Aus der Hals-Nasen-Ohrenklinik der - Heinrich-Heine
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Aus der Hals-Nasen-Ohrenklinik der Heinrich Heine-Universität Düsseldorf Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. Schipper FUNKTIONELLE RELEVANZ VON CHEMOKINEN IM METASTASIERUNGSPROZESS VON KOPF-HALS KARZINOMEN Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin Der Medizinischen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf vorgelegt von Christine Eulert 2008 Als Inauguraldissertation gedruckt mit der Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf gez.: Univ.-Prof. Dr. med. Joachim Windolf Dekan Referent: Priv.-Doz. Dr. med. T.K. Hoffmann Korreferent: Univ.-Prof. Dr. med. B. Homey Inhaltsverzeichnis Seite 1 Einleitung ........................................................................................................... 2 1.1 1.1.1 Pathogenese ......................................................................................... 3 1.1.2 Die Organspezifität der Metastasierung ................................................ 4 1.2 Chemokine ................................................................................................... 5 1.2.1 Die Chemokinsuperfamilie .................................................................... 5 1.2.2 Biologische Funktionen von Chemokinen und ihren Rezeptoren ........ 11 1.2.3 Funktion von Chemokinen in malignen Erkrankungen ........................ 12 1.3 Maligne Kopf-Hals Tumore ......................................................................... 13 1.3.1 Plattenepithelkarzinome ...................................................................... 15 1.3.2 Adenoid-zystische Karzinome ............................................................. 16 1.4 2 Metastasierung ............................................................................................. 3 Fragestellung ............................................................................................. 18 Material und Methoden ................................................................................... 19 2.1 Charakterisierung der Chemokinrezeptorexpression in AZK und PEK der Kopf-Hals-Region .................................................................................................. 19 2.1.1 Zelllinien und Zellkultur ....................................................................... 19 2.1.2 Analyse der Chemokinrezeptorexpression auf RNS-Ebene mittels quantitativer real–time PCR (Taq-Man®) ......................................................... 21 2.1.3 Analyse der Chemokinrezeptorexpression auf Proteinebene in vitro mittels Durchflußzytometrie ............................................................................... 23 2.1.4 Analyse der Chemokinrezeptorexpression auf Proteinebene in vivo mittels Immunhistochemie ................................................................................. 23 2.2 In vitro Funktion und Regulation tumorassoziierter Chemokinrezeptoren .. 25 2.2.1 Analyse von Migration und Invasion von Tumorzellen auf Chemokingradienten mittels Chemotaxis Assays .............................................. 25 2.2.2 Modulation von Chemokinrezeptoren durch Chemotherapie .............. 26 2.2.3 Analyse intrazellulärer Signaltransduktionswege mittels Western- Blotting zum Nachweis aktivierter Signalmoleküle ............................................ 27 2.2.4 3 Analyse chemokinvermittelter antiapoptotischer Signale .................... 28 Ergebnisse ....................................................................................................... 30 3.1 Tumorzelllinien von adenoid-zystischen Karzinomen und Plattenepithelkarzinomen exprimieren distinkte Chemokinrezeptorprofile in vitro. 30 3.1.1 Chemokinrezeptorexpression von AZK und PEK auf RNS-Ebene ...... 30 3.1.2 Chemokinrezeptorexpression von AZK und PEK auf Protein-Ebene .. 33 3.2 AZK und PEK exprimieren distinkte Chemokinrezeptoren in vivo .............. 36 3.3 CXCR4 mediiert die gerichtete Migration von Tumorzellen in vitro ............ 39 3.4 Das antineoplastische Agens Cisplatin induziert CXCR4-Expression auf Tumorzellen .......................................................................................................... 40 3.5 CXCL12/CXCR4-Interaktion führt zur Aktivierung von “survival pathways“ in Tumorzellen .......................................................................................................... 43 4 Diskussion ....................................................................................................... 45 5 Literaturverzeichnis ........................................................................................ 52 6 Zusammenfassung .......................................................................................... 59 7 Anhang ............................................................................................................. 60 Abkürzungen _____________________________________________________________ 1 Abkürzungen Abb – Abbildung Akt – Proteinkinase B AZK – adenoid-zystisches Karzinom DNS – Desoxyribonukleinsäure cAMP – zyklisches Adenosinmonophosphat cDNA – complementary DNA ERK1/2 – extrazellulär Signal-regulierte Kinasen 1 und 2 GPCR – G-Protein gekoppelter Rezeptor IP3 – Inositoltrisphosphat KHT – Kopf-Hals Tumore MAPK – durch Mitogene aktivierte Proteinkinasen mRNS – Boten-RNS PE – Phycoerythrin PEK – Plattenepithelkarzinom PIP2 – Phosphatidylinositolbiphosphat PKB – Proteinkinase B, Akt RNS – Ribonukleinsäure RT-PCR – Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion SDS PAGE – Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamid Gel Electrophorese Tab Tabelle – Einleitung ________________________________________________________________ 2 1 Einleitung Metastasierung ist das Resultat multipler, aufeinanderfolgender Ereignisse und stellt einen hochgradig organisierten, nicht zufälligen und organspezifischen Prozess dar1. Gerichtete Migration von Tumorzellen sowie ihre invasive Kapazität sind fundamentale Bestandteile des Metastasierungsprozesses. Obwohl eine Anzahl von bekannten, physiologischen Molekülen für die Stimulation von Tumorzellmotilität und -invasion von Bedeutung sind, sind die genauen molekularen Mechanismen, die die gerichtete Wanderung/Metastasierung von Tumorzellen in spezifische Organe vermitteln, weitestgehend unbekannt1-3. Schlüsselprozesse stellen die Adhäsion an Endothelzellen, transendotheliale Migration sowie die gerichtete Wanderung durch extrazelluläre Matrix dar. In den letzten Jahren wurde gezeigt, daß Chemokine und deren Rezeptoren für die Wanderung und das organspezifische "Homing" von Leukozyten von zentraler Bedeutung sind4. Chemokine sind Vertreter einer Superfamilie von kleinen, zytokinähnlichen Proteinen, die aufgrund ihrer Interaktion mit G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), die Polymerisation des Zytoskeletts, die feste Adhäsion an das Endothel sowie die gerichtete Wanderung von Leukozyten vermitteln4. Diese sezernierten Proteine interagieren in einer koordinierten Art und Weise mit Zelloberflächenproteinen wie beispielsweise Integrinen, um das spezifische "homing" von unterschiedlichen Subtypen hämatopoietischer Zellen in definierte anatomische Kompartimente zu steuern4,5. Muller et al. konnten 2001 erstmals die funktionelle Bedeutung von ChemokinRezeptor-Interaktionen für den Metastasierungsprozess zeigen6-9. Dabei wurde der Chemokinrezeptor CXCR4 als zentraler Vermittler der hämatogenen Metastasierung von Mammakarzinomzellen identifiziert und seine Relevanz in Rezeptor- Antagonisierungsstudien in vivo demonstriert6. Anknüpfend an diese Beobachtungen sollte in der vorliegenden Arbeit die funktionelle Rolle von Chemokinen im Invasionsund Metastasierungsprozess von Kopf-Hals-Tumoren untersucht werden. Dabei stellen insbesondere zwei Tumorentitäten innerhalb der Gruppe der malignen KopfHals-Karzinomen aufgrund ihres distinkten aber unterschiedlichen Metastasierungsmusters ein interessantes Untersuchungsobjekt dar: Während Plattenepithelkarzinome (PEK) der oropharyngealen Mukosa durch eine hohe Rate an lymphogenen Metastasen (~60%)10 bei insgesamt später und seltener Einleitung ________________________________________________________________ 3 hämatogener Disseminierung (< 10%) charakterisiert sind11, zeigen die von den Speicheldrüsen ausgehenden adenoid-zystischen Karzinome (AZK) eine hohe Inzidenz an hämatogenen Metastasen (40-60%) bei gleichzeitig niedriger Inzidenz von Lymphknotenmetastasen (<10%)12. Bisher ist ungeklärt, welche molekularen Mechanismen diesen unterschiedlichen, annähernd reziproken Metastasierungsmustern zugrunde liegen. 1.1 Metastasierung Die wesentlichen Kriterien für die Malignität einer Neoplasie sind ihre autonome, invasive und destruktive Proliferation sowie die Fähigkeit zur Metastasierung. Unter dem Begriff der Metastasierung versteht man die Absiedlung von Tumorzellen abseits des Primärtumors. Metastasierung beruht auf dem komplexen Zusammenspiel verschiedener molekularer Ereignisse und stellt einen hochgradig organisierten, nicht zufälligen und organspezifischen Prozess dar13,14 Statistisch betrachtet gelangen täglich pro Gramm Primärtumor bis zu 4 Mio. Zellen in den systemischen Kreislauf, wobei nur ein Bruchteil hiervon tatsächlich zur Entstehung einer Metastase führt15. 1.1.1 Pathogenese Die Metastasierung stellt einen komplexen, mehrstufigen Prozess dar. Im ersten Schritt kommt es durch Veränderungen in den Zell-Zell-Kontakten zu einem Verlust der Adhäsion und Lösung von Tumorzellen aus dem Verband des Primärtumors16. Nachfolgend gewinnen Tumorzellen einzeln oder im Zellverbund Anschluß an das Blut- bzw. Lymphgefäßsystem, ein Vorgang welcher als Intravasation bezeichnet wird13,14,16. Von elementarer Bedeutung hierfür sind die Proteolyse extrazellulärer Matrix sowie die gerichtete Migration/Invasion von Tumorzellen14. Nach erfolgreicher Extravasation im Zielorgan stellen invasive Kapazität, Proliferation und Angiogenese Schlüsselprozesse dar, welche für die Entstehung eines metastatischen Focus notwendige Voraussetzung sind13,14,16. Obwohl eine Anzahl bekannter, physiologischer Moleküle für die Stimulation von Tumorzellmotilität und -invasion von Bedeutung sind (Tab.1), sind die genauen molekularen Mechanismen, die die gerichtete Wanderung/Metastasierung von Tumorzellen in spezifische Organe vermitteln, weitestgehend unbekannt3,14,15. Einleitung ________________________________________________________________ 4 Tabelle 1. Molekulare Mechanismen der Metastasierung. Biologische Funktion Beispielmoleküle Literaturstelle Überleben Insuline like Growth Factor IGF Bogenrieder 200314 Adhäsion Cell adhesion molecules CAMs, Cadherine, Integrine Hsu 200217 Chemokine, Met-SF/HGF- Müller 20016 Signalweg Boccaccio18 Proteolyse MMPs, Heparanase Egeblad 200219 immune escape Verlust der MHC-Expression Bogenrieder 200314 Migration 1.1.2 Die Organspezifität der Metastasierung Bereits 1889 beobachtete der Chirurg Stephen Paget, daß bei Karzinompatienten bestimmte Organe eine große Anzahl von Metastasen aufwiesen, während andere kaum Metastasen zeigten20. Die Ursache hierfür blieb jedoch ein Rätsel, da die beobachteten Metastasierungsmuster nicht allein durch anatomische Unterschiede in Blut- und Lymphfluss verschiedener Organe erklärt werden konnten15,20. Bis heute wurden drei verschiedene wissenschaftliche Konzepte entwickelt, die die Problematik organspezifischer Metastasierung versuchen, zu erklären. Das erste Konzept ist die sogenannte “growth factor theory”. Sie postuliert, daß Tumorzellen in allen Organen in Abhängigkeit von der Hämodynamik extravadieren, aber nur in solchen Organen multiplizieren, die entsprechende Wachstumsfaktoren bereitstellen16. Die “adhesion theory” besagt, daß die Extravasation von Tumorzellen durch bestimmte Adhäsionsmoleküle gesteuert wird, die ihrerseits wiederum vom Endothel in einer organspezifischen Art und Weise exprimiert werden21. Die dritte Theorie ist die “chemoattractant theory“. In Studien wurde gezeigt, daß Tumorzellen aufgrund von Chemokingradienten in bestimmte Organe metastasieren können6,7,9,22 (Abb. 1). Chemokine sind chemotaktisch wirksame, zytokinähnliche Moleküle, deren Struktur und Funktion im Folgenden näher erläutert wird. Einleitung ________________________________________________________________ 5 Abbildung 1. Chemokine im Metastasierungs- prozess. Schematische Darstellung der funktionellen Relevanz von Chemokinen im Metastasierungsprozess. 1.2 Chemokine Chemokine sind kleine (8-14 kD), zytokinähnliche Proteine, die aufgrund der Interaktion mit G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) verschiedene Zellen anlocken und aktivieren können. In ihrer Paraderolle kontrollieren sie physiologischerweise das Wanderungsverhalten von Leukozyten4,23,24. 