1 Einleitung
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1 EINLEITUNG 5 1.1 Allgemein 5 1.2 Die tumorspezifische Zelloberfläche im Blickpunkt für einen therapeutischen Ansatz 5 1.2.1 Kohlenhydrate 5 1.2.2 Lectine 8 1.2.3 Kohlenhydrat-Lectin-Interaktion 11 1.2.4 Die Bedeutung der Kohlenhydrat-Lectin Interaktion in der Tumorbiologie 14 1.3 Glycomimetika 25 1.4 Rationales Design mittels Molecular Modeling 29 1.4.1 Einleitung 29 1.4.2 Molecular Modeling 30 1.5 Drug Targeting- Konzept 33 1.5.1 Definition Drug Targeting 33 1.5.2 Definition Glycotargeting 34 1.5.3 Endogene Lectine als Drug Target 34 1.6 Anticancer Vakzine 35 2 ARBEITSHINTERGRUND UND ZIELSETZUNG 40 3 ERGEBNISSE 42 3.1 Synthese 42 3.1.1 Chemische Methoden der O-Glycosidierung 42 3.1.2 Diels-Alder (DA) Reaktion 44 3.1.3 Biotinylierte DA-Mimetika 46 3.1.3.1 Glycosidierung der Furan-Bausteine 46 3.1.3.2 Darstellung von biotinylierten DA-Mimetika 47 3.1.4 Synthese von 1, 3, 5 Trishydroxymethylcyclohexan- Mimetika (TMC) 49 3.2 Biologische Untersuchungen 51 3.2.1 Biotinylierte Oligsaccharidmimetika als diagnostische Werkzeuge 51 3.2.1.1 Einleitung 51 3.2.1.2 Evaluierung des diagnostischen Potentials der Kohlenhydratmimtika über die Fluoreszenzfärbung 52 3.2.2 Fluoreszenzfärbung histologischer Schnitte am Colon-Tumor und –Normalgeweben 60 3.2.3 Adhäsionsassay von TMC-Galactosiden und Furan-Galactosiden an B16F1 und B16F10Zellen 61 3.2.4 Invasionsassay in Boydens Invasionskammern 66 3.2.5 MMP Aktivitätsmessung über Zymogramm 68 3.2.6 Untersuchung auf Tyrosin-Phosphat 69 3.3 Molecular Modeling: 2-D Struktur-Aktivität-Studie 71 4 DISKUSSION UND AUSBLICK 81 5 ZUSAMMENFASSUNG 98 6 EXPERIMENTELLER TEIL 101 6.1 Materialien und Methoden 101 6.1.1 Materialien zur chemische Synthese und Analytik 101 6.1.2 Materialien und Methoden für die Zellkultur 103 6.1.2.1 Routine-Zellkultur 103 6.1.2.2 Fluoreszenzfärbung von adhärent wachsenden Zellen 105 6.1.2.3 Fluoreszenzfärbung von Schnitten aus Colontumor und Normalgewebe 106 6.1.2.4 Adhäsionsassay an extrazellulärem Matrix-Protein Fibronectin 106 6.1.2.5 Invasion-Assay in der Boyden-Kammer (semi-in vivo-Assay) 107 6.1.2.6 MMP-2 Protease Aktivitätsmessung am Zymogramm 108 6.1.2.7 Messung der Tyrosin-Phosphatase Aktivität von SKOV-3 Zellen 109 a. Proteinbestimmung nach Lowry im Mikromaßstab 109 b. SDS-Polyacrylamid-Gelektrophorese nach Laemmli (1970) 109 c. Färbung mit Coomassie 111 d. Western-(Protein-) Blotting 111 e. Immundetektion auf Proteinblots-Untersuchung auf Tyrosin-Phosphat 112 6.2 Synthesevorschriften 113 7 LITERATURVERZEICHNIS 124 8 VERÖFFENTLICHUNGEN 137 Abkürzungsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ad ABA °C δ BSA Bz CRD Cy DAPI DA DC DMEM DMF DMSO EDTA EE ESI FCS FITC Fuc Gal GalNAc GlcNAc GSL Hepes HPLC J KDa KG M mAb m/z Me mg ml mmol mM MS µmol µl NHS NMR p.a. PBS PE Rf RT SC Auffüllen auf Acrylamid-Bisacrylamid Grad Celsius Chemische Verschiebung in ppm (parts per million) Bovine serum albumin BenzoylCarbohydrate Recognition Domain Cyclohexan 4´, 6-Diamidino-2-Phenylindol Diels-Alder Dünnschichtchromatographie Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium Dimethylforamid Dimethylsulfoxid Ethylendiamintetraessigsäure Essigsäureethylester (Ethylacetat) Electrospray Ionisation Fötales Kälberserum Fluorescein Isothiocyanat Fucose Galactose N-Acetylgalactosamin N-Acetylglucosamin Glycosphingolipid N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N´-[2-ethansulfonsäure] High performance liquid chromatography Kopplungskonstante in Hz KiloDalton Kieselgel Molar (mol/L) monoclonal Antibody Masse-Ladungs-Verhältnis Methanol Milligramm (10-3 g) Milliliter (10-3 l) Millimol (10-3 mol) Masse/Volumenprozent Massenspektrometrie Mikroliter (10-6 mol) Microliter (10-6 l) N-Hydroxysuccinimid Nuclear Magnetic Resonance Pro analysi Phosphate buffered saline, isotinoscher Phosphatpuffer Petrolether Related to front Raumtemperatur Säulenchromatographie 3 Abkürzungsverzeichnis SDS-Page TMC TMS Triflat Tris Triton X-100 UV Sodium Dodecyl Sulfate Poyacrylamid Gelelelectrophoresis Trishydroxymethylcyclohexan Trimethylsilyl Trifluormethansulfonat Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan t-Octylphenoxypolyethoxyethanol Ultraviolett 4 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Allgemein Jedes Jahr erkranken weltweit mehr als zehn Millionen Menschen an Krebs- mehr als sechs Millionen sterben daran. Allein in der Bundesrepublik liegt die Zahl der Neuerkrankungen laut deutschem Krebsregister bei jährlich etwas 340 000 Männer und Frauen an Krebs, mehr als 210 000 sterben davon. Damit zählt Krebs, trotz der Fortschritte, die in der medizinischen Diagnostik und Behandlung in den vergangenen Jahrzehnten erzielt worden, sind mit den Herz-KreislaufErkrankungen zu den häufigsten Todesursachen [Krebsatlas]. Die herkömmlichen Behandlungsmethoden wie chirurgische Eingriffe, Chemotherapie und Bestrahlung haben sich nicht in allen Fällen als ausreichend erwiesen, um die heterogene Krankheit Krebs zu heilen. Eine große Bandbreite von Tumortypen können aufgrund ihrer Histologie unterschieden werden, aber auch im Tumor selbst herrscht keine Uniformität der Zellen vor. Bei der Entwicklung von therapeutischen Ansätzen gewinnen zellbiologische Targets immer mehr an Bedeutung in den essentiellen Forschungsgebieten wie die Untersuchung der Invasion, Metastasierung und der Zellmembran [Davis D, Tanneberger S, 1983]. 1.2 Die tumorspezifische Zelloberfläche im Blickpunkt für einen therapeutischen Ansatz 1.2.1 Kohlenhydrate Kohlenhydrate gehören neben den Lipiden, Proteinen und Nukleinsäuren zu den vier großen Naturstoffklassen. Die klassischen Funktionen der Kohlenhydrate wurden als Energiequelle (Glukose, Glykogen) oder als biologisches Baumaterial (Cellulose, Chitin) verstanden, und erst in den letzten 30 Jahren konnte durch die fortschreitende Entwicklung analytischer und synthetischer Techniken die Funktion der Oligsaccharidstrukturen von eukaryontischen Zellen verstanden 5 Einleitung werden. Oligosaccharidstrukturen liegen in der Natur meistens kovalent an Lipide oder Proteine gebunden vor. Die entsprechenden Moleküle werden Glykolipide und Glycoproteine genannt und unter dem Begriff Glycokonjugate zusammengefasst. Abb.1.2-1 Metabolische Umwandlung von Monosacchariden in der ER und im Golgi-Apparat. Präsentation von Oligosaccharidstrukturen auf Proteinen (und Lipiden), die in der Membran eingebettet sind [Bertozzi CR, 2001]. Abb. 1.2-2 (links) Vereinfachte schematische Darstellung der Lipid-Doppelschicht der Zellmembran einer eukaryontischen Zelle. Oligsaccharidstrukturen sind kovalent an Lipide und an Proteine gebunden. Glycolipide und Glycoproteine exponieren ihre Zuckeranteile auf der extrazellulären Seite der Plasmamembran. Der Oligosaccharidmantel einer Zelle wird als „Glycocalix“ bezeichnet. [Lindhorst TK, 2000] Oligosaccharidstrukturen können mit einem Protein auf zwei verschiedene Weisen verknüpft werden: a) durch die C-1 Bindung des N-Acetylgalactosamin mit 6 Einleitung der Hydroxyl-Gruppe des Threonins oder Serins über eine O-glycosidische Bindung oder b) durch die Verknüpfung von N-Acetylglucosamin am C-1 Nglycosidisch an Asparagin gebunden. Kohlenhydratedomänen von Glycoproteinen und –lipiden werden von einer Serie von Glycosyltransferasen im endoplasmatischen Retikulum und Golgi-Apparat synthetisiert. Des weiteren können Glycosidasen Kohlenhydratbausteine entfernen und damit die Oligosaccharidstruktur der Glycokonjugate modifizieren (s. Abb. 1.2-2). Kohlenhydrate besitzen ein enormes Potential biologische Informationen zu codieren, wie der Vergleich zu Peptiden verdeutlichen lässt. Während Nukleinsäuren und Proteine aus bifunktionellen Monomeren aufgebaut sind, werden Oligo- und Polysaccharide aus oligofunktionellen Molekülen zusammengesetzt. Diese können auf viele unterschiedliche Arten miteinander verknüpft werden. Führt die chemische Verknüpfung zweier bifunktioneller Peptidbausteine zu Monosacchariden zwei mögliche sogenannte Peptidstrukturen, lineare, als auch können vielfach aus zwei verzweigte Oligosaccharide entstehen. Eine Hexopyranose kann an fünf verschiedenen Hydroxygruppen mit einem anderen Zuckermolekül glycosidisch verknüpft werden, wobei dieser Glycosylierungsschritt zwei verschiedene stereochemische Resultate haben kann: die Ausbildung einer α- oder einer β-glycosidischen Bindung. So lässt sich danach errechnen, dass bei der glycosidischen Verknüpfung zwei verschiedener Hexapyranosen schon 20 mögliche Disaccharide gebildet werden. Durch die Variation der Verknüpfungsart in Oligosacchariden verfügt die Natur also über ein enormes Potential an struktureller Variabilität, so dass Zucker für die molekulare Codierung biologischer Informationen geradezu geeignet erscheint. Die so präsentierten Glycokonjugate spielen eine wichtige Rolle in der Zell-ZellKommunikation und Zell-Matrix-Interaktionen (auch Strukturproteine wie das Kollagen und Fibronectin sind glycosyliert). Die Glycocalix gibt jedem Zelltyp ein spezifisches Aussehen. Das Oligosaccharidmuster einer Zelle ist auch typisch für ihr Entwicklungsstadium und ihre Zelldifferenzierung. Auch pathologische Veränderungen und maligne Transformationen der Zellen gehen mit oft charakteristischen Veränderungen des Oligosaccharidmusters einher [Kobata A, 1998], so dass tumorassoziierte Oligosaccharide 7 (Tumor-Antigene) auch Einleitung diagnostisch für die Testung auf Krebszellen anwendbar sind. Auch die Blutgruppenzugehörigkeit wird von unterschiedlichen Oligosaccharidmustern auf den Erythrozytenoberflächen eines Individuums bestimmt. Die Blutgruppen A und B unterscheiden sich in den zugrundeliegenden Saccharidstrukturen. Es gibt noch zahlreiche Beispiele, die die bedeutende Rolle von Oligosaccharidstrukturen von Glycokonjugaten als Markermoleküle bei Zell-Zell- und Zell-Matrix- Erkennungsprozessen unterstreichen: Biologisches Ereignis Infektion Fertilisation Entzündung (Leukozyten Rekrutierung) Metastasierung Kohlenhydrat-Liganden auf Gastzelle Eier Leukozyten, Endothelzellen Zielorganen, maligne Zellen Lectin-Rezeptoren auf Mikroorganismen Spermien Endothelzellen, Leukozyten Maligne Zellen, Zielorgan (wahrscheinlich) Tab. 1 Wichtige biologische Erkennungsprozesse werden über Kohlenhydrat-Lectin-Interaktionen vermittelt 1.2.2 Lectine Proteine, die selektiv und spezifisch an Zuckerstrukturen binden, um die in ihnen gespeicherte Information zu decodieren, nennt man Lectine (Lateinisch: legere= wählen). Diese heterogene Proteinklasse [Gabius HJ, 1997] besitzt keine enzymatische Aktivität und unterscheidet sich von Immunglobulinen (Antikörper), die auch Zuckerstrukturen binden können. Die Fähigkeit von pflanzlichen Lectinen an Zucker zu binden und Aggregation zu induzieren ist schon seit Jahrhunderten bekannt. Jedoch erst 1960 als Peter Nowel ein Lectin mit dem Namen PHA (Phytohaemagglutinin) aus der Red Kidney-Bohne isolierte, die die Proliferation von peripheren Lymphozyten induzierte, begann eine intensive Forschung auf diesem Gebiet, der viele Aspekte der Zellbiologie eröffnete. Ursprünglich kannte man Lectine nur aus dem Pflanzenreich, später entdeckte man auch tierische endogene- Lectine (bei Mikroorganismen, Insekten und Menschen). Die Menge an Daten über endogene Lectine wächst von Jahr zu Jahr. Die wichtige Entdeckung des ersten Säugerlectins und seiner Interaktion mit Oligosaccharidstrukturen von Glycokonjugaten stammt aus den Siebziger Jahren. Endogene Lectine zeigen 8 Einleitung keine Homologien zu pflanzlichen Lectinen. Damals zeigten Ashwell und Morell, dass Sialoglycoproteine des Blutplasmas nach enzymatischer Desialylierung mit Neuraminidase terminale Galactose präsentierte, die dann vom Asialoglycoprotein-Rezeptor der Leberzellen erkannt wurde [Ashwell G, Harford J 1982]. Dieser Prozess erklärt den Mechanismus der Eliminierung alter Glycoproteine aus dem Blutkreislauf. Allgemein sind Lectine oligomere Proteine, die ein bis mehrere Kohlenhydrat erkennende Domänen oder CRDs (Carbohydrate Recognition Domaine) in ihrem Molekül aufweisen. Aufgrund von Gemeinsamkeiten ihrer CRD Primärstruktur werden sie in C-, S-, P- und I-TypLectine kategorisiert. Lectine eines Typs zeigen in der kohlenhydratbindenden Domäne (CRD) eine hohe Homologie der Aminosäuresequenz. Die CRD umfasst im Falle von C-Typ Lectinen etwa 135 Aminosäuren, beim S-Typ ist sie etwa 130 Aminosäuren lang. Die Gesamtstruktur der Lectine ist andererseits oft recht unterschiedlich und eher spezifisch für bestimmte Organe, Gewebe oder Spezies. C-Typ-Lectine Die Klasse der C-Typ-Lectine sind Ca2+ abhängig. Die C-Typ Lectine liegen entweder membrangebunden oder sezerniert vor. C-Typ Lectine haben eine oder mehrere CRDs und man hat nach heutigem Stand um die 50 endogene C-TypLectine identifiziert. Alle besitzen eine Ca 2+ abhängige Bindungsdomäne und ein hydrophobes Zentrum. • Collectin –Familie: Mannose bindende Proteine (MBP) • Mannose-Rezeptor (MR): Phospholipase A2 (PLA2), Dendritischer Zellrezeptor (DEC-205), MP-multi -Lectin Rezeptor • L-, E-, P-Selectine Galectine Diese Lectin-Klasse ist Ca 2+ unabhängig und gehört zu der Klasse der S-Typ- Lectine. Bis dato sind 10 Galectine identifiziert worden. Sie haben gemein, dass sie N-Acetylactosamine (Galβ1-nGlcNAc-R) primär über die Erkennung der β-Gal Einheit, binden. Die CRDs der Galectine sind hauptsächlich von drei Exons 9 Einleitung codiert, die ~20 - 40% Homologie aufweisen. Basierend auf ihrer CRD-Struktur unterteilt man Galectine in drei Gruppen: Galectin-1, -2, -5, -7,-10 besitzen nur eine CRD. Galectin-4, -6, -8, -9 bestehen aus sich zwei tandem-wiederholenden CRD Typen. Galectin-3 ist ein Abb. 1.2-3 Darstellung von C-Typ Säugerzelllectine. Repräsentative Strukturen von drei Gruppen von Membran-assoziierten Lectinen: Gruppe II, das Hühnerleber Lectin (homolog zum Mammalian Asialoglycoprotein Rezeptor); Gruppe IV, Selectin Zelladhäsion Molekül; und Gruppe VI, Makrophage Mannose Rezeptor. Group III Lectine (Collectine), wie Mannose-bindende Proteine, die in extrazellulärer Flüssigkeit zu finden sind. Group I CRD-besitzende Proteine wie Proteoglycane der extrazellulären Matrix. Andere Domäne dieser Moleküle schließen den EGF, epidermal growth factor-like repeats; CR, complement regulatory domains; FN-II, fibronectin type II repeats; COL, collagen-like sequences, GAG, glycosamino-glycan attachment sites; and HA, hyaluronic acid-binding domains mit ein [Weis, WI et al., 1992]. chimärer Typ und besitzt die terminale COOH-Gruppe am CRD, ein Amino Ende mit 12 asscelatorischen Resten und eine kollagenartige Domäne bestehend aus sich wiederholenden Sequenzen von Pro-Gly-Tyr. Galectine existieren sowohl intra- als auch extrazellulär und werden von der Zelle auch in löslicher Form sezerniert. Galectine sind involviert in verschiedenen Prozessen wie Zelladhäsion, Zellwachstumsregulation, Apoptose, Entzündung, Immunreaktion, Embryogenese, Angiogenese und Metastasierung [Perillo NL et al., 1998, Barondes SH et al., 1994, Rabinovich GA 1999, Cooper DN und Barondes SH, 1999, Nangia-Makker P, 2000]. 10 Einleitung P-Typ Lectine Lectine des T-Typs binden hauptsächlich an Monnose-6-Phosphate. Zu dieser Gruppe gehören die beiden transmembranen Mannose-6-phosphat Rezeptoren. Der 300 kDa Rezeptoren, der kationenunabhängig bindet, kommt als Monomer im Trans-Golgi-Netzwerk und an der Plasmamembran vor. Der 45 kDa Rezeptor bindet kationenabhängig und befindet sich lediglich im Trans-Golgi-Netzwerk. I-Typ Lectine Lectine des I-Typs zeichnen sich durch eine variable Anzahl extrazellulärer Domänen aus, die Immunglobulinen sehr ähnlich sind. Sie sind an Adhäsionsprozessen beteiligt und binden an saure Oligosaccharide. Bedeutende Vertreter dieser Klasse sind die ICAM (intracellular adhesion molecules). Zu den ITyp Lectinen zählt auch die Gruppe der Sialinsäure bindenden Siglecs. Als Vertreter dieser Gruppe wäre das Myelin-assoziierte Glycoprotein (MAG) zu nennen [Powell LD und Varki A, 1995]. 1.2.3 Kohlenhydrat-Lectin-Interaktion Der Informationstransfer in zellulären Systemen erfolgt auf molekularer Ebene vielfach über Oligosaccharid – Protein- Wechselwirkungen. Oligosaccharide besitzen wie schon in Abschnitt „Kohlenhydrate“ erwähnt aufgrund ihrer strukturellen Besonderheiten eine den Proteinen und Nucleinsäuren überlegene Speicherkapazität für biologische Informationen [Rüdiger H et al., 2000]. Als Rezeptoren stehen Kohlenhydrat-Lectin den Oligosacchariden Wechselwirkungen die bilden Lectine die gegenüber. Die molekularbiologische Grundlage für zahlreiche normale und pathologische Erkennungsprozesse wie zum Beispiel bei Zelladhäsionsvorgängen [Varki A, 1993]. So bindet der InfluenzaVirus über viruseigene Lectine, die Hämagglutinine, an terminale Sialinsäureeinheiten von Memranglycoproteinen und ermöglicht so die Invasion in die Wirtszellen [Colman PM et al., 1983; Burmeister WP et al., 1992]. 11 Einleitung Abb.1.2-4 Oberflächen Oligosaccharidstrukturen sind als Erkennungsstrukturen an vielen biologischen Prozessen beteiligt. Die Wechselwirkungen zwischen Oligosacchariden und Lectinen sind sehr spezifisch und stellen meistens Initialschritte für weitere Signalübertragungen dar, die im nächsten Schritt in eine stärkere Protein-ProteinBindung übergehen. [Wong CH, Homepage] Die Interaktionen zwischen Kohlenhydraten und Lectinen sind sehr spezifisch, jedoch binden die meisten Kohlenhydrate den Proteinrezeptor sehr schwach und die Assoziationskonstanten sind selten größer als 106 M-1. Aber gerade diese schwachen, nicht-kovalenten und doch sehr spezifischen Bindungen ermöglichen erst das sogenannte Rolling von Leukozyten entlang der Endothelzellwand bei Entzündungsprozessen. In der Initialphase verlangsamen sich die Leukozyten durch die Kohlenhydat - Protein (E-, P- und L-Selectine) -Interaktion. Die zweite Phase, die in der festen Adhäsion und Ausschleusung der Leukozyten resultiert, wird von Protein-Protein (Integrine)- Wechselwirkungen gesteuert (s Abb. 1.2-8). Man nimmt an, dass Sialyl –Lewis-X (sLex) als Ligand für die Selectine dient. In der Forschung dient das sLex deshalb als Referenzligand und Leitstruktur für die Synthese von Selectinblockern, die als Entzündungshemmer dienen sollen. 12 Einleitung Abb.1.2-5 x -links: Beispiele für sLe –Antagonisten. 6 hat 50 x höhere Aktivität zu E-Selectin und 7 zeigt 3 10 x höhere Aktivität x zu P-Selectin als sLe . -rechts: Multivalente Liganden binden A an oligomere Rezeptoren (Chelat Effekt); B durch Bindung am primären und sekundären Bindungsstellen vom Rezeptor; C durch resultierendes Clustern der Rezeptor an der Membran. [Bertozzi CR, Kiessling LL, 2001] Im Zusammenhang der schon oben erwähnten Interaktion zwischen InfluenzaVirus und Wirtszelle, die sehr spezifisch über die Kohlenhydrat – Lectin – Wechselwirkung stattfindet, ist die Bindungskonstante deutlich höher als 106 M-1 Bereich. Diese Beobachtung ist zurückzuführen auf multivalente Wechselwirkungen zwischen Lectinen und Oligosaccharidstrukturen. Liegen Saccharide des richtigen Typs in der richtigen Orientierung in multivalenter oder geclusterter Form vor, stellt man eine Erhöhung in Affinität und Spezifität zum korrespondierenden Proteinrezeptor fest. Diese Erhöhung ist unerwartet größer als das, was man durch lokale Konzentrationserhöhung (statistischer Effekt) erklären könnte. Dieses Phänomen wird als Cluster- oder Multivalenter Effekt bezeichnet. Lee et al., 1983 zeigte das beispielhaft an den Messungen der Bindungsaffinitäten zwischen dem Asialoglycoprotein-Lectin und synthetischen Galactosiden. Er demonstrierte, dass ein tetraantennäres Undecasaccharid eine 10 6 M-1 größere Avidität aufwies als die korrespondierende monoantennäre Struktur [Lee YC et al., 1983]. 13 Einleitung 1.2.4 Die Bedeutung Tumorbiologie der Kohlenhydrat-Lectin Interaktion in der Allgemein Ein Tumor entsteht durch eine Mutation, die nach mindestens einer Zellteilung als irreversibler Schaden erhalten bleibt, wenn sie vorher nicht repariert wurde (Initiation). Die Promotion bewirkt eine Selektion und klonale Expansion präneoplastischer Zellpopulationen, d.h. der Nachkommen initiierter Zellen. Die Umwandlung präneoplastischer Zellen und benigner Neoplasien in maligne Tumore, die invasive Eigenschaften aufweisen, wird als Progression bezeichnet. Die invasive Eigenschaft ermöglicht der Zelle die Intra- und Extravasation, um sich auf einem entfernten Organ anzusiedeln. Diesen Prozess bezeichnet man als Metastasierung. Abbildung 1.2-6 zeigt die relevanten Schritte in der Entwicklung von der Entartung eines benignen Tumors zum malignen Tumors. Dabei sind neben der Initiation, Promotion die Angiogenese, Invasion und Migration wichtige Schritte der Metastasierung und Focus für Grundlagenforschung und klinischen Anwendungen. MMP= Matrix Metalloprotease [Coussens LM, 2002] Den Tumor in seiner malignen Form zu bekämpfen ist immer noch eine große Herausforderung. Die großen Schwierigkeiten liegen darin, dass die Progression einen dynamischen Prozess darstellt bei der die Tumorzelle durch Selektion ihre Eigenschaften kontinuierlich ändert. Krebs ist keine uniforme Erscheinung und damit schwer therapierbar. 14 Einleitung Kohlenhydratstrukturen und Metastasierung Eine Vielzahl von Untersuchungen zeigten, dass der Metastasierungsprozess mit der Veränderung von Glycosylierungsprozessen einhergeht. Diese Veränderungen während der Progression können dann die Selektion zu mehr invasiven und metastasierenden Zellen steuern. Das Schema von S. Hakomori [1996] zeigt, dass das Stadium der Invasion und Metastasierung von Cell-Social Functions ausgeübt werden. Diese Funktionen umfassen die Zell-Zell- und ZellECM –Interaktionen (Extracellular Matrix) und werden von ZelloberflächenRezeptoren der Adhäsion/Erkennung, Hydrolasen und zum Teil von Rezeptoren der Wachstumsfaktoren und Hormonen reguliert. Die Rezeptor Expression und das Glycosylierungsmuster der BM (Basalmembrane) und EC (endothelial cell) verändern sich während der Metastasierung, so dass das Durchlaufen der verschiedenen Stadien der Metastasierung wie Adhäsion und Invasion ermöglicht werden kann. Das Schema von Hakomori S. (Abbildung 1.1-5) zeigt, dass die Cell-Social-Functions hauptsächlich durch Glycosylierung bestimmter Rezeptoren kontrolliert werden. Die Glycosylierung dient als Schalter für die Aktivierung und Deaktivierung eines Rezeptors bzw. sie ist maßgeblich an der korrekten Faltung bzw. Struktur des Rezeptorproteins beteiligt. Wird das Glycosylierungsmuster der Zellmembran, BM und EC verändert, können cell social functions aufgehoben werden und zur Autonomie der Zelle führen. Cell Social Functions (controlled mainly by glycosylation) Housekeeping Functions (controlled mainly by phosphorylation) Adhesion and motility receptors, hydrolasis Invasion Receptors controlling Transmembrane signaling Tumor growth Metabolism, respiration Translation,Transcription motility, cell cycle, etc. 15 Einleitung Abb. 1.2-7 Schematische Darstellung der Involvierung der Glycosylierung beim Metastasierungsprozess; BM, Basalmembran; DAG, Diacylglycerol; EC, Endothelial cells; ECM, extracellular matrix; PC, parenchymatous cells of organs; PLT, Platelet; TC, tumor cells;GSL,Glycosphingolipid; LAMP, Lysosme associated membrane protein 1. Tumorzelle verlässt Tumorverband abhängig von der E-Cadherin-Aktivität, die wiederum abhängig ist von der An-/Abwesenheit der ß1-6GlcNAc-Antenne. 2.TC-ECM/TC-BM-Interaktion hängt vom zwei TC-Membran-Rezeptoren ab: Integrin, CD44. Ihre Aktivität ist abhängig vom y Glycosylierungsgrad. 3.LAMP-1-Aktivität wird von Poly-LacNAc + H /Le Glycosylierung gesteuert. 4. Migration und Invasion geschieht auch im Zusammenhang der Integrin-Glycosylierung. 6. Expression von Selectin, ICAM und anderen Adhäsionsmolekülen. 7.Selectin und ICAM abhängige x a Adhäsion und Extravasation von TCs werden von Sle , SLe gesteuert. 8. Kontakt mit Zielorgan: dieser Schritt ist abhängig von der Glycosylierung verschiedener Adhäsionsmoleküle und Kohlenhydrat-bindenden Molekülen wie CD44, Cadherin, Integrin, Galectin und GSL [Hakomori S, 1996]. 