Expression der MikroRNA bei Patienten mit uterinen
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Aus der Klinik und Poliklinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe (Direktor: Univ.-Prof. Dr. med. M. Zygmunt) der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald Expression der MikroRNA bei Patienten mit uterinen Leiomyosarkomen Inaugural – Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Medizin (Dr. med.) der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald 2016 Vorgelegt von: Cernat Victor geb. am: 16 Mai 1989 in: Chisinau, Moldawien Dekan: Prof. Dr. rer. nat. Max P. Baur 1.Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. Winfried Barthlen 2.Gutachter: PD Dr. C. Busemann Ort, Raum: Klinik und Poliklinik für Kindermedizin, Raum J 1.038 Tag der Disputation: 13.06.2017 2 Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis…………………………………………………………………...5 Einleitung………………………………………….……………………………………….7 MicroRNA…………………………………….………………… ………………….7 1.1 . 1.1.1. Expression der miR-1 im menschlichen Krebs………….……………………...9 1.2 Uterine Leiomyosarkome…………………………………………….…………..12 1.2.1. Ätiologie der Leiomyosarkome……………………………………….…………13 1.2.2. Epidemiologie und Stadieneinteilung………………………….……………….14 1.2.3. Pathologie……………………………………………………….………………...16 1.2.4. Diagnostik……………………………………………………….………………...19 1.2.5. Therapie und Nachsorge……………………………………. ……….………….21 . 1.3 Endometriale Stromasarkom………………………….………………………...25 Material und Methode.............................................................................................28 2.1 Zellkultur…………………………………………………….…………………….28 2.1 1 Zelllinien und Medien……………………………………….…………………...28 . 2.2 RNA-Isolation……………………………………………….………………….....29 2.3 Reverse Transkription und Polymerase Kettenreaktion….…………………..30 2.4 Transfektion…………………………………………………….………………... 31 2.5 Western-Blot………………………………………………….…………………..32 2.6 Untersuchung der miRNA im Leiomyosarkom…………….…………………..34 . Ergebnisse.…………………………………………………………….…………………35 3.1 Etablierung eines in vitro Leiomyosarkom-Modells………….……………….35 3.2 Basalexpression von miR-1 in SK-UT-1……………… ……………………….36 3.3 Expression in uterinen Sarkomen……………………….……………………...38 3.4 Transiente Transfektion…………………………….…………………………....40 3.5 Stabile Transfektion…………………………………………….…………………41 3.6 Elektrophoretische Proteinauftrennung……………………….………………..43 . 3 Diskussion………………………………………………………………………………...46 Zusammenfassung……………………………………………………………………....48 Literaturverzeichnis………………………………………………………………………50 Tabellenverzeichnis……………………………………………………………………...61 Abbildungsverzeichnis…………………………………………………………………..62 Eidesstattliche Erklärung………………………………………………………………..63 Lebenslauf………………………………………………………………………………..64 Danksagung……………………………………………………………………………...66 4 Abkürzungsverzeichnis AJCC The American Joint Committee on Cancer ATF Activating transcription factor BSA Bovine serum Albumin CD10 Cluster of differentiation 10 c-KIT Proto-oncogene c-Kit c-MET MET proto-oncogene DEAE Diethylaminoethyl DNA Deoxyribonucleic acid EMT Epithelial – zu –mesenchymale Transition ERK Extracellular-signal-regulated kinase ESS Endometrial Stromasarkom FBS Fetal bovine serum FCS Fetal calf serum FoxP1 Forkhead box protein P1 HDAC4 Histone deacetylase 4 IL6 Interleukine 6 IL-1β Interleukine 1 β LG ESS Low-grade endometrial stromasarkom LK Lymphknoten LMS Leiomyosarkom MAP-Kinase Mitogen-activated protein kinase miR-1 MicroRNA -1 miR-21 MicroRNA 21 miR-133a Micro RNA 133a miRNA Micro RNA mRNA Messenger RNA 5 MET Metabolic equivalent protooncogen MEK Mitogen-activated protein kinase MRT Magnetresonanztomographie NKZLK Nicht kleinzelligen Lungenkarzinom p38 P38 mitogen-activated protein kinase PBS Phosphate buffered saline solution pri-miRNA Primär miRNA PIK3CA Phosphatidylinositol 3-kinase PIM1 Proto-oncogene serine/threonine-protein kinase 1 RISC RNA-induced silencing complex RNA Ribonucleic acid RPM Rotations pro minute rtPCR Real time PCR SDS Sodium Dodecyl Sulfate siRNA Small interfering RNA TAGLN2 Transgelin 2 TBST Tris-Buffered Saline and Tween 20 TNF-α Tumor nekrosis faktor UES Undifferentiated ESS U-LMS Uterine Leiomyosarkom 6 Einleitung 1.1 MicroRNA MikroRNAs (miRNA) sind kleine, hoch konservierte, nicht-kodierende RNA-Moleküle, die eine wichtige Rolle bei der Genregulation und Genexpression spielen wie z.B. die Kontrolle der mRNA [1]. MiRNAs bestehen aus 18-22 Nukleotiden, die hauptsächlich am 3΄Ende, untranslierten Bereich ihre Ziel-mRNA binden und somit Gene posttranskriptionel regulieren [2]. MiRNAs wurden das erste Mal in 1993 bei Caenorhabditis elegans Nematoden durch Rosalind C. Lee beschrieben. Seitdem wurden verschiedene miRNA-Molekülen in Pflanzen, Tieren und Menschen entdeckt und als eine hochkonservierte RNA-Gruppe definiert [3]. Aktuell sind mehr als 1000 miRNAs im Menschen bekannt, die ungefähr 30 % der Gene regulieren. Dadurch spielt miRNA eine große Rolle bei physiologischen und pathologischen Prozessen, wie z. B. der Kardiogenese, Apoptose und Tumorgenese und sind überwiegend in den nichtkodierenden Abschnitten der DNA kodiert [4]. Die Transkription von miRNAs wird meistens durch die RNA-Polymerase II katalysiert und führt zur Synthese der primären Transkripte, den pri-miRNAs. Im ersten Prozessierungsschritt wird die primäre miRNA durch die RNAase Drosha zur prämiRNA geschnitten (ca. 100 Nukleotide) [5, 6]. Nach Translation der prä-miRNA von Nukleus in das Zytoplasma erfolgt der zweite Prozessierungsschritt durch die Ribonuklease Dicer. Es entsteht die doppelsträngige miRNA aus 18-25 Nukleotiden. Die reife miRNA bindet an den Multiproteinkomplex – RNA-induced silencing complex (RISC) [7]. Die miRNAs binden die korrespondierende mRNA, welches in der Regel durch Aktivierung der Argonaut-Proteine, die als Ribonuklease wirken, abgebaut wird. Dadurch wird die Konzentration der mRNA spezifisch verringert und das 7 entsprechende Protein kann nur noch in geringen Mengen oder überhaupt nicht mehr synthetisiert werden. Da der RISC enzymatisch wirkt, kann der Komplex mehrfach hintereinander mRNAs abfangen und abbauen und so die Expression eines Gens effizient verringern [8, 9]. Neben der Degradation einer Ziel-mRNA kann miRNA auch die Translation einer mRNA hemmen. Dies passiert zumeist, wenn die miRNA mit Fehlpaarungen an ihre mRNA bindet. Es können mehr als 100 Gene durch eine miRNA reguliert werden, umgekehrt kann eine mRNA auch durch mehrere verschiedene miRNAs reguliert werden [10, 11]. Die meisten miRNA-Gene befinden sich innerhalb von Introns und nicht-kodierenden Sequenzen des menschlichen Genoms. Einige miRNAs sind in sogenannten Clustern gruppiert. Hierbei werden die miRNAs als multicistronische Transkripte synthetisiert und unterliegen somit einer gemeinsamen Regulation. Studien haben gezeigt, dass miRNAs in zwei große Gruppen eingeteilt werden können: Tumorsuppressoren und Onkogene. Die Initiation der Tumorentwicklung beginnt daher oftmals durch die Dysregulation der beiden miRNA-Gruppen und der folgenden Modulation von zentralen onkogenen Signalwegen [12, 13]. Viele miRNAs werden gewebespezifisch exprimiert. So wurden z.B. miR-1 (microRNA-1), miR-133a und miR-206 ursprünglich als muskelspezifische miRNAs beschrieben. MiR-1 ist jedoch mittlerweile in zahlreichen soliden Tumoren identifiziert worden und wird vermutlich ubiquitär in nahezu allen Geweben exprimiert. Zur Rolle von miR-1 in Myosarkomen liegen bisher keine experimentellen Daten vor [14]. 