1.2.1 Die Chemokinsuperfamilie Typisches Merkmal der Chemokine ist ihre Aminosäuresequenz. In der Regel finden sich vier konservierte Cystein-Aminosäuren. Anhand der Abfolge der ersten beiden Cystein-Aminosäuren werden vier distinkte Chemokin-Subfamilien unterschieden (Tab.2)23. Erstens, die CC-Chemokinfamilie, bei der die ersten beiden Cysteine in direkter Nachbarschaft angeordnet sind, zweitens, die CXC-Chemokinfamilie mit Separation der ersten beiden Cystein-Aminosäuren durch ein “Nicht-Cystein”; drittens, die C-Chemokine, die als Besonderheit nur einen Cystein-Rest aufweisen und viertens, die CX3C-Chemokinfamilie, deren Vertreter drei “Nicht-Cysteine” Einleitung ________________________________________________________________ 6 zwischen den ersten beiden Cystein-Aminosäuren in der Aminosäuresequenz zeigen4,23,24. Tabelle 2. Struktur und Name der Chemokine. Struktur Name NH2 - - C X C - -C - -C - -COOH CXC – Chemokinfamilie (alpha) NH2 - - C C - -C - -C - -COOH CC – Chemokinfamilie (beta) NH2 - - C - - - - - - - -C - -COOH C – Chemokinfamilie (gamma) NH2 - - C X3 C - -C - -C - -COOH CX3C – Chemokinfamilie (delta) Nach anfänglich uneinheitlicher Benennung der Chemokine regten die Drs Yoshie und Zlotnik eine systematische Nomenklatur an (Keystone Conference 1999), die mittlerweile von der WHO übernommen wurde und bei der sich der Name aus der Chemokinsubfamilie (z.B. CC oder CXC) und dem Zusatz L für Ligand (Chemokin) oder R für Rezeptor ergibt (IUIS/WHO Subcommittee on Chemokine Nomenclature, 2003). Bislang sind 25 humane CC-Chemokine, 15 humane CXC–Chemokine, zwei humane C–Chemokine und ein humanes CX3C–Chemokin bekannt. Einleitung ________________________________________________________________ 7 Tabelle 3. Systematische Nomenklatur für Chemokine (Keystone Meeting 1999). CC Chemokin / Rezeptor Familie Systematischer Name Humaner Ligand Muriner Ligand Chemokinrezeptor(en) CCL1 I-309 TCA-3, P500 CCR8 CCL2 MCP-1, MCAF MCP-1, JE CCR2, CCR5 CCL3 MIP-1α, LD78α, LD78β, AT464.1, AT464.2, GOS19-1, GOS19-2 MIP-1α CCR1, CCR5 CCL4 MIP-1β, AT744.1, AT744.2, Act-2, G-26, HC21, H400, LAG-1 MIP-1β CCR1, CCR5, CCR8 CCL5 RANTES RANTES CCR1, CCR3,CCR4, CCR5 CCL6 Unbekannt C10, MRP-1 CCL7 MCP-3 NC28, FIC, MARC CCR1, CCR2, CCR3 CCL8 MCP-2, HC14 MCP-2 CCR2, CCR3 CCL9/10 Unbekannt MRP-2, CCF18, MIP-1γ Unbekannt CCL11 Eotaxin Eotaxin CCR3 CCL12 Unbekannt MCP-5 CCR2 CCL13 MCP-4, NCC-1, CKβ−10 Unbekannt CCR2, CCR3 CCL14 HCC-1, HCC-3, NCC-2 Unbekannt CCR1 CCL15 HCC-2, MIP-1δ, NCC-3, MIP-5, Lkn-1 Unbekannt CCR1, CCR3 CCL16 HCC-4, NCC-4, LEC, LMC LCC-1 CCR1 CCL17 TARC, dendrokine TARC CCR4, CCR8 CCL18 DC-CK1, PARC, MIP-4, AMAC-1 Unbekannt Unbekannt CCL19 MIP-3β, ELC, exodus-3, Ckβ−11 MIP-3β CCR7 CCL20 MIP-3α, LARC, exodus-1, MIP-3α CCR6 CCL21 6Ckine, SLC, exodus-2, TCA-4 6Ckine CCR7 CCL22 MDC, STCP-1, DCtactin-β ABCD-1 CCR4 CCL23 MPIF-1, MIP-3, CKβ8, CKβ8-1 Unbekannt CCR1 CCL24 Eotaxin-2, MPIF-2, Ckβ−6 Unbekannt CCR3 CCL25 TECK TECK CCR9 (GPR9-6) CCL26 Eotaxin-3 Unbekannt CCR3 CCL27 CTACK, ALP CTACK, ALP CCR10 CCL28 CCL28, MEC CCL28 CCR10 Einleitung ________________________________________________________________ 8 CXC Chemokin / Rezeptor Familie Systematischer Name Humaner Ligand Muriner Ligand Chemokinrezeptor(en) CXCL1 GRO-1, GROα, MGSA-α GRO/KC CXCR2 > CXCR1 CXCL2 GRO2, GROβ, MIP-2α, MGSA-β GRO/KC CXCR2 CXCL3 GRO3, GROγ, MIP-2β GRO/KC CXCR2 CXCL4 PF4 PF4var1, PF4alt Unbekannt CXCL5 ENA-78 LIX CXCR2 CXCL6 GCP-2 CKα-3 CXCR1, CXCR2 CXCL7 NAP-2 Unbekannt CXCR2 CXCL8 IL-8, MDNCF, NAP-1, NCF Unbekannt CXCR1, CXCR2 CXCL9 Mig, Humig Mig CXCR3 CXCL10 IP-10 crg-2, mob-1 CXCR3 CXCL11 I-TAC, H174, b-R1 Unbekannt CXCR3 CXCL12 SDF-1α, SDF-1β, PBSF SDF-1α/β CXCR4 CXCL13 BLC, BCA-1, BLR1L, Angie CXCR5 CXCL14 BRAK, bolekine BRAK Unbekannt CXCL15 Unbekannt Lungkine Unbekannt CXCL16 CXCL16 CXCL16 CXCR6 (STRL33) C Chemokin / Rezeptor Familie Systematischer Name Humaner Ligand Muriner Ligand Chemokinrezeptor XCL1 Lymphotactin, SCM-1α, ATAC Lymphotactin XCR1 XCL2 SCM-1β XCR1 CX3C Chemokin / Rezeptor Systematischer Name Humaner Ligand Muriner Ligand Chemokinrezeptor CX3CL1 Fractalkine, neurotactin Fractalkine CX3CR1 Einleitung ________________________________________________________________ 9 Die biologischen Effekte von Chemokinen werden durch die Interaktion mit GProtein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR), die sieben transmembranäre Domänen besitzen, vermittelt (Abb.2). Ähnlich wie die Chemokinliganden zeigt die Familie der Chemokinrezeptoren in den letzten Jahren eine deutliche Expansion. Zur Zeit kennen wir 10 CC-, 6 CXC und je einen XC- sowie CX3C-Rezeptor (Tab.3). Neben den identifizierten Chemokinrezeptoren gibt es jedoch eine Reihe weiterer sogenannter “verwaister“ GPCR, für die bis heute noch kein Ligand identifiziert werden konnte. Ausgehend von rekrutierten G-Proteinen verwenden Chemokinrezeptoren verschiedene Signaltransduktionswege, um unterschiedliche biologische Funktionen zu vermitteln (Tab.3, Abb.2)4,23,24. Chemokine CCR1-10 XCR1 CXCR1-6 CX3CR1 Abbildung 2. Signaltransduktion von Chemokinrezeptoren. Chemokinrezeptoren umfassen sieben transmembranäre Domänen und sind an G-Proteine gekoppelt. Zur Zeit kennen wir 10 CC-, 6 CXC-Rezeptoren, und je einen XC- und CX3C- Rezeptor. Verschiedene Signaltransduktionswege werden von Chemokinrezeptoren verwendet, um biologische Funktionen wie Integrinaktivierung, Apoptose, Genexpression, Adhäsion und Chemotaxis zu vermitteln. Einleitung _______________________________________________________________ 10 Interessanterweise existiert ein gewisser Grad an Promiskuität innerhalb der Chemokinsuperfamilie. Dies äußert sich in der Tatsache, daß einige Liganden denselben Rezeptor für die Vermittlung ihrer biologischen Funktionen verwenden (Tab.3). Sortiert man Chemokinliganden nach ihrer chromosomalen Lage und ihrem Rezeptorbindungsverhalten, so fällt auf, daß sogenannte „Cluster”-Chemokine, die auf dem selben Chromosom lokalisiert sind und identische Rezeptoren binden, existieren (Tab.3, Abb.3). Eine kleinere Anzahl an Chemokinen, die sogenannten „Non-Cluster”-Chemokine, binden häufig einen spezifischen Rezeptor und haben eine besondere chromosomale Lokalisation (Tab.3, Abb.3)3. Betrachtet man die Chemokinsuperfamilie in ihrer Gesamtheit, so fällt auf, daß die Vertreter, die als erstes identifiziert wurden, zu großen Mengen in vielen verschiedenen Zelltypen gebildet werden (z.B. CCL3-5). Die Chemokine, die als letztes gefunden wurden, zeigen im Gegensatz dazu ein sehr restriktives Expressionsmuster und sind nur in sehr wenigen Geweben und Zellen vorhanden (z.B. CCL25, CCL27, CCL28)3. CXCR1 6 8 CXCR2 1 2 CXCR3 9 10 11 3 5 6 7 8 CCR1 3 5 CCR2 2 7 13 CCR3 5 7 CXCR4 12 CCR4 CXCR5 13 CCR5 3 CXCR6 16 CCR6 20 CCR7 19 21 XCR1 CX3CR1 2 1 1 7 13 14 15 16 23 8 11 13 15 24 26 8 17 22 4 CCR8 1 CCR9 25 CCR10 27 28 5 8 Abbildung 3. „Cluster”- versus „Non-Cluster”-Chemokine. Das Schema stellt die Rezeptor/Liganden-Interaktionen sowie die chromosomale Lokalisation von Chemokinen dar (rot = 4q12-q13, orange = 4q21.21, gelb = 10q11.1, violett = 17q11.2, rosa = 2q33-q37, hellblau = 1q23, dunkelblau = 19p13.2, hellgrün = 4q21, dunkelgrün = 16q13, tiefgrün = unbekannt, braun = 9p13, grau = 5p13). Es können „Cluster”-Chemokine (Liganden, die identische chromosomale Lage aufweisen) und „Non-Cluster”-Chemokine (Liganden in spezifischer chromosomaler Lokalisation) unterschieden werden. Einleitung _______________________________________________________________ 11 Nach Bindung des Chemokins an den spezifischen Rezeptor können verschiedene Signalwege zur weiteren Signaltransduktion aktiviert werden, wie beispielsweise die Erhöhung des intrazellulären Kalziumspiegels, Aktivierung der Phospholipase C und Umwandlung von Phosphatidylinositolbiphosphat (PIP2) in Inositoltrisphosphat (IP3) und Diacylglycerin, Aktivierung der Proteinkinase C, Phosphorylierung der Proteine Akt und ERK, sowie die Beeinflussung des cAMP Spiegels2,25. Besondere Erwähnung verdienen die Proteinkinase B (PKB), auch Akt genannt, und die durch Mitogene aktivierten Proteinkinasen (MAPK), vor allem die extrazellulär Signalregulierten Kinasen 1 und 2 (ERK1/2), da sie in den verschiedenen Signaltransduktionswegen Schlüsselpositionen besetzen26-29. Zentrale Elemente dieser Transduktionswege sind die Phosphoinositid-3 Kinase, die ihrerseits zur Phosphorylierung und Aktivierung von Akt führt und das Oncogen Ras, welches in der Phosphorylierung und Aktivierung von Funktionen sind beispielsweise die ERK1/2 mündet29,30. Die vermittelten Induktion von Aktinpolymerisation und Chemotaxis31 sowie Zellreifung und Reduktion der Apoptoserate32,33. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass verschiedene Malignome eine erhöhte Akt-Aktivität besitzen, was in einer verminderten Apoptoserate, einer vermehrten Proliferation und Invasivität des jeweiligen Tumors resultiert27,34-37. Auf zellulärer Ebene werden durch Chemokin/Rezeptor-Interaktionen zentrale Prozesse reguliert26: der Zellzyklus, das Wachstum, die Zellmotilität sowie das Überleben der Zelle26,28, wobei die Steuerung direkt über die Beeinflussung regulatorischer Proteine oder indirekt über die Kontrolle der Transkription und des Zellmetabolismus erfolgen kann29. Die biologischen Funktionen, die durch Chemokine und ihre Rezeptoren vermittelt werden können, wie z.B. Apoptose, Genexpression, Integrinaktivierung, Reorganisation des Zytoskeletts, Adhäsion sowie gerichtete Migration (Tab. 3, Abb. 2) werden im Folgenden näher beleuchtet4,23,24. 1.2.2 Biologische Funktionen von Chemokinen und ihren Rezeptoren In ihrer Paraderolle regulieren Chemokine die Leukozytenmigration. Zusammen mit Adhäsionsmolekülen vermitteln Chemokine die feste Adhäsion von Leukozyten an das Endothel, die transendotheliale Migration sowie Wanderung durch extrazelluläre Matrix und bestimmen die spezifische Lokalisierung distinkter Leukozytensubpopulationen in peripheren Geweben4,23,24. Diese initialen Befunde zur Biologie Einleitung _______________________________________________________________ 12 von Chemokinen identifizieren Angehörige dieser Proteinsuperfamilie als potente Kandidaten, die die Rekrutierung von pathogenetisch relevanten Leukozytensubpopulationen in periphere Organe steuern und somit sowohl in der Initiierung als auch in der Chronifizierung von Erkrankungen eine wichtige Rolle spielen4. Chemokine sind für das Zusammenspiel und die Funktion des Immunsystems von elementarer Bedeutung. Sie regulieren die zielgerichtete Migration naiver und auch reifer immunkompetenter Zellen, sie beeinflussen wesentlich den Aufbau der primären und sekundären lymphatischen Organe, die Tund B-Zellreifung sowie den Tropismus und das “Homing“ von Leukozytensubpopulationen23,34,37. Auch bei vielen entzündlichen Erkrankungen konnte die Schlüsselrolle von Chemokinen und ihren Rezeptoren gezeigt werden. Akute Entzündungen wie beispielsweise Sepsis oder bakterielle Pneumonien werden wesentlich von Chemokinen reguliert35,38 . Auch chronische oder rezidivierende Entzündungen sind durch das Zusammenspiel spezifischer Chemokine und ihrer Rezeptoren charakterisiert. Wichtige Beispiele sind die Multiple Sklerose33, die chronisch entzündlichen Darmerkrankungen34, die rheumatoide Arthritis35, die Psoriasis37 sowie Erkrankungen des atopischen Formenkreises38. Mit Fortschreiten der Chemokinforschung konnten weitere biologische Funktionen entdeckt werden. So werden zum Beispiel Angiogenese und Angiostase unter anderem von Chemokinen beeinflusst23. In Tierversuchen führte das Fehlen des Chemokin-Rezeptorenpaares CXCL12/CXCR4 zu schweren kardiovaskulären Fehlbildungen31. Darüber hinaus vermitteln Chemokine Veränderungen in der Genexpression, die Reorganisation des Zytoskeletts und können die Apoptose von Zellen beeinflussen4,23,24. 