Molekularbiologische Grundlagen und Diagnostik der hereditären

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© 2002
In memoriam I. Witt
Schattauer GmbH
Molekularbiologische Grundlagen und Diagnostik
der hereditären Defekte von Antithrombin III,
Protein C und Protein S
I. Witt †
Universität Freiburg i. Br.
Keywords
Schlüsselwörter
Antithrombin-III-Mangel, Protein-C-Mangel, Protein-SMangel, molekulare Defekte, DNA-Analytik
Antithrombin III deficiency, protein C deficiency,
protein S deficiency, molecular defects, DNA analysis
Zusammenfassung
Summary
Die enormen Fortschritte in der Molekularbiologie in den
letzten Jahren ermöglichten sowohl die Aufklärung der
Nukleotidsequenzen der Gene für Antithrombin III
(AT III), Protein C (PROC) und Protein S (PROS) als
auch die Identifizierung zahlreicher Mutationen bei
hereditären Defekten dieser wichtigen Inhibitoren des
plasmatischen Gerinnungssystems. Da die Gene für AT III
(13,8 kb) und PROC (11,2 kb) nicht groß und relativ
leicht zu analysieren sind, gibt es bereits umfangreiche
»databases« der Mutationen (50, 73). Für AT III sind
79 und für PROC 160 unterschiedliche Mutationen
beschrieben.
Sowohl beim AT-III-Mangel als auch beim Protein-CMangel hat die Mutationsaufklärung neue Erkenntnisse
über die Struktur-Funktions-Beziehung der Proteine
gebracht. Beim Protein-C-Mangel steht die klinische
Relevanz der DNA-Analyse im Vordergrund, da die
Diagnostik des Protein-C-Mangels auf der Proteinebene
nicht immer zuverlässig möglich ist.
Das Protein-S-Gen ist für die Analytik schwer zugänglich,
da es groß ist (80 kb) und außerdem ein Pseudogen
existiert. Es sind schon zahlreiche Mutationen bei Patienten mit Protein-S-Mangel identifiziert worden. Eine
Database ist bisher nicht publiziert. Die klinische Notwendigkeit zur Mutationsaufklärung besteht ebenso
wie beim Protein-C-Mangel. Es ist zu erwarten, dass
zukünftig die Identifizierung von Mutationen auch beim
Protein-S-Mangel beschleunigt vorangeht.
Recent progress in molecular biology enabled the elucidation of the nucleotide sequences of the genes for antithrombin III (AT III), protein C (PROC) and protein S
(PROS). Furthermore numerous mutations were identified causing genetic defects of the important inhibitors
of blood coagulation. As the genes for AT III (13.8 kb)
and PROC (11.2 kb) are small and easy to analyze a
great number of molecular defects already are described
in extensive databases (50, 73): 79 different mutations for AT III and 160 for PROC are included.
The identification of mutations leading to AT III and
PROC deficiency has given important information on the
structure-function relationships of the proteins. In case of
protein C deficiency the clinical relevance of DNA analyses is most important because the diagnosis at the protein level is often uncertain. The gene for PROS is not so
easy to analyze like the other two genes. The PROS gene is large and also a PROS pseudogene exists.
Although a number of mutations have been identified,
there has not been published a database until now. The
clinical relevance to identify gene defects in PROS
deficiency is as important as for PROC deficiency.
Presumably the elucidation of PROS gene defects will
advance in the near future.
D
Man findet hereditäre Defekte der Inhibitoren zu etwa 5-10% bei jüngeren Patienten mit einer Thromboseneigung (59).
Die Bestimmung der Aktivität und
Antigenkonzentration der Inhibitoren im
Plasma ist heute fester Bestandteil in der
Diagnostik der Thrombophilie. Etwa Mitte
der 80er Jahre wurden die Nukleotidsequenzen der Gene, die für diese Inhibitoren kodieren, aufgeklärt. Das löste eine
ie Bedeutung von Antithrombin
III, Protein C und Protein S für die
Regulation des plasmatischen Gerinnungssystems zeigt sich eindringlich
durch die pathologischen Folgen bei einem
Mangel oder Defekt dieser Parameter.
Nachdruck aus: Hämostaseologie 1994; 14:
199–208.
Hämostaseologie 2/2002
Hämostaseologie 2002; 22: 57–66
Fülle von Mutationsidentifizierungen bei
den entsprechenden Inhibitormangelzuständen aus, und in absehbarer Zukunft
wird die DNA-Diagnostik bei hereditärer
Thrombophilie zur Routine im spezialisierten Gerinnungslabor gehören. Mit den folgenden Ausführungen soll der derzeitige
Stand der molekularbiologischen Grundlagen und Diagnostik des AntithrombinIII-, Protein-C- und Protein-S-Mangels
dargestellt werden.
Antithrombin III
Struktur und Funktion
Antithrombin III (AT III) ist ein Serinproteinase-Inhibitor (SERPIN) mit einem
Molekulargewicht von 58,2 kD, dessen
Primärstruktur durch Aminosäure- und
cDNA-Sequenzierung aufgeklärt wurde
(68, 15). Das einkettige Glykoprotein wird
in der Leber mit einem Signalpeptid von
32 Aminosäuren synthetisiert. Nach der Abspaltung dieses Peptids, das für den intrazellulären Transport und die Sekretion erforderlich ist, wird das AT-III-Molekül ins
Plasma sezerniert und besteht dann aus
432 Aminosäuren. An vier Stellen ist das
Protein glykosyliert.
Typisch für SERPINE ist eine spezifische Peptidbindung (reactive site, P1-P1’Bindung), die von Proteinasen erkannt und
gespalten wird (13). Die Spaltung führt
zu einer Konformationsänderung des
SERPINS und zur Komplexbildung mit der
Proteinase und damit zu ihrer Inaktivierung. Die Reactive-site-Bindung von AT
III liegt zwischen Arg 393 und Ser 394, in
der Nähe des C-Terminus. Diese Bindung
wird von vielen Proteinasen erkannt, bevorzugt aber von Thrombin und Faktor Xa.
