Inhaltsverzeichnis 1. EINLEITUNG 7 1.1 Das

Gentechnische Modifikationen
der Arylsulfatase B
zur Entwicklung von Therapien
für das Maroteaux-Lamy-Syndrom
Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Fakultät für Biologie
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
vorgelegt von
Elke Martinez
aus Aachen
Freiburg, Januar 2002
Dekan der Biologischen Fakultät:
Promotionsvorsitzender:
Leiter der Arbeit:
Prof. Dr. H. Kleinig
Prof. Dr. S. Rossel
Prof. Dr. C. Peters
Publikationen:
BIESTER S., VON HORNUNG M., PAULY-EVERS M., MARTINEZ E., REINHECKEL, T.,
MATZNER U., TITELBACH D., MABE P., VOSKOBOEVA J., STRAUCH O.,
GLIMM H., PETERS C., VON KALLE C. (2002) Retroviral hematopoetic gene
therapy of murine mucopolysaccharidosis VI with the human arylsulfatase B
cDNA. Manuskript eingereicht.
MARTINEZ E., REINHECKEL T., SCHREMPP M., PETERS C. (2002) In vitro mutagenesis of
potential glycosylation sites of arylsulfatase B. Effects on intracellular sorting,
secretion and enzymatic activity. Manuskript in Vorbereitung.
Abstracts:
BIESTER S., V. HORNUNG M., PAULY-EVERS M., MATZNER U., MARTINEZ E.,
STRAUCH O., REINHECKEL T., V. KALLE C., PETERS C. (2001) Correction of
murine mucopolysaccharidosis VI by ex vivo retroviral gene transfer of the
human arylsulfatase B gene. Molecular Therapy 3(5), 225.
MABE P. , VON HORNUNG M., MARTINEZ E., REINHECKEL T., TITTELBACH D.,
MATZNER U., VOSKOBOEVA J., STRAUCH O., GLIMM H., PETERS C., VON
KALLE C. (2001) Cellular and gene therapy with below-normal levels of ASB
gene expression reverse the Maroteaux-Lamy disease phenotype in the MPS-VI
mouse model. BLOOD 98(11), 2898.
MARTINEZ E., REINHECKEL, T., PETERS, C. (2001) Characterisation of underglycosylated human arylsulfatase B mutants. 13th ESGLD Workshop, 20.-23.
September 2001, Woudshoten.
Inhaltsverzeichnis
1
Inhaltsverzeichnis
1.
EINLEITUNG
7
1.1
Das lysosomale Kompartiment
7
1.1.1
Bildung der Mannose-6-Phosphat-Erkennungsmarker
9
1.1.2
Mannose-6-Phosphat-Rezeptoren und Sortierung lysosomaler Proteine
11
1.2
Lysosomale Speicherkrankheiten
12
1.3
Mukopolysaccharidosen (MPS)
13
1.4
Die Mukopolysaccharidose Typ VI (Maroteaux-Lamy-Syndrom)
14
1.4.1
Symptomatik der MPS VI
14
1.4.2
Biochemische Grundlagen der MPS VI
15
1.4.3
Genetische Ursachen der MPS VI
16
1.5
Die Arylsulfatase B
17
1.6
Therapeutische Ansätze für die MPS VI
20
2.
AUFGABENSTELLUNG
22
3.
MATERIAL
23
3.1
Geräte
23
3.2
Verbrauchsmaterialien
24
3.3
Enzyme, Standards und Antibiotika
24
3.4
Kits zur Bearbeitung von DNA, RNA und Protein
24
3.5
Radioaktive Substanzen
25
3.6
Antikörper, Streptavidin und acidophiler Farbstoff
25
3.7
Chemikalien
25
Inhaltsverzeichnis
2
3.8
Medienzusätze und gepufferte Salzlösungen
25
3.9
Häufig benutzte Lösungen
26
3.10
Medien zur Anzucht von Bakterien
26
3.11
Medien zur Kultivierung von BHK21-Zellen
26
3.12
Vektoren
27
3.13
Bakterien
27
3.14
Zellen
27
3.15
Mauslinien
27
3.16
EDV
27
4.
METHODEN
28
4.1
Molekularbiologische Methoden
28
4.1.1
Isolierung von DNA
28
4.1.1.1
Isolierung von Plasmid-DNA (Mini-Präparation)
28
4.1.1.2
Isolierung von Plasmid-DNA mit hoher Kopienzahl (Midi-Präparation)
29
4.1.1.3
Isolierung von Plasmid-DNA mit geringer Kopienzahl (Midi-Präp.)
30
4.1.1.4
Isolierung von genomischer DNA aus Mausschwänzen
30
4.1.1.5
Isolierung von genomischer DNA aus BHK21-Zellen
30
4.1.2
Isolierung von Gesamt-RNA
31
4.1.3
Konzentrationsbestimmung von DNA und RNA
32
4.1.3.1
Photometrische Analyse
32
4.1.3.2
Ethidiumbromid-Fluoreszenzmessung im Agarose-Gel
32
4.1.4
Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen
32
4.1.5
Reinigung von DNA-Fragmenten über ein Agarose-Gel
33
4.1.6
Behandlung von DNA mit alkalischer Phosphatase
34
4.1.7
Reinigen von DNA-Fragmenten nach enzymatischer Behandlung oder
nach PCR
34
4.1.8
Ligation von DNA-Fragmenten
35
4.1.9
Transformation von Plasmid-DNA in E. coli Bakterien
35
Inhaltsverzeichnis
3
4.1.10
Einfrieren von Bakterien
36
4.1.11
Elektrophoresetechniken zur Auftrennung von DNA- und RNA
36
4.1.11.1
Agarose-Gelelektrophorese
36
4.1.11.2
Agarose-Formaldehyd-Gelelektrophoresen zur Trennung von RNA
36
4.1.12
DNA-Amplifikation durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
37
4.1.13
Nachweis von spezifischer mRNA
38
4.1.14
Ortspezifische Mutagenese
38
4.1.15
Sequenzierung von Doppelstrang-DNA
41
4.1.16
Transfer von DNA auf einen Hybond-N Filter (Southern-Blot)
42
4.1.17
DNA-Markierung mit α32P-dCTP
43
4.1.18
DNA-Reinigung über Sephadex G-50
43
4.1.19
Hybridisierung von Hybond-N Filtern mit einer radioaktiven Sonde
44
4.2
Zellbiologische und biochemische Methoden
44
4.2.1
Methoden zur Arbeit mit eukaryotischen Zellen
44
4.2.1.1
Trypsinieren von Zellen und Gewinnung eines Zell-Pellets
45
4.2.1.2
Einfrieren von Zellen
45
4.2.1.3
Auftauen und Revitalisieren von Zellen
45
4.2.1.4
Gewinnung von Zell-Überstand
46
4.2.1.5
Stabile und transiente Transfektion von BHK21-Zellen mit DNA
46
(Kalziumphosphat-Kopräzipitation)
46
4.2.1.6
Subklonierung eukaryotischer Zellen
47
4.2.2
Mikroskopische Techniken
48
4.2.2.1
β-Galaktosidase-Färbung
48
4.2.2.2
Indirekte Immunfluoreszenz -Färben saurer Kompartimente und
Nachweis der humanen Arylsulfatase B
48
4.2.3
Biochemische Methoden
49
4.2.3.1
Gewinnung von Zell-Lysaten
49
4.2.3.2
Metabolische Markierung mit 35S-Met/Cys („Pulse-Chase“)
50
4.2.3.3
Waschen von Pansorbin
50
4.2.3.4
Immunpräzipitation der humanen Arylsulfatase B
51
4.2.3.5
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Proteinen
53
4.2.3.6
Färbung der SDS-Gele mit Kolloidal-Coomassie
54
4.2.3.7
Transfer von Proteinen auf eine PVDF-Membran (Western-Blot)
54
Inhaltsverzeichnis
4
4.2.3.8
Enzymaktivitätsbestimmung der Arylsulfatase B
55
4.2.3.9
Enzymaktivitätsbestimmung β-Hexosaminidase (β-Hex)
56
4.2.3.10
Proteinbestimmung nach Lowry
56
4.2.3.11
ELISA zur Quantifizierung humaner Arylsulfatase B
57
4.2.3.12
Biotinylierung monoklonaler Antikörper
58
4.2.3.13
Aufreinigung rekombinanter huASB aus Zellkultur-Überständen
58
4.2.3.14
Deglykosylierung von Glykoproteinen mittels Glykosidasen
60
4.2.3.14.1 Deglykosylierung mittels Endoglykosidase H (EndoH)
60
4.2.3.14.2 Deglykosylierung mittels N-Glykosidase F (PNGaseF)
61
4.3
Methoden zur Arbeit mit Mäusen
61
4.3.1
Maushaltung
61
4.3.2
Gezielte Verpaarung von Mäusen und Vaginalpfropfkontrolle
62
4.4
Statistische Analysen
62
5.
ERGEBNISSE
63
5.1
Charakterisierung von unterglykosylierten Mutanten der humanen
Arylsulfatase B
5.1.1
Überprüfen des möglichen Einflusses der Mutationen auf die
Sekundärstruktur der huASB
5.1.2
72
Expression des huASB-Proteins in primären Zellklonen der huASBGlykosylierungsmutante N426Q
5.1.7
71
Expression der huASB-mRNA in primären Zellklonen der
Glykosylierungsmutante N426Q
5.1.6
69
Integration der huASB-cDNA bei primären Zellklonen der
Glykosylierungsmutante N426Q
5.1.5
67
Stabile Transfektion von BHK21-Zellen mit huASB-Expressionsvektoren zur Gewinnung huASB überexprimierender Zelllinien
5.1.4
64
Ortsspezifische Mutagenese und Gewinnung von Expressionsvektoren der huASB-cDNA
5.1.3
63
73
Analyse der huASB-Glykosylierungsmutanten N426Q, N426S und
einer Doppelmutante N279Q/N426Q
74
Inhaltsverzeichnis
5.1.8
5
Charakterisierung der huASB-Glykosylierungsmutanten N188Q,
N279Q und N366Q
5.1.8.1
76
Nachweis der Glykosylierungen der huASB anhand Wildtyp und
den Glykosylierungsmutanten N188Q, N279Q und N366Q
77
5.1.8.2
Charakterisierung der N-Glykosylierungen der huASB
79
5.1.9
Sekretion von Wildtyp-huASB und den Glykosylierungsmutanten
N188Q, N279Q und N366Q aus BHK21-Zellen
5.1.10
80
Sortierung der huASB-Glykosylierungsmutanten N188Q, N279Q und
N366Q
5.1.11
83
Prozessierung des huASB-Proteins in Wildtyp-huASB und huASBGlykosylierungsmutanten exprimierenden BHK21 Zellen
5.1.12
85
Bestimmung kinetischer Parameter von gereinigter Wildtyp-huASB und
huASB-Glykosylierungsmutanten
87
5.1.12.1
Charakterisierung der zwei aufgereinigten Formen der huASB
89
5.1.12.2
Bestimmung von Km und Vmax beider aufgereinigter Formen der huASB 90
5.1.12.3
Bestimmung enzymatischer Parameter der huASB in situ in Zellüberständen und Zell-Lysaten
5.2
94
Entwicklung eines für rekombinante humane ASB immuntoleranten
MPS VI-Mausmodells für Enzymersatztherapie-Studien
96
5.2.1
Austausch des Cystein 91 im aktiven Zentrum der huASB gegen Serin
96
5.2.2
Generierung eines Expressionsplasmids zur Expression der huASBC91ScDNA unter der Kontrolle eines β-Aktin Promotors
5.2.3
Expressionskontrolle des Plasmid-Konstrukts ptChuASBC91S in
BHK21-Zellen
5.2.4
97
99
Generierung einer für humane Arylsulfatase B immuntoleranten
Mauslinie
100
5.2.5
Nachweis transgener "Founder"
100
5.2.6
Phänotyp der transgenen Maus huASBC91STg
102
6.
DISKUSSION
103
6.1
Gewinnung rekombinanter humaner Arylsulfatase B
103
6.2
Sortierung der humanen Arylsulfatase B
107
Inhaltsverzeichnis
6.3
Prozessierung der humanen Arylsulfatase B
6.4
Synthese, Sekretion und Endozytose rekombinanter humaner
Arylsulfatase B
6.5
6
108
109
Bestimmung der enzymatischen Parameter rekombinanter humaner
Arylsulfatase B
112
6.6
Therapieansätze für die Mukopolysaccharidose VI
115
6.6.1
Enzymersatztherapie
115
6.6.2
Somatische Gentherapie
117
6.7
Ausblick
119
7.
ZUSAMMENFASSUNG
120
8.
LITERATURVERZEICHNIS
121
9.
ANHANG
132
10.
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
135
Einleitung
1.
7
Einleitung
Die Lysosomen sind das zentrale Kompartiment des zellulären Katabolismus. Der
Ausfall lysosomaler Hydrolasen kann katabole Prozesse stören und schwerwiegende
Krankheitsbilder, die lysosomalen Speicherkrankheiten, verursachen.
1.1
Das lysosomale Kompartiment
Die eukaryotische Zelle ist in Kompartimente mit unterschiedlichen Funktionen
gegliedert. Im lysosomalen Kompartiment werden extrazelluläre, endozytierte
Makromoleküle (Proteine, Lipide, Nukleinsäuren und Saccharide) oder phagozytierte
Pathogene degradiert (De Duve and Wattiaux, 1966). Auf Phagozytose spezialisierte
Zellen wie Makrophagen bilden spezielle Phagolysosomen aus (Mellman et al., 1986).
Eine weitere Aufgabe der Lysosomen ist es, "alte" intrazelluläre zytosolische
Makromoleküle und Organellen abzubauen. Dieser Vorgang wird als Autophagie
bezeichnet (Dunn, 1990). Zur Degradation der unterschiedlichen Substrate sind im
lysosomalen Kompartiment ca. 50 Hydrolasen lokalisiert. Dabei handelt es sich um
Glykoproteine, die als inaktive Vorstufen am rauen Endoplasmatischen Retikulum
(rER) synthetisiert und aufgrund N-terminaler Signalsequenzen in das ER-Lumen
transferiert werden. Die Glykosylierung lysosomaler Proteine und sekretorischer
Proteine erfolgt kotranslational im ER sowie posttranslational im Golgi-Apparat. Im
trans-Golgi Netzwerk (TGN) erfahren die lysosomalen Glykoproteine eine Sortierung.
Während sekretorische Glykoproteine über Transportvesikel sezerniert werden, werden
lösliche lysosomale Glykoproteine aufgrund besonderer Erkennungssignale in die
Lysosomen sortiert (Abb. 1). Als Erkennungssignal dienen posttranslational an den
Oligosacchariden der lysosomalen Glykoproteine synthetisierte Mannose-6-Phosphate.
Diese werden von membranständigen Mannose-6-Phosphat-Rezeptoren im TGN
erkannt, gebunden und die lysosomalen Enzyme über Clathrin-"coated-vesicles" in die
Endosomen sortiert. In den Endosomen treffen zum Abbau bestimmte Makromoleküle
mit den lysosomalen Enzymen zusammen. Die Prozessierung inaktiver Vorstufen
lysosomaler Enzyme beginnt bereits im prälysosomalen, endosomalen Kompartiment
(Gieselmann et al., 1983; Hasilik, 1992). Die lysosomalen Proteine dissoziieren in den
Endosomen von den Mannose-Phosphat-Rezeptoren und gelangen danach in die
Einleitung
8
Lysosomen (Kornfeld, 1992). Dort wird die Prozessierung durch limitierte Proteolyse
der lysosomalen Enzyme bei einem sauren pH-Wert zwischen 4,5 und 5 abgeschlossen.
Aus den lysosomalen Proenzymen werden so reife lysosomale Enzyme (Sabatini, 2001;
von Figura and Hasilik, 1986). Für die β-Hexosaminidase und die α-Mannosidase
konnte gezeigt werden, dass schon die Proformen katalytisch aktiv sind (Hasilik et al.,
1982; Mierendorf et al., 1983).
P
P
MPR
LE
EE
P
P
P
Ly
P
B
A
trans-Golgi
P
P
cis-Golgi
P
rER
P
Mannose-6-Phosphat
Glykoprotein
Mannose-6-Phosphat-Rezeptor
Abb. 1: Schema zur Sortierung sekretorischer und lysosomaler Proteine
Die Synthese und Exozytose sekretorischer Proteine (A) und die Sortierung lysosomaler Proteine (B) ist
vereinfacht dargestellt. Ly: lysosomales Kompartiment; EE: frühes endosomales Kompartiment;
LE: spätes endosomales Kompartiment; rER: raues Endoplasmatisches Retikulum.
Einleitung
9
Bei den lysosomalen Hydrolasen handelt es sich hauptsächlich um Proteasen,
Sulfatasen, Glykosidasen, Nukleasen und Lipasen, deren Aktivitätsoptimum bei einem
pH von 4,5 bis 5 liegt. Der saure pH-Wert in den Lysosomen wird durch Protonenpumpen aufrechterhalten, die zu den vakuolären ATPasen gehören (Mellman et al.,
1986). Die Synthese lysosomaler Enzyme in Form von katalytisch inaktiven
Proenzymen, die relativ späte Aktivierung und die zusätzliche Aktivitätseinschränkung
auf einen sauren pH-Bereich, dienen zum Schutz zellulärer und auch extrazellulärer
Proteine vor Verdauung durch Proteasen. Die vorzeitige Degradation lysosomaler
Enzyme wird durch ihren hohen Glykosylierungsgrad verhindert. Weiterhin ist die
Innenseite
der
Lysosomenmembran
durch
hochgradig
glykosylierte
integrale
Membranproteine wie die Lamps ("lysosomal associated membrane proteins") und
Limps ("lysosomal integral membrane proteins") vor dem Abbau durch saure
Hydrolasen geschützt (Kornfeld and Mellman, 1989; Kundra and Kornfeld, 1999).
1.1.1
Bildung der Mannose-6-Phosphat-Erkennungsmarker
Lysosomale Proteine werden ko- und posttranslational modifiziert. Bereits im ER
erkennt die Oligosaccharyltransferase die Glykosylierungs-Motive Asn-X-Thr/Ser in
der Aminosäuresequenz der nascierenden Polypeptidkette und transferiert die
Zuckerketten aus zwei N-Acetyl-Glukosamin-, neun Mannose- und drei Glukoseresten
von
einem
membrangebundenen
Dolicholpyrophosphat-Lipid-Carrier
auf
den
Asparaginrest in diesem Motiv. Im ER werden die Oligosaccharide durch die
α-Glukosidase-1 und -2 bereits vor Abschluss der Translation verkürzt. Nach dem
Transfer der so modifizierten Glykoproteine vom ER in den cis-Golgi, trennen sich die
Synthesewege sekretorischer und lysosomaler Glykoproteine. Die mannosereichen
Oligosaccharid-Seitenketten sekretorischer Proteine werden zu Oligosacchariden des
komplexen Typs umgebaut. Dazu werden zunächst Mannosereste durch die
α-Mannosidase-1 abgespalten und anschließend im medialen- und trans-Golgi die
Oligosaccharide modifiziert. An diesen Modifikationen sind die N-Acetyl-GlukosaminTransferase-1 und -2, die α-Mannosidase-2, die Fukosyl- und die Sialyl-Transferase
beteiligt (Abb. 2). Schließlich werden die Glykoproteine mit den so generierten
Oligosacchariden des komplexen Typs über sekretorische Vesikel sezerniert.
Einleitung
10
Lysosomale Proteine können sowohl komplexe als auch mannosereiche OligosaccharidKetten tragen (Hasilik and Von Figura, 1981; Sabatini, 2001). Die mannosereichen
Oligosaccharide der löslichen lysosomalen Glykoproteine erhalten im cis-Golgi ihre
Mannose-6-Phosphat Erkennungssignale zur lysosomalen Sortierung (Pohlmann et al.,
1982). Hierfür werden an mannosereiche Oligosaccharid-Seitenketten durch die
N-Acetyl-Glukosamin-1-Phosphotransferase N-Acetyl-Glukosamin-1-Phosphate an das
C6-Atom von ein bis zwei Mannoseresten angehängt. Die N-Acetyl-GlukosaminPhosphodiesterase spaltet anschließend die endständigen N-Acetyl-Glukosamine ab und
bildet so Mannose-6-Phosphate (Abb. 2). Ist die Phosphotransferase defekt kommt es
infolge fehlender Mannose-6-Phosphat-Erkennungssignale zur verstärkten Sekretion
lysosomaler Proteine in den Extrazellulärraum (I-Zell-Krankheit; Hasilik et al., 1981;
Reitman et al., 1981).
Abb. 2: N-Glykosylierung sekretorischer und lysosomaler Enzyme nach (Sabatini, 2001)
1: N-Acetyl-Glukosamin-Phosphodiesterase; 2: N-Acetyl-Glukosamin-1-Phosphotransferase;
3: α-Mannosidase-1; 4: N-Acetyl-Glukosamin-Transferase-1; 5: α-Mannosidase-2; 6: N-AcetylGlukosamin-Transferase-2 und Fukosyl-Transferase; 7: N-Acetyl-Galaktosamin-Transferase; 8: SialylTransferase.
Einleitung
1.1.2
11
Mannose-6-Phosphat-Rezeptoren und Sortierung lysosomaler Proteine
In Säugerzellen konnten zwei unterschiedliche Mannose-6-Phosphat-Rezeptoren (MPR)
nachgewiesen werden, die endständige Mannose-6-Phosphatreste N-glykosidischer
Oligosaccharid-Seitenketten eines Glykoproteins binden können. Dabei handelt es sich
einerseits um den MPR 46, einen Kationen-abhängigen Rezeptor mit einem
Molekulargewicht von 46kDa (Hoflack and Kornfeld, 1985), und andererseits um den
MPR 300, einen Kationen-unabhängigen Rezeptor mit einem Molekulargewicht von ca.
300kDa (Sahagian et al., 1981). Für letzteren konnte gezeigt werden, dass er mit dem
insulinähnlichen Wachstumsfaktor II (IGFII)-Rezeptor identisch ist, wobei die beiden
Liganden IGFII und Mannose-6-Phosphat-Glykoprotein an unterschiedlichen Stellen
binden (MacDonald et al., 1988). Die Bindung der mit Mannose-6-Phosphat markierten
Glykoproteine an diese zwei Rezeptoren erfolgt mit unterschiedlichen Affinitäten und
pH-Optima (Hoflack et al., 1987; Tong and Kornfeld, 1989). Beide Rezeptoren sind an
der Sortierung lysosomaler Enzyme beteiligt (Kornfeld, 1992; Stein et al., 1987). MPRLigand-Komplexe aus dem trans-Golgi-Netzwerk werden über Vesikel zu den frühen
oder späten Endosomen transportiert (Griffiths et al., 1988). Dort kommt es aufgrund
des sauren pH in diesem Kompartiment zu einer Dissoziation des Liganden von seinem
Rezeptor, wobei die Liganden, d.h. die mit Mannose-6-Phosphat markierten
Glykoproteine, in die Lysosomen sortiert werden, und die Rezeptoren ins ER
rezirkulieren (von Figura and Hasilik, 1986). In den Lysosomen selbst sind keine MPR
nachweisbar (Kornfeld and Mellman, 1989). Normalerweise wird ein kleiner Anteil der
lysosomalen Enzyme (5-10%) MPR-unabhängig in den Extrazellulärraum sezerniert.
Eine Überexpression des MPR 46 führt zu einer erhöhten Sekretion lysosomaler
Enzyme (Chao et al., 1990). Dieser scheinbare Widerspruch lässt sich dadurch erklären,
dass der MPR 46 im frühen endosomalen Kompartiment lokalisiert ist, welches im
ständigen Austausch mit der Plasmamembran steht und so die Sekretion lysosomaler
Enzyme ermöglicht. Sowohl der MPR 46 als auch der MPR 300 sind auch an der
Plasmamembran zu finden. Sezernierte Glykoproteine, die mit Mannose-6-Phosphat
markiert sind, können jedoch nur über den MPR 300 und nicht durch den MPR 46
endozytiert werden (Stein et al., 1987). Weitere Rezeptoren der Plasmamembran wie
der Mannose-Rezeptor der Makrophagen und der Asialoglykoprotein-Rezeptor der
Hepatozyten können ebenfalls Glykoproteine endozytieren (Spiess, 1990).
Einleitung
1.2
12
Lysosomale Speicherkrankheiten
Lysosomale Speicherkrankheiten sind ein klassisches Beispiel für monogene
Erbkrankheiten. Aufgrund ihrer klar definierten Äthiologie eignen sie sich zur
Entwicklung von Therapiemodellen. Lysosomale Speicherkrankheiten beruhen in der
Regel auf autosomal rezessiv vererbten genetischen Defekten lysosomaler Enzyme, die
an
katabolen
Stoffwechselwegen
von
Proteinen,
Lipiden,
und
komplexen
Kohlehydraten beteiligt sind. Nur die Fabry-Krankheit und das Hunter-Syndrom werden
X-chromosomal vererbt (Neufeld, 1991, 2001). Es sind bis heute mehr als 35 kongenitale lysosomale Speicherkrankheiten bekannt. Die Funktionsverluste lysosomaler
Enzyme beruhen meist auf Punktmutationen, Deletionen oder "Missense"-Mutationen.
In einigen Fällen sind auch Aktivatorproteine der lysosomalen Enzyme defekt, wie bei
bestimmten Formen der GM2-Gangliosidose, bei welcher ein die β-Hexosaminidase
aktivierendes Protein fehlt (Conzelmann and Sandhoff, 1978). Bei den lysosomalen
Speicherkrankheiten sammeln sich die nicht vollständig abgebauten Intermediate
kataboler Stoffwechselwege in den Lysosomen an. Dabei kommt es zur Vergrößerung
und Vervielfältigung der Lysosomen in der Zelle. Der resultierende Funktionsverlust
der betroffenen Zellen führt schließlich zum Funktionsausfall von Geweben und
Organen. Schwere Verlaufsformen führen zum Tod der Patienten. Die Krankheitsbilder
der unterschiedlichen lysosomalen Speicherkrankheiten sind sehr heterogen. Es sind je
nach Enzymdefekt sehr unterschiedliche Organe betroffen, da die Substrate der
katabolen Stoffwechselwege qualitativ und quantitativ unterschiedlich verteilt sind.
Auch können bei den Patienten individuelle Schweregrade unterschieden werden, die
von der residualen Aktivität des betroffenen Enzyms abhängen. Zu den typischen
Charakteristika
lysosomaler
Speicherkrankheiten
gehören:
Skelettdysplasien,
Dysfunktion des zentralen und peripheren Nervensystems und Vergrößerung viszeraler
Organe. Der Verlauf der Krankheiten ist immer chronisch-progredient. Die lysosomalen
Speicherkrankheiten werden nach der jeweiligen Speichersubstanz in vier Gruppen
eingeteilt:
1.
Lipidosen,
2.
Mukopolysaccharidosen,
4. Glykogenosen (Gieselmann, 1995).
3.
Glykoproteinosen,
Einleitung
1.3
13
Mukopolysaccharidosen (MPS)
Die Mukopolysaccharidosen (MPS) sind eine Gruppe seltener, autosomal rezessiv
vererbter lysosomaler Speicherkrankheiten (Neufeld, 2001). Nur das Hunter-Syndrom
wird X-chromosomal vererbt. Bei den MPS werden Mukopolysaccharide in den
Lysosomen gespeichert. Die Mukopolysaccharide werden heute als Glykosaminoglykane bezeichnet. Sie sind Strukturbestandteile der Proteoglykane, welche am Aufbau
der Grundsubstanz des Bindegewebes beteiligt sind. Bei den sieben beschriebenen
Mukopolysaccharidosen liegt jeweils die Defizienz eines der 11 lysosomalen Enzyme
(4 Exoglykosidasen, 5 Sulfatasen, 1 Transferase, 1 Endoglykosidase) zugrunde, die am
schrittweisen Abbau der Glykosaminoglykane beteiligt sind (Tab. 1).
Glykosaminoglykane (GAG's) sind unverzweigte Polysaccharide der extrazellulären
Matrix, die aus sich wiederholenden Disaccharideinheiten aufgebaut sind. Ein
Disaccharid besteht aus einem Aminozucker (N-Acetyl-Glukosamin oder N-AcetylGalaktosamin) und aus einer Uronsäure (Glukuronsäure oder Iduronsäure) bzw. bei
Keratansulfat aus einer Galaktose. Der Aminozucker trägt meist eine Sulfatgruppe. Die
Iduronsäure kann ebenfalls sulfatiert sein. Die Sulfatreste und Carboxylgruppen der
einzelnen Zuckermoleküle verleihen den GAG's eine stark negative Gesamtladung. Man
unterteilt die GAG's nach ihrer Zusammensetzung in vier Klassen: 1. Hyaluronat,
2. Chondroitin- und Dermatansulfat, 3. Heparansulfat und Heparin, 4. Keratansulfat
(Piez, 1984). Die GAG's sind Bestandteil der Proteoglykane, die in hohen
Konzentrationen in Bindegeweben vorkommen. Bei Funktionsverlust der katabolen
Enzyme sind daher auch besonders solche Gewebe mit hohem Bindegewebsanteil, wie
z.B. Knorpel, betroffen. Deshalb sind Skelettdeformationen (Dysostosis multiplex) und
Gelenkversteifungen die Hauptsymptome der MPS. Weitere typische Merkmale dieser
Erkrankungen sind Organvergrößerungen (Milz, Leber), Taubheit, Corneatrübung,
Hautverdickungen, pulmonale und kardiovaskuläre Funktionsstörungen sowie bei den
meisten Mukopolysaccharidosen eine mentale Retardierung. Gemeinsam ist den MPS
ein chronisch-progredienter Verlauf mit sehr heterogener klinischer Manifestation
sowohl zwischen den verschiedenen MPS als auch innerhalb eines Typs der MPS.
Diagnostiziert werden die MPS anhand der Ausscheidung der GAG's im Urin, sowie
durch Messung der Enzymaktivitäten in Haut-Fibroblasten oder Leukozyten bzw. durch
molekulare Diagnostik.
Einleitung
14
Tab. 1: Überblick über die verschiedenen Mukopolysaccharidosen
Klassifizierung Name
Defizientes Enzym
Typ I
Hurler/Scheie-Syndrom
α-L-Iduronidase
TypII
Hunter-Syndrom
α-L-Iduronat-Sulfatase
A: Heparan-N-Sulfatase
TypIII
Sanfilippo-Syndrom A-D
B: α -N-Acetyl-Glukosaminidase
C: N-Acetyl-Transferase
D: N-Acetyl-Glukosamin-6-Sulfatase
A: N-Acetyl-Galaktosamin-6-Sulfatase
TypIV
Morquio-Syndrom A+B
TypVI
Maroteaux-Lamy-Syndrom Arylsulfatase B
TypVII
Sly-Syndrom
β-Glukuronidase
Typ IX
----------
Hyaluronidase
B: β-Galaktosidase
erstellt nach Neufeld & Muenzer (Neufeld, 2001)
1.4
Die Mukopolysaccharidose Typ VI (Maroteaux-Lamy-Syndrom)
Die Mukopolysaccharidose Typ VI (MPS VI), auch Maroteaux-Lamy-Syndrom
genannt, wurde 1963 von Maroteaux und Lamy beschrieben (Maroteaux, 1963). Bei
dieser Erkrankung handelt es sich um einen seltenen aber schwerwiegenden autosomal
rezessiv vererbten Defekt im Dermatansulfat- und Chondroitinsulfat-Abbau mit einer
Inzidenz von etwa 1:1.000.000 bei lebenden Neugeborenen (Neufeld, 2001).
1.4.1
Symptomatik der MPS VI
Bei der MPS VI sind verschiedene Gewebe und Organe von der lysosomalen
Speicherung der Zwischenprodukte aus dem Dermatan- und Chondroitinsulfat-Abbau
betroffen. Besonders auffällig sind die Veränderungen des Skelettsystems: die
Deformation von Knochen resultiert in Minderwuchs und groben Gesichtszügen
(kranio-faziale Dysplasie). Es kommt zu Gelenkversteifungen durch Ablagerungen von
Zwischenprodukten des Chondroitinsulfat-Abbaus in den Gelenkknorpeln. Des weiteren
gehören Organvergrößerungen (Hepatosplenomegalie) und Hornhauttrübungen zum
typischen Krankheitsbild. Etwa 20-30% der Patienten entwickeln eine funktionell
relevante Kardiomyopathie. Funktionsstörungen der Herzklappen manifestieren sich bei
Einleitung
15
90% der Patienten (Wippermann, 1995). Auffallend ist die geringe Beeinträchtigung
von Intellekt und Psychomotorik. Eine Enzymersatztherapie könnte daher für MPS VIPatienten erfolgversprechend sein, da das Problem der Überwindung der Blut-Hirnschranke bei dieser Erkrankung nicht relevant ist. Es bestehen unterschiedliche
Ausprägungen der MPS VI, die mit unterschiedlichen residualen Enzymaktivitäten
korrelieren (Brooks, 1993; Brooks et al., 1991). Man findet eine leichte adulte (Jin et
al., 1992), eine intermediäre juvenile (Wicker et al., 1991) und eine schwere infantile
(Isbrandt et al., 1996; Jin et al., 1992; Litjens et al., 1992) Verlaufsform. Patienten mit
der schweren Verlaufsform sterben meist im Alter von 20-30 Jahren an Herzversagen.
1.4.2
Biochemische Grundlagen der MPS VI
MPS VI -Patienten sind nicht in der Lage Dermatan- und Chondroitinsulfat abzubauen,
da eine Defizienz der Arylsulfatase B (ASB; N-Acetyl-Galaktosamin-4-Sulfatase;
EC 3.1.6.12) vorliegt. Dieses lysosomale Enzym spaltet die C4-Sulfatgruppen am nichtreduzierenden Ende von N-Acetyl-Glukosaminen hydrolytisch ab (Abb. 3; Fluharty et
al., 1975; Matalon et al., 1974; O'Brien et al., 1974; Shapira et al., 1975). MPS VIPatienten synthetisieren zwar meist noch ein ASB-Protein, dieses wird jedoch entweder
sofort degradiert oder mit verminderter Enzymaktivität exprimiert (Isbrandt et al., 1994;
Litjens et al., 1996; Brooks et al., 1991).
Dermatansulfat ist aus sich wiederholenden Disaccharideinheiten aufgebaut, die
ihrerseits aus N-Acetyl-Galaktosamin-4-sulfat und Uronsäure bestehen. Bei letzterer
handelt es sich meist um die α-L-Iduronsäure und selten um eine Glukuronsäure
(Roden, 1980). Die Uronsäure kann ebenfalls sulfatiert sein. Chondroitinsulfat ist aus
D-Glukuronat und N-Acetyl-Galaktosamin-4- oder -6-sulfat aufgebaut. In den
Lysosomen erfolgt der schrittweise Abbau von Dermatansulfat vom nichtreduzierenden Ende her durch drei Exoglykosidasen und zwei Sulfatasen. Im Fall des
Auftretens einer Glukuronsäure ist wahrscheinlich eine Endoglykosidase beteiligt
(Hyaluronidase; Neufeld, 2001). Chondroitinsulfat wird durch die Kombination von
β-Glukuronidase, β-Hexosaminidase, Arylsulfatase B und N-Acetyl-Galaktosamin-6Sulfatase schrittweise abgebaut. Die Hyaluronidase kann im Fall einer Enzymdefizienz
der β-Glukuronidase, der Arylsulfatase B oder der N-Acetyl-Galaktosamin-6-Sulfatase
als Endoglykosidase Chondroitinsulfat spalten (Neufeld, 2001).
Einleitung
A
16
B
Abb. 3: A) Schrittweiser Abbau des Dermatansulfats und B) MPS VI-Patient
A) Die Arylsulfatase B, hier mit dem Synonym N-Acteyl-Galaktosamin-4-Sulfatase bezeichnet,
katalysiert den 3. Schritt beim Abbau des Dermatansulfats. Defizienzen der katabolen Enzyme auf den
verschiedenen Stufen des Abbaus führen zu verschiedenen lysosomalen Speicherkrankheiten:
1: MPS II, Hunter-Syndrom (α-L-Iduronat-Sulfatase defizient); 2: MPS I, Hurler-, Scheie- und HurlerScheie-Syndrom (α-L-Iduronidase defizient); 3: MPS VI: Maroteaux-Lamy-Syndrom (Arylsulfatase B
defizient); 4: Sandhoff-Krankheit (β-Hexosaminidase A und B defizient); 5: MPS VII: Sly-Syndrom
(β-Glukuronidase defizient). Aus Neufeld & Muenzer (Neufeld, 2001). B) Das Bild zeigt einen etwa
1 Jahr alten MPS VI-Patienten. Das Bild wurde freundlicherweise von Prof. Dr. C. Peters zur Verfügung
gestellt.
