TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN II
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TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN II. Medizinische Klinik und Poliklinik des Klinikums rechts der Isar Die Bedeutung von Socs3 im in-vivo-Modell der pankreatischen Karzinogenese Thuy Trang Phan TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN II. Medizinische Klinik und Poliklinik des Klinikums rechts der Isar (Direktor: Univ.-Prof. Dr. Roland M. Schmid) Die Bedeutung von Socs3 im in-vivo-Modell der pankreatischen Karzinogenese Thuy Trang Phan Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Medizin genehmigten Dissertation. Vorsitzender: Prüfer der Dissertation: Univ.-Prof. Dr. Ernst J. Rummeny 1. Priv.-Doz. Dr. Hana Algül 2. Univ.-Prof. Dr. Helmut Friess Die Dissertation wurde am 10.07.2014 bei der Technischen Universität München eingereicht und durch die Fakultät für Medizin am 15.04.2015 angenommen. Meinen Eltern gewidmet INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS I. ABKÜRZUNGEN ......................................................................................................... 3 II. 1. 1.1. 1.2. 2. 2.1. 2.2. 3. 3.1. 3.2. 4. EINLEITUNG............................................................................................................... 5 Das Pankreaskarzinom ................................................................................................ 5 Epidemiologie ................................................................................................................. 5 Molekularbiologische und –genetische Hintergründe .................................................... 6 Das murine Pankreaskarzinommodell ..................................................................... 11 Das Cre/loxP-Rekombinationssystem .......................................................................... 12 Das KrasG12D-Mausmodell ........................................................................................... 13 Suppressors of cytokine signaling (SOCS) ............................................................... 16 Die Struktur von Socs3 ................................................................................................. 16 Socs3 als Zytokin-Signaltransduktionsinhibitor........................................................... 17 Zielsetzung der Arbeit ................................................................................................ 21 III. 1. 1.1. 1.2. 1.3. 1.4. 1.5. MATERIAL UND METHODEN .............................................................................. 22 Material ....................................................................................................................... 22 Chemikalien .................................................................................................................. 22 Geräte und Hilfsmittel .................................................................................................. 24 Puffer und Lösungen .................................................................................................... 25 Gele............................................................................................................................... 27 Antikörper..................................................................................................................... 28 1.5.1. 1.5.2. 1.6. 1.7. 2. 2.1. Primer für Genotypisierung .......................................................................................... 29 Mäuse ........................................................................................................................... 29 Methoden ..................................................................................................................... 30 Versuchstiere ................................................................................................................ 30 2.1.1. 2.1.2. 2.2. Proteinisolierung/Proteingewinnung aus Mauspankreasgewebe ............................... 35 Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford .................................................... 35 Western Blot Analyse ................................................................................................ 36 Histochemische Methoden ........................................................................................... 38 2.5.1. 2.5.2. IV. Isolation von mRNA aus murinem Pankreasgewebe ................................................ 33 cDNA-Synthese ......................................................................................................... 33 Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) .................................................................... 33 Reaktionsansatz und Reaktionsbedingungen............................................................. 34 Quantifizierung der Genexpression ........................................................................... 35 Proteinchemische Methoden......................................................................................... 35 2.4.1. 2.4.2. 2.4.3. 2.5. DNA-Extraktion aus der Mausschwanzspitze ........................................................... 31 Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR)................................... 31 Agarose-Gelelektrophorese ....................................................................................... 32 Detektion und Quantifizierung der Gen-Transkription ................................................ 33 2.3.1. 2.3.2. 2.3.3. 2.3.4. 2.3.5. 2.4. Behandlung mit BrdU................................................................................................ 30 Gewebeentnahme in vivo-Präparation und Materialgewinnung ............................... 30 Molekularbiologische Methoden .................................................................................. 31 2.2.1. 2.2.2. 2.2.3. 2.3. Antikörper für Immunhistochemie (IHC).................................................................. 28 Antikörper für Western Blot (WB)............................................................................ 28 Immunhistochemie .................................................................................................... 38 Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.-Färbung)............................................................ 39 ERGEBNISSE............................................................................................................. 41 II. 1. 1.1. 1.2. 2. 2.1. 2.2. 2.3. 3. 3.1. 3.2. EINLEITUNG Pankreasspezifische Inaktivierung von Socs3 in der Maus .................................... 41 Generierung einer pankreasspezifisch Socs3-defizienten Mauslinie Socs3Δpanc unter Anwendung des Cre/loxP-Rekombinationssystems ..................................................... 41 Morphologische Charakterisierung des exokrinen und endokrinen Δpanc Pankreaskompartiments von Soc3 -Mäusen ........................................................... 44 Nachweis der Aktivierung des Stat3/Socs3-Signalweges im KrasG12D-Mausmodell ...................................................................................................................................... 46 Nachweis der pankreatischen Aktivierung von p-Stat3 im KrasG12D-Mausmodell...... 46 Expression des Stat3-abhängigen endogenen Inhibitors Socs3 im KrasG12DMausmodell .................................................................................................................. 47 Aktivierung der an der Jak2/Stat3-Signaltransduktion beteiligten Proteine in KrasG12DMäusen ......................................................................................................................... 49 Homozygote Socs3-Deletion führt zu einer konstitutiven Aktivierung des Stat3Signalweges im KrasG12D-Mausmodell ...................................................................... 51 Generierung der pankreasspezifisch Socs3-defizienten Tumormodellmaus G12D Δpanc Kras ;Socs3 ....................................................................................................... 51 Proteinbiochemische und morphologische Charakterisierung von KrasG12D;Socs3ΔpancMäusen ......................................................................................................................... 51 3.2.1. 3.2.2. 3.2.3. 4. 4.1. Einfluss der Inaktivierung des endogenen Inhibitorproteins Socs3 auf die PanINProgression im KrasG12D-Mausmodell ....................................................................... 56 Beschleunigung der PanIN-Progression in KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäusen .................... 56 4.1.1. V. 1. 2. Proteinbiochemischer Nachweis verstärkter Stat3-Phosphorylierung und Expression Stat3-abhängiger Proteine ............................................................................................ 51 Konstitutive Aktivierung des onkogenen K-Ras-Proteins in KrasG12D;Socs3ΔpancMäusen......................................................................................................................... 53 Gewichts- und Pankreasanalyse bei KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäusen ............................... 54 Morphologische und quantitative Charakterisierung der PanIN-Läsionen ............... 56 6. DISKUSSION ............................................................................................................. 66 Rolle von Socs3 für die pankreatische Karzinogenese im KrasG12D-Mausmodell . 66 Einfluss von Socs3 auf die Apoptose und Proliferation im KrasG12D-Mausmodell ...................................................................................................................................... 68 Entzündliche Prozesse fördern die Initiierung und Progression der pankreatischen Vorläuferläsionen zu duktalem Pankreaskarzinom .................... 71 Rolle von Socs3 bei der Pankreasfibrosierung/Desmoplasie in KrasG12DTumormäusen ............................................................................................................. 75 Die Bedeutung von Socs3 in Transdifferenzierungsprozessen im Pankreas der KrasG12D-Tumormäuse ................................................................................................ 78 Ausblick ....................................................................................................................... 81 VI. ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................ 82 VII. LITERATURVERZEICHNIS .................................................................................. 85 3. 4. 5. VIII. ABBILDUNGSVERZEICHNIS ................................................................................ 99 IX. TABELLENVERZEICHNIS .................................................................................. 101 X. DANKSAGUNG ....................................................................................................... 102 XI. ERKLÄRUNG .......................................................................................................... 104 2 II. I. EINLEITUNG ABKÜRZUNGEN A Abb. APS Beta-HCG Bcl-2 Bcl-XL bp BrdU BSA c CA CaCl2 CEA CK-19 Cox-2 Cre DAB dH2O ddH2O DNA DTT EGF EDTA F FAMMM GAP GDP gp130 GTP h HCL H.E. HEPES H2O2 IHC IL Jak KH2PO4 KCl kD Ampere Abbildung Ammoniumperoxiddisulfat Humanes Choriongonadotropin B-cell-lymphoma-2 B-cell lymphoma-extra large Basenpaare 5-Brom-2-desoxyuridin Bovines Serumalbumin Konzentration Carbohydrate Antigen Kalziumchlorid Carcino-Embryonales Antigen Cytokeratin-19 Cyclooxygenase-2 cyclization recombination Diaminobenzidin einfach destilliertes Wasser zweifach destilliertes Wasser desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) Dithiothreitol epidermal growth factor Ethylendiamintetraacetat Flox familial atypical mole-malignant melanoma GTPase aktivierendes Protein Guanosindiphosphat Glykoprotein 130 Guanosintriphosphat Stunde(n) Hydrogenchlorid Hämatoxylin-Eosin 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)ethansulfonsäure Wasserstoffperoxid Immunhistochemie Interleukin Januskinase Kaliumdihydrogenphosphat Kaliumchlorid Kilodalton 3 II. l loxP LSL M Mcl-1 Min. MAPK Muc5 NaCl Na2HPO4 NaOH p PanIN PBS PCR PDAC PFA PMSF PSC RNA RNAse rpm RT RTK SDS-PAGE SH2 SOCS STAT Stat TAE TBS TEMED TGFß Tris UV V WB EINLEITUNG Liter locus of x-over of P1 lox-STOP-lox Molar myeloid leukemia cell differentiation protein 1 Minute (n) mitogen-activated protein kinase Mucin 5 Natriumchlorid Natriumbicarbonat Natriumhydroxid Phospho pankreatische intraepitheliale Neoplasie phosphate-buffered saline polymerase chain reaction (Polymerasekettenreaktion) pancreatic ductal adenocacinoma Paraformaldehyd Phenylmethylsulfonylfluorid pancreatic stellate cell ribonucleid acid (Ribonukleinsäure) Ribinuklease rounds per minute (Umdrehungen pro Minute) Raumtemperatur Rezeptortyrosinkinase Sodium DodecylsulfatPolyacrylamidgelelektrophorese Src-homology 2 suppressor of cytokine signaling signal transducer and activator of transcription (human) signal transducer and activator of transcription (murin) Tris-Acetat-EDTA Tris-buffered saline N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin transforming growth factor-beta Tris(hydroxymethyl)-aminomethan Ultraviolett Volt Western Blot 4 II. EINLEITUNG II. EINLEITUNG 1. Das Pankreaskarzinom 1.1. Epidemiologie Das Pankreaskarzinom umfasst eine heterogene Gruppe von pankreatischen Malignomen. Im Jahr 2011 liegt die Anzahl der Neuerkrankungen in den USA bei 44.030, 37.660 Patienten verstarben am Pankreaskarzinom. Seit 1998 wird eine stetige Zunahme der Inzidenz dieser aggressiven Tumorerkrankung verzeichnet. Somit stellt das duktale Adenokarzinom des Pankreas eine fast immer fatal verlaufende Erkrankung dar, die sowohl bei Männern als auch bei Frauen an neunter Stelle der geschätzten malignen Neuerkrankungen und an vierter Stelle der tumorbedingten Todesfälle steht (American Cancer Society 2011). Mit einer medianen Überlebenszeit von etwa drei bis fünf Monaten und einer 5-Jahresüberlebensrate von weniger als 5% hat das Pankreaskarzinom eine düstere Prognose (Hezel et al., 2006). Das hochaggressive Ausbreitungsmuster des Pankreaskarzinoms in Form frühzeitiger Metastasierung in lymphatische und periphere Organe trägt zusätzlich zur infausten Prognose dieser Tumorerkrankung bei. In der Tat weisen etwa 80% der Patienten bei der Diagnosestellung Fernmetastasen auf (Yeo et al., 2002b). Darüber hinaus ist die frühzeitige Infiltration und Ausbreitung der Karzinomzellen entlang der intra- und extrapankreatischen Nerven charakteristisch für das PDA (Pour et al., 1991; Okusaka et al., 2001; Hirai et al., 2002). Aufgrund der weitgehenden Resistenz des fortgeschrittenen Karzinoms gegenüber einem breiten Spektrum an konventioneller Chemo- und Radiotherapie bzw. Radiochemotherapie (Lionetto et al., 1995), stellt die chirurgische Resektion die einzige kurative Therapieoption dar, wobei weniger als 20% der Tumore überhaupt resezierbar sind (Yeo et al., 1995; Rosewitz et al., 1997). Nur etwa 20% der chirurgisch therapierten Patienten überleben die ersten drei Jahre nach der Operation (Shaib et al., 2007). Das mittlere Erkrankungsalter bei der Diagnosestellung liegt bei 70 Jahren. Nur etwa 10% der Patienten entwickeln diesen Tumor vor dem 50. Lebensjahr. Somit stellt dieses Karzinomleiden eine Erkrankung des hohen Lebensalters dar. Neben dem Alter konnte das Rauchen als führender vermeidbarer Risikofaktor in der Pankreaskarzinogenese deklariert werden. 25% der Karzinome lassen sich auf den Zigarettenkonsum zurückführen. Als weitere denkbare Risikofaktoren werden eine fett- und fleischreiche, ballaststoffarme Ernährung, Übergewicht, eine chronische Pankreatitis und ein lange bestehender Diabetes Mellitus beschrieben (Lowenfels et al., 2006). 5-10% aller Pankreastumore sind mit einer familiären Prädisposition assoziiert und zeigen somit eine familiäre Häufung. Patienten mit positiver 5 II. EINLEITUNG Familienanamnese haben gegenüber der Normalbevölkerung ein zweifach erhöhtes Risiko an Bauchspeicheldrüsenkrebs zu erkranken (Schenk et al., 2001). In den meisten Fällen gehäuften Auftretens maligner Neoplasien des Pankreas ist die genetische Ursache nicht klar definiert. Bei den familiären Tumorprädispositionssyndromen, die einen kleinen Teil der hereditären Karzinome ausmachen, sind jedoch autosomaldominant vererbte Keimbahnmutationen bestimmter Gene für die hohe Tumorpenetranz verantwortlich (Lynch et al., 1996). Folgende Tumorprädispositionssyndrome sind mit dem Pankreaskarzinom assoziiert (Hong et al., 2011): - Das familiäre Mamma- und Ovarialkarzinom mit der BRCA2 (breast cancer gene 2)Mutation; - das Peutz-Jeghers-Syndrom mit dem mutierten Tumorsuppressorgen STK11 (Serin/Threonin Kinase 11); - das FAMMM (familial atypical mole-malignant melanome)-Syndrom, das mit einer Mutation des Genlokus CDKN24 (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A) einhergeht; - die hereditäre Pankreatitis, bei der das kationische Trypsinogen-Gen PRSS1 (Protease, Serin1) betroffen ist; - darüber hinaus das hereditäre non-polypöse kolorektale Karzinom (HNPCC)-Syndrom mit Keimzellmutationen der DNA Reparatur-Gene hMSH1, hMSH2, etc (Aarnio et al., 1995) - und die familiäre adenomatöse Polyposis (FAP) mit funktioneller Inaktivierung des Genprodukts des APC-Gens (Su et al., 2000). Untersuchungen haben allerdings gezeigt, dass die mit diesen Syndromen assoziierten Genveränderungen besonders in fortgeschrittenen Tumorstadien zu finden sind, weniger in prämalignen Läsionen. Infolge dessen geht man davon aus, dass diese Genmutationen eher die Tumorprogression der Präkanzerose und weniger die Tumorinitiierung fördern (Sunil et al., 2003; Hezel et al., 2006) 1.2. Molekularbiologische und –genetische Hintergründe Der häufigste histologische Subtyp des Pankreaskarzinoms entwickelt sich in über 85% der Fälle aus Pankreasgangzellen und wird als pankreatisches duktales Adenokarzinom (PDA) bezeichnet. Etwa 15-20% der Neoplasien wie zystische Tumoren (seröses oligozystisches Adenom, muzinöse nichtneoplastische Zyste), Azinuszellzystadenome, Azinuszellkarzinome, solid-pseudopapilläre Neoplasien, Plattenepithelkarzinome und Lymphome entwickeln sich aus anderen Zellen des exokrinen Pankreas. Endokrine Tumoren wie das 6 II. EINLEITUNG Insulinom, Gastrinom und Glukagonom treten selten auf (Mulkeen et al., 2006). In diesem Abschnitt der Arbeit soll besonders auf das PDA und dessen Vorläuferläsionen eingegangen werden. Begriffe wie Pankreaskarzinom, Pankreastumor und duktales Adenokarzinom werden in diesem Zusammenhang synonym verwendet. In den letzten Jahren haben klinische, histopathologische und molekulargenetische Untersuchungen drei wichtige Typen von Vorläuferläsionen identifiziert, die sich über einen schrittweisen Transformationsprozess zum duktalen Adenokarzinom entwickeln können. Zu diesen Vorstufen gehören zum einen die muzinös-zystischen Neoplasien (MCN), die intraduktalen papillär-muzinösen Neoplasien (IPMN) und zum anderen die pankreatisch intraepithelialen Neoplasien (PanINs) (Brugge et al., 2004; Maitra et al., 2005). Das auf molekularer und histopathologischer Ebene am besten untersuchte und charakterisierte Tumorprogressionsmodell für das Pankreaskarzinom beruht auf der Entwicklung und Progression der PanINs zum pankreatischen duktalen Adenokarzinom. Demnach werden drei PanIN-Stadien klassifiziert, die je nach Schwere der zellulären und architektonischen Atypien im Bereich der duktalen Strukturen aufsteigend eingestuft werden (PanIN-1 bis PanIN-3, siehe Abbildung 1). Abbildung 1: Morphologische Tumorprogression über PanIN-Vorläuferläsionen. Die H.E.-Färbung zeigt die unterschiedlichen PanIN-Stufen mit aufsteigenden zellulären und architektonischen Atypien. Das PanIN-1A-Stadium weist ein verlängertes Zylinderepithel auf, das im Stadium-1B in ein papilläres Wachstum übergeht. Moderate Kernatypien mit Polaritätsverlust, Hyperchromatismus, verminderte Mitoserate sind charakteristisch für Stadium PanIN-2. PanIN-3 Läsionen zeigen neben zunehmender Schwere der Kernatypien Abknospung von Epithelzellen und intraluminale Nekrosen (400-fache Vergrößerung). Der Stern kennzeichnet Azini. 7 II. EINLEITUNG PanIN-1A und PanIN-1B sind durch eine Zellkörperverlängerung und eine vermehrte Schleimproduktion gekennzeichnet. Die im PanIN-1A-Stadium noch vorhandene flache epitheliale Architektur des Pankreasganges geht im Stadium-1B in ein papilläres Wachstumsmuster über. Erstaunlicherweise lassen sich diese frühesten Vorläuferformen in 40% aller adulten Pancreata nachweisen, ohne dass ein malignes Geschehen vorliegt. Das PanIN-2-Stadium weist moderate Kernatypien in Form von Polaritätsverlust, Hyperchromatismus, nukleärer Vergrößerung und verminderter Mitoserate auf, die im Stadium-3 an Schwere zunehmen. Zusätzlich beobachtet man bei diesem terminalen Läsionsgrad weit in das Ganglumen ragende epitheliale Zellknospen sowie luminale Nekrosen als Zeichen von Zelluntergang und –abstoßung. PanIN-Läsionen der Stufe 3 findet man in der Regel in weniger als 5% der gesunden Organe, während 30-50% aller invasiven Karzinome diese typischen schweren Veränderungen aufzeigen. Pankreasadenokarzinome weisen darüber hinaus ein an das Tumorgewebe angrenzendes reaktives desmoplastisches Stroma auf. Dieses „Tumor-Microenvironment“ setzt sich aus einer Vielzahl unterschiedlicher Zellen, extrazellulären Matrixproteinen und neugebildeten Gefäßen zusammen, die das Wachstum und die Progression des PDAC fördern. Infiltrierende inflammatorische Zellen und Makrophagen setzen Chemokine und Zytokine frei, die wiederum eine reaktive Aktivierung von Fibroblasten und pankreatische Sternzellen (pancreatic stellate cells, PSC) bewirken. Fibroblasten und aktivierte PSCs produzieren daraufhin Fibronektin und Kollagen, was die Fibrosierung des Pankreasparenchyms verstärkt und das Tumorwachstum begünstigt (Algül et al., 2007b). Molekulare Untersuchungen haben gezeigt, dass die morphologischen Auffälligkeiten einzelner PanIN-Progressionsstufen bis zum invasiven Karzinom bestimmte genetische Veränderungen aufweisen, die entsprechend ihrer Anzahl und Schwere mit dem Grad der Läsion korrelieren (siehe Abbildung 2). Wie bei anderen Tumorentitäten kommt in diesem Zusammenhang Onkogenen und Tumorsuppressorgenen eine besondere Bedeutung zu (Sakorafas et al., 2001). 8 II. EINLEITUNG Abbildung 2: Morphologisches und genetisches Pankreasadenokarzinoms (Hruban et al., 2000). Progressionsmodell des duktalen Die Kras-Punktmutation am Kodon 12 ist die wohl bedeutendste mit der Tumorgenese assoziierte Mutation eines Onkogens. Initiale PanIN-Läsionen und Pankreasadenokarzinome weisen eine Mutationsrate von bis zu 44% bzw. 100% auf (Shibata et al., 1990; Magee et al., 2001). Das K-Ras-Protein stellt das Genprodukt von Kras dar und gehört zu den kleinen GTPbindenden Proteinen der Ras-Familie. Diese auch als G-Proteine genannten Moleküle sind an der Innenseite der Plasmamembran lokalisiert und werden nach Bindung von Zytokinen, Hormonen, Wachstumsfaktoren an die extrazelluläre Domäne der G-Protein-gekoppelten Transmembranrezeptoren aktiviert. Hierbei kommt es zur Umwandlung von inaktivem, GDPgebundenen K-Ras in die aktive, GTP-assoziierte Form. Über nachgeschaltete intrazelluläre Signaltransduktionswege wie zum Beispiel die Raf-mitogen-activated protein kinase (RafMAP-Kinase)- oder die Phosphoinositol-3-Kinase-Signalkaskade wird der extrazelluläre Stimulus in den Nucleus übertragen, wo eine Aktivierung weiterer Transkriptionsfaktoren initiiert wird. Somit übernehmen die R-Proteine eine bedeutende Funktion in der Zellproliferation, Differenzierung und Apoptose (Friday et al., 2008). Bei Kras-Mutationen handelt es sich meist um eine Punktmutation eines einzelnen Nukleotids, wodurch ein Aminosäureaustausch (Glycin wird durch Valin, Arginin oder Aspartat ersetzt) stattfindet und infolge dessen ein Genprodukt mit Verlust der intrinsischen katalytischen Eigenschaft entsteht. Aufgrund der Unfähigkeit zur Hydrolyse des gebundenen GTP bleibt das „falsche“ G-Protein konstitutiv aktiv, sodass durch permanente Stimulierung der DownstreamKaskade kontinuierlich Signale an den Zellkern vermittelt werden, die zu dereguliertem unkontrollierbaren Zellwachstum, Zellteilung und Differenzierung führen (Downward 2003). 