Sensorische Rhodopsine: Modellsystem für transmembrane

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Sensorische Rhodopsine: Modellsystem für
transmembrane Signaltransduktion
Johann P. Klare und Martin Engelhard,
Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie, Dortmund
Die archaebakterielle Phototaxis wird wie
die Chemotaxis enterischer Bakterien
durch Histidin-Kinase-gekoppelte Rezeptoren reguliert. Die homologen Signaltransduktionsketten steuern die Bewegung
der Bakterien zu Orten optimaler Lebensbedingungen. Eine der zentralen, noch
weitgehend ungeklärten Fragestellungen
betrifft den Signaltransfer vom angeregten
Rezeptor zur zytoplasmatischen Domäne.
Neuere Untersuchungen zur Struktur und
Funktion des photophoben Photorezeptors
(Sensor Rhodopsin II) aus N. pharaonis
erlauben es nun, die ersten Schritte des
transmembranen Signaltransfers auf molekularer Ebene zu erklären.
Abb. 1: Die vier archaebakteriellen Rhodopsine aus H. salinarum. In den letzten Jahren wurden
weitere Verwandte sowohl in Eukaryonten als auch in Eubakterien beschrieben[6]
Einleitung
Einzellige Lebewesen werden oft mit
plötzlichen Veränderungen ihrer Umwelt
konfrontiert, auf die sie schnell und adäquat
reagieren müssen, um ihre Überlebenschancen zu erhöhen. Hierzu müssen sie Reize aus der Umgebung aufnehmen, sie verstärken, in zelluläre Signale umsetzen und
schließlich muss die Antwort der Zelle auf
die extrazelluläre Herausforderung gesteuert werden. Diese Reaktion kann sowohl genetischer als auch lokomotorischer Natur
sein. Schon im ausgehenden 19. Jahrhundert
wurde die Reaktion von Bakterien auf chemische Reize und Licht beschrieben[1, 2].
Die Erforschung der bakteriellen Signalketten nahm einen großen Aufschwung mit
den Arbeiten von J. Adler über die Chemotaxis von Bakterien[3], sodass heute ein recht
genaues Bild der beteiligten Komponenten
und ihres Zusammenspiels besteht (zusammengefasst z. B. in STOCK et al.[4]).
Ein weiterer Anreiz zur Erforschung der
bakteriellen Signaltransduktion wurde durch
die Entdeckung von zwei sensorischen Rhodopsinen in Halobakterium salinarum, einem
Archaebakterium, geschaffen (referiert in
SCHÄFER et al.[5]). Diese Photorezeptoren haben auf der einen Seite große strukturelle
Ähnlichkeiten mit Bakteriorhodopsin, der
Licht-aktivierten Protonenpumpe, auf der
anderen Seite binden sie so genannte Transducermoleküle, deren zytoplasmatische Domäne wiederum große Sequenzhomologien
mit den Chemorezeptoren enterischer Bakterien aufweist. Die Gemeinsamkeiten von
Phototaxis und Chemotaxis legen es nahe,
die Erkenntnisse auch auf das jeweilig andere System zu übertragen. Allerdings bietet das Studium der Phototaxis besondere
Vorteile, da die Experimente mit Licht als
einfach zu handhabendem „Substrat“
durchgeführt werden können.
Bakterielle Rhodopsine
H. salinarum exprimiert vier verschiedene
bakterielle Rhodopsine, die in zwei funktionell unterschiedliche Gruppen, den Ionenpumpen Bakteriorhodopsin (BR) und
Halorhodopsin (HR) sowie den sensorischen
Rhodopsinen SRI und SRII aufgeteilt werden (Abb.1) (zusammengefasst in[5, 6]). Es
handelt sich um 7-Helix Membranproteine,
die Retinal über eine protonierte Schiff Base an ein Lysin binden. Die Wechselwirkung
des Chromophors mit dem Protein bestimmt
die Lage des Absorptionsmaximums (z.B.
