Untersuchungen zur Replikation und Transkription von Marburg

Aus dem Institut für Virologie
Klinikum der Philipps-Universität Marburg
Direktor: Prof. Dr. H.-D. Klenk
des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg
und des Universitätsklinikums Gießen und Marburg, Standort Marburg
Untersuchungen zur Replikation und Transkription von
Marburg- und Ebolavirus
Inaugural-Dissertation zur Erlangung
des Doktorgrades
der Humanbiologie (Dr. rer. physiol.)
dem Fachbereich Medizin
der Philipps-Universität Marburg
vorgelegt
von
Sven Enterlein
aus Köln
Marburg 2005
Angenommen vom Fachbereich Medizin
der Philipps-Universität Marburg am 27. September 2005
Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs
Dekan: Prof. Dr. Maisch
Referent: Prof. Dr. H.-D. Klenk
Korreferentin: Prof. Dr. Bauer
Für meinen Vater
Inhaltsverzeichnis
1
Inhaltsverzeichnis
1
Inhaltsverzeichnis
i
I
Einleitung
1
2
Filoviren als Pathogen
2
3
2.1
Klassifizierung
2
2.2
Epidemiologie
2
2.3
Pathogenese und Diagnose
3
2.4
Prävention und Therapie
3
Molekularbiologie der Filoviren
4
3.1
Morphologie
4
3.2
Aufbau des Genoms
5
3.3 Funktionen der viralen Proteine
3.3.1
NP, VP35, VP30, L
3.3.2
VP24, VP40
3.3.3
GP
6
6
7
7
3.4
Replikation und Transkription
7
3.5
Artifizielles Replikations- und Transkriptionssystem
(Minigenomsystem)
9
4
Problemstellung dieser Arbeit
11
II
Material und Methoden
12
5
Material
13
6
5.1
Geräte
13
5.2
DNA-Oligonukleotide, Primer
13
5.3
Hersteller der eingesetzten Kits und Enzyme
14
5.4
Radioaktive Substanzen
14
5.5
Peptid-konjugierte Phosphorodiamidat-Morpholinooligomere (PPMOs)
14
5.6
Puffer und Lösungen
15
5.7
Vektoren und Plasmide
17
5.8 Zellkultur und Viren
5.8.1
Zelllinien
5.8.2
Viren
5.8.3
Verwendete Bakterienstämme
17
17
17
18
5.9
18
Kommerzielle Antikörper
Methoden
6.1 Arbeiten mit Zellkultur und Viren
6.1.1
Passagieren von Zellen
19
19
19
i
Inhaltsverzeichnis
6.1.2
6.1.3
6.1.4
6.1.5
6.1.6
6.1.7
6.2
Anzucht und Vermehrung von Viren
Titerbestimmung durch TCID50-Analyse
Infektion von Säugerzellen mit MVA-T7
Isolierung viraler Antigene
Aufbereitung von Proben für Analyse im Elektronenmikroskop
Behandlung von Säugerzellen mit P-PMOs und Infektion mit EBOV
Transfektion von Plasmid-DNA mit Fugene 6
19
19
20
20
21
21
21
6.3 Arbeiten mit Bakterien
6.3.1
Herstellen Z-kompetenter E. coli
6.3.2
Transformation Z-kompetenter E. coli
22
22
22
6.4 Isolierung, Analyse und Aufreinigung von Nukleinsäuren
6.4.1
Plasmid-DNA Minipräparation (Miniprep)
6.4.2
Plasmid-DNA Maxipräparation (Maxiprep)
6.4.3
Aufreinigung von RNA
6.4.4
Phenol/Chloroform-Extraktion von Nukleinsäuren
6.4.5
Fällen von Nukleinsäuren
6.4.6
Isolierung replizierter RNA aus Säugerzellen
6.4.7
Agarosegel-Elektrophorese (DNA)
6.4.8
Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen
6.4.9
Aufreinigung von DNA über Silica-Säulchen
6.4.10 Formaldehyd-Agarosegel-Elektrophorese (RNA)
6.4.11 Northern-Blot-Analyse
6.4.12 Polyacrylamidgel für radioaktive DNA-Sequenzierung
22
22
23
23
23
23
24
24
25
25
25
25
26
6.5 Synthese und Modifikation von Nukleinsäuren
6.5.1
Restriktionsverdau
6.5.2
Ligation
6.5.3
(Radioaktive) Phosphorylierung, Dephosphorylierung
6.5.4
Reverse Transkription, Primer-Extension
6.5.5
In vitro-Transkription
6.5.6
Markieren von RNA-Fragmenten mit Digoxigenin (DIG)
6.5.7
Chemische Modifizierung von RNA
6.5.8
Standard- (nicht-radioaktive) Sequenzierung von DNA
6.5.9
Radioaktive Sequenzierung von DNA
27
27
27
28
28
29
29
30
31
31
6.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR), in vitro-Mutagenese
6.6.1
Amplifikation einer spezifischen Sequenz
6.6.2
In vitro-Mutagenese
6.6.3
Reverse-Transkriptions-PCR (RT-PCR)
31
31
32
33
6.7 Nachweis der Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)
6.7.1
Radioaktiver Aktivitätsnachweis (CAT-Assay)
6.7.2
Detektion des CAT-Proteins mittels ELISA
34
34
35
6.8 Proteinanalysen
6.8.1
SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
6.8.2
Coomassie-Färbung
6.8.3
Western-Blot-Analyse
35
35
35
36
ii
Inhaltsverzeichnis
6.8.4
Immunfluoreszenz-Analyse
36
III
Ergebnisse
39
7
Optimierung der Isolierung und Detektion replizierter RNA
40
8
7.1
Einfluss der MVA-T7-Infektion auf die Menge an replizierter RNA in
40
HuH-T7- und BSR T7/5-Zellen
7.2
Änderung der Konditionen zur Isolierung replizierter RNA
41
7.3
Einsatz des Plasmids pCAGGS/T7 zur Steigerung der Effizienz
42
7.4
Analyse der T7-RNA-Polymerase-Expression
43
7.5
Zusammenfassung Kapitel 7
44
Sekundärstrukturanalyse des Transkriptionsstart-Signals (TSS) des
Marburgvirus
8.1 Sekundärstrukturanalyse des MARV-spezifischen leaders
8.1.1
Klonierung der Positivstrang-Minigenome 2.1.1 CAT Mut und 3M5M (+)
8.1.2
Analyse der Wildtyp-Sekundärstruktur
9
46
46
46
47
8.2 Chimären aus MARV- und EBOV-Transkriptionsstart-Signalen
8.2.1
Klonierung der MARV/EBOV TSS Chimären
8.2.2
Analyse der Sekundärstruktur von tss_MARV1→EBOV2 (+) RNA
8.2.3
Analyse der Replikations- und Transkriptionsaktivität der
MARV/EBOV TSS-Chimären
51
8.3
54
Zusammenfassung Kapitel 8
Lokalisierung und Charakterisierung der genomischen
Promotorelemente für Replikation und Transkription
50
50
50
55
9.1 Analyse der Promotorelemente bei MARV
9.1.1
Deletionsmutanten der 3’-NTR von 3M-5M
9.1.2
Analyse auffälliger Motive im 3’-Ende des MARV-Genoms
55
55
57
9.2 Analyse des Replikationspromotors des EBOV
9.2.1
Deletionsmutanten der 3’-NTR von 3E-5E
9.2.2
Charakterisierung des zweiten Promotorelements von EBOV
9.2.3
Ist das Motiv (UN5)3 hinreichend als zweites Promotorelement?
59
60
61
63
9.3 Analyse des Replikationspromotors von EBOV Reston
9.3.1
Deletionsmutanten der 3’-NTR von 3R-5R
9.3.2
Analyse der Motive (UN5)3 und (CUAANN)2
64
64
65
9.4
66
Zusammenfassung Kapitel 9
10 Lokalisierung und Charakterisierung des antigenomischen
Replikationspromotors
67
10.1 Mutanten der 5’-NTR von 3M-5M, 3E-5E und 3R-5R
67
10.2 Zusammenfassung Kapitel 10
69
11 Etablierung eines Reverse-Genetik-Systems für MARV
11.1 Klonierungsstrategie
70
70
iii
Inhaltsverzeichnis
11.2 Ermittlung der optimalen Konditionen für effizientes Virus-Rescue
11.2.1 Auswahl der Zelllinie
11.2.2 Ablauf der Rescue-Experimente
11.2.3 Titration der Expressionsplasmide
71
71
71
72
11.3 Zusammenfassung Kapitel 11
76
12 Welche Rolle spielt VP30M im Volle-Länge-Rescue-System?
77
12.1 Herstellung verschiedener Mutanten des VP30M
77
12.1.1 Klonierung von pMARV (+) VP30knockout
77
12.1.2 Klonierung von pMARV (+) VP30Zn-Finger knockout und pTM1/VP30M Zn77
Finger knockout
12.2 Expressions- und Kolokalisationsstudien von VP30M Zn-Finger knockout
(pTM1)
78
12.3 Funktionalitätskontrolle von pTM1/VP30M Zn-Finger knockout im EBOVspezifischen Minigenomsystem
79
12.4 Austausch von pTM1/VP30M im Volle-Länge-Rescue-System
81
12.5 Rescue von Volle-Länge-Klonen mit mutiertem VP30-Gen
83
12.6 Zusammenfassung Kapitel 12
84
13 Analyse von Promotormutanten im Volle-Länge-MARV
85
13.1 Herstellung der Mutanten pMARV (+) leader 3U→A und pMARV (+)
+3x EBOV UN5
85
13.2 Untersuchung der Mutanten im Volle-Länge-Rescue-System
85
13.3 Zusammenfassung Kapitel 13
87
14 Inhibition der Replikation von EBOV durch Peptid-konjugierte
Phosphorodiamidat-Morpholinooligomere
88
14.1 Strategie
88
14.2 Analyse der Inhibitionseffizienz in Zellkultur
14.2.1 Auswahl des effizientesten Inhibitors
14.2.2 Bestimmung der Zytotoxizität der P-PMOs in Zellkultur
14.2.3 Untersuchung der konzentrationsabhängigen Inhibition von 3136 PPMO
14.2.4 Einfluss des Applikationszeitpunkts auf die Inhibition
14.2.5 Untersuchung der Inhibition von MARV mit 3136 P-PMO
89
89
90
91
93
94
14.3 Zusammenfassung Kapitel 14
94
IV Diskussion
95
15 Untersuchungen zu den genomischen und antigenomischen
Promotoren von Filoviren
96
15.1 Probleme beim Nachweis replizierter RNA
96
15.2 Sekundärstruktur des Transkriptionsstart-Signals von MARV
97
15.3 Charakterisierung der Replikationspromotoren von MARV, EBOV-Z
99
und EBOV-R
iv
Inhaltsverzeichnis
16 Etablierung eines Volle-Länge-Rescue-Systems für MARV und seine
Anwendung
106
16.1 Erfolgreiche Isolierung von rekombinantem MARV
106
16.2 Anwendung des Rescue-Systems – Rolle des VP30
108
16.3 Anwendung des Rescue-Systems – Ausblick
110
16.4 Anwendung des Rescue-Systems – Untersuchung der genomischen
Promotorregion
111
16.5 Anwendung des Rescue-Systems – Hilfsmittel für „Bioterroristen“?112
17 Die gezielte Herunterregulierung von VP35 inhibiert die Vermehrung
von EBOV
113
17.1 Der Translationsstart des VP35 als vielversprechendes Ziel
113
17.2 3136 P-PMO schränkt spezifisch die Vermehrung von EBOV ein und
114
schützt Mäuse vor tödlicher Infektion
18 Zusammenfassung
117
V
119
Anhang
19 Liste der eingesetzten Oligonukleotide/Primer
I
20 Abbildungsverzeichnis
IV
21 Tabellenverzeichnis
V
22 Abkürzungsverzeichnis
VI
23 Veröffentlichungen und Präsentationen
23.1 Präsentationen auf Kongressen und Tagungen
23.1.1 Vorträge
23.1.2 Posterpräsentationen
23.2 Abgeschlossene Publikationen
24 Literaturverzeichnis
VIII
VIII
VIII
VIII
IX
X
25 Verzeichnis der akademischen Lehrer
XXI
26 Danksagung
XXII
v
Einleitung
I
Einleitung
Einleitung – Molekularbiolgie der Filoviren
2
Filoviren als Pathogen
2.1
Klassifizierung
Zu der Familie der Filoviridae zählen bislang nur das Marburg- (MARV) und das Ebolavirus (EBOV). Das Ebolavirus kann weiterhin in die Subtypen Zaire (EBOV-Z),
Sudan (EBOV-S), Ivory Coast (EBOV-IC) und Reston (EBOV-R) unterteilt werden
(Feldmann & Klenk, 1996). Aufgrund der molekularbiologischen Eigenschaften (Kapitel
3) wurden die Filoviren zusammen mit den Paramyxoviridae, Rhabdoviridae und Bor-
Mononegavirales
naviridae in die Ordnung der Mononegavirales eingeordnet (ICTV, 1991).
2.2
Paramyxoviridae (z.B. Respiratorisches Synzytialvirus (RSV), Masern, Nipah, Sendai)
Rhabdoviridae
(z.B. Vesikuläres Stomatitisvirus (VSV), Rabies)
Bornaviridae
(Borna)
Filoviridae
Marburg Virus, Ebola Virus
(Zaire, Sudan, Ivory Coast, Reston)
Epidemiologie
1967 erkrankten Personen in Marburg, Frankfurt und dem damaligen Jugoslawien,
die mit Material von Affen aus Afrika in Kontakt gekommen waren, an schwerem hämorrhagischem Fieber. Als Ursache wurde ein bisher unbekanntes Virus ermittelt
(Gedigk et al., 1968, Siegert et al., 1967). Dies war das erste bekannte Auftreten einer
Filovirusinfektion in der westlichen Welt. Ausbrüche von durch MARV hervorgerufenem
hämorrhagischem Fieber (Marburg hemorrhagic fever, MHF) wurden nur sporadisch in
Südafrika beobachtet, bei einer Mortalität von etwa 20-60% (Slenczka, 1999, WHO,
1999). Die zwei größten Ausbrüche gab es 1998-2000 in der demokratischen Republik
Kongo (Zeller, 2000) und erst kürzlich (2004/2005) in Angola (http://www.who.int/
csr/don/archive/disease/marburg_virus_disease/en/index.html), bei denen die Mortalitätsraten zwischen 80 und 90% lagen. Durch das EBOV hervorgerufene hämorrhagische Fieber (Ebola hemorrhagic fever, EHF) trat weitaus häufiger auf mit Mortalitätsraten bis zu etwa 90% (Feldmann et al., 1996, Feldmann et al., 2004, WHO, 1978). Die
Übertragung von Filoviren geschieht hauptsächlich über Körperflüssigkeiten infizierter
Patienten oder Affen (Dowell et al., 1999), aber Übertragung durch Aerosole, obwohl
unwahrscheinlich, kann nicht ausgeschlossen werden (Leffel & Reed, 2004, Roels et
al., 1999). Vereinzelt gab es auch Berichte von Infektionen mit Filoviren durch Laborunfälle (Formenty et al., 1999, Geisbert & Jahrling, 2003, Nikiforov et al., 1994).Die einzigen bisher bekannten Ausbrüche von EBOV-R gingen auf von den Philippinen impor2
Einleitung – Molekularbiolgie der Filoviren
tierte Affen zurück, bei Menschen wurde jedoch keine Krankheit ausgelöst (Geisbert &
Jahrling, 1990, Miranda et al., 2002). EHF ist auch ein bedeutendes Problem für die
Population von Gorillas und Schimpansen in Zentralafrika (Vogel, 2004).
2.3
Pathogenese und Diagnose
Filoviren rufen in Menschen und nicht-humanen Primaten ein schweres hämorrhagisches Fieber hervor. Die frühen Symptome von MHF und EHF sind sehr ähnlich und
zunächst unspezifisch: Kopfschmerzen, Müdigkeit, Schluckbeschwerden, Gelenk- und
Muskelschmerzen. Kurz darauf verschlechtert sich der Zustand des Patienten und neben hohem Fieber tritt der charakteristische Ausschlag auf. Punktförmige Hämorrhagien der Schleimhäute und des Gastrointestinaltraktes können in der Endphase der
Erkrankung zu generalisiertem Organversagen und Tod führen (Zusammengefasst in:
Mahanty & Bray, 2004, Peters & Khan, 1999). Da die Anzeichen für virale hämorrhagische Fieber sich in der Differenzialdiagnose stark ähneln, sind molekularbiologische
bzw. biochemische Nachweise zur Identifizierung oftmals notwendig. Dazu zählen ELISA (Ksiazek et al., 1999), RT-PCR (Sanchez et al., 1999, Weidmann et al., 2004) oder
Elektronenmikroskopie. Mitverantwortlich für den schnellen und schweren Verlauf ist,
dass keine ausreichende Immunantwort während der ersten Woche der Infektion zu
beobachten ist. Sowohl für EBOV als auch MARV konnte eine immunsupprimierende
Wirkung des VP35 (siehe 3.3.1) gezeigt werden.
2.4
Prävention und Therapie
Bisher ist weder eine spezifische Therapie noch eine Impfung verfügbar. Allerdings
kann eine Ausbreitung durch geeignete Eindämmungs- und Quarantäneprozeduren
verhindert oder zumindest stark eingeschränkt werden (Informationen von WHO/CDC:
http://www.cdc.gov/ncidod/dvrd/spb/mnpages/vhfmanual.htm). Verschiedene Methoden wurden eingesetzt, um einen wirksamen Impfstoff zu entwickeln, darunter klassische Versuche wie attenuierte Viren, virale Vektoren, die für filovirale Proteine kodieren
sowie Impfstoffe aus Untereinheiten z.B. DNA oder virusähnliche Partikel (VLP) (Hevey
et al., 1997, Hevey et al., 1998, Hevey et al., 2001, Jones et al., 2005, Sullivan et al.,
2003, Vanderzanden et al., 1998, Warfield et al., 2003, Warfield et al., 2004). Die Suche nach Impfstoffen und Therapeutika wird nicht nur durch die hohen Sicherheitsstandards erschwert, sondern auch durch die Diskrepanz der Wirksamkeit in unterschiedlichen Tiermodellen (Burnett, 2005, Geisbert & Hensley, 2004). Bisher konnte nur ein
rekombinanter Inhibitor des Faktor VIIa-Gerinnungsproteins das Überleben von EBOVinfizierten Affen auf 33% anheben (Geisbert & Hensley, 2004, Geisbert et al., 2003).
Aufgrund der hohen Mortalität, der fehlenden Behandlungs- und Vakzinierungs3
Einleitung – Molekularbiolgie der Filoviren
möglichkeiten und der nicht auszuschließenden Übertragung durch Aerosole wurden
Filoviren (inkl. EBOV-R) als Erreger der biologischen Sicherheitsstufe S4 eingestuft
und dürfen nur unter strengsten Sicherheitsbedingungen gehandhabt werden
(http://www.bba.de/gentech/gentsv.pdf).
3
Molekularbiologie der Filoviren
3.1
Morphologie
Im Elektronenmikroskop können Marburg- und Ebolaviren voneinander differenziert
werden; die einzelnen EBOV-Subtypen hingegen sind nicht zu unterscheiden (Geisbert
& Jahrling, 1995). Die fadenförmige Erscheinung hat den Filoviren ihren Namen gegeben (filum, lat.: Faden) (Kiley et al., 1982). Die Gestalt ist pleomorph, die Virionen können verzweigt, gerade oder „6“-förmig sein, bei einer Länge von durchschnittlich
665 nm (MARV) und 805 nm (EBOV) (Slenczka, 1999) und einem konstanten Durchmesser von etwa 80 nm (Abb. 1, oben). Das helikale Nukleokapsid besteht aus der
viralen RNA, die von NP, dem Nukleoprotein, dicht enkapsidiert ist, sowie den viralen
Proteinen VP35, VP30 und L (siehe auch 3.3.1). Diese dichte Verpackung verleiht der
Nukleinsäure Resistenz gegenüber Nukleaseverdau. Die vier Nukleokapsidproteine
sind an der Replikation und Transkription des viralen Genoms beteiligt (Boehmann et
al., 2005, Mühlberger et al., 1998, 1999). Umgeben ist das Nukleokapsid von einer
Hüllmembran, in die das einzige Oberflächenprotein, GP, inseriert ist (Volchkov et al.,
1998). Im Matrixraum zwischen Membran und Nukleokapsid befinden sich die beiden
Proteine VP40 und VP24 (Dessen et al., 2000, Han et al., 2003).
A
100 nm
GP
B
VP24
L
VP35
VP30
VP40
NP
RNA
Abb. 1. Morphologie eines Filoviruspartikels. (A) Elektronenmikroskopische Aufnahme eines
Marburgviruspartikels
(aufgenommen von Frau Dr. Larissa
Kolesnikova) bei 50 000-facher
Vergrößerung. Die innere Elektronendichte stellt das Nukleokapsid dar, die äußere die Hüllmembran mit ein- bzw. angelagerten Proteinen. (B) Schematische Interpretation der Virusstruktur. Die einzelnen Komponenten sind weder stöchiometrisch noch im richtigen Größenverhältnis dargestellt. Die Komponenten des Nukleokapsids
sind unterstrichen (RNA, NP, L,
VP30 und VP35).
4
Einleitung – Molekularbiolgie der Filoviren
3.2
Aufbau des Genoms
Wie alle Vertreter der Ordnung Mononegavirales besitzen Filoviren ein einzelsträngiges, nicht-segmentiertes RNA-Genom in negativer Orientierung; virale RNA ist somit
nicht infektiös (Kiley et al., 1982). Die Länge beträgt etwa 19 kb (EBOV-Z: 18959 nts,
MARV: 19111 nts), womit die Filoviren das längste Genom innerhalb der Ordnung besitzen. Am 3’- und 5’-Ende befinden sich hoch konservierte, nicht-transkribierte Regionen, die leader bzw. trailer genannt werden (Kiley et al., 1986). Für beide Sequenzbereiche sind stabile Sekundärstrukturen vorhergesagt (Sanchez et al., 1989, Volchkov et
al., 1999). Das Genom weist sieben offene Leserahmen (ORFs) auf: 3’-NP-VP35VP40-GP-VP30-VP24-L-5’, von denen sieben (MARV) bzw. acht (EBOV) Proteine synthetisiert werden (Sanchez et al., 1996, Volchkov et al., 1995).
Die einzelnen Gene sind durch hoch konservierte Transkriptionsstart- (TSS; 3’CUNCNUNUAAUU-5’) und –stoppsignale (TStpS; 3’-UAAUUCUUUUU-5’) begrenzt
(Mühlberger et al., 1996). Die meisten Gene sind durch intergenische Regionen getrennt, die sich in Länge und Sequenz stark unterscheiden. Zudem treten aber auch
Genüberlappungen auf, die bei den einzelnen Filoviren unterschiedlich lokalisiert sind
(Abb. 2); die Überlappungen beschränken sich dabei auf fünf hoch konservierte Nukleotide „UAAUU“ der TSS (Feldmann et al., 1992, Sanchez et al., 1993). Die Ausbildung
MARV
L
VP24
NP
VP35 VP40
GP
VP30
5’
3’
IR
leader
IR
IR
IR
trailer
IR Überlapp
EBOV (Zaire)
NP
VP35
VP40
GP/sGP
VP30
L
VP24
5’
3’
trailer
IR Überlapp
IR Überlapp IR Edit. Überlapp
stelle
leader
kb
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16 17
18
19
Abb. 2. Genomorganisation von Marburg- und Ebolavirus. Beide Genome bestehen aus etwa 19 kb einzelsträngiger RNA (MARV: 19.111 [Musoke], EBOV-Z: 18.959 [Mayinga]) in negativer Orientierung. Flankiert werden die Gene (grau) von nicht-kodierenden Sequenzen (weiß). Zwischen den Genen befinden
sich entweder intergenische Regionen (IR) von variabler Sequenz und Länge oder es treten Überlappungen auf. Am 3’-Ende befindet sich die sog. leader-, am 5’-Ende die trailer-Sequenz. Gene, die für die
Nukleokapsidproteine (NP, VP35, VP30 und L) kodieren, sind dunkelgrau hinterlegt. Eine Besonderheit
bei dem Gen des Oberflächenproteins GP von EBOV ist, dass primär ein sezerniertes sGP gebildet wird,
und nur nach transkriptionalem Editing das membraninserierte strukturelle GP (nach Lamb, 1996b).
5
Einleitung – Molekularbiolgie der Filoviren
von Sekundärstrukturen im Bereich der TSS auf mRNA-Ebene wurde 1996 durch
Computeranalysen vorhergesagt (Mühlberger et al., 1996) und mit leichten Modifikationen 2002 für das TSS des NP-Gens von EBOV experimentell bestätigt (Weik et al.,
2002). Ob derartige Strukturen auch auf der umhüllten vRNA zu finden sind, ist noch
ungeklärt.
3.3
3.3.1
Funktionen der viralen Proteine
NP, VP35, VP30, L
Die vier Proteine NP, VP35, VP30 und L bilden zusammen mit der viralen RNA den
Ribonukleoprotein- (RNP) Komplex (Abb. 1B). Sie schützen die RNA und katalysieren
Replikation und Transkription (3.4).
Das Nukleoprotein NP interagiert mit der RNA und umhüllt sie vollständig. Es ist
phosphoryliert (Becker et al., 1994), O-glykosyliert sowie sialyliert, und ist am Knospungsprozess beteiligt (Huang et al., 2002, Licata et al., 2004).
VP35 wird als Analogon zu dem P-Protein der Paramyxoviren und Rhabdoviren angesehen, obwohl es nur sehr schwach oder nicht phosphoryliert ist (Becker & Mühlberger, 1999, Elliott et al., 1985, 1993). Der Komplex aus VP35 und L bildet die aktive
RNA-abhängige RNA-Polymerase, wobei VP35 als Kofaktor fungiert und L die katalytische Untereinheit darstellt (Becker & Mühlberger, 1999). Eine weitere wichtige Funktion des VP35 liegt in seiner Fähigkeit, die Interferon-I-(IFN I) Antwort der infizierten Zellen zu hemmen (Basler et al., 2003, 2000).
Lange Zeit wurde VP30 als Phosphoprotein-Analogon anderer Mononegavirales angesehen, da es stark phosphoryliert und eng mit dem RNP-Komplex assoziiert ist
(Elliott et al., 1985, 1993). Dies wurde allerdings widerlegt, als für MARV gezeigt werden konnte, dass minigenomische RNA ohne VP30 repliziert und transkribiert wurde
(Mühlberger et al., 1998); bei EBOV war VP30 nur für effiziente Transkription notwendig (Mühlberger et al., 1999). Eine wichtige Funktion des VP30 von EBOV ist die Aktivierung der Transkription (Weik et al., 2002). Der Phosphorylierungsgrad von VP30
beeinflusst die Transkriptionsaktivierung und Bindung an NP (Modrof et al., 2001,
2002). Bei dem Respiratorischen Synzytialvirus (RSV), einem Pneumovirus, findet sich
ebenfalls ein viertes Nukleokapsidprotein (M2-1). Collins et al. (1996) konnten zeigen,
dass es sich dabei um einen Antiterminationsfaktor der Transkription handelt. Die Rolle
von VP30 des Marburgvirus ist hingegen unbekannt. Die VP30-Proteine von MARV
und EBOV zeigen beide ein Zink-Bindungsmotiv, welches bei EBOV essentiell für die
Funktion ist (Modrof et al., 2003), bei MARV bisher nicht näher charakterisiert.
6
Einleitung – Molekularbiolgie der Filoviren
3.3.2
VP24, VP40
Sowohl VP24 als auch VP40 sind im Raum zwischen Nukleokapsid und Hüllmembran lokalisiert (Abb. 1). VP40 ist das am häufigsten vorkommende virale Protein. Expression von VP40 resultiert in der Ausbildung und Knospung von Virus-ähnlichen Partikeln (VLP) (Jasenosky et al., 2001, Timmins et al., 2001); es ist nicht mit dem RNP
assoziiert, wohl aber mit der Membran (Elliott et al., 1985). Es bildet Oktamere und
bindet RNA (Hoenen et al., 2005). Die Kristallstruktur ist seit einigen Jahren bekannt
(Dessen et al., 2000). VP24 ist sowohl mit dem RNP als auch mit der Membran assoziiert (Elliott et al., 1985) und eventuell ein Pathogenitätsfaktor (Volchkov et al., 2000).
Basler und Palese (2004) haben zudem beschrieben, dass das VP24 von EBOV spezifisch die Interferon-induzierte Genexpression inhibiert. Das Zusammenspiel der beiden
Matrixproteine und der Knospungsprozess sind in Jasenosky und Kawaoka (2004) zusammengefasst.
3.3.3
GP
Das einzige Oberflächenprotein, das Glykoprotein GP, wird vom vierten Gen kodiert.
Es handelt sich um ein N- und O-glykosyliertes Typ-I Transmembranprotein, das als
Homotrimer in die Membran inseriert ist (Feldmann et al., 1991). Bei EBOV ist nicht
membrangebundenes GP das primäre Genprodukt, sondern eine verkürzte, lösliche
Form (sGP). Das Volle-Länge-GP wird erst durch kotranskriptionale Editierung synthetisiert (Volchkov, 1999). Das Glykoprotein ist für die Fusion des Virus mit der Wirtszellmembran verantwortlich (Weissenhorn et al., 1998) und stellt das rezeptorbindende
Protein dar, wobei der Rezeptor selbst noch umstritten ist (Alvarez et al., 2002, Chan et
al., 2001, Simmons et al., 2003).. Ebenfalls stehen noch viele Fragen zum Einfluss von
GP bzw. sGP auf Zytotoxizität und immunsupprimierende Wirkung offen (z.B. Feldmann et al., 1999, Schnittler & Feldmann, 1999, Sui & Marasco, 2002, Takada & Kawaoka, 2001, Volchkov et al., 2001).
3.4
Replikation und Transkription
In der infizierten Zelle finden zwei RNA-synthetisierende Ereignisse statt: Bei der
Transkription wird das Genom in mRNAs überschrieben, bei der Replikation entsteht
über ein komplementäres Antigenom eine Kopie des gesamten Genoms. Während
diese beiden Vorgänge bei anderen Vertretern der Mononegavirales sehr genau beschrieben sind (Kolakofsky et al., 2004, Lamb, 1996a, Wagner, 1996), fehlen bei den
Filoviren noch viele Details. Es kann aber angenommen werden, dass die Prozesse bei
allen nicht-segmentierten Negativstrang- (NNS) RNA-Viren sehr ähnlich ablaufen.
7
Einleitung – Molekularbiolgie der Filoviren
Nach der Infektion der Zelle wird angenommen, dass das enkapsidierte Genom vom
Transkriptionskomplex (Transkriptase) zunächst in mRNAs überschrieben wird, die
polyadenyliert sind und eine Cap-Struktur aufweisen (Sanchez & Kiley, 1987, Weik et
al., 2002). Dabei beginnt die RNA-Synthese am TSS und endet mit der Polyadenylierung am TStpS. Eine kurze RNA, die dem leader entspricht und bei anderen Monone-
gavirales gefunden wird, konnte bisher nicht nachgewiesen werden. Es wird davon
ausgegangen, dass die Polymerase nur eine Bindungsstelle hat und nicht an jedem
Gen neu beginnt. Das gesamte Genom wird dabei abgetastet und intergenische Regionen ohne RNA-Synthese übersprungen. Da die Polymerase nicht immer fehlerfrei
reinitiiert, entsteht ein Gradient an mRNAs, der von 3’ nach 5’ abnimmt:
NP>VP35>VP40>sGP/GP>VP30>VP24>L (Mühlberger et al., 1996). Dieses Phänomen wurde erstmals gezeigt für das Vesikuläre Stomatitisvirus, VSV (Iverson & Rose,
1981).
Die Umschaltung von Transkription zu Replikation ist mechanistisch bisher ungeklärt. Im Gegensatz zur Transkriptase ignoriert die Replikase (Replikationskomplex) die
Start- und Stoppsignale der Transkription und generiert so eine Kopie des gesamten
Genoms. Ein sehr einfaches Modell, dass verfügbares NP einer der Regulatoren der
Umschaltung ist, ist weitgehend akzeptiert (Kolakofsky, 1982). Inzwischen weisen viele
Erkenntnisse jedoch auf einen deutlich komplexeren Mechanismus hin (Kolakofsky et
al., 2004). Bei dem Rabiesvirus beispielsweise ist das Matrixprotein M ein Regulator
Transkription und Replikation (Finke et al., 2003). Es ist nicht auszuschließen, dass
auch bei Filoviren Transkriptase und Replikase unterschiedliche Proteinzusammensetzungen haben, wie z.B. bei VSV (Qanungo et al., 2004). Ein Hinweis darauf könnte
sein, dass das VP30 von EBOV nur für die Transkription, nicht aber für die Replikation
benötigt wird (Mühlberger et al., 1999).
Die Promotoren für Replikation und Transkription sind für einige NNS-RNA-Viren
schon recht gut charakterisiert. Gemeinsam haben dabei alle Viren, dass die ersten
etwa 15 nts wichtig für beide Prozesse sind. Dies, und die hohe Komplementarität von
leader und trailer lassen vermuten, dass cis-aktive Signale für die Enkapsidierung ur
Replikation dort lokalisiert sind, wie z.B. für das Respiratorische Synzytialvirus (RSV)
untersucht wurde (Peeples & Collins, 2000). Des Weiteren gibt es für den Replikationspromoter zwei Modelle: (A) Ein Sequenzabschnitt enthält sämtliche wichtige Signale, d.h. es handelt sich um einen einteiligen Promotor. Dies konnte für z.B. RSV und
VSV gezeigt werden (Fearns et al., 2000, Li & Pattnaik, 1999). (B) Bei NNS-RNA-Viren,
die der „rule of six“ folgen, deren Genom also eine durch sechs teilbare Länge aufweist
(Calain & Roux, 1993), findet sich ein zweigeteilter Promotor. Dabei sind zwei Se8
Einleitung – Molekularbiolgie der Filoviren
quenzabschnitte, durch einen spacer getrennt, wichtig für die Replikation. Bisher konnte ein solcher Promoter z.B. für das Sendaivirus (Calain & Roux, 1993), hPIV2 (humanes Parainfluenzavirus Typ 2 (Skiadopoulos et al., 2003), Simian Virus 5 (Murphy &
Parks, 1999) oder Newcastle Disease Virus (Marcos et al., 2005) gezeigt werden. Für
EBOV wurde nachgewiesen, dass der Replikationspromotor auch zweigeteilt ist (Weik,
2001) und der „rule of six“ folgt, obwohl das für das EBOV-Genom selbst nicht gilt
(Schlenz, 2002).
3.5
Artifizielles Replikations- und Transkriptionssystem (Minigenomsystem)
Zur Manipulation und Untersuchung von Replikations- und Transkriptionssignalen
außerhalb eines BSL-4 Labors steht seit einigen Jahren sowohl für EBOV als auch für
MARV ein rekonstituiertes System zur Verfügung, (Mühlberger et al., 1998, 1999). Dabei werden eukaryotische Zellen mit Plasmiden, die für die Nukleokapsidproteine und
ein Minigenom kodieren, transfiziert. Diese Zellen exprimieren die T7-RNA-Polymerase
entweder konstitutiv (BSR T7/5, HuH-T7) oder transient durch Infektion mit MVA-T7
oder Transfektion eines entsprechenden Plasmids (pCAGGS/T7). Das Minigenom enthält die Sequenz des leaders und der 3’-NTR des NP-Gens sowie die 5’-NTR des LGens und den trailer. Die viralen Gene wurden durch das Gen der ChloramphenicolAcetyltransferase (CAT) ersetzt (Abb. 3, unten). Die T7 RNA Polymerase transkribiert
die Plasmide in mRNAs der Nukleokapsidproteine und die minigenomische RNA, die
dann durch die viralen Proteine verpackt, repliziert und transkribiert wird (Abb. 3, oben).
Replikation kann durch replizierte RNA nachgewiesen werden, Transkription durch
CAT-mRNA oder CAT-Aktivität.
9
Einleitung – Molekularbiolgie der Filoviren
VP35
NP
VP30
L
2
3
a 1
4
AAAAAA
CAT
5
b
MG
3’
le 3’-NTR (NP)
5’-NTR (L)
tr
5’
Abb. 3. Schematische Darstellung des artifiziellen Replikations- und Transkriptionssystem für EBOV und
MARV. Säugerzellen, die entweder stabil oder transient die T7-RNA-Polymerase exprimieren, werden mit
Plasmiden, die für das Minigenom (MG) und die Nukleokapsidproteine NP, VP30, VP35 und L kodieren,
transfiziert. Da sie unter Kontrolle eines T7-RNA-Polymerase-Promotors stehen, werden die entsprechenden RNAs transkribiert (c). Die viralen mRNAs werden translatiert (d), und die Nukleokapsidproteine
replizieren (e) und transkribieren (f) das Minigenom. Transkription kann entweder über die mRNA (b)
oder über das Translationsprodukt (CAT, g) nachgewiesen werden. Die enkapsidierte und daher Nuklease-resistente replizierte RNA (a) kann nach Mikrokokken-Nuklease-Verdau über Northern Blot detektiert
werden.
10
Einleitung – Problemstellung
4
Problemstellung dieser Arbeit
Zu Beginn dieser Arbeit waren zu der Promotorstruktur des EBOV-Z bereits einige
Daten verfügbar (Schlenz, 2002, Weik, 2001). Sie waren jedoch unvollständig und teilweise widersprüchlich. In dieser Arbeit sollte versucht werden, die Lücken zu füllen und
die Struktur des genomischen Replikationspromotors des EBOV-Z detailliert zu charakterisieren. Dazu sollte besonderer Wert auf sich wiederholende und unter den Filoviren
konservierte Motive gelegt werden.
Über die Promotorelemente im 3’-Ende des MARV hingegen war fast nichts bekannt. Die Notwendigkeit des vierten Nukleokapsidproteins VP30 für die Transkription
des EBOV-Z ist abhängig von der Sekundärstruktur, die vom TSS gebildet wird (Weik
et al., 2002). Computeranalysen sagen eine komplett andere Struktur für das TSS des
MARV voraus. Wird diese tatsächlich gebildet und ist sie vielleicht der Grund für die
VP30-unabhängige Transkription? Was passiert, wenn die Sekundärstruktur des TSS
des MARV durch die EBOV-spezifische ersetzt wird? Des Weiteren sollte der Replikationspromotor charakterisiert und mit dem des EBOV-Z und EBOV-R verglichen werden.
Ein großes Projekt in Zusammenarbeit mit Prof. Volchkov in Lyon stellte die Etablierung eines Reverse-Genetik-Systems für MARV dar, mithilfe dessen infektiöses MARV
aus cDNA erzeugt werden sollte. Die ersten Untersuchungen mit diesem System sollten die Rolle des VP30 klären. Ferner sollten einige Promotormutanten erzeugt und
getestet werden.
Die vierte Aufgabe war das Testen von synthetischen DNA-Analoga auf ihre Fähigkeit, die Vermehrung von EBOV in Zellkultur spezifisch zu inhibieren. Dies sollte in Zusammenarbeit mit AVI BioPharma Inc. (Corvallis, OR, USA) und dem United States
Army Medical Research Institute for Infectious Diseases (USAMRIID, MD, USA) geschehen. Punkte der Fragestellung waren z.B. welche Sequenzen sich eignen, und ob
die Inhibition auch im Mausmodell beobachtet werden kann.
11
Material&Methoden
II
Material und Methoden
Material
5
Material
5.1
Geräte
Gerätename
ABI PRISMTM 377 DNA Sequenzer
Bio-Imager Analyzer BAS-1000
Bio-Image Screen: Imaging plate 2040S; MP
Brutschrank 6000
Certomat® S
ELISA-Reader Dynatech MR7000
Entwicklermaschine Optimax 2010
Hersteller
Perkin-Elmer Cetus, Norwalk (USA)
Fuji, Kanagawa (Japan)
Fuji, Kanagawa (Japan)
Heraeus Instruments, Hanau
B. Braun Biotech International, Melsungen
Dynex Technologies, Denkendorf
Protec Medizintechnik GmbH&Co KG, Oberstenfelde
Eppendorf Thermostat 5320
Eppendorf, Hamburg
Eppendorf Thermomixer 5436
Eppendorf, Hamburg
Eppendorf-Centrifuge 5417 C§
Eppendorf, Hamburg
Eppendorf-Centrifuge 5417 R§
Eppendorf, Hamburg
Fluoreszenzmikroskop
Zeiss
Gel Doc™ 2000 Gel Documentation System Bio-Rad, München
Beckmann, Palo Alto (USA)
J-25 Avanti™Centrifuge
LKB Pump P-1
Pharmacia (Amersham), Freiburg
Maxi 14 Hybridisierungsofen
HYBAID, Heidelberg
MegaBACE
Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH,
Freiburg
Megafuge 1.0R
Heraeus Instruments, Hanau
Mikrowellengerät
Bosch
Minifuge R Centrifuge
Beckmann, Palo Alto
pH-Meter C6832
Schott Laborgeräte
Polaroid MP4 Land Camera
Polaroid, Cambridge (USA)
Primus Thermocycler
MWG-Biotech, Ebersberg
Sicherheitswerkbank
Heraeus Instruments, Hanau
Sonifier 450
G. Heinemann, Schwäbisch Gmünd
Spot Kamera
Diagnostic Instruments, Michigan (USA)
UV-Schirm 302 nm
Bachofer, Reutlingen
UV-Spektrophotometer GeneQuant
Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH,
Freiburg
Vacuum Blotter
Appligene
Vakuum-Zentrifuge (Speed-vac)
von Keutz, Reiskirchen
Vortexer REAX 2000
Heidolph
§
Soweit nicht anders angegeben, wurden Zentrifugationen in diesen Zentrifugen durchgeführt.
5.2
DNA-Oligonukleotide, Primer
Oligonukleotide bis zur internen Nummer #436 wurden von Dr. M. Krause im Institut
für Molekularbiologie und Tumorforschung (IMT) in Marburg synthetisiert. Alle sonstigen Primer und synthetischen Oligonukleotide wurden entweder von Sigma-Aldrich
oder Invitrogen erworben. Die Auflistung der Oligonukleotide ist detailliert im Anhang
(Kapitel 19) zu finden.
13
Material
5.3
Hersteller der eingesetzten Kits und Enzyme
Produkt
ABI Prism™ Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit
AmpliScribe™ T7 Transcription Kit
CAT-ELISA
CDP-Star
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)
E.Z.N.A.® Plasmid Miniprep Kit I
Omniscript RT Kit
OneStep RT-PCR Kit
QIAEX II Gel Extraction Kit
QIAgen® (HiSpeed) Plasmid Maxi Kit
QIAfilter™ Plasmid Maxi Kit
QIAquick™ Gel Extraction Kit
QIAquick™ PCR Purification Kit
PfuTurbo Polymerase
Polynukleotidkinase (PNK)
Pwo Polymerase
Protein Assay 5x Farbstoffkonzentrat
Restriktionsenzyme
RiboScribe™ T7 Transcription Kit
RNase-Inhibitor (40 U/µl)
RNeasy Mini Kit
SuperScript II™ MMLV RNase H- RT
Super Signal Kit
T4-DNA-Ligase
T7 SequencingTM Kit
Hersteller
Perkin Elmer Cetus, Norwalk (USA)
Biozym Diagnostik GmbH, Oldendorf
Roche, Mannheim
Roche, Mannheim
Roche, Mannheim
Peqlab, Erlangen
Qiagen, Hilden
Qiagen, Hilden
Qiagen, Hilden
Qiagen, Hilden
Qiagen, Hilden
Qiagen, Hilden
Qiagen, Hilden
Stratagene, Heidelberg
Roche, Mannheim
Peqlab, Erlangen
Bio-Rad, München
New England Biolabs, Frankfurt/Main
Biozym Diagnostik GmbH, Oldendorf
Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
Qiagen, Hilden
Invitrogen, Karlsruhe
Pierce
New England Biolabs, Frankfurt/Main
Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH,
Freiburg
Z-Competent E.coli Transformation Kit™ and Zymo Research, Orange (USA)
Buffer Set
5.4
Radioaktive Substanzen
14
C-markiertes Chloramphenicol (58 mCi/mmol=25 nCi/µl) und [γ-32P]-markiertes
ATP (6 000 Ci/mmol=150 µCi/µl) wurden von Amersham erworben. Das Chloramphenicol wurde in 250 mM Tris⋅Cl, pH 7,5 gelöst und bei -20 °C gelagert. Markiertes ATP
war gebrauchsfertig und wurde bei 4 °C aufbewahrt.
5.5
Peptid-konjugierte Phosphorodiamidat-Morpholinooligomere (P-PMOs)
Sämtliche Antisense-Oligomere für Inhibitionsversuche (Kapitel 14) wurden von AVI
BioPharma Inc. (Corvallis, OR, USA) synthetisiert und zur Verfügung gestellt. Die in
kristalliner Form erhaltenen P-PMOs wurden in sterilem Wasser zu einer Endkonzentration von 2 mM gelöst und bei 4 °C dunkel gelagert. In der folgenden Tabelle sind die
verwendeten P-PMOs und ihre Zielsequenzen aufgelistet.
14
Material
Name
Ziel
leader
tss-NP
108
3136
11588
18959
scramble
leader
NP TSS$
3’ NTR NP§
VP35-Gen
L-Gen
trailer
N/A
Zielposition@
Sequenz #
1-22 (–)
45-67 (–)
108-130 (–)
3136-3115 (+)
11588-11567 (+)
18959-18938 (+)
Unspez. Kontrolle
CGG
CGA
GAA
GTT
GTA
TGG
AGT
P-PMO (PMO konjugiert mit R9F2*-Peptid)
ACA
ATA
ATT
GTC
GCC
ACA
CTC
CAC
ACT
GTT
ATC
ATT
CAC
GAC
AAA
ATG
ACT
TTG
TAA
AAA
TTG
AAG
AGG
GTA
TTA
TAT
AAA
CTA
AAA
AAG
ATC
GAC
CAA
GAA
CCT
GAA
ATT
ACA
CAG
GAG
GAA
CA
G
AA
CC
C
G
A
Tabelle 1. Eigenschaften P-PMOs und ihre Ziele auf EBOV-spezifischer RNA. @ Die Zielposition verweist
auf die komplementären Nukleotide im EBOV-Genom (–) oder -Antigenom (+) (bezogen auf GenBank
$
§
Accession Number AF086833. Transkriptionsstart-Siganl des NP-Gens. Bereich innerhalb der 3’-NTR
#
des NP-Gens, der wichtig für effiziente Replikation ist (Weik et al., 2005). Sequenzen sind in 5’–3’ ange*
geben. Das Peptid R9F2 ist in Kinney et
5.6
al. (2005) beschrieben.
Puffer und Lösungen
Im Allgemeinen wurden (Fein-)Chemikalien von JT Baker, Merck, Serva oder Sigma-Aldrich benutzt. Sofern nicht anders angegeben, sind Puffer und Lösungen mit
doppelt destilliertem, autoklaviertem Wasser (ddH2O) angesetzt worden.
