Dokumentvorlage für Diplomarbeiten

Aus dem Institut für Zoologie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
und der Klinik für Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde
der Medizinischen Hochschule Hannover
______________________________________
Elektrophysiologische und histologische Untersuchungen
zum protektiven Effekt von Glial cell line-derived neurotrophic factor,
Brain-derived neurotrophic factor, Dexamethason und Elektrostimulation
auf Spiralganglienzellen ertaubter Meerschweinchen
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Verena Scheper
aus Emstek
Hannover 2007
Wissenschaftliche Betreuung:
PD Dr. rer. nat. K.-H. Esser
für die Tierärztliche Hochschule Hannover
PD Dr. med. T. Stöver
für die Medizinische Hochschule Hannover
1. Gutachter:
PD Dr. rer. nat. K.-H. Esser
2. Gutachter:
Prof. Dr. W. Baumgärtner
Tag der mündlichen Prüfung: 25.05.2007
Gefördert durch die Europäische Union im Rahmen des „Quality of life and management of living resources“-Projektes „BioEar“ (Projektnummer QLRT -200101563).
Meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
Verzeichnis eigener Vorträge, Poster und publizierter Vortragskurzfassungen
Abkürzungsverzeichnis
1
Einleitung ................................................................................................................. 1
2
Literaturübersicht ................................................................................................... 4
2.1
Das Hörorgan .............................................................................................................. 4
2.1.1 Anatomie des Hörorganes ..................................................................................................... 4
2.1.1.1
Die Hörschnecke (Cochlea)........................................................................................... 4
2.1.1.2
Das Spiralganglion (Ganglion spirale) .......................................................................... 8
2.1.2 Physiologie des Hörorgans.................................................................................................... 9
2.1.3 Ursachen und Klassifizierungen von Hörschädigungen...................................................... 10
2.1.4 Haarzellschädigung und Degeneration der Spiralganglienzellen ........................................ 11
2.1.5 Das Cochlea-Implantat (CI) ................................................................................................ 12
2.2
2.2.1
2.2.2
2.2.3
2.3
2.3.1
2.3.2
2.3.3
2.3.4
2.3.5
2.3.6
2.3.7
2.3.8
2.4
2.4.1
2.4.2
2.5
2.5.1
2.5.2
2.6
Evozierte Potentiale des auditorischen Systems ..................................................... 14
Allgemeines......................................................................................................................... 14
Akustisch evozierte auditorische Hirnstammpotentiale, AABR ......................................... 15
Elektrisch evozierte auditorische Hirnstammpotentiale, EABR.......................................... 16
Die Neurotrophen Faktoren Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor und
Brain-Derived Neurotrophic Factor........................................................................ 18
Neurotrophe Faktoren (NTF) .............................................................................................. 18
Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) und die GDNF-Familie ............. 19
In vitro Effekte von GDNF auf Spiralganglienzellen.......................................................... 20
In vivo Effekte von GDNF auf Spiralganglienzellen........................................................... 20
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) und die Neurotrophin-Familie...................... 21
In vitro Effekte von BDNF auf Spiralganglienzellen .......................................................... 22
In vivo Effekte von BDNF auf Spiralganglienzellen........................................................... 23
GDNF- und BDNF- Effekte auf die Funktionalität des Hörorgans nach Ertaubung........... 24
Das Glukokortikoid Dexamethason (DEX)............................................................. 25
Glukokortikoide .................................................................................................................. 25
Dexamethason und seine Wirkung auf das Innenohr .......................................................... 26
Effekte elektrischer Stimulation (ES) auf Spiralganglienzellen............................ 27
In vitro Effekte elektrischer Stimulation auf Spiralganglienzellen und die zugrunde
liegenden Mechanismen ...................................................................................................... 27
In vivo Effekte elektrischer Stimulation auf Spiralganglienzellen ...................................... 28
Effekte einer kombinierten GDNF- bzw. BDNF- Applikation und elektrischer
Stimulation auf das SGZ-Überleben und die Funktionalität des Innenohres nach
Ertaubung .................................................................................................................. 30
3
Zielsetzung.............................................................................................................. 32
4
Material und Methoden ........................................................................................ 33
4.1
Material...................................................................................................................... 33
4.1.1 Versuchstiere....................................................................................................................... 33
4.1.1.1
Tierhaltung .................................................................................................................. 33
4.1.1.2
Versuchsgruppen......................................................................................................... 34
4.1.1.2.1 AP-Gruppe............................................................................................................. 34
4.1.1.2.2 AP+ES(M)-Gruppe................................................................................................ 34
4.1.1.2.3 GDNF-Gruppe ....................................................................................................... 34
4.1.1.2.4 GDNF+ES-Gruppe ................................................................................................ 34
4.1.1.2.5 BDNF-Gruppe ....................................................................................................... 34
4.1.1.2.6 BDNF+ES-Gruppe ................................................................................................ 35
4.1.1.2.7 AP+ES(B)-Gruppe................................................................................................. 35
4.1.1.2.8 DEX-Gruppe.......................................................................................................... 35
4.1.1.2.9 DEX+ES-Gruppe................................................................................................... 35
4.1.2 Pharmaka............................................................................................................................. 36
4.1.3 Chemikalien zur Verwendung während der Operationen ................................................... 36
4.1.4 Technische Geräte mit Anwendung am Tier....................................................................... 36
4.1.4.1
Die Elektroden-Mikropumpensysteme........................................................................ 38
4.1.4.1.1 Das monopolare Elektroden-Mikropumpensystem ............................................... 38
4.1.4.1.2 Das bipolare Elektroden-Mikropumpensystem ..................................................... 38
4.1.4.2
Die Mikropumpen ....................................................................................................... 40
4.1.5 Reagenzien, Laborbedarf, Verbrauchsmaterialien und Geräte zur Gewinnung und
Aufarbeitung der Cochlea sowie zur Spiralganglienzellauswertung ................................... 40
4.2
Methoden ................................................................................................................... 41
4.2.1
Messung akustisch evozierter Hirnstammpotentiale
(acoustically evoked auditory brainstem response (AABR)) .............................................. 42
4.2.2 Ertaubung von Meerschweinchen ....................................................................................... 44
4.2.3 Elektroden- und Pumpen-Implantation ............................................................................... 45
4.2.4 Messung elektrisch evozierter auditorischer Hirnstammpotentiale
(electrically evoked auditory brainstem response (EABR))................................................ 46
4.2.5 Chronische elektrische Stimulation..................................................................................... 49
4.2.6 Pumpenwechsel................................................................................................................... 50
4.2.7 Gewinnung und Aufarbeitung der Cochleae ....................................................................... 50
4.2.7.1
Transkardiale Perfusion............................................................................................... 50
4.2.7.2
Pumpentest .................................................................................................................. 51
4.2.7.3
Felsenbeinentnahme und Gewinnung der Cochleae.................................................... 51
4.2.7.4
Aufbereitung der Cochleae für die lichtmikroskopische Untersuchung...................... 51
4.2.8 Schneiden und Färben der Cochleae ................................................................................... 52
4.2.9 Lichtmikroskopische Auswertung....................................................................................... 53
4.2.10 Statistische Auswertung und Bindegewebsbeurteilung....................................................... 56
5
Ergebnisse .............................................................................................................. 57
5.1
Ergebnisse der AABR-Messungen........................................................................... 57
5.2
Ergebnisse der EABR-Messungen........................................................................... 60
5.3
Histologische Befunde an Cortiorgan und Basilarmembran ................................ 63
5.4
Quantitative Analyse der Spiralganglienzellen ...................................................... 63
5.4.1
5.4.2
5.4.3
Dichte der Spiralganglienzellen in ertaubten, nicht implantierten Cochleae....................... 66
Dichte der Spiralganglienzellen in ertaubten und implantierten linken Cochleae............... 67
Interner Vergleich der Dichten der Spiralganglienzellen rechter und linker ertaubter
Cochleae der Tiere einer Experimentalgruppe .................................................................... 68
5.4.4 Überleben der Spiralganglienzellen der Versuchsgruppen im Vergleich zur
Kontrollgruppe .................................................................................................................... 70
5.4.5 Protektive Effekte der Einzel- und Kombinationsstimuli auf die Spiralganglienzellen im
Vergleich ............................................................................................................................. 72
5.4.5.1
GDNF.......................................................................................................................... 72
5.4.5.2
GDNF+ES................................................................................................................... 73
5.4.5.3
BDNF .......................................................................................................................... 74
5.4.5.4
BDNF+ES ................................................................................................................... 75
5.4.5.5
AP+ES(M) .................................................................................................................. 76
5.4.5.6
AP+ES(B) ................................................................................................................... 77
5.4.5.7
DEX ............................................................................................................................ 77
5.4.5.8
DEX+ES...................................................................................................................... 77
5.5 Dexamethason-Wirkung auf das Bindegewebswachstum und die Effekte der
elektrischen Stimulation .............................................................................................. 81
5.5.1
5.5.2
6
Effekte von Dexamethason auf das Bindegewebswachstum nach Implantation eines
monopolaren Elektroden-Mikropumpensystems................................................................. 81
Wirkung von Dexamethason auf die Effekte der elektrischen Stimulation......................... 85
Diskussion............................................................................................................... 87
6.1
Auswirkungen der unterschiedlichen Interventionsmethoden auf die
Funktionalität der Cochlea....................................................................................... 87
6.2
Überleben der Spiralganglienzellen in den ertaubten, nicht implantierten
Cochleae ..................................................................................................................... 90
7
6.3
Beurteilung der Dichten überlebender Spiralganglienzellen in den mit AP und
DEX behandelten Cochleae...................................................................................... 91
6.4
Bewertung der Spiralganglien-Überlebensrate nach chronischer elektrischer
Stimulation................................................................................................................. 92
6.5
Effekte einer verzögerten Therapie mittels neurotropher Faktoren auf das
Überleben der Spiralganglienzellen......................................................................... 94
6.6
Beurteilung der protektiven Effekte einer verzögerten kombinierten Therapie
aus Nervenwachstumsfaktoren und elektrischer Stimulation auf
Spiralganglienzellen .................................................................................................. 96
6.7
Bewertung des Bindegewebswachstums nach Dexamethason-Applikation......... 99
6.8
Einfluss von Dexamethason auf den Effekt der elektrischer Stimulation.......... 100
Zusammenfassung ............................................................................................... 102
8
Summary .............................................................................................................. 105
9
Literaturverzeichnis ............................................................................................ 108
10 Anhang.................................................................................................................. 125
10.1
Reagenzien und Lösungen...................................................................................... 125
10.2
Laborbedarf, Operationsbesteck und Verbrauchsmaterialien........................... 126
10.3
Geräte ....................................................................................................................... 128
10.4
Herstellung von Lösungen...................................................................................... 128
Erklärung .................................................................................................................... 131
DANKSAGUNG.......................................................................................................... 132
Verzeichnis eigener Vorträge, Poster und
publizierter Vortragskurzfassungen
Teile der vorliegenden Dissertationsarbeit wurden bereits als Vorträge, Poster und publizierte Vortragskurzfassungen (Abstracts) auf Kongressen vorgestellt oder sind als Vortrag akzeptiert:
•
SCHEPER, V., WEFSTAEDT, P., LENARZ, T., STÖVER, T.
Untersuchungen zum protektiven Effekt einer Kombination aus elektrischer
Stimulation und Dexamethason auf Spiralganglienzellen experimentell ertaubter
Meerschweinchen
In: 77. Jahresversammlung der Deutschen Gesellschaft für Hals-Nasen-OhrenHeilkunde, Kopf- und Hals-Chirurgie e.V. 2006 (Vortrag, Poster, e-Abstract)
•
SCHEPER, V., PAASCHE, G., MILLER, J.M., LENARZ, T., STÖVER, T.
Effects of combined electrical stimulation and neurotrophic factor treatment on
spiral ganglion cells in deafened guinea pigs
In: Bionics and Regeneration of the Ear, the 7th International Academic Conference of Immunobiology in Otorhinolaryngology, University of Melbourne and
the Bionic Ear Institute, Melbourne, Australia, 2006 (Poster)
•
SCHEPER, V., PAASCHE, G., MILLER, J.M., LENARZ, T., STÖVER, T.
Effects of combined electrical stimulation and GDNF treatment on spiral ganglion cells in deafened guinea pigs
In: 43rd Inner Ear Biology Workshop and Satellite Symposium on "Hearing Rehabilitation and Innovative Inner Ear Therapy" Montpellier, France, 2006
(Poster)
•
SCHEPER, V., LENARZ, T., STÖVER, T.
Effects of combined treatment with electrical stimulation and dexamethasone on
spiral ganglion cells in deafened guinea pigs
In: 2nd international symposium, interface biology of implants, Rostock, 2006
(Poster)
•
SCHEPER, V., PAASCHE, G., MILLER, J.M., LENARZ, T., STÖVER, T.
Combination of electrical stimulation and neurotrophic factor treatment in
deafened guinea pigs
In: Association for Research in Otolaryngology, MidWinter Meeting 2007,
Denver, CO, USA (Poster)
•
SCHEPER, V., SASSE, S., PAASCHE, G., MILLER, J.M., LENARZ, T.,
STÖVER, T.
Spiralganglienzell-Überleben bei verzögerter Applikation einer minimierten
GDNF-Konzentration und elektrischer Stimulation
In: 78. Jahresversammlung der Deutschen Gesellschaft für Hals-Nasen-OhrenHeilkunde, Kopf- und Hals-Chirurgie e.V. 2007 (Vortrag)
Für die vorliegende Arbeit wurden die in den Vorträgen und Postern dargestellten
Ergebnisse in einen Kontext gesetzt, ausführlicher beschrieben sowie durch weitere
Ergebnisse ergänzt.
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
ABR
AABR
AdGDNF
AEP
AP
Aqua dest.
BAEP
BDG
BDNF
BERA
bzw.
ca.
CI
dB
DEX
EABR
ERA
ES
et al.
FAEP
FEEP
FGF
GDA
GDNF
GFRα-1
h
HS
Hz
IHC
kg
KGW
kHz
l
µ
µA
µg
µl
µs
µV
m
mA
MAEP
mg
ml
mmol
ms
n
N.
NaCl
ng
NGF
Abbildung
Auditory Brainstem Response
akustisch evozierte auditorische Hirnstamm-Potentiale,
acustically evoked auditory brainstem response
GDNF exprimierender adenoviraler Vektor
Akustisch Evozierte Potentiale (auditory evoked potentials)
artifizielle Perilymphe
Aqua destillata, destiliertes Wasser
Brainstem Auditory Evoked Potential
Bindegewebe
Brain-Derived Neurotrophic Factor
Brainstem Electric Response Audiometry
beziehungsweise
cirka
Cochlea Implantat
Dezibel
Dexamethason
elektrisch evozierte auditorische Hirnstammpotentiale,
Electrically evoked Auditory Brainstem Response
Elektrische Reaktionsaudiometrie
elektrische Stimulation
et alii (und andere)
Frühe akustisch evozierte Potentiale
Frühe elektrisch evozierte Potentiale
Fibroblast Growth Factor
Glutardialdehyd
Glial Cell line-Derived Neurotrophic Factor
GDNF Family Receptor α 1
hora (Stunde)
Hörschwelle
Hertz
Innere Haarzellen, inner hair cells
Kilogramm
Körpergewicht
Kiloherz
Liter
mikro (x 10-6)
Mikroampere
Mikrogramm
Mikroliter
Mikrosekunde
Mikrovolt
milli (x 10-3)
Milliampere
Mittlere akustisch evozierte Potentiale
Milligramm
Milliliter
Millimol
Millisekunde
Stichprobenumfang
Nervus
Natriumchlorid
Nanogramm
Nerve Growth Factor
NT-3/4/5
NTF
NTR
OHC
p
PBS
pH
p.o.
pps
Pt-Ir
RET
RNS
ROS
s
SAP
Sc.
s.c.
SGZ
SP
SPF
SPL
Std.
Tab.
TNT
Trk
u.a.
V
V.
v.a.
z. B.
Neurotrophin-3, -4, -5
neurotrophe Faktoren
Neurotrophinrezeptor
äußere Haarzellen, outer hair cells
Probability (Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der Ähnlichkeit zweier
Datengruppen)
phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)
negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoff-Ionenkonzentration
per os
pulses per second
Platin-Iridium
rearranged in transformation, intrazellülärer Rezeptor
reactive nitrogen species
reactive oxygen species
Sekunde
Summenaktionspotential
Scala
sub cutan
Spiralganglienzellen
Schalldruck (sound pressure)
Spezifisch pathogen frei
Schalldruckpegel (sound pressure level)
Stunden
Tabelle
Tumor Nekrose Faktor
Tyrosin Kinase
unter anderem
Volt
Vena
vor allem
zum Beispiel
1
1
Einleitung
Hörminderung und Taubheit stellen in den industrialisierten Nationen eine der am
weitesten verbreiteten Krankheiten dar. Man geht davon aus, dass von einer Gesamtanzahl von 800.000 Geburten pro Jahr in Deutschland 400 bis 500 Kinder mit dauerhaften Hörstörungen zur Welt kommen. Das bedeutet, dass von 1000 Neugeborenen
1 bis 1,2 schwerhörig sind. Die Behandlung taub geborener und ertaubter Patienten ist
in den letzten Jahren durch die Einführung künstlicher elektronischer Innenohrprothesen, so genannter Cochlea-Implantate (CI), revolutioniert worden. Inzwischen ist die
CI-Versorgung die weitläufig anerkannte Routinebehandlung von Patienten mit
vollständigem sensorineuralen Hörverlust. Insbesondere taub geborenen Kindern ist es
nach Versorgung mit einem Cochlea-Implantat möglich, Sprache zu erlernen. Allerdings gibt es nach wie vor große individuelle Unterschiede hinsichtlich des Erfolges,
der mit einem CI erreicht wird (LENARZ 1997).
Eine Erklärung für diese Variabilität könnte in der Anzahl der für eine elektrische
Stimulation (ES) zur Verfügung stehenden Spiralganglienzellen (SGZ) liegen:
SPOENLIN (1984) und ALTSCHULER et al. (1999) konnten zeigen, dass bei einsetzender Taubheit zunächst die Haarzellen absterben und nachfolgend die peripheren
Dendriten des Hörnerven und die nachgeschalteten Spiralganglienzellen degenerieren.
Da das Cochlea-Implantat die Funktion der geschädigten Haarzellen durch eine direkte
elektrische Stimulation der SGZ übernimmt, ist der Erfolg eines CI’s auch von der Anzahl der für eine elektrische Stimulation zur Verfügung stehenden Spiralganglienzellen
abhängig. Dementsprechend wird die Anzahl der SGZ in der Literatur als eines der entscheidenden Elemente für den Erfolg einer CI-Versorgung angesehen (INCESULU u.
NADOL 1998; LOUSTEAU 1987, LEAKE et al. 1992; SHEPHERD et al. 1994). Die
Zeitspanne zwischen Ertaubung und Versorgung mit einem CI ist eine den Erfolg der
Therapie mitbestimmende Variable. Je mehr Zeit zwischen Ertaubung und Implantation
verstreicht, desto geringer wird die Zahl der für die elektrische Stimulation zur Verfügung stehenden Spiralganglienzellen (WEBSTER u. WEBSTER 1981).
Wäre es möglich die Anzahl der vitalen SGZ nach Ertaubung auf einem hohen Niveau
zu erhalten, könnte vermutlich die Effektivität der Cochlea-Implantate deutlich erhöht
2
werden. Eine Verzögerung der Degeneration der Spiralganglienzellen beziehungsweise
(bzw.) deren Erhalt nach Ertaubung stellt damit einen zentralen Schritt auf dem Weg zu
einer weiteren Verbesserung der Effektivität der Cochlea-Implantat-Versorgung dar.
In den letzten Jahren wurde eine Reihe von Substanzen identifiziert, die einen
protektiven Effekt auf Spiralganglienzellen bei einsetzender Taubheit ausüben können.
Diese so genannten neurotrophen Faktoren (NTF) umfassen Substanzen wie glial cell
line-derived neurotrophic factor (GDNF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF),
Neurotrophin-3 (NT-3), fibroblast growth factor (FGF) und viele andere. YLIKOSKI et
al. (1998) und YAGI et al. (2001) konnten in Versuchen an ertaubten Meerschweinchen
zeigen, dass eine sofort nach Ertaubung einsetzende Intervention mit GDNF eine
effektive Spiralganglienzellprotektion bewirkt. Auch für BDNF konnte solch ein
verbessertes SGZ-Überleben an ertaubten Meerschweinchen im Vergleich zu einer
Kontrollgruppe gezeigt werden (STAECKER et al. 1996; HEGARTY et al. 1997;
MILLER et al. 1997). GILLESPIE et al. (2004) fanden, dass sogar eine 14 Tage nach
Ertaubung verzögert einsetzende BDNF-Gabe die SGZ-Population signifikant erhöht. In
der Realität dauert es zwischen einigen Wochen bis hin zu Jahren nach der Ertaubung,
bis ein Patient mit einem CI versorgt wird. Somit stellt sich die Frage, ob nach drei
Wochen, um zunächst die geringste Verzögerungsspanne zu untersuchen, noch
ausreichend vitale SGZ vorhanden sind, welche einer möglichen Protektion durch die
neurotrophen Faktoren zur Verfügung stehen und falls sie vorhanden sind, welches
Protektionsausmaß in diesem Degenerationsstadium noch erzielt werden kann.
Neben der lokalen Freisetzung von neurotrophen Faktoren im Innenohr, scheint auch
die einer Cochlea-Implantat-Stimulation nachempfundene elektrische Reizung selbst
einen protektiven Effekt auf SGZ ausüben zu können. Allerdings stellen sich die
Ergebnisse tierexperimenteller Versuche diesbezüglich nicht einheitlich dar, so dass
eine abschließende Bewertung einer elektrischen Stimulation (ES) als protektiver
Stimulus für SGZ in vivo bisher nicht getroffen werden kann (HARTSHORN et al.
1991; SHEPHERD et al. 1993; MITCHELL et al. 1997). Es ist zu vermuten, dass die
unterschiedlichen Untersuchungsergebnisse auf der Verwendung unterschiedlicher
Stimulationsparameter beruhen, welche das Ausmaß des protektiven Einflusses der ES
auf die SGZ bestimmen. Zu diesen Parametern zählen unter anderem die Reizfrequenz,
die
Intensität,
die
Wiederholungsrate
und
die
Pulsbreite.
Vorangegangene
Untersuchungen halfen, die optimalen Stimulationsparameter zur chronischen
3
elektrischen Stimulation von Meerschweinchen-Cochleae zu bestimmen (MITCHELL
et al. 1997). Diese Einstellungen wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit
übernommen. Neben der Untersuchung, ob diese Parameter auch nach dreiwöchiger
Taubheitsphase noch zu einem Erhalt der Spiralganglienzellen führen, sollte ermittelt
werden, ob eine unterschiedliche Positionierung zwischen aktiver Elektrode und
Referenzelektrode Auswirkungen auf den möglichen protektiven Effekt der elektrischen
Stimulation auf die SGZ hat.
In vitro Untersuchungen konnten belegen, dass durch elektrische Stimulation eine
Freisetzung neurotropher Faktoren hervorgerufen werden kann (BALKOWIEC u.
KATZ 2000). Es ist daher zu vermuten, dass die zellprotektive Wirkung der ES auf
einer Vermittlung durch neurotrophe Faktoren beruht. Es wäre daher möglich, dass die
Kombination beider Interventionsmethoden einen synergistischen Effekt bewirkt.
Perspektivisch wäre zur Optimierung der Spiralganglienzellprotektion die Kombination
einer Lokaltherapie mittels NTF und einer elektrischen Stimulation durch das Implantat
von höchstem Interesse. Um dies zu untersuchen wurde in der vorliegenden Arbeit
zunächst der Effekt einer drei Wochen nach systemischer Ertaubung verzögert
einsetzenden elektrischen Stimulation auf SGZ untersucht. Anschließend wurde der
Effekt der Kombination aus elektrischer Stimulation und GDNF bzw. BDNF betrachtet.
Neben einer möglichst großen Anzahl vitaler SGZ ist für eine optimale Versorgung mit
einem CI eine enge Nerv-Elektroden-Interaktion von Bedeutung (GANTZ et al. 1993;
LENARZ 1998). Aus diesem Grunde ist es das Ziel ungewollte Nebeneffekte der
Cochlea-Implantat-Operation, wie implantationsbezogene Entzündungsprozesse oder
Bindegewebsbildung im Bereich der inserierten Elektrode, auf ein Minimum zu
reduzieren. Mögliche Kandidaten für eine derartige therapeutische Intervention im
Innenohr sind Glukokortikoide wie zum Beispiel Dexamethason. Im Tierversuch konnte
nachgewiesen werden, dass Dexamethason (DEX) den nach lärm- (TAKEMURA et al.
2004) und aminoglykosid-induziertem (HIMENO et al. 2002) Hörverlust einsetzenden
Haarzellverlust und die daraus resultierende Hörschwellenerhöhung signifikant
verringern konnte. Mögliche protektive bzw. toxische Effekte von Glukokortikoiden auf
Spiralganglienzellen im Sinne eines verstärkten oder verminderten Spiralganglienzellüberlebens wurden bisher in vivo nicht untersucht. Ebenso wenig wurde untersucht,
welchen Einfluss Glukokortikoide auf den möglichen SGZ-protektiven Effekt der
elektrischen Stimulation haben.
4
2
Literaturübersicht
2.1
Das Hörorgan
Das auditorische System der Säugetiere lässt sich in einen peripheren Anteil, das
eigentliche Hörorgan, und einen zentralen Anteil, die zentrale Hörbahn, unterteilen. Im
Weiteren soll speziell auf das Hörorgan (SEIFERLE 1992) eingegangen werden.
2.1.1 Anatomie des Hörorganes
Das Hörorgan besteht aus drei Teilen: dem Außen-, Mittel- und Innenohr. Das äußere
Ohr besteht aus der Ohrmuschel sowie dem sich anschließenden äußeren Gehörgang.
Das Trommelfell bildet den Abschluss des äußeren Ohres und trennt dieses vom
Mittelohr, welches im Felsenbein liegt (Abb. 1).
An das Trommelfell schließt sich eine knöcherne, luftgefüllte Höhle, das Mittelohr
(Auris media) an. Dieses setzt sich aus der Paukenhöhle (Cavum tympani) und der
Ohrtrompete (Tuba auditiva, Eustachische Röhre) zusammen. In der Paukenhöhle
liegen die der Schallübertragung dienenden Gehörknöchelchen (Ossicula auditus).
Hammer (Malleus), Amboß (Incus) und Steigbügel (Stapes) sind beweglich miteinander
verbunden und überbrücken den Abstand zwischen Trommelfell und dem Ovalen
Fenster
(Fenestra vestibuli), welches das Mittelohr vom nachfolgenden Innenohr
abgrenzt. Im Innenohr (Auris interna) befindet sich das eigentliche statoakustische
Doppelsinnesorgan. Es besteht aus zwei miteinander in Verbindung stehenden
funktionellen Teilen, dem Gleichgewichtsorgan (Vestibularapparat) und der sich
rostroventral anschließenden Schnecke (Cochlea).
2.1.1.1
Die Hörschnecke (Cochlea)
Die Cochlea liegt beim Meerschweinchen, im Gegensatz zur anatomischen
Beschaffenheit des Menschen, nahezu frei im Mittelohr (Abb. 1 und 2) und wird durch
eine dünne Knochenwandung, welche sich um eine konusförmige Achsenspindel
(Modiolus) windet, von diesem abgegrenzt. Beim Menschen weist sie 2,5 und beim
Meerschweinchen 3,5 bis nahezu 4, sich verjüngende Windungen auf. Vom Modiolus
ragt eine senkrecht angeordnete, ebenfalls spiralförmig verlaufende, dünne Knochen-
5
Abb. 1: Aufbau des menschlichen Ohres (BOENNINGHAUS u. LENARZ 2004,
Abb. I.1)
Abb. 2: Innenansicht des Meerschweinchenfelsenbeins (COOPER u. SCHILLER,
1975)
6
lamelle (Lamina spiralis ossea) in den knöchernen Schneckengang vor. Dieser Vorsprung und zwei an ihm entspringende Membranen teilen den knöchernen Schneckengang in zwei perilymphatische Treppengänge, die an der Modiolusspitze (Apex) über
einen Hohlraum (Helicotrema) miteinander kommunizieren, sowie in einen zwischen
den beiden Membranen liegenden häutigen Schlauch, den Ductus cochlearis (Abb. 3).
Der obere der drei in der Cochlea verlaufenden Flüssigkeitsräume wird als
Vorhoftreppe (Scala vestibuli) bezeichnet und beginnt am ovalen Fenster (Fenestra
vestibuli) (SEIFERLE 1992). Von hier aus verläuft er zum Helicotrema, wo er mit der
am runden Fenster (Fenestra cochleae) endenden Paukentreppe (Scala tympani) in
Verbindung steht. Beide Scalen enthalten zusammen ein Perilymphvolumen von 15,94
µl (SHINOMORI et al. 2001). Der zwischen diesen beiden Scalen liegende Ductus
cochlearis bzw. auch Scala media genannte Raum, wird durch die Reißnersche
Membran (Membrana vestibularis) von der Scala vestibuli und durch die Basilarmembran von der Scala tympani getrennt. Die seitliche Begrenzung der Scala media
bildet die Stria vascularis, durch die die Versorgung der Scala media und der ihr
assoziierten Strukturen mit kaliumreicher Endolymphe erfolgt. Das Volumen dieses
Raumes beträgt 4,69 µl (SHINOMORI et al. 2001). Das Cortische Organ (Organum
spirale) befindet sich auf der zwischen der Lamina spiralis ossea und dem Ligamentum
spirale verlaufenden Basilarmembran (Lamina basilaris) und besteht aus den mit
Stereovilli versehenen Haarzellen sowie Stützzellen (DEITERS’sche Zellen). Zwei, zu
Pfeilerzellen umgewandelte Stützzellen bilden den Cortischen Tunnel, der eine
Einteilung der Haarzellen in innere (IHC) und äußere Haarzellen (OHC) zulässt. Axial
befindet sich eine Reihe innerer Haarzellen, während peripher drei bis maximal fünf
Reihen an äußeren Haarzellen vorhanden sind. Die modiolusseitige Begrenzung des
Cortischen Organs erfolgt durch den Limbus spiralis osseae, dessen oberer Rand
(Labium limbi vestibulare) die Ansatzstelle für die Tektorialmembran (Membrana
tectoria)
bildet.
Unterhalb
der
Tektorialmembran
liegen
die
erwähnten
Haarsinneszellen. Während die Stereovilli der OHC festen Kontakt mit der sie
bedeckenden Tektorialmembran haben, flotieren die der IHC frei in der Endolymphe
(HOTH u. LENARZ 1997).
7
Abb. 3: Darstellung eines Querschnitts durch eine Windung der Cochlea (SEIFERLE
1992)
8
2.1.1.2
Das Spiralganglion (Ganglion spirale)
Die knöcherne Achse der Cochlea, der Modiolus, enthält einen feinen Knochenkanal
(Canalis spiralis cochleae, Rosenthalscher Kanal), in welchem der Hörnerv,
Blutgefäße und das bipolare Ganglienzellen enthaltende Spiralganglion (Ganglion
spirale cochleae) liegen.
Das Ganglion spirale wird von den zentralen Axonen der bipolaren Nervenzellen
gebildet (LEONHARDT 1990) und stellt das erste auditorische Neuron des afferenten
Leitungsbogens dar. Die peripheren Fortsätze des Ganglion spirale bilden die
dendritischen Fasern des Hörnervs. Sie verlassen den Modiolus und treten unter Verlust
ihrer Markscheide von unten durch die Basilarmembran. Von dort ziehen sie frei durch
den inneren Tunnel und bilden synapsenartige Kontakte mit den Haarzellen
(BREDBERG 1977; LEONHARDT 1990; NADOL 1990). Am basalen Pol der OHC
inserieren vorwiegend efferente Hörnervenfasern (90%) wohingegen nur 5 bis 10% an
afferenten synaptischen Strukturen von den OHC entsandt werden, von denen jede
durch Kollaterale mit ca. zehn äußeren Haarzellen verbunden wird (ABBAS 1988;
BREDBERG 1977; LEONHARDT 1990; ZENNER 1994). Die IHC werden an ihrem
basalen Pol vorwiegend von afferenten Fasern und nur von wenigen efferenten Fasern,
die mit afferenten Fasern über axodendritische Synapsen in Verbindung stehen,
innerviert (HOTH u. LENARZ 1997). Bipolare myelinisierte Typ I-Ganglienzellen
stellen bis zu 95% der gesamten Spiralganglienzellen, wohingegen pseudounipolare
unmyelinisierte Ganglienzellen vom Typ II 5% der SGZ ausmachen (ROMAND u.
ROMAND 1987). Typ I-Ganglienzellen der Meerschweinchen sind mit einem mittleren
Durchmesser von 12-25 µm etwas größer als Typ II-Ganglienzellen (BICHLER 1984).
Funktionell repräsentieren die Typ I Zellen größtenteils die afferente Versorgung der
inneren Haarzellen, wohingegen den Typ II-Zellen die afferente Versorgung der
äußeren Haarzellen zukommt (RUBEL u. FRITZSCH 2002).
Die zentralen Neuriten des Spiralganglions vereinigen sich zum Nervus cochlearis des
sensorischen Nervus vestibulocochlearis (VIII. Hirnnerv). Dieser entspringt mit seinen
beiden Wurzeln (Radix cochlearis und vestibularis) aus dem verlängerten Rückenmark.
Über dieses erreichen die spezifischen Erregungen das Gehirn und werden in den
Endkernen des Rhombencephalons auf die sekundären Neurone und somit auf die
zentralen Leitungsbahnen umgeschaltet.
9
2.1.2 Physiologie des Hörorgans
Das Hörorgan reagiert auf Schallwellen, die als Druckschwankung der Luft auftreten,
und vermittelt diese als bewusste Sinnesempfindungen (z.B. Geräusche und Töne). Als
Hören wird das Aufnehmen dieser Schallreize, die Weiterleitung der Reize durch
Nervenfasern und das Deuten dieser Reize im Gehirn bezeichnet. Ein Ton wird durch
eine Sinusschwingung einer einzigen Frequenz dargestellt, während Geräusche ein
breites Frequenzband innerhalb des Hörbereiches umfassen (ZENNER 1994).
Die Leistungsfähigkeit des Hörorgans ist bei den verschiedenen Spezies sehr
unterschiedlich ausgeprägt. Säugetiere weisen eine große artspezifische Variabilität im
Hörbereich auf. Für den Menschen liegt der wahrnehmbare Frequenzbereich in der
Jugend zwischen 20 Hz und 20 kHz und zwischen 2 und 5 kHz ist das Gehör am
empfindlichsten (LEHNHARDT u. LASZIG 2001). Beim Elefanten liegt die untere
Hörgrenze bei ca. 14 Hz (Infraschall), bei einigen Fledermausarten reicht die obere
Hörschwelle bis ca. 160 kHz (Ultraschall) (PENZLIN 1991; SCHMIDT-NIELSEN
1999). Meerschweinchen hören in einem Frequenzbereich von 50 Hz bis 50 kHz (FAY
1988).
