ARBEITSTECHNIKEN IN DER PROTEINCHEMIE 2

ARBEITSTECHNIKEN IN DER
PROTEINCHEMIE
Teil 2
Proseminar
Prof. F. Pittner
SS 2006
Kapillarelektrophorese
Vereinigt elektrophoretische und chromatografische Techniken zu einer neuen
Separationsmethode
Vorteile:
• Hochauflösend
• Reproduzierbar
• Trennung innerhalb weniger Minuten
• Empfindlichkeit bis in den attomol-Bereich
• Möglichkeit zur automatischen Probenaufgabe
• Mikropräparative Fraktionssammlung
• Computersteuerung
Detektion der Probe:
• UV-Detektoren
• Fluoreszenz-Detektoren
• Leitfähigkeit
• Radioaktivität
• Elektrochemische Detektoren
• Massenspektroskopie
HPCE (High Performance Capillary Elektrophoresis) 1
•
•
•
•
Quarzkapillare (Innendurchmesser 20-150 µm, Länge 10-150 cm)
Netzgerät: Spannung bis 30 kV
Detektion direkt durch die Kapillare
Probenaufgabe:
* elektrokinetisch (Nutzen des elektroosmotischen Flusses)
* hydrostatisch (Druckdifferenz, Vakuum, Schwerkraft)
* wenige Nano- bis Mikroliter werden aufgetragen
HPCE (High Performance Capillary Elektrophoresis) 2
• Elektroosmotischer Fluss:
Kapillarwand durch Ionisation der
Silanolgruppen negativ geladen:
Bei Anlegen der Spannung wandern
Gegenionen zur Kathode und
transportieren das Lösungsmittel mit
• „Free- Zone-Elektrophorese“:
*Trennung auf Grund der Kombination von elektrophoretischer
Beweglichkeit der Ionen und dem elektroosmotischen Fluss
* Ausbildung einer el. Doppelschicht an Wand/Elektrolyt Grenzschicht
* Beeinflussung des elektroosmotischen Flusses durch:
Höhe der angelegten Spannung, pH, Ionenstärke, Pufferviskosität,
Additive, verschiedene Beschichtung der Kapillarwand
* Prinzip:
Elektrophoretische Beweglichkeit d. positiven, negativen und neutralen
Probenmoleküle ist unterschiedlich, aber ALLE wandern getrieben durch
den elektroosmotischen Fluss in Richtung KATHODE. Die
Gesamtwanderungsgeschwindigkeit eines Moleküls
= elektrophoretische Beweglichkeit + elektroosmotischer Fluss
HPCE Techniken 1
•
•
Beschichtete Innenwände:
zur Minimierung von Wand/Probe Wechselwirkungen (durch Zusatz von
Acetonitril noch weiter optimierbar)
* Elektroosmotischer Fluss bei dieser Technik fast vollständig eliminiert →
Trennung hier überwiegend rein elektrophoretisch
* Biopolymere: starke Tendenz zur WW mit Kapillarwänden → Tailing der
Banden, Beeinflussung der elektroosmot. Flusseigenschaften der Kapillare
* Verbesserung dieser Probleme: hohe pH Werte, hohe Ionenstärke, Zusatz
von Harnstoff und SDS
Gelgefüllte Kapillaren:
* Gelelpho
mit Polyacrylamid
* SDS-Gelelpho
* Agarosegele
→ extrem hohe Auflösungen
Isoelektrische Fokussierung:
* Voraussetzung: Eliminierung des elektroosmotischen Flusses durch
Beschichtung der Innenwand
* Probe + Ampholytgemisch in die Kapillare gebracht
* nach erfolgter Trennung: Kapillarinhalt durch angelegten Druck aus der
Kapillare am Detektor vorbeigeführt
}
•
HPCE Techniken 2
•
Micellentechnik:
Problem der Zonen-Kapillarelektrophorese ist:
neutrale Moleküle wandern als eine Gruppe mit dem elektroosmotischen
Fluss → keine Auftrennung!!
Problemlösung:
Zugabe von Micellenbildnern (z.B. SDS): Micellen tragen negative
Ladungen → elektrophoretische Bewegung entgegengesetzt dem
elektroosmotischen Fluss
→ Trennung erfolgt durch unterschiedliche Verteilung der neutralen
Moleküle in der elektroosmotisch getriebenen wässrigen Phase und der
(sich langsamer bewegenden) elektrophoretisch wandernden
Micellenphase
Die Stärke dieser Techniken liegt in der Kombination von HPCE mit HPLC!