16 Einleitung Verdeutlichen lässt sich das am Beispiel der N-Glykosilierung von Integrinen. Dort sorgt die N-Glycosylierung für die korrekte Zusammensetzung der α und β Untereinheiten der Integrine [Chammas R und Brentani R, 1991]. Die Überexpression von N-verknüpften multiantennären Glycanen verursachte eine permanente Aktivität der Integrine, wodurch die Interaktionen zwischen Tumorzelle und EC oder Tumorzelle und BM unterstützt und folglich die Intravasation in die Blutbahn erleichtert wird. Oligosaccharidstrukturen sind somit beteiligt an Zell-Zell und Zell-ECM-Interaktionen [Opdenakker G et al., 1993; Sharon N, 1980]. Die Zell-Glycosylierung hängt von der Expression und Funktion verschiedener Glycosyltransferasen und Glycosidasen ab. Transfektionsversuche mit Genen, die verschiedene Glycosyltransferasen codieren, zeigten in der Senseund Antisense Orientierung, dass eine Veränderung in der Oligosaccharidstruktur auf Zelloberflächen das Metastasierungspotential der Tumorzelle beeinflusst. Diesen Untersuchungen gingen Beobachtungen voraus, dass der Zuckeranteil der Glycokonjugate (Glycolipide und Glycosphingolipide oder Glycoproteine) von Tumorzellen Veränderungen im Muster aufwiesen. Es gibt zwei Hauptursachen für das veränderte Oligsaccharidmuster: Inhibierung der Kohlenhydratsynthese oder die De Novo Synthese. In Tumoren neuroectodermalen oder epithelialen Ursprungs wie Glioma, Melanoma und Brustkrebs hat man zum Beispiel eine Überexpression von GD3 Gangliosiden beobachtet [Hakomori S, 1985, Zeng G et al. 2000, Manfredi MG et al., 1999]. Ganglioside sind Sialinsäure-haltige Glycosphingolipide, die primär auf der Plasmamembran exprimiert sind und eine wichtige Rolle in Zellwachstum und Differenzierung spielen. Die neuesten Untersuchungen ergaben, das GD3 Ganglioside die Produktion von VEGF (vascular endothelial growth factor) stimulieren und somit an der Angiogenese beteiligt sind [Koochekpour S et al., 1996]. Weitere Analysen von membranverankerten Oligosaccharidstrukturen bei Tumorzellen zeigten, dass vielfach eine Überexpression von großen Nverzweigten Oligosaccharidstrukturen [Dennis JW et al., 1992; Fernandes B et al., 1991] in Brust- und Coloncarcinomen auftreten, die meistens β-1-6GlcNAc - verzweigte N-Glycane darstellen (tri- oder tetra- antennäre Oligosaccharide). Verantwortlich für die Überexpression von β-1-6 verzweigten N-verknüpften Oligosacchariden ist die erhöhte Aktivität von N-acetylglucosamyltransferase V 17 Einleitung (GlcNAc-TV). β-1-6GlcNAc- verzweigte N-Glycane stellen auch zusätzliche Lactosamin-Antennen dar, die eine terminale Verknüpfung mit Sialinsäure, die durch die erhöhte Aktivität der Sialyltransferase promoviert wird, ermöglichen. Folglich lässt sich so der erhöhter Gehalt an Sialinsäure auf der Zelloberfläche beim Coloncarzinom strukturell erklären. Die Sialinsäure als Indikator für die Bestimmung des Metastasierungspotentials von humanen Coloncarzinomzellen ist seit langem bekannt [Morgenthaler J et al. 1990, Harvey BE und Thomas P, 1993, Kijima-Suda I et al., 1986]. Einige Sialoglycokonjugate haben das Konzept der Carzinom assoziierten Sialin-Expression am Beispiel vom α2,6GalNAc Dissaccharid, auch bekannt als sialyl-Tn Antigen, verifiziert. Dieses Antigen kann als Prognose- Indikator durch immunhistochemische Methoden mit dem monoklonalen Antikörper TKH2 genutzt werden. Es ist dabei wichtig zu erwähnen, dass sialyl-Tn Antigen auch auf Normal- Colon Epithelium exprimiert ist, aber hierbei ist die Sialinsäure O-acetyliert und kann somit nicht vom monoklonalem Antikörper TKH2 detektiert werden. Auch die Veränderung in der Expression von Antigenen der Histo-Blutgruppe ABO und Lewis-Gruppen ist ein häufig beobachtetes Phänomen bei verschiedenen malignen Tumoren [Hakomori S, 1989]. Eine Reduktion oder ein komplettes Fehlen von A- und B-Antigenen der Histo-Blutgruppe wurden bei einigen humanen malignen Carcinomen wie Lunge und Blasenkarzinomen beobachtet [Mandel U et al. 1992; Orntoft TF, 1992; Lee JS et al., 1991; Yuan M et al., 1985]. Des weiteren zeigten Matsumoto, dass der Verlust von A und B Kohlenhydratstrukturen mit einer schlechten Prognose für Lungenkrebspatienten korrelierte [Matsumoto H et al. 1993]. Man nimmt an, dass eine reduzierte Expression von A und B-Kohlenhydratstrukturen mit höherem Invasions-und Metastasierungspotential der Tumorzellen einhergeht. Für eine Erklärung auf molekularer Ebene sorgte Ishikawa [Ishikawa D et al. 1998]. Er transfizierte Colonkarzinomzellen mit cDNAs der Transferasen der Blutgruppe A oder B und stellte eine stark reduzierte Motilität im Matrigel-Invasionsassay fest. Die Motilität wird größtenteils kontrolliert durch α3, α6, und β1 Integrine. Er vermutet daher, dass der Status der A und B Glycosylierung der Integrine Einfluss auf das Invasionspotential hat. Auch Chammas R et al., 1991 zeigten, dass die korrekte Ausübung der Integrin-Funktion nur durch N-Glycosylierung der Integrine 18 Einleitung stattfinden kann, denn die Glycosylierung gewährleistet die korrekte Faltung der αund β- Untereinheiten der Integrine [Hakomori S, 1996]. Auch die Antigene Lex, Ley (Lewis-Blutgruppe) sialyliert oder nicht, stehen im Blickpunkt der Krebsforschung . Man nimmt an, dass sie die Liganden für endogene C-Typ Lectine (Selectine) sind [Oriol R et al., 1986]. Diese Interaktionen spielen bei Entzündungsprozessen eine wichtige Rolle. Abb. 1.2-8 Schematische Darstellung des Entzündungsprozesses. Normalerweise bewegen sich die Leukozyten schnell im vaskularen Strom der Blutgefäße, ohne dass eine Wechselwirkung mit dem Endothel stattfindet. Durch Wechselwirkungen von Kohlenhydratabschnitten in Glycokonjugaten mit Selectinen kommt es zur Verlangsamung, dem sogenannten „Rolling“ von Leukozyten. Danach wird die feste Anheftung der Leukozyten durch Protein-Protein Wechselwirkungen möglicht, die durch die Interaktion aktivierter Leukozyten-Integrine mit dem Counter-Rezeptor ICAM-1 auf dem Endothel zustande kommt. Es kommt zum Stop und zur Durchtritt der Leukozyten in die Blutbahn [Lindhorst, 2000]. Leukozyten, die auf ihrer Zelloberfläche sLex exprimiert haben treten in Wechselwirkung mit den Selectinen der Endothelzellwand und die anschließende Extravasation wird durch Protein-Protein-Wechselwirkung vermittelt. Integrine auf den Leukozyten binden dabei an ICAM (intercellular adhesion molecules) auf den Endothelzellen. Man nimmt an, dass diese entzündungssteuernden Moleküle auch beim Metastasierungsprozess eine Rolle spielen, um die Intra- und Extravasation von Tumorzellen zu ermöglichen. So stellte sich heraus, dass Patienten mit Colonkarzinom und gleichzeitig hohem sLex (sialyl Lewisx) Expressionslevel eine schlechte Prognose hatten. Zusammengefasst deuten die Daten darauf hin, dass maligne Transformation oft mit Veränderungen der Zelloberflächen Oligosaccharidstrukturen korreliert. Die vielfach beobachtete Assoziation mit der Veränderung des Glycosylierungsmusters auf Tumorzellen (schon im frühem Stadium) und der Überlebensrate der Patienten zeigt, dass das Glycosylierungsmuster eine wichtige Rolle in der Tumorprogression einnimmt und die Richtung in mehr maligne Phänotypen dirigiert. 19 Einleitung Lectine und Metastasierung Zunehmend gibt es Hinweise darauf, dass Lectine eine Rolle in verschiedenen biologischen Prozessen spielen, wie bei der Zellproliferation, Apoptose, Zelladhäsion, im Immunsystem, beim Tumorwachstum und bei Metastasierungsprozessen. x a y Die Überexpression von sLe , sLe und Le in der Mehrheit der humanen Carcinomen von Colon, Blase, Brust und Lunge, veranlassten Untersuchungen zu ihren korrespondierenden Rezeptoren. Da sLex und sLea Selectin-Liganden (P-, E-, L-Selectin) sind, die bei Entzündungsprozessen miteinander in Wechselwirkung treten, sind viele Untersuchungen zum Expressionsmuster von P-, E- und L-Selectinen bei der Metastasierung gemacht worden. So zeigten metastasierende Zellen des Lungen-Adenocarcinoms HAL-8Luc und die Zelllinie x a H-59, die sLe und sLe überexprimieren, auch gleichzeitig eine hohe Adhäsion an E-Selectin [Brodt P et al., 1997]. Diese Adhäsion konnte sowohl mit anti-ESelectin mAb (monoclonal Antibody) x als auch mit mAb gegen sLe blockiert werden [Martin- Satue M et al., 1998]. Normale Endothelzellen exprimieren einen sehr geringen oder keinen detektierbaren Level an E- und P-Selectin. Diese Beobachtungen weisen darauf hin, dass nur bei Inokulation mit HAL-8Luc und H59 Zellen die E-Selectin Expression am Endothelium induziert wird und somit zur Erhöhung des Metastasierungspotentials beiträgt [Brodt P et al., 1997]. Die Begründung liegt vielleicht darin, dass die Produktion von IL-1 (Interleukin-1) und/oder TNF (Tumor Nekrose Faktor), die fähig sind, P- und E-Selectin auf Endothelzellen hochzuregulieren, durch die Tumorzellen angeregt wird. Tatsächlich hat man bei der Inokulation (in die Milz / portal) von H-59- und B16F1 Zellen, die in die Leber metastasieren eine höhere Konzentration von IL-1 und TNF in der Leber gemessen [Khatib AM et al., 1999]. Diese Studien unterstreichen, dass Tumorzellen den E-Selectin-Level auf Endothelzellen erhöhen können und dass diese Fähigkeit mit dem Metastasierungspotential korreliert. Des weiteren wirkte lösliches E-Selectin als Inhibitor für die Kolonisation der Lunge durch HT-29-Zellen (Colonkarzinomzellen). Interessanterweise besaß nur lösliches E-Selectin Anti-Metastasierungseffekte , aber nicht lösliches LSelectin, für das HT-29-Zellen auch Liganden besitzt. P-Selectin ist auf Blutplättchen und Endothelzellen [Varki A, 1994] und auf verschiedenen humanen 20 Einleitung Tumoren exprimiert [Stone JP et al., 1993]. Die Möglichkeit, dass P-Selectin eine Rolle im Metastasierungsprozess spielen könnte zeigte Kim [Kim YJ et al., 1998]. RAG Mäuse mit T- und B-Lymphozyten- Defizienz, aber NK Zell (natural killer cell) -Aktivität können normalerweise transplantierte Tumorzellen nicht abstoßen und entwickeln progressiv wachsenden Tumor. Handelt es sich bei den RAG-/Mäusen jedoch um P-Selectin knock-out Mäuse, entwickelten nur noch 2 von 9 dieser Mäuse (RAG - /-, P-Selectin -/-) einen Tumor. Diese Ergebnisse implizieren, dass P-Selectin die Metastasierung fördert. Bei RAG-/-, P-Selectin +/+ Mäusen hat man des weiteren beobachten können, dass die Tumorzellen mit den durch Thrombin aktivierten Blutplättchen aggregierten, jedoch die P-Selectin defizienten Mäuse keine rosettenförmige Aggregation der Tumorzellen zeigten. Die immunohistochemische Analyse von Lungengewebeschnitten nach Inokulation von LS180 Zellen ergab, dass der größte Teil der Tumorzellen komplett mit Blutplättchen bedeckt waren. Tumorzellen, die in den Blutstrom gelangen reagieren mit verschiedenen zell- und nicht-zell-Bestandteilen des Blutes und können dabei das Koagulationssystem aktivieren. Dies könnte dann zu Tumor Mikroembolien führen, die eine Disposition in entfernte Organe und die Formierung von Metastasen erleichtern [Gasic GJ et al., 1986]. Außerdem vermutet man, dass die Blutplättchen durch die Interaktion ihres P-Selectins mit den Liganden auf der Tumorzelle eine schützende Hülle um die Tumorzelle bilden und diese somit von NK-Zellen nicht erkannt werden. Mit dieser Taktik entkommen Tumorzellen dem Immunsystem. Auf diese Vermutungen basierend werden schon viele Anti-koagulierende Substanzen wie Heparin oder Warfarin eingesetzt, die die Metastasierung erkennbar inhibieren [Gorelik E et al., 1984; 1987]. Auch die Funktion von Galectinen bei Zell-Zell, Zell-ECM-Interaktionen und Zellmigration gewinnt mehr Metastasierungsprozessen. und mehr Galectin-3 an bindet zentraler Laminin, Bedeutung bei carcinoembryonale Antigene und Fc Rezeptoren für IgE. [Perillo NL et al., 1997; Ohannesian DW et al., 1995; Zhou Q und Cummmings RD, 1993]. Galectine sind auf normalen Zellen und auf der ECM zu finden. Auch maligne Zellen exprimieren Galectine. Des weiteren sind sie auch in löslicher Form bekannt. Maligne Zellen sind wie schon erwähnt gekennzeichnet durch die veränderte Oligosaccharidstruktur auf der 21 Einleitung Zellmembran, aber auch in der veränderten Expression von Galectinen [Raz A und Lotan R, 1987]. Erhöhte Expression von Galectin-3 korreliert mit neoplastischer Progression bei einigen Krebsarten in Kopf, Nacken und ZNS (Zentrales Nervensystem) [Schoeppner HL et al., 1995, Gillenwater A et al., 1996, Bresalier RS et al., 1997]. Die Veränderung in der Galectin-3 Expression hat einen Effekt auf die Interaktion zwischen korrespondierenden Liganden der normalen Zellen und Tumorzellen und auf die Fähigkeit der Tumorzelle, lokal zu wachsen und in verschiedene Organen zu metastasieren. Diese Vermutung wurde unterstützt durch Gen-Transfektionsexperimente. Gering metastasierende Colon Krebszellen (LS174T) wurden mit Galectin-3 cDNA transfiziert. Bei Inokulation dieser Zellen in Nacktmäuse beobachtete man ein höheres Metastasierungspotential dieser Zellen [Bresalier RS et al., 1998]. Eine andere Untersuchung zeigte, dass drei von fünf humanen Brustkrebs Zelllinien, die in Nacktmäusen wachsen konnten, auch Galectin-3 exprimierten, wohingegen die zwei Zelllinien, die nicht in Nacktmäusen wuchsen, kein Galectin-3 exprimierten. Als Kontrolle transfizierte man diese zwei Zelllinien mit Galectin-3 cDNA, die dann proliferierten. Ein Klon besaß sogar das Potential, in Nacktmäusen nicht nur zu wachsen, sondern auch in deren Lymphknoten zu metastasieren. [Nangia-Makker P et al., 1997]. Diese Ergebnisse lieferten somit weitere Beweise für die wichtige Rolle von Galectin-3 bei der Metastasierung. Weitere Untersuchungen bestätigten den Zusammenhang zwischen Überexpression von Galectin-3 und erhöhtem Metastasierungspotential, das gleichzeitig die Bildung von heterotypischen und homotypischen Zellaggregaten und erhöhtem Invasionspotential einschließt [Raz A und Lotan R, 1987, Raz A et al., 1989, Raz et al., 1990, Meromsky L et al. 1986]. Man vermutet, dass transfiziertes Galectin-3 anti-apoptotische Effekte induziert. In Experimenten wurde demonstriert, dass die Expression von Galectin3 bei Brustcarcinomzellen BT549, die, durch Cisplatin induzierte Apoptose inhibierte, ohne dabei den Expressionslevel der Pro-apoptotischen Familie der BCL2 Proteine (BAX, BCL-X) zu verändern. Dadurch werden optimale Bedingungen für das Überleben von Tumorzellen, Proliferation und Metastasierung geschaffen [Akahani S et al., 1997]. Des weiteren zeigten Galectin-3 transfizierte Zellen eine verstärkte Adhäsion an Laminin und Kollagen Typ IV mit einem gleichzeitig höheren Invasionspotential durch Matrigel 22 Einleitung (synthetische ECM) [Warfield PR et al., 1997, Le Marer N und Hughes RC, 1996, Cooper DN und Barondes SH, 1999, Barondes SH et al., 1994]. Die Ursache liegt wahrscheinlich in der erhöhten Interaktion zwischen Galectin-3 mit seinem natürlichen Liganden. Galectin-1 kann Laminin, Fibronectin, CD43, CD45 an T Lymphozyten und βLactosamin enthaltenden Glycolipiden binden, jedoch wurde bis dato keine Korrelation zwischen Galectin-1 und Kanzerogenität gefunden. Die Interaktionen zwischen Lectinen und Zuckern bei der Zelle Metastasierung können von zwei Seiten beleuchtet werden. Zum einen können tumorassoziierte Lectine mit dem KohlenhydratAnteil der Glycokonjugate, die auf normalen Zellen und auf der ECM Abb.1.2-9 Schematische Darstellung zeigt die möglichen Interaktionen zwischen (Tumor-) Zellen, Zelle und ECM via Proteinen/Lectinen und Oligosacchariden. [Kaltner H,1998] exprimiert wechselwirken sind, oder ähnlich können Lectine der normalen Zelle mit tumorassoziierten wechselwirken. Einfache Zucker wie D-Galactose und Arabinogalactan konnten signifikant die Bildung von experimentellen Lebermetastasen durch L-1 Sarkomzellen blockieren. Ähnliches beobachtete man bei B16 Melanomzellen, die mit Methyl- α-D-Lactose und Lacto-N-tetrose behandelt wurden [Beuth J et al., 1987, Oguchi H et al. 1990]. Eine andere Studie zeigte, dass homotypische Aggregationen von Zellen die Metastasierung fördern: Citrus-Pectin präsentiert im natürlichen Zustand eine verzweigte Kette aus komplexen Kohlenhydraten (50% Anhydrogalacturonsäure, 20% Galactose, 15% Arabinose) und im modifizierten Zustand eine lineare hauptsächlich aus Galacturonsäure bestehende Kette. Die Behandlung der B16F1 Melanomzellen mit natürlichem Citrus-Pectin führte zu einer 3-fach höhere Anzahl an Metastasen als die Behandlung mit modifiziertem Citrus-Pectin [Platt D und Raz A, 1992]. Die Behandlung mit modifiziertem CitrusPectin inhibierte sowohl die Adhäsion an Laminin als auch die homotypische Zellaggregation. Fazit ist, dass eine positive Korrelation zwischen homotypischer 23 Einleitung Zellaggregation und Metastasierungpotential in vitro existiert [Raz A et al., 1980]. Die Erklärung klingt plausibel, denn die Tumorzellaggregationen erhöht die Embolisierung in der pulmonären Vaskulatur. Homotypische Aggregationen könnten zum einen via Integrin-Ligand erfolgen [Qian F et al., 1994], zum anderen über die Lectin-Kohlenhydrat-Interaktion von Tumorzellen oder durch Brückenbildung zwischen Tumorzellen durch Serumglycoproteine [Inohara H und Raz A, 1995]. Darüber hinaus zeigte Galectin-3 noch einen anderen Effekt in in vitro Experimenten, nämlich die Anregung zur Blutkapillarbildung und chemotaktischer Reaktion der Endothelzellen. Ebenso konnte eine in vivo Vaskularisierung beobachtet werden. Galectin-3 wirkt also als AngiogeneseStimulator [Nangia-Makker P et al., 2000]. Diese Stimulierung konnte kompetitiv mit Lactose und mit modifiziertem Citrus Pectin inhibiert werden. Diese Versuche legen nahe, dass Galectin-3 an der Angiogenese beteiligt ist und damit das Tumorwachstum und die Metastasierung fördert. MBP (Mannose bindendes Protein) und MR (Mannose Rezeptor) und Metastasierung Eines der prominentesten C-Typ-Lectine ist das MBP. MBP spielt eine wichtige Rolle bei der frühen Immunabwehr, in der MBP mit fremden Oligosacchariden auf pathogenen Organismen wechselwirkt und so zur Aktivierung der Komplementkaskade beiträgt, die letzlich zur Opsonisierung führt. MBP gehört zu der bisher relativ begrenzten Anzahl von Lectinen, die kristallisiert und deren Röntgenstruktur aufgeklärt werden konnte. Abb. 1.2-9 Die CRDs (Carbohydrate Recognition Domain) des MBP (Mannose Binding Receptor) sind identisch. Die Abstände der Kohlenhydrat Bindungsstellen (gezeigt in der Vergrößerung) von MBP liegen zwischen 4.5 and 5.3 nm. [Dwek RA, 1996] 24 Einleitung Einige experimentelle Daten zeigten, dass der rekombinante Vaccini Virus mit humanem MBP Gen signifikant das Tumorwachstum bei Mäusen inhibieren konnte, die zuvor mit SW1116 Coloncarzinomzellen inokuliert wurden, [Ma Y et al., 1999]. Dies unterstreicht den unabhängigen Mechanismus des Anti-TumorEffekts von MBP. MR ist ein 175 kDa Transmembranglycoprotein, das auf Makrophagen und dendritischen Zellen vorkommt. MR besitzt acht tandemartig angeordnete CRDs (Carbohydrate Recognition Domain), die Mannose, Fucose und GlcNac binden können. MR ist auch auf bestimmten Zelltypen der Endothelzellen exprimiert und könnte die Organ- oder Gewebsspezifität bestimmter metastasierender Zellen erklären. Werden B16 Zellen mit 1-DMM (1-deoximannojirimycin) behandelt, exprimieren sie verstärkt High mannose type Oligosaccharide auf ihrer Zelloberfläche. Das führt zu einer erhöhten Adhäsion an HSE-Zellen (Endothelzelltyp) im Vergleich zu den parentalen Zellen. Diese Adhäsion konnte mit anti -VCAM-1 und mit IL-1 Antagonisten inhibiert werden. VCAM-1 ist der Ligand für das VLA-4 Integrin, das von B16-Zellen exprimiert wird. Für die erhöhte Adhäsion der B16-Zellen an Endothelzellen macht Mendoza die Bindung der Tumorzellen an MR verantwortlich, wodurch die Produktion von IL-1 anregt wird. IL-1 wiederum induziert die VCAM-1 Expression auf Endothelzellen. VCAM-1 bindet dann an das Integrin VLA-4 der B16-Zelle und trägt zum Tumorarrest, zur Extravasation und letzten Endes zur Metastasierung bei [Mendoza L et al., 1998]. 1.3 Glycomimetika Chemische Synthesen ermöglichen die Vereinfachung und Variation natürlicher Vorbildstrukturen, die dann besser und billiger zugänglich werden. Dabei gelingt es häufig, gleichzeitig neben der strukturellen Vereinfachung wichtiger Moleküle, auch deren biologische Wirksamkeit und Spezifität zu erhöhen. Nach dem Vorbild natürlich vorkommender Kohlenhydratanaloga werden Verbindungen als abgewandelte Glycomimetika bezeichnet. synthetische Sie können strukturell oft recht weit von den natürlichen Vorbildern entfernt sein (s. Abb. 1.25). Mit der bedeutenden Rolle von Kohlenhydraten in vielen biologischen 25 Einleitung Prozessen, insbesondere die kohlenhydratvermittelten Erkennungsfunktionenergaben sich eine Vielzahl an Möglichkeiten zur therapeutischen Intervention in pathogenen Prozessen, aber die Entwicklung von Pharmaka auf Kohlenhydratbasis verlief bisher deutlich langsamer als vorhergesagt. Zum einen bereitet die Analytik von komplexen Oligosaccharidstrukturen, die durch die Mikroheterogenität der Glycostrukturen in vivo zusätzlich erschwert wird, große Probleme, zum anderen ist die chemische Synthese komplexer Kohlenhydrate aufgrund der Polyfunktionalität äußerst anspruchsvoll und lässt eine Vermeidung von Schutzgruppen-Techniken meistens nicht zu. Darüber hinaus besitzen Kohlenhydrate prinzipiell ungünstige pharmakologische Eigenschaften [Toone EJ, 1994; St Hilaire PM et al., 1994]. Diese Eigenschaften beinhalten die geringe Affinität zu ihren Proteinrezeptoren, die Inaktivität bei oraler Aufnahme und die geringen Halbwertzeiten in vivo durch den enzymatischen Abbau durch Glycosidasen. Es gelten daher folgende Anforderungen an Glycomimetika, die die Funktionen natürlicher Glycostrukturen imitieren, ohne die oben genannten Nachteile zu besitzen. • Verbesserte biologische Aktivität; in der Regel durch Erhöhung der Affinität zu Proteinen bzw. Proteinrezeptoren. • Erhöhte in vivo Stabilität, z. B. gegenüber enzymatischem Abbau • Vereinfachte Strukturen durch vereinfachte Synthesestrategien, die eine schnelle und billige Zugänglichkeit. • Verbesserte pharmakologische Eigenschaften, um z. B. die Verfügbarkeit am Wirkort zu verbessern oder die Applikationsform zu vereinfachen. Geeignete Mimetika eröffnen somit neue Ansätze für eine erfolgreiche und gezielte Bekämpfung von bisher nur schlecht therapierbaren Krankheiten. Darüber hinaus können sie durch Modulation oder Inhibition spezifischer biologischer Vorgänge dazu beitragen, die oftmals unbekannten molekularbiologischen Grundlagen vieler Oligosaccharid- vermittelten Prozesse aufzuklären. Die Struktur des Mimetikums ist von entscheidender Bedeutung für seine Funktion. Zwischen der als Vorbild dienenden Verbindung und dem entsprechenden Mimetikum muss hierbei nicht notwendigerweise eine große strukturelle Ähnlichkeit bestehen, entscheidend 26 ist vielmehr eine enge Einleitung Funktionsverwandtschaft [Gruner SAW et al., 2002]. Als bevorzugter Ansatz hat sich bisher das rationale Design, wie das Molecular Modeling von Mimetika bewährt. Ausgehend von einer natürlichen Vorbildstruktur werden durch gezielte Modifikationen und Vereinfachungen neue Strukturen erhalten und durch geeignete Assays auf ihre biologische Wirkung untersucht. Die so erhaltenen Daten können dann bei einer weiteren Strukturoptimierung berücksichtigt werden. Als Alternative haben sich auch bei der Entwicklung von Glycomimetika kombinatorische Ansätze als sinnvoll erwiesen. Vor allem in Fällen, in denen Kohlenhydrat-Rezeptorwechselwirkungen unklar sind und ein rationales Design folglich schwierig, konnten biologisch aktive Glycomimetika durch Entwicklung von Substanzbibliotheken erhalten werden [Martens CL et al., 1995]. Glycomimetika lassen sich, entsprechend ihres Funktionskonzepts in zwei Gruppen unterteilen [Sears P und Wong CHJ, 1998], obwohl eine strenge Zuordnung nicht immer möglich ist: • Mimetika, die Lectin- bzw. Selectin-spezifische Oligosaccharidepitope nachahmen und somit eine direkte Intervention in biologische Prozesse durch kompetitive Bindung an spezifischen Rezeptoren ermöglichen. • Mimetika, die durch Modulation bzw. Inhibition von Enzymen, die an der Biosynthese von Oligosaccharidstrukturen beteiligt sind, eine Intervention in biologische Prozesse ermöglichen. Die Synthese von Gycomimetika ist ein wesentlicher Schritt auf dem Weg zu Wirkstoffen auf Kohlenhydratbasis, die sich prinzipiell als Therapeutika für Krankheiten eignen, die mit der Funktion von Kohlenhydraten kausal zusammenhängen. Eines der derzeit am intensivsten bearbeiteten Gebiete der Glycomimetika-Forschung ist die Synthese und Untersuchung von E-, P- und LSelectinen-bindenden Strukturen auf Kohlenhydratbasis [Simanek EE et al., 1998], um Erkrankungen zu bekämpfen, die mit akuten und chronisch entzündliche Prozessen einhergehen, wie Rheumatismus, Psoriasis, oder Dermatitis. Die natürliche Oligosacchariddeterminante, die von diesen Membranproteinen erkannt wird, ist das Sialyl-Lex-Tetrasaccharid (s. Abb. 1.2-2) [Kiefel MJ und von Itzstein M, 2002]. Es gibt eine Reihe von Ansätzen, die die Inhibierung des 27 Einleitung initialen kohlenhydrateabhängigen Adhäsionsschritts am Endothel durch hochaffine sLex-Mimetika anstreben soll, jedoch ist bis heute der große Duchbruch nicht gelungen. Es gibt schon eine Reihe von Mono- und Disaccharid Mimetika, die virale und bakterielle Infektionen bekämpfen. Zum Beispiel die Neuraminidase-Hemmer Zanamivir® (4) und Oseltamivir ® (5) [von Itzstein M et al., 1993, Kim CU et al., 1997]. (s. Abb.1.3-1). Sie imitieren das Glycosyl- KationIntermediat 2, das während der Hydrolyse der terminalen Sialinsäure entsteht und hemmen die Enzymfunktion und damit die Anbindung des Virus an die Wirtszelle. Abb. 1.3-1 Die Neuraminidase des Influenza Virus katalysiert die Hydrolyse der terminalen Sialinsäure und ermöglicht somit den Transport des Virus in den Mucus des Atemtraktes [Vogel P 2001]. Multivalente Glycomimetika Unter Berücksichtigung der Multivalenz von Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkung wurden zahlreiche Glycomimetika als multivalente Glycokonjugatstrukturen synthetisiert, welche möglichst die natürlichen, mutivalenten Glycokonjugatmoleküle der Glycocalix imitieren und einen Multivalenzeffekt 28 Einleitung hervorrufen sollen. Dabei ist es ohne Kenntnis der genauen Rezeptorstruktur schwierig, die Stereochemie der multivalenten Liganden genau vorherzusagen und die einzelnen Liganden in einem Ligand-Cluster strukturell optimal zu organisieren. Meistens verlässt man sich auf die Variation der Cluster-Strukturen, z. B. bezüglich der Länge verwendeter Spacer oder der Zahl der Zuckerbausteine, um zu möglichst potenten Verbindungen zu gelangen. Ein höherer Multivalenzgrad ist aber nicht unbedingt mit höherer „Wirkung“ oder mit höherer Affinität gleichzusetzen [Lundquist JJ und Toone EJ, 2002]. Der Cluster-oder Multivalenz Effekt setzt sich aus vielen anderen Mechanismen zusammen wie die intramolekulare oder Chelat-Bindung, die intermolekulare aggregative Bindung und die sterische Stabilisierung. Die Wahl der richtigen Kohlenhydratbausteine, in der richtigen räumlichen Orientierung, erhöht die Bindungsaffinität zum Rezeptor. Kleinere aber strukturell wohldefinierte Glycocluster besitzen den Vorteil, dass sich ihre biologische Aktivität auf ihre strukturelle Basis zurückführen lassen (s. Abb. 1.2-5). 1.4 Rationales Design mittels Molecular Modeling 1.4.1 Einleitung Günstige Vorraussetzungen für ein rationales Drug Design ist die Kenntnis der tertiären Struktur des Proteins und idealerweise die Kristallstruktur mit komplex gebundenem Liganden, um die wesentlichen Wechselwirkungen auf atomarer Ebene zu identifizieren und zu optimieren. Die Suche nach einem potenten „Hemagglutinin-Inhibitor“ mittels Informationen aus der Kristallstrukturanalyse ergab bis dato nicht den gewünschten Erfolg. Mittlerweile ist es jedoch, u.a. durch Einsatz von Computermethoden gelungen, einen Wirkstoff auf Kohlenhydratbasis zu entwickeln, der selektiv die Bindungstaschen der Neuraminidase blockiert [von Itzstein M et al., 1993; Taylor NR und von Itzstein M, 1996] (s. S.24, Abb. 1.3-1). Ausgangsbasis für ein rationales Drug Design war auch hier die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur der Neuraminidase und die Entschlüsselung der Wechselwirkung durch Molecular Modeling Methoden [Colman PM et al., 1987]. Auch im Bereich der Krebsentstehung spielen die Wechselwirkungen zwischen 29 Einleitung Kohlenhydraten und Proteinen eine wichtige Rolle, daher ist die Aufklärung der Erkennungsprozesse zwischen Oligosacchariden und Lectinen einerseits, Antikörpern oder Enzymen andererseits von zentraler Bedeutung auf diesem aktuellen Forschungsgebiet [Sharon N, 1998, Gabius HJ, 1997, Dwek RA, 1996]. Leider sind nur wenige Kristallstrukturen zuckerkennender Proteine bekannt, weil die Bindungsaffinität zwischen Oligosacchariden und Proteinen sehr schwach ist und folglich die Proteine mit LIgand für eine Kristallstrukturanalyse schwer zugänglich sind. Virus Kohlenhydrat Lectin Rezeptor Zelloberfläche a b c Abb. 1.4.