Arbeiten mit DNA und RNA
10x TBE
890 mM Tris⋅Cl, 890 mM Borsäure, 20 mM EDTA; autoklavieren
5x FA-Laufpuffer
0,1 M MOPS (auf pH 7,0 mit NaOH eingestellt), 40 mM NaOAc
3 M NaOAc pH 5,2
Binding Buffer (BB)
pH7,0, 5 mM EDTA pH 8,0; in dunklen Flaschen lagern
3 M NaOAc; pH mit HOAc auf 5,2 einstellen; autoklavieren
500 mM NaCl, 10 mM Tris Cl pH 7,5, 1 mM EDTA pH 8,0, 0,1%
(w/v) SDS
20 mM Tris Cl pH 7,5, 2 mM EDTA pH 8,0, 0,2% (w/v) SDS
10 mM Tris Cl pH 7,5, 10 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 10 mM CaCl2,
5% (v/v) Triton-X 100, 0,3% (w/v) Deoxycholat
2x Elution Buffer (EB)
Mikrokokken-Nuklease(MCN) Puffer
Chemische Modifizierung von RNA
CMCT-Puffer
50 mM Kaliumtetraborat-Lösung, pH 8,0, 10 mM MgCl2, 100 mM
CMCT-Stock-Lösung
2x DMS-Stopp-Puffer
10x HMK-Puffer
Extraktionspuffer
Northern Blot
5 M NaCl
20x SSC
10% SDS
0,5 M EDTA
50x Denhardts Lösung
Hybridisierungslösung
nach Collins
Alkalischer
Transferpuffer
NH4Cl
100 mM CMCT in CMCT-Puffer gelöst; Lagerung bei -20 °C
600 mM NaOAc pH mit 6,5, 400 mM Tris Cl pH 7,5, 10 mM EDTA
pH 8,0, 100 mM β-Mercaptoethanol
200 mM HEPES pH 7,9, 600 mM KCl, 120 mM MgCl2
300 mM NaOAc pH 6,5, 5 mM EDTA pH 8,0, 0,5% (w/v) SDS,
25 mM Kaliumtetraborat-Lösung, pH 7,0
autoklaviert
3 M NaCl, 0,3 M Na3Citrat-Dihydrat; pH mit HCl auf 7,0 einstellen
10% (w/v) SDS unter HCl-Zugabe lösen, pH auf 7,0-7,5 einstellen
EDTA mit NaOH-Plätzchen lösen; pH auf 8,0 einstellen
2,5% (w/v) Ficoll (Typ 400), 2,5% (w/v) Polyvinylpyrrolidon, 2,5%
(w/v) BSA; bei –20 °C lagern
30 ml 20x SSC, 10 ml 50x Denhardts, 1 ml 10% SDS; bei –20 °C
lagern
3 M NaCl, 8 mM NaOH
15
Material
Northern Blot (Fortsetzung)
1M Phosphatpuffer
1 M Na2HPO4 mit 1 M NaH2PO4 auf pH von 6,8 einstellen
RNA-Waschpuffer
0,1% (w/v) SDS, 0,1x SSC
Puffer I
0,1 M Maleinsäure, 0,15 M NaCl; pH mit NaOH auf 7,5 einstellen;
10% RNABlockingreagenz
Puffer III
(Chemilumineszenzpuffer)
5x Formaldehyd- (FA)
Laufpuffer
FA-Agarosegel
Auftragspuffer
autoklavieren
10% (w/v) Blockingreagenz (Roche) unter Erwärmen in Puffer I
„lösen“; autoklavieren
100 mM Tris, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2 (vor Gebrauch 1/10
Vol. 0,5 M zugeben); pH mit HCl auf 9,5 einstellen; ohne MgCl2
autoklavieren
0,1 M MOPS pH 7,0, 40 mM NaOAc pH 7,0, 5 mM EDTA; zuerst
MOPS mit NaOH einstellen; autoklavieren
2 µl H2O, 1 µl 5x FA-Laufpuffer, 1,75 µl 37% Formaldehyd, 5 µl
Formamid (immer frisch ansetzen)
SDS-PAGE und Western Blot
10x TBS
1x TBS-T
10% SDS
5x SDS-Laufpuffer
5x Sammelgelpuffer
(RGB)
10x Trenngelpuffer (SGB)
2x SDS Probenpuffer
4% Sammelgel (2 Gele)
10% Trenngel (2 Gele)
Coomassie Färbelösung
0,25 M Tris, 1,37 M NaCl; pH mit HCl auf 7,5 einstellen
1x TBS mit 0,1% (v/v) Tween 20
10% (w/v) SDS unter HCl-Zugabe lösen, pH auf 7,0-7,5 einstellen
0,25 M Tris, 1,92 M Glycin, 0,5% (w/v) SDS
1,87 M Tris, 0,5% (w/v) SDS; pH mit HCl auf 7,5 einstellen
1,25 M Tris, 1,0% (w/v) SDS; pH mit HCl auf 6,5 einstellen
25% (v/v) Glycerin, 125 mM DTT, 2,5% (w/v) SDS, 113 mM Tris⋅Cl
pH 6,8, Spatelspitze Bromphenolblau; unter Erhitzen lösen und
pH mit HCl auf 7,2 einstellen
0,5 ml 10x SGB, 0,67 ml 30% Acrylamid, 3,83 ml H2O, 25 µl 10%
APS, 5 µl TEMED
2 ml 5x RGB, 3,33 ml 30% Acrylamid, 4,67 ml H2O, 50 µl 10%
APS, 10 µl TEMED
0,25% (w/v) Coomassie blue, 45% (v/v) Methanol, 10% (v/v)
HOAc
Strippingpuffer
100 mM β-Mercaptoethanol, 2% SDS, 62,5 mM Tris⋅Cl
Entfärbelösung
Kathodenpuffer
50% (v/v) Methanol, 10% (v/v) HOAc
40 mM ε-Amino-Capronsäure, 25 mM Tris, 20% (v/v) Ethanol
(vergällt)
300 mM Tris, 20% (v/v) Ethanol (vergällt)
25 mM Tris, 20% (v/v) Ethanol (vergällt)
Anodenpuffer I
Anodenpuffer II
Immunfluoreszenz
PBS++
4% Paraformaldehyd
(PFA) in DMEM
Blockingreagenz
8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 gNa2HPO4, 0,2 g KH2PO4, 0,13 g CaCl2
auf 1 l; autoklavieren
40 g Paraformaldehyd bei 60 °C unter Rühren in 1 l DMEM lösen
2% (w/v) BSA, 0,2% (v/v) Tween 20, 3% (v/v) Glycerin,
0,05% (w/v) NaN3 auf 1 l mit PBSdef; steril filtrieren
Kulturmedien für Bakterien und Antibiotikalösungen
LB
LB Agar, 2YT Agar
1,0% (w/v) Bacto-Pepton (Trypton), 0,5% (w/v) Hefeextrakt,
1,0% (w/v) NaCl; autoklavieren
1,5% (w/v) Bacto-Agar zum Medium geben; autoklavieren
16
Material
Kulturmedien für Bakterien und Antibiotikalösungen (Fortsetzung)
2YT Medium
Ampicillin stock
Tetracyclin stock
1,6% (w/v) Bacto-Pepton (Trypton), 1,0% (w/v) Hefeextrakt,
0,5% (w/v) NaCl; autoklavieren
Pulver (Ratiopharm) in sterilem H2O aufnehmen (0,1 mg/ml);
Aliquots bei –20 °C lagern
(0,1 mg/ml); Aliquots bei –20 °C lagern
Medien für Zellkultur (Invitrogen)
DMEM komplett mit
FCS
BHK 21 Medium
komplett mit NCS
DMEM (–L-Glutamin), 2-10% (v/v) FCS, 1% PS, 1% L-Glutamin
BHK 21, 2-10% (v/v) NCS, 1% nicht essentielle Aminosäuren,
1% PS, 5% Tryptose Phosphate Broth
Sonstige Puffer/Lösungen
10x TNE
5.7
1,5 M NaCl, 100 mMTris Base, 30 mM EDTA; pH mit HCl auf 7,6
einstellen; autoklavieren
Vektoren und Plasmide
Die verwendeten Plasmide der Minigenomsysteme sind in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben: MARV: Mühlberger et al. (1998), EBOV-Z: Mühlberger et al.
(1999), EBOV-R: Boehmann et al. (2005). Die Plasmide des Volle-Länge-Systems des
MARV (ohne Mutanten) waren im Labor vorhanden.
5.8
Zellkultur und Viren
Medien und Zusätze für die Zellkultur (Antibiotika, Serum, Aminosäuren,
Trypsin/EDTA) wurden von Invitrogen erworben, Tryptose Phosphate Broth von Sigma.
Verbrauchsmaterial wurde von Greiner oder Costar bezogen.
5.8.1
Zelllinien
HuH-T7, eine von Huh7-Zellen abgeleitete humane Hepatoma-Zelllinie, wurde von
V. Gauss-Müller, Medizinische Molekularbiologie der Universität von Lübeck bereitgestellt (Beneduce et al., 2002). Babyhamster Nierenzellen (BSR T7/5, abgeleitet von
einer BHK-21 Zelllinie) wurden von K.K. Conzelmann (Max von Pettenkofer Institut,
München) zur Verfügung gestellt (Buchholz et al., 1999). Beide Zelllinien exprimieren
stabil die T7-RNA-Polymerase. HeLa-, Huh7- sowie Vero-Zellen wurden von der ECACC erworben.
5.8.2
Viren
Sämtliche Arbeiten mit genetisch unveränderten Marburg- und Ebolaviren wurden
im Labor der Sicherheitsstufe L4 in Marburg durchgeführt. Für rekombinante Filoviren
wurde das „Jean Mérieux P4 Research Center“ in Lyon genutzt. MVA-T7 (Sutter et al.,
1995) wurde unter Bedingungen der biologischen Sicherheitsstufe S2 gehandhabt.
17
Material
5.8.3
Verwendete Bakterienstämme
Je nach Anwendung wurden drei unterschiedliche Bakterienstämme (Tabelle 2) eingesetzt. Während die Stämme XL-1 blue und DH10 B zur Amplifikation von PlasmidDNA benutzt wurden, wurden Proteine in BL-21 Bakterien exprimiert.
E. coli Stamm
Genotyp
Vertreiber
XL-1 blue
E. coli B recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44
relA1 lac [F´ proAB lacIqZ∆M15 Tn10 (Tetr)].
Stratagene, Heidelberg
DH10 B
E. coli B F- mcrA ∆ (mrr-hsdRMS-mcrBC)
φ80lacZ∆M15 ∆lacX74 deoR recA1 endA1 ara∆139
∆(ara, leu)7697 galU galK λ- RPSl NUPg λ- tonA
E. coli B F– ompT hsdS(rB– mB–) dcm+ Tetr gal λ(DE3)
endA Hte [argU proLCamr]
Invitrogen, Karlsruhe
BL-21
Stratagene, Heidelberg
Tabelle 2. Genotypen der verwendeten E. coli Bakterien.
5.9
Kommerzielle Antikörper
Die folgende Tabelle enthält Angaben zu den Antikörpern, die kommerziell erworben
wurden. Die benötigten Verdünnungen sind in Tabelle 4 aufgelistet.
Antikörper gegen
Maus IgG
Meerschweinchen IgG
Kaninchen IgG
Maus IgG
T7-RNA-Polymerase
Actin
Aus (Organismus)
Ziege
Ziege
Ziege
Ziege
Maus
Kaninchen
Markierung
Rhodamin
FITC
POD
POD
-----
Hersteller
Dianova
Dianova
Dianova
Dianova
Novagen
Sigma Aldrich
Tabelle 3. Kommerziell erhältliche Antiköper, die in dieser Arbeit verwendet wurden.
18
Methoden
6
Methoden
6.1
6.1.1
Arbeiten mit Zellkultur und Viren
Passagieren von Zellen
Die Kultivierung der Zellen erfolgte generell in Inkubatoren in einer feuchten 5%igen
CO2-Atmosphäre bei 37 °C. BSR T7/5-Zellen wurden in komplettiertem BHK-21Medium mit 10% Neugeborenes-Kälber-Serum (NCS) mit 1 mg/ml Geneticin gehalten.
Alle anderen Zellen wurden in DMEM komplett mit 10% Fötalem Kälber-Serum (FCS)
kultiviert. HuH-T7-Zellen wurden zusätzlich mit 0,5 mg/ml Geneticin behandelt.
Zum Passagieren der Zellen wurden diese in 2 ml Trypsin/EDTA abgelöst und mit
8 ml Medium resuspendiert. Entsprechend der benötigten Dichte wurden die Zellen in
20 ml bzw. 40 ml Medium (75 cm²- bzw. 162 cm²-Flaschen) umgesetzt.
6.1.2
Anzucht und Vermehrung von Viren
Filoviren wurden in Vero-Zellen vermehrt. Dazu wurden Vero-Zellen (70-90% dicht)
in 162 cm²-Flaschen mit je 10 ml Virusverdünnung (1:100 für EBOV-Z, 1:20 für Marburgvirus und EBOV-R) infiziert und 1 h bei 37 °C im Brutschrank inkubiert. Danach
wurden 35 ml DMEM komplett mit 2% FCS zugegeben und die Zellen inkubiert, bis sich
ein deutlicher CPE zeigte. Typische Werte hierbei waren: EBOV-Z 4-5 Tage, MARV 6-7
Tage und EBOV-R 10-14 Tage. Die Überstände wurden in 50 ml Falcon-Röhrchen aufgeteilt, in einer Heraeus Megafuge 1.0R für 10 min bei 6 000 rpm und 4 °C abzentrifugiert und in neue Falcon-Röhrchen überführt. Diese wurden bei 4 °C gelagert.
6.1.3
Titerbestimmung durch TCID50-Analyse
Da Plaque-Assays zur Bestimmung des viralen Titers bei Filoviren oft schwierig
sind, wurde anstelle der plaque forming units (pfu) der TCID50/ml (Tissue Culture Infec-
tious dose) als Titer bestimmt. Vero-Zellen wurden zu einer Dichte von 30-60% in 96er
Gewebekulturplatten ausgesät und über Nacht inkubiert. Für jede Probe wurden mind.
3 Spuren vorbereitet. Am nächsten Tag wurde das Medium entfernt und in jede Vertiefung 180 µl DMEM komplett mit 5% FCS vorgelegt. Im Sicherheitslabor wurde aus der
ersten Reihe das Medium entfernt und mit 200 µl der unverdünnten Virussupension beschickt. Mit einer Mehrkanalpipette wurden 20 µl in die jeweils nächste Reihe überführt
und durch Auf- und Abpipettieren gemischt. Die so entstandenen Verdünnungsreihen
wurden inkubiert, bis sich der CPE nicht mehr veränderte. Die Berechnung des
TCID50/ml erfolgte nach der Methode von Spearman und Kärber.
19
Methoden
6.1.4
Infektion von Säugerzellen mit MVA-T7
Die zu infizierenden Zellen wurden zu einer Dichte von 50-70% in geeigneten
Schälchen ausgesät und über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen
einmal mit DMEM +P/S gewaschen und mit 10-100 µl Virussuspension (abh. vom verwendeten Stock) für 1 h infiziert. Das Infektionsmedium wurde danach entfernt, und die
Zellen gegebenenfalls transfiziert (6.2). Die Inkubation erfolgte dann bei 33 °C.
6.1.5
Isolierung viraler Antigene
Um ausreichende Mengen an Virionen zu erhalten, wurden Viren in acht Flaschen
wie oben beschrieben gezüchtet (6.1.2). Die abzentrifugierten Überstände (10 min
6 000 rpm in einer Heraeus-Megafuge) in einer Glasflasche vereinigt und zunächst über
ein Sucrosekissen gereinigt. Dazu wurden 25 ml der Suspension in SW28 Zentrifugenröhrchen vorgelegt und vorsichtig mit 5 ml einer 20%igen Sucroselösung (w/v in
1x TNE) unterschichtet. Nach dem Auffüllen und Austarieren wurde für 2 h bei
25 000 rpm in einer Beckmann-Ultrazentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und je 2 Pellets in 500 µl 1x TNE resuspendiert. Alle Röhrchen wurden mit insgesamt 500 µl 1x TNE nachgespült und sämtliche Ansätze in einem 50 ml FalconRöhrchen vereint.
Als zweiter Aufreinigungsschritt wurden die Proben auf einen K2Tartrat/GlycerinGradienten aufgetragen. Der Gradient wurde aus 40% K2Tartrat-Lösung und 30% Glycerin-Lösung (beides in 1x TNE) mit Hilfe einer LKB Pump P-1 (Pharmacia) gegossen.
Die vorgereinigten Virionen wurden vorsichtig auf den Gradienten aufpipettiert und mit
1x TNE überschichtet, um die Röhrchen aufzufüllen. Die Auftrennung erfolgte über
Nacht (16 h) bei 28 000 rpm und 4 °C in einer Beckmann-Ultrazentrifuge.
Die im Gradienten deutlich sichtbare Virionenbande wurde mit einer stumpfen Kanüle abgesaugt und in ein 50 ml Falcon-Röhrchen überführt, nachdem die obere Schicht
bis auf etwa 2 cm abgenommen worden war. Um die Gradientenlösung zu verdünnen,
wurde die Virensuspension mind. 1:3 in 1x TNE verdünnt und auf SW41 Zentrifugenröhrchen aufgeteilt. Pelletiert wurden die Virionen durch Zentrifugation bei 38 000 rpm
für 25 min bei 4 °C in einer Beckmann-Ultrazentrifuge. Der Überstand wurde abgegossen, und die Pellets wurden in insgesamt 500 µl PBSdef resuspendiert. Die Röhrchen
wurden mit 250 µl PBSdef nachgespült und die Fraktionen vereint. Zum Inaktivieren des
Virus wurde SDS auf eine Endkonzentration von 1% (w/v) zugegeben, gemischt und in
einem frischen Reaktionsgefäß 10 min lang im Wasserbad gekocht.
20
Methoden
6.1.6
Aufbereitung von Proben für Analyse im Elektronenmikroskop
Viruspartikel wurden wie im vorigen Abschnitt (6.1.5) beschrieben über ein Sucrosekissen aufgereinigt und pelletiert. Das Pellet wurde in 50 µl 4%PFA in DMEM aufgenommen und über Nacht bei 4 °C inaktiviert. Die Aufreinigung erfolgte wie zuvor beschrieben (Funke et al., 1995). Ein Tropfen der Suspension wurde 1 min lang auf einem Formvar-Carbon-beschichtetes Nickelgitter platziert, und überschüssige Flüssigkeit mit einem Filterpapier entfernt. Nach Waschen mit PBS wurden die Proben mit 2%
Phosphowolframsäure negativ gefärbt und mit einem Zeiss 109 Elektronenmikroskop
untersucht. Die Aufnahmen wurden von Frau Dr. Kolesnikova durchgeführt.
6.1.7
Behandlung von Säugerzellen mit P-PMOs und Infektion mit EBOV
Das folgende Standardprotokoll für die Inhibitionsversuche mit P-PMOs in Zellkultur
wurde benutzt, wenn nicht anders vermerkt. 105 Vero-Zellen wurden pro Vertiefung in
12er Zellkulturplatten ausgesät und über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurden die
Zellen mit 5,0 µM P-PMOs in 500 µl DMEM komplett + 2% FCS für 3 h inkubiert. Die
vorbehandelten Zellen wurden mit EBOV (oder MARV) infiziert (mutiplicity of infection
(MOI) = 5) und 1 h inkubiert. Das Inokulum wurde entfernt und durch 1 ml DMEM komplett mit 2% FCS ersetzt, in dem 5,0 µM des jeweiligen P-PMOs gelöst waren. Die Ansätze wurden 24-72 h inkubiert und die Hemmung der Replikation über RT-PCR (6.6.3)
oder TCID50-Analyse (6.1.3) ausgewertet.
6.2
Transfektion von Plasmid-DNA mit Fugene 6
Zellen für die Transfektion mit Fugene 6 (Roche) wurden in 6er Gewebekulturplatten
zu einer Dichte von 50-70% ausgesät. Vor der eigentlichen Transfektion wurden die
Zellen 2x mit DMEM +L-Glutamin (im Folgenden Medium genannt) gewaschen, mit
1 ml Medium versetzt und in den Brutschrank gestellt. Während der Inkubation wurde
die zu transfizierende DNA in Schraubröhrchen in 200 µl Medium und das Fugene 6 in
800 µl Medium verdünnt. Dabei wurden für jedes Mikrogramm DNA 3 µl Fugene 6 eingesetzt. Das Transfektionsreagenz wurde zu der verdünnten DNA gegeben und durch
8maliges Auf- und Abpipettieren vorsichtig gemischt. Der Ansatz wurde 15-20 min bei
Raumtemperatur inkubiert, damit sich die Transfektionskomplexe bilden konnten. Nach
der Inkubation wurde das Transfektionsgemisch auf die Zellen pipettiert. Nach 8-24 h
im Brutschrank wurde das Medium gegen DMEM komplett mit 2% FCS ausgetauscht.
21
Methoden
6.3
6.3.1
Arbeiten mit Bakterien
Herstellen Z-kompetenter E. coli
Zur Herstellung sämtlicher kompetenter Bakterien wurde das Z-Competent E.coli
Transformation Kit™ der Firma Zymotec (Orange, USA) benutzt. Von einem bei -80 °C
gelagerten Stock wurde in gefrorenem Zustand eine kleine Menge mit einer sterilen
Pipettenspitze abgekratzt, um 5 ml SOB-Medium anzuimpfen (bei XL-1 blue mit
0,1 µg/ml Tetracyclin). Die Kultur wurde über Nacht bei 37 °C geschüttelt, und am
nächsten Tag wurden 100 ml SOB (ohne Antibiotika) damit inokuliert. Inkubiert wurde
bei 20-25 °C und etwa 220 rpm, bis eine OD600 von 0,4-0,6 erreicht worden war. Die
Kultur wurde auf zwei 50 ml Falcon-Röhrchen aufgeteilt, 10 min auf Eis gekühlt und
danach in einer Heraeus Megafuge für 5 min bei 2 500 rpm, 4 °C zentrifugiert. Die
nachfolgenden Schritte wurden mit vorgekühlten Puffern und Pipetten durchgeführt.
Der Überstand wurde entfernt, die Pellets wurden in insgesamt 10 ml 1x washing buffer
(5 ml Verdünnungspuffer +5 ml 2x Waschpuffer) resuspendiert und erneut zentrifugiert.
Nachdem der Überstand vorsichtig abgenommen worden war, wurde das Pellet in
10 ml 1x Resuspensions-Puffer (5 ml Verdünnungspuffer + 5 ml 2x ResuspensionsPuffer) aufgenommen und in 100 µl bzw. 200 µl Aliquots aufgeteilt. Diese wurden in
flüssigem Stickstoff schockgefroren und anschließend bei -80 °C gelagert.
6.3.2
Transformation Z-kompetenter E. coli
Von der zu amplifizierenden DNA wurden ja nach Herkunft unterschiedliche Mengen
eingesetzt: Maxi/Mini: 10-100 ng, Ligation: 3-7,5 µl, in vitro-Mutagenese: 3-7,5 µl. Die
DNA wurde zu 50-100 µl Z-kompetenten Bakterien gegeben, leicht durch Anschnipsen
gemischt und 30-60 min auf Eis inkubiert. Danach wurden die Transformationsansätze
auf vorgewärmte LB-Agarplatten mit 100 µg/ml Ampicillin ausgestrichen und über
Nacht bei 37 °C inkubiert. Am nächsten Tag konnten einzelne Kolonien zur Analyse
gepickt werden. Alternativ wurden die transformierten Bakterien direkt in eine Maxiprep-Kultur (6.4.2) gegeben, wenn nur ein Plasmid amplifiziert werden sollte.
6.4
6.4.1
Isolierung, Analyse und Aufreinigung von Nukleinsäuren
Plasmid-DNA Minipräparation (Miniprep)
Einzelkolonien wurden mit einer sterilen Pipettenspitze gepickt und in ein 15 ml Falcon-Röhrchen mit 5 ml LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin überführt; sollte noch am
selben Tag die Miniprep durchgeführt werden, wurden nur 3 ml Medium angeimpft. Die
Kulturen wurden bei 37 °C geschüttelt, bis sie eine ausreichende Dichte hatten (meist
über Nacht). Die Isolierung der Plasmid-DNA erfolgte mit dem E.Z.N.A. Plasmid Mini22
Methoden
pep Kit I der Firma Peqlab (Erlangen) nach Herstellerangaben aus 1,5 ml der Bakterienkulturen. Nach sämtlichen empfohlenen Waschschritten wurde die DNA in 50-100 µl
ddH2O eluiert.
6.4.2
Plasmid-DNA Maxipräparation (Maxiprep)
Für größere Plasmidmengen (>100 µg) wurden drei Kits der Firma Qiagen benutzt:
Qiagen Plasmid Maxi Kit, QIAfilterTM Plasmid Maxi Kit und das Qiagen HiSpeed Maxi
Kit. 100-250 ml LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin wurden mit 100-250 µl der entsprechenden Miniprep-Kultur angeimpft und 16-20 h bei 37 °C geschüttelt (ÜbernachtKultur). Im Falle von sehr großen Plasmiden (>20 kb), wie den Konstrukten des VolleLänge-Systems von MARV (Kapitel 11), wurde mit 200 µl der frischen Übernacht-Kultur
eine erste Vorkultur (20 ml LB-Medium mit Ampicillin) angeimpft und bis zur Logphase
inkubiert (etwa 3-4 h bei 37 °C). 200 µl davon dienten zum Inokulieren einer zweiten
20 ml-Vorkultur. Diese wurde nach etwa 5 h (anfängliche Logphase) dazu benutzt, die
Übernacht-Kultur anzuzüchten. Die Plasmid-DNA wurde in allen Fällen laut Herstellerangaben isoliert und gefällt. Das Pellet wurde zunächst in 200-300 µl ddH2O aufgenommen (beim HiSpeed Kit in 500 µl eluiert), die Konzentration spektrophotometrisch
bei 260 nm bestimmt und auf 1,0 oder 0,5 µg/µl eingestellt.
6.4.3
Aufreinigung von RNA
RNA aus Zellen wurde mit Hilfe des RNeasy Mini Kits (Qiagen, Hilden) gemäß den
Angaben im Handbuch im Kapitel „Animal Cell“ aufgereinigt. Die Lysiskonditionen sind
bei den einzelnen Applikationen aufgeführt. Ansätze aus in vitro Reaktionen wurden
nach den Schritten im Kapitel „RNA Cleanup“ aufgereinigt.
6.4.4
Phenol/Chloroform-Extraktion von Nukleinsäuren
Proteine und sonstige Verunreinigungen können durch Extraktion mit organischen
Lösungsmitteln effektiv entfernt werden. Dazu wurden zur wässrigen Lösung der Nukleinsäure ein gleiches Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) gegeben.
Nach sorgfältigem Mischen wurden die Phasen durch Zentrifugation (2 min bei
14 000 rpm) getrennt, und die obere mit gleichem Volumen Chloroform/Isoamylalkohol
(24:1) erneut extrahiert. Die Nukleinsäure konnte danach durch Ethanolfällung (6.4.5)
ankonzentriert werden.
6.4.5
Fällen von Nukleinsäuren
Eine quantitative Methode zur Ankonzentrierung von Nukleinsäuren besteht in der
Fällung mit Alkohol (Ethanol (EtOH) oder Isopropanol) und hohen Konzentration an
Salz, wie z.B. Natriumacetat (NaOAc) oder Natriumchlorid (NaCl). Die wässrige Lösung
23
Methoden
von DNA oder RNA wurde mit 1/10 Vol. 3 M NaOAC pH 5,0-6,0 und 2,5 Vol. 100% EtOH versetzt und gemischt. Bei kleinen DNA-Fragmenten (<50 bp und Primer) und
bei RNA wurde noch 1,0 µl Glykogen (20 µg/µl, Fermentas) als Präzipitationshilfe zugegeben. Gefällt wurde über Nacht bei -20 °C oder 15 min bis 4 h lang auf einer Isopropanol/Trockeneismischung. Die Nukleinsäuren wurden durch 20minütiges Zentrifugieren bei 4 °C und maximaler Geschwindigkeit pelletiert und mit 500-1 000 µl 70%
EtOH gewaschen. Nach 10minütiger Zentrifugation wie zuvor wurde der Überstand
komplett mit einer ausgezogenen Spitze entfernt, das Pellet 5 min bei Raumtemperatur
an der Luft getrocknet und in einem geeigneten Volumen Puffer oder ddH2O aufgenommen.
6.4.6
Isolierung replizierter RNA aus Säugerzellen
Diese Methode wurde im Labor etabliert (Mühlberger et al., 1998) und im Laufe dieser Doktorarbeit mehrfach abgeändert und angepasst. Die besten Ergebnisse konnten
unter folgenden Bedingungen erzielt werden:
36-48 h nach der Transfektion (6.2) wurden die Zellen auf einem Kühlakku 2x mit
kaltem PBSdef gewaschen und dann in 500 µl kaltem PBSdef abgekratzt. Die Zellen
wurden in 1,5 ml-Schraubröhrchen bei 8 000 rpm (4 °C) für 6 min pelletiert, in 200 µl
MCN-Puffer resuspendiert, 8-12x mit einer 1 ml-Spritze mit violetter Kanüle (0,55 mm)
geschert und anschließend mit 60 der längsten Impulse im Branson Sonifier 450 bei ca.
0-4 °C beschallt. Um Zelltrümmer und nicht lysierte Zellen zu entfernen, folgte ein
Zentrifugationsschritt von 5 min bei etwa 2 500 rpm. Der Überstand wurde vorsichtig in
ein neues Schraubröhrchen überführt und mit 51 U Mikrokokken (S7)-Nuklease
(300 U/µl, Fermentas) für 70 min bei 33 °C inkubiert, um ungeschützte Nukleinsäuren
(DNA und RNA) zu verdauen. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 700 µl RLT-Puffer
und 500 µl 100% EtOH gestoppt und die RNA isoliert (6.4.3). Eluiert wurde in 200 µl
ddH2O, gefolgt von einer Fällung (6.4.4) über Nacht.
6.4.7
Agarosegel-Elektrophorese (DNA)
Die Auftrennung von DNA-Fragmenten aufgrund ihrer Größe erfolgte elektrophoretisch über ein Agarosegel. Richtwerte für die Prozentualität des Gels waren: 1% für
Fragmente von 2 kb bis 23 kb, 1,5% für 0,5-2 kb und 2% für 50-500 bp. Die entsprechende Menge an Agarose (analytisch: UltraPURE Agarose, Invitrogen; präparativ:
Agarose NA, Amersham Biosciences) wurde in 35 ml 1x TBE pro Gel angesetzt. Proben wurden mit 6x Loading Dye bzw. 6x Orange Loading Dye (Fermentas) versetzt und
aufgetragen. Nach ca. 10minütigem Einlaufen bei 30 mA wurde die Stromstärke auf
50 mA erhöht und die Proben separiert, bis eine ausreichende Auftrennung erreicht
24
Methoden
war. Doppelsträngige DNA wurde durch Interkalation von Ethidiumbromid (ca. 10 µl
einer 10 mg/ml Stammlösung auf 50 ml 1x TBE) markiert und unter UV-Licht bei
302 nm sichtbar gemacht. Die entstandenen Bandenmuster wurden fotografiert oder
ausgedruckt (QuantityOne 4.4.0, Bio-Rad).
6.4.8
Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen
Um einzelne DNA-Fragmente von anderen zu isolieren, wurde die DNA zunächst
wie eben beschrieben (6.4.7) elektrophoretisch aufgetrennt und bei 365 nm sichtbar
gemacht. Mit einem sauberen Skalpell wurde die gewünschte Bande möglichst genau
ausgeschnitten und in einem 2 ml-Reaktionsgefäß abgewogen. Kleine Fragmente (50100 bp) wurden mittels einer Glasmatrix (QIAEX II Gel Extraction Kit, Qiagen) extrahiert, größere Fragmente (>100 bp) über Silica-Säulchen (QIAquick Gel Extraction Kit,
Qiagen). Die Extraktion erfolgte nach Herstellerangaben; eluiert wurde in 50 µl ddH2O.
6.4.9
Aufreinigung von DNA über Silica-Säulchen
Eine schnelle Methode zur Aufreinigung von geschnittener DNA (6.5.1) oder PCRFragmenten (6.6.1) stellte das „QIAquick PCR Purification Kit“ der Firma Qiagen zur
Verfügung: Die Probe wurde mit ddH2O auf 100 µl aufgefüllt, mit 500 µl Puffer PB versetzt und gemischt. Nach dem Binden an das Silica-Säulchen wurde einmal mit PEPuffer gewaschen, kurz durch Zentrifugation getrocknet und die gereinigte DNA in 50 µl
ddH2O eluiert.
6.4.10 Formaldehyd-Agarosegel-Elektrophorese (RNA)
RNA, die mittels der Northern Blot Technik analysiert werden sollte, wurde auf einem denaturierenden Agarosegel aufgetrennt. Die Agarose (UltraPURE Agarose, Invitrogen) für ein 1,5%iges Gel wurde in 23 ml frischem ddH2O aufgekocht und mit 6 ml
5x FA-Laufpuffer versetzt; verdampftes H2O wurde aufgefüllt. Hatte die Agarose eine
Temperatur von ca. 60 °C, wurde unter dem Abzug 1 ml 37% Formaldehydlösung zugegeben, gemischt, und das Gel gegossen. Für die Elektrophorese wurde 1x FALaufpuffer verwendet.
6.4.11 Northern-Blot-Analyse
Spezifische RNA (mRNA oder replizierte RNA) wurde durch nicht-radioaktive Northern-Blot-Analyse nachgewiesen. Dazu wurde die RNA aus einem FormaldehydAgarosegel (6.4.10) auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche) übertragen und
dort durch Hybridisierung mit einer Digoxigenin-markierten RNA-Sonde (6.5.6) detektiert.
25
Methoden
Transfer. Zunächst wurde die Membran in Methanol und dann in alkalischem Transferpuffer geschwenkt. Die Blotapparatur wurde wie in Weik (2001) gezeigt zusammengebaut. Der Transfer lief 90 min bei 50 mbar, wobei immer eine Schicht Transferpuffer
auf dem Gel blieb. Dem Transfer folgte eine 15minütige Neutralisierung in 200 mM
Phosphatpuffer pH 6,8. Parallel wurde 1 ml Heringsspermien DNA (Stratagene) bei
95 °C denaturiert. Während die getrocknete Membran 2 min lang auf einem UV-Schirm
fixiert wurde, wurde die DNA auf Eis gestellt.
(Prä)Hybridisierung. In einem Hybridisierungsröhrchen (Kobe) wurden 19 ml auf
65 °C vorgewärmte Hybridisierungslösung nach Collins mit der Heringsspermien-DNA
versetzt und der Blot bei 65 °C mind. 4-6 h unter Rotation prähybridisiert. Die Hybridisierungslösung wurde bis auf 3 ml abgenommen und 3-10 µl einer DIG-markierten
Sonde zugegeben, die 3 min bei 95 °C denaturiert und 3 min auf Eis gestellt worden
war. Die Hybridisierung erfolgte rotierend für mind. 12 h bei 65 °C.
Detektion. Nach der Hybridisierung wurde die Membran für 5 min in RNA Waschpuffer geschwenkt und dann mind. 2 h lang bei 65 °C in einem frischen Hybridisierungsröhrchen (gefüllt mit vorgewärmtem RNA-Waschpuffer) gewaschen. Danach wurden
restliches SDS und SSC durch 5minütiges Waschen in Puffer I entfernt. Um unspezifische Bindungsstellen auf der Membran abzusättigen, wurde die Membran 1 h lang in
65 ml 2%igem Blockingreagenz (Roche) geschüttelt. Das für die Detektion verwendete
Anti-Digoxigenin-AP Fab-Fragment (Roche) wurde 3 min bei 10 000 rpm bei 4 °C
zentrifugiert, um Aggregate zu pelletieren. Von der Blockinglösung wurden 35 ml abgenommen und 2 µl des Antikörperfragments zugegeben (d.h. 1:20 000 verdünnt). Die
Bindung erfolgte 30 min schüttelnd bei Raumtemperatur. Zum Entfernen unspezifisch
gebundener Fragmente wurden 3 Waschungen in Puffer I mit 0,3% (v/v) Tween 20
durchgeführt. Restliches Detergenz wurde durch Äquilibrieren für 5 min in Puffer III
abgewaschen. Die Membran wurde dann in eine Einschweiß-Folie gelegt, mit 1 ml
1:200 in Puffer III verdünntem CDP-Star (Roche) betropft und 5 min lang inkubiert. Vor
dem Zusammenschweißen wurde die restliche Flüssigkeit vorsichtig herausgedrückt,
und dann ein Strahlungs-sensitiver Film (Hyperfilm, Amersham; BioMAX, Kodak) aufgelegt. Die Entwicklung erfolgte nach unterschiedlichen Expositionszeiten automatisiert
in dem Entwickler Optimax 2010 (Protec Medizintechnik GmbH&Co KG).
6.4.12 Polyacrylamidgel für radioaktive DNA-Sequenzierung
Radioaktiv markierte DNA-Fragmente wurden auf einem denaturierenden, 8%igen
Polyacrylamidgel aufgetrennt. Zunächst wurden die Platten gut gesäubert und die größere dann mit Silicalösung behandelt, damit sich das Gel später leichter ablösen ließ.
26
Methoden
In einem Becherglas wurden 20 ml 40% Acrylamid/Bisacrylamid (Roth), 10 ml 10xTBE,
20 ml ddH2O und 50 ml 46,7% Harnstofflösung (in H2O) gut vermischt. Zur Polymerisierung wurden 500 µl APS und 100 µl TEMED zugegeben. Nach ca. 1 h konnte das Gel
dann beladen werden. Die Proben stammten ausschließlich aus Versuchen der chemischen Modifizierung von RNA (6.5.7) und wurden 3 min lang bei 95 °C denaturiert. Von
den Sequenzier-Reaktionen der Matrize (6.5.9) wurden je 2,5 µl, von der modifizierten
RNA jeweils 5,0 µl auf das Gel aufgetragen. Bei einer Spannung von 1.4 kV lief das
Gel, bis die dunkelblaue Farbstofffront gerade herausgelaufen war. Das Gel wurde
dann vorsichtig auf ein großes Stück Whatman-Papier gelegt und 30 min unter Hitze
und Vakuum getrocknet. Zur Auswertung wurde entweder eine BioImager-Platte (Fuji)
oder ein Kodak Hyperfilm aufgelegt.
6.5
6.5.1
Synthese und Modifikation von Nukleinsäuren
Restriktionsverdau
Restriktionsenzyme (New England Biolabs) wurden benutzt, um DNA an spezifischen Sequenzen zu schneiden. Zwei Ziele wurden damit verfolgt:
Analytischer Verdau. Das Vorhandensein einer Erkennungssequenz wurde z.B.
nach einer in vitro-Mutagenese (6.6.2) oder Ligation (6.5.2) überprüft. Aus den resultierenden Fragmenten konnten Rückschlüsse auf den Erfolg des Versuchs gezogen werden. Dazu wurden 100-250 ng der DNA in einem 20 µl Ansatz mit 3-10 U Enzym im
entsprechenden Puffer bei der empfohlenen Temperatur für 2-18 h inkubiert. Der Verdau wurde wie in 6.4.8 beschrieben gelelektrophoretisch ausgewertet.
Quantitativer Verdau. Größere Mengen DNA wurden verdaut, um z.B. PCRFragmente (6.6.1) oder Vektoren für die Ligation vorzubereiten. In einem 50 µl Ansatz
wurden 5 µg vektorielle DNA bzw. 38-44 µl PCR-Ansatz mit 5 µl Reaktionspuffer und
10-20 U Enzym unter den empfohlenen Bedingungen mind. 2 h inkubiert.
Mussten zwei Enzyme eingesetzt werden, so wurde ein Doppelverdau in dem am
besten geeigneten Puffer durchgeführt. War dies nicht möglich, wurde nach dem ersten
Verdau die DNA aufgereinigt (entweder über ein präparatives Agarosegel (6.4.8), oder
über Silica-Säulchen, (6.4.9) und einem zweiten Verdau mit dem anderen Enzym unterzogen.
6.5.2
Ligation
Nicht-zirkuläre DNA-Fragmente wurden mit Hilfe der T4-DNA-Ligase zusammengefügt. Dabei wurde ein geschnittenes PCR-Fragment in einen kompatiblen Vektor ligiert.
In einem 15 µl Ansatz wurden 1,5 µl 10x Reaktionspuffer und 1,5 µl 10 mM ATP vorge27
Methoden
legt. Das einzufügende Fragment wurde im Verhältnis zum dephosphorylierten Vektor
(6.5.3) 3:1-7:1 eingesetzt, das fehlende Volumen (abzüglich 0,5 µl (3 U) T4 DNA Ligase
(New England Biolabs), die als letztes zugegeben wurde) mit ddH2O aufgefüllt. Als
Kontrolle diente ein Ansatz ohne Insertions-Fragment. Plasmide, in die durch in vitroMutagenese größere Sequenzen eingefügt worden waren (6.6.2), wurden zuerst
phosphoryliert (6.5.3) und dann ohne zusätzliche DNA-Fragmente religiert. Die Inkubation erfolgte für 1-2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 16 °C. Der Ligationsansatz wurde später zur Transformation von kompetenten E. coli (6.3.2) benutzt.
6.5.3
(Radioaktive) Phosphorylierung, Dephosphorylierung
Synthetisch hergestellte Oligonukleotide sind am 5’-Ende nicht phosphoryliert. Diese
Eigenschaft kann z.B. dazu genutzt werden, um eine radioaktiv markierte Phosphatgruppe anzuhängen. Für manche Versuche war es aber auch notwendig, dass eine 5’Phosphatgruppe für die Reaktion zur Verfügung stand. In beiden Fällen ist die Reaktion
gleich, nur das Substrat (Phophat-Donor) unterschiedlich: radioaktiv: [γ-32P]-ATP, nicht
radioaktiv: ATP.
0,8 µl
1,0 µl
2,0 µl
1,0 µl
5,2 µl
Primer (10 pmol/µl)
10x PNK Puffer (Roche)
ddH2O
Polynukleotid Kinase (PNK, 10 U/µl; Roche)
[γ-32P]-ATP (6,000 Ci/mmol) bzw.
3,0 µl ATP (10 mM) + 2,2 µl ddH2O
Nach einstündiger Inkubation bei 37 °C wurde die PNK für 10 min bei 65 °C inaktiviert. Die phosphorylierten Oligonukleotide wurden auf 50 µl mit ddH2O aufgefüllt und
über „Omni Quick Spin Oligo Columns“ (Roche) laut Herstellerangaben aufgereinigt.
Die Elution erfolgte in 50 µl ddH2O.
6.5.4
Reverse Transkription, Primer-Extension
Zur Reversen Transkription (RT) wurde das OmniScript Kit der Firma Qiagen eingesetzt. Die RNA wurde auf 14 µl mit RNase-freiem H2O verdünnt und 5 min lang bei
65 °C denaturiert. Nach 3minütiger Inkubation auf Eis wurden
2,0 µl
2,0 µl
30 pmol
0,5 µl
1,0 µl
10x Puffer
dNTP-Mix (10 mM)
Primer
RNase-Inhibitor (40 U/µl)
Reverse Transkriptase (4 U/µl)
zugegeben. Nach Inkubation bei 37 °C für 1-2 h wurden 10 µl des Reaktionsgemischs in einer PCR (6.6.1) eingesetzt.
Eine spezielle Anwendung der RT war die Primer-Extension. Dazu wurde chemisch
modifizierte RNA (6.5.7) als Vorlage für die RT benutzt: 5,0 µl RNA, 2,0 µl Super28
Methoden
Script II-Puffer (Invitrogen) und 1,0 µl radioaktiv markierter Primer wurden 10 min bei
70 °C denaturiert und nach Abkühlen auf Eis mit
0,4 µl
1,0 µl
0,2 µl
0,4 µl
dNTP-Mix (125 mM)
DTT (100 mM)
RNase-Inhibitor (40 U/µl)
SuperScript II (200 U/µl)
versetzt. Nach 50minütiger Inkubation bei 37 °C wurde die Reaktion durch Zugabe
von 10 µl STOP-Puffer (aus T7-Sequencing™ Kit von Amersham) beendet. Die Proben
wurden bis zum Auftragen auf ein denaturierendes Sequenziergel (6.4.12) kurzfristig
bei 4 °C oder länger (> 5 h) bei -20 °C.
6.5.5
In vitro-Transkription
Größere Mengen (mehrere Mikrogramm) RNA von einer DNA-Matrize mit T7-Promotor wurden mit dem Ampliscribe Kit (Epicenter) synthetisiert. Zunächst wurden 5 µg
DNA hinter der zu transkribierenden Sequenz linearisiert (6.5.1), um ein „Run-off“Transkript zu generieren, anschließend aufgereinigt (6.4.3) und in 45 µl RNase-freiem
H2O eluiert. Pro Reaktion wurden folgende Komponenten zusammenpipettiert:
8,0 µl
2,0 µl
je 1,5 µl
2,0 µl
0,5 µl
1,0 µl
DNA-Matrize
10x Puffer
ATP, CTP, GTP, UTP
100 mM DTT
RNase-Inhibitor (40 U/µl)
T7 RNA Polymerase (1 U/µl)
Nach 2stündiger Inkubation bei 37 °C wurde 1,0 µl RNase-freie DNase (1 U/µl) zugegeben und weitere 15-30 min bei 37 °C inkubiert. Der Ansatz wurde auf 100 µl mit
ddH2O aufgefüllt und mit 350 µl RLT-Puffer +1% β-Mercaptoethanol (RNeasy Kit, Qiagen) und 250 µl 100% Ethanol versetzt. Die RNA konnte danach wie in 6.4.3 beschrieben aufgereinigt werden.
6.5.6
Markieren von RNA-Fragmenten mit Digoxigenin (DIG)
Um die Verwendung von radioaktivem Phosphor zu minimieren, wurden RNASonden mit Digoxigenin markiert, welches über eine Antikörperreaktion detektiert werden kann. Dies geschah unter Verwendung des „RNA DIG labeling Kits“ von Roche.
Vorbereitend wurden 5 µg der DNA-Matrize linearisiert (6.5.1), aufgereinigt (6.4.9) und
in 45 µl RNase-freiem H2O eluiert. 13 µl dieser DNA-Lösung wurden mit 2,0 µl Nukleotid-DIG-Mix, 2,0 µl 10x Puffer, 1,0 µl RNase-Inhibitor (40 U/µl) und 2,0 µl T7 RNA Polymerase versetzt (1 U/µl) und 2,5-3 h lang bei 37 °C inkubiert. Nach Zugabe von 1,0 µl
DNase (1 U/µl) wurde weitere 15-30 min inkubiert, die RNA dann aufgereinigt (6.4.3)
und in 100 µl H2O eluiert.
29
Methoden
6.5.7
Chemische Modifizierung von RNA
Die chemische Modifizierung der Basen eines RNA-Moleküls kann zur Aufklärung
der gebildeten Sekundärstruktur eingesetzt werden. Dabei werden zwei Chemikalien
benutzt, die jeweils zwei Basen spezifisch modifizieren. Eine reverse Transkription dieser modifizierten RNA mit einem radioaktiv markierten Primer (Primer-Extension, 6.5.4)
bewirkt einen Polymerisations-Stopp eine Base stromaufwärts der Modifikation. Die
Abbruchbanden können auf einem denaturierenden Sequenziergel (6.4.12) aufgetrennt
und analysiert werden.
Die beiden verwendeten Chemikalien sind DMS (Dimethylsulfat) und CMCT (1Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)-carbodiimid-metho-p-toluensulfonat). DMS methyliert
(sortiert nach Reaktivität) G-N7>A-N1>C-N3, wobei die erste Modifikation keinen Einfluss auf die Polymerase hat. CMCT modifiziert U-N7>G-N2.
Für die Modifizierungen pro Ansatz 5,0 µg RNA benötigt, weshalb in vier Parallelansätzen RNA vom entsprechenden Plasmid transkribiert wurde (6.5.5). Nach der Elution
in je 100 µl frischem ddH2O wurde die Konzentration photometrisch bestimmt. Die RNA
wurde präzipitiert (6.4.4) und mit CMCT-Puffer auf eine Konzentration von 4,0 µg/µl
eingestellt. Davon wurden 2,0 µl abgenommen und für die DMS-Modifikation mit ddH2O
auf 1,0 µg/µl verdünnt.
Modifizierung mit DMS. DMS ist sehr giftig und wirkt mutagen, weshalb besondere
Vorsicht geboten ist (Abzug, Atemschutz, Ärmel abkleben). In zwei Reaktionsgefäßen
wurde je 1,0 µl RNA (1,0 µg) mit 19 µl 10x HMK, 168 µl ddH2O und 2,0 µl RNaseInhibitor vermischt und für 10 min auf Eis gestellt. Nach 10minütiger Inkubation bei
30 °C wurden zu dem Ansatz D+ 0,8 µl DMS bzw. zu D- 0,8 µl ddH2O pipettiert, gemischt und weitere 5 min bei 30 °C inkubiert. Danach wurden 10 µl tRNA (1 µg/µl) und
200 µl DMS-Stopp-Puffer zugegeben und die Ansätze 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die (modifizierte) RNA wurde mittels Phenol/Chloroform-Extraktion (6.4.4) und
anschließend bei -20 °C gefällt. Die RNA wurde für die Primer-Extension (6.5.4) in 10 µl
RNase-freiem Wasser aufgenommen.
Modifizierung mit CMCT. In zwei Reaktionsgefäßen wurden je 12,5 µl RNA (4 µg/µl)
vorgelegt. Zu einem Ansatz (CMCT+) wurden 12.5 µl CMCT-Stock-Lösung pipettiert,
zum anderen (CMCT-) 12,5 µl CMCT-Puffer. Beide Ansätze wurden für 10 min bei
37 °C inkubiert und dann nach Zugabe von 2,5 Volumen 100% Ethanol mind. 15 min
lang auf einem Isopropanol/Trockeneis-Gemisch gefällt (6.4.4). Das Pellet wurde ohne
einen Waschschritt in 200 µl RNA-Extraktionspuffer aufgenommen und anschließend
Phenol/Chloroform-extrahiert. Zur gereinigten wässrigen Phase wurden 600 µl 100%
30
Methoden
EtOH gegeben, und das Gemisch erneut gefällt. Das Pellet wurde in 400 µl RNasefreiem Wasser aufgenommen und für die Primer-Extension verwendet (6.5.4).