9 II. EINLEITUNG Molekulare Analysen haben eine signifikant verstärkte Amplifikation von Her2/neu mit permanenter Aktivierung der entsprechenden Signaltransduktion und erhöhte EGFKonzentrationen beim PDA nachgewiesen. Bereits in frühen PanIN-Stadien ist die Überexpression vorzufinden, sodass sie offenbar neben der Kras-Mutation zu den frühzeitig im Ablauf der Tumorprogression auftretenden genetischen Veränderungen zählt (Lei et al., 1995; Tsiambas et al., 2006; Hudis 2007). Neben den Onkogenen werden die Tumorsuppressorgene als zweithäufigste mutierte Genklasse im Pankreasadenokarzinom betrachtet. Mutationen an den jeweiligen Genloki bewirken entweder eine Funktionsreduktion oder sogar einen vollständigen Funktionsverlust der entsprechenden Genprodukte. Zu den wichtigsten Vertretern der Tumorsuppressorgene gehören INK4A (inhibitor of cyclin dependent kinase 4A) und ARF (Alternative Reading Frame), die sich beide auf der gleichen Region 9p21 des Chromosoms 9 befinden. Das auch als CDKN2A (cyclin dependent kinase inhibitor 2A) bezeichnete INK4A kodiert für das tumorsuppressive Protein p16, dessen Inaktivierung in etwa 98% aller sporadischen Pankreaskarzinome auftritt (Schutte et al., 1997). Über eine inhibitorische Bindung von p16 an die Cyklin-abhängigen Kinasen Cdk4 und Cdk6, wodurch die funktionelle Phosphorylierung des Retinoblastom-Proteins verhindert wird, kommt es zur Hemmung der Progression des Zellzyklus vor dem Eintritt in die S-Phase. Aus der INK4A-Mutation resultiert konsequenterweise eine unkontrollierte Zellproliferation durch Störungen in der Zellzyklusregulation. Der zweite vom gleichen Genlokus kodierte Tumorsuppressor ist das Transkript der ARF-Gensequenz und wird als p19 bezeichnet. Die Aufgabe dieses Proteins besteht in der Hemmung der MDM2-abhängigen Ubiquitinierung und somit der Verhinderung des proteasomalen Abbaus von p53. Konsequenterweise führt die Loss-of-function-Mutation des betroffenen Genabschnitts zur Reduktion des p19-Spiegels und zum Abfall des p53-Levels (Wilentz et al., 1998; Lowe et al., 2003). Das auf dem Chromosom 17 ansässige Tumorsuppressorgen TP53 kodiert einen weiteren für die Kontrolle der Zellzyklus-Progression wichtigen „Wächter des Genoms“ p53. TP53 ist das am häufigsten mutierte Gen in malignen Tumoren des Menschen. Beim Pankreaskarzinom beträgt die Mutationsrate 50 bis 75%, wobei diese genetische Veränderung zumeist in fortgeschrittenen PanIN-3-Läsionen vorzufinden ist (Talar-Wojnarowska et al., 2006). Das Protein p53 stimuliert als Transkriptionsfaktor bei Replikationsstress mit Akkumulation von gravierenden DNA-Schäden eine Reihe von Genen, die einen Zellzyklusarrest einleiten. Bei Funktionsverlust des Proteins durch homozygote Mutation kommt es zum Ausfall der tumorsuppressiven Eigenschaft des Genprodukts und das Wachstum von Zellen mit 10 II. EINLEITUNG prokarzinogenen chromosomalen Aberrationen wird gefördert (Sherr 2004; Efeyan et al., 2007). Ein weiterer an der späteren Pankreastumorgenese beteiligter Tumorsuppressor ist SMAD4 bzw. DPC4 (deleted in pancreatic cancer locus 4), dessen Genprodukt SMAD4 bzw. DPC4 eine besondere Bedeutung in der Transforming Growth Faktor-ß (TGF-ß)-Signalkaskade besitzt. Über dieses Messenger-Protein löst TGF-ß die Transkription spezieller Zielgene mit antiproliferativer Wirkung aus. Infolgedessen kommt es bereits in der G1-Phase des Zellzyklus zu einem Arrest, wodurch das Wachstum und die Differenzierung epithelialer Zellen zum Stillstand kommen. Läsionen in diesem Genlokus führen zu unkontrollierter Proliferation duktaler Zellen im Pankreas (Bardeesy et al. 2002; Miyaki et al., 2003). Ebenso sind genetische Veränderungen des BRCA2-Gens in fortgeschrittenen Stadien der Tumorprogression beschrieben worden. Eine Inaktivierung bedeutet Dysregulation der DNAReparaturprozesse und daraus resultierende zelluläre Entartung (Hahn et al., 2003; Couch et al., 2007). 2. Das murine Pankreaskarzinommodell Trotz des zunehmenden Verständnisses der Signale und Mechanismen der Kanzerogenese gehört das duktale Pankreasadenokarzinom zu den sehr schwer therapierbaren Tumorerkrankungen. Deshalb hat sich die Pankreaskarzinom-Forschung zum Ziel gesetzt, die humane Erkrankung und ihre Charakteristika in möglichst identischen präklinischen Modellorganismen widerzuspiegeln und somit eine effizientere Therapie zu entwickeln. Erstaunlicherweise lassen sich die molekularbiologischen und –genetischen Veränderungen des humanen Pankreaskarzinoms und dessen Vorstufen in der Maus exakt nachbilden. Auf der Grundlage dieser Erkenntnis wurden in den letzten Jahren einige Mausmodelle entwickelt, bei denen mittels moderner molekularer Technik die Aktivierung von relevanten Onkogenen bzw. das Ausschalten von Tumorsuppressorgenen ermöglicht wird (Hruban et al., 2006; Olive et al., 2006). Zur Generierung genetisch gezielt modifizierter Mäuse bietet sich idealerweise das Cre/loxP-Rekombinationssystem an, welches zur Etablierung des in dieser Arbeit verwendeten KrasG12D-Mausmodells essentiell war. Demzufolge werden im Folgenden sowohl die Cre/loxPTechnologie als auch das KrasG12D-Mausmodell ausführlich beschrieben. 11 II. 2.1. EINLEITUNG Das Cre/loxP-Rekombinationssystem Die Rekombination ist definiert als ein durch spezifische Enzyme (Rekombinasen) katalysierter Prozess der Spaltung und Neuverknüpfung der DNA. Auf diesem Prinzip basierend ermöglicht die Cre/loxP-Technik eine gezielte Entfernung von DNA-Sequenzen in relevanten Gewebe- oder Zellarten, ohne dass andere davon betroffen sind. Ein in der molekulargenetischen Forschung häufig verwendetes Rekombinationsverfahren beruht auf der Aktivität der Cre (cyclization recombination)-Rekombinase des Bakteriophagen P1. Dieses 38 kD schwere, in allen Organismen vorkommende Protein katalysiert die ortsspezifische Rekombination zwischen zwei angrenzenden locus of x-over of P1 (loxP)- Erkennungssequenzen. Das loxP-Motiv besteht aus einer 8 bp Spacer-Region, die wiederum von zwei, jeweils 13 bp langen, invertierten Wiederholungen (inverted repeats) flankiert wird. Die invers repetitiven Komponenten dienen der Erkennung und DNA-Bindung von Cre. Die zwei eingebauten loxP-Sequenzen ermöglichen eine effiziente Exzision des loxP-flankierten („gefloxten“) DNA-Abschnitts. Das herausgeschnittene DNA-Segment wird als zirkuläres Rekombinationsprodukt intrazellulär abgebaut. Lediglich verbleibt eine einzelne loxP-Sequenz im modifizierten Genmaterial. Mittlerweile ist das Cre/loxP-Rekombinationssystem als eine gängige molekulargenetische Methode zur Herstellung gewebespezifischer Knockout-Mäuse etabliert. Zur Generierung dieser transgenen Tiere werden zwei genetisch veränderte Mauslinien benötigt (siehe Abbildung 3). Abbildung 3: Gewebespezifische Deletion von Mausgenen mittels Cre/loxP-Technologie. Der grüne Pfeil kennzeichnet den Vorgang der Transkription. In Zelltypen mit aktiver CreRekombinase in der Cre/loxP-Maus ist die Genfunktion durch Exzision zerstört. 12 II. EINLEITUNG Die Mauslinie 1 der F0-Generation trägt den gefloxten Genabschnitt. Hierzu werden die gleichgerichteten loxP-Sequenzen vor und nach dem betroffenen Allel in die flankierenden Intronbereiche integriert, somit bleibt das Zielexon funktionsfähig. Die Mauslinie 2 der Parentalgeneration exprimiert die Cre-Rekombinase selektiv in bestimmten Geweben bzw. Zelltypen. Zur Generierung der Cre-Maus wird ein Cre-Transgen in das Genom eingebracht. Die Auswahl des vorgeschalteten Promotors, unter dessen Kontrolle das Cre-Transgen gestellt wird, bestimmt über Zeitpunkt und Gewebespezifität der Cre-Expression. Daher wird die CreRekombinase nur von denjenigen Zellen gebildet, die auch über den entsprechenden Promotor verfügen (Claudine 2004). Nach Verpaarung der parentalen Cre-exprimierenden und gefloxten Mauslinien geht eine Maus (Mauslinie 3) in der F1-Generation hervor, die beide genetische Veränderungen in ihrem Erbgut trägt. Cre-Rekombinase exprimierende Zelltypen weisen eine Exzision des loxPmarkierten Zielexons und daraus resultierend eine Deletion des definierten Gens auf. Im Gegensatz dazu bleibt in allen anderen Geweben ohne Cre-Transkription die entsprechende Genfunktion unbeeinflusst. Somit lässt sich mithilfe der Cre/loxP-basierenden Methode ein gewebespezifischer Gen-Knockout in der Mausgenetik etablieren. Eine weitere Bedeutung gewinnt das Cre/loxP-System in der Induktion gewebespezifischer Mutationen über die Verwendung loxP-flankierter STOP-Kassetten. Diese Art der Genommodifikation wurde im KrasG12D-Mausmodell zur Herstellung onkogener KrasMutationen angewendet und wird im folgenden Abschnitt detailliert beschrieben. 2.2. Das KrasG12D-Mausmodell Mit der Entwicklung des LSL-KrasG12D Mausmodells für das PDA gelang dem Forscherteam unter David Tuveson und Tyler Jacks die Etablierung eines der bedeutendsten murinen pankreatischen Karzinommodelle, welches auch in dieser Arbeit eine wesentliche Stellung einnimmt. Grundidee dieses Tiermodells ist die vom endogenen Kras-Locus ausgehende heterozygote pankreasspezifische Aktivierung des mutierten Kras(G12D)-Onkogens. Über die Transfektion eines Plasmids in einen Mausstamm wurde das Kras-Allel so verändert, sodass dieses ein modifiziertes Exon 1 mit einer Guanin-zu-Adenin-Transition auf dem Kodon 12 (G12D) und folglich einen Glycin-Aspartat-Aminosäureaustausch im Genprodukt aufweist (Jackson et al., 2001). Unter Anwendung des bereits beschriebenen Cre/loxP- Rekombinationssystems wird die gezielte Expression des veränderten Kras-Allels spezifisch in Pankreaszellen erreicht. Hierzu wird dem das Kodon 12 enthaltende Exon 1 eine Lox-STOPLox (LSL)-Sequenz vorgeschaltet (siehe Abbildung 4). Dieser LSL-Konstrukt verhindert die 13 II. EINLEITUNG Transkription des veränderten Strukturgens und somit die Überexpression des onkogenen KRas-Proteins in der LSL-KrasG12D-Mauslinie. Um eine KrasG12D-Aktivierung selektiv im Pankreas vorzunehmen, wird die LSL-KrasG12D-Maus mit einer Mauslinie gekreuzt, in der die Cre-Rekombinase unter pankreassspezifischem Promotor Pdx-1 oder als Knock-in heterozygot durch Entfernung des Exons 1 in einen Ptf1a-Lokus eingebaut exprimiert wird. Die daraus resultierende Mauslinie bezeichnet man als Ptf1a-Creex1 bzw. Pdx1-Cre (Hingorani et al., 2003a; Nakkai et al., 2007). Pdx1 kodiert für den Transkriptionsfaktor Pankreatischer und duodenaler Homebox Faktor 1 (Pdx1), der auch als Insulin-Promotor-Faktor 1 bezeichnet und ab dem Entwicklungstag 8,5 produziert wird. Eine homozygote Deletion von Pdx1 endet letal in der Embryonalperiode. Das von Ptf1a-Genbereich kodierte Ptf1a-Protein, welches auch als p48 genannt wird, stellt die Untereinheit des heterotrimerischen Pankreastranskriptionsfaktorkomplex 1 dar (Rose et al., 2001). P48 wird ab Tag 9,5 der Embryonalentwicklung exprimiert und ist gemeinsam mit Pdx1 für die pankreasspezifische Differenzierung der Zellen verantwortlich. Das Vorhandensein beider Faktoren ist essenziell für die morphologische und funktionelle Entwicklung der Vorläuferzellen zu Pankreasgewebszellen, wobei erwachsene Mäuse Pdx1 zur Bildung der Inselzellen und p48 zur Initiierung der Azinuszelldifferenzierung benötigen (Rose et al., 2001; Beres et al., 2006). Demzufolge führt die vollständige Deletion der p48-Gene zu einer Agenesie des exokrinen Pankreas und konsequenterweise zum Tod der Mäuse früh postnatal (Krapp et al., 1998; Sellik et al., 2004). Nach Kreuzung der transgenen Mauslinien LSL-KrasG12D und Ptf1-Creex1 bzw. Pdx1-Cre geht nun eine Mausmutante LSL-Kras+/G12D;Ptf1a-Creex1 bzw. LSL-Kras+/G12D ;Pdx1-Cre hervor, die eine Heterozygotie für das KrasG12D-Allel aufweist. Aufgrund der Ptf1a- bzw. Pdx1-CreRekombinase assoziierten Exzision der loxP-flankierten STOP-Sequenz in diesem auch als KrasG12D bezeichneten Tumormausmodell entfällt die transkriptionsinhierende Funktion der STOP-Kassette, was wiederum zur deregulierten hochfrequenten Transkription des mutierten Exon 1 führt (siehe Abbildung 4). 14 II. EINLEITUNG Abbildung 4: Systematik der Generierung des KrasG12D-Tumormausmodells. Grüne Pfeile beschreiben die Transkription der Strukturgene. Roter Balken kennzeichnet die transkriptionsinhibierende Wirkung der STOP-Kassette (modifiziert nach Hingorani et al 2003). Mithilfe der LSL-KrasG12D Mauslinie ist die selektive endogene Expression des onkogenen KRas-Proteins in Ptf1a bzw. Pdx1 positiven und Cre-Rekombinase positiven Pankreasgewebszellen möglich. Somit kann die Tumorentwicklung pankreasspezifisch initiiert und die Entstehung des humanen Pankreaskarzinoms exakt in der Maus rekapituliert werden. Die genetisch veränderten KrasG12D-Mäuse zeigen daraufhin alle Stadien der PanIN-Läsionen, die analog zum humanen PDA in ihrer Anzahl und Schwere mit dem Alter der Mäuse zunehmen. In 10% der Fälle und nach einer Latenz von etwa neun Monaten entwickeln sich auch invasive und metastasierende Karzinome. Der Nachweis der Kras-Mutation bei allen PanIN-Stufen in den Progenitorzellen bestärkt dessen Bedeutung in der Induktion und Progression der Pankreaskarzinogenese. Bei LSL-KrasG12D;Pdx1-Cre-Mäusen treten zusätzlich andere Tumoren mit variierender Penetranz auf, wie die intestinale Hyperplasie des Magenepithels, monokutane Papillome und hyperplastische Polypen des Duodenums. Die simultane Existenz dieser Malignome beweist die embryonale Expression von Pdx1 in endothelialen Vorläuferzellen (Rose et al., 2001). Ausgehend von diesem etablierten KrasG12DTumormausmodell sind verschiedene komplexe Tiermodellsysteme entwickelt worden, die additiv zu dem mutierten Kras-Allel andere genetische Veränderungen aufzeigen. Damit lässt sich der Einfluss einzelner Genmutationen auf die Karzinomentwicklung und –progression genauer analysieren und mögliche Ansatzpunkte für ein gezieltes medizinisches Eingreifen finden. 15 II. 3. EINLEITUNG Suppressors of cytokine signaling (SOCS) Die Mitglieder der SOCS-Familie stellen wichtige Feedback-Inhibitoren des ZytokinSignaltransduktionswegs dar. Mittlerweile sind acht SOCS-Proteine (CIS, Socs1-Socs7) beschrieben worden, die auf ein Zytokinsignal gewebeabhängig exprimiert werden. Von diesen auch als STAT-induzierte STAT-Inhibitoren (SSI) bezeichneten negativen Regulatoren der Zytokin-Signalkaskade sind die Proteine Socs1, Socs2 und Socs3 besonders gut charakterisiert und nehmen eine wichtige Stellung in der Interleukin-6 (IL-6) Signalkaskade ein. Im Gegensatz dazu sind Socs4 bis Socs7 bislang noch wenig erforscht (Krebs et al., 2000). Aufgrund der tragenden Rolle von Socs3 in dieser Arbeit, soll im Folgenden besonders auf diesen inhibitorischen Regulationsfaktor eingegangen werden. 3.1. Die Struktur von Socs3 Socs3 stellt ein aus 225 Aminosäuren (AS) bestehendes Molekül dar, das aus unterschiedlichen Domänen zusammengesetzt ist (vergleiche Abbildung 5). Die einzelnen Abschnitte erfüllen im Rahmen der Signaltransduktion bestimmte Funktionen, die in ihrer Gesamtheit für den negativen Feedback-Mechanismus des Socs3-Proteins von großer Bedeutung sind. Die Nterminale Kinase-Inhibitor-Region (KIR) bindet als Pseudosubstrat an das aktive Zentrum von Janus-Kinasen (Jak), wodurch das Andocken nativer Substrate blockiert wird. Eine zentrale Stellung nimmt die SH2 (Scr-homology-2)-Domäne im Socs3-Molekül ein. Diese bildet die eigentliche Kinase-Bindungsstelle, die eine hohe Affinität zu phosphorylierten Tyrosinresten im Aktivierungsloop der Jaks aufweist. Unterstützt wird die SH2-Sequenz von den beiden flankierenden N-ESS (extended SH2 subdomain) und C-ESS-Domänen, die strukturell die Assoziation und die Affinität von SH2 an die Tyrosinmotive erhöht. Am C-terminalen Ende der SH2-Domäne liegt eine PEST-Insertion zwischen zwei konservierten SekundärStrukturelementen. Untersuchungen haben gezeigt, dass dieses PEST-Motiv als wichtiger Regulator der Proteinstabilität fungiert und seine Entfernung weder zu einer Strukturveränderung führt noch die Funktion von Socs3 beeinträchtigt. Jedoch zeigen PESTKnockout Mäuse eine Zunahme der Socs3-Halbwertszeit durch Beeinflussung des Proteasomvermittelten Abbaumechanismus (Babon et al., 2006). Die für die hemmende Wirkung von Socs3 ebenfalls wichtige SOCS-Box-Region ist C-terminal lokalisiert (siehe Abbildung 5). 16 II. EINLEITUNG Abbildung 5: Schematische Darstellung der Socs3-Architektur. Die Socs3-Struktur besteht aus einem kleinen N-Terminus, einer Kinase-Inhibitor-Region (KIR), einer SH2-Domäne und einer C-terminalen SOCS-Box. Die zentrale SH2-Domäne setzt sich aus 141 Aminosäuren (AS) zusammen und wird durch ein aus 35 AS bestehendes PEST-Motiv unterbrochen. N-terminal bzw. C-terminal wird die SH2-Domäne durch eine N-ESS- bzw. C-ESS-Sequenz flankiert (modifiziert nach Babon et al. 2006). Durch Rekrutierung von Elongin B, Elongin C, Cullin 2 und das Ringfinger-Protein Rbx1 an der SOCS-Box bildet sich ein E3-Ubiquitin-Ligase-Komplex (siehe Abbildung 6), in dem Socs3 als Adaptormolekül die Ubiquitination und Degradation von bestimmten an der Signaltransduktion beteiligten Proteinen fördert (Kamura et al., 1998; Kamura et al. 2004). Abbildung 6: Socs3 als Trägermolekül des E3-Ubiquitin-Ligase-Komplexes (modifiziert nach Krebs et al. 2000). 3.2. Socs3 als Zytokin-Signaltransduktionsinhibitor Die intrazelluläre Socs3-Proteinkonzentration ist unter normalen Umständen relativ gering. Für die Aktivierung des auf Chromosom 11 liegenden Socs3-Gens (entspricht dem humanen Socs3-Gen auf Chromosom 17) ist die Interaktion von Zytokinen besonders der Interleukin (IL)-6-Familie, Wachstumsfaktoren wie den Insulin-like growth factor oder Hormonen mit den spezifischen Zelloberflächenrezeptoren essentiell. Innerhalb der Untergruppen zeigen die Zytokine ähnliche Molekül- und Rezeptorstrukturen. Stellvertretend soll an dieser Stelle der IL-6-Rezeptor und dessen anschließende Signaltransduktionswege näher erläutert werden. Der IL-6-Rezeptor verfügt über zwei Untereinheiten. Durch Bindung an das extrazelluläre Zytokin-bindende Modul, das auch als Glykoprotein (gp)180 bekannt ist, übt IL-6 seine biologische Aktivität aus. Intrazellulär bilden die ubiquitär exprimierten gp130- Rezeptoruntereinheiten die signalvermittelte Struktur durch Aktivierung der Signalkaskade 17 II. EINLEITUNG und stellen gleichzeitig Ziel verschiedener Rückkopplungsmechanismen dar. Weitere Charakteristika des IL-6-Rezeptors sind die fehlende intrinsische katalytische Tyrosinkinaseaktivität und die Verankerung in der Plasmamembran über eine singuläre Transmembrandomäne. Bei Interaktion des Liganden IL-6 mit der extrazellulären Rezeptorkomponente kommt es zunächst zur Aktivierung rezeptorassoziierter, intrazellulärer Janus-Kinasen (Jak) durch Autophosphorylierung. Daraufhin phosphorylieren die aktivierten Jaks die zytosolischen Zytokinrezeptoranteile am Tyrosinrest 759, der als Bindungsstelle sowohl für diverse Transkriptionsfaktoren wie Stat3 als auch Inhibitoren wie Socs3-Moleküle fungiert. Die Rezeptor-Ligand-Interaktion setzt somit den Jak/Stat-Signalweg ebenso wie die PI3K- und die Ras/Raf/MAPK-Signalkaskade in Gang. Die als Monomere im Zytoplasma lokalisierten Stat3-Moleküle binden an die gp130Untereinheit und werden anschließend Jak-vermittelt am Tyrosin 705 phosphoryliert. Die aktivierten phospho(p)-Stat3-Elemente lagern sich dann zu Homo-oder Heterodimeren zusammen, die in den Zellkern translozieren und dort an Enhancer-Sequenzen in Promotoren von IL-6-Zielgenen binden und folglich deren Transkriptionsfrequenz positiv modulieren (siehe Abbildung 7). In vielen malignen Tumoren kommt es durch eine Hyperaktivität der Rezeptor-Tyrosinkinasen zu einer konstitutiven Phosphorylierung und Aktivierung von Stat3 und folglich zu einer Überexpression der an verschiedenen physiologischen Prozessen wie Proliferation, Apoptose, Angiogense, Inflammation beteiligten Zielgene. Dies führt zur Dysregulation des Zellzyklus und der Zellfunktion, was wiederum das Wachstum und Überleben transformierter Zellen begünstigt und die Karzinomentwicklung fördert. Abbildung 7: Die Mechanismen der Aktivierung der IL-6/Jak/Stat3-Signalkaskade und dessen Feedback-Inhibition durch Socs3. 18 II. EINLEITUNG Die Aktivierung der Ras/Raf/MAPK-Kaskade setzt die Bildung eines Molekülkomplexes bestehend aus SHP2 (SH2-Domäne enthaltende Phosphatase 2), Grb2 (growth factor receptor bound protein 2), SOS (son of sevenless) und Gab1 (GRB2-associated binding protein 1) voraus. Diese Proteineinheit bindet über SHP2 an die phosphorylierte Y759-Domäne und vermittelt die Umwandlung des GDP-Ras in die energiereiche GTP-gebundene Form. Im weiteren Verlauf kommt es nacheinander zur Aktivierung von Raf (rat fibrosarcoma), MEK (Mitogen-activated protein kinase kinase) und MAPK (Mitogen-activated protein kinase), welche anschließend intranukleär Transkriptionsfaktoren phosphoryliert und auf diese Weise die Transkription von verschiedenen Ras-Zielgenen initiiert. Die Genprodukte beeinflussen Wachstum, Proliferation, Zelldifferenzierung und Apoptose (Lim et al., 2005 Friday et al., 2008). Abbildung 8: Die Aktivierung der Ras/Raf/MAPK- und PI3K/AKT–Signalkaskade durch IL-6 und dessen negative Regulation durch Socs3. Ein weiterer mit der IL-6-Signaltransduktion assoziierter Signalweg verläuft über die Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K). Obwohl diesem eine große Bedeutung in der Regulation mannigfaltiger Zellprozesse zugesprochen wird, ist die Komplexität der Signalkaskade noch nicht vollständig verstanden. Nach Aktivierung durch Bindung an die pY759-Einheit oder durch das aktive G-Protein Ras ist PI3K in der Lage, bestimmte Membranlipide wie PIP2 (Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphat) (Phosphatidylinositol-3,4,5-Trisphosphat) zu phosphorylieren. Als in PIP3 second-messenger rekrutiert PIP3 die Proteinkinase B (PKB; AKT) an die Plasmamembran, wo die Phosphorylierung und Aktivierung dieses Enzyms stattfindet. In ihrer aktiven Form beeinflusst AKT eine Reihe von zellulären Prozessen wie die Hemmung der Apoptose durch Inhibition pro-apoptotischer Proteine der Bcl-Familie, die Stimulation der Proteintranslation 19 II. EINLEITUNG an den Ribosomen durch Aktivierung von mTOR (mammalian Target of Rapamycin) und die Förderung der Proliferation durch Inaktivierung des proliferationshemmenden Forkhead-BoxProtein O3 (FOXO), welches die Zellteilung und Zellwachstum supprimiert. Alle genannten Abläufe fördern letztendlich bei konstitutiver Aktivierung der Signalkaskade die Tumorinitiierung und –progression (Manning et al. 2007; Assinder et al., 2009). Als Antagonist von PI3K wird die Phosphatase PTEN (Phosphatase and Tensin homolog) beschrieben, die PIP3 zu PIP2 dephosphoryliert und somit folglich die Aktivierung von AKT verhindert. Eine Loss-of-function Mutation von PTEN resultiert daher in einer anhaltenden Funktion der Proteinkinase B und führt letztlich zu unkontrolliertem Wachstum und Proliferation der Zelle (Dubrovska et al., 2008). Um einer Dauerstimulation entgegen zu wirken wird die IL-6-Wirkung über verschiedene Mechanismen reguliert. In diesem Zusammenhang kommt insbesondere der FeedbackInhibition durch Socs3-Proteine als negative Rückkopplung eine große Bedeutung zu. Nach Zytokin- bzw. Stat-induzierter Expression von Socs3 (Lang et al., 2003), bindet dieses Genprodukt mit der SH2-Domäne direkt an das Phosphotyrosin 759 der zytoplasmatischen gp130-Domäne und verhindert dadurch die Rekrutierung und Aktivierung nativer an der Signaltransduktion beteiligter Substrate wie Stat3 (vergleiche Abbildung 7). Die Affinität zu Jaks ist jedoch im Gegensatz zu Socs1 relativ gering, sodass höhere Konzentrationen für die gleiche Hemmwirkung benötigt werden (Babon et al., 2006). Darüber hinaus fördert Socs3 den proteasomalen Abbau der Signal-Proteine durch Bildung des E3-Ubiquitin-LigaseKomplexes. Es kommt schließlich zur Terminierung der IL-6-Signaltransduktion. Die starke Induktion des endogenen Inhibitors legt eine regulierende Funktion des Socs3 in der pankreatischen Onkogenese nahe. Das Fehlen von Socs3-Molekülen durch homozygote Deletion des entsprechenden Gens resultiert in konstitutiver IL-6-Signalvermittlung und führt infolgedessen zu ungehindertem Wachstum und Entwicklung maligner Prozesse. 