Als dynamische Breite wird die Schallintensität bezeichnet, die vom Ohr verarbeitet
werden kann. Diese umfasst für das menschliche Ohr einen so großen Wert, dass für sie
ein logarithmisches Maß als Schalldruckpegel (SPL) in Dezibel (dB) eingeführt wurde.
Daraus ergibt sich für das menschliche Ohr eine dynamische Breite von 0-120 dB. Das
gesamte Ohr mit all seinen Strukturen dient der Aufgabe, den eingefangenen Schall den
Sinneszellen so zuzuführen, dass diese ihn möglichst gut aufnehmen können.
Schallwellen erreichen über die Ohrmuschel und den äußeren Gehörgang das Trommelfell, womit der Vorgang des Hörens initiiert wird. Das Trommelfell wird durch die
Schallwelle in Schwingung versetzt und gibt die mechanische Bewegung an die
Gehörknöchelchenkette weiter. Der Druck des Steigbügels auf das ovale Fenster
bewirkt eine Wanderwelle in der dahinter liegenden Flüssigkeit (Perilymphe). Diese
Wellen laufen entlang der Vorhoftreppe durch die immer enger werdenden Windungen
zur Schneckenspitze. Über die Basilarmembran wird auch die Endolymphe im Ductus
cochlearis angeregt und bewirkt eine Reizung des Cortischen Organs. An der
Schneckenspitze gelangen die Druckwellen in den Paukengang, laufen wieder zur Basis
der Schnecke zurück und erschöpfen sich schließlich im runden Fenster.
Die Auslenkung der Basilarmembran führt zu einer Scherung der Stereovilli der
äußeren Haarzellen durch die darüber liegende Tektorialmembran (LEONHARDT
10
1990). Die so entstehenden gerichteten Flüssigkeitsströme bewirken ebenfalls eine
Deflexion der inneren Haarzellen (PICKLES u. COREY 1992). Darin besteht der
adäquate Reiz für die Erregung der Sinneszellen. Durch die Depolarisation der inneren
Haarzellen werden an ihrer Basis afferente Neurotransmitter freigesetzt und somit die
Auslösung eines postsynaptischen Nervenaktionspotentials erreicht (LIBERMANN
1984; ZENNER 1994). Die inneren Haarzellen führen somit den endgültigen
Transduktionsprozeß, die Umwandlung des mechanischen Signals der äußeren
Haarzellen in ein körpereigenes bioelektrisches Signal, aus (mechanoelektrische
Transduktion) (ABBAS 1988; ALLEN 1980; KLINKE 1987; ZENNER u. PLINKERT
1992; PLATH 1981).
Die Auslenkung der Basilarmembran ist stark nach dem Tonotopieprinzip organisiert,
wobei
die
passive
Wanderwelle
die
Basilarmembran
in
Abhängigkeit
der
Stimulusfrequenz an verschiedenen Stellen maximal auslenkt (ABBAS 1988;
ALLEN 1980; BÈKÉSY 1970; ZENNER 1994). Dadurch kommt es zur
Frequenzdispersion, das heißt, unterschiedliche Frequenzen erregen unterschiedliche
Sinneszellen (LEONHARDT 1990). Bei hohen Frequenzen erfolgt die maximale
Auslenkung der Basilarmembran an der Basis, bei tiefen Frequenzen an der Schneckenspitze (KLINKE 1987). Die scharfe Abstimmung und Frequenzselektivität wird somit
bereits auf der Ebene der Haarzellen erzeugt.
2.1.3 Ursachen und Klassifizierungen von Hörschädigungen
Hörminderung und Taubheit stellen in den industrialisierten Nationen einen der am
weitesten verbreiteten Krankheitskomplexe dar. Die Ursachen von Hörstörungen
sind äußerst vielfältig. Man kann zwischen kongenital (vor oder während der Geburt)
und postnatal (nach der Geburt) entstandenen Schäden unterscheiden. Kongenitale
Schäden werden zudem in hereditär (erblich), pränatal (vor der Geburt) und perinatal
(während der Geburt) erworbene Hörschäden unterteilt (BOENNINGHAUS 1993).
Eine nicht-ätiologische Einteilung von Hörstörungen beruht auf der Lokalisation der
Fehlfunktion.
Unter
diesem
Aspekt
lassen
sich
schallleitungsbedingte
und
schallempfindungsbedingte Hörstörungen unterscheiden.
Die
Ursache
einer
schallleitungsbedingten
(konduktiven)
Hörstörung
betrifft
ausschließlich das Außen- sowie das Mittelohr. Sie ist bedingt durch eine Störung der
Übertragung der Schallwellen, z. B. bei Verlegung des Gehörganges (Fremdkörper,
11
Otits externa, o.ä.), Trommelfellruptur oder Mittelohrveränderungen (Otitis media,
Erguss).
Eine Schallempfindungsschwerhörigkeit, auch sensorineurale Schwerhörigkeit genannt,
entsteht
entweder
im
Innenohr
(Innenohrschwerhörigkeit
=
sensorische
Schwerhörigkeit), im Hörnerven (Nervenschwerhörigkeit = neurale Schwerhörigkeit)
(BOENNINGHAUS 1993) oder im zentralen Anteil der Hörbahn.
Schädigungen des Innenohrs beruhen vor allem (v.a.) auf einer Zerstörung der
Haarzellen. Sie führen zu sensorischen Schallempfindungsschwerhörigkeiten, welche
bei vollständiger Zerstörung der sensorischen Elemente eine vollständige Taubheit zur
Folge haben können. Mögliche Ursachen für derartige Innenohrschäden umfassen
chronische und akute akustische Traumen, toxische Schäden (z.B. durch Antibiotika
und Zytostatika) sowie Infektionen (insbesondere bakterielle Meningitiden). Als
Ursachen kommen aber auch degenerative Entwicklungen sowie ein erbbedingter
Hörabbau in Frage. Sowohl die Schädigung der IHC als auch die Schädigung der OHC
führen zu Wahrnehmungsverlusten.
2.1.4 Haarzellschädigung und Degeneration der Spiralganglienzellen
Gesunde Haarzellen übertragen den physikalisch-mechanischen Schallreiz in eine
bioelektrische Erregung, welche über das Spiralganglion und die afferenten Fasern des
Nervus (N.) cochlearis im Gehirn zu einer Hörempfindung führt. Die Zerstörung der
Sinneszellen
führt
sekundär
zu
einer
Degeneration
der
nachgeschalteten
Spiralganglienzellen (OTTE et al. 1978; WEBSTER u. WEBSTER 1981; SUTTON u.
MILLER 1983; SPOENDLIN 1984; JYUNG et al. 1989; LEAKE et al. 1991; NADOL
u. HSU 1991), deren Funktionalität und Anzahl einen entscheidenden Einfluss auf den
Erfolg einer Cochlea-Implantat-Behandlung haben (GANTZ et al. 1993).
Lärmexposition und Aminoglykosid-Antibiotika haben sich zur Untersuchung der
Effekte einer Ertaubung durch Haarzellverlust im in vivo Modell durchgesetzt.
Lärmexposition führt laut OHINATA et al. (2000) und YAMASHITA et al. (2004) zur
Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) und reaktiver
Stickstoffspezies (reactive nitrogen species, RNS). ROS und RNS leiten die Bildung
freier Radikale ein, welche eine Haarzellschädigung und nachfolgende –apoptose
verursachen.
Über
identische
Signalwege
führen
auch
Aminoglykoside
zur
Haarzelldegeneration (PRIUSKA u. SCHACHT 1995; TAKUMIDA et al. 1999). Es
konnte gezeigt werden, dass das Aminoglykosid-Antibiotikum Kanamycin in
12
Kombination mit dem Diuretikum Ethacrynsäure zu einer Zerstörung der OHC und IHC
führt (WEST et al. 1973). JYUNG et al. konnten 1989 zudem beweisen, dass die
Kombination beider Substanzen, bedingt durch die Haarzellschädigung, die Dichte der
SGZ vermindert.
Haarzellen produzieren Neurotrophe Faktoren (NTF) wie z.B. Neurotrophin-3,
brain- derived neurotrophic factor oder glial cell line-derived neurotrophic factor
(GDNF), welche für SGZ überlebenswichtig sind. Zusätzlich beeinflussen von den
Haarzellen freigesetzte Neurotransmitter die Membranaktivität der SGZ, was sich
additional positiv auf ihr Überleben auswirkt. Unter anderem werden sowohl der
mangelnde stimulierende Einfluss der Haarzellen auf die SGZ im Sinne fehlender
Aktionspotentiale durch die Neurotransmitter, als auch das Fehlen der NTF für die
Degeneration der peripheren
auditorischen Neurone nach erfolgter Haarzell-
degeneration verantwortlich gemacht. Fehlt der trophische Support, kommt es zum
Absterben der betroffenen SGZ durch Apoptose.
2.1.5 Das Cochlea-Implantat (CI)
Bei sensorischer Taubheit oder bei durch Hörgeräte nicht nutzbaren Hörresten mit
erhaltener Leitfähigkeit des N. cochlearis und intakter zentraler Hörbahn besteht die
Möglichkeit, durch direkte elektrische Reizung der SGZ Höreindrücke auszulösen
(BOENNINGHAUS u. LENARZ 2004; LENARZ 1998). Eine Innenohrprothese, das
Cochlea-Implantat (CI), übernimmt die Funktion der Haarzellen durch direkte
elektrische Stimulation des Hörnerven (MATSCHKE u. PLATH 1988).
Cochlea-Implantate bestehen aus einem im Ohrbereich zu tragenden Mikrophon, einem
Sprachprozessor,
einer
externen
Sendespule,
einer
Empfangsspule,
einer
Verarbeitungseinheit sowie einer Cochlea-Implantat-Elektrode (JAEKEL et al. 2002).
Das Mikrophon nimmt die akustischen Signale auf und leitet sie über ein Kabel einem
Sprachprozessor zu. Dieser wandelt die akustischen Signale durch Filterung,
Komprimierung und Entrauschung in elektrische Impulsfolgen um. Die Signalmuster
werden an eine Übertragungsspule weitergeleitet, die sich aus einem Sender- und einem
Empfängerteil zusammensetzt. Die Sendeantenne, die hinter dem Ohr angebracht ist,
überträgt die Impulse transcutan auf das subcutan retroauriculär implantierte
Empfängerteil (LEHNHARDT et al. 1986). Dieses besitzt eine Empfangsantenne,
welche die elektrischen Impulse aufnimmt. Die Elektrode, bestehend aus einem
biegsamen Bündel leitender Drähte, welche jeweils an einem frei liegenden
13
Elektrodenkontakt enden, wird über eine Cochleostomie möglichst modiolus- und damit
spiralganglienzellnah in der Sc. tympanie positioniert. Die Elektrodenkontakte, je nach
Hersteller variiert ihre Anzahl (maximal 22), haben auf Grund ihrer Position in der
Scala tympani nur indirekten Kontakt zum Spiralganglion.
Die durch Cochlea-Implantate erzielten Höreindrücke bei erwachsenen Patienten sind
im Wesentlichen als sehr positiv zu bewerten. Allerdings gibt es beträchtliche
Unterschiede in den Ergebnissen, die durch die Hörprothese erreicht werden können
(CLARK et al. 1987; RISBERG et al. 1990). Von fast allen Implantatträgern wird
berichtet, dass sie wieder Hörsensationen erfahren. Der Höreindruck, der erzielt wird,
ist
jedoch
infolge
der
individuellen
Voraussetzungen
bei
jedem
Patienten
unterschiedlich (GANTZ et al. 1993). Seine Qualität lässt sich nicht mit Sicherheit
vorhersagen. In jedem Fall wird Schall anders wahrgenommen, als es die ertaubte
Person vor ihrer Hörschädigung gewohnt war. Ein Grund hierfür sind unter anderem
post operativ eintretende Entzündungsvorgänge, welche Bindegewebsneubildungen
entlang der Elektrode nach sich ziehen und somit zu einer Verschlechterung der
Nerv-Elektroden-Interaktion
führen.
Zum
anderen
ist
der
Erfolg
einer
Cochlea-Implantat-Versorgung maßgeblich von der Anzahl funktionsfähiger SGZ
abhängig (GANTZ et al. 1993; PFINGST u. SUTTON 1983). Für eine therapeutische
Intervention im Innenohr mit dem Ziel der Unterdrückung von Entzündungsprozessen
im Rahmen der Elektroden-Implantation bilden Glukokortikoide (z.B. Dexamethason)
interessante Therapieoptionen, wohingegen sich sowohl neurotrophe Faktoren (z.B.
glial cell line-derived neurotrophic factor und brain-derived neurotrophic factor) als
auch eine elektrische Stimulation hypothetisch als Interventionen eignen, um eine
fortschreitende Spiralganglienzell-Degeneration aufzuhalten (WEFSTAEDT 2006).
14
2.2
Evozierte Potentiale des auditorischen Systems
2.2.1 Allgemeines
Die elektrische Reaktionsaudiometrie (electric response audiometry, ERA) ist ein Verfahren der objektiven Audiometrie zur Registrierung von evozierten Potentialen. Mit
Hilfe der ERA ist eine Diagnostik der Art und des Ausmaßes von Schädigungen der
gesamten Hörbahn vom peripheren Hörorgan bis zur neuralen Verarbeitung möglich.
Von allen Stufen der Hörbahn lassen sich durch an der Körperoberfläche platzierte
Elektroden Potenziale ableiten, die durch definierte Reize hervorgerufen werden. Die
gemessenen Potenziale sind Teil der gesamten elektrischen Aktivität des Gehirns.
Durch Reizwiederholung und anschließende Mittelung hebt sich das evozierte Potenzial
von der spontanen Elektroencephalogramm-Aktivität ab und wird als Wellenverlauf im
Zeit (Millisekunden, ms)- Spannungsdiagramm (Mikrovolt, μV) dargestellt.
Mit Hilfe der Ableitung evozierter Potentiale des auditorischen Systems (auditory evoked potentials, akustisch evozierte Potenziale, AEP), einem Teilgebiet der elektrischen
Reaktionsaudiometrie, werden die beim Hörvorgang entlang der Hörbahn auftretenden
Aktionspotentiale von der Cochlea bis hin zum auditorischen Cortex registriert. Periphere Stimulation, afferente Erregungsleitung und zentrale neuronale Verschaltung sind
die physiologischen Grundlagen der AEPs. Evozierte Potentiale stellen in der Audiologie eine wesentliche Ergänzung zu den subjektiven Hörtests dar. Sie werden in der
Hals-Nasen-Ohrenheilkunde zur objektiven Messung der Hörfunktion eingesetzt. Mit
Hilfe der AEPs ist es möglich, auch am narkotisierten Versuchstier Messungen durchzuführen. Zudem hat diese Methode den Vorteil, dass es sich um eine nicht invasive
Technik handelt.
Die Ableitung erfolgt bei Tieren in der Regel über Nadelelektroden. Sie werden am
Vertex (Positivpol), am rechten und linken Mastoid (Negativpole) und in der rechten
Kniefalte (Erdung) platziert. Zwischen Vertex und dem dem Reiz zugewandten Mastoid
wird die ipsilaterale Antwort abgeleitet. Die kontralaterale Antwort wird zwischen Vertex und dem dem Reiz abgewandten Mastoid abgeleitet. Das AEP-Signal verläuft in
einem charakteristischen Muster, dessen Extrema in der Audiologie als Welle bezeichnet werden. Als Amplitude einer Welle ist die Differenz des positiven zum darauf
folgenden negativen Extremum definiert. Aufgrund ihres zeitlichen Auftretens im
15
Abstand zum auslösenden Reiz (Latenz) werden die gemessenen Potentiale in sehr
frühe, frühe, mittlere, späte und sehr späte Potentiale eingeteilt. Zudem lassen sich den
Wellen aufgrund der Latenz spezifischen Regionen der Hörbahn als Generatoren
zuordnen. Die sehr frühen AEPs (SFAEP, Sehr Frühe Akustisch Evozierte Potentiale)
umfassen die mit der Elektrocochleographie gewonnenen cochleären Mikrophonpotentiale, das Summationspotential der Cochlea, sowie das Summenaktionspotential
des Hörnervens (HOTH u. LENARZ 1994). Sie treten innerhalb der ersten 5 ms nach
Reizbeginn auf. Wellen im Bereich bis 10 ms nach Reizgebung werden als frühe
Potentiale (FAEP, Frühe AEP) oder Hirnstammpotentiale bezeichnet. Die Nomenklatur
innerhalb dieses Feldes ist nicht immer einheitlich. Häufig verwendete Bezeichnungen
sind „brainstem evoked response audiometry (BERA)“, „brainstem auditory-evoked
potential (BAEP)“ und „auditory brainstem response (ABR)“.
Die FAEP erfassen die Reaktionen bis einschließlich des Hirnstammes, welcher nicht
von Narkotika beeinflusst wird und somit eine Registrierung sowohl im wachen wie
auch im narkotisierten Zustand zulässt, was bei der Arbeit mit Tieren von großer
Relevanz ist. Mittlere Akustisch Evozierte Potentiale (MAEP) erscheinen 10-50 ms
nach dem auslösenden Reiz. Schwelle und Verlauf der Signale werden von Narkosemitteln und auch vom Alter verschiedenartig beeinflusst (KRAUS et al. 1985). Im
Anschluss daran folgen die Späten und Sehr Späten akustisch evozierten Potentiale
(SAEP, SSAEP), bei denen es sich um Antworten des auditorischen Cortex handelt.
Im weiteren Verlauf dieses Kapitels werden die Methoden zur objektiven Hörschwellenmessung mittels Ableitung akustisch und elektrisch evozierter FAEPs näher
erläutert. Die frühen akustisch evozierte Hirnstammpotenziale werden im Weiteren als
AABR, akustisch evozierte auditorische Hirnstammpotentiale (acustically evoked
auditory brainstem response) und die frühen elektrisch evozierten Hirnstammpotenziale
als EABR, elektrisch evozierte auditorische Hirnstammpotentiale (electrically evoked
auditory brainstem response) bezeichnet.
2.2.2 Akustisch evozierte auditorische Hirnstammpotentiale, AABR
Die AABR des Meerschweinchens setzen sich aus 7 vertex-positiven Wellen
zusammen. Diese werden entweder mit römischen Ziffern P I- VII oder mit J1 – J7, in
Anlehnung an einen der Erstbeschreiber (JEWETT 1970) bezeichnet. Bei den akustisch
evozierten Potenzialen handelt es sich zum Teil um Überlagerungen von Summenaktionspotenzialen aus verschiedenen Kerngebieten, so dass eine getrennte Zuordnung
16
zu einzelnen Kernen der Hörbahn nicht eindeutig getroffen werden kann. Nach HOTH
und LENARZ (1994) wird das Potenzial I topologisch den cochleären Strukturen sowie
der Aktivität des Hörnerven zugeordnet, P II dem Eintritt des Hörnerven in den Hirnstamm, P III dem Nucleus Cochlearis, P IV der ipsilateralen oberen Olive oder dem
Lemniscus lateralis und P V der kontralateralen oberen Olive oder dem Lemniscus
lateralis oder dem Colliculus inferior. Die späteren Potenziale VI und VII, die nur
inkonstant nachweisbar sind, sind dem Zwischenhirn und dem primären auditorischen
Cortex zuzuordnen.
Die akustische Stimulation des auditorischen Systems erfolgt im Allgemeinen durch so
genannte Clicks. Der Clickreiz ist ein Rechteckimpuls mit einer steil ansteigenden
Flanke. Die kurze Reizdauer und die damit verbundene schnelle Änderung des Schalldruckes führen zur synchronen Erregung einer großen Anzahl von Neuronen. Durch die
Synchronität überlagern sich die einzelnen Aktionspotentiale der Nerven der gesamten
Hörbahn, es entsteht ein Summenaktionspotential (SAP). Das SAP der zentralen Hörbahn von der Cochlea über den Hörnerv und den Hirnstamm bis zum auditorischen
Cortex ist als AABR messbar.
Zur Bestimmung der akustischen Hörschwelle bei Meerschweinchen wird P III herangezogen. Laut INGHAM et al. (1998) ist die akustische Hörschwelle als die niedrigste
Stimulusintensität definiert, welche eine wiederholbare, mindestens 0.5µV große, Amplitude evoziert.
2.2.3 Elektrisch evozierte auditorische Hirnstammpotentiale, EABR
Nach Implantation einer Innenohrelektrode werden durch intracochleäre Stimulation
elektrische Impulse im Hörnerv erzeugt, welche über die aufsteigende Hörbahn weitergeleitet werden. In Folge der Reizverarbeitung entstehen elektrische Potentiale, die an
der Kopfoberfläche registriert werden können (HOTH und LENARZ 1994). Analog zu
den AABRs ist es ebenfalls möglich, die Reaktion der zentralen Hörbahn auf direkte
elektrische Reizung des Hörnervs sichtbar zu machen. Die elektrische Reizung erfolgt
mit Hilfe der Implantat-Elektrode. Das Ergebnis der Messungen sind die frühen elektrisch evozierten Potenziale (FEEP), welche im Weiteren elektrisch evozierte auditorische Hirnstammpotentiale, Electrically Evoked Auditory Brainstem Response, EABR,
genannt werden (Abb.4). Sie werden mittels Elektroden an der Schädeloberfläche abgeleitet. Die Benennung der Wellen erfolgt analog zu der der akustischen Messung mit
P I-VII. Anhand der EABR-Messung lässt sich die Qualität der Implantation beurteilen.
17
Je enger der Kontakt zwischen Elektrode und Hörnerv, desto geringer ist die
Hörschwelle (SHEPHERD et al. 1993, 1997). Die Bestimmung der Hörschwelle erfolgt
auf Grund der Amplitudengröße der dritten Welle. Diejenige Stromstärke, welche eine
wiederholbare 1µV oder größere Amplitude der dritten Welle hervorrufen kann, wird
als elektrische Hörschwelle, oder auch Reizschwelle bezeichnet (YAMAGATA et al.
2004).
Abb. 4: Darstellung einer typischen EABR-Kurve eines normal hörenden Meerschweinchens nach MILLER et al. (1995). Es wurde eine bipolare intracochleaere
Elektrode verwendet. Stimulus: 20 µs monophasische rektanguläre Pulse alternierender Polarität. Die Stimulusintensitäten sind rechts neben der jeweiligen Ableitung beschrieben. Die römischen Ziffern bezeichnen die gemittelten Wellen.
18
2.3
Die Neurotrophen Faktoren Glial Cell Line-Derived
Neurotrophic Factor und Brain-Derived Neurotrophic
Factor
2.3.1 Neurotrophe Faktoren (NTF)
Im Nervensystem existieren im Wesentlichen zwei Zelltypen: zum einen Neurone, die
über ihre Fortsätze, Axone und Dendriten, miteinander verbunden sind und für die
Informationsspeicherung und -weiterleitung zuständig sind und zum anderen ubiquitär
vorhandene Gliazellen, die für die Versorgung von Neuronen und die Erhaltung der
Homöostase verantwortlich sind. Im Normalzustand, aber insbesondere bei pathogenen
Prozessen, kommunizieren diese beiden Zelltypen über elektrische Signale, direkte
Zell-Zell-Kontakte und extrazelluläre Moleküle miteinander. Eine wichtige Rolle
spielen bei diesen komplexen Interaktionen neurotrophe Faktoren (NTF). In der
vorliegenden Arbeit wurden die Effekte der NTF auf die Neurone des Rosenthalschen
Kanals, die so genannten Spiralganglienzellen, untersucht. Im weiteren Verlauf dieser
Arbeit wird deshalb nur auf diesen neuronalen Zelltyp eingegangen.
Neurotrophe Faktoren, eine Subklasse der Wachstumsfaktoren, sind endogene, lösliche,
Proteine, welche das Überleben und das Wachstum sowie die morphologische
Plastizität oder Synthese von Proteinen für differenzierte Neuronfunktionen regulieren
(LOUGHLIN u. FALLON 1993). LIPON und KALIL zeigten 1995, dass neurotrophe
Faktoren sowohl auf neuronale wie auch auf non-neurale Zellen wirken. Während der
embryonalen und postnatalen Entwicklung regulieren sie die Differenzierung und das
Überleben von Neuronen im gesamten Nervensystem. Im adulten Nervensystem spielen
sie eine wichtige Rolle für die Erhaltung der synaptischen Verbindungsfähigkeit und
Plastizität (MANESS et al. 1994). Aufgrund struktureller und funktioneller Homologien
sowie spezifischer Affinitäten zu bestimmten Rezeptortypen können die NTF in
mindestens vier verschiedene Familien unterteilt werden: 1. die Neurotrophine, welche
die am besten charakterisierte Familie der neurotrophen Faktoren darstellt, 2. die
Fibroblast Growth Factor (FGF)- Familie (acidic und basic fibroblast growth factor,
aFGF und bFGF), 3. die neuropoetischen Cytokine (z.B. ciliary neurotrophic factor,
CNTF) und 4. die GDNF Familie (LIPTON u. KALIL 1995). Diverse NTF spielen eine
wichtige Rolle während der Entwicklung des auditorischen Systems, von der
morphologischen Ausbildung des endolymphatischen Ganges über die Größe der
SGZ-Population bis hin zur neuronalen Verschaltung. Diese Wirkungen führen zu der
19
Hypothese, dass NTF einer traumatisch bedingten SGZ-Degeneration entgegenwirken
könnten (GILLESPIE u. SHEPHERD 2005). Für einige Faktoren wie z.B. GDNF und
BDNF konnte im Rahmen von in vitro und in vivo Versuchen eine Protektion der SGZ
nach Ertaubung nachgewiesen werden.
2.3.2 Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) und die
GDNF-Familie
Die GDNF-Familie wird zur Transforming Growth Factor-β-(TGF-β)-Superfamilie
gezählt und setzt sich aus GDNF und den verwandten Proteinen Neurturin
(KOTZBAUER et al. 1996), Artemin (BALOH et al. 1998) und Persephin
(MILBRANDT et al. 1998) zusammen.
Der Rezeptor-Komplex für GDNF wurde annähernd zeitgleich von verschiedenen
Forschungsgruppen entdeckt (LINDSAY u. YANCOPOULOS 1996; MASON 1996)
und besteht aus zwei Komponenten. Eine Komponente ist der extrazelluläre
GDNF-family receptor α-1 bis 4 (GFRα-1 bis 4) (JING et al. 1996; TREANOR et al.
1996) und die andere Komponente ist ein intrazellulärer Rezeptor der trk-Superfamilie
(trk = Tyrosin Kinase) mit der Bezeichnung RET (rearranged in transformation). Jing et
al. (1996) zufolge bindet das GDNF-Molekül an das GFRα-1-Rezeptormolekül,
welches mit RET interagieren und so verschiedene Signalkaskaden auslösen. Neurturin
zeigt Präferenz für die Bindung an GFRα-2, Artemin für GFRα-3 und Persephin für
GFRα-4. GDNF, Neurturin, Artemin und Persephin führen alle durch ihre
GFRα-Rezeptoren zu einer sekundären Aktivierung von RET und initialisieren somit
die intrazelluläre Signalkaskade (STÖVER et al. 2000a).
GDNF wurde 1993 als eine von Gliazellen produzierte Substanz isoliert und als
Wachstumsfaktor, welcher das Überleben von embryonalen dopaminergen Neuronen
des Mittelhirns fördert, also jene Zellen, welche bei Morbus-Parkinson degenerieren,
charakterisiert (LIN et al. 1993, 1994; TOMAC u. LINDQUIST 1995). GDNF wird von
diversen Zelltypen synthetisiert und beeinflusst die Entwicklung und das Überleben
unterschiedlichster neuronaler Zellen (MOORE et al. 1996; PICHEL et al. 1996).
Sowohl HENDERSON et al. (1994) als auch BUJ-BELLO et al. (1995) und TRUPP et
al. (1995) konnten trophische Effekte des GDNF auf eine Vielzahl neuronaler Zellen
unterschiedlichster Entwicklungsstadien sowohl des peripheren als auch des zentralen
Nervensystems nachweisen (WEFSTAEDT 2006). GDNF ist für die Entwicklung der
Niere (HELLMICH et al. 1996) und des enterischen Nervensystems (SANCHEZ et al.
20
1996) mit von entscheidender Bedeutung. ARENAS et al. gelang es 1995 die Wirkung
auf noradrenerge Neurone aufzuzeigen während WILLIAMS und Kollegen (1996) Effekte auf cholinerge Neurone bewiesen.
2.3.3 In vitro Effekte von GDNF auf Spiralganglienzellen
Verschiedene in vitro Untersuchungen belegen den protektiven Effekt des GDNFs auf
Spiralganglienzellen. YLIKOSKI et al. (1998) und QUN et al. (1999) zeigten an vereinzelten Spiralganglienzell-Kulturen embryonaler (embryonaler Tag 16, 18 und 21) und
postnataler Ratten im Alter von bis zu 12 Tagen, dass 100pg GDNF/ml Lösungsmittel
das Spiralganglienzellüberleben nach 48 Stunden Kultivierung im Vergleich zu einer
Kontrollgruppe signifikant verbessern konnte. Im vergangenen Jahr wurde eine ausdifferenzierende Wirkung des GDNF auf kultivierte Vorläuferzellen von Spiralganglienzellen adulter Menschen und Meerschweinchen nachgewiesen (RASK-ANDERSEN et
al.
2005).
WEFSTAEDT
(2006)
untersuchte
den
Einfluss
unterschiedlicher
GDNF-Konzentrationen (25 ng, 50 ng, 100 ng) auf dissoziierte Spiralganglienzellen 3-5
Tage alter Ratten und wies ein signifikantes Überleben der SGZ nach Behandlung mit
100 ng GDNF nach.
2.3.4 In vivo Effekte von GDNF auf Spiralganglienzellen
Unterschiedlichste NTF beeinflussen das SGZ-Überleben in vivo (SHAH et al. 1995;
MILLER et al. 1997; GILLESPIE et al. 2004, 2005). Da die Überlegungen zur Anwendung von NTF am Menschen dahin zielen, Patienten mit sensorineuralem Hörverlust
und nachfolgender Degeneration der SGZ zu behandeln, führen viele Arbeitsgruppen
zunächst eine Ertaubung der Versuchstiere durch. YLIKOSKI et al. (1998) untersuchten
die protektive Wirksamkeit einer chronischen intracochleaeren GDNF-Applikation auf
die SGZ ertaubter Meerschweinchen. Ab dem vierten Tag nach Lärmtrauma-Exposition
wurden zunächst 72ng GDNF über 7 Tage in das Innenohr appliziert. Nachfolgend
wurden 50 ng GDNF über 14 Tage verabreicht. Im Vergleich zu einer Kontrollgruppe
ermittelten YLIKOSKI et al. (1998) durch die GDNF-Therapie einen signifikant erhöhten Spiralganglienzellerhalt. Andere Arbeitsgruppen ertaubten Meerschweinchen systemisch mittels Kanamycin und Ethacrynsäure (KUANG et al. 1999; YAGI et al. 2000;
KANZAKI et al. 2002). 50 ng/ml GDNF, vor der Ertaubung mittels eines Pumpsystems
in Meerschweinchencochleae appliziert, führten zu einer Erhöhung der SGZ-Dichte im
Vergleich zur Zellzahl im unbehandelten Ohr (KUANG et al. 1999). YAGI et al. (2000)
21
und KANZAKI et al. (2002) applizierten das GDNF mittels adenoviraler Vektoren
(AdGDNF) 4-7 Tage nach Ertaubung. Die Ergebnisse beider Arbeitsgruppen zeigen
eine signifikante Protektion der Nervenzellen nach Ertaubung.
Ein Ziel dieser Arbeit war es, den SGZ-protektiven Effekt einer nach Ertaubung
verzögert einsetzenden chronischen Applikation von 100 ng/ml GDNF zu untersuchen.
Hintergrund dieser Fragestellung ist die klinische Situation der Cochlea-ImplantatVersorgung in der Humanmedizin. Auch in der Klinik erfolgt die Versorgung
betroffener Patienten mit einer zeitlichen Verzögerung. Somit würde eine potentielle,
im Rahmen der CI-Operation beginnende, Wachstumsfaktor-Applikation erst ab diesem
Zeitpunkt starten. Aus diesem Grund ist es von praktischer Bedeutung, den Effekt von
GDNF auf die Neurone zu untersuchen, wenn diese schon einer fortschreitenden
Degeneration ausgesetzt sind.
2.3.5 Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) und die NeurotrophinFamilie
BDNF bildet zusammen mit dem Nerve Growth Factor (NGF), dem Neurotrophin-3
(NT-3) sowie dem Neurotrophin 4/5 (NT-4/5) die Gruppe der Neurotrophine
(GILLESPIE u. SHEPHERD 2005). Neurotrophine sind, wie die anderen neurotrophen
Faktoren, körpereigene Signalstoffe welche an membranständige Rezeptoren binden. Es
existieren zwei Typen von Rezeptoren für Neurotrophine: a: p75 Neurotrophin Rezeptor
(p75NTR), ein Rezeptor der Tumor Nekrose Faktor (TNF)-Rezeptor Familie, b: Rezeptoren der Tyrosinkinase-Rezeptor-Familie (TrkA, TrkB und TrkC). Der p75NTR ist in
der Lage alle fünf Neurotrophine zu binden, allerdings ist die Affinität vergleichsweise
gering. Die Rezeptoren der Trk-Familie hingegen sind affiner und binden spezifisch nur
bestimmte Neurotrophine, wobei TrkB der das BDNF bindende Rezeptor ist (HUANG
u. REICHARDT 2001). Die Bindung von Neurotrophinen an p75NTR führt zum
programmierten Zelltod (Apoptose). Bindung an Rezeptoren der Trk-Familie hingegen
löst eine Kaskade von Kinasen aus, die sich anti-apoptotisch auswirkt.
Nach der ersten Beschreibung von BDNF 1982 (BARDE et al. 1982) gelang bereits
1989 die Klonierung und heterologe Expression (LEIBROCK et al. 1989). BDNF spielt
als Vertreter der Gruppe der Neurotrophine eine essentielle Rolle in der Entwicklung,
dem Erhalt und der Funktion verschiedenster neuronaler Zellen im zentralen und
peripheren Nervensystem (LOUGHLIN u. FALLON 1993).
