Professor Dr. med. Ha
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Universitätsklinikum Ulm Zentrum für Innere Medizin Klinik für Innere Medizin III Ärztlicher Direktor: Professor Dr. med. Hartmut Döhner Expression und Immunogenität des Tumor-assoziierten Antigens G250 (Carboanhydrase IX, MN 75) bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom des Kopf- und Hals-Bereichs Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm vorgelegt von Franziska Borchert aus Berlin 2008 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Klaus-Michael Debatin 1. Berichterstatter: PD Dr. Mark Ringhoffer 2. Berichterstatter: Prof. Dr. Thomas Barth Tag der Promotion: 18.06.2009 II Für meine Familie III Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis..........................................................................VI 1 Einleitung.................................................................................................. 1 1.1 Plattenepithelkarzinome des Kopf-Hals-Bereichs (squamous cell carcinoma of the head and neck= SCCHN) .............................................. 1 1.2 Epidemiologie und Risikofaktoren............................................................. 1 1.3 Klassifikation der Tumorstadien nach dem TNM-Schema und histologischem Differenzierungsgrad (Grading) ........................................ 2 1.4 Stadienadaptierte Therapieformen............................................................ 3 1.5 Tumor-assoziierte Antigene (TAA)............................................................ 7 1.6 Das Tumor-assoziierte Antigen G250 (Carboanhydrase IX,MN 75) ......... 8 1.7 Ziel der Arbeit.......................................................................................... 12 2 Material und Methoden .......................................................................... 13 2.1 Materialien .............................................................................................. 13 2.1.1 Laborgeräte............................................................................................. 13 2.1.2 Plastikwaren............................................................................................ 15 2.1.3 Laborchemikalien.................................................................................... 15 2.1.4 Spezielle Chemikalien, Marker, Antikörper ............................................. 16 2.2 Methoden ................................................................................................ 18 2.2.1 Tumorproben von Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereiches (HNSCC)................................................................................................. 18 2.2.2 Isolation von mononukleären Zellen über einen Dichtegradienten.......... 19 2.2.3 T2-Zellen................................................................................................. 19 2.2.4 Synthetische Peptide .............................................................................. 20 2.2.5 Western Blot (WB) .................................................................................. 20 2.2.6 Gemischte Lymphozyten-Peptid-Kultur (MLPC) ..................................... 23 2.2.7 Enzyme linked Immunospot Assay (ELISPOT)....................................... 25 2.2.8 Immunzytologie....................................................................................... 32 2.2.9 Durchflusszytometrie/Tetramerfärbung................................................... 33 2.3 Statistik ................................................................................................... 34 IV 3 Ergebnisse.............................................................................................. 35 3.1 Tumorproben .......................................................................................... 35 3.2 Western Blot ........................................................................................... 37 3.3 Immunzytologie....................................................................................... 38 3.4 Gemischte Lymphozyten-Peptidkultur (MLPC) ....................................... 39 3.5 Durchflusszytometrie/ Tetramerfärbung.................................................. 40 3.6 ELISPOT................................................................................................. 41 4 Diskussion.............................................................................................. 43 5 Zusammenfassung ................................................................................ 47 6 Literaturverzeichnis............................................................................... 49 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis ................................................. 58 Danksagung ........................................................................................... 59 V Abkürzungsverzeichnis A. dest. Aqua destillata AB-Serum Serum von männlichen Spendern mit der Blutgruppe AB ADCC Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity AEC 3-Amino-9-ethylcarbazol AJCC American Joint Committee on Cancer AFP Alpha-Fetoprotein Ak Antikörper APZ Antigen-präsentierende Zelle ATCC American Type Culture Collection BCIP 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate BSA Bovines Serum Albumin CA Carboanhydrase CAIX Carboanhydrase IX CD Cluster of Differentiation cDNA complementary Deoxyribonucleic Acid CEA Karzinoembryonales Antigen COX Cyclooxygenase CTL Cytotoxic T-lymphocytes / Zytotoxische T-Lymphozyten CUP Cancer of Unknown Primary DMF Dimethylformamid DMSO Dimethyl-Sulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure / Desoxyribonucleic Acid DNAse Desoxyribonuklease DTT Dithiothreitol EBV Ebstein-Barr-Virus EGF Epithelial Growth Faktor / Epithelialer Wachstumsfaktor EGFR Epithelial Growth Faktor- / Epithelialer WachstumsfaktorRezeptor ELISPOT Enzyme Linked Immuno Spot Assay EDTA Ethylendiamintetraacetat EpCAM Epithelial Cell Adhesion Molecule FACS Fluorescence-Activated-Cell-Sorter / Durchflusszytometer VI FCS fötales Kälberserum FITS Fluorescein-Iso-Thio-Cyanat 5-FU 5-Fluoruracil GLUT1 Glukosetransporter 1 GM-CSF granulocyte-macrophage colony stimulating factor h hour / Stunde HeLa Helen Lane (Zervixkarzinom-Zelllinie) HER2 Human epidermal growth factor receptor 2 / Humaner epithelialer Wachstumsfaktor-Rezeptor HIF Hypoxie-induzierbarer Faktor HIV Humanes Immundefizienz-Virus HLA Humanes Leukozyten Antigen HPV Humanes Papilloma Virus HV Healthy Volunteer / Gesunder Proband IL Interleukin ICH Immunhistochemie IMP Influenza Matrix Protein IFN Interferon Ig Immunglobulin 5-JÜR 5-Jahres-Überlebensrate MAGE Melanoma Associated Antigen min Minute MLPC Mixed Lymphocyte Peptide Culture / Gemischte Lymphozyten-Peptid-Kultur MN75 mouse monoclonal antibody 75 NBT Nitro-Blue-Tetrazoliumchloride NSAID Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug NZK Nierenzellkarzinom PBMN Peripheral Blood Mononuclear Cells / Periphere Blutmonozyten PDGF platelet derived growth factor PE R-Phycoerythrin PBS Phosphate Buffered Saline / Phosphat gepufferte Kochsalzlösung VII PG Prostaglandin P/S Penicillin/ Streptomycin PVDF Polyvinylidendifluorid RNA Ribonukleinsäure/Ribonucleic-Acid RPMI Zellkulturmedium für Leukozyten, entwickelt am Roswell Park Memorial Institute SCCHN squamous cell carcinoma of the head and neck SDS Sodium-Duodecyl-Sulfat s second / Sekunde Spez. Spezifisch SKRC Sloan-Kettering renal cell carcinoma cell line TAA Tumor assoziiertes Antigen TBS Tris-Buffered Saline TBST Tris-Buffered Saline Tween-20 TKI Tyrosin-Kinase-Inhibitor TNM T=Tumor, N=Node, M=Metastasis TRIS Tris-Hydroxymethyl-Aminomethan U/min Umdrehungen pro Minute UICC Union International Contre Cancer VEGF Vascular Endothelial Growth endothelialer Wachstumsfaktor VHL von Hippel-Lindau WB Western Blot VIII Factor / Vaskulärer 1 Einleitung Seite 1 1 Einleitung 1.1 Plattenepithelkarzinome des Kopf-Hals-Bereichs (squamous cell carcinoma of the head and neck= SCCHN) Unter dem Begriff Plattenepithelkarzinome des Kopf-Hals-Bereichs fasst man eine Vielzahl bösartiger Tumoren zusammen, die ihren Ausgang von der Schleimhaut des oberen Aerodigestivtraktes nehmen. Die Plattenepithelkarzinome stellen mit ca. 90% den überwiegenden Anteil der malignen Tumoren des Kopf-Hals-Bereichs. Nach Lokalisation des Primärtumors unterscheidet man Karzinome der Mundhöhle, des Pharynx (Oro-, Hypo- und Nasopharynx) und des Larynx, die wesentlich häufiger auftreten, als Karzinome der Nasenhaupt- und -nebenhöhlen. Daneben erscheinen Plattenepithelkarzinome im Kopf-Hals-Bereich als Tumoren der Kopfspeicheldrüsen und der Gesichts- und Kopfhaut. 1.2 Epidemiologie und Risikofaktoren Plattenepithelkarzinome des oberen Aerodigestivtraktes gehören zu den sechs häufigsten Karzinomen weltweit. Jährlich erkranken mehr als 500.000 Menschen an einem Plattenepithelkarzinom des oberen Aerodigestivtraktes, von denen mehr als 60% versterben (Jemal et al. 2005, Parkin et al. 1999). Es handelt sich hierbei in etwa der Hälfte der Fälle um Larynxkarzinome. Der Altersgipfel liegt in der 6. Lebensdekade, wobei zunehmend jüngere Patienten betroffen sind. Die Inzidenz und Mortalität der Kopf-Hals-Tumoren hat sich in den letzten Jahrzehnten nahezu verdoppelt, als wesentliche Ursache wird hierfür der zunehmende Gebrauch der Hauptrisikofaktoren Nikotin und Alkohol angesehen. Einige der Tumoren weisen geschlechtsspezifische Unterschiede auf, so liegt das Häufigkeitsverhältnis des Larynxkarzinoms von Männern zu Frauen bei 7:1, wohingegen der Unterschied beim Mundhöhlenkarzinom wesentlich geringer ausgeprägt ist. In den letzten Jahren zeigt sich jedoch eine Zunahme der Inzidenz zu Ungunsten der Frauen, bedingt vor allem durch vermehrtes Zigarettenrauchen. Alkoholkonsum potenziert die toxische Wirkung des Rauchens, vermutlich über eine Schwächung der plattenepithelialen Barrieren der Schleimhaut. 1 Einleitung Seite 2 Als weiterer Risikofaktoren gelten interindividuelle Unterschiede im Metabolismus der Zigarettenrauch-assoziierten Karzinogene. Dies wird auf Genvariationen (Polymorphismen) im Metabolismus dieser Substanzen zurückgeführt. Virale Infektionen, kanzerogene Chemikalien, ein geschwächtes Immunsystem (z.B. HIV) und schlechte Mundhygiene kommen ebenfalls als auslösende Faktoren in Betracht. Neuere Studien zeigen für humane Papillom Viren (HPV), besonders HPV-16, eine wesentliche Rolle sowohl für die Entstehung eines Mundhöhlenkarzinomes, als auch des Larynxkarzinoms. Die Larynxpapillomatose kann als fakultative Präkanzerose in ein Plattenepithelkarzinom übergehen. Das Nasopharynxkarzinom ist Ebstein-Barr-Virus (EBV) assoziiert und kommt endemisch gehäuft in Süd-Ost-Asien vor. Trotz einer Verbesserung der Diagnostik sowie der Entwicklung neuer Therapieverfahren, hat sich die Gesamtüberlebensprognose in den letzten 30 Jahren nicht wesentlich verbessert (Jemal et al. 2005). Für fortgeschrittene, resektable Tumoren beträgt die 5-Jahres-Überlebenswahrscheinlichkeit 50%. Für Tumoren, die primär konservativ therapiert werden beträgt diese lediglich 20%. Nach Durchführung einer Standardtherapie entwickeln 50-60% der Patienten ein lokoregionäres Rezidiv, bei 15-25% finden sich im Verlauf Fernmetastasen. Treten Rezidive oder Fernmetastasen auf, beträgt die mediane Überlebenszeit nur noch sechs Monate (Adelstein et al. 2003). 1.3 Klassifikation der Tumorstadien nach dem TNM-Schema und histologischem Differenzierungsgrad (Grading) Für die Wahl des Therapieverfahrens sind eine genaue Bestimmung der Größe und Ausdehnung des Tumors notwendig. Die Kenntnis über das Vorhandensein oder Fehlen von Lymph- und Fernmetastasen ist für die Prognose und das Therapieziel wesentlich. Kopf-Hals-Tumoren metastasieren bevorzugt lymphogen, Fernmetastasen sind selten. Die Klassifikation der Tumorstadien erfolgt nach dem international anerkannten TNM-System der UICC (Union International Contre Cancer 1997) und beschreibt die Größe des Primärtumors (zunehmend von T1-T4), das Ausmaß der lymphogenen Metastasierung (zunehmend von N1-N3) und das Auftreten von Fernmetastasen (M1). 