(wegen unterschiedlicher Trennprinzipien ein echt zweidimensionales
Verfahren)
Polyacrylamid- Gelelektrophorese (PAGE)
Isoelektrische Fokussierung 1
Isoelektrische Fokussierung 2
Präparative Dichtegradientenelektrophorese 1
Präparative Dichtegradientenelektrophorese 2
Präparative Dichtegradientenelektrophorese 3
Eichkurven für Gele
Isotachophoresse
Disk-Elektrophorese
Senkrechte Disk-Elektrophorese auf Trägergelen:
entweder auf zylindrischem Trenngel oder auf
Gelplatte
angegebene pH Werte und Polaritäten sind die
am Häufigsten benutzten
Ampholine Molekül (Ausschnitt)
Servalyt Molekül (Ausschnitt)
Beispiele für Enzymelektroden und Thermistoren:
Glucose Elektrode (Einsatz in Blut, Plasma, …)
a)
GOD
Glucose + O2 + H 2O
Sauerstoffelektrode
b)
Glucose + Chinon + H2O
H2O2 + Gluconsäure
Pt-Elektrode
pH Elektrode
GOD
Hydrochinon + Gluconsäure
Pt-Elektrode
+
Chinon + 2 H + 2 e
-
Harnstoff Elektrode (Einsatz in Blut, Harn, …)
Harnstoff + 2 H 2O
Urease
+
2 NH4 + 2 HCO3
CO 2 Sensor
+
NH4 Sensor
Aminosäure-Elektrode
Aminosäur e
Decarboxylase
-
Amin + CO2
CO2 Sensor
Alkohol Elektrode
RCH2OH + O2
ADH
RCHO + H2 O2
Pt-Elektrode
Prototypen für Enzymelektroden und Thermistoren:
Potentielle Vorteile einer enzymatischen Katalyse in
nicht-wässrigen Lösungsmitteln
•
•
•
•
•
•
•
Erzielung von günstigeren thermodynamischen Gleichgewichten
Erhöhung der Löslichkeit unpolarer Substrate
Veränderte Substratspezifität
Weniger Nebenreaktionen, die H2O als Reaktant benötigen
Erleichterte Produktrecovery
Verbesserte Enzymstabilität (vor allem in mit Wasser nicht mischbaren
Lösungsmitteln)
Verminderte Gefahr mikrobieller Kontamination
Vorschläge für das Engineering von Enzymen für das
Arbeiten in nichtwässrigen Lösungsmitteln
•
Schaffen von verbesserten Möglichkeiten zur WW der Enzymoberfläche mit
organischen Lösungsmitteln (hydrophobere Oberfläche, ähnlich wie bei
Membranproteinen)
► Entfernung von Oberflächenladungen
→ Verminderung der benötigten H2O-Konzentration
→ möglicher Einfluss auf das pH Optimum
•
Maßnahmen zur Stabilisierung der Konformation
► Interne Quervernetzungen:
Einführen neuer Disulfidbindungen (mit möglichst großem Loop in die flexiblen
Regionen des Enzymmoleküls)
→ Reduzieren der Konformationsentropie
→ Verminderung von intermolekularer Aggregation
→ Verminderung von irreversibler Inaktivierung durch Proteinauffaltungen
► Einführung neuer und Intensivierung bestehender H-Brücken oder anderer
elektrostatischer Wechselwirkungen im Molekülinneren
► Verstärkung von V.d.Waals WW; Aufrechterhaltung bzw. Verbesserung einer
dichten Packung des Enzyms
► Optimierung von H-Brücken im Molekülinneren (hoher Ordnungsgrad der
Sekundärstruktur) durch Verwendung geeigneter Seitengruppen zur Bildung
zusätzlicher H-Brücken zur Hauptkette, Begünstigung elektrostatischer WW im
Molekülinneren durch das organische Medium (Stabilitätsverminderung wenn in
organischen Lösungsmitteln Ionenpaare an der Moleküloberfläche liegen)
Selektive chemische Modifikation zur Veränderung der
