Einführung in die Laborpraxis - Kremer / Bannwarth - Beck-Shop

Springer-Lehrbuch
Einführung in die Laborpraxis
Basiskompetenzen für Laborneulinge
von
Bruno P Kremer, Horst Bannwarth
1. Auflage
Einführung in die Laborpraxis – Kremer / Bannwarth
schnell und portofrei erhältlich bei beck-shop.de DIE FACHBUCHHANDLUNG
Thematische Gliederung:
Medizin, Gesundheitswesen allgemein
Springer 2008
Verlag C.H. Beck im Internet:
www.beck.de
ISBN 978 3 540 85177 6
Inhaltsverzeichnis: Einführung in die Laborpraxis – Kremer / Bannwarth
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Photometrieren
Die Spektroskopie, auch Spektralphotometrie, Spektrophotometrie oder
einfach nur Photometrie genannt, umfasst eine Anzahl experimenteller
Messverfahren, die generell die Wechselwirkung elektromagnetischer
Strahlung mit Materie nutzen. Diese quantifizierenden Verfahren haben
eine überragende Bedeutung nicht nur in der naturwissenschaftlichen Forschung, sondern auch in der täglichen Praxis von Kontrolllabors. Sie gestatten nämlich einerseits die Identifizierung von Stoffen in einer Lösung
anhand von charakteristischen Absorptionsspektren, ermöglichen aber
auch eine exakte Bestimmung der Konzentration eines gelösten Stoffes.
Bei der Spektroskopie wird das Licht einer definierten Lichtquelle in ein
Spektrum zerlegt (Farbzerlegung). Stoffe, die spektral untersucht werden
sollen, setzt man einer bestimmten Lichtqualität (= Farbe, d.h. einer bestimmten Wellenlänge λ aus. Aus dem Absorptions- bzw. Extinktionsverhalten lassen sich wichtige Rückschlüsse auf die Qualität oder die
Quantität bestimmter zu untersuchender Stoffe ziehen. Spektroskopische
Methoden sind wichtige Analyseverfahren der Physik, Chemie und Biochemie. Sie finden zudem in der Astronomie Anwendung, weil das Licht
von Himmelskörpern bemerkenswerte Rückschlüsse auf die Eigenschaften
von Lichtemittenten im Weltall erlaubt. Spektroskopische Untersuchungen
waren auch entscheidend wichtig für die Aufklärung des Schalenaufbaus
der Atome und die Entwicklung der Quantenmechanik.
Pioniere der Spektroskopie waren Gustav Kirchhoff (1824–1887) und
Robert Bunsen (1811–1899), die 1859 in Heidelberg entdeckten, dass verschiedene chemische Elemente die Flamme eines Gasbrenners in charakteristischer Weise färben. Joseph von Fraunhofer (1787–1826) hatte bereits
1814 im Spektrum des Sonnenlichtes zahlreiche dunkle Linien entdeckt,
die man später nach ihm als Fraunhofer’sche Linien bezeichnete. Er
konnte dieses Phänomen aber nicht genauer erklären, weil die notwendigen
Kenntnisse des Atombaus und der Vorgänge bei der Absorption und Emission von Licht noch nicht verfügbar waren.
Bei der Wechselwirkung von Strahlung und Materie unterscheidet man
unter anderem die folgenden Möglichkeiten:
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17 Photometrieren
• Elastische Streuung: Man beobachtet nur eine Impulsänderung der Photonen. Beispiele sind die Beugung von Röntgen-, Elektronen- und
Neutronenstrahlung.
• Inelastische Streuung: Resonante Absorption und Emission von Photonen bzw. Lichtquanten.
17.1 Spektroskopie und Photometrie
Im Allgemeinen verwendet man die Bezeichnung Spektroskopie auch für
die Messung der Energieverteilung von Gamma-Strahlen oder Strahlung
von Teilchen wie Alpha- und Beta-Strahlen oder von freien Neutronen.
Spektroskopie bzw. Photometrie im engeren Sinn bezieht sich dagegen
überwiegend auf die Untersuchung, bei welchen Frequenzen bzw. Wellenlängen eine bestimmte Substanz Energie in Form von Lichtquanten bzw.
elektromagnetischen Wellen aufnehmen (absorbieren) oder abgeben (emittieren) kann.
Die Energie eines Lichtquants oder die entsprechende Frequenz einer
elektromagnetischen Welle lässt sich mit der Energiedifferenz zweier
quantenmechanischer Zustände der zu untersuchenden Substanz wiedergeben:
∆E = h ⋅ v
[Gl. 17-1]
Darin bedeuten h die Planck’sche Konstante, ν die Frequenz des Lichts
und ΔE die Energiedifferenz. Diese Beziehung ist die Grundgleichung der
Spektroskopie. Die Energiedifferenzen quantenmechanischer Zustände
sind von der stofflichen Zusammensetzung einer Probe und von ihrer atomaren bzw. molekularen Struktur abhängig. Die von den Stoffen ausgehende Strahlung enthält daher wichtige Informationen. Mithilfe der Spektroskopie lassen sich somit aus dem gemessenen Spektrum wichtige
Rückschlüsse auf den strahlenden Körper ziehen, beispielswiese auf seine
Struktur, Temperatur und Bewegung (Doppler-Effekt).