1 Einleitung Seite 3 Tabelle 1: TNM-Stadieneinteilung für Plattenepithelkarzinome des Kopf- und Hals-Bereichs. (Jede Tumorart innerhalb der Gruppe der Kopf-Hals-Tumoren hat eine hiervon abgeleitete, eigene Stadieneinteilung). T Primärtumor T1 Tumor < 2 cm T2 Tumor > 2 cm und < 4 cm T3 Tumor > 4 cm T4 Tumor wächst in Nachbarstrukturen, wie z.B. Knochen, Muskel, Haut ein N regionäre Lymphknoten N1 Eine einzelne Lymphknotenmetastase < 3 cm auf der gleichen Seite N2a Eine einzelne Lymphknotenmetastase > 3 bis 6 cm auf der gleichen Seite N2b mehrere Lymphknotenmetastasen < 6 cm auf der gleichen Seite N2c Lymphknotenmetastasen auf beiden Seiten oder auf der Gegenseite < 6 cm N3 Lymphknotenmetastase > 6 cm M Fernmetastasen M0 keine Fernmetastasen M1 Vorliegen von Fernmetastasen Abkürzungen: (Metastasis) TNM-Klassifikation. T=Tumor, N=Lymphknoten (Nodes), M=Fernmetastasen Der TNM-Status bezieht sich auf das Tumorstadium zum Zeitpunkt der Diagnosestellung und wird histopathologisch gesichert. Der Differenzierungsgrad gibt Informationen über den Malignitätsgrad des Tumors (Grading) und reicht von G1 (gut oder hochgradig differenziert) über G2 (mäßig oder mittelgradig differenziert) und G3 (schlecht oder wenig differenziert) bis G4 (un- oder entdifferenziert). 1.4 Stadienadaptierte Therapieformen An therapeutischen Möglichkeiten stehen neben der operativen Tumorresektion die Radio- und die Chemotherapie oder eine Kombination dieser verschiedenen Verfahren zur Verfügung. Das Behandlungskonzept erfolgt in Abhängigkeit von 1 Einleitung Seite 4 TNM-Stadium und histologischer Diagnose und wird für jeden Patienten individuell erstellt. Die Chirurgie ist nach wie vor das wichtigste Standbein in der Therapie von resektablen Tumoren des Kopf- und Hals-Bereichs. Ziel ist die vollständige Tumorresektion einschließlich vorhandener Lymphknotenmetastasen (R0-Resektion). Diese werden in der Regel durch „Neck-Dissection“ entfernt. Art und Umfang der Lymphknotenentfernung sind abhängig von Anzahl, Größe und Lokalisation der Lymphknotenmetastasen und der Lage des Primärtumors. Erste Therapieoption bei T1-Tumoren ist die radikale Resektion +/- „NeckDissection“. Alternativ ist eine alleinige Radiotherapie bei T1-Tumoren bei Wunsch des Patienten auf Organerhalt möglich. Bei fortgeschrittenen Tumoren (> T2) ist nach kurativer Operation die alleinige postoperative Strahlentherapie der Goldstandard, bei so genannten Hochrisikopatienten hat sich die konkomidante Radiochemotherapie etabliert, die bei diesem Patientenkolektiv eine signifikante Überlegenheit im Vergleich zu einer alleinigen Radiotherapie gezeigt hat. Alternativ kann in besonderen Fällen eine primäre Radiochemotherapie erwogen werden. Für alle Patienten mit inoperablen Tumoren bzw. internistischer Kontraindikation gegen eine Operation, stellt entsprechend neueren Studienergebnissen (Pignon et al. Lancett 2000) die simultane Radiochemotherapie die Standardtherapieform dar. Dies gilt auch für Patienten, die einen operativen Eingriff strikt ablehnen. Die Chemotherapie hat einen festen Platz innerhalb von Therapieregimen bei fortgeschrittenen und inoperablen Tumoren. Die alleinige Chemotherapie wird bislang nur in palliativer Absicht bei Patienten mit Metastasen oder bei lokoregionärem Rezidiv eingesetzt. Dabei haben sich bei Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs folgende Substanzen als wirksam erwiesen: Cisplatin, Carboplatin, Methothrexat, Ifosphamid, Cyclophosphamid, Vincaalkaloide und 5-Floururacil (5-FU). Platinderivate gehören zu den wirksamsten Chemotherapeutika bei Plattenepithelkarzinomen. Die höchsten Remissionsraten erzielen Kombinationstherapien mit Cisplatin, bzw. Carboplatin und einer 5-FU-Dauertherapie. Von den neueren Substanzen sind die Taxane (Paclitaxel, Docetaxel) aufgrund ihrer strahlensensibilisierenden Eigenschaft viel versprechend. 1 Einleitung Seite 5 In neueren Studien hat sich die Dreierkombination aus Doxetaxel, Cisplatin und 5FU bei Patienten mit inoperablen Tumoren als wirksam in Bezug auf eine Verzögerung der Krankheitsprogression erwiesen. Die Prognose der Patienten, die ein Rezidiv nach Operation und/oder Strahlentherapie erleiden, ist infaust. Das mediane Überleben liegt in diesen Fällen zumeist unter 10 Monaten. Wenngleich das Gesamtüberleben durch eine erneute Radiotherapie oder eine zytostatische Behandlung bis dato nicht verlängert werden konnte, profitieren vor allem symptomatische Patienten von einer palliativen Radio- und/oder Chemotherapie im Sinne einer Verbesserung der Lebensqualität. Das Therapieansprechen ist nach Strahlentherapie oder kombinierter Radiochemotherapie deutlich schlechter als bei nicht vorbehandelten Patienten. Die zurzeit viel versprechendsten Substanzen in der Rezidivtherapie scheinen die Taxane mit Remissionsraten von ca. 40% zu sein. Zu den neueren Therapieoptionen zählt die Immuntherapie. Der Epidermale Wachstumsfaktor (EGF)-Rezeptor ist ein transmembranes Glykoprotein und gehört zur Familie der erbB-Rezeptoren. Der phosphorylierte EGF-Rezeptor und seine Substrate aktivieren die Signaltransduktion über eine Aktivierung der Tyrosin-Kinase. Der EGFR spielt eine wesentliche Rolle in der Genese von soliden Tumoren und ist häufig in Plattenepithelkarzinomen überexprimiert. Die EGFR-Expression ist für das Zellwachstum bei Plattenepithelkarzinomen des Kopf- und Hals-Bereichs entscheidend. Fast alle Tumore exprimieren den EGFR (Bonner et al. 2006). Es konnte gezeigt werden, dass eine Überexpression des EGFR mit einer schlechten Prognose und Radiotherapie-Resistenz korreliert (Modjtahedi et al. 1994, Slamon et al. 1995). In vitro, wie auch im Rahmen klinischer Studien mit einem monoklonalen Antikörper (mAb) gegen den EGFRezeptor, konnte gezeigt werden, dass durch Induktion von Apoptose und durch Hemmung der Angiogenese die Tumorprogression gestoppt werden kann. Ein Vorteil dieser Therapie ist, dass auch bei therapierefraktären Tumoren eine Remission erzielt werden kann. Speziell bei Tumoren des Kopf- und Hals-Bereichs aufgrund der Tumor-assoziierten Symptome (Schluckstörungen, Atemnot, Schmerzen) stellt dies eine Bereicherung für die Therapie dar. Ein weiterer Vorteil liegt in der sehr guten Verträglichkeit des Anti-EGF-Rezeptor-Antikörpers. 1 Einleitung Seite 6 Erbitux® (Cetuximab) ist der erste monoklonale IgG1-Antikörper seiner Art, der gezielt extrazellulär am epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) ansetzt und somit die Bindung von Wachstumsfaktoren hemmt. Bei Patienten mit lokal fortgeschrittenen Tumoren des Kopf-Hals-Bereichs hat Cetuximab positive Überlebensdaten gezeigt und die mittlere Gesamtüberlebenszeit in Kombination mit Bestrahlung um fast 20 Monate gegenüber der alleinigen Bestrahlung verlängert. Darüber hinaus hat Cetuximab auch eine klinisch bedeutsame Wirksamkeit bei rezidivierendem und/oder metastasierendem Tumoren des KopfHals-Bereichs erzielt (Trigo et al. 2004, Vermorken et al. 2007, Burtness et al. 2005). Seit April 2006 ist Cetuximab in Deutschland in Kombination mit Radiatio für die Behandlung von lokal oder regional fortgeschrittenen Plattenepithelkarzinomen des Kopf- und Hals-Bereichs zugelassen. Eine weitere Option den EGF-Rezeptor zu inhibieren, stellen „small molecules“, z.B. Tyrosin-Kinase-Inhibitoren (TKIs) wie Gefitinib dar, die an eine intrazelluläre Domäne des Rezeptors binden und somit die Tyrosin-Phosphorylierung reversibel oder irreversibel hemmen. Patienten mit Mutationen in Exon 19 oder 21 des EGFR-Gens zeigen in bis zu 80% ein Ansprechen auf Gefitinib, was einen potentiellen Nutzen für mutationspositive Patienten in frühen oder fortgeschrittenen Erkrankungsstadien zeigt (Lynch et al. 2004). Präklinische Studien haben gezeigt, dass EGFR-Inhibitoren wie Gefitinib und mAbs wie Cetuximab in Kombination mit Radiotherapie oder Chemotherapie wirksam sind. Ebenfalls in Erprobung ist die Wirksamkeit von VEGF-Rezeptor-Inhibitoren, wie Bevacizumab (Avastin®) bei Kopf- und Halstumoren. Avastin ist in Deutschland zur Behandlung des metastasierten Nierenzellkarzinom (NZK) in klinischer Prüfung. Eine weitere Gruppe von Medikamenten mit anti-neoplastischer Wirkung sind NSAIDs (non-steroidal anti-inflammatory drugs). Cyclooxygenase-Hemmer (COXHemmer) verhindern die Bildung von Prostaglandinen (PGs). PGs spielen eine Rolle in der Pathogenese der Tumorentstehung durch Stimulation von Zellproliferation und Motilität, Hemmung von Apoptose und Induktion der Angiogenese. Hohe Konzentrationen von COX-2 sind assoziiert mit Lymphknotenmetastasen, einer schlechten Prognose und einem schlechten Ansprechen auf Radiotherapie 1 Einleitung Seite 7 bei Patienten mit Hals-und Kopftumoren (Chang et al. 2004). Die Expression von COX-2 korreliert ebenfalls mit der EGFR-Expression, so dass sich Kombinationen von EGFR- und COX-2-Hemmern als wirksam erweisen könnten. 1.5 Tumor-assoziierte Antigene (TAA) Tumor-assoziierte Antigene (TAA) sind Proteine, die in Zusammenhang mit der Entstehung und dem Wachstum von Tumoren auftreten. Sie werden in oder auf Tumorzellen gebildet oder entstehen durch Induktion anderer Zellen. Sie zirkulieren als Makromoleküle im Blut und anderen Körperflüssigkeiten oder werden durch immunhistologische Methoden direkt im Tumorgewebe nachgewiesen. Jeder Tumor weist als individuelles Resultat seiner malignen Transformation ein spezifisches Antigenmuster auf. Für manche Tumorentitäten lassen sich bestimmte Proteine mit einer gewissen Regelmäßigkeit nachweisen, so dass sie als „Tumormarker“ in der posttherapeutischen Verlaufskontrolle eingesetzt werden können. Unter den Tumor assoziierten Antigenen lassen sich vier verschiedene Typen klassifizieren (Rosenberg et al. 1999): Sie können zum einen Fremdproteine viraler Herkunft sein (Onkoproteine E6 und E7 des Humanen Papillomavirus 16), oder sie entstehen durch Mutation aus vorhandenen zellulären Proteinen (Zellzyklusprotein cdk 4, Caspase-8 und das Onkogen ras). Daneben gibt es eine Reihe von Proteinen, die in gesunden Zellen regulär nachweisbar und in vielen Karzinomarten überexprimiert sind (EpCAM, c-myc, EGFR, HER-2/neu). Andere Tumoren produzieren differenzierungs- und gewebsspezifische Antigene, die physiologischerweise nur im fetalen Organismus in erhöhten Konzentrationen vorkommen. Hierzu zählen das Karzinoembryonale Antigen (CEA), eines der ältesten als tumorassoziiert bekannten Antigene und das Alpha-Fetoprotein (AFP). Von Tumor-assoziierten Antigenen (TAA) abgeleitete Peptide, die durch Klasse IMoleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (HLA) präsentiert werden, können spezifische zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) induzieren (Van der Bruggen und Van den Eynde 2006). Die Immuntherapie, wie sie darauf aufbauend in den vergangenen Jahren vor allem für Melanome, aber auch gynäkologische Tumoren entwickelt wurde, befindet sich in der klinischen Erprobungsphase. Diese Therapie setzt als wesentliches Element die Charakterisierung von TAA voraus. Der zusätzliche Einsatz von Zytokinen wie GM-CSF (Jäger et al. 1996) oder auch 1 Einleitung Seite 8 von Dendritischen Zellen (Hus et al. 2005, Su et al. 2005) kann die spezifische TZell- Antwort gegen TAA verstärken. Es wurden bei Patienten mit Melanom oder Nierenzellkarzinom auch Ribonukleinsäure (RNS)- und Proteinvakzine ebenso wie Vakzine mit viralen Vektoren eingesetzt (Dannull et al. 2005, Rosenberg et al. 2003). 