22
2.3.6 In vitro Effekte von BDNF auf Spiralganglienzellen
Es liegen Untersuchungen vor, welche belegen, dass BDNF, NT-3 und NT-4/5 auf das
Überleben früher postnataler SGZ in Kultur einen fördernden Einfluss haben. Verschiedene Arbeitsgruppen konnten zeigen, dass BDNF, im Gegensatz zu neurotrophin-freien
Kontrollkulturen, das SGZ-Überleben signifikant steigert (ZHENG et al. 1995;
MALGRANGE et al. 1996; MARZELLA et al. 1999, WEFSTAEDT et al. 2005).
PIRVOLA et al. (1992) konnten für Spiralganglienzellen der Ratte demonstrieren, dass
BDNF sowohl das Spiralganglienzellüberleben als auch das Auswachsen von Neuriten
aus kultivierten Spiralganglienzellexplantaten fördern kann. LEFEBVRE et al. (1994)
führten Versuche an Kulturen adulter Ratten-SGZ durch und konnten beweisen, dass
BDNF auch hier zu einem signifikanten Anstieg der SGZ-Überlebensrate führt. Diese
Ergebnisse unterstützen die These, dass Neurotrophine für die permanente trophische
Zuwendung im auditorischen System während des Erwachsenseins notwendig sind
(GILLESPIE u. SHEPHERD 2005).
Andere in vitro Studien belegen, über die alleinige Erhöhung des SGZ-Überlebens hinaus, dass BDNF Spiralganglienzellen vor den ototoxischen Folgen von Aminoglykosiden (LALWANI et al. 2002; GAO 1999), therapeutischer Medikamente (GAO 1999)
und Chemotherapeutika (ZHENG u. GAO 1996; GAO 1999; DUAN et al. 2002) schützen kann. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass Neurotrophe Faktoren in der
Prävention der zerstörenden Effekte von therapeutischen ototoxischen Sunstanzen, welche zu den Hauptursachen für sensorineuralen Hörverlust zählen, eine wichtige Rolle
spielen (GILLESPIE u. SHEPHERD 2005).
Verschiedene
Arbeitsgruppen
konnten
in
vitro
demonstrieren,
dass
BDNF-
Konzentrationen von 50 ng bis 100 ng/ml, im Vergleich zu anderen Konzentrationen,
die stärkste SGZ-protektive Wirkung ausüben (ZHENG et al. 1995; HEGARTY et al.
1997; MOU et al. 1997; WEFSTAEDT et al. 2005).
ZHENG et al. (1995) verglich die Wirkungen von NGF, NT-3, NT-4/5 und BDNF auf
kultivierte, mittels Cisplatin toxisch behandelter SGZ früher postnataler Ratten (Tag 5).
Im Rahmen dieser Untersuchungen stellte sich heraus, dass NT-3, NT-4/5 und BDNF
einen steigernden Effekt auf das Überleben postnataler SGZ ausübt, NGF allerdings
nicht. Der das Überleben der SGZ steigernde Effekt war am stärksten bei NT-4/5 ausgeprägt. Auch NT-3 führte zu einer Erhöhung der SGZ-Dichte trotz CisplatinBehandlung. Allerdings war dieser Effekt weniger stark ausgeprägt als in der mit BDNF
behandelten Gruppe. WEFSTAEDT et al. (2005) verglichen unter anderem den
23
SGZ-protektierenden Effekt von 25, 50 und 100 ng/ml BDNF und GDNF auf Kulturen
dissoziierter postnatale SGZ (Ratten) und kamen zu dem Ergebnis, dass BDNF in allen
getesteten Konzentrationen einen effektiveren SGZ-Schutz gewährleistet als GDNF.
2.3.7 In vivo Effekte von BDNF auf Spiralganglienzellen
Neben in vitro Überlebensstudien Spiralganglienzellen betreffend, demonstrieren in
vivo Studien, dass die Freisetzung von BDNF im Innenohr die sekundäre Degeneration
der Spiralganglienzellen nach Haarzellverlust verringern kann. Zudem konnte gezeigt
werden, dass auch eine verzögerte Neurotrophin-Verabreichung, zur Gewährleistung
des Fortschreitens degenerativer Prozesse, protektiv auf SGZ wirkt. An mittels
Kanamycin und Ethacrynsäure ertaubten Meerschweinchen konnte gezeigt werden, dass
intracochleaer verabreichtes BDNF mit einer Konzentration von 50 ng/ml, ab dem siebten Tag nach ototoxischer Behandlung für 14 Tage appliziert, ein verbessertes Haarund Spiralganglienzellüberleben bewirkt (MILLER et al. 1997). Auch einen Tag nach
Ertaubung (LALWANI et al. 2002 (adenoviral)) und fünf Tage nach Ertaubung beginnende vierwöchige (GILLESPIE et al. 2003 (Protein, 62,5µg/ml)) und achtwöchige
(STAECKER et al. 1996 (Protein, 1mg/ml)) BDNF-Behandlungen von ototoxisch ertaubten Meerschweinchen führten zu diesem Ergebnis.
GILLESPIE et al. (2004) demonstrierten, dass sowohl BDNF, NT-3, NT-4/5 und NGF,
jeweils in einer Konzentration von 62,5µg/ml verabreicht, ein weiteres Fortschreiten der
SGZ-Degeneration nach vierzehntägiger Taubheit verhindern können. Auch eine Kombination aus BDNF und NT-3 (50 µg/ml) hat nach einer Taubheit von vier Wochen
noch ähnlichen protektiven Einfluss (WISE et al. 2005). Ebenso konnte gezeigt werden,
dass eine zwei oder sechs Wochen nach Neomycin-Ertaubung verzögert einsetzende
Behandlung mittels einer Kombination aus BDNF (100 µg/ml) und CNTF (100 ng/ml)
schützend auf das Innenohr wirken kann (SHINOHARA et al. 2002; YAMAGATA et
al. 2004). Zu ähnlichen Ergebnissen eines verbesserten Spiralganglienzellüberlebens
kamen auch NAKAIZUMI et al. (2004), welche BDNF und/oder CNTF mittels adenoviraler Vektoren 7 Tage nach Ertaubung in die Scala tympani injizierten. SHEPHERD
et al. (2005) demonstrierten, dass nach Aminoglykosid/Furosemid-induzierter Ertaubung von Meerschweinchen eine BDNF-Konzentration von 62,5µg/ml, ab dem fünften
Tag nach Ertaubung für 28 Tage intracochleaer verabreicht, die Anzahl überlebender
SGZ, im Vergleich zu einer Kontrollgruppe, signifikant erhöhen konnte.
24
Obwohl BDNF-Effekte auf das SGZ-Überleben nach Ertaubung untersucht wurden, ist
dessen Wirkung noch nicht für die hier verwendeten Konditionen mit einer Konzentration von 50 ng/ml, einer Taubheitsphase von 21 Tagen vor Therapiebeginn und einer
Behandlungsdauer von vier Wochen beschrieben worden. Diese Arbeit dient der Untersuchung der Wirkung von BDNF zu den so eben beschriebenen Konditionen auf das
SGZ-Überleben. Zudem soll der beobachtete Effekt des BDNFs mit dem des GDNF,
welches demselben Versuchsaufbau folgend eingesetzt wird, verglichen werden, um
eventuell eine Aussage treffen zu können, welcher der beiden Neurotrophen Faktoren
effektiver für eine zukünftige in vivo Anwendung geeignet erscheint.
2.3.8 GDNF- und BDNF- Effekte auf die Funktionalität des Hörorgans
nach Ertaubung
Neben den Auswirkungen der NTF-Therapie auf Spiralganglienzellen spielt auch ihre
Wirkung auf die Funktionalität des Innenohres eine wichtige Rolle. Auch wenn GDNF
und BDNF, wie oben beschrieben, SGZ-protektiv wirken können, so würde dies keinen
medizinischen Gewinn bringen, wenn nicht auch gleichzeitig die Funktionalität positiv
beeinflusst werden würde. Für einige NTF, wie zum Beispiel acidic fibroblast growth
factor (aFGF, SUGAHARA et al. 2000) oder neurotrophin-3 (NT-3, SHOJI et al.
2000 a) konnte gezeigt werden, dass ihr Einsatz zu einer Verbesserung der Cochleafunktion nach Traumaexposition führen kann.
Nicht alle Arbeitsgruppen, welche die Wirkungen von GDNF und BDNF auf das SGZÜberleben nach Ertaubung untersuchten, führten gleichzeitig auch funktionelle Tests,
wie Ermittlungen der akustischen oder elektrischen Hörschwelle, durch.
Nur zwei Arbeitsgruppen prüften in ihren GDNF-Studien neben möglichen morphologischen Veränderungen durch Faktorgabe auch eventuell auftretende Modifikationen der
akustischen Hörschwellen im Verlauf der Behandlung mit GDNF. YLIKOSKI et al.
(1998) konnten hierbei keinerlei Unterschiede betreffend der Hörschwellen zwischen
GDNF behandelten und unbehandelten Tieren bzw. Kontrollseiten feststellen. Im
Gegensatz hierzu konnten SHOJI et al. (2000b), welche die Effektivität von GDNF zur
Verminderung von Cochlea-Schäden (Haarzellen) nach Lärmtrauma untersuchte,
zeigen, dass eine Intervention mittels 100 ng GDNF zu einer signifikant geringeren
Hörschwellenerhöhung nach Lärmexposition führte.
BDNF-Therapie nach Ertaubung kann neben einer Protektion der SGZ auch zu einer
funktionalen Erhaltung bzw. Verbesserung führen. Dass die Intervention mittels BDNF
25
die funktionelle Effektivität des auditorischen Systems signifikant erhöhen kann wurde
von SHEPHERD et al. (2005) mittels EABR-Messungen und von SHOJI et al. (2000a)
mittels AABR-Messung bewiesen. Auch in Kombination mit anderen NTF wie
CNTFAX1 (ciliary neurotrophic factor axokine-1) bewirkt BDNF im Vergleich mit einer
Kontrollgruppe eine signifikante Erniedrigung der Hörschwelle ertaubter Meerschweinchen, wie SHINOHARA et al. (2002) und YAMAGATA et al. (2004) mittels EABRMessung nachweisen konnten.
2.4
Das Glukokortikoid Dexamethason (DEX)
2.4.1 Glukokortikoide
Glukokortikoide werden in der Nebennierenrinde gebildet und zählen zu den Steroidhormonen. Die wichtigsten natürlichen Vertreter dieser Gruppe der Steroidhormone
sind Cortisol, Cortison und Corticosteron. Die zur Steroidwirkung führenden Schritte
beginnen mit dem Eindringen des Steroidmoleküls in die Zelle und seiner Bindung an
ein spezifisches zytoplasmatisches Rezeptorprotein (HOLLENBERG et al. 1985;
GREEN u. CHAMBOM 1986). Über mehrere, sowohl intrazellulär als auch im Zellkern stattfindende, Schritte bewirken die Glukokortikoide die Synthese von spezifischen Proteinen, welche die Wirkungen des Glukokortikoids vermitteln.
Bisher konnten in jedem Zelltyp der daraufhin untersucht wurde, unter anderem auch
in verschiedenen cochleären und vestibulären Regionen und im Zytosol von Spiralganglienzellen (TEN CATE et al. 1993; PITOVSKI et al. 1994; ZUO et al. 1995), die
Existenz von Glukokortikoidrezeptoren nachgewiesen werden (BALLARD et al.
1974). Es gibt lediglich Schwankungen in der Anzahl, die zwischen 5 000 und 100
000 pro Zelle liegt (FEHM 1990). In Folge dessen kann vermutet werden, dass jede
Zelle eine Reaktion zeigen wird, wenn sie Glukokortikoiden ausgesetzt wird und dass
das biologische Resultat dieser Reaktion für jeden Zelltypus spezifisch ist (FEHM
1990). So haben Glukokortikoide Einfluss auf die Hämatopoese sowie den Muskel-,
Wasser-, Elektrolyt-, Fett-, Kohlenhydrat- und Eiweißstoffwechsel. Durch Hemmeffekte der Glukokortikoide auf die Proteinsynthese der Lymphozyten und eine
hypotrophierende Wirkung auf Lymphknoten und den Thymus bewirken sie eine
Suppression der zellvermittelten Immunität. Antiphlogistisch wirken sie auf Grund der
Hemmung der Proliferation von Fibroblasten und von entzündlichem Granulations-
26
gewebe sowie der Verminderung
der Ablagerung von Kollagengrundsubstanzen
(PSCHYREMBEL 1994; FEHM 1990).
Die verschiedenen klinisch gebräuchlichen Steroide unterscheiden sich durch ihre
Affinität zum Rezeptor. Im Wesentlichen läuft die Affinität zum Rezeptor der
antiinflammatorischen Potenz parallel. Während die natürlichen Steroide wie das Kortisol nicht nur Affinität zum Glukokortikoidrezeptor, sondern auch zum Mineralokortikoidrezeptor haben, handelt es sich bei den klinisch gebräuchlichen Steroiden
überwiegend um
synthetisch hergestellte reine Glukokortikoide. Bei den synthe-
tischen Glukokortikoiden sind infolge chemischer Veränderungen des Cortisolmoleküls die unerwünschten mineralokortikoiden Nebenwirkungen der Glukokortikoide vermindert, die erwünschten glukokortikoiden Aktivitäten jedoch erhöht
(FEHM 1990). Außerdem wurden synthetische Glukokortikoide entwickelt, bei denen
die entzündungshemmenden Eigenschaften besonders ausgeprägt sind. Zu diesen zählt
das Dexamethason.
2.4.2 Dexamethason und seine Wirkung auf das Innenohr
Dexamethason ist ein synthetisches Glukokortikoid. Wie die natürlichen Glukokortikoide wirkt es katabolisch auf den Fett-, Protein- und Kohlenhydratmetabolismus
und beeinflusst das Immunsystem und den Ionentransport in Neuronen des zentralen
Nervensystems. Wie fast alle Glukokortikoide signalisiert Dexamethason über einen
zytosolischen Glukokortikoidrezeptor (ZHOU u. CIDLOWSKI 2005) und ist so in der
Lage, die Transkriptionsrate verschiedener Zielgene zu steigern oder zu hemmen
(STELLATO 2004).
Glukokortikoide, insbesondere Dexamethason, werden aufgrund ihrer antiinflammatorischen und immunsuppressiven Wirkung in Bezug auf das Innenohr erfolgreich in
der Therapie von Krankheitsgeschehen angewendet, für die eine autoimmune Ursache
angenommen wird (MC CABE 1979; HAYNES et al. 1980; KANZAKI et al. 1993).
Dexamethasonapplikation führte im Falle von Hörverlusten und Tinnitus die mit dem
Morbus Méniere assoziiert sind zu einer Verbesserung des Tinnitusgeschehens sowie
einer verminderten Wahrscheinlichkeit eines Fortschreitens des Hörverlustes (SHEA u.
GE 1996). Dass aminoglycosid-bedingter Hörverlust durch Dexamethason-Infusion in
die Scala tympani eingedämmt werden kann, konnten HIMENO et al. im Jahr 2002 am
Meerschweinchenmodell beweisen. Die gleiche Arbeitsgruppe zeigte, dass Dexametha-
27
son zu einer Verringerung der durch Lärm verursachten Traumen führt (TAKEMURA
et al. 2004).
Zusätzlich zu den genannten Einsatzmöglichkeiten könnte Dexamethason in
Verbindung mit Cochlea-Implantaten eingesetzt werden. Neben einer möglichst großen
Anzahl vitaler Spiralganglienzellen ist für eine optimale Patientenversorgung mit einem
Cochlea-Implantat eine enge Nerven-Elektroden-Interaktion anzustreben. Ungewollte
Nebeneffekte der Cochlea-Implantat-Operation, wie implantationsbezogene Entzündungsprozesse oder Bindegewebsneubildung im Bereich der inserierten Elektrode,
könnten durch die antiinflammatorische und immunsuppressive Wirkung des
Dexamethasons auf ein Minimum reduziert werden. In vitro Versuche an kultivierten
SGZ zeigten, dass 100 ng/ml DEX keinerlei Einfluss auf Spiralganglienzellen ausübt
(WEFSTAEDT 2006). In humanen Versuchen verringerte eine einmalige intraoperative
Applikation von 20mg/ml Triamcinolon-Kristall-Suspension die Impedanz verglichen
mit einer Kontrollgruppe signifikant (PAASCHE et al. 2006). Dies lässt darauf
schließen, dass Steroide, und somit auch DEX, als mögliche Interventionsmethoden zur
Optimierung der CI-Versorgung in Erwägung zu ziehen sind.
Ein Ziel dieser Arbeit ist es, die Effekte einer lokalen Dexamethason-Therapie auf das
postoperative Bindegewebswachstum nach Elektrodeninsertion zu untersuchen. Des
Weiteren soll die Frage beantwortet werden, inwiefern eine lokale DexamethasonBehandlung Einfluss auf einen möglichen SGZ-protektierenden Effekt der elektrischen
Stimulation ausübt.
2.5
Effekte elektrischer Stimulation (ES) auf Spiralganglienzellen
2.5.1 In vitro Effekte elektrischer Stimulation auf Spiralganglienzellen
und die zugrunde liegenden Mechanismen
In der Literatur finden sich nur wenige Angaben betreffend der Auswirkungen
elektrischer Stimulation auf kultivierte Spiralganglienzellen. Zudem kamen die sich mit
dieser Problematik beschäftigenden Arbeitsgruppen zu keinen übereinstimmenden
Ergebnissen. HEGARTY et al. (1997) führten Versuche mit vereinzelten Spiralganglienzellen der Ratte durch, welche nach Wechselfeldstimulation ein signifikant
gesteigertes Überleben zeigten. WEFSTAEDT (2006) hingegen, welcher ebenfalls die
Effekte elektrischer Stimulation auf das Zellüberleben kultivierter vereinzelte Spiral-
28
ganglienzellen der Ratte untersuchte, konnte keinen signifikanten Unterschied hinsichtlich eines verbesserten Spiralganglienzellüberlebens im Verhältnis zur unstimulierten
Kontrollgruppe feststellen.
Verschiedene Arbeitsgruppen konnten zeigen, dass die protektiven Effekte der
Depolarisation auf Spiralganglienzellen in vitro (HEGARTY et al. 1997) und in vivo
(MILLER et al. 2002, 2003) auf einem gesteigerten Ca2+-Influx in die Zellen durch
Steuerung spannungsabhängiger Ca2+-Kanäle beruht. Zum einen aktiviert das Ca2+ die
Ca2+ /Calmodulin abhängige Kinase (CaMK) (HANSON u. SCHULMAN 1992),
welche wiederum das depolarisationsabhängige Überleben der Zellen vermittelt
(HACK et al. 1993). Zum anderen erhöht das Ca2+ das als ein Überlebensfaktor für
Neurone geltende intrazelluläre cAMP (RYDEL u. GREENE 1988; KAISER u.
LIPTON 1990; D’MELLO et al. 1993; GALLI et al. 1995; HANSON et al. 1998) via
der Ca2+ /calmodulin-abhängigen Adenylyl-Zyklase (COOPER et al. 1995). Untersuchungen von HANSEN et al. (2001) und GHOSH et al. (1994) lassen darauf
schließen, dass neben den genannten noch ein autokriner Signalweg initiiert wird, der
über die gesteigerte Freisetzung neurotropher Faktoren auto- oder parakrin das Spiralganglienzellüberleben steigert.
2.5.2 In vivo Effekte elektrischer Stimulation auf Spiralganglienzellen
Im Jahr 1987 konnte LOUSTEAU an mittels Kanamycin und Ethacrynsäure systemisch
ertaubten und vor der Ertaubung einseitig mit einer elektrischen Innenohrprothese
versorgten Meerschweinchen demonstrieren, dass eine chronische elektrische Stimulation mittels biphasischer Rechteckpulse (eine Stunde/Tag; 100 µA; 250 µs/Phase; 200
Hz; 45 Tage Dauer) die Dichte der SGZ auf der stimulierten Seite im Vergleich zur unstimulierten Seite auf einem höheren Niveau erhalten konnte. Auch in einem ähnlichen
Versuch mit systemisch ertaubten Meerschweinchen konnte bei sofort nach Ertaubung
beginnender chronischer sinusoidaler elektrischer Stimulation (2 Std./Tag; 0 µA, 100
µA, 200 µA, 300 µA und 400 µA; 1000 Hz; neun Wochen Dauer) ein signifikant gesteigertes Überleben der SGZ im Vergleich zur unstimulierten Seite gefunden werden
(HARTSHORN et al. 1991). LEAKE et al. (1991, 1992) führten Versuche an systemisch ertaubten Katzen durch und variierten unterschiedliche Stimulationsparameter.
Ihre ersten Versuche im Jahr 1991 zeigten, dass eine um 10-16 Wochen nach Ertaubung
verzögert einsetzende einseitige intracochleäre Stimulation mittels biphasischer Rechteckpulse (eine Stunde/Tag; 6 dB über HS; 200 µs/Phase; 30 Hz; 4, 13 und 14 Wochen
29
Dauer) bei einer 13 bzw. 14 Wochen dauernden Stimulation zu einer signifikanten Erhöhung der SGZ-Dichte führte (LEAKE et al. 1991). Im darauf folgenden Jahr führte
dieselbe Arbeitsgruppe einen ähnlichen Versuch mit veränderten Stimulationsparametern durch. Die Intensität des Stimulus wurde auf 2 dB oberhalb der gemessenen HS
reduziert und die Dauer auf 4 Stunden am Tag für bis zu 23 Wochen erhöht. Die Ergebnisse dieser Studie lassen darauf schließen, dass eine Verlängerung der Stimulationsdauer bei niedriger Intensität den SGZ-protektierenden Effekt der ES potenziert (LEAKE et al. 1992). MITCHELL et al. (1997) untersuchten den Einfluss verschiedener
Reizfrequenzen und Pulsdauern auf die Dichte der SGZ ertaubter Meerschweinchen. Sie
kamen ebenfalls zu dem Ergebnis, dass eine ES die Spiralganglienzelldichte nach Ertaubung auf hohem Niveau erhalten kann. Es waren aber keine Unterschiede beim Vergleich der verschiedenen Reizparameter feststellbar. Durch Untersuchung der Auswirkungen einer elektrischen Gleichstrom-Stimulation (0,4-2,8 µA; Pulsdauer 50 µs, 20000
pps) von SGZ normal hörender Katzen nach einer Stimulationsdauer von 2200 h zeigten
SHEPHERD et al. (1999) die Wichtigkeit einer ladungsneutralen Stimulation für einen
maximalen Spiralganglienzellerhalt. So führte die Durchführung einer Gleichstromstimulation zu einer signifikant verringerten Spiralganglienzelldichte gegenüber unstimulierten Kontrolltieren.
Im Gegensatz zu den vorgenannten Untersuchungen konnten NI et al. (1992) und
SHEPHERD et al. (1994) keinen Unterschied in der Ganglienzelldichte zwischen elektrisch stimulierten und unstimulierten Cochleae ertaubter Katzen nachweisen. Die
Versuchstiere wurden nach Ertaubung mit Kanamycin und Ethacrynsäure über ca. 100
Tage insgesamt bis zu 1730 Stunden mit biphasischen Rechteckpulsen (100 µs/Phase)
einer Frequenz von 100Hz intracochleär stimuliert (SHEPHERD et al. 1994). Zu
ähnlichen Ergebnissen kamen ARAKI et al. (1998): neonatal mit Kanamycin und
Ethacrynsäure ertaubte Katzen wurden für 49 bis 67 Tage mit biphasischen Rechteckpulsen (100 µs/Phase) einer Frequenz von 200Hz für mindestens 16 Stunden täglich
elektrisch intracochleaer stimuliert. Die Reizintensität lag jeweilig 6dB über der zuvor
ermittelten EABR-Hörschwelle. In einer histopathologischen Studie zur Untersuchung
möglicher schädlicher Effekte einer elektrischen Stimulation auf SGZ wurden normal
hörende Katzen bilateral mit Cochlea-Implantaten versorgt und mit ladungsneutralen
biphasischen Pulsen (1000-2000 Hz) elektrisch stimuliert (XU et al. 1997). Nach einer
Stimulationsdauer von 2100 h konnten morphologisch keine auf die elektrische Stimulation zurückzuführenden Schädigungen des Spiralganglions im Vergleich zu einer
30
Kontrollgruppe nachgewiesen werden (XU et al. 1997). Diese Ergebnisse zeigten, dass
eine chronische elektrische intracochleäre Stimulation keine pathologischen Effekte in
noch vorhandenen Spiralganglienzellen ausübt. In einer ähnlichen Studie mit ertaubten
Meerschweinchen konnte in elektrisch stimulierten Cochleae eine signifikante Erhöhung der Dichte der SGZ, aber nicht der absoluten SGZ-Zahl festgestellt werden (LI et
al. 1999). Diese Erhöhung der Spiralganglienzelldichte unter elektrischer Stimulation
wurde nicht auf einen möglichen protektiven Effekt zurückgeführt, sondern auf eine
Verengung des Rosenthalschen Kanals in Folge elektrischer Stimulation (LI et al.
1999).
2.6
Effekte einer kombinierten GDNF- bzw. BDNF- Applikation
und elektrischer Stimulation auf das SGZ-Überleben und
die Funktionalität des Innenohres nach Ertaubung
Die Effekte einer 4-7 Tage nach Ertaubung einsetzenden Kombinationstherapie aus
GDNF und elektrischer Stimulation auf das Überleben der SGZ wurden 2002 von
KANZAKI et al. untersucht. Hierfür wurden Meerschweinchen ertaubt (Kanamycin und
Ethacrynsäure) und bekamen 4-7 Tage später einmalig intracochleaer GDNF mittels
eines adenoviralen Vektors (AdGDNF) appliziert. Zeitgleich begann die elektrische
Stimulation (ES) der Tiere. Bei diesen Experimenten wurde festgestellt, dass der Kombinationsstimulus (ES + AdGDNF) hinsichtlich eines maximalen Spiralganglienzellerhalts nach experimenteller Ertaubung effektiver war als die jeweiligen Einzelstimuli
(KANZAKI et al. 2002). Dieser statistisch signifikante Unterschied spiegelte sich
jedoch nicht in vorgenommenen EABR-Messungen wieder, welche in der AdGDNF +
ES-Gruppe verglichen mit der ES-Gruppe keine statistisch signifikante Differenz in den
durchschnittlichen Hörschwellen ergab. Zu bemerken ist jedoch, dass es in beiden Versuchsgruppen im Verlauf der Untersuchung zu einer 10%ige Abnahme der Hörschwelle
im Vergleich zur Ausgangshörschwelle kam.
Ein Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung des Effektes einer drei Wochen verzögert
nach Ertaubung einsetzenden, kombinierten chronischen Behandlung mittels definierter
GDNF-Dosis und elektrischer Stimulation auf SGZ systemisch ertaubter Meerschweinchen. KANZAKI et al. (2002) wiesen zwar einen additiven Effekt beider Behandlungskomponenten nach, doch verwendete diese Arbeitsgruppe adenovirale Vektoren zum
Einbringen des GDNF ins Innenohr. Auch wenn es heutzutage möglich ist, den Grad
der Genexpression durch diätetische Promotoren zu regulieren, so ist es doch kaum
31
möglich, die Freisetzungsrate und somit die Konzentration des produzierten Proteins im
Innenohr zu bestimmen. Bis heute existieren keine Studien, welche den kombinierten
Effekt einer definierten GDNF-Konzentration und elektrischen Stimulation auf SGZ in
vivo untersuchen. Zudem werden Cochlea-Implant-Patienten, auch heute noch, nicht
direkt im Anschluss eines sensorineuralen Hörverlustes implantiert. Dementsprechend
sollte man im Rahmen von in vivo Versuchen, deren Ergebnisse auf humane Gegebenheiten umgesetzt werden sollen, eine angemessene Zeitspanne zwischen Ertaubung und
Therapiebeginn verstreichen lassen. Kanzaki und Kollegen (2002) begannen die GDNFElektro-Therapie 4-7 Tage nach Ertaubung. In der vorliegenden Studie sollen die Auswirkungen einer Kombination aus 100 ng/ml GDNF (WEFSTAEDT et al. 2005) und
elektrischer Stimulation auf Spiralganglienzellen mit einem verlängerten ErtaubungsImplantations-Intervall von 21 Tagen untersucht werden.
Eine additive Wirksamkeit auf SGZ ertaubter Meerschweinchen konnte auch für die
Kombination einer elektrischen Stimulation mit kontinuierlicher BDNF-Applikation
(10 µg BDNF je Cochlea), ab dem fünften Tag nach Ertaubung über einen Zeitraum von
28 Tagen verabreicht, demonstriert werden (SHEPHERD et al. 2005). Eine alleinige ES
erwies sich dabei sowohl morphologisch als auch funktionell (Hörvermögen) als nicht
effektiv für einen verbesserten Spiralganglienzellerhalt, wohingegen die Kombinationstherapie zu einem signifikant verbesserten Spiralganglienzellüberleben und auch zu
erniedrigten Hörschwellen nach EABR-Untersuchung führte (SHEPHERD et al. 2005).
Ein verbessertes Spiralganglienzellüberleben wurde insbesondere in den Windungen der
Cochlea gefunden, die in Folge der Elektrodeninsertion elektrisch stimuliert werden
konnten (SHEPHERD et al. 2005).
Da die Cochlea-Implantat-Versorgung von Patienten mit akutem sensorineuralen Hörverlust erst zeitlich verzögert erfolgt und die Verwendung von Wachstumsfaktoren als
therapeutische Mittel aus toxikologischer und ökonomischer Sicht möglichst minimal
gehalten werden sollte, untersuchte diese Arbeit unter anderem die Effekte einer drei
Wochen nach Ertaubung verzögert einsetzenden chronischen Behandlung mit einer minimierten BDNF-Dosis von 50 ng/ml und zeitgleicher elektrischen Stimulation auf das
Überleben der Spiralganglienzellen.
32
3
Zielsetzung
Entsprechend der dargestellten Sachverhalte ergeben sich für die vorliegende Arbeit
folgende Zielsetzungen:
ƒ
Histologische Untersuchung der Effekte einer verzögerten GDNF-, BDNF- und
Dexamethason-Applikation sowie monopolaren oder bipolaren elektrischen Stimulation auf die Spiralganglienzellen ertaubter Meerschweinchen
ƒ
Elektrophysiologische Untersuchung möglicher synergistischer Effekte einer
Kombination aus GDNF oder BDNF und elektrischer Stimulation auf die Funktionalität der SGZ nach Ertaubung
ƒ
Untersuchung möglicher synergistischer Effekte einer Kombination aus GDNF
oder BDNF und elektrischer Stimulation auf das Überleben der Spiralganglienzellen nach Ertaubung
ƒ
Histologische Untersuchungen bezüglich einer möglichen Reduktion von Bindegewebsbildung nach Insertion eines Cochlea-Implantats durch Dexamethason
ƒ
Untersuchung des Einflusses einer Dexamethason-Applikation auf mögliche
protektive Effekte der elektrischen Stimulation auf Spiralganglienzellen
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit könnten die tierexperimentelle Grundlage für
eine anzustrebende humane Anwendung der Interventionsmodelle schaffen.
33
4
Material und Methoden
4.1
Material
4.1.1 Versuchstiere
Als Versuchstiere wurden Meerschweinchen gewählt, da für diese Spezies
standardisierte, operative Zugänge zum Innenohr bestehen und sich die anatomischen
Dimensionen als günstig für mikrochirurgische Eingriffe erwiesen haben. Zudem
existieren für diese Tierart etablierte Methoden zur systemischen Ertaubungen und es
liegen bereits Untersuchungen über FAEP vor, so dass Vergleichswerte für die eigenen
Untersuchungen zur Verfügung standen.
Für die Untersuchungen wurden männliche Meerschweinchen des BFA-Stammes mit
einem Anfangsgewicht von ca. 250 g bis 450 g verwendet. Die Tiere stammen aus der
Zucht der Charles River WIGA GmbH, Sulzfeld. Die Verwendung der Tiere zu
wissenschaftlichen
Zwecken
wurde
vom
Niedersächsischen
Landesamt
für
Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit genehmigt (Tierversuchsanträge 02/558,
04/913 und 04/914). Die Studie wurde in Übereinstimmung mit dem Deutschen
Tierschutzgesetz und mit der Richtlinie 86/601/EEC des Rates der europäischen
Gemeinschaft zum Schutz der für experimentelle Zwecke verwendeten Tiere
durchgeführt.
Der Hörstatus der Tiere, welche in der vorliegenden Studie eingesetzt wurden, war bei
allen Tieren einheitlich. Es handelt sich um normal hörende Meerschweinchen
(Hörschwelle < 50 dB). Dies wurde vor dem eigentlichen Experiment durch Ableitung
akustisch evozierter Hirnstammpotentiale überprüft. Alle Versuche fanden in
Operationsräumen des Zentralen Tierlabors der Medizinischen Hochschule Hannover
statt.
4.1.1.1
Tierhaltung
Die Meerschweinchenhaltung erfolgte in den Räumlichkeiten des Zentralen Tierlabors
der Medizinischen Hochschule Hannover und entsprach der EG-Richtlinie für die
Haltung
von
Versuchstieren
der
Länder
der
Europäischen
Union.
Die
Lebensbedingungen waren für alle Versuchstiere identisch. Die Tiere wurden in
34
Dreiergruppen beziehungsweise post implantationem einzeln in Typ 4 Makrolon®Käfigen (Uno Roestvaststaal B.V., Zevenaar, Holland) auf einer Standardeinstreu bei
Raumtemperatur und 55 ± 5% relativer Luftfeuchtigkeit bei einem täglichen hell/ dunkel-Zyklus von jeweilig 12 Stunden gehalten. Sie erhielten ein Trockenpelletfutter
(Ssniff®, Spezialdiäten GmbH, Soest) sowie Heu und Trinkwasser ad libitum.
4.1.1.2
Versuchsgruppen
Die Gesamtzahl von 49 Versuchstieren setzt sich aus 9 Gruppen zusammen, wobei alle
Tiere systemisch ertaubt und 21 Tage später linksseitig implantiert wurden. Eine zusammenfassende Darstellung der unterschiedlichen Experimentalgruppen findet sich in
Tabelle. 1. Die Benennung der Gruppen erfolgte aufgrund von mir eingeführter Abkürzungen, welche auf der jeweils angewendeten Intervention basierten.
4.1.1.2.1 AP-Gruppe
Diesen Tieren wurde ein monopolares Elektroden-Mikropumpensystem implantiert. Sie
wurden nicht stimuliert. Durch das Mikropumpensystem wurde artifizielle Perilymphe
(AP) in die Cochlea appliziert.
4.1.1.2.2 AP+ES(M)-Gruppe
Die dieser Gruppe zugehörigen Tiere wurden von Tag 24 bis 48 durch ein monopolar
wirkendes Elektroden-Mikropumpenmodell elektrisch stimuliert. In die Cochlea wurde
artifizielle Perilymphe eingeleitet.
