Sodium on its way A biochemical study of Na transport by the NADH

Research Collection
Doctoral Thesis
Complex I: Sodium on its way
A biochemical study of Na� transport by the NADH:quinone
oxidoreductase (NDH I) from Klebsiella pneumoniae
Author(s):
Gemperli, Anja C.
Publication Date:
2002
Permanent Link:
https://doi.org/10.3929/ethz-a-004511819
Rights / License:
In Copyright - Non-Commercial Use Permitted
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ETH Library
Diss. ETH No. 14885
Complex I: Sodium on its way
A biochemical study of Na+ transport by the
NADH:quinone oxidoreductase (NDH I) from Klebsiella pneumoniae
A dissertation submitted to the
SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZÜRICH
for the degree of
DOCTOR OF NATURAL SCIENCES
presented by
ANJA C. GEMPERLI
Dipl. chem. ETH Zürich
born February 22, 1972
from Mogelsberg (SG)
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. P. Dimroth, examiner
Prof. Dr. L. Thöny-Meyer, co-examiner
Dr. J. Fritz-Steuber, co-examiner
Zürich 2002
Zusammenfassung
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Zusammenfassung
Die elektrogene NADH:Chinon Oxidoreduktase aus Klebsiella pneumoniae pumpt Na+
Ionen. Die spezifische Na+ Transportaktivität des Enzyms in Membranen konnte durch anaerobe
Reinigung von 0.2 µmol min-1 mg-1 auf 4.7 µmol min-1 mg-1 nach Rekonstitution in Liposomen
erhöht werden. Die prosthetischen Gruppen von Komplex I, (Eisen-Schwefel-Cluster und FMN)
wurden im gereinigten Protein zu 50-70 % der erwarteten Werte angereichert. Des Weiteren
konnten erstmals 2 zusätzliche Chinone, Ubichinon 6 und Ubichinon 8, als Kofaktoren in einem
bakteriellen Komplex I identifiziert werden. Die chemische (NADH Oxidation/Chinon
Reduktion) und die vektorielle (Na+ Transport) Reaktion des Enzyms war strikt gekoppelt, da
Chinon in Abwesenheit von Na+ Ionen nicht reduziert wurde. Die Aktivierung von Komplex I
durch Na+ Ionen konnte durch die Hill Gleichung beschrieben werden. Daraus wurde der Hill
Koeffizient von 1.96 und eine halbmaximale Sättigung bei 330 µM Na+ berechnet. Der Quotient
der Na+ Transport und Chinon-Reduktion Initialraten ergab eine Na+/e- Stöchiometrie von 1 für
Komplex I von K. pneumoniae.
Komplex I von K. pneumoniae und die ATP Synthase von Ilyobacter tartaricus konnten
durch einen elektrochemischen Na+ Gradienten gekoppelt werden, wenn sie gemeinsam in
Proteoliposomen rekonstituiert wurden. Dabei wurde der Na+ Gradient durch exergonen
Elektronentransport (NADH → Q) von Komplex I aufgebaut und trieb die ATP Synthese an.
Diese Reaktion konnte umgekehrt werden (rückläufiger Elektronentransport) wenn die Triebkraft
der ATP Hydrolyse die Energie für die Reduktion von NADH mit Chinol lieferte. Das
Membranpotential war unabdingbar für den rückläufigen Elektronentransfer, wohingegen der
chemische Na+ Konzentrationsgradient die NAD Reduktion zwar beschleunigte, aber nicht
zwingend nötig war. Komplex I zeigte keine Protonentransport-Aktivität.
2
Summary
Summary
The electrogenic NADH:quinone oxidoreductase from Klebsiella pneumoniae transports Na+
ions. After anaerobic purification and characterization the oxidoreductase was identified as
complex I (NDH I) from Klebsiella pneumoniae. NADH-driven Na+ transport catalyzed by
complex I increased more than 23-fold (4.7 µmol min-1 mg-1) compared to Na+ translocation into
native membrane vesicles (0.2 µmol min-1 mg-1). Complex I was found to contain approximately
50-70% of the expected cofactors (Fe, acid labile sulfur and FMN) which increased during
purification in correlation with Na+ transport activity. In addition, the purified complex I from
K. pneumoniae was found to contain quinones, namely Q6 and Q8, which had not been identified
previously in bacterial complex I. The reduction of Q by NADH was strictly Na+ -dependent
which indicated coupling of the chemical and the vectorial reaction of the pump. The Na+
activation profile corresponded to the Hill equation with a Hill coefficient KH(Na+) = 1.96 and
with a half maximal saturation at 0.33 mM Na+. Comparing the initial rates of Na+ transport and
Q1 reduction activities, a Na+/e- transport stoichiometry of 1 was calculated for complex I.
Coreconstitution of purified complex I from K. pneumoniae and the Na+ -translocating F1F0
ATPase from Ilyobacter tartaricus resulted in the coupling of the two enzymes via an
electrochemical Na+ gradient. A sodium cycle could be established driving the synthesis of ATP
in the course of NADH oxidation (forward electron transfer) or ATP-driven NAD reduction with
ubiquinol (reverse electron transfer). A transmembrane voltage (∆Ψ) was shown to be
obligatorily required for reverse electron transfer while the chemical Na+ concentration gradient
(∆pNa+) accelerates NAD reduction by complex I, but was dispensable. Pumping of protons
instead of or in addition to Na+ transport by complex I could be excluded.