Humanmedizin an der Medizinischen Universität Graz 2004-2007 Bakkelaureatsstudium der Gesundheits-und Pflegewissenschaften an der Medizinischen Universität Graz Zusatzqualifikationen und Praktika: 2010-2012 freie Wissenschaftliche Mitarbeiterin im Rahmen der Diplomarbeit am Institut für Pathologie am Universitätsklinikum LKH Graz (OA Dr. Martin Asslaber, Neuropathologie) 12 Wochen Famulatur am Institut für Pathologie, Universitätsklinikum LKH Graz 2 Wochen Famulatur am Institut für Pathologie, LKH Graz West 4 Wochen Famulatur an der Station für Innere Medizin, Barmherzige Brüder Graz 4 Wochen Famulatur (im Rahmen eines Speziellen-Studien-Moduls) an der chirurgischen Abteilung des Universitätsklinikums LKH Graz 2 Wochen Famulatur Neurologie, LSF Graz 62 2 Wochen Famulatur Psychiatrie, LSF Graz 6 Wochen Pflichtpraktikum Chirurgie/Neurochirurgie am Universitätsklinikum Heidelberg (1. Fächergruppe des 3. Studienabschnittes) 6 Wochen Pflichtpraktikum Innere Medizin/Kardiologie am Universitätsklinikum Heidelberg (2. Fächergruppe des 3. Studienabschnittes) 5 Wochen Pflichtpraktikum Psychiatrie am Universitätsklinikum LKH Graz (3. Fächergruppe des 3. Studienabschnittes) 5 Wochen Pflichtpraktikum Allgemeinmedizin bei Ordination Dr. Wieser-Erlitz, Frohnleiten (Pflichtfamulatur Allgemeinmedizin des 3. Studienabschnittes) Geringfügige Mitarbeit in der Praxis bei Prof. Dr. Wolfgang Wolf, Facharzt für Kardiologie Spezielle Studienmodule: 1.)Klinisch-topographische Anatomie des Kopf-Hals-Traktes (1 Monat) 2.)Klinisch-topographische Anatomie der Eingeweide (1 Monat) 3.)Klinisch-topographische Anatomie der Extremitäten (1 Monat) 4.) Chirurgische Operationslehre (1Monat) 5.)Parasitologie (1 Monat) Abschlussarbeiten: Bakkelaureatsarbeiten (Studium Gesundheits-und Pflegewissenschaften): 1.)Dickdarmkrebs-Gesundheitsvorsorge und pflegerische Maßnahmen 2.)Methoden der Basalen Stimulation Diplomarbeit (Studium Humanmedizin): Expression von Alix als Marker für Microvesicular Bodies (MVBs) und dessen Rolle in der Tumorprogression von Astrozytomen (Institut für Pathologie, Universitätsklinikum LKH Graz) 63 Sprachkenntnisse: Deutsch (Muttersprache Englisch (fließend) Spanisch (ausgebaute Kenntnisse) 64