4.1.1.2.3 GDNF-Gruppe
Durch ein monopolares Prothesen-Modell wurde den Tieren dieser Versuchsgruppe
glial cell line-derived neurotrophic factor ins Innenohr appliziert. Eine elektrische Stimulation fand nicht statt.
4.1.1.2.4 GDNF+ES-Gruppe
Die Tiere dieser Gruppe wurden mittels eines monopolar wirkenden ElektrodenMikropumpensystem mit GDNF und intracochleärer elektrischer Stimulation versorgt.
4.1.1.2.5 BDNF-Gruppe
Brain-derived neurotrophic factor wurde mittels eines bipolaren ElektrodenMikropumpensystems intracochleaer appliziert.
35
4.1.1.2.6 BDNF+ES-Gruppe
Auch in dieser Gruppe wurde BDNF appliziert. Zusätzlich erfolgte eine bipolare intracochleaere elektrische Stimulation.
4.1.1.2.7 AP+ES(B)-Gruppe
Den Tieren dieser Gruppe wurde artifizielle Perilymphe ins Innenohr geleitet. Gleichzeitig erfolgte eine bipolare elektrische Stimulation.
4.1.1.2.8 DEX-Gruppe
Ein monopolar designtes Elektroden-Mikropumpensystem leitete Dexamethason ins
Innenohr.
4.1.1.2.9 DEX+ES-Gruppe
Diese Tiere wurden zeitgleich mittels Dexamethason und monopolarer elektrischer Stimulation behandelt.
Tabelle 1: Übersicht über die Versuchsgruppen und ihre Benennung in dieser Dissertation, die
Tierzahlen, die Wirkungsweise der verwendeten Elektroden-Mikromumpensysteme, die applizierte Substanz und die elektrische Stimulation
Experimentelle Konditionen
Versuchsgruppe/
Benennung,
Ertaubung
ElektrodenMikropumpensystem
Substanz
Elektrische
Stimulation
AP, n=7
ja
monopolar
AP
nein
AP+ES(M), n=6
ja
monopolar
AP
ja
GDNF, n=6
ja
monopolar
GDNF
nein
GDNF+ES, n=5
ja
monopolar
GDNF
ja
BDNF, n=6
ja
bipolar
BDNF
nein
BDNF+ES, n=5
ja
bipolar
BDNF
ja
AP+ES(B), n=3
ja
bipolar
AP
ja
DEX, n=6
ja
monopolar
DEX
nein
DEX+ES, n=5
ja
monopolar
DEX
ja
Tierzahl
36
4.1.2 Pharmaka
a) Atropinsulfat (0,5 mg/ml), Atropinsulfat Braun 0,5 mg®; B. Braun Melsungen AG,
Melsungen
b) Carprofen (50 mg/ml), Rimadyl®, 20 ml; Pfizer GmbH, Karlsruhe
c) Ethacrynsäure (50 mg), Edecrin®; Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, New Jersey, USA
d) Isotone Natriumchloridlösung, 0,9% (20/10/5 ml); Fa. B. Braun Melsungen AG,
Melsungen
e) Lactobacillen (Lactobacillus (L.) fermentum, L. casei, L. plantarum, L. acidophilus,
je 60 mg) und Streptococcus faecium (60 mg), Bird Bene-Bac®; A. Albrecht GmbH
& Co., Aulendorf
f) Kanamycinsulfat (333 mg/ml), Kanamycin Injection, USP®; American Pharmaceutical Partners, Inc., Schaumburg, IL, USA
g) Ketaminhydrochlorid (115,3 mg/ml), Ketamin Gräub®10%; A. Albrecht GmbH &
Co., Aulendorf
h) Prilocainhydrochlorid (20 mg/ml), Xylonest® 1%; AstraZeneca GmbH, Plankstadt
i) Sulfamethoxazol (200 mg) und Trimethoprim (40 mg), Cotrim K-ratiopharm® Saft;
ratiopharm GmbH, Ulm
j) Thilo-Tears® Gel; Alcon Pharma (Dr. Thilo) GmbH, Freiburg i. Breisgau
k) Xylazin-Hydrochlorid
(23,32
mg/ml)
und
p-Hydroxybenzoesäuremethylester
®
(1 mg/ml) in Natriumchloridlösung, Rompun 2%; Bayer Vital GmbH, Leverkusen
4.1.3 Chemikalien zur Verwendung während der Operationen
a) Carboxylatzement, Durelon®; ESPE Dental AG, Seefeld
b) Polymethylmethacrylat, Meta Fast Resin® Puder und Lösung; J. Morita Europe
GmbH, Dietzenbach
4.1.4 Technische Geräte mit Anwendung am Tier
a) AABR-Messeinheit: Die Ableitung der akustisch evozierten Hirnstammpotentiale
(acoustically evoked auditory brainstem response, AABR) erfolgte mit Hilfe der
BERA-Messeinheit Nicolet Viking IV (Version 4.4) der Firma Nicolet Biomedical
(Madison, Wisconsin, USA). Diese Messeinheit besteht aus mehreren HardwareKomponenten: einem Personal-Computer (PC) mit einem integriertem Signalgene-
37
rator, einem integrierten Verstärker, einem EA 101 Vorverstärker, einem
Analog/Digital-Wandler, einem Bandpassfilter und einem Farbmonitor. Eine
Multifunktions-Bedienkonsole, eine deutsche Standardtastatur und eine „PC-Maus“
dienten der Menüführung. Zusätzlich war das System mit einer Analysesoftware zur
Auswertung der akustisch evozierten Potentiale ausgestattet. Lautsprecher (Nicolet
TIP-300 Tubal Insert Phone, Nicolet) und
Ableitelektroden (Subdermal EMG
Needle Electrodes, 12 mm, Medtronic Xomed, Jacksonville, Florida USA) wurden
extern an die Messeinheit angeschlossen.
b) EABR-Messeinheit: Der Messaufbau zur Ableitung der elektrisch evozierten
Hirnstammpotentiale (electrically evoked auditory brainstem response, EABR)
bestand aus einem modifizierten Aufbau für die Messung von akustisch evozierten
Potentialen. Die Generierung der elektrischen Pulse erfolgte durch die Nicolet
Viking IV Messeinheit in Kombination mit einem Pulsgenerator (TGP 110 10MHz
Pulse Generator, Thurlby Thandar instruments, Huntingdon, England). Diese zwei
Geräte ermöglichten die Generierung monophasischer Pulse. Eine in den Zentralen
Forschungswerkstätten der Medizinischen Hochschule Hannover hergestellte
„Biphasische Box“ diente zur Umwandlung der monophasischen Stimuli in
biphasische Reize und ermöglichte zusätzlich die Einstellung der Stimulusintensität
zwischen
0 und 1 mA. Die Biphasische Box wurde über ein Kabel mit dem
Konnektor des Elektroden-Mikropumpensystems verbunden. Die evozierten
Potentiale wurden mittels isolierter Verbindungskabel von den Ableitschrauben
(s. 4.2.3) der Meerschweinchen zum Verstärker des Messsystems geleitet. Zur
Messung, Darstellung und Aufzeichnung der Potentialdifferenzen bei elektrischer
Stimulation diente wiederum die Nicolet-Messapparatur.
c) Portabler Stimulator: Da die Tiere 24 Stunden am Tag, für eine Dauer von 24
Tagen, elektrisch stimuliert werden, befindet sich der Stimulator am Tier. Mittels
einer Verankerungsschraube am Tier und eine Bohrung in der Bodenplatte des
Stimulators ist das Gerät am implantierten Tiere fixierbar und die Tiere können sich
weiterhin frei bewegen. Dieser, zum kontinuierlichen Tragen geeigneten, Stimulator
wurde uns freundlicherweise vom Kresge Hearing Research Institute, The
University of Michigan, Ann Arbor, Michigan, USA zur Verfügung gestellt. Durch
vier 3 V Batterien betrieben (10.2.), generiert der Stimulator bei einer Frequenz von
250 Hz 100 µs dauernde Rechteckimpulse wechselnder Polarität. Die Stimulusintensität ist zwischen 50 µA und 1000 µA justierbar.
38
d) Wärmebett, bestehend aus Badthermostat Thermostat C10 der Fa. Thermo Haake,
Karlsruhe, und Liegefläche, hergestellt in den Zentralen Forschungswerkstätten der
Medizinischen Hochschule Hannover.
e) Stativmikroskop OPMI-6-M, Fa. Carl Zeiss
f) Kautereinheit: Elektrochirurgiegerät Erbotom T175E, Fa. Erbe, Tübingen; Bipolare
Koagulationspinzette, abgewinkelt und dazugehöriges Kabel, Fa. Medicalis,
Garbsen
g) Bohrsystem Storz Unidrive II plus, Fa. Storz,
h) Haarschneidemaschine ECO-black M, Tondeo Werk GmbH, Solingen
4.1.4.1
Die Elektroden-Mikropumpensysteme
In dieser Studie wurden zwei Elektroden-Mikropumpensysteme unterschiedlicher
Hersteller verwendet. Beide Modelle bestanden aus einer aktiven Elektrode, einer
Referenzelektrode, einem Verbindungsstück für die elektrische Stromzufuhr (so
genannter Konnektor) und einem Silikonschlauch an welchem die Mikropumpe befestigt wurde.
4.1.4.1.1 Das monopolare Elektroden-Mikropumpensystem
Die aktive Elektrode und die Referenzelektrode der von der Fa. MedEl GmbH,
Innsbruck, Österreich, hergestellten Elektroden-Schlauch-Kombination verlaufen
getrennt (Abb. 5) und werden in der Cochlea und im Mittelohr positioniert. Somit
handelt es sich um ein monopolares Modell. Die aktive Elektrode besteht aus einem
50 µm starkem Platin-Iridium(Pt-Ir)-Draht, welcher an einem Ballkontakt (0,25 mm
Durchmesser) endet. Der Draht ist von einer Silikonschicht (0,60 mm Durchmesser)
ummantelt in welcher auch ein Medikamentenkanal von 150 µm Durchmesser verläuft.
Kanal und Elektrode separieren sich am perkutanen Konnektor, an welchem der Draht
endet und der Silikonschlauch zur Pumpenbefestigung beginnt. Dieser hat einen
Außendurchmesser von 1,2 mm und einen Innendurchmesser von 0,6mm. Ein
unisolierter Pt-Ir-Draht von 150 µm Stärke dient als Referenzelektrode.
4.1.4.1.2 Das bipolare Elektroden-Mikropumpensystem
Dieses Elektrodenmodell besteht aus sechs jeweils 0,3 mm breiten, ringförmigen
Pt-Ir-Elektrodenkontakten, welche sich in einem Abstand von jeweils 0,4 mm an der
Elektrodenspitze befinden. Der erste und vierte Kontakt sind durch einen 0,4 mm
dicken teflonisolierten Pt-Ir-Draht mit einem Steckkontakt, dem Konnektor, verbunden.
39
Da beide aktiven Kontakte intracochleaer platziert werden handelt es sich um ein
bipolares Elektrodenmodell. Die Elektrodendrähte sind in einem Silikonträger
eingebettet, dessen Außendurchmesser 0,2032 mm beträgt. Im Inneren des Silikons
befindet sich ein Medikamentenkanal mit einem Durchmesser von 0,12 mm welcher an
der Elektrodenspitze endet. Elektrodendrähte und Medikamentenkanal separieren sich
20 mm von der Elektrodenspitze entfernt (Abb. 6). Dieses Elektroden-Mikropumpensystem wurde von der Fa. Cochlear Ltd., Sydney, Australien, hergestellt.
A
1
Referenzelektrode
B
aktive Elektrode
4
Konnektor
Osmotische Pumpe
3
Silikonschlauch
C
5
9
1
2
3
1
Flow Moderator
D
1
Abb. 5: Darstellung des monopolaren Elektroden-Mikropumpensystems der Firma
MedEl. A: Elektroden-Mikropumpensystem mit osmotischer Pumpe und dem beide
Komponenten verbindenden Flow Moderator. B: Endstück der aktiven Elektrode.
C: Mittelstück der aktiven Elektrode und Applikationskanal im Silikonmantel.
D: Ventralansicht des Konnektors. Erläuterungen: 1: aktive Elektrode; 2: Massedraht;
3:
150
µm-Medikamentenkanal;
5: Silikonmantel.
4:
Kanalöffnung,
B
1
mm
vor
2
Kugelkontakt,
40
Abb. 6: Darstellung des bipolaren Elektroden-Mikropumpensystems der Firma Cochlear. A: Elektroden-Mikropumpensystem. B: Endstück der Elektrode mit den 6 Kontakten (2). C: Elektrodenspitze mit der Pt-Ir-Elektrode (1), den Kontakten (2), dem Medikamentenkanal (3), der Kanalöffnung (4) und dem Silikonmantel (5). D: Ventralansicht
des Konnektors.
4.1.4.2
Die Mikropumpen
Die osmotichen Pumpen (Alzet® mini-osmotic pump, model 2002, Durect Corporation,
Cupertino, CA, USA) weisen eine Infusionsrate von 0.5 µl/Std. für eine Dauer von 14
Tagen auf. Mittels eines als Flow Moderator bezeichneten Verbindungsteils werden die
Pumpen am Silikonschlauch der Elektroden befestigt (Abb. 5).
4.1.5 Reagenzien, Laborbedarf, Verbrauchsmaterialien und Geräte zur
Gewinnung und Aufarbeitung der Cochlea sowie zur
Spiralganglienzellauswertung
Ein Verzeichnis der verwendeten Lösungen, Reagenzien (10.1) und Geräte (10.3) sowie
des verwendeten Laborbedarfs inklusive aller Verbrauchsmaterialien (10.2) findet sich
in Tabellenform im Anhang.
41
4.2
Methoden
Alle Messungen und Eingriffe (Abb. 7) an Tieren fanden unter Anästhesie statt. Den
Tieren wurde initial 40 mg Ketamin/kg Körpergewicht (KGW) in Kombination mit
10 mg Xylazin/ kg KGW intra muskulär (i.m.) verabreicht. Zur Erhaltung wurde die
halbe Ursprungsdosis verwendet. Eine Mischspritze bestehend aus 1,5 ml Ringer Lactat
oder Natrium Chlorid (NaCl)/ 100 g KGW, 0,05 ml Atropin/kg KGW und 0,1 ml
Carprofen/kg KGW sub cutan (s.c.) injiziert diente als Flüssigkeitsdepot, zur Minderung
muköser Sekretion und zur Analgesie. Die Tiere wurden auf einem Wärmebett platziert,
welches die Körpertemperatur bei 37-38° Celsius hielt.
Unmittelbar nach der Messung der akustisch evozierten Potentiale (AABR, s. 4.2.1) zur
Festlegung der Ausgangshörschwelle wurden die Meerschweinchen am Tag 0 systemisch ertaubt (s. 4.2.2). Der Erfolg der Ertaubung wurde mit Hilfe einer erneuten
AABR-Messung 5 Tage später verifiziert (s. 4.2.1).
Am 21. Tag nach der Ertaubung erfolgte die linksseitige Implantation aller Tiere mit
einem Elektroden-Mikropumpensystem, an welches eine osmotischen Pumpe zur intracochleären Freisetzung der neurotrophen Faktoren (GDNF und BDNF) bzw. DEX oder
AP adaptiert wurde (s. 4.2.3). Durch eine intraoperative Messung elektrisch evozierter
Potentiale (EABR) wurde die korrekte Lage der implantierten Elektroden bestätigt und
die elektrische Hörschwelle der Tiere bestimmt (s. 4.2.4).
Bei allen Tieren wurde am Tag 34 und 48 eine erneute AABR-Messung durchgeführt.
Am Tag 34 fand außerdem bei allen Tieren ein Pumpenwechsel statt (s. 4.2.5). Die zur
elektrischen Stimulation bestimmten Tiere wurde ab dem 24. Versuchstag mit einem
portablen Stimulator versorgt und kontinuierlich 8 dB oberhalb der an Tag 21 bestimmten EABR-Hörschwelle stimuliert. Am 28., 34., 41. und 48. Tag wurden bei diesen
Tieren weitere AABR- und EABR-Messungen durchgeführt, um die Stimulatoren an
etwaige Hörschwellenänderungen anzupassen.
Alle Tiere wurden am 48. Versuchstag getötet. Die Cochleae wurden beidseits entnommen und für die histologische Untersuchung bearbeitet. Die Ergebnisse der rechten und
linken Cochlea eines jeden Tieres sowie die Ergebnisse der Cochleae der einzelnen
Gruppen wurden miteinander verglichen und statistisch ausgewertet.
42
Abb. 7: Zeitschema zur Darstellung des Versuchsablaufes. Die obere Zeitskala
bezieht sich auf nicht elektrisch stimulierte Tiere, die untere auf elektrisch stimulierte Tiere. Die sich zwischen den beiden Zeitskalen befindenden Beschriftungen betreffen alle Versuchsgruppen. Die unteren Beschriftungen beziehen sich
nur auf elektrisch stimulierte Tiere.
4.2.1 Messung akustisch evozierter Hirnstammpotentiale
(acoustically evoked auditory brainstem response (AABR))
Nadelelektroden wurden subdermal am Vertex (aktiv), am rechten und linken Mastoid
(Referenz) und in der rechten Kniefalte (Erde) platziert. Die neuralen Aktivitäten
wurden durch einen EA101 Vorverstärker geleitet und ein Viking IV Signal Analyser
diente zur Aufnahme, Auswertung und Darstellung der Messungen (s. 4.1.2.5.a)). Es
wurden biphasische Click Stimuli mit einer Wiederholungsrate von 10 Hz und 100 µsec
Dauer präsentiert (INGHAM et al. 1998). Die obere und untere Grenzfrequenz betrugen
100 Hz und 3 kHz. Die Strompulse wurden mit Hilfe von Ohrhörern, welche im
äußeren Gehörgang platziert wurden, in akustische Signale umgewandelt. Um die
Hörschwelle zu bestimmen wurden die Stimuli von 60 dB SPL absteigend zunächst in
Intensitätsstufen von 10 dB SPL, um die Hörschwelle herum in 5 dB SPL Schritten,
dargeboten. Die Hörschwelle wurde definiert als die niedrigste Stimulusintensität,
welche reproduzierbare AABRs mit einer Amplitude von mindestens 0.5 µV Amplitude
evozierte (YAMAGATA et al. 2004). Abbildung 8 zeigt beispielhaft die Methode zur
Bestimmung der akustischen Hörschwelle.
43
Das kontralaterale Ohr wurde durch die Präsentation weißen Rauschens, jeweils 30 dB
SPL unter dem entsprechend verwendeten Click-Stimulus, vertäubt. Die AABRMessungen wurden bei allen Tieren an den Tagen 0, 5 oder 6, 21, 34 und 48 vorgenommen. Die akustische Hörschwelle der elektrisch stimulierten Tiere wurde zusätzlich
am 28. und 41. Tag nach der Ertaubung bestimmt. Um in den Versuch mit einbezogen
zu werden mussten die Tiere normal hörend sein. Dies hieß, ihre durch AABR-Messung
bestimmte Ausgangshörschwelle musste am Tag 0 vor der Ertaubung ≤ 50 dB SPL
betragen (KANO u. STARR 1987; MITCHELL et al. 1997).
Abb. 8: Auszug aus einer am Versuchstag 0 durchgeführten AABR-Messung (Tier
B25) zur Veranschaulichung der Bestimmung der akustischen Hörschwelle. Es sind die
ersten 10 ms nach Stimulusgabe gegen die Stimulusamplitude (0,5 µV) dargestellt. Die
Reizintensitäten sind rechts der jeweiligen Ableitung beschrieben. Die Bestimmung der
Hörschwelle erfolgte aufgrund der Amplitude der 3. Welle. Es zeigt sich deutlich, dass
die Amplitude der 3. Welle mit sinkender Stimulusintensität abnimmt. Bei einer Stimulation mit 30 dB SPL ist noch eine 0,5 µV große Amplitude zu erkennen, bei 25 dB SPL
hingegen nicht. Somit lag die akustische Hörschwelle dieses Tieres bei 30 dB SPL.
Verzögerung: 0ms.
44
4.2.2 Ertaubung von Meerschweinchen
Um die Ausgangssituation eines Cochlea-Implantat-Patienten mit sensorineuralem
Hörverlust modellhaft darstellen zu können, muss eine gezielte Zerstörung der
Haarzellen im Versuchstier gewährleistet sein. Es sind einige Methoden entwickelt
worden, um einen schnellen und totalen Hörverlust bei Meerschweinchen zu erreichen.
Aminoglykosidantibiotika sind bekannt für ihr hohes ototoxisches Potential. Einen
wirkungsvollen Vertreter dieser Gruppe stellt das Kanamycin dar. WEST et al. (1973)
konnten nachweisen, dass eine Kombination Kanamycins mit dem Schleifendiuretikum
Ethacrynsäure, welches mit einer Latenz von 2 Stunden verabreicht werden soll,
innerhalb von 2 Std. zur permanenten Zerstörung fast aller Haarzellen führt.
Für die Ertaubung der Tiere wurden 400 mg Kanamycin/kg KGW s.c. injiziert. Nach
einer Stunde wurden die Tiere narkotisiert (s. 4.2), die akustische Hörschwelle bestimmt
(s. 4.2.1) und die Tiere für die Operation vorbereitet. Zunächst wurde ein linksseitiger
paramedianer Hautschnitt an der ventralen Halsseite vorgenommen, die Halsmuskulatur
den anatomischen Strukturen folgend stumpf durchtrennt und die externe Vena (V.)
jugularis vorgelagert. Um das Gefäß wurden drei Schlaufen aus resorbierbarem
Nahtmaterial gelegt. Der herzwärtsgelegene Faden wurde legiert während die zwei
übrigen locker als Schlaufen um das Gefäß verblieben. Unter mikroskopischer Sicht
(10.3) wurde mittels einer feinen chirurgischen Schere (10.2) oberhalb der Legierung
eine feine Venotomie durchgeführt, durch welche ein Silikonschlauch (10.2) ca. 1,5 cm
in craniale Richtung in die V. jugularis eingeführt wurde. Das Gefäß wurde durch
sanftes Anziehen der mittleren Schlaufe um den Schlauch fixiert und die richtige
Positionierung des Schlauches durch eine mit NaCl gefüllte Spritze überprüft. Floß bei
Aspiration das Blut ohne jegliche Behinderung in den Schlauch bzw. floss bei Injektion
keine Flüssigkeit neben das Gefäß, so lag der Schlauch optimal in der Vene.
Anschließend wurde die NaCl-Spritze durch die Ethacrynsäure enthaltende Spritze
ersetzt und 40 mg/kg KGW des Diuretikums langsam intra venös appliziert. Zum
durchspülen des Schlauches wurde anschließend wiederum die NaCl-haltige Spritze
verwendet. Nach erfolgter Applikation wurde der Schlauch soweit zurückgezogen, dass
seine Öffnung zwischen mittlerer und cranialer Schlaufe lag. Die oberste Schlinge
wurde straff zugezogen und der Schlauch vollständig entfernt. Anschließend wurde die
mittlere Ligatur entfernt, das Gefäß unter Sichtkontrolle zurückgelagert, die Muskulatur
45
mit resorbierbarem Nahtmaterial (10.2) mittels Einzellheften verschlossen und die Haut
mit nichtresorbierbarem Nahtmaterial (10.2) adaptiert.
4.2.3 Elektroden- und Pumpen-Implantation
Am Vortag der Implantationsoperation wurden die osmotischen Pumpen steril mit der
jeweils anzuwendenden Lösung (10.4.1-10.4.4) befüllt.
Der durch MITCHELL et al. (1997) beschriebenen Operationsmethode folgend wurden
drei als epidural ableitende Elektroden fungierende Schrauben (M2x4 mm, 10.2) und
drei Schrauben zur Befestigung der Stimulatorhalterung implantiert (Abb. 9). Eine
medial einen cm caudal des Bregmas positionierte Schraube diente als aktive Elektrode.
Einen cm rostral des Bregmas in der Medianen wurde die Referenzelektrode befestigt.
Die zweite aktive Elektrode befand sich sinistral einen cm lateral des Bregmas. Zur
Fixierung der gegenläufigen Schraube (M3x12mm, 10.2), welche als Halterung des
Stimulators diente, wurden drei 2 x 8mm Zylinderschrauben (10.2) triangelförmig um
den Medialpunkt des Bregmas positioniert (Abb. 9). Eine zwischen den Schulterblättern
liegende subkutane Tasche wurde gefertigt und diente zur Aufnahme der osmotischen
Pumpe. Zur Freilegung der linksseitigen Bulla wurden die Haut und das Platysma
postaurikulär inzisiert, die Muskulatur nach kaudal verlagert und der mastoidale Anteil
des M. sternocleidomastoideus von seinem Ursprung entfernt. Die Bulla wurde von
ihrem Periost befreit, das Mittelohr mittels einer 11er Skalpellklinge (10.2) eröffnet und
die Rundfenstermembran durch einen Mikrohaken (10.2) zerstört. Sowohl Konnektor
als auch Silikonschlauch der Elekroden-Mikropumpen-Konstruktion wurden durch
einen subkutanen Gang von postauriculaer in Richtung der dorsalen Schädeloberfläche
gezogen. Der Schlauch wurde, um eine Entlastung desselben zu gewährleisten, um die
einen cm posterior des Bregmas gelegene Schraube geführt. Die Pumpe wurde
angeschlossen und in der subkutanen Tasche zwischen den Scapulae positioniert
(BROWN et al. 1993). Alle Schrauben, der Schlauch und der Konnektor (in einer
Position, welche das spätere Einfügen des Stimulators ermöglichte) wurden mittels
Polymethylmethacrylat (4.1.3) auf der Schädeloberfläche befestigt (MITCHELL et al.
1997). Die Elektrode wurde unter mikroskopischer Sicht vorsichtig über die Rundfensteröffnung etwa 3 mm tief in die Scala tympani eingeführt. Aufgrund der
Flexibilität
des
Materials
konnten
beide
Modelle
entlang
der
natürlichen
Schneckenwindung gleiten. Im Falle des monopolaren Elektroden-Mikropumpensystems wurde die Referenzelektrode innerhalb der Bulla an deren Außenwandung
46
platziert. Zur Kontrolle der Funktionalität und
korrekten Positionierung der Elektrode
wurde eine intraoperative EABR-Messung durchgeführt. Die Elektrode wurde durch
den darauf folgenden Verschluss des Bulladefektes mittels Carboxylatzement (4.1.3)
fixiert. Die Wunde wurde in zwei Schichten geschlossen, wobei absorbierbarer Faden
für die Adaptation der Muskulatur und Nylonfaden zum Verschluss der Haut verwendet
wurden (10.2). Der Operation anschließend erfolgte eine erneute Messung der elektrischen Hörschwelle (4.2.4.)
Abb. 9: Schematische Darstellung der Schraubenpositionierung.
4.2.4 Messung elektrisch evozierter auditorischer Hirnstammpotentiale
(electrically evoked auditory brainstem response (EABR))
Die intracochleaere akute elektrische Stimulation der Tiere zur Bestimmung der elektrischen Hörschwelle fand direkt nach der Implantation der Elektrode sowie am 28., 34.,
41. und 48. Tag nach der Ertaubung statt. Die genaue Beschreibung der EABRMesseinheit erfolgt in 4.1.2.3 b).
Die monophasischen elektrischen Signale wurden durch den integrierten Signalgenerator der Messapparatur (Viking IV) erzeugt, getriggert und an den Frequenzgenerator
weitergeleitet. Durch die Triggerung konnte eine reizsynchrone Aufnahme und dadurch
die zeitliche Kopplung zwischen Reiz und Ableitung der Reizantwort hergestellt
47
werden. Durch den Frequenzgenerator war die Präsentation von 50 µsec dauernden
Strompulsen mit einer Wiederholungsrate von 50 Pulsen pro Sekunde (pulses per
second, pps) möglich. Eine „Biphasische Box“ diente der Umwandlung der monophasischen Pulse in biphasische Rechteckimpulse, zudem war an ihr die Stromstärke
zwischen 0-1 mA einstellbar. Die registrierten Antworten des Hirnstammes wurden
bezogen auf 500 präsentierte Stimuli gemittelt. Die Stimulusintensität wurde in 10 µA
Schritten verändert und so die elektrische Hörschwelle bestimmt. Als elektrische Hörschwelle wurde die niedrigste Stromstärke (µA) bezeichnet, welche eine Amplitude von
1 µV oder größer hervorrief (YAMAGATA et al. 2004). Abbildung 10 zeigt anhand
eines Tieres der BDNF+ES-Gruppe beispielhaft die mittels EABR-Messung ermittelten
Ableitungen sowie die bei diesem Tier messbare Verbesserung der Hörschwelle zwischen dem Tag der Implantation und dem Tag des Versuchsendes.
48
Abb. 10: Beispielhafte Darstellung der gemittelten Potentiale der am 21. (A) und 48.
(B) Versuchstag durchgeführten EABR-Messung (Tier 23) zur Veranschaulichung der
Hörschwellenbestimmung. Die bei unterschiedlichen Stromstärken (µA) gemittelten
Ableitungen sind gegen die Zeitdauer (ms) nach Stimulusgabe aufgetragen und zur
besseren Veranschaulichung je Messtag in einem Graphen dargestellt. Die jeweiligen
Stimulusintensitäten sind rechts neben der zugehörigen Ableitung angegeben. In Abbildung A ist bei einer Stimulation mit 230 µA bei 2 ms eine PIII Welle mit einer höheren Amplitude als 1 µV zu sehen, welche bei der Anwendung von 220 µA nicht zu beobachten ist. Somit liegt die elektrische Hörschwelle dieses Tieres nach Implantation bei
230 µA. 27 Tage später lässt sich bereits bei einer Stimulationsstärke von 140 µA eine
PIII Welle mit einer größeren Amplitude als 1 µV beobachten, welche bei der Anwendung von 130 µA noch nicht darstellbar ist. Somit liegt die EABR-Hörschwelle an diesem Tag bei 140 µA und hat sich gegenüber der Ausgangshörschwelle um fast 100 µA
verbessert.
49
4.2.5 Chronische elektrische Stimulation
Die chronische elektrische intracochleaere Stimulation der Tiere der AP+ES(M)Gruppe, der GDNF+ES-Gruppe, der BDNF+ES-Gruppe, der AP+ES(B)-Gruppe und
der DEX+ES-Gruppe durch einen portablen Stimulator (4.1.2.3 c)) begann drei Tage
nach der Implantationsoperation, um den Tieren eine Phase der Erholung zu gewähren.
24 Tage lang wurden den Tieren 250 biphasische spannungsstabilisierte Pulse pro
Sekunde mit einer Dauer von jeweils 100 µs pro Phase in einem 40 zu 60 Arbeitszyklus
(40% duty cycle) 8 dB oberhalb der am Tag 21 ermittelten elektrischen Hörschwelle
präsentiert (Abb. 11).
µA
4ms
100 µs
3800 µs
200 µs
4ms x 100 = 400ms
600ms
Abb. 11: Darstellung der Parameter der chronischen elektrischen Stimulation: Biphasische Rechteckpulse unterschiedlicher Intensität (0 - 1000 µA); Pulsbreite: 200 µs;
Reizfrequenz: 250 Hz; Stimulusburst: 4 ms; Interburstinterval: 600 ms.
An den Tagen 28, 34 und 41 fanden jeweils erneute EABR-Messungen statt. Im Falle
einer veränderten elektrischen Hörschwelle wurde der Stimulator neu justiert und der
neuen Reizschwelle des Tieres angepasst, so dass wiederum 8 dB oberhalb der
Hörschwelle stimuliert wurde.
Die Stimulatoren wurden jeweils auf einen 2 dB oberhalb der elektrischen
Hörschwellen liegenden µA-Wert eingestellt. Die Bestimmung der Hörschwelle erfolgte
bei einer Pulsbreite von 50 µs während mit einer Pulsbreite von 100 µs chronisch
50
elektrisch stimuliert wurde. Dies ergibt einen verdoppelten Ladungseintrag ins Gewebe,
der einer Stimulation mit verdoppelter Stromstärke bei gleich bleibender Pulsbreite
entspricht. Die Berechnung der um 8 dB erhöhten Stimulationsstärke erfolgte nach
folgender Gleichung: dB = 20 x log (Stromstärke/Hörschwelle), Stromstärke = 100,05 x
Hörschwelle. Hieraus ergibt sich nach obiger Formel eine Korrektur von 6 dB und
damit eine Stimulation von 8 dB oberhalb der Hörschwelle für alle Versuchsgruppen
mit elektrischer Stimulation.
4.2.6 Pumpenwechsel
Da die verwendeten Mikropumpen eine Applikationsdauer von 14 Tagen aufwiesen, die
Tiere jedoch 27 Tage mit Substanzen versorgt werden sollten, fand am 13. Tag nach der
Implantation ein Wechsel der Pumpen statt. Hierfür wurde am narkotisierten Tier ein
medianer Hautschnitt zwischen den Schulterblättern geführt, die Pumpe vorgelagert,
vom Applikationsschlauch getrennt und eine neue Pumpe befestigt. Diese wurde
subcutan in die Position der verbrauchten Pumpe gebracht und die Wunde wurde
dreischichtig verschlossen.
4.2.7 Gewinnung und Aufarbeitung der Cochleae
4.2.7.1
Transkardiale Perfusion
Am 48. Versuchstag wurden die Tiere anästhesiert (s. 4.2) und AABR- und
EABR- Messungen wurden durchgeführt. Nach nochmaliger i.m. Injektion einer vollen
Narkosedosis wurden die Tiere transkardial perfundiert. Ziel war es, einen
gleichmäßigen Strukturenerhalt und eine blutfreie Cochlea zu erreichen. Dem
betreffenden Tier wurden 10 ml Xylonest® s.c. entlang der nachfolgenden Schnittlinien
verabreicht: 1. median entlang der Linea alba bis zum Schlüsselbein, 2. in einem Bogen
von der Apertura thoraxis bis in die rechte Achselhöhle, 3. dem rechten letzen
Rippenbogen ca. 2 cm folgend. Zunächst wurde eine Thorakotomie durchgeführt, das
Herz freigelegt und der Herzbeutel eröffnet. Ein Schnitt in den rechten Vorhof
ermöglichte den Abfluss von Blut und Perfusionslösung (REUTER 1997). In die linke
Kammerwand wurde eine an ein Infusionsgerät angeschlossene Kanüle (10.2)
eingeführt über welche dem Herzen zunächst 200 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (phosphat buffered saline, PBS (10.4)) zur Ausspülung des Blutes aus dem
Kreislaufsystem zugeführt wurde. Anschließend wurde der Körper durch Zufuhr von
200 ml 5%igen Glutardialdehyds (GDA (10.1)) fixiert.
51
4.2.7.2
Pumpentest
Nach erfolgter Perfusion wurde die Haut oberhalb der Mikropumpe eröffnet. Die
korrekte Adaptation der Pumpe am Silikonschlauch wurde ebenso kontrolliert wie die
Färbung der Flüssigkeit im Schlauch.