1.4.3
Genetische Ursachen der MPS VI
Im humanen Arylsulfatase B (ASB)-Gen konnten bisher 45 klinisch relevante
Mutationen gefunden werden (Litjens and Hopwood, 2001). MPS VI-Patienten weisen
bei homozygot-rezessivem Erbgang meist eine Kombination von unterschiedlichen
Mutationen in den ASB-Allelen auf ("compound heterozygote"). Bisher konnte keine
prädominante Mutation nachgewiesen werden. Bei ca. 70% der Mutationen handelt es
sich um "Missense"-Mutationen. Einige dieser "Missense"-Mutationen erlauben die
Einleitung
17
Synthese eines ASB-Proteins mit einer residualen Enzymaktivität, was zu einem
milderen Verlauf der Erkrankung führen kann (Jin et al., 1992; Litjens et al., 1996;
Simonaro and Schuchman, 1995). Außerdem konnten sieben "Nonsense"-Mutationen,
eine Insertion und sechs Deletionen erfasst werden (Isbrandt et al., 1994; Isbrandt et al.,
1996; Litjens and Hopwood, 2001; Litjens et al., 1992; Villani et al., 1998; Voskoboeva
et al., 1994). Eine vollständige ASB-Defizienz (Null-Mutation) führt dabei in der Regel
zu einem schweren Verlauf der MPS VI. Die vielfältigen Kombinationsmöglichkeiten
der Mutationen resultieren in unterschiedlichen ASB-Restaktivitäten und führen so zu
dem heterogenen klinischen Erscheinungsbild der MPS VI.
1.5
Die Arylsulfatase B
Die humane Arylsulfatase B (huASB) gehört zu der Proteinfamilie der Sulfatasen. Die
Sequenzhomologie von etwa 20-30% zu paralogen und orthologen Sulfatasen deutet auf
ein gemeinsames Ursprungsgen hin. Bisher sind in Mammaliae 12 Sulfatasen bekannt,
wobei 8 in den Lysosomen und 4 membrangebunden am ER, am Golgi sowie an der
Plasmamembran lokalisiert sind (Hopwood, 2001). Alle Sulfatasen spalten ihre
jeweiligen Substrate mit hoher Substratspezifität. Acht der Sulfatasen sind mit
Stoffwechselkrankheiten assoziiert. Eine seltene Stoffwechselkrankheit, die "Multiple
Sulfatase-Defizienz" (MSD), bei der alle Sulfatasen inaktiv sind, führte zur Entdeckung
einer einzigartigen ko- oder posttranslationalen Modifikation, bei der im ER ein Cystein
im aktiven Zentrum zu einem Formylglycin oxidiert wird (Dierks et al., 1998; Schmidt
et al., 1995). Diese Oxidation ist essentiell zur Aktivierung der Sulfatasen. Von Bond et
al. wurde aufgrund hoch konservierter Aminosäuren ein für alle Sulfatasen gleicher
katalytischer Mechanismus postuliert. Diese hoch konservierten Aminosäuren
stabilisieren bei der huASB während der Hydrolyse den Sulfatester und ein
zweiwertiges Metall-Ion im aktiven Zentrum (Bond et al., 1997; Hopwood, 2001). Die
Arylsulfatase B ist eine von sechs identifizierten Arylsulfatasen (A-F). Der Name
Arylsulfatase ist auf die Fähigkeit zurückzuführen, in vitro synthetische chromogene
und fluorogene Arylsulfate zu spalten.
Einleitung
18
Die cDNA der huASB wurde unabhängig von Schuchmann et al. (Schuchman et al.,
1990) und Peters et al. (Peters et al., 1990) isoliert und sequenziert. Der offene
Leserahmen der huASB-cDNA umfasst 1599 Nukleotide (s. Anhang; Peters et al.,
1990). Die kodierende Region ist auf 8 Exone aufgeteilt (Modaressi et al., 1993). Das
huASB-Gen ist auf dem Chromosom 5q13-q14 lokalisiert (Litjens et al., 1989) und
erstreckt sich über ca. 220kb (Enders, A., unpublizierte Daten). Die huASB-cDNA
kodiert für 533 Aminosäuren, wobei die ersten 40-41 Aminosäuren das Signalpeptid
zum Transfer in das ER-Lumen bilden (Schmidt, B., unpublizierte Daten; Kobayashi et
al., 1992). Im ER findet man eine 491/492 Aminosäuren umfassende Vorstufe der reifen
lysosomalen huASB mit einem kalkulierten Molekulargewicht von 56kDa. Das
scheinbare Molekulargewicht von 66-68kDa in der SDS-Gelelektrophorese lässt auf
Glykosylierung des Proteins schließen. Für ASB aus humanen Fibroblasten und
humaner Placenta konnten Glykosylierungen und eine Phosphorylierung der
Mannosereste nachgewiesen werden (Kobayashi et al., 1992; Steckel et al., 1983). In
der Aminosäuresequenz der huASB sind sechs potentielle N-Glykosylierungsstellen mit
dem Sequenzmotiv Asn-X-Thr/Ser vorhanden (Peters et al., 1990; Schuchman et al.,
1990). Ob alle sechs potentiellen Glykosylierungsstellen wirklich glykosyliert sind und
an welcher Position sich welcher Oligosaccharid-Typ (mannosereich oder komplex)
befindet, konnte noch nicht geklärt werden. Nach den Kristallstrukturdaten
(Brookhaven Protein Data Bank: 1 FSU) liegen alle sechs potentiell glykosylierten
Asparagine, für die N-Acetyl-Glukosamin-Phosphotransferase gut zugänglich, an der
Moleküloberfläche (Abb. 4), wobei zwei dieser Asparagine sicher glykosyliert sind
(Asn 279 und Asn 426) und eines (Asn 366) wahrscheinlich glykosyliert ist (Bond et
al., 1997). Zur Glykosylierung der weiteren drei Asparagine (Asn 188, Asn 291 und
Asn 458) gibt es keine eindeutigen Aussagen. Die Position Asn 188 spielt
möglicherweise eine besondere Rolle bei der lysosomalen Sortierung, da sie exponiert
in einem β-Loop liegt (Abb. 4; Bond et al., 1997).
Einleitung
19
Abb. 4: Tertiärstruktur der huASB
Die Moleküldaten sind aus der Brookhaven Protein Data Bank entnommen (Identifikationscode: 1FSU).
Das 3D-Bild wurde mit dem Programm RasMol generiert. Die sechs potentiellen Glykosylierungsstellen
sind rot markiert. Die Positionen der vier als wichtig erachteten Asparagine sind angegeben.
In den Lysosomen findet die Prozessierung der unreifen Proform zur reifen Form der
huASB statt. Es entstehen dabei drei Peptide (α, β und γ), welche durch DisulfidBrücken miteinander verbunden sind (Abb. 5; Bond et al., 1997; Kobayashi et al.,
1992). Möglicherweise beginnt bereits im prälysosomalen Kompartiment die
Prozessierung der huASB, wie es für andere lysosomale Enzyme wie Cathepsin D
beobachtet werden konnte (Gieselmann et al., 1983; Taylor et al., 1990). Zur
Aktivierung der huASB ist die ko- oder posttranslationale Transformation des Cysteins
91 im aktiven Zentrum zu einem Formylglycin notwendig (Schmidt et al., 1995; von
Figura et al., 1998). In Bakterien findet man ebenfalls eine Oxidation des konservierten
Cysteins zu Formylglycin. Ausnahmen bilden das Bakterium Klebsiella pneumoniae
und E. coli, die anstelle des Cysteinrestes einen Serinrest besitzen, der ebenfalls zu
einem Formylglycin umgewandelt werden kann (Miech et al., 1998). Da Bakterien aber
nicht die komplexen Glykosylierungen und Phosphorylierungen an dem huASB-Protein
durchführen können, muss die huASB-cDNA zur Gewinnung von rekombinantem
huASB-Protein in eukaryotischen Zellen exprimiert werden.
Einleitung
20
α
41/42
424
γ
466
β
533
Cys91
188
279
291 366
426 458
Abb. 5: Proteinstruktur der prozessierten reifen huASB
Die prozessierte huASB (ohne N-terminales Leader-Peptid) besteht aus drei Polypeptiden α, β und γ, die
durch Disulfid-Brücken miteinander verbunden sind. Die Positionen der sechs potentiellen
Glykosylierungsstellen sind mit Pfeilen markiert. Weiterhin sind die Positionen der Prozessierungsstellen
und des Cys91 angezeigt. Die errechneten Molekulargewichte der Peptide sind für α: 43kDa, β: 8kDa
und γ: 5kDa.
1.6
Therapeutische Ansätze für die MPS VI
Die MPS VI ist bis heute nicht heilbar. Neben symptomatischer Therapie werden
allogene Knochenmark-Transplantationen als erste Ansätze für eine kausale Therapie
bei MPS VI-Patienten durchgeführt (Herskhovitz et al., 1999). Die Entwicklung von
innovativen Therapieansätzen für die MPS VI stellt aufgrund der Schwere des
Krankheitsbildes und der verkürzten Lebenserwartung der Patienten eine große
Herausforderung dar.
An Tiermodellen wurden für die MPS VI bisher zwei unterschiedliche Therapieansätze
erprobt. Dabei handelt es sich um gentherapeutische Ansätze (Biester, 2001; Biester
2002; Simonaro et al., 1999) und Enzymersatztherapien (Crawley et al., 1996; Evers,
1996). Bei der somatischen Gentherapie werden gentechnisch modifizierte, ASBproduzierende, autologe Knochenmarkzellen intravenös injiziert. Bei der Enzymersatztherapie erfolgt eine Applikation rekombinanten ASB-Enzyms intraperitoneal oder
intravenös (Byers et al., 2000; Crawley et al., 1996; Crawley et al., 1997; Evers, 1996).
Voraussetzung für die durchgeführten Therapien ist erstens das Phänomen, dass nicht
alle lysosomalen Enzyme in die Lysosomen sortiert, sondern ca. 5-10% sezerniert
werden. Voraussetzung ist zweitens, dass eine partielle Sekretion und rezeptorvermittelte Endozytose zum Transfer lysosomaler Enzyme von Donor-Zellen zu
defizienten Zellen in ausreichenden Mengen geschieht, um eine metabolische Korrektur
in letzteren zu bewirken ("cross correction"; Neufeld, 1991). Für Enzymersatztherapien
muss rekombinantes Enzym in großen Mengen gereinigt werden, was technisch und
finanziell sehr aufwendig ist. Ein weiteres Problem der Enzymeratztherapien stellen die
Immunreaktionen auf das rekombinante Enzym dar (Brooks et al., 1997). In MPS VII-
Einleitung
21
Mäusen konnte ein hoher Antikörpertiter nach Injektion humaner β-Glukuronidase
nachgewiesen werden (Sly et al., 2001). Die Immunreaktionen nach Applikation
rekombinanter huASB können in MPS VI-Mäusen bis zum anaphylaktischen Schock
führen (Evers, 1996). Weiterhin ist es aufgrund proteolytischer Inaktivierungen nicht
einfach, im Serum die Stabilität und enzymatische Aktivität des rekombinanten Enzyms
zu erhalten. Es wird daher angestrebt, möglichst stabile, enzymatisch aktive
rekombinante Enzyme zu generieren.
Die somatische Gentherapie eröffnet neue Möglichkeiten der kausalen Therapie
monogener Erbkrankheiten. In "Severe combined immunodeficiency" (SCID)Patienten, konnte durch somatische Gentherapie der SCID-Phänotyp vollständig
korrigiert und so klinische Heilungserfolge erzielt werden (Cavazzana-Calvo et al.,
2000). Bei SCID handelt es sich um eine monogen vererbte Defizienz für die AdenosinDesaminase. Bei der MPS VI ist dagegen eine mangelnde Effizienz gentherapeutischer
Transplantations-Experimente
in
Tiermodellen
zu
beobachten.
Das
klinische
Erscheinungsbild von MPS VI-Katzen konnte durch Gentherapie nicht verbessert
werden (Simonaro et al., 1999). Das ist möglicherweise darauf zurückzuführen, dass das
therapeutische Enzym nicht in ausreichenden Mengen synthetisiert bzw. sezerniert wird
und daher nicht alle defizienten Zellen korrigiert werden können. Eine zu geringe
Sekretion des rekombinanten Enzyms wurde bei Arylsulfatase A-defizienten Mäusen
als Ursache für die nur partielle Korrektur pathologischer Befunde vermutet (Matzner et
al., 2001). Bei ASB-defizienten Mäusen konnte durch gentherapeutische Transplantations-Experimente die Speicherung von Glykosaminoglykanen in den betroffenen
Organen Herz, Leber und Niere auf nahezu normale Werte reduziert werden. Allerdings
konnten die Skelettdysplasien nicht korrigiert werden (Biester, 2001; Biester 2002). Die
Menge an verfügbarem therapeutischen Enzym kann durch die Erhöhung der Sekretion
aus den Produzentenzellen gesteigert werden. Für die humane Arylsulfatase A (ASA)
wurde gezeigt, dass eine unterglykosylierte Mutante, die keine Mannose-6-Phosphate
als Erkennungssignal zur lysosomalen Sortierung mehr trägt, aus Maus LTK--Zellen
in vitro verstärkt sezerniert wird (Gieselmann et al., 1992). Weiterhin wurde die erhöhte
Sekretion der unterglykosylierten ASA-Mutante nach retroviralem Gentransfer und
Transplantations-Experimenten in vivo belegt (Matzner et al., 2001). Eine erhöhte
Sekretion konnte ebenso für eine unterglykosylierte Mutante der β-Glukuronidase
nachgewiesen werden (Shipley et al., 1993).
Aufgabenstellung
2.
22
Aufgabenstellung
Das Maroteaux-Lamy Syndrom (Mukopolysaccharidose Typ VI; MPS VI) ist eine
lysosomale Speicherkrankheit, der eine Defizienz der Arylsulfatase B (ASB) zugrunde
liegt. Die MPS VI geht mit Skelettdeformationen, Gelenkversteifungen, Minderwuchs,
Hornhauttrübung, Hepatosplenomegalie und Funktionsstörungen der Herzklappen
einher. Herzversagen führt häufig zum Tod der Patienten. Eine kurative Therapie für die
MPS VI ist nicht bekannt. Die Entwicklung von Enzymersatztherapie und somatischer
Gentherapie eröffnen Möglichkeiten, diese monogen bedingte Erbkrankheit kausal zu
therapieren.
Dazu ist es erforderlich, ein rekombinantes humanes Arylsulfatase B (huASB)-Enzym
zu generieren, das für den therapeutischen Einsatz hinsichtlich Sekretion, Endozytose
und enzymatischer Parameter optimiert ist. Für eine unterglykosylierte Arylsulfatase AMutante wurde eine erhöhte Sekretion gezeigt. Bei der Arylsulfatase B ist die
Ausgangslage mit sechs potentiellen Glykosylierungsstellen wesentlich komplexer als
bei der Arylsulfatase A, die nur drei Glykosylierungen aufweist. Dennoch ist es von
großem Interesse, ob durch systematische Mutation der Glykosylierungsstellen der
huASB die Sortierung des Enzyms beeinflusst wird und die Menge an sezernierter ASB
erhöht werden kann. In der vorliegenden Arbeit sollten daher unterglykosylierte
Mutanten der huASB generiert, in BHK21-Hamsterzellen stabil exprimiert und auf
Stabilität, Sortierung, Prozessierung, Sekretion sowie enzymatische Parameter
untersucht werden.
Die Entwicklung von Tiermodellen, die zur Situation des MPS VI-Patienten äquivalent
sind, ist eine weitere unabdingbare Voraussetzung für die vorklinische Validierung
innovativer Therapieansätze. Ein spezielles Problem von Enzymersatztherapie-Studien
in Tiermodellen stellen Immunreaktionen auf das rekombinante humane Protein dar.
Aus diesem Grund sollte in der vorliegenden Arbeit eine transgene Maus generiert
werden, die eine inaktive, stabile Form der huASB konstitutiv exprimiert. Nach
Kreuzung dieser transgenen Maus mit einer ASB-defizienten Maus sollte das
resultierende transgene MPS VI-Mausmodell gegenüber zugeführter humaner ASB
immuntolerant sein. Somit sollte dieses neue MPS VI-Modell der Situation der MPS VIPatienten, welche oft ein ASB-Protein mit geringer Restaktivität synthetisieren, besser
angepasst sein. Das neue MPS VI-Mausmodell wäre damit für EnzymersatztherapieStudien geeigneter als die bisher vorhandene ASB-defiziente Mauslinie.
Material
3.
Material
3.1
Geräte
Agarose-Gelelektrophoresekammern
Äkta Explorer 100
Blotsystem
Brutschränke
Eismaschine
ELISA Reader
Filmentwicklungsmaschine
Geltrockner Typ 583
Heizblock
Hybridisierungsofen Typ 400
Image-Scanner
Konzentrierungseinheiten Centricon
Magnetrührer Ikamag RCT
Mikroskope Axioplan-2 und Axioskop-2
Mikrowellenherd
Multipette
pH-Meter
Phosphoimager FLA 3000
Rollrad
Schüttelinkubator G25
Schüttelwasserbad
SDS-Gelelektrophoresesysteme:
- Mini-Protean
- SE600-15-1-5
Sequenziergerät ABI 377 Prism
Spannungsgeräte EPS2A200
Spektrophotometer DUR640
β-Counter Easycount 2000
Sterilbänke Lamin Air HB2448
Stickstofftank
Szintillationszähler TriCarb 2100TR
Thermocycler Gene Amp PCR System
Thermocycler T3
Transilluminator
Ultraschallbad Branson
UV-Handlampe Typ HL-6-KM
Vakkumzentrifuge
Vortex Genie-2
Waagen
Wasserbad
Zentrifugen:
- 5417R
- J2-HS
- Varifuge 3.0; Biofuge 13; Biofuge fresco
23
Thoma & Zitt, Freiburg
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
BioRad, München
Kendro, Hanau
Ziegra, Isernhagen
Molecular Devices, München
Kodak, Stuttgart
BioRad, München
Thoma & Zitt, Freiburg
Bachofer, Reutlingen
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Millipore, Badford / USA
Janke & Kunkel, Staufen
Zeiss, Jena
Siemens, Karlsruhe
Eppendorf, Hamburg
Knick, Berlin
Raytest, Straubenhardt
Breda Scientific, Niederlande
New Brunswick, Edison / USA
GFL, Burgwedel
BioRad, München;
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Applied Biosystems, FosterCity, CA / USA
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Beckman, München
Scotlab, Washington / USA
Kendro, Hanau
Air liquide, Düsseldorf
Packard, Canberra / Australia
Perkin Elmer, Boston, MA / USA
Biometra, Göttingen
Herolab, Wiesloch
Heinemann, Schwäbisch Gmünd
Bachofer, Reutlingen
Bachofer, Reutlingen
Scientific Industries, Bohemia,NY / USA
Satorius, Göttingen
Haake, Karlsruhe
Eppendorf, Hamburg
Beckman, München
Kendro, Hanau
Material
3.2
Verbrauchsmaterialien
96- und 24-Loch-Platten für die Zellkultur
96-Loch-Platten für ELISA F96-MaxiSorp Immuno Platte
Anzuchtkolben 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml
Dialyseschläuche Float-A-Lyzer MWCO 15.000, CE
Einfrierröhrchen für Zellen
Gewebekulturflaschen T25, T75
Gewebekulturschalen 3cm, 6cm, 10cm, 20cm
Hybond-N und Hybond-P Filter
Plastikpipetten 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 25ml, steril
Plastikröhrchen 12ml, 15ml, 50ml, 250ml Falcon
Reaktionsgefäße 0,5ml, 1,5ml, 2ml
Röntgenfilme X-omat AR
Spritzen und Kanülen
Sterilfilter Millex-HA 0,2µm, 0,4µm
Sterilfiltrierflaschen
Whatman 3MM-Papier
Zellschaber
3.3
Greiner, Frickenhausen
Nalge Nunc, Rochester, NY / USA
Schott, Mainz
Roth, Karlsruhe
Nalge Nunc, Rochester, NY / USA
Nalge Nunc, Rochester, NY / USA
Greiner, Frickenhausen
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Greiner, Frickenhausen
Becton Dickinson, F. Lakes, NJ / USA
Eppendorf, Hamburg
Kodak, Stuttgart
Braun, Melsungen
Millipore, Bedford, MA / USA
Nalge Nunc, Rochester, NY / USA
Schleicher & Schüll, Dassel
Greiner, Frickenhausen
Enzyme, Standards und Antibiotika
1kb-, 100bp DNA-Leiter
Ampicillin, Na Salz
DNase I, RNase-frei
Endoglykosidase H
GeneticinR (G418)
Klenow-Fragment
Penicillin / Streptomycin
Phosphatase, alkalisch (Kalb Darm)
PNGaseF
Proteinase K
Proteinstandard, “low range”, vorgefäbt
Puromycin
Restriktionsendonukleasen
Reverse Transkriptase Superscript II
RNase A
SmartTM DNA Leiter
T4-DNA-Ligase
T4-Polynukleotidkinase
Taq-DNA-Polymerase
3.4
24
Gibco Invitrogen, Karlsuhe
Merck, Darmstadt
Boehringer, Mannheim; Qiagen, Hilden
Boehringer, Mannheim
Gibco Invitrogen, Karlsuhe
New England Biolabs, USA
Gibco Invitrogen, Karlsuhe
MBI Fermentas, St. Leon-Rot
Boehringer, Mannheim
Merck, Darmstadt
BioRad, München
Sigma, München
New England Biolabs, USA
Gibco Invitrogen, Karlsuhe
Boehringer, Mannheim
Eurogentec, Belgien
New England Biolabs, USA
New England Biolabs, USA
Perkin Elmer, Boston, MA / USA
Kits zur Bearbeitung von DNA, RNA und Protein
DNeasy Tissue
Dye Terminator Cycle Sequencing
Megaprime DNA Labeling
Plasmid Midi
Plasmid Mini
QIAquick Gelextraction
QIAquick PCR Purification
QuickChangeTM Site-Directed-Mutagenesis
RNeasy Mini
Qiagen, Hilden
Applied Biosystems, Foster City,CA / USA
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Qiagen, Hilden
Qiagen, Hilden
Qiagen, Hilden
Qiagen, Hilden
Stratagene, La Jolla,CA / USA
Qiagen, Hilden
Material
3.5
Radioaktive Substanzen
[α-32P]dCTP
Pro-mixTM L-[35S] in vivo cell labelling mix
3.6
25
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Antikörper, Streptavidin und acidophiler Farbstoff
α-huASB-Antikörper, monoklonal (ASB F58.3)
wurde freundlicherweise von D. Brooks und J.J. Hopwood, Adelaide / Australien zur
Verfügung gestellt
α-huASB-Antikörper, monoklonal (ASB F58.3), biotinyliert (s.o.); in unserer Arbeitsgruppe biotinyliert.
α-huASB-Antiserum, affinitätsgereinigt aus Kaninchen
Institut für Physiologische Chemie der Universität Münster nach Steckel (Steckel et al., 1983),
wurde freundlicherweise von K.v. Figura, Göttingen, zur Verfügung gestellt.
α-Kaninchen IgG, Meerrettich-Peroxidase (HRP)-gekoppelt aus Ziege
Chemicon International , Hofheim
α-Kaninchen IgG, CyTM3-gekoppelt aus Ziege
Dianova, Hamburg
Streptavidin, mit Meerrettich-Peroxidase (HRP)-gekoppelt
Southern Biotechnology Associates, USA
Streptavidin, mit AlexaTM488-gekoppelt
Molecular Probes, Eugene, OR / USA
LysoTrackerTM Red DND-99
Molecular Probes, Eugene, OR / USA
3.7
Chemikalien
Alle verwendeten Chemikalien besaßen den Reinheitsgrad pro analysii und wurden von den Firmen
Boehringer (Mannheim), Gibco Invitrogen (Karlsruhe), Merck (Darmstadt), Serva (Heidelberg),
Pharmacia (Freiburg), BioRad (München) und Sigma (München) bezogen. Die Herkunft spezieller
Chemikalien wird in den Methoden ausgewiesen.
3.8
Medienzusätze und gepufferte Salzlösungen
Bacto-Hefe-Extract
Bacto-Trypton
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)
Fötales Kälberserum (FCS)
HEPES
1M, steril
L-Glutamin
200mM, steril
Natrium-Pyruvat
100mM, steril
NZamin (Casein Hydrolysat)
PBS (Phosphate buffered saline) 1x, steril
Trypsin / EDTA
0,5g/Liter
Difco, Detroit / USA
Difco, Detroit / USA
Gibco Invitrogen, Karlsruhe
PAN Biotech, Aidenbach
Gibco Invitrogen, Karlsruhe
Gibco Invitrogen, Karlsruhe
Gibco Invitrogen, Karlsruhe
Gibco Invitrogen, Karlsruhe
Gibco Invitrogen, Karlsruhe
Gibco Invitrogen, Karlsruhe
Material
3.9
26
Häufig benutzte Lösungen
6x Auftragspuffer für DNA-Gelelektrophorese:
0,25% Bromphenolblau; 0,25% Xylencyanol; 30-40% Ficoll Typ 400;
10mM Tris pH 7,5; 10mM EDTA; 0,1% SDS
Ficoll in Wasser bei 37°C lösen, dann alle restlichen Substanzen dazugeben
und mit ddH2O zum Endvolumen aufgefüllt.
3.10
3.11
0,5M EDTA
181,1g Dinatriumethylendiamintetraacetat x 2H2O in 800ml ddH2O gelöst;
pH 8,0 mit 20g NaOH eingestellt; auf 1 Liter aufgefüllt
10% SDS:
10g Natriumdodecylsulfat in 100ml ddH2O bei 65°C gelöst
20x SSC
175,3g NaCl; 88,2g Na-Citrat in 1 Liter ddH2O; pH 7,0
50x TAE:
2M Tris-Base; 100mM EDTA mit Essigsäure auf pH 8,0 eingestellt
1x TBS:
10mM Tris/HCl, pH 7,4; 0,9% NaCl
TE:
10mM Tris/HCl pH 7,6; 10mM EDTA
1M Tris/HCl
121,1g Tris in 1 Liter ddH2O; gewünschter pH zwischen 7,2 und 9,0 mit
konzentrierter HCl eingestellt
Medien zur Anzucht von Bakterien
LB
10g Bacto-Trypton; 5g Bacto-Hefe-Extract; 5g NaCl. Die Substanzen wurden
in 800ml ddH2O gelöst, der pH auf 7,5 eingestellt, mit ddH2O auf 1000ml
aufgefüllt und autoklaviert. Das LB-Medium wurde bei 4°C gelagert. Zur
Herstellung der LB-Agarplatten wurde dem LB-Medium vor dem
Autoklavieren 15g Agar pro Liter zugesetzt. Die über 60°C heiße Agarlösung
wurde in Petrischalen gegossen und die Agarplatten nach dem Erstarren bei
4°C gelagert.
NZY+Broth
10g NZamin (Casein Hydrolysat); 5g Bacto-Hefe-Extrakt; 5g NaCl; Die
Substanzen wurden in 800ml ddH2O gelöst, der pH mit NaOH auf 7,5
eingestellt und autoklaviert. Nach dem Autoklavieren wurden 12,5ml
1M MgCl2, 12,5ml 1M MgSO4 und 10ml sterilfiltrierte 2M Glukoselösung
zugegeben, das Volumen auf 1000ml mit ddH2O aufgefüllt und steril filtriert.
Medien zur Kultivierung von BHK21-Zellen
Standardmedium:
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; Nr.41966029), Glukosegehalt 4500 mg/Liter, 5%FCS,
1% L-Glutamin, 1% Pen/Strep
Für die Kultivierung von mit huASB transfizierten BHK21-Zellen:
Standardmedium mit 5µg/ml Puromycin (zur Selektion)
Für die Kultivierung von huASB-produzierenden Zellen (BS):
Standardmedium mit 35µg/ml Puromycin; 500µg/ml G418 (zur Selektion)
Zur Aufreinigung der huASB aus den stabil transfizierten BHK21-Zellen:
DMEM Nut-Mix-F12 (Nr. 21331-020) mit FCS-Konzentrationen von 2,5% und 1%; DMEM/F12Medium (Nr. 21041-025) ohne Phenolrot und ohne FCS.
Für metabolische Markierungsexperimente:
DMEM-Medium (Nr. 21013-024), Glukosegehalt 4500mg/Liter; ohne Met/Cys; 1% Pen/Strep;
1% Glutamin; 1% Na-Pyruvat
Material
3.12
27
Vektoren
puC18
ptC
pBHE
pcASBX
pCMVβ
pSV2pac
pBEH CA7
pBEAX
3.13
Stratagene, La Jolla,CA / USA
Sly, W.; St.Louis, MO / USA (s. Anhang)
Artelt, P. (Artelt et al., 1988)
Evers, M.; Göttingen (s. Anhang)
BD Biosciences Clontech, Heidelberg
Vara, J.A.(Vara et al., 1986)
Peters, C. (Peters et al., 1990)
Martinez, E. ; Freiburg (Abb. 11)
Bakterien
E. coli DH5α
supE44 ∆lacU169(Φ80lacZ∆M15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-relA1
E. coli XL1-Blue
recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F’ proAB lacqZ∆M15 Tn10 (Tetr)]
3.14
Zellen
BHK21: Baby Hamster Nieren Zellen; ATCC: CCL 10; USA
BS-Zellen: BHK21-Zellen, huASB und MPR 46 stabil exprimierend (Evers, 1996)
3.15
3.16
Mauslinien
ASB-/-
ASB-defiziente Mauslinie auf dem genetischen Hintergrund von 129SvS2;
„Knock out“-Mausmodell für MPS VI (Evers et al., 1996); eigene Zucht.
huASBC91STg
Transgene Mauslinie, die eine inaktive Mutante der huASB auf dem
genetischen Hintergrund von FVB/Nico exprimiert; in Zusammenarbeit mit
Eurogentec, Belgien generiert; eigene Zucht.
ASB+/-/huASBC91STg
Kreuzung aus den oben genannten Mauslinien; eigene Zucht.
EDV
Hardware:
PC; Macintosh
Software:
Word, Excel, Powerpoint 2000 (Microsoft); Origin (Microcal); Protean,
Lasergene (DNA Star); Photoshop (Adobe); Image MasterTM 1D; RasMol;
GCK
(Texico);
PHDsec
(Embl,
Predict
Protein
Server;
www.embl.de/predictprotein)
Methoden
28
4.
Methoden
4.1
Molekularbiologische Methoden
4.1.1
Isolierung von DNA
4.1.1.1
Isolierung von Plasmid-DNA (Mini-Präparation)
Soweit möglich sind die Pufferzusammensetzungen nach Angaben des Herstellers aufgeführt.
P1-Puffer:
50mM Tris, pH 8,0
10mM EDTA
100µg/ml RNase A
P2-Puffer:
0,2M NaOH
1% SDS
N3-Puffer:
PE-Puffer:
EB-Puffer:
3M KaAc, pH 5,5
80% Ethanol
10mM Tris, pH 8,5
Die Plasmid-DNA wurde durch die modifizierte alkalische Lyse-Methode von
Birnboim & Doyle (Birnboim and Doly, 1979) mit dem Plasmid Mini Kit (Qiagen)
isoliert.
Drei bis fünf ml LB/Amp-Medium (150µg/ml Ampicillin) wurden mit einer einzelnen
Bakterienkolonie angeimpft und über Nacht bei 37°C geschüttelt. Die Hälfte der Kultur
wurde am nächsten Tag mit 3.000xg zentrifugiert und das Pellet in 250µl P1-Puffer
resuspendiert. Die Lyse der Bakterien erfolgte mit 250µl P2-Puffer und die
anschließende Renaturierung der Plasmid-DNA mit 350µl N3-Puffer.
Nach
zehnminütiger Zentrifugation mit 11.000xg wurde der Überstand vorsichtig
abgenommen und auf eine Silikatgel-Membran (Qiagen-Säule) gegeben. Während einer
einminütigen Zentrifugation wurde die DNA an die Säule gebunden. Anschließend
wurde mit 750µl Puffer PE gewaschen und die Plasmid-DNA mit 50µl EB-Puffer
eluiert. Es folgte eine DNA-Konzentrationsbestimmung (s. 4.1.3).
Methoden
4.1.1.2
29
Isolierung von Plasmid-DNA mit hoher Kopienzahl (Midi-Präparation)
P1-Puffer :
50mM Tris, pH 8,0
10mM EDTA
100µg/ml RNase A
P2-Puffer:
0,2M NaOH
1% SDS
P3-Puffer:
QBT-Puffer:
3M KaAc, pH 5,5-Puffer
750mM
50mM
15%
0,15%
NaCl
MOPS, pH 7,0
Ethanol
Triton X-100
QC-Puffer:
1M NaCl
50mM MOPS, pH 7,0
15% Ethanol
QF-Puffer:
1,25M NaCl
50mM Tris, pH 8,5
15% Ethanol
Die Plasmid-DNA wurde durch die modifizierte alkalische Lyse-Methode von
Birnboim & Doyle (Birnboim and Doly, 1979) mit dem Plasmid Midi Kit (Qiagen)
isoliert.
Eine einzelne Bakterienkolonie von einer LB/Amp-Agarplatte wurde in 3-5ml LBMedium mit 150µg/ml Ampicillin angeimpft und ca. 8h bei 37°C geschüttelt. Aus
dieser Vorkultur wurden 100µl in 100ml LB/Amp-Medium gegeben und über Nacht bei
37°C geschüttelt. Am nächsten Tag wurde die Bakterienkultur mit 3.000xg 15min
zentrifugiert. Das Pellet wurde in 4ml P1-Puffer resuspendiert. Anschließend erfolgte
die Lyse der Bakterien durch Hinzufügen von 4ml P2-Puffer und 15min Inkubation bei
RT. Nach Zugabe von 4ml kaltem P3-Puffer und Inkubation für 15min auf Eis wurde
die denaturierte Plasmid-DNA durch Neutralisieren renaturiert. Die bakterielle
genomische DNA und die Proteine befanden sich nach einstündiger Zentrifugation mit
3.000xg in SDS-Komplexen im Pellet. Der Überstand mit der gelösten Plasmid-DNA
wurde vorsichtig abgenommen und über Zellstoff auf die Anionenaustauscher-Säule
gegeben, die zuvor mit 4ml QBT-Puffer äquilibriert worden war. Anschließend wurde
die Säule zweimal mit je 10ml QC-Puffer gewaschen und schließlich die Plasmid-DNA
mit 5ml QF-Puffer eluiert. Die DNA wurde durch Zugabe von 0,7fachem Volumen
Isopropanol bei RT gefällt und durch Zentrifugation mit 3.000xg für 1h pelletiert. Das
Pellet wurde mit 2ml 70% Ethanol gewaschen und nach 30minütiger Zentrifugation mit
3.000xg für ca. 15min bei 37°C getrocknet. Das DNA-Pellet wurde in 100µl 10mM Tris
pH 8,5 gelöst.
Methoden
4.1.1.3
30
Isolierung von Plasmid-DNA mit geringer Kopienzahl (Midi-Präparation)
Die Plasmide pBEAX wurden nach dem „very low-copy“- Protokoll (Qiagen) isoliert.
Dieses Protokoll entspricht dem beschriebenen Protokoll der Midi-Präparation von
Plasmid-DNA mit hoher Kopienzahl (s. 4.1.1.2). Im folgenden sollen nur die
Veränderungen genannt werden:
Das Kulturvolumen betrug 500ml. Die Puffervolumina wurden daher auf je 20ml für
Puffer P1, P2 und P3 erhöht. Nach Ausfällen der SDS-Komplexe wurde der Überstand
mit 0,7fachem Volumen Isopropanol gefällt und das DNA-Pellet in 500µl TE –Puffer
pH 8,0 gelöst. Nach Äquilibrieren der Säule wurden die 500µl plus 4,5ml QBT-Puffer
auf die Säule gegeben und weiter wie in 4.1.1.2 verfahren.
4.1.1.4 Isolierung von genomischer DNA aus Mausschwänzen
NET:
100mM
10mM
25mM
NaCl
Tris pH 8,0
EDTA
Es wurde eine Mausschwanzbiopsie durchgeführt und 0,5cm Mausschwanz wurden ca.