1.2.3 Funktion von Chemokinen in malignen Erkrankungen Neben ihrer zentralen Bedeutung für die Leukozytenwanderung spielen Chemokine eine komplexe Rolle im Tumormikromilieu. Dabei vermitteln Chemokine nicht nur die Anti-Tumor-Immunantwort, sondern agieren als potentielle Tumorprogressoren beispielsweise durch die Stimulation von Wachstumsfaktoren und angiogenetischen Faktoren, durch Induktion von Matrix-Remodellierung oder Tumorzellmigration, durch Modulation von Adhäsionsmolekülen und durch eine Umkehrung der Anti-TumorImmunantwort2. Darüber hinaus können Chemokine direkt Angiogenese induzieren2 und die Proliferation von Tumorzellen beeinflussen2. Ein Meilenstein gelang 2001 Einleitung _______________________________________________________________ 13 Müller et al., die die funktionelle Relevanz von Chemokin/Rezeptor-Interkationen für die Migration und Metastasierung von Tumorzellen im Mammakarzinom demonstrieren konnten6,7,9. Eine umfassende quantitative real-time PCR-Analyse aller bekannten Chemokinrezeptoren (CCR1-CCR10, CXCR1-CXCR5, XCR1 und CX3CR1) ergab, daß Zellen dieser Tumorentität Chemokinrezeptoren in definierter Weise auf mRNS-Ebene exprimieren. Dabei zeigten Mammakarzinomzellen im Vergleich zu normalen duktalen Mammaepithelzellen eine deutliche Überexpression der Chemokinrezeptoren CXCR4 und CCR7. Diese Beobachtungen ließen sich auf Proteinebene sowohl in vitro als auch in vivo bestätigen. Vergleichende, quantitative PCR-Analysen der korrespondierenden Liganden für CXCR4, CXCL12, bzw. für CCR7, CCL21, ergaben, daß diese Chemokine selektiv und am höchsten in Organen gebildet werden, die primäre Metastasierungsziele des Mammakarzinoms darstellen (Lunge, Leber, Knochenmark, Lymphknoten), jedoch auf signifikant niedrigerem Niveau in Organen gebildet werden, die seltener Mammakarzinommetastasen aufweisen (Haut, Skelettmuskel). In vitro induzierten CXCL12 und CCL21 Aktinpolymerisation, Pseudopodienbildung sowie Migration und Invasion von Mammakarzinomzellen. Eine Neutralisation der CXCL12-CXCR4-Signaltransduktion in vivo mittels eines blockierenden anti-CXCR4-Antikörpers führte zu einer signifikanten Reduktion Mammakarzinomzellen in (65-83%) Lunge und der Metastasierung Lymphknoten in von humanen einem orthotopen Mammakarzinommodell. Diese Beobachtungen beschränken sich nicht nur auf das Mammakarzinom, Chemokine scheinen prinzipiell für den Metastasierungsprozess maligner Tumoren von Bedeutung zu sein39. Auch andere Gruppen konnten aktuell dieses Konzept stützen und zeigen, daß beispielsweise die akute myeloische und lymphoblastische Leukämie40, die chronische lymphatische Leukämie41, das Non-Hodgkin B-ZellLymphom42, das Ovarialkarzinom43 sowie das Pankreaskarzinom44 funktionell aktive Chemokinrezeptoren ausprägen, welche die Migration von Tumorzellen vermitteln. Weitere Beispiele sind auch das Bronchialkarzinom, das maligne Melanom und das Endometriumkarzinom45-47. 1.3 Maligne Kopf-Hals Tumore Unter dem Begriff der malignen Kopf-Hals-Tumore (KHT) wird eine Vielzahl unterschiedlicher Neoplasien zusammengefasst, die im Bereich von Mund, Rachen Einleitung _______________________________________________________________ 14 oder Kehlkopf entstehen. Mit einer weltweiten Inzidenz von über 500.000 Fällen jährlich besitzen maligne KHT eine große epidemiologische Bedeutung und gehören zu den häufigsten Malignomen48. Bezogen auf die deutsche Bevölkerung rechnet man basierend auf den Daten der jeweiligen, landeseigenen Krebsregister mit einer Inzidenz von ca. 13.000 Fällen jährlich. Hierbei sind Männer, abhängig von der Tumorlokalisation, insgesamt drei- bis fünfmal häufiger betroffen als Frauen. Dieser Unterschied spiegelt sich auch in der altersbereinigten Mortalitätsrate der 20 häufigsten Krebstodesursachen wider: während sich im Jahr 2003 maligne KHT an sechster Stelle der häufigsten Krebstodesursachen der männlichen Bevölkerung finden, stehen sie in der weiblichen Bevölkerung an 17. Stelle (GEKID, 2006). Unterstrichen wird die Bedeutung dieser Zahlen durch die Tatsache, dass Neoplasien bis zum 85. Lebensjahr die häufigste Todesursache im Erwachsenenalter darstellen49. Über 60% der Malignome des Kopf-Hals Bereichs befinden sich zum Zeitpunkt der Diagnose in einem fortgeschrittenen Tumorstadium, in über 50% der Fälle weisen die Patienten bei Erstdiagnose bereits Lymphknotenmetastasen auf50. Entscheidend für die Überlebensrate und die Prognose von Tumorpatienten sind vor allem das Tumorstadium und die Metastasierung2,15,51. Obwohl durch Einschluss modernster Operationstechniken in Kombination mit Chemotherapie- und Bestrahlungsprotokollen Fortschritte in der lokoregionären Kontrolle erzielt wurden, hat sich die 5-Jahres-Überlebensrate seit zwei Dekaden nicht wesentlich verbessert52. Für die vorliegende Arbeit wurden zwei histologische Subtypen der Kopf-Hals Tumoren gewählt, die sich durch ihr nahezu reziprokes Metastasierungsverhalten (Tab.4) als Experimentalmodell besonders anbieten, um einen möglichen Zusammenhang zwischen der Chemokinrezeptorexpression und organspezifischer Metastasierung der malignen KHT zu erforschen: das Plattenepithelkarzinom (PEK) und das adenoid-zystische Karzinom (AZK). Tabelle 4. Metastasierungsmuster von AZK und PEK. Metastasierungsmuster Lymphogen Hämatogen AZK spät, selten früh, häufig PEK früh, häufig spät, selten Einleitung _______________________________________________________________ 15 1.3.1 Plattenepithelkarzinome Das Plattenepithelkarzinom (PEK) ist mit über 90% der häufigste histologische Subtyp der Kopf-Hals-Tumore und entsteht aus mukosalen Keratinozyten der oberen Schluck-Atemstraße48,53. Die wichtigsten Risikofaktoren für das Auftreten eines PEK sind Nikotin- und Alkoholabusus51. Jeder dieser Faktoren erhöht für sich genommen das Erkrankungsrisiko um das drei- bis neunfache, während beide gemeinsam das Risiko an einem Plattenepithelkarzinom zu erkranken, um den Faktor Hundert steigern51. Auch das Auftreten von Zweitneoplasien, die bei PEK im KopfHalsbereich in 20 bis 33% der Fälle auftreten und zu einer deutlichen Einschränkung der Lebenserwartung führen, werden durch fortbestehende Rauch- und 54 Alkoholgewohnheiten stark begünstigt . Histopathologisch können verschiedene Differenzierungsgrade des PEK unterschieden werden: entdifferenziert/anaplastisch, gering differenziert, mäßig und hoch differenziert. Das PEK zeichnet sich durch eine frühe lymphogene Metastasierung aus, zum Zeitpunkt der Erstdiagnose bestehen bereits in über 50% der Fälle bereits Lymphknotenmetastasen, eine hämatogene selten und wenn überhaupt im verzögerten Intervall50. Die Therapie der PEK des Kopf-Hals-Bereiches erfolgt stadienabhängig. In den Stadien I und II Fernmetastasen) (Tumorgröße sind die unter Operation 4cm ohne und/oder Lymphknotenbefall Bestrahlung mit oder guten Heilungserfolgen Therapie der Wahl47,50. Im häufigeren Fall der fortgeschrittenen PEK der Stadien III und IV (Tumorgröße größer als 4cm mit Lymphknotenbefall oder Fernmetastasen) erfolgt die Behandlung chirurgisch in Kombination mit Radiatio und Chemotherapie oder durch eine primäre Radiochemotherapie. PEK der Stadien III und IV besitzen jedoch trotz extensiver, multimodaler Therapiekonzepte eine schlechte Prognose50. Deshalb wurde in zahlreichen Studien nach prognostisch relevanten Faktoren geforscht. Es konnte gezeigt werden, dass neben dem Tumorstadium vor allem die Ausprägung der lymphogenen Metastasierung gemessen an Morphologie der der Anzahl befallenen der Lymphknotenmetastasen, Lymphknoten und ein einer veränderten Überschreiten der Lymphknotenkapsel Prognose-limitierend sind15,44,55 . Trotz großer Anstrengungen, bestehende Therapiekonzepte zu optimieren und dem erreichten Teilerfolg der höheren lokoregionären Kontrolle, konnte bisher keine durchgreifende Verbesserung der Prognose 48,50 metastasierten Stadium erzielt werden . von Patienten mit KHT im Einleitung _______________________________________________________________ 16 1.3.2 Adenoid-zystische Karzinome Das adenoid-zystische Karzinom (AZK) ist ein maligner epithelialer Tumor, der seinen Ursprung von den Speicheldrüsen nimmt und mit 3-5% aller Kopf-Hals Karzinome im Vergleich zum PEK (bis zu 90%) eine seltene Tumorentität darstellt56. Bezüglich der Lokalisation und der Häufigkeit sind die großen und kleinen Speicheldrüsen zu je 50% betroffen. Im Gegensatz zum Plattenepithelkarzinom des Kopf-Hals-Bereiches gibt es keine bekannten Risikofaktoren für das AZK. Daher ist diese Tumorentität keinen präventiven Maßnahmen zugänglich56. Histologisch lässt sich das AZK anhand seines Wachstums in drei Formen einteilen: glandulärkribriform, tubulär und solide. Ein besonders typisches Merkmal der AZK sind ein schwer beurteilbares, häufig unterschätztes, infiltratives Wachstum sowie die Tendenz, sich entlang von Nervenstrukturen auszubreiten. Die Krankheitsprogression zeichnet sich durch zahlreiche Rezidive und einen protrahierten Verlauf aus. Im Gegensatz zum PEK ist das AZK durch eine frühe, hämatogene Metastasierung in distinkte Organe wie Lunge, Gehirn, Knochen und Leber charakterisiert57. Fernmetastasen können aber auch nach Jahren aggressiver Therapie und lokoregionärer Kontrolle des Primärtumors auftreten58,59. Perineurale Invasion und eine ausgedehnte Tumorgröße sind wichtige Hinweise auf mögliche Fernmetastasen60. Lymphogene Metastasen sind im Gegensatz zum PEK selten60. Sowohl Fernmetastasen als auch Lymphknotenmetastasen werden als ungünstige prognostische Marker gewertet61. Die Standardtherapie besteht in einer chirurgischen Intervention, dabei wird das Ausmaß des Eingriffs durch die Lokalisation sowie die Größe des Primärtumors bestimmt. Bei ausgedehnten Befunden empfehlen neuere Studien zur besseren lokoregionären Kontrolle eine postoperative Radiatio61. Für den häufig vorzufindenden Fall des metastasierten AZK (40-60%) wurde der Einsatz einer Vielzahl antineoplastisch wirksamer Substanzen beschrieben, ohne daß sich bislang hieraus ein etabliertes Standardprotokoll entwickelt hätte. Das bei malignen KHT am häufigsten verwendete Chemotherapeutikum stellt Cisplatin dar50. Wirkmechanismus von Cisplatin. Cisplatin (Cis-Diammindichloroplatinum (II)) ist ein planarer Schwermetallkomplex, um dessen Platin–Zentralatom sich zwei Aminogruppen und zwei Chloratome gruppieren62 Die zytotoxische Wirkung resultiert aus einer Ereigniskette, an deren Ende der programmierte Zelltod, die Apoptose, steht62,63. Dabei beruht der zytotoxische Effekt auf der Vernetzung der DNS mit Einleitung _______________________________________________________________ 17 Bildung sogenannter “crosslinks“ durch Cisplatin62,64. Die Alteration der DNS wird durch verschiedene Typen regulatorischer Proteine entdeckt und führt zu pro- sowie antiapoptotischen Signalen. Zum einen werden Reperaturmechanismen initiert, zum Beispiel durch Proteine der Xeroderma Pigmentosum Gruppe65. Zum anderen werden proapoptotische Proteine, wie zum Beispiel p53, aktiviert63. Wichtig für die Signaltransduktion bis zur Apoptose sind die Mitogen aktivierten Proteinkinasen MAPK und ihre Effektoren ERK1/2, sowie die Kinase Akt63. Cisplatin-Resistenzmechanismen. Es gibt verschiedene Ursachen, die zur Resistenz maligner Zellen gegen Cisplatin führen können63. Neben einer gesteigerten Aktivität der DNS-Reperaturproteine können auch Veränderungen in der Signaltransduktion zwischen DNS und effektiver Apoptose zu einer Cisplatinresistenz führen63,66. Hierbei sind ebenfalls die vorher beschriebenen Moleküle Akt und ERK1/2 von großer Bedeutung63,67. Da neue therapeutische Substanzen häufig mit konventionellen Standardverfahren kombiniert werden, ist es wichtig, die Wege ihrer Interaktion und Regulation zu verstehen. Darüber hinaus entwickeln Tumorzellen, die eine Behandlung mit ionisierenden Strahlen oder Chemotherapeutika überlebt haben, nicht selten einen anderen Phänotyp im Vergleich zur Zellpopulation vor Therapie, bis hin zu einem erhöhten metastastischen Potential68. Einleitung _______________________________________________________________ 18 1.4 Fragestellung Aufgrund der Tatsache, daß die lymphogene und hämatogene Metastasierung eine der Hauptursachen für die tumorspezifische Letalität maligner Erkrankungen darstellt, ist es von zentraler Bedeutung, die dem Metastasierunsprozess zugrunde liegenden molekularen Mechanismen besser zu verstehen, um neue tumorspezifische Behandlungsstrategien entwickeln zu können. Tumorzellmigration und Metastasierung zeigen deutliche Gemeinsamkeiten mit dem Wanderungsverhalten von Leukozyten, das wesentlich von Chemokinen beeinflusst wird14. In der vorliegenden Arbeit wurden das PEK und das AZK aufgrund ihres nahezu reziproken Metastasierungsverhaltens als Modell gewählt, um folgende zentrale Fragen zu untersuchen: a) Ist das generelle Konzept, daß Chemokine von funktioneller Relevanz für den Metastasierungsprozess sind, übertragbar auf maligne KHT, und unterscheiden sich PEK und AZK in ihrem Chemokinrezeptorprofil? Hierfür wurde die Expression aller Chemokinrezeptoren in vitro und in vivo in verschiedenen Erkrankungsstadien von PEK und AZK untersucht. b) Welche Funktionen werden durch Chemokinrezeptoren in Tumorzellen vermittelt? Um dieser Frage nachzugehen, wurden Chemokin/Rezeptor- Interaktionen an etablierten Zellinien von PEK und AZK durch funktionelle in vitroAssays untersucht, sowie nach intrazellulären Mechanismen der Signaltransduktion geforscht. c) Wie werden tumorassozierte Chemokinrezeptoren reguliert? Hierfür wurde der Effekt verschiedener, für das “tumor microenvironment“ relevanter Faktoren einschließlich Chemokine, Wachstumsfaktoren und proinflammatorische Zytokine auf die Chemokinrezeptorexpression untersucht. Ein weiterer Aspekt war die Untersuchung der Interaktion zwischen Chemokinrezeptorexpression und Chemotherapie. 