8 1.1.1 Expression der miR-1 im menschlichen Krebs Der Einsatz von Hochdurchsatz-Microarray Technologien und quantitativen (RTPCR) hat gezeigt, dass miR-1 bei zahlreichen Krebsarten downreguliert ist. Lungenkrebs ist die Hauptursache krebsbedingter Todesfälle bei Männern und Frauen weltweit [15]. Es wurde gezeigt, dass miR-1 in einem Lungen-Tumor Modell downreguliert ist [16]. Aufgrund der antionkogenische Wirkung von miR-1 zeigten Tumorzellen mit niedriger miR-1 Expression höhere Raten von Zellwachstum, Replikation, Motilität/Migration und Tumorbildung. Die miR-1 reduzierte die Expression onkogener Targets wie (MET) (Met proto-oncogene) und Pim-1 (Proto-oncogene serine/threonine-protein kinase), die in Lungenkrebs sehr häufig hochgeregelt sind und Wachstum sowie Überleben der Krebszellen fördern. Auch die Reduktion der zwei miR-1 Targets/FoxP1 und (HDAC4) unterdrückt das onkogene Potenzial in Lungenkrebszellen [16-18]. Umgekehrt führt die Inhibition von miR-1 zu erhöhtem Zellwachstum und geht mit einer Induktion dieser Target-Gene einher. Eine Studie zu miR-1 im Serum zeigte besseres Überleben von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom (NKZLK) [19]. Eine weitere Studie zeigte, dass insgesamt 70 % der NKZLK-Gewebeproben eine niedrigere miR-1 Expression und eine hohe PIK3CA-Expression aufweisen. Überdies gibt es eine Relation zwischen Expressionsniveaus von miR-1 und PIK3CA beim NKZLK mit klinischer Charakteristik und Prognose [20]. Die Ergebnisse zeigten, dass nach einem Jahr nach dem operativen Eingriff nicht nur die Patienten mit einer niedrigen miR-1 Expression, sondern auch die Patienten mit einer hohen PIK3CA-Expression eine wesentlich höhere Inzidenz für Lymphknotenmetastasen und Rezidive haben. Dies könnte darauf hinweisen, dass die Expression von miR-1 und PIK3CA im NKZLK hilfreich für die Prävention von 9 Lymphknotenmetastasen und postoperativen Rezidiven sein kann. In einer weiteren Studie mit A549 Lungenkrebszellen zeigte eine Überexpression von miR-1 eine morphologische Veränderung vom mesenchymalen zum epithelialen Phänotyp. Hierbei zeigten die Zellen eine erhöhte Expression von E-Cadherin (epitheliale transmembranare Glykoproteine aus der Gruppe der Adhäsionsproteine), das eine Interaktion von kortikalen Aktinfilamenten und Vinculin vermittelt. Der E-CadherinAktin-Vinculin-Komplex spielt eine wichtige Rolle bei der Zell-Zell-Adhäsion und bei der Zellarchitektur [17, 20]. Auch bei gastrointestinalen Karzinomen ist miR-1 im Vergleich zu gesundem Lebergewebe dysreguliert [21]. Ektopische Expression von miR-1 in (HCC-Zellen) inhibiert das Zellwachstum und reduziert Replikation und Überleben [22, 23]. FoxP1 und MET-mRNA haben drei bzw. zwei miR-1 Bindungsstellen in der 3΄untranslierten Region und werden durch Überexpression von miR-1 down reguliert. Progression, Zell-Zyklus und Apoptose werden gehemmt. In einer Studie zum Kolonkarzinom war miR-1 in 84,6 % der Tumoren down reguliert und korrelierte mit der Überexpression von MET, insbesondere in Metastasen. Weitere Studien bestätigten, dass miR-1 im Vergleich zu gesundem Gewebe in Darmkrebs supprimiert ist [24]. Bei urogenitalen Karzinomen ist miR-1 ebenfalls down reguliert [25]. In Prostatatumoren ist miR-1 im Vergleich zu nicht-malignem Gewebe down reguliert und supprimiert seine Target-Gene (Exportin 6 und Protein Kynase 9) [26]. MiR-1 gilt daher auch in Prostatakarzinomzellen als Inhibitor von Proliferation, Migration, Wundheilung und Invasivität [27]. Weitere in vitro Experimente haben gezeigt, dass miR-1 in Prostatazellen zur Inhibition und Downregulierung der Gene von Zellprogression, Mitose, DNA Replikation/Reparatur und Aktindynamik führt. Analysen zeigten, dass miR-1 als 10 Tumorsuppressor wirkt, der die zelluläre Organisation von F-Aktin und somit die Filopodienbildung steuert [28]. Aufgrund dieser Eigenschaften werden miR-1 neben anderen miRNAs als diagnostische und prognostische Biomarker der Tumorprogression diskutiert. Die epithelial-zu-mesenchymal Transition (EMT) ist ein zelluläres Programm, das die Ausprägung eines beweglichen mesenchymalen Phänotyps bewirkt. Slug ist ein wichtiger Regulator der EMT und ein direkter Repressor der miR-1 Transkription. Im Blasenkarzinome ist miR-1 downreguliert und fungiert ebenfalls als ein Tumorsuppressor. Die Überexpression von miR-1 in Blasenkrebszellen führt zur Inhibition von Viabilität, Invasivität, Migration und Proliferation der Zellen. Es wurden einige miR-1 Ziel-Gene identifiziert, darunter die Caspasen 3 und 7 [29-31]. Die miRNA Expression in Hals- und Schädelkarzinomen zeigten 6 miR-Spezien (miR1, miR-21, miR-133a, miR-205, miR-206 und let-7d) und sind im Vergleich zu gesunden Zellen downreguliert. Als ein Target von miR-1 wurde Transgelin 2 (TAGLN2) identifiziert [32, 33]. Eine Überexpression von miR-1 kann in Rhabdomyosarkomzellen, durch Apoptose, die Migration und Proliferation inhibieren. Neuere Studien zeigen, dass die Transfektion von miR-1 bei Rhabdomyosarkomzellen die c-Met Expression supprimiert und zur Inhibition der Zellproliferation und des Tumorwachstums führt. 11 1.2 Uterine Leiomyosarkome Die uterinen Sarkome sind eine heterogene Gruppe von seltenen Tumoren des uterinen mesodermalen Gewebes wie der Uterusmuskulatur, des endometrialen Stromas oder des uterinen Bindegewebes. Sie haben eine Häufigkeit von 3–9% aller Uterusmalignome. Im Vergleich mit den Karzinomen des Endometriums zeigen sich die Sarkome als gynäkologisch bösartige Neubildungen, die am häufigsten zum Tod führt [34, 35]. Die uterinen Sarkome unterteilen sich in Leiomyosarkome mit einer Häufigkeit von 40%, endometriale Stromasarkome (Low-Grade und High-Grade) mit 10–15 % und undifferenzierte Sarkome mit 5–10 % [36, 37]. Des weiteren unterscheidet man Adenosarkome, Liposarkome, Fibrosarkome und Chondrosarkome mit einer Häufigkeit von unter 5 % den uterinen Sarkome [38]. Die uterine Leiomyosarkome sind sehr aggressive Tumoren und zeigen eine schlechte Prognose selbst wenn der Tumor noch auf den Uterus begrenzt ist. Die Rezidivrate der uterine Leiomyosarkome zeigen einen Unterschied zwischen 53 71%. Diese Tumoren haben eine Häufigkeit von 10–15 % der uterinen mesenchymalen Tumoren und treten zumeist bei Frauen zwischen 40–45 Jahren auf. Die häufigsten Beschwerden sind anormale uterine Blutungen, pelvine Schmerzen und Dysmenorrhoe. 25 % der Frauen sind allerdings beschwerdefrei [37]. Laut aktuellen S-3 Leitlinien und Literaturhinweisen ist die Therapie der Wahl beim endometrialen Stromasarkom die totale Hysterektomie. Eine Morcellation mit Entfernung beider Adnexe wird nicht empfohlen [41]. 12 1.2.1 Ätiologie der Leiomyosarkome Die exakten Ursachen der U-LMS sind noch nicht ganz geklärt. Diese Tumoren können spontan, ohne eine konkrete Ursache auftreten. In seltenen Fällen entstehen die Tumoren aus einem gutartigen Fibroid (Myome). Es wird vermutet, dass diese Tumoren genetische oder immunologische Abnormalitäten, aufgrund externer Faktoren (UV-Licht Einwirkung, ionisierende Strahlung und bestimmte Chemikalien) und Stress darstellen [42]. Andere Theorien bestätigen, dass die U-LMS eine Konsequenz der abnormalen Entwicklung und Funktion der Onkogene oder der Tumorsuppressorgene sind. Die Onkogene kontrollieren das Wachstum der Zellen und die Tumorsuppressorgene kontrollieren die Zellteilung und den programmierten Zelltod [43]. Die U-LMS sind mit spezifischen genetischen und umgebungsbedingten Risikofaktoren assoziiert. Bestimmte vererbte Familien-Erkrankungen könnten eine wichtige Rolle für die Entwicklung der U-LMS spielen. Manche von diesen Erkrankungen sind das Gardner Syndrom (der eine Mutation des Adenomatös Polyploid Coli-Protein zugrunde liegt), Li-Fraumeni Syndrom (multiple Tumoren), Werner-Syndrom und Neurofibromatosis. Allerdings ist der genaue Gebund zwischen diesen Erkrankungen und den U-LMS noch nicht bekannt [44, 45]. 