Collagen Genes - ETH E

Diss.ETH
ÄX'"S>
DISS ETH No 10873
Identification of Functional Elements
in the Promoters of two Type VI
Collagen Genes
A dissertation submitted to the
Swiss Federal Institute of
for the
Technology Zürich
degree
of
Doctor of Natural Sciences
presented by
Thomas Willimann
Dipl. phil. II of the Univeisity of Zürich
born 13.9.63
Citizen of Zürich (ZH) and
accepted
on
Wettingen (AG)
the recommendation of
Prof. Dr. K. H. Winterhalter, examiner
PD Dr. B.
Prof. Dr. P.
Trüeb, co-examiner
Sonderegger, co-examiner
1994
7
2.
Zusammenfassung
Typ
Kollagen
VI
Zellen. Es besteht
mesenchymaler
und a3(VI).
der extrazellulären Matrix
Hauptbestandteil
ist ein
aus
den
Polypeptidketten: al(VI), a2(VI)
Jede dieser drei Untereinheiten wird durch
produzieren
kodiert. Fibroblasten
durch Onkogene transformiert,
viel
wird die Produktion der al(VI) und a2(VI)
so
auf der Stufe der
man
in
spontan
Herunter-regulierung
Tumoren. Diese
mesenchymalen
Gen
VI. Sind diese Fibroblasten
Kollagen
Kette drastisch vermindert. Denselben Effekt beobachtet
entstandenen
eigenes
ein
findet
Die Promotoren der al(VI) und a2(VI)
Transkription statt.
Gene haben eine ähnliche Struktur wie Promotoren
von
"Housekeeping"
Genen: sie enthalten keine TATA box, sind G/C reich und die
Transkription
beginnt an mehreren Stellen.
Regulation
Um die
dieser TATA-losen Promotoren
zu
verstehen,
Kollagen
wurden die aktivierenden Elemente der al(VT) und <x2(VI)
Promotoren untersucht. Der
al(VI) Promotor wurde
DNasel-Footprinting-Experimenten
embryonen analysiert.
Verdau
mit Zellkern-Extrakten
Diese Versuche offenbarten drei
geschützte Stellen,
zuerst anhand von
von
aus
Hühner¬
einem DNase I
welche A, B und C genannt wurden. Die
Transkriptionsfaktoren, die mit den drei Stellen interagieren, wurden mit GelRetardations-Experimenten
diversen DNA
charakterisiert. Dabei wurde die Hilfe
Oligonukleotiden
und
von
Antikörpern,
Stelle A
vom
Transkriptionsfaktor
werden beide
von
ähnlichen Proteine
Um
hintereinander
ein
vor
zu
belegen,
die
notwending sind,
Sequenzen
Reportergen ligiert
wurden.
transfektiert wurden,
Vergleich
zu
einem
um
die
wurden
der drei Stellen
diese
Wenn
zeigten
sie eine
genomischen Fragment,
welches das Kernstück des al(VI) Promotors enthält. Demnach
drei Stellen A, B und C vollauf,
Spl-
dass die Stellen A, B und C
denen die DNA
Minipromotoren in Hühnerfibroblasten
hohe Promotoraktivität im
belegen, dass
die der Familie der
gebunden,
alleine für die Aktivität des al(VI) Gens
Minipromotoren hergestellt, bei
für
API erkannt wird. Die Stellen B und C
zwei Faktoren
angehören.
spezifisch
die
bereits bekannte Faktoren sind, zugezogen. Diese Versuche
von
Transkription
genügen
des al(VI) Gens
die
zu
induzieren.
Der a2(VI) Promotor wurde ebenfalls mit DNase
Analysen untersucht.
vom
DNase I Verdau
Es wurde aber
geschützt war.
nur
eine Stelle (Sl
Ur\\ weitere
genannt) entdeckt, die
mögliche
wurden stufenweise Deletionen des Promotor-Kernstücks
verkürzten
Fragmente
wurden in Gel Retardations
I-Footprinting-
Stellen
zu
finden,
angefertigt.