1.6 Das Tumor-assoziierte Antigen G250 (Carboanhydrase IX,MN 75) Bei der Gruppe der Carboanhydrasen (CA) handelt es sich um Zink bindende Metalloenzyme, die die reversible Hydratisierung von CO2 zu Hydrogencarbonat (Bicarbonat) nach der Formel: CO2+H2O ↔ H++HCO3-katalysieren. Sie werden in einer Vielzahl von Geweben produziert und spielen eine wichtige Rolle in mehreren biologischen Prozessen, wie Säure-Base-Haushalt, pH-Regulation, CO2- und Ionentransport, Glukoneogenese, Lipogenese und Respiration. Die verschiedenen CA Isoenzyme sind hoch polymorph, unterscheiden sich hinsichtlich ihrer kinetischen Eigenschaften, ihrer Zelllokalisation, ihrer Gewebsverteilung und ihrer Empfänglichkeit für Inhibitoren. Vierzehn enzymatisch aktive Carboanhydrasen sind in Säugetieren bereits bekannt, von denen die CA-I, -II, -III, -VII und -XIII im Cytoplasma lokalisiert sind. Die CA-I ist stark exprimiert in Erythrozyten. CA-IV, -IX, -XII, -XIV und -XV sind Plasmamembran gebunden, CA-VA und CA-VB sind mitochondrial und CA-VI ist die einzige sekretorische Form, vorkommend in Milch und Speichel. Von den vierzehn aktiven Isoenzymen, sind die CA-IX und CA-XII mit einigen Malignomen assoziiert. Das CA-IX Gen ist lokalisiert auf Chromosom 9p12-p13. Das Gen besteht aus elf Exons und zehn Introns und kodiert für ein Protein bestehend aus 466 Aminosäuren. Im Western Blot ist das CA-IX Protein durch den monoklonalen Maus Antikörper 75 (MN75) als Doppelbande bei 54/58 kDa detektierbar. Die CA-IX ist ein Transmembran-Protein, lokalisiert an der Zelloberfläche, wo es Oligomere formt, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. Die Oligomerisation scheint die Vorraussetzung für die biologische Aktivität des Enzyms zu sein. 1 Einleitung Seite 9 Die CA-IX besteht aus vier Domänen: einem N-terminalen Signalpeptid, einem extrazellulären Teil, bestehend aus einer Proteoglykan-ähnlichen Domäne und einer CA-katalytischen Domäne, einer transmembranen Region und einem kurzen zytoplasmatischem C-Terminus. Die Proteoglykan-ähnliche Domäne scheint für Zell-Zell- sowie Zell-Matrix-Adhäsion verantwortlich zu sein. Bei der CA-Domäne handelt es sich um ein hoch aktives Enzym mit hoher Protonentransferrate. Die Aktivität der CA-IX kann durch Sulfonamide gehemmt werden. Die menschliche CA-IX (ursprünglich MN Protein genannt) wurde erstmals in der Zervix-Karzinom Zelllinie HeLa durch Gebrauch des monoklonalen Antikörpers MN75 identifiziert (Pastorekova et al. 1992). Zusätzlich zu Enzymaktivität und pH-Kontrolle handelt es sich bei der CA-IX um ein Zell-Adhäsionsmolekül, das möglicherweise an Zell-Proliferation und -Kommunikation mitwirken kann. Die höchste Expressionsrate der CA-IX im gesunden Gewebe wurde beim Menschen im Verdauungstrakt, vor allem in der Magenmukosa und der Gallenblase gefunden, außerdem mit abnehmender Expressionsrate in Ileum, Kolon, Leber und Pankreas. Die CA-IX ist relativ hoch exprimiert und mit hoher Prävalenz in einigen Tumorgeweben vorhanden, z.B. Nierenzellkarzinom, Karzinomen der Cervix uteri, des Ösophagus, der Lunge, der Mamma und auch bei Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereiches. Physiologisches Gewebe exprimiert dagegen dieses Protein nicht. Im Gegensatz dazu verlieren Tumoren von Geweben, die ursprünglich die CA-IX exprimieren, wie Magen und Gallenblase, einiges oder alles ihrer CA-IX-Aktivität, wenn sie maligne entarten. Die CA-XII-Expression zeigt ebenfalls eine klare Assoziation mit bestimmten Tumoren, so ist sie z.B. beim Nierenzellkarzinom überexprimiert. 1986 haben Oosterwijk et al. einen monoklonalen Antikörper G250 (MAb G250) beschrieben, der gegen das humane Nierenzellenkarzinom (NZK) gerichtet war. MAb G250 hat mit 90% der primären NZK und 82% der metastasierten NZK reagiert, aber nicht mit dem umgebenden gesunden Nierengewebe (Pastorekova et al. 1992). Die Kreuz-Reaktivität mit normalem Gewebe hat sich auf die Magenmukosa und und den Gallengang beschränkt. Schließlich wurde die cDNA, die für das G250 Antigen kodiert, geklont und die Sequenzanalyse zeigte die Identität mit dem CA-IX- Antigen. 1 Einleitung Seite 10 Transfektion von cDNA der CA-IX in NIH3T3 Zellen verursachte eine Veränderung der Zellmorphologie: die Zellen waren spindelförmig, kleiner, weniger adhärend auf Plastikoberflächen und wuchsen auf Softagar heran. Diese Charakteristika ließen auf eine Rolle der CA-IX in der Regulation von Zellproliferation und Transformation schließen. Es wurde gezeigt, dass die CA-IX durch Hypoxie in einer Reihe von malignen Zellen in vitro induziert werden kann, wie z.B. in Zelllinien von Harnblase, Mamma, Zervix und Bronchialkarzinomen (Wykoff et al. 2000). Das von Hippel-Lindau (VHL)-Tumor-Suppressor-Gen scheint in diesem Prozess eine kritische Rolle zu spielen. Die Transkription von G250/CA-IX kann durch den Transkriptionsfaktor HIF-1α durch eine Bindungsstelle in der Promoterregion auf dem G250/CA-IX-Gen aktiviert werden. HIF-1α ist unter normalen Bedingungen durch das VHL-Protein reguliert. VHL ist ein Tumor-Supressor-Gen, dessen kodierendes Protein mit HIF1α interaktiert und nach Bindung zur proteasomalen Degradierung von HIF-1α führt. VHL ist in vielen Tumoren mutiert. Mutiertes VHL oder Hypoxie, z.B. in nekrotischen Bereichen des Tumors, führen zur Akkumulation von HIF-1α. HIF-1α gelangt nach Komplexbildung mit der HIF-1β-Untereinheit zu vermehrter transkriptioneller Aktivität. Plattenepithelkarzinome des Kopf-Hals-Bereiches sind charakterisiert durch heterogene Hypoxie-Regionen (Hockel et al. 1996). Hypoxie resultiert normalerweise in Zelltod. Tumorzellen jedoch passen sich an dieses feindliche Milieu an, was es ihnen ermöglicht zu überleben und zu proliferieren. Diese Fähigkeit bestimmt ihr malignes Potential und zeigt einen aggressiveren Phenotyp (Harris et al. 2002). Immunhistochemische Untersuchungen über die Expressionrate der CA-IX in Tumoren des Kopf-Hals-Bereiches ergeben Werte von 99% und bei 26% bis 89% der Tumoren ist die CA-IX hoch exprimiert (Koukourakis et al. 2001, Beasley et al. 2001, Hoogsteen et al. 2005). CA-IX wurde bereits als Marker für Tumor-Hypoxie verwendet und Studien haben gezeigt, dass dieses Enzym wichtig für das Tumorwachstum und Überleben der malignen Zellen ist (Robertson et al. 2004). In mehreren Studien bei Patienten mit Mamma-, Bronchial-, Zervix- oder Hals- und Kopf-Tumoren zeigte sich die CA-IX-Expression als ein von anderen prognostischen Kriterien unabhängiger Faktor, der mit einer schlechten Prognose assoziiert ist. 1 Einleitung Seite 11 CA-IX Überexpression geht ebenfalls mit einem schlechten Ansprechen auf Chemo- und Radiotherapie einher. Im Vergleich mit anderen Markern wie GLUT1 und Pimonidazol scheint die CA-IX der robusteste Marker zu sein. Die Oberflächenexpression der CA-IX macht sie zu einem potentiellen Ziel einer Antikörpertherapie. Darüber hinaus könnte aufgrund ihrer Überexpression in Tumorgewebe die Entwicklung einer Tumor-Vakzinierung gegen CA-IX eine weitere Therpiemöglichkeit für Patienten mit Tumoren des Kopf- und Hals-Bereichs werden. Am besten untersucht ist die CA-IX bisher bei Patienten mit NZK, bei denen 1986 der WX-G250 Antikörper identifiziert wurde. Das CA-IX-Antigen ist beim NZK vom klarzelligen Typ in mehr als 95% der Fälle exprimiert (Uemura et al. 1999), wohingegen gesundes Nierengewebe keine CA-IX-Expression zeigt. Die Prognose des metastasierten NZK ist sehr schlecht, da es mit konventionellen Behandlungsmöglichkeiten nicht kurativ angehbar ist. Die Zytokinbasierten Immuntherapien mittels Interferon-a (IFNa) und Interleukin 2 (IL-2) stellen bislang die Therapie der Wahl des metastasierten NZK dar. Konsequenterweise legt man besonders hier den Fokus auf neue, möglichst spezifische Therapiemodalitäten. Ein wachsendes Verständnis der Biologie des NZK erlaubt die Untersuchung von molekularen Markern, die möglicherweise prognostische oder prädiktive Relevanz haben. Patienten mit metastasiertem NZK und einer hohen CA-IX-Expression scheinen, was das Gesamtüberleben betrifft, eine bessere Prognose zu haben, als Patienten mit niedriger CA IX-Expression. Dies gilt jedoch nicht für Patienten ohne Metastasen. CA-IX scheint hier ein guter prognostischer Marker zu sein. Es konnte gezeigt werden, dass eine hohe CA-IX-Expression bei den meisten Patienten mit fortgeschrittenem NZK mit einer signifikant besseren Überlebensrate nach Interleukin-2 (IL-2) Therapie korreliert (Atkins et al. 2005). Verschiedene Antikörper kommen bereits als Standardbehandlung bei bestimmten Tumoren mit bemerkenswertem klinischen Resultaten und einem günstigen Toxizitätsprofil zum Einsatz. 1 Einleitung Seite 12 1.7 Ziel der Arbeit Die Therapie von Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs bleibt aufgrund einer erheblichen Tumorheterogenität problematisch. Trotz einer Verbesserung der Diagnostik sowie moderner Operations- und Bestrahlungsverfahren hat sich das Langzeitüberleben in den letzten 20 Jahren nicht wesentlich verbessert. Es ist daher entscheidend, neue immuntherapeutische Strategien mit der Identifikation weiterer Tumor-assoziierter-Antigene (TAAs) zu entwickeln. Ein innovativer Ansatz ist eine Vakzinierungstherapie mit Peptiden, die von Tumorassoziierten-Antigenen abgeleitet sind. Eine solche Vakzinierung kann in Kombination mit Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) zur Induktion von Tumorspezifischen CD8+ T-Zellen und zur Aktivierung von B-Zellen und Natürlichen Killer (NK)-Zellen führen. In dieser Studie wurden die Expression des TAA G250/ CA-IX mittels Western Blot und Immunhistochemie auf Plattenepithelkarzinomzellen des Kopf-Hals-Bereichs nachgewiesen und Tumor-spezifische CD8+ TZellen von Patienten mit Plattenepithelkarzinomen der Kopf-Hals-Region in vitro generiert. Die Aktivierung dieser T-Zellen wurde durchflusszytometrisch charakterisiert und ihre zytotoxische Funktion durch Exposition gegenüber mit Tumorzelllysat gepulsten autologen Antigen-präsentierenden Zellen und Tumorzellen mittels Enzyme linked Immunospot Assay (ELISPOT) evaluiert. 2 Material und Methoden Seite 13 2 Material und Methoden 2.1 Materialien 2.1.1 Laborgeräte Autoklav WEBECO (Stuttgart, Deutschland) Bestrahlungsgerät BIOBeam 8000 (STS Steuerungstechnik & Strahlenschutz, Braunschweig, Deutschland) Blotting-Apparatur Trans-Blot SD (BIORAD) Blotting-Papier Gel-Blotting-Papier GB004 (Schleicher&Schuell, Düren Deutschland) Brutschrank Steri-Cult Incubator (Forma Scientific, Marietta, Ohio, USA) B 5042 E (Heraeus Instruments, Hanau, Deutschland) Digitalwaage Mettler PC 440 (Mettler, Giessen, Schweiz) Precisa 3000C-6000D (PAG Oerlikon, Zürich, Schweiz) ELISPOT-Reader Immuno Spot (C.T.L. Europe, Reutlingen, Deutschland) Durchflusszytometer FACSCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) Film Kodak BioMAX MR-1 (Kodak, Stuttgart, Deutschland) Filmentwickler Curix 60 (Agfa, Mortsel, Belgien) Flüssigstickstofftank (Taylor Wharton, Mildstedt, Deutschland) Gelkammer Novex Mini-Cell (Invitrogen) Homogenisator (Dianova GmbH, Hamburg, Deutschland) Kühlschrank -20°C (Bosch) Ultra Low -80°C (Sanyo) +4°C und -20°C (Liebherr) Magnetständer MACS MultiStand (Miltenyi Bergisch Gladbach, Deutschland) Magnetrührer KAMAG REO (Bender&Hoblin) Biotec GmbH, 2 Material und Methoden Membranen Seite 14 Western Blot: Immotilon-P Transfer Membrane (Miilipore Bedford, MA, USA) Mikroskop Vergrößerung 3, 2, 10, 16 und 100fach (Carl Zeiss, Jena, Deutschland) Mixer / Schüttler Thermomixer 5436 und Thermomixer compact (Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland) Mini Rocking Platform (Biometra) Netzgerät Power Pack HC (BIO-RAD) Photometer Pharmacia Ultrospec III (LKB Biochrom, Cambridge, England) Pipetten 0,5-10 µl, 10-100 µl, 50-250 µl und 100-1000 µl Eppendorf Reference (Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland) Pipettboy (Integra Bioscenics) Röntgenkassette (Dr. Goos-Suprema GmbH, Heidelberg, Deutschland) Sterile Arbeitsbank Hera-Safe HS-18 und HLB 2448 (Heraeus Instruments, Hanau, Deutschland) Vortexer Vortex-Genie 2 (Scientific Industries) REAX 2000 und REAX Top (Heidolph) Waage Precisa 220M (Swiss Quality); Sartorius BP8 Wasserbad GFL Zentrifugen Biofuge pico (I) und Labofuge M (II) (Heraeus Instruments, Osterode, Deutschland); Beckman Instruments, GS-6R und Fullerton, GS-15R CA, USA), (Beckman alle mit Standard-Rotor Zerkleinerungsmaschine Medicon Medimachine, (DAKO, Glostrup, Dänemark) 2 Material und Methoden Seite 15 2.1.2 Plastikwaren Einfrier-Röhrchen Nunc Cryo Tube®Vials 