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Witt
Außer der proteinasebindenden Domäne enthält AT III eine weitere wichtige
funktionelle Domäne, an die Heparin und
andere Glykosaminoglykane binden. Diese
Domäne ist nahe dem N-Terminus lokalisiert und enthält einen hohen Anteil an positiv geladenen Aminosäuren. Die Domäne
der reactive site und die heparinbindende
Domäne sind strukturell verbunden und
beeinflussen sich gegenseitig.
Die Bindung von Heparin an AT III bewirkt ebenfalls eine Konformationsänderung des AT-III-Moleküls. Sehr wahrscheinlich findet dabei eine Veränderung
der Umgebung der reactive site statt, wodurch die Inhibierung von Proteinasen beschleunigt wird. An der Heparinbindung
sind einerseits spezifische Sulfatgruppen
einer bestimmten Pentasaccharidsequenz
im Heparinmolekül (4, 18, 83) beteiligt und
andererseits spezielle basische Aminosäuren (Lysin- und Arginingruppen) im
AT-III-Molekül (8).
Einblicke in die heparinbindenden Sequenzen gaben einerseits Untersuchungen
mit chemisch modifizierten Aminosäuren
und andererseits die Eigenschaften von
AT-III-Varianten. Essentiell für die Heparinbindung sind Lys 105, Lys 114, Lys 125
und Lys 136 (16, 54, 69). Weiter sind die Argininreste 47, 123, 129 und 145 notwendig
(10, 45, 82). Aber auch Mutationen, die zur
Veränderung der primären Kontaktstelle
für Heparin führen, vermindern die Heparinaffinität, z. B. die Mutationen Pro 41 Leu, Leu 99 Phe und Ser 116 Pro
(17, 63, 65).
Entscheidend für die Heparinbindung
sind aber nicht nur die spezifischen Aminosäuren, die den direkten Kontakt zwischen
AT III und Heparin vermitteln, sondern
auch die Konformation der heparinbindenden Domäne sowie die intakte Tertiärstruktur des Moleküls.
Organisation des Gens
Das AT-III-Gen ist auf dem langen Arm
von Chromsom 1 in der Position 1q23-q25
(9) lokalisiert. Es ist mit 13,8 kb nicht besonders groß und enthält 7 Exons mit den
entsprechenden Introns. Die vollständige
Nukleotidsequenz wurde 1993 publiziert
(66). Ursprünglich hatte man angenommen, dass es nur 6 Exons gibt. Dann wurde
noch ein Intron in Exon 3 gefunden, was
zur Bezeichnung Exon 3a und 3b führte
(Abb. 1). Die kodierenden Sequenzen für
die beiden funktionellen Domänen des
Moleküls sind in den Exons 2 und 3a (heparinbindende Domäne) und Exon 6 (proteinasebindende Domäne) lokalisiert.
Über die Strukturen, die das Gen regulieren, ist wenig bekannt. Es gibt keine
TATA-, CCAAT- oder GC-reichen Regionen am 5’-Ende des Gens. In den Introns
wurden 10 repetitive Alu-Elemente gefunden, wovon 4 im Intron 4 lokalisiert sind
(67).
Genetische Defekte
AT-III-Mangel ist ein erwiesener Risikofaktor für thromboembolische Erkrankungen, vorwiegend des venösen Systems. Ein
hereditärer Mangel oder Defekt des Proteins wird bei 2-5% der jüngeren Patienten
mit Thrombophilie als Ursache gefunden.
In der gesamten Population hat der hereditäre AT-III-Mangel eine Häufigkeit von
1 : 2000 bis 1 : 5000 (84). Der AT-III-Mangel
wird autosomal-dominant vererbt, das
heißt, dass heterozygote Defektträger symptomatisch sein können. Sie haben im
Plasma etwa 50% der normalen AT-IIIAktivität. Patienten mit homozygotem
AT-III-Mangel wurden nur vereinzelt beobachtet.
Der hereditäre AT-III-Mangel kann als
Typ I vorliegen, bei dem Konzentration und
Aktivität des Inhibitorproteins vermindert
sind, oder in seltenen Fällen als Typ II, bei
dem die Konzentration des Proteins normal ist und ein Defekt der Proteinstruktur
eine verminderte Aktivität im Plasma verursacht. Der Defekt kann die reactive site,
die heparinbindende Domäne oder beide
Regionen des Moleküls betreffen. Die nach
den derzeitigen Kenntnissen sinnvolle
Klassifizierung des AT-III-Mangels ist in
Tabelle 1 zusammengefasst (52).
Nach der Aufklärung der Nukleotidsequenz sind zahlreiche Mutationen in der
DNA von Personen mit hereditärem ATIII-Mangel identifiziert worden (51, 52).
Von den Mutationen, die in der von Lane
(52) zusammengestellten Database enthalten sind, betreffen relativ viele ein CpGDinukleotid. Man findet entweder einen
Austausch von CG durch TG oder CA.
Diese Tatsache stützt die Hypothese, dass
CG-Dinukleotide »hot spots« für Mutationen sind, und zwar aufgrund der spontanen
Desaminierung von 5’-Methylcytosin zu
Thymin. Interessant ist, dass Mutationen
von CpG-Dinukleotiden vorwiegend beim
Typ II des AT-III-Mangels gefunden werden, und dabei wiederum besonders bei
dem Subtyp, bei dem die heparinbindende
Domäne betroffen ist.
Typ I
Abb. 1 Schematische Darstellung des Antithrombin-III-Gens und die von ihm kodierten Proteinregionen [modifiziert nach
Lane et al. (53)]
Hämostaseologie 2/2002
Beim AT-III-Mangel vom Typ I sind nur in
ca. 8% der Fälle größere Deletionen in der
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Defekte bei AT III, Protein C, Protein S
DNA gefunden worden. Meistens liegen
Punktmutationen vor. Interessant ist eine
vollständige Deletion des Exons 5, die
durch eine homologe Rekombination zwischen den Alu-Repeats 7 und 10 entstanden ist, die in den Introns 4 und 5 lokalisiert
sind (66).