Eigenschaften von Enzymen und Antikörpern
Ziele:
•
•
•
•
•
•
•
Höhere Stabilität
Bessere Löslichkeit
Maskierung von Antigenizität
Modifizierung im Hinblick auf
* Aktivierbarkeit
* Inhibierbarkeit
Verschiebung der pH Optima
Veränderung der Substratspezifität
Kombinieren von chemischen Eigenschaften diverser prosthetischer
Gruppen mit der Bindungsspezifität des aktiven Zentrums
Selektive chemische Modifikation zur Veränderung der Eigenschaften
von Enzymen und Antikörpern
Beispiele 1
Enzym-PEG Konjugate:
O
N O
O
O (CH2CH2O)nCH3
O
O
Methoxy-polyethylenglycolsuccinimidyl-succinat
NH2
NH O
O
O (CH2CH 2O)nCH 3
O
• katalytische Aktivität wird meist schwächer, bleibt aber erhalten
• resistenter gegen proteolytische Spaltungen
• nicht mehr allergen (als „Drug“ einsetzbar –z.B. PEG-Asparaginase gegen Tumoren)
• arbeitet auch in hydrophobem Ambiente
•Aktiv in mit H2O nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln (z.B. PEG Enzym doppelt
so aktiv in Benzol wie natives Enzym in Puffer)
Selektive chemische Modifikation zur Veränderung der Eigenschaften
von Enzymen und Antikörpern
Beispiele 2
Peptidligasen durch Modifikation des aktiven Zentrums diverser Proteasen:
CH2OH
PMSF
O
C H2 O S CH 2
O
-
HX
CH2XH
X = S bzw. Se
PMSF: Phenylm ethylsulfonylfluorid
• Hydrolyse unterdrückt (keine Bildung von ‚Acyl-Enzym‘-Intermediaten)
•Ligase Wirkung drastisch verstärkt
Gruppenspezifische Nucleasen:
N
S S oligonucleotid
SH
unspezifische
Phosphodiesterase
S S olig onucleotid
gruppenspezifische Nuclease für
einsträngige DNA bzw. RNA mit komplementären
Sequenzen
Selektive chemische Modifikation zur Veränderung der Eigenschaften
von Enzymen und Antikörpern
Beispiele 3
Künstliche Redoxenzyme:
O
Br
CH3
N
N
N
N
SH
O
O
CH3
ein 10-Methylisoalloxazin Derivat
zB.: Papain,
Pyruvat DECARBOXYLASE
(Thiamin-abhängig)
O
S
CH3
N
N
O
N
N
O
Pyruvat OXIDASE
(Flavogruppen-abhängig)
CH3
Selektive chemische Modifikation zur Veränderung der Eigenschaften
von Enzymen und Antikörpern
Beispiele 4
Umwandlung von Antikörpern in Enzyme:
Antigen
1)
„Affinity-labelling“ als Strategie
zum Einführen katalytischer
Gruppen in die Biorecognitionsposition von Antikörpern
S S(CH2)3 CHO
1) DTT
AK
AK
2) NaC NBH3
S
S
2)
NH
NH2
S S
N
N
HS
N
H
Eingeführte Imidazolgruppen
katalysieren diverse Hydrolysen
N
S S
S S
N
Permethylierung von Lys-NH2 Gruppen
Vermeidung von Reaktionen mit reaktiven
Substraten, die Quervernetzungen und
Präzipitationen verursachen können
1) CH 2O
2) NaCNBH3
NH2
NCH3
H
N
H
N
Vorgänge bei Enzyminaktivierungen
Methoden zur Vermeidung von Proteininaktivierungen
Gründe und Mechanismen für die Inaktivierung 1:
• Proteasen und Autolyse: Inaktivierung durch zeitraubende Arbeitsschritte
und Lagerung: Mikroorganismen, exogene Proteasen → Neigung zu
proteolytischer Spaltbarkeit = Maß für den Denaturierungsgrad eines
Proteins
• Aggregation: Folge der Proteinauffaltung auf Grund von
•
•
Denaturierungseinflüssen
nat. Protein ↔ aufgefaltetes Protein → aggregiertes Protein → aggregiertes
Protein mit neugebildeten –S-S- Brücken
