Studien zur Interaktion von zyklisch Nukleotid-gesteuerten
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Studien zur Interaktion von zyklisch Nukleotid-gesteuerten Kanälen aus Arabidopsis thaliana mit regulatorischen Proteinen Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Cornelia Fischer aus Worms Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 10.03.2017 Vositzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Georg Kreimer Gutachter/in: Prof. Dr. Petra Dietrich Prof. Dr. Stefan Hoth Inhaltsverzeichnis INHALTSVERZEICHNIS Inhaltsverzeichnis ..................................................................................................................................... I 1. Einleitung ........................................................................................................................................... 1 1.1 Calcium in Pflanzenzellen ............................................................................................................. 1 1.2 Ca2+-Signalnetzwerke in Pflanzen ................................................................................................. 1 1.3 ABA-induzierter Stomaschluss ..................................................................................................... 4 1.4 Zwei ausgewählte Komponenten Ca2+-abhängiger Signalwege ................................................... 6 1.4.1 Calmoduline (CaMs) als Ca2+-Sensoren................................................................................. 6 1.4.2 Ca2+-abhängige Proteinkinasen (CDPKs) .............................................................................. 7 1.5 CNGCs als mögliche Ca2+-Permeationswege ............................................................................... 8 1.5.1 CNGCs erfüllen diverse physiologische Funktionen ........................................................... 10 1.5.2 Struktureller Aufbau von CNGCs ........................................................................................ 11 1.5.3 Calmodulin-Bindedomänen der CNGCs .............................................................................. 12 1.5.4 Regulation von CNGCs ........................................................................................................ 13 1.6 Zielsetzung dieser Arbeit ............................................................................................................ 15 2. Ergebnisse ........................................................................................................................................ 16 2.1 Calmoduline als Liganden von CNGCs ...................................................................................... 16 2.1.1 CNGC20 und CaMs sowie CMLs befinden sich in räumlicher Nähe zueinander ............... 16 2.1.2 Identifizierung einer IQ-Domäne als CaMBD in CNGC20 ................................................. 17 2.1.3 CNGC1 enthält ebenfalls eine IQ-Domäne .......................................................................... 19 2.1.4 Besitzen alle CNGCs eine funktionelle IQ-Domäne? .......................................................... 20 2.1.5 Aminosäuren vor dem IQ-Motiv sind von Bedeutung für die CaM-Interaktion .................. 24 2.1.6 CNGC19 bindet CaMs über einen größeren Bereich um das IQ-Motiv .............................. 26 2.1.7 Die Umgebung der IQ-Domäne beeinflusst deren CaM-Bindeeigenschaften – Beispiel: CNGC2 .......................................................................................................................................... 27 2.1.8 Komplementationsanalysen von dnd1 sprechen gegen die αC-Helix als CaMBD .............. 29 2.1.9 Die Interaktion mit den IQ-Domänen erfolgt über die C-Schleife der CaMs ...................... 32 2.1.10 Calcium-Abhängigkeit der CaM-Interaktion mit CNGC-IQ-Domänen............................. 34 2.1.10.1 Die Interaktion mit dem C-Terminus von CNGC20 ist Ca2+-abhängig .......................... 34 2.1.10.2 CNGC-Untereinheiten besitzen eine unterschiedliche Ca2+-Abhängigkeit bei der CaMBindung ......................................................................................................................................... 35 2.1.10.3 Die CaM-Bindung an CNGC20 ist in planta Ca2+-unabhängig ...................................... 37 2.1.10.4 CNGC2 bindet CaMs Ca2+-unabhängig in planta ........................................................... 41 2.2 Interaktionen mit Kinasen und Phosphatasen ............................................................................. 43 2.2.1 CNGCs interagieren mit Phosphatasen ................................................................................ 43 2.2.2 In Hefen interagierten CNGC20 und CNGC9 nicht mit diversen CDPKs........................... 44 I 2.2.3 CNGCs und CDPKs interagieren in planta .......................................................................... 47 2.2.4 CDPKs beeinflussen die Lokalisierung von CNGCs nicht .................................................. 51 2.2.5 CDPKs interagieren vermutlich über die CaM-ähnliche Domäne ....................................... 52 2.2.6 CNGCs und CDPKs interagieren in Oocyten....................................................................... 53 2.2.7 Die Herstellung löslicher rekombinanter CNGC-Termini erweist sich als schwierig .......... 55 3. Diskussion......................................................................................................................................... 58 3.1 Mögliche Regulation der CNGCs durch Phosphorylierung ........................................................ 58 3.2 Lokalisierung von CNGCs .......................................................................................................... 62 3.3 IQ-Domänen fungieren als CaMBDs in CNGCs......................................................................... 64 3.4 Ca2+-Abhängigkeit der CaM-Bindung an CNGCs ...................................................................... 66 3.5 Modell zur CaM-abhängigen Regulation der CNGCs................................................................. 68 3.6 Ausblick....................................................................................................................................... 71 4. Material und Methoden .................................................................................................................. 73 4.1 Material........................................................................................................................................ 73 4.2 Methoden ..................................................................................................................................... 93 4.2.1 Molekularbiologische Methoden .......................................................................................... 93 4.2.2 Methoden zur Arbeit mit Pflanzen ....................................................................................... 97 4.2.3 Mikroskopie ........................................................................................................................ 100 4.2.4 Methoden zur Arbeit mit Hefen.......................................................................................... 101 4.2.5 Methoden zur Arbeit mit Oocyten ...................................................................................... 102 4.2.6 Methoden zur Arbeit mit Proteinen .................................................................................... 103 5. Zusammenfassung ......................................................................................................................... 105 6. Anhang ........................................................................................................................................... 108 6.1 Literaturverzeichnis ................................................................................................................... 108 6.2 Abbildungsverzeichnis .............................................................................................................. 120 6.3 Tabellenverzeichnis ................................................................................................................... 121 6.4 Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................................. 121 6.5 Zusatzmaterial ........................................................................................................................... 124 Lebenslauf ........................................................................................................................................... 138 Danksagung ......................................................................................................................................... 140 Erklärung ............................................................................................................................................. 141 II 1. Einleitung 1. EINLEITUNG 1.1 Calcium in Pflanzenzellen Das Makroelement Calcium (Ca2+) spielt eine grundlegende Rolle in der Entwicklung höherer Pflanzen und ihren regulatorischen Prozessen. Aufgrund seiner physikalischen Eigenschaften bindet Ca2+ bevorzugt Sauerstoff und kann unlösliche Komplexe mit Phosphaten bilden, so zum Beispiel mit ATP oder auch mit Proteinen und Membranen (Katz et al., 1996). Daher kann Ca2+ in der Zelle toxisch sein und benötigt eine strikte Regulation zu einer cytosolischen Konzentration im nanomolaren Bereich (Williamson, 1975). Unter Ruhebedingungen herrscht hier eine ungefähre Konzentration von 30-200 nM (Clarkson et al., 1988; Felle, 1988). Das cytosolische freie Ca2+ wird durch Bindung an Proteine, Lipide und Polysaccharide und durch Export mittels spezieller Transportproteine gering gehalten. Höhere Konzentrationen im millimolaren Bereich werden in Organellen wie ER und Vakuole gespeichert oder im Apoplasten gehalten. So befinden sich in der Vakuole 1 mM und im Apoplasten 1-10 mM Ca2+ (Bush, 1995; Martins et al., 2013). Um die Calciumionen gegen den Konzentrationsgradienten in diese Speicher zu bringen, wird entweder von Ca2+-ATPasen Energie verbraucht oder von H+/Ca2+-Antiportern der bestehende Protonengradient verwendet (Hirschi; Sanders et al., 1999; Axelsen und Palmgren, 2001). 1.2 Ca2+-Signalnetzwerke in Pflanzen Als sessile Organismen müssen Pflanzen auf Einflüsse von außen in verschiedenster Weise reagieren. Sie sind abiotischen Faktoren wie Licht- und Temperaturveränderungen oder osmotischen Schwankungen und biotischem Stress wie der Infektion von Pathogenen, sowie dem Einwirken herbivorer Tiere ausgesetzt. Aber auch Signale von Symbiosepartnern und pflanzeneigene Hormone müssen erkannt werden. Reize von außen und interne Signale werden von den einzelnen Zellen unter anderem über spezifische Rezeptoren wahrgenommen. Arabidopsis besitzt zum Beispiel über 600 Rezeptor-ähnliche Kinasen (RLK, Receptor-Like Kinases), die eine N-terminale Signalsequenz, eine transmembranspannende Helix und eine cytoplasmatische Kinasedomäne besitzen (Shiu und Bleecker, 2001). Auf die Wahrnehmung eines Signals folgen Phosphorylierungen in der Zelle und ein Anstieg der Ca2+Konzentration (Haley et al., 1995). Unterschiedliche Reize führen zu einem Ca2+-Ausstrom aus verschiedenen Ca2+-Speichern (Sanders et al., 1999). Dieser Strom entlang des Konzentrationsgradienten wird durch Ionenkanäle ermöglicht. Als mögliche Kandidaten werden neben spannungsabhängigen Ionenkanälen häufig Liganden-aktivierte Ionenkanäle in der Plasmamembran und TPC1 im Tonoplasten diskutiert (Sanders et al., 2002; Tuteja und Mahajan, 2007 a; Kudla et al., 2010). Zu den Liganden-aktivierten Kanälen gehören neben Glutamatrezeptoren (GLRs) auch zyklisch Nukleotid-gesteuerte Kanäle (CNGCs, Cyclic Nucleotide-Gated Channels). CNGCs werden in 1 Kapitel 1.5 genauer vorgestellt und sind Hauptaugenmerk dieser Arbeit. Der Ca2+-Anstieg verläuft Stimulus spezifisch. Batistič und Kudla (2012) haben Beispiele für Stimulus-spezische Ca2+Antworten zusammengefasst. So gibt es mono- und bi-phasische Signaturen. Sie beinhalten einen einzigen Ca2+-Anstieg und -Abfall oder zwei hintereinander. Außerdem kann die Ca2+-Konzentration oszillieren. Diese sogenannten Ca2+-Signaturen unterscheiden sich in Dauer, Amplitude, Frequenz und Lokalisierung der Ca2+-Konzentrationsänderung (Webb et al., 1996; McAinsh und Pittman, 2009). Sie sind nicht nur im Cytosol zu finden, sondern auch in Doppelmembran-umgebenen Organellen wie zum Beispiel dem Zellkern (Xiong et al., 2006; Charpentier und Oldroyd, 2013). Abbildung 1: Schematische Darstellung einer EF-Hand. A: zwei Zylinder stellen zwei Helices dar, verbunden mit einer Schleife, in der ein Ca2+-Ion (gelb) gebunden wird. B: Konsensussequenz einer EF-Hand; Helices sind dunkelrot umrandet, Aminosäuren der Schleife sind in einem Bogen angeordnet. E - Glutamat, h - hydrophobe Aminosäure, * - beliebige Aminosäure, G - Glycin, I Isoleucin, rot - Aminosäuren für Ca2+-Interaktion (Positionen X, Y, Z, -Y, -X, -Z der Schleife), gestrichelte Linie – Bindung mit Ca2+ (gelb). Die Informationen der Ca2+-Signale werden daraufhin entschlüsselt und zum Beispiel in Proteinmodifikationen umgewandelt. Hierfür sind bestimmte Proteine zuständig, wovon die meisten EF-Hände zur Bindung von Ca2+ besitzen (Kretsinger und Nockolds, 1973; Strynadka und James, 1989). EF-Hände sind Ca2+-Bindemotive, die eine typische Helix-Schleife-Helix-Struktur aufweisen (Abb. 1 A). Die Nomenklatur in der Schleife ist aus der ursprünglichen oktaedrischen Beschreibung der Ca2+-bindenden Liganden hervorgegangen (X, Y, Z, -Y, -X, -Z). Dazwischen liegen variable Aminosäuren. An der -Z-Position (Abb. 1 B) befindet sich meist ein Glutamat, das zwei koordinative Bindungen über die beiden Sauerstoffatome der Seitengruppe mit Ca2+ eingeht. Da Ca2+ somit zwar sechs Aminosäuren bindet, die Koordinationszahl tatsächlich aber sieben ist, wird die molekulare Geometrie nun pentagonal bipyramidal genannt (Mitchell et al., 2015). Eine Mutation des Glutamat zu Alanin verhindert die Ca2+-Bindung an die EF-Hand (Fruen et al., 2003). Ca2+-Bindeproteine sind zum Beispiel Calmoduline (CaMs, Calcium-Modulated Proteins, Kapitel 1.4.1) und Calmodulin-ähnliche Proteine (CMLs, Calmodulin-Like Proteins), Calcium-abhängige Proteinkinasen (CDPKs, CalciumDependent Protein Kinases, Kapitel 1.4.2), CDPK-verwandte Kinasen (CRKs, CDPK-Related 