Diese
Experimenten eingesetzt,
8
um
weitere
Bindungsstellen
für nukleare Faktoren
ergab total vier Bindungsstellen: wiederum
S3. Die
Transkriptionsfaktoren,
Gel-Retardations-Experimenten
welche
Promotor
an
Spl
finden. Diese
Analyse
die Stelle Sl, eine Stelle S2, X und
diese Stellen
von
binden, wurden in
Oligonukleotiden
mit diversen
Die Stellen Sl, S2 und S3 werden alle
identisch mit den zwei
an
zu
je
identifiziert.
zwei Proteinen erkannt, die
ähnlichen Faktoren sind, welche im cxl(VI)
die Stellen B und C binden: Das Protein, das die Stelle X erkennt,
zeigte kein typisches Verhalten von bisher bekannten Transkriptionsfaktoren.
In
UV-Crosslinking-Versuchen
schien dieses unidentifizierte Protein ein
Molekular-gewicht von 43 kDa zu haben.
Die Stellen Sl, S2, X und S3
grosse Teile des Kernstücks des a2(VI) Promotors. Um
Stellen für die
Fragmente
zu
belegen
bestimmen, welche
transkriptioneile Aktivität wichtig sind, wurden die verkürzten
vor
ein
Reportergen ligiert.
Hühnerfibroblasten transfektiert wurden,
Wenn
diese Konstrukte
zeigten Fragmente
in
mit kleinen
Deletionen bereits eine mehr als zweifache Reduktion der Promotoraktivität.
Diese unerwartete
Beobachtung
Promotor Kernstück nach
vorgegebene
der
Länge
räumlichen
führte
Bindung
der
zur
dass das a2(VI)
Hypothese,
entsprechenden Faktoren
dreidimensionale Struktur einnimmt.
Jegliche Aenderungen
der DNA stört oder verhindert offenbar die
Struktur,
was zu
einem Verlust der
eine genau
Bildung
an
dieser
transkriptioneilen Aktivität
führt.
Die beiden untersuchten Promotoren
Klassen: der al(VI)
Promotor besteht
Transkriptionsfaktoren, aus
Diese
denen
Minipromotoren zeigen
Reporter-Gen-Versuchen.
aus
gehören
drei
verschiedenen
zu
Bindungsstellen
für
Minipromotoren gebildet werden können.
eine hohe
transkriptionelle
Der cc2(VI) Promotor
Aktivität in
bildet nach der
hingegen
Bindung der Faktoren eine genau definierte Struktur aus, die empfindlich
jegliche Aenderungen
der DNA
Promotoren verschieden
aufgebaut sind,
Länge reagiert. Obwohl
ist ihre Aktivität in
Versuchen ähnlich hoch. Im menschlichen Genom
liegen
auf
die beiden
Reporter-Genbeide Gene in
derselben Bande auf Chromosom 21. Falls die Gene für die al(VI) und oc2(VI)
Kette des Huhns ebenfalls auf demselben Chromosom
Mechanismen wie die
DNA
Methylierung
Ausbildung
für die
von
liegen,
könnten
höheren Chromatinstrukturen oder
Herunterregulierung
transformierten Zellen verantwortlich sein.
der
Transkription
in
9
Summary
3.
VI is
Collagen
mesenchymal
of the extracellular matrix of most
major component
a
cells. It is
of three distinct
composed
ct2(VI) and <x3(VD, each of which is encoded by
in cells transformed
transcriptional level.
The
features characteristic for
TATA
region
oncogenes
Collagen VI is
gene.
are
coordinately
in cells derived from
or
tumors. This inhibition of
spontaneous mesenchymal
the
by
Single
and ot2(VI) genes
highly expressed in fibroblasts. The al(VI)
downregulated
a
Polypeptides, al(VI),
biosynthesis
occurs
at
promoters of the al(VI) and <x2(VI) genes have
housekeeping
box, transcription is initiated
is rieh in G and C. To
at
study
gene promoters:
they
contain
no
several Start sites and the promoter
of these TATA less
regulation
the
promoters, the activating elements of the al(VI) and <x2(VI) collagen
promoters were characterized.