20 II. 4. EINLEITUNG Zielsetzung der Arbeit Das duktale Adenokarzinom des Pankreas ist eine hochmaligne Tumorerkrankung des Menschen mit einer Mortalitätsrate von 100% und einer frustranen Prognose (Lowensfels et al., 2006). Trotz der zunehmenden Kenntnisse aus intensiven Forschungsuntersuchungen über die histopathologischen und molekulargenetischen Ursachen stellt die Prognose eines Pankreaskarzinoms für den heutigen Stand der Therapie immer noch eine große Herausforderung dar. Mithilfe neu entwickelter Tumormausmodelle versucht man die Mechanismen der Tumorentwicklung und- progression nachzuvollziehen und somit Rückschlüsse auf das humane Pankreaskarzinom zu ziehen. Die KrasG12D-Mutation spielt in der Tumorinitiierung und Tumorprogression eine tragende Rolle. Untersuchungen haben diese genetische Veränderung sowohl in den PanINVorläuferläsionen als auch in fortgeschrittenen metastasierten und invasiven Tumorstadien nachgewiesen. Andere aktivierende und hemmende molekulare Mechanismen im Rahmen der PanIN-Progression zu invasiven duktalen Adenokarzinomen sind bisher weitgehend unbekannt und sind Gegenstand gegenwärtiger Forschungsarbeiten. Der suppressor of cytokine signaling 3 (Socs3) ist als negativer Regulator zahlreicher Signaltransduktionswege besonders der IL-6/Jak/Stat3-Signalkaskade beschrieben worden (Lang et al. 2003). Obwohl für Socs3 eine zunehmende Bedeutung in der Karzinogenese postuliert wird (Ogata et al., 2006), ist dessen Funktion und Wirkungsweise in der pankreatischen Onkogenese bisher nur unzureichend untersucht. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Rolle bzw. dem Einfluss von Socs3 auf die durch die KrasG12D-Mutation induzierte murine Pankreaskarzinogenese. Im Rahmen der durchgeführten Untersuchungen werden dabei folgende wichtige Fragestellungen formuliert: - Lässt sich in PanIN-Läsionen von LSL-KrasG12D;Ptf1a-Creex1 (KrasG12D)-Mäusen eine verstärkte Expression und folglich eine erhöhte Konzentration von Socs3 nachweisen? - Welche Konsequenz hat dann eine homozygote Deletion des Socs3-Gens mit konsekutiver Socs3-Inaktivierung für die Entwicklung und Progression von PanINs in KrasG12D-Mäusen? - Was bedeutet dieser Genverlust für das Wachstum und Entwicklung der genetisch veränderten Tiere? 21 III. MATERIAL UND METHODEN III. MATERIAL UND METHODEN 1. Material 1.1. Chemikalien Chemikalie ABC-Lösung Name und Firma ABC Elite Kit Vector, Burlingame, USA Acrylamid Rotiphorese Gel 30 (Roth,Karlsruhe) Antigen Unmasking Solution H-330 Vector Labs, Burlingame, USA APS Sigma, Steinheim Avidin Avidin/Biotin Blocking, Vector Labs, Burlingame, USA Biorad, München Biorad Protein Assay Biotin BrdU Avidin/Biotin Blocking, Vector Labs, Burlingame, USA Protein Assay Dye Reagent Concentrate # 500-0006, Bio-Rad Bromphenol blue sodium salt (Sigma, Steinheim) Sigma, Steinheim BSA Cohn V fraction (Sigma, Steinheim) ddH2O Aqua ad injectabilia (Diaco,Naila) dH2O DirectPCR® Lysis Reagent Aqua Delta Select Spüllösung (Delta Select, München) DAB Substrate kit for Peroxidase, Vector Laboratories Peqlab, Erlangen DMEM Gibco DNA-Größenstandard DNA-Leiter-Mix (Peqlab, Erlangen) ECL EDTA Amersham ECL Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare, München) Sigma, Steinheim Eindeckmedium (Mounting Medium) Pertex, Medite Eosin Croma, Münster Ethanol Apotheke MRI Ethidiumbromid Sigma, Steinheim Goat Serum Sigma, Steinheim Hämalaun Merck, Darmstadt Hämatoxylin Merck, Darmstadt HCl Merck, Darmstadt Bradford (5x) Bromphenolblau DAB 22 III. MATERIAL UND METHODEN HEPES Sigma, Steinheim Histoclear Roti-Histol (Roth, Karlsruhe) 30%H2O2 Merck, Darmstadt Isofluran Forene (Abbott, Wiesbaden) LE Agarose Biozym Scientific, Oldendorf β-Mercaptoethanol Sigma, Steinheim Magermilchpulver Sigma, Steinheim Methanol Roth, Karlsruhe NP-40 Roche, Mannheim Pertex-Eindeckmedium Instamed PBS Dulbecco (Biochrom AG, Berlin), Medite, Burgdorf PFA Apotheke MRI Phosphatase Inhibitor Cocktail I Sigma, Steinheim Phosphatase Inhibitor Cocktail II Sigma, Steinheim Protease-Inhibitor Cocktail Sigma, Steinheim Proteinase K Rabbit serum Roche, Mannheim Precision plus protein™ standard (Biorad, München) Sigma, Steinheim Ras Activation Assay Kit Biomal, Hamburg RedTaq ReadyMix Sigma, Steinheim RNAseZap Sigma, Steinheim SDS Streptavidin/Biotin block SDS Ultra pure (Roth, Karlsruhe) Vector Laboratories, Orton Southgate TEMED Sigma, Steinheim Tris-HCL Roth, Karlsruhe Tris-Base Roth, Karlsruhe Tween-20 Roth, Karlsruhe PBS-Pulver Protein-Größenstandard Tabelle 1: Chemikalien. 23 III. 1.2. MATERIAL UND METHODEN Geräte und Hilfsmittel Geräte Agarosegel-Bildwandler Agarosegelkammer Name und Firma Molecular Imager Gel Doc XR System (Biorad, München) Sub-Cell GT (Biorad, München) Automatischer Filmprozessor Amersham Hyperprocessor (GE Healthcare) Computer Hardware Apple Deckgläser #1 H868, 24x60 mm Elektrophoreseapparatur Eppis Mini-PROTEAN Tetracell (Biorad, München) Amersham Hyperprocessor (GE, Healthcare, München) Eppendorfer Falcons Falcon®, BD, Franklin Lakes, USA Feinwaage Analytic Sartorius, Göttingen Filmkassette BAS Cassette 2025 (Fujifilm, Kleve) Heizplatte Thermomixer compact (Eppendorf, Hamburg) Bio-Cassettes 07-7130, Bio-Optica, Mailand,lt. Diax 900 (Heidolph, Schwabach) Entwicklermaschine Histologiekassetten Homogenisator Hyperfilm Kamera Amersham Hyperfilm ECL (GE Healthcare, München) ApoTome, Zeiss, Oberkochen Magnetrührer MR 3001 (Heidolph, Schwabach) Microtome HM 355, Microm GmbH Mikroskope Mikrowelle Axio Imager A1 (Zeiss, München) Axiover 40 CFL (Zeiss, München) MZ75 (Leica, Wetzlar) Siemens, München Neubauer®-Zählkammer Marienfeld Objektträger pH-Meter Superfrost®Plus, Menzel-Gläser, Braunschweig Thermo Scientific, Schwerte Parafilm®PM-992, pechiney plastic packaging, Brampton, USA Inolab pH 720 (WTW, Weilheim) Pipetten Eppendorf Research, Hamburg Parafilm SafeSeal-Tips® Professional, (Biozym Oldendorf) PowerPac basic, Bio-Rad Pipettenspitzen Power supply 24 III. MATERIAL UND METHODEN Scanner Canon Schwenktisch L40 (Labinco, Breda, Niederlande) Slides-Folien Spektrophotometer Thermo scientific Stromquelle Power Pac Basic (Biorad, München) Thermoblock/Schüttler Thermocycler Thermomixer compact (Eppendorf, Hamburg) Mastercycler (Eppendorf, Hamburg) Transferapparat Mini Trans-Blot Cellfer (Biorad, München) 2001 (Anthos, Krefeld) Immobilon-P Transfer Membrane (Millipore, Schwalbach) Reax top (Heidolph, Schwabach) Transfermembran Vortexer Waage Whatman-Papier BP 2100 S (Sartorius Göttingen) Microtest TM 96 Zellkulturplatte (Becton Dickinson, Heidelberg) Biometra, Göttingen WinRead Anthos Zentrifuge Centrifuge 5415R (Eppendorf, Hamburg) Well-Platte Tabelle 2: Geräte und Hilfsmittel. 1.3. Puffer und Lösungen Puffer/Lösung ABC-Lösung Antigendemaskierungslösung pH 8,0 Blocklösung (5 %) für IHC Blocking-Puffer (5 %) für WB BrdU Stock-Lösung 50 µg/µl Zusammensetzung Pufferlösung Reagenz A Reagenz B 1 mM EDTA oder Citratpuffer Serum Avidin Pufferlösung (PBS/PBS-T, TBS/TBS-T) Skim milk TBS/T oder PBS/T Menge 2,5 ml 1 Tropfen 1 Tropfen BrdU dH2O 500 ml 10 ml 50 µl 4 Tropfen 945 µl 10 g 200 ml 200 ml mit NaOH alkalisieren bis BrdU vollständig aufgelöst ist, steril filtrieren und Stocklösung bei -20°C aufbewahren DAB-Lösung dH2O Buffer Stock-Lösung DAB-Lösung H2O2-Lösung 25 2,5 ml 1 Tropfen 1 Tropfen 1 Tropfen III. MATERIAL UND METHODEN Deparaffinisierung Hydratation IP–Puffer/Lysispuffer Lagerung bei 4°C 5x Laemmli-Ladepuffer pH 6,8 10x Laufpuffer pH 8,3 Lysispuffer für Isolation genomischer DNA aus Mausschwanzspitzen 10x PBS, pH 7,4 PBST Peroxidase Blocklösung 3 % Histoclear Ethanol Ethanol Histoclear EDTA pH 8,0 HEPES pH 7,9 NaCl Glycerin NP-40 und kurz vor der Lyse supplementieren mit: DTT PMSF Protease Inhibitor Cocktail Phosphatase Inhibitor Cocktail I Phosphatase Inhibitor Cocktail II SDS Glycerin Tris-HCL Bromophenolblau ß-Mercaptoethanol Tris-Base Glycin SDS DirectPCR® Proteinase K Alternative: selbst angesetzter Puffer Tris EDTA NaCl SDS Proteinase K kurz vor der Lyse dazugeben NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 Auf 1 l mit dH2O auffüllen PBS 10x dH2O Tween-20 H2O2 30 % 26 76 % 96 % 100 % 76 % 96 % 100 % 1 mM 50 mM 150 mM 10 % 0.5 % 1 mM 0,2 mM 1% 1% 1% 10 % 50 % 300 mM 0,05 % 5% 30 g 144 g 10 g Auf 1 l mit dH2O auffüllen 200-300 µl 0,2-0,4 mg/ml 50 mM 100 mM 100 mM 1% 0,5 mg/ml 80 g 2g 14,4 g 2,4 g 100 ml 900 ml 0,1 % 100 µl III. MATERIAL UND METHODEN PFA 4 % Proteinase K-Buffer, pH 7,5 Sammelgelpuffer pH 6,8 Stripping Puffer pH 2,0 50x TAE (Tris-Acetat-EDTA)Puffer pH 8,5 10x TBS, pH 7,6 TBS-T 10x Transfer-Puffer pH 8,3 1x Transfer-Puffer Trenngelpuffer pH 8,8 dH2O PFA 8 % PBS CaCl2 Tris-Base Glycerin Proteinase K Tris-Base Auf 100 ml mit dH2O auffüllen, pH mit HCL einstellen Glycin SDS EDTA Tris-Base Essigsäure Tris-Base NaCl Auf 1 l mit dH2O auffüllen 10x TBS dH2O Tween 20 Tris Glycin Auf 1 l mit dH2O auffüllen 10x Transferpuffer Methanol dH2O Tris-HCL Auf 1 l mit dH2O auffüllen 900 µl 20 ml 20 ml 20 mM 10 mM 50 % 1% 0,5 M 25 mM 1% 0,5 M 2M 1M 24,2 g 80 g 100 ml 900 ml 1 ml 30 g 144 g 100 ml 200 ml 700 ml 1,5 M Tabelle 3: Puffer und Lösungen. 1.4. Gele Gel Sammelgel Trenngel dH2O Trenngelpuffer Acrylamid 30 % SDS 10 % APS 10 % TEMED 7,5 % 4,9 ml 2,6 ml 2,5 ml 100 µl 50 µl 15 µl Zusammensetzung destilliertes Wasser Sammelgelpuffer Acrylamid 30 % SDS 10 % APS TEMED 10 % 4,1 ml 2,6 ml 3,3 ml 100 µl 50 µl 15 µl Tabelle 4: Gele. 27 Menge 3,0 ml 1,3 ml 750 µl 50 µl 25 µl 10 µl 12 % 3,4 ml 2,6 ml 4,0 ml 100 µl 50 µl 15 µl 15 % 2,5 ml 2,6 ml 5,0 ml 100 µl 50 µl 15 µl III. 1.5. MATERIAL UND METHODEN Antikörper 1.5.1. Antikörper für Immunhistochemie (IHC) Erster Antikörper Amylase Quelle Verdünnung Inkubationszeit Firma Ziege 1:500 BrdU CK-19 Ratte Ratte 1:250 1:300 Zwei Nächte 4°C 2 h RT 18 h 4°C Cleaved Caspase 3 Cyclin D1 Hase 1:300 18 h 4°C Hase 1:300 18 h 4°C F4/80 Ratte 1:100 18 h 4°C Glucagon 1:500 1 h RT 1:100 1 h RT 1:250 18 h 4°C Muc5A Meerschweinchen MeerSchweinchen Armenien Hamster Maus 1:100 2 h RT phospho-ERK Hase 1:100 18 h 4°C phospho- Stat3 Hase 1:50 18 h RT 1:500 1 h RT 1:500 1 h RT 1:500 1 h RT 1:500 1 h RT Insulin Muc1 Socs3 Sekundärer Antikörper Biotinylierter Ziege Anti-Hase Biotinylierter Hase Anti-Ziege Biotinylierter Ziege AntiMeerschweinchen Biotinylierter Hase Anti-Ratte Sigma, Steinheim Serotec, Düsseldorf Hybridom Bank, Iowa City USA Cell Signaling, Frankfurt Labvision/NeoMarkers, USA Caltag Laboratories, UK Linco DakoCytomation, Hamburg Labvision/Neomarkers, USA Labvision/Neomarkers, USA Cell Signaling, Frankfurt Cell Signaling, Frankfurt Vector, Burlingame, USA Vector, Burlingame, USA Vector, Burlingame, USA Vector, Burlingame, USA Tabelle 5: Antikörper für IHC. 1.5.2. Antikörper für Western Blot (WB) Erster Antikörper ß-Actin Bax Bcl-2 Quelle Verdünnung Inkubationszeit Firma Maus Hase Maus 1:2000 1: 500 1:500 18 h 4°C 18 h 4°C 18 h 4°C 28 Sigma, Steinheim BD, Heidelberg Cell Signaling III. MATERIAL UND METHODEN Bcl-XL Hase 1:500 18 h 4°C Cox-2 Ziege 1:200 18 h 4°C Cyclin D1 HSP70 Maus Hase 1:500 1:500 18 h 4°C 18 h 4°C Mcl-1 Hase 1:500 18 h 4°C p21 Maus 1:500 18 h 4°C p53 PCNA phospho-ERK Maus Maus Hase 1:500 1:500 1:500 18 h 4°C 18 h 4°C 18 h 4°C Phospho-Jak 2 Hase 1:500 18 h 4°C 1:500 18 h RT 1:500 1:500 18 h RT 18 h RT 1:2000 1:2000 1 h RT 1 h RT PhosphoHase Stat3Y705 Stat3 Hase Survivin Maus Sekundärer Antikörper Anti-Hase IgG Ziege Anti-Maus IgG Schaf Frankfurt Cell Signaling, Frankfurt Caymann, Ann Arbor, USA Santa Cruz, Heidelberg Cell Signaling, Frankfurt Epitomics, Burlingame, USA BD Pharmingen, Heidelberg Santa Cruz, Heidelberg Santa Cruz, Heidelberg Cell Signaling, Frankfurt Cell Signaling, Frankfurt Cell Signaling, Frankfurt Santa Cruz, Heidelberg Santa Cruz, Heidelberg Promega, Mannheim GE Healthcare, München Tabelle 6: Antikörper für Western Blot. 1.6. Primer für Genotypisierung Gen Socs3 Ptf1a-cre Kras Primername Socs3 loxpA Socs3 loxpB Cre487 p48as1642 Kras 3 Kras 5 Oligonukleotidsequenz (5ʼ- 3ʼ) -GCGGGCAGGGGAAGAGACTGTCTGGGGTTG-GGCGCACGGAGCCAGCGTGGATCTGCG-GTCCAATTTACTGACCGTACACCAA-CCTCGAAGGCGTCGTTGATGGACTGCA-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGCG-CGCAGACTGTAGAGCAGCG- Tabelle 7: Primer. 1.7. Mäuse Maus LSL-KrasG12D Ptf1a-Creex1 Socs3Flox/Flox LSL-KrasG12D;Ptf1a-Creex1 Socs3F/F;Ptf1a-Creex1 LSL-KrasG12D;Socs3F/F;Ptf1a-Creex1 Kurzbezeichnung Socs3F/F KrasG12D Socs3Δpanc KrasG12D;Socs3Δpanc Tabelle 8: Mäuse. 29 Referenz (Jackson et al., 2001) (Nakhai et al., 2007) (Okada, Nakamura 2006) Eigene Kreuzung Eigene Kreuzung Eigene Kreuzung III. MATERIAL UND METHODEN 2. Methoden 2.1. Versuchstiere 2.1.1. Behandlung mit BrdU 5-Brom-2-desoxyuridin (BrdU) ist ein Thymidinanalogon, welches von proliferierenden Zellen in vitalen Geweben aufgenommen werden kann. In phosphorylierter Form wird BrdU anstelle des Nukleotids Desoxythymidintriphosphat (dTTP) in die neu synthetisierte DNA (Desoxyribonukleinsäure) aufgenommen. Mithilfe spezifischer Antikörper gegen BrdU kann eine stattgefundene DNA Synthese immunhistochemisch nachgewiesen werden. Damit dient die Behandlung mit 5-Brom-2-desoxyuridin der labordiagnostischen Markierung bzw. dem Nachweis proliferierender Zellen. Für die Detektion und Quantifizierung der proliferierenden Zellen wird die BrdU StockLösung 1:10 mit 0,9 % NaCl auf eine Endkonzentration von 2 mg/ml verdünnt. Die Mäuse wurden zwei Stunden vor Präparation intraperitoneal mit 10 µl/g Körpergewicht (50 µg BrdU/g Körpergewicht Maus) injiziert. 2.1.2. Gewebeentnahme in vivo-Präparation und Materialgewinnung Zur Gewebegewinnung wurden die zu untersuchenden Tiere zwei Stunden nach der BrdUInjektion mit einer Überdosis Isofluran euthanasiert und das Gewicht bestimmt. Nach Desinfektion des Abdomens der Mäuse mit 70 % Alkohol, Freilegung der Bauch- und Thoraxhöhle erfolgte zuerst die Inspektion auf ggf. vorhandenen Aszites, Blut, Metastasen, vergrößerte Lymphknoten etc.. Anschließend wurden Pankreas, Milz, Leber, Lunge und Duodenum entnommen. Nach Bestimmung des Pankreasgewichts wurden Gewebestückchen aus verschiedenen Pankreasanteilen (Caput, Corpus und Cauda) zur Protein- und RNABestimmung reseziert und in kleinen Eppis in Flüssigstickstoff schockgefroren. Das restliche Pankreasgewebe und die anderen entnommenen Präparate wurden in 4 % Paraformaldehyd (PFA) über Nacht fixiert. Am nächsten Tag wurde die Paraformaldehydlösung durch phosphatgepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline, PBS) ersetzt. Zur weiteren Verarbeitung wurden die Proben ins Institut für Pathologie der Technischen Universität München geschickt, wo sie schließlich in Paraffin eingebettet wurden und somit für die Immunhistochemie zur Verfügung standen. Zur Nachgenotypisierung (PCR) wurden die Schwanzspitzen der verwendeten Mäuse getrennt und bei -20°C bis zur Anwendung gelagert. Alter, Geschlecht, Gewicht und Genotyp der Tiere sowie die bei der Resektion beobachteten Auffälligkeiten wurden notiert. 30 III. MATERIAL UND METHODEN Alle Experimente wurden nach den Richtlinien des lokalen Tierschutzkommitees durchgeführt. 2.2. Molekularbiologische Methoden 2.2.1. DNA-Extraktion aus der Mausschwanzspitze Die DNA-Extraktion ist Voraussetzung für die Analyse des entsprechenden DNA-Abschnitts mittels Polymerasekettenreaktion (PCR), die wiederum für die Bestimmung des Genotyps der Versuchstiere essentiell ist. Genomische DNA aus Mausschwänzen wurde mithilfe des DirectPCR®Lysis Reagent (peqlab) isoliert. Die Isolation erfolgte nach dem Protokoll DirectPCR®Lysis Reagent. Die ca. 0,5-1 cm großen Mäuseschwänze wurden mit 200-250 µl DirectPCR®Lysis Reagent, komplettiert mit 0,2-0,3 mg/ml Proteinkinase K, in Reaktionsgefäßen bei 55 °C über Nacht in einem Thermoschüttler bis zur kompletten Lyse des Gewebes inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Proben zur Inaktivierung der Proteinase K bei 85 °C für 45 Min. erhitzt und anschließend für zehn Sekunden zentrifugiert. Der Überstand wurde so für die nachfolgende PCR gewonnen und das Pellet verworfen. Für die anschließende Genotypisierung wurde 1 µl pro 25 µl PCR-Reaktion eingesetzt. 2.2.2. Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) Die PCR diente der in vitro erfolgten enzymatischen Amplifikation der zu untersuchenden Genabschnitte (spezifische DNA-Sequenzen) der verwendeten Versuchstiere. Mithilfe einer hitzestabilen DNA-Polymerase und zwei definierter Oligonukleotidprimer, die den zu amplifizierenden DNA-Abschnitt am 5ʼ- und 3ʼ-Ende flankieren, lässt sich die spezifische DNA-Sequenz polymerisieren und somit exponentiell vervielfältigen. Die PCR ermöglicht somit den Nachweis kleinster DNA-Mengen. Zur Gewinnung einer ausreichenden DNA-Menge ist die PCR in drei Schritte unterteilt, die sich in 12-50 genau definierten Zyklen wiederholen: 1. Denaturierung des DNA-Doppelstranges 2. Anlagerung (Annealing) der spezifischen Primer 3. Verlängerung (Elongation) der einsträngigen DNA durch die DNA-Polymerase 31 III. MATERIAL UND METHODEN Die PCR-Proben mit jeweils 25 µl wurden wie folgt angesetzt: Reagenz dH2O Primer 1 Primer 2 (oder PrimerMix) RedTag Ready Mix DNA Menge 10,5 µl 0,5 µl 0,5 µl 1 µl 12,5 µl 1 µl Folgende Primer-Sequenzen wurden für die Genotypisierung verwendet: siehe Tabelle 7 Alle Ansätze wurden noch einmal kurz herunter zentrifugiert, bevor die PCR in einem automatischen Thermocycler unter folgenden Bedingungen durchgeführt wurde: 1. Initiale Denaturierung 5 Min. 95°C 2. Denaturierung 30 Sek. 95°C Annealing der Primer 30 Sek. 60°C Elongation 90 Sek. 72°C Terminale Elongation 10 Min. 72°C 3. 40 Zyklen Die erhaltenen DNA-Amplifikate können dann direkt mithilfe der Agarose-Gelelektrophorese analysiert und der Erfolg der DNA-Amplifikation überprüft werden. 2.2.3. Agarose-Gelelektrophorese Mittels der Agarose-Gelelektrophorese ist eine Größentrennung der DNA-Stränge und durch Vergleich mit Strängen bekannter Größe eine DNA-Größenbestimmung möglich. Zur horizontalen Auftrennung der Moleküle wird ein aus Agarosepolymeren vernetztes Gel hergestellt, dessen Konzentration je nach Fragmentgröße zwischen 1 % und 3 % liegt. Der Molekularsiebeffekt des Gels dient dabei als Trennprinzip. Die Agarose wurde in 1x TAEPuffer in der Mikrowelle fünf Minuten bis zum Kochen erwärmt. Anschließend wurde pro 10 ml Gellösung 1 µl Ethidiumbromid substituiert. Das flüssige Gel wurde dann blasenfrei in die entsprechende Gelkammer gegossen und ein Gelkamm eingesetzt. Nach Verfestigung des Gels erfolgte die Beladung der Geltaschen mit jeweils 15 µl der in der PCR gewonnenen DNA-Amplifikate und dem Größenstandard, der der Größenbestimmung der Fragmente diente. Aufgrund der negativen Ladung wanderten die DNA-Moleküle nach Anlegen einer elektrischen Spannung von 120V von der Kathode zur Anode, wobei die Wanderungsgeschwindigkeit der DNA-Moleküle durch die Gelmatrix von ihrer Größe abhängig war. Je kleiner das Molekül, desto schneller bewegte es sich. Die Trennschärfe wird ebenfalls von der Gelkonzentration, der angelegten Spannung und der Laufzeit beeinflusst. 32 III. MATERIAL UND METHODEN Zur Visualisierung der aufgetrennten DNA dient die Interkalation der EthidiumbromidMoleküle zwischen den Basen der DNA. Durch die so verstärkte fluoreszierende Eigenschaft von Ethidiumbromid im ultravioletten Licht kann die daran gebundene DNA sichtbar gemacht werden. Das Ergebnis wurde mit einer LCD-Kamera festgehalten und die Größenanalyse mithilfe des Gel Doc XR Systems durchgeführt. 2.3. Detektion und Quantifizierung der Gen-Transkription 2.3.1. Isolation von mRNA aus murinem Pankreasgewebe Zur Gewinnung von RNA wurde zunächst das Pankreasgewebe entnommen und in RLTPuffer/1 % (v/v) β-Mercaptoethanol überführt. Anschließend erfolgte die Zerkleinerung mithilfe eines Homogenisators DIAX 900. Die Extraktion der RNA aus den Homogenisaten wurde mit dem RNeasy®Mini Kit nach den Protokollangaben des Herstellers durchgeführt. Dieses Kit enthält mit Silicagel gefüllte Säulen, über welche die RNA aufgereinigt wird. Die RNA-Konzentration wurde photometrisch unter Zuhilfenahme eines Eppendorf BioPhotometers gemessen. Nicht angewendete Lysate wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert. 2.3.2. cDNA-Synthese Die Umschreibung von RNA in cDNA erfolgte durch reverse Transkription gemäß Herstellerprotokollen. Hierzu wurden 5 µg RNA nach Substitution von 1 µl Oligo(dT)-Primer und 1 µl SuperScriptTM II Reverse Transkriptase in cDNA enzymatisch umgewandelt. Bis zur weiteren Anwendung wurden die cDNA-Produkte bei -20 °C gelagert. 2.3.3. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) Die Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) stellte die Kombination aus zwei molekulargenetischen Methoden, der Reversen Transkriptase (RT) und der PolymeraseKettenreaktion (PCR), dar, die dem Nachweis von RNA aus Genexpression spezifischer Gene in Zellen, Geweben etc. dienten. Via qRT-PCR konnte die Produktsynthese in Echtzeit verfolgt werden. Hierzu wurde die DNA mit einem interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff markiert, der am Ende eines jeden Zyklus optisch angeregt wurde, sodass die Fluoreszenzemission anschließend gemessen werden konnte. Hierbei korrelierte die Zunahme der Fluoreszenz mit der Zunahme der DNA-Konzentration. Der häufig, auch in dieser Arbeit verwendete Fluoreszenzfarbstoff ist SYBRTMGreen I, welcher sich an doppelsträngige DNA anlagerte. DNA-Einzelstränge und einzelsträngige Oligonukleotid-Primer wurden von SYBRTMGreen I mit einer geringeren Affinität gebunden, sodass diese die Messung 33 III. MATERIAL UND METHODEN behinderte. Um die Messung unspezifischer Fluoreszenz durch so genannte Primerdimere zu minimieren, wurde die Detektionstemperatur angehoben. Da Primerdimere einen geringeren Schmelzpunkt als spezifische PCR-Produkte besaßen, konnten sie bei höheren Temperaturen nicht mehr detektiert werden. Deswegen erfolgte die Registrierung der Fluoreszenz erst nach einer kurzen Inkubation bei 80 °C, anstatt schon nach der Elongation bei 72 °C. Der Nachteil der geringen Spezifität konnte durch Optimierung des Primerdesigns und der gewählten Reaktionsbedingungen ausgeglichen werden. Desweiteren ließ sich die Bildung spezifischer PCR-Produkte anhand der Fragmentlänge nach abgelaufener PCR mithilfe einer Schmelzkurvenanalyse überprüfen. Hierbei wurde die doppelsträngige DNA bei kontinuierlicher Temperaturerhöhung von 70 °C auf 90 °C aufgeschmolzen. An dem für das Fragment definierten Schmelzpunkt zerfiel der DNA-Doppelstrang in Einzelstränge, wodurch eine Abnahme der Fluoreszenz der Probe registriert wurde. Aufgrund der höheren Schmelztemperatur der spezifischen doppelsträngigen PCR-Produkte gegenüber unspezifischen Primerdimeren, widerspiegelte die Höhe des Peaks der Schmelzkurve annähernd die Fragment-Konzentration. 2.3.4. Reaktionsansatz und Reaktionsbedingungen Das für die qRT-PCR verwendete Reaktionsgemisch setzte sich zusammen aus SYBR Green PCR Master Mix 2x, 100 ng cDNA und je 900 nM sense- und antisense-Primer in einem Reaktionsvolumen von 25 µl. Die anschließende PCR fand in einem ABI-PRISM 7700 Sequenz-Detektions-System unter folgenden Reaktionsbedingungen statt: 1. Initiale Denaturierung 3 Min. 94°C 2. Inkubation 30 Sek. 94°C 3. Inkubation 30 Sek. 60°C 4. Inkubation 30 Sek. 72°C 3. Inkubation 3 Sek. 80°C Nach dem letzten Inkubationsschritt eines jeden 40 Zyklen PCR-Zyklus erfolgte die Fluoreszenzmessung. Zur Bestimmung der Schmelzkurven wurde die Temperatur in 0,5°CSchritten von 70 bis 90°C angehoben und jeweils für drei Sekunden gehalten und währenddessen die Fluoreszenz registriert. 