Stichproben (n=22) der Mikropumpen wurden auf ihre Funktionalität untersucht. Hierfür wurde der Silikonschlauch 3cm vor der Pumpe durchtrennt. Mittels einer Kanüle
und einer Spritze wurde der Schlauch vom 0,5. bis 1. Zentimeter mit Mineralöl (10.1)
und vom 1. bis zum 2. Zentimeter mit Hämalaun-Lösung (10.1) gefüllt. Die Öffnung
des Schlauches wurde einen Zentimeter weit mit Öl verschlossen. Anschließend wurden
die Pumpen-Schlauch-Kombinationen in einem Glasbehälter in NaCl gelagert und in
einem Wärmeschrank bei 37°C aufbewahrt. Nach 12 Stunden wurde die Bewegung der
blauen Flüssigkeitsstrecke beurteilt. Hatte sich diese in Richtung der Schlauchöffnung
bewegt, so war die entsprechende Pumpe funktionell intakt. Alle getesteten Pumpen
wiesen volle Funktionalität auf.
4.2.7.3
Felsenbeinentnahme und Gewinnung der Cochleae
Der Fixierung folgten die Dekapitierung und die Abpräparation der Schädelhaut. Die
Schädeldecke wurde durch zwei Scherenschnitte (10.2) vom Hinterhauptsloch in Richtung rostral zu den caudalen Augenwinkeln hin gelöst und durch Umklappen nach
rostral entfernt. Nach Entfernung der Hirnanteile wurden die Felsenbeine manuell aus
dem Schädel heraus gebrochen und in PBS (10.4) überführt. Die weitere Dissektion
erfolgte unter einem Auflichtstereomikroskop (10.3) mittels feiner Uhrmacherpinzetten
(10.2). Dabei wurde zunächst das Felsenbein eröffnet und die Bullawand großflächig
entfernt. An den rechten Cochleae wurde sowohl das runde wie auch das ovale Fenster
mittels einer feinen Pinzette (10.2) zerstört. An den linken Cochleae wurde das ovale
Fenster eröffnet und die Elektroden wurden vorsichtig entfernt. Allen Cochleae wurde
eine kleine Öffnung in den Apex gebohrt. Anschließend wurden sie vom runden Fenster
aus in Richtung Apex mit 4% GDA vorsichtig durchgespült, in 4%iges GDA überführt
und für 24 Stunden bei 4°C im Dunkeln fixiert.
4.2.7.4
Aufbereitung der Cochleae für die lichtmikroskopische Untersuchung
Im Anschluss an den Fixationsvorgang wurden die Cochleae mindestens 1 Stunde bei
Raumtemperatur auf einem Schwingtisch (10.3) in einer 20%igen Tri-Natriumcitrat
Pufferlösung (10.4) gespült, wobei die Flüssigkeit nach Bedarf, aber mindestens 3 Mal,
52
erneuert wurde. Zur Entkalkung wurden die Cochleae bei Raumtemperatur in Entkalkungslösung (10.4) gelagert welche täglich gewechselt wurde. Die Verweildauer war
vom jeweiligen Verknöcherungsgrad abhängig und betrug ungefähr 2 Wochen. Erneute
Zugabe von Spülpuffer und eine Einwirkzeit von einer Stunde auf dem Schwingtisch
beendeten die Entkalkung. Die Entwässerung erfolgte durch eine aufsteigende Alkoholreihe: 50%iges, 70%iges, 90%iges und 100%iges Ethanol, wobei die einzelnen Konzentrationen jeweils 2 Std. einwirkten. Über Nacht erfolgte die Einwirkung reinsten
Methylbenzoats (10.1). Am darauf folgenden Tag wurde das Methylbenzoat verworfen
und die Einbettung der Präparate in Paraffin erfolgte: die Cochleae wurden mit flüssigem Paraffin durchtränkt und über Nacht im 65°C warmen Trockenschrank belassen.
Nachfolgend wurden sie mit senkrecht stehender Schneckenachse in Einbettschälchen
gestellt, welche mit Paraffin ausgegossen wurden. Die Paraffin-Cochlea-Blöcke erkalteten bei Zimmertemperatur und wurden bei – 21°C gelagert.
4.2.8 Schneiden und Färben der Cochleae
Die Paraffin-Cochlea-Blöcke wurden aus ihren Schälchen herausgelöst und auf kleine
Holzklötze aufgeschmolzen, welche in die Präparathalterung des Mikrotoms eingesetzt
wurden. Serienschnitte mit einer Stärke von 5 µm wurden angefertigt. Die Schnittrichtung wurde senkrecht zur Modiolusachse gewählt. Alle Schnitte wurden auf Objektträger aufgezogen und über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet.
Die beschickten Objektträger wurden nach folgendem Hämalaun/Eosin-Färbeschema
weiterbehandelt:
1. Xylol
2x 5 min
2. Carbol-Xylol
5 sec.
3. 100% Ethanol
5 min
4. 90% Ethanol
5 min
5. 70% Ethanol
5 min
6. Aqua dest.
5 min
7. Hämalaun
6 min
8. Leitungswasser 8 min, anfangs wechseln
9. Eosin
2,5-3 min
10. Leitungswasser 5 min
11. 70% Ethanol
2,5 min
12. 90% Ethanol
2,5 min
13. 100% Ethanol
2,5 min
14. Carbol-Xylol
5 sec.
15. Xylol
2x 5 min
Nach der Färbung wurden die Schnitte mit Entellan® eingedeckelt und für mindestens
24 Stunden zum Trocknen unter einen Abzug gestellt.
53
4.2.9 Lichtmikroskopische Auswertung
Ein mitmodiolarer Schnitt wurde zufällig ausgewählt. Dieser erste Schnitt und jeder
fünfte nachfolgende Schnitt wurden analysiert. Insgesamt wurden je Cochlea 5 Schnitte
mit je 7 Querschnitten des Rosenthalschen Kanals für die quantitative Analyse der SGZ
herangezogen. Die Rosenthalschen Kanäle wurden entlang der Windung von basal nach
apikal als untere basale und obere basale Windung, als erste, zweite, dritte und vierte
mittlere Windung sowie als apikale Windung bezeichnet (Abb. 12). In jedem Paraffinschnitt wurde jeder Querschnitt des Rosenthalschen Kanals beurteilt.
Die Auswertung erfolgte unter Verwendung eines Mikroskops (10.3) und einer CCDCamera (10.3) mit angeschlossenem rechnergestütztem Bildbearbeitungssystem Analysis® (10.3). Zunächst erfolgte eine digitale Aufnahme jedes Rosenthalschen Kanals.
Deren Kontur wurde mittels des Bildverarbeitungsprogramms nachgezogen und die
jeweilige Fläche wurde computergestützt berechnet. Nachfolgend wurde die SGZ-Zahl
pro Querschnitt bestimmt (Abb.13).
Einschlusskriterien für die SGZ in die Zählung waren ein Neurondurchmesser von mindestens 12 µm und ein sichtbarer Nucleus, wobei keine Differenzierung zwischen Typ
I- und Typ II-SGZ (SPOENDLIN 1975) vorgenommen wurde. Aus der Fläche eines
Rosenthalschen Kanals und der sich darin befindenden SGZ-Anzahl wurde die SGZDichte berechnet, welche als Spiralganglienzellen pro 10.000 µm2 (SGZ/ 10.000 µm2)
angegeben wurde. Auf Grund von Variabilitäten beim Schneidevorgang waren im
apikalen Bereich der Cochlea nicht immer zuverlässige Flächenbestimmungen und
Messungen der SGZ-Zahl möglich. Daher wurden diese Werte mit denen der vierten
mittleren Windung kombiniert.
54
7
6
5
4
M
3
2
Sc. v.
1
Sc. t.
Abb. 12: Mitmodiolares Schliffbild einer Meerschweinchencochlea zur Erläuterung der
Benennung der Rosenthalschen Kanäle. 1: untere basale Windung; 2: obere basale
Windung; 3: erste mittlere Windung; 4: zweite mittlere Windung; 5: dritte mittlere
Windung; 6: vierte mittlere Windung; 7: apikale Windung; Sc. t.: Scala tympani; Sc. v.:
Scala vestibuli; M: Modiolus
55
Abb. 13: Beispielhafte Darstellung der computergestützten Auswertung der Spiralganglienzelldichte eines Rosenthalschen Kanals. Die rote Linie beschreibt die äußere
Grenze des Kanals welche manuell nachgezogen wurde. Das Analysis®-System errechnete die Fläche des mit der Markierung erfassten Bereichs (rechter oberer Bildbereich, in diesem Fall 23060,35 µm2). Wiederum manuell wurden die überlebenden Spiralganglienzellen durch Mausklick gekennzeichnet (rote Additionszeichen) und das
Computerprogramm errechnete bei Beendigung der Messung die Gesamtzahl der Nervenzellen (hier: 10 SGZ). Vergrößerung: 200fach.
56
4.2.10 Statistische Auswertung und Bindegewebsbeurteilung
Die statistische Auswertung der SGZ-Dichten erfolgte mittels GraphPad Prism®. Zunächst wurde eine Prüfung der Daten auf Normalverteilung durchgeführt. Nachfolgend
wurde der t-Test für abhängige Stichproben für die Analyse der SGZ-Dichten-Differenz
zwischen den behandelten linken und ertaubten, aber ansonsten unbehandelten rechten
Cochleae innerhalb der Tiere einer Gruppe herangezogen. Die Zelldichten der verschiedenen Gruppen wurden mittels eines multiplen Gruppenvergleiches mit Adjustierung
nach Bonferroni verglichen.
Das Bindegewebswachstum in der Scala tympani und dem assoziierten Mittelohr der
implantierten (= linken) Cochleae wurde anhand einer Skala von 0 (= kein Bindegewebe vorhanden) bis +++ (= maximale Ausprägung des Bindegewebes) beurteilt. Die genaue Aufschlüsselung wird unter 5.5.1. beschrieben.
57
5
Ergebnisse
5.1
Ergebnisse der AABR-Messungen
Akustisch evozierte Hirnstammpotential (AABR)-Messungen wurden bei allen Tieren
am 0., 5. oder 6., 21., 34., und 48. Versuchstag durchgeführt. Die Tiere der elektrisch
stimulierten Gruppen wurden am 28. und 41. Versuchstag zu zusätzlichen akustischen
Messungen herangezogen (Abb. 14).
An Tag 0 wurden die Ausgangshörschwellen aller Tiere vor dem Ertaubungseingriff
bestimmt. Die höchste gemessene Hörschwelle lag bei 50 dB, die niedrigste bei 25 dB.
Der Durchschnitt betrug 35 dB. Somit galten alle Experimentaltiere als normal hörend
und konnten in den Versuch einbezogen werden (KANO u. STARR 1987) (Abb. 14).
Der Erfolg der Ertaubung wurde am 5. oder 6. Versuchstag an allen Tieren exklusive
einem, welches von der Ertaubungsoperation noch nicht vollständig genesen war, verifiziert. Bei allen untersuchten Meerschweinchen erhöhte sich die Hörschwelle
(Abb. 14). Die geringste Zunahme betrug 60 dB, die höchste 100 dB. Im Mittel lag die
Hörschwellenzunahme bei 76 dB. Somit galten alle Tiere als ertaubt und konnten an
weiteren Versuchen teilnehmen (MITCHELL et al. 1997).
Vor der Implantation der Elektroden-Mikropumpensysteme an Tag 21 fand eine erneute
AABR-Messung statt (Abb. 14). Verglichen mit den vor der Ertaubung ermittelten Hörschwellen zeigten alle Tiere eine Erhöhung der individuellen Hörschwelle von mindestens 60 dB. Im Vergleich zur Messung am 5. Experimentaltag gab es bei 12 Tieren keine Veränderung der Hörschwelle. Eine Erhöhung war bei 16 Tieren zu beobachten und
20 Meerschweinchen zeigten eine Erniedrigung der akustischen Hörschwelle. Die Hörschwelle des an Tag 5 nicht gemessenen Meerschweinchens lag am 21. Versuchstag bei
110 dB. Die Ausgangshörschwelle dieses Tieres betrug 35 dB.
Die Hörschwelle aller elektrisch stimulierten Tiere erhöhte sich zwischen Tag 21 und
Tag 28 des Versuches um mindestens 5 dB (Abb. 14). Die AP+ES(B)-Gruppe zeigte
mit einer durchschnittlichen Hörschwellenerhöhung von 7 dB die geringste Steigerung,
die AP+ES(M)-Gruppe und die BDNF+ES-Gruppe lagen mit durchschnittlich 15 bzw.
17 dB Hörschwellenerhöhung im Mittelfeld und die DEX+ES-Gruppe und die
58
GDNF+ES-Gruppe zeigten mit einem Durchschnittswert von 24 bzw. 26 dB die größte
Zunahme.
AABR Hörschwellen (dB SPL)
125
100
75
AP
AP+ ES(M)
GD NF
GD NF+ ES
BD NF
BD NF+ ES
AP+ ES(B)
D EX
D EX+ ES
50
25
0
10
20
30
40
50
Versuchstag
Abb. 14: Darstellung der an den Versuchstagen 0, 5 oder 6, 21, 28, 34, 41 und 48 gemessenen durchschnittlichen akustischen Hörschwellen (Symbole) sowie der jeweiligen Standartfehler (vertikale Balken) aller Experimentalgruppen. Die Ausgangshörschwellen aller Tiere erhöhten sich nach Ertaubung (Tag 0) um mindestens 60 dB.
Auch nach der Implantation (Tag 21) zeigten alle Experimentalgruppen eine durchschnittliche Zunahme der Hörschwellen.
Am 13. Tag nach der Implantation (Versuchstag 34) zeigte sich, dass sich die Hörschwellen fast aller Mitglieder der Experimentalgruppen, verglichen zu den an Tag 21
gemessenen Schwellen, erhöht hatten (Abb. 15). Drei Tiere, aus jeweils verschiedenen
Versuchsgruppen, zeigten am 34. Versuchstag die gleiche HS wie am Tag der Implantation. Bei manchen Individuen erhöhte sich die HS um 5 dB, bei anderen um bis zu
40 dB. Im Durchschnitt lag die Hörschwellenerhöhung bei 19 dB.
59
Die Hörschwellen der Tiere der stimulierten Gruppen erhöhten sich in 10 Fällen, welche
auf alle GruppeN verteilt waren, zwischen Tag 28 und Tag 34 noch einmal. Bei 11 Tieren ließ sich am 34. Versuchstag die gleiche HS wie am 28. Tag messen. Je ein Mitglied
der AP+ES-Gruppe und der DEX+ES-Gruppe zeigte an Tag 34 eine Erniedrigung der
HS um 5 dB. Bei einem Tier der BDNF-Gruppe wurde am 34. Tag eine gegenüber der
Tag-28-Hörschwelle um 25 dB verminderte HS gemessen. Im Durchschnitt erhöhten
sich die Hörschwellen der AP+ES(M)-Gruppe (0,8 dB), der GDNF+ES-Gruppe (5 dB),
der AP+ES(B)-Gruppe (11 dB) und der DEX+ES-Gruppe (1 dB). Der Mittelwert der
Hörschwellen der BDNF+ES-Gruppe lag 4 dB unterhalb des an Tag 28 gemessenen
Durchschnittes (Abb. 15).
135
AABR Hörschwellen (dB SPL)
125
115
AP
AP+ ES(M)
GD NF
GD NF+ ES
BDNF
BDNF+ ES
AP+ ES(B)
DEX
DEX+ ES
105
95
20
25
30
35
40
45
50
Versuchstag
Abb. 15: Darstellung des Verlaufs der durchschnittlichen AABR-Hörschwellen (Symbole) und der jeweiligen Standardfehler (vertikale Balken) der unstimulierten Versuchsgruppen an den Versuchstagen 21, 34, und 48 sowie der stimulierten Versuchsgruppen an den Versuchstagen 21, 28, 34, 41 und 48. Bei allen Gruppen war nach der Implantation (Tag 21) eine Erhöhung der Hörschwelle zu beobachten.
60
Die an Tag 41 bei den elektrisch stimulierten Tieren durchgeführten AABR-Messungen
zeigten, dass es im Vergleich zu den am 34. Versuchstag ermittelten Hörschwellen, in
jeder Versuchsgruppe Tiere mit unveränderter HS, erhöhter HS und erniedrigter HS
gab. Der Vergleich der am 41. und 48. Versuchstag gemessenen Hörschwellen zeigt
einen ähnlich durchsetzten Verlauf (Abb. 15).
Der Vergleich der am 21. Versuchstag unmittelbar vor der Implantationsoperation gemessenen Hörschwellen mit den am 48. Tag gemessenen zeigte, dass sich die Schwellen fast aller Tiere erhöhten. Nur ein Tier der AP-Gruppe zeigte keine HS-Veränderung
und ein Tier der DEX-Gruppe zeigte eine Verbesserung um 5 dB. Durchschnittlich erhöhte sich die Hörschwelle bei den mit AP behandelten Tiere von Tag 21 bis Tag 48 um
20 dB, bei der AP+ES(M)-Gruppe um 15 dB, bei der GDNF-Gruppe um 23 dB, bei den
mit GDNF und ES behandelten Tieren um 30 dB, bei der BDNF-Gruppe um 17 dB, bei
der BDNF+ES-Gruppe um 14 dB, bei der AP+ES(B)-Gruppe um 18 dB, bei der DEXGruppe um 22 dB und bei der mit DEX und ES behandelten Gruppe um 24 dB (Abb.
15).
5.2
Ergebnisse der EABR-Messungen
Die Messungen der elektrisch evozierten auditorischen Hirnstammpotentiale (EABR)
wurden an den chronisch elektrisch stimulierten Tieren am 21., 28., 34., 41. und 48.
Versuchstag durchgeführt. In Ergänzung zu den Untersuchungen bezüglich des SGZÜberlebens unter GDNF-, BDNF- und DEX-Therapie in Kombination mit elektrischer
Stimulation wurden die Auswirkungen dieser Interventionsmethoden auf die elektrische
Hörschwelle (HS) untersucht. Verglichen wurde der Hörschwellenverlauf von Tieren
die artifizielle Perilymphe über 27 Tage intracochleaer appliziert bekamen und entweder
monopolar
(MedEl-Elektroden-Mikropumpensystem)
oder
bipolar
(Cochlear-
Elektroden-Mikropumpensystem) stimuliert wurden. Die elektrisch evozierten Hörschwellen der Tiere dieser Gruppen wurden zudem mit denen von solchen verglichen,
welche mittels eines MedEl-Implantats chronisch elektrisch stimuliert wurden und zeitgleich GDNF oder DEX intracochleaer appliziert bekamen oder bipolar stimuliert
wurden und zeitgleich BDNF verabreicht bekamen (Abb. 16). Normwert für die Beurteilung des Hörschwellenverlaufs jeder Versuchsgruppe waren die bei Implantation der
Elektrode für jede Versuchsgruppe ermittelten durchschnittlichen Ausgangshörschwellen (Tab.3)
61
Tabelle 3: Darstellung der durch Messung der elektrisch evozierten auditorischen
Hirnstammpotentiale (EABR) ermittelten mittleren Ausgangshörschwellen sowie Standardabweichungen der elektrisch stimulieren Versuchsgruppen. Die Mittelwerte der
Ausgangshörschwellen dienten als Normwerte zur Beurteilung der Entwicklung der
elektrischen Hörschwelle im Versuchsverlauf.
Versuchsgruppe
AP+ES(M)
GDNF+ES
DEX+ES
BDNF+ES
AP+ES(B)
Mittlere EABR-
158,3
251,7 ±
138,5
281,7 ±
99,08
288,3 ±
130,4
303,3
Hörschwelle
(µA) und Standardabweichung
± 27,87
±140,1
Wie Abbildung 16 zeigt, wiesen die Tiere der AP+ES(M)-Gruppe die niedrigsten Ausgangshörschwellen auf. Die Werte lagen bei allen 6 Tieren zwischen 120 und 190 µV
(Mittel: 158 µV). Die Ausgangshörschwellen der Mitglieder der GDNF+ES-Gruppe
lagen zwischen 110 und 510 µV (Mittel: 266 µV), die der BDNF+ES-Gruppe zwischen
230 und 530 µV (Mittel: 318 µV), die der AP+ES(B)-Gruppe zwischen 190 und 460 µV
(Mittel: 303 µV) und die der DEX+ES-Gruppe zwischen 180 und 290 µV (Mittel:
246 µV).
Sowohl die GDNF+ES-Gruppe als auch die AP+ES(B)-Gruppe zeigten im gesamten
Versuchsverlauf eine stetige Verringerung der durchschnittlichen elektrischen Hörschwelle. Die mittlere HS der DEX+ES-Gruppe stieg nach der Innenohrmanipulation
zunächst um 10 µV an, um im weiteren Verlauf des Versuches permanent bis auf knapp
180 µV zu sinken. Die durchschnittliche HS der mit einer Kombination aus BDNF und
elektrischer Stimulation behandelten Tiere fiel zwischen Tag 21, 28 und 34 von 318 µV
auf 262 µV und 246 µV. Zwischen dem 34. und 41. Versuchstag erhöhte sich die HS
um 52 µV auf 298 µV, um schlussendlich bis zum 48. Experimentaltag wieder auf
264 µV zu sinken (Abb. 16). In der AP+ES(M)-Gruppe erhöhte sich die durchschnittliche HS zwischen dem Zeitpunkt der Implantation und der Messung am 34. Versuchstag von 158 µV über 178 µV auf 228 µV. Am 41. Tag war eine Verringerung der
mittleren HS auf 178 µV messbar, welche bis zur Tag 48-Messung auf 188 µV stieg.
62
395
EABR Hörschwellen (μV)
345
295
AP+ES(M)
GDNF+ES
245
BDNF+ES
AP+ES(B)
DEX+ES
195
145
20
25
30
35
40
45
50
Versuchstag
Abb. 16: Darstellung des Verlaufs der durchschnittlichen Hörschwellen der elektrisch
stimulierten Versuchsgruppen vom Tag der Implantation (Tag 21) über Tag 28, 34, 41
bis zum 48. Versuchstag. Gezeigt werden die Mittelwerte (Symbole) und die jeweiligen
Standartfehler (vertikale Balken). Auch wenn es im Verlauf der Messungen zu teils
erheblichen Schwankungen kam, so wird doch deutlich, dass sich die Hörschwellen im
Falle der GDNF+ES-, der BDNF+ES-, der AP+ES(B)- und der DEX+ES-Gruppe im
Vergleich zur elektrischen Ausgangshörschwelle bis zum Tag 48 verbesserten. Die
Durchschnittshörschwellen der AP+ES(M)-Gruppe jedoch stiegen im Verlauf der
Messungen an.
63
5.3
Histologische Befunde an Cortiorgan und
Basilarmembran
In allen bewerteten histologischen Schnitten war ein nahezu vollständiger Verlust der
Haar- und Stützzellen zu beobachten. Abbildung 17 illustriert dieses repräsentativ. In
allen Versuchsgruppen war das Cortiorgan über eine Distanz von mindestens drei
Windungen, von der unteren basalen Windung bis zur dritten mittleren Windung,
zerstört. In der vierten mittleren und der apikalen Windung war das Ausmaß des Zellverlustes variabel. Hier fehlte das Cortiorgan entweder vollständig oder es waren noch
einzelne, aber geschädigte Haarzellen vorhanden. In Einzelfällen konnte ein völlig
erhaltenes Cortiorgan im apikalen Bereich der Cochlea detektiert werden. Keines der
untersuchten Präparate zeigte eine Verletzung der Basilarmembran durch das Elektroden-Mikropumpensystem.
5.4
Quantitative Analyse der Spiralganglienzellen
Zur Untersuchung der Effekte der neurotrophen Faktoren glial cell line-derived
neurotrophic factor und brain-derived neurotrophic factor sowie des Glukokortikoids
Dexamethason und elektrischer Stimulation durch zwei unterschiedliche Elektrodenmodelle auf die Spiralganglienzellpopulation systemisch ertaubter Meerschweinchen
wurden 49 Tiere linksseitig mit einem Elektroden-Mikropumpsystem versorgt. Gemäß
der eingangs formulierten Hypothese eines gesteigerten Überlebens der SGZ (GDNF,
BDNF) bzw. eines nicht beeinträchtigten SGZ-Überlebens (DEX) unter Zusatz der genannten Faktoren wurden selbige je 6 Tieren für die Dauer von 27 Tagen in die sinistrale Scala tympani verabreicht. Zusätzlich wurden 16 Meerschweinchen implantiert,
welchen artifizielle Perilymphe intracochleaer verabreicht wurde. Zur Untersuchung der
Effekte elektrischer Stimulation auf das SGZ-Überleben nach Ertaubung wurden 6
dieser Tiere durch ein monopolares Elektrodenmodell elektrisch stimuliert. Weitere 3
Tiere wurden mit einem bipolaren Elektrodenmodell versorgt und elektrisch stimuliert.
Zudem wurden die Effekte einer Kombinationsstimulation mit BDNF, GDNF und DEX
an je 5 Tieren untersucht. Die BDNF+ES-Tiere wurden mittels eines bipolaren Elektroden- Mikropumpensystems stimuliert. Die GDNF- und DEX-Tiere wurden durch ein
monopolares Elektroden-Mikropumpensystem stimuliert.
64
Abb. 17: Beispielhafte Darstellung des in den verschiedenen Cochleawindungen eines
Meerschweinchens unterschiedlich ausgeprägten Verlustes der Haar- und Stützzellen
48 Tage nach der Verabreichung einer Kombination aus Kanamycin und Ethacrynsäure
(linke Cochlea Tier B35). In der zweiten mittleren Windung (2.m) ist das vollständige
Fehlen der Haar- und Stützzellen (Sternchen) unter und neben der Tektorialmembran
(T) zu beobachten. In der vierten mittleren Windung (4.m) sind zwar beschädigte, jedoch
weiterhin vorhandene Haarzellen und andere Strukturen des Cortiorgans (OC) erkennbar. In allen Versuchsgruppen war das Cortiorgan von der unteren basalen Windung bis
zur dritten mittleren Windung zerstört. Weiter apikal jedoch war das Ausmaß der Beschädigung der Zellen äußerst variable. B: Basilarmembran; lso: Lamina spiralis ossea;
M: Modiolus; R: Rosenthalscher Kanal; Sv: Stria vascularis; Vergrößerung: 40 fach.
65
Insgesamt wurden für 98 Cochleae die Anzahl der SGZ und die Flächen der Rosenthalschen Kanäle bestimmt. Mittels dieser Daten war es möglich, die durchschnittliche
SGZ-Dichte jeder Cochlea zu ermitteln. Es wurden Vergleiche zwischen den durchschnittlichen SGZ-Dichten der rechten Cochleae aller Versuchsgruppen durchgeführt.
Ebenso wurden die durchschnittlichen Dichten der linken Cochleae aller Versuchsgruppen verglichen. Auch ein interner Vergleich der mittleren Dichten der SGZ der rechten
Cochleae einer Versuchsgruppe mit der mittleren Zelldichte der kontralateralen linken
Cochleae wurde durchgeführt.
Da die jeweilige rechte Cochlea eines Tieres die SGZ-Dichte nach 48 Tagen Taubheit
wiedergibt, spiegelt die Differenz zwischen der SGZ-Dichte der linken und der rechten
Cochlea eines Tieres die Wirkung der jeweiligen Intervention wider. Die, durch die
jeweilige Therapie bedingte, linksseitige Protektion der SGZ innerhalb eines Tieres
wird als Summe der durchschnittlichen Dichte der überlebenden SGZ der implantierten
Seite (dSGZi) abzüglich der durchschnittlichen Dichte überlebender SGZ der nicht implantierten Seite (dSGZni) angegeben (dSGZi-dSGZni). Aus dieser durchschnittlichen
Dichte durch Protektion überlebender SGZ eines Tieres wurde die mittlere Dichte der je
Versuchsgruppe durch Protektion überleben SGZ berechnet. Dieses Verfahren zur
Berechnung der Dichte der durch Protektion überlebenden SGZ sowie die der Terminus
„Dichte“ ist in der Literatur etabliert (MILLER et al. 1997; KANZAKI et al. 2002).
Korrekt wäre hier die Benennung „Dichte-Differenzwert“.
Zur Beurteilung der Effekte der unterschiedlichen Behandlungsformen auf die SGZ
nach Ertaubung wurden die Dichten der protektierten SGZ der linken Cochleae
(dSGZi – dSGZni) aller Versuchsgruppen mittels eines multiplen Gruppenvergleichs
mit Adjustierung nach Bonferroni (Bonferroni multiple comparison test) verglichen.
Die durchschnittlichen Dichten der protektierten SGZ (dSGZi – dSGZni) sowie die zugehörigen Standardabweichungen aller Versuchsgruppen sind in Tabelle 2 dargestellt.
66
Tabelle 2: Übersicht der mittleren Dichten der protektierten SGZ aller Versuchsgruppen. Dargestellt sind jeweils die Anzahl der untersuchten Tiere sowie die Mittelwerte
und Standardabweichungen der ermittelten Dichten der protektierten SGZ je Experimentalgruppe. Weitere statistische Auswertungen der Spiralganglienzelldichten werden
im nachfolgenden Teil dieser Arbeit behandelt.
Versuchsgruppe Tierzahl
Mittlere Dichte der
protektierten SGZ / 10.000 µm2,
Standardabweichung
AP
7
-0,45 ± 0,61
AP+ES(M)
6
0,74 ± 0,72
GDNF
6
1,08 ± 0,76
GDNF+ES
5
2,46 ± 0,76
DEX
6
-0,10 ± 1,31
DEX+ES
5
2,05 ± 1,72
BDNF
6
1,10 ± 1,99
BDNF+ES
5
1,68 ± 0,82
AP+ES(B)
3
1,18 ± 0,79
5.4.1 Dichte der Spiralganglienzellen in ertaubten, nicht implantierten
Cochleae
Die systemisch ertaubten, nicht implantierten rechten Cochleae aller Tiere wurden 48
Tage nach Ertaubung gewonnen und gaben somit die SGZ-Dichten nach 48 Tagen
Degeneration wieder. Unterschiede in der SGZ-Dichte könnten Rückschlüsse auf
eventuell auftretende Einflüsse der linksseitigen Interventionen auf die assoziierte
rechte Cochlea zulassen. Ein multipler Gruppenvergleich mit Adjustierung nach
Bonferroni ergab für keine Gegenüberstellung der Gruppen untereinander einen
signifikanten Unterschied (p > 0,05).
Die durchschnittliche SGZ-Dichte lag zwischen 2,33 (DEX-Gruppe) und 3,93
(AP+ES(B)-Gruppe) SGZ/ 10.000 µm2. Die durchschnittliche Zellzahl der rechten
67
Cochleae der AP-Gruppe betrug 2,84 SGZ/ 10.000 µm2, der AP+ES(M)-Gruppe
2,86 SGZ/ 10.000 µm2, der GDNF-Gruppe 3,01 SGZ/ 10.000 µm2, der GDNF+ESGruppe
der
3,03 SGZ/ 10.000 µm2,
BDNF+ES-Gruppe
der
3,60 SGZ/ 10.000 µm2,
BDNF-Gruppe
2,91 SGZ/ 10.000 µm2
und
der
DEX+ES
BDNF
DEX+ES-Gruppe
2
Durchschnittliche SGZ-Dichte
rechter Cochleae (ohne Therapie)
(SGZ-Zahl/10.000μm 2)
3,35 SGZ/ 10.000 µm (Abb. 18).
5.0
2.5
0.0
AP
AP+ES
GDNF
(M)
n=7
n=6
GDNF+ES
DEX
(M)
n=6
n=5
(M)
n=6
n=5
n=6
BDNF+ES
AP+ES
(B)
(B)
n=5
n=3
Versuchsgruppe und Tierzahl
Abb. 18: Durchschnittliche SGZ-Dichte und jeweiliger Standardfehler rechter ertaubter
Cochleae aller Versuchsgruppen 48 Tage nach Ertaubung. Es waren keine statistisch
signifikanten Unterschiede feststellbar (Multipler Gruppenvergleich mit Adjustierung
nach Bonferroni, p > 0,05). Die in den kontralateralen linken Ohren verwendeten
Stimulationen
sind
unter
den
Versuchsgruppen
in
Klammern
dargestellt.
(M) = monopolare Stimulation, (B) = bipolare Stimulation.
5.4.2 Dichte der Spiralganglienzellen in ertaubten und implantierten
linken Cochleae
Die durchschnittlichen SGZ-Dichten der ertaubten und mit GDNF, BDNF, DEX und/
oder ES behandelten Cochleae lagen zwischen 2,23 SGZ/ 10.000 µm2 (DEX) und
5,49 SGZ/ 10.000 µm2 (GDNF+ES). Die zweitniedrigste durchschnittliche SGZ-Dichte
mit 2,38 SGZ/ 10.000 µm2 wiesen die linken Cochleae der Kontrollgruppe (AP) auf. Es
folgten die AP+ES(M)-Gruppe (3,60 SGZ/ 10.000 µm2), die mit GDNF behandelte
Gruppe (4,10 SGZ/ 10.000 µm2), die BDNF+ES-Gruppe (4,60 SGZ/ 10.000 µm2), die
mit dem Wachstumsfaktor BDNF behandelten Cochleae (4,70 SGZ/ 10.000 µm2), die
AP+ES(B)-Gruppe (5,12 SGZ/ 10.000 µm2) und die mit DEX+ES versorgten Cochleae
68
(5,40 SGZ/ 10.000 µm2). Im statistischen Vergleich ergab sich zwischen der AP-Gruppe
und der GDNF+ES-Gruppe ein signifikanter Unterschied mit p < 0,01. Gegenüber der
durchschnittlichen SGZ-Dichte der DEX-Gruppe zeigte die GDNF+ES-Gruppe eine
signifikante Erhöhung der Zelldichte (p < 0,01). Ein weiterer signifikanter Unterschied
war zwischen den SGZ-Dichten der AP+ES(B)-Gruppe und der DEX-Gruppe feststellbar. Hier lag der p-Wert unter 0,05. Alle übrigen Vergleiche ließen keine signifikanten
Unterschiede in den Dichten der erhaltenen SGZ erkennen.
Durchschnittliche SGZ-Dichten
linker Cochleae (mit Therapie)
(SGZ-Zahl/ 10.000 μm 2)
**
*
**
5.0
2.5
0.0
AP
AP+ES
GDNF
(M)
n=7
n=6
GDNF+ES
DEX
(M)
n=6
n=5
n=6
DEX+ES
(M)
n=5
BDNF
BDNF+ES AP+ES
(B)
n=6
n=5
(B)
n=3
Versuchsgruppe und Tierzahl
Abb. 19: Darstellung der durchschnittlichen SGZ-Dichten und der zugehörigen Standardfehler linker ertaubter Cochleae aller Versuchsgruppen. Es waren statistisch signifikante Unterschiede zwischen der GDNF+ES-Gruppe und der AP-Gruppe (p < 0,01)
und der DEX-Gruppe (p < 0,01), sowie zwischen der DEX-Gruppe und der AP+ES(B)Gruppe (p < 0,05) feststellbar (p < 0,05 = *, p < 0,01 = **, (M) = monopolare Stimulation, (B) = bipolare Stimulation).