13 1.2.2 Epidemiologie und Stadieneinteilung Die Daten über die jährliche Inzidenz der uterinen Sarkome zeigen eine Erkrankungsrate von 0.35 bis 7.02 für jede 100.000. Frau [46, 47]. 2010 zeigte sich, laut des Bayerischen Krebsregisters, eine Alter-Inzidenz von 1,32 für 10.000 Frauen in Deutschland. Die überwiegende Mehrheit von 2.079 Fällen, die zwischen 2009–2011 in Deutschland registriert wurden, waren Frauen in der Postmenopause. Bei der ersten Diagnose sind folglich mehr als 80 % Frauen in Deutschland älter als 40 Jahre [48,49]. Aktuell zeigen sich die U-LMS als die häufigsten uterinen Sarkome. Allerdings beträgt die Häufigkeit dieser Erkrankung nur 1–2 Prozent der uterinen Tumoren, mit einer jährlichen Inzidenz von 0,64 pro 100.000 Frauen. Dies entspricht insgesamt 30% aller uterinen Sarkome. Charakteristisch für diese Erkrankung sind eine frühzeitige hämatogene Ausbreitung und das Schwanken der Heilungsrate dieser Patienten zwischen 20–60 % [50, 51]. Die meisten U-LMS treten bei Frauen in Zusammenhang mit einer vaginalen Blutung56%, einer greifbaren Beckenformation - 54% und Beckenschmerzen - 22% auf. Gewöhnlich ist die Symptomatik der U-LMS ähnlich bei der Leiomyome. Die präoperative Differenzierung dieser zwei Tumorarten ist kompliziert [52, 53]. Somit sind U-LMS in der Regel Zufallsbefunde, die sich nach Hysterektomie oder „Myom“-Enukleation ergeben [54, 55]. Bis 2009 erfolgte die Stadieneinteilung der U-LMS nach der modifizierten FIGOStadieneinteilung von 1988 der Endometriumkarzinome [56]. Aufgrund einer erhöhten Prädilektion für Lungenmetastasen und einer niedrigen Ausbreitung in regionale Lymphknoten wurde 2009 eine neue Klassifikation der ULMS erstellt [57]. 14 Die neue Klassifikation zeigt einen Überblick über klinische Anzeichen der U-LMS, wobei die Größe des Tumors ein prognostisches Kriterium darstellt. 2010 entschied „The American Joint Committee on Cancer“ (AJCC), die neue Klassifikation nach einer Revision der nationalen Krebsregister zu benutzen [58]. Die Stadieneinteilung ist deutlich besser auf die U-LMS zugeschnitten, als die bislang verwendete Gruppierung nach den Kriterien des Endometriumkarzinoms. Sie berücksichtigt den wichtigen Prognosefaktor, Tumorgröße und die Tatsache, dass ULMS auch primär in der Zervix entstehen können, was nicht zwangsläufig ein höheres Risiko bzw. Stadium begründet. Ein Problem besteht darin, dass die Ergebnisse der überwiegenden Mehrheit der retro-prospektiven und randomisierten Studien nur bedingt auf die neue Stadieneinteilung übertragen werden können. Während z. B. das Stadium II der alten Einteilung noch ein auf den Uterus begrenztes, wenn auch auf die Zervix übergegriffenes, Sarkom beinhaltete, repräsentiert das aktuelle Stadium II eine extrauterine, wenn auch auf das Becken beschränkte, Erkrankung. In das Stadium III eingestufte Tumoren wurden nach der alten Einteilung dem Stadium IV zugeordnet. Damit können Therapien, die sich auf die Stadien II und III bezogen, nicht kritiklos auf die aktuellen Stadien II und III übertragen werden [62, 63]. 15 1.2.3 Pathologie Meist ist das U-LMS primär intramural lokalisiert. Im typischen Fall liegt ein solitärer Tumor des Uterus, zumeist innerhalb des Myometriums, vor. Von dort wächst der Tumor schnell in Richtung der Serosa oder Cavum. Dabei kann er das Cavum verdrängen oder aufbrechen und mit Tumormasse ausfüllen. Der Tumor kann auch im Sinne eines gestielten Myoms wachsen und wie ein „Myoma in statu nascendi“ durch den Zervikalkanal hindurch in die Scheide prolabieren [64]. Nur etwa 5 % der U-LMS entstehen primär in der Zervix. Die meisten Tumoren haben eine Größe von 6–10 cm. Das liegt neben dem relativ raschen Wachstum vor allem daran, dass man sich unter der Verdachtsdiagnose des Leiomyoms häufig erst ab dieser Größe zu einer operativen Entfernung entschließt [65]. Sehr große U-LMS und Karzinosarkome könnten bei älteren Frauen mit dünner Uteruswand sogar zur Uterusinversion führen. Der Tumor kann auch neben anderen Myomen vorkommen und in diesem Fall häufig nicht als solches erkannt werden. Die U-LMS sind in ihrer Konsistenz meist fleischig weich, haben unscharfe Grenzen zur Umgebung und es ist keine definierte Kapsel nachweisbar. Sie sind damit nicht wie ein gewöhnliches Myom gut ausschälbar. Es fehlen die bei Leiomyomen typischen verwirbelten Strukturen. Die Schnittfläche kann auch glatt erscheinen. Sie ist meist von rosiger, gelblicher oder fischfleischähnlich grau-weißer Farbe [66, 67]. Des weiteren spielt die sowohl makroskopische als auch mikroskopische Beurteilung des Resektionsergebnisses (R) eine große Rolle. Das Ausmaß der Resektion hat prognostischen Charakter und entscheidet oftmals über das weitere therapeutische Vorgehen [68]. Auch das histopathologische Grading (G) ist für die Therapie und Prognose von großer Bedeutung. Sarkome zeigen entsprechend ihres Grades unterschiedliche Mitoseraten, die auch ihre Metastasierungstendenz widerspiegeln. Damit sind sowohl 16 die Information über die mitotische Aktivität als auch das Wissen über vorhandene Tumornekrose wichtige Faktoren der präoperativen Beurteilung [69, 70]. Die histologische Klassifikation maligner Tumoren der glatten Muskulatur richtet sich nach dem morphologischen Erscheinungsbild und umfasst das LMS und das epithelioide LMS, wobei keine Abhängigkeit zur Lokalisation besteht. Die Prognose geht nicht vom Tumortyp, sondern vom Tumorgrading aus [71, 72]. Um den Differenzierungsgrad exakt einteilen zu können, existieren verschiedene Grading-Klassifikationen. Dem entnommenen Gewebe können folgende fünf Differenzierungsgrade zugeteilt werden: gut (G1), mäßig (G2), schlecht differenziert (G3), undifferenziert (G4) sowie nicht beurteilbar (Gx). Insbesondere bei den U-LMS findet diese Graduierung Anwendung. Für die präoperative Diagnose und Therapieplanung sind somit Tumorgröße, Grading – unter Angabe von Zellatypie, Mitoserate und Tumornekrose – sowie die Tumorausbreitung bzw. Infiltration von entscheidender Wichtigkeit [73]. Die zytogenetischen Veränderungen in U-LMS sind weitaus komplexer als in gewöhnlichen Leiomyomen. Diese Veränderungen schließen numerische und strukturelle Abnormalitäten ein. Außerdem variieren spezifische zytogenetische Aberrationen in den Metaphasen. Diese Änderungen generieren beim U-LMS eine steigende genomische Instabilität und die hohe Frequenz chromosomaler Aberrationen verursachen nukleare Atipien. Solche Aberrationen deuten die pathobiologischen Prozesse an, die eine Bildung von Neoplasien der glatten Muskulatur stimulieren [74, 75]. Manche uterinen und extrauterinen LMS haben dennoch viel einfachere Kariotypen, sodass Tumoren mit einfachen Alterationen, Ziel der positionellen Klonierung sind. Die genomische Instabilität analysierter U-LMS zeigen im Vergleich mit der komparativen genomischen Hybridisierung (eine Technik für die Messung der chromosomalen Bereicherungen und Verluste) multiple und komplexe Änderungen. So zeigen sich Verluste der Heterozygosität für lange Arme des 10-er und 13-er 17 Chromosomen bei mehr als der Hälfte von U-LMS, aber keine beim Leiomyomen. Diese Studien zeigten, dass die genomische Instabilität eine wichtige Unterscheidung zwischen gutartigen und bösartigen Tumoren der glatten Muskulatur des Uterus ist [76, 77]. Die U-LMS metastasieren selten lymphogen (3,5–8 %), in die Adnexe (ca. 3,5 %) oder intraperitoneal (ca. 5 %). Bei makroskopisch, auf den Uterus beschränkte Tumoren gibt es in lediglich ca. 2 % Lymphknotenmetastasen und in 3% mikroskopische Ovarialmetastasen. Die Tumorausbreitung verläuft am häufigsten hämatogen in der Lunge [78, 79]. 