6.5.8
Standard- (nicht-radioaktive) Sequenzierung von DNA
Die Methoden zur Sequenzierung wurden mehrfach gewechselt. Als letzte Methode
wurden 100-125 ng des zu sequenzierenden Plasmids mit 10 pmol Primer versetzt und
auf 6,0 µl mit ddH2O aufgefüllt. Die Proben wurden von einer technischen Assistentin
für die Sequenzierung im MegaBACE (Amersham Pharmacia) vorbereitet und analysiert.
6.5.9
Radioaktive Sequenzierung von DNA
Das Sequenzieren von DNA mit radioaktiv markierten Primern wurde für die Auswertung der chemischen Modifizierung (6.5.7) benötigt. Zunächst musste die DNAMatrize kurz vor Verwendung alkalisch denaturiert werden. Dazu wurden 2,0 µl der
DNA (1 µg/µl) mit 8,0 µl 2 M NaOH 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Neutralisation mit 7,0 µl 3 M NaOAc pH 5,2 und 4 µl ddH2O wurde die DNA mit 120 µl 100%
EtOH mind. 15 min lang auf Isopropanol/Trockeneis gefällt (Pelletieren und waschen
wie bei 6.4.5). Das Pellet wurde in 10 µl ddH2O aufgenommen und mit dem „Short-Mix“
des T7-SequencingTM Kit (Amersham) laut Protokoll mit 2,0 µl radioaktiv markiertem
Primer sequenziert. Die fertigen Proben wurden auf ein Polyacrylamidgel aufgetragen
(6.4.12).
6.6
6.6.1
Polymerase-Kettenreaktion (PCR), in vitro-Mutagenese
Amplifikation einer spezifischen Sequenz
Als effizientes Mittel, spezifische Bereiche einer DNA-Matrize zu vervielfachen, wurde die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eingesetzt. Die benötigten Primer (Kapitel 19)
wiesen oft eine flankierende Restriktionsschnittstelle auf, um das PCR-Produkt nach
enzymatischem Verdau (6.5.1) in einen geeigneten Vektor ligieren (6.5.2) zu können.
Die Reaktion wurde mit der Pwo-Polymerase der Firma Peqlab (Erlangen) durchgeführt. Ein 100 µl Reaktionsansatz enthielt gewöhnlich:
5-50 ng
10 µl
2 µl
3 µl
3 µl
2,5 µl
DNA-Matrize
10x Pwo-Puffer komplett (+MgSO4)
10 mM dNTP-Mix (Stratagene)
Primer 1 (10 pmol/µl)
Primer 2 (10 pmol/µl)
Pwo-Polymerase (1 U/µl) (später zugeben)
Abweichungen sind in den jeweiligen Versuchen aufgeführt.
31
Methoden
Das Grundgerüst des PCR-Profils bestand aus folgenden Schritten:
Prozess
Denaturierung
Abkühlen; Pwo–Zugabe
Denaturierung
Anlagerung
x30-35
Synthese
Fertigstellung der Synthese
Lagerung
}
Temp.
99 °C
90 °C
94 °C
(variabel)
72 °C
72 °C
8 °C
Zeit
3 min
2 min
45 s
1 min
(2 min pro kb)
10 min
∞
Die Anlagerungs-Temperatur sowie sonstige Änderungen sind in den jeweiligen Experimenten angegeben.
6.6.2
In vitro-Mutagenese
Eine Abwandlung der eben beschriebenen PCR wurde eingesetzt, um spezifisch
wenige Nukleotide zu entfernen, zu substituieren oder hinzuzufügen. Es handelt sich
dabei um eine Modifikation des kommerziell erhältlichen QuikChange Mutagenese-Kits
(Stratagene): Zwei komplementäre Primer, die beide die gewünschte(n) Mutation(en)
enthalten, wurden mit der Matrizen-DNA in einer PCR-Reaktion inkubiert. Dabei lagern
sich die Primer in der ersten Runde an jeweils einen Strang der Matrize an, so dass
beide Stränge mit den Mutationen synthetisiert werden. Diese stehen in der zweiten
Runde als Matrize zur Verfügung, und so kann die modifizierte DNA exponentiell amplifiziert werden. Wichtig bei dieser Methode ist, dass die Matrizen-DNA aus Bakterien
stammt, die Plasmid-DNA methylieren. Diese wird in dem der PCR anschließenden
DpnI-Verdau fragmentiert, während die in vitro synthetisierten Doppelstränge nicht methyliert und somit vor der Restriktion geschützt sind; hemimethylierte Doppelstränge
werden ebenfalls verdaut. Nach der Restriktion wurde ein Teil der Probe auf ein Agarosegel aufgetragen (6.4.7) und bei erfolgreicher PCR in Bakterien amplifiziert (6.3.2).
Für eine in vitro-Mutagenese wurde die PfuTurbo-Polymerase (Stratagene) benutzt,
die mit einer geringen Fehlerrate auch längere DNA-Fragmente synthetisieren kann. In
einer 50 µl Reaktion wurden dafür folgende Komponenten eingesetzt:
250 ng
5 µl
2 µl
125 ng
125 ng
1,0 µl
DNA-Matrize
10x Pfu Cloned Buffer
10 mM dNTP-Mix (Stratagene)
Primer 1
Primer 2
PfuTurbo-Polymerase (2.5 U/µl) (später zugeben)
Abweichungen sind in den jeweiligen Versuchen aufgeführt.
32
Methoden
Das Grundgerüst des PCR-Profils bestand aus folgenden Schritten:
Prozess
Denaturierung
Abkühlen; Pfu–Zugabe
Denaturierung
Anlagerung
x16
Synthese
Fertigstellung der Synthese
Lagerung
}
Temp.
99 °C
90 °C
90 °C
(variabel)
68-72 °C
Zeit
3 min
2 min
1 min
1 min
(2 min pro kb) + 10 s
68-72 °C
10 min
8 °C
∞
Die Anlagerungs-Temperatur ist in den einzelnen Experimenten angegeben.
Zur PCR-Reaktion wurde 1 µl (10 U) DpnI (New England Biolabs) gegeben und die
Proben dann für 1-16 h bei 37 °C inkubiert. Für das analytische Agarosegel (1%) wurden 3-5 µl der Probe aufgetragen.
Bei schwierigen Reaktionen war oftmals ein stark geändertes Profil, das auf Angaben des Pfu-Herstellers (Stratagene) basiert, erfolgreich (z.B. Einfügen von Fremdsequenz durch Primer-Überhang):
Prozess
Denaturierung
Abkühlen; Pfu–Zugabe
Denaturierung
Anlagerung
x10
Synthese
Denaturierung
Anlagerung
x20
Synthese
Fertigstellung der Synthese
Lagerung
}
}
Temp.
99 °C
90 °C
92 °C
40 °C
68 °C
92 °C
(variabel)
72 °C
Zeit
3 min
2 min
20-30 s
45 s
(2 min pro kb)
20-30 s
45 s
(1 min pro kb) + 10 s
72 °C
10 min
8 °C
∞
Variante der in vitro-Mutagenese-PCR. Die Anlagerungs-Temperatur ist in den einzelnen Experimenten angegeben.
Anschließend wurde die DNA mit DpnI verdaut und auf einem Agarosegel analysiert
(s.o.). Plasmide, in die durch überhängende Oligonukleotide Sequenzen eingefügt
wurden, mussten zusätzlich phosphoryliert (6.5.3) und durch Ligation zirkularisiert
(6.5.2), bevor sie zur Transformation von E. coli (6.3.2) benutzt werden konnten.
6.6.3
Reverse-Transkriptions-PCR (RT-PCR)
Da die PCR DNA als Vorlage braucht, muss RNA zunächst in DNA überschrieben
(revers transkribiert) werden. Die RT-PCR kann entweder in zwei aufeinander folgenden Schritten geschehen (6.5.4) oder direkt in einem Ansatz. Letzteres hat den Vorteil,
dass keine Reinigungsschritte nötig sind, und alle Schritte in einem Reaktionsgefäß
33
Methoden
ablaufen. Diese OneStep RT-PCR (Qiagen) wurde hauptsächlich zur Kontrolle eingesetzt, z.B. um virale RNA zu detektieren.
Von der gereinigten RNA (6.4.3) wurden 1-10 µl mit RNase-freiem H2O auf 20 µl
aufgefüllt und Sekundärstrukturen 5 min bei 65 °C zerstört. Nach einer 3minütigen Inkubation auf Eis wurden zu jedem Ansatz
10 µl
2 µl
3 µl
3 µl
0,5 µl
2,0 µl
9,5 µl
5x Puffer
5 mM dNTP-Mix
Primer 1 (10 pmol/µl)
Primer 2 (10 pmol/µl)
RNase-Inhibitor (40 U/µl)
Enzyme-Mix
ddH2O
zugegeben. Das RT-PCR-Profil sah im Allgemeinen folgendermaßen aus:
Prozess
Reverse Transkription
Inaktivierung der RT
Denaturierung
Anlagerung
x35
Synthese
Fertigstellung der Synthese
Lagerung
}
Temp.
50 °C
95 °C
94 °C
50 °C
72 °C
Zeit
(2 min pro kb)
72 °C
10 min
8 °C
∞
30 min
15 min
1 min
1 min
Die Anlagerungs-Temperatur sowie sonstige Änderungen sind in den jeweiligen Experimenten angegeben.
Die erhaltenen Produkte wurden entweder direkt auf einem Agarosegel analysiert
(6.4.7) oder aufgereinigt (6.4.9), mit Restriktionsenzymen verdaut (6.5.1), und das Restriktionsmuster ausgewertet.
6.7
Nachweis der Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)
Das Reporterprotein CAT wurde mittels zweier unterschiedlicher Methoden nachgewiesen: Zum einen über die enzymatische Aktivität (6.7.1), zum anderen über das
Vorhandensein des Proteins an sich (6.7.2). Letztere Methode hat den Vorteil, dass
evtl. inaktive Fusionsproteine im ELISA möglicherweise noch erkannt werden.
6.7.1
Radioaktiver Aktivitätsnachweis (CAT-Assay)
Die zu untersuchenden Zellen wurden 36-48 h nach Transfektion zwei Mal mit kaltem PBSdef gewaschen und mit 150 µl 1x Reporter Lysis Puffer (Promega) 15 min bei
Raumtemperatur lysiert. Das Zelllysat wurde abgeschabt und nach 20sekündigem Mischen 5 min lang bei 6 000 rpm zentrifugiert. Vom Überstand wurde in der Regel 1,0 µl
(MARV und EBOV-R) oder 1,0 µl einer 1:10 Verdünnung (EBOV-R) eingesetzt; die
genauen Mengen sind in den Ergebnissen angegeben. Das Lysat wurde mit 1,0 µl Ace34
Methoden
tyl-Coenzym A (70 mg/ml, Roche) und 2,0 µl
14
C-markiertem Chloramphenicol (Amers-
ham) in einem Gesamtvolumen von 150 µl 250 mM Tris Cl, pH 7,5 mind. 3,5 h bei
37 °C inkubiert. Proben aus dem Sicherheitslabor wurden mit 1% (w/v) SDS versetzt,
gemischt, kurz zentrifugiert und in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Dieses wurde
dann für 10 min im Wasserbad gekocht und anschließend ausgeschleust. Das (acetylierte) Chloramphenicol wurde mit 5 Volumen (750 µl) Ethylacetat (850 µl bei Proben
aus dem Sicherheitslabor) durch 30sekündiges Mischen extrahiert und die Phasen
durch Zentrifugation (2 min bei 10 000 rpm) getrennt. Von der oberen Phase wurden
725 µl (800 µl bei Proben aus dem Sicherheitslabor) in ein neues Reaktionsgefäß mit
zwei Löchern im Deckel überführt und 15 min unter Vakuum bei eingeschalteter Hitze
in der Vakuum-Zentrifuge eingedampft. Das Pellet wurde in 10 µl Ethylacetat aufgenommen und auf eine Kieselgelplatte (Merck) aufgetragen. Die unterschiedlich acetylierten Formen des Chloramphenicol wurden in einem Laufmittel aus 95% (v/v) Chloroform und 5% (v/v) Methanol getrennt. Zur Detektion der Radioaktivität wurde eine Bioimager-Platte etwa 1 h lang aufgelegt. Die Platte wurde in einem BAS 1000 ausgelesen;
das Programm TINA 2.09g (Raytest) diente zur Auswertung der erhaltenen Grafik.
6.7.2
Detektion des CAT-Proteins mittels ELISA
Zum spezifischen Nachweis des CAT-Proteins in transfizierten Zellen wurde das
CAT-ELISA Kit von Roche benutzt. Zellen wurden nach Herstellerangaben lysiert, und
zunächst wurde der Gesamt-Proteingehalt bestimmt (Protein Assay Reagent, Bio-Rad):
50 µl Zelllysat wurden mit 1,0 ml 1x Farbstoff versetzt, und die Absorption bei 595 nm
gemessen. Die normalisierten Mengen an Zelllysat wurden dann für den CAT-ELISA
eingesetzt.
6.8
6.8.1
Proteinanalysen
SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
Proteinproben wurden auf denaturierenden Polyacrylamidgelen der Größe entsprechend aufgetrennt. Zelllysate wurden mit gleichem Vol. 2x Probenpuffer versetzt und
5 min bei 95 °C denaturiert. Die Gele bestanden aus 4-6%igem Sammelgel und 1015%igem Trenngel (5.6). Die Proben wurden in 1x SDS-Laufpuffer aufgetrennt, bis die
Farbstofffront herausgelaufen war.
6.8.2
Coomassie-Färbung
SDS-Polyacrylamidgele wurden in für 15-30 min Coomassie-Färbelösung und anschließend solange in Entfärbelösung geschwenkt, bis die Proteinbanden deutlich
35
Methoden
sichtbar waren. Die gefärbten Gele wurden in das DryEasy System (Invitrogen) eingespannt und über Nacht bei 37 °C getrocknet.
6.8.3
Western-Blot-Analyse
Zum selektiven Nachweis von Proteinen wurden die Proteine aus dem SDS-Polyacrylamidgel auf eine Immobilion-P Membran (Millipore) transferiert und mit spezifischen Antikörpern detektiert. Die Membran wurde zunächst kurz in Methanol aktiviert
und dann in Anodenpuffer II äquilibriert. Pro Gel wurden drei Whatman-Papiere
(6×9 cm) in Kathoden-, Anoden I- oder Anodenpuffer II eingeweicht und die BlotApparatur wie in Abb. 4 gezeigt aufgebaut. Pro Membran wurden 43 mA eingestellt (0,8
mA/cm2 Membran) und für eine Dauer von 1,5 Stunden transferiert. Nach dem Transfer
wurden die Markerbanden nachgezogen, und die Membran für 1 h (Raumtemperatur)
oder ü.N. (4 °C) mit 5% Milchpulver in TBS/PBSdef +0,1% Tween 20 abgesättigt. Der
Erstantikörper wurde wie in Tabelle 4 aufgeführt in 5% Milchpulver in TBS/PBSdef
+0,1% Tween 20 verdünnt, und der Blot 1 h oder ü.N. (4 °C) unter Schwenken inkubiert. Ungebundene Antikörper wurden durch dreimaliges Waschen für 10 min mit
TBS/PBSdef +0,1% Tween 20 entfernt. Der Peroxidase-gekoppelte Zweitantikörper
wurde gemäß Tabelle 4 in 5% Milchpulver in TBS/PBSdef +0,1% Tween 20 verdünnt
und die Membran 1 h unter Schwenken inkubiert. Ungebundene Antikörper wurden
durch zweimaliges Waschen mit TBS/PBSdef +0,1% Tween 20 entfernt, gefolgt von
zwei Waschschritten mit TBS/PBSdef. Als Substrat für die Peroxidase wurde das Super
Signal Kit (Pierce) benutzt. Je 500 µl der beiden Lösungen wurden vermischt und auf
den Blot getropft. Nach 5minütiger Inkubation in einer Folientasche wurde überschüssige Lösung herausgedrückt und ein Film (Amersham Pharmacia) aufgelegt.
Abb. 4. Schematischer Aufbau der Western
Blot-Apparatur. Die Whatman-Papiere wurden mit dem angegebenen Puffer getränkt;
Blasen wurden mit einer Pipette „ausgerollt“.
Kathode
3x Whatman/Kathodenpuffer
SDS-Polyacrylamidgel
PVDF-Membran
3x Whatman/Anodenpuffer II
3x Whatman/Anodenpuffer I
Anode
6.8.4
Immunfluoreszenz-Analyse
Immunfluoreszenzen wurden mit auf Deckgläschen (Menzel-Gläser) oder „chamber
slides“ (Nalgene) kultivierten Zellen durchgeführt. Beide Verfahren sind sehr ähnlich,
weshalb die Methode für die Deckgläschen beschrieben wird; Unterschiede sind hervorgehoben. Die Transfektion bzw. Infektion erfolgte wie in den einzelnen Experimenten beschrieben. Proben aus dem Sicherheitslabor wurden über Nacht in DMEM mit
36
Methoden
4% Paraformaldehyd (PFA) inaktiviert und danach nach Standardprotokoll weiterbehandelt.
Die Deckgläschen wurden 3x 5 min in PBSdef gewaschen und anschließend für
5 min bei -20 °C mit Aceton/Methanol (1:1) permeabilisiert. Das Lösungsmittelgemisch
wurde durch 3maliges Waschen in PBSdef entfernt. Um unspezifische Bindungen zu
minimieren, wurde zunächst 10 min mit 0,1 M Glycin (in H2O) inkubiert und nach 3
Waschschritten mit PBSdef für 10 min mit 2% IFA-Blockinglösung abgesättigt. Der
Erstantikörper (im experimentellen Teil angegeben) wurde wie in Tabelle 4 gezeigt in
Blockinglösung verdünnt. Pro Deckgläschen bzw. benutztem Feld einer chamber slide
wurden 25 µl auf Parafilm pipettiert und das Deckgläschen bzw. die chamber slide mit
der Zellseite nach unten aufgelegt. Die Inkubation erfolgte 1 h in einer verschlossenen
feuchten Box. Nicht gebundener Antikörper wurde in 4 Waschschritten mit PBSdef entfernt. Der Zweitantikörper wurde gemäß den Angaben in Tabelle 4 verdünnt und wie
der Erstantikörper inkubiert. Erneut wurde 4x mit PBSdef gewaschen. Zur Anfärbung der
Zellkerne wurde der Farbstoff DAPI (10 mg/ml) 1:10 000 in PBS++ verdünnt und 5 min
wie für die Antikörper beschrieben in der feuchten Kammer inkubiert. Alternativ wurde
DAPI 1:100 in PBS++ vorverdünnt und wiederum 1:100 verdünnt direkt zum 2. Antikörper gegeben. Nach 4maligem Waschen in PBSdef wurden die Deckgläschen kurz in
ddH2O geschwenkt und vorsichtig durch Auftupfen auf ein Papiertuch getrocknet. Als
Fixiermedium wurde ein Tropfen Fluoprep (BioMérieux, Lyon; versetzt mit 2,5% DABCO (Sigma-Aldrich)) auf einen Objektträger (Menzel-Gläser) gegeben, und die Deckgläschen bzw. die chamber slide mit der Zellseite nach unten aufgelegt. Zur Aushärtung wurden die Deckgläschen über Nacht im Kühlschrank gelagert. Die Fluoreszenz
wurde an einem Leica Mikroskop mit unterschiedlichen Filtern durchgeführt. Bilder
wurden mit einer Spot Kamera aufgenommen und mit der Software Spot bearbeitet.
37
Methoden
Antikörper
Organismus
Datum
Verdünnung
WB
IFA
Anmerkungen
1. Antikörper
α-NP (MARV)
α-NC (MARV)
α-VP30 /2(MARV)
α-VP30 (MARV)
α-Aktin
α-T7 RNA Pol.
Maus
--1:100-200
Kaninchen
08.07.94
--1:100
Meerschweinchen 16.04.98
--1:50
--Maus
Jan. 96
1:5 000
--Kaninchen
1:40 000
1:100*
Maus
1:10 000
monoklonal, 2B10
Serum
Serum
monoklonal, USAMRIID
monoklonal, Sigma
monoklonal, Novagen
2. Antikörper
α-Maus
Ziege
div.
---
α-Meerschweinchen
α-Maus
α-Kaninchen
Ziege
div.
---
Ziege
Ziege
div.
div.
1:10 000
1:40 000
1:200 Rhodamin (1:2 vorverd.), Dianova
1:200 FITC (1:2 vorverd.),
Dianova
--POD, Dianova
--POD, Dianova
Tabelle 4. Auflistung der im Western Blot (WB) und Immunfluoreszenz (IFA) eingesetzten Antikörper. Die
Zweitantikörper wurden kommerziell erworben. * Der Antikörper lieferte in der Immunfluoreszenz keine
Ergebnisse.
38
Ergebnisse
III
Ergebnisse
Ergebnisse – Methodisches
7
Optimierung der Isolierung und Detektion replizierter RNA
Zu Beginn dieser Arbeit wurde replizierte RNA aus Versuchen des Minigenomsys-
tems aus HeLa-Zellen nach Infektion mit MVA-T7 isoliert (Mühlberger et al., 1998). Es
wurden immer zwei Schälchen einer 6er Gewebekulturplatte pro Probe benötigt, und
die Ergebnisse waren oft unzureichend. Zudem werden durch die Infektion zusätzliche
Proteine in die Zelle gebracht, die einen Einfluss auf die Ergebnisse haben könnten. In
der Zwischenzeit waren zwei Zelllinien verfügbar, die konstitutiv die T7-RNAPolymerase exprimieren: BSR T7/5 und HuH-T7 (5.8.1). Das Minigenomsystem wurde
auf die Verwendung dieser Zelllinien ohne MVA-T7-Infektion optimiert.
7.1
Einfluss der MVA-T7-Infektion auf die Menge an replizierter RNA in HuHT7- und BSR T7/5-Zellen
Die anfänglichen Versuche, HuH-T7-Zellen zur Isolierung replizierter RNA zu verwenden, lieferten keine reproduzierbaren Ergebnisse. Daher wurden die Level replizierter RNA in HuH-T7- und BSR T7/5-Zellen mit und ohne Infektion mit MVA-T7 verglichen. Die Zellen wurden in 6er Gewebekulturplatten zu einer Dichte von 50-70% ausgesät, und am nächsten Tag wurde je ein Schälchen entweder mit 15 µl MVA-T7 in
500 µl DMEM infiziert oder mit DMEM bei 33 °C inkubiert. Nach einer Stunde wurde
das Inokulum abgenommen, und die Zellen wurden mit den pTM1-Plasmiden von L
(1,0 µg), VP35 (0,5 µg), NP (0,1 µg) sowie dem Minigenomvektor 3M-5M (1,0 µg) transfiziert (6.2). 24 h p.t. wurde das Transfektionsmedium abgenommen und mit frischem
DMEM komplett +2% FCS ersetzt. Zwei Tage p.t. wurden die Zellen wie in Schlenz
(2002) beschrieben lysiert, und die replizierte
RNA isoliert. Für die Detektion der Positiv-
M HuH-T7
pTM1/L
MVA-T7
+
+
+
-
2
3
BSR T7/5
+
-
+
+
4
5
strang-Minigenome wurde eine DIG-markierte
CAT-Sonde
gegen
(+)-CAT
eingesetzt
(Mühlberger et al., 1998). Im Northern Blot
(Abb. 5) war deutlich zu erkennen, dass in
1
Abb. 5. Northern-Blot-Analyse replizierter RNA
HuH-T7-Zellen ohne Infektion mit MVA-T7 aus HuH-T7- und BSR T7/5 –Zellen in Abhängigkeit von der Infektion mit MVA-T7. Die Zel-
keine spezifische RNA zu detektieren war len wurden wo angegeben mit 15 µl MVA-T7
(Spur 3), wohl aber nach der Infektion (Spur infiziert und 1 h p.i. mit dem Minigenomvektor
3M-5M und den notwendigen Plasmiden der
2). In BSR T7/5-Zellen hingegen war auch Nukleokapsidproteine VP35, NP und L transfi-
ziert. 48 h p.t. wurden die Zellen lysiert und auf
ohne Infektion eine Bande replizierter RNA replizierte RNA im Northern Blot untersucht.
erkennbar (Spur 4), die sich durch die Infekti- Der Pfeil verweist auf spezifische Banden. M:
in vitro-transkribierte (+)-Minigenom-RNA (2.1
on signifikant verstärkte (Spur 5). Allerdings CAT Mut); die obere Bande ist durch unvollständiges Schneiden des Ribozyms bedingt.
40
Ergebnisse – Methodisches
war der Hintergrund der aus HuH-T7-Zellen isolierten RNA wesentlich geringer. Eine
Erhöhung der Menge des Minigenomvektors von 1,0 auf 2,0 µg zeigte, dass keine Infektion mehr nötig war (Daten nicht gezeigt).
7.2
Änderung der Konditionen zur Isolierung replizierter RNA
Nachdem die Isolierung replizierter RNA ohne MVA-T7-Infektion aus nur einem
Schälchen einer 6er Gewebekulturplatte möglich war, sollte der oftmals auftretende
hohe Hintergrund (Abb. 5 Spuren 4+5) reduziert werden. Als erstes wurde die Zusammensetzung des Lysispuffers leicht verändert. Die optimale Mg-Konzentration für die
Mikrokokken-Nuklease (MCN) ist laut Hersteller (MBI) 10 mM. Bisher waren aber nur
1,5 mM im Puffer vorhanden; die Konzentration an MgCl2 wurde dementsprechend
erhöht. Die Konzentration von Deoxycholat wurde von 5% auf 3% herabgesetzt, um die
Gesamtmenge an Detergenz zu verringern. Die Zellen wurden unverändert zwei Mal
mit kaltem PBSdef gewaschen, abgekratzt und abzentrifugiert. Das Pellet wurde in
200 µl MCN-Puffer resuspendiert, aber im Unterschied zu Weik (2001) und Schlenz
(2002) zuerst mit einer violetten Kanüle 8x geschert und dann erst beschallt. Das sollte
bewirken, dass die durch das Scheren entstandenen Fragmente durch das Beschallen
weiter zerkleinert werden können. Dem Beschallen folgte eine niedertourige Zentrifugation (5 min bei etwa 2 500 rpm), um große Zelltrümmer zu entfernen. Diese können
Nukleinsäuren enthalten, die nicht für die MCN zugänglich sind, deshalb nicht verdaut
werden können und daher evtl. Hintergrundsignale hervorrufen. Durch diesen Schritt
konnte der Hintergrund schon deutlich reduziert werden, wenn auch unter teilweisem
Verlust des spezifischen Signals (Abb. 6). Als nächstes wurden die Parameter des
MCN-Verdaus verändert. Bisher wurde 70 min bei 30 °C mit 9 U Enzym inkubiert
(Schlenz, 2002). Die Menge des Enzyms wurde auf 15 bzw. 51 U erhöht. Zudem wurde
die Temperatur auf 33 oder 37 °C angehoben, und die Inkubationszeit auf 60 min verringert. Als beste Kombination stellte sich heraus: 2,0 µg Minigenomvektor, veränderter
Puffer (10 mM MgCl2, 3% Deoxycholat), 5minütige Zentrifugation bei etwa 2 500 rpm,
51 U MCN–Inkubation bei 33 °C.
41
Ergebnisse – Methodisches
Abb. 6. Einfluss der Zentrifugation auf den Nachweis replizierter RNA im Northern Blot. BSR T7/5Zellen wurden mit EBOV-spezifischen Plasmiden
transfiziert und 2 Tage p.t. geerntet. Die Isolierung
replizierter RNA erfolgte in modifiziertem Puffer und
entweder mit (Spuren 1-3) oder ohne (Spuren 4-6)
Zentrifugationsschritt (5 min bei etwa 2 500 rpm)
nach Lyse. ∆250/∆140/∆130/∆125/ ∆120: 3E-5E
leader ∆250/∆140/∆130/∆125/∆120. Die Konstrukte sind in 9.2.1 beschrieben. Pfeile verweisen auf
die Höhe der spezifischen Banden, Sternchen (*)
markieren Hintergrundbanden, die nicht immer
entfernt werden konnten.
∆250
Zentrif.
+L
-L
∆140
+
+
+
∆120
∆125
-
-
*
1
7.3
∆130
2
3
4
-
*
5
*
6
Einsatz des Plasmids pCAGGS/T7 zur Steigerung der Effizienz
Die sorgfältig erarbeitete Optimierung des Nachweises replizierter RNA war leider
nicht immer reproduzierbar. Die Vermutung, dass die Zellpassage eine wichtige Rolle
spielt, ebenso wie die Expressionslevel der T7-RNA-Polymerase (7.4), erwies sich als
richtig. Daher wurden erneut HuH-T7-Zellen getestet und mit BSR T7/5-Zellen verglichen. Als Neuerung wurde diesmal ein Plasmid kotransfiziert, welches die T7-RNAPolymerase unter Kontrolle eines β-chicken-fibroblast-Promotors exprimiert (Niwa et
al., 1991).
HuH-T7- bzw. BSR T7/5-Zellen wurden mit MARV-spezifischen Expressionsplasmiden sowie 1,0 oder 2,0 µg Minigenomvektor und 1,0 µg pCAGGS/T7 bzw. pTM1 (leer)
transfiziert. Die Zellen wurden nach 2 Tagen wie im vorigen Abschnitt (7.2) beschrieben auf replizierte RNA untersucht. Unter diesen Bedingungen lieferten HuH-T7-Zellen
sehr gute Ergebnisse (Abb. 7). Die aus BSR T7/5 isolierte replizierte RNA zeigte ungewöhnlich hohe Hintergrundsignale, die die spezifischen Banden überlagerten (Daten
nicht gezeigt). Die Zugabe des Plasmids pCAGGS/T7 konnte die Menge an replizierter
RNA erheblich steigern. Die Transfektion von 2,0 µg Minigenomvektor ohne dieses
Plasmid (Abb. 7A Spur 5) erzielte ein deutlich schwächeres Signal als 1,0 µg zusammen mit pCAGGS/T7 (Abb. 7A Spur 3). Um die Menge der transfizierten DNA möglichst gering zu halten, und weil die Transfektion von 1,0 µg Minigenomvektor mit
1,0 µg pCAGGS/T7 ein ausreichend starkes spezifisches Signal lieferte, wurden alle
folgenden Versuche mit replizierter RNA unter diesen Bedingungen durchgeführt.
42
Ergebnisse – Methodisches
Abb. 7. Einfluss von pCAGGS/T7 auf den
Nachweis replizierter RNA aus HuH-T7 im
Northern Blot. HuH-T7-Zellen wurden wie im
Text beschrieben mit MARV-spezifischen
Plasmiden transfiziert. Als Minigenom diente
3M-5M; von pCAGGS/T7 (pT7) wurde 1,0 µg
zugegeben. Der Pfeil markiert die spezifischen
Banden replizierter RNA.
pT7
pTM1/L
µg 3M-5M
+
1,0
1
7.4
+
+
+
1,0
2
3
+
2,0
4
5
+
+
+
2,0
6
7
8
Analyse der T7-RNA-Polymerase-Expression
Um ein Erklärung für die unterschiedlichen Ergebnisse zu finden, wurde die Expression der T7-RNA-Polymerase in den verschiedenen Zellen unter verschiedenen Bedingungen untersucht. In einer Versuchsreihe wurden HuH-T7-, BSR T7/5- und HeLaZellen mit und ohne Infektion mit MVA-T7 auf Expression der T7-RNA-Polymerase im
Western Blot untersucht. Die Zellen wurden dafür in 35 mm Zellkulturschälchen zu einer Dichte von 50% ausgesät. Am nächsten Tag wurden die Zellen wie in 7.1 beschrieben mit MVA-T7 infiziert oder mit 1,0 µg pCAGGS/T7 transfiziert. Nach 48 h wurden die
Zellen gewaschen und in 2x SDS-Probenpuffer lysiert. 10 µl des Lysats wurden auf ein
4%/10% SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen (6.8.1) und im Western Blot (6.8.3) analysiert (Abb. 8). Wie erwartet wurde bei nicht infizierten HeLa-Zellen keine T7-RNAPolymerase nachgewiesen (Spur 5). Während bei nicht infizierten BSR T7/5-Zellen
bereits ein schwaches Signal zu sehen war (Spur 3), konnte bei HuH-T7-Zellen ohne
Infektion keine T7-RNA-Polymerase nachgewiesen werden (Spur 1). Dies erklärt die
oftmals beobachtete schwächere Replikation von Minigenomen in HuH-T7-Zellen verglichen mit BSR T7/5-Zellen (vgl. Abb. 5). Nach Infektion mit MVA-T7 war bei sämtlichen Proben ein deutliches Signal zu sehen (Spuren 2, 4, 6); die Expression in BSR
T7/5-Zellen wurde deutlich gesteigert (Spur 4).
Später, als das Plasmid pCAGGS/T7 zur Verfügung stand, wurde die Expression
der T7-RNA-Polymerase von transfizierten und infizierten Zellen verglichen. HuH-T7-,
BSR T7/5- und HeLa-Zellen wurden dafür in 6er Gewebekulturplatten zu einer Dichte
von 60-70% ausgesät und über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden am nächsten Tag
mit entweder 15 µl MVA-T7 infiziert, mit 1,0 µg pCAGGS/T7 transfiziert oder nur mit
Medium behandelt. Nach 20 h wurde das Medium gegen DMEM komplett mit 2% FCS
ausgetauscht. Nach 48 wurden die Zellen wie oben beschrieben lysiert, und 10 µl des
Lysats in einer SDS-PAGE mit anschließendem Western Blot analysiert (Abb. 8 B). Wie
43
Ergebnisse – Methodisches
bei dem vorigen Experiment zeigten unbehandelte HuH-T7-Zellen keine detektierbare
Expression der T7-RNA-Polymerase (Spur 4), BSR T7/5 nur eine schwache (Spur 1).
Die Ansätze der HeLa-Zellen konnten nicht detektiert werden, da die Zellen durch die
Transfektion mit Fugene zu stark geschädigt wurden. Durch Infektion mit MVA-T7
konnten die Level der T7-RNA-Polymerase deutlich gesteigert werden (Spuren 2 und
5). Die Transfektion des Plasmids pCAGGS/T7 bewirkte ein schwaches Signal in HuHT7-Zellen (Spur 6) und eine Steigerung des Signals in BSR T7/5-Zellen (Spur 3). Obwohl die Infektion mit MVA-T7 eine wesentlich bessere Expression der T7-RNAPolymerase bewirkte, wurde in den folgenden Experimenten das Plasmid pCAGGS/T7
kotransfiziert. Dadurch sollten mögliche Störfaktoren wie z.B. virale Proteine verringert
werden.
A
B
Infektion mit MVA-T7
HuH-T7 BSR T7/5
MVA-T7
Transfektion von pCAGGS/T7
HeLa
-
+
-
+
-
+
1
2
3
4
5
6
BSR T7/5
MVA-T7
pT7
HuH-T7
-
+
-
+
-
+
-
+
1
2
3
4
5
6
Abb. 8. Western-Blot-Analyse der T7-RNA-Polymerase-Expression. Die T7-RNA-Polymerase wurde mit
einem monoklonalen Maus-Antikörper (Novagen, 1:10 000) in Kombination mit einem POD-gekoppelten
Ziege-α-Maus-Antikörper (Dianova, 1:40 000) detektiert. (A) Expression in HuH-T7-, BSR T7/5- und HeLaZellen, die entweder mit MVA-T7 infiziert wurden (Spuren 2, 4, 6) oder nicht (Spuren 1, 3, 5). (B) Vergleich
der Expression von infizierten (MVA-T7) und transfizierten (pT7 = pCAGGS/T7) Zellen. Unbehandelte
Zellen sind in Spuren 1 und 4 aufgetragen.
7.5
Zusammenfassung Kapitel 7
Die Analyse replizierter RNA aus transfizierten Zellen erwies sich häufig als schwierig und nicht gut reproduzierbar. Es wurden mehrere Parameter geändert, um v.a. den
oft starken Hintergrund zu reduzieren. Der MCN-Puffer, die Zelllyse und die Inkubation
mit MCN wurden leicht verändert (7.2). Um die Infektion der Zellen mit MVA-T7 (oder
anderen Viren) zu umgehen, wurden Zelllinien getestet, die konstitutiv die T7-RNAPolymerase exprimieren: BSR T7/5 und HuH-T7. Da jedoch auch mit diesen Zellen
nicht immer gute Ergebnisse erzielt werden konnten, wurden diese Zellen zusätzlich
mit MVA-T7 infiziert oder mit einem Plasmid transfiziert, das die T7-RNA-Polymerase
kodiert. Die Expression der T7-RNA-Polymerase wurden im Western Blot überprüft,
und die Expressionslevel verglichen (Abb. 8). Wenn die unterschiedlichen Bedingungen zur Analyse replizierter RNA im Northern Blot benutzt wurden, so korrelierte die
Effizienz der Signale mit der Expression der T7-RNA-Polymerase (Abb. 5). Obwohl
BSR T7/5-Zellen nach Transfektion des pCAGGS/T7-Plasmids eine höhere Expression
der T7-RNA-Polymerase zeigten (Abb. 8B), war der Hintergrund oft so hoch, dass die
44
Ergebnisse – Methodisches
spezifischen Banden der replizierten RNA nicht mehr zu erkennen waren (Daten nicht
gezeigt). HuH-T7-Zellen hingegen zeigten nur die spezifischen Banden ohne viel Hintergrund (Abb. 7). Die optimierte Methode lieferte oft sehr gute Ergebnisse, aber leider
nicht immer. Ein Grund für den schlechten oder fehlenden Nachweis replizierter RNA,
auch unter optimierten Bedingungen, scheint die Passagenummer der Zellen zu sein;
war diese zu hoch, dann wurden keine zufriedenstellenden Ergebnisse erzielt.
45
Ergebnisse – Transkriptionsstart-Signal von MARV
8
Sekundärstrukturanalyse des Transkriptionsstart-Signals (TSS)
des Marburgvirus
Für das EBOV konnte gezeigt werden, dass die Sekundärstruktur, die im Bereich
des Transkriptionsstart-Signals (TSS) gebildet wird, die Notwendigkeit von VP30 zur
Transkriptionsaktivierung bestimmt (Weik et al., 2002). Da das MARV kein VP30 für
effiziente Transkription benötigt (Mühlberger et al., 1998), war es interessant zu untersuchen, welche Sekundärstruktur das TSS des MARV bildet und ob Mutationen einen
Einfluss auf die Notwendigkeit von VP30 haben. Deshalb wurde die Sekundärstruktur
des TSS des MARV durch chem. Modifizierung experimentell bestimmt. Durch gezielte
in vitro-Mutagenese wurde versucht, die Sekundärstruktur des EBOV-spezifischen TSS
zu simulieren.
8.1 Sekundärstrukturanalyse des MARV-spezifischen leaders
8.1.1
Klonierung der Positivstrang-Minigenome 2.1.1 CAT Mut und 3M-5M (+)
Zur Bestimmung der RNA-Sekundärstruktur über chemische Modifizierung (6.5.7)
benötigt man eine Bindungsstelle für den Primer, die etwa 40-50 nts von der zu bestimmenden Sequenz entfernt ist. Die zu analysierende Struktur beginnt 48 nts vom 3’Ende entfernt, was eine Analyse am Negativstrang-Minigenom sehr schwierig macht,
weshalb auf ein Positivstrang-Minigenom zurückgegriffen werden musste. Ein Minigenom in positiver Orientierung, 2.1 CAT Mut, war bereits im Labor vorhanden
(Mühlberger et al., 1998). Allerdings basierte es auf einer falschen Sequenz, bei der
ACA85-87 mit CAC angegeben worden war. Diese drei Nukleotide wurden durch in vitroMutagenese mit Primern #1190 und #1191 (Anlagerungs-Temp.: 52 °C) zurückmutiert,
um 2.1.1 CAT Mut zu erhalten.
Die Klonierung von 3M-5M (+) erforderte mehrere Schritte. Als erstes wurde eine
PCR (6.6.1) mit Primern #211 und #1264 durchgeführt (Anlagerungs-Temp.: 55 °C).
Durch #1264 wurden eine XmaI-Schnittstelle und die T7-Promotor-Sequenz eingefügt.
Die PCR-Produkte wurden aufgereinigt und mit PvuII und XmaI verdaut; als Vektor
wurde 3R-5R (+) (Boehmann, 2003) ebenso verdaut, um den EBOV-R-spezifischen
leader zu entfernen. Nach Ligation lag ein Konstrukt mit MARV-spezifischem leader
und EBOV-R-spezifischem trailer vor (3M-5R (+)). Um den trailer auszutauschen, wurden 3M-5R (+) und 2.1.1 CAT Mut mit NcoI und RsrII verdaut, und das 623 bp Fragment von 2.1.1 CAT Mut in den Vektor 3M-5R (+) ligiert. Das resultierende Plasmid 3M5M (+) weist folgende Unterschiede zu 2.1.1 CAT Mut auf:
46
Ergebnisse – Transkriptionsstart-Signal von MARV
nt(s)
1
103
107-113
116
118
Region
leader
3’-NTR NP-Gen
CAT-Gen
2.1.1 CAT Mut
G
T
CGGCCGC
A
A
3M-5M (+)
A
G
TTTTTAT (Vaccinia Terminator)
C
T
Tabelle 5. Unterschiede der Positivstrang-Minigenome 2.1.1 CAT Mut und 3M-5M (+). Die Nummerierung bezieht sich auf die Negativstrang-RNA des Minigenoms 3M-5M.
8.1.2
Analyse der Wildtyp-Sekundärstruktur
Analysen des 3’-Endes des MARV-Genoms mithilfe des Webservers „mfold“
(http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/rna) sagen im leader und in der 3’NTR des NP-Gens stabile Sekundärstrukturen voraus (Mathews et al., 1999, Zuker,
2003). Wie in Abb. 9 gezeigt ist, unterscheiden sich die vorhergesagten Strukturen von
genomischer und antigenomischer RNA nur sehr wenig. Aufgrund der verwendeten
Methode zur Bestimmung der Sekundärstruktur (6.5.7) konnte die Negativstrang-RNA
nicht untersucht werden.
Als Matrize für die Transkription diente das Plasmid 2.1.1 CAT Mut (s.o.). Die DNA
wurde mit Sal I linearisiert und in vitro transkribiert (6.5.5). 50 µg der RNA wurden mit
CMCT modifiziert und 1,0 µg mit DMS (6.5.7). Alle Ansätze wurden einer PrimerExtension mit Primer #862 unterzogen (6.5.4), und die unmodifizierte DNA-Matrize
(2.1.1 CAT Mut) wurde parallel mit demselben Primer radioaktiv sequenziert (6.5.9).
Nach der Auftrennung auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel wurde eine BioImager-Platte aufgelegt und eingescannt (Abb. 10). Die zwei hairpin-Strukturen, die von
B
A
3’
5’
Abb. 9. Computervorhersage der RNA-Sekundärstruktur im 3'-Terminus des MARV Genoms. (A) Vorhergesagte Struktur der genomischen (Negativstrang) RNA. (B) Vorhergesagte Struktur der antigenomischen
(Positivstrang) RNA. Die Nummerierung der Nukleotide bezieht sich auf die Negativstrang-RNA von
MARV Stamm Musoke. In beiden Fällen ist das Transkriptionsstart-Signal mit einem Strich markiert, und
die loops (ungepaarte Bereiche) sind durchnummeriert.
47
Ergebnisse – Transkriptionsstart-Signal von MARV
der Software „mfold“ vorgeschlagen wurden (Abb. 9), konnten im Wesentlichen bestätigt werden. Der Vergleich der Modifikationsmuster der chemischen Modifizierung auf
die vorhergesagte Struktur verifizierte, dass das TSS (bis auf das erste nt, G49) komplett gepaart vorliegt. Auch loop 6 (Abb. 9B) wurde bestätigt; lediglich das abschließende Basenpaar A68•U77 scheint zeitweise geöffnet zu sein. Des Weiteren scheint
loop 5 (Abb. 9B) größer zu sein als vorgeschlagen: nts UCU83-85 liegen ungepaart vor,
ebenso UU76-77 und UU63-64. Da auf der jeweils gegenüberliegenden Seite des vorhergesagten Stammes keine ungepaarten Basen vorliegen, sind diese Modifikationen eventuell auf instabile, d.h. sich öffnende und schließende, loops zurückzuführen. Wie
beim Basenpaar A68•U77 scheint das den Stamm abschließende Basenpaar A50•U97
ebenfalls zeitweise ungepaart vorzuliegen.
Zur ersten vorhergesagten hairpin-Struktur, die nts 1-37 umfasst (Abb. 10B), sind
weniger Daten auswertbar, da die Auftrennung keine Unterscheidung der einzelnen
Banden zulässt. Das letzte, als modifiziert zu erkennende Nukleotid, ist A16. Dieses
schließt laut Vorhersage loop 2 ab, der teilweise bestätigt wurde. Innerhalb der Stammregion sind nur noch zwei weitere Nukleotide modifiziert, A26 und A35, die auch als ungepaart berechnet wurden. U36, welches zu einem A•U Basenpaar am Ende eines
loops gehört, ist modifiziert worden, aber laut Vorhersage gepaart. Wie in den Fällen
zuvor, ist dies wahrscheinlich auf eine weniger stabile Paarung zurückzuführen. Der
Bereich zwischen den beiden Sekundärstrukturen, nts 38-59, wurde als ungepaart bestätigt. Die Computervorhersage stimmt demnach weitestgehend mit den Ergebnissen
der chemischen Modifizierung überein. Allerdings scheinen die ungepaarte Bereiche
abschließenden A•U Basenpaare teilweise ungepaart vorzuliegen. Außerdem ist der
interne loop 5 größer als berechnet, was wahrscheinlich ebenfalls durch ein Gleichgewicht aus gepaarten und ungepaarten Zuständen bedingt ist. Abb. 10 zeigt die aus den
Daten abgeleitete Sekundärstruktur der ersten 106 Nukleotide der antigenomischen
MARV-RNA.
48
Ergebnisse – Transkriptionsstart-Signal von MARV
A
A
DMS
+
-
CMCT
+
B
B
2.1.1 CAT Mut (DNA)
-
T
G
C
DMS
+
A
-
CMCT
+
2.1.1 CAT Mut (DNA)
-
T
G
C
A
A48
A50
G49
A16
A18
A20
A23
A26
A10
A60
A20
UU63/64
G22
T30
A35
A38
U36
UU39/41
A40
AAA42-44
AAA46-48
U45
T70
UUG69-71
A72
A74
C75
G73
UU76/77
C80
A50
5’-G1GACACACAA10AAACAAGAGA20TGATGATTTT30
GTGTATCATA40TAAATAAA...-3’
Abb. 10. Ergebnis und Interpretation der chemischen
Modifizierung von in vitro transkribierter 2.1.1 CAT
Mut-RNA (Autoradiogramme). Das Plasmid 2.1.1
CAT Mut wurde mit SalI linearisiert und in vitro transkribiert. 12,5 µg der RNA wurden zur chem. Modifizierung mit CMCT eingesetzt, 1,0 µg für die Modifizierung mit DMS. Zu den Kontrollansätzen (-) wurde
das Modifikationsagens nicht zugegeben. Nach der
Modifizierung wurden die RNAs gefällt und mit radioaktiv markiertem Primer #862 in einer RT-Reaktion
eingesetzt. 2,0 µg der DNA-Matrize 2.1.1 CAT Mut
wurden alkalisch denaturiert, gefällt und mit demselben Primer sequenziert. 5,0 µl der Reaktionen wurden auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel
analysiert. (A) Modifikationsmuster der ersten 48 nts
(1-48). (B) Bereich vom Transkriptionsstart-Signal
(nts 49-60) bis zum AUG des NP-Gens (nt 104). Die
gekennzeichneten Nukleotide wurden modifiziert,
d.h. sie liegen ungepaart vor. Im unteren Teil der
Abbildungen sind die Modifikationen auf die Primärsequenz übertragen: Grau hinterlegte Nukleotide
wurden entweder durch DMS (A und C) oder CMCT
(G und U) modifiziert. Die Sequenz der Matrize wurde gespiegelt, um der Sequenz der RNA zu entsprechen. (C) Die Ergebnisse der chem. Modifizierung
wurden auf die Computervorhersage von „mfold“
übertragen. Ungepaarte interne Bereiche (loops) sind
durchnummeriert (2-6). Der Sequenzbereich, der
nicht analysiert werden konnte, ist grau dargestellt.