5h in 500µl NET-Puffer und 30µl Proteinase K (10mg/ml) bei 56°C im Schüttler
verdaut. Fellreste wurden mit 11.000xg abzentrifugiert und der Überstand mit 500µl
Isopropanol gefällt. Dabei fiel die genomische DNA als „Knäuel“ aus, das mit Hilfe
einer am Ende verschmolzenen Pasteurpipette geangelt werden konnte. Die DNA wurde
anschließend in 500µl 70% Ethanol gewaschen und bei RT an der Luft getrocknet.
Anschließend wurde die DNA in 100µl 10mM Tris pH 8,5 1-2h bei 37°C gelöst. Die
Lagerung der gelösten genomischen DNA erfolgte bei 4°C.
4.1.1.5
Isolierung von genomischer DNA aus BHK21-Zellen
Soweit möglich sind die Pufferzusammensetzungen nach Angaben des Herstellers aufgeführt.
AL-Puffer:
enthält chaotropes Salz
AW 1- und
AW 2-Puffer:
Waschlösungen mit Salz und ansteigender Ethanolkonzentration
AE-Puffer:
10mM Tris, pH 9,0
0,5mM EDTA
Methoden
31
Genomische DNA wurde mit dem „DNAeasy Tissue Kit“ (Qiagen) aus BHK21-Zellen
isoliert.
Dazu wurden BHK21-Zellen trypsiniert, die Zellzahl mit der Neubauer Zählkammer
bestimmt und 3*106 Zellen durch fünfminütiges Zentrifugieren mit 340xg pelletiert. Das
Zell-Pellet wurde einmal mit 3ml PBS gewaschen, zentrifugiert und bei –20°C
eingefroren. Nach Auftauen wurde das Pellet in 200µl PBS resuspendiert. Danach
wurden die Zellen durch Zugabe von 20µl Proteinase K und 200µl Puffer AL gemischt
und durch Inkubation bei 70°C für 10min lysiert. Nach Zugabe von 200µl 100%
Ethanol wurde der Ansatz gemischt und das Zell-Lysat auf eine Silikatgel–Membran
(Säule) geladen und 1min mit 11.000xg zentrifugiert. Die DNA bindet an die Membran.
Salze und Proteine wurden durch Zugabe von 500µl Puffer AW1, Zentrifugation,
Zugabe von 500µl Puffer AW2 und erneuter Zentrifugation ausgewaschen. Die DNA
wurde mit 200µl Puffer AE eluiert.
4.1.2
Isolierung von Gesamt-RNA
Soweit möglich sind die Pufferzusammensetzungen nach Angaben des Herstellers aufgeführt.
RLT-Puffer:
enthält Guanidiniumisothiocyanat
RW1- und RPE-Puffer:
Waschpuffer mit Salz und Ethanol
RDD:
keine Angaben des Herstellers
Gesamt-RNA wurde mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) isoliert. Benutzt wurde das
Protokoll zur Isolierung von Gesamt-RNA aus tierischen Zellen.
BHK21-Zellen wurden trypsiniert und in der Neubauer-Zählkammer gezählt. 3x 106
Zellen wurden pelletiert, das Pellet einmal mit PBS gewaschen und dann bei –20°C
eingefroren oder direkt weiterverarbeitet. Das Zell-Pellet wurde in 350µl RLT-Puffer
aufgenommen und fünfmal mit einer Spritze (0,9mm Durchmesser) aufgeschlossen. Die
Lösung wurde nach Zugabe von 350µl 70% Ethanol auf die Silikat-Säule geladen. Die
Säule wurde mit 350µl RW1 Puffer gewaschen und 15sek mit 11.000xg zentrifugiert.
Zur Degradation kontaminierender genomischer DNA wurden 10µl DNase in 70µl
Puffer RDD direkt auf die Säule pipettiert und 15min bei RT inkubiert. Nach drei
Waschschritten (einmal mit 350µl RW1-Puffer und zweimal mit 500µl RPE-Puffer)
wurde die RNA mit 30-50µl RNase-freiem H2O eluiert.
Methoden
4.1.3
32
Konzentrationsbestimmung von DNA und RNA
4.1.3.1 Photometrische Analyse
Die photometrische Messung von DNA und RNA erfolgte bei 260nm gegen H2O in
einer Quarzküvette. Eine optische Dichte bei 260nm von 1 (OD260=1) entspricht einer
Konzentration von 50µg/ml doppelsträngiger DNA, bzw. 40µg/ml RNA bzw. 31 µg/ml
bei Oligonukleotiden.
4.1.3.2
Ethidiumbromid-Fluoreszenzmessung im Agarose-Gel
Diese Methode empfiehlt sich zur Konzentrationsbestimmung von kleinen DNAMengen. In einem 1%igen Agarose-Gel (0,5 µg/ml Ethidiumbromid) wurde ein Aliquot
der zu quantifizierenden DNA-Probe und in einer benachbarten Spur 400ng einer
λ-Phagen-DNA, die mit der Restriktionsendonuklease HindIII verdaut worden war,
aufgetrennt. Die Fluoreszenzintensitäten der DNA-Probe und des Standards (die 2,3kb
Bande enthält 19ng) wurden auf einem UV-Transilluminator verglichen und die DNAKonzentration der Probe abgeschätzt.
4.1.4
Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen (Lehrach, 1982)
Die Aktivität von Restriktionsendonukleasen wird in Units angegeben. Eine Unit (1U)
entspricht der Menge an Restriktionsenzym, die benötigt wird, um 1µg Lambda-DNA
in 1h vollständig zu schneiden. Um sicherzustellen, dass die Spaltung quantitativ
abläuft, wurde die Enzymmenge im Überschuss eingesetzt. Die Spaltung genomischer
DNA erfolgte für ca. 16h.
Für eine analytische Restriktionsanalyse wurde folgender Reaktionsansatz verwendet:
ca. 1µg DNA
2µl 10x Puffer
5-10U Restriktionsendonuklease
mit ddH2O auf 20µl aufgefüllt
Der Ansatz wurde 1h bei 37°C inkubiert und anschließend auf einem Agarose-Gel
analysiert.
Methoden
33
Für eine präparative Restriktionsanalyse wurden entsprechend größere Mengen
eingesetzt:
ca. 5µg DNA
6µl Puffer
20-30U Restriktionsendonuklease
mit ddH2O auf 60µ aufgefüllt
Der Ansatz wurde ca. 3h bei 37°C inkubiert.
Die Restriktionsendonukleasen und die zugehörigen Puffer wurden von der Firma New
England Biolabs bezogen.
4.1.5
Reinigung von DNA-Fragmenten über ein Agarose-Gel
QG-Puffer:
Ermöglicht durch hohe Salzkonzentration das Binden von DNA an die SilikatSäule. Die DNA verliert die Hydrathülle und fällt aus.
PE-Puffer:
Waschpuffer mit Salz und Ethanol
EB-Puffer :
10mM Tris, pH 8,5
Das auf dem Agarose-Gel aufgetrennte DNA-Fragment (s. 4.1.11.1) wurde unter
langwelligem UV-Licht (Handlampe) aus dem Gel ausgeschnitten, gewogen und mit
dem "Gel-Extraction Kit" (Qiagen) gereinigt.
Zu einem Volumen Gel wurden drei Volumina QG-Puffer gegeben und für 10min bei
50°C inkubiert. Während der Inkubation wurde das Gemisch mehrfach gemixt, um die
Auflösung des Gels zu unterstützen. Nachdem das Gel vollständig gelöst war, wurde ein
Gelvolumen Isopropanol hinzugefügt und der Ansatz auf eine Silikat-Säule geladen.
Die Säule wurde 1min mit 10.000xg zentrifugiert, mit 750µl PE-Puffer gewaschen und
wieder 1min zentrifugiert. Nach erneuter Zentrifugation sollte kein PE-Pufferrest mehr
vorhanden sein. Die DNA konnte dann mit 30-50µl EB-Puffer nach einminütiger
Inkubation bei RT eluiert werden.
Methoden
4.1.6
34
Behandlung von DNA mit alkalischer Phosphatase
10x CIAP-Puffer:
0,1M
0,1M
Tris pH 7,5
MgCl2
Nach dem Aufspalten von Plasmid-DNA mit nur einer Restriktionsendonuklease
(s. 4.1.4), folgte eine Dephosphorylierung der 5’-OH-Enden, um eine Religation des
Vektors zu verhindern. Der Phosphatester der 5’-Enden wurde enzymatisch mit der
alkalischen Phosphatase entfernt.
Reaktionsansatz:
2µg DNA (nach Restriktionsverdauung)
5µl 10x CIAP-Puffer
1µl CIAP (Calf intestine alkaline phosphatase, 1U/µl)
mit ddH2O auf 50µl aufgefüllt
Der Ansatz wurde 30min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde das DNA-Fragment
über eine Säule gereinigt (s. 4.1.7).
4.1.7
Reinigen von DNA-Fragmenten nach enzymatischer Behandlung oder nach
PCR
PB-Puffer:
ermöglicht durch hohe Salzkonzentration das Binden von DNA an die SilikatSäule
PE-Puffer:
Waschlösung, enthält Ethanol
EB-Puffer:
10mM Tris, pH 8,5
Das Reinigen von DNA-Fragmenten nach enzymatischer Behandlung (z.B. mit
alkalischer Phosphatase) oder das Aufreinigen von PCR-Fragmenten erfolgte mit dem
"PCR-Purifikation Kit" (Qiagen).
Zu einem Volumen zu reinigendem Reaktionsansatz wurden fünf Volumina PB-Puffer
zugegeben und auf die Silikat-Säule geladen. Die DNA bindet an die Säule. Nach
Zentrifugation mit 11.000xg für 30-60sek wird die Säule mit 750µl PE-Puffer
gewaschen und wieder mit 11.000xg zentrifugiert. Restliches Ethanol wird durch
nochmalige Zentrifugation entfernt. Die DNA wird mit 50µl EB-Puffer durch
Zentrifugation eluiert.
Methoden
4.1.8
35
Ligation von DNA-Fragmenten
10x Ligase-Puffer:
0,25M
50mM
50mM
5mM
Tris pH 7,6
DTT
MgCl2
ATP
DNA-Fragmente wurden mit der DNA-Ligase aus dem T4-Phagen verknüpft. Bei
bimolekularen Ligationsreaktionen wurde ein molekulares Verhältnis von 4:1 von
Fragment zu Vektor-DNA gewählt. Es wurden ca. 20ng Vektor-DNA eingesetzt. Zu der
DNA wurde 1µl 10x Ligase-Puffer und 1µl T4-DNA-Ligase (1U/µl) zugegeben und mit
ddH2O auf 10µl aufgefüllt. Der Ligationsanatz wurde bei 14°C für 16h inkubiert.
4.1.9
Transformation von Plasmid-DNA in E. coli Bakterien
4% X-Gal
0,4g 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galaktopyranosid in Dimethylformamid
0,1M IPTG
240mg Isopropyl-1-Thio-β-D-Galaktopyranosid in ddH2O
Je Transformationsansatz wurden 50µl kompetente DH5α (GIBCO) bei RT aufgetaut
und sofort auf Eis gestellt. Es wurde jeweils ein halber Ligationsansatz (5µl) zugegeben
(s. 4.1.8). Nach 30min Inkubation auf Eis, erfolgte ein Hitzeschock bei 42°C für 90sek
und eine fünfminütige Inkubation auf Eis. Nach Zugabe von je 500µl vorgewärmtem
LB-Medium ohne Ampicillin und Inkubation für 1h bei 37°C im Schüttelinkubator
wurden je 50% des Ansatzes auf LB/Amp-Platten (150µg/ml Ampicillin) plattiert und
anschließend für 16h bis 20h bei 37°C inkubiert. Als Transformationseffizienzkontrolle
wurden 100pg puc18 (Kontrollplasmid mit Antibiotikaresistenz) transformiert.
Bei der Verwendung geeigneter Kombinationen von Plasmiden (β-Galaktosidaseaktivität) und Wirtsstämmen (z.B. XL1-Blue) ist die Identifikation rekombinanter
Plasmide durch
Blau-Weiß-Selektion möglich.
In
diesem
Fall
wurden die
vorgewärmten LB-Agarplatten etwa 30min vor dem Ausstreichen der Bakterien mit
10µl 0,1M IPTG und 25µl 4% X-Gal behandelt. Bakterienkolonien, die Plasmide mit
inserierten DNA-Fragmenten aufgenommen haben, sind aufgrund der β-Galaktosidaseaktivität weiß. Solche Bakterienkolonien, die kein Plasmid mit inseriertem DNAFragment aufgenommen haben sind blau.
Methoden
36
4.1.10 Einfrieren von Bakterien
900µl einer 100-500 ml Bakterienkultur wurden mit 100µl DMSO gemischt und zur
Lagerung bei -80 °C eingefroren.
4.1.11 Elektrophoresetechniken zur Auftrennung von DNA- und RNA
4.1.11.1 Agarose-Gelelektrophorese
Zur Auftrennung von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Größe wurden AgaroseGelelektrophoresen verwendet. Die für die Gele benutzte Agarose-Konzentration richtet
sich nach der Größe der zu trennenden DNA-Fragmente:
Agarose-Konzentration (%)
0,6%
0,9%
1,2%
1,5%
2,0%
Trennbereich (kb)
20-1
7-0,5
6-0,4
4-0,2
3-0,1
Die erforderliche Menge Agarose wurde in 150-400ml 1x TAE aufgekocht und nach
dem Abkühlen mit Ethidiumbromid versetzt (Endkonzentration 0,5µg/ml). Die Agarose
wurde in einen Gelträger gegossen und auf RT abgekühlt. Die Proben wurden mit
6x Auftragspuffer versetzt und in die Geltaschen geladen. Die Elektrophorese wurde bei
einer Feldstärke von 5-7 Volt/cm durchgeführt. Die DNA-Fragmente wurden unter
UV-Licht durch das interkalierte Ethidiumbromid in dem Agarose-Gel sichtbar. Über
ein Videosystem wurde ein Bild der in dem Gel fluoreszierenden DNA-Fragmente
erstellt.
4.1.11.2 Agarose-Formaldehyd-Gelelektrophoresen zur Trennung von RNA
Um eine Kontamination mit RNase zu verhindern, wurden Chemikalien verwendet, die
nur für RNA-Arbeiten bereitstehen und ddH2O mit Diethylpyrocarbonat (DEPC)
vorbehandelt.
10x Laufpuffer:
200mM
50mM
10mM
Mops
NaAc
EDTA
pH 7,0 mit 2N NaOH eingestellt
Methoden
RNA-Auftragspuffer:
37
4 Teile
2 Teile
4 Teile
2 Teile
1 Teil
Formamid
Formaldehyd (37%)
DEPC-ddH2O
10x Ladepuffer
Bromphenolblau (H2O gesättigte Lösung)
RNA-Elektrophoresen wurden in einer mit NaOH vorbehandelten, RNase-freien
Gelkammer durchgeführt. 1% Agarose wurde in 1x Laufpuffer aufgekocht, auf 55°C
abgekühlt, mit Ethidiumbromid (Endkonzentration 0,5µg/ml) versetzt und in einen
RNase-freien Gelträger gegossen. Etwa 2-5µg RNA wurde mit 5µl 4M LiCl in 50µl
DEPC-H2O für 10min bei –80°C präzipitiert, 10min bei 4°C und 11.000xg zentrifugiert,
15min in der Vakuumzentrifuge getrocknet und das Pellet in 25-30µl Auftragspuffer
aufgenommen. Vor dem Auftragen wurden die Proben zuerst 5min auf 65°C erhitzt und
dann auf 4°C abgekühlt. Die Elektrophorese erfolgte bei einer Feldstärke von
5-7Volt/cm.
4.1.12 DNA-Amplifikation durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
PCR dNTP-Mix:
je 2,5mM
10x PCR-Puffer:
800mM
200mM
50mM
dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Tris pH 8,9
(NH4)2SO4
MgCl2
Zur in vitro-Amplifikation eines spezifischen DNA-Abschnitts wurden folgende
Reagenzien pipettiert:
10µl
2µl
25pmol
25pmol
0,3-0,5µg
0,5µl
10x PCR-Puffer
PCR dNTP Mix
Primer 1
Primer 2
genomische DNA bzw. cDNA
AmpliTaq DNA Polymerase (5U/µl)
auf 100µl mit ddH2O aufgefüllt
Die Reaktionsbedingungen wurden für die PCR-Anwendungen optimiert. Für die PCR
mit genomischer DNA bzw. cDNA und den Primern AB14c und AB25nc (s. Anhang)
wurden folgende Bedingungen gewählt:
Methoden
35 Zyklen:
letzter Zyklus:
38
5min
15sek
30sek
2min
10min
∝
95°C
96°C
58°C
72°C
72°C
4°C
Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden auf einem 2%igen Agarose-Gel
aufgetrennt.
4.1.13 Nachweis von spezifischer mRNA
Zum Nachweis von spezifischer mRNA wurde eine RT-PCR durchgeführt. Zunächst
wurde die isolierte Gesamt-mRNA (s. 4.1.2) mittels reverser Transkription in cDNA
umgeschrieben. Dazu wurde zu 1µg RNA 1µl Oligo(dT) Primer (500µg/ml) zugegeben
und auf 12µl mit H2O aufgefüllt. Das Binden der Primer erfolgte für 10min bei 70°C.
Nach dem Abkühlen auf Eis wurde 4µl 5x "First Strand" Puffer (250mM Tris pH 8,3;
375mM KCl; 15mM MgCl2 ), 2µl 0,1M DTT und 1µl 10mM dNTP zugegeben und
vorsichtig gemischt. Nach 2min auf 42°C wurde 1µl der Reversen Transkriptase
"Superscript II" hinzugefügt, gemischt und 50min bei 42°C revers transkribiert. Durch
15min bei 70°C wurde das Enzym inaktiviert; die cDNA konnte in der PCR eingesetzt
werden (4.1.12).
4.1.14 Ortspezifische Mutagenese
Die
ortspezifische
Mutagenese
der
Plasmide
zur
Herstellung
der
huASB-
Glykosylierungsmutanten und der transgenen Maus wurde mit dem „QuickChangeTM
Site-Directed-Mutagenesis-Kit“ (Stratagene) durchgeführt.
In der vorliegenden Arbeit wurden in die cDNA der huASB Punktmutationen
eingeführt, die den Austausch jeweils einer Aminosäure zur Folge hatten. Die
Mutationen wurden mit Hilfe modifizierter Primer durch die Pfu-Polymerase in ein
Plasmid (pcASBX) eingeführt, das die huASB-cDNA enthielt. Es wurden jeweils zwei
gegenläufige Primer synthetisiert, welche die Punktmutationen für den Austausch der
vier Asparagine N188, N279, N366 und N426 gegen Glutamine, bzw. bei N426
zusätzlich noch für den Austausch von Asparagin gegen Serin, enthielten.
Methoden
39
Angegeben sind die Primersequenzen jeweils in 5’→ 3’ – Richtung; die Originalsequenz der huASB-cDNA ist jeweils über das veränderte Codon geschrieben:
AB N188Qc
AAT
CATTAATTGACGCTCTGCAGGTCACACGATGTGC
AB N188Qnc
ATT
GCACATCGTGTGACCTGCAGAGCGTCAATTAATG
AB N279Qc
AAT
GGATGAAGCAGTAGGACAGGTCACTGCAGC
AB N279Qnc
ATT
GCTGCAGTGACCTGTCCTACTGCTTCATCC
AB N366Qc
AAT
CAGGGGACACACCCAGGGCACAAAGCCTC
AB N366Qnc
ATT
GAGGCTTTGTGCCCTGGGTGTGTCCCCTG
AB N426Qc
AAC
CCAGAATATTCAGCCTTTCAGACATCTGTCCATGCTGC
AB N426Qnc
GTT
GCAGCATGGACAGATGTCTGAAAGGCTGAATATTCTGG
AB N426Sc
AAC
CCAGAATATTCAGCCTTTAGCACATCTGTCCATGCTGC
AB N426Snc
GTT
GCAGCATGGACAGATGTGCTAAAGGCTGAATATTCTGG
ABC91Sc
TGC
ACGCAGCCGCTGTCGACGCCGTCGCGG
ABC91Snc
GCA
CCGCGACGGCGTCGACAGCGGCTGCGT
Mit je zwei gegenläufigen, die Mutation enthaltenden Primern, wurde die Plasmid-DNA
mit Hilfe der Pfu-Polymerase amplifiziert und so die Mutation in die neu synthetisierten
DNA-Stränge eingeführt.
Methoden
40
Reaktionsansatz:
ad 50µl
5µl 10x Reaktionspuffer
40-100ng Plasmid-DNA
400ng Primer 1 (AB...c)
400ng Primer 2 (AB...nc)
1µl dNTP Mix
ddH2O
1µl Pfu DNA Polymerase
Der Reaktionsansatz durchlief folgende Temperaturzyklen:
16 Zyklen:
1 min
30sek
1 min
12 min
95°C,
95°C (Denaturieren der DNA),
55°C (Binden der Primer),
68°C (Extension durch Pfu)
Nach dem Abkühlen auf Eis für 2min wurde die parentale, methylierte Matrizen-DNA
mit dem methylierungsspezifischen Restriktionsenzym DpnI durch einstündige
Inkubation bei 37°C verdaut. Superkompetente XL1-Blue E.coli (Stratagene) wurden
mit 1µl dieses Ansatzes transformiert. Dazu wurde ein 50µl Aliquot der Bakterien auf
Eis aufgetaut, in vorgekühlte 12ml Polypropylen-Röhrchen gefüllt und 1µl aus der DpnI
Restriktionsverdauung zugegeben und gemischt. Nach Inkubation für 30min auf Eis
wurde die DNA mittels eines Hitzeschocks von 45sek Dauer bei 42°C von den
Bakterien aufgenommen. Der Ansatz wurde auf Eis 2min abgekühlt und in auf 42°C
vorgewärmtem 0,5ml "NZY+broth"-Medium 1h bei 37°C geschüttelt (250rpm).
Schließlich wurde der gesamte Ansatz auf je zwei LB/Amp-Platten ausplattiert und bei
37°C 16-20h inkubiert. Einzelne Bakterienkolonien wurden durch Restriktionsspaltung
oder Sequenzierung analysiert. Die Effizienz der Mutagenese konnte mit einem
mitgelieferten Kontrollplasmid und Primern überprüft werden. Sie lag bei über 80%.
Zur Kontrolle der Transformationseffizienz wurde das Plasmid pUC18 parallel
transformiert und die Kolonien ausgezählt. Die Transformationseffizienz lag bei ca.
1*107 Kolonien pro µg DNA.
Methoden
41
4.1.15 Sequenzierung von Doppelstrang-DNA
Doppelstrang-DNA-Proben wurden mit Hilfe der Didesoxy-Methode von Sanger
sequenziert (Sanger et al., 1977). Es wurde der “ABI PRISMR BigDye Terminator
Cycle Sequencing Ready Reaction Kit” (Applied Biosystems) verwendet.
Die zu sequenzierende Plasmid-Doppelstrang-DNA wurde auf 100 ng/µl, die Primer auf
3.2 pmol/µl eingestellt. Die Reaktion wurde auf Eis pipettiert.
Reaktionsansatz:
5 µl dsDNA
6 µl H20
8 µl „BigDye-Mix“: ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP,dITP,
dATP, dCTP, dTTP; Tris/HCl, pH 9,0;
MgCl2;
hitzestabile
Pyrophosphatase;
AmpliTaq DNA Polymerase, FS)
1 µl Primer
Anschließend wurde die Polymerasereaktion zur Amplifikation der DNA-Fragmente
und zum Einbau der fluoreszenzmarkierten Didesoxynukleotide durchgeführt:
25 Zyklen:
30sek
15sek
4min
96°C
50°C
60°C
∞
4°C
Der Ansatz wurde in ein Eppendorfgefäß überführt, die DNA mit 50 µl 100% EtOH und
2µl 3M NaAc pH 4,6 gefällt. Nach Zentrifugation mit 11.000xg für 30min bei RT
wurde der Überstand dekantiert und das Salz mit 250 µl 70% Ethanol aus dem Pellet
ausgewaschen. Der Ansatz wurde 2min bei RT zentrifugiert, der Überstand dekantiert
und das Pellet 5-10min in der Vakuumzentrifuge getrocknet. Das trockene Pellet wurde
bei –20°C eingefroren und der „core facility“ des SFB 364 (Frau Dr. Marie Follo)
übergeben. Dort wurde das DNA-Pellet in 4µl Formamid/EDTA pH 8,0 (5:1)
aufgenommen, 2min bei 90°C denaturiert, auf ein denaturierendes Polyacrylamid-Gel
geladen und mit dem ABI Prism 377 DNA Sequencer analysiert. Dabei wurden die vier
unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffgrupen, die jeweils an ein bestimmtes Nukleotid
gekoppelt sind, mit einem 40mW Argon-Laser angeregt und die Fluoreszenzsignale
durch ein Detektorsystem des DNA-Sequenziergeräts identifiziert und ausgewertet.
Methoden
42
4.1.16 Transfer von DNA auf einen Hybond-N Filter (Southern-Blot)
Denaturierungslösung:
0,5M
1,5M
NaOH
NaCl
Neutralisierungslösung:
1M
0,5M
1mM
Tris/HCl pH 7,2
NaCl
EDTA
Es wurden 5µg bis 10µg genomische DNA mit einem oder einer Kombination mehrerer
Restriktionsenzyme in einem Gesamtvolumen von 70µl bei 37°C für 16h verdaut. Nach
Zugabe von 15µl 6x Auftragspuffer wurde die gespaltene DNA auf ein 0,8%iges
Agarose-Gel geladen und für 5-6h bei 60V elektrophoretisch aufgetrennt. Mit Hilfe
eines Lineals wurden dabei die Migrationsweite der DNA-Marker bestimmt und
dokumentiert. Anschließend wurde die DNA in dem Gel in Denaturierungslösung
zweimal 15min denaturiert, danach zweimal 15min in Neutralisierungslösung
neutralisiert und vor dem DNA-Transfer noch einmal 10min mit 20x SSC (s. 3.9)
äquilibriert. Die DNA-Fragmente wurden aus dem Gel auf eine Nylonmembran
Hybond-N oder N+ (Amersham Pharmacia Biotech) transferiert. Die Abbildung zeigt
die Technik des Transfers von Nukleinsäuren aus Agarose-Gelen auf Hybond-N Filter.
Der Pfeil (Abb. 6) zeigt die Richtung des Flüssigkeitsstromes an, durch den die DNA
aus Agarose-Gelen auf einen darüberliegenden Filter übertragen wird.
Innerhalb von ca. 16h wurde die DNA durch Kapillarkräfte auf die Membran
transferiert. Nach Abschluss des DNA-Transfers wurde die DNA durch zweistündiges
Erhitzen auf 80°C auf der Membran immobilisiert. Anschließend erfolgte die
Hybridisierung der Membran mit einer radioaktiven Sonde.
Abb. 6: Transfer von Nukleinsäuren auf einen Hybond-N Filter
Methoden
43
4.1.17 DNA-Markierung mit α32P-dCTP (Feinberg and Vogelstein, 1983)
Reaktionspuffer:
dNTP
Tris pH 7,8
MgCl2
β-ME
Random Primer
Zur Markierung doppelsträngiger DNA wurde der „Megaprime-Kit“ (Amersham
Pharmacia Biotech) verwendet.
Zunächst wurden 25ng gereinigtes DNA-Fragment (Sonde) in 14µl ddH2O 5min
aufgekocht und dann 2min auf Eis abgekühlt. Anschließend wurde die DNA radioaktiv
markiert.
Reaktionsansatz:
14µl DNA-Fragment
5µl Reaktionspuffer
30µCi α32P-dCTP
1µl Klenow-Enzym (1U/µl)
Der Ansatz wurde 10min bei 37°C inkubiert. Die radioaktiv markierten DNAFragmente wurden auf einer Sephadex G50 Säule von nicht inkorporierten Nukleotiden
getrennt (s. 4.1.18) und die eingebaute Radioaktivität durch Szintillationszählung
bestimmt. Die spezifische Aktivität radioaktiv markierter Sonden lag in der Regel
zwischen 5x108 – 1x109 cpm/µg DNA.
4.1.18 DNA-Reinigung über Sephadex G-50
Sephadex G50 wurde zur Abtrennung von Salzen und radioaktiven Nukleotiden von
DNA-Fragmenten benutzt.
Zunächst wurden 5g Sephadex G50 in 50ml TE aufgeschwemmt und autoklaviert. Eine
1000µl-Pipettenspitze wurde mit einem Stopfen aus silanisierter Glaswolle am unteren
Ende verschlossen und mit Sephadex G50 gefüllt (ca. 1ml). Die Spitze wurde in ein
kleines Greiner-Röhrchen gestellt und in einem 10ml Kulturröhrchen 3min bei 1.800xg
zentrifugiert. Das Eluat wurde verworfen und die mit destilliertem H2O auf 200µl
Volumen eingestellte Probe auf das Gelbett aufgetragen. Nach Zentrifugieren mit
1.800xg für 3min wurde das Eluat in ein neues Eppendorfgefäß überführt. In 1% der
Probe wurde die eingebaute Radioaktivität durch Szintillationszählung gemessen.
Methoden
44
4.1.19 Hybridisierung von Hybond-N Filtern mit einer radioaktiven Sonde
Denhardts:
Hybridisierungsmix:
Lachsspermien-DNA:
Vor
Hybridisierung
1% Ficoll
1% Polyvinylpyrrolidon
1% BSA
72ml
36ml
1,5ml
1,5g
3ml
30ml
Formamid
20x SSC
1M Tris, pH 7,5
SDS
50x Denhardts
50% Dextransulfat
15g Dextransulfat wurden mit ddH2O auf 30ml aufgefüllt und bei
80°C gelöst; anschließend wurden die anderen angegebenen
Substanzen zugesetzt und das Volumen mit ddH2O auf 150ml
aufgefüllt.
Die Lachsspermien-DNA wurde mit einer sterilen Schere zerkleinert
und in H2O gelöst (10mg/ml). Nach 10min Ultraschallbehandlung
wurde die Lösung in der Mikrowelle aufgekocht und nochmals
ultraschallbehandelt. Die so gelöste DNA wurde in 2ml-Aliquoten bei
-20°C gelagert.
wurde
die
Membran
mit
Hybridisierungsmix
in
einer
Hybridisierungsröhre bei 42°C vorinkubiert. Lachsspermien-DNA (Endkonzentration
100µg/ml) wurde zu der eluierten radioaktiven Sonde (s. 4.1.18) zugegeben und 5min
bei 95°C denaturiert. Die radioaktive Sonde wurde anschließend zu dem
Hybridisierungsmix gegeben und die Membran über Nacht bei 42°C auf einem Rollrad
hybridisiert. Die Hybridisierungslösung wurde am nächsten Tag abgenommen und die
Membran zweimal 10min bei RT mit 2x SSC, 0,1% SDS, dann zweimal mit 0,2x SSC,
1% SDS bei 65°C für 20min gewaschen. Die Membran wurde feucht in Folie
eingepackt. Zur Autoradiografie wurde ein Röntgenfilm (Kodak Xomat-AR) auf die
Membran gelegt und für 1 Tag bis 14 Tage bei –80°C exponiert.
4.2
Zellbiologische und biochemische Methoden
4.2.1
Methoden zur Arbeit mit eukaryotischen Zellen
In der vorliegenden Arbeit wurden BHK21-Zellen (Baby Hamster Kidney-Zellen;
ATCC, USA) verwendet. Die Zellen wurden in wassergesättigter Atmosphäre unter
5%CO2 bei 37°C kultiviert. Medien und Lösungen wurden, wenn nicht anders
angegeben, auf 37°C vorgewärmt. Um Zellen zu pelletieren, wurden die Zellsuspensionen für 5min mit 340xg zentrifugiert.
Methoden
45
4.2.1.1 Trypsinieren von Zellen und Gewinnung eines Zell-Pellets
Das Medium wurde von der Gewebekulturschale abgesaugt und die Zellen einmal mit
PBS gewaschen. Die Zellen wurden ca. 5min mit 0,5ml/25cm2 Trypsin/EDTA (0,5g/l)
bei 37°C bis zur Abrundung der Zellen (mikroskopische Kontrolle) inkubiert. Die
Reaktion wurde durch Zugabe der fünffachen Menge an serumhaltigem Medium
gestoppt, die Zellen durch mehrfaches Aufsaugen mit der Pipette vereinzelt und die
Zellzahl pro ml mit der Neubauer-Zählkammer bestimmt. Die Zellen wurden in der
gewünschten Dichte ausplattiert oder zur weiteren Bearbeitung durch Zentrifugation
pelletiert, einmal mit PBS gewaschen und bei -20°C gelagert.
Nach metabolischer Markierung mit 35S Met/Cys (s. 4.2.3.2) wurden die Zellen von der
Plastikoberfläche mit einem Zellschaber abgeschabt, in 1ml PBS aufgenommen,
dreimal mit PBS gewaschen, pelletiert und bei –20°C eingefroren.
4.2.1.2 Einfrieren von Zellen
Einfriermedium:
10%
20%
DMEM
FCS
DMSO
Pelletierte Zellen (4.2.1.1) wurden in 500µl kaltem Medium mit 10% FCS und ohne
Antibiotika resuspendiert und in ein mit 500µl kaltem Einfriermedium gefülltes
Kryoröhrchen gegeben. Nach vorsichtigem Mischen wurden die Zellen langsam auf
-80°C gekühlt (Styropormantel) und am nächsten Tag zur Lagerung in flüssigen
Stickstoff transferiert.
4.2.1.3 Auftauen und Revitalisieren von Zellen
Eukaryotische Zellen wurden aus flüssigem Stickstoff in einem 37°C Wasserbad 1min
aufgetaut, bis nur noch ein kleiner Eiskern zu sehen war, und in 9ml kaltes DMEM mit
10% FCS gegeben. Nach Zentrifugation wurde das Pellet in 5ml bis 10ml Medium
resuspendiert, die Zellen in eine Kulturflasche gegeben und bei 37°C inkubiert. Am
folgenden Tag wurde das Medium gewechselt, um Reste von DMSO zu entfernen.
Methoden
4.2.1.4
46
Gewinnung von Zell-Überstand
Für ELISA (s. 4.2.3.11) und Enzymaktivitätsbestimmungen (s. 4.2.3.8) wurde nach
zwei bis drei Tagen Inkubation der mit huASB transfizierten BHK21-Zellen das
Medium abgenommen, die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und frisches Medium
zugegeben. Nach Inkubation für 4h wurde das Medium abgenommen, kontaminierende
Zellen abzentrifugiert und der Überstand bei -80°C eingefroren oder direkt
weiterverarbeitet.
Für metabolische Markierungsexperimente (4.2.3.2) wurde der Überstand nach
metabolischer Markierung und nach 0-6h "CHASE" abgenommen, zentrifugiert und bei
–20°C eingefroren. Die Gewinnung von Zell-Überstand zur Reinigung der huASB wird
in 4.2.3.13 näher beschrieben.
4.2.1.5
Stabile und transiente Transfektion von BHK21-Zellen mit DNA
(Kalziumphosphat-Kopräzipitation)
BBS-Puffer:
50mM BES
280mM NaCl
1,5mM Na2HPO4
pH 6,95 mit 5N NaOH eingestellt
Die transiente und stabile Transfektion von eukaryotischen Zellen unterscheiden sich
darin, dass bei einer stabilen Transfektion mit Hilfe eines Antibiotikums auf
Einzelklone selektioniert wird, die das transfizierte DNA-Stück in ihr Genom integriert
haben. Bei der transienten Transfektion wird ca. 48h nach Transfektion die
Genexpression episomal vorliegender transfizierter DNA analysiert. Bei der stabilen
Transfektion wird die Antibiotikaresistenz durch eine Kotransfektion mit dem
Selektionsplasmid pSV2pac, das ein Puromycin-Resistenzgen trägt, übertragen. Das
Plasmid mit dem zu exprimierenden huASB-Gen wurde in 10fachem bzw. 20fachem
molarem Überschuss zu dem Selektionsplasmid in die Zellen transfiziert, um die
Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass die resistenten Einzelklone auch das ASB-Gen
enthalten.
Zwanzig Stunden vor Transfektion wurden 3-5x105 BHK21-Zellen auf 6cm
Gewebekulturschalen in DMEM-Medium (5%FCS) ausplattiert. Dann wurde 3h vor
Methoden
47
Transfektion das Medium gewechselt. Die DNA wurde mittels eines KalziumphosphatPräzipitats in die Zellen transfiziert.
