Die Rolle eines Scaffold-Attachment-Faktor

Universität
Bremen
Heinrich-Pette-Institut
Hamburg
Die Rolle des Proteins
„Scaffold Attachment Factor A“ (SAF-A)
beim Aufbau und der Architektur des Zellkerns
vorgelegt dem Fachbereich 2 (Biologie/Chemie)
der Universität Bremen als
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
von
Roger Helbig
Bremen, im Februar 2005
Der praktische Teil dieser Dissertation wurde am Heinrich-Pette-Institut für Experimentelle
Virologie und Immunologie in Hamburg in der Abteilung Molekulare Zellbiologie unter der
beratenden Tätigkeit von Herrn Dr. F.O. Fackelmayer durchgeführt.
Der Betreuer des Dissertationsvorhabens war Herr Prof. Dr. R. Stick aus dem Fachbereich 2
(Biologie/Chemie) der Universität Bremen.
Gutachter der Dissertation:
1. Prof. Dr. Reimer Stick, Universität Bremen
2. Dr. Frank O. Fackelmayer, Heinrich-Pette-Institut Hamburg
Tag des öffentlichen Kolloquiums:
07. April 2005; 14:00 Uhr
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ...................................................................................................................
1
1.1 Der Zellkern ......................................................................................................
1.2 Kernrekonstitution in vitro ...............................................................................
1.3 Organisationsebenen eukaryotischer DNA .......................................................
1.4 Räumliche und molekulare Organisation der DNA-Replikation ......................
1.5 X-Chromosomen-Inaktivierung ........................................................................
1.6 Die Kernmatrix..................................................................................................
1.7 Kernmatrix-assoziierte DNA-Bereiche (S/MARs) ...........................................
1.8 SAF-A................................................................................................................
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2. Zielsetzung ................................................................................................................. 24
3. Material ....................................................................................................................... 25
3.1 Geräte und Verbrauchsmaterial.........................................................................
3.2 Chemikalien, Reagenzien und Enzyme.............................................................
3.3 Antikörper .........................................................................................................
3.4 Kits ....................................................................................................................
3.5 Zellinien und Bakterien .....................................................................................
3.6 Software.............................................................................................................
3.7 Expressionsvektor-Konstrukte ..........................................................................
3.8 Puffer und Lösungen .........................................................................................
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4. Methoden .................................................................................................................... 35
4.1 Methoden: Eukaryotische Zellen ...................................................................
4.1.1 Kultivierung eukaryotischer Zellen ....................................................
4.1.2 Transfektion eukaryotischer Zellen ....................................................
4.1.3 Herstellung stabiler Zellinien .............................................................
4.1.4 Langzeitlagerung eukaryotischer Zellen ............................................
4.1.5 Immunfluoreszenz-Färbung eukaryotischer Zellen............................
4.1.6 Herstellung cytogenetischer Präparate / Metaphasespreitungen ........
4.1.7 Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ........................................
4.1.8 Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP).......................
4.1.9 Vorbereitung von Zellen für die Durchflußcytometrie.......................
4.1.10 Vorbereitung von Zellen für die FACS ............................................
4.1.11 Vitalitätstest ......................................................................................
4.1.12 Replikations-Assay...........................................................................
4.1.13 Transkriptions-Assay........................................................................
4.1.14 RNA-Isolierung aus eukaryotischen Zellen .....................................
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42
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43
Inhaltsverzeichnis
II
4.1.15 Array-Analysen ................................................................................ 44
4.2 Methoden: Xenopus-Ei-Extrakt .....................................................................
4.2.1 Kernzusammenbau in vitro.................................................................
4.2.2 Kernzusammenbau in Gegenwart von Antikörpern ...........................
4.2.3 Immundepletion von xSAF-A aus Ei-Extrakten.................................
4.2.4 Immunfluoreszenz-Färbung einfacher Kerne .....................................
4.2.5 Halopräparation einfacher Kerne........................................................
4.2.6 Hemmung von DNA-Polymerasen im Xenopus-Ei-Extrakt...............
4.2.7 Visualisierung und Synchronisation der DNA-Replikation
in einfachen Kernen ...........................................................................
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49
4.3 Methoden: allgemein und gemischt ...............................................................
4.3.1 Transformation prokaryotischer Zellen ..............................................
4.3.2 Herstellung einer Affinitätschromatographiesäule.............................
4.3.2.1 Protein-Expression in Bakterien ..................................................
4.3.2.2 Protein-Aufreinigung aus Bakterien mittels IMAC .....................
4.3.2.3 Proteinkopplung an SulfoLink-Gel ..............................................
4.3.3 Aufreinigung und Konzentrierung von Antikörpern ..........................
4.3.4 Markierung von Antikörpern..............................................................
4.3.5 SDS-PAGE .........................................................................................
4.3.6 Western Blot .......................................................................................
4.3.7 RT-PCR ..............................................................................................
4.3.8 Beschichtung von Deckgläschen mit Alzianblau ...............................
4.3.9 DNA-Färbung und Einbettung von Präparaten ..................................
4.3.10 Matrixpräparation in situ ..................................................................
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5. Ergebnisse .................................................................................................................. 61
5.1 Ergebnisse: Xenopus-Ei-Extrakt....................................................................
5.1.1 Strukturmerkmale einfacher Kerne ....................................................
5.1.2 Organisation von xSAF-A in einfachen Kernen.................................
5.1.3 Einfluß von xSAF-A Antikörpern auf die Kernbildung .....................
5.1.4 Lokalisierung von replizierter DNA in einfachen Kernen .................
5.1.5 Lokalisierung von Replikationsfaktoren in einfachen Kernen ...........
5.1.6 Western-Blot-Analyse von Antikörpern.............................................
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5.2 Ergebnisse: Eukaryotische Zellen..................................................................
5.2.1 Organisation von SAF-A in eukaryotischen Zellen ...........................
5.2.2 Anreicherung von SAF-A in inaktiven X-Chromosomen (Xi) ..........
5.2.3 X-Chromosomale Situation in den Zellinien
HEK293, SF767 und IMR90 ..............................................................
5.2.4 Auswirkung von C280 auf die Chromatinstruktur .............................
5.2.5 Auswirkung von C280 auf Chromosomenterritorien .........................
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97
Inhaltsverzeichnis
5.2.6 Auswirkung von C280 auf die Kernmatrix ........................................
5.2.7 Auswirkung von C280 auf die Replikation und Transkription ..........
5.2.8 Auswirkung von C280 auf den Zellzyklus .........................................
5.2.9 Auswirkung von C280 auf die chromatingebundene
Fraktion von Replikationsfaktoren .....................................................
5.2.10 Array-Auswertung ............................................................................
5.2.11 Mobilität von SAF-A und SAF-A-Konstrukten in Zellkernen.........
III
98
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115
120
6. Diskussion ................................................................................................................... 126
6.1 xSAF-A in rekonstituierten Kernen.......................................................
6.2 SAF-A und C280 in komplexen Zellkernen..........................................
6.3 Anreicherung von SAF-A in Xi.............................................................
6.4 Kernmatrix in vivo .................................................................................
128
137
146
149
7. Zusammenfassung ................................................................................................... 153
8. Literatur...................................................................................................................... 154
9. Anhang ........................................................................................................................ 176
9.1 Abkürzungen.......................................................................................... 176
9.2 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis ................................................... 177
9.3 Danksagung ........................................................................................... 180
Einleitung
1
1. Einleitung
Der Zellkern, zuerst im Jahre 1802 von Franz Bauer beschrieben und später durch Robert
Brown im Jahre 1831 popularisiert, ist eines der auffälligsten aber auch eines der am
wenigsten
verstandenen
Organellen
eukaryotischer
Zellen.
Die
konventionelle
Durchlichtmikroskopie gewährt nur einen sehr begrenzten Einblick in das strukturelle
Innenleben des Zellkerns. Es erscheint daher nicht verwunderlich, daß das primäre Interesse
für lange Zeit vornehmlich der biochemischen Charakterisierung des Zellkerns galt. Erst
durch die Verbesserung und das Aufkommen neuer fluoreszenzmikroskopischer Techniken in
den letzten 20 Jahren sowie durch die Erkenntnis, daß im Zellkern Struktur-FunktionsBeziehungen bestehen, wurde das Forschungsfeld der Zellkernarchitektur merklich
wiederbelebt. Besonders die Fähigkeit, Proteine innerhalb der Zelle mit einem
fluoreszierenden Anhang wie dem grünfluoreszierenden Protein GFP zu versehen und mittels
der Lebendzellmikroskopie zu verfolgen, haben in den letzten Jahren enorm zu einem
besseren Verständis der Zellkernarchitektur beigetragen. Die zwei fundamentalen Aspekte der
Kernarchitektur sind: 1) Der Zellkern enthält verschiedene Subkompartimente. 2) Der
Zellkern ist ein höchst dynamisches Organell.
Im folgenden wird die strukturelle und funktionelle Organisation des Zellkerns näher
vorgestellt, wobei Aspekte, die im direkten Zusammenhang mit dieser Arbeit stehen,
ausführlicher beschrieben sind.
1.1 Der Zellkern
Ein für eukaryotische Zellen charakteristisches Merkmal ist das Vorhandensein eines
Zellkerns (lateinisch „Nucleus“, griechisch „Karyon“). Der in der Regel runde bis ovale
Zellkern ist mit einem durchschnittlichen Durchmesser von ~10µm das größte und
lichtmikroskopisch auffälligste Organell eukaryotischer Zellen. Er enthält nahezu die
gesamte
genetische
Information
der
Zelle
und
stellt
den
Hauptort
des
Nukleinsäuremetabolismus dar. In ihm finden elementare Prozesse wie z.B. die DNAReplikation, die DNA-Rekombination , die DNA-Reparatur sowie die Expression von Genen
statt.
Der Zellkern ist vom Cytoplasma der Zelle durch eine Kernhülle abgegrenzt. Die Kernhülle
besteht unter anderem aus zwei Membranen, die durch einen perinukleären Spalt voneinander
getrennt sind. Die äußere der beiden Membranen geht kontinuierlich in das rauhe
Einleitung
2
endoplasmatische Retikulum über, und ist häufig mit Ribosomen besetzt. An Stellen der
Kernporen treffen die äußere und die innere Membran aufeinander.
Kernporen sind die Kernhülle durchspannende, supramolekulare Proteinkomplexe, die dem
passiven wie auch dem aktiven Materialaustausch zwischen Nucleo- und Cytoplasma dienen
(Görlich & Mattaj, 1996; Stoffler et al., 1999). Auf der cytoplasmatischen Seite ist der Kern
über Intermediärfilamente mit dem Cytoskelett der Zelle verbunden (Übersicht in Herrmann
& Aebi, 2000), wodurch eine bewegliche Lagerung des Kerns erreicht wird. Der inneren
Membran liegt in Richtung des Nucleoplasmas eine als Lamina bezeichnete faserige Struktur
auf, die sich größtenteils aus Laminen zusammensetzt (Übersicht in Goldman et al., 2002).
Die Lamine stellen hochkonservierte Proteine dar, die eine enge Verwandtschaft zu den
cytoplasmatischen Intermediärfilamenten aufweisen und als Intermediärfilamente vom Typ V
klassifiziert sind (Stewart, 1993). Neben der mechanischen Unterstützung und des Einflußes
auf die Form und das Volumen von Zellkernen, scheinen die Lamine eine Anzahl weiterer
Prozesse im Zellkern zu beeinflussen (Moir et al., 1995). Zum Beispiel sind die Lamine an
der Anheftung des Chromatins beteiligt, und spielen darüber hinaus eine wichtige Rolle beim
reversiblen Abbau des Zellkerns in der frühen Metaphase der Mitose, bei der die Auflösung
der Kernhülle mit einer vorübergehenden Phosphorylierung von Lamin B einhergeht (Gerace
& Burke, 1988).
Trotz der komplexen und vielfältigen biochemischen Prozesse im Zellkern, die einen
gewissen Grad der morphologischen Komplexität erwarten lassen, galt das Kerninnere für
lange Zeit als wenig organisiert. Frühe lichtmikroskopische Betrachtungen ließen kaum
Strukturen erkennen, und der Großteil des Kerns schien mit einem flüssigem Medium gefüllt
zu sein, welches als nukleärer Saft bzw. Karyolymphe bezeichnet wurde (Fawcett, 1966;
Berezney, 1984). Das vermeintliche Fehlen distinkter nukleärer Strukturen führte daher zu der
Annahme, daß der Kern ein „chaotisches“ Organell sei, welches große Mengen ungeordneter
DNA und homogen verteilte Proteine enthält. Erst mit der Weiterentwicklung
mikroskopischer Techniken und molekularbiologischer Methoden im letzten Jahrzehnt
kristallisierte sich heraus, daß der Zellkern eine hochkomplexe Architektur besitzt und in
verschiedene Domänen bzw. Kompartimente unterteilt ist (s. Abb. 1). Im Gegensatz zu den
Organellen im Cytoplasma sind die Kompartimente im Zellkern allerdings nicht von
Membranen
umgeben.
Das
größte
Subkompartiment
im
Zellkern
bilden
die
Chromosomenterritorien. Der Begriff „Chromosomenterritorium“ wurde bereits im Jahre
1909 von Theodor Boveri geprägt, der damit seine Ansicht zum Ausdruck bringen wollte, daß
Einleitung
3
O
A
B
N
C
M
D
E
L
K
F
J
G
I
H
Abb. 1: Der Nucleus der Mammalia. Der eukaryotische Zellkern ist ein hochkomplexes
Organell, welches sich in eine Vielzahl verschiedener Kompartimente/Domänen untergliedert. Die
fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen A) bis O) zeigen eine kleine Auswahl dieser.
A) Heterochromatin (HP1α); B) PcG body; C) Cajal body & Gem; D) Chromatin-Protein HMG-1C;
E) PML body; F) Nuclear speckles; G) SAM68 body; H) Chromosomenterritorien (Chr. 1);
I) Kernmatrix; J) Perinucleoläres Kompartiment; K) Nucleolus; L) Kernlamina; M) RNA-Pol-IITranskriptionsstellen; N) Opt-Domäne; O) Cleavage body. (Abbildung modifiziert nach Jim Duffy aus
Spector (2001)).
Chromosomen während der Interphase als getrennte Individuen erhalten bleiben (Boveri,
1909). Erst ca. 80 Jahre später konnte tatsächlich demonstriert werden, daß im Zellkern
voneinander getrennte Territorien existieren, die jeweils nur die DNA eines bestimmen
Chromosoms enthalten (Cremer et al., 1982a,b; Lichter et al., 1988). Die Größe der
Territorien ist hierbei von der DNA-Menge des jeweiligen Chromosoms abhängig. Die
Territorien selbst sind aus distinkten Chromosomenarm- und Chromosomenband-Domänen
(Dietzel et al., 1998) aufgebaut. Die kleinsten erkennbaren Einheiten (~300 bis ~800nm) von
Chromosomenterritorien stellen die subchromosomalen Foci dar (Zink et al., 1998; Verschure
et al., 1999).
Ob Chromosomen zueinander eine genau festgelegte Anordnung im Zellkern einnehmen ist
aufgrund sich widersprechender Beobachtungen (Nägele et al., 1995; Allison & Nestor, 1999)
nicht eindeutig geklärt. Eventuell ist der Grad der Ordnung vom Zelltyp abhängig (Chandley
et al., 1996). Eine Schlüsselrolle für die Positionierung von Chromosomen im Zellkern
scheint allerdings deren Gendichte zu spielen. So nehmen Chromosomen vergleichbarer
Größe, aber unterschiedlicher Gendichte, verschiedene Positionen ein (Boyle et al., 2001).
Dies zeigt sich gut beim Vergleich der Chromosomen 18 und 19. Beide Chromosomen haben
einen ähnlichen DNA-Gehalt (85 und 67Mb), das Territorium des Gen-armen und spät
replizierenden Chromosoms 18 liegt jedoch in der Nähe der Kernperipherie, wohingegen das
Einleitung
4
Gen-reiche und früh replizierende Chromosom 19 weiter im Inneren des Kerns vorzufinden
ist (Croft et al., 1999).
Umgeben und teilweise durchzogen sind die Chromosomenterritorien von einem Chromatinfreien Raum, der als Interchromatindomänen-Kompartiment (ICD-Kompartiment) bezeichnet
wird (Verschure et al., 1999; Solovei et al., 2000; Visser et al., 2000, Übersicht in Cremer &
Cremer, 2001). Elektronenmikroskopische Aufnahmen haben gezeigt, daß der Raum des ICDKompartiments von einem Ribonucleoprotein-Netzwerk ausgefüllt wird (Shanker Narayan et
al., 1967). An seinen weitesten Stellen formt das ICD-Kompartiment Lakunen von einigen
Mikrometern Durchmesser, an seinen feinsten Stellen bildet es Verzweigungen mit einem
Durchmesser von nur einigen Nanometern (Cremer at al., 2000).
Der Nucleolus ist ein weiteres Kompartiment des Zellkerns und das einzige, welches
lichtmikroskopisch sichtbar ist. Die meisten Säugetier-Zellen lassen 1 bis 5 Nucleoli mit
einem Durchmesser von 0,5 bis 5µm erkennen. Der Nucleolus ist der Ort der rRNA-Synthese,
der rRNA-Prozessierung und des Zusammenbaus der ribosomalen Untereinheiten (Spector,
1993; Scheer & Hock, 1999; Olson et al., 2000). Entsprechend seiner Morphologie und
Funktionsräume läßt sich der Nucleolus in ein fibrilläres Zentrum, ein dichtes fibrilläres
Kompartiment und eine granuläre Region einteilen (Scheer & Rose, 1984; Raska et al., 1989;
Rendon et al., 1992; Thiry, 1992a,b). Neben den bereits erwähnten Funktionen scheint der
Nucleolus weitere Aufgaben, wie z.B. die Sequestration von Proteinen, wahrzunehmen
(Pederson, 1998; Olson et al., 2000). So wird das Protein Mdm2, welches für den Export von
p53 in das Cytoplasma notwendig ist, durch den Faktor Ink4/ARF im Nucleolus sequestriert,
wodurch eine Wechselwirkung zwischen Mdm2 und p53 unterbleibt. Das Protein p53 wird
somit nicht in das Cytoplasma transportiert und dort abgebaut, sondern verbleibt im Kern, wo
es seine Funktion als Tumorsuppressor wahrnehmen kann (Tao & Levine, 1999; Weber et al.,
1999).
Neben dem Nucleolus existiert eine wachsende Familie kleiner, im Kern verteilter
Kerndomänen bzw.
Kernkörperchen („nuclear bodies“, Dundr & Misteli, 2001), die in
erweiterten Regionen des Interchromatin-Raumes liegen (Matera, 1999). Zu ihnen zählen z.B.
Cajal bodies, PML (promyelocytic leukemia) bodies, PcG bodies, SAM68 nuclear bodies,
Gems und Speckles, deren Größe zwischen ~0,2 und ~1,5µm liegt (Spector, 2001). Besonders
gut charakterisiert sind die Speckles, die Cajal bodies und die PML bodies.
Cajal bodies, die in einer Stückzahl von 1 bis 10 pro Kern vorkommen, enthalten Faktoren für
das Spleißen von prä-mRNA (Gall, 2000). Sie sind in die Biogenese von snRNA involviert,
und ihre strukturelle Integrität ist von Coilin abhängig (Tucker et al., 2001; Shpargel et al.,
Einleitung
5
2003). PML bodies (10 bis 30 pro Kern) enthalten einige kritische Regulatoren der
Zellproliferation, der Apoptose und der Genomstabilität, wie z.B. das TumorsuppressorProtein PML (Zhong et al., 2000). Die Ultrastruktur der PML bodies erinnert an einen
dichten Ring oder an einen „Doughnut“ (Sternsdorf et al., 1997; Hodges et al., 1998). Obwohl
PML bodies Orte biochemischer Aktivität sind, z.B. wird p53 durch die HIP-Kinase-2 als
Antwort auf eine UV-Bestrahlung phosphoryliert (Hofmann et al., 2002), scheinen sie
hauptsächlich als nukleäres Depot zu dienen, welches bestimmte Proteine in einer regulierten
Weise rekrutiert und wieder freiläßt (Negorev & Maul, 2001).
Ein relativ großes Volumen des Kerns (ca. 20%) wird von den Speckles eingenommen, die
aufgrund ihrer hohen Konzentration von Spleißing-Faktoren auch als „splicing factor
compartments“ (SFCs) bezeichnet werden (Beck, 1961; Spector, 1990; Spector et al., 1991;
Spector, 1993; Misteli & Spector, 1998). Die SFCs sind allerdings nicht der primäre Ort des
Spleißens. Ihre Funktion besteht vielmehr in der Speicherung, Modifizierung und dem
Zusammenbau
von
spleißosomalen
Komponenten
(Misteli,
2000).
Die
elektronenmikroskopische Betrachtung von SFCs läßt dichte granuläre Strukturen
(„interchromatin granule clusters“ = IGC) erkennen, die einen Durchmesser von 20-25nm
aufweisen (Monneron & Bernhard, 1969). Neben snRNAs und Spleißing-Faktoren können in
SFCs auch Transkriptionsfaktoren (Larsson et al., 1995; Mortillaro et al., 1996; Zeng et al.,
1997), Faktoren der 3’-Prozessierung (Schul et al., 1989; Krause et al., 1994) und ribosomale
Proteine (Mintz et al., 1999) gefunden werden. Insgesamt scheinen SFCs ca. 150
verschiedenen Proteine zu enthalten (Mintz et al., 1999).
Neben den soeben beschriebenen, äußerst spezialisierten Kernkörperchen sind auch die
grundlegenden Prozesse der DNA-Replikation und der Transkription innerhalb des Zellkerns
in distinkten Domänen organisiert. Die Markierung von Transkriptionsstellen der RNAPolymeraseII durch den Einbau von Br-UTP in naszierende RNA führt im Nucleoplasma zur
Detektion von Foci mit einem Durchmesser von 40 bis 80nm (Iborra et al., 1996). Die Anzahl
der Transkriptionsstellen reicht von 500 bis 10000 pro Zelle (Pombo et al., 1999), wobei in
HeLa-Zellen schätzungsweise 30 einzelne Transkriptionseinheiten bzw. RNA-PolymeraseMoleküle pro Transkriptionsstelle zu sogenannten Transkriptionsfabriken zusammengefaßt
sein sollen (Jackson et al., 1998). Neben der Transkription scheinen die RNA-PolymeraseIIFabriken auch in die weitere Prozessierung der mRNA, wie das „capping“, die
Polyadenylierung und das Spleißen, involviert zu sein (Myer & Young, 1998). Weiterhin
deuten experimentelle Befunde darauf hin, daß mit der Transkription an den
Transkriptionsfabriken
geringfügige
Translationsprozesse
gekoppelt
sind,
die
der
Einleitung
6
Qualitätskontrolle der RNA und dem „non-sense mediated decay“ aberranter RNATranskripte dienen könnten (Iborra et al., 2001).
Auch der Prozeß der DNA-Replikation ist in zahlreichen Foci organisiert, die ein genau
festgelegtes räumliches und zeitliches Verteilungsmuster während der S-Phase aufweisen
(Nakayasu & Berezney, 1989; van Dierendonck et al., 1989; Manders et al., 1992). Auf die
räumliche und molekulare Organisation der DNA-Replikation wird in Abschnitt 1.4
ausführlicher eingegangen.
Interessanterweise können Kerne in vitro mittels spezieller zellfreier Systeme, z.B. XenopusEi-Extrakten, de novo um zugegebene DNA rekonstituiert werden (siehe nächster Abschnitt 1.2 Kernrekonstitution in vitro). Der Grundaufbau dieser in vitro-Kerne ist mit dem von
nativen Zellkernen vergleichbar. Die Gesamtorganisation und die strukturelle Komplexität der
rekonstituierten Kerne ist allerdings wesentlich einfacher als die von echten Zellkernen. So
deutet zum Beispiel nichts darauf hin, daß in einfachen Kernen Nucleoli und Kernkörperchen
existieren. Die rekonstituierten Kerne können gewissermaßen als die Basisversion eines
Zellkerns ohne zusätzliche Extras aufgefaßt werden. Die „Einfachheit“ der gebildeten Kerne
kann genutzt werden, um Struktur-Funktions-Beziehungen und grundlegende Kernfunktionen
ohne
die
Interferenz
epigenetischer
Effekte
zu
studieren.
Aufgrund
der
guten
Manipulierbarkeit von Kernbildungsreaktionen bieten sich die einfachen Kerne zudem zur
Identifikation von Faktoren an, die eine wichtige Rolle für die Kernbildung und die
Kernarchitektur spielen.
1.2 Kernrekonstitution in vitro
Im Verlauf der Oogenese von Eizellen des Krallenfrosches Xenopus laevis werden eine
Vielzahl nucleärer Komponenten synthetisiert und für den späteren Gebrauch gespeichert. Zu
den Komponenten gehören u.a. Histone, TopoisomeraseII, Komponenten der Kernmembran,
Kernporen, RNA und Enzyme der DNA-Replikation (Benbow & Ford, 1975; Laskey et al.,
1977; Woodland & Adamson, 1977; De Robertis et al., 1982; Benedetti et al., 1983; Forbes et
al., 1983a). Reife Xenopus-Eier sind in der MetaphaseII der Meiose arretiert (Newport &
Kirschner, 1984; Smith, 1989; Übersicht in Ferrel, 1999). Während der Fertilisation kommt es
zu einem transienten Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration und zur Aktivierung der
Eier, wodurch sich die Metaphase-Chromosomen binnen kürzester Zeit (5 bis 10min)
dekondensieren und sich ein Interphase-Kern bildet (Busa & Nuccitelli, 1985; Newport, 1987;
Stricker, 1999).
Einleitung
Forbes
und
7
Mitarbeiter
(1983b)
mikroinjizierten proteinfreie (nackte) DNA des
Bakteriophagen Lambda (λ) in aktivierte Xenopus-Eier und beobachteten, daß diese DNA in
membranumhüllte Vesikel verpackt wird. Die Vesikel waren morphologisch nicht von
normalen Kernen zu unterscheiden und reagierten ebenfalls auf Zellzyklussignale. Dies
verdeutlichte, daß im Ei-Cytoplasma alle notwendigen Komponenten zur Kernbildung
vorhanden sind und selbst proteinfreie und zudem noch artfremde DNA als Induktor für
diesen Prozeß dienen kann.
Das erste zellfreie System, welches eine Kernbildung in vitro ermöglichte, wurde von Lohka
und Masui (1983) beschrieben. Das System basiert auf dem Cytoplasma aktivierter Eier des
Frosches Rana pipiens und induziert bei demambranisierten Spermien von Xenopus laevis die
Bildung einer Kernhülle, die Dekondensation des Chromatins und die Initiation der DNASynthese. Ein weiteres zellfreies System stammt von Burke und Gerace (1986), die
Metaphase-Chromosomen und einen Extrakt von CHO-Zellen für die Kernbildung in vitro
verwendeten. Von Newport wurde 1987 erstmals die in vitro Bildung von Kernen um
„nackte“ λ-DNA in cytoplasmatischen Ei-Extrakten von Xenopus laevis beschrieben. Die Eier
wurden vor der Präparation der cytoplasmatischen Fraktion durch die Verwendung eines
Calcium-Ionophores aktiviert und somit in die Interphase entlassen. Alternativ kann eine
Aktivierung auch durch eine Elektroporation von Eiern oder die direkte Zugabe von Ca2+ zu
präparierten MetaphaseII-Ei-Extrakten erfolgen.
Wird aktivierten Xenopus-Ei-Extrakten λ-DNA und ein ATP-regenerierendes System zur
Energieversorgung hinzugefügt, kann innerhalb kurzer Zeit die Bildung einfacher Kerne
beobachtet werden. Newport (1987) gab für die einzelnen Schritte des Kernzusammenbaus
den folgenden Zeitrahmen an: Nukleosomenbindung (0-40min), Chromatinkondensation (4080min), Bildung einer Kernhülle und Dekondensation des Chromatins (80-180min).
Die in vitro gebildeten Kerne sind von einer doppelten Membran und einer darunter liegenden
Lamina umgeben, die in regelmäßigen Abständen (~500nm) von Kernporen durchzogen sind
(Newport, 1987). Auch findet in solchen einfachen Kernen DNA-Replikation statt, wobei das
Vorhandensein einer intakten Kernhülle eine wichtige Voraussetzung dafür ist. Die DNAReplikation startet ca. 60min nach der Zugabe der λ-DNA und dauert für 60 bis 80min an
(Newport, 1987).
Bei der Kernbildung fällt auf, daß die λ-DNA nach der Bindung von Histonen noch weiter zu
dicht gepackten Sphären kondensiert und die Bildung einer Kernhülle und die
Dekondensation des Chromatins erst mit einer zeitlichen Verzögerung stattfindet. Im
Gegensatz dazu werden Metaphase-Chromosomen im Xenopus-Ei-Extrakt bereits nach sehr
Einleitung
8
kurzer Zeit dekondensiert und von einer Kernhülle umgeben (5 bis 10min). Aufgrund dieser
Beobachtungen schlug Newport (1987) für den Kernzusammenbau um DNA zwei
Hauptphasen vor. In der ersten Phase wird die zugegebene DNA in eine Struktur verpackt, die
ähnlich zu Metaphase-Chromosomen ist. Das heißt, die DNA wird zunächst mit Histonen
besetzt und anschließend durch die Bindung zusätzlicher Proteine (u.a. „Scaffold“-Proteine)
weiter umstrukturiert. Erst dann ist in der zweiten Phase eine Bindung von Laminen und
Membranvesikeln möglich, der die Dekondensation und die Ausbildung einer Kernhülle folgt.
Das Xenopus-System ist frei zugänglich für Manipulationen, und stellt somit einen
interessanten Ansatz dar, die einzelnen Schritte der Kernbildung und der DNA-Replikation
näher zu studieren. So können z.B. vor dem Start der Kernbildung Proteine von Interesse
mittels Immundepletion aus dem Ei-Extrakt entfernt werden, um z.B. die Frage zu klären, ob
diese Proteine essentiell für die Kernbildung sind. Ebenso bietet sich die Möglichkeit,
modifizierte Proteine in den Extrakt einzubringen. Von wesentlichem Vorteil ist, daß die in
vitro gebildeten Kerne nicht von einer Zellmembran umgeben sind und somit fluoreszierende
Nukleotidanaloga, die in der Regel membran-impermeabel sind, für die direkte Visualisierung
von Replikationsfoci bzw. replizierter DNA verwendet werden können.
1.3 Organisationsebenen eukaryotischer DNA
Ein geordneter und regulierter Ablauf der Reaktionen des Nukleinsäuremetabolismus setzt
eine hohes Organisationsmaß der DNA voraus. Zum Beispiel besitzt eine diploide
menschliche Zelle 23 Chromsomenpaare, die zusammengerechnet einen DNA-Gehalt von
~6x109 Basenpaaren aufweisen. Im ausgestreckten Zustand hätte die DNA eine Länge von
etwa zwei Metern. Hieraus wird ersichtlich, daß ein hoher Grad der Komprimierung und
strukturellen Organisation existieren muß, um die DNA in einen Zellkern von nur einigen
Mikrometern Durchmesser zu verpacken. Neben der Verpackung muß die strukturelle
Organisation der DNA zusätzlich einen gezielten Zugriff auf Gene, Replikationsstartpunkte
und regulatorische Sequenzen gewährleisten. Die Organisation der DNA wird durch die
Wechselwirkung mit verschiedenen Proteinen erreicht, die eine hierarchische Faltung der
DNA in verschieden hohe Organisationsebenen bewirken. Während des Prozesses der
Genaktivierung ist dann wieder eine sequentielle Entfaltung der kompaktierten DNA
erforderlich (Hansen & Ausio, 1992; Krajewski & Razin, 1993).
Auf der ersten Organisationsebene liegt die DNA im Komplex mit kleinen basischen
Proteinen vor, den Histonen (Übersichten in van Holde, 1988; Wolffe, 1995). Je zwei der
„Core“-Histone H2A, H2B, H3 und H4 bilden ein zylindrisches Histon-Oktamer (Morse &
Einleitung
9
Simpson, 1988; van Holde, 1988), um welches die DNA-Doppelhelix mit 146bp in Form
einer linksgängigen Superhelix 1,75mal gewunden ist (Luger et al., 1997). Hierdurch wird
eine 6-7fache Komprimierung der DNA erreicht. Der DNA-Histonoktamer-Komplex wird als
„Core“-Nukleosom bezeichnet und bildet die sich wiederholende Grundeinheit des
Chromatins. Verbunden sind die Nukleosomen durch die „Linker“-DNA, die in Abhängigkeit
von Spezies und Gewebe in ihrer Länge (20-80bp) variiert und gewöhnlich mit dem „Linker“Histone H1 assoziiert ist (van Holde, 1988; Wolffe, 1995). Das Histon H1 bindet an die Einund Austrittstellen der DNA des Nukleosoms (Krajewski & Ausio, 1996) und ist essentiell für
die Faltung der 10nm-Nukleosomenkette in eine Faser mit einem Durchmesser von ~30nm
(Thoma et al., 1979; Allan et al., 1986).
Für die Organisation der 30nm-Faser, die zu einer 40fachen Komprimierung der DNA führt,
bestehen verschiedene Modelle (Übersicht in Widom 1989; van Holde & Slatanova, 1995;
Fletcher & Hansen, 1996). Nach Graziano et al. (1994) ist die Nukleosomenkette zu einer
kompakten helikalen Faser gewunden. Je sechs Nukleosomen bilden eine Helixwindung und
wechselwirken dabei so miteinander, daß sich Histon H1 im Inneren der Faser befindet. Die
aminoterminalen Domänen der „Core“-Histone sind dagegen von außen frei zugänglich für
Modifikationen und können so eine lokale Veränderung der Chromatinstruktur induzieren
(Smith, 1991).
Die
Chromatinstruktur
und
damit
zusammenhängend
auch
die
Transkriptionsaktivität kann über Modifikationen wie Acetylierungen, Methylierungen oder
Phophorylierungen von Histonen moduliert werden (Wade et al., 1997; Davie, 1998). So
führen Histon-Acetyltransferasen aufgrund der Acetylierung von Lysinresten in den
aminoterminalen Domänen von Histonen zu einer Abschwächung der DNA-Histon-Bindung
und zu einem leichteren Zugang der Transkriptionsmaschinerie (Übersichten in Wolffe &
Pruss, 1996; Grunstein, 1997; Wade et al., 1997). Als Gegenspieler der HistonAcetyltransferasen
fungieren
Histon-Deacetylasen,
die
zu
einer
Inaktivierung
der
Transkription führen. Rekrutiert werden die Histon-Deacetylasen unter anderem durch das
Protein MeCP2, das an methylierte CpG-Inseln in nukleosomaler DNA bindet (Übersicht in
Bestor, 1998; Jones et al., 1998; Nan et al., 1998).
Nach heutigen Vorstellungen wird eine weitere Verpackung der DNA durch die Organisation
der 30nm-Chromatinfaser in voneinander unabhängige Schleifen („chromatin loops“) mit
5-200kbp erreicht (Nelson et al., 1986; Davie, 1995; Razin et al., 1995). Hierdurch kommt es
zu einer weiteren Komprimierung des Chromatins um das 10-15fache. Die Schleifen sind mit
ihrer Basis über bestimmte AT-haltige DNA-Bereiche mit einer komplexen Struktur aus
Einleitung
10
Nicht-Histon-Proteinen und RNA, die als Kernmatrix („nuclear matrix“) oder auch
Kerngerüst („nuclear scaffold“) bezeichnet wird, verankert (s. Abb. 2).
Nach experimenteller Entfernung von Histonen erstrecken sich die verankerten DNASchleifen weit über die Kernperipherie hinaus (Vogelstein et al., 1980). Der Kern erscheint
dann wie von einem „Heiligenschein“ aus DNA umgeben, weshalb diese Strukturen auch als
Halo bezeichnet werden. Im Metaphasechromosom sind die Chromatin-Schlaufen laut der
„radial loop theory“ (Marsden & Laemmli, 1979) extrem dicht in radialer Anordnung um die
Chromosomenachse gepackt.
Die Verankerung der Chromatinschleifen, die stabil gegenüber Salzextraktionen und dem
Verdau durch DNaseI ist (Cai et al., 2003), ist keinesfalls statisch. Wurde früher
angenommen, daß die verankerten DNA-Bereiche während verschiedener Stadien der
Entwicklung und des Zellzyklus sowie im mitotischen und meiotischen Chromatin die
gleichen seien (Mirkovitch et al., 1988), so weisen neuere Erkenntnisse darauf hin, daß die
Verankerung wesentlich flexibler ist (Micheli et al., 1993). Zum Beispiel konnten während
der Entwicklung von Xenopus-Embryonen Veränderungen in der Verankerung einzelner
Gendomänen beobachtet werden (Vassetzky et al., 2000). Zu einer Neuverankerung
bestimmter DNA-Bereiche kommt es auch während der T-Zell-Aktivierung (Cai & KohwiShigematsu, 1999). Interessanterweise scheinen aktive Gene bevorzugt an der Basis von
30nm Chromatinfaser
Gen
DNA-Loops
(5-200kbp)
DNABindedomäne
SAF-A
S/MARBindeprotein
S/MARDNA
(0,2-7kb)
RNA/MatrixBindedomäne
Kernmatrix
Abb. 2: Modellvorstellung der höheren Chromatinorganisation. Nach einer gängigen
Modellvorstellung ist das Chromatin im Zellkern in Form von Schleifen („loops“) organisiert, die an ihrer
Basis über bestimmte DNA-Elemente (-> S/MARs, s. Kap. 1.7) mit einer unlöslichen Struktur aus
Proteinen und RNA (-> Kernmatrix, s. Kap. 1.6) verbunden sind. Die Vermittlung zwischen den S/MARs
und der Kernmatrix geschieht über spezielle Bindeproteine der Kernmatrix. Das Kernprotein SAF-A
(s. Kap. 1.8) erfüllt die nötigen Voraussetzungen eines solchen Bindeproteins, da es zum einen Bestandteil
der Kernmatrix ist und zum anderem spezifisch an S/MARs binden kann.
Einleitung
11
Schleifen zu liegen (Gerdes et al., 1994; Cook, 1999). Auch deuten Experimente darauf hin,
daß an der Basis der Schleifen DNA-Replikationsprozesse stattfinden (Pardoll et al., 1980).
Vielfach wird die Chromatin-Schleife daher auch als die strukturelle und funktionelle Einheit
des Chromatins angesehen, die für die Genexpression und die DNA-Replikation
verantwortlich ist (Gasser & Laemmli, 1987; Cook, 1994; Jackson, 1997; Cook, 1999).
Nach einem Modell von Saitoh & Laemmli (1994) sind die Chromatinschleifen entlang der
Achse von Metaphasechromosomen unterschiedlich dicht gepackt. In R-Banden sollen die
Schleifen länger und weniger dicht gefaltet sein als in Q- bzw. G-Banden. In den Territorien
von Interphase-Chromosomen bleiben die Banden der Metaphase-Chromosomen als distinkte
Domänen in Form von subchromosomalen Foci erhalten (Zink et al., 1998, 1999).
Interessanterweise können den Chromosomenbanden bestimmte Charakteristika zugeordnet
werden. Die GC-reichen R-Banden sind transkriptionell aktiv (Euchromatin) und enthalten
vorwiegend Haushaltsgene (Holmquist, 1992; Craig & Bickmore, 1993). Im Kern sind die
Bereiche des R-Chromatins diffus verteilt und vorzugsweise in der Peripherie von
Chromosomenterritorien lokalisiert (Ferreira et al., 1997; Qumsiyeh, 1999; Sadoni et al.,
1999; Cremer & Cremer, 2001). Im Gegensatz zu den R-Banden weisen die AT-reichen GBanden deutlich weniger und vorwiegend gewebespezifische Gene auf, die nur in bestimmten
Zelltypen transkribiert werden (Manuelidis, 1990; Sumner, 1990; Craig & Bickmore, 1993).
Die G-Banden, die sich vorzugsweise an der Kernperipherie und um die Nucleoli lokalisieren,
sind in der Regel transkriptionell inaktiv, da in ihnen das fakultative Heterochromatin
organisiert ist (Qumsiyeh, 1999; Cremer & Cremer, 2001). Neben den G- und R-Banden
existieren ebenfalls noch sogenannte C-Banden. Die C-Banden sind primär in der
Centromerregion lokalisiert und repräsentieren konstitutives Heterochromatin, welches
offensichtlich keine Gene beinhaltet und sich aus tandemartig wiederholenden SatellitenDNA-Sequenzen zusammensetzt (Sumner, 1990; Craig & Bickmore, 1993). Die Ausbildung
von Heterochromatin wird durch epigenetische Modifikationen hervorgerufen. Eine
essentielle Modifikationen für die Ausbildung von Heterochromatin stellt hierbei die
Methylierung des Lysin-Restes an Position neun von Histon H3 dar (Lachner & Jenuwein,
2002), die im folgenden zur Rekrutierung des Kernproteins HP1 (heterochromatin protein 1)
beiträgt (Lachner et al., 2001). Aufgrund des kondensierten Zustandes erscheint
Heterochromatin durch DNA-Farbstoffe, wie z.B. DAPI, stärker gefärbt als Euchromatin
(Bickmore & Craig, 1997). Ein sehr prominentes Beispiel für epigenetische Modifikationen,
die zur Ausbildung von fakultativem Heterochromatin führen, stellt der Prozeß der XChromosom-Inaktivierung dar. Hierauf wird im übernächsten Abschnitt (-> 1.5 X-
Einleitung
12
Chromosomen-Inaktivierung) ausführlicher eingegangen. Neben der unterschiedlichen
Lokalisierung, Anfärbbarkeit und Transkriptionsaktivität unterscheiden sich eu- und
heterochromatische Bereiche auch im Zeitpunkt der Replikation und der Morphologie der
Replikationsfoci (siehe folgender Abschnitt -> 1.4 Räumliche und molekulare Organisation
der DNA-Replikation). Offensichtlich besteht im Zellkern ein Zusammenhang zwischen der
transkriptionellen Aktivität, der räumlichen Positionierung und dem Zeitpunkt der Replikation
von Chromatinregionen (Sadoni et al., 1999).
1.4 Räumliche und molekulare Organisation der DNA-Replikation
Eine wichtige Voraussetzung, die eine Zelle vor ihrer Teilung und der Weitergabe der
genetischen Information erfüllt haben muß, ist die Duplikation der genomischen DNA. Bei
diesem Prozeß muß gewährleistet sein, daß keine Region der chromosomalen DNA vergessen
oder öfter als einmal repliziert wird. Dies ist wichtig, um die genomische Integrität zu wahren
und etwaige Folgen einer unkorrekten Duplikation, die den Zelltod oder die Zellentartung zur
Folge haben kann, zu vermeiden. Die DNA-Replikation ist daher ein komplexer, streng
regulierter und koordinierter Prozeß.
Eukaryotische Zellen regulieren die Initiation der DNA-Replikation durch den geordneten
Zusammenbau und Abbau von Replikationskomplexen an Startstellen der Replikation, die als
ORIs (origin of replication) bezeichnet werden (Tye, 1999). Die am besten charakterisierten
ORIs sind die ARS-Elemente (autonomously replicating sequences) aus der Hefe
Saccharomyces cerevisiae, die extrachromosomalen Plasmiden und Chromosomen die
Fähigkeit zur Replikation verleihen (Brewer & Fangman, 1987; Huberman et al., 1988). ARSElemente haben eine Größe von ca. 150bp und weisen eine AT-reiche Konsensussequenz von
11bp auf (Marahrens & Stillman, 1992; Lee & Bell, 1997). In vielzelligen Organismen
gestaltet sich die Identifizierung von ORIs als kompliziert. Zwar können auch hier AT-reiche
Sequenzen gefunden werden, ansonsten unterscheiden sich die ORIs aber sehr voneinander
und eine eindeutige Konsensussequenz scheint in höheren Eukaryoten nicht zu existieren
(DePamphilis, 1999; Altman & Fanning, 2001; Gilbert, 2001; Liu et al., 2003). Es wird daher
angenommen, daß ORIs in Mammalia nicht exklusiv durch ihre DNA-Sequenz definiert sind,
sondern eher durch gebundene Transkriptionsfaktoren, die lokale Chromatinstruktur oder die
Position innerhalb des Kerns bestimmt werden (Cook, 1999; Mechali, 2001; Biamonti et al.,
2003).
Gegen Ende der Mitose und während der G1-Phase kommt es an den ORIs zur Entstehung
von Prä-Replikationskomplexen („pre-RC“ = „pre-replicative complexes“). Zuerst bindet der
Einleitung
13
heterohexamere Komplex ORC (origin recognition complex), bestehend aus den Proteinen
ORC1 bis ORC6 (Bell & Stillman, 1992), an den ORI. Es folgt die sequentielle Bindung der
Proteine Cdc6 und Cdt1 (Maiorano et al., 2000; Nishitani et al., 2000; Tada et al., 2001).
Anschließend
erfolgt
die
Rekrutierung
des
heterohexameren
MCM-Komplexes
(minichromosome maintenance), der sich aus den Proteinen MCM2 bis MCM7
zusammensetzt (Tanaka et al., 1997; Lei & Tye, 2001).
Während des Übergangs von der G1- zur S-Phase kommt es durch die Kinasen Cdk2 und
Cdc7, die im Komplex mit CyclinE und Dbf4 vorliegen (Cdk2-CyclinE und Cdc7-Dbf4), zur
Bindung des Faktors Cdc45 an die pre-RCs (Mimura & Takisawa, 1998; Zou & Stillman,
1998), wodurch die Aktivierung der pre-RCs eingeleitet wird (Quintana & Dutta, 1999; Lei &
Tye, 2001). Im Verlauf der Aktivierung bzw. während der S-Phase werden die Faktoren Cdc6
und MCM vom Chromatin entfernt (Krude et al., 1996; Jiang et al., 1999; Petersen et al.,
1999). Eine de novo Bindung von MCMs an das Chromatin wird durch spezifische Kinasen
(Cdks) der S- und M-Phase verhindert (Coverley et al., 1996; Noton & Diffley, 2000). Neue
pre-RCs können somit erst nach dem Abbau der Kinasen in der Mitose entstehen. Die MCMs
spielen daher eine wichtige Rolle, die DNA-Replikation auf eine einzelne Runde pro
Zellzyklus zu limitieren (Tye, 1994; Chong et al., 1995; Kubota et al., 1995).
Die Assoziation von Cdc45 mit dem pre-RC während des Übergangs von der G1- zur S-Phase
führt zur Ausbildung eines Prä-Initiationskomplexes und leitet die Initiation der DNAReplikation ein. So kommt es zur Öffnung und Entwindung der ORIs und zur Bindung des
heterotrimeren Faktors RPA an die einzelsträngige DNA (Tanaka & Nasmyth, 1998;
Mimura et al., 2000; Walter & Newport, 2000). Die Helikase, die zur Entwindung der DNA
führt, ist bisher noch nicht identifiziert wurden, es bestehen aber Hinweise darauf, daß es sich
um einen MCM-Teilkomplex (MCM4-6-7) handelt (Ishimi, 1997). Ist der ORI ausreichend
entwunden, erfolgt die Bindung der DNA-Polymerase α und der Start der DNA-Synthese
(Tanaka & Nasmyth, 1998; Mimura et al., 2000; Walter & Newport, 2000). Die mit einer
Primase assoziierte DNA-Polymerase α synthetisiert zunächst de novo einen kurzen RNADNA-Primer, der dann durch die hochprozessiven und eine 3’-5’-Exonuklease aufweisenden
Polymerasen δ und ε verlängert wird (Waga & Stillman, 1998; Hübscher et al., 2000).
Weitere Faktoren, die bei der DNA-Replikation benötigt werden, sind u.a. RFC, PCNA, RPA,
Topoisomerase I+IIa/b, FEN-1, RNaseH1 und DNA Ligase I (Übersichten in Bambra et al.,
1997; Waga & Stillman, 1998).
In Zellkernen von Mammalia findet die Replikation in sogenannten Replikationsfoci statt.
Hier sind Proteine, die in die Replikation involviert sind, zu mikroskopisch sichtbaren
Einleitung
14
Komplexen zusammengefaßt (Leonhardt et al., 2000a). Die Replikationsfoci bilden sich zu
spezifischen Zeiten während der S-Phase an genau definierten Positionen im Kern (Sadoni et
al., 2004). Durch den Einbau von Nukleotidanaloga in neu synthetisierte DNA können
Replikationsfoci in Form von markierten DNA-Foci visualisiert werden. Die Foci entsprechen
einem oder mehreren örtlich zusammengefaßten Replicons mit einem Gesamtgehalt von
~1Mbp (Jackson & Pombo, 1998; Berezney et al., 2000). Der DNA-Gesamtgehalt sowie die
Anzahl der Replicons einzelner Foci kann allerdings beträchtlich variieren (Berezney et al.,
2000). Während der S-Phase ändert sich die Anzahl, Größe, Form und Verteilung der
Replikationsfoci. Die drei Hauptmuster der Replikationsfoci können der frühen (Typ I), der
mittleren (Typ II) und der späten (Typ III) S-Phase zugeordnet werden (Nakayasu &
Berezney, 1989; Ma et al., 1998). Die Replikationsfoci der frühen sowie der späten S-Phase
können noch weiter in die Typen IA und IB sowie IIIA und IIIB unterteilt werden, so daß im
Verlauf S-Phase insgesamt fünf verschiedene Muster beobachtet werden können (Humbert &
Usson, 1992; O’Keefe et al., 1992; Dimitrova & Gilbert, 1999; Dimitrova & Berezney, 2002).
Während der ersten ~30min der S-Phase (Typ IA) sind die Replikationsfoci (einige Dutzend
bis ein paar Hundert) relativ klein und mit Ausnahme der Peripherie, der Nucleoli und
heterochromatischer Regionen im gesamten Kern verteilt.
In den nächsten 1 bis 5h (Typ IB) nimmt die Anzahl (einige Hundert bis Ein-/Zweitausend)
und Intensität der Foci zu, so daß nahezu der komplette Kern - ausgenommen die Nucleoli gefüllt zu sein scheint. Während dieser frühen S-Phase (Typ IA und IB) wird das Euchromatin
des Zellkerns repliziert (Williams & Ockey, 1970; Nakayasu & Berezney, 1989; O’Keefe et
al., 1992). Beim Übergang in die mittlere S-Phase (Typ II, Dauer: 2 bis 3h) ändert sich die
Größe und Intensität der Foci nicht, jedoch fällt deren Anzahl stark ab, und die Lokalisierung
ist
nun
vornehmlich
perinucleär/perinucleolär,
sowie
an
einigen
intranucleären,
heterochromatischen Bereichen. In den nächsten 1 bis 2h (Typ IIIA) nimmt die Anzahl der
Foci bis auf einige hundert zu. Die Foci werden größer und unregelmäßiger (ring-, kettenbzw. hufeisenförmig) und liegen sowohl an der Peripherie als auch im Inneren des Kerns.
Während der letzten ~1h der S-Phase (Typ IIIB) können nur wenige, aber dafür sehr große
Foci beobachtet werden. Diese Foci colokalisieren mit konstitutivem Heterochromatin an der
Peripherie und weiter im Inneren des Kerns gelegenen Bereichen.
Die beschriebenen Replikationsmuster können sowohl in primären, immortalisierten als auch
transformierten Zellen von Mammalia beobachtet werden (Dimitrova & Berezney, 2002).
Zudem sind Replikationsfoci auch in anderen Eukaryoten, wie z.B. Pflanzen (Sparvoli et al.,
Einleitung
15
1994) und Hefen (Pasero et al., 1997), beschrieben worden. Interessanterweise lassen sich
selbst in einfachen Kernen, die sich de novo in Xenopus-Ei-Extrakten um λ-DNA oder
demembranisierte Spermien gebildet haben, Replikationsfoci beobachten (Mills et al., 1989;
Cox & Laskey, 1991; Chen et al., 2001). Das Phänomen der Replikationsfoci scheint somit
eine konservierte Eigenschaft der eukaryotischen DNA-Replikation und Kernarchitektur zu
sein.
1.5 X-Chromosomen-Inaktivierung
Zwischen männlichen und weiblichen Säugetieren ist auf cytogenetischer Ebene eine
auffälliger Unterschied in der Ausstattung ihrer Geschlechtschromosomen (Gonosomen,
Heterosomen) feststellbar. Weibliche Individuen weisen in der Regel zwei X-Chromosomen
auf, wohingegen männliche Individuen nur ein X-Chromosom und ein kleineres, genarmes YChromosom besitzen. Trotz dieses Unterschiedes zwischen den Geschlechtern ist kein
wesentlicher Unterschied in der exprimierten Gesamtproteinmenge X-chromosomaler Gene
zwischen XX- und XY-Individuen zu erkennen. Erreicht wird dies durch den Mechanismus
der Dosiskompensation. Bereits vor ca. 40 Jahren postulierte Mary Lyon (Lyon-Hypothese),
daß in weiblichen Individuen eines der beiden X-Chromosomen inaktiviert wird, um eine
Dosiskompensation und transkriptionelle Balance zu männlichen XY-Individuen zu schaffen
(Lyon, 1961). Cytologisch manifestiert sich das inaktivierte X-Chromosom (Xi) im
Interphasekern als eine deutlich anfärbbare Chromatinmasse, die zu Ehren ihres Entdeckers
als Barr-Körper bezeichnet wird und Bedeutung als cytogenetischer Marker zur
Identifizierung von Zellen mit einer aberranten Anzahl von X-Chromosomen hat
(Barr & Bertram, 1949; Barr & Carr, 1962). So folgt die X-Chromosomen-Inaktivierung der
„n-1“-Regel, die besagt, daß alle X-Chromosomen einer Zelle bis auf eines inaktiviert werden
(Übersicht in Lyon, 1996; Lee & Jaenisch, 1997). Weist eine Zelle z.B. eine aberrante Anzahl
von vier X-Chromosomen auf, dann werden drei (= 4-1 ) X-Chromosomen inaktiviert und als
Barr-Körper sichtbar. Eine wesentliche Rolle für die Initiation der Inaktivierung spielt eine
auf dem X-Chromosom befindliche Region mit der Bezeichnung XIC (X inactivation center),
die beim Menschen im Chromosomenband Xq13 lokalisiert ist (Brown et al., 1991). Innerhalb
dieser Region liegt das XIST-Gen (X inactivation specific transcript), welches exklusiv vom
inaktiven X-Chromosom exprimiert wird und dessen Transkript eine nicht-kodierende, aber
cis-agierende RNA (~17kb) ist (Brown et al., 1992). Die XIST-RNA bleibt nach ihrer
Expression in enger räumlicher Nähe zu dem X-Chromosom und breitet sich von der XICRegion über die gesamte Länge des X-Chromosoms aus. Durch FISH-Analysen konnte
Einleitung
16
gezeigt werden, daß die XIST-RNA das gesamte inaktive X-Chromosome umhüllt und somit
das gleiche nukleäre Territorien wie dieses einnimmt (Clemson et al., 1996). Die Assoziation
mit der XIST-RNA ist der erste detektierbare Schritt während der X-ChromosomenInaktivierung, dem weitere epigenetische Modifizierungen wie die Methylierung von Histon
H3, die Hypoacetylierung von Histon H4, die Anreichung mit der Histonvariante macroH2A
und die Methylierung der DNA des zu inaktivierenden X-Chromosoms folgen (Übersicht in
Brockdorf, 2002).
Durch
die
Modifikationen
erlangt
das
inaktive
X-Chromosom
heterochromatische Eigenschaften, d.h., das inaktivierte X-Chromosom lokalisiert sich
bevorzugt an der Peripherie der Nucleoli oder des Kerns und es repliziert seine DNA erst spät
während der S-Phase (Gilbert at al., 1962; Morishma et al., 1962). Einige Gene in der
pseudoautosomalen Region und einigen anderen Regionen „entkommen“ der Inaktivierung
des X-Chromosoms (Übersichten in Rappold, 1993; Disteche, 1995). Bezeichnend für diese
Gene ist, daß sie Homologe auf dem Y-Chromosom besitzen, wodurch keine Notwendigkeit
zur Dosiskompensation besteht (Jegalian & Page, 1998).
Trotz der Entdeckung des Barr-Körpers vor mehr als 50 Jahren ist bisher nur wenig über
dessen Zusammensetzung bekannt. Die Identifizierung von Proteinen, die spezifisch im BarrKörper angereichert sind, ist allerdings eine wichtige Voraussetzung, um die Mechanismen,
die zur Erlangung bzw. Erhaltung des Xi-Status führen, besser zu verstehen.
So ist z.B. noch nicht bekannt, wie bzw. durch was die XIST-RNA im Territorium von Xi
zurückgehalten wird. Diese „Immobilität“ ist sehr auffällig, da andere RNA-Spezies und auch
Nucleoproteinpartikel in der Regel eine hohe Mobilität aufweisen und im Kern frei
diffundieren (Calapez et al., 2002).
Selbst nach einer nahezu kompletten Entfernung des Chromatins und einer anschließenden
Salzextraktion ändert sich die Lokalisierung der XIST-RNA nicht, was vermuten läßt, daß sie
Bestandteil einer Nicht-Chromatin-Kernstruktur (-> Kernmatrix) ist (Clemson et al., 1996).
1.6 Die Kernmatrix
Die Basis für die räumliche und funktionelle Organisation des Zellkerns soll eine dynamische
Gerüststruktur bilden, die als Kernmatrix bezeichnet wird (Stein & Berezney, 2000). Die
Kernmatrix ist operational als die Struktur definiert, die im Kern nach der Extraktion der
DNA und löslicher Proteine verbleibt. Bereits 1948 wurden von Zbarskii und Debov
Strukturen in Zellkernen beschrieben, die der Extraktion durch Hochsalzlösungen
widerstanden. Smetana war der erste, der im Zusammenhang mit diesen NichtChromatinstrukturen von einem fibrogranulären Netzwerk aus Ribonucleoproteinen sprach
Einleitung
17
(Smetana et al., 1963). Der prägnante und populäre Begriff „Kernmatrix“ wurde allerdings
erst ca. 10 Jahre von Berezney eingeführt (Berezney & Coffey, 1974). Für die Präparation der
Kernmatrix existieren verschiedene Methoden, die jedoch alle zu der Isolierung
vergleichbarer Strukturen führen (Übersicht in Nickerson, 2001). Eine klassische Methode
besteht darin, die DNA permeabilisierter Zellen durch DNaseI zu degradieren und
anschließend eine Extraktion mit 250mM Ammoniumsulfat durchzuführen. Hierdurch werden
bei HeLa-Zellen ~87% der Proteine, ~28% niedermolekulare RNA (Größe: 2-5kb) und über
97% der DNA entfernt (He et al., 1990). Elektronenmikroskopisch läßt sich im Inneren der
extrahierten Kerne ein Netzwerk aus dicken polymorphen Fasern (Durchmesser 20-30nm)
erkennen, welches mit der Kernlamina in Verbindung steht und mit granulären Strukturen
besetzt ist (Fey at al., 1988; He et al., 1990) (s. Abb. 3A und 3B). Die granulären Strukturen
der polymorphen Fasern können durch eine Hochsalz-Behandlung mit 2M NaCl extrahiert
werden, wodurch Filamente mit einem Durchmesser von ~10nm sichtbar werden, die auch als
„Core“-Filamente bezeichnet werden (He et al., 1990) (s. Abb. 3C). Zusätzlich lassen sich die
Lamina und Reste der Nucleoli erkennen, die mit dem dreidimensionalen Netzwerk der
„Core“-Filamente in Verbindung stehen. In den mit 2M NaCl extrahierten Kernen verbleiben
~8% der Proteine und weniger als 0,1% der DNA, jedoch ~70% der RNA, bei der es sich
vorwiegend um hochmolekulare hnRNA (~20kb) handelt (He et al., 1990).
A
B
C
Abb. 3: Die Zellkern-Matrix. Die Abbildungen A bis C zeigen elektronenmikroskopische
Aufnahmen („resinless section“) von Matrixstrukturen. A) Die dargestellte Übersichtsaufnahme eines
Zellkerns nach einer Matrixpräparation läßt die Lamina (L) und Reste der Nucleoli (Nu) erkennen, die mit
einem faserigen Netzwerk im Innern des Kerns in Verbindung stehen. (Balken = 1µm). B) Bei höherer
Vergrößerung wird deutlich, daß das faserige Netzwerk aus granulären Komponenten besteht, die an
darunterliegenden 10nm-Filamenten („core filaments“, siehe Pfeile) organisiert sind. (Balken = 100nm).
C) Die Behandlung der Kernmatrix mit Hochsalzlösungen (~ 2M NaCl) führt zur Extraktion der granulären
Faserkomponenten. Übrig bleiben die verzweigten 10nm-„Core“-Filamente. (Balken = 100nm).
(Abbildungen A und B aus Nickerson et al. (1997); Abbildung C aus He et al. (1990)).
Einleitung
18
Zusammengefaßt handelt es sich bei der inneren Kernmatrix also um ein Netzwerk aus
verzweigten und vorwiegend aus hnRNA bestehenden 10nm-Filamenten, welches mit
zusätzlichem Material in Form von granulären Strukturen besetzt ist.
Die Proteinzusammensetzung der Matrix ist komplex und vom Zelltyp abhängig (Fey at al.,
1988). Mit einem Anteil von 75% kommen hnRNP-Proteine, an die 70% der hnRNA der
Matrix gebunden sind, am häufigsten vor (Mattern et al., 1996; Mattern et al., 1997).
Weiterhin findet man in der Matrix z.B. Proteine der Transkription und DNA-Replikation
(Polymerasen, DNA-Topoisomerasen, DNA-Helikasen), Komponenten des Spleißapparates
(Übersicht in Verheijen et al., 1988), Histon-Acetyltransferasen und –Deacetylasen (Hendzel
et al., 1994) sowie verschiedene Vertreter der Steroid-Hormonrezeptor-Familie (Übersicht in
Stenoien et al., 1998).
Nach Cook handelt es sich bei den granulären Strukturen der Matrix u.a. um molekulare
„Fabriken“
der
DNA-Replikation
(„replication
factories“)
und
der
Transkription
(„transcription factories“) (Hassan & Cook, 1993; Hozak et al., 1993; Jackson et al., 1993),
die bei behutsamer Matrixpräparation sogar einen Großteil ihrer Aktivität behalten (Jackson et
al., 1988; Cook, 1989). Auch verschiedene Kernkörperchen, z.B. PML bodies, MAD bodies
und Speckles, liegen mit der Matrix assoziiert vor (Dyck et al., 1994; Nickerson et al., 1995;
van Driel et al., 1995; Melnick & Licht, 1999; Downes et al., 2000). Weiterhin konnte ein
Zusammenhang
zwischen
der
Kernmatrix
und
der
strukturellen
Integrität
von
Chromosomenterritorien beobachtet werden (Ma et al., 1999). So ist die Kernmatrix der Ort,
an dem die Chromatinschleifen verankert sind (Pienta & Coffey, 1984; Pienta et al., 1991;
Gerdes et al., 1994; Bickmore & Oghene, 1996).
Aufgrund der zahlreichen Aktivitäten, die mit der Kernmatrix assoziiert sind, wird dieser eine
wichtige Rolle bei der räumlichen und funktionellen Organisation des Zellkerns
zugeschrieben (Berezney et al., 1995; Jackson & Cook, 1995; Nickerson et al., 1995; van
Driel et al., 1995; Berezney & Wei, 1998).
1.7 Kernmatrix-assoziierte DNA-Bereiche (S/MARs)
An die Kernmatrix bindende DNA-Bereiche werden entsprechend ihrer Präparationsmethode
entweder als SARs („scaffold attachment regions“, Mirkovitch et al., 1984) oder MARs
(„matrix associated regions“, Cockerill & Garrard, 1986) bezeichnet. Unter SAR-DNA
versteht man diejenige DNA, die als Bestandteil der Kernmatrix dem Verdau durch
Restriktionsenzymen widersteht und fest mit der Kernmatrix verbunden ist. Als MAR-DNA
wird diejenige DNA bezeichnet, die in vitro an die vollständig von DNA befreite Kernmatrix
Einleitung
19
bindet. Da beide Präparationsmethoden zu gleichen Ergebnissen führen und sich SARs und
MARs in ihrer biologischen Funktion nicht unterscheiden, werden sie inzwischen häufig
zusammengefaßt als S/MARs bezeichnet (Romig et al., 1992). S/MARs sind AT-reich
(~70%), haben ein Länge von 200 bis 3000bp und weisen verschiedene spezifische SequenzMotive wie z.B. „A-boxes“ und „T-boxes“ (Gasser & Laemmli, 1986), ATATTT(T)-Motive
(Cockerill & Garrard, 1986, Mielke et al., 1990), TopoisomeraseII-Erkennungssequenzen
(Käs & Laemmli, 1992), Bereiche von oligo(dA)*oligo(dT) (Käs et al., 1989) und „inverted
repeats“ (Boulikas, 1995) auf. Eine Konsensussequenz konnte bisher nicht gefunden werden.