Oxidation: bei aromatischen Seitenketten, Methionin, Cystein und Cystin
durch: O2, H2O2, Sauerstoffradikale
(Cysteinreduktion zu Cystin: im Basischen in Gegenwart von Cu2+)
Detergentien: bereits bei niedrigen Konzentrationen (oft irreversibel)
* viele Proteine halten kationische Detergentien besser aus
* nichtionische Detergentien (z.B. Triton X-100) haben meist keine oder
nur geringe Wirkung
Methoden zur Vermeidung von Proteininaktivierungen
Gründe und Mechanismen für die Inaktivierung 2:
•
pH Extreme:
* Ionisierung katalytisch wichtiger Gruppen → Inaktivierung bei erhaltener
Proteinstruktur → reversibel
* pH weit weg vom pI → elektrostatische Abstoßung gleichnamiger
Ladungen → Entfaltungstendenz
* Ionisierbare Gruppen im Molekülinneren nur bei Auffaltung ionisierbar
* Hydrolyse von Peptidbindungen (im stark Sauren oder mildem pH und
höherer Temperatur)
* kurze Hydrolyse bei Asparaginsäureresten, besonders in Nachbarschaft
von Prolin im schwach Sauren
* Desaminierung von Asparagin und Glutamin → negative Ladungen im
hydrophoben Bereich → Desaktivierung (bei jedem pH möglich)
* Basen-katalysierte ß-Elimination: Zerstörung von –S-S- Bindungen:
Methoden zur Vermeidung von Proteininaktivierungen
Gründe und Mechanismen für die Inaktivierung 3:
•
Denaturierende Agentien: Inaktivierung selbst wäre reversibel, aber
irreversible Desaktivierung durch Aggregation (Folge von Auffaltung) oder
Autolyse (im Fall von Proteasen), abhängig von der Reaktion können
manche dieser Reagentien auch stabilisieren
* Chaotrope: Guanidiniumchlorid (6M),
Harnstoff (8-10M) ( – enthält 0,02M Cyanat im Gleichgewicht → reagiert
mit –NH2 und –SH → irreversible Inaktivierung → immer frisch bereiten)
* hohe Salzkonzentrationen (stabilisierend oder destabilisierend)
Lyotrope Reihe nach Hofmeister:
stabilisierend
destabilisierend
(CH3)4N+ > NH4+ > K+, Na+ > Mg2+ > Ca2+ > Ba2+
SO42- > Cl- > Br- > NO3- > ClO4- > SCN* Chelatbildner:
Metallionen bindende Reagentien (EDTA, …) inaktivieren Metalloenzyme
durch Metallentzug bzw. Anlagerung im Enzyminneren als Ligand, sie
können aber auch störende Metallionen binden → stabilisierend
* Organische Lösungsmittel: Enzyme arbeiten im wässrigen UND
(suspendiert) in hydrophoben Lösungsmitteln, Inaktivierung wenn H2O
mischbare Lösungsmittel dazukommen
Stabilisatoren: einige polare aprotische Lösungsmittel (z.B. DMSO, DMF)
in niedriger Konzentration, Glycerin, Zucker, Polyethylenglycol
Methoden zur Vermeidung von Proteininaktivierungen
Gründe und Mechanismen für die Inaktivierung 4:
•
•
Schwermetalle und –SH Reagentien:
Hg2+, Cd2+, Pb2+ reagieren mit –SH (zu Mercaptiden), His und Trp-resten
-S-S- hydrolytisch gespalten in Gegenwart von Ag+ od. Hg2+ als Katalysator
-SH hältige Reagentien: Inaktivierung durch Reduktion von -S-S- (meist
reversibel) oder Bildung von Mischdisulfiden
Höhere Temperaturen:
2 stufiger Prozess: zuerst reversible thermische Auffaltung, dann
irreversible Inaktivierung durch Reaktion der neu exponierten Gruppen bzw.