1,8 ml (Nalge Nunc International, Roskilde, Dänemark) ELISPOT-Platten MultiScreen-IP, MultiScreen 96-well filtration and assay plate (Millipore) FACS-Röhrchen FALCON® Polystyrene Round-Bottom Tube 5 ml (Becton Dickinson) Filter Filcon® 70 µm Filter (DAKO) Kulturflaschen NUNCLON® Surface 40, 160 und 400 ml (Nalge Nunc) Pipetten FALCON® Serologische Pipetten 2, 5, 10, 25 und 50 ml (Becton Dickinson) Pipettenspitzen epT.I.P.S. Standard 0.1-10, 2-200 und 50-1000 µl (Eppendorf AG) Platten NUNCLON® Surface 12, 24, 48, 96 well (Nalge Nunc) Röhrchen FALCON® Polypropylen Tubes 15 und 50 ml (Becton Dickinson) Trennsäule MACS MS+ Separation Columns (Miltenyi Biotec GmbH) 2.1.3 Laborchemikalien Sämtliche Laborchemikalien wurden in höchstmöglicher Reinheit von folgenden Firmen bezogen: Roth GmbH + Co.; Karlsruhe, Deutschland Fluka Chemie AG; Buchs, Schweiz Merck KGaA; Darmstadt, Deutschland Sigma Chemical Co.; St. Louis, MO, USA Sigma-Aldrich Chemicals, Deisenhofen, Deutschland GibcoBRL®, Life Technologies; Karlsruhe, Deutschland 2 Material und Methoden Seite 16 2.1.4 Spezielle Chemikalien, Marker, Antikörper Ammoniumchlorid Erythrozytenlysepuffer (Sigma-Aldrich) 3-Amino-9-Ethylcarbazol Enzymsubstrat (Sigma) Antikörper Anti-MN75/G250, monoklonaler Maus-Antikörper in Hybridom-Medium (Prof. Pastorekova, Bratislava, Slowakei) Anti-Maus IgG Meerrettich-Peroxidase (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, England) Anti-Actin, C-11, goat polyclonal IgG (Santa Cruz Biotechnologies, USA) BSA Bovines Serum Albumin (Sigma) DNAse Desoxyribonuklease (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) Einfriermedium RPMI 1640, 20% humanes AB-Serum (German Red Cross Blood Center, Ulm, Germany) und 10% Dimethyl-Sulfoxid (DMSO) (Merck) FACS-Antikörper CD8PE, PE anti-human CD8, CD4 FITC, FITC anti-human CD4 (PharMingen, Becton Dickinson) Färbelösung ECLTM Western blotting detection reagents (Amersham) Tryptan Blau 0,4% (Sigma-Aldrich) Färbetabletten BCIP (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate) und NBT (Nitroblue tetrazolium chloride) Färbe- tabletten (Sigma) SIGMA FAST® 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate / Nitro blue tetrazolium (BCIP/NBT) kombiniert (Sigma) Ficoll-Lösung BIOCOLL Separating Solution, Dichte: 1,077 (Biochrom AG, Berlin, Deutschland) L-Glutamin Zusatz für das Medium der Zellkulturen (Biochrom AG) Lysing Matrix D (Bio 101 Systems, Q BIO gene, France) Lysing solution 10% Triton, 1M Tris HCL (pH 8,0), NaCl 4g, 0,5M EDTA, 0,1M Orthovanandat 2 Material und Methoden Seite 17 Magnetische Markierung MicroBeads CD8 (Miltenyi Biotec GmbH) Marker Western Blot: 1.)Bench MarkTM Prestained Protein Ladder (GibcoBRL®, Life Technologies; Karlsruhe, Deutschland) 2.) RPN 756 Rainbow® Marker (Amersham Life Science) PBS phosphate buffered saline 10x (w/o Calcium and magnesium) (Gibco, Invitrogen C. AKL, NZ) Penicillin Zusatz für das Medium der Zellkulturen (Invitrogen Gibco, Grand Island, USA) Peptide IMP, G250, HER2, MAGE (Thermo Electron Corporation, Ulm, Deutschland) Protease Inhibitor (Complete, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) Protein-Assay BIO-RAD Protein Assay und BIO-RAD Protein Standard II (BIO RAD, Hercules, CA, USA) X-VIVO 10 Medium (Cambrex Bio Science, Verviers, Belgien) Streptomycin Zusatz für das Medium der Zellkulturen(Invitrogen Gibco) 2 Material und Methoden Seite 18 2.2 Methoden 2.2.1 Tumorproben von Plattenepithelkarzinomen des Kopf-HalsBereiches (HNSCC) Wir erhielten Tumorgewebe von 22 kaukasischen Patienten (20 männlich, 2 weiblich) mit histologisch gesichertem Plattenepithelkarzinom des Larynx, Oropharynx oder Hypopharynx in 21 Patienten und einem Patienten mit Lymphknotenmetastase bei einem Primärtumor unklaren Ursprungs (CUP, cancer of unknown primary). Die Tumorproben wurden während chirurgischer TumorResektion von der Abteilung für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde der Universitätsklinik Ulm zwischen Dezember 1999 und April 2007 gewonnen. Ein positives Votum der Ethikkommission der Universität Ulm zur Gewinnung von Gewebeproben und peripherem Blut von Patienten mit Kopf-Hals-Tumoren liegt vor. Alle Patienten unterzeichneten nach umfassender Information eine Einverständniserklärung und einen Gewebe-Übereignungsvertrag. Bei der Tumoroperation wurde ein Teil des soliden Tumorgewebes zur feingeweblichen Aufarbeitung entnommen und sofort in 4°C kaltes RPMI 1640 Medium aufgenommen. Um sicherzustellen, dass es sich bei dem entnommenen Gewebe um repräsentatives Gewebe handelt, wurde eine Probe in die Abteilung für Pathologie zur Schnellschnittuntersuchung eingesandt. Ein weiterer Teil des operativ entfernten Tumorgewebes ging zur Herstellung einer Einzelzellsuspension in das HNO -Labor. Die entsprechende solide Tumorprobe wurde dazu unter sterilen Bedingungen in einer Petrischale mit einem Skalpell grob zerkleinert. Mit Zugabe von X-VIVO 10 Medium und 0,08 mg/ml DNAse, zur Verhinderung von Zellklumpung, wurden kleine Gewebestücke in spezielle Probengefäße, so genannte „Medicons“ (Medicon, Tuttlingen, Deutschland) überführt und für eine Minute in einer mechanischen Zerkleinerungsmaschine (Medicon Medimachine, DAKO, Dänemark) zu Einzellzellen zerkleinert. Anschließend wurde die Zellsuspension zur weiteren Vereinzellung durch einen Filcon® Filter (Filcon 70µm, DAKO, Glostrup, Dänemark) der Porengröße 70 µm gefiltert und mit 8,3 g/l Ammoniumchlorid (Sigma-Aldrich, München, Deutschland) zur Erythrozytenlyse, inkubiert. Die Lyse war nach 1-5 min wirksam. Danach wurden die Zellen zweimal in X-VIVO 10 Medium gewaschen und in Einfriermedium, welches RPMI 1640, 20% Serum von männlichen Spendern mit der Blutgruppe AB (AB-Serum) und 2 Material und Methoden 10% DSMO enthält, Seite 19 aufgenommen und im Stickstofftank bei -196°C kryokonserviert. 2.2.2 Isolation von mononukleären Zellen über einen Dichtegradienten Periphere Blutproben wurden von gesunden HLA-A2+ Blutspendern und von Patienten, nach deren Einverständnis entnommen. Die Isolation der mononukleären Zellen des peripheren Blutes (peripher blood mononuklear cells, PBMN) folgte über einen Dichtegradienten mit der FicollSeparationslösung durch Zentrifugation. Es wurden je 15-18 ml Ficoll-Lösung in entsprechende Falcons vorgelegt und mit dem Gemisch aus EDTA-antikoaguliertem peripherem Blut und PBS ganz langsam überschichtet. Die Zentrifugation erfolgte bei 2000 Umdrehungen pro Minute (716 g) für 20 min ohne Abbremsung. Dabei entstand eine milchige Interphase zwischen Ficoll-Lösung und Plasma, welche die mononukleären Zellen enthielt. Diese wurden vorsichtig abpipettiert und mehrmals mit PBS gewaschen. Die Viabilität der PBMNs wurde mit der Tryptanblau-Färbung bestimmt und betrug immer >95%. Die viablen Zellen wurden in der Neubauer-Kammer (Zeiss, Oberkochen, Deutschland) gezählt, in Einfriermedium aufgenommen und im Stickstofftank bei 196°C kryokonserviert. 2.2.3 T2-Zellen Die T2-Zelllinie stammt von der „ATCC-American Type Culture Collection“ (www.atcc.org). Diese T2-Zelllinie ist eine Hybridomzelllinie mit einem Transporterdefekt, assoziiert mit der Antigen-Prozessierung, welche durch die Fusion einer lymphoblastischen B-Zelllinie mit einer lymphoblastischen T-Zelllinie (ATCC-CRL-1992) entstanden ist. Die T2-Zelllinie wurde in ELISPOT-Assays für HLA-A2 restringierte Peptid-Epitope verwendet und in einem Brutschrank bei 37°C in eine r 5% CO2 enthaltenden Atmosphäre aufbewahrt. Als Medium für die Zellen wurde ein Standard ABMedium verwendet, das aus RPMI 1640, 10% AB-Serum, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 U/ml Streptomycin bestand. 2 Material und Methoden Seite 20 2.2.4 Synthetische Peptide Bei den in unserer Studie verwendeten Peptiden handelte es sich um ein vom Influenza-Matrix-Protein (IMP) abgeleitetes Peptid (pos. 58-66: GIL GFV FTL), G250 Peptid (pos. 24-32: QLL LSL LLL), Humaner epithelialer WachstumsfaktorRezeptor (HER2) Peptid (pos. 633-641: IIS AVV GIL) und Melanoma associated Antigen-(MAGE)-A3 Peptid (pos. 271-279: FLW GPR ALV). Alle Peptide sind HLA-A*0201 restringierte CD8+ T-Zell Epitope. Sie waren für die Versuche in DMSO, gemischt mit PBS in einer Konzentration von 1 µg/ml gelöst. Alle Peptide wurden von Thermo Electron Corporation (Ulm, Germany) in einer Reinheit von mindestens 95%, gemessen durch Chromatographie, hergestellt. 2.2.5 Western Blot (WB) Im Western Blot werden gelöste Proteine mittels Sodium-Duodecyl-Sulfat Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page) aufgetrennt. Anschließend werden sie auf eine Nitrocellulosemembran übertragen, auf die man spezifische Antikörper einwirken lässt, die ihrerseits spezifische Proteine erkennen, welche dann durch enzymgekoppelte Anti-Immunglobuline sichtbar gemacht werden können. Folgende Arbeitsschritte wurden durchgeführt: Proteinisolation Von jeder zu untersuchenden Gewebeprobe wurden kleine Tumorstücke zusammen mit 1 ml Lyse-Puffer in ein Kunststoffröhrchen mit Porzellankügelchen (Lysing Matrix D, MP Biomedicals, Ohio, USA) gegeben. Die Probe wurde dann drei- bis fünfmal für je 40 Sekunden auf hoher Stufe mit einem Homogenizer (MP Biomedicals, Ohio, USA) homogenisiert und anschließend für 20 min. bei 4°C über Kopf rotiert. Danach wurden die homogenisierten Proben in neue Eppendorfröhrchen überführt und mit 12000 U/m für 30 min. bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand (etwa 600µl) wurde abpipettiert, in neue Eppendorfröhrchen gegeben, die in der Zwischenzeit beschriftet wurden, und auf Eis gelagert. Protein-Konzentrationsbestimmung nach Bradford Das Photometer wurde auf eine Wellenlänge von 595 nm eingestellt. Die BIORAD-Protein Assay Stammlösung ist ein 5-fach Konzentrat und muss zu- 2 Material und Methoden Seite 21 nächst mit destilliertem Wasser verdünnt werden. Für den Leerwert (0) wurde nur die Stammlösung mit 5 µl Lysepuffer am Photometer gemessen. Pro Probe wurden zwei Kunststoffküvetten mit 5 µl Probe und 1 ml BIORAD-Protein Assay Stammlösung (BIORAD, Kalifornien, USA) vorbereitet. Aus den erhaltenen Messwerten wurde der Mittelwert gebildet und durch 5 dividiert, da 5 µl Probe eingesetzt worden sind. Schließlich erfolgte das Aliquotieren der Proben zu je 50 µl Probe pro Röhrchen, sowie das Einfrieren und Lagern bei -80°C. Western Blot Tag 1 Vorbereitung der Protein-Proben Die Proben wurden zunächst auf Eis langsam aufgetaut und gut resuspendiert. Dann wurde 20 µg Protein pro Probe durch Zugabe von A. bidest. auf ein Volumen von 15 µl gebracht. Anschließend erfolgte die Zugabe von 5 µl Loading- Buffer (SDS-Gel-Lade-Puffer) um ein Endvolumen von 20 µl zu erzielen. Die Proben wurden dann für 10 min. auf dem Thermoheizblock bei 70°C unter Schütteln denaturiert, anschließend 1 min. bei 10000 U/min. in einer Tisch- Zentrifuge anzentrifugiert Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Während dessen wurde die Elektrophoresekammer mit 760 ml A. bidest. und 40 ml MOPS Running Buffer aufgefüllt. Die Proben wurden in die Taschen eines 412% Bis-Tris Polyacrylamidgel (NuPAGE, Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) aufgetragen und eine Elektrophorese bei 200 V für 1:10 h zum Auftrennen der Proben durchgeführt. Als Verlaufskontrolle dienten zwei verschiedene Marker, zum einen 10 µl BIORAD-Presicion Plus Protein Standards-Kaleidoskope, sichtbar auf dem Gel, und zum anderen 3 µl Magic Marker (Magic Mark WB Invitrogen), sichtbar auf dem Film. „Semidry Blotting“ Für jedes Gel wurden zunächst 12 Gel-Blotting-Filterpapiere auf eine Größe von 7x8 cm (56 cm2) zugeschnitten. Ebenfalls wurde eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran (Millipore Corporation, Bedford, USA) so vorbereitet, dass sowohl Breite als auch Höhe mit der des Gels übereinstimmten. Die Membran 2 Material und Methoden Seite 22 wurde zuerst in Methanol aktiviert, dann kurz in A. dest. abgewaschen und anschließend für ca. 20 min. in Anoden-I-Puffer gelegt. Daraufhin wurden 4 Filterpapiere in Anoden-II-Puffer getränkt und als erstes auf die Graphitplatte (Plus-Pol) des Blotters gelegt. Dann folgten 4 in Anoden-I-Puffer getränkte Filterpapiere. Als nächstes wurde das Gel aus der Halterung herausgelöst und auf die Membran gelegt. Beides kam mit der Membran auf dem in Anoden-I-Puffer getränktem Filterpapier zu liegen. Zwischenräume wurden mit Parafilm ausgelegt um einen evtl. Höhenunterschied und Stromfluss auszugleichen. Zuletzt wurden noch vier in Kathodenpuffer getränkte Filterpapiere auf das Gel gelegt und anschließend der Minus-Pol des Blotters als Deckel oben aufgelegt. Der Blotter wurde für 1 h bei 140 mA (3mA/cm2) an den Power Pack HC angeschlossen. Nach dem Blotting wurde die Membran kurz in PBS 0,05% Tween gewaschen und anschließend in 20 ml einer Milchpulverlösung bei 4°C über Nacht geschwenkt, um unspezifische Bindestellen der Membran zu blocken. Western Blot Tag 2 1. Antikörper Nach einmaligem kurzem Waschen in PBS 0,05% Tween (PBS-T) folgte die Inkubation mit dem Primär-Antikörper MN75/G-250. Bei dem Antikörper handelt es sich um einen monoklonalen Maus-IgG2b-Antikörper, gewonnen aus einer Hybridom-Zelllinie, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Frau Prof. S Pastorekova, Bratislava, Slowakei. Das Hybridom-Medium enthält 10% FCS und 0,02% Sodiumazid. Der G250-Antikörper wird in einer Verdünnung von 1:10 bis 1:40 in einem Gesamtvolumen von 10 ml bei 4°C über Nacht in kubiert. Western Blot Tag 3 2. Antikörper Nach der Inkubation wurde die Membran dreimal für 10 min mit PBS-T gewaschen. Anschließend wurde sie für 2 h bei Raumtemperatur mit einem MeerrettichPeroxidase konjugiertem Zweit-Antikörper IgG-anti-Maus in einer Verdünnung von 1:5000 in einem Gesamtvolumen von 20 ml inkubiert. 