Das Bild der Punktmutationen ist
äußerst heterogen. Von den 39 in der Database von Lane (52) beschriebenen Punktmutationen bei Typ I wurden nur vier in
mehreren Familien gefunden. Hauptsächlich liegen Mutationen vor, die durch Nukleotidaustausch oder kleinere Deletionen
und Insertionen (<3 bp oder <3 bp · n) zu
einer Verschiebung des Leserasters (Frameshift-Mutationen) und damit zu einem vorzeitigen Abbruch der Translation (StoppCodon) führen. Nur wenige Mutationen
sind bekannt, die ein regelrechtes Processing der RNA verhindern (Splice-siteMutationen) oder die Synthese eines instabilen Proteins verursachen (MissenseMutationen).
Typ II
Ein wesentliches Ergebnis der bisherigen
Mutationsanalysen ist, dass bei den verschiedenen Unterformen des Typ-II-Mangels Mutationen in den Regionen des Gens
gefunden wurden, die für die beiden wichtigen funktionellen Domänen des Moleküls
kodieren. So konnten entscheidende Einblicke in die Beziehung zwischen Struktur
und Funktion des Proteins gewonnen werden. In der neuesten Fassung der Database
(52) sind 31 verschiedene Typ-II-Mutationen enthalten.
Beim Typ RS (effect on reactive site)
liegen Mutationen direkt in der reactive
site vor. Mutationen, die zu einem Austausch der Aminosäure in P1 führen, z. B.
Arg 393 durch Cys, His oder Pro aber auch
die Mutation Gly 392 Asp, führen zur
Synthese eines inaktiven Proteins (24, 26,
27, 49, 50). Interessant ist die Substitution
von Arg durch Cys in Position 393. Durch
den zusätzlichen oberflächenorientierten
Cystinrest wird Albumin an das defekte
AT-III-Molekül gebunden (25, 43). Ähnliche Komplexbildungen mit Albumin sind
auch für andere Proteinvarianten bekannt.
Substitutionen in P1’ (Ser 394) verändern die Spezifität des Inhibitors: die Akti-
Tab. 1 Klassifizierung des hereditären Antithrombin-III-Mangels
vität gegenüber Thrombin nimmt drastisch
ab, während die gegenüber Faktor Xa fast
unverändert bleibt.
AT-III-Varianten, denen Mutationen in
der Region des Gens zugrunde liegen, die
für die reactive site kodiert, sind nicht in
der Lage, Proteinasen zu binden und zu
inhibieren. Die Defektträger haben ein
hohes Risiko für thromboembolische Komplikationen. Früher wurde angenommen,
dass Mutationen, die in der unmittelbaren
Nähe der reactive site (P 12 - P 10) liegen,
ebenfalls die Spaltung des Inhibitors und
damit eine Inaktivierung der Proteinase
verhindern. Sie wurden als Typ IIb bezeichnet (53). Genaue Untersuchungen der Varianten Ala 394 Pro und Ala 382 Thr
haben aber gezeigt, dass die pathologischen
Inhibitoren gespalten werden können
(14, 44).Vermutlich ist bei diesen Varianten
die Stabilisierung des Inhibitor/ProteinaseKomplexes defekt.
AT-III-Varianten vom Typ HBS (effect
on heparin binding site) zeigen eine defekte Heparinbindungskapazität. Mutationen, die zu diesem Defekt führen, liegen an
Stellen des Gens, die für die heparinbindende Domäne des Proteins kodieren. Die
Substitution von Arg 47 durch Cys, His
oder Ser und von Arg 129 durch Gln verändert die Affinität von Heparin zu AT III
(32, 48). Auch Mutationen, die die Konformation der heparinbindenden Domäne
verändern, reduzieren die Heparinaffinität
erheblich, z. B. Pro 41 Leu (17), Leu 99
Phe (65) und Ser 116 Pro (63). Interessant ist die Mutation Ile 7 Asn, die den
Einbau einer neuen Kohlenhydratseitenkette ermöglicht und dadurch die Heparinbindung beeinflusst (12). Personen mit
diesen Mutationen auf einem Allel, also
heterozygote Defektträger, haben ent-
weder gar kein oder nur ein minimales
Risiko für Thromboembolien.
Kürzlich wurde das Vorkommen der
Mutation Leu 99 Phe bei zwei jungen
Patienten in homozygoter Form gefunden
(19). Auch die Mutation Arg 46 Lys ist
als homozygoter Defekt identifiziert worden (vgl. Übersicht in 19). Alle homozygoten Patienten litten an thrombotischen
Gefäßverschlüssen, dabei auffallend häufig
auch im arteriellen System.
AT-III-Varianten vom Typ PE (pleiotropic effect) liegen Mutationen der Aminosäuren 402-407 und 429 zugrunde. Sie
liegen noch in der Nähe der reactive ite und
verändern sowohl die Funktion des Inhibitors als auch die Heparinbindung. Der Einfluss auf die reactive site wird durch die
Nähe der Mutation verständlich. Die verminderte Heparinaffinität wird offensichtlich durch eine Beeinflussung der heparinbindenden Domäne verursacht. Personen
mit diesen Varianten haben verminderte
AT-III-Konzentrationen im Plasma und ein
hohes Risiko für Thromboembolien.
Genetische Polymorphismen
In der Database der AT-III-Mutationen
sind mehrere Polymorphismen aufgelistet
(52): zwei liegen in der 5’-untranslatierten
Region, einige in den Exons 2, 4 und 5 sowie zwei in Intron 4. Zum Teil ist die Anzahl der untersuchten Chromosomen sehr
gering. Kürzlich wurden zwei Trinukleotidpolymorphismen in den 3'-Enden von AluRepeats beschrieben (67).