34 III. MATERIAL UND METHODEN 2.3.5. Quantifizierung der Genexpression Die Analyse der Expressionsniveaus der Gene erfolgte entweder durch absolute Quantifizierung anhand einer gegebenen Kalibrierkurve oder durch relative Quantifizierung mit Einbezug eines oder mehrerer Referenzgene. Diese auch als „housekeeping“-Gene bezeichneten Referenzgene wurden als Ladekontrolle eingesetzt, da deren Expressionsniveau in allen Proben gleichbleibend hoch ist. Häufig wird das Haushaltsgen Cyclophilin eingesetzt. Als Maß für die Quantifizierung der DNA-Startmenge wurde der sogenannte Ct-(Cycle Threshold für Schwellenwert-Zyklus) bzw. CP-(Crossing Point)-Wert verwendet, welcher die Anzahl der nötigen PCR-Zyklen zum Erreichen eines konstant definierten Fluoreszenzniveaus beschrieb. Unter optimalen Bedingungen und bei 100 %iger Effizienz kommt es zur Verdopplung der DNA-Menge und analog dazu auch der Fluoreszenzemission nach jedem PCR-Zyklus. Zur Berechnung des Expressionsniveaus wurde zunächst für jede untersuchte Probe die Differenz zwischen dem CP-Wert des Referenzgens und des zu untersuchenden Gens ermittelt: ΔCP = CP-Zielgen – CP-Referenzgen und anschließend in die Gleichung 2-ΔCP eingesetzt. 2.4. Proteinchemische Methoden 2.4.1. Proteinisolierung/Proteingewinnung aus Mauspankreasgewebe Zur Proteingewinnung aus Mauspankreasgewebe wurde zunächst das nach der Resektion der Mäuse schockgefronene Pankreasgewebe auf Eis aufgetaut und danach mit einem Skalpell zerkleinert. Um die intrazellulären Proteine zu isolieren, wurde das Gewebe mit je 600 µl IPPuffer/Lysispuffer resuspendiert und homogenisiert. Nachdem die Proben für 30 Min. auf Eis gelagert wurden, erfolgte abschließend eine zehnminütige Zentrifugation bei 4°C und 13.200 rpm. Der dabei gewonnene proteinhaltige Überstand wurde für die weitere Diagnostik abgenommen, während das Pellet verworfen wird. 2.4.2. Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford Die Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford (Bradford, 1976) erfolgte mit dem BioRad Protein-Assay. Hierbei handelt es sich um eine photometrische Methode, bei der der Triphenylmethanfarbstoff Coomassie-Brillant-Blau G-250 zur Komplexbildung mit Proteinen eingesetzt wird. Je nach Proteinkonzentration ist das Maß der Proteinbindung an den Farbstoff unterschiedlich, was wiederum zu unterschiedlichen Farbveränderungen führt. Coomassie-Brillant-Blau G-250 hat in ungebundener Form ein Absorptionsmaximum bei 465 nm, das in der gebundenen Form auf 595 nm erhöht wird. Die Absorptionsverschiebung ist 35 III. MATERIAL UND METHODEN photometrisch messbar und stellt somit ein Maß für die Proteinkonzentration der verwendeten Probe dar. Zunächst wird der Bio Rad Protein-Assay im Verhältnis 1:5 mit dH2O verdünnt. Anschließend wurde auf einer 96-Well-Platte 10 µl der Probe oder 10 µl des Standards mit 250 µl 1x Bradford-Lösung gemischt. Als Standardprotein diente BSA (c=1 mg/ml), welches in Form einer Standardreihe (0, 1, 2, 4, 6, 8 mg/ml) eingesetzt wurde. Die Proteinlösungen (aus 2.3.1.) wurden im Verhältnis 1:5 mit dH2O verdünnt, bevor sie in die Wells pipettiert wurden. Anschließend wurde die Extinktion der Proben mithilfe des Spektrophotometers bei 595 nm gemessen und die Proteinkonzentration anhand der Kalibrierkurve aus den Konzentrationen der Standards berechnet. 2.4.3. Western Blot Analyse Unter Western Blot versteht man die Übertragung von Proteinen von einem ElektrophoreseGel auf eine Membran, um diese immunologisch zu detektieren bzw. nachzuweisen. Bei dieser Methode wird zunächst das Proteingemisch der zu untersuchenden Proben mittels Gelelektrophorese nach Ladung und Größe aufgetrennt und anschließend auf eine Membran transferiert. Durch das Aufbringen spezifischer Primär- und Sekundärantikörper auf die Membran erfolgt der Proteinnachweis. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) dient der Auftrennung der Proteine der eingesetzten Proben nach ihrer Größe und Ladung. Dazu wurde das Mini-PROTEAN 3Gelelektrophorese-System (BioRad) verwendet. Der Ausgangspunkt der Proteinauftrennung ist die Überführung der Tertiär- und Sekundärstruktur der Proteine in die Primärstruktur durch Erhitzung der Proben mit einem SDS-Überschuss auf 95 °C. Dadurch erfolgt die Aufspaltung der Wasserstoffbrücken und Streckung der Moleküle. SDS als anionisches Detergenz maskiert die Eigenladung der Proteine, wodurch Mizellen mit konstanter negativer Ladung entstehen. Die Aufspaltung der Schwefelbrücken zwischen Cysteinen wurde durch die Substitution von ß-Mercaptoethanol unterstützt. Basis für das Prinzip der SDS-PAGE ist das Polyacrylamid-Gel, dessen Gelmatrix aus einem Trenngel und Sammelgel besteht und somit eine diskontinuierliche Elektrophorese gewährleistet. Das weitporige Sammelgel als Molekularsieb verhinderte die Aggregation der Proteine beim Eintritt in das Gel, während das engporige Trenngel die Trennung der Proteine ermöglichte. Die variierenden Konzentrationen des Trenngels (7,5; 10; 12; 15 %; siehe Tabelle 4) mit unterschiedlichem Anteil an Acrylamid waren umgekehrt proportional zur untersuchten Proteingröße und bestimmten die 36 III. MATERIAL UND METHODEN Trenneigenschaften des Gels. Durch die Wahl der richtigen Gelkonzentration sollte eine optimale Bandenschärfe im untersuchten Molekulargewichtsbereich erreicht werden. Das Trenngel-Gemisch wird mit Ammoniumpersulfat, einem Radikalstarter und TEMED, einem Polymerisierungskatalysator, versetzt und zügig zwischen zwei abgedichtete, durch einen Abstandhalter (Spacer) voneinander getrennte Glasplatten blasenfrei gegossen. Der Abstand zwischen den Glasplatten, die sauber und fettfrei sein müssen, beträgt 1,5 mm. Das Trenngel wurde nach oben hin mit dH2O überschichtet, welches zum einen eine Glättung der Geloberfläche ermöglichte und zum anderen eine Störung der Gelpolymerisation durch den Luftsauerstoff verhinderte. Nach Verfestigung des Gels wurde dH2O abgegossen und das Sammelgel etwa einen Zentimeter hoch über das Trenngel pipettiert. Ein spezieller Kamm wurde in das Sammelgel eingesteckt, um Taschen zu erhalten. Diese wurden anschließend mit den Proben nach definierten Proteinmengen gefüllt. Eine Geltasche wurde mit dem Längenstandard belegt. Nach Auffüllen der Elektrophorese-Apparatur mit Laufpuffer erfolgte der Gellauf bei einer Anfangsspannung von 70 V im Sammelgel und 90-120 V (je nach Gelkonzentration) im Trenngel. Proteintransfer Die aufgetrennten Proteine wurden mithilfe eines vertikalen Tank-Blot Systems (Mini TransBlot) auf eine Nitrozellulose-Membran transferiert. Die Nitrozellulose-Membran wurde in Methanol 100 % bei Raumtemperatur (RT) für eine Minute aktiviert. Anschließend wurden das zu blottende Gel, die Membran und die Filterpapiere in Transferpuffer äquilibriert und danach als Sandwich luftblasenfrei in eine Blotkassette gelegt. Die Kassette wurde in eine Blotkammer (Mini Blot Transfer CellTM) mit eiskaltem Transferpuffer überführt und der Transfer bei 350 mA für 1-2 Std. durchgeführt. Die Transferbedingungen mussten dabei auf die Molekülgröße des gewünschten Proteins angepasst werden, da verschieden große Proteine unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeiten aufzeigten. Proteindetektion Die geblottete Membran wurde nach dem Transfer kurz bei RT mit einer Pufferlösung gewaschen und anschließend eine Stunde bei RT im Blocking-Puffer unspezifisch geblockt. Der Nachweis der auf die Nitrocellulosemembran geblotteten Proteine erfolgte durch Immunodetektion mit spezifischen Antikörpern. Die Inkubation mit dem entsprechenden Primärantikörper (siehe Tabelle 6) und der Pufferlösung erfolgte in einer eingeschweißten Folie bei 4 °C über Nacht. Am nächsten Tag wurde die Membran zunächst 5x10 Min. mit der Pufferlösung gewaschen, um danach eine Stunde bei RT auf einem Schüttler mit 37 III. MATERIAL UND METHODEN peroxidasegekoppeltem Sekundärantikörper (siehe Tabelle 6) inkubiert zu werden. Nach erneutem Waschgang für 5x10 Min. mit der entsprechenden Pufferlösung erfolgte die Proteindetektion mit dem Amersham ECLTM Western Blotting Detektion Reagents auf Amersham HyperfilmTMECL, welcher mithilfe des Amersham Automatic Film-Prozessor entwickelt wurde. Wiederverwendung der Membran (Membran-Stripping) Wenn verschiedene Proteine auf einer Membran sequenziell detektiert werden sollten, wurde diese zunächst mit Pufferlösung gewaschen, danach in Stripping-Pufferlösung für 30 Min. gestrippt. Nach erneutem Waschgang wurde die Membran für eine Stunde in Blockierlösung 5 % geschwenkt, bevor diese mit dem nächsten Primärantikörper inkubiert wurde. 2.5. Histochemische Methoden 2.5.1. Immunhistochemie Das Prinzip der Immunhistochemie beruht auf der Affinität von Antikörpern zu einem bestimmten Gewebeantigen als Antigen-Antikörper-Reaktion. Die immunhistochemischen Techniken ermöglichen den hochspezifischen Nachweis von Proteinen und Strukturen, gegen die Antikörper gebildet werden können. Mithilfe von markierten Antikörpern können diese detektiert und somit sichtbar gemacht werden. Je nach Art und Lokalisation des zu untersuchenden Proteins bzw. der Art und Beschaffenheit des zu untersuchenden Gewebes ist die Wahl der richtigen Methode aus einer Vielzahl an Methoden der immunhistochemischen Färbung zu treffen. Das Ergebnis und die Qualität der Färbung sind von mehreren Variablen abhängig: Zum einen beeinflussen die Fixierung des Materials, die Einbettungsmethode und die Vorbehandlungsmethoden die Gewebequalität, zum anderen ist die Antigen-AntikörperReaktion von der optimalen Temperatur, der Antikörperkonzentration und der Inkubationszeit abhängig. Die Immunhistochemie wurde in dieser Arbeit an Paraffingewebeschnitten durchgeführt. Herstellung von Paraffinschnitten Unmittelbar nach der Resektion der Mäuse werden die entnommenen Gewebeproben in 4 % gepuffertem Paraformaldehyd über Nacht fixiert, um die Autolyse bzw. Heterolyse zu verhindern. Am nächsten Tag wurde das Fixierungsmittel ausgewaschen und das Gewebematerial in heißem Paraffinwachs getränkt, das bei Abkühlung erstarrt. Das Gewebe erhielt dadurch Stabilität und eine gleichmäßige Konsistenz, was die Herstellung dünner und 38 III. MATERIAL UND METHODEN gleichmäßiger Schnitte ermöglichte. Paraffinschnitte ließen sich mittels Schlittenmikrotomen anfertigen. Die 3,5 µm dicken Gewebeschnitte wurden zunächst in ein Warmwasserbad übertragen, in dem sie gestreckt und von Falten befreit wurden. Danach wurden sie auf beschichtete Objektträger aufgezogen und über Nacht bei RT getrocknet. Zur Färbung wurden die Schnitte zuerst in Xylol (dreimal fünf Minuten) entparaffiniert und dann durch eine absteigende Alkoholreihe (jeweils drei Minuten in 100 %, 96 % und 76 % Alkohol) bis zum dH2O hydratisiert. Die Vorbehandlung der Gewebeschnitte mit EDTA- oder mit CitratPufferlösung (Antigen Unmasking Solution) in der Mikrowelle für zehn Minuten diente der Demaskierung der Antigene. Danach wurden die Schnitte 15 Min. bei RT abgekühlt, mit dH2O und/ohne Waschpuffer gewaschen und anschließend zur Blockierung der endogenen Peroxidaseaktivität 15 Min. in frisch angesetzter 3 % H2O2-Lösung inkubiert. Nach jedem Schritt wurden die Gewebeschnitte mit dH2O und 3x5 Min. mit Waschpuffer (PBS bzw. PBS/T oder TBS bzw. TBS/T) gewaschen. Die darauffolgende immunhistochemische Färbung wurde nach der (Strept)Avidin-Biotin-Komplex-Methode (ABC-Methode) durchgeführt. Streptavidin-Biotin-Komplex-Methode Die Streptavidin-Biotin-Methode als indirekte Nachweismethode nutzt die starke Affinität von Avidin bzw. Streptavidin für Biotin zur Bildung von Komplexen aus enzymmarkierten Avidin-Biotin-Komplexen mit biotinylierten Sekundärantikörpern. Dabei bindet das Glykoprotein Avidin bzw. Streptavidin an den Sekundärantikörper. Bei der Färbung werden nacheinander Primärantikörper (siehe Tabelle 5), biotinylierter Sekundärantikörper (siehe Tabelle 5) und Avidin-Biotin-Enzymkomplex-Substrat-Chromogenlösung appliziert, wobei die Meerrettichperoxidase am häufigsten als Enzym verwendet wird. Die Funktion der Peroxidase liegt in der Elektronenübertragung von Chromogen DAB (3,3-Diaminobenzidin) auf das zugegebene Substrat Wasserstoffperoxid, das dadurch zu Wasser reduziert wird. Im Rahmen dieser Redoxreaktion fällt DAB zu einem unlöslichen, bräunlichen Endprodukt aus, das eine signalverstärkende Wirkung hat. 2.5.2. Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.-Färbung) Die H.E.-Färbung ist eine der Routinefärbemethoden in der Histologie und dient durch die Anfärbung verschiedener Untersuchung. Diese Strukturen klassische eines Gewebeschnittes Übersichtsfärbung wird der morphologischen typischerweise vor den immunhistochemischen Färbungen durchgeführt und setzt sich aus zwei Einzelfärbungen 39 IV. ERGEBNISSE zusammen, mithilfe derer physiologische aber pathologische Aspekte von Zellen, Zellbestandteilen und Extrazellularmatrix untersucht werden können. Hämatoxylin Hämatoxylin ist ein Inhaltstoff aus dem Blauholzbaum und wird als natürlicher Farbstoff verwendet. Die färbende Eigenschaft entwickelt das Hämatoxylin durch dessen Aufbereitung zu Hämalaun. Hämalaun färbt saure bzw. basophile Strukturen wie Zellkerne mit der darin enthaltenen DNA, Mitochondrien, das raue endoplasmatische Retikulum (rER), Kollagenfasern und Elastin blau. Eosin Eosin ist ein synthetischer Farbstoff und färbt alle basischen (eosinophilen) bzw. azidophilen Strukturen rot, insbesondere die Zytoplasmaproteine. Die Färbung Zur Färbung wurden zunächst die Paraffinschnitte (siehe 2.4.1.) 2x5 Min. in Histoclear (Xylol) entparaffiniert und dann in einer absteigenden Alkoholreihe (2x100 %, 2x96 % und 2x76 %) bis zum dH2O hydratisiert. Die Gewebeschnitte wurden anschließend für 10 Min. mit Hämalaun gefärbt. Nach der Hämalaun-Färbung erschienen die Zellkerne aufgrund des niedrigen pH-Wertes der Färbelösung rötlich-braun. Der Farbton schlug sich nach Spülen der Schnitte in laufendem Leitungswasser in blauviolett um. Danach erfolgte die Gegenfärbung mit Eosin für 5 Min., das Waschen in 96 % Ethanol und Isopropanol für 25 Sek. Bevor die Schnitte mit Pertex blasenfrei eingedeckt wurden, erfolgte die Behandlung mit Histoclear für 2x3 Min.. 40 IV. ERGEBNISSE IV. ERGEBNISSE 1. Pankreasspezifische Inaktivierung von Socs3 in der Maus 1.1. Generierung einer pankreasspezifisch Socs3-defizienten Mauslinie Socs3Δpanc unter Anwendung des Cre/loxP-Rekombinationssystems Socs3 scheint für die Karzinogenese vieler maligner Tumoren eine besondere Rolle zu spielen (Ogata et al. 2006). Als negativer Regulator des Jak/Stat3-Signalweges ist dieses Molekül bereits in verschiedenen Arbeiten beschrieben worden. Um die Bedeutung des Socs3-Proteins in der pankreatischen Onkogenese zu evaluieren, generierten wir zunächst eine Mauslinie, die eine pankreasspezifische Inaktivierung des Socs3-Gens und somit eine Socs3-Defizienz aufweist. Davon ausgehend untersuchten wir in einem weiteren Schritt den Effekt der Socs3Deletion auf die PanIN-Entwicklung in KrasG12D-Tumormäusen. Socs3 wird nach Zytokin-Rezeptor-Interaktion über die Aktivierung des Transkriptionsfaktors p-Stat3 durch Janus-Kinasen vermehrt exprimiert. Da wir eine Inaktivierung von Socs3 und den daraus resultierenden Wegfall des negativen Feedback-Mechanismus auf den Jak/Stat3Signalkaskade nur in murinen Pankreasgewebszellen anstrebten, wurde das im Abschnitt I.2.1. beschriebene Cre/loxP-Rekombinationssystem angewendet (siehe Abbildung 9). Abbildung 9: Schematische Darstellung der Generierung der Socs3Δpanc-Mauslinie. Nach Kreuzung der SocsF/F-Maus mit der Ptf1a-Creex1-Maus entsteht die Socs3Δpanc-Mauslinie durch Exzision des Exons 2 mithilfe der Cre-Rekombinase. 41 IV. Hierzu ERGEBNISSE benötigten wir eine Socs3Flox/Flox(Socs3F/F)-Mauslinie und eine Ptf1a-Cre- Rekombinase exprimierende Maus Ptf1a-Creex1. Die gefloxte Socs3-Maus wurde uns von Okada und Kollegen für die Untersuchungen zur Verfügung gestellt (Mori et al., 2004; Okada et al., 2006). Diese genetisch modifizierte Maus besaß am Exon 2 beider Socs3-Allele flankierende loxP-Sequenzen (Socs3F). Das Exon 2 kodiert für die Bindungsdomäne des Soc3-Moleküls am gp130-Rezeptor. Nach anschließender Kreuzung der Socs3F/F-Maus mit der unter I.2.2. bereits beschriebenen, von unserem Labor generierten Ptf1a-Creex1-Maus gingen Nachkommen hervor, die eine Cre-Rekombinase-vermittelte Exzision des loxPmarkierten Exons 2 auf beiden Socs3-Allelen aufwiesen (siehe Abbildung 9). Das benachbarte Exon 1 hingegen wurde nicht deletiert. Zum Nachweis des Knockouts haben wir Exon 2 spezifische Primer eingesetzt und konnten eine deutlich reduzierte mRNAKonzentration in den Socs3Δpanc-Mäusen detektieren, während Exon 1 spezifische Primer keinen Unterschied aufzeigten (vergleiche Abbildung 10). Abbildung 10: Nachweis der Deletion von Exon 2 im Socs3-Gen mittels mRNA Konzentrationsbestimmung. *p < 0,005; n≥4. Da die Cre-Rekombinase nur in Ptf1a-Promotor-positiven Zellen gebildet wird, erfolgt die genetische Modifizierung der Socs3-kodierten Region spezifisch und ausschließlich nur in pankreatischen Progenitorzellen, im exokrinen und in definierten Teilen des endokrinen Pankreas. Durch die homozygote Gendeletion entsteht die neue konditionale Socs3-defiziente Mauslinie Socs3F/F;Ptf1a-Creex1 bzw. Socs3Δpanc. Durch die Inaktivierung des Socs3-Gens entfällt die Expression seiner Genprodukte. Dadurch ist die endogene negative Feedback-Inhibition des Jak/Stat3-Signalweges durch Socs3 aufgehoben. Die gp130-Domäne, die im Rahmen der Hemmung von Socs3 gebunden wird, steht für die Bindung und Aktivierung der an der Stat3-vermittelten Signaltransduktion beteiligten Proteine zur Verfügung. Diese beeinflussen wiederum als intranukleäre Initiatoren 42 IV. ERGEBNISSE die Transkription bestimmter Zielgene und steuern somit Prozesse der Proliferation, Apoptosis und Inflammation. Um den Effekt der Ptf1a-Cre-assoziierten DNA-Mutation im Bereich des Socs3-Lokus zu evaluieren, wurde der Genotyp der aus der Kreuzung von Socs3F/F- und Ptf1a-Creex1-Mäusen hervorgehenden Nachkommen mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) bestimmt. Das hierfür benötigte genetische Material gewannen wir aus der Schwanzspitze der Mäuse. Anschließend führten wir die PCR wie unter II.2.2. beschrieben durch. Dabei verwendeten wir die Socs3Primer A und B, die eine Abgrenzung des Wildtyp-Allels von am Exon 2 gefloxtem Socs3Allel ermöglichten. Zusätzlich dienten zwei Primer Cre487 und p48as1642 dem Nachweis des Ptf1a-Cre-Transgens auf der DNA (vergleiche Tabelle 8). Die PCR-Ergebnisse in der Abbildung 9 zeigen bezüglich des Genotyps drei mögliche Kombinationen, wobei alle Nachkommen homozygot für das Ptf1a-Cre-Transgen sind. Socs3+/+;Ptf1a-Creex1-Mäuse weisen eine deutliche Bande für das Socs3-Wildtyp-Allel auf, d.h. sie zeigen keine mutative Veränderung im Bereich dieses Genlokus und sind deshalb homozygot für das entsprechende Allel. Anders besitzen Socs3+/Δ;Ptf1a-Creex1-Mäuse ein Allel entsprechend dem Wildtyp-Genotyp und ein loxP-flankiertes Exon 2 auf dem zweiten Allel. Die für uns relevante und interessante Kombination waren die auch als Socs3Δ/Δ;Ptf1aCreex1 bzw. Socs3Δpanc bezeichneten Mäuse. Die pankreasspezifische Cre-Rekombinasevermittelte, homozygote Deletion des Exons 2 auf beiden Allelen des Socs3-Gens lässt sich nur in diesen Mäusen initiieren, sodass diese die Grundlage unserer weiteren Untersuchungen darstellen. Abbildung 11: PCR-Analysen der möglichen Genotypen aus der Kreuzung von Socs3F/F-und Ptf1a-Creex1-Mäusen. loxP=gefloxtes Allel; wt=Wildtyp-Allel. 43 IV. 1.2. ERGEBNISSE Morphologische Charakterisierung des exokrinen Pankreaskompartiments von Soc3Δpanc-Mäusen und endokrinen Nach dem molekulargenetischen Nachweis der homozygoten Socs3-Deletion in Socs3ΔpancMäusen mittels PCR interessierte uns die Auswirkung dieser Cre-Rekombinase vermittelten DNA-Mutation auf die Morphologie und die physiologische Funktionalität des exokrinen und endokrinen Pankreaskompartiments. Hierzu fertigten wir Paraffin-Schnitte aus isolierten Pankreata von vier Wochen alten Socs3F/F-und Socs3Δpanc-Mäusen an. Die H.E.-Färbung der Schnitte diente zur anatomischen Abgrenzung und Differenzierung der unterschiedlichen Gewebekomponente. Um relevante Proteine zu detektieren, setzten wir die Technik der Immunhistochemie ein (siehe Abbildung 12). Abbildung 12: Charakterisierung des exokrinen und endokrinen Pankreaskompartiments. Morphologische und immunhistochemische Analysen des Pankreas vier Wochen alter Socs3F/F- und Socs3Δpanc-Mäuse. IS=Langerhans-Inseln; Schwarze Pfeile stellen normale Pankreasgänge dar. (100fache Vergrößerung) 44 IV. ERGEBNISSE Die in Abbildung 12 veranschaulichte H.E.-Übersichtsfärbung verdeutlicht, dass es keinen Unterschied in der Pankreasmorphologie zwischen der Socs3Δpanc-Maus und der Socs3F/FKontrollmaus besteht. In beiden Darstellungen erkennen wir die Pankreas-typische Gewebestruktur zusammengesetzt aus Lobuli, welche von Bindegewebssepten voneinander abgegrenzt sind. Da dieses Organ hauptsächlich aus serös-exokrinen Drüsen besteht, ist in beiden Schnittpräparaten eine große Dichte an basophilen Azinuszellen und hellen zentroazinären Zellen deutlich erkennbar. Zwischen den Läppchen verlaufen Ausführungsgänge, die sich im Ductus pancreaticus vereinigen. Vereinzelt erkennt man scharf abgrenzbare Langerhans-Inseln, welche die endokrine Funktion des Organs erfüllen. Aus diesem unauffälligen Befund beider Präparate lässt sich schließen, dass die homozygote Socs3-Deletion in der Socs3Δpanc-Linie die Morphologie des exokrinen und endokrinen Pankreaskompartiments nicht beeinträchtigt. Zur Evaluation der Funktion der endokrinen Zellgruppen detektierten wir mittels immunhistochemischer Färbung Insulin und Glucagon unter Nutzung der Spezifität markierter Primärantikörper. Auch hier konnten wir keinen Unterschied in der Hormonproduktion feststellen. Es lassen sich im Vergleich bei beiden Mauslinien sowohl Insulin, welches von den zentral liegenden dominierenden β-Zellen produziert wird, als auch Glucagon, das von den randständig lokalisierten α-Zellen sezerniert wird, nachweisen. Somit bleibt die endokrine Funktion der Langerhans-Inselzellen von der Socs3-Mutation unbeeinflusst. Zusätzlich hatten wir das Pankreasgewebe beider exemplarisch dargestellten Tiere immunhistochemisch nach Cytokeratin-19 (CK-19) detektiert. CK-19 ist ein zytoskelettales Protein, welches von einschichtigem Epithel und luminalen Drüsenzellen zur Stabilisierung und Formgebung produziert wird. Hierbei zeigen sich sowohl bei der Socs3Δpanc-Maus als auch der Kontrollmaus Socs3F/F eine annähernd gleiche CK-19 Expression. Desweiteren interessierte uns die Gewichtsentwicklung der Tiere aus beiden Mauslinien. Hierzu ermittelten wir ab der dritten bis ca. 20. Lebenswoche wöchentlich das Gewicht von zehn Socs3-Knockoutmäusen und 15 SocsF/F-Mäusen. Die gemessenen Gewichte wurden tabellarisch aufgelistet, der Mittelwert und die Standardabweichung daraus berechnet und in Abbildung 13 graphisch dargestellt. Auch hier konnten wir keine gravierenden Unterschiede zwischen den Knockout- und den Kontrollmäusen feststellen. Zwar zeigen die Socs3ΔpancTiere in der Verlaufsbeobachtung gegenüber gleichaltrigen Vergleichstieren leicht höhere Mittelwerte, diese gleichen sich aber ab der 18. Lebenswoche den Werten der SocsF/F-Mäuse an und bleiben im Verlauf konstant. 