Um das Kalziumphosphat-Präzipitat herzustellen, wurden 20µg Plasmid-DNA und 2µg
Resistenzplasmid pSV2pac (bei der stabilen Transfektion) auf 438µl mit 10mM Tris
pH 7,6 aufgefüllt, 62µl 2M CaCl2 zugegeben und gemischt. Dann wurden 500µl BBSPuffer tropfenweise zugegeben und 30min bei RT inkubiert. Die Lösung wurde
anschließend unter Schwenken auf die Zellen getropft und die Präzipitate unter dem
Mikroskop beobachtet. Nach 24h wurde das Medium gewechselt. Am zweiten Tag nach
Transfektion wurde zur stabilen Transfektion Selektionsmedium mit 2µg/ml Puromycin
zugegeben. Die Zellen aus der transienten Transfektion wurden unmittelbar durch
indirekte Immunfluoreszenz (s. 4.2.2.2) analysiert. Acht bis zehn Tage nach Beginn der
Selektion waren die resistenten Klone als Zellhaufen mit dem bloßen Auge sichtbar. Die
Selektion wurde auf 5µg/ml Puromycin erhöht. 14-16 Tage nach Selektionsstart wurden
stabile Klone unter dem Mikroskop ausgewählt, gepickt, in 96-well-Platten überführt
und in 2 Tropfen Trypsin dissoziiert. Die Zellen wurden anschließend in 24-well-Platten
ausgesät. Nach dem Expandieren in Gewebekulturflaschen (T25) wurde die Hälfte der
Zellen in DMSO-haltigem Medium eingefroren (s. 4.2.1.2) und die andere Hälfte zur
Herstellung von Zell-Pellets (s. 4.2.1.1) zur Gewinnung von Protein, DNA und RNA
weiterkultiviert. Die Zellklone wurden auf ihre ASB-Aktivität untersucht und bei
positivem Ergebnis subkloniert (s. 4.2.1.6).
4.2.1.6
Subklonierung eukaryotischer Zellen
Um Mischklone zu vermeiden, wurden Zellklone durch Zellvereinzelung subkloniert.
Dazu wurden auf 96-Loch-Platten nach Zellzahl-Bestimmmung Zell-Verdünnungsreihen ausplattiert, so dass in den höchsten Verdünnungen mit großer Wahrscheinlichkeit einzelne Zellen zu finden waren. Sechs Stunden nach Ausplattieren der Zellen
wurde die
96-Loch-Platte mittels eines Durchlicht-Mikroskops durchmustert.
Vertiefungen, die eine Zelle enthielten wurden markiert. Anschließend wurden diese
Einzelzellen der markierten Vertiefungen expandiert, eingefroren und für weitere
Experimente verwendet.
Methoden
48
4.2.2
Mikroskopische Techniken
4.2.2.1
β-Galaktosidase-Färbung
Färbelösung:
Fixativ:
5mM
5mM
20mM
1mg/ml
K3Fe(CN)6
K4Fe(CN)6
MgCl2
X-Gal
mit ddH2O aufgefüllt
2% Formaldehyd
0,2% Glutardialdehyd
mit PBS aufgefüllt
Um die Transfektionseffizienz zu überprüfen, wurde ein Teil der Zellen mit dem
pCMVβ-Plasmid transfiziert, das für eine β-Galaktosidase codiert.
Etwa 48h nach Transfektion oder auch nach Selektion stabiler Klone wurde das
Medium abgenommen und die Zellen einmal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden
anschließend mit 2ml (pro 6cm Schale) Fixativ behandelt und nach zweimaligem
Waschen mit PBS wurde 3ml Färbelösung zugegeben. Die Blaufärbung trat nach
mehreren Stunden Inkubation bei 37°C auf. Blaue und weiße Zellen bzw. Zellhaufen
wurden ausgezählt und die Transfektionseffizienz bestimmt.
4.2.2.2
Indirekte Immunfluoreszenz -Färben saurer Kompartimente und Nachweis der
humanen Arylsulfatase B
Für die indirekte Immunfluoreszenz wurden 2x104 BHK21-Zellen auf Deckgläschen
(20x 20mm) ausgesät und 2 Tage in 3cm-Schalen mit je 2ml Medium kultiviert. Zur
Darstellung saurer Kompartimente wurde nach Entfernen des Mediums 1µl LysoTrackerTM Red (Molecular Probes;Wunderlich et al., 2001) in 1ml Medium ohne Serum
und ohne Antibiotika für 30min bei 37°C zu den Zellen gegeben. Die Zellen wurden
anschließend zweimal mit 2ml PBS gewaschen. (Bei der Einfachfärbung der huASB in
BHK21-Zellen wurde nicht mit Lyso Tracker Red inkubiert).
Die Fixierung der Zellen erfolgte mit 1ml auf 37°C vorgewärmtem Formaldehyd für
30min bei RT. Alle folgenden Schritte liefen bei RT ab. Das Formaldehyd wurde durch
zweimaliges Waschen mit 2ml PBS entfernt. Anschließend wurde die Zellmembran
durch Inkubation mit 2ml 50mM NH4Cl (in PBS) stabilisiert und nach Waschen mit
2ml PBS, wurden die Zellen für zweimal 5min mit 1ml 0,3% Triton X-100
Methoden
49
permeabilisiert. Nach zwei weiteren Waschschritten mit PBS wurden potentielle
unspezifische Bindungsstellen durch Inkubation für dreimal 5min mit 2ml
0,2% Gelatine in PBS blockiert. Schließlich wurden pro Deckgläschen 50µl antihuASB-Antiserum in einer Verdünnung von 1:400 bis 1:800 auf Parafilm aufgetropft
und darauf das Deckgläschen mit den Zellen nach unten in einer feuchten Kammer bei
RT inkubiert. Nach 1h wurden die Zellen für dreimal 5min mit je 2ml 0,2% Gelatine
gewaschen und anschließend der Zweitantikörper, ein α-Kaninchen IgG aus der Ziege,
zugegeben. Je nach Antikörper (mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen: Cy3, Texas
Red, FITC, bzw. Biotin markiert; Dianova) wurden Verdünnungen von 1:1000 bis
1:8000 angesetzt und wie zuvor je 50µl Antikörper auf den Parafilm pipettiert, und im
Dunkeln 1h bei RT inkubiert. Bei Verwendung eines Biotin-markierter Antikörpers,
erfolgte nach dreimaligem Waschen mit 0,2% Gelatine die Zugabe von 1:50 verdünntem Streptavidin SA-Alexa 488 (Molecular Probes) und eine Inkubation für 30 min
bei RT. Die folgenden Prozeduren erfolgten unter Lichtschutz. Die Zellen wurden
dreimal 5min mit 0,2% Gelatine und zweimal 5min mit PBS gewaschen, dreimal in
ddH2O getaucht und die Rückseite mit Papier abgetupft. Das Einbetten der Zellen
wurde durch Auftropfen von 30µl Mowiol (Bei FITC markiertem Zweitantikörper mit
Mowiol/DABCO 3:1) auf einen Objektträger und Auflegen des Deckgläschens mit den
Zellen erreicht. Nach 16h Polymerisation wurde das Deckgläschen mit Nagellack
versiegelt und konnte bis zu mehreren Monaten bei 4°C gelagert werden. Zur
Fluoreszenz-Mikroskopie der Präparate wurde ein Axiophot- bzw. Axioplan-Mikroskop
von Zeiss benutzt.
4.2.3
Biochemische Methoden
4.2.3.1 Gewinnung von Zell-Lysaten
BHK21-Zellen wurden trypsiniert, in der Neubauer-Kammer gezählt und 3x106 Zellen
wurden pelletiert und eingefroren (s. 4.2.1.1). Zur Gewinnung der Zell-Lysate wurden
die eingefrorenen Zell-Pellets bei RT aufgetaut. Die Zellen wurden mit 300µl TBS mit
0,1% TritonX-100 resuspendiert und zusätzlich mit 3x10sek Ultraschall aufgeschlossen.
Nach weiteren 10min auf Eis wurden die Proben mit 11.000xg 6min zentrifugiert. Der
Überstand wurde entweder direkt weiterverarbeitet oder bei –20°C eingefroren. Das
Pellet wurde verworfen.
Methoden
4.2.3.2
50
Metabolische Markierung mit 35S-Met/Cys („Pulse-Chase“)
Met/Cys-defizientes Medium:
1%
1%
1%
DMEM „high glucose“ ohne Met/Cys
Pen/Strep
Glutamin
Na-Pyruvat
Auf 3cm Gewebekulturschalen wurden je 2-5x104 stabil transfizierte BHK21-Zellen
ausgesät und bis zur Konfluenz (ca. 2 Tage) bei 37°C kultiviert. Nach dreimaligem
Waschen mit 2ml PBS wurden die Zellen 1h mit Met/Cys-defizientem Medium bei
37°C vorinkubiert. Anschließend wurden die Zellen durch Zugabe von 60-80µCi
35
S Met/Cys pro 3cm Schale während 2h bei 37°C metabolisch markiert („PULSE“).
Nach zweimaligem Waschen mit PBS, wurde DMEM mit Met/Cys zugegeben und nach
den „CHASE“- Zeiten von 0h bis 6h der Überstand abgenommen (s. 4.2.1.4) und ein
Zell-Pellet (s. 4.2.1.1) gewonnen. Aus den Überständen und Zellen erfolgte eine
Immunpräzipitation der huASB (s. 4.2.3.4).
Zur Bestimmung der inkorporierten Radioaktivität durch Szintillationszählung, wurden
dem Medium zu Beginn und am Ende der metabolischen Markierung vier Aliqoute zu
10µl entnommen.
4.2.3.3
Waschen von Pansorbin
NET-Puffer:
50mM Tris/HCl pH 7,4
0,15M NaCl
5mM EDTA
Pansorbin (Calbiochem, USA) ist eine 10% Suspension aus Staphylococcus aureus
Zellmembranen, die aufgrund von membranständigem Protein-A, IgG mit einer
Kapazität von 2mg/ml binden. Nach Bindung kann dieser Antikörper-PansorbinKomplex abzentrifugiert werden. Aufgrund dieser Eigenschaft wird Pansorbin als
Fällungshilfe für Immunkomplexe benutzt.
Um eine unspezifische Adsorption von Nicht-Immunkomplexen zu unterdrücken,
wurde das Pansorbin folgendermaßen vorbehandelt: Die Pansorbin-Suspension wurde
für 5min bei 20.000xg zentrifugiert und das Pellet in NET-Puffer aufgenommen. Dann
wurde die Suspension für 30min bei 85°C erhitzt und 5min mit 20.000xg zentrifugiert.
Anschließend wurde es in NET-Puffer mit 1% SDS 5min bei 95°C erhitzt und wie oben
Methoden
51
zentrifugiert. Danach folgte dreimaliges Waschen in NET-Puffer mit 0,5% BSA und
0,5% Triton X-100 und zweimaliges Waschen mit PBS. Das vorgewaschene Pansorbin
wurde bei 4°C als 10%ige Suspension in PBS mit 1% BSA und 0,04% NaN3
aufbewahrt. Vor Verwendung wurde die Suspension zentrifugiert und nur das Pellet zur
Präzipitation von Immunkomplexen eingesetzt.
4.2.3.4
Immunpräzipitation der humanen Arylsulfatase B
Es
wurde
eine
indirekte
Immunpräzipitation
nach
dem
modifizierten
Immunpräzipitations-Protokoll von Lemansky et al. (Lemansky et al., 1985)
durchgeführt.
Homogenisationspuffer: 50mM
1mM
1mM
5mM
Tris pH 7,4
PMSF
EDTA
Jodacetamid
mit ddH20 aufgefüllt
Neufeld-Puffer:
Tris pH 8,5
NaCl
SDS
NP-40
mit ddH20 aufgefüllt
10mM
0,6M
0,1%
0,05%
Präzipitations-Immunomix:
0,2%
10%
1mM
1mM
1mM
Wasch-Immunomix:
1%
0,5%
20ml
2M-KCl-Immunomix:
SDS
BSA
PMSF
EDTA
Jodacetamid
mit ddH20 aufgefüllt
Triton X-100
Natriumdesoxycholat
10x PBS
mit ddH20 auf 200ml aufgefüllt
Wasch-Immunomix in 2M KCl
reduzierender Solubilizer:
5g
2g
1ml
300mg
0,5g
nicht red. Solubilizer:
Glycerol
SDS
β-Mercaptoethanol
Tris-Base
Coomassie Blue G-250
auf 50ml mit ddH2O aufgefüllt
wie red. Solubilizer, ohne β-Mercaptoethanol
Methoden
52
Der eingefrorene Überstand (2ml) aus dem "Pulse-Chase" Experiment (4.2.3.2) wurde
mit 2ml 20% Trichloressigsäure (TCA; 10% Endkonzentration) für mindestens 30min
auf Eis gefällt und anschließend in Eppendorfgefäßen mit 20.000xg zentrifugiert. Das
Protein-Pellet wurde in ca. 0,3ml 0,2M NaOH bei 37°C gelöst. Der Ansatz wurde dann
gegen 1 Liter TBS ca. 16h bei 4°C dialysiert.
Das eingefrorene Zell-Pellet wurde in 500µl Homogenisationspuffer suspendiert und
3x10sek mit Ultraschall behandelt. 10µl wurden abgenommen und mit 1Vol 20% TCA
und 1µg BSA für mindestens 30min auf Eis gefällt. Das Pellet wurde in 1Vol
0,1N NaOH gelöst und mit 2 Volumen 0,4M Hepes-Puffer neutralisiert. Die in
zellulären Proteinen inkorporierte Radioaktivität wurde mittels Szintillationszählung
ermittelt. Aus dem restlichen Zell-Lysat (490µl) wurde nach Inkubation für 10min auf
Eis die genomische DNA mit 5µl 3% Protaminsulfat (in H2O) für 10min auf Eis gefällt
und 60min mit 11.000xg im Eppendorfgefäß abzentrifugiert.
Im folgenden wurden Überstand und Zell-Lysat auf die gleiche Art weiterbehandelt. Es
wurde 400µl Präzipitationsimmunomix und 30µl Pansorbin auf das Zell-Lysat bzw.
50µl Pansorbin auf den dialysierten Überstand gegeben und 1h bei 4°C auf dem Rollrad
inkubiert, um unspezifische Bindungen an Pansorbin abzufangen. Nach einminütiger
Zentrifugation mit 20.000xg, wurde nochmals je 30µl Pansorbin-Pellet zugegeben und
eine weitere Stunde inkubiert. Nach Zentrifugation wurde die huASB mit 2µl antihuASB-Antiserum über Nacht auf dem Rollrad bei 4°C aus dem Überstand präzipitiert.
Am nächsten Tag wurden mit 40µl (20µl/µl Antiserum) vorgewaschenem PansorbinPellet (4.2.3.3) die ASB Antigen-Antikörperkomplexe 1h bei 4°C auf dem Rollrad
gebunden. Der Ansatz wurde 1min mit 11.000xg zentrifugiert und das Pellet mit je 1ml
der folgenden Puffer gewaschen. Der Ansatz wurde jedes Mal 1min mit 11.000xg
zentrifugiert.
1. Neufeld-Puffer
2. Waschimmunomix
3. 2MKCl-Immunomix
4. 2xPBS
Das Pellet wurde schließlich in 70µl reduzierendem bzw. nicht-reduzierendem
Solubilizer resuspendiert, 5min bei 95°C aufgekocht, 2min mit 11.000xg zentrifugiert,
der Überstand abgenommen und bei -20°C eingefroren. 60µl wurden für eine SDSPAGE verwendet (s. 4.2.3.5). Weitere 10µl wurden zur Bestimmung der präzipitierten
Radioaktivität abgenommen.
Methoden
4.2.3.5
53
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Proteinen
Die elektrophoretische Auftrennung von Proteingemischen erfolgte mittels SDSPolyacrylamid-Gelelektrophorese nach Laemmli (Laemmli, 1970).
AB-Mix:
Acrylamid/Bisacrylamid-Mix:
40%T, 3%C
Laufpuffer:
1x SDS Elektrophoresepuffer
10x SDS Elektrophoresepuffer:
60,5g
288g
20g
Tris (MW 121,14)
Glycin (MW 75,07)
SDS (MW 288,38)
reduzierender Solubilizer:
5g
2g
1ml
300mg
0,5g
Glycerol
SDS
β-Mercaptoethanol
Tris-Base
Coomassie Blue G-250
auf 50ml mit ddH2O aufgefüllt
wie red. Solubilizer, ohne β-Mercaptoethanol
nicht red. Solubilizer:
Dazu wurden 8-12,5%ige Trenngele gegossen.
Beispiel:
Trenngel (12,5%):
12,5ml
10ml
14,1ml
3ml
400µl
------40ml
AB-Mix
1,5M Tris/HCl pH 8,8
ddH2O
Glycerol
10%SDS
+140µl 10% APS
+ 20µl TEMED
Sammelgel (3%):
1,95ml
3,75ml
9,15ml
150µl
------15ml
AB-Mix
1,5M Tris/HCl pH 8,8
ddH2O
10%SDS
+ 50µl
+ 10µl
10% APS
TEMED
Die SDS-Gelelektrophorese wurde in Vertikalsystemen (Amersham Pharmacia Biotech;
BioRad) durchgeführt. Das frisch gemischte, nicht polymerisierte Trenngel wurde
zwischen die gesäuberten, durch Spacer getrennte Glasplatten gegossen und sofort mit
ddH2O überschichtet. Nach 30min bei RT wurde das H2O entfernt, das Sammelgel
eingegossen und der Probenkamm eingesetzt. Nach weiteren 20min Polymerisation
Methoden
54
wurde der Probenkamm entfernt und die Taschen mit Laufpuffer gespült. Die zu
trennenden Proben wurden 1:1 mit Solubilizer auf 40µl (Minigele: 100x 80 x1,5mm)
bzw. 60-100µl (große Gele: 160 x 180x 1,5mm) versetzt und vor dem Auftragen 5min
bei 95°C denaturiert. Für einen Western-Blot von Zell-Lysaten wurden 10µg-20µg
Probe aufgetragen. Zur Größenbestimmung der getrennten Proteine wurde 12µl eines
vorgefärbten Proteinstandards (BioRad) aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte bei
RT mit 100V bis die gewünschte Auftrennung der Proben an vorgefärbten
Markerproteinen ablesbar war.
4.2.3.6
Färbung der SDS-Gele mit Kolloidal-Coomassie
Kolloidal-Coomassie Färbelösung:
30ml 85%ige Phosphorsäure
100g Ammoniumsulfat
20ml 5% (w/v) Coomassie brilliant blue- G250-Lösung
mit ddH2O auf 950ml aufgefüllt
Für die Färbung der Gele wurde die Kolloidal-Coomassie Färbung nach Neuhoff
(Neuhoff et al., 1988) angewendet. Die Fixierung der SDS-Gele erfolgte in je 150ml
12% TCA für mindestens 1h. Nach Abgießen der TCA wurden die Gele mit je 150ml
ddH20 5min lang gewaschen. Das ddH20 wurde verworfen und es erfolgte die
Kolloidal-Coomassie Färbung mit 150ml kolloidaler Färbelösung plus 20% Methanol
für mindestens 48h auf einem Schütteltisch. Anschließend wurde mit je 150ml
20% Methanol entfärbt.
4.2.3.7 Transfer von Proteinen auf eine PVDF-Membran (Western-Blot)
Transferpuffer:
14,4g
5,8g
20%
Glycin
Tris
Methanol
mit ddH2O auf 1 Liter aufgefüllt
Die PVDF-Membran (Hybond-P, Amersham Pharmacia Biotech) wurde 10sek in
Methanol aktiviert. Anschließend wurde sie 5min in ddH2O und mindestens 10min in
Transferpuffer äquilibriert. Das Gel wurde nach Elektrophorese in Transferpuffer
getaucht und auf zwei ebenfalls in Transferpuffer getränkte Whatmanfilter gelegt. Ein
„Tankblot“ (Abb. 7) wurde aufgebaut. Danach wurde eine Stromstärke von 500mA für
Methoden
55
2-4h angelegt. Nach dem Proteintransfer wurden unspezifische Proteinbindungsstellen
durch eine mindestens einstündige Inkubation der Membran mit 3% BSA in TBS mit
0,1%Tween blockiert. Anschließend wurde zweimal kurz mit TBS/0,1% Tween
gewaschen. Zum Nachweis der huASB wurde die Membran mit anti-huASB-Antiserum
(1:4000 in TBS/0,1%Tween) ca. 16h bei 4°C auf dem Rollrad inkubiert. Nach dreimal
zehnminütigem Waschen mit TBS/0,1%Tween, wurde die Membran mit dem
Zweitantikörper (α-Kaninchen IgG-POD, 1:6000 in TBS/0,1%Tween) für 3h bei RT
inkubiert. Nach drei zehnminütigen Waschschritten, wurden 10mg Diaminobenzidin
(DAB) in 50ml TBS gelöst, mit 25µl H2O2 versetzt und auf die Membran gegeben. Die
Farbreaktion wurde gestoppt, indem die Substratlösung abgenommen und mit reichlich
ddH2O gespült wurde.
+
Anode
Kathode
Schwamm
3x3MM Papier
Polyacrylamid-Gel
PVDF-Membran
3x3MM Papier
Schwamm
-
Abb. 7: "Tankblot" zum Transfer von Proteinen auf eine PVDF-Membran
4.2.3.8
Enzymaktivitätsbestimmung der Arylsulfatase B
Substratlösung:
10mM p-Nitrocatecholsulfat (Sigma N-7251)
0,5M NaAc-Puffer pH 5,5
Je 30µl Zell-Lysat, Zell-Überstand oder gereinigte huASB wurden mit 120µl
Substratlösung versetzt und 5-180min bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde mit
300µl 0,6M NaOH abgestoppt. Die Extinktion wurde bei 515nm gegen einen Leerwert
gemessen.
Methoden
56
Die Enzymaktivität wurde wie folgt berechnet:
∆E x G(µl)_________
12,6 x V(ml) x ∆t(min)
=
mU
ml
∆E =Extinktion
∆t = Zeit
G = Gesamtvolumen
V = Probenvolumen
Extinktionskoeffizient = 12,6
4.2.3.9
Enzymaktivitätsbestimmung β -Hexosaminidase (β
β -Hex)
Substratlösung:
10mM
0,1M
0,08%
0,4%
p-Nitrophenyl-N-Acetyl-β-D-Glucosaminid (Sigma N9376)
NaCitrat pH 4,6
NaN3
BSA
Es wurden 10µl Zell-Lysat mit 100µl Substratlösung versetzt, 10-180min bei 37°C
inkubiert und dann mit 500µl 0,4M Glycin/NaOH pH10,4 abgestoppt. Die Extinktion
wurde bei 405nm gemessen. Die Enzymaktivität wurde wie folgt berechnet:
∆E x G(µl)_________
18,5 x V(ml) x ∆t(min)
=
mU
ml
Extinktionskoeffizient = 18,5
4.2.3.10 Proteinbestimmung nach Lowry
Die Proteinbestimmung nach Lowry basiert auf der Reaktion des Folin-CiocalteuPhenol-Reagenz (Phosphor-Wolfram/Molybdänsäure Complex) mit Proteinen, wobei
sich durch Reaktion mit Tyrosinen eine blaue Färbung ergibt, deren Extinktion
photometrisch bestimmt werden kann (Lowry, 1951). Es wurde der „BioRad Protein
Assay DC“ für Microtiterplatten verwendet, der einen modifizierten Micro-LowryAssay darstellt.
Standard:
10mg/ml BSA in Verdünnungen von 0-2mg/ml in TBS mit 0,1% TritonX-100
Lösung A’:
Lösung A mit 20µl/ml Lösung C (2min bei 37°C, mischen)
Methoden
57
Dazu wurde 5µl Standard bzw. 5µl Probe mit 25µl Lösung A’ und 200µl Lösung B
versetzt und in einer Microtiterplatte 15min bei RT inkubiert. Die Extinktion wurde bei
650nm gemessen, eine Standardkurve erstellt und über die Geradengleichung die
Proteinkonzentration berechnet.
4.2.3.11 ELISA zur Quantifizierung humaner Arylsulfatase B
Zur Quantifizierung humaner Arylsulfatase B in Zellüberständen, Zell-Lysaten und
aufgereinigten huASB-Proteinfraktionen wurde ein Sandwich-ELISA etabliert.
Blockierungspuffer:
1%
0,05%
Standard:
0,55mg/ml
PBS
BSA
Tween 20
gereinigte huASB
Standardreihe:
0,1,5,10,25,50,100 ng huASB/ml PBS
Waschlösung:
PBS
0,05% Tween20
je Vertiefung 200µl pipettiert
TMB-Lsg:
240mg Tetramethylbenzidin in 5ml Aceton lösen, anschließend 45ml Methanol
zugeben, mischen und dunkel bei RT lagern.
K-Citrat-Puffer:
42g Zitronensäure-Monohydrat in 950ml ddH2O lösen, pH mit KOH-Plätzchen
grob auf pH 3,6 einstellen, lange rühren lassen; mit 4N KOH auf pH 3,95
titrieren, mit ddH2O auf 1Liter auffüllen und anschließend 275µl 30% H2O2
zugeben, mischen und dunkel bei 4°C lagern
Es wurden 96-well-Platten mit 100µl anti-huASB-Antiserum je Vertiefung (1:1000 in
PBS verdünnt) beschichtet. Nach 1h bei 37°C wurden die Platten ausgeschlagen und zur
Absättigung unspezifischer Proteinbindungsstellen mit 300µl Blockierungspuffer pro
Vertiefung für 1h bei RT inkubiert. Die Platten wurden dreimal gewaschen
(Waschlösung) und der Standard bzw. die Proben zu je 100µl pipettiert. Zell-Lysate
wurden 1:500, Zellüberstände 1:10 und gereinigte Fraktionen 1:1000 bis 1:20.000 verdünnt. Nach Inkubation bei 4°C für ca. 16h, dem Ausschlagen und Waschen der Platten
wurde je 100µl eines biotinylierten monoklonalen anti-huASB-Antikörpers 1:500 in
Blockierungspuffer
hinzugefügt.
Auf
eine
einstündige
Inkubation
und
drei
Waschschritte folgte eine Inkubation mit je 100µl 1:2000 in Blockierungspuffer
verdünntem Streptavidin-HRP für 1h bei RT. Die Platten wurden nach drei
Waschschritten mit je 100µl Tetramethylbenzidin (TMB)–Lösung, die 1:20 in
Methoden
58
Kaliumcitrat-Puffer verdünnt wurde, inkubiert. Es kam zu einer Blaufärbung der
Proben. Nach ca. 15-20min wurde die Reaktion mit je 50µl 2N H2SO4 abgestoppt und
die Platte bei 450nm gemessen.
4.2.3.12 Biotinylierung monoklonaler Antikörper
Reaktionspuffer:
100mM
NaCO3, pH 8,4
Lagerpuffer:
10mM
150mM
Tris
NaCl, pH 8,2
Der monoklonale Antikörper F58.3 gegen huASB (3,55mg/ml) wurde mit
Reaktionspuffer auf eine Konzentration von 2mg/ml eingestellt und anschließend 1h
gegen 500ml, ca. 16h gegen 1 Liter und nochmals 1h gegen 500ml Reaktionspuffer
dialysiert. Nach Bestimmung der Konzentration (≥1mg/ml) wurde 160µg Sulfo-NHydroxysuccinimid-Biotin (Pierce; 10mg/ml in DMSO) zugegeben und 4h bei RT auf
dem Drehrad inkubiert. Ungebundenes Sulfo-N-Hydroxysuccinimid-Biotin wurde durch
Dialyse gegen Lagerpuffer entfernt. Der biotinylierte Antikörper wurde bei 4°C
gelagert.
4.2.3.13 Aufreinigung rekombinanter huASB aus Zellkultur-Überständen
Die Reinigung der huASB erfolgte aus serumfreien Zellkultur-Überständen mit Hilfe
des Chromatographie-Systems Äkta-Explorer (Amersham Pharmacia Biotech). Ein
Schema zur Aufreinigung befindet sich in 4.1.12. Die Fraktionen wurden für jede
Elution automatisch von A1..A12, B1...B12, C1...C12, D1....D12 nummeriert.
Kationenaustauscher 1:
HiLoad 16/10 SP Sepharose Fast Flow, ca. 20ml Bettvolumen,
Sulfonsäuregruppen
Ladepuffer 1:
25mM NaAc
1mM CaCl2, pH 5,0
Elutionspuffer 1:
25mM NaAc pH 5,0
1M NaCl
1mM CaCl2
Methoden
Anionenaustauscher :
59
ResourceQ, 1ml Bettvolumen, quartäre Aminogruppen
Ladepuffer 2 :
10mM Tris
25 mM NaAc
mit NaOH auf pH 7,5 einstellen
Elutionspuffer 2:
10mM Tris
25mM NaAc
1M NaCl
pH 7,5
Kationenaustauscher 2:
Ladepuffer 3:
Gelfiltration:
Ladepuffer 4:
Resource S, 1ml Bettvolumen, Sulfonsäuregruppen
25mM NaAc
pH 5,0
HiLoad 26/60 Superdex 75 prep grade (ca. 330ml Bettvolumen)
10mM Tris
0,9% NaCl
1mM CaCl2 pH 7,5
Aus einer Gewebekulturflasche (T75) mit konfluenten, stabil mit Wildtyp-huASB oder
huASB-Glykosylierungsmutanten transfizierten BHK21-Zellen wurden die Zellen
trypsiniert und auf zehn bis zwanzig 20cm Gewebekulturschalen verteilt (Verdünnung
1:20). Sie wurden mit DMEM/Nut Mix F12-Medium mit 2,5% FCS kultiviert. Nach
zwei Tagen wurde das Medium gewechselt und die FCS-Konzentration auf 1%
herabgesetzt. Nach weiteren zwei Tagen wurde, bei Konfluenz der Zellen, das Medium
nochmals gewechselt und DMEM/F12 ohne Phenolrot und ohne FCS zugegeben. Unter
diesen Bedingungen war das Zellwachstum sehr eingeschränkt. Insgesamt fünfmal im
Abstand von drei Tagen wurde der Überstand der Zellen abgenommen, Zelltrümmer mit
1.000xg 10min abzentrifugiert und der Überstand bei 4°C gelagert.
Das Gesamtvolumen des serumfreien Zellkultur-Überstandes wurde bestimmt und mit
vier Volumina Ladepuffer 1 verdünnt. Der pH wurde mit Essigsäure auf pH 5,0
eingestellt und die Lösung über Nacht bei 4°C gerührt. Es bildete sich ein sehr feines
Präzipitat, das mit 20.000xg für 30 min bei 4°C abzentrifugiert wurde. Nach Filtration
des Überstandes mit 0,2µm Filtern, wurde eine Kationenaustauscher-Säule mit
Ladepuffer 1 äquilibriert und mit der Probe beladen. Nach Laden dieser Säule erfolgte
ein Waschschritt mit dem entsprechenden Ladepuffer. Eluiert wurde mit einem
Salzgradienten, der durch automatisiertes Mischen von Ladepuffer und Elutionspuffer
erreicht wurde. Die Proteine wurden mit einem Salzgradienten von 0M ◄ 0,65M NaCl
eluiert (E1) und in den Eluatfraktionen die Arylsulfatase-Aktivität bestimmt (s. 4.2.3.8).
Methoden
60
Die Fraktionen mit Arylsulfatase-Aktivität wurden vereinigt (20-30ml) und mit 300350ml Ladepuffer 2 verdünnt.
Die zweite Säule, ein Anionenaustauscher, wurde mit Ladepuffer 2 äquilibriert und die
Probe geladen. Der Durchlauf wurde aufgefangen und die huASB mit Elutionspuffer 2
mit einem Salzgradienten 0M ◄ 0,3M NaCl eluiert. Es folgte die Bestimmung der
Arylsulfatase-Aktivität in den Eluatfraktionen. Die Fraktionen, in denen ArylsulfataseAktivität nachgewiesen werden konnte, wurden vereinigt und mit „UltrafreeKonzentrierungsröhrchen“ (Porengröße 10kDa; Millipore) bei 10°C, mit 800xg 30min1h von 8-10ml auf 0,5ml eingeengt (E2).
Der Durchlauf wurde mit Essigsäure auf pH 5,0 eingestellt und auf eine weitere
Kationenaustauscher-Säule geladen, die zuvor mit Ladepuffer 3 äquilibriert worden
war. Die huASB wurde von 0M ◄ 0,3M NaCl mit Elutionspuffer 1 eluiert.
Die Fraktionen mit ASB-Aktivität wurden wiederum vereinigt und konzentriert (E3).
Schließlich wurden die konzentrierten Eluate E2 und E3 jeweils auf eine GelfiltrationsSäule gegeben und die Proteine nach Größe aufgetrennt. Die Säule war mit Laufpuffer 4
äquilibriert worden. Die Eluatfraktionen, in denen Arylsulfatase-Aktivität nachgewiesen
werden konnte, wurden mit Centricon-Röhrchen (Amicon) für 5h bei 10°C mit 7500xg
auf 30-70µl eingeengt. Die Konzentrate wurden bei –20°C eingefroren. Nach
Bestimmung der Proteinkonzentration (s. 4.2.3.10) und der Arylsulfatase-Aktivität
wurden die Konzentrate mittels SDS-PAGE (s. 4.2.3.5), Western-Blot (s. 4.2.3.7) und
ELISA (s. 4.2.3.11) analysiert.
4.2.3.14 Deglykosylierung von Glykoproteinen mittels Glykosidasen
4.2.3.14.1 Deglykosylierung mittels Endoglykosidase H (EndoH)
Die Endoglykosidase H (EndoH) spaltet N-glykosidisch gebundene mannosereiche
Oligosaccharide.
Für eine Spaltung der Oligosaccharide wurde 1µg gereinigtes Protein (s. 4.2.3.13)
eingesetzt und in folgendem Reaktionsansatz 5min bei 95˚C denaturiert:
0,5µl 10% SDS
0,5µl β-Mercaptoethanol
10µl 0,5M NaAc pH 5,5
mit ddH2O auf 38,75µl aufgefüllt
Methoden
61
Nach Zugabe von 1,25µl 0,2M PMSF (Proteaseinhibitor) wurden die Glykoproteine mit
10µl EndoH (100mU) über Nacht bei 37˚C deglykosyliert. Die Probe wurde mit einem
Volumen reduzierendem Solubilizer versetzt und parallel zu einer unbehandelten Probe
auf eine SDS-PAGE (s. 4.2.3.5) geladen.
4.2.3.14.2 Deglykosylierung mittels N-Glykosidase F (PNGaseF)
Die N-Glykosidase F (PNGaseF) spaltet alle Typen N-glykosidisch gebundener
Oligosaccharide.
Für eine Spaltung der Oligosaccharide wurde 1µg gereinigtes Protein (s. 4.2.3.13)
eingesetzt und in folgendem Reaktionsansatz 5min bei 95˚C denaturiert:
0,5µl 10% SDS
0,5µl β-Mercaptoethanol
25µl 200mM NaPO4 pH 8,6
mit ddH2O auf 38,75µl aufgefüllt
Nach Zugabe von 0,5µl Nonidet P-40, 1,25µl 0,2M PMSF (Proteaseinhibitor) wurden
die Glykoproteine mit 10µl PNGaseF über Nacht bei 37˚C deglykosyliert. Die Probe
wurde mit einem Volumen reduzierendem Solubilizer versetzt und parallel zu einer
unbehandelten Probe auf eine SDS-PAGE (s. 4.2.3.5) geladen.
4.3
4.3.1
Methoden zur Arbeit mit Mäusen
Maushaltung
Die Mäuse wurden unter konventionellen Bedingungen gehalten (Hogan, 1986). Die
Temperatur in den Mausräumen beträgt 21-23°C, die Luftfeuchtigkeit 45-60%. Es
wurde ein Tag-Nacht-Rhythmus von 12h Licht (6-18Uhr) und 12h Dunkelheit
eingehalten, so dass ein Paarungszeitpunkt um Mitternacht angenommen werden kann.
Der Stamm MPS VI mit einer muASB-Defizienz, war von Meike Pauly-Evers generiert
worden (Evers et al., 1996) und wurde in der Tierhaltung des Neurozentrums der
Universitätsklinik Freiburg gezüchtet.