Indikationen zur Gendiagnostik
Beim AT-III-Mangel besteht immer noch
ein großer Bedarf an Kenntnissen über die
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Hämostaseologie 2/2002
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Witt
Abb. 2 Modell des Protein-C-Moleküls [modifiziert nach Dahlbäck und Stenflo (21)]. Die Pfeile kennzeichnen die Lokalisation der Introns bzw. den Beginn der Exonbereiche mit der Nummerierung der Exons sowie mit der Angabe der Position
der ersten Aminosäure der von dem entsprechenden Exon kodierten Proteinregion. Zwischen den Aminosäuren 311 und
325 wird die Bindungsstelle für Faktor Va angenommen und zwischen den Aminosäuren 390 bis 404 eine weitere Bindungsstelle für Faktor Va sowie für Faktor VIIIa. : Kohlenhydratseitenketten, Y: -carboxylierte Glutaminsäurereste, Hya: Hydroxyasparaginsäure, TM: Thrombomodulin, *: Stelle der proteolytischen Spaltung des Proteins in die leichte (links von *)
und in die schwere Kette (rechts von *; dabei wird außerdem ein Dipeptid abgespalten), His211, Asp257, Ser360: Aminosäurereste des katalytischen Zentrums
Beziehungen zwischen Struktur und Funktion des Proteins. Mutationsuntersuchungen sind somit unerlässlich.
Für Patienten, die einen hereditären ATIII-Mangel haben, der zuverlässig auf der
Proteinebene nachweisbar ist, ist die Aufklärung der zugrunde liegenden Mutation
insofern von Bedeutung, als Mutationen,
die nur die heparinbindende Domäne betreffen, mit einem minimalen bzw. gar
keinem Risiko für thromboembolische Erkrankungen verbunden sind.
Methoden der Gendiagnostik
Da das AT-III-Gen relativ klein ist, erfolgt
die Mutationsaufklärung üblicherweise
durch Sequenzierung des gesamten Gens.
Bei bekannter Mutation eines Indexpatienten können DNA-Proben von Familienangehörigen durch Restriktionsenzymverdau
oder durch Blot-Verfahren mit geringem
Aufwand untersucht werden.
Protein C
Struktur und Funktion
Protein C ist eine Serinproteinase, die in
der Leber als einkettiges Polypeptid synHämostaseologie 2/2002
thetisiert wird. Auch Protein C entsteht
zunächst in einer Prä-Proform, bestehend
aus 461 Aminosäuren. Beim intrazellulären
Processing wird ein Leader-Peptid von
42 Aminosäuren abgespalten. Es besteht aus
einem hydrophoben Signalpeptid (Aminosäuren -42 bis -25) und einem Propeptid
(Aminosäuren -25 bis -1). Das Signalpeptid
ist für das Processing und die Sekretion
notwendig, während das Propeptid die Erkennungssequenz für das Carboxylasesystem enthält, durch das bestimmte Glutaminsäurereste Vitamin-K-abhängig zu Carboxyglutaminsäure carboxyliert werden. Intrazellulär wird das Protein außerdem glykosyliert (vgl. Übersicht in 21, 81).
Das einkettige Molekül wird im GolgiApparat durch ein trypsinähnliches Enzym
zwischen Arg 157 und Thr 158 in ein zweikettiges Molekül gespalten. In einem weiteren Schritt, der vermutlich im Plasma
stattfindet, wird das Dipeptid Arg 157 – Lys
156 abgespalten (30).
Das im Plasma in zweikettiger Form
zirkulierende Glykoprotein hat ein Molekulargewicht von 62 kD (419 Aminosäuren) und besteht aus der leichten (21 kD)
und der schweren Kette (41 kD), die nur
noch durch eine Disulfidbrücke (Cys 141 –
Cys 277) verbunden sind. Ca. 15% des Proteins findet man noch als einkettige Form
im Plasma (57, 60). Die beiden Formen
haben nach der Aktivierung vermutlich die
gleiche Aktivität.
Der aminoterminale Teil der leichten
Kette enthält die sogenannte Gla-Domäne,
in der die 9 -carboxylierten Glutaminsäurereste lokalisiert sind. Sie sind für die
kalziumabhängige Bindung des Proteins an
Phospholipidoberflächen essenziell. Nach
einem kurzen Zwischenpeptid von 8 Aminosäuren folgen zwei Epidermal-growthfactor(EGF)-ähnliche Domänen, die bei
der Aktivierung zusammen mit der GlaDomäne an der Bindung des Thrombin/
Thrombomodulin-Komplexes beteiligt sind
(41). In der zum N-Terminus hin gelegenen
EGF-homologen Region befindet sich eine
-Hydroxyasparaginsäure, die durch posttranslationale Hydroxylierung von Asparaginsäure entsteht. Diese modifizierte Asparaginsäure findet man auch in anderen
Vitamin-K-abhängigen Proteinen. Vermutlich ist sie an der Kalziumbindung beteiligt.
Die schwere Kette trägt das aktive Zentrum der Serinproteinase und das 12 Aminosäuren lange Aktivierungspeptid, das bei
der Aktivierung des Proenzyms durch
Thrombin abgespalten wird (Abb. 2). Der
am Endothel lokalisierte Thrombinrezeptor Thrombomodulin bewirkt eine mehrere
tausendfache Beschleunigung der Aktivierung.
Inhibierend wirkt aktiviertes Protein C
durch proteolytische Spaltung der Gerinnungsfaktoren Va und VIIIa. Dazu werden
negativ geladene Phospholipide, Ca2+Ionen und der Kofaktor Protein S benötigt.
Außerdem hat Protein C eine profibrinolytische Wirkung, da es einen Plasminogenaktivatorinhibitor hemmt.
Protein S ist ebenfalls ein Vitamin-Kabhängiges Protein (71 kD), das in der Leber, im Endothel und in den Megakaryozyten synthetisiert wird. Es liegt im Plasma
zu etwa 60% an den Inhibitor des Komplementsystems C4b-Binding-Protein (C4bBP) gebunden vor. Nur das freie Protein S
ist als Kofaktor für Protein C wirksam.