18 1.2.4 Diagnostik Aufgrund einer seltenen Inzidenz der U-LMS der Population ist es wichtig um die genetischen Veränderungen und die Einwirkungen der Umgebung zu wissen, die für die Entwicklung der uterinen Sarkome ein großes Risiko bedeuten könnten. Eine ausgeprägte Familienanamnese der Patientinnen wäre hilfreich, um genetische Veranlagungen zu entdecken, wie z. B. eine Familiengeschichte mit Polypose, Neurofibromatose, Myomatosis und verschiedene Formen der Weichteilsarkomen [80]. In einer amerikanischen Studie aus dem Jahr 2012 wurde die Analyse einer SarkomaKohorte mit 889 Patienten durchgeführt. Von 179 Patienten mit LMS hatten lediglich 15 Erste-Linienverwandte mit U-LMS, 124 Patienten hatten Erste-Linienverwandte mit anderen Leiomyosarkom-Arten [81, 82]. Die Symptome der U-LMS sind in Abhängigkeit von der exakten Stelle, Größe und Ausbreitung des Tumors sehr variabel. 25 % der Frauen haben gewöhnlich keine Beschwerden, aber bei Frauen mit einer Symptomatik, zeigen sich als häufigste Beschwerden anormale Blutungen der Scheide oder des Uterus (die postmenopausale Blutung ist ein wichtiger Faktor, den eine U-LMS zeigen kann) [83]. Es können auch andere Symptome, wie z. B. Druck oder Schmerzen, die das kleine Becken oder den Magen betreffen und Scheidenausfluss, auftreten. Im Allgemeinen zeigen die Patientinnen oftmals Ermüdung, Fieber, Gewichtsverlust und Unwohlsein. Weniger häufige Beschwerden können folgende sein: Unterbauchschmerzen; Rückenschmerzen und/oder Beinschmerzen, wenn der Tumor auf Stellen im Rückenmark drückt; Nieren- oder Seitenschmerzen; starker Harndrang, wenn der Tumor auf die benachbarte Harnblase drückt [82, 83]. Die zumeist U-LMS zeigen sich gewöhnlich als große, oval förmige Tumoren, die einen inhomogene und bizarren innerlichen Charakter haben (bei der Sonographie 19 erkennbar). Diese Tumoren beinhalten gemischte echoreiche und echoarme Komponenten, umgeben von dünnem Myometrium und einer zentralen Nekrose [84]. Die Ultraschalldiagnostik stellt die bildgebende Methode der ersten Wahl dar und ist in der Regel bezüglich Bildgebung ausreichend. Gewöhnlich ist jedoch eine exakte Lokalisation der Läsion nicht immer möglich. Die Differenzierung eines subserösen Leiomyoms von einem U-LMS kann schwierig sein. Die Ultraschall - Untersuchung neigt zudem dazu, die Größe der Läsion zu überschätzen. Bei schnell wachsenden Leiomyomen stellt sich die Frage der Abgrenzung zum U-LMS [85]. Die Magnetresonanztomographie ist die sensitivste Untersuchung für die Erkennung von U-LMS. Sie ermöglicht eine exakte Größeneinschätzung der Raumforderung und eine Aussage bezüglich ihrer uterinen Lage. Dies hat entscheidenden Einfluss auf die Wahl der Operationstechnik [86]. Weiterhin können diese Tumoren MR-tomographisch von verschiedenen anderen Läsionen von Uterus und Ovar differenziert werden. Im Uterus sind vor allem die Adenomyose und Endometriumkarzinome differentialdiagnostisch abzugrenzen. Der uterine Ursprung einer Läsion lässt sich außerdem durch das oben erwähnte „beaksign“ (Schnabelzeichen) erkennen [87]. Die Endometrium Stromatumoren können auch eine Reaktivität für diffuse AlphaAktin der glatten Muskulatur haben und enthalten Progesteronrezeptoren und exprimieren Beta-Katenin [88, 89]. 20 Estrogen- und 1.2.5 Therapie und Nachsorge Die traditionelle Therapie der U-LMS ist die totale chirurgische Resektion, eine Hysterektomie (inklusive Resektion der Zervix) und bilaterale Salpingo- Oophorektomie [94]. Die Durchführung dieses Eingriffes ist empfehlenswert, wenn eine U-LMS nach einer Myomektomie zufällig entdeckt wird. Auch wenn der Tumor begrenzt oder komplett entfernt werden konnte, bleibt ein großes Risiko eines lokalen Rückfalles und ferner Rezidiven. Aktuelle Studien zeigen, dass eine große Rate dieser Tumoren Hormonesensibel sind [95-97]. Obwohl der Befall der Lymphknoten gewöhnlich ein Prognose-Faktor ist, liegt die Häufigkeit der Lymphknoten-Metastasen bei einer Rate von 3 % [98]. Eine Lymphadenektomie ist deshalb keine mögliche/empfehlenswerte Therapieform. Trotz der adäquaten chirurgischen Resektion der U-LMS unterliegen die Patienten einem weiteren erhöhten Risiko für lokale und ferne Rezidiven. Die adjuvante Radiotherapie wird nicht als eine adäquate und hilfreiche Therapie-Modalität bewertet. Nebenwirkungen der Radiotherapie sind die vaginalen Blutungen, HautToxizität, Durchfall und abdominelle Schmerzen. Rückblickend wird bestätigt, dass die adjuvante Radiotherapie das Risiko von lokalen Rezidiven reduziert [99, 100]. In der randomisierten Phase-III-Studie, die von der „The European Organization for research and Treatment of Cancer“ Studiengruppe initiert (1988 bis 2011) wurde, war das primäre Ziel die Wirksamkeit der Radiotherapie zu untersuchen. 224 der im Rahmen der Studie untersuchten Patientinnen wurden mit resizierten U-LMS im Stadium I und II identifiziert. Die Patientinnen, die sich einer totalen chirurgischen Resektion des Tumors unterzogen haben, bekamen eine weitere adjuvante Radiotherapie für 5 Wochen. Diese Follow-up-Studie dauerte 6 Jahre und zeigte, 21 dass die postoperative pelvine Radiotherapie keine Verbesserung der Überlebensrate dieser Patienten bewirkte [101]. Im Allgemeinen ist bis heute die Antwort-Rate von Chemotherapie noch begrenzt. Die Standardschemata der Chemotherapie sind aktuell und vor allem auf das Doxorubicin-Präparat ausgerichtet, das in Kombination mit Ifosfamiden oder als Einzeltherapie benutzt/durchgeführt werden kann. Doxorubicin ist das meist verwendete Präparat in der Einzeltherapie bei U-LMS. Die Dosierung von Doxorubicin von 60 mg/m2 i.v. einmal in 3 Wochen zeigt eine objektive Antwort-Rate von 15–25 % über eine Behandlungsdauer von weniger als 6 Monaten [102]. Das Präparat kann bei einer Dosierung, die 500 mg/m2 übersteigt, toxisch sein und zu einer Kardiomyopathie führen. Aus diesem Grund ist es empfehlenswert, ein liposomales Doxorubicin zu benutzen [103]. Das Ifosfamide-Präparat kann auch als Einzeltherapie-Präparat benutzt werden. Es zeigt eine Antwort-Rate von 17 Prozent bei Patienten mit U-LMS, die eine Dosis von 1,5mg/m2 einmal für 5 Tage mit einer Behandlungsdauer von 3 Wochen bekamen. Dieses Präparat zeigt sich toxisch für den Urogenitaltrakt und kann zu einer hämorrhagischen Zystitis führen. Aus diesem Grund ist es empfehlenswert, Ifosfamide in Kombination mit Mesna zu benutzen, was die Detoxifikation der gefährlichen Metaboliten unterstützt [104, 105]. Des weiteren zeigt sich die Kombination von Gemcitabine und Docetaxel aktuell als eine Therapiemöglichkeit der U-LMS. Aktuell demonstrieren prospektive Phase-IIStudien, dass diese o. g. Kombination als first-line oder second-line Therapie wirksam ist und mit einer erhöhten Gesamt-Antwort Rate von 27–53 Prozent und einem mittleren Gesamtüberleben von 14–18 Monaten führt [106, 107]. Ein anderes Präparat, das im Rahmen der U-LMS-Therapie aktuell ist, ist das Präparat Trabectedine, ein synthetisches Tetrahydroisoquinoline Alkaloid, das isoliert ist aus Ecteinascidia turbinata. Der Wirkmechanismus dieses Präparates besteht darin, eine kovalente Bindung zur Guaninerest aufzubauen, innerhalb derer kleine 22 DNA-Groove mit DNA-bindenden Proteinen und Transkription-Faktoren interferieren. Diese Molekülen verhindern die Organisierung und den Einbau des MikrotubuliNetzwerkes. Trabectedine wirken als Inhibitoren der Transkription von MDR1-Genen, die für die Codierung von