Allerdings wurde eine S/MAR-Erkennungssignatur identifiziert, die in 80% aller S/MARs
vorkommt und sich aus zwei degenerierten Sequenzmotiven (AATAAYAA und
AWWRTAANNWWGNNNC) im Abstand von <200bp zusammensetzt (van Drunen et al.,
1999). Für die Bindung an die Kernmatrix werden Sekundärstrukturen der S/MARs, wie z.B.
eine besonders enge kleine Furche (Käs et al., 1989), eine gebogene DNA-Form (Homberger,
1989), partiell einzelsträngige Bereiche (Bode et al., 1992) oder „Hairpin“-Strukturen (Bode
et al., 2000), verantwortlich gemacht.
S/MARs sind bisher in den verschiedensten Eukaryoten von der Hefe bis zum Menschen
nachgewiesen wurden (Mirkovitch et al., 1984; Amati & Gasser, 1988; Bode & Maass, 1988;
Phi-Van & Strätling, 1988; Hall et al., 1991). Die Beobachtung, daß S/MARs artübergreifend
erkannt werden und somit evolutionär konserviert sind (Cockerill & Garrard, 1986; Izaurralde
et al., 1988; Phi-Van & Strätling, 1988), deutet auf eine wichtige Funktion dieser für die
eukaryotische Zelle hin. Funktionen, die neben der Schlaufenorganisation des Chromatins
(s. Abb. 2) mit S/MARs in Verbindung gebracht werden, sind u.a. transkriptionelle
Regulierung (Klehr et al., 1991), Replikationskontrolle („origins of replication“) (Boulikas,
1995) sowie DNA-Reparatur und Rekombination (Sperry et al., 1989; Bode et al., 2000).
S/MARs kommen ausschließlich in nicht-kodierenden Regionen vor, wo sie oft in der Nähe
von Promotoren und Enhancern liegen und u.a. als Bindungsstellen für Aktivator- und
Repressorproteine dienen (Gasser & Laemmli, 1986; Zong & Scheuermann, 1995; Oancea et
al., 1997).
Da S/MARs häufig Transkriptionseinheiten (Farache et al., 1990) bzw. komplexe Genloci
(Gasser & Laemmli, 1987) flankieren, werden sie ebenfalls mit der Ausbildung von
Domänengrenzen in Verbindung gebracht. Allerdings sind auch innerhalb von Introns
liegende S/MARs bekannt (Romig et al., 1994; Schübeler et al., 1996).
Um die komplexen Wechselwirkungen und Funktionen von Kernmatrix und S/MARElementen zu verstehen, ist es wichtig, „Vermittler“-Proteine zu identifizieren und zu
Einleitung
20
charakterisieren. Die Gruppe der bisher ermittelten S/MAR-Bindeproteine ist äußerst
heterogen. Zu ihr zählen ubiquitäre, häufig vorkommende Proteine wie die TopoisomeraseII
(Adachi et al., 1989), Histone H1 (Izaurralde et al., 1989), Lamin B1 (Luderus et al., 1992),
HMG I/Y (Zhao et al., 1993) und Nucleolin (Dickinson & Kohwi-Shigematsu, 1995), aber
auch Proteine wie z.B. SATB1 (Dickinson et al., 1992) oder p114 (Yanagisawa et al., 1996),
die nur in bestimmten Zelltypen exprimiert werden. Obwohl viele dieser Proteine gut
charakterisiert sind, war es bisher nicht möglich, zu entscheiden, welches der Proteine für die
Zellkernarchitektur und/oder für die Effekte der S/MARs in vivo von Relevanz ist. Das im
nächsten Abschnitt beschriebene S/MAR-Bindeprotein SAF-A scheint eine wichtige Rolle
bezüglich der Zellkern-Architektur und -Funktion wahrzunehmen. Dies wird aus mehreren
Vorarbeiten und auch aus Erkenntnissen, die im Rahmen dieser Arbeit gewonnen wurden,
deutlich.
1.8 SAF-A
SAF-A („Scaffold Attachment Factor A“) ist ein S/MAR-bindendes Kernprotein, welches in
verschiedenen Vertebraten wie Mensch, Rind, Maus und Frosch (Xenopus laevis) vorzufinden
ist (Romig et al., 1992). Das humane SAF-A-Protein, welches von einem Gen in der
chromosomalen Region 1q44 codiert wird, weist ein apparentes Molekulargewicht von
120kDa und einen isoelektrischen Punkt von 5,0 auf (Romig et al., 1992). Alternativ wird
SAF-A auch als hnRNP-U bezeichnet, da eine Subpopulation des Proteins als Bestandteil von
hnRNP-Komplexen identifiziert wurde (Choi & Dreyfuss, 1984). Es existieren mindestens 20
verschiedene hnRNP-Proteine, deren Molekulargewicht von 34kDa (hnRNP-A1) bis 120kDa
(hnRNP-U = SAF-A) reicht (Choi & Dreyfuss, 1984; Pinol-Roma et al., 1988). Die hnRNPProteine sind an der Verpackung von hnRNA beteiligt (Samarina, 1996) und spielen
außerdem eine Rolle bei der Prozessierung und dem Transport der RNA (Übersichten in
Swanson, 1995; Weighardt et al., 1996).
Immunfluoreszenz-Färbungen lassen eine Lokalisierung von SAF-A in tausenden von
dichtgedrängten Foci erkennen, die mit Ausnahme der Nucleoli im gesamten Kern verteilt
sind. Für den Kernimport von SAF-A konnten bisher zwei Kernlokalisierungssignale (NLS)
identifiziert werden. Die erste NLS stellt eine potentielle NLS mit einer Länge von 9AS
(241KKRGVKRPR249)
dar
(Kiledjian
&
Dreyfuss,
1992),
die
zweite
NLS
(9KKLKVSELKEELKKRR24) liegt innerhalb der DNA-Bindedomäne des Proteins (s.u.) und
ist zweigeteilt (Schwander, 2004).
Einleitung
21
Pro Kern kommt SAF-A in einer hohen Anzahl von ~2 Millionen Molekülen vor
(Fackelmayer & Richter, 1994). Ca. 25% davon sind frei löslich (eventuell RNA-gebunden)
und durch 250mM (NH4)2SO4 extrahierbar. Weitere 25% des Proteins scheinen
chromatingebunden und lassen sich nach einer Behandlung mit DNaseI durch 250mM
(NH4)2SO4 extrahieren. Die restlichen 50% des Proteins sind Bestandteil der Kernmatrix und
widerstehen auch einer Hochsalzextraktion mit 1,7M NaCl (Fackelmayer et al., 1994; Mattern
et al., 1996). Für die Bindung an die Kernmatrix sind die letzten 210 Aminosäuren im CTerminus von SAF-A wichtig (Herrmann, 2002). SAF-A ist eines der zehn häufigsten
Proteine in Matrixpräparationen und unter diesen das einzige, welches spezifisch an S/MARDNA bindet (Mattern et al., 1996). Dem Protein wird daher eine wichtige Rolle bei der
strukturellen Organisation des Chromatins und der funktionellen Architektur des Zellerkerns
zugesprochen (Fackelmayer et al., 1994; Göhring & Fackelmayer, 1997).
Die DNA-Bindedomäne von SAF-A liegt innerhalb der ersten 45 N-terminalen Aminosäuren
des Proteins und umfasst 31AS (AS-Position: 11-41) (Göhring et al., 1997; Kipp et al. 2000).
Auffällig ist in dieser Region eine Abfolge von acht Leucinen, die durch jeweils drei bzw.
vier
andere
Aminosäuren
voneinander
getrennt
sind
(„spaced
leucine
motif“).
Datenbankanalysen haben ergeben, daß in den verschiedensten Eukaryoten von der Hefe bis
zum Menschen Proteine existieren, die Homologien zu der DNA-Bindedomäne von SAF-A
aufweisen (Kipp et al., 2000). Da die DNA-Bindedomäne in SAF-A entdeckt wurde und
ebenfalls in SAF-B vorhanden ist, erhielt sie die Bezeichnung „SAF-Box“ (s. Abb. 4). Die
SAF-Box wurde als erste Proteindomäne identifiziert, die spezifisch an S/MAR-DNA bindet
und zugleich evolutionär hoch konserviert ist. Die Wechselwirkung einer SAF-Box mit DNA
ist allerdings sehr schwach. Zu einer spezifischen und stabilen Bindung von SAF-A an DNA
kommt es erst, wenn mindestens fünf „A-tracts“ (A-tract = vier oder mehr
aufeinanderfolgende Adeninreste) in einer Sequenz >200bp vorliegen und SAF-A zusätzlich
multimerisiert, wodurch mehrere SAF-Boxen miteinander gekoppelt werden (Kipp et al.,
2000). Dieser Mechanismus, bei dem die Kopplung vieler schwacher, niederaffiner
Wechselwirkungen in einer starken und spezifischen Bindung resultiert (kooperativer Effekt),
wird als Massenbindung bezeichnet (Zuckerkandl & Villet, 1988). Die Multimerisierung von
SAF-A kann in vitro beobachtet werden. So bildet aufgereinigtes SAF-A in der Gegenwart
von DNA filamentöse Strukturen (Länge bis über 1µm; Durchmesser 35nm), an denen die
DNA verankert und z.T. schlaufenförmig organisiert ist (Fackelmayer et al., 1994; Romig et
al., 1992). Die Multimerisierungsdomäne von SAF-A konnte bis auf die letzten 85
Aminosäuren im C-Terminus eingegrenzt werden (Schwander et al., 2004).
Einleitung
22
Ebenfalls weist SAF-A im C-terminalen Abschnitt eine RNA-Bindedomäne auf. Durch
Deletions- und Bindungsstudien konnte ein minimale Region von 26 Aminosäuren ermittelt
werden (AS-Position: 695 bis 720), die unerlässlich für die Bindung an RNA ist (Kiledjian &
Dryfuss, 1992). Die Region erstreckt sich auf der aktuellen SAF-A-Proteinsequenz (824 AS)
von Position 713 bis 738. Aufgrund des mehrmaligen Vorkommens (insgesamt 4x) der
Aminosäureabfolge Arginin (R)-Glycin (G)-Glycin (G) wird die RNA-Bindedomäne auch als
RGG-Box bezeichnet. Eine RGG-Box findet sich z.B. auch in den RNA-bindenden Proteinen
SSB1 (Jong et al., 1987), Nucleolin (Maridor et al., 1990), Fibrillarin (Aris & Blobel, 1991),
hnRNP-A1 (Buvoli et al., 1988) und dem mit SAF-A verwandten Protein E1B-AP5 (Gabler et
al., 1998).
In silico können mittels Sequenzanalyse (-> NCBI Conserved Domain Search) zwei weitere
mögliche Domänen für SAF-A ermittelt werden. Zum einen handelt es sich um eine SPRYDomäne (AS 330-462) mit unbekannter Funktion im mittleren Bereich von SAF-A, und zum
anderen weist der weiter C-terminal gelegene Bereich von SAF-A eine geringe Homologie zu
einer putativen Kinase-Domäne (AS 498-648) auf.
Für SAF-A sind verschiedene Protein-Interaktionspartner identifiziert wurden. Zu ihnen
gehören
der
Proliferationsinhibitor
Necdin
(Taniura
&
Yoshikawa,
2002),
die
Rezeptoruntereinheit E3RS der E3-Ubiquitin-Ligase SCFß-TrCP (Davis et al., 2002), die
Protein-Arginin-Methyltransferase 1 (Herrmann et al., 2004) und Transkriptionsfaktoren wie
der Glukocorticoid-Rezeptor (Eggert et al., 1997; Eggert et al., 2001), die Histonacetylase
p300/CBP (Martens et al., 2002) und die RNA-PolymeraseII (Kim & Nikodem, 1999).
SAF-A scheint daher (regulatorisch) in die Prozesse der Proliferation, des proteosomalen
Abbaus und der Transkription involviert zu sein. Auch scheint SAF-A eine Rolle bei der
sauer
neutral
basisch
NH3+-
-COOSAFBox
NLS I
SPRYDomäne
(putative KinaseDomäne)
RGG- MMDomäne
Box
Abb. 4: Domänenstruktur von SAF-A. Die Wechselwirkung von SAF-A mit Nukleinsäuren
erfolgt über die N-terminal gelegene SAF-Box (-> spezifische Bindung an S/MARs) und die C-terminal
gelegene RGG-Box (-> Bindung an RNA). Mittels Sequenzvergleich konnten im mittleren Bereich von
SAF-A eine SPRY-Domäne und eine putative Kinase-Domäne identifiziert werden. Der SPRY-Domäne
konnte bisher keine Funktion zugeordnet werden. Ebenso ist nichts über eine katalytische Aktivität der
vorhergesagten Kinase-Domäne bekannt. SAF-A verfügt über zwei Kernlokalisationssignale. Neben der
dargestellten NLSI existiert innerhalb der ersten 45 Aminosäuren noch eine weitere NLS (NLSII, nicht
eingezeichnet). Innerhalb der letzten 85 Aminosäuren des Proteins liegt die Multimerisierungsdomäne
(MM-Domäne) von SAF-A. Die letzten 210 Aminosäuren im C-Terminus (siehe gestrichelte Linie) spielen
zudem eine wichtige Rolle für die Immobilisierung und Matrixbindung des Proteins.
Einleitung
23
Replikation (Jenke et al., 2002) und der Inaktivierung von X-Chromosomen (Helbig &
Fackelmayer, 2003) zu spielen.
Zusammenfassend kann festgehalten werden, daß SAF-A ein multifunktionelles Protein des
Zellkerns ist, welches sowohl mit DNA, RNA als auch verschiedenen Proteinen wechselwirkt
und Aufgaben in der funktionellen Strukturierung des Zellkerns wahrnimmt.
Das im Krallenfrosch Xenopus laevis gefundene SAF-A (xSAF-A) umfasst 774 Aminosäuren
und weist ein apparentes Molekulargewicht von 110kDa auf. Zum humanen SAF-A hat es
eine Homologie von 67,2%. Der geringste Grad der Konservierung besteht in einer Region,
die reich an sauren Resten ist und den Aminosäurepositionen 46 bis 242 auf dem humanen
SAF-A entspricht. Der Rest von xSAF-A weist zum humanen SAF-A eine wesentlich größere
Homologie (>85%) auf. Am stärksten konserviert sind der N-Terminus, in dem die DNABindedomäne (SAF-Box) liegt, und der C-Terminus, der die RNA-Bindedomäne (RGG-Box)
sowie die Matrix-Bindedomäne und Multimerisierungsdomäne beinhaltet. Die SAF-Box
von xSAF-A ist zu der des humanen SAF-A-Proteins mit der Ausnahme einer Aminosäure
identisch, wobei der Aminosäureaustausch unkritisch für die Bindung an S/MAR-DNA ist
(Kipp et al., 2000). In kultivierten Xenopus-Fibroblasten ist xSAF-A ausschließlich im Kern
lokalisiert, wo es ein Muster aus granulären Mikrofoci zeigt, welches vergleichbar mit dem
Muster von SAF-A in Zellkernen von humanen Zellen ist. Auch in Ei-Extrakten von Xenopus
laevis (siehe Kernrekonstitution in vitro, Kapitel 1.2) ist xSAF-A in einer hohen
Konzentration von 2 bis 4ng/µl vorhanden.
Zielsetzung
24
2. Zielsetzung
Das primäre Ziel dieser Arbeit besteht in der Klärung der Frage, ob das Kernprotein SAF-A
als Kernmatrixkomponente eine wichtige Rolle für die strukturelle und funktionelle
Organisation des Zellkerns spielt. Hierfür soll im ersten Abschnitt der Arbeit aufgrund der
besseren Manipulierbarkeit zunächst mit Xenopus-Ei-Extrakt gearbeitet werden, der es
ermöglicht, einfache Kerne mit einer reduzierten strukturellen Komplexität in vitro zu
rekonstituieren. Im zweiten Abschnitt sollen die mit dem „künstlichen“ Xenopus-System
gewonnen Erkenntnisse erweitert und auf ihre Gültigkeit in komplexen Kernen eukaryotischer
Zellen überprüft werden.
Die primäre Fragestellung läßt sich in mehrere Teilfragen untergliedern:
1. Ist
xSAF-A
in
Xenopus-Ei-Extrakten
ein
essentieller
Faktor
für
die
Kernrekonstitution?
2. Wie ist xSAF-A in einfachen Kernen organisiert, und ist xSAF-A eine Komponente
der Kernmatrix in einfachen Kernen?
3. Ist (x)SAF-A bzw. die Kernmatrix an der Organisation des Chromatins beteiligt?
4. Kann die Kernmatrix mit der strukturellen bzw. funktionellen Organisation
grundlegender Prozesse, wie z.B. der DNA-Replikation, in Verbindung gebracht
werden?
5. Läßt sich eine Kernmatrix in lebenden Zellen visualisieren?
Material
25
3. Material
3.1 Geräte und Verbrauchsmaterial
Bakterien-Inkubationsschüttler Innova 4000
Bakterien-Kulturröhrchen (18x180cm)
Bakterienkulturroller TC-7
Brutschrank HeraCell mit CO2-Begasung
Centricon Ultrafree-4 (Ausschlußgröße 50kDa)
Centricon YM-30 (Ausschlußgröße 30kDa)
Cryoröhrchen (1,5ml)
Deckgläschen (rund: Ø 10mm, Ø 14mm; eckig: 15x15mm)
Durchflußcytometer, Serie FACSCalibur
Einwegspritze (50ml)
Einwegspritzen (1ml, 5ml, 20ml)
Elektroporationsküvetten (1mm Elektrodenabstand)
Elektroporationssystem Gene Pulser II
Epifluoreszenzmikroskop, Modell DMRA
Erlenmeyerkolben / Schikanekolben
FACS-Gerät, Serie FACSAria
Falcon-Röhrchen (50ml)
Faltenfilter (Ø 15cm)
Fixogum (Foto-Klebstoff)
Gasbrenner Typ Teclu (für Erdgas)
Gefrierschrank (–20°C) GS2783
Gefrierschrank (–80°C) 984 DUO
Geldokumentationssystem BioDocAnalyze
Gelgießstände, Elektrophoresekammern und Gelkämme
Gewebekulturschale mit Glasbodeneinsatz P35G-0-14-c (∅ 35mm)
Gewebekulturschalen cell star (∅ 60, 100 und 145mm)
Glaspipetten (0,1ml, 5ml und 10ml)
Glaswaren, diverse
Hamilton-Mikroliterspritze (Modell 705, 50µl)
Heizblock HBT130-2
Hybridisierungsofen
Invers-Durchlicht-Mikroskop Axiovert 25 (Zellkultur)
Invers-Fluoreszenz-Mikroskop Axiovert 35
Kimwipes
Konfokalmikroskop LSM510 confocorII
Konfokalmikroskop, Modell TCS
Kühlschrank (4°C) KS3140
Magnetrührer Color Squid
Magnetrührer, beheizbar Typ: RCT basic
Mikropipetten Pipetman (2, 20, 100, 200 und 1000µl)
Mikrowelle Micromat 241W
Minisäule (Poly-Prep Chromatography Colum 0,8x4cm)
Nylonmembran Hybond N+
Objektträger (75x25mm)
Parafilm
PCR-Reaktionsgefäß (0,5ml, ultradünn)
NBS
Merck
NBS
Heraeus
Millipore
Millipore
Nalgene
Marienfeld
BD Biosciences
Terumo
Braun
EQUIBIO
Bio-Rad
Leica
Merck
BD Biosciences
Greiner
Machery-Nagel
Herma
Merck
Liebherr
Forma Scientific
Biometra
Technik / Uni Konstanz
MatTek
Greiner-Bio-one
Brand
Schott-Duran
Merck
HLC
Bachofer
Zeiss
Zeiss
Kimberly-Clark
Zeiss
Leica
Liebherr
IKA
IKA
Gilson
AEG
Bio-Rad
Amersham
Marienfeld
American National Can
Eppendorf
Material
pH-Elektrode InLab412
pH-Meßstäbchen (pH 0-14)
pH-Meter CG842
Photometer Smartspec 3000
Pipettenspitzen (2, 200 und 1000µl)
Pipettierhilfe accu jet, elektrisch
Plastikwaren (Messzylinder, Kolben, Becher etc.)
PVDF-Membran, Immobilon
Reaktionsgefäß (Cup; 2ml)
Reaktionsgefäße (Cups; 0,5ml, 1,5ml)
Rollenmischer Mixer SRT1
Röntgenfilme SuperRX (13x18cm)
Röntgenfilmentwickler classic E.O.S Typ 5270/100
Scanner Epson Expression
Schütteltisch TypVX7 (für Gele und Membranen)
Schüttler Vortex-Genie2
Sicherheitswerkbank HeraSafe, Klasse2, TypH, HS15
Spannungsquelle E815 1200V – 500mA (Elektrophorese)
Spannungsquelle Power Pac 200 (Western Blot)
Spritzenkanülen (0,5x24mm, 0,6x30mm, 0,9x40mm)
Sterilfilter (0,2µm und 0,45µm)
Stickstofftank (cryobiological storage vessel Typ Cy50900)
Thermocycler Mastercycler gradient
Thermodrucker UPD890
Thermomixer 5436
Thermopapier UPP110 HA
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell 170-3940
Ultraschallhomogenisator Sonoplus HD2070
Waage BP121S (Feinwaage)
Waage BP610 (Grobwaage)
Wasserbad 1008
Wipptisch KickII
X-Ray-Ganzmetall-Autoradiographie-Kassetten (18x24cm)
Zellkulturtiefkühlbehälter Cryo 1C („Mr. Frosty”)
Zellsieb (Falcon Tube + nylon mesh strainer (35µm))
Zentrifuge Avanti J-E
Zentrifuge DW-41-230 (Mini-Tischzentrifuge)
Zentrifuge Minifuge Centrifuge 5415D (Tischzentrifuge)
Zentrifuge Super T21
Zentrifugenbecher 250ml
Zentrifugenröhrchen (14ml)
Zentrifugenröhrchen (PP, 13ml)
26
Mettler-Toledo
Machery-Nagel
Schott
Bio-Rad
Eppendorf
Brand
Nalgene
Millipore
Sorenson
Eppendorf
Stuart Scientific
Fuji
AgFA
Epson
Janke & Kunkel
FSI
Heraeus
Consort
Bio-Rad
Sherwood
Schleicher Schuell
BTC
Eppendorf
Sony
Eppendorf
Sony
Bio-Rad
Bandelin
Sartorius
Sartorius
GFL
BrenzelBioAnalytik
Merck
Nalgene
BD Biosciences
Beckman Coulter
Qualiton
Eppendorf
Sorvall
Sorvall
Sarstedt
Sarstedt
3.2 Chemikalien, Reagenzien und Enzyme
Aceton
Agar
Agarose
Albumin (perliert, bovin, p.a.)
Alzianblau 8GS
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris)
Merck
Difco
Sigma
Roth
Fluka
Merck
Material
Ammoniumperoxodisulfat (APS)
Ampicillin
Aphidicolin
ATP
Biotin-16-dUTP
Bradford-Reagenz
Bromphenolblau
5-Brom-2’-deoxyuridin (BrdU)
5-Bromuridin (BrU)
BSA (50mg/ml)
Calciumchlorid (CaCl2)
Chloramphenicol
Chloroform
Chromosom-Painting-Sonden
Coomassie-Brillant Blau R-250
Creatinkinase
Creatinphosphat
1,4 Diazabicyclo[2,2,2]octane (DABCO)
Didesoxythymidintriphosphat (ddTTP)
Dimethylsulfoxid (DMSO)
1,4 Dithiothreitol (DTT)
DMEM High Glucose Medium (+ L-Glutamin, - NaPyruvat)
DNA-Molekulargewichtsstandard:
-Lambda DNA/Eco130I (StyI)/MluI Marker 17)
- 100bp Ladder GeneRuler
DNaseI (10U/µl), RNase-frei
dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
ECL SuperSignal WestFemto
ECL Western Blotting Detection
Essigsäure 100% (= Eisessig)
Ethanol 100%, p.a.
Ethidiumbromid (10mg/ml)
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
Fetales Kälberserum (FCS)
Firststrand-Buffer (5x) für Reverse Transkription
Fluorescein-12-uridine-5’-triphosphate
Formaldehyd (mind. 37%, stabilisiert mit 10% Methanol)
Formamid
G418-Sulfat (Geneticin)
D(+) Glucose
Glycerin 87%
Glycin
Harnstoff
Hefeextrakt
Hoechst 33258 (max. Ex/Em: 352/461 nm)
Imidazol
Immersionsöl ImmersolTM 518F (ne = 1,518 (23°C))
IPTG, dioxanfrei
Ladepuffer (6x) für Agarosegele
Lambda-DNA (300µg/ml)
L-Cystein-HCl
27
Sigma
Boehringer
Sigma
Boehringer
Roche
Bio-Rad
Roth
Sigma
Aldrich
NEB
Merck
Sigma
Merck
Q-BIOgene
Roth
Boehringer
Sigma
Sigma
Sigma
Merck
Roth
PAA
MBI
MBI
Roche
Sigma
Pierce
Amersham
Merck
Merck
Roth
Roth
PAA
Gibco
Roche
Merck
Merck
PAA
Sigma
Merck
Roth
Roth
Difco
Sigma
Merck
Zeiss
Roth
Biolab
MBI
Serva
Material
Lysozym (146700 U/mg)
Magermilchpulver
Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl2 * 6H2O)
2-Mercaptoethanol
Methanol 100%, p.a.
N,N,N’,N’-Tetramethylendiamin (TEMED)
N-2-Hydroxyethylpiperazin-N’-2-Ethansulfonsäure (HEPES)
Natriumchlorid (NaCl)
Natriumdeoxycholsäure
Natriumdodecylsulfat (SDS)
Natriumhydroxid (NaOH)
Natriumtetrathionat (NaTT)
Nickel-Nitrilotriessigsäure-Agarose (Ni-NTA-Agarose)
Nonidet P40 Substitute (NP-40)
Paraformaldehyd (pFa)
para-Phenylendiamin (PPD)
Penicillin (10000U/ml) / Streptomyin (10mg/ml) (100x)
Phenol (pH7,5-8, äquilibriert in TE)
Piperazin-N,N’-bis(2-ethansulfonsäure) (PIPES)
Polyethylenimin (PEI), hochmolekular, wasserfrei
Ponceau-S
Primer fibro1 5’ TGA TCA TGC TGC TGG GAC TT 3’
Primer fibro2 5’ TGT GCC TCT CAC ACT TCC AC 3’
Protein A Magnetic Beads
Protein-Molekulargewichtsstandard:
- High Molecular weight SDS-Page (HMW)
pRSET-A (bakterieller Expressionsvektor)
Resin Ag 501-X8 (D), 20-50 mesh
Reverse Transkriptase M-MLV (200U/µl)
Rhodamin123 (max. Ex/Em: 507/529 nm)
RNase mixture (50µg/ml), DNase-frei
RNaseA
RNase-Inhibitor (40U/µl)
RNase-Inhibitor RNasin (40U/µl)
Rotiblock 10x
Rotiphorese 30, Acrylamid (30g/v) / Bisacrylamid (0,8g/v)
D(+) Saccharose (= Sucrose)
Salzsäure 25%
SS-DNA (low molecular ~100bp)
Sulfolink Coupling Gel
SYTOX-Green (max. Ex/Em: 504/523 nm)
Taq-Polymerase (5U/µl)
Taq-Puffer (10x)
Tetrametylrhodamine-5-2’-deoxy-uridine-5’-triphosphate
TO-PRO-3 (max. Ex/Em: 642/661 nm)
TOTO-3 (max. Ex/Em: 642/660 nm)
tri-Natriumcitrat-Dihydrat
Triton X-100
Trypsin (0,5g/l) mit EDTA (0,2g/l) in 1xPBS
Trypton
Tween 20
28
Roche
Laborbestand
Merck
Merck
Merck
Roth
Sigma
Merck
Fluka
Roth
Merck
Sigma
Qiagen
Fluka
Riedel de Haën
Sigma-Aldrich
PAA
Roth
Sigma
Sigma
Sigma
MWG
MWG
NEB
Sigma
Invitrogen
Bio-Rad
Gibco
Molecular Probes
Roche
Roche
Ambion
Promega
Roth
Roth
Roth
Merck
Fluka
Pierce
Molecular Probes
MBI
MBI
Roche
Molecular Probes
Molecular Probes
Merck
Sigma
PAA
Merck
Promega
Material
29
3.3 Antikörper
Tab. 1: Primäre Antikörper (Auszug)
Antigen
Bromdesoxyuridin
hnRNP C1/C2
Antikörper
mouse α-BrdU
(clone BU20a)
mouse α-BrdU
(B2531, clone BU33)
rabbit α-Cdk4
(H-22; sc-601)
rabbit α-Cyclin A
(sc 751)
rabbit α-Cyclin C
(H-184; sc-5610)
rabbit α-Cyclin D2
(C-17; sc-181)
mouse α-Cyclin E
(#554193)
mouse α-GFP (clone 7.1 & 13.1)
(1 814 460)
mouse α-hnRNP C1/C2
macroH2A1.2
rabbit α-human mH2A1.2
MCM3
rabbit α-human MCM3 (K594)
ORC2
rabbit α-human ORC2
RPA
rabbit α-human RPA (K529)
SAF-A
rabbit α-human SAF-A (K371)
SAF-A (SAF-Box)
xMCM3
rabbit α-human SAF-A
(K593 = αN45)
rabbit α-human MCM3 (K594)
xNucleoplasmin
mouse α-Xenopus NP
xORC1
rabbit α-Xenopus ORC1 (K584)
xPol α, p180
rabbit α-Xenopus Pol α p180
xPol δ, p50
rabbit α-Xenopus Pol δ p50
xPol ε, p60
rabbit α-Xenopus Pol ε p60
xPol δ, p66
rabbit α-Xenopus Pol δ p66
xPol α, p70
rabbit α-Xenopus Pol α p70
xRPA
rabbit α-human RPA (K529)
xSAF-A
rabbit α-Xenopus SAF-A (FBK)
Bromuridin
Cdk4
Cyclin A
Cyclin C
Cyclin D2
Cyclin E
GFP
1)
WB = Western Blot; IF = Immunfluoreszenz
Verdünnung1)
WB IF 1:20
WB IF 1:1200
WB 1:200
IF
WB 1:50
IF
WB 1:200
IF
WB 1:200
IF
WB 1:1000
IF
WB 1:1000
IF 1:300
WB IF 1:3000
WB 1:1000
IF 1:100(0)
WB IF 1:100
WB IF 1:100
WB 1:1000
IF 1:300
WB 1:1000
IF 1:400
WB 1:1000
IF 1:400
WB 1:50
IF 1:20
WB 1:1000
IF 1:400
WB 1:1000
IF 1:20
WB 1:5000
IF 1:200
WB 1:5000
IF 1:200
WB 1:5000
IF 1:200
WB 1:5000
IF 1:200
WB 1:5000
IF 1:200
WB 1:1000
IF 1:100
WB 1:1000
IF 1:100
Herkunft
DAKO
Sigma
Santa Cruz
Santa Cruz
Santa Cruz
Santa Cruz
BD Biosciences
Roche
Gideon Dreyfuss
Pennsylvania, USA
John Pehrson,
Pennsylvania, USA
AG Knippers,
Konstanz
AG Knippers,
Konstanz
Laborsammlung
Laborsammlung
Laborsammlung
AG Knippers,
Konstanz
Christine Dreyer,
Tübingen
AG Knippers,
Konstanz
Shou Waga,
Osaka, Japan
Shou Waga,
Osaka, Japan
Shou Waga,
Osaka, Japan
Shou Waga,
Osaka, Japan
Shou Waga,
Osaka, Japan
Laborsammlung
Laborsammlung
Material
30
Tab. 2: Sekundäre Antikörper
Antikörper
Alexa Fluor 488 goat α-mouse IgG2)
Alexa Fluor 488 goat α-rabbit IgG
Alexa Fluor 568 goat α-mouse IgG
Alexa Fluor 568 goat α-rabbit IgG
Cy2 donkey α-rabbit IgG
Cy5 donkey α-mouse IgG
goat α-mouse IgG, HRP-konjugiert
goat α-rabbit IgG, HRP-konjugiert
Verdünnung1)
1:300,
IF
1:300,
IF
1:300,
IF
1:300,
IF
1:300,
IF
1:50,
IF
1:50000, WB
1:50000, WB
Herkunft
Molecular Probes
Molecular Probes
Molecular Probes
Molecular Probes
Jackson
Dianova
Sigma
Sigma
1)
IF = Immunfluoreszenz; WB = Western Blot; 2) Kreuzreaktion mit Peripherie einfacher Kerne aus
Xenopus-Ei-Extrakten.
3.4 Kits
AmpoLabeling-LPR
GEArray S-Serie (Apoptosis & Cell Cycle, HS603)
RNeasy
Zenon Tricolor
Superarray
Superarray
Qiagen
Molecular Probes
3.5 Zellinien und Bakterien
HEK293
IMR90
SF767
E. coli
(embryonale Nierentumor-Zellinie, ♀)
(normale, diploide Fibroblasten, ♀)
(Glioblastom-Zellinie, ♀)
Stamm BL21(DE3)RIL
Laborsammlung
ATCC
Laborsammlung
Stratagene
3.6 Software
Image-J
MAR-Wiz V1.5
http://rsb.info.nih.gov/ij/
http://www.futuresoft.org/modules/MarFinder/
3.7 Expressionsvektor-Konstrukte
Für die Expression von eGFP wurde der Vektor pEGFP-N1 (Clontech) verwendet. Die
Expression von SAF-A (AS 1-824) und der SAF-A-Konstrukte N280 (AS 1-284), I280 (AS
267-545), C280 (AS 540-824), ∆N45 (Deletion der AS 1-45), ∆RGG (Deletion der AS 701740), ∆N45∆RGG (Deletion der AS 1-45 und 701-740) erfolgte mittels des Vektors pEGFPNLS (Ostendorp, 2001). Bei diesem Vektor handelt es sich um eine Modifikation des Vektors
pEGFP-N1. Die Modifikation besteht in einer zwischen der MCS und dem eGFP-Gen
eingefügten NLS des SV40 großen T-Antigens. Folglich sind mit dem Vektor pEGFP-NLS
exprimierte Proteine N-terminal mit einer NLS und C-terminal mit eGFP versehen.
Für die Expression des Fusionsproteins eGFP-NLS-β-Galaktosidase wurde der Vektor
pHM838 verwendet (Sorg & Stamminger, 1999). Alle Expressionsvektor-Konstrukte wurden
freundlicherweise von Mitgliedern der Arbeitsgruppe Fackelmayer in aufgereinigter Form
(CsCl-Gradient) zur Verfügung gestellt.
Material
31
3.8 Puffer und Lösungen
Antifade (DABCO):
2% bis 10% (w/v) DABCO
90% (v/v) Glycerol
100mM Tris-HCl (pH 7,6)
Antifade (PPD):
1% (w/v) p-Phenylendiamin
90% (v/v) Glycerol
100mM Tris-HCl (pH 9,0)
Aphidicolin (500x ^
= 3mM):
1mg/ml; Lösungsmittel: DMSO
3% BSA/1xPBS:
3g BSA
10ml 10xPBS
ad 100ml H2O
15min, 15000xg, RT
mittlere Schicht verwenden
50xCaCl2:
2mM CaCl2
Coomassie-Entfärberlösung:
40% (v/v) Methanol
10% (v/v) Essigsäure
Coomassie-Färbelösung:
2g/l Coomassie-Brillant Blau R-250
40% (v/v) Methanol
10% (v/v) Essigsäure
filtriert
CSK-Puffer:
10mM PIPES (pH 6,8)
100mM NaCl
300mM Sucrose
3mM MgCl2
ddTTP (400x ^
= 10mM):
4,84mg/ml; in 10mM Tris-HCl (pH 8,0)
50xER:
100mM ATP
1000mM Creatinphosphat
1000µg/ml Creatinkinase
500mM HEPES-KOH (pH 7,5)
Fixativ (Carnoys-Lösung):
3 Teile Methanol
1 Teil Eisessig
Glycerinkissen:
5,8ml Glycerin
1,8ml 10xPBS
ad 20ml H2O
Harnstoffpuffer:
8M Harnstoff
20mM Tris-HCl
5mM Imidazol
pH 8,0
Material
32
HGPF-Puffer:
40% (v/v) Glycerol
8% (w/v) Formaldehyd
0,9xPBS
10µg/ml Hoechst 33258
oder 2,5µM SYTOX-Green
KHMD-Puffer:
50mM KCl
50mM HEPES (pH 7,6)
5mM MgCl2
1mM DTT
Laufpuffer SDS-PAGE (10x):
10g/l SDS
30,3g/l Tris-Base
144,1g/l Glycin
LB-Medium:
10g/l NaCl
10g/l Trypton
5g/l Hefeextrakt
pH 6,84 uneingestellt
NaTT (50mM):
76,6mg/5ml
10xPBS:
80g/l NaCl
2g/l KCl
14,4g/l Na2HPO4*2H2O
2,4g/l KH2PO4
pH 7,4
10xPBS (für Xenopus laevis):
80g/l NaCl
2g/l KCl
14,4g/l Na2HPO4*2H2O
1,2g/l KH2PO4
pH 7,1 uneingestellt
pH 7,6 nach Verdünnung auf 1xPBS
4% pFa:
4g pFa in 60ml H2O auf 55°C erhitzen
NaOH dazugeben, bis pFa in Lösung
(~4 Tropfen 1M NaOH)
abkühlen lassen
10ml 10xPBS
ad 100ml H2O
Ponceau-S-Lösung:
0,2% (w/w) Ponceau-S
5% (v/v) Eisessig
Probenpuffer für SDS-PAGE (10x):
100mM Tris-HCl (pH 8,0)
25% (w/v) SDS
50% (v/v) 2-Mercaptoethanol
0,25% (w/v) Bromphenolblau
Rhodamin123 (2500x):
10mg/ml; Lösungsmittel: DMSO
Material
33
RIPA (1x):
50mM Tris-HCl (pH 8,0)
150mM NaCl
1% (v/v) Nonidet-P40
0,5% (w/v) Natriumdeoxycholsäure
0,1% (w/v) SDS
RLN:
50mM Tris-HCl (pH 8,0)
140mM NaCl
1,5mM MgCl2
0,5% (v/v) Nonidet-P40
Sammelgelpuffer SDS-PAGE (2x):
250mM Tris-HCl (pH 6,8)
7mM SDS
1 Spatelspitze Bromphenolblau/100ml
Semidry-Puffer:
5,8g/l Tris-Base
2,9g/l Glycin
0,37g/l SDS
200ml/l Methanol
über Nacht bei lose zugedrehtem Deckel
entgasen lassen
SOC-Medium:
2% (w/v) Trypton
0,5% (w/v) Hefeextrakt
10mM NaCl
2,5mM KCl
10mM MgCl2
10mM MgSO4
20mM Glucose
sterilfiltriert
20xSSC:
3M NaCl
0,3M tri-Natriumcitrat
pH 7,0
10xTAE:
48,8g/l Tris-Base
11,42ml/l Eisessig
20ml/l 0,5M EDTA (pH 8,0)
TE-Puffer (1x):
10mM Tris-HCl (pH 8,0)
1mM EDTA-NaOH (pH 8,0)
TNT-Puffer (1x):
150mM NaCl
10mM Tris-HCl (pH 8,0)
0,05% (v/v) Tween 20
Trenngelpuffer SDS-PAGE (5x):
1,86M Tris-HCl (pH 8,8)
15mM SDS
Material
34
Matrixpuffer 1:
(Isotonischer Puffer 1)
10mM PIPES (pH 6,8)
100mM NaCl
300mM Sucrose
3mM MgCl2
0,5% (v/v) Triton X-100
2mM NaTT (frisch zugeben)
Matrixpuffer 2:
(Extraktionspuffer 1)
10mM PIPES (pH 6,8)
250mM (NH4)2SO4
300mM Sucrose
3mM MgCl2
0,5% (v/v) Triton X-100
Matrixpuffer 3:
(Isotonischer Puffer 2)
10mM PIPES (pH 6,8)
50mM NaCl
300mM Sucrose
3mM MgCl2
0,5% (v/v) Triton X-100
200U/ml DNaseI
Matrixpuffer 4:
(Extraktionspuffer 2)
10mM PIPES (pH 6,8)
50mM NaCl
250mM (NH4)2SO4
300mM Sucrose
3mM MgCl2
0,5% (v/v) Triton X-100
Matrixpuffer 5:
(Extraktionspuffer 3)
10mM PIPES (pH 6,8)
1,7M NaCl
300mM Sucrose
3mM MgCl2
0,5% (v/v) Triton X-100
WB-Elutionspuffer:
62,5mM Tris-HCl (pH 6,7)
2% SDS
100mM 2-Mercaptoethanol
xMatrixpuffer 1:
0,9xPBS
xMatrixpuffer 2:
0,9xPBS
250mM (NH4)2SO4
xMatrixpuffer 3:
0,9xPBS
3mM MgCl2
xMatrixpuffer 4:
s. xMatrixpuffer 2
xMatrixpuffer 5:
0,9xPBS
2M NaCl
Methoden
35
4. Methoden
4.1 Methoden: Eukaryotische Zellen
4.1.1 Kultivierung eukaryotischer Zellen
Die adhärenten Zellinien HEK293, IMR90 und SF767 wurden in DMEM, dem 10% FCS
sowie 100U/ml Penicillin und 100µg/ml Streptomycin hinzugefügt waren, bei feuchter
Atmosphäre, 37°C und 5% CO2-Begasung kultiviert. HEK293- und SF767-Zellen wurden alle
zwei Tage 1:5, IMR90-Zellen alle fünf Tage 1:3 mittels Feuchttrypsinierung passagiert.
4.1.2 Transfektion eukaryotischer Zellen
Zellen der Zellinien HEK293, IMR90 und SF767 wurden chemisch mittels Polyethylenimin
(PEI) transfiziert. Zu 50µl DMEM (-FCS, -P/S) wurden 10µg der zu transfizierenden DNA
(aufgereinigt durch CsCl-Dichtegradientenzentrifugation) gegeben. In einem zweiten
Reaktionsgefäß wurden 350µl DMEN (-FCS, -P/S) und 4,5µl einer frisch angesetzten
0,45%igen (v/v) PEI-Arbeitslösung gemischt und anschließend langsam aber mit schnell
kreisenden Bewegungen der Pipettenspitze zu der DNA-Lösung gegeben. Sofort nach der
Zugabe wurde der Ansatz für einige Sekunden gut gemischt und dann für 30min bei RT
inkubiert. In der Zwischenzeit wurde das Medium der zu transfizierenden Zellen durch 3ml
frisches DMEM (+FCS, +P/S) ausgetauscht. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde der
komplette Transfektionsansatz unter ständigem Schwenken der Kulturschale tropfenweise
auf die Zellen gegeben. Nach 3 bis 5h bei Standardkulturbedingungen wurde das
Transfektionsmedium von den Zellen abgesaugt und durch 10ml frisches DMEM (+FCS,
+P/S) ersetzt. Die angegebenen Mengen bzw. Volumina beziehen sich auf 100mmKulturschalen.
4.1.3 Herstellung stabiler Zellinien
HEK293-Zellen wurden einen Tag nach der Transfektion mit neuem Medium (DMEM mit
FCS und P/S) versorgt, das G418 (Neomycin-Analog) in einer Endkonzentration von 1mg/ml
enthielt. G418 ist ein Antibiotikum, das durch seine Bindung an Ribosomen und eine damit
verbundene Blockierung der Proteinsynthese zytotoxisch wirkt. Voraussetzung für die
Verwendung von G418 war somit, dass der transfizierte Expressionsvektor neben dem zu
Methoden
36
exprimierenden Insert zusätzlich ein G418- bzw. Neomycinresistenzgen (neor) enthielt; das
Resistenzgen codiert für eine Aminoglykosid-3’Phosphotransferase (APH).
Durch die Aufrechterhaltung des Selektionsdruckes für mindestens 4 Wochen wurde
gewährleistet, dass nur Zellen überlebten, die den Expressionsvektor stabil in ihr Genom
integriert hatten. Die Zellen wurden während der Selektionsphase immer dann mit neuem
Selektionsmedium versorgt, wenn der im Medium enthaltene pH-Wertindikator Phenolrot
aufgrund eines sauren pH-Wertes eine deutliche Gelbfärbung zeigte.
Unmittelbar nach der Selektion erfolgte von einem Teil der stabilen Zellen immer eine
Langzeitlagerung.
4.1.4 Langzeitlagerung eukaryotischer Zellen
Für die Langzeitlagerung von Zellen wurden diese bei einer Konfluenz von 75 bis 100%
trypsiniert und in 4 bis 6ml (gilt für 145mm Platte) DMEM (+FCS, +P/S), dem 10% (v/v)
DMSO zugesetzt waren, resuspendiert. Anschließend wurde die Zellsuspension zügig auf
1,5ml Cryoröhrchen aliquotiert. Die Röhrchen wurden fest (!) verschraubt und in einen mit
Isopropanol (RT) gefüllten Einfrierbehälter (Mr. Frosty) gestellt. Anschließend erfolgte die
Tiefkühlung der Zellen bei –80°C über Nacht.
Das Isopropanol fungiert als Isolationsmedium und führt zu einer konstanten Tiefkühlung der
Zellen mit einer Rate von –1°C/min. Die Zellen wurden für maximal 3 Wochen bei –80°C
zwischengelagert. Die Langzeitlagerung der eingefrorenen Zellen erfolgte in flüssigem
Stickstoff.
Für die Wiederaufnahme der Kultivierung der cryokonservierten Zellen wurden diese bei
37°C im Wasserbad aufgetaut und anschließend der gesamte Inhalt des Cryoröhrchens in eine
mit vorgewärmten Medium (+FCS, +P/S) gefüllte 145mm Kulturschale entleert. Nach dem
Absetzen der Zellen bzw. am nächsten Tag erfolgte ein Mediumwechsel.
4.1.5 Immunfluoreszenz-Färbung eukaryotischer Zellen
Alzianblau-beschichtete DG (10mm), die mit Zellen bewachsen waren, wurden durch
viermaliges Eintauchen in 1xPBS von Medium befreit und mit 4%pFa (100µl/DG) für 20min
bei RT fixiert. Nach einem kurzen Waschen in 1xPBS wurden die DG zum Blocken noch
reaktiver Aldehydgruppen für 10min bei RT mit 100mM Tris-HCl (pH 7,6) inkubiert.
Anschließend wurde zur Permeabilisierung 0,5% (v/v) Triton X-100/1xPBS auf die Zellen
gegeben. Nach 10min wurde kurz in 1xPBS gewaschen. Die DG wurden anschließend in
einer feuchten Kammer platziert und zum Absättigen unspezifischer Antikörper-Bindestellen
Methoden
37
mit 3% (w/v) BSA/1xPBS (100µl/DG) für 1h bei RT inkubiert. Nach zweimaligem Waschen
in 1xPBS wurde mit primärem Antikörper in 1xPBS (20-100µl/DG) für 1h bei 37°C
inkubiert. Darauf folgend wurden die DG ausgiebig in 1xPBS gewaschen (mind. 30x
eingetaucht) und dann mit sekundärem Antikörper in 1xPBS (20-100µl/DG) für 30min bei
37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die DG erneut ausgiebig in 1xPBS gewaschen
und anschließend in Antifadelösung eingebettet. Direkt daran schloß sich die mikroskopische
Betrachtung der Präparate an.
4.1.6 Herstellung cytogenetischer Präparate / Metaphasespreitungen
Zur Anreicherung von Metaphasen wurde Zellkulturen vor der Aufarbeitung Colcemid in
einer Endkonzentration von 40ng/ml hinzugegeben. Die schnell proliferierenden Zellinien
HEK293 und SF767 wurden ~40min mit Colcemid behandelt. Für die langsamer wachsende
Zellinie IMR90 erfolgte die Colcemidbehandlung über Nacht. Anschließend wurde das
colcemidhaltige Zellkulturmedium abgesaugt und die Zellen mit 1xPBS gewaschen. Dann
wurden die Zellen mit Trypsin-EDTA-Lösung von dem Kulturschalenboden gelöst und in 5ml
DMEM (+FCS, +P/S), welches 1:4 bis 1:7 mit H2O verdünnt war, resuspendiert. Nach einem
20minütigen Quellen der Zellen im hypotonen DMEN bei RT auf einem Wipptisch wurden
die Zellen mit frischem Fixativ (-20°C) fixiert. Um ein Verklumpen der Zellen bei der
Fixativ-Zugabe zu verhindern, wurden die gequollenen Zellen in eine 10ml-Pipette
aufgenommen, die zeitgleich und langsam mit einer anderen Pipette, die 5ml Fixativ enthielt,
an der Gefäßinnenwand eines conical zulaufenden 14ml-Plastikröhrchens (!) entleert wurde.
Die Zellen wurden dann durch eine 10minütige Zentrifugation (100xg, RT) in einem
Ausschwingrotor pelletiert. Der Überstand wurde bis auf ca. 300µl abgesaugt und das
Zellpellet durch Klopfen gelockert. Anschließend wurde mit Fixativ (-20°C) auf 10ml
aufgefüllt und erneut zentrifugiert (10min, 100xg, 4°C). Der Fixativ-Austausch wurde 3 bis
4mal wiederholt. Die Lagerung der aufgearbeiteten Zellen erfolgte in Fixativ bei 4°C.
Für das Anfertigen von Objektträgerpräparaten wurden die aufgearbeiteten Zellen zunächst
für 10min bei 100xg und 4°C zentrifugiert und in 5 bis 10ml frischem Fixativ resuspendiert.
Nach einer erneuten Zentrifugation (s.o.) wurden der Überstand bis auf ca. 300 bis 1000µl
(abhängig von der Größe des Pellets) verworfen und die Zellen in der Restflüssigkeit
resuspendiert. Von der Zellsuspension wurden 50µl aus einer Höhe von ca. 10cm auf das
obere Ende eines feuchten, leicht nach unten geneigten (ca. 30°) Objektträgers (mit 70%
EtOH gereinigt und in H2O bei 4°C gelagert) getropft. Zur besseren Spreitung bzw.
Vereinzelung der Chromosomen wurde zweimal längs über den OT gepustet. Die Qualität der
Methoden
38
Präparate wurde nach der Trocknung bei RT (ca. 5 bis 10min) mittels eines PhasenkontrastInversmikroskopes begutachtet. Präparate mit einer ausreichenden Anzahl gut gespreiteter
Metaphasen (mindestens 10 pro OT) wurden über Nacht bei RT gelagert und für FISHExperimente verwendet.
4.1.7 Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)
Die FISH an Metaphasespreitungen bzw. cytogenetischen Standardpräparaten erfolgte nach
dem Protokoll der Firma Q-BIOgene für Chromosomen-Painting-Sonden.
Im folgenden wird die sogenannte 3D-FISH näher beschrieben, die gegenüber klassischen
FISH-Protokollen
den
Vorteil
bietet,
daß
dreidimensionale
Zellstrukturen
und
Proteinlokalisierungen besser erhalten bleiben.
Vorbehandlung:
Auf
Alzianblau-beschichteten DG (10mm) gewachsene Zellen wurden kurz (6maliges
Eintauchen) in 1xPBS gewaschen und anschließend für 20min mit 100µl 4%iger pFa-Lösung
bei RT fixiert; alternativ wurde mit 4%iger pFa-Lösung bei 37°C, feuchter Atmosphäre und
5% CO2-Begasung im Zellkulturbrutschrank fixiert. Die DG wurden dann kurz in 1xPBS
gewaschen und mit 100mM HCl überschichtet. Nach einer 10minütigen Inkubation wurde
erneut in 1xPBS gewaschen und zur Neutralisierung sowie zum Blocken noch reaktiver
Aldehydgruppen mit 100mM Tris-HCl (pH 7,6) inkubiert. Nach einem Waschschritt in
1xPBS wurde zur weiteren Permeabilisierung und Extraktion 0,5% (v/v) Triton X-100/1xPBS
auf die Zellen gegeben. Zehn Minuten später wurden die DG erneut kurz in 1xPBS
gewaschen und im selbigen bis zur Denaturierung gelagert.
Denaturierung und Hybridisierung:
Die DNA-Denaturierung der auf den DG befindlichen Zellen erfolgte durch eine 4minütige
Inkubation in 70% Formamid/0,6xSSC bei 73°C und eine darauf folgende Inkubation in
50% Formamid/2xSSC bei 73°C. Die DG wurden von überschüssigem Denaturierungspuffer
befreit und sofort in 2,5µl (gilt für 10mm DG) der Hybridisierungssonde, die auf einem OT
vorgelegt war, eingebettet. Anschließend wurden die DG großzügig mit Fixogum versiegelt.
Die Hybridisierung erfolgte lichtgeschützt über Nacht in einer feuchten Kammer bei 37°C.
Es wurden ausschließlich Chromosomen-Painting-Sonden der Firma Q-BIOgene verwendet,
die mit dem rotfluoreszierenden Farbstoff Rhodamin (Ex. max. 560nm, Em. max. 585nm)
direkt gekoppelt waren. Vor der Verwendung wurden die bei –20°C gelagerten Sonden für
5min bei 37°C aufgetaut, gut gemischt („Vortex“) und kurz zentrifugiert. Anschließend
Methoden
39
wurden 10µl entnommen und bei 79°C für 10min denaturiert. Die Sonden wurden dann zur
Verringerung unspezifischer Bindungen an repetetive Sequenzen für 40 bis 60min bei 37°C
partiell renaturiert und bis zur Auftragung auf Eis gelagert.
Post-Hybridisierung / Waschschritte
Nach der Hybridisierung wurden die DG vorsichtig von Fixogum befreit und vom OT gelöst.
Um ein Scheren der Zellen zu vermeiden, erfolgte dies in einer mit 2xSSC gefüllten
Petrischale. Die DG wurden kurz in 2xSSC gewaschen bzw. zwischengelagert und dann
zweimal für jeweils 10min in 50% Formamid/2xSSC bei 43°C inkubiert. Darauf folgten zwei
hochstringente Waschschritte in 0,1xSSC bei 60°C für jeweils 10min.
Die DG wurden anschließend in 1xPBS äquilibriert (einige Minuten) und nach der Einbettung
in Antifade-Lösung mikroskopisch betrachtet. Alternativ wurde vor der Einbettung der DG
eine Immunfluoreszenz-Färbung durchgeführt.
4.1.8 Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP)
Mittels FRAP läßt sich die Mobilität bzw. die Diffusionsgeschwindigkeit von
fluoreszierenden Molekülen in Lösungen sowie in lebenden Zellen untersuchen. Die Methode
beruht darauf, daß die fluoreszierenden Moleküle innerhalb einer definierten Region durch
einen kurzzeitigen, hochenergetischen Laserpuls irreversibel geblichen (bleaching) werden
und anschließend die Rückkehr der Fluoreszenz (fluorescence recovery), welche durch die
Diffusion von nicht-geblichenen Molekülen in die geblichene Region bedingt ist, über die
Zeit verfolgt wird. Zudem bewegen sich geblichene Moleküle aus der geblichenen Region
heraus. Es kommt zu einer Durchmischung geblichener und ungeblichener Moleküle.
Die FRAP-Experimente wurden an einem Konfokal-Mikroskop des Typs LSM510
durchgeführt. Es wurden HEK293-Zellen verwendet, die einen Tag vor der Messung in 35mm
Kulturschalen mit Glasbodeneinsatz mit eGFP-Konstrukten transfiziert worden waren. Die
Zellen wurden während der Messung durch einen beheizbaren Objektträgertischaufsatz
konstant bei 37°C gehalten.
Die Aufnahmen wurden bei einer Auflösung von 128x128, einer Datentiefe von 8 Bit und
einem Vergrößerungsfaktor (Zoom) von 4 mit einem Öl-Immersionsobjektiv (PlanApochromat 63x / N.A. 1,4) bei maximal geöffneter Lochblende (Pinhole) getätigt. Die
Hauptleistung des Argon-Lasers wurde auf 85% gesetzt. Die Anregung von eGFP erfolgte
durch die 488nm-Linie des Argon-Lasers, für die Detektion wurde ein 530nm-Langpassfilter
verwendet. Um das Bleichen während der Aufnahmen zu minimieren, wurde die
Methoden
40
Transmission der 488nm-Linie auf 0,5% reduziert. Hingegen wurde für das aktive und
irreversible Bleichen von eGFP die Transmission der Laserlinien bei 458, 477, 488 und
514nm auf 100% gesetzt. Die rechteckige Bleichregion (ROI) deckte in x-Richtung die
^ 4,3µm).
gesamte Breite des Kerns ab und hatte in y-Richtung eine Höhe von 15 Pixeln (=
Das Bleichen erfolgte für 80 Iterationen (Dauer 1,359s), d.h., der Laser fuhr die Bleichregion
80mal ab. Direkt vor und nach dem Bleichen wurde eine gewisse Anzahl Bilder in konstanten
zeitlichen Abständen aufgenommen, um den Verlauf der Fluoreszenzströme zu verfolgen.
Gewöhnlich wurde die Anzahl der vor dem Bleichen aufzunehmenden Bilder auf 3 und die
Gesamtzahl der aufzunehmenden Bilder auf 400 gesetzt. Die Verzögerung der Aufnahme
aufeinanderfolgender Bilder wurde auf 0msec gesetzt. Die Bilder wurden daher so schnell
wie möglich nacheinander aufgenommen (~125ms/Bild).
Auswertung von FRAP-Daten:
Für die Messung der Fluoreszenzintensitäten wurden die aufgenommenen Bildserien mit dem
LSM-Reader (PlugIn) des Programms Image-J eingelesen. Durch zweimaliges Ausführen der
Lupenfunktion erfolgte eine Vergrößerung der Bilder. Anschließend wurde in der
Bleichregion („in“) ein Rechteck (20x9) eingezeichnet und die Intensität innerhalb der
eingezeichneten Region für alle Bilder einer Serie mittels der Funktion „measure“ des ROIManagers gemessen. Die ermittelten Intensitäten wurden als Textdatei gespeichert. Die
gleiche Prozedur wurde für einen nicht-geblichenen Bereich („out“) innerhalb des selben
Kerns wiederholt. Die Zeitdaten einer Bilderserie wurden durch die Funktion „apply t-stamp“
des ROI-Managers ausgelesen und ebenfalls als Textdatei gespeichert. Die weitere
Verarbeitung der Daten erfolgte mit dem Programm Excel.
Um den Verlust der Fluoreszenzintensität des Kerns durch Bleichungsprozesse zu
berücksichtigen, wurde die relative Fluoreszenzintensität (RFI) wie folgt berechnet:
RFI = (intn*outt0)/(outtn*int0). Hierbei beziehen sich „intn“ und „outtn“ auf die
Fluoreszenzintensitäten innerhalb bzw. außerhalb der Bleichregion zum Zeitpunkt „n“. Mit
„int0“ und „outt0“ ist die Fluoreszenzintensität innerhalb bzw. außerhalb der Bleichregion vor
dem Bleichen gemeint. Die Gleichung enthält weiterhin einen Korrekturfaktor (outt0/ int0), der
ungleiche Ausgangsfluoreszenzintensitäten in den Bereichen „in“ und „out“ ausgleicht. Die
graphische Auftragung der ermittelten RFI-Werte gegen die Zeit ergibt eine FRAP-Kurve.
Die maximal in den geblichenen Bereich zurückkehrende Fluoreszenz (RFImax), also der
Endwert der FRAP-Kurve, gibt Auskunft über den prozentualen Anteil der mobilen
(RFImax*100) wie auch der immobilen Fraktion (1-RFImax)*100)) des geblichenen Proteins.
Methoden
41
Der Diffusionskoeffizient (D) wurde modifiziert und stark vereinfacht nach Axelrod et al.
(1976) wie folgt berechnet:
D = ω2 / (4*τ)
[cm2/s]
ω = Höhe des geblichenen Bereichs in y-Richtung [cm]
τ = t1/2, d.h. die Zeit [s], nach der die Hälfte von RFImax
erreicht ist
4.1.9 Vorbereitung von Zellen für die Durchflußcytometrie
Für die Durchflußcytometrie wurden HEK293-Zellen verwendet, die in 100mm Kulturschalen
mit eGFP-Konstrukten transfiziert worden waren. Die Zellen wurden einen Tag nach der
Transfektion komplett auf eine 145mm-Kulturschale umgesetzt und zwei Tage später
geerntet. Hierfür wurden die Zellen zweimal mit 10ml 0,1% (w/v) EDTA/1xPBS (4°C)
gewaschen und durch Trypsin vom Plattenboden gelöst. Anschließend wurden die Zellen in
10ml 0,1% (w/v) EDTA/1xPBS (4°C) resuspendiert und zentrifugiert (5min, 310xg, 4°C).
Der Übertand wurde verworfen und das Pellet durch Klopfen gelockert. Dann wurden die
Zellen in 700µl 0,1% (w/v) EDTA/1xPBS (4°C) resuspendiert und mit 10ml Methanol
(-20°C) fixiert; um Zelltrümmer und ein Verklumpen der Zellen zu vermeiden, erfolgte die
Methanol-Zugabe analog der in Kapitel 4.1.6 beschriebenen Fixativ-Zugabe. Nach einer
mindestens 20minütigen Inkubation auf Eis wurden die Zellen über Nacht bzw. bis zur
Durchflußcytometrie bei –20°C gelagert.
Die Durchflußcytometrie sowie die vorherige DNA-Färbung der fixierten Zellen mit
Propidiumjodid
wurden
freundlicherweise
von
Daniel
Speidel
(HPI,
Hamburg)
vorgenommen.
4.1.10 Vorbereitung von Zellen für die FACS
Für die fluoreszenzgestützte Zellsortierung wurden HEK293-Zellen verwendet, die sowohl
stabil als auch transient (gewöhnlich 2 Tage) mit eGFP-Konstrukten transfiziert waren. Für
die FACS wurden die Zellen zweimal mit 1xPBS (RT) gewaschen und dann durch Trypsin
vom Kulturschalenboden gelöst. Anschließend wurden die Zellen zwei kleiner (100mm) bzw.
einer großen (145mm) Zellkulturschale in 3 bis 5ml 4% (v/v) FCS/1xPBS (RT) resuspendiert
und durch ein Zellsieb (35µm Ausschlußgröße) pipettiert. Direkt daran schloß sich die FACS
an. Die Sortierungen wurden in Form von Massensortierungen vorgenommen. Hierbei
wurden nicht nur die eGFP-positiven, sondern auch die eGFP-negativen Zellen eines
Methoden
42
Transfektionsansatzes gesammelt, die dann als Kontrolle bzw. Vergleich bei z.B. WesternBlots und Microarrays dienten. Die Zellsortierungen wurden freundlicherweise von Arne
Düsedau (HPI, Hamburg) durchgeführt.
4.1.11 Vitalitätstest
Die Vitalität von Zellen wurde durch die Verwendung der Farbstoffe Rhodamin123 und
Propidiumjodid bestimmt.
In
aktiven
Mitochondrien
lebender
Zellen
wird
das
Emissionsverhalten
des
membranpermeablen Farbstoffs Rhodamin123 in Abhängigkeit des Membranpotentials
verändert. Das heißt, aktive Mitochondrien lebender Zellen zeigen eine Rot/Grünfluoreszenz,
in inaktiven Mitochondrien toter Zellen zeigt der Farbstoff diese Fluoreszenz hingegen nicht.
Das Prinzip der Färbung mit dem membranimpermeablen Propidiumjodid beruht darauf, daß
dieser Farbstoff von lebenden Zellen mit intakter Zellmembran ausgeschlossen wird und
deren DNA/RNA nicht färbt. In tote Zellen mit einer „löchrigen“ bzw. nicht mehr intakten
Membran kann der Farbstoff hingegen eindringen. Die DNA/RNA dieser Zellen fluoresziert
durch das Propidiumjodid rot.
Färbungen
mit
Rhodamin123
erfolgten
an
Zellen
in
35mm
Kulturschalen
mit
Glasbodeneinsatz. Die Zellen wurden mit Medium versorgt, welches Rhodamin123 in einer
Konzentration von 4µg/ml enthielt. Nach einer 5minütigen Inkubation im Brutschrank wurde
das Rhodamin-haltige Medium abgesaugt. Die Zellen wurden 3mal mit 1xPBS gewaschen
und anschließend mit neuem Medium versorgt. Direkt daran schloß sich die mikroskopische
Betrachtung der Zellen an.
Die Färbungen von Zellen mit Propidiumjodid und anschließende Durchflußcytometrien zur
Bestimmung des prozentualen Anteils toter Zellen wurden freundlicherweise von Daniel
Speidel (HPI, Hamburg) durchgeführt.