Hinderung der Rückfaltung in den nativen zustand, weil Seitengruppen
verändert wurden (z.B. Ionisierung bisher ungeladener Gruppen aus dem
Core, die nicht mehr rückgängig gemacht werden konnte,…)
* 90-100°C:
pH abhängige Desaminierung von Asn und Gln,
Hydrolyse von Peptidbindungen (neben Asp),
Oxidation von Cysteinresten
-SH/-S-S- Interchange
Zerstörung von –S-S- Bindungen
Reduzierende Zucker im System reagieren mit ε-Aminogruppen von Lys
(„Maillard Reaktion“)
Methoden zur Vermeidung von Proteininaktivierungen
Gründe und Mechanismen für die Inaktivierung 5:
•
•
•
•
•
•
Mechanische Einwirkungen:
* Schütteln: Vergrößerung der Oberfläche zwischen Luft und Flüssigkeit –
Proteine ordnen sich in der Interphase an hydrophobe Reste werden nach
außen exponiert → Aggregation
* Reibung (bei hohem Flux): Konformationsänderungen → hydrophobe
Gruppen exponiert → Denaturierung
Ultraschall: Druckwellen → Microbubbles gelöster Gase expandieren rasch
→ kollabieren sehr heftig (Cavitation) → mechan. Kräfte und freie Radikale
durch Hitze in den Microbubbles
Druck: Inaktivierung bei hohem Druck (0,1-6 kbar) – Multimere dissoziieren
Kühlen: Konformationsänderungen in allosterischen Enzymen
Frieren, Tauen, Dehydratation: im Microenvironment ändert sich Konz. von
Salzen und Wasser → pH Änderungen (Phosphatpuffer pH 7 → 3,5)
Ionenstärkeänderungen: bei Erhöhung Dissoziation oligomerer Proteine
SH Gruppen bei niedrigen Temperaturen oxidationsanfälliger durch O2
(Löslichkeit von O2 bei -3°C 1150 mal höher als bei 0°C)
Strahlung: kovalente Änderungen in der Primärstruktur durch Radikalbildung (OH◦, H2O2, solvatisierte e-, ...) → Quervernetzung und
Aminosäurezerstörung, auch indirekt durch reaktive Gruppen d. Mediums
auch manchmal möglich durch UV und sichtbares Licht
Minimieren von Inaktivierungen
Strategien um Enzyme rigider zu machen:
•
•
•
•
Steigerung der intrinsischen Stabilität:
* Benutzen von Enzymen aus thermophylen oder halophylen Organismen
(Unterschiede: zusätzl. Salzbrücken, leicht veränderte Aminosäurezus. )
* Proteinengineering: Zufallsmutagnese (‚random‘) bzw.
spezifische Mutagenese (‚site-specific)
Zusätze (spezifische Liganden, Cofaktoren oder Substrat-Shift im
Gleichgewicht nativ/aufgefaltet bewirken)
* unspezifisch: Glykole, Alkohole, Neutralsalze
* Konkurrenten für die Inaktivierbarkeit:
Bulk-Proteine (BSA) schützen bei Interphasen
Thiolreagentien (Radikalstopper)
Chelatbildner (Metallspuren entfernen – sehr negativ bei Salzbrücken)
Immobilisierung bietet Schutz durch
* Multiattachment (sterische Stabilisierung→ resistenter gegen Inhibitoren)
* Verhinderung von freier Diffusion
Chemische Modifikation:
* bifunktionelle Reagenzien: Quervernetzen (große Loops!), Einführen
zusätzlicher reaktiver Gruppen vor dem Quervernetzen), Koppeln mit
Kohlenhydraten (wasserlösliche Polymere) – große stabilisierende Effekte
auch gegenüber Proteasen
Minimieren von Inaktivierungen
Beispiele:
•
•
•
Stabilisieren proteolytischer Enzyme gegen Autolyse:
* Chemisches Modifizieren (Dextrankonjugate) - führt zu sterischer
Hinderung der Proteolyse
* Modifizieren der –NH2 Gruppen durch Anhydride von Dicarbonsäuren:
-NH3+ wird zu –COO- (negative Ladung steigt) – elektrostatische
Abstoßungen minimieren intermolekulare Aktionen
Viele Proteasen spalten in der Nähe von -NH3+ → verhindert durch
Acylierung
Verhindern von Aggregation:
* Verringern der Proteinkonzentration (aggregieren bei 0,01 – 10 mg/l)
* pH einstellen weit weg vom pI: höhere elektrostatische Abstoßung
* Vermeiden von –S-S- durch gemischte Disulfide mit Glutathion
Verhindern von Oxidation:
* Immobilisierung an geladenen Trägern (Aussalzeffekt durch die Ladung →
O2 weniger löslich) → geladene Träger bewirken Microenvironment wie
eine konzentrierte Salzlösung
* Lagerung in Gegenwart von Dithiothreit (>200mM):
!! niedrigere Konzentrationen können auch inaktivieren, da in Gegenwart
von Luft und Spuren von Metallionen Oxidation von Dithiothreit unter
H2O2 Bildung möglich ist (→ Oxidation von –SH Gruppen)
Methodenvergleiche
TRÄGERFORMEN
•