SRIλ
SRIIλ
max = 580 nm;
max = 490 nm). Nach
Anregung durch Licht werden Photozyklen
durchlaufen, die die Proteine über mehrere
thermisch relaxierende Intermediate zurück
zum Grundzustand führen. Während des
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stoffkonzentrationen und hohe Lichtintensitäten, die zu einer photo-oxidativen Schädigung der Zellen führen könnten, ermöglicht es der photophobe Rezeptor SRII der
Zelle diese nachteiligen Bedingungen zu
vermeiden.
Rezeptor-Transducer Komplex
Abb. 2: Wie unterscheidet die H. salinarum Zelle orangenes von blauem Licht? H. salinarum bildet
stäbchenförmige Zellkörper mit bipolar inserierten Flagellen (A). Die Rotation der Flagellen kann
sowohl im – als auch gegen den Uhrzeigersinn erfolgen. Unter konstanten Bedingungen wechselt der
Flagellenmotor ungefähr alle 10 Sekunden seine Drehrichtung, sodass die Zelle sich unter Einfluss der
Brown’schen Molekülbewegung stochastisch fortbewegt. Schwimmt H. salinarum in Richtung eines
Gradienten von ’schädlichem’ blauem Licht verkürzt es das Schaltintervall, in Gegenrichtung wird es
verlängert (B). In Gradienten von orangenem Licht werden die Intervall-Längen entgegengesetzt
moduliert (C). Die resultierende Gesamtbewegung führt das Bakterium von blauem zum orangenem
Licht. Die Bilder wurden aus folgenden Arbeiten entnommen: (A) ALAM & OESTERHELT (1984), JMB 176,
459–475; (B, C) STOECKENIUS et al. (1988), J. Bacter. 170, 2790
Photozyklus werden Protonen
(HR jedoch pumpt Cl– !) vektoriell über die Plasmamembran
transportiert, allerdings im Falle
der sensorischen Rhodopsine
mit sehr geringer Effizienz. Für
BR und SRII wurde dabei nachgewiesen, dass diese Reaktionen
durch eine auswärts gerichtete
Bewegung der fünften Helix
(Helix F) begleitet werden.
SRI erfüllt eine duale Funktion. Die Anregung durch orangenes Licht vermittelt die positive Phototaxis, zusätzliches
blaues Licht bewirkt in einem
Zwei-Photonen-Prozess eine
photophobe Antwort der Bakterien. Das Zusammenspiel der
beiden Lichtqualitäten dirigiert
die Zellen zu Orten, die optimal
für das Funktionieren des Bakteriorhodopsins sind (Abb. 2).
Unter der starken Sonneneinstrahlung südlicher Breitengrade können die Bakterien also eine zusätzliche Energiequelle
nutzen, die es ihnen gestattet,
auch bei niedrigen Sauerstoffkonzentrationen zu überleben.
Treffen allerdings die Bakterien
gleichzeitig auf große SauerBIOspektrum · 2/04 · 10. Jahrgang
Mit der Entdeckung, dass sowohl SRI als
auch SRII Komplexe mit so genannten
Transducer-Proteinen (Halobacterial transducer of rhodopsin, Htr) ausbilden[7, 8], hat
die Erforschung der archaebakteriellen Chemo- und Phototaxis (erste Experimente zur
Phototaxis siehe [9]) einen neuen Aufschwung genommen. Die Transducer bestehen normalerweise aus zwei Domänen,
einer Membran- sowie einer zytoplasmatischen Domäne (SRII aus H. salinarum besitzt noch eine zusätzliche extrazelluläre Serin-Rezeptor Domäne[10]). Der membranständige Teil des Rezeptor-Transducer Komplex der homologen Proteine aus Natronobakterium pharaonis wurde inzwischen aus
kubischen Lipidphasen kristallisiert und die
Struktur bestimmt (Abb. 3[11]). Der Komplex
kristallisiert in der gleichen 2:2 Stöchiometrie, wie sie auch in Membranen gefunden
wird[12, 13]. Zusammen mit vorliegenden
Abb. 3: Kristallstruktur des SRIITransducer Komplexes aus N.