P-Glycoprotein zuständig sind [108, 109]. Es ist bestätigt, dass die Medikamente, die eine Blockierung von P-Glycoproteinen durchführen, die Fähigkeit haben, die Sensibilität zur Chemotherapie der Sarkomazellen wiederherzustellen. Im Rahmen einer Phase-II-Studie erhielten 54 Patienten mit Weichteilsarkomen (davon 22 U-LMS) eine Therapie mittels Trabectedin 1,5 mg/m2, die als 24-Stunden-Infusion, ein Mal in 3 Wochen, gegeben wurde. Die Studie zeigte eine Antwort-Rate von 11 Prozent (6 von 54 Patienten), wobei sich 3 von diesen Tumoren (scheinbar) als U-LMS zeigten. Das mittlere Gesamtüberleben lag bei 12.8 Monaten [110, 111]. Die Toxizität dieses Präparates kann zu Nebenwirkungen, wie bspw. Neutropenie und Hepatotoxizität, führen [112, 113]. Eine große Menge an uterinen Leiomyosarkom-Tumoren zeigt eine variable Expression von Östrogen- (7–71 %) und Progesteronrezeptoren (17–60 %) sowie Androgenrezeptoren (40 %) [114, 115]. Die Hormon-Therapie zeigt sich als eine attraktive Alternative Therapie-Möglichkeit und die erste Fallberichte zeigten dauerhafte Antworten bei der Therapie mit Progestinen wie Medroxyprogesteron bei Patienten mit metastatischen U-LMS [116]. Pazopanib ist ein oral zu verabreichender, potenter Multi-Tyrosinkinase-Inhibitor (TKI) der “Vascular Endothelial Growth Factor”-Rezeptoren (VEGFR)-1, -2 und -3, der “Platelet-Derived Growth Factor”-Rezeptoren (PDGFR)-α und -β und des “Stem Cell Factor”-Rezeptors (c-KIT) mit IC50- Werten von 10, 30, 47, 71, 84 bzw. 74 nM. In präklinischen Untersuchungen hemmte Pazopanib dosisabhängig die ligandeninduzierte Autophosphorylierung der VEGFR-2-, c-Kit- und PDGFRRezeptoren in Zellkulturen. In vivo hemmte Pazopanib die VEGF-induzierte VEGFR2- Autophosphorylierung in Mäuselungen, die Angiogenese in verschiedenen 23 Tiermodellen und das Wachstum vieler humaner Transplantationstumore bei Mäusen. 24 1.3 Endometriale Stromasarkom Das endometriale Stromasarkom ist als rein homogenes Sarkom eine eigeständige uterine Tumorentität und soll aus klinischer und prognostischer Sicht sowohl vom Stromaknoten als auch vom undifferenzierten endometrialen Sarkom abgegrenzt werden. Die aktuelle WHO-Klassifikation unterteilt die ESS in Low-Grade ESS (LG ESS), HG-ESS und undifferenzierte ESS (UES). LG-ESS bestehen aus mesenchymalen Zellen des endometrialen Stromas in der Proliferationsphase und zeigen eine Infiltration der Blutgefäße mit oder ohne Lymphinfiltration [39, 40]. Das endometriale Sarkom ist das häufigste vom endometrialen Stroma ausgehende Sarkom und dennoch beträgt der Anteil an allen Genitaltumoren nur 0,2% und in Analogie zum Stroma Knoten tritt es vorrangig bei prämenopausalen Patientinnen, in Einzelfällen schon im 2. Lebensjahrzehnt auf [118, 119]. Die primären Lokalisationen sind im gesamten Genitalbereich, inklusive der Vulva, aber auch retroperitoneal sowie in der Bauchhöhle einschließlich aller Darmabschnitte und der Leber möglich. Fast immer lässt sich bei diesen Lokalisationen ein Zusammenhang mit einer Endometriose herstellen [120]. Makroskopisch bietet das endometriale Stromasarkom ein ähnliches Bild wie der Stroma Knoten. Die Schnittfläche des Tumors ist gelblich bis gelblich-braun, mitunter auch rosig. Entsprechend seines infiltrativen Wachstums sind die Tumorgrenzen i.d.R. unscharf, häufig sind strangartige oder knotige Infiltrationen zu erkennen. Je nach Ausmaß der Infiltration können die Tumorgrenzen makroskopisch allerdings auch scharf erscheinen. Der Tumor kann zunächst als kleines Knötchen und später polypös in das Uterus-Cavum vorwachsen. Er kann hysteroskopisch, sonographisch und intraoperativ zunächst wie ein Polyp oder wie ein Endometriumkarzinom imponieren. Bei einem mehr knotigen Wachstum ähneln die Konsistenz und das 25 Aussehen einem Myom bzw. Fibromyom, zumal die Masse des Tumors oft innerhalb des Myometriums liegt [121]. Das endometriale Stromasarkom ist nicht selten ein Zufallsbefund am Hysterektomiepräparat. Bei Symptomatik werden die Patientinnen meistens wegen Zusatzblutungen und/oder Neorrhagien bzw. wegen Blutungen in der Postmenopause auffällig. Das Wachstum des Tumors führt zu einem unregelmäßig vergrößerten Uterus häufig gekoppelt mit Unterbauchschmerzen. Palpatorisch fällt die fleischige Konsistenz des meist vergrößerten Uterus auf. Neben den anderen uterinen Sarkomen ist das endometriale Stromasarkom eine wesentliche Ursache für eine Uterusvergrößerung in der Postmenopause. Prinzipiell ist ein Hinweis auf ein Sarkom anzusehen. Ein innerhalb der Uteruswand wachsendes endometriales Stromasarkom lässt sich durch seine deutlich weichere Konsistenz und die unscharfen Grenzen zur Umgebung zwar relativ gut vom Myom aber kaum von einer Adenomyose differenzieren. Bei einem polypösen Wachstum in das Uteruscavum hinein kann der Tumor im Zervikalkanal erscheinen. Derartige Befunde sind oft mit einer fötiden Qualität vergesellschaftet [122, 123]. Bei Zusatzblutungen und Blutungen in der Postmenopause sind prinzipiell eine Hysteroskopie und/oder eine fraktionierte Abrasio indiziert. Dabei ist zu berücksichtigen, dass die Abrasio in bis zu 30% alle Fälle eine falsche histologische Diagnose liefert. Für die Diagnostik ist ein zytologischer Abstrich wegen geringgradiger zellulärer Atypien meist wertlos. Bei aus der Zervix herausragenden Tumormassen sollte man sich auf eine entsprechende Biopsie beschränken. Eine Hysteroskopie und/oder Abrasio birgt in diesem Fall das Risiko einer Uterusperforation [124]. Die immunohistochemischen Untersuchungen der endometrialen stromalen Knoten und LG ESS haben typischerweise eine positive Antwort zu Vimentin, Muskelspezifisches Aktin, Alpha-Aktin der glatten Muskulatur und häufig zu Keratin. Die 26 meisten Endometrium Stromatumoren sowie die normalen Endometrium Stromazellen haben eine Affinität zur CD10-Verfärbung [90, 91]. Sonographisch ist das Bild vielgestaltig. Das Cavum ist häufig zentral mit nur unscharf vom Endometrium abzugrenzenden Tumormassen ausgefüllt. Neben homogenen hypoechogenen können auch zystische Strukturen sichtbar sein. Auch scheint der Tumor mitunter durch ecoreiche „Septen“ in Felder unterteilt zu sein. Ein innerhalb der Uteruswand gelegenes endometriales Sarkom zeichnet sich neben der inhomogenen Echogenität durch schlecht definierte Grenzen zum Myometrium aus. Meist ist das Endometrium an den Rand gedrängt. Ebenso sind vom Myometrium ausgehende polypoide Massen, die in das Cavum vorwuchern, möglich. Die Grenzen zum Endometrium sind auch hier unscharf und in Richtung Myometrium können noduläre Strukturen darstellbar sein [125]. Im MRT stellt sich das endometriale Stromasarkom als Tumor im Uteruscavum oder im Myometrium dar. Die meisten endometrialen Stromasarkome zeigen ein stärkeres Enhancement als das Myometrium. Intramural können knotige wurmartige Strukturen erkennbar sein. Die Unterscheidung von einem Leiomyosarkom, einem Endometriumkarzinom oder einem Myom mit zystischer Degeneration ist häufig schwierig. Das Signal ist in T1-gewichteten Bilder typischerweise hoch und in T2gewichteten Bildern heterogen hoch. Das endometriale Stromasarkom unterscheidet sich vom Endometriumkarzinom, wenn überhaupt, durch irreguläre Tumorgrenzen meist in Kombination mit randständigen knotigen Läsionen. Die Therapie der Wahl des ESS beinhaltet die Hysterektomie mit beidseitiger Adnexektomie, Lymphknotenevaluation und möglichst komplettem Tumordebulking. Aufgrund des lokales Vorwachsen in die Lymphbahnen und Lymphknotenmetastasen häufig sind (33%) wird beim ESS eine paraaortale und pelvine Lymphonodektomie sinnvoll [126]. 