19 Material und Methoden 2 Material und Methoden In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von Chemokinen und ihren Rezeptoren im Metastasierungsprozess von Tumoren der Kopf-Hals-Region untersucht. Dabei wurden zwei histologische Entitäten einander gegenüber gestellt, die sich klinisch durch ihr distinktes Metastasierungsmuster unterscheiden: das Plattenepithelkarzinom (PEK) mit überwiegend lymphogener Metastasierung und das adenoid-zystische Karzinom (AZK) mit vorwiegend hämatogener Disseminierung. Methodische Schwerpunkte finden sich in folgenden molekularbiologischen und zellbiologischen Bereichen: • Zellkultur primärer Tumorzellen • quantitative real-time PCR • Durchflußzytometrie • Immunhistochemie • Chemotaxis-Assays • Western-Blotting • Apoptose-Nachweis 2.1 Charakterisierung der Chemokinrezeptorexpression in AZK und PEK der Kopf-Hals-Region Zur Charakterisierung der Chemokinrezeptorexpression in humanen AZK und PEK wurden zunächst umfassende Analysen aller Chemokinrezeptoren quantitativer real-time PCR, Durchflußzytometrie und mittels Immunhistochemie durchgeführt. 2.1.1 Zelllinien und Zellkultur Zur Charakterisierung des Chemokinrezeptorprofils von AZK und PEK der Kopf-HalsRegion in vitro wurden primäre Zellkulturen untersucht. Zelllinien. Zelllinien von AZK sind im Gegensatz zu PEK schwierig zu etablieren. Aus diesem Grund sind in der Weltliteratur nur wenige etablierte AZK-Linien bekannt. Eine der am besten charakterisierten AZK-Zellinien stellt die ACC-3-Linie (ACC3/ACC T#3, Prof. Saku, Niigata, Japan) dar. Diese sowie die Zellinie ACC-2 (ACC2/ACC T#2, Prof. Qiu Wie-liu, Shanghai Second Medical University, P.R. of China), 20 Material und Methoden welche aus AZK generiert wurden (He RG, 1986), wurden der Arbeitsgruppe freundlicherweise durch Dr. W.L. Qiu (Shanghai, China) zur Verfügung gestellt. Die primären Zelllinien der PEK wurden von Primärtumoren im Kopf-Hals Bereich (UD-SCC 1 – 4/SCC T#1 – 4, UD–SCC 6/SCC T#6, UD–SCC 7A/SCC T#7, UD– SCC8/SCC T#8, UM-SCC 10A/SCC T#10, UM-SCC 17A/SCC T#17, UM-SCC 24A/SCC T#24) sowie deren zugehörigen Lymphknotenmetastasen (UD-SCC 7B/SCC M#7, UM-SCC 10B/SCC M#10, UM-SCC 17B/ SCC M#17, UM-SCC 24B/SCC M#24) etabliert. Eine detaillierte Ausführung zur Etablierung dieser Zelllinien und deren Charakterisierung wurden von Ballò und Masters verfasst69. Tabelle 5. Charakteristika der Zelllinien. 1 Zelllinie Geschlecht1 Alter2 TNM Ursprung SCC T#1 m3 64 pT3pN2b Tonsilla palatina SCC T#2 m 58 pT1pN3 Hypopharynx SCC T#3 m 45 pN+ Larynx SCC T#4 m 45 pT3pN1 Zungengrund SCC T#6 m 62 pT2N0M0 Zunge SCC T#7 m 71 T2N2b Valleculae SCC T#8 m 43 unbekannt Larynx SCC T#10 m 57 T3N0M0 Stimmband SCC M#10 m 58 T3N1M0 Lymphknotenmetastase SCC T#17 4 w 47 T1N0M0 Supraglottis SCC M#17 w 47 T1N0M0 Halsweichteile SCC T#24 m 41 T2N0M0 Zunge SCC M#24 m 41 T2N0M0 Hals, persistierende Metastase Geschlecht des Patienten, 2Alter bei Erstdiagnose, 3männlich, 4weiblich Kultivierung. Die Tumorzellen wurden in 75cm² Falcon-Kulturflaschen Cellstar® (Greiner bio-one, Essen, Deutschland) als Monolayer kultiviert. Die routinemäßige Propagation der Zellen erfolgte in DMEM (Dulbeco’s Modified Eagle Medium von Gibco, Eggenstein, Deutschland) und dem Zusatz von 10%, hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum FCS (Gibco, Eggenstein, Deutschland) und 2mM L-Glutamin (Gibco, Eggenstein, Deutschland) sowie einer antibiotisch-antimykotischen Lösung (Gibco, Eggenstein, Deutschland). Als einzige Ausnahme ist die Zelllinie ACC T#2 (ACC-2) zu nennen, die RPMI (Gibco, Eggenstein, Deutschland) mit identischen Zusätzen, also 10% hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum (FCS), 2mM L-Glutamin 21 Material und Methoden und 1% antibiotisch-antimykotischer Lösung als Nährmedium erhielt. Für Kontrollversuche wurden, nach regelrechter Einverständniserklärung der Spender, primäre Keratinozyten aus gesunder Schleimhaut gewonnen und kultiviert. Hierzu wurden Gewebeproben in schmale Streifen geschnitten und mit Dispase-I Lösung (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) bei 4°C über Nacht inkubiert. Am folgenden Tag wurden die mukosalen Keratinozyten vorsichtig von der Lamina propria gelöst und mit Trypsin-EDTA Lösung (Boehringer, Mannheim, Deutschland) bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Anschließend wurde eine homogene Zellsuspension der primären mukosalen Keratinozyten in serumfreiem KeratinozytenMedium (Keratinocyte-SFM von Gibco, Eggenstein, Deutschland) mit dem Zusatz von antibiotisch-antimykotischer Lösung (ebenfalls von Gibco) vorbereitet und in 75cm² Kulturflaschen ausgesät. 2.1.2 Analyse der Chemokinrezeptorexpression auf RNS-Ebene mittels quantitativer real–time PCR (Taq-Man®) Zur Charakterisierung des Chemokinrezeptorprofils von AZK und PEK auf RNSEbene dienten Analysen mittels quantitativer real-time PCR. Hierzu musste zunächst wie nachfolgend beschrieben die RNS aus den Zellen extrahiert, die Proben mit DNAse inkubiert und in komplementäre DNS (cDNS) umgeschrieben werden. RNS-Extraktion. Zur Extraktion der Gesamt-RNS wurden die Zellen nach Entfernen des Kulturüberstandes in 5ml TRIZOL® aufgenommen. Nach Zugabe von 1ml Chloroform wurden die Proben 20 min bei 10000 rpm und 4°C zentrifugiert, um die RNS von der DNS- und Proteinphase zu trennen. Die wässrige, RNS-haltige Phase wurde in ein sauberes Gefäß übernommen und das gleiche Volumen an –20°C vorgekühltem Isopropanol zugegeben. Nun wurde die RNS über Nacht gefällt und anschließend zentrifugiert. Nach Entfernung des Überstandes wurde das Pellet luftgetrocknet und in 50µl DEPC-Wasser (Roth, Karlsruhe, Deutschland) aufgenommen. Die beschriebenen Arbeitsschritte wurden auf Eis durchgeführt. Die Bestimmung der Nukleinsäurekonzentration erfolgte durch Messung der Absorption im Bereich von 260 nm, 280 nm und 320 nm mit einem Pharmacia Biotech Ultrospec 3000 Spektralphotometer. Die Konzentration und Reinheit wurde nach Sambrook et al.70 berechnet. Für RNS entspricht eine Absorption A260 von 1 der Konzentration von genau 40 µg RNS/ml. 22 Material und Methoden Generierung der cDNS mittels Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR). Zur reversen Transkription der Gesamt-RNS zu cDNS (RT-PCR) wurden 4µg RNS in 10µl DEPC-H2O (Roth, Karlsruhe, Deutschland) mit 1µl DNAse I (Roche, Mannheim, Deutschland), 1,5µl 5-fach RT-Buffer (Invitrogen, Karlsruhe, Germany), 1µl RNAseInhibitor (RNAsin, Roche, Mannheim, Deutschland) und 2,5µl DEPC-H2O für 20 min bei 37°C gefolgt von 10 min bei 70°C im Thermocycler inkubiert. Im weiteren Verlauf wurden die Proben nach Zugabe von 3,6µl Oligo dT (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland und 0.4µl Random Hexamer (Promega, Madison, USA) für 10min bei 70°C im Thermocycler belassen, anschließend erfolgte das Annealing auf Eis. Nach Zugabe von 4,5µl 5-fach Puffer (Invitrogen, Karlsruhe, Germany), 1,5µl dNTP (Invitrogen, Karlsruhe, Germany), 1µl DTT (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) und 1µl RNAsin (RNAsin, Roche, Mannheim, Deutschland) wurden die Proben für 2min wieder im Thermocycler bei 42°C inkubiert. Die eigentliche reverse Transkription erfolgte nach Zugabe von 2µl Superscript II (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) für 50 min bei 42°C und 10 min bei 70°C im Thermocycler. Im letzten Schritt wurde eine cDNS Konzentration von 10 mg/µl eingestellt, basierend auf der RNS- Konzentrationsmessung vor der RT-PCR. Quantitative real-time PCR. Als spezifische Primerpaare für die folgenden Chemokine und Chemokinrezeptoren wurden verwendet4,71: CCL1-CCL5 CCL7-CCL8, CCL11, CCL13, CCL14, CCL16-22, CCL24-CCL28 CXCL1-CXCL6, CXCL8-CXCL16 CCR1-10, CXCR1-6, XCL1, XCR1, CX3CL1, CX3CR1. Primer und Probes wurden auf Kreuzreaktivität getestet und sind kommerziell erhältlich (Applied Biosciences, Foster City, CA, USA). Quantitative real-time PCRReaktionen verwendeten SYBR-Green als Reporter für Reaktionen mit Chemokin/Rezeptor-spezifischen Primerkombinationen und FAM als Reporter für Reaktionen mit Chemokin/Rezeptor-spezifischen Primer/Probe-Kombinationen. Probes für die interne Positivkontrolle (ribosomale 18S-RNS oder Ubiquitin) waren mit dem VIC-Reporter assoziiert. Die Proben unterliefen folgende Stadien: Stadium 1, 50°C für 2 Minuten, Stadium 2, 95°C für 10 Minuten und Stadium 3, 95°C für 15 Sekunden, gefolgt von 60°C für 1 Minute. Stadium 3 wurde 40 Mal wiederholt. Genspezifische PCR Produkte wurden mittels eines ABI PRISMÆ 7000 Sequence Detection System (Perkin Elmer, Foster City, CA) kontinuierlich während 40 Zyklen gemessen. Die Target-Genexpression zwischen verschiedenen Proben wurde 23 Material und Methoden normalisiert basierend auf den Werten der internen Positivkontrolle. Plasmid-cDNS in fünf definierten Konzentrationen wurde verwendet, um die genspezifische mRNSExpression zu quantifizieren. 2.1.3 Analyse der Chemokinrezeptorexpression auf Proteinebene in vitro mittels Durchflußzytometrie Die Untersuchung der Chemokinrezeptorexpression auf Proteinebene erfolgte mittels Durchflußzytometrie. Die Versuche wurden wie vorbeschrieben durchgeführt5,72. Der immunologische Nachweis erfolgte dabei entweder mit Antikörpern, an die der Fluoreszenzfarbstoff direkt gebunden ist, oder indirekt über Primär- und Sekundärantikörper. Für den Nachweis der folgenden Chemokinrezeptoren wurden direkt an Phycoerythrin (PE)-konjugierte, humane Antikörper verwendet: CCR1, CCR2, CCR3, CCR5, CCR7, CCR9 (alle von R&D Systems Inc., Minneapolis, MO, USA) sowie CCR4, CCR6, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6 (alle von BD PharMingen, San Diego, CA, USA). Indirekte Färbungen erfolgten für die Rezeptoren CCR8 und CCR10. Zur Detektion von CCR8 wurden zunächst ungelabelte anti – CCR8 Antikörper (210-762-R100, goat IgG, Alexis Biochemicals, Lausanne, Schweiz) und im nächsten Schritt PE-konjugierte Antikörper verwendet (Caltag, Burlingame, CA, USA). CCR10 wurde mit biotingebundenen anti-CCR10 Antikörpern (clone 1908; DNAX Research Institute, Palo Alto, CA, USA) und anschließend mit PE-konjugiertem Streptavidin gefärbt. Für die intrazelluläre Färbung von CCR7 und CXCR5 wurde vor der oben beschriebenen Färbung das IntraStain Kit (DAKO, Glostrup, Dänemark) angewandt. 2.1.4 Analyse der Chemokinrezeptorexpression auf Proteinebene in vivo mittels Immunhistochemie Die Untersuchung der Chemokinrezeptorexpression auf Proteinebene in vivo erfolgte mittels Immunhistochemie in Proben aus Operationsresektaten der entsprechenden Malignome. Gewebeproben. Nach ausführlicher Aufklärung und schriftlichem Einverständnis wurden je eine Probe pro Patient aus chirurgischen Exzidaten von PEK und AZK verschiedener Erkrankungsstadien gewonnen, sowie, abhängig von der 24 Material und Methoden Verfügbarkeit, Proben von Lymphknotenmetastasen. Die Grösse der entnommenen Probe orientierte sich dabei an der Grösse des jeweiligen chirurgischen Exzidates, sodaß keine Beeinträchtigung der diagnostischen Beurteilbarkeit auftrat. Da es sich beim AZK um eine maligne Erkrankung mit geringer Inzidenz handelt, waren zwei operative Zentren in die Patientenrekrutierung eingebunden. Als klinischer Kooperationspartner diente die HNO-Universitätsklinik in Pittsburgh, USA. Mit Einverständnis des IRB (Institutional Review Board), Pittsburgh, USA, und der hiesigen Ethikkommission (Studien Nr.: 1945) standen 57 Proben von AZK in Form von Paraffinschnitten zur Verfügung. Für die Entität des PEK konnten 29 verschiedene Primärtumorpräparate sowie 12 "matched pairs" (d.h. Primärtumor und zugehörige Lymphknotenmetase) verwendet werden. Vorraussetzung für weitere Untersuchungen war die Bestätigung der histopathologischen Diagnose. Als Kontrollen dienten Gewebeproben aus gesundem Speicheldrüsengewebe und oropharyngealer Mukosa. Immunhistochemie. Die Präparate wurden routinemäßig in Formalin fixiert, anschließend in Paraffin eingebettet, um daraus 3 – 5µm dünne Schnitte anzufertigen, die dann mit anti–humanen Antikörpern gegen CXCR4, beziehungsweise CCR7, wie vormals von Müller et al. beschrieben6, gefärbt wurden. CXCR4-Färbung. Hierzu wurden die Schnitte bei 70°C fixiert und ausgehend von Xylol in einer absteigenden Alkoholreihe je zwei Minuten pro Lösung bis zu Aqua dest. entparaffiniert. Nach Antigen-Demaskierung (VECTOR Antigen Unmasking Solution, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) wurden die Proben mit 0,6 % H2O2 behandelt. Es folgten der Avidin- und Biotin-Blockierungsschritt. Die Inkubation mit dem primären Antikörper gegen CXCR4, beziehungsweise dem Isotyp, wurde in einer Konzentration von 3µg/ml durchgeführt und anschließend der biotinylierte Sekundärantikörper zugegeben. Nach der Färbereaktion mit dem Avidin-BiotinKomplex (Vectastain ABC Peroxidase Kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) wurde die Färbereaktion mit dem AEC-Reagenz (VECTOR Peroxidase Substrate Kit AEC, #SK-4200, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) durchgeführt und mit Hämatoxyllin Gill No. 1 (Sigma, #GHS 1 -32, Sigma Aldrich, St.Louis, MO, USA) gegengefärbt. CCR7-Färbung. Hierfür wurden die Tumorschnitte in Aceton fixiert und mit H2O2 vorbehandelt. Darauf folgten der Avidin- und Biotin-Blockierungsschritt (VECTOR Blocking Kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Die Färbung wurde mit 25 Material und Methoden einem monoklonalen anti-humanen Antikörper gegen CCR7 (R&D Systems Inc., Minneapolis, MO, USA) beziehungsweise dem entsprechenden Isotyp (BD PharMingen, San Diego, CA, USA) durchgeführt. Nach Behandlung mit dem AECReagenz (DAKO AEC Kit) wurde eine Gegenfärbung mit Hämatoxylin angeschlossen. Die histopathologische Beurteilung führten zwei unabhängige Untersucher durch, die die Immunreaktion der jeweiligen Schnitte in eine Skala von negativ bis zweifach positiv einteilten (0 = keine, + = schwache, ++ = starke immunhistochemische Reaktion). 