U83
C84
U85
A90
U97
G98
A99
A100
A100
G101
A102
G103
A104
U105
5’-...GA50AGAAUAUUAA60CAUUGACAUU70GAGACUUGUC80
AGUCUGUUAA90UAUUCUUGAA100GAGAUG...-3’
C MARV leader
20
G A
4
U
G
A
A U
C G
A 3 A
A U
A U
10 A U
A U30
C G
A U
C G
A U
C 2 A
A U*
5’ A G C A
A G
A
C
U
U
A U*
C G
A U
G C 80
*U A
*U G
*
5 U
C*
A U*
C G
60 A U
A U
U A
U A 90
A U
U A
A U
A U
G C
A U
U A U A A A U A A A G A U* G A A G A G A U G 3’
nts 1-106 RNA (+)
A
G
A
G
40
6
70 U
50
100
Unterstrichene nts wurden modifiziert; da in einigen Fällen nur ein nt eines vorhergesagten Basenpaares
modifiziert worden ist, sind diese mit einem Sternchen (*) gekennzeichnet und die Bindungen gestrichelt.
Besonders loop 5 konnte nicht eindeutig charakterisiert werden. Das Transkriptionsstart-Signal ist mit einer
(roten) Linie markiert, das AUG Startcodon des NP-Gens ist umrahmt.
49
Ergebnisse – Transkriptionsstart-Signal von MARV
8.2 Chimären aus MARV- und EBOV-Transkriptionsstart-Signalen
Die Sekundärstruktur um das TSS bei EBOV RNA war bereits bekannt (Weik et al.,
2002). Nachdem für MARV eine komplett andere Struktur nachgewiesen wurde, stellte
sich die Frage, ob MARV das EBOV-TSS (inkl. der Nukleotide, die für die Ausbildung
der Sekundärstruktur verantwortlich sind) erkennt (a). Außerdem sollte untersucht werden, ob die EBOV-spezifische Sekundärstruktur erkannt würde, wenn das MARVspezifische TSS erhalten bleibt (b). Dafür wurden zwei Mutanten durch je zwei aufeinander folgende in vitro-Mutagenese-Schritte hergestellt: Konstrukt tss_MARV→EBOV,
um Fragestellung (a), und tss_MARV1→EBOV2, um Fragestellung (b) zu beantworten.
8.2.1
Klonierung der MARV/EBOV TSS Chimären
Plasmid tss_MARV→EBOV wurde durch zweifache in vitro-Mutagenese (6.6.2) von
3M-5M [215] Mut 1 hergestellt. Als erstes wurde eine PCR mit Primern #1063 und
#1064 (Anlagerungs-Temp.: 50 °C) durchgeführt. Mit dem aufgereinigten Produkt folgte
die zweite Runde mit Primern #1128 und #1129 (Anlagerungs-Temp.: 50 °C). Die Matrize 3M-5M [215] Mut 1 enthielt bereits zwei Austausche: U51→C und A55→C. Dadurch
wurden insgesamt 10 nts gegenüber 3M-5M verändert (Tabelle 6).
Für das Konstrukt tss_MARV1→EBOV2 wurde 3M-5M einer in vitro-Mutagenese mit
Primern #1178 und #1179 unterzogen, gefolgt von einer PCR mit Primern #1180 und
#1181 (Anlagerungs-Temp.: 52 °C). In beiden Schritten wurden jeweils 3 nts ausgetauscht (Tabelle 6).
Konstrukt
3M-5M
tss_MARV→EBOV (1)
tss_MARV→EBOV (2)
tss_MARV1→EBOV2 (1)
tss_MARV1→EBOV2 (2)
Sequenz (–)-RNA (3’→5’)
...C49UUCUUCUAAUU60GUAACUGUAA70CUCUGAACAG80...
...C49UCCUUCUAAUU60AUUAAAAGGA70GUCUGAACAG80...
...C49UCCUUCUAAUU60AUUAAAAGGA70GUCUGAACAG80...
...C49UUCUUAUAAUU60AUUACAGUAA70CUCUGAACAG80...
...C49UUCUUAUAAUU60AUUACAAGAA70GUCUGAACAG80...
Tabelle 6. Sequenzen der MARV/EBOV-Transkriptionsstart-Signal-Chimären. Durch in vitro-Mutagenese
eingeführte Substitutionen sind durch einfache Unterstreichung markiert, wohingegen doppelt unterstrichene Nukleotide bereits in der Matrize ausgetauscht waren. In den Klammern ist angegeben, ob das
Konstrukt das Produkt der ersten oder zweiten PCR ist. Die Sequenz des TSS ist grau hinterlegt.
8.2.2
Analyse der Sekundärstruktur von tss_MARV1→EBOV2 (+) RNA
Um zu überprüfen, ob die Einführung der EBOV-spezifischen Sekundärstruktur erfolgreich war, wurde neben einer Computervorhersage (Abb. 11) wieder eine chemische Modifizierung an in vitro transkribierter Positivstrang-RNA durchgeführt. Dazu
musste das Minigenom tss_MARV1→EBOV2 zunächst in (+)-Orientierung umkloniert
werden. Ähnlich der Herstellung von 3M-5M (+) wurde eine PCR mit Primern #211 und
#1264 durchgeführt (Anlagerungs-Temp.: 55 °C); als Matrize wurden die Negativ50
Ergebnisse – Transkriptionsstart-Signal von MARV
strang-Plasmide
benutzt
[es
wurden
auch die anderen chimären Konstrukte
außer tss_MARV→EBOV (1) umkloniert,
aber nicht weiter verwendet]. Nach Restriktion mit PvuII und XmaI wurden die
PCR-Fragmente in 3M-5M (+) ligiert, das
gleichermaßen geschnitten worden war.
Die chemische Modifizierung wurde wie
in 6.5.7 beschrieben durchgeführt. Das
Ergebnis entsprach nur teilweise der
Computervorhersage (Abb. 12A und B) Abb. 11. Computervorhersage der (+) RNA von
und war auch sonst nur schwer zu inter- tss_MARV1→EBOV2. Das Transkriptionsstart-Signal
pretieren. Viele Nukleotide waren nur
ist rot hervorgehoben.
sehr schwach, aber reproduzierbar, modifiziert (z.B. UG69/70). Zudem gab es bei nts 7174 eine Diskrepanz zwischen der Standardsequenzierung (6.5.8), die die gewünschte
Sequenz eindeutig bestätigte (Abb. 12C), und der radioaktiven Sequenzierung (Abb.
12B Kasten). Auch die Banden der modifizierten RNA sind an dieser Stelle unscharf.
Die teils nur schwachen Modifikationen und die fehlende Übereinstimmung mit in silicoAnalysen legen den Schluss nahe, dass es sich um ein Gleichgewicht zweier Strukturen handelt. Dabei enthält die eine tatsächlich die EBOV-spezifische Sekundärstruktur
(Abb. 12D, Struktur II), die allerdings etwas instabiler ist. In beiden Fällen liegt jedoch
das TSS bis auf ein Nukleotid gepaart vor.
8.2.3
Analyse der Replikations- und Transkriptionsaktivität der MARV/EBOV
TSS-Chimären
Beide Konstrukte, tss_MARV→EBOV und tss_MARV1→EBOV2, wurden im rekonstituierten Minigenomsystem (3.5) auf ihre Fähigkeit überprüft, repliziert und transkribiert
zu werden. Es wurden sowohl MARV- als auch EBOV-spezifische Nukleokapsidproteine getestet. Da die Abhängigkeit der Transkription von VP30 bei EBOV mit der Ausbildung der Sekundärstruktur in Verbindung steht (Weik et al., 2002), wurde der Einfluss
von VP30 auf die Transkription genauer untersucht.
51
Ergebnisse – Transkriptionsstart-Signal von MARV
A
A
DMS
+
-
+
-
A35
A38
A40
AAA42-44
AAA46-48
A20
A59
A60
A62
A63
U*21
T30 C*A*71/72
U36
UU39/41
A40
U45
5’-G1 GACACACAA10AAACAAGAGA 20UGAUGAUUUU 30
GUGUAUCAUA40UAAAUAAA...-3’
C
C
DMS
+
A10
A16
A18
A20
A23
A26
BB
tss_MARV1->
EBOV2 (DNA)
T
G
C
A
CMCT
C80
A81
A*89
A*9 0
A*92
-
tss_MARV1->
EBOV2 (DNA)
T
G
C
A
CMCT
+
G49
A50
U*58
U61
A60
UG*UU64-67
U*G*69/70
T70
UG*U77-79
G73
C80
U*87
U*88
A90
G*91
A99
A100
A100
A102
A104
U*105
G106
5’-...GA50AGAAUAUUAA 60UAAUGUUCUU 70CAGACUUGUC 80
AGUCUGUUAA90UAUUCUUGAA 100GAGAUG...-3’
D
D
I
dG=-29.5
II
dG=-28.9
Abb. 12. Ergebnis der chemischen Modifizierung von in vitro transkribierter tss_MARV1→EBOV2 (+)
RNA. Die RNA wurde wie im Abbildungstext zu Abb. 10 beschrieben modifiziert und auf einem Polyacrylamidgel analysiert. (A) Modifikationsmuster der ersten 48 nts (1-48). Das Sternchen (*) markiert nur
schwach modifizierte Nukleotide. (B) Bereich vom Transkriptionsstart-Signal (nts 49-60) bis zum AUG des
NP-Gens (nt 104). Die markierten Nukleotide sind modifiziert worden, d.h. sie liegen ungepaart vor. Im
unteren Teil der Abbildungen sind die Modifikationen auf die Primärsequenz übertragen: Grau hinterlegte
Nukleotide wurden entweder durch DMS (A und C) oder CMCT (G und U) modifiziert; grau umrahmte
Nukleotide waren nur sehr schwach modifiziert. Der gestrichelte Kasten zeigt den Bereich an, der sich
vom Ergebnis der Standardsequenzierung unterscheidet. (C) Chromatogramm der Sequenzierung der
DNA-Matrize mit Primer #211. Das Kästchen zeigt die Nukleotide, die in der radioaktiven Sequenzierung
nicht eindeutig bestimmt werden konnten. (D) Interpretation der Ergebnisse. Es scheint ein Gleichgewicht
zwischen den beiden Strukturen I und II zu herrschen, da die Modifikationsmuster keine genaue Aussage
zulassen. Die EBOV-spezifische Sekundärstruktur (II) ist laut Vorhersage energetisch etwas ungünstiger.
52
Ergebnisse – Transkriptionsstart-Signal von MARV
Zur Analyse der Transkriptionsaktivität der Mutanten im CAT-Assay (6.7.1) wurden
HuH-T7-Zellen mit den Expressionsplasmiden der Nukleokapsidproteine (pTM1/L,
pTM1/VP35, pTM1/NP, pTM1/VP30) von entweder MARV oder EBOV und dem entsprechenden Minigenomvektor transfiziert (6.2). Zellen wurden 48 h p.t. lysiert und
1,0 µl des Zelllysats im CAT-Assay eingesetzt. Der Nachweis replizierter RNA durch
Northern-Blot-Analyse (6.4.11) wurde nur mit MARV-spezifischen Plasmiden durchgeführt. HuH-T7-Zellen wurden mit den Expressionsplasmiden pTM1/LM, pTM1/VP35M,
pTM1/NPM, dem entsprechenden Minigenomvektor und pCAGGS/T7 transfiziert. An
Tag 2 p.t. wurden die Zellen lysiert, die replizierte RNA isoliert und im Northern Blot
analysiert. Sowohl Transkription als auch Replikation waren bei beiden Mutanten stark
beeinträchtigt. Im CAT-Assay konnte gezeigt werden, dass weder EBOV- noch MARVspezifische Proteine in der Lage sind, tss_MARV→EBOV und tss_MARV1→EBOV2 zu
transkribieren (Abb. 13A). Da transkribierte RNA nur nach vorausgegangener Replikation nachgewiesen werden kann (Mühlberger et al., 1998), wurde replizierte RNA direkt
analysiert. Tatsächlich war bei beiden Ansätzen die Replikation stark bis sehr stark
(Abb. 13B). Anscheinend replizierte Mutante tss_MARV→EBOV (Spur 4), welche
10 nts Unterschied zu 3M-5M aufweist, besser als Mutante tss_MARV1→EBOV2 (Spur
6) mit nur 6 Unterschieden. Allerdings lässt die Methodik des Northern Blots keine genaue Quantifizierung zu, und in Wiederholungsversuchen waren beide Signale fast
nicht detektierbar (Daten nicht gezeigt). Die starke Reduktion der replizierten RNA und
das Fehlen von CAT-Aktivität lässt darauf schließen, dass sowohl der Promotor für
Replikation als auch Transkription durch die Mutationen des TSS betroffen sind. In den
folgenden Experimenten ging es nun darum, die Struktur der Promotoren näher zu untersuchen.
53
Ergebnisse – Transkriptionsstart-Signal von MARV
A
Transkriptionsaktivität der MARV/EBOV TSS-Chimären
100%
wt
tss_MARV->EBOV
tss_MARV1->EBOV2
90%
rel. CAT-Aktivität zu wt-Minigenom
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
+VP30
B
-L
EBOV-Plasmide
M 3M-5M
pTM1/L
1
-VP30
M→E M1→E2
+
-
+
-
+
-
2
3
4
5
6
7
-VP30
-L
+VP30M
MARV-Plasmide
+VP30E
Abb. 13. Replikations- und Transkriptionsaktivität der
MARV/EBOV TSS-Chimären. HuH-T7-Zellen wurden
wie im Text beschrieben transfiziert. (A) Ausgewertet
wurde die CAT-Aktivität 48 h p.t. Als Referenz (d.h.
100%) wurde bei „EBOV-Plasmide“ 3E-5E mit VP30
eingesetzt, bei „MARV-Plasmide“ 3M-5M ohne VP30.
Angezeigt ist der Mittelwert von mind. 2 Experimenten. (B) Northern Blot replizierter RNA. M: Marker
(vgl. Abb. 5); M→E: tss_MARV→EBOV; M1→E2:
tss_MARV1→ EBOV2. Die Pfeile verweisen auf die
Bande der replizierten RNA,
8.3 Zusammenfassung Kapitel 8
Dieses Kapitel beschäftigte sich mit der Analyse des Transkriptionsstart-Signals
(TSS) von MARV. Durch chemische Modifizierung wurde die Sekundärstruktur der Positivstrang-RNA bestimmt (Abb. 10), die sich deutlich von der des EBOV-TSS unterscheidet (Weik et al., 2002). Chimären aus MARV- und EBOV-spezifischem TSS zeigten nur noch stark eingeschränkte Replikation und keine CAT-Aktivität (Abb. 13). Durch
chemische Modifizierung konnte gezeigt werden, dass die gewünschte Sekundärstruktur, MARV-TSS-Sequenz mit EBOV-ähnlicher Struktur, nicht die stabilste ist (Abb. 12).
Deshalb konnte keine eindeutige Aussage getroffen werden, ob die Sekundärstruktur
per se wichtig ist.
54
Ergebnisse – Genomische Promotorelemente
9
Lokalisierung und Charakterisierung der genomischen Promotorelemente für Replikation und Transkription
Die genomische RNA von Negativstrang-RNA-Viren ist im Gegensatz zu der von
Positivstrang-RNA-Viren per se nicht infektiös. Zunächst werden von der genomischen
RNA mRNAs transkribiert, die dann für die Translation in Proteine genutzt werden
kann. Später dient das Genom als Matrize für die Replikation, wobei jedoch der Mechanismus bzw. der Auslöser des Umschaltens von Transkription auf Replikation noch
nicht endgültig geklärt und zudem für die einzelnen Mononegavirales unterschiedlich
sein kann. Beispielsweise reguliert beim Rabiesvirus das Matrixprotein M die Replikation (Finke et al., 2003). Die Promotoren für Transkription und (genomische) Replikation
sind mit größter Wahrscheinlichkeit im leader und der 3’-NTR des NP-Gens lokalisiert.
In diesem Kapitel wird die Lokalisierung und Charakterisierung der Promotorelemente
beschrieben.
9.1 Analyse der Promotorelemente bei MARV
9.1.1
Deletionsmutanten der 3’-NTR von 3M-5M
Als erster Schritt zur Kartierung der beiden Promotoren wurden Deletionsmutanten
der 3’-NTR von MARV(nts 1-103) in 3M-5M hergestellt. Dafür wurden im Minigenom
3M-5M Nukleotide aufwärts des CAT-Gens (Abb. 14) deletiert. Die Fragmente wurden
mittels PCR erzeugt (Tabelle 7), mit NdeI und RsrII verdaut, über ein Gel gereinigt und
in 3M-5M ligiert.
3M-5M RNA
leader
1
48
VΘ
3’
TSS
3’-Del.
61
3’-NTR (NP)
103
5’-Del.
CAT-Gen
5’
trailer
18679
18946
19111
5’-NTR (L)
Abb. 14. Schematischer Aufbau der minigenomischen 3M-5M-RNA. Die RNA ist in negativer Orientierung (3’–5’) gezeigt; das Positivstrang-Minigenom ist 5’–3’ orientiert. Die nicht-transkribierten Bereiche
(leader und trailer) sind als leere Kästen dargestellt, das Transkriptionsstart-Signal (TSS) schraffiert. Die
grauen Kästen repräsentieren die transkribierten, aber nicht translatierten Sequenzen des NP- bzw. LGens. Diese und leader bzw. trailer werden hier als 3’- bzw. 5’-NTR zusammengefasst. 3’-Del. und 5’Del. zeigen die Bereiche an, die deletiert wurden. Die Nummerierung entspricht der Genomposition in
MARV Musoke. VΘ: Vaccinia-Terminator.
55
Ergebnisse – Genomische Promotorelemente
Fragment
∆10 (∆96)
∆20 (∆86)
∆30 (∆76)
∆32 (∆74)
∆34 (∆72)
∆35 (∆71)
∆36 (∆70)
∆40 (∆66)
Primer 2
#1066
#1067
#1068
#1276
#1300
#1277
#1299
#1069
Temp.
50 °C
50 °C
50 °C
51 °C
52 °C
51 °C
52 °C
50 °C
nicht deletiert
1-96
1-86
1-76
1-74
1-72
1-71
1-70
1-66
Tabelle 7. Erzeugung der Deletionsmutanten
des 3M-5M-leaders. Als Matrize diente bei
allen Reaktionen 3M-5M, und als erster Primer #1059. Der Name der Fragmente in
Klammern entspricht den Nukleotiden, die
noch vorhanden sind (nach M. Weik), der
andere denen, die deletiert wurden. Temp.:
Anlagerungs-Temperatur der PCR. Die Fragmente sind von einer NdeI- und RsrIISchnittstelle flankiert.
Alle Deletionsmutanten wurden im MARV-spezifischen Minigenomsystem auf Replikations- und Transkriptionsaktvität untersucht. HuH-T7-Zellen wurden mit den Plasmiden der Nukleokapsidproteine (pTM1/LM, pTM1/VP35M, pTM1/NPM) sowie dem entsprechenden Minigenomvektor transfiziert (6.2) und 2 Tage p.t. entweder im CATAssay (6.7.1) oder Northern Blot (6.4.11) analysiert. Auf Transkriptionsebene hatten
Deletionen von nt 106 bis einschließlich nt 71 mäßig bis keinen Einfluss (Abb. 15A). Es
war keine direkte Abhängigkeit der Transkription von der Anzahl der deletierten
Nukleotide erkennbar. Mutanten 3M-5M leader ∆20, ∆30, ∆32 und ∆35 waren mit 4065% die schwächsten Konstrukte, während ∆10, ∆34 und ∆36 etwa 100% Aktivität
aufwiesen. Wurden 40 nts deletiert (∆40), d.h. die ersten 66 nts waren noch vorhanden,
so war keine Transkriptionsaktivität zu detektieren. Bei der Analyse der replizierten
RNA (Abb. 15B) war ebenfalls kein klares Muster zu erkennen. 3M-5M leader ∆36 wurde am stärksten repliziert (Spur 7), ∆34 beispielsweise aber eher schwach (Spur 5).
Konstrukt 3M-5M leader ∆40 (Spur 8) war in keinem der Experimente zur Replikation
fähig. Die fehlende CAT-Aktivität ist demnach höchstwahrscheinlich auf fehlende
Replikation zurückzuführen. Wichtige Elemente für Replikation und evtl. Transkription
scheinen daher innerhalb der ersten 69 nts der 3’-NTR von MARV zu liegen. Als nächstes sollte durch gezielte Mutationen die Struktur der Promotoren charakterisiert werden.
56
Ergebnisse – Genomische Promotorelemente
A
Transkriptionseffizienz der 3M-5M 3'-NTR Deletionsmutanten
160%
140%
rel. CAT-Aktivität zu 3M-5M
120%
100%
80%
60%
40%
20%
0%
3M-5M
3M-5M -L
d10
d20
d30
B
∆
10
1
9.1.2
∆
2
20
30 32 34 35 36 40
∆
∆ ∆ ∆ ∆ ∆
M
-5
M
3
3
9
4
5
6
7
8
d32
d34
d35
d36
d40
Abb. 15. Replikations- und Transkriptionseffizienz der MARV-spezifischen 3'-NTR Deletionsmutanten. HuH-T7-Zellen wurden
wie im Text beschrieben transfiziert. (A)
CAT-Aktivität 48 h p.t. Als Referenz wurde
3M-5M (ohne VP30) gesetzt. Angegeben ist
die Standardabweichung von mind. 3 Experimenten. (B) Northern Blot replizierter RNA.
Analyse auffälliger Motive im 3’-Ende des MARV-Genoms
Die Sequenzen der 3’-NTRs von MARV, EBOV-Z und EBOV-R wurden miteinander
verglichen, um evtl. auftretende Homologien zu finden (Abb. 16).Zwei Motive waren
auffällig und wurden näher untersucht:
a) Zwei aufeinander folgende Hexamere „GUAACU“ bei MARV, die bei EBOVZ und EBOV-R in ähnlicher Form vorkommen (Abb. 16, kursiv)
b) Sich wiederholende U (oder UA) im Abstand von 6 nts (MARV: 6 bzw. 7,
EBOV-Z: 8, EBOV-R: 5 bzw. 6; Abb. 16, fett)
Als erstes wurden von dem zweiten Hexamer „GUAACU“ vier Nukleotide einzeln
durch in vitro-Mutagenese ausgetauscht: 3M-5M leader C65→G, U68→A, A70→U und
C71→G. In der PCR wurde 3M-5M als Matrize mit Primerpaaren #1297#1298,
#1295/1296, #1293/1294 und #1291/1292 eingesetzt (Anlagerungs-Temp.: 52 °C).
HuH-T7-Zellen wurden mit den resultierenden Plasmiden transfiziert und 2 Tage p.t.
auf Replikations- und Transkriptionsaktivität der Minigenome untersucht. Nur bei
C71→G war ein Rückgang der CAT-Aktivität zu beobachten (A) während die anderen
Mutanten etwa wt-Level aufwiesen.
57
Ergebnisse – Genomische Promotorelemente
MARV 3'
UCUGUGUGUUUUU
GUUCUCUACUACU
AAAACACAUAG UAUAŮUUAUUŮ CUUCUŮAUAAUŮ
10
20
30
40
50
60
EBOV 3' GCCUGUGUGUUUUUC UUUCUUCUUAAAAAUCCUA GAAAACACACG CUUAUUGAUA CUCCUUCUAAUU
10
20
30
40
50
60
RES 3'GGCCUGUGUGUUUUUC UUUUUUCCAAAAAAUUCU GAAAAACACACG CUCAUUGAUA CUCCUUCUAAUU
10
20
30
40
50
60
MARV
GUAACŮ GUAACŮ CUGAAC AGUCGACAAUUA
70
80
90
EBOV AUUAAA AGGAGA GUAACU UUAAAU AUAGCC UUAAAU UUAACU UUAACA AUGACA UUAGUGUGGACC
70
80
90
100
110
120
130
RES GUCAAA AGGAGŮ CAAAUŮ CUAUAŮ GUGACŮ UUAACŮ CUAACŮ CUAAGA GGAGAA
70
80
90
100
110
120
Abb. 16. Sequenzvergleich der 3'-NTRs von MARV (Musoke), EBOV-Z und EBOV-R (Pennsylvania). Die
Sequenzen der genomischen RNA wurden so angeordnet, dass ähnliche Abschnitte untereinander stehen. Unterstrichen: TSS; kursiv: sich wiederholendes Hexamer (MARV) mit ähnlichen Motiven bei EBOV –
Z und EBOV-R (Res); fett: im Abstand von 6 nts auftretende U bzw. UA; Ů: alternative UN5 in einem anderen Raster.
Um zu überprüfen, ob diese Reduktion nicht auf eingeschränkte Replikation zurückzuführen ist, wurden B). Mutanten C71→G, U68→A und C65→G (Spuren 4, 6 und 7)
zeigten etwa die gleiche Aktivität wie 3M-5M (Spur 1), während Minigenom A70→U
deutlich besser replizierte (Spur 5). Die Intensität der Banden konnte reproduziert werden.
In der nächsten Versuchsreihe wurden parallel zu EBOV-Z und EBOV-R die aufeinander folgenden Hexamere UN5 untersucht. Dafür wurden die U-Reste dreier HexameB
A
rel. CAT-Aktivität zu 3M-5M
Transkriptionseffizienz der "GUAACU"
Substitutionsm utanten
r
ke - 5M
ar
3 M -L
M
→
1
C7
G
A7
→
0
U
→
8
U6
A
→
G
5
C6
120%
100%
1
80%
60%
40%
20%
0%
3M-5M 3M-5M C71G
-L
A70U
U68A
C65G
2
3
4
5
6
7
Abb. 17. Transkriptionseffizienz der
Substitutionsmutanten des zweiten Hexamers "GUAACU". Die verschiedenen
Mutanten wurden im Minigenomsystem
im CAT-Assay auf Transkriptionsaktivität
(A) bzw. im Northern Blot auf Replikationsaktivität (B) untersucht. Die Ergebnisse der CAT-Assays beruhen auf
mind. zwei unabhängigen Experimenten.
re (nts 62, 68 und 74) durch in vitro-Mutagenese mit Primerpaar #1316/1317 gegen A
ausgetauscht (3M-5M leader 3U→A) und im Minigenomsystem analysiert. Wieder wurden HuH-T7-Zellen mit den notwendigen Plasmiden transfiziert und nach zwei Tagen
auf Replikation und Transkription untersucht. Sowohl die CAT-Aktivität (Abb. 18A) als
auch die Menge an replizierter RNA (Abb. 18B) waren signifikant reduziert. Die UReste in den aufeinander folgenden UN5 Hexameren (nts 62-79) spielen also eine
wichtige Rolle für effiziente Replikation im Minigenomsystem.
58
Ergebnisse – Genomische Promotorelemente
A
B
CAT-Assay von 3M-5M leader 3U→A
M 3M-5M
pTM1/L
+
-
2
3
3U→A
+
-
4
5
rel. CAT-Aktivität zu 3M-5M
120%
100%
1
80%
Abb. 18. Untersuchungen der Replikation und Transkription von 3M-5M
leader 3U→A. (A) Analyse der
Transkriptionsfähigkeit mittels CATAssay der Mutante. Die angegebenen
Werte sind das Mittel aus 3 Experimenten. (B) Northern Blot replizierter
RNA.
60%
40%
20%
0%
3M-5M
3M-5M -L
3U->A
Um zu untersuchen, ob eine Erhöhung der Anzahl der UN5-Hexamere eine Steigerung der Effizienz bewirken konnte, wurden 2 (CGUAAAUAUAGC) oder 3 (CGUAACU
UUAAAUAUUGC)
UN5-Motive
(U-Reste
sind
unterstrichen)
des
EBOV-Repli-
kationspromotors an Pos. 79 durch in vitro-Mutagenese eingefügt (das kursiv gedruckte
Nukleotid ist nicht in der EBOV-Sequenz enthalten sondern resultierte aus falscher
Primer-Überlappung). Die beiden Konstrukte, 3M-5M leader +2x EBOV UN5 und 3M5M leader +3x EBOV UN5, wurden zunächst im CAT-Assay untersucht (Abb. 19). Es
war allerdings keine signifikante Steigerung der CAT-Aktivität messbar.
CAT-Assay von 3M-5M leader +EBOV UN5
rel. CAT-Aktivität zu 3M-5M
140%
125%
120%
110%
100%
100%
80%
60%
40%
20%
0%
0%
3M-5M
3M-5M -L
+ 2x UN5
+ 3x UN5
Abb. 19. Einfluss der Insertion von
EBOV UN5 in den Replikationspromotor
des MARV. Hinter nt 78 in 3M-5M wurden entweder 12 (2x UN5) oder 18 (3x
UN5) nts des EBOV-Replikationspromotors eingefügt, um die Anzahl der UN5Hexamere zu erhöhen. Beide Konstrukte sind Produkte einer in vitro-Mutagenese an 3M-5M mit Primerpaar
#1656/#1657 (vgl. 13.1), in welcher
verschiedenste Insertionen entstanden.
BSR T7/5-Zellen wurden mit den Minigenomkomponenten transfiziert, 2 d p.t.
lysiert, und 1,0 µl des Lysats wurde im
CAT-Assay eingesetzt. Die Werte repräsentieren das Mittel aus 3 unabhängigen Experimenten.
9.2 Analyse des Replikationspromotors des EBOV
Zu Beginn dieser Arbeit war über die Struktur des Replikationspromotors von EBOV
bereits einiges bekannt (Schlenz, 2002, Weik, 2001):
•
Die ersten 94 nts unterstützen Replikation
59
Ergebnisse – Genomische Promotorelemente
•
Der Promotor ist zweigeteilt; Promotorelement (PE) 1 und PE2 sind durch einen
spacer getrennt, dessen Sequenz unwichtig ist, dessen Länge aber nur in 6erSchritten verändert werden darf
•
Das zweite Promotorelement enthält Motive im Abstand von sechs Nukleotiden
(ein Merkmal der „rule of six“)
•
Substitutionen von nts 55-90 und 84-110 werden toleriert.
Diese Ergebnisse waren z.T. widersprüchlich, und PE2 blieb weitgehend uncharakterisiert. Diese Lücke zu füllen war ein Teil dieser Doktorarbeit.
9.2.1
Deletionsmutanten der 3’-NTR von 3E-5E
Zunächst wurden zusätzlich zu den von M. Weik (2001) angefertigten Deletionsmutanten vier weitere hinzu gefügt (die Zahlen geben die noch verbleibenden Nukleotide
an): 3E-5E leader ∆140, ∆130, ∆125 und ∆121, weil in diesem Bereich eine starke
Abnahme der Replikation zu beobachten war. Diese Mutanten wurden im Minigenomsystem auf Replikation und Transkription untersucht. BSR T7/5-Zellen wurden mit den
Plasmiden der Nukleokapsidproteine VP35, NP und L sowie den Minigenomvektoren
transfiziert und 2 d p.t. analysiert. Die CAT-Aktivität der Mutanten ∆130, ∆125 und
∆121 gleicht der von 3E-5E oder ist etwas stärker; 3E-5E leader ∆140 hingegen zeigte
im Mittel nur etwa 50% Aktivität (Abb. 20A). Diese Tendenz findet sich auch auf dem
Level der replizierten RNA (Abb. 20B). Dies lässt darauf schließen, dass hauptsächlich
die Replikation beeinflusst ist. Die Beobachtung, dass die Replikationsaktivität zwischen ∆150 und ∆108 stark abnimmt (Weik, 2001) konnte nicht bestätigt werden. Es
scheint sogar eher, dass mit zunehmender Deletion die Replikationsaktivität ansteigt
(Abb. 20B). Das zweite Promotorelement scheint demnach nicht zwischen nts 150 und
108 lokalisiert zu sein.
A
rel. CAT-Aktivität zu 3E-5E
200%
B
Transkriptionsaktivität der 3E-5E 3'-NTR
Deletionsm utanten
40
∆1
30
∆1
25
∆1
21
∆1
3E-5E
-L
+L
180%
160%
140%
120%
1
100%
80%
60%
40%
20%
0%
3E-5E
3E-5E -L
d140
d130
d125
d121
2
3
4
5
6
Abb. 20. Analyse der Deletionsmutanten
des 3E-5E-leaders. BSR T7/5-Zellen
wurden mit den mutierten Minigenomen
transfiziert und 2 d p.t. analysiert. (A)
Ergebnisse der CAT-Assays von mind. 5
verschiedenen Ansätzen. (B) Northern
Blot der replizierten RNA.
60
Ergebnisse – Genomische Promotorelemente
9.2.2
Charakterisierung des zweiten Promotorelements von EBOV
Nachdem die zusätzlichen Deletionsmutanten keinen eindeutigen Einfluss gezeigt
hatten, wurden in Analogie zu MARV auffällige Motive näher untersucht. Für das Sendaivirus wurde gezeigt, dass bei Austausch eines C des Motivs (CN5)3 die Replikation
erlischt (Tapparel et al., 1998). Da dieses Motiv auch bei EBOV zwischen nts 108 und
125 vorkommt und sich mit dem wiederholt auftretenden Hexamer „GUAACU“ bei
MARV teilweise deckt (Abb. 16), wurde das mittlere C (nt 114) durch eine in vitroMutagenese gegen A ausgetauscht (3E-5E leader x114). Die Tests im Minigenomsystem (CAT-Assay und Northern Blot replizierter RNA) zeigten, dass diese Substitution
keinen Einfluss auf die Replikationseffizienz hatte (Abb. 21).
Als nächstes wurden die Hexamere UN5 untersucht. Im Fall von EBOV-Z folgen 8
Hexamere aufeinander (nts 81-128), von denen 7 der Struktur UAN4 entsprechen. Ausgehend von nt 81 wurden von 3’ nach 5’ (vRNA Orientierung) die U-Reste mittels in
vitro-Mutagenese gegen A ausgetauscht (Tabelle 8).Die resultierenden Plasmide wurden zur Transfektion von HuH-T7-Zellen eingesetzt. Nach zwei Tagen wurden die Zellen geerntet und entweder im CAT-Assay oder Northern Blot analysiert. Im CAT-Assay
zeigte sich eine deutliche Abhängigkeit der Replikations- bzw. Transkriptionseffizienz
von der Anzahl der noch vorhandenen intakten Hexamere UN5: Je mehr U-Reste substituiert wurden, desto schwächer war das Signal (Abb. 21A). Bei 5 substituieren Us
(3E-5E leader 5U→A) war nur noch eine sehr schwache Bande replizierter RNA sichtbar (Abb. 21B Spur 5). Ebenso war das CAT-Signal auf knapp 20% des Wildtyps (3E5E) gesunken (Abb. 21A). Waren nur noch zwei Hexamere intakt (3E-5E leader
6U→A), so verringerte sich das Signal auf Hintergrundstärke. Das Ergebnis konnte im
Northern Blot (Abb. 21) bestätigt werden. Demnach sind mind. drei der aufeinander
folgenden Hexamere UN5 ein wichtiger Bestandteil des zweiten Promotorelements.
Das schwache Signal der Positivkontrolle 3E-5E im Northern Blot (Abb. 21B, Spur 1) ist
sehr wahrscheinlich auf eine schlechte DNA-Qualität zurückzuführen, da auch in anderen Experimenten ungewöhnlich niedrige Replikation beobachtet wurde (Daten nicht
gezeigt).
Konstrukt
3E-5E leader 3U→A
3E-5E leader 4U→A
3E-5E leader 5U→A
Primerpaar
#1318/#1319
#1416/#1417
#1418/#1419
Matrize
3E-5E
3E-5E leader 3U→A
3E-5E leader 6U→A
Temp.
44 °C
50 °C
50 °C
3E-5E leader 6U→A
#1349/#1350
3E-5E leader 3U→A
48 °C
Subst. nts
81,87, 93
81,87, 93, 99
81,87, 93,
99, 105
81,87, 93,
99, 105, 111
#UN5
5
4
3
2
Tabelle 8. Eigenschaften der 3E-5E leader UN5 Substitutionsmutanten. Temp.: Anlagerungs-Temperatur
während der in vitro-Mutagenese; Subst. nts: Position der Basen (U), die gegen A ausgetauscht wurden;
#UN5: Anzahl der verbleibenden Hexamere UN5.
61
Ergebnisse – Genomische Promotorelemente
Dieses Ergebnis trug dazu bei, die bisher widersprüchlichen Ergebnisse der Deletions- und Substitutionsmutanten (Schlenz, 2002, Weik, 2001) zu erklären. Anhand der
Deletionsmutanten wurde der Bereich des zweiten Promotorelements grob zwischen nt
90 und 100 kartiert. Substitution genau dieses Bereiches (nts 84-110) wurde jedoch
toleriert. Dies kann erklärt werden, wenn jegliche drei aufeinander folgenden Hexamere
UN5 als Promotorelement genutzt werden können. Im Falle von 3E-5E leader ∆92, einer replikationsdefizienten Mutante, waren nur noch zwei Hexamere intakt (U an Pos.
81 und 87), während die Mutante 3E-5E leader ∆94, die noch repliziert wurde, drei
aufwies (U an Pos. 81, 87 und 93) (Weik et al., 2005). Die Substitution von nts 84-110
ließ drei Hexamere mit U-Resten an Pos. 111, 117 und 123 übrig, aber bei Substitution
von nts 84-120 fehlte das U an Pos. 111 (vgl. Abb. 22).
Diese Annahme konnte durch einen weiteren Versuch gefestigt werden: In der Mutante 3E-5E ∆250 x90-110 (mit Austausch der nts 84-110) wurden zwei der noch vorhandenen drei Hexamere durch in vitro-Mutagenese zerstört (U111→A und U117→A;
Primerpaar #1644/#1645; Anlagerungs-Temp.: 48 °C). Das erhaltene Minigenom, 3E5E ∆250 x90-110 2U→A, wurde in HuH-T7-Zellen auf Replikationsfähigkeit getestet.
Im Northern Blot konnte gezeigt werden, dass die eingeführten Substitutionen die
A
Transkriptionsaktivität der 3E-5E leader nU→ A
Substitutionsmutanten
180%
rel. CAT-Aktivität zu 3E-5E
160%
140%
120%
100%
80%
60%
40%
20%
0%
3E-5E
B
3E
1
E
-5
-L
2
3U
3
A
→
4U
4
→
A
5U
5
3E-5E -L
A
→
6
6U
→
A
E
-5
3E
7
x114
14
x1
8
3U->A
4U->A
5U->A
6U->A
Abb. 21. Analyse der 3E-5E leader Substitutionsmutanten. Transfizierte HuH-T7-Zellen wurden nach 2 Tagen
lysiert und untersucht. (A) Ergebnisse der CAT-Assays
von mind. 5 unabhängigen Experimenten. (B) Nachweis
replizierter RNA im Northern Blot. Die Positivkontrolle 3E5E ist in mehreren Experimenten zu schwach gewesen,
was höchstwahrscheinlich mit schlechter DNA-Qualität
zu begründen ist.
62
Ergebnisse – Genomische Promotorelemente
Replikation zum Erliegen brachten (Abb. 22A). Es scheint also, dass das zweite Promotorelement keine feste Position mit Bezug auf das 3’-Ende der genomischen RNA
haben muss, sondern dass der Abstand zwischen PE1 und PE2 in 6er-Schritten variieren kann.
9.2.3
Ist das Motiv (UN5)3 hinreichend als zweites Promotorelement?
Interessant war jetzt zu überprüfen, ob das gefundene Motiv (UN5)3 bzw. (UAN4)3
nicht nur notwendig, sondern auch hinreichend als zweites Promotorelement ist.
Gleichzeitig sollte die Hypothese, dass jegliche drei aufeinander folgende Hexamere
UN5/UAN4 benutzt werden können, weiter gefestigt werden. Dazu wurden zwei inaktive
Insertions-/Deletionsmutanten aus den Untersuchungen zur „rule of six“, 3E-5E leader
∆250 +5 und ∆250 -5, sowie eine inaktive Substitutionsmutante (3E-5E leader ∆250
x90-120) (Schlenz, 2002) durch Punkmutationen verändert. Durch das Primerpaar
#1526/#1527 wurden in ∆250 +5 die A-Reste and Pos. 99, 105 und 111 zu U mutiert
(Anlagerungs-Temp.: 48 °C), wodurch drei aufeinander folgende und richtig positionierte UN5 entstanden; das Konstrukt wurde 3E-5E leader ∆250 +5 3U genannt. Plasmid
3E-5E ∆250 -5 hingegen wies schon drei Hexamere UN5 mit U-Resten an Pos. 93, 99
und 105 auf, wurde aber trotzdem nicht repliziert (Schlenz, 2002). In diesem Konstrukt
wurde daher das jeweils auf die U-Reste folgende Nukleotid gegen A ausgetauscht.
Die in vitro-Mutagenese wurde mit Primerpaar #1618/#1619 (Anlagerungs-Temp.:
40 °C) durchgeführt und das Produkt 3E-5E leader ∆250 -5 3UA genannt. Mit Plasmid
3E-5E leader ∆250 x90-120 wurden zwei in vitro-Mutagenesen durchgeführt, um das
Motiv (UN5)3 an zwei verschiedenen Stellen wieder herzustellen. Nts G87 und G93 wurden durch Primerpaar #1634/#1635 zu U ausgetauscht (3E-5E leader ∆250 x90-120 3’
UN5), G111 und G117 durch Primerpaar #1636/#1637 (3E-5E leader ∆250 x90-120 5’
UN5). Alle Plasmide wurden im Minigenomsystem auf Replikation untersucht. HuH-T7Zellen wurden mit den die Nukleokapsidproteine kodierenden Plasmiden und den Minigenomvektoren transfiziert und 2 d p.t. lysiert. Replizierte RNA wurde isoliert und im
Northern Blot analysiert. Kein Konstrukt mit rekonstituiertem (UN5/UAN4)3-Motiv wurde
repliziert (Abb. 22B und C). Weder die modifizierte Insertionsmutante 3E-5E leader
∆250 +5 3U, noch die modifizierte Deletionsmutante 3E-5E leader ∆250 -5 3UA zeigten replizierte RNA trotz vorhandenem Motiv (UN5)3 bzw. (UAN4)3 (Abb. 22B, Spuren 3
und 5). Auch die Einführung des Motivs an zwei unterschiedlichen Stellen in der Substitutionsmutante 3E-5E leader ∆250 x90-120 konnte die Replikationsfähigkeit nicht wieder herstellen. Das Motiv (UN5)3 ist demnach zwar notwendig, aber nicht hinreichend
als zweites Promotorelement.
63
Ergebnisse – Genomische Promotorelemente
A
B
x90-110
1
x90-110
2U→A
pTM1/L
2
∆250 +5
3U
∆250
∆250 -5
3UA
+
-
+
-
+
-
1
2
3
4
5
6
C
x90-120
x90-120
x90-120 5’ UN5
∆250
3’ UN5
1
2
3
4
Abb. 22. Northern-Blot-Analyse des Motivs (UN5/UAN4)3 in Derivaten von 3E-5E leader ∆250. (A) Zerstörung des (UN5)3-Motivs in 3E-5E ∆250 x90-110. (B) (UN5)3 bzw. (UAN4)3 eingefügt in 3E-5E ∆250 +5 bzw.
-5. (C) 3E-5E ∆250 x90-120 mit eingefügtem (UN5)3.
9.3 Analyse des Replikationspromotors von EBOV Reston
EBOV-R zeigt in der 3’-NTR viele Homologien zu EBOV-Z und auch MARV (Abb.
16). Auf den Ergebnissen der Analysen von EBOV-Z und MARV aufbauend wurden die
Promotorelemente von EBOV-R grob charakterisiert.
9.3.1
Deletionsmutanten der 3’-NTR von 3R-5R
Um abzuschätzen, welcher Bereich der 3’-NTR von EBOV-R für effiziente Replikation und Transkription nötig ist, wurde die 3’-NTR im Minigenom 3R-5R (Boehmann et
al., 2005) vom CAT-Gen her schrittweise verkürzt (vgl. Abb. 14). Ausgehend von 3R5R wurden verschiedene PCRs durchgeführt (Tabelle 9), die Produkte mit NdeI und
RsrII verdaut und in mit NdeI- und RsrII-geschnittenen Vektor 3R-5R ligiert.
Fragment
∆250
∆150
∆125
∆100
∆95
∆89
Primer 2
#1462
#1533
#1534
#1535
#1661
#1662
Temp.
52 °C
52 °C
52 °C
52 °C
55 °C
55 °C
nicht deletiert
1-250
1-150
1-125
1-100
1-95
1-89
Tabelle 9. Erzeugung der Deletionsmutanten des 3R-5R-leaders. Als erster Primer
diente bei allen Reaktionen #340, als Matrize 3R-5R. Der Name der Fragmente entspricht den Nukleotiden, die noch vorhanden
sind. Temp.: Anlagerungs-Temperatur der
PCR. Die Fragmente besitzen eine NdeIund eine RsrII-Schnittstelle.
Im bisherigen EBOV-R-spezifischen Minigenomsystem wurde sehr viel DNA zur
Transfektion benötigt (Boehmann, 2003). Um die Zellen weniger zu schädigen, wurden
die Plasmidmengen reduziert. Als optimale Plasmidmengen für die Isolierung replizierter RNA ergaben sich: 1,0 µg Minigenomvektor, 1,5 µg pTM1/LR, 0,7 µg pTM1/NPR,
0,35 µg pTM1/VP35R und 0,5 µg pCAGGS/T7; CAT-Assays wurden nicht durchgeführt.
HuH-T7-Zellen wurden nach diesem Schema transfiziert und 2 d p.t. auf replizierte
RNA untersucht. Die anschließende Northern-Blot-Analyse zeigte, dass, wie auch bei
EBOV Zaire beobachtet, ein großer Teil der 3’-NTR deletiert werden kann (Abb. 23).
Deletionen bis nt 250 (3R-5R leader ∆250) wurden sehr gut toleriert, während darauf
folgende Deletionen die Replikationseffizienz verminderten (3R-5R leader ∆150,
64
Ergebnisse – Genomische Promotorelemente
∆125). Die ersten 100 nts (3R-5R leader ∆100) zeigten ein sehr schwaches, aber reproduzierbares Signal replizierter RNA (Abb. 23, Spuren 6+8). Alle weiteren Deletionsmutanten, bei denen 95 oder weniger Nukleotide vorhanden waren (3R-5R leader
∆95 und ∆89), zeigten keine Replikation mehr (Abb. 23, Spuren 9+10). Die wichtigen
Elemente für Replikation liegen demnach in den ersten 100-125 nts des EBOV-RGenoms.
3R-5R
+L
1
9.3.2
∆250
-L
2
3
∆150
4
∆125
5
M
∆100
6
∆125
7
∆100
8
∆95
9
∆89
Abb. 23. Northern-BlotAnalyse replizierter RNA
der
3R-5R-leader-Deletionsmutanten. M: in vitro
transkribiertes 3E-5E (+).
10
Analyse der Motive (UN5)3 und (CUAANN)2
Die beiden Motive wurden in Analogie zu MARV und EBOV-Z untersucht. Als erstes
wurden in 3R-5R gleichzeitig C103 und C109 durch A ersetzt. Die in vitro-Mutagenese
wurde mit Primerpaar #1302/#1303 bei 53 °C durchgeführt. HuH-T7-Zellen wurden für
einen CAT-Assay mit folgenden Plasmidmengen transfiziert: 2,0 µg Minigenomvektor,
1,0 µg pTM1/LR, 0,5 µg pTM1/NPR, 0,5 µg pTM1/VP35R und 0,5 µg pTM1/VP30R. Nach
zwei Tagen wurden die Zellen lysiert, und 1,0 µl des Lysats für die CAT-Reaktion eingesetzt. Es konnte wie bei MARV und EBOV-Z keine Abnahme der Transkription/Replikation beobachtet werden (Daten nicht gezeigt). Daher wurde das Augenmerk
auf das Motiv (UN5)3 gerichtet. 3R-5R wurde mit Primerpaar #1460/#1461 mutiert (Anlagerungs-Temp.: 50 °C), wodurch U92 und U104 zu A substituiert wurden (3R-5R leader
2U→A). Da sich bei MARV und EBOV-Z eine Auswirkung auf die Replikation gezeigt
hatte, wurde nur auf replizierte RNA untersucht. HuH-T7Zellen wurden mit den Plasmiden der Nukleokapsidproteine
3R-5R
+L
-L
1
2
∆250 2U→A
und den Minigenomen wie unter 9.3.1 beschrieben transfiziert und 2 d p.t. lysiert. Replizierte RNA wurde im Northern
Blot nachgewiesen (Abb. 24). Die Replikation wurde auch in
diesem Fall signifikant reduziert. Im Vergleich zu 3R-5R
3
4
(Spur 1) oder 3R-5R leader ∆250 (Spur 3) ist das Signal von Abb. 24. Northern-Blot-Ana3R-5R leader 2U→A (Spur 4) deutlich schwächer. Das Motiv lyse des Motivs (UN5)3 in der
3’-NTR von 3R-5R. ∆250: 3R-
(UN5)3 scheint folglich auch ein Bestandteil des Replikati- 5R leader ∆250; 2U→A: 3Ronspromotors des EBOV-R zu sein.