Organisation des Gens
Das Protein-C-Gen (PROC) ist auf Chromosom 2 in Position 2q13-q14 lokalisiert.
Es ist ca. 11,2 kb lang und besteht neben
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Defekte bei AT III, Protein C, Protein S
der Promotorregion aus insgesamt neun
Exons und acht intervenierenden Introns.
Die Nukleotidsequenz des gesamten Gens
ist seit 1985/86 bekannt (31, 73). Exon 1 und
die ersten 21 Nukleotide von Exon 2 bilden
den 5'-untranslatierten Teil des Gens. Exon
2 und ein Teil von Exon 3 kodieren für das
Leader-Peptid, der Rest von Exon 3 für die
Gla-Domäne. In dem sehr kleinen Exon 4
(24 bp) ist die Nukleotidsequenz für
das kurze Zwischenpeptid (Aminosäuren
38-46) festgelegt und in Exon 5 und 6 die
Sequenz für die beiden EGF-homologen
Domänen. Exon 7 und 8 sowie ein beträchtlicher Teil von Exon 9 kodieren für
die katalytische Domäne des Proteins. Im
Rest des Exons 9 liegt die Terminationssequenz (Abb. 2).
Genetische Defekte
Ebenso wie der AT-III-Mangel ist auch der
Mangel an Protein C ein erwiesener Risikofaktor für thromboembolische Erkrankungen. Der hereditäre Protein-C-Mangel
kommt zu 5-8% in der Gruppe junger Patienten mit Thrombophilie vor (36). In der
Gesamtbevölkerung schätzt man das Vorkommen von Protein-C-Defekten, die mit
Thromboembolien assoziiert sind, auf etwa
1 : 16000. Der Defekt wird autosomal-dominant vererbt. Daneben gibt es eine Form
des Protein-C-Mangels, der nicht mit einem
erhöhten Risiko für Thromboembolien
verbunden sein soll (61). Seine Prävalenz
wird auf etwa 1 : 200 bis 1 : 300 geschätzt.
Ob es aber wirklich Familien mit ProteinC-Mangel ohne jegliche Symptomatik gibt,
ist bisher nicht überzeugend bewiesen.
In der seltener auftretenden homozygoten oder compound-heterozygoten Form
verursacht der Protein-C-Mangel bereits
beim Neugeborenen das Bild der Purpura
fulminans oder massive Thrombosen. Es
sind aber auch zahlreiche Fälle von homozygotem oder compound-heterozygotem
Protein-C-Mangel beobachtet worden, bei
denen Symptome erst im jungen Erwachsenenalter auftraten. Meist ist die Protein-CAktivität und -Konzentration <10%, es
werden aber auch Werte um 25% gefunden
(1).
Auch unter Berücksichtigung zusätzlicher Risikofaktoren ist bisher immer noch
ungeklärt, warum nur bei einem Teil der
Mitglieder von Familien mit Protein-CMangel Thromboembolien auftreten.
Neuere Untersuchungen deuten darauf
hin, dass die Faktor-V-Mutation (7), die
eine Resistenz gegen aktiviertes Protein C
verursacht, bei Patienten mit symptomatischem Protein-C-Mangel häufiger vorkommt als bei asymptomatischen Personen
(47).
Genauso wie beim Antithrombin-IIIMangel gibt es auch beim Protein-C-Mangel den Typ I mit verminderter Konzentration und Aktivität und den Typ II mit normaler Proteinkonzentration und verminderter Aktivität durch Synthese eines abnormalen Proteinmoleküls.
Seit der Aufklärung der Nukleotidsequenz des Protein-C-Gens sind sehr viele
Mutationen identifiziert worden (75, 88)
und ihre Zahl nimmt ständig zu. In der von
Reitsma et al. (76) zusammengestellten
letzten Database der Protein-C-Mutationen (Fassung 1995) sind 160 verschiedene
Mutationen enthalten. Die Zahl der identifizierten Mutationen ist sicher noch höher,
da nicht alle in der Database erfasst sind.
Sowohl im Hinblick auf die Lokalisation
als auch auf die Art der Mutationen bietet
sich ein sehr heterogenes Bild. Interessant
ist, dass 32% der Einzel-Basenaustausche
in CpG-Dinukleotiden auftreten. Es sind
entweder C T- oder G A-Substitutionen. Nach der neuen Database der Protein-
C-Mutationen (76) wurden 88% der Mutationen bei heterozygoten Patienten identifiziert und 12% bei homozygoten, compound-heterozygoten oder nicht klar
klassifizierbaren Patienten. Einige der
homozygoten und compound-heterozygoten Fälle sind in der Beschreibung einer
compound-heterozygoten Patientin von
Alhenc-Gelas et al. zusammengestellt worden (1). Weiter berichteten Sori et al. (79)
und Witt et al. (87) über die Mutationsaufklärung bei homozygoten Neugeborenen.
Entsprechend der wesentlich höheren
Prävalenz des Protein-C-Mangels vom
Typ I gegenüber dem Typ II sind natürlich
auch sehr viel mehr Mutationen bei Patienten mit Protein-C-Mangel Typ I aufgeklärt
worden (76).
Typ I
Beim Protein-C-Mangel vom Typ I wurden
mit Ausnahme des kleinen Exons 4 in allen
Exons Mutationen gefunden. Es handelt
sich bevorzugt um Punktmutationen, vorwiegend um Missense-Mutationen, bei
denen eine Aminosäure durch eine andere
ersetzt ist. Erstaunlicherweise findet man
bei diesen Mutationen kein pathologisches
Protein im Plasma. Man muss annehmen,
dass das Protein nicht richtig prozessiert
wird oder dass das defekte Protein sehr
schnell aus der Zirkulation eliminiert wird.