2 1. Einleitung Kinases), Ca2+/CaM-abhängige Kinasen (CCaMKs) und Calcineurin B-ähnliche Proteine (CBLs, Calcineurin B-Like proteins), die in Verbindung mit CBL-interagierenden Proteinkinasen (CIPKs) agieren (Tuteja, 2009; Batistic und Kudla, 2012). Diese Proteine werden in „sensor relays“ und „sensor responder“ eingeteilt. „Sensor relays“ wie zum Beispiel Calmodulin gehen durch die Ca2+Bindung eine Konformationsänderung ein (Wahrnehmung des Signals). Dies hat eine Auswirkung auf die Bindung mit einem Interaktionspartner, wodurch das Signal weitergeleitet wird. Der Interaktionspartner antwortet dann mit einer Änderung der Struktur oder enzymatischen Aktivität. „Sensor responder“ hingegen, wie zum Beispiel CDPKs, gehen eine Konformationsänderung ein, die einen Einfluss auf die eigene enzymatische Aktivität haben. Sie besitzen also eine eigene Effektordomäne (Sanders et al., 2002). Die Ca2+-Signale werden hauptsächlich in (i) Phosphorylierungsreaktionen oder (ii) transkriptionelle Antworten umgewandelt (Sanders et al., 2002; Dodd et al., 2010; Kudla et al., 2010). Abbildung 2: Fließschema zum Ablauf einer Signaltransduktionskette. Ein Stimulus (blauer Blitz) wird von einem spezifischen Rezeptor (grün-schwarz-lila) an der Plasmamembran (PM, grau) wahrgenommen. Daraufhin erfolgen Ca2+-Einströme aus verschiedenen Pools (Ca2+ - gelb, Ca2+Kanäle – orange) und somit Ca2+-Signaturen, welche von Sensoren wahrgenommen und übersetzt werden. Die Übersetzung resultiert unter anderem in Proteinmodifikation (Proteine – dunkelblau) oder Genexpression (oliver Balken mit Pfeil). Genauere Erläuterungen im Text. 3 (i) Das Anfügen einer Phosphatgruppe an ein Protein kann dessen Konformation oder ProteinInteraktionen beeinflussen. Bisher wurde gezeigt, dass CDPK und MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase)-Signaltransduktionswege miteinander verbunden sein können und dass CDPKs bei der Antwort auf biotischen und abiotischen Stress, z.B. Stomabewegung, Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und Phosphorylierung von Transkriptionsfaktoren, beteiligt sind (Ludwig et al., 2005; Mori et al., 2006; Kobayashi et al., 2007; Zhu et al., 2007; Ishida et al., 2008). Das CBL/CIPK-Netzwerk ist hauptsächlich in der Signaltransduktion von abiotischen Reizen wie Trockenheit, Salz, osmotische Veränderungen, aber auch Ionenhomöostase und Entwicklung involviert und reguliert verschiedene Transportproteine und Ionenkanäle (Luan, 2009 a; Luan et al., 2009 b; Kudla et al., 2010; Mähs et al., 2013). (ii) In Arabidopsis reagieren über 200 Gene auf eine Veränderung der Ca2+-Konzentration (Kaplan et al., 2006). Ca2+/CaM-aktivierte Transkriptionsaktivatoren (CAMTAs) agieren neben weiteren in Signaltransduktionswegen, die durch verschiedene Umweltreize ausgelöst werden (Yang und Poovaiah, 2002; Finkler et al., 2007). CaM7 selbst kann auch direkt als Trankriptionsfaktor bei der Regulation Licht-induzierter Gene fungieren (Kushwaha et al., 2008). In Abbildung 2 wird der Ablauf von Ca2+-Signaltransduktionswegen in Pflanzen vereinfacht zusammengefasst. Eine solche Signalkaskade wird nun am Beispiel des Stomaschlusses als Reaktion auf das Phytohormon Abscisinsäure (ABA, Abscisic Acid) verdeutlicht. 1.3 ABA-induzierter Stomaschluss Neben der Funktion in Samenentwicklung, Samendormanz und anderen Vorgängen wird Abscisinsäure (ABA) als Stresshormon benötigt (Schopfer et al., 1979; Leung und Giraudat, 1998; Rock, 2000; Finkelstein et al., 2002; Tuteja, 2007 b). Besonders bei Störungen im Wasserhaushalt ist es für die Induktion einer Reaktion zuständig. Wassermangel induziert die ABA-Synthese. Stomata werden dann durch verschiedene Signalprozesse und letztendlich die Aktivität von Ionenkanälen und eine Minderung des Turgordrucks geschlossen. Somit wird ein weiterer transpirationsbedingter Wasserverlust verhindert. Folgend wird nur auf den Ca2+-abhängigen Aspekt dieser Regulation eingegangen (Abb. 3). ABA wird von spezifischen Rezeptoren, PYRABACTIN RESISTANCE 1 (PYR)/PYR-LIKE1 (PYL)/REGULATORY COMPONENTS OF ABA RECEPTORS (RCAR), wahrgenommen und gebunden (Ma et al., 2009; Park et al., 2009). Dieser Komplex inhibiert Phosphatasen der Gruppe der PP2Cs, wie ABI1 durch Bindung und verhindert somit die Inhibition der SNF1 (Sucrose NonFermenting)-Related Kinase 2 OPEN STOMATA1 (OST1/SnRK2.6; Yoshida et al., 2006; Park et al., 2009; Nishimura et al., 2010). OST1 kann nun die NADPH-Oxidase aktivieren (Sirichandra et al., 2009). 4 NADPH-abhängige Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) aktiviert dann 1. Einleitung hyperpolarisationsaktivierte Ca2+-Kanäle (Pei et al., 2000; Murata et al., 2001). Über diesen Weg ruft ABA in Arabidopsis Schließzellen Ca2+-Oszillationen hervor (Allen et al., 2000). Hier gibt es zwei Mechanismen zur Schließung der Stomata: Eine kurzzeitige Ca2+-reaktive Schließung erfolgt, sobald sich die cytosolische Ca2+-Konzentration erhöht. Ein langzeitiger Stomaschluss entsteht durch Ca2+-Programmierung. Bei letzterem bleiben die Stomata aufgrund einer charakteristischen Signatur (definiert durch Frequenz, Dauer und Amplitude) vorerst geschlossen (Allen et al., 2001). Zusätzlich wurde gezeigt, dass eine de novo Proteinsynthese zur Erhaltung der langzeitigen Ca2+-programmierten Schließung beiträgt (Cho et al., 2009). CDPKs interagieren zwar mit ABA-bezogenen Transkriptionsfaktoren (Choi et al., 2005; Zhu et al., 2007; Zhang et al., 2014), CPK3 und CPK6 werden jedoch dem kurzzeitigen Stomaschluss zugeordnet. Sie regulieren gemeinsam einen S-Typ (slow-type) -Anionenkanal in der Plasmamembran (Mori et al., 2006). Ein Ausstrom von Anionen aus dem Cytosol führt zur Depolarisierung der Plasmamembran, was den K+-Kanal GORK (guard cell outward rectifying K+ channel) aktiviert (Ache et al., 2000; Hosy et al., 2003). K+ strömen aus der Zelle, der Turgordruck sinkt und Wasser wird aus den Schließzellen entlassen. Hier wurde nur ein vereinfachter Ausschnitt einer komplexen Regulation der Stomaöffnungsweite dargestellt. Neben der Ca2+-abhängigen gibt es auch eine Ca2+-unabhängige Regulation der Stomaweite (Li und Assmann, 1996; Laanemets et al., 2013). SLAC1 kann zum Beispiel direkt durch OST1 aktiviert werden (Geiger et al., 2009) Abbildung 3: Fließschema zum ABA-induzierten Ca2+-abhängigen Stomaschluss. Erläuterungen im Text. PM – Plasmamembran. 5 1.4 Zwei ausgewählte Komponenten Ca2+-abhängiger Signalwege Im folgenden Abschnitt werden zwei Vertreter der Ca2+-Sensoren genauer vorgestellt. CaMs und CDPKs wurden in dieser Arbeit zur Untersuchung der Regulation von CNGCs verwendet. 1.4.1 Calmoduline (CaMs) als Ca2+-Sensoren Calmoduline sind ein prototypisches Beispiel für Ca2+-bindende Proteine der EF-Hand-Familie. Als regulatorische Proteine sind sie in verschiedene Ca2+-abhängige Signalwege eingebunden und zählen zu den „sensor relays“ (Sanders et al., 2002). Das Arabidopsisgenom enthält sieben Gene, die zusammen für vier CaM-Isoformen kodieren, welche sich in nur wenigen Aminosäuren unterscheiden. Diese sind CaM1/4, CaM2/3/5, CaM6 und CaM7 (McCormack et al., 2005). Darüber hinaus gibt es in Arabidopsis 50 CaM-ähnliche Proteine, die CMLs. Hier besteht nur noch eine Aminosäureidentität von 16-75 % im Vergleich mit CaM2 (McCormack und Braam, 2003). Während CaMs aus 149 Aminosäuren bestehen und vier EF-Hände besitzen, haben CMLs 83-330 Aminosäuren und formen alle - bis auf CML1 – mindestens zwei EF-Hände, die meisten sogar vier und CML12 weist sogar sechs EF-Hände auf (McCormack und Braam, 2003). Abbildung 4: Calmoduline – Konformation und Bindedomänen. A: Apo-CaM (4 EF-Hand-Motive). B: Ca2+ (gelb)/CaM. C: helikale Anordnung der Aminosäuren der CaMBD aus CNGC1 nach Köhler et al. (2000), + - positiv geladene Aminosäuren, * - hydrophobe Aminosäuren; Aminosäureanordnung nach HeliQuest (Gautier et al., 2008). D: Konsensussequenz des IQ-Motivs. CaMs sind in zwei globuläre Domänen mit je zwei EF-Händen eingeteilt, die als N- und C-Schleife oder auch N- und C-Lobe bezeichnet werden. Beide Lobes haben eine unterschiedliche Affinität für Ca2+. Der C-Lobe bindet Ca2+ stärker (Teleman et al., 1986; Astegno et al., 2016). Eine kooperative Bindung ist für ihre Funktion notwendig, weswegen EF-Hände oft in Paaren auftreten (Luan et al., 6 1. Einleitung 2002; Gifford et al., 2007). Durch die Bindung von bis zu vier Ca2+ gehen CaMs eine Konformationsänderung vom „geschlossenen“ (Apo-CaM, Abb. 4 A) zum „offenen“ (Ca2+/CaM, Abb. 4 B) Zustand ein. Bei der „offenen“ Konformation treten hydrophobe Aminosäurereste an die Oberfläche, die für die Bindung von Zielproteinen wichtig sind. Ein besonderes Augenmerk bei der Interaktion mit Zielproteinen sind Methionine, die starke Van-der-Waals-Kräfte eingehen (O'Neil und DeGrado, 1990; Vogel und Zhang, 1995). Des Weiteren stabilisiert unter anderem jeweils ein kurzes, antiparalleles β-Faltblatt zwischen den Ca2+-Bindeschleifen eines EF-Hand-Paares die strukturelle Anordnung im Ca2+/CaM (Grabarek, 2006). Bindedomänen für Calmoduline (CaMBDs) lassen sich schwer vorhersagen, da sie meist keine konservierte Sequenz, sondern eine bestimmte Struktur besitzen, eine amphiphile α-Helix (Abb. 4 C). Diese besitzt hydrophobe Aminosäuren auf einer Seite der Helix und positiv geladene auf der anderen (O'Neil und DeGrado, 1990). Motive für Ca2+-abhängige CaM-Bindung werden danach bezeichnet, an welchen Positionen sich konservierte große, hydrophobe Aminosäuren, auch Ankerreste genannt, wie Tryptophan oder Phenylalanin, befinden. Die hydrophoben Anker bilden mehrere Kontakte mit hydrophoben Bereichen des Ca2+/CaM aus. Das beinhaltet einige Interaktionen mit Methioninen der Lobes. Die Motive sind 1-10, 1-14 oder 1-16 und Varianten mit weiteren konservierten hydrophoben Aminosäuren an Position 5 oder 8 (Rhoads und Friedberg, 1997; Yamniuk und Vogel, 2004). Als Motiv für die Ca2+-unabhängige CaM-Bindung ist ein Isoleucin-Glutamin (IQ)-Motiv bekannt. Dieses besitzt die konservierte Sequenz [I,L,V]QxxxRxxxx[R,K] (Abb. 4 D), wobei x für eine beliebige Aminosäure steht (Cheney und Mooseker, 1992; Rhoads und Friedberg, 1997; Bähler und Rhoads, 2002). Zielproteine für Calmoduline sind zum Beispiel Rezeptorkinasen, CNG-Kanäle, Transkriptionsfaktoren, IQD-Proteine, Myosine, Ca2+-ATPasen, Kinasen und weitere Enzyme (Snedden und Fromm, 2001; Reddy et al., 2002; Abel et al., 2005; Hartmann et al., 2014; Virdi et al., 2015). 1.4.2 Ca2+-abhängige Proteinkinasen (CDPKs) Als Beispiel für „sensor responder“, bei denen Sensor- und Effektordomäne in einem Protein zusammen gefasst sind (Sanders et al., 2002), werden hier die Ca2+-abhängigen Proteinkinasen (CDPKs) vorgestellt. Die Serin/Threonin-Proteinkinasen können somit das Ca2+-Signal direkt in Phosphorylierungssignale weiterleiten (Harper et al., 2004; Harper und Harmon, 2005). Das Genom von Arabidopsis verfügt über 34 Gene (CPKs), die für CDPKs kodieren und in vier Gruppen eingeteilt werden (Harmon et al., 2001; Cheng et al., 2002). CDPKs besitzen eine variable N-terminale Domäne, die die Variabilität der Isoformen ausmacht und Ziel für Myristoylierungen/Palmytoylierungen zur Membranverankerung ist, gefolgt von einer Kinasedomäne. Dahinter befindet sich die CDPK-Aktivierungsdomäne (CAD), die aus einem Pseudosubstratsegment und einer Ca2+-Bindedomäne besteht, die wegen ihrer meist 4 EF-Hände auch CaM-ähnliche Domäne genannt wird (Abb. 5; Harper et al., 1994; Liese und Romeis, 2013). Die 7 meisten CDPKs besitzen 4 EF-Hände und somit zwei Paare Ca2+-bindender Strukturen (Cheng et al., 2002). Diese EF-Hand-Paare zeigen unterschiedliche Ca2+- und Substrataffinitäten (Rutschmann et al., 2002; Christodoulou et al., 2004). Abbildung 5: Struktureller Aufbau von CDPKs. V – variable Domäne, K – Kinasedomäne, CAD – CDPK-aktivierende Domäne bestehend aus P – Pseudosubstrat und der CaM-ähnlichen Domäne mit 4 EF-Händen (orange). Die CAD fehlt bei konstitutiv aktiven CDPKs (CACDPKs). Bei geringen Ca2+-Konzentrationen in der Zelle liegen CDPKs im inaktiven Zustand vor, bei dem das Pseudosubstratsegment an das aktive Zentrum der Kinasedomäne bindet und die Kinaseaktivität somit inhibiert (Harper et al., 2004). Erst bei einem Anstieg der Ca2+-Konzentration in der Zelle bindet auch das N-terminale EF-Hand-Paar an das Pseudosubstrat und führt zu einer Konformationsänderung, bei der das aktive Zentrum der Kinasedomäne vom Pseudosubstrat freigelassen wird (Harper et al., 2004; Liese und Romeis, 2013). Dieses Modell der Ca2+-abhängigen Aktivierung der CDPKs konnte mit Kristallstrukturen aktiver und nicht-aktiver CDPKs bestätigt werden (Ojo et al., 2010; Wernimont et al., 2010; Wernimont et al., 2011). Nun erfolgt die eigentliche Substratbindung und phosphorylierung. CDPKs können auch durch Auto- und Transphosphorylierung reguliert werden (Liese und Romeis, 2013). Wird die CAD deletiert, erhält man eine konstitutiv aktive CDPK, auch CACDPK genannt (Abb. 5; Harper et al., 1994). Weitere Angaben bezüglich Expression, Lokalisierung, Acylierung und Funktion haben Boudsocq und Sheen (2013) zusammengestellt. Zielproteine für CDPKs sind unter anderem Ionenkanäle, Transkriptionsaktivatoren, Zytoskelettproteine, NADPH-Oxidasen, Ionenpumpen, Aquaporine, metabolische und weitere Enzyme (Harmon et al., 2000; Cheng et al., 2002; Harper und Harmon, 2005; Curran et al., 2011; Boudsocq und Sheen, 2013). 1.5 CNGCs als mögliche Ca2+-Permeationswege Das Arabidopsisgenom enthält 20 Gene, die für zyklisch Nukleotid-gesteuerte Ionenkanäle (CNGCs) kodieren. Sie sind in vier Hauptgruppen (I - IV) unterteilt, wobei die letzte Gruppe wiederum in zwei Subgruppen (IV A und IV B) eingeteilt wird (Abb. 6; Mäser et al., 2001). 