2.2 In vitro Funktion und Regulation tumorassoziierter Chemokinrezeptoren Nach der Charakterisierung der Chemokinrezeptorprofile von AZK und PEK wurden mögliche biologischen Funktion in vitro mittels Chemotaxis-Assays, Western-Blotting und Apoptose-Assays analysiert sowie Untersuchungen zur Regulation tumorassoziierter Chemokinrezeptoren durchgeführt. 2.2.1 Analyse von Migration und Invasion von Tumorzellen auf Chemokingradienten mittels Chemotaxis Assays Chemokine induzieren die spezifische Rekrutierung inflammatorischer Zellen in distinkte anatomische Regionen4. Die molekulare Basis von Tumorzellmigration und Invasion hingegen ist bis heute nicht vollständig geklärt, wobei jedoch schon seit Längerem angenommen wird, daß externe Stimuli den Prozess der Zellmotilität beeinflussen73. Alterationen der Zell-Zell-Adhäsion sowie die Sekretion und Aktivierung proteolytischer Enzyme sind essentiell für die Tumorzellinvasion73 und die Interaktion mit chemotaktischen Faktoren könnte einen kritischen Schritt in diesem Prozess repräsentieren. Während sicher ist, daß Chemokine das “homing“ von Leukozyten in periphere Gewebe mediieren4, ist das biologische Wirkungsspektrum dieser Moleküle auf Tumorzellen bisher nicht vollständig definiert. 2001 konnten Müller et al. zeigen, dass CXCR4 und CXCL12 Chemotaxis und Invasion von Mammakarzinomzellen induzieren6, eine Beobachtung, die die potentielle Rolle von Chemokinen im Metastasierungsprozess unterstreicht. 26 Material und Methoden Anknüpfend daran sollte in der vorliegenden Arbeit die chemotaktische Antwort von AZK- und PEK-Zellen des Kopf-Hals-Bereiches auf verschiedene Chemokine in Transwell-Chemotaxis-Assays untersucht werden. Dabei wurden Transwell-Inserts 60min bei Raumtemperatur mit Fibronectin (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, USA) 5µg/ml vorbehandelt6. Als Negativkontrolle wurde DMEM ohne jeglichen Zusatz, als Positivkontrolle DMEM mit 5% FCS in die Multiwell-Platten vorgelegt. Die übrigen Wells wurden mit DMEM und dem Zusatz unterschiedlicher Konzentrationen an CXCL12 (humanes rekombinantes CXCL12, R&D Systems Inc., Minneapolis, MO, USA) vorbereitet. Anschließend wurden die mit Fibronectin vorbehandelten Transwell-Inserts in die Multiwell-Platten eingesetzt und mit der entsprechenden Tumorzellsuspension (0,5-1x105 Zellen) befüllt. Die Inkubation erfolgte über 9h (AZK) beziehungsweise 15h (PEK) im Brutschrank unter Standardbedingungen. Anschließend konnten solche Zellen, die an der Unterseite des Inserts adhärierten, angefärbt und lichtmikroskopisch quantifiziert werden. Die unterschiedlichen Inkubationszeiten wurden basierend auf Beobachtungen in Vorversuchen gewählt. Alle Chemotaxisassays wurden drei Mal in Tripletts durchgeführt. 2.2.2 Modulation von Chemokinrezeptoren durch Chemotherapie Radiotherapie und Chemotherapie repräsentieren effektive und etablierte Behandlungsmethoden bei PEK des Kopf-Hals-Bereiches, die meist im Rahmen multimodaler Therapiekonzepte angewandt werden74,75. Hierbei ist Cisplatin das am häufigsten verwendete Chemotherapeutikum in KHT76. Während kürzlich gezeigt wurde, daß eine erhöhte Expression von Chemokinen in Tumorzellen mit einem metastatischen Phänotyp assoziiert und durch chemotherapeutische Substanzen induzierbar ist68, ist bisher nicht bekannt, ob dieser Zusammenhang auch für die Expression von Chemokinrezeptoren auf Tumorzellen gilt. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob die in vitro-Behandlung mit Chemotherapeutika mit einer Veränderung des Chemokinrezeptorprofils einhergeht. Hierfür wurden die Zellen zunächst 72 Stunden einer Standardkultivierung zugeführt. Für die anschließende Inkubation wurde frisches Nährmedium - entsprechend der Zelllinie – und dem Zusatz von Cisplatin (Bristol Myers Squibb, München, Deutschland) in den Konzentrationen 1, 3 oder 9µg/ml beziehungsweise 5µg/ml des Transkriptions- und RNS-Polymerase-Inhibitors α-Amanitin (Sigma Aldrich, St.-Louis, 27 Material und Methoden MO, USA) beziehungsweise einer Kombination von Cisplatin und α-Amanitin verwendet. In den anschließenden, wie oben vorbeschriebenen, durchflußzytometrischen Analysen wurde die Chemokinrezeptorexpression untersucht. Der Antitumor-Effekt wurde mit dem 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)–2, 5– diphenyltetrazolium Bromid Test (MTT, Sigma Aldrich, St.-Louis, MO, USA) überprüft. Dabei wurde die mitochondrielle Aktivität in Zellen als Maß für die zytotoxische Wirkung verwendet. Metabolisch aktive Zellen können MTT mittels des mitochondrialen Enzyms Succinatdehydrogenase zum farbigen Formazan-Salz umsetzen. Im nächsten Schritt wurde das wasserunlösliche Formazansalz mit Isopropanol extrahiert, um die Absorbtion der Isopropanollösung bei 570nm zu quantifizieren. 2.2.3 Analyse intrazellulärer Signaltransduktionswege mittels WesternBlotting zum Nachweis aktivierter Signalmoleküle Chemokine vermitteln ihre Signale über die Bindung an spezifische Chemokinrezeptoren, welche zur intrazellulären Signaltransduktion heterotrimere GProteine benötigen, man spricht daher von den sogenannten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR)23. Wichtige Signaltransduktionsmoleküle in der weiteren Signalkaskade sind die Proteinkinase B (PKB), auch Akt genannt, und die durch Mitogene aktivierten Proteinkinasen (MAPK), vor allem die extrazellulär Signalregulierten Kinasen 1 und 2 (ERK1/2). Um die intrazelluläre Signaltransduktion in malignen KHT nach Chemokin–Rezeptor-Interaktion zu überprüfen, wurde mittels Western Blotting die Phosphorylierung der Proteinkinase B (AKT) und der extrazellulär-regulierten Kinasen 1/2 (ERK1/2) untersucht. Dazu wurden AZK–Zellen mit humanem, rekombinantem CXCL12 (500ng/ml, R&D Systems Inc., Minneapolis, MO, USA) behandelt, wobei verschiedene Inkubationszeiten (5min, 15min, 30min, 60min) gewählt wurden. Nach einem kurzem Waschgang folgte die Zelllyse mit doppelt konzentriertem SDS–Page Ladepuffer [125mM Tris; 4% (w/v) SDS; 20% (v/v) Glycerin; 100mM DTT; 0,2% (w/v) Bromophenolblau (pH 6,8)]. Die gewonnenen Proteine und die visköse DNS wurden durch eine 2sec-Sonifizierung und Erhitzen (35min bei 95°C) denaturiert. Anschließend wurden die Proben in die Geltaschen (15 – 20µl/Geltasche) der SDS–Polyacrylamidgele eingebracht und stromkontrolliert (60mA) elektrophoretisch aufgeteilt. 28 Material und Methoden Die verwendeten Puffer und SDS-Polyacrylamid Gele setzen sich im Einzelnen wie folgt zusammen: Lösungen: Lösung 1: 30% (w/v) Acrylamid; 0,8% (w/v) Bisacrylamid Lösung 2: 0,4% (w/v) SDS; 1,5 M Tris (8mM EDTA); pH 8,8 Lösung 3: 0,4% (w/v) SDS; 1,5 M Tris (8mM EDTA); pH 6,8 Polyacrylamidgel (10% bzw. 8% Acrylamid): Trenngel 1 (10% Acrylamid): 33,3% (v/v) Lösung 1; 25% (v/v) Lösung 2; 41,7% (v/v) H2O; 7 x 10-3% (v/v) APS; 7 x 10-4% (v/v) N,N,N’,N’ Tetramethylendiamin (TEMED) Trenngel 2 (8% Acrylamid): 26,6% (v/v) Lösung 1; 25% (v/v) Lösung 2; 48,4% (v/v) H2O; 7 x 10-3% (v/v) APS; 7 x 10-4% (v/v) TEMED Sammelgel (4% Acrylamid): 13,4% (v/v) Lösung 1; 30% (v/v) Lösung 3; 56,6% (v/v) H2O; 7,5 x 10-3% (v/v) APS; 7 x 10-4% (v/v) TEMED Elektrodenpuffer: 0,2 M Glycin; 0,1 M Tris; 0,1% (w/v) SDS; pH 8,8 APS: 10 – 12% (w/v) Ammoniumperoxidsulfat Die 1mm dicken Gele wurden in zwei Arbeitsschritten hergestellt: Im ersten Schritt wurde das Trenngel gegossen und während des Polymerisierens mit Isopropanol überschichtet. Nach Entfernen des Isopropanols wurde im zweiten Schritt das Sammelgel gegossen. Die Gelläufe wurden in Novex-Minigel Kammern (Novex, Frankfurt) durchgeführt, elektrophoretisch aufgetrennt und geblottet. Für den spezifischen Proteinnachweis wurden polyklonale Antikörper – in der vom Hersteller vorgegebenen Verdünnung - eingesetzt. Die Antikörper (Anti-phosphoERK1/2, Anti-total ERK1/2, anti-phospho-Akt (Ser473) und anti-total-Akt stammen von Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). 2.2.4 Analyse chemokinvermittelter antiapoptotischer Signale Neben der gezielten Rekrutierung spezifischer Zellpopulationen vermögen Chemokine auch die Apoptose zu beeinflussen77. Um die Bedeutung der ChemokinRezeptor Interaktion von CXCR4-CXCL12 bezogen auf die Apoptoserate von Tumorzellen zu untersuchen, wurden AZK-Zellen für 24 Stunden mit Cisplatin, bzw. einer Kombination aus Cisplatin und humanem CXCL12 behandelt und mit 5µg/ml Hoechst 33342 (Sigma Aldrich, St.-Louis, MO, USA) gefärbt. Als Negativkontrolle dienten unbehandelte Zellen. Anschließend wurden die apoptotischen Zellen anhand Material und Methoden 29 der typischen Morphologie mit Chromatinkondensation und –fragmentierung mittels Fluoreszenz identifiziert und quantifiziert. 30 Ergebnisse 3 Ergebnisse 3.1 Tumorzelllinien von adenoid-zystischen Plattenepithelkarzinomen Karzinomen exprimieren und distinkte Chemokinrezeptorprofile in vitro Zunächst wurde untersucht, ob adenoidzystische Karzinome (AZK) und Plattenepithelkarzinome (PEK) charakteristische Chemokinrezeptorprofile aufweisen, welche mit den nahezu reziproken klinischen Metastasierungsmustern dieser beiden Tumorentitäten korrelieren. Hierzu wurde eine umfassende quantitative real-time PCR Analyse aller bekannten Chemokinrezeptoren (CCR1-10, CXCR1-6, CX3CR1 und XCR1) an humanen Zelllinien von AZK und PEK durchgeführt (Abb.4). 3.1.1 Chemokinrezeptorexpression von AZK und PEK auf RNS-Ebene Abbildung 4 zeigt die Chemokinrezeptorexpression auf mRNS Ebene in Zellinien von adenoidzystischen Karzinomen (n=2), primären Zelllinien von Primärtumoren von Plattenepithelkarzinomen (n=10) und korrespondierenden Lymphknotenmetastasen (n=3) im Vergleich zu primären mukosalen Keratinozyten. Während mukosale Keratinozyten ein äußerst begrenztes Rezeptorrepertoir exprimierten mit Hochregulation eines einzigen Chemokinrezeptors, CXCR1 (Abb.4m), wiesen AZK und PEK-Zellen eine Überexpression unterschiedlicher Chemokinrezeptoren auf (Abb.4). AZK-Zellen zeigten im Gegensatz zu Zelllinien von PEK eine besonders hohe Expression des Chemokinrezeptors CXCR4 (Abb.4p) während mRNS von verschiedenen anderen Rezeptoren nur in geringen Mengen detektiert werden konnte (Abb.4). PEK-Zellen hingegen exprimierten ein breiteres Spektrum an Chemokinrezeptoren (Abb.4). So fand sich eine Überexpression von CXCR1 und CXCR2 (Abb.4m,n), Chemokinrezeptoren, die im Zusammenhang mit Interleukin-8 vermittelter Proliferation und Invasion von Tumorzellen beschrieben wurden78. CXCR1 und CXCR2-mRNS wurde von der Mehrzahl der PEK -Zellen ausgeprägt, während diese Ergebnisse 31 Rezeptoren in AZK-Zellen nicht nachweisbar waren (Abb.4m,n). Darüber hinaus fand sich in PEK-Zellen eine konstante Hochregulierung auf mRNS-Ebene für CCR3, CCR7, CXCR3, CXCR5 und CXCR6 (Abb.4c, 4g, 4o, 4q, 4r). Vor allem CCR7 (Abb.4g) und CXCR5 (Abb.4q) wurden konstant von den verschiedenen PEKZelllinien exprimiert, während sich keine oder nur eine äußerst geringe Expression in AZK-Zelllinien fand (Abb.4g, 4q). Interessanterweise wurde für CCR3, CCR7 und CXCR5 eine Assoziation mit Metastasierung in lokoregionale Lymphknoten für andere Tumorentitäten bereits beschrieben79-82. Eine Überexpression der Chemokinrezeptors CXCR4 ließ sich in PEK-Zelllinien im Gegensatz zu AZK-Zellen nicht nachweisen (Abb.4p). 