5.4.3 Interner Vergleich der Dichten der Spiralganglienzellen rechter und
linker ertaubter Cochleae der Tiere einer Experimentalgruppe
Zur Untersuchung der Effekte der verschiedenen Versuchskonditionen auf das SGZÜberleben innerhalb einer Versuchsgruppe wurden die durchschnittlichen SGZ-Dichten
rechter ertaubter aber ansonsten unbehandelter Cochleae und linker ertaubter behandelter Cochleae der Tiere einer Experimentalgruppe miteinander verglichen. Diese Gegenüberstellung zeigte teilweise erhebliche Unterschiede (t-Test für abhängige Stichproben,
69
Abb. 20). In nahezu allen Versuchsgruppen lag die SGZ-Dichte der linken Cochleae
über derjenigen der Rechten. Ausnahmen bildeten die singulär mit artifizieller Perilymphe und Dexamethason behandelten Gruppen. Hier lag die durchschnittliche SGZDichte der linken behandelten Seite unterhalb der der rechten Seite. In der AP-Gruppe
betrug die durchschnittliche SGZ-Dichte der linken Seite 2,38 SGZ/ 10.000 µm2 und die
der rechten Seite 2,84 SGZ/ 10.000 µm2. Die linken Cochleae der DEX-Gruppe wiesen
eine durchschnittliche SGZ-Dichte von 2,23 SGZ/ 10.000 µm2 auf, wohingegen die
SGZ-Dichte der rechten Cochleae bei 2,79 SGZ/ 10.000 µm2 lag.
Wie Abbildung 20 zeigt, lag die linksseitige SGZ-Dichte in der BDNF-Gruppe und der
AP+ES(B)-Gruppe oberhalb der rechtsseitigen (BDNF: 4,70 vs. 3,60 SGZ/ 10.000 µm2;
AP+ES(B): 5,12 vs. 3,93 SGZ/ 10.000 µm2). Der statistische Vergleich der rechten und
linken Cochleae beider Gruppen führte zu keinen signifikanten Unterschieden (BDNF:
*
**
5.0
ns
*
ns
ns
**
**
ns
2.5
B
D
B
N
D
F
N
F+
ES
(B
)
A
P+
ES
(B
)
D
EX
D
EX
+E
S(
M
)
G
D
G
N
D
F
N
F+
ES
(M
)
0.0
A
P
A
P+
ES
(M
)
Durchschnittliche SGZ-Dichte
(SGZ/ 10.000 μm2)
p = 0,1169; AP+ES(B): p = 0,0609).
Versuchsgruppe
links, ertaubt, behandelt
rechts, ertaubt, ansonsten unbehandelt
Abb. 20: Darstellung der durchschnittlichen SGZ-Dichten (SGZ-Zahl/ 10.000 µm2, Mittelwert ± Standardfehler) der Cochleae ertaubter Meerschweinchen nach linksseitiger
intracochleaerer Behandlung mittels AP, AP+ES(M), GDNF, GDNF+ES, BDNF,
BDNF+ES, AP+ES(B), DEX oder DEX+ES verglichen mit der assoziierten ertaubten,
ansonsten unbehandelten rechten Cochlea. Signifikante Unterschiede nach Anwendung des t-Tests für abhängige Stichproben sind mittels eckiger Klammern über den
jeweiligen Säulen dargestellt (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **, ns = nicht signifikant, (M) =
monopolare Stimulation, (B) = bipolare Stimulation).
70
Beide nicht mit einem NTF behandelten, aber elektrisch stimulierten Gruppen,
AP+ES(M) und DEX+ES, wiesen auf der linken Seite eine statistisch signifikant höhere
durchschnittliche SGZ-Dichte auf als auf der rechten Seite (p < 0,05). In der
AP+ES(M)-Gruppe stand die linksseitige SGZ-Zahl von 3,60 SGZ/ 10.000 µm2
derjenigen der rechten Seite von 2,86 SGZ/ 10.000 µm2 gegenüber. Die DEX+ES
Cochleae verfügten über eine durchschnittliche SGZ-Zahl von 2,23 SGZ/ 10.000 µm2,
wohingegen die assoziierten rechten Seiten 2,79 SGZ/ 10.000 µm2 aufwiesen. Beide mit
Wachstumsfaktor und ES behandelten Gruppen sowie die GDNF-Gruppe zeigten beim
Vergleich der linken und rechten Seiten eine statistische Signifikanz von p < 0,01. In
diesen Gruppen fanden sich durchschnittliche Zellzahlen von 4,60 vs. 2,92 SGZ/ 10.000
µm2 (BDNF+ES, p = 0,0051), 5,49 vs. 3,03 SGZ/ 10.000 µm2 (GDNF+ES, p = 0,0010)
und 4,10 vs. 3,01 SGZ/ 10.000 µm2 (GDNF, p = 0,008).
5.4.4 Überleben der Spiralganglienzellen der Versuchsgruppen im
Vergleich zur Kontrollgruppe
Gemäß der eingangs formulierten Hypothese eines gesteigerten SGZ-Überlebens
(GDNF, BDNF, ES) bzw. eines nicht beeinträchtigten SGZ-Überlebens (Dexamethason) nach Ertaubung wurden den Tieren die jeweiligen Faktoren intracochleaer verabreicht (100 ng/ml GDNF, 50 ng/ml BDNF, 100 ng/ml DEX).
Zur vergleichenden Untersuchung der Effekte der verschiedenen Interventionen auf die
SGZ-Population wurden die Daten aller Experimentalgruppen denen der Kontrollgruppe gegenüber gestellt. Dieser Vergleich ermöglicht die Beurteilung, der effektivsten zur
SGZ-Protektion nach 21 Tagen Taubheit geeigneten Behandlungsmethode.
Als Kontrollgruppe dienten 7 linksseitig mit einem monopolaren Elektrodemodell implantierte Tiere. Ab dem 21. Versuchstag wurde ihnen durch das Mikropumpensystem
artifizielle Perilymphe in die Scala tympani geleitet. Die mittlere Dichte protektierter
SGZ dieser Gruppe lag bei -0,45 Zellen/ 10.000 µm2 (Abb. 21). Auch die DEX-Gruppe
wies einen negativen Wert für die durchschnittliche Dichte protektierter SGZ auf (-0,10
SGZ/ 10.000 µm2). Der Vergleich beider Datensätze ergab keine statistischen Signifikanzen. Ebenso verhielt es sich mit der alleinigen BDNF-Behandlung, welche mit 1,10
SGZ/ 10.000 µm2 eine nicht signifikant unterschiedliche aber tendenziell höhere SGZDichte im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigte. Die monopolare elektrische Stimulation
führte zu einer statistisch signifikanten Protektion der SGZ gegenüber der Kontrollgruppe (p < 0,05), wobei die durchschnittliche Dichte protektierter SGZ der
71
AP+ES(M)-Gruppe 0,74 SGZ/ 10.000 µm2 betrug. Der Vergleich der ermittelten durchschnittlichen Dichten protektierter SGZ der Kontrollgruppe und der mit der bipolaren
Elektrode rein intracochleaer elektrisch stimulierten Gruppe (AP+ES(B)) ergab eine
Erhöhung der SGZ-Überlebensrate von 0,64 Zellen in den AP+ES(B)-behandelten
4.0
***
**
ns
1.5
**
*
*
*
F+
ES
(B
)
A
P+
ES
(B
)
B
D
N
F
B
D
N
D
EX
D
EX
+E
S(
M
)
-1.0
G
D
N
G
F
D
N
F+
ES
(M
)
ns
A
P
A
P+
ES
(M
)
Durchschnittliche Dichte protektierter SGZ
(dSGZi-dSGZni, Zellen/ 10.000 μm2)
Cochleae und somit eine signifikante Differenz mit p < 0,05.
Versuchsgruppe
Abb. 21: Darstellung der durchschnittlichen Dichten und des jeweiligen Standardfehlers protektierter SGZ (Summe der durchschnittlichen SGZ-Dichte der therapierten
Cochlea und nicht therapierten Cochleae, dSGZi-dSGZni) aller Experimentalgruppen
nach 48 Tagen Taubheit und 27 Tagen (Substanz) bzw. 24 Tagen (ES) Therapiedauer.
Signifikante Unterschiede gegenüber der Kontrollgruppe (AP) sind über den jeweiligen
Säulen dargestellt (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **; p < 0,001 = ***, ns = nicht signifikant, (M)
= monopolare Stimulation, (B) = bipolare Stimulation).
Für den Kombinationsstimulus aus bipolarer elektrische Stimulation und BDNFApplikation (BDNF+ES) konnte ebenfalls ein signifikant gesteigertes SGZ-Überleben
im Vergleich zur AP-Gruppe mit p < 0,05 demonstriert werden (1,68 SGZ/ 10.000 µm2
vs. -0,45 SGZ/ 10.000 µm2). Die mittlere Dichte protektierter SGZ betrug bei GDNFbehandelten
Tieren
1,085
SGZ/ 10.000 µm2
und
bei
DEX+ES
behandelten
2,05 SGZ/ 10.000 µm2. Beide Behandlungsmethoden führten zu signifikanten Unterschieden verglichen mit der durchschnittlichen SGZ-Dichte der AP-Gruppe (p < 0,01).
Die mit p < 0,001 höchste statistische Signifikanz erzielte der Vergleich der durch-
72
schnittlichen Dichte protektierter SGZ der Kontrollgruppe mit der der GDNF+ESGruppe. Hier stand die Dichte protektierter SGZ/ 10.000 µm2 von -0,45 (AP) derjenigen
der GDNF+ES-Gruppe von 2,46 SGZ/ 10.000 µm2 gegenüber.
5.4.5 Protektive Effekte der Einzel- und Kombinationsstimuli auf die
Spiralganglienzellen im Vergleich
Zur Untersuchung der Effekte der verzögert nach Ertaubung applizierten Faktoren
GDNF und BDNF sowie des Glukokortikoids Dexamethason auf die SpiralganglienzellPopulation wurde systemisch ertaubten Meerschweinchen über eine Dauer von 27 Tagen linksseitig intracochleaer mit GDNF, BDNF bzw. DEX therapiert.. Zusätzlich wurden die Effekte einer alleinigen monopolaren und bipolaren elektrischen Stimulation
und die einer Kombinationsstimulation mit GDNF, BDNF und Dexamethason untersucht. Die SGZ-Dichten-Differenz zwischen der behandelten linken Cochlea und der
ertaubten, aber ansonsten unbehandelten, rechten Cochlea eines Tieres gibt die Dichte
protektierter SGZ in diesem Individuum an. Die durchschnittliche Dichte der protektierter SGZ der Tiere einer Gruppe kann mit der der übrigen Gruppen verglichen werden.
Der statistische Vergleich der durchschnittlichen Dichten protektierter SGZ aller Experimentalgruppen mittels des multiplen Gruppenvergleichs mit Adjustierung nach
Bonferroni lässt eine Beurteilung des Protektionsvermögens jeder einzelnen Gruppe zu.
5.4.5.1
GDNF
GDNF behandelte Cochleae zeigten mit einer durchschnittlichen Dichte von 1,08 protektierten
SGZ/ 10.000 µm2
eine
ähnliche
Zellzahl
wie
AP+ES(B)
(1,19 SGZ/ 10.000 µm2) und BDNF (1,10 SGZ/ 10.000 µm2) behandelte Cochleae. Der
statistische Vergleich der SGZ-Dichten der GDNF-Gruppe und der Kontrollgruppe
(-0,45 SGZ/ 10.000 µm2) zeigte mit p < 0,01 einen hoch signifikanten Unterschied
(Abb. 22). Auch gegenüber der GDNF+ES-Gruppe (2,45 SGZ/ 10.000 µm2) zeigte die
GDNF-Gruppe eine signifikante Differenz in der SGZ-Zahl pro Fläche (p < 0,05). Tendenziell zeigte sich in der mittleren SGZ-Dichte der GDNF-Gruppe ein leichter Anstieg
der
überlebenden
Spiralganglienzellen
im
Vergleich
2
zur
AP+ES(M)-
2
(0,74 SGZ/ 10.000 µm ) und DEX-Gruppe (-0,10 SGZ/ 10.000 µm ), beziehungsweise
ein
leichter
Abfall
der
überlebenden
SGZ
im
Vergleich
zur
BDNF+ES-
(1,68 SGZ/ 10.000 µm2) und DEX+ES-Gruppe (2,05 SGZ/ 10.000 µm2), der sich jedoch als nicht signifikant unterschiedlich darstellte.
73
5.4.5.2
GDNF+ES
Im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigten die GDNF+ES behandelten Cochleae eine um
2,91 SGZ/ 10.000 µm2 erhöhte SGZ-Dichte (Abb.22). In der statistischen Auswertung
ergab dies einen hoch signifikanten Unterschied mit p < 0,001. Die Gegenüberstellung
der mittleren SGZ-Dichte der GDNF+ES behandelten Cochleae mit der der AP+ES(M)
behandelten zeigte, dass die GDNF+ES behandelten Cochleae eine 3,3mal höhere Dichte protektierter SGZ aufwiesen als die AP+ES(M)-Cochleae (2,46 SGZ/ 10.000 µm2 vs.
0,74 SGZ/ 10.000 µm2,
p < 0,01).
Auch
im
Vergleich
zur
DEX-Gruppe
(-0,11 SGZ/ 10.000 µm2) ergibt die statistische Auswertung eine Signifikanz von
p < 0,01. Gegenüber der durchschnittlichen SGZ-Dichte in GDNF behandelten Cochleae (1,08 SGZ/ 10.000 µm2) zeigte die GDNF+ES behandelte Gruppe einen statistisch
signifikanten Unterschied in der Dichte überlebender SGZ mit p < 0,05. Abbildung 22
zeigt, dass die durchschnittliche SGZ-Dichte GDNF+ES-behandelter Cochleae auch
augenscheinlich über derjenigen der BDNF-, BDNF+ES-, AP+ES(B)-, DEX- und
DEX+ES-behandelten lag. Doch der statistische Vergleich der Dichte-Zahlen ergab hier
keine Signifikanzen.
4.0
*
**
**
1.5
*
**
***
(B
)
)
P+
ES
(B
A
B
D
N
B
F+
ES
D
N
F
(M
)
+E
S
EX
D
F+
ES
D
EX
(M
)
N
F
D
G
D
N
G
P+
ES
A
P
(M
)
-1.0
A
Durchschnittliche Dichte protektierter SGZ
(dSGZi-dSGZni, Zellen/ 10.000 qm2)
74
Versuchsgruppe
Abb. 22: Darstellung der Mittelwerte und Standardfehler der durchschnittlichen Dichten
protektierter SGZ aller Versuchsgruppen (mittlere SGZ-Dichte der implantierten, therapierten Cochleae abzüglich der durchschnittlichen SGZ-Dichte der assoziierten ertaubten, nicht implantierten kontralateralen Cochleae, dSGZi-dSGZni). Mittels multiplem
Gruppenvergleich mit Adjustierung nach Bonferroni werden die Werte der GDNF- und
GDNF+ES-Gruppe statistisch mit denen der übrigen Experimentalgruppen verglichen.
Statistisch signifikante Unterschiede zur GDNF+ES-Gruppe sind über den jeweiligen
Säulen dargestellt, während diejenigen der GDNF-Gruppe separat mittels eckiger
Klammern verdeutlicht sind. Nicht signifikante Vergleiche werden nicht dargestellt
(p < 0,05 = *; p < 0,01 = **; p < 0,001 = ***, (M) = monopolare elektrische Stimulation,
(B) = bipolare elektrische Stimulation).
5.4.5.3
BDNF
Die Dichten protektierter SGZ der Tiere der BDNF-Gruppe variierten zwischen -0,84
und 4,07 SGZ/ 10.000 µm2, wobei der Durchschnitt bei 1,10 SGZ/ 10.000 µm2 lag. Im
statistischen Vergleich (multipler Gruppenvergleich mit Adjustierung nach Bonferroni)
der Dichte-Werte der überlebenden SGZ der BDNF-Gruppe mit denen der anderen Experimentalgruppen konnten keinerlei Signifikanzen festgestellt werden.
75
5.4.5.4
BDNF+ES
Cochleae welche zeitgleich mit BDNF und ES behandelt wurden zeigten eine mittlere
Dichte protektierter SGZ von 1,69 SGZ/ 10.000 µm2. Im Vergleich mit der AP-Gruppe
(-0,45 SGZ/ 10.000 µm2) und der DEX-Gruppe (-0,11 SGZ/ 10.000 µm2) findet sich
jeweils einen statistisch signifikanter Unterschied von p < 0,05 (Abb. 23). Alle anderen
4.0
*
*
1.5
)
)
P+
ES
(B
A
D
N
F+
ES
(B
F
N
B
D
B
EX
EX
+E
S(
M
)
D
D
F
F+
ES
(M
)
N
D
G
G
D
N
)
P+
ES
(M
A
P
-1.0
A
Durchschnittliche Dichte protektierter SGZ
(dSGZi-dSGZni, Zellen/ 10.000q m2)
Vergleiche ergaben keine statistisch signifikanten Unterschiede.
Versuchsgruppe
Abb. 23: Statistischer Vergleich der durchschnittlichen Dichten protektierter SGZ der
BDNF+ES behandelten Experimentalgruppe mit denen der übrigen Gruppen (mittlere
SGZ-Dichte der implantierten, therapierten Cochleae abzüglich der durchschnittlichen
SGZ-Dichte der assoziierten ertaubten, nicht implantierten kontralateralen Cochleae,
dSGZi-dSGZni). Dargestellt sind jeweils die Mittelwerte sowie der Standardfehler.
Statistisch signifikante Unterschiede waren im Vergleich mit der Kontrollgruppe und der
DEX-Gruppe nachweisbar (p < 0,05 = *), alle übrigen Vergleiche waren nicht signifikant.((M) = monopolare Stimulation, (B) = bipolare Stimulation)
76
5.4.5.5
AP+ES(M)
Im Vergleich zur Kontrollgruppe (AP) lag die durchschnittliche SGZ-Dichte der mit
artifizieller Perilymphe behandelten und gleichzeitig mit monopolarer elektrischer Stimulation versorgten Tiere (AP+ES(M)) signifikant höher (-0,45 SGZ/ 10.000 µm2 vs.
0,74 SGZ/ 10.000 µm2; p < 0,05; Abb. 24). Auch die statistische Gegenüberstellung von
AP+ES(M)-Daten und denen der GDNF+ES-Gruppe (2,46 SGZ/ 10.000 µm2) zeigte
signifikante Unterschiede (p < 0,01). Hier lag die mittlere SGZ-Dichte der AP+ES(M)-
4.0
**
*
1.5
+E
EX
B
D
N
B
F
D
N
F+
ES
(B
)
A
P+
ES
(B
)
)
S(
M
EX
D
D
G
G
-1.0
D
N
F
D
N
F+
ES
(M
)
*
A
P
A
P+
ES
(M
)
Durchschnittliche Dichte protektierter SGZ
(dSGZi-dSGZni, Zellen/ 10.000 qm2)
behandelten Cochleae unterhalb der der GDNF+ES-behandelten.
Versuchsgruppe
Abb. 24: Statistischer Vergleich der durchschnittlichen Dichten protektierter SGZ der
AP+ES(M)- und AP+ES(B)-behandelten Cochleae mit denen der übrigen Gruppen
(mittlere SGZ-Dichte der implantierten Cochleae abzüglich der durchschnittlichen SGZDichte der kontralateralen ertaubten, nicht implantierten Cochleae, dSGZi-dSGZni).
Dargestellt sind jeweils die Mittelwerte sowie der Standardfehler. Die durchschnittliche
SGZ-Dichte der mit der monopolaren Elektrode versorgten Tiere (AP+ES(M)) zeigte
gegenüber der AP- und der GDNF+ES-Gruppe statistisch signifikante Unterschiede mit
p < 0,05 bzw. p < 0,01, welche mittels eckiger Klammern dargestellt sind. Eine statistisch signifikante Differenz der mittleren SGZ-Dichte ist auch im Vergleich der
AP+ES(B)-Gruppe mit der AP-Gruppe feststellbar und oberhalb der betreffenden Säule
abgebildet (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **; (M) = monopolare Stimulation, (B) = bipolare
Stimulation).
77
5.4.5.6
AP+ES(B)
Die mittlere Dichte protektierter SGZ der mit einem bipolaren ElektrodenMikropumpensystem versorgten und stimulierten Tiere lag bei 1,19 SGZ/ 10.000 µm2.
Bei Anwendung des multiplen Gruppenvergleichs mit Adjustierung nach Bonferroni
war gegenüber der durchschnittlichen SGZ-Dichte der Kontrollgruppe
(-0,45 SGZ/ 10.000 µm2) eine Signifikanz mit p < 0,05 feststellbar (Abb. 24).
5.4.5.7
DEX
Cochleae die über 27 Tage hinweg mit Dexamethason behandelt wurden wiesen eine
durchschnittliche SGZ-Dichte von 2,23 SGZ/ 10.000 µm2 auf, die zugehörigen rechten
Cochleae zeigten hingegen 2,33 SGZ/ 10.000 µm2. Dies bedeutet, dass in dieser Experimentalgruppe die mittlere Dichte protektierter SGZ -0,11 SGZ/ 10.000 µm2 betrug. Im
statistischen Vergleich mit den durchschnittlichen Dichten protektierter SGZ der anderen Versuchsgruppen zeigten sich signifikante Unterschiede gegenüber der DEX+ESGruppe (p < 0,05), der BDNF+ES-Gruppe (p < 0,05) und der GDNF+ES-Gruppe
(p < 0,01) (Abb. 25).
5.4.5.8
DEX+ES
Die durchschnittliche Dichte protektierter SGZ der DEX+ES-Gruppe lag mit
2,05 SGZ/ 10.000 µm2 zwischen der der GDNF+ES-Gruppe und der der BDNF+ESGruppe.
Gegenüber der DEX-Gruppe (-0,11 SGZ/ 10.000 µm2) und der AP-Gruppe
(-0,45 SGZ/ 10.000 µm2) zeigt die DEX+ES-Gruppe eine höhere Zahl protektierter
SGZ, wobei dieser Unterschied im Falle des Vergleichs mit der AP-Gruppe zu einer
statistischen Signifikanz mit p < 0,01, und im Vergleich mit der DEX-Gruppe zu einer
statistischen Signifikanz mit p < 0,05 führte (Abb. 25).
Abbildung 26 zeigt beispielhafte mikroskopische Aufnahmen der Rosenthalschen Kanäle aller Versuchsgruppen.
4.0
*
**
*
1.5
F+
ES
(B
)
A
P+
ES
(B
)
N
F
N
B
D
B
D
EX
EX
+E
S(
M
)
D
D
D
G
D
N
F
N
F+
ES
(M
)
*
G
P+
ES
(M
)
-1.0
A
P
**
A
Durchschnittliche Dichte protektierter SGZ
(dSGZi-dSGZni, Zellen/ 10.000 qm2)
78
Versuchsgruppe
Abb. 25: Effekte einer singulären Behandlung mit 100 ng DEX und einer Kombination
derselben mit monopolarer elektrischer Stimulation im Vergleich zu den anderen Experimentalgruppen. Dargestellt ist der statistischer Vergleich der durchschnittlichen Dichten protektierter SGZ der DEX- und der DEX+ES-Gruppe mit denen der übrigen Gruppen (mittlere SGZ-Dichte der implantierten Cochleae abzüglich der durchschnittlichen
SGZ-Dichte der kontralateralen ertaubten, nicht implantierten Cochleae, dSGZidSGZni). Die durchschnittliche SGZ-Dichte der mit Dexamethason behandelten Tiere
(DEX) zeigte gegenüber der GDNF+ES-Gruppe einen statistisch signifikanten Unterschied mit p < 0,01. Auch gegenüber der BDNF+ES-Gruppe und der DEX+ES-Gruppe
waren signifikante Differenzen in der SGZ-Dichte feststellbar (p < 0,05). Der statistische Vergleich der mittleren SGZ-Dichte der DEX+ES-Versuchsgruppe mit denen der
anderen Gruppen führte sowohl die DEX-Gruppe als auch die AP-Gruppe betreffend
zu signifikanten Unterschieden (p < 0,05 bzw. p < 0,01). Auf Unterschiede zur DEXGruppe bezogene Signifikanzen sind mittels Klammern dargestellt, auf die DEX+ES
bezogene sind oberhalb der betreffenden Säule abgebildet. (p < 0,05 = *;
p < 0,01 = **; (M) = monopolare Stimulation, (B) = bipolare elektrische Stimulation)
79
80
Abb. 26: Beispielhafte mikroskopische Aufnahmen der Rosenthalschen Kanäle aller
Versuchsgruppen (A – I) zur Darstellung der Spiralganglienzellen. Die Pfeile verweisen
auf repräsentative Spiralganglienzellen der jeweiligen Behandlungsgruppe. A: APGruppe. Diese repräsentative Darstellung belegt, dass die Cochleae dieser Versuchsgruppe nahezu keine intakten SGZ aufwiesen. Der Pfeil deutet auf eine degenerierte
Spiralganglienzelle. B: AP+ES(M)-Gruppe. Die Aufnahme zeigt, dass in dieser Gruppe,
im Vergleich zu der AP-Gruppe (A), intakte, überlebende SGZ vorhanden waren. C:
GDNF-Gruppe. Die mikroskopische Aufnahme zeigt, verglichen mit der Abbildung der
AP+ES(M)-Gruppe, ein vermehrtes Überleben der SGZ. D: GDNF+ES-Gruppe. Die
Darstellung belegt die in dieser Gruppe ermittelte hohe SGZ-Dichte. Der Rosenthalsche Kanal besteht fast ausschließlich aus intakten SGZ. E: BDNF-Gruppe. Deutlich ist
das Vorhandensein überlebender SGZ zu erkennen. Der Vergleich dieser Aufnahme
mit C untermauert die annähernd gleiche SGZ-Dichte beider Experimentalgruppen. F:
BDNF+ES-Gruppe. Die Abbildung zeigt beispielhaft die in dieser Versuchsgruppe
beobachtete hohe SGZ-Zahl, v. a. im Vergleich mit den anderen Teilabbildungen. G:
DEX-Gruppe. Dieses Bild veranschaulicht die in dieser Versuchsgruppe ermittelte
geringe SGZ-Zahl. H: DEX+ES-Gruppe. Es ist eine relativ große Zahl intakter SGZ zu
sehen. Auf die Größe des Rosenthalschen Kanals bezogen spiegelt diese Darstellung
die hohe durchschnittliche Dichte überlebender SGZ in dieser Versuchsgruppe wider.
I: AP+ES(B)-Gruppe. Der Großteil der hier dargestellten SGZ zeigt deutliche Anzeichen einer Degeneration. Dennoch sind einige intakte Zellen erkennbar, welche die in
dieser Gruppe ermittelte SGZ-Dichte erklären. Die Sterne markieren Bindegewebsbildung in der Scala tympani. Vergrößerung A bis I: 200fach.
81
5.5
Dexamethason-Wirkung auf das Bindegewebswachstum
und die Effekte der elektrischen Stimulation
Die Tiere zweier Versuchsgruppen bekamen über 27 Tage, nach der Implantation eines
monopolaren
Elektroden-Mikropumpensystems,
100 ng/ml
Dexamethason
intracochleaer appliziert. Eine dieser Gruppen wurde additiv für 24 Tage elektrisch
stimuliert.
5.5.1 Effekte von Dexamethason auf das Bindegewebswachstum nach
Implantation eines monopolaren Elektroden-Mikropumpensystems
Sechs Versuchstieren wurde ausschließlich Dexamethason verabreicht. Diese Gruppe
diente der Beurteilung des Einflusses einer Applikation von 100 ng/ml DEX auf die
Bindegewebsneubildung nach Implantation eines Elektroden-Mikropumpensystems.
Die Auswertung des Bindegewebswachstums erfolgte in allen Versuchsgruppen
qualitativ. Aufgrund der Lokalisation des Bindegewebes (BDG) wurde zwischen
intracochleaerer Neubildung und solcher in der Bulla unterschieden. Das Bindegewebswachstum im Mittelohr wurde mit 0 = kein Bindegewebe (Abb. 27),
+ = Bildung eines dünnen BDG-Schlauches um die Elektrode, ++ = Bildung eines stark
ausgeprägten Bindegewebsschlauches um die Elektrode und +++ = Ausbreitung des
Bindegewebes im Mittelohr beschrieben. Für den intracochleaeren Bereich wurde eine
Gradierung von 0 = kein Bindegewebe, + = schwache Bindegewebsneubildung,
++ = starke Bindegewebsneubildung und +++ = vollständige Füllung der Sc. tympani
mit Bindegewebe angewendet (Abb. 28).
Tabelle 3 zeigt, dass zwei der mit DEX behandelten Tiere keine Bindegewebsneubildung in den untersuchten Strukturen aufwiesen. Bei zwei Tieren hatte sich ein feines
bindegewebiges Häutchen um die Elektrode gebildet und die histologischen
Cochleaschnitte zeigten eine vollständige Füllung der Sc. tympani mit Bindegewebe.
Ein weiteres Tier wies einen stark ausgeprägten Bindegewebsschlauch um die Elektrode
auf, wohingegen in der Cochlea keine Anzeichen für Bindegewebsbildungen zu finden
waren. Das letzte Tier dieser Versuchsgruppe zeigte sowohl in der Bulla als auch in der
Cochlea massives Bindegewebswachstum, wobei sich das BDG im Mittelohr zu
knöchernen Trabekeln, welche sich durch das Lumen zogen, differenziert hatte.
Diese Aufschlüsselung der, in mit Dexamethason behandelten Cochleae aufgefundenen,
Bindegewebsneubildungen verdeutlicht, wie breit gefächert, von nicht vorhanden, bis
hin zu vollständiger Ausfüllung der jeweiligen Struktur, sich das Bindegewebswachs-
82
tum in dieser Experimentalgruppe darstellte. Auch in den anderen Versuchsgruppen
reichte die Beurteilung des BDG-Wachstums von nicht vorhanden bis maximaler
Ausbildung. Tabelle 2 verdeutlicht, dass bei einem Vergleich der DEX-behandelten
Innenohren mit denen der anderen Versuchsgruppen keine das Bindegewebswachstum
betreffenden Tendenzen beobachtet werden konnten.
Abb. 27: Darstellung eines eröffneten Felsenbeines mit Sicht auf das Trommelfell, die
Cochlea und die inserierte Elektrode. Dies ist eine beispielhafte Darstellung für ein Tier
dessen BDG-Wachstum im Mittelohr mit 0 bewertet wurde (Cochlea D12L). Die
Flüssigkeitsansammlung ist durch die Präparation in PBS bedingt.
83
Abb. 28: Beispielhafte Darstellungen der vier unterschiedlichen Kategorien der Bindegewebsneubildung in der Cochlea. A: keine Bindegewebsneubildung =0; B: schwache
Bindegewebsneubildung =+; C: starke Bindegewebsneubildung =++; D: vollständige
Füllung der Sc. tympani mit Bindegewebe =+++. Die Pfeile weisen auf das vorhandene
Bindegewebe; E: Elektrodenkanal; Aufgrund der Elektrodenkanäle in den Bildern C
und D kann zudem auf die Lage der Elektrode in der Sc. tympani geschlossen werden.
Je näher die Elektrode am Modiolus platziert wird, desto näher befindet sie sich auch
an den Zielzellen der elektrischen Stimulation und der Faktorapplikation, den Spiralganglienzellen, und kann so optimal wirken. Anhand der in den Teilabbildungen C und
D erkennbaren, durch das Bindegewebe gebildeten Kanäle, lässt sich auf eine Elektrodenpositionierung direkt unterhalb des Rosenthalschen Kanals am Modiolus schließen.
Vergrößerung: 40fach.
84
Tab. 3: Beurteilung des Bindegewebes in den implantierten Cochleae und den zugehörigen Mittelohren. Erläuterung:
Bulla: 0 = kein Bindegewebe, + = Bildung eines dün-
nen BDG-Schlauches um die Elektrode, ++ = Bildung eines stark ausgeprägten Bindegewebsschlauches um die Elektrode, +++ = Ausbreitung des BDG im Mittelohr; Cochlea: 0 = kein Bindegewebe, + = schwache Bindegewebsneubildung, ++ = starke Bindegewebsneubildung, +++ = vollständige Füllung der Sc. tympani mit Bindegewebe.
Versuchsgruppe
AP
AP+ES(M)
GDNF
Tier
Bulla
79
+
+
68
++
++
67
++
0
65
++
+++
+++
Die Bulla wurde nicht beurteilt
18
0
Die Bulla wurde nicht beurteilt
15
0
Die Bulla wurde nicht beurteilt
78
+
+
75
0
+++
74
+
+++
73
++
+++
72
+
+++
69
++
+++
32
0
++
34
+++
Die Bulla wurde nicht beurteilt
35
0
Die Bulla wurde nicht beurteilt
36
0
Die Bulla wurde nicht beurteilt
56
0
Die Bulla wurde nicht beurteilt
+++
Die Bulla wurde nicht beurteilt
23
+
+++
+++
+++
39
41
+++
42
53
BDNF
BDNF+ES
Die Bulla wurde nicht beurteilt
++
Die Bulla wurde nicht beurteilt
0
Die Bulla wurde nicht beurteilt
B01
0
B02
+
B09
0
B12
++
B15
++
+++
0
B25
+
++
++
++
B26
0
+++
B27
+
0
+++
Cochlea nicht beurteilbar
0
Cochlea nicht beurteilbar
B04
B24
AP+ES(B)
Anmerkungen
20
60
GDNF+ES
Cochlea
B28
+
B35
+
B36
++
+++
B46
+
+++
85
Tab. 3 (Fortsetzung)
Versuchsgruppe
Tier
Bulla
Cochlea
DEX
D05L
0
0
DEX+ES
D06L
0
0
D15L
+
+++
D17L
+++
0
D18L
+++
+++
D19L
+
+++
D02L
++
+++
D11L
++
++
D12L
0
+++
D16L
++
+++
D25L
++
+++
Anmerkungen
Mittelohr mit knöchernen Trabekeln durchzogen
5.5.2 Wirkung von Dexamethason auf die Effekte der elektrischen
Stimulation
Um die Wirkung von Dexamethason auf den, das Überleben der SGZ beeinflussenden,
Effekt der elektrischen Stimulation zu untersuchen, wurden fünf Meerschweinchen mit
einer Kombination aus Dexamethason (100 ng/ml) und elektrischer Stimulation
(250 pps, 100 µs pro Phase, 40% duty cycle, 8dB oberhalb der elektrischen HS) versorgt. Die in den so behandelten Cochleae ermittelten durchschnittlichen Dichten protektierter SGZ wurden mit denen aus mit artifizieller Perilymphe und elektrischer Stimulation durch das gleiche Implantatmodell behandelten Tieren verglichen (Abb.29).