8 1. Einleitung Abbildung 6: Phylogenetischer Stammbaum der CNGCs aus Arabidopsis thaliana. Die 20 CNG-Kanäle werden in fünf Untergruppen eingeteilt. Alignment mit ClustalΟ, Stammbaum mit Phylodendron erstellt. Tierische CNG-Kanäle sind bereits intensiv erforscht und ihre Stellung innerhalb von Signalkaskaden ist bekannt. Kurz vor der Jahrtausendwende wurden auch Pflanzenforscher auf eine solche Kanalfamilie aufmerksam und fanden die ersten CNGCs in verschiedenen pflanzlichen Spezies. Diese wurden zum Teil wegen ihrer Eigenschaft CaMs zu binden benannt, HvCBT1 (Hordeum vulgare calmodulin binding transporter 1) und NtCBP4 (Nicotiana tabacum calmodulin binding protein 4) (Schuurink et al., 1998; Arazi et al., 1999). Zur selben Zeit wurden auch die ersten CNGCs (CNGC1CNGC6) aus Arabidopsis beschrieben, welche auch CaMs binden und K+-aufnahmedefiziente Hefen teilweise komplementieren konnten (Köhler et al., 1999). Parallel zu der Arbeit von Köhler und Kollegen wurde gezeigt, dass diese Komplementation durch Verwendung zyklischer Nukleotide verbessert wurde (Leng et al., 1999). Für CNGC1-CNGC4, CNGC11 und CNGC12, sowie NtCBP4 wurde mit Hilfe dieses Hefekomplementationssystems gezeigt, dass die Kanäle K+ leiten können (Köhler et al., 1999; Leng et al., 1999; Mercier et al., 2004; Ali et al., 2006; Gobert et al., 2006; Yoshioka et al., 2006). Bei der Expression in den heterologen Systemen Oocyten des Krallenfroschs Xenopus laevis und HEK (human embryonic kidney)-Zellen wurde für CNGC2 eine Leitfähigkeit für K+ und Ca2+ festgestellt (Leng et al., 1999). Eine spätere Untersuchung fügte weitere monovalente Kationen (Cs+, Li+, Rb+) hinzu (Leng et al., 2002). Hier wurden auch cAMP-abhängige K+-Ströme durch die Expression von CNGC1 und NtCBP4 in Oocyten erzeugt. Außerdem wurde bei CNGC2 ein sehr schwacher Na+-Strom in Oocyten, aber nicht in HEK-Zellen gemessen (Leng et al., 2002). Eine 9 bessere Na+-Leitfähigkeit wurde für CNGC1, CNGC3 und CNGC4 in verschiedenen Expressionssystemen gezeigt (Balague, 2003; Hua, 2003 b; Gobert et al., 2006). Des Weiteren wurde indirekt nachgewiesen, dass die Pflanzen über NtCBP4 und CNGC1 auch Pb2+ aufnehmen können (Arazi et al., 1999; Sunkar et al., 2000). Ca2+ gesellt sich als weiteres divalentes Kation hinzu, welches durch die Poren von CNGC1 und CNGC2 geleitet wird (Leng et al., 1999; Ali et al., 2006). 2004 wurden in Schließ- und Mesophyllzellen Ca2+-Kanäle gemessen, die durch cAMP aktiviert werden (Lemtiri-Chlieh und Berkowitz). Fast zehn Jahre später wurden CNGC5 und CNGC6 mit einer cGMPaktivierbaren nicht-selektiven Ca2+-permeablen Kationenaktivität in der Plasmamembran von Schließzellen in Verbindung gebracht (Wang et al., 2013). Unter Verwendung höherer Konzentrationen von cAMP (1 mM; im Vergleich zu dem eben erwähnten Versuch mit cGMP – 500 µM) wurden CNGC2-bedingte Ca2+-Ströme in Schließzellen gemessen (Ali et al., 2007). Außerdem wurden für CNGC6 Ca2+-Ströme in der Plasmamembran von Wurzelprotoplasten gemessen (Gao et al., 2012). Erst kürzlich wurden auch die pollenspezifischen CNGCs, CNGC7, CNGC8, CNGC16 und CNGC18, als Ca2+-Kanäle bestätigt (Gao et al., 2014; Gao et al., 2016). Insgesamt wurde gezeigt, dass CNGCs allgemein nicht-selektiv für mono und divalente Kationen sind und sie werden aufgrund der Leitfähigkeit für Ca2+ mit Ca2+-Signalwegen in Verbindung gebracht (Very und Sentenac, 2002; Kaplan et al., 2007; Kudla et al., 2010; Hedrich, 2012; Virdi et al., 2015). 1.5.1 CNGCs erfüllen diverse physiologische Funktionen CNG-Kanäle aus Arabidopsis zeigen ein differentielles Expressionsmuster und sind an verschiedenen physiologischen Funktionen beteiligt, z.B. an Reaktionen auf biotische und abiotische Faktoren, Ionenhomöostase, Entwicklung und Fortpflanzung (Kaplan et al., 2007; Chin et al., 2009; Dietrich et al., 2010). Im folgenden Abschnitt werden nur ausgewählte Beispiele vorgestellt. CNGC7, CNGC8, CNGC16 und CNGC18 sind hauptsächlich in Pollen exprimiert (Bock et al., 2006). Sie sind für die Pollenentwicklung und -stresstoleranz und somit für die Fortpflanzung wichtig (Frietsch et al., 2007; Tunc-Ozdemir et al., 2013 a; Tunc-Ozdemir et al., 2013 b; Zhou et al., 2014). Kürzlich wurde gezeigt, dass diese alle einschließlich CNGC9 und CNGC10 Ca2+-spezifische Kanäle sind und CNGC18 essentiell dafür ist, dass Pollenschläuche die Eizellen erreichen (Gao et al., 2014; Gao et al., 2016). Einige Arbeiten belegen die Beteiligung an biotischen Stressantworten. Die cpr22 (constitutive expresser of PR genes22)-Mutante ist eine Chimäre aus CNGC11 und CNGC12, die durch eine Rekombination beider Kanalgene in der Region, die für Transmembrandomäne 3 kodiert, entstanden ist. Diese Mutation ruft Läsionen wie bei einer hypersensitiven Antwort (HR – hypersensitive response) nach Pathogenbefall hervor und zeichnet sie durch gehemmtes Wachstum, sowie gekräuselte Blätter aus (Yoshioka et al., 2001; Yoshioka et al., 2006). Der Verlust von CNGC2 und CNGC4, die zusammen die Untergruppe IV B im phylogenetischen Stammbaum bilden, führt zu den Mutanten dnd1 und dnd2 (defense, no death), die auch PR (pathogen related)-Gene konstitutiv 10 1. Einleitung exprimieren, aber keine HR zeigen. Zudem sind sie zwergwüchsig und besitzen einen erhöhten Salicylsäuregehalt (SA), wobei der Verlust einer HR und Zwergwuchs teilweise unabhängig von der SA-Konzentration sind (Yu et al., 1998; Clough et al., 2000; Balague, 2003). Die Transkriptmenge von CNGC20 wird bei einer Behandlung mit bestimmten PAMPs (pathogen-associated molecular patterns) und zusätzlich zu der von CNGC19 bei Salzstress erhöht, jedoch bei Nematodenbefall reduziert (Hammes et al., 2005; Winter et al., 2007; Kugler et al., 2009). Zudem wird die Expression von CNGC19 bei Bormangel erhöht und dessen Beteiligung sowie der von weiteren CNGCs an der Regulation der Ca2+-Homöostase vorgeschlagen (Quiles-Pando et al., 2013; Gonzalez-Fontes et al., 2014). 1.5.2 Struktureller Aufbau von CNGCs Die Ende der 90er Jahre entdeckten pflanzlichen CNG-Kanäle wurden mit pflanzlichen K+Einwärtsgleichrichtern und tierischen CNG-Kanälen verglichen (Köhler et al., 1999; Leng et al., 1999): Sie besitzen sechs Transmembrandomänen (TMDs, S1-S6, Abb. 7) und eine Porenschleife zwischen S5 und S6. Einerseits ist diese Spanne länger als bei tierischen CNG- und bei K+-Kanälen, andererseits entspricht die Porensequenz nicht der typischen GYGD-Sequenz von K+-Kanälen. Sie ähnelt eher der von unspezifischen, tierischen CNG-Kanälen. Das S4-Motiv besitzt weniger positiv geladene Aminosäuren zur Wahrnehmung von Spannungsänderungen als spannungsabhängige Kanäle. Abbildung 7: Struktureller Aufbau von CNG-Kanälen. Große Zylinder – TMDs, blaue Pfeile – β-Faltblätter, kleine Zylinder am C-Terminus – α-Helices, weitere Erläuterungen siehe Text. Die N- und C-Termini sind weniger hydrophob. Die Kanäle weisen am C-Terminus regulatorische Domänen wie eine Bindestelle für zyklische Nukleotide (CNBD) und Calmoduline (CaMBD) auf (Abb. 7). Die CNBD besteht aus vier α-Helices (αA, αP, αB, αC) und acht β-Faltblättern (β1-β8), 11 welche sich zwischen αA und αB befinden und zwischen β6 und β7 wiederum von αP unterbrochen werden (Kaplan et al., 2007). Tierische CNGCs hingegen besitzen die CaMBD an N- und C-Terminus (Pifferi et al., 2006; Ungerer et al., 2011). Die Bildung von Homo- oder Heterotetrameren wird angenommen. Die vier Porenschleifen bilden zusammen eine Kanalpore zwischen den vier Untereinheiten (Kaplan et al., 2007; Dietrich et al., 2010). 1.5.3 Calmodulin-Bindedomänen der CNGCs Bereits bei dem ersten beschriebenen pflanzlichen CNG-Kanal (HvCBT1) wurde eine Ca2+-abhängige Interaktion zwischen dem C-Terminus des Kanals und CaM gezeigt. Die Position der CaMBD wurde weit hinter der CNBD vorhergesagt (Schuurink et al., 1998). Die C-Termini der Kanäle CNGC1 und CNGC2 aus Arabidopsis zeigten eine Interaktion mit CaM2 und CaM4 in Hefen (Köhler et al., 1999). Später wurde ein 1-14 Motiv für die Ca2+-abhängige Interaktion des C-Terminus von CNGC1 mit CaM2 und CaM4 ausfindig gemacht. Diese Sequenz entspricht in etwa der αC-Helix der CNBD und zeigt somit eine Überlappung der beiden regulatorischen Domänen. Die CaM-ähnlichen Proteine CML8 und CML9 interagierten nicht mit den C-Termini (Köhler und Neuhaus, 2000). Der Tabakkanal NtCBP4 wurde über die Bindung mit radiomarkiertem CaM gefunden (Arazi et al., 1999). Die CaMBD wurde auch in der αC-Helix bestimmt, wobei eine C-terminale Erweiterung um das Tryptophan-reiche Motiv WRTW für eine starke CaM-Bindung nötig war (Arazi et al., 2000 a). Das in 17 von 20 CNGCs konservierte Arginin in diesem Motiv trägt zur Funktionalität von CNGCs bei (Chin et al., 2010). Die αC-Helix als CaMBD wurde in ein kompetitives Regulationsmodell für pflanzliche CNGCs aufgenommen (Arazi et al., 2000 b; Kaplan et al., 2007). In der ELM (Eukaryotic Linear Motif Resource)-Datenbank werden auch Ca2+-unabhängige CaMBDs, IQ-Motive, für CNGCs vorhergesagt (Dinkel et al., 2016). IQ-Motive wurden 1992 in Myosinen charakterisiert und zu einer einfachen Konsensussequenz [I,L,V]QxxxRxxxx[R,K], wobei x für eine beliebige Aminosäure steht, zusammengefasst (Cheney und Mooseker, 1992; Rhoads und Friedberg, 1997; Bähler und Rhoads, 2002). Abel und Kollegen verwiesen bereits auf die in CNGCs vorhergesagten, aber bislang noch nicht untersuchten IQ-Domänen (2005). In der dieser Arbeit vorangehenden Masterarbeit wurde die Interaktion zwischen CNGC20 und CaMs untersucht. Dort konnte gezeigt werden, dass alle CaM-Isoformen mit dem C-Terminus von CNGC20 interagieren und die CaM-ähnlichen Proteine CML8 und CML9 nicht. Bei einem ersten Mapping-Ansatz wurde festgestellt, dass nicht die αC-Helix für diese CaM-Bindung verantwortlich ist, sondern die CaMBD in den letzten 34 Aminosäuren des C-Terminus und somit hinter der CNBD liegt (Fischer, 2010). Dort befindet sich auch ein IQ-Motiv. 12 1. Einleitung 1.5.4 Regulation von CNGCs Bei der Expression von CNG-Kanälen in heterologen Systemen zur funktionellen Untersuchung wurde immer wieder davon berichtet, dass Probleme mit der Expression auftraten und entweder keine oder nur in einigen Zellen Ströme gemessen werden konnten (Leng et al., 2002; Balague, 2003; Ali et al., 2006). Zum einen wurde hier die Toxizität durch die Expression der CNGGs diskutiert, zum anderen können aber auch wichtige Regulatoren in den heterologen Systemen fehlen. Ionenkanäle werden durch verschiedene Modifikationen beeinflusst. CNGCs sind mit tierischen HCN(Hyperpolarization-Activated Cyclic Nucleotide-Gated) Kanälen verwandt (Chin et al., 2009). Hier sind viele Phosphorylierungsstellen bekannt, die verschiedene Auswirkungen auf die Kanäle haben (Zheng und Trudeau, 2015). Auch bei pflanzlichen spannungsabhängigen Ca2+-Kanälen wurde ein Zusammenhang zwischen Phosphorylierung und Aktivität des Kanals gezeigt (Stoelzle et al., 2003). Am Beispiel des ABA-bedingten Stomaschlusses wurde gezeigt, dass CDPKs den S-Typ Anionenkanal durch Phosphorylierung aktivieren (Mori et al., 2006). Vor fünf Jahren wurden Phosphorylierungen von CNGCs durch CDPKs nachgewiesen (Curran et al., 2011). Daraufhin zeigten Zhou und Kollegen eine Aktivierung des pollenspezifischen CNGC18 durch CPK32 in Oocyten (2014). Weitere Untersuchungen bezüglich der Regulation pflanzlicher CNGCs durch Phosphorylierung sind bisher noch nicht veröffentlicht. CNG-Kanäle können auch durch Bindung anderer Proteine wie CaMs oder Moleküle wie zyklische Nukleotide beeinflusst werden, für welche Bindestellen und Bindung nachgewiesen wurden (Kaplan et al., 2007). Während bei Hefen, die in der Aufnahme von K+ eingeschränkt sind, solche besser bei geringen K+-Konzentrationen (10 mM KCl) wuchsen, die CNGC2 exprimierten, als solche, die keinen zusätzlichen Kanal besaßen („Leervektor“ transformiert, wuchsen nur bei 100 mM KCl), konnten erstere bei noch weit niedrigeren K+-Konzentrationen (0,1 mM KCl) wachsen, wenn membrangängiges (dibutyryl-) cAMP hinzugegeben wurde (Köhler et al., 1999; Leng et al., 1999). Das bedeutet, dass zyklische Nukleotide die Aktivität der Kanäle erhöhen können. In den oben genannten elektrophysiologischen Messungen der CNGCs oder Komplementationsanalysen wurde gezeigt, dass zyklische Nukleotide (CNs, cNMPs) die Funktion des Kanals verstärken. Die Zugabe von CaM verhinderte die Aktivierung von CNGC2 durch cAMP Ca2+-abhängig (Hua et al., 2003 a). Mit dieser Beobachtung und der Überlappung von CNBD und CaMBD wurde eine kompetitive Regulation der CNGCs durch CNs und CaMs angenommen. Nach dem Modell von Arazi und Kollegen (2000 b) und detaillierter von Kaplan und Kollegen (2007) aktivieren zyklische Nukleotide durch Bindung an die CNBD die CNGCs und Kationen können in die Zelle strömen. Bei steigender Ca2+-Konzentration binden Calmoduline Ca2+, gehen eine Konformationsänderung ein und können somit an die CaMBDs der CNGCs binden. Dabei werden CNs verdrängt und die Kanäle schließen wieder (Abb. 8). 13 Abbildung 8: Modell zur kompetitiven Regulation von CNGCs. TMDs einer Untereinheit sind jeweils zusammen in einem großen Zylinder dargestellt. Vier Zylinder (I, II und III, IV dahinter – Beschriftung verdeckt) – ein Kanal-Tetramer. Zur Vereinfachung ist nur ein C-Terminus einer Kanaluntereinheit dargestellt. A: Zyklische Nukleotide (cNMP) binden an die CNBDs der C-Termini. Der Kanal öffnet und kann Kationen leiten. CaM liegt in der apo-Form vor. B: Bei höherer Ca2+-Konzentration binden CaMs Ca2+ und hiernach an die CaMBDs der C-Termini und verdrängen cNMPs. Der Kanal schließt. Modell adaptiert nach Kaplan et al. (2007). Die neuesten Erkenntnisse, dass CaMs bei CNGC20 in den letzten 34 Aminosäuren des Kanals, statt an der αC-Helix, und somit außerhalb der CNBD binden, ergeben die Frage, ob das bisher bekannte Modell auf alle CNGCs zutrifft oder ob CNs und CaMs unabhängig voneinander die Kanäle regulieren können (Fischer, 2010). 14 1. Einleitung 1.6 Zielsetzung dieser Arbeit Die Funktion und Regulation pflanzlicher CNG-Kanäle sind im Gegensatz zu ihren tierischen Äquivalenten noch sehr oberflächlich untersucht. Dies liegt vor allem daran, dass Schwierigkeiten darin bestehen, die Kanäle in heterologen Systemen funktionell zu exprimieren und dort vermutlich Regulatoren fehlen. Daher war das Ziel dieser Arbeit die Interaktion mit zwei Gruppen von Regulationsproteinen näher zu untersuchen. Hierfür wurden mögliche Aktivatoren (CDPKs), die die funktionelle Expression ermöglichen könnten und Inhibitoren (CaMs), deren Interaktion mit CNGCs noch unzureichend verstanden wird, ausgewählt. Vor Beginn dieser Arbeit gab es Hinweise, dass hyperpolarisationsaktivierte Kanäle Phosphorylierungsvorgänge zur Funktionalität brauchen und dass Peptide von CNGCs durch CDPKs phosphoryliert werden. Daher wurde angestrebt, die Interaktion zwischen CNGCs und Kinasen sowie Phosphatasen in verschiedenen Expressionssystemen zu untersuchen. CNG-Kanäle können mit CaMs interagieren und werden durch sie reguliert. Unterschiedliche CaMBDs in verschiedenen Kanälen deuten auf eine komplexe Regulation durch CaMs und Ca2+ hin. Die CaM-Bindung an CNGC20 erforderte eine nähere Untersuchung sowie die Bestimmung der genauen CaMBD. Da bisher nur ein paar CNGCs auf eine CaM-Bindung hin getestet wurden, sollten die Interaktionstests auf alle 20 Kanaluntereinheiten ausgeweitet werden. Des Weiteren war ein Ziel der Arbeit, die Ca2+-Abhängigkeit der Interaktion zu untersuchen. Bisher wurden Ca2+-abhängige Bindungen gezeigt, IQ-Domänen, von denen vermutlich eine in CNGC20 vorkommt, sind aber für eine Ca2+-unabhängige Bindung bekannt. Für die Untersuchungen wurden das Hefe-Zwei-HybridSystem (YTH, Yeast Two-Hybrid) und die Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BiFC) eingesetzt und weiter optimiert. Für zukünftige in vitro-Interaktionstests mit Regulationsproteinen war die Aufgabe, den C-Terminus von CNGC20 rekombinant herzustellen. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Analyse von Funktionsdomänen der CNGCs, indem der kleinwüchsige Phänotyp von dnd1 (cngc2-1) und dessen Empfindlichkeit gegenüber höheren Ca2+Konzentrationen genutzt wurde, um Komplementationsexperimente durchzuführen. Da die Expression von CNGC2 in dnd1 zur Wiederherstellung des Wildtypphänotyps führt, ergab sich daher die Möglichkeit zu untersuchen, inwiefern Mutationen in der CaMBD die Funktionalität des Kanals beeinflussen. 15 2. Ergebnisse 2. ERGEBNISSE Die funktionelle Expression von pflanzlichen CNGCs in heterologen Systemen war zu Beginn dieser Arbeit nicht reproduzierbar, da vermutlich Aktivatoren/Regulatoren fehlten. Um solche Proteine zu identifizieren, wurden direkte Interaktionsstudien mit möglichen Regulatoren der CNGCs durchgeführt. Zum einen sollte die Bindedomäne für Calmoduline (CaMBD) im C-Terminus des CNGC20 genauer lokalisiert und allgemein die CaMBD innerhalb der Kanalfamilie weiter untersucht werden. Des Weiteren sollte ein möglicher Aktivator der CNGCs durch direkte Interaktionsstudien mit Kinasen ermittelt werden. 2.1 Calmoduline als Liganden von CNGCs In vorangehenden Untersuchungen wurde mit Hilfe des Yeast two-Hybrid (YTH)-Systems gezeigt, dass der C-Terminus von CNGC20 mit allen Calmodulin-Isoformen (CaMs) aus Arabidopsis, aber nicht mit den Calmodulin-ähnlichen Proteinen 8 und 9 (CML8, CML9) interagierte. Die Möglichkeit der Interaktion konnte aufgrund der Lokalisierung der Proteine – CNGC20 in der Plasmamembran (PM) und CaM2 in Cytosol und Zellkern (ZK) – angenommen und mit Hilfe der Bimolekularen Fluoreszenzkomplementation (BiFC) bestätigt werden. Eine Kartierung der CaMBD innerhalb des CTerminus von CNGC20 zeigte, dass diese im Gegensatz zu bisherigen Ergebnissen (Köhler et al., 1999; Köhler und Neuhaus, 2000; Kaplan et al., 2007) in den letzten 34 Aminosäuren des C-Terminus auf die αC-Helix folgend zu finden ist (Fischer, 2010). 2.1.1 CNGC20 und CaMs sowie CMLs befinden sich in räumlicher Nähe zueinander Neben der Frage nach der genauen CaMBD war auch unklar, warum die CMLs nicht mit CNGC20 interagierten. Da CNGC20 in der PM lokalisiert ist (Fischer, 2010), wurde untersucht, ob sich die CaM-Isoformen, sowie CML8 und CML9 im angrenzenden Cytosol befinden. Für CaM2 konnte dies bereits gezeigt werden (Fischer, 2010). CaMs und CMLs wurden als GFP-Fusionen transient in Tabak exprimiert. Für alle CaMs, sowie CML8 und CML9 wurde eine Fluoreszenz in Cytosol und Zellkern detektiert (Abb. 9). Somit befanden sich die CMLs und die CaMs in räumlicher Nähe zu CNGC20. Die CMLs und der untersuchte Kanal sind also räumlich gesehen nicht daran gehindert, miteinander zu interagieren. Unterschiedliche Bindeeigenschaften von CaMs und CMLs an CaMBDs werden an dieser Stelle als Hauptgrund für eine fehlende Interaktion vermutet. 16 2. Ergebnisse Abbildung 9: Subzelluläre Lokalisierung von CaMs und CMLs in Tabakepidermiszellen. Konfokalmikroskopische Aufnahmen von transformierten Tabakepidermiszellen. Alle CaM-Isoformen, sowie CML8 und CML9 befinden sich in ZK und Cytosol. N-terminale GFP-Fusionen. Größenstandard = 50µm. 2.1.2 Identifizierung einer IQ-Domäne als CaMBD in CNGC20 Zur genaueren Bestimmung der CaMBD in CNCG20 wurden zwei weitere Peptide im Hefesystem getestet. In allen folgenden YTH-Versuchen wurden, wenn nicht anders angegeben, Kanal-Varianten als C-terminale Fusionen an die GAL4-Bindedomäne und CaMs sowie CMLs als C-terminale Fusionen an die GAL4-Aktivierungsdomäne eingesetzt. Im Calmodulin-bindenden Kanalprotein 4 aus Tabak (NtCBP4) wurde eine Verbesserung der Calmodulin-Bindung durch eine Erweiterung der αCHelix um die Aminosäuren WRTW ermöglicht (Arazi et al., 2000 a). Dies berücksichtigend wurde das αC-Peptid aus CNGC20 alleine mit der homologen Erweiterung WRLR (Abb. 12) verwendet. Dieses Peptid interagierte unter den experimentellen Bedingungen dieser Arbeit in Hefen allerdings nicht mit CaMs (Abb. 10 B). Innerhalb der letzten 34 Aminosäuren von CNGC20 wurde ein IQ-Motiv vorhergesagt (Cheney und Mooseker, 1992; Rhoads und Friedberg, 1997; Bähler und Rhoads, 2002; Rost et al., 2004; Abel et al., 2005). Ein Peptid von nur 16 Aminosäuren (CNGC20737-752), welches das IQ-Motiv enthält, reichte aus, um mit allen CaMs zu interagieren (Abb. 10 C). Somit zeigte es ein ähnliches Ergebnis wie unter Verwendung des kompletten C-Terminus (Abb. 10 A). Des Weiteren führte eine Deletion der IQ-Domäne aus dem C-Terminus des Kanals zu einem Verlust der Interaktion mit Calmodulinen (Abb. 10 D) und bestätigte somit die Notwendigkeit der IQ-Domäne für die Bindung von CaMs. Wurden drei aufeinanderfolgende Arginine innerhalb der IQ-Domäne zu Alaninen mutiert, wurde die Interaktion zwischen dem C-Terminus von CNGC20 und CaMs geschwächt. Nach 1,5 Tagen war hier meist noch kein Wachstum der Hefen auf Nährmedien ohne 17 Tryptophan, Leucin und Histidin zu sehen, jedoch nach drei Tagen (Abb. 10 E). Dies deutet auf eine sehr schwache Interaktion hin. Somit wurde die CaMBD innerhalb des C-Terminus von CNGC20 auf ein 16 Aminosäuren langes Peptid reduziert, das ein IQ-Motiv enthält. Des Weiteren kann aus diesen Ergebnissen geschlossen werden, dass nur die IQ-Domäne als CaMBD dient und keine weitere Bindestelle für CaMs in diesem C-Terminus vorhanden ist. Abbildung 10: CNGC20 interagiert mit CaMs über die IQ-Domäne. YTH-Versuche. Hefewachstum auf Medium ohne Tryptophan und Leucin (-W-L) zur Selektion der kotransformierten Zellen und in Abwesenheit von Tryptophan, Leucin und Histidin (-W-L-H) zur Analyse der Interaktion. Die Hefen jeder Kombination wurden in einer Konzentration von OD600=2, 0,2 und 0,02 nebeneinander aufgetragen. Interaktionstest zwischen A: CNGC20-C-Terminus, B: αC-Peptid, C: IQ-Peptid, D: Deletion (hellgrauer Balken in F) der IQ-Domäne aus dem C-Terminus (Übergang …RLRHRL…) und E: CTerminus mit Mutation in der IQ-Domäne (rot in F) und den CaM-Isoformen sowie CML8. F: Grafische Darstellung der in A-E verwendeten Proteine/Peptide von CNGC20. Ein hellgrauer Balken überdeckt den deletierten Bereich, Mutationen sind rot geschrieben. Genaue Aminosäureangaben können der Tabelle 11 entnommen werden. 18 2. Ergebnisse 2.1.3 CNGC1 enthält ebenfalls eine IQ-Domäne Da sich die CaM-Bindung bei CNGC20 anders verhielt, als für andere CNGCs bisher beschrieben wurde (Kaplan et al., 2007), wurde ein weiterer Kanal aus einer anderen Untergruppe der pflanzlichen CNGCs auf die Interaktion mit CaMs untersucht. CNGC1 befindet sich in der Gruppe I (Abb. 6). Abbildung 11: CNGC1 interagiert mit CaMs über eine IQ-Domäne. YTH-Versuche. Hefewachstum auf Medium ohne Tryptophan und Leucin (-W-L) zur Selektion der kotransformierten Zellen und in Abwesenheit von Tryptophan, Leucin und Histidin (-W-L-H) zur Analyse der Interaktion. Die Hefen jeder Kombination wurden in einer Konzentration von OD600=2, 0,2 und 0,02 nebeneinander aufgetragen. Interaktionstest zwischen A: CNGC1-C-Terminus, B: αC-Peptid, C: IQ-Peptid, D: Erweiterung des αC-Peptids, E: Deletion der αC -Domäne aus dem C-Terminus (Übergang …ASQSQQ…) und F: Deletion der IQ-Domäne aus dem C-Terminus (Übergang …KTWEES…) und den CaM-Isoformen sowie CML8. G: Grafische Darstellung der in A-F verwendeten Proteine/Peptide von CNGC1. Ein hellgrauer Balken überdeckt jeweils den deletierten Bereich. Genaue Aminosäureangaben können der Tabelle 11 entnommen werden. 19 Der C-Terminus von CNGC1 interagierte wie der von CNGC20 mit allen CaM-Isoformen und nicht mit den verwendeten CMLs in Hefen (Abb. 11 A). Auch hier band ein 17 Aminosäuren langes, zur CNGC20-IQ-Domäne komplementäres Peptid die CaMs (Abb. 11 C). Unter Verwendung des αCPeptids von CNGC1 als Köder wuchsen die Hefen nicht (Abb. 11 B). Durch das Auftreten eines unterschiedlich starken Hefewachstums bei CNGC1-C und CNGC1-IQ mit CaMs wird geschlussfolgert, dass die Bindung der CaMs an das IQ-Peptid schwächer war als an den ganzen CTerminus (Abb. 11 C, A). In silico Analysen sagten eine größere Helix in einem Bereich vorher, der αC-Helix und IQ-Domäne einschließt (Rost et al., 2004). Ein größeres, der IQ-Domäne vorangehendes Peptid, die αC-Helix einschließend (grHelix), wurde auf Bindung mit CaMs getestet. Auch dieses Peptid, das den Bereich der αC-Helix N-terminal erweitert und C-terminal bis zum Beginn des IQ-Motivs reicht, interagierte nicht mit CaMs (Abb. 11 D). Deletionsversuche zeigten, dass der C-Terminus von CNGC1 auch ohne αC-Helix CaMs band (Abb. 11 E). Allerdings wurde die Interaktion bei einem Fehlen der IQ-Domäne unterbunden (Abb. 11 F). Dies weist darauf hin, dass auch in CNGC1 die CaM-Bindung durch eine IQ-Domäne und nicht durch die αC-Helix vermittelt wird. 2.1.4 Besitzen alle CNGCs eine funktionelle IQ-Domäne? Da sich CNGC1 und CNGC20 bei den Interaktionstests ähnlich verhielten und jeweils die IQDomäne, aber nicht die αC-Helix CaMs band, wurden zunächst alle Kanäle in einem Alignment in diesem Bereich des C-Terminus verglichen (Abb. 12). Diesem Alignment wurden die Sequenzen weiterer pflanzlicher CNGCs aus Tabak, NtCBP4 (calmodulin binding protein), und Gerste, HvCBT1 (calmodulin binding transporter), hinzugefügt (Schuurink et al., 1998; Arazi et al., 1999). Die αBund αC-Helix der Bindestelle für zyklische Nukleotide (CNBD), wurden in homologen Bereichen zu hyperpolarisationsaktivierten Kanälen (HCNs) und weiteren CNBD enthaltenden Kanälen, deren Struktur der Bindedomäne für zyklische Nukleotide durch Kristallisierung aufgeklärt wurde (Zagotta et al., 2003; Xu et al., 2010; Lolicato et al., 2011; Brelidze et al., 2012; Brelidze et al., 2013; Pessoa et al., 2014), eingetragen (Alignment, Anhang). Die Balken über den Sequenzen markieren die bisher angenommene CaMBD (Köhler et al., 1999; Reddy et al., 2002) sowie deren Erweiterung (Punkte, (Arazi et al., 2000 a) und das IQ-Motiv, definiert als IQxxxRxxxxR (Bähler und Rhoads, 2002; Abel et al., 2005). Alle Kanäle ähneln sich hier stark und enthalten in dem Bereich konservierte Aminosäuren (*) sowie Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (:). Demnach könnten alle CNGCs eine funktionelle IQ-Domäne besitzen. 20 2. Ergebnisse Abbildung 12: Alignment der CNGCs im Bereich putativer CaMBDs. 20 Arabidopsis CNGCs, HvCBT1 und NtCBP4 wurden bezüglich ihrer Proteinsequenz im Bereich der αC-Helix und C-terminaler IQ-Domäne verglichen. Die letzten beiden Helices (αB, αC) der CNBD wurden nach einem Vergleich mit weiteren CNBDs (Anhang), deren Kristallstruktur bekannt ist, eingetragen. Die CaMBD wurde nach Köhler und Kollegen (2000) über dem Alignment mit einem grauen Balken, deren Erweiterung nach Arazi und Kollegen (2000 a) mit grauen Punkten markiert. Ein weiterer grauer Balken indiziert die Position des IQMotivs (Bähler und Rhoads, 2002). Die für CNGC20 verwendeten Peptide αC (gestrichelt) und IQ (durchgehend) sind in der entsprechenden Sequenz umrandet. Modifiziert nach Fischer et al. (2013). Nun wurden alle Arabidopsis CNGCs auf die Fähigkeit, CaMs zu binden, mit Hilfe der YTH-Methode untersucht. Zunächst wurde festgestellt, dass fast alle C-Termini mit allen CaMs gleich gut interagierten (Abb. 13 B). Ausnahmen waren die C-Termini von CNGC11 und CNGC17, mit denen keine Interaktion stattfand. Für CNGC17 wurde daraufhin ein kürzerer Bereich des C-Terminus (sC) verwendet, in dessen Gegenwart ebenfalls kein Hefewachstum nach 2 Tagen auf Selektionsplatten erfolgte (Abb. 14 C). Beide CNGC17-C Varianten resultierten in einem Hefewachstum nach vier Tagen, was auf eine schwache Interaktion hinweist (Abb. 14 B, C). Demgegenüber wurde für den CTerminus von CNGC11 auch nach vier Tagen Inkubation keine Interaktion festgestellt (Abb. 14 A). 