32 Ergebnisse Abbildung 4. PEK und AZK exprimieren spezifische Chemokin- rezeptorprofile auf mRNS Ebene in vitro. Umfassende quantitative real-time RT-PCR Analyse aller bekannten Chemokinrezeptoren (CCR1-10 (a-j), CXCR1-6 (m-r) CX3CR1 (k) und XCR1 (l)) in AZK (n=2) und PEK Zelllinien, welche von verschiedenen Primärtumoren (T; n=10) oder den zugehörigen Lymphknotenmetastasen (M; n=3; 3 matched pairs) generiert wurden, im Vergleich zu primären mukosalen Keratinozyten (MK; n=1). Menge der Genexpression in fg/ 25ng Gesamt-cDNS. 33 Ergebnisse 3.1.2 Chemokinrezeptorexpression von AZK und PEK auf ProteinEbene Durchflußzytometrische Analysen für CXCR4 bestätigten eine hohe Oberflächenexpression dieses Chemokinrezeptors auf AZK-Zellen (25–95%) (Abb.5a und Tab.6), während PEK-Zellen und primäre mukosale Keratinozyten keine oder nur eine geringe (<4%) CXCR4-Proteinexpression zeigten (Abb.5b und Tab.6). Für CCR7 konnte trotz der hohen Expression auf RNS-Ebene (Abb.4g) keine signifikante Oberflächenexpression auf PEK-Zellen detektiert werden (Abb.5c und Tab.6). Um zu klären, ob dieser Rezeptor in intrazellulären Pools im Zytoplasma von PEK-Zellen gespeichert wird, wurden intrazelluläre Färbungen für CCR7 durchgeführt. Hierfür wurden drei repräsentative PEK-Zelllinien ausgewählt (SCC T#1, SCC T#6 und SCC T#24), welche eine deutliche CCR7-Expression auf RNS– Ebene aufwiesen, und einer AZK-Zelllinie (ACC T#3) gegenüberstellt. Wie in Abbildung 5d dargestellt, fand sich für PEK-Zellen eine hohe intrazelluläre Konzentrationen an CCR7-Protein, während AZK-Zellen diesen Rezeptor nicht exprimierten (Daten nicht gezeigt). Diese intrazelluläre Expression von CCR7 konnte zusätzlich in immunzytochemischen Analysen für die Gewebeschnitte bestätigt werden (Abb.5e, 5f). Um zu determinieren, welchen Regulationsmechanismen die Proteinexpression von CCR7 in PEK-Zellen in vitro unterliegen könnte, wurde der Einfluß des Mikromilieus auf die CCR7-Oberflächenexpression näher untersucht. Hierfür wurden PEK-Zellen mit verschiedenen proinflammatorischen Zytokinen und Wachstumsfaktoren einschliesslich TNF-α, TGF-β und EGF in vitro inkubiert und die Oberflächenexpression von CCR7 durchflußzytometrisch analysiert. Zusammenfassend führte keiner der genannten Stimuli zu einer signifikanten Hochregulierung der CCR7Oberflächenexpression auf PEK-Zellen (Daten nicht gezeigt). Ähnlich wie CCR7 war auch CXCR5 trotz signifikanter Expression auf RNS-Ebene (Abb.4q) nicht als Oberflächenprotein auf PEK-Zellen nachweisbar (Abb.5g und Tab.6). Allerdings zeigten intrazelluläre Färbungen dieses Rezeptors eine signifikante CXCR5-Proteinexpression im Zytoplasma von PEK-Zellen (Abb.5h). Darüber hinaus führte ein 24-stündiger Serumentzug zu einer Induktion der Oberflächenexpression von CXCR5 auf PEK-Zellen (15% CXCR5-positive Zellen) (Abb.5i). 34 Ergebnisse Weitere Chemokinrezeptoren, welche auf der Oberfläche von PEK-Zellen detektiert werden konnten, waren CCR3 und CCR6, allerdings zeigte sich hier nur eine schwache Oberflächenexpression (Tab.6). Andere Rezeptoren wurden nicht konstant an der Oberfläche von PEK-Zellen, AZK-Zellen oder primären mukosalen Keratinozyten exprimiert (Tab.6). Darüber hinaus fand sich kein signifikanter Unterschied im Chemokinrezeptorprofil in PEK-Zelllinien generiert von Primärtumoren im Vergleich zu Lymphknotenmetastasen (Abb.4 und Tab.6). Tabelle 6. Oberflächenexpression der Chemokinrezeptoren in AZK und PEK CCR1 CCR2 CCR3 CCR4 CCR5 CCR6 CCR7 CCR8 CCR9 - - - - - 22 - - - 2 - - - - - - SCC T #1 - - - - - 2 - - - - - - - - - - SCC T#2 - - 2 - - 4 - - - - - - - - - - SCC T#3 - - 2 - - 3 - - - - - - - - - - SCC T#4 - - 2 - - 4 - - - - - 3 - 2 - - SCC T#6 - - - - - 4 5 - - - - 2 - 4 - - SCC T#7 - - 2 - - 3 - - - - - - - - - - SCC T#8 - - 2 - - 5 - - - - - - - 3 - - SCC T#10 - 2 4 2 - - 2 - 5 - 6 - - 2 3 - SCC M #10 - - 4 - - 4 - - 2 12 7 - - 2 6 - SCC T#17 - - 2 - - 6 - - - - - - 2 - - - SCC M#17 - - 2 - - 4 - - - - - 2 - - - - SCC T#24 - - 2 - - - - - - - - - - - - - SCC M#24 - - - - - 3 - - - - - - - - - - ACC T#2 - - - - - 6 - - 4 - - - - 25 - - ACC T#3 - - - - - - - - - - - - - 95 - - MK1 3 4 1 MK, mukosale Keratinozyten - 2 CCR10 CXCR1 CXCR2 CXCR3 CXCR4 CXCR5 CXCR6 3 Prozentsatz positiverZellen – T, Zelllinie mit Primärtumor als Ursprung - 4M, Zelllinie mit Lympknotenmetastase als Ursprung 35 Zellzahl Zellzahl Zellzahl Zellzahl Ergebnisse Abbildung 5. Spezifische Chemokinrezeptorexpression in AZK- und PEKZelllinien auf Proteinebene. Durchflußzytometrische Analysen der CXCR4-Expression von AZK (T#3) (a) und PEK-Zellen (T#1) (b). Durchflußzytometrische Analysen der Oberflächen-(c) und intrazellulären (d) CCR7-Expression in PEK-Zellen (T#1). Immunzytochemische Analysen von PEKZellen (T#1) mit einem spezifischen CCR7-Antikörper (f), bzw. dem entsprechenden Isotyp (e). 200x Vergrößerung. Durchflußzytometrische Analysen der Oberflächen-(g) und intrazellulären CXCR5- 36 Ergebnisse Expression (h) in PEK-Zellen (T#6) sowie CXCR5-Oberflächenexpression nach 24h Serumentzug (i). Die grau gefüllten Histogramme entsprechen der Isotypfärbung, die schwarz umrandeten Histogramme CXCR4, CCR7, bzw. CXCR5. 3.2 AZK und PEK exprimieren distinkte Chemokinrezeptoren in vivo Um die in vivo Relevanz der Expression von CXCR4 und CCR7 zu untersuchen, erfolgten immunhistochemische Analysen an Gewebeproben von Primärtumoren AZK (n=57) sowie an primären PEK (n=29) mit den korrespondierenden Lymmphknotenmetastasen in 12 Fällen. Während sich CXCR4 in Gewebeproben normaler Speicheldrüsen nicht nachweisen ließ (Abb.6a), zeigten 56 von 57 der AZK (98%) eine starke CXCR4-Expression (2fach positiv) (Abb.6a) und lediglich eine AZK-Probe eine schwache Expression (1fach positiv) (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz hierzu stellten sich 19 von 29 der primären PEK (66%) negativ für CXCR4 dar (Abb.6b), während interessanterweise 23 von 26 Fälle (88%) eine hoch positive Färbereaktion für CCR7 aufwiesen (Abb.6g, 6h). Im Detail stellte sich die Verteilung von CXCR4 in PEK wie folgt dar: 9 von 29 der Tumore (31%) waren schwach positiv (Abb.6c) und nur eine PEK-Probe (3%) war stark positiv, die überwiegende Mehrzahl (66%) jedoch zeigte keine CXCR4Expression (Abb.6b). Darüber hinaus ließ sich in zwei der CXCR4-positiven Proben eine Betonung der CXCR4-Expression im Bereich der invasiven Front des Primärtumors nachweisen (Abb.6d), was die Vermutung nahe legt, daß CXCR4 für die Tumorinvasion eine bedeutende Rolle spielen könnte. Um festzustellen, ob Primärtumore ein anderes Rezeptorexpressionsmuster aufweisen als die zugehörigen Lymphknotenmetastasen wurden 12 sogenannte "matched pairs" immunhistochemisch untersucht (Abb.6e-h). CXCR4 ließ sich in 5 von 12 Primärtumoren sowie in 7 von 12 Lymphknotenmetastasen nicht nachweisen (Abb.6e-f, Tab.7). 6 von 12 Primärtumoren und 5 von 12 Lymphknotenmetastasen zeigten eine schwach positive Reaktion für CXCR4 (Daten nicht gezeigt) während sich in nur einem Primärtumor eine stark positive Färbereaktion für CXCR4 fand (Daten nicht gezeigt). Zwischen der Chemokinrezeptorexpression von Primärtumoren und zugehöriger Lymphknotenmetastase zeigte sich kein signifikanter Unterschied in der Expression von CXCR4. Ergebnisse 37 Im Gegensatz hierzu wurde CCR7 in allen 12 Primärtumoren und in 10 von 12 korrespondierenden Lymphknotenmetastasen exprimiert (Abb.6g-h, Tab.7). Dabei fand sich in 8 von 12 Primärtumoren und in 5 von 12 Lymphknotenmetastasen eine stark positive Färbereaktion für diesen Rezeptor (Abb.6g-h, Tab.7). In Analogie zum Expressionsmuster von CXCR4 fand sich auch für CCR7 kein Unterschied in der Expression zwischen Primärtumoren und Lymphknotenmetastasen. Zusammenfassend weist die distinkte Expression von CXCR4 in AZK und CCR7 in PEK darauf hin, daß diese Rezeptoren eine wichtige Rolle bei der hämatogenen (CXCR4) bzw. lymphogenen (CCR7) Metastasierung dieser beiden Tumorentitäten spielen könnten. 38 Ergebnisse Abbildung 6. CXCR4- und CCR7-Expression in Operationsresektaten von AZK und primären PEK mit zugehörigen Lymphknotenmetastasen. Repräsentative Ergebnisse der immunhistochemischen Analysen für CXCR4 (a-f) und CCR7 (g, h). Primärtumore von AZK zeigen eine deutliche und homogene CXCR4 Expression (a; rechte Seite) während das gesunde Speicheldrüsengewebe keine CXCR4-Expression aufweist (a; linke Seite). (b)Variable CXCR4Expression in Primärtumoren von PEK. Fehlende CXCR4 Proteinexpression in einem primären PEK; CXCR4 exprimierende Endothelzellen (Pfeil). (c) Schwache CXCR4 Expression in einem anderen primären PEK (Pfeile) und fehlende CXCR4-Expression in gesunder Mukosa (c, links). (d) Betonung der CXCR4-Expression im Bereich der invasiven Front (Pfeile) eines primären PEK (repräsentativ für 2/29 PEK). Fehlen von CXCR4 (e, f) bei gleichzeitig deutlicher CCR7-Expression (g, h) im Sinne einer Membranfärbung (g, inset) in einem PEK Primärtumor (e,g) Lymphknotenmetastase (f,h). Vergrößerungen: 250x (a, b) und 100x (c-h). und der zugehörigen 39 Ergebnisse Tabelle 7. CXCR4- und CCR7-Expression in Primärtumoren von PEK und zugehörigen Lymphknotenmetastasen Chemokinrezeptorexpression CXCR4 CCR7 1 0 1+ 2+ T1 (n=12) 5 6 1 M2 (n=12) 7 5 0 T (n=12) 0 8 4 M (n=12) 2 7 3 T, Primärtumor – 2M, Lymphknotenmetastase 3.3 CXCR4 mediiert die gerichtete Migration von Tumorzellen in vitro CXCL12, der korrespondierende Ligand von CXCR4, wird konstitutiv in hohem Maße in Lunge und Leber exprimiert, Organe welche die häufigsten Metastasenlokalisationen bei AZK repräsentieren6,12 und mediiert die gerichtete Migration von Zellen in vitro und in vivo4. Nach Identifizierung distinkter Chemokinrezeptorprofile in PEK und AZK-Zellen und dem Feststellen einer hohen CXCR4-Expression in AZK, wurde untersucht, ob CXCR4 in Tumorzellen funktionell aktiv ist. In durchflußzytometrischen Analysen führte eine Inkubation der CXCR4-positiven AZK-Zellinie ACC T#2 mit CXCL12-Protein zu einer zeitabhängigen Internalisierung des Rezeptors mit Abnahme der Oberflächenexpression von CXCR4 (Abb.7) Abbildung 7. Zeitabhängige Zellzahl Internalisierung von CXCR4 in das Zytoplasma. Durchflußzytometrische Analysen der CXCR4-Oberflächenexpression von AZK Zellen nach CXCL12 Exposition (500ng/ml) zu den jeweils angegebenen Zeitpunkten. CXCR4 Darüber hinaus zeigten AZK-Zellen in Chemotaxis Assays eine gerichtete Migration auf CXCL12-Gradienten in einer dosisabhängigen Art und Weise (Abb.8, p<0,05). 40 Ergebnisse PEK-Zellen, welche CXCR4-negativ waren, zeigten keine chemotaktische Antwort Zellzahl nach CXCL12-Exposition (Abb.8). Abbildung 8. Chemotaktische Antwort von AZK Zellen auf CXCL12. AZK-Zellen zeigen im Gegensatz zu PEK-Zellen eine chemotaktische Antwort auf einen CXCL12-Gradienten (1, 10, 100, 1000, 1500ng/ml) in dosisabhängiger Weise. Transwell-Migrationsassay von AZK-Zellen (ACC T#3, schwarze Histogramme) und PEK-Zellen (SCC T#1, gestreifte Piktogramme). Die Ergebnisse sind als durchschnittliche Anzahl der migrierten Zellen pro 5 Gesichtsfelder mit Standardabweichung dargestellt (*p < 0,05 im Vergleich zur Kontrolle nach dem Student’s T-Test). 3.4 Das antineoplastische Agens Cisplatin induziert CXCR4Expression auf Tumorzellen Cisplatin stellt ein sehr wirkungsvolles und häufig eingesetztes chemotherapeutisches Agens in der Behandlung von malignen KHT dar76,77,83,84. Um festzustellen, ob Cisplatin zu einer Veränderung der Chemokinrezeptorexpression auf Tumorzellen führt, wurden hoch CXCR4-exprimierende AZK-Zellen mit ansteigenden, sublethalen Dosen von Cisplatin (1, 3, und 9 µg/ml) in vitro inkubiert. Dabei entsprachen die gewählten Konzentrationen den therapeutischen Wirkkonzentrationen, die im Serum von Patienten mit malignen KHT während einer Cisplatintherapie gemessen werden können85,86. In vitro wurde der Antitumor-Effekt mittels eines MTT-Assays determiniert, welcher die mitochondriale Aktivität als Maß für die zytotoxische Wirkung eines Agens verwendet. In MTT-Assays zeigte sich bei den oben genannten Konzentrationen von Cisplatin eine Hemmung der Zellvermehrung von 24-78% (Daten nicht gezeigt). Interessanterweise führte die Cisplatin-Exposition zu einer dosisabhängigen Induktion der CXCR4-Proteinexpression auf AZK-Zellen (Abb.9a-b). Nach Ergebnisse 41 24stündiger Inkubationszeit mit Cisplatin vervielfachte sich die mittlere Fluoreszenz für CXCR4 um den Faktor 1,5 bis 2 (Abb.9b). Um die zugrunde liegenden Mechanismen dieser Hochregulierung näher zu beleuchten, wurden AZK-Zellen mit einer Kombination aus Cisplatin und α-Amanitin, einem Inhibitor der RNSPolymerase-II vermittelten Transkription, behandelt. Im Falle der Koinkubation mit αAmanitin konnte die Cisplatin-vermittelte Induktion von CXCR4 um bis zu 85% reduziert werden (Abb.9c). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß die Induktion von CXCR4 durch Cisplatin eine erhöhte Gentranskription voraussetzt. 42 Zellzahl Zellzahl Ergebnisse Abbildung 9. AZK-Zellen zeigen eine erhöhte CXCR4-Expression nach Behandlung mit Cisplatin (a-c) und weisen eine gesteigerte Überlebensrate bei CXCL12-Exposition auf (d, e). (a) Oberflächenexpression von CXCR4 auf unbehandelten AZK-Zellen (schwarze Linie), bzw. Cisplatin-behandelten AZK-Zellen (1µg/ml Cisplatin - gepunktete Linie, 3µg/ml - gestrichelte Linie, 9µg/ml - graue Linie). Das grau gefüllte Histogramm zeigt die IsotypKontrolle. (b) Relative mittlere Fluoreszenz der CXCR4-Oberflächenexpression auf AZK-Zellen nach Cisplatin-Inkubation. Die Fluoreszenz ist als relative mittlere Fluoreszenz im Vergleich zu unbehandelten Zellen angegeben mit der Standardabweichung für drei unabhängige Experimente. (c) Durchflußzytometrische Analysen von CXCR4 bei unbehandelten AZK-Zellen (schwarze Linie), Cisplatin-behandelten Zellen (3µg/ml Cisplatin - gestrichelte Linie) oder Cisplatin (3µg/ml) und αAmanitin-behandelten (5µg/ml) AZK-Zellen (graue Linie). (d) CXCL12 induziert die Phosphorylierung von Akt und ERK1/2 in AZK-Zellen. AZK- Zellen wurden mit CXCL12 (500ng/ml) inkubiert und 43 Ergebnisse Zelllysate zu unterschiedlichen Zeitpunkten mittels Western-Blot untersucht. Als Positivkontrolle diente humanes EGF (10ng/ml) ein bekannter Aktivator von Akt und ERK1/2. Die Ergebnisse stellen repräsentative Daten aus drei unabhängigen Experimenten dar. (e) Prozentsatz apoptotischer AZKZellen, nachgewiesen mit dem Farbstoff Hoechst 33342, welche entweder unbehandelt waren oder mit Cisplatin (9µg/ml) allein bzw. einer Kombination aus Cisplatin (9µg/ml) und CXCL12 (500ng/ml) inkubiert wurden. Bei den Ergebnissen handelt es sich um die Durchschnittwerte von vier unabhängigen Experimenten unter Angabe der jeweiligen Standardabweichung (*** p < 0,001; Student’s t-Test). 