Für ein defektes intrazelluläres »protein
Abb. 3 Modell des Protein-S-Moleküls [modifiziert nach Dahlbäck und Stenflo (21)]. Die Pfeile kennzeichnen die Lokalisation der Introns bzw. den Beginn der Exonbereiche mit der Nummerierung der Exons sowie mit der Angabe der Position
der ersten Aminosäure der von den entsprechenden Exons kodierten Proteinregion. Zwischen den Aminosäuren 605 und
614 wird die Bindungsstelle für das C4b-Binding-Protein (C4b-BP) angenommen. : Bindungsstellen für Kohlenhydratseitenketten, Y: -carboxylierte Glutaminsäurereste, Hya: -Hydroxyasparaginsäure, Hyn: -Hydroxyasparagin, SHBG:
Steroidhormonbindungsstelle
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folding« bei der Synthese sprechen die
Analysen von Wacey et al. (85) und Greengard et al. (38) an Molekülmodellen der
Serinproteinasedomäne.
Neben den Missense-Mutationen kommen vereinzelt auch Splice-site-, Frameshift- und Nonsense-Mutationen vor. Bis
auf wenige Ausnahmen (19) kommen keine
größeren Deletionen oder Insertionen vor.
Bei der Vielfalt der Mutationen beobachtet
man eine Häufung im Exon 9, was aufgrund seiner Größe auch zu erwarten ist.
Nach der Database (76) betreffen ca. 42%
aller Mutationen das Exon 9 und ca. 20%
davon wiederum die Mutation Arg 230 Cys.
Typ II
Auch für den Protein-C-Mangel vom Typ II
wurden zahlreiche verschiedene Mutationen identifiziert. Alle Typ-II-Mutationen
sind Missense-Mutationen, und die meisten
betreffen die Gla-Domäne. Die Mutationen Arg 169 Trp und Arg 169 Gln verhindern die Aktivierung des Proteins durch
Thrombin. Man findet dabei geringe Mengen eines pathologischen Proteins im
Plasma. Weiter sind Mutationen bekannt,
die die Aminosäuren des aktiven Zentrums
betreffen oder bei denen die Bindung von
Protein C an Thrombomodulin defekt ist.
Genetische Polymorphismen
Im PROC-Gen sind verschiedene Polymorphismen gefunden worden, drei davon in
der 5'-untranslatierten Promotorregion:
C/T (67:33) in der Nukleotidposition -1654,
A/G (57:43) in Position -1641 und A/T
(58:42) in Position -1476 (81). Außerdem
gibt es Polymorphismen in den Positionen
3204 (Exon 5, C/T, 87:13), 3342 (Exon 6,
T/G, 59:41), 6181 (Exon 7, A/G, 64:36) und
7228 (Exon 8, T/C, 65:35) (75). Der Polymorphismus im Exon 7 wurde in Japan beobachtet und konnte in Deutschland nicht
nachgewiesen werden (89). Im Intron G
wurde ein G/T-Polymorphismus in der
Position 6378 (73:27) gefunden (89).
Hämostaseologie 2/2002
Indikationen zur Gendiagnostik
Obwohl auch für Protein C noch viele Fragen zur Beziehung zwischen Struktur und
Funktion offen sind, hat die Gendiagnostik
beim Protein-C-Mangel doch hauptsächlich eine klinische Bedeutung. Die Diagnostik des Protein-C-Mangels auf der Proteinebene ist mit vielen Problemen behaftet. Zum ersten hat die funktionelle Protein-C-Bestimmung im Plasma analytisch
eine recht große Fehlerbreite, und außerdem wird sie durch verschiedene Störfaktoren beeinflusst. Erwähnt sei hier nur die
Verminderung der Protein-C-Aktivität in
vitro bei Vorliegen einer Resistenz gegen
aktiviertes Protein C, die man erst seit
kurzem kennt. Die analytisch zuverlässigere Bestimmung mit einem chromogenen
Substrat hat den Nachteil, dass nicht alle
Fälle des Protein-C-Mangels vom Typ II
damit erfasst werden.
Weiter besteht eine relativ breite Überlappung der Protein-C-Werte von gesunden Personen und Personen mit einem
heterozygoten Protein-C-Mangel. Allaart
et al. (3) untersuchten die Protein-C-Aktivität und die Nukleinsäuresequenz des Protein-C-Gens bei 161 symptomatischen und
asymptomatischen Mitgliedern aus Familien mit Protein-C-Mangel. Beim Vergleich
der Plasmaaktivität mit der DNA-Analyse
des Gens ergab sich, dass bei alleiniger Zuordnung nach der Plasmaaktivität 15% der
nach der DNA-Analyse heterozygoten
Defektträger nicht identifiziert und 5% der
Gesunden als defizient angesehen worden
wären.
Besonders gravierend ist, dass ein Protein-C-Mangel unter der oralen Antikoagulation nicht sicher diagnostiziert werden
kann. Alle Versuche über die Verhältnisbildung zur Aktivität anderer Vitamin-K-abhängiger Faktoren sind praktisch gescheitert. Ein Umsetzen der Antikoagulation
auf Heparin zur Abklärung eines ProteinC- oder Protein-S-Mangels bedeutet für
den Patienten eine erhebliche Belastung.
Eine weitere Indikation zur Gendiagnostik ist bei Neugeborenen aus Familien mit
bekanntem Protein-C-Mangel gegeben.
Neugeborene haben nur etwa 10% der
Protein-C-Aktivität von Erwachsenen, und
Erwachsenenwerte werden erst am Ende
des ersten Lebensjahres erreicht. Es ist
zwar möglich, einen homozygoten Mangel
mit völlig fehlender Aktivität und Konzentration festzustellen, ob aber ein compound-heterozygoter oder heterozygoter
Mangel vorliegt, ist im Neugeborenen- und
Säuglingsalter nicht zuverlässig zu beurteilen.
Methoden der Gendiagnostik
Da das Protein-C-Gen nicht besonders
groß ist, erfolgt die Identifizierung der
Mutationen vielfach durch direktes Sequenzieren aller Exons mit den angrenzenden Intron-Bereichen. Bis auf das große
Exon 9 können alle anderen Exon/IntronBereiche jeweils als ein DNA-Fragment
amplifiziert werden. Das Exon 9 wird üblicherweise in 2 oder 3 Teilsegmenten amplifiziert.