PLATTENVERFAHREN IM FLACHBETT (DÜNNSCHICHT)
Vorteile
einfache Apparatur, leicht
kühlbar, gute
Vergleichsmöglichkeit,
kombinierbar mit 2dimensionalen Techniken
•
Nachteile
nur geringes Probenvolumen möglich,
Dichteproblem bei Plattenherstellung und Lauf
empfohlen nur für Fokussierung und
kontinuierliche Elpho
→ statt Elektrodengefäßen Filterkartonstreifen
verwenden
ZYLINDRISCHE TRENNGELE
Vorteile
großes Probenvolumen
möglich - besonders bei
Fokussierung, robuste Gele
Nachteile
aufwendigere Apparatur, sorgfältige Gelherstellung nötig, Überwachung des Laufs
Methodenvergleiche
TRENNPRINZIPIEN
ELEKTROPHORESE OHNE DISKONTINUUM
Vorteile
Handhabung einfach, Betrieb billig,
anodisch und kathodisch
wandernde Proteine erfasst
DISK-ELEKTROPHORESE
relativ scharfe Trennung, große
Probenvolumina möglich
Nachteile
Trennung relativ unscharf, verdünnte
Proben müssen konzentriert werden
Vorbereitungen umständlich, unmöglich
alle Proteine in einem Lauf erfassbar
ELEKTROFOKUSSIERUNG
scharfe Trennung, Proteine mit
pI=3-10 in einem Lauf erfassbar,
gr.Probenvol. möglich, pI Messung
leicht
viele Proteine denaturieren am pI,
Chemikalien teuer, Probleme der
Mikroheterogenität von Proteinen
ISOTACHOPHORESE
wie Fokussierung, pH variierbarer,
etwas günstiger für Enzymtests
Chemikalien ev. teuer, junge Methode →
viele eigene Vorversuche nötig
Störungen bei der Polymerisation von Polyacrylamidgelen
•
•
•
•
GEL POLYMERISIERT NICHT:
a) Chemische Polymerisation:
in der Ansatzmischung zu viel O2 gelöst → evakuieren
Acrylamid unrein → umkristallisieren
Ammonperoxodisulfat zu alt (Lösung bzw. Festsubstanz) → neu machen
bzw. mit doppelter Konzentration herstellen
b) Fotopolymerisation:
Riboflavin verdorben → frische Substanz verwenden, sonst
Möglichkeiten wie oben
GEL TRÜBE UND SPRÖDE ODER SALBIG:
zu viel Bis
GEL KLEBRIG ODER WEICH:
Bis vergessen?
GELPOLYMERISATION ZU SCHNELL (kein ruhiges Ansetzen möglich)
a) Ansatzmischung schütteln → O2 darin gelöst
b) Konzentration an Peroxodisulfat bzw. Riboflavin herabgesetzt
c) Lichtschutz verbessern
Fehler an Disk-Gelen und deren Ursache
•
•
•
•
•
•
•
Große Luftblasen im Gel:
Ansatz schlecht entgast, unvorsichtig gegossen
Kleine Luftbläschen im Gel:
zu starke Erwärmung unter der Polymerisierlampe → entgasen und
Polymerisation durch Kühlen verzögern
Unteres Ende des Röhrchens nicht mit Gel gefüllt:
a) besonders große Luftblasen (s. oben)
b) Glasröhrchen unten beim Gießen sauberer abschließen
Unebene Oberfläche des Trenngels:
Wasserüberschichtung nicht rasch genug vorgenommen → verwerfen
Ungleiche Gel-länge (obwohl gleich viel eingefüllt):
a) unkalibrierte Röhrchen unterschiedlicher Dicke verwendet
b) Wasserüberschichtung nicht gleichmäßig vorgenommen → schlecht
polymerisiert durch Aufwirbeln
Pilzförmiges Unterende des Gels ragt aus dem Röhrchen:
Fehler beim Verschließen des Röhrchens beim Gießen → überstehendes
Gel abschneiden (Draht oder Spatel, keine scharfe Klinge!)
Gel löst sich vorzeitig vom Glasröhrchen:
Röhrchen ungenügend entfettet, Trenngel zu schnell polymerisiert → bei
Polymerisation kühlen
Proteinfärbungen
•
•
•
•
•
•
Amidoschwarz
Lissamingrün (Lichtgrün)
Azokarmin
Ponceau-Rot
Coomassie Brilliant Blue R-250
Fluorescamin Test (für Aminosäuren, Peptide, Proteine, primäre
Amine)
• Silverstaining
• Pas Stain (für Glycoproteine)
• Sudanschwarz B (Solvent Black 3) für Lipoproteine
Nachweis von Oxidoreduktasen
Dehydrogenasen:
Tetrazoliumsalze: werden durch NADH zu roten oder blauen
unlöslichen Formazan-Farbstoffen reduziert
Nachweis vonOxidoreduktasen
Phenoloxidasen :
Inkubation der Gele in 10-3M Lösung eines Substrats in Citrat-Phosphatpuffer pH 5
Substrate (für Laccasen = Polyphenoloxidasen)
Nachweis von Oxidoreduktasen
• Peroxidase:
Laccase, die statt O2 Peroxid als Akzeptor benützt → zum Nachweis wird
dem entsprechenden Laccasetest einfach 0,5% H2O2 zugesetzt
• Katalase:
Gele in 3% H2O2 inkubiert und wieder herausgeholt → An Stellen, welche
Katalase enthalten, wird H2O2 zerstört und ist durch anschließende
Farbreaktionen nicht mehr nachweisbar.