The al(VI) promoter
was
first
investigated by
with nudear extracts from ducken
analyses
embryos.
DNAse I
A
Footprinting
fragment containing
the basic promoter harboured three distinct elements, termed A, B and C,
which
were
protected
from DNAse I
interact with these three sites
combination with the
specific antibodies
A
raised
identified
were
of various
The nudear
by gel
proteins
that
retardation assays in
oligonudeotide competitiors
as
well
against well-characterized transcription factors.
as
Site
target for the transcriptional activator API, whereas sites B and C
was a
were
use
digestion.
recognized
each
multigene family.
able to direct
by
two distinct nudear
To address the
transcription,
a
question
were
basic al(VI)
to a
collagen promoter. Thus,
Spl
are
construet was created in which
placed in front of a reporter gene.
transfection into ducken fibroblasts, this construet exhibited
promoter activity when compared
to the
whether the three sites alone
minipromoter
the sequences of sites A, B and C
proteins belonging
a
high
After
relative
large genomic fragment containing the
the three sites
are
suffident to induce
transcription of this gene.
The cx2(VI) promoter
using nudear extracts from
Sl)
was
protected
deletions
were
was
analyzed by
chicken
from DNase I
performed
from
DNase I
embryos. However, only one site (termed
digestion.
a
footprinting analyses
To detect other
fragment containing
the basic a2(VI)
promoter. These shortened fragments
were
investigate
nudear factores. These
their
ability
for
revealed four nudear factor
binding
binding
used in
nudear factors that interact with these four sites
A
use
retardation assays to
(again), S2,
sites: site Sl
retardation assays in combination with the
gel
sites, nested
were
experiments
X and S3. The
identified
of various
by gel
oligonudeotide
10
Sites Sl, S2 and S3
competitiors.
proteins identical
to the
The nuclear factor
Spl
and S3
were
as a
protein
to
with
in front of
proteins binding to
the al(VI) promoter.
element X could not be related to
molecular
a
comprise large portions
ligated
two distinct nuclear
preliminary
characterized factor. In
migrated
related
binding
recognized by
were
a
assays this factor
crosslinking
UV
mass
of the a2(VI)
of 43 kDa. Since sites Sl, S2, X
promoter, the deleted fragments
reporter gene. These
constructs were transfected
into ducken tendon fibroblasts and tested for their
transcription. Surprisingly,
activity
even
promoter represents
a
recognized by
that
even
changes
minor
distinct architectural
in DNA
length
to activate
transcriptional
that the a2(VI)
Suggestion
type of promoter which forms
dimensional structure when
ability
short deletions reduced
at least two-fold. This led to the
a
its nudear
a
collagen
well defined three-
proteins.
It is
possible
interfere with the formation of the
complex and therefore reduce the transcriptional activity
of the basic promoter element
The two
promoters described in this study
different dasses: the al(VI)
collagen promoter
nudear factors bind. These three sites
with füll promoter
promoter forms
changes
of the
a
in DNA
complex
activity
distinct
can
be combined to
band
genes
are
on
complex when bound by its
collagen
nudear factors. Minor
length of the basic promoter element disturbs the formation
and leads to
a
dramatic reduction in
a
transcriptional activity.
comparably high activity
are
located in the
chromosome 21. If in the ducken genom the al(VI) and a2(VI)
located
mechanisms like
account
to two
minipromoters
in reporter gene assays. The <x2(VI)
reporter gene assays. The human al(VI) and a2(VI) genes
same
belong
contains three sites to which
However, the al(VI) and a2(VI) promoters exhibit
in
seem to
for the
as
well
higher
syntenic
on
the
Orders of chromatin
same
or
chromosome, other
DNA
methylation
down-regulation observed in transformed fibroblasts.
may