2 Material und Methoden Seite 23 Färbung der Membran und Belichtung des Films Nach dreimaligem Waschen der Membran wurden die Proteinbanden mittels Chemilumineszenz (ECL Western Blotting Detection Reagents, Amersham Biosciences, UK) auf einem Film nach Entwicklung sichtbar. „Stripping“ Die Membranen wurden zunächst für 15 min in den im Wasserbad auf 54°C erwärmten stripping buffer gelegt, anschließend kurz mit PBS 0,1% TWEEN gewaschen und dann für 1h in einer Milchpulverlösung geblockt. Nun folgte die Inkubation mit dem 1.Antikörper β-Actin, einem polyklonalen IgGAntikörper, in einer Verdünnung von 1:1000 bei 4°C über Nacht.Nach gründlichem Waschen wurde die Membran für 2 h bei Raumtemperatur mit dem 2. Antikörper donkey α goat inkubiert. Die Filmentwicklung erfolgte wie bereits beschrieben mit dem ECL-Detektionssystem. 2.2.6 Gemischte Lymphozyten-Peptid-Kultur (MLPC) Tag 0: Beladen der Zellen mit CD8+ MicroBeads: Die PBMNs von HLA-A2 positiven und im Western Blot G-250 positiven Patienten wurden mit einer Viabilität von > 90% aufgetaut und in RPMI-Medium aufgenommen. Nach Zentrifugation bei 1200 U/m (250 g) für 10 min wurde das Medium wieder abpipettiert und die Zellen in ca. 5 ml Seperationspuffer aufgenommen. Anschließend wurden die Zellen gezählt. Nach Zentrifugation und abpipettieren des Puffers, wurden die Zellen mit CD8+ magnetischen Beads beladen: Pro 1x107 Zellen wurden 80 µl Separationspuffer und 20 µl MicroBeads hinzugegeben und anschließend für 15 min im Kühlschrank inkubiert. Nach der Inkubation wurden die magnetischen Beads durch Zugabe von ca. 5 ml Separationspuffer und anschließender Zentrifugation wieder entfernt. Die Zellen wurden nun erneut in 500 µl Separationspuffer aufgenommen. Zellfiltration: Zunächst wurde die MACS-Säule (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland) an das magnetische Feld des MACS Separators gesteckt und mit 500 µl 2 Material und Methoden Seite 24 Separationspuffer befeuchtet. Das Efluat wurde verworfen. Bei dem Vorhandensein von Verunreinigungen in der Probe wurde ein Filter auf die Säule gesetzt. Nun wurde die Zellsuspension auf die Säule gegeben und durchlaufen gelassen. Um eine hohe Reinheit zu erzielen, wurde die Säule dreimal mit 500 µl Separationspuffer gewaschen. Dieses Efluat enthielt die CD8- Antigen-präsentierenden Zellen. Nach dem letzten Waschschritt wurde die Säule von dem Magneten entfernt. Auswaschen: Die Säule wurde von dem Magneten entfernt und auf ein 15 ml Röhrchen gesteckt. Auf die Säule wurde 1 ml Seperationspuffer gegeben und die Zellen mit einem Stempel ausgewaschen. Dieses letzte Eluat enthielt die separierten Zellen (CD8+). Zellzählung: Die CD8+ und die CD8- Zellen wurden jeweils mit etwas AB-Medium aufgefüllt, gezählt und anschließend zentrifugiert. Das Medium wurde abpipettiert. Die Reagenzröhrchen wurden erneut mit Medium aufgefüllt: CD8+ Zellen: 5x105 Zellen in 500 µl AB-Medium CD8- Zellen: 2x106 Zellen in 500 µl AB-Medium Die CD8+ Zellen wurden in je 500 µl Medium pro Napf auf eine 24-Napf Platte gegeben und anschließend im Brutschrank inkubiert. Die CD8- Zellen werden bei 30 Gy bestrahlt, was ihnen ihr Proliferationsvermögen entzog, ihre Fähigkeit zur Antigenpräsentation jedoch nicht beeinflusste. Pulsen der CD8-Zellen mit dem jeweiligen Peptid: Nach dem Bestrahlen wurden 2,5 µg/ml β2-Microglobulin zu den CD8-Zellen pipettiert und diese anschließend in je 500 µl Medium in entsprechend viele 15 ml Röhrchen aufgeteilt. Nun folgten die Zugabe von 20 µg/ml des G-250 Peptids, dem Kontrollpeptid Influenza-Matrix-Protein (IMP: GILGFVFTL) und einmal keine Peptidzugabe (no peptid) oder HER als ein irrelevantes Peptid und somit als Negativkontrolle. Die Zellen wurden für 1,5 h im Brutschrank inkubiert. 2 Material und Methoden Seite 25 Zugabe der CD8-Zellen auf die 24-Napf Platte: Nach der Inkubation wurden die CD8-Zellen erneut zentrifugiert, um das Peptid abzuwaschen und in frisches Medium aufgenommen. Die CD8- Zellen wurden nun zu den CD8+-Zellen in je 500 µl Medium pro Napf auf die 24-Napf-Platte gegeben und ca. viermal mit einer Pipettenspitze vorsichtig durchmischt. Tag 1: Die Zellen wurden mit 2,5 ng/ml IL-2 (humanes Interleukin-2, Sigma-Aldrich, München, Deutschland) und 20 ng/ml IL-7 (rekombinantes humanes Interleukin-7, Strathmann Biotec AG Hamburg, Deutschland) pro Napf stimuliert. Dazu wurden die Interleukine in 100 µl AB-Medium pro Napf aufgenommen und vorsichtig auf die Zellen „getupft“ um diese nicht zu zerstören. Tag 8: Die T-Zellen wurden herausgelöst und in der Tryptanblau-Färbung mikroskopisch gezählt und auf ihre Viabilität überprüft. Das Expressionsmuster der T-Zellen wurde in der FACS-Analyse, sowie ihre Funktionalität (Zytotoxizität) im ELISPOTAssay untersucht. 2.2.7 Enzyme linked Immunospot Assay (ELISPOT) Der Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT-Assay) ist ein hoch sensitiver Test zur Detektion antigenspezifischer T-Zellen. Nach Stimulation mit einem entsprechenden Antigenpeptid sezernieren nur T-Zellen, die spezifisch dieses Antigenpeptid binden, bestimmte Zytokine. Antigen-spezifische CD8+ T-Zellen können anhand der Sekretion von Interferon-gamma (IFN-γ) und Granzyme B ermittelt werden. IFN-γ ist dabei ein Marker der Aktivierung der Immunabwehr, während Granzyme B ein Effektor Molekül ist, das als Marker der zellvermittelten Lyse von Zielzellen fungiert. 2 Material und Methoden Seite 26 1) Reagenzien/Puffer für IFN-γγ ELISPOT Coating-Puffer: 318 mg Na2CO3 + 580 mg NaHCO3 + 49 mg NaN3; auf 100 ml Aqua dest. aufgefüllt; (0,1 M, pH 9,6); steril filtriert Substrat-Puffer (zur alkalische-Phosphatase-Blaufärbung mit BCIP/NBT): BCIP= 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolylphosphat NBT= Nitroblau-Tetrazolium 0,1 M TRIS (6,05 g / 500 ml) + 0,1 M NaCl (2,9 g / 500 ml) + 5 mM MgCl2 (237 mg / 500 ml); auf 500 ml aufgefüllt; steril filtriert 2) Puffer für Granzyme B-ELISPOT Coating Puffer: 1 x PBS = 100 ml 10 x PBS + 900 ml Aqua dest. Blocking Lösung: RPMI 1640 + 10 % fötales Kälberserum (FCS) + 100 Units/ml PenicillinStreptomycin + 2mM L-Glutamin Wasch-Puffer I: 1 x PBS + 0,05 % Tween-20 Wasch-Puffer II: 1 x PBS Dilution-Puffer: 1 x PBS + 10 % FCS Substrat Lösung (Meerrettich-Peroxidase-Rotfärbung): BD AEC Substrate Reagent Set: 1ml AEC Substrat + 20 µl AEC Chromogen AEC= 3-Amino-9-ethylcarbazol Arbeitsschritte: Tag 1 Beschichtung der IFN-γγ Platte Zunächst wurden zum Beschichten der 96-Napf Nitrozellulose Platte pro ml benötigtem Ansatz 15 µl des hochaffinen monoklonalen “Fänger” Antikörpers “1D1K” [1 mg/ml] (IFN-γ mAbs) in Coating Buffer aufgenommen. Von diesem Ansatz wurden daraufhin pro Napf 100 µl auf die ELISPOT-Platte pipettiert und diese über Nacht bei 4°C inkubiert. 2 Material und Methoden Seite 27 Beschichtung der Granzyme B Platte Für die Granzyme B Platte wurden 5 µl des Capture Antibodys in 995 µl 1xPBS gegeben und jeweils 100 µl pro Napf auf die ELISPOT-Platte gegeben. Die Platte wurde über Nacht bei 4°C inkubiert. Tag 2 Am Tag 2 des ELISPOTs wurden die in der MLPC stimulierten CD-8+ Zellen im Verhältnis 1:5 mit Antigenpeptid gepulsten CD8- oder T2 Zellen auf eine IFN-γ Platte und eine Granzyme B Platte gegeben. Diese wurden über Nacht bei 37°C und 5% CO2 im Inkubator inkubiert. A) Herstellung des autologen Mediums 10% autologes Patientenserum wurde zu 90% RPMI 1640 mit 100 Units/ml Penicillin, 100 Units/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin gegeben. B) Herstellung des Tumorzelllysates Die Tumorzellen wurden aufgetaut, zentrifugiert und gezählt. Aus einem Teil wurde Turmorzelllysat zum Pulsen der CD8- Zellen hergestellt, der andere Teil wurde als autologe Turmorzellen im Verhältnis 5:1 zu den CD 8+ Zellen aus der MLPC auf die Elispot-Platte aufgebracht. Zur Herstellung des Tumorzellysats wurden die Zellen in 500µl RPMI 1640 resuspendiert und fünf mal für 1,5 min in flüssigem Stickstoff gefroren und anschließend in einem 37°C warmen Wasserbad für je 4 min wieder aufgetaut. Um die entstanden Zelltrümmer zu entfernen wurde die Suspension 10 min bei 400 g zentrifugiert und der entstandene Überstand in ein neues EppendorfRöhrchen überführt. C) Vorbereitung der CD8 negativen Zellen Die nach der CD8+ Selektion kryokonservierten CD8- Zellen der Patienten wurden aufgetaut, bei 1200 U/min zentrifugiert, in frisches Medium aufgenommen und über Nacht in einer Zellkulturflasche im Brutschrank bei 37°C und 5% CO 2 ruhen gelassen. Anschließend wurden die Zellen in einer Neubauer Zählkammer gezählt, erneut zentrifugiert und so mit Medium aufgefüllt, dass sich in 500 µl 2 Material und Methoden Seite 28 4x105 Zellen befanden [da später für 1 TEIL CD8+ Zellen aus der MLPC (= mind. 1x105 ) 4 TEILE CD8- Zellen gebraucht wurden]. Diese Suspension wurde nun mit 30 Gy bestrahlt, um eine Proliferation zu verhindern. Danach wurden pro ml 2,5 µg β2 -Mikroglobulin zugegeben und die Zellen in 15 ml Röhrchen aufgeteilt. Nun wurden jeweils 20 µg/ml Peptid (G250-, IMP-, CMV-, Mage-Peptid, Tumorzelllysat) oder kein Peptid (no peptide) zugegeben und die Zellen für 1 h bei RT und anschließend 1 h bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen nochmals zentrifugiert und in die gleiche Menge autologes Medium aufgenommen. D) Vorbereitung der T2-Zellen Die T2-Zellen wurden aus den Kulturflaschen entnommen und bei 1200 U/min für 10 min zentrifugiert. Nach dem Abgießen des Überstandes wurde das entstandene Pellet je nach seiner Größe mit AB-Medium aufgefüllt, resuspendiert und die Zellen mit Hilfe der Neubauerschen Zählkammer gezählt. Die Zellen wurden zentrifugiert und anschließend so verdünnt, dass sich in 500 µl 4x105 T2-Zellen befanden. Pro ml wurden 2,5 µg β2 -Mikroglobulin zugegeben und die Zellen in 15 ml Röhrchen aufgeteilt. Anschließend wurden jeweils 20 µg/ml Peptid (G250-, IMP-, CMV-, Mage-Peptid, Tumorzelllysat) oder kein Peptid (no peptide) zugegeben und die Zellen 1 h bei RT und anschließend 1 h bei 37°C inkubiert. Nach dieser zweistündigen Inkubation wurden die Zellen noch einmal in AB-Medium gewaschen, bevor das Pellet in die gleiche Menge autologes Medium aufgenommen wurde. E) Blocken der Platte IFN-γγ Platte: Die über Nacht beschichtete Platte wurde jetzt zweimal mit je 200 µl PBS pro Napf gewaschen, was durch einfaches Befüllen und anschließendes Ausklopfen der Platte geschah. Danach wurden pro Napf 100 µl der Lösung aus PBS + 10% autologem Serum pipettiert und für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Granzyme B Platte: Diese Platte wurde einmal mit 200 µl Blocking Solution pro Napf gewaschen und anschließend mit 200 µl Blocking Lösung pro Napf für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. 