pharaonis. Rot: Rezeptor; Grün:
Transducer; Gelb: Retinal. (a) Blick
aus Richtung der Membran; ES:
extrazelluläre Seite; CS: Zytoplasma. Die gepunkteten Linien
schließen den hydrophoben Teil der
Proteine ein. Der in den extrazellulären Raum herausragende Teil des
Transducer-Dimers stellt vermutlich
das evolutionäre „Überbleibsel“ der
Ligandenbindungsdomäne eines
Proto-Chemorezeptors dar, aus dem
sich die Phototransducer entwickelt
haben könnten (vgl. SRII aus H.
salinarum, das eine Serin Rezeptor
Domäne noch besitzt). Es konnten
lediglich Daten über den transmembranen Bereich (Aminosäuren
24–82) des Transducers gewonnen
werden, Strukturinformationen über
den, für den Signal Transfer wichtigen, C-Terminus (HtrII83–114) fehlen.
(b) Der Blick aus Richtung des Zytoplasmas verdeutlicht den rotationssymmetrischen Aufbau des
Komplexes
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Abb. 4: Archaebakterielle Signaltransduktion. Nach Aktivierung der sensorischen Rhodopsine durch
Licht (SR’s) wird das Signal auf den – für den jeweiligen Rezeptor spezifischen – Transducer (Htr) übertragen und zu dessen zytoplasmatischem Ende weitergeleitet. Hier bindet über ein Adapterprotein
(CheW) die Kinase CheA. Dieses dimere Protein phosphoryliert in einer autokatalytischen Reaktion
Histidin. Die Phosphatgruppe kann anschließend entweder auf eine Asparaginsäure der „response
Regulatoren“ CheY oder CheB übertragen werden. CheY fungiert als „switch Faktor“, der die Drehrichtung des Flagellenmotors ändert. Fumarat wurde ebenfalls als „switch Faktor“ erkannt[19]. CheB sowie
die Methyltransferase CheR sind in die Adaptation der Bakterien an konstante Stimuli involviert. Die
Abbildung wurde aus Gordeliy et al. [11] übernommen
strukturellen Daten über die Chemorezeptoren existieren damit Informationen über
die Rezeptordomäne, den Transmembranteil sowie über die große zytoplasmatische
Domäne. Allerdings fehlen Daten über den
für den Signaltransfer so wichtigen „Linker“-Bereich, der zwischen dem transmembranen und dem zytoplasmatischen Abschnitt lokalisiert ist.
Signaltransduktionskette
Die zytoplasmatische Domäne bildet ein
langes, in sich verwobenes Bündel aus vier
Helices, das 260 Å in das Zytoplasma hineinragt (Abb. 4). Es enthält die Signaldomäne zur Aktivierung der His-Kinase CheA sowie die Methylierungsregion, die die Aktivität der Signaldomäne steuert. Man nimmt
heute an, dass die Rezeptoren nicht als voneinander unabhängige Dimere in der Zelle
vorkommen sondern in der Nähe der Flagellen höhere Aggregate ausbilden (siehe
z.B. [14]). Die zytoplasmatischen Partner der
halobakteriellen Signaltransduktionskette
weisen große Ähnlichkeiten mit den entsprechenden Proteinen der enterischen Bakterien auf und gehören damit zu der Klasse
der Zwei-Komponenten Systeme[15] (siehe
Abb. 4). Die Homologie zwischen der archaebakteriellen Phototaxis und der E. coli
Chemotaxis wurde auch mit Hilfe von chimären Transducer-Molekülen nachgewie-
sen. In diesen Experimenten wurden E. coli Zellen generiert, die die Fähigkeit zur
Phototaxis besitzen[16].