21 Abbildung 13: CaMBDs der CNGCs sind IQ-Domänen im C-Terminus. YTH-Versuche. Hefewachstum auf Medium ohne Tryptophan, Leucin und Histidin (-W-L-H) zur Analyse der Interaktion. Die Hefen jeder Kombination wurden in einer Konzentration von OD600=2 aufgetragen. Getestet wurde die Interaktion zwischen A: 20 CNGC-N-Termini, B: 20 C-Termini, C: 20 αC-Domänen, D: 20 IQDomänen mit allen CaM-Isoformen und CML8. Genaue Aminosäureangaben können der Tabelle 11 entnommen werden. Negativkontrollen wurden durchgeführt sowie die Selektion der ko-transformierten Hefen auf (-W-L-Medium) und verschiedene Konzentrationen der Hefen verwendet. Dies kann dem Anhang entnommen werden. Die Ergebnisse wurden teilweise aus Bachelorarbeiten entnommen und entsprechend oberhalb der Streifen markiert (Olivia Hügelschäfer (2012) °; Julia Wartha (2012) #; Markus Birkenbach (2013) *; Johannes Keseler (2013) +). Die Doppelverwendung von Ergebnissen zur Vervollständigung der Grafik wird im folgenden Text erläutert. Da tierische CNGCs ihre CaMBDs unter anderem auch am N-Terminus tragen (Trudeau und Zagotta, 2003), wurden zusätzlich alle N-Termini der 20 Arabidopsis CNGCs auf eine CaM-Bindung untersucht. Diese Kombinationen resultierten in keinem Hefewachstum auf dem Mangelmedium ohne 22 2. Ergebnisse Tryptophan, Leucin und Histidin (Abb. 13 A). Dies zeigt, dass die Interaktionen mit CaMs nicht über die N-Termini der CNGCs stattfinden. Abbildung 14: Die C-Termini von CNGC11 und CNGC17 interagieren nicht oder sehr schwach mit CaMs. YTH-Versuche. Hefewachstum auf Medium ohne Tryptophan und Leucin (-W-L) zur Selektion der kotransformierten Zellen und in Abwesenheit von Tryptophan, Leucin und Histidin (-W-L-H) zur Analyse der Interaktion. Die mittlere Spalte zeigt das Resultat auf -W-L-H-Selektionsmedium nach zwei Tagen Inkubation (2d), die rechte Spalte nach vier Tagen (4d). Die Hefen jeder Kombination wurden in einer Konzentration von OD600=2, 0,2 und 0,02 nebeneinander aufgetragen. Interaktionstest zwischen A: C-Terminus von CNGC11, B: C-Terminus von CNGC17, C: kürzerem C-Terminus (sC) von CNGC17 mit allen CaM-Isoformen und CML8. Genaue Aminosäureangaben können der Tabelle 11 entnommen werden. Um einen Überblick zu erhalten, ob alle IQ-Domänen CaMs binden können und ob manche Kanäle CaMs durch die αC-Helix vermittelt binden, wurden von allen CNGCs aus Arabidopsis die zu CNGC20 homologen Bereiche für αC und IQ-Domäne in YTH-Vektoren kloniert und direkte Interaktionstests durchgeführt. CNGC7 und CNGC8 kodieren im Bereich der αC-Helix für dasselbe Peptid. Daher wurde nur ein für dieses Peptid kodierender Genabschnitt verwendet, das Ergebnis aber zur Vervollständigung in Abbildung 13 doppelt dargestellt. Dies gilt auch für CNGC6/CNGC9, sowie CNGC10/CNGC13. Die IQ-Domänen von CNGC3/CNGC11 kodieren für dasselbe Peptid. Auch hier 23 wurde nur einer der beiden für das Peptid kodierenden Genabschnitte eingesetzt. Während keine der αC-Helices mit CaMs interagierte (Abb. 13 C), zeigten ungefähr die Hälfte der IQ-Domänen eine Interaktion mit CaMs (Abb. 13 D). In der Stärke des Hefewachstums unter Verwendung der IQDomänen wurde teilweise ein Unterschied (schwächeres Wachstum) zur Verwendung der korrespondierenden C-Termini beobachtet (Abb. 13 D, B). Des Weiteren ist bei den einzelnen Versuchen (verschiedene Streifen in Abb. 13 D) zu sehen, dass die Hefen bei Kombination mit den verschiedenen CaM-Isoformen unterschiedlich stark wuchsen. Am besten wurde CaM2 gebunden, die schwächste Interaktion fand meist mit CaM4 statt. Folglich ermöglichen manche IQ-Domänen eine selektive Bindung der CaMs. Für CNGC20 und 15 war die Interaktion mit der IQ-Domäne ähnlich stark wie mit dem C-Terminus (Abb. 13 D, B). Die IQ-Peptide von CNGC11 und CNGC17 interagierten stärker mit CaMs als die entsprechenden C-Termini (Abb. 13 D, 14). Das deutet darauf hin, dass diese beiden Kanaluntereinheiten prinzipiell mit CaMs interagieren können, die CaMBDs im isolierten C-Terminus in der dreidimensionalen Struktur verdeckt sein könnten. Somit fand die Interaktion mit CaMs bei allen CNGCs am C-Terminus statt. Dort banden bei einem Großteil der Kanäle IQ-Domänen die CaMs. Allerdings besaßen manche der IQ-Peptide schwächere CaM-Bindeeigenschaften im Vergleich zu den korrespondierenden C-Termini. Dies weist darauf hin, dass noch weitere Bereiche der C-Termini zur Interaktion mit CaMs beitragen. Weiter wurde nun bei CNGCs, deren αC- und IQ-Peptide nicht mit CaMs interagierten, untersucht, über welchen Bereich des C-Terminus die CaM-Bindung stattfindet. 2.1.5 Aminosäuren vor dem IQ-Motiv sind von Bedeutung für die CaM-Interaktion Da für alle CNGCs eine IQ-Domäne vorhergesagt wird (UniProt Consortium, 2015), stellte sich die Frage, warum manche der Peptide CaMs binden konnten und andere nicht. Dies ließ sich nicht aufgrund der Hydrophobizität der Peptide vorhersagen (Anhang). Die Sequenzen der interagierenden und nicht interagierenden IQ-Peptide wurden miteinander verglichen (Abb. 15 A, C). Die im IQMotiv definierten Aminosäuren Isoleucin (oder Leucin oder Valin), Glutamin und zwei Arginine (oder Lysin), [I,L,V]QxxxRxxxx[R,K] (Bähler und Rhoads, 2002), stimmen großteils in allen Peptiden überein. Die nicht interagierenden Peptide unterscheiden sich in einzelnen Aminosäuren an verschiedenen Stellen im Peptid zu den interagierenden. Auffällig jedoch sind häufiger auftretende Unterschiede in den dem IQ-Motiv vorangehenden Aminosäuren. Während die interagierenden Peptide immer mit zwei Alaninen beginnen, sind an der Stelle in den nicht interagierenden Sequenzen weniger hydrophobe Aminosäuren wie Glycin, Serin oder Threonin zu finden. Nun stellte sich die Frage, ob diese vorangehenden Aminosäuren einen Einfluss auf die Interaktion mit CaMs haben. Deshalb erfolgte ein Austausch der ersten beiden Aminosäuren Glycin und Threonin aus dem CNGC16 IQ-Peptid gegen zwei Alanine (Abb. 15 D). Tatsächlich wurde durch diese Substitution eine Bindung mit CaMs hergestellt (Abb. 15 D, rechte Seite). Der Austausch von GAS durch AAC führte auch in CNGC13 zu einer Interaktion. Umgekehrt wurde die Interaktion der IQ-Domänen von 24 2. Ergebnisse CNGC2, CNGC9 und CNGC20 mit CaMs durch einen Austausch der Alanine durch Glycin und Threonin unterbunden. Die Interaktion zwischen CNGC9 und CaM4 war hier wie auch in Abbildung 13 gezeigt schwächer als mit CaM2 (Abb. 15 B). Somit wurde gezeigt, dass die Aminosäuren in der IQ-Domäne, die sich vor dem eigentlichen IQMotiv befinden, maßgeblich zu den Bindeeigenschaften der Peptide beitragen. Abbildung 15: Aminosäuren vor dem IQ-Motiv beeinflussen die Interaktion mit CaMs. Alignment der interagierenden (A) und nicht-interagierenden (C) IQ-Peptide mit Sequenzlogo (http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi). Auffällig unterschiedliche Aminosäuren wurden in (C) rot markiert. Aminosäuren die mutiert wurden sind fett geschrieben (A, C). B + D: YTH-Versuche. Hefewachstum auf Medium ohne Tryptophan und Leucin (-W-L) zur Selektion der kotransformierten Zellen und in Abwesenheit von Tryptophan, Leucin und Histidin (-W-L-H) zur Analyse der Interaktion. Die Hefen jeder Kombination wurden in einer Konzentration von OD600=2, 0,2 und 0,02 nebeneinander aufgetragen. Interaktionstest zwischen B: den IQ-Domänen von CNGC2, CNGC9 und CNGC20 (Spalte „WT“) sowie den Mutanten, bei denen die ersten beiden Alanine zu GT mutiert wurden (Spalte „Mutante“) und CaM2 bzw. CaM4, D: den IQ-Domänen von CNGC13 und CNGC16 (Spalte „WT“) sowie den Mutanten, bei denen die ersten ersten in (C) fett markierten Aminosäuren mutiert wurden (Spalte „Mutante“) und CaM2 bzw. CaM4. Genaue Aminosäureangaben können der Tabelle 11 entnommen werden. Die Ergebnisse wurden teilweise aus Bachelorarbeiten entnommen und entsprechend markiert (Markus Birkenbach (2013) *; Johannes Keseler (2013) +). 25 2.1.6 CNGC19 bindet CaMs über einen größeren Bereich um das IQ-Motiv In Abbildung 13 wurde bei neun CNGCs gezeigt, dass der C-Terminus mit CaMs interagieren kann, jedoch nicht über die verwendeten Peptide für αC-Helix oder IQ-Domäne. Ein Beispiel hierfür ist CNGC19. Der C-Terminus band alle CaM-Isoformen und nicht CML8 (Abb. 13, Abb. 16 A). Dessen αC-Helix konnte wie bei allen anderen αC-Peptiden keine Interaktion mit CaMs eingehen (Abb. 13 C, 16 A), das IQ-Peptid war, obwohl es mit zwei Alaninen beginnt, auch nicht in der Lage CaMs zu binden (Abb. 13 D, 15 C, 16). Abbildung 16: CNGC19 besitzt eine funktionelle IQ-Domäne. YTH-Versuche. Hefewachstum auf Medium ohne Tryptophan, Leucin und Histidin (-W-L-H) zur Analyse der Interaktion. Die Hefen jeder Kombination wurden in einer Konzentration von OD600=2, 0,2 und 0,02 nebeneinander aufgetragen. Interaktionstest zwischen A: CNGC19-C-Terminus, αC-Peptid, IQ-Peptid, Erweiterung des IQ-Peptids N- und C-terminal (IQext), nur N-terminal (IQNext) und nur C-Terminal (IQCext) und den CaM-Isoformen sowie CML8. B: Grafische Darstellung der in A verwendeten Proteine/Peptide von CNGC19. Genaue Aminosäureangaben können der Tabelle 11 entnommen werden. Funktionelle IQ-Domänen werden mit einer Länge von ca. 30 Aminosäuren vorhergesagt (UniProt Consortium, 2015). Daher wurde für CNGC19 ein erweitertes IQ-Peptid (IQext, Abb. 16), beginnend mit dem konservierten, ersten Arginin aus dem WRLR-Motiv (Arazi et al., 2000 a), getestet, welches alle CaMs binden konnte. Dies zeigt, dass CNGC19 CaMs in diesem Bereich binden kann, jedoch die zuvor gewählten 16 Aminosäuren (minimales IQ-Peptid) dafür nicht ausreichen, sondern weitere 26 2. Ergebnisse Aminosäuren aus der Umgebung nötig sind. Um dies wieder einzugrenzen, wurde das minimale IQPeptid nur N-terminal (IQNext) oder nur C-terminal (IQCext) erweitert (Abb. 16 B). Beide Peptide konnten CaMs binden. Eine N-terminale Erweiterung von nur 3 weiteren Aminosäuren reichte also aus, um die Interaktion wiederherzustellen (Abb. 16 A). Jedoch war diese Interaktion schwächer als mit einer Erweiterung von 11 Aminosäuren (IQCext) und beide schwächer als unter der Verwendung des ganzen C-Terminus (Abb. 16 A). Dieses Experiment zeigt, dass die das IQ-Motiv umgebenden Aminosäuren generell einen wichtigen Einfluss auf die Bindeeigenschaften der CaMBD haben. Somit können einige CNGCs mit CaMs über eine Kern-Konsensussequenz interagieren, bei der 16 bzw. 17 Aminosäuren ausgehend von der -4Position (relativ zu dem Isoleucin als Position 0) für eine CaM-Bindung ausreichen. Bei anderen CNGCs sind weitere Aminosäuren aus der Umgebung für die Interaktion notwendig. 2.1.7 Die Umgebung der IQ-Domäne beeinflusst deren CaM-Bindeeigenschaften – Beispiel: CNGC2 Bisher wurde gezeigt, dass CNGCs über IQ-Domänen im C-Terminus mit CaMs interagieren und die dem IQ-Motiv vorangehenden oder sie umgebende Aminosäuren einen Einfluss auf diese Bindung haben. Nun wird am Beispiel von CNGC2 die Untersuchung mit Hilfe von Mutationen, Deletionen und der Verwendung verschiedener Peptide an einer Kanaluntereinheit zusammengeführt. Auch hier interagierte in diesen Experimenten der C-Terminus von CNGC2 mit allen CaMs und nicht mit CML8. Das αC-Peptid war nicht in der Lage CaMs zu binden. Eine Erweiterung des αC-Peptids um die beiden in 2.1.4 besprochenen, relevanten Alanine aus dem IQ-Peptid (αCAA) führte zu keiner Interaktion (Abb. 17 A). Die αC-Helix aus CNGC1-4 wird als ein 1-14 Motiv für die Bindung von CaMs postuliert (Crivici und Ikura, 1995; Köhler und Neuhaus, 2000). Das bedeutet, dass die Aminosäuren, die eine basisch amphiphile αC-Helix bilden, von langen hydrophoben oder aromatischen Aminosäuren umgeben sind, die sich an Position 1 und 14 befinden, welche bei der Bindung von CaM involviert sind. Um zu testen, ob die αC-Helix für die Interaktion mit CaMs tatsächlich benötigt wird, wurden die ersten drei Aminosäuren der αC-Helix, Phenylalanin, Arginin und Tyrosin, zu Alaninen mutiert (Ignatz, 2008), sodass das Phenylalanin als äußerer aromatischer Anker fehlt und insgesamt die Hydrophobizität der Helix leicht herabgesetzt wird (HeliQuest; Gautier et al., 2008). Der entsprechend mutierte C-Terminus (CFRY->AAA) interagierte trotzdem sehr gut mit allen CaM-Isoformen (Abb. 17 A; Beer, 2012), was darauf hindeutet, dass diese Region nicht für die CaM-Bindung von CNGC2 verantwortlich ist. Das IQ-Peptid alleine band CaMs (Abb. 13, Abb. 17 A), während das Fehlen der IQ-Domäne wie auch bei CNGC1 und CNGC20 zu einem Verlust der Interaktion des deletierten C-Terminus mit CaMs führte (C∆IQ, Abb. 17 A). 27 Abbilduung 17: Ausführliche Untersuchung der CaMBD in CNGC2. YTH-Versuche. Hefewachstum auf Medium ohne Tryptophan, Leucin und Histidin (-W-L-H) zur Analyse der Interaktion. Die Hefen jeder Kombination wurden in einer Konzentration von OD600=2, 0,2 und 0,02 nebeneinander aufgetragen. Interaktionstest zwischen A: CNGC2 C-Terminus (C), αC-Peptid (αC), erweitertem αC-Peptid (αCAA), C-Terminus mit Mutation in der αC-Domäne (CFRY->AAA), IQ-Peptid (IQ), C-Terminus ohne IQ-Domäne (C∆IQ, Deletion, Übergang …RTWRGE…), B: C-Terminus mit Mutationen in der IQ-Domäne (IQm1, IQm2, IQm3), C: mutiertem IQ-Peptid, C-Terminus mit Mutation am Anfang der IQ-Domäne und den CaM-Isoformen sowie CML8. D: Grafische Darstellung der in A-F verwendeten Proteine/Peptide von CNGC1. Ein hellgrauer Balken überdeckt jeweils den deletierten Bereich. Genaue Aminosäureangaben können der Tabelle 11 entnommen werden. 28 2. Ergebnisse Zusätzlich wurden im C-Terminus von CNGC2 und CNGC20 Mutationen in der basischen Region der IQ-Domäne eingeführt. Jeweils drei Arginine bzw. zwei Arginine und ein Lysin wurden zu drei Alaninen mutiert. Während diese Mutation im C-Terminus von CNGC20 zu einer Schwächung der CaM-Bindung führte (Abb. 10), interagierte der C-Terminus von CNGC2 mit entsprechend gelegener Mutation (RRK->AAA, CIQm3) sehr gut mit CaMs (Abb. 17 B, D). Eine Verschiebung des mutierten Bereichs um zwei Aminosäuren weiter nach vorne (RRR->AAA, CIQm2) oder eine Aminosäure nach hinten (RKR->AAA, CIQm1) führte zu gleichem Ergebnis. Auch diese beiden Varianten des CTerminus interagierten gut mit CaMs (Abb. 17 B, D). Somit ist diese basische Region im Gegensatz zu CNGC20 bei CNGC2 von keiner großen Bedeutung für die CaM-Bindung. Die Ergebnisse der Interaktionsstudien für CNGC20 zeigten, dass die IQ-Domäne dieses Kanals die CaM-Bindeeigenschaften des gesamten C-Terminus reflektiert: Mutationen im oder die Deletion des IQ-Motivs führten zum Verlust bzw. einer Reduktion der CaM-Bindung (Abb. 15). Wurden die Alanine an Position -3 und -4 des IQ-Motivs zu Glycin und Threonin mutiert, banden weder das IQPeptid (Abb. 15 B) noch der C-Terminus von CNGC20 (nicht gezeigt). Die Interaktionen zwischen CNGC2 und CaMs stellten sich dagegen komplexer dar: Während diese Mutation der Alanine an Position -3 und -4 des IQ-Motivs die CaM-Bindung des entsprechenden Peptids wie erwartet verhinderte, hatte dieselbe Mutation keinen Einfluss auf die Bindung des gesamten C-Terminus (Abb. 17C). Da der C-Terminus von CNGC2 ohne IQ-Domäne (C∆IQ) nicht mit CaMs interagierte (Abb. 17 A), lassen diese Ergebnisse den Schluss zu, dass in der Hefe die Interaktion zwischen CaMs und CNGC2 durch die IQ-Domäne vermittelt, aber auch stark von der Umgebung des IQ-Motivs beeinflusst wird. 2.1.8 Komplementationsanalysen von dnd1 sprechen gegen die αC-Helix als CaMBD Die Arabidopsis-Mutante dnd1 (defense, no death 1) enthält eine Punktmutation im CNGC2-Gen (Yu et al., 1998; Clough et al., 2000). Diese führt zu einem Stopp-Codon in Exon 3 an W290 und somit zu einem vorzeitigen Translationsabbruch. dnd1-Pflanzen und T-DNA Insertionslinien für CNGC2 (cngc2-2) entwickeln einen auffällig kleinwüchsigen Phänotyp, welcher durch die Expression von CNGC2 komplementiert wird (Abb. 18; Clough et al., 2000; Chan et al., 2003). Des Weiteren reagieren dnd1-Pflanzen hypersensitiv auf hohe Ca2+-Konzentrationen in ihrem Wachstumsmedium (Chan et al., 2003). Diesen Phänotyp sich zunutze machend, wurden Pflanzenlinien für Komplementationsanalysen hergestellt, um die Bedeutung von Funktionsdomänen in CNGC2 zu charakterisieren (Ignatz, 2008). Davon wurden folgende Linien zur weiteren Selektion und letztendlich für die Wachstumsversuche verwendet: In dnd1/CNGC2 (kurz dnd1/VL) wird CNGC2 unter dem 35S Blumenkohlmosaikvirus-Promotors im dnd1-Hintergrund exprimiert. Diese Linie dient als Positivkontrolle, da bereits bekannt ist, dass die Expression von CNGC2 in dnd1 den Ca2+-Phänotyp komplementiert (Chan et al., 2003). In dnd1/CNGC2FRY (kurz dnd1/FRY) wird CNGC2 mit Mutationen am Anfang