-1 a. Virus blockiert durch hochaffine Kohlenhydrate, b. Virus-Zellrezeptor-Bindung c. Virus-Bindung blockiert durch hochaffine Lectine Außerdem liefern Kristallstrukturanalysen nur ein statisches Bild der Moleküle, die das dynamische Verhalten (Konformationsänderungen, intermolekulare Stöße) vieler biologischer Funktionen nicht widerspiegeln. Diese Informationen lassen sich durch NMR-Methoden oder Molecular Dynamics (MD)-Simulations erhalten. MD-Simulationen finden daher zur Simulation von Biomolekülen eine breite Anwendung [van Gunsteren WF und Berendsen HJC, 1990; Levitt M und Sharon R, 1988; Siebert HC et al., 1996; Böhm HJ et al.,1996]. 1.4.2 Molecular Modeling Die Simulation molekularer Strukturen vom Pharmakon, Rezeptor und ihrer Komplexe ist ein beliebtes Feld in Drug Design. Diese Vorgehensweise zielt darauf ab Struktur-Aktivitätsbeziehungen auf dem atomaren Level aufzuklären. 30 Einleitung Ein verbessertes Verständnis dieser Beziehungen kann dann als Leitfaden für neue Moleküle mit spezifischen pharmakologischen Eigenschaften dienen. Die oftmals unbekannte Rezeptorstruktur führte dazu, große Substanzbibliotheken mit multivalenten Strukturen aufzubauen, in der Hoffnung hochaffine Liganden zu generieren. Molecular Dynamics Simulation (MD) Bei der Protein-Ligand-Wechselwirkung spielt die Flexibilität beider Partner eine wichtige Rolle. Vorraussetzung für die Bindung des Liganden ist, dass er eine Konformation einnehmen kann, die der Gestalt der Proteinbindetasche entspricht. Umgekehrt sind auch Proteine in gewissem Umfang flexibel. Zum Beispiel können die an der Oberfläche befindliche Seitenketten unterschiedliche Konformationen einnehmen oder ganze Domänen können sich relativ zueinander bewegen. Die MD ist ein theoretisches Verfahren zur Beschreibung dieser Effekte. Das Prinzip der MD besteht darin, die Bewegung einer endlichen Zahl von Atomen bzw. Molekülen (10-105) unter der Einwirkung des gewählten Kraftfelds zu verfolgen. Bei der Rechnung wird angenommen, dass die Wechselwirkung zwischen den Teilchen den Gesetzen der klassischen Mechanik folgt. Die Newtonschen Bewegungsgleichungen werden hierbei mit einem numerischen Verfahren schrittweise für alle Teilchen gleichzeitig gelöst. Meist wird angenommen, dass die zwischen zwei Teilchen wirkende Kraft nicht von weiteren Teilchen beeinflusst wird. Logische Operationen mit Molekülvolumina Welche Hinweise sind aus solchen Berechnungen zu entnehmen? Als Arbeitshypothese ist anzunehmen, dass ein Molekül nur dann an einen Rezeptor gebunden wird, wenn seine Größe den dort maximal verfügbaren Platz nicht überschreitet. Um sich ein Bild darüber zu verschaffen, betrachtet man das gemeinsame Volumen aller Derivate. Eine mögliche Erklärung für die fehlende Aktivität eines Moleküls kann sein, dass es Bereiche in der Bindetasche besetzten müsste, die bereits vom Protein eingenommen werden. Volumenvergleiche zwischen aktiven und inaktiven Derivaten liefern Hinweise auf die mögliche Gestalt der Rezeptortasche. Man muss also herausfinden, welche Gruppen vom 31 Einleitung Ligand und Rezeptor einander entsprechen und so den Pharmacophor definieren. Es wird zudem ein Verfahren benötigt, das die Moleküle in Konformationen bringt, in denen äquivalente Gruppen des Pharmacophors im Raum analog orientiert werden. Pharmacophorvergleiche Active Analog Approach ist ein Verfahren, dass eine Konformationsanalyse mit der Suche nach dem Pharmacophor verbindet. Wirkstoffe wechselwirken, wie oben schon erwähnt, mit Rezeptoren auf sehr spezifische Art und Weise. Deshalb ist es durchaus möglich, dass nur Teilstrukturen der Leitverbindung an relevanten Wechselwirkungen beteiligt sind. Die relevanten Gruppen eines Moleküls, die mit einem Rezeptor wechselwirken und für die Aktivität verantwortlich sind, werden als Pharmacophor bezeichnet. Das Pharmacophor ist damit für die Initiierung des biologischen Effekts verantwortlich. In Kombination mit einem molekülgraphischen Vorgehen, wie dem Molecular Modeling können Pharmacophor-Modelle gezeichnet werden, die die charakteristischen Eigenschaften des Moleküls (Winkel und Abstände der Erkennungseinheiten) geometrisch darstellen. Dieser Schritt basiert auf 2DStruktur-Aktivitätsstudien, in der Atome und/oder funktionelle Gruppen der Leitstruktur schrittweise verändert und dann diese Veränderungen in einer biologischen Antwort gemessen werden. Diese Daten lassen nicht nur Rückschlüsse auf die Rezeptorstruktur zu, sondern dienen auch als Plattform für die Entwicklung von maßgeschneiderten Mimetika. Als erstes muss man allen Molekülen eines Datensatzes einen Pharmacophor zuweisen. Es ist zu definieren, welche Gruppen zueinander äquivalent sein sollen. Dann führt man für das erste Moleküls des Datensatzes eine systematische Konformationssuche durch. Während der Suche bestimmt man in jeder eingestellten Geometrie die Abstände zwischen den funktionellen Gruppen des Pharmacophors. Diese Abstände werden gespeichert. Aus den Datensätzen ergeben sich die möglichen Bindungsgeometrien der pharmacophoren Gruppen in den Liganden [Marshall GR et al., 1979]. 32 Einleitung 1.5 Drug Targeting- Konzept 1.5.1 Definition Drug Targeting Drug Targeting Strategien können in zwei Kategorien eingeteilt werden: „Pro Drug-Targeting“ und „Carrier vermitteltes Targeting“. Der Pro Drug wird erst am Wirkort in die aktive Form umgewandelt. Beim Carrier vermitteltem Targeting unterscheidet man zwischen „aktivem“ „und passivem“ Targeting. Wird der Ligand am Wirkort vom Rezeptor erkannt bezeichnet man diesen Mechanismus als „aktiv“, während beim passivem Targeting die physikochemischen Eigenschaften des Drug (Wirkstoff)/Carrier-Komplexes zu einer Internalisierung und folglich einer selektiven Akkumulation in den Zielzellen führt und dabei die anderen Zellen, die durch eine andere Beschaffenheit der Zellmembran den Komplex nicht aufnehmen können, ausschließt [Wadhwa MS und Rice KG, 1995]. Für eine erfolgreiche in vivo Therapie muss die Identifizierung des Wirkortes, die Endozytose und die Internalisierung des Wirkstoffes in die Zielzelle gewährleistet sein [Ghose TI und Blair AH, 1987; Pimm MV 1988, Koppel GA 1990; Vaickus L und Foon KA, 1991; Kosmas C et al., 1993; Weigand M et al., 2001]. Gezielte Abgabe des Wirkstoffes beinhaltet zudem auch Design und Synthese von Carriern mit Liganden, die als Drug/Carrier-Komplex vom Rezeptor erkannt und internalisiert werden. Monoklonale Antikörper (mAb), Albumin, Transferrin, Insulin, epidermale Wachstumsfaktoren und Biotin sind Beispiele für Biomoleküle, die einem solchen Drug Targeting Konzept Verwendung finden. Die Erwartungen, dass mAb diese Parameter besitzen würden und als programmierbare „magic bullets“ (Ehrlich P, 1906) dienen könnten, blieben unerfüllt. Beim Einsatz von mAbs wurde die heterogene Expression von Tumorantigenen auf Zelloberflächen der Tumorzellen nicht berücksichtigt (Hoch-und Runterregulierung), die zur Selektion bestimmter Tumorzellen führt. 33 den /oder Einleitung 1.5.2 Definition Glycotargeting Das Targeting Potential mit Kohlenhydraten gewinnt immer mehr an Bedeutung. Kohlenhydrate sind wegen ihres geringen Molekulargewichts attraktive Drug Targeting Kandidaten. Ihre strukturelle Diversität kombiniert mit dem Potential eine große Anzahl von Zielrezeptoren zu adressieren und ihre Möglichkeit der Internalisierung über rezeptorvermittelter Endocytose befürworten das Glycotargeting Konzept [Shen TY 1987; Monsigny M et al., 1988a; Karlsson KA, 1991; Lerchen HG et al., 2000]. Kohlenhydrate werden an Zellen gebunden und über membrangebundene Lectine internalisiert. Die Kohlenhydrat-Lectin- Interaktion ist beschrieben unter 1.2.3. Biologisch aktive Oligosaccharide sind meistens Glycokonjugate (Glykolipide, -proteine), die die Bioverfügbarkeit und die Serum-Halbwertszeit kontrollieren und Zell-Zell-/Zell-ECM-Interaktionen vermitteln. Es sind schon eine Reihe von zellmembrangebundenen Lectinen bekannt, die zusammen mit ihren Liganden endozytiert werden und die Kohlenhydratliganden den Lysosomen zuführen [Ashwell G und Harford J, 1982; Wileman T et al., 1985]. Da Lectine terminale Kohlenhydrate erkennen und binden können, läuft die Endozytose relativ unbeeinflusst von der Größe und Komposition der Aglykone ab. Folglich können Kohlenhydratliganden an Wirkstoffe gekoppelt werden, um sie als trojanische Pferde in die Zielzelle einzuschleusen. 1.5.3 Endogene Lectine als Drug Target Ashwell und seine Mitarbeiter haben das erste endogene Lectin entdeckt, als sie die Clearance von alten Plasmaglycoproteinen untersuchten. Ausgediente Plasmaglycoproteine werden von Exoglycosidasen durch die Entfernung des terminalen Sialinsäurerests gekennzeichnet. Dadurch tragen sie Galactosereste, die durch die Bindung an Galactose-spezifischen Rezeptoren der LeberHepatozyten eliminiert werden. Dieses Leberlectin ist heute als Ashwell-Rezeptor bzw. Asialoglycoproteinrezeptor (ASGP-R) (s.Abb. 1.2-3 Gr.II) bekannt. ASGP-R bindet und internalisiert die meisten Galactose tragenden Liganden, doch konnte Lee zeigen, dass die Bindungsaffinität stark von der Struktur der Galactose-Liganden abhängt [Lee YC et al., 1983]. Mono- und divalente 34 Einleitung Galactoside hatten Dissoziationskonstanten im millimolarem Bereich und sind somit irrelevant für ein Drug Targeting Konzept, wohingegen Liganden, die einen Cluster von drei Galactose-Resten tragen, die Dissoziationskonstante iin den nanomolaren Bereich erhöhen konnten. Diese Ergebnisse korrelierten gut mit der Struktur des ASGP-R, denn der Rezeptor besitzt drei Untereinheiten mit jeweils einer Galactose-Bindungsstelle [Rice KG et al., 1990]. Andere membranständige Lectine aus der Familie der Galectine repräsentieren weitere potentielle Kandidaten für ein Drug-Targeting-Konzept. Sie erkennen hauptsächlich Nacetyllactosamin tragende Oligosaccharide und spielen wie schon in Kapitel 1.2.4 erwähnt eine wichtige Rolle in Zell-Zell und Zell-ECM-Interaktionen. Außerdem werden individuelle Mitglieder der Galectin-Familie gewebsspezifisch exprimiert und eröffnen damit die Möglichkeit einer Entwicklung von selektiv bindenden Kohlenhydrat-Liganden zur Erhöhung der Drug Targeting Effizienz [Barondes SH et al., 1994]. Die oben beschriebenen Fakten und Überlegungen zum Glycotargeting führten zur Entwicklung von spezifischen Markern für Lectine, wie zum Beispiel Neoglycoproteine, Neoglycopeptide und glycosylierte Polymere. Neoglycoproteine sind synthetische Konstrukte aus Mono-, Di- oder Oligosacchariden und kovalent gebundenen Proteinen, wie BSA (Bovine Serum Albumine) [Stowell CP und Lee YC, 1980; Lee YC und Lee RT, 1994]. Die Marker können aufgrund ihrer hohen Bindungsspezifität gegen tumorspezifische Glycokonjugate oder Lectinrezeptoren eingesetzt werden. Sie dienen als Träger für Cytotoxine, Chemotherapeutika und können durch Bindung von Radioisotopen oder Fluoreszenzfarbstoffen zum (Radio-) Imaging verwendet werden. 1.6 Anticancer Vakzine Kohlenhydrat-Antigene, die den größten Teil der Zelloberflächen Antigene ausmachen, sind prominente Kandidaten für die Krebsimmuntherapie, denn sie werden von Antikörpern erkannt und die Immunantwort gegen Kohlenhydrate ist hauptsächlich auf eine Antikörper-Reaktion zurückzuführen. Sie bietet die Möglichkeit, den Fokus auf die Induktion einer Antikörper-Antwort zu legen, um so den komplexen Vorgang einer T-Zellen Immunität zu umgehen. haben wie schon in Kapitel 1.2.4 35 erwähnt häufig Tumorzellen veränderte Einleitung Oligosaccharidstrukturen auf ihrer Zelloberfläche im Vergleich zu normalen Zellen. Zumeist sind es Ganglioside (GM2, GD2, GD3), T-Antigene (TN, sialyl-TN) und die Trisaccharide der Lewis verwandten Blutgruppe (Lex, Ley und Lea) (s. Abb. 1.6-1). Des weiteren finden sich erhöhte Werte für 1,6 β GlcNAc-Einheiten N-verknüpfter Glycane und allgemein eine erhöhte Sialisierung und Fucosylierung wieder. Diese Veränderungen macht sich die Immuntherapie zu nutze [Livingston PO, Zhang S und Lloyd KO, 1997]. Während Krebszellen gelegentlich bis zu 106 Moleküle der Protein-Tumorantigene präsentieren, wie EGF (Epidermal Growth Factor)Rezeptoren oder HER2neu [Davidson NE et al., 1987; Lewis GD et al., 1993], ist der Mittelwert der Kohlenhydrat-Tumorantigen Präsenz auf Krebszellen deutlich höher. Der Mittelwert der GM2 oder GD3 Molekülen auf Melanomazellen beträgt > 7 10 und für Sarkoma oder Neuroblastoma gelten Zahlen, die größer sind als 5 x 7 10 [Hamilton et al., 1993; Helling F und Livingston PO, 1994]. Basierend auf diese Daten werden zur Zeit klinische Studien mit Patienten durchgeführt, die mit mAb gegen GM2, GD2 und GD3 behandelt werden [Irie RF et al., 1989; Houghton AN et al., 1985; Dippold WG et al., 1988; Cheung N-K V et al., 1987, Saleh MN et al., 1992]. Zu der Klasse der Kohlenhydrat-Antigene, die zunehmend an Bedeutung in der Immuntherapie gewinnen, gehören das Thomsen-Friedenreich (TF) Antigen, TN und sTN Blutgruppen verwandte Antigene, die auf Mucinen und verschiedenen epithelialen Tumoren exprimiert werden, sowie die Gruppe von Kohlenhydrat-Antigene, die die Oligosaccharidstrukturen Fucosyl-GM1, Ley und GloboH Antigene umfasst. Im Laufe der Erforschung ihres Potentials für eine Kohlenhydrat-Antikörper basierende Immuntherapie haben sich Vor- und Nachteile herauskristallisiert, die weiter intensive Studien erfordern. Eine Reihe von Vorteilen, die eine Immuntherapie mit Kohlenhydrat-Antigenen befürworten, sind: a. der Überfluss an Kohlenhydrat-Antigenen auf Krebszellen. b. ihre Immunogenität mit wohldefinierten konjugierten Vakzinen. c. die Tatsache, dass Antikörper gute Waffen gegen Mikrometastasen und zirkulierende Tumorzellen darstellen. d. dass Kohlenhydrate sich als gutes Angriffsziel sowohl in der aktiven als auch passiven Immuntherapie gegen Krebs dargestellt haben. 36 Einleitung e. die Möglichkeit Kohlenhydrat-Antigene zu isolieren und zu synthetisieren erleichtert die Konstruktion von Vakzinen auf Kohlenhydratbasis. f. Kohlenhydrate, die als Liganden für Selectine und Adhäsine dienen, können in Metastasierungsprozesse eingreifen (s. 1.2.4) Diese Argumente unterstreichen die Möglichkeit Vakzine zu konstruieren, um die Produktion von Antikörper für eine erfolgreiche Immuntherapie zu induzieren. Tumor Antigene (mAb) Melanoma GM2 (696), GD2 (3F8), GD3 (R24) Neuroblastoma GM2 (696), GD2 (3F8), GD3 (R24), polysialic acid (735) Sarcoma GM2 (696), GD2 (3F8) B cell lymphoma GM2 (696), GD2 (3F8) Small-cell lung cancer GM2 (696), fucosyl GM1 (F12), polysialic acid (735), goboH (MBr1), sialyl a Le (19.9) Breast GM2 (696), TF (49H.8) Prostate GM2 (696), Tn (1E3), sTn (CC49), TF(49H.8) Lung GM2 (696), GloboH (MBr1), Le (S193), Sialyl Le (CS1ex-1) Colon GM2 (696), sTn(CC49), B72.3), TF(49H.8), Sialyl Le (19.9), Le (S193), y x a y x Sialyl Le (CS1ex-1) y Ovary GM2 (696), GloboH (MBr1), sTn(CC49), B72.3), TF(49H.8), Le (S193) Stomach GM2 (696), Le (SH1), Le (S193), Le (T-174), Sialyl Le (19.9) x y a a Tab. 1.2 Kohlenhydrat-Antigene, die auf >60% der Tumoren exprimiert und immuno-histochemisch detektiert wurden, sind Gangliosid-Antigene und Blutgruppen verwandte Antigene. mAb= monoclonal Antibody, Le= Lewis antigen, sTn sialyl-Tn [Livingston PO et al., 1997] Die Forschung und Entwicklung kohlenhydratbasierter Immuntherapien konzentrieren sich besonders auf Ganglioside (GM2, GD2, GD3), Blutgruppen A, B, H und Lewis-Antigene [Livingston PO et al., 1997; Chapman PB et al., 2000; Kudryashov V et al.,2001; Sabbatini PJ et al.,2000]. Auch Lewisy (Ley) –Protein konjugierte Vakzine wurden schon erfolgreich in der klinischen Phase I erprobt [Sabbatini PJ et al.,2000]. Diese Ergebnisse basieren y auf intensiven Studien bei der Entwicklung von Le -Antikörper in vitro, die von y y synthetischen Le generiert wurden. Die aus synthetischen Le gewonnenen Antikörper in Kombination mit verschiedenen Adjuvanten stellten sich als potentielle Kandidaten für die Immuntherapie dar. 37 Einleitung [Livingston PO et al., 1997] 38 Einleitung Jedoch haben sich auch Nachteile bei diesen Studien herausgestellt: Kohlenhydrat-Antigene werden allgemein in die Kategorie der T-Lymphozyten unabhängigen Antigene eingestuft. D.h., dass sie von T-Lymphozyten nicht erkannt werden und diese somit den B-Lymphozyten auch keine Hilfe anbieten (Cytokine) können. Diese Tatsache resultiert bei der Immunisierung mit Kohlenhydrat-Antigenen (in reiner Form oder Expression auf Tumorzellen) in geringen Antikörper-Titern und in geringer Bindungsaffinität der Antikörper. Diese Antikörper verbleiben meist auch in dem IgM Status trotz wiederholter Impfung. Verzögerte Hypersensitivität-Antwort, Cytokin-Ausschüttung und zytotoxische TLymphozyten Antwort fehlen vollständig. Auch in Kombination mit Adjuvantien (Protein Carrier wie KLH= Keyhole Limpit Hemocyanine) erreicht man nur einen höheren Antikörper-Titer und nur in einigen Fällen ein Class switching zu IgG, aber es werden keine T-Helferzellen und zytotoxische T Lymphozyten aktiviert. Diese nachteiligen Argumente führen aktuell zur Entwicklung von polyvalenten Antikörpern und Glycopeptiden, die Blutgruppen-Determinanten tragen [Danishefsky SJ und Allen JR, 2000; Glunz PW et al., 2000; Marcaurelle LA und Bertozzi CR, 2002]. Gleichzeitig konzentriert sich die Forschung auf die Grundlagen von Erkennung/Spezifität und Bindungsaffinität zwischen Antikörpern und Antigenen, die wichtig sind für die Entwicklung von maßgeschneiderten Vakzinen. 39 Ergebnisse 2 Arbeitshintergrund und Zielsetzung Aus den speziellen Charakteristika der Lectine (Kohlenhydrat bindende Proteine) ergeben sich neue Kohlenhydratbasis Konzepte [Gabius zur HJ, Entwicklung 1997]. Lectine von Therapeutika haben die auf Eigenschaft, Kohlenhydratstrukturen zu erkennen, zu binden, und die gespeicherte Information abzugreifen und weiterzuleiten (z. B. Signaltransduktion) [Weis WI und Drickamer K, 1996]. Dies wird durch besondere funktionelle Domänen der Proteinstruktur, der carbohydrate recognition domains (CRD) ermöglicht. Die Vielfältigkeit dieser Domänen spiegelt die große Bandbreite der Oligosacchardistrukturen wider [Ahmed H und Chatterjee BP, 1988]. Im Metastasierungsprozeß spielen Kohlenhydrat-Protein-Interaktionen eine entscheidende Rolle. Metastasierende Krebszellen benutzen Lectine auf der Zelloberfläche des Zielorgans zur Invasion. Umgekehrt verwenden metastasierende Tumoren auch ihre eigenen Lectine auf Tumorzellen zur Adhäsion und Invasion [Gorelik E et al., 2001 (Rev.)]. Daher ergeben sich zwei Mechanismen Tumorlectine zur Inhibierung durch der Metastasierung: Bindung von zum geeigneten einen können synthetischen Kohlenhydratstrukturen an der Interaktion mit der extrazellulären Matrix gehindert werden, zum anderen können synthetische Kohlenhydratstrukturen mit den Kohlenhydratstrukturen metastasierender Tumorzellen um die Lectine des Zielorgans in Konkurenz treten. Die natürlichen Liganden der meisten endogenen Lectine sind nicht bekannt, daher muss ein breites Spektrum von synthetischen Liganden einfach zugänglich sein, um die Bindungseigenschaften zu optimieren. Aufgrund der relativ schwachen Affinitäten bei Kohlenhydrat-Protein-Interaktionen hat sich ein multivalenter Aufbau der Kohlenhydratliganden als erfolgreich erwiesen: Durch den synthetischen Aufbau multivalenter Strukturen kann der in der Natur vorgefundene Clustereffekt nachempfunden werden, der zu einer erheblichen Bindungsverstärkung führt [Drickamer K und Taylor ME, 1993]. 40 Ergebnisse Auf diesen Kenntnissen basierend sollte im chemisch-synthetischen Teil der Arbeit ein Synthesekonzept entwickelt werden für die Generierung von Bibliotheken multivalenter Kohlenhydratstrukturen, bei denen der Kohlenhydratanteil und die Core-Einheit variiert werden können. Im zweiten Arbeitsabschnitt sollten die dargestellten Kohlenhydratverbindungen in geeigneter Weise derivatisiert werden, um sie als Sonde zur Detektion von Oberflächenlectinen einzusetzen. Mittels Fluoreszenzmikroskopie sollen an Tumorzellen verschiedenen Ursprungs die Lectin-Oligosaccharid Interaktionen visualisiert werden. Für die Entwicklung eines Therapeutikums auf Kohlenhydratbasis zur Inhibierung des Metastasierungsprozesses sollten die synthetisierten Strukturen hinsichtlich der Inhibierung relevanter Teilprozesse der Metastasierung wie Adhäsion und Invasion in aussagekräftigen Testsystemen bewertet werden. Kohlenhydrate, die sich zur Inhibierung eines für die Metastasierung relevanten Schritts als geeignet erweisen, können schließlich einer präklinischen Prüfung unterzogen werden. 41 Ergebnisse 3 Ergebnisse 3.1 Synthese Im folgenden Abschnitt werden die Ergebnisse der durchgeführten Synthesen beschrieben. Die genauen Angaben zur Synthesevorschrift und die analytischen Daten sind im Kapitel „Experimenteller Teil“ zu finden. 3.1.1 Chemische Methoden der O-Glycosidierung Die O-Glycosidierung besteht aus einem Aktivierungsschritt, bei der ein Monosaccharid im allgemeinen an der C-1 Position durch eine geeignete Abgangsgruppe aktiviert wird und in der die Positionen C-2, C-3, C-4 und C-6 mit Schutzgruppen versehen sind. Im Glycosidierungsschritt wird der aktivierte Glycosyldonor mit einem Glycosylakzeptor (Aglycon) mit Hilfe von Promotoren zu einem Glycosid umgesetzt. Im letzten Schritt erfolgt die Entschützung (s. Abb. 3.1-1) [Lindhorst T, 2000, Schmidt RR, 1997] Glycosidierungsschritt: RO RO O RO + RO HO Aglycon -HA Promotor O RO O RO OR OR A Aglycon Entschützungsschritt: RO HO z. B. Hydrierung o. Esterspaltung HO O RO O RO OR Aglycon O O HO OH Aglycon Abbildung 3.1-1 Schematische Darstellung einer Glycosidsynthese in zwei Schritten. A= Abgangsgruppe; R= Schutzgruppe Zur klassischen Glycosidierungsmethode gehört die Koenigs-Knorr-Reaktion [Koenigs W und Knorr E, 1901] und verwandte Methoden [Paulson H, 1982; Houben-Weyl, 1992]. Bei dieser Reaktion dienen Glycosylhalogenide als Glycosyldonoren. Als Promotoren werden Schwermetallsalze wie Silbersalze 42 Ergebnisse eingesetzt. Helferich modifizierte diese Methode durch Verwendung von Quecksilberbromid oder Quecksilbercyanid [Helferich B und Weis K, 1956]. Diese Reaktion ist eine wertvolle Technik zur Synthese von komplexen Oligosacchariden und Glycokonjugaten [Kunz H, 1987, 1993]. Nachteilig ist die Verwendung einer equimolaren Menge des Schwermetallsalzes und die damit verbundenen Probleme der Entsorgung, die für eine Large Scale Synthese nicht attraktiv sind und die zu erwartenden geringen Ausbeuten [Schmidt RR, 1997]. Eine attraktive Alternative stellt die Trichloracetimidat-Methode oder das ImidatVerfahren nach Schmidt dar [Schmidt RR und Michel J, 1980; Schmidt RR, 1989]. Der Glycosyldonor ist hierbei ein O-Glycosyltrichloracetimidat des entsprechenden Zuckers, welches durch basenkatalysierte Umsetzung des am anomeren C-Atom ungeschützten Zuckers mit Trichloracetonitril erhalten wird [Grundler und Schmidt RR, 1984]. Durch geeignete Wahl der Base kann die Darstellung des α- oder βGlycosylimidats kontrolliert werden (s. Abb. 3.1-2) [Kinzy W und Löw A, 1993;, Greilich U et al., 1993; Bommer R und Schmidt RR, 1989; Schmidt RR und Michel J, 1981]. Als Schutzgruppen werden in der Regel Acetyl- und Benzoylgruppen oder die hydrogenolytisch spaltbaren Benzylgruppen verwendet. Die acyl- geschützen α-Glycosylimidate reagieren unter Säurekatalyse in hohen Ausbeuten zu den entsprechenden β-Glycosiden [Rio S et al, 1993; Petitou M et al., 1991]. BzO 1. Schritt BzO CCl3-CN/NaH O BzO BzO OBz 2. Schritt BzO O BzO BzO Katalysator OBz O OH + R-OH CCl3 BzO BzO O OR OBz NH Abb. 3.1-2 Schematische Darstellung der Trichloracetimidat-Methode. 1. Schritt: Darstellung eines Trichloracetimidats; 2. Schritt: Glycosidierung. R= Aglycon, Bz= Benzoyl-Schutzgruppe Als Katalysatoren dienen Lewis-Säuren wie beispielsweise das Trimethylsilyltrifluoromethansulfonat (TMS-triflat) oder Bortrifluorid Etherat (Et2OBF3). Als Lösungsmittel werden für das Imidat-Verfahren ähnlich mittelpolare Systeme (z.B. Dichlormethan, Acetonitril) wie für die Koenigs-Knorr-Synthese verwendet. 43 Ergebnisse 3.1.2 Diels-Alder (DA) Reaktion Die Diels-Alder Reaktion ist eine klassische Reaktion in der organischen Chemie, die weitverbreitet genutzt wird, um auf regio- und stereo-kontrolliertem Wege kleine und komplexere Moleküle zu synthetisieren. Mit dem Potential C-C, CHeteroatom und Heteroatom-Heteroatom Bindungen zu knüpfen wird die DielsAlder Reaktion zu einem vielseitigen synthetischen Werkzeug [Fringuelli F und Taticchi A, 1990]. Seit ihrer Entdeckung 1928 [Diels O und Alder K, 1928] existieren bis dato mehr als 17000 Veröffentlichungen, die synthetische, mechanistische und theoretische Aspekte abdecken. Allein die Hälfte der Publikationen entstanden in den letzten zehn Jahren. Die klassische Diels-Alder Reaktion ist eine konzertiert ablaufende Cylcoaddition zwischen einem konjugierten Dien und einer zweiten Komponente, das sogenannte Dienophil, die mindestens eine π-Bindung besitzt: Dienophil Dien Die Diels-Alder Reaktion ist stereospezifisch Die Diels-Alder Reaktion ist nicht nur bezüglich des Substitutionsmusters der ursprünglichen Doppelbindung stereospezifisch, sondern auch im Bezug auf die Orientierung der beiden Ausgangsverbindungen zueinander. Das Maleinsäureanhydrid hat zwei Möglichkeiten als Dienophil mit dem Cyclopentadien zu reagieren (s. Abb. 3.1-3). 