27 Material und Methoden 2.1 Zellkultur 2.1.1 Zelllinien und Medien Um die molekularen Prozesse der Expression von miRNA in Zellen der U-LMS zu untersuchen, wurden eine LMS Zelllinie verwendet. Zellline Ursprung SK-UT-1 Grad III, mesodermaler Tumor, ähnlich dem Leiomyosarkom OVCAR3 Ovarial-Karzinom TOV-112 Ovarial-Karzinom TOV-21G Ovarial-Karzinom SKOV-3 Ovarial-Karzinom Tabelle 1: Zelllinien der Ovarial-Karzinome und Leiomyosarkome Die eingesetzte SK-UT-1Zelllinie, stammt aus eine Leiomyosarkoms des Uterus. Die SK-UT-1 Zellen wurden in Eagel Minimum Essential Medium mit 10 % fötalem Rinderserum, 1 % PBS kultiviert und zweimal die Woche kontrolliert. Zum Umsetzen wurden die Zellen mit Trypsin inhibiert (5 min, 37oC), in PBS resuspendiert und in Verdünungen von 1:3 bis 1:6 in neuen Flaschen angesätzt. 28 2.2 RNA-Isolation SK-UT-1 Zellen wurden in 6 Wells inkubiert und die Gesamt-RNA mit 500 µl Trizol pro Well präpariert. Nach Zugabe von 100 µl Chloroform je Ansatz wurden diese gemischt, 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend abzentrifugiert (5 min, 4oC, 12000 RPM). Die wässrige RNA-Phase wurde abgenommen und in sterile 1,5 ml Eppis überführt. Nach Zugabe von 250 µl Isopropanol wurden die Ansätze gemischt und für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erneuter Zentrifugation (10 min, 4oC, 12000 RPM) wurde der Überstand mit 500 µl 75%igem Ethanol versetzt und zentrifugiert (5 min, 4oC, 12000 RPM). Der Überstand wurde vorworfen und die trockenen RIVA-Sedimente in 20-30 µl DEPC-H2O gelöst. Die RNA Konzentration wurden mittels Photometer bestimmmt. 29 2.3 Reverse Transkription und Plymerase Kettenreaktion Die Reverse Transkription erfolgte mit SuperScript RT und spezifisch Oligonukleotiden. Der Ansatz ist in wie folgt: -0,7 µl DEPC-H2O - 1,0 µl RNA (100 ng/ µl) - 1,5 µl 5 x RT-Buffer - 1,0 µl miR-1 SLOOP - 1,0 µl U6 SLOOP -1,0 0,25 mM dNTP - 0,05 µl RiboLock 40U/ µl - 0,2 SuperScript RT 200u/ µl Für die folgende quantitative Polymerase-Kettenreaktion wurde das SensiMix SYBR Hi-ROX mit genutzt. - 5,2 µl Millipore-Wasser - 0,4 µl forward Primer - 0,4 µl reverse Primer - 2,0 µl RT-Produkt (cDNA) 8,0 µl SensiMix SYBR Hi-ROX Die real-time PCR wurde in 96-Well Platte durchgeführt. 2 µl cDNA wurde mit 14 µl Mastermix je well analysiert. Gewebeproben von OC-Patientinen wurden in flüßigem Stickstoff (196 oC) gelagert. Zur Extraktion der RNA wurden Gewebestücke im Cryotom (-20oC) 0,14 µm dicke 30 Scheiben geschnitten, mit 500 µl Trifast versetzt und für 10 Minuten bei 4oC. Die weitere Präparation erfolgte gemäß Protokoll. 31 2.4 Transfektion Das Grundprinzip jeder chemischen Transfektion ist ähnlich. Sie beruhen auf positiv geladenen Trägermolekülen, die einen Komplex mit den Nukleinsäuren bilden, um sie für die Transfektion zu verpacken. Diese Trägermoleküle schaffen es, die negative Ladung der Zellmembran zu überqueren, sodass sie ihren Inhalt in das Innere der Zelle transportieren zu können. Das Protokoll sieht wie folgt aus: - 15 – 60 Minuten vor der Transfektion: Mediumswechsel auf 2 ml(6-Well)/500 µl (24-Well) -Medium (Medium ohne FCS oder Gentamycin) - DNA auf Eis auftauen - DNA-Mastermix und Lipofectamin-Mastermix herstellen: Verhältnis von DNA : Lipofectamin 1 : 1,5 µg : µl 6-Well: pro Well 0,5 ml DNA-Mix und 0,5 ml LF-Mix 3 µg DNA (normal) 1,5 µg DNA (miR-1) 24-Well: pro Well 250 µl DNA-Mix und 250 µl LF-Mix 0,6 µg DNA (normal) 0,3 µg DNA (miR-1) - Mastermixe einzeln 5 Minuten bei RT inkubieren - LF-Mix zu DNA-Mix geben, gut resuspendieren - 20 Minuten bei RT inkubieren - 1 ml (6-Well)/ 500 µl (24-Well) auf jedes Well tropfen lassen - Inkubation bei 37°C 32 2.5 Western Blot Da der Lämmli-Puffer ein wichtiger Teil des Prozess war, um Zellen zu lysieren, bereiteten wir diesen Puffer aus drei verschiedenen Komponenten vor: 50 % 2x Lämmli + 45 % Aqua bidest + 5 % ß-Mercaptoethanol. Den gewachsenen Zellkulturplatten (die konfluent gewachsen sein müssten) wurde der Zellkulturüberstand abpipettiert. Die Wells wurden ein Mal mit PBS gewaschene, je circa 500 µl. Als Nächstes wurde der fertige Lämmli-Puffer geteilt und in jede Well 200 µl des Puffers hineingegeben, die Platte auf Eis gestellt und leicht geschwenkt, bis der Inhalt benetzt war. Nach 2 Minuten wurden die Zelllysate aufgenommen, mit der Pipette durchgerührt, weil der Inhalt sehr viskos war, und in ein 1,5 ml-Eppi gegeben und auf Eis gestellt. Das wiederholten wir mit allem Wells. Danach wurden diese Eppis für 5 Minuten bei 95 °C auf den Schüttler gestellt. Im nächsten Schritt des Experimentes erfolgte die Gel-Elektrophorese. Dafür mussten alle Proben und ein LICOR-Marker aufgetaut werden, um dann noch einmal 5 Minuten bei 95 °C zu schütteln. Da im Prozess weiterhin Antikörper benutzt wurden, ließen wir ein Milchpulver bei Raumtemperatur und die Antikörper-Puffer bei 4 °C auftauen. Die fertigen Gele wurden entnommen und in das Elektrophorese-Gerät eingestellt. Zuvor entfernten wir die grünen Streifen (unterhalb). Damit dieses Gerät normal funktionieren konnte, füllten wir es mit einem spezifischen Puffer, dem SDSLaufpuffer, sodass die Kammer (endlich) vorsichtig herausgetrennt wurde, damit auch die Taschen mit dem Puffer gespült werden konnten. Die fertigen Proben wurden mit Hilfe einer 20 µl-Pipette in die Taschen gegeben und beiderseits in die erste und letzte Tasche LICOR-Marker zur Kontrolle gegeben. Zu Beginn programmierten wir das Gerät so, dass es bei einer 100 V-Intensität für 5 Minuten arbeitet. Bei Trennung der Marker konnten wir das Gerät auf 150–200 V einstellen. Die Laufzeit des Prozesses betrug je nach Voltstärke zwischen 30 und 45 Minuten. 5 Minuten vor Ende bereiteten 33 wir die Filter und die Filterpapiere vor. Pro Gel benutzten wir 5 Filterpapiere und inkubierten im Transferpuffer. Die Membranen stellten wir zunächst für 30 Sekunden in Methanol, um diese zu aktivieren, dann 2 Minuten in Aqua bidest, um diese zu spülen und erneut im Transferpuffer zu inkubieren. Am Ende des ElektrophoreseProzesses spannten wir die Gele aus und knackten die Platten aus, ohne die Gele zu beschädigen. Des Weiteren inkubierten wir die Gele im Transferpuffer. Um die Blots aufzubauen, benutzten wir die Filterpapiere wie folgt: Als erstes Layout stellten wir 2 Filterpapiere, dann legten wir eine Membran, 1 Gel und wieder 3 Filterpapiere übereinander. Das Blotgerät wurde im User-defined Protocol für eine Laufzeit von 30 Minuten eingestellt. Nach 30 Minuten entnahmen wir die Membranen mit Vorsicht und benutzten für jede Membran 50 ml-Flacons. In jeden Falcon wurden je 5 ml Milchpulver gegeben und die Membranen ebenfalls in Flacons (abseits) gestellt. Die Blockierung der Membranen wurde für 1–3 Stunden, in Milchpulver bei Raumtemperatur, auf einen Roller durchgeführt. Nach dieser Zeit entfernten wir den Inhalt des Flacons und wuschen ihn ein Mal mit TBS-T aus. Danach nahmen wir die vorbereiteten Antikörper aus dem Kühlschrank und inkubierten die Membranen über Nacht bei 4 °C. Die Antikörperkonzentrationen wurden wie folgt hergestellt: HSP27: 1:10.000 (ca. 3x verwenden) ß-Actin: 1:40.000 (jedes Mal neu ansetzen) mouse rabbit Am nächsten Tag wurde die Membran 3x mit TBS-T gewaschen und für 1 Stunde mit dem sekundären Antikörper inkubiert. Der Inhalt wurde erneut 3x mit TBS-T gewaschen, dann wurde jede Membran zwischen 2 Filterpapieren getrocknet. Die Detektion der Banden wurde mit Hilfe eines Gerätes – dem ODYSSEY-Detektor – durchgeführt. 