4.1.12 Replikations-Assay
Replikations-Assays wurden an HEK293-Zellen durchgeführt, die transient mit verschiedenen
eGFP-Konstrukten transfiziert waren. Die Zellen wurden einen Tag nach der Transfektion 1:3
in neue Kulturschalen, in die mehrere DG (10mm) vorgelegt waren, umgesetzt, um
ausreichend Raum für die Proliferation zu gewährleisten. Am nächsten Abend (ca. 30h nach
der Transfektion) wurden die Zellen mit neuem DMEM (+FCS, +P/S) versorgt, das BrdU in
einer Endkonzentration von 10µM enthielt. Es wurde über Nacht inkubiert. Anschließend
wurden die mit den Zellen bewachsenen DG durch mehrmaliges Eintauchen (4 bis 6mal) in
Methoden
43
1xPBS von Medium befreit und für 20 bis 30min bei RT mit 4%iger pFa-Lösung (100µl/DG)
fixiert. Nach kurzem Waschen in 1xPBS wurde zum Blocken noch reaktiver Aldehydgruppen
für 10min mit 100mM Tris-HCl (pH 7,6) inkubiert. Die DG wurden dann erneut in 1xPBS
gewaschen und kurz in 2M HCl äquilibriert (1x eingetaucht). Anschließend wurden die Zellen
für 20min bei RT mit 2M HCl (100µl/DG) behandelt, um die DNA zu denaturieren und das in
die DNA inkorporierte BrdU für Antikörper zugänglich zu machen. Die HCl-Behandlung
wurde durch ein neutralisierendes Waschen (6maliges Eintauchen) und eine 5minütige
Zwischenlagerung in 100mM Tris-HCl (pH 7,6) beendet.
Das eingebaute BrdU wurde mittels Immunfluoreszenz detektiert. Der primäre Antikörper
(DAKO, clone Bu20a) wurde 1:20 und der sekundäre Antikörper (Molecular Probes, rabbit
anti-mouse Alexa 568) 1:200 verdünnt verwendet. Die Inkubation mit den Antikörpern
erfolgte für jeweils 30min bei RT.
4.1.13 Transkriptions-Assay
Für den Nachweis von Transkriptionsaktivität wurden auf Alzianblau-beschichteten DG
kultivierte HEK293-Zellen einen bzw. zwei Tage nach der Transfektion mit DMEM (+FCS,
+P/S) versorgt, das BrU in einer Endkonzentration von 7,5mM enthielt. Nach einer
Inkubationsdauer von 3h wurden die Zellen kurz (6mal) in 1xPBS gewaschen und für 20min
bei RT mit 4%iger pFa-Lösung (100µl/DG) fixiert. Einige DG wurden vor der Fixierung für
2min mit CSK-Puffer (100µl/DG), welcher 0,5% (v/v) Triton X-100 enthielt, extrahiert. Der
Nachweis des in RNA-Polymerasetranskripten eingebauten BrU erfolgte durch eine
Immunfluoreszenz-Färbung. Der primäre Antikörper (Sigma, mouse anti-BrdU, clone Bu33),
der gegen BrdU gerichtet ist und mit BrU kreuzreagiert, wurde 1:1200 verdünnt in
1,5% BSA/1xPBS verwendet (1h, 37°C). Der sekundäre Antikörper (Molecular Probes, goat
anti-mouse Alexa 568) wurde in einer Verdünnung von 1:300 in 1xPBS verwendet (30min,
37°C).
4.1.14 RNA-Isolierung aus eukaryotischen Zellen
Die Isolierung von RNA erfolgte aus HEK293-Zellen, die zwei Tage nach Transfektion
mittels FACS sortiert worden waren. Direkt nach der Sortierung wurden die Zellen in 13mlZentrifugenrörchen mit einem Ausschwingrotor pelletiert (5min, 300xg, 4°C), in 1ml 1xPBS
(eiskalt) resuspendiert und in ein 1,5ml Reaktionsgefäß überführt. Die Zellen wurden erneut
zentrifugiert (5min, 300xg, 4°C) und noch einmal mit 1xPBS gewaschen. Anschließend
wurden die Zellen in 175µl RLN-Puffer (eiskalt), dem vor Gebrauch RNasin
Methoden
44
(Endkonzentration: 1000U/ml) und DTT (Endkonzentration: 1mM) zugesetzt worden waren,
resuspendiert und für 5min auf Eis lysiert. Durch eine Zentrifugation (2min, 300xg, 4°C)
wurden die Kerne pelletiert und die im Überstand befindliche cytoplasmatische RNA mit dem
RNeasy-Minikit (Qiagen) nach Herstellerangaben weiter aufgereinigt.
Das Kit verwendet stark denaturierende (Guanidinhydrochlorid) und reduzierende (2Mercaptoethanol) Pufferkomponenten, die durch eine Inaktivierung von RNasen zur
Stabilisierung der RNA beitragen. Das Aufreinigen bzw. Waschen der RNA geschieht über
zentrifugierbare Minisäulen des Kits, die eine hochaffine Matrix für RNA, die größer als
200nt ist, besitzen. Kleinere RNA, wie z.B. 5,8S rRNA, 5S rRNA und t-RNA, wird nicht
durch die Säulenmatrix zurückgehalten und geht verloren. Die Elution der gewaschenen
RNAs von den Minisäulen erfolgte mit 30µl H2O (RNase-frei). Die isolierte RNA wurde bis
zu weiteren Verwendung bei –80°C gelagert.
Zur Qualitätskontrolle wurden 4µl der RNA mit 1µl 10xSDS-Probenpuffer für 5min bei 60°C
erhitzt (Inaktivierung von RNasen und Auflösung von Sekundärstrukturen) und anschließend
in einem 1,5%igen Agarosegel aufgetrennt; es wurde auf deutlich erkennbare Banden für die
18S und 28S rRNA und das Vorhandensein hochmolekularer RNA geachtet.
Weiterhin wurde 1µl der RNA für eine RT-PCR mit Fibronectin-spezifischen Primern
verwendet, um u.a. auf inhibitorische Substanzen für die RT-PCR zu testen.
4.1.15 Array-Analysen
Für Array-Analysen wurden Produkte bzw. Kits der Firma Superarray verwendet. Die
Durchführung erfolgte in den meisten Punkten exakt nach Herstellerangaben. Deshalb wird
im folgenden hauptsächlich der Ablauf beschrieben und auf eine detaillierte Wiedergabe
bzw. Abschrift der Protokolle verzichtet. Weiterhin sind Modifikationen und Ergänzungen der
Protokolle aufgeführt.
Sonden-Herstellung:
Die Generierung von Sonden für Array-Hybridisierungen erfolgte mit dem GEArray RTAmpoLabeling Kit. Mit dem Kit wurde in einem ersten Schritt RNA durch eine Reverse
Transkription in cDNA umgeschrieben und diese in einem zweiten Schritt amplifiziert und
mit Biotin-16-dUTP markiert. Bei der verwendeten RNA handelte es sich um
cytoplasmatische RNA von HEK293-Zellen. Die RNA war zwei Tage nach Transfektion und
anschließender FACS der Zellen mittels des RNeasy-Kits isoliert worden. Es wurden 2,5µl
Methoden
45
der aufgereinigten RNA, dies entspricht in etwa der RNA aus ~112500 Zellen, in die Reverse
Transkription eingesetzt.
Überprüfung der Markierungseffizienz:
Die Markierungseffizienz von Sonden wurde vor deren Verwendung für ArrayHybridisierungen überprüft. Hierfür wurde 1µl der Sondenlösung mit 19µl 1xAgaroseGelladepuffer gemischt. Von dieser 1:20 Verdünnung wurden Reihenverdünnungen mit dem
Faktor 4 in jeweils 9µl 1xGelladepuffer bis zu einer Endkonzentration von 1:10240
hergestellt. Von jeder Verdünnung wurde 1µl auf eine Hybond N+-Nylonmembran
aufgetragen und für mindestens 10min trocknen gelassen. Der Nachweis des in die cDNA
inkorporierten Biotin-16-dUTP erfolgte durch die Bindung von Streptavidin (Verdünnung
1:8000), das mit alkalischer Phosphatase (AP) gekoppelt war, und eine anschließende
Chemilumineszenzreaktion mit dem mitgelieferten CDP-Star als Substrat; die 1:8000
Verdünnung des Streptavidin-AP-Konjugats wurde aus einer frisch angesetzten 1:8
Vorverdünnung (2µl Streptavidin und 14µl 1xPufferF) hergestellt. Laut Superarray-Angaben
sind Sonden, die ab einer Verdünnung von 1:1000 ein Signal zeigen, für Hybridisierungen
geeignet.
Sonden-Denaturierung und Hybridisierung:
Aufgrund der sehr guten Sonden-Markierungseffizienz, es konnten Signale bis zu einer
Verdünnung von 1:5140 und 1:10240 beobachtet werden, wurde für Hybridisierungen nicht
die gesamte, sondern nur die Hälfte (25µl) der Sondenlösung eingesetzt. Weiterhin wurden
die Sonden für die Hybridisierung nicht in 750µl sondern in 1000µl GEAhyb-Lösung
verdünnt. Vor der Verdünnung in GEAhyb-Lösung wurden die Sonden durch eine 3minütige
Inkubation bei 90°C denaturiert und für 5min auf Eis gelagert. Die GEAhyb-Lösung enthielt
weiterhin denaturierte SS-DNA (Endkonzentration: 100µg/ml).
Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 60°C in einem Hybridisierungsofen mit Rollrad
(~ 10 Umdrehungen/min) an Arrays, die zuvor für 2h bei 60°C in GEAhyb-Lösung (mit
100µg/ml denaturierter SS-DNA) geblockt worden waren.
Bei den verwendeten Arrays handelte es sich um 3,8 x 4,8cm große Nylonmembranen der
GEArray S-Serie. Diese Membranen enthalten in einem Raster von 16x30 Einzelpunkten bis
zu 450 cDNA-Fragmente von Gengruppen, die in spezifische biologische Reaktionswege
involviert sind. Weiterhin sind auf den Membranen zwecks Normalisierung die cDNAFragmente einiger Haushaltsgene (z.B. GAPDH, ß-Actin) sowie Negativkontrollen (pUC18DNA und DNA-freie Stellen) enthalten. Die in dieser Arbeit verwendeten Membranen des
Methoden
46
Typs GEArray HS 603 enthielten cDNA Fragmente von Genen der Apoptose und des
Zellzyklus.
Post-Hybridisierung / Waschritte / Entwicklung:
Die Membranen wurden nach der Hybridisierung ausgiebig und stringent bei 60°C im
Hybridisierungsofen gewaschen (2x12min 2xSSC/1%SDS, 2x12min 0,1xSSC/0,5%SDS).
Die gebundenen Sonden wurden durch eine Chemilumineszenzreaktion detektiert und die
Signale auf Röntgenfilm aufgenommen. Um auch sehr schwache Signale detektieren zu
können und starke Signale nicht überzubelichten bzw. im linearen Bereich zu halten, wurden
pro Experiment mehrere Filme mit verschieden langen Expositionen belichtet (Dauer: <1s bis
2min). Die computergestützte Auswertung und Normalisierung der Signalintensitäten mit
Hilfe des Programms „GEArray Analyzer“ der Firma Superarray wurde freundlicherweise
von F.O. Fackelmayer vorgenommen.
4.2 Methoden: Xenopus-Ei-Extrakt
4.2.1 Kernzusammenbau in vitro
Für die Bildung von einfachen Kernen in vitro wurden freundlicherweise von F.O.
Fackelmayer mitotische Ei-Extrakte des Krallenfrosches Xenopus laevis (arretiert in der
MetaphaseII der Meiose) zur Verfügung gestellt. Die Extrakte waren nach der Methode von
Findeisen et al. (1999) präpariert worden und lagen in Form von tiefgefrorenen (-80°C) 25µlAliquoten (Extraktkügelchen) vor.
Für eine Standard-Kernbildungsreaktion wurde ein Extraktkügelchen in einem 0,5ml oder
1,5ml Reaktionsgefäß zwischen den Fingern aufgetaut. Anschließend wurden zur Entlassung
des Extraktes in die Interphase 0,5µl einer 50xCaCl2-Lösung (Endkonzentration: 0,4mM) und
zur Energieversorgung 0,5µl einer 50xER-Lösung (Endkonzentration: 2mM ATP, 20mM
Creatinphosphat, 20µg/ml Creatinkinase, 10mM HEPES-KOH, pH 7,5) hinzugefügt. Darauf
folgend wurde durch zehnmaliges vorsichtiges und luftblasenfreies Auf- und Abpipettieren
gemischt und für 20min bei 21°C inkubiert. Dann wurde die Kernbildung induziert, indem
260 bis 300ng concatemerisierte λ-DNA vorsichtig mit dem Extrakt gemischt wurden (s.o.).
Nach einer 20minütigen Inkubation bei 21°C wurde erneut gemischt, diesmal allerdings etwas
energischer, um größere Kern- bzw. DNA-Aggregate aufzulösen.
Die Kernbildung wurde durch die Entnahme von 0,5µl aus den Ansätzen, die auf einem OT
mit 0,5µl HGPF-Puffer gemischt wurden, mikroskopisch kontrolliert. Die Kernbildung wurde
Methoden
47
als komplett angesehen, wenn die Kerne eine runde Form hatten und von einer im
Phasenkontrast dunkel erscheinenden Kernhülle umgeben waren. Gewöhnlich war dies ~40
bis ~90min nach der DNA-Zugabe der Fall. In der Regel wurden Kernbildungsansätze ab dem
Zeitpunkt der DNA-Zugabe nie länger als drei Stunden inkubiert.
4.2.2 Kernzusammenbau in Gegenwart von Antikörpern
Gegen xSAF-A gerichtete Antikörper wurden zeitgleich mit der CaCl2- und ER-Lösung oder
aber 10min vorher zu Ei-Extrakten gegeben. Bei den Antikörpern handelte es sich um α-bee
und α-N45, die mittels Affinitätschromatographie und Centricon-Säulen aufgereinigt und
konzentriert worden waren (s. Kapitel 4.3.3). Zu 25µl Ei-Extrakt wurde 1µl α-bee (4 bis
6mg/ml) bzw. 1µl α-N45 (3mg/ml) oder aber 0,5µl beider Antikörper gegeben.
Kontrollansätze erhielten 1µl 1xPBS oder 1µl der konzentrierten Antikörper, die zuvor durch
eine 3minütige Inkubation bei 90°C denaturiert worden waren. Die Kernbildungsreaktion
wurde ansonsten wie in Kapitel 4.2.1 beschrieben durchgeführt.
4.2.3 Immundepletion von xSAF-A aus Ei-Extrakten
Die Immundepletion von xSAF-A aus Ei-Extrakten erfolgte durch die Verwendung von
Protein A-Magnetkügelchen („magnetic beads“), an die spezifische Antikörper für xSAF-A
gekoppelt waren. Vor der Kopplung der Antikörper wurden die Magnetkügelchen 4mal in
500µl 1xTNT gewaschen. Die Separierung der Kügelchen vom Puffer erfolgte durch das
Anlegen eines starken Magneten an die Reaktionsgefäßwand für mindestens 30s. Die
Kügelchen wurden nach dem letzten Waschschritt in 200µl 1xTNT resuspendiert und mit 5µg
Antikörper für 1h bei RT auf einem Rollermischer inkubiert.
Bei den verwendeten Antikörpern handelte es sich um α-bee und α-joc, die gegen die
Teilfragmente bee (Aminosäureposition 46 bis 401) und joc (Aminosäureposition 154 bis
313) von xSAF-A gerichtet sind. Die Antikörper wurden freundlicherweise von F.O.
Fackelmayer in aufgereinigter Form (Konzentration: ~ 0,25µg/µl) aus Kaninchen-Seren zur
Verfügung gestellt.
Die Magnetkügelchen wurden nach der Bindung der Antikörper 3mal mit 500µl 1xTNT
sowie 3mal mit 500µl 0,9xPBS gewaschen und anschließend in Ei-Extrakt resuspendiert. Für
die Depletion wurden 30µl Extrakt verwendet. Zur Bestimmung der Depletionseffizienz
wurde 1µl des Extraktes vor der Depletion sowie 1µl des Extraktüberstandes nach jeder
Depletionsrunde abgenommen. Die Depletion erfolgte auf Eis für eine Gesamtdauer von
Methoden
48
40min. Eine Depletion bestand dabei aus mehreren Runden, d.h., der Extrakt wurde z.B.
2x20min oder 4x10min mit Antikörper-Magnetkügelchen inkubiert.
Die Trennung der Magnetkügelchen vom Extrakt erfolgte bei 4°C durch das Anlegen eines
magnetischen Feldes für 2 bis 3min.
Mit dem depletierten Extrakt wurde eine Kernbildungsreaktion angesetzt. Als Kontrolle
diente Ei-Extrakt, der mit Magnetkügelchen ohne Antikörper inkubiert worden war.
Zur Bestimmung der Depletionseffizienz wurden die Magnetkügelchen, die 4mal mit 500µl
1xTNT gewaschen worden waren, und die gesammelten Überstände (je 1µl) in 20µl 1xSDSPAGE-Probenpuffer aufgenommen und für 5min bei 90°C inkubiert. Es folgte eine SDSPAGE mit anschließendem Western-Blot. Zur Detektion von xSAF-A wurde der Antikörper
α-FBK verwendet.
4.2.4 Immunfluoreszenz-Färbung einfacher Kerne
In Xenopus-Ei-Extrakten gebildete Kerne wurden durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren
mit einem zehnfachen Volumen 3,7% Formaldehyd/0,9xPBS (0,9xPBS entspricht der
Ionenstärke des Extraktes) gemischt und für 40min bei RT fixiert. Anschließend wurden die
Kerne mittels eines Ausschwingrotors durch ein 2,3cm hohes Glycerinkissen (25% Glycerin
in 0,9xPBS) auf Alzianblau-beschichtete DG (10mm) zentrifugiert (10min, 2000xg, 4°C).
Hierfür wurden Szintillationsgefäße verwendet, denen der Boden entfernt worden war. Im
Deckel des Szintillationsgefäßes, welcher nun als Boden fungierte, befand sich das mit 2,5ml
Glycerinlösung überschichtete DG. Pro DG wurde in der Regel 1/10 bis 1/5 des fixierten
^ 2,5 bis 5µl Extrakt) auf das Glycerinkissen aufgetragen. Nach der
Kernansatzes (=
Zentrifugation wurden die DG durch mehrmaliges Eintauchen in 0,9xPBS von anhaftender
Glycerinlösung befreit und anschließend sofort für Immunfluoreszenz-Färbungen (IF)
verwendet. Der Ablauf der IF entsprach dem für eukaryotische Zellen (s. Kapitel 4.1.5), mit
der Ausnahme, daß in der Regel auf die Behandlung mit 0,5% Triton/1xPBS verzichtet und
für die 3%ige BSA-Lösung, die Verdünnung der Antikörper und das Waschen der DG nicht
1xPBS, sondern 0,9xPBS verwendet wurde.
Primäre Antikörper, die eine erhöhte unspezifische Hintergrundfärbung erkennen ließen
(häufig der Fall für unaufgereinigte Antikörper-Seren), wurden vor ihrer Verwendung in
0,9xPBS mit 0,1% BSA verdünnt und für 15min bei 16000xg und 4°C zentrifugiert.
Zusätzlich wurden die DG vor dem Blocken für 5min mit 0,3% (v/v)Triton X-100/0,9xPBS
bei RT inkubiert.
Methoden
49
4.2.5 Halopräparation einfacher Kerne
Xenopus-Ei-Extrakten (50µl) mit de novo gebildeten Kernen wurde ein zehnfaches Volumen
0,9xPBS mit 1mM NaTT (frisch angesetzt) hinzugegeben. Es wurde vorsichtig durch Aufund Abpipettieren (5 bis 10mal) gemischt und für 30min bei 37°C inkubiert. Anschließend
wurden die stabilisierten Kerne durch ein Glycerinkissen auf DG (10mm) zentrifugiert (s.
Kapitel 4.2.4). Pro DG wurde 1/5 der Kernsuspension (= 10µl Extrakt) verwendet. Nach der
Zentrifugation wurden die DG durch zweimaliges Waschen in 0,9xPBS von Resten der
Glycerinlösung befreit und in 0,9xPBS zwischengelagert. Zur Kontrolle der Integrität und
Morphologie der Kerne wurde ein DG in HGPF-Lösung eingebettet und mikroskopisch
begutachtet. Sahen die Kerne intakt aus, wurde mit den restlichen DG eine Halopräparation,
modifiziert nach de Belle et al. (1998), durchgeführt. Hierfür wurden die DG mit 2M
NaCl/0,9xPBS (100µl/DG) überschichtet und für 4min bei RT extrahiert. Anschließend
wurden die DG für je 2min mit 10xPBS, 5xPBS, 2xPBS und 1xPBS (100µl/DG) inkubiert. Es
folgte eine Fixierung mit 3,7% Formaldehyd/0,9xPBS (100µl/DG) für 40min bei RT. Daran
schloß sich eine Dehydratisierung in 10, 30, 50, 70 und 95% Ethanol (100µl/DG) für jeweils
1min bei RT an. Dann wurden die DG luftgetrocknet und nach einer Rehydratisierung in
0,9xPBS (10min) für Immunfluoreszenz-Färbungen verwendet.
4.2.6 Hemmung von DNA-Polymerasen im Xenopus-Ei-Extrakt
Die Inhibierung der replikativen Polymerasen (Pol α, δ und ε) im Ei-Extrakt erfolgte durch
das Alkaloid Aphidicolin (Endkonzentration: 6µM bzw. 2µg/ml). Für die Inhibierung der bei
Reparaturprozessen involvierten DNA-Polymerase β wurde das Didesoxynukleotid ddTTP
(Endkonzentration:
25µM)
verwendet.
Die
Stammlösungen
der
Inhibitoren
(500x Aphidicolin: 3mM bzw. 1mg/ml; 400x ddTTP: 10mM) wurden unmittelbar vor
Gebrauch 1:10 bzw. 1:8 in H2O verdünnt, um 50fach konzentrierte Arbeitslösungen zu
erhalten. Die Inhibitoren wurden entweder direkt zu Beginn der Kernbildungsreaktion, d.h.
zeitgleich mit dem CaCl2 und dem energieregenerierenden System, oder aber spätestens 5min
vor dem gewünschten Effekt der Hemmung zu einfachen Kernen in den Extrakt gegeben.
Methoden
50
4.2.7 Visualisierung und Synchronisation der DNA-Replikation in
einfachen Kernen
Zur Visualisierung von replizierter DNA in einfachen Kernen wurde Extrakten frühestens
40min nach Induktion der Kernbildung, d.h. 40min nach der λ-DNA-Zugabe, fluoreszierende
Nukleotid-Analoga (Fluorescein-12-dUTP oder Tetramethylrhodamin-5-dUTP) in einer
Endkonzentration von 20µM hinzugegeben.
In einigen Fällen wurden die Kerne für die DNA-Replikation synchronisiert, wodurch erreicht
werden sollte, daß die DNA-Replikation an allen ORIs sämtlicher Kerne gleichzeitig startet.
Für die Synchronisierung wurde die Kernbildung in Extrakten induziert, die Aphidicolin
(Inhibitor replikativer DNA-Polymerasen) in einer Konzentration von 6µM enthielten. Das
Aphidicolin wurde 60min nach Zugabe der λ-DNA durch zweimaliges Waschen der Kerne in
1ml Kernwaschpuffer (KHMD-Puffer) entfernt; die Zentrifugation der Kerne erfolgte für
3min bei 2000xg und 4°C. Zum Starten der Replikation sowie zur Markierung der
neugebildeten DNA wurden die Kerne in Ei-Extrakt, der frisch in die Interphase entlassen war
und fluoreszierende Nukleotid-Analoga (s.o.) enthielt, resuspendiert.
Für Pulse-Chase-Experimente wurden solche Kerne nach einem 10minütigen Pulse mit den
fluoreszierenden Nukleotiden 3mal mit jeweils 1ml Kernwaschpuffer gewaschen (Chase) und
in neuen Extrakt, der frisch in die Interphase entlassen war und keine fluoreszierenden
Nukleotide enthielt, resuspendiert und für weitere 120min inkubiert.
Weiterhin wurden Pulse-Chase-Experimente in modifizierter Form an nicht synchronisierten
Kernen durchgeführt, um Zentrifugationen und damit verbundene mechanische Belastungen
der Kerne zu vermeiden. Hierfür wurde Extrakten 40min nach Induktion der Kernbildung
Tetramethylrhodamin-5-dUTP (Endkonzentration: 20µM) hinzugegeben (Pulse). Nach einer 3
bis 5minütigen Inkubation wurde dTTP (Endkonzentration: 20mM) in einem 100fachen
molaren Überschuß gegenüber Tetramethylrhodamin-5-dUTP zu dem Extrakt pipettiert
(Chase) und für weitere 120min inkubiert.
Methoden
51
4.3 Methoden: allgemein und gemischt
Folgende Methoden wurden nach Sambrook et al. (1989) oder den angegebenen Protokollen
durchgeführt und werden im folgenden nicht näher beschrieben:
- Agarose-Gelelektrophorese von DNA
- Coomassiefärbung von Proteingelen
- Bestimmung von DNA-Konzentrationen
- Proteinfällung nach Wessel und Flügge (1984)
- Bestimmung der Proteinmenge (Bradford, 1976)
4.3.1 Transformation prokaryotischer Zellen
Die Transformation von Zellen des Bakteriums Escherichia coli (Stamm: BL21(DE3)RIL))
erfolgte durch die Methode der Elektroporation. Bei –80°C gelagerte elektrokompetente
Bakterien (40µl Aliquote) wurden schnell zwischen den Fingern aufgetaut und anschließend
sofort auf Eis gestellt. Nach der Zugabe von 1 bis 10ng Plasmid-DNA wurde durch
mehrmaliges, behutsames Auf- und Abpipettieren gemischt und die Bakterien/DNASuspension in eine auf Eis vorgekühlte Elektroporationsküvette (Elektrodenabstand: 1mm)
überführt. Zur gleichmäßigen Verteilung der Suspension und der Entfernung eventuell
vorhandener Luftbläschen zwischen den Elektroden, wurde die Küvette einige Male auf eine
feste Unterlage geklopft. Die Elektroporation erfolgte bei 1,8kV, 25µF und 200Ω.
Unmittelbar nach dem Elektroschock wurden die Bakterien vorsichtig in 1000µl SOCMedium (eiskalt) resuspendiert und in ein auf Eis vorgekühltes Kulturröhrchen überführt.
Nach einer 30 bis 60minütigen Inkubation bei 37°C im Bakterienroller wurden verschiedene
Volumina des Transformationsansatzes (z.B. 20, 100 und 200µl) auf LB-Selektiv-Agarplatten
ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Der Rest des Transformationsansatzes
wurde für eine etwaige erneute Plattierung am nächsten Tag bei 4°C gelagert.
4.3.2 Herstellung einer Affinitätschromatographiesäule
Im folgenden wird die Herstellung einer Affinitätschromatographie-Säule zur Aufreinigung
des Antikörpers α-bee beschrieben. Es sind die einzelnen Schritte von der bakteriellen
Expression über die Aufreinigung bis hin zur SulfoLink-Kopplung des mit einem 6xHisTag
versehenen xSAF-A-Teilfragments „bee“ aufgeführt. Das Teilprotein bee deckt die
Aminosäurepositionen 46 bis 401 von xSAF-A ab.
Methoden
52
4.3.2.1 Protein-Expression in Bakterien
E. coli des Stammes BL21(DE3)RIL wurden mit ~5ng des Expressionsvektors pRSET-A, in
den die für das bee-Fragment codierende cDNA inseriert war (freundlicherweise von F.O.
Fackelmayer zur Verfügung gestellt), transformiert, auf LB-Selektiv-Agarplatten (50µg/ml
Ampicillin, 34µg/ml Chloramphenicol) ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Am
Abend darauf wurde mit 3 bis 6 gut gewachsenen Kolonien eine Vorkultur in 10ml LB
(50µg/ml Ampicillin, 34µg/ml Chloramphenicol) angesetzt und diese bis zum nächsten
Morgen bei RT ohne Schütteln belassen. Dann wurde die Vorkultur für 1 bis 2h bei 37°C im
Bakterienroller bis zu einer OD600 von 0,4 bis 0,8 inkubiert und anschließend komplett für die
Animpfung einer 500ml LB-Hauptkultur (50µg/ml Ampicillin, 34µg/ml Chloramphenicol)
verwendet, welche bei 37°C und unter Schütteln (Erlenmeyerkolben (2 Liter): 250-300rpm,
Schikanekolben (2 Liter): 150rpm) weiterinkubiert wurde.
Die Expression des rekombinanten Proteins wurde bei einer OD600 zwischen 0,5 und 0,8
(optimal sind 0,8) durch die Zugabe von 500µl einer 1M IPTG-Stammlösung induziert. Drei
Stunden später wurde die Kultur zentrifugiert (10min, 6000xg, 4°C), das Pellet in 20ml
eiskaltem 20mM Tris-HCl (pH 8,0) resuspendiert und bei –20°C eingefroren.
4.3.2.2 Protein-Aufreinigung aus Bakterien mittels IMAC
Die geernteten und in 20mM Tris-HCl (pH 8,0) eingefrorenen Expressionsklone (s. voriges
Kapitel) wurden langsam bei RT aufgetaut (40ml benötigten ca. 1,5 bis 2h). Anschließend
wurden der Bakteriensuspension Lysozym (Endkonzentration: 0,5mg/ml) und Triton X-100
(Endkonzentration: 0,2% (v/v)) hinzugegeben. Es folgte eine einstündige Inkubation bei RT
auf einem Rollermischer, der sich eine Ultraschallbehandlung auf Eis mit 8 Pulsen à 10s bei
97% Leistung und Pausen von 5s zwischen den Pulsen anschloß. Das Bakterienlysat wurde
dann für 10min bei 10000xg und 4°C zentrifugiert. Die Pellets, welche das bee-Protein in
Form von „inclusion bodies“ enthielten, wurden in Harnstoffpuffer resuspendiert (4 bis 6ml
Harnstoffpuffer pro 500ml Bakterienkultur). Nach einer erneuten Zentrifugation (10000xg,
10min, 4°C) wurde der Überstand, in dem nun die Proteine der „inclusion bodies“ gelöst
waren, mit NiNTA-Agarose versetzt. Für das gelöste Proteinmaterial aus 1000ml
^ 300µl gesetztem Volumen) verwendet.
Bakterienkultur wurden 600µl NiNTA-Agarose (=
Nachdem für 1 bis 2h bei RT gemischt worden war, wurde die Suspension in eine Minisäule
gegeben und gewartet, bis sich die NiNTA-Agarose abgesetzt hatte. Der Auslauf der Säule
wurde geöffnet, der Durchfluß gesammelt und erneut über die Säule gegeben. Anschließend
Methoden
53
wurde das gesetzte Säulenmaterial mit 35ml (mindestens 100xVolumen der NiNTA-Agarose)
Harnstoffpuffer gewaschen. Das gebundene Protein wurde mit 80mM Imidazol in 6
Fraktionen zu 300µl (entspricht dem gesetztem Säulenmaterial) von der NiNTA-Agarose
eluiert. Vor der Elution der Fraktionen 1 bis 5 wurde das Imidazol für jeweils 5min auf die
NiNTA-Agarose einwirken gelassen. Fraktion 6 wurde über Nacht bei 4°C in 80mM Imidazol
gelagert und erst am nächsten Tag aufgefangen.
Für die Überprüfung der Qualität und Quantität wurden 15µl jeder Fraktion einer SDS-PAGE
mit anschließender Coomassie-Färbung unterzogen. Das „Aufkochen“ der Eluate im SDSPAGE-Probenpuffer erfolgte für 5min bei 60°C und nicht bei 90°C, um die Gefahr der
Spaltung von Peptidbindungen durch Imidazol zu minimieren.
4.3.2.3 Proteinkopplung an SulfoLink-Gel
Das Prinzip der Kopplung von Proteinen an SulfoLink-Gel beruht darauf, dass Sulfhydryle
effizient mit alkylierenden Agenzien reagieren. Das SulfoLink-Gel besteht aus einer
Agarosematrix, an die über 12atomige Spacer Jodacetylgruppen immobilisiert sind. Freie
Sulfhydrylgruppen, wie sie z.B. in Cysteinresten von Proteinen vorkommen, greifen das CαAtom der Jodacetylgruppe nukleophil an. Es kommt zu einer nukleophilen Substitution, bei
der HJ freigesetzt und zwischen dem Cα-Atom des Jodacetyls und dem S-Atom der
Sulfhydrylgruppe eine kovalente Bindung in Form eines Thioethers geschlossen wird.
Über den HisTag isolierte Proteine aus Bakterien wurden vor der Kopplung an SulfoLink-Gel
mit Hilfe von Centricon-Säulen (zentrifugierbare Filtereinheiten) konzentriert. Für das beeProtein (apparentes Molekulargewicht: ~ 66kDa) wurde eine Centricon-Säule mit einer
Ausschlußgröße von 30kDa und einem maximalen Füllvolumen von 2ml verwendet.
Die Zentrifugation erfolgte bei 5000xg und 4°C für 8min, wodurch sich das aufgetragene
Füllvolumen von 2ml auf ca. 0,5ml reduzierte; für die Konzentrierung von ca. 10ml beeProteinlösung waren somit mehrere, sukzessive Zentrifugationsschritte erforderlich.
Das aufkonzentrierte Protein wurde in 5xTE (50mM Tris-HCl (pH 8,5), 5mM EDTA)
umgepuffert, indem die Proteinlösung in der Centriconsäule 6mal mit 1ml 5xTE gewaschen
wurde. Zur Elution des Proteins von der Säule, wurde diese kopfüber zentrifugiert (2min,
1000xg, 4°C). Das aufgefangene Protein wurde bis zur Kopplung an das SulfoLink-Gel (s.u.)
auf Eis zwischengelagert.
Methoden
54
Auf eine Minisäule wurden 1000µl einer zuvor auf Raumtemperatur erwärmten SulfoLinkGelsuspension aufgetragen. Nach dem Setzen des Gelmaterials
wurde der SulfoLink-
Gelpuffer aus der Säule laufen gelassen und das SulfoLink-Gel mit 30ml 5xTE gespült.
Anschließend wurde die zu koppelnde Proteinlösung (∼1ml mit ∼700µg bee-Protein) auf die
Säule gegeben, das Sulfolink-Gel in dieser resuspendiert und über Nacht bei RT auf einem
Rollermischer
inkubiert;
5µl
der
Proteinlösung
wurden
zur
Bestimmung
der
Kopplungseffizienz nicht auf die Säule aufgetragen und bei –20°C eingefroren (=
ungekoppelte Proteinlösung). Am nächsten Tag wurde die Säule in ein Stativ eingeklemmt
und gewartet, bis sich die Sulfolink-Gel gesetzt hatte. Dann wurde der Durchfluß (=
gekoppelte Proteinlösung) zur späteren Bestimmung der Kopplungseffizienz gesammelt und
die Säule mit 50ml 5xTE gespült. Zur Blockierung noch freier und reaktiver Jodacetylreste
des SulfoLink-Gels wurde die Säule mit 1ml einer frisch angesetzten 50mM Cysteinlösung
für 1h bei RT auf einem Rollermischer inkubiert. Anschließend wurde mit 25ml einer 1M
NaCl-Lösung und dann mit 25ml H2O gewaschen. Nach einem finalen Waschschritt mit 50ml
5xTE wurde die Säule bis zur Antikörperaufreinigung in 5xTE/20% EtOH bei 4°C gelagert.
Zur Bestimmung der Kopplungseffizienz und zur Kontrolle der Proteinintegrität wurden 5µl
der ungekoppelten und gekoppelten Proteinlösung (s.o.) miteinander verglichen. Jeweils 1µl
der beiden Lösungen wurde auf eine mit Methanol aktivierte PVDF-Membran getropft und
nach dem Trocknen mit Coomassie gefärbt. Die restlichen 4µl wurden mittels SDS-PAGE
aufgetrennt und mit Coomassie gefärbt.
4.3.3 Aufreinigung und Konzentrierung von Antikörpern
Die Aufreinigung von polyklonalen Antikörpern aus Seren von immunisierten Kaninchen
erfolgte mittels selbsthergestellter Affinitätschromatographie-Säulen, an welche die zur
Immunisierung verwendeten Proteinfragmente immobilisiert waren.
Für die Aufreinigung von Antikörpern gegen die DNA-Bindedomäne von SAF-A (SAF-Box),
wurde das synthetische Peptid „N45“ verwendet, welches den N-terminalen 45 Aminosäuren
des menschlichen SAF-A entspricht. Das Peptid war über einen zusätzlich am N-Terminus
angefügten
Cysteinrest
an
Thiopropyl-Sepharose
gekoppelt.
Die
Säule
wurde
freundlicherweise von F.O. Fackelmayer zur Verfügung gestellt.
Zur Aufreinigung von Antikörpern gegen den Bereich der Aminosäurereste von Position 46
bis 401 von SAF-A aus Xenopus laevis, wurde das mit einem HisTag versehene, in Bakterien
rekombinant exprimierte Teilprotein „bee“ verwendet, welches an SulfoLink-Agarose
immobilisiert war.
Methoden
55
Die Affinitätschromatographie-Minisäule wurde mit 1xSäulenvolumen (~10ml) 5xTE
gewaschen. Anschließend wurden 3ml Glycin-Puffer (200mM Glycin, 200mM NaCl, pH 2,0)
auf die Säule gegeben. Sofort nach dem Durchfließen des Glycin-Puffers wurde zwecks
Neutralisierung mit 1xSäulenvolumen 5xTE gespült. Zur Überprüfung des pH-Wertes wurde
der Rest des Durchflusses auf pH-Indikatorstäbchen getropft. Anschließend wurden 2,5ml
Serum mit dem gleichem Volumen 1xRIPA gemischt und auf die Säule gegeben. Die
Bindung der Antikörper an ihr Epitop erfolgte über Nacht bei RT auf einem Rollermischer.
Am folgenden Tag wurde nach dem Setzen des Säulenmaterials der Serumdurchfluß
gesammelt und erneut über die Säule gegeben. Nach einem 6maligen Waschen der Säule mit
1xPBS (~60ml) wurden die Antikörper mit Glycin-Puffer in 6 Fraktionen zu 500µl eluiert.
Das Eluat wurde in Reaktionsgefäße tropfen gelassen, in die zur Neutralisierung 180µl
(mindestens 1/3 des Elutionsvolumens) 1M Tris-HCl (pH 8,0) vorgelegt waren. Unmittelbar
nach dem Eluieren einer Fraktion wurde der Reaktionsgefäßinhalt gut gemischt und der pHWert kontrolliert. Von jeder Fraktion wurde 1µl auf eine MeOH-aktivierte PVDF-Membran
getropft und mit Coomassie gefärbt. Fraktionen, die eine Färbung erkennen ließen, wurden
vereinigt und zwecks Umpufferung sowie Konzentrierung auf eine Centricon-Säule mit einer
Ausschlußgröße von 50kDa und einem Füllvolumen von 4ml gegeben. Es wurde 10min bei
7500xg und 4°C zentrifugiert, wodurch sich das Füllvolumen von 4ml auf ~500µl reduzierte.
Die Umpufferung der Antikörper erfolgte durch ein 8maliges Waschen der Säule mit 1xPBS.
Um eine maximale Konzentrierung der Antikörper zu erreichen, wurde nach dem letzten
Waschschritt solange zentrifugiert, bis keine weitere Volumenabnahme mehr zu erkennen
war. In der Regel stagnierte das Endvolumen nach einer 30 bis 60minütigen Zentrifugation
zwischen 30 und 50µl.
Die Proteinkonzentration der Antikörper-Lösung wurde mit dem Bradford-Reagenz der Firma
Bio-Rad ermittelt. Als Proteinstandard diente BSA der Firma New England Biolabs.
Die Lagerung der konzentrierten Antikörper erfolgte bei 4°C.
4.3.4 Markierung von Antikörpern
Die Fluoreszenz-Markierung von Antikörpern erfolgte mit dem Zenon Tricolor Rabbit IgG
Labeling Kit (Molecular Probes). Es wurden affinitätschromatographisch aufgereinigte
Antikörper verwendet, die nach ihrer Elution von der Säule nicht weiter umgepuffert worden
waren. Das heißt, die Antikörper-Lösungen enthielten ~150mM NaCl, ~150mM Glycin und
~270mM Tris. Je 1µg Antikörper wurde mit H2O auf ein Volumen von 15µl aufgefüllt, mit
Methoden
56
5µl Zenon-Markierungsreagenz gemischt und für 5min bei RT inkubiert. Die Hälfte des
Markierungsansatzes wurde für eine spätere Verwendung bei 4°C verwahrt, die restlichen
10µl wurden mit 2,5µl Zenon-Blockierungsreagenz gemischt. Es wurde erneut für 10min bei
RT inkubiert. Anschließend wurden die markierten Antikörper sofort für ImmunfluoreszenzFärbungen benutzt.
Das Prinzip der Markierung von Antikörpern mit dem Zenon-Kit beruht auf Fluorophorgekoppelten Fab-Fragmenten (= Markierungsreagenz). Die Fab-Fragmente sind spezifisch für
die Fc-Region der zu koppelnden Antikörper und binden an diese. Nicht gebundene FabFragmente, die bei Doppel- bzw. Mehrfachfärbungen mit anderen primären Antikörpern
kreuzreagieren könnten, werden durch die Zugabe eines Überschußes unspezifischer
Antikörper (= Blockierungsreagenz) gebunden und somit neutralisiert.
4.3.5 SDS-PAGE
Die elektrophoretische Auftrennung von Proteinen in SDS-PA-Gelen (5cm x 8cm x 0,7mm)
erfolgte nach Laemmli (1970). In Abhängigkeit der Größe der aufzutrennenden Proteine
wurden Trenngele mit einer Konzentration von 7,10 oder 12% verwendet (s. Tab. 3). Das
Sammelgel hatte eine Konzentration von 4% (s. Tab. 4). Die Polymerisation wurde durch die
Zugabe von 50µl 10% (w/v) APS und 10µl TEMED zu 5ml der PA-Gellösungen gestartet.
Die Elektrophorese erfolgte bei einer Stromstärke von 15 bis 25mA und wurde in der Regel
beim Austritt der Bromphenolblau-Lauffront aus dem Gel gestoppt.
Das Anfärben der Proteine im Gel wurde mit Coomassie-Brillantblau nach Sambrook et al.
(1989) durchgeführt.
Tab. 3: Zusammensetzung von SDSPA-Gelen verschiedener Konzentration
7% 10% 12%
[ml] [ml] [ml]
Trenngelpuffer (5x) 1
1
1
Rotiphorese 30
1,2 1,7 2
H2O
2,8 2,3 2
Tab. 4: Sammelgelzusammensetzung
4%
[ml]
Sammelgelpuffer (2x) 2,5
Rotiphorese 30
0,7
H2O
1,8
4.3.6 Western Blot
Der Transfer von Proteinen aus einem SDS-PA-Gel auf eine PVDF-Membran erfolgte für 1h
in einer Semi-Dry-Blot-Apparatur bei einer konstanten Stromstärke von 0,05A pro Gel bzw.
1mA pro cm2 Gelfläche (Geldicke: 0,7mm). Die PVDF-Membran war zuvor mit Methanol
aktiviert und für einige Minuten in Transfer-Puffer äquilibriert worden. Das PA-Gel hingegen
Methoden
57
wurde direkt nach der Elektrophorese, d.h. ohne zuvorige Äquilibrierung in Transfer-Puffer,
verwendet. Nach dem Transfer wurde die Membran kurz in H2O gewaschen und für 1min mit
Ponceau-S-Lösung gefärbt. Es wurde in H2O entfärbt bis die Banden des mitaufgetragenen
Molekulargewichtsstandards zu erkennen waren. Diese wurden mittels Kugelschreiber
markiert. Anschließend wurde die Membran vollständig in 1xTNT entfärbt. Zum Blocken
unspezifischer Bindestellen wurde die Membran für 30min bei RT in 50ml 1xRotiblock
geschüttelt. Dann wurde die Membran kurz in 1xTNT gewaschen und anschließend mit dem
in 1xTNT verdünnten primären Antikörper für 1h bei RT unter Schütteln inkubiert. Danach
wurde mindestens 3mal für jeweils 5min mit 1xTNT gewaschen. Es folgte die Inkubation mit
HRP-gekoppelten sekundärem Antikörper (Verdünnung: 1:50000 in 1xTNT mit 0,5% (w/v)
Magermilchpulver) für 30min bei RT. Anschließend wurde erneut gut gewaschen (s.o.). Der
gebundene sekundäre Antikörper wurde durch eine Chemilumineszenz-Reaktion mit einem
ECL-System (Amersham bzw. Pierce) nachgewiesen und das Chemilumineszenz-Signal auf
Röntgenfilm aufgenommen. Abschließend wurden die auf der Membran markierten
Molekulargewichtsstandardbanden auf den entwickelten Film übertragen.
Membranen, die nach der Entwicklung erneut mit Antikörpern inkubiert werden sollten,
wurden ausgiebig in 1xTNT (5x5min) gewaschen. Alternativ wurden die Antikörper entfernt.
Das Entfernen („Strippen“) gebundener Antikörper von Membranen erfolgte durch eine
Inkubation in WB-Elutionspuffer für 30 bis 60min bei 70°C. Anschließend wurden die
Membranen in H2O (5x5min) und 1xTNT (5x5min) gewaschen.
Für stringentere Bedingungen bei Western-Blot-Analysen wurde der Puffer 1xTNT durch den
Puffer 1xRIPA ersetzt.
4.3.7 RT-PCR
In ein 0,5ml PCR-Reaktionsgefäß wurden 0,5µl Random-Primer (Hexamere, 500ng/µl), 1µl
dNTPs (je 10mM) sowie die zu revers transkribierende RNA pipettiert. Das Gesamtvolumen
des Ansatzes wurde mit H2O auf 11µl eingestellt. Anschließend erfolgte zur Auflösung von
RNA-Sekundärstrukturen eine Inkubation bei 65°C für 5min. Direkt danach wurde der Ansatz
für 5min auf Eis gestellt. Zum Sammeln des Cup-Inhalts am Boden wurde kurz zentrifugiert.
Es folgte die Zugabe von 4µl 5xFirststrand-buffer, 2µl 0,1M DTT und 0,5µl RNase-Inhibitor
(40U/µl). Nach dem Mischen des Ansatzes wurde dieser für 2min bei 37°C inkubiert.
Anschließend wurde 1µl der Reversen Transkriptase M-MLV (200U/µl) hinzugegeben,
gemischt und für 10min bei 25°C und 60min bei 37°C inkubiert. Die Lagerung der cDNA
erfolgte bei –20°C.
Methoden
58
Für die PCR wurden 4µl der cDNA-Lösung verwendet. Die PCR-Ansätze (s. Tab. 5) wurden
auf Eis pipettiert und für die PCR in einen auf 94°C vorgeheizten Mastercycler überführt.
Tab. 5: Zusammensetzung eines 50µl-Standard-PCR-Ansatzes.
Volumen [µl] Endkonzentration
H2O
36
10xPCR-Puffer
5
1x
MgCl2 (25mM)
3
1,5mM
dNTPs (je 2,5mM)
2
100µM
Primer_forward (10µM) 1
0,2µM
Primer_reverse (10µM) 1
0,2µM
cDNA
4
Taq (1U/µl)
1
1U/50µl
Das PCR-Temperaturprofil für die Verwendung des Primerpaares fibro1/fibro2 war wie folgt:
2min 94°C, 30x (60s 94°C, 45s 60°C, 45s 72°C), 10min 72°C.
4.3.8 Beschichtung von Deckgläschen mit Alzianblau
Die Beschichtung von DG erfolgte in 145mm Kulturschalen, die Platz für ca. 100 DG
(Ø 10mm) boten. Die DG wurden mit 50ml einer 0,1%igen (w/v) Alzianblaulösung (besitzt
eine positive Nettoladung) überschichtet und für mindestens 30min bei RT geschüttelt.
Anschließend wurde ausgiebig mit H2O gewaschen (5x5min) und die DG in der Kulturschale
trocknen gelassen. Die beschichteten DG wurden im Dunkeln bei RT gelagert. Die
Alzianblaulösung wurde ebenfalls lichtgeschützt bei RT gelagert und bis zu 6mal
wiederverwendet
4.3.9 DNA-Färbung und Einbettung von Präparaten
Die Färbung der DNA von einfachen Kernen aus Xenopus-Ei-Extrakten erfolgte durch das
Einbetten der Präparate in Antifadelösung (meist mit DABCO), die das grünfluoreszierende
SYTOX-Green (2,5µM) oder das blaufluoreszierende Hoechst 33258 (10µg/ml) enthielt.
Die DNA-Färbung von Zellkernen mit Hoechst 33258 (3 bis 10µg/ml) erfolgte auf die gleiche
Weise. Die Färbung der DNA von Zellkernen mit dem im Infrarotbereich fluoreszierenden
TO-PRO-3 (1µM in 1xPBS) oder TOTO-3 (1µM in 1xPBS) wurde durch eine mindestens
5minütige Inkubation mit der entsprechenden Färbelösung (~20µl pro DG) bei RT erreicht.
Anschließend wurden die Präparate ohne weitere Waschschritte direkt in Antifadelösung
(immer mit PPD !) eingebettet. Sofern die Zellen vor der Färbung noch nicht permeablisiert
Methoden
59
waren, wurde dies durch eine 10minütige Inkubation mit 0,5% (v/v) Triton X-100/1xPBS
erreicht.
Vor dem Einbetten der DG wurden diese seitlich auf ein Papiertuch getupft, um sie von
überschüssiger Flüssigkeit zu befreien. Das Einbetten der DG (10mm) erfolgte in 1,5µl
Antifadelösung, die auf einem OT vorgelegt waren. Nach einer kurzen Wartezeit (~5min), die
der Trocknung überschüssiger bzw. anhaftender Flüssigkeitsreste und ausgetretener
Antifadelösung diente, wurden die DG zur räumlichen Fixierung mit Nagellack (farblos)
umrandet. Nach dem Aushärten des Nagellacks erfolgte die finale Versiegelung der DG,
indem Nagellack auf die Naht zwischen dem DG und die Nagellackumrandung gegeben
wurde. Vor der mikroskopischen Betrachtung wurde die Oberfläche der DG mittels eines
H2O-befeuchteten Kimwipes von eingetrockneten Pufferresten befreit. Die Lagerung der
Präparate erfolgte lichtgeschützt bei 4°C.
4.3.10 Matrixpräparation in situ
Die Matrixpräparation bzw. Zellfraktionierung wurde modifiziert nach He et al. (1990)
durchgeführt (s. Abb. 5).
Abb. 5: Matrixpräparation Schematische Darstellung
Auf Alzianblau-beschichteten DG (10mm) gewachsene Zellen wurden durch viermaliges
Eintauchen in 1xPBS von Medium befreit und anschließend mit Matrixpuffer1 (100µl/DG)
Methoden
60
überschichtet. Matrixpuffer 1 war zur Stabilisierung nukleärer Strukturen unmittelbar vor
Gebrauch Natriumtetrathionat (NaTT, Endkonzentration: 2mM) zugegeben worden. Nach
einer 10minütigen Inkubation bei RT wurden die Zellen dann mit Matrixpuffer 2 (100µl/DG)
extrahiert. Es wurde wiederum für 10min bei RT inkubiert. Anschließend erfolgte für 20min
bei RT eine Degradierung der zellulären DNA in Matrixpuffer 3 (100µl/DG), dem vor
Gebrauch DNaseI (Endkonzentration: 200U/ml) zugesetzt worden war. Dann wurden die
Zellen durch aufsteigende Salzkonzentrationen mit Matrixpuffer 4 (100µl/DG) für 5min bei
RT und Matrixpuffer 5 (100µl/DG) für 7min bei RT extrahiert.
Abschließend wurden die Zellen vorsichtig zweimal mit 1xPBS gewaschen und mit 4%iger
pFa-Lösung (100µl/DG) für 20min bei RT fixiert.
Anmerkungen:
-
Die DG wurden vor den Inkubationen in den einzelnen Puffern jeweils einmal mit dem
entsprechenden Puffer (100µl/DG) vorgewaschen.
-
Vor der Inkubation im DNaseI-haltigen Matrixpuffer 3 erfolgte ein zweimaliges Waschen
der DG mit DNaseI-freiem Matrixpuffer 3, um ein möglichst Ammoniumionen-armes
Milieu für die enzymatische Aktivität der DNaseI zu schaffen.
-
Für die Matrix-Präparation mit RNase wurde zu Matrixpuffer 1 RNaseA in einer
Endkonzentration von 200µg/ml gegeben.
-
Für die Präparation einer DNA-reichen Matrix wurde auf die Behandlung der Zellen mit
Matrixpuffer 3 und Matrixpuffer 4 verzichtet. Das heißt, nach der Inkubation in
Matrixpuffer 2 schloß sich unmittelbar die Extraktion der Zellen mit Matrixpuffer 5 an.
-
Einfache Kerne aus Xenopus-Ei-Extrakten wurden für Matrixpräparationen wie unter
„Halopräparation einfacher Kerne“ (Kapitel 4.2.5) beschrieben vorbehandelt und auf
Deckgläschen zentrifugiert. Anschließend wurden die Kerne kurz mit xMatrixpuffer 1
gewaschen. Die weitere Behandlung mit den xMatrixpuffern 2 bis 5 war analog zu der
Behandlung von eukaryotischen Zellen mit den Matrixpuffern 2 bis 5.
Ergebnisse
61
5. Ergebnisse
Im folgenden werden die Ergebnisse dieser Arbeit vorgestellt. Der Ergebnisteil ist in zwei
Hauptabschnitte untergliedert:
Im ersten Abschnitt werden die Ergebnisse präsentiert, die mittels des Xenopus-Ei-Extraktes
und in vitro rekonstituierter Kerne gewonnen wurden. Hierbei wird zunächst auf die
Strukturmerkmale in vitro gebildeter Kerne sowie auf die räumliche Anordnung des
Chromatins und des Proteins xSAF-A in einfachen Kernen eingegangen. Durch Matrix- und
Halopräparationen an den rekonstituierten Kernen wurde getestet, ob xSAF-A als Marker für
Kernmatrixstrukturen verwendet werden kann und ob das Chromatin an den durch xSAF-A
gefärbten Strukturen organisiert bzw. verankert ist.
Daran schließen sich die Ergebnisse von Kernbildungsreaktionen an, die mit Ei-Extrakt
durchgeführt wurden, aus dem xSAF-A zuvor depletiert bzw. zu dem xSAF-A-spezifische
Antikörper hinzugegeben worden war(en). Durch diese Experimente sollte untersucht werden,
ob xSAF-A eine essentielle Komponente für den Kernbildungsprozeß und die Architektur
einfacher Kerne darstellt.
Letztendlich werden die Ergebnisse vorgestellt, die bezüglich der DNA-Replikation in
einfachen Kernen gewonnen werden konnten. Zu in vitro gebildeten Kernen wurden
fluoreszierende Nukleotidanaloga gegeben, um Replikationsfoci bzw. replizierte DNA zu
visualisieren. Durch Immunfärbungen auf xSAF-A und Replikationsfaktoren an solchen
Kernen sollte die relative Lage von xSAF-A-Strukturen zu Replikationsfoci und
Replikationsfaktoren untersucht werden. Konkret wurde der Frage nachgegangen, ob ein
räumlicher Zusammenhang zwischen Kernmatrixstrukturen und Orten aktiver Replikation
besteht.
Der zweite Abschnitt des Ergebnisteils stellt Beobachtungen an eukaryotischen Zellen vor.
Durch diese sollten die mit dem „künstlichen“ Xenopus-System gewonnenen Erkenntnisse
vertieft und, sofern dies möglich war, auf ihre Gültigkeit in komplexen Zellkernen hin
überprüft werden.
Wie im Xenopus-Ergebnisteil wird zunächst die räumliche Anordnung und Organisation von
SAF-A im Zellkern mittels fluoreszenzmikroskopischer Techniken dargelegt. Hierauf folgt
die genauere Untersuchung der beobachteten Anreicherung von SAF-A in inaktiven XChromosomen (Xi).
Ergebnisse
62
Die nächsten Kapitel widmen sich der Analyse eines dominant negativen Konstruktes von
SAF-A. Bei dem Konstrukt handelt es sich um das carboxyterminale Drittel von SAF-A,
genannt C280, dessen Expression die native Lokalisierung und Organisation von SAF-A in
Zellkernen massiv beeinträchtigt. Die Auswirkungen der durch C280 verursachten Störung
von SAF-A auf die Chromatinorganisation, Chromosomenterritorien, die Kernmatrix, den
Zellzyklus, die DNA-Replikation, die Beladung des Chromatins mit Replikationsfaktoren und
die Transkription werden näher vorgestellt. Zudem werden die Ergebnisse einer MicroarrayAnalyse präsentiert, mit der die zelluläre Antwort in C280 exprimierenden Zellen auf mRNAEbene untersucht wurde.
Im letzten Kapitel des Ergebnisteils werden die Mobilitäten von SAF-A:eGFP und diverser
SAF-A:eGFP-Konstrukte dargelegt, die mittels der Methode der „fluorescence recovery after
photobleaching“ (FRAP) in Zellkernen lebender Zellen bestimmt wurden. Durch diese
Experimente sollte untersucht werden, ob SAF-A in Zellkernen eine immobile Komponente
darstellt, die mit der Existenz einer Kernmatrix in vivo vereinbar ist, und welche Bereiche
bzw. Domänen von SAF-A Einfluß auf die Mobilität nehmen.
Ergebnisse
63
5.1 Ergebnisse: Xenopus-Ei-Extrakt
5.1.1 Strukturmerkmale einfacher Kerne
In Ei-Extrakten von Xenopus laevis konnten bereits 20min nach Zugabe von λ-DNA
Vorstufen von Kernen beobachtet werden. Die Kernvorstufen hatten eine ungleichmäßige
Form und ließen keine Kernhülle erkennen. Mit fortschreitender Inkubationszeit wurden die
Kerne gleichförmiger und runder. Nach 40 bis 60min zeigten die meisten Kerne eine runde
bis ovale Form und einen Durchmesser von 3 bis 6µm. Weiterhin wiesen die Kerne eine
Kernhülle auf, die im Phasenkontrast als schwarze Umrandung zu erkennen war. Zusätzlich
konnten mittels Phasenkontrast im hell erscheinenden Kerninneren homogen verteilte dunkle
Flecken beobachtet werden.
Die Färbung der DNA einfacher Kerne mit verschiedenen Farbstoffen (z.B. Hoechst 33258,
SYTOX-Green oder Propidiumjodid) ließ ein Muster aus schwach bzw. ungefärbten dunklen
Bereichen erkennen, die von intensiv gefärbten Bereichen umrandet waren. Die dunklen
Bereiche der DNA-Färbung erinnerten an die dunklen Phasenkontraststrukturen (s. Abb. 6)
und colokalisierten mit diesen.
Die Größe und Morphologie sowie das DNA-Färbemuster der Kerne änderten sich durch
längere Inkubationszeiten nicht mehr.
Phako
DNA
merge
Abb. 6: Strukturmerkmale einfacher Kerne. Die Abbildungen zeigen in vitro gebildete Kerne, die
3h nach der Zugabe von λ−DNA zu Ei-Extrakten fixiert wurden. Im Phasenkontrast (Phako) ist deutlich die
dunkle Kernhülle erkennbar, die die Kerne umschließt. Das Innere der Kerne weist ein granuläres Muster auf,
welches auch bei der DNA-Färbung (hier Hoechst 33258, zwecks eines besseren Kontrastes in Pink
dargestellt) der Kerne sichtbar ist. In seltenen Fällen waren die Kerne nicht komplett mit DNA gefüllt (untere
Bildreihe). Die Kerne erlangten trotzdem eine runde Form. Auffallend ist, daß in solchen Kernen das im
Phasenkontrast erkennbare granuläre Muster auf die DNA-gefärbten Bereiche beschränkt war. (Balken = 1µm)
Ergebnisse
64
5.1.2 Organisation von xSAF-A in einfachen Kernen
Immunfluoreszenz-Färbungen, die an einfachen Kernen mit spezifischen Antikörpern für
xSAF-A durchgeführt wurden, zeigten bei der Betrachtung mit dem Epifluoreszenzmikroskop
eine Lokalisierung von xSAF-A in einer Vielzahl von Foci, die über den gesamten Kern
verteilt
waren
(s. Abb. 7A).
Die
genauere
Betrachtung
der
Signale
mittels
Konfokalmikroskopie ließ eine Organisation von xSAF-A in flecken- und filamentförmigen
Strukturen erkennen, die einen Durchmesser von 414 +/- 61nm hatten (s. Abb. 7B).
A
xSAF-A
B
Abb. 7: xSAF-A-Strukturen in einfachen Kernen. Die Bilder zeigen in vitro gebildete Kerne
nach einer Immunfluoreszenz-Färbung von xSAF-A (primärer Antikörper: α-FBK).
(A) Die Epifluoreszenzaufnahmen lassen eine Lokalisierung von xSAF-A in einer Vielzahl von Foci
erkennen. (B) Die Konfokalaufnahmen zeigen punkt- bis filamentförmige Strukturen für xSAF-A mit einem
Durchmesser von ~400nm. (Balken = 1µm)
Um eine Aussage über die dreidimensionale Verteilung der xSAF-A-Strukturen machen zu
können, wurden einfache Kerne von ihrem oberen bis zu ihrem unteren Ende mittels der
Konfokalmikroskopie „durchfahren“, um eine Serie aufeinanderfolgender z-Ebenen
aufzunehmen. Hierbei zeigte sich, daß xSAF-A im gesamten Kern (xyz) verteilt ist
(s. Abb. 8). Die filamentförmigen xSAF-A-Strukturen waren in ihrer Länge variabel und
verliefen zum Teil über größere Distanzen. In einigen Fällen durchspannten sie die Kerne
sogar, ließen aber nie eine Verzweigung oder Querverbindung zu anderen xSAF-A Strukturen
erkennen.
Ergebnisse
65
A
B
Abb. 8: Räumliche Organisation von xSAF-A in einfachen Kernen.
(A) Eine Serie konfokaler z-Schnitte durch einen einfachen Kern nach einer Immunfluoreszenz-Färbung auf
xSAF-A. Die z-Schnitte verdeutlichen, daß die xSAF-A Strukturen im gesamten Kern verteilt sind.
(Balken = 1µm)
(B) Die Projektion konfokaler z-Serien auf eine Ebene läßt für xSAF-A ein Färbemuster erkennen, das dem
von Epifluoreszenzaufnahmen ähnlich ist (vgl. Abb. 7). (Balken = 1µm)
Ergebnisse
66
Die gleichzeitige Betrachtung der gefärbten DNA und der xSAF-A Strukturen (s. Abb. 9) in
einfachen Kernen ließ erkennen, daß die DNA an den Stellen der xSAF-A Strukturen im
Vergleich zum restlichen Kern nur sehr schwach oder gar nicht gefärbt war. Die xSAF-A
Strukturen und die DNA-Färbung schienen sich gegenseitig auszuschließen. Die xSAF-A
Strukturen lagen somit in den „Löchern“ der DNA-Färbung und colokalisierten mit den
dunklen Strukturen, die mittels Lichtmikroskopie (Phasenkontrast bzw. DIC) beobachtet
werden konnten.
Eine Kontrollfärbung auf das Protein Nucleoplasmin ließ eine sehr homogene Verteilung in
einfachen Kernen erkennen. Dies demonstriert, daß Proteine auch andere Lokalisierungen als
xSAF-A einnehmen können und nicht gezwungenermaßen in den Löchern der DNA-Färbung
konzentriert sein müssen.
DNA
xSAF-A
merge
Nucleoplasmin
Abb. 9: Vergleich des Färbemusters von xSAF-A und der DNA in einfachen Kernen.
Die abgebildeten Kerne (konfokale Aufnahme) wurden mit dem DNA-Farbstoff SYTOX-Green gefärbt.
Die DNA-Färbung läßt dunkle punkt- und röhrenförmige Strukturen erkennen, die nicht oder deutlich
schwächer als der Rest des Kerns gefärbt sind. Die Überlagerung (merge) der Aufnahmen der DNAFärbung und der Immunfluoreszenz für xSAF-A zeigt, daß xSAF-A die dunklen Bereiche der DNA-Färbung
ausfüllt. Die Immunfärbung der selben Kerne auf Nucleoplasmin (NP) lässt eine diffuse Verteilung im
gesamten Kern und keine Konzentrierung in den dunklen Bereichen der DNA-Färbung erkennen.