Von den eingesetzten Screening-Verfahren scheint die denaturierende GradientenGelelektrophorese (DGGE) am besten
geeignet zu sein, um den Exonbereich zu
finden, in dem eine Mutation liegt. Zur
DGGE liegen eindrucksvolle Ergebnisse
der Arbeitsgruppe um Gandrille vor (33,
34). Aber auch mit der Temperaturgradienten-Gelelektrophorese (40) und mit dem
Einzelketten-Konformationspolymorphismus (SSCP) (79) ist die Erkennung von
Mutationen in einem bestimmten DNASegment möglich. Empfehlenswert ist derzeit der Einsatz der DGGE mit nachfolgender Sequenzierung der für eine Mutation verdächtigen Segmente des Gens.
Protein S
Struktur und Funktion
Protein S wird wie Protein C Vitamin-Kabhängig synthetisiert, und zwar in Leberzellen (28), Endothelzellen (29) und in
Megakaryozyten (62). Es entsteht zunächst
als einkettiges Molekül mit einem LeaderPeptid von 41 Aminosäuren. Das Signalpeptid von 21 Aminosäuren ist verantwortlich für das intrazelluläre Processing,
während das 16 Aminosäuren lange Pro-
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Defekte bei AT III, Protein C, Protein S
peptid die Erkennungssequenz für das
-Carboxylasesystem darstellt, das die Carboxylierung Vitamin-K-abhängiger Proteine
katalysiert (46). Das Protein wird außerdem intrazellulär glykosyliert. Nach der
Abspaltung des Leader-Peptids liegt Protein S im Plasma als einkettiges Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von
70 kD vor, das aus 635 Aminosäuren besteht.
Die Primärstruktur des Proteins wurde
aus der cDNA-Sequenz abgeleitet (55). In
der Nähe des N-Terminus des Moleküls ist
die Gla-Domäne mit den 11 -carboxylierten Glutaminsäureresten lokalisiert. Die
Gla-Domäne wird beendet durch eine
kurze hydrophobe Sequenz, die vier aromatische Aminosäurereste enthält und als
H-Region bezeichnet wird. Es folgt dann
eine thrombinsensitive Region, in der das
Protein durch Thrombin gespalten und damit inaktiviert werden kann.
Die thrombinsensitive Region ist verbunden mit 4 aufeinanderfolgenden Epidermal-growth-factor-homologen Domänen, wie sie für eine Reihe von Gerinnungsproteinen charakteristisch sind. Es
folgt dann aber nicht wie bei anderen Vitamin-K-abhängigen Proteinen eine katalytische Domäne, sondern eine 380 Aminosäuren lange C-terminale Region, die eine
starke Homologie zu hormonbindenden
Proteinen zeigt (5, 35). In der Epidermalgrowth-factor-homologen Region befinden
sich eine -Hydroxyasparaginsäure (Hya)
und drei -Hydroxyasparagin(Hyn)-Reste,
die für die Kalziumbindung essenziell sind
(Abb. 3).
Protein S hat eine Kofaktorfunktion für
aktiviertes Protein C (APC) bei der Inaktivierung von Faktor Va und Faktor VIIIa.
Die Reaktion läuft an der Oberfläche von
Phospholipiden in Gegenwart von Ca2+Ionen ab. Protein S beschleunigt die Wirkung von APC, indem es die Bindung von
APC über eine Kalziumbrücke an Phospholipidoberflächen erleichtert. Protein S
kommt im Plasma in freier Form (40%)
und gebunden (60%) an den Inhibitor des
Komplementsystems, C4b-Binding-Protein
(C4b-BP), vor. Nur die freie Form hat
Kofaktorfunktion (vgl. Übersicht in 21, 39).
Organisation des Gens
Genetische Defekte
Das menschliche Genom enthält zwei
Protein-S-Gene, die früher als PS und
PS bezeichnet wurden. Nach der neuen
Nomenklatur werden die beiden Gene
PROS I und PROS II genannt. Sie sind
beide auf Chromosom 3 in der Nähe des
Zentromers lokalisiert (72, 86). PROS I ist
das aktive Gen, während PROS II als
Pseudogen angesehen werden muss. Das
PROS-I-Gen dehnt sich über 80 kb aus und
besteht aus 15 Exons und den entsprechenden Introns (23, 42, 55, 71, 78). Exon 1 kodiert für das Signalpeptid und Exon 2 für
das Propeptid, das die Erkennungssequenz
für die Carboxylase darstellt, sowie für die
Gla-Domäne. Die kurze Sequenz aus aromatischen Aminosäuren, die auf die GlaDomäne folgt, wird wie bei allen VitaminK-abhängigen Proteinen von einem Exon
allein kodiert, bei PROS I von Exon 3. Die
für Protein S typische thrombinsensitive
Region wird ebenfalls von einem Exon
allein kodiert (Exon 4). In den Exons 5 bis
8 ist jeweils die Sequenz für eine der 4
EGF-homologen Domänen festgelegt. Die
Region des Protein S, die eine hohe Homologie zu steroidhormonbindenden Proteinen aufweist, wird von 7 Exons kodiert
(Exons 9 bis 15) (Abb. 3).
Die Entstehung der beiden Gene, die
eine Homologie von etwa 97% aufweisen,
stellt man sich folgendermaßen vor:
Zunächst hat sich ein Vorläufergen verdoppelt. In einem der beiden Gene sind
dann zahlreiche Mutationen manifest geworden, die mit einer Genexpression, sowohl bei der Transkription als auch bei der
Translation, nicht mehr vereinbar waren.
So fehlt im Pseudogen das Exon 1, das für
die 5'-untranslatierte Region und das Propeptid kodiert. In Exon 2 liegt eine Splicesite-Mutation vor und im weiteren Gen
drei Stopp-Codons und eine FrameshiftMutation. Außerdem hat das Pseudogen 33
Missense-Mutationen und 11 Polymorphismen.