Rezeptor-Transducer Signaltransfer
Der Rezeptor wird durch die Absorption von
Licht aktiviert, was in einer frühen Reaktion
zur Isomerisierung des Retinals führt. Anschließend wird die Schiff Base deprotoniert
und ein Proton wird an das extrazelluläre
Medium abgegeben. In diesem Zeitbereich
(3 ms) werden auch Konformationsänderungen des Proteins beobachtet, die eine
Auswärtsbewegung der Helix F bewirken
[17]. Die Weiterleitung des Signals von dem
Rezeptor auf den Transducer wurde mit Hilfe von orts-spezifisch Spin-markiertem SRII
bzw. HtrII näher untersucht. Aus den ESRSpektren einer grossen Anzahl so modifizierter Proteine konnten Daten über die
Umgebung der ersetzten
Seitenketten gewonnen
werden. Durch zusätzliche
Messungen bei tiefen Temperaturen wurden Inter-SpinAbstände bestimmt, die zusammen mit den anderen ESR Daten zu
einem topologische Modell des
SRII/HtrII Komplexes führten[13]. Dieses Modell weist große Ähnlichkeit zu der
später bestimmten Kristallstruktur auf[11],
was die Bedeutung der ESR-Spektroskopie
zur Strukturaufklärung von Biomolekülen
unterstreicht.
Aus den zeitabhängigen Abstands- und
Mobilitätsänderungen konnten zudem
Schlüsse auf den Mechanismus des Rezeptor-Transducer Signaltransfers gezogen werden. Nach diesem Modell wird die Helix F
Bewegung simultan in eine Rotationsbewegung der zweiten Transmembranhelix
(TM2) des Transducers umgesetzt (Abb. 5).
Die Rück-Rotation zum Grundzustand erfolgt unabhängig von dem Rezeptor etwa
200 ms später. Dies erlaubt der Zelle, die Aktivität des Transducers nach eigenen Anforderungen zu regulieren. Dem Modell einer
Rotation von TM2 steht der Vorschlag einer Kolbenbewegung von 1–2 Å gegenüber,
auf die verschiedene Experimente an Chemorezeptoren hindeuten[18]. Eine solche zusätzliche kleine Bewegung kann von den
ESR Experimenten nicht ausgeschlossen
werden, sodass auch eine Schrauben-artige
Konformationsänderung möglich erscheint.
Unabhängig von dem genauen Mechanismus bleibt es jedoch vollkommen ungeklärt, wie diese kleinen Änderungen mit hoher Genauigkeit den
langen Weg von der Membranoberfläche zu der 260 Å entfernten Signaldomäne übertragen
werden können.
Literatur
[1] Engelmann, T.W. (1882): Über
Licht- und Farbenperception niedrigster
Organismen. Plügers Arch. 29, 387–400
[2] Pfeffer, W. (1883): Locomotorische
Richtungsbewegungen durch chemische
Reize. Ber. Deut. Botan. Ges. 1, 524–533
Abb. 5: Mechanismus des Signaltransfers. Die sich auswärts
bewegende Helix F stößt tangential an TM2 und bewirkt hierdurch eine Drehbewegung von etwa 20°
[3] Adler, J. (1975): Chemotaxis in bacteria. Annu. Rev. Biochem. 44, 341–356
BIOspektrum · 2/04 · 10. Jahrgang
Überblick
[4] Stock, A.M., Robinson, V.L. & Goudreau, P.N.
(2000): Two-component signal transduction. Annu. Rev.
Biochem. 69, 183–215
[5] Schäfer, G., Engelhard, M. & Müller, V. (1999):
Bioenergetics of the archaea. Microbiol. Mol. Biol. Rev.
63, 570–620
[6] Engelhard, M., Schmies, G. & Wegener, A.A.
Photoreceptors and Light Signalling. Batschauer, A. (ed.),
pp. 1–39 (Royal Society of Chemistry, Cambridge, 2003).