Methoden
4.3.2
62
Gezielte Verpaarung von Mäusen und Vaginalpfropfkontrolle
2-3 Weibchen wurden mit einem Männchen verpaart. Die weiblichen Mäuse wurden
jeden Morgen etwa 7-9h nach dem angenommenen Verpaarungszeitpunkt durch
Vaginalpfropfkontrolle überprüft. Das Sperma bildet einen gelblich-weißen Pfropf im
Ausgang der Vagina. Mittels einer abgerundeten Pasteurpipette wurde die Vagina leicht
geweitet, so dass auch tieferliegende Spermapfropfen registriert werden konnten.
Weibliche Tiere mit einem Pfropf wurden separat gesetzt, und das Eintreten einer
Schwangerschaft beobachtet. Diese gezielte Verpaarung wurde angesetzt, um Gruppen
gleichalter
Tiere
für
Knochenmarktransplantationsexperimente
bzw.
für
Enzymsubstitutionstherapien zu erhalten.
4.4
Statistische Analysen
Statistische Analysen wurden mit den Computer-Programmen Origin oder Excel
durchgeführt. Die aufgezeigten Werte sind Mittelwerte aus der jeweils angegebenen
Anzahl unabhängiger Experimente. Die Streuungsmaße sind als Standardfehler (S.E.)
aufgeführt. Zum Vergleich von Mittelwerten zweier Gruppen wurde der zweiseitige
t-Test verwendet. Zum multiplen Gruppenvergleich wurde ANOVA verwendet. Bei
einem
Signifikanzniveau
unterschiedlich bewertet.
von
p<0,05
wurden
die
Gruppen
als
signifikant
Ergebnisse
63
5.
Ergebnisse
5.1
Charakterisierung von unterglykosylierten Mutanten der humanen
Arylsulfatase B
Die humane Arylsulfatase B (huASB) besitzt sechs potentielle Glykosylierungsstellen.
Davon konnten anhand von Kristallstrukturdaten zwei Positionen N279 und N426 als
sicher und eine Position N366 als wahrscheinlich glykosyliert nachgewiesen werden.
Für die drei Positionen N188, N291 und N458 konnte in den Kristallstrukturdaten kein
Hinweis auf Glykosylierung gefunden werden, was aber nicht ausschließt, dass diese
Positionen glykosyliert sind. Interessanterweise liegt die Position N188 exponiert in
einem β-Loop, der möglicherweise ein potentielles Strukturmotiv zur lysosomalen
Sortierung darstellt (Bond et al., 1997). Inwiefern die einzelnen Glykosylierungen der
huASB bei der lysosomalen Sortierung oder Sekretion eine Rolle spielen ist noch
unklar. Zum Zweck gentherapeutischer Ansätze für die MPS VI ist es wichtig, dass ein
optimales therapeutisches huASB-Enzym besser sezerniert wird. Für eine unterglykosylierte, enzymatisch aktive Mutante der huASA wurde gezeigt, dass sie verstärkt
sezerniert wird (Gieselmann et al., 1992; Matzner et al., 2001). Daher soll der Einfluss
von Unterglykosylierung auf die Sortierung und Sekretion der huASB untersucht
werden.
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde eine ortsspezifische Mutagenese der als
glykosyliert bzw. exponiert erachteten Positionen N188, N279, N366 und N426
durchgeführt. Die mutierte huASB wurde in eukaryotischen Zellen stabil exprimiert
und die mutierten huASB-Proteine hinsichtlich ihrer Enzymaktivität, Stabilität,
Sortierung, Prozessierung und Sekretion untersucht. Anschließend wurden die
mutierten huASB-Proteine aus eukaryotischen
enzymatische Parameter bestimmt (Abb. 8).
Zellüberständen
gereinigt und
Ergebnisse
64
Austausch der Asparagine N188, N279, N366 und N426 durch Glutamine
und durch Serin (N426) durch ortsspezifische Mutagenese der huASB cDNA
Stabile Transfektion in BHK21 Zellen
Nachweis der cDNA-Integration, Transkription, Proteinexpression und Enzymaktivität der huASB
Subklonierung der stabil transfizierten BHK21
Untersuchen von Sortierung, Prozessierung und Sekretion der huASB
Reinigung der huASB Glykosylierungsmutanten aus Zellkulturüberständen
Bestimmung enzymatischer Parameter der huASB
Abb. 8: Zusammenfassung der Generierung und Charakterisierung unterglykosylierter Mutanten der
huASB.
5.1.1
Überprüfen des möglichen Einflusses der Mutationen auf die Sekundärstruktur der huASB
Um den Einfluss der Mutationen auf die Sekundärstruktur der humanen Arylsulfatase B
(huASB) besser abschätzen zu können, wurden die Mutationen in der Primärstruktur
Computer-unterstützt simuliert und Sekundärstruktur-Vorhersagen durchgeführt.
Dazu wurde die Sequenz der huASB-cDNA mit der Identifikationsnummer J05225 aus
der „GenBank“ (NCBI) geladen und das Programm Protean (DNAStar) zur Vorhersage
von
Sekundärstrukturen
benutzt.
Die
erhaltene
Übersicht
mit
errechneten
Sekundärstruktur-Vorhersagen nach Garnier-Robson (Garnier, 1978), Chou-Fasman
(Chou, 1978), Eisenberg (Eisenberg et al., 1984), Karplus-Schulz (Karplus, 1985),
Kyte-Doolittle (Kyte and Doolittle, 1982), Jameson-Wolf (Jameson and Wolf, 1988)
und Emini (Emini, 1985) wurde mit der korrespondierenden Ansicht nach Austausch
Ergebnisse
65
der Asparagine in der Aminosäuresequenz durch Glutamine (N188Q, N279Q, N366Q
und N426Q) überlagert und verglichen.
Durch die Austausche N188Q, N279Q und N366Q ergaben sich nur geringfügige
Veränderungen. Durch den Austausch des Asparagin N426 durch Glutamin veränderte
sich die Vorhersage nach Garnier-Robson. Die Ausprägung eines β-Faltblatts in der
mutierten Region ist weniger wahrscheinlich und ein β-Loop oder eine Coil-Struktur
werden begünstigt. Daher erfolgte eine Computer-unterstützte Simulation weiterer
Aminosäureaustausche von Asn 426 gegen Tyr, Gln, Val, Cys, Ile, Leu, Asp, Thr und
Ser. Nach den Strukturvorhersagen waren für den Austausch durch Serin die geringsten
Veränderungen zu erkennen. Zur Ausweitung der Analysen wurde ein zweites
Programm zur Proteinstruktur-Vorhersage herangezogen: PHDsec auf dem "Predict
Protein" Server des EMBL in Heidelberg. Die Aminosäuresequenzen des nicht
veränderten und des mutierten huASB-Proteins wurden online als Textfiles an den
"Predict Protein" Server geschickt. Als Ergebnis wurde eine Auflistung von
Wahrscheinlichkeiten für α-Helices, β-Faltblätter und β-Loops in der Sekundärstruktur
der Glykosylierungsmutanten der huASB mit einer Genauigkeit von >72% (Rost, 2001;
Rost and Sander, 1993; Rost et al., 1994) erhalten. Die Analyse ergab für N426Q
deutliche Veränderungen in der Wahrscheinlichkeit einer Helixbildung (Abb. 9). Das
Einfügen eines Glutaminrestes begünstigt die Bildung einer α-Helix. Außerdem wurde
die Vorhersage für die Zugänglichkeit von Lösungsmitteln für die Position N426 von
39Å2 auf 71Å2 erhöht. Ebenso wurde der Austausch von Asparagin N426 gegen Serin
in diesem Programm getestet. Dieser Austausch führte zu keinen wesentlichen
Veränderungen in der Sekundärstruktur-Vorhersage für die huASB (Abb. 9).
Aufgrund dieser Ergebnisse wurden die Asparagine N188, N279, N366 und N426 der
huASB zunächst gegen Glutamine und N426 zusätzlich gegen ein Serin ausgetauscht.
Bei dem Austausch von Asparagin durch Glutamin handelt es sich um einen gängigen,
konservativen Aminosäureaustausch, da Asparagin und Glutamin sich nur durch eine
-CH2 Gruppe innerhalb der Aminosäurekette unterscheiden (s. Anhang; Gieselmann et
al., 1992; Berg-Fussman et al., 1993; Hermans et al., 1993; Millat et al., 1997;
Tikkanen et al., 1995).
Ergebnisse
66
WT
426
Aminosäure
D D S S L P E Y S A F N T S V H A A I R H
Struktur
L L L L L L E E E E E L L L L L L L L L L
Wahrscheinlichkeit 9 9 8 8 7 3 1 3 6 5 4 1
1 1 3 2 6 6 5 4 6
α-Helix
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 1 1 0 1 1 2 2 1
β-Faltblatt
0 0 0 0 1 3 4 6 7 7 6 4
4 3 2 3 1 0 0 1 1
Loop
9 9 8 8 7 5 4 3 1 2 3 4
5 4 5 5 7 7 7 6 7
N426Q
426
Aminosäure
D D S S L P E Y S A F Q T S V H A A I R H
Struktur
L L L L L L L L H H H H H H H H H H H H H
Wahrscheinlichkeit 9 9 9 9 9 8 5 2 1 1 3 6
7 6 7 8 7 7 5 3 1
α-Helix
0 0 0 0 0 0 2 2 3 3 5 7
7 7 7 8 7 7 6 5 4
β-Faltblatt
0 0 0 0 0 0 1 2 2 3 1 0
0 1 1 0 0 0 0 0 0
Loop
9 9 9 9 9 8 6 4 3 2 2 2
1 1 1 0 1 1 2 3 5
N426S
426
Aminosäure
D D S S L P E Y S A F S
T S V H A A I R H
Struktur
L L L L L L E E E E E L L L L L L L L L L
Wahrscheinlichkeit 8 9 9 8 7 3 2 4 6 5 2 1
1 1 2 1 4 6 6 5 6
α-Helix
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 1 1 1 1 1 2 2 1
β-Faltblatt
0 0 0 0 1 3 5 6 7 6 5 4
4 3 3 4 2 0 0 1 1
Loop
9 9 9 8 8 5 4 2 1 2 4 5
4 4 4 4 6 7 7 6 7
Abb. 9: Sekundärstruktur-Vorhersagen für Wildtyp-huASB (WT) und die Glykosylierungsmutanten
N426Q und N426S
Die Vorhersagen wurden mit PHDsec auf dem Predict Protein Server des Embl-Instituts in Heidelberg
generiert. Die Aminosäuren sind im Ein-Buchstaben-Code angegeben. Die vorhergesagte
Sekundärstruktur ist abgekürzt mit L für Loop, H für α-Helix und E für β-Faltblatt. Die Gesamtwahrscheinlichkeit für die vorhergesagte Struktur und die Einzelwahrscheinlichkeiten sind angegeben
(Werte von 0-9, wobei 0 für die geringste und 9 für die höchste Wahrscheinlichkeit steht).
Ergebnisse
5.1.2
67
Ortsspezifische Mutagenese und Gewinnung von Expressionsvektoren der
huASB-cDNA
Die ortsspezifische Mutagenese wurde mit dem Plasmid pcASBX (s. Anhang)
durchgeführt. Das Plasmid pcASBX enthält den ca. 1,8kb umfassenden offenen
Leserahmen der huASB-cDNA mit 5’ ATG und 3’ STOP-Codon. Es wurden je zwei
gegenläufige Oligonukleotide synthetisiert, welche die jeweiligen Punktmutationen für
den Austausch der vier Asparagine N188, N279, N366 und N426 enthielten (s. 4.1.14).
Die Mutationen konnten mit Hilfe einer PCR mit diesen modifizierten Primern in die
huASB-cDNA eingeführt werden (ortsspezifische Mutagenese). DH5α E.coli Bakterien
wurden mit der mutierten Plasmid-DNA transformiert und die isolierte Plasmid-DNA
der erhaltenen Bakterienkolonien mittels Restriktionsanalyse (N188Q) bzw. DNASequenzierungen (N279Q, N366Q, N426Q, N426S) auf die Mutation getestet. Bei
Austausch von Asparagin N188 durch Glutamin entstand in der huASB-cDNA eine
zusätzliche, zweite PstI-Erkennungssequenz, die zur Analyse der isolierten PlasmidDNA genutzt werden konnte (Abb. 10). Zusätzlich wurden die positiven Resultate aus
den PstI-Restriktionsanalysen durch Sequenzierung verifiziert.
Abb. 10: PstI-Restriktionsanalyse zur Identifizierung der die Mutation N188Q enthaltenden Bakterienklone
Aus Bakterienkolonien isolierte Plasmid-DNA wurde mit dem Restriktionsenzym PstI verdaut (PstI).
Die DNA-Fragmente, die einen Bakterienklon mit der Mutation in der huASB-cDNA charakterisieren,
sind mit einer Pfeilspitze (K) markiert. 3-6: Beispiele für Bakterienklone, die das pcASBX-Plasmid mit
der N188Q huASB-cDNA enthalten; 7-8: Beispiele für Bakterienklone, die pcASBX-Plasmid mit der
Wildtyp huASB-cDNA enthalten; P: mit PstI verdautes pcASBX-Plasmid als Kontrolle;
unv.: unverdaute Plasmid-DNA; M: 1kb DNA-Leiter.
Ergebnisse
68
Die Analyse der cDNA der huASB-Glykosylierungsmutanten N279Q und N366Q
ergab keine passende Erkennungssequenz für Restriktionsenzyme, die zur Identifikation
der positiven Bakterienklone verwendet werden konnte. Daher wurden diese Plasmide
über den Bereich der jeweiligen Mutation sequenziert. Zur Sequenzierung der
Glykosylierungsmutanten wurden folgende Primer benutzt: AB9c für N188Q; AB22nc
für 279Q; AB19c für N366Q; AB23c für N426Q bzw. N426S. Es konnten für alle
Glykosylierungsmutanten Bakterienklone gefunden werden, welche die jeweilige
mutierte Plasmid-DNA enthielten.
Die in der Mutagenese benutzte Pfu DNA-Polymerase aus pyrococcus furiosus arbeitet
mit einer mehr als zehnfach höheren Genauigkeit (Fehlerrate 1,6 *10-6) als die Taq I
DNA-Polymerase (Lundberg et al., 1991). Um dennoch weitere zufällige Mutationen
auszuschließen, wurde die 1,8kb huASB-cDNA vollständig sequenziert (Primersequenzen s. Anhang). Es wurde keine weitere Mutation gefunden. Die Wildtyp bzw.
mutierte huASB-cDNA wurde jeweils aus dem Plasmid pcASBX (s. Anhang) mit den
Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI ausgeschnitten und in den eukaryotischen
Expressionsvektor pBHE über die Restriktionsschnittstellen EcoRI und BamHI kloniert
(Abb. 11). In dem resultierenden Expressionsplasmid pBEAX wurde der Gegenstrang
der huASB-cDNA vollständig sequenziert. Um eine hohe Expression der huASBcDNA in eukaryotischen Zellen zu erreichen, ist die huASB-cDNA von dem SV40Promotor und dem SV40-Polyadenylierungssignal flankiert. Die erhaltenen Plasmide
wurden mit pBEAX für Wildtyp-huASB bzw. pBEAXN188Q, pBEAXN279Q,
pBEAXN366Q
und
pBEAXN426Q
Glykosylierungsmutanten benannt.
und
pBEAXN426S
für
die
huASB-
Ergebnisse
69
HindIII
XhoI
PstI
SalI
AccI
BamHI
SV40 Promotor
Ampicillin
EcoRV
pBEAX
PstI
4760bp
Ori ColE1
huASBcDNA
SV40 PolyA
EcoRI
Abb. 11: Plasmidkarte des Expressionsplasmids pBEAX
1,8kb Wildtyp huASB-cDNA Insert in dem Plasmid pBHE (Artelt et al., 1988). Die zur Klonierung
benutzen Restriktionsschnittstellen BamHI und EcoRI sind unterstrichen.
5.1.3
Stabile Transfektion von BHK21-Zellen mit huASB-Expressionsvektoren
zur Gewinnung huASB überexprimierender Zelllinien
Die eukaryotischen Expressionsplasmide pBEAX, pBEAXN188Q, pBEAXN279Q,
pBEAXN366Q, pBEAXN426Q und pBEAXN426S, die für die Wildtyp-huASB bzw.
huASB-Glykosylierungsmutanten kodieren, wurden in BHK21-Zellen transfiziert. Zur
Selektion der Zellklone, die das Konstrukt stabil integriert haben, wurden die Zellen mit
einem Selektionsvektor pSV2pac (Vara et al., 1986) kotransfiziert und anschließend mit
dem Antibiotikum Puromycin selektioniert.
Ergebnisse
70
Tab. 2: Anzahl der primären Zellklone und erhaltenen Subklone aus stabiler Transfektion von BHK21Zellen mit Wildtyp-huASB und Glykosylierungsmutanten.
WT
39
Zellklone mit
ArylsulfataseAktivität
11
8
% der Subklone mit
ArylsulfataseAktivität
73
N188Q
30
6
20
13
13
100
N279Q
30
12
40
10
8
80
N366Q
17
6
35
2
2
100
N426Q (S1)
28
7 → 0*
26 → 0*
7
5 → 0*
71 → 0*
33
9 → 0*
27 → 0*
40
4 → 0*
10 → 0*
15
0
0
16
0
0
N279/N426Q 33
0
0
CA7
31
11
35
BHE
22
0
0
primäre
Zellklone
% der Zellklone mit
erhaltene
ArylsulfataseSubklone
Aktivität
28
11
(S2)
N426S (S1)
(S2)
Subklone mit
Arylsulfatase-Aktivität
WT: Wildtyp; S1: 1. Subklonierung; S2: Subklonierung eines weiteren primären Zellklons; BHE: mit
leerem Vektor transfizierte BHK21-Zellen; CA7: BHK21-Zellen, die Wildtyp-huASB mit dem "Leader
Peptid" der lysosomalen sauren Phosphatase (LAP) unter der Kontrolle des SV40-Promotors exprimieren
(Peters et al., 1990). * Die huASB-Aktivität ging nach drei bis vier Passagen verloren.
Je ca. 30 Zellklone wurden auf Expression des huASB-Proteins getestet (Tab. 2). Dazu
wurden in Zell-Lysaten die Arylsulfatase- und β-Hexosaminidase-Aktivitäten
gemessen. Die endogene β-Hexosaminidase (β-Hex) der BHK21-Zellen dient hier als
lysosomales Leitenzym, um die gemessenen Arylsulfatase-Aktivitäten auf den Gehalt
lysosomaler Proteine in der Probe zu normieren. Der Quotient aus Arylsulfatase- und
β-Hex-Aktivität gibt somit Aufschluss über die Expression aktiver Arylsulfatasen. Zur
Unterscheidung endogener Hamster Arylsulfatase-Aktivität der BHK21-Zellen von der
Aktivität der exprimierten huASB wurden mit leerem Expressionsvektor transfizierte
BHK21-Zellen untersucht. Sie zeigten ein Arylsulfatase/β-Hex Verhältnis von 0,1-0,3.
Daher ließen sich Zellklone mit huASB-Proteinexpression, die ein Verhältnis von
Arylsulfatase/β-Hex über 1 aufwiesen, eindeutig identifizieren. Als positive Kontrolle
dienten BS-Zellen. Dabei handelt es sich um stabil transfizierte BHK21-Zellen, die
Wildtyp-huASB-cDNA unter der Kontrolle eines RSV-LTR-Promotors (Anson et al.,
1992) und zusätzlich den kleinen Mannose-6-Phosphat-Rezeptor (MPR 46) exprimieren
(Evers, 1996). In Lysaten von BS-Zellen wurde ein Arylsulfatase/β-Hex-Verhältnis um
5 gefunden.
Ergebnisse
71
Einzelne Klone wurden ausgewählt und subkloniert, um reine Einzelklone zu erhalten.
Für die Glykosylierungsmutanten N426Q und N426S wurden je zwei Klone subkloniert
(Tab. 2). Folgende Einzelklone exprimieren enzymatisch aktive Wildtyp-huASB bzw.
eine enzymatisch aktive mutante Formen der huASB:
-
WT-42 4G5 (WT)
-
188-18 3H7 (N188Q)
-
279-42 3H5 (N279Q)
-
366-5-1 (N366Q)
Für N426Q bzw. N426S konnte kein Subklon mit stabiler huASB-Aktivität etabliert
werden. Es wurden 28 primäre Zellklone aus stabiler Transfektion von BHK21-Zellen
mit N426Q auf ASB-Aktivität untersucht. Die Klone N426Q-6, -9, -11, -12, -14, -17
und -22 zeigten nach ersten Enzymaktivitätsmessungen einen erhöhten Arylsulfatase/βHex-Quotienten (1,3 bis 4,1; Abb 14). Nach Kultivieren der Stammklone über drei bis
vier Passagen bzw. Subklonieren zweier primärer, huASB-Protein exprimierender,
Klone und Kultivieren der insgesamt 40 Subklone über drei bis vier Passagen, ging die
huASB-Aktivität wieder verloren. Die für die potentielle Glykosylierungsstelle N426
erhaltenen Ergebnisse sollen im folgenden dargestellt werden.
5.1.4
Integration der huASB-cDNA bei primären Zellklonen der Glykosylierungsmutante N426Q
Um zu zeigen, dass die Transfektion erfolgreich war, wurden die 28 primären Klone
aus der Transfektion mit pBEAXN426Q auf DNA-Integration untersucht. Genomische
DNA wurde aus je 3x106 stabil transfizierten BHK21-Zellen gewonnen. Anschließend
wurde eine PCR über Exon 7 und Exon 8 der huASB-cDNA mit den Primern AB14c
und AB25nc etabliert, die ein 200bp DNA-Fragment amplifiziert. Als Negativkontrolle
wurden BHK21-Zellen verwendet, um auszuschließen, dass die huASB-Primer mit dem
Gen der endogenen Hamster-ASB kreuzreagieren. Die Negativkontrollen zeigten kein
DNA-Fragment. In 22 von 28 expandierten primären Zellklonen konnte ein spezifisches
huASB-cDNA-Fragment von 200bp und damit die Integration der huASB-cDNA
nachgewiesen werden (Abb. 12).
Ergebnisse
72
Abb. 12: PCR zum Nachweis der Integration huASB-cDNA in das Genom von primären Zellklonen der
huASB N426Q Glykosylierungsmutante
Die genomische PCR wurde mit den Primern AB14c und AB25nc durchgeführt. Das spezifische huASBcDNA-Fragment ist mit einer Pfeilspitze markiert (◄). In Zellklon 12 wurde ebenfalls ein spezifisches
huASB-cDNA-Fragment identifiziert (nicht gezeigt). Die Klone 16 und 18 fehlen, sie sind nach
Vereinzelung nicht angewachsen. BS: Positiv-Kontrolle, BHK21-Zellen, die Wildtyp-huASB unter der
Kontrolle des RSV LTR-Promotors exprimieren; B: Negativkontrolle, untransfizierte BHK21-Zellen;
H: Negativkontrolle ohne genomische DNA; Ma: 1kb-DNA-Leiter; Mb: 100bp-DNA-Leiter
5.1.5
Expression der huASB-mRNA in primären Zellklonen der Glykosylierungsmutante N426Q
Um die Intaktheit der integrierten huASB-Expressionskassette zu überprüfen, wurde
aus 3x106 Zellen der primären Klone von N426Q RNA isoliert. Die genomische DNA
in der Präparation wurde mit DNase I verdaut. Die RNA wurde auf einem Agarose-Gel
überprüft, um eine Degradation auszuschließen. Mittels reverser Transkription wurde
die RNA in cDNA umgeschrieben und es wurde eine PCR mit den Primern AB14c und
AB25nc durchgeführt. In 17 von 26 Klonen konnte spezifische huASB-mRNA
nachgewiesen werden (Abb. 13).
Ergebnisse
73
Abb. 13: RT-PCR zum Nachweis der huASB-mRNA in primären Zellklonen der huASB-Glykosylierungsmutante N426Q
Die PCR wurde aus revers transkribierter cDNA (D) stabil transfizierter BHK21-Zellen mit den Primern
AB14c und AB25nc durchgeführt. Um Kontaminationen in der RNA-Präparation mit genomischer DNA
auszuschließen, wurde die PCR auch direkt mit RNA durchgeführt (R). Das spezifische huASB-cDNAFragment ist mit einer Pfeilspitze ( ) markiert. Klon 31 zeigt ebenfalls ein spezifisches huASB-cDNAFragment (nicht gezeigt). Für Klon 12 und 25 konnte keine RNA isoliert werden. Die Klone 16 und 18
fehlen, sie sind nach Vereinzelung nicht angewachsen. Klon 26 wurde als negativ betrachtet, da es sich
hierbei um eine Kontamination mit genomischer DNA handelt. BS: Positivkontrolle, BHK21-Zellen, die
Wildtyp-huASB unter der Kontrolle des RSV LTR-Promotors exprimieren; B: Negativkontrolle,
untransfizierte BHK21-Zellen; Ma: 1kb-DNA-Leiter; Mb: 100bp-DNA-Leiter
5.1.6
Expression des huASB-Proteins in primären Zellklonen der huASBGlykosylierungsmutante N426Q
Wie in der Einleitung dargestellt, besteht die huASB nach Reifung aus 3 Polypeptiden
(α, β und γ), die durch Disulfid-Brücken miteinander verbunden sind (Abb. 5). Mittels
reduzierender SDS-PAGE lassen sich die kleinen Polypeptid-Fragmente β und γ nur
schwer darstellen, daher wird im folgenden die Darstellung auf die α-Untereinheit
beschränkt.
Um die Expression des huASB-Proteins zu untersuchen, wurde aus 3x106 stabil
transfizierten BHK21-Zellen ein Zell-Lysat gewonnen. Nach reduzierender SDS-PAGE
und Western-Blot konnte mit einem anti-huASB-Antiserum in vier primären Zellklonen
(9, 11, 17 und 22) die Expression des huASB-Proteins nachgewiesen werden (Abb. 14).
Dieses Enzym ist in diesen Zellklonen auch enzymatisch aktiv (ASB/β-Hex >1;
Abb. 14). Nach Subklonierung des Zellklons N426Q-17 war das huASB-Protein in
keinem der 29 getesteten Subklone (von 33 Subklonen insgesamt) im Western-Blot
detektierbar (nicht gezeigt). Durch das Passagieren der primären Zellklone oder der
subklonierten Zellen ging die Expression des huASB-Proteins regelmäßig verloren
(Tab. 2).
Ergebnisse
74
M B WT 1 2 3
4 5 6 7 M 8 9 10 11 12 13 14 15 17 M 19 20 21 22 23 24 25 26 27 M 28 29 31
50kDa
PCR
RT-PCR
ASB/ß-Hex
+
-
- + - + + +
- + - + + +
0,2 0,1 0,2 0,1 0,6 3,7 0,3
+ + + + + + + + + - + ? + + -
+
+
-
+ + + + + + + + + + + + ? - -
- - +
+? - +
0,2 3,8 0,2 2,3 1,6 0,2 2,9 0,3 4,1
0,1
0,5 0,8 1,3 0,2 0,1 0,2 0,3 0,2
0,5 0,1 0,2
Abb. 14: Western-Blot zum Nachweis des huASB-Proteins in primären Zellklonen der Glykosylierungsmutante N426Q
Es wurde jeweils 20µg Gesamtprotein aus Zell-Lysaten von stabil transfizierten BHK21-Zellen auf einer
SDS-PAGE aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran transferiert und mit anti-huASB-Antiserum analysiert.
1-31: BHK21 Zellklone, die aus der stabilen Transfektion mit N426Q hervorgegangen waren. Die
Zellklone 16 und 18 waren nach Vereinzelung nicht angewachsen. Aus Zellklon 30 konnte kein ZellLysat gewonnen werden. M: Molekulargewichtsmarker; B: Negativkontrolle, untransfizierte BHK21Zellen; WT: Positivkontrolle, Wildtyp-huASB exprimierende BHK21-Zellen
5.1.7
Analyse der huASB-Glykosylierungsmutanten N426Q, N426S und einer
Doppelmutante N279Q/N426Q
Da laut Vorhersage die Sekundärstruktur für die huASB-Glykosylierungsmutante
N426S im Vergleich zu N426Q nur eine geringere strukturelle Veränderung erfährt,
wurde pBEAXN426S stabil in BHK21-Zellen transfiziert und resultierende Zellklone
analysiert.
Nach stabiler Transfektion von BHK21-Zellen mit pBEAXN426S wurden 40 primäre
Zellklone auf huASB-Aktivität geprüft. In vier Klonen (N426S-1, -6, -8, -17) wurde ein
erhöhter Quotient aus Arylsulfatase- zu β-Hex-Aktivität gemessen. Die Werte des
Quotienten lagen zwischen 1,26 und 4,49 und wiesen somit auf Überexpression des
huASB-Proteins hin. Im Western-Blot konnten spezifische Proteinbanden bei sechs
primären Klonen (N426S-1, -2, -6, -8, -14, -17) nachgewiesen werden. Nach drei bis
vier Passagen, sowie nach Subklonierung zweier Zellklone N426S-1 und N426S-6,
konnte in 15 bzw. 16 Subklonen keinerlei Arylsulfatase-Aktivität gemessen werden.
Sowohl der Austausch von N426 der huASB durch Glutamin als auch durch Serin
führten somit zu dem gleichen Ergebnis: keine humane Arylsulfatase B-Aktivität nach
Subklonierung bzw. Passagieren der Zellen.
Initial war neben diesen Einfachmutanten auch die Doppelmutante N279Q/N426Q, bei
der die sicher glykosylierten Asparagine N279 und N426 (Bond et al., 1997) gegen
Glutamine ausgetauscht sind, hergestellt worden. Nach Transfektion dieser DoppelGlykosylierungsmutante konnte in insgesamt 30 von 33 primären Zellklonen eine DNAIntegration mittels PCR nachgewiesen werden. Transkription erfolgte in 18 dieser
primären Klone. Jedoch konnte in 31 getesteten primären Klone kein huASB-Protein
und keine Enzymaktivität nachgewiesen werden.
Ergebnisse
Mittels
indirekter
75
Immunfluoreszenz
konnte
bei
den
transient
transfizierten
Expressionsplasmiden pBEAXN426Q, pBEAXN426S und pBEAXN279Q/N426Q in
ca. 1% der transfizierten BHK21-Zellen eine perinukleäre, vesikuläre Färbung gezeigt
werden, die typisch für lysosomale Proteine ist. Im Vergleich dazu konnte bei
transienten Transfektionen mit Wildtyp-huASB und den Glykosylierungsmutanten
N188Q und N279Q in ca. 1%-10% der transfizierten BHK21-Zellen eine perinukleäre,
vesikuläre Färbung nachgewiesen werden. Bei den Glykosylierungsmutanten N426Q,
N426S und N279Q/N426Q waren allerdings auch netzförmige Strukturen zu erkennen,
was auf einen Verbleib des Proteins im ER und anschließende Degradation hindeuten
könnte (Abb. 15).
A
B
C
D
Abb. 15: Indirekte Immunfluoreszenz zum Nachweis der Expression der huASB in transient mit den huASBGlykosylierungsmutanten N426Q, N426S und N279Q/N426Q transfizierten BHK21-Zellen
In A) N426Q, B) N426S und C) N279Q/N426Q ist die typische perinukleäre, vesikuläre lysosomale
Lokalisation der huASB gezeigt; in D) N426Q ist eine netzförmige, perinukleäre Struktur dargestellt. Zur
Anfärbung des huASB-Proteins wurde anti-huASB-Antiserum mit α-Kaninchen-IgG, Texas Red
markiert, kombiniert.
Ergebnisse
76
Zusammengefasst zeigen diese Resultate, dass die huASB-Glykosylierungsmutanten
N426Q und N426S in BK21 Zellen als aktives Protein nachweisbar sind. Jedoch gelang
es nicht, Zellklone zu gewinnen, die eine stabile Expression des mutierten huASBProteins zeigen, obwohl im Vergleich mit Wildtyp-huASB und den huASBGlykosylierungsmutanten N188Q, N279Q und N366Q insgesamt mehr als doppelt so
viele primäre Zellklone (68) und mehr als drei- bis viermal soviele Subklone je
Subklonierung (31 bzw. 40) untersucht wurden (Tab. 2). Das weist darauf hin, dass die
huASB-Glykosylierungsmutanten N426Q bzw. N426S instabil sind und/oder einen
Selektionsnachteil für transfizierte BHK21-Zellen darstellen.
5.1.8
Charakterisierung der huASB-Glykosylierungsmutanten N188Q, N279Q
und N366Q
Für Wildtyp-huASB und die huASB-Glykosylierungsmutanten N188Q, N279Q und
N366Q wurde je ein stabil exprimierender Subklon etabliert (s. 5.1.3) und für die
weiteren Untersuchungen eingesetzt. Alle folgenden Analysen beschränken sich auf
diese Subklone: WT-42 4G5 (WT); 188-18 3H7 (N188Q); 279-42 3H5 (N279Q) und
366-5-1 (N366Q). Die Subklone werden der Einfachheit halber im folgenden mit WT,
N188Q, N279Q und N366Q bezeichnet.
Die Transkription und somit vollständige Integration der huASB-cDNA in Wildtyp und
Glykosylierungsmutanten konnte mit Hilfe einer RT-PCR nachgewiesen werden
(Abb. 16).
Um die eingeführten Punktmutationen N188Q, N279Q und N366Q im Genom der
Subklone nachweisen zu können, wurde nach Isolierung genomischer DNA eine PCR
mit den Primern AB13c und AB25nc durchgeführt. Das amplifizierte 1,1kb Fragment
der huASB-cDNA, das die mutierten Regionen enthält, wurde mit den Primern AB13c,
AB28nc (für N188Q), AB17c, AB22nc (für N279Q) und AB19c, AB25nc (für N366Q)
sequenziert (Abb. 17).
Ergebnisse
77
Abb. 16: RT-PCR zum Nachweis von huASB-mRNA in den Subklonen von Wildtyp-huASB und huASBGlykosylierungsmutanten
Die PCR wurde aus revers transkribierter cDNA stabil transfizierter BHK21-Zellen mit den Primern
AB14c und AB25nc durchgeführt. Um Kontaminationen in der RNA-Präparation mit genomischer DNA
auszuschließen, wurde die PCR auch direkt mit RNA durchgeführt. Das spezifische huASB-cDNAFragment mit einer Größe von ca. 200bp ist mit einer Pfeilspitze markiert ( ). BS: Positivkontrolle,
BHK21-Zellen, die Wildtyp-huASB-cDNA unter der Kontrolle des RSV LTR-Promotors exprimieren. B:
Negativkontrolle, untransfizierte BHK21-Zellen.
Abb. 17: Verifizierung der Punktmutationen im Genom der Subklone N188Q, N279Q und N366Q durch
Sequenzierung von huASB-cDNA spezifischen PCR-Fragmenten
A) N279Q; B) N188Q; C) N366Q . Asparagine (AAT) wurden gegen Glutamine (CAG) ausgetauscht
5.1.8.1
Nachweis
der
Glykosylierungen
der
huASB
anhand
Wildtyp
und
den
Glykosylierungsmutanten N188Q, N279Q und N366Q
Bisher konnten aufgrund von huASB-Kristallstrukturdaten die Glykosylierungsstellen
N279 und N426 als sicher und N366 als wahrscheinlich glykosyliert eingestuft werden
(Bond et al., 1997). Im folgenden soll dies für N279 und N366 verifiziert werden und
eine weitere Position N188 als ebenfalls glykosyliert nachgewiesen werden.
In den ausgewählten Subklonen konnte mit Hilfe eines Western-Blots huASBProteinsynthese für die Glykosylierungsmutanten N188Q, N279Q und N366Q sowie
den Wildtyp in reduzierenden und nicht-reduzierenden SDS-Gelen belegt werden. Dabei
konnte eindeutig für alle huASB-Glykosylierungsmutanten eine Verkleinerung der αUntereinheit um 2kDa gezeigt werden (Abb. 18).
Ergebnisse
78
Abb. 18: Western-Blot zum Nachweis von Wildtyp-huASB und huASB-Glykosylierungsmutanten
Nach reduzierender SDS-PAGE wurde ein Western-Blot mit dem anti-huASB-Antiserum durchgeführt.
Gezeigt ist die α-Untereinheit prozessierter huASB. B: Negativkontrolle, untransfizierte BHK21-Zellen;
BS: Positivkontrolle, BHK21-Zellen, die Wildtyp-huASB unter der Kontrolle des RSV LTR-Promotors
exprimieren.