2 Material und Methoden Seite 29 F) Vorbereitung der Effektorzellen aus der MLPC Die kultivierten Zellen aus der MLPC wurden jeweils einzeln in 15 ml Röhrchen aufgenommen und zweimal mit AB-Medium gewaschen und anschließend gezählt. Nach Ermittlung der Zellzahl wurde erneut abzentrifugiert (1200 U/min, 10 min), der Überstand abpipettiert und das Pellet so in autologes Medium aufgenommen, dass sich in 500 µl 1x105 Zellen befanden. G) Vorbereiten der Tumorzellen Die autologen Tumorzellen wurden zu 1x105 Effektorzellen gegeben. Dazu mussten die Zellen zuerst aus dem Stickstofftank genommen, dann aufgetaut und möglichst rasch in 10 ml X-Vivo + 0,08 mg/ml DNAse aufgenommen werden. Die Zellen wurden zentrifugiert, gezählt, erneut zentrifugiert und anschließend in 500 µl X-Vivo + DNAse resuspendiert. H) Aufbringen der Zellen auf die Platte Nach der Inkubation der Zellen sowie der Platten wurde die IFN-γ Platte sechsmal mit 200 µl PBS pro well gewaschen. Bei der Granzyme B Platte musste nur die Blocking Lösung entfernt werden. Die Zugabe der Zellen erfolgte nach einem festen Schema (siehe folgende Tabelle auf Seite 30). 2 Material und Methoden Seite 30 Tabelle 2: Pipettierschema für die ELISPOT-Platten. Identisches Vorgehen für den Granzyme B- und den Interferon (IFN)-γ Enzyme linked Immunospot Assay (ELISPOT). 1 2 CD8+ Zellen stimuliert mit CD8- Zellen stimuliert mit T2-Zellen stimuliert mit Autologe Tumorzellen µl aus µl aus µl gesamt Spalte 1 Spalte 2 G250 + G250 → 500 500 = 1000 G250 + Turmorzellen → 500 500 = 1000 IMP + IMP → 500 500 = 1000 HER2 + Mage → 500 500 = 1000 kein Peptid + Kein Peptid → 500 500 = 1000 G250 + → 500 500 = 1000 G250 + → 500 500 = 1000 IMP + IMP → 500 500 = 1000 HER2 + Mage → 500 500 = 1000 Kein Peptid + Kein Pepitd → 500 500 = 1000 G250 Tumorzellen Abkürzungen: IMP = Influenza Matrix Protein, HER2 = Humaner epithelialer Wachstumsfaktor Rezeptor. Kein Peptid und HER2 sind Negativkontrollen, IMP ist die Positivkontrolle. Je drei Näpfe wurden auf jeder Platte pro Zellsuspension mit 100 µl zügig befüllt. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Tag 3 A) Detektion IFN-γγ: Zuerst wurden die Zellen durch fünfmaliges Waschen mit 200 µl PBS pro Napf von der Platte entfernt. Anschließend wurde die Platte fünfmal mit PBS + 0,05% Tween20 (200 µl /Napf) gewaschen. Danach erfolgte die Detektion. Hierzu wurde der biotinylierte monoklonale Antikörper 7-B6-1-Biotin mit einer Konzentration von 1 µg pro ml in PBS + 0,05% Tween20 aufgenommen, davon je 100 µl pro Napf pipettiert, und die Platte daraufhin 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Granzyme B: Die Zellen wurden hier durch zweimaliges Waschen mit 200 µl/ Napf Aqua dest. entfernt. Die Platten wurden zwischen den Schritten je drei bis fünf Minuten ruhig stehen gelassen. Anschließend wurden sie dreimal mit „Wash Buffer I“ gewaschen und der Detektions-Antikörper, ein biotinylierter anti-Human Granzyme B Antikörper, in einer Verdünnung von 1:250 (= 8 µl Antikörper in 1992 µl Dilution Puffer) zu je 100 µl / Napf auf die Platte gegeben. Dann wurde die Platte 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. 2 Material und Methoden Seite 31 B) Enzyme IFN-γγ = Streptavidin-Alkaline Phosphatase Die Platte wurde 6mal mit PBS + 0,05% Tween20 gewaschen (200 µl /Napf). Das Streptavidin wurde 1:1000 in PBS + 0,05% Tween20 verdünnt und jeweils 100 µl pro Napf aufgebracht. Es folgte eine erneute Inkubation für ein bis zwei Stunden bei Raumtemperatur. Granzyme B = Streptavidin-horseradish peroxidase (Streptavidin – HRP) Die Platte wurde dreimal mit „Wash Buffer I“ gewaschen. Dann wurde die AvidinHRP in einer Verdünnung von 1:100 (= 20 µl Avidin – HRP + 1980µl Dilution Puffer) zu je 100 µl pro Napf aufgetragen und die Platte 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. C) Färbung Granzyme B: Nach der Inkubation wurde die Platte zunächst viermal mit „Wash Buffer I“ gewaschen und anschließend zweimal mit „Wash Buffer II“ (je mit 200 µl /Napf). Um die Färbelösung herzustellen wurden 40 µl AEC Chromogen zu 2 ml AEC Subsrat gegeben (= Verdünnung 1:50) (BD TM AEC Substrate Reagent Set). Hiervon wurden je 100 µl/Napf auf die Platte pipettiert. Die Platte wurde für 5 bis 60 min inkubiert. IFN-γγ: Nach dem Inkubationsschritt wurde die Platte wiederum sechsmal mit PBS + 0,05% Tween20 gewaschen (200 µl /Napf). Anschließend wurde zweimal mit Substrat-Puffer gewaschen. Zum Ansetzen der Färbelösung, wurde zunächst 1 Tablette BCIP in 500 µl Dimethylformamid (DMF) gelöst. Ebenfalls gelöst wurde 1 Tablette NBT in 1 ml H20. Beide Lösungen wurden dann mit einem 0,45 µm feinen Filter filtriert und waren danach im Dunkeln und bei 4°C für ca. 30 min lagerbar. 330 µl des gelösten NBT und 33 µl des gelösten BCIP wurden in 10 ml SubstratPuffer gegeben und gut gemischt. Anschließend wurden je 100 µl dieser Färbelösung pro Napf auf die Platte pipettiert und die Platte für maximal 30 min bei Raumtemperatur im Dunklen inkubiert. D) Stoppen der Farbreaktion IFN-γγ sowie Granzyme B: Abschließend wurden zum Stoppen der Farbreaktion die Platten dreimal mit 200 µl Aqua dest./ Napf gewaschen. Die Platten wurden über Nacht zum Trocknen stehengelassen und am folgenden Tag konnten bei 2 Material und Methoden Seite 32 positivem Testergebnis die durch IFN-γ bzw. Granzyme B entstanden Spots mit dem ELISPOT-Reader (CTL, Reutlingen, Deutschland) ausgewertet werden. 2.2.8 Immunzytologie Die Immunzytologie, auch Immunhistochemie oder Immunzytochemie genannt, ist eine weitere Methode um relevante Proteine durch Antigen-Antikörper-Bindungen nachzuweisen. Der Nachweis erfolgt hier in situ auf zellulärer Ebene durch entsprechende Markierung mit anschließender lichtmikroskopischer Auswertung. Die PBMN`s von HV`s (gesunde Spender, healthy volunteers) als Negativkontrolle und einer SKRC-Zelllinie (Sloan-Kettering renal cell carcinoma cell line) als Positivkontrolle für G250 wurden mittels der Zytospin-Methode auf einen Objektträger gebracht. Nach dem Spin erfolgte die Fixierung. Bei den zu untersuchenden Patientenproben handelte es sich um in Paraffin eingebettete Tumorschnitte. Anschließend wurden die Proben mit dem anti MN75/G-250-Antikörper in einer Verdünnung von 1:100 inkubiert. Um den Primärantikörper sichtbar zu machen, wurde als Detektionssystem ein Komplex aus einem polyklonalen biotinylierten Fab-Antikörper, der mit allen Maus-IgG Isotypen reagiert, und einer daran gekoppelten Streptavidin-biotinylierten Peroxidase verwendet (alles von Amersham, Wycombe, UK). 3-Amino-9-Ethylcarbazol (Sigma, St. Louis, USA) diente als Enzymsubstrat. Die Negativkontrollen wurden ohne Primärantikörper-Inkubation detektiert. 2 Material und Methoden Seite 33 2.2.9 Durchflusszytometrie/Tetramerfärbung Die Durchflusszytometrie ermöglicht die simultane Messung verschiedener physikalischer Eigenschaften einer Zelle wie relative Größe, relative Granularität und relative Fluoreszenzintensität. Die Zelle befindet sich dabei in einem Flüssigkeitsstrom (Durchfluss). Merkmal dieser Methode ist, dass innerhalb kürzester Zeit tausende Zellen in einem laminaren Probenstrom einzeln an einem Laser vorbeigeleitet und charakterisiert werden können. Die Fluoreszenzfarbstoffe werden durch das von den Lasern ausgesandte monochromatische Licht angeregt, und emittieren je nach zugegebenem Fluorochrom, Licht unterschiedlicher Wellenlänge. Um die G250-Antigen-spezifischen CD8+ T-Zellen in vitro nachzuweisen, wurden die CD8+ T-Lymphozyten, die zuvor 8 Tage in der MLPC-Kultur mit bestrahlten und mit G250-, IMP- oder HER2-Peptid gepulsten CD8- Antigen-präsentierenden Zellen stimuliert wurden, mit einem anti-CD8 Antikörper und einem G250-PeptidTetramerkomplex gegengefärbt. Für die Messung wurden die zu untersuchenden CD8+ T-Zellen zunächst in ABMedium aufgenommen und anschließend bei 1200 U/min für 10 min zentrifugiert. Pro Messung wurden je FACS-Röhrchen 0,5 -1x106 Zellen benötigt. Diese Menge wurde nach dem Waschen in 1 ml PBS +1% BSA (FACS-Puffer) aufgenommen und erneut zentrifugiert. Der Proteinzusatz verhinderte dabei die unspezifische Bindung der Antikörper über deren Fc-Rezeptor an zelluläre Antigene. Der Überstand wurde dekantiert und zu den in dem restlichen Volumen verbleibenden Zellen die entsprechenden fluoreszenzgekoppelten Antikörper hinzu pipettiert. Die CD8+ T-Lymphozyten wurden für 40 Minuten mit dem entsprechenden HLAA2/G250 Peptid Tetramer*PE, HLA-A2/IMP Peptid Tetramer* PE, HLA-A2/HER2 Peptid Tetramer* PE und dem HLA-A2/WT1-Peptid Tetramer*PerCP bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Für eine Sechsfach-Färbung folgte nun die Zugabe von 5 µl CD8*APC-Cy7, 5 µl CD45RA*APC (Invitrogen, Caltag, CA, USA), 10 µl CCR7*PE-Cy7, 10 µl CD28*FITC oder 10 µl CD27*FITC (BD, Heidelberg) mit einer weiteren Inkubationszeit von 20 Minuten bei 4°C im Dunkeln. Danach wurden die Zellen in PBS gewaschen und anschließend in ca. 250 µl PBS aufgenommen. Nun folgte die Auswertung in der Durchflusszytometrie. Mindestens 100,000 Zellen wurden ausgewertet und für jede Probe wurde eine entsprechende Isotypkontrolle durchgeführt, um den Grenzwert für die positiven 2 Material und Methoden Seite 34 Zellen zu definieren. Die Analyse erfolgte an gegateten Lymphozyten, um tote Zellen und Debris auszuschließen. Nur CD8+ Tetramer+ CCR7- CD45RA+ TLymphozyten sind zytotoxische Effektor-T-Zellen (Greiner et al., 2005; Giannopoulos et al. 2006). 2.3 Statistik Die Speicherung und Verwaltung der Patienten- und Untersuchungsdaten erfolgte in einer Excel-Datei. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden keine dedizierten statistischen Berechnungen durchgeführt, da das Patientenkollektiv sehr klein war, die Messungen nur zu einem Zeitpunkt durchgeführt wurden und keine Vergleichsberechnungen nötig waren. 3 Ergebnisse Seite 35 3 Ergebnisse 3.1 Tumorproben Wir erhielten Tumorproben von 22 kaukasischen Patienten (20 männlich, 2 weiblich) mit einem UICC Stadium I bis III Plattenepithelkarzinom des Larynx (n=5), Oropharynx (n=8), Hypopharynx (n=5), Epiglottis (n=2), Tonsille (n=1) und ein Patient mit Lymphknotenmetastase bei CUP (Tabelle 2). Das mediane Alter der Patienten betrug 58+/- 9 Jahre. Von 14 Tumorpatienten erhielten wir periphere Blutproben mit 6,6x107+/-4,2x107 PBMC nach Isolation mittels FICOLL und zusätzlich 3,1+/- 1,3 ml Serum pro Patient 1-14 in Tabelle 2. Darüber hinaus erhielten wir 11 solide Tumorproben mit 1,9x107+/- 3,1x107 Tumorzellen nach Zerkleinerung zu Tumoreinzelzellsuspensionen. Von allen Patienten erhielten wir außerdem solides Tumorgewebe. Alle Proben wurden bei -80°C tiefgefroren. 