45 IV. ERGEBNISSE Abbildung 13: Gewichtsanalyse der Socs3Δpanc- und Socs3F/F-Nachkommen. Beide Mauslinien zeigen ein etwa annähernd gleiches Gewicht; p < 0,05. Aus den bisherigen Ergebnissen kann schlussfolgernd festgestellt werden, dass die Socs3Defizienz weder einen Einfluss auf die Entwicklung des exokrinen und endokrinen Pankreas hat noch die Gewichtsentwicklung der Socs3-Knockoutmäuse beeinträchtigt. Somit stellt die SocsΔpanc-Mauslinie die Grundlage für gentechnologisch basierte Analyse der Inaktivierung des Inhibitorproteins Socs3 in der pankreatischen Onkogenese dar. 2. Nachweis der Aktivierung des Stat3/Socs3-Signalweges im KrasG12DMausmodell 2.1. Nachweis der pankreatischen Aktivierung von p-Stat3 im KrasG12DMausmodell Über die Beteiligung von Stat3 an der Pankreaskarzinogenese des Menschen ist bereits in einigen Arbeiten beschrieben worden. Sämtliche Untersuchungen an humanen Karzinomresektaten und Pankreaskarzinomzelllinien zeigen hohe Konzentrationen am Tyrosinrest 705 phosphorylierter und somit aktivierter Stat3-Moleküle. Jedoch sind die genauen Mechanismen des Stat3-Signalweges in der pankreatischen Onkogenese bisher unbekannt. Um die Bedeutung von Stat3 in der Initiierung und Progression KrasG12Dinduzierter PanIN-Läsionen zu evaluieren, generierten wir zunächst die KrasG12D-Mauslinie. Hierfür kreuzten wir die von der Arbeitsgruppe um Tuveson uns zur Verfügung gestellten LSL-KrasG12D-Mäuse (Jackson et al., 2001) mit der von uns gentechnisch veränderten Ptf1aCreex1-Mauslinie. Die daraus hervorgehenden KrasG12D-Nachkommen zeigten alle drei PanINStufen, die sich nach einer Latenzzeit zu invasiven, metastatischen duktalen Adenokarzinomen entwickelten. Im nächsten Schritt untersuchten wir die Aktivierung des 46 IV. ERGEBNISSE Stat3-Signalweges in den Pankreata dieser Tumormodellmäuse. Mittels der unter II.2.3. beschriebenen Western Blot-Methode wiesen wir die Expression von Stat3-Molekülen nach, die dann durch Phosphorylierung am Tyrosin 705 zu p-Stat3 aktiviert werden. In der Abbildung 14 sind die Ergebnisse dargestellt. Der Nachweis von Stat3 bzw. p-Stat3 in den präneoplastischen Läsionen des Pankreas führt zu der Hypothese, dass Stat3 an der pankreatischen Onkogenese im KrasG12D-Mausmodell beteiligt sein könnte. Abbildung 14: Proteinbiochemischer Nachweis der Expression von Stat3 und p-Stat3 in Pankreata neun Wochen alter KrasG12D-Mäuse. 2.2. Expression des Stat3-abhängigen KrasG12D-Mausmodell endogenen Inhibitors Socs3 im Nachdem wir die Stat3-Expression und dessen Phosphorylierung zu p-Stat3 in der KrasG12DMaus mittels Western Blot analysiert haben, überprüften wir anschließend die Aktivierung von Socs3. Das Socs3-Gen mit Stat3-responsiven Elementen in ihren Promotoren gehört zu den Zielgenen dieser Moleküle. Das Genprodukt Socs3 reguliert in einer negativen Rückkopplung (negatives feedback) die Stat3-Signalvermittlung und verhindert somit eine konstitutive Aktivierung der Signalkaskade. Durch Bindung der Stat3-Dimeren an die vorgeschaltete Promotorregion kommt es zur Induktion der Socs3-Transkription und zur Bildung der mRNA, einer einsträngigen messenger Ribonukleinsäure, die als Matrize der Proteinbiosynthese dient. Konsequenterweise führt die vermehrte Stat3-Aktivierung in der KrasG12D-Tumormauslinie zu einer erhöhten Transkriptionsfrequenz des Socs3-Genlokus mit gesteigerter Synthese der mRNA. Abbildung 15 veranschaulicht die von uns mittels quantitativer Real-Time-PCR (quantitative EchtzeitPCR) gemessene relative Socs3-mRNA in Pankreata von KrasG12D-Mäusen im Vergleich zu den Kontroll-LSL-KrasG12D-Tieren, bei denen die vorgeschaltete gefloxte STOP-Kassette die Transkription des onkogenen Kras verhindert. 47 IV. ERGEBNISSE Abbildung 15: Quantitative Real-Time-PCR Analysen der vermehrten Expression von Socs3mRNA in neun Wochen alten KrasG12D-Mäusen. Mittelwert ± Standardabweichung (n ≥ 5), *p < 0.005 Die Ergebnisse zeigen für die Mauslinie KrasG12D eine deutlich erhöhte mRNA-Expression des endogenen Inhibitors Socs3 gegenüber der der Kontrolltiere. Konsequenterweise führt die gesteigerte mRNA-Bildung zu einer verstärkten Socs3-Proteinbiosynthese an den Ribosomen. Im Folgenden überprüften wir die Expression von Socs3 in der KrasG12D-Mauslinie auf histochemischer Ebene. Wie Abbildung 16 demonstriert, konnten wir immunhistochemisch mithilfe eines gegen Socs3 gerichteten Primärantikörpers dessen vermehrte Bildung in AziniZellen und PanIN-Läsionen neun Wochen alter KrasG12D-Mäuse nachweisen. Somit legt die starke Induktion des endogenen Inhibitors eine regulierende Funktion des Socs3 in der pankreatischen Onkogenese nahe. Abbildung 16: Immunhistochemische Detektion von Socs3 in Zellen der Azini (schwarze Pfeile) und in den PanIN-Läsionen (weiße Pfeile) neun Wochen alter KrasG12D-Mäuse. 48 IV. 2.3. ERGEBNISSE Aktivierung der an der Jak2/Stat3-Signaltransduktion beteiligten Proteine in KrasG12D-Mäusen Neben der Induktion des endogenen Inhibitors Socs3 regulieren phosphorylierte Stat3-Dimere intranukleär die Transkription bestimmter Gene, die an der Steuerung von Proliferation, Wachstum, Apoptose und Inflammation beteiligt sind. Der Nachweis der exprimierten Genprodukte lässt auf die Aktivierung des Jak2/Stat3-Signaltransduktionsweges rückschließen. Hierzu setzen wir erneut die Methode der Immunhistochemie ein und detektieren die relevanten Proteine. Das zu färbende Pankreasgewebe stammte von 13 Wochen alten KrasG12D-Mäusen und offenbart histologisch PanIN-Vorläuferläsionen (siehe Abbildung 17). Charakteristisch für die pankreatischen intraepithelialen Neoplasien in diesem Wochenalter ist die Zunahme der Anzahl der Ausführungsgänge, eine Verlängerung des epithelialen Zellkörpers der Ducti und eine erhöhte zytoplasmatische Muzinproduktion. Hinzu geht das normalerweise flach dominierende Ausführungsgang-Epithel in ein papilläres Wachstumsmuster über. Diese auf Abbildung 17 aufgeführten Eigenschaften weisen auf PanIN-Stufen 1A bis 1B hin, die zusätzlich ein umgebendes desmoplasmatisches Stroma aufweisen. Sowohl in den Azinuszellen als auch in den Pankreasgangzellen innerhalb der PanIN-Läsionen lässt sich das phosphorylierte Jak2-Protein (p-Jak2) nachweisen. Das aktive p-Jak2 phosphoryliert das Stat3-Monomer am Tyrosinrest Y705 zu p-Stat3 (Babon et al., 2006). Dementsprechend konnten wir, wie Abbildung 17 veranschaulicht, sowohl in den Azini als auch in den duktalen Zellen eine erhöhte p-Stat3-Konzentration detektieren. Darüber hinaus ist es uns gelungen, die Expression Stat3-abhängiger Proteine in den präneoplastischen Läsionen und in den Azinuszellen 13 Wochen alter KrasG12D-Mäuse zu demonstrieren. Hierzu zählen Cyclin D1, Survivin, die antiapoptisch wirkenden und zur Proteinfamilie der Bcl-2 (B-cell lymphoma-2) gehörigen Mitglieder Mcl-1 (Myloid cell lymphoma-1) und Bcl-XL. Zusätzlich ließen sich andere Moleküle bei unseren immunhistochemischen Untersuchungen detektieren, wie die Matrix Metalloproteinase-2 (MMP-2), welche im Abbau der extrazellulären Matrix involviert ist und somit für den Prozess der Metastasierung eine entscheidende Rolle spielt und das proinflammatorische Protein Cox-2 (Cyclooxygenase-2). Auch die Expression des von uns nachgewiesenen Hitzeschockproteins-70 (heat shock protein 70, HSP-70) ist Stat3-abhängig und wird durch dessen Aktivierung gesteigert. HSP-70 stabilisiert in Situationen des zellulären Stresses andere Eiweißstrukturen, um diese vor Denaturierung und Abbau zu schützen. Andererseits unterstützt HSP-70 die proteasomale Degradation funktionsunfähiger Proteinmoleküle. 49 IV. ERGEBNISSE Somit können wir in unseren bisherigen Untersuchungen p-Stat3, des diesem Molekül vorgeschalteten p-Jak2 und die gesteigerte Expression diverser Stat3-abhängiger, in den Jak2/Stat3-Signalweg involvierter Proteine nachweisen. Diese Veränderungen sind sowohl in den PanINs als auch in den Zellen der Azini vorzufinden. Desweiteren belegen unsere Versuche erstmalig den Nachweis der starken Induktion des endogenen Inhibitors Socs3 in Azinuszellen und duktalen Zellen der Vorläuferläsionen im Rahmen der Stat3-Signalkaskade. Diese Ergebnisse legen eine regulierende inhibierende Funktion von Socs3 in der pankreatischen Onkogenese nahe. Die folgenden Experimente fokussieren auf die Auswirkung der homozygoten Socs3-Deletion auf die Stat3-Signaltransduktion. Ziel ist es herauszufinden, inwiefern diese Socs3-Mutation die Aktivierung von Stat3 und die Expression Stat3-assoziierter Proteine beeinflusst und welche Konsequenz diese molekulargenetische Veränderung auf die KrasG12D-vermittelte Tumorinitiierung und progression hat. Abbildung 17: Aktivierung der Stat3-Signalkaskade im KrasG12D-Mausmodell. Immunhistochemische Untersuchung der Expression von p-Stat3, p-Jak2 und Stat3-abhängigen Proteinen in Azinuszellen und PanINs 13 Wochen alter KrasG12D-Mäuse. Schwarze Sterne stellen Azini dar; schwarze Pfeile kennzeichnen PanIN-Läsionen (200-fache Vergrößerung). 50 IV. ERGEBNISSE 3. Homozygote Socs3-Deletion führt zu einer konstitutiven Aktivierung des Stat3-Signalweges im KrasG12D-Mausmodell 3.1. Generierung der pankreasspezifisch Socs3-defizienten Tumormodellmaus KrasG12D;Socs3Δpanc Um der Bedeutung von Socs3 auf die KrasG12D-vermittelte Tumorinitiierung und -progression genauer nachzugehen, generierten wir zunächst eine Socs3-defiziente KrasG12D-Mauslinie. Hierzu benötigten wir erneut zwei Mauslinien: die bereits unter I.2.2. beschriebene LSLKrasG12D;Ptf1a-Creex1 (KrasG12D)-Tumormaus und die unter III.1.1. charakterisierte Socs3F/F;Ptf1a-Creex1 (Socs3Δpanc)-Mauslinie. Nachdem wir beide Mauslinien miteinander gekreuzt haben, gingen Nachkommen hervor, die einen Genotyp LSL-KrasG12D;Socs3F/F; Ptf1a-Creex1 aufwiesen. Diese neu entstandene auch als KrasG12D;Socs3Δpanc bezeichnete Tumormauslinie besaß sowohl das aktive pankreasspezifische Onkogen KrasG12D, welches die Entwicklung und Progression der PanINs förderte, als auch die Ptf1a-Cre-vermittelte homozygote Deletion des Exons 2 des Socs3-Gens, die zu einer fehlenden Expression von Socs3 führte. Somit haben wir mit der Etablierung des neuen KrasG12D;Socs3ΔpancTumormausmodells die Basis für die daran anschließenden Versuche geschaffen. Hierin galt es die Charakteristika der von uns generierten KrasG12D;Socs3Δpanc-Maus mit den der nicht Socs3-defizienten KrasG12D-Kontrollmaus zu vergleichen und so die Bedeutung bzw. die Relevanz des Inhibitorproteins Socs3 auf die KrasG12D-vermittelte Entwicklung pankreatischer präneoplastischer Läsionen und die Stat3-Phosphorylierung zu untersuchen. 3.2. Proteinbiochemische und KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäusen morphologische 3.2.1. Proteinbiochemischer Nachweis verstärkter Expression Stat3-abhängiger Proteine Charakterisierung von Stat3-Phosphorylierung und Der Tyrosinrest 759 an der zytosolischen gp130-Untereinheit stellt im phosphorylierten Zustand die Andockstelle für die Stat3-Monomere und Socs3-Moleküle dar. Gebunden an diesem aktiven Phosphotyrosin werden die Stat3-Proteine anschließend Jak2-vermittelt am Tyrosin 705 zu p-Stat3 umgewandelt. Das phosphorylierte Tyrosin 759 ist zugleich Bindungsort von dem endogenen Inhibitor Socs3, an dem dieser den inhibierenden FeedbackMechanismus auf den Stat3-Signaltransduktionsweg ausübt (Lang et al., 2000). Ausgehend von diesen Vorkenntnissen untersuchten wir im folgenden Schritt die Auswirkung der pankreasspezifischen Socs3-Defizienz auf die Induktion von p-Stat3 und den Stat3abhängigen Proteinen in KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäusen. Hierzu verglichen wir die Western 51 IV. ERGEBNISSE Blot-Analysen der Socs3-defizienten KrasG12D-Maus mit den der KrasG12D-Kontrollmaus. Die von uns im Rahmen der Experimente verwendeten Antikörper sind in Tabelle 7 aufgelistet. Zunächst überprüften wir proteinbiochemisch die Expression von Stat3, p-Stat3 und p-Jak2 in beiden Mauslinien. Wie Abbildung 18 demonstriert, exprimieren sowohl vier Wochen alte KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäuse als auch gleich alte KrasG12D-Kontrolltiere Stat3 und p-Stat3. Jedoch weist das Pankreasgewebe der KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäuse eine frühzeitige und prolongierte Stat3-Phosphorylierung auf, was an dem hohen Proteinlevel von p-Stat3 zu erkennen ist. Auch die Phosphorylierung der dem Stat3-Molekül vorgeschalteten Jak2 ist ebenso frühzeitig nachweisbar. Desweiteren interessierte uns die Auswirkung der Socs3-Defizienz auf die Expression Stat3abhängiger Proteine. Wie die Western Blot-Analysen in der Abbildung 18 veranschaulichen, führt die frühzeitige und prolongierte Aktivierung von p-Stat3 ebenfalls zu einer gesteigerten Expression diverser Stat3-Zielproteine in den exemplarisch dargestellten vier Wochen alten KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäusen im Vergleich zu den KrasG12D-Kontrolltumormäusen. Für BclXL, Mcl-1, Cox-2, HSP-70 und Cyclin D1 weisen die Socs3-deletierten KrasG12D-Mäuse ein höheres Proteinlevel auf. ß-actin wurde hier als Ladekontrolle eingesetzt. A B Abbildung 18: Proteinbiochemischer Nachweis der Socs3-Defizienz in KrasG12D;Socs3ΔpancMäusen. A: Nachweis der frühzeitigen und prolongierten Stat3-Phosphorylierung im Pankreasgewebe vier Wochen alter Socs3-defizienter KrasG12D-Mäuse. B: Verstärkte Expression Stat3-abhängiger Proteine in Western Blot-Analysen vier Wochen alter KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäuse. 52 IV. ERGEBNISSE 3.2.2. Konstitutive Aktivierung KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäusen des onkogenen K-Ras-Proteins in Das G-Protein K-Ras bindet im aktiven Zustand Guanosintriphosphat (GTP). Durch die intrinsische Hydrolyseaktivität wird das GTP-gebundene K-Ras bei Terminierung des Ligandensignals in die inaktive GDP-assoziierte Form umgewandelt. Bei der KrasG12DMutation liegt eine ungenügende Überführung von GTP-korreliertem K-Ras in die inaktive GDP-gebundene Konfiguration, wodurch eine konstitutive, wachstumsfördernde K-RasProteinaktivität entsteht (Shibata et al., 1990). Da in den Socs3-defizienten KrasG12D-Mäusen sowohl eine KrasG12D-Mutation als auch eine Socs3-Deletion vorliegt, überprüften wir mithilfe des Ras-Aktivierungsassays mit dem Ras Activation Assay Kit, ob die Inaktivierung von Socs3 einen Einfluss auf die Ausprägung der G12D-Mutation ausübt. Das Prinzip dieser eingesetzten Methode beruht auf der hochspezifischen Bindung der Ras-bindenden Domäne (RBD) des im Kit enthaltenen Proteins Raf-1 (Ras effector kinase) an aktives GTPkorreliertes Ras-Protein. Nach Herstellung der Proteinlysate aus Pankreasgewebe beider Mauslinien wurden diese jeweils mit dem Raf-1 RBD Agarose enthaltenden Reaktionsreagenz versetzt. Anschließend ließ sich der entstandene Raf-RBD/GTP-Ras Komplex im Western Blot mit einem konjugierten Ras-spezifischen Sekundärantikörper detektieren. Die Western Blot-Ergebnisse des durchgeführten Ras Pull-Down Assays in der Abbildung 19 zeigen für beide vier Wochen alte KrasG12D- und KrasG12D;Socs3Δpanc-Mauslinien eine annähernd gleich starke Expression von RBD- und damit von GTP-assoziiertem Ras-Protein im Pankreas. Aus unseren gewonnenen Daten kann demnach geschlossen werden, dass die pankreasspezifische Inaktivierung des Socs3-Gens keinen Einfluss auf die Ras-Aktivität bzw. auf die Expression des konstitutiv aktiven K-Ras-Proteins ausübt. Beide genetische Veränderungen existieren nebeneinander und scheinen synergistisch die Progression von pankreatischen intraepithelialen Neoplasien zum duktalen Adenokarzinom zu verstärken. Abbildung 19: Nachweis der Expression konstitutiv aktiver K-Ras-Proteine. In beiden Mauslinien liegt eine unveränderte Aktivierung des onkogenen K-Ras-Proteins vor. 53 IV. ERGEBNISSE 3.2.3. Gewichts- und Pankreasanalyse bei KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäusen Um die Auswirkung der Socs3-Deletion auf die Entwicklung duktaler Adenokarzinome des Pankreas in KrasG12D-Tumormäusen rechtzeitig feststellen zu können, überwachten wir sieben KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäuse ungefähr sechs Monate. In diesem Beobachtungszeitraum analysierten wir regelmäßig das Gewicht, das Wohlbefinden, Krankheitsentwicklung und – verlauf der Tiere. Einige Mäuse wurden aufgrund fortgeschrittenen Krankheitszustandes mit starkem Gewichtsverlust, ausgedehntem Aszites, Ikterus und palpabler abdominaler Tumormasse der weiteren Untersuchung geopfert oder schieden durch Tod aus der Beobachtung aus. Wie Abbildung 20 und 21 veranschaulichen, wiesen sechs Wochen alte Socs3-defiziente KrasG12D-Mäuse im Vergleich zum gleichaltrigen Wildtyp und zu den KrasG12D-Mäusen ein signifikant niedrigeres Gewicht auf. Das Endgewicht dieser Tiere lag mit etwa 18 g deutlich unter dem des Wildtyps bzw. der KrasG12D-Kontrollmäuse, während das Körpergewicht der beiden letzteren sich meist auf dem gleichen Level bewegten und minimale Unterschiede aufwiesen. Abbildung 20: Gewichtsanalyse sechs Wochen alter KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäuse (n=7) im Vergleich zu gleichaltrigen KrasG12D-Kontrollmäusen (n=7) und zum Wildtyp (n=17). *p > 0,05; **p < 0,0005; ***p < 0,0005. Bei der Resektion wurden die Pankreata 13 Wochen alter KrasG12D-Tumormäuse und KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäuse isoliert und auf Hinweise bezüglich der Entwicklung pankreatischer Neoplasien makroskopisch analysiert. Dabei verglichen wir die entnommenen Bauchspeicheldrüsen der geopferten KrasG12D-, KrasG12D;Socs3Δpanc-Tiere und des Wildtyps miteinander bezüglich Größe, makroskopisch 54 sichtbare Veränderungen und IV. ERGEBNISSE Gewebebeschaffenheit. Die Abbildung 21 demonstriert ein im Vergleich zum Wildtyp stark vergrößertes Pankreas der KrasG12D-Tumormaus. Zusätzlich lassen sich Lobulierungen und Indurationen im Organgewebe nachweisen. Die zusätzliche Socs3-Defizienz in KrasG12D-Tumormäusen bewirkt jedoch eine starke Abnahme des Organgewichts (siehe Abbildung 21). Abbildung 21: Analyse des makroskopischen Pankreasaspekts. Größe, Form und Konsistenz der Pankreata 13 Wochen alter KrasG12D; Socs3Δpanc-Mäuse und KrasG12D-Kontrollmäuse im Vergleich zum Wildtyp. Zum Größenvergleich ist aus jeder Mauslinie ein Tier exemplarisch dargestellt. Abbildung 21 demonstriert ein im Vergleich zum Wildtyp bis auf ein Fünftel der Organmasse geschrumpfte Bauchspeicheldrüse mit diffus nodulärer und lobulierter Parenchymstruktur. Die ausgedehnte Fibrosierung des sonst weichen Gewebes lässt das Organ derb, knotig und formlos erscheinen. Diese makroskopisch sichtbaren Veränderungen an den Pankreata der von uns generierten KrasG12D;Socs3Δpanc-Mauslinie deuten auf vorhandene präneoplastische und/oder neoplastische Prozesse hin, die sich scheinbar in weiter fortgeschrittenen Stadien befinden als die der gleichaltrigen Mäuse mit singulärer KrasG12D-Mutation. Im Beobachtungszeitraum von sechs Monaten entwickelten 28,57% (2/7) der KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäuse ein Pankreasadenokarzinom, während in der KrasG12D-Kohorte keine Karzinomentwicklung zu beobachten war. Die Tumorlatenz von etwa 63 Tagen bei den KrasG12D;Socs3Δpanc-Versuchstieren war somit geringer im Vergleich zu den KrasG12DKontrolltieren. Aus unseren bisher gewonnen Daten können wir damit annehmen, dass die pankreasspezifische Deletion des Socs3-Gens und die dadurch aufgehobene negative Rückkopplung auf den Stat3-Signalweg einen maßgeblichen Effekt auf die Tumorprogression in der KrasG12D-induzierten pankreatischen Onkogenese haben könnte. Die im Folgenden durchgeführten Experimente sollen unsere angenommene Hypothese belegen. 55 IV. ERGEBNISSE 4. Einfluss der Inaktivierung des endogenen Inhibitorproteins Socs3 auf die PanIN-Progression im KrasG12D-Mausmodell 4.1. Beschleunigung der PanIN-Progression in KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäusen 4.1.1. Morphologische und quantitative Charakterisierung der PanIN-Läsionen In der vergleichenden Analyse der PanIN-Entwicklung in Pankreata von KrasG12D- und KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäusen im folgenden Abschnitt möchten wir den Einfluss der aus der Inaktivierung des Inbibitorproteins Socs3 fehlenden Hemmung des Stat3-Signalweges auf die alterskorrelierte PanIN-Progression in Socs3-defizienten KrasG12D-Mäusen näher beleuchten. Zunächst untersuchten wir anhand H.E.-gefärbter Gewebefeinschnitte vier, neun, 13 und 18 Wochen alter KrasG12D-Kontrollmäuse und KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäuse die Pankreasmorphologie im Vergleich. Die Ergebnisse dieser Übersichtsfärbung sind in zehnund 100-facher Vergrößerung in der Abbildung 22 dargestellt. 56 IV. ERGEBNISSE Abbildung 22: Morphologische Charakterisierung der PanINs und des PDA. H.E.-Übersichtsfärbungen der Pankreasgewebefeinschnitte vier, neun, 13 und 18 Wochen alter Tiere bei zehn- und 100-facher Vergrößerung. Schwarze Pfeile kennzeichnen PanIN-Läsionen; der weiße Pfeil hebt einen reaktiven Ausführungsgang hervor; der weiße Stern markiert regelrechte Azini; der schwarze Stern kennzeichnet das PDA. KrasG12D-Tumormodellmäuse weisen zum Zeitpunkt von vier Wochen ein nahezu unauffälliges Pankreas auf. Zwischen den normal konfigurierten Azini sind die Ausführungsgänge schmal und selten sichtbar. Vereinzelt können wir reaktive Ausführungsgänge und PanIN-1-Läsionen darstellen. Die Lobuli werden von unauffälligen Bindegewebssepten separiert, die keine Entzündungszellen enthalten. Das Pankreas der neun Wochen alten Tiere offenbart bereits bei zehnfacher Vergrößerung suspekte Areale, die diffus im ganzen Organ lokalisiert vorliegen. Diese weißen Salzkorn-artige Läsionen lassen die betroffene Bauchspeicheldrüse durchlöchert erscheinen. Bei höherer Vergrößerung eines betroffenen Bereiches erkennen wir eine zunehmende Anzahl reaktiver Gangstrukturen und früher Stadien von PanIN-Läsionen. Die jetzt zwischen den basophilen Azinuzellen deutlich sichtbaren Ausführungsgänge mit stark eosinophilen duktalen Zellen sind erweitert und treiben die Lobuli auseinander. Die zunehmende Anzahl histologisch erkennbarer Ducti mit 57 IV. ERGEBNISSE Formanomalie lässt auf einen neoplastischen duktalen Prozess hindeuten. Zudem weist das vermehrte desmoplastische Stroma auf eine verstärkte Entzündungsreaktion mit fibrotischer Begleitreaktion hin. Mit zunehmendem Alter nimmt sowohl die Dichte als auch die Schwere der PanIN-Läsionen zu. Die zehnfache Vergrößerung des Pankreas der 13 Wochen alten KrasG12D-Kontrollmaus veranschaulicht, dass in diesem Stadium ein dominierender Organteil von den PanINs eingenommen ist und die zunehmende Ausdehnung dieser eine Verdrängung der exokrinen Azini bedeutet. Bei 100-facher Vergrößerung erkennen wir im Vergleich zur neun Wochen alten Maus Areale mit übermäßig dilatierten Gangstrukturen, die statt dem normal flachen Epithel ein papilläres Wachstumsmuster offenbaren. Zusätzlich bewirkt die raumfordernde Expansion des umgebenden desmoplastischen Stromas ein Auseinanderdriften der Azini. Um die 18. Lebenswoche zeigt die 10-fach vergrößerte Pankreasaufnahme der Mäuse mit KrasG12D-Mutation eine weitere Progression der PanIN-Dichte und des Schweregrades der Neoplasien. Wie Abbildung 22 verdeutlicht, erstrecken sich präneoplastische Läsionen und das Stroma über fast das ganze Organ mit daraus resultierendem deutlichem Rückgang der Azinuszellen. In der höheren Vergrößerung erkennen wir zusätzlich intraluminale Pankreasgangnekrosen als Charakteristikum der PanINs im Stadium 3 und atrophierte Azinuszellen. Die exemplarisch dargestellten Pankreata der KrasG12D-Mäuse unterschiedlichen Alters zeigen somit die für diese Tumormauslinie typische zeit- bzw. altersabhängige PanIN-Progression. Die Socs3-Defizienz in KrasG12D-Mäusen lässt in den H.E.