34 2.6 Untersuchung der miRNA im Leiomyosarkom Die Gewebeproben sind aus der Tumorbank entnommen. Zu Beginn wurden den Patienten verschiedene Gewebeproben entnommen. Diese wurden ca. 24 Stunden in flüssigem Stickstoff (196 °C) gelagert und anschließend bis zum Experiment bei – 80 °C gelagert. Danach fertigten wir im Cryothom (–20 °C) 0,14 µm große Schnitte an. Pro Probe wählten wir 10 Schnitte. Im weiteren Verlauf wurde die Zugabe von je 500 µl Trifast durchgeführt und dann 10 Minuten im 4°C-Schüttler lysiert. Weiter führten wir die RNA-Isolation sowie die RNA-Messung rtPCR nach Protokoll durch. 35 Ergebnisse 3.1 Etablierung eines in vitro Leiomyosarkom-Modells Für die folgenden molekular-biologische Untersuchung zur Rolle des Tumorsuppresors miR-1 beim Leiomyosarkom wurden SK-UT-1 Zellen eingesetzt. Die Zellen wuchsen im Vergleich mit etablierten Zelllinien andere Entitäten vergleichsweise schnell, wurden 2 mal wöchentlich in Verdünnungsverhältnisse von 1:8 bis 1:12 vorgesetzt und zeigten der typisch länglichen, spindelförmige Morphologie (Abb.1 A, B). Abb. 1A: SK-UT-1 Zellen in Flaschen mit Abb. 1B: SK-UT-1 Zellen in Flaschen mit Medium und Diamidino-Phenylindolen Medium und Diamidino-Phenylindolen (fluorescent) 36 3.2 Basalexpression von miR-1 in SK-UT-1 Zellen Um die Funktionalität von miR-1 bei der Progression des Leiomyosarkom besser zu verstehen wurde die basale Expression des Turmosuppressors in SK-UT-1 Zellen sowie einige Vergleichszelllinien der Ovarialkarzinoms (OVCAR, SKOV), der Endometriumkarzinom (MFE-280, MFE-296), der Mammkarzinom (MCF-7, MDA), der Prostatakarzinom (LnCaP, PC-3) sowie der Herzmuskel Zellen HL-1 und Herzmuskelgewebe am Mäuse analysiert. relative miR-1 Expression 600,000.00 Abb. 2: Basales Wachstum der Zellen verschiedener Zelllinien. Hier zeigte sich die höchste basale Expression der miR-1 bei den Herzgewebe-Zellen. 500,000.00 400,000.00 300,000.00 200,000.00 100,000.00 HL-1 Herzgewebe Zelllinien 25.00 Abb. 3: miR-1 Basales Wachstum der Zellen verschiedener Zelllinien. Unterschiedliche Expression der miR-1 bei verschiedenen Krebs-Arten. relative miR-1 Expression 20.00 15.00 10.00 5.00 - Wie in der Literatur beschrieben zeigte sich in der Herzmuskelzellen HL-1 und der Gewebeproben die höchten Expressionsraten von miR-1. Die malignen Zellen wiesen eine deutlich geringere miR-1-Expression auf. Die Unterschiede waren nicht sehr 37 groß, die Linien aus OC und EC sowie die PC Linie PC-3 hatte etwas höhere Level von miR-1 als die Zellen von MC, Leimyosarkom und der PC-Linie LnCaP. 38 3.3 MiR-1 Expression in uterinen Sarkomen Nach Etablierung der miR-1Detektion in SK-UT-1 Zellen, wurde die miR-1 Expression in Gewebeproben von Patientinnen mit uterinen Sarkomen bestimmt. Insgesamt wurden 19 Gewebeproben analysiert, von denen 4 aus gesunde Uterusgewebe stammten, 3 aus Leiomyosarkom Gewebe, 7 aus Karzinosarkom-Gewebe und 5 aus Stromasarkome-Gewebe. Die Analyse der präparierten MicroRNA mittels quantitativer RT-PCR zeigte eine deutlich niedrigere miR-1 Synthese in den malignen Geweben verglichen mit der Gewebeproben gesunder Tumoren. In Proben von Leiomyosarkom war das Niveau von miR-1 auf 59 % reduziert (Abb. 5A), in den Geweben von Karzinosarkom und Stromasarkom sogar auf 94,5% (Abb. 5B), bzw. 90,5% (Abb. 5C) reduziert. Der Vergleich von primären und rezidiven Tumorgewebe konnte nur bei Proben von Leiomyosarkom und Stromasarkom vorgenommen werden. Vorbehaltlich der sehr niedrigen Probenzahl zeigte die Auswertung, dass die miR-1 Konzentration in den Rezidiven tendenziell nochmals absinken. miR-1: primär vs. Rezidiv 1.4 1.2 1 0.8 Gesamt 0.6 primär 0.4 rezidiv 0.2 0 Gesunde Karzinosarkome Leiomyosarkome Stromasarkome Abb. 4: Basale Expression der miR-1 bei gesundem Gewebe und bei Krebszellen in Primär-Tumoren und bei Rezidiv-Episoden. 39 miR-1: Gesund vs. Leiomyosarkome 1.400 1.200 1.000 0.800 0.600 0.400 0.200 - miR-1 A Gesunde Leiomyosarkome miR-1: Gesund vs. Karzinosarkom 1.400 1.200 1.000 0.800 0.600 0.400 0.200 - Abb. 5: miR-1 B Gesunde Karzinosarkome miR-1: Gesund vs. Stromasarkom 1.500 1.000 miR-1 0.500 C Gesunde Stromasarkome 40 Der Unterschied der miR-1 Expression zwischen gesundem Gewebe und LeiomyosarkomGewebe. 3.4 Transiente Transfektion Durch transiente Transfektion können die Nukleinsäuren in Zellen eingebracht werden, die sodann zu ihren Genprodukten exprimiert werden. Im Allgemein führt eine transiente Transfektion zu einer verstärkten Synthese der Zielgens bis zu 96 h nach Transfektion. Die Transfektion mit dem Vektor pSuperior-puro-miR-1 führte zu einer Erhöhung der miR-1 Konzentration von das 3,5-fache (Abb.6). miR-1 Abb. 6: Die transiente Transfektion der SK-UT-1 Zelllinie. 8 6 4 2 0 pSUPERIOR.puro pSUPERIOR.puro-miR-1 Die Analyse des Zellwachstums zeigte jedoch keinen Unterschied zwischen miR-1 überexprimierenden und Kontrollzellen. Demnächst führte die Transfektion dazu, dass das physiologische Wachstum der Zellen gestüzt war. Da die transiente Transfektion somit nicht für diese Untersuchung geeignet war, wurden in folgenden stabile Zelllinien hergestellt. 6 pSUPERIOR.pur o 5 4 pSUPERIOR.pur o-miR-1 3 2 1 0 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h Stunden der Prozess des Wachstums Abb. 7: Kinetik der SK-UT-1 Zellen nach transienter Transfektion. 41 3.5 Stabile Transfektion Da bei stabilen Transfektion die Vektor-DNA in das Genom der Zellen integriert wird, kann die genetische Information an die Tochterzellen weitergegeben werden. Zur Selektion des genomisch integrierten Vektor, wurde die Zellen und Transfektion mit Puromycin inhibiert. Den Vektor induzierte Resistenz gegen dieses Antibiotikum führte dazu, dass nur stabile Zellklone wachsen konnten. Aufgrund unterschiedlicher Puromycin-Sensibilität von Zellen wurde zuerst die Puromycin-Konzentration austitriert, bei der die maternale Zellen nicht mehr wachsen können (Abb.8). Für die folgende Selektion wurde Puromycin in eine Konzentration von 0,3 µg/ml eingesetzt. 7 6 5 Ko 4 0,1 µg/ml 3 0,3 µg/ml 2 0,5 µg/ml 1 0 24h 48h 72h 96h 120h 144h Abb. 8: Kinetik der SK-UT-1 Zellen nach stabile Transfektion. Wachstumskinetiken mit der miR-1 überexprimierende SK-UT-1-miR-1 Zelllinie, zeigte über den Inhibitionszeitraum von 288 h keine Wachstumshemmung verglich mit der Kontrolllinie SK-UT-1-puro (Abb.9). 42 Abb. 9: Kinetik der SK-UT-1 Zellen nach stabiler Transfektion. Die Wachstumskurve ist bis zur 216 Stunden steigend. 43 3.6 Elektrophoretische Proteinauftrennung Zur Überprüfung der zellulären Effekte einer miR-1 Überexpression wurden 10 µg der Proteinproben mittels eines 4-12% Gradientengel aufgetrennt und mit spezifische Antikörpern analysiert. Die transiente Überexpression von miR-1 zeigte keine Effekte auf die miR-1 Targets ERK 1/2 und p38 sowie auf den Phosphorilierungsstatus dieser Proteine (Abb.10). Abb. 10: Western Blot Ergebnisse von transienter Überexpression. Die Quantifizierung verdeutlichte, dass die äußerst geringen Änderungen der Targetproteine statistisch nicht signifikant wäre. Die deutliche Änderung war bei der Expression von p38 zu detektieren, die in Anwesenheit von miR-1auf 86 % verglich mit Kontroll-tranfizierte Zelle absank. Zu genauere Überprüfung der miR-1-Funktionalität wurde eine Zelllinie dargestellt, die die Sequenz von miR-1 in ihr Genom integriert hatte und somit miR-1 stabil überexprimieren konnte. 44 Auch hier wurde kein Einfluss der höheren miR-1-Konzentration auf die überprüften Targetproteine nachgewiesen (Abb. 11). Die quantitative Auswertung der Western Blots zeigte zwar etwas größere Differenz der detektierten Targets zu den KontrollZellen, jedoch blieben auch hier die Änderungen nicht significant. Trotz der stabile Überexpression von miR-1 blieben die Standardabweichung der durchschnittlichen Expressionsraten der Targets vergleichsweise hoch. Abb. 11: Western Blot Analyse nach stabilen Transfektionen der SKUT-1 Zelllinie. 