3 Ergebnisse Seite 36 Tabelle 3: Zusammenfassende Synoptische Darstellung der Ergebnisse der Pathologie und der immunologischen Untersuchungen für die Patienten # 1-22. Nr 1 Diagnose HLA- IHC WB ELISPOT Durchfluss TMN-Stadium A2 G250 G250 G250 zytometrie IFNγ/GranB G250% + n.v. n.v. (+) n.d. n.d. Hypopharynx-Ca, pT3 pN2 pM0, GII - P+ M (+) 2 Larynx-Ca, pT3 pN1 M0, GII-III + P+ M (+) 3 CUP- SCC, N1 M0 + + + 4 / n.a. n.d. 4 Oropharynx-Ca, pT4 pN2 M0, GII - - - n.v. n.v. 5 Hypopharynx-Ca, pT3 N2 Mx, GII + n.d. + 8/8 0.10 0 / 53 Tz 6 Oropharynx-Ca, pT1 pN2 M0, GII-III + + + 0/0 0.07 0 / 14 Tz 7 Larynx-Ca, pT3 pN2 cM0 R0, GII + (+) + 2/5 0.01 8 Oropharynx-Ca, cT4 N2 M1, GI - + (+) n.v. n.v. 9 Oropharynx-Ca links, pT1 N1 M0, + + (+) 24 / n.a. 0.03 + P (+)/- (+) 1/0 0.00 GII 10 Hypopharynx-CA, pT1 pN2 cM0, GIII M+ 0 / 167 Tz 11 Oropharynx-Ca pT3 N2 M0, GII + + + 0 / n.a. 0.04 12 Hypopharynx-Ca pT3 N2 Mx, GII - P +/- - n.v. n.v. M (+)/13 Hypopharynx-Ca, pT4 cN2 M0, GII - n.d. + n.v. n.v. 14 Oropharynx-Ca, pT1 pN2 pMx, GII + + - n.d. n.d. 15 Epiglottis-Ca, pT2 pN0 pM0 n.d. (+)/- (+) n.d. n.d. 16 Larynx-Ca, pT4 N0 M1, GIII n.d. (+) (+) n.d. n.d. 17 Tonsillen-Ca rechts, T2 N2 M0, GII n.d. (+) n.a. n.d. n.d. 18 Oropharynx-Ca links, pT2 pN2 M0, n.d. + n.a. n.d. n.d. GII 19 Oropharynx-Ca, pT2 pN1 M0, GII n.d. n.d. (+) n.d. n.d. 20 Larynx-Ca, T4 N2 Mx, GII n.d. - (+) n.d. n.d. 21 Epiglottis-Ca, pT2 pN2 M0, GIII n.d. +/- n.a. n.d. n.d. 22 Larynx-Ca, pT3 pN2 M0, GII n.d. +/- (+) n.d. n.d. Abkürzungen: n.v. = nicht verwendbar; immunologische Assays konnten nur für HLA-A2+ Patienten durchgeführt werden, n.a. = nicht auswertbar; n.d. = nicht durchgeführt; P =Primärtumor; M = Metastase; Tz = Tumorzellen als Target-Zellen für die Stimulation von G250 spezifischen Effektor-T-Zellen im ELISPOT-assay. Für Patienten # 15 – 22 waren nur Tumorproben verfügbar, jedoch keine PBMC. Immunhistochemie (ICH) und Western Blot (WB) Definition: + = starke Färbung für G250 wie die Kontrollzelllinie SKRC, mehr als 70% der Tumorzellen positv; (+) = schwache Färbung; +/- = heterogene Färbung mit <70% positiver Tumorzellen; - = keine Färbung. Alle in dieser Tabelle dargestellten ELISPOT Werte stellen Werte nach Abzug der Hintergrundspots dar, definiert als Spots nach Stimulation mit einem irrelevanten Peptid. 3 Ergebnisse Seite 37 3.2 Western Blot Mittels Westernblot wurden Untersuchungen zur Expression von G250 auf Proteinebene durchgeführt. Dazu wurde der nicht-kommerziell erhältliche monoklonale Maus-Antikörper G250/MN-75 eingesetzt, der aus einer Hybridom-Zelllinie gewonnen wurde. Von den 22 soliden Tumorproben von Patienten mit Plattenepithelkarzinom des Kopf-Hals-Bereiches, konnten wir je 2,7+/- 0,8 µg/µl Protein pro Tumorgewebe isolieren. Pro Probe wurden 20 µg Protein mittels SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt und anschließend mit dem Semidry-Blotting Verfahren geblottet. Auf jeder Westernblot-Membran gab es jeweils eine Bande mit einer Positiv-und einer Negativkontrolle. Als Positivkontrolle diente isoliertes Protein aus der SKRC 52-Zelllinie (Sloan-Kettering-Renal-Cell-Carcinoma cell line), als Negativkontrolle dienten verschiedene HV-Proben. Als Kontrolle für die Verwendbarkeit der Membran, dass heißt, der Intaktheit des Proteins, diente im Anschluss das Membran„Stripping“ mit Beta-Aktin. Als Verlaufskontrolle diente der Magic Marker, der auf einer Bande mitlief und auf dem Film sichtbar war. Der G250-Antikörper zeigte eine Doppelbande bei ca. 54/58 kDa, die bei allen verwendeten Negativkontrollen nicht nachweisbar war. Von 20 Tumorpatienten konnte Protein gewonnen und im Westernblot untersucht werden. 16 von 20 Patienten (80%) wurden positiv getestet, jedoch mit unterschiedlich starker Färbung. 6 Patienten (30%) zeigten stark positive Banden. 50 kDa - G250 54/58 kDa 40 kDa - Beta-Aktin 42 kDa SKRC HV #7 #10 #5 #6 #9 #12 Abbildung 1: Western Blot für G250 Protein bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom des Kopf-Hals-Bereichs. (obere Reihe G250-Westenblot, untere Reihe Positivkontrolle mit BetaAktin): Es zeigt sich bei G250-positiven Patienten mit Plattenepithelkarzinom des Kopf-HalsBereichs eine Doppelbande bei 54/58 kDa, die bei tumorfreiem Gewebe nicht zu finden ist. Patient 6 war mindestens genau so stark positiv wie die Kontrollzelllinie Sloan-Kettering renal cell carcinoma cell line (SKRC 52). Mononukleäre Zellen des periphären Blutes eines normalgesunden Spenders (HV) waren negativ. Der untere Western Blot stellt die Positivkontrolle mit Beta-Aktin dar, die bei 42 kDa eine Bande zeigt. 3 Ergebnisse Seite 38 50 kDa - G250 54/58 kDa 40 kDa - Beta-Aktin 42 kDa MM SKRC HV Pat#3 Pat#21 Pat#20 Pat#13 Abbildung 2: Westernblot für G250 Protein bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom des Kopf-Hals-Bereichs: Die Patienten 3, 20, 13 (Tabelle 3) waren positiv für G250. Die Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes eines gesunden Spenders (HV) waren ebenso wie die Patientenprobe 21 (Tabelle 3) negativ. 3.3 Immunzytologie Die Diagnose Plattenepithelkarzinom des Kopf-Hals-Bereichs wurde durch die Pathologie mittels Hämatoxilin-Eosin Färbung gestellt. Die immunhistologische Färbung mit dem MN-75/G250 Antikörper diente dem Nachweis der Proteinexpression von G250 auf Zellebene. Als Positivkontrolle diente die Zelllinie SKRC52, als Negativkontrolle PBMN von normalgesunden Spendern. Die Positivkontrollen färbten sich stark positiv für G250. Von 19 Gewebeschnitten solider Tumorproben, liessen sich 17 (89%) Proben positiv für G250 färben, mit unterschiedlich starker Farbintensität, was zum einen mit dem unterschiedlichen Malignitäts- und Invasivitätsstadium des Tumors in Zusammenhang stehen könnte, zum anderen mit dem Bereich des Tumors, aus dem der Gewebeschnitt stammte. Abbildung 3: Darstellung der Immunhistologischen Färbung mit G250. Die Kontrolllinie SloanKettering renal cell carcinoma cell line (SKRC52) (links) Positivkontrolle für G250, Negativkontrolle eines normalgesunden Spenders (HV) (rechts). 3 Ergebnisse Seite 39 Abbildung 4: Darstellung der G250-Proteinexpression mittels immunhistologischer Färbung für einen Patienten mit Oropharynxkarzinom. Die Pfeile zeigen auf das G250-exprimierende Tumorgewebe des Patienten #6 (Tabelle 3), während das nicht-neoplastische Tonsillenepithel keine G250-Expression zeigt. 3.4 Gemischte Lymphozyten-Peptidkultur (MLPC) Zunächst wurde bei 14 Patienten, von denen wir periphere Blutproben besaßen, eine Humane-Leukozyten-Antigen-Typisierung auf HLA-A2 mittels Durchflusszytometrie durchgeführt. Dies geschah in Anbetracht der Tatsache, dass unsere T-Zell-assays (ELISPOT und Durchflusszytometrie) auf diesen HLA Typ beschränkt sind. Neun von 14 Patienten (64%) waren positiv für HLA-A2, wovon jedoch zwei Patienten negativ für G250 im Western Blot getestet wurden, so dass letztendlich von sieben der HLA-A2 positiven Patienten die CD8+ Zell-Separation mittels MLPC folgte. Die MLPC (Mixed Lymphocyte Peptid Culture) diente der Aktivierung einer zellulären Immunantwort auf das Antigen G250, die anschließend durch ELISPOT und Durchflusszytometrie ausgewertet wurde. Dazu wurden zunächst periphere Blutmonozyten (PBMN) aus dem Blut der Tumorpatienten mittels Zentrifugation über einen Dichtegradienten (FICOLL) isoliert. 3 Ergebnisse Seite 40 Anschließend wurden diese Zellen wie beschrieben durch den MACS-Separator mit magnetischen Beads in CD8+ Effektorzellen und CD8- antigenpräsentierende Zellen separiert. Die separierten CD8+ Zellen wurden für acht Tage mit dem Tumorantigen G250 in Kultur bei 37°C und Zugabe von bestrahlten CD8- Zel len, stimuliert. Stimulation mit IMP diente als Positivkontrolle, ohne Peptidstimulation (no peptid) und HER2, ein irrelevantes Peptid, waren die Negativkontrollen. Diese CD8+ Zellpopulationen wurden anschließend auf ihre Funktionalität im ELISPOT-Assay, sowie auf ihr Expressionsmuster in der FACS-Analyse untersucht. 3.5 Durchflusszytometrie/ Tetramerfärbung Nach acht Tagen in Kultur wurden die G250 spezifischen CD8+ Zellen mittels Tetramerfärbung in der Durchflusszytometrie weiter untersucht. Vier von sechs Proben testeten positiv mit T-Zell-Frequenzen von 0,03-0,10% für CD8+ Tetramer+ CCR7- CD45RA+ T-Zellen mit Erreichen eines Mittelwertes von 0,04% für diese Population nach Abzug der Negativkontrolle. G250 IMP HER2 0,1% 1.65% 0,03% Abbildung 5: Darstellung der Durchflusszytometrie für Patient #5 (aus Tabelle 3, Seite 35): Das linke Diagramm zeigt im rechten oberen äußeren Quadranten die mit G250-Peptid stimulierte Population der Peptid-spezifischen CD8+ Tetramer+ zytotoxischen Effektor-T-Zellen mit einer Frequenz von 0,1%; die Diagramme daneben zeigen die Positivkontrolle Influenza Matrix Protein (IMP)- und ein irrelevantes Peptid (HER2) als Negativkontrolle. 3 Ergebnisse Seite 41 3.6 ELISPOT Nach acht Tagen in Kultur wurde die Aktivität der TAA G250 spezifischen CD8+ TZellen mittels INFγ- und Granzyme B-ELISPOT weiter untersucht. Als Targetzellen in Kultur dienten sowohl G250 gepulste T2-Zellen, als auch Tumorzellen. Aktivierte CD8+T-Zellen können anhand der Sekretion bestimmter Zytokine ermittelt werden. INFγ ist ein Marker für die Immunabwehr, während Granzyme B als Effektormolekül zytolytisches Potential besitzt. Im INFγ-ELISPOT zeigten von sieben getesteten Patienten drei positive spots mit 4-24 spots, was ein Mittel von sechs spots nach Abzug der Negativkontrolle ergibt. Der Granzyme B-ELISPOT wurde von vier Patientenproben durchgeführt, wovon vier Patienten als positiv getestet wurden mit 8-167 spots, mit Erreichen eines Mittels von 78 spots. Drei Patientenproben konnten aufgrund technischer Probleme und ungnügendem Tumor Irrel pep CD8+(G250)/Tumorzellen Patientenmaterial nur im INFγ-ELISPOT weiter untersucht werden. Kein pep 0 5 10 15 20 4 Spots/ 5x10 Zellen Abbildung 6: Darstellung eines Granzyme B-ELISPOTs für Patient #6 (aus Tab. 3, Seite 35): Es konnte eine hohe Granzyme B Sekretion der G250 spezifischen Tumorzellen gezeigt werden (obere Reihe). In der mittleren und unteren Reihe Darstellung der deutlich geringeren Granzyme BSekretion der Negativkontrollen (mit HER2 (irrel pep) oder ohne Peptid (kein pep) stimulierte Tumorzellen). 3 Ergebnisse Seite 42 Abbildung 7: Darstellung eines Granzyme B ELISPOT-assays für Patient #5 (aus Tabelle 3, Seite 35): Links ist der Granzyme B-ELISPOT, rechts der IFN-γ-ELISPOT dargestellt. Positivkontrollen mit Influenza Matrix Protein (IMP) und Cytomegalievirus (CMV). Negativkontrollen (mit HER2 oder ohne Peptid (kein Pep). Die G250-spezifischen CD8+ T-Zellen zeigten im Granzyme B-ELISPOT eine hohe Detektion wenn sie mit G250-Peptid gepulsten T2-Zellen oder Tumorzellen stimuliert wurden. Stimulation mit T2-Zellen, gepulst mit HER2 oder ohne Peptid, zeigten dagegen keine signifikante Granzyme B Detektion. Im IFN-γ-ELISPOT zeigten die G250spezifische CD8+ T-Zellen jedoch keine signifikante IFN-γ-Detektion nach Stimultion mit T2 oder Tumorzellen, die vorher mit G250-Peptid stimuliert wurden. 4 Diskussion Seite 43 4 Diskussion Konventionelle Therapieverfahren wie Chirurgie, Radio- und/ oder Chemotherapie konnten die Überlebensrate von Patienten mit Plattenepithelkarzinomen des Kopfund Hals-Bereichs während der letzten 20 Jahre nur unwesentlich verbessern, so dass ein hoher Bedarf an der Entwicklung neuer spezifischer Therapiestrategien besteht. Durch verbesserte Kenntnis der Tumorimmunologie stellt die T-Zell basierte Immuntherapie speziell mit Tumor-assoziierten Antigenen (TAA) einen neuen und viel versprechenden Ansatz in der Therapie dieser Patienten dar. In dieser Studie wurde die Expression und Immunigenität des TAA G250/CA-IX untersucht. G250/CA-IX gehört zu den membrangebundenen Carboanhydrasen, die die reversible Hydratatisierung von CO2 zu Hydrogencarbonat (CO2 +H2O ↔H2CO3 ↔ HCO3-+H+) katalysiert und in mehreren biologischen sowie pathologischen Prozessen wie Säure-Base-Haushalt, Zell-Zell-Adhäsion, Zell-Proliferation und Tumor-Progression (Pastorek et al. 1994) eine Rolle spielt. Plattenepithelkarzinome des Kopf-Hals-Bereichs zeigen häufig heterogene Hypoxieregionen. Die CA-IX wird unter normalen Bedingungen durch das VHLProtein in Nierenzellkarzinom-Zelllinien, sowie in Plattenepithelkarzinomen des Kopf- und Hals-Bereichs herabreguliert. VHL-Mutationen wurden in über 75% der Nierenzellkarzinome vom klarzelligen Typ gefunden (Rini et al. 2005). Eine VHLGen-Inaktivierung oder eine Hypoxie führen zu einer Aktivierung des HIFTranskriptionskomplexes. Der Promoter des CA-IX-Gens enthält das „Hypoxia Response Element (HRE)“, eine Bindestelle für den Hypoxia induzierenden Faktor-1α (HIF-1α). Es konnte gezeigt werden, dass die Induktion von Hypoxie in Zelllinien, bei denen der HIF-Signalweg defekt ist, fehlt, jedoch nach Transfektion von humanem HIF-1α wiederhergestellt wird. Der HIF DNA-bindende Komplex ist ein Heterodimer, der aus einer α- und βUntereinheit besteht. In Anwesenheit von Sauerstoff ist die HIF-α Untereinheit hydroxyliert und somit Ziel für VHL- abhängige proteasomale Degradierung. Dagegen findet unter hypoxischen Bedingungen oder VHL-Mutation keine Hydroxylierung statt und der stabilisierte HIF-α erlangt transkriptionelle Aktivität. 