(Balken = 1µm)
Matrixpräparationen an einfachen Kernen (s. Abb. 10) verdeutlichten, daß es sich bei den
xSAF-A Strukturen um sehr stabile Strukturen handelte, die sich weder durch eine nahezu
komplette Entfernung der DNA mit DNaseI noch durch Hochsalzbehandlungen extrahieren
ließen. Im Vergleich zu nicht extrahierten Kernen erschienen die xSAF-A Matrixstrukturen
allerdings etwas länger, dünner und ungeordneter.
Ergebnisse
67
Durch die Verwendung hoher Laserintensitäten und sensitiver Detektoreinstellungen am
Konfokal-Mikroskop zeigte sich, daß Matrixpräparationen noch geringe Restmengen an DNA
aufwiesen. Diese DNA colokalisierte mit Matrixstrukturen. Möglicherweise war diese DNA
durch eine besonders enge Assoziation mit den Matrixstrukturen vor dem Abbau durch
DNaseI geschützt. An Matrixpräparationen durchgeführte Immunfärbungen auf das DNAEinzelstrang-bindende Protein RPA, welches in nicht-extrahierten Kernen mit xSAF-A
colokalisiert (s. Kapitel 5.1.5), ließen keine Signale erkennen. Dieses Protein wurde also im
Gegensatz zu xSAF-A durch die DNaseI-Behandlung und Hochsalzbehandlung vollständig
aus einfachen Kernen extrahiert.
xSAF-A
DNA
merge
RPA
DNA
merge
Abb. 10: Matrixpräparation von einfachen Kernen. Die Konfokalaufnahmen zeigen einfache
Kerne nach einer sequentiellen Behandlung mit 250mM (NH4)2SO4, DNaseI und 2M NaCl und einer
anschließenden Immunfluoreszenz auf xSAF-A und RPA. Für xSAF-A sind filamentförmige Signale
sichtbar. Das Kontroll-Protein RPA wurde hingegen extrahiert und zeigt keine Strukturen mehr auf. Die
DNA-Färbung mit SYTOX-Green lässt Restmengen von DNA erkennen, die dem DNaseI-Abbau
widerstanden; für die Aufnahme wurden hohe Laserleistungen und sensitive Detektoreinstellungen
verwendet. Die Übereinanderlegung (merge) der Bilder für die DNA-Färbung und die Immunfluoreszenz
für xSAF-A verdeutlicht, daß die gefärbte DNA an den Stellen der (xSAF-A) Matrixstrukturen liegt.
(Balken = 1µm)
In Kernbildungsansätzen konnten weiterhin vereinzelte, in der Regel punktförmige xSAF-A
Strukturen gefunden werden, die nicht Bestandteil von (größeren) Kernen waren. Die
Strukturen waren ringförmig von DNA umgeben (s. Abb. 11). Einfache Kerne schienen aus
diesen xSAF-A/DNA-Untereinheiten aufgebaut zu sein. Die Organisation der DNA um die
xSAF-A Strukturen sowie die enge Assoziation von DNaseI-resistenter DNA mit
Matrixstrukturen legten den Schluß nahe, daß die DNA mit ihrer Basis an den zentralen
xSAF-A Matrixstrukturen verankert sein könnte. Halopräparationen an einfachen Kernen
Ergebnisse
68
xSAF-A
DNA
merge
Abb. 11: Konfokale Aufnahmen von xSAF-A/DNA-Untereinheiten. Die abgebildete
xSAF-A/DNA-Untereinheit ist eine Rekonstruktion aus 10 einzelnen Untereinheiten, die alle auf eine Ebene
projiziert wurden, um die Signalqualität bzw. Bildschärfe der sehr kleinen Strukturen zu verbessern. Die
DNA wurde mit SYTOX-Green und xSAF-A durch eine Immunfluoreszenz mit α-FBK und goat anti-rabbit
Alexa 568 gefärbt. Der Durchmesser der xSAF-A-Struktur (~400nm) ist mit dem des DNA-gefärbten
Bereichs vergleichbar. (Balken = 400nm)
bekräftigten dies (s. Abb. 12); dabei wurden fertig gebildete, unfixierte Kerne auf
Deckgläschen zentrifugiert und mit 2M NaCl behandelt, was aufgrund der Extraktion von
Nukleosomen und einer damit verbundenen Auflösung der 30nm-Faser zu einer starken
Dekondensierung der DNA führt. Dies hatte ein „Platzen“ und eine Auflösung der
geschlossenen, runden Morphologie der Kerne zur Folge, wodurch der Kerninhalt über einen
größeren
Bereich
des
Deckgläschens
verteilt
wurde.
Die
DNA-Färbung
von
Halopräparationen ließ röhrenartige Strukturen erkennen. Die Strukturen waren an ihrer
Peripherie intensiv gefärbt; hier konzentrierte sich die DNA. Im Inneren der Röhren war keine
DNA-Färbung sichtbar. Ausgehend von der Peripherie der Röhrenstrukturen breitete sich die
DNA mehr oder minder in Form von Fasern aus. Mit zunehmender Entfernung von den
Röhren wurde die DNA-Färbung immer schwächer.
Die xSAF-A Strukturen waren trotz der Hochsalzbehandlung und Zerstörung der
Kernmorphologie sehr gut erhalten, und erinnerten an die filamentösen Strukturen in nicht
extrahierten Kernen. Die Signale für xSAF-A lagen ausschließlich im Inneren der DNARöhrenstrukturen und füllten diese komplett aus. Das heißt, ein Großteil der DNA
organisierte sich um die xSAF-A Filamente und schien mit diesen salzstabil assoziiert zu sein.
Ergebnisse
69
IF
DNA
merge
xSAF-A
xSAF-A
xSAF-A
RPA
Abb. 12: Halopräparation einfacher Kerne. Die konfokalen Aufnahmen zeigen einfache
Kerne, an denen nach einer Hochsalzextraktion Immunfluoreszenzen (IF) für xSAF-A und RPA
durchgeführt wurden. Die DNA wurde mit SYTOX-Green gefärbt.
Das Protein xSAF-A lässt eine Lokalisierung in punkt- und filamentförmigen Strukturen erkennen. Der
Großteil der DNA konzentriert sich um die xSAF-A-Signale in Form von ring- und röhrenartigen
Strukturen. Der Rest der DNA weist eine diffusere Färbung auf. Der vergrößerte Ausschnitt einer
Halopräparation (dritte Bildreihe von oben) lässt erkennen, daß sich von den Strukturen DNA-Fasern
ausbreiten.
Die Immunfluoreszenz für RPA zeigt kein Signal. Das Protein wurde im Gegensatz zu xSAF-A durch die
Hochsalzbehandlung vollständig aus den Kernen extrahiert. (Balken = 1µm)
Ergebnisse
70
5.1.3 Einfluß von xSAF-A Antikörpern auf die Kernbildung
Um zu betrachten, ob xSAF-A eine essentielle Rolle für die Bildung und Organisation
einfacher Kerne spielt, wurden zwei Ansätze verfolgt. Zum einen wurde versucht, xSAF-A
aus Extrakten vor deren Verwendung für die Kernbildung zu depletieren, zum anderen wurde
versucht, xSAF-A in Extrakten durch die Zugabe spezifischer, stark konzentrierter Antikörper
zu neutralisieren bzw. zu blockieren.
Die Immundepletion von xSAF-A aus Extrakten gelang nie vollständig. Sowohl eine
2x20minütige als auch eine 4x10minütige Inkubation von Extrakten mit Protein-AMagnetkügelchen, an die xSAF-A spezifische Antikörper (α-bee bzw. α-joc) gekoppelt
waren, ließ bei Western-Blot-Analysen immer noch eine Bande für xSAF-A erkennen
(s. Abb. 13). Die Menge des depletierten Proteins betrug im besten Fall ca. 70%.
1 2 3 4 5 6 7
8 9 10
kDa
116
97
116
97
66
45
Abb. 13: Depletion von xSAF-A aus Ei-Extrakten.
Western-Blot auf
xSAF-A
Coomassie-gefärbte
Membran des WesternBlots
Bahn 1: Extrakt vor der Depletion (1µl); Bahn 2 bis 5: Extrakt nach den Depletionsrunden 1 bis 4 (je 1µl).
Der Extrakt wurde nacheinander für je 10min mit den xSAF-A spezifischen Antikörpern α-joc, α-bee, α-joc
und α-bee, die an magnetische Kügelchen gekoppelt waren, depletiert. Bahn 6: Molekulargewichtsstandard
(HMW); Bahn 7 bis 10: Eluiertes Protein von den Magnetkügelchen der Depletionsrunden 1 bis 4.
Die Verwendung von depletierten Extrakten für Kernbildungsreaktionen führte nie zur
Bildung von Kernen. Allerdings konnte auch in den dazugehörigen Kontrollextrakten, die mit
Protein-A-Magnetkügelchen ohne Antikörper inkubiert worden waren, keine Kernbildung
beobachtet werden. Dies zeigt, daß es sich nicht um eine spezifische Hemmung der
Kernbildung handelte, die auf die partielle Depletion von xSAF-A zurückzuführen wäre.
Auffällig ist, daß von gewaschenen Protein-A-Magnetkügelchen neben xSAF-A noch eine
ganze Reihe weiterer Proteine eluiert werden konnte. Offensichtlich führte diese
unspezifische Entfernung von Proteinen zu einer indirekten Verdünnung des Extraktes und zu
einer Beeinträchtigung der Kernbildung.
Ergebnisse
71
Da Extrakte sehr anfällig gegenüber Depletionen schienen, wurde alternativ versucht, die
Kernbildung in Extrakten durch die Zugabe von hochkonzentrierten xSAF-A-spezifischen
Antikörpern (ca. 3 bis 4mg/ml) zu inhibieren.
Die separate sowie die kombinierte Zugabe der Antikörper α-bee und α-N45 zu Ei-Extrakten
während der Entlassung in die Interphase hatte keinen inhibierenden Effekt auf die
Kernbildung. Aus Kernbildungsreaktionen mit Antikörpern entnommene Kerne, die mit
HGPF-Lösung fixiert und gefärbt waren, ließen keinen Unterschied bezüglich der Anzahl, der
Morphologie sowie des DNA-Färbemusters zu Kernen aus Kontrollansätzen erkennen.
Immunfluoreszenzen, bei denen ausschließlich sekundärer Antikörper verwendet wurde,
zeigten intensive Signale in Kernen, die sich in Gegenwart von α-bee gebildet hatten
(s. Abb. 14). Die Signale waren punkt- bis filamentförmig und erinnerten an die typische
Verteilung von xSAF-A in einfachen Kernen. Dies zeigt, daß der Antikörper im Extrakt an
xSAF-A gebunden hat und mit diesem in Kerne eingebaut wurde.
Der Antikörper α-N45 wurde ebenfalls in Kerne eingebaut und ließ im Vergleich zu α-bee
ein etwas diffuseres Färbemuster erkennen.
α-bee
α-N45
Abb. 14: Einbau von xSAF-A-spezifischen Antikörpern in einfache Kerne. Ei-Extrakt
wurde zum Zeitpunkt der Entlassung in die Interphase 1µl xSAF-A spezifischer Antikörper α-bee
(~4mg/ml) oder α-N45 (~3mg/ml) hinzugegeben. Drei Stunden nach Induktion der Kernbildung wurden die
Kerne fixiert, auf DG zentrifugiert und einer Immunfluoreszenz unterzogen, bei der ausschließlich
sekundärer Antikörper (goat anti-rabbit Alexa 568) verwendet wurde. Die abgebildeten Kerne lassen
deutliche Signale erkennen, wie sie typisch für xSAF-A sind. Für α-bee erscheinen die Signale
punktförmiger und weniger diffus als für α-N45. (Balken = 1µm)
Kerne, die sich in Gegenwart der beiden Antikörper α-N45 und α-bee gebildet hatten
(s. Abb. 15), schienen fragiler als Kontrollkerne zu sein und wiesen nach der Zentrifugation
auf Deckgläschen eine stark ausgefranste DNA-Struktur und eine nicht mehr klar begrenzte
Kernperipherie auf. Weiterhin zeigten diese Kerne im Vergleich zu Kontrollkernen einen
reduzierten Einbau von Tetramethylrhodamin-5-dUTP, also eine verminderte Replikation.
Ergebnisse
72
DNA
A
+AK
-AK
xSAF-A
B
repl. DNA
merge
+AK
-AK
Abb. 15: Kernbildung in Gegenwart von xSAF-A Antikörpern.
Zu 25µl Ei-Extrakt wurden während der Entlassung in die Interphase je 0,5µl der xSAF-A spezifischen
Antikörper α-bee und α-N45 gegeben (+AK). Kontrollansätzen wurde 1µl 1xPBS hinzugegeben (-AK).
Nach einer 30minütigen Inkubation erfolgte die Induktion der Kernbildung mit λ-DNA.
Tetramethylrhodamin-5-dUTP wurde 1:20h nach der Induktion zugegeben. Zehn Minuten später wurden die
Kerne fixiert, auf DG zentrifugiert und einer Immunfluoreszenz auf xSAF-A mit α-FBK unterzogen.
(A) Die Epifluoreszenzaufnahmen (630x) zeigen DNA-Färbungen der Kerne mit Hoechst 33258. Zwecks
eines besseren Kontrastes zum schwarzen Hintergrund ist die gefärbte DNA in Grün dargestellt Die Kerne
aus dem Ansatz mit Antikörpern (+AK) zeigen im Gegensatz zu Kontrollkernen (-AK) eine diffuse DNAFärbung, die nicht mehr klar durch die Kernperipherie begrenzt ist. Zudem ist das granuläre
Pünktchenmuster der ungefärbten DNA-Bereiche in diesen Kernen verlorengegangen. (Balken = 5µm)
(B) Die konfokalen Übersichtsaufnahmen lassen einen gut sichtbaren Einbau von Tetramethylrhodamin-5dUTP in die replizierte DNA von Kontrollkernen (-AK) erkennen. Kerne mit Antikörpern (+AK), die mit
exakt den gleichen Einstellungen aufgenommen wurden, weisen hingegen kaum sichtbare Signale auf.
Weiterhin erscheint die Signalstärke für xSAF-A etwas schwächer als in Kontrollkernen. Die Pfeile
markieren Stellen, an denen Kerne liegen. (Balken = 5µm)
Ergebnisse
73
Erfolgte die Zugabe von Antikörpern zu Kernbildungsreaktionen 10min vor der Entlassung
des Extraktes in die Interphase, kam es zu einer erheblichen Beeinträchtigung der
Kernbildung.
Kernbildungsansätze, denen der Antikörper α-bee 10min vor der Zugabe von CaCl2 und des
energieregenerierenden Systems hinzugefügt worden war, ließen eine Stunde nach Induktion
der
Kernbildung
deutlich
weniger
Kerne
als
Kontrollansätze
erkennen,
denen
hitzedenaturierter α-bee-Antikörper hinzugefügt worden war (s. Abb. 16A). Eine Auszählung
der Kerne 2,5h nach Induktion der Kernbildung führte zur Ermittlung einer ~6mal höheren
Kernanzahl im Kontrollansatz. Die Anzahl der Kerne in Ansätzen mit Antikörpern nahm über
die Zeit weiter zu und glich sich der von Kontrollansätzen immer mehr an. Die Antikörper
gegen xSAF-A im Extrakt schienen den Prozeß des Kernzusammenbaus also nicht komplett
zu inhibieren, sondern eher zu verlangsamen. Allerdings wiesen die in Gegenwart von
intakten Antikörpern gebildeten Kerne im Vergleich zu Kontrollansätzen immer eine stark
gestörte Struktur auf (s. Abb. 16B). Das heißt, die Kerne erschienen fransig, unregelmäßig
geformt und stellenweise stark kondensiert. Weiterhin waren die xSAF-A-Strukturen oftmals
schmaler und deutlich enger gepackt als in Kontrollkernen.
Ergebnisse
A
74
+AK
B
-AK
+AK
DNA
xSAF-A
-AK
merge
DNA
xSAF-A
merge
Abb. 16: Beeinflussung der Kernbildung durch die Prä-Inkubation von Ei-Extrakt
mit Antikörpern gegen xSAF-A. Zu 25µl Ei-Extrakt wurde 1µl konzentrierter xSAF-A spezifischer
Antikörper α-bee (4,4mg/ml) gegeben (+AK). Kontrollansätzen wurde 1µl hitzedenaturierter Antikörper αbee hinzugegeben (-AK). Zehn Minuten später wurden die Extrakte in die Interphase entlassen. Zwanzig
Minuten darauf erfolgte die Induktion der Kernbildung durch die Zugabe von λ-DNA. (A) Aus den
Ansätzen wurden 1h nach Induktion der Kernbildung 0,5µl entnommen und fixiert. Die DNA der Kerne
wurde mit SYTOX-Green gefärbt. Die Übersichtsaufnahmen (146 x 146µm) lassen erkennen, daß der
Ansatz mit intakten Antikörpern (+AK) im Vergleich zum Kontrollansatz (-AK) eine deutlich niedrigere
Anzahl gebildeter Kerne aufweist. (B) Die Ansätze wurden ~3h nach Induktion der Kernbildung fixiert und
auf DG zentrifugiert. Es folgte eine Immunfluoreszenz auf xSAF-A (primärer AK: α-FBK), die Färbung der
DNA mit SYTOX-Green und die Auswertung der Präparate mittels Konfokal-Mikroskopie. Die Kerne aus
dem +AK-Ansatz erscheinen mißgestaltet und lassen im Vergleich zum Kontrollansatz (-AK) auffällige
Unterschiede bezüglich der Färbung von xSAF-A und der DNA erkennen. Die meisten Kerne im Ansatz
+AK entsprachen dem oberen der drei abgebildeten Kerne. (Balken = 1µm)
Ergebnisse
75
5.1.4 Lokalisierung von replizierter DNA in einfachen Kernen
Fluoreszierende Nukleotidanaloga (Fluorescein-12-dUTP, Tetramethylrhodamin-5-dUTP)
wurden nach ihrer Zugabe zu Ei-Extrakten in Kerne eingebaut. Erfolgte die Zugabe frühestens
40min nach Induktion der Kernbildung (Zugabe der λ-DNA) konnten bei der Betrachtung mit
dem Epifluoreszenzmikroskop zahlreiche kleine, fluoreszierende Foci in Kernen gesehen
werden. Erfolgte die Zugabe der Nukleotidanaloga früher, ließ sich eine eher homogene
Färbung des gesamten Kerns und keine Ansammlung in Foci erkennen. Der Einbau der
fluoreszierenden Nukleotide in Foci ließ sich durch Aphidicolin, einem potenten Inhibitor
replikativer DNA-Polymerasen, komplett unterbinden (s. Abb. 17). So zeigten Kerne, die
5min vor Zugabe von Fluorescein-12-dUTP mit Aphidicolin prä-inkubiert worden waren,
lediglich eine sehr schwache, diffuse, grünliche Hintergrundfluoreszenz. Die Zugabe von
ddTTP zu Extrakten, d.h. die Hemmung der in Reparaturprozessen involvierten DNA-
DNA
Fl-12-dUTP
merge
kein
Inhibitor
ddTTP
Aphidicolin
Abb. 17: Markierung von Replikationsfoci in einfachen Kernen. Zu Ei-Extrakten wurden
1,5h nach Induktion der Kernbildung DNA-Polymerase-Inhibitoren (Aphidicolin und ddTTP) gegeben.
Kontrollansätze erhielten keine Inhibitoren. Fünf Minuten später wurde Fluorescein-12-dUTP zu den
Extrakten gegeben, um neu synthetisierte DNA zu markieren. Nach 20min wurden die Kerne fixiert, auf DG
zentrifugiert und deren DNA mit Hoechst 33258 gefärbt. Die Auswertung erfolgte mit einem
Epifluoreszenzmikroskop, wobei für alle Aufnahmen die gleiche Belichtungszeit verwendet wurde.
Kontrollkerne ließen einen Einbau von Fl-12-dUTP in zahlreiche kleine Foci erkennen. Das gleiche
Signalmuster konnte für Kerne beobachtet werden, in denen die DNA-Reparatur durch ddTTP gehemmt
war. Kerne, in denen die DNA-Replikation durch Aphidicolin gehemmt war, ließen hingegen keinen bzw.
einen deutlich reduzierten Einbau von Fl-12-dUTP erkennen. (Balken = 1µm)
Ergebnisse
76
Polymerase β, hatte keinen Einfluß auf die Inkorporierung der markierten Nukleotide in Foci.
Die kombinierte Zugabe beider Hemmstoffe schien zu einer kompletten Inhibierung des
Einbaus von Fluorescein-12-dUTP in Kerne zu führen. Es konnten weder die fluoreszierenden
Foci noch die diffuse Hintergrundfluoreszenz beobachtet werden.
Die aufgeführten Ergebnisse der DNA-Inhibitoren zeigen, daß der Einbau der
fluoreszierenden Nukleotid-Analoga in Foci durch DNA-Replikationsprozesse und nicht
durch DNA-Reparatur bedingt ist. Die schwache, diffuse Hintergrundfluoreszenz scheint
dagegen auf geringfügigen Reparaturprozessen zu basieren.
Eine gleichzeitige Betrachtung von xSAF-A und der Replikationsfoci in einfachen Kernen
mittels Konfokalmikroskopie zeigte einen hohen Grad der Colokalisierung (s. Abb. 18). So
lag frisch replizierte DNA auf und in unmittelbarer Nähe von xSAF-A Strukturen. Diese
räumliche Beziehung konnte auch noch nach Halopräparationen beobachtet werden
(s. Abb. 19). Die frisch replizierte DNA scheint daher besonders eng und salzstabil mit
(xSAF-A) Matrixstrukturen in einfachen Kernen assoziiert zu sein.
xSAF-A
repl. DNA
merge
Abb. 18: Vergleich der Lokalisation von xSAF-A und frisch replizierter DNA.
Ei-Extrakt wurde 1,5h nach Induktion der Kernbildung Fluorescein-12-dUTP zugegeben. Zwanzig Minuten
später wurden die Kerne fixiert und xSAF-A durch eine Immunfluoreszenz (primärer AK: α-FBK) gefärbt.
Die obere Bildreihe zeigt die konfokale Aufnahme eines einfachen Kerns nach der Immunfluoreszenz. Die
Signalmuster für xSAF-A (rot) und die frisch replizierte DNA (grün, durch Einbau von Fluorescein-12dUTP) sind sehr ähnlich. Die untere Bildreihe zeigt einen vergrößerten Ausschnitt des Kerns, der die enge
räumliche Beziehung von xSAF-A und der replizierten DNA verdeutlicht. (Balken = 1µm)
Ergebnisse
77
xSAF-A
repl. DNA
merge
RPA
repl. DNA
merge
Abb. 19: Salzstabile Assoziation frisch replizierter DNA mit xSAF-A-gefärbten
Strukturen. Die konfokalen Aufnahmen zeigen einfache Kerne, die für 1h in Gegenwart von
Fluorescein-12-dUTP repliziert haben und anschließend einer Halopräparationen unterzogen wurden. Für
die replizierte DNA (repl. DNA) sind diffuse, schwach grünfluoreszierende sowie diskrete, deutlich
grünfluoreszierende Strukturen zu erkennen. Letztere colokalisieren mit den punkt- und filamentförmigen
xSAF-A Strukturen, wie die Übereinanderlegung (merge) der Aufnahmen der replizierten DNA und der
Immunfluoreszenz für xSAF-A verdeutlicht. Die Colokalisation erinnert an die enge räumliche Beziehung
von frisch replizierter DNA und xSAF-A Strukturen in nicht extrahierten Kernen.
Die Immunfluoreszenz auf das Kontrollprotein RPA lässt im Gegensatz zu xSAF-A keine Signale erkennen.
Das Protein wurde durch die Halopräparation extrahiert. (Balken = 1µm)
Eine Zeitreihenanalyse an einfachen Kernen, die für die DNA-Replikation synchronisiert
worden waren, ließ erkennen, daß das Färbemuster der replizierten DNA über die Zeit
zunehmend diffuser wurde (s. Abb. 20). So zeigten Kerne, die für 5min in Gegenwart von
Fluorescein-12-dUTP repliziert hatten, eine enge räumliche Beziehung zwischen replizierter
DNA und xSAF-A Strukturen. Zwanzig Minuten nach Zugabe des Fluorescein-12-dUTP
konnte replizierte DNA auch in weiterer Entfernung von xSAF-A Strukturen beobachtet
werden. Nach 1h war nahezu der gesamte Kern mit replizierter DNA gefüllt. Das
Verteilungsmuster der replizierten DNA erinnerte dann an die mit SYTOX-Green gefärbte
DNA einfacher Kerne.
Die ersten detektierbaren Signale des Einbaus fluoreszierender Nukleotid-Analoga in
replizierte DNA lagen immer und unabhängig vom Zeitpunkt der Zugabe auf bzw. in
Ergebnisse
78
unmittelbarer Nähe von xSAF-A Strukturen. Dies und die Zeitreihenanalyse deuten darauf
hin, daß die DNA-Replikation an (xSAF-A) Matrixstrukturen stattfindet und sich die
replizierte DNA anschließend von diesen Strukturen fortbewegt. Um dies zu verifizieren,
wurden Pulse-Chase-Experimente durchgeführt (s. Abb. 21). Diese zeigten sowohl an
synchronisierten als auch an nicht synchronisierten Kernen, daß die während des Pulses (3
bzw. 10min) mit fluoreszierenden Nukleotiden markierte replizierte DNA im darauf
folgenden Chase (120min) ihre enge räumliche Beziehung zu xSAF-A Strukturen verlor. Im
Gegensatz zum Pulse zeigte das Färbemuster der replizierten DNA am Ende des Chase keine
Ähnlichkeit mehr mit dem xSAF-A Strukturen auf und sparte diese häufig aus.
xSAF-A
repl. DNA
merge
5min
20min
60min
Abb. 20: Zeitreihenanalyse der DNA-Replikation in einfachen Kernen. Kerne wurden in
Extrakt gebildet, dem Aphidicolin zugesetzt war, um die DNA-Replikation zu hemmen. Der synchrone Start
der DNA-Replikation erfolgte durch ein Waschen der Kerne und das Resuspendieren dieser in frischen
Extrakt. Der Extrakt enthielt Fluorescein-12-dUTP, um neu synthetisierte DNA zu markieren. Nach 5, 20
und 60min wurden Kerne aus dem Ansatz entnommen, fixiert und auf DG zentrifugiert. Es folgte eine
Immunfluoreszenz auf xSAF-A und die Auswertung mittels Konfokalmikroskopie. Die Aufnahmen lassen
erkennen, daß der Einbau von Fluorescein-12-dUTP in neu synthetisierte DNA (repl. DNA) an den
xSAF-A Strukturen startet. Je weiter die Zeit voranschreitet, desto mehr replizierte DNA kann in den
Bereichen zwischen den xSAF-A Strukturen gefunden werden und desto diffuser wird das Färbemuster der
replizierten DNA. Die Färbung für xSAF-A ändert sich hingegen nicht und läßt auch nach 60min noch eine
diskrete Anordnung in punkt- und filamentförmigen Strukturen erkennen. (Balken = 1µm)
Ergebnisse
79
A
xSAF-A
repl. DNA
merge
xSAF-A
repl. DNA
merge
Pulse
(10min)
Chase
(120min)
B
Pulse
(3min)
Chase
(120min)
Abb. 21: Replizierte DNA bewegt sich von xSAF-A Strukturen fort.
A) Kerne wurden in Gegenwart von Aphidicolin gebildet, um die DNA-Replikation zu inhibieren. 40min
nach Induktion der Kernbildung wurde die DNA-Replikation gestartet, indem die Kerne durch mehrmaliges
Waschen von Aphidicolin befreit und in frischen Extrakt, dem Fluorescein-12-dUTP zugesetzt war,
resuspendiert wurden. Nach einer 10minütigen Markierung (Pulse) der frisch replizierten DNA (repl. DNA)
wurden die Kerne gewaschen und in frischen Extrakt ohne Fluorescein-12-dUTP für weitere 120min
replizieren gelassen (Chase).
B) Extrakt wurde 40min nach Induktion der Kernbildung Tetrametyhlrhodamin-5-dUTP hinzugegeben.
Nach einer 3minütigen Markierung (Pulse) der replizierten DNA erfolgte der Chase, indem dTTP im
100fachen molaren Überschuß gegenüber Tetramethylrhodamin-5-dUTP zu den Kernen gegeben und für
weitere 120min inkubiert wurde.
Direkt am Ende vom Pulse und Chase wurden Kerne aus den Ansätzen entnommen und fixiert. Nach der
Zentrifugation der Kerne auf DG erfolgte eine Immunfluoreszenz auf xSAF-A und die Auswertung mittels
Konfokalmikroskopie. Die Kerne beider Ansätze (A und B) zeigen für den Pulse ein deckungsgleiches
Muster für xSAF-A und die frisch replizierte DNA. Am Ende des Chase ist diese Ähnlichkeit nicht mehr
vorhanden. Die im Pulse markierte DNA erscheint nun großflächiger verteilt und liegt häufig nicht mehr
auf, sondern eher neben den Signalen für xSAF-A. (Balken = 1µm)
Ergebnisse
80
5.1.5 Lokalisierung von Replikationsfaktoren in einfachen Kernen
Die enge räumliche Assoziation von frisch replizierter DNA und xSAF-A Strukturen legte
nahe, daß an den Strukturen ebenfalls Replikationsfaktoren lokalisiert sein müssten.
Um dies zu untersuchen, wurden Immunfluoreszenzen mit Antikörpern gegen ORC1, RPA,
MCM-3 und die DNA-Polymerasen α,δ und ε durchgeführt. Alle Antikörper stammten, wie
dies auch der Fall für die Antikörper gegen xSAF-A war, aus Kaninchen. Das heißt, eine
Doppelfärbung auf xSAF-A und die Replikationsfaktoren war nicht möglich. Eine Ausnahme
bildeten die Antikörper für RPA, die in aufgereinigter Form vorlagen und daher durch
Verwendung des Zenon Tricolor Kits direkt mit einem grünfluoreszierenden Fluorophor
gekoppelt
wurden.
Mit
aufgereinigten
xSAF-A
Antikörpern,
die
mit
einem
rotfluoreszierenden Fluorophor gekoppelt waren, war somit eine Doppelfärbung möglich.
Um dennoch Aussagen über die Lokalisierung der anderen Replikationsfaktoren zu xSAF-A
bei Einzelfärbungen machen zu können, wurden als Bezugspunkt die „Löcher“ der DNAFärbung einfacher Kerne gewählt. Da xSAF-A in diesen Löchern lokalisiert ist, kann
aufgrund der relativen Lage der Signale der Replikationsfaktoren zu den Löchern der DNAFärbung indirekt darauf geschlossen werden, ob die Replikationsfaktoren mit xSAF-A
colokalisieren oder nicht.
Die Immunfluoreszenzen für ORC1 und RPA ließen in einfachen Kernen flecken- und
filamentförmige Strukturen erkennen, wie sie typisch für xSAF-A sind (s. Abb. 22A). Die
Signale lagen weiterhin ausschließlich in den Löchern der DNA-Färbung. Die beiden
Faktoren konzentrieren sich somit in Bereichen, in denen xSAF-A bzw. Matrixstrukturen
lokalisiert sind. Der hohe Grad der räumlichen Übereinstimmung von RPA und xSAF-A
verdeutlichte sich bei der direkten Betrachtung beider Proteine mittels Doppelfärbung
(s. Abb. 22B). Die Signale der Immunfluoreszenz für die Polymerasen α, δ und ε ließen in
einfachen Kernen ebenfalls flecken- und filamentförmige Strukturen erkennen (s. Abb. 23).
Allerdings waren diese etwas diffuser und weniger scharf begrenzt als die Signale für ORC1,
RPA oder xSAF-A. Dies traf vor allem auf die Einzelfärbungen für die Polymerasen α zu.
Die Färbung für die Polymerase ε zeigte die größte Ähnlichkeit zu xSAF-A Strukturen auf.
Die Signale der Polymerasen füllten die Löcher der DNA-Färbung aus, konnten aber auch in
anderen Bereichen der Kerne gefunden werden. Die Polymerasen schienen somit nicht
ausschließlich in Regionen von xSAF-A bzw. Matrixstrukturen lokalisiert zu sein.
Die gleichzeitige Färbung von Kernen auf alle drei Polymerasen, führte zu einer
Verbesserung der Signalqualität und ließ eine deutlichere Konzentrierung der Signale in den
„Löchern“ der DNA-Färbung erkennen.
Ergebnisse
A
81
IF
DNA
merge
RPA
xSAF-A
merge
DIC
DIC & xSAF-A
DIC & RPA
ORC1
RPA
B
Abb. 22: Lokalisierung von ORC1 und RPA in einfachen Kernen.
A) Die konfokalen Aufnahmen zeigen Kerne, an denen eine Immunfluoreszenz (IF) auf ORC1 und RPA
durchgeführt wurde. Die DNA wurde mit SYTOX-Green gefärbt. Die Signale für ORC1 und RPA sind
flecken- bzw. filamentförmig und in den Bereichen des Kerns lokalisiert, die keine oder nur eine schwache
DNA-Färbung aufweisen.
B) Die Doppelfärbung mit Fluorophor-gekoppelten primären Antikörpern gegen RPA (grün) und xSAF-A
(rot) lässt erkennen, daß die Strukturen für xSAF-A und RPA im selben Kern nahezu deckungsgleich sind.
Die DIC-Aufnahme des Kerns zeigt auffällige dunkle Bereiche. Die Signale für xSAF-A und RPA liegen
meist in und in unmittelbarer Nähe dieser dunklen Bereiche. Zu beachten ist, daß die Aufnahmen für
xSAF-A und RPA im Gegensatz zur DIC-Aufnahme konfokal sind und sich daher bezüglich der Ausmaße
der z-Ebene unterscheiden. (Balken = 1µm)
Ergebnisse
82
IF
DNA
merge
Pol α p180
Pol δ p66
Pol ε p60
Pol α p180
δ p66
ε p60
Abb. 23: Lokalisierung replikativer DNA-Polymerasen in einfachen Kernen.
Die Bilder zeigen konfokale Aufnahmen von in vitro gebildeten Kernen, an denen Immunfärbungen (IF) für
die Polymerasen α (180kDa Untereinheit), δ (66kDa Untereinheit) und ε (60kDa Untereinheit) durchgeführt
wurden. Für den untersten Kern wurden alle drei Antikörper kombiniert. Die DNA der Kerne ist mit
SYTOX-Green gefärbt. Für die Polymerasen sind fleckenförmige Signale zu erkennen. Die Bereiche der
Kerne, die keine oder nur eine schwache DNA-Färbung aufweisen (Bereiche der Kernmatrix), werden von
den Polymerase-Signalen ausgefüllt. Allerdings sind Polymerase-Signale auch in anderen Bereichen der
Kerne zu beobachten. (Balken = 1µm)
Zur Kontrolle und um zu verdeutlichen, daß an den Stellen der Replikationsfaktoren
tatsächlich replikative Prozesse stattfinden, wurden an einfachen Kernen, die 5min nach
Markierung der replizierten DNA mit Fluorescein-12-dUTP fixiert worden waren,
Immunfluoreszenzen durchgeführt (s. Abb. 24). Das Färbemuster für ORC1, RPA und die
Polymerasen (exemplarisch wurde die Untereinheit p66 der Polymerase δ betrachtet) war mit
dem der frisch replizierten DNA vergleichbar. Ebenfalls war dies eine weitere, indirekte
Bestätigung, daß die obigen Faktoren an Stellen von xSAF-A liegen.
Ergebnisse
83
IF
repl. DNA
merge
ORC1
Polδ p66
RPA
Abb. 24: Colokalisation von Replikationsfaktoren und frisch replizierter DNA.
Die Bilder zeigen konfokale Aufnahmen von einfachen Kernen, die im Extrakt für 5min mit Fluorescein-12dUTP inkubiert wurden, um frisch replizierte DNA zu markieren. Anschließend wurden die Kerne fixiert
und Immunfluoreszenzen auf ORC1, RPA und die Polymerase δ durchgeführt. Die Signale der
Immunfluoreszenzen (IF) und der replizierten DNA (repl. DNA) lassen in den selben Kernen ein ähnliches
Muster und einen hohen Grad der räumlichen Übereinstimmung (s. merge) erkennen. (Balken = 1µm)
Die Betrachtung von MCM-3 ließ im Gegensatz zu den eben erwähnten Faktoren eine
deutlich andere Lokalisierung und keine Konzentrierung in flecken- oder filamentförmigen
Strukturen erkennen. Weiterhin schien sich das Färbemuster von MCM-3 über die Zeit, in
Abhängigkeit der Menge der replizierten DNA zu ändern (s. Abb. 25). So wiesen Kerne, die
keinen oder nur einen geringen Einbau von Fluorescein-12-dUTP zeigten und daher noch
nicht bzw. nur wenig DNA repliziert hatten, eine intensive, homogene MCM-3 Färbung im
gesamten Inneren auf. Im Gegensatz dazu ließen Kerne, die eine intensive, diffuse
Grünfluoreszenz zeigten und somit einen großen Teil ihrer DNA repliziert hatten, nur noch
eine schwache bzw. gar keine MCM-3 Färbung mehr erkennen. Die MCM-3 Färbung schien
sich somit invers zur Färbung der replizierten DNA zu verhalten. Das heißt, je mehr
replizierte DNA, desto weniger MCM-3 Signal. Die gleichzeitige Betrachtung des
Färbemusters von MCM-3 und replizierter DNA in Kernen, die zwischen den beiden obigen
Extremata lagen, zeigte, daß die MCM-3 Signale vornehmlich in Bereichen lagen, die frei von
Ergebnisse
84
replizierter DNA waren. Dieses Ergebnis und die Abnahme der MCM-3 Färbung mit
voranschreitender Replikation legen nahe, daß der Faktor MCM-3 nicht replizierte DNA
markiert und im Verlauf der Replikation von dieser abgelöst wird, wie bereits für MCMProteine menschlicher Zellen beschrieben (Krude et al., 1996).
A
repl. DNA
MCM-3
merge
repl. DNA
MCM-3
merge
früh
mittel
spät
B
mittel
Abb. 25: Vergleich des Färbemusters von MCM-3 und replizierter DNA.
In vitro gebildete Kerne wurden in der Gegenwart von Fluorescein-12-dUTP für 5, 50 und 90 Minuten
replizieren gelassen. Anschließend wurden die Kerne fixiert und auf DG zentrifugiert. Es folgte die Färbung
von MCM-3 mittels Immunfluoreszenz. Die Auswertung der Präparate wurde am Konfokalmikroskop
vorgenommen.
(A) Kerne mit unterschiedlich weit fortgeschrittenen Stadien (früh, mittel spät) der DNA-Replikation. Je
weiter die DNA-Replikation vorangeschritten ist, desto schwächer und weniger dicht ist die MCM-3
Färbung. (Balken = 1µm)
(B) Vergrößerte Ausschnitte aus Kernen im mittleren Stadium. Die Signale für MCM-3 liegen oft in
Bereichen, die frei von replizierter DNA sind. (Balken = 1µm)
Ergebnisse
85
5.1.6 Western-Blot-Analyse von Antikörpern
Die Überprüfung der Spezifität von primären Antikörpern, die für ImmunfluoreszenzExperimente an in vitro gebildeten Kernen verwendet wurden, erfolgte durch Western-Blots.
Die Verwendung der Antikörper ließ die Detektion der folgenden Xenopus-Proteinbanden
erwarten: SAF-A - 110kDa, ORC1 – 115kDa, MCM3 - 105kDa, Pol ε p60 - 60kDa, Pol α
p70 - 70kDa, Pol α p180 - 180kDa, Pol δ p50 - 50kDa, Pol δ p66 - 66kDa, RPA p70/p32 – 70
und 32kDa, Nucleoplasmin – Phospho-Homopentamer 31 bis 33kDa (Rowles et al., 1996;
Jullien et al., 1999; Gillespie & Blow, 2000; Prokhorova & Blow, 2000; Kobayashi et al.,
2002; Fukui et al., 2004). Die durchgeführten Western-Blot-Analysen bestätigten die
Erwartungen, d.h., die Antikörper führten zur Detektion größenspezifischer Proteinbanden
(s. Abb. 26). Allerdings waren bei der Verwendung einiger Antikörper (z.B. MCM3, Pol ε
p60) zusätzlich einige schwache, unspezifische Nebenbanden sichtbar. Außerdem erkannte
der gegen die humane 70- und 32kDa-RPA-Untereinheit gerichtete polyklonale Antikörper
116
97
66
116
97
66
45
NP
kDa
RPA
Pol δ p66
Pol δ p50
Pol α p180
Pol α p70
kDa
Pol ε p60
MCM3
ORC1
xSAF-A
lediglich die 32kDa-Untereinheit des korrespondierenden Xenopus-Proteins.
kDa
66
45
29
Abb. 26: Überprüfung der Spezifität von Antikörpern mittels Western-Blot. In SDSPA-Gelen wurde pro Spur 1µl denaturierter Xenopus-Ei-Extrakt (entspricht ca. 50µg Protein) aufgetrennt,
auf eine PVDF-Membran transferiert und mit verschiedenen (Xenopus-spezifischen) Antikörpern inkubiert.
Die Antikörper für die Proteine MCM3 und RPA sind gegen Mensch gerichtet, kreuzreagieren aber mit den
entsprechenden Xenopus-Proteinen. Für die Detektion von xSAF-A wurde der Antikörper α-FBK verwendet.
Ebenfalls wurde die Qualität der polyklonalen, xSAF-A-spezifischen Antikörper α-bee und
α-N45 kontrolliert. Die beiden Antikörper waren aus dem Serum immunisierter Kaninchen
mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt und durch zentrifugierbare Centricon-Säulen
(Ausschlußgröße: 50kDa) konzentriert worden. Durch die Zugabe der Antikörper zu
Kernbildungsrektionen sollte untersucht werden, ob xSAF-A eine wichtige Rolle für die
Bildung bzw. Architektur von einfachen Kernen spielt (s. Kapitel 5.1.3, Einfluß von xSAF-A
Antikörpern auf die Kernbildung). Die Auftrennung der hitzedenaturierten, reduzierten
Antikörper in einem 12%igen SDS-PA-Gel (s. Abb. 27A) ließ eine deutliche Bande für die
schweren Ketten im Bereich von
~45 bis
~55kDa und eine diffusere Bande für die
Ergebnisse
86
heterogeneren leichten Ketten unterhalb von 29kDa erkennen. Für die Reinheit der
Antikörper-Aufreinigung wurde das Fehlen der Bande von Kaninchen-Serum-Albumin
(67kDa), welches das Hauptprotein im Serum ist, zugrundegelegt. Die Verwendung der
beiden Antikörper für Western-Blot-Analysen führte zur Detektion einer größenspezifischen
Bande für xSAF-A bei ~116kDa (s. Abb. 27B). Neben der xSAF-A-Bande waren allerdings
noch einige niedrigmolekularere Banden zu beobachten. Diese Nebenbanden beruhen auf der
Denaturierung des Ei-Extraktes und sind nach einer Immunpräzipitation von nativem EiExtrakt mit α-N45 bzw. α-bee und einer anschließenden Western-Blot Analyse des
Immunpräzipitats mit den beiden Antikörpern nicht sichtbar (persönliche Mitteilung F.O.
Fackelmayer). Die Antikörper eignen sich also trotz der bei Western-Blot-Analysen
detektierten Nebenbanden für die Zugabe zu nativem Ei-Extrakt.
A
α-N45
α-bee
kDa
116
66
45
B
α-N45 α-bee
XSAF-A
kDa
116
97
66
29
Abb. 27: Qualitätskontrolle aufgereinigter xSAF-A-Antikörper.
(A) Gelelektrophoretische Auftrennung der Antikörper α-N45 (~1µg) und α-bee (~4µg) im SDS-PA-Gel
(12%) mit anschließender Coomassie-Färbung.
(B) Western-Blot. Denaturierter Ei-Extrakt (1µl pro Bahn) wurde im SDS-PA-Gel aufgetrennt und auf eine
PVDF-Membran transferiert. Für die Immunfärbung wurden die beiden Antikörper α-N45 und α-bee in
einer Konzentration von ~1µg/ml verwendet.
Ergebnisse
87
5.2 Ergebnisse: Eukaryotische Zellen
5.2.1 Organisation von SAF-A in eukaryotischen Zellen
In eukaryotischen Zellen (HEK293, IMR90 und SF767) exprimiertes SAF-A:eGFP ist
während der Interphase ausschließlich nukleär lokalisiert. Die Verteilung des rekombinanten
Proteins ist dabei dem Färbemuster der DNA sehr ähnlich. Das heißt, das Protein ist
großflächig im gesamten Kern verteilt und spart mehrere kleinere sowie größere Bereiche aus
(s. Abb. 28A). Bei den größeren Bereichen handelt es sich unter anderem um Nucleoli.
Mitotische Zellen ließen eine Konzentrierung von SAF-A:eGFP in Chromosomen erkennen
(s. Abb. 28B). Während der Prophase erschienen die Chromosomen homogen durch
SAF-A:eGFP gefärbt. Metaphase-Chromosomen wiesen hingegen oft eine deutliche
Anreicherung von SAF-A:eGFP in ihrer Peripherie auf; SAF-A schien die Chromosomen zu
umhüllen. Der Rest der Zelle ließ eine etwas schwächere Grünfluoreszenz erkennen. Diese
A
HEK293
IMR90
SF767
B
HEK293
HEK293
HEK293
Abb. 28: Lokalisierung von SAF-A in eukaryotischen Zellen während der Interphase
und Mitose.
(A) Auf Deckgläschen gewachsene Zellen verschiedener Zellinien (HEK293, IMR90 und SF767), die
SAF-A:eGFP transient exprimierten, wurden einen Tag nach der Transfektion fixiert und am
Konfokalmikroskop analysiert. SAF-A läßt eine großflächige Verteilung in den dargestellten InterphaseKernen erkennen. Die Nucleoli sind von SAF-A ausgespart. Zudem ist eine deutliche Anreicherung von
SAF-A in ein bzw. zwei Regionen der Kerne zu beobachten. (Balken = 10µm)
(B) Konfokale Aufnahmen verschiedener Mitosestadien von HEK293-Zellen, die SAF-A:eGFP transient
exprimieren. Die beiden linken Aufnahmen zeigen durch SAF-A:eGFP gefärbte Strukturen, die an
Chromosomen in der Prophase erinnern. Die rechte Aufnahme verdeutlicht die Lokalisierung von SAF-A
während der Metaphase; in dieser Phase scheint SAF-A bevorzugt in der Peripherie von Chromosomen
konzentriert zu sein. (Balken = 10µm)
Ergebnisse
88
Anreicherung von SAF-A in der Peripherie von Chromosomen scheint typisch für transient
transfizierte Zellen zu sein, da stabil exprimierende Zellen diesen Phänotyp nur selten zeigten
und vorwiegend eine homogene Färbung ihrer Metaphase-Chromosomen durch SAF-A:eGFP
aufwiesen.
Auch nach Matrixpräparationen, d.h. nach einer Entfernung des Großteils der DNA durch
DNaseI und einer anschließenden Hochsalzextraktion, wies SAF-A in Kernen noch eine
deutlich erkennbare Färbung auf. Der direkte Vergleich von SAF-A Strukturen in den selben
Zellen vor und nach Matrixpräparationen zeigte, daß sich die Lokalisierung von SAF-A
während der Matrixpräparation kaum änderte und die SAF-A Matrixstrukturen häufig
deckungsgleich mit den Strukturen vor der Extraktion waren (s. Abb. 29). Die
Matrixpräparation führte somit zu keiner artifiziellen Umlagerung oder Neuenstehung von
Strukturen durch z.B. etwaige Präzipitations- oder Aggregationsprozesse.
A
vor
nach
merge
B
vor
nach
Abb. 29: Matrixpräparationen führen zu keiner wesentlichen Veränderung der
SAF-A-Strukturen in Zellkernen. Von HEK293-Zellen, die SAF-A:eGFP transient exprimierten,
wurden vor und nach Matrixpräparationen konfokale Aufnahmen gemacht.
(A) Kern einer HEK293-Zelle vor (rot) und nach (grün) der Entfernung des Chromatins und einer
Hochsalzextraktion (-> Matrixpräparation). Die Übereinanderlegung (merge) der beiden Bilder läßt
deckungsgleiche Strukturen in gelb erscheinen. (Balken = 5µm)
(B) Vergrößerte Ausschnitte (6,5 x 6,5µm) des in der Abbildung (A) dargestellten Kerns. Die durch
SAF-A:eGFP gefärbten Strukturen sind im nicht-extrahierten und im extrahierten Kern sehr ähnlich
zueinander.
Mitotische SAF-A Strukturen konnten nach Matrixpräparationen nie gefunden werden. Nur
DNA-reiche Matrixpräparationen, bei denen auf die Behandlung mit DNaseI verzichtet
wurde, ließen mitotische SAF-A Strukturen erkennen. Diese Strukturen lagen mehr oder
Ergebnisse
89
minder zentral, längs der Chromosomenachse in einer diffusen DNA-Färbewolke
(s. Abb. 30).
SAF-A:eGFP
DNA
merge
Abb. 30: DNA-reiche Matrixpräparation. An HEK-293-Zellen, die SAF-A:eGFP transient
exprimierten, wurde eine Matrixpräparationen ohne DNaseI-Behandlung durchgeführt. Dargestellt ist die
konfokale Aufnahme einer Mitose. Das Protein SAF-A hat trotz der Extraktionen mit 250mM (NH4)2SO4
und 1,7M NaCl seine Assoziation mit den Chromosomen nicht verloren. Die DNA der Chromosomen
erscheint aufgelockert und „wolkig“, was wahrscheinlich auf die Extraktion von Histonen zurückzuführen
ist. Die zentrale Lage von SAF-A in den DNA-gefärbten Bereichen erweckt den Eindruck, daß das Protein
Teil des Chromosomengerüstes ist. (Balken = 10µm)
5.2.2 Anreicherung von SAF-A in inaktiven X-Chromosomen (Xi)
In matrixpräparierten wie auch in nicht extrahierten HEK293-Zellen konnte häufig eine
deutliche Ansammlung von SAF-A:eGFP in zwei Bereichen (∅ ca. 2,5µm) der Kerne
festgestellt werden (s. Abb. 31). Das gleiche Phänomen war für die Zellinien SF767 und
IMR90 zu beobachten. Allerdings konzentrierte sich SAF-A in diesen Zellen nur in einem
Bereich des Kerns. DNA-Färbungen ließen in diesen Bereichen kondensierte DNA-Strukturen
erkennen. Die Größe und Form erinnerten an Chromosomenterritorien, und die häufige
perinucleäre und/oder perinucleoläre Lokalisierung sowie die kondensierte Erscheinung
legten die Vermutung nahe, daß es sich um Barr-Körper, also inaktivierte X-Chromosomen
SAF-A:eGFP
DNA
merge
Abb. 31: Anreicherung von SAF-A in Barr-Körpern. Dargestellt ist der Kern einer
HEK293-Zelle, die stabil das Fusionsprotein SAF-A:eGFP exprimiert. Die Aufnahme erfolgte mit einem
Epifluoreszenzmikroskop bei 630facher Vergrößerung. Die DNA des Kerns ist mit Hoechst 33258 gefärbt
und zwecks eines besseren Kontrastes zum Hintergrund in Rot dargestellt. Im Kern sind in der Nähe der
Peripherie zwei große, unregelmäßige Regionen sichtbar, die eine erhöhte Färbeintensität bzw.
Packungsdichte der DNA aufweisen (Barr-Körper). Für SAF-A ist in diesen zwei Regionen eine
Anreicherung zu erkennen. (Balken = 5µm)
Ergebnisse
90
(Xi), handeln könnte.
FISH-Analysen mit X-chromosomal spezifischen Painting-Sonden führten in HEK293Kernen zu mehreren Signalen. Zwei der Signale colokalisierten mit den Bereichen, die eine
Anreicherung für SAF-A:eGFP aufwiesen (s. Abb. 32). SAF-A war somit tatsächlich in
einigen der X-Chromosomenterritorien konzentriert. Allerdings ließen die FISH-Analysen
SAF-A:eGFP
X-Paint
merge
Abb. 32: Anreicherung von SAF-A in X-Chromosomenterritorien. An HEK293-Zellen,
die SAF-A:eGFP (grün) transient exprimierten, wurde eine 3D-FISH mit Painting-Sonden (rot) für das
X-Chromosom durchgeführt. Die Auswertung erfolgte mittels Konfokalmikroskopie. Der dargestellte
Kern weist in der aufgenommenen z-Ebene zwei große Bereiche (∅ ca. 2,5µm) auf, die mit SAF-A
angereichert sind. Die Painting-Sonden lassen drei Hybridisierungssignale erkennen, von denen zwei mit
den Bereichen colokalisieren, die eine Anreicherung für SAF-A zeigen. (Balken = 5µm)
Anmerkung: In HEK293-Zellen konnten mehr als nur drei X-Painting-Signale detektiert werden (s. Kap.
5.2.3). Die zusätzlichen Signale sind hier nicht zu sehen, da sie außerhalb der fokalen Ebene liegen.
keine Aussage darüber zu, ob es sich um aktive oder inaktive X-Chromosomenterritorien
handelte. Um dies zu betrachten, wurden Immunfärbungen mit Antikörpern gegen
macroH2A1.2 (mH2A1.2) durchgeführt. Das Protein mH2A1.2 stellt eine Histonvariante dar,
die in inaktivierten X-Chromosomen angereichert ist und nach einer Immunfluoreszenz eine
als „macro chromatin body“ (MCB) bezeichnete Struktur erkennen lässt, die mit inaktivierten
X-Chromosomen colokalisiert (Costanzi & Pehrson, 1998).
Immunfluoreszenz-Färbungen mit α-mH2A1.2 an SAF-A:eGFP exprimierenden HEK293Zellen führten zur Detektion von zwei MCBs, die an den Stellen lagen, die mit SAF-A:eGFP
angereichert waren (s. Abb. 33, obere Bildreihe). Dies war die Bestätigung, daß SAF-A:eGFP
eine erhöhte lokale Konzentration in inaktivierten X-Chromosomen aufweist.
Um auszuschließen, daß dieser Zusammenhang lediglich auf die embryonale NierentumorZellinie HEK293 zutrifft, wurden ebenfalls die Glioblastom-Zellinie SF767 und primäre
Fibroblasten der diploiden Zellinie IMR90, die einen normalen Karyotyp aufweist, betrachtet.
Beide Zellinien stammen von weiblichen Individuen. In den Kernen der zwei Zellinien konnte
jeweils ein MCB, also ein inaktiviertes X-Chromosom, detektiert werden. Weiterhin zeigten
die Kerne beider Zellinien einen Bereich, der eine Anreicherung für SAF-A:eGFP
Ergebnisse
91
aufwies. Dieser Bereich colokalisierte mit dem MCB (s. Abb. 33, mittlere und untere
Bildreihe). Folglich ist die Aussage, daß SAF-A:eGFP in inaktivierten X-Chromosomen
angereichert ist, auch für die Zellinien SF767 und IMR90 gültig.
SAF-A:eGFP
mH2A1.2
merge
DNA
HEK293
SF767
IMR90
Abb. 33: Anreicherung von SAF-A in „macro chromatin bodies“ (MCBs). An
HEK293-, SF767- und IMR90-Zellen wurde eine Immunfluoreszenz auf mH2A1.2 durchgeführt, um
MCBs bzw. inaktive X-Chromosomen zu färben. Die konfokalen Aufnahmen lassen für HEK293 zwei
MCBs und für SF767 und IMR90 jeweils ein MCB im Kern erkennen. Die MCBs liegen an den Stellen,
die eine Anreicherung für SAF-A aufweisen. Die DNA-Färbung des HEK293-Kerns mit TO-PRO-3 läßt
Barr-Körper erkennen. (Balken = 5µm)
Auch nach Matrixpräparationen waren die mit SAF-A angereicherten Bereiche noch deutlich
zu sehen. Dies traf sowohl für das rekombinante SAF-A:eGFP als auch für das endogene
SAF-A zu (s. Abb. 34A). Das chromatingebundene Protein mH2A1.2 wurde hingegen durch
die DNaseI-Behandlung und die Hochsalzextraktion nahezu komplett entfernt und ließ keine
Konzentrierung mehr in MCBs erkennen (s. Abb. 34B).
Auffallend war, daß Immunfluoreszenzen mit Antikörpern gegen SAF-A in nicht extrahierten
Zellen nur selten eine Konzentrierung in Xi zeigten (s. Abb. 35). Die Matrixpräparationen
deuten darauf hin, daß Chromatin keine wesentliche Rolle für die strukturelle Integrität der
SAF-A-Strukturen in Xi spielt. Vielmehr scheint RNA ein wichtiger Faktor für die
Lokalisation und Stabilität von SAF-A in Xi zu sein, wie Lokalisationsstudien mit dem
Ergebnisse
A
B
92
endogenes SAF-A
SAF-A:eGFP
mH2A1.2
merge
Abb. 34: SAF-A behält seine Anreicherung in inaktiven X-Chromosomen auch nach der
Entfernung des Chromatins. Die konfokalen Aufnahmen (36,5 x 36,5µm) zeigen Kerne von HEK293Zellen nach einer Matrixpräparation, also einer sukzessiven Extraktion mit 0,5% Triton X-100,
250mM (NH4)2SO4, RNase-freier DNaseI und 1,7M NaCl. (A) An den extrahierten Kernen von nicht
transfizierten Zellen wurde eine Immunfluoreszenz auf endogenes SAF-A (primärer AK: K371) durchgeführt.
Es ist eine Konzentrierung des endogenen SAF-A in punktförmigen Bereichen zu erkennen. (B) An den
extrahierten Kernen von Zellen, die SAF-A:eGFP exprimierten, wurde eine Immunfluoreszenz auf mH2A1.2
durchgeführt, welches als Histonvariante im Chromatin inaktiver X-Chromosomen angereichert ist. Der
abgebildete Kern verdeutlicht, daß es durch die Extraktion des Chromatins zu einem kompletten Verlust von
mH2A1.2 kommt. Die Konzentrierung von SAF-A:eGFP in inaktiven X-Chromosomen ist durch die Entfernung
des Chromatins und die Hochsalzbehandlung hingegen nicht betroffen. (Balken = 5µm)
SAF-A:eGFP
IF
merge
Abb. 35: SAF-A ist in Bereichen inaktiver X-Chromosomen für Antikörper schwer
zugänglich. An nicht extrahierten, SAF-A:eGFP exprimierenden HEK293-Zellen wurde eine
Immunfluoreszenz (IF) mit einer Kombination aus zwei SAF-A-spezifischen Antikörpern (K371 und K593)
durchgeführt. Die Auswertung der Präparate erfolgte am Konfokalmikroskop. Für SAF-A:eGFP ist in den
beiden dargestellten Kernen eine deutliche Anreicherung in zwei Bereichen, den inaktiven X-Chromosomen
(Xi), zu erkennen. Die Antikörper lassen hingegen nur für den unteren Kern eine Anreicherung von SAF-A in
Xi erkennen. Im oberen Kern wird das in Xi angereicherte SAF-A nicht erkannt. Dies war, bis auf wenige
Ausnahmen, für die meisten Kerne der Fall. (Balken = 5µm)
Ergebnisse
93
SAF-A-Konstrukt „∆RGG“ und Matrixpräparationen mit RNaseA belegten.
Bei ∆RGG handelt es sich um ein Deletionskonstrukt von SAF-A, dem im C-terminalen
Abschnitt 44 Aminosäuren (entspricht ~5% des Gesamtproteins) fehlen. Der deletierte
Abschnitt, die RGG-Box, stellt die RNA-Bindedomäne von SAF-A dar. Die stabile
Expression von ∆RGG:eGFP in HEK293-Zellen ließ in lebenden Zellen und nach
Matrixpräparationen eine Verteilung erkennen, die der von SAF-A vergleichbar war; die
Lokalisierung von ∆RGG:eGFP in lebenden Zellen schien etwas diffuser und weniger
strukturiert. Ein gravierender Unterschied war allerdings, daß ∆RGG:eGFP keine
Anreicherung in Xi zeigte. So ließen auf mH2A1.2 durchgeführte Immunfluoreszenzen eine
deutliche Färbung von MCBs, aber keine Konzentrierung von ∆RGG:eGFP in diesen
Bereichen erkennen (s. Abb. 36).
Um auszuschließen, daß dieser Unterschied auf verschieden starken Expressionsstufen von
∆RGG:eGFP und SAF-A:eGFP beruht, wurden Western-Blot-Analysen an sortierten, stabil
exprimierenden HEK293-Zellen vorgenommen. Diese ließen für beide Konstrukte eine
gleiche Expressionsstärke erkennen (s. Abb. 37). Weiterhin konnte den Western-Blots
∆ RGG:eGFP
mH2A1.2
merge
SAF-A:eGFP
mH2A1.2
merge
Abb. 36: Die RNA-Bindedomäne von SAF-A ist essentiell für die Anreicherung in
inaktiven X-Chromosomen. In HEK293-Zellen, die SAF-A:eGFP bzw. ∆RGG:eGFP stabil
exprimierten, wurden die inaktiven X-Chromosomen durch eine Immunfluoreszenz auf mH2A1.2 gefärbt.
Die konfokalen Aufnahmen lassen pro Kern zwei inaktive X-Chromosomen erkennen. SAF-A:eGFP ist in
den inaktiven X-Chromosomen angereichert. Für das SAF-A-Deletionskonstrukt ∆RGG, dem die RNABindedomäne fehlt, ist hingegen keine Anreicherung in den inaktiven X-Chromosomen feststellbar.
(Balken = 5µm)
Ergebnisse
kDa
94
1
116
97
2
3
SAF-A:eGFP bzw. ∆RGG:eGFP
endogenes wtSAF-A
Abb. 37: Vergleich der Proteinmengen von SAF-A:eGFP, ∆RGG:eGFP und
endogenem SAF-A in HEK293-Zellen. Von sortierten HEK293-Zellen, die SAF-A:eGFP bzw.
∆ RGG:eGFP stabil exprimierten, und von nicht transfizierten HEK293-Zellen wurden Proteinextrakte für
Western-Blot-Analysen hergestellt. Pro Gelbahn wurden ~10µg Protein aufgetragen. Als primärer
Antikörper (rabbit anti-SAF-A) wurde K371 verwendet. Bahn 1: nicht transfizierte Zellen;
Bahn 2: SAF-A:eGFP exprimierende Zellen; Bahn 3: ∆RGG:eGFP exprimierende Zellen.
entnommen werden, daß die rekombinanten Proteine im Vergleich zum endogenen wtSAF-A
nur ca. 5-10% ausmachten und somit nicht überexprimiert waren.
Ein weiterer Hinweis, daß RNA eine wichtige Rolle für die Stabilität von SAF-A in Xi spielt,
lieferten Matrixpräparationen, bei denen dem ersten Puffer RNaseA zugesetzt war. HEK293Zellen, die auf diese Weise präpariert wurden, verloren ihre Anreicherung von SAF-A in den
Bereichen der inaktiven X-Chromosomenterritorien (nahezu) vollständig. (s. Abb. 38).
wtSAF-A
SAF-A:eGFP
+ RNase
- RNase
Abb. 38: Der enzymatische Abbau von RNA führt zum Verlust der Anreicherung von
SAF-A in Xi. An nicht transfizierten und SAF-A:eGFP-exprimierenden HEK293-Zellen wurden
Matrixpräparationen mit als auch ohne RNase durchgeführt. Die RNase (RNaseA: 200 µg/ml) war im ersten
Matrixpuffer enthalten. Endogenes wtSAF-A wurde in nicht transfizierten Zellen durch eine
Immunfluoreszenz (primärer AK: K371) gefärbt. Die Auswertung der Präparate erfolgte am
Konfokalmikroskop (Bildgröße: 36,5 x 36,5µm). Die RNase-behandelten Zellen (+RNase) lassen im
Vergleich zu den RNase-unbehandelten Zellen (-RNase) keine bzw. nur noch eine stark reduzierte
Anreicherung von wtSAF-A und SAF-A:eGFP in zwei Bereichen, den inaktiven X-Chromosomen, erkennen.
(Balken = 5µm)
Ergebnisse
95
5.2.3 X-Chromosomale Situation in den Zellinien HEK293, SF767 und
IMR90
Die Zellinien HEK293, SF767 und IMR90, für die eine Anreicherung von SAF-A in
inaktivierten
X-Chromosomen
beobachtet
werden
konnte,
wurden
cytogenetisch
aufgearbeitet. An den cytogenetischen Präparaten wurde eine FISH mit X-Painting-Sonden
durchgeführt, um die X-chromosomale Gesamtsituation in den Zellinien zu betrachten
(s. Abb. 39). Außerdem wurde an den Metaphasespreitungen der cytogenetischen Präparate
die Anzahl der Chromosomen pro Zelle bestimmt.