3.5 CXCL12/CXCR4-Interaktion führt zur Aktivierung von “survival pathways“ in Tumorzellen Um zu determinieren, ob CXCL12/CXCR4-Interaktionen zu einer Aktivierung von Signaltransduktionswegen führen, welche Zellüberleben und Proliferation vermitteln, untersuchten wir die Aktivierung der Akt/Proteinkinase B (Akt/PKB) und der über extrazelluläre Signale regulierten Kinasen ERK1 und ERK2. Akt/PKB ist ein “downstream“-Effektor der Phosphatidylinositol 3’-Kinase (PI3K), welche antiapoptotische Signale in Zellen aktiviert87. Die mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPK) ERK1 und 2 spielen ein Rolle für die Zellproliferation, Differenzierung und das Überleben29. Zunächst wurden AZK-Zellen in serum-freiem Medium zusammen mit 500ng/ml CXCL12-Protein inkubiert und Zelllysate zu unterschiedlichen Zeitpunkten gewonnen. Mittels Western Blot-Analyse wurde dann der Gehalt an phosphoryliertem und damit aktiviertem Akt/PKB und aktiviertem ERK1/2 bestimmt (Abb.9d). Wie Abbildung 9d verdeutlicht, werden Akt/PKB und ERK1/2 durch CXCL12-Stimulation in signifikantem Maße aktiviert. Diese Aktivierung zeigte sich für beide Kinasen nach fünf Minuten und erreichte nach 15 Minuten ein Maximum (Abb.9d). Während die Phosphorylierung von Akt/PKB auch nach 60 Minuten auf konstantem Niveau nachweisbar blieb, sank die Aktivierung von ERK1/2 nach 60 Minuten wieder auf das Kontrollniveau (Abb.9d). Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass CXCL12/CXCR4-Interaktionen in AZKZellen zu einer Aktivierung von intrazellulleren Signalttransduktionswegen führen, welche Zellüberleben und Proliferation unterstützen und damit Tumorprogression fördern. Um zu untersuchen, ob die Aktivierung von Akt/PKB und ERK1/2 durch CXCL12 tatsächlich das Überleben von Tumorzellen begünstigt, wurden AZK-Zellen mit Ergebnisse 44 Cisplatin alleine oder mit einer Kombination aus Cisplatin und CXCL12 inkubiert, anschließend mit HOECHST 33342 gefärbt und der Anteil apoptotischer Zellen ermittelt. Dabei lag die basale Apoptose-Rate in unbehandelten AZK-Zellen durchschnittlich bei 2,5%. Cisplatin alleine induzierte bei einer Konzentration von 9µg/ml nach 24h eine signifikanten Erhöhung der Apoptose in AZK-Zellen auf 44%, während durch Koinkubation mit CXCL12 diese Steigerung der Apoptose wiederum signifikant gesenkt werden konnte(Abb.9e, p<0,001). Diese Ergebnisse legen nahe, daß CXCL12 tatsächlich die Cisplatin-induzierte Apoptose zu hemmen vermag und damit das Überleben von AZK-Zellen begünstigen kann. 45 Diskussion 4 Diskussion Die Fähigkeit zur Metastasierung stellt ein zentrales Charakteristikum des malignen Phänotyps dar39. Klinisch repräsentiert sie den wichtigsten prognostischen Faktor, welcher entscheidend die tumorbedingte Morbidität und Lethalität bei den meisten Tumorentitäten beeinflusst50. Molekularbiologisch betrachtet, ist Metastasierung das Resultat multipler, aufeinander folgender Ereignisse und stellt einen nicht-zufälligen und organspezifischen Prozess dar, welcher durch eine Vielzahl von Molekülen beeinflusst wird14. Welche molekularen Mechanismen der gerichteten Wanderung von Tumorzellen in spezifische Organe zugrunde liegen, ist bislang nicht vollständig geklärt. In der vorliegenden Arbeit wurden zellspezifische Merkmale untersucht, die für die Organotropie der Metastasierung von malignen KHT von Bedeutung sein könnten. Dabei wurden zwei histologische Entitäten der malignen KHT ausgewählt, welche sich aufgrund unterscheiden: ihres PEK nahezu reziproken und AZK50,60. Metastasierungsmusters deutlich Während PEK überwiegend lymphogen metastasieren50, erfolgt die Disseminierung bei AZK vor allem hämatogen60. Daher eignen sich die beiden Tumorentitäten besonders als Modell, um das Phänomen der organspezifischen Metastasierung näher zu untersuchen. Der Metastasierungsprozess zeigt wesentliche Gemeinsamkeiten mit dem Wanderungsverhalten von Leukozyten, welches maßgeblich durch Chemokine und ihre Rezeptoren reguliert wird88. Im Jahr 2001 konnte erstmals in Studien im Mammakarzinom belegt werden, daß Chemokin/Rezeptor-Interaktionen das “homing“ von Tumorzellen in distinkte Organe mediieren6. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß PEK und AZK distinkte Chemokinrezeptorprofile aufweisen, welche ursächlich für das differente Metastasierungsmuster dieser beiden Tumorentitäten sein könnten. So präsentierten PEK-Zellen eine grössere Bandbreite an Chemokinrezeptoren, während AZK-Zellen überwiegend den Chemokinrezeptor CXCR4 ausprägten. Die Mehrheit der PEK-Zelllinien zeigte eine signifikante Hochregulierung der Rezeptoren CXCR1 und CXCR2. Dabei ist der Ligand, CXCL8, unter anderem ein potenter angiogenetischer Faktor23,89. Durch Interaktion mit CXCR1 und CXCR2 auf Endothelzellen reguliert CXCL8 die Proliferation und Migration von Endothelzellen und vermittelt anti-apoptotische Signale in diesen Zellen90. Darüber hinaus führt 46 Diskussion CXCL8 zur Einwanderung immunkompetenter Zellen in inflammatorische Gewebe und beeinflusst die Leukozytenaktivierung89. In aktuellen Studien in malignen Erkrankungen wie dem malignen Melanom91, dem hepatozellulären Karzinom92, dem Bronchialkarzinom93 und dem Pankreaskarzinom94 konnte gezeigt werden, daß CXCL8 die Proliferation, das Überleben und die Invasion von Tumorzellen fördern sowie Angiogenese induzieren kann90,93. Für das Prostatakarzinom wurde eine positive Korrelation zwischen einer CXCR1- bzw. CXCR2-Überexpression und einem fortgeschrittenen Tumorstadium festgestellt95. Es ist anzunehmen, daß diese Chemokinrezeptoren auch beim PEK der Kopf-Hals-Region eine wichtige Rolle für die Proliferation und Invasion von Tumorzellen spielen und somit Tumorprogression fördern können. Einen autokrinen, pro-proliferativen Mechanismus für CXCL8CXCR1/CXCR2-Interaktionen vermuteten erstmals Watanabe et al., die nachwiesen, daß PEK-Zellen CXCL8 exprimieren96. Darüber hinaus wurde in PEK-Zellen eine Überexpression des Chemokins CXCL5 gefunden, welches über Bindung an CXCR1 bzw. CXCR2 eine wichtige Rolle bei der Proliferation, Invasion und Metastasierung spielen soll97. In der vorliegenden Arbeit zeigten PEK-Zellen neben einer Überexpression von CXCR1 und CXCR2 eine Hochregulation der Chemokinrezeptoren CCR7 und CXCR5. Im Gegensatz dazu wurden diese Rezeptoren in normalen, mukosalen Keratinozyten sowie in AZK–Zellen nicht oder nur auf geringem Niveau exprimiert. Die korrespondierenden Liganden CCL19 und CCL 21 für CCR7 bzw. CXCL13 für CXCR5 werden unter homöostatischen Bedingungen im Lymphknoten gebildet98,99. Aufgrund dieser Tatsache stellen CCR7 und CXCR5 vielversprechende Kandidaten dar, welche die Metastasierung von PEK in Lymphknoten vermitteln könnten. Unter physiologischen Bedingungen vermitteln die Chemokine CCL19 und CCL21 bzw. CXCL13 die Wanderung von T- und B-Lymphozyten, dendritischen und weiteren immunkompetenten Zellen in lymphatische Organe99-101. Sekundäre lymphatische Organe besitzen einen komplexen Aufbau und eine charakteristische Kompartimentierung100. Bemerkenswerterweise werden diese Chemokine in unterschiedlichen Bereichen lymphatischer Gewebe exprimiert99,100. Durch diese spezifischen Chemokingradienten können unterschiedliche Zellpopulationen in distinkte Kompartimente lymphatischer Organe dirigiert werden. Dies ermöglicht die Ontogenese und die Aufrechterhaltung der Kompartimentierung der sekundären lymphatischen Organe98-100. Das komplexe Zusammenspiel zwischen der 47 Diskussion koordinierten CXCR5- bzw. CCR7-Expression verschiedener Zellen einerseits und der distinkten Chemokinexpression in lymphatischem Gewebe andererseits bilden somit die Basis für ein funktionierendes Immunsystem. Betrachtet man CCR7 und CXCR5 jeweils für sich, so spielt CCR7 eine wichtige Rolle für die Migration naiver Lymphozyten und reifer dendritischer Zellen in die drainierenden Lymphknoten88. So gelangen CCR7-positive T-Zellen deutlich schneller und in größerer Anzahl in afferente Lymphbahnen und zu den drainierenden Lymphknoten als CCR7-negative T-Zellen102. Auch in malignen Prozessen vermittelt Tumorentitäten wie CCR7 dem wichtige Signale. Kolonkarzinom103, 80 Ösophaguskarzinom , dem Melanom 105 In dem verschiedenen soliden Magenkarzinom104, und dem Mammakarzinom 106 dem konnte eine CCR7-Expression auf Tumorzellen nachgeweisen werden. Dabei fand sich interessanterweise in einigen dieser Studien eine Korrelation zwischen der CCR7Expression und dem Ausmaß der Lymphknotenmetastasierung80,103-106. Darüber hinaus korrelierte in hämatologischen Neoplasien eine CCR7-Überexpression klinisch mit einer ausgeprägten Lymphadenopathie der betroffenen Patienten81. In der vorliegenden Arbeit konnte CCR7-Protein in vitro lediglich intrazellulär detektiert werden. Im Gegensatz hierzu ließ sich in den immunhistochemischen Färbungen CCR7 membranständig nachweisen. Diese Ergebnisse legen die Vermutung nahe, daß der Transport des Rezeptors zur Zelloberfläche von Faktoren abhängt, die sich eher unter in vivo-Bedingungen finden. Bei den PEK-Zellen konnte durch Serum-Entzug oder eine Behandlung mit pro-inflammatorischen Zytokinen und Wachstumsfaktoren keine CCR7-Oberflächenexpression in vitro induziert werden. Demzufolge scheint die Kombination mehrerer der genannten Faktoren oder ein bislang unbekanntes Agens für die Präsentation von CCR7 an der Zelloberfläche notwendige Voraussetzung zu sein. Insgesamt zeigte die Mehrzahl der humanen PEK-Gewebeproben eine deutliche CCR7-Expression in den Primärtumoren sowie den korrespondierenden Lymphknotenmetastasen. Daher könnte CCR7 eine zentrale Rolle bei der Absiedlung von PEK-Zellen in den drainierenden Lymphknoten spielen. Eine ähnliche Schlußfolgerung zogen Tsuzuki et al., die in aktuellen Untersuchungen an oralen PEK zeigten, daß eine erhöhte CCR7-Expression mit verschiedenen klinischen Parametern der Tumorerkrankung korrelierte107. In diesem Zusammenhang wurden die Größe der Lymphknotenmetastasen, ein fortgeschrittenes Tumorstadium, eine erhöhte Rezidivhäufigkeit und Karzinom- 48 Diskussion assoziierte Mortalität sowie eine insgesamt ungünstige Prognose genannt107. Wang und Mitarbeiter postulierten in einer weiteren Studie, dass PEK-Zellen während der lymphatischen Metastasierung das Differenzierungs- und Migrationsmuster dendritischer Zellen nachahmen108. Bei dendritschen Zellen findet sich der CCR6+CCR7-Phänotyp in der Haut während der CCR6-CCR7+ Phänotyp zu den lokal drainierenden Lymphknoten wandert109. In der vorliegenden Arbeit konnten jedoch keine Unterschiede in der CCR7-Expression von Primärtumoren und zugehörigen Lymphknotenmetastasen auf mRNS-Ebene oder Proteinebene detektiert werden. Zu einem ähnlichen Resultat kommen Ding et al.80, die eine vergleichbar hohe Expression von CCR7 in PEK des Ösophagus und den zugehörigen Lymphknotenmetastasen nachweisen konnten. Mittlerweile belegen zahlreiche Studien, daß die Chemokinrezeptorexpression in Primärtumoren und korrespondierenden Lymphknotenmetastasen nicht signifikant unterschiedlich ist110,111. Somit scheint die Regulierung der Chemokinrezeptorexpression einen frühen Schritt in der Tumorgenese darzustellen. CXCR5 trägt wesentlich zur gerichteten Migration von T- und B-Lymphozyten in sekundäre lymphatische Organe bei98,99. In Malignomen wurde bislang vor allem in hämatologischen Neoplasien eine erhöhte CXCR5-Expression beobachtet112-116. In diesen Zellen induziert der CXCR5-Ligand CXCL13 eine gerichtete Migration114 und vermag Apoptose zu hemmen116. Darüber hinaus korrelierte die CXCR5-Expression signifikant mit der Akkumulation maligner Zellen innerhalb lymphatischer Organe115. Klinisch bestand ein deutlicher Zusammenhang zwischen der CXCR5-Expression und einer verstärkten Lymphadenopathie117. In der vorliegenden Arbeit zeigten die untersuchten PEK-Zelllinien eine hohe CXCR5-Expression sowohl auf der mRNS- als auch Proteinebene. Diese Beobachtungen untermauern das postulierte Konzept, daß Metastasierung und Leukozytenwanderung grundlegende molekulare Mechanismen teilen, und daß CXCL13/CXCR5-Interaktionen neben CCR7 eine wesentliche Rolle