Die
durchschnittliche
Spiralganglienzell-Dichte
der
AP+ES(M)-Tiere
betrug
0,74 Zellen/ 10.000 µm2, die der DEX+ES-Gruppe 2,05 SGZ/ 10.000 µm2. Die Überlebensrate in den mit DEX und ES behandelten Cochleae war zwar augenscheinlich höher
als die in den mit monopolarer elektrischer Stimulation behandelten Cochleae (Abb.
29), jedoch ergab die statistische Auswertung in diesem Fall keinen signifikanten Unterschied.
Durchschnittliche Dichte protektierter SGZ
(dSGZi-dSGZni, Zellen/ 10.000 qm2)
86
ns
4.0
1.5
-1.0
AP+ES(M)
DEX+ES
n=6
n=5
Versuchsgruppe
Abb. 29: Darstellung der durchschnittlichen Dichten protektierter SGZ sowie des zugehörigen Standardfehlers der AP+ES(M)-Gruppe und der DEX+ES-Gruppe. (dSGZidSGZni = mittlere SGZ-Dichte der implantierten Cochleae abzüglich der durchschnittlichen SGZ-Dichte der kontralateralen ertaubten, nicht implantierten Cochleae; ns =
nicht signifikant; n = Anzahl der Tiere)
87
6
Diskussion
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Effekte unterschiedlicher, verzögert nach
Ertaubung beginnender, lokaler Therapien des Innenohres auf die Funktionalität der
Cochlea und die Überlebensrate der Spiralganglienzellen (SGZ) zu untersuchen. Die
Nervenwachstumsfaktoren glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) und
brain-derived
neurotrophic
factor
(BDNF)
wurden
als
Einzelstimuli
und
Kombinationsstimuli mit elektrischer Stimulation (ES) appliziert. Zur Bestimmung der
Funktionalität der Cochlea wurden elektrophysiologische Messungen durchgeführt. Um
die neuroanatomischen Auswirkungen der Interventionsmethoden zu untersuchen,
wurden die mittleren Dichten der überlebenden SGZ quantitativ erfasst. Ein weiteres
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung des Einflusses lokal verabreichten
Dexamethasons (DEX) auf den das Überleben der SGZ beeinflussenden Effekt der
elektrischen Stimulation. Weiterhin sollte die Wirkung des Dexamethasons auf die
Bindegewebsneubildung nach der Implantation des Elektroden-Mikropumpensystems
untersucht werden.
Als Versuchstiere wurden Meerschweinchen gewählt, da für dieses Modell eine Reihe
von Vorarbeiten existieren und ein entsprechendes ototoxisches Ertaubungsmodell
etabliert ist (WEST et al. 1973).
6.1
Auswirkungen der unterschiedlichen
Interventionsmethoden auf die Funktionalität der Cochlea
Die in der vorliegenden Studie präsentierten Ergebnisse der Messungen der akustisch
evozierten auditorischen Hirnstammpotentiale (AABR) belegen die erfolgreiche
Ertaubung mittels Kanamycin und Ethacrynsäure. In den, dem Ertaubungseingriff
folgenden, Messungen waren sowohl positive als auch negative Schwankungen der
Hörschwellen von 5 oder 10 dB zu beobachten. Diese sind durch Messfehler zu
erklären. Eine Verbesserung der akustischen Hörschwellen durch die verschiedenen
Behandlungsmethoden war nicht zu registrieren und aufgrund der irreparablen
Haarzellschädigung auch nicht zu erwarten.
88
Verschiedene Faktoren beeinflussen die Physiologie der SGZ und den Erfolg von
Cochlea-Implantaten. Fehlen die SGZ, können durch das Cochlea-Implantat keine
elektrisch evozierten Potentiale der aufsteigenden Hörbahn generiert werden. Der Erhalt
vieler SGZ stellt damit ein wichtiges Ziel zur Verbesserung der Funktion der CochleaImplantate dar. Mittels Messung elektrisch evozierter akustischer Hirnstammpotentiale
(EABR) wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit die funktionale Effektivität der
Interventionsmethoden in den elektrisch stimulierten Versuchstieren untersucht. Die
Ergebnisse zeigen eine Korrelation zwischen dem ermittelten Überleben der SGZ und
der Veränderung der elektrischen Hörschwellen im Versuchsverlauf. Ein Absinken der
Hörschwelle bedeutete hierbei eine Verbesserung, ein Anstieg der Reizschwelle eine
Verschlechterung der cochleaeren Funktion.
Die GDNF+ES-Gruppe wies sowohl die höchste Dichte überlebender SGZ als auch die
stärkste Erniedrigung der EABR-Hörschwelle auf. Auch die Tiere, welche mit
artifizieller Perilymphe und bipolarer elektrischer Stimulation behandelt wurden
(AP+ES(B)-Gruppe) zeigten eine hohe mittlere Dichte der SGZ und ein stetiges Sinken
der Hörschwelle während des Versuchsverlaufs. Die mittleren Hörschwellen der
DEX+ES-Gruppe und der BDNF+ES-Gruppe stiegen im Versuchsverlauf zunächst an,
vielen bis zum 48. Tag jedoch auf einen niedrigeren Wert als den am 21. Versuchstag
gemessenen ab. Korrelierend zeigten beide Gruppen hohe Überlebensraten der SGZ. In
der monopolar stimulierten Versuchsgruppe (AP+ES(M)-Gruppe) verschlechterte sich
die durchschnittliche Hörschwelle verglichen mit der Ausgangshörschwelle um 30 µV
und die Dichte der überlebenden SGZ war, verglichen mit den anderen elektrisch
stimulierten Gruppen, die niedrigste.
Eine Reihe möglicher singulärer oder additiv wirkender Mechanismen kommen für die
Verbesserungen der elektrischen Hörschwellen in Frage. Zunächst zeigen die
Ergebnisse, dass die Wachstumsfaktoren und die elektrische Stimulation die Dichte der
überlebenden SGZ im Vergleich zu unbehandelten Cochleae erhöht. Somit stehen der
elektrischen Stimulation vermehrt vitale Neuronen zur Depolarisation zur Verfügung.
Dies erniedrigt die elektrische Hörschwelle, da eine geringere Stromstärke zur
Potentialänderung erforderlich ist.
Weiterhin ist durch in vitro Experimente (LEFEBVRE et al. 1994; WEFSTAEDT 2006)
und in vivo Studien (STAECKER et al. 1996; WISE et al. 2005) bekannt, dass
neurotrophe Faktoren Neuritenaussprossungen fördern können. Wenn sich dieses
Wachstum in Richtung der Elektrode bewegt, wie es STAECKER et al. (1996)
89
demonstrieren konnten, kann vermutet werden, dass dies auch in einer Reduktion der
EABR-Hörschwellen resultiert.
BDNF hat zusätzlich einen großen Effekt auf die Aktionspotentialbildung und die
Verteilung der Kalium-Kanäle in den SGZ der Säugetiere (ADAMSON et al. 2002).
Zudem ist bekannt, dass BDNF durch Aktivierung einer Natrium-Ionen-Weiterleitung
Neuronen des zentralen Nervensystems depolarisiert (BLUM et al. 2002; KAFITZ et al.
1999). Veränderungen der Verteilung und Durchlässigkeit der Ionenkanäle können zu
einer Erniedrigung der neuralen Schwellen führen.
Die Ergebnisse der AP+ES(M)-Gruppe stimmen mit den Resultaten anderer
Arbeitsgruppen, welche über eine Zunahme der EABR-Hörschwelle während des
Implantationszeitraumes
in
ertaubten
Meerschweinchen
berichteten,
überein
(SHEPHERD et al. 2005; SHINOHARA et al. 2002). Die Verschlechterung der
Hörschwelle
beruht
wahrscheinlich
auf
dem
fortschreitenden
Prozess
der
SGZ-Degeneration nach Ertaubung. Die gemessenen durchschnittlichen Hörschwellen
der BDNF+ES-Gruppe zeigen einen ähnlichen Verlauf wie die der AP+ES(M)-Gruppe,
sinken zum Versuchsende jedoch auf einen niedrigeren Wert ab, als zum Zeitpunkt der
Implantation. Es ist davon auszugehen, dass zunächst die Degeneration der SGZ und die
damit verbundene Erhöhung der EABR-Hörschwelle überwiegt, dann jedoch die
Wirkung des BDNF verstärkt hervor tritt.
Die präsentierten Daten belegen eine, durch die Kombination aus Wachstumsfaktoren
und elektrischer Stimulation hervorgerufene, Verbesserung der Funktionalität der
Cochlea. Die Erniedrigung der elektrischen Hörschwelle nach Anwendung der
Kombinationsstimuli steht in direktem Zusammenhang zu der klinischen Anwendung
von Cochlea-Implantaten. Je niedriger die elektrische Hörschwelle liegt, desto geringer
ist die zur Generierung von Höreindrücken benötigte Stromstärke. Zum einen ist durch
eine minimierte Stromstärke eine anatomisch genauere Stimulation der cochleaeren
Strukturen möglich. Bei hohen Stimulusintensitäten besteht ein großes elektrisches
Feld, welches unter Umständen angrenzende Strukturen wie den Nervus facialis oder
das Gleichgewichtsorgan mitbeeinflusst. Zum anderen erniedrigt sich durch eine
geringere Stromstärke der Energieverbrauch. Dies hat praktische Vorteile für die
Patienten, da sich die Batterielebensdauer erhöht.
90
6.2
Überleben der Spiralganglienzellen in den ertaubten, nicht
implantierten Cochleae
Um auszuschließen, dass die einseitige cochleaere Applikation der neurotrophen
Faktoren Einfluss auf die kontralaterale Cochlea ausübt, wurden die Überlebensraten
der SGZ der ertaubten, nicht implantierten Cochleae miteinander verglichen. Frühere
Untersuchungen konnten unilateral intracochleaer applizierte Substanzen auch in der
assoziierten kontralateralen Cochlea detektieren, beziehungsweise deren biologische
Wirkungen auch kontralateral nachweisen (LALWANI et al. 1997, 1998; STÖVER et
al. 2000b). Die Ursache hierfür wird in der Substanzausbreitung aus der Perilymphe der
inokulierten Sc. tympani, über den Ductus cochlearis in den Liquor, und von dort, über
den kontralateralen Ductus cochleari,s zur gegenüberliegenden Cochlea gesehen
(STÖVER et al. 2000b).
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die durchschnittlichen Dichten der
überlebenden SGZ der ertaubten, nicht implantierten Cochleae in allen Versuchsgruppen dieser Studie nahezu identisch waren. Die Gegenüberstellung der mittleren
Dichte der Neuronen der linken Cochleae der verschiedenen Therapiegruppen jedoch
zeigte statistisch signifikante Differenzen. Ebenso statistisch signifikant fiel der
Vergleich der durchschnittlichen Dichten überlebender SGZ der linken (behandelten
Cochleae) abzüglich der der assoziierten rechten Cochleae aus. Dies lässt den Schluss
zu, dass die linksseitigen Substanzapplikationen keinen Einfluss auf die kontralateralen
Cochleae hatten.
Um sicher zu stellen, dass die durchschnittlichen Dichten, durch die Interventionen
überlebender, SGZ verglichen wurden, nutzten wir die rechtsseitig detektierte Dichte
der SGZ als Basiswert der Zelldichte. Dieser Basiswert gab, da von der jeweiligen
Therapie unbeeinflussten, das Überleben der SGZ nach 48 Tagen Taubheit je Tier
wieder. Auf diesen Wert wurde die durchschnittliche, durch Implantation,
Substanzapplikation und/oder elektrische Stimulation manipulierte Dichte der SGZ der
kontralateralen Cochlea bezogen. Die Differenz der Dichten der SGZ der linken und
rechten Cochlea eines Tieres gab die durch die jeweils angewendete Intervention
überlebenden Spiralganglienzellen pro Tier an. Der Vergleich der durchschnittlichen
Dichten der überlebenden SGZ jeder Experimentalgruppe erlaubte die Beurteilung des
protektiven Effekts der jeweiligen Therapie auf die SGZ nach dreiwöchiger Ertaubung.
91
6.3
Beurteilung der Dichten überlebender
Spiralganglienzellen in den mit AP und DEX behandelten
Cochleae
Zwei Versuchsgruppen wurden weder Nervenwachstumsfaktoren appliziert noch
wurden sie elektrisch stimuliert. Eine dieser Gruppen wurde mit artifizieller Perilymphe
behandelt (AP-Gruppe). Die Dichte der überlebenden SGZ dieser Gruppe diente als
Basiswert für die Beurteilung der Überlebensraten der SGZ der anderen Versuchsgruppen. Die zweite Gruppe wurde mit Dexamethason behandelt (DEX-Gruppe).
Anhand dieser Gruppe sollte das Bindegewebswachstum in implantierten Cochleae
untersucht werden. Zudem stellte sie eine Vergleichsgruppe zur Beurteilung des in der
DEX+ES-Gruppe ermittelten Überlebens der SGZ dar. Beide Gruppen (AP- und
DEX-Gruppe) geben die Dichte überlebender SGZ nach 48 Tagen Taubheit und
Manipulation durch die Insertion des Elektrodenträgers wieder.
Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl die AP-Gruppe als auch die DEX-Gruppe in den
implantierten Cochleae eine geringere durchschnittliche Dichte der überlebenden SGZ
aufweist, als in den jeweils zugehörigen kontralateralen Cochleae. Der Vergleich der
durchschnittlichen Dichten überlebender SGZ der AP-Gruppe und der DEX-Gruppe
ergab keinen signifikanten Unterschied. Da davon auszugehen ist, dass sowohl
artifizielle Perilymphe als auch Dexamethason, in einer Konzentration von 100 ng/ml,
keine toxische Wirkung auf die Spiralganglienzellen hatten (SHIRWANY et al. 1998;
TAKEMURA et al. 2004), lässt sich vermuten, dass der Vorgang der Applikation von
Substanzen und/oder die chirurgische Intervention zu einer gesteigerten Degeneration
der SGZ führten. Diese Vermutung wird von SHEPHERD et al. (2005) unterstützt,
welche in ertaubten und mit AP behandelten Cochleae eine geringere Dichte
überlebender SGZ vorfanden, als in den assoziierten ertaubten, aber ansonsten
unbehandelten Cochleae.
Im Rahmen der Auswertung des SGZ-Überlebens wurde neben der Kontrolle der
Zerstörung des Cortischen Organs und des Bindegewebswachstums in der Scala
tympani auch auf eventuelle Beschädigungen der intracochleaeren Strukturen durch das
Implantat geachtet. Obwohl histologisch keine Defekte identifiziert wurden kämen
dennoch Mikroläsionen der Stria vascularis, welche Störungen der Homöostase der
Perilymphe bedingen könnten, in Frage. Eine verschlechterte oder unterbleibende
Nährstoffversorgung der Nervenzellen und somit eine beschleunigte Degeneration
gegenüber der nicht implantierten Seite wäre die Folge. Zukünftige mikrostrukturelle
92
Untersuchungen der Cochlea könnten hier möglicherweise zusätzliche Informationen
ergeben.
6.4
Bewertung der Spiralganglien-Überlebensrate nach
chronischer elektrischer Stimulation
Zur Untersuchung der Effekte einer drei Wochen nach Ertaubung verzögert
einsetzenden elektrischen Stimulation (ES) auf das Überleben der SGZ wurden
Meerschweinchen mit einem Elektroden-Mikropumpensystem versorgt. Um zusätzlich
die Auswirkung der Positionierung der Elektrodenkontakte zu untersuchen, wurden
zwei Versuchsgruppen gebildet. Eine Gruppe wurde mit einem monopolaren
Elektroden-Mikropumpensystem implantiert (AP+ES(M)-Gruppe) und eine zweite
Gruppe mit einem bipolaren Modell (AP+ES(B)-Gruppe).
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die durchschnittliche SGZ-Dichte
der mit elektrischer Stimulation therapierten Cochleae der AP+ES(B)-Gruppe höher lag
als die der assoziierten nicht therapierten Cochleae. Die mittlere Überlebensrate der
SGZ der AP+ES(M)-Gruppe war in den elektrisch stimulierten Cochleae signifikant
höher als in den zugehörigen ertaubten, aber ansonsten unbehandelten Cochleae
(p < 0,05). Keine signifikanten Unterschiede waren hinsichtlich des Protektionsvermögens der monopolaren und bipolaren Stimulationsmethode feststellbar.
Somit belegen die Daten, dass auch eine 24 Tage nach Ertaubung einsetzende
chronische elektrische Stimulation die SGZ vor sekundärer Degeneration schützt. Zur
Erzielung des gesteigerten Überlebens der SGZ kann demnach sowohl monopolare als
auch bipolare Stimulation angewendet werden.
Dieses Resultat stellt eine wesentliche Ergänzung früherer Studien dar, welche den
steigernden Effekt der elektrischen Stimulation auf die Überlebensrate der SGZ
untersuchten. MITCHELL et al. (1997) stimulierten Meerschweinchen ab dem achten
Tag nach Ertaubung und verwendeten die gleichen Stimulationsparameter wie in der
vorliegenden Arbeit. Verglichen mit der Dichte der SGZ in den ertaubten Kontrollcochleae, zeigten die chronisch stimulierten Cochleae eine durchschnittliche Erhöhung
der überlebenden SGZ von 25,7%. In der vorliegenden Studie resultierte die
monopolare elektrische Stimulation, verglichen mit den zugehörigen Kontrollohren, in
einer 25,87%igen Erhöhung der Dichte überlebender SGZ. Die bipolare elektrische
Stimulation steigerte die Überlebensrate der SGZ in den implantierten Cochleae,
93
verglichen mit den zugehörigen Kontrollcochleae, um 30,27%. Dies entspricht
annähernd den von MITCHELL et al. (1997) demonstrierten Daten, obwohl in der
vorliegenden Studie ein um drei Wochen verzögerter Therapiebeginn vorlag. Aufgrund
der unterschiedlichen Verzögerungszeiträume zwischen der Ertaubung und dem
Therapiebeginn bei MITCHELL et al. (1997) und der vorliegenden Arbeit ist davon
auszugehen, dass die von MITCHELL et al. (1997) ermittelten Dichten überlebender
SGZ höher waren, als die in dieser Arbeit ermittelten Dichten. Jedoch gaben
MITCHELL et al. (1997) keine absoluten Zellzahlen die Dichte der überlebenden SGZ
betreffend an. Aufgrund der unvollständigen Daten ist kein Vergleich der von ihnen
ermittelten absoluten Dichten der überlebenden SGZ mit den im Rahmen der
vorliegenden Arbeit ermittelten Zellzahlen möglich.
Die in der vorliegenden Studie durch elektrische Stimulation bedingten Dichten
überlebender SGZ und die von MITCHELL et al. (1997) veröffentlichten Daten,
differieren von denen anderer Arbeitsgruppen. Sowohl LOUSTEAU (1987) als auch
HARTSHORN et al. (1991) ermittelten in elektrisch stimulierten Meerschweinchen ein
um mindestens 20% höheres Überleben der SGZ als in der vorliegenden Arbeit oder bei
MITCHELL et al. (1997) detektierbar war. LOUSTEAU (1987) und HARTSHORN et
al. (1991) stimulierten die Tiere ab dem zweiten Tag nach Ertaubung (1 Std./Tag) bzw.
direkt beginnend nach der ototoxischen Behandlung (2 Std./ Tag). LOUSTEAU (1987)
fand in den elektrisch stimulierten Cochleae eine um 59,07% höhere mittlere Dichte der
SGZ als in den Kontrollcochleae. HARTSHORN et al. (1991) detektierten bei elektrisch
stimulierten Tieren ein, verglichen zum Kontrollmaterial, durchschnittlich um 50%
höheres Überleben der SGZ. Sowohl LOUSTEAU (1987) als auch HARTSHORN et al.
(1991) stimulierten intermittierend für eine bzw. zwei Stunden am Tag. In dem im
Rahmen dieser Arbeit untersuchten Versuchsmodell hingegen, erfolgte die elektrische
Stimulation 24 Stunden am Tag. Somit ist davon auszugehen, dass die Dauer der
elektrischen Stimulation nicht ausschlaggebend für die von LOUSTEAU (1987) und
HARTSHORN et al. (1991) ermittelten höheren Dichten überlebender SGZ ist.
Vielmehr
lässt sich vermuten, dass das Fehlen einer Therapieverzögerung bei
LOUSTEAU (1987) und HARTSHORN et al. (1991) der Grund für deren effektivere
Protektion der SGZ von mehr als 20% im Vergleich zu den vorliegenden Ergebnissen
ist.
Eine längere Verzögerung des Therapiebeginns führt zu einer verstärkten Degeneration
der SGZ und somit zu einer höheren Dichtereduktion (WEBSTER u. WEBSTER 1981).
94
Dies bedeutet, dass aufgrund der Degenerationskinetik bei verzögert einsetzender
elektrischer Stimulation eine geringere Anzahl SGZ vorhanden ist, die durch die
beginnenden Therapie vor Degeneration geschützt werden kann. Dementsprechend
verringert sich abhängig von der bei Therapiebeginn vorhandenen Ausgangsdichte der
SGZ auch die Dichte der überlebenden SGZ bei Beendigung der Behandlung.
Die Anzahl überlebender SGZ ist mit von entscheidender Bedeutung für die Effektivität
eines Cochlea-Implantats. Die Verringerung des Ausmaßes der Degeneration der Zellen
nach Ertaubung ist somit ein wichtiges Ziel. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass
auch eine, nach Ertaubung verzögert einsetzende, elektrische Stimulation zu einem
signifikant gesteigerten Überleben der SGZ führt. Da Cochlea-Implantat-Patienten in
der Regel erst Wochen bis Monate nach Ertaubung mit einer Prothese versorgt werden,
lassen unsere Ergebnisse darauf schließen, dass auch im Menschen durch die
Stimulation mittels Cochlea-Implantat potentiell eine Protektion der verbliebenen
Spiralganglienzellen möglich sein sollte.
6.5
Effekte einer verzögerten Therapie mittels neurotropher
Faktoren auf das Überleben der Spiralganglienzellen
Ein Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung und Gegenüberstellung der
neuroanatomischen Reaktionen der ertaubten Cochlea auf eine 21 Tage nach Ertaubung
verzögert einsetzende Therapie mittels Glial cell line-derived neurotrophic factor
(GDNF, 100 ng/ml) und Brain derived neurotrophic factor (BDNF, 50 ng/ml).
Die
Ergebnisse
belegen,
dass
eine
chronische
intracochleaere
Applikation
rekombinanten GDNFs zu einer signifikanten Protektion der SGZ vor sekundärer
Degeneration führt. Auch exogenes BDNF bewirkte eine Steigerung der Überlebensrate
der SGZ verglichen zur Kontrollgruppe. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die
untersuchten neurotrophen Faktoren (NTF) auch bei einer Therapieverzögerung von 21
Tagen eine Erhöhung der Dichte überlebender SGZ bewirken. In der BDNF-Gruppe
variierten die Überlebensraten der SGZ der einzelnen Cochleae stark. Dies bedingte
große Standardabweichungen, welche vermutlich dafür verantwortlich sind, dass bei der
statistischen Auswertung, verglichen mit der Kontrollgruppe, keine Signifikanzen
nachweisbar waren.
Die vorliegenden Ergebnisse erweitern zum Teil die Resultate anderer Arbeiten
erheblich. MILLER et al. (1997) konnten zeigen, dass BDNF in einer Konzentration
95
von
50 ng/ml, sieben Tage nach Ertaubung verabreicht, einen signifikanten Schutz
der SGZ vor Degeneration bietet. Auch bei 14 Tage verzögertem Behandlungsbeginn
konnte eine Minderung der SGZ-Degeneration festgestellt werden (GILLESPIE et al.
2004), wobei in diesem Fall jedoch eine um den Faktor Tausend höhere Konzentration
(65,2 µg/ml) verwendet wurde. In der vorliegenden Arbeit wurde nachgewiesen, dass
BDNF auch bei einer Therapieverzögerung von drei Wochen, und unter Verwendung
einer sehr viel niedrigeren Konzentration, eine starke Protektion der SGZ bewirken
kann.
WEBSTER und WEBSTER (1981) untersuchten unterschiedliche Ertaubungsmethoden
an Meerschweinchen. Sie demonstrierten, dass eine Kombination aus Kanamycin und
Ethacrynsäure binnen 2 Wochen nach Behandlung zu einem signifikanten Verlust der
Neuronen führt.
Den Ergebnissen von WEBSTER und WEBSTER (1981) folgend betrug die
Behandlungsverzögerung in der vorliegenden Arbeit 21 Tage, so dass eine signifikante
Spiralganglienzelldegeneration, wie sie in humanen CI-Patienten vorliegt, gewährleistet
war.
Im Gegensatz zu den Ergebnissen anderer Forschungsgruppen, welche GDNF als
erfolgreiche Substanz zur Protektion von SGZ nach Ertaubung identifizierten, zeigen
die Zellzählungen der vorliegenden Arbeit in den GDNF-behandelten Cochleae eine
geringere SGZ-Dichte von 4,09 Zellen/ 10.000 µm2. YLIKOSKI et al. (1998) ermittelten im Rahmen ihrer Versuche 8,7 ± 0,9 SGZ auf 10.000 µm2 Fläche der Rosenthalschen Kanäle GDNF-behandelter Cochleae. YAGI et al. (2000) fanden ungefähr 25
SGZ und KANZAKI et al. (2002) durchschnittlich 9 SGZ auf 10.000 µm2.
In
den
genannten
Arbeiten
wurde
GDNF
oder
ein
entsprechender
GDNF-exprimierender Vektor entweder direkt nach Applikation ototoxischen Substanzen bzw. maximal 7 Tage nach Lärmexposition verabreicht.
Die Ursache für die Differenz bezüglich der SGZ-Überlebensraten verglichen mit
unseren Ergebnissen liegt vermutlich in der von uns angewendeten längeren
Therapieverzögerung von 21 Tagen begründet. Hintergrund dieser Annahme ist die
Degenerationskinetik, welcher die Spiralganglienzellen unterliegen (WEBSTER u.
WEBSTER 1981).
96
6.6
Beurteilung der protektiven Effekte einer verzögerten
kombinierten Therapie aus Nervenwachstumsfaktoren
und elektrischer Stimulation auf Spiralganglienzellen
Ein übergeordnetes Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Effekte
einer synchronen Therapie aus Nervenwachstumsfaktoren (NTF) und elektrischer
Stimulation auf das Überleben der SGZ nach Ertaubung. Es sollte ermittelt werden, ob
die Kombinationstherapie auch nach einem Verzögerungsintervall zwischen Ertaubung
und Therapiebeginn protektiv auf überlebende SGZ wirkt. Zudem wurde die Fragestellung bearbeitet, ob der protektive Effekt der Kombination aus NTF und elektrischer
Stimulation verglichen mit den jeweiligen Einzellinterventionen differiert. GDNF
(100 ng/ml) und BDNF (50 ng/ml) wurden ab dem 21. Tag nach systemischer
Ertaubung chronisch intracochleaer appliziert. Die elektrische Stimulation begann am
24. Versuchstag und wurde bis zum Versuchsende (Tag 48) fortgeführt.
Mit der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine synchrone Behandlung
mit GDNF bzw. BDNF und einer elektrischen Stimulation in einer statistisch
signifikanten Zunahme der überlebenden Spiralganglienzellen resultiert. Zudem belegen
die Daten, dass dieser Effekt auch nach einer Therapieverzögerung von drei Wochen
erreicht wird. Weiterhin zeigen die Ergebnisse, dass die Kombinationstherapien einen
effektiveren Schutz der SGZ bieten als die jeweiligen Einzelstimuli. Die GDNF+ESGruppe zeigte, verglichen mit der GDNF-Therapie, ein signifikant gesteigertes
Überleben der SGZ. Der Vergleich der SGZ-Überlebensraten der GDNF+ES-Gruppe
und der AP+ES(M)-Gruppe zeigte einen hoch signifikanten Unterschied. Die Erhöhung
der Dichte der überlebenden SGZ durch den Kombinationsstimulus aus BDNF und
elektrischer Stimulation übertraf jene, welche in der BDNF-Gruppe detektiert wurde um
durchschnittlich 0,59 Zellen/ 10.000 µm2. Gegenüber der AP+ES(B)-Gruppe erhöhte
sich die durchschnittliche Dichte der SGZ um 0,50 Zellen/ 10.000 µm2. Der Vergleich
der Effekte der GDNF+ES- und BDNF+ES-Behandlung zeigt keine statistisch
signifikanten Unterschiede.
Vorangegangene Arbeiten untersuchten den, zwar nicht um Wochen nach Ertaubung
verzögert einsetzenden, doch kombinierten Effekt aus zeitgleicher GDNF-Applikation
und elektrischer Stimulation (KANZAKI et al. 2002). Das Ergebnis der vorliegenden
Arbeit, welches belegt, dass eine GDNF Behandlung in Kombination mit elektrischer
Stimulation, verglichen zu den jeweiligen Einzeltherapien, ein signifikant gesteigertes
97
Überleben der SGZ bewirkt, stimmt grundsätzlich mit den Befunden von KANZAKI et
al. (2002)
überein. Kanzaki und Mitarbeiter ertaubten Meerschweinchen mittels
Kanamycin und Ethacrynsäure, applizierten einmalig GDNF exprimierende adenovirale
Vektoren (AdGDNF) und begannen die elektrische Stimulation acht Tage nach der
ototoxischen Behandlung für 35 Tage. In diesem Versuchsregime zeigte die
durchschnittliche Dichte der überlebenden SGZ der GDNF+ES-Gruppe verglichen mit
derjenigen der GDNF-Gruppe und der ES-Gruppe eine signifikante Erhöhung mit
p < 0,05. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen die Daten von KANZAKI
et al. (2002) bezüglich des Vergleichs der GDNF+ES-Gruppe und der GDNF-Gruppe
mit p < 0,05. Darüber hinaus zeigte der statistische Vergleich der Dichten der überlebenden SGZ in der GDNF+ES-Gruppe und der ES-Gruppe in der vorliegenden Arbeit
mit p < 0,01 eine noch höhere Signifikanz.
Die Stimulationskonditionen waren in beiden Versuchsreihen, abgesehen von der
verwendeten Stromstärke (Kanzaki: 100 µA; hier: 8 dB oberhalb der elektrischen
Hörschwelle), identisch. Die Signifikanzen zwischen der GDNF+ES- und der
GDNF-Gruppe fielen bei beiden Experimenten gleich aus. Das legt die Vermutung
nahe, dass die im Rahmen der beiden Experimente unterschiedlich stark ausgeprägten
protektiven Effekte der GDNF+ES-Gruppe verglichen mit der ES-Gruppe (KANZAKI
et al. 2002: p < 0,05; in der vorliegenden Arbeit: p < 0,01) in den unterschiedlichen
Applikationsmethoden begründet liegt. Kanzaki und Mitarbeiter untersuchten die
Effektivität der vektorvermittelten GDNF-Expression in der Cochlea und bewiesen,
dass im Rahmen des Versuches eine GDNF-Synthese gewährleistet war. Doch diese
Detektion erfolgte nur qualitativ. Bis heute bestehen kaum Möglichkeiten bei, durch
virale Vektoren vermittelter, Proteinexpression die Freisetzungsrate und somit die
Konzentration des synthetisierten Proteins im Innenohr zu bestimmen. KANZAKI et al.
(2002) bewiesen mit ihrer Arbeit, dass GDNF in Kombination mit ES additiv
protektierend auf SGZ wirkt. Diese Erkenntnis lieferte einen neuen Ansatzpunkt zur
Erforschung neuer Methoden zur Optimierung der Effektivität von Cochlea Implantaten. Um genauere Informationen bezüglich des betreffenden Proteins und seiner
Wirkung, deren Mechanismen und eventueller toxischer Effekte zu erhalten, bedarf es
der Kenntnis der verwendeten Konzentrationen. Mit dem Applikationssystem der
Mikropumpen konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit das reine Protein in einer
genau definierten Konzentration über einen exakt bestimmbaren Zeitraum am
gewünschten Zielort freigesetzt werden.
98
Unsere Ergebnisse zeigen, dass 100 ng/ml GDNF, ab dem 21. Tag nach Ertaubung für
einen Zeitraum von 4 Wochen chronisch intracochleaer injiziert, in Kombination mit
elektrischer Stimulation zu einer hoch signifikanten Steigerung der Überlebensrate der
Spiralganglienzellen führt.
Die in dieser Arbeit untersuchte Kombination aus BDNF und synchroner bipolarer
elektrischer Stimulation resultierte, verglichen zu der Kontrollgruppe, in einer statistisch
signifikanten Zunahme der Dichte der überlebenden SGZ. Diese Erhöhung der Dichte
der Neuronen in der BDNF+ES-Gruppe übertraf auch die in der BDNF-Gruppe
ermittelte durchschnittliche Dichte überlebender SGZ. Die Zunahme des trophischen
Effektes des exogenen BDNFs auf die SGZ durch die chronische elektrische
Stimulation wurde auch im Rahmen vorhergehender Arbeiten, welche keine
Therapieverzögerung anwendeten, beschrieben (SHEPHERD et al. 2005). Die
Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegen, dass auch eine drei Wochen nach akutem
sensorineuralen Hörverlust verzögert einsetzende chronische Kombinationstherapie aus
BDNF
und
elektrischer
Stimulation
den
protektiven
Effekt
der
alleinigen
BDNF-Therapie auf die SGZ übertrifft.
Verschiedene Mechanismen, bzw. eine Kombination aus diesen, könnten für den
additiven Effekt der Therapie aus neurotrophen Faktoren und elektrischer Stimulation
ursächlich in Frage kommen. Zum einen ist bekannt, dass neuronale Aktivität, also auch
der Stimulus der elektrischen Stimulation, durch Hochregulation der Transkription des
BDNF-Gens, die Sekretion endogenen BDNFs in verschiedensten Neuronen steigert
(ROCAMORA et al. 1996; NANDA u. MACK 2000; BALKOWIECK u. KATZ 2000;
LU 2003). Zum anderen kann hochfrequente, durch elektrische Stimulation induzierte,
neuronale Aktivität die Anzahl der BDNF spezifischen TrkB-Rezeptoren auf
Oberfläche
von
Neuronen
des
zentralen
Nervensystems
der
hochregulieren
(MEYER-FRANKE et al. 1998; DU et al. 2000). Ebenso können die GDNF-Rezeptoren
GFR-α1 und – α2 durch Depolarisation der Zellmembranen vermehrt exprimiert werden
(DOXAKIS et al. 2000). Durch die erhöhte Rezeptorzahl kann die elektrische
Stimulation zu einer verstärkten Wirkungsweise von BDNF und GDNF in den
Spiralganglienzellen führen. Es ist jedoch zu bemerken, dass dieser Effekt die
peripheren Neurone, und somit die Spiralganglienzellen betreffend, noch nicht
nachgewiesen wurde.