der αC-Domäne 29 exprimiert. Hier sind F645, R646 und Y647 zu Alaninen mutiert, was die Hydrophobizität der αCHelix reduziert (Gautier et al., 2008). Bei tierischen Kanälen mit Mutationen in der CaMBD wurde gezeigt, dass diese Mutationen die CaM-Bindung in vitro nicht beeinträchtigen, die Regulation des Kanals jedoch stark verändern (Tang et al., 2002; Fallon et al., 2005). Daher wurde in diesem Versuch untersucht, ob diese Mutation, trotz CaM-Bindung an den mutierten C-Terminus (Abb. 17 A), einen Einfluss auf die Kanalregulation hat. Des Weiteren wurde eine Pflanzenlinie eingesetzt, bei der CNGC21-517 exprimiert wurde (dnd1/∆C). Hier fehlen sowohl dem im dnd1-Hintergrund vorliegenden durch die Punktmutation verkürzten CNGC2, als auch dem eingebrachten Kanal die regulatorischen Einheiten CNBD und CaMBD. Zusätzlich wurde eine Linie untersucht, bei der CNGC2 mit Mutationen in der CNBD exprimiert wird (dnd1/2M). Bei den Mutationen handelt es sich um ein stark konserviertes Glycin gefolgt von einem Aspartat, die beide jeweils zu einem Alanin mutiert wurden (G599A, D600A). In dieser Arbeit wurden für die oben genannten Pflanzenlinien homozygote Linien für die jeweils eingebrachte CNGC2-Variante isoliert (Kapitel 4.2.2.5). War dies der Fall, wurden die Pflanzen in Wachstumsversuchen eingesetzt. Nach fünftägiger Voranzucht unter gleichen Bedingungen wurden die Pflanzen auf ½ MS + 1 % Saccharose-Platten, welche 1,5 mM CaCl2 enthalten, bzw. auf ½ MS + 1 % Saccharose + 18,5 mM CaCl2-Platten (Endkonzentration: 20 mM CaCl2) umgesetzt und deren Wachstum nach 13 weiteren Tagen dokumentiert und ausgewertet. Abbildung 18 zeigt repräsentative Beispiele für die auf den verschiedenen Medien gewachsenen Pflanzenlinien. Während alle Pflanzen bei geringer Calciumkonzentration relativ gleichmäßig wuchsen (Abb. 18 A, B), waren größere Unterschiede unter Hochcalciumbedingungen erkennbar (Abb. 18 D, E). Die Ca2+-Hypersensitivität zeigte sich hier bei dnd1, sowie dnd1/2M und dnd1/∆C in reduziertem Wachstum. Zur statistischen Auswertung der Ergebnisse wurden Trockengewichte von dnd1, der Positivkontrolle (dnd1/VL) und zwei dnd1/FRY-Linien, welche für die Untersuchung der CaM-Bindung besonders relevant sind, bestimmt und Mittelwerte sowie Standardfehler berechnet. Bei den Pflanzen, die auf Platten mit 1,5 mM Ca2+ wuchsen, bestand kein signifikanter Unterschied zwischen den verschiedenen Linien (Abb. 18 C). Vergleicht man die einzelnen Pflanzenlinien zwischen den beiden Wachstumsbedingungen miteinander, wurde nur innerhalb der dnd1-Pflanzen ein signifikant reduziertes Trockengewicht festgestellt, welches sich vom Wachstum auf 1,5 mM Ca2+ zu dem auf 20 mM ca. halbierte (Abb. 18 C, F). Der Wachstumsunterschied bei 20 mM Ca2+ zwischen dnd1 und den Komplementationslinien ist signifikant (Abb. 18 F). Somit wird der Wachstumsphänotyp sowohl in den Pflanzen, die CNGC2 exprimieren (dnd1/VL), als auch in den Pflanzen, die CNGC2FRY exprimieren (dnd1/FRY-1 und dnd1/FRY-2) komplementiert (Abb. 18 D-F). Die Mutationen in der αC-Domäne haben keinen Einfluss auf die Funktionalität des Kanals für die Adaptation an Hochcalciumbedingungen. Die beiden weiteren Linien (dnd1/2M und dnd1/∆C) reagierten wie auch dnd1 hypersensitiv auf die hohen Calciumkonzentrationen. Das bedeutet im Fall der dnd1/2M-Pflanzen, dass der Bereich mit dem konservierten Glycin und dem Aspartat in der CNBD von großer Bedeutung für die Regulation von 30 2. Ergebnisse CNGC2 ist. Aus den Versuchen mit dnd1/∆C kann man schließen, dass CNGC2 ohne C-terminale regulatorische Domänen nicht zur Anpassung an hohe Calciumkonzentrationen beiträgt. Da jedoch jeweils nur eine Linie untersucht wurde, muss diese Schlussfolgerung durch weitere unabhängige Linien bestätigt werden. Abbildung 18: CNGC2 komplementiert den dnd1-Wachstumsdefekt auch mit Mutationen in der αCDomäne. Komplementationsanalyse mit dem Ca2+-hypersensitiven dnd1-Wachstumsphänotyp. Repräsentative Abbildungen des Wachstumsversuchs von dnd1 und Komplementationslinien (Erläuterungen siehe Text) auf ½ MS + Saccharose-Platten (Ca2+-Konzentration 1,5 mM; A, B) und auf auf ½ MS + Saccharose + 18,5 mM CaCl2-Platten (Ca2+-Endkonzentration 20 mM; D, E). C+F: Mittelwerte und Standardfehler des Trockengewichts der entsprechenden bei 1,5 mM (C) und 20 mM (F) Ca2+ gewachsenen Pflanzen. * Signifikante Abweichung von dem Trockengewicht von dnd1 innerhalb dieser Ca2+-Konzentration (t-Test, p < 0,05, n=4 in C, n=6 in F). CaMs konnten den C-Terminus mit der Mutation in der αC-Domäne noch binden (Abb. 17 A) und mit diesen Versuchen wurde gezeigt, dass die Mutation auch keinen Einfluss auf die Funktion von CNGC2 hat, womit die Pflanzen auch auf höheren Ca2+-Konzentrationen wachsen können. Daher wurden weitere Pflanzenlinien hergestellt, die CNGC2 mit Mutationen in der IQ-Domäne exprimieren bzw. bei dem diese Domäne deletiert ist. Bei den Mutationen handelt es sich um jene in der basischen Region bzw. an den Alaninen an Position -3 und -4 der IQ-Domäne, welche bereits im C-Terminus eingeführt und in YTH-Versuchen getestet wurden (Abb. 17). Tabelle 1 zeigt eine Übersicht der erstellten Konstrukte/Pflanzen sowie die Beschreibung der Mutationen/Deletion. 31 Tabelle 1: Weitere Komplementationslinien. Komplemen- Ergebnisse im dnd1 transformiert mit Beschreibung dnd1/IQm1 CNGC2IQm1/pMDC32 Mutationen in IQ-Domäne: RKR681-683AAA Interaktion dnd1/IQm2 CNGC2IQm2/pMDC32 Mutationen in IQ-Domäne: RRR678-680AAA Interaktion dnd1/IQm3 CNGC2IQm3/pMDC32 Mutationen in IQ-Domäne: RRK680-682AAA Interaktion dnd1/∆IQ CNGC2∆IQ/pMDC32 Aminosäuren 669-725 deletiert keine Interaktion dnd1/GT CNGC2GT/pMDC32 Mutationen in der IQ-Domäne: AA669-670GT Interaktion2 tationslinie YTH1 1 CaM-Interaktionstests unter Verwendung des C-Terminus von CNGC2 mit entsprechenden Mutationen bzw. der Deletion. 2 Das IQ-Peptid mit dieser Mutation interagierte nicht mit CaMs. Diese Mutationen sowie die Deletion der IQ-Domäne wurden in der cDNA von CNGC2 und über den Zielvektor pMDC32 (Curtis und Grossniklaus, 2003) mittels Floral dip-Methode (Clough und Bent, 1998) in dnd1-, sowie auch in Col-0- und Col-0 Aeq-Pflanzen eingebracht. Homozygote Linien sind zurzeit noch nicht vorhanden, sodass noch keine Wachstumsversuche damit durchgeführt werden konnten. Aufgrund der Ergebnisse der YTH-Studie wäre eine fehlende Komplementation von dnd1 durch die IQ-Deletionsmutante zu erwarten, da die CaM-Bindung vermutlich eine wichtige FeedbackRegulation des Kanals vermittelt. Generell ermöglicht diese zeitaufwändige Komplementationsstudie eine grobe Struktur-Funktionsanalyse in Pflanzen. Einen weiteren interessanten Ansatz wählten Baxter und Kollegen (2008) zur Struktur-Funktionsanalyse. Dort wurden Pflanzen, welche die Chimäre CNGC11/12 exprimierten, mit Ethymethylsulfonat (EMS) mutagenisiert und untersucht, welche Mutationen in der Chimäre den cpr22 Phänotyp unterdrücken. Untersuchungen mithilfe elektrophysiologischer Methoden wären in der Lage biophysikalische Eigenschaften wie Leitfähigkeit für bestimmte Ionen und die Funktion des Gatings zu erschließen. 2.1.9 Die Interaktion mit den IQ-Domänen erfolgt über die C-Schleife der CaMs Bisher wurde gezeigt, dass CaMs über IQ-Domänen an die C-Termini der CNGCs binden. Diese Untersuchungen kann man bei genauer Betrachtung der Struktur von Calmodulinen noch weiter vertiefen. CaMs werden in zwei Schleifen, auch Lobes genannt, unterteilt, N- und C-Lobe. Jede Schleife besteht aus zwei EF-Händen und kann somit jeweils zwei Ca2+ binden. Für die Lobes sind unterschiedliche Bindeeigenschaften für Ca2+ bekannt (Teleman et al., 1986). CaM2 wurde in die Aminosäuren 1-78 (N-Lobe) und Aminosäuren 79-149 (C-Lobe) aufgeteilt (van Petegem et al., 2005). Zur Untersuchung der Interaktion zwischen IQ-Domäne und Calmodulinen wurden aus jeder Untergruppe der CNGCs (Mäser et al., 2001) zwei Vertreter ausgewählt, einer, bei dem das getestete IQ-Peptid mit CaMs interagierte (Abb. 13) und einer, bei dem vermutlich ein 32 2. Ergebnisse größerer Bereich zur Interaktion mit CaMs benötigt wird. Außerdem wurde CNGC17 aufgrund der sehr schwachen CaM-Interaktion hinzugezogen. Die C-Termini der Vertreter wurden auf Interaktion mit dem N- und C-Lobe von CaM2 im Vergleich zur CaM2-Volllänge getestet (Abb. 19). Abbildung 19: CaM interagiert über den C-Lobe mit C-Termini von CNGCs. YTH-Versuche. Hefewachstum auf Medium ohne Tryptophan, Leucin und Histidin (-W-L-H) zur Analyse der Interaktion. Die Hefen jeder Kombination wurden in einer Konzentration von OD600=2, 0,2 und 0,02 nebeneinander aufgetragen. Interaktionstest zwischen ausgewählten C-Termini und CaM2 (erste Spalte), dem N-Lobe von CaM2 (zweite Spalte) und dem C-Lobe von CaM2 (dritte Spalte) jeweils nach zwei Tagen Inkubation und dem C-Lobe von CaM2 nach vier Tagen Inkubation (vierte Spalte). Wie bereits in Abbildung 13 gezeigt wurde, interagierten mit Ausnahme von CNGC17 auch hier alle C-Termini mit CaM2 (Abb. 19, erste Spalte). Für den C-Terminus von CNGC17 wurde festgestellt, dass die Hefen länger inkubiert werden mussten, damit Hefekolonien eindeutig sichtbar waren (Abb. 14). Eine Inkubationszeit von länger als zwei Tagen gilt bei den in dieser Arbeit durchgeführten YTHExperimenten als Maß für eine sehr schwache Interaktion. Bei der Kombination CNGC12 C-Terminus und CaM2 wurde ein etwas schwächeres Hefewachstum beobachtet (Abb. 19, erste Spalte). Keiner der C-Termini interagierte mit dem N-Lobe von CaM2 (Abb. 19, zweite Spalte), wohingegen alle den C-Lobe binden konnten (Abb. 19, dritte und vierte Spalte). Bei letzterem wurde jedoch ein großer Unterschied in der Stärke der Interaktion beobachtet. Bei Verwendung des C-Terminus von CNGC2, CNGC13, CNGC15, CNGC18 und CNGC20 wuchsen die Hefen bereits nach zwei Tagen in allen Verdünnungen stark, von CNGC4 und CNGC9 schwächer, von CNGC19 noch schwächer und von 33 CNGC6, CNGC12 und CNGC17 kaum sichtbar. Nach vier Tagen Inkubation wurde in Gegenwart aller Kombinationen ein Hefewachstum beobachtet (Abb. 19, rechte Spalte). Da zwar der N-Lobe alleine nicht mit den C-Termini interagierte, die Bindung zwischen C-Lobe mit den C-Termini nach zwei Tagen schwächer war als mit dem vollständigen CaM2, kann man daraus schlussfolgern, dass zwar die Interaktion hauptsächlich über den C-Lobe vermittelt stattfindet, jedoch der N-Lobe auch einen Einfluss auf diese Bindung hat. 2.1.10 Calcium-Abhängigkeit der CaM-Interaktion mit CNGC-IQ-Domänen Calmoduline können Calcium binden und eine Konformationsänderung eingehen. Dies äußert sich in einer Änderung von Apo-CaM zu Ca2+/CaM. In einem der beiden Zustände können CaMs ihre Ziele affiner binden oder loslassen. IQ-Domänen werden als Ziele für Apo-CaMs, also für eine Ca2+unabhängige Bindung definiert (Rhoads und Friedberg, 1997). Die Ca2+-Abhängigkeit der CaMBindung an CNGCs wurde näher untersucht und wird in den folgenden Kapiteln weiter erläutert. 2.1.10.1 Die Interaktion mit dem C-Terminus von CNGC20 ist Ca2+-abhängig Für CNGC20 wurde die Interaktion zwischen dem C-Terminus des Kanals und CaM2 in vitro unter zwei verschiedenen Bedingungen getestet. Hierfür wurden Strep-CaM2 und der C-Terminus von CNGC20 als Fusion mit S- und His-Tag sowie Maltosebindeprotein (MBP; S-His-MBP-CNGC20-C) in E. colis exprimiert und das CaM-Fusionsprotein affinitätschromatographisch isoliert. Der Rohextrakt der E.colis, die S-His-MBP-CNGC20-C hergestellt haben, wurde in einem SDS-Gel aufgetrennt, auf eine Nitrocellulosemembran geblottet und diese mit Blockierungspuffer in Anwesenheit von entweder 5 mM CaCl2 oder 5 mM EGTA gewaschen. Zu diesen Blockierungslösungen wurde aufgereinigtes Strep-CaM2 zugegeben, welches unter den bevorzugten Bedingungen an den C-Terminus in der Membran band. Der Strep-Tag des gebundenen CaM2 wurde mithilfe von Antikörpern und Meerrettich-Peroxidase (HRP, horseradish peroxidase) detektiert. Auf dem entwickelten Blot zeigte sich eine Bande auf erwarteter Höhe (62 kDa) des S-His-MBPCNGC20-C auf der mit CaCl2-behandelten Nitrocellulosemembran (Abb. 20). Als Positivkontrolle wurde Strep-CaM2 auch über SDS-PAGE aufgetrennt und auf die Membran übertragen. Das somit in der Membran befindliche Strep-CaM konnte sowohl auf der CaCl2 als auch auf der EGTAbehandelten Seite detektiert werden und belegte die Übertragung der Proteine auf die Membran (nicht gezeigt). Das Ergebnis deutet darauf hin, dass die Interaktion zwischen CNGC20 und CaM2 Ca2+-abhängig ist. 34 2. Ergebnisse Abbildung 20: CaM2 bindet den C-Terminus von CNGC20 Ca2+-abhängig. CaM-Bindungs-Overlay assay des C-Terminus von CNGC20. Die Bindung von Strep-CaM2 an S-His-MBPCNGC20-C (62 kDa) wurde abhängig von der Anwesenheit von 5 mM CaCl2 mittels anti-Strep-Anitikörper detektiert (links). Nach Inkubation der S-His-MBP-CNGC20-C bindenden Nitrocellulosemembran mit CaM2 und 5 mM EGTA wurde CaM2 nicht detektiert (rechts). 