Diese Ergebnisse konnten durch Immunpräzipitationen der huASB aus Zell-Lysaten
verifiziert werden. Dazu wurden Zellklone, die Wildtyp-huASB und huASBGlykosylierungsmutanten stabil exprimieren, metabolisch markiert und anschließend die
huASB immunpräzipitiert. Wie im Western-Blot ist auch hier der Größenunterschied
von etwa 2kDa, welcher der Größe eines Oligosaccharids entspricht, von Wildtyp und
mutierten Formen der huASB eindeutig nachweisbar (Abb. 19).
Abb. 19: Metabolische Markierung und Immunpräzipitation von Wildtyp-huASB und Glykosylierungsmutanten
Die Subklone, die Wildtyp-huASB bzw. die huASB-Glykosylierungsmutanten exprimieren, wurden zwei
Stunden mit 35S Met/Cys metabolisch markiert, zwei Stunden in nicht-radioaktivem Medium kultiviert
("Chase"), und anschließend mit anti-huASB-Antiserum immunpräzipitiert. Gezeigt ist die
α-Untereinheit. N366Q und N366QB bezeichnen zwei unterschiedliche Subklone. BS: Positivkontrolle,
BHK21-Zellen, die Wildtyp-huASB unter der Kontrolle des RSV LTR-Promotors exprimieren.
Somit werden die mutierten huASB-Proteine N188Q, N279Q und N366Q in BHK21Zellen stabil exprimiert. Die Größenreduzierung der Glykosylierungsmutanten weist
darauf hin, dass die in den BHK21-Zellen exprimierte huASB mindestens an den
Positionen N188, N279 und N366 glykosyliert ist.
Ergebnisse
79
5.1.8.2 Charakterisierung der N-Glykosylierungen der huASB
Um die Glykosylierungen der huASB näher zu charakterisieren, wurden die
N-glykosidisch gebundenen Oligosaccharide von gereinigtem huASB-Protein mit den
Glykosidasen EndoH und PNGaseF hydrolytisch abgespalten. Während die Glykosidase
EndoH nur Oligosaccharide des mannosereichen Typs spaltet, hydrolysiert die PNGaseF
auch Oligosaccharide des komplexen Typs. Nach Spaltung der Glykosylierungen der
Wildtyp-huASB mit der Glykosidase EndoH, verringerte sich das Molekulargewicht für
die α-Untereinheit auf der SDS-PAGE um ca. 4kDa und nach PNGaseF-Spaltung um
ca. 6kDa (Abb. 20).
Abb. 20: Nachweis von mannosereichen und komplexen N-Glykosylierungen an gereinigter Wildtyp-huASB
und huASB-Glykosylierungsmutante N366Q
Nach reduzierender SDS-PAGE und Protein-Transfer auf eine PVDF-Membran (Western-Blot), wurde
die gereinigte Wildtyp-huASB und die gereinigte Glykosylierungsmutante N366Q mit dem anti-huASBAntiserum nachgewiesen. Gezeigt ist die α-Untereinheit prozessierter huASB vor und nach GlykosidaseSpaltung (EndoH und PNGaseF). M: Marker; unv.: unverdaut.
Daraus ergibt sich, dass auf der α-Untereinheit der gereinigten Wildtyp-huASB zwei
mannosereiche Oligosaccharide und ein komplexes Oligosaccharid lokalisiert sind. Bei
der
Betrachtung
der
huASB-Glykosylierungsmutanten
zeigte
sich,
dass
die
Glykosylierungsmutante N366Q nach EndoH-Hydrolyse ebenfalls eine Verkleinerung
der α-Untereinheit der huASB um ca. 4kDa aufwies. Eine PNGaseF-Behandlung der
Glykosylierungsmutante
führte
zu
keiner
weiteren
Größenreduzierung
der
Ergebnisse
α-Untereinheit
80
(Abb.
20).
Zusammenfassend
lässt
dies
auf
ein
komplexes
Oligosaccharid an der Position N366 und auf zwei mannosereiche Oligosaccharide an
den Positionen N188 und N279 schließen. Die Position N291 scheint in BHK21-Zellen
nicht glykosyliert zu sein.
5.1.9
Sekretion von Wildtyp-huASB und den Glykosylierungsmutanten N188Q,
N279Q und N366Q aus BHK21-Zellen
Lysosomale Enzyme werden nach Bindung an die Mannose-6-Phosphat-Rezeptoren
MPR 46 und MPR 300 im TGN in die Lysosomen sortiert. Ca. 5-10% der lysosomalen
Enzyme werden direkt in den Extrazellulärraum sezerniert.
Die Sekretion der huASB kann durch die Syntheserate des huASB-Proteins in den stabil
transfizierten BHK21-Zellen beeinflusst werden. Daher wurde zunächst die huASBProtein-Syntheserate in huASB-Wildtyp und Glykosylierungsmutanten exprimierenden
BHK21-Zellen bestimmt und anschließend die Sekretionsrate auf die Syntheserate
normiert.
Zur Bestimmung der huASB-Protein-Syntheserate wurden stabil exprimierende
BHK21-Zellen zwei Stunden metabolisch mit
35
S Cys/Met markiert, und die huASB
unmittelbar nach Markierung immunpräzipitiert. Nach Auftrennung auf einer SDSPAGE, Exposition auf einer Phosphoimager-Platte und Auswertung mit dem Programm
ImageMasterTM (Amersham Pharmacia Biotech), konnten die Pixel pro Bande
unprozessierter huASB und somit eine Syntheserate für das huASB-Protein pro Zeit
ermittelt werden. Die Glykosylierungsmutanten exprimierenden BHK21-Zellen
synthetisieren im Vergleich mit huASB-Wildtyp-Zellen nur 36-80% huASB-Protein.
BS-Zellen synthetisieren doppelt so viel wie huASB-Wildtyp-Zellen (Abb. 21A). Die
unterschiedliche ASB-Synthese in BS-Zellen und BHK21-Zellen, die Wildtyp-huASB
bzw. huASB-Glykosylierungsmutanten exprimieren, könnte durch die unterschiedlichen
Promotoren verursacht sein. BS-Zellen exprimieren die huASB unter der Kontrolle des
RSV-LTR-Promotors während die anderen Zelllinien die huASB-cDNA Expression mit
dem SV40-Promotor steuern. Die Synthese des huASB-Proteins in transfizierten
BHK21-Zellen ist außerdem abhängig von der Anzahl der integrierten Kopien und
positionellen Effekten im Genom.
Nach metabolischer Markierung stabil transfizierter BHK21-Zellen, konnte die
Vorläuferform
der
huASB
nach
vier
Stunden
"Chase"
aus
dem
Medium
Ergebnisse
81
immunpräzipitiert
werden.
Um
die
Sekretion
der
verschiedenen
huASB-
Glykosylierungsmutanten mit der Sekretion der Wildtyp-huASB zu vergleichen, wurde
der Zell-Überstand von stabil transfizierten BHK21-Zellen nach vier Stunden geerntet
und analysiert. Die huASB wurde mittels ELISA quantifiziert. Von huASB-Wildtyp
bzw. jeder Glykosylierungsmutante wurden sieben bis neun Überstände untersucht, die
aus drei unabhängig voneinander aufgetauten Zellchargen gewonnen wurden. In jedem
ELISA wurde der Mittelwert der Wildtyp-huASB-Mengen in ng pro 106 Zellen
berechnet. Die Werte der huASB-Glykosylierungsmutanten wurden in jedem ELISA auf
den jeweiligen Wildtyp-Wert normiert. Aus diesen normierten Werten wurde daraufhin
ein Mittelwert errechnet und somit für jeden Überstand zu einem bestimmten Zeitpunkt
ein
auf
Wildtyp
normierter
Wert
erhalten.
Dabei
zeigte
sich,
dass
die
Glykosylierungsmutanten exprimierenden Zellen nur 50-70% huASB-Protein der
Wildtyp-Zellen sezernieren. Dagegen sezernieren BS-Zellen im Vergleich mit WildtypZellen ca. dreimal soviel huASB-Protein (Abb. 21B). BS-Zellen sind zusätzlich mit dem
kleinen Mannose-6-Phosphat-Rezeptor (MPR 46) transfiziert, was zu einer erhöhten
Sekretion lysosomaler Enzyme in den Extrazellulärraum führt (Chao et al., 1990).
Die Bestimmung der Synthese- und Sekretionsrate ermöglicht es, die Sekretion des
huASB-Proteins auf dessen Synthese zu normieren (Abb. 21C). Daraus resultiert, dass
Wildtyp-huASB und die Glykosylierungsmutanten N279Q und N366Q exprimierende
BHK21-Zellen eine vergleichbare Sekretion des huASB-Protein aufweisen. Jedoch wird
von BS-Zellen 1,8fach mal mehr huASB sezerniert als von Wildtyp-Zellen, was nur auf
die Koexpression des Mannose-6-Phosphat-Rezeptors zurückzuführen ist, da die
Sekretion auf die Synthese normalisiert wurde. Die Zellen mit der huASBGlykosylierungsmutante N188Q wiesen ebenfalls eine erhöhte Sekretion auf, die um ein
1,4faches über der Sekretion der Wildtyp-huASB exprimierenden Zellen liegt.
Möglicherweise hat der Austausch des Asparagin zu Glutamin an der Position N188,
bzw. das Fehlen des Oligosaccharids, einen Sekretionsrate steigernden Effekt, ähnlich
der zusätzlichen Transfektion mit dem kleinen Mannose-6-Phosphat-Rezeptor in den
BS-Zellen.
Ergebnisse
82
Abb. 21: Sekretion und Synthese des huASB-Proteins in Glykosylierungsmutanten und Wildtyp-huASB
exprimierenden Zellen
A) HuASB-Proteinsynthese: Die Proteine der BHK21-Zellen, die stabil Wildtyp-huASB oder huASBGlykosylierungs-mutanten exprimieren, wurden zwei Stunden mit 35S Met/Cys metabolisch markiert,
immunpräzipitiert und mit SDS-PAGE aufgetrennt. Die Banden wurden mit dem Programm
ImageMasterTM (Amersham Pharmacia Biotech) nach Exposition auf einer BAS-MS PhosphoimagerPlatte (Raytest) ausgewertet. Gezeigt ist die huASB-Protein-Syntheserate in 4h pro 106 Zellen, normiert
auf Wildtyp (WT, 100%). Die Mittelwerte und SE sind angegeben (n=2-3).
B) Sekretion des huASB-Proteins: Die Menge der sezernierten huASB in Überständen von stabil
transfizierten BHK21 wurde mit acht ELISAs gemessen. Da mehrere ELISAs verglichen wurden, mussten
die einzelnen Werte auf Wildtyp normalisiert werden. Mittelwerte und SE sind gezeigt (n=7-9); **p<0,01
signifikant unterschiedlich zu WT, N188Q, N279Q und N366Q; *p<0,05 signifikant unterschiedlich zu
N188Q, N279Q und N366Q.
C) Sekretionsrate: Die Sekretionsrate ist der Quotient aus Sekretion und Syntheserate der huASB
bezogen auf vier Stunden, 106 Zellen und normiert auf Wildtyp.
Ergebnisse
83
5.1.10 Sortierung der huASB-Glykosylierungsmutanten N188Q, N279Q und N366Q
Lysosomale Proteine werden zu 90-95% über die Endosomen in die Lysosomen sortiert.
Die Sortierung erfolgt über Bindung an Mannose-Phosphat-Rezeptoren. Die endosomale
bzw. lysosomale Sortierung der huASB-Glykosylierungsmutanten wurde mit Hilfe von
indirekter Immunfluoreszenz untersucht.
In
BHK21-Zellen,
die
Wildtyp-huASB
bzw.
huASB-Glykosylierungsmutanten
exprimieren, wurde die huASB mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz, über ein
Alexa 488 markiertes Streptavidin, grün angefärbt. Gleichzeitig wurden saure
Kompartimente mit dem azidophilen Farbstoff "LysoTracker Red" (Molecular Probes)
rot markiert (Abb. 22). Dieser Farbstoff ist leicht basisch und trägt ein Fluorophor. Er
akkumuliert in sauren Kompartimenten der Zelle und wird daher zum Anfärben von
lysosomalen und endosomalen Kompartimenten benutzt (Wunderlich et al., 2001; Zhao
and Morales, 2000). Als Resultat konnte eine Kolokalisation der huASB mit dem
azidophilen Farbstoff nachgewiesen (gelb; Abb. 22), und somit die Sortierung in die
späten Endosomen bzw. Lysosomen als sauren Kompartimenten in der Zelle gezeigt
werden. Die Mutationen der Glykosylierungsstellen N188, N279 und N366 haben
keinen Einfluss auf die Sortierung der huASB, d.h. die Oligosaccharid-Seitenketten an
den Positionen N188, N279 und N366 sind nicht essentiell für den Transport der huASB
in die Lysosomen.
Ergebnisse
84
Abb. 22: Indirekte Immunfluoreszenz zum Nachweis der Sortierung der huASB in die Lysosomen der stabil
mit huASB-Wildtyp und huASB-Glykosylierungsmutanten transfizierten BHK21-Zellen
A) Indirekte Färbung der huASB mit α-huASB-Antiserum aus Kaninchen, Biotin markiertem IgG aus
Ziege und Streptavidin-AlexaTM 488 (Molecular Probes; grün).
B) "LysoTracker Red" Färbung (rot). C) Überlagerung von A und B.
Ergebnisse
85
5.1.11 Prozessierung des huASB-Proteins in Wildtyp-huASB und huASBGlykosylierungsmutanten exprimierenden BHK21 Zellen
Die huASB wird in späten Endosomen bzw. in Lysosomen durch proteolytische
Prozessierung in drei Polypeptidketten (α, β und γ) gespalten. Um die Prozessierung des
huASB-Proteins zu untersuchen, wurden stabil mit Wildtyp-huASB und den
Glykosylierungsmutanten transfizierte BHK21-Zellen metabolisch markiert, und die
huASB aus dem Zell-Lysat immunpräzipitiert. Die Ergebnisse zeigen, dass bei der
Prozessierung
von
Wildtyp-huASB
und
huASB-Glykosylierungsmutanten
im
Zeitverlauf von 0h bis 4h "Chase" kein Unterschied in der Kinetik erkennbar ist: die
huASB war im Wildtyp und allen drei Glykosylierungsmutanten nach 2h zu etwa 50%
und nach 4h fast vollständig prozessiert (Abb. 23).
Die unprozessierte Form der Wildtyp-huASB wurde auf der SDS-PAGE bei ca.
66-68kDa nachgewiesen. Die Differenz von 10-12kDa zur errechneten Masse von
56kDa deutet auf fünf bis sechs Glykosylierungsstellen auf der huASB hin. Die
α-Untereinheit der Wildtyp-huASB hat nach Prozessierung auf der SDS-PAGE eine
Größe von 49-50kDa. Die Differenz von 6-7kDa zur errechneten Masse von 43kDa
deutet auf drei Glykosylierungsstellen auf der α-Untereinheit hin. Auf der
α-Untereinheit sind maximal vier Glykosylierungsstellen lokalisiert, von denen drei in
der vorliegenden Arbeit als sicher glykosyliert nachgewiesen wurden: N188, N279 und
N366 (s. 5.1.8.1). Des weiteren ist aufgrund der Ergebnisse aus der OligosaccharidAnalyse mittels Glykosidase-Spaltung eine Glykosylierung der Position N291 in
BHK21-Zellen unwahrscheinlich (s. 5.1.8.2).
Die Resultate zeigen, dass die Mutation einzelner Glykosylierungsstellen (N188, N279
und N366) die Prozessierung nicht verändern. Aufgrund der vollständigen
proteolytischen
Prozessierung
kann
ferner
geschlossen
werden,
dass
die
Glykosylierungsmutanten tatsächlich mit der Kinetik der Wildtyp-huASB in die späten
Endosomen bzw. die Lysosomen gelangen.
Ergebnisse
86
Abb. 23: Prozessierungs-Kinetik der Wildtyp-huASB und der Glykosylierungsmutanten N188Q, N279Q und
N366Q
Metabolische Markierung und „Chase“ von 0 bis 4 Stunden. A) Die unprozessierte Form der WildtyphuASB (WT und BS) ist in der reduzierenden SDS-PAGE bei 66-68kDa (bK),die prozessierte
α-Untereinheit ist bei 50kDa (K) nachweisbar. Bei den Glykosylierungsmutanten sind die
unprozessierten und prozessierten Formen (K) um ca. 2kDa kleiner. Diese Differenz entspricht dem
Verlust eines Oligosaccharids. B) Übersicht über die Kinetik der Prozessierung von huASB in Wildtyp-,
BS- und den drei Glykosylierungsmutanten. Angegeben ist der prozentuale Anteil der prozessierten Form
(α-Kette), der mit folgender Formel berechnet wurde:
Anteil prozessierte Form (α-Kette) in % = Pixel [prozessierte Form]*100/Pixel[unprozessierte Form + prozessierte Form].
Für den 2h "Chase"-Wert sind Mittelwerte und SE angegeben; n=3-5.
Ergebnisse
87
5.1.12 Bestimmung kinetischer Parameter von gereinigter Wildtyp-huASB und
huASB-Glykosylierungsmutanten
Zur Bestimmung der kinetischen Parameter Km und Vmax der Wildtyp-huASB und
huASB-Glykosylierungsmutanten, wurde rekombinantes huASB-Protein aus Zellüberständen von stabil transfizierten BHK21-Zellen gewonnen. Dazu wurden die Zellüberstände von Wildtyp, BS, N188Q, N279Q und N366Q exprimierenden Zellen durch
Ionenaustauschchromatographie und Gelfiltration gereinigt (Abb. 24A). Aus dem
Überstand von Wildtyp-huASB und Glykosylierungsmutanten exprimierenden BHK21
Zellen konnten zwei unterschiedliche Formen der huASB aufgereinigt werden, die
Arylsulfatase-Aktivität zeigten. Die Formen unterscheiden sich in ihrer Größe und
Ladung. Die huASB mit höherem Molekulargewicht hat an den Anionenaustauscher
gebunden und wurde nach anschließender Gelfiltration in der Fraktion C11 bzw. bei
N366Q in der Fraktion C12 eluiert. Die huASB-Form mit dem niedrigeren
Molekulargewicht dagegen hat nicht an den Anionenaustauscher gebunden und konnte
nach anschließender Gelfiltration in der Fraktion D2 eluiert werden (Abb. 24A).
Insgesamt konnten für jede huASB-Glykosylierungsmutante und huASB-Wildtyp
0,2-5µg huASB-Protein gereinigt werden.
Ergebnisse
88
A
ÜS
SO3-
K1
NH4+
A
SO3-
G
NH4+
SO3-
NH4+
SO3-
NH
C11 (huASB-Vorläuferform)
+
4
E1
E2
D
SO3-
K2
G
SO3SO3SO3
D2 (prozessierte huASB)
-
E3
Abb. 24: Aufreinigung huASB aus Zell-Überstand stabil transfizierter BHK21-Zellen über IonenaustauschChromatographie und Gelfiltration
A) Schema zur Aufreinigung huASB aus Zell-Überstand; B) Nicht-reduzierende SDS-PAGE mit ZellÜberstand und Eluaten aus den einzelnen Reinigungsschritten von Wildtyp-huASB exprimierenden
BHK21-Zellen. Mit Coomassie gefärbtes Polyacrylamid-Gel. ÜS: Zell-Überstand aus huASB
exprimierenden BHK21-Zellen; E1: Eluat aus erster Kationenaustauscher-Säule (K1), Fraktionen A3-A4;
E2: Eluat aus Anionenaustauschersäule (A), Fraktionen A7-A10; E3: Eluat aus zweiter
Kationenaustauscher-Säule (K2), Fraktionen B1-B4; C11: Fraktion nach Gelfiltration des Eluats aus der
Anionenaustauschersäule mit Arylsulfatase-Aktivität, Vorläuferform der huASB; D2: Fraktion nach
Gelfiltration des Eluats aus der zweiten Kationenaustauscher-Säule mit Arylsulfatase-Aktivität,
prozessierte Form der huASB; D2 ist aus zwei verschiedenen Reinigungen aufgetragen. Die Banden, die
im Western als spezifische huASB-Banden identifiziert wurden, sind mit einem Stern (*) markiert
(s. Abb. 25).
Ergebnisse
89
5.1.12.1 Charakterisierung der zwei aufgereinigten Formen der huASB
Um die beiden Formen aus den Fraktionen C11(C12) und D2 zu charakterisieren,
wurde zunächst die Größe in einer SDS-PAGE bestimmt. Unter nicht-reduzierenden
Bedingungen konnten im anschließenden Western-Blot in der C11 (C12) Fraktion zwei
bis maximal drei für huASB spezifische Protein-Banden identifiziert werden, wobei die
prominente Bande bei 66-68kDa zu finden war (Abb. 25). Unter reduzierenden
Bedingungen blieb die 66-68kDa-Bande als prominente Bande erhalten, ein bis zwei
weitere kleinere Banden waren ebenfalls zu erkennen. Es handelt sich bei der
prominenten 66-68kDa-Bande wahrscheinlich um eine nicht prozessierte aber
glykosylierte Vorläuferform der huASB, die aus einer Polypeptidkette besteht, welche
die α-, β- und γ-Untereinheiten umfasst. Die weiteren, viel schwächeren Banden stellen
vermutlich unterschiedlich glykosylierte Formen der huASB dar. Die prominente
66-68kDa-Bande in der C11-Fraktion aus Zell-Überstand der BS-Zellen läuft im
reduzierenden Gel bei ca. 50kDa und stellt somit eine prozessierte Form der huASB
dar. BS-Zellen sind zusätzlich mit dem kleinen Mannose-6-Phosphat-Rezeptor
transfiziert, der einen verstärkten Austausch des endosomalen Kompartiments mit der
Plasmamembran ermöglicht und so zu erhöhter Sekretion prozessierter lysosomaler
Proteine führt (Chao et al., 1990). Die unprozessierte Vorläuferform der WildtyphuASB und Glykosylierungsmutanten erreicht den Extrazellulärraum hingegen über
direkte Sekretion nach Passieren des Golgi-Apparates.
Andererseits finden sich in der D2-Fraktion in Wildtyp- und GlykosylierungsmutantenZell-Überstand unter nicht-reduzierenden Bedingungen zwei bis drei Banden, wobei
sich ein bis zwei prominente Banden bei 56 und 58kDa ausmachen lassen, die unter
reduzierenden Bedingungen bei ca. 50kDa laufen und somit prozessierte, aber
unterschiedlich glykosylierte Formen der huASB darstellen (Abb. 25). Die exakte
Größenbestimmung eines Proteins ist unter nicht-reduzierenden Bedingungen im SDSGel nicht möglich. Weiterhin können prozessierte Formen, die unter nichtreduzierenden Bedingungen noch durch Disulfid-Brücken zusammengehalten werden,
ein anderes Laufverhalten im SDS-Gel zeigen, als nicht prozessierte Formen, welche
nur aus einer Polypeptidkette bestehen. Durch N-terminale Sequenzierung mittels
Edmann-Abbau wurden in der D2-Fraktion die N-Termini der α, β- und γ-Untereinheiten eindeutig nachgewiesen (Schmidt, B., Göttingen, unpublizierte Daten).
Ergebnisse
90
Somit handelt es sich bei der D2-Fraktion wahrscheinlich um prozessierte, aber
unterglykosylierte Formen der huASB.
Abb. 25: Western-Blot der aus BHK21-Zell-Überstand gereinigten rekombinanten Wildtyp-huASB und
Glykosylierungsmutanten
Jeweils 1µg Protein wurde mit SDS-PAGE aufgetrennt. Die huASB wurde nach Protein-Transfer auf
eine PVDF-Membran mit anti-huASB-Antiserum detektiert.
β-ME: β-Mercaptoethanol; C11, C12, D2: aufgereinigte Fraktionen aus der Gelfiltration; M: Molekulargewichtsmarker. (Nicht-reduzierte huASB reagiert schlechter mit dem huASB-Antiserum als reduzierte
huASB.)
5.1.12.2 Bestimmung von Km und Vmax beider aufgereinigter Formen der huASB
Für
eine
geplante
Enzymersatztherapie
soll
aus
Zell-Überstand
gereinigtes
rekombinantes huASB-Enzym eingesetzt werden. Deshalb wurden die enzymatischen
Parameter Km und Vmax der unprozessierten und prozessierten aus Zell-Überstand
gereinigten Formen der Wildtyp-huASB und huASB-Glykosylierungsmutanten
bestimmt. Dazu wurde die Enzymaktivität für verschiedene Substratkonzentrationen
zwischen 0,1mM bis 10mM für Wildtyp und Glykosylierungsmutanten mit dem
artifiziellen Substrat p-Nitrocatecholsulfat gemessen (Tab. 3). Nach Quantifizierung der
huASB in den einzelnen Fraktionen mit Hilfe eines ELISAS konnte die spezifische
ASB-Aktivität berechnet werden. Die Auswertung erfolgte mittels der LineweaverBurk- und den Eadie-Hofstee-Diagramme. Km und Vmax wurden aus den spezifischen
Enzymaktivitäten (V)
und
Substratkonzentrationen (S)
Geradengleichungen errechnet (Abb. 26; Tab. 3).
aus
den
jeweiligen
Ergebnisse
91
Lineweaver-Burk-Diagramm
A
0,035
0,030
y= 0,0052x + 0,0097
0,025
1/V
0,020
0,015
y= 0,003x + 0,0061
0,010
0,005
-3
-2
-1
0
1
N366Q Vorläufer
N366Q prozessiert
B
2
3
4
5
300
350
1/S
Eadie-Hofstee-Diagramm
180
160
140
120
V
100
Y= -0,4936x + 165,89
80
60
40
y= -0,5238x + 104,01
20
0
0
50
100
N366Q Vorläufer
N366Q prozessiert
150
200
250
V/S
Abb. 26: Diagramme zur Berechnung der enzymatischen Parameter Km und Vmax für die huASBGlykosylierungsmutante N366Q
A) Lineweaver-Burk-Diagramm und B) Eadie-Hofstee-Diagramm. Dargestellt sind eine lineare
Regression und die Geradengleichungen, aus denen Km und Vmax bestimmt wurden. V: spezifische
Enzymaktivität der ASB; S: Substratkonzentration (p-Nitrocatecholsulfat-Substrat).
Ergebnisse
92
Die Km-Werte der huASB-Glykosylierungsmutanten unterscheiden sich nicht
wesentlich und liegen um 0,5mM (gemittelt). Dagegen liegt der Km-Werte für die
unprozessierte Vorläuferform der gereinigten Wildtyp-huASB aus stabil transfizierten
BHK21 um ein 5faches höher als bei den huASB-Glykosylierungsmutanten. Außerdem
ist der Km-Wert der Wildtyp-Vorläuferform mehr als doppelt so hoch wie der Km-Wert
der reifen, prozessierten Wildtyp-huASB (Abb. 27; Tab. 3). Bei den zwei aus BSZellen gereinigten Formen handelt es sich jeweils um prozessierte, aber unterschiedlich
glykosylierte Wildtyp-huASB. Deren Km-Werte unterscheiden sich kaum und liegen im
Bereich der Km-Werte der huASB-Glykosylierungsmutanten.
Betrachtet man Vmax der verschiedenen Formen der huASB, fällt zunächst auf, dass die
maximale Geschwindigkeit für die Substratumsetzung der Glykosylierungsmutanten
N188Q und N279Q sowohl in den Vorläuferformen, als auch in den reifen Formen der
huASB um ein Mittel von 25U/mg ASB-Protein liegen (Tab. 3). Im Vergleich dazu
zeigen die prozessierten und unprozessierten N366Q-Glykosylierungsmutanten eine
vierfach bzw. sechsfach erhöhte Vmax. Weiterhin ist Vmax für die prozessierte Form von
N366Q mehr als doppelt so hoch wie für die prozessierte, reife Form der WildtyphuASB. Auffällig ist, dass die unprozessierte Vorläuferform der Wildtyp-huASB die
höchste Vmax im Vergleich mit den anderen unprozessierten Formen der huASB zeigt.
Die prozessierte, glykosylierte huASB-Form der BS-Zellen zeigt eine der aus WildtyphuASB-Zellen gewonnenen, unprozessierten huASB vergleichbare Vmax. Die Vmax der
prozessierten, aber unterglykosylierten Form der BS-Zellen dagegen beträgt nur ein
fünftel der Vmax der glykosylierten Form.
Zusammengefasst ist die Substrataffinität der drei huASB-Glykosylierungsmutanten
höher als die Substrataffinität der Wildtyp-huASB. Allerdings ist Vmax für die
Glykosylierungsmutanten N188Q und N279Q niedriger als für Wildtyp-huASB. Nur
N366Q zeigt eine höhere Vmax als Wildtyp-huASB und könnte einen therapeutischen
Vorteil bei Enzymersatztherapien für die MPS VI bieten. In diesem Zusammenhang
muss bei der Reinigung rekombinanter huASB zum Zweck des Enzymersatzes darauf
geachtet werden, dass die huASB in unterschiedlichen Formen mit verschiedenen
Enzymaktivitäten auftreten kann.
Ergebnisse
93
Tab. 3: Kinetische Parameter gereinigter Proteinfraktionen prozessierter und unprozessierter WildtyphuASB und Glykosylierungsmutanten
WT
WT
N188Q
N188Q
N279Q
N279Q
N366Q
N366Q
BS
BS
unproz.
proz.
unproz.
proz.
unproz.
proz.
unproz.
proz
proz.
proz.
(C11)
(D2)
(C11)
(D2)
(C11)
(D2)
(C12)
(D2)
(C11)
(D2)
65
105
8
3
31
63
84
21
23
322
0,1
-
6
-
-
8
4
17
28
43
6
0,25
16
18
-
-
17
9
29
59
78
12
0,5
56
27
6
12
23
13
51
72
132
19
0,75
63
37
-
-
28
18
66
107
150
26
ASB µg/ml (ELISA)
Substratkonzentration
Spezifische Enzymaktivität (U/mg)
1
80
33
8
14
33
19
74
103
193
28
2,5
91
49
11
18
35
21
93
148
233
40
5
85
36
15
17
35
23
99
165
242
42
10
75
44
13
18
28
22
83
148
216
39
Km
2,64
1,01
0,77
0,32
0,35
0,52
0,54
0,49
0,51
0,77
Vmax
213
70
15
19
38
26
103
164
256
49
nach Lineweaver-Burk
R
0,839
0,968
0,966
0,966
0,979
0,966
0,988
0,991
0,992
0,998
p
0,0038
<0,0001
0,0026
0,0026
<0,0001
<0,0001
<0,0001
<0,0001
<0,0001
<0,0001
Km
---------
0,44
0,78
0,31
0,29
0,45
0,52
0,49
0,5
0,71
Vmax
---------
47
15
19
36
25
104
166
259
47
R
-0,163
-0,613
-0,813
-0,920
-0,798
-0,925
-0,889
-0,918
-0,913
-0,945
p
0,37
0,02
0,036
0,0098
0,0028
0,00014
0,00045
0,00018
0,00021
<0,0001
nach Eadie-Hofstee
Für die gereinigten Fraktionen C11 (C12) und D2 von Wildtyp-huASB und Glykosylierungsmutanten
wurden aus den Geradengleichungen des Lineweaver-Burk Diagramms und Eadie-Hofstee Diagramms
Km und Vmax bestimmt. Angegeben sind die spezifischen huASB-Enzymaktivitäten für 0,1mM bis 10mM
Substrat p-Nitrocatecholsulfat in U/mg ASB-Protein; die Menge huASB in der jeweiligen Fraktion in
µg/ml (mit ELISA quantifiziert), Km und Vmax und die dazugehörigen Korrelationskoeffizienten (R) und
die Signifikanzen (p) der linearen Korrelation. Bei nicht-signifikantem Zusammenhang mit p>0,05
wurden die errechneten Werte nicht angegeben.
Ergebnisse
94
Km
3,0
Km (mM)
2,5
2,0
C11
1,5
D2
1,0
0,5
0,0
WT
N188Q
N279Q
N366Q
BS
Vmax
300
Vmax (U/mg)
250
200
C11
150
D2
100
50
0
WT
N188Q
N279Q
N366Q
BS
Abb. 27: Km und Vmax gereinigter prozessierter und unprozessierter huASB aus Wildtyp und
Glykosylierungsmutanten
A) Km und B) Vmax wurden aus dem Lineweaver-Burk-Diagramm errechnet. Bei C11 handelt es sich um
unprozessierte und bei D2 um prozessierte Formen gereinigter huASB. Eine Ausnahme bildet die C11Fraktion der BS-Zellen, die eine prozessierte Wildtyp-huASB darstellt.
5.1.12.3 Bestimmung enzymatischer Parameter der huASB in situ in Zellüberständen und
Zell-Lysaten
Die Enzymaktivität von Wildtyp-huASB und Glykosylierungsmutanten wurde mit dem
artifiziellen Substrat p-Nitrocatecholsulfat in Zellüberständen und Zell-Lysaten von
stabil transfizierten BHK21-Zellen bestimmt, und auf den, mit Hilfe von ELISA
ermittelten,
huASB-Gehalt
bezogen.
Im
Überstand
von
Wildtyp-huASB
exprimierenden BHK21-Zellen wurde eine signifikant höhere spezifische ASBAktivität (p<0,05) als im Überstand der die huASB-Glykosylierungsmutanten N188Q
Ergebnisse
95
und N366Q exprimierenden BHK21-Zellen gemessen (Tab. 4). Zu N279Q konnte kein
signifikanter Unterschied festgestellt werden. Die im Zell-Lysat gemessenen
spezifischen Aktivitäten der huASB-Glykosylierungsmutanten N188Q und N279Q
unterschieden sich nicht von der bei Wildtyp-huASB gemessenen spezifischen
Aktivität. Sie liegt bei 90U/mg ASB-Protein. Die spezifische Aktivität der N366Q
Glykosylierungsmutante im Zell-Lysat ist signifikant höher (p<0,01) als die der beiden
anderen Glykosylierungsmutanten- und Wildtyp-huASB, sie liegt bei 132 U/mg ASBProtein (Tab. 4).
Der Unterschied zwischen spezifischer Aktivität im Überstand und im Zell-Lysat
könnte darauf zurückzuführen sein, dass sich unterschiedliche Formen der huASB im
Überstand bzw. in der Zelle befinden. Die Abweichungen zu den Vmax der gereinigten
Fraktionen der huASB (s. 5.1.12.2) sind wahrscheinlich einerseits in dem Vorkommen
verschiedener Formen der huASB in der Zelle und im Zell-Überstand in situ begründet.
Andererseits könnten die unterschiedlichen Enzymaktivitäten auch auf die unterschiedlichen Empfindlichkeiten auf zum Teil extreme Reinigungsbedingungen (pH-Wert,
Ionenstärke) zurückzuführen sein.
Tab. 4: Spezifische Aktivitäten der huASB aus Zell-Überstand und Zell-Lysaten von BHK21-Zellen
spezifische huASB-Aktivitäten im
spezifische huASB-Aktivitäten im
Überstand
Zell-Lysat
in U/mg
in U/mg
WT
43 ± 2,5*
95 ± 6,5
N188Q
30 ± 4,0
84 ± 9,9
N279Q
37 ± 6,9
96 ± 4,5
N366Q
35 ±1,0
132 ± 6,5**
BS
30 ± 3,1
86 ± 13,3
ASB-Aktivitäten wurden in den Überständen und Zell-Lysaten von stabil transfizierten BHK21-Zellen
gemessen. Die huASB-Aktivität wurde mit dem Substrat p-Nitrocatecholsulfat bestimmt und huASBProtein mit ELISA quantifiziert. Die spezifische Aktivität (U/mg) wurde berechnet. Mittelwerte ± SE
sind angegeben; n=6-9. **p<0,01 signifikant unterschiedlich zu WT, N188Q, N279Q und BS. *p<0,05
signifikant unterschiedlich zu N188Q, N366Q und BS.
Ergebnisse
5.2
96
Entwicklung eines für rekombinante humane ASB immuntoleranten
MPS VI-Mausmodells für Enzymersatztherapie-Studien
Bei Injektionen humaner Arylsulfatase B (huASB) in ASB-defiziente Mäuse im
Rahmen einer Pilotstudie zur Enzymersatztherapie wurden Immunreaktionen auf das
zugeführte huASB-Protein beobachtet, die bis zum anaphylaktischen Schock führten
(Evers, 1996). Deshalb wurde ein transgenes, für die huASB immuntolerantes,
Mausmodell huASBC91STg generiert. Von Brooks et al. wurde gezeigt, dass ein
Austausch des Cystein C91 im aktiven Zentrum der huASB durch Serin zu einer
vollständig inaktiven aber stabilen Mutante der ASB führt (Brooks et al., 1995).