99
Die beschriebenen Mechanismen können in einer, die Effekte der Applikation der
exogenen neurotrophen Faktoren steigernden, trophischen Aktivität resultieren. Dies
erklärt jedoch nicht die anatomisch teilweise bis zum Apex der Cochlea reichende
Erhöhung der Dichte überlebender SGZ in den mit BDNF+ES und GDNF+ES
therapierten Cochleae. In den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Versuchen
wurden Elektrodenmodelle verwendet, welche lediglich die basale Windung der
Cochlea direkt elektrisch stimulierten (Kontakte 1 und 4 der bipolaren Elektrode,
Ballkontakt der monopolaren Elektrode). Dennoch fand sich eine Protektion der SGZ in
allen Windungen der Cochlea. Dieser weit gestreute trophische Effekt der elektrischen
Stimulation, wurde im Rahmen anderer in vivo Versuche, welche den Effekt der
elektrischen Stimulation untersuchten, als typisch, aber nicht erklärbar, beschrieben
(LEAKE et al. 1999; MITCHEL et al. 1997).
Die vorliegenden Daten belegen, dass auch eine drei Wochen nach akutem sensorineuralen Hörverlust verzögert einsetzende Kombinationstherapie aus GDNF oder
BDNF und elektrischer Stimulation den protektiven Effekt der jeweiligen Einzeltherapie auf die SGZ übertrifft. Dies ist eine neue und wichtige Erkenntnis. Für die
potentielle humane Anwendung bedeutet dies, dass in einer klinischen Situation mit
bereits zeitlich weit zurückliegender Ertaubung eine Kombinationstherapie aus GDNF
und ES oder BDNF und ES sinnvoller sein könnte, als die jeweilige Einzeltherapie.
6.7
Bewertung des Bindegewebswachstums nach
Dexamethason-Applikation
Die Reaktion des Innenohres auf das Cochlea-Implantat wird als Formation eines
bindegewebigen Schlauches um den Elektrodenträger beschrieben. Zusätzlich können,
abhängig vom Ausmaß des Insertionstraumas, Reaktionen wie Ossifikation oder
Bildung von Narbengewebe an den intracochleaeren Strukturen auftreten. Diese
Veränderungen wurden anhand von post mortem durchgeführten Felsenbeinhistologien
beschrieben und werden als Resultat inflammatorischer Prozesse interpretiert.
Dexamethason stellt eine potentielle Intervention zur Vermeidung dieser ungewollten
Nebeneffekte der Implantation des Elektrodenträgers dar. Ab der Insertion der
Elektrode wurden chronisch über 4 Wochen 100 ng/ml DEX in die Cochlea appliziert.
Obwohl
Dexamethason
bekannte
antiinflammatorische
und
immunsuppressive
Eigenschaften besitzt, ließ sich ein solcher Effekt in den vorliegenden Untersuchungen
100
nicht nachweisen. Die Ergebnisse zeigen keine Unterschiede hinsichtlich des Bindegewebswachstums in implantierten Cochleae mit und ohne Dexamethasonapplikation.
Frühere Untersuchungen konnten eine biologische Wirkung des synthetischen
Glukokortikoids Triamcinolon im Innenohr nachweisen (PAASCHE et al. 2006). Es
wurden signifikante Reduktionen der Impedanzen bei Cochlea-Implantat-Patienten nach
einmaliger Applikation einer 20 mg/ml Triamcinolon-Kristallsuspension untersucht.
Aufgrund dieser Befunde vermuteten wir, dass sich die postoperative Bindegewebsneubildung durch Steroidgabe verringern lässt. Die hier ermittelten Ergebnisse können
dies allerdings nicht bestätigen.
Es ist davon auszugehen, dass die operationsbedingten Entzündungsprozesse vier
Wochen nach der Implantation der Elektrode beendet sind. Da das Dexamethason in der
vorliegenden Studie bis zu diesem Zeitpunk chronisch appliziert wurde, ist der
Therapiezeitraum als Ursache für die fehlende Bindegewebsunterdrückung vermutlich
auszuschließen.
Es muss allerdings bedacht werden, dass die Konzentration des Steroids in der
vorliegenden Arbeit (100 ng/ml) eventuell zu gering gewählt war. SHIRWANY et al.
(1998) zeigten, dass 1mg/ml Dexamethason, über vier Wochen einmal wöchentlich in
das Innenohr appliziert, keinen pathologischen Effekt auf die Haarzellen ausübt und
auch die akustischen Hörschwellen nicht signifikant verändert. Weitergehende
Untersuchungen sollten klären, ob höhere Dexamethasonkonzentrationen als die in der
vorliegenden Studie gewählten, eventuell geeignet sind, die für die Optimierung des
Nerven-Elektrodenkontaktes gewünschte Bindegewebsreduktion zu erzielen. Auch ist
die Verwendung von kristalloiden Suspensionen, wie von PAASCHE et al. (2006)
beschrieben, eine weitere Möglichkeit einen reproduzierbaren pharmalologischen Effekt
auf die Bindegewebsneubildung zu erzielen.
6.8
Einfluss von Dexamethason auf den Effekt der
elektrischer Stimulation
Ein weiteres Teilziel dieser Arbeit war die Untersuchung des Einflusses von
Glukokortikoiden auf den protektiven Effekt der elektrischen Stimulation auf die SGZ.
Hierfür wurden 100 ng/ml Dexamethason bei zeitgleicher elektrischer Stimulation in
die Cochlea appliziert.
101
Die Ergebnisse zeigen, dass die alleinige monopolare elektrische Stimulation der
Cochlea zu einer statistisch signifikanten Erhöhung der mittleren Dichte überlebender
SGZ führt (p < 0,05). Die Kombination der elektrischen Stimulation mit Dexamethason
führt ebenso zu einer Protektion der SGZ (p < 0,01). Der direkte Vergleich beider
Gruppen ergab keinen signifikanten Unterschied. Dieses Ergebnis belegt, dass
Dexamethason keinen negativen Effekt auf die das Überleben der SGZ steigernde
Wirkung der elektrischen Stimulation ausübt.
Dexamethason, in einer Konzentration von 100 ng/ml verabreicht, könnte in
Verbindung mit Cochlea-Implantaten lokal als Antiinflammativum eingesetzt werden.
Es würde den das Überleben der SGZ beeinflussenden Effekt der Depolarisation durch
das Implantat nicht beeinträchtigen.
102
7
Zusammenfassung
Verena Scheper (2007):
Elektrophysiologische und histologische Untersuchungen zum protektiven Effekt
von Glial cell line-derived neurotrophic factor, Brain-derived neurotrophic factor,
Dexamethason
und
Elektrostimulation
auf
Spiralganglienzellen
ertaubter
Meerschweinchen
Hörminderung und Taubheit stellen in den industrialisierten Nationen eine der am
weitesten verbreiteten Krankheiten dar. Die Behandlung taub geborener und ertaubter
Patienten ist in den letzten Jahren durch die Einführung künstlicher elektronischer
Innenohrprothesen, so genannter Cochlea-Implantate (CI), revolutioniert worden.
Inzwischen ist die CI-Versorgung die weitläufig anerkannte Routinebehandlung von
Patienten mit vollständigem sensorineuralen Hörverlust. Allerdings gibt es nach wie vor
große individuelle Unterschiede hinsichtlich des Erfolges, der mit einem CI erreicht
wird.
Eine Erklärung für diese Variabilität könnte in der Anzahl der für eine elektrische
Stimulation zur Verfügung stehenden Spiralganglienzellen (SGZ) liegen. Da das CI die
Funktion der geschädigten Haarzellen durch eine direkte elektrische Stimulation der
SGZ übernimmt, ist der Erfolg eines CI’s auch von der Anzahl der für eine elektrische
Stimulation zur Verfügung stehenden SGZ abhängig. Diese unterliegen nach
Haarzellverlust einer Degeneration, welche mit der Dauer der Taubheitsphase
fortschreitet.
Neurotrophe Faktoren wie Glial cell line-derived neurotrophic factor
(GDNF) und Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) sowie elektrische Stimulation
bewirken, als Einzel- und Kombinationsstimuli direkt nach Ertaubung appliziert, eine
Protektion der SGZ vor Degeneration. Unklar war vor der Durchführung dieser Arbeit,
ob die Degeneration der SGZ auch bei verzögert einsetzender Therapie verlangsamt,
oder gar gestoppt werden kann.
Neben einer möglichst großen Anzahl vitaler SGZ ist für eine optimale Versorgung mit
einem CI eine enge Nerven-Elektroden-Interaktion von Bedeutung. Diese kann durch
eine Minimierung implantationsbezogener Bindegewebsneubildung im Bereich der
inserierten Elektrode verbessert werden. Dexamethason ist aufgrund seiner bekannten
anti-inflammatorischen und anti-proliferativen Eigenschaften bei lokaler Applikation
103
ins Innenohr potentiell geeignet, unerwünschte Bindegewebsbildungen im Bereich der
implantierten
CI-Elektoden
zu
minimieren
und
damit
für
eine
verbesserte
Nerven-Elektroden-Interaktion zu sorgen.
Die Ziele der vorliegenden Arbeit waren die quantitative Bestimmung der
SGZ-Überlebensraten sowie die Untersuchung der Funktionalität der Cochlea nach
fortgeschrittener Taubheit. Zusätzlich sollte die Wirkung Dexamethasons auf die
Gewebsreaktionen nach Elektrodeninsertion sowie auf den das SGZ-Überleben
steigernden Effekt der elektrischen Stimulation untersucht werden. Folgende
experimentelle Bedingungen wurden an 49 Meerschweinchen untersucht:
-
Einzelstimuli: GDNF (100 ng/ml, n=6), BDNF (50 ng/ml, n=6), Dexamethason
(100 ng/ml, n=6), monopolare (AP+ES(M), n=6) und bipolare
(AP+ES(B), n=3) elektrische Stimulation (ES)
-
Kombinationsstimuli: GDNF+ES(M, n=5), BDNF+ES(B, n=5),
Dexamethason+ES(M, n=5)
-
Kontrollgruppe: artifizielle Perilymphe (AP, n=7)
Die Versuche wurden unter Anwendung nachfolgender Methoden und Konditionen
durchgeführt:
-
Elektrophysiologische Bestimmung der akustischen (AABR) und
elektrischen (EABR) Hörschwellen
-
Mikrochirurgische systemische Ertaubung
-
Implantation der Elektroden-Mikropumpensysteme
-
Pumpenwechsel
-
Materialgewinnung
-
Histologische quantitative Bestimmung der Dichten der SGZ
(Zahl der protektierten SGZ/ 10.000 µm2)
Tag 0: Messung der akustischen Hörschwelle, Ertaubung; Tag 5: Messung der
akustischen Hörschwelle; Tag 21: Messung der akustischen Hörschwelle, Implantation;
Tag 24: Beginn der elektrischen Stimulation (stimulierte Tiere); Tag 28: Messung der
elektrischen Hörschwelle, Justierung des Stimulators (stimulierte Tiere); Tag 34:
Messung der elektrischen Hörschwelle, Justierung des Stimulators (stimulierte Tiere),
Pumpenwechsel; Tag 41: Messung der elektrischen Hörschwelle, Justierung des
Stimulators (stimulierte Tiere); Tag 48: Messung der elektrischen Hörschwelle
(stimulierte Tiere), Materialgewinnung, Aufarbeitung der Cochleae, mikroskopische
quantitative Bestimmung der Dichten überlebender SGZ.
104
Die Ergebnisse der Arbeit belegen ein verbessertes Überleben der SGZ nach 3 Wochen
verzögerter Anwendung von GDNF (p < 0,01; 1,08 ± 0,76 SGZ/ 10.000 µm2) im
Vergleich zu der Kontrollgruppe (-0,45 ± 0,61 SGZ/ 10.000 µm2). Die BDNF-Therapie
führte gegenüber der Kontrollgruppe zu keiner signifikanten Erhöhung der
SGZ-Überlebensrate (1,10 ± 2,93 SGZ/ 10.000 µm2). Der Vergleich der protektiven
Effekte der beiden Nervenwachstumsfaktoren zeigte keinen Unterschied. Die
monopolare und die bipolare elektrische Stimulation führten, verzögert nach Ertaubung
initiiert, zu einer gesteigerten Überlebensrate der SGZ (p < 0,05; AP+ES(M): 0,74 ±
0,72 SGZ/ 10.000 µm2, AP+ES(B): 1,19 ± 0,79 SGZ/ 10.000 µm2). Auch die elektrischen Hörschwellen der chronisch stimulierten Versuchsgruppen zeigten im Versuchsverlauf eine Verbesserung. Die Kombinationstherapie aus neurotrophen Faktoren und
elektrischer Stimulation bewirkte, trotz der verzögerten Therapieeinleitung, einen zum
Teil hoch signifikanten synergistischen, die SGZ protektierenden, Effekt (GDNF+ES:
p < 0,001; 2,46 ± 0,76 SGZ/ 10.000 µm2); BDNF+ES: p < 0,05; 1,69 ± 0,82
SGZ/ 10.000 µm2). Dieser spiegelte sich auch funktionell in einer Reduktion der
elektrischen Hörschwelle im Versuchsverlauf wider. Die Dexamethasonapplikation
konnte
postoperatives
Gewebewachstum
nicht
verhindern.
Die
Kombination
Dexamethasons mit elektrischen Stimulation führte zu einer Protektion der SGZ
(p < 0,01; 2,05 ± 1,72 SGZ/ 10.000 µm2). Somit übt Dexamethason keinen negativen
Effekt auf die das Überleben der SGZ steigernde Wirkung der elektrischen Stimulation
aus.
Diese Ergebnisse sind innovativ und haben ein großes klinisches Anwendungspotential.
Die gewählten Versuchsbedingungen entsprechen viel eher der klinischen Situation, bei
der eine Cochlea-Implantat-Versorgung ebenfalls erst mit einem zeitlichen Verzug nach
Ertaubung durchgeführt wird. Die gewonnen Daten belegen, dass die nach Ertaubung
einsetzende Degeneration der SGZ mit verzögert initiierten Therapien positiv
beeinflusst werden kann. Die kombinierte Intervention aus Nervenwachstumsfaktoren
und elektrischer Stimulation erwies sich, im Vergleich zu den jeweiligen Einzelstimuli,
als hochgradig geeignet diesen Effekt hervorzurufen. Die Ergebnisse sind sehr
ermutigend hinsichtlich einer zukünftigen klinischen Anwendung einer elektrischen
Stimulation des Hörnerven durch ein Cochlea-Implantat bei gleichzeitiger lokaler
Applikation von
Implantate.
Nervenwachstumsfaktoren zur Steigerung der Effektivität der
105
8
Summary
Verena Scheper (2007):
Electrophysiological and histological investigations into the protective effect of
glial cell-line derived neurotrophic factor, brain-derived neurotrophic factor,
dexamethasone and electrical stimulation on spiral ganglion cells of deafened
guinea pigs
Hearing loss – ranging from mild hearing loss to total deafness – is one of the most
widespread diseases in the industrialised countries. The treatment of individuals with
congenital or acquired deafness has been revolutionized in the past years by the
introduction of artificial electronic inner ear prostheses, so-called cochlear implants
(CI). Meanwhile cochlear implantation has become widely accepted as routine
treatment for patients with complete sensorineural hearing loss. However, there are still
large individual differences in the level of success achieved with a cochlear implant.
One explanation for this variability could lie in the number of spiral ganglion cells
(SGC) available for electrical stimulation. As the CI takes over the function of the
damaged hair cells by means of direct electrical stimulation of the SGC, the success of a
CI also depends on the number of SGC available for electrical stimulation. After hair
cell loss, these undergo degeneration, which progresses with ongoing deafness.
Neurotrophic factors such as glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) and
brain-derived neurotrophic factor (BDNF) as well as electrical stimulation, if applied as
single and combined stimuli directly after the onset of deafness, protect SGC from
degeneration. Prior to starting this work it was not clear whether SGC degeneration can
be slowed down or even stopped if the commencement of therapy is delayed.
Apart from the fact that as large a number of vital SGC as possible must be available,
good nerve-electrode interaction is of great importance in order to achieve optimum
results with a cochlear implant. This can be improved by minimising implantationrelated connective tissue growth around the inserted electrode. Due to its well-known
eurosi lammatory and antiproliferative effects after local application into the inner
ear, dexamethasone is potentially suitable to reduce unwanted connective tissue growth
around implanted CI electrodes and thus enhances improved nerve-electrode
interaction.
106
The aims of this work were the quantitative determination of SGC survival rates and the
investigation of cochlear functionality following advanced deafness. In addition, the
effect of dexamethasone on the tissue reaction after electrode insertion and on SGC
survival following electrical stimulation was to be examined. The following
experimental conditions were tested in 49 guinea pigs:
-
single stimuli: GDNF (100 ng/ml, n=6), BDNF (50 ng/ml, n=6), Dexamethasone
(100 ng/ml, n=6), monopolar (AP+ES(M), n=6) and bipolar (AP+ES(B), n=3)
electrical stimulation (ES)
-
combined stimuli: GDNF+ES(M, n=5), BDNF+ES(B, n=5),
dexamethasone +ES(M, n=5)
-
control group: artificial perilymph (AP, n=7)
The experiments were conducted while applying the following methods and conditions:
-
electrophysiological determination of acoustic (AABR) and electrical
(EABR) auditory thresholds
-
microsurgical systemic deafness
-
implantation of electrode-micropump-systems
-
pump exchange
-
recovery of material
-
histological quantitative determination of SGC densities (number of
protected SGC/ 10,000 µm2)
Day 0: measurement of the acoustic auditory threshold, deafening; day 5: measurement
of the acoustic auditory threshold; day 21: measurement of the acoustic auditory
threshold, implantation; day 24: commencement of electrical stimulation (stimulated
animals); day 28: measurement of the electrical auditory threshold, adjustment of the
stimulator (stimulated animals); day 34: measurement of the electrical auditory
threshold, adjustment of the stimulator (stimulated animals), pump exchange; day 41:
measurement of the electrical auditory threshold, adjustment of the stimulator
(stimulated animals); day 48: measurement of the electrical auditory threshold
(stimulated animals), recovery of material, histological preparation of the cochleae,
microscopic quantitative determination of the densities of surviving SGC.
107
The results of this work indicate increased SGC survival after GDNF application has
been delayed for three weeks (p < 0.01; 1.08 ± 0.76 SGC/ 10,000 µm2) in comparison to
the control group (-0.45 ± 0.61 SGC/ 10,000 µm2). BDNF therapy did not result in an
increased SGC survival rate (1.10 ± 2.93 SGC/ 10,000 µm2). The comparison of the
protective effect of both nerve growth factors showed no difference. Monopolar and
bipolar electrical stimulation, if initiated after a delay following the onset of deafness,
led to an increased SGC survival rate (p < 0.05, AP+ES(M): 0.74 ± 0.72
SGC/ 10,000 µm2, AP+ES(B): 1.19 ± 0.79 SGC/ 10,000 µm2). The electrical auditory
thresholds of the chronically stimulated test group also improved during the experiment.
Despite delayed initiation of therapy, the combined therapy consisting of neurotrophic
factors and electrical stimulation resulted in a considerably significant synergistic
SGC-protecting effect (GDNF+ES: p < 0.001; 2.46 ± 0.76 SGC/ 10,000 µm2);
BDNF+ES: p < 0.05; 1.69 ± 0.82 SGC/ 10,000 µm2). This effect was also reflected
functionally in a reduction of the electrical auditory threshold during the experiment.
Dexamethasone application was not able to prevent postoperative tissue growth but in
combination with monopolar electrical stimulation increased SGC survival was detected
(p < 0.01; 2.05 ± 1.72 SGC/ 10,000 µm2). Therefore dexamethasone has no negative
effect on the SGC-protective effect of the electrical stimulation.
These results are innovative and have great potential for clinical application. The
experimental conditions chosen correspond to the clinical situation where cochlear
implantation is performed after some delay following the onset of deafness. The data
gathered suggest that SGC degeneration after the onset of deafness can be positively
influenced with delayed therapy. Combined intervention of nerve growth factors and
electrical stimulation proved highly suitable to achieve this effect, even more so than
the single stimuli. These results are very promising towards future clinical application
of electrical stimulation of the auditory nerve induced by a cochlear implant with
simultaneous local application of nerve growth factors to increase the implant’s
effectivity.
108
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125
10 Anhang
10.1 Reagenzien und Lösungen
Ameisensäure
Merck KgaA, Darmstadt
Artifizielle Perilymphe
Zusammensetzung siehe 9.4
BDNF „recombinant human“
R&D Systems, Wiesbaden
Benzol
Merck, Darmstadt
Dexamethason „Fortecortin® Inject 40mg“
Merck, Darmstadt
Entellan®
Merck, Darmstadt
Eosin G
Merck, Darmstadt
Ethanol zur Entwässerung
Merck, Darmstadt
Ethanol, vergällt 70% zur Desinfektion
Medizinische Hochschule Hannover
GDNF „recombinant rat“
R&D Systems, Wiesbaden
Glutardialdehyd (GDA), 25%ig
Merck, Darmstadt
Guinea Pig Serum Albumin, GPSA
Sigma-Albricht Chemie GmbH, Steinheim
Hämalaun nach Mayer
Merck, Darmstadt
Methylbenzoat
Merck, Darmstadt
Mineralöl
Sigma-Albricht Chemie GmbH, Steinheim
Paraffin
Merck, Darmstadt
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung „PBS Invitrogen, GIBCOTM, Paisley, Schottland
Tabletten“
Tri-Natrium-Citrat
Merck, Darmstadt
Xylol
Merck, Darmstadt
126
10.2 Laborbedarf, Operationsbesteck und
Verbrauchsmaterialien
Deckgläser 24x60
Menzel-Gläser, Braunschweig
Einmalkanülen “BD MicrolanceTM3“, 22G x Becton-Dickinson, Fraga
11/4´´-Nr. 12, 0,7 x 30mm
(Huesca)/Spanien
Einmalkanülen “100 Sterican®“, 27G x Braun, Melsungen
11/2´´, 0,4 x 12mm
Einmalspritze „Omnifix®-F“, Luer, steril, Braun, Melsungen
1ml, 2ml, 5ml, 10ml
Einweg Skalpellklingen “Surgical blade Produkte für die Medizin AG, pfm, Köln
stainless No. 11“ und “No.21” Feather
safety
Färbegestelle und Färbebehälter
Omnilab, Gerden
Handschuhe aus Latex, SAFESKIN SATIN Kimberly-Clark, Zaventem, Belgien
PLUS“ Gr. S
Infusionsgerät “Intrafix® Primeline Comfort“
Braun, Melsungen
Laborglaswaren (Erlenmeyerkolben,
Omnilab, Gehrden/ VWR, Darmstadt
Bechergläser, Flaschen, etc.)
“Laborrasierklingen”
Omnilab, Gerden
Lithiumbatterien „renata CR 1632“ und Renata SA, Schweiz
„renata 1616“, 3V
Marderhaarpinsel Nr.1
Omnilab, Gerden
Mullkompressen, 5x5cm
Lohmann & Rauscher International GmbH
& Co. KG., Rengsdorf
Nadelhalter Halsey, 13cm
Aesculap, Tuttlingen
Nahtmaterial nicht resorbierbar, „Sera- Serag Wiessner, Naila
lon®“, 3/0
Nahtmaterial resorbierbar, „Vicry®l“, 3/0
Ethicon GmbH, Norderstedt
Objektträger Super Frost Plus
Omnilab, Gerden
Operationshandschuhe
supreme“, Gr. 61/2
„sempermed® Semperit Technische Produkte, Wien,
Österreich
127
Pinzette „Adson”, 12cm
Fine Science Tools, Heidelberg
Pinzette nach Dumas, gerade, extra spitz
VWR, Hannover
Pinzette „neoLab-Dumont INOX Nr. 3“
Fine Science Tools, Heidelberg
Pinzette „Dumont INOX Nr.5“
Fine Science Tools, Heidelberg
Pinzette
„Dumont-Präzisions-Pinzette, Omnilab, Gerden
Nr.7, gebogen“
Pinzette „Uhrmacherpinzette,
12cm, Nr.7“
gebogen, Gelbrich, Isernhagen
Pipettenspitzen mit Filter, 0,5-10 µl
Eppendorf , Hamburg
„epT.I.P.S.“
Pipettenspitzen mit Filter, 101-1000 µl
Starlab, Ahrensburg
„TipOne“
Pipettenspitzen mit Filter, 1-200 µl „TipO- Starlab, Ahrensburg
ne“
Pipettenspitzen mit Filter, 2-20 µl „ART®
Molecular BioProducts, San Diego, USA
Gel 20P“
Schere chirurgisch, fein, gerade
Omnilab, Gehrden
Schere chirurgisch, gerade
Aesculap, Tuttlingen
Sterilfilter zum Einmalgebrauch, 0,2 µm
Sartorius, Göttingen
„Minisart®“
Sterilisierkassette
Gelbrich, Isernhagen
Wundspreitzer modifiziert nach Finsen
Aesculap, Tuttlingen
Zellkulturschale 60 x 15 „NunclonTM“
NuncTM, Wiesbaden
Zylinderschrauben, rostfrei,
M2x8mm, M3x12mm
M2x4mm, Baumarkt
128
10.3 Geräte
Aqua tridest. Aufbereitungsanlage „SG
Wasser und Regenerierstation, Barsbüttel
Reinstwasser System Typ SG-RS90-4 UF“
Auflichtstereomikroskop „MZ6“
Leica, Wetzlar
Autoklav „Typ 23“
Melag, Berlin
CCD-Camera „Color View XS“
Olympus, Hamburg
Computereinheit mit Software: „Analysis
Olympus, Hamburg
Ver. 3.2, SIS“, „MS Excel“, „MS Word“,
„Graph Pad Prism 4“
Infertmikroskop „Olympus CKX41“
Olympus, Hamburg
Kühlgefrierkombination „Typ 56134“, 4 °C,
Liebherr, Bieberach
-20° C
Laborfeinwaage „Typ 2462“
Sartorius, Göttingen
Laborwaage „Typ 510-63“
Kern, Albstadt
Magnetrührer mit Heizplatte „RH basic“
IKA, Willmington, USA
Pipette, einstellbar „pipetman“ (0-2 µl, 1-
Gilson, Villers Le Bel/Frankreich
10 µl, 10-100 µl, 20-200 µl, 100-1000 µl)
Rotationsmikrotom
Mikrotom 315“
„Shandon
Finesse® Thermo Electron Corporation
Schwingtisch „Labotron“
Infors AG, Bottmingen, Schweiz
Streckbad „GFL-1052 Paraffin-Streckbad“
Omnilab, Gehrden
Wärmeschrank
Heraeus Instuments, Kendro Laboratory
Products, Hanau
10.4 Herstellung von Lösungen
1. Artifizielle Perilymphe:
145 mM
NaCl (Natriumchlorid)
8.4738 g/L
2.7 mM
KCl (Kaliumchlorid)
0.2013 g/L
2.0 mM
MgSO4 (Magnesiumsulfat)
1.2 mM
CaCl2 (Kalziumchlorid) 0.1764 g/L
5.0 mM
HEPES
1.1915 g/L
0.2408 g/L
129
mit HPLC Wasser auf 1 Liter aufgefüllt, pH mittels N NaOH auf 7.4 eingestellt,
Osmolarität 285-294 mOsm/L, in 4ml Aliquots (für die Befüllung der Pumpen mit
AP) bzw. 50ml Aliquots (Aliquotierung von GDNF, BDNF und DEX) tiefgefroren,
die Substanzen stammen von Merck, Darmstadt.
2. GDNF Aliquotierung für eine Konzentration von 100 ng/ml:
Lieferung: 10 µg lyophilisiert (9.1)
¾ 100ml AP herstellen bzw. auftauen (9.4.1) und sterilfiltrieren
¾ 0,5ml AP zum GDNF pipettieren und GDNF lösen
¾ 0,5ml GDNF-AP-Lösung zu den verbleibenden 99,5ml AP pipettieren
¾ Lösung 1/2Std. mit Rührfisch (9.2) auf Magnetrührtisch (9.3) gut
mischen
¾ je 4ml der Lösung aliquotieren
¾ bei <-20°C 6 Monate haltbar
3. BDNF Aliquotierung für eine Konzentration von 50 ng/ml:
Lieferung: 5µg lyophilisiert (9.1)
¾ 100ml AP herstellen bzw. auftauen (9.4.1) und sterilfiltrieren
¾ 0,5ml AP zum BDNF pipettieren und BDNF lösen
¾ 0,5ml BDNF-AP-Lösung zu den verbleibenden 99,5ml AP pipettieren
¾ Lösung 1/2Std. mit Rührfisch (9.2) auf Magnetrührtisch (9.3) gut
mischen
¾ je 4ml der Lösung aliquotieren
¾ bei <-20°C 6 Monate haltbar
4. DEX Aliquotierung für eine Konzentration von 100 ng/ml:
Lieferung: Fortecortin® : 5ml, 40mg/ml (9.1)
¾ 50ml AP herstellen bzw. auftauen (9.4.1) und sterilfiltrieren
¾ 49999,375µl (49ml + 999µl + 375 nl) AP in 50ml Glas pipettieren
¾ 625µl Fortecortin® hinzu pipettieren
¾ Lösung 1/2Std. mit Rührfisch (9.2) auf Magnetrührtisch (9.3) gut
mischen
¾ je 4ml der Lösung aliquotieren
¾ bei <-20°C 6 Monate haltbar
5. Pumpenfülllösung für Befüllung von 3 Alzet-Pumpen Modell 2002:
¾ den benötigten 4ml Aliquot (AP = 9.4.1, GDNF = 9.4.2, BDNF = 9.4.3,
DEX = 9.4.4) auftauen
¾ 5mg Guinea Pig Serum Albumin (GPSA, 9.1) mit Feinstwaage (9.3)
abwiegen und im Aliquot in Lösung bringen;
¾ Aliquot-GPSA sofort zur Pumpenbefüllung (3.2.3)verwenden
6. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS):
Zur Herstellung der phosphatgepufferten Kochsalzlösung (0,14 M NaCl, 0,01 M
PO4 Puffer, 0,0003 KCl; pH 7,45) wurde eine Tablette PBS (9.1) in 500 ml
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Reinstwasser (9.3) gelöst und anschließend steril filtriert (0,2 µm, (9.2)).
7. 20%ige Tri-Natriumcitrat Pufferlösung
1l Reinstwasser (9.3) wurden mit 200g 100%igen Tri-Natriumcitrat (9.1)
vermischt.
8. Entkalker
Ansatz 1l: 650ml 20% iges Tri-Natriumcitrat (9.1)
350ml 90%ige Ameisensäure (9.1)
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Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation
„Elektrophysiologische und histologische Untersuchungen zum protektiven Effekt
von Glial cell line-derived neurotrophic factor, Brain-derived neurotrophic factor,
Dexamethason und Elektrostimulation auf Spiralganglienzellen ertaubter Meerschweinchen“
selbstständig verfasst habe. Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen:
1.
2.
3.
4.
5.
Die Materialien und Geräte wurden von der Klinik für Hals-Nasen-OhrenHeilkunde der Medizinischen Hochschule Hannover (Leiter: Prof. Dr. Th. Lenarz)
zur Verfügung gestellt.
Die Pflege der für diese Arbeit verwendeten Tiere sowie die Bereitstellung der
Operationsräume erfolgte durch das Zentrale Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover (Leiter: Prof. Dr. H. J. Hedrich).
Die Cochlea-Elektroden-Mikropumpensysteme wurden von der Firma MedEl sowie von der Firma Cochlear Inc. entwickelt und zur Verfügung gestellt.
Das Schneiden der Cochleae sowie das nachfolgende Färben der histologischen
Schnitte wurde dankenswerter Weise von Herrn P. Erfurt durchgeführt.
Die statistische Auswertung erfolgte unter Anleitung und Hilfe von Herrn Bernhard
Vaske, Biometrie der Medizinischen Hochschule Hannover.
Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- oder Beratungsdiensten (Promotionsberater oder anderen Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.
Ich habe die Dissertation bei folgender Institution angefertigt: Klinik für Hals- Nasenund Ohrenheilkunde der Medizinischen Hochschule Hannover.
Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht.
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen und der Wahrheit entsprechend gemacht habe.
Hannover, den 20.02.2007
Verena Scheper
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DANKSAGUNG
Herrn PD Dr. T. Stöver danke ich herzlich für die Überlassung des äußerst interessanten
Dissertationsthemas sowie für seine wertvollen Anregungen. Er war ein hervorragender
Motivator, der viel Freiheit zur Entwicklung und Verwirklichung eigener Ideen ließ.
Herrn PD Dr. K.-H. Esser, meinem Doktorvater an der Tierärztlichen Hochschule
Hannover, gilt mein besonderer Dank für die sehr freundliche und unkomplizierte
Betreuung meiner Doktorarbeit.
Herrn Prof. Dr. Th. Lenarz, dem Leiter der Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde, gilt
mein besonderer Dank für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes und der Arbeitsmittel.
Seine beeindruckende Arbeits- und Berufsauffassung ist mir weiterhin ein großes
Vorbild.
Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Peter Erfurt. Er hat mir durch seine unermüdliche geistige und praktische Unterstützung sowohl durch den Alltag als auch durch viele
widrige Zeiten geholfen.
Meinen Kollegen Gentiana, Gerrit, Uta, Kirsten, Anke, Susanne, Patrick, Nurdanat sowie allen anderen Mitarbeitern der Klinik und Poliklinik für Hals-NasenOhrenheilkunde der Medizinischen Hochschule Hannover danke ich für die kollegiale
und freundschaftliche Zusammenarbeit.
Den Tierpflegern, insbesondere K.-H. Napierski, P. Zerbe und K.-D. Reimann sowie
den Tierärzten Prof. Dr. K. Otto und Dr. S. Glage des Zentralen Tierlabors danke ich für
die liebevolle Betreuung meiner Meerschweinchen und die fachliche Beratung in Krisenzeiten.
Herrn Bernhard Vaske danke ich für die Beratung bei der Auswahl geeigneter statistischer Auswertungsmethoden.
Ich danke Georg, Anni, Denise, Conny, Rike und Mareike für Ihre einzigartige Freundschaft und Hilfsbereitschaft. Ohne Sie hätte ich es nervlich wohl kaum geschafft. Danke, dass ihr immer für mich da seid.
Meinen Eltern Gisela und Heinrich Scheper danke ich für die Ermöglichung meines
Studiums und dafür, dass sie immer an mich geglaubt haben.