44 Ergebnisse Abb.3.1-3 Beispiel einer Diels-Alder Cycloaddition mit Maleinsäureanhydrid und Cyclopentadien und Endo – und Exo-Produkt entstehen bei der Reaktion Die linke Struktur in Abb. 3.1-3 wird als Endo-Produkt, die rechte als Exo- Produkt bezeichnet. Die Exo-Verbindung ist die thermodynamisch stabilere von beiden, bei normalen Temperaturen jedoch, entsteht bevorzugt die kinetisch kontrollierte Endo-Verbindung (91%). Bei der Reaktion mit einem Furan und Maleinimid ist das Verhältnis von Endooder Exo- Verbindung durch die Reaktionstemperatur steuerbar [Fringuelli F und Taticchi a, 1990]. O O O 90°C endo NH O + NH O O O O 25°C NH exo O Abb. 3.1-4 Analog zu 3.1-3 entstehen exo- und endo-Verbindungen, deren bevorzugte Bildung durch die Reaktionstemperatur dirigiert wird. 45 Ergebnisse 3.1.3 Biotinylierte DA-Mimetika 3.1.3.1 Glycosidierung der Furan-Bausteine Als Ausgangsprodukte zur Darstellung von DA-Mimetika stehen 3,4- und 2,5substituierte Bishydroxymethyl Furane, die nach Gaylord synthetisiert wurden zur Verfügung [Gaylord NG, 1956]. Im 1. Schritt werden sie glycosidiert, wobei sich die Glycosidierung mit Benzoyl-geschützten Sacchariden nach der ImidatMethode bewährt hat. Der Fokus dieser Arbeit lag auf der Glycosidierung von ß-3,4- und ß-2,5Bishydroxymethyl Furanen mit D-Galactose, L-Fucose. Schritt 1: OBz OBz OBz OBz OH HO TMS-Triflat in CH2Cl2 O BzO + O OBz O OBz BzO O BzO OBz O O OBz OBz -30°C CCl3 NH 1 O 2 Schritt 2: OBz OBz OH OH OBz BzO O BzO O OBz O O OH HO O O OBz OBz NaOMe/MeOH bei RT HO OH O O O O OH OH O 3 Abb.3.1-5 Schematische Darstellung der Glycosidierung von 3,4 Bishydroxymethyl Furan nach der Imidat-Methode. Bz= Benzoyl-Schutzgruppe Nach der Entschützung stehen die glycosidierten Furan-Bausteine verschiedenen Dienophilen für eine Diels-Alder Reaktion zur Verfügung. 1 Die H-NMR spektroskopischen Daten diglycosidierter 3,4 Furane lassen sich als pseudosymmetrische Verbindung interpretieren, obwohl sie durch Glycosidierung mit zum Beispiel zwei D-Galactosen keine Spiegelebene besitzen. Bei dem mit DGalactose glycosidierten 2,5 Furan ist dieselbe Beobachtung zu machen. 46 Ergebnisse GalO OGal FucO OFuc FucO OGal O O O 3 5 7 OH OH GalO OGal O Gal= HO O O OH OH 10 Fuc= O O OH HO Abb.3.1-6 Struktur der glycosidierte 3,4- und 2,5-Bishydroxymethyl Furane, die nach Abb. 3.1-3 synthetisiert wurden. Gal=ß-D-Galactose, Fuc=ß-L- Fucose 3.1.3.2 Darstellung von biotinylierten DA-Mimetika Für die Darstellung von biotinylierten DA-Mimetika fand die Umsetzung der glycosidierten Furan-Bausteinen mit biotinylierten Maleinimiden [Sigma Aldrich, Deisenhof] statt. Zwar entsteht bei dieser Reaktion ein tricyclisches Gerüst, aber die Core-Struktur ist definiert durch das Oxabicycloheptan, das einer Saccharidstruktur ähnelt. Um die Bezeichnung bei den DA-Mimetika zu vereinfachen, wurde die Nummerierung des Furans beibehalten (s. Abb.3.1-7). Ein wesentlicher Vorteil der Diels-Alder-Reaktion ist die Art des Lösungsmittels (hier: H2O) im moderaten Temperaturbereich von Raumtemperatur bis 40°C in dem diese Reaktionen ablaufen. 3. Schritt 2 RO RO 3 O 4 N + O RO O in H2O 40°C Biotin 2 3 RO O 4 5 N 5 3,4-DA-Mimetikum O Biotin O Abb.3.1-7 Schematische Darstellung einer Diels-Alder-Reaktion mit 3,4-Bishydroxymethyl glycosidierten Furan (Dien) und biotinylierten Maleinimid (Dienophil) zum biotinylierten 3,4 DAMimetikum. R= Monosaccharid. Nomenklatur: Die Position der Saccharide im DA-Mimetika richtet sich nach dem Furan. Die entstandenen Produkte bei zwei gleichen Sacchariden lassen sich in Exo- und Endo-Produkt unterscheiden, dessen jeweilige Bildung sich durch die Reaktionstemperatur steuern lässt. Bei Raumtemperatur wird bevorzugt das Exo47 Ergebnisse Produkt gebildet [Anet FAL, 1962; Kwart H und Burchuk I, 1952; Mc Elhanon JR und Wheeler DR, 2001] (s. Abb.3.1-4). Bei der 1 H-NMR spektroskopischen Analyse kann man Exo- und Endoverbindungen im Verhältnis 60:40 deutlich anhand der Integrale der Protonen am Oxabicylcohexan ermitteln. Für die ExoVerbindung liegt die chemischen Verschiebung bei H-5 und H-8 bei 5.4 ppm. Für die Endo-Verbindung ist das Signal bei 5.62 ppm zu finden. Sind zwei verschiedene Saccharide am Oxabicycloheptan-Gerüst substituiert entstehen vier Stereoisomere: O GalO GalO O O O FucO N FucO Biotin N Biotin O O O FucO FucO O O O GalO N GalO Biotin N Biotin O O GalO FucO O O N FucO O 11 Biotin FucO O N GalO O O O 12 Biotin O N GalO O Biotin 13 Abb.3.1-8 Struktur der biotinylierten DA-Mimetika, die nach Abb. 3.1-5 synthetisiert wurden. Gal=ß-D Galactose, Fuc=ß-L Fucose. Die Reaktionen laufen unter milden Bedingungen mit Ausbeuten zwischen 38 % und 45 % (11- 13). Ein Problem stellt jedoch die Retro-Diels-Alder Reaktion dar, die beim Furan durch seinen aromatischen Charakter bedingt ist [Fringuelli F und Taticchi A, 1990]. Vorläufig durchgeführte Kinetik-Untersuchungen mittels HPLC zeigten, dass die Saccharide an Position 3 und 4 ausreichend Stabilität des DAMimetikums bei Raumtemperatur gewährleisten, die sie für den biologischen Assay (Fluoreszenzfärbung) einsetzbar machen, wohingegen die 2,5 DA-Mimetika 48 Ergebnisse durch ihre geringere Halbwertszeit einen limitierenden Faktor für die biologische Anwendbarkeit darstellen. 3.1.4 Synthese von 1, 3, 5 Trishydroxymethylcyclohexan- Mimetika (TMC) Für die Struktur-Aktivitätsstudie wurden neben den DA-Mimetika TMC-Mimetika synthetisiert. Die TMC-Mimetika unterscheiden sich bezüglich ihrer Corestruktur vom DA-Mimetikum. Anstatt eines Oxabicycloheptans, stellt die zentrale Struktur ein Cyclohexan dar, die einer Saccharidstruktur erheblich näher kommt, da sie die verschiedenen Konformationsmöglichkeiten eines Saccharids (Wanne, Sessel) einnehmen kann. Im Vordergrund dieser Arbeit standen die Synthese von di- und trivalenten TMCGalactosiden. Setzt man für die Reaktion das Trishydroxymethylcyclohexan mit dem Imidat im Verhältnis 1:3 ein, erhält man di- und trivalente TMC-Mimetika im Verhältnis 1:2. Nach säulenchromatographischer Trennung der di- und trivalenten benzoylgeschützten TMC-Mimetika folgt die Entschützung und die Aufreinigung über HPLC. Die Ausbeuten liegen bei 30% (20= TMC-Digal) und 60% (21=TMC-Trigal). Wie schon bei den glycosidierten Furanen beobachtet zeigen die TMCDiGalactoside und TMC-TriGalactoside im 1H-NMR eine pseudosymmetrische Verbindung, die wegen der Symmetrieebene besitzt. Beim Konformation des Cyclohexans keine 13 C-NMR lassen sich aber drei Peaks zuordnen, von denen zwei Peaks als die beiden C-Atome der Methylengruppe identifiziert worden sind, die mit den Galactosen verknüpft sind (34.73, 34.82) und ein Peak dem C-Atom der Methylengruppe, die zur OH-Gruppe führt, zugehörig ist (s. Abb. 3.3-3). 49 Ergebnisse OBzOBz O BzO 1. Schritt OBz O OBzOBz OH OBz OBz O + HO BzO OBz O OH O O BzO CCl3 OBz OBz O O TMS-Triflat CH2Cl2 -30°C NH BzO BzO OBz OH OBzOBz O O BzO OBz OBz O O BzO BzO OBz 2. Schritt Trennen, Entschützen OH OH O OH NaOMe/MeOH OH OH HO O O HO OH + OH O 20 OH OH O O O O HO HO HO OH OH OH O O OH 21 HO HO OH Abb. 3.2-1 Synthese der di- und trivalenten TMC-Galactoside. Synthese erfolgte nach der ImidatMethode. Als Glycosyldonor wurde das benzoylgeschützte Galactosetrichloracetimidat eingesetzt. Als Promoter diente das TMS-Triflat. . 50 Ergebnisse 3.2 Biologische Untersuchungen 3.2.1 Biotinylierte Oligsaccharidmimetika als diagnostische Werkzeuge 3.2.1.1 Einleitung Das diagnostische Potential der in 3.1.3 und 3.1.4 beschriebenen Oligosaccharidmimetika wurde anhand geeigneter in vitro Testsysteme ermittelt. Zu diesem Zweck wurde eine Methode zur Anfärbung von Tumorzellen mit biotinylierten Kohlenhydratmimetika und FITC (Fluoresceinisothiocyanat)- gekoppeltem Avidin etabliert, die es ermöglichte, zuckererkennende Domänen auf der Tumorzellmembran zu visualisieren und nach ihren charakteristischen Anfärbemustern auszuwerten. Diese Studie basiert auf Daten, die zeigen, dass die Lectinexpression abhängig ist vom Zelltyp und vom pathologischen Zustand. Das diagnostische Potential wurde bestimmt durch • Fluoreszenzfarbtests an einem breiten Spektrum humaner TumorZelllinien, die Monolayer adhärent wachsen. • Tests mit verschiedenen biotinylierte Oligosaccharidmimetika, die sich in ihren Zuckerbausteinen und in ihrer stereochemischen Orientierung unterscheiden, um eine Struktur-Aktivitätsbeziehung ableiten zu können. Des weiteren wurde der Einfluss synthetischer Oligosaccharide auf das Adhäsions- und Invasionspotential von B16-Zellen getestet. Der letzte Teil der biologischen Untersuchungen deckte den molekularbiologischen Aspekt ab. Hierbei wurde der Einfluss von synthetischen Oligosacchariden auf die MMPAktivität und Tyrosinphosporylierung untersucht. 51 Ergebnisse 3.2.1.2 Evaluierung des diagnostischen Potentials der Kohlenhydratmimtika über die Fluoreszenzfärbung Die Abbildung 3.2.-1 zeigt die Färbeschritte an adhärent wachsenden Zellen. Nach Absättigung unspezifischer Bindungsstellen, werden die fixierten Zellen mit biotinylierten Oligosaccharidmimetika inkubiert. Das Biotin reagiert mit Avidin, das kovalent an dem Fluoreszenzmarker FITC gebunden ist. Die Reaktion ist sehr spezifisch und 4 1 x 10 Zellen aussäen und 3 Tage kultivieren (bis zur gewünschten Zelldichte) Zellen fixieren m. 3% Formaldehyd • Blockierungsschritt, 1 h bei RT • Inkubation mit biotinyliertem Kohlenhydratmimetikum, 2 h bei RT • Inkubation mit Avidin-FITC, 1 h bei RT im Dunkeln • Färbung der Zellkerne mit DAPI, 1 min bei RT im Dunkeln Eindecken mit Elvanol auf Objektträger Auswertung am Fluoreszenzmikroskop Abbildung 3.2-1 Schematische Durchführung einer Fluoreszenzfärbung mit biotinylierten Oligosaccharidmimetika ist durch die hohe Bindungsaffinität von Biotin zu Avidin eine verbreitete LabelingMethode in der Zellbiologie. Fakultativ kann die Zellmembran mit Triton X100 permeabilisiert werden. Als Kontrolle dienen Zellen, die nur mit Avidin- FITC inkubiert wurden. Folgende humane, adhärent wachsende Tumor- Zelllinien wurden für die Fluoreszenzfarbtests gewählt: A431 (Fabricant, RN et al.,1977) : Vulva, Plattenepithelcarzinom MCF-7 (Soule, HD et al., 1973) : Mamma, Adenocarzinom PLC (Alexander, JJ et al., 1976) : primäres Leberzellcarzinom Glioma U333 CG/343 MG (Achstätter et al., 1986): Astrozytom SKOV-3 (Fogh J et al., 1977): Ovarialcarzinom 52 Ergebnisse SW480 (Fogh J et al., 1977): Coloncarzinom CaCo-2 (Fogh et al., 1977): Colon, Adenocarzinom _________________________________________________________________ SV80 (Franke et al., 1979): normale humane Fibroblasten Folgende biotinylierte Kohlenhydratmimetika wurden für die Fluoreszenzfarbmethode eingesetzt: 3,4DA-Kohlenhydratmimetika 3,4DAGalGal O RO TMC-Kohlenhydratmimetikum O RO *TMCGalGal NH 3,4DAFucFuc Biotin RO 3,4DAGalFuc N S O OR Biotin O R= Gal und/oder Fuc *diese Verbindung wurde freundlicherweise von Prof. Dr. M. Wießler, DKFZ-Heidelberg zur Verfügung gestellt Fluoreszenzfärbung an verschiedenen Zelllinien mit verschiedenen Kohlenhydratmimetika A431 a b c Abbildung 3.2-2 zeigt A431 Zellen die mit a DAFucFuc, b DAGalGal und c DAGalFuc (100x) inkubiert wurden. A431 Zellen stammen aus einem Plattenepithelkarzinom der Vulva und sind adhärente Zellen, die als Monolayer wachsen. Sie sind mit biotinylierten Kohlenhydratmimetika wie in 6.1.2.2 beschrieben, behandelt worden. 53 Ergebnisse Bild a zeigt Zellen, die mit DAFucFuc inkubiert wurden. Die Fluoreszenzintensität ist zwar hoch, jedoch wird das Anfärbemuster durch hohes Hintergrundleuchten überdeckt. Dafür zeigen die A431 Zellen ein charakteristisches Bild, wenn sie mit 3,4DAGalGal angefärbt wurden (b). Zwar ist die Fluoreszenzintensität deutlich schwächer, aber dafür wird die spezifische Anfärbung an der Peripherie der Zelle gut erkennbar. Man würde die begrenzte Anfärbung der Plasmamembran um die Region der Polkappen vermuten. Das beste Resultat erzielte die Anfärbung der Zellen mit 3,4DAGalFuc, da beide wichtigen Parameter für die Diagnostik wie hohe Fluoreszenzintensität und Spezifität gepaart auftreten (c). Da sich die Zellen bei dieser Fluoreszenzfärbung leicht vom Coverslip lösten, war besondere Vorsicht bei allen Wasch- und Inkubationsschritten geboten. MCF-7 a b Abbildung 3.2-3 zeigt MCF-7Zellen die mit a DAFucFuc, b DAGalGal (100x) inkubiert wurden. Das Mammacarzinom MCF-7 zeigte hingegen keine spezifische Anfärbung durch die 3,4 DA-Mimetika. Exemplarisch zeigen Abbildung 3.2-3 a und b die diffuse Anfärbung der Zellen, was zum Teil vom hohen Hintergrundleuchten herrührt. Das lässt vermuten, dass auch Bestandteile der extrazelluläre Matrix angefärbt sind. Die Gliazellen in Abbildung 3.2-4 a sind mit DAFucFuc inkubiert worden und färben wie bei den MCF-7 Zellen in einem etwas geringerem Maße diffus und unspezifisch. Die Inkubation mit biotinyliertem DAGalGal zeichnet sich aber durch eine polarisierte Anfärbung aus. Die 200-fache Vergrößerung zeigt die lokale Begrenzung der Anfärbung in der Nähe vom Zellkern oder an der Peripherie der Zelle. Zur topographischen Orientierung wurden die Zellkerne mit DAPI wie in 6.1.2.3 beschrieben, angefärbt (d). 54 Ergebnisse Glia a b c d Abbildung 3.2-4 zeigt a Glia-Zellen die mit 3,4DAFucFuc (100x) und mit b+ c 3,4DAGalGal und inkubiert wurden (100x, 200x). d zeigt die Zellkerne von c, die mit DAPI sichtbar gemacht wurden. PLC a b c d Abbildung 3.2-5 zeigt PLC-Zellen die mit a 3,4DAFucFuc, b 3,4DAGalGal c 3,4DAGalFuc inkubiert wurden. d zeigt die Zellkerne von c, die mit DAPI sichtbar gemacht wurden. (100x) Die PLC-Zellen zeigten bei der Behandlung mit 3,4DAFucFuc (a) und mit DAGalGal (b) kaum Unterschiede in ihrem Anfärbemuster. In c erscheint aber die Fluoreszenzintensität nach Inkubation mit DAGalFuc höher als in a und b und visualisiert damit gleichzeitig eine charakteristische Anfärbung an der Peripherie 55 Ergebnisse der Zelle, die z. T. „sichelförmig“ abgebildet ist. d zeigt die mit DAPI angefärbten Zellkerne von c. CaCo-2 a b c d Abbildung 3.2-6 zeigt CaCo-2 Zellen die mit a 3,4DAFucFuc , b 3,4DAGalGal (100x) und a 3,4DAGalFuc inkubiert wurden. d zeigt die Zellkerne von c, die mit DAPI sichtbar gemacht wurden (200x). Hervorzuheben ist in dieser Versuchsreihe die Anfärbung zweier ColoncarzinomZelllinien: CaCo-2 und SW480. CaCo-2 Zellen lassen sich zwar gut mit 3,4DAFucFuc und 3,4DAGalGal anfärben, sind aber im Erscheinungsbild eher verschwommen. Die Behandlung der Zellen mit 3,4DAGalFuc demonstriert jedoch eine charakteristische Anfärbung der Plasmamembran, die als polarisierte Anfärbung an den Pokappen definiert ist (c). Diese Beobachtung würde gut mit den aus der Literatur beschriebenene Polarisierung des Endocytoseprozesses (patching, capping) korrelieren. 56 Ergebnisse SW480 Zellen zeigen die gleichen charakteristischen Anfärbungen wie CaCo-2 Zellen. Auch in diesem Fall ergibt eine Inkubation der Zellen mit 3,4DAGalFuc eine polarisierte Anfärbung (s. Abb. 3.2-7a). Diese Beobachtung könnte gut mit dem in der Literatur bekannten Fucose-Rezeptor auf der SW480-Zellmembran, dem endozytotische Funktionen zugeschrieben wird, zusammenhängen [Lerchen HJ, 2000]. SW480 a b c d e f Abbildung 3.2-7 zeigt SW480-Zellen, die mit a 3,4DaFucFuc, b mit 3,4DAGalGal, mit c 3,4DAGalFuc inkubiert worden sind. d sind die mit DAPI angefärbten Zellkerne von c. Zellmembran wurde mit Triton X100 permeabilisiert und Zellen anschliessend mit 3,4DaGalFuc inkubiert. f ist das korrespondierende DAPI-Bild von e. Die intrazelluläre Anfärbung von SW480 Zellen nach Permeabilisierung mit Triton X100 mit allen drei 3,4DA-Mimetika zeigen eine extreme Kumulation der Fluoreszenz in der Zelle, genauer im Zellkernbereich und am Cytoskelett., wie die 57 Ergebnisse Abb. 3.2-7e exemplarisch zeigt. Im Zellkern selbst sind hellere Spots zu erkennen, die mit Kernlectinen in Verbindung gebracht werden könnten [Gabius HJ, 1997]. Die intrazelluläre Anfärbung wurde mit allen Kohlenhydratmimetika und Zelllinie durchgeführt und jedes Mal war die starke Zellkernfärbung zu beobachten. Die SKOV-3 Zellen ließen sich auch gut mit 3,4DAGalFuc anfärben. In diesem Fall ist die ganze Zelle ausser der Plasmamembran auf dem Zellkern (linker Pfeil) angefärbt und manche Zellen färben gar nicht an (Abb. 3.2-8a ). Das Bild b zeigt SKOV-3 Zellen, die mit dem Kohlenhydratmimetikum TMCGalGal behandelt wurden. Die SKOV-3 Zellen sind stark angefärbt, besonders deutlich in der Region um die FAPs (Focal Adhesion Points), die die Kontaktstellen zwischen Zelle und ECM darstellen. Auch die charakteristische Anfärbung der ECM, die den Hintergrund wie einen „Sternenhimmel“ erscheinen lässt, ist ein charakteristisches Merkmal für die Anfärbung von SKOV-3 Zellen mit TMC-Digal. SKOV-3 Ungefärbte Zelle a b c Abbildung 3.2-8 zeigt a SKOV-3 Zellen, die mit 3,4DAGalFuc wurden. Die Fluoreszenzintensität ist hoch. Die ganze-hier langgestreckte- Zelle weist eine gleichmäßige Färbung auf. Oben rechts sieht man eine Zelle, die kaum angefärbt ist. b zeigt Zellen, die mit TMCGalGal inkubiert wurden. Die ECM erscheint wie ein „Sternenhimmel“. c zeigt die korrespondierenden Zellkerne zu b, die mit DAPI angefärbt wurden. 58 Ergebnisse Zur Kontrolle wurden normale humane Fibroblasten mit den drei 3,4DA-Mimetika inkubiert. Die diffuse Anfärbung und die geringe Fluoreszenzintensität entspricht der Kontrollgruppe ohne 3,4DA-Mimetika (s. Abb. 3.2-9). Bild c zeigt die Kerne von b. SV80 a b c Abbildung 3.2-9 zeigt a SV80 Zellen, die mit 3,4DAFucFuc und mit 3,4DAGalGal (b) inkubiert worden sind. Die Fluoreszenzintensität unterscheidet sich kaum von der Kontrollgruppe ohne Kohlenhydratmimetika. Dass tatsächlich Zellen im Bild sind zeigt das korrespondierende Bild mit der DAPI-Färbung der Kerne (c). Wichtig zu erwähnen ist die Versuchsreihe mit 2,5DAGalGal, die keine charakteristischen Anfärbungen auf den getesteten Zelllinien zeigten. Man kann die Versuchsreihe mit der einer Kontrollgruppe vergleichen. Da dieses Mimetikum auch chemisch nicht stabil zu sein scheint, wurde die Versuchsreihe mit diesen Verbindungen nicht fortgesetzt. 59 Ergebnisse 3.2.2 Fluoreszenzfärbung histologischer Schnitte am Colon-Tumor und – Normalgeweben Diese Arbeit entstand in Zusammenarbeit mit dem Universitätsklinikum Mannheim (Dr. Keese und Dr. Sturm) Da die Coloncarzinomzellen diskrete und intensive Anfärbungen mit den 3,4 DAMimetika zeigten, haben wir beschlossen, die Fluoreszenzfärbungen auf histologische Gewebeschnitte vom Darm zu übertragen. Coloncarzinome verschiedener Differenzierungsstadien und Normalgewebe wurden mit den drei biotinylierten 3,4DA-Mimetika wiederum über Avidin-FITC angefärbt, um Unterschiede des Anfärbemusters festzustellen. Das Ziel dieses Arbeitsabschnittes war es, die in vitro Färbeversuche auf Gewebeschnitte zu übertragen, die weitgehend die morphologischen Eigenschaften eines Organs beibehalten haben. Es wurden Gewebeproben von acht Patienten untersucht, die in Normalgewebe, in gut und weniger gut differenzierte Coloncarzinome klassifiziert wurden. Es zeigte sich, dass die Kohlenhydratmimetika nicht tumorspezifisch sind. Keine der 3,4 DA-Mimetika zeigten charakteristische Anfärbungen, aus der sich Normal-, gut und schlecht differenziertes Tumorgewebe unterscheiden ließe. Außerdem zeigte das 3,4DAGalGal nur bei einem Patienten im Tumor eine Anfärbung. Die beiden anderen 3,4DAMimetika zeigten intensive Färbungen in der Mucosa und an den Endothelzellen, teilweise war auch das Cytoplasma gefärbt. Anhand der Fluoreszenzintensitäten konnten jedoch Aussagen über den Differenzierungsstatus des Tumors gemacht werden. 3,4DAFucFuc und 3,4DAGalFuc färbten die histologischen Schnitte von vier schlecht differenzierten Tumorgeweben besser an als die korrespondierenden Normalgewebe, d.h., dass das Färbemuster vom Normalgewebe zwar im Tumorgewebe erhalten blieb, jedoch war eine höhere Fluoreszenzintensität im Tumorgewebe zu verzeichnen. Der Vergleich zwischen Normalgewebe und gut differenziertem Tumorgewebe ergab nur bei einem Patienten eine höhere Fluoreszenzintensität im Tumor. Zusammengefasst ist die Übertragung der Fluoreszenzfärbung von in vitro auf in vivo mit Limitationen verbunden, die eine diagnostische Auswertung an Gewebeschnitten mit 3,4DA-Mimetika zur Zeit nicht möglich machen. 60 Ergebnisse 3.2.3 Adhäsionsassay von TMC-Galactosiden und Furan-Galactosiden an B16F1 und B16F10Zellen Der Adhäsionsassay entstand in Zusammenarbeit mit C. Gronewold, E. Frei, A. Chatterjee Die Fluoreszenzfärbung hatte gezeigt, dass diskrete Bereiche der Zelle mit den Galactosid-Mimetika angefärbt werden. Besonders charakteristisch ist die Anfärbung der SKOV-3 Zellen mit TMC-Digal, die die Region der FAPs („Focal Adhesion Points“) visualisierte. FAPs sind dynamische Strukturen, die dadurch entstehen, dass bei einer Ligandenbindung und Zelladhäsion ein Clustering von Integrinen induziert wird. Sie bilden den Kontakt zwischen Zelle und ECM. Mit Hilfe dieser Kontaktstellen können die Zellen auf der ECM migrieren. Die Adhäsions- und Migrationsprofile von Zellen bestimmen das Metastasierungspotential [Hood JD und Cheresh DA, 2002]. Aufgrund ihres unterschiedlichen Metastasierungspotentials sind B16F1 und B16F10 Zellen gute Modelle Metastasierungsmechanismen. Die B16F1 zur Untersuchungen von Zellen zeigen ein geringeres Metastasierungspotential in vivo als die B16F10 Zellen[Fiedler IJ,1973; Fiedler IJ, 1975]. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von verschiedenen, multivalenten TMCund Furan-Galactosiden auf das Adhäsions- und Migrationsverhalten von B16F1 und B16F10 Zellenuntersucht. Als Kontrollen hat man folgende Verbindungen gewählt: 1ß-Methylgalactosid, TMC-Core und eine Kontrollgruppe ohne Testverbindungen. Alle Adhäsionsversuche wurden an Fibronectin durchgeführt. 61 Ergebnisse OH HO O HO HO O OH HO O O O O O O HO HO OH O H O O H OH OH O HO OH OH O HO O OH O HO O O OH OH 8= TMC-Digalactosid OH HO HO OH HO O OH OH 3= TMC-Trigalactosid OH OH OH HO OH HO OH O HO OH OH O HO 26= 2,5 FuranGalGal 27=3,4 FuranGalGal Abb. 3.2-10 Chemische Strukturen der Testverbindungen. Der Abbildung 3.2-11 zeigt, dass die maximale Adhäsion von ~75% schon bei einer Konzentration von 0,5 µg Fibronectin erreicht ist und danach in ein Plateau übergeht. Daher wurden alle Adhäsionsassays bei einer Konzentration von 0,5 µg Fibronectin /96 well-Platte durchgeführt. Adhäsion of B16F1 und B16F10 Zellen an Fibronectin 85 % Max. Adhäsion 75 65 55 45 35 25 15 B16F1/Fib. B16F10/Fib 5 -5 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 Konzentration Fibronectin in µg/ Platte Abb. 3.2.11 zeigt die Adhäsionseigenschaft von B16F1 und B16F10 Zellen an Fibronectin. Das Plateau ist bei einer Konzentration von 0,5µg Fibronectin erreicht. 62 Ergebnisse Adhäsion von B16F1 Zellen an Fibronectin Di- Gal Tri-Gal Trishxdroxy-methyl-Cyclohexan Methyl-Galactose 2,0 1,8 1,6 Inhibitionsrate 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 5 mM 10 mM 20 mM 40 mM Abbildung 3.2-12 zeigt die Adhäsion-Inhibitionsraten von B16F1 Zellen nach der Behandlung mit verschiedene TMC-Galactosiden, 1ß-Methylgactosid und TMC-Core an Fibronectin, im Vergleich zu den Kontrollen. Adhäsion von B16F10 Zellen an Fibronectin Di-Gal Tri-Gal Trishxdroxy-methyl-Cyclohexan Methyl-Galactose 1,6 1,4 inhibitionrate 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 5 mM 10 mM 20 mM 40 mM Abbildung 3.2-13 zeigt Adhäsion-Inhibitionsraten von B16F10 nach der Behandlung mit verschiedenen TMC-Galactosiden, 1ß-Methylgalactosid, TMC-Core an Fibronectin im Vergleich zu den Kontrollen. 63 Ergebnisse Adhäsion von B16F1 Zellen an Fibronectin B16F1 inkub. m. 3,4 Furan-GalGal 1,40 B16F1 inkub. m. 2,5 FuranGalGal 1,20 Inhibitionsrate 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 5 mM 10 mM 20 mM 40 mM Abbildung 3.2-14 zeigt die Adhäsion-Inhibitionsrate von B16F1 Zellen nach der Inkubation mit 3,4 Furan-Galactosiden und 2,5Furan-Galactosiden an Fibronectin im Vergleich zu den Kontrollen. Adhäsion von B16F10 Zellen an Fibronectin 1,60 B16F10 inkub. m. 3,4 FuranGalGal 1,40 B16F10 inkub. m. 2,5 FuranGalGal Inhibitionsrate 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 5 mM 10 mM 20 mM 40 mM Abbildung 3.2-15 zeigt die Adhäsion-Inhibitionsrate von B16F10 Zellennach der Inkubation mit 3,4 Furan-Galactosiden und 2,5 Furan-Galactosiden an Fibronectin im Vergleich zu den Kontrollen. Die Abbildungen 3.2-12 und 3.2-13 zeigen den Einfluss der beiden TMCGalactoside und der Kontrollsubstanzen auf die Adhäsion von B16F1 und B16F10 Zellen an Fibronectin. Die beiden Zelllinien, die sich in ihrem Metastasierungspotential unterscheiden reagieren in ihrem Adhäsionsverhalten 64 Ergebnisse nach Inkubation mit verschiedenen Kohlenhydratmimetika offensichtlich verschieden. Die Inhibitionsrate ermöglicht, alle Ergebnisse miteinander zu vergleichen. Sie errechnet sich aus Inhibitionsrate = Adhäsion Zucker Adhäsion kontrolle Alle Daten, die über den Wert 1 liegen deuten auf eine Stimulation der Adhäsion hin, wohingegen ein Wert < 1 eine Inhibition der Adhäsion bedeutet. Auffällig ist zuerst einmal, dass die Testsubstanzen einen viel drastischeren Effekt auf den B16F10 Zellen besaßen als auf den B16F1 Zellen. Die B16F1 Zellen zeigten kaum einen Einfluss auf das Adhäsionspotential an Fibronectin nach Behandlung mit den verschiedenen Testsubstanzen unabhängig von den Konzentrationen. Anders sieht es bei den B16F10 Zellen aus. Die Testsubstanzen TMC-TriGal und TMC-Core inhibieren jeweils in ähnlicher Weise die Adhäsion. Die maximale Inhibierung von ~25% wird bei beiden Testsubstanzen mit 20mM erreicht. Bei der Konzentration von 5 und 10mM ist bis auf eine leicht erhöhte Adhäsion bei 10mM TMC-TriGal keine Abweichung des Adhäsionspotentials gegenüber den Kontrollen zu verzeichnen. Das maximale Inhibitionspotential wurde nach Inkubation der B16F10 Zellenmit TMC-DiGal erzielt. Bei 40mM konnte die Adhäsion bis zu 80% reduziert werden. Die Kontrollsubstanz 1ßMethylgalactosid wirkte unabhängig von der Konzentration durchgehend stimulierend auf die Adhäsion und das TMC-Core mit einer ähnlichen Molekülgröße, zeigte keinen Einfluss auf das Adhäsionsverhalten. Die Abbildung 3.2-15 illustriert das Adhäsionsverhalten der mit divalenten FuranGalactosiden behandelten B16F10 Zellen. Die unterschiedliche stereochemische Orientierung der Galactoside mit Furan als Core hat keinen signifikanten Einfluss auf die Adhäsionshemmung. Beide Stereoisomere hemmen etwa gleich die Adhäsion der B16F10 Zellen. Die maximale Inhibierung, mit leichter Adhäsionsstimulierung bei 10 mM 3,4 FuranGalGal wurde bei einer Konzentration von 20 mM mit 25% erreicht. 