45 Abb. 12: Western Blot Ergebnisse von stabile Überexpression. 46 Diskussion Seitdem in den 90er jahren die ersten microRNAs in Caenorhabditis elegans entdeckt wurden [117], wuchsen die Kenntnisse über die kleinen, nicht-kodierenden RNAMolekülen stetig an. Neben der zeitlichen Regulation entwicklungsspezifischen Prozesse gelten mircoRNAs als Feinregulatoren der Gene-expression in zahlreiche zelluläre Prozessen. Daher spielen microRNAs in der molekulare Medizin nicht nur eine sehr wichtige Rolle als diagnostische und prognostische Biomarker, sondern könnten darüber hinaus als therapeutische Zielstrukturen genutzt werden. Bis heute sind die Funktion von microRNAs bei Krebs-Erkrankungen nur sehr ungenau entschlüsselt, jedoch wurde in viele Studien eine Dysregulation der microRNA in Krebs-Geweben nachgewiesen. Im U-LMS gibt es allerdings kaum Studien zur Funktion von microRNAs. Ausgehend von der Funktionalität der miR-1 in anderen Entitäten wurde in der vorliegenden Arbeit Expression, Regulation und Funktion von miR-1 bei U-LMS untersucht. Zurzeit existieren keine geeigneten Biomarker für Diagnose und Prognose des ULMS, weswegen große Hoffnung auf Krankheitsspezifische microRNAs gesetzt wurden. Die SK-UT-1 Zelllinie stammt von einem U-LMS und kann in erster Näherung für molekularbiologische Analysen eingesetzt werden, ersetzt jedoch nicht die Evaluierung in Patienten-Material. Zur Abschätzung der miR-1 Expression in SK-UT-1 Zelllinien des Endometriumkarzinoms (MFE-280, MFE-296) des Brust-Krebs (MCF-7, MDA-MB231), des Prostatakarzinoms (PC-3, LnCAP) und des Ovarialkarzinoms (OVCAR-3, SK-OV-3). Da miR-1 besonders stark in Muskelzelle exprimiert wird, wurden zudem Herzmuskelzellen in die Analyse einbezogen. In den malignen Zellen waren weitgehend ähnliche Expression Raten zu sehen. Studien haben gezeigt, dass in 47 Krebs-Zellen miR-1 als Tumorsuppressor fungiert. Dies konnten wir in SK-UT-1 Zellen nicht bestätigen, die Überexpression von miR-1 führte nicht zur vermuteten Hemmung des Zellwachstums. Zur besseren Einschätzung der miR-1-Funktionen im U-LMS werden zusätzlich Patientenproben untersucht. Da U-LMS eine vergleichsweise seltene Krebserkrankung darstellt, wurde auch andere SarkomEntitäten in die Untersuchung einbezogen. Insgesamt wurden 19 Gewebe Proben analysiert, die sich wie folgt zusammensetzen: 4 Proben aus gesundem Uterus, 7 Karzinosarkome, 5 Stromasarkome und 3 Leiomyosarkome, davon 3 Rezidive. Aufgrund der geringen Probenzahl, war jedoch eine statistische Auswertung der Daten nicht sinnvoll. Tendenziell ließ sich jedoch feststellen, dass miR-1 im Vergleich zu gesundem Uterusgewebe in allen 3 Sarkomen herabreguliert erscheint. Verglichen mit Karzinosarkomen und Stromasarkomen zeigte sich zudem, dass miR-1 im U-LMS am stärksten exprimiert wurde. 48 Zussamenfassung Die uterine Leiomyosarkomen sind eine Gruppe von seltenen und aggressiven mesenchymalen Tumoren des Uterus. Die Diagnose dieser Tumoren wird oftmals erst zum Zeitpunkt der histo-pathologischen Befundung im Rahmen einer Hysterektomie gestellt. Klinisch ist es bisher nicht möglich eine Verdachtsdiagnose eines U-LMS zu stellen, da spezifische Symptome in den frühen Tumorstadien fehlen und keine geeigneten diagnostischen Methoden zur Verfügung stehen. Andererseits wird bei frühzeitiger Diagnose die Therapiewahl signifikant zum verbesserten Überleben der Patientin führen. Die komplette chirurgische Resektion des Uterus, d.h. Hysterektomie ohne Morcellment stellt die erste Therapiewahl dar und vermindert entscheidend das Rezidiv Risiko. Trotz einer erzielbaren kompletten Tumorresektion der U-LMS im frühen Tumorstadium, bleibt das Rezidiv Risiko hoch. Die Therapie der inoperablen Tumoren beinhaltet die systemische palliative Chemotherapie, die Target-Agents Therapie, Hormontherapie und die Radiotherapie. Das Ziel dieser Arbeit war den Stellenwert von nicht-kodierenden RNA-Moleküle, beim U-LMS zu unteruschen. In der Zelllinie SK-UT-1, die ähnlichen Charakteristika wie die U-LMS aufweist, wurde die Expression der microRNA miR-1 analysiert. Im Vergleich mit anderen 4-Zelllinien, zeigte die SK-UT-1 Zelllinie eine niedrigere miR-1 Expression. Die weiteren Untersuchungen der miR-1 Expression im gesundem Uterus-Geweben der Menschen, Gewebe des Herzmuskels von Mäusen und Gewebe der U-LMS ergab die höchste miR-1 Expression im Herzmuskel-Gewebe, die sich durch eine große Affinität der miR-1 für Muskel-Gewebe erklären lässt. Im Vergleich zwischen gesundem und U-LMS-Gewebe zeigte sich eine Überexpression in gesunden Geweben und eine erniedrigte Expression der miR-1 in U-LMS Gewebe. Diese 49 Ergebnisse unterstreichen die Hypothese, dass die miR-1 Moleküle eine Rolle als Tumor-Inhibitoren bei der Genregulation der U-LMS spielen könnten. Des Weiteren zeigte, dass miR-1 keinen wesentlichen Einfluss auf die p38 und ERK1,2 Expression zu haben scheint. Diese Proteine spielen eine wichtige Rolle bei der Apoptose und Stress-Antwort der Zellen auf externe Stimuli. Zusammenfassend, lässt sich festhalten, dass die miR-1-Molkülen vermutlich eine bedeutende Rolle bei der Entwicklung der U-LMS insbesondere bei der Transkription und Gen-Regulation zu haben scheinen. 50 Literaturverzeichnis [1] Friedman RC, Farh KK, Burge CB, Bartel DP. Most mammalianmRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 2009; 19(1): 9. [2] Esteller M. Non-coding RNAs in human disease. Nat Rev Genet. 2011; 12(12): 861-74. [3] Olsen PH, Ambros V. 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Abb.3: Basales Wachstum der Zellen verschiedener Zelllinien…………………….36 Abb.4: Basale Expression der miR-1 bei gesundem Gewebe…………………...…38 Abb.5: Der Unterschied der miR-1 Expression zwischen Gewebe……………......39 Abb.6: Die transiente Transfektion der SK-UT-1 Zellinie mit Puromycin……….....40 . Abb.7: Kinetik der SK-UT-1 Zellen nach transienter Transfektion…………………40 . Abb.8: Kinetik der SK-UT-1 Zellen nach stabile Transfektion…………………....41 . Abb.9: Kinetik der SK-UT-1 Zellen nach stabiler Transfektion……………………..42 Abb.10: Western Blot Ergebnisse von transiente Überexpression……...…………..43 . Abb.11: Western Blot Analyse nach stabilen Transfektionen………………………...44 Abb.12: Western Blot Ergebnisse von stabile Überexpression………...……………45 63 Eidesstattliche Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig verfasst und keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe. Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät und keiner anderen wissenschaftlichen Einrichtung vorgelegt worden. Ich erkläre, dass ich bisher keine Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und dass eine Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt. Datum Victor Cernat 64 Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich für die Unterstützung bei der Anfertigung dieser Arbeit bedanken. Ein besonderer Dank gebührt meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. med. A. Mustea für die Möglichkeit, diese Arbeit schreiben zu dürfen, für das Überlassen dieses interessanten Themas sowie Vorschläge zur Verbesserung und Anregungen bei der Korrektur. Vielen Dank an allen Mitarbeitern vom Forschungslabor von Herrn Prof. A.Mustea (Dr. rer. nat. Matthias Stoppe, Karoline Diesingk) für die Bereitstellung der Informationen und die Hilfe, ohne die diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Spezieller Dank gilt meinen Eltern und meiner Frau vor allem für die geduldige moralische Unterstützung. 65