Weiterhin wurde von Sly et al. nachgewiesen, dass, mit Hilfe einer inaktiven Mutante
der humanen β-Glukuronidase, eine für humane β-Glukuronidase immuntolerante
Mauslinie auf einem MPS VII-Hintergrund generiert werden konnte (Sly et al., 2001).
Diese transgene Maus ermöglichte Enzymersatztherapie-Studien mit humanem
β-Glukuronidase-Enzym am Mausmodell. Die huASBC91S transgene Mauslinie soll
die enzymatisch inaktive, aber stabile Mutante C91S der humanen ASB exprimieren.
Nach Kreuzung mit dem ASB-defizienten Mausmodell (ASB-/-; Evers et al., 1996),
sollte das Tier keine ASB-Aktivität zeigen und immuntolerant für humane ASB sein.
5.2.1
Austausch des Cystein 91 im aktiven Zentrum der huASB gegen Serin
Für die C91S Mutation der huASB ist bekannt, dass die ASB-Aktivität in vitro
vollständig eliminiert ist, ohne dass die Proteinstruktur beeinflusst wird (Brooks et al.,
1995). Zur Generierung einer transgenen Maus, welche die huASBC91S exprimiert,
wurde mit dem Plasmid pcASBX und den Primern AB91Sc und AB91Snc eine
ortsspezifische Mutagenese durchgeführt. Dabei wurde der Cysteinrest C91 (Codon:
TGC) im aktiven Zentrum der huASB gegen einen Serinrest (Codon: TCG)
ausgetauscht. Durch die Mutation entsteht in der cDNA der huASB eine zusätzliche
Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym AccI. Eine Restriktionsanalyse mit AccI
nach Mutagenese diente der Identifizierung von Bakterienkolonien, die das Plasmid mit
der mutierten Form der huASB-cDNA enthielten. Drei positive Klone wurden
ausgewählt und mit dem Primer AB9c sequenziert. Alle drei enthielten die gewünschte
Ergebnisse
97
Mutation. Um weitere Mutationen auszuschließen, wurde das Insert der aus dem
Bakterienklon Nr.3 isolierten Plasmid-DNA zusätzlich mit den Primern M13(-34),
AB135c, AB23c, AB112c (s. Anhang) vollständig sequenziert. Dadurch wurden
zusätzliche Mutationen ausgeschlossen.
5.2.2
Generierung eines Expressionsplasmids zur Expression der huASBC91ScDNA unter der Kontrolle eines β-Aktin Promotors
Die huASBC91S-cDNA wurde in den eukaryotischen Expressionsvektor ptC
(s. Anhang) kloniert, der den Hühnchen β-Aktin Promotor plus Intron 1 und das
Kaninchen β-Globin Intron mit dem SV40-Polyadenylierungssignal enthält. Der Vektor
ptC wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI aufgeschnitten und, nach Abspalten der
endständigen Phosphatgruppen, mit der Klenow Polymerase aufgefüllt. Die
huASBC91S-cDNA wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI aus dem Plasmid pcASBX
herausgeschnitten und die überhängenden Enden mit Klenow Polymerase aufgefüllt.
Nach Ligation wurden DH5α E.coli Bakterien mit dem Konstrukt transformiert.
Konstrukte mit der richtigen Orientierung wurden durch eine XbaI/EcoRV
Restriktionsanalyse identifiziert. Klon 17 wurde als positiver Klon mit der richtigen
Orientierung ausgewählt (Abb. 28). Der Vektor wird im folgenden als ptChuASBC91S
bezeichnet (Abb. 29).
Um
Mutationen
auszuschließen
wurden
beide
DNA-Stränge
des
Plasmids
ptChuASBC91S mit folgenden Primern sequenziert: AB9c, AB135c, AB23c, AB112c,
AB12nc, AB22nc, AB25nc und βGInc. Es konnten weitere Mutation ausgeschlossen
werden.
Ergebnisse
98
Abb. 28: Restriktionsanalyse nach Ligation und Transformation des ptChuASBC91S in DH5α
α E. coli.
Die isolierte Plasmid-DNA wurde mit den Restriktionsenzymen XbaI und EcoRV in einem Ansatz
verdaut. Aufgetragen wurde jeweils unverdautes Plasmid und XbaI/EcoRV und verdautes Plasmid. Die
beiden DNA-Fragmente (0,6kb und 6,8kb), die einen positiven Bakterienklon charakterisieren, sind mit
einer Pfeilspitze (K) markiert. Ma: 1kb-DNA-Leiter; 2, 17: positive Bakterienklone aus der
Transformation; 3: Bakterienklon mit falscher Orientierung des huASB-cDNA-Inserts; 4, 7: linearisiertes
Plasmid; ptC: Plasmid ohne huASB-cDNA.
EcoRI
XbaI
ß-Aktin Promotor
KpnI
XhoI
AccI
SalI
ClaI
BamHI
BamHI
EcoRV
* C91S
AccI
ApaI
huASBcDNA
ptChuASBC91S
BamHI
(7475 bp)
ß-Globin Intron
EcoRI
SV40 Poly A
SacI
XhoI
NotI
Abb. 29: Vektorkarte von ptChuASBC91S
Dargestellt ist der Vektor ptChuASBC91S mit dem Hühnchen β-Aktin Promotor inklusive Intron 1 und
dem Kaninchen β-Globin-Intron mit dem SV40-Polyadenylierungssignal. Das huASB-cDNA-Insert trägt
die Mutation C91S, durch die eine weitere AccI-Erkennungssequenz eingeführt wurde. Eingezeichnet
sind relevante Restriktionsschnittstellen.
Ergebnisse
5.2.3
99
Expressionskontrolle des Plasmid-Konstrukts ptChuASBC91S in BHK21Zellen
Um das Plasmid-Konstrukt ptChuASBC91S auf Funktionalität zu testen, wurde dieses
transient in BHK21-Zellen transfiziert. Mit indirekter Immunfluoreszenz wurde
anschließend
die
huASBC91S
mit
einem
huASB-spezifischen
Antiserum
nachgewiesen. Es konnte gezeigt werden, dass tatsächlich ein huASBC91S-Protein in
den transfizierten BHK21-Zellen synthetisiert und in die Lysosomen sortiert wird
(Abb. 30).
A
B
C
Abb. 30: Indirekte Immunfluoreszenz zum Nachweis der Proteinexpression und lysosomalen Sortierung der
huASBC91S in transient transfizierten BHK21-Zellen
Transient in BHK21-Zellen transfizierte huASBC91S wurde mit Kaninchen anti-huASB-Antiserum
(1:400) und anti-Kaninchen-IgG aus der Ziege, das mit Texas Red markiert war (1:1000), angefärbt.
HuASBC91S-Protein zeigt die typische perinukleäre, vesikuläre lysosomale Färbung.
A) mit huASBC91S (ptChuASBC91S) transient transfizierte BHK21-Zellen;
B) mit leerem Vektor (pBHE) transient transfizierte BHK21-Zellen;
C) mit Wildtyp-huASB (pBEAXWT) transient transfizierte BHK21-Zellen.
Ergebnisse
5.2.4
100
Generierung einer für humane Arylsulfatase B immuntoleranten Mauslinie
Die für die humane ASB immuntolerante Mauslinie wurde in Zusammenarbeit mit der
Firma Eurogentec generiert. Zur Generierung der transgenen Maus wurde das PlasmidKonstrukt ptChuASBC91S (Abb. 29) verwendet. Um den Vektorhintergrund zu
entfernen, wurde ptChuASBC91S mit dem Restriktionsenzym XhoI verdaut und das
resultierende 4,4kb DNA-Insert nach Agarose-Gelelektrophorese isoliert. Das DNAFragment wurde gereinigt und auf eine Konzentration von 1µg/µl eingestellt. Die
Reinheit wurde mittels photometrischer Analyse und auf einem Agarose-Gel überprüft.
Es wurden in zwei Injektionsrunden 203 befruchtete Oozyten von superovulierten
FVB/Nico Mäusen mit dem linearisierten Konstrukt injiziert. Nach 2 Tagen in vitro
Kultivierung wurden 189 Embryonen in insgesamt sieben pseudoschwangere Weibchen
des Mausstamms FVB/Nico reimplantiert. Drei Wochen nach Injektion wurden die
Nachkommen geboren, die im Alter von vier Wochen auf Integration des Transgens
überprüft wurden (Abb. 31 und 32). Insgesamt waren nach der ersten Injektionsrunde
12, nach der zweiten Injektionsrunde 6 Tiere geboren worden.
5.2.5
Nachweis transgener "Founder"
Zum Nachweis der Integration des Transgens wurde aus Mausschwanzbiopsien
genomische DNA gewonnen und eine PCR mit den Primern AB14c und AB25nc
durchgeführt. Es konnte ein spezifisches DNA-Fragment von 200bp in 3 von 18 Tieren
(8989, 8993 und 9278) nachgewiesen werden (Abb. 31; für 9278 Daten nicht gezeigt).
Diese Tiere haben das Transgen in ihr Genom integriert und stellen die "Founder"
(Gründer) für die neue transgene Mauslinie dar.
Die Ergebnisse wurden im Southern-Blot verifiziert (Abb. 32).
Die Mausschwanzbiopsien 8987-8998 aus der ersten Injektionsrunde und die in der
PCR positive Probe 9278 aus der zweiten Injektionsrunde wurden in einem SouthernBlot untersucht. Als Sonde wurde ein 1,8kb XbaI-Fragment aus pcASBX (s. Anhang)
verwendet, das die gesamte huASB-cDNA enthält. Im Southern-Blot hybridisierte die
radioaktiv markierte Sonde nur mit den Proben mit den Nummern 8989 und 9278, die
Probe Nummer 8993 war negativ (Abb. 32).
Ergebnisse
101
Abb. 31: PCR von genomischer DNA aus Mausschwanzbiopsien der potentiellen transgenen "Founder" zum
Nachweis der Integration der huASBC91S-cDNA
Dargestellt sind die Ergebnisse von Mäusen aus der ersten Injektionsrunde. Die spezifische huASBBande von 200bp ist mit einer Pfeilspitze (K) markiert. Die Banden um 500bp und unter 100bp stellen
unspezifische Banden dar, da sie auch in der Negativkontrolle (N), einer nicht transgenen FVB/Nico
Maus auftreten. Als Positivkontrolle dienten 20ng Vektor ptChuASBC91S (P). Ma: 1kb Marker. Das
Bild wurde uns freundlicherweise von Eurogentec zur Verfügung gestellt. Die Maus mit der Nummer
9278 zeigte ebenfalls ein spezifisches huASB-cDNA-Fragment (hier nicht gezeigt).
Abb. 32: Southern-Blot von genomischer DNA aus Mausschwanzproben der potentiellen transgenen
"Founder"
Genomische DNA aus den Mausschwänzen 8987 bis 8998 und 9278 wurde mit BamHI verdaut, nach
Gelelektrophorese auf einen Hybond-N Filter transferiert und mit der radioaktiven XbaI-Sonde
(s. Anhang) hybridisiert. Nur die Maus mit der Nummer 8989 aus der ersten Injektionsrunde zeigt eine
hybridisierende Bande bei 1,8kb, die dem huASB-cDNA-Insert entspricht. Aus der zweiten
Injektionsrunde hybridisiert die Probe Nr. 9278. Die Positivkontrolle BS zeigt drei Banden von 4,5kb,
5kb und 6kb, was auf drei Integrationsorte der huASB-cDNA ins Genom hindeutet. Diese Zellen sind mit
dem Vektor pRSVN.4S transfiziert, der im Gegensatz zu ptChuASBC91S keine BamHIErkennungssequenz besitzt.
B: untransfizierte BHK21-Zellen; BS: BHK21-Zellen, die Wildtyp-huASB unter dem LTR-Promotor des
Rous-Sarkoma-Virus exprimieren und zusätzlich noch mit dem MPR 46 transfiziert sind; M: Marker.
Ergebnisse
5.2.6
102
Phänotyp der transgenen Maus huASBC91STg
Bei den Mäusen mit der Nummer 8989 und 9278 handelt es sich um männliche, für
huASBC91S transgene Tiere. Sie wurden zur Generierung einer transgenen für humane
ASB immuntoleranten Mauslinie mit weiblichen MPS VI-Mäusen (Evers et al., 1996)
verpaart. Die Nachkommen wurden auf Integration der DNA des huASBC91S Gens
mittels PCR untersucht. Bisher konnte in 18 von 47 Nachkommen der F1-Generation
eine Integration der huASB-cDNA nachgewiesen werden. Diese 18 Tiere sind
heterozygot für murine ASB (+/-) und transgen für huASBC91S. Sowohl der Phänotyp
der zwei "Founder"-Tiere (5 Monate alt), als auch der Phänotyp der 18 Tiere der F1Generation, die zum Zeitpunkt des Verfassens dieser Arbeit sechs Wochen alt waren,
scheint sich nicht von dem der Wildtyp-Mäuse zu unterscheiden. Die DNA-Integration
wird bei der F1-Generation mittels Southern-Blot verifiziert. Durch weitere Kreuzung
der Mäuse des Genotyps ASB+/-/huASBC91STg mit Geschwister-Tieren wird eine ASBdefiziente, die inaktive huASBC91S exprimierende Mauslinie mit dem Genotyp
ASB-/-/huASBC91STg generiert.
Abb. 33: Transgene "Founder"-Maus Nr. 9278
Gezeigt ist eine männliche 5 Monate alte Maus, die das Transgen huASBC91S in ihr Genom integriert
hat (genetischer Hintergrund: FVB/Nico). Der Phänotyp erscheint normal.
Diskussion
6.
103
Diskussion
Die Mukopolysaccharidose VI (MPS VI) ist bis heute nicht heilbar. Die Therapie der
Patienten erfolgt weitgehend symptomatisch. Erste Ansätze für eine kausale Therapie
werden in Form von allogenen Knochenmark-Transplantationen bei MPS VI-Patienten
durchgeführt
(Herskhovitz
et
al.,
1999).
Zugleich
werden
im
Tiermodell
Enzymersatztherapie und somatische Gentherapie getestet. Für die Therapieansätze zur
Behandlung der MPS VI ist es notwendig, stabiles, enzymatisch aktives, rekombinantes
humanes Arylsulfatase B (huASB)-Protein in therapeutisch ausreichenden Mengen zur
Verfügung zu stellen. Die Verfügbarkeit des huASB-Proteins für die defizienten Zellen
des MPS VI-Patienten kann z.B. durch verstärkte Synthese oder verstärkte Sekretion
eines rekombinanten huASB-Proteins in Donor-Zellen erreicht werden. Im folgenden
werden die essentiellen Charakteristika wie Synthese, Sekretion, Endozytose, Km und
Vmax der Wildtyp-huASB und huASB-Glykosylierungsmutanten diskutiert. Diese
Diskussion geschieht unter dem Gesichtspunkt der Bereitstellung eines für
therapeutische Zwecke optimalen ASB-Enzyms sowohl für die Enzymersatztherapie als
auch im Rahmen der somatischen Gentherapie. Darüber hinaus ist die Sortierung und
Prozessierung der Wildtyp-huASB und der huASB-Glykosylierungsmutanten von
grundlegendem Interesse.
6.1
Gewinnung rekombinanter humaner Arylsulfatase B
Die Generierung eukaryotischer Zelllinien, die ein rekombinantes Protein stabil
exprimieren, ist im allgemeinen nicht trivial. Schon die Integration des Fremdgens in
das eukaryotische Genom kann ein Problem darstellen. Es kann zur Integration von
Teilfragmenten der cDNA kommen, die zu keinem Transkriptionsprodukt führen.
Weiterhin kann die Translation der spezifischen mRNA gestört sein. Auch verlieren
eukaryotische Zellen oft integrierte Fremd-DNA nach mehreren Zellkultur-Passagen
durch möglicherweise entstehende Selektionsnachteile.
Diskussion
104
Für die huASB-Glykosylierungsmutanten N188Q, N279Q und N366Q konnten
BHK21-Zelllinien gewonnen werden, die stabiles, enzymatisch aktives, rekombinantes
huASB-Protein exprimieren (s. 5.1.3).
Jedoch konnten für die huASB-Glykosylierungsmutanten N426Q bzw. N426S und die
Doppelmutante N279Q/N426Q keine stabil exprimierenden BHK21-Zelllinien generiert
werden. Sowohl in der huASB-Glykosylierungsmutante N426Q als auch in der
Glykosylierungsmutante N426S konnte in einigen wenigen primären Zellklonen
enzymatisch aktives huASB-Protein nachgewiesen werden. Die huASB-Enzymaktivität
ging jedoch nach drei bis vier Zellkulturpassagen regelmäßig verloren. Für die
Doppelmutante N279Q/N426Q konnte in den primären Zellklonen keine huASBProteinexpression gefunden werden. Da insgesamt für die Position N426 dreimal so
viele primäre Zellklone und auch je Glykosylierungsmutante insgesamt dreimal so viele
Subklone
-
im
Vergleich
zu
Wildtyp-huASB
und
den
anderen
huASB-
Glykosylierungsmutanten - untersucht wurden, kann eine unzureichende Anzahl
untersuchter Zellklone als Ursache ausgeschlossen werden.
Um der instabilen Expression von enzymatisch aktivem rekombinantem huASB-Protein
in
den
Glykosylierungsmutanten
N426Q,
N426S
und
der
Doppelmutante
N279Q/N426Q auf den Grund zu gehen, wurde die Integration der huASB-cDNA und
die Transkription in primären Zellklonen nach stabiler Transfektion untersucht. Es
konnte gezeigt werden, dass 79-90% der untersuchten primären Zellklone der huASBGlykosylierungsmutante N426Q bzw. N279Q/N426Q die huASB-cDNA integriert
hatten.
Weiterhin
konnte
in
77%
der
primären
Zellklone
der
huASB-
Glykosylierungsmutante N426Q ein spezifisches huASB-Transkript nachgewiesen
werden. Das belegt, dass das Problem weder in der Integration noch in der
Transkription der huASB-cDNA liegt.
Möglicherweise bildet die Expression des an der Position N426 mutierten huASBProteins einen Selektionsnachteil für die BHK21-Zellen. Die artifizielle Überexpression
des an der Position 426 mutierten huASB-Proteins könnte den gesamten
Zellstoffwechsel der BHK21-Zellen stören. Dieser Selektionsnachteil müsste jedoch ein
spezifisches Merkmal der N426Q Glykosylierungsmutante sein, da die Generierung
stabil huASB-Protein exprimierender Zelllinien von Wildtyp-huASB und den huASBGlykosylierungsmutanten N188Q, N279Q und N366Q erfolgreich war. Auch die BSZellen, welche doppelt soviel huASB Protein synthetisieren wie stabil mit WildtyphuASB transfizierte BHK21-Zellen, sind in der Lage, sich über viele Zellkulturpassagen
Diskussion
105
zu teilen und die Wildtyp-huASB stabil zu exprimieren. Allerdings weisen BS-Zellen
eine geringere Proliferationsrate als untransfizierte BHK21-Zellen auf (Daten nicht
gezeigt). Geringere Proliferationsraten transfizierter Zellklone könnten bei den huASBGlykosylierungsmutanten N426Q bzw. N426S und N279Q/426Q zur Verdünnung und
damit
zum
Verlust
der
erfolgreich
transfizierten
Zellklone
führen.
Um
Selektionsnachteile für Zellen, welche nach Transfektion die huASB-cDNA integriert
haben, zu vermeiden, wurden daher in weiteren Transfektionsrunden primäre Zellklone
sofort nach einer Passage subkloniert. Da aber auch diese Subklone keine huASBEnzymaktivität
über
mehrere
Zellteilungen
zeigten,
kann
eine
geringere
Proliferationsrate nicht die Ursache für fehlende huASB-Enzymaktivität in den mit
huASB N426Q, N426S und N279Q/N426Q transfizierten BHK21-Zellen sein. Eine
weitere Ursache des Rückgangs der huASB-Enzymaktivität kann in dem Verlust der
zunächst stabil integrierten huASB-cDNA liegen. Die Antibiotikaresistenz bleibt dabei
scheinbar erhalten, da die Zellklone ständigem Selektionsdruck durch das Antibiotikum
ausgesetzt sind. Der Verlust der huASB-Enzymaktivität könnte auch in einer durch die
Mutation an der Position N426 entstandenen Instabilität des huASB-Proteins liegen, die
zum frühzeitigen Abbau der huASB-Glykosylierungsmutante N426Q bzw. N426S
führt. Da aber sowohl huASB-Protein nachgewiesen als auch huASB-Enzymaktivität in
den huASB-Glykosylierungsmutanten gemessen werden konnte, ist eine frühzeitige
Degradation der huASB-Glykosylierungsmutanten N426Q und N426S im ER durch den
Prozess der "quality control" unwahrscheinlich. Außerdem konnte in transient
transfizierten BHK21-Zellen die endosomale bzw. lysosomale Sortierung der huASBGlykosylierungsmutanten N426Q, N426S und N279Q/N426Q zumindest qualitativ
nachgewiesen werden (s. 5.1.7). Andere netzförmige, perinukleäre Strukturen (Abb. 15)
deuten eher auf eine Lokalisation im ER hin. Aus oben genannten Gründen ist es aber
unwahrscheinlich, dass es sich hierbei um eine Fehlsortierung oder Degradation des
Proteins im ER handelt. Die Beobachtung dieser netzförmigen Muster bei anderen
Glykosylierungsmutanten unterstützt die Vermutung eines Färbeartefakts (Daten nicht
gezeigt).
Bezüglich der Stabilität des huASB-Proteins N426Q und N426S konnte in ComputerSimulationen durch den Austausch von Asparagin N426 gegen Glutamin eine
Veränderung in der Sekundärstruktur-Vorhersage nach Garnier-Robson (Garnier, 1978)
und nach Rost (Rost et al., 1994) beobachtet werden. Die Methode von Garnier-Robson
gibt die Neigung (propensity) eines Aminosäurerestes an, in einer bestimmten Struktur
Diskussion
106
zu existieren. Es ist ein statistischer Ansatz, der auf der Untersuchung bekannter
Kristallstrukturen beruht, um Regionen als α-Helices, β-Faltblätter, β-Loops oder Coils
zu definieren. Mit der Methode des "protein predict" Servers des Embl-Instituts nach
Rost, die dagegen auf neuronalen Netzwerken und auf evolutionären Informationen
multipler Sequenzvergleiche (Rost, 1996) aufbaut, können Protein-SekundärstrukturVorhersagen mit einer Genauigkeit von über 70% gemacht werden. Aus den Resultaten
solcher Vorhersagen kann nicht auf Einflüsse auf die Tertiärstruktur eines Proteins
geschlossen werden. Räumliche Interaktionen von Aminosäureresten in der Tertiärstruktur des Proteins können mit dieser Methode nicht vorhergesagt werden. Da die
ausgetauschten Asparagine alle an der Oberfläche des Moleküls lokalisiert sind (Bond
et al., 1997), sollte der Einfluss auf umgebende Aminosäurereste nicht sehr groß sein.
Der Austausch von N426 durch Serin, anstelle von Glutamin, bewirkte in der
Computer-Simulation geringfügigere Veränderungen in den Vorhersagen zur Sekundärstruktur und sollte so das Risiko einer durch Mutation der Glykosylierungsstelle N426
bewirkten Instabilität des rekombinanten huASB-Proteins mindern (s. 5.1.1). Es konnte
in den Struktur-Vorhersagen nach Rost gezeigt werden, dass die Zugänglichkeit für
Lösungsmittel (solvent accessibility) für die huASB-Glykosylierungsmutante N426Q
fast doppelt so hoch war wie für Wildtyp-huASB, für N426S jedoch nicht verändert
war. Dies könnte ein Indiz dafür sein, das Proteasen leichter einen Zugang finden und
die huASB degradieren können. Da aber die huASB-Glykosylierungsmutante N426S
ebenfalls nicht stabil exprimiert werden konnte, spielen womöglich in den
Sekundärstruktur-Vorhersagen nicht berücksichtigte Strukturveränderungen wie z.B.
der Wegfall einer Zuckerkette eine Rolle. Es konnte gezeigt werden, dass N-Glykane an
der Faltung von Proteinen beteiligt sind und die Stabilität von Proteinen begünstigen
(Helenius and Aebi, 2001; Imperiali and O'Connor, 1999). Weiterhin schützen
Glykosylierungen Proteine vor vorzeitigem proteolytischen Abbau. Eine fehlende
Glykosylierung an der Position N426 auf der huASB-Moleküloberfläche könnte die
Zugänglichkeit für lysosomale Proteasen erleichtern. Dabei könnten lysosomale
Endopeptidasen mit breiter Spezifität, wie die Cysteinproteasen Cathepsin B und L oder
die
Aspartylprotease
Cathepsin
D,
zu
einer
vorzeitigen
Degradation
der
unterglykosylierten huASB führen. Die Glykosylierung an der Position N426 könnte
somit im Gegensatz zu denen an den Positionen N188, N279 und N366 eine besondere
Rolle beim Schutz der huASB vor vorzeitigem proteolytischen Abbau spielen. Dass
durch die zwei Aminosäureaustausche gegen Serin und Glutamin jeweils spezifische
Diskussion
107
Erkennungssequenzen für Proteasen entstehen ist unwahrscheinlich, aber möglich.
Zusammengefasst ergibt sich daraus, dass die Glykosylierung an der Position N426
scheinbar zum Erhalt der Proteinstabilität der huASB wichtig ist.
6.2
Sortierung der humanen Arylsulfatase B
Für die katabole Funktion der huASB ist es essentiell, dass diese in die Lysosomen der
Zellen sortiert wird, da dort der Abbau des Dermatansulfats stattfindet. Die lysosomale
Sortierung für Wildtyp-huASB und die huASB-Glykosylierungsmutanten N188Q,
N279Q und N366Q konnte mit indirekter Immunfluoreszenz belegt werden. Daraus
kann geschlossen werden, dass die Mutationen der Asparagine N188, N279 und N366
keinen Einfluss auf die Sortierung haben. Für die Position N366 konnte belegt werden,
dass es sich um eine Glykosylierung des komplexen Typs handelt (s. 5.1.8.2), die keine
Rolle bei der lysosomalen Sortierung spielt. Bei den Positionen N279 und N188
dagegen handelt es sich wahrscheinlich um Glykosylierungen des mannosereichen
Typs, die aber ebenfalls nicht essentiell für die lysosomale Sortierung sind. Die Position
N426 scheint ebenfalls nicht essentiell für den Transport in die Lysosomen zu sein, da
bei transienter Transfektion der Glykosylierungsmutanten N426Q und N426S die
lysosomale Sortierung nachgewiesen werden konnte (s. 6.1 und 5.1.7). Möglicherweise
sind noch zwei weitere Asparagine (N291 und N458) der huASB glykosyliert und daher
an der Sortierung in die Lysosomen über Mannose-6-Phosphate beteiligt. Allerdings
konnte in der Kristallstruktur der huASB kein Hinweis auf Glykosylierung an diesen
Positionen gefunden werden (Bond et al., 1997). Weiterhin lässt die Spaltung der
Oligosaccharide durch die Glykosidasen EndoH und PNGaseF vermuten, dass die
Position N291 in BHK21-Zellen nicht glykosyliert ist. Möglicherweise ist keine der
Oligosaccharid-Seitenketten alleine essentiell für den Transport in die Lysosomen, da
die anderen den Ausfall eines Sortierungssignals kompensieren können (Gieselmann et
al., 1992). Aufschluss darüber könnte eine huASB-Glykosylierungsmutante geben,
deren Asparagine alle gegen Glutamine ausgetauscht sind. Allerdings lässt die
Instabilität der huASB-Glykosylierungsmutanten N426Q, N426S und N279Q/N426Q
vermuten, dass eine unglykosylierte huASB-Mutante ebenfalls nicht stabil exprimiert
werden kann. Möglicherweise könnte eine mangelnde lysosomale Sortierung mit einer
Diskussion
108
transient transfizierten unglykosylierten Mutante nachgewiesen werden und damit die
Rolle der Mannose-6-Phosphate am Transport der huASB in die Lysosomen untersucht
werden. Ein MPR-unabhängiger Transport wurde für lysosomale lösliche Proteine
vermutet (Gieselmann et al., 1992; Tikkanen et al., 1995) und für lysosomale
Membranproteine belegt (Krentler et al., 1986).
6.3
Prozessierung der humanen Arylsulfatase B
Lysosomale Proteine werden als unreife Proenzyme synthetisiert und in endosomalen
und lysosomalen Kompartimenten proteolytisch prozessiert (Sabatini, 2001). Für
Wildtyp-huASB und die huASB-Glykosylierungsmutanten N188Q, N279Q und N366Q
konnte gezeigt werden, dass sie zur reifen Form prozessiert werden (s. 5.1.11). Die
meisten proteolytischen Prozessierungen lysosomaler Enzyme finden im lysosomalen
Kompartiment statt (Hasilik and Neufeld, 1980). Für verschiedene lysosomale
Hydrolasen konnte ebenso eine proteolytische Prozessierung in den Endosomen
nachgewiesen werden (Hasilik, 1992). Das heißt, mit der Prozessierung des huASBProteins konnte ein weiterer Hinweis auf die korrekte Sortierung der huASBGlykosylierungsmutanten in endosomale bzw. lysosomale Kompartimente erhalten
werden. Die Prozessierung der huASB-Glykosylierungsmutanten findet mit der
gleichen Kinetik statt wie bei dem Wildtyp-huASB-Protein (s. 5.1.11). Somit haben die
Mutationen keinen Einfluss auf die Prozessierung der huASB.
Aus BHK21-Zellüberständen konnte nach vier Stunden für Wildtyp-huASB und die
huASB-Glykosylierungsmutanten nur die Vorläuferform der huASB immunpräzipitiert
werden. Aus Zellkultur-Überständen von stabil transfizierten BHK21-Zellen konnte
jedoch auch eine prozessierte huASB gereinigt werden. Möglicherweise wird eine
prozessierte huASB über die Endosomen aus der Zelle ausgeschleust. Die erhöhte
Sekretion lysosomaler Enzyme nach Transfektion mit dem MPR 46 belegen die
Hypothese, dass lysosomale Enzyme über die Endosomen aus der Zelle geschleust
werden können (Chao et al., 1990). Möglicherweise sind auch die Lysosomen an der
Exozytose von prozessierten lysosomalen Proteinen beteiligt (Andrews, 2000).
Weiterhin könnten aktive Proteasen im Zellüberstand die huASB proteolytisch spalten.
Dass die prozessierte Form nach vier Stunden nicht aus dem Medium von BHK21-
Diskussion
109
Zellen immunpräzipitiert werden konnte, könnte darin begründet sein, dass innerhalb
von insgesamt vier bis sechs Stunden (die metabolische Markierung mitgerechnet) noch
keine prozessierte huASB aus dem endosomalen Kompartiment freigesetzt wurde, oder
noch keine proteolytische Prozessierung im Medium stattfand. Das schließt jedoch nicht
aus, dass sich im Zell-Überstand nicht radioaktiv markierte, prozessierte huASB befand.
Für die lysosomale saure Phosphatase konnten prozessierte Formen im Medium von
Haut-Fibroblasten nachgewiesen werden, die jedoch vermutlich schon im Golgi
prozessiert und über sekretorische Vesikel sezerniert wurden (Lemansky et al., 1985).
Bei der proteolytischen Prozessierung der huASB scheint es sich um keine
Enzymaktivierung zu handeln, da auch unprozessierte Formen der huASB
Arylsulfatase-Aktivität
aufweisen
(s. 5.1.12;
Steckel
et
al.,
1983).
Für
die
β-Hexosaminidase und die α-Mannosidase konnte ebenfalls eine enzymatische
Aktivität für die Proform nachgewiesen werden (Hasilik et al., 1982; Mierendorf et al.,
1983).
6.4
Synthese, Sekretion und Endozytose rekombinanter humaner Arylsulfatase B
Ein Ziel dieser Arbeit ist es, mit gentechnischen Methoden ein huASB-Enzym zu
gewinnen, das für den therapeutischen Einsatz optimierte Eigenschaften aufweist. Um
eine zur Therapie defizienter Zellen ausreichende Verfügbarkeit des huASB-Enzyms zu
erreichen, sollte ein solches huASB-Enzym in möglichst großen Mengen aus
produzierenden Zellen sezerniert werden. Die Steigerung der Sekretion der huASB kann
einerseits durch Erhöhung der Protein-Synthese oder durch die Steigerung des
sekretorischen Prozesses erreicht werden.
Es konnte gezeigt werden, dass die Synthese der huASB in BS-Zellen im Vergleich zu
Wildtyp-huASB-Zellen um das Doppelte gesteigert werden konnte. Diese Steigerung
beruht möglicherweise auf dem Einsatz eines LTR-Promotors. Die Wildtyp-huASBZellen exprimieren die huASB-cDNA unter der Kontrolle des SV40-Promotors. Eine
weitere Ursache der erhöhten huASB-Protein-Synthese könnte auch eine erhöhte
Anzahl an integrierten Kopien der huASB-cDNA sein. Der Einbau einer erhöhten
Kopienzahl von huASB-cDNA wurde durch Doppelselektion der BS-Zellen nach
Transfektion begünstigt.
Diskussion
110
Der limitierende Faktor für die Überexpression der huASB könnte deren Aktivierung
durch Transformation des aktiven Cystein C91 zu einem Formylglycin darstellen
(Dierks et al., 1998). Ein Überschreiten der Kapazität des an der Oxidation des Cysteins
beteiligten enzymatischen Apparats könnte zu einer geringeren spezifischen Aktivität
des Enzympräparates führen. Für BS-Zellen konnte beobachtet werden, dass die
sezernierte, prozessierte und unterglykosylierte Form der huASB (D2) eine nur halb so
hohe maximale spezifische enzymatische Aktivität (Vmax) hat wie die von WildtyphuASB exprimierenden Zellen sezernierte prozessierte und vollständig glykosylierte
huASB (s. 5.1.12.2). Die Kapazitätsüberschreitung des Cystein-transformierenden
enzymatischen Apparats könnte die Ursache dafür sein. Ferner könnten die fehlenden
Glykosylierungen ein Grund für die reduzierte enzymatische Aktivität darstellen. Bisher
konnte jedoch nur nachgewiesen werden, dass N-Glykane an dem Transport, der
Sortierung, der Stabilität und der Faltung von Glykoproteinen beteiligt sind (Helenius
and Aebi, 2001).
Zur Steigerung der Sekretion wurden unterglykosylierte Mutanten der huASB generiert,
die durch das Fehlen lysosomaler Sortierungssignale ins Medium sezerniert werden
sollten. Durch Normalisierung der Sekretionsrate auf die Syntheserate konnte gezeigt
werden, dass die BHK21-Zellen, die huASB-Glykosylierungsmutanten N279Q und
N366Q exprimieren, eine mit den Wildtyp-huASB exprimierenden BHK21-Zellen
vergleichbare Sekretionsrate aufweisen. Interessanterweise weist dagegen die huASBGlykosylierungsmutante N188Q eine 1,4fach höhere Sekretionsrate im Vergleich mit
den Wildtyp-huASB exprimierenden Zellen auf. Die Mutation der Position N188Q
scheint einen ähnlich die Sekretionsrate steigernden Effekt zu haben wie die zusätzliche
Transfektion mit dem MPR 46. Für BS-Zellen konnte gezeigt werden, dass diese
1,8fach mehr huASB-Protein sezernieren als Wildtyp-huASB-Zellen, was auf die
Kotransfektion mit dem MPR 46 zurückzuführen ist. Von Chao et al. konnte
demonstriert werden, dass die Überexpression des MPR 46 in BHK21- und Maus
L-Zellen die Sekretion neusynthetisierter lysosomaler Proteine wahrscheinlich über
einen Austausch des Rezeptors zwischen frühen Endosomen und Plasmamembran
wesentlich erhöht (Chao et al., 1990). Gieselmann et al. haben belegt, dass eine
unterglykosylierte Mutante der huASA 3fach bis 4fach im Vergleich mit huASAWildtyp aus Maus LTK--Zellen sezerniert wurde (Gieselmann et al., 1992). Die huASA
besitzt nur drei potentielle Glykosylierungsstellen, von denen zwei (Waheed et al.,
1983) oder drei (Gieselmann et al., 1992) genutzt werden. Laut Gieselmann et al.
Diskussion
111
können bei der huASA alle drei Oligosaccharide unabhängig von ihrer Position
phosphoryliert werden.