2.1.10.2 CNGC-Untereinheiten besitzen eine unterschiedliche Ca2+-Abhängigkeit bei der CaMBindung Die Ca2+-Abhängigkeit wurde weiter im Hefesystem untersucht. Im Abschnitt 2.1.8 wurde gezeigt, dass die CaM-Bindung an den C-Terminus der CNGCs hauptsächlich über den C-Lobe des Calmodulins stattfindet (Abb. 19). Durch Mutationen in der EF-Hand kann die Bindung von Ca2+ verhindert werden (Fruen et al., 2003). Daher wurden in CaM2 die Glutamate an der -Z-Position in EF-Hand 3 und 4 nach Fruen et al. (2003) zu Alaninen mutiert, sodass der C-Lobe kein Ca2+ mehr binden konnte. Die resultierende Mutante wurde CaM2E3,4A genannt. Nun wurden YTH-Versuche mit den C-Termini und Peptiden korrespondierend zu C-terminalen Bereichen aus CNGC19, CNGC20 und CNGC2 durchgeführt und die Interaktion mit CaM2 und CaM2E3,4A verglichen. Bei den C-Termini von CNGC19 und CNGC20 war die Bindung von CaM2E3,4A stark reduziert (Abb. 21 A, B), was die Interpretation unterstützt, dass diese Interaktionen Ca2+-abhängig sind. Im Gegensatz dazu interagierten die IQ-Peptide von CNGC19 und CNGC20 sowohl mit CaM2 als auch mit CaM2E3,4A gleichermaßen. Daraus lässt sich ableiten, dass entweder eine weitere CaMBD für eine Ca2+-abhängige Bindung des gesamten C-Terminus verantwortlich ist und die Ca2+-unabhängige Bindung unterdrückt oder dass die umgebenden Aminosäuren einen Einfluss auf die Ca2+-Abhängigkeit der Bindung an die IQ-Domäne haben. Für letztere Hypothese sprechen die Ergebnisse zur Interaktion der Peptide von CNGC19. Während die N-terminale Erweiterung des 17 Aminosäuren langen IQ-Peptids um nur 3 Aminosäuren (IQNext) nur zu einer schwachen Interaktion mit CaM2 führte, welche durch die Mutation im CaM-C-Lobe unterbunden wurde, zeigte das Peptid mit einer größeren C-terminalen Erweiterung der minimalen IQ-Domäne (IQCext) sowohl mit CaM2, als auch mit CaM2E3,4A eine starke Interaktion (Abb. 21 A). Das auf beiden Seiten erweiterte IQ-Peptid (IQext) interagierte mit CaM2 Ca2+-unabhängig. Da der C-Terminus als eine große N-terminale Erweiterung stark Ca2+-abhängig CaM2 band (Abb. 21 A), kann vermutet 35 werden, dass der Bereich N-terminal zu der IQ-Domäne einen starken Einfluss auf die Ca2+Abhängigkeit hat. Abbildung 21: Unterschiedliche Ca2+-Abhängigkeiten bei der CaM-Bindung zwischen den CNGCs. YTH-Versuche. Hefewachstum auf Medium ohne Tryptophan, Leucin und Histidin (-W-L-H) zur Analyse der Interaktion. Die Hefen jeder Kombination wurden in einer Konzentration von OD600=2, 0,2 und 0,02 nebeneinander aufgetragen. Interaktionstest zwischen A: CNGC19-C-Terminus, IQ-Peptid, Erweiterung des IQPeptids N- und C-terminal (CNGC19IQext), nur N-terminal (CNGC19IQNext) und nur C-Terminal (CNGC19IQCext), B: dem C-Terminus von CNGC20, dem IQ-Peptid, IQ-Peptid mit Mutationen der Alaninen an Position -3-4 zu Glycin und Threonin, dem C-Terminus mit diesen Mutationen, C: dem C-Terminus von CNGC2, dem IQ-Peptid, IQ-Peptid mit Mutationen der Alaninen an Position -3-4 zu Glycin und Threonin, dem C-Terminus mit diesen Mutationen und CaM2 im Vergleich zu CaM2E3,4A. Im Gegensatz zu CNGC19 und CNGC20 interagierte der C-Terminus von CNGC2 sowohl mit CaM2 als auch mit CaM2E3,4A stark (Abb. 21 C). Die Bindung war also Ca2+-unabhängig oder unbeeinflusst von der Konformation des CaM2-C-Lobes. In Abschnitt 2.1.6 wurde gezeigt, dass die GT-Mutation am Anfang des IQ-Peptids einen Einfluss auf die CaM-Bindung hat. Das IQ-Peptid von CNGC2, das mit Glycin und Threonin statt zwei Alaninen beginnt, konnte keine CaMs mehr binden. Wenn sich jedoch diese Mutation im ganzen C-Terminus befand, schien sie eine untergeordnete Rolle zu spielen, 36 2. Ergebnisse da der C-Terminus mit dieser Mutation CaMs band (Abb. 17 und 21 C). Bei diesem Versuch wird klar, dass die GT-Mutation einen Einfluss auf die Ca2+-Abhängigkeit der CaM-Interaktion ausübte. Das Hefewachstum war bei Verwendung von CNGC2CGT und CaM2E3,4A im Vergleich zum nicht mutierten C-Terminus stark reduziert. Bei CNGC20 blieb die fehlende Interaktion mit der GTMutation sowohl in der IQ-Domäne als auch im C-Terminus unverändert, auch wenn CaM kein Ca2+ mehr am C-Lobe binden konnte (Abb. 21 B). Zu beachten ist, dass, wenn man die Verdünnung zu OD600=0,02 der Hefen betrachtet, das Hefewachstum bei CaM2E3,4A minimal im Vergleich zu CaM2 reduziert ist. Zusammengefasst lässt sich aus den YTH- und Overlay-Ergebnissen schließen, dass die IQ-Domänen CaMs Ca2+-unabhängig binden. Allerdings zeigen sich große Unterschiede in den Bindeeigenschaften der C-Termini verschiedener CNGCs. 2.1.10.3 Die CaM-Bindung an CNGC20 ist in planta Ca2+-unabhängig Als weitere unabhängige Methode zur Untersuchung der Interaktion zwischen CNGCs und CaMs wurde die Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BiFC) in Nicotiana benthamiana, hinzugezogen. Diese ermöglicht die Visualisierung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen durch Rekonstitution eines intakten Fluorophors und somit die Analyse der Interaktion mit CNGC20 in seiner natürlichen Umgebung, der Plasmamembran von Pflanzenzellen (Ghosh et al., 2000; Walter et al., 2004; Fischer et al., 2013). Außerdem ist der Ort der Proteinbindung nicht wie bei YTH-Versuchen auf den Zellkern beschränkt und erlaubt es, eine Kanaluntereinheit inklusive der Transmembrandomänen für die Untersuchung einzusetzen. Mit dieser Methode wurde bereits die CaM-Interaktion mit CNGC20 gezeigt (Fischer et al., 2013). Für die BiFC-Analyse wurde die N-terminale Hälfte des Fluorophors Venus (VN) an das C-terminale Ende von CNGC20 (CNGC20-VN) und dessen Varianten fusioniert. Eine Übersicht der verwendeten CNGC20-Varianten wurde in Tabelle 2 zusammengestellt. Die C-terminale Hälfte des Fluorophors (VC) wurde N-terminal an CaM2 (VC-CaM2) bzw. CaM2E3,4A (VC-CaM2E3,4A) fusioniert. Die BiFC-Signale nach Ko-Expression von CNGC20-VN und VC-CaM2 wurden in Übereinstimmung mit dem zellulären Lokalisationsmuster des Kanals an der Plasmamembran detektiert (Abb. 22 A). CNGC20 lokalisierte hauptsächlich in der Plasmamembran, unabhängig davon, ob sich GFP am Noder C-Terminus des Kanals befand (Fischer et al., 2013). Bei Verwendung von CNGC20-VN mit der löslichen C-terminalen Venushälfte (VC) als Negativkontrolle wurden keine Fluoreszenzsignale aufgelöst (Abb. 22 K). Auch in Gegenwart der N-terminalen Fusion von der N-terminalen Fluorophorhälfte an CNGC20 (VN-CNGC20) mit VC-CaM2 wurden keine oder nur schwache Signale detektiert (Fischer et al., 2013). Die Indentität der punktuellen Strukturen der BiFC- und GFP-Signale (Abb. 22 Q + R; Fischer et al., 2013), die auf eine inhomogene Verteilung innerhalb der Membran hindeuten und vornehmlich in stark exprimierenden Zellen beobachtet wurden, wurden in dieser Arbeit nicht weiter untersucht. 37 Tabelle 2. Übersicht der in BiFC-Versuchen verwendeten CNGC20-Varianten und Vergleich der Ergebnisse der YTH- und BiFC-Studien zur Interaktion zwischen CNGC20 und CaM2. CNGC20-Variante CNGC20 CNGC20∆C34 CNGC20∆IQ CNGC20R748-750A CNGC20GT 1 Beschreibung = CNGC201-764: Kanal-Volllänge = CNGC201-730: 34 Aminosäuren am C-Terminus inklusive des IQ-Motivs fehlen = CNGC201-736_753-764: Deletion der IQ-Domäne = CNGC201-764_R748-750A: Mutation innerhalb der IQ-Domäne = CNGC201-764_AA737-738GT: Mutation am Anfang der IQDomäne Ergebnisse BiFC1 Ergebnisse YTH2 +++ +++ ++ - + - ++++ + +++ - Die BiFC-Studien wurden mit den Volllängen-Versionen von CNGC20 durchgeführt. Die gelbe Fluoreszenz von Venus wurde quantitativ in Blattscheiben aus infiltrierten Bereichen in acht (CNGC20, CNGC20∆C34, CNGC20∆IQ) bzw. sieben (CNGC20R748-750A, CNGC20GT) unabhängigen Experimenten für jeweils 7-14 technische Replikate (Blätter) bestimmt. Ein repräsentatives Ergebnis ist in Abb. 22 dargestellt. 2 Die YTH-Studien wurden mit der jeweiligen C-Terminus-Variante beginnend mit der Aminosäure 517 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den Abbildungen 10, 15 und 21 dargestellt und für CNGC20∆C34 aus Fischer et al. (2013) entnommen. Drei „+“ bedeuten eine starke Interaktion. Mehr oder weniger „+“ geben eine stärkere oder schwächere Interaktion in Bezug auf CNGC20 Volllänge bzw. C-Terminus mit CaM2 an. „–„ bedeutet, dass keine Interaktion stattfand. In Abbildung 22 A-O und Q sind die BiFC-Signale aus infiltrierten Bereichen eines Tabakblatts dargestellt, die am konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommen wurden. Eine Quantifizierung der gelben Fluoreszenz wurde mit Blattscheiben vorgenommen, die in dem filterbasierten Plattenlesegerät TECAN infinite 200 PRO ausgelesen wurden. Abbildung 22 P zeigt das repräsentative Ergebnis eines Versuchs von insgesamt acht bzw. sieben unabhängigen Experimenten, welche in Tabelle 2 zusammengefasst sind. Zunächst wurde die Stärke des BiFC-Signals zwischen CNGC20 und dessen Varianten, in der Interaktion mit CaM2 verglichen. Das BiFC-Signal wurde gegenüber der Wildtyp-Kontrolle geringfügig abgeschwächt, wenn 34 Aminosäuren am C-Terminus des Kanals fehlten (CNGC20∆C34), die das IQ-Motiv einschlossen (Abb. 22 B). Die quantitative Auswertung der gelben Fluoreszenz in acht unabhängigen Experimenten bestätigte die im Mittel geringfügige Abnahme der Intensität durch den Verlust dieser Aminosäuren. Wurden nur die Aminosäuren 737-752 deletiert, die in YTHExperimenten als IQ-Peptid verwendet wurden, so interagierte CNGC20∆IQ noch schwächer mit CaM2 als CNGC20∆C34. CNGC20∆IQ-VN erzielte nur noch ca 50 % des BiFC-Signals in Gegenwart von VCCaM2 (Abb. 22 B + P) und belegte damit die Rolle der IQ-Domäne als funktionelle CaM-Bindestelle 38 2. Ergebnisse in planta. Nun stellte sich aber die Frage, warum CNGC20∆C34, bei dem auch die IQ-Domäne fehlte, stärker interagierte als CNGC20∆IQ bzw. warum das Vorhandensein, der letzten 12 Aminosären die Bindung von CaMs unterdrückt, wärend in Abwesenheit eine stärkere Interaktion mit CaM2 in planta möglich war. Außerdem unterschied sich das Ergebnis stark zu den Ergebnissen der YTH-Studien, bei denen das Fehlen der letzten 34 Aminosäuren bzw. der IQ-Domäne zu einem Verlust der CaMInteraktion führte und gar keine Hefen mehr auf entsprechendem Selektionsmedium wuchsen (Tabelle 2). Abbildung 22: CaM interagiert in planta mit CNGC20, unabhängig davon, ob der C-Lobe Ca2+ bindet. Repräsentativer BiFC-Versuch mit CNGC20- und CaM2-Varianten. Konfokalmikroskopische Aufnahmen des Venus-BiFC-Signals (A-O, Q) und GFP (R) in Epidermiszellen von N. benthamiana. A-E: Kombinationen aus CNGC20-Varianten mit CaM2. F-J: Kombinationen aus CNGC20-Varianten und CaME3,4A. K-O: Negativkontrollen für die CNGC20-Varianten in Kombination mit dem löslichen Venus C-Terminus. P: Mittelwert und Standardfehler aus einem von acht Experimenten mit n=7. Sterne indizieren Werte mit signifikantem Unterschied im Vergleich zu CNGC20-VN jeweils in Kombination mit VC-CaM2 (t-test, p < 0,05). Von den Negativkontrollen werden nur zwei (schwarze Balken) dargestellt. Q: Nähere Aufnahme, Kombination wie A. R: GFP-CNGC20. Größenstandards: A-O = 50 µm, Q = 20 µm, R = 10 µm. 39 Punktmutationen im basischen Bereich der IQ-Domäne, die zur Abnahme der Interaktion des CTerminus mit CaMs in der Hefe führte, sorgten sogar für ein im Vergleich zum Wildtyp stärkeres BiFC-Signal in Kombination mit VC-CaM2 (CNGC20R748-750A, Abb. 22 D, P, Tabelle 2). CNGC20GT mit einem Austausch der für die CaM-Bindung wichtigen Alanine an Position -3 und -4 des Konsensus-IQ-Motivs verhielten sich wie der Wildtyp (Abb. 22 E, P), während diese Mutation im CTerminus von CNGC20 zu einem Verlust der Interaktion mit CaMs in YTH-Experimenten führte. Die quantitative Auswertung der BiFC-Signale ergab die folgende Sequenz der Fluoreszenzintensitäten: CNGC20R748-750A > CNGC20GT = CNGC20 > CNGC20∆C34 > CNGC20∆IQ Die apparente Bindungsstärke, die durch das Wachstum der Hefen unter Verwendung des C-Terminus von CNGC20 mit entsprechenden Mutationen und Deletionen im YTH angezeigt wurde, folgte hingegen der Reihung: CNGC20 >> CNGC20R748-750A > CNGC20GT = CNGC20∆C34 = CNGC20∆IQ Damit stehen die Ergebnisse der BiFC-Methode im teilweisen Widerspruch zu denen aus den YTHExperimenten, in denen sowohl die Deletion der IQ-Domäne (∆C34 und ∆IQ) als auch die Punktmutation am N-terminalen Bereich der IQ-Domäne (CNGC20-CGT) einen Verlust der CaMBindung zur Folge hatte. In Übereinstimmung wiesen jedoch beide Methoden die Interaktion mit CaM2 sowie eine Inhibition der CaM-Bindung durch die Deletion der Aminosäuren 737-752 (∆IQ) nach. Hieraus lässt sich die Bedeutung der IQ-Domäne für die CaM-Interaktion ableiten. Warum die Deletion der letzten 34 Aminosäuren (∆C34) und die Punktmutationen nur einen schwachen negativen, keinen oder einen abweichenden Effekt auf die BiFC-Signale hatten, bleibt jedoch unklar. CNGC20 wies in diesen BiFC-Versuchen andere CaM-Bindungseigenschaften auf als der C-Terminus in Hefeexperimenten. Bei letzteren wurde gezeigt, dass CaM2 Ca2+-abhängig über den C-Lobe an den C-Terminus des Kanals bindet. Daher wurde nun auch die Ca2+-Abhängigkeit in planta untersucht, um zu sehen ob dieser Unterschied in der Bindung zwischen CaM und mutiertem CaM auch mit der BiFC-Methode dargestellt wird. Dazu wurde wieder CaM2E3,4A genutzt, bei dem die letzten beiden EFHände stillgelegt wurden (Abb. 22 F-J, P). Die Kombinationen in Abbildung 22 F-J wurden in dasselbe Blatt infiltriert wie A-E, sodass ein direkter Vergleich möglich war. Die Interaktionen der CNGC20-Varianten mit CaM2E3,4A ergaben im Vergleich zu den Interaktionen mit CaM2 keinen signifikanten Unterschied. Dieses Ergebnis unterscheidet sich ebenfalls zu denen der YTH-Versuche, bei denen der C-Terminus von CNGC20 nur noch sehr schwach mit CaM2E3,4A interagierte. Dies deutet darauf hin, dass die CaM2-Bindung unabhängig von der Ca2+-Beladung des C-Lobes erfolgen kann. Der Unterschied der beiden Methoden könnte darauf zurückgeführt werden, dass in planta auch Interaktionen mit dem N-Lobe dargestellt werden, welcher eine niedrigere Affinität für Ca2+ hat als der C-Lobe (Teleman et al., 1986; Astegno et al., 2016). Um dies weiter zu untersuchen, könnten die einzelnen Lobes in BiFC-Versuche eingesetzt oder eine weitere Variante von CaM verwendet werden, bei der alle EF-Hände mutiert sind, sodass dieses mutierte CaM gar kein Ca2+ mehr binden kann. 40 2. Ergebnisse 2.1.10.4 CNGC2 bindet CaMs Ca2+-unabhängig in planta Da sich CNGC20 und CNGC2 in den YTH-Versuchen zur Ca2+-Abhängigkeit unterschiedlich verhielten, dort band der C-Terminus von CNGC2 im Gegensatz zu den C-Termini von CNGC19 und CNGC20 auch CaM2E3,4A stark (Abb. 21), wurde auch CNGC2 in einem BiFC-Experiment eingesetzt. Bei der Expression von CNGC2-VN mit VC-CaM2 fiel zum einen auf, dass innerhalb der infiltrierten Bereiche manche Regionen stärker leuchtende Zellen enthielten und außerdem, dass die Fluoreszenz subzellulär sowohl im Endoplasmatischen Retikulum (ER; Kreise um den Zellkern und Stränge durch die Zelle, teilweise Netzstruktur), als auch in größeren Aggregaten detektiert wurde (Abb. 23 A). Diese großen Aggregate sind nicht vergleichbar mit den Punkten/Aggregaten, die in 2.1.10.3 beschrieben wurden. Sie waren viel größer und befanden sich nicht nur an der Plasmamembran. Abbildung 23: CNGC2 bindet CaM Ca2+-unabhängig in planta, jedoch hat die GT-Mutation einen Einfluss auf die Ca2+-Abhängigkeit. Repräsentativer BiFC-Versuch mit CNGC2- und CaM2-Varianten. Konfokalmikroskopische Aufnahmen des Venus-BiFC-Signals (A-F). A-C: Kombinationen aus CNGC2-VN und VC-CaM2 (A), VC-CaM2E3,4A (B) und dem löslichen Venus C-Terminus als Kontrolle (C). D-F: Kombinationen aus CNGC2GT-VN und VC-CaM2 (D), VC-CaM2E3,4A (E) und dem löslichen Venus C-Terminus als Kontrolle (F). G: Statistische Auswertung mit Mittelwert der gelben Fluoreszenzsignale und Standardfehler mit n=11. Sterne indizieren Werte mit signifikantem Unterschied zwischen den Werten der durch Balken miteinander verbundenen Kombinationen (ttest, p < 0,05). Größenstandards = 50 µm. 41 Tabelle 3:Vergleich von YTH- und BiFC-Ergebnissen für CNGC20 und CNGC2. CaM2 1 CNGC20 CNGC20GT CNGC2 CNGC2GT YTH1 +++ +++ +++ CaM2E3,4A BiFC2 +++ +++ +++ ++++ YTH1 (+) +++ + BiFC2 +++ +++ +++ +++ Die YTH-Studien wurden mit der jeweiligen C-Terminus-Variante beginnend mit der Aminosäure 517 (CNGC20) bzw. 502 (CNGC2) durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 21 dargestellt. 