5R leader 2U→A.
65
Ergebnisse – Genomische Promotorelemente
9.4 Zusammenfassung Kapitel 9
In diesem Kapitel wurden die Replikationspromotoren von MARV, EBOV-Z und EBOV-R untersucht. Bei EBOV-Z war schon einiges aus früheren Arbeiten bekannt,
nicht aber die genaue Struktur der Promotorelemente. Für MARV und EBOV-R gab es
kaum Daten. Für die Replikation von MARV-spezifischen Minigenomen sind die ersten
69 nts der 3’-NTR ausreichend (Abb. 15), aber auch die U-Reste dreier repetetiver Hexamere der Form UN5 (mit U an Pos. 62, 68 und 74) haben sich als wichtig erwiesen
(Abb. 18). Auch wenn EBOV-Z und EBOV-R sehr wahrscheinlich eine sehr ähnliche
Promotorstruktur zeigen, so unterscheidet sie sich von der des MARV deutlich. Die
Signale für Replikation und Transkription scheinen zum Teil zu überlappen, d.h. es gibt
auch keine spacer-Sequenz, da Mutationen des Transkriptionsstart-Signals und der
folgenden Nukleotide auch die Replikation stark beeinflusst haben (Abb. 13). Die
(UN5)3-Hexamere finden sich auch in der 3’-NTR von EBOV-Z und EBOV-R und spielen dort eine wichtige Rolle für effiziente Replikation (Abb. 21, Abb. 24). Für EBOV stellen sie zumindest einen Teil des zweiten Promotorelements dar. Die Motive (UN5)3 oder
(UAN4)3 waren allerdings nicht ausreichend, um die Replikationsfähigkeit von inaktiven
EBOV-spezifischen Minigenomen wieder herzustellen (Abb. 22).
66
Ergebnisse – Antigenomischer Replikationspromotor
10 Lokalisierung und Charakterisierung des antigenomischen
Replikationspromotors
10.1 Mutanten der 5’-NTR von 3M-5M, 3E-5E und 3R-5R
Während am 3’-Ende des filoviralen Genoms Promotoren für Replikation und Transkription vorhanden sind, befindet sich im 5’-Ende lediglich ein Replikationspromotor
(Mühlberger et al., 1998). Die komplementäre Sequenz der 5’-NTR dient beim Antigenom als Analog zur 3’-NTR des Genoms und beinhaltet somit sämtliche Signale für
Enkapsidierung und Replikation. Bei MARV, EBOV-Z und EBOV-R sind die ersten 1214 nts von Genom und Antigenom identisch (Abb. 25). Des Weiteren gibt es große Bereiche bis etwa zum TSS, die hohe Homologie aufweisen. Dies lässt darauf schließen,
dass die Promotoren der genomischen und antigenomischen Replikation sehr ähnlich
oder sogar identisch sind.
MARV
.
.
.
.
Le 2 CUGUGUGUUUUUGUUCUCUACUACU...AAAACACAUAGUAUAU 42
||||||||||||
|||||| ||
|||||||| | ||||
cTr 2 CUGUGUGUUUUU....UCUACUUCUUACAAAACACAAUGAAUAU 41
EBOV
.
.
.
.
.
Le 2 CCUGUGUGUUUUUCUUUCUUCUU......AAAAAUCCUAGAAAACACACGCU 47
||||||||||||| ||||| |
||||||
||||||||||||
cTr 2 CCUGUGUGUUUUUUCUUCUUUAUCUAAAUAAAAAUUU..AAAAACACACGCU 51
Reston
.
.
.
.
.
Le 3 CCUGUGUGUUUUUCUUUUUU...CCAAAAAAU.UCUGAAAAACACACGCUCAUUG 53
|||||||||||||| |||||
||||||||| |
|||||||||||| ||||
cTr 2 CCUGUGUGUUUUUCCUUUUUUAACCAAAAAAUAUUACAAAAACACACGCGAAUUG 56
Abb. 25. Vergleich der genomischen und antigenomischen Enden von MARV, EBOV-Z und EBOV-R. Le:
leader (3’-Ende des Genoms); cTr: Komplementärer trailer (3’-Ende des Antigenoms). Die Nummerierung
entspricht der Position im Genom (Le) bzw. im Antigenom (cTr).
Um den Bereich einzugrenzen, der essentiell für die antigenomische Replikation ist,
wurde die 5’-NTR des L-Gens vom Transkriptionsstopp-Signal ausgehend verkürzt. Die
Deletionen in 3E-5E und 3M-5M wurden anfänglich in Negativstrang-Minigenome eingeführt, die so erzeugten Konstrukte danach aber in Positivstrang-Minigenome umkloniert, um die Auswirkung auf die antigenomische Replikation direkt untersuchen zu
können. Weitere Deletionsmutanten wurden nur in (+)-Orientierung erzeugt. Die Fragmente wurde durch PCR an entweder dem Positivstrang- oder NegativstrangMinigenom hergestellt (Tabelle 10). Als Schnittstellen wurden für (+)-Konstrukte NotI
und SacI verwendet, für (–)-Konstrukte EcoRV und NotI.
67
Ergebnisse – Antigenomischer Replikationspromotor
Fragment
EBOV ∆151
EBOV ∆121
EBOV ∆110*
EBOV ∆100*
EBOV ∆90*
Primer 2
#1404
#1405
#1530
#1531
#1532
Temp.
50 °C
50 °C
50 °C
50 °C
50 °C
Pos./Neg.#
(+)/(–)
(+)/(–)
(+)
(+)
(+)
nicht deletiert§
1-151
1-121
1-110
1-100
1-90
MARV ∆150
MARV ∆105
MARV ∆100*
MARV ∆95*
MARV ∆90
#1395
#1396
#1528
#1529
#1397
52 °C
52 °C
50 °C
50 °C
52 °C
(+)/(–)
(+)/(–)
(+)
(+)
(+)/(–)
1-150
1-105
1-100
1-95
1-90
Reston ∆132*
Reston ∆102*
#1536
#1537
50 °C
50 °C
(+)
(+)
1-132
1-102
Tabelle 10. Daten zur Klonierung der 5’-NTR Mutanten von MARV, EBOV-Z und EBOV-R. * Diese Klone
wurden zwar fertiggestellt, bisher konnten jedoch noch keine auswertbaren Ergebnisse erzielt werden.
#
Deletionen im Negativstrang-Minigenom [(-)] und/oder Positivstrang-Minigenom [(+)]; als 1. Primer diente
#339 für (+)- und #340 für (–)- Konstrukte. Die erzeugten Fragmente haben eine NotI- und EcoRV- bzw.
SacI-Schnittstelle. § Die Nummerierung der nicht-deletierten nts bezieht sich auf die 3’-Enden des Antigenoms.
Zusätzlich wurden im trailer des Negativstrang-Minigenoms 3M-5M vier U-Reste (nts
-86, -92, -98 und -104) durch in vitro-Mutagenese mit Primerpaar #1402/#1403 (Anlagerungs-Temp.: 50 °C) zu A mutiert. Die Replikation der Konstrukte wurde im Minigenomsystem
untersucht.
HuH-T7-Zellen
wurden
mit
den
Plasmiden
pTM1/L,
pTM1/VP35, pTM1/NP und dem entsprechenden Minigenomvektor transfiziert (6.2).
2 d p.t. wurde aus den Zellen die replizierte RNA isoliert und im Northern Blot analysiert. Für die Negativstrang-Minigenome wurde wie zuvor eine DIG-markierte CATSonde gegen (–)-CAT zur Detektion eingesetzt, für Positivstrang-Minigenome wurde
eine (+)-CAT Sonde DIG-markiert (6.5.6). Wie in der 3’-NTR der Minigenome konnte
auch in der 5’-NTR von 3M-5M und 3E-5E ein Großteil der Sequenz entfernt werden,
ohne dass die Replikation eingeschränkt wurde (Abb. 26). Im negativsträngigen Minigenom 3M-5M waren die letzten 90 nts des trailers ausreichend, die Replikation zu
ermöglichen (Abb. 26A Spur 5). Wurden dieselben Deletionen im PositivstrangMinigenom 3M-5M (+) untersucht, so waren 90 nts als antigenomischer Replikationspromotor reproduzierbar nicht mehr ausreichend (Abb. 26C Spur 5); lediglich in
einem Experiment wurde eine sehr schwache Bande replizierter RNA detektiert (nicht
gezeigt). Im EBOV-spezifischen System wurden Minigenome, die die letzten 151 nts
enthielten, deutlich effizienter repliziert als diejenigen, bei denen die 5’-NTR auf 121 nts
verkürzt war. Dies wurde sowohl für das positivsträngige (Abb. 26B Spuren 3 und 4) als
auch für das negativsträngige (Abb. 26D Spuren 3 und 4) Minigenom beobachtet. Die
in Tabelle 10 mit einem „*“ markierten Konstrukte wurden mehrfach getestet, aber aufgrund technischer Schwierigkeiten konnten keine auswertbaren Ergebnisse erzielt
werden.
68
Ergebnisse – Antigenomischer Replikationspromotor
A
C
3M-5M
-L
∆150
∆105
∆90
1
2
3
4
5
3M-5M
(+)
-L
∆150
(+)
∆105
(+)
∆90
(+)
1
2
3
4
5
4U→A
B
6
D
3E-5E
-L
∆151
∆121
1
2
3
4
-L
∆151
(+)
∆121
(+)
1
2
3
Abb. 26. Northern-Blot-Analyse replizierter RNA der 5’-NTR Mutanten. Auswirkung der Deletionen und
Substitution bei Negativstrang-Minigenomen 3M-5M (A) und 3E-5E (B). Als Vergleich dazu sind in (C) und
(D) die entsprechenden Deletionen (ohne Substitution 4U→A) im Positivstrang-Minigenom aufgezeigt. Der
Pfeil zeigt die schwache Bande der Positivkontrolle (Spur 1). Die Nummerierung zeigt an, wie viele Nukleotide der 5’-NTR noch vorhanden sind. Pfeile verweisen auf die spezifischen Banden der replizierten RNA.
10.2 Zusammenfassung Kapitel 10
Die außergewöhnlich langen nicht-translatierten Regionen des 5’-Endes von MARV
und EBOV-Z wurden schrittweise verkürzt. Um den Effekt auf antigenomische Replikation zu analysieren, wurden die Deletionen in Positivstrang-Minigenome eingebracht.
Von den hergestellten Konstrukten mit verändertem antigenomische Replikationspromotor konnten aufgrund technischer Probleme nur wenige im Minigenomsystem erfolgreich getestet werden. Trotzdem lässt sich aus den erhaltenen Daten schließen, dass
die minimale Sequenz für Replikation etwa 100 nts beträgt, sowohl bei MARV als auch
EBOV-Z. Bei MARV konnte zudem eine Abnahme der Replikation gezeigt werden,
wenn die Us von vier aufeinander folgenden Hexameren UN5 gegen A ausgetauscht
wurden (Abb. 26A, Spur 6).
69
Ergebnisse – Volle-Länge--Rescue-System für MARV
11 Etablierung eines Reverse-Genetik-Systems für MARV
Mithilfe von künstlichen Untersuchungsmethoden wie dem Minigenomsystem und
virusähnlichen Partikeln (VLP) können zwar wichtige Aspekte der viralen Replikation
und Transkription (Signale auf RNA-Ebene und Funktionsanalyse der Nukleokapsidproteine) und des Knospungsprozesses außerhalb des Hochsicherheitslabors
studiert werden. Dennoch ist ein System wünschenswert, welches alle Aspekte des
viralen Lebenszyklus von der Anheftung an die Zelle bis zur Knospung im viralen Kontext untersuchen lässt. Dazu ist ein cDNA-Klon des viralen (Anti-)Genoms notwendig,
der nach Belieben verändert werden kann. Durch Transfektion von geeigneten Zellen
mit der cDNA und den Plasmide, die für die Nukleokapsidproteine kodieren, können
dann rekombinante Viren erzeugt werden (Virus-Rescue). Ein solches System ist für
EBOV bereits seit einigen Jahren verfügbar (Neumann et al., 2002a, Volchkov et al.,
2001). In diesem Kapitel wird die Etablierung eines Volle-Länge-Rescue-Systems für
das MARV beschrieben.
11.1
Klonierungsstrategie
Durch RT-PCR von viraler MARV-RNA (Stamm Musoke, GenBank accession number Z29337) und PCR an bereits vorhandenen MARV-Plasmiden wurden fünf Vektoren
hergestellt, die jeweils einen Teil des MARV-Genoms enthalten (Abb. 27A). Jedes der
Konstrukte befindet sich in einem pBlueScript II KS (+)-Vektor (Stratagene). Die einzel-
A
B
pMARV SacII/ XhoI
BssHII
BssHII
1
SacII
Sma I
800
pBS
Xho I
BssHII
Sac II
Rsr II
leader NP’
T7 promoter
Hδ V
trailer
Stu I
pMARV XhoI/ ApaI
801
3918
XhoI
T7 promoter
leader
pBS
NP
ApaI
Apa I
'NP
VP35
VP35'
pMARV ApaI/ SacI
SspI
3919
8991
ApaI
SacI
'VP35
VP40
GP*
pMARV SacI/ SalI
8992
16726
SalI
SacI
'VP30
VP24
pMARV(+)
Sal I
VP40
22152 bps
VP30'
Ssp I
L
GP*
L'
VP30
pMARV SalI/SacII
16727
19111
SalI
SacII... BssHII
'L
trailer
VP24
SacI
Hδ V
Abb. 27. Klonierungsstrategie für das Volle-Länge-Plasmid pMARV (+). (A) Schematische Darstellung der
Plasmide, die für die Klonierung eingesetzt wurden; der Vektor wurde weggelassen. Eine zusätzliche
SspI-Schnittstelle im GP-Gen (GP*) dient als genetischer Marker. Die angegebenen Zahlen repräsentieren
die Nukleotidposition im MARV-Genom (GenBank accession number Z29337). Die flankierenden Schnittstellen wurden zur Klonierung eingesetzt. (B) Vektorkarte von pMARV (+). Wichtige Schnittstellen sind
angegeben. Das MARV-Genom steht unter der Kontrolle eines T7-RNA-Polymerase-Promotors und wird
durch ein Hepatitis delta Virus-Ribozym (HδV) abgeschlossen. Dadurch wird eine (+)-RNA mit korrekten
Enden synthetisiert.
70
Ergebnisse – Volle-Länge--Rescue-System für MARV
nen Fragmente wurden durch Restriktionsverdau und Ligation zu einem Volle-LängePlasmid, pMARV (+), kombiniert, welches das komplette Antigenom des MARV unter
Kontrolle eines T7-RNA-Polymerase-Promotors enthält. Am 3’-Ende befindet sich ein
Hepatitis delta Virus-Ribozym, das für das korrekte 5’-Ende der durch die T7-RNAPolymerase synthetisierten RNA sorgt (Abb. 27B). Mutationen können in die einzelnen
Kassetten eingebracht werden, die dann das entsprechende Fragment im Plasmid
pMARV (+) ersetzen. Als genetischer Marker, der eine Unterscheidung zwischen rekombinantem und MARV Wildtyp (wt) zulässt, wurde eine zusätzliche SspI-Schnittstelle
in das GP-Gen (nt 6 220) eingefügt. Zusätzlich ist das erste Nukleotid des Genoms
ausgetauscht (A→G), um die Effizienz des T7-RNA-Polymerase-Promotors zu erhöhen
(Pattnaik et al., 1992). Sowohl die Klonierungskassetten als auch das fertige
pMARV (+) waren zu Beginn dieser Arbeit im Labor vorhanden.
11.2
Ermittlung der optimalen Konditionen für effizientes Virus-Rescue
11.2.1 Auswahl der Zelllinie
In Versuchen mit dem Minigenom hatte sich gezeigt, dass HuH-T7-Zellen besser für
den Nachweis replizierter RNA geeignet sind als BSR T7/5-Zellen (7.4), während BSR
T7/5-Zellen die Transfektion besser tolerieren. Zudem ist die Expression der T7-RNAPolymerase in diesen Zellen besser (Abb. 8). Aufgrund der langen Inkubationszeit
nach der Transfektion (6-8 Tage), in welcher die HuH-T7-Zellen häufig starben, wurden
für Rescue-Versuche ausschließlich BSR T7/5-Zellen zur Transfektion eingesetzt. Allerdings wurde für EBOV berichtet, dass der Knospungsprozess in diesen Zellen stark
eingeschränkt ist (Volchkov et al., 2001). Erst die Kokultivierung der transfizierten BSR
T7/5-Zellen mit Vero-Zellen ermöglichte effizientes und reproduzierbares VirusRescue.
11.2.2 Ablauf der Rescue-Experimente
Subkonfluente (etwa 50-70%) BSR T7/5-Zellen wurden in 25 cm²-Flaschen mit den
verschiedenen Ansätzen mittels Fugene 6 transfiziert (6.2). In der Regel wurden drei
Ansätze parallel durchgeführt. Etwa 20 h p.t. wurde das Transfektionsmedium durch
BHK-Medium mit 2-5% NCS ersetzt. An Tag 5 oder 6 p.t. wurden die BSR T7/5-Zellen
im Medium abgekratzt und zur Inokulation von Vero-Zellen (20-40% dicht in 75 cm²Flaschen) benutzt. Als Kontrollen wurde eine Flasche mit einer 1:1 000 Verdünnung
des MARV infiziert, sowie eine Flasche mit 5 ml Medium inkubiert (Mock-Kontrolle).
Nach einer Stunde wurden 15 ml BHK-Medium mit 2-5% NCS zugegeben, und die Ansätze 6 Tage im Brutschrank inkubiert. Für die Lyse der Mischkulturen wurde der Über71
Ergebnisse – Volle-Länge--Rescue-System für MARV
stand abgenommen und aufbewahrt. Die Zellen wurden 5-10 min zu -80 °C gestellt und
danach im Brutschrank aufgetaut, und der Vorgang wurde zweimal wiederholt. Der
Überstand wurde zum Ablösen der Zellen benutzt und die Suspension anschließend
kurz gemischt und durch Zentrifugation (10 min bei 6 000 rpm) von Zelltrümmern befreit. Die Lysate wurden bei 4 °C gelagert und für weitere Versuche eingesetzt. Zur
RNA-Isolierung wurden gewöhnlich Vero-Zellen in 25 cm²-Flaschen mit dem Überstand
der Mischkulturen infiziert. Diese wurden nach 6-12 Tagen im Medium (5 ml) abgekratzt und die Zellen von 1,5 ml der Suspension zur RNA-Isolierung pelletiert (3 min bei
10 000 rpm). Die Isolierung erfolgte nach Standardprotokoll des Herstellers. Die gereinigte RNA wurde in einer RT-PCR mit Primern #1124 und #1125 (35 Zyklen; Anlagerungs-Temp.: 50 °C) eingesetzt, um ein die nts 5 890-6 521 der viralen RNA-Spezies
umfassendes Fragment zu amplifizieren, welches den genetischen Marker (zusätzliche
SspI-Schnittstelle im GP-Gen) enthält. Ein Verdau mit SspI resultiert in zwei Banden
(331 und 301 bp), wenn es sich um rekombinantes MARV handelt. Im Laufe der Experimente haben sich geringfügige Änderungen ergeben, die an den entsprechenden
Stellen erwähnt sind.
11.2.3 Titration der Expressionsplasmide
Basierend auf den Daten des MARV-spezifischen Minigenomsystems (Mühlberger
et al., 1998) wurden verschiedene Kombinationen der Plasmide, die für die Nukleokapsidproteine NP, VP35, VP30 und L des MARV kodieren, zusammen mit pMARV (+)
getestet (Tabelle 11). Um die Expression der T7-RNA-Polymerase zu steigern, wurde
sämtlichen Ansätzen 0,5 µg pCAGGS/T7 zugefügt (vgl. 7.4).
Ansatz pTM1/NPM pTM1/VP30M pTM1/VP35M pTM1/LM pMARV (+)
1
0,5
0,1
0,5
2,0
4 µg
2
0,5
0,1
0,5
1,0
4 µg
3
0,5
0,5
1,0
2,0
4 µg
4
0,5
0,5
0,5
1,0
4 µg
5
0,5
0,1
0,5
2,0
2 µg
6
0,5
0,1
0,5
1,0
2 µg
7
0,5
0,5
1,0
2,0
2 µg
8
0,5
0,5
0,5
--2 µg
Fugene 6
23 µl
20 µl
25,5 µl
21 µl
17 µl
14 µl
19,5 µl
15 µl
Tabelle 11. Titrationsexperiment zum Rescue von rekombinantem MARV. Zu allen Ansätzen wurde
0,5 µg pCAGGS/T7 zusätzlich transfiziert. Der umrahmte Ansatz (2) war der effizienteste.
BSR T7/5-Zellen wurden nach Standardprotokoll (11.2.2) mit den in Tabelle 11 aufgelisteten Plasmiden transfiziert und weiterbehandelt. 5 d p.t. wurden die BSR T7/5Zellen mit Vero-Zellen gemischt und weitere 6 Tage inkubiert. Die Mischkulturen wurden lysiert und Vero-Zellen in 25 cm²-Flaschen mit 2 ml der zentrifugierten Überstände
infiziert, um rekombinantes Virus über RT-PCR nachweisen zu können (11.2.2).
72
Ergebnisse – Volle-Länge--Rescue-System für MARV
Als Kontrolle wurde eine Flasche mit MARV infiziert (1:1 000). Die Ausbildung des
CPE wurde täglich überprüft. Nach 6 Tagen war ein deutlicher CPE in der infizierten
Kontrolle zu sehen, bei Ansatz 2 nach 8 Tagen. Ansatz 3 und 6 zeigten erst nach 10
Tagen einen klaren CPE; Abb. 28A zeigt lichtmikroskopische Aufnahmen der Zellen an
Tag 8 p.i. Als sich ein deutlicher CPE zeigte, wurden die Zellen abgekratzt, in einer
Heraeus Megafuge pelletiert (10 min bei 3 000 rpm) und aus dem Pellet RNA isoliert;
der Überstand wurde bei 4 °C aufbewahrt.
MARV-wt
Mock
Ansatz 2
Ansatz 3
Ansatz 6
Ansatz 8
Abb. 28. Lichtmikroskopische Analyse des rekombinanten MARV. Vero-Zellen wurden mit Passage 1 der
Ansätze 2, 3, 6 und 8 sowie MARV-wt als Referenz infiziert. Die Aufnahmen des CPE erfolgten 8 d p.i.
Mit der RNA wurde eine RT-PCR wie zuvor beschrieben (11.2.2) durchgeführt. Von
der Reaktion wurden 3 µl auf ein 2% Agarosegel aufgetragen und analysiert (Daten
nicht gezeigt). Die RT-PCR-Produkte der positiven Ansätzen (2, 3 und 6) und der
MARV-Kontrolle wurden aufgereinigt (6.4.9) und 5 µl davon mit SspI verdaut. Auf ein
2%iges Agarosegel wurden 3 µl unverdautes RT-PCR-Produkt sowie der Verdau
SspI
A2
- +
A3
- +
A6
- +
wt
- +
1
3
5
7
aufgetragen und analysiert (Abb. 29). Alle
Ansätze der Transfektion zeigten die zwei
600 bp
erwarteten Banden bei 331 und 301 bp
(Spuren 2, 4 und 6), während die Kontrolle
300 bp
nicht verdaut wurde (Spur 8). Das Auftreten der zwei Banden der Kontrolle bei etwa
Abb.
29.
2
4
Restriktionsanalyse
6
der
8
RT-PCR-
640 und 660 bp nach dem Verdau war re- Produkte aus Titrationsexperimenten zum MARVproduzierbar und ist nicht zu erklären. Die Rescue. A2, A3, A6: Ansätze (der Transfektionen)
2, 3 und 6; wt: MARV-Infektion.
73
Ergebnisse – Volle-Länge--Rescue-System für MARV
stärkere Bande in Ansatz 2 (Spur 1) im Vergleich zu Ansatz 3 und 6 (Spuren 3 und 5).
weist darauf hin, dass die Menge an viraler RNA unterschiedlich war. In Spur 2 ist daher auch noch ein schwaches Signal unverdauter DNA zu sehen.
Zusätzlich wurde die Anwesenheit von infektiösem rekombinanten MARV mittels
Immunfluoreszenz-Analyse überprüft. Mit 0,5 ml Überstand aus infizierten Vero-Zellen
(Passage 1, s. oben) der positiven Ansätze (2, 3 und 6), Ansatz 8 (ohne pTM1/LM) und
der MARV-Infektion wurden Vero-Zellen auf Deckgläschen 1 h lang inkubiert. Danach
wurden 2 ml DMEM komplett mit 2% FCS zugegeben und die Zellen für 48 h inkubiert.
Die Proben wurden über Nacht mit 4% PFA in DMEM inaktiviert und am nächsten Tag
analysiert (6.8.4).
MARV-wt
Mock
Ansatz 2
Ansatz 3
Ansatz 6
Ansatz 8
Abb. 30. Immunfluoreszenz-Analyse der Überstände aus dem Titrationsexperiment. VeroZellen wurden mit Überständen der ersten Passage infiziert und nach 48 h inaktiviert. Virales NP wurde mit einem monoklonalen Maus-α-NP-Antikörper detektiert und anschließend
mit Rhodamin-gekoppeltem Ziege-α-Maus-Antikörper gefärbt. Blau: Zellkerne (DAPI).
74
Ergebnisse – Volle-Länge--Rescue-System für MARV
Detektiert wurde das NP des MARV mit einem monoklonalen Maus-α-NP-Antikörper
(1:200) und anschließend gefärbt mit einem Rhodamin-gekoppelten Ziege-α-MausAntikörper (1:200); Zellkerne wurden mit DAPI markiert. Nach Inkubation mit 4% PFA in
DMEM über Nacht wurden die Immunfluoreszenzen ausgewertet (Abb. 30). Die Ansätze, die in der RT-PCR positiv waren (Abb. 29), zeigten auch deutliche Signale in der
Immunfluoreszenz. Die Menge an nachgewiesener viraler RNA schien dabei in etwa
mit der Anzahl infizierter Zellen zu korrelieren: Ansatz 2 zeigte sowohl in der RT-PCR
(Abb. 29 Spur 1) als auch in der Immunfluoreszenz die stärksten Signale. Um dies weiter zu bestätigen, wurden die Titer der Ansätze 2, 3, 6 und 8 über einen TCID50-Assay
(6.1.3) bestimmt. Jeder Ansatz wurde parallel in 4 Spuren getestet. Das Ergebnis nach
11 Tagen ist in Abb. 31 dargestellt. Der Titer von Ansatz 2 unterschied sich nur unwesentlich von dem des MARV-wt, während die Titer der Ansätze 3 und 6 etwa 1,0 bis 1,5
log-Stufen geringer waren.
TCID50 der Ansätze des Titrationsexperiments
1,E+07
1,E+06
TCID50/ml
1,E+05
1,E+04
Abb. 31. TCID50-Analyse der rekombinanten MARV aus Titrationsexperimenten. Der CPE blieb nach 11
Tagen konstant und wurde ausgewertet. Die Negativkontrollen (Ansatz
8, ohne pTM1/L und Mock, ohne
Virus) zeigten keine Zeichen einer
Infektion.
1,E+03
1,E+02
1,E+01
1,E+00
MARV wt Ansatz 2 Ansatz 3 Ansatz 6 Ansatz 8
Mock
Als weiterer Nachweis wurden elektronenmikroskopische Aufnahmen von gereinigten Viruspartikeln angefertigt. Je eine 75 cm²-Flasche mit Vero-Zellen (ca. 50% dicht)
wurde mit 5 ml einer 1:20 verdünnten Virussuspension von MARV-wt oder rekombinantem MARV (Ansatz 2) infiziert. Nach einer Stunde wurde das Inokulum gegen
DMEM komplett mit 2,5% FCS ausgetauscht. An Tag 6 p.i. war in beiden Flaschen ein
deutlicher CPE sichtbar, und die Überstände wurden abgenommen und durch Zentrifugieren von Zelltrümmern befreit (10 min bei 6 000 rpm in einer Heraeus Megafuge).
Virionen wurden wie in 6.1.5 beschrieben in SW28-Röhrchen pelletiert, nach dem
Trocknen in 50 µl 4% PFA in DMEM aufgenommen und über Nacht bei 4 °C gelagert.
Die Proben wurden nach Standardprotokoll (6.1.6) für das Elektronenmikroskop vorbereitet und ausgewertet. Die aufgenommenen Bilder (Abb. 32) zeigen keine Unterschie75
Ergebnisse – Volle-Länge--Rescue-System für MARV
de zwischen rekombinantem MARV und MARV-wt. Beide Proben zeigten die unterschiedlichen charakteristischen Erscheinungsformen von MARV, die von stabartig über
gewinkelt bis zur „6er“-Form reichten.
200 nm
MARV-wt
200 nm
rek. MARV
Abb. 32. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von rekombinantem MARV und MARV-wt (1:70 000).
Viren wurden in Vero-Zellen vermehrt und 6 Tage p.i. über ein Sucrosekissen pelletiert. Nach Inaktivierung
mit 4%PFA wurden die Proben auf einem beschichteten Nickelgitter fixiert und im Elektronenmikroskop
untersucht. MARV-wt: MARV-Wildtyp; rek. MARV: rekombinantes MARV aus Ansatz 2. Der Balken repräsentiert 200 nm.
11.3
Zusammenfassung Kapitel 11
Rekombinantes MARV konnte erfolgreich aus transfizierten BSR T7/5-Zellen nach
Kokultivierung mit Vero-Zellen isoliert werden. Ein deutlicher CPE war an Tag 8 p.i. zu
erkennen. Als Nachweis des rekombinanten Virus wurde eine RT-PCR, die einen Bereich um den genetischen Marker im GP-Gen amplifizierte, durchgeführt, und ein
Restriktionsverdau des Produkts mit SspI brachte die erwarteten Fragmente (Abb. 29).
Immunfluoreszenz-Analyse (Abb. 30) und elektronenmikroskopische Aufnahmen (Abb.
32) zeigten keine Unterschiede zu MARV-wt, und auch die Titer waren nahezu gleich
(Abb. 31). Von verschiedenen Kombinationen der die Nukleokapsidproteine kodierenden Plasmide stellte sich die folgende als sehr effizient heraus: 0,5 µg pTM1/NPM,
1,0 µg pTM1/LM, 0,5 µg pTM1/VP35M, 0,1 µg pTM1/VP30M, 0,5 µg pCAGGS/T7 und
4,0 µg pMARV (+) (Ansatz 2). Diese Plasmidmengen wurden für weitere RescueExperimente eingesetzt. Im Laufe der Experimente wurde lediglich die Menge an
pCAGGS/T7 auf 1,0 µg erhöht.
76
Ergebnisse – Analyse von VP30 des MARV
12 Welche Rolle spielt VP30M im Volle-Länge-Rescue-System?
12.1
Herstellung verschiedener Mutanten des VP30M
Die Funktion des VP30 von MARV ist bisher ungeklärt. Im MARV-spezifischen, artifiziellen Minigenomsystem (Mühlberger et al., 1998) wird es nicht benötigt, was die
Untersuchung auf funktioneller Ebene sehr erschwert hat. Es kann allerdings in geringem Maße die Funktion des VP30 des EBOV (VP30E) übernehmen, wenn es im EBOVspezifischen Minigenomsystem eingesetzt wird (Mühlberger et al., 1999). Die Funktion
und/oder Struktur scheint bei beiden Proteinen daher zumindest ähnlich zu sein. Über
VP30E ist einiges aus Untersuchungen im Minigenomsystem bekannt (vgl. 3.3.1). Um
nun zu untersuchen, ob VP30 im MARV-Rescue notwendig ist und eine strukturelle
und/oder eine funktionelle Komponente des Nukleokapsids ist, wurden zwei Mutanten
des Proteins entworfen.
12.1.1 Klonierung von pMARV (+) VP30knockout
Als erstes sollte ein Volle-Länge-Konstrukt hergestellt werden, welches kein VP30
exprimiert. In dieser Mutante wurden drei Stop-Codons (A8991→U, G8987→U und
U8984→A) und ein zusätzliches Nukleotid (nt 8 989) für eine Verschiebung des Leserasters (frameshift) eingefügt. Dazu wurde mit Primern #74 und #390 eine PCR an pMARV
ApaI/SacI (Abb. 27) durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde gereinigt (6.4.9) und wie
pMARV (+) mit BsrGI und SacI verdaut. Nach Ligation der beiden Komponenten war
das Plasmid pMARV (+) VP30knockout kloniert.
12.1.2 Klonierung von pMARV (+) VP30Zn-Finger knockout und
pTM1/VP30M Zn-Finger knockout
Im Gegensatz zur vorigen Mutante, in welcher das VP30 komplett ausgeschaltet
werden sollte, wurde in pMARV (+) VP30Zn-Finger knockout ein mögliches funktionelles Motiv
zerstört. Sowohl beim VP30 des EBOV als auch des MARV gibt es eine KonsensusSequenz PKDI/MCX8CX4CX3HX2E/D (Cys3-His), welche ein Zink-bindendes Motiv (ZnFinger-Motiv) darstellt. Dieses Motiv wurde bei EBOV gut charakterisiert und die ZinkBindung experimentell nachgewiesen. Mutationen der Cys-Reste oder des His brachten die Transkription zum Erliegen (Modrof et al., 2003). Ob dieses Motiv für die Vermehrung des MARV wichtig ist, sollte durch zwei Ansätze verfolgt werden. Zum einen
wurde das Cys3-His-Motiv im Expressionsplasmid pTM1/VP30M, zum anderen in
pMARV (+) zerstört. Durch das Primerpaar #1547/#1548 wurden in VP30M die nts
G9 143→C und A9 155→U ausgetauscht. Dies bewirkte einen Aminosäureaustausch von
77
Ergebnisse – Analyse von VP30 des MARV
Cys92→Ser und His96→Leu, welche einen Teil des Zn-Finger-Motivs darstellen (Abb.
33). Das Plasmid pTM1/VP30M wurde über in vitro-Mutagenese (6.6.2) mit Hilfe der
beiden Primer mutiert (Anlagerungs-Temp.: 50 °C). Zum anderen wurden dieselben
Mutationen in mehreren Schritten in das Volle-Länge-Plasmid eingebracht. Die Mutagenese des VP30-Gens in der Kassette pMARV SacI/SalI war mehrfach erfolglos, sehr
wahrscheinlich aufgrund der Größe des Plasmids (~10,6 kb). Deshalb wurde aus diesem Vektor zunächst ein großer Teil des L-kodierenden Fragments (nts 12.124-16.726)
durch KpnI-Verdau entfernt. Nach Gelreinigung des großen Fragments (~6 kb) und
Religation wurde mit dem erhaltenen Plasmid pMARV SacI/SalI ∆L die in vitroMutagenese bei 45 °C Anlagerungs-Temperatur wiederholt; die Effizienz war dieses
Mal sehr gut. Das mutierte VP30-Fragment wurde mit EcoRV und SacI herausgeschnitten und in pMARV SacI/SalI kloniert (ebenfalls mit EcoRV und SalI geschnitten). Das
Plasmid pMARV SacI/SalIZn-Finger
knockout
konnte dann über die SacI- und SalI-
Schnittstelle in pMARV (+) kloniert werden. Plasmid pMARV (+) VP30Zn-Finger knockout enthält die gewünschten Mutationen im VP30-Gen des Volle-Länge-Genoms.
VP30M Zn-finger knockout
5’-C9136CC ACT TCT AAT AGA GAT CTT GAC CTT GAT9165 -3’
(mRNA)
(Aminosäuren)
P
T
S92 N
R
D
L 96 D
L
D
Abb. 33. Nukleotid- und Aminosäuresequenz des mutierten Zn-fingers in VP30M. Die Nukleotide wurden
entsprechend der Position im Genom des MARV (Musoke) nummeriert. Die ausgetauschten Nukleotide
sind unterstrichen und die daraus resultierenden Aminosäureaustausche fett gedruckt.
12.2
Expressions- und Kolokalisationsstudien von VP30M Zn-Finger knockout
(pTM1)
Zur Überprüfung der Expressionsrate des VP30M Zn-Finger knockout im pTM1-Vektor wurden HuH-T7-Zellen mit 1,0 und 2,0 µg pTM1/VP30M bzw. pTM1/VP30M
Zn-Finger knockout
sowie 0,5 µg pCAGGS/T7 transfiziert (6.2). 48 h p.t. wurden die Zellen gewaschen, in
500 µl PBSdef abgekratzt und pelletiert (5 min, 10 000 rpm). Die Zellen wurden in 100 µl
PBSdef resuspendiert und mit 100 µl 2x SDS-Probenpuffer lysiert. 20 µl der Lysate wurden auf 6%/12% SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen und aufgetrennt. Anschließend
wurde ein Western Blot gegen VP30M durchgeführt. Als Erstantikörper wurde ein monoklonaler Maus-α-VP30M-Antikörper (1:5 000; Tabelle 4) eingesetzt; als Expressionskontrolle wurde Aktin nachgewiesen (nicht gezeigt). Als Zweitantikörper diente ein Ziege-α-Maus-Antikörper (POD-gekoppelt) (1:40 000; Tabelle 4). Abb. 34 zeigt einen
Röntgenfilm nach 3 s Exposition. Die Expressionsrate ist bei VP30 wt (Spuren 1+2)
und mutiertem VP30M (Spuren 3+4) vergleichbar.
78
Ergebnisse – Analyse von VP30 des MARV
Modrof und Kollegen konnten zeigen, dass
VP30E trotz des zerstörten Zn-Fingers mit NPE inter-
VP30 wt
µg
VP30 Zn ko
1.0
2.0
1.0
2.0
1
2
3
4
agiert, jedoch nicht mehr die Transkription aktiviert
(Modrof et al., 2003, Modrof et al., 2001). Ob VP30M
noch in der Lage war, mit NPM zu inter- Abb. 34. Western-Blot-Analyse der
agieren und damit als Komponente des Nukleo- Expression von VP30M (wt) und VP30M
Zn-Finger knockout
Zn-Finger
knockout
(VP30Zn
ko).
HuH-T7-
kapsids zu fungieren, wurde über Immunfluores- Zellen wurden mit den entsprechenden
pTM1-Plasmiden transfiziert 48 h p.t.
zenz-Analyse untersucht. HuH-T7-Zellen auf Deck- geerntet und analysiert.
gläschen wurden mit 0,5 µg NP und 1,5 µg des VP30-wt oder des mutierten VP30M in
pTM1 sowie 0,5 µg pCAGGS/T7 transfiziert. Als Kontrollen wurden die Expressionsplasmide einzeln transfiziert und dabei mit pTM1 (leer) auf 2,5 µg DNA aufgefüllt.
48 h p.t. wurden die Zellen kurz gewaschen und über Nacht in DMEM mit 4% PFA inkubiert. Am nächsten Tag wurde eine Immunfluoreszenz-Analyse mit Meerschweinchen-α-VP30M/2-Antiserum (1:50; Tabelle 4) und monoklonalem Maus-α-NP-Antikörper
(1:200; Tabelle 4) durchgeführt. Als Zweitantikörper wurden Ziege-α-Maus-Rhodamin
und Ziege-α-Meerschweinchen-FITC eingesetzt (beide 1:200; Tabelle 4). In Abb. 35
sind die Fluoreszenzaufnahmen abgebildet. Sowohl VP30M-wt als auch VP30M Zn-Finger
knockout
zeigten bei solitärer Expression eine gleichmäßige Verteilung im Zytoplasma
(Abb. 35A 2+3), NPM war in den typischen Einschlusskörperchen lokalisiert (Abb. 35A
1). Wurden NPM und VP30M-wt koexprimiert, so verlagerte sich VP30M-wt in die NPEinschlusskörperchen (Abb. 35B 2+3). Dasselbe war bei VP30M Zn-Finger knockout zu beobachten; das Protein war nicht mehr diffus verteilt, sondern war zum größten Teil mit
NPM kolokalisiert (Abb. 35B 5+6). Die diffuse Hintergrundfärbung (Abb. 35B 6) ist mit
der wesentlich größeren Menge an VP30-Plasmid (1,5 µg) im Vergleich zu NP (0,5 µg)
zu begründen.
12.3
Funktionalitätskontrolle von pTM1/VP30M Zn-Finger knockout im EBOVspezifischen Minigenomsystem
Wie schon erwähnt ist die Replikation und Transkription von Minigenomen im
MARV-spezifischen Minigenomsystem unabhängig von der Anwesenheit von VP30.
Allerdings kann VP30M in eingeschränktem Maße die Funktion des VP30E im EBOVspezifischen System übernehmen (Mühlberger et al., 1999). Diese Eigenschaft wurde
benutzt, um die Funktionalität des mutierten Proteins abschätzen zu können.
79
Ergebnisse – Analyse von VP30 des MARV
A
B
Einzelexpression
1
2
3
NP
VP30-wt
VP30 Zn ko
Koexpression
α-NP (Rhodamin)
α-VP30M (FITC)
Merge
2
3
4
5
6
VP30 Zn ko
VP30 wt
1
Abb. 35. Immunfluoreszenz-Studien von VP30M-wt und VP30M Zn-Finger knockout (VP30 Zn ko). (A) HuH-T7Zellen wurden mit entweder pTM1/NPM (1), pTM1/VP30M-wt (2) oder pTM1/VP30M Zn-Finger knockout (3) transfiziert und 48 h p.t. fixiert. (B) Kolokalisationsanalyse von NPM und VP30M. HuH-T7-Zellen wurden mit
pTM1/NPM und entweder pTM1/VP30M-wt (2+3) oder pTM1/VP30M Zn-Finger knockout (5+6) transfiziert und
ebenfalls 48 h p.t. fixiert. Merge: Überlagerung des Rhodamin- und FITC-Signals. Die Pfeile weisen exemplarisch auf NP-Einschlusskörperchen hin. NPM wurde mit einem monoklonalen Maus-α-NP- und Rhodamin-gekoppeltem Ziege-α-Maus-Antikörper detektiert, VP30M mit Meerschweinchen-α-VP30-Antiserum
und FITC-gekoppeltem Ziege-α-Meerschweinchen-Antikörper.
80
Ergebnisse – Analyse von VP30 des MARV
HuH-T7-Zellen wurden mit 1,0 µg 3E-5E, 0,5 µg pTM1/NPE, 0,5 µg pTM1/VP35E,
1,0 µg pTM1/LE und verschiedenen pTM1/VP30-Plasmiden (0,1 µg VP30E, 2,0 µg
VP30M, 2,0 µg VP30M Zn-Finger knockout oder 0,1 µg VP30E H90L) transfiziert (6.2). Das Konstrukt pTM1/VP30E H90L wurde von J. Modrof hergestellt und besitzt ebenfalls ein zerstörtes Zn-Finger-Motiv (Modrof et al., 2003). An Tag 2 p.t. wurden die Zellen lysiert
und 1,0 µl des Zelllysats im CAT-Assay eingesetzt (6.7.1). In Abb. 36 ist das Ergebnis
aus drei unabhängigen Experimenten dargestellt. Mit VP30M konnten im Durchschnitt
etwa 11% der Transkriptionsaktivität von VP30E erreicht werden. In den restlichen Ansätze (ohne VP30, mit VP30M Zn-Finger knockout und VP30E H90L), war keine Aktivität nachweisbar. Das Zn-Finger-Motiv im VP30 scheint also sowohl bei VP30E als auch bei
VP30M eine wichtige Rolle für die Transkriptionsaktivierung im EBOV-spezifischen Minigenomsystem zu spielen.
rel. CAT-Aktivität zu VP30E
Transkriptionseffizienz VP30M Zn-finger knockout
120%
100%
80%
60%
40%
20%
Abb. 36. Bestimmung der Transkriptionsaktivität von VP30M Zn-Finger
knockout. HuH-T7-Zellen wurden mit
EBOV-spezifischen Plasmiden (3E5E,
pTM1/VP35E,
pTM1/LE,
pTM1/NPE) sowie unterschiedlichen
VP30-Konstrukten transfiziert und im
CAT-Assay untersucht. Die Werte
sind das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten. VP30E H90L
ist in Modrof et al. (2003) beschrieben.
0%
VP30E
12.4
-VP30
VP30M
VP30M Zn
ko
VP30E
H90L
Austausch von pTM1/VP30M im Volle-Länge-Rescue-System
Der Einfluss von VP30 auf das Rescue von MARV wurde zunächst auf der Ebene
der transfizierten Expressionsplasmide untersucht. VP30M (pTM1/VP30M) wurde entweder gegen das VP30 des MARV mit zerstörtem Zn-Finger-Motiv (pTM1/VP30M
Finger knockout)
Zn-
oder das VP30 des EBOV (pTM1/VP30E) ausgetauscht oder weggelassen.
BSR T7/5-Zellen wurden wie in 11.2.3 beschrieben mit 4,0 µg pMARV (+), 0,5 µg
pTM1/NPM, 0,5 µg pTM1/VP3M, 1,0 µg pTM1/LM und 0,5-1,0 µg pCAGGS/T7 transfiziert. Dazu kamen entweder 0,1 µg pTM1/VP30M, 0,1 bzw. 0,5 µg pTM1/VP30M Zn-Finger
knockout,
oder 0,1 µg pTM1/VP30E; Ansätze ohne VP30 wurden mit pTM1 (leer) aufgefüllt.
An Tag 6 p.t. wurden die BSR T7/5-Zellen im Medium abgekratzt und mit Vero-Zellen
gemischt (11.2.2). Nach 7 Tagen Inkubationszeit wurden die Zellen durch Frieren und
Tauen lysiert, und die Zelltrümmer abzentrifugiert (11.2.2). Frische Vero-Zellen wurden
mit dem gereinigten Lysat infiziert, und 11 Tage p.i. wurde die RNA aus dem Zellpellet
81
Ergebnisse – Analyse von VP30 des MARV
isoliert. Nach der Aufreinigung wurde eine RT-PCR mit Primern #1124 und #1125
durchgeführt, und von den Produkten wurden 3 µl auf ein 2% Agarosegel aufgetragen.
Abb. 37 fasst die Ergebnisse von zwei unabhängigen Versuchsreihen zusammen.
Die Spuren 1-5 zeigen, dass vier von fünf „Standard-Ansätzen“ positiv waren. Ohne
VP30 waren in zwei von drei Ansätzen sehr schwache Banden zu sehen (Spuren 6-8).
Wurde pTM1/VP30M-wt durch 0,1 µg pTM1/VP30M Zn-Finger knockout ersetzt, war kein Signal
zu sehen (Spuren 9-11). Bei der fünffachen Menge (0,5 µg) waren 1/3 (0,5 µg
pCAGGS/T7) bzw. 3/3 (1,0 µg pCAGGS/T7) Ansätzen positiv (Spuren 12-17). Rescue
von rekombinantem MARV mit EBOV VP30 in der Transfektion war in zwei von fünf
Ansätzen erfolgreich (Spuren 18-23). Die schwächere Bande in Spur 20 stammt aus
einer Transfektion mit 0,5 µg pCAGGS/T7. Weder in der Mock-Kontrolle (keine Infektion, keine Transfektion; Spur 24) noch in der Wasserkontrolle der RT-PCR (Spur 26) ist
ein Signal zu erkennen, weshalb eine Verunreinigung der Primer ausgeschlossen werden konnte. Die Möglichkeit, dass das sehr schwache Signal in den Ansätzen ohne
VP30 (Spuren 6+7) von mitgeschlepptem Plasmid aus der Transfektion stammen könnte, wurde stichprobenartig durch eine Trennung von Reverser Transkription und PCR
überprüft. Die aufgereinigte RNA eines Ansatzes ohne VP30 (Spur 6) oder mit EBOV
VP30 (Spur 21) wurde mit Primer #1124 in einer Reversen Transkription entweder mit
oder ohne Enzym inkubiert (6.6.3). Die Hälfte der Reaktionsansätze wurde in einer
PCR mit Primern #1124 und #1125 (6.6.1) eingesetzt (Anlagerungs-Temp.: 55 °C), von
2
3
4
5
6
7
0,5 µg
VP30 Zn ko
12 13
14
15 16
8
9
10
11
0,1 µg
VP30E
17
18
19 20
RT
21 22 23
∅VP30
+
-
1
2
H2O
1
∅VP30
B
wt
0,1 µg VP30M
0,1 µg
VP30 Zn ko
Mock
A
24
25
26
+VP30E H2O
+
+
3
4
5
Abb. 37. RT-PCR von RNA aus Rescue-Experimenten mit verschiedenen pTM1/VP30-Transfektionen.