Färbung: in KI Lösung wird durch H2O2 Iod freigesetzt → wenn das Gel
Stärke enthält → Blaufärbung → Katalasebanden bleiben weiß
Imprägnieren des Gels mit schwarzem PbS → dieses wird durch H2O2 zu
PbSO4 oxidiert (weiß) → Katalase-banden bleiben schwarz
Nachweis von Hydrolasen:
• Esterasen:
Substrat: β-Naphthylacetat
Das in der Nachweislösung enthaltene Diazoniumsalz kuppelt mit dem
freigesetzten Naphthol zu Azofarbstoffen
Substrat: Indoxylacetat: Indigobildung durch O2 (Luft)
Nachweis von Hydrolasen:
• Lipasen:
Substrate: Naphtholderivate (z.B. Naphthyllaurat) – Nachweis analog zu
Esterasen
• Peptidasen und Proteasen (greifen nur größere Polypeptide an) :
Nachweis: Inkubation mit Proteinlösung → Anfärben: An Stellen, wo
Proteine gespalten wurden, bilden sich weiße Banden
künstliche Substrate von Peptidasen: Naphthylamide → nach Hydrolyse:
Kupplungsreaktionen mit einem Diazoniumsalz
Nachweis von Hydrolasen:
• Glycosidasen und ähnliche Enzyme:
CH2OH
OH
OH
O
O
H C
Hydrolyseprodukt (Glucose) durch
NH O N
Glucoseoxidase zu Glucose oxidiert →
H
C
Wasserstoff auf NitroblautetrazoliumH3C O
C
salz übertragen (analog
Künstliches Substrat z.B. H3C O
Dehydrogenasetests)
Naphthol-AS-BI-N-acetyl-β-D-glucosamid
• Sonstige Hydrolasen (Sulfatasen, Phosphatasen,
Nucleasen)
mit ähnlichen Methoden nachweisbar wie z.B.:
OSO 3
Br
5-Brom-2-naphthylsulfat
-OPO3
5-Benzoyl-2naphthylphosphat
Wichtige Grundbegriffe der Immunologie:
• Antigen: Körperfremdes Agens, welches beim Eindringen in den
Organismus eine Immunantwort hervorruft (z.B. Fremdproteine,
Bakterien, Viren, div. Makromoleküle)
• Epitop: Jener Molekülteil des Antigens, welcher von einem
spezifischen Antikörper erkannt werden kann.
• Hapten: Niedermolekularer Stoff, der erst durch Bindung an ein
Makromolekül (z.B. Protein) immunogen wirkt.
• Antikörper: Zusammengesetztes Protein höherer Organismen, das
ein bestimmtes Epitop eines Antigens biorecognitiv binden kann und
dadurch das Unschädlichmachen des Antigens einleitet
(monoklonal, polyklonal: monospezifisch bzw. unspezifisch)
• Avidität eines Antikörpers: Bindungsstärke an das Antigen
• Kreuzreaktionen: Unterschiedliche Antigene können ein oder
mehrere gemeinsame Epitope besitzen ® darauf gerichtete
Antikörper können mit beiden Antigenen reagieren ® für den
Analytiker unerwünscht!!
Immunodiffusion 1
Immunodiffusion 2
Ouchterloni Test (zweidimensionale Doppeldiffusion)
A,B,C,D: Antigen Determinanten, Anti AB Serum
Identische
Determinanten –
verschmolzene
Präzipitations-muster
Nichtidentische
Determinanten –
überkreuzte
Zonen
Teilweise identische
Determianten –
Sporenbildung der
Präzipitationszonen
Immunodiffusion 3
Ouchterloni Test
Einfluss der relativen Molekülmasse des Antigens auf die Form der
Präzipitationszonen
Masse Antigen A <<
Masse eines IgG (zB.
Humanserum-albumin
68 000)
Masse Antigen B ~
Masse des IgG
(zB. IgA)
Masse Antigen C >>
Masse eines IgG (zB.