Die Verdoppelung des Vorläufergens
und die Mutation eines der beiden Gene
zum Pseudogen ist wahrscheinlich während
der Primatenentwicklung abgelaufen, vermutlich nach der Abzweigung des OrangUtans von den afrikanischen Affen (71).
Der hereditäre Protein-S-Mangel in der
heterozygoten Form ist mit einem erhöhten
Risiko für thromboembolische Komplikationen assoziiert und klinisch dem ProteinC-Mangel sehr ähnlich. In der Gruppe
jüngerer Patienten mit ungeklärten oder
rezidivierenden Thromboembolien hat der
Protein-S-Mangel eine Prävalenz von 5-8%
(36).
Nach der Einteilung von Bertina (6)
liegt ein Protein-S-Mangel vom Typ I vor,
wenn die Konzentrationen von gesamtem
Protein S und freiem Protein S vermindert
sind. Beim Typ II liegt ein defektes ProteinS-Molekül vor: man findet eine verminderte Aktivität bei normaler Konzentration für
gesamtes und freies Protein S. Dieser Typ
ist sehr selten, nicht zuletzt wegen der analytischen Schwierigkeiten der Aktivitätsbestimmung. Beim häufig vorkommenden
Typ III ist die Konzentration des gesamten
Protein S normal und die der freien Form
vermindert (vgl. Übersicht in 21).
Beim Protein-S-Mangel scheinen häufiger als beim Protein-C-Mangel auch arterielle Thrombosen vorzukommen (2). In der
homozygoten Form verursacht der ProteinS-Mangel genauso wie der Protein-C-Mangel beim Neugeborenen das klinische Bild
der Purpura fulminans (56, 58).
Der Mutationsnachweis ist wegen der
Größe des Gens und dem Vorhandensein
des Pseudogens sehr viel schwieriger als
beim AT-III- oder Protein-C-Mangel. Bisher ist noch keine Database der Mutationen publiziert worden. In der Literatur sind
aber zahlreiche Mutationen beschrieben
worden (11, 37, 62, 70, 74, 77). Im Folgenden
werden einige davon dargestellt.
Schmidel et al. (77) fanden eine 5,3-kbDeletion bei zwei Familien mit symptomatischem Protein-S-Mangel. Die Deletion
umfasst über 90% des Introns L, das gesamte Exon 13 und etwa 25% von Intron
M. Es wird postuliert, dass ein verkürztes
Protein gebildet wird, das nicht glykosyliert
ist, da die Glykosylierungsstellen alle in
Exon 13 liegen. Es wurde kein pathologisches Protein im Plasma nachgewiesen.
Von Reitsma et al. (74) wurden kürzlich
drei neue Mutationen mitgeteilt. In Position
2 des Codons -25 fand sich eine einzelne In-
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Hämostaseologie 2/2002
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Witt
sertion von T, was durch Frameshift zu einem Stopp-Codon in -4 führt.Weiter wurde
ein G A-Austausch in Position +5 der
»donor splice site« von Intron 10 gefunden
sowie ein A T-Austausch im Stopp-Codon
des Protein-S-Gens. Der letzte Austausch
ist die Ursache für ein Protein-S-Molekül,
das um 14 Aminosäuren verlängert ist.
Eine Mutation im Pseudogen (PROS
II), die zur Aufhebung einer MspI-Schnittstelle führt, wurde in einer Familie mit Protein-S-Mangel als genetischer Marker gefunden (70). Interessant ist auch die Mutation, die als Ursache eines homozygoten
Protein-S-Mangels bei einem 3-jährigen
Kind gefunden wurde, das als Neugeborenes kurz nach der Geburt eine Purpura fulminans entwickelt hatte. Es handelt sich um
die Deletion eines Basenpaares (Adenin)
im Codon 43, lokalisiert in Exon 3 (37). Die
Mutation führt durch Frameshift zu einem
Stopp-Codon in Position 45. Das synthetisierte Protein kann nur die Gla-Domäne
und die hydrophobe Region enthalten. Da
bei wiederholten Analysen immer eine geringe Menge an Protein nachgewiesen werden konnte, muss man annehmen, dass das
pathologische Protein im Blut zirkuliert.
Genetische Polymorphismen
Bisher sind zwei neutrale Dimorphismen
bekannt. Diepstraten et al. (22) beschrieben einen A/G-Austausch (52:48) im
Codon für Pro 626. Ein weiterer A/G-Austausch in der Nukleotidposition 732 wurde
in heterozygoter Form bei 1,65% von 182
normalen japanischen Individuen gefunden (90).
Indikationen zur Gendiagnostik
Eine wichtige Indikation zur Gendiagnostik ist wie beim Protein-C-Mangel dadurch gegeben, dass unter oraler Antikoagulation ein Protein-S-Mangel nicht diagnostiziert werden kann. Weiter kommt
beim Protein S dazu, dass die Differenzierung zwischen der freien und gebundenen
Form in Plasmaproben nicht zuverlässig ist.
Daraus resultiert, dass auch die Zuordnung
eines Protein-S-Mangels zu einem beHämostaseologie 2/2002
stimmten Typ nicht sicher vorgenommen
werden kann. So kann in Zukunft nur die
Gegenüberstellung von Genotyp und
Phänotyp das Verständnis des Protein-SMangels erweitern. Leider ist die Analytik
des Protein-S-Gens äußerst schwierig und
zeitaufwendig.
Methoden der Gendiagnostik
Derzeit ist die adäquate Analyse des aktiven Protein-S-Gens die direkte Sequenzierung aller Exons. Es gibt nur wenige Berichte über Untersuchungen mithilfe von
Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen (RFLP). Die Identifizierung einer
Frameshift-Mutation in Exon 5 erfolgte
nach einem Screening mit Hilfe der DGGE
(11). Bisher kann noch kein zuverlässiges
Screening-Verfahren empfohlen werden.
Es ist zu hoffen, dass in absehbarer Zeit der
Rückstand in der Mutationsaufklärung bei
Protein-S-Mangel aufgeholt wird.
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