65 Ergebnisse 3.2.4 Invasionsassay in Boydens Invasionskammern Der Invasionsassay entstand in Zusammenarbeit mit A. Chatterjee, E. Frei Ein weiterer wichtiger Aspekt in der Untersuchung der Metastasierung von Krebszellen ist das Studium des Invasionspotentials. Die Adhäsion wurde durch verschiedene synthetische untersuchen, ob Invasionspotential die zu Galactoside synthetischen beeinflussen. beeinträchtigt. Galactoside Viele Daher galt auch fähig Untersuchungen es sind, belegen, zu das dass Kohlenhydrat-Lectin-Interaktionen eine wichtige Rolle im Metastasierungsprozess spielen (s. Kapitel 1.2). Dabei sind sowohl die Kommunikation zwischen Zellen als auch die Zell-ECM-Interaktion wichtige Schritte bei der Metastasierung. Die selben Testsubstanzen vom Adhäsionsassay wurden auch im Invasionsassay eingesetzt. Der Invasionsassay wurde in sogenannten Boydens Invasionskammer durchgeführt, die ein semi-in vivo-System darstellen. Die Kammer besteht aus 2 Einheiten (s. Abb. 3.2-16). Der Boden der oberen Kammer ist mit extrazellulärer Matrix beschichtet, die vom Engelbreth-Holm-Swarm Maus Sarkom extrahiert wurde. Die Matrix enthält unter anderem Laminin, Kollagen Typ IV, Heparan Sulfat Proteoglycan, Entactin und Wachstumsfaktoren. Serumfreies Medium Serumhaltiges Medium Abbildung 3.2-16 zeigt das Schema einer Boyden Kammer (Becton Dickinson), die aus zwei unterschiedlich großen Kammern besteht. Die kleinere Kammer, die in der größeren hängt ist mit Matrigel (synthetische ECM) beschichtet. Die größere Kammer ist mit serumhaltigem Medium (+ FCS als Lockstoff) gefüllt. In der oberen Kammer werden die Zellen, die vorher in serum-freiem DMEMMedium mit den Testsubstanzen inkubiert wurden (105 Zellen/50 mM/0,3 cm2) 66 Ergebnisse ausgesät. In diesem Versuch fungieren die Verbindungen ß-Methylgalactosid und das TMC-Core wie in 3.2.3 als Kontrollsubstanzen, außerdem existiert eine Kontrollgruppe ohne Testsubstanz. Die untere Kammer wird mit serumhaltigem Medium befüllt. Das FCS („Fetal calf serum“) dient als Lockstoff. Pore Abbildung 3.2-5a zeigt die Unterseite des Matrigels aufgenommen mit einem Lichtmikroskop nach 40 h. Das Zelle obere Bild (langgezogene zeigt B16-Zellen Formen), die mit TMC-Tri-Gal inkubiert wurden. Die runden Strukturen sind Poren der a Membran Diese Aufnahme b zeigt Zellen, die mit TMC-DiGal inkubiert wurden. Die Hemmung der Invasion ist gegenüber der dem Tri-Galactosid und dem Core am größten. b c zeigt B16-Zellen, die mit dem TMC- Core inkubiert. Es wurde keine Hemmung der Invasion durch das Core beobachtet. Die Dichte der Zellen gegenüber größer und b ist entspricht deutlich der unbehandelten Kontrolle. c Abb. 3.2-5 Die darin enthaltenen chemoattraktiven Substanzen locken die, im serumfreien Medium „ausgehungerten“ Zellen, durch das Matrigel. Besonders sorgfältig sind die nicht migrierten Zellen mit einem Wattestäbchen zu entfernen. 67 Ergebnisse Das Ergebnis des Invasionsassays korreliert gut mit dem Adhäsionsassay. Das TMC-Core hemmt die Migration der Zellen nicht, das TMC-Trigalactosid bewirkt eine leichte Inhibierung und den größten Inhibitionseffekt erzielt man mit TMCDigalactosid. 3.2.5 MMP Aktivitätsmessung über Zymogramm Der MMP-Assay entstand in Zusammenarbeit mit A. Chatterjee, E. Frei MMP-2 gehört zu der Klasse der Matrix-Metalloproteinasen die etwa 24 Familien umfasst. Es ist schon lange bekannt, dass im Tumorgewebe höhere Konzentrationen an MMPs existieren [Liotta LA, 1992, (Rev.); Coussens LM, 2002; Egeblad M und Werb Z, 2002]. Sie zerstören die Matrix Barrieren (ECM, Basalmembran) und ermöglichen damit die Invasion der Zelle ins umliegende Gewebe, die Intra-und Extravasation und letzlich die Metastasierung in entfernte Organe (s. Abb. 3.2-2). Die in 3.2.3 und 3.2.4 beschriebenen Versuche zeigen, dass Adhäsion und Invasion durch verzweigte Kohlenhydrat-Verbindungen beeinflusst werden können. Um zu untersuchen, ob MMPs durch synthetische Kohlenhydratmimetika in ihrer Expression verändert oder in ihrer Funktion gestört werden, wird im folgenden Assay die Aktivität von MMP-2, auch Gelatinase A genannt, das am häufigsten im Tumorgewebe zu finden ist, bestimmt. B16 Zellen sezernieren und aktivieren zudem MMP-2. Nach Inkubation mit den verschiedenen synthetischen Kohlenhydratmimetika, die bereits für die Adhäsions- und Invasionsassays verwendet wurden, wurde die Aktivität mittels Zymogrammen (ECM-Proteine enthaltende Gele) visualisiert. Hierfür wurden B16 Zellen in serumfreien DMEM-Medium und 50 mM der Kohlenhydratverbindung 24h lang kultiviert. Die von den Zellen sezernierte MMP-2 wurden wie in „Material und Methoden“, 6.1.2.5 beschrieben gewonnen und in die Taschen des Polyacrylamidgels gefüllt und zwar in der Weise, dass jede Tasche gleich viel Protein enthielt. Die Eigenschaft von MMP-2, Gelatine zu degradieren, nutze man aus und führte die Gelelektrophorese mit einem 7.5%-PolyacrylamidGel, das 1% Gelatine enthielt, durch. Das Coomassie färbt nur Gelatinehaltige 68 Ergebnisse Bereiche des Gels blau. Die Bereiche des Gels, die durch MMP-2 degradiert wurden, bleiben weiß und lassen folglich auf MMP-Aktivität schließen. 10 Kont. TMC-ßGalactosid: 10-50 mM Kont. a. 20 30 50 TMCKont. Core ßMethylgalactosid [mM] b. c. Abb. 3.2.-6 a.-c. zeigt Zymogramme von B16-Zellen, die mit TMC-ßTrigalactosiden, ßMethylgalactosid, TMC-Core, Kont.= Zellen unbehandelt. c. TMC-Core Konzentration = 50mM. Abbildung 3.2-6 a zeigt, dass das TMC-TriGal schon bei einer Konzentration von 10 mM die Aktivität von MMP-2 völlig hemmt. 1ß-Methylgalactosid zeigte hingegen keinen Einfluss auf die MMP-Aktivität auch nicht bei hohen Konzentrationen (b). TMC-Core Verbindung hingegen zeigt im Vergleich zur Kontrolle (ohne Testsubstanz) bei einer Konzentration von 50 mM einen leichten Inhibierungseffekt auf die MMP-Aktivität. Die zur Zeit laufenden Versuche mit 3,4FuranGalGal zeigen auch eine Inhibition der MMP-2 Aktivität, die größer ist als beim TMC-Core, was auf eine StrukturAktivitätsbeziehung hindeutet. 3.2.6 Untersuchung auf Tyrosin-Phosphat Im nächsten Schritt ist es wichtig, die durch die Interaktionen zwischen Kohlenhydraten und korrespondierenden Rezeptoren (e.g. Lectin) ausgelösten Effekte oder Signale zu identifizieren. Wichtige Prozesse, wie die Adhäsion und Invasion konnten durch verschiedene Galactoside inhibiert werden. Wir wollten untersuchen, ob eine Inhibition der Adhäsion einen Einfluss auf die TyrosinPhosphorylierung hat und somit einen Hinweis erhalten, ob die Signaltransdutkion beeinflusst wird. Die Regulation der Signaltransduktionskette geschieht durch 69 Ergebnisse Tyrosin-Phosphorylierung und Dephosphorylierung. Tyrosin-Phosphat ist somit ein Universalindikator für die Detektion dieses biologischen Effekts [Hunter T, 1996]. Für diese Untersuchung wurden 2x105 SKOV-3 Zellen / well-Platte (1,5 cm2) ausgesät und wie in 6.1.2.7 beschrieben 48 h lang kultiviert. 24 h vor Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen mit jeweils 40 mM TMC-DiGal, TMC-TriGal, 3,4FuranGalGal und den Kontrollsubstanzen ß1-Methylgalactosid und TMC-Core inkubiert. 24 h nach der Inkubation werden die Zellen entsprechend 6.1.2.6 behandelt. Nach der Bestimmung des Proteingehaltes nach Lowry im Mikromaßstab werden die Taschen des 7,5% SDS-Gels mit derselben Menge an Protein befüllt. Abb.3.2-7 In Bande 1 sind SKOV-3 Zellen mit ßMethylgalactosid, Bahn 2 mit TMC-Core, Bahn 3 mit TMC-TriGal und Bahn 4 mit 3,4 FuranGalGal inkubiert worden. Die Bahn 5 ist der Proteinmarker. 1 2 3 4 5 Nach dem Western-Blotting sah man auf der Nitrocellulose Membran keine Färbung von Banden. Dass der Proteintransfer vom Gel auf der Nitrocellulosemembran erfolgreich war, ließ der Proteinmarker erkennen. Leider lässt sich an diesem Versuch nicht erkennen, dass die Tyrosin-Phosphorylierung durch die synthetischen Kohlenhydrate beeinflusst wird, da in keiner der Zelllysaten Tyrosinphosphat nachgewiesen werden konnte. 70 Ergebnisse 3.3 Molecular Modeling: 2-D Struktur-Aktivität-Studie Diese Arbeit entstand in Zusammenarbeit mit Dr. C-W. von der Lieth Spektroskopischen Abteilung, DKFZ. Aufgrund der Ergebnisse aus den Arbeiten von Schmauser, 1999, schien es, dass Colontumore Lectine exprimieren, die eine hohe Bindungsaffinität zu Ley = (Fuc-α1→2-Gal-β→4(Fucα1→3)GlcNAc-β1→R besitzen. Die an Ley affinitätschromatographisch angereicherten Lectine konnten anschließend mit Fucose und Galactose selektiv von der Affinitätssäule eluiert werden. Diese Daten stellen die These auf, dass nicht nur, wie in der Literatur schon beschrieben, Ley auf Colon- und auch Ovarialtumoren überexprimiert ist, sondern auch ihre korrespondierenden Lectin- Rezeptoren. Die These wird unterstützt durch die Ergebnisse der Fluoreszenzfärbung von Tumorzellen aus den Colon- und Ovarialkarzinomen (Kap. 3.2.1). Die 3,4DAMimetika, die sowohl Galactose als auch Fucose am Core gebunden haben und somit aus Bausteinen von Ley bestehen, färbten die Colon- und Ovarialcarzinomzellen besonders gut an. Mittels Molecular Modeling sollte nun überprüft werden, ob die DA-Mimetika aufgrund ihrer strukturellen Eigenschaften Ley imitieren und damit das Potential besitzen, dieselben Rezeptoren wie Ley zu adressieren. Fucose 1 Galactose Core= GlcNAc y R Abbildung 3.3-1 zeigt die 3D Struktur von Le . = die geometrischen Zentren der Pyranoseeinheiten, die als Pseudoatome definiert werden. Sie dienen der Berechnung von mittleren Abstände und Winkel zwischen den Pyranoseeinheiten . 71 Ergebnisse Zur Berechnung der mittleren Abstände von Ley und der Winkelabstände wurde jeweils ein Pseudoatom für die Galactose, der Fucose1 und Fucose2 und für das Core (GlcNAc) definiert. Bei den Mimetika sind Pseudoatome für jeden Kohlenhydratbaustein, für das DA-Core (Oxa-bicylcoheptan-Struktur) und für das TMC- Core (Cylcohexan-Struktur) definiert. Zur Durchführung der Molecular Dynamics Simulation-Studien wurde für die untersuchte Struktur eine 3-D-Struktur mit der BIOPOLYMER Option von INSIGHT II (MSI/Accelrys 9685 Scranton Road San Diego, CA) konstruiert. Als Kraftfeld wurde CFF91 gewählt, das in der automatischen Prozessierung von INSIGHT II implementiert ist. Die Moleküle werden in das Zentrum einer Wasserbox der Größe 25x25x25 Å platziert. Das Molekül bewegt sich frei über 1 ns bei einer Temperatur von 400 K und einer Dielektrizitätskonstante (ε) von 1 und einem Cutoff von 10 Å für die nicht bindenden Wechselwirkungen. Nach einer Minimierungsphase mit maximal 1000 Schritten folgt ein Equilibrierungsphase von 50.000 Schritten, an die sich die sogenannte Produktionsphase anschließt, bei der in 1 fs (10-15 s) langen Intergrationsschritten, 1.000.000 Bewegungen durchgeführt werden. Jede 1.000. Struktur wird in einem Archiv gespeichert und anschließend für alle enthaltenen Konformationen des Archivs der Abstand zwischen den Pseudoatomen und die dazugehörigen Winkel mit den statistischen Parametern bestimmt. Die statistische Berechnung der definierten Parameter wurde mit dem CAT (Conformational Analysis Tool)-Programm durchgeführt [Frank, M 2000]. Alle 1000 Konformationen werden im 3D-Raum in der gleichen Orientierung überlagert, um einen einfachen, visuellen Vergleich anstellen zu können. Zur Visualisierung wurden die berechneten Positionen der Pseudoatome mit dem RasMol-Programm dargestellt. Die Position der Pseudoatome wird als Kugel dargestellt. Überlagert werden jeweils drei Atome der mittleren GlcNAc (=Core). 72 Ergebnisse 3 2 A B 4 Abbildung 3.3-2 Als Stabmodell werden zufällig eine der 1000 Strukturen dargestellt: y A =Le –Modell. Die statistische Evaluierung der Daten wurden mit dem CAT (High-Performance Conformational Analysis Tool) durchgeführt. Die drei verschiedenen Dreiecke sind aus den mittleren Werten von Distanz und Winkel zwischen den jeweiligen Kohlenhydraten und dem Core (=rote Kugel) dargestellt. B zeigt ein 2,3,4 DA-ß-GalGalGal Stabmodell. Zur Visualisierung der Daten wurde das RasMol-Programm verwendet. Die relevanten Gruppen eines Moleküls, die mit einem Rezeptor wechselwirken und für die Aktivität verantwortlich sind, werden als Pharmacophor bezeichnet. Das Pharmacophor ist damit verantwortlich. Geometrische für die Initiierung des biologischen Effekts und physikochemische Charakteristika von biologisch aktiven Moleküle können herangezogen werden zur qualitativen Ableitung eines Pharmacophor-Modells [Böhm HJ, Klebe G, Kubinyi, 1996]. Oligosaccharide sind hochgradig flexible Moleküle, die unter physiologischen Bedingungen verschiedene Konformationen einnehmen können. Aus diesem Grund wurde die Methode des Molecular Dynamics Simulations hier verwendet und jeweils die Mittelwerte von 1000 Konformationen zur Ableitung des Pharmacophor-Modells herangezogen. Die Abstände und Winkel der Pseudoatome der terminalen Residuen, die an der Interaktion mit Lectinen beteiligt sind, bilden eine sinnvolle Abstraktion zur Charakterisierung der für die Bindung notwendigen geometrischen Bedingungen. Pharmacophor-Modelle sind daher gut geeignet, einen direkten geometrischen Vergleich der Strukturen zwischen Ley und den Kohlenhydratmimetika zu ermöglichen, so dass sich auf einfachem Weg eine Struktur-Aktivitätsbeziehung ableiten lässt. Im weiteren Schritt können aus den Molecular Modeling Daten Rückschlüsse auf den unbekannten Rezeptor mittels Rezeptor-Mapping, deren 73 Ergebnisse Methode näher in Kap. 1.4.2 beschrieben ist, gemacht werden [v.d. Lieth CW et al., 1995]. Die wichtigsten Kennzahlen der Abstandsberechnung sind der maximale und der minimale Abstand sowie der Mittelwert auf der Basis von 1000 Konformationen. Darüber hinaus werden Varianz und Standardabweichung angegeben. Die wichtigsten Kennzahlen bei der Winkelberechnung aus drei Pseudoatomen sind der maximale und der minimale Winkel sowie der Mittelwert auf der Basis von 1000 Konformationen. Auch hierbei wurden Varianz und Standardabweichungen angegeben. Die Simulationsbedingungen für die Kohlenhydratmimetika, die im biologischen Teil dieser Arbeit getestet wurden, wurden wie für Ley gewählt. Die mittleren Werte der Abstände und die dazugehörigen Winkel sind in Tab.3.31 aufgestellt. Die Gegenüberstellung der Pharmacophor-Modelle mit den Ergebnissen aus der Zellfärbung (Kap 3.2.1) ergeben eine gute Korrelation. Je mehr die Ähnlichkeit der zur untersuchten abgeleiteten Größen (Winkel, Abstände) zwischen Mimetika und Ley gegeben ist, desto bessere Anfärbeergebnisse wurden erzielt. Die Pharmacophor-Modelle der divalenten Mimetika können nur als geometrische Figur (hier: Dreieck) dargestellt werden, wenn die Abstände und Winkel von mindestens drei Pseudoatome in das Modell einbezogen werden. Bei den divalenten Mimetika sind es folglich die beiden Kohlenhydratbausteine und das Core (s. Abb. 3.3-3). OR O RO 1 RO HO 5 2 3 3 4 O 5 N Biotin OR O Abb. 3.3-3 Die divalenten TMC- und DA-Mimetika (3, 4 DA-Mimetikum expemplarisch dargestellt) haben 2 Kohlenhydratbausteine =R und das Core= als 3. Bezugspunkt zur Darstellung eines Pharmacophor-Modells. Die Nummerierung des DA-Mimetikums bezieht sich auf das ehemalige Furan. Bezieht man beim Ley-Pharmacopor-Modell das Core mit ein ergeben sich drei mögliche Pharmacophor-Modelle: Ley_Core-Gal-Fuc1, 74 Ley_Core-Gal-Fuc2, Ergebnisse Ley_Core-Fuc1-Fuc2 (s. Abb.3.3-2). Verglichen wurde dabei nur das Dreieck Ley_Core-Fuc1Fuc2 mit den Mimetika, weil es die besten geometrischen Parameter für eine Gegenüberstellung besitzt. Die anderen Dreiecke Ley_CoreGal-Fuc1 und Ley_Core-Gal-Fuc2 fallen durch ihre geringe Abstände der Kohlenhydrate-Bausteine zueinander (zwischen 5,01-5,04 Å ) zu klein aus für einen Vergleich. So zeigt die Abbildung Pharmacophor-Modells mit 3.3-4 den Vergleich des Ley_Core-Fuc1Fuc2- dem 3,4DAGalGal Pharmacophor-Modell und 2,5DAGalGal Pharmacophor-Modell. Sie illustriert die grosse Ähnlichkeit von 3,4DAGalGal-Pharmacophor-Modell zum Ley –Model im Gegensatz zum 2,5DAGalGal-Modell. Dieses Ergebnis korreliert gut mit den Farbtests in vitro, in der 3,4DAGalGal ein deutlich höheres diagnostisches Potential an Colon- und Ovarialcarcinomzellen zeigten als das 2,5DAGalGal. 3,4 DAGalGal 2, 5 DAGalGal 104,1° ± 6.5 84,0° ± 3,1 165,0 ± 15,3 5,96 Å ± 0,2 5,0 Å ± 0,1 6,1 Å ± 0,01 5,71 Å ± 0,2 5,0 Å ± 0,3 6,1 Å ± 0,01 Ley_Core-Fuc1Fuc2 37,0° ± 3,8 54,2° ± 5,2 7,5 ° ± 3,7 38,9° ± 3,0 9,2 Å ± 0,5 44,8° ± 3,2 7,5 Å ± 0,6 7,5 ° ± 3,7 12,1 Å ± 0,3 Abb.3.3-4 Pharmacophor-Modelle aus den Berechnungen mit zwei Kohlenhydratbausteinen und Core. Die Mittelwerte der Winkel und Abstände ergeben Dreiecke. Berechnungen basieren auf Molecular Dynamics Simulation mit Discover im CFF91-Kraftfeld bei 400 K in Wasser. =Core. Die strukturelle Ähnlichkeit zum Ley_Core-Fuc1Fuc2-Pharmacophor-Modell wird erhöht, wenn einer der beiden Galactose-Bausteine durch eine Fucose ausgetauscht wird. Die geometrische Optimierung ist in Abbildung 3.3-5 visualisiert. 75 Ergebnisse 3,4 DAGalFuc Core: 75,3° ± 14,9 6,0 Å ± 0,4 5,5 Å ± 0,4 Ley_Core-Fuc1Fuc2 Fuc: 48,9° ± 7,7 7,0 Å ± 1,1 Gal: 55,9° ± 9 y Abb.3.3-5 Vergleich zwischen Pharmacophor-Modell Le _Core-Fuc1Fuc2 und 3,4 DAGalFuc. = Core. Berechnungen basieren auf Molecular Dynamics Simulation mit Discover im CFF91y Kraftfeld bei 400 K in Wasser. Winkel und Abstandswerte für Le s. Abb.3.3-4 oder Tab.3.3-1 A+B Auch hier findet man den Bezug zum Farbergebnis: Verglichen mit dem 3,4 DAGalGal färbte das 3,4 DAGalFuc-Mimetikum die Coloncarzinomzellen deutlich stärker. Die Färbung zeigt diskrete, farbintensive Bereiche auf der Zellmembran. Das Pharmacophor-Modell des TMC-Digalactosid ähnelt in seiner Geometrie dem 3,4 DAGalGal. Ersetzt man hier einen der Galactose-Bausteine durch einen Fucose-Baustein ändern sich die Werte der Abstände und Winkel nur geringfügig. Die Auswertung der Abstände und Winkel der Zuckereinheiten der trivalenten Mimetika hat den Vorteil, dass ein direkter Vergleich mit den drei terminalen Residuen von Ley möglich ist, von denen anzunehmen ist, dass sie die stärksten Wechselwirkungen mit dem Lectin ausbilden. Bei trivalenten DA- und TMCMimetika werden die drei Kohlenhydrat-Bausteine als Bezugspunkte für die Darstellung von Pharmacophor-Modellen gewählt. Die Auswertung ergab, dass das trivalente DA-Galactosid nahezu gleiche mittlere Abstands- und Winkelwerte besitzt wie Ley und somit die optimalen Vorraussetzungen hat, Ley zu imitieren. Anders verhält es sich beim trivalente TMC-Galactosid: mit den großen Abständen zwischen den Galactose-Bausteine (9,6-11.2 Ǻ) und den Winkeln von 53, 58 und 69 bilden sie keine strukturelle Basis für ein Ley –Mimetikum (s. Abb.) 76 Ergebnisse Es gilt noch zu unterstreichen, dass die trvialenten Furane (Furanderivate sind Ausgangsverbindung für die Synthese von DA-Mimetika) nahezu gleiche Pharmacophor-Geometrie besitzen, wie die trialenten DA-Mimetika. 1,3,5-TMCTrigal 58° ± 13,7 99,9°± 6,6 2,3,4 DAGalGalGal 95,1°± 7,5 11,2Å ± 1,3 10,3Å ± 1,6 5,0 Å ± 0,3 5,0 Å ± 0,1 7,2± Å 0,8 8,1± Å 0,9 LeyFuc1Fuc2Gal 55° ± 12,6 9,6Å ± 1,6 55° ± 12,6 42,7° ± 3,9 7,5 Å ± 0,6 42,2± 7,5 43° ± 6,7 11,7± Å 0,4 43± 6,7 y Abb. 3.3-4 Pharmacophor-Modelle von 1,3,5 TMCTrigal; 2,3,4 DAGalGalGal und Le im Vergleich. Die Mittelwerte der Winkel und Abstände ergeben Dreiecke. Berechnungen basieren auf Molecular Dynamics Simulation mit Discover im CFF91-Kraftfeld bei 400 K in Wasser. Wichtig sind diese Daten für den Invasions- und Adhäsionsassay, die ausschließlich mit den Furanen (und TMC-Mimetika) und nicht mit den DAMimetika durchgeführt wurden. Zusammengefasst zeigt die Studie den Vorzug der DA-Mimetika gegenüber den TMC-Mimetika als idealen Kandidaten für ein Ley-Mimetikum hinsichtlich des eingenommenen geometrischen Raums. Auch die gute qualitative Übereinstimmung mit den Farbtests an Colon- und Ovarialcarzinomzellen ist gegeben. Auch der geringere synthetische Aufwand zur Darstellung von DA-Mimetika spricht für diese Verbindungen. Daher sollten für ein rationales Design die DAMimetika und ihre biologischen Daten als Ausgangsverbindung genutzt werden, um potente Ley-Mimetika zu generieren, da vieles darauf hindeutet, dass diese 77 Ergebnisse fähig sind mit dem natürlichen Ley um dieselben Bindungsstellen zu konkurieren. Die DA-Mimetika würden sich daher auch für ein Drug Targeting Konzept eignen. DA-Mimetika bilden zudem die Basis für die Generierung von Antikörper gegen Ley, denn Ley ist bei bestimmten Tumoren wie Colon, Ovar und Lunge überexpremiert [Hellstrom, I et al., 1990; Kim YS et al., 1986; Sakamoto J et al., 1986; Yin BWT et al., 1996]. Berechnung mit 2 Kohlenhydrat-Bausteinen und Core (A) Abstand der Kohlenhydrate zum Core y Le (Fuc1Core) y Le (Fuc2Core) y Le (GalCore) y Le (Fuc1Fuc2) y Le (Fuc1Gal) y Le (Fuc2Gal) 3,4-DA-ß-Gal3Gal4 3,4-DA-ß-Gal3Core 3,4-DA-ß-Gal4Core 3,4-DA-ß-Gal3Fuc4 3,4-DA-ß-Gal3Core 3,4-DA-ß-Fuc4Core 2,5-DA-ßGal2Gal5 2,5-DA-ßGal2Core u.ßGal5Core 2,4-DA-ß-Gal2Gal4 2,4-DA-ß-Gal2Core 2,4-DA-ß-Gal4Core 2,3-DA-ß-Gal2Gal3 2,3-DA-ß-Gal2Core 2,3-DA-ß-Gal3Core (2),3,4-DA-ß-Gal3Gal4* (2),3,4-DA-ß-Gal3Core* (2),3,4-DA-ß-Gal4Core* 1,3-TMC-ß-Gal1Gal2 1,3-TMC-ß-Gal1Core 1,3-TMC-ß-Gal2Core 1,3-TMC-ß-GalFuc 1,3-TMC-ß-GalCore 1,3-TMC-ß-FucCore Min [Å] Max [Å] Varianz 5,34 7,38 5,62 9,66 6,37 5,4 10,54 6,46 6,59 9,90 6,67 6,78 12,68 6,55 Mittelwert [Å] 5,03 6,12 5,62 7,50 5,01 5,04 9,19 5,71 5,96 6,97 5,50 6,02 12,14 6,14 0,01 0,17 0,01 0,31 0,06 0,01 0,24 0,03 0,04 1,09 0,17 0,14 0,11 0,04 StandardAbweichung [Å] 0,11 0,42 0,09 0,56 0,25 0,11 0,49 0,17 0,2 1,05 0,41 0,38 0,33 0,01 4,73 4,72 5,02 5,89 4,40 4,71 5,19 5,23 4,81 4,45 4,52 4,77 10,25 5,21 7,41 5,13 5,14 4,56 5,27 4,76 5,10 5,62 5,34 6,13 5,04 5,20 6,57 5,43 5,23 12,42 6,48 6,84 9,59 6,53 6,69 9,99 6,89 6,87 12,85 6,77 6,87 12,35 6,78 6,80 10,90 6,07 6,26 7,10 6,19 6,27 8,06 6,46 6,25 9,88 6,11 6,44 10,00 6,19 6,33 0,75 0,06 0,08 0,96 0,02 0,07 0,85 0,04 0,06 2,17 0,18 0,05 1,53 0,10 0,12 0,86 0,24 0,29 0,98 0,14 0,26 0,92 0,20 0,25 1,47 0,42 0,23 1,24 0,31 0,35 78 Ergebnisse Die Gruppe um Danishefsky synthetisierte Ley mit großem synthetischen Aufwand und generierte mit dieser Verbindung potente Antikörper für die Immuntherapie [Danishefsky SJ et al., 1995]. Mit dieser Strategie sind schon Erfolge in den klinischen Studien zu verzeichnen [Sabbatini PJ et al., 2000]. Der Vorteil der DAMimetika gegenüber des synthetischen Ley ist ihre einfachen Synthese und folglich schnelle Bereitstellung von Substanzbibliotheken aus denen Antikörper mit unterschiedlichen Bindungsaffinitäten generiert werden können, die maßgeblich den Spezifitäts- und Selektivitätscharakter ausmachen. (B) Winkel d. Kohlenhydrate zueinander u. zum Core Ley (Fuc1Fuc2Core) y Le (Fuc2Fuc1Core) y Le (GalFuc2Core) y Le (Fuc2GalCore) y Le (Fuc2CoreGal) y Le (Gal Fuc1Core) y Le (Fuc1GalCore) 3,4-DA-ß-Gal3Gal4Core 3,4-DA-ß-Gal4Gal3Core 3,4-DA-ß-Gal4CoreGal3 3,4-DA-ß-Gal3Fuc4Core 3,4-DA-ß-Fuc4 Gal3Core 3,4-DA-ß-Fuc4 Core Gal3 2,5-DA-ßGal2Gal5Core 2,5-DA-ßGal5Gal2Core 2,5-DA-ßGal5CoreGal2 2,4-DA-ß-Gal2Gal4Core 2,4-DA-ß-Gal4Gal2Core 2,4-DA-ß-Gal4CoreGal2 2,3-DA-ß-Gal2Gal3Core 2,3-DA-ß-Gal3Gal2Core 2,3-DA-ß-Gal3CoreGal2 3,4-DA-ß-Gal3Gal4Core* 3,4-DA-ß-Gal4Gal3Core* 1,3-TMCß-Gal2Gal1Core 1,3-TMCß-Gal1Gal2Core 1,3-TMCß-Gal1 Core Gal2 1,3-TMCß-Gal1Fuc3Core 1,3-TMCß-Fuc3Gal1Core 1,3-TMCß-Fuc3 Core Gal1 Min Max 29,76 34,20 43,00 54,13 41,64 53,61 48,23 27,06 30,44 58,03 24,09 23,83 45,70 0,22 0,22 131,12 7,55 6,60 77,69 30,11 37,99 44,07 33,70 33,30 6,34 6,27 62,12 18,81 19,84 64,0 50,12 74,6 68,16 95,37 60,38 72,45 65,38 69,5 57,85 122,50 68,92 79,19 132,08 24,60 24,28 179,56 52,30 52,47 165,86 71,53 72,27 111,37 65,90 66,30 67,35 58,41 167,39 57,67 61,93 141,34 Mittelwert Varianz StandardAbweichung 3,15 5,15 3,60 5,72 2,46 1,98 1,98 3,76 3,01 6,54 7,65 8,98 14,94 3,71 3,71 7,41 7,40 7,99 15,26 6,71 5,70 11,83 5,80 6,40 11,34 9,33 20,37 7,68 7,71 15,03 9,94 41,82 26,48 54,17 12,92 55,92 32,72 72,45 6,05 51,63 4,76 63,94 3,91 58,27 14,12 37,04 9,06 38,9 42,74 104,06 58,56 48,90 80,66 55,86 223,16 75,25 13,76 7,50 13,80 7,49 54,95 165,01 54,80 26,41 63,76 27,47 232,92 126,12 45,024 55,58 32,38 54,46 139,93 69,96 33,30 51,40 40,80 49,30 128,55 38,53 86,95 35,58 414,82 105,89 58,91 36,12 59,40 36,12 225,88 106,89 Tabelle 3.3-1 A +B Daten der Abstände und Winkeln zwischen 2 Kohlenhydratbausteinen+Core. *trivalentes DA-Galactosid mit Galactose an Position 2. FUC1= Fucose 1, FUC2= Fucose 2, Gal= Galactose 79 Ergebnisse Berechnung mit 3 Kohlenhydrat-Bausteinen Abstand d. Kohlenhydrate zueinander y Le Fuc1Fuc2 y Le (Fuc1Gal) y Le (Fuc2Gal) 2,3,4-DA-ß-Gal2Gal3 2,3,4-DA-ß-Gal3Gal4 2,3,4-DA-ß-Gal4Gal2 1,3,5-TMC-ß-Gal1Gal3 1,3,5-TMC-ß-Gal1Gal5 1,3,5-TMC-ß-Gal5Gal3 2,3,4FuranßGal2Gal3 2,3,4FuranßGal2Gal4 2,3,4FuranßGal3Gal4 Winkel d. Kohlenhydrate Zueinander y Le (Fuc1Fuc2Gal) y Le (Fuc2Fuc1Gal) y Le (Fuc1GalFuc2) 2,3,4-DA-ß-Gal2Gal3Gal4 2,3,4-DA-ß-Gal3Gal2Gal4 1,3,5-TMC-ß-Gal1Gal3Gal5 1,3,5-TMC-ß-Gal3Gal1Gal5 2,3,4FuranßGal2Gal3Gal4 2,3,4FuranßGal3Gal4Gal2 Min [Å] Max [Å] Mittelwert [Å] Varianz StandardAbweichung [Å] 5,89 4,40 4,71 5,08 5,10 9,55 6,6 5,3 5,1 4,67 6,87 4,65 Min 9,66 6,37 5,40 9,57 9,99 12,63 13,1 12,8 13,0 10,72 12,72 11,07 Max 7,50 5,01 5,04 7,17 8,06 11,67 11,2 9,6 10,3 7,67 10,54 7,41 Mittelwert 0,31 0,06 0,01 0,66 0,85 0,17 1,6 2,4 2,6 1,92 1,85 1,71 Varianz 27,94 74,50 29,52 67,9 24,7 25,0 24,5 45,63 16,65 55,34 121,21 54,74 123,7 66,8 94,2 95,5 145,64 87,12 0,56 0,25 0,11 0,82 0,92 0,41 1,3 1,6 1,6 1,39 1,36 1,31 StandardAbweichung 3,85 7,51 7,51 6,6 6,7 12,6 13,7 19,22 12,66 14,84 42,66 56,39 95,13 56,39 42,21 43,2 99,9 44,9 43,0 158,0 53,0 188,8 58,4 369,41 90,84 160,23 45,54 y Tabelle 3.3-2 Berechnung für trivalente Mimetika und Le . Die Dreiecke bilden sich aus drei Kohlenhydratbausteinen. 