Die Tumorzellinien HEK293 und SF767 ließen eine erhöhte Chromosomenanzahl und eine
aberrante Situation für die X-Chromosomen erkennen. Die weiblichen, primären Fibroblasten
der
Zellinie
IMR90
zeigten
hingegen
keine
Auffälligkeiten
bezüglich
der
Chromosomenanzahl und der X-Chromosomen.
Für die Tumorzellinie HEK293 konnten 81 Chromosomen pro Metaphase ausgezählt werden.
Die FISH für das X-Chromosom ließ 14 Signale erkennen, die sich auf 12 Chromosomen
verteilten. Die Signale waren bezüglich ihrer Größe und Anordnung sehr unterschiedlich. Nur
ein Chromosom, das von mittlerer Größe und submetacentrisch war, zeigte eine komplette
Färbung durch die FISH-Sonden. Bei vier anderen Chromsomen war hingegen nur der p- oder
q-Arm komplett gefärbt. Eine nur partielle Färbung im distalen Abschnitt des q-Arms konnte
für ein relativ großes, submetacentrisches Chromosom festgestellt werden. Dieses
Chromosom ließ auf dem gleichen Arm noch ein weiteres Signal erkennen. Die Signale auf
den restlichen Chromosomen, die eine Hybridisierung aufwiesen, waren deutlich kleiner. Bei
diesen Chromosomen lagen die Signale bevorzugt in der Centromerregion oder am distalen
bzw. proximalen Ende einer der beiden Chromosomenarme. Zwei dieser Chromosomen
wiesen jeweils zwei Hybridisierungssignale auf.
Für die Tumorzellinie SF767 wurde eine Chromosomenanzahl von 60 pro Zelle ermittelt. Auf
drei submetacentrischen Chromosomen konnten Hybridisierungssignale detektiert werden.
Zwei dieser Chromosomen, die bezüglich ihrer Größe und der Lage des Centromers ähnlich
waren, ließen eine komplette Färbung durch die FISH-Sonden erkennen. Das dritte
Chromosom wies hingegen nur eine Färbung im distalen Abschnitt des q-Arms auf.
An cytogenetischen Präparaten der Zellinie IMR90 konnten 46 Chromosomen pro
Metaphasespreitung ausgezählt werden. Auf zwei der 46 Chromosomen konnten FISHSignale beobachtet werden. Die beiden Chromosomen waren submetacentrisch und
vollständig durch die X-chromosomalen Painting-Sonden gefärbt.
Ergebnisse
96
HEK293
SF767
IMR90
Kern
Metaphase
Abb. 39: FISH mit X-Paint-Sonden an den Zellinien HEK293, SF767 und IMR90.
Zellen der Zellinien HEK293, SF767 und IMR90 wurden unter hypotonen Bedingungen quellen gelassen,
mit Methanol:Eisessig fixiert und auf Objektträger getropft. Anschließend wurde eine FISH mit PaintingSonden für das X-Chromosom durchgeführt (rote Signale). Die DNA der Präparate wurde mit
Hoechst 33258 gefärbt (blaue Signale). Die Auswertung erfolgte am Epifluoreszenzmikroskop. Für jede
Zellinie ist ein Kern und eine Metaphasespreitung dargestellt. Die Anzahl der FISH-Signale und der
Chromosomen ist für die drei Zellinien unterschiedlich. Besonders auffällig ist die Zellinie HEK293, die
einen beinahe tetraploiden Chromosomensatz und eine höchst aberrante Verteilung des X-chromosomalen
Materials erkennen läßt. (Balken = 5µm)
Anmerkung: Die abgebildeten Aufnahmen der Zellinie HEK293 lassen einige der FISH-Signale aufgrund
ihrer geringen Größe nicht bzw. nur schwer erkennen.
Ergebnisse
97
5.2.4 Auswirkung von C280 auf die Chromatinstruktur
Die transiente Expression des SAF-A-Teilkonstruktes C280:eGFP, welches dem letzten
Drittel von SAF-A entspricht, führte bereits einen Tag nach der Transfektion zu einer
deutlichen Änderung der Chromatinstruktur in HEK293-Zellen. DNA-Färbungen ließen in
C280 exprimierenden Zellen eine wesentlich heterogenere Verteilung des Chromatins als in
nicht transfizierten Zellen erkennen (s. Abb. 40). Das Chromatin schien sich fleckenartig in
mehrere größere Bereiche zu konzentrieren, die eine stark kondensierte Struktur aufwiesen
und
sich
intensiv
mit
DNA-Farbstoffen
färbten.
Der
Raum
zwischen
diesen
„Chromatininseln“ zeigte keine oder eine deutlich verminderte DNA-Färbung. Häufig ließ
sich auch eine intensive Färbung der Kernperipherie beobachten. Auffällig war die
Lokalisierung von C280. Das Konstrukt war von den kondensiert erscheinenden
Chromatinstrukturen
ausgeschlossen
und
lokalisierte
sich
hauptsächlich
in
den
Zwischenbereichen, die keine bzw. nur eine schwache DNA-Färbung aufwiesen.
Die Expression des Gesamtproteins SAF-A:eGFP hatte hingegen keine Auswirkungen auf die
Organisation des Chromatins. Das DNA-Färbemuster der Kerne von SAF-A:eGFP
exprimierenden und nicht transfizierten Zellen war vergleichbar. Im Gegensatz zu C280 ließ
SAF-A eine wesentlich homogenere und großflächigere Verteilung in Kernen erkennen und
colokalisierte mit Chromatin.
5.2.5 Auswirkung von C280 auf Chromosomenterritorien
Die deutliche Umstrukturierung des Chromatins in C280 exprimierenden Zellen legte nahe,
daß auch die Integrität von Chromosomenterritorien betroffen sein könnte. Um dies näher zu
betrachten, wurden separate 3D-FISH-Analysen mit Painting-Sonden für die Chromosomen 1
und X an HEK293-Zellen durchgeführt. Für beide Chromosomen ließ sich in C280
exprimierenden Zellen im Vergleich zu nicht transfizierten Zellen jedoch kein augenfälliger
Unterschied bezüglich der Struktur, Größe, Lage und Anzahl der Chromosomenterritorien
feststellen. Die genauere Betrachtung von Zellen mittels Konfokalmikroskopie nach einer 3DFISH mit Painting-Sonden für das X-Chromosom führte zu der Beobachtung, daß C280 nicht
in Chromosomenterritorien gefunden werden konnte (s. Abb. 41). Die C280-Strukturen
sparten die Chromosomenterritorien im Gegensatz zu SAF-A:eGFP komplett aus, was im
Einklang mit der Lokalisierung des Chromatins in C280:eGFP und SAF-A:eGFP
exprimierenden Zellen steht.
Ergebnisse
98
Weiterhin wurde eine gesonderte Färbung der inaktiven X-Chromosomen durch eine
Immunfluoreszenz auf mH2A1.2 vorgenommen. In C280 transfizierten HEK293-Zellen
konnte eine Konzentrierung der Signale in zwei Bereichen, den MCBs, beobachtet werden,
die mit Barr-Körpern colokalisierten und keine Auffälligkeiten zu den MCBs von Zellen
zeigten, die nicht oder mit SAF-A:eGFP transfiziert waren (s. Abb. 42). C280 schien somit
keinen
Einfluß
auf
den
Inaktivierungsstatus
der
X-Chromosomen
bzw.
deren
ordnungsgemäße Beladung mit mH2A1.2 zu haben.
Die MCBs waren frei von C280-Signalen. SAF-A war hingegen in MCBs angereichert (s.
auch Kapitel 5.2.2).
5.2.6 Auswirkung von C280 auf die Kernmatrix
Matrixpräparationen an C280:eGFP exprimierenden HEK293-Zellen demonstrierten, daß
C280 als letztes Drittel von SAF-A zur Bindung an die nukleäre Matrix befähigt ist, da es sich
wie das SAF-A-Gesamtprotein nicht durch DNase-Verdau und Hochsalzextraktion aus den
Kernen extrahieren läßt. Ebenso wie bei nicht extrahierten, lebenden Zellen wiesen die durch
C280 gefärbten Strukturen deutliche Unterschiede zu den Strukturen von SAF-A auf
(s. Abb. 43). Die C280-Strukturen erschienen lokal konzentrierter und sparten größere
Bereiche im Kern aus. Im Zentrum dieser von C280 umgebenen „Höhlen“ lagen Nucleoli. Die
Matrixstrukturen von SAF-A schlossen sich im Gegensatz zu C280 direkt an die Nucleoli an
und ließen keine großflächigen Hohlräume erkennen.
Die Expression von C280 führt also zu einer Umorganisation der Kernmatrixstruktur. Dies
wird auch durch die veränderte Lokalisation von endogenem SAF-A in Matrixpräparationen
von C280 exprimierenden Zellen bestätigt. Die Zellen verloren ihre typische SAF-AVerteilung und ließen stattdessen eine intensive Färbung und Colokalisierung von endogenem
SAF-A mit den C280-Strukturen erkennen (s. Abb. 44). Der gleiche Effekt von C280 konnte
auf die Lokalisation des Proteins hnRNP-C beobachtet werden (s. Abb. 45), das in vivo im
Komplex mit endogenem SAF-A vorliegt (Schwander, 2004)
Ergebnisse
99
A
C280:eGFP
DNA
merge
B
SAF-A:eGFP
DNA
merge
Abb. 40: C280 beeinflußt die Organisation des Chromatins. HEK293-Zellen wurden mit
(A) C280:eGFP und (B) SAF-A:eGFP transfiziert. Zwei Tage später wurden die Zellen fixiert und deren
DNA mit TO-PRO-3 gefärbt. Die anschließende Auswertung der Präparate erfolgte am Konfokalmikroskop.
Zellen, die das SAF-A-Teilkonstrukt C280:eGFP exprimierten, lassen im Vergleich zu C280-negativen
Zellen und Zellen, die unverkürztes SAF-A:eGFP exprimierten, eine auffällige Veränderung der DNAFärbung erkennen. Das Chromatin scheint in sich zusammengefallen und heterochromatisch. Zudem
schließen sich die C280-Strukturen und die gefärbte DNA gegenseitig aus. Für SAF-A, welches eine
deutlich andere Verteilung als C280 aufweist, ist hingegen ein hoher Grad der Übereinstimmung mit der
DNA-Färbung feststellbar, wie die gelbliche Mischfarbe der Übereinanderlegung (merge) der Aufnahmen
verdeutlicht. (Balken = 5µm)
Ergebnisse
100
A
C280:eGFP
X-Paint
merge
B
SAF-A:eGFP
X-Paint
merge
Abb. 41: C280 und Chromosomenterritorien schließen sich gegenseitig aus. HEK293Zellen wurden (A) mit C280:eGFP und (B) mit SAF-A:eGFP transfiziert. Zwei Tage später wurden die
Zellen fixiert und eine 3D-FISH mit X-Chromosom-spezifischen Painting-Sonden durchgeführt. Die
Auswertung der Präparate erfolgte mittels Konfokalmikroskopie. Die Aufnahmen lassen erkennen, daß in
den Kernen der C280 exprimierenden Zellen die Bereiche mit X-Paint-Signal von C280-Strukturen
ausgespart sind. Für SAF-A, welches eine wesentlich homogenere Verteilung als C280 aufweist, ist
hingegen auch eine Lokalisierung innerhalb der Bereiche der X-Paint-Signale feststellbar. Zwei der
Bereiche mit X-Paint-Signal (inaktive X-Chromosomen, s. Kapitel 5.2.2) lassen sogar eine Anreicherung für
SAF-A erkennen. (Balken = 5µm)
Ergebnisse
101
A
C280:eGFP
mH2A1.2
merge
DNA
B
∆ N45:eGFP
mH2A1.2
merge
DNA
Abb. 42: C280 und ∆N45 haben keinen Einfluß auf „macro chromatin bodies“
(MCBs). HEK293-Zellen wurden (A) mit C280:eGFP und (B) mit ∆N45:eGFP transfiziert. Einen Tag
später wurden die Zellen fixiert und einer Immunfluoreszenz auf mH2A1.2 unterzogen. Die DNA der Zellen
wurde mit TO-PRO-3 gefärbt. Die Auswertung der Präparate erfolgte mittels Konfokalmikroskopie. In
Kernen von Zellen, die C280 ( = C-terminales Drittel von SAF-A) bzw. ∆N45 ( = Deletion der ersten 45 AS
(DNA-Bindedomäne) im N-Terminus von SAF-A) exprimierten, ist eine Ansammlung von mH2A1.2 in
zwei MCBs sichtbar, wie dies typisch für die Zellinie HEK293 ist. Die Pfeile auf den Aufnahmen der
DNA-Färbung deuten auf heterochromatische Strukturen (Barr-Körper = inaktivierte X-Chromosomen), die
an den Stellen der MCBs liegen. Innerhalb der MCBs sind keine Signale für C280:eGFP und ∆N45:eGFP
sichtbar. Die gefärbten Strukturen der SAF-A-Teilproteine C280 und ∆N45, denen beiden die DNABindedomäne fehlt, sehen sehr ähnlich aus. Sowohl die C280- als auch die ∆N45-Strukturen lassen einen
Ausschluß von Chromatin erkennen. (Balken = 5µm).
Ergebnisse
102
A
C280:eGFP
TOTO-3
merge
B
SAF-A:eGFP
TOTO-3
merge
Abb. 43: Vergleich der Matrixstrukturen von SAF-A und C280. HEK293-Zellen wurden
zwei Tage nach Transfektion mit C280:eGFP bzw. SAF-A:eGFP einer Matrixpräparation unterzogen. Die
Präparationen wurden anschließend fixiert und mit dem Nukleinsäurefarbstoff TOTO-3 gefärbt. Die
Auswertung erfolgte mittels Konfokalmikroskopie. Sowohl für (A) C280:eGFP als auch für (B)
SAF-A:eGFP sind Matrixstrukturen in den mit 250mM (NH4)2SO4, DNaseI und 1,7M NaCl extrahierten
Kernen sichtbar, die sich allerdings deutlich voneinander unterscheiden. Die C280-Strukturen erscheinen
grobmaschiger und lassen im Vergleich zu SAF-A große Bereiche des Kerns unausgefüllt. In einigen dieser
C280-freien Bereichen liegen Reste von Nucleoli, die mit TOTO-3 angefärbt sind. Die SAF-A-Strukturen
sparen ebenfalls Bereiche aus, in denen Nucleoli lokalisiert sind. Allerdings schließen die SAF-A-Strukturen
im Gegensatz zu den C280-Strukturen unmittelbar an die Nucleoli an. (Balken = 5µm)
Ergebnisse
103
A
C280:eGFP
wtSAF-A
merge
B
SAF-A:eGFP
wtSAF-A
merge
Abb. 44: C280 führt zur Umlagerung der Matrixstrukturen von SAF-A. Von HEK293Zellen wurde einen Tag nach der Transfektion mit (A) C280:eGFP bzw. (B) SAF-A:eGFP die nukleäre
Matrix präpariert. Die Präparationen wurden fixiert und eine Immunfärbung gegen wtSAF-A durchgeführt.
Der verwendete Antikörper (K371) ist gegen das N-terminale Drittel von SAF-A gerichtet und bindet daher
nicht an C280 (C-terminales Drittel von SAF-A). Die Aufnahmen lassen erkennen, daß die Matrixstrukturen
von SAF-A in Zellen, die C280:eGFP exprimieren, auffällig verändert sind. Im Vergleich zu Zellen, die
nicht transfiziert sind oder SAF-A:eGFP exprimieren, erscheint die Verteilung von SAF-A in den
C280-positiven Zellen wesentlich „klumpiger“ und ungleichmäßiger. Die Übereinanderlegung (merge) der
Matrixstrukturen von C280 und SAF-A verdeutlicht, daß beide Strukturen colokalisieren und SAF-A in den
C280-positiven Zellen die Verteilung von C280 angenommen hat. (Balken = 5µm)
Ergebnisse
104
A
C280:eGFP
hnRNP-C
merge
B
SAF-A:eGFP
hnRNP-C
merge
Abb. 45: C280 führt zur Umlagerung der Matrixstrukturen von hnRNP-C. HEK293Zellen wurden mit (A) C280:eGFP und mit (B) SAF-A:eGFP transfiziert. Einen Tag später wurden die
Zellen einer Matrixpräparation unterzogen und fixiert. Anschließend wurde das Protein hnRNP-C durch
eine indirekte Immunfluoreszenz gefärbt. Die konfokalen Aufnahmen zeigen, daß die Lokalisierung von
hnRNP-C in Kernen von Zellen, die C280 exprimieren, verändert ist. Im Vergleich zu Zellen, die nicht
transfiziert sind oder SAF-A:eGFP exprimieren, läßt hnRNP-C in Kernen von C280-positiven Zellen eine
wesentlich heterogenere bzw. fleckigere Verteilung und große ausgesparte Areale erkennen. Sowohl für
SAF-A:eGFP als auch für C280:eGFP ist ein hoher Grad der Colokalisation mit hnRNP-C feststellbar.
(Balken = 5µm)
Ergebnisse
105
5.2.7 Auswirkung von C280 auf die Replikation und Transkription
Zur Klärung, ob C280 neben der strukturellen Veränderung des Chromatins und der nukleären
Matrix auch Einfluß auf die Funktionalität von Kernen nimmt, wurden die Prozesse der DNAReplikation und RNA-Transkription betrachtet.
Der verwendete DNA-Replikationsnachweis beruht auf dem Einbau von Brom-Desoxyuridin
(BrdU) in neu synthetisierte DNA und einer anschließenden Sichtbarmachung des
inkorporierten BrdU durch Immunfluoreszenz. Der Transkriptionsnachweis ist vom Prinzip
ähnlich, nur daß Brom-Uridin (BrU) anstelle von BrdU verwendet wird.
Bei diesen Experimenten zeigte das Teilprotein C280 einen deutlichen Effekt auf die DNAReplikation (s. Abb. 46). Nur 13% der C280 exprimierenden Zellen, die zwei Tage nach der
Transfektion über Nacht mit BrdU inkubiert worden waren, ließen einen Einbau von BrdU in
ihre DNA erkennen. Im Gegensatz dazu waren 89%, 81% und 73% der Zellen
replikationsaktiv, die die Kontrollproteine eGFP, β-Gal-NLS:eGFP und das gesamte
SAF-A:eGFP exprimierten. Als interne Kontrolle wurden zusätzlich die Zellen des C280Transfektionsansatzes ausgewertet, die keine DNA aufgenommen hatten und daher kein
C280-Protein exprimierten; von diesen Zellen waren 93% replikationskompetent. Die
Auswirkung von C280 auf die Replikation konnte auch noch bei der Verwendung einer 5fach
niedrigeren Menge des C280:eGFP-Expressionskonstruktes für die Transfektion (2µg anstatt
10µg) beobachtet werden. Zellen, die mit weniger Konstrukt transfiziert worden waren und
eine Inkorporierung von BrdU in die DNA aufwiesen, ließen häufig einen räumlichen
Ausschluß der C280-Strukturen und der replizierten DNA erkennen. Die Signale der
replizierten DNA in Zellen, die SAF-A:eGFP, eGFP oder β-Gal-NLS:eGFP exprimierten,
erinnerten an die allgemeine DNA-Färbung von Kernen durch Hoechst 33258 oder
TO-PRO-3.
Die Expression von C280 war nicht unmittelbar cytotoxisch, und die Zellen blieben noch
mehrere Tage nach der Transfektion lebensfähig. Die Färbung von Zellen mit Propidiumjodid
drei Tage nach deren Transfektion und eine anschließende Durchflußcytometrie ließ für
C280:eGFP exprimierende Zellen und Zellen, die SAF-A:eGFP, eGFP und β-Gal-NLS:eGFP
exprimierten, einen geringen, vergleichbaren Anteil (6 bis 10%) toter Zellen erkennen. Auch
die Färbung von C280 exprimierenden Zellen mit dem Farbstoff Rhodamin123, der sich in
aktiven Mitochondrien anreichert, zeigte einen und zwei Tage nach der Transfektion keine
Unterschiede zu Kontrollzellen. Am dritten Tag nach der Transfektion schien die Intensität
der Mitochondrienfärbung der C280 exprimierenden Zellen gegenüber der von Kontrollzellen
jedoch schwächer zu werden.
Ergebnisse
A
106
exprimiertes
Protein
β-GalNLS
inkorporiertes
BrdU
merge
SAF-A
C280
100
BrdU-positive Zellen
[%]
B
80
93
60
89
81
73
40
20
13
-
eGFP ßGal-NLS SAF-A
C280
Abb. 46: C280 stört die DNA-Replikation. An HEK293-Zellen, die eGFP und die mit eGFP
fusionierten Proteine ß-Gal-NLS, SAF-A und C280 exprimierten, wurde ein Replikations-Nachweis
durchgeführt. Hierfür wurden die Zellen ~50h nach ihrer Transfektion über Nacht mit BrdU-haltigem
Medium inkubiert. Der Nachweis, ob die Zellen repliziert und das Nukleotidanalog BrdU in ihre DNA
inkorporiert hatten, erfolgte durch eine indirekte Immunfluoreszenzfärbung mit BrdU-spezifischen
Antikörpern. (A) Die konfokalen Übersichtsaufnahmen (146x146µm) lassen für nicht-transfizierte Zellen
und Zellen, die SAF-A:eGFP und ß-Gal-NLS:eGFP exprimieren, einen deutlichen Einbau von BrdU
erkennen. Die C280:eGFP exprimierenden Zellen zeigen hingegen keinerlei Einbau. (Balken = 10µm)
(B) Die quantitative Auswertung (n = 200 bis 250) der Immunfärbungen verdeutlicht, daß nur wenige
(13%) der C280-positiven Zellen ihre DNA repliziert haben. Nicht-transfizierte Zellen (-) und Zellen, die
die anderen eGFP-Fusionsproteine exprimieren, weisen einen ca. 6 bis 7mal höheren Anteil BrdU-positiver
Zellen auf.
Ergebnisse
Die
Vitalität
107
der
transfizierten
Zellen
konnte
auch
durch
den
Nachweis
von
Transkriptionsaktivität (s. Abb. 47) bestätigt werden. So ließen C280:eGFP exprimierende
Zellen und auch Zellen, die SAF-A:eGFP oder β-Gal:eGFP exprimierten, einen deutlichen
Einbau von BrU in Nucleoli erkennen. Zusätzlich konnte BrU in zahlreichen kleinen
Pünktchen im Kern und im Cytoplasma detektiert werden. Die Signale im Cytoplasma lagen
bevorzugt in der Nähe des Kerns. Auch bei Zellen, die vor der Fixierung mit CSKPuffer + 0,5% Triton X-100 extrahiert worden waren, ließen Immunfärbungen auf BrU noch
kleine Pünktchen im Kern und eine intensive Färbung der Nucleoli erkennen. Die BrUPünktchen in Kernen schienen vorzugsweise randständig und auf Lücke von SAF-A- und
C280-Strukturen zu liegen.
Die relative Anzahl C280:eGFP exprimierender Zellen, die einen Einbau von BrU aufwiesen,
war mit der von SAF-A:eGFP und β-Gal:eGFP exprimierenden Zellen vergleichbar. So
wiesen z.B. zwei Tage nach der Transfektion 93% der C280-positiven Zellen einen Einbau
von BrU auf. Für SAF-A:eGFP bzw. β-Gal:eGFP exprimierende Zellen lag der Anteil der
BrU-positiven bei 98% bzw. 92%.
Im Gegensatz zur Replikation schien die Expression von C280 - zumindest für den
betrachteten Zeitraum - keinen inhibierenden Effekt auf die Transkription auszuüben.
Ergebnisse
A
108
exprimiertes
Protein
β-Gal-NLS
inkorporiertes
BrU
merge
SAF-A
C280
100
BrU-positive Zellen
[%]
B
75
92
98
93
50
25
0
ß-Gal-NLS
SAF-A
C280
Abb. 47: C280 hat keinen Effekt auf die Transkription. An HEK293-Zellen, die ß-Gal-NLSeGFP, SAF-A:eGFP oder C280:eGFP transient exprimierten, wurde ein Transkriptionsnachweis
durchgeführt. Hierfür wurden die Zellen für 3h mit BrU-haltigem Medium inkubiert. In RNA eingebautes
BrU wurde durch eine indirekte Immunfluoreszenz sichtbar gemacht. (A) Die konfokalen Aufnahmen lassen
für die Zellen aller drei Transfektionsansätze einen deutlichen Einbau von BrU in Nucleoli erkennen.
Ebenfalls sind viele kleine BrU-positive Foci inner- und außerhalb der Kerne sichtbar. Der
Transkriptionsnachweis wurde einen Tag nach der Transfektion durchgeführt. (Balken = 5µm) (B) Die
relative Anzahl eGFP-positiver Zellen, für die ein Einbau von BrU (Transkription) nachgewiesen werden
konnte, lag für alle drei Transfektionsansätze (ß-Gal-NLS:eGFP, SAF-A:eGFP und C280:eGFP) über 90%
(n = 161 bis 166). Der Transkriptionsnachweis wurde zwei Tage nach der Transfektion durchgeführt.
Ergebnisse
109
5.2.8 Auswirkung von C280 auf den Zellzyklus
An HEK293-Zellen wurden Zellzyklus-Analysen durchgeführt, um zu untersuchen, ob der
hohe prozentuale Anteil C280 exprimierender Zellen, die keine DNA-Replikation aufweisen,
durch einen (spezifischen) Zellzyklus-Arrest bedingt ist. Dazu wurden Zellen mit C280
transient transfiziert und nach drei Tagen durch Zellsortierungen in exprimierende und nicht
exprimierende Zellen getrennt. Die getrennten Populationen wurden per Durchflußcytometrie
auf ihren DNA-Gehalt hin analysiert.
Im Gegensatz zu nicht exprimierenden Kontrollzellen zeigten die C280-positiven Zellen eine
drastisch reduzierte und kaum erkennbare Population von Zellen mit einem DNA-Gehalt, der
für die S- und G2-Phase spezifisch ist (s. Abb. 48). Dieses Ergebnis bestätigt somit die
Beobachtung, daß ein hoher Prozentsatz C280 exprimierender Zellen keinen Einbau von
BrdU in DNA und daher keine Replikation aufweist (s. voriges Kapitel).
Die Durchflußcytometrien der Zellen, die transient mit SAF-A:eGFP oder β-Gal:eGFP
transfiziert waren, zeigten keinen auffälligen Unterschied zu Kontrollzellen und ließen im
Gegensatz zu C280-positiven Zellen eine deutliche Fraktion der Zellen in der S- und G2Phase erkennen. Dies demonstriert, daß der Effekt von C280 spezifisch ist und nicht auf einen
etwaigen „Transfektionsschock“ der Zellen beruht.
Um die Ergebnisse der Durchflußcytometrie zu vertiefen, wurden Western-Blot-Analysen auf
C280:eGFP
SAF-A:eGFP
β-Gal:eGFP
exprimierend
nicht
exprimierend
G1
S G2
Abb. 48: C280 führt zur Arretierung des Zellzyklus. HEK293-Zellen wurden mit
Expressionsvektorkonstrukten für C280:eGFP, SAF-A:eGFP und ß-Gal:eGFP transfiziert. Drei Tage
später wurden Durchflußcytometrien zur Bestimmung des DNA-Gehaltes der Zellen durchgeführt. Die
obere Bildreihe zeig die DNA-Histogramme der transfizierten Zellen, die die jeweiligen eGFP-Konstrukte
exprimieren. Die untere Bildreihe zeigt die DNA-Histogramme der dazugehörigen Kontrollzellen, die
während der Transfektionsprozedur keine DNA aufgenommen haben und daher die eGFP-Konstrukte
nicht exprimieren. Pro Histogramm wurden 10000 Zellen vermessen. Zellen, die C280 exprimieren,
weisen im Gegensatz zu Kontrollzellen und Zellen, die SAF-A:eGFP oder ß-Gal:eGFP exprimieren,
nahezu ausschließlich einen G1-typischen DNA-Gehalt auf. (Ordinate: Zellzahl; Abszisse: DNA-Gehalt)
Ergebnisse
110
G1- und S-Phase spezifische Zellzyklusproteine durchgeführt, wodurch näher eingegrenzt
werden sollte, ob C280 exprimierende Zellen strikt in der G1-Phase oder in der sehr frühen SPhase arretiert sind. Für die Experimente wurden HEK293-Zellen verwendet, die transient (2
bis 3 Tage) mit C280:eGFP bzw. SAF-A:eGFP transfiziert waren und mittels FACS in eGFPpositive und eGFP-negative Zellen sortiert worden waren.
Die eGFP-negativen Zellen
dienten als interne Kontrolle. Je nach Transfektionseffizienz und Anzahl der sortierten Zellen
konnten bei Western-Blot-Analysen ~75000 bis ~160000 Zellen pro Bahn geladen werden.
Bei gleichmäßiger Beladung (Gesamtprotein) der Bahnen ließen Western-Blot-Analysen in
der Bandenintensität des Proteins RPA (70kDa Untereinheit) keine Unterschiede zwischen
nicht-transfizierten Zellen und Zellen, die
C280:eGFP bzw. SAF-A:eGFP exprimierten,
erkennen. Das Protein RPA eignete sich somit als Ladekontrolle und zur Normalisierung von
ungleich beladenen Bahnen. Im folgenden werden die Western-Blot-Ergebnisse von drei
Zellsortierungen beschrieben:
Sortierung 1 (s. Abb. 49, oben):
Für die Cycline A und E konnte bei C280 exprimierenden Zellen im Vergleich zu
Kontrollzellen eine deutliche Reduktion der Bandenintensität festgestellt werden. Zellen,
die mit SAF-A:eGFP transfiziert waren, ließen hingegen Bandenintensitäten für die beiden
Cycline erkennen, die mit denen von Kontrollzellen vergleichbar waren.
Sortierung 2 (s. Abb. 49, mitte):
Auch hier erschien die Menge der Cycline A und E für C280 exprimierende Zellen auf den
ersten Blick reduziert. In SAF-A:eGFP exprimierenden Zellen war die Bandenintensität
ebenfalls reduziert und mit der von C280 exprimierender Zellen in etwa vergleichbar; für
Cyclin A war die Bande für C280 etwas schwächer als für SAF-A. Allerdings zeigte die
Betrachtung der Ladekontrolle (RPA), daß die Bahnen für C280 und SAF-A ungleich und mit
weniger Protein als die jeweiligen Kontrollen beladen waren. Nach einem Angleich bzw.
einer Normalisierung der verschiedenen Bahnen ließen die C280:eGFP und SAF-A:eGFP
exprimierenden Zellen identische Bandenintensitäten für Cyclin A und E erkennen, die
gegenüber Kontrollzellen nur minimal reduziert waren.
Ergebnisse
111
Sortierung 3 (s. Abb. 49, unten):
Ebenfalls wurden das Zellzyklusprotein Cyclin D2 und die mit diesem Protein assoziierte
Kinase CDK4 betrachtet. Für Cyclin D2 konnte kein Unterschied zwischen nichttransfizierten Zellen und Zellen, die C280:eGFP bzw. SAF-A:eGFP exprimierten, festgestellt
werden. Hingegen war die Menge der Kinase CDK4 in Zellen, die C280:eGFP und
SAF-A:eGFP exprimierten leicht reduziert.
Weiterhin wurde das Protein Cyclin C betrachtet. Für dieses Protein konnte sowohl bei
transfizierten als auch bei nicht-transfizierten
Zellen mittels Western-Blot keine Bande
detektiert werden (nicht dargestellt).
Die Zellen für die Sortierungen 1 und 2 wurden zwei Tage nach ihrer Transfektion verwendet.
Am Abend vor der Zellsortierung wurden die Zellen mit frischem Medium versorgt.
Auffallend für die eGFP-positiven Zellen der Sortierung 1 war, daß diese zwei Populationen
erkennen ließen, die sich in ihrer Größe unterschieden. Für die beiden Sortierungen wurde
ein relativ weiter Fluoreszenzintensitätsbereich (FITC-A: ~2x103 bis ~2x105) für die eGFPpositiven Zellen verwendet. Das heißt, es wurden sehr schwach bis sehr stark
grünfluoreszierende Zellen gesammelt. Als eGFP-negative Zellen wurden die Zellen der
C280-Transfektionsansätze gesammelt, die eine Fluoreszenzintensität (FITC-A) kleiner als
~2x103 aufwiesen.
Die Zellen für die Sortierung 3 wurden drei Tage der Transfektion verwendet. Einen Tag nach
der Transfektion wurden die Zellen mit neuem Medium versorgt. Das Transfektionsprotokoll
war im Gegensatz zu den vorigen Sortierungen leicht modifiziert. Ebenfalls war der
Fluoreszenzintensitätsbereich („Gate“) so gelegt, daß nur eGFP-positive Zellen gesammelt
wurden, die eine mittlere Fluoreszenzintensität (FITC-A: 104 bis 105) aufwiesen. Als eGFPnegative Zellen wurden die Zellen des SAF-A-Transfektionsansatzes gesammelt, die eine
Fluoreszenzintensität (FITC-A) zwischen 7x10 und 4x102 besaßen.
Die vorgestellten Ergebnisse der Western-Blot-Analysen an sortierten Zellen beruhen auf
(Vor-)Versuchen mit relativ geringen Proteinmengen, bei denen z.T. Modifikationen bei der
Durchführung vorgenommen wurden. Die Ergebnisse sind daher nicht final und eingeschränkt
zu betrachten. Besonders die widersprüchlichen Ergebnisse der Cycline A und E in C280positiven Zellen (vgl. Sortierung 1 und 2) bedürfen einer weiteren Verifizierung.
Ergebnisse
112
Sortierung 1
C280
Anzahl
500
300
2
10
Anzahl
-
S
- C
-
S
RPA
100
700
500
300
100
- C
3
10
10
4
CycE
10 Intensität
(FITC-A)
5
SAF-A
RPA
CycA
Intensität
102 103 104 105 (FITC-A)
Anzahl
Sortierung 2
1000
750
500
250
original
C280
Intensität
Anzahl
-
S C
- S C
-
S C
- S C
RPA
102 103 104 105 (FITC-A)
1000
750
500
250
normalisiert
SAF-A
CycE
RPA
CycA
Intensität
102 103 104 105 (FITC-A)
Anzahl
Sortierung 3
300
200
100
C280
RPA
Anzahl
Intensität
200
150
100
50
S C
102 103 104 105 (FITC-A)
SAF-A
CycD2
CDK4
Intensität
102 103 104 105 (FITC-A)
Abb. 49: Western-Blot-Analyse von Zellzyklus-Proteinen. HEK293-Zellen wurden (A+B)
zwei Tage und (C) drei Tage nach der Transfektion mit C280:eGFP bzw. SAF-A:eGFP mittels FACS in
eGFP-positive und eGFP-negative Zellen sortiert. Auf den links abgebildeten Histogrammen der
Zellsortierungen ist die Anzahl (Ordinate) der sortierten Zellen mit einer bestimmten Fluoreszenzintensität
(Abszisse) im grünen Wellenlängenbereich (FITC-A) dargestellt. Die eGFP-positiven Zellen sind grün und
die eGFP-negativen Zellen blau markiert. Die rechts abgebildeten Western-Blots wurden an den sortierten
Zellen durchgeführt. Das Protein RPA dient dem Vergleich der geladenen Proteinmengen.
(S = SAF-A:eGFP exprimierende Zellen; C = C280:eGFP exprimierende Zellen; „-” = interne
Kontrollzellen, die während der Transfektion keine DNA aufgenommen haben und somit weder C280:eGFP
noch SAF-A:eGFP exprimieren)
Ergebnisse
113
5.1.9 Einfluß von C280 auf die chromatingebundene Fraktion von
Replikationsfaktoren
Der
inhibierende
Effekt
von
C280
auf
die
DNA-Replikation
wurde
durch
Immunfluoreszenzen auf die Proteine MCM-3, RPA und ORC2 näher betrachtet, die an
verschiedenen Schritten der DNA-Replikation beteiligt sind. Die Zellen wurden vor der
Fixierung für die Immunfluoreszenz mit CSK-Puffer + 0,5% Triton X-100 behandelt, um
lösliches Protein, das nicht an Chromatin und nukleäre Strukturen gebunden war, zu
extrahieren (s.u.). In Kernen von HEK293-Zellen ließen sich nach der Immunfluoreszenz für
MCM-3 verschiedene Färbemuster erkennen (s. Abb. 50, obere Bildreihe). So konnte für
einen Teil der Kerne eine homogene Färbung beobachtet werden (Typ 1). Andere Kerne
ließen hingegen ausschließlich eine deutliche Färbung der Peripherie und mehrerer größerer
Bereiche im Inneren erkennen (Typ 3). Weiterhin konnten Kerne beobachtet werden, die
zwischen diesen beiden Färbemustern lagen (Typ 2). Auch Kerne, die gar keine Färbung
aufwiesen, konnten gefunden werden. Die Immunfluoreszenz für RPA (s. Abb. 50, mittlere
Bildreihe) ließ ebenfalls verschiedene Färbemuster erkennen, die mit denen von MCM-3
vergleichbar waren. Die verschiedenen Färbemuster für RPA und MCM-3 können der G1bzw. sehr frühen S-Phase (Typ 1) und weiter vorangeschrittenen Stadien der S-Phase (Typ 2
und 3) zugeordnet werden (Dimitrova et al., 1990).
Für ORC2 (s. Abb. 50, untere Bildreihe) war das Färbemuster hingegen immer gleich. Das
Protein war gleichmäßig im gesamten Kern verteilt. Lediglich die Intensität der Färbung
unterschied sich bei einigen Kernen. Im Gegensatz zu MCM-3 und RPA wiesen alle
betrachteten Kerne eine Färbung für ORC2 auf.
Die Expression von C280:eGFP ließ bereits einen Tag nach der Transfektion einen Effekt auf
die Beladung des Chromatins mit MCM-3 und RPA erkennen. Im Vergleich zu nicht
transfizierten Kontrollzellen war der Anteil der C280-positiven Zellen, die eine Färbung für
MCM-3 und RPA zeigten, um etwa die Hälfte reduziert (s. Abb. 51). So wiesen für MCM-3
nur 34% und für RPA lediglich 29% der C280-positiven Zellen eine Färbung auf. Im
Gegensatz dazu konnte für MCM-3 in 73% und für RPA in 57% der nicht transfizierten
Zellen eine Färbung beobachtet werden. Die Färbung auf MCM-3 und RPA in den nicht
transfizierten Zellen war zudem häufig stärker als in den Zellen, die C280 exprimierten.
Weiterhin auffällig war, daß C280 exprimierende Zellen nahezu kein Färbemuster vom Typ 3
erkennen ließen. Die Expression von SAF-A:eGFP führte im Gegensatz zu C280:eGFP zu
keiner auffälligen Reduktion der Anzahl der Zellen, die positiv für MCM-3 und RPA waren.
Für MCM-3 ließen sich in 60% und für RPA in 47% der SAF-A:eGFP exprimierenden Zellen
Ergebnisse
114
Typ 1
Typ 2
Typ 3
Typ 1
Typ 2
Typ 3
RPA
MCM3
ORC2
60
80
70
73
60
70
60
50
40
30
20
34
10
0
C280
Kontrolle
SAF-A Kontrolle
RPA-positive Zellen [%]
MCM-positive Zellen [%]
Abb. 50: Lokalisation von RPA, MCM-3 und ORC2. Auf DG gewachsene HEK293-Zellen
wurden für 10min mit CSK-Puffer + 0,5% Triton X-100 bei RT extrahiert. Anschließend wurden die Zellen
mit Paraformaldehyd fixiert und einer Immunfärbung auf die Replikationsfaktoren RPA, MCM-3 und
ORC2 unterzogen. Es folgte eine Auswertung der Präparate mittels Konfokalmikroskopie. Die Aufnahmen
für RPA lassen verschiedene Färbemuster in den Kernen erkennen. Das gleiche gilt für MCM-3. Die
mittlere der Aufnahmen für RPA zeigt zwei intensiv gefärbte Bereiche im Kern, die an inaktivierte XChromosomenterritorien erinnern. Für ORC2 war im Gegensatz zu MCM-3 und RPA immer das gleiche
Färbemuster zu beobachten. (Balken = 5µm)
57
50
47
40
52
30
20
29
10
0
C280
Kontrolle
SAF-A Kontrolle
Abb. 51: C280 beeinflußt die chromatingebundene Fraktion von MCM und RPA.
Auf DG gewachsene HEK293-Zellen, die C280:eGFP bzw. SAF-A:eGFP transient exprimierten, wurden
einen Tag nach ihrer Transfektion für 10min mit CSK-Puffer + 0,5% Triton X-100 bei RT extrahiert.
Anschließend wurden die Zellen mit Paraformaldehyd fixiert und eine Immunfluoreszenz auf die
Replikationsfaktoren RPA und MCM-3 durchgeführt. Dann wurde der Anteil der transfizierten Zellen
bestimmt, die eine Färbung für MCM (linkes Diagramm) bzw. RPA (rechtes Diagramm) erkennen ließen.
Als Kontrollen dienten Zellen, die während der Transfektionsprozedur keine DNA aufgenommen hatten.
(n = mindestens 550 Zellen).
Ergebnisse
115
Signale detektieren. Bei Kontrollzellen, die kein SAF-A:eGFP exprimierten, war ein Anteil
von 70% für MCM-3 und ein Anteil von 52% für RPA positiv. Die Signalstärken und die
Färbemuster (Typ 1 bis 3) für MCM-3 und RPA waren in Kontrollzellen und Zellen, die
SAF-A:eGFP exprimierten, vergleichbar.
Auf ORC2 konnte einen Tag nach der Transfektion mit C280 kein Effekt beobachtet werden.
Alle transfizierten Zellen ließen Signale für ORC2 erkennen, die im gesamten Kern verteilt
waren. Das gleiche traf für Zellen zu, die mit SAF-A:eGFP transfiziert waren.
Abschließend sei noch einmal darauf hingewiesen, daß sich die gemachten Beobachtungen
auf Zellen beziehen, die unter milden Bedingungen extrahiert worden waren. Wurden die
Zellen nicht extrahiert und die Gesamtpopulation der Proteine MCM-3 und RPA betrachtet
(lösliches + gebundenes Protein), ließ sich der Effekt von C280 nicht erkennen. Auch konnten
dann keine verschiedenen Färbemuster für MCM-3 bzw. RPA in Kernen beobachtet werden;
alle Kerne ließen eine intensive Färbung erkennen, die dem Typ 1 ähnlich war.
5.2.10 Array-Auswertung
Durch die Verwendung von Microarrays, die immobilisierte cDNA-Fragmente von typischen
Zellzyklus- und Apoptose-Zielgenen enthielten, sollten detaillierte Informationen darüber
gesammelt werden, wie C280 die Proliferation von Zellen beeinflußt und welche Signalwege
bzw. welche Streßantwort die Expression von C280 in Zellen induziert. Für die ArrayAnalysen wurden HEK293-Zellen verwendet, die C280:eGFP bzw. SAF-A:eGFP transient
exprimierten. Die Zellen wurden zwei Tage nach ihrer Transfektion mittels der Methode der
FACS in eGFP-positive Zellen (C280(+) und SAF-A(+)) sowie eGFP-negative Zellen
(C280(-) und SAF-A(-)) sortiert. Die eGFP-negativen Zellen der Transfektionsansätze dienten
als
interne
Kontrollen.
Die
gesammelten
eGFP-negativen
Zellen
hatten
eine
Fluoreszenzintensität (FITC-A) von ~0,5x102 bis ~3x102 und die eGFP-positiven eine
Intensität von ~104 bis ~2x105 (s. Abb. 52A). Als positive Zellen wurden somit Zellen
gesammelt, die eine mittlere bis starke Expression von C280:eGFP und SAF-A:eGFP
aufwiesen. Aus den sortierten Zellen wurde die cytoplasmatische RNA isoliert und deren
Qualität gelelektrophoretisch sowie durch eine RT-PCR mit Fibronectin-spezifischen Primern
kontrolliert. Die gelelektrophoretische Auftrennung der hitzedenaturierten RNA in einem
nicht-denaturierenden Agarose-Gel ließ deutliche Banden für die 18S-RNA und die 28S-RNA
im Größenbereich von ~1000 bis ~1200bp und ~1800 bis ~2000bp erkennen (s. Abb. 52B,
Bahn 1 bis 4), was die strukturelle Integrität der isolierten RNA verdeutlichte. Zudem zeigte
sich ein „RNA-Schmier“ der sich vom hochmolekularen Bereich der Geltaschen bis zu einer
Ergebnisse
116
Größe von ~400bp erstreckte. Die RT-PCR führte für jede der RNA-Präparationen zu einer
deutlichen und größenspezifischen Bande (256bp) (s. Abb. 52B, Bahn 7 bis 10). Die RNAPräparationen enthielten somit keine Verunreinigungen, die einen inhibierenden Effekt auf die
RT-PCR hatten. Die Qualität der RNA eignete sich folglich zur Herstellung Biotin-markierter
cDNA-Sonden. Die Markierungseffizienz der Sonden wurde vor deren Verwendung für
Array-Hybridisierungen durch Verdünnungsreihen überprüft. Laut Hersteller sind Sonden für
Array-Hybridisierungen ausreichend, wenn diese mindestens bis zu einer Verdünnung von
~1:1000 ein Signal erkennen lassen. Für die Sonden aller Ansätze (C280(+)/(-) und SAFA(+)/(-)) konnte noch bis zu einer Verdünnung von 1:20480 ein deutliches Signal festgestellt
werden (s. Abb. 52C); sogar bei einer Verdünnung von 1:81920 konnten noch schwache
Signale detektiert werden. Die Markierungseffizienz der generierten Sonden war folglich sehr
gut. Die Hybridisierung der Arrays mit den Sonden führte zu den in Abb. 52D dargestellten
Signalmustern. Für die Ansätze C280(-), SAF-A(+) und SAF-A(-) waren die Signale
bezüglich ihrer Anordnung und Intensität praktisch identisch. Hingegen schien der Array, der
mit den Sonden des Ansatzes C280(+) hybridisiert worden war, mehr und zum Teil
intensivere Signale aufzuweisen. Offensichtlich war die Transkription einiger Gene in den
C280 exprimierenden Zellen erhöht. Die quantitative Auswertung der normalisierten ArraySignale ergab, daß in C280 exprimierenden Zellen die RNA-Menge von insgesamt 269
betrachteten Genen bei 57 Genen (21,2%) erhöht und bei 4 Genen (1,5%) erniedrigt war (s.
Tab. 6). Als signifikant erhöht wurde die RNA-Menge bzw. die Transkription von Genen
eingestuft, wenn diese um den Faktor 2 größer als bei Kontrollzellen war. Hingegen wurde
die Transkriptmenge bei einem Faktor <0,8 als erniedrigt eingestuft. Die drei am stärksten
hochregulierten Transkripte waren die der Gene Bad (Faktor 9,96), XRCC3 (Faktor 8,78) und
TNFB/LT (Faktor 7,94). Bei den vier Genen, deren mRNA-Menge erniedrigt war, handelte es
sich um RPA (Faktor 0,59), GSR (Faktor 0,71), Cyclin B1 (Faktor 0,76) und Cul1 (Faktor
0,77).
Ergebnisse
117
A
Anzahl
300
Anzahl
150
C280
200
SAF-A
(-)
100
(-)
100
102
(+)
50
102
103
104
105
Intensität (FITC-A)
B
C280(-)
C280(+)
SAF(-)
1 2 3 4
1:20
1:80
Verdünnung
bp
9824
3472
1882
1268
421
28S
18S
D
103
104
105
Intensität (FITC-A)
C
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
(+)
1:320
1:1280
1:5120
1:20480
1:81920
SAF(+)
Abb. 52: Array-Analysen: Vorarbeiten und Rohdaten.
(A) Histogramm der Zellsortierungen von HEK293-Zellen, die mit C280:eGFP bzw. SAF-A:eGFP transient
(2 Tage) transfiziert waren. In grün sind die gesammelten eGFP-positiven Zellen (C280(+) bzw. SAF-A(+))
und in blau die gesammelten eGFP-negativen Zellen (C280(-) bzw. SAF-A(-)) dargestellt.
(B) Isolierte RNA (cytoplasmatisch) aus den folgenden sortierten Zellen: 1) SAF-A(-), 2) SAF-A(+),
3) C280(-) und 4) C280(+); RT-PCR mit Fibronectin-spezifischen Primern an der RNA aus den folgenden
sortierten Zellen: 7) SAF-A(-), 8) SAF-A(+), 9) C280(-) und 10) C280(+); 5) PCR-Positivkontrolle, 6) RTPCR-Positivkontrolle, 12) PCR-Negativkontrolle, 13) RT-PCR-Negativkontrolle; 11) DNA-GrößenStandard. Das Agarose-Gel ist 1%ig und nicht-denaturierend.
(C) Biotin-Markierungseffizienz von cDNA-Sonden, welche aus der isolierten RNA der folgenden
sortierten Zellen hergestellt wurden: 1) C280(+), 2) C280(-), 3) SAF-A(+) und 4) SAF-A(-).
(D) Arrays des Typs GEArray HS 603 der Firma SuperArray nach der Hybridisierung mit den hergestellten
cDNA-Sonden.
Ergebnisse
118
Tab. 6: Quantitative Array-Auswertung. Es sind die Gene vom Array des Typs GEArray HS 603
aufgeführt, für die in C280:eGFP exprimierenden Zellen eine im Vergleich zu Kontrollzellen
(Faktor >2) bzw. verminderte Transkription (Faktor <0,8) beobachtet werden konnte.
Nr.
Symbol
Genname
Beschreibung
Genlocus
1
BAD
Bad
11q13.1
BCL2-antagonist of cell death
X-ray repair complementing defective
2
XRCC3
XRCC3
14q32.3
3
LTA
TNFB/LT
5
TIMP3
TIMP3
6
7
TRAF1
TNFSF13B
TRAF1
TNFSF13B
8
CCL3
MIP-1a/
SCYA3
9
10
BLK
CRYAB
Blk
Cryab
11
NFKB1
KBF1
12
MT1H
13
TP73L
Metallothionein 1H
p51B, TP63,
TP73L
MT1A
SCYA21
TRAILR3/DcR1
14
MT1A
15
CCL21
16 TNFRSF10C
17
TNFRSF8
CD30
18
TNFRSF18
19
TNFRSF1A
TNFRSF18/
GITR
TNFR1
20
21
22
BOK
CCND2
CCL4
BCL2L9
Cyclin D2
MIP-1b
23
BCL2L2
Bcl-w
24
25
26
TRAF2
IL8
TNFSF7
27
28
IL6
LTB
TRAP3
IL-8
CD27L/
CD70
IL-6
LT-b
29
CDKN2D
p19-INK4D
30
31
TFDP1
TNFRSF7
DP1
CD27
32
33
HMOX2
TNFSF15
HEME2
VEGI
34
TNFRSF4
OX40
repair in Chinese hamster cells 3
Lymphotoxin Alpha
(TNF Superfamily, Member 1)
Tissue inhibitor of metalloproteinase 3
(Sorsby fundus dystrophy,
pseudoinflammatory)
TNF receptor-associated factor 1
tumor necrosis factor (ligand)
superfamily, member 13b
Chemokine (C-C motif) ligand 3
(Macrophage inflammatory protein
1-alpha)
B lymphoid tyrosine kinase
Crystallin, alpha B
Nuclear factor of kappa light polypeptide
gene enhancer in B-cells 1 (p105)
Metallothionein 1H
Tumor protein 63 kDa with strong
homology to p53
Metallothionein 1A (functional)
Chemokine (C-C motif) ligand 21
Tumor necrosis factor receptor
superfamily, member 10c, decoy
without an intracellular domain
Tumor necrosis factor receptor
superfamily, member 8
(CD30 ligand receptor)
Tumor necrosis factor receptor
superfamily, member 18
Tumor necrosis factor receptor
superfamily, member 1A
BCL2-related ovarian killer
Cyclin D2
Small inducible cytokine A4
(homologous to mouse Mip-1b)
BCL2-like 2
TNF receptor-associated factor 2
Interleukin 8
Tumor necrosis factor (ligand)
superfamily, member 7
Interleukin 6 (interferon, beta 2)
Lymphotoxin beta
(TNF superfamily, member 3)
Cyclin-dependent kinase inhibitor
2D (p19, inhibits CDK4)
Transcription factor Dp-1
Tumor necrosis factor receptor
superfamily, member 7
Heme oxygenase (decycling) 2
Tumor necrosis factor (ligand)
superfamily, member 15; vascular
endothelialcell growth inhibitor
Tumor necrosis factor receptor
superfamily,member 4
erhöhte
Faktor
9,96
8,78
6p21.3
7,94
22q12.3
6,59
9q33-q34
13q32-34
5,74
5,11
17q11q21
4,89
8p23-p22
11q22.3q23.1
4q24
4,82
4,82
16q13
4,58
3q27-q29
4,32
16q13
9p13
8p22-p21
4,27
4,09
3,82
1p36
3,74
1p36.3
3,68
12p13.2
3,56
2q37.3
12p13
17q12
3,54
3,50
3,13
14q11.2q12
9q34
4q13-q21
19p13
3,10
3,10
3,10
3,03
7p21
6p21.3
3,03
2,87
19p13
2,87
13q34
12p13
2,83
2,79
16p13.3
9q32
2,78
2,69
1p36
2,69
4,75
Ergebnisse
119
35
TNFRSF5
CD40
36
MT2A
37
38
CCNA2
UBE3A
Metallothionein 2A
Cyclin A
E6-AP
39
TNFRSF12
DR3/Apo3
40
TNFRSF21
TNFRSF21
41
CCND1
Cyclin D1
42
BNIP3
Nip3
43
TNF
TNFA
44
MCM2
MCM2
45
MRE11A
MRE11A
46
SOD2
47
TNFRSF6B
IPO-B/
MNSOD
TNFRSF6B
48
49
HSF1
DFFA
Tcf5
DFFA
50
HMOX1
51
BCL6
HO-1/
HEME1
Bcl-6
52
TRAF4
TRAF-4
53
54
55
TRAF6
CCNC
CDC37
TRAF6
Cyclin C
CDC37
56
BAG3
BAG3 (Bis)
57
MAD2L2
MAD2L2
58
59
60
61
CUL1
CCNB1
GSR
RPA3
Cul1
Cyclin B
GSR
RPA3
Tumor necrosis factor receptor
superfamily, member 5
Metallothionein 2A
Cyclin A2
Ubiquitin protein ligase E3A (human
papilloma virus E6-associated protein,
Angelman syndrome)
Tumor necrosis factor receptor
superfamily, member 12 (translocating
chain-associationmembrane protein)
Tumor necrosis factor receptor
superfamily, member 21
Cyclin D1 (PRAD1: parathyroid
adenomatosis 1)
BCL2/adenovirus E1B 19kDa
interacting protein 3
Tumor necrosis factor
(TNF superfamily, member 2)
Minichromosome maintenance deficient
(S. cerevisiae) 2 (mitotin
Meiotic recombination (S. cerevisiae)
11 homolog A
Superoxide dismutase 2, mitochondrial
Tumor necrosis factor receptor
superfamily, member 6b, decoy
Heat shock transcription factor 1
DNA fragmentation factor, 45kDa,
alpha polypeptide
Heme oxygenase (decycling) 1
B-cell CLL/lymphoma 6 (zinc finger
protein 51)
TNF receptor-associated factor 4
TNF receptor-associated factor 6
Cyclin C
CDC37 cell division cycle 37 homolog
(S. cerevisiae)
Homo sapiens BCL2-associated
athanogene 3
MAD2 (mitotic arrest deficient, yeast,
homolog)-like 2
Cullin 1
Cyclin B1
Glutathione reductase
Replication protein A3 (14kD)
20q12q13.2
16q13
2,67
4q25-q31
15q13
2,58
2,56
1p36.2
2,55
6p21.112.2
11q13.3
2,53
10q26.3
2,45
6p21.3
2,44
3q21
2,42
11q21
2,40
6p25.3
2,39
20q13.3
2,36
8q24.3
1p36.3
2,36
2,34
22q13.1
2,32
3q27
2,31
17q11q12
11p12
2,30
19p13.2
2,69
2,51
2,30
2,25
2,18
10q25.2p26.2
1p36
2,15
2,10
7q36.1
5q12
8p21.1
7p22
0,77
0,76
0,71
0,59
Ergebnisse
120
5.2.11 Mobilität von SAF-A und SAF-A-Konstrukten in Zellkernen
Zur Bestimmung der Mobilität von SAF-A in Kernen von lebenden HEK293-Zellen wurden
FRAP-Experimente durchgeführt. Um Bereiche und Domänen von SAF-A näher
einzugrenzen, die auf die Mobilität Einfluß nehmen, wurden Deletions- und Teilkonstrukte
von SAF-A transient exprimiert und in FRAP-Experimenten untersucht. Bei den
Deletionskonstrukten handelte es sich um ∆N45 (Deletion der DNA-Bindedomäne = SAFBox), ∆RGG (Deletion der RNA-Bindedomäne = RGG-Box) und ∆N45∆RGG (Deletion der
SAF- und RGG-Box). Als Teilkonstrukte wurden N280 (beinhaltet die SAF-Box), I280 und
C280 (beinhaltet die RGG-Box) verwendet, die dem vorderen, mittleren und hinteren Drittel
von SAF-A entsprechen. Alle Konstrukte waren N-terminal mit einer NLS und C-terminal mit
eGFP versehen. Die Proteine β-Galaktosidase (β-Gal), dessen apparentes Molekulargewicht
mit dem von SAF-A vergleichbar ist, und eGFP wurden als frei diffundierende, hoch mobile
Referenzproteine verwendet. Die normalerweise im Cytoplasma lokalisierte ß-Galaktosidase
war ebenfalls mit einer NLS und eGFP versehen. Das Protein eGFP war hingegen klein
genug, um passiv die Kernporen zu passieren. Die ungefähren apparenten Molekulargewichte
der untersuchten Proteine können der Abb. 53 entnommen werden.
Die FRAP-Experimente wurden einen Tag nach der Transfektion der Zellen durchgeführt.
Innerhalb eines definierten Bereichs der Kerne wurde die eGFP-Fluoreszenz durch
kurzzeitige, hochenergetische Laserpulse geblichen und anschließend der Rückstrom
fluoreszierender Proteine aus ungeblichenen Bereichen in den geblichenen Bereich über die
Zeit verfolgt.
1
2
3
4
5
6
7
*
9 10
8
*
*
kDa
116
97,4
66,0
45,0
29,0
Abb. 53: Western-Blot-Analyse von Proteinen, die in FRAP-Experimenten
untersucht wurden. 1) ß-Gal, 2) SAF-A, 3) ∆RGG, 4) ∆N45, 5) ∆N45∆RGG, 6) N280, 7) I280,
8) C280, 9) NLSeGFP, 10) eGFP. Die Proteine der Bahnen 1 bis 8 sind mit einer NLS und eGFP fusioniert.
Alle Proteine wurden transient in HEK293-Zellen exprimiert. Einen Tag nach der Transfektion wurden die
Zellen geerntet, Proteinlysate hergestellt und an diesen ein Western-Blot mit eGFP-spezifischen Antikörpern
durchgeführt. Für die Proteine 6) N280, 7) I280 und 8) C280 sind zusätzlich zu der jeweils spezifischen
Bande (mit einem Sternchen markiert) noch weitere Nebenbanden zu erkennen, bei denen es sich um
Abbauprodukte und womöglich freies eGFP handelt.
Ergebnisse
Bereits
die
121
„qualitative
Auswertung“,
d.h.
die
rein
visuelle
Betrachtung
der
Fluoreszenzrückströme, ließ deutliche Unterschiede zwischen einzelnen Protein-Konstrukten
erkennen (s. Abb. 54). Das Protein eGFP diffundierte am schnellsten und füllte den
geblichenen Bereich bereits unmittelbar nach dem Bleichen (weniger als 1s) mit
ungeblichenen eGFP-Molekülen wieder aus. Ebenfalls konnte für die β-Galaktosidase sowie
die SAF-A-Teilkonstrukte N280 und I280 eine schnelle Rückkehr der Fluoreszenz (~3 bis
~7s) in den geblichenen Bereich beobachtet werden; die Geschwindigkeit für N280 und ß-Gal
war vergleichbar, I280 war schneller.
prä
0
1,25
2,5
3,75
5
6,25
49,25 Zeit[s]
ß-GalNLS
SAF-A
N280
I280
C280
∆N45∆RGG
∆N45
∆RGG
eGFP
Abb. 54: Qualitative FRAP-Daten. Die Aufnahmen zeigen FRAP-Experimente an HEK293Zellen, die eGFP, NLS-ß-Gal:eGFP, NLS-SAF-A:eGFP sowie verschiedene SAF-A-Konstrukte, die mit
einer NLS und eGFP versehen waren, transient exprimierten. Die Spalte links (prä) zeigt die eGFPFluoreszenz unmittelbar vor dem Bleichen. Die Bilder der folgenden Spalte (0s) wurden unmittelbar nach
dem kurzzeitigen, irreversiblen Bleichen der Fluoreszenz in einer definierten Region (Höhe in y-Richtung:
4µm, Breite in x-Richtung: gesamter Kern bzw. gesamte Zelle) aufgenommen. Die folgenden fünf Bilder
zeigen den Fluoreszenzrückstrom aus ungeblichenen Bereichen in den geblichenen Bereich über die Zeit
(zeitlicher Abstand ~1,25s). Die Bildspalte ganz rechts läßt die Fluoreszenzverteilung im Kern bzw. in der
Zelle am Ende der Messung nach ~49s erkennen. (Bildgröße = 36,6 x 36,6µm)
Ergebnisse
122
Das Protein SAF-A, das SAF-A-Teilprotein C280 sowie die SAF-A-Deletionskonstrukte
∆N45, ∆RGG und ∆N45∆RGG ließen hingegen innerhalb der ersten Sekunden einen kaum
wahrnehmbaren Fluoreszenzrückstrom in den geblichenen Bereich erkennen. Diese Proteine
schienen immobiler. Auch am Ende der Messung nach ~49s war der geblichene Bereich in
Kernen von Zellen, die SAF-A:eGFP, ∆N45:eGFP und C280:eGFP exprimierten, aufgrund
der noch immer erheblich verminderten Fluoreszenz im Vergleich zu ungeblichenen
Nachbarbereichen deutlich wahrnehmbar. Auch für ∆RGG war der geblichene Bereich am
Ende der Messung noch sichtbar, allerdings weniger deutlich, da mehr Fluoreszenz in den
geblichenen Bereich zurückgekehrt war.
Für ∆N45∆RGG war der geblichene Bereich
hingegen am Ende der Messung nicht mehr sichtbar;
die Fluoreszenzintensitäten im
geblichenen und ungeblichenem Bereich erschienen (für das menschliche Auge) gleich.
Für die quantitative Auswertung der FRAP-Daten wurde die relative Fluoreszenzintensität
(RFI) des geblichenen Bereichs bestimmt, indem für jeden Zeitpunkt der Messung die
Fluoreszenzintensitäten (gleichgroßer Regionen) außerhalb und innerhalb des geblichenen
Bereichs zueinander ins Verhältnis gesetzt wurden (s. Kapitel 4.1.8). Ein RFI-Endwert von 1
bedeutet zum Beispiel, daß am Ende der Messung die Fluoreszenzintensitäten innerhalb und
außerhalb des geblichenen Bereichs wieder gleich sind und somit die mobile Fraktion des
Proteins 100% beträgt. Ein RFI-Endwert von zum Bespiel 0,2 heißt hingegen, daß lediglich
20% des Proteins mobil sind und daß das Protein ein immobile Fraktion von (100% - 20% =)
80% besitzt Die graphische Auftragung der ermittelten RFI-Werte (in Prozent) gegen die
Zeit führte zu den in Abb. 55 dargestellten FRAP-Kurven, die bezüglich ihrer Steigung
(Diffusionsgeschwindigkeit) und des erreichten Endwertes (mobile Fraktion) zum Teil
deutliche Unterschiede erkennen lassen. Für eGFP, β-Gal, N280 und I280 erreichen die
Kurven einen Endwert von 99% bis 100%, d.h., die mobile Fraktion dieser Proteine beträgt
zwischen 99 und 100%. Im Gegensatz dazu fällt die mobile Fraktion für SAF-A (20,5%), die
Deletionskonstrukte ∆N45 (32,5%), ∆RGG (56,6%) und ∆N45∆RGG (85,4%) sowie für das
Teilkonstrukt C280 (28,3%) deutlich geringer aus. Die immobile Fraktion von SAF-A
(79,5%), ∆N45 (67,5%) und C280 (71,7%) übersteigt sogar die mobile Fraktion.
Um die Auswirkungen einzelner Domänen und Teilbereiche von SAF-A auf das
Diffusionsverhalten besser miteinander vergleichen zu können, sind die FRAP-Kurven für die
Deletionskonstrukte von SAF-A in Abb. 56A und die FRAP-Kurven der Teilkonstrukte von
SAF-A in Abb. 56B gegenübergestellt.