RNA wurde 11 Tage p.i. aus Vero-Zellen isoliert, die mit Passage 1 der rekombinanten Viren infiziert worden waren. (A) Ergebnis der RT-PCR mit Primern #1124 und #1125. Die fett gedruckten Spuren (4-8; 1517; 21-26) gehören zu einer Versuchsreihe, in der 1,0 µg pCAGGS/T7 transfiziert wurden, nicht-fette (1-3;
9-14; 18-20) hingegen mit 0,5 µg. VP30 Zn ko: VP30M Zn-Finger knockout; Mock: weder transfizierte noch infizierte Kontrolle; wt: mit MARV-wt infizierte Kontrolle; H2O: Wasserkontrolle der RT-PCR. (B) Kontrolle auf
Plasmid-Kontamination. Die RNA, die für die Reaktionen in Spur 6 (1+2) und 21 (3+4) eingesetzt worden
war, wurde entweder mit Reverser Transkriptase (RT) oder ohne inkubiert und anschließend einer PCR
unterzogen. H2O: Wasserkontrolle aus der RT-PCR.
82
Ergebnisse – Analyse von VP30 des MARV
der 5 µl auf einem 2% Agarosegel analysiert wurden (Abb. 37B). Die schwache Bande
des Ansatzes 6 und die starke von Ansatz 21 konnten in der zweistufigen RT-PCR reproduziert werden (Spuren 1 bzw. 3). Wurde das Enzym RT jedoch nicht zugegeben,
so war in keiner der beiden Proben ein Signal zu erkennen (Spuren 2 und 4). Die Wasserkontrolle war ebenfalls negativ (Spur 5). Dies weist darauf hin, dass sich das sehr
schwache Signal in den Ansätzen ohne VP30 auf virale RNA zurückführen lässt.
12.5
Rescue von Volle-Länge-Klonen mit mutiertem VP30-Gen
In den im vorigen Abschnitt beschriebenen Versuchen wurde untersucht, ob VP30
für die Generierung von rekombinantem MARV mit wt-Genom notwendig ist. Ist ein
solches Virus entstanden, steht im nächsten Infektionszyklus wieder nicht-mutiertes
VP30 zur Verfügung, wodurch Replikation und Transkription wie in der wt-Situation
stattfinden können. Mit den Volle-Länge-Mutanten pMARV (+) VP30knockout und
pMARV (+) VP30Zn-Finger knockout (vgl. 12.1) sollte untersucht werden, ob die entstandenen
Viren replikationskompetent sind, oder ob die Mutationen letal waren. Die beiden Mutanten wurden im Rescue-System eingesetzt (11.2.2). BSR T7/5-Zellen wurden mit den
notwendigen Plasmiden (11.2.2, aber 1,0 µg pCAGGS/T7) in drei gleichen Ansätzen
transfiziert und 6 Tage p.t. mit Vero-Zellen gemischt. Die Mischkulturen wurden erneut
6 Tage inkubiert und dann durch Frieren und Tauen lysiert (11.2.2). Frische VeroZellen wurden zur weiteren Analyse infiziert. Ansätze, die mit pMARV (+) transfiziert
wurden, zeigten 8 Tage p.i. einen starken CPE, während die Zellen bei den beiden
VP30-Mutanten 10 Tage p.i. nur schwach geschädigt waren. Als der CPE deutlich erkennbar war, wurde aus dem Zellpellet die RNA nach Protokoll isoliert und eine RTPCR durchgeführt. Das Ergebnis der anschließenden Agarosegel-Elektrophorese ist in
Abb. 38 dargestellt. Das Rescue von allen drei Ansätzen mit pMARV (+) war erfolgreich; die RT-PCR zeigte ein sehr starkes Signal (Spuren 1-3). Alle übrigen Ansätze, in
denen ein mutiertes Genom eingesetzt worden war, zeigten nur eine sehr schwache
Bande in der RT-PCR (pMARV (+) VP30knockout: Spuren 4-6, pMARV (+) VP30Zn-Finger
knockout:
Spuren 7-9). Spur 10 zeigt die Wasserkontrolle der RT-PCR, die kein Signal
lieferte.
83
Ergebnisse – Analyse von VP30 des MARV
1
2
pMARV (+)
VP30knockout
3
4
5
pMARV (+)
VP30 Zn ko
6
7
8
H2O
pMARV (+)
9
10
Abb. 38. RT-PCR-Analyse von rekombinanten MARV mit mutiertem VP30-Gen. Vero-Zellen wurden mit
Passage 1 der rekombinanten Viren infiziert und nach 8 (Ansätze 1-3) bzw. 10 Tagen (Ansätze 4-9) auf
virale RNA untersucht. Die RT-PCR wurde mit Primern #1124 und #1125 durchgeführt, und die Ansätze
wurden auf einem 2% Agarosegel analysiert. H2O: Wasserkontrolle der RT-PCR.
12.6
Zusammenfassung Kapitel 12
Mit dem erfolgreich etablierten Volle-Länge-Rescue-System des MARV wurde die
Rolle des VP30 untersucht, da dieses Protein im MARV-spezifischen Minigenomsystem nicht benötigt wird. Zwei Ansätze wurden dabei verfolgt: a) Austausch und Mutation des VP30-Expressionsplasmids pTM1/VP30M in der Transfektion und b) Einbringen
von Mutationen in das VP30-Gen im Volle-Länge-Plasmid pMARV (+). In beiden Ansätzen wurde u.a. ein funktionelles Motiv des VP30, das Zn-Finger-Motiv, zerstört, um
zwischen einer strukturellen und funktionellen Rolle unterscheiden zu können. Das
mutierte VP30M wurde wie VP30M-wt exprimiert (Abb. 34) und kolokalisierte mit NPM
(Abb. 35). Im EBOV-spezifischen Minigenomsystem zeigte VP30M
Zn-Finger knockout
keine
Aktivierung der Transkription mehr (Abb. 36). Wurde das Zn-Finger-Motiv in
pTM1/VP30 zerstört, so war das Rescue möglich, wenn auch etwas eingeschränkt (4/6
Versuchen, Abb. 37 Spuren 12-17). Allerdings führte diese Mutation im VP30-Gen des
Volle-Länge-Genoms zu einer starken Abnahme der viralen Replikation, und die Viren
konnten nicht effizient vermehrt werden (Abb. 38 Spuren 7-9). Wurde VP30 aus der
Transfektion entfernt, war ebenfalls nur sehr ineffizientes Rescue möglich (Abb. 37
Spuren 6-8). Ein komplettes Ausschalten des VP30 im MARV-Genom zeigte dasselbe
Ergebnis wie die Zerstörung des Zn-Finger-Motivs (Abb. 38 Spuren 4-6). Auch das
VP30 des EBOV konnte eingesetzt werden, um rekombinantes MARV zu erzeugen
(Abb. 37 Spuren 18-23).
84
Ergebnisse – Promotormutanten des Volle-Länge-MARV
13 Analyse von Promotormutanten im Volle-Länge-MARV
13.1
Herstellung der Mutanten pMARV (+) leader 3U→A und pMARV (+) +3x
EBOV UN5
Für die Untersuchung von Promotorelementen in rekombinanten Marburgviren wurden zwei Mutanten entworfen. Eine war das Volle-Länge-Analog zu 3M-5M leader
3U→A (siehe 9.1.2), in welcher die nts U62, U68 und U74 zu A substituiert wurden. In das
zweite Konstrukt, pMARV (+) +3x EBOV UN5, wurden 18 nts aus dem EBOVReplikationspromotor (nts 80-97, siehe 9.2.2) hinter nt 78 eingefügt, um die Anzahl der
Hexamere UN5 um 3 auf 10 zu erhöhen. Beide Mutanten wurden durch in vitroMutagenese hergestellt. Bei pMARV (+) leader 3U→A diente pMARV SacII/XhoI als
Matrize, um mit Primerpaar #1316/#1317 die gewünschten Mutationen einzufügen (Anlagerungs-Temp.: 40 °C). Das Produkt diente als Vektor und wurde mit SacII und SmaI
geschnitten und dephosphoryliert und das 4,3 kb-Fragment über ein Gel gereinigt. Als
zweites Teilstück wurde pMARV (+) mit denselben Enzymen geschnitten und das
17,8 kb-Fragment über ein Gel gereinigt. Die beiden Fragmente wurden zu pMARV (+)
leader 3U→A ligiert. Die 18 EBOV-spezifischen nts in pMARV (+) +3x EBOV UN5 wurden mit einer abgewandelten in vitro-Mutagenese (6.6.2) über Primer #1656/#1657 in
pMARV SacII/XhoI eingebracht (Anlagerungs-Temp.: 40 °C); das Produkt wurde
phosphoryliert (6.5.3). Nach DpnI-Verdau wurde das 5 kb-Fragment über ein Gel gereinigt, da eine starke Hintergrundbande vorhanden war, und anschließend ligiert. Ein
Klon hatte die richtige Sequenz und wurde mit RsrII und SmaI geschnitten und
dephosphoryliert. In diesen Vektor wurde mit RsrII und SmaI geschnittenes pMARV (+)
ligiert.
13.2
Untersuchung der Mutanten im Volle-Länge-Rescue-System
BSR T7/5-Zellen wurden nach Standardprotokoll mit den Expressionsplasmiden für
NPM, LM, VP35M, VP30M und pCAGGS/T7 sowie den mutierten Volle-LängeKonstrukten transfiziert (11.2.3). Des Weiteren wurde ein Ansatz ohne T7-RNAPolymerase getestet. 5 Tage p.t. wurden Vero-Zellen in 25 cm²-Flaschen mit 1 ml des
Überstandes infiziert, an Tag 11 p.i. lysiert und auf virale RNA untersucht. Die BSR
T7/5-Zellen wurden im restlichen Medium abgekratzt, mit Vero-Zellen in 75 cm²Flaschen gemischt und die Mischkulturen nach 6 Tagen lysiert (11.2.2). Mit dem Lysat
wurden Vero-Zellen in 25 cm²-Flaschen infiziert, aus denen 7 d p.i. RNA isoliert wurde.
Mit den RNA-Proben wurde eine RT-PCR mit Primern #1124 und #1125 durchgeführt,
und die Produkte wurden auf einem 2% Agarosegel analysiert. Die positiven Proben
85
Ergebnisse – Promotormutanten des Volle-Länge-MARV
wurden mit SspI geschnitten und die Restriktionsmuster mittels AgarosegelElektrophorese ausgewertet. In einem Ansatz war es möglich, direkt aus den Überständen der transfizierten BSR T7/5-Zellen Virus in Vero-Zellen zu amplifizieren (Abb.
39A). Bei diesem Ansatz war pMARV (+) +3x EBOV UN5 als Genom eingesetzt worden
(Spur 3). Bei allen anderen Ansätzen war nur eine sehr schwache Bande (Spuren 1-3)
bzw. gar keine (Spur 5) sichtbar. Verdau mit SspI bestätigte, dass es sich um rekombinantes MARV handelte (Spur 10). Wurden die transfizierten BSR T7/5-Zellen mit VeroZellen kokultiviert und dann dieses Lysat zur Infektion eingesetzt, so änderte sich das
Bild geringfügig (Abb. 39B). Neben pMARV (+) +3x EBOV UN5 (Spur 3) zeigte der Ansatz mit transfiziertem pMARV (+) eine starke Bande (Spur 1). Wieder war eine schwache Bande bei pMARV (+) leader 3U→A sichtbar (Spur 2) nicht aber bei dem Ansatz
ohne pCAGGS/T7 (Spur 4) oder in der nicht-transfizierten Kontrolle (Spur 5). Der Kontrollverdau mit SspI zeigt in den beiden positiven Proben das Bandenmuster für rekombinantes MARV (Spuren 9+11).
SspI
3U→A
+ 3x UN5
-pT7
Mock
MARV-wt
pMARV (+)
3U→A
+ 3x UN5
-pT7
Mock
MARV-wt
H2O
B
pMARV (+)
A
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
7
MARV-wt
+
7
8
3x UN5
+
9
10
SspI
pMARV (+)
+
8
9
3x UN5 MARV-wt
+
+
10
11
12
13
Abb. 39. RT-PCR-Analyse von rekombinantem MARV mit mutiertem 3’-Ende. BSR T7/5-Zellen wurden
nach Standardprotokoll transfiziert. (A) Vero-Zellen wurden mit 1 ml des Überstands der transfizierten
Zellen inkubiert und 10 d p.i. auf virale RNA untersucht. (B) Auswertung der RT-PCR nach Standardprotokoll: BSR T7/5-Zellen wurden zunächst mit Vero-Zellen kokultiviert, und das Lysat der Mischkultur wurde
nach 6 Tagen zur Infektion von Vero-Zellen benutzt. An Tag 7 p.i. wurden die Vero-Zellen lysiert und mittels RT-PCR analysiert. 3U→A: pMARV (+) leader 3U→A; +3x UN5: pMARV (+) +3x EBOV UN5; -pT7: kein
pCAGGS/T7 im Transfektionsansatz; Mock: Nicht transfiziert, nicht infiziert; MARV-wt: Infektion mit MARVwt; H2O: Wasserkontrolle. Unten: Kontrolle der positiven Proben durch SspI-Verdau.
86
Ergebnisse – Promotormutanten des Volle-Länge-MARV
13.3
Zusammenfassung Kapitel 13
Mit pMARV (+) leader +3x EBOV UN5 ist erstmalig erfolgreich ein rekombinantes
MARV mit verändertem Genom aus cDNA erzeugt worden. Auch war es erstmals möglich, Vero-Zellen direkt mit dem Überstand transfizierter BSR T7/5-Zellen zu inokulieren
und Virus nachzuweisen. Die Substitution der U-Reste an Pos. 62, 68 und 74 hatten
bereits im Minigenom zu stark reduzierter Replikation geführt, und zeigten auch beim
Rescue nur eine sehr schwache Bande.
87
Ergebnisse – Inhibition der EBOV-Replikation durch PMOs
14 Inhibition der Replikation von EBOV durch Peptid-konjugierte
Phosphorodiamidat-Morpholinooligomere
14.1
Strategie
Antisense-Oligonukleotide werden schon seit fast 30 Jahren eingesetzt, um das
Wachstum von Viren in vitro zu hemmen (Kurreck, 2003, Stephenson & Zamecnik,
1978, Zamecnik & Stephenson, 1978). Die ständige Weiterentwicklung der chemischen
Struktur der Antisense-Oligonukleotide hat nicht nur deren Stabilität gesteigert, sondern
auch
die
Aufnahme
in
die
Zellen
(Kurreck,
2003).
Phosphorodiamidat-
Morpholinooligomere (PMO) sind neutral geladene, synthetische DNA-Analoga, die
über Phosphorodiamidat-Bindungen verknüpft sind und einen Morpholinring enthalten
(Abb. 40). Durch diese Modifikationen des PMO-Rückgrats konnte eine nahezu vollständige Resistenz gegen Nuklease-Verdau bei Erhalt der Wasserlöslichkeit erreicht
werden (Hudziak et al., 1996). Argininreiche Peptide wurden an PMOs angehängt, um
die Aufnahme in Zellen zu steigern (Deas et al., 2005, Moulton et al., 2004). Im Vergleich
zu
anderen
Einzelstrang-DNA-
Analoga weisen PMOs:RNA-Duplexe eine
höhere Stabilität auf und haben weniger
unspezifische Effekte (Stein et al., 1997,
Summerton, 1999). Die Funktion der PMOs
basiert auf Watson-Crick-Basenpaarungen,
wobei sehr häufig die Region des Translationsstarts einer mRNA als Zielsequenz
diente (Review: Heasman, 2002). Peptidkonjugierte PMOs (P-PMOs) wurden er-
DNA
PMO
P-PMO
folgreich eingesetzt, um die Replikation Abb. 40. Chemische Strukturen von DNA, PMO
und P-PMO. Das negativ geladene Phosphatrück-
verschiedener Viren in Zellkultur zu hem- grat des DNA-Strangs ist bei den PMOs durch
men, darunter Vesiviren (Stein et al., Phosphorodiamidate ersetzt, die Zucker der Basen
2001), Maus-Hepatitis-Virus (Neuman et
al., 2004) und verschiedene Flaviviren
durch Morpholinringe. Die P-PMOs besitzen am 3’Ende eine Acetylgruppe und sind am 5’-Ende mit
einem Peptid (R9F2) konjugiert, um die Aufnahme
in die Zelle zu verbessern.
(Deas et al., 2005, Kinney et al., 2005)
In dieser Arbeit wurden sechs Bereiche des EBOV-Genoms ausgewählt, zu denen
je ein Antisense-P-PMO hergestellt und getestet wurde. Die P-PMOs waren sowohl
gegen Sequenzen der Negativstrang- (vRNA) als auch Positivstrang- (mRNA oder Antigenom) RNA-Spezies gerichtet. Die Zielregionen sind in Abb. 41 schematisch dargestellt.
88
Ergebnisse – Inhibition der EBOV-Replikation durch PMOs
EBOV (Zaire)
11588
3136
3’
NP
VP35 VP40
GP
VP30
VP24
leader
18959
5’
L
trailer
leader
tss-NP
leader tss
108
rep pro
Abb. 41. Schematische Darstellung des EBOV-Genoms und der Zielbereiche der P-PMOs. Die Gene der
Nukleokapsidproteine sind dunkelgrau hinterlegt. P-PMOs wurden entweder gegen negativsträngige genomische RNA (
) oder positivsträngige antigenomische RNA bzw. mRNA (
) gerichtet. Ziele auf
dem Negativstrang sind in dem eingesetzten Kasten hervorgehoben: der leader (leader), das Transkriptionsstart-Signal des NP-Gens (tss-NP) sowie ein Teil des genomischen Replikationspromotors (rep
pro, 108). Die Positivstrang-Ziele sind die Translationsstart-Bereiche des VP35- (3136) und L-Gens
(11588) sowie der trailer (18959). Die Nummerierung der Nukleotide bezieht sich auf die GenBank Accession Number AF086833. Details zu den P-PMOs sind im Abschnitt aufgeführt.
14.2
Analyse der Inhibitionseffizienz in Zellkultur
14.2.1 Auswahl des effizientesten Inhibitors
Zunächst wurden die verschiedenen P-PMOs (Tabelle 1, 5.3) in Vero-Zellkultur auf
ihre Fähigkeit getestet, die Replikation von EBOV herabzusetzen. Je 105 Vero-Zellen
wurden in 12er Zellkulturplatten ausgesät und über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag
wurden die Zellen mit drei verschiedenen Konzentrationen der P-PMOs (1,25, 2,5 und
5,0 µM) für 3 h vorbehandelt und danach mit EBOV infiziert (6.1.7). Das Inokulum wurde nach 1 h gegen 1 ml DMEM komplett mit 2% FCS und den jeweiligen P-PMOs ausgetauscht. 48 h p.i. wurden Vero-Zellen in 96er Zellkulturplatten für die Bestimmung
des TCID50 infiziert (6.1.3). An Tag 12 p.i. blieb der CPE unverändert, und der Titer
wurde berechnet. Ein repräsentatives Ergebnis ist in Abb. 42 dargestellt. Die relative
Effizienz der P-PMOs war in Wiederholungsexperimenten sehr ähnlich, aber der jeweils ermittelte Titer unterschied sich z.T. um 1-2 Logstufen. Die Zugabe von 1,25 µM
P-PMO bewirkte bei fast allen Inhibitoren nur einen sehr geringen Rückgang des viralen Titers um 0,5-1,0 Logstufen, was in etwa dem Wert des Kontroll-P-PMOs Scramble
entspricht. Einzige Ausnahme war 3136, welches nahezu 2 Logstufen Reduktion zeigte. Bei steigender Konzentration (2,5 µM) veränderte sich der Titer in allen Ansätzen
bis auf 18959 nur unwesentlich. Bei 5,0 µM bewirkten tss-NP und 11588 eine Reduktion des Titers um etwa 2 Logstufen verglichen mit dem nicht behandelten Ansatz, wohingegen 3136 und 18959 den Titer um fast 3 Logstufen reduzierten. Bei allen drei
Konzentrationen war die Reduktion durch das unspezifische Scramble-P-PMO etwa
0,5 Logstufen.
89
Ergebnisse – Inhibition der EBOV-Replikation durch PMOs
1,0E+05
1,25 µM
2,5 µM
5,0 µM
1,0E+04
TCID50/ml
1,0E+03
1,0E+02
1,0E+01
1,0E+00
leader
tss-NP
108
3136
11588
18959
Scramble
w/o
P-PMO
Abb. 42. Inhibitions-Analyse aller P-PMOs in verschiedenen Konzentrationen. Vero-Zellen wurden nach
Protokoll mit 1,25, 2,5 oder 5,0 µM der P-PMOs für 3 h vorbehandelt und anschließend mit EBOV infiziert.
Danach wurden wieder P-PMOs zugegeben und 48 h lang inkubiert. Der Überstand wurde benutzt, um
Vero-Zellen für eine TCID50-Analyse zu infizieren. 12 Tage p.i. wurde der CPE ausgewertet und der
TCID50/ml berechnet.
14.2.2 Bestimmung der Zytotoxizität der P-PMOs in Zellkultur
Die P-PMOs können auf mindestens zwei Weisen die Zellen in Kultur schädigen.
Zum einen können die Basen unspezifisch mit zellulären mRNAs interagieren und so
den Stoffwechsel der Zelle stören, zum anderen kann die Zellmembran durch die Aufnahme physikalisch angegriffen werden. Dies würde ebenfalls zu einer Verringerung
des viralen Titers führen. Um die schädigende Wirkung der P-PMOs auf Vero-Zellen zu
überprüfen, wurden von der Herstellerfirma Zytotoxizitätsanalysen (MTT-Analyse) mit
den eingesetzten Komponenten durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass das 18959
P-PMO bei Konzentrationen über 10 µM zunehmend zytotoxisch wirkte, während 3136
bis zu 20 µM kaum Zytotoxizität zeigte (siehe Diskussion). In unserem Labor wurden
Vero-Zellen mit 5,0 µM 3136, Scramble oder DMEM komplett + 2% FCS für 3 h vorbehandelt und anschließend mit EBOV infiziert oder mit Medium inkubiert. Nach der Infektion wurden frisches DMEM komplett mit 2% FCS mit bzw. ohne Inhibitoren zugegeben. Die Zellen wurden jeden Tag lichtmikroskopisch untersucht und fotografiert. In
Abb. 43 sind Aufnahmen von Tag 6 p.i. abgebildet. Unbehandelte oder mit Scramble-PPMO behandelte Zellen, die mit EBOV infiziert worden waren, zeigten etwa 3-4 Tage
p.i. einen charakteristischen CPE. Die mit 3136 inkubierten Zellen hingegen waren bis
Tag 6 p.i. frei von CPE (B oben). Keine der beiden Komponenten löste bei nicht90
Ergebnisse – Inhibition der EBOV-Replikation durch PMOs
infizierten Zellen einen sichtbaren CPE aus (B unten). Das P-PMO 3136 wurde deshalb
in den weiteren Experimenten näher untersucht, um die Inhibitionseigenschaften zu
analysieren.
3136
Scramble
ohne P-PMO
EBOVInfektion
ohne
Infektion
Abb. 43. Analyse der Zytotoxizität der eingesetzten P-PMOs durch Lichtmikroskopie. Die Fotos von infizierten (obere Reihe) und nicht-infizierten (untere Reihe) Vero-Zellen, die mit 5,0 µM P-PMO behandelt
wurden, wurden an Tag 6 p.i. aufgenommen.
14.2.3 Untersuchung der konzentrationsabhängigen Inhibition von 3136 PPMO
Vero-Zellen in 24er Gewebekulturplatten wurden nach Standardprotokoll (6.1.7) mit
6 verschiedenen Konzentrationen (0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 µM und 10 µM) der P-PMOs
3136 und Scramble oder ohne P-PMO 3 h lang inkubiert, bevor mit EBOV infiziert wurde. 48 h p.i. wurde der Überstand benutzt, um Vero-Zellen in 96er Gewebekulturplatten
für eine Bestimmung des TCID50 zu infizieren (6.1.3). Die Titer wurden 14 d p.i. anhand
des CPEs berechnet (Abb. 44A). In weiteren Experimenten wurde die virale Replikation
untersucht. 105 Vero-Zellen wurden in 12er Zellkulturplatten ausgesät und nach Protokoll mit 5 Konzentrationen (0,1, 0,5, 1,0, 2,5 und 5,0 µM) der P-PMOs vorbehandelt und
anschließend mit EBOV infiziert. 24 h nach der Infektion wurde der Überstand abgenommen, und die Zellen wurden einmal mit PBSdef gewaschen und anschließend für
die Isolierung von RNA lysiert (6.4.3). Die RNA wurde aufgereinigt, und die Konzentrationen wurden photometrisch bestimmt; für die RT-PCR wurde 1,0 µg RNA eingesetzt.
Als Nachweis der viralen RNA wurde ein Bereich im Übergang von VP35 zu VP40 (nts
3660-4778) mit Primern #1581 und #1285 und GAPDH-mRNA als Kontrolle mit Primern #1440 und #1441 amplifiziert. Je 3,0 µl der Ansätze wurden auf einem 2% Agarosegel analysiert und fotografiert. Die Stärke der VP35/VP40-spezifischen Banden wurde über diejenige der GAPDH-mRNA normalisiert. Anhand dieses Wertes wurden die
relativen Level zur Kontrolle ohne P-PMO berechnet (Abb. 44).
91
Ergebnisse – Inhibition der EBOV-Replikation durch PMOs
3136 P-PMO zeigte eine konzentrationsabhängige Inhibition der EBOV-Infektion.
Bei Zugabe von 1,0 µM Inhibitor wurde der Virustiter um eine Logstufe reduziert und
A
Einfluss der Konzentration der P-PMOs auf den Virustiter
1,0E+06
TCID 50/ml
1,0E+05
1,0E+04
1,0E+03
1,0E+02
3136 P-PMO
Scramble P-PMO
1,0E+01
ohne P-PMO
1,0E+00
0
2
4
6
8
10
P-PMO [µM]
B
Einfluss der Konzentration der P-PMOs auf
virale Replikation (RT-PCR)
Abb. 44. Abhängigkeit der Inhibition von
der Konzentration der P-PMOs 3136 und
Scramble. Vero-Zellen wurden mit
verschiedenen Konzentrationen der PPMOs vorinkubiert und 48 h nach Infektion mit EBOV untersucht. (A) Einfluss au
den Virustiter. Der Überstand der Zellen
wurde für die TCID50-Analyse eingesetzt
und 14 d p.i. der Titer berechnet. (B)
Einfluss auf virale Replikation. 1,0 µg der
Gesamt-RNA wurde in einer RT-PCR
eingesetzt, in welcher nts 3 660-4 778 von
EBOV bzw. GAPDH-mRNA als Kontrolle
amplifiziert wurden. Die Stärke der Banden in einem 2% Agarosegel wurden
bestimmt und auf die Kontrolle ohne PPMO relativiert.
140%
%VP35-RNA der Kontrolle
3136 P-PMO
120%
Scramble P-PMO
100%
80%
60%
40%
20%
0%
0
1
2
3
4
5
6
P-PMO [µM]
etwa um zwei Logstufen bei höheren Konzentrationen (2,5, 5,0 und 10 µM) (Abb. 44A).
Die unspezifische Kontrolle Scramble P-PMO zeigte bei den höchsten Konzentrationen
von 5,0 und 10 µM eine 5-10fache Reduktion des Virustiters. Eine ähnliche Tendenz
ergab sich bei der Analyse der viralen RNA (Abb. 44B). Nach Zugabe von 1,0 µM 3136
P-PMO wurde die Menge an viraler RNA um 25% reduziert, bei 2,5 und 5,0 µM waren
es zwischen 60-70%. Scramble P-PMO zeigte bis 2,5 µM keinen Effekt, reduzierte die
EBOV-spezifische RNA bei 5,0 µM jedoch um 30-40%. Obwohl auch das unspezifische
P-PMO bei hohen Konzentrationen (5,0 µM) eine Reduktion des Virustiters und der
viralen RNA bewirkte, war der inhibitorische Effekt bei 3136 P-PMO weitaus stärker.
Als Nächstes wurde untersucht, zu welchem Zeitpunkt der P-PMO-Zugabe die effizienteste Inhibition erreicht wurde.
92
Ergebnisse – Inhibition der EBOV-Replikation durch PMOs
14.2.4 Einfluss des Applikationszeitpunkts auf die Inhibition
Bei den bisher beschriebenen Versuchen wurden die P-PMOs 3 h vor der Infektion
auf die Zellen gegeben. Für die Praxis ist es jedoch interessant, ob der prophylaktische
Schutz nach Infektion therapeutisch genutzt werden kann. In einem entsprechenden
Versuchsmodell wurden 104 Vero-Zellen in 24er Gewebekulturplatten ausgesät und
über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurden standardmäßig 5,0 µM der Inhibitoren
(3136 oder Scramble P-PMO) 3 h vor Infektion oder zu verschiedenen Zeitpunkten
nach der Infektion auf die Zellen gegeben. Nach der Infektion mit EBOV wurde das
Inokulum abgenommen, und zu den „0 h“- sowie den vorinkubierten Proben wurden
5,0 µM P-PMO gegeben. Die anderen Ansätze erhielten die Inhibitoren entweder 4, 8
oder 24 h p.i. Alle Proben wurden 72 h p.i. lysiert und wie im vorigen Abschnitt beschrieben auf virale RNA mittels RT-PCR untersucht. Abb. 45 zeigt ein repräsentatives
Agarosegel, auf dem 3,0 µl der Reaktionen aufgetragen wurden. Es war eine deutliche
Abhängigkeit der Inhibitionseffizienz vom Applikationszeitpunkt zu erkennen: Je später
der Inhibitor 3136 P-PMO zugegeben wurde, desto stärker war das Signal der viralen
RNA. Die beste Inhibition wurde bei Vorbehandlung beobachtet (Spur 1), Wurde der
Inhibitor direkt (0 h p.i., Spur 2) oder 4-8 h (Spuren 3+4) nach der Infektion zugesetzt,
zeigte sich eine schwache Bande. Die Intensität der Bande erreichte etwa 50% von der
infizierten Probe ohne P-PMO (Spur 6), wenn der Inhibitor erst 24 h p.i. (Spur 6) auf die
Zellen gegeben wurde. Ein weitaus geringere Inhibition wurde bei Scramble P-PMO
beobachtet: Auch bei vorbehandelten Zellen war ein deutliches Signal zu erkennen
(Spur 8), und die Ansätze bis einschließlich 8 h p.i. (Spuren 9-11) zeigten Level an viraler RNA, die etwa Spur 5 (3136 24 h p.i.) entsprachen. Wurde der unspezifische Inhibitor 24 h p.i. zugesetzt (Spur 12), war das Signal mit der infizierten Probe ohne P-PMO
vergleichbar (Spur 6). Im folgenden Abschnitt wurde die Spezifität der beiden P-PMOs
8 h p.i.
24 h p.i.
ohne P-PMO
Mock
3 h vorbehandelt
0 h p.i.
3
4
5
6
7
8
9
5,0 µM 3136
24 h p.i.
4 h p.i.
2
8 h p.i.
0 h p.i.
1
4 h p.i.
3 h vorbehandelt
näher untersucht.
10 11 12
5,0 µM Scramble
Abb. 45. RT-PCR-Analyse der Inhibition durch P-PMOs nach Zugabe
zu unterschiedlichen Zeitpunkten.
Vero-Zellen wurden entweder standardmäßig mit 3136 oder Scramble
P-PMO 3 h lang vorbehandelt, oder
die Inhibitoren wurden nach der Infektion zugegeben. RNA wurde
72 p.i. isoliert und einer RT-PCR
unterzogen. Die Proben wurden auf
einem 2% Agarosegel analysiert.
Mock: nicht infiziert.
93
Ergebnisse – Inhibition der EBOV-Replikation durch PMOs
14.2.5 Untersuchung der Inhibition von MARV mit 3136 P-PMO
Um zu bestätigen, dass 3136 P-PMO spezifisch nur EBOV inhibiert, wurden Huh7Zellen nach Standardprotokoll (6.1.7) mit 2,5 und 5,0 µM 3136 oder Scramble P-PMO
vorbehandelt, aber anstelle von EBOV mit MARV infiziert. Huh7-Zellen wurden für diesen Versuch eingesetzt, weil sie sich sehr gut mit MARV infizieren lassen. Die Zellen
wurden 24 h p.i. geerntet und für RNA-Isolierung lysiert. RT-PCR wurde mit Primern
#1124/#1125 (vgl. 11.2.2) durchgeführt und die entstandenen Produkte auf einem 2%
P-PMO
(Spuren
1+2),
unspezifischem
2,5
5,0
2,5
5,0
H2O
den Ansätzen mit EBOV-spezifischem 3136
∅ P-PMO
Agarosegel untersucht (Abb. 46). Zwischen
1
2
3
4
5
6
3136
Scramble
Scramble P-PMO (Spuren 3+4) und der
Kontrolle ohne Inhibitor (Spur 5) sind keine
signifikanten Unterschiede zu erkennen. Die
Abb. 46. RT-PCR-Kontrolle der Spezifität der P-
Wasserkontrolle (Spur 6) zeigt, dass keine PMOs. Huh7-Zellen wurden mit den P-PMOs für
3 h vorbehandelt und mit MARV (MOI=5) infiziert.
Kontamination vorliegt. Die Inhibition des 24 h p.i. wurden die Zellen lysiert, RNA isoliert
EBOV durch 3136 P-PMOs ist demnach und auf MARV-spezifische RNA untersucht. ∅ Pspezifisch, da die Replikationslevel von
PMO: nur Infektion; H2O: Wasserkontrolle.
MARV nicht beeinflusst werden.
14.3
Zusammenfassung Kapitel 14
Das letzte Kapitel beschäftigte sich mit der Analyse von inhibitorischen Eigenschaften synthetischer DNA-Analoga (P-PMOs) in EBOV-infizierten Zellen. Die Inhibitoren
wurden gegen sechs unterschiedliche Zielregionen gerichtet, die sowohl negativ- als
auch positivsträngige RNA-Spezies umfassten. Ein Screening zeigte, dass ein gegen
den VP35-Translationsstart (mRNA) gerichtetes P-PMO (3136) in der Lage war, den
Virustiter um 3 Logstufen bzw. mehr als 2 Logstufen zu verringern, verglichen mit Ansätzen ohne P-PMO bzw. mit einem unspezifischen P-PMO (Scramble) (Abb. 42). Mit
dem 3136 P-PMO wurden weitere Studien durchgeführt, die zeigten, dass der Inhibitor
nicht zytotoxisch (Abb. 43) und die Inhibition konzentrationsabhängig (Abb. 44) und
EBOV-spezifisch (Abb. 46) ist. Zudem wurde gezeigt, dass der Zeitpunkt der Applikation wichtig ist für eine effiziente Inhibition. Das beste Ergebnis wurde mit dreistündiger
Vorbehandlung erzielt, während eine Zugabe von 3136 P-PMO 24 h p.i. die virale RNA
nur um etwa 50% reduzierte (Abb. 45).
94
Diskussion
IV
Diskussion
Diskussion – Struktur der 3’-NTR und Promotorelemente
15 Untersuchungen zu den genomischen und antigenomischen
Promotoren von Filoviren
In der vorliegenden Arbeit wurden die Promotorregionen von drei Vertretern der Filoviren, Marburgvirus (MARV), Ebolavirus Zaire (EBOV-Z) und Ebolavirus Reston (EBOV-R), eingehend studiert und im Minigenomsystem (vgl. Mühlberger et al., 1998,
1999) analysiert. Im 3’-Ende des MARV wird eine stabile Sekundärstruktur im Bereich
des Transkriptionsstart-Signals (TSS) durch in silico-Analysen vorhergesagt, die sich
deutlich von der des EBOV unterscheidet (Weik et al., 2002). Die Struktur wurde mittels
chemischer Modifizierung experimentell untersucht und durch Mutationen verändert.
Die Replikations- und Transkriptionseigenschaften der Mutanten wurden anschließend
im Minigenomsystem analysiert. Der Schwerpunkt der weiteren Untersuchungen lag
auf der Charakterisierung der Elemente, die für die Replikation verantwortlich sind. In
früheren Arbeiten wurden für den Replikationspromotor des EBOV teils widersprüchliche Ergebnisse gewonnen (Schlenz, 2002, Weik, 2001), die durch die Ergebnisse
dieser Arbeit erklärt werden konnten. Durch Vergleich der 3’-NTR von MARV, EBOV-Z
und EBOV-R sowie durch Deletions- und Substitutionsmutanten in dieser Region wurde ein wichtiges Motiv gefunden, welches bei allen drei Viren für effiziente Replikation
notwendig aber nicht hinreichend ist. Die Replikationspromotoren von EBOV und
MARV unterscheiden sich aber in anderen Aspekten. Abschließend wurde der antigenomische Replikationspromotor grob charakterisiert.
Eine der Hauptmethoden, die in dieser Arbeit eingesetzt wurden, ist die Detektion
replizierter RNA via Northern Blot. Weil diese Methode sehr empfindlich ist, wurden
mehrfach Optimierungsversuche unternommen. Es konnten einige Verbesserungen
erzielt werden, die z.B. den Einsatz von Vacciniaviren (MVA-T7) als Quelle der T7RNA-Polymerase überflüssig machten.
15.1
Probleme beim Nachweis replizierter RNA
Virale genomische und antigenomische RNA ist u.a. durch die komplette und sehr
dichte Enkapsidierung durch NP (und weitere Nukleokapsidproteine) charakterisiert.
Das Nukleokapsid widersteht hohen Salzkonzentrationen und zeigt Resistenz gegenüber einem Verdau mit Mikrokokken-Nuklease (MCN) (Becker et al., 1998, Mühlberger
et al., 1998). Virale mRNA-Spezies hingegen sind nicht enkapsidiert und somit MCNsensitiv (Mühlberger et al., 1998). Dieser Unterschied kann benutzt werden, um etwa
gleichgroße mRNA und replizierte, positivsträngige Minigenom-RNA voneinander unterscheiden zu können. Das artifizielle Minigenomsystem für MARV und EBOV basierte
auf HeLa-Zellen, die mit MVA-T7 infiziert und anschließend mit Plasmid-DNA transfi96
Diskussion – Struktur der 3’-NTR und Promotorelemente
ziert wurden. Obwohl die Effizienz sehr gut ist, ist ein System ohne zusätzliche Infektion wünschenswert. Aus diesem Grund wurden Zelllinien eingesetzt, die die T7-RNAPolymerase konstitutiv exprimieren: BSR T7/5 und HuH-T7. Zusätzlich wurden die teilweise sehr niedrigen Expressionslevel der T7-RNA-Polymerase durch Transfektion des
Plasmids pCAGGS/T7 erhöht, wenn auch nicht mit derselben Effizienz wie durch die
Infektion mit MVA-T7 (Abb. 8). Die Menge an replizierter RNA korrelierte bei den Versuchen gut mit der Expressionsrate der T7-RNA-Polymerase (Abb. 7). Eine pauschale
Aussage, welche Zelllinie am besten geeignet ist, konnte nicht getroffen werden. Anfänglich lieferten BSR T7/5-Zellen gute Ergebnisse, während bei HuH-T7-Zellen keine
Signale replizierter RNA detektiert werden konnten (Abb. 5). Später allerdings wurde
der Hintergrund bei BSR T7/5-Zellen immer höher, und eine Auswertung war nicht
mehr möglich; diesmal lieferten HuH-T7-Zellen ein hervorragendes Ergebnis (Abb. 7).
Der Grund für dieses Verhalten scheint in der Passagenummer der Zellen zu liegen. Je
älter die Zellen waren, desto schlechter konnten Ergebnisse reproduziert werden. Es ist
also empfehlenswert, eine niedrige Passagenummer für Versuche mit replizierter RNA
zu verwenden.
15.2
Sekundärstruktur des Transkriptionsstart-Signals von MARV
Im 3’-Ende des EBOV wurde eine regulatorische RNA-Sekundärstruktur gefunden,
in welcher das TSS des NP-Gens teilweise gepaart vorliegt. Ist diese Struktur intakt, so
wird VP30 als Transkriptionsaktivator benötigt. Wird die Struktur allerdings durch Mutation zerstört, so kann die Transkription unabhängig von VP30 stattfinden (Weik et al.,
2002). Im Gegensatz dazu wird im MARV-spezifischen Minigenomsystem für die
Transkription kein VP30 benötigt (Mühlberger et al., 1998). Es sollte daher untersucht
werden, ob das TSS des NP-Gens von MARV in die Bildung einer Sekundärstruktur
involviert ist und ob Mutationen, die diese Struktur verändern, die VP30-Abhängigkeit
verändern. Die vom „mfold“-Server vorgeschlagene Sekundärstruktur des TSS des
MARV unterschied sich dramatisch von der des EBOV (Abb. 47) und konnte bis auf
wenige Abweichungen durch chemische Modifizierung und Primer-Extension bestätigt
werden (8.1.2). Wurde das TSS des MARV entweder durch das des EBOV ersetzt oder
wie erwähnt nur die Sekundärstruktur verändert, war keine Transkription, wohl aber
noch eine schwache Replikation des Minigenoms tss_MARV→EBOV messbar. Mögliche Gründe werden im weiteren Verlauf dieses Kapitels diskutiert. Weder Nukleokapsidproteine des MARV noch des EBOV konnten die Transkription vermitteln; auch
VP30 hatte keinen Einfluss (Abb. 13). Die Bemühungen, die Sekundärstruktur des TSS
des NP-Gens des EBOV mit MARV-spezifischer Sequenz zu simulieren (8.2.1), waren
97
Diskussion – Struktur der 3’-NTR und Promotorelemente
nicht erfolgreich, da sich sehr wahrscheinlich ein Gleichgewicht zweier Strukturen einstellt, bei dem die Ausbildung der EBOV-TSS-spezifischen energetisch ungünstiger ist
(Abb. 12). Allerdings wurden die Sekundärstrukturanalysen nur mit Plusstrang-RNA
durchgeführt, weil aufgrund methodischer Limitierung keine Negativstrang-RNA eingesetzt werden konnte (vgl. Weik et al. (2005)). Die Rolle der Sekundärstrukturen bei Positivstrang-RNA kann z.B. in der Stabilisierung der mRNAs oder Regulation der Translation liegen (Klaff et al., 1996, Liebhaber, 1997, Mühlberger et al., 1996).
Der Promotor für die Transkription des NP-Gens erstreckt sich beim MARV wahrscheinlich über das konservierte TSS hinaus, was durch Substitutionen im Bereich von
nt 61-69 gezeigt werden konnte (Abb. 13). Dass die Sekundärstruktur an sich nicht
wichtig ist, wurde durch weitere Versuche gezeigt, in denen die zweite Hälfte der in
Abb. 47 dargestellten Struktur komplett entfernt wurde: Deletionen bis einschließlich nt
71 hatten keinen negativen Einfluss auf Replikation oder Transkription (vgl. Abb. 15).
EBOV-Minigenome, die ein intaktes TSS aber eine veränderte Sekundärstruktur aufwiesen, wurden im EBOV-spezifischen Minigenomsystem sowohl repliziert als auch
transkribiert. Interessanterweise war VP30 nur notwendig, wenn die authentische Sekundärstruktur vorhanden war (Weik et al., 2002).
Nicht analysiert wurde, ob sich eine panhandle-Struktur zwischen den viralen Enden, d.h. der 3’-NTR des NP-Gens
und der 5’-NTR des L-Gens, ausbildet, oder ob eine interne Struktur im
3’-NTR für die Modifikationsmuster
verantwortlich ist. Um dies zu überprüfen, wäre eine RNA zu konstruieren, die nur das 3’-Ende und
z.B. das CAT-Reportergen umfasst.
Für das EBOV wurde durch ein
solches Konstrukt gezeigt, dass
eine Interaktion zwischen 3’- und 5’Ende unwahrscheinlich ist (Weik et
al., 2005). Auch Crary und Kollegen
G
A G
70 U
U
A
C
A
G
*U
*U
A
C
60 A
A
U
U
A
U
A
A
G
A
5’ G A
50
A
C
MARV
U
U*
G
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U*
C*
U*
G
U
U
A
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U
A
U
U
C
U
U* G A A G A G A U G 3’
100
EBOV
A
A
U
U
A
U
A
A
G
A
60 A
G
G
A
A U G
U
U
U
U
C
C
U
C U C
70
80
3’
Abb. 47. Vergleich der Sekundärstrukturen des TSS des
fanden, dass weder eine mögliche NP-Gens von MARV und EBOV. Beide RNA-Strukturen
panhandle- noch 3’-interne Struktur wurden anhand von Positivstrang-RNA nachgewiesen. Das
TSS ist jeweils durch eine Linie hervorgehoben, das Start-
eine entscheidende Rolle für die AUG bei MARV unterstrichen, mit * markierte nts konnten
Replikation spielt (Crary et al.,
nicht eindeutig bestimmt werden. Die Struktur bei EBOV ist
entnommen aus Weik et al. (2002).
98
Diskussion – Struktur der 3’-NTR und Promotorelemente
2003). Bei Influenza A, einem segmentierten Negativstrang-RNA-Virus, hingegen wurde eine Interaktion von 3’- und 5’-Enden in Form einer corkscrew-Struktur gezeigt (Flick
et al., 1996, Hsu et al., 1987). Für VSV wurde nahegelegt, dass die Interaktion der Genom-Enden die Replikation steigert, die 3’-interne hairpin-Struktur hingegen die
Transkription (Wertz et al., 1994). Andere Gruppen jedoch zeigten für VSV und hPIV3,
dass dieses Phänomen eher auf einen stärkeren Replikationspromotor als auf die endständige Komplementarität zurückzuführen ist (Li & Pattnaik, 1997, Tapparel & Roux,
1996).
RNA-Sekundärstrukturen spielen bei vielfältigen biologischen Prozessen eine Rolle.
Ein bemerkenswertes Beispiel, welches zuerst bei Positivstrang-RNA-Viren (z.B. Picorna- und Flaviviren) entdeckt worden ist, ist die interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES, internal ribosome entry site). Sie ersetzt die Cap-Struktur und bringt Ribosomen
direkt an oder in die Nähe des Translationsstarts der mRNA. Eine Störung der Capabhängigen zellulären Proteinsynthese beeinflusst die virale, Cap-unabhängige also
kaum (Pelletier et al., 1988). Die IRES sind sehr komplex strukturiert und binden häufig
noch weitere (zelluläre) Proteine (Reviews z.B. in Kean, 2003, Martinez-Salas & Fernandez-Miragall, 2004). Diese Strukturen finden sich auch in eukaryotischen Zellen, wo
sie die Expression von z.B. Stressproteinen oder pro-apoptotischen Faktoren regulieren (Reviews z.B. in Pyronnet et al., 2000, Stoneley & Willis, 2004, Vagner et al.,
2001). In Bakterien können RNA-Strukturen u.a. eine Reaktion auf Umwelteinflüsse wie
Hitze oder Chemikalien ermöglichen (Narberhaus, 2002).
Die Ausbildung von Sekundärstrukturen der sehr fest enkapsidierten genomischen
und antigenomischen viralen RNA ist umstritten. Eine Möglichkeit wäre, dass die kurze
Zeitspanne, die die Polymerase mit der RNA interagiert, ausreichend für die Bildung
stabiler Strukturen ist. Bisher waren allerdings alle Versuche, isolierte Nukleokapside
chemisch zu modifizieren, erfolglos.
15.3
Charakterisierung der Replikationspromotoren von MARV, EBOV-Z und
EBOV-R
Filoviren besitzen innerhalb der Ordnung der Mononegavirales das längste Genom
und die längsten nicht-translatierten Regionen. Analyse von natürlich auftretenden de-
fective interfering particles (DIP) des EBOV zeigte, dass auch verkürzte 3’- und 5’Enden (156 bzw. 177 nts) effizient verpackt und repliziert werden können. Weder das
Gesamtgenom noch die (natürlichen) DIP weisen eine durch 6 oder andere ganze Zahlen teilbare Länge auf, was eine „rule of six“ ausschließt (Calain et al., 1999, Mühlberger et al., 1999). Charakteristika der „rule of six“ sind eine durch sechs teilbare Genom99
Diskussion – Struktur der 3’-NTR und Promotorelemente
länge, ein zweigeteilter Promotor und ein Promotormotiv, welches wichtige Elemente in
6er-Abständen beinhaltet (Calain & Roux, 1993, Durbin et al., 1997, Rager et al., 2002,
Skiadopoulos et al., 2003). Eine Erklärung dafür wurde von Vulliemoz und Roux (für
das Sendaivirus, SeV) vorgeschlagen: Die Enkapsidierung der RNA durch das Nukleoprotein N umfasst genau 6 nts, und die Promotorelemente müssen auf derselben Seite der RNA-Helix liegen, um von der Replikase/Transkriptase erkannt zu werden
(Vulliemoz & Roux, 2001). Andererseits gibt es auch Viren der Mononegavirales wie
z.B. das Pneumovirus RSV (Respiratorisches Synzytialvirus), die nicht der „rule of six“
folgen und einen ungeteilten Replikationspromotor haben (Samal & Collins, 1996). Sequenzvergleiche zeigten, dass Filoviren näher mit RSV verwandt sind als mit anderen
Viren (Mühlberger et al., 1992). Ebenso benötigen beide Viren ein viertes Nukleokapsidprotein als Transkriptionsaktivator (RSV: M2-1, EBOV: VP30) (Bermingham &
Collins, 1999, Weik et al., 2002).