-gefärbten Gewebefeinschnitten eine Beschleunigung der PanIN-Progression erkennen. Im Vergleich zu gleichaltrigen KrasG12D-Mäusen ist das Pankreas dieser Mäuse interessanterweise schon nach vier Wochen morphologisch sehr stark umgewandelt. Bereits bei 10-facher Vergrößerung demaskieren sich duktale Vorläuferläsionen aufgrund starker Gangdilatation, die annähernd die Hälfte des Organs eingenommen haben. Während Pankreata vier Wochen alter KrasG12D-Mäuse nahezu unauffällig erscheinen, fallen bei näherer histologischer Betrachtung der Gewebestruktur gleichaltriger KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäuse ausgedehnte fibrotisch umgebaute heterogene Areale auf. Neben normalen Azinis und reaktiven Gängen sind ausgeprägte hochgradig veränderte Ausführungsgänge in Form von PanIN-1- bis PanIN-3-Läsionen zu erkennen. Die schon in der vierten Lebenswoche eingetretenen Veränderungen der Gangstruktur deuten auf ein im Vergleich zu der KrasG12D-Tumormauslinie sehr früh einsetzendes neoplastisches duktales Geschehen mit ausgedehnter fibrotischer Begleitreaktion hin. Um das Ausmaß der PanIN-Progression bei pankreasspezifischer Inaktivierung von Socs3 noch genauer beurteilen zu können, führten wir anschließend einen quantitativ analytischen 58 IV. ERGEBNISSE Vergleich der Gangstrukturen in Pankreata vier Wochen alter KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäuse und KrasG12D-Kontrollmäuse durch. Hierfür bestimmten wir zunächst mittels 200-fach vergrößerter pankreatischer Gewebeschnitte die Gesamtzahl der Ausführungsgänge bei beiden Mauslinien. Das in Abbildung 23 dargestellte Ergebnis zeigt eine mittlere Anzahl von etwa sieben Gängen pro 10 Gesichtsfelder im Pankreasgewebe der KrasG12D-Kontrollmäuse. Die Socs3defizienten KrasG12D-Tiere weisen mit im Durchschnitt 14 Gängen pro 10 Gesichtsfelder eine doppelte Anzahl an duktalen Strukturen auf. Abbildung 23: Vergleichende Auswertung der Gesamtzahl an Ausführungsgängen pro zehn Gesichtsfelder an mindestens 17 sequentiellen Schnitten vier Wochen alter Versuchstiere (200-fache Vergrößerung). Mittelwert ± Standardabweichung (n ≥ 5); *p < 0,0001. Die ermittelten sichtbaren Ausführungsgänge setzen sich aus reaktiven Gängen und PanINLäsionen zusammen. Reaktive duktale Strukturen weisen entweder ein noch normales kubisches Epithel mit zunehmendem Transformationscharakter in Form gesteigerter CK-19Expression oder metaplastische duktale Strukturen mit Umwandlung des kubischen Pankreasgangepithels in Platten- oder Übergangsepithel ohne Atypie-Zeichen auf. Mit der Bestimmung der relativen Häufigkeit pankreatischer intraepithelialer Neoplasien von der Gesamtzahl lässt sich die PanIN-Dichte im jeweiligen Gewebe ermitteln. Da im definierten Progressionsmodell des Pankreasadenokarzinoms neoplastische Vorläuferläsionen in PanIN-Stadium 1 bis 3 klassifiziert sind, interessierte uns in der anschließenden Analyse die Bestimmung der relativen Häufigkeit der einzelnen PanIN-Stufe an der Gesamtzahl der neoplastisch veränderten Gangstrukturen. Dadurch würde eine Beschleunigung der PanIN-Progression in der KrasG12D;Socs3Δpanc-Linie im Vergleich zur 59 IV. ERGEBNISSE KrasG12D-Linie bestätigen lassen. Hierzu wurden erneut 200-fach vergrößerte pankreatische Gewebeschnitte eingesetzt (siehe Abbildung 24). Abbildung 24: Quantifizierung der reaktiven Gänge und PanIN-Läsionen pro zehn Gesichtsfelder in mindestens 17 sequentiellen Feingewebsschnitten zum Zeitpunkt von vier Wochen und bei 200-facherVergrößerung. Mittelwert ± Standardabweichung ( n ≥ 5); *p < 0,0001, **p < 0,005 Aus der Quantifizierung konnten wir eine deutlich erhöhte Zahl sichtbarer Pankreasgänge in KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäusen im Vergleich zu der KrasG12D-Linie ermitteln. Reaktive Gangstrukturen treten ausgedehnt bereits zum Zeitpunkt von vier Wochen in großen Arealen auf. Die Anzahl der PanIN-Läsionen ist signifikant erhöht, wobei eine Dominanz des PanIN1-Stadiums zum Zeitpunkt von vier Wochen vorliegt. PanIN-Läsionen höheren Grades sind nur in geringer Dichte detektierbar. Gleichaltrige KrasG12D-Kontroltiere zeigen im Vergleich nur vereinzelte PanIN-1-Läsionen, während höhergradige Vorläuferläsionen in dem entsprechenden Alter noch nicht im Pankreasgewebe vorzufinden sind. Aus unseren gewonnenen Daten können wir schlussfolgern, dass die Inaktivierung des endogenen Inhibitors Socs3 in der KrasG12D-Tumormauslinie im Vergleich zur KrasG12DTumormodellmaus zu einer Beschleunigung der PanIN-Entwicklung mit Bildung hoher PanIN-Dichte bereits zum frühen Zeitpunkt von vier Wochen führt. 60 IV. ERGEBNISSE Immunhistochemische Zusatzfärbungen mit gegen CK-19, p-Stat3 und Cyclin D1 gerichteten Primärantikörpern bestätigen die bereits unter III.3.2.1. beschriebene verstärkte Aktivierung von p-Stat3 und des Stat3-abhängigen Proteins Cyclin D1 in den Azinuszellen, reaktiven Gängen und PanIN-Läsionen bei der Socs3-defizienten KrasG12D;Socs3Δpanc-Mauslinie (siehe Abbildung 25). Abbildung 25: Immunhistochemischer Nachweis der übermäßigen Expression von CK-19, pStat3 und Cyclin D1 in reaktiven Gängen und PanIN-Läsionen vier Wochen alter KrasG12D;SocsΔpanc-Mäuse. 100-fache Vergrößerung Die intensive Expression des Intermediärfilaments CK-19 als Epithelzellmarker ist charakteristisch für einen malignen duktalen Prozess im Rahmen der PanIN-Progression. In der weiteren Entwicklung nimmt die Anzahl besonders der höhergradigen Läsionen zu. Hinzu treten fokale Karzinome auf, die von ausgeprägter fibrotischer Umwandlung des sonst weichen Pankreasgewebes begleitet werden. Die 10-fach vergrößerte Übersichtsfärbung der exemplarisch gewählten neun Wochen alten KrasG12D;Socs3Δpanc-Maus zeigt ein an Größe abnehmendes Pankreas, welches stark aufgelockert erscheint. Mehr als die Hälfte des betroffenen Organs ist von neoplastischen Vorläuferläsionen höheren Grades mit luminaler Nekrose befallen. Morphologisch normale Azinuszellen sind zugunsten der Karzinomexpansion verdrängt und nur noch vereinzelt gruppiert detektierbar. In der 13. Lebenswoche weisen die Pankreata der erkrankten Tiere nur noch ein Drittel der Organgröße gleichaltriger KrasG12D-Kontrollmäuse auf. Das Gewebe wird 61 IV. ERGEBNISSE weiterhin neoplastisch verändert bis in der 18. Lebenswoche der größte Teil der Bauchspeicheldrüse vom invasiv duktalen Adenokarzinom (PDA) eingenommen wird. Makroskopisch imponiert dieser maligne Tumor als gelblich-graues, knotig umgebautes Gewebe von derber Konsistenz. Das histologische Bild, wie in Abbildung 26 veranschaulicht, wird geprägt durch atypisch unregelmäßige, drüsenartige Gangstrukturen, die von einer ausgedehnten desmoplastischen Reaktion begleitet werden. Die mikroskopisch klare Unterteilung des Organgewebes ist nicht mehr erkennbar. Zusätzliche immunhistochemische Färbungen des Tumorareals bestätigen die exzessive CK-19-Expression durch die duktalen Strukturen und eine übermäßige Phosphorylierung des Stat3-Proteins am Tyrosin Y705 (siehe Abbildung 26). Abbildung 26: H.E.-Färbung des duktalen Adenokarzinoms des Pankreas und immunhistochemische Detektion von CK-19 und p-Stat3 in atypischen, drüsenartigen Gangstrukturen. 100-fache Vergrößerung. Der gezoomte Ausschnitt verdeutlicht die reichliche nukleäre Ansammlung von p-Stat3 in duktalen Zellen. Unsere Ergebnisse aus der vergleichenden Analyse der Pankreasmorphologie belegen somit die frühzeitige und prolongierte Aktivierung des Stat3-Signalweges und die daraus resultierende Beschleunigung der KrasG12D-induzierten 62 PanIN-Progression und der IV. ERGEBNISSE Entstehung fokaler Karzinome in KrasG12D-Tumormodellmäusen mit Inaktivierung des Inhibitorproteins Socs3. Diese Tiere zeigen pankreasmorphologisch bereits in der vierten Lebenswoche neben harmlosen reaktiven Gängen alle Stadien der PanIN-Läsionen, die sich rasch zu fokalen Karzinomen mit ausgedehnter fibrotischer Umwandlung entwickeln, während Pankreata KrasG12D-Kontrollmäuse gleichen Alters nahezu regelrecht normal erscheinen. Aus unseren bisherigen Daten kann somit geschlossen werden, dass Socs3 eine wichtige Funktion als Tumorsuppressor im Rahmen der pankreatischen Onkogenese ausübt und über die Regulation der Stat3-Phosphorylierung die PanIN-Progression in pankreasspezifischen KrasG12D-exprimierenden Mäusen bestimmt. Um die Veränderungen der duktalen Strukturen und dessen Entwicklung genauer charakterisieren zu können, führen wir zusätzlich immunhistochemische Färbungen auf Muc1 (Mucin 1), Muc5 (Mucin 5) und CK-19 bei vier Wochen und neun Wochen alten KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäusen und KrasG12D-Kontrollmäusen durch (vergleiche Abbildung 27). Abbildung 27: Detektion von Muc1, Muc5 und CK-19 in Pankreata vier und neun Wochen alten Mäusen mittels immunhistochemischer Färbung zur genauen Charakterisierung der neoplastisch transformierten Gänge (100-fache Vergrößerung). Muc1 ist ein transmembranöses, hauptsächlich apikal lokalisiertes Protein der Epithelzellen, welches aufgrund der Größe und der negativen Ladung die Adhäsion anderer Zellen und 63 IV. ERGEBNISSE Mikroorganismen verhindert. Bei zahlreichen Adenokarzinomen oder anderen epithelialen Tumoren kommt es zu einer Überexpression dieses Moleküls. Durch Polaritätsverlust der Zelle bei fortgeschrittenen Tumoren wird Muc1 vermehrt auch basolateral gebildet, was eine verminderte Zelladhäsion hervorruft. Die Abnahme des Zellzusammenhalts stellt somit die Voraussetzung der Metastasenbildung bei invasiven Karzinomen dar. Muc5 gehört ebenfalls zu den Glykoproteinen, die jedoch von Schleimhäuten als sekretorische Mucine abgesondert werden. Eine verstärkte Expression dieses Makromoleküls liegt in PanIN-Läsionen und Adenokarzinomen vor. Wie die in Abbildung 27 dargestellten Immunhistochemie-Bilder veranschaulichen, lassen sich zahlreiche sowohl Muc1- als auch Muc5-exprimierende Ausführungsgänge und PanINs in vier Wochen alten KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäusen nachweisen, die in der neunten Lebenswoche an Dichte und Schweregrad zunehmen. Im Vergleich dazu sind im Pankreasgewebe der exemplarisch gewählten KrasG12D-Kontrollmaus die Mucin-positiven Gänge und intraepithelialen Neoplasien erst zum Zeitpunkt von neun Wochen detektierbar, während vier Wochen alte Tiere nur vereinzelt Muc1 in den reaktiven Gängen produzieren. Auch die Anzahl der CK-19-exprimierenden Gangstrukturen und PanINs in Pankreata der KrasG12D-Linie ist deutlich geringer als im Gewebe gleichaltriger Socs3-defizienten KrasG12D-Mäuse. Somit unterstützen die gewonnenen Daten einer frühzeitigen und intensiven Expression PanIN-spezifischer Markerproteine Muc1, Muc5 und CK-19 in der Bauchspeicheldrüse von KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäusen die Aussage: Die Deletion von Socs3 in der KrasG12D;Socs3ΔpancMauslinie führt zu einer deutlichen Beschleunigung der Progression KrasG12D-induzierter PanINs mit frühem Auftreten von invasiv duktalen Pankreasadenokarzinomen. 5. Zusammenfassung der Ergebnisse In Bezug auf die unter I.4. formulierte Zielsetzung können die Ergebnisse der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen wie folgt zusammengefasst werden: 1) Im LSL-KrasG12D;Ptf1a-Creex1(KrasG12D)-Tumormausmodell konnten wir in den PanIN-Läsionen eine Aktivierung des Stat3-Signaltransduktionsweges nachweisen. Das Homodimer aus zwei aktivierten p-Stat3 fungiert als intranukleärer Transkriptionsfaktor und reguliert die Expression diverser Stat3-Zielproteine. Socs3 als wichtiger Tumorsuppressor lässt sich in KrasG12D-Mäusen in hoher Konzentration detektieren und reguliert den IL6/Stat3-Signalweg über negative Rückkopplung. 64 IV. ERGEBNISSE 2) Socs3-defiziente KrasG12D-Mäuse weisen im Verlauf der Beobachtung ein im Vergleich zu KrasG12D-Kontrolltieren deutlich reduziertes Körper- und Pankreasgewicht auf. 3) Mithilfe des Cre/loxP-Rekombinationssystems gelang es uns die Generierung der LSL-KrasG12D;Socs3F/F;Ptf1a-Creex1(KrasG12D;Socs3Δpanc)-Mauslinie. Diese genetisch veränderten Tiere weisen eine pankreasspezifische Deletion des Exons 2 des Socs3Gens auf. Die auf diesem Wege erreichte Inaktivierung des endogenen Inhibitorproteins Socs3 im Pankreas führt zu einer frühzeitigen und prolongierten Jak2-vermittelten Stat3-Phosphorylierung am Tyrosinrest Y705 (p-Stat3), die bereits zum Zeitpunkt von vier Wochen detektierbar ist. Sowohl Morphologie und Physiologie des endokrinen und exokrinen Pankreas als auch die PanIN-induzierte konstitutive Aktivierung des onkogenen KrasG12D bleiben von der Socs3-Deletion unbeeinflusst. Histomorphologische und proteinbiochemische Untersuchungen des Pankreas der KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäuse im Vergleich zu KrasG12D-Kontrollmäusen belegen jedoch die beschleunigte Entwicklung und Progression der altersabhängigen KrasG12D-induzierten PanIN-Läsionen schon nach der vierten Lebenswoche. 4) Im Beobachtungszeitraum von sechs Monaten entwickelten 28,57% (2/7) der KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäuse ein Pankreasadenokarzinom, während in der KrasG12DKohorte keine Karzinomentwicklung zu beobachten war. Die Tumorlatenz von etwa 63 Tagen bei den KrasG12D;Socs3Δpanc-Versuchstieren war somit kürzer im Vergleich zu den KrasG12D-Kontrolltieren. Das Pankreasgewebe ist schon zum Zeitpunkt von vier Wochen morphologisch stark umgewandelt. Es finden sich heterogene Areale mit normalen Azinis, PanIN-Läsionen unterschiedlichen Grades mit ausgedehnter desmoplasmatischer Stromareaktion vor. 5) Aus den gewonnenen Ergebnissen lässt sich schlussfolgern, dass die Inaktivierung des endogenen Tumorsuppressors Socs3 die Progression präneoplastischer Läsionen im murinen KrasG12D-Tumormodell beschleunigt. Socs3 übt somit durch negative Rückkopplung eine tragende Funktion im Akzelerationsprozess der PanINs aus und bestimmt über die Stat3-Phosphorylierung die Regulation der PanIN-Entwicklung und –Progression zu invasiv duktalem Adenokarzinom. 65 V. DISKUSSION V. DISKUSSION 1. Rolle von Socs3 für die pankreatische Karzinogenese im KrasG12D-Mausmodell Obwohl Socs3 bereits in einigen humanen Tumorzelllinien und –geweben als ein wichtiger Tumorsuppressor beschrieben wurde, blieb dessen genaue Rolle und Funktion in der pankreatischen Karzinogenese bisher unbeleuchtet. In einigen Studien wurde über eine endogene DNA-Hypermethylierung als epigenetischer Inaktivierungsmechanismus bestimmter Socs-Gene im Rahmen der Karzinogenese spekuliert. He und Kollegen konnten in humanen NSCLC (Nichtkleinzelliges Karzinom)-Zellinien, Mesotheliom-Zelllinien und operativ gewonnenem Lungenkarzinomgewebe eine im Vergleich zu den normalen Kontrollzelllinien supprimierte Expression des Socs3-Transkripts feststellen. Die Socs3-Defizienz in den Tumorzellen resultierte in einer Hyperaktivität des Jak/Stat-Signaltransduktionsweges mit proliferativer und onkogener Eigenschaft. Eine genetische Wiederherstellung der Socs3-Funktion induzierte hingegen durch Inhibition der Stat3-Aktivität Apoptose und Suppression des Zellwachstums. Interessanterweise wurden hypermethylierte CpG-Inseln des Socs3-Gens in allen Tumorzelllinien gefunden, während normale Gewebszellen mit regelrechter Socs3-Expression keine Veränderung der entsprechenden Genareale zeigten (He et al., 2003). CpG-Inseln haben ihre Bedeutung in der Regulation der Genexpression und stellen somit einen Mechanismus der epigenetischen Genregulation dar (Antequera 2003). Die Methylierung der CpG-Inseln eines Gens hat die Konsequenz, dass dieses Gen nicht mehr transkribiert wird, was unter anderem in der Tumorentstehung durch das Abschalten relevanter Tumorsuppressorgene eine große Rolle spielt. Untersuchungen mittels molekulargenetischer Analysen an ösophagealem Plattenepithelkarzinom und BarrettAdenokarzinom (Tischoff et al., 2007), humanem Kopf- und Hals-Plattenepithelkarzinom und deren dysplastischen Vorläuferläsionen (Weber et al., 2005), hepatozellulären Karzinomen (HCC) und deren präneoplastischen Läsionen (Niwa et al., 2005) offenbarten ebenfalls eine Hypermethylierung der CpG-Inseln enthaltenden Socs3-Promotorregion. Auch hier kam es als Folge der Socs3-Defizienz zu einer konstitutiven Aktivierung des Stat3-Signalweges. Im Kolon bietet die endogene Induktion der Socs3-Expression demzufolge einen protektiven Mechanismus gegenüber Verletzung-induzierter Kryptenhyperplasie und Entzündungsassoziierter Karzinogenese durch Hemmung der IL-6/Stat3-Signalkaskade (Rigby et al., 2007). 66 V. DISKUSSION In den meisten Karzinomzellen der Ovarien und der Mamma kommt es zu einer Inaktivierung des Socs1- und Socs2-Gens durch CpG-Hypermethylierung in der Promotorregion, wodurch diese Gene nicht mehr transkribiert werden. Im Gegensatz zu den Ergebnissen von He und Kollegen war die Promotorregion des Socs3-Gens in den beiden genannten Tumorentitäten nicht hypermethyliert und das Genprodukt dementsprechend intrazellulär in hoher Konzentration detektierbar. Darüber hinaus wurde eine erhöhte Stat3-Aktivität in den betroffenen Tumorzellen registriert, die auf die fehlende Expression des Socs1-Moleküls mit wachstums- und proliferationsinhibierender Wirkung zurück geführt wurde (Yoshikawa et al., 2001; Lee et al., 2006). Die konstitutive Stat3-Aktivierung ist mit einer Überexpression von Socs3 assoziiert und führte zur Zunahme der Proliferationsrate der mamillären Epithelzellen. Die gewonnenen Ergebnisse ließen Sutherland und Kollegen annehmen, dass das endogene Inhibitorprotein Socs3 in dieser Zellart keine Tumorsuppressor-Aktivität erfüllt, was wiederum dessen vielseitige teilweise unerforschte Funktion in verschiedenen Karzinomarten verdeutlicht (Sutherland et al., 2004). Drei Jahre nach der Veröffentlichung der Arbeit von Sutherland und Kollegen, wurde die Studie von der Arbeitsgruppe um Evans publik, in der sie entgegen Sutherlands Aussagen eine Zunahme der Expression von Socs2 bis Socs7 postulierten. Im Vergleich zu den normalen mamillären Epithelzellen reagierten die Tumorzelllinien trotz hypermethylierter CpG-Inseln adäquat auf Zytokin- bzw. Wachstumsfaktor-Signale mit erhöhter Expression von Socs1 und Socs3, wodurch der Mechanismus der Socs-vermittelten Feedback-Inhibition nicht gestört wurde (Evans et al., 2007). In Übereinstimmung mit den Ergebnissen von der Arbeitsgruppe um Sutherland, konnten sie belegen, dass trotz Zunahme des Socs3-Levels in Mammakarzinomzellen keine effiziente Feedback-Inhibition auf konstitutive Stat3Aktivierung erfolgte. Socs3 fungierte stattdessen als Tumorpromotor, welcher die IFNα/Stat1-vermittelte Wachstumsinhibition hemmte. Die intrazelluläre Stat3-Aktivierung im Rahmen der pankreatischen Onkogenese scheint ebenfalls unter der Socs3-Kontrolle zu stehen. In unseren Versuchen konnten wir erstmalig zeigen, dass in KrasG12D-Tumormäusen eine erhöhte Socs-3 Expression vorliegt. Um den Einfluss von Socs3 auf die Pankreaskarzinogenese im KrasG12D-transgenen Mausmodell zu untersuchen, generierten wir eine weitere Mauslinie mit pankreasspezifischer Socs3-Deletion. Eine Inaktivierung des Socs3-Gens führte demnach zu einer prolongierten und verstärkten Stat3-Phosphorylierung, was wiederum die Beschleunigung der PanIN-Progression und die Entstehung von Pankreaskarzinomen förderte. 67 V. DISKUSSION Im Einklang mit den aufgeführten Daten konnten wir in unserer Arbeit zeigen, dass innerhalb des Beobachtungszeitraums von sechs Monaten 28,57% (2/7) der KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäuse ein Pankreasadenokarzinom entwickelten, während in der KrasG12D-Kohorte keine Karzinomentwicklung zu beobachten war. Die Tumorlatenz von etwa 63 Tagen bei den KrasG12D;Socs3Δpanc-Versuchstieren war somit kürzer im Vergleich zu den KrasG12DKontrolltieren. 2. Einfluss von Socs3 auf die Apoptose und Proliferation im KrasG12D-Mausmodell Proliferation und Apoptose sind zellautonome Effekte, die das Gleichgewicht zwischen Zellwachstum und –eliminierung gewährleisten. Ein Ungleichgewicht dieser teilweise komplexen Mechanismen kann eine unkontrollierte Proliferation begünstigen und die Tumorentstehung fördern. Während in frühen und späten PanIN-Stadien die Apoptose als ein seltenes Ereignis anzusehen ist, stellt die Proliferation einen dominierenden Mechanismus in der Tumorprogression dar (Luttges et al., 2003). Stat3 ist bereits in vielen Untersuchungen als einen wichtigen Regulator des programmierten Zelltods und des Zellzyklus beschrieben worden (Konnikova et al., 2003; Lin et al., 2005; Xihong et al., 2008). Aktivierte p-Stat3 Homo- oder Heterodimere aktivieren als Transkriptionsfaktoren zahlreiche Zielgene. U.a. werden Proteine wie Bcl-XL, Mcl-1, Survivin und Cyclin D1 vermehrt gebildet. Bcl-XL und Mcl-1 gelten als anti-apoptotische Signalmoleküle, die durch verstärkte Expression zum Überleben transformierter Zellen in einigen humanen Tumorerkrankungen beiträgt (Krajewska et al., 1996; Okaro et al., 2001; Ma et al., 2004; Bhattacharya et al., 2005; Yu et al., 2009; Placzek et al., 2010). Untersuchungen an humanen Pankreastumorzelllinien haben gezeigt, dass eine Inaktivierung von Stat3 in einer Abnahme der Transkriptionsrate von Bcl-XL und Mcl-1 resultierte und folglich die Apoptose induzierte (Huang et al., 2010). In unseren weiterführenden Experimenten konnten wir zum ersten Mal nachweisen, dass die homozygote Deletion des negativen Regulators Socs3 in vier Wochen alten KrasG12D-Tumormäusen eine frühe und prolongierte Stat3-Aktivierung hervorruft und somit eine im Vergleich zu gleichaltrigen KrasG12D-Tumormäusen stärkere Expression der anti-apoptotischen Proteine Bcl-XL und Mcl1 verursacht. Zusätzlich zu den o.g. Ergebnissen konnten wir proteinbiochemisch eine stärkere Cyclin-D1 Expression in Socs3-defizienten KrasG12D-Tumormäusen im Vergleich zu den KrasG12DKontrollmäusen nachweisen. Cyclin D1 ist ein proliferationsförderndes, intranukleär 68 V. DISKUSSION lokalisiertes Protein, welches die G1/S-Progression innerhalb des Zellzyklus fördert und somit die proliferative Aktivität einer Zelle steuert (Baldin et al., 1993). Die Überexpression von Cyclin D1 in KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäusen kennzeichnete somit eine Verkürzung des G1/SPhasenübergangs, die wiederum die Progression transformierter Zellen innerhalb des Zellzyklus beschleunigt und die Entwicklung von Karzinomen wesentlich beeinflusst. In anderen Studien konnte in Übereinstimmung mit unseren Resultaten ebenfalls eine Überexpression von Cyclin D1 in humanen Pankreaskarzinomzellen nachgewiesen werden, die mit einer schlechten Prognose assoziiert ist (Gansauge et al., 1997). Die Bedeutung von Cyclin D1 in der Tumorgenese nicht nur im Pankreasadenokarzinom, sondern auch in zahlreichen anderen Tumorarten wird auch in anderen Arbeiten betont (Musgrove et al., 2011). In unseren Versuchen konnten wir erstmalig zeigen, dass die übermäßige Stat3 Expression in vier Wochen alten KrasG12D-Mäusen eine starke Aktivierung der genannten Proteine zur Folge hat. Dieses Ergebnis verdeutlicht die Proliferation als dominierender Prozess in der PanIN-Progression. Die zusätzliche, homozygote Deletion des Socs3-Gens in diesen Tumormäusen führt zu einer im Vergleich zu gleichaltrigen KrasG12D-Kontrollmäusen verstärkten und prolongierten Aktivierung von Stat3 und der Stat3-assoziierten Proteine durch Wegfall des negativen Inhibitors. Die dadurch hervorgerufene, persistierende Stat3 Aktivität und die vermehrte Bildung anti-apoptotischer und proliferationsfördernder Moleküle verursachten eine Beschleunigung der PanIN-Progression zu pankreatischem duktalem Adenokarzinom. Im murinen Modell der Hepatitis-assoziierten Hepatokarzinogenese stieg nach Injektion des Karzinogens DEN bzw. con A die IL-6 Serumkonzentration sowohl im Wildtyp als auch in den Soc3-Knockouts ohne signifikanten Unterschied dramatisch an. Jedoch war in den Socs3defizienten Tieren nach 24 Stunden eine anhaltende und stärkere Stat3-Phosphorylierung im Vergleich zu den Wildtypen detektierbar. In diesem Zusammenhang nahm die Transkriptionsfrequenz der Stat3-Zielgene Bcl-XL, Mcl-1, Cyclin D1 zu. Die homozygote Deletion des Socs3-Gens in den Leberparenchymzellen resultierte in einer verstärkten, prolongierten Stat3-Aktivierung und beschleunigte infolgedessen die Entwicklung des HCC (Ogata et al., 2006). Ein weiteres Ergebnis unserer experimentellen Untersuchungen stellte die immunhistochemiche Detektion des Enzyms Cyclooxygenase 2 (Cox-2) in präneoplastischen pankreatischen Läsionen dar. Cox-2 gehört zu den Zielgenen von Stat3 und wird bei dessen Aktivierung verstärkt transkribiert (Yu et al., 2008). Cox-2-Synthese wird erst bei 69 V. DISKUSSION Entzündungen bzw. Verletzung des Gewebes induziert und fördert anschließend die Produktion von pro-inflammatorischen Prostaglandinen, die chronische Entzündungen unterhalten. Inflammatorische Prozesse sind bedeutende epigenetische Faktoren, die maßgeblich zur Entstehung und Progression zahlreicher Tumoren führen (Shacter et al., 2002). Die PanIN-Progression und die Tumorentwicklung in der Pankreaskarzinogenese scheinen auch entzündungsassoziiert zu sein (Raimondi et al., 2010). Da Cox2 ein Zielgen von Stat3 darstellt und dessen Genprodukt pro-inflammatorische Wirkung besitzt, kann davon ausgegangen werden, dass Stat3 maßgeblich als Regulator tumor-assoziierter Entzündung fungiert. Mittels immunhistochemischer Färbungen konnten wir in PanINs der KrasG12DTumormäuse Cox-2 nachweisen. Unsere Western-Blot Analysen demonstrierten eine bereits in der vierten Lebenswoche verstärkte und prolongierte Expression von Cox-2 in Socs3defizienten KrasG12D-Mäusen im Vergleich zu den gleichaltrigen KrasG12D-Kontrolltieren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die homozygote Deletion von Socs3 die Stat3vermittelte Cox-2-Synthese verstärkt, die wiederum inflammatorische Mechanismen bereits in der vierten Lebenswoche aktivieren und so eine tumor-assoziierte Entzündung unterhalten, die die PanIN-Progression und Karzinomentwicklung beschleunigen. Weiterhin begünstigt das durch Cox-2 gebildete Prostaglandin E2 in vielen Tumorarten die Bildung des Angiogenese-Faktors VEGF, das wiederum das Tumorwachstum fördert. Demzufolge wird vermutet, dass Cox-2 eine wesentliche Rolle in der Tumorgenese spielen könnte (Simmons et al., 2004). In KrasG12D-induzierten PanINs war uns ebenfalls der proteinbiochemische Nachweis von HSP-70 möglich. HSP-70 stellt ein wichtiger Bestandteil des Chaperonsystems dar, das ubiquitär in eukaryontischen Zellen vorkommt. Die wichtigsten Funktionen von HSP-70 liegen in der richtigen Faltung und Aktivierung vieler Proteine. Zusätzlich ermöglicht dieses Molekül über anti-apoptotische Mechanismen das Überleben und Wachstum von Tumorzellen (Hatfield et al., 2012). HSP-70 wird reichlich in malignen Tumoren unterschiedlichen Ursprungs gebildet und seine Expression korreliert mit erhöhter Zellproliferation, schlechter Differenzierung, Lymphknotenmetastasen und schlechtem Therapie-Outcome (Ciocca et al., 1993; Vargas-Roig et al., 1997; Jäättelä, 1999). Das Gen HSP-70 gehört ebenfalls zu den Zielgenen von Stat3. Analog zur verstärkten und prolongierten Aktivierung von Stat3 in vier Wochen alten, Socs3-defizienten KrasG12D-Tumormäusen konnten wir mittels Western BlotMethode ebenfalls eine im Vergleich zu den Kontrolltieren verstärkte HSP-70 Bildung nachweisen. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass HSP-70 als zytoprotektives Molekül 70 V. DISKUSSION für das Überleben und Wachstum transformierter Azinuszellen im Rahmen der Tumorprogression von großer Bedeutung ist. Die Rolle von Socs3 im Rahmen der pankreatischen Karzinogenese ist bisher kaum beleuchtet worden. In einigen humanen Tumorzelllinien wurde die Bedeutung von Socs3 als negativer Regulator in der Inhibition der IL-6/Jak2/Stat3-Signalkaskade und der daraus resultierenden Reduktion zellulärer Proliferation, Induktion von Apoptose und ZellzyklusArrest hervorgehoben. Demzufolge wird diesem Molekül ein Anti-Tumoreffekt zugeschrieben (Iwahori et al., 2011). In unseren experimentellen Untersuchungen konnten wir erstmals die Expression von Socs3 im murinen in-vivo KrasG12D-Modell belegen. Demzufolge scheint dieses Molekül in der Regelung zellulärer Prozesse wie Apoptose, Proliferation, Zelldifferenzierung nicht nur unter physiologischen Bedingungen sondern auch im Rahmen der pankreatischen Karzinogenese eine wichtige Stellung einzunehmen. Neben Socs3 konnten wir mittels immunhistochemischer Methode auch andere Stat3-Zielproteine nachweisen, die in ihrer Gesamtheit zu kontinuierlicher Proliferation, apoptotischer Resistenz, Angiogenesestimulation, zellulärer Invasivität und Metastasierung sowie tumor-assoziierter Inflammation führen. Durch die zusätzliche homozygote Deletion von Socs3 in KrasG12DTumormäusen entfällt dessen Inhibition auf den Stat3-Signalweg, wodurch diese Zielgene bereits in frühen Lebenswochen vermehrt transkribiert werden und tumor-fördernde Mechanismen aktivieren. 3. Entzündliche Prozesse fördern die Initiierung und Progression der pankreatischen Vorläuferläsionen zu duktalem Pankreaskarzinom Inflammation ist definiert als eine lokale oder systemische Reaktion eines Organismus auf einen internen oder externen Fremdstoff oder ein Antigen mit dem Ziel der Entfernung dieser potentiell schädigenden Reize, um Voraussetzungen für anschließende Gewebereparaturprozesse zu schaffen. Damit ist sie Ausdruck der Immunreaktion. Nach Gewebsverletzung wandern Entzündungszellen wie Mastzellen, Makrophagen, Granulozyten, Lymphozyten aber auch Fibroblasten in die geschädigte Geweberegion und aktivieren Reparaturprozesse mit Angiogenese, Koordination der Zellmigration und Wiederherstellung der extrazellulären Matrix. In der Regel ist die Inflammation ein selbstlimitierender Prozess aufgrund der balancierten Verhältnisse zwischen initial freigesetzten, pro-inflammatorischen Botenstoffen 71 und anti-inflammatorischen V. DISKUSSION Signalmolekülen. Eine Dysregulation dieser Mechanismen kann zu einer chronischen Entzündung des betroffenen Gewebes führen mit der Gefahr der Tumorentwicklung (Barton, 2008; Medzhitov, 2008; Raimondi et al., 2010). Das Pankreas als Digestionsorgan enthält in den Zellen der exokrinen Drüsen viele Enzymvorstufen, die bei Schädigung des Gewebes freigesetzt und aktiviert werden. Es entsteht eine akute Pankreatitis. Rezidivierende Pankeatitiden führen letztendlich zur Entstehung einer Organgewebes, chronischen was wiederum Entzündung der mit irreversiblen Ausgangspunkt für Veränderungen die Entstehung des eines Pankreaskarzinoms sein kann (Raimondi et al., 2010). In den letzten Jahren wurde im Rahmen zahlreicher Pankreatitis-Forschungen ein Zusammenhang zwischen chronischer Pankreatitis und pankreatischer Karzinogenese postuliert (Lowenfels et al., 1993; Malka et al., 2002). Kras-Mäuse mit einer chronischen Cholezystokinin-Analogon) induziert Pankreatitis wie z.B. entwickelten bereits im durch Caerulein fünften (ein Lebensmonat ausgeprägte Atrophie der Azini und zunehmende Fibrosierung im Vergleich zu den Kontrolltieren. Desweiteren zeigte sich in den Pankreata der Kras-Tiere eine deutliche azinärduktale Metaplasie sowie multifokale metaplastische Gänge mit atypischen Kernstrukturen und luminalen Veränderungen, die auf prä-maligne Vorgänge hindeuten. Die Hälfte der KrasMäuse entwickelten bereits in frühem Lebensalter von fünf Monaten frühe PanIN-Läsionen im Vergleich zu gleichaltrigen Kontrolltieren. Die Schwere der Läsionen nahm mit zunehmendem Alter der Tiere zu, bis schließlich ein Drittel der Kras-Tumormäuse invasive duktale Adenokarzinome im achten Lebensmonat entwickelten. Im Vergleich dazu waren in den Organen der ebenfalls mit Caerulein behandelten Kontrolltieren weder PanINs noch invasive Karzinome nachweisbar. Somit stellt die chronische Pankreatitis ein wesentlicher Faktor dar, der zur Beschleunigung der Kras-induzierten PanIN-Progression führt (Guerra et al., 2007). In Entzündungsprozessen wurden dem inflammatorisch-potenten Zytokin IL-6 und dessen Signalkaskade über Stat3/Socs3 eine besondere Bedeutung zugesprochen (Hodge et al., 2005). Die Aktivierung von Stat3 sowohl in humanen Pankreasadenokarzinomen (Scholz et al., 2003; Hutzen et al., 2009; Glienke et al., 2010; Lin et al., 2010b) als auch in den PanINLäsionen der Tumormäuse (Lesina et al., 2011; Fukuda et al., 2011) lässt vermuten, dass entweder zell-autonome Mechanismen oder autokrine bzw. parakrine Stimulation der Zellen für diesen Effekt verantwortlich sind. Unsere immunhistochemischen Ergebnisse offenbarten ausgedehnte Jak2- und Stat3-Aktivierung sowohl in den duktalen als auch infiltrierenden und 72 V. DISKUSSION Azini-Zellen. Die Jak2-Phosphorylierung wies möglicherweise auf eine parakrine oder autokrine, weniger auf eine zell-autonome Aktivierung der Signalkaskade hin (Heinrich et al., 1998; Bravo et al., 2000). Bei den Liganden handelt es sich dabei um Zytokine wie IL-6, IL11, IL-27, aber auch LIF (leukemia inhibitor factor) und OSM (Oncostatin M). Die intensive, ubiquitäre Jak2/Stat3-Aktivierung im KrasG12D-Tumormausmodell lässt vermuten, dass gp130-Rezeptorliganden in der pankreatischen Onkogenese eine besondere Stellung einnehmen könnten. In einigen klinischen Studien konnte gezeigt werden, dass eine Korrelation zwischen der Höhe der IL-6-Serumkonzentration und dem Outcome bzw. der Prognose der an Pankreaskarzinom erkrankten Patienten besteht (Ebrahimi et al., 2004; TalarWojnarowska et al., 2009). In zahlreichen Untersuchungen konnten Azinuszellen als epitheliale Quellen von Zytokinen wie IL-6 und IL-11 in einer mit Caerulein induzierten Pankreatitis nachgewiesen werden (Grady et al., 1997; Blinman et al., 2000; Bhatia et al., 2002). Die Expression von IL-6 und IL-11 in den Azini von Stat3-defizienten KrasG12D-Mäusen war eindeutig niedriger als in den Azini der KrasG12D-Kontrolltiere (Fukada et al., 2011). Diese Ergebnisse und die Kenntnis, dass sowohl IL-6, IL-11, als auch IL-6Rα und gp130 Zielgene von Stat3 sind (Ernst et al., 2008; Toth et al., 2011), lassen schlussfolgern, dass Stat3 möglicherweise selbst durch Steigerung der IL-6 bzw. IL-11 Expression und über einen autokrinen Mechanismus die Jak2/Stat3-Signalkaskade im murinen KrasG12D-Modell des Pankreaskarzinoms aktiviert (Fukada et al., 2011). Im Einklang mit den Ergebnissen der Arbeitsgruppe um Fukuda konnten wir in unseren Versuchen ebenfalls eine höhere IL-6 mRNA-Konzentration in KrasG12D-Tumormäusen als in den LSL-KrasG12D-Kontrollmäusen messen. Zusätzlich ist unserer Arbeitsgruppe gelungen, in isolierten Tumorzelllinien, die im Gegensatz zum Primärtumor oder Metastasen keine bzw. geringfügige Stat3-Aktivierung aufzeigen, nach IL-6 Stimulation eine starke Stat3Phosphorylierung zu induzieren (Lesina et al., 2011). Somit konnten wir zeigen, dass neben der autokrinen Zellstimulation ein parakriner Mechanismus der Stat3-Aktivierung existiert. Ein typisches, morphologisches Merkmal des duktalen Pankreaskarzinoms ist die reaktive, stromale Desmoplasie angrenzend an die PanINs und das Tumorgewebe. Dieses desmoplastische Stroma stellt ein für die Karzinomentwicklung komplexes „TumorMicroenvironment“ dar, das sich aus extrazellulärer Matrix, myofibroblastischen, pankreatischen Sternzellen und v.a. inflammatorischen Zellen und Makrophagen zusammensetzt. Untersuchungen haben gezeigt, dass Entzündungszellen insbesondere Makrophagen für die Synthese von Chemokinen und inflammatorischen Zytokinen wie IL-6 73 V. DISKUSSION verantwortlich sind (Algül et al., 2007b; Erkan et al., 2008). Weiterführende Experimente unserer Arbeitsgruppe konnten tatsächlich infiltrierende Makrophagen als wichtigste Produzenten von IL-6 identifizieren, das zur Aktivierung der Stat3/Socs3-Signalkaskade in den Tumorvorläufer- bzw. Tumorzellen führt (Lesina et al., 2011). In Zusammenschau der Forschungsergebnisse sowohl unserer Arbeitsgruppe als auch von Fukada und Kollegen kann geschlussfolgert werden, dass eine parakrine Stimulation der transformierten Zellen durch IL6-Freisetzung aus den Makrophagen die intrazelluläre Jak2/Stat3/Socs3-Signalkaskade aktiviert. Der Traskriptionsfaktor Stat3 fördert in seiner aktiven Form wiederum die Bildung von IL-6 und IL-11, was zusätzlich als autokriner Mechanismus die Aktivität des Stat3Signalweges aufrechterhält. Einige Analysen haben gezeigt, dass Stat3 sowohl in Tumorzellen als auch in Entzündungszellen wie Makrophagen, natürlichen Killerzellen und neutrophilen Granulozyten im „Tumor-Microenvironment“ konstitutiv aktiviert ist. Durch diese Dauerstimulation verhindert Stat3 zum einen die Expression vieler für die Immunantwort gegen die transformierten Zellen wichtiger Botenstoffe und zum anderen fungiert dieser Transkriptionsfaktor als Aktivator diverser für die Immunsuppression bedeutender Gene u.a. auch IL-6. Somit unterdrückt die konstitutive Aktivierung der Stat3-Signalkaskade bei Stat3Defizienz die antitumoröse Immunantwort, was die Bedeutung dieses Signalweges sowohl in der Immunmodulation als auch der Tumorentwicklung unterstreicht (Yu et al., 2007). Die IL-6/Jak2/Stat3-Signalkaskade ist ein ubiquitär vorkommender Signalweg, der bereits im Rahmen entzündungsassoziierter Onkogenese in anderen Organen wie der Lunge (Li et al., 2007) und dem Kolon (Bollrath et al., 2009; Grivennikov et al., 2009) beschrieben wurde. Die komplexe Bedeutung von Socs3 im Rahmen akuter und chronischer Inflammation wurde in einigen Studien untersucht. Demnach kam es nach Stimulation von isolierten, pankreatischen Azinus-Zellen mit Lipopolysaccharide (LPS), Tumornekrosefaktor (TNF)-α, IL-6 oder IL-1ß zu einer erhöhten mRNA-Synthese sowohl von Stat3 als auch Socs3. Die Induktion des endogenen, negativen Regulators im Pankreas könnte für die Hemmung der Synthese pro-inflammatorischer Gene eine wichtige Rolle spielen. Die Socs3 HochRegulation in Azinuszellen inhibiert möglicherweise die weitere Zytokin-Induktion und hemmt somit die Prolongation und Chronifizierung entzündlicher Prozesse (Vona-Davis et al., 2005). In thermisch behandelten Hepatozyten konnte ebenfalls eine deutlich erhöhte Stat3Expression und –Aktivierung sowie eine gesteigerte Socs3-Synthese beobachtet werden. Nicht-Leberparenchymzellen wie Kupffer-Zellen wurden als Quelle inflammatorischer 74 V. DISKUSSION Zytokine wie IL-6, IL-1 und TNF-α identifiziert. Somit stellten diese wichtigen Zellen der Socs3-Aktivierung in Rahmen immunologischer Prozesse dar. Das erhöhte Socs3-Proteinlevel ging mit einer abnehmenden Stat3-Phosphorylierung einher. Die Stimulation primär isolierter Hepatozyten mit IL-6 führte ebenfalls zu einer Zunahme der Socs3-Konzentration und Abnahme von Stat3-Aktivität im Vergleich zu nicht mit IL-6 stimulierten Zellen. Daraus kann geschlussfolgert werden, dass Socs3 die Stat3-Aktivierung hemmte und somit die IL6Signaltransduktion terminierte (Kong et al., 2002). Im Rahmen chronisch entzündlicher Darmerkrankungen limitiert die Socs3-Überexpression die Aktivierung der IL-6/Stat3-Signalkaskade in den betroffenen Darmzellen und verhindert eine Hyperproliferation der Darmkrypten und die entzündungs-assoziierte Karzinogenese (Suzuki et al., 2001; Rigby et al., 2007). In Übereinstimmung zu unseren Ergebnissen führt eine Socs3-Deletion zur Hyperaktivierung der Stat3-Signalkaskade, was wiederum die chronische Entzündung und die damit assoziierte Tumorinitiierung und –progression fördert. Einige Studien haben gezeigt, dass eine intrazelluläre Proteintherapie mit Socs3 das Ausmaß entzündlicher Prozesse und Apoptose vermindert. Die auf diesem Wege erfolgte Auffüllung der endogenen Socs3-Reserve bei Defizienz terminierte die Zytokin-Signaltransduktion wie z.B. durch IL-6 und verhindert somit Apoptose und hämorrhagische Nekrosen im Rahmen einer akuten Entzündung der Leber (Jo et al., 2005). Socs3 scheint wichtige Mechanismen im Rahmen von Entzündungsprozessen zu regulieren. Um die Bedeutung dieses Moleküls für die entzündungsassoziierte Tumorgenese genauer beschreiben zu können sind weiterführende Untersuchungen notwendig. 4. Rolle von Socs3 bei der Pankreasfibrosierung/Desmoplasie in KrasG12D-Tumormäusen Ein bedeutendes, histomorphologisches Kerncharakteristikum des duktalen Pankreasadenokarzinoms ist die Bildung einer ausgeprägten Desmoplasie. Diese Veränderung ist gekennzeichnet durch eine massive Fibrosierung des Pankreasgewebes, was als Folge einer gestörten Homöostase der extrazellulären Matrix (ECM) darstellt. Unter normalen physiologischen Umständen wird die Organarchitektur durch ein Gleichgewicht zwischen Synthese und Degradation der ECM aufrechterhalten. Demzufolge führt eine Imbalance zugunsten der vermehrten Bildung zu einer unphysiologischen Fibrosierung des Gewebes (Algül et al., 2007; Pandol et al., 2009). Untersuchungen haben gezeigt, dass die Aktivität der 75 V. DISKUSSION Desmoplasie einen prognostischen Wert bei Patienten mit Pankreaskarzinom besitzt, wobei eine hohe Aktivität mit einer schlechteren Prognose assoziiert ist (Erkan et al., 2008). Zu den wichtigsten zellulären Bestandteilen des desmoplasmatischen Stromas zählen neben inflammatorischen Zellen und Makrophagen v.a. die pankreatischen Sternzellen (pancreatic stellate cells, PSC). Die PSCs sind Äquivalente zu den hepatischen Sternzellen (auch als Ito Zellen oder HSCs genannt) und sind in ihrem aktivierten Zustand für die Produktion von Proteinen der ECM wie Kollagene Typ I und III sowie Fibronektin verantwortlich. Im normalen, gesunden Pankreasgewebe sind ruhende, gering proliferierende PSCs in den periazinären und interlobulären Organbereichen lokalisiert und synthetisieren kaum ECM. Eine parakrine Aktivierung erfolgt bei Entzündungsprozessen oder im Rahmen tumoröser Erkrankungen durch infiltrierende Zellen wie mononukleare Zellen, die v.a. TGF-ß1, PDGF, TGF-α sowie Zytokine IL-1, IL-6 und Sauerstoffradikale freisetzen (Algül et al., 2007; Shimizu, 2008). Die aktivierten PSCs veränderten ihre Morphologie zu proliferierenden myofibroblastenähnlichen Zellen, die neben den o.g. Proteinen α-smooth muscle actin (αSMA), Matrix-Metalloproteasen (MMPs) und deren Inhibitoren exprimieren. Das Vorkommen von α-SMA beschränkt sich normalerweise auf vaskuläre, glatte Muskelzellen und ist im pankeatischen Gewebe sehr gering. Vielmehr ist dieses Protein als intrazelluläres, in Mikrofilamentenbündel lokalisiertes Molekül in Myofibroblasten, glatten Muskelzellen und Myoepithelzellen zu finden (Gugliotta et al., 1988; Desmouliere et al,. 1993). MMPs und ihre spezifische Gewebeinhibitoren (TIMPs) werden sowohl von PSCs als auch von Tumorzellen gebildet. MMPs dienen der Degradation der ECM durch Abbau der Matrixproteine sowie der Basalmembran und tragen somit zur Metastasierung von Tumorzellen bei. TIMP-1 und TIMP-2 inhibieren dagegen die MMPs und verhindern damit den Abbau der ECM (Algül et al., 2007). PSCs werden nicht nur parakrin stimuliert. Der Nachweis der Expression des TGF-ß1 Rezeptors an der Zelloberfläche und des Signalmoleküls TGF-ß1 zeigt, dass die Aktivität der PSCs, einst durch exogene Faktoren getriggert, durch autokrine Stimulationsmechanismen auch bei Abwesenheit exogener Noxen aufrechterhalten wird. Trotz zahlreicher Studien zur Entstehung einer Desmoplasie im Rahmen diverser Pankreaserkrankungen sind die zugrundeliegenden Mechanismen zur dessen Entstehung und Rolle in der pankreatischen Karzinogenese sehr komplex und bisher noch nicht ausreichend geklärt. Jedoch ist die Akkumulation von gering durchblutetem Stroma ein typisches Merkmal für PanIN-Läsionen, wobei die Ausprägung mit dem Grad der PanIN-Stufen zunimmt (Erkan et al., 2012). 76 V. DISKUSSION In unseren Untersuchungen wiesen die Pankreata Socs3-defizienter KrasG12D-Tumormäuse morphologisch ebenfalls ausgedehnte Fibrosierungsareale auf. Die Ergebnisse demonstrierten ein im Vergleich zum Wildtyp bis auf ein Fünftel der Organmasse geschrumpfte Bauchspeicheldrüse mit diffus nodulärer und lobulierter Parenchymstruktur. Die ausgedehnte Fibrosierung des sonst weichen Gewebes lässt das Organ derb, knotig und formlos erscheinen. Diese makroskopisch sichtbaren Veränderungen an den Pankreata der von uns generierten KrasG12D;Socs3Δpanc-Mauslinie deuten auf vorhandene fibrotische Prozesse hin, die sich scheinbar in weiter fortgeschrittenen Stadien befinden als die der gleichaltrigen Mäuse mit singulärer KrasG12D-Mutation. Während Pankreata vier Wochen alter KrasG12DMäuse nahezu unauffällig erscheinen, fallen bei näherer histologischer Betrachtung der Gewebestruktur gleichaltriger KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäuse ausgedehnte fibrotisch umgebaute heterogene Areale auf. Dieses desmoplasmatische Stroma ist besonders um PanIN-Läsionen detektierbar. Die Fibrosierungsprozesse scheinen durch die Socs3-Deletion beschleunigt zu sein. In Anlehnung an die Arbeit von Ogata und Kollegen könnte die Erklärung für unsere Ergebnisse darin liegen, dass bei chronischen Entzündungsprozessen, Einwirkung von chemischen Noxen oder Apoptoseprozessen eine dynamische Kaskade von Reaktionen hervorgerufen wird, bei der Entzündungszellen wie Makrophagen aktiviert werden, die anschließend eine Reihe von Zytokinen wie IL-6 und Wachstumsfaktoren produzieren und freisetzen, wodurch ruhende PSCs zu proliferierenden Myofibroblasten aktiviert werden. Die zunehmende Transkription des Stat3-Zielgens TGF-ß1 in den Makrophagen aber wahrscheinlich auch in den transformierten Zellen verursacht eine parakrine Stimulation der PSCs zu proliferierenden Myofibroblasten, die dann vermehrt ECM-Proteinen wie Kollagene und Fibronektin freisetzen. Somit stellt TGF-ß1 ein wichtiges Signalmolekül für Fibrosierungsprozesse dar (Saxena et al., 2002; Ogata et al., 2006). Diese Matrixproteine fördern in ihrer Gesamtheit die Pankreasfibrosierung. Durch autokrine Stimulationsmechanismen kann die Aktivierung der PSCs trotz Wegfall der Stimuli aufrechterhalten werden. In KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäusen kommt es durch die Socs3-Deletion zu einem Ausfall der negativen Rückkopplung der Stat3-Signalkaskade, wodurch es möglicherweise zu einer verstärkten TGF-ß1 Expression und zu einer Beschleunigung der Fibrosierungsprozesse kommt. Um die Komplexität und die genauen, grundlegenden Mechanismen der Pankreasfibrosierung genauer verstehen zu können, sind weiterführende Untersuchungen erforderlich. 