Ergebnisse
123
SAF-A (n=33)
C280 (n=49)
75
100
eGFP
NLS
75
RFI [%]
RFI [%]
100
50
eGFP
NLS
50
25
25
0
0
-5
10
25
40
Zeit [s] -5
10
∆ N45 (n=51)
eGFP
NLS
50
eGFP
75
RFI [%]
RFI [%]
NLS
50
25
25
0
0
10
25
40
Zeit [s] -5
10
∆ Ν 4 5 ∆ RGG (n=20)
75
RFI [%]
75
RFI [%]
100
50
NLS
25
eGFP
40
Zeit [s]
NLS
25
40
Zeit [s] -5
10
ßGal (n=20)
25
I280 (n=16)
75
75
RFI [%]
100
RFI [%]
Zeit [s]
0
10
100
50
50
25
eGFP - NLS
0
NLS
eGFP
0
10
25
40
Zeit [s] -5
Abb. 55: FRAP-Kurven. Die Diagramme
zeigen die graphische Auswertung der FRAPDaten in Form von FRAP-Kurven. Auf der
Ordinate ist die in den geblichenen Bereich von
Kernen zurückkehrende Fluoreszenz als relative
Fluoreszenzintensität (RFI) angegeben. Auf der
Abszisse ist die Zeit in Sekunden angegeben. Die
negativen Zeitwerte beziehen sich auf Zeitpunkte
unmittelbar vor dem Bleichen. Innerhalb der
einzelnen Diagramme sind die „gefrapten“
Protein-Konstrukte schematisch dargestellt (rot =
SAF-Box; blau = RGG-Box).
10
25
40
Zeit [s]
40
Zeit [s]
eGFP (n=15)
100
RFI [%]
-5
40
50
0
25
25
N280 (n=16)
100
-5
Zeit [s]
100
75
25
40
∆ RGG (n=25)
100
-5
25
75
50
25
0
-5
10
25
Ergebnisse
∆N45∆RGG
75
∆RGG
50
∆N45
25
100
RFI [%]
B
100
RFI [%]
A
124
75
N280
I280
50
C280
25
SAF-A
SAF-A
0
-5
0
10
25
40 Zeit
[s]
-5
10
25
40 Zeit
[s]
Abb. 56: Vergleich der FRAP-Kurven der Deletions- und Teilkonstrukte von SAF-A.
(A) Gemeinsame Darstellung der FRAP-Kurven von SAF-A und der Deletionskonstrukte von SAF-A. (B)
Gemeinsame Darstellung der FRAP-Kurven von SAF-A und der Teilkonstrukte von SAF-A. Die Proteine
C280 und ∆N45 sind dem Protein SAF-A bezüglich des Kurvenverlaufs und der Immobilität am
ähnlichsten.
Der direkte Vergleich der FRAP-Kurven für die Deletionskonstrukte und SAF-A läßt
folgende Reihenfolge bezüglich der Kurvensteigung und des erreichten Endwertes
(aufsteigend geordnet) erkennen: SAF-A, ∆N45, ∆RGG und ∆N45∆RGG. Dies verdeutlicht,
daß die Deletion der RNA-Bindedomäne (RGG-Box) eine größere Auswirkung auf die
Erhöhung der mobilen Fraktion von SAF-A nimmt als die Deletion der DNA-Bindedomäne
(SAF-Box). Die DNA-Bindedomäne scheint somit einen geringeren Einfluß auf die
Immobilisierung von SAF-A als die RNA-Bindedomäne zu haben. Ähnliches läßt der
Vergleich der FRAP-Kurven für SAF-A und der Teilkonstrukte N280, I280 und C280
erkennen. Das vordere Drittel von SAF-A (N280), welches die DNA-Bindedomäne
beinhaltet, sowie das mittlere Drittel von SAF-A (I280) erreichen beide einen RFI-Endwert
von 99 bis 100% und sind somit hoch mobil; das Teilprotein N280 erreicht den Endwert im
Gegensatz zu I280 etwas später und diffundiert somit, höchstwahrscheinlich durch die
Wechselwirkung mit DNA, etwas langsamer. Das letzte Drittel von SAF-A (C280), welches
die RNA-Bindedomäne beinhaltet, verhält sich im Vergleich zu den anderen beiden Dritteln
deutlich anders. So sind die FRAP-Kurven für C280 und SAF-A zueinander sehr ähnlich; die
Kurve für C280 liegt innerhalb der Fehlerbalken der Kurve für SAF-A und umgekehrt. Das Cterminale Drittel von SAF-A scheint somit ausschlaggebend für die Immobilisierung des
Gesamtproteins zu sein. Neben der RGG-Box muß allerdings noch mindestens eine weitere
Domäne im C-terminalen Drittel von SAF-A existieren, die zur Immobilisierung beiträgt.
Dies wird aus dem Ergebnis für das Deletionskonstrukt ∆N45∆RGG ersichtlich, welches trotz
fehlender RGG-Box und SAF-Box immer noch eine immobile Fraktion von 14,6% aufweist.
Ergebnisse
125
Zur besseren Übersicht der FRAP-Ergebnisse sind diese in Tab. 7 nochmals gesondert
aufgeführt. Ebenfalls weist diese Tabelle die ermittelten t1/2-Werte und die daraus
resultierenden Diffusionskoeffizienten aller betrachteten Proteine auf. Das Protein eGFP
(~27kDa) ist hierbei mit dem niedrigsten t1/2-Wert von
resultierenden
Diffusionskoeffizienten
von
~0,124s und einem daraus
~3,73x10-7 cm2/s
das
am
schnellsten
diffundierende Protein. SAF-A und C280 sind die am langsamsten diffundierenden Proteine
(t1/2 = 14,18s bzw. 15,67s). SAF-A bewegt sich somit im Kern ca. 114mal langsamer als eGFP
und ca. 6mal langsamer als β-Gal (t1/2 = 2,24s).
Abschließend sei darauf hingewiesen, daß die Kurven für SAF-A, C280, ∆RGG, ∆N45 und
∆N45∆RGG am Ende der Meßzeit nach ~49s noch nicht ihr Plateau erreicht haben, sondern
noch weiter ansteigen. Die RFI-Endwerte dieser Kurven sind daher nicht als tatsächliche,
sondern als vorzeitige RFI-Endwerte aufzufassen.
Tab. 7: Quantitative FRAP-Ergebnisse für SAF-A, dessen Deletions- und
Teilkonstrukte und die Referenzproteine β-Gal und eGFP.
Protein
Mobile
Immobile
t1/2
D
Fraktion [%]
Fraktion [%]
[s]
[cm2/s]
SAF-A
20,5
79,5
14,18
3,26x10-9
C280
28,3
71,7
15,67
2,95x10-9
∆N45
32,5
67,5
10,95
4,22x10-9
∆RGG
56,6
43,4
9,08
5,09x10-9
∆N45∆RGG
85,4
14,6
6,34
7,29x10-9
N280
100,0
0,00
3,11
1,49x10-8
β-Gal
99,0
1,00
2,24
2,06x10-8
I280
99,0
1,00
0,871
5,31x10-8
eGFP
99,4
0,6
0,124
3,73x10-7
Diskussion
126
6. Diskussion
Das
Wissen
um
die
Kompartimentierung
des
eukaryotischen
Stoffwechsels
in
membranumgrenzte Zellorganellen sowie das Vorhandensein eines Cytoskeletts wird
heutzutage als selbstverständlich angesehen und kann in jedem allgemeinen Lehrbuch der
Biologie nachgelesen werden. Relativ neu ist hingegen die Erkenntnis, daß auch der Zellkern
eine komplexe Kompartimentierung aufweist (Übersichten in Lamond & Earnshaw, 1998;
Fackelmayer, 2000; Cremer & Cremer, 2001; Dundr & Misteli, 2001). Diese blieb aufgrund
unzulänglicher Untersuchungsmethoden und der relativ hohen Packungsdichte von Zellkernen
mit DNA, RNA und Proteinen, die einen tieferen Einblick ins Innere verwährten, zunächst
verborgen. Erst mit der Verbesserung und Weiterentwicklung mikroskopischer Techniken
und dem Aufkommen neuer Methoden in den letzten zwei Jahrzehnten wandelte sich das Bild
des Kerns von einem „Sack“, der chaotisch mit Nukleinsäuren und Proteinen gefüllt ist, zu
einem Organell, welches strukturell hoch organisiert ist. Erste Hinweise gaben unter anderem
Autoimmun-Antikörper von menschlichen Patienten, die diskrete intranukleäre Strukturen
färbten (Tan, 1982) und somit zu der Idee führten, daß verschiedene Proteine in
unterschiedlichen Bereichen des Kerns angereichert sind. Mittlerweile sind eine Vielzahl
dieser „nuclear bodies“ bekannt (Übersicht in Spector, 2001), ihre genaue Funktion ist aber,
bis auf einige wenige, weitgehend unbekannt. Im übertragenen Sinne können die „nuclear
bodies“ als Organellen des Kerns aufgefaßt werden, die im Gegensatz zu den Organellen des
Cytoplasmas aber nicht von einer Membran umgeben sind. Weiterhin ist das Chromatin im
Zellkern hierarchisch organisiert, wobei verschiedene Modelle davon ausgehen, daß das
Chromatin schleifenförmig in Interphase-Chromosomen verpackt ist (Manuelidis & Chen,
1990; Belmont & Bruce, 1994; Sachs et al., 1995; Yokota et al., 1995; Li et al., 1998; Münkel
et al., 1999). Durch Fluoreszenz in situ Hybridisierungen (FISH) konnte demonstriert werden,
daß die Interphase-Chromosomen im Zellkern Territorien einnehmen, die sich gegenseitig
nicht durchmischen (Lichter et al., 1988). Die Grundlage der (Sub-) Kompartimentierung des
Zellkerns und der Organisation des Chromatins könnte eine dreidimensionale, dynamische
Gerüststruktur aus RNA und Proteinen sein, die als Kernmatrix oder auch Kerngerüst
bezeichnet wird (Stein & Berezney, 2000). Der Gedanke einer Gerüststruktur in Zellkernen ist
bereits über 50 Jahre alt (Zbarskii & Debov, 1948) und erscheint durchaus plausibel, da alle
anderen Ebenen der Organisation vom Cytoplasma bis hin zum kompletten Organismus
ebenfalls eine strukturelle Unterstützung aufweisen. Trotz zahlreicher experimenteller
Befunde, die für eine Kernmatrix und deren Involvierung in die Regulation der Genexpression
Diskussion
127
und die DNA-Replikation sprechen (Übersicht in Berezney et al., 1995), ist die „in vivo“Existenz der Kernmatrix nach wie vor ein umstrittenes Thema (diskutiert in Martelli et al.,
2002).
Der
Hauptkritikpunkt
besteht
darin,
daß
Kerne
zur
Visualisierung
von
Matrixstrukturen mittels der Elektronenmikroskopie zuvor extrahiert und von Chromatin
befreit werden müssen, was die Gefahr der artifiziellen (Neu-)Entstehung von Strukturen birgt
(diskutiert in Pederson, 2000a).
Im Rahmen dieser Doktorarbeit, bei der primär die Rolle des Kernproteins SAF-A für die
Funktionalität und Architektur von Kernen betrachtet wurde, konnten neue Erkenntnisse
bezüglich der Matrixfrage gewonnen werden. Hierbei wurden sowohl einfache Kerne, die sich
in Xenopus-Ei-Extrakten de novo um Lambda-DNA gebildet hatten, als auch komplexe
Zellkerne betrachtet. Die in vitro gebildeten Kerne sind vom ihrem Grundaufbau mit nativen
Zellkernen vergleichbar. So weisen sie eine doppelte Kernmembran, eine Lamina, Kernporen
und eine höhere Organisation des Chromatins auf (Newport, 1987). Die strukturelle
Gesamtkomplexität der einfachen Kerne ist im Vergleich zu „echten“ Zellkernen jedoch
wesentlich simpler. Diese „Einfachheit“ der in vitro Kerne wurde in dieser Arbeit genutzt, um
Struktur-Funktions-Beziehungen zu visualisieren, die in komplexen Zellkernen nicht oder nur
schwer darstellbar gewesen wären. Zum Beispiel konnte in dieser Arbeit durch die
Verwendung einfacher Kerne zum ersten Mal demonstriert werden, daß die DNA-Replikation
exklusiv an der Oberfläche von Matrixstrukturen erfolgt. Im weiteren Verlauf wurde versucht,
die Ergebnisse der in vitro Kerne auf native, lebende Zellkerne zu übertragen. Die
gewonnenen Daten sind mit der Existenz einer Kernmatrix (in vivo) vereinbar und lassen
erkennen, daß deren Integrität entscheidend für die DNA-Replikation und Zellproliferation
ist. Zur Visualisierung von Matrixstrukturen wurde das Protein SAF-A verwendet. SAF-A ist
eines der 10 häufigsten Proteine in klassischen Matrixpräparationen und unter diesen das
einzige, welches spezifisch an S/MAR-DNA bindet (Romig et al., 1992; Mattern et al., 1996).
Diese Brückenfunktion von SAF-A zwischen Chromatin und Kernmatrix sowie dessen hohe
Konzentration in Zellkernen (~2 Millionen Moleküle/Kern) und Xenopus-Ei-Extrakten
(~4ng/µl) machen das Protein zu einem guten Kandidaten für die Kernarchitektur.
Diskussion
128
6.1 xSAF-A in rekonstituierten Kernen
In einfachen Kernen konnten für xSAF-A voneinander getrennte flecken- und
filamentförmige Strukturen beobachtet werden, die einen Durchmesser von etwa 400nm
hatten. Die Strukturen waren räumlich über den gesamten Kern verteilt. Die DNA-Färbung
von einfachen Kernen mit Farbstoffen wie Hoechst 33258, Propidiumjodid und SYTOXGreen verhielt sich komplementär zu den xSAF-A Strukturen. So ließen die Bereiche der
xSAF-A-Strukturen häufig keine oder nur eine schwache DNA-Färbung erkennen,
wohingegen der Rest des Kerns, also die Bereiche zwischen den SAF-A Strukturen, eine
intensive DNA-Färbung aufwiesen. Die DNA-Färbung einfacher Kerne ließ somit ein
granuläres Muster erkennen, bei dem die xSAF-A Strukturen, bildlich gesprochen, wie
Puzzleteile in die DNA-armen Bereiche paßten. Diese Verteilung konnte nicht nur bei der
Verwendung von Lambda-DNA, sondern auch durch den Gebrauch von Xenopus-Spermien
(in dieser Arbeit nicht dargestellt) als DNA-Matrize für Kernbildungsreaktionen beobachtet
werden. Auch in der Publikation von Lopez-Soler et al. (2001) ist in einfachen Kernen, die
sich um aufgereinigtes Spermien-Chromatin von Xenopus laevis gebildet haben, ein
granuläres DNA-Färbemuster zu erkennen. Die DNA-Organisation von einfachen Kernen, die
sich im Xenopus-Ei-Extrakt um artfremde „nackte“ Lambda-DNA und um arteigenes
Spermien-Chromatin bilden, scheint somit (visuell) vergleichbar.
Um zu testen, ob xSAF-A in den „Löchern“ der DNA-Färbung stabile Strukturen ausbildet,
wurden Matrixpräparationen durchgeführt. Das Protein xSAF-A konnte weder durch den
Verdau des Chromatins mittels DNaseI noch durch eine anschließende Hochsalzbehandlung
aus einfachen Kernen extrahiert werden. Dies steht mit früheren Ergebnissen von
Matrixpräparationen in Einklang, die im Vorfeld dieser Doktorarbeit im Rahmen des
Xenopus-Projektes
an
einfachen
Kernen
durchgeführt
wurden
(Fackelmayer,
unveröffentlichte Daten). Unter der Voraussetzung, daß es während der Präparation nicht zu
artifiziellen Präzipitationsprozessen kommt, verdeutlicht dies, daß die xSAF-A Strukturen in
den Löchern der DNA-Färbung nicht auf einer losen Ansammlung des Proteins basieren, die
durch das umgebende Chromatin aufrecht erhalten werden. Das Protein SAF-A ist also nicht
nur ein Bestandteil von Matrixpräparationen in eukaryotischen Zellkernen (Fackelmayer et
al., 1994; Mattern et al., 1996), sondern kann mittels klassischer Matrixpräparationen auch in
einfachen Kernen als Matrixkomponente identifiziert werden.
Im Vergleich zu eukaryotischen Zellkernen, in denen SAF-A eher eine großflächige
Verteilung zeigt (s. Abb. 28), ist xSAF-A mit seinen punkt- und filamentförmigen Strukturen
in einfachen Kernen jedoch auffällig anders organisiert (vgl. Abb. 7). Interessanterweise
Diskussion
129
bildet humanes, aufgereinigtes SAF-A, wenn dieses in vitro mit DNA gemischt wird,
filamentöse Aggregate aus (Romig et al., 1992), die stark an die xSAF-A Strukturen in
einfachen Kernen erinnern. Dies führt zu der Idee, daß die xSAF-A Strukturen der in vitro
gebildeten Kerne auf einer relativ „einfachen“ Organisationsebene basieren könnten, die
eventuell eine Vorstufe zu der Organisation von SAF-A in komplexen Zellkernen darstellt.
Allerdings muß darauf hingewiesen werden, daß die humanen SAF-A Aggregate
(Durchmesser: 35 +/- 4nm) um einen Größenfaktor von etwa 10 kleiner als die xSAF-A
Strukturen (Durchmesser: 414 +/- 61nm) sind. Aufgrund unterschiedlich auflösender
Aufnahmeverfahren sind die Größen jedoch nur bedingt miteinander vergleichbar. So wurden
die humanen SAF-A Aggregate mittels Elektronenmikroskopie (A = ~ 0,3nm) analysiert,
wohingegen für die Aufnahmen der xSAF-A Strukturen die wesentlich geringer auflösende
Lichtmikroskopie (A = ~200nm) verwendet wurde. Da die xSAF-A Strukturen mit ihrer
Größe dicht am Rande des Auflösungsvermögens der Lichtmikroskopie liegen, wäre es
weiterführend
sicherlich
sinnvoll,
die
xSAF-A
Strukturen
auch
mittels
der
Elektronenmikroskopie zu analysieren, um zum einen eine exaktere Größenbestimmung zu
ermöglichen, und zum anderen einen tieferen Einblick in den Feinaufbau der Strukturen zu
erlangen.
Ein interessantes Detail, welches elektronenmikroskopischen Aufnahmen von in vitro
gebildeten, humanen SAF-A Aggregaten entnommen werden kann, ist, daß zugegebene DNA
in Form von Fasern und Schlaufen an den SAF-A Aggregaten verankert ist (Romig et al.,
1992; Fackelmayer et al., 1994). Mehrere Beobachtungen deuten darauf hin, daß auch die
xSAF-A Strukturen an der Anheftung und Organisation der DNA beteiligt sind. Zum Beispiel
konnte in größeren, dekondensierteren Kernen, die sich im Ei-Extrakt gebildet hatten, oft eine
intensivere DNA-Färbung in unmittelbarer Umgebung der xSAF-A Strukturen beobachtet
werden. Offensichtlich konzentrierte sich die DNA um die xSAF-A Strukturen. Zudem ließen
sich in Kernbildungsreaktionen einzelne punktförmige xSAF-A Strukturen beobachten, die
ringförmig von DNA umgegeben waren („DNA-Donut“, „DNA-Kringel“). Einfache Kerne
schienen modulartig aus diesen xSAF-A/DNA-Untereinheiten aufgebaut zu sein. Für die
Organisation der xSAF-A/DNA-Untereinheiten läßt sich ein Modell vorstellen (s. Abb. 56),
bei dem das Chromatin in Form von Schleifen wie eine Rosette an einem zentralen
Proteingerüst aus spezifischen „attachment“-Faktoren befestigt ist (Filipski et al., 1990).
Auch nach Halopräparationen von einfachen Kernen konzentrierte sich ein Großteil der DNA
noch um die xSAF-A Strukturen. Halopräparationen führen zu der Extraktion von Histonen
und lassen Chromatinschleifen als DNA-Halo erscheinen, der an Kernmatrix- oder
Diskussion
130
DNA
xSAF-A
merge
Abb. 56: Modell einer xSAF-A/DNA-Untereinheit. Für die Organisation des Chromatins in
einfachen Kernen läßt sich ein Modell vorstellen, bei dem die DNA in Form von Schleifen (grün) an einem
zentralen Proteingerüst aus „attachment“-Faktoren (rot), wie z.B. xSAF-A, verankert ist. Die Bearbeitung
der gezeichneten xSAF-A/DNA-Untereinheit mit dem Weichzeichner-Filter des Programms Photoshop
(->dient der Simulation der lichtmikroskopischen Auflösung) führt zu Strukturen, die den mikroskopisch
beobachteten xSAF-A/DNA-Untereinheiten zum verwechseln ähnlich sehen (vgl. Abb. 11). (Abbildung
erstellt von F. O. Fackelmayer)
Chromosomengerüst-Strukturen verankert ist (Vogelstein et al., 1980; Gerdes et al., 1994;
Bickmore & Oghene, 1996). Die Ergebnisse der Halopräparationen an einfachen Kernen
stehen also mit der Annahme im Einklang, daß die DNA an den xSAF-A-gefärbten Strukturen
befestigt ist. Dies deckt sich auch mit der Beobachtung, daß nach Matrixpräparationen von
einfachen Kernen noch geringe Restmengen von DNA detektiert werden konnten, die mit
(xSAF-A) Matrixstrukturen colokalisierten. Offensichtlich ist diese DNA durch eine
besonders enge Assoziation mit den Strukturen vor dem Abbau durch DNase geschützt, wie
dies bereits für matrixgebundene DNA-Elemente höherer eukaryotischer Zellen beschrieben
ist (z.B. Jackson et al., 1990; Pemov et al., 1998).
Für die Anheftung der DNA bzw. des Chromatins an Kern-Matrixstrukturen eukaryotischer
Zellkerne werden AT-reiche S/MAR-DNA-Elemente verantwortlich gemacht, denen eine
wichtige Rolle bei der strukturellen und funktionellen Organisation des Chromatins
zugesprochen wird (Übersicht in Heng et al., 2001). Da xSAF-A eine SAF-Box als DNABindedomäne aufweist, die spezifisch an S/MAR-DNA bindet (Kipp et al., 2000), liegt der
Schluß nahe, daß xSAF-A als Matrixkomponente an der Verankerung und Organisation des
Chromatins in einfachen Kernen beteiligt ist. Die Tatsache, daß sich Kerne in vitro auch um
die DNA des Bakteriophagen Lambda bilden, lassen die Notwendigkeit eukaryotischer
S/MARs und somit auch S/MAR-bindender Proteine für die Organisation des Chromatins in
solchen einfachen Kernen auf den ersten Blick jedoch fragwürdig erscheinen.
Interessanterweise existiert aber innerhalb des Lambda-Genoms ein AT-haltiger Bereich, der
in vitro sowohl gut an Kernmatrixpräparationen als auch an aufgereinigtes SAF-A bindet
(Romig et al., 1994). Eventuell übernimmt in einfachen Kernen, die sich um Lambda-DNA
gebildet haben, dieses Pseudo-S/MAR-Element die Funktion eines „echten“ eukaryotischen
S/MAR-Elements. Dafür würden auch die S/MAR-Erkennungssignatur (van Drunen et al.,
Diskussion
1999),
die
131
innerhalb
des
24045TATAGTAAATTAGTTA24060
Lambda-Pseudo-S/MAR-Elements
und 8mer:
24086TATCATTC24093)
(16mer:
identifiziert werden
konnte, sowie das hohe MAR-Potential (Peak an der Sequenzposition: 23800), welches sich
mit dem Programm MAR-Wiz V1.5 zeigte (s. Abb. 57), sprechen.
Angenommen, die über die Cos-Sites concatemerisierte Lambda-DNA (Genomgröße:
48502bp) liegt in einfachen Kernen als 30nm-Chromatinfaser vor (Verpackungsfaktor: 40x),
welche über die Pseudo-SAR-Elemente an den xSAF-A-gefärbten Strukturen verankert ist,
ergäbe sich für die daraus resultierenden 48kb-Chromatinschleifen eine Länge von ~200nm.
Unter Berücksichtigung der sehr kleinen Strukturgrößen, die im Grenzbereich der
lichtmikroskopischen Auflösung liegen, kommt diese theoretische Chromatinschleifen-Länge
dem beobachteten, ca. 400nm umfassenden DNA-Bereich, der die xSAF-A Strukturen
umgab, erstaunlich nahe. Eine Chromatinschleife mit einem Ausmaß von 400nm würde dafür
sprechen, daß nicht jedes Pseudo-S/MAR-Element, sondern nur jedes zweite an der
Verankerung der Lambda-DNA beteiligt ist. Daß identische S/MARs nicht alle als Anker
dienen, scheint nicht ungewöhnlich. Zum Beispiel wird in der Arbeit von Heng et al. (2004)
von einem 9mer aus identischen S/MAR flankierten 40kb-Einheiten berichtet, das nach der
stabilen Integration in das Genom von Mäusen nicht die erwartete Anzahl von neun 40kbSchleifen zeigte, sondern eher eine flexible Nutzung der identischen S/MARs als Anker
erkennen ließ, da die S/MARs mittels FISH sowohl in der Kernmatrix als auch in
Chromatinschleifen detektiert werden konnten.
Ob in einfachen Kernen das Lambda-Pseudo-S/MAR-Element tatsächlich an der Verankerung
der DNA beteiligt ist, oder ob die Bindung an (xSAF-A) Matrixstrukturen über andere,
willkürliche DNA-Bereiche erfolgt und S/MARs keine wesentliche Rolle in dem
embryonalen Xenopus-System spielen, wurde in dieser Doktorarbeit nicht näher untersucht.
MAR-Potential
1,00
0,75
23800
0,50
0,25
4900
9800
14700
19600
24500
29400
34300
39200 44100 48502
Position in Basenpaaren
Abb. 57: MAR-Potential von Lambda-DNA. Dargestellt ist das mit dem Programm
MAR-Wiz (Version 1.5) ermittelte MAR-Potential-Profil der DNA des Bakteriophagen Lambda
(λ, 48502bp, Accession: NC_001416). Die hintere Hälfte der λ-DNA weist mehrere Bereiche mit
einem erhöhten MAR-Potential auf. Der Bereich mit dem höchsten MAR-Potential liegt im
mittleren Teil (Position: 23800) der λ-DNA-Sequenz.
Diskussion
132
Zur Klärung dieser Frage(n) könnten u.a. Chromatin-Immunpräzipitationen (ChIPs) beitragen,
die aufgrund der relativ großen Anzahl benötigter Kernen bisher noch nicht durchgeführt
wurden.
Daß xSAF-A aber eine wichtige Rolle für die Architektur und den Zusammenbau einfacher
Kerne spielt, ließen Kernbildungsreaktionen erkennen, die in Gegenwart von xSAF-Aspezifischen Antikörpern durchgeführt wurden. Die Bildung von Kernen im Xenopus-EiExtrakt, der vor der Zugabe des CaCl2 (Entlassung in die Interphase) und des energieregenerierenden Systems, für 10min mit xSAF-A-spezifischen Antikörpern prä-inkubiert
worden war, war deutlich beeinträchtigt. Im Vergleich zu stringenten Kontrollansätzen, denen
hitzedenaturierter xSAF-A-Antikörper aus der gleichen Aufreinigung hinzugegeben worden
war, wurden deutlich weniger Kerne gebildet, und die Kernrekonstitution verlief erheblich
langsamer. Der Großteil der wenigen Kerne, die gebildet wurden, ließ die typische
Anordnung von xSAF-A in flecken- und filamentförmigen Strukturen vermissen. Stattdessen
zeigte sich eine diffuse und strukturlose Verteilung von xSAF-A. Interessanterweise war in
solchen Kernen auch die Organisation des Chromatins betroffen, da kein granuläres DNAFärbe-Muster mehr beobachtet werden konnte; die „Löcher“ der DNA-Färbung fehlten und
die Kerne erweckten nicht mehr den Eindruck, als wenn sie aus einzelnen DNA-„Donuts“
aufgebaut seien. Dies läßt darauf schließen, daß xSAF-A (indirekt oder direkt) an der
Organisation des Chromatins in einfachen Kernen beteiligt ist. Auffallend war, daß der
inhibierende Effekt auf die Kernbildung erst dann deutlich auftrat, wenn mitotischer EiExtrakt mit den xSAF-A-spezifischen Antikörpern prä-inkubiert worden war. Erfolgte die
Zugabe der polyklonalen xSAF-A-Antikörper hingegen zeitgleich mit der Entlassung des
mitotischen Extraktes in die Interphase (Zugabe des CaCl2 und des energieregenerierenden
Systems), erschienen die Kerne im Vergleich zu Kontrollkernen zwar anfälliger gegenüber
mechanischer Beanspruchung (-> Zentrifugation auf Deckgläschen), der Prozeß der
Kernbildung selbst ließ jedoch keine Auffälligkeiten bezüglich der Anzahl der gebildeten
Kerne sowie des xSAF-A- und DNA-Färbemusters erkennen. Die Entlassung des Extraktes in
die Interphase führt daher offensichtlich zu Modifikationen, die den neutralisierenden Effekt
der xSAF-A-spezifischen Antikörper stark abschwächen bzw. verhindern. Hierfür sind
mehrere Erklärungen denkbar. Eventuell binden Ca2+-Ionen an xSAF-A. Dies könnte zu einer
Epitop-Maskierung
oder
Konformationsänderung
von
xSAF-A
führen
und
eine
Abschwächung der Antikörper-Bindung zur Folge haben. Auch wäre es denkbar, daß beim
Mitose-Interphase-Übergang stattfindende Phosphorylierungsreaktionen Einfluß auf die
Antikörperbindung nehmen. Eventuell assoziiert bzw. wechselwirkt xSAF-A auch
Diskussion
133
unmittelbar bzw. sehr bald nach der Entlassung in die Interphase mit anderen Proteinen, was
ebenfalls die Maskierung von Epitopen zur Folge haben könnte. Glycerol-GradientenZentrifugationen mit mitotischem Xenopus-Ei-Extrakt haben gezeigt, daß xSAF-A zu über
85% in monomerer Form vorliegt und nur 10-15% des Proteins mit RNA assoziiert sind
(Fackelmayer, unveröffentlichte Daten). Im mitotischen Ei-Extrakt sind die (sterischen)
Voraussetzungen für die Bindung von Antikörpern an xSAF-A also günstig. Es wäre
interessant zu untersuchen, ob xSAF-A auch in Ei-Extrakten, denen CaCl2 und das
energieregenerierende System hinzugegeben worden ist, vorwiegend in monomerer Form
vorliegt. Wenn nicht, könnte dies die Erklärung für den nicht-inhibierenden Effekt der
xSAF-A-Antikörper im interphasischen Ei-Extrakt sein.
Die Beobachtung, daß xSAF-A ein Bestandteil der präparierten Kernmatrix ist und Einfluß
auf die Architektur und Chromatinorganisation einfacher Kerne nimmt, legte nahe, daß das
Protein als strukturelle Komponente auch für die Funktionalität in vitro gebildeter Kerne von
Bedeutung ist. So spielt die Kernstruktur zum Beispiel eine wichtige Rolle für den Prozeß der
DNA-Replikation (Übersicht in DePamphilis, 2000), und verschiedene Arbeiten haben einen
Zusammenhang zwischen der Kernmatrix und der DNA-Replikation aufgezeigt (Übersichten
in Berezney et al., 1995; Nickerson, 2001). Mit dem Xenopus-System rekonstituierte Kerne
sind ein ideales Untersuchungsobjekt, diesen Zusammenhang näher zu studieren. Das
Xenopus-System stellt ein embryonales System ohne Transkriptionsaktivität dar, welches zu
einer kompletten Runde semi-konservativer Replikation fähig ist (Newport & Kirschner,
1984; Blow & Laskey, 1986; Leno & Laskey, 1991). Biochemisch ist das System gut
charakterisiert, und ein Großteil unseres heutigen Wissens über die Einzelheiten der
molekularen und regulatorischen Prozesse bei der DNA-Replikation wurde mit Hilfe des
Xenopus-Systems gewonnen (siehe z.B. Romanowski et al., 1996 und 2000; Rowles et al.,
1996; Strausfeld et al., 1996; Gillespie et al., 2000; Mimura et al., 2000; Walter, 2000; Blow
2001; Waga et al., 2001; Chou et al., 2002; Fukui et al., 2004). Über die strukturelle Basis und
die räumliche Organisation der DNA-Replikation ist hingegen weniger bekannt. Durch die
Verwendung von xSAF-A als Markerprotein für die Kernmatrix war es in dieser Arbeit
möglich, die Lokalisierung von Replikationsfaktoren und replizierter DNA relativ zur Lage
von (xSAF-A) Matrixstrukturen in nicht-extrahierten Kernen genauer zu untersuchen.
Die Markierung frisch replizierter DNA in einfachen Kernen, die sich um Lambda-DNA
gebildet hatten, ließ zahlreiche kleine, fleckenförmige Signale erkennen, die im gesamten
Kern verteilt waren. Solche Replikationsfoci lassen sich auch in komplexen Zellkernen sowie
Diskussion
134
in einfachen Kernen, die im Ei-Extrakt um Xenopus-Spermien assembliert werden,
beobachten (Nakamura et al. 1986; Mills et al., 1989; Nakayasu & Berezney, 1989; Cox &
Laskey, 1991; Chen et al., 2001). Die Replikation der DNA in den Foci von Zellkernen findet
an Multienzymkomplexen statt, die neben allen wesentlichen Replikationsenzymen auch
Zellzyklusproteine, wie z.B. Cyclin A und Cdk2, enthalten (Nakamura et al., 1986; Nakayasu
& Berezney, 1989; Cardoso et al., 1993; Nickerson et al., 1995). Diese Replikations„Fabriken“ bzw. „Maschinerien“ , in denen mehrere Replikationsgabeln zusammengefaßt sind
(Cox & Laskey, 1991; Blow et al., 2001), konnten elektronenmikroskopisch sichtbar gemacht
und ultrastrukturell beschrieben werden (Hozak et al., 1993; Hozak et al., 1994). Neuere
Untersuchungen, die auf der Lebendzell-Mikroskopie von PCNA:eGFP (s.u.) exprimierenden
Zellen beruhen, lassen erkennen, daß die Replikationsfoci keine bzw. nur eine geringfügige
Bewegung aufweisen und sich weder teilen noch miteinander fusionieren (Leonhardt et al.,
2000b);
PCNA
(proliferating
cell
nuclear
antigen)
ist
eine
Komponente
der
Replikationsmaschinerie und wurde historisch als das erste Protein in Replikationsfoci
identifiziert (Celis & Celis, 1985; Bravo & Macdonald-Bravo, 1987). Die beobachtete
„Immobilität“ ist mit der Vorstellung vereinbar, daß die Replikationsmaschinerie stabil an
einer darunter liegenden Nicht-Chromatin-Struktur, der nukleären Matrix, organisiert bzw.
verankert sein könnte (Tubo & Berezney, 1987; Hozak et al., 1993). Bisher war es aufgrund
der strukturellen Komplexität von Zellkernen allerdings nicht möglich, diese räumliche
Beziehung zwischen der Kernmatrix und der Replikationsmaschinerie in nicht-extrahierten
Kernen aufzuzeigen.
Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte beobachtet werden, daß die DNA-Replikation in
einfachen Kernen, die sich um Lambda-DNA gebildet hatten, an xSAF-A-(Matrix)-Strukturen
startet. Das heißt, frisch replizierte DNA, die durch den Einbau von fluoreszierenden
Nukleotiden markiert worden war, colokalisierte mit den xSAF-A-Strukturen. Gleiches
konnte für das Protein ORC1 festgestellt werden. Das Protein ORC1 ist eine Komponente des
heterohexameren ORC-Komplexes (origin recognition complex), der essentiell für die
Initiation der DNA-Replikation ist und von dem bekannt ist, daß er mit Initiationsstellen
colokalisiert (Romanowski et al., 1996). Die beobachtete Lokalisierung von ORC1 an Stellen
von (xSAF-A) Matrixstrukturen steht in Einklang mit Ergebnissen von Fujita et al. (2002), die
eine DNase-resistente Assoziation von ORC1 mit Nicht-Chromatin-Strukturen (Kernmatrix)
in Zellkernen von HeLa-Zellen nachweisen konnten.
Auffallend war, daß die ersten Signale des Einbaus fluoreszierender Nukleotide immer zuerst
an den xSAF-A-Strukturen detektiert werden konnten, auch wenn der Zeitpunkt der Zugabe
Diskussion
135
der markierten Nukleotide zu den in vitro Kernen von Versuch zu Versuch variierte. Das ließ
vermuten, daß nicht nur die Initiation an den (xSAF-A) Matrixstrukturen stattfindet, sondern
auch der eigentliche Prozeß der DNA-Replikation an den Strukturen abläuft. Dies wurde
durch die Lokalisierung des Replikationsfaktors RPA weiter bekräftigt. Das Protein RPA,
welches in höheren Eukaryoten das vorherrschende DNA-Einzelstrang-Bindeprotein ist,
stabilisiert entwundene DNA an Replikationsgabeln (Übersicht in Wold, 1997) und ist daher
ein guter Marker für Stellen mit stattfindender Replikation (Edwards et al., 2002). In
einfachen Kernen ließ das Protein RPA (nahezu) immer eine enge Colokalisation mit den
xSAF-A-Strukturen erkennen. Allerdings konnten in Ei-Extrakten, die relativ lange (>3h)
repliziert hatten, auch vereinzelt Kerne gefunden werden, die eine eher homogene Verteilung
von RPA aufwiesen (Daten nicht gezeigt). Höchstwahrscheinlich wurde in diesen Kernen die
Replikationsmaschinerie nach der Beendigung der Replikation aufgelöst.
Auch die replikativen Polymerasen α, δ und ε konnten in einfachen Kernen in Regionen der
(xSAF-A-) Kernmatrixstrukturen gefunden werden. Das Färbemuster war im Vergleich zu
den Proteinen xSAF-A, ORC1 oder RPA aber meist „unschärfer“ und granulärer. So konnten
kleinere Polymerase-Signale auch in anderen (nicht-xSAF-A-) Regionen der Kerne gefunden
werden. Eventuell handelt es sich bei diesen Signalen um chromatingebundene, aber inaktive
Polymerasen, wie dies für inaktive RNA-PolymeraseII-Moleküle, die nicht mit naszierender
RNA colokalisieren, beschrieben ist (Jackson et al., 1998).
Halo-Präparationen an einfachen Kernen ließen eine enge Assoziation zwischen replizierter
DNA und (xSAF-A-) Matrixstrukturen erkennen. Die Resistenz gegenüber der Extraktion mit
2M NaCl sowie die enge Assoziation mit der Kernmatrix scheint eine typische Eigenschaft
von frisch replizierter DNA zu sein (Carri et al., 1986; Dijkwel et al., 1986; Vaughn et al.,
1990).
Durch Pulse-Chase-Experimente konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal direkt demonstriert
werden, daß die frisch replizierte DNA in einfachen Kernen nur transient mit den xSAF-AStrukturen colokalisiert, und sich die replizierte DNA im weiteren Verlauf der DNAReplikation von den xSAF-A-Strukturen fortbewegt. Dies steht mit Pulse-ChaseExperimenten von Hunt & Vogelstein (1981) in Einklang, die in dem Eukaryoten Physarum
polycephalum zeigen konnten, daß im Pulse markierte, frisch replizierte DNA während der
Chase-Phase die Assoziation mit der Kernmatrix verliert. Gleiches lassen Autoradiographien
an Halo-Präparationen von eukaryotischer Zellen erkennen, bei denen mittels [3H]Thymidin
markierte, neu replizierte DNA eine Bewegung von der Basis zur Peripherie von DNASchlaufen zeigt. Dies bestärkt die Hypothese, daß die DNA an der Basis von
Diskussion
136
Chromatinschlaufen durch DNA-Polymerasen, die mit der Kernmatrix komplexiert sind,
repliziert wird (Pardoll et al., 1980; Vogelstein et al. 1980).
Neben den Replikationsfaktoren ORC1, RPA und den Polymerasen α, δ, ε wurde ebenfalls
die Lokalisierung des Replikationsfaktors MCM3 in einfachen Kernen betrachtet. Das Protein
MCM3 ist Bestandteil des heterohexameren Komplexes MCM2-7, welcher während der G1Phase an das Chromatin bindet und dieses für die Replikation lizenziert (Prokhorova & Blow,
2000; Dimitrova et al., 2002). Die Mehrheit der MCM-Komplexe colokalisiert allerdings
nicht mit Stellen der DNA-Replikation, sondern scheint eher entlang des Chromatins verteilt
zu sein (Romanowski et al., 1996; Dimitrova et al., 1999; Edwards et al., 2002). Zum Beispiel
lassen Immunfluoreszenz-Studien an einfachen Kernen, die sich im Xenopus-Ei-Extrakt um
demembranisierte Spermien gebildet haben, eine nahezu homogene MCM3-Färbung erkennen
(Romanowski et al., 1996). Im Verlauf der DNA-Replikation werden die MCM-Proteine nach
und nach vom Chromatin entlassen (Romanowski et al., 1996; Donovan et al., 1997). Kerne,
die ihre DNA noch nicht oder nur zu einem geringen Teil repliziert haben, lassen also eine
deutliche, homogene MCM-Färbung erkennen, wohingegen für Kerne, die in ihrer DNAReplikation weiter fortgeschritten sind, eine schwächere, granulärere MCM-Färbung zu
erwarten ist. Genau dies konnte in einfachen Kernen, die sich um Lambda-DNA gebildet
hatten, beobachtet werden. Die MCM3-Verteilung in den einfachen Kernen ließ zu keinem
Zeitpunkt eine Ähnlichkeit mit dem Färbemuster von xSAF-A erkennen. Weiterhin konnte
keine Colokalisation zwischen MCM3 und replizierter DNA festgestellt werden; eher
schienen sich die beiden Signale auszuschließen, wie es auch in menschlichen Zellen der Fall
ist (Krude et al., 1996).
Die mit dem Xenopus-System gewonnnen Ergebnisse lassen erkennen, daß xSAF-A eine
wichtige Funktion für die Kernbildung und Kernarchitektur wahrnimmt und legen nahe, daß
die Kernmatrix eine Art Plattform für die strukturelle Organisation der DNA-Replikation und
die Entstehung von Replikationsfoci bildet.
Zusammenfassend läßt sich folgendes Szenario in einfachen Kernen entwerfen: Die Kerne
besitzen eine Kernmatrix, zu deren Bestandteilen das S/MAR-bindende Protein xSAF-A
gehört. Das Chromatin ist in Form von Schleifen an dieser „Gerüst“-Struktur verankert.
Ebenfalls sind Proteine der DNA-Initiation und DNA-Replikation (ORC1, RPA, Pol α, δ, ε)
an der Kernmatrix organisiert. Die DNA-Initiation (ORC1) startet an der Kernmatrix, und die
Replikationsgabeln (RPA) verbleiben während des gesamten Prozesses der DNA-Replikation
an der Kernmatrix. Das Chromatin der einfachen Kerne ist mit MCM-Proteinen beladen,
Diskussion
137
wodurch es als kompetent für die Replikation markiert wird. Das replikationskompetente
Chromatin wird während der Replikation durch die an der Matrix immobilisierte
Replikationsmaschinerie (Pol α, δ, ε) gespult. Jede Chromatinschleife könnte dabei eine
unabhängige Replikationseinheit bzw. ein Replikon darstellen. Das Chromatin verliert im
Verlauf der DNA-Replikation seine MCM-Markierung, wodurch verhindert wird, daß bereits
replizierte Chromatinabschnitte nochmals repliziert werden. MCM-gebundenes Chromatin
signalisiert der Replikationsmaschinerie, daß noch unreplizierte DNA im Kern vorliegt. Die
DNA-Replikation fährt dann so lange fort, bis das gesamte Chromatin repliziert und von
MCM-Proteinen befreit ist.
6.2 SAF-A und C280 in komplexen Zellkernen
Im zweiten Abschnitt dieser Arbeit wurden die mit dem Xenopus-System gewonnen Daten
auf ihre Gültigkeit in „echten“ Zellkernen überprüft. Ist SAF-A bzw. die Kernmatrix für die
strukturelle Organisation und Funktionalität komplexer Zellkerne von Bedeutung? Zur
Klärung dieser Frage wurde u.a. auf das SAF-A-Konstrukt C280 zurückgegriffen (Ostendorp,
2001). Das C280-Teilprotein entspricht dem letzten Drittel von SAF-A, in dem die RNABindedomäne (RGG-Box) lokalisiert ist. Zudem ist das letzte Drittel entscheidend für die
Matrixbindung und die intermolekulare Wechselwirkung von SAF-A-Molekülen (Herrmann,
2002; Schwander, 2004). Die im N-Terminus liegende DNA-Bindedomäne (SAF-Box) von
SAF-A fehlt dem C280-Konstrukt. Aus Vorversuchen in der Arbeitsgruppe war bekannt, daß
C280:eGFP exprimierende Zellen nur selten Mitosen erkennen ließen und es nicht möglich
war, Zellinien zu etablieren, die das Konstrukt stabil exprimierten (Fackelmayer, persönliche
Mitteilung). Das SAF-A-Teilprotein scheint also einen negativen Effekt auf die
Zellproliferation auszuüben. Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte beobachtet werden, daß
die Expression von C280:eGFP zu einer starken Störung der Chromatinverteilung von
Zellkernen führt. Das Chromatin erscheint in C280 exprimierenden Zellen zu kollabieren und
konzentriert sich oft fleckenartig in mehrere größere Bereiche des Zellkerns. Auffällig war,
daß sich die C280:eGFP-Strukturen und die DNA-Färbung gegenseitig ausschlossen. Zellen,
die das Gesamtprotein SAF-A:eGFP exprimierten, ließen hingegen einen hohen Grad der
Colokalisation zwischen den SAF-A:eGFP-Strukturen und der DNA-Färbung erkennen und
zeigten
keine
auffälligen
Veränderungen
der
Chromatinstruktur.
Auch
nach
Matrixpräparationen war ein deutlicher Unterschied zwischen den SAF-A- und C280Strukturen zu beobachten, was zu der Annahme führte, daß C280 nicht nur einen Einfluß auf
die Chromatinstruktur hat, sondern auch zu einer Umorganisierung der Kernmatrix führt. Um
Diskussion
138
dies genauer zu untersuchen, wurden die Kernmatrixstrukturen von C280 und SAF-A in
denselben Zellen gefärbt. Hierfür wurde von C280:eGFP exprimierenden Zellen die
Kernmatrix präpariert und anschließend eine Immunfluoreszenz-Färbung mit dem SAF-Aspezifischen Antikörper K371 vorgenommen. Dieser Antikörper erkennt das vordere Drittel
von SAF-A (Ostendorp, 2001) und bindet somit nicht an C280. Wenn C280 keine
Umstrukturierung der (SAF-A-) Kernmatrix zur Folge hat, ist zu erwarten, daß die C280Matrixstrukturen und die typischen SAF-A-Matrixstrukturen in ein und demselben Kern
coexistieren. Hat C280 hingegen einen Einfluß auf die Organisation von SAF-A bzw. die
Kernmatrix, sollten auch die typischen SAF-A-Matrixstrukturen verändert sein. Letzteres war
der Fall. So wiesen die durch den Antikörper K371 gefärbten Matrixstrukturen in den C280exprimierenden Zellen einen hohen Grad der Colokalisation mit den C280-Strukturen auf. Ein
vergleichbares Kollabieren konnte auch für die Matrixstrukturen der Proteine hnRNP-C1/C2
in C280 exprimierenden Zellen festgestellt werden.
Die Beobachtungen lassen folgern, daß in komplexen Zellkernen ein Zusammenhang
zwischen der Organisation von SAF-A bzw. der Kernmatrix und der Strukturierung des
Chromatins besteht. Dies steht gut mit den gemachten Beobachtungen in den einfachen
Kernen im Einklang. Zudem deuten verschiedene Studien (direkt oder indirekt) darauf hin,
daß die Kernmatrix an der strukturellen Aufrechterhaltung und der Organisation von
Chromosomenterritorien beteiligt ist und sich diese nach der Destabilisierung oder der
Zerstörung der Kernmatrix verteilen bzw. auflösen (Haaf & Ward, 1996; Croft et al., 1999;
Ma et al., 1999). Durch Fluoreszenz in situ Hybridisierungen mit Chromosomen-PaintingSonden (spezifisch für Chr. 1 und X) wurde überprüft, ob die gestörte Matrixstruktur in C280
exprimierenden Zellen ebenfalls einen Effekt auf die strukturelle Integrität von
Chromosomenterritorien hat. Die mikroskopische Betrachtung ließ jedoch keine merklichen
Auffälligkeiten zwischen den Chromosomenterritorien in C280:eGFP-transfizierten und
nicht-transfizierten Zellen erkennen. Dies muß aber nicht bedeuten, daß C280 keinen Effekt
auf die Territorien ausübt. So sollten sich zukünftige Experimente mit quantitativen
Positionsvermessungen und Volumenbestimmungen der Chromosomenterritorien befassen,
wie es unter anderem in den Arbeiten von Chandley et al. (1996), Eils et al. (1996), Boyle et
al. (2001) und Tanabe et al. (2002) beschrieben ist.
Möglicherweise sind die Chromosomenterritorien von C280 exprimierenden Zellen aufgrund
der kondensierten und heterochromatischen Erscheinung des Chromatins kompakter als die
Chromosomenterritorien in nicht-transfizierten Kontrollzellen. Aufschlußreich wären auch
Mehrfachhybridisierungen, um zu untersuchen, ob sich die relative Lage einzelner
Diskussion
139
Chromosomen zueinander verändert oder ob sich in C280 exprimierenden Zellen
verschiedene Chromosomenterritorien partiell durchmischen bzw. miteinander überlappen
können.
Die im Xenopus-System gemachte Beobachtung, daß Replikationsfoci in Bereichen von
(xSAF-A-) Matrixstrukturen organisiert sind, sowie die zahlreichen Publikationen und
Modelle, die die Kernmatrix mit der DNA-Replikation in Zusammenhang bringen (z.B. Cook,
1991; Falaschi et al., 2000), ließen erwarten, daß sich die gestörte Matrixorganisation in C280
exprimierenden Zellen negativ auf die DNA-Replikation auswirkt. Dies konnte tatsächlich
beobachtet werden. So ließ nur ein sehr geringer Anteil C280:eGFP exprimierender Zellen
(13%), die über Nacht mit BrdU inkubiert worden waren, einen Einbau des markierten
Nukleotids in DNA erkennen. In Kontrollansätzen lag der Anteil BrdU-positiver Zellen
hingegen 6 bis 7mal höher. Die Kontrollansätze bestanden aus Zellen, die eGFP, SAFA:eGFP bzw. ß-Gal:eGFP exprimierten; als interne Kontrolle dienten Zellen, die während der
Transfektionsprozedur keinen Expressionsvektor aufgenommen hatten. Um auszuschließen,
daß eventuell inkorporiertes BrdU in C280 exprimierenden Zellen aufgrund der stark
gestörten und kondensiert erscheinenden Chromatinstruktur für α-BrdU-Antikörper nicht
zugänglich ist und C280 exprimierende Zellen somit fälschlicherweise als replikationsnegativ
eingestuft
werden,
wurden
Durchflußcytometrie-Experimente
durchgeführt.
Die
Durchflußcytometrie bestätigte die Ergebnisse der BrdU-Versuche. Im Vergleich zu
Kontrollzellen war die Population von C280 exprimierenden Zellen, die einen für die S-Phase
typischen DNA-Gehalt aufwies, drastisch reduziert und kaum wahrnehmbar. Gleiches galt für
C280 exprimierende Zellen mit einem G2-typischen DNA-Gehalt. Die Durchflußcytometrie
ließ eindeutig erkennen, daß die C280 exprimierenden Zellen nahezu ausschließlich einen G1typischen DNA-Gehalt aufwiesen. Dies legt nahe, daß C280 zu einem G1-Arrest des
Zellzyklus führt. Allerdings ist auch ein sehr früher Block in der S-Phase (vor der Elongation)
denkbar.
Um
dies
näher
zu
untersuchen,
wurden
Western-Blot-Analysen
auf
Zellzyklusproteine durchgeführt. Das Hauptaugenmerk galt hierbei den Cyclinen D, E und A,
die zusammen mit ihren assoziierten Cdks (cyclin dependent kinases) eine regulatorische
Schlüsselfunktion für das Voranschreiten der G1-Phase und den Eintritt in die S-Phase
wahrnehmen. Die Expression der Cycline E und A ist periodisch und fluktuiert während des
Zellzyklus. Die D-Typ-Cycline agieren gewissermaßen als Wachstumsfaktor-Sensor, deren
Expression mehr von extrazellulären Bedingungen als von der Position der Zelle im
Zellzyklus abhängt. Sofern mitogene Stimuli vorliegen, werden sie während des gesamten
Diskussion
140
Zellzyklus exprimiert (Übersicht in Sherr, 1996). Cyclin D wird für die Expression von
Cyclin E und die A benötigt (Übersicht in Murray, 2004). In der G1-Phase des Zellzyklus
werden zunächst die D-Typ-Cycline (D1, D2, D3; Matsushime et al., 1991; Motokura et al.,
1991; Xiong et al., 1991) und darauffolgend die E-Typ-Cycline (Cyclin E1 und E2; Koff et
al., 1991; Gudas et al., 1999; Payton & Coats, 2002) exprimiert. Der katalytische Partner für
Cyclin D ist CDK4 oder CDK6, für Cyclin E ist es CDK2 (Morgan, 1995). Die Aktivität von
Cyclin E-CDK2 erreicht ihren Peak am G1/S-Phase-Übergang, danach wird Cyclin E schnell
abgebaut und durch Cyclin A ersetzt (Übersicht in Sherr, 2000).
C280:eGFP exprimierende Zellen ließen im Vergleich zu Kontrollzellen, die SAF-A:eGFP
oder kein Konstrukt exprimierten, keinen Unterschied im Cyclin D2-Gehalt erkennen. Die
Expression von C280 scheint daher zu keiner Störung von Signalwegen zu führen, die in die
Erkennung und Weiterleitung von Wachstumsfaktorreizen involviert sind. Auffällig war
hingegen die
Proteinmenge der Cycline E und A in C280 exprimierenden Zellen. Im
Vergleich zu Kontrollzellen waren die Blot-Banden für die beiden Cycline deutlich reduziert
und nur schwach zu erkennen. Dies läßt darauf schließen, daß die C280 exprimierenden
Zellen früh in der G1-Phase arretiert sind und den Restriktionspunkt der G1-Phase (Übersicht
in Pardee, 1989) nicht überschreiten. Allerdings konnten diese Ergebnisse bei der
Wiederholung des Versuches nicht reproduziert werden. Hier zeigten sich für die Cycline E
und A von C280 exprimierenden Zellen Bandenintensitäten, die denen von Kontrollzellen
ähnlich waren. Aufgrund der unklaren Cyclin-Ergebnisse bedarf es weiterer, exakt
kontrollierter Wiederholungen des Experimentes, um eine gesicherte Aussage über die
Position und Art des Zellzyklusarrestes machen zu können. Zusätzlich könnten Kinase-Assays
durchgeführt werden, um zu testen, ob mit den Cyclinen tatsächlich eine katalytische
Aktivität assoziiert ist, oder ob die CDKs der jeweiligen Cycline durch die Bindung von
CDK-Inhibitoren (CKIs = CDK inhibitors; z.B. Sherr & Roberts, 1999) in ihrer
Kinaseaktivität gehemmt sind. Ergänzend dazu wäre die Durchführung von Western-BlotAnalysen auf CKIs sinnvoll.
Ein dominant negativer Einfluß auf die DNA-Replikation bzw. Proliferation ist auch für die
beiden SAF-A-Konstrukte ∆N45 und SAFG29A bekannt (Kipp et al., 2000; Schwander,
2004). Dem Protein ∆N45 fehlen die ersten 45 Aminosäuren im N-Terminus. In diesem
Bereich ist die DNA-Bindedomäne (SAF-Box) von SAF-A lokalisiert. Bei dem Protein
SAFG29A ist die an der Position 29 hochkonservierte Aminosäure Glycin gegen Alanin
ausgetauscht, wodurch die DNA-Bindefähigkeit der SAF-Box verlorengeht. Die Verteilung
Diskussion
141
von ∆N45:eGFP und SAFG29A:eGFP in Zellkernen ist mit der von C280:eGFP vergleichbar,
und ebenso wie C280 hat die Expression der beiden Konstrukte eine Umstrukturierung des
Chromatins zur Folge. Die S/MAR-DNA-Bindeaktivität scheint somit eine überaus wichtige
Rolle für die richtige Lokalisierung und architektonische Rolle von SAF-A zu spielen. Alle
drei Konstrukte verfügen über den C-terminalen Abschnitt von SAF-A, der für die
Matrixbindung und die Interaktion bzw. Multimerisierung von SAF-A-Proteinen nötig ist
(Herrmann, 2002, Schwander, 2004). Der hervorgerufene negative Effekt der drei Konstrukte
geht höchstwahrscheinlich darauf zurück, daß diese durch ihre Einlagerung in
Matrixstrukturen und SAF-A-Komplexe zu einer lokalen Verdünnung bzw. Verdrängung
endogener SAF-A-Moleküle führen. Da die Bindung einer einzigen SAF-Box an DNA sehr
schwach ist und für eine stabile und spezifische DNA-Bindung immer mehrere (mindestens 5)
SAF-Boxen durch eine Multimerisierung einzelner SAF-A-Moleküle kombiniert werden
müssen (Kipp et al., 2000), reicht wahrscheinlich schon ein verhältnismäßig geringfügiger
Einbau der mutanten SAF-A-Proteine C280, ∆N45 oder SAFG29A in die Multimere aus, um
die kooperative DNA-Bindung der endogenen SAF-A-Proteine zu destabilisieren.
Interessanterweise schien die gestörte Chromatin- und Matrixstruktur in C280 exprimierenden
Zellen keinen Einfluß auf die Transkription zu haben. Zellen, die für einige Stunden mit BrUhaltigem Medium inkubiert worden waren, ließen einen deutlichen Einbau des markierten
Nukleotids in Nucleoli sowie viele kleine Foci innerhalb und außerhalb des Kerns erkennen,
wie dies unter anderem auch in der Arbeit von Pellizzoni et al. (2001) beschrieben ist. Im
Cytoplasma konzentrierten sich die BrU-Signale häufig an einer Seite des Kerns in einem
Bereich, der bei der Betrachtung mittels der DIC-Durchlichtmikroskopie, diffuse Strukturen
erkennen ließ. Vermutlich handelte es sich hierbei um das endoplasmatische Retikulum, an
dem BrU-markierte Transkripte zur Translation angelagert sind. Der Anteil BrU-positiver
Zellen lag sowohl für C280:eGFP exprimierende Zellen als auch für Kontrollzellen, die SAFA:eGFP oder ß-Gal:eGFP exprimierten, bei über 90%. Die stattfindende Transkription in
C280 exprimierenden Zellen verdeutlicht, daß die gestörten, heterochromatisch erscheinenden
Chromatinstrukturen in den Zellen für die Transkriptionsmaschinerie zugänglich sind.
Die Transkriptionsaktivität der C280-transfizierten Zellen eröffnete die Möglichkeit,
Microarray-Analysen durchzuführen. Durch die Verwendung eines Microarrays, der 269
verschiedene Gene des Zellzyklus und der Apoptose abdeckte, sollten nähere Informationen
über die blockierte DNA-Replikation sowie die Art und Weise des Zellzyklus-Arrestes in den
C280 exprimierenden Zellen gesammelt werden. Die Auswertung der Arrays ergab, daß in
Diskussion
142
C280 exprimierenden Zellen die Transkriptmenge von 57 Genen deutlich erhöht und nur von
vier Genen schwach vermindert war. In Zellen, die das Gesamtprotein SAF-A:eGFP
exprimierten, war im Vergleich zu Kontrollzellen keine auffällige Veränderung der
Transkriptmengen der 269 betrachteten Gene feststellbar.
Aus den Microarray-Daten läßt sich ableiten, daß das Protein C280 zu einer Streßsituation
innerhalb der Zelle führt. So war z.B. die Transkriptmenge von Genen der Bcl-2-Familie
verändert. Die Bcl-2-Familie umfaßt sowohl Promotoren als auch Inhibitoren des Zelltodes.
Zu den pro-apoptotischen Bcl-2-Mitgliedern gehören z.B. Bad, Blk, Nip3 und Bok (Yang et
al., 1995; Chen et al., 1997; Hegde et al., 1998; Cory & Adams, 2002). Alle vier Gene waren
in den C280 exprimierenden Zellen hochreguliert. Ein erhöhter mRNA-Gehalt konnte aber
auch für das Gen Bcl-w (Gibson et al., 1996) detektiert werden, welches zu den ApoptoseInhibitoren der Bcl-2-Familie zählt.
Weiterhin waren die Transkriptmengen mehrerer Gene aus der Familie der TNF- (tumor
necrosis factor) Liganden und TNF-Rezeptoren sowie von Genen aus der TRAF-Familie
erhöht. Der Faktor TNF, welcher ein gut bekannter Mediator der Apoptose ist (Smith et al.,
1994), führt z.B. durch die Interaktion von TNFR1 mit TRAF2 zu der Aktivierung des
Transkriptionsfaktors NF-kB (Übersichten in May & Ghosh, 1997; May & Ghosh, 1998)
dessen mRNA-Menge in C280 exprimierenden ebenfalls erhöht war. NF-kB ist in die
Regulation
einer
Vielzahl
verschiedener
zellulärer
Prozesse
(z.B.
Zellwachstum,
Differenzierung, Proliferation, Streß- und Immunantwort) involviert.
Ebenfalls deuten die hochregulierten mRNAs des Hitzeschock-Proteins αB-crystallin (Cryab)
und des Hitzeschock-Transkriptionsfaktors HSF1 auf eine Streßsituation in C280
exprimierenden Zellen hin. Für αB-crystallin sind verschiedene Funktionen beschrieben. In
vitro zeigt das Protein Chaperone-ähnliche Eigenschaften (Ito et al., 2001). In vivo scheint
αB-crystallin eine wichtige Rolle für die Erhaltung und Kontrolle des Cytoskeletts zu spielen
(Lutsch et al., 1997; Quinlan, 2002). Es kann zum einen mit Intermediär-Filamenten vom
TypIII interagieren und deren Zusammenbau modulieren (Djabali et al., 1999), und zum
anderen übt es während Streßsituationen wahrscheinlich eine Schutzfunktion auf das
Cytoskelett aus (Djabali et al., 1999; Verschuure et al., 2002). Das Protein αB-crystallin
verleiht der Zelle eine Resistenz gegenüber verschiedenen Arten von Streß, zudem kann es
die Apoptose inhibieren (Mehlen et al., 1996). Vor dem Hintergrund, daß für C280
exprimierende Zellen des öfteren eine Anfälligkeit gegenüber mechanischer Beanspruchung
beobachtet werden konnte (die Zellen schienen während der Zentrifugation zu lysieren),
Diskussion
143
erscheint die Hochregulation eines Cytoskelett-schützenden Proteins (αB-crystallin) durchaus
plausibel.
Der
Transkriptionsfaktor
HSF1
wird
infolge
eines
Hitzeschocks
oder
anderer
Streßbedingungen aktiviert, wodurch es zu einer gesteigerten Transkription von HSP (heat
shock protein) -Genen kommt (Cotto & Morimoto, 1999; Morano & Thiele, 1999). Die durch
HSF1 eingeleitete Streßantwort bewirkt einen Schutz der Zelle vor der Apoptose, der jedoch
durch TNFα transient abgeschwächt werden kann (Schett et al., 2003). Zudem scheint HSF1
die Aktivierung von NF-kB inhibieren zu können (Bureau et al., 2004).