Die Spektroskopie umfasst einen großen Teil des elektromagnetischen
Spektrums einschließlich des sichtbaren Lichtes und reicht von der kurzwelligen Gamma-Strahlung bis zu langwelligen Radiowellen. Die Präzisionsspektroskopie ermöglicht es, aus der genauen Lage oder der Stärke
von Spektrallinien physikalische Größen, zum Beispiel bestimmte Naturkonstanten zu bestimmen. Die wellenlängengenaue Untersuchung der
Lichtemission und -absorption von Molekülen und Atomen mithilfe von
Gitter- und Prismenspektrometern sind die am längsten eingesetzten spektroskopischen Verfahren. Das Element Helium wurde zuerst durch spektro-
17.1 Spektroskopie und Photometrie
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skopische Untersuchungen des Sonnenlichtes erkannt. Besondere Erfolge
der astronomischen Spektralanalyse und Spektroskopie sind die als Doppler-Effekt gedeutete Rotverschiebung des Lichtes von Sternen bzw. Galaxien, die Quantifizierung der Wirkung von Magnetfeldern auf die Sonne
und helle Sterne (Zeeman-Effekt) sowie vor allem die Bestimmung von
Sterntemperaturen und ihrer Zugehörigkeit zu bestimmten Spektralklassen
des Hertzsprung-Russel-Diagramms.
Wellenlänge (nm):
3 × 10-8
γ- und Röntgen
Strahlung
Frequenz (Hz):
1022
Kernübergänge
Übergänge
innerer Elektronen
3 × 102 3 × 103
3
UV
1016
IR
Licht
1014
3 × 105
3 × 1012
Mikrowellen/ Radiostrahlung
1012
Übergänge
Valenzelektronen
Molekülschwingung
Molekülrotation
105
Spin-Orientierung
ESR NMR
Abb. 17-1. Einteilung des elektromagnetischen Spektrums
Bei der Molekülspektroskopie untersucht man die Wechselwirkung
von Molekülen mit elektromagnetischen Feldern. Dies ermöglicht die Charakterisierung molekularer Eigenschaften wie beispielsweise die Bindungslängen und -stärken, aber auch die Identifizierung der atomaren Bestandteile. Die beobachteten Molekülspektren unterscheiden sich von den
Atomspektren durch deutlich mehr und meist überlappende Linien, die
Banden. Der Grund dafür ist, dass die Moleküle nicht nur durch Elektronenübergänge, sondern auch bei Schwingungen der Atome gegeneinander
und durch Rotationen des Moleküls um eine seiner Achsen Energie absorbieren oder emittieren (vgl. Abb. 17-1).
Zur Messung der Absorptions- oder Emissionseigenschaften einer Substanz im UV- oder sichtbaren Bereich des Spektrums (UV/VIS-Photometrie) verwendet man ein Spektralphotometer (Abb. 17-2). Darin wird
das von einer Lichtquelle emittierte Licht mit Hilfe eines Monochromators
spektral zerlegt. Über besondere Filterteinrichtungen (Kanten-, Interferenzoder andere Filter) wählt man aus dem Lampenspektrum möglichst engbandig eine bestimmte Wellenlänge aus, in der die zu photometrierende
Verbindung besonders gut absorbiert, beispielsweise die Wellenlänge λ =
340 nm für die Messung des Übergangs von reduziertem Nicotinsäureamid-adenin-dinucleotid (NADH) in seine oxiderte Form NAD+. Bei der
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Aufnahme eines Absorptionsspektrums wählt man den interessierenden
Spektralbereich aus und lässt vom Spektralphotometer sukzessive dessen
Wellenlängen auf die Messprobe einstrahlen. Der Detektor (Photomultiplier) bzw. die damit gekoppelte Messelektronik vergleicht die Intensität
des absorbierten oder des emittierten Lichtes in Abhängigkeit von der Wellenlänge. Mess- und Ausgabegröße sind entweder die Transmission
(= Prozentanteil des nicht absorbierten Lichtes) oder die Extinktion (Absorption, Optische Dichte), die keine Einheit hat und Werte zwischen 0
und 1 annimmt. Für jede das Licht absorbierende Substanz ist der molare
Extinktionskoeffizient ε bekannt oder zu ermitteln. Er gibt die Absorption
einer reinen Verbindung in einer Lösung mit der Stoffmengenkonzentration c = 1 mol L–1 an.
Lichtquelle
Monochromator Filter
Messkammer
Detektor
Anzeige
(Küvette) (Photomultiplier)
Abb. 17-2. Schema zum Aufbau eines Spektralphotometers
Ein praktisches Laborbeispiel für die Anwendung der Spektroskopie ist
die photometrische Konzentrationsbestimmung eines Stoffes in Lösung.
Manche Substanzen erscheinen uns deswegen farbig, weil sie Licht einer
bestimmten Wellenlänge absorbieren. Meist liegt das Absorptionsmaximum (λmax) in einem sehr engen Wellenlängenbereich des sichtbaren
Spektrums (ca. 400–700 nm). In diesem Bereich lässt eine Lösung der farbigen Substanz das eingestrahlte Licht infolge der Absorption nur teilweise
durch. Der Logarithmus des Verhältnisses von eingestrahlter (I0) zu durchgelassener Lichtmenge (I) wird als Extinktion (E) bezeichnet. Dabei gilt
folgende Beziehung:
[Gl. 17-1]
E = lg I0 / I
Die Extinktion ist in einem weiten Bereich, in dem gemessen werden kann,
der Konzentration des gelösten Stoffes proportional (Lambert-Beer’sches
Gesetz):
E=ε ×d ×c
Darin bedeuten
ε: molarer Extinktionskoeffizient
d: Schichtdicke
c: Konzentration
[Gl. 17-2]