bei der lymphogenen Ausbreitung diese Tumorentität spielen könnten. Der einzige Chemokinrezeptor, der auf hohem Level von AZK-Zellen, nicht jedoch von PEK-Zellen exprimiert wurde, war CXCR4. Dieser Rezeptor bindet in monogamer Weise das Chemokin CXCL124,6. CXCL12/CXCR4-Interaktionen haben, 49 Diskussion basierend auf ihre Fähigkeit die gerichtete Migration unterschiedlichster Zellentypen zu induzieren, elementare Bedeutung für die Embryogenese/Organogenese, die Hämatopoese und Leukozytenwanderung sowie Angiogenese23. So halten CXCL12/CXCR4 während der Organogenese eine Schlüsselposition inne, indem sie die gezielte Wanderung embryonaler Vorläuferzellen in definierte Kompartimente vermitteln41. Diese zentrale Rolle von CXCR4 in der embryonalen Entwicklung wird durch die Beobachtung unterstrichen, daß ein Gen-“knock-out“ in murinen Embryonen bereits früh zu embryonaler Lethalität führt41. Auch die Entwicklung des ZNS und seine Plastizität werden durch CXCR4 und CXCL12 beeinflusst118. Darüber hinaus trägt dieses Ligand-Rezeptor-Paar entscheidend zum Aufbau und der Kompartimentierung lymphatischer Organe bei30. So dirigieren CXCL12/CXCR4Interaktionen die gerichtete Migration von Lymphozyten und koordinieren die Reifung immunkompetenter Zellen119,120. Zusätzlich mediieren sie das “homing“ unterschiedlicher Vorläuferzellen in Leber und Knochenmark4,30,119. In der vorliegenden Arbeit führte die Aktivierung von CXCR4 auf AZK-Zellen zur gerichteten Migration, eine Beobachtung, die eine mögliche Rolle von CXCR4 im Metastasierungsprozess unterstreicht. Interessanterweise stellt CXCR4 den am häufigsten beschriebenen Chemokinrezeptor in malignen Erkrankungen dar39,121. Wie funktionelle Untersuchungen zeigen, induziert CXCR4 die gezielte Migration von Tumorzellen in vitro122 und fördert die Entstehung von Fernmetastasen in verschiedenen murinen Modellen6,123. Klinisch findet sich beim AZK ein überwiegend hämatogenes Metastasierungsmuster in Lunge und Leber12,124. Dabei wird der korrespondierende Ligand, CXCL12, gerade in diesen Organen auf hohem Niveau exprimiert6. Die Überexpression von CXCR4 im vorwiegend hämatogen metastasierenden AZK legt den Schluß nahe, daß CXCR4 eine Steuerungsfunktion für AZK-Zellen während der hämatogenen Disseminierung übernimmt. Im Gegensatz zur häufigen hämatogenen Metastasierung finden sich bei dieser Tumorentität selten Lymphknotenmetastasen12,125, obwohl CXCL12 auch in lymphatischen Geweben eine hohe Expression zeigt. Trotz der Tatsache, daß einige Studien CXCR4 eine gewisse Bedeutung für den Prozess der lymphogenen Metastasierung einräumen126,127, kommt die überwiegende Zahl an Veröffentlichungen zu der Schlussfolgerung, daß CXCR4 nicht maßgeblich an der 50 Diskussion lymphogenen Streuung von Tumoren beteiligt ist128. In Lymphknoten wird CXCL12 in der Umgebung hochendothelialer Venolen exprimiert120 und ist an der Rekrutierung von Memory T-Zellen über den Blutstrom nicht aber über das Lymphgefäßsystem beteiligt119. Aus diesem Grund könnte die mikroanatomische Verteilung der Expression von CXCL12 ursächlich für die seltene lymphogene Metastasierung des AZK sein. Neben der hohen Expression von CXCR4 in AZK fand sich in der vorliegenden Arbeit auch in einigen wenigen Plattenepithelkarzinomen eine Überexpression dieses Rezeptors in vivo. Bemerkenswerterweise zeigte sich hier histologisch eine deutlich randbetonte Expression von CXCR4 im Bereich der invasiven Front des Primärtumors, eine Beobachtung, welche eine Rolle für CXCR4 bei der Invasion des Primärtumors für das PEK vermuten lässt. Studien beim Prostatakarzinom129 und das Ovarialkarzinom130 unterstützen dieses Konzept. Die Induktion von Apoptose in Tumorzellen stellt das Hauptziel einer systemischen Chemotherapie dar. Das in malignen KHT am häufigsten verwendete Chemotherapeutikum Cisplatin76 entfaltet seine zytotoxische Wirkung über eine Interkalierung der DNS62, welche wiederum über komplexe Signalwege in der Induktion von Apoptose mündet63. Es werden aber auch Signalwege aktiviert, die das Überleben von Tumorzellen begünstigen können63,131. Dabei wird das endgültige Schicksal der Zellen durch das Gleichgewicht zwischen “pro-apoptotischen“ und “pro-survival“-Signalen bestimmt. Wie die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, führte eine Behandlung von AZK-Zellen mit Cisplatin in subletaler Dosierung zu einer Induktion der CXCR4Expression auf der Zelloberfläche. Da die Hochregulierung von CXCR4 in Anwesenheit des Transskriptionsinhibitors α-Amanitin deutlich gehemmt werden konnte, scheint eine veränderte Gentranskription Voraussetzung für die Induktion von CXCR4 zu sein. Darüber hinaus ließ sich in der vorliegenden Studie durch CXCL12 eine Aktivierung intrazellulärer Signaltransduktionswege via Akt und ERK1/2 nachweisen, Proteine, welche den Zellzyklus regulieren sowie die Proliferation und das Überleben von Zellen beeinflussen28,132,133. Diese Beobachtung ist im Einklang mit den Ergebnissen 51 Diskussion verschiedener anderer Studien, die zeigen konnten, dass über CXCL12/CXCR4 „prosurvival" sowie Proliferationssignale an unterschiedliche Zelltypen, wie beispielsweise CD4+T-Zellen87, embryonale neurale Zellen134 und interessanterweise auch an Karzinomzellen, Prostatakarzinomzellen77,137, Mammakarzinomzellen135,136, wie Pankreaskarzinomzellen44 und Glioblastomzellen77,110,138 vermittelt. Neben der Tatsache, dass CXCL12/CXCR4Interaktionen zu einer Aktivierung von Überlebenssignalen in Tumorzellen führen29,139, konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, daß CXCL12 die durch Cisplatin induzierte Apoptoserate in AZK-Zellen senkt. Es scheint daher wahrscheinlich, daß die Suppression von Apoptose via CXCL12/CXCR4 zu einer erhöhten Tumorzellvitalität während einer Chemotherapie führt und damit zu einer erhöhten Cisplatin-Resistenz beiträgt. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, daß die Unterschiede im Metastasierungsverhalten zweier histologisch unterschiedlicher maligner KHT, dem AZK und dem PEK, mit distinkten Chemokinrezeptorprofilen assoziiert sind. Das spezifische Rezeptorprofil des AZK ist darüber hinaus mit intrazellulären Signaltransduktionwegen verknüpft, welche das Überleben und die Proliferation von Tumorzellen begünstigen. Aktuell wird intensiv nach Chemokinrezeptorantagonisten bzw. Antikörpern gesucht, welche zur Behandlung des disseminierten Tumorstadiums eingesetzt werden können. Dabei scheint es, dass die Effektivität konventioneller Therapien einschließlich der Chemotherapie durch die Kombination mit Chemokinrezeptorneutralisierenden Therapeutika gesteigert werden kann, da hierdurch „survival pathways“ unterdrückt und die Apoptoserate gesteigert werden kann. Diese und weitere Strategien stellen, basierend auf den vorliegenden Ergebnissen, vielversprechende neue Ansätze in der Behandlung metastasierter Karzinome dar. Literaturverzeichnis 52 5 Literaturverzeichnis 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. Nicolson, G. L. Cancer progression and growth: relationship of paracrine and autocrine growth mechanisms to organ preference of metastasis. Exp Cell Res 204, 171-80 (1993). Wang, J. M., Deng, X., Gong, W. & Su, S. Chemokines and their role in tumor growth and metastasis. J Immunol Methods 220, 1-17 (1998). Yeatman, T. J. & Nicolson, G. L. Molecular basis of tumor progression: mechanisms of organ-specific tumor metastasis. Semin Surg Oncol 9, 256-63 (1993). Zlotnik, A. & Yoshie, O. Chemokines: a new classification system and their role in immunity. Immunity 12, 121-7 (2000). Homey, B. et al. CCL27-CCR10 interactions regulate T cell-mediated skin inflammation. Nat Med 8, 157-65 (2002). Muller, A. et al. 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Obwohl eine Anzahl von bekannten, physiologischen Molekülen für die Stimulation von Tumorzellmotilität und -invasion von Bedeutung sind, sind die genauen molekularen Mechanismen, die die gerichtete Wanderung/Metastasierung von Tumorzellen in spezifische Organe vermitteln, weitestgehend unbekannt. Tumorzellmigration und Metastasierung zeigen deutliche Gemeinsamkeiten mit dem Wanderungsverhalten von Leukozyten. Schlüsselprozesse stellen die Adhäsion an Endothelzellen, transendotheliale Migration sowie die gerichtete Wanderung durch extrazelluläre Matrix dar. In den letzten Jahren wurde gezeigt, daß Chemokine und deren Rezeptoren für die Wanderung und das organspezifische "Homing" von Leukozyten von zentraler Bedeutung sind. Chemokine sind Vertreter einer Superfamilie von kleinen, zytokinähnlichen Proteinen, die aufgrund ihrer Interaktion mit "G-protein coupled" Rezeptoren (GPCRs), die Polymerisation des Zytoskeletts, die feste Adhäsion an das Endothel sowie die gerichtete Wanderung von Leukozyten vermitteln. Diese sezernierten Proteine interagieren in einer koordinierten Art und Weise mit Zelloberflächenproteinen wie beispielsweise Intergrinen, um das spezifische "Homing" von unterschiedlichen Subtypen hämatopoietischer Zellen in definierte anatomische Kompartimente zu steuern. Um die zellulären und molekularen Mechanismen der organspezifischen Metastasierung zu untersuchen, wurden PEK- / AZK-Zelllinien und Gewebeproben verwendet, die von Patienten mit Primärtumor bzw. mit metastasiertem Tumorleiden stammten. Umfassende Analysen menschlicher Chemokinrezeptoren auf mRNA und Proteinebene zeigten, dass PEK- und AZK-Zellen ein spezifisches, nicht-zufälliges Chemokinrezeptormuster exprimieren. PEK exprimierten hauptsächlich Chemokinrezeptoren, die physiologischerweise zum Erhalt der Homöostase in Lymphknoten exprimiert werden, als wichtigste Vertreter seien hier der CC-Chemokinrezeptor (CCR) 7 und der CXC-Chemokinrezeptor (CXCR) 5 genannt. Ein Unterschied bezüglich der Chemokinrezeptorexpression ließ sich zwischen Primärtumor und entsprechender Metastase bei PEK nicht nachweisen. Im Gegensatz zu PEK exprimierten AZK den Rezeptor CXCR4, der gleichzeitig als zentraler Vermittler der hämatogenen Metastasierung gilt. In Chemotaxisassays zeigten AZK eine gradientenabhängige chemotaktische Reaktion auf CXCL12, den Liganden von CXCR4. Die Behandlung von AZK-Zellen mit Cisplatin zeigte eine Hochregulierung der CXCR4- Expression an der Zelloberfläche, diese Hochregulation wiederum konnte durch die zusätzliche Gabe von dem Transkriptionshemmstoff -Amanitin gehemmt werden. Die Behandlung von AZK-Zellen mit CXCL12 führte zur Aktivierung von Akt und ERK1/2 Signaltransduktionswegen. Darüber hinaus supprimierte die CXCL12-Behandlung die Cisplatin-induzierte Apoptoserate in AZKZellen und legt nahe, dass die CXCR4 induzierte Signalkaskasde Teil eines TumorzellÜberlebensprogramms darstellt. Die Charakterisierung der distinkten Chemokinrezeptorprofile von PEK und AZK in vitro und in Tumorgewebeproben (in vivo) und der Nachweis ihrer funktionellen Relevanz für Migration und Überleben der malignen Zellen bilden die Grundlage, für das Verständnis des spezifischen Metastasierungsverhalten von PEK und AZK sowie für die Entwicklung neuer therapeutische Ansätze gerade in der klinisch problematischen Metastasierungssituation. Anhang 60 Danksagung Ich danke Herrn Prof. Dr. med. J. Schipper und Herrn Prof. Dr. med. U. Ganzer für die Möglichkeit, meine Dissertation an der Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde durchführen zu können. Mein besonderer Dank gebührt Dr. med. Anja Müller-Homey, PD Dr. med. Thomas K. Hoffmann und Prof. Dr. med. B. Homey für die gemeinschaftliche Bereitstellung des Themas, ihre stets vorhandene Diskussionsbereitschaft sowie ihre engagierte Unterstützung bei der Niederschrift der Arbeit. Besonders herzlich möchte ich den Mitarbeitern des dermatologischen Labors und der Arbeitsgruppe von Bernhard Homey für ihre uneingeschränkte Hilfsbereitschaft, die wertvollen Ratschläge und das freundschaftliche Arbeitsklima danken. Von Herzen danke ich meiner Familie, die mich begleitet und unterstützt hat. 61 Anhang CURRICULUM VITAE PERSÖNLICHE DATEN Name Christine Suzanne Käthe Eulert * am 25.10.1979 in Tübingen Anschrift Judenbühlweg 10 97082 Würzburg SCHULBILDUNG 1986 – 1990 1990 – 1996 1996 – 1999 Grundschule St. Burkard, Würzburg St. Ursula Gymnasium, Würzburg Matthias-Grünewald Gymnasium, Würzburg Abschluss: Allgemeine Hochschulreife STUDIUM 1999 – 2001 Studium der Humanmedizin, Julius-Maximilians Würzburg Abschluss: Ärztliche Vorprüfung 2001 – 2006 Studium der Humanmedizin, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Abschluss: Staatsexamen der Humanmedizin Universität PRAKTISCHES JAHR 1. Tertial 2. Tertial 3. Tertial Otorhinolaryngologie, Universitätsklinik Düsseldorf Chirurgie, New Royal Infirmary, University of Edinburgh, Schottland Innere Medizin, Universitätsklinik Düsseldorf Rotation: internistische Notaufnahme und Kardiologie AKTUELLE TÄTIGKEIT seit Januar 2007 wissenschaftliche Mitarbeiterin der Medizinischen Klinik I der Universität Würzburg