Auch für die mRNA von p73 konnte in C280 exprimierenden Zellen ein erhöhter Gehalt
festgestellt werden. Das Polypeptid p73 gehört zu der Familie der p53-Proteine. Ebenso wie
p53 kann auch p73 (als Antwort auf DNA-Beschädigungen und Streß) die Apoptose in einer
Vielzahl von Zellinien induzieren und die Transkription von Genen mit p53-„response
elements“ bewirken (Jost et al., 1997; Kaghad et al., 1997). Hierdurch läßt sich
gegebenenfalls auch der erhöhte mRNA-Level von p19INK4d in den C280 exprimierenden
Zellen erklären. Bei dem Protein p19INK4d handelt es sich um einen CDK-Inhibitor, der
spezifisch für die Cyclin-D-Typ-abhängigen Kinasen CDK4 und CDK6 ist (Chan et al., 1995;
Hirai et al., 1995). Diese Kinasen haben eine wichtige Funktion beim Durchschreiten der G1Phase, indem sie den Tumorsuppressor Rb (Retinoblastoma) phosphorylieren und dadurch
inaktiveren (Sherr, 1993; Lundberg & Weinberg, 1998). Unterbleibt die Phosphorylierung
von Rb, z.B. durch die p19INK4d vermittele Inhibierung der Kinasen CDK4 und CDK6, hat
dies einen Zellzyklusarrest in der frühen G1-Phase zur Folge (Übersicht in Sherr, 1996). Auf
den ersten Blick liegt die Annahme nahe, daß die beobachtete Anreicherung von C280
exprimierenden Zellen mit einem G1-Phase-typischen DNA-Gehalt auf einem G1-Arrest
basieren könnte, der durch die Inhibierung der Cyclin-D-abhängigen Kinasen und einer
daraus resultierenden Beibehaltung des aktiven Rb-Status hervorgerufen wird. Allerdings
wurden die C280-Experimente mit Zellen der Tumorzellinie HEK293 durchgeführt. HEK293Zellen sind mit den Adenovirus-Onkogenen E1A und E1B transformiert, die eine
Inaktivierung von p53 und Rb bewirken (Whyte et al., 1988; Löber et al., 2002; Weber et al.,
2002). Zellen mit inaktiviertem Rb-Protein erfahren durch INK4-Proteine keinen G1-Arrest
und benötigen für das Überschreiten des Restriktionspunktes der G1-Phase keine Cyclin-Dabhängigen Kinasen (Übersicht in Sherr, 1996). Ein durch p19INK4d vermittelter G1Zellzyklusarrest in HEK293-Zellen erscheint daher eher unwahrscheinlich. Eventuell führt
p19INK4d aber über einen „Umweg“ zum Zellzyklusarrest, indem es zu einer gesteigerten
Freisetzung von gebundenen Cip/Kip-Proteinen führt. Bei den Cip/Kip-Proteinen handelt es
Diskussion
144
sich um Inhibitoren der Kinase CDK2 (Übersicht in Sherr & Roberts, 1999).
Interessanterweise werden Mitglieder der Cip/Kip-Familie, z.B. p27Kip1 und p21Cip1, durch
Cyclin D-CDK4-Komplexe sequestriert (Sherr & Roberts, 1995). Durch die Bindung von
Vertretern der INK4-Familie an CDK4/6 werden die sequestrierten Cip/Kip-Proteine
freigesetzt, wodurch diese dann die katalytische Aktivität von CyclinE-CDK2 inhibieren und
den Zellzyklus in der G1-Phase arretieren können (Übersicht in Sherr & Roberts, 1999). Die
INK4-Proteine tragen also indirekt zur Inhibierung von CDK2 bei. Allerdings soll diese Art
der CDK2-Inhibierung ungenügend sein, um in Rb-negativen Zellen einen Zellzyklusarrest zu
bewirken (Sherr, 2000). Es ist daher fraglich, ob der Mechanismus in HEK293-Zellen von
Relevanz ist.
Für die mRNA-Level der Cycline in C280 exprimierenden ließen die Microarray-Daten für
das mitotische Cyclin B1 eine Reduktion und für die Cycline D1, D2, A2 und C eine
Erhöhung feststellen. Alle anderen Cyclin-mRNAs (Cyclin A1, B2, E1, E2, F, G1, G2 und H)
waren im Vergleich zu Kontrollzellen unverändert. Das Vorhandensein der mRNA von
Cyclin A2 (S-Phase-Cyclin) dürfte eigentlich dafür sprechen, daß die Zellen in die späte G1Phase bzw. in die S-Phase eintreten können. Interessant erscheint der gesteigerte mRNAGehalt von Cyclin C. Normalerweise besitzen Zellen in der G0-Phase eine erhöhten Cyclin C
Gehalt, und die Aktivität von Cyclin C/CDK3-Komplexen scheint kritisch für den G0/G1Übergang zu sein (Ren & Rollins, 2004). Dies läßt spekulieren, daß C280 exprimierende
Zellen eventuell aus dem Zellzyklus aus- und in die G0-Phase eintreten. Allerdings liegt
Cyclin C auch mit CDK8 in Komplexen vor. Die Cyclin C/CDK8-Komplexe spielen im
Gegensatz zu Cyclin C/CDK3-Komplexen eine wichtige Rolle bei der Regulation der RNAPolymeraseII-Aktivität und der Kontrolle der Transkription, indem sie unter anderem die
carboxyterminale
Domäne
(CTD)
der
großen
RNA-PolymeraseII-Untereinheit
phosphorylieren (Akoulitchev et al., 2000).
In Anbetracht der gestörten Chromatinstruktur in C280 exprimierenden Zellen erscheint es am
naheliegendsten, daß DNA-Beschädigungen und/oder Probleme bei der DNA-Replikation den
Zellzyklus-Arrest induzieren. Dies würde sich gut mit dem deutlich erhöhten mRNA-Level
von XRCC3 in C280 exprimierenden Zellen decken. Der Faktor XRCC3 gehört zu der
Rad51-Proteinfamilie (Liu et al., 1998). Das Protein Rad51 weist sowohl strukturelle als auch
funktionelle Ähnlichkeiten zu dem RecA-Protein aus E. coli auf, welches eine zentrale Rolle
bei der prokaryotischen Antwort auf DNA-Beschädigungen einnimmt (Roca & Cox, 1991;
Kowalczykowski et al., 1994; Friedberg et al., 1995; Shinohara & Ogawa, 1995). In
menschlichen Fibroblasten und Lymphozyten kommt es als Antwort auf DNA-
Diskussion
145
Beschädigungen, z.B. herbeigeführt durch ionisierende bzw. ultraviolette Strahlung oder
DNA-alkylierende Agenzien wie Methylmethansulfonat, zur Ausbildung von Rad51-Foci
(Haaf et al., 1995). Die direkte Interaktion von XRCC3 mit Rad51 scheint wichtig für die
Bildung und Stabilisierung der Rad51-Foci an Stellen der DNA-Beschädigung sowie den
Prozeß der rekombinatorischen DNA-Reparatur zu sein (Bishop et al., 1998). Bedingt durch
die DNA-Läsionen würden dann Signalwege induziert werden, die zum Zellzyklus-Arrest
führen. Zum Beispiel induzieren Doppelstrangbrüche die Aktivierung des Faktors ATM, der
u.a. durch die Phosphorylierung des Tyrosinrestes 15 der CDK2 einen negativen Einfluß auf
die katalytische Aktivität des CDK2-CyclinE-Komplexes ausübt (Costanzo et al., 2000; Falck
et al., 2001), dessen Aktivität jedoch wichtig für die Bindung von Cdc45 und die Aktivierung
von ORIs ist (Walter, 2000); ATM führt in diesem Fall also zum G1-Arrest.
Die aufgeführten Beispiele lassen erkennen, daß C280 zu einer weitgefächerten Antwort
innerhalb der Zellen führt. Letztendlich muß aber bedacht werden, daß sich die MicroarrayDaten auf der Ebene der mRNA bewegen und diese Daten keinen direkten Rückschluß auf die
tatsächlich vorliegenden Proteingehalte der einzelnen Faktoren zulassen. Das heißt, es stehen
noch Western-Blot-Analysen (und CDK-Kinase-Assays) aus, um die Microarray-Daten auf
Proteinebene abzusichern. Erst dann scheint die Postulierung eines Modells, welches den
durch C280 verursachten Zellzyklusarrest erklären kann, ratsam.
Diskussion
146
5.3 Anreicherung von SAF-A in Xi
Eine interessante Beobachtung für SAF-A, die in allen daraufhin betrachteten weiblichen
Zellinien gemacht werden konnte, war dessen Anreicherung in Territorien inaktiver XChromosomen (Xi). Sowohl in Zellkernen der beiden Tumor-Zellinien HEK293 und SF767,
als auch in Zellkernen normaler Fibroblasten der Zellinie IMR90, ließ SAF-A in Bereichen
inaktiver X-Chromosomen eine im Vergleich zum Rest des Kerns auffällige Ansammlung
erkennen. Als Markerprotein für die inaktivierten X-Chromosomen wurde die Histonvariante
macroH2A1.2 verwendet, von der bekannt ist, daß sie im Chromatin inaktivierter XChromosomen konzentriert ist (Costanzi & Pehrson, 1998). Für alle drei Zellinien
colokalisierten die Bereiche, die eine Anreicherung für SAF-A und mH2A1.2 aufwiesen.
Die Inaktivierung von X-Chromosomen erfolgt durch einen mehrstufigen Prozeß. Eine
Schlüsselrolle bei diesem Prozeß spielt eine große, nicht-codierende RNA (XIST-RNA), die
exklusiv vom inaktiven X-Chromosom transkribiert wird und mit diesem im engen Kontakt
bleibt. Die XIST-RNA, die nur in Xi gefunden werden kann, breitet sich nach der
Transkription entlang des X-Chromosoms aus, bis dieses komplett von der RNA umhüllt ist
(Brown et al., 1992). Die eingeschränkte Mobilität der XIST-RNA im Kern und deren
Toleranz gegenüber der nahezu kompletten enzymatischen Entfernung des Chromatins
(-> Matrixpräparation) haben zu der plausiblen Hypothese geführt, daß die XIST-RNA der
Prototyp einer architektonischen RNA ist (Clemson et al., 1996). Interessanterweise konnte in
dieser Doktorarbeit beobachtet werden, daß auch das architektonische Kernprotein SAF-A
seine deutliche Anreicherung in Bereichen inaktiver X-Chromosomen nach der Durchführung
von Matrixpräparationen beibehält. Diese Anreicherung von SAF-A und der XIST-RNA in
Kernmatrixregionen inaktiver X-Chromosomen sowie die Fähigkeit von SAF-A über seine
RGG-Box mit RNA wechselzuwirken, legen nahe, daß beide Faktoren eng miteinander
assoziiert sind. Daß hnRNP-Proteine, zu denen auch SAF-A (hnRNP-U) zählt, an XIST-RNA
binden können, wurde in der Arbeit von Brown & Baldry (1996) demonstriert, die in vitro
eine Wechselwirkung zwischen hnRNP-C1/C2 und der XIST-RNA nachweisen konnten.
Um der Frage nachzugehen, ob die RNA-Bindung von SAF-A eine Rolle für die
Anreicherung in inaktiven X-Chromosomen spielt, wurde auf das SAF-A-Konstrukt ∆RGG
zurückgegriffen, bei dem die RNA-Bindedomäne (RGG-Box) von SAF-A deletiert ist. Im
Gegensatz zu SAF-A:eGFP konnte für das Konstrukt ∆RGG:eGFP keine Anreicherung in
inaktiven X-Chromosomen beobachtet werden. Das Protein SAF-A scheint also tatsächlich
über die Interaktion mit RNA in inaktiven X-Chromosomen konzentriert zu sein. Dies steht
mit der Beobachtung in Einklang, daß SAF-A bei Matrixpräparationen seine deutliche
Diskussion
147
Anreicherung in Bereichen inaktiver X-Chromosomen durch eine Inkubation mit RNase A
verliert. Der Schluß, daß die XIST-RNA zu einer Anreicherung von SAF-A in Xi führt,
erscheint daher plausibel. Der Beweis für eine direkte Wechselwirkung der beiden Moleküle
steht jedoch noch aus.
Auffällig war die Beobachtung, daß Immunfluoreszenzen auf endogenes SAF-A an nichtextrahierten Zellen nur selten bzw. kaum eine Anreicherung von SAF-A in Xi erkennen
ließen. Im Gegensatz dazu zeigten Zellen, an denen eine Immunfluoreszenz auf endogenes
SAF-A nach einer Matrixpräparation durchgeführt wurde, und lebende Zellen, die
SAF-A:eGFP exprimierten, eine deutliche Anreicherung des Proteins in inaktiven XChromosomen. Dies läßt folgern, daß SAF-A in inaktiven X-Chromosomen nicht-extrahierter
Zellen nur schlecht für Antikörper zugänglich ist. Mögliche Ursachen hierfür könnten eine
besonders kompakte Struktur der Kernmatrix und/oder eine Interaktion von SAF-A mit
anderen Faktoren sein, die sterisch mit der Bindung von Antikörpern interferieren. Dies
würde auch erklären, daß frühere Studien bezüglich der SAF-A-Lokalisierung in nichtextrahierten Zellen, die mit den gleichen Antikörpern wie in dieser Doktorarbeit durchgeführt
wurden, keine Anreicherung von SAF-A in Kernregionen inaktivierter X-Chromosomen
erkennen ließen (siehe Neri et al., 1997; Mattern et al., 1999; Verschure et al., 2002).
Die Anreicherung des multifunktionellen Kernproteins SAF-A in Kernmatrix-Regionen von
inaktivierten X-Chromosomen könnte aus mehreren Gründen von Relevanz sein. Es ist z.B.
vorstellbar, daß SAF-A eine Rolle bei der Immobilisierung der XIST-RNA spielt, wodurch
die Diffusion der XIST-RNA in andere Kernregionen und eine illegitime Inaktivierung Xifremder Chromatinabschnitte verhindert wird. Neben der Zurückhaltung der XIST-RNA in Xi
könnte SAF-A auch eine wichtige Funktion für die Verteilung der XIST-RNA in inaktiven XChromosomen haben. Bisher ist noch nicht geklärt, wie sich die XIST-RNA entlang
inaktivierter X-Chromosoms ausbreitet. Nach einem Konzept von Riggs (1990) sind im
X-Chromosom sogenannte „way stations“ oder „boosters“ (spezifische DNA-Sequenzen)
verteilt, die bei der Ausbreitung der XIST-RNA behilflich sein sollen. Ein guter Kandidat für
diese „boosters“ scheinen „long interspersed repetetive sequence elements “ (LINEs) zu sein,
wobei dem LINE-1 Element (L1) eine besondere Rolle zukommen soll (Lyon, 1998). Dieses
Element kommt in X-Chromosomen bedeutend häufiger vor als in autosomaler DNA (Bailey
et al., 2000). Da die XIST-RNA nicht direkt an DNA bindet, wird vermutet, daß die XISTRNA mit den L1-Elementen über Adapter-Proteine bzw. einen RNA-Protein-Komplex in
Wechselwirkung steht (Bailey et al., 2000).
Diskussion
148
Interessanterweise sagt das Programm MAR-Wiz für das menschliche L1-Element (L1.4,
L19092, 6053bp) in zwei großen Bereichen ein hohes MAR-Potential voraus (s. Abb. 58). Da
SAF-A neben seiner RNA-Bindedomäne auch eine DNA-Bindedomäne (SAF-Box) besitzt,
mit der es spezifisch an S/MAR-DNA bindet, erscheint es naheliegend, daß SAF-A eine
Vermittlerfunktion zwischen der XIST-RNA und den L1-Elementen spielen könnte. Die
Beobachtung, daß SAF-A in vitro spezifisch an L1-Elemente bindet (Fackelmayer,
unveröffentlichte Daten) bestärkt diesen Verdacht.
Eine durch SAF-A vermittelte Assoziation der XIST-RNA mit dem Chromatin, könnte auch
zur Stabilisierung der RNA beitragen, da Xist-RNA, die nicht stabil mit dem Chromatin
assoziiert, offensichtlich einem schnellen Abbau unterliegt (Wutz et al., 2002).
Weiterhin besteht die Möglichkeit, daß durch die Anreicherung von SAF-A in Xi eine erhöhte
lokale Dichte von S/MAR-Bindungsstellen geschaffen wird und dies zu einer verstärkten
lokalen Kompaktierung und Inaktivierung des Chromatins beiträgt.
Welche der vorgeschlagenen Funktionen SAF-A in inaktivierten X-Chromosomen ausübt,
muß durch zukünftige Versuche näher geklärt werden. Weiterhin wäre es aufschlußreich zu
untersuchen, ob SAF-A eher wichtig für die Initiation oder die Erhaltung des inaktiven XChromosomenstatus ist.
MAR-Potential
1,00
0,75
0,25
610
1220
1830
5000
2200
0,50
2440
3050
3660
4270
4880
5490
6053
Position in Basenpaaren
Abb. 58: MAR-Potential des humanen L1-Elements. Die Analyse des menschlichen
Line1-Elements (L1.4, 6053bp, Accession: L19092) mit dem Programm MAR-Wiz (Version 1.5)
führt zu der Identifikation von zwei Bereichen, die ein hohes MAR-Potential aufweisen.
Diskussion
149
5.4 Kernmatrix in vivo
Die in dieser Arbeit gezogenen Schlüsse bezüglich der Relevanz einer Kernmatrix basieren in
erster Linie auf Beobachtungen des Proteins SAF-A, welches als Marker für die Kernmatrix
verwendet wurde. Die Verwendung von SAF-A erschien sinnvoll, da es in Xenopus-EiExtrakten und Zellkernen (Fackelmayer & Richter, 1994) in hoher Menge vorkommt und dies
mit einer strukturellen bzw. architektonischen Rolle des Proteins gut vereinbar ist. Zudem ist
SAF-A in klassischen Matrixpräparationen eines der 10 häufigsten Proteine und unter diesen
das einzige mit S/MAR-DNA-Bindeaktivität (Mattern et al., 1996).
Die Matrixpräparationen lassen erkennen, daß SAF-A Bestandteil einer stabilen Struktur ist,
die sich nicht durch DNase- und Hochsalzbehandlungen aus (Zell-)Kernen extrahieren läßt.
Aufgrund der Resistenz gegenüber der Hochsalzextraktion dürfte SAF-A sogar eine
Komponente der 10nm-„Core“-Filamente (He at al., 1990) sein. Die relativ harschen und
unphysiologischen Bedingungen bei der Durchführung klassischer Matrixpräparationen
(0,25M (NH4)2SO4, DNaseI, ~2M NaCl) lassen jedoch berechtigterweise eine kritische
Hinterfragung der Ergebnisse zu. Es sind z.B. Präzipitations- und Aggregationsprozesse
vorstellbar, wodurch die Gefahr besteht, daß präparierte Kernmatrizen artifizielle Strukturen
und verfälschte Proteinzusammensetzungen aufweisen. Kritiker des Konzeptes der
Kernmatrix gehen sogar soweit, die elektronenmikroskopisch sichtbaren Filamentstrukturen
von Matrixpräparationen gänzlich als Artefakt abzutun und die Relevanz einer Kernmatrix für
die Kernarchitektur ernsthaft in Frage zu stellen (z.B. Pederson, 2000a). Handelt es sich bei
den präparierten SAF-A-Kernmatrixstrukturen um Präzipitations- und Aggregationsartefakte?
Kurzum, dem Feld der Kernmatrixforschung fehlen ausreichende Belege, die auf die Existenz
einer Kernmatrix in vivo hindeuten. Um die in vitro bzw. in situ beobachtete Unlöslichkeit
von SAF-A in vivo zu verifizieren, erschien es sinnvoll, Mobilitätsuntersuchungen in
lebenden Zellen durchzuführen. Mittels der Methode der FRAP kann sowohl die
Diffusionsgeschwindigkeit als auch die mobile bzw. immobile Fraktion von fluoreszierenden
Molekülen in lebenden Zellen bestimmt werden. Trotz des hohen Gehalts an DNA, RNA und
Proteinen in Zellkernen, der einen intuitiv an eine viskose, gelartige und stark
diffusionsbeschränkende Umgebung denken läßt, haben FRAP-Experimente der letzten Jahre
gezeigt, daß verschiedenste Proteine, wie z.B. Faktoren des Chromatin-„remodeling, der
Transkriptionsaktivierung, des prä-mRNA-Spleißens oder der rRNA-Prozessierung, innerhalb
des Zellkerns äußerst mobil sind (Huang et al., 1998; Houtsmuller et al., 1999; Pederson,
2000b; Phair & Misteli, 2000; Shopland & Lawrence, 2000; Snaar et al., 2000). Die
gemessene Viskosität des Nucleoplasmas ist nur ungefähr fünfmal höher als die von Wasser
Diskussion
150
(Wachsmuth et al., 2000), was gut zu der Beobachtung paßt, daß sich mit FITC markierte
Dextrane im Zellkern nur ca. viermal langsamer als in wässriger Lösung bewegen (Seksek et
al., 1997). Ein monomeres Protein kann den Zellkern innerhalb weniger Sekunden
durchqueren und selbst große molekulare Komplexe können innerhalb einiger Minuten vom
Zentrum des Kerns zu seiner Peripherie diffundieren (Seksek et al., 1997; Phair & Misteli,
2000).
Welche Mobilität wäre aber für ein Protein zu erwarten, das ein Bestandteil der Kernmatrix
ist? An Cytoskelett-Strukturen durchgeführte FRAP-Experimente lassen nur eine sehr
langsame Rückkehr der Fluoreszenz in geblichene Bereiche erkennen. So benötigt F-Actin für
eine vollkommene Fluoreszenzrückkehr in geblichene Bereiche ~30min (Wang, 1987) und
Vimentin 23 +/- 12min (Yoon et al., 1998). Analog zu den FRAP-Ergebnissen der
Cytoskelett-Strukturen sollten integrale Bestandteile eines vermeintlichen Kerngerüstes
ebenfalls eine deutlich verminderte Mobilität aufweisen. Für Lamin B1 trifft dies zu. Das
Protein ist eine immobile Komponente der Kernlamina und zeigt selbst nach mehreren
Stunden nur eine geringfügige Fluoreszenzrückkehr in geblichene Bereiche (Daigle et al.,
2001). Die in vivo beobachtete Immobilität steht also mit der Unlöslichkeit bzw. der
präparativen Identifizierung des Proteins als Matrixkomponente in Einklang. Aufgrund der
perinukleären Lokalisierung der Lamina stellt dies allerdings keinen Beweis für eine innere
Kerngerüststruktur dar. Häufig verwendete Markerproteine für die innere Kernmatrix sind
NuMA (Nuclear and Mitotic Apparatus, z.B. Harborth et al., 1999; Yu & de la Espina, 1999;
Scholey et al., 2001) und TopoII (TopoisomeraseII, z.B. Berrios et al., 1985; Earnshaw et al.,
1985; Gasser et al., 1986). Allerdings konnte jetzt in neueren Arbeiten demonstriert werden,
daß beide Proteine recht mobil sind. So verhält sich die TopoisomeraseII in vivo wie ein
lösliches Protein (Christensen et al., 2002), und NuMA:eGFP zeigt in FRAP-Experimenten
bereits in weniger als einer Minute eine komplette Fluoreszenzrückkehr (Stenoien et al.,
2003). Die hohe Mobilität macht die Involvierung der beiden Proteine in die Ausbildung einer
in vivo-Kernmatrixstruktur eher unwahrscheinlich. Auch die Beobachtungen, daß
proliferationsinaktive,
ausdifferenzierte
Zellen
nur
sehr
wenige
Moleküle
der
TopoisomeraseII enthalten (Heck & Earnshaw, 1986; Phi-Van & Strätling, 1988) und sich
einfache Kerne in NuMA-depletierten Xenopus-Ei-Extrakten effizient um SpermienChromatin bilden und zudem ihre DNA replizieren können (Merdes & Cleveland, 1998),
sprechen eher gegen eine essentielle Involvierung der beiden Proteine in die Kernarchitektur.
Die in dieser Doktorarbeit durchgeführten FRAP-Experimente an SAF-A:eGFP ließen im
Gegensatz zu NuMA und der TopoisomeraseII einen hohen Grad der Immobilität im Zellkern
Diskussion
151
erkennen. Ungefähr 80% des SAF-A-Proteins scheinen in vivo immobilisiert zu sein, da
innerhalb von ~50s lediglich eine Fluoreszenzrückkehr von ~20% in geblichene Bereiche
beobachtet
werden
konnte.
Selbst
in
FRAP-Langzeitversuchen,
bei
denen
der
Beobachtungszeitraum nach dem Bleichen auf 12,5 Minuten ausgedehnt wurde, kehrten nur
<25% der SAF-A:eGFP-Fluoreszenz zurück (Fackelmayer, unveröffentlichte Daten). Die
zwischen 20 und 25% liegende mobile Fraktion von SAF-A, die mittels FRAP bestimmt
wurde, stimmt gut mit früheren Daten von Zellfraktionierungen überein, bei denen gezeigt
werden konnte, daß ~25% des Proteins löslich vorliegen (Fackelmayer et al., 1994).
Als inertes Kontrollprotein wurde bei den FRAP-Messungen das Fusionsprotein ßGalaktosidase-NLS-eGFP (Sorg & Stamminger, 1999) verwendet, dessen apparentes
Molekulargewicht (~140kDa) mit dem von SAF-A:eGFP vergleichbar ist. Im Gegensatz zu
SAF-A ließ die ß-Galaktosidase bereits innerhalb weniger Sekunden eine vollständige
Fluoreszenzrückkehr in geblichene Bereiche erkennen, was verdeutlicht, daß Proteine mit
einem Molekulargewicht von SAF-A prinzipiell frei im Kern diffundieren können. Die
ausgeprägte Immobilität von SAF-A in vivo steht mit der beobachteten Unlöslichkeit von
SAF-A bei Matrixpräparationen in Einklang. Das Vorkommen von SAF-A in präparierter
Kernmatrix scheint daher kein Aggregationsartefakt zu sein, welches durch die Entfernung
der DNA hervorgerufen wird (Cremer & Cremer, 2001). Dafür spricht auch die Beobachtung,
daß sich die SAF-A-Strukturen während der Extraktion von Zellen nicht wesentlich
verändern; die SAF-A-Strukturen in ein und derselben Zelle sehen vor und nach einer
klassischen Matrixpräparation ähnlich aus.
Mit SAF-A scheint daher zum ersten Mal ein Protein gefunden zu sein, welches nicht nur in
vitro, sondern auch in vivo die Existenz einer Kernmatrix belegt.
Die geringe Mobilität von SAF-A konnte auch für C280 (letztes Drittel von SAF-A)
beobachtet werden, was die Theorie bekräftigt, daß der störende Einfluß von C280 auf die
DNA-Replikation und die Chromatinstruktur durch eine Einlagerung des Konstruktes in die
Kernmatrix hervorgerufen wird. Eine vergleichbare Immobilität wurde auch für das SAF-AKonstrukt ∆N45 festgestellt, welches durch die Deletion der ersten 45 Aminosäuren seine
Fähigkeit zur DNA-Bindung verloren hat. Die beiden Konstrukte verdeutlichen, daß die
DNA-Bindeaktivität unwesentlich für die Immobilisierung ist. Vielmehr scheint das letzte
Drittel von SAF-A essentiell für die Assoziation mit der Kernmatrix zu sein. Dies steht mit
den FRAP-Ergebnissen für das vordere (N280:eGFP) und mittlere Drittel (I280:eGFP) von
SAF-A in Einklang, die beide bereits binnen kürzester Zeit (~3s bzw. ~0,8s) eine komplette
Fluoreszenzrückkehr in geblichene Bereiche erkennen ließen. An der Immobilisierung von
Diskussion
152
SAF-A nicht unwesentlich beteiligt ist dagegen die im letzten Drittel des Proteins gelegene
RNA-Bindedomäne (RGG-Box). Die Deletion der RGG-Box hat nahezu eine Verdreifachung
der mobilen Fraktion von SAF-A (Konstrukt: ∆RGG) zur Folge. Die Involvierung der RNABindedomäne in die Immobilisierung von SAF-A, scheint auch vor dem Hintergrund
plausibel, daß naszierende RNA (hnRNA) nahezu quantitativ mit isolierter Kernmatrix
assoziiert bleibt (He et al., 1990). Neben der RGG-Box müssen aber noch weitere Domänen
im C-terminalen Drittel von SAF-A existieren, die zur Immobilisierung beitragen. Dies läßt
sich aus den FRAP-Daten für das Konstrukt ∆N45∆RGG ableiten, welches trotz der Deletion
der DNA- und RNA-Bindedomäne immer noch eine immobile Fraktion von ~15% aufweist.
In
Frage
kommen
hierfür
die
in
den
letzten
85AS
von
SAF-A
lokalisierte
Multimerisierungsdomäne (Schwander, 2004) und die weiter N-terminal gelegene MatrixBindedomäne, deren Position noch nicht genauer eingegrenzt werden konnte. Das
Vorhandensein der Multimerisierungsdomäne ist sogar essentiell für die Immobilisierung des
Proteins. Dies geht aus FRAP-Experimenten an ∆C85:eGFP hervor, die keine immobile
Fraktion und eine mittlere Halbwertszeit der Fluoreszenzrückkehr von weniger als ~3s
erkennen lassen (Sachse, 2004).
Zukünftige FRAP-Experimente sollten sich auf weitere vermeintliche Strukturkomponenten
der Kernmatrix konzentrieren, um zu untersuchen, ob auch für diese eine hohe Immobilität,
die für die Existenz eines Kerngerüstes in vivo sprechen würde, nachweisbar ist.
Ein guter Kandidat dürfte z.B. das Protein EAST sein, bei dem es sich offensichtlich um die
Komponente eines dynamischen und expandierbaren Kerngerüstes im extrachromosomalen
Raum von Zellkernen aus Drosophila handelt (Wasser & Chia, 2000).
Zusammenfassung
153
7. Zusammenfassung
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die Rolle des Proteins SAF-A („Scaffold Attachment
Factor A“) für die Kernarchitektur untersucht. Hierbei wurden sowohl einfache Kerne, die
sich in vitro in Xenopus-Ei-Extrakt um Lambda DNA-gebildet hatten, als auch komplexe
Zellkerne eukaryotischer Zellen betrachtet.
Für den Prozeß der Kernbildung in vitro und die Architektur einfacher Kerne konnte das im
Xenopus-Ei-Extrakt enthaltene Protein xSAF-A als eine wichtige Komponente identifiziert
werden. In einfachen Kernen ist xSAF-A in flecken- und filamentförmigen Strukturen
lokalisiert, die Bestandteil der Kernmatrix sind. An diesen Strukturen ist das umgebende
Chromatin organisiert und verankert. Zudem konnte durch die Verwendung der einfachen
Kerne zum ersten Mal demonstriert werden, daß der Prozeß der DNA-Replikation an
(xSAF-A) Matrixstrukturen erfolgt.
In Zellkernen humaner Zellen konnte im Vergleich zu einfachen Kernen eine wesentlich
homogenere Verteilung des Proteins SAF-A beobachtet werden. Auch hier ist SAF-A eine
Komponente der Kernmatrix. Auffällig ist die deutliche Anreicherung von SAF-A in
inaktiven X-Chromosomen (Xi), was auf eine Involvierung des Proteins in die Initiation
und/oder Erhaltung des transkriptionell inaktiven Status hindeutet. Die Umverteilung der
nativen Lokalisierung von SAF-A innerhalb der Kernmatrix durch das dominant negative
SAF-A-Konstrukt C280 ist mit einer Störung der höheren Chromatinorganisation, einem
Zellzyklus-Arrest und einer stark verminderten DNA-Replikation verbunden. Zudem konnte
durch FRAP-Experimente an dem Protein SAF-A erstmalig eine Kernmatrixkomponente
identifiziert werden, die in lebenden Zellen eine hohe Immobilität aufweist.
Zusammenfassend kann festgehalten werden, daß das Protein SAF-A sowohl in einfachen als
auch in komplexen Kernen eine bedeutende Rolle für die Kernarchitektur und die damit
verbundene
Kernfunktion
wahrnimmt.
Das
Protein
ist
ein
Bestandteil
von
Kernmatrixstrukturen, die offensichtlich in die höhere Organisation des Chromatins involviert
sind und als strukturelle „Plattform“ für den Prozeß der DNA-Replikation dienen.
Literatur
154
8. Literatur
Adachi, Y., Käs, E., Laemmli, U.K., Preferential, cooperative binding of DNA topoisomerase II to scaffoldassociated regions, EMBO J., 8, 3997-4006 (1989).
Akoulitchev, S., Chuikov, S., Reinberg, D., TFIIH is negatively regulated by cdk8-containing mediator
complexes, Nature, 407, 102-106 (2000).
Allan, J., Mitchell, T., Harborne, N., Boehm, L., Crane-Robinson, C., Roles of H1 domains in determining
higher order chromatin structure and H1 location, J. Mol. Biol., 187, 591-601 (1986).
Allison, D.C., Nestor, A.L., Evidence for a relatively random array of human chromosomes in the mitotic ring,
J. Cell. Biol., 145, 1-14 (1999).
Altman, A.L., Fanning, E., The Chinese hamster dihydrofolate reductase replication origin beta is active at
multiple ectopic chromosomal locations and requires specific DNA sequence elements for activity, Mol. Cell.
Biol., 21, 1098-1110 (2001).
Amati, B.B., Gasser, S.M., Chromosomal ARS and CEN elements bind specifically to the yeast nuclear
scaffold, Cell, 54, 967-978 (1988).
Aris, J. P., Blobel, G., cDNA cloning and sequencing of human fibrillarin, a conserved nucleolar protein
recognized by autoimmune antisera, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 931-935 (1991).
Axelrod, D., Koppel, D.E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W.W., Mobility measurements by analysis of
fluorescence photobleaching recovery kinetics, Biophys. J., 16, 1055-1069 (1976).
Bailey, J.A., Carrel, L., Chakravarti, A., Eichler, E.E., Molecular evidence for a relationship between LINE-1
elements and X chromosome inactivation: the Lyon repeat hypothesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 66346639 (2000).
Bambra, R.A., Murante, R.S., Henricksen, L.A., Enzymes and reactions at the eukaryotic DNA replication
fork, J. Biol. Chem., 272, 4647-4650 (1997).
Barr, M.L., Bertram, E.G., A morphological distinction between neurones of the male and female, and the
behaviour of the nucleolar satellite during accelerated nucleoprotein synthesis, Nature, 163, 676-677 (1949).
Barr, M.L., Carr, D.H., Correlation between sex chromatin and chromosomes, Acta Cytol., 6, 34-45 (1962).
Beck, J.S., Variations in the morphological patterns of ’autoimmune’ nuclear fluorescence, Lancet, 1, 12031205 (1961).
Bell, S.P., Stillman, B., ATP-dependent recognition of eukaryotic origins of DNA replication by a multiprotein
complex, Nature, 357, 128-134 (1992).
Belmont, A.S., Bruce, K., Visualization of G1 chromosomes: a folded, twisted, supercoiled chromonema model
of interphase structure, J. Cell Biol., 127, 287-302 (1994).
Benbow, W., Ford, C., Cytoplasmic control of nuclear DNA synthesis during early development of Xenopus
laevis: a cell-free assay, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 2437-2441 (1975).
Benedetti, P., Baldi, M., Mattoccia, Tocchini-Valentini, G., Purification and characterization of Xenopus
laevis topoisomerase II, EMBO J., 2, 1303-1308 (1983).
Berezney, R., Coffey, D.S., Identification of a nuclear protein matrix, Biochem. Biophys. Res. Commun., 60,
1410-1417 (1974).
Berezney, R., Organization and functions of the nuclear matrix, In Chromosomal Nonhistone Proteins, 4 (ed.
L.L. Hnilica; Boca Raton, FL: CRC Press), 119-180 (1984).
Literatur
155
Berezney, R., The nuclear matrix: A heuristic model for investigating genomic organization and function in the
cell nucleus, J. Cell. Biochem., 47, 109-123 (1991).
Berezney, R., Mortillaro, M.J., Ma, H., Wei, X., Samarabandu, J., The nuclear matrix: A structural milieu
for genomic function, Int. Rev. Cytol., 162A, 1-65 (1995).
Berezney, R., Wei, X., The new paradigm: Integrating genomic function and nuclear architecture, J. Cell.
Biochem. Suppl., 30-31, 238-242 (1998).
Berezney, R., Dubey, D.D., Huberman, J.A., Heterogeneity of eukaryotic replicons, replicon clusters, and
replication foci, Chromosoma, 108, 471-484 (2000).
Berrios, M., Osheroff, N., Fisher, P.A., In situ localization of DNA topoisomerase II, a major polypeptide
component of the Drosophila nuclear matrix fraction, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4142-4146 (1985).
Bestor, T.H., Gene silencing. Methylation meets acetylation, Nature, 393, 311-320 (1998).
Biamonti, G., Paixao, S., Montecucco, A., Peverali, F.A., Riva, S., Falaschi, A., Is DNA sequence sufficient
to specify DNA replication origins in metazoan cells ?, Chromosome Res., 11, 403-412 (2003).
Bickmore, W.A., Oghene, K., Visualizing the spatial relationships between defined DNA sequences and the
axial region of extracted metaphase chromosomes, Cell, 84, 95-104 (1996).
Bickmore, W.A., Craig, J.M., Chromosome Bands: Patterns in the Genome, Springer-Verlag, Heidelberg
(1997).
Bishop, D.K., Ear, U., Bhattacharyya, A., Calderone, C., Beckett, M., Weichselbaum, R.R., Shinohara, A.,
Xrcc3 is required for assembly of Rad51 complexes in vivo, J. Biol. Chem., 273, 21482-21488 (1998).
Blow, J.J., Control of chromosomal DNA replication in the early Xenopus embryo, EMBO J., 20, 3293-3297
(2001).
Blow, J.J., Gillespie, P.J., Francis, D., Jackson, D.A., Replication origins in Xenopus egg extract are 5-15
kilobases apart and are activated in clusters that fire at different times, J. Cell Biol., 152, 15-25 (2001).
Blow, J.J., Laskey, R.A., Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of
Xenopus eggs, Cell, 47, 577-587 (1986).
Bode, J., Maass, K., Chromatin domain surrounding the human interferon-ß gene as defined by scaffoldattached regions, Biochemistry, 27, 4706-4711 (1988).
Bode, J., Kohwi, Y., Dickinson, L., Joh, T., Klehr, D., Mielke, C., Kohwi-Shigematsu, T., Biological
significance of unwinding capability of nuclear matrix-associating DNAs, Science, 255, 195-197 (1992).
Bode, J., Benham, C., Knopp, A., Mielke, C., Transcriptional augmentation modulation of gene expression by
scaffold/matrix-attached regions (S/MAR elements), Crit. Rev., Eukaryot. Gene Expr., 10, 73-90 (2000).
Boulikas, T., Chromatin domains and prediction of MAR sequences, Int Rev. Cytol., 162A, 279-388 (1995).
Boveri, T., Die Blastomerenkerne von Ascaris megalocephala und die Theorie der Chromosomenindividualität,
Archiv für Zellforschung, 3, 181-286 (1909).
Boyle, S., Gilchrist, S., Bridger, J.M., Mahy, N.L., Ellis, J.A., Bickmore, W.A., The spatial organization of
human chromosomes within the nuclei of normal and emerin-mutant cells, Hum. Mol. Genet., 10, 211-219
(2001).
Bradford, M. M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing
the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem., 72, 248-254 (1976).
Bravo, R., Macdonald-Bravo, H., Existence of two populations of cyclin/proliferating cell nuclear antigen
during the cell cycle: association with DNA replication sites, J. Cell Biol., 105, 1549-1554 (1987).
Literatur
156
Brewer, B.J., Fangman, W.L., The localization of replication origins on ars plasmids in Saccharomyces
cerevisiae, Cell, 51, 463-471 (1987).
Brockdorf, N., X-chromosome inactivation: closing in on proteins that bind Xist RNA, Trends Genet., 18, 352358 (2002).
Brown, C.J., Lafreniere, R.G., Powers, V.E., Sebastio, G., Ballabio, A., Pettigrew, A.L., Ledbetter, D.H.,
Levy, E, Craig, I.W., Willard, H.F., Localization of the X inactivation centre on the human X chromosome in
Xq13, Nature, 349, 82-84 (1991).
Brown, C.J., Hendrich, B.D., Rupert, J.L., Lafreniere, R.G., Xing, Y., Lawrence, J., Willard, H.F., The
human XIST gene: analysis of a 17kb inactive X-specific RNA that contains conserved repeats and is highly
localized within the nucleus, Cell, 71, 527-542 (1992).
Brown, C.J., Baldry, S.E., Evidence that heteronuclear proteins interact with XIST RNA in vitro, Somat. Cell
Mol. Genet., 22, 403-417 (1996).
Bureau, W.D., Melotte, D., Christians, E., Gustin, P., Evidence for a role of heat shock factor 1 in inhibition
of NF-kappaB pathway during heat shock response-mediated lung protection, Am. J. Physiol. Lung Cell Mol.
Pysiol., 287, 953-961 (2004).
Burke, B., Gerace, L., A cell-free system to study reassembly of the nuclear envelope at the end of mitosis,
Cell, 44, 639-652 (1986).
Busa, W.B., Nuccitelli, R., An elevated free cytosolic Ca2+ wave follows fertilization in the eggs of the frog
Xenopus laevis, J. Cell. Biol., 100, 1325-1329 (1985).
Buvoli, M., Biamonti, G., Tsoulfas, P., Bassi, M.T., Ghetti, A, Riva, S., Morandi, C., cDNA cloning of
human hnRNP protein A1 reveals the existence of multiple mRNA isoforms, Nucleic Acids Res., 16, 3751-3770
(1988).
Cai, S., Han, H-F, Kohwi-Shigematsu, T., Tissue-specific nuclear architecture and gene expression regulated
by SATB1, Nature Genetics, 34, , 42-51 (2003).
Cai, S., Kowhi-Shigematsu, T., Intranuclear relocalization of matrix binding sites during T cell activation
detected by amplified fluorescence in situ hybridization, Methods, 19, 394-402 (1999).
Calapez, A., Pereira, H.M., Calado, A., Braga, J., Rino, J., Carvalho, C., Tavanez, J.P., Wahle, E., Rosa,
A.C., Carmo-Fonseca, M., The intranuclear mobility of messanger RNA binding proteins is ATP dependent
and temperature sensitive, J. Cell Biol., 159, 795-805 (2002).
Cardoso, M.C., Leonhardt, H., Nadal-Ginard, B., Reversal of terminal differentiation and control of DNA
replication: Cyclin A and Cdk2 specifically localize at subnuclear sites of DNA replication, Cell, 74, 979-992
(1993).
Carri, M.T., Micheli, G., Graziano, E., Pace, T., Buongiorno-Nardelli, M., The relationship between
chromosomal origins of replication and the nuclear matrix during the cell cycle, Exp. Cell Res., 164, 426-436
(1986).
Celis, J.E., Celis, A., Cell cycle-dependent variations in the distribution of the nuclear protein cyclin
proliferating cell nuclear antigen in cultured cells: subdivision of S phase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 32623266 (1985).
Chan, F.K.M., Zhang, J., Chen, L., Shapiro, D.N., Winoto, A., Identification of human/mouse p19, a novel
CDK4/CDK6 inhibitor with homology to p16ink4, Mol. Cell. Biol., 15, 2682-2688 (1995).
Chandley, A.C., Speed, R.M., Leitch, A.R., Different distributions of homologous chromosomes in adult
human Sertoli cells and in lymphocytes signify nuclear differentiation, J. Cell Sci., 109, 773-776 (1996).
Chen, C.-Y., Graham, J., Yan, H., Evidence for a Replication Function of FFA-1, the Xenopus Orthologue of
Werner Syndrome Protein, J. Cell Biol., 152, 985-996 (2001).
Literatur
157
Chen, G., Ray, R., Dubik, D., Shi, L., Cizeau, J., Bleackley, R.C., Saxena, S., Gietz, R.D., Greenberg, A.H.,
The E1B 19K/Bcl-2-binding Protein Nip3 is a Dimeric Mitochondrial Protein that Activates Apoptosis, J. Exp.
Med., 186, 1975-1983 (1997).
Choi, Y.D., Dreyfuss, G., Isolation of the heterogeneous nuclear RNA-ribonucleoprotein complex (hnRNP): a
unique supramolecular assembly, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 7471-7475 (1984).
Chong, J.P., Mahbubani, H.M., Khoo, C.Y., Blow, J.J., Purification of an MCM-containing complex as
component of the DNA replication licensing system, Nature, 375, 418-421 (1995).
Chou, D.M., Petersen, P., Walter, J.C., Walter, G., Protein Phosphatase 2A regulates binding of Cdc45 to the
prereplication complex, J. Biol. Chem., 277, 40520-40527 (2002).
Christensen, M.O., Larsen, M.K., Barthelmes, H.U., Hock, R., Andersen, C.L., Kjeldsen, E., Knudsen,
B.R., Westergaard, O., Boege, F., Mielke, C., Dynamics of human DNA topoisomerse IIalpha and IIbeta in
living cells, J. Cell. Biol., 157, 31-44 (2002).
Clemson, C.M., McNeil, J.A., Willard, H.F., Lawrence, J.B., XIST RNA paints the inactive X chromosome at
interphase: evidence for a novel RNA involved in nuclear/chromosome structure, J. Cell Biol., 132, 259-275
(1996).
Cockerill, P.N., Garrard, W.T., Chromosomal loop anchorage sites appear to be evolutionary conserved, FEBS
Lett., 205, 5-7 (1986).
Cook, P.R., The nucleoskeleton and the topology of transcription, Eur. J. Biochem., 185, 487-501 (1989).
Cook, P.R., The nucleoskeleton and the topology of replication, Cell, 66, 627-635 (1991).
Cook, P.R., RNA polymerase: Structural determinant of the chromatin loop and the chromosome, BioEssays,
16, 425-430 (1994).
Cook, P.R., The organization of replication and transcription, Science, 284, 1790-1795 (1999).
Cory, S., Adams, J.M., The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch, Nat. Rev. Cancer, 2,
647-656 (2002).
Costanzi, C., Pehrson, J.R., Histone macroH2A1 is concentrated in the inactive X chromosome of female
mammals, Nature, 393, 599-601 (1998).
Costanzo, V., Robertson, K., Ying, C.Y., Kim, E., Avvedimento, E., Gottesman, M., Grieco, D., Gautier, J.,
Reconstitution of an ATM-dependent checkpoint that inhibits chromosomal DNA replication following DNA
damage, Mol. Cell, 6, 649-659 (2000).
Cotto, J.J., Morimoto, R.I., Stress-induced activation of the heat-shock response: cell and molecular biology of
heat-shock factors, Biochem. Soc. Symp., 64, 105-118 (1999).
Coverley, D., Wilkinson, H.R., Downes, C.S., A protein kinase-dependent block to reinitiation of DNA
replication in G2 phase in mammalian cells, Exp. Cell. Res., 225, 294-300 (1996).
Cox, L.S., Laskey, R.A., DNA replication occurs at discrete sites in pseudonuclei assembled from purified DNA
in vitro, Cell, 66, 271-275 (1991).
Craig, J.M., Bickmore, W.A., Chromosome bands – flavours to savour, BioEssays, 15, 349-354 (1993).
Cremer, T., Cremer, C., Schneider, T., Baumann, H., Hens, L., Kirsch-Volders, M., Analysis of
chromosome position in the interphase nucleus of Chinese hamster cells by laser-UV-mircoirradiation
experiments, Hum. Genet., 62, 201-209 (1982a).
Cremer, T., Cremer, C., Schneider , T., Baumann, H., Luedtke, E.K., Sperling, K., Teuber, V., Zorn, C.,
Rabl’s model of the interphase chromosome arrangement tested in Chinese hamster cells by premature
chromosome condensation and laser UV-microbeam experiments, Hum. Genet., 60, 46-56 (1982b).
Literatur
158
Cremer, T., Kreth, G., Koester, H., Fink, R.H., Heintzmann, R., Cremer, M., Solovei, I., Zink, D., Cremer,
C., Chromosome territories, interchromatin domain compartment and nuclear matrix. An integrated view of
functional nuclear architecture, Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expression, 12, 179-212 (2000).
Cremer, T., Cremer, C., Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells,
Nature Genetics, 2, 292-299 (2001).
Croft, J.A., Bridger, J.M., Perry, P., Boyle, S., Teague, P., Bickmore, W.A., Differences in the localization
and morphology of chromosomes in the human nucleus, J. Cell Biol., 145, 1119-1131 (1999).
Daigle, N., Beaudouin, J., Hartnell, L., Imreh, G., Hallberg, E., Lippincott-Schwartz, J., Ellenberg, J.,
Nuclear pore complexes form immobile networks and have a very low turnover in live mammalian cells, J. Cell
Biol., 154, 71-84 (2001).
Davie, J.R., The nuclear matrix and the regulation of chromatin organization and function, Int. Rev. Cytol.,
162A, 191-250 (1995).
Davie, J.R., Covalent modifications of histones: expression from chromatin templates, Curr. Opin. Dev., 8, 173178 (1998).
Davis, M., Hatzubai, A., Andersen, J.S., Ben-Shushan, E., Fisher, G..Z., Yaron, A., Bauskin, A., Mercurio,
F., Mann, M., Ben-Neriah, Y., Pseudosubstrate regulation of the SCF(beta-TrCP) ubiquitin ligase by hnRNPU, Genes Dev., 16, 439-451 (2002).
De Robertis, E., Lienhard, S., Parisot, R., Intracellular transport of mircoinjected 5S and small nuclear RNAs,
Nature, 295, 572-577 (1982).
DePamphilis, M.L., Replication origins in metazoan chromosomes: fact or fiction, BioEssays, 21, 186-197
(1999).
DePamphilis, M.L., Review: nuclear structure and DNA-replication, J. Struct. Biol., 129, 186-197 (2000).
Dickinson, L.A., Joh, T., Kohwi, Y., Kohwi-Shigematsu, T., A tissue specific MAR/SAR DNA-binding
protein with unusual binding site recognition, Cell, 70, 631-645 (1992).
Dickinson, L.A., Kohwi-Shigematsu, T., Nucleolin is a matrix attachment region DNA-binding protein that
specifically recognizes a region with high base-unpairing potential, Mol. Cell Biol., 15, 456-65 (1995).
Dietzel, S, Jauch, A., Kienle, D., Qu, G., Holtgreve-Grez, H., Eils, R., Münkel, C., Bittner, M., Meltzer,
P.S., Trent, J.M., Cremer, T., Separate and variably shaped chromosome arm domains are disclosed by
chromosome arm painting in human cell nuclei, Chromosome Res., 6, 25-33 (1998).
Dijkwel , P.A., Wenink, P.W., Poddighe, J., Permanent attachment of replication origins to the nuclear matrix
in BHK-cells, Nucleic Acids Res., 14, 3241-3249 (1986).
Dimitrova, D.S., Gilbert, D.M., The spatial position and replication timing of chromosomal domains are both
established in early G1 phase, Mol. Cell, 4, 983-993 (1999).
Dimitrova, D.S., Todorov, I., Melendy, T., Gilbert, D.M., Mcm2, but not RPA, is a component of the
mammalian early G1-phase prereplication complex, J. Cell Biol., 146, 709-722 (1999).
Dimitrova, D.S., Berezney, R., The spatio-temporal organization of DNA replication sites is identical in
primary, immortalized and transformed mammalian cells, J. Cell. Sci., 115, 4037-4051 (2002).
Dimitrova, D.S., Prokhorova, T.A., Blow, J.J., Todorov, I.T., Gilbert, D.M., Mammalian nuclei become
licensed for DNA replication during late telophase, J. Cell Sci., 115, 51-59 (2002).
Disteche, C.M., Escape from X inactivation in human and mouse, Trends Genet., 11, 17-22 (1995).
Djabali, K., Piron, G., de Nechaud, B., Portier, M.M., αB-crystallin interacts with cytoplasmic intermediate
filament bundles during mitosis, Exp. Cell Res., 253, 649-662 (1999).
Literatur
159
Donovan, S., Harwood, J., Drury, L.S. Diffley, J.F., Cdc6p-dependent loading of Mcm proteins onto prereplicative chromatin in budding yeast, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 5611-5616 (1997).
Downes, M., Ordentlich, P., Kao, H.-Y., Alvarez, J.G.A., Evans, R.M., Identification of a nuclear domain
with deacetylase activity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 10330-10335 (2000).
Dundr, M., Misteli, T., Functional architecture in the cell nucleus, Biochem. J., 556, 297-310 (2001).
Dyck, J.A., Maul, G.G., Miller, W.H.J., Chen, D.K., Kakizuka, A., Evans, R.M., A novel macromolecular
structure is a target of the promyelocytic-retionic acid receptor oncoprotein, Cell, 76, 333-343 (1994).
Earnshaw, W.C., Halligan, B., Cooke, C.A., Heck, M.M., Liu, L.F., Topoisomerase II is a structural
component of mitotic chromosome scaffolds, J. Cell Biol., 100, 1706-1715 (1985).
Edwards, M.C., Tutter, A.V., Cvetic, C., Gilbert, C.H., Prokhorova, T.A., Walter, J.C., MCM2-7
complexes bind chromatin in a distributed pattern surrounding the origin recognition complex in Xenopus egg
extract, J. Biol. Chem., 277, 33049-33057 (2002).
Eggert, M., Michel, J., Schneider, S., Bornfleth, H., Baniahmadet, A., Fackelmayer, F.O., Schmidt, S.,
Renkawitz, R., The glucocorticoid receptor is associated with the RNA-binding nuclear matrix protein hnRNP
U, J. Biol. Chem., 272, 28471-28478 (1997).
Eggert, H., Schulz, M., Fackelmayer, F.O., Renkawitz, R., Eggert, M., Effects of the heterogeneous nuclear
ribonucleoprotein U (hnRNP U/SAF- A) on glucocorticoid-dependent transcription in vivo, J. Steroid Biochem.
Mol. Biol., 78, 59-65 (2001).
Eils, R., Dietzel, S., Bertin, E., Schröck, E., Speicher, M.R., Ried, T., Robert-Nicoud, M., Cremer, C.,
Cremer, T., Three-dimensional reconstruction of painted human interphase chromosome territories have similar
volumes but differ in shape and surface structure, J. Cell. Biol., 135, 1427-1440 (1996).
Fackelmayer, F.O., Dahm, K., Renz, A., Ramsperger, U., Richter, A., Nucleic acid-binding properties of
hnRNP-U/SAF-A, a nuclear matrix protein which binds DNA and RNA in vivo and in vitro, Eur. J. Biochem.,
221, 749-757 (1994).
Fackelmayer, F.O., Richter, A., Purification of two isoforms of hnRNP-U and characterization of their nucleic
acid binding activity, Biochemistry, 33, 10416-10422 (1994).
Fackelmayer, F. O., Die Architektur des Zellkerns, Biospektrum, 6, 441-444 (2000).
Falaschi, A., Eukaryotic DNA replication – a model for a fixed double replisome, Trends Genet., 16, 88-92
(2000).
Falck, J., Mailand, N., Syljuasen, R.G., Bartek, J., Lukas, J., The ATM-Chk2-Cdc25A checkpoint pathway
guards against radioresistant DNA synthesis, Nature, 410, 842-847 (2001).
Farache, G., Razin, S.V., Rzeszowska-Wolny, J., Moreau, J., Recillas Targa, F., Scherrer, K., Mapping of
structural and transcription-related matrix attachment sites in the α-globin gene domain of avian erythroblasts
and erythrocytes, Mol. Cell. Biol., 10, 5349-5358 (1990).
Fawcett, D.W., An Atlas of Fine Structure: The Cell, Its Organelles and Inclusions, Philadelphia: W.B.
Saunders Co. (1966).
Ferreira, J., Paolella, G., Ramos, C., Lamond, A.I., Spatial organization of large-sale chromatin domains in
the nucleus: A magnified view of single chromosome territories, J. Cell Biol., 139, 1597-1610 (1997).
Ferrel, J.E., Xenopus oocyte maturation: new lessons from good egg, BioEssays, 21, 833-842 (1999).
Fey, E.W., Krochmalnic, G., Penman, S., The Nonchromatin Substructures of the Nucleus: The
Ribonulceoprotein (RNP)-containing and RNP-depleted Matrices Analyzed by Sequential Fractionation and
Resinless Section Electron Mircoscopy, J. Cell Biol., 102, 1654-1665 (1988).
Literatur
160
Filipski, J., Leblanc, J., Youdale, T., Sikorka, M., Walker, P.R., Periodicity of DNA folding in higher order
chromatin structures, EMBO J., 9, 1319-1327 (1990).
Findeisen, M., El-Denary, M., Kapitza, T., Graf, R., Strausfeld, U., Cyclin A-dependent kinase activity
affects chromatin binding of ORC, Cdc6, and MCM in egg extracts of Xenopus laevis, Eur. J. Biochem., 264,
415-426 (1999).
Fletcher, T.M., Hansen, J.C., The nucleosomal array: structure/function relationships, Crit. Rev. Eukaryotic
Gene Expression, 6, 149-188 (1996).
Forbes, D., Kornberg, T., Kirschner, M., Small nuclear RNA transcription and assembly in early Xenopus
development, J. Cell Biol., 97, 62-72 (1983a).
Forbes, D., Kirschner, M., Newport, J., Spontaneous formation of nucleus-like structures around
bacteriophage DNA mircoinjected into Xenopus eggs, Cell, 34, 13-23 (1983b).
Friedberg, E.C., Walker, G.C., Siede, W., DNA repair and Mutagenesis, Amercian Society of Mircobiology,
Washington D.C. (1995).
Fujita, M., Ishimi, Y., Nakamura, H., Kiyono, T., Tsurumi, T., Nuclear organization of DNA replication
initiation proteins in mammalian cells, J. Biol. Chem., 277, 10354-10361 (2002).
Fukui, T., Yamauchi, K., Muroya, T., Akiyama, M., Maki, H., Sugino, A., Waga, S., Distinct roles of DNA
polymerases delta and epsilon at the replication fork in Xenopus egg extracts, Genes to Cell, 9, 179-191 (2004).
Gabler, S., Schutt, H., Groitl, P., Wolf, H., Shenk, T. and Dobner, T., E1B 55-kilodalton-associated protein:
a cellular protein with RNA-binding activity implicated in nucleocytoplasmic transport of adenovirus and
cellular mRNAs, J. Virol., 72, 7960-71 (1998).
Gall, J.G., Cajal bodies: the first 100 years, Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 16, 273-300 (2000).
Gasser, S.M., Laemmli, U.K., A glimpse at chromosomal order, Trends Genet., 3, 16-22 (1987).
Gasser, S.M., Laemmli, U.K., Cohabitation of scaffold binding regions with upstream/enhancer elements of
three developmentally regulated genes of Drosophila melangogaster, Cell, 46, 521-530 (1986).
Gasser, S.M., Laroche, T., Falquet, J., Boy de la Tour, E., Laemmli, U.K., Metaphase chromosome structure.
Involvement of topoisomerase II, J. Mol. Biol., 188, 613-629 (1986).
Gerace, L., Burke, B., Functional organization of the nuclear envelope, Ann. Rev. Cell Biol., 4, 335-374 (1988).
Gerdes, M.G., Carter, K.C., Moen, P.T., Lawrence, J.B., Dynamic changes in the higher-level chromatin
organization of specific sequences revealed by in situ hybridization to nuclear halos, J. Cell Biol., 126, 289-304
(1994).
Gibson, L., Holmgreen, S.P., Huang, D.C., Bernard, O., Copeland, N.G., Jenkins, N.A., Sutherland, G.R.,
Baker, E., Adams, J.M., Cory, S., Bcl-w, a novel member of the Bcl-2 family, promotes cell survival,
Oncogene, 13, 665-675 (1996).
Gilbert, C.W., Muldal, S., Lajthal, L.G., Rowley, J., Time-sequence of human chromosome duplication,
Nature, 195, 869-873 (1962).
Gilbert, D.M., Making sense of eukaryotic DNA replication origins, Science, 294, 96-100 (2001).
Gillespie, P.J., Blow, J.J., Nucleoplasmin-mediated chromatin remodelling is required for Xenopus sperm
nuclei to become licensed for DNA replication, Nucleic Acids Res., 28, 472-480 (2000).
Gillespie, P.J., Li, A., Blow, J.J., Reconstitution of licensed replication origins on Xenopus sperm nuclei using
purified proteins, BMC Biochemistry, 2, 1471-2091 (2000).
Literatur
161
Göhring, F., Fackelmayer, F.O., The scaffold/matrix attachment region binding protein hnRNP U (SAF-A) is
directly bound to chromosomal DNA in vivo: a chemical cross linking study, Biochemistry, 36, 8276-8283
(1997).
Göhring, F., Schwab, B.L., Nicotera, P., Leist, M., Fackelmayer, F.O., The novel SAR-binding domain of
scaffold attachment factor A (SAF-A) is a target in apoptotic nuclear breakdown, EMBO J., 16, 7361-7371
(1997).
Goldman, R.D., Gruenbaum, Y., Moir, R.D., Shumaker, D.K., Spann, T.P., Nuclear lamins: building blocks
of nuclear architecture, Genes Dev., 16, 533-547 (2002).
Görlich, D., Mattaj, I.W., Nucleocytoplasmic Transport, Science, 271, 1513-1518 (1996).
Graziano, V., Gerchman, S.E., Schneider, D.K., Ramakrishnan, V., Histone H1 is located in the interior of
the chromatin 30-nm filament, Nature, 368, 351-354 (1994).
Grunstein, M., Histone acetylation in chromatin structure and transcription, Nature, 389, 349-352 (1997).
Gudas, J.M., Payton, M., Thukral, S., Chen, E., Bass, M., Robinson, M.O., Coats, S., Cyclin E2, a novel G1
cyclin that binds Cdk2 and is aberrantly expressed in human cancers, Mol. Cell. Biol., 19, 612-622 (1999).
Haaf, T., Golub, E.I., Reddy, G., Radding, C.M., Ward, D.C., Nuclear foci of mammalian Rad51
recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92, 2298-2302 (1995).
Haaf, T., Ward, D.C., Inhibition of RNA polymerase II transcription causes chromatin decondensation, loss of
nuclear structure, and dispersion of chromosomal domains, Exp. Cell. Res., 224, 163-173 (1996).
Hall, G., Allen, G.C., Loer, D.C., Thompson, W.F., Spiker, S., Nuclear scaffolds and scaffold-attachment
regions in higher plants, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 9320-9324 (1991).
Hansen, J.C., Ausio, J., Chromatin dynamics and the modulation of genetic activity, Trends Biochem.Sci., 17,
184-191 (1992).
Harborth, J., Wang, J., Gueth-Hallonet, C., Weber, K., Osborn, M., Self assembly of NuMA: multiarm
oligomers as structural units of a nuclear lattice, EMBO J., 18, 1689-1700 (1999).
Hassan, A.B., Cook, P.R., Visualization of replication sites in unfixed human cells, J. Cell Sci., 105, 541-550
(1993).
He, D.C., Nickerson, J.A., Penman, S., Core filaments of the nuclear matrix, J. Cell Biol., 110, 569-580 (1990).
Heck, M.M.S., Earnshaw, W.C., Topoisomerase II: A specific marker for cell proliferation, J. Cell Biol., 103,
2569-2581 (1986).
Hegde, R., Srinivasula, S.M., Ahmad, M., Blk, a BH3-containing mouse protein that interacts with Bcl-2 and
Bcl-XL, is a potent death agonist. J. Biol. Chem., 273, 7783-7786 (1998).
Helbig, R., Fackelmayer, F.O., Scaffold attachment factor A (SAF-A) is concentrated in inactive X
chromosome territories through its RGG domain, Chromosoma, 112, 173-182 (2003).
Hendzel, M.J., Sun, J.M., Chen, H.Y., Rattner, J.B., Davie, J.R., Histone acetyltransferase is associated with
the nuclear matrix, J. Biol. Chem., 269, 22894-22901 (1994).
Heng, H.H.Q., Goetze, S., Ye, C.J., Liu, G., Stevens, J.B., Bremer, S.W., Wykes, S.M., Bode, J., Krawetz,
A., Chromatin loops are selectively anchored using scaffold/matrix-attachment regions, J. Cell. Sci., 117, 9991008 (2004).
Heng, H.H.Q., Krawetz, S.A., Lu, W., Bremer, S., Liu, G., Ye, C.J., Re-defining the chromatin loop domain,
Cytogenet. Cell Genet., 93, 155-161 (2001).
Literatur
162
Herrmann, F., Untersuchungen zu funktionellen Wechselwirkungen des Kernproteins SAF-A, Diplomarbeit,
Universität Konstanz (2002).
Herrmann, F., Bossert, M., Schwander, A., Akgün, E., Fackerlmayer, F.O., Arginine methylation of scaffold
attachment factor A by heterogeneous nuclear ribonulceoprotein particle-associated PRMT1, J. Biol. Chem.,
279, 48774-48779 (2004).
Herrmann, H., Aebi, U., Intermediate filaments and their associates: multi-talented structural elements
specifying cytoarchitecture and cytodynamics, Curr. Opin. Cell Biol., 12, 79-90 (2000).
Hirai, H., Roussel, M.F., Kato, J., Ashmun, R.A., Sherr, C.J., Novel INK4 proteins, p19 and p18, are specific
inhibitors of the cyclin D-dependent kinases CDK4 and CDK6, Mol. Cell. Biol., 15, 2672-2681 (1995).
Hodges, M., Tissot, C., Howe, K., Grimwade, D., Freemont, P.S., Structure, organization, and dynamics of
promyelocytic leukemia protein nuclear bodies, Am. J. Hum. Genet., 63, 297-304 (1998).