Nach den Kristallstrukturdaten liegt der Asparaginrest N188 der huASB in einem
exponierten β-Loop und könnte daher durch seine exponierte Position eine besondere
Rolle bei der Phosphorylierung sowie Sortierung der huASB in die Lysosomen
einnehmen (Bond et al., 1997). Mannosereste des Oligosaccharids an der Position N188
sind so ebenfalls exponierter und möglicherweise besser zugänglich für die N-AcetylGlukosamin-Phosphotransferase oder auch für den MPR 46 oder MPR 300. Beide MPR
sind an der Sortierung in die Lysosomen beteiligt. Die huASB-Glykosylierungsmutante
N188Q stellt eine interessante Form mit potentiell therapeutischem Nutzen dar, da sie
korrekt in die Lysosomen transportiert (s. 5.1.10) und gleichzeitig in höherem Maße
sezerniert wird als Wildtyp-huASB. Es könnte auch geprüft werden, ob eine
Koexpression der huASB-Glykosylierungsmutante mit dem MPR 46 eine noch
effizientere Steigerung der huASB-Sekretion bewirkt. Dies könnte für therapeutische
Ansätze wie der Gentherapie ein Vorteil sein, da höhere Mengen an zirkulierendem
Enzym im Serum auch eine effizientere Versorgung der Zielzellen beinhaltet.
Außerdem könnte durch verbesserte Sekretion die Produktion von rekombinanter
huASB mit eukaryotischen Zellen zu Zwecken der Enzymersatztherapie gesteigert
werden.
Um effizient defiziente Zellen der MPS VI-Patienten zu therapieren, muss die huASB
auch von den defizienten Zellen endozytiert und in die Lysosomen transportiert werden
können. Eine lysosomale Sortierung konnte für die huASB-Glykosylierungsmutanten
N188Q, N279Q und N366Q und auch für die Wildtyp-huASB gezeigt werden (s. 6.2
und 5.1.10). Für eine aus LEC-1-Zell-Überstand (Stanley et al., 1975) gereinigte und
anschließend dephosphorylierte huASB konnte eine verminderte Endozytose in
Geweben von MPS VI-Katzen beobachtet werden (Crawley et al., 1996). Zum
Nachweis der Endozytose wurden erste Experimente durchgeführt. Es konnte im
Vergleich zu Kontrollen weder für die huASB-Glykosylierungsmutanten noch für
Wildtyp-huASB ein Anstieg der Arylsulfatase-Aktivität in muASB-defizienten MausFibroblasten gemessen werden (Daten nicht gezeigt). Es konnten im Vergleich zu
Endozytose-Studien mit einer unterglykosylierten Mutante der huASA nur 10% der
Enzymaktivität der huASB in diesen Experimenten eingesetzt werden, da bisher nur
geringe Mengen an huASB-Protein gereinigt worden sind. Für die unterglykosylierte
Mutante der huASA konnte in vitro die Endozytose des gereinigten Enzyms in
Diskussion
112
LTK--Zellen nachgewiesen werden. Der therapeutische Effekt auf defiziente Zellen
("cross correction") dieser unterglykosylierten huASA-Mutante war in vitro sehr gering.
Auch konnte in einer nachfolgenden Knochenmark-Transplantation zwar die verstärkte
Sekretion dargelegt werden, aber ein therapeutischer Erfolg blieb aus. Die SulfatidSpeicherung in den Lysosomen der Gewebe von muASA-defizienten Mäusen konnte
nicht korrigiert werden. Da auch keine huASA-Aktivität in den Geweben nach
Transplantation gemessen wurde, liegt das Problem in der mangelnden Endozytose der
unterglykosylierten Mutante (Matzner et al., 2001). Dieses Beispiel zeigt, dass neben
der verbesserten Sekretion die Endozytose für die therapeutische Wirkung essentiell ist.
Erste Versuche zur Endozytose waren aufgrund unzureichender Enzym-Mengen nicht
erfolgreich. Daher werden zunächst für die huASB-Glykosylierungsmutanten größere
Enzym-Mengen gereinigt. Anschließend werden zuerst an muASB-defizienten MausFibroblasten und danach an huASB-defizienten Fibroblasten von MPS VI-Patienten
Untersuchungen zur Endozytose durchgeführt.
6.5
Bestimmung der enzymatischen Parameter rekombinanter humaner
Arylsulfatase B
Ein besser sezerniertes huASB-Protein sollte als optimales therapeutisches Enzym auch
eine hohe enzymatische Aktivität aufweisen. Zur Analyse der spezifischen
Enzymaktivität der huASB wurde zunächst rekombinantes huASB-Protein gereinigt. Es
konnte für Wildtyp-huASB und die huASB-Glykosylierungsmutanten N188Q, N279Q
und N366Q huASB-Protein aus Zellkulturüberständen von BHK21-Zellen gewonnen
werden. Dabei wurden zwei Formen der huASB mit Sulfatase-Aktivität in
unterschiedlichen Fraktionen gefunden. Es handelt sich um eine glykosylierte,
prozessierte Form und eine glykosylierte, nicht prozessierte Vorläuferform der huASB.
Allerdings hatte die prozessierte Form im nicht-reduzierenden Gel nicht die erwartete
Größe (s. 5.1.12.1). Dabei sollte beachtet werden, dass die exakte Größenbestimmung
eines Proteins unter nicht-reduzierenden Bedingungen im SDS-Gel nicht möglich ist.
Außerdem zeigen prozessierte Formen, die unter nicht-reduzierenden Bedingungen
noch durch Disulfid-Brücken zusammengehalten werden, ein anderes Laufverhalten im
SDS-Gel, als nicht prozessierte Formen, welche nur aus einer Polypeptidkette bestehen.
Diskussion
113
Da die N-Termini der α-, β- und γ-Untereinheit der huASB nachgewiesen werden
konnten, handelt es sich bei den kleineren Formen der huASB wahrscheinlich um
vollständige, aber unterglykosylierte Formen der huASB. Wobei die α-Untereinheit
vermutlich drei Glykosylierungen trägt und die γ-Untereinheit nicht glykosyliert ist. Auf
der gereinigten Vorläuferform der huASB befinden sich auf der α-Untereinheit drei bis
vier Glykosylierungen und auf der γ-Untereinheit maximal zwei Glykosylierungen.
Aus BS-Zell-Überstand konnte nur prozessierte huASB gereinigt werden. Da diese
Zellen zusätzlich den MPR 46 stabil exprimieren, wird hier über die frühen Endosomen
huASB-Protein sezerniert, das schon prozessiert ist. Das könnte ein möglicher Hinweis
auf vorzeitige Prozessierung der huASB im endosomalen Kompartiment sein. Eine
proteolytische Prozessierung im prälysosomalen/endosomalen Kompartiment konnte
auch für andere lysosomale Enzyme nachgewiesen werden (Gieselmann et al., 1983;
Hasilik, 1992).
In den gereinigten ASB-Fraktionen wurden die Km- und Vmax-Werte bestimmt. Es
konnte gezeigt werden, dass die Km-Werte der huASB-Glykosylierungsmutanten sich
nicht unterscheiden, sie sind in beiden Fraktionen (Vorläufer und prozessierte Form)
und in den verschiedenen huASB-Glykosylierungsmutanten gleich und liegen um
0,5mM. In der Literatur sind für das Substrat p-Nitrocatecholsulfat (pNCS) Km-Werte
von 2,6mM bis 3,6mM beschrieben (Gold et al., 1976; McGovern et al., 1982). Es
konnte gezeigt werden, dass der Km-Wert der unprozessierten Wildtyp-huASB um ein
5faches höher (bei 2,6mM) liegt als der Km-Wert der unprozessierten huASBGlykosylierungsmutanten. Das bedeutet, dass die unprozessierten Glykosylierungsmutanten eine 5fach höhere Affinität zu dem pNCS-Substrat zeigen. Beim Vergleich
der prozessierten huASB zeigen die Glykosylierungsmutanten eine zwei- bis dreimal
höhere Substrataffinität als die Wildtyp-huASB. Eine gesteigerte Affinität der huASB
gegenüber dem Substrat ist wichtig bezüglich der Entwicklung einer optimalen
Therapie.
Allerdings
ist
es
entscheidend,
ob
die
Affinitätssteigerung
der
Glykosylierungsmutanten auch für das natürliche Substrat beobachtet werden kann.
Dazu sollte die huASB in größeren Mengen gereinigt werden und danach mit einem
spezifischen Trisaccharid-Substrat (Hopwood et al., 1986) die Messungen wiederholt
werden.
Es konnte ebenfalls festgestellt werden, dass die Vmax-Werte Unterschiede aufweisen.
Erstaunlicherweise
zeigt
die
unprozessierte
Wildtyp-huASB
eine
höhere
Diskussion
114
Substratumsetzung als die prozessierte. Das kann darauf zurückzuführen sein, dass das
artifizielle p-Nitrocatecholsulfat-Substrat der ASB verwendet wurde. Daher sollen diese
Experimente mit dem natürlichen Trisaccharid-Substrat wiederholt werden (Hopwood
et
al.,
1986).
Die
unprozessierte
Glykosylierungsmutante
N366Q
weist
interessanterweise eine vierfach höhere und die prozessierte Form eine sechsfach höhere
Substratumsatz-Geschwindigkeit als die beiden anderen huASB-Glykosylierungsmutanten auf. Gleichzeitig liegt Vmax der prozessierten huASB N366Q sogar um mehr
als das Doppelte über Vmax der Wildtyp-huASB. Dieser Aspekt ist relevant für einen
therapeutischen Nutzen. Die huASB-Glykosylierungsmutante N366Q stellt eine ideale
Form zu Therapiezwecken dar: sie zeigt eine höhere Substratumsetzung und eine höhere
Substrataffinität als die Wildtyp-huASB. In Zell-Lysaten stabil transfizierter BHK21Zellen konnten diese Resultate für eine höhere Substratumsetzung bestätigt werden.
Ebenso wurde im Zell-Lysat eine signifikant erhöhte Substrataffinität gegenüber der
Wildtyp-huASB nachgewiesen.
Weiterhin ist die Substratumsetzung der prozessierten, vollständig glykosylierten
huASB der BS-Zellen um ein fünffaches höher als die der prozessierten, aber
unterglykosylierten Form. Für die prozessierte huASB der BS-Zellen die höchste
Substratumsetzung
bei
hoher
Substrataffinität
zu
beobachten.
Daher
sollte
berücksichtigt werden, dass die prozessierte, vollständig glykosylierte huASB der BSZellen genauso zu Therapiezwecken verwendet werden könnte. Auch hier sollten
weitere Untersuchungen mit dem natürlichen Trisaccharid-Substrat erfolgen (Hopwood
et al., 1986).
Unterschiede der Km- und Vmax-Werte in den gereinigten Fraktionen der huASB und in
den Zell-Lysaten sind möglicherweise auf das Auftreten unterschiedlich prozessierter
und glykosylierter Formen der huASB in den BHK21-Zellen zurückzuführen. Diese
können, wie in der Reinigung gezeigt, verschiedene Enzymaktivitäten aufweisen.
Außerdem wurde durch die Überexpression ein künstliches System geschaffen. Die
Enzyme, die zur Glykosylierung, proteolytischen Prozessierung und auch zur
Aktivierung des katalytischen Cysteinrestes benötigt werden sind nicht überexprimiert
und können daher ihre Aufgaben unter Umständen nicht effizient vollenden.
Diskussion
115
6.6
Therapieansätze für die Mukopolysaccharidose VI
6.6.1
Enzymersatztherapie
Die MPS VI eignet sich gut zur Entwicklung von Enzymersatztherapien, da:
1. es viele Tiermodelle gibt.
2. die Arylsulfatase ein stabiles Enzym ist, das rekombinant hergestellt werden kann
(Yogalingam et al., 1996; Evers, 1996).
3. das Gehirn bei MPS VI-Patienten nicht von der Krankheit betroffen ist und daher das
Problem der Blut-Hirnschranke nicht existiert.
4. nur 5% Enzymaktivität ausreichen, um einen therapeutischen Effekt zu erzielen
(Brooks et al., 1991).
Bei einem 45-jährigen Probanden, der eine enzymatische ASB-Restaktivität von 5%
aufwies,
konnten
trotz
lysosomaler
Glykosaminoglykan-Speicherungen
und
Dermatansulfat-Ausscheidung keine klinischen Symptome festgestellt werden. Erst bei
ASB-Aktivitäten <5% manifestiert sich die MPS VI (Brooks et al., 1991).
Es gibt zu allen Formen der MPS-Tiermodelle, die entweder durch spontane Mutation
bei Hund, Katze, Ratte, Maus, Ziege, oder durch gezielte Ausschaltung des Gens bei der
Maus, gekennzeichnet sind. Sie haben einen mit dem MPS-Patienten vergleichbaren
Phänotyp, der aber meist mit einem milderem Verlauf der Krankheit einhergeht. Für die
MPS VI gibt es zwei Katzenmodelle mit unterschiedlichen Punktmutationen im ASBGen (Jezyk et al., 1977; Yogalingam et al., 1998; Yogalingam et al., 1996), ein
Rattenmodell (Kunieda et al., 1995; Yoshida et al., 1993), ein Hundemodell (Neer et al.,
1995) und ein "Knock out"-Mausmodell (Evers et al., 1996).
Ein
generelles
Problem
bei
Enzymsubstitutionen
ist
das
Auftreten
von
Immunreaktionen auf injiziertes therapeutisches Enzym. Einige muASB-defiziente
Mäuse verstarben an einem anaphylaktischen Schock, ausgelöst durch Applikation von
humaner ASB, die aus Zellüberständen gereinigt worden war (Evers, 1996). Die
Immunreaktion kann sowohl durch das als fremd erkannte Protein, als auch
möglicherweise durch Verunreinigungen bei der Aufreinigung des humanen ASB
Proteins ausgelöst worden sein. Ebenso konnten Immunreaktionen bei MPS VI-Katzen
beobachtet werden (Brooks et al., 1997). Durch Verwendung von rekombinantem ASBProtein derselben Spezies konnten bessere Erfolge erzielt werden (Bielicki et al., 1999).
Diskussion
116
Das in unserer Arbeitsgruppe existierende Mausmodell sollte dahingehend optimiert
werden, dass Immunreaktionen ausbleiben. In der vorliegenden Arbeit konnte dazu eine
transgene Maus generiert werden, welche die cDNA einer humanen ASBC91S-Mutante
in ihr Genom integriert hat (s. 4.2.5). Dazu wurde ein eukaryotischer Expressionsvektor
generiert, der die inaktive Variante der huASB, die huASB91S, enthält. Mit indirekter
Immunfluoreszenz konnte gezeigt werden, dass die inaktive huASB91S in vitro
exprimiert wird und in das lysosomale Kompartiment sortiert wird. Es konnten zwei
männliche "Founder" generiert werden, die zur Etablierung einer neuen transgenen
Mauslinie mit muASB-defizienten Mäusen (Evers et al., 1996) gekreuzt wurden. Es
konnte gezeigt werden, dass das Transgen über die Keimbahn an die Nachkommen der
F1-Generation
weitergegeben
wird.
Die
transgenen
Geschwister-Mäuse
der
F1-Generation werden derzeit untereinander verpaart, um homozygot ASB-defiziente
und gleichzeitig für huASBC91S transgene Mäuse (ASB-/-/huASB91STg) zu erhalten.
Erwartet wird, dass nach der Mendelschen Spaltungsregel 12,5% der Nachkommen den
gewünschten Genotyp besitzen. Der Phänotyp der ASB+/-/huASBC91S-Mäuse schien
bis zum Zeitpunkt der Fertigstellung dieser Arbeit normal. Mittels Western-Blot und
Enzymaktivitätsbestimmungen sollen Proteinexpression und Enzymaktivität der
huASBC91S bestimmt werden. Im weiteren Verlauf des Projektes wird das neue
Mausmodell histologisch untersucht. Dieses Mausmodell ASB-/-/huASB91STg soll dann
mit huASB therapiert werden. Es stellt gegenüber dem bisherigen Mausmodell (Evers et
al., 1996) eine Verbesserung dar, da eine Immunreaktion auf huASB-Protein
voraussichtlich ausbleiben wird. Von Sly et al. (Sly et al., 2001) konnte gezeigt werden,
dass mit Hilfe einer inaktiven Mutante der humanen β-Glukuronidase eine für humane
β-Glukuronidase immuntolerante Mauslinie auf einem MPS VII-Hintergrund generiert
werden konnte. Diese transgene Maus ermöglichte Enzymersatztherapie-Studien mit
humanem β-Glukuronidase-Enzym am Mausmodell. Immunreaktionen blieben dabei
aus. Nach stabiler Transfektion der inaktiven Variante huASB91S in CHO-Zellen
konnte von Brooks et al. gezeigt werden, dass alle 10 getesteten Epitope der huASB bei
dem huASB91S-Protein erkannt werden (Brooks et al., 1995). Daher sollte die
transgene Maus keine Antikörper gegen appliziertes huASB-Protein bilden. Des
weiteren spiegelt dieses Maus-Modell besser die Situation der Patienten wieder, da
diese meist noch huASB-Protein exprimieren, das eine Restaktivität von <5% zeigt
Diskussion
117
(Brooks et al., 1991; Litjens and Hopwood, 2001). Das heißt, bei den MPS VI-Patienten
ist eine Immuntoleranz gegenüber der applizierten ASB zu erwarten.
Im Rahmen dieser Arbeit sind rekombinante huASB-Glykosylierungsmutanten und die
produzierenden Zelllinien generiert und analysiert worden. Es sollte im Zusammenhang
mit Enzymersatztherapie erstens darüber nachgedacht werden, wie das rekombinante
huASB-Protein produziert wird, um möglichst große Mengen zu erhalten und zweitens,
welche Form der huASB (Wildtyp oder Glykosylierungsmutante) ein für die Therapie
optimiertes Enzym darstellt. Sowohl die Glykosylierungsmutante N188Q, die bezüglich
der verbesserten Sekretion und der höheren Substratspezifität interessant ist, als auch
die Glykosylierungsmutante N366Q, die eine höhere Substrataffinität und eine
effektivere Substratumsetzung zeigt, eignen sich für die Enzymersatztherapie. Die
Glykosylierungsmutante N188Q zeigt eine reduzierte Substratumsetzung und eignet
sich daher wahrscheinlich weniger als die Glykosylierungsmutante N366Q. Letztere
bringt den Vorteil des schnelleren Umsatzes bereits vorhandener GlykosaminoglykanSpeicherungen. Eine Kotransfektion mit dem MPR 46 und der Glykosylierungsmutante
N366Q könnte einen kumulativen positiven Effekt bezüglich der Sekretion bewirken.
Aus diesen Gründen könnte die huASB-Glykosylierungsmutante N366Q als eine
Alternative zum Wildtyp-Enzym bei Enzymersatztherapien darstellen.
6.6.2
Somatische Gentherapie
Die erforderliche Immunsuppression durch Myeloablation bei allogenen KnochenmarkTransplantationen
ist
bei
MPS VI-Patienten
oft
nicht
vertretbar.
Allogene
Knochenmark-Transplantationen führen zudem oft zu Transplantatabstoßungen und der
GVHD ("Graft versus host disease"). Dagegen trat bei einem MPS VI-Patienten nach
Transplantation von Nabelschnurblut seines Geschwisters keine GVDH auf, und
gleichzeitig konnte eine Verbesserung der klinischen Symptomatik erreicht werden
(Lee et al., 2000). Dieses Verfahren der Nabelschnurblut-Transplantation ist nur
eingeschränkt möglich. Daher bietet die gentherapeutische Manipulation ASBdefizienter Stammzellen den entscheidenden Vorteil, autologe Transplantationen
durchführen zu können. Von Peters et al. konnte gezeigt werden, dass die ASBAktivität in humanen Zellen nach retroviraler Transduktion wiederhergestellt werden
konnte (Peters et al., 1991). Eine somatische Gentherapie in MPS VI-Katzen führte zu
Diskussion
118
keiner Verbesserung der klinischen Symptome. Es konnte zwar gezeigt werden, dass es
zu einer Langzeitexpression der retroviral transduzierten huASB kommt, jedoch wurde
vermutet, dass die Enzymexpression zu gering war (Simonaro et al., 1999). Dagegen
konnte eine somatische Gentherapie in einem MPS VII-Mausmodell (Marechal et al.,
1993) und in muASB-defizienten Mäusen (Biester, 2001; Biester 2002) gute Erfolge
erzielen. Die huASB konnte nach Transduktion muriner Stammzellen mit huASBexprimierenden Retroviren und anschließender Knochenmark-Transplantation über
einen langen Zeitraum in der muASB-defizienten Maus exprimiert werden. Sowohl die
Speicherung der Glykosaminoglykane in Herz, Leber und Niere als auch die GAGAusscheidung im Urin nahm ab. Das Knochenwachstum konnte nicht beeinflusst
werden (Biester, 2001; Biester 2002). Nach einer Knochenmark-Transplantation (ohne
Gentherapie) von zwei Tage alten muASB-defizienten Mäusen, deren chondrale
Ossifikation noch nicht abgeschlossen ist, konnten keine Veränderungen der
Knochenlängen beobachtet werden (Mabe, P.; unpublizierte Daten). Möglicherweise
wurde zu wenig huASB-Enzym von den ASB exprimierenden Knochenmarkszellen
synthetisiert bzw. sezerniert, um therapeutische Effekte in den Knochen zu erzielen.
Daher sollte einerseits die hypersezernierte Glykosylierungsmutante der huASB N188Q
in
retrovirale
Vektorsysteme
hämatopoietischen
Stammzellen
kloniert
eine
werden
und
Transplantation
nach
Transduktion
durchgeführt
von
werden.
Andererseits sollte die Glykosylierungsmutante N366Q, die eine höhere maximale
Substratumsatz-Geschwindigkeit zeigt, ebenfalls in der somatischen Gentherapie
eingesetzt werden. Somit sollte der Vorteil der besseren Umsetzung der schon
vorhandenen Glykosaminoglykan-Speicherungen ausgenutzt werden. In diesem
Zusammenhang ist es wichtig, noch einmal darauf hinzuweisen, dass für beide
unterglykosylierten Mutanten gezeigt werden konnte, dass sie katalytisch aktiv sind und
korrekt
sortiert
und
prozessiert
werden.
Daher
eignen
sich
diese
Glykosylierungsmutanten unter der Voraussetzung, dass sie endozytiert werden, um in
ASB-defizienten Zellen ihre katabole Funktion auszuüben.
Diskussion
6.7
119
Ausblick
Durch
die
in
dieser
Arbeit
durchgeführten
Untersuchungen
der
huASB-
Glykosylierungsmutanten ergab sich ein möglicher Einsatz von zwei dieser
Glykosylierungsmutanten sowohl in der Enzymersatztherapie als auch in der
somatischen Gentherapie. Das beste therapeutische Enzym wäre ein hypersezerniertes,
stabiles Enzym mit hoher Substratumsetzung. Daher könnte es interessant sein, die
Doppelmutante N188Q/N366Q zu generieren und zu beobachten, ob sich die beiden
vorteilhaften Effekte der Hypersekretion und höheren Substratumsetzung summieren.
Unabhängig davon sollte eine Kombination von Enzymersatztherapie und Gentherapie
erfolgen, um optimale therapeutische Effekte zu erzielen. Weiterhin sollte die
Gentherapie in neonatalen Mäusen durchgeführt werden, bevor das Knochenwachstum
abgeschlossen ist. In Bearbeitung sind derzeit außerdem ex-vivo selektionierbare
retrovirale Vektorsysteme, die eine Myeloablation überflüssig machen könnten und so
die organschädigenden Wirkungen vermindern. Ein gentherapeutischer Ansatz kann
über zwei mögliche Wege zur Korrektur der defizienten Zellen führen: einerseits durch
rezeptorvermittelte Endozytose des von Donor-Zellen synthetisierten Enzyms und
andererseits durch "Trans-Differenzierung" der hämatopoietischen Stammzellen. Es
wurde auch vermutet, dass direkte Zell-Zellkontakte eine Rolle bei der Therapie
defizienter Zellen spielen (Bou-Gharios et al., 1993). Zur "Trans-Differenzierung"
konnte gezeigt werden, dass hämatopoietische Stammzellen zu Herzmuskelzellen (Orlic
et al., 2001), Hepatozyten (Lagasse et al., 2000), glatten Muskelzellen (Ferrari et al.,
1998; Gussoni et al., 1999) und neuronalen Zellen (Brazelton et al., 2000; Mezey et al.,
2000) differenzieren. Das bisher am schwierigsten zu therapierende Gewebe in
MPS VI-Patienten sind die Knochen bzw. das Knorpelgewebe. Eine Differenzierung
von hämatopoietischen Stammzellen in Knorpelzellen konnte noch nicht gezeigt
werden. Man erhofft sich, dass bei Transplantationen retroviral transduzierter
Knochenmarkszellen, mesenchymale Stammzellen (Bianco et al., 2001; Koc and
Lazarus, 2001), für die eine Differenzierung zu Knorpelzellen in vitro gezeigt werden
konnte, in vivo zu Knorpelzellen differenzieren und das defiziente Enzym exprimieren.
Der Enzymdefekt in den Knorpelzellen könnte so durch autologe KnochenmarkTransplantation retroviral transduzierter mesenchymaler Stammzellen vermindert oder
sogar normalisiert werden.
Zusammenfassung
7.
120
Zusammenfassung
Das Maroteaux-Lamy Syndrom (Mukopolysaccharidose Typ VI) ist eine autosomal
rezessiv vererbte lysosomale Speicherkrankheit. Es kommt zur Speicherung von
Glykosaminoglykanen in den Lysosomen. Die Ursache dieser Speicherung liegt in einer
Defizienz der lysosomalen Arylsulfatase B. Die humane Arylsulfatase B (huASB) besitzt
sechs potentielle Glykosylierungsstellen. Sie wird nach Erkennung durch Mannose-6Phosphat-Rezeptoren in die Lysosomen sortiert und ist dort am Dermatansulfat- und
Chondroitinsulfat-Abbau beteiligt. Durch Mutation der Glykosylierungsstellen sollte ein
für die Therapie optimiertes huASB-Enzym generiert werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden vier für die lysosomale Sortierung potentiell wichtige
Glykosylierungsstellen der huASB durch ortsspezifische Mutagenese der huASB-cDNA
eliminiert. Für die Glykosylierungsmutanten N426Q und N426S konnte enzymatisch
aktives huASB-Protein zwar nachgewiesen werden, jedoch gelang es nicht, stabil
exprimierende Zelllinien zu generieren. Dagegen konnten für die drei unterglykosylierten
huASB-Glykosylierungsmutanten N188Q, N279Q und N366Q stabile Zelllinien
generiert und rekombinantes, aktives Enzym gereinigt werden. Es konnte gezeigt
werden, dass die huASB an den Positionen N188, N279 und N366 tatsächlich
glykosyliert ist. Die Glykosylierungen an den Positionen N188, N279 und N366 sind
nicht essentiell für die lysosomale Sortierung, da alle drei Glykosylierungsmutanten in
die Lysosomen transportiert werden und außerdem mit einer der Wildtyp-huASB
vergleichbaren Kinetik zum reifen Enzym prozessiert werden. Interessanterweise konnte
für die in einem exponierten β-Loop liegende Glykosylierungsstelle N188 nach Mutation
eine gegenüber der Wildtyp-huASB um das 1,4fache erhöhte Sekretion aus BHK21Zellen demonstriert werden. Des weiteren konnte nach Reinigung des huASB-Proteins
für
die
Glykosylierungsmutante
nachgewiesen
werden.
Außerdem
N366Q
eine
waren
gesteigerte
die
Substratumsetzung
Substrataffinitäten
für
die
unterglykosylierten Mutanten N188Q und N366Q erhöht. Der Einsatz der huASBGlykosylierungsmutanten
N188Q
und
N366Q
könnte
Vorteile
für
die
Enzymersatztherapie und somatische Gentherapie bieten.
Weiterhin wurde zur Weiterentwicklung des existierenden MPS VI-Mausmodells eine
transgene Maus generiert, die eine inaktive, stabile Form der huASB exprimiert und für
die murine ASB defizient ist. Dieses neue MPS VI-Mausmodell sollte immuntolerant für
die rekombinante, im Rahmen von Enzymersatztherapie-Studien zugeführte huASB sein.
In diesem optimierten MPS VI-Tiermodell kann in Zukunft die Wirksamkeit der
Glykosylierungsmutanten N188Q und N366Q für die Therapie der MPS VI überprüft
werden.
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8.
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Anhang
9.
132
Anhang
Abb. 34: Die Strukturformeln der Aminosäuren Asparagin und Glutamin und ihre Codons.
EcoRI
BamHI
XbaI
ß-Globin Intron
ß-Aktin Promotor
EcoRI
ApaI
KpnI
XhoI
AccI
SalI
ClaI
XhoI
NotI
ptC
SacI
5600bp
pBluescript KS+
Abb. 35: Plasmidkarte von ptC.
Ausgangsvektor zur Generierung des Expressionsplasmids ptChuASBC91S, von W. Sly.
Angegeben sind relevante Schnittstellen von Restriktionsenzymen.
Anhang
133
KpnI (4152)
XhoI (4137)
pBluescriptSK(-)
f1(-)origin
SalI (4131)
lacZ
AccI (4131)
Ampicillin
HindIII (4116)
EcoRV (4110)
EcoRI (4104)
XbaI (4100)
pcASBX
4815bp
ColE1
XbaI-Sonde
PstI (3133)
PstI (2850)
nur bei
pcASBXN188Q
EcoRV (2791)
huASBcDNA
XbaI (2223)
BamHI (2235)
(SmaI/RsaI) (2233)
Abb. 36: Plasmidkarte von pcASBX
Ausgangsvektor für die Mutagenese der huASB-cDNA, kloniert von Meike Pauly-Evers.
Eingezeichnet ist die XbaI-Sonde, die zur Hybridisierung im Southern-Blot (s. 4.2.5) verwendet wurde.
Anhang
134
Abb. 37: HuASB-cDNA Insert des Plasmids pcASBX und Oligonukleotid-Primer, die für die Sequenzierung
und die PCR benutzt wurden.
Angegeben sind die Positionen der potentiellen N-Glykosylierungen N188, N279, N291, N366, N426 und
N458; Das Cys91 im aktiven Zentrum, das Start- und das Stop-Codon sind eingezeichnet. Außerdem
sind die Restriktionsenzyme angegeben, die zur Klonierung benutzt wurden. Exon 7 ist mit einer
durchbrochenen Linie, Exon 8 ist mit einer durchgezogenen Linie markiert.
Abkürzungsverzeichnis
10.
135
Abkürzungsverzeichnis
°C
Abb.
Ac
Amp
APS
ASB
ATG
ATP
β-Hex
β-ME
bp
BHK21
BSA
cDNA
cpm
CTP
dATP
dCTP
dGTP
DEPC
DMEM
DMSO
DNA
dNTP
DTT
dTTP
E
E. coli
EDTA
ELISA
ER
et al.
FCS
feASB
GAG
h
huASB
IGFII
IPTG
kb
kDa
LB/Amp
LTR
M
min
MPR 46
MPR 300
MPS
mRNA
muASB
NCBI
OD
PCR
PBS
PMSF
Grad Celsius
Abbildung
Acetat
Ampicillin
Ammoniumperoxodisulfat
Arylsulfatase B
Startcodon
Adenosintriphosphat
β-Hexosaminidase
β-Mercaptoethanol
Basenpaare
Baby Hamster Kidney-Zellen (Baby Hamster Nieren Zellen)
Bovine Serum Albumin (Rinderserumalbumin)
komplementäre DNA
counts per minute (Impulse pro Minute)
Cytidintriphosphat
Desoxyadenosintriphosphat
Desoxycytidintriphosphat
Desoxyguanidintriphosphat
Diethyl-Pyrocarbonat
Dulbecco's Modified Eagle Medium
Dimethylsulfoxid
Desoxyribonukleinsäure
Didesoxy-Nukleosid-Trisphosphat
Dithiothreitol
Desoxythymidintriphosphat
Extinktion
Escherischia coli
Ethylen-Diaminoethyl-Tetra-Acetat
Enyme-Linked Immunosorbent Assay
Endoplasmatisches Retikulum
et alii (lat: und andere)
fötales Kälberserum
feline ASB
Glykosaminoglykan
Stunde
humane Arylsulfatase B
Insuline Like Growth Factor II
Isopropyl-β-D-Thiogalaktose
Kilobasen
Kilodalton
LB Medium mit 150µ/ml Ampicillin
long terminal repeat
molar
Minute
Mannose-Phosphat-Rezeptor, Molekulargewicht 46kDa
Mannose-Phosphat-Rezeptor, Molekulargewicht ca. 300kDa
Mukopolysaccharidose(n)
messenger RNA
murine ASB
National Center for Biotechnology Information
Optische Dichte
Polymerase Chain-Reaction (Polymerase Kettenreaktion)
Phosphate Buffered Saline
Phenylmethylsulfonylfluorid
Abkürzungsverzeichnis
RNA
RSV
R
rER
RT
RT-PCR
s.
SCID
SDS
SDS-PAGE
SE
sek
SV40
TCA
Temed
TGN
Tris
T25, T75
U
UV
V
w/v
WT
X-Gal
136
Ribonukleinsäure
Rous Sarcoma Virus
Korrelationskoeffizient
raues Endoplasmatisches Retikulum
Raumtemperatur
PCR aus revers transkribierter cDNA
siehe
severe combined immunodeficiency
Sodium-Dodecyl-Sulfat
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Standard Error (Standard Fehler)
Sekunde
Simian Virus
Trichloressigsäure
N,N,N',N'-Tetramethyl-Ethylendiamin
Trans-Golgi Netzwerk
Tris(hydroxymethyl)-aminoethan
Gewebekulturflaschen mit einer Fäche von 25cm2 bzw. 75cm2
Unit(s) = Enzymeinheit(en)
Ultraviolett
Volt
weight/volume
Wildtyp
5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galaktopyranosid
Die chemischen Elemente wurden mit den üblichen Symbolen abgekürzt. Die
Aminosäuren wurden entweder im Drei- oder Ein-Buchstaben-Code angegeben.
Bei einigen Fachbegriffen wurden die englischen Fachtermini wie z.B. Insert
verwendet, da auch in der deutschsprachigen Literatur eine Übersetzung dieser Begriffe
unüblich und unzureichend ist.
Danksagung
Ich möchte mich bei Herrn Prof. Dr. C. Peters für die Chance bedanken, in seiner
Arbeitsgruppe eine Doktorarbeit anfertigen zu können. Außerdem danke ich ihm für die
interessante Themenstellung und die kritische Begleitung bei der Bearbeitung des
Projekts.
Ich bedanke mich ganz besonders bei Dr. Thomas Reinheckel für die vielen, vielen
"dates", die Motivation und Unterstützung, das Verständnis und seinen unvergleichlichen
Humor. Die wertvollen Tipps und anregenden Diskussionen haben einen wesentlichen
Beitrag zum Gelingen dieser Arbeit geleistet. Thomas, Danke !!!!
Ich möchte mich ganz herzlich bei Moni bedanken. Was hätte ich ohne Dich gemacht?
Dein Einsatz für die ASB kennt auch zu ungewöhnlichen Zeiten keine Grenzen. Dein
Wissen zu praktischen Durchführungen und die kritischen Diskussionen haben mir sehr
viel weitergeholfen. Danke !
Ein besonderer Dank geht an Karin und Susi für ihren tatkräftigen Einsatz zur Rettung
von Doktorandinnen.
Ein Dankeschön an die ganze AG Peters, besonders an die Reinheckel'sche Truppe und
die Ex-Deussings, für die wirklich angenehme Arbeitsatmosphäre und die tollen
Gespräche (gell, Ingrid)!!! Und danke an alle fürs Korrekturlesen!!
Ein besonderer Dank an Regina für ihre Hilfsbereitschaft und das Herz auf dem rechten
Fleck !
Ein Dankeschön an Eva und Jo für die Hilfe mit den Bildern !
Und natürlich ein ganz liebes Dankeschön an Wolfgang, dessen Einsatzbereitschaft zur
Computer- bzw. Datenrettung selbst am Wochenende keine Grenzen kennt!
Dzienkuje bardzo, Marlena, za odbudowanie mojei motivacji, oraz oczywiscie za
wspolnie spedzone narciarskie chwile.
Und ein ganz liebes Dankeschön an Ela und Sonja für ihr Verständnis und ihre mir sehr
wertvolle Freundschaft.
Ein ganz lieber Dank meinen Eltern und meiner Schwester für ihre Liebe, ihr Verständnis
und ihre Unterstützung.
Y pues...... Gracias, Marcel, por tus interminables preguntas, la critica constructiva y por
la magia que trajiste a mi vida.