80 Diskussion und Ausblick 4 Diskussion und Ausblick Die Basis dieser Arbeit bildet die Kenntnis über die wichtige biologische Rolle der Kohlenhydrat-Lectin-Interaktion. Diese dient dem Informationstransfer in zellulären Systemen. Oligosaccharidestrukturen besitzen dabei eine enorme Speicherkapazität für biologische Informationen. Lectine sind eine heterogene Proteinklasse. Sie besitzen die Eigenschaft, Kohlenhydrate zu binden und die in den Oligosaccharidstrukturen gespeicherte Information zu decodieren [Drickamer und Taylor, 1993; Weis und Drickamer, 1996)]. Häufig stehen veränderte Oligosaccharid- und Lectin-Expression auf der Zellmembran für einen pathologischen Zustand. Aufgrund der relativ schwachen Affinitäten bei Kohlenhydrat-Protein-Interaktionen habe ich im ersten Abschnitt der Arbeit eine Synthesestrategie aufgebaut, die auf einfachem Wege und mit möglichst billigen Ausgangssubstanzen auskommend zu multivalenten Kohlenhydratstrukturen führen sollte, die dem in der Natur vorkommenden Clustereffekt nachempfunden werden kann und zu einer erheblichen Bindungsverstärkung führt [Lee YC, 1992; Kiessling LL und Pohl NL, 1996]. Die synthetischen Kohlenhydratstrukturen dienten dann im nächsten Abschnitt dieser Arbeit als Werkzeug für den Aufbau eines diagnostischen Konzepts, das an verschiedenen humanen Tumorzelllinien evaluiert wurde. Des weiteren fungieren sie als Modellverbindungen für die Aufklärung der Kohlenhydrat-Lectin- Interaktionen im Tumorgeschehen. Die wohldefinierte Molekülstruktur ermöglichte eine SAR-Studie (Structure Activity Relationship), die mit Molecular Modeling – Berechnungen unterstützt wurde. 81 Diskussion und Ausblick Zwei Verbindungsklassen waren Schwerpunkt dieser Arbeit, die sich hauptsächlich in ihrer Corestruktur unterscheiden: 1. TMC-Verbindungen und 2. Furan-Verbindungen. Die an die beiden Core-Strukturen gebundenen Kohlenhydrat-Bausteine besitzen demnach unterschiedliche stereochemische Orientierungen. Der Furanbaustein kann in 2,3,4 und 5 Stellung glycosidiert werden, abhängig von der Ausgangsverbindung (s. Abb. 5.1). Bei der 3,4 Glycosidierung am Furan geht man von einem 3,4 Furandicarbonsäuredimethylester aus, der mit Lithiumaluminiumhydrid reduziert wird. Die Ausbeuten lagen bei 80%. [70% Lit. Kornfeld EC, 1955]. Die Ausgangssubstanz eines 2,5 glycosidierten Furans ist das 2-Methoxycarbonylfuran, welches chloriert [Finan PA et al., 2000] (77%), verseift und dann wie oben reduziert wird. Die Benzoylgruppe als Schutzgruppe am Kohlenhydrat-Baustein hat sich in Kombination mit der Imidat-Methode als Glycosidierungtechnik bewährt. Die Produkte konnten durch Säulenchromatographie analysenrein gewonnen werden und im Fall von 3,4 Furandigalactosid war eine Umkristallisation (PE:EE 3:1) möglich. Es wurden Ausbeuten von 50-60% erzielt. RO RO RO O O RO RO O RO RO RO RO RO O O RO RO COOH CHO O O GluO GluO Abb. 5.1 Substanzbibliothek mit Furanbausteine, die mit verschiedenen Dienophilen reagieren können. R= z.B. Glucose, Galactose Fucose, Lactose, N-acteyl-glucosamin, Neuraminsäure 82 Diskussion und Ausblick Die Synthesestrategie sollte nun in die Richtung der multivalenten und mit funktionellen Gruppen versehenen Furanbausteinen (s. Abb. 5.1) gehen, um die in der Biologie anderen relevanten Kohlenhydratstrukturen, wie die Lactose oder auch die Neuraminsäure, N-Acetylgalactosamin oder N-Acetylglucosamin in biologischen Assays zu screenen. Zur Zeit wird in der Arbeitsgruppe Wießler, Deutsches Krebsforschungszentrum, tri- und tetraantennäre Furane zu diesem Zwecke synthetisiert. Die Darstellung der DA-Verbindungen ausgehend vom Furan als Dien und Maleinimid als Dienophil, sind auf die klassische Diels-AlderReaktion zurückzuführen. Die Reaktion verlief sehr gut in Wasser mit einer leicht erhöhten Temperatur von 40°C. Mit diesem Syntheseweg konnte eine einfache, effektive Möglichkeit zur Darstellung von biotinylierten Saccharidmimetika in zufriedenstellenden Ausbeuten (35-43%) realisiert werden. Der Nachteil von TMC-Strukturen für den diagnostischen Einsatz liegt in der Beschränkung auf divalente Strukturen, denn die dritte OH-Gruppe wird immer für die Kopplung des NHS-aktivierten Biotins über einen Amin-Linker genutzt. Für die Fluoreszenzfärbung mit biotinylierten DA-Mimetika sollten Parameter, wie hohe Fluoreszenzintensität und Spezifität, die allgemeine Qualitätskriterien für eine Diagnostik sind, erfüllt werden. Tendenziell zeigten die 3,4DA-Mimetika, die mit zwei Fucosen oder zwei Galactosen ausgestattet sind eine schlechtere Anfärbung der Tumorzellen als das 3,4DAGalFuc. Ausnahmen sind die SW480 Zellen, die mit 3,4DAFucFuc behandelt wurden. Sie zeigten diskrete Anfärbungen an den Polkappen, die gut mit der in der Literatur beschriebenen Polarisierung des Endozytoseprozesses (patching, capping) korrelieren würde [Childs, GV, 1999]. Das 3,4DA-Mimetikum könnte aufgrund der beiden Fucose-Bausteine den bekannten Fucose-Rezeptor auf der SW480 Zellmembran adressieren [Gabius HJ et al., 1987; Gabius S et al., 1990; Monsigny M et al., 1984]. Wäre diese Annahme richtig, könnte dieser Fucose-Rezeptor, der sich für ein Tumor-Targeting eignen soll im Fokus eines Lectin-vermittelten Drug-Targetings stehen, indem man an das 3,4DAFucFuc ein Wirkstoff koppelt der direkt am Fucose-Rezeptor bindet und endozytiert wird [Lerchen HG et al., 1999; Wadhwa MS und Rice KG, 1994; Yamazaki N et al., 2000]. Der Vorteil liegt auch an der niedermolekularen Struktur, die ein immunogenes Potential beim in vivo Einsatz ausschließen würde. 83 Diskussion und Ausblick Wird einer der beiden Fucose-Bausteine gegen eine Galactose ausgetauscht werden die angefärbten Bereiche an den Polkappen größer. Das deutet darauf hin, dass das 3,4DAGalFuc ein größeres Lectin-Spektrum anspricht, was einerseits die Bindungsaffinität erhöhen kann, aber eventuell Einbußen in der Spezifität, die für ein aktives Drug Targeting essentiell ist, mit sich bringt. Es ist wichtig zu unterstreichen, dass durch den Austausch von einem Fucose-Baustein in ein Galactose-Baustein, die Bindungseigenschaft deutlich beeinflusst wird. Eine Steigerung der Spezifität von symmetrischen divalenten DA-Mimetika zu den 3,4DAGalFuc ist ebenso bei einer anderen Coloncarcinomzelllinie zu beobachten. 3,4DAGalGal und 3,4DAFucFuc färben die Zellen diffus an, wohingegen 3,4DAGalFuc charakteristische Anfärbungen an den Polkappen zeigen, wie schon bei den Coloncarcinomzellen SW480 zu beobachten war. Eine andere Ausnahme für eine gute Anfärbung mit einem symmetrischen DAMimetikum ist das 3,4DAGalGal an Gliazellen. Sie scheinen Rezeptoren für Galactose zu besitzen, die ein gutes diagnostisches Potential zu besitzen. Die Anfärbung ist auch hier polarisiert, aber man findet diese Polarisierung auch in der Nähe des Zellkerns. Die PLC Zellen illustrieren ein ganz anderes Färbemuster. Mit 3,4DAGalFuc werden charakteristische Bereiche der Plasmamembran, die sich als schmale sichelförmige oder punktuelle Abschnitte darstellen, angefärbt. Dieser einzelne bzw. polarisierte Abschnitt der Plasmamembran begrenzten Anfärbungen des entsprechenden Rezeptorproteins durch 3,4DAGalFuc lässt überdies eine regulierte Expression dieses Proteins vermuten. Bei den SKOV-3 Zellen ist die ganze Zelle mit 3,4DAGalFuc stark angefärbt. Die Färbung mit TMCDiGal zeigte ebenso eine starke Anfärbung der Zellen. Nur unterscheidet sie sich darin, dass hier offenbar die Region um die Focal Adhesion Points (FAP) angefärbt wurde. FAPs sind dynamische Strukturen, die über eine Integrin-Reorganisation, das sogenannte Clustering, entstehen. Dieses Clustering wird durch Ligandenbindung und Zelladhäsion induziert, die ein outside-in Signalling hervorruft, wobei die Integrine in die Regulation intrazellulärer biochemischer Prozesse wie Reorganisation des Cytoskeletts, Aktivierung von Kinasen und Phosphatasen und Genexpression eingreifen [Sewald N, 2002]. 84 Diskussion und Ausblick Es ist bekannt, dass die molekulare Basis der Zelladhäsion von den Wechselwirkungen zwischen Proteinen (Integrine, Cadherine und einige Immunoglobuline), sowie zwischen Proteinen und Kohlenhydraten (bei Selectinen und bestimmten Immunoglobulinen) gebildet wird [Kreis T und Vale R, 1999]. Im Adhäsionsassay hat man zudem beobachtet, dass das TMC-DiGalactosid besonders gut die Adhäsion an Fibronectin hemmen konnte im Vergleich zu oder den Furan-DiGalactosiden und dem TMC-TriGal. Dieses deutet darauf hin, dass TMC-DiGal die optimale strukturelle Voraussetzung besitzt, um in den Adhäsionsprozess eingreifen zu können. Dafür verantwortlich könnte die Bindung an Proteinen sein, die an der FAP-Region lokalisiert sind oder die Bindung an ECM Rezeptoren. Ähnliches ist bei der Adhäsion von Melanomzellen an Vitronectin beobachtet worden, wo gezeigt werden konnte, dass VitornectinRezeptor, GD2 und die FAPs kolokalisieren [Cheresh DA et al.,1987]. Dass nicht alle Zelllinien ausgeprägte Spezifität zu mindestens einer der 3,4DAMimetika zeigten, illustriert die MCF-7 Zelllinie. Auffällig war das hohe Hintergrundleuchten, das die eventuell charakteristische Anfärbungen der Plasmamembran überdeckt hat. Es sieht so aus, als wäre die ECM stark angefärbt, was dann zu diesem diffus erscheinenden Bild führt. Bei den Fibroblasten SV80 zeigte sich überhaupt keine Anfärbungen mit allen drei DA-Mimetika. Dieses Resultat unterstreicht indirekt, dass die 3,4DA-Mimetika bevorzugt epithelialen Zellen anfärben. SV80 Zellen sind Bindegewebszellen, die als Zelllinie etabliert worden sind und die Aufgabe haben extrazelluläre Matrix zu serzernieren. Es sind keine Tumorzellen, sondern normale Zellen. Das deutet darauf hin, dass DA-Mimetika somit Tumorzellen von Normalzellen unterscheiden könnten. 3,4DA-Mimetika und das TMC-DiGal binden an diskrete Stellen auf der Plasmamembran. Wird aber die Zellmembran permeabilisiert zeigt sich ausnahmslos bei allen Zelllinien mit allen Mimetika eine extreme Kumulation der Fluoreszenz in der Zelle. Charakteristisch ist die starke Anfärbung des Zellkerns mit helleren Farbspots auf der Kernmembran, die von Kernlectinen herrühren könnten, wie sie auch in der Literatur beschrieben sind [Gabius HJ, 1997]. Bei der Zelllinie SW480 hat man zudem die Anfärbung des Cytoskeletts beobachten können. 85 Diskussion und Ausblick Diese sehr spezifische Anfärbung der Plasmamembran und die im Vergleich sehr intensive Anfärbung der Zellkerne, wenn die Plasmamembran nicht mehr intakt ist, macht die Limitation bei der Färbung von Gewebeschnitten aus. Hier wurde versucht die gute Anfärbung der Colontumorzellen SW480 und CaCo-2 auf humanes Colontumorgewebe zu übertragen. Das Ziel war das Potential der 3,4DA-Mimetika für die Differenzierung zwischen Normal- und Tumorgewebe zu testen. Die Färbetests an Gewebeschnitten zeigten aber, dass die 3,4DAMimetika keine Tumorspezifität zeigten, denn das Färbemuster im Tumor und Normalgewebe war gleich nur im Tumorgewebe zum Teil stärker. Die Lectinexpression bei Tumoren scheint eher in der Quantität als in der Qualität gegenüber bestimmten Normalgewebe Proteinen verändert würde dann zu sein. Eine Überexpression im guten Zusammenhang mit von dem Anfärbeergebnis stehen. Hauptsächlich wurde die Mucosa und die Endothelzellen angefärbt. Starke Anfärbungen sind auch im Cytoplasma zu sehen. Die diffuse Anfärbung hat sicherlich mit der Intaktheit der Zellen zu tun, denn durch den Schnitt besitzen die meisten Zellen eine beschädigte Zellmembran. Dadurch werden intrazelluläre Strukturen zugänglich und angefärbt. Beurteilt man das diagnostische Potential nur anhand der Fluoreszenzintensitäten lässt sich ein Tumorgewebe Unterschied feststellen. zwischen In vier gut von und acht schlecht differenziertem Tumorproben war die Fluoreszenzintensität von schlecht differenziertem Gewebe im Vergleich zum Normalgewebe höher. Bei gut differenziertem Tumorgewebe war nur in einem Fall eine höhere Fluoreszenzintensität als im Normalgewebe zu verzeichnen. Eine mögliche Erklärung für diese Anfärbung liefern die Kenntnisse über den Unterschied zwischen gut und schlecht differenziertem Tumorgewebe. Es ist bekannt, dass schlecht differenzierte Tumoren aggressiver sind und die Patienten eine schlechte Prognose haben. Meistens haben solche Tumore bestimmte Rezeptoren (SGLT-Rezeptoren= Sodium-coupled clucose transport proteins) überexprimiert, wachsen schneller und metastasieren. Die Daten von Seimetz aus der affinitätschromatographischen Isolierung von Proteinen aus Pankreastumoren an verschiedenen immobilisierten Zuckern zeigten zudem, dass in zwei der drei untersuchten Patientenproben ein Protein von 180 kDA isoliert wurde, das eine hohe Affinität zu Fucosyl-BSA-Sepharose zeigte. Bei beiden Patienten konnte 86 Diskussion und Ausblick dieses Protein sowohl aus Tumor- als auch aus Normalgewebe isoliert werden, wobei die aus dem Normalgewebe isolierte Menge unter gleichen Bedingungen etwas geringer war. Ein Patient zeigte im Tumor- und Normalgewebe jeweils ein Protein von 75 kDa, das mit hoher Affinität an Lactosid-Sepharose bindet. Die aus dem Normalgewebe isolierte Proteinmenge war auch hier wieder geringer. Diese Ergebnisse illustrieren, dass viele tumorassoziierten Lectine sich eher quantitativ als qualitativ vom Normalgewebe unterscheiden. Neben der Lectin-Zucker-Interaktion könnte die Bindung der Mimetika an der Plasmazellmembran auch auf Zucker-Zucker-Interaktionen beruhen. Auch die Akkumulation von Glycospingolipiden (GSL) wird von Hakomori als Zell-ZellAdhäsion erklärt. In der Praxis zeigt sich, dass eine erhöhte Expression von sLex und sLea bei Patienten mit Colontumoren mit einer schlechten Prognose korreliert [Shimodaira K et al., 1997; Nakamori S et al., 1993]. Eine erhöhte Lectinexpression auf der Plasmazellmembran und vermehrte GSLExpression könnten somit für eine stärkere Bindung von 3,4DA-Mimetika an schlecht differenzierten Tumorgewebe im Vergleich mit gut differenzierten verantwortlich sein. Die diskrete Anfärbung um die Region der FAPs mit biotinyliertem TMC-DiGal ließ uns vermuten, dass diese Zuckerstruktur die Zelladhäsion beeinflussen könnte. Die Adhäsionversuchsreihe zeigte, dass TMC-DiGalactosid von allen untersuchten Mimetika der beste Inhibitor der Zelladhäsion an Fibronectin war. Trivalentes TMC-Galactosid konnte den vermeintlich „Multivalenten Effekt“ nicht nachahmen, was bedeutet, dass der Multivalenzgrad nicht gleichzusetzen ist mit einem höheren biologischen Effekt, wie beispielsweise eine Steigerung der Bindungsaffinität. Dieser nicht lineare Zusammenhang von Multivalenz und Bindungsaffinität ist bekannt [Lundquist JJ und Toone EJ, 2002 (Rev.)]. Vielfach sind geometrische und physikochemische Eigenschaften einer Struktur mitentscheidend für eine Bindung an den Rezeptor. Das TMC-TriGal besitzt ein ähnlich Adäsionspotential wie 3,4- und 2,5-Furan-Galactoside. Die optimale Konzentration dieser Mimetika war bei 20 mM, wobei die Adhäsion bis maximal 40% gehemmt werden konnte. Im Vergleich dazu lag die optimale Konzentration von TMC-DiGal bei 40 mM, welches die Zelladhäsion um 80% hemmte. Eine 87 Diskussion und Ausblick durchweg stimulierende Wirkung auf die Adhäsion zeigte das 1-ß- Methylgalactosid. Man hatte angenommen, dass das TMC-Core, welches ein Zucker-Mimetikum darstellt und dessen Molekülgröße mit dem des 1-ßMethylgalactosid gleichzusetzen ist, ähnlich wirkt. Es zeichnete sich jedoch überhaupt kein Effekt ab. Zur Erforschung der Funktion von Kohlenhydrat-Lectin-Interaktionen in verschiedenen Prozessen der Metastasierung wie Adhäsion und Invasion fiel die Wahl auf B16F1 und B16F10 Zellen, die ein etabliertes Metastasierungsmodell darstellen. Denn die Varianten F1 und F10-Zellen wurden nach ihrem Metastasierungspotential in die Lungen von Mäusen selektiert. B16F1 ist weniger stark metastasierend ist als B16F10 Zellen[Fidler IJ, 1973; Fidler IJ, 1975]. Die Zell-Adhäsion und –Erkennung sind fundamentale Prozesse, die die Zellorganisation in Gewebe und Organe ermöglichen. Sind die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen gestört, werden Zell-Zell- und Zell-ECMKontakte aufgehoben, was fatale Folgen haben kann, wie das autonome Verhalten maligner Tumorzellen zeigen. Die Adhäsion einer Zelle beruht auf mehreren Mechanismen, die in geordneter Reihenfolge (zuerst Zucker-Zucker-Interaktion) und konzertiert (Zucker-Protein und Protein-Protein im selben Zeitrahmen) ablaufen. Man unterscheidet, wie oben erwähnt die Adhäsion an der ECM und die Zell-Zell-Adhäsion, die wiederum in homo- und heterotypische Aggregationen unterteilt wird. Meistens sind diese Mechanismen koexistent und bewirken einen additiven oder synergistischen Effekt. Die Sache wird noch komplizierter, wenn man die möglichen Wechselwirkungen Zucker-Zucker, Zucker-Protein und Protein-Protein– Wechselwirkungen in die Überlegungen mit einbezieht. An diesem Modell konnte gezeigt werden, dass die Adhäsion von B16F1 Zellen an Fibronectin durch die Zuckermimetika nicht beeinflusst wird, obwohl die Bindungsstärke der unbehandelten B16F1 und B16F10 Zellen gleich sind Da die Parameter wie Zellkulturbedingungen, ECM-Protein und die Testubstanzen konstant sind, ist das unterschiedliche Adhäsionsverhalten der unterschiedlichen Ausstattung der Zellmembranen von B16F1 und B16F10 Zellen zuzuschreiben. Bisher wurde nur die unterschiedliche Oligosaccharid-Expression auf der 88 Diskussion und Ausblick Zellmembran von F1 und F10-Zellen beleuchtet, die das unterschiedliche Bindungsverhalten an pflanzliche Lectine [Raz A et al., 1980] untersuchten. Sicher ist auch, dass die F1 und F10-Varianten unterschiedliche GM3 –Levels auf der Zelloberfläche exprimieren: F10 Zellen haben einen höheren GM3-Level als F1 Zellen [Kojima M Adhäsionskapazität et von al., 1992]. B16F1 Genauere und Studien B16F10 untersuchten Zellenan die GM3–Gangliosid (NeuAcα2→3Galß1→4Glcß1→1Cer) und fanden heraus, dass die Adhäsion abhängig ist von zwei Faktoren: Dem GM3 Expressionslevel auf den Zellen und der Konzentration bzw. Dichte der an der well-Platte immobilisierten GM3 [Song Y, et al., 1998 ; Iwabuchi K, et a.,l 1998; Kojima N und Hakomori S, 1989]. Adhäsionsassays mit Kombinationen von GSL und Proteinen auf der well-Platte weisen darauf hin, dass die GSL-GSL-Interaktion für die frühe Phase der Adhäsion verantwortlich ist, die dann abgelöst wird von GLS-Protein- und ProteinProtein-Interaktionen [Kojima N und Hakomori S, 1991; Kojima N et al., 1992]. Demnach scheint die Zucker Zucker-Interaktion, wenn auch eine schwache Bindung repräsentierend, von hoher Spezifität zu sein, denn durch sie werden erst Bindungen zu Proteinen und dann Protein-Protein-Wechselwirkung möglich. Unterschiede im Adhäsionsverhalten von B16F1 und B16F10 Zellen nach Zugabe von synthetischen Zuckern deuten darauf hin, das eine Interaktion der Galactose Mimetika mit den zelleigenen GM3 (und andere noch nicht identifizierte Zuckerstrukturen auf der B16F10-Zellmembran) eine wichtige Rolle bei der Hemmung der Adhäsion spielen. Diese sind zwar schwache Wechselwirkungen, aber offenbar für die Initialphase der Adhäsion wichtig. Weiter zeigen die Ergebnisse des Adhäsionsassay, dass viele Parameter die Adhäsion beeinflussen: 1. die Konzentration des eingesetzten Zuckers 2. die richtige Molekülgröße (plus optimale Multivalenz) 3. die Zuckerstruktur per se (Hydrohilie/Hydrophobie) 4. die stereochemische Orientierung der Kohlenhydratbausteine Diese Parameter müssen so optimiert sein, dass die Initialphase der ZuckerZucker Interaktion in eine Protein-Zucker-Interaktion und Protein-ProteinInteraktion übergehen kann. Die Wechselwirkung scheint wohl eher mit den Glycolipiden, Glycoproteinen oder Lectinen der Zellen als mit dem Fibronectin 89 Diskussion und Ausblick stattzufinden, sonst wäre die Adhäsion von B16F1 und B16F10 Zellen gleichermaßen beeinflusst worden. Schauen wir uns im Detail die Rolle der oben aufgelisteten Parameter an: Die Konzentration scheint wichtig zu sein, denn eine Inhibierung der Adhäsion von B16F10 ist erst ab 20 mM zu beobachten. Häufig ist bei niedrigen Konzentrationen der Zuckermimetika sogar eine Adhäsionsverstärkung festzustellen, die den bifunktionellen Charakter von Galactosiden aufweist. Ein kleines Molekül wie das 1-ß-Methylgalactosid bewirkt zwar eine verstärkte Adhäsion, die aber scheinbar durch die schwache Bindungsaffinität nicht erkennbar ist. Einen verstärkten biologischen Effekt, z B. die Reduktion des Adhäsionspotentials, erreicht man nur, wenn die Galactoside in geclusterter Form angeboten werden. Jedoch muss die geclusterte Gesamtstruktur wiederum so konzipiert sein, wechselwirken 2,5FuranGalGal um zu mit können. Verbindungen dem Denn korrespondierenden die können divalenten nicht das Adhäsion-Rezeptor 3,4FuranGalGal und Inhibitionspotential des divalenten TMC-Galactosids erreichen. Daher ist die Stereochemie ein weiteres Kriterium für die Interaktionen mit den Zelloberflächenzuckern und -proteinen. Das TMC-DiGal scheint alle oben aufgezählten Parameter in sich zu vereinen, um mit der B16F10 Zellmembran wechselwirken zu können. Die Bindungspartner können Lectine oder andere regulatorische Proteine wie Integrine, CD44 oder Galectine sein, die sich auch qualitativ und quantitativ in B16F1 und B16F10 Zellen unterscheiden können [Hakomori S, 1996]. Die N-Glycoslierung von Integrinen ist essentiell für ihre Bindung an Fibronectin. Werden sie deglycosyliert dissoziieren die α5 und ß1 Untereinheiten und die Bindung zu Fibronectin geht verloren. Im Adhäsionsassay ist zu beobachten, dass bei niedrigen Konzentrationen (zwischen 5-10 mM) der Testsubstanzen 3,4FuranGalGal, TMC-TriGal die Adhäsion der Zellen an Fibronectin erhöht wird und erst ab einer Konzentration >10 mM die Zelladhäsion reduziert wird. Ähnliches ist schon in der Literatur beschrieben: Zheng zeigte, dass GM3 die Aktivität vom α5ß1-Integrin beeinflusst. In diesem Zusammenhang stellte er fest, dass bei einer Zugabe von GM3 die Bindungsaktivität an Fibronectin regulierbar ist. Bei einer bestimmten Konzentration von GM3 beobachtete er eine verstärkte Bindung der (FUA 169)- Zelle an Fibronectin, jedoch bei einer höheren 90 Diskussion und Ausblick Konzentration wurde diese Bindung aufgehoben [Zheng M et al., 1993]. Hakomori postuliert zudem, dass die Akkumulation von GM3 und GD3 in humanen und Mausmelanomen für die Zell-Zell-Adhäsion verantwortlich ist [Hakomori S, 1996]. Es ist also möglich, dass die Konzentration von GM3 und GD3 ein adhäsionsregulierender Faktor ist, der die Präferenz für die Adhäsion an Fibronectin (und anderen ECM-Proteinen) oder an andere Zellen steuert [Cheresh DA et al., 1987; Ozeki Y et al., 1995]. Denn separat enthüllten andere Arbeiten die wichtige Funktion der Zell-Zell-Adhäsion bei der Metastasierung. Man zeigte in vitro, dass die Tumorzellaggregation auf homotypische Zell-Zell-Adhäsionen zurückzuführen ist, die die Metastasierung durch die Embolisierung in der pulmonären Vaskulatur fördert [Raz A, 1980]. Diese Daten aus der Literatur zusammengefasst liefern nun die Interpretation der Resultate aus den eigenen Adhäsionsassays. Es wäre somit möglich, dass z. B. TMC-DiGal in die Integrin abhängige Adhäsion eingreifen kann. TMC-DiGal wirkt dann wie GM3 konzentrationsabhängig auf das Adhäsionspotential. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind jedoch noch unklar. Auch die Anfärbung der FAP-Region der SKOV-3 Zellen mit TMC-DiGal lässt sich gut in diese These einordnen, wenn man zeigen kann, dass tatsächlich Adhäsionsmoleküle wie Integrine oder CD44 adressiert sein könnten. Die andere Möglichkeit wäre die Beeinflussung der Zucker-Zucker-Interaktion, die zu einer Adhäsionserhöhung zwischen den Zellen führt und gleichzeitig das Adhäsionspotential an Fibronectin reduziert. Auch in den eigenen Adhäsionsassays ließ sich die Tendenz zur Zellaggregation während der Inkubation der B16F10 Zellenmit TMC-TriGal und mit 1-ß-Methylgalactosid beobachten. Die Galectine sind dabei von besonderem Interesse, weil sie spezifisch Lactose und Galactose binden können und damit die Möglichkeit besitzen, mit den TMCDiGal zu interagieren. Die Überexpression von Galectinen, insbesondere Galectin3 auf Tumorzellen wird für erhöhte Adhäsion und Metastasierungspotential verantwortlich gemacht [Bresalier RS et al. 1998]. Es ist demnach denkbar, dass TMC-DiGal die Galactose-Bindungsstellen von Galectin-3 absättigt und so ihre Bindungsfunktion inaktiviert. Dass auch auf der ECM-Seite Galectin-Zucker Interaktionen möglich sind, zeigen Untersuchungen von Ozeki. Sie wiesen in vitro nach, dass Galectin-1 eine adhäsive Wirkung auf Sarkomazellen an Fibronectin 91 Diskussion und Ausblick besitzt, die durch die Zugabe von Lactose inhibiert werden konnte. Sie zeigten zudem immunohistochemisch, dass Galectin-1, Fibronectin und Laminin in der ECM kolokalisiert vorliegen. Sie postulieren deshalb, dass das ECM-Galectin-1 eine adhäsionskontrollierende Rolle spielt [Ozeki Y et al., 1995]. Für den in vivo Versuch mit adhäsionshemmende Wirkung B16F10 Zellen würde das bedeuten, dass die von TMC-DiGal die Invasion bzw. das Metastasierungspotential reduzieren könnte. Das Invasionsassay in der Boyden Kammer bestätigte diese These in vitro. Das TMC-DiGal zeigte bei den B16 Melanomzellen das höchste Inhibitionspotential im Gegensatz zum TMC-Core, TMC-TriGal und 1-ß-Methylgalactosid. Abb. 4.1-1 zeigt zwei Zellen, die gerade durch eine Pore die im Matrigel eingebettet ist, wandern. Das Invasionspotential wird über die Quantität der durchgewanderten Zellen ermittelt. Bislang wurde nur die akute Cytotoxizität von TMC-DiGal und TMC-TriGal mittels Trypanblau bestimmt, aber man geht davon aus, da TMC-Core und 1ßMethylgalactosid keine toxischen Verbindungen darstellen, dass TMC-DiGal und TMC-TriGal auch keine zelltoxischen Eigenschaften besitzen. Fazit ist, dass hier Adhäsions- und Invasionspotential zusammenhängen, denn wird die Adhäsion an der ECM über einen noch ungeklärten Mechanismus durch TMC-DiGal gehemmt, wird die Migration durch die ECM erschwert. Experimente von Briles und Korneld bekräftigen diese Annahme. Sie trennten B16-Zellen in gut und schlecht adhärierende Zellen und stellten fest, dass gut adhärierende Zellen im Maus-Modell invasiver waren, als die schlecht adhärierende Zellen [Briles EB und Kornfeld S, 1978]. Metalloproteinasen (MMP) sezernieren zu können zeichnen maligne Tumorzellen aus, denn dadurch gelingt ihnen die Degradierung der ECM und BM und folglich 92 Diskussion und Ausblick die Intravasation in die Blutbahnen. Broocks und Chattopadhyay zeigten, dass es einen biologischen Zusammenhang zwischen Integrinen und MMPs gibt [Brooks PC et al., 1996; Chattopadhyay N et al. 2001]. Durch die Stimulierung der Tumorzell-Integrine α5ß1, αVß3 konnte die Expression von verschiedenen MMPs aktiviert werden [Deryugina EI et al., 2000; Hofmann UB et al.,2000; Deryugina EI et al., 2001]. Da TMC-DiGal und TMC-TriGal zeigten, dass sie das Invasionspotential von B16 Zellen reduzieren, untersuchten wir die MMP-Aktivität bei der Inkubation von B16 Zellen mit verschiedenen Zuckerverbindungen. Das Inhibierungspotential der MMP-Aktivität nimmt in dieser Reihenfolge zu: 1-ß-Methylgalactosid < TMC-Core < 3,4 Furan < TMC-TriGal. Diese vorläufigen Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Inhibierung der Invasion durch synthetische Zucker auch im Zusammenhang mit der Inaktivierung von MMP stehen könnte. Es stellt sich dabei immer mehr die Frage, woran das TMC-DiGal oder die 3,4 und 2,5DiGal-Furane binden und ob sie einen direkten oder indirekten Effekt auslösen, wodurch die Adhäsion bzw. Invasion und eventuell die MMP-Aktivität inhibiert werden. Die essentielle Rolle der Zucker-Lectin-Interaktionen während der Metastasierung verdeutlichen Experimente mit Mäusen, bei denen eine Inhibition der Lebermetastasierung durch Infusion von Arabinogalactan und D-Galactose erzielt wurden. Klinische Experimente zeigten, dass durch die Infusion von Galactose vor und nach der operativen Entfernung von Colontumoren, die Bildung von Lebermetastasen inhibiert wurde. Nach Galactose-Infusion bildeten drei Patienten Lebermetastasen im Vergleich zur Kontrollgruppe, die sieben Patienten mit Lebermetastasen beinhaltete. Dies könnte auf eine Absättigung von Galactose-bindenden Leber-Lectinen zurückzuführen sein [Beuth J et al., 1987; Beuth J et al., 1995]. Trotz des Erfolges wird die Euphorie über diese Daten abgeschwächt, wenn man weiß, dass anstatt Lebermetastasen Lunge- und Knochenmetastasen gebildet wurden. Fazit ist aber, dass das Ansiedeln/ Anheften von Tumorzellen an bestimmte Organe via Interaktionen zwischen den Oligosaccharidstrukturen auf malignen Zellen und den Lectinen der Zellmembran des Zielorgans oder umgekehrt gesteuert wird. Überdies darf die Rolle der ECM nicht vernachlässigt werden, weil sie einerseits Kohlenhydratbindende Proteine 93 Diskussion und Ausblick wie das Galectin-1 besitzt und andererseits auch hochverzuckert ist. Frühere Arbeiten zeigten, dass B16F10 Zellen nur an Laminin adhärieren, wenn sowohl das Integrin α6ß1 (für die Bindung an Laminin verantwortlich) und Laminin glycosyliert sind. Wurden sie jeweils einzeln enzymatisch deglycosyliert konnte die Adhäsion inhibiert werden [Chammas R et al., 1991; Dean JW III et al., 1990]. Daher werden zur Zeit Adhäsionsassays mit verschiedenen ECM-Proteinen (Vitronectin, Laminin) in der Dissertation von C. Gronewold durchgeführt. Die Parallelen zum Anfärbemuster von TMC-DiGal (Anfärbung der FAP-Region bei SKOV-3) und zum hohen Inhibierungseffekt im Adhäsionsassay regen zusätzlich an, nach unterschiedlichen Anfärbemustern von B16F1 und F10-Zellen mit TMC-DiGal zu schauen, um mögliche Bindungspartner, die für die Adhäsion verantwortlich sind, visualisieren zu können. Zwar muss man vorsichtig sein, wenn man humane und murine Zellen und dazu noch von einem jeweils anderen Organ stammend, vergleicht, aber TMC-DiGal scheint eine Kohlenhydrat-Verbindung zu repräsentieren, die in allen Assays hohe biologische Aktivität zeigt und daher in anderen Systemen weiterhin als Referenzsubstanz eingesetzt werden sollte. Um ein dezidiertes Bild über die Bindungsmöglichkeiten zwischen synthetischen Zuckern und ECM-Proteinen und Zellmembran-Proteinen/Lectinen zu erhalten, müsste man Bindungsstudien durchführen, z.B. SPR (Surface Plasmon Resonance Methode), die über fluoreszenzmarkiertem Zucker und immobilisierten (ECM-) Protein laufen könnte. SPR stellt eine elegante Methode dar, um RealTime-Experimente durchzuführen, die das dynamische Bindungsverhalten zwischen zwei Komponenten wiedergeben. Damit könnte man auch Assays in Kombination mit verschiedenen Zuckern verschiedener Molekülgrößen oder Verzweigungsgrad durchführen, die um die selben Rezeptoren konkurrieren. Die Technologie ist soweit entwickelt, dass letztlich ganze Plasmamembranfragmente als stationäre Phase für Bindungsstudien mit Zuckern eingesetzt werden können. Zusammengefasst unterstreichen diese Daten die Koexistenz von vielen verschiedenen Mechanismen für die Adhäsion und Invasion von Tumorzellen, wobei die Zucker-Zucker- und Zucker-Lectin-Interaktionen eine wichtige Rolle zu spielen scheinen, die noch näher untersucht werden müssen. Diese Interaktionen können konzertiert ablaufen, sich gegenseitig verstärken und unter bestimmten 94 Diskussion und Ausblick Bedingungen inhibiert werden. Fazit: diese Prozesse sind sehr spezifische Erkennungsprozesse, die Einfluss auf das Metastasierungspotential haben. Molecular Modeling zur Ermittlung einer Struktur-Aktivität-Beziehung Die biologischen Effekte aus den Anfärbe-, Adhäsions- und Invasionsassays, die durch die verschiedenen Kohlenhydratstrukturen hervorgerufen werden lassen die Ableitung einer Struktur-Aktivitätsbeziehungen zu, die mit Hilfe von Molecular Modeling-Daten näher untersucht wurden. Denn wichtig ist es, allgemeine auf struktureller Ebene basierende zellbiologische und biomolekulare Gesetze für Adhäsions- und Invasionsmechanismen zu finden, die bei metastasierenden Zellen verändert vorliegen und immer mehr in den Kontext von veränderter Kohlenhydrat-Lectin-Interaktion gebracht werden. So hat man zum Beispiel häufig N-acetylglucosamin ß1,6-Mannose verzweigte Oligosaccharidstrukturen bei metastasierenden Tumorzellen gefunden oder häufig an O-Glycanen verknüpfte sLex und sLea in stark metastasierenden y colorectalen Tumoren und Le [Dennis JW et al., 1987; Shimodaira K et al., 1997; Kim YS, et al., 1996; Roth J 2002] Aus den Molecular Modeling Berechnungen zeigte sich eine hohe geometrische Ähnlichkeit der Pharmacophor-Modelle von Ley und 3,4DAGalFuc (erstellt aus den Mittelwerten von Winkel und Abstände der Kohlenhydratbausteine mit und ohne Bezug zum Core-Element). Die Darstellung besagt, dass 3,4DAGalFuc den optimalen geometrischen Raum besitzt, um dieselben Rezeptorbindungsstellen wie Ley adressieren zu können. Der Vergleich der Pharmacophor-Modelle untereinander zeigte, dass sich 3,4DAGalGal und 2,5DAGalGal nicht sonderlich von ihren korrespondierenden Ausgangsubstanzen 3,4- und 2,5-Furanen unterscheiden. Das bedeutet also, dass die Pharmacophore (Kohlenhydrat-Bausteine) von 3,4-Furan und 3,4 DAMimetika denselben geometrischen Raum einnehmen und folglich dieselben Bindungspartner adressieren können. Molecular Modeling Daten sagen auch voraus, dass der eingenommene geometrische Raum der Kohlenhydrat-Bausteine zwischen 3,4Furan und TMCDiGal ähnlicher ist als zwischen den beiden Furan-Isomeren. Diese demonstrierten jedoch im Adhäsionsassay ähnliche Hemmeigenschaften und 95 Diskussion und Ausblick waren schwächer als TMC-DiGal. In diesem Fall korrelieren Molecular Modeling Daten nicht mit dem biologischen Effekt. Im Anfärbetest zeigten die 2,5DAGalGal kaum eine Färbung an SKOV-3 Zellen, wohingegen 3,4DAGalGal und TMC-DiGal die Zellen stark anfärbten. Aber hier ist die Annäherung der Molecular Modeling Daten mit den biologischen Daten mit Vorsicht zu bewerten. Denn zum einen spielt beim 2,5DA-Mimetikum sicherlich die Stabilität der Struktur eine wichtige Rolle, denn die ersten kinetischen Daten zeigten, dass bei Raumtemperatur allmählich die Retro-Diels-Alder-Reaktion einsetzt, die eine korrekte Anfärbung daher nicht möglich macht. Zum anderen färbten zwar 3,4DAGalGal und TMC-DiGal gleich gut, aber das Färbemuster war bei den SKOV-3 Zellen jeweils ein anderes (TMC-DiGal: ganze Zelle und FAPRegion; 3,4DAGalGal: ganze Zelle). Des weiteren veranlasste die gute Korrelation zwischen den Anfärbungen mit 3,4DAGalFuc auf Coloncarcinomzellen CaCo-2 und SW480 und den Ergebnissen von Schmauser, die Ley-Lectine aus Colontumorgewebe mittels Affinitätschromatographie isolierte, die Berechnung der Pharmacophor-Modelle für Ley [Schmauser, 1999]. Der Vergleich der beiden Pharmacophor-Modelle zeigte eine fast identische geometrische Raumbesetzung der Kohlenhydratbausteine von 3,4DAGalFuc und Ley. Daher wird postuliert, dass die exzellente Anfärbung mit 3,4DAGalFuc zum einen auf Interaktionen mit Ley beruhen, weil Ley als Tumorantigen auf Colontumoren überexprimiert ist. Zum anderen ist die spezifische Anfärbung auf Interaktionen mit den korrespondierenden Ley-Lectinen zurückzuführen [Feizi T, 1987; Kim YS, 1986; Sakomoto J et al., 2000]. Zusammengefasst lässt sich sagen, dass Kohlenhydrat-Lectin-Interaktionen eine wichtige Rolle in der Metastasierung spielen. Abhängig von der Struktur und den Kohlenhydrat-Bausteinen konnte eine Färbemethode etabliert werden, die die Spezifität der Lectinexpression auf der Zellmembran von Tumorzellen visualisieren konnte. Wichtige Schritte bei der Metastasierung wie Adhäsion und Invasion konnten beeinflusst werden, die auch einen Zusammenhang zur MMPAktivität herstellten. Offenbar sind mehrere Interaktionen bei diesen Prozessen wichtig: Kohlenhydrat-Kohlenhydrat-, Kohlenhydrat-Protein- und Protein-Protein96 Diskussion und Ausblick Interaktionen und die Wechselwirkung zwischen den Zellen und der ECM. Des weiteren ist es wichtig zu eruieren, worauf die visualisierte Bindung der Kohlenhydratmimetika auf fixierte Zellen beruht, welche Proteine adressiert werden und welche Effekte, z. B. die Signaltransduktionkaskade, durch eine Bindung des Zuckers ausgelöst werden. 97 Zusammenfassung 5 Zusammenfassung Im Rahmen dieser Arbeit sind verzweigte Kohlenhydratmimetika mit einer einfachen Synthesestrategie dargestellt worden, die keine anspruchsvolle Schutzgruppentechnik erforderte. Als Basis für ein Drug Targeting Konzept wurde mit den verzweigten Sacchariden eine Fluoreszenzfärbe-Methode zur Lokalisierung von Lectinen auf der Plasmamembran von intakten Tumorzellen etabliert. Die Bedeutung der Zucker-Lectin-Interaktionen im Tumorgeschehen wurde mit synthetischen Zuckern in zellbiologischen Experimenten untersucht. Die sich daraus ergebenden Struktur-Aktivitätsbeziehungen wurden mit Hilfe von Molecular Modeling Methoden interpretiert. Die Glycosidierung über benzoylgeschützte Imidate hat sich als einfaches und effizientes Verfahren herausgestellt Kohlenhydratverbindungen mit dargestellt der wurden. verschiedene Die zwei verzweigte verschiedenen Corestrukturen führten zu zwei Typen von Kohlenhydratmimetika, die einerseits auf Trishydroxymethyl-Cyclohexan (TMC) und andererseits auf Bishydroxymethylfuran aufgebaut wurden. Die TMC-Digalactoside wurden über einen Aminspacer mit NHS-Biotin derivatisiert. Für die glycosidierten Furane stellte sich die Umsetzung mit Biotin-Maleinimid in Wasser über die Diels-Alder (DA) Reaktion als idealer Syntheseweg dar. Mit Hilfe der biotinylierten 3,4DA-Mimetika und TMC-DiGal konnten diskrete Bereiche auf der Plasmamembran von verschiedenen Tumorzelllinien angefärbt werden, die sich als sehr spezifisch darstellten. Bei der Inkubation der Colontumorzellen mit 3,4DAGalFuc war eine Polarisierung der Anfärbung zu beobachten, die gut mit der aus der Literatur beschriebenen Polarisierung des Endozytoseprozesses (patching, capping) korreliert. 3,4DAFucFuc ergab eine polarisierende Färbung mit SW480 Zellen, die Fucose-Rezeptoren mit endozytotischer Funktion besitzen. Hieraus ergibt sich für diese Zuckerverbindung eine Einsatzmöglichkeit für ein tumorspezifisches Drug Targeting. Ferner färbte TMC-DiGal die “focal adhesion points“ der Ovarialkarzinomzellen SKOV-3 an. 98 Zusammenfassung Es konnte gezeigt werden, dass eine Vielzahl von Faktoren das Anfärbemuster beeinflussten. Zum einen spielt die räumliche Orientierung der Kohlenhydratbausteine und zum anderen die Kohlenhydratbausteine selbst eine wichtige Rolle für die charakteristische Anfärbung. Hervorzuheben ist, dass normale humane Fibroblasten mit den biotinylierten DA-Mimetika keine Anfärbungen zeigten. In einem Metastasierungsmodell konnten unterschiedlich verzweigte Galactoside wichtige Metastasierungsschritte wie Adhäsion und Invasion beeinflussen. Die Adhäsion der stark metastasierenden B16F10 Zellen an Fibronectin wurde durch das divalente TMC-Digalactosid am stärksten gehemmt. Die beiden isomeren Furandigalactoside waren schwächere Inhibitoren, während die Kontrolle, das 1-ßMethyl-Galacotsid die Zelladhäsion leicht stimulierte. Im Vergleich dazu wurde das Adhäsionspotential von schwach metastasierenden B16F1 Zellen nicht beeinflusst. Ferner konnte die Migration der B16 Zellen signifikant durch die synthetischen Galactoside gehemmt werden. Das divalente TMC-Galactosid zeigte wieder die höchste inhibitorische Potenz. Die Kontrollsubstanz TMC-Core (ohne Zucker) zeigte dabei keinen Einfluss. Weitere Untersuchungen demonstrierten die Reduktion der MMP-Aktivität durch multivalente Kohlenhydratstrukturen, die im Fall TMC-TriGal sogar ganz gehemmt werden konnte. Diese Ergebnisse liefern somit weitere Anhaltspunkte zur Aufklärung der Funktion von Kohlenhydraten bei der Metastasierung. Mit Molecular Modeling Berechnungen wurde die Struktur von Ley, welches auf Coloncarzinomzellen überexprimiert ist, mit der von 3,4DAGalFuc, welches die Colonzelllinien CaCO-2 und SW480 spezifisch anfärbte, verglichen. Die Pharmacophor-Modelle zeigten, dass 3,4DAGalFuc die geometrischen Vorraussetzungen besitzt, um Rezeptoren für Ley zu adressieren. Diese Daten eröffnen neue Perspektiven für die Immuntherapie, wo zur Zeit monoklonale Antikörper aus synthetischem Ley generiert und in klinischen Studien erprobt werden. Die Kombination von chemischer Synthese, biologischen Untersuchungen und Molecular Modeling Berechnungen demonstrierten in dieser Arbeit das ideale 99 Zusammenfassung Vorgehen zur Aufklärung des komplexen biologischen Zusammenhanges der Kohlenhydrat-Lectin-Interaktion. In dieser Arbeit konnte über wohldefinierte, kleine Moleküle auf Kohlenhydratbasis Informationen über die Struktur- Aktivitätsbeziehung gewonnen werden, die in einem Drug Targeting Konzept und in der Immuntherapie Eingang finden können. 100 Experimenteller Teil 6 Experimenteller Teil 6.1 Materialien und Methoden 6.1.1 Materialien zur chemische Synthese und Analytik Lösungsmittel und Trocknungsmittel Alle Reaktionen wurden in wasserfreien, käuflich erworbenen p.A. Lösungsmitteln durchgeführt. Die polaren Lösungsmittel Acetonitril, DMF, DMSO, Ethanol, Methanol wurden über Molekularsieb 3 Å getrocknet, alle anderen Lösungsmittel über Molekularsieb 4 Å. Die Lösungsmittel für die HPLC wurden von der Firma Merck, Lichrosolv® und der Firma Roth (Karlsruhe, D), Gradient Grade, bezogen. Das Milipore-Wasser wurde anwendungsgerecht 5 min. im Ultraschallbad entgast. Reagenzien Soweit nicht anders angegeben wurden alle kommerziell erhältlichen Edukte über die Firmen Sigma-Aldrich (Deisenhof, D), Merck (Darmstadt, D), Fluka (Neu-Ulm, D) bezogen. Kernresonanzspektroskopie 1 H-NMR: Bruker AM 250 (250 MHZ) [Bruker, Rheinstetten, D] Bruker Am 500 (500 MHZ) [Bruker, Rheinstetten, D] 13 C-NMR: Bruker AM 250 (63 MHZ) [Bruker, Rheinstetten, D] Bruker Am 500 (125 MHZ) [Bruker, Rheinstetten, D] Abteilung Zentrale Spektroskopie des DKFZ, Heidelberg 101 Experimenteller Teil Massenspektroskopie Elektrospray-Ionisation (ESI) [Finnigan MAT TSQ 7000] Abteilung Zentrale Spektroskopie des DKFZ, Heidelberg Dünnschichtchromatographie Dünnschichtfolien Polygram Sil G/UV254 [Macherey-Nagel, Düren, D] Schmelzpunktbestimmungsröhrchen [Marienfeld, D] beidseitig offen Sprühreagenzien für die Dünnschichtchromatograhie • • Vanillin-Schwefelsäure-Sprühreagenz (Stahl 1967) Zusammensetzung 0,1 % Lösung von Vanillin in 50% H2SO4 Anwendung insbesondere bei höheren Alkoholen/Saccharide Cer-Molybdän-Sprühreagenz Zusammensetzung 24 g (NH4)6Mo7O24x2 H2O mit 1 g CeSO4 in 500 ml 10 % H2SO4 gelöst Anwendung bei allen oxidierbaren Substanzen (Universalreagenz) Alle Reagenzien wurden im Heißluftstrom erhitzt zum Erreichen ihrer spezifischen Anfärbung Säulenchromatographie Kieselgel KG 60, 0.063-0.02 mm [Macherey-Nagel, Düren, D] Kieselgel KG 60, 0.04-0.063 mm [Macherey-Nagel, Düren, D] Geräte und Materialien für die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) • Hewlett-Packard HP 1090 [Hewlett Packard, Bad Homburg] Säule (analytisch) PuroSpher RP-18e 5µm, 125 x 3 mm Detekor UV-Vis HP Integrator 3396A • Gilson Abimed [Merck, Darmstadt, D] [Jasco, Groß-Umstadt, D] [Hewlett Packard, Bad Homburg] [Langenfeld, D] 102 Experimenteller Teil Säule Detektor Software PuroSphere RP 18(e) [Merck, Darmstadt] Sedex Lichtstreu, [Alfortville Cedex, F] Modell 55 Gilson Uni Point® System Sonstige Geräte Fraktionsammler LKB Super Frac Gefriertrockner Beta 1-8 Rotationsverdampfer R-114/Wasserbad B480 Trockenschrank T 6120 Vakuumpumpe RD 4 [Pharmacia, Hilter, D] [Christ, Osterode, D] [Büchi, Flawil, CH] [Heraeus, Hanau, D] [Vacuubrand, Wertheim,D] 6.1.2 Materialien und Methoden für die Zellkultur 6.1.2.1 Routine-Zellkultur • Medium und Zusätze DMEM RPMI 1640 ohne L-Glutamin HEPES-Puffer 1 M L-Glutamin FCS (Fötales Kälberserum) • [Pan Systems, Aidenbach, D] [Pan Systems, Aidenbach, D] [Pan Systems, Aidenbach, D] [Pan Systems, Aidenbach, D] [Pan Systems, Aidenbach, D] Reagenzien Trypanblau 0.5 in physiol. Kochsalzlsg. PBS ohne Ca2+/Mg2+ EDTA (Versen) 1% (w/v) in PBS Ohne Ca2+/Mg2+ DAPI DMSO für die Gaschromatographie • [Biochrom, Berlin, D] [PAA, Linz, CH] [Biochrom, Berlin, D] [Hoechst, D] [Merck, Darmstadt, D] Daten für die Routine Zellkultur für folgende humane Tumorzelllinien s. Literaturangaben im Kapitel „Ergebnisse“ • Verbrauchsmaterialien Gewebekulturflaschen 25 cm2 / 50 ml; 75 cm2 / 250 ml Zentrifugenröhrchen Falcon, 15, 50 ml Spritzenfilter 0,2µm Cryovials 2ml • [Becton Dickinson, Heidelberg, D] [Becton Dickinson, Heidelberg, D] [Renner, Darmstadt, D] [NUNC, Wiesbaden, D] Geräte Zählkammer nach Neubauer [Renner, Darmstadt, D] 103 Experimenteller Teil Brutschrank B 5060 Sterile Werkbank HERAsafe Umkehrphasenmikroskop Leitz, DM IL Sorvall Super T21-Zentrifuge [Heraeus, Hanau, D] [Heraeus, Hanau, D] [Leica, Wetzlar, D] [Kendro Lab. Prod., Osterode, D] Einfrieren der Zellen Zellen einer laufenden Routinesubkultur werden jeweils nach Anweisung der ACCT Nr. abgeerntet und 2 x mit 10 ml frischem Kulturmedium bei 900 rpm bei 25 °C abzentrifugiert. Das Zellpellet wird im Kulturmedium mit 10 % DMSO resuspendiert , wobei das Volumen so gewählt werden soll, dass in 2 x 106 Zellen /ml enthalten sind. 1 ml Zellsuspension wird in ein Cryoröhrchen überführt. Das Einfrieren erfolgt bei –80 °C im Gefrierschrank oder durch die kontrollierte Abkühlung ei 1 °C / min in der Tumorbank des DKFZ. Auftauen der Zellen Das Cryoröhrchen wird 1 min der Raumtemperatur ausgesetzt und anschließend rasch bei 37 °C im Wasserbad aufgetaut. Die Zellsuspension wird in 10 ml vorgewärmten Kulturmedium überführt und anschließend bei 900 rpm bei 25 °C 5 min lang (2 x) abzentrifugiert, um das DMSO zu entfernen. Die Vitalität, die bei mindestens 80 % liegen sollte, wird mit Trypanblau überprüft. Die Zellen werden in der Zellkulturflasche nach Anweisung der DKFZ-Tumorbank subkultiviert. Mycoplasmentest Der Test auf Mycoplasmen erfolgt bei Zellen, die von der Subkultur entnommen und auf sterile Deckgläschen angezüchtet werden. Sie werden mit PBS gewaschen und 10 min mit 3% Formaldehyd (oder MeOH : Eisessig= 4:1) fixiert. Die fixierten Zellen werden mit PBS gewaschen und anschließend mit DAPI einem DNA-Interkalator in einer Konzentration von 1 µg / ml für einige Minuten im Dunkeln inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen mit PBS werden die Zellen luftgetrocknet und mit Elvanol auf einem Objekträger eingedeckt. Sind die Zellen mit Mycoplasmen kontaminiert erkennt man die DNA der Mycoplasmen anhand der punktförmig fluoreszierenden Areale am und im Zellbereich. 104 Experimenteller Teil 6.1.2.2 Fluoreszenzfärbung von adhärent wachsenden Zellen • Reagenzien, Stammlösungen Waschpuffer: PBS (Phosphate Buffered Saline) pH 7,2 Fixierlösung: 3% Formaldehyd/PBS Permeabilisierunglösung: 0,1% Triton X-100/PBS Blockierungslösung: 0,1% BSA (5% Milchpulver) Färbelösung a: 2 µg/50 µl biotinyliertes DA-Mimetikum Färbelösung b: Avidin-FITC (1:100) Kernfärbelösung: 0,0001% DAPI/PBS _________________________________________________________________ • Biotinylierung von TMC-DiGal mit EZ-Link NHS-LC-Biotin Reaktionspuffer: 50 mM NaCO3, pH 7,5 Reaktionslösung: 0,05 mM TMC-DiGal in 1ml Reatkionspuffer Biotinlösung: 0,055 mM EZ Link NHS-Biotin [Sigma Aldrich, Deisenhof, D] in 1 ml DMF Stoppreagenz: 0,01 mM Methylamin _________________________________________________________________ • Materialien und Geräte Deckgläschen Objektträger Fluoreszenzmikroskop Kamera Coverslips Objektträger Gewebekulturschalen, Falcon, 35 x 10 mm • [Leica-Orthoplan, Bensheim,D] [Vario-Orthomat, Bensheim,D] [Becton Dickinson, Heidelberg, D] Durchführung Adhärent wachsende Zellen werden auf Coverslips (2 x 104 /1cm Ø) ausgesät und unter Routine-Zellkultur Bedingungen gezüchtet. Vor Erreichen der Konfluenz werden die Zellen mit Fixierlösung inkubiert und nach dreimaligem Waschen mit PBS werden die Deckgläschen falls erwünscht 5 min mit Permeabilisierunglösung inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS werden die fixierten Zellen eine Stunde mit 5% Milchpulver/PBS-Lösung bei Raumtemperatur inkubiert, um unspezifische Bindungsstellen abzusättigen. Im ersten Färbeschritt werden die Deckgläschen mit Färbelösung a inkubiert. Die Zellen werden danach erneut gewaschen und unter lichtgeschützten Bedingungen mit Avidin-FITC (Färbelösung b) eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Zur topographischen Orientierung der Zellen werden die Zellkerne mit DAPI (Kernfärbelösung) 105 Experimenteller Teil angefärbt. Zum Schluss werden die Zellen kurz luftgetrocknet und mit Elvanol auf dem Objektträger eingedeckt. Die Auwertung der Färbung erfolgt unter dem Fluoreszenzmikroskop. 6.1.2.3 Fluoreszenzfärbung von Schnitten aus Colontumor und Normalgewebe s.o. 6.1.2.2 6.1.2.4 Adhäsionsassay an extrazellulärem Matrix-Protein Fibronectin • Reagenzien s. Routine-Zellkultur für B16F1, B16F10 Melanomazellen Adhäsionspuffer: 1% BSA/ PBS, 1 mM Ca 2+, 1mM Mg2+ Szintillationslösung: (Methyl-3H) Thymidin [Amersham Life Science] (spezifischen Aktivität von 1µCi/µl) ECM-Protein-Lösung: 50 µg/ 96 well-Platte Fibronectin [Invitrogen] • Materialien und Geräte 12-well Platten 96-well Platten, flexibel Multikanal-Pipette Eppendorf-Pipette, 200 µl, 1000 µl Falcon-Röhrchen 15 ml Szintillationsröhrchen • Durchführung Beschichten der 96-well Platten mit ECM-Proteinen: Die flexiblen 96-well Platten werden mit 50 µl der Fibronectin-Lösung beschichtet und über Nacht abgedeckt bei 4 °C gelagert. Am nächsten Tag wird die Lösung durch leichtes Klopfen auf der Unterseite der Platte auf Haushaltspapier entfernt. Anschließend werden die wells mit 200 µl für eine Stunde bei 37 °C inkubiert. Adhäsionsassay: Zellen der Zelllinie B16F1 bzw. B16F10 (Maus-Melanom) werden in einer 12 wellPlatte in 1 ml DMEM-Medium (4,5 g/l Glucose, 3,7 g/l NaHCO3, 4 mM L- Glutamin, 10% FCS) ausgesät. Um die Zellen später quantifizieren zu können 106 Experimenteller Teil wird das Medium mit der erforderlichen Menge Tritium-gelabeltem Thymidin versetzt (20 µCi/ 1*106 Zellen/ ml Medium). Nach 16 h Inkubation bei 30°C und 5% CO2 werden die Zellen mit 0,05 %-iger EDTA-Lösung abgelöst, ausgezählt und 3x mit serumfreiem DMEM-Medium gewaschen. Die Zellen werden in einem Eppendorf-Cup mit dem zuvor in Adhäsionspuffer gelösten Saccharid-Liganden versetzt. Nach einstündiger Inkubation bei 37°C unter leichtem Schütteln, werden 5 x 104 Zellen direkt in die zuvor beschichtete Platte pipettiert und nochmals 1h bei 37°C inkubiert. Nicht anhaftenden Zellen werden durch dreimaliges Waschen mit PBS entfernt und die haftenden Zellen werden unter dem Mikroskop visuell ausgewertet. Zur exakten Quantifizierung werden die Wells mit einer Schere vereinzelt und in Szintillationsröhrchen überführt. Das Röhrchen wird mit 5 ml Szintillationslösung befüllt und im Flüssig-Szintillator vermessen. Die Standardabweichung wurde berechnet nach Bishop Y et al.,1975. 6.1.2.5 Invasion-Assay in der Boyden-Kammer (semi-in vivo-Assay) • Reagenzien, Stammlösungen s. Routine-Zellkultur für B16F1, B16F10 Melanomazellen • Materialien und Geräte BD BiocatTM MatrigelTM Invasion Chamber (Lot Number: 006011), 24-well Platten, mit 12 extrazellulärere Matrix - Membran [Becton Dickinson, USA] Wattestäbchen, steril Lichtmikroskop Kamera • Durchführung Jedes Well wird mit 750 µl DMEM Medium/ 5 % FCS gefüllt. B16F1 und B16F10 Melanoma Zellen werden in 40 mmol Saccharid-Ligand im FCS-freiem DMEMMedium suspendiert und im Verhältnis 1 x 105 Zellen / obere Kammer ausgesät. Die Zellen werden 24 oder 48 Stunden lang bei 37 °C, 5% CO2 Atmosphäre kultiviert. Danach werden die Zellen auf der oberen Seite der Membran mit einem sterilen Wattestäbchen entfernt. Zur besseren Quantifizierung können die Zellen 107 Experimenteller Teil mit Hematoxilin angefärbt. Die Zahl der invasiven Zellen werden mikroskopisch ausgewertet. 6.1.2.6 MMP-2 Protease Aktivitätsmessung am Zymogramm • Reagenzien Für die Gelektrophorese s. 6.1.2.10 + 1% Gelatine Entwicklungspuffer: 150 mM NaCl; 50 mM Tris; 10 mM, CaCl, pH= 7.6 Färbung s. 5.1.2.11 • Material s. 6.1.2.7 b • Durchführung B16 Zellen werden in einer Zellkulturflasche (5 x 105 Zellen / 25 cm2) ausgesät. Nachdem sie am Boden der Zellkulturflasche angewachsen sind, wäscht man vorsichtig die Zellen mit Serum freiem DMEM-Medium. Die Zellen werden über Nacht (24 h) mit 50 mM Zuckerligand inkubiert (Als Kontrolle dient ß1Methylgalactosid und die Core-Struktur). Der Zellüberstand (2 ml) wird entnommen und bei 5000 g zentrifugiert, um die restlichen Zellbestandteile abzutrennen. Der nun klare Zellüberstand wird im Centrigon auf die 10-fache Konzentration reduziert (200 µl). Vom Konzentrat werden 50 µl entnommen und auf die Konzentration 0,065 M Tris pH 6,8 und 2% SDS eingestellt. (Nach 30 min Inkubationszeit bei 37 °C werden die Proben in die Taschen eine 7,5% Polyacrylamid Gel, die 1% Gelatine enthält, gefüllt. Ist die Elektrophorese beendet wird das Gel mit Triton X100 für 30 min (2x) gewaschen und für 24 h bei 37 °C mit Entwicklungspuffer inkubiert. Anschließend wird das Gel nach Coomassie Farbmethode (5.1.2.11) für 1 h gefärbt und dann mit 40% Methanol und 10% Essigsäure entfärbt. Die MMP-Aktivität wird durch weiße Banden am blauen Gel angezeigt. 