77 V. 5. DISKUSSION Die Bedeutung von Socs3 in Transdifferenzierungsprozessen im Pankreas der KrasG12D-Tumormäuse Die häufigste bisher bekannte und auch histologisch am besten untersuchte Vorläuferläsion des Pankreaskarzioms ist die PanIN, die einen duktalen Phänotyp besitzt sowie einen duktalen Ursprung aufweist. Untersuchungen an genetisch veränderten Mausmodellen haben jedoch gezeigt, dass durch azinär-duktale Metaplasie tubuläre Komplexe entstehen, die als flache, intermediäre Strukturen eine weitere, alternative Vorläuferläsion des PDAC bilden können. Die Metaplasie ist definiert als Umwandlung einer differenzierten Gewebe- bzw. Zellart in Anpassung auf die vorherrschende Umgebung. Rezidivierende Reizzustände durch chemische, entzündliche und mechanische Stimuli rufen demzufolge eine meist qualitative Änderung des Gewebes bzw. der Zellen hervor. Zum Beispiel entsteht durch chronische Reflux-Ösophagitis aus dem Plattenepithel des unteren Ösophagusbereichs ein magenschleimhautähnliches Zylinderepithel des Barrett-Ösophagus. In der Regel stellt die Metaplasie einen reversiblen Vorgang dar, der bei Beendigung des einwirkenden Reizes eintritt. Bleibt der Stimulus jedoch persistent, kann sich die Metaplasie zu einer Dysplasie entwickeln (Lowenfels et al., 2000; Hruban et al., 2001; Fléjou, 2005). Azinär-duktale Metaplasie (ADM) wurde bereits bei der Caerulein-induzierten Pankreatitis im Kras-Mausmodell beobachtet (Guerra et al., 2007). Es ist jedoch unklar, ob die ADM primär aus expandierten, duktalen Zellen und durch anschließenden Austausch der azinären Zellen oder durch direkte Reprogrammierung azinärer Zellen in Zellen mit duktalen Eigenschaften entwickelt, wobei azinären Zellen bei der PanIN-Entwicklung eine bedeutende Rolle zugesprochen werden. In KrasG12D-exprimierenden Mäusen treten azinär-duktale Metaplasien entweder zusammen mit PanIN-Läsionen auf oder sie sind diesen vorangestellt. Es wird somit postuliert, dass die onkogene Kras-Mutation die ADM, die PanIN-Entwicklung und letztendlich die Entstehung des Pankreasadenokarzinoms induziert (Kopp et al., 2012). Die metaplastischen Strukturen enthalten sowohl azinäre Zellen mit Zymogengranula als auch Übergangszellen mit duktalen Merkmalen wie muzinöses Zytoplasma, CK-19 Expression und Sox9-Bildung (Zhu et al., 2007; Morris et al., 2010). Wie im humanen Pankreaskarzinom entwickelten sich in den Pankreata der KrasG12D;Pdx1-Cre- und LSL-KrasG12D;p48CreMäuse drei verschiedene Zonen von Zellen, die aus PanINs, ADM und normalen AzinusZellen bestehen. Aufgrund des frühen Auftretens der ADM im Rahmen der humanen, pankreatischen Karzinogenese ist ihre Bedeutung im Rahmen der Tumorprogression bisher nur wenig erforscht. Im in-vivo-Mausmodell jedoch zeigte sich bereits bei vier Wochen alten LSL-KrasG12D;p48Cre-Tumormäusen ausgedehnte azinäre Metaplasie, die aufgetriebene, 78 V. DISKUSSION offene Lumina besitzen und muzin-produzierende Gang-ähnliche Zellen enthalten (Zhu et al., 2007). Der Nachweis sowohl von Amylase (spezifischer Marker von Azinus-Zellen) als auch von K19 (CK-19, spezifischer Marker duktaler Zellen) bestätigte das Vorliegen einer metaplastischen Veränderung. Weiterführende Immunoblot-Untersuchungen offenbarten eine Abnahme der azinären Genprodukte, während die Bildung duktaler Genprodukte anstieg. Diese Ergebnisse der Arbeitsgruppe um Zhu demonstrierten deutlich die Kras-induzierte Veränderung der Azinus- zu duktalen Zellen in KrasG12D;p48Cre-Mäusen. Die Zellproliferation innerhalb der metaplastischen Strukturen ist sehr hoch, wobei sich die Zellen erst nach Umwandlung in Gang-ähnliche Zellen aktiv teilen. In der vorliegenden Arbeit konnten wir in Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Zhu und Kollegen bereits in der vierten Lebenswoche azinär-duktale Metaplasie und vereinzelte, frühe PanIN-Läsionen detektieren. Mit steigendem Alter der Tiere nahm die Anzahl histologisch erkennbarer Ducti mit Formanomalie zu, die auf einen metaplastischen duktalen Prozess hindeutete. Die positive immunhistochemische Detektion von duktalen Markern wie CK-19 und Mucinen sowie die morphologisch ausgeweiteten, offenen Lumina der tubulären Strukturen deuteten ebenfalls auf eine azinär-duktale Metaplasie hin. In vielen Untersuchungen versuchten Forscher herauszufinden, welche molekulargenetische Mechanismen für die metaplastische Veränderungen verantwortlich sind und inwiefern sich diese von den der PanIN-Vorläuferläsionen unterscheiden. Dabei konnten sie feststellen, dass viele in den metaplastischen Komplexen aktivierten Signalkaskaden auch in frühen PanINVorläufern vorzufinden waren (Kopp et al., 2012). Unter anderem werden dem Notch- (Zhu et al., 2007), EGF- und dem Hedgehog-Signaltransduktionsweg eine große Bedeutung zugeschrieben (Means et al., 2005; Pasca di Magliano et al., 2006; De La O et al., 2008; Fendrich et al., 2008). Ein weiterer für die ADM- bzw. PanIN-Entwicklung relevanter Signalweg stellt die Stat3Signalkaskade dar. Die Akkumulation von ADM und PanIN-Vorläuferläsionen in Pdx1Cre;LSL-KrasG12D-Mäusen veranlasste zur Überprüfung der Rolle von Stat3 in der Entwicklung dieser für die pankreatische Karzinogenese wichtigen Veränderungen. Die Pankreata der Stat3-defizienten KrasG12D-Mäuse wiesen im Vergleich zu den Pdx1-Cre;LSLKrasG12D;Stat3F/+-Kontrolltieren zum größten Teil ein normales Pankreasparenchym mit vereinzelten, sporadisch auftretenden ADM und PanINs auf. Das Organgewebe der Kontrollmäuse zeigte hingegen ausgedehnte azinär-duktale Metaplasien und PanINFormationen als Antwort auf eine exzessive Stat3-Aktivierung zu p-Stat3. Somit konnte geschlussfolgert werden, dass die Stat3-Deletion die Kras-induzierte ADM- und PanIN79 V. DISKUSSION Bildung bzw. -Progression zwar nicht verhindert, diese aber deutlich vermindert. Somit stellt der Stat3-Signalweg bzw. die IL-6-Signaltransduktion mögliche, therapeutische Ziele in der Behandlung des pankreatischen Adenokarzinoms dar (Corcoran et al., 2011). Eine Stat3-Überexpression im Rahmen der azinär-duktalen Differenzierung wurde ebenfalls in der genetisch generierten Ptf1a-Cre;CAG-CAT-PDX1-Mauslinie der Arbeitsgruppe um Miyatsuka beobachtet. Neben der persistierenden Pdx1-Synthese, was die Induktion von ADM verursacht, wurde von einer verstärkten Stat3-Aktivierung in den metaplastisch veränderten, duktalen Einheiten des Organparenchyms berichtet. Die Ergebnisse von Miyatsuka und Kollegen verdeutlichten die essenzielle Bedeutung der Hoch-Regulation von Pdx-1 und der konstitutiven Stat3-Aktivierung für die Formation tubulärer Komplexe. Als Antwort auf die Stat3-Hyperaktivierung in Ptf1a-Cre;CAG-CAT-PDX1-Mäusen fanden sie eine Überexpression von Socs3. Dieses Resultat legte dem negativen Regulator Socs3 eine regulierende Funktion auf den Stat3-Signalweg im Rahmen der ADM nahe (Miyatsuka et al., 2006). Unsere immunhistochemische Schnittfärbungen von KrasG12D-Mäusen bestätigen die Ergebnisse der oben beschriebenen Arbeiten, dass die metaplastischen Veränderungen vermehrt Stat3 exprimieren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die verstärkte Aktivierung von Stat3 in diesem Mausmodell ein frühes Ereignis bei der Entwicklung von metaplastischen Strukturen darstellt. Im Rahmen weiterführender Untersuchungen überprüften wir die Abhängigkeit der Reprogrammierung von Azini in duktale Zellen in vivo von Socs3. Auch hier fanden wir Socs3 als Antwort auf die verstärkte Stat3-Aktivierung in den metaplastischen Pankreasstrukturen der KrasG12D-Mäuse überexprimiert vor. Somit legt die starke Induktion des endogenen Inhibitors eine regulierende Funktion des Socs3 in der azinär-duktalen Metaplasie nahe. Eine Socs3-Deletion in der von uns generierten KrasG12D;Socs3Δpanc-Mauslinie mit früher und verstärkter Stat3-Expression resultiert in einer Beschleunigung der ADM bzw. PanIN-Progression in den entsprechenden Organen. Im Vergleich zu gleichaltrigen KrasG12D-Kontrollmäusen sind metaplastisch duktale Veränderungen bereits in der vierten Lebenswoche ausgedehnt im Pankreasgewebe der KrasG12D;Socs3Δpanc-Tumormäuse vorzufinden, während die Geweben der Kontrollmäuse nahezu normal erscheinen. Immunhistochemische Untersuchungen auf CK-19, Mucin 1 und Mucin 5 dienten zur genauen Charakterisierung der ADM und der Bestätigung der Beschleunigung der ADM in Socs3-deletierten Mäusen. Bereits im Alter von vier Wochen entwickeln KrasG12D;Socs3Δpanc-Tumormäuse metaplastische Gänge mit ausgedehnter CK-19, Muc1 und Muc5-Expression, während gleichaltrige KrasG12D-Kontrollmäuse ein nahezu 80 V. DISKUSSION unauffälliges Organ aufweisen. Diese azinär-duktale Metaplasie könnte die Entstehung von pankreatischen Neoplasien hervorrufen, sodass weiterführende Untersuchungen benötigt werden. 6. Ausblick Über die Inaktivierung von Socs3 in humanen Karzinomen und Tumorzelllinien ist in einigen Arbeiten berichtet worden (He et al., 2003; Sutherland et al., 2004; Weber et al., 2005; Niwa et al., 2005). Die Bedeutung von Socs3 im murinen in-vivo-Modell des Pankreaskarzinoms blieb jedoch bisher unbeleuchtet. In unseren Untersuchungen konnten wir zeigen, dass die KrasG12D-Mauslinie zeit- und altersabhängig alle PanIN-Stufen entwickelten, die den humanen pankreatischen Vorläuferläsionen entsprechen. Zudem ließ sich eine starke Stat3Phosphorylierung am Tyrosinrest Y705 in den KrasG12D-Tumormäusen nachweisen. Socs3 wird Stat3-abhängig exprimiert und fungiert in den PanIN-Läsionen als essentieller Regulator der Aktivierung und Inhibition von Stat3 und bestimmt somit über die zeitabhängige Progression der PanINs im KrasG12D-Tumormausmodell. Aus unseren Ergebnissen können wir damit annehmen, dass auch in humanen Pankreaskarzinomen die Ausschaltung der Socs3-Aktivität eine Beschleunigung der malignen Transformation und Progression bedeutet. In einigen durchgeführten experimentellen Untersuchungen der letzten Jahre versuchten Forscher die Socs3-Effizienz auf molekulargenetischer Ebene wiederherzustellen. In humanen Tumorzelllinien wurde die häufig vorzufindende Methylierung und folglich Inaktivierung des Socs3-Gens durch die Behandlung mit der demethylierenden Verbindung 5-aza-2deoxycytidin (5-AZA-DC; Sutherland et al., 2004; Weber et al., 2005; Niwa et al., 2005) oder Socs3-Gen tragender viraler (CMV, Adenoviren) Vektoren (Lin et al., 2010; Rossa et al., 2012) aufgehoben. Die dadurch ermöglichte Reaktivierung der Socs3-Expression reduzierte die Proliferationsrate und induzierte die Apoptose von humanen Tumorzellen. Ebenfalls kam es zu einer Down-Regulierung der Stat3-Phosphorylierung sowie der Stat3-abhängigen Zielproteine, die diverse Mechanismen des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung, der Apoptose und Inflammation steuerten (He et al., 2003; Weber et al., 2005; Iwahori et al., 2011). Diese Ergebnisse demonstrierten, dass das endogene Inhibitorprotein Socs3 einen potenziell tumorsuppressiven Effekt besitzt und dessen Inaktivierung eine Beschleunigung der Tumorprogression bedeutet. Bisher ist der Einfluss von Socs3 auf die Initiierung und Progression von präneoplastischen Läsionen des Pankreas zu duktalen Adenokarzinomen kaum beleuchtet worden. Mit den gewonnenen Daten gelang unserer Arbeitsgruppe erstmalig 81 VI. ZUSAMMENFASSUNG der Nachweis, dass Socs3 die Rolle eines essentiellen Regulators der zeitabhängigen Progression der PanINs in der KrasG12D-initiirenden Onkogenese des Pankreas einnimmt und die Inaktivierung dieses endogenen Inhibitors letztlich in einer malignen Entartung duktaler Zellen endet. Diese Erkenntnisse über die Funktion und Mechanismen des Stat3/Socs3Signalweges sollen den Ausgangspunkt für weitere sowohl experimentelle als auch klinische Untersuchungen zur Validierung eines spezifischen und vielversprechenden Targets in der Therapie des hochaggressiven Pankreasadenokarzinoms darstellen. VI. ZUSAMMENFASSUNG Das Pankreaskarzinom steht an vierter Stelle der tumorbedingten Todesfälle. Mit einer medianen Überlebenszeit von etwa drei bis fünf Monaten und einer 5-Jahresüberlebensrate von weniger als 5% hat das Pankreaskarzinom eine düstere Prognose (Hezel et al., 2006). Wesentliche Ursachen für das schlechte Outcome dieser Tumorerkrankung sind die späte Diagnosestellung, frühe Metastasierung und mangelnde Therapieoptionen (Lionetto et al., 1995; Yeo et al., 2002b; Kleef et al., 2007a). Für die Entstehung des duktalen Pankreasadenokarzinoms wurde auf histopathologischer und molekulargenetischer Demzufolge Ebene entsteht der ein spezifisches invasive Tumor Tumorprogressionsmodell aus definierten, entwickelt. präneoplastischen Vorläuferläsionen, den sogenannten pankreatischen intraepithelialen Neoplasien (PanINs), die wiederum in drei Stadien eingeteilt sind. Mit steigendem Schweregrad dieser Läsionen nehmen die architektonischen und zellulären Veränderungen der duktalen Strukturen ebenfalls zu. Molekulargenetische Untersuchungen haben gezeigt, dass die einzelnen PanINProgressionsstufen bestimmte genetische Veränderungen in Form von Mutationen der Onkogene und Tumorsuppressorgene aufweisen (Hruban et al., 2000). Mithilfe des Cre/loxP-Rekombinationssystems gelang David Tuveson und Tyler Jacks die Etablierung eines Mausmodells, in dem die pankreasspezifische KrasG12D-Mutation am Exon1 des entsprechenden Gens vorliegt. In diesem Tumormausmodell konnte das komplette PanINSpektrum rekapituliert werden, da die genetisch veränderten Mäuse alters- und zeitabhängig alle Stadien dieser Vorläuferläsionen aufzeigen (Jackson et al., 2001). Ausgehend von diesem etablierten KrasG12D-Tumormausmodell sind verschiedene komplexe Tiermodellsysteme entwickelt worden, die additiv zu dem mutierten Kras-Allel andere genetische Veränderungen aufzeigen. Damit lässt sich der Einfluss 82 einzelner Genmutationen auf die VI. ZUSAMMENFASSUNG Karzinomentwicklung und –progression genauer analysieren und mögliche Ansatzpunkte für ein gezieltes medizinisches Eingreifen finden. Das Socs3-Molekül hat intrazellulär eine auf den IL6/Jak2/Stat3-Signalweg inhibierende Funktion. Stat3-vermittelt exprimiert, moduliert dieses Inhibitorprotein in einer FeedbackSchleife die Stat3-Phosphorylierung und somit die Stat3-abhängige Expression von bestimmten Zielgenen, die Prozesse der Proliferation, Apoptose, Angiogenese und Inflammation steuerten. In zahlreichen humanen Tumorgeweben bzw. -zelllinien konnte bereits eine Inaktivierung von Socs3 wie z.B. durch eine Hypermethylierung der Promotorregion und folglich eine Hemmung der Socs3-Transkription als epigenetische Veränderung nachgewiesen werden (Sutherland et al., 2004; Weber et al., 2005; Niwa et al., 2005). Die Auswirkung einer Socs3-Defizienz auf die Progression der Vorläuferläsionen zu duktalen Adenokarzinomen in der pankreatischen Onkogenese blieb bisher jedoch unbeleuchtet. In dieser Arbeit haben wir zunächst die Expression von Stat3 und Stat3-abhängigen Proteinen v.a. Socs3 in KrasG12D-Tumormäusen auf proteinbio- und immunhistochemischer Ebene bestätigt. Daraus konnte geschlussfolgert werden, dass Socs3 eine balancierende Funktion auf die Stat3-Phosphorylierung ausübt. Um die Auswirkung einer Socs3-Defizienz auf die PanIN-Progression genau beurteilen zu können, generierten wir in einem weiteren Schritt mithilfe der Cre/loxP-Technologie eine KrasG12D;Socs3Δpanc-Mauslinie, die eine Deletion des für die Bindungsdomäne am gp130Rezeptor kodierenden Exons 2 im Socs3-Gen aufweisen. Durch diese genetische Mutation ist die Bindung an den intrazellulären Rezeptorbestandteil und folglich die Feedback-Hemmung der Stat3-Phosphorylierung nicht mehr gewährleistet. Socs3-defiziente KrasG12D-Mäuse weisen keine Beeinträchtigung in der morphologischen und funktionellen Entwicklung des exokrinen und endokrinen Pankreas auf. Ebenso wird die Ausprägung der KrasG12D-Mutation durch die Socs3-Deletion nicht beeinflusst. Diese Mauslinie ermöglicht somit die Untersuchung des Inhibitorproteins Socs3 auf die pankreatische Karzinogenese und die Stat3-Phosphorylierung. Unsere morphologische und biochemische Forschungsergebnisse demonstrieren für KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäuse im Vergleich zu den KrasG12D-Kontrolltieren eine frühzeitige und prolongierte Stat3-Phosphorylierung, die bereits nach vier Wochen postpartum detektierbar ist, sowie eine Beschleunigung KrasG12D-initiierenden der PanIN-Progression. Interessanterweise ist das Pankreas der Socs3-defizienten KrasG12D-Mäuse schon zum Zeitpunkt von vier Wochen morphologisch sehr stark umgewandelt. In dem fibrotisch 83 umgebauten Organ sind heterogne Areale detektierbar, die neben normalen Azinis ausgeprägt hochgradig veränderte Gänge in Form von PanINs aufweisen. Das endogene Inhibitorprotein Socs3 übt somit die Rolle eines Tumorsuppressors in der Onkogenese des Pankreas aus und bestimmt über die Regulation der Stat3-Phosphorylierung die PanIN-Progression. Unsere Ergebnisse dienen dazu, einen neuen vielversprechenden Ansatz in der Therapie und Prophylaxe des Pankreaskarzinoms zu definieren und zu etablieren, weshalb weitere experimentelle und klinische Studien angeschlossen werden sollten. 84 VII. LITERATURVERZEICHNIS VII. LITERATURVERZEICHNIS Aarnio M., Mecklin J.P., Aaltonen L.A., Nystrom-Lahti M., Jarvinen, H.J. (1995). Life-time risk of different cancers in hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC) syndrome. Int. J. Cancer 64, 430-433. Abell K., Bilancio A., Clarkson R.W.E., Tiffen P.G., Altaparmakov A.I., Burdon T.G., Asano T., Vanhaesebroeck B., Watson C.J. (2005). Stat3-induced apoptosis requires a molecular switch in PI(3)K subunit composition. Nature Cell Biology 7, 392–398. Adler G., Seufferlein T. 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ABBILDUNGSVERZEICHNIS ABBILDUNGSVERZEICHNIS Abbildung 1: Morphologische Tumorprogression über PanIN-Vorläuferläsionen ................... 8 Abbildung 2: Morphologisches und genetisches Progressionsmodell des duktalen Pankreaskarzinoms. .................................................................................................................. 10 Abbildung 3: Gewebespezifische Deletion von Mausgenen mittels Cre/loxP-Technologie. .. 13 Abbildung 4: Systematik der Generierung des KrasG12D-Tumormausmodells. ....................... 16 Abbildung 5: Schematische Darstellung der SOCS3-Architektur. .......................................... 18 Abbildung 6: SOCS3 als Trägermolekül des E3-Ubiquitin-Ligase-Komplexes ..................... 18 Abbildung 7: Die Mechanismen der Aktivierung der IL-6/Jak/Stat3-Signalkaskade und dessen Feedback-Inhibition durch SOCS3-Moleküle .......................................................................... 19 Abbildung 8: Die Aktivierung der Ras/Raf/MAPK- und PI3K/AKT-Signalkaskade durch IL-6 und dessen negative Regulation durch Socs3........................................................................... 20 Abbildung 9: Schematische Darstellung der Generierung der Socs3Δpanc-Mauslinie. ............. 42 Abbildung 10: Nachweis der Deletion von Exon 2 im Socs3-Gen mittels mRNA Konzentrationsbestimmung ...................................................................................................... 43 Abbildung 11: PCR-Analysen der möglichen Genotypen aus der Kreuzung von Socs3F/F-und Ptf1a-Creex1-Mäusen. ............................................................................................................... 44 Abbildung 12: Charakterisierung des exokrinen und endokrinen Pankreaskompartiments. ... 45 Abbildung 13: Gewichtsanalyse der Socs3Δpanc- und Socs3F/F-Nachkommen. ........................ 47 Abbildung 14: Proteinbiochemischer Nachweis der Expression von Stat3 und p-Stat3 in Pankreata neun Wochen alter KrasG12D-Mäuse........................................................................ 48 Abbildung 15: Quantitative Real-Time-PCR Analysen der vermehrten Expression von Socs3mRNA in neunWochen alten KrasG12D-Mäusen. ..................................................................... 49 Abbildung 16: Immunhistochemische Detektion von Socs3 in Zellen der Azini (schwarze Pfeile) und in den PanIN-Läsionen (weiße Pfeile) neun Wochen alter KrasG12D-Mäuse. ....... 49 Abbildung 17: Aktivierung der Stat3-Signalkaskade im KrasG12D-Mausmodell. .................... 51 Abbildung 18: Proteinbiochemischer Nachweis der Socs3-Defizienz in KrasG12D;Socs3ΔpancMäusen. .................................................................................................................................... 53 Abbildung 19: Nachweis der Expression konstitutiv aktiver K-Ras-Proteine. ........................ 54 Abbildung 20: Gewichtsanalyse sechs Wochen alter KrasG12D;Socs3Δpanc-Mäuse (n=7) im Vergleich zu gleichaltrigen KrasG12D-Kontrollmäusen (n=7) und zum Wildtyp (n=17). ........ 55 Abbildung 21: Analyse des makroskopischen Pankreasaspekts. ............................................. 56 99 Abbildung 22: Morphologische Charakterisierung der PanINs und des PDA......................... 58 Abbildung 23: Vergleichende Auswertung der Gesamtzahl an Ausführungsgängen pro zehn Gesichtsfelder an mindestens 17 sequentiellen Schnitten vier Wochen alter Versuchstiere (200-fache Vergrößerung) ........................................................................................................ 60 Abbildung 24: Quantifizierung der reaktiven Gänge und PanIN-Läsionen pro zehn Gesichtsfelder in mindestens 17 sequentiellen Feingewebsschnitten zum Zeitpunkt von vier Wochen und bei 200-facher Vergrößerung .............................................................................. 61 Abbildung 25: Immunhistochemischer Nachweis der übermäßigen Expression von CK-19, p-Stat3 und Cyclin D1 in reaktiven Gängen und PanIN-Läsionen vier Wochen alter KrasG12D;SocsΔpanc-Mäuse. 100-fache Vergrößerung .............................................................................................................. 62 Abbildung 26: H.E.-Färbung des duktalen Adenokarzinoms des Pankreas und immunhistochemische Detektion von CK-19 und p-Stat3 in atypischen, drüsenartigen Gangstrukturen. .............................. 63 Abbildung 27: Detektion von Muc1, Muc5 und CK-19 in Pankreata vier und neun Wochen alten Mäusen mittels immunhistochemischer Färbung zur genauen Charakterisierung der neoplastisch transformierten Gänge. 100-fache Vergrößerung. .......................................................................... 64 100 IX. TABELLENVERZEICHNIS IX. TABELLENVERZEICHNIS Tabelle 1: Chemikalien ............................................................................................................ 24 Tabelle 2: Geräte und Hilfsmittel ............................................................................................. 26 Tabelle 3: Puffer und Lösungen ............................................................................................... 28 Tabelle 4: Gele ......................................................................................................................... 28 Tabelle 5: Antikörper für IHC .................................................................................................. 29 Tabelle 6: Antikörper für Western Blot ................................................................................... 30 Tabelle 7: Primer ...................................................................................................................... 30 Tabelle 8: Mäuse ...................................................................................................................... 30 101 X. DANKSAGUNG X. DANKSAGUNG Die Dissertation wurde an der II. Medizinischen Klinik und Poliklinik der Medizinischen Fakultät der Technischen Universität durchgeführt. An dieser Stelle bedanke ich mich bei all den Menschen, die am Zustandekommen dieser Dissertation beteiligt waren: Mein ganz besonderer Dank geht an meinen Doktorvater Herrn Priv.-Doz. Dr. Hana Algül, der mich herzlich in sein Forschungsteam aufgenommen und mir das überaus interessante und anspruchsvolle Thema dieser Arbeit zur Verfügung gestellt hat. Durch ihn ergab es für mich die Möglichkeit in einer hochprofessionellen Arbeitsgruppe tätig sein zu dürfen und auf fachlich höchstem Niveau Einblicke in die Grundlagenforschung zu erhalten. Desweiteren möchte ich mich bei meinem Doktorvater für seine Betreuung, Geduld, Motivation und konzeptionelle Unterstützung bei der Fertigstellung der Dissertation bedanken. Trotz seines weitreichenden Engagements sowohl im klinischen als auch wissenschaftlichen Bereich stand er mir zu jeder Zeit mit Rat und Tat zur Seite. Vielen herzlichen Dank! Dem Direktor der II. Medizinischen Klinik und Poliklinik Herrn Prof. Dr. med. R.M. Schmid danke ich für die Möglichkeit, in seiner Klinik promovieren zu dürfen. Bei Frau Marina Lesina und Frau Karen Dlubatz möchte ich mich besonders für die hochkompetente Einführung in die wissenschaftlich-experimentelle Arbeit des Gastroenterologischen Forschungslabors und ihre unerschöpfliche Geduld bedanken. Mit ihrer Hilfe war es mir möglich enorme praktische Kenntnisse und Erfahrungen zu gewinnen. Ebenso möchte ich mich bei all den wissenschaftlichen Mitarbeitern des Gastroenterologischen Forschungslabors für ihre Hilfsbereitschaft bedanken. Auch meinen Mitdoktoranden danke ich für ihre Unterstützung bei manchen Experimenten. Meinen Eltern Herrn Phan Nhan Hoa und Frau Chu Thi Minh Hao und meiner Schwester Phan Ngoc Trang danke ich für ihre Fürsorge, Liebe und Unterstützung. Ohne sie wären mein Medizinstudium und diese Promotion nicht möglich und ihnen möchte ich diese Arbeit widmen. Vielen Dank, liebe Eltern und Schwester! Bei meinem Freund Nico Brehm möchte ich mich für die tatkräftige Unterstützung nicht nur bei der Fertigstellung der Dissertation sondern auch bei zahlreichen Prüfungen bedanken. In 102 vielen schlaflosen Nächten war er die Person, die immer an meiner Seite stand und mich immer wieder psychisch und physisch aufbaut. Vielen, vielen Dank Nico! Mein letzter Dank geht an Herrn Andreas Kaiser, der diese Arbeit für mich Korrektur las. Herzlichen Dank für die ausgezeichneten und wertvollen Hinweise! 103 XI. ERKLÄRUNG XI. ERKLÄRUNG Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und unter Verwendung der angegebenen Hilfsmittel, persönlichen Mitteilungen und Quellen angefertigt habe. München, den 23.03.2014 104