4 Diskussion Seite 44 Dieser Komplex steigert die Transkription verschiedener Hypoxie induzierender Gene, wie VEGF, platelet derived growth factor (PDGF), c-kit (stem cell factor receptor, CD117) und vor allem G250/CA-IX. Diese Wachstumsfaktoren binden ihren spezifischen Tyrosinkinase-Rezeptor auf der Tumorzelle, resultierend in Zellproliferation und Angiogenese. Dieser Mechanismus wurde sowohl im klarzelligen Nierenzellkarzinom (Van Spronsen et al. 2005) aber auch im HNSCC beschrieben (Beasley et al. 2001). G250/CA-IX wird als Zellmembranprotein in vielen Karzinomen auf der Oberfläche exprimiert. G250 ist assoziiert mit einem schlechten Ansprechen auf Radio- und Chemotherapie und somit verbunden mit einer schlechten Prognose (Beasley et al. 2001, Hunakova et al. 2007, Haaspasalo et al. 2006, Driessen et al. 2006). Das positive Ansprechen von Patienten mit NZK auf die Behandlung mit antiVEGF Antikörpern (Bevacizumab), VEGF Rezeptor-Kinase Inhibitoren (SU11248sunitinib, PTK787), Raf Kinase Pathway Inhibitoren (BAY439006-sorafenib) und mTOR pathway Inhibitoren (CCI779-temsirolimus) (Van Spronsen et al. 2005) zeigt, dass ein immunhistochemisches Screening von Patienten auf Expression von G250/CA-IX in der Identifizierung von Patienten hilfreich sein könnte, die möglicherweise von einer solchen medikamentösen Therapie ebenfalls profitieren. Darüber hinaus erfüllt das TAA G250 die Voraussetzung für einen Therapieansatz als monoklonale Antikörper-Therapie, da es homogen auf Tumorgewebszellen, in normalem Gewebe hingegen jedoch nur begrenzt exprimiert wird. Es wurden Klinische Phase I/II-Studien mit anti-G250 monoklonalem Antikörper entweder allein, als chimerischer Antikörper radioaktiv markiert oder in Kombination mit zytotoxischem Chemotherapeutikum durchgeführt, um Pharmakokinetik und biologische Verteilung von wiederholten Dosen zu untersuchen (Davis et al. 2007, Bleumer et al. 2004, Al-Batran 2004, Divgi et al. 1998). Trotz guter Pharmakokinetik, gutem Toxizitätsprofil und exzellenter Affinität des Antikörpers zum Tumor zeigte der anti-G250-Antikörper als Einzeltherapie geringere antitumorale Aktivität als in Kombinationstherapie (Davis et al. 2007). In vitro Studien zeigten, das der chimäre monoklonale Antikörper WX-G250 eine Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (Antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC) auslösen kann (Surfus et al. 1996), die durch geringe Dosen von IL-2 verstärkt werden kann (Liu et al. 2002, Meropol et al. 1998). 4 Diskussion Seite 45 Daraufhin wurde bei Patienten mit progressivem metastasierten NZK vom klarzelligen Typ eine Multizenterstudie mit der Kombination aus WX-G250 und einer täglichen subkutanen Injektion von niedrig dosiertem IL-2 durchgeführt. Bei 23% der Patienten wurde ein klinischer Nutzen durch Krankheitsstabilisation von 24 oder mehr Wochen erreicht. Mittleres Überleben war 22 Monate, gut vergleichbar mit dem Überleben bei WX-G250-Monotherapie von 16 Monaten, so dass von einem additiven/synergistischen Effekt ausgegangen werden kann. Die Überlebenszeit war zuletzt gleich hoch wie die bei Therapie mit den üblichen Zytokinen, jedoch mit einem günstigeren Toxizitätsprofil (Bleumer et al. 2006). Experimentell konnte gezeigt werden, dass genetisch veränderte autologe TZellen, die einen Einzelketten-Antikörper Rezeptor tragen, in vivo reagieren. Dazu wurde ein Einzel-Ketten-Antikörper-Typ (single-chain-antibody-type (scFv)) entwikkelt, abgeleitet vom monoklonalen Antikörper (mAB) G250 (Weijtens et al. 1996), dessen Gen retroviral in primäre humane T-Zellen transfiziert wurde. Der scFv(G250)-Rezeptor wurde nun auf der Oberfläche dieser Zellen exprimiert, was den T-Zellen erlaubte, CA-IX zu erkennen und Antigen-spezifische Effektorfunktionen, wie Zytokinproduktion und Zytolyse CA-IX-positiver NZK-Zelllinien auszuführen (Lamers et al. 2002, Lamers et al 2006). Ausserdem wurden weitere, von G250/CA-IX abgeleitete und auf HLA-A*0201 restringierte T-Zell-Epitope identifiziert, die die Bildung peptidspezifischer zytotoxischer T-Zellen in vitro und in vivo induzieren (Vissers et al. 1999, Ringhoffer et al. 2004). Die Verwendung von G250/CA-IX abgeleiteten Peptiden im Rahmen Klinischer Phase I/II-Vakzinierungsstudien bei Patienten mit fortgeschrittenem NZK scheint sicher zu sein. Eine gastrointestinale oder hepatische Toxizität wurde trotz physiologischer CA-IX-Expression auf dem Epithel des Gallengangssystems und auf Magenschleimhautzellen nicht beobachtet (Uemura et al. 2006, Bleumer et al. 2007). Die Studie von Uemura et al. konnte zeigen, dass zum einen die meisten Patienten peptidspezifische CTLs bzw. peptidspezifisches reaktives Immunglobulin G (IgG) bildeten, andererseits auch ein klinisches Ansprechen zeigten. In der vorliegenden Arbeit wurden Proben von 22 Patienten (20 männlich, 2 weiblich) mit UICC Stadium I bis III Plattenepithelkarzinom von Larynx (n=5), Oro- 4 Diskussion Seite 46 pharynx (n=8), Hypopharynx (n=5), Epiglottis (n=2), Tonsille (n=1) und ein Patient mit Lymphknotenmetastase bei CUP Plattenepithelkarzinom untersucht. Mittels Western Blot und Immunhistochemie konnten wir nachweisen, dass in unserem Kollektiv 80% der HNSCC Patienten im Western Blot G250 exprimierten, wobei 30% der Patienten besonders starke Banden zeigten und 89% der Patienten in der Immunhistochemie G250 exprimierten. Die beiden Untersuchungsmethoden korrelierten gut miteinander, bis auf wenige Ausnahmen, bedingt durch fehlerhafte Proben. Anschliessend folgten die Induktion von antigenspezifischen zytotoxischen TZellen mittels MLPC nur bei Patienten die sowohl im Western Blot positiv waren, als auch HLA-A2 positiv, in Anbetracht, dass unsere T-Zell Assays ELISPOT und Durchflusszytometrie beschränkt auf diesen HLA Typ sind. Neun von 14 Patienten (64%) waren positiv für HLA-A2, wovon jedoch zwei Patienten negativ für G250 im Westernblot getestet wurden, so dass letztendlich von sieben der HLA-A2 positiven Patienten MLPCs und die anschliessende Auswertung durch ELISPOT und Durchflusszytometrie folgten. In der Durchflusszytometrie waren vier von sechs Proben positiv. Im Granzyme B-ELISPOT wurden drei von vier Proben positiv getestet, während im INFγ-ELISPOT drei von sieben Patientenproben positiv waren. Interessanterweise zeigten die G250 spezifischen T-Zellen eine starke Granzyme B Antwort, jedoch nur eine geringe INFγ-Sekretion. Die Granzyme-B-Freisetzung charakterisiert das zytolytische Potential der CD8+ T-Zellen, die nicht unbedingt INFγ, jedoch eventuell andere Zytokine wie IL-2 (hier nicht getestet) freisetzen können. Aufgrund der mit anderen Studien vergleichbaren und viel versprechenden Daten mit hoher Expressionsrate und Immunogenität des TAA G250/CA-IX in Patienten mit HNSCC, sind weitere Untersuchungen dieses immuntherapeutischen Ansatzes mit G250/CA-IX-Peptidvakzinierung oder anderer T-Zell abhängiger Immuntherapien gerechtfertigt und indiziert. 5 Zusammenfassung Seite 47 5 Zusammenfassung Trotz der Fortschritte in Chirurgie-, Radio- und Chemotherapie ist die Prognose von Patienten mit Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs weiterhin schlecht, so dass ein großer Bedarf an neuen Therapiestrategien besteht. Ein möglicher Ansatz ist hierbei die Immuntherapie. Ziel dieser Arbeit war die Ermittlung des Expressionsverhaltens und der Immunogenität des Tumor-assoziierten Antigens G250 (Carboanhydrase IX, MN 75) bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom des Kopf-Hals-Bereichs. Proben von 22 Patienten wurden mittels Western Blot und Immunhistochemie auf ihre G250-Expression auf Proteinebene untersucht. Im Western Blot wurden 80% der Patienten positiv getestet, wobei 30% der Proben besonders starke Banden zeigten. In der Immunhistochemie waren 89% der Tumorproben positiv. Die Ergebnisse der beiden Untersuchungsmethoden korrelierten dabei gut miteinander. Von 14 der 22 Patienten besaßen wir periphere Blutproben, so dass diese Patienten auf ihre Humane-Leukozyten-Antigen- (HLA)Typisierung auf HLA-A2 mittels Durchflusszytometrie untersucht wurden. Letztendlich waren sieben der Patienten sowohl im Western Blot G250, als auch in der Durchflusszytometrie HLA-A2 positiv, so dass von diesen Patienten gemischte Lymphozyten-Peptid-Kulturen (MLPCs) angelegt und Tumorzell-Suspensionen hergestellt wurden. Die Induktion von Peptid-spezifischen, gegen G250 gerichteten zytotoxischen T-Zellen wurde anschliessend mittels Enzyme linked Immunospot Assay (ELISPOT) und Durchflusszytometrie ausgewertet. Vier von sechs Patienten wurden in der Durchflusszytometrie mit Frequenzen von 0,03-0,10% mit einem erreichten Mittel von 0,04% positiv getestet Im Interferon (IFN)-γ-ELISPOT zeigten drei von sieben Proben positive spots mit Werten von 4-24 mit einem Mittel von sechs Spots. Der Granzyme B-ELISPOT war in drei von vier Fällen positiv mit Werten von 8-167 Spots und einem Mittel von 78 Spots. Zusammenfassend kann gefolgert werden, dass G250 auf Grund seiner hohen Expressionsrate auf Tumorgewebe und der dabei fehlenden Expression im Normalgewebe, sowie der Fähigkeit zur Induktion einer spezifischen zellulären Immunantwort als sehr interessante Struktur erscheint, die Anlass zu weiteren 5 Zusammenfassung Seite 48 Untersuchungen beispielsweise im Rahmen einer zukünftigen G250/CA-IX Peptidvakzinierungstherapie, die im Sinne einer aktiven Immuntherapie bei Patienten mit Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs zum Einsatz kommen könnte. 6 Literaturverzeichnis Seite 49 6 Literaturverzeichnis 1. Adelstein DJ, Li Y, Adams GL, Wagner H Jr, Kish JA, Ensley JF, Schuller DE, Forastiere AA. An intergroup phase III comparison of standard radiation therapy and two schedules of concurrent chemoradiotherapy in patients with unresectable squamous cell head and neck cancer. J Clin Oncol 2003; 21:92-98. 2. 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Abbildungs- und Tabellenverzeichnis Seite 58 Abbildungs- und Tabellen-Verzeichnis Tab. 1. TNM-Stadieneinteilung für Tumore des Kopf- und Hals-Bereichs .......... 3 Tab. 2. Pipettierschema für ELISPOT-Platten .................................................. 30 Tab. 3. Synoptische Darstellung der Ergebnisse der Pathologie und der immunologischen Untersuchungen ...................................................... 36 Abb. 1. Expression von G250 Protein bei Patienten mit Kopf-Hals-Tumoren ... 37 Abb. 2. Expression von G250 Protein bei Patienten mit Kopf-Hals-Tumoren ... 38 Abb. 3. Immunhistologische Färbung auf G250 (Pos./Neg. Kontrolle) ............. 38 Abb. 4. G250-Expression mittels immunhistologischer Färbung eines Patienten mit Oropharynx Karzinom..................................................................... 39 Abb. 5. Durchflusszytometrie für verschiedene Antigene ............................ .....40 Abb. 6. Nachweis G250 spezifischer T-Zellen in einem Granzyme B ELISPOT Assay ................................................................................................... 41 Abb. 7. Sekretion von Granzyme B und IFN-γ durch G250 spezifische T-Zellen ............................................................................................................. 42 Danksagung An dieser Stelle möchte ich all denen danken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben: Prof. Dr. Michael Schmitt für die Überlassung und engagierte Betreuung des Dissertationsthemas sowie Frau Dr. Anita Schmitt für die ausführliche Hilfs- und Diskussionsbereitschaft während der gesamten Durchführung dieser Arbeit. Frau Marlies Götz für die geduldige Einführung in die Welt der molekularbiologischen Methoden und die Betreuung während der Zeit der Labortätigkeit. Allen Mitarbeitern und Doktoranden der Arbeitsgruppe für Tummorimmunologie der Abteilung für Innere Medizin III des Universitätsklinikums Ulm für die freundschaftlicheUnterstützung.