M. Weik und K. Schlenz konnten zwei Promotorelemente (PE) für die Replikation
des EBOV identifizieren, die durch eine spacer-Region voneinander getrennt sind. Der
Abstand zwischen PE1 und PE2 konnte um 6 nts verlängert oder verkürzt werden, ohne dass die Replikationseffizienz verringert wurde. Allerdings standen die Ergebnisse
von Substitutions- und Deletionsmutanten in Widerspruch zueinander, und die detaillierte Struktur von PE2 blieb unklar (Schlenz, 2002, Weik, 2001). Durch Vergleich der
3’-Enden von MARV, EBOV-Z und EBOV-R wurden zwei gut konservierte Motive gefunden (siehe Abb. 16), die näher untersucht wurden: Motiv 1: ein sich wiederholendes
Hexamer (bei MARV „GUAACU“, bei EBOV-Z bzw. EBOV-R „U/CAACNN“), Motiv 2: 5-8
UN5-Hexamere, von denen ein gewisser Anteil UAN4 ist. Durch Punktmutationen konnte gezeigt werden, dass Motiv 1 nicht wichtig für die Replikation oder Transkription war,
obwohl in der 3’-NTR der Filoviren G und C nur zu 28-37% vorkommen. Für SeV,
hPIV3 und das Masernvirus konnte (CN5)3 als zweites Promotorelement identifiziert
werden, für das Simianvirus 5 (SV5) und das Newcastle Disease Virus (N4CG)3. Beim
MARV besteht das 2. Motiv aus (UN5)7, beginnt 3’ vom TSS mit nt 38 und ist durchgängig. Im Falle von EBOV-Z und EBOV-R scheint die Sekundärstruktur, in die das TSS
involviert ist, ein durchgängiges Motiv zu stören. An Position 50 bzw. 51 befindet sich
das erste von 4 UN5, an Position 80 bzw. 87 folgen dann 8 bzw. 5 weitere (erste Angabe EBOV-Z, zweite EBOV-R). Des Weiteren kann bei MARV und EBOV-R ein alternatives Leseraster gewählt werden, in dem jeweils 6 UN5 auftreten (Abb. 16); dieses Leseraster wurde aber nicht untersucht. Am genauesten wurde das UN5-Motiv bei EBOVZ untersucht. Die Replikationsfähigkeit mutierter Minigenome nahm stetig ab, je weniger intakte UN5-Hexamere vorhanden waren. Interessanterweise schienen jegliche drei
100
Diskussion – Struktur der 3’-NTR und Promotorelemente
aufeinander folgende Hexamere UN5 (die 5’ des TSS liegen) als Replikationspromotor
nutzbar zu sein, was die bisher widersprüchlichen Ergebnisse zum EBOVReplikationspromotor erklären konnte. Durch Deletionen wurden die 5’-gelegenen Hexamere entfernt, und bis zu drei Hexameren (∆94) war eine schwache aber reproduzierbare Replikation sichtbar. Bei nur zwei Hexameren (∆92) konnte keine replizierte
RNA detektiert werden (Weik et al., 2005). Dieses Ergebnis wurde auch nach dem Einführen gezielter Punkmutationen sichtbar, bei denen mehrere aufeinander folgende
UN5 gegen AN5 ausgetauscht wurden. Drei aufeinander folgende Hexamere ermöglichten schwache Replikation, zwei hingegen waren nicht mehr aktiv (Abb. 21). Zusätzlich
konnte gezeigt werden, dass die Substitution von nts 84-110, darunter auch die Us an
Pos. 81, 87, 93, 99 und 105, mit unspezifischer Sequenz nur einen schwachen Einfluss
auf die Replikation hatte; drei Hexamere waren noch intakt. Wurden allerdings 10 weitere nts ersetzt (3E-5E ∆250x84-120) oder nur die Us an Pos. 111 und 117, so war nur
noch ein Hexamer vorhanden, und die Replikation kam zum Erliegen (Weik et al.,
2005). Sämtliche Versuche, die Replikationsfähigkeit von Minigenomen wieder herzustellen, waren erfolglos. Dafür wurde das (UN5)3-Motiv an verschiedenen Positionen
durch in vitro-Mutagenese in unterschiedliche Minigenome eingebracht. In einer Mutante, 3E-5E ∆250 -5 (Schlenz, 2002), die bereits drei UN5-Hexamere enthielt aber nicht
replizierte, wurde das Motiv zu (UAN4)3 erweitert, ohne Replikation zu erhalten. Der
wahrscheinlichste Grund ist, dass alle wichtigen Signale neben den Us aus dem Leseraster geraten sind, weil in dieser Mutante der Abstand des PE2 zu PE1 um 5 verringert war. Mit (UN5)3 ist ein minimales Motiv gefunden worden, welches zwar notwendig
für die Replikation ist, aber nicht hinreichend.
Sowohl die Länge als auch die Sequenz der 3’-NTR des EBOV-R und EBOV-Z sind
sehr ähnlich (Abb. 16). Obwohl keine detaillierten Studien zur Struktur der Promotoren
für Replikation und Transkription des EOBV-R durchgeführt wurden, ist ein EBOV-Zähnlicher Aufbau wahrscheinlich. Deletionen haben gezeigt, dass die ersten etwa 100125 nts ausreichend für die Replikation sind (Abb. 23), was vergleichbar mit EBOV-Z ist
(Weik et al., 2005). Auch ein Teil des Replikationspromotors ist, soweit hier untersucht,
ähnlich aufgebaut. Durch die gleichzeitige Substitution der Us an Pos. 92 und 104 waren maximal 2 Hexamere UN5 hintereinander intakt, was zu einer starken Reduzierung
der Menge an replizierter RNA führte. Dies entspricht tendenziell den Ergebnissen des
Replikationspromotors des EBOV-Z, denn bei zwei oder weniger UN5-Hexameren war
keine Replikation mehr möglich. Allerdings lässt sich nicht ausschließen, dass das
zweite Leseraster, in welchem 6 UN5 anstelle von 5 vorkommen, einen größeren Ein101
Diskussion – Struktur der 3’-NTR und Promotorelemente
fluss hat. Vorher sollte auf jeden Fall untersucht werden, ob auch beim EBOV-R ein
zweigeteilter Promotor vorliegt.
Ein entscheidend anderer Aufbau der 3’-NTR findet sich beim MARV. Die Länge der
(natürlichen) 3’-NTR ist mit 104 nts in etwa so lang wie die minimale Sequenz, die für
die Replikation von EBOV-spezifischen Minigenomen benötigt wird. Durch Deletionen
konnte gezeigt werden, dass die ersten 70 nts für Replikation und Transkription benötigt werden (Abb. 15). Die gleichzeitige Substitution mehrerer Nukleotide des TSS oder
der darauf folgenden Sequenz hatte einen Verlust der Transkriptionsaktivität und eine
starke Reduktion der Replikation zur Folge (Abb. 13). Allerdings hatten einzelne Punkmutationen im Bereich von nt 65-71 keinen signifikanten Einfluss auf Replikation oder
Transkription (Abb. 17). Wurde hingegen das bereits im EBOV ausführlich untersuchte
(UN5)n-Motiv teilweise zerstört, indem die Us an Pos. 62, 68 und 74 gleichzeitig zu A
mutiert wurden und nur noch 4 UN3 übrig blieben, war die Replikation stark beeinträchtigt (Abb. 18). Deletionen bis nt 70 wurden toleriert, weshalb U74 anscheinend keine
kritische Rolle für den Replikationspromotor spielt (Abb. 15). Daher wäre es möglich,
dass die gleichzeitige Substitution der nts 56, 62 und 68 einen größeren Einfluss auf
die Replikationseffizienz haben könnte. Die Untersuchungen der Minigenome mit veränderter TSS-Sekundärstruktur (8.2) unterstützen die Annahme, dass wichtige Replikationselemente zwischen nt 60 und 70 lokalisiert sind. Mutante tss_MARV1→EBOV2,
die 5 Substitutionen in dieser Region hat, war nur stark eingeschränkt zur Replikation
fähig, ähnlich der Mutante tss_MARV→EBOV mit 7 Substitutionen; in Wiederholungsexperimenten waren beide Banden fast nicht detektierbar. Diese Reduktion ist nicht
alleine auf die Zerstörung des (UN5)3-Motivs zurückzuführen. Wie auch für PE2 des
EBOV-Z beschrieben, sind noch andere Nukleotide für eine effiziente Replikation notwendig.
Diese Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass sich die genomische Promotorstruktur des MARV deutlich von der der Ebolaviren unterscheidet, obwohl teilweise
dieselben Elemente (drei Hexamere UN5) involviert sind (Abb. 48). Während die Signale für Replikation und Transkription des EBOV separiert und für den Replikationspromotor eine zweigeteilte Struktur ermittelt werden konnte (Weik et al., 2005), scheint
beim MARV ein einteiliger Replikationspromotor vorzuliegen, der mit den Transkriptionssignalen überlappt. Ein generelles Problem bei der Bestimmung der Transkriptionsaktivität im eingesetzten Minigenomsystem ist aber, dass das CAT-Signal stark abhängig von replizierter minigenomischer RNA als Matrize ist. Ist die Replikation gestört,
so war bei bisher noch keiner Mutante Transkription messbar. Eine Möglichkeit, die
beiden Prozesse voneinander zu entkoppeln, wäre, die antigenomische Replikation zu
102
Diskussion – Struktur der 3’-NTR und Promotorelemente
stören, um damit die Synthese von genomischer RNA zu unterbinden. Somit wäre die
Menge an Matrize für die Transkription konstant und nur durch die eingesetzte Menge
an cDNA bestimmt. Für das RSV existiert eine solche Mutante bereits (Peeples & Collins, 2000), nicht aber für Filoviren. In dieser Arbeit wurde der antigenomische Replikationspromotor von MARV, EBOV-Z und EBOV-R zwar grob kartiert, aber für eine verwendbare Mutante muss überprüft werden, ob Enkapsidierung und genomische Replikation unbeeinträchtigt sind.
Zweigeteilte Promotoren, deren zweites Promotorelement der „rule of six“ folgt, findet man bei Mitgliedern der Paramyxovirusfamilie in den Unterfamilien Respiro-, Morbilli-, Rubula- und Avulavirus. Wichtige Beispiele für das zweite Promotorelement sind
(CN5)3, welches sich bei dem Sendai- und dem humanen Parainfluenzavirus 3 findet
(Hoffman & Banerjee, 2000, Tapparel et al., 1998) oder (N4CG)3 beim Simianvirus 5
und Newcastle Disease Virus (Marcos et al., 2005, Murphy & Parks, 1999). Die Gesamtlänge des Genoms der Viren ist dabei immer durch 6 teilbar. Im Gegensatz dazu
ist das Genom bei Filoviren nicht durch 6 teilbar, und anstelle von 3 Hexameren mit
A
EBOV-Z
55
3’
PE1
68
128
81
469
UN5UN5UN5
TSS
1
spacer
1
NP
deletierbar
PE2
5’
55
GCCUGUGUGUUUUUCUUUCUUCUUAAAAAUCCUAGAAAACACACGCUUAUUGAUA
67
81
CUCCUUCUAAUUAUUAAAAGGAGAG UAACUU UAAAUA UAGCCU UAAAUU
123
UAACUU UAACAA UGACAU UAGUGU GGAC...
B
MARV
1
48 60
70
103
3’
Rep
TSS
UN5UN5UN5UN5UN5UN5
Pro
NP
deletierbar
1
5’
37
UCUGUGUGUUUUUGUUCUCUACUACUAAAACACAUAG
48
60
70
UAUAŮU UAUUŮC UUCUŮA UAAUŮG UAACŮG UAACŮC
103
UGAACA GUCAGACAAUUAUAAGAACUUCUC...
Abb. 48. Vergleich der genomischen Promotorelemente von EBOV-Z und MARV. Die Daten zur Struktur
wurden anhand verschiedener Mutanten erhalten, die RNA-Struktur (Einsätze rechts; Markierung: TSS)
durch chemische Modifizierung. Die Promotorelemente für Replikation sind durch schwarze Boxen repräsentiert. Bereiche, die ohne signifikanten Einfluss auf Replikation und Transkription entfernt werden konnten, sind schraffiert dargestellt. Das NP-Gen (NP, dunkelgraue Box) war in den Minigenomen durch das
CAT-Gen ersetzt. Die grau hinterlegten Nukleotide der angegebenen Sequenz liegen gepaart vor, das
TSS ist unterstrichen. (A) Der Replikationspromotor des EBOV-Z ist zweigeteilt (PE1 und PE2). Die
spacer-Region schließt das TSS sowie die Sequenz der Sekundärstruktur (hellgrau) ein und kann um 6 nts
verlängert oder verkürzt werden. PE2 besteht aus mind. (UN5)3, wobei das erste U an Pos. 81, 87, …, 111
liegen kann (fett in Nukleotidsequenz). (B) Der Replikationspromotor (RepPro) des MARV überlappt mit
dem TSS und beinhaltet das Motiv (UN5)3. Ů: Alternative UN5, die nicht untersucht wurden.
103
Diskussion – Struktur der 3’-NTR und Promotorelemente
konservierten C bzw. CG finden sich 8 UN5-Hexamere. Zudem reichen die Signale bei
MARV und EBOV bis in das erste Gen (NP) hinein. Allerdings ist das Pneumovirus
RSV am engsten mit den Filoviren verwandt, für welches bisher allerdings noch kein
Promotorelement gefunden, das der „rule of six“ folgt.
Die ersten Ergebnisse der trailer-Deletionsmutanten wurden an NegativstrangMinigenomen gewonnen. Die 3M-5M-trailer-Deletionsmutanten ∆150, ∆150 und ∆90
zeigten eine sehr gute Replikationseffizienz, während die Substitutionsmutante 3M-5M
trailer 4U→A nur sehr schwach repliziert wurde (Abb. 26A). Die Untersuchung von trai-
ler-Mutationen in negativsträngigen Minigenomen ist jedoch ungenau, weil durch die
T7-RNA-Polymerase kontinuierlich negativsträngiges Minigenom als Matrize für Positivstrang-RNA transkribiert wird. Da der genomische Promotors funktionell ist, ist nur
die Amplifikation gestört ist. Deshalb erhält man ein (Hintergrund-)Signal, auch wenn
der antigenomische Replikationspromotor defekt ist. Wenn sowohl der genomische als
auch der antigenomische Replikationspromotor funktionsfähig sind und Amplifikation
stattfinden kann, sollte sich das Signal der replizierten RNA deutlich verstärken. Um die
Probleme mit dem Hintergrund zu vermeiden, wurden die Mutationen in PositivstrangMinigenomen untersucht. Die Replikation von 3M-5M trailer ∆150 (+) war besser als
die von ∆105 (+), allerdings zeigte ∆90 (+) keinerlei Replikation (Abb. 26C). Wäre die
∆90 (+)-Mutante tatsächlich replikationsdefizient, sollte das entsprechende (-)Konstrukt nur ein Hintergrundsignal liefern. 3M-5M trailer ∆90 (-) repliziert jedoch ähnlich effizient wie 3M-5M (Abb. 26A Spur 5). Eine andere Möglichkeit ist, dass der ∆90
(+)-Klon zusätzliche Mutationen hat, die die Replikation verhindern. Das schwache
Signal von 3M-5M trailer 4U→A (Abb. 26A Spur 6) würde dann den eigentlichen Hintergrund repräsentieren. Die in vitro-Mutagenese des (+)-Klons war bisher nicht erfolgreich, was eine genaue Aussage unmöglich macht. Bei den untersuchten trailerDeletionsmutanten von 3E-5E waren keine Unterschiede zwischen den Negativstrangund Positivstrang-Minigenomen zu erkennen (Abb. 26B und D). In beiden Fällen war
die Replikation von ∆121 deutlich geringer als die von ∆151.
Wie in Abb. 49 gezeigt ist, findet sich in der komplementären Sequenz des trailers
des MARV und EBOV ein (UN5)4-Motiv, welches in der Substitutionsmutante 3M-5M
trailer 4U→A sowie in der Deletionsmutante 3M-5M trailer ∆90 zerstört wurde. Eine
eindeutige Aussage zur Bedeutung dieses Motivs für die antigenomische Replikation
kann aus oben genannten Gründen allerdings nicht getroffen werden. Dieses Motiv
wurde in der 3E-5E-trailer-Deletionsmutante ∆121 auch zerstört, und die Replikation
war stark beeinträchtigt. Dennoch scheint der Einfluss dieses Motivs auf die antigeno104
Diskussion – Struktur der 3’-NTR und Promotorelemente
mische Replikation nicht so drastisch zu sein wie beim genomischen Replikationspromotor, wo mind. 3 Hexamere intakt sein mussten. Die erhaltenen Ergebnisse lassen
daher lediglich den Schluss zu, dass der für die antigenomische Replikation wichtige
Bereich beim MARV die letzten 90-105 nts und beim EBOV-Z etwa die letzten 121 nts
umfasst.
Die 5’-NTR der Mononegavirales wurden bisher nur wenig untersucht. Die vorliegenden Daten stammen aus Isolierung und Charakterisierung von DIP oder Untersuchungen an copyback-Minireplikons. In natürlich vorkommenden DIP des VSV wurden
36 nts der 5’-NTR gefunden, und in Versuchen mit mutierten Minireplikons waren
29 nts ausreichend, um infektiöses Virus zu erzeugen (Pattnaik et al., 1995, Whelan &
Wertz, 1999). Im 5’-Ende des SV5 werden die letzten 90 nts als antigenomischer Promotor benötigt, von denen drei Regionen wichtige Primärsequenz enthalten, deren Abstand ebenfalls wichtig ist (Keller et al., 2001). Peeples und Collins erreichten durch
eine einzige Punktmutation, den antigenomischen Replikationspromotor zu zerstören
und die Synthese von minigenomischer RSV-RNA auf einen Schritt zu begrenzen
(Peeples & Collins, 2000). Die gleiche Gruppe konnte zeigen, dass die komplementäre
Sequenz der letzten 36 nts des trailers des RSV zur Replikation fähig war, wenn sie
direkt 3’ des TSS angefügt wurde. Durch diverse Versuche wurde gezeigt, dass die
Promotornutzung der 3’- und 5’-Enden teilweise gleich ist (Fearns et al., 2000). In dieser Arbeit konnte dies aus Zeitgründen nicht ausführlich gezeigt werden. Wichtige Folgeexperimente umfassen daher die genaue Untersuchung des UN5-Motivs und die
Lokalisierung
von
MARV cTrailer:
CCUGUGUGUU 10UUUUCUACUU
AAAUUAAAAA
Motiven.
20CUUACAAAAC 30ACAAUGAAUA 40UAGUUUCGAA 50
*
*
*
60AUUAAAAUAU 70AUAACCAAAA 80AGAAUUAAAU 90GUAAGUGUAG100
CUGU* AAGAUC110
^∆105
EBOV cTrailer:
ACCUGUGUGU 10UUUUUCUUCU
UGGUAAAAAG
gemeinsamen
^∆90
20UUAUCUAAAU 30AAAAAUUUAA 40AAACACACGC 50
60GUCCUUAGGA 70AAAACGUUGC 80AAAUAAGACC 90GCUCGGAAGA100
CUACUCGCAC110CAGUUACAGA120AUUAAUAGUA130AUUGUGCUUC140UAAUAAUAGA150U
^∆121
^∆151
Abb. 49. Komplementäre Sequenz der trailer des MARV und EBOV-Z. Die Sequenzen sind entsprechend
des Antigenoms nummeriert. U-Reste, die zu dem UN5-Motiv gehören sind unterstrichen und mit einem
Sternchen (*) markiert, wenn sie gegen A ausgetauscht wurden (MARV). Unter den Sequenzen sind die
Positionen der Deletionsmutanten angegeben.
105
Diskussion – Volle-Länge-Rescue-System für MARV
16 Etablierung eines Volle-Länge-Rescue-Systems für MARV und
seine Anwendung
Das Minigenomsystem, welches sowohl für EBOV-Z, EBOV-R und MARV existiert,
eignet sich sehr gut, um unter Bedingungen außerhalb der Sicherheitsstufe 4 Replikation und Transkription zu untersuchen (Boehmann et al., 2005, Mühlberger et al., 1998,
Mühlberger et al., 1999). Um komplexere Problemstellungen, wie z.B. die Auswirkung
von Mutationen im Oberflächenprotein oder in Proteinen, die mit dem Immunsystem
interagieren, untersuchen zu können, ist ein Volle-Länge-System notwendig. Durch
molekularbiologische Standardmethoden kann das virale Genom als cDNA direkt modifiziert und der Einfluss in vivo studiert werden. Ein wichtiges Forschungsgebiet ist die
Erzeugung rekombinanter Viren, die als Kandidaten eines attenuierten Lebendvakzins
dienen könnten, wie schon für VSV und RSV gezeigt werden konnte (Ball et al., 1999,
Wertz et al., 1998, Whitehead et al., 1999). Inzwischen stehen für sehr viele Vertreter
der Mononegavirales Rescue-Systeme zur Verfügung (Reviews z.B. in Conzelmann,
2004, Neumann et al., 2002b). Der Durchbruch der reversen Genetik der Mononegavi-
rales gelang 1994, als zum ersten Mal das Volle-Länge-Antigenom anstelle des Genoms eingesetzt wurde (Schnell et al., 1994). Bisher ist nur für das Sendaivirus ein
Rescue-System beschrieben, das auf genomischer RNA basiert (Kato et al., 1996).
Trotz zahlreicher Versuche war es lange Zeit nicht möglich gewesen, infektiöses MARV
allein aus cDNA-Plasmiden zu erzeugen. Ein solches System wurde 2001 von Volchkov und Kollegen für das EBOV vorgestellt (Volchkov et al., 2001). Das RescueSystem für MARV wurde in der vorliegenden Arbeit präsentiert. Sämtliche Arbeiten mit
rekombinantem MARV mussten aufgrund von Sicherheitsbestimmungen in Lyon im
Labor von Prof. Volchkov durchgeführt werden.
16.1
Erfolgreiche Isolierung von rekombinantem MARV
Das MARV wächst unter gleichen Infektionsbedingungen deutlich langsamer als
EBOV-Z. Ein ausgeprägter CPE ist erst 5-6 Tage nach Infektion von MARV sichtbar,
verglichen mit 3 Tagen bei EBOV-Z. Diese Inkubationszeit ist für HuH-T7- und BSR
T7/5-Zellen recht lang, da sie spätestens nach 4-5 Tagen umgesetzt werden müssen.
Außerdem sind die Zellen – insbesondere HuH-T7 – nach einer Transfektion stark geschädigt und lösen sich z.T. ab. Das Rescue von Metapneumo- und Masernviren konnte deutlich verbessert werden, wenn transfizierte Zellen mit Vero-Zellen kokultiviert
wurden (U. Buchholz, persönliche Mitteilung, Parks et al., 1999). Gassen und Kollegen
stellten in Experimenten zum Rescue von Canine Distemper Virus fest, dass sich abgelöste HeLa-Zellen durch Zugabe von Vero-Zellen wieder absetzten und zu einem dich106
Diskussion – Volle-Länge-Rescue-System für MARV
ten Zellrasen wuchsen (Gassen et al., 2000). Obwohl sich rekombinante EBOV direkt
aus transfizierten BSR T7/5-Zellen isolieren ließen, war die Ausbeute gering, wahrscheinlich wegen ineffizienter Knospung (Volchkov et al., 2001). Aufgrund dieser Beobachtungen wurden zunächst HuH-T7-Zellen, die in anderen Versuchen sehr gute
Transfektionseffizienz und hohe Ausbeute an replizierter RNA gezeigt hatten (vgl. Kapitel 7), transfiziert und 6 d p.t. mit subkonfluenten Vero-Zellen gemischt. Die anfänglichen Experimente mit HuH-T7-Zellen waren zwar teilweise erfolgreich aber nicht reproduzierbar. BSR T7/5-Zellen zeigten eine wesentlich bessere Verträglichkeit gegenüber Transfektion der etwa 7 µg DNA mit Fugene 6. Möglicherweise war auch der Umstieg von 6er-Gewebekulturplatten auf 25 cm²-Flaschen ein positiver Faktor, weil dadurch eine größere Fläche mit mehr Zellen für denselben Transfektionsansatz zur Verfügung stand. Nach der Transfektion wurden in den BSR T7/5-Zellen wahrscheinlich
nur geringe Mengen an Viren gebildet, die evtl. nur ineffizient freigesetzt wurden. In
einem Experiment wurden Vero-Zellen entweder mit den Überständen transfizierter
BSR T7/5-Zellen infiziert oder mit den transfizierten Zellen kokultiviert. Von acht getesteten Proben war nur eine nach Infektion positiv (pMARV (+) leader 3U→A), aber die
Positivkontrolle (pMARV (+)) konnte erst nach Kokultivierung detektiert werden (Abb.
39). Der Grund dafür ist wahrscheinlich, dass freigesetzte Viren die kokultivierten VeroZellen infizieren und sich in diesen effizient vermehren konnten. Trotzdem war es nötig,
anschließend frische Vero-Zellen mit den Überständen der Mischkulturen zu infizieren,
um ausreichende Mengen an Virus für weitere Versuche zu erhalten.
Ein weiterer kritischer Faktor war die Expressionsrate der T7-RNA-Polymerase. In
Experimenten, die die Isolierung replizierter RNA verbessern sollten, wurde eine deutliche Steigerung der RNA-Menge durch Kotransfektion des Plasmids pCAGGS/T7 beobachtet (Abb. 7). Wurden 0,5 µg pCAGGS/T7 transfiziert, so war das Rescue nicht zu
100% effizient, mit 1,0 µg hingegen waren alle Kontrollansätze positiv (z.B. Abb. 37).
Insgesamt bewirkte die Zugabe dieses Plasmids eine Steigerung der Effizienz der Rescue-Experimente auf etwa 90%. Die Expressionsrate der T7-RNA-Polymerase ist ein
kritischer Faktor, weil nicht nur alle Plasmide – inkl. des Volle-Länge-Antigenoms – in
ausreichenden Mengen transkribiert werden müssen, sondern auch das Verhältnis zwischen z.B. NP und VP35 kritisch ist. Während im Minigenomsystem die Veränderung
des Verhältnisses pTM1/NP:pTM1/VP35 von 1:5 auf 1:1 Replikation und Transkription
zum Erliegen brachte (Mühlberger et al., 1998), war das Verhältnis von 1:1 im VolleLänge-Rescue-System sehr effizient (11.2.3, z.B. Ansatz 2). Eine Erklärung ist, dass
das Volle-Länge-Genom mit gut 19,1 kb RNA mehr NP benötigt als die Minigenome mit
einer Länge von nur etwa 1,2 kb. Wurde mehr Polymerase (pTM1/LM) transfiziert, war
107
Diskussion – Volle-Länge-Rescue-System für MARV
das Rescue nur unwesentlich schwächer (11.2.3, Ansatz 3). Beim Masernvirus hingegen war die transfizierte Menge des Polymerase-Plasmids und des Antigenoms kritisch
(A. Maisner, pers. Mitteilung).
16.2
Anwendung des Rescue-Systems – Rolle des VP30
Eine Besonderheit von Filoviren ist, dass sie ein viertes Nukleokapsidprotein – VP30
– kodieren, was innerhalb der Mononegavirales nur noch bei Pneumoviren (M2-1) auftritt (Becker et al., 1998, Kiley et al., 1982). Die Funktion des VP30 des EBOV liegt in
der Transkriptionsaktivierung, wohingegen das M2-1 des humanen RSV ein Antiterminationsfaktor ist (Collins et al., 1996, Fearns & Collins, 1999, Hardy et al., 1999, Hardy
& Wertz, 1998, Weik et al., 2002). Untersuchungen zum Beitrag des VP30 des MARV
zu Replikation und/der Transkription im MARV-spezifischen Minigenomsystem waren
nur bedingt möglich, da VP30 keinen Einfluss auf die beiden Prozesse hatte, aber im
EBOV-spezifischen Minigenomsystem geringe Aktivität zeigte (Mühlberger et al., 1998,
1999). Interessanterweise besitzen VP30M und VP30E ein Zink-bindendes Motiv Cys3His, welches von Modrof und Kollegen für EBOV eingehend untersucht wurde. Wurde
der Zn-Finger zerstört, war die Transkription gestört, nicht aber die Bindung an NP
(Modrof et al., 2003). Die Bedeutung dieses Motivs in VP30M wurde zunächst im EBOV-spezifischen Minigenomsystem untersucht. Ein zerstörtes Zn-Finger-Motiv resultierte in einem Verlust der Transkriptionsaktivität (Abb. 36). Wurde pTM1/VP30M Zn-Finger
knockout
benutzt, um rekombinantes MARV zu erzeugen, war das Rescue möglich (4 von
6 Ansätzen, Abb. 37A). Während VP30M das Rescue von EBOV-Z in Experimenten mit
heterologen Nukleokapsidproteinen nicht unterstützte (Theriault et al., 2004), war es
umgekehrt möglich, VP30M durch VP30E zu ersetzen und rekombinantes MARV zu
generieren, wenn auch mit geringerer Effizienz, denn selbst unter optimalen Bedingungen war nur einer von drei Ansätzen positiv (Abb. 37A). Wurde kein VP30-Plasmid
transfiziert, zeigten sich in zwei von drei Ansätzen sehr schwache Banden (Abb. 37A),
die auf negativsträngige RNA zurückzuführen waren, also wahrscheinlich schwache
Replikation widerspiegeln (Abb. 37B). Dennoch war es bisher nicht möglich, infektiöses
Virus aus diesen Ansätzen zu isolieren oder positive Signale in der Immunfluoreszenz
zu erhalten. In Wiederholungsexperimenten zeigte auch die Kontrolle, in der kein
pTM1/LM transfiziert worden war, eine vergleichbare Hintergrundbande (Daten nicht
gezeigt). Es ist daher nicht auszuschließen, dass die sehr schwachen Signale doch
unspezifisch sind und nicht auf virale (–)-RNA zurückgeführt werden können.
Es gibt einen entscheidenden Unterschied zwischen dem Minigenom- und VolleLänge-Rescue-System: Wenn heterologe Nukleokapsidproteine zum Rescue einge108
Diskussion – Volle-Länge-Rescue-System für MARV
setzt werden, läuft die Replikation und/oder die Transkription möglicherweise nur sehr
ineffizient ab und nur wenige Viren entstehen. Diese können sich allerdings anschließend exponentiell vermehren, da die authentischen viralen Proteine zur Verfügung
stehen. Im Minigenomsystem hingegen findet immer nur die verringerte Replikation/Transkription ohne Amplifikation statt. Dies stellten auch Theriault und Kollegen fest,
als sie den Einfluss von heterologen Helferplasmiden auf die Rescue-Effizienz des
EBOV-Z untersuchten. Einige Kombinationen von Nukleokapsidproteinen, die im Minigenomsystem keine Replikation und Transkription zuließen, resultierten dennoch in der
Entstehung infektiöser Viren (Theriault et al., 2004).
Sämtliche Rescue-Versuche mit Genomen, in denen das VP30-Gen mutiert ist, waren erfolglos. Zwar konnte in den RT-PCR-Proben der Ansätze eine schwache Bande
detektiert werden, die aber wie eben diskutiert wahrscheinlich unspezifisch ist, weil
infektiöses Virus weder passagiert noch in der Immunfluoreszenz sichtbar gemacht
werden konnte. Es ist möglich, dass die Mutationen im VP30-Gen die Vermehrung der
Viren derart eingeschränkt hatte, dass keine Viren mehr produziert werden konnten.
Die Wiederholung der Rescue-Experimente war mehrfach erfolglos (inkl. der Standardansätze), weil die Zellen bzw. das Medium stark mit Mykoplasmen kontaminiert waren.
Bis zum Ende dieser Arbeit war eine Verifizierung der Ergebnisse daher leider nicht
möglich.
Beide experimentellen Ansätze weisen darauf hin, dass VP30 wichtig für den Lebenszyklus des MARV ist, obwohl es im Minigenomsystem nicht benötigt wird
(Mühlberger et al., 1998). Aus den vorliegenden Daten lässt sich nicht eindeutig sagen,
ob VP30 ausschließlich eine strukturelle Komponente oder auch transkriptionell aktiv
ist. Denn obwohl VP30M und VP30E beide ein Zn-Finger-Motiv enthalten, scheint EBOV
dieses nicht gleich gut nutzen zu können. Es ist dennoch essentiell, denn die Zerstörung führt bei beiden Proteinen zum Verlust der Transkriptionsaktivität. Ein Vergleich
der Kristallstrukturen beider Proteine könnte zeigen, ob eine unterschiedliche Lokalisierung des Zn-Finger-Motivs die Ursache ist. Allerdings bildet VP30 unlösliche Aggregate, was eine Aufreinigung und die davon abhängige Kristallisation bisher unmöglich
machten (S. Enterlein, unveröffentlichte Ergebnisse, B. Hartlieb, pers. Mitteilung,
Modrof et al., 2003). Zudem ist immer noch ungeklärt, ob VP30 direkt mit (viraler) RNA
interagiert, oder ob es über Protein:Protein-Interaktionen mit den restlichen Nukleokapsidproteinen verbunden ist (vgl. Becker et al., 1998). Es konnte gezeigt werden,
dass die Phosphorylierung des VP30M wichtig für die Rekrutierung in die von NP gebildeten Einschlusskörperchen ist, was eine Interaktion der beiden Proteine nahe legt
(Modrof et al., 2001). In Experimenten mit siRNAs wurde gezeigt, dass die Ausschal109
Diskussion – Volle-Länge-Rescue-System für MARV
tung von VP30 die Synthese aller MARV-spezifischen Proteine stark einschränkte, was
eine Beteiligung an der Replikation und/oder Transkription vermuten lässt (Fowler et
al., 2005). Collins und Kollegen fanden, dass der Antiterminationsfaktor der Transkription des RSV, M2-1, für das Rescue von rekombinantem RSV notwendig war (Collins
et al., 1999). Im Gegensatz dazu konnte rekombinantes humanes Metapneumovirus
ohne M2-1 (und M2-2) erzeugt werden, obwohl die Virusreplikation im Tiermodell stark
eingeschränkt war (Buchholz et al., 2005).
16.3
Anwendung des Rescue-Systems – Ausblick
Rekombinantes MARV zeigte in keiner der angewandten Nachweisemethoden signifikante Unterschiede zum MARV-wt (11.2). Das Virus wuchs zu ähnlichen Titern und
zeigte charakteristischen CPE etwa 5-6 d p.i. Bisher konnten noch keine Tierversuche
mit rekombinantem MARV durchgeführt werden, weil die Sequenz des Volle-LängeKonstrukts auf einem Isolat basiert, welches ausschließlich in Zellkultur passagiert
wurde und daher keinen Wirtstropismus für Nagetiere aufweist. Der Einsatz in Tieren
wie z.B. Mäusen oder Meerschweinchen würde also zunächst eine Anpassungsphase
erfordern. Alternativ könnten die Mutationen, die für den unterschiedlichen Tropismus
verantwortlich sind, gezielt in das Genom eingebracht werden, sobald die Unterschiede
der Genomsequenzen bekannt sind. Ein an Meerschweinchen angepasstes MARV ist
bereits seit einigen Jahren bekannt (Hevey et al., 1997). An Meerschweinchen angepasstes EBOV zeigte insgesamt nur acht Substitutionen im L-, NP- und VP24-Gen, von
denen zwei nicht zu Aminosäureaustauschen führten (Volchkov et al., 2000). Wenn ein
angepasstes Virus vorhanden ist, können dann Effekte von Mutationen auf z.B. die
Wechselwirkung mit dem Wirtsorganismus eingehend studiert werden. Ein wichtiger
Kandidat ist neben dem Oberflächenprotein GP das VP35, was nicht nur für Replikation
und Transkription, sondern auch für die Inhibierung der Interferon-Typ-I-Antwort verantwortlich ist (Basler et al., 2003, Basler, 2004). Interessant wäre eine Mutante, die
zwar Replikation und Transkription unterstützt, aber kein Interferon-Antagonist mehr ist.
Untersuchungen zu diesem Thema werden momentan für EBOV durchgeführt (M.
Grosch, pers. Mitteilung). Aber auch in Zellkultur können rekombinante Viren zur Aufklärung der Pathogenese und v.a. des viralen Lebenszyklus eingesetzt werden. Ein
rekombinantes EBOV, welches das grün-fluoreszierende Protein eGFP ins Genom
inseriert hatte, wurde u.a. bereits erfolgreich für die Untersuchung von antiviralen Komponenten in Zellkultur eingesetzt (Towner et al., 2005). Um die Interaktionen des Rabiesvirus mit der Wirtszelle besser untersuchen zu können, wurde ein rekombinantes
Virus hergestellt, welches ein eGFP-gekoppeltes P-Protein exprimierte. Dadurch war
110
Diskussion – Volle-Länge-Rescue-System für MARV
es möglich, die Bindung an und Aufnahme in die Zelle durch Fluoreszenzmikroskopie
verfolgen zu können (Finke et al., 2004). Ein rekombinantes MARV bietet demnach
eine Fülle von Anwendungsmöglichkeiten, die über Studien des viralen Lebenszyklus
über Pathogenitätsuntersuchungen bis hin zur Entwicklung eines attenuierten Virus
reichen.
16.4
Anwendung des Rescue-Systems – Untersuchung der genomischen
Promotorregion
In dieser Arbeit wurden zwei Volle-Länge-Konstrukte mit Mutationen im 3’-Ende des
Genoms auf ihre Fähigkeit untersucht, infektiöses Virus zu erzeugen. Ein Konstrukt
enthielt U→A Substitutionen an Pos. 62, 68 und 74, welche im Minigenomsystem zu
einer deutlichen Reduzierung der Replikation geführt hatten (Abb. 18). Auch nach mehreren Versuchen war ein Rescue des Volle-Länge-Genoms mit denselben Mutationen
nicht möglich, obwohl die Sequenzierung bisher keine zusätzlichen Mutationen aufzeigte. Es wurde erwartet, dass eine verringerte Replikationseffizienz dennoch zu vermehrungsfähigen Viren führt, wenn auch langsamer, denn im Gegensatz zum Minigenomsystem findet im Volle-Länge-Rescue-System eine Amplifikation statt (s.o.).
Die zweite untersuchte Mutante enthielt 18 zusätzliche nts, welche den minimalen
EBOV-spezifischen Replikationspromotor ((UN5)3) darstellen (nts 80-97). Dadurch sollte eine verbessert Replikation erreicht werden, unter der Annahme, dass die Anzahl
der UN5-Hexamere wichtig ist. Zunächst erschien diese Annahme bestätigt, weil nur bei
dieser Mutante direkt aus dem Überstand transfizierter BSR T7/5-Zellen Virus auf VeroZellen übertragen werden konnte. Weitere Inkubation auf Vero-Zellen zeigten allerdings keinen früheren CPE, was auf eine beschleunigte Vermehrung hingedeutet hätte
(Daten nicht gezeigt). Als zusätzliche Überprüfung wurden zwei Minigenome konstruiert, die entweder zwei oder drei UN5-Motive des EBOV-Replikationspromotors enthielten. Die Replikation und Transkription der beiden Konstrukte wurde im Minigenomsystem über CAT-Assays quantifiziert (Abb. 19). Den Ergebnissen des Volle-LängeKonstrukts entsprechend war auch bei den Minigenomen keine signifikante Zunahme
der Replikation/Transkription zu beobachten. Allerdings kann aus diesen Ergebnissen
geschlossen werden, dass das Einfügen einer Fremdsequenz sowohl von Minigenomen als auch vom Volle-Länge-MARV toleriert werden. Es gilt weiter zu untersuchen,
ob die eingefügten Nukleotide auch nach mehreren Passagen noch vorhanden sind,
oder ob sie ausgetauscht oder entfernt wurden. Aus evtl. Mutationen könnten dann
Rückschlüsse auf wichtige Motive ermöglichen.
111
Diskussion – Volle-Länge-Rescue-System für MARV
16.5
Anwendung des Rescue-Systems – Hilfsmittel für „Bioterroristen“?
Seit einigen Jahren ist die Nutzung von Filoviren als biologische Waffen heiß diskutiert, obwohl bisher noch keine Übertragung durch Aerosole nachgewiesen werden
konnte und eine Übertragung engen Kontakt mit infizierten Personen bzw. infiziertem
biologischen Material benötigt (Bray, 2003, Burnett, 2005, Feldmann et al., 1992, 2004,
Leffel & Reed, 2004, Niedrig et al., 2004, Slenczka, 1999). Im Vergleich zu bakteriellen
Kampfstoffen wie z.B. Anthrax erfordern Viren sehr viel mehr technische Ausstattung
für steriles Arbeiten (Inkubatoren, Sicherheitswerkbanken etc.) und eine geeignete
Zellkultur. Viren sind außerhalb eines Wirtes nur begrenzt stabil und sind im Falle von
umhüllten Viren empfindlich gegenüber Lösungsmitteln. Infektiöses Material ist wahrscheinlich relativ einfach aus Ausbruchsgebieten zu bekommen, aber die gezielte Modifizierung der viralen RNA erfordert technisches Wissen und eine gute Laborausstattung. Es ist nicht ausreichend, die virale RNA zu isolieren und Zellen mit dem cDNAPlasmid zu transfizieren, wie es z.B. für Positivstrang-RNA-Viren gezeigt werden konnte (Racaniello & Baltimore, 1981, Taniguchi et al., 1978) oder gar aus Primern die Sequenz zusammenzusetzen (Cello et al., 2002). Für die Generierung von NegativstrangRNA-Viren benötigt man neben dem viralen Genom noch die Nukleokapsidproteine,
die die Replikation und Transkription vermitteln (Reviews z.B. in Conzelmann, 2004,
Neumann et al., 2002b). Die hier vorgestellten Ergebnisse des Volle-Länge-RescueSystems basieren auf Plasmiden, die in vielen Schritten unter Verwendung zahlreicher
molekularbiologischer Methoden entstanden. Da diese Plasmide nicht frei verfügbar
sind, müssten diese Schritte unabhängig wiederholt werden, was sehr zeitaufwendig
und fehleranfällig ist. Selbst mit dem Wissen des funktionierenden Rescue-Systems
des EBOV war ein solches System für das MARV lange Zeit nicht erfolgreich, was die
Empfindlichkeit dieser Systeme widerspiegelt. Um mit diesem System waffenfähige
Filoviren erzeugen zu können, wären als nächstes Mutanten notwendig, die sich leichter, am besten aerosol, übertragen lassen. Dies ist mit Gewissheit keine leichte Aufgabe. Die größte Wirkung von Filoviren als potentielle Biowaffe besteht demnach vorerst
in der Verbreitung von Furcht (Bray, 2003).
112
Diskussion – Inhibition von EBOV durch P-PMOs
17 Die gezielte Herunterregulierung von VP35 inhibiert die Vermehrung von EBOV
Die Inhibierung von viralen Infektionen ohne starke Nebenwirkungen ist das erstrebenswerte Ziel eines guten Therapeutikums. Neben einem rekombinanten Inhibitor des
Faktor VIIa-Gerinnungsproteins konnte auch ein attenuiertes VSV, welches das GP
von MARV oder EBOV exprimierte, die Überlebenschance von EBOV-infizierten Affen
verbessern (Geisbert & Hensley, 2004, Geisbert et al., 2003, Jones et al., 2005) (siehe
auch 2.4). Bisher ist die Isolierung der infizierten Personen die beste Möglichkeit, eine
Filovirus-Epidemie einzugrenzen. Oft wird erst spät eine Filovirusinfektion diagnostiziert, was Behandlungen erschwert. Für einzelne Fälle, wie sie z.B. bei einem Laborunfall auftreten können, wäre evtl. ein Inhibitor ausreichend, der nur kurz nach der Infektion wirksam ist, weil er sofort nach dem Unfall oder sogar präventiv appliziert werden
kann.
In dieser Arbeit wurden Daten präsentiert, die die spezifische Inhibition von EBOV
durch Peptid-konjugierte synthetische DNA-Analoga (P-PMOs) in Zellkultur zeigen. Die
gleichen Sequenzen, sowohl mit als auch ohne Peptidkonjugat, wurden in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Dr. Bavari (USAMRIID, Frederick, USA) im Tiermodell
und AVI BioPharma Inc. (Corvallis, Oregon, USA) in einem zellfreien System getestet.
Die Ergebnisse werden im Folgenden vorgestellt, verglichen und diskutiert.
17.1
Der Translationsstart des VP35 als vielversprechendes Ziel
Insgesamt wurden sechs Zielsequenzen auf viralen RNA-Spezies ((–)-RNA oder (+)RNA bzw. mRNA) ausgesucht, zu denen komplementäre, P-PMOs synthetisiert wurden. Die Überprüfung in Zellkultur ergab, dass nur zwei P-PMOs inhibitorische Wirkung
zeigten: 3136 P-PMO, das gegen den Translationsstart des VP35 ((+)-RNA), und
18959 P-PMO, das gegen das Komplement des trailers (ebenfalls (+)-RNA) gerichtet
war (Abb. 42). Allerdings zeigte 18959 P-PMO eine ungewöhnlich hohe Zytotoxizität,
was eine spezifische Inhibition in Frage stellte und eine weitere Verwendung ausschloss (Abb. 50). Die Ursache für die fehlende Inhibierung der übrigen P-PMOs ist
unklar. Es bleibt die grundlegende Frage, ob die Konstrukte nicht mit der Zielsequenz
paaren konnten, oder ob die Basenpaarung zwar zustande kam, diese aber keine signifikanten Auswirkungen auf kritische molekulare Ereignisse des EBOV hatte. Die drei
gegen (–)-RNA gerichteten P-PMOs waren sehr wahrscheinlich aufgrund der physikalisch Unzugänglichkeit der RNA nicht in der Lage Basenpaare auszubilden. Die feste
Enkapsidierung der RNA durch die Nukleokapsidproteine wurde durch die Stabilität in
113
Diskussion – Inhibition von EBOV durch P-PMOs
Abb. 50. Auswertung der Zytotoxizität der
P-PMOs. Vero-Zellen wurden mit 5-25 µM
der P-PMOs 3136, 18959 und Scramble
inkubiert. Nach 24 h wurden die Zellen in
einem MTT-Assay untersucht (Kinney et
al., 2005). Die Daten sind als prozentuale
Änderung gegenüber unbehandelten
Vero-Zellen aufgetragen. Zur Verfügung
gestellt von D. Stein.
120,00%
Percent of Control
100,00%
80,00%
60,00%
40,00%
20,00%
18959
3136
Scr
0,00%
5
10
µM P-PMO
15
20
hohen Salzkonzentrationen und durch Resistenz gegenüber Verdau mit MCN nach
Behandlung mit nicht-ionischen Detergenzien gezeigt (Becker et al., 1998, Boehmann
et al., 2005, Mühlberger et al., 1998, 1999). Bisher wurden hauptsächlich InhibitionsStudien mit PMOs an Positivstrang-RNA-Viren wie z.B. Dengue- und Coronaviren
durchgeführt, in denen der Translationsstart eines viralen Proteins als Ziel diente
(Kinney et al., 2005, Neuman et al., 2004). Der Mechanismus der Inhibition an dieser
Stelle ist wahrscheinlich, dass sich eine PMO:RNA-Duplex bildet, die eine korrekte
Positionierung der ribosomalen 60 S Untereinheit stört und so die Translation einschränkt oder gänzlich verhindert (Ghosh et al., 2000). Im Falle von EBOV kann eine
Interferenz mit der Synthese genomischer RNA jedoch nicht ausgeschlossen werden,
da sich auf dem Antigenom dieselbe Zielsequenz befindet. Das VP35 des EBOV ist ein
vielseitiges virales Protein, das als Kofaktor der Polymerase in Replikation und
Transkription involviert ist, zudem aber noch mit dem Immunsystem interferiert (Basler
et al., 2003, 2000, 2004, Boehmann et al., 2005, Mühlberger et al., 1998, 1999). Unter
Verwendung einer anderen antisense-Methode, nämlich von small interfering (si)RNAs
gegen NP, VP30 und VP35 des MARV, konnte die Menge an viralen Proteinen nach
Infektion deutlich reduziert werden (Fowler et al., 2005).