Hofmann, T.G., Möller, A., Sirma H., Zentgraf, H. Taya, Y., Droge, W., Will, H., Schmitz, M.L.,
Regulation of p53 activity by its interaction with homeodomain-interacting protein kinase-2, Nat. Cell Biol., 4,
1-10 (2002).
Holmquist, G.P., Chromosome bands: their chromatin flavors and their functional feature, Am. J. Hum. Genet.,
51, 17-37 (1992).
Homberger, H.P., Bent DNA is a structural feature of scaffold-attached regions in Drosophila melanogaster
interphase nuclei, Chromosoma, 98, 99-104 (1989).
Houtsmuller, A.B., Rademalers, S., Nigg, A.L., Hoogstraten, D., Hoeijmakers, J.H., Vermeulen, W., Action
of DNA repair endonuclease ERCC1/XPF in living cells, Science, 284, 958-961 (1999).
Hozak, P., Hassan, A.B., Jackson, D.A., Cook, P.R., Visualization of replication factories attached to
nucleoskeleton, Cell, 73, 361-373 (1993).
Hozak, P., Jackson, D.A., Cook, P.R., Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural
characterization of replication sites during the cell cycle, J. Cell Sci., 107, 2191-2202 (1994).
Huang, S., Deerinck, T.J., Ellisman, M.H., Spector, D.L., The perinucleolar compartment and transcription, J.
Cell Biol., 143, 35-47 (1998).
Huberman, J.A., Zhu, J., Davis, L.R., Newlon, C.S., Close association of a DNA replication origin and an arselement on chromosome III of the yeast, Saccharomyces cerevisiae, Nucleic Acids Res., 16, 6373-6384 (1988).
Hübscher, U., Nasheuer, H.-P., Syväoja, J.E., Eukaryotic DNA polymerases, a growing family, Trends
Biochem. Sci., 25, 143-147 (2000).
Humbert, C., Usson, Y., Eukaryotic DNA replication is a topographically ordered process, Cytometry, 13, 603614 (1992).
Hunt, B.F., Vogelstein, B., Association of newly replicated DNA with the nuclear matrix of Physarum
polycephalum, Nucleic Acids Res., 9, 349-363 (1981).
Iborra, F.J., Pombo, A., Jackson, D.A, Cook, P.R., Active RNA polymerases are localized within discrete
transcription „factories“ in human nuclei, J. Cell Sci., 109, 1427-1436 (1996).
Iborra, F.J., Jackson, D.A., Cook, P.R., Coupled transcription and translation within nuclei of mammalian
cells, Science, 293, 1139-1142 (2001).
Ishimi, Y., A DNA helicase activity is associated with an MCM4,-6 and -7 protein complex, J. Biol. Chem., 272,
24508-24513 (1997).
Ito, H, Kamei, K,m Iwamoto, I., Inaguma, Y., Nohara, D., Kato, K., Phosphorylation-induced change of the
oligomerization state of αB-crystallin, J. Biol. Chem., 276, 5346-5352 (2001).
Literatur
163
Izaurralde, E., Mirkovitch, J., Laemmli, U.K., Interaction of DNA with nuclear scaffolds in vitro, J. Mol.
Biol., 200, 111-125 (1988).
Izaurralde, E., Käs, E. and Lemmli, U.K., Highly preferential nucleation of histon H1 assembly on scaffoldassociated regions, J. Mol. Biol. 210, 573-585 (1989).
Jackson, D.A., Yuan, J., Cook, P.R., A gentle method for preparing cyto- and nucleo-skeletons and associated
chromatin, J. Cell Sci., 90, 365-378 (1988).
Jackson, D.A., Dickinson, P., Cook, P.R., Attachment of DNA to the nucleoskeleton of HeLa cells examined
using physiological conditions, Nucleic Acids Res., 18, 4385-4393 (1990).
Jackson, D.A., Hassan, A.B., Errington, R.J., Cook, P.R., Visualization of focal sites of transcription within
human nuclei, EMBO J., 12, 1059-1065 (1993).
Jackson, D.A., Cook, P.R., The structural basis of nuclear function, Int. Rev. Cytol., 162A, 125-149 (1995).
Jackson, D.A., Chromatin domains and nuclear compartments: establishing sites of gene expression in
eukaryotic nuclei, Mol. Biol. Rep., 24, 209-220 (1997).
Jackson, D.A, Iborra, F.J., Manders, E.M., Cook, P.R., Numbers and organization of RNA polymerases,
nascent transcripts, and transcription units in HeLa nuclei, Mol. Biol. Cell., 9,1523-1536 (1998).
Jackson, D.A., Pombo, A., Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear
organization contributes to the efficient activation and propagation of S-Phase in human cells, J. Cell Biol., 140,
1285-1295 (1998).
Jegalian, K., Page, D.C., A proposed path by which genes common to mammalian X and Y chromosomes
evolve to become X inactivated, Nature, 394, 776-780 (1998).
Jenke, B.H., Fetzer, C.P., Stehle, I.M., Jonsson, F., Fackelmayer, F.O., Conradt, H., Bode, J., Lipps, H.J.,
An episomally replicating vector binds to the nuclear matrix protein SAF-A in vivo, EMBO Rep., 3, 349-354
(2002).
Jiang, W., Wells, N.J., Hunter, T., Multistep regulation of DNA replication by Cdk phosphorylation of
HsCdc6, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 6193-6198 (1999).
Jones, P.L., Veenstra, G.J.C, Wade, P.A., Vermakk, D., Kaas, S.U., Landsberger, N., Strouboulis, J.,
Wolffe, A.P., Methylated DNA and MeCP2 recruit histone deacetylase to repress transcription, Nature Genetics,
19, 187-191 (1998).
Jong, A. Y., Clark, M.W., Gilbert. M., Oehm, A., Campbell, H.L., Saccharomyces cerevisiae SSB1 protein
and its relationship to nucleolar RNA-binding proteins, Mol. Cell. Biol., 7, 2947-2955 (1987).
Jost, C. A., Marin, M. C., Kaelin, W. G., Jr., p73 is a simian [correction of human] p53-related protein that
can induce apoptosis, Nature, 389, 191–194 (1997).
Jullien, D., Görlich, D., Laemmli, U.K., Adachi, Y., Nuclear import of RPA in Xenopus egg extracts requires a
novel protein XRIPalpha but not importin alpha, EMBO J., 18, 4348-4358 (1999).
Kaghad, M., Bonnet, H., Yang, A., Creancier, L., Biscan, J. C., Valent, A., Minty, A., Chalon, P., Lelias, J.
M., Dumont, X., Ferrara, P., McKeon, F., Caput, D., Monoallelically expressed gene related to p53 at 1p36, a
region frequently deleted in neuroblastoma and other human cancers, Cell, 90, 809–819 (1997).
Käs, E., Izaurralde, E., Laemmli, U.K., Specific inhibition of DNA binding to nuclear scaffolds and histone
H1 by distamycin. The role of oligo(dA)*(dT) tracts, J. Mol. Biol., 210, 587-599 (1989).
Käs, E., Laemmli, U.K., In vivo topoisomerase II cleavage of the Drosophila histone and satellite III repeats:
DNA sequence and structural characteristics, EMBO J., 11, 705-716 (1992).
Literatur
164
Kiledjian, M., Dreyfuss, G., Primary structure and binding activity of the hnRNP U protein: binding RNA
through RGG box, EMBO J., 11, 2655-2664 (1992).
Kim, M. K., Nikodem, V. M., hnRNP U inhibits carboxy-terminal domain phosphorylation by TFIIH and
represses RNA polymerase II elongation, Mol. Cell Biol., 19, 6833-6844 (1999).
Kipp, M., Göhring, F., Ostendorp, T., van Drunen, C.M., van Driel, R., Przyblyski, M., Fackelmayer,
F.O., SAF-box, a conserved protein domain that specifically recognizes scaffold attachment region DNA, Mol.
Cell Biol., 20, 7480-7489 (2000).
Klehr, D., Maass, K., Bode, J., Scaffold-attached regions from the human interferon-ß domain can be used to
enhance the stable expression of genes under the control of various promoters, Biochemistry, 30, 1264-1270
(1991).
Kobayashi, T., Tada, S., Takashi, T., Murofushi, H., Seki, M., Enomoto, T., Focus-formation of replication
protein A, activation of checkpoint system and DNA repair synthesis induced by DNA double-strand breaks in
Xenopus egg extract, J. Cell. Sci., 115, 3159-3169 (2002).
Koff, A., Cross, F., Fisher, A., Schumacher, J., Leguellec, K., Philippe, M., Roberts, J.M., Human cyclin E,
a new cyclin that interacts with two members of the CDC2 gene family, Cell, 66, 1217-1228 (1991).
Kowalczykowski, S.C., Dixon, D.A., Eggleston, A.K., Lauder, S.D., Rehrauer, W.M., Biochemistry of
homologous recombination in Escherichia coli, Microbiol. Rev., 58, 401-465 (1994).
Krajewski, W.A., Razin, S.V., DNA-protein interactions and spatial organization of DNA, Mol. Biol. Rep., 18,
167-175 (1993).
Krajewski, W.A., Ausio, J., Modulation of the higher-order folding of chromatin by deletion of histone H3 and
H4 terminal domains, Biochem. J., 317, 395-400 (1996).
Krause, S., Fakan, S., Weis, K., Whale, E., Immunodetection of poly(A) binding protein II in the cell nucleus,
Exp. Cell Res., 214, 75-82 (1994).
Krude, T., Musahl, C., Laskey, R.A., Knippers, R., Human replication proteins hCdc21, hCdc46 and
P1Mcm3 bind chromatin uniformly before S-Phase and are displaced locally during DNA replication, J. Cell
Sci., 109, 309-318 (1996).
Kubota, Y., Mimura, S., Nishimoto, S., Takisawa, H., Nojima, H., Identification of the yeast MCM3-related
protein as a component of Xenopus DNA replication licensing factor, Cell, 81, 601-609 (1995).
Lachner, M., O’Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., Jenuwein, T., Methylation of histone H3 lysine 9 creates a
binding site for HP1 proteins, Nature, 410, 116-120 (2001).
Lachner, M., Jenuwein, T., The many faces of histone lysine methylation, Curr. Opin. Cell Biol., 14, 286-298
(2002).
Lamond, A.I, Earnshaw, W.C., Structure and function in the nucleus, Science, 280, 547-553 (1998).
Larsson, S., Charlieu, J., Miyagawa, K., Engelkamp, D., Rassoulzadegan, M., Ross, A., Cusin, F., van
Heyningen, V., Hastie, N., Subnuclear localization of WT1 in splicing or transcription factor domains is
regulated by alternative splicing, Cell, 81, 391-401 (1995).
Laskey, R.A., Mills, A.D., Morris, N.R., Assembly of SV40 chromatin in a cell-free system from Xenopus
eggs, Cell, 10, 237-243 (1977).
Lee, D.G., Bell, S.P., Architecture of the yeast origin recognition complex bound to origins of DNA replication,
Molecular and Cellular Biology, 17, 7159-7168 (1997).
Lee, J.T., Jaenisch, R., The (epi)genetic control of mammalian X-chromosome inactivation, Curr. Opin. Genet.
Dev., 7, 274-280 (1997).
Literatur
165
Lei, M., Tye, B.K., Initiating DNA synthesis: from recruiting to activating the MCM complex, J. Cell Sci., 114,
1447-1454 (2001).
Leno, G.H., Laskey, R.A., DNA replication in cell-free extracts from Xenopus laevis, Methods Cell Biol., 36,
561-579 (1991).
Leonhardt, H., Sporbert, A., Cardoso, M.C., Targeting regulatory factors to intranuclear replication sites, Crit.
Rev. Eukaryot. Gene Expr., 12, 127-133 (2000a).
Leonhardt, H., Rahn, H-P, Weinzierl, P., Sporbert, A., Cremer, T., Zink, D., Cardoso, M.C., Dynamics of
DNA replication factories in living cells, J. Cell. Biol., 149, 271-279 (2000b).
Li, G., Sudlow, G., Belmont, A.S., Interphase cell cycle dynamics of late replicating, heterochromatic
homogenously staining regions: precise choreography of condensation/decondensation and intracellular
positioning, J. Cell Biol., 140, 975-989 (1998).
Lichter, P., Cremer, T., Borden, J., Manuelidis, L., Ward, D.C., Delineation of individual human
chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ suppression hybridization using recombinant DNA
libraries, Hum. Genet., 80, 224-234 (1988).
Liu, N., Lamerdin, J.E., Tebbs, R.S., Schild, D., Tucker, J.D., Shen, M.R:, Brookman, K.W., Sciliano,
M.J., Walter, C.A., Fan, W., Narayana, L.S., Zhou, Z.Q., Adamson, A.W., Sorensen, K.J., Chen, D.J.,
Jones, N.J., Thompson, L.H., XRCC2 and XRCC3, new human Rad51-family members, promote chromosome
stability and protect against DNA cross-links and other damages, Mol. Cell, 1, 783-793 (1998).
Liu, G., Malott, M., Leffak, M., Multiple functional elements comprise a Mammalian chromosomal replicator,
Mol. Cell. Biol., 23, 1832-1842 (2003).
Löber, C., Lenz-Satöppler, C., Dobbelstein, M., Adenovirus E1-transformed cells grow despite the continous
presence of transcriptionally active p53, J. General Virology, 83, 2047-2057 (2002).
Lohka, M., Masui, Y., Formation in vitro of sperm pronulcei and mitotic chromosome induced by amphibian
ooplasmic components, Science, 220, 719-721 (1983).
Lopez-Soler, R.I., Moir, R.D., Spann, T.P., Stick, R., Goldman, R.D., A role for nuclear lamins in nuclear
envelope assembly, J. Cell. Biol., 154, 61-70 (2001).
Luderus, M.E., de Graaf, A., Mattai, E., den Blaauwen, J.L., Grande, M.A., de Jong, L., van Driel, R.,
Binding of matrix attachment regions to lamin B1. Cell, 70, 949-959 (1992).
Luger, K., Mäder, A.W., Richmond, R.K., Sargent, D.F., Richmond, T.J., Crystal structure of the
nucleosome core particle at 2.8 A resolution, Nature, 389, 251-260 (1997).
Lundberg, A.S., Weinberg, R.A., Functional inactivation of the retinoblastoma protein requires sequential
modification by at least two distinct cyclin-cdk complexes, Mol. Cell. Biol., 18, 753-761 (1998).
Lutsch, G., Vetter, R., Offhauss, U., Wieske, M., Grone, H.J., Klemenz, R., Schmike, I., Stahl, J.,
Benndorf, R., Abundance and location of the small heat shock protein HSP25 and αB-crystallin in rat and
human heart, Circulation, 96, 3466-3476 (1997).
Lyon, M.F., Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L.), Nature, 190, 372-373 (1961).
Lyon, M.F., Pinpoiting the centre, Nature, 379, 116-117 (1996).
Lyon, M.F., X-chromosome inactivation: a repeat hypothesis, Cytogent. Cell Genet., 80, 133-137 (1998).
Ma, H., Samarabandu, J., Devdhar, R.S., Acharya, R., Cheng, P.C., Meng, C., Berezney, R., Spatial and
temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells, J. Cell Biol., 143, 1415-1425 (1998).
Literatur
166
Ma, H., Siegel, A.J., Berezney, R., Association of chromosome territories with the nuclear matrix. Disruption
of human chromosome territories correlates with the release of a subset of nuclear matrix proteins, J. Cell Biol.,
146, 531-542 (1999).
Maiorano, D., Moreau, J., Mechali, M., XCDT1 is required for the assembly of pre-replicative complexes in
Xenopus laevis, Nature, 404, 622-625 (2000).
Manders, E.M.M., Stap, J., Brakenhoff, G.J., van Driel, R., Aten, J.A., Dynamics of three dimensional
replication patterns during the S-phase analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy, J. Cell
Sci., 103, 857-862 (1992).
Manuelidis, L., A view of interphase chromosomes, Science, 250, 1533-1540 (1990).
Manuelidis, L., Chen, T.L., A unified model of eukaryotic chromosomes, Cytometry, 11, 8-25 (1990).
Marahrens, Y., Stillman, B., A yeast chromosomal origin of DNA replication defined by multiple functional
elements, Science, 255, 817-823 (1992).
Maridor, G., Krek, W., Nigg, E.A., Structure and developmental expression of chicken nucleolin and NO38:
coordinate expression of two abundant non-ribosomal nucleolar proteins, Biochim. Biophys. Acta, 1049, 126-133
(1990).
Marsden, M.P., Laemmli, U.K., Metaphase chromosome structure: evidence for a radial loop model, Cell, 17,
849-858 (1979).
Martelli, A.M., Falcieri, E., Zweyer, M., Bortul, R., Tabellini, G., Cappellini, A., Cocco, L., Manzoli, L.,
The controversial nuclear matrix: a balanced point of view, Histol. Histopathol., 17, 1193-1205 (2002).
Martens, J. H., Verlaan, M., Kalkhoven, E., Dorsman, J.C., Zantema, A., Scaffold/matrix attachment region
elements interact with a p300-scaffold attachment factor A complex and are bound by acetylated nucleosomes,
Mol. Cell Biol., 22, 2598-2606 (2002).
Matera, A.G., Nuclear bodies: multifaceted subdomains of the interchromatin space, Trends Cell Biol., 9, 302309 (1999).
Matsushime, H., Roussel, M.F., Ashmun, R.A., Sherr, C.J., Colony stimulating factor 1 regulates novel
cyclins during the G1 phase of the cell cycle, Cell, 65, 701-713 (1991).
Mattern, K.A., Humbel, B.M., Muijsers, A.O., de Jong, L., van Driel, R., hnRNP proteins and B23 are the
major proteins of the internal nuclear matrix, J. Cell. Biochem., 62, 275-289 (1996).
Mattern, K.A., van Goethem, R.E.M., de Jong, L., van Driel, R., The major internal nuclear matrix proteins
are common to different human cell lines, J. Cell. Biochem., 65, 42-45 (1997).
Mattern, K.A., van der Kraan, I., Schul, W., de Jong, L., van Driel, R., Spatial organization of four hnRNP
proteins in relation to sites of transcription, to nuclear speckles, and to each other in interphase nuclei and
nuclear matrices of HeLa cells, J. Exp. Cell Res., 246, 461-470 (1999).
May, M.J., Ghosh, S., Rel/NF-kB and IKB proteins: an overview, Seminars in Cancer Biology, 8, 63-73 (1997).
May, M.J., Ghosh, S., Signal transduction through NF-kB, Immun. Today, 19, 80-88 (1998).
Mechali, M., DNA replication origins: from sequence specificity to epigenetics, Nat. Rev. Genet., 2, 640-645
(2001).
Mehlen, P., Schulze-Osthoff, K., Arrigo, A.P., Small stress proteins as novel regulators of apoptosis. Heat
shock protein 27 blocks Fas/Apo-1- and staurosporine-induced cell death, J. Biol. Chem., 271, 16510-16514
(1996).
Melnick, A., Licht, J.D., Deconstructing a disease: RARα, ist fusion partners, and their roles in the
pathogenesis of acute promyelocytic leukemia, Blood, 93, 3167-3215 (1999).
Literatur
167
Merdes, A., Cleveland, D.W., The role of NuMA in the interphase nucleus, J. Cell Sci., 111, 71-79 (1998).
Micheli, G., Luzzatto, A.R.C., Carri, M.T., de Capoa, A., Peliliccia, F., Chromosome length and DNA loop
size during early embryonic development of Xenopus laevis, Chromosoma, 102, 478-483 (1993).
Mielke, C., Kohwi, Y., Kowhi-Shigematsu, T., Bode, J., Hierarchical binding of DNA fragments derived from
scaffold-attached regions: Correlation of properties in vitro and function in vivo, Biochemistry, 29, 7475-7485
(1990).
Mills, A.D., Blow, J.J., White, J.G., Amos, W.B., Wilcock, D., Laskey, R.A., Replication occurs at discrete
foci spread throughout nuclei replicating in vitro, J. Cell Sci., 94, 471-477 (1989).
Mimura, S., Takisawa, H., Xenopus Cdc45-dependent loading of DNA polymerase α onto chromatin under the
control of S phase cdk, EMBO J., 17, 5699-5707 (1998).
Mimura, S., Masuda, T., Matsui, T., Takisawa, H., Central role for Cdc45 in establishing an initiation
complex of DNA replication in Xenopus egg extracts, Genes Cell, 5, 439-452 (2000).
Mintz, P.J, Patterson, S.D., Neuwald, A.F., Spahr, C.S., Spector, D.L., Purification and biochemical
characterization of interchromatin granule clusters, EMBO J., 18, 4308-4320 (1999).
Mirkovitch, J., Mirault, M.-E., Laemmli, U.K., Organization of the higher-order chromatin loop: specific
DNA attachment sites on nuclear scaffold, Cell, 39, 223-232 (1984).
Mirkovitch, J., Gasser, S.M., Laemmli, U.K., Scaffold attachment of DNA loops in metaphase chromosomes,
J. Mol. Biol., 200, 101-109 (1988).
Misteli, T., Cell Biology of transcription and pre-mRNA splicing: nuclear architecture meets nuclear function, J.
Cell Sci., 113, 1841-1849 (2000).
Misteli, T., Spector, D.L., The cellular organization of gene expression, Curr. Opin. Cell Biol., 10, 322-331
(1998).
Moir, R.D., Spann, T.P., Goldman, R.D., The dynamic properties and possible functions of nuclear lamins, Int.
Rev. Cytol., 162B, 141-182 (1995).
Monneron, A., Bernhard, W., Fine structural organization of the interphase nucleus in some mammalian cells,
J. Ultrastruct. Res., 27, 266-288 (1969).
Morano, K.A., Thiele, D.J., Heat shock factor function and regulation in response to cellular stress, growth, and
differentiation signals, Gene Expr., 7, 271-282 (1999).
Morgan, D.O., Principles of CDK regulation, Nature, 374, 131-134 (1995).
Morishma, A., Grumbach, M.M., Tayler, J.H., Asynchronous duplication of human chromosomes and the
origin of sex chromatin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48, 756-763 (1962).
Morse, R.H., Simpson, R.T., DNA in the nucleosome, Cell, 54, 285-287 (1988).
Mortillaro, M.J., Blencowe, B.J., Wei, X., Nakayasu, H., Du, L., Warren, S., Sharp, P.A., Berezney, R., A
hyperphosphorylated form of the large subunit of RNA polymerase II is associated with splicing complexes and
the nuclear matrix, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 93, 8253-8257 (1996).
Motokura, T., Bloom, T., Kim, H.G., Juppner, H., Rudermann, J.V., Kronenberg, H.M., Arnold, A., A
novel cyclin encoded by a bcl1-linked candidate oncogene, Nature, 350, 512-515 (1991).
Münkel, C., Eils, R., Dietzel, S., Zink, D., Mehring, C., Wedemann, G., Cremer, T., Langowski, J.,
Compartmentalization of interphase chromosomes observed in simulation and experiment, J. Mol. Biol., 285,
1053-1065 (1999).
Literatur
168
Murray, A.W., Recycling the cell cycle: cyclins revisited, Cell, 116, 221-234 (2004).
Myer, V.E., Young, R.A., RNA polymerase II holoenzymes and subcomplexes, J. Biol. Chem., 273, 2775722760 (1998).
Nägele, R., Freeman, T., McMorrow, L., Lee, H.Y., Precise spatial positioning of chromosomes during
prometaphase: evidence for chromosomal order, Science, 270, 1831-1835 (1995).
Nakamura, H., Morita, T., Sato, C., Strutural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase
in the mammalian nucleus, Exp. Cell Res., 165, 291-297 (1986).
Nakayasu, H., Berezney, R., Mapping replicational sites in the eukaryotic cell nucleus, J. Cell Biol., 108, 1-11
(1989).
Nan, X., Ng, H., Johnson, C.A., Laherty, C.D., Turner, B.M., Eisenman, R.N., Bird, A., Transcriptional
repression by the methyl-CpG-binding protein MeCP2 involves a histone deacetylase complex, Nature, 393,
386-389 (1998).
Negorev, D., Maul, G.G., Cellular proteins localized at and interacting within ND10/PML nuclear bodies/PODs
suggest functions of a nuclear depot, Oncogene, 20, 7234-7242 (2001).
Nelson, W.G., Pienta, K.J., Barrack, E.R., Coffey, D.S., The role of the nuclear matrix in the organization and
function of DNA, Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 15, 457-475 (1986).
Neri, L.M., Fackelmayer, F.O., Zweyer, M., Kohwi-Shigematsu, T., Martelli, A.M., Subnuclear localization
of S/MAR-binding proteins is differently affected by in vitro stabilization with heat or Cu2+, Chromosoma, 106,
81-93 (1997).
Newport, J., Kirschner, M.W., Regulation of the cell cycle during early Xenopus development, Cell, 37, 731742 (1984).
Newport, J., Nuclear reconstitution in vitro: stages of assembly around protein-free DNA, Cell, 48, 205-217
(1987).
Nickerson, J.A., Blencowe, B.J., Penman, S., The architectural organization of nuclear metabolism, Int. Rev.
Cytol., 162A, 67-123 (1995).
Nickerson, J.A., Krockmalnic, G., Wan, K.M., Penman, S., The nuclear matrix revealed by eluting chromatin
from a cross-linked nucleus, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 94, 4446-44450 (1997).
Nickerson, J.A., Experimental observations of a nuclear matrix, J. Cell. Sci., 114, 463-474 (2001).
Nishitani, H., Lygerou, Z., Nishimoto, T., Nurse, P., The Cdt1 protein is required to license DNA for
replication in fission yeast, Nature, 404, 625-628 (2000).
Noton, E., Diffley, J.F., CDK inactivation is the only essential function of the APC/C and the mitotic exit
network proteins for origin resetting during mitosis, Mol. Cell, 5, 85-95 (2000).
O’Keefe, R.T., Henderson, S.C., Spector, D.L., Dynamic organization of DNA replication in mammalian cell
nuclei: spatially and temporally defined replication of chromosome-specific alpha-satellite DNA sequences, J.
Cell Biol., 116, 1095-1110 (1992).
Oancea, A.E., Berru, M., Shulman, M.J., Expression of the (recombinant) endogenous immunoglobulin
heavy-chain locus requires the intronic matrix attachment regions, Mol. Cell. Biol., 17, 2658-2668 (1997).
Olson, M.O.J., Dundr, M., Szebeni, A., The nucleolus: An old factory with unexpected capabilities, Trends
Cell. Biol., 10, 189-196 (2000).
Ostendorp, T.. Untersuchungen zur Domänenstruktur des menschlichen Kernproteins SAF-A, Diplomarbeit,
Universität Konstanz (2001).
Literatur
169
Pardee, A.B., G1 events and regulation of cell proliferation, Science, 246, 603-608 (1989).
Pardoll, D.M., Vogelstein, B., Coffey, D.S., A fixed site of DNA replication in eukaryotic cells, Cell, 19, 527536 (1980).
Pasero, P., Braguglia, D., Gasser, S.M., ORC-dependent and origin-specific initiation of DNA replication at
defined foci in isolated yeast nuclei, Genes Dev., 11, 1504-1518 (1997).
Payton, M., Coats, S., Cyclin E2, the cycle continues, Int. J. Biochem. Cell Biol., 34, 315-320 (2002).
Pederson, T., Survey and summary: The plurifunctional nucleolus, Nucl. Acids Res., 17, 3871-3876 (1998).
Pederson, T., Half a century of „The nuclear Matrix“, Mol. Biol. Cell, 11, 799-805 (2000a).
Pederson, T., Diffusional protein transport within the nucleus: a message in the medium Nature Cell Biol., 2,
E73-E74 (2000b).
Pellizzoni, L., Charroux, B., Rappsilber, J., Mann, M., Dreyfuss, G., A functional interaction between the
survival motor neuron complex and RNA Polymerase II, J. Cell. Biol., 152, 75-85 (2001).
Pemov, A., Bavykin, S., Hamlin, J.L., Attachment to the nuclear matrix mediates specific alterations in
chromatin structure, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 14757-14762 (1998).
Petersen, B.O., Lukas, J., Sorensen, C.S., Bartek, J., Helin, K., Phosphorylation of mammalian CDC6 by
cyclin A/CDK2 regulates its subcellular localization, EMBO J., 18, 396-410 (1999).
Phair, R.D., Misteli, T., High mobility of proteins in the mammalian cell nucleus, Nature, 404, 604-609 (2000).
Phi-Van, L., Strätling, W.H., The matrix attachment regions of the chicken lysozyme gene co-map with the
boundaries of the chromatin domain, EMBO J., 7, 655-664 (1988).
Pienta, K.J., Coffey, D.S., A structural analysis of the role of the nuclear matrix and DNA loops in the
organization of the nucleus and chromosome, J. Cell. Sci. Suppl., 1, 123-135 (1984).
Pienta, K.J., Getzenberg, R.H., Coffey, D.S., Cell structure and DNA organization, Crit. Rev. Eukaryotic Gene
Expression, 1, 355-385 (1991).
Pinol-Roma, S., Choi, Y., Matunis, M.J. and Dreyfuss, G., Immunopurification of heterogeneous nuclear
ribonucleoprotein particles reveals an assortment of RNA-binding proteins, Genes Dev., 2, 215-227 (1988).
Pombo, A., Jackson, D.A, Hollinshead, M., Wang, Z., Roeder, R.G., Cook, P.R., Regional specialization in
human nuclei: visualization of discrete sites of transcription by RNA poylmerase III, EMBO J., 18, 2241-2253
(1999).
Prokhorova, T.A., Blow, J.J., Sequential MCM/P1 sub-complex assembly is required to form a hetero-hexamer
with replication licensing activity, J. Biol. Chem., 275, 2491-2504 (2000).
Quinlan, R., Cytoskeletal competence requires protein chaperones, Prog. Mol. Subcell. Biol., 28, 219-233
(2002).
Quintana, D.G., Dutta, A., The metazoan origin recognition complex, Frontiers in Bioscience, 4, 805-815
(1999).
Qumsiyeh, M.B., Structure and function of the nucleus: anatomy and physiology of chromatin, Cell. Mol. Life
Sci., 55, 1129-1140 (1999).
Rappold, G.A., The pseudoautosomal regions of the human sex chromosomes, Hum. Genet., 92, 315-324
(1993).
Raska, I., Reimer, G., Jarnik, M., Kostrouch, Z., Raska, K., Does the synthesis of ribosomal RNA take place
within the nucleolar fibrillar centers or dense fibrillar components?, Biol. Cell, 65, 79-82 (1989).
Literatur
170
Razin, S.V., Gromova, H., Iarovaia, O.V., Specifity and functional significance of DNA interaction with the
nuclear matrix: new approaches to clarify the old questions, Int. Rev. Cytol., 162B, 405-448 (1995).
Ren, S., Rollins, B.J., Cyclin C/cdk3 promotes Rb-dependent G0 exit, Cell, 117, 239-251 (2004).
Rendon, M.C., Rodrigo, R.M., Goenechea, L.G., Garcia-Herdugo, G., Valdivia, M.M., Moreno, F.J.,
Characterization and immunolocalization of a nuclear antigen with anti-NOR serum in HeLa cells, Exp. Cell
Res., 200, 393-403 (1992).
Riggs, A.D., Marsupials and mechanisms of X chromosome inactivation, Aust. J. Zool., 37, 419-441 (1990).
Roca, A.I., Cox, M.M., The RecA protein: structure and function, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 25, 415-456
(1991).
Romanowski, P., Madine, M.A., Rowles, A., Blow, J.J., Laskey, R.A., The Xenopus origin recognition
complex is essential for DNA replication and MCM binding to chromatin, Curr. Biol., 6, 1416-1425 (1996).
Romanowski, P., Marr, J., Madine, M.A., Rowles, A., Blow, J.J., Gautier, J., Laskey, R.A., Interaction of
Xenopus Cdc2-Cyclin A1 with the Origin Recognition Complex, J. Biol. Chem., 275, 4239-4243 (2000).
Romig, H., Fackelmayer, F.O., Renz, A., Ramsperger, U., Richter, A., Characterization of SAF-A, a novel
nuclear DNA binding protein from HeLa cells with high affinity for nuclear matrix/scaffold attachment DNA
elements, EMBO J., 11, 3431-3440 (1992).
Romig, H, Ruff, J., Fackelmayer, F.O., Patil, M.S., Richter, A., Characterization of two intronic nuclearmatrix-attachment regions in the human DNA topoisomerase I gene, Eur, J. Biochem., 221, 411-419 (1994).
Rowles, A., Chong, J.P.J., Brown, L., Howell, M., Evan, G.I., Blow, J.J., Interaction between the origin
recognition complex and the replication licensing system in Xenopus, Cell, 87, 287-296 (1996).
Sachs, R.K., van den Engh, G., Trask, B., Yokota, H., Hearst, J.E., A random-walk/giant-loop model for
interphase chromosomes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 2710-2714 (1995).
Sachse, G., Untersuchung zur Dynamik des Kerngerüstes in lebenden Zellen, Diplomarbeit, Universität
Hamburg (2004).
Sadoni, N., Langer, S., Fauth, C., Bernardi, G., Cremer, T., Turner, B.M., Zink, D., Nuclear organization of
mammalian genomes: polar chromosome territories build up functionally distinct higher order compartments, J.
Cell. Biol., 146, 1211-1226 (1999).
Sadoni, N., Cardoso, M.C., Stelzer, E.H.K., Leonhardt, H., Zink, D., Stable chromosomal units determine the
spatial and temporal organization of DNA replication, J. Cell. Sci., 117, 5353-5365 (2004).
Saitoh, Y., Laemmli, U.K., Metaphase chromosome structure: bands arise from a differential folding path of the
highly AT-rich scaffold, Cell, 76, 609-622 (1994).
Samarina, O.P., hnRNP particles, Bioessays, 18, 595-601 (1996).
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Press, New York (1989).
Scheer, U., Hock, R., Structure and function of the nucleolus, Curr. Opin. Cell Biol., 11, 385-390 (1999).
Scheer, U., Rose, K.M., Localization of RNA polymerase I in interphase cells and mitotic chromosomes by
light and electron microscopic immunocytochemistry, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81, 1431-1435 (1984).
Schett, G., Steiner, C.W., Xu, Q., Smolen, J.S., Steiner, G., TNFalpha mediates susceptibility to heat-induced
apoptosis by protein phosphatase-mediated inhibition of the HSF1/hsp70 stress response, Cell Death Differ., 10,
1126-1136 (2003).
Literatur
171
Scholey, J.M., Rogers, G.C., Sharp, D.J., Mitosis, microtubules, and the matrix, J. Cell Biol., 154, 261-266
(2001).
Schuebeler, D., Mielke, C., Maass, K., Bode, J., Scaffold/Matrix-Attached Regions Act upon Transcription in
a Context-Dependent Manner, Biochemistry, 35, 11160-11169 (1996).
Schul, W., van Driel, R., de Jong, L., A subset of poly(A) polymerase is concentrated at sites of RNA synthesis
and is associated with domains enriched in splicing factors and poly(A) RNA, Exp. Cell Res., 238, 1-12 (1989).
Schwander, A., Die funktionelle Domänenstruktur des humanen Kernproteins Scaffold Attachment Factor A,
Dissertation, Universität Hamburg (2004).
Seksek, O., Biwersi, J., Verkman, A.S., Translational diffusion of macromolecules-sized solutes in cytoplasm
and nucleus, J. Cell Biol., 138, 131-142 (1997).
Shanker Narayan, K., Steele, W.J., Smetana, K., Busch, H., Ultrastructural aspects of the ribonucleoprotein
network in nuclei of walker tumor and rat liver, Exp. Cell Res., 46, 65-77 (1967).
Sherr, C.J., Mammalian G1 cyclins, Cell, 73, 1059-1065 (1993).
Sherr, C.J., Cancer cell cycles, Science, 274, 1672-1677 (1996).
Sherr, C.J., Roberts, J.M., Inhibitors of mammalian G1 cyclin-dependent kinases, Genes & Dev., 9, 1149-1163
(1995).
Sherr, C.J., Roberts, J.M., CDK inhibitors: positive and negative regulators of G1-phase progression, Genes &
Dev., 13, 1501-1512 (1999).
Sherr, C.J., The pezcoller lecture: cancer cell cycles revisited, Cancer Res., 60, 3689-3695 (2000).
Shinohara, A., Ogawa, T., Homologous recombination and the roles of double-strand breaks, Trends Biochem.
Sci., 20, 387-391 (1995).
Shopland, L.S., Lawrence, J.B., Seeking common ground in nuclear complexity, J. Cell Biol., 150, F1-F4
(2000).
Shpargel, K.B., Ospina, J.K., Tucker, K.E., Matera, A.G., Hebert, M.D., Control of Cajal body number is
mediated by the coilin C-terminus, J. Cell Sci., 116, 303-312 (2003).
Smetana, K., Steele, W.J., Busch, H., A nuclear ribonucleoprotein network, Exp. Cell Res., 31, 198-201 (1963).
Smith, C.A., Farrah, T., Goodwin, R.G., The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteins:
activation, costimulation, and death, Cell, 76, 959-962 (1994).
Smith, L.D., The induction of oocyte maturation: transmembrane signaling events and regulation of the cell
cycle, Development, 107, 685-699 (1989).
Smith, M.M., Histone structure and function, Curr. Opin. Cell Biol., 3, 429-437 (1991).
Snaar, S., Wiesmeijer, K., Jochemsen, G., Tanke, H.J., Dirks, R.W., Mutational analysis of fibrillarin and its
mobility in living human cells, J. Cell Biol., 151, 653-662 (2000).
Solovei, I., Kienle, D., Little, G., Eils, R., Saelyeva, L., Schwab, M., Jager, W., Cremer, C., Cremer, T.,
Topology of double minutes (dmins) and homogeneously staining regions (HSRs) in nuclei of human
neuroblastoma cell lines, Genes Chromosom. Cancer, 29, 297-308 (2000).
Sorg, G., Stamminger, T., Mapping of nuclear localization signals by simultaneous fusion to green fluorescent
protein and to beta-galactosidase, Biotechniques, 26, 858-862 (1999).
Sparvoli, E., Levi, M., Rossi, E., Replicon clusters may form structurally stable complexes of chromatin and
chromosomes, J. Cell Sci., 107, 3097-3103 (1994).
Literatur
172
Spector, D.L., Higher order nuclear organization: three-dimensional distribution of small nuclear
ribonucleoprotein particles, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 147-151 (1990).
Spector, D.L., Fu, X.-D., Maniatis, T., Association between distinct pre-mRNA splicing components and the
cell nucleus, EMBO J., 10, 3467-3471 (1991).
Spector, D.L., Macromolecular domains within the cell nucleus, Annu. Rev. Cell. Biol., 9, 256-315 (1993).
Spector, D.L., Nuclear domains, J. Cell. Sci., 114, 2891-2893 (2001).
Sperry, A.O., Blasquez, V.H., Garrard, W.T., Dysfunction of chromosomal loop attachment sites: illegitimate
recombination linked to matrix association regions and topoisomerase II, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 54975501 (1989).
Stein, G.S., Berezney, R., 25 years of contributions to characterizing gene expression and replication within the
three-dimensional context of nuclear architecture, Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr., 10, v-vi (2000).
Stenoien, D.L., Sharp, Z.D., Smith, C.L., Mancini, M.A., Functional subnuclear partitioning of transcription
factors, J. Cell. Biochem., 70, 213-221 (1998).
Stenoien, D.L., Sen, S., Mancini, M.A., Brinkley, B.R., Dynamic association of a tumor amplified kinase,
Aurora-A, with the centrosome and mitotic spindle, Cell Motility and the Cytoskeleton, 55, 134-146 (2003).
Sternsdorf, T., Grotzinger, T., Jensen, K., Will, H., Nuclear dots: actors on many stages, Immunbiology, 198,
307-331 (1997).
Stewart, M., Intermediate filament structure and assembly, Curr Opin. Cell. Biol, 5, 3-11 (1993).
Stoffler, D., Fahrenkrog, B., Aebi, U., The nuclear pore complex: from molecular architecture to functional
dynamics, Curr. Opin. Cell Biol., 11, 391-401 (1999).
Strausfeld, U.P., Howell, M., Descombes, P., Chevalier, S., Rempel, R.E., Adamczewski, J., Maller, J.L.,
Hunt, T., Blow, J.J., Both cyclin A and cyclin E have S-Phase promoting (SPF) activity in Xenopus egg
extracts, J. Cell Sci., 109, 1555-1563 (1996).
Stricker, S.A., Comparative biology of calcium signaling during fertilization and egg activation in animals, Dev.
Biol., 211, 157-176 (1999).
Sumner, A.T., Chromosome Banding, Unwin Hyman Limited, London (1990).
Swanson, M.S., Functions of nuclear pre-MRNA/mRNA binding proteins. In “Pre-mRNA Processing“ (A.I.
Lamond, Ed.), Springer Verlag, Heidelberg (1995).
Tada, S., Li, A., Maiorano, D., Mechali, M., Blow, J.J., Repression of origin assembly in metaphase depends
on inhibition of RLF-B/Cdt1 by geminin, Nat. Cell Biol., 3, 107-113 (2001).
Tan, E.M., Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): their immunbiology and medicine, Adv. Immunol., 33,
167-240 (1982).
Tanabe, H., Müller, S., Neusser, M., von Hase, J., Calcagno, E., Cremer, M., Solovei, I., Cremer, C.,
Cremer, T., Evolutionary conservation of chromosome territory arrangements in cell nuclei from higher
primates, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 99, 4424-4429 (2002).
Tanaka, T., Knapp, D., Nasmyth, K., Loading of an MCM protein onto DNA replication origins is regulated
by Cdc6p and CDKs, Cell, 90, 649-660 (1997).
Tanaka, T., Nasmyth, K., Association of RPA with chromosomal replication origins requires an MCM protein,
and is regulated by Rad53, and cyclin- and dbf4-dependent kinases, EMBO J., 17, 5182-5191 (1998).
Taniura, H., Yoshikawa, K., Necdin interacts with the ribonucleoprotein hnRNP U in the nuclear matrix, J.
Cell Biochem., 84, 545-555 (2002).
Literatur
173
Tao, W., Levine, A.J., p19ARF stabilizes p53 by blocking nucleo-cytoplasmic shuttling of Mdm2, Proc. Nat.
Acad. Sci. USA, 96, 6937-6941 (1999).
Thiry, M., Ultrastructural detection of DNA within the nucleolus by sensitive molecular immunocytochemistry,
Exp. Cell Res., 200, 135-144 (1992a).
Thiry, M., New data concerning the functional organization of the mammalian cell nucleolus: detection of RNA
and rRNA by in situ molecular immuncytochemistry, Nucl. Acids Res., 20, 6195-6200 (1992b).
Thoma, F., Koller, T., Klug, A., Involvement of histone H1 in the organization of the nucleosome and of the
salt-dependent superstructures of chromatin, J. Cell Biol., 83, 403-427 (1979).
Tubo, R.A., Berezney, R., Identification of 100 and 150 S DNA polymerase alpha-primase megacomplexes
solubilized from the nuclear matrix of regenerating rat liver, J. Biol. Chem., 262, 5857-5865 (1987).
Tucker, K.E., Berciano, M.T., Jacobs, E.Y., LePage, D.F., Shpargel, K.B., Rossiere, J.J., Chan, E.K.,
Lafarga, M., Conlon, R.A., Matera, A.G., Residual Cajal bodies in coilin knockout mice fail to recruit Sm
snRNPs and SMN, the spinal muscular atrophy gene product, J. Cell Biol., 154, 293-307 (2001).
Tye, B.K., MCM proteins in DNA replication, Annu. Rev. Biochem., 68, 649-686 (1999).
Tye, B.K., The MCM2-3-6 proteins: are they replication licensing factors?, Trends Cell Biol, 4, 160-166 (1994).
van Dierendonck, J.H., Kayzer, R., van de Velde, C.J.H., Cornelisse, C.J., Subdivision of S-Phase by
analysis of nuclear 5-bromodesoxyuridine staining patterns, Cytometry, 10, 143-150 (1989).
van Driel, R., Wansink, D.G., van Steensel, B., Grande, M.A., Schul, W., de Jong, L., Nuclear domains and
the nuclear martix, Int. Rev. Cytol., 162A, 151-189 (1995).
van Drunen, C.M., Sewalt, R.G.A.B., Oosterling, R.W., Weisbeek, P.J., Smeekens, S.C.M., van Driel, R., A
bipartite sequence element associated with matrix/scaffold attachment regions, Nucleic Acids Res., 27, 29242930 (1999).
van Holde, K.E., Chromatin, Springer-Verlag, New York, 289-343 (1988).
van Holde, K.E., Zlatanova, J., Chromatin higher order structure: chasing a mirage?, J. Biol. Chem., 270, 83738376 (1995).
Vassetzky, Y., Hair, A., Mechali, M., Rearrangement of chromatin domains during development in Xenopus,
Genes Dev., 14, 541-552 (2000).
Vaughn, J.P., Dijkwel, P.A., Mullenders, L.H., Hamlin, J.L., Replication forks are associated with the nuclear
matrix, Nucleic Acids Res., 18, 1965-1969 (1990).
Verheijen, R., van Venrooij,W., Ramaekers, F., The nuclear matrix: structure and composition, J. Cell Sci.,
90, 11-36 (1988).
Verschure, P.J., van der Kraan, I., Manders, E.M., van Driel, R., Spatial relationship between transcription
sites and chromosome territories, J. Cell. Biol., 147, 13-24 (1999).
Verschure, P.J., van der Kraan, I., Enserink, J.M., Mone, M.J., Manders, E.M., van Driel, R., Large-scale
chromatin organization and the localization of proteins involved in gene expression in human cells, J.
Histochem. Cytochem., 50, 1303-1312 (2002).
Verschuure, P., Croes, Y., van den Ijssel, P.R.L.A., Quinlan, R.A., de Jong, W.W., Boelens, W.C.,
Translocation of small heat shock protein to the actin cytoskeleton upon proteasomal inhibition, J. Mol. Cardiol.,
34, 117-128 (2002).
Visser, A.E., Jaunin, F., Fakan, S, Aten, J.A., High resolution analysis of interphase chromosome domains, J.
Cell. Sci., 113, 2585-2593 (2000).
Literatur
174
Vogelstein, B., Pardoll, D.M., Coffey, D.S., Supercoiled loops and eukaryotic DNA replication, Cell, 22, 79-85
(1980).
Wachsmuth, M., Waldeck, W., Langowski, J., Anomalous diffusion of fluorescent probes inside living cell
nuclei investigated by spatially-resolved fluorescence correlation spectroscopy, J. Mol. Biol., 298, 677-689
(2000).
Wade, P.A., Pruss, D., Wolffe, A.P., Histone acetylation: chromatin in action, Trends Biochem. Sci., 22, 128132 (1997).
Waga, S., Masuda, T., Takisawa, H., Sugino, A., DNA polymerase epsilon is required for coordinated and
efficient chromosomal DNA replication in Xenopus egg extracts, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 4978-4983
(2001).
Waga, S., Stillman, B., The DNA replication fork in eukaryotic cells, Annu. Rev. Biochem., 67, 721-751
(1998).
Walter, J., Newport, J., Initiation of Eukaryotic DNA Replication: Origin Unwinding and Sequential
Chromatin Association of Cdc45, RPA, and DNA Polymerase α, Mol. Cell, 6, 617-627 (2000).
Walter, J.C., Evidence for sequential action of cdc7 and cdk2 protein kinases during initiation of DNA
replication in Xenopus egg extracts, J. Biol. Chem., 275, 39773-39778 (2000).
Wang, Y.-L., Mobility of filamentous actin in living cytoplasm, J. Cell Biol., 105, 2811-2816 (1987).
Wasser, M., Chia, W., The EAST protein of Drosophila controls an expandable nuclear endoskeleton, Nature
Cell Biology, 2, 268-275 (2000).
Weber, H.O., Samuel, T., Rauch, P., Funk, J.O., Human p14ARF-mediated cell cycle arrest strictly depends on
intact p53 signaling pathways, Oncogene, 21, 3207-3212 (2002).
Weber, J.D., Taylor, L.J., Roussel, M.F., Sherr, C.J., Bar-Sagi, D., Nuclear Arf sequesters Mdm2 and
activates p53, Nature Cell Biol., 1, 20-27 (1999).
Weighardt, F., Biamonti, G., Riva, S., The roles of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) in RNA
metabolism, BioEssays, 18, 747-756 (1996).
Wessel, D. and Flugge, U. I., A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence
of detergents and lipids, Anal. Biochem. 138, 141-143 (1984).
Whyte, P., Buckkovich, K.J., Horowitz, J.M., Friend, S.H., Raybuck, M., Weinberg, R.A., Harlow, E.,
Association between an oncogene and an anti-oncogene: the adenovirus E1A proteins bind to the retinoblastoma
gene product, Nature, 334, 124-129 (1988).
Widom, J., Toward a unified model of chromatin folding, Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 18, 356-395
(1989).
Williams, C.A., Ockey, C.H., Distribution of DNA replicator sites in mammalian nuclei after different methods
of cell synchronization, Exp. Cell Res., 63, 365-372 (1970).
Wold, M.S., Replication protein A: a heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for
eukaryotic DNA-metabolism, Annu. Rev. Biochem., 66, 61-92 (1997).
Wolffe, A.P., Chromatin. Structure and Function, Academic Press, 2nd Ed, London (1995).
Wolffe, A.P., Pruss, D., Targeting chromatin disruption: Transcription regulators that acetylate histones, Cell,
84, 817-819 (1996).
Woodland, H., Adamson, E., The synthesis and storage of histones during oogenesis of Xenopus oocytes, Dev.
Biol., 57, 118-135 (1977).
Literatur
175
Wutz, A., Rasmussen, T.P., Jaenisch, R., Chromosomal silencing and localization are mediated by different
doamins of Xist RNA, Nature Genetics, 30, 167-174 (2002).
Xiong, Y., Connolly, T., Futcher, B., Beach, D., Human D-type cyclin, Cell, 65, 691-699 (1991).
Yanagisawa, J., Ando, J., Nakayama, J., Kohwi,Y., Kohwi-Shigematsu, T., A matrix attachment regin
(MAR)-binding activity due to a p114 kilodalton protein is found in human breast carcinomas and not in normal
and benign breast disease tissues, Cancer R., 56, 457-462 (1996).
Yang, E., Zha, J., Jockel, E., Boise, L.H., Thompson, C.B., Korsmeyer, S.J., Bad, a heterodimeric partner for
Bcl-xL and Bcl-2, displaces Bax and promotes cell death, Cell, 80, 285-291 (1995).
Yokota, H., van den Engh, G., Hearst, J.E., Sachs, R.K., Trask, B.J., Evidence for the organization of
chromatin in megabase pairsized loops arranged along a random walk path in human G0/G1 interphase nucleus,
J. Cell Biol., 130, 1239-1249 (1995).
Yoon, M., Moir, R.D., Prahlad, V., Goldman, R.D., Motile properties of Vimentin intermediate filament
networks in living cells, J. Cell Biol., 143, 147-157 (1998).
Yu, W., de la Espina, S.M.D., The plant nucleoskeleton: ultrastructural organization and identification of
NuMA homologues in the nuclear matrix and mitotic spindle of plant cells, Exp. Cell Res., 246, 516-526 (1999).
Zbarskii, I.B., Debov, S.S., On the proteins of the cell nucleus, Dokl. Akadd. Nauk. SSSR, 63, 795-798 (1948).
Zeng, C., Kim, E., Warren, S.L., Berget, S.M., Dynamic relocation of transcription and splicing factors
dependent upon transcriptional activity, EMBO J., 16, 1401-1412 (1997).
Zhao, K., Käs, E., Gonzales, E., Laemmli, U.K., SAR-dependent mobilization of histone H1 by HMGI/Y in
vitro: HMGI/Y is enriched in H1-depleted chromatin, EMBO J., 12, 3237-47 (1993).
Zhong, S., Salomoni, P., Pandolfi, P.P., The transcriptional role of PML and the nuclear body, Nature Cell
Biol., 2, 85-90 (2000).
Zink, D., Cremer, T., Saffrich, R., Fischer, R., Trendelenburg, M.F., Ansorge, W., Stelzer, E.H.K.,
Structure and dynamics of human interphase chromosome territories in vivo, Hum. Genet., 102, 241-251 (1998).
Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A.E., Cremer, C., Cremer, T., Organization of early and late replicating DNA
in human chromosome territories, Exp. Cell. Res., 247, 176-188 (1999).
Zong, R., Scheuermann, R.H., Mutually exclusive interaction of a novel MAR-binding protein and the NFµNRR enhancer repressor: implications for regulation of immunoglobulin heavy-chain expression, J. Biol.
Chem., 270, 24010-24018 (1995).
Zou, L., Stillman, B., Formation of a pre-initiation complex by S-Phase cyclin cdk-dependent loading of
Cdc45p onto chromatin, Science, 280, 593-596 (1998).
Zuckerkandl, E., Villet, R., Generation of high specificity of effect through low-specificity binding of proteins
to DNA, FEBS Lett., 231, 291-298 (1988).
Anhang
176
9. Anhang
9.1 Abkürzungen
A
Abb.
AK
AP
APS
AS
ATP
ß-Gal
bp
BrdU
BrU
BSA
BTC
ca.
CDK
cDNA
Chr.
CKI
Da
DABCO
ddTTP
DG
DIC
D
DMEM
DMSO
DNA
DNase
dNTP
DTT
E. coli
ECL
EDTA
eGFP
Em
ER
et al.
EtOH
Ex
FACS
FCS
FISH
FRAP
FSI
g
GFL
G-Phase
h
HEK
Ampere oder Auflösungsvermögen
Abbildung
Antikörper
alkalische Phosphatase
Ammoniumperoxodisulfat
Aminosäure
Adenosintriphosphat
ß-Galaktosidase
Basenpaare
Bromdesoxyuridin
Bromuridin
Bovines Serumalbumin
Barnstead Thermolyne
Corporation
circa
cyclin dependent kinases
complementary DNA
Chromosom
CDK inhibitor
Dalton
1,4 Diazabicyclo[2,2,2]octane
Didesoxythymidintriphosphat
Deckglas
differential interference contrast
Diffusionkoeffizient
Dulbecco’s modified eagle
medium
Dimethylsulfoxid
Desoxyribonukleinsäure
Desoxyribonuklease
Desoxynukleosidtriphosphat
Dithiothreitol
Escherichia coli
enhanced chemiluminescence
Ethylendiamtetraessigsäure
enhanced green fluorescent
protein
emission
energy regeneration
et alii
Ethanol
excitation
fluorescence activated cell sorting
Fetales Kälberserum
Fluoreszenz in situ
Hybridisierung
fluorescence recovery after
photobleaching
Fischer Scientific Industries
Erdbeschleunigung (9,81m/s2)
Gesellschat für Labortechnik
„Gap“-Phase
Stunde
human embryonal kidney
HEPES
hnRNP
HPI
HRP
IF
IMAC
IPTG
Konz.
l
Laser
LB
LSM
MAR
max.
MCB
MCS
MeOH
min
N.A.
NaTT
NEB
NFL
Ni-NTA
NLS
nm
NP-40
Nr.
nt
OD
OT
P/S
PAGE
PBS
PCR
PEI
pFa
PIPES
Pol
PPD
PVDF
repl.
RFI
RNA
RNase
ROI
RT
s
N-2-Hydroxyethylpiperazin-N’-2ethansulfonsäure
heterogenous nuclear
ribonulceoprotein
Heinrich-Pette-Institut
horse radish peroxidase
(Meerrettich-Peroxidase)
Immunfluoreszenz
immobilisierte MetallchelatAffinitätschromatographie
Isopropylthiogalaktose
Konzentration
Liter
light amplification by stimulated
emission of radiation
Luria Broth bzw. Luria Bertani
laser scanning microscope
matrix associated region
maximal
macro chromatin body
multiple cloning site
Methanol
Minute
Numerische Apertur
Natriumtetrathionat
New England Biolabs
New Branswick Scientific
Nickel-Nitrilotriessigsäure
nuclear localization signal
Nanometer
Nonidetphenylpolyethylglycol-40
Nummer
Nukleotid
optische Dichte
Objektträger
Penicillin/Streptomycin
Polyacrylamidgelelektrophorese
phosphate buffered saline
polymerase chain reaction
Polyethylenimin
Paraformaldehyd
Piperazin-N,N’-bis(2ethansulfonsäure)
Polymerase
Para-Phenylendiamin
polyvinylidene fluoride
repliziert(e)
relative Fluoreszenzintensität
Ribonukleinsäure
Ribonuklease
region of interest
Raumtemperatur oder Reverse
Transkription
Sekunde
Anhang
s.
s.o.
s.u.
SAF-A
SAR
SDS
S-Phase
SS
SSC
SV 40
t1/2
Tab.
Taq
177
TEMED
Tris
siehe
siehe oben
siehe unten
scaffold attachment factor A
scaffold attachment region
Natriumdodecylsulfat
Synthese-Phase
salmon sperm (Lachssperma)
standard saline citrate
Simian Virus 40
Halbwertszeit der
Fluoreszenzrückkehr
Tabelle
Thermos aquaticus
U
u.a.
V
v
w
wt
Xi
x
z.B.
z.T.
N,N,N’,N’-Tetramethylendiamin
Tris-(hydroxymethyl)aminomethan
unit
unter anderem
Volt
volume
weight
Wildtyp
inaktives X-Chromosom
Xenopus
zum Beispiel
zum Teil
9.2 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
Abb.
Titel
Seite
1
Der Nucleus der Mammalia
3
2
Modellvorstellung der höheren Chromatinorganisation
10
3
Die Zellkern-Matrix
17
4
Domänenstruktur von SAF-A
22
5
Matrixpräparation – Schematische Darstellung
59
6
Strukturmerkmale einfacher Kerne
63
7
xSAF-A-Strukturen in einfachen Kernen
64
8
Räumliche Organisation von xSAF-A in einfachen Kernen
65
9
Vergleich des Färbemusters von xSAF-A und der DNA in einfachen
Kernen
66
10
Matrixpräparation von einfachen Kernen
67
11
Konfokale Aufnahmen von xSAF-A/DNA-Untereinheiten
68
12
Halopräparation einfacher Kerne
69
13
Depletion von xSAF-A aus Ei-Extrakten
70
14
Einbau von xSAF-A-spezifischen Antikörpern in einfache Kerne
71
15
Kernbildung in Gegenwart von xSAF-A Antikörpern
72
16
Beeinflussung der Kernbildung durch die Prä-Inkubation von Ei-Extrakt
mit Antikörpern gegen xSAF-A
74
17
Markierung von Replikationsfoci in einfachen Kernen
75
18
Vergleich der Lokalisation von xSAF-A und frisch replizierter DNA
76
Anhang
19
178
Salzstabile Assoziation frisch replizierter DNA mit xSAF-A-gefärbten
Strukturen
77
20
Zeitreihenanalyse der DNA-Replikation in einfachen Kernen
78
21
Replizierte DNA bewegt sich von xSAF-A Strukturen fort
79
22
Lokalisierung von ORC1 und RPA in einfachen Kernen
81
23
Lokalisierung replikativer DNA-Polymerasen in einfachen Kernen
82
24
Colokalisation von Replikationsfaktoren und frisch replizierter DNA
83
25
Vergleich des Färbemusters von MCM-3 und replizierter DNA
84
26
Überprüfung der Spezifität von Antikörpern mittels Western-Blot
85
27
Qualitätskontrolle aufgereinigter xSAF-A-Antikörper
86
28
Lokalisierung von SAF-A in eukaryotischen Zellen während der Interphase
und Mitose
29
87
Matrixpräparationen führen zu keiner wesentlichen Veränderung der
SAF-A-Strukturen in Zellkernen
88
30
DNA-reiche Matrixpräparation
89
31
Anreicherung von SAF-A in Barr-Körpern
89
32
Anreicherung von SAF-A in X-Chromosomenterritorien
90
33
Anreicherung von SAF-A in „macro chromatin bodies“ (MCBs)
91
34
SAF-A behält seine Anreicherung in inaktiven X-Chromosomen auch nach
35
der Entfernung des Chromatins
92
SAF-A ist in Bereichen inaktiver X-Chromosomen für Antikörper schwer
92
zugänglich
36
Die RNA-Bindedomäne von SAF-A ist essentiell für die Anreicherung in
93
inaktiven X-Chromosomen
37
Vergleich der Proteinmengen von SAF-A:eGFP, ∆RGG:eGFP und
94
endogenem SAF-A in HEK293-Zellen
38
Der enzymatische Abbau von RNA führt zum Verlust der Anreicherung
94
von SAF-A in Xi
39
FISH mit X-Paint-Sonden an den Zellinien HEK293, SF767 und IMR90
96
40
C280 beeinflußt die Organisation des Chromatins
99
41
C280 und Chromosomenterritorien schließen sich gegenseitig aus
100
42
C280 und ∆N45 haben keinen Einfluß auf „macro chromatin bodies“
101
(MCBs)
43
Vergleich der Matrixstrukturen von SAF-A und C280
102
Anhang
179
44
C280 führt zur Umlagerung der Matrixstrukturen von SAF-A
103
45
C280 führt zur Umlagerung der Matrixstrukturen von hnRNP-C
104
46
C280 stört die DNA-Replikation
106
47
C280 hat keinen Effekt auf die Transkription
108
48
C280 führt zur Arretierung des Zellzyklus
109
49
Western-Blot-Analyse von Zellzyklus-Proteinen
112
50
Lokalisation von RPA, MCM-3 und ORC2
114
51
C280 beeinflußt die chromatingebundene Fraktion von MCM und RPA
114
52
Array-Analysen: Vorarbeiten und Rohdaten
117
53
Western-Blot-Analyse von Proteinen, die in FRAP-Experimenten
untersucht wurden
120
54
Qualitative FRAP-Daten
121
55
FRAP-Kurven
123
56
Vergleich der FRAP-Kurven der Deletions- und Teilkonstrukte von SAF-A
124
57
Modell einer xSAF-A/DNA-Untereinheit
130
58
MAR-Potential von Lambda-DNA
131
59
MAR-Potential des humanen L1-Elements
148
Tab.
Titel
Seite
1
Primäre Antikörper (Auszug)
29
2
Sekundäre Antikörper
30
3
Zusammensetzung von SDS-PA-Gelen verschiedener Konzentration
56
4
Sammelgelzusammensetzung
56
5
Zusammensetzung eines 50µl-Standard-PCR-Ansatzes
58
6
Quantitative Array-Auswertung
118
7
Quantitative FRAP-Ergebnisse für SAF-A, dessen Deletions- und
Teilkonstrukte und die Referenzproteine β-Gal und eGFP
125
Anhang
180
9.3 Danksagung
Bei Herrn Prof. Dr. R. Stick bedanke ich mich recht herzlich dafür, daß er sich als
Erstgutachter und Betreuer meiner Arbeit bereit erklärt hat.
Dr. Frank O. Fackelmayer (FOF) danke ich für die Bereitstellung des, so finde ich, sehr
spannenden und teilweise exotischen Themas. Auch möchte ich ihm für den sicheren
Arbeitsplatz, die zahlreichen Tips & Tricks (hab’ eine Menge dazugelernt), die kleinen sowie
großen Hilfen und die motivierende Stimmung danken.
Für das äußerst angenehme Arbeitsklima, die freundschaftliche Atmosphäre und die heiteren
Momente danke ich besonders Maike Bossert (unsere freaky (Ex-)TA; viel Erfolg in Kanada),
Frank Herrmann (der IP-Meister), Giulia Mearini (Frau Superschnell) und Andrea Schwander
(die Akkordarbeiterin), die während meiner Promotionszeit den festen Kern der
Arbeitsgruppe „Molekulare Zellbiologie“ bildeten. Ein Dankeschön geht auch an die
transienten Mitglieder der Arbeitsgruppe - Katja Reuschlein, Gregor Sachse und Ercan
Akgün-Franke - für die sehr informativen und kurzweiligen Unterhaltungen.
Rudolph Reimer möchte ich für seine ständige und sofortige Hilfsbereitschaft im Felde der
Mikroskopie und die zahlreichen Antikörperspenden danken.
Weiterhin geht ein herzlicher Dank an Daniel Speidel, der trotz seiner knapp bemessenen Zeit
Durchflußcytometrie-Analysen für mich durchgeführt hat.
Ein großer Dank geht auch an Arne Düsedau (den FACS-Meister) für die zahlreichen und
prompten Zellsortierungen, ohne die ein Teil dieser Arbeit nicht möglich gewesen wäre.
Letztendlich möchte ich mich auch bei der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) für die
Bereitstellung der finanziellen Mittel bedanken.
Erklärung
Gem. § 6 (5) Nr. 1-3 PromO
Hiermit erkläre ich, daß ich
1. die Arbeit ohne unerlaubte Hilfe angefertigt,
2. keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel
benutzt und
3. die den benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen
als solche kenntlich gemacht habe.
Hamburg, den 18. Februar 2005
____________________
( Roger Helbig)