[7] Ferrando-May, E., Krah, M., Marwan, W. &
Oesterhelt, D. (1993): The methyl-accepting transducer
protein Htrl is functionally associated with the photoreceptor sensory rhodopsin I in the archaeon Halobacterium salinarium. EMBO J. 12, 2999–3005
[8] Yao, V.J. & Spudich, J.L. (1992): Primary structure
of an archaebacterial transducer, a methyl- accepting
protein associated with sensory rhodopsin I. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 89, 11915–11919
[9] Hildebrand, E. & Dencher, N. (1975): Two photosystems controlling behavioural responses of Halobacterium halobium. Nature 257, 46–48
[10] Hou, S.B., Brooun, A., Yu, H.S., Freitas, T. &
Alam, M. (1998): Sensory rhodopsin II transducer HtrII
is also responsible for serine chemotaxis in the archaeon
halobacterium salinarum. J. Bacteriol. 180, 1600–1602
[11] Gordeliy, V.I., Labahn, J., Moukhametzianov,
R., Efremov, R., Granzin, J., Schlesinger, R., Büldt,
G., Savopol, T., Scheidig, A.J., Klare, J.P. & Engelhard, M. (2002): Molecular basis of transmembrane sig-
nalling by sensory rhodopsin II-transducer complex. Nature 419, 484–487
[12] Zhang, X.-N. & Spudich, J.L. (1998): HtrI is a
dimer whose interface is sensitive to receptor photoactivation and His-166 replacements in sensory rhodopsin I.
J. Biol. Chem. 273, 19722–19728
[13] Wegener, A.A., Klare, J.P., Engelhard, M. &
Steinhoff, H.J. (2001): Structural insights into the early
steps of receptor-transducer signal transfer in archaeal
phototaxis. EMBO J. 20, 5312–5319
[14] Kim, S.H., Wang, W. & Kim, K.K. (2002): Dynamic and clustering model of bacterial chemotaxis receptors: Structural basis for signaling and high sensitivity.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 11611–11615
[15] Rudolph, J., Nordmann, B., Storch, K.F.,
Gruenberg, H., Rodewald, K. & Oesterhelt, D.
(1996): A family of halobacterial transducer proteins.
FEMS Microbiol. Lett. 139, 161–168
[16] Trivedi, V.D. & Spudich, J.L. (2003): Photostimulation of a sensory rhodopsin II/HtrII/Tsr fusion chimera
activates CheA-autophosphorylation and CheY-phosphotransfer in vitro. Biochemistry 42, 13887–13892
[17] Wegener, A.A., Chizhov, I., Engelhard, M.
Steinhoff, H.J. (2000): Time-resolved detection of transient movement of helix F in spin-labelled pharaonis sensory rhodopsin II. J. Mol. Biol. 301, 881–891
[18] Falke, J.J. & Hazelbauer, G.L. (2001): Transmembrane signaling in bacterial chemoreceptors. Trends
Biochem. Sci. 26, 257–265
Martin Engelhard
Jahrgang 1942, Studium
der Chemie an der Universität Göttingen, Promotion 1974 bei Prof.
Dr. W. Lüttke am Institut
für Organische Chemie,
Johann P. Klare
Jahrgang 1969, Studium
der Chemie and der
Universität Dortmund,
Promotion 2003 bei PD
Universität Göttingen,
1974–1977 Postdoc in
der Abteilung von Prof.
Dr. B. Merrifield, Rockefeller University, New
York, seit 1977 Wissenschaftlicher Mitarbeiter
am Max Planck Institut
für Ernährungsphysiologie (jetzt Max-Planck-Institut für molekulare
Physiologie), 1996 Habilitation am Fachbereich Chemie der Universität Dortmund.
Dr. M. Engelhard am
Max-Planck-Institut für
molekulare Physiologie
über die Struktur und
Funktion der archaebakteriellen Rhodopsine, Universität Dortmund. Seit 2003 PostDoc am Max-Planck-Institut für molekulare
Physiologie in der Arbeitsgruppe von PD Dr.
M. Engelhard.
BIOspektrum · 2/04 · 10. Jahrgang
[19] Marwan, W., Schäfer, W. & Oesterhelt, D.
(1990): Signal transduction in Halobacterium depends on
fumarate. EMBO J., 9, 355–362
Korrespondenz-Adresse:
Dr. Martin Engelhard
Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie
Otto-Hahn-Str. 11
D-44227 Dortmund
Tel.: 0231-1332302
Fax.: 0231-1332399
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