17.2 3136 P-PMO schränkt spezifisch die Vermehrung von EBOV ein und
schützt Mäuse vor tödlicher Infektion
In Zellkultur stellte sich heraus, dass 3136 P-PMO spezifisch die Vermehrung des
EBOV hemmt und keinen Einfluss auf die Infektion mit MARV hat (Abb. 46). Die Inhibition war konzentrationsabhängig und umso effizienter, je früher die Applikation stattfand (Abb. 44 und Abb. 45). In einem zellfreien System wurde die Abhängigkeit der
Effizienz von der Länge der komplementären Sequenz der PMOs untersucht. Dabei
wurden unkonjugierte PMOs in der Länge verändert (16, 19 und 22mer) und nur 3136
P-PMOs als konjugierte Kontrolle (22mer) eingesetzt. Es stellte sich heraus, dass nur
114
Diskussion – Inhibition von EBOV durch P-PMOs
3136 PMO (22mer) und 3136 P-PMO einen Effekt zeigten, wobei der des konjugierten
PMOs deutlich stärker ausgeprägt war (Abb. 51). Schon in einer früheren Arbeit wurde
dieses Phänomen beobachtet, dass Peptid-konjugierte PMOs eine höhere Effizienz
zeigen als unkonjugierte, unabhängig vom verwendeten Peptid (Neuman et al., 2004).
Da die Bindung der Basenpaare gleich stark sein sollte, ist möglicherweise das Peptid
ein zusätzlicher sterischer Faktor, der z.B. die Anlagerung der ribosomalen 60 S Untereinheit verhindert (s.o.).
Abb. 51. Sequenz-spezifische Inhibition von VP35E in einem zellfreien
Translations-Assay. RNA wurde in
vitro transkribiert von einer Matrize,
die einen Teil des VP35-Gens (-98
bis +98, nts 3020-3157 des EBOVGenoms) gefolgt von der kodierenden Sequenz der GlühwürmchenLuziferase umfasste. 1 nM der RNA
wurde in Anwesenheit verschiedener
Konzentrationen der angegebenen
PMOs in vitro translatiert (rabbit
reticulocyte lysate). Angegeben ist
der Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten. Zur Verfügung
gestellt von A. Kroeker.
100
90
80
Percent Inhibition
70
3136 PMO (16mer)
3136 PMO (19mer)
3136 PMO (22mer)
3136 P-PMO (22mer)
Scramble PMO
Scramble P-PMO
60
50
40
30
20
10
0
-10
-20
-30 -3
10
10-2
10-1
100
101
102
µM PMO
Versuche in Zellkultur mit unkonjugierten PMOs waren erfolglos, aber der Einsatz in
Mäusen zeigte sehr gute Wirksamkeit. Mäusen wurden zweifach (24 h und 4 h) je
500 µg der PMOs injiziert, bevor sie mit einer tödlichen Dosis mausadaptiertem EBOV
infiziert wurden. Die Überlebensrate der Mäuse stieg mit der Länge der PMOs: das
16mer ermöglichte ein Überleben von 50%, das 19mer 70% und das 22mer 85%. Die
Überlebensrate stieg sogar auf 100%, wenn das konjugierte 3136 P-PMO eingesetzt
wurde (Abb. 52). Diese Daten zeigen einen prophylaktischen Schutz gegen tödliche
Infektion mit EBOV in Mäusen, aber es ist noch unklar, ob die (P)-PMOs auch als Therapeutikum eingesetzt werden können. Die Versuche in Zellkultur deuten darauf hin,
dass nur eine Vorbehandlung mit P-PMOs die Vermehrung des EBOV fast gänzlich
inhibiert und eine frühere Applikation einen besseren Schutz gewährt. Im Gegensatz
dazu überlebten Mäuse, die erst 24 h nach Infektion mit einer tödlichen Dosis EBOV
mit einem ähnlichen Inhibitor behandelt wurden (S. Bavari, pers. Mitteilung). In Zellkultur bleibt ein wichtiger Faktor außer Acht: das Immunsystem, was für die unterschiedlichen Ergebnisse der Versuche in Zellkultur und im Mausmodell mitverantwortlich sein
115
Diskussion – Inhibition von EBOV durch P-PMOs
könnte. Obwohl noch weitere Versuche durchgeführt werden müssen, stellen die (P)PMOs einen vielversprechenden Kandidaten für die prophylaktische und evtl. sogar
therapeutische Nutzung dar.
Abb. 52. Antisense-PMOs, die gegen das
VP35-Gen gerichtet sind, erhöhen das Überleben von EBOV-infizierten Mäusen. (A)
Kaplan-Meier-Überlebenskurve von Mäusen, die 24 und 4 h vor Infektion mit EBOV
mit je 500 µg von 3136 (‹), leader (S) oder
Scramble (¯) PMO behandelt wurden. Die
Mäuse wurden mit etwa 1 000 plaque forming units (PFU) von mausadaptiertem
EBOV infiziert. Die Ergebnisse sind als
prozentuale Überlebensrate der einzelnen
Gruppen aufgetragen (n=20-30/Gruppe). (B)
Überleben von Mäusen, die mit je 500 µg
von 3136 22mer (‹), 19mer („), 16mer (S)
oder Scramble (¯) PMO 24 und 4 h vor
Infektion mit etwa 1 000 PFU EBOV behandelt wurden. Die prozentuale Überlebensrate beruht auf n=10-20 Mäusen pro Gruppe.
(C) Auswirkung des Peptidkonjugats auf das
Überleben. Mäuse wurden wie zuvor 24 und
4 h vor Infektion mit etwa 1 000 PFU EBOV
mit je 500 µg 3136 PMO (‹), 3136 P-PMO
(S), scrambled PMO (¯) oder Scramble PPMO ({) vorbehandelt. Die Kurve zeigt die
Überlebensrate von n=10-20 Mäusen pro
Gruppe an. Zur Verfügung gestellt von K.
Warfield.
116
Zusammenfassung
18 Zusammenfassung
Filoviren, zu denen das Marburg- (MARV) und das Ebolavirus Zaire (EBOV-Z) gehören, zählen zu den tödlichsten Humanpathogenen, gegen die es weder ein Therapeutikum noch einen Impfstoff gibt. Innerhalb der Mononegavirales besitzen sie das längste
Genom (etwa 19 kb) und als einzige Mitglieder neben den Pneumoviren ein viertes
Nukleokapsidprotein, VP30. Dieses dient beim EBOV als Transkriptionsaktivator, die
Funktion für das MARV ist aber ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit wurden die cisaktiven Signale für Replikation und Transkription des MARV, EBOV-Z und Ebolavirus
Reston (EBOV-R) untersucht und gemeinsame Motive verglichen. Weiter wurde ein
Volle-Länge-Rescue-System für das MARV etabliert, mithilfe dessen die Rolle des
VP30 untersucht wurde. Als ein Kooperationsprojekt wurden die inhibitorischen Eigenschaften synthetischer DNA-Analoga auf die Vermehrung von EBOV-Z in Zellkultur
analysiert.
Die Sekundärstruktur des Transkriptionsstart-Signal (TSS) des MARV wurde mittels
chemischer Modifizierung ermittelt und unterschied sich gravierend von der des EBOVTSS. Wurde die bei EBOV-Z gebildete Sekundärstruktur zerstört, so war kein VP30
mehr für die Transkription notwendig (Weik et al., 2002). Chimären der beiden Sekundärstrukturen führten zum Verlust der Transkription und zu starker Reduzierung der
Replikationsfähigkeit; VP30 hatte dabei keinen Einfluss auf die Transkription. Durch
weitere Experimente konnte gezeigt werden, dass wahrscheinlich die Primärsequenz
entscheidend für die Replikation und Transkription ist und nicht die Sekundärstruktur.
Mithilfe des rekonstituierten Minigenomsystems für EBOV-Z wurde der genomische
Replikationspromotor eingehend untersucht. Es war bereits bekannt, dass zwei Promotorelemente vorliegen, und die dazwischenliegende Sequenz unwichtig war und nur um
6 nts verlängert oder verkürzt werden konnte, ohne die Replikation zu beeinträchtigen
(Schlenz, 2002, Weik, 2001). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass nur 3 von 8
vorkommenden UN5-Hexameren nötig sind, um Replikation zu unterstützen. Dieses
Motiv wurde auch bei EBOV-R und MARV gefunden. Allerdings deuten die Daten darauf hin, dass der genomische Replikationspromotor des MARV nur aus einem Element
besteht, in dem die Replikations- und Transkriptionssignale überlappen.
Als ein sehr nützliches Hilfsmittel zur detaillierten Untersuchung des MARV wurde
ein Volle-Länge-Rescue-System etabliert, in welchem rekombinantes MARV durch
Transfektion des Antigenoms und Plasmiden der Nukleokapsidproteine VP30, VP35,
NP und L erzeugt werden konnte. Somit war eine gezielte Manipulation des viralen
Genoms möglich. Arbeiten mit rekombinanten Viren wurden in Kooperation mit Prof.
117
Zusammenfassung
Volchkov in Lyon durchgeführt. Mithilfe dieses Systems konnte gezeigt werden, dass
VP30 eine wichtige Rolle für die effiziente Vermehrung des MARV in Zellkultur darstellt,
obwohl eher eine strukturelle als katalytische Funktion angenommen wird. Bisher waren solche Untersuchungen nicht möglich, da VP30 im Minigenomsystem keine Funktion zukam. Zudem war es möglich, ein rekombinantes MARV zu erzeugen, welches
18 nts des Replikationspromotors des EBOV-Z inseriert hatte.
Schließlich wurde eine Inhibition der Vermehrung des EBOV-Z in Zellkultur durch
ein gegen die Translationsstart-Sequenz des VP35-Gens gerichtetes, peptidkonjugiertes Phosphorodiamidat-Morpholinooligomer (P-PMO) gezeigt. Die Daten zeigten eine
sehr gute prophylaktische Nutzbarkeit, jedoch eingeschränkte Wirkung, wenn das PPMO nach der Infektion appliziert wurde. Diese Ergebnisse wurden von der Kooperationsgruppe des USAMRIID in Mausexperimenten mit unkonjugierten PMOs bestätigt.
Der Einsatz von (P)-PMOs zur Hemmung von VP35 ist ein vielversprechender prophylaktischer und evtl. sogar therapeutischer Ansatz für Filovirusinfektionen.
118
Anhang
V
Anhang
Anhang – Primerliste
19 Liste der eingesetzten Oligonukleotide/Primer
#
211
339
340
436
Name
kompl. zu nts§
CAT-368 Pvu II
--ANDY IN (2037)
--ANDY BACK (181)
--EBO - 2728 v / Bgl II fwd 2 728-2 751
1059
MBG-leader f
fwd
1-16
1060
MBG-NP 258 r
rev
249-233
1061
CAT BglII f
fwd
---
1062
1063
CAT r
MBG TKmut f
rev
fwd
--45-86
1064
MBG TKmut r
rev
86-45
1065
MBG-leader r
rev
82-106
1066
MBG-lead-10 r
rev
72-96
1067
MBG-lead-20 r
rev
62-86
1068
MBG-lead-30 r
rev
52-76
1069
MBG-lead-40 r
rev
42-66
1124
1125
1128
SspI-test#F
SspI-test#R
MBG TM mut2 f
fwd
rev
fwd
5 890-5 910
6 501-6 521
55-86
1129
MBG TM mut2 r
rev
86-55
1178
MBG1->EBO2 r1
rev
42-74
1179
MBG1->EBO2 f1
fwd
74-42
1180
MBG1->EBO2 r2
rev
42-74
1181
MBG1->EBO2 f2
fwd
74-42
1190
2.1 ACA f
fwd
44-73
1191
2.1 ACA r
rev
73-44
1263
MBG lead 1-28
rev
1-28
1264
Xma T7 MBG lead
fwd
1-22
1276
MBG lead-32 r
rev
49-74
1277
MBG lead-35 r
rev
49-71
1285
EBO40W95A_rv
rev
4 778-4 748
1291
MBG-Rep-C71G
fwd
52-82
Sequenz 5’→3’¶
GTA
GCT
GGG
gat
AGG
ggt
cat
acc
AAT
tcg
ATA
ata
CTA
AGA
CAG
TAA
gag
AAC
gag
CAA
gag
TGT
gag
C
gag
TTT
CAG
GTA
CTA
AGA
CAG
TAA
CTG
ATT
AAA
TTG
CAG
TAA
GAA
TTG
GAC
AGA
CTC
AGT
AGA
T
gat
GAC
gag
TAT
gag
TCT
GAC
TTG
GAA
TCA
ATA
CGC
GTT
aga
AAC
cgg
gcc
cgg
CCC
aga
TAC
ata
TGA
CTT
ACT
TCT
cat
AGA
cat
GTC
cat
CAA
cat
TCC
CGC
ATG
tct
AGC
AGC
CTA
GCT
TGA
CGA
GTT
AAC
ACG
ACG
ATT
ATT
GTC TGG
ACC
GCT CAG
AAG TAG TCA
acc
gac
tac
TGA
tct
CAC
ttt
GGA
GTC
GAC
TCC
atg
C
atg
T
atg
T
atg
gcg agg agg tgg aga tgc
cca GAC ACA CAA AAA CAA
cag gag atc tCC AAG ATC
cat
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TGA
GAA
TGA
CTT
ACT
TCT
ACA
CTT
TAA
AGA
ACT
TAT
GAA
TCA
TTG
G
TTC
C
CAC
atg
T
ATA
GTC
GGA
GTC
GAC
TCC
AGT
CTT
AGA
CTT
GAC
TCT
TAT
GTC
TCA
TCA ATG TTA ATA TTC TTC
ccc
ACA
cat
TCT
cat
TC
ACC
C
TAT
G
ggg
CAA
atg
TC
atg
aGA GAA AAA AAT CAC TGG
gcc
AGA
AGT
AAG
TCA
CAT
cat
TTA
CTG
TCT
TAG
CTC
ggt gaa aac
ATA TTT ATA CTG
CAG TAT AAA TAT
TTC AAG AAT ATT
AGA ATA TTA ACA GAC TGA
CAG ACT GAC AAG TCT CAA
AGT CTC AAT GTT AAT ATT
TAT
AGA
AGA
AGT
AAG
TCA
CTC
TAT
AGA
GTC
AAG
TC
TAA
TG
GTC
TCT
TTC
TTA
CTG
TCT
TAG
AAT
TT
ATA
AG
TCT
CAT ATC
ATA TGA
ATA ATT TTC CTC
GAG GAA AAT TAT
GAC ATT ATT AAT
TTA ATA ATG TCA
GAA GAA CAT TAT
TAA TGT TCT TCA GAC
TGT TAA TAT TCT TGA
AAG AAT ATT AAC AGA CTG ACA
ACA AAA ACA AGA GAT GAT GAT
tta ata cga ctc act atA
AAA CAA GAG ATG ATG AT T
TCT CAA TGT CAA TGT TAA
CAA TGT CAA TGT TAA TAT
TAG AGG AAG Cgc AAT TGG AAT
TAA CAT TGA CAT TCA GAC TTG
I
Anhang – Primerliste
#
1292
Name
MBG-Rep-C71G
kompl. zu nts§
rev
82-52
1293
MBG-Rep-A70U
fwd
52-82
1294
MBG-Rep-A70U
rev
82-52
1295
MBG-Rep-U68A
fwd
52-82
1296
MBG-Rep-U68A
rev
82-52
1297
MBG-Rep-C65G
fwd
52-82
1298
MBG-Rep-C65G
rev
82-52
1299
MBG lead-36
rev
52-82
1300
MBG lead-34
rev
82-52
1302
RES C-A
fwd
49-70
1303
RES C-A
rev
49-72
1316
MBG U-A f
fwd
52-82
1317
MBG U-A r
rev
82-52
1318
EBO U-A1 f
fwd
75-103
1319
EBO U-A1 r
rev
103-75
1320
1321
1349
EBO U-A2 f
EBO U-A2 r
EBO 3U-A2f
fwd
rev
fwd
94-118
118-94
90-120
1350
EBO 3U-A2r
rev
120-90
1395
MARV-tr-150r
fwd
1396
MARV-tr-105r
fwd
1397
MARV-tr-90r
fwd
1402
MARV-Ur-4UAf
fwd
1403
MARV-Ur-4UAr
rev
1404
EBOV-tr-151f
fwd
1405
EBOV-tr-121f
fwd
1440
1441
1460
gapdh f
gapdh rev
Res-lead 2U->A
fwd
rev
fwd
18 96818 958
19 02319 004
19 03819 019
18 99719 036
19 03618 997
18 80718 826
18 83718 856
----83-113
1461
Res-lead 2U->A
rev
113-83
1462
Res Pen del250
rev
247-227
1526
EBOV lead+5/3U
fwd
81-103
Sequenz 5’→3’¶
CTG
ATT
GAA
TCA
CTG
ATT
GAA
TCA
CTG
ATT
GAA
TCA
CTG
ATT
gag
CTT
gag
TTC
CAC
C
GAG
G
GAA
TCA
CTG
ATT
CCT
TA
TAA
GG
TCG
GTA
TAT
ACT
CAG
AAT
ttt
TGA
ttt
AAA
ttt
AAT
AAT
AAA
GTT
CTT
ttt
TGT
ttt
TCA
TGA
GCA
AAG
ATT
GAA
TCT
atg
AAC
TTT
ATC
ACA
C
TAT
G
ACA
C
TAT
G
ACA
C
TAT
G
ACA
C
cat
C
cat
TTC
TGA
AGT CTG AAT GTC AAT GTT AAT
TAA CAT TGA CAT AGA GAC TTG
AGT CTC TAT GTC AAT GTT AAT
TAA CAT TGA CTT TGA GAC TTG
AGT CTC AAA GTC AAT GTT AAT
TAA CAT TCA CAT TGA GAC TTG
AGT CTC AAT GTG AAT GTT AAT
atg AAT GTC AAT GTT AAT ATT
atg TCA ATG TCA ATG TTA ATA
AAT TTA GAT TTA GAT TCT CCT
GAG AAT CTA AAT CTA AAT TTC AGT
TAT TAA CTT TGA CTT TGA GTC TTG
G
ACA AGA CTC AAA GTC AAA GTT AAT
C
CTC TTT GAA TTT TAT TTC GGA ATT
ATT CCG AAA TAA AAT TCA AAG AGA
GAT
ACA
TTC
G
TAA
A
gcg
T
gcg
T
gcg
A
TTC
TAA
TTT
TCT
gcg
T
gcg
T
AGG
GAG
ATA
C
TCT
T
cat
TTT AAT TTG AAT TTG TTA C
AAT TCA AAT TAA AAT CCG A
GGA TTT TAA TTT GAA TTT GTT
CAA ATT CAA ATT AAA ATC CGA
gcc gcT TTC TCT GAT GAC AAG
gcc gcA TGT CGA TGT GAA TGT
gcc gcT AAA TTA AGA AAA ACC
TAG
GAA
CTT
AGA
gcc
AAA
AAA
ATT
AAT
gcT
GTC GAA GTG AAA GTA
C
TTA CTT TCA CTT CGA
T
AGA TAA TAA TCT TCG
gcc gcA AGA CAT TGA CCA CGC
TCG GAG TCA ACG GAT TTG
ATG ATG ACC CTT TTG GCT
TAC TCT GAA ATT GAG TTT GAG
CAA ACT CAA TTT CAG AGT ATA
atg ATT CAG AGC TCT AGG AAA
AAT GAT CAT CTC AAT GAA AAT TAT
GGA
II
Anhang – Primerliste
#
1527
Name
EBOV lead+5/3U
kompl. zu nts§
rev
103-81
1528
MARV tr del95
fwd
1529
MARV tr del100
fwd
1530
EBOV tr del90
fwd
1531
EBOV tr del100
fwd
1532
EBOV tr del110
fwd
1533
Res lead del150
rev
19 01719 035
19 01219 030
18 86818 886
18 85818 876
18 84818 866
148-128
1534
Res lead del125
rev
123-103
1535
Res lead del100
rev
98-78
1536
Res tr del132
fwd
1537
Res tr del102
fwd
1547
fwd
rev
9 169-9 133
1581
1618
MARV VP30
C->S,H->L
MARV VP30
C->S,H->L
Del 168-177 F
EBOV lead-5/3UA F
18 76418 782
18 79418 812
9 133-9 169
fwd
fwd
3 660-3 680
83-118
1619
EBOV lead-5/3UA R rev
118-83
1634
fwd
76-104
rev
104-76
fwd
99-129
rev
129-99
fwd
118-129
rev
129-118
rev
78-56
fwd
79-101
1661
EBOV x90-120/3U-A
3' F
EBOV x90-120/3U-A
3' R
EBOV x90-120/3U-A
5' F
EBOV x90-120/3U-A
5' R
EBOV x90-110/2A-U
3' F
EBOV x90-110/2A-U
3' R
MARV+EBOV
3xN5U
MARV+EBOV
3xN5U
Res lead del95
rev
95-75
1662
Res lead del89
rev
89-69
1548
1635
1636
1637
1644
1645
1656
1657
§
¶
Sequenz 5’→3’¶
TCC
ATT
ttt
AAA
ttt
AAG
ttt
AAA
ttt
TAA
ttt
CTC
atg
CAG
atg
ATC
atg
ACT
ttt
TGT
ttt
AGT
GAT
CTT
GAT
GAA
GAA
GGT
TTA
TTA
CGA
CTC
TC
GAT
AG
TAG
ACA
GTG
TCT
TAG
ACA
GTG
TCT
att
TTA
tta
TGA
atg
GAG
atg
AAC
GAT ATA ATT TTC ATT GAG ATG ATC
AAA
gcg gcc gcG AAT GTA AAT TAA GAA
gcg gcc gcG ATG TGA ATG TAA ATT
gcg gcc gcC CAG AAT AAA CGT TGC
gcg gcc gcA GAA GGC TCG CCA GAA
gcg gcc gcA ACG CTC ATC AGA AGG
cat atg CAC AAC CAG GGA AAG TTA
cat atg GCA AAG AGG AGA ATC TCA
cat atg TTT CAG TGT ATA TCT TAA
gcg gcc gcG TAA TAT GAG TGA TAA
gcg gcc gcA CTA ACT AGC TTT AGT
CCC
GAT
TAT
GTG
AGT
ATA
CTG
CAG
TAT
TCA
ACT
AAT
CAA
GGA
GCG
TCG
TAA
TAA
ACC
TTC
TCT
C
GGT
TC
ATT
GAT
AAT AGA GAT CTT GAC
CAA GA TCT CTA TTA
CGG GGT AAG
TTT AAT TTG AAT TTG
CAA ATT CAA ATT AAA ATC
CGA GGA CAA GTT ATT AGA
CTA ATA ACT TGT CCT CGG AAT GAG
ATC
C
TGA
A
ATC
C
TGA
A
tca
AT
tat
AG
cat
TGG TCG AGA TGG AAA TTA ATC
TTA ATT TCC ATC TCG ACC AGA
TGG TCG TTT GTT TCT GTA ATC
TTA CAG AAA CAA ACG ACC AGA
atg CAA GTC TCA ATG TCA ATG
cgg TCA GTC TGT TAA TAT TCT
atg CAG TGT ATA TCT TAA ACT
cat atg ATA TCT TAA ACT GAG GAA
Gibt an, zu welchen (viralen) Nukleotiden der Primer komplementär ist (in 3’→5’-Orientierung)
Unterstrichene Nukleotide: Substitutionen, fett: Schnittstellen; Kleinbuchstaben: unspezifische Sequenz; Großbuchstaben: spezifische Sequenz;
III
Anhang – Abbildungs-/Abkürzungs-/Tabellenverzeichnis
20 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1. Morphologie eines Filoviruspartikels.............................................................. 4
Abb. 2. Genomorganisation von Marburg- und Ebolavirus. ....................................... 5
Abb. 3. Schematische Darstellung des artifiziellen Replikations- und
Transkriptionssystem für EBOV und MARV. ................................................ 10
Abb. 4. Schematischer Aufbau der Western Blot-Apparatur. ................................... 36
Abb. 5. Northern-Blot-Analyse replizierter RNA aus HuH-T7- und BSR T7/5 –Zellen in
Abhängigkeit von der Infektion mit MVA-T7. ................................................ 40
Abb. 6. Einfluss der Zentrifugation auf den Nachweis replizierter RNA im Northern Blot.
..................................................................................................................... 42
Abb. 7. Einfluss von pCAGGS/T7 auf den Nachweis replizierter RNA aus HuH-T7 im
Northern Blot. ............................................................................................... 43
Abb. 8. Western-Blot-Analyse der T7-RNA-Polymerase-Expression....................... 44
Abb. 9. Computervorhersage der RNA-Sekundärstruktur im 3'-Terminus des MARV
Genoms. ....................................................................................................... 47
Abb. 10. Ergebnis und Interpretation der chemischen Modifizierung von in vitro
transkribierter 2.1.1 CAT Mut-RNA (Autoradiogramme)............................... 49
Abb. 11. Computervorhersage der (+) RNA von tss_MARV1→EBOV2................... 51
Abb. 12. Ergebnis der chemischen Modifizierung von in vitro transkribierter
tss_MARV1→EBOV2 (+) RNA. .................................................................... 52
Abb. 13. Replikations- und Transkriptionsaktivität der MARV/EBOV TSS-Chimären.54
Abb. 14. Schematischer Aufbau der minigenomischen 3M-5M-RNA....................... 55
Abb. 15. Replikations- und Transkriptionseffizienz der MARV-spezifischen 3'-NTR Deletionsmutanten. ...................................................................................... 57
Abb. 16. Sequenzvergleich der 3'-NTRs von MARV (Musoke), EBOV-Z und EBOV-R
(Pennsylvania).............................................................................................. 58
Abb. 17. Transkriptionseffizienz der Substitutionsmutanten des zweiten Hexamers
"GUAACU".................................................................................................... 58
Abb. 18. Untersuchungen der Replikation und Transkription von 3M-5M leader 3U→A.
..................................................................................................................... 59
Abb. 19. Einfluss der Insertion von EBOV UN5 in den Replikationspromotor des MARV.
..................................................................................................................... 59
Abb. 20. Analyse der Deletionsmutanten des 3E-5E-leaders. ................................. 60
Abb. 21. Analyse der 3E-5E leader Substitutionsmutanten. .................................... 62
Abb. 22. Northern-Blot-Analyse des Motivs (UN5/UAN4)3 in Derivaten von 3E-5E leader
∆250. ............................................................................................................ 64
Abb. 23. Northern-Blot-Analyse replizierter RNA der 3R-5R-leader-Deletionsmutanten.
..................................................................................................................... 65
Abb. 24. Northern-Blot-Analyse des Motivs (UN5)3 in der 3’-NTR von 3R-5R.......... 65
Abb. 25. Vergleich der genomischen und antigenomischen Enden von MARV, EBOV-Z
und EBOV-R................................................................................................. 67
Abb. 26. Northern-Blot-Analyse replizierter RNA der 5’-NTR Mutanten................... 69
Abb. 27. Klonierungsstrategie für das Volle-Länge-Plasmid pMARV (+). ................ 70
IV
Anhang – Abbildungs-/Abkürzungs-/Tabellenverzeichnis
Abb. 28. Lichtmikroskopische Analyse des rekombinanten MARV.......................... 73
Abb. 29. Restriktionsanalyse der RT-PCR aus Titrationsexperimenten zum MARVRescue. ........................................................................................................ 73
Abb. 30. Immunfluoreszenz-Analyse der Überstände aus dem Titrationsexperiment.74
Abb. 31. TCID50-Analyse der rekombinanten MARV aus Titrationsexperimenten. .. 75
Abb. 32. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von rekombinantem MARV und MARV
wt (1:20 000)................................................................................................. 76
Abb. 33. Nukleotid- und Aminosäuresequenz des mutierten Zn-fingers in VP30M... 78
Abb. 34. Western-Blot-Analyse der Expression von VP30M wt und VP30M Zn-Finger knockout
(VP30 Zn ko). ............................................................................................... 79
Abb. 35. Immunfluoreszenz-Studien von VP30M wt und VP30M Zn-Finger knockout (VP30 Zn
ko). ............................................................................................................... 80
Abb. 36. Bestimmung der Transkriptionsaktivität von VP30M Zn-Finger knockout. ............. 81
Abb. 37. RT-PCR von RNA aus Rescue-Experimenten mit verschiedenen pTM1/VP30Transfektionen.............................................................................................. 82
Abb. 38. RT-PCR-Analyse von rekombinanten MARV mit mutiertem VP30-Gen.... 84
Abb. 39. RT-PCR-Analyse von rekombinantem MARV mit mutiertem 3’-Ende. ...... 86
Abb. 40. Chemische Strukturen von DNA, PMO und P-PMO. ................................. 88
Abb. 41. Schematische Darstellung des EBOV-Genoms und der Zielbereiche der PPMOs............................................................................................................ 89
Abb. 42. Inhibitions-Analyse aller P-PMOs in verschiedenen Konzentrationen. ...... 90
Abb. 43. Analyse der Zytotoxizität der eingesetzten P-PMOs durch Lichtmikroskopie.
..................................................................................................................... 91
Abb. 44. Abhängigkeit der Inhibition von der Konzentration der P-PMOs 3136 und
Scramble. ..................................................................................................... 92
Abb. 45. RT-PCR-Analyse der Inhibition durch P-PMOs nach Zugabe zu
unterschiedlichen Zeitpunkten...................................................................... 93
Abb. 46. RT-PCR-Kontrolle der Spezifität der P-PMOs. .......................................... 94
Abb. 47. Vergleich der Sekundärstrukturen des TSS des NP-Gens von MARV und
EBOV............................................................................................................ 98
Abb. 48. Vergleich der genomischen Promotorelemente von EBOV-Z und MARV.103
Abb. 49. Komplementäre Sequenz der trailer des MARV und EBOV-Z................. 105
Abb. 50. Auswertung der Zytotoxizität der P-PMOs............................................... 114
Abb. 51. Sequenz-spezifische Inhibition von VP35E in einem zellfreien TranslationsAssay.......................................................................................................... 115
Abb. 52. Antisense-PMOs, die gegen das VP35-Gen gerichtet sind, erhöhen das
Überleben von EBOV-infizierten Mäusen................................................... 116
21 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1. Eigenschaften P-PMOs und ihre Ziele auf EBOV-spezifischer RNA....... 15
Tabelle 2. Genotypen der verwendeten E. coli Bakterien. ....................................... 18
Tabelle 3. Kommerziell erhältliche Antiköper, die in dieser Arbeit verwendet wurden.18
Tabelle 4. Auflistung der im Western Blot (WB) und Immunfluoreszenz (IFA)
eingesetzten Antikörper................................................................................ 38
V
Anhang – Abbildungs-/Abkürzungs-/Tabellenverzeichnis
Tabelle 5. Unterschiede der Positivstrang-Minigenome 2.1.1 CAT Mut und 3M-5M (+).
..................................................................................................................... 47
Tabelle 6. Sequenzen der MARV/EBOV Transkriptionsstart-Signal-Chimären. ...... 50
Tabelle 7. Erzeugung der Deletionsmutanten des 3M-5M-leaders. ......................... 56
Tabelle 8. Eigenschaften der 3E-5E leader UN5 Substitutionsmutanten.................. 61
Tabelle 9. Erzeugung der Deletionsmutanten des 3R-5R-leaders........................... 64
Tabelle 10. Daten zur Klonierung der 5’-NTR Mutanten von MARV, EBOV-Z und
EBOV-R........................................................................................................ 68
Tabelle 11. Titrationsexperiment zum Rescue von rekombinantem MARV. ............ 72
22 Abkürzungsverzeichnis
A
bp
C
CAT
cDNA
Ci
Adenin
ddH2O
DIG
DIP
DMEM
DNA
DTT
EBOV (-Z, -R)
EHF/MHF
EtOH
G
GP
HδV
hPIV3
IFN
IRES
kb
M
MARV
MCN
MOI
NaOAc
NP
nt(s)
NTR
OD
ORF
P/S
PBS
PCR
PFA
PFU
doppelt-destilliertes Wasser
Digoxigenin
basepair(s); Basenpaar(e)
Cytosin
Chloramphenicol-Acetyl-Transferase
komplementäre DNA
Curie
defective interfering particles
Dulbecco's Modified Eagle's Medium
Desoxyribonukleinsäure
Dithiothreitol
Eboalvirus (Zaire, Reston)
Ebola/Marburg haemorrhagic fever
Ethanol
Guanin
Glykoprotein
Hepatitis-Delta-Virus
humanes Parainfluenzavirus Typ 3
Interferon
Interne Ribosomen-Eintrittsstelle
kilobases; 1000 Basen
molar (mol/l)
Marburgvirus
Mikrokokken-Nuklease
multiplicity of infection
Natriumacetat
Nukleoprotein
nucleotide(s); Nukleotid(e)
nicht-translatierte Region
Optische Dichte
open reading frame; offener Leserahmen
Penicillin/Streptomycin
phosphate buffered saline
polymerase chain reaction; Polymerase-Kettenreaktion
Paraformaldehyd
plaque forming units
VI
Anhang – Abbildungs-/Abkürzungs-/Tabellenverzeichnis
PMO
P-PMO
RNA
rpm
RSV
RT
SeV
SV5
T
TCID50
TSS
TStpS
U
VLP
VP
VSV
Phosphorodiamidat-Morpholinooligomer
Peptid-konjugiertes Phosphorodiamidat-Morpholinooligomer
Ribonukleinsäure
revolutions per minute; Umdrehungen pro Minute
Respiratorisches Synzytialvirus
Reverse Transkriptase/Transkription
Sendaivirus
Simianvirus 5
Thymin
tissue culture infectious dose
Transkriptionsstart-Signal
Transkriptionsstopp-Signal
Uracil; Units
virus like particles; virusähnliche Partikel
virales Protein
Vesikuläres Stomatitisvirus
VII
Anhang – Veröffentlichungen/Präsentationen
23 Veröffentlichungen und Präsentationen
23.1
Präsentationen auf Kongressen und Tagungen
23.1.1 Vorträge
1.
Enterlein, S., Volchkov, V., Weik, M. und Mühlberger, E. Filovirus Reverse Genetics. BioHacking: Biological Warfare Enabling Technologies, Juni 2005 in McLean, Virginia, USA
2. Enterlein, S., Volchkov, V.und Mühlberger, E. Elements Involved in Replication
and Transcription of Marburg Virus. Spezielles Seminar, März 2005 in Galveston, Texas, USA.
3. Mühlberger, E., Weik, M., and Enterlein, S. The replication and transcription
strategy of Marburg and Ebola viruses: differences and similarities. Second European Virology, Sept. 2004 in Madrid, Spanien.
4. Mühlberger, E. Marburg und Ebola-Viren: Profil zweier tödlicher Erreger. Symposium „Emerging infectious diseases“ des Graduiertenkollegs „Molekulare Veterinärmedizin“, 2004 in Gießen, Deutschland.
5. Enterlein, S., Weik, M., Schlenz, K. und Mühlberger, E. The Ebola Virus Replication Promotor: What „U“ can do. 23rd Annual Meeting of the American Society
for Virology, Juli 2004 in Montreal, Kanada.
6. Mühlberger, E. Replication and transcription of filoviruses. University of Washington, 2003 in Seattle, USA.
7. Mühlberger, E. Weik, M., Enterlein, S., Becker, S., Klenk, H.-D. The replication
and transcription strategy of Marburg and Ebola viruses: differences and similarities. VRC Symposium on viral hemorrhagic fevers, NIH, 2003 in Bethesda,
USA.
8. Enterlein, S., Weik, M. und Mühlberger, E. Comparison of Signals Involved in
Replication and Transcription of Ebola and Marburg Virus. Jahrestagung der
Gesellschaft für Virologie 2003, März 2003 in Berlin, Deutschland
9. Mühlberger, E. The replication and transcription strategy of filoviruses. Institut
für Virologie, 2002 in Erlangen, Deutschland.
10. Mühlberger, E. The transcription strategy of Ebola virus. SFB 286: Fourth workshop on intracellular transport and maturation of proteins, 2002 in Marburg,
Deutschland.
23.1.2 Posterpräsentationen
1.
2.
3.
Enterlein, S., Weik, M., Schlenz, K. und Mühlberger, E. The Ebola Virus Replication Promotor: What „U“ can do. Conference on Biodefence, Dez. 2004 in
Beer Sheva, Israel.
Enterlein, S., Weik, M., Schlenz, K. und Mühlberger, E. The Ebola Virus Replication Promotor: What „U“ can do. Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie
2004, März 2004 in Tübingen, Deutschland.
Enterlein, S., Weik, M. und Mühlberger, E. Comparison of Signals Involved in
Replication and Transcription of Ebola and Marburg Virus. XIIth International
Conference on Negative Strand Viruses, Juni 2003 in Pisa, Italien.
VIII
Anhang – Veröffentlichungen/Präsentationen
23.2
1.
2.
3.
4.
Abgeschlossene Publikationen
Enterlein, S., Volchkov, V., Weik, M., Kolesnikova, L. und Mühlberger, E. Rescue of recombinant Marburg virus from cDNA is dependent on the fourth nucleocapsid protein VP30. [eingereicht]
Enterlein, S.*, Warfield, K.L.*, Stein, D.A., Swenson, D.L., Kroeker A.D., Iversen, P.L., Bavari, S., and Mühlberger, E. VP35 knockdown inhibits Ebola virus
amplification and protects against lethal infection. [eingereicht] (* gleichberechtigte Autoren)
Weik, M.*, Enterlein, S.*, Schlenz, K. und Mühlberger, E. The Ebola Virus Genomic Replication Promoter is Bipartite and Follows the Rule of Six. 2005. J Virol [Im Druck]. (* gleichberechtigte Autoren)
Boehmann, Y., Enterlein, S., Randolf, A. und Mühlberger, E. A reconstituted
replication and transcription system for Ebola Virus Reston and comparison with
Ebola Virus Zaire. 2005. Virology 332 (1):406-17.
IX
Anhang – Literaturverzeichnis
24 Literaturverzeichnis
Alvarez, C. P., Lasala, F., Carrillo, J., Muniz, O., Corbi, A. L. & Delgado, R. (2002). Ctype lectins DC-SIGN and L-SIGN mediate cellular entry by Ebola virus in cis
and in trans. J Virol 76, 6841-4.
Ball, L. A., Pringle, C. R., Flanagan, B., Perepelitsa, V. P. & Wertz, G. W. (1999). Phenotypic consequences of rearranging the P, M, and G genes of vesicular stomatitis virus. J Virol 73, 4705-12.
Basler, C. F., Mikulasova, A., Martinez-Sobrido, L., Paragas, J., Mühlberger, E., Bray,
M., Klenk, H. D., Palese, P. & Garcia-Sastre, A. (2003). The Ebola virus VP35
protein inhibits activation of interferon regulatory factor 3. J Virol 77, 7945-56.
Basler, C. F., Wang, X., Mühlberger, E., Volchkov, V., Paragas, J., Klenk, H. D., Garcia-Sastre, A. & Palese, P. (2000). The Ebola virus VP35 protein functions as a
type I IFN antagonist. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 12289-94.
Basler, C. F. a. P., P. (2004). Modulation of Innate Immunity by Filoviruses. In Ebola
and Marburg Viruses, pp. 305-349. Edited by H. D. a. F. Klenk, H. Norfolk: Horizon Bioscience.
Becker, S., Huppertz, S., Klenk, H. D. & Feldmann, H. (1994). The nucleoprotein of
Marburg virus is phosphorylated. J Gen Virol 75 ( Pt 4), 809-18.
Becker, S. & Mühlberger, E. (1999). Co- and posttranslational modifications and functions of Marburg virus proteins. Curr Top Microbiol Immunol 235, 23-34.
Becker, S., Rinne, C., Hofsass, U., Klenk, H. D. & Mühlberger, E. (1998). Interactions of
Marburg virus nucleocapsid proteins. Virology 249, 406-17.
Beneduce, F., Kusov, Y., Klinger, M., Gauss-Muller, V. & Morace, G. (2002). Chimeric
hepatitis A virus particles presenting a foreign epitope (HIV gp41) at their surface. Antiviral Res 55, 369-77.
Bermingham, A. & Collins, P. L. (1999). The M2-2 protein of human respiratory syncytial virus is a regulatory factor involved in the balance between RNA replication
and transcription. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 11259-64.
Boehmann, Y. (2003). Molekularbiologische Untersuchungen der Ebola-Viren Zaire
und Reston mit Hilfe reverser Genetik. In Institut für Virologie, pp. 132. Marburg:
Philipps-Universität Marburg.
Boehmann, Y., Enterlein, S., Randolf, A. & Mühlberger, E. (2005). A reconstituted replication and transcription system for Ebola virus Reston and comparison with Ebola virus Zaire. Virology 332, 406-17.
Bray, M. (2003). Defense against filoviruses used as biological weapons. Antiviral Res
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XIX
Anhang – Curriculum Vitae
Persönliche Daten:
Name
Geburtsort/-datum
Nationalität
Familienstand
Sven Günter Eric Enterlein
10. Juli 1977 in Köln, Deutschland
Deutsch
ledig
Kontakt:
Privat
Konrad-Laucht-Weg 4
35037 Marburg
[email protected]
Labor
Institut für Virologie
Robert-Koch-Str. 17
35037 Marburg
[email protected]
(Hoch)Schulausbildung
2002-Juni
Philipps-Universität Marburg, Deutschland
2005
Institut für Virologie
Doktorarbeit “Untersuchungen zur Replikation und
Transkription des Ebola- und Marburgvirus”
Okt. 2000 - University of Leeds, UK, School of Biochemistry
Sept. 2001
and Molecular Biology (Division of Virology)
MScRes “Studies on a Selectable Reporter for Hepatitis C Virus Internal Ribosome Entry Site Function”
1997-2000
Ruhr-Universität-Bochum, Deutschland
Fakultät für Chemie (Fachbereich Biochemie)
30.09.99: Vordiplom, Note 1,3 (Bichemie: 1,0,
Physikalische Ch.: 1,0, Biologie: 2,0, Physik:
1,0, Analytische Ch.: 1,3, Organische Ch.: 1,0);
Diplom-Hauptfachprüfung Immunologie(18.09.2000),
Note 1,0
1990-1996
Städtisches Gymnasium Rheinbach, Deutschland
14.06.96: Abitur, Note 1,8
1987-1990
Tagesheimgymnasium Kerpen, Deutschland
1984-1987
Ev. Grundschule Kerpen, Deutschland
1983-1984
Hoch-Tief Elementary School Djiddah, Saudi Arabien
Stipendien
2002-2004
April-Mai 2002
2000-2001
Kekulé Stipendium der „Fonds der Chemischen
Industrie”, Frankfurt/Main
FAZIT Stipendium
Jahresstipendium des DAAD für Großbritannien
Sonstige Ausbildung
Seit Juli 2003
Arbeit im L4-Labor der Philipps-Universität
Marburg; Gastarbeit im „Jean Mérieux P4 Research Center” in Lyon, Frankreich (Prof.
Volchkov)
Okt. 2001 –
Wissenschaftlicher Mitarbeiter im „Institute
Dez. 2001
for Animal Health“, Pirbright, UK (Picornavirus-Gruppe von Dr. Belsham)
07.07.1997 –
Mikrobiologisches Praktikum bei TecPar, Curi07.08.1997
tiba, Brasilien
XX
Anhang – Verzeichnis der Hochschullehrer
25 Verzeichnis der akademischen Lehrer
Meine akademischen Lehrer in Bochum waren die Damen und Herren:
Benecke, Blöchl, Bucher, Drieß, Engels, Erdmann, Falkenberg, Feigel, Gatermann, Haas, Hasselmann, Hatt, Heumann, Hollmann, Hollmann, Hoveman, Kiltz,
Kind, Link, Müller, Neumann, Schuhmann, Sheldrick, Streckert, Stuhl, von Kiedrowski, Weingärtner, Westerholt, Wildner, Wöll, Würflinger
Meine akademischen Lehrer in Leeds (UK) waren die Damen und Herren:
Beales, Harris, Killington und Rowlands
XXI
Anhang – Danksagung
26 Danksagung
Mein Dank gilt als erstes Herrn Prof. Dr. H.-D. Klenk, der mich bereitwillig als Doktorand in seine Obhut genommen hat. Vor allem bei offiziellen Gesuchen hat sein Einfluss des Öfteren meinen Weg wesentlich vereinfacht.
Frau Privatdozentin Dr. Elke Mühlberger möchte ich zunächst für ihr Vertrauen danken, das sie von Anfang an in mich gesetzt hat. Zudem stand sie mir in sämtlichen
Problemsituationen – sei es theoretisch, praktisch oder privat – immer mit einem offenen
Ohr und sehr wertvollen Ratschlägen zur Seite.
Nach Frankreich zu Prof. Dr. Viktor Volchkov geht ein weiteres Dankeswort. Sein
Engagement hat es mir ermöglicht, die S4-Versuche am rekombinanten Marburgvirus
in Lyon durchführen zu können.
Und was wäre eine Arbeitsgruppe ohne ein gutes Team? Für die Einarbeitung
möchte ich v.a. Dr. Michael Weik danken, auf dessen Ordnung immer Verlass war (bis
er uns leider verlassen hat); aus seinen und Kathrin Schlenz’ Beobachtungen konnte
ich viel Nutzen ziehen. Sven Miller und Dr. Yannik Boehmann sorgten ebenfalls für ein
gutes Arbeitsklima. Ziemlich oft musste ich mich auf die Crew unseres Labors verlassen, wenn ich mal wieder was vergessen hatte: Kristina Brauburger, Melanie Grosch,
Verena Krähling, Judith Küsters und Martina Lobe. Ungerecht wäre es, die Leute aus
G23 unter der Schirmherrschaft von PD Dr. Stephan Becker außen vor zu lassen. Besonders möchte ich unserer TA Angelika Lander danken, die meist für dumme Fragen
herhalten musste. Dr. Rüttger Ebendt sei gedankt für die unermüdliche Arbeit an Hardund Software.
Of course, a big thanx goes to our collaborators at AVI-BioPharma Inc. and the USAMRIID in the US for their precious suggestions and invaluable data.
Meinem Vater möchte ich für sämtliche Unterstützung danken, die er mir im Laufe
der Jahre immer wieder hat zukommen lassen, was alles andere als eine Selbstverständlichkeit ist. Ohne ihn wäre ich jetzt nicht da, wo ich bin.
Unglaublich aber wahr: Ich habe auch ein Privatleben! Henni danke ich für ihre Geduld mit mir. Ohne ihre Zuwendung wäre ich sicher oft verrückt geworden. An alle anderen (Alice, Folker, Jochen (&Familie), Martin, Melanie…): Danke für die tolle Zeit!
XXII
EHRENWÖRTLICHE ERKLÄRUNG
Ich erkläre ehrenwörtlich,
dass ich die dem Fachbereich Medizin Marburg
zur Promotionsprüfung eingereichte Arbeit
mit dem Titel
Untersuchungen zur Replikation und Transkription von Marburg- und Ebolavirus
am Institut für Virologie, Klinikum der Philipps-Universität Marburg, mit Unterstützung
durch Herrn Prof. Dr. H.-D. Klenk, ohne sonstige Hilfe, selbst durchgeführt und bei der
Abfassung der Arbeit keine anderen als die in der Dissertation aufgeführten Hilfsmittel
benutzt habe.
Ich habe an keinem in- oder ausländischen Medizinischen Fachbereich ein Gesuch um
Zulassung zur Promotion eingereicht, noch die vorliegende oder eine andere Arbeit als
Dissertation vorgelegt.
Vorliegende Arbeit wurde/wird in folgenden Publikationsorganen veröffentlicht:
1. Enterlein, S., Volchkov, V., Weik, M., Kolesnikova, L. und Mühlberger, E. Rescue of recombinant Marburg virus from cDNA is dependent on the fourth nucleocapsid protein VP30. [eingereicht]
2. Enterlein, S.*, Warfield, K.L.*, Stein, D.A., Swenson, D.L., Kroeker A.D., Iversen, P.L., Bavari, S., and Mühlberger, E. VP35 knockdown inhibits Ebola virus
amplification and protects against lethal infection. [eingereicht] (* gleichberechtigte Autoren)
3. Weik, M.*, Enterlein, S.*, Schlenz, K. und Mühlberger, E. The Ebola Virus Genomic Replication Promoter is Bipartite and Follows the Rule of Six. 2005.
Journal of Virology 79 (16):10660-671 (* gleichberechtigte Autoren)
4. Boehmann, Y., Enterlein, S., Randolf, A. und Mühlberger, E. A reconstituted
replication and transcription system for Ebola Virus Reston and comparison with
Ebola Virus Zaire. 2005. Virology 332 (1):406-17.
Marburg, den 27. September 2005
Sven Enterlein