Hämocyanin ca. 3.106)
Immunodiffusion 4
Radiale Immundiffusion:
Objektträger mit Agar +
Antiumanserumalbumin
(HSA), Tröge von 4 mm Ø
wurden mit gleichen
Mengen der Lösungen der
unten angegebenen HSA
Konzentrationen gefüllt,
4°C, über Nacht
Diffusionsweite: (hier
Äquivalenzpunkt)
Eichkurve zur
Bestimmung des Antigens
Immunodiffusion 5
Zweidimensionale doppelte Immundiffusion
Antiserum
Verdünnungen des Antigens
große Ausführung in
Petrischalen:
Hier wird der
Einfluss der Antigenkonzentrationen auf
die Lage der
Präzipitationszonen
zwischen den
Trögen gezeigt
Häufige Stanzmuster
Immunelektrophorese 1
Elektrophorese von Serumproteinen
Blotten des Celluloseacetatstrips nach dem
Entfernen aus dem
Einweichbad
Aufbringen der
Serumproben
auf die an der
„aligning base“
ausgerichteten
Platte
Laden der Kammer Färben und
mit den Cellulose- Entfärben der Strips
acetatstreifen
Immunelektrophorese 2
Elektrophorese 90 min, 10 V/cm (Trennung der Proteine)
Diffusion und Präzipitation: 16 – 24 h
Immunelektrophorese 3
Mikroimmunelektrophorese:
a) Stanzmuster im Agar, in die
leeren runden Tröge werden
die Antigene HSA und HS
eingefüllt
b) nach der Elektrophorese
getrennte, aber so nicht
nachweisbare Proteine; Agar
wird aus den länglichen Trögen
entfernt
c) Zugabe der Antiseren in die
Tröge, Beginn der Diffusion der
Antigen- und
Antikörpermoleküle
d) Erwartete Präzipitationszonen
Immunelektrophorese 4
„Raketenelektrophorese“ einer bekannten Verdünnungsreihe von
menschlichem Serumalbumin (HSA) und zweier unbekannter
Lösungen x und x/2
5
10
15
20
25
x
x/2
µg HSA
Radioimmunassay (RIA)
Reaktionen während eines RIA. Der lösliche Antigen/Antikörperkomplex ist
das Produkt des 1. Schrittes und Ausgangsprodukt für den 2. Schritt
H3C
SO2
+
N Cl Na
Chloramin T
Synthese von Iodtyrosin mit dem Lactoperoxidase-Oxidationssystem:
O
KI
131
+ H2O2+ HO
131
O-
C
CH
NH2
I
H2O + KOH +
HO
O
O-
C
CH
NH2
Enzymimmunoassay 1
Prinzip des kompetitiven ELISA:
Spezifische Antikörper an Festphase
adsorbiert
Zusatz von freiem Antigen
und enzymgekuppeltem
Antigen, Inkubation, waschen
Bindung des freien und des
gekuppelten Antigens
Zusatz des Substrates,
Inkubation
Messung der Enzymaktivität
Die unter Standardbedingungen gemessene Aktivität ist der Menge des enzymgekuppelten Antigens proportional
Enzymimmunoassay 2
Indirekter ELISA:
Spezifisches Antigen an
Festphase adsorbiert
Inkubation mit Versuchsserum, in
dem man spezifische Antikörper
vermutet, waschen
Anheftung spezifischer
Antikörpermoleküle
Inkubation mit Antiimmunglobulinserum mit
gekoppeltem Enzym, waschen
Bindung des
enzymgekoppelten Antiimmunglobulin-Antikörpers
Zusatz des Enzymsubstrats,
messen
Messung der Enzymaktivität
Die unter Standardbedingungen gemessene Aktivität ist der Menge des
spezifischen Antikörpers im Versuchsserum direkt proportional
Enzymimmunoassay 3
Sandwich ELISA mit zwei Antikörpern:
Spezifische Antikörper an
Festphase adsorbiert
Zusatz der Antigenlösung unbekannten Gehalts, Inkubation, waschen
Bindung des
spezifischen Antigens
Zusatz des Kupplungsprodukts eines
2. spezifischen AK mit Enzym,
Inkubation, waschen
Bindung des enzymgekoppelten Antikörpers
Zusatz des Enzymsubstrats,
messen
Messung der Enzymaktivität
Die unter Standardbedingungen gemessene Aktivität ist der Menge des
spezifischen Antigens in der Lösung unbekannten Gehalts proportional
Enzymimmunoassay 4
Hapten-Inhibitionstest