108 Experimenteller Teil 6.1.2.7 Messung der Tyrosin-Phosphatase Aktivität von SKOV-3 Zellen a. Proteinbestimmung nach Lowry im Mikromaßstab • Reagenzien Aufschlusslösung :100 mM NaOH; 200 mM Na2CO3; 1 mM Kaliumnatriumtartrat-Tetrahydrat [Merck, Darmstadt] 25 mM CuSO4 x 5 H2O [Merck, Darmstadt] Folinlösung: 30 ml Folin-Ciocalteus Phenolreagenz [Merck, Darmstadt] • Geräte Mikroküvetten Greiner Greiner Labortechnik, D UV/Vis Spektrophotometer WPA Lightwave [Thermo Dux GmbH, Wertheim] • Durchführung Für die Eichgerade wird Bovines Serumalbumin (BSA) als Standardprotein gewählt. 4 mg BSA wird in 10 ml bidestilliertem Wasser aufgelöst und aus dieser Stammlösung werden 3 BSA-Konzentrationreihen zwischen 0-50 µg / 200 µl aufgestellt. Jede Konzentrationsprobe wird gut mit 1 ml Aufschlusslösung gemischt und für mindestens 10 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend werden die Konzentrationsproben mit jeweils 100 µl verdünnte Folin-Lösung (Folin : H2O = 1 : 1,5) für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und dann bei einer Wellenlänge von 600 nm am Spektrophotometer gegen Aqua bidest. als Referenz gemessen. Für die Proteinbestimmung in den Zellen wird Aqua bidest. gegeben, die einer Konzentration von 2x 106 Zellen /ml entspricht. Die Zellen werden mit einem Ultraschall-Desintegrator für 30 Sekunden auf niedriger Energiestufe homogenisiert. Aus diesen Lösungen wurden Aliquots zur Proteinbestimmung in Dreifachenwerten entnommen b. SDS-Polyacrylamid-Gelektrophorese nach Laemmli (1970) • Reagenzien Puffer: Acrylamid-Bisacrylamid-Stammlösung: 30 g Acrylamid;0,8 g Bisacrcylamid ad 100 ml Aqua bidest. 109 Experimenteller Teil Trenngelpuffer (5-fach: 22,7 g Tris; 30 ml 1N HCl ad 100 ml Aqua bidest., pH 8,8 Sammelgelpuffer (4-fach):6 g Tris; 48 ml 1 N HCl ad 100 ml Aqua bidest., pH 6,8 Probenpuffer (5-fach): 7,5 g SDS; 2,5 ml 2-Mercapto-propandiol 25 ml Glycerin; 2,5 ml Bromphenolblau (1% in MeOH) ad 50 ml 62, 5 mM Tris/HCl, pH 6,8 Laufpuffer: 3,03 g Tris; 14,4 g Glycin; 1,0 g SDS ad 1000 ml Aqua bidest., pH 8,3 Gelansätze Trenngel (10%) (30 ml): 10 ml ABA-Stammlösung; 6 ml Trenngelpuffer; 3 ml SDS (1% in Aqua bidest.); 0,03 ml TEMED Sammelgel (3%) (10 ml): 1 ml ABA-Stammlösung; 2,5 ml Sammelgelpuffer 1 ml SDS (1% in Auqa bidest.); 5,4 ml Aqua bidest.; 0,1 ml APS (10% in Aqua bidest.); 0,01 ml TEMED • Geräte Transphor Electrophoresis Unit, Heidolph, Kehlheim SE 260 Mighty Small Elektrophoresekammer, Höfer/Pharmacia, Freiburg Tischzentrifuge • Durchführung SKOV-3 Zellen werden in 24-well Platten (2 x 105 Zellen / 1,5 cm2) ausgesät. Nach 2 Tagen werden die Zellen mit 40 mM Zuckerliganden inkubiert. Nach 24 h werden die Zellen mit PBS / EDTA abgelöst (106 Zellen) und bei 300 x g zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das Pellet in Aqua bidest. aufgenommen und gut durchmischt. Nach sorgfältiger Homogenisierung mit einem Spitz-Ultraschall wird das Gesamtvolumen bestimmt und 60 µl für die Proteinbestimmung entnommen und ein Teilvolumen der Suspension mit dem gleichen Teilvolumen 4% igem Lämmli-Puffer gemischt. Die Proben werden nun bei 95 °C im Wasserbad 5 min lang erhitzt und nochmals bei 300 x g zentrifugiert. Man entnimmt das Volumen aus dem Überstand, das bei allen Proben die gleiche Proteinmenge enthält (aus 5.1.2.7 a ermittelt), damit ein direkter Signalvergleich der Probenbanden auf dem Gel gezogen werden kann. Die Lösungen für das Trenngel werden unter Eiskühlung gemischt, bis kurz unter den oberen Rand der Glasplatten gegossen und vorsichtig mit Aqua bidest. 110 Experimenteller Teil überschichtet. Nach abgeschlossener Polymerisation wird die Überschichtungslösung abgegossen und das Sammelgel unter Verwendung eines geeignenten Kammes darüber gegossen. Die Proben werden in die Taschen eines 7,5% Polyacrylamid Gel gefüllt die Gelelektrophorese bei 20-60 mA durchgeführt. Ein Gel wird zur Kontrolle nach 5.1.2.7 c weiterbearbeitet und das andere Gel nach 5.1.2.7 d behandelt. c. Färbung mit Coomassie • Reagenzien Fixierlösung: 40% Methanol, 7% Essigsäure Färbelösung:10% Essigsäure, 25% Methanol, Coomassie-Brilliant Blue G 205 [Sigma, Deisenhof, D] Entfärber: 10% Essigsäure, 25% Methanol Waschlösung: 25% Methanol Aufbewahrungslösung: 25% Methanol • Durchführung Nach erfolgter Elektrophorese wird das Gel mindestens 1 Stunde lang mit der Fixierlösung inkubiert. Es folgt die Inkubation mit der Färbelösung für eine Stunde bei Raumtemperatur. Nach Entfärbung des Gels in Entfärbelösung für 30 Sekunden wird es mehrere Male in Waschlösung gewaschen und schließlich bis zur weiteren Verwendung darin aufbewahrt. d. Western-(Protein-) Blotting Elektrophoretischer Transfer von Proteinen aus Gelen auf Nitrocellulose nach Towbin (1979) im Tank-Blot-Verfahren • Reagenzien Nitrocellulosemembran, Schleicher und Schüll, Düsseldorf, D) Transferpuffer: 25 mM Tris; 114 mM Glycin; 10% Methanol Equilibrierungspuffer: 25 mM Tris; 114 mM Glycin; 10% Methanol; 3% SDS Blockierungspuffer: 10 mM Tris-Cl / 150 mM NaCl pH 7,4 mit 5% Milchpulver Waschpuffer: 10mM Tris-Cl / 150 mM NaCl, pH 7,4 mit 5% Tween 20 111 Experimenteller Teil • Geräte Transphor Electrophoresis Unit Taumelschüttler • Heidolph, Kehlheim, D Höfer/Pharmacia, Freiburg, D Durchführung Die Nitrocellulosemembran wird 30 min vor Abschluss der Gelelektrophorese im Transferpuffer equilibriert . Nach Abschluss der Elektrophorese wird das Gel 30 min in Equilibrierungpuffer sanft geschüttelt. Der Blot-Sandwich wird luftblasenfrei unter Beibehaltung des Gelformates zusammengesetzt. Die Nitrocellulose wird zur Anode, das Gel zur Kathode gerichtet. Der Transfer findet bei Raumtemperatur statt. Minigele werden 1 h bei einer konstanten Stromstärke von 250 mA bei 150 Volt geblottet. Die Blotentwicklung im Blockierungspuffer geschieht über Nacht bei 4 °C. e. Immundetektion auf Proteinblots-Untersuchung auf Tyrosin-Phosphat • Reagenzien 1. Antikörper: Mouse-Tyrosin-Phosphatase [DAKO, Hamburg, D] 2. Antikörper: Rabbit-Anti-Mouse Peroxidase [DAKO, Hamburg, D] Waschpuffer: 0,02 % NaN3; 0,1% Tween; in PBS, pH 7,5 Substratpuffer und Entwicklungslösung: Nitro-Blue Tetrazolium/Bromo-ChloroIndolyl-Phosphate (NBT / BCIP) Substrat Farbdetektion, [Sigma Aldrich] • Durchführung Nach der Inkubation des Blots mit dem 1.Antikörper (im Blockierungspuffer verdünnt s.o.) für mindestens 2h bei 37°C wird er 3x 5 Minuten lang gewaschen. Danach findet eine 1h Inkubation mit dem 2. Antikörper (1:1000) statt. Nach Wiederholung des Waschgangs erfolgt die Entwicklung der Proteinbanden mit der Substrat- und Entwicklungslösung, die gleichmäßig auf Nitrocellulosepapier verteilt und im Dunkeln etwa 20 min inkubiert wird. Die Tyrosin-Phosphat-Bande wird durch violett gefärbte Banden angezeigt. Die Reaktion mit dem Substrat wird durch 3x Waschen mit bidestilliertem Wasser gestoppt. 112 Experimenteller Teil 6.2 Synthesevorschriften 1. Standardvorschrift für 3,4 glycosidierte Furane (2,4,6,8,9) 10.0 eq des 3,4- oder 2,5- Bis-hydroxymethylfuran werden mit 10.1 eq oder 2.2 eq (mono- oder diglycosidiert) Imidat in 150 ml trockenem Dichlormethan unter Argonstrom aufgenommen und 30 min bei Raumtemperatur geührt. Das Reaktionsgemisch wird auf –40 °C (Aceton/Trockeneis) gekühlt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0.3 eq TMS-Triflat initiiert. Das Reaktionsgemisch wird nach 2h bei –20 °C mit Zugabe von halbgesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung unter intensivem Rühren abgebrochen. Anschließend wird das Reaktionsgemisch durch ein Faltenfilter abfiltriert, zweimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt und zweimal mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, durch einen Faltenfilter abfiltriert und eingeengt. Die Aufreinigung erfolgte säulenchromatographisch (SiO2, Petrolether/Essigsäureethylester 2:1). Ausbeute: 50-60% 2. Standardvorschrift zur Entschützung von benzoylgeschützten glycosidierten Furanen(3,5,7) 3,4-Bis-benzoyl-saccharidoxymethyl-furane werden in Methanol aufgenommen, gerührt, mit frisch angesetzter 0.1 N Natriummethanolat-Lösung versetzt und 12h bei Raumtemperatur weitergerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit Ionenaustauscherharz Dowex H+ 50 WX8 neutralisiert, durch einen Faltenfilter abfiltriert und nach 2x Waschen mit Methanol im Rotationsdampfer eingeengt. Anschließend wird das Produkt in Wasser aufgenommen mit Diethylether gewasschen und die Wasserphase durch Gefriertrocknung eingeengt. Die präparative Aufreinigung geschieht über HPLC (Säule: Lichrosphere-RP18-(e); Eluent: Acetonitril /H2O = 0/100→50/50 in 40 min; Fluss: 0.1 ml/min, UV= 210 nm). Ausbeute:55- 66% 3. Standardvorschrift für die Umsetzung von 3,4-Bis-saccharid-oxymethyl-furane TM und EZ-Link PEO-maleimide activated biotin [Pierce] (11,12) 1 eq 3,4-Bis-benzoyl-saccharidoxymethyl-furan wird mit 1.2 eq PEObiotinmaleinimid in H2O aufgenommen und 6h bei erhöhter Temperatur (40 °C) gerührt. Das Produkt wird über Gefriertrocknung eingeengt. Die Aufreinigung erfolgt über die präparative HPLC (Säule: Lichrosphere-RP18-(e); Eluent: Acetonitril:H2O=O:100 gradient; →50/50 in 20 min; Fluss: 0.1 ml/min, UV= 210 nm). Ausbeute: 35-43% 113 Experimenteller Teil 3,4-Bis-2,3,4,6-tetra-benzoyl-ß-D-galactopyranosyloxymethyl-furan =2 3,4GalGalBzFuran OBzOBz OBz BzO O BzO OBz O O O OBz OBz C74H60O21 Exact Mass: 1284,36 O DC: KG, PE:EE 3:1; Rf= 0.9 1 H-NMR : δH (250 MHz, CDCl3) : 7.2-8.12 (m, 18H, 4x H-2Bz, 4x H-3Bz, 4x H-4Bz, 4x H-5Bz, H2Fur, H5Fur); 5.84 (dd, 1H, H-4); 5.67 (dd, J1,2= 7.94 Hz, 1H, H-2); 5.41 (dd, J2,3= 10.3 Hz, J3,4= 3.5 Hz, 1H, H-3); 4.63 (d, 1H, CH2aFur); 4.57 (dd, J6Ha,6Hb=11.34 Hz, 1H, 6-Ha); 4.34 (dd, J6Hb,6Ha=6.5 Hz, 1H, 6-Hb); 4.21 (d, 1H, CH2bFur); 4.11 (d, 1H, H-1); 3.8 (qd, J5,6a= 6.6 Hz, J5,6b= 6.2 Hz, J4,5= 1.0 Hz, 1H, H-5) 13 C.NMR : δC (63 MHz, CDCl3) : 142.4 (C-2/5Fur); 120.3 (C-3/4Fur); 99.7 (C-1); 77.51, 77.2, 77.0, 76.49 (4x CBz); 76.49, 71.4, 71.15, 69.82 (C-2, C-3, C-4, C-5); 62.0 (CCH2aFur); 61.62 (C-CH2bFur) MS (ESI) : m/z (%) : 1307.4 [M+Na]+ (100) Diese Verbindung lässt sich gut Umkristallisieren mit PE:EE 1:1 _________________________________________________________________ 3,4-Bis-ß-D-galactopyranosyloxymethyl-furan =3 3,4GalGalFuran OH OH OH HO O HO OH O O O O OH OH C18H28O13 Exact Mass: 452,15 HPLC (s. Bedingung in 2. Standardvorschrift) : Rt= 5.83 min 114 Experimenteller Teil 1 H-NMR : δH (250 MHz, CDCl3) : 7.64 (s, 2H, H2Fur, H5Fur); 4.91 (d, 2H, CH2aFur); 4.71 (d, 2H, CH2bFur); 4.47 (d, J1,2= 7.82 Hz, 1H, H-1); 3.93 (dd, 1H, H-4); 3.83 (dd, J2,3=11.54 Hz, 1H, H-2); 3.76 (dd, 1H, H-3); 3.69 (qd, J1,5= 7.77 Hz, J3,5= 4.23, J4,5= 0.98 Hz, 1H, H-5) ; 3.63 (dd, J6a,6b= 9.86 Hz, J6a,4= 3.35 Hz, H-6a) ; 3.52 (dd, J6b,1= 7.62 Hz ; H-6b) 13 C.NMR : δC (63 MHz, CDCl3) : 148.1 (C-2/5Fur); 124.8 (C-3/4Fur); 105.9 (C-1); 79.73, 77.39, 75.25, 73.25 (C-2, C-3, C-4, C-5); 65.8 (C-6), 65.59 (C-CH2Fur) MS (ESI) : m/z (%) : 475.0 [M+ Na] + (100) _________________________________________________________________ 3,4-Bis-2,3,4-tri-benzoyl-ß-L-fucosyloxymethyl-furan =4 3,4FucFucBzFuran OBz OBz BzO O BzO OBz O O O O OBz C60H52O17 Exact Mass: 1044,32 DC: KG, PE:EE 3:1; Rf= 0.1 1 H-NMR : δH (250 MHz, CDCl3) : 7.2-8.12 (m, 14H, 3x H-2Bz, 3x H-3Bz, 3x H-4Bz, 3x H-5Bz, H2Fur, H5Fur); 5.65 (dd, 1H, J2,3= 10.4 Hz, H-2); 5.6 (dd, 1H, H-4); 5.4 (dd, J3,4= 3.5 Hz, 1H, H-3); 4.67 (d, 1H, CH2aFur); 4.3 (d, 1H, CH2bFur); 4.24 (d, J1,2= 7.9 Hz, 1H, H-1); 3.7 (qd, 1H, H-5); 1.28 (d, 3H, CH3) 13 C.NMR : δC (63 MHz, CDCl3) : 142.0 (C-2/5Fur); 120.5 (C-3/4Fur); 99,5 (C-1); 77.42, 76.9, 76.4 (3x CBz); 71.84, 70.98, 69.78, 69.47 (C-2, C-3, C-4, C-5); 61.49 (2x CCH2Fur), 16.14 (CH3) MS (ESI) : m/z (%) : 1067.4 [M+Na]+ (100) _________________________________________________________________ 115 Experimenteller Teil 3,4-Bis-2,3,4-tri-benzoyl-ß-L-fucosyloxymethyl-furan =5 3,4FucFucFuran OH OH HO O HO OH O O OH O C18H28O11 Exact Mass: 420,16 O HPLC (s. Bedingung in 2. Standardvorschrift) : Rt= 5.07 min 1 H-NMR : δH (250 MHz, CDCl3) : 7.62 (s, 2H, H2Fur, H5Fur); 4.87 (d, 2H, CH2aFur); 4.67 (d, 1H, CH2bFur) ; 4.45 (d, 2H, H-1); 3.7 (qd, J5,6= 6.52 Hz, 1H, H-5); 3.75 (dd, J3,4= 3.5 Hz, 1H, H-4); 3.63 (dd, J2,3=9.92 Hz, 1H, H-3); 3.4 (dd, J1,2= 7.8 Hz, 1H, H-2); 1.28 (d, 3H, CH3) 13 C.NMR : δC (63 MHz, CDCl3) : 146.3 (C-2/5Fur); 123.2 (C-3/4Fur); 104.3 (C-1); 77.54, 75.91, 75.46, 75.02 (C-2, C-3, C-4, C-5) ; 65.9 (2x C-CH2Fur), 19.95 (CH3) MS (ESI) : m/z (%) : 443.0 [M+ Na] + (100) ; 863.4 [2M+ Na] + (60) _________________________________________________________________ 3,4-Bis-(2,3,4,6-tetra-benzoyl-ß-D-galactopyranosyl)-2,3,4-tri-benzoyl-ß-L-fucosyl)oxymethyl-furan =6 3,4GalFucBzFuran OBz OBz OBz BzO O BzO OBz O O O O OBz C67H56O19 Exact Mass: 1164,34 DC: KG, PE:EE 2:1; Rf= 0.2 1 H-NMR : δH (250 MHz, CDCl3) : 7.2-8.12 (m, 14H, 3x H-2Bz, 3x H-3Bz, 3x H-4Bz, 3x H-5Bz, H2Fur, H5Fur); 5.94 (dd, J4Gal,3Gal= 3.51 Hz, 1H, H-4Gal); 5.75 (dd, J2Gal,1Gal= 7.94 Hz, J2Gal,3Gal=10.41 Hz, 1H, H-2Gal); 5.7 (dd, J2Fuc,3Fuc= 10.51 Hz, J2Fuc,1Fuc= 8.04 Hz, 1H, H-2Fuc); 5.65 (dd, 1H, J4Fuc,3Fuc= 3.71, J4Fuc,5Fuc=1.13, H-4Fuc), 5.48 (d,d, 1H, H-3Gal) ; 5.43 (dd, 1H, H-3Fuc) ; 116 Experimenteller Teil 4.62 (d, 1H, CH2aFur); 4.59 (d, 1H, H-6a) ; 4.54 (d, 1H, H-1Fuc) ; 4.38 (d, 1H, d, CH2bFur); 4.36 (d, 1H, d, 1H, H-6b) ; 4.32 (d, 1H, H-1Gal); 4.11 (d, 1H, CH2bFur); 4.11 (d, 1H, H-5Gal); 3.8 (qd, 1H, H-5Fuc); 1.29 (d, 3H, CH3) 13 C.NMR : δC (63 MHz, CDCl3) : 142.3 (C-2/5Fur); 120.47 (C-3/4Fuc-Fur); 120.21 (C-3/4Gal-Fur); 99.65 (C1Gal/Fuc); 99.59 (C-1Fuc/Gal) 77.51, 77.2, 77.0, 76.49 (4x CBzGal, 3xCBzFuc); 72.1, 71.72, 71.21, 71.07, 69.70, 69.61, 6843, 68.11 (C2Fuc/Gal, C-3 Fuc/Gal, C-4 Fuc/Gal, C-5 Fuc/Gal); 62.0 (C-6 ); 61.44 (C-CH2Fur) MS (ESI) : m/z (%) : 1187 [M+Na]+ (100), 1195.5 [M+Cl]- (65) _________________________________________________________________ 3,4-Bis-ß-D-galactopyranosyl)-ß-L-fucosyl)-oxymethyl-furan =7 3,4GalFucFuran OH OH OH HO O HO OH O O O OH C18H28O12 Exact Mass: 436,16 O HPLC (s. Bedingung in 2. Standardvorschrift) : Rt= 3.48 min 1 H-NMR : δH (250 MHz, CDCl3) : 7.63 (s, 2H, H2Fur, H5Fur); 4.92 (d, 2H, CH2aFur); 4.89 (d, 2H, CH2bFur); 4.07-4.47 (m, 2H, H-1Gal, H-1Fuc); 3.52-3.86 (m, 10H , H-2Gal, H-3 Gal, H-4 Gal, H-5 Gal, H-6a, H-6b, H-2 Fuc, H-3 Fuc, H-4 Fuc, H-5Fuc) 13 C.NMR : δC (63 MHz, CDCl3) : 146.2 (C-2/5Fur); 123.24 (C-3/4Fuc-Fur); 123.14 (C-3/4Gal-Fur) ; 104.3 (C1Fuc/Gal); 78.08, 75.83, 75.68, 74.2, 74.12, 73.76, 73.54, 73.32 (C2Gal/Fuc, C-3 Gal/Fuc, C-4 Gal/Fuc, C-5 Gal/Fuc); 71.51 (C-6) ; 64.25 (C-6), 65.14 (C-CH2bFur) ; 18.24 (CH3) MS (ESI) : m/z (%) :459.0 [M+Na] + (100); 437.0 [M+ H] + (10); 471.0 [M+ Cl] – (15) _________________________________________________________________ 117 Experimenteller Teil 3-(-2,3,4-tri-benzoyl)-ß-L-fucosyloxymethyl-furan =8 3,4FucBzFuran OBz BzO OH O O OBz O C33H30O10 Exact Mass: 586,18 DC : KG, PE :EE 2:1, Rf= 0.33 1 H-NMR : δH (250 MHz, CDCl3) : 7.41-8.1 (m, 14H, 3x H-2Bz, 3x H-3Bz, 3x H-4Bz, 3x H-5Bz, H2Fur, H5Fur); 5.77 (dd, 1H, J2,3= 10.4 Hz, H-2); 5.71 (dd, 1H, H-4); 5.5 (dd, J3,4= 3.5 Hz, 1H, H-3); 4.89 (d, 1H, CH2aOFuc); 4.87 (d, J1,2= 7.9 Hz, 1H, H-1); 4.66 (d, 1H, CH2bO-Fuc); 4.43 (d, 1H, CH2aFur-OH); 4.37 (d, 1H, CH2bFur-OH) ; 4.1 (qd, 1H, H-5); 1.37 (d, 3H, CH3) 13 C.NMR : δC (63 MHz, CDCl3) : 142.0 (C-2/5Fur); 124.77 (C-3/4Fur-OH); 120.26 (C-3/4Fur-Fuc) ; 99,7 (C1); 77.5, 77.0, 76.49 (3x CBz); 72.11, 70.97, 69.97, 69.7 (C-2, C-3, C4, C-5); 61.54 (C-CH2Fur-Fuc); 55.06 (C-CH2Fur-OH); 16.14 (CH3) MS (ESI) : m/z (%) : 609.3 [M+Na]+ (100) ; 1195.5 [2M+Na]+ (60) _________________________________________________________________ 3,-(Bis-2,3,4,6-tetra-benzoyl)-ß-D-galactopyranosyloxymethyl-furan =9 3,4GalBzFuran OBz OBz O BzO OBz O HO O C40H34O12 Exact Mass: 706,21 DC: KG, PE:EE 2:1; Rf= 0.4 118 Experimenteller Teil 1 H-NMR : δH (250 MHz, CDCl3) : 7.4-8.12 (m, 18H, 4x H-2Bz, 4x H-3Bz, 4x H-4Bz, 4x H-5Bz, H2Fur, H5Fur); 5.92 (dd, 1H, H-4); 5.78 (dd, J1,2= 7.94 Hz, 1H, H-2); 5.52 (dd, J2,3= 10.3 Hz, J3,4= 3.5 Hz, 1H, H-3); 4.67 (d, 1H, CH2aO-Fuc); 4.6 (dd, J6Ha,6Hb=11.34 Hz, 1H, 6-Ha); 4.43 (d, CH2aFur-OH); 4.42 (d, CH2bFur-OH) 4.38 (dd, J6Hb,6Ha=6.5 Hz, 1H, 6-Hb); 4.34 (d, 1H, CH2bO-Fuc); 4.11 (d, 1H, H-1); 3.8 (qd, J5,6a= 6.6 Hz, J5,6b= 6.2 Hz, J4,5= 05 Hz, 1H, H-5) 13 C.NMR : δC (63 MHz, CDCl3) : 142.4 (C-2/5Fur); 124.2 (C-3/4Fur-OH); 120.26 (C-3/4Fur-Gal) 99,7 (C-1); 77.51, 77.2, 77.45, 76.3 (4x CBz); 76.38, 71.2, 71.15, 69.72 (C-2, C3, C-4, C-5); 62.21 (C-CH2aFur-Gal ); 55.62 (C-CH2bFur-OH) MS (ESI) : m/z (%) : 729.4 [M+Na]+ (100) _________________________________________________________________ 2,5-Bis-ß-D-galactopyranosyloxymethyl-furan =10 2,5GalGalFuran OHOH OH HO O HO OH O O O OH OH C18H28O13 Exact Mass: 452,15 O 2,5 Bis-hydroxymethyl-furan wird nach der 1. und 2. Standardvorschrift umgesetzt. HPLC (s. Bedingung in 2. Standardvorschrift) : Rt= 5.97 min 1 H-NMR : δH (250 MHz, CDCl3) : 6.52 (s, 2H, H3Fur, H4Fur); 4.87 (d, 2H, CH2aFur); 4.75 (d, 2H, CH2bFur); 4.47 (d, J1,2= 7.62 Hz, 1H, H-1); 3.93 (dd, 1H, H-4); 3.81 (dd, J2,3=11.54 Hz, 1H, H-2); 3.75 (dd, 1H, H-3); 3.69 (qd, J1,5= 7.77 Hz, J3,5= 4.23, J4,5= 0.98 Hz, 1H, H-5) ; 3.63 (dd, J6a,6b= 9.86 Hz, J6a,4= 3.35 Hz, H-6a) ; 3.52 (dd, J6b,1= 7.62 Hz ; H-6b) 13 C.NMR : δC (63 MHz, CDCl3) : 155.7 (C-2/5Fur); 117.6 (C-3/4Fur); 116.2 (C-3/4Fur); 106.0 (C-1); 79.76, 77.38, 75.26, 73.2 (C-2, C-3, C-4, C-5); 67.49 (C-6), 65.51 (CCH2Fur) MS (ESI): m/z (%): 475.0 [M+ Na] + (100); 491 [M+ K] + (20); 487.2 [M+ Cl] – (100) 119 Experimenteller Teil 2,6 Tricyclo-[5,2,1,0 ]-4-aza-3,5-dioxo-10-oxa-8,9-Bis-(fucosyloxymethyl)-4-biotinyl8-decan= 11 3,4DAFucFuc HO O O O 4iii 5iii HN O NH 4 3 5 S 2 3ii 1ii ii 2 ii 4 N H 5* 4* 1* O 2* O 3* 7* H N 6* N 3iii 8* O 2iii O OH O HO 6iii O O HO O OH OH C41H63N5O18S Exact Mass: 945,39 Die Synthese von biotinylierte 3,4 und 2,5DA-Mimetika werden nach der 3. Standardvorschrift durchgeführt. HPLC (s. Bedingung in 3. Standardvorschrift) : Rt= 11.05 min 1 H-NMR : δH (250 MHz, CDCl3) : 5.62-5.95 (m, 2H, 2endoiii, 5endoiii); 5.45 (s, 2H, 2exoiii,5exoiii) 4.72 (dd, 1H, 6aiii); 4.58 (dd, 1H, 6biii); 4.45 (d, 1H, H-1Fuc); 4.43 (d, J4,3= 7.63, 1H, H-4); 4.39 (d, 1H, H-3); 3.85 (dd, J5Fuc,6Fuc= 6.7, 1H, H-5Fuc); 3.81 (d, J8*a,8*b= 3.2, 1H, H-8a*); 3.72 (d, 1H, H-8b*); 3.69 (d, J3Fuc,4Fuc= 3.4, 1H, H-4Fuc); 3.66 (d, 1H, H-3Fuc); 3.58-3.72 (m, 12H, 1ab*, 2ab*, 3ab*, 4ab*, 5ab*, 6ab*); 3.44 (dd, 1H, H-2Fuc); 3.38 (dd, 1H, H-2); 3.09 (dd, 1H, H-5a); 3.04 (d, 1H, H-5b); 3.01 (s, 2H, 4exoiii, 3exoiii); 2.85 (d, 1H, Ha-5); 2.57 (t, J7a*,7b*= 6.36, 1H, 7a*); 2.49 (t, 1H, 7b*) 2.35 (t, 1H, 4aii); 2,33 (t, 1H, 4bii); 1.33 (d, 3H, CH3) MS (ESI): m/z (%): 968 [M+ Na] + (100) Exo- und Endo-Verbindungen treten im Verhältnis 60:40 auf. 120 Experimenteller Teil 2,6 Tricyclo-[5,2,1,0 ]-4-aza-3,5-dioxo-10-oxa-8,9-Bis-(galactopyranosyloxymethyl)4-biotinyl-8-decan= 12 3,4DAGalGal OH OH O O HO HO OH 2iii O HO 3iii OH O 5iii O OH 6iii O O 7* N iii 4 H N 8* O 4* 5* 6* O 3* O 1* O O 2* N H NH HN 3 ii 4 ii 1ii 2ii 4 3 2 S C41H63N5O20S Exact Mass: 977,38 endo und exo Verbindungen gemischt HPLC (s. Bedingung in 3. Standardvorschrift) : Rt= 10.34 min 1 H-NMR : δH (250 MHz, CDCl3) : 5.62-5.95 (m, 2H, 2endoiii, 5endoiii); 5.43 (s, 2H, 2exoiii,5exoiii) 4.73 (dd, 1H, 6aiii); 4.56 (dd, 1H, 6biii); 4.48(d, 1H, H-1Gal); 4.43 (d, J4,3= 7.63, 1H, H-4); 4.39 (d, 1H, H-3); 3.95 (dd, 1H, H-4Gal) 3.81 (d, J8*a,8*b= 3.2, 1H, H-8a*); 3.75 (qd, 1H,H-5Gal) 3.72 (d, 1H, H-8b*); 3.62 (dd,1H, H6a); 3.52 (dd, 1H, H-6b); 3.58-3.72 (m, 12H, 1ab*, 2ab*, 3ab*, 4ab*, 5ab*, 6ab*); 3.38 (dd, 1H, H-2); 3.09 (dd, 1H, H-5a); 3.05 (d, 1H, H5b); 3.03 (s, 2H, 4exoiii, 3exoiii); 2.85 (d, 1H, Ha-5); 2.57 (t, J7a*,7b*= 6.36, 1H, 7a*); 2.49 (t, 1H, 7b*) 2.35 (t, 1H, 4aii); 2,33 (t, 1H, 4bii) MS (ESI): m/z (%): 475.0 [M+ Na] + (100); 491 [M+ K] + (20); 487.2 [M+ Cl] – (100) _________________________________________________________________ Analytische Daten von 13 HPLC (s. Bedingung in 3. Standardvorschrift) : Rt= 10.4 min MS (ESI): m/z (%): 985.0 [M+ Na] + (100) 121 5 Experimenteller Teil 1,3 Bis-ß-D-galactopyranosyloxymethyl-5-methanol-cyclohexan=20 TMC-DiGal OH OH O HO HO OH HO OH O O OH O OH C21H38O13 Exact Mass: 498,23 Das TMC-DiGal wird anlog nach 1. und 2. Standardvorschrift umgesetzt. In diesem Fall wird 1 eq 1,3,5-Tris-hydroxymethylcyclohexan mit 2.5 eq. Tetrabenzoylgalactoseimidat umgesetzt. Die Trennung der Di- und Trigalactoside erfolgt über die Kieselgelsäule (PE: EE 3:1) und im nächsten Schritt die Entschützung nach Standardvorschrift 2. HPLC: Säule: Lichrosphere-RP18-(e); Eluent: CH3CN : H2O 0:100 gradient → 20 80 in 20 min; Fluss: 0.1 ml/min, Sedex Lichtstreudetektor); Rt= 15.2 min. Ausbeute : 20 % 1 H-NMR : δH (250 MHz, CDCl3) : 4.44 (d, 1H, J1,2= 7.7, H-1); 3.98 (dd, 1H, H-4); 3.86 (dd, 2H, CH2a/bGalCy); 3.85 (dd, 1H, J2,3= 11.5, H-2); 3.8 (dd, 1H, H-3); 3.72 (qd, 1H, J5,6a= 3.3, J5,6b= 7.6; H-5); 3.7 (dd, 1H, J6a/b,CH2a/b-Gal= 9.91 H-6a); 3.6 (d, 2H, CH2a/b/c-GalCy); 3.57 (dd, 1H, J6b,1= 7.7, H-6b); 3.52 (d, 2H, CH2-OHCy); 1.56-2.0 (m, 6H, CH2-Cy); 1.9-0.66 (m, 3H, CH-Cy) 13 C.NMR : δC (63 MHz, CDCl3) : 105.95 (C-1); 78.54 (C-2); 77.92 (C-3); 75.70 (C-4), 73.72 (C-5); 71.53 (CH2-OGal); 70.06 (CH2-OH); 63.78 (C-6); 41.24 (C-OHCy); 39.27 (Ca/b-OGalCy); 34.96 (CH2-OHCy); 34.81( CH2aOHCy); 34.73( CH2bOHCy) MS (ESI) : m/z (%) : 521.2 [M+Na] + (100) _________________________________________________________________ 122 Experimenteller Teil 1,3,5-Tris-ß-D-galactopyranosyloxymethyl-5-methanol-cyclohexan=21 TMC-TriGal OH OH O HO HO OH HO OH O O C27H48O18 Exact Mass: 660,28 O O OH OH O HO HO OH s. Standardvorschrift 20 HPLC: Säule: Lichrosphere-RP18-(e); Eluent: CH3CN : H2O 0:100 gradient → 20 80 in 20 min; Fluss: 0.1 ml/min, Sedex Lichtstreudetektor); Rt= 13.65 min. Ausbeute : 55 % 1 H-NMR : δH (250 MHz, CDCl3) : 4.44 (d, 1H, J1,2= 7.7, H-1); 3.98 (dd, 1H, H-4); 3.85 (dd, 4H, CH2a/b/cGalCy); 3.85 (dd, 1H, J2,3= 11.5, H-2); 3.8 (dd, 1H, H-3); 3.72 (qd, 1H, J5,6a= 3.3, J5,6b= 7.6; H-5); 3.7 (dd, 1H, J6a/b,CH2-Gala/b/c= 9.91 H-6a); 3.6 (d, 6H, CH2-Gal); 3.57 (dd, 1H, J6b,1= 7.7, H-6b); 2.0-1.73 (m, 6H, CH2-Cy); 0.8-0.62 (m, 3H, CH-Cy) 13 C.NMR : δC (63 MHz, CDCl3) : 105.95 (C-1); 78.52 (C-2); 77.93 (C-3); 75.71 (C-4), 73.73 (C-5); 71.54 (CH2-OGal); 63.8 (C-6); 39.21 (Ca/b/c-OGalCy); 34.93( CH2a/b/cCy) MS(ESI):m/z (%): 683.0 [M+Na] +(100) 123 Literaturverzeichnis 7 Literaturverzeichnis Achstätter T, Moll R, Anderson A, Kuhn C, Pitz S, Schwechheimer K, Franke WW. 1986 Expression of glial filament protein (GFP) in nerve sheaths and non-neural cells re-examined using monoclonal antibodies, with special emphasis on the co- xpression of GFP and cytokeratins in epithelial cells of human salivary gland and pleomorphic adenomas. 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Schmauser, “Simple oligosaccharide mimics as specific drug carriers targeting tumor associated lectins“. 20th International Carbohydrate Symposium, Hamburg, Germany, August 2000, th 20 Abstract Book, p.309 Auszeichnung „2002 AACR-Pfizer Scholar in Training Award“ erhalten auf der 93. Jahrestagung der American Association for Cancer Research in San Francisco, USA, 6.-10 April 2002 137 Danksagung 9 Danksagung Mein Dank gilt: Ganz besonders Prof. Dr. Manfred Wießler für die interessante Themenstellung, die ständige Hilfs- und Diskussionsbereitschaft, die guten Arbeitsbedingungen und den großen Freiraum bei der Bearbeitung dieses Themas. • • • • • • • • • • • • • • • • Prof. Dr. Gert Fricker für die freundliche Übernahme des zweiten Gutachtens. Dr. Eva Frei für die Betreuung, ihre große Hilfsbereitschaft und der Diskussionsbereitschaft-wo oft aus 10 min 1h wurden; und die kritische Durchsicht dieser Arbeit. Dr. Claus-Wilhelm von der Lieth für die Hilfe bei der Durchführung der Molecular-Modeling Studien und den anregenden Diskussionen. Dr. Lutz Langbein für die Unterstützung bei den Zellversuchen und wissenschaftliche Diskussionen . Dr. Amitava Chatterjee für die Hilfe bei der Durchführung der zellbiologischen Untersuchungen und anregende Diskussionen. Claas Gronewold für die Durchführung der Adhäsionsassays, interessanten Diskussionen und den Gummibärchen. Peter Lorenz und Ed Müller für ihre Unterstützung bei der Durchführung der Synthesen und ihre hilfreichen praktischen Ratschläge. Andrea Breuer für ihre Hilfe beim Western Blotting und den Goodies in ihrer Schublade. Dr. Hans-Christian Kliem für die äußerst lehrreichen Diskussionen und zahlreichen Einführungen in die (Software-) technischen Hilfsmitteln. Karl Albert Klokow für die freundliche Hilfe bei der Durchführung der HPLCAnalytik PD Dr. Heinz Schmeiser für die anregenden Diskussionen und Unterstützung. Meinen ehemaligen Kollegen vom Labor H348: Dr. Birgit Schmauser, Dr. Bernd Sauerbrei und Dr. Roland Müller für die tiefgreifenden Diskussionen, Unterstützung, Humor und Freundschaft. Dirk Stach für seine stete Hilfsbereitschaft und seinen Humor. Ilse Schindler für das saubere Geschirr, den Pflanzen und für die persönliche Fürsorge. Dr. William Hull, Gabriele Schwebel-Schilling und Gerda Baumann für die Aufnahme der NMR-Spektren und Gerhard Erben für die Durchführung der massenspektroskopischen Untersuchungen. allen ehemaligen und aktuellen Kollegen Christina, Hélène, Bernd, Oli, Chris, Martina, Marie, Hartmut, Volker, Herbert, Ali, Jost, Erwin, Regine, Nicole, Nadine, Sonja, Bettina, Christoph,Thomas und Michael für die freundliche Arbeitsatmosphäre. 138