2 Die BiFC-Studien wurden mit den Volllängen-Versionen durchgeführt. Die Ergebnisse sind aus den Abbildungen 22 und 23 bzw. der Tabelle 2 entnommen. Die Codierung für Interaktionen erfolgte wie in Tabelle 2. Vergleicht man die Fluoreszenz der exprimierten Kombinationen CNGC2-VN mit VC-CaM2 und mit VC-CaM2E3,4A, zeigten diese in Summe aus 11 technischen Replikaten keinen signifikanten Unterschied in der Intensität (Abb. 23 A, B, G). Somit stimmt dieses Ergebnis mit dem Ergebnis aus dem YTH-Versuch (Abb. 21) überein und besagt, dass CNGC2 mit CaM2 unabhängig davon, ob der C-Lobe Ca2+ gebunden hat, interagiert. Wurden die Alanine an Position -3 und -4 zum IQ-Motiv von CNGC2 zu Glycin und Threonin mutiert, interagierte diese Mutante wie im YTH-Versuch auch mit CaM2. Die gemessene Fluoreszenzintensität war sogar stärker als die, die aus der Kombination mit dem Wildtyp-Kanal hervorging (Abb. 23 D, A, G, Tabelle 3). Die Interaktion zwischen CNGC2GT-VN mit VC-CaM2E3,4A war schwächer als jene mit VC-CaM2; allerdings bestand kein Unterschied zwischen CNGC2GT-VN und CNGC2-VN jeweils mit VC-CaM2E3,4A (Abb 23, Tabelle 3). Letzteres wich von den Ergebnissen aus den Hefeversuchen ab, da die Interaktion dort von CNGC2 mit CaM2E3,4A zu CNGC2GT mit dem mutierten CaM stark reduziert war. Somit stimmen diese Ergebnisse nur teilweise mit denen der YTHVersuche überein. Die ersten Untersuchungen deuten darauf hin, dass CNGC2, wie auch im YTH-Versuch gezeigt wurde, CaMs Ca2+-unabhängig bindet bzw. unabhängig von einer Ca2+-Beladung des C-Lobes. CNGC2 verhielt sich in diesem Fall wie CNGC20, wobei sich die Ergebnisse in Hefeversuchen unterschieden. Ob die GT-Mutation einen Einfluss auf die Ca2+-Abhängigkeit hat, bleibt noch offen. Nun müsste dieses Ergebnis in weiteren Wiederholungen bestätigt und, wie im vorherigen Kapitel vorgeschlagen wurde, auch Versuche mit Mutationen im N-Lobe von CaM2 durchgeführt werden. Insgesamt wurde in dem Kapitel „Calmoduline als Liganden für CNGCs“ gezeigt, dass alle CNGCs funktionelle IQ-Domänen als CaMBDs besitzen. Dabei reicht bei manchen ein kleinerer Abschnitt um das IQ-Motiv für die Interaktion mit CaMs aus, bei anderen ist ein größerer Bereich involviert. Die Umgebung um diese Domänen haben Einflüsse auf die Bindeeigenschaften. Außerdem wurden sowohl Ca2+-abhängige, als auch -unabhängig Interaktionen mit CaMs nachgewiesen, welche hauptsächlich über deren C-Lobe stattfinden. 42 2. Ergebnisse 2.2 Interaktionen mit Kinasen und Phosphatasen Ionenkanäle werden nicht nur durch die Bindung verschiedener Liganden (z.B.: CaMs, CNs, Ca2+) reguliert. Auch durch die posttranslationale Modifikation durch Proteinkinasen, die vornehmlich eine Phosphatgruppe kovalent auf Serin, Threonin oder Tyrosin übertragen, werden deren Eigenschaften maßgeblich beeinflusst (Zheng und Trudeau, 2015). 2.2.1 CNGCs interagieren mit Phosphatasen In Kooperation mit Prof. Dr. Erwin Grill (TU München) wurden Yeast Two-Hybrid Versuche zur Interaktion zwischen CNGC-Termini und Phosphatasen durchgeführt. Hierfür wurden sowohl die bisher untersuchten Kanäle CNGC2 und CNGC20 als auch weitere CNGCs (CNGC3, CNGC9, CNGC12 und CNGC15) ausgewählt. Die untersuchten Phosphatasen ABI1, ABI2, HAB1, HAB2, PP2CA, HAI1, HAI2 und HAI3 gehören der Gruppe der PP2Cs (Proteinphosphatase 2C) an, deren Funktion für die ABA-Signalkette vielfach belegt ist (z.B. Schweighofer et al., 2004; Melcher et al., 2009; Umezawa et al., 2010; Santiago et al., 2012; Singh et al., 2016). Abbildung 24: CNGCs interagieren mit Phosphatasen. YTH-Versuche. A: Übersicht der Ergebnisse aus verschiedenen Kombinationen. Grün – Interaktion, hellgrün – schwache Interaktion, grau – keine Interaktion, weiß – nicht getestet. B: Hefewachstum auf Medium ohne Tryptophan und Leucin (-W-L) zur Selektion der ko-transformierten Zellen und in Abwesenheit von Tryptophan, Leucin und Histidin (-W-L-H) zur Analyse der Interaktion. Die Hefen jeder Kombination wurden in einem Konzentrationsgefälle nebeneinander aufgetragen. Interaktionstests zwischen dem C-Terminus von CNGC2 (links) und dem N-Terminus von CNGC20 (rechts) mit den Phosphatasen ABI2, ABI1, HAB2, PP2CA, HAI1, HAI2, HAI3. Diese Versuche wurden von Christian Kornbauer aus der Arbeitsgruppe Grill (TUM) durchgeführt. 43 Abbildung 24 A fasst nachgewiesene Interaktionen zusammen, wobei in grün Interaktionen dargestellt wurden. Grau gibt an, dass keine Bindung stattfand. Sowohl N- als auch C-Termini interagierten mit Phosphatasen. Des Weiteren wurde beobachtet, dass manche Termini verschiedene Phosphatasen und manche spezifisch nur eine banden. Die N-Termini von CNGC2 und CNGC3 und die C-Termini von CNGC3 und CNGC20 interagierten mit keiner der getesteten Phosphatasen. Interessant war die spezifische Interaktion zwischen dem N-Terminus von CNGC20 und ABI1 (Abb. 24 B), da der Kanal wie auch die Phosphatase in Schließzellen exprimiert ist (Kugler et al., 2009). Zusammengefasst wurde gezeigt, dass CNGCs mit Phosphatasen der Gruppe der PP2Cs interagierten und bei den verschiedenen Kanälen und ihren Termini unterschiedliche Spezifitäten auftraten. 2.2.2 In Hefen interagierten CNGC20 und CNGC9 nicht mit diversen CDPKs Um Phosphatase-Gegenspieler und mögliche Aktivatoren von CNGCs zu finden, wurde zunächst eine weitere Methode in Hefen, Split-Ubiquitin, gewählt, bei der die membranständige Kanaluntereinheit statt nur löslicher Teile genutzt werden kann. Ein Interaktions-Screen sollte unter Verwendung einer cDNA-Bibliothek von der Firma Dualsystems Biotech AG, Schlieren (Schweiz), durchgeführt werden. Hierfür wurde der bisher genauer untersuchte CNGC20 ausgewählt. Da in silico-Analysen eine Vorhersage für ein Signalpeptid zu Beginn des Kanals trafen und dieses das Targeting an die PM in Hefen stören könnte, wurde nach Angabe der Firma die cDNA ohne die für die ersten 23 Aminosäuren kodierende Basen (CNGC20∆N23) in entsprechende Vektoren kloniert. In Vorversuchen wurde CNGC20∆N23 als Fusionsprotein unter anderem mit der C-terminalen Hälfte von Ubiquitin (Cub) zusammen mit verschiedenen Transmembranproteinen, die unterschiedliche Membranen als Zielort haben und mit dem der N-terminalen Hälfte von Ubiquitin (Nub) fusioniert waren, exprimiert. Als Nub wurden sowohl der Wildtyp (NubI), der die Zusammenlagerung der Ubiquitinhälften auch ohne Interaktion der zu untersuchenden fusionierten Proteine ermöglicht, als auch die mutierte Form (NubG) verwendet, welche die Affinität der Ubiqutinhälften verringert, sodass eine Zusammenlagerung darauf beschränkt wird, dass die Fusionsproteine diese durch Interaktion in räumliche Nähe bringen müssen. Durch diese Tests wurde geschlussfolgert, dass der Kanal nicht die Plasmamembran erreichte. Daher wurde die Lokalisierung von CNGC20 in Hefen mithilfe von GFPFusionen überprüft. Zunächst wurde CNGC20∆N23-GFP in Hefen exprimiert. Im Vergleich mit Beispielbildern der Yeast GFP Fusion Localization Database (http://yeastgfp.yeastgenome.org/) war CNGC20∆N23 vornehmlich im ER zu finden (Abb. 25 A), was an der kleineren Ringstruktur in den Hefen zu erkennen ist. In manchen Zellen traten Aggregate auf. Zusätzlich wurde die grüne Fluoreszenz an Strukturen in den Zellen und ungleichmäßig am Rand detektiert. Ob ein Teil der GFP-Fusionsproteine die PM erreicht und dort inhomogen verteilt ist oder dies auf intrazelluläre Strukturen hindeutet, ist unklar. Jedenfalls war kein gleichmäßig leuchtender Ring am Rand der Zelle zu erkennen, was von 44 2. Ergebnisse einer eindeutigen PM-Lokalisierung zu erwarten wäre. Um den Einfluss des N-Terminus auf die Lokalisierung von CNGC20 in Hefen weiter zu untersuchen, wurden die ersten 99 Aminosäuren deletiert. CNGC20∆N99-GFP war ebenfalls hauptsächlich im ER zu finden (Abb. 25 B). Der Kanal verblieb auch in Pflanzen im ER, wenn der N-Terminus fehlte. Dies deutet auf eine Rolle des NTerminus für das Targeting bzw. ER-Export hin. Zwischen N- (Abb. 25 E) und C-Terminaler GFPFusion (Abb. 25 F) war ein Unterschied zu sehen. Während sich GFP-CNGC20∆N192 hauptsächlich im ER und kaum in Aggregaten befand (Abb. 25 E), war CNGC20∆N192-GFP umgekeht hauptsächlich in Aggregaten am Rand der Zelle, aber auch im ER gelegen (Abb. 25 F). Abbildung 25: Lokalisierung von CNGC20-Varianten in Hefen in Vergleich zu Tabak-Epidermiszellen. Expression von GFP-Fusionen in Hefen und Tabak. Konfokalmikroskopische Aufnahmen. A-D: Expression CTerminaler GFP-Fusionen in Hefen. E-H in Tabak: GFP-CNGC20∆N192 (E), CNGC20∆N192-GFP (F), GFPCNGC20 (G), GFP-CNGC20∆C34 (H). Größenbalken: A+B = 3 µm, C+D = 10 µm, E+F = 40 µm, G+H = 20 µm. G+H modifiziert nach Fischer et al., 2013. Die Position des Fluorophors beeinflusste jedoch nicht die Lokalisierung der Volllänge in Pflanzen (Fischer et al., 2013). Die Volllänge von CNGC20 war in Pflanzenzellen in der PM bzw. in Pünktchen an der PM (Abb. 25 G, 22 R) zu finden. Daher wurde in Hefen auch die Lokalisierung der Volllänge untersucht. Dort war der Kanal in ER und Aggregaten zu finden (Abb. 25 C). Zusätzlich wurde sowohl in Hefen als auch in Pflanzen die Lokalisierung von CNGC20 untersucht, bei dem die letzten 34 Aminosäuren fehlten (CNGC20∆C34), da die Arginin-reiche Region in der IQ-Domäne auch als NLS fungieren kann, wenn der C-Terminus alleine exprimiert wird und dies einen Einfluss auf die Lokalisation haben könnte (Fischer et al., 2013). Alternativ könnten die basischen Aminosäuren als ER-Retentions- oder -Entlassungssignal fungieren (Zerangue et al., 2001; Michelsen et al., 2005). In Tabak konnte CNGC20∆C34 auch die Plasmamembran erreichen (Abb. 25 H), in Hefen war wieder 45 eine ER-Lokalisierung zu beobachten (Abb. 25 D). Aufgrund dieser unterschiedlichen Lokalisierungen in Hefen und Pflanzen wurde von einem Interaktionsscreen in Hefen abgesehen. Im Zuge der experimentellen Arbeiten wurde veröffentlicht, dass Ca2+-abhängige Proteinkinasen (CDPKs, Ca2+-dependent protein kinases) Peptide von CNGCs phosphorylieren (Curran et al., 2011). Folglich wurden direkte Interaktionsstudien mit CNGC-Termini und Kandidaten-Kinasen aus der Familie der CDPKs durchgeführt. Für diese YTH-Versuche wurde ein neuer Gateway-kompatibler Zielvektor hergestellt, der eine C-terminale Fusion der GAL4-AD an das zu untersuchende Protein ermöglicht, da der N-Terminus der Kinasen Ziel für Myristoylierungen/Palmytoylierungen ist (Boudsocq und Sheen, 2013). Ein Interaktionstest für ausgewählte CDPKs mit dem N- und CTerminus von CNGC20 zeigte keine Kanal-Kinase-Bindung auf (Abb. 26). Abbildung 26: Ausgewählte CDPKs interagieren nicht mit CNGC20 in Hefen. YTH-Versuche. Hefewachstum auf Medium ohne Tryptophan und Leucin (-W-L) zur Selektion der kotransformierten Zellen und in Abwesenheit von Tryptophan, Leucin und Histidin (-W-L-H) zur Analyse der Interaktion. Die Hefen jeder Kombination wurden in einer Konzentration von OD600=2, 0,2 und 0,02 nebeneinander aufgetragen. Interaktionstest zwischen dem N-Terminus (CNGC20-N) bzw. C-Terminus (CNGC20-C) von CNGC20 und den angegebenen CDPKs. Daraufhin wurde der Kanal CNGC9, welcher in Wurzelhaaren (Brady et al., 2007; Winter et al., 2007) exprimiert wird und von Curran et al. (2011) als einer der durch CDPKs phosphorylierten Kandidaten veröffentlicht wurde, auch auf eine Interaktion mit verschiedenen CDPKs untersucht. Weder der Nnoch der C-Terminus von CNGC9 interagierten mit diesen Kinasen im YTH (Abb. 27). 46 2. Ergebnisse Abbildung 27: Ausgewählte CDPKs interagieren nicht mit CNGC9 in Hefen. YTH-Versuche. Hefewachstum auf Medium ohne Tryptophan und Leucin (-W-L) zur Selektion der kotransformierten Zellen und in Abwesenheit von Tryptophan, Leucin und Histidin (-W-L-H) zur Analyse der Interaktion. Die Hefen jeder Kombination wurden in einer Konzentration von OD600=2, 0,2 und 0,02 nebeneinander aufgetragen. Interaktionstest zwischen dem N-Terminus (CNGC9-N) bzw. C-Terminus (CNGC9C) von CNGC9 und den angegebenen CDPKs. 2.2.3 CNGCs und CDPKs interagieren in planta Parallel zu den YTH-Versuchen wurde eine mögliche Interaktion zwischen CNGCs und CDPKs in planta mit der BiFC-Methode untersucht. Hierfür wurde aus jeder Untergruppe der AtCNGCs ein Vertreter ausgewählt. CNGC9, CNGC12, CNGC17 und CNGC20 wurden mit einer N- bzw. Cterminalen Fusion der N-terminalen Venushälfte eingesetzt (VN-CNGC bzw. CNGC-VN). CPK1 und CPK34 wurden mit C-terminaler Fusion der C-terminalen Venushälfte (CPK-VC) für Interaktionstests verwendet, weil diese beiden Kinasen die häufigsten und stärksten Phosphorylierungen an CNGCs von den vier getesteten CDPKs zeigten (Curran et al., 2011). Auffällig war, dass sowohl bei N- als auch bei C-terminaler Fusion der Venushälfte an die Kanaluntereinheiten BiFC-Signale bei Verwendung oben genannter und weiterer CDPKs detektiert wurden. Dies deutet darauf hin, dass die Kinasen beide Termini der CNGCs binden können. Eine genauere Auswertung der einzelnen Versuche zeigt, dass die BiFC-Signale an einem der Termini tendenziell stärker waren (Tab. 4). Bei CNGC9 und CNGC20 wurden stärkere Fluoreszenzen detektiert, wenn die Fluorophorhälfte am C-Terminus des Kanals fusioniert war, bei CNGC12 und CNGC17 am N-Terminus. Des Weiteren wurde beobachtet, dass CPK34 stärker mit den CNGCs interagierte als CPK1 (Tab. 1). Dies stimmt mit den bisher veröffentlichten Phosphorylierungen überein, bei denen bei CPK34 immer höhere Phosphorylierungslevels der CNGC-Peptide als bei CPK1 gemessen wurden (Curran et al., 2011). 47 Tabelle 4: Relative Fluoreszenzergebnisse aus den BiFC-Versuchen mit CNGCs und CDPKs. Kanal CNGC9 CNGC12 CNGC17 CNGC20 1 Stärkere Fluoreszenz an C-Terminus N-Terminus N-Terminus C-Terminus Häufigkeit1 6/7 4/4 6/7 4/4 CPK34 > CPK12 8/8 3/3 4/4 2/3 Auswertung in wie vielen von wie vielen unabhängigen Versuchen die Interaktion (die BiFC-Signale) mit dem in der vorherigen Spalte angegebenen Terminus stärker waren. 2 Angabe in wie vielen von wie vielen unabhängigen Versuchen die Interaktion der CNGCs mit CPK34 stärker war als mit CPK1. Neben CPK1 und CPK34 wurden weitere Kinasen dieser Familie getestet. Abbildung 28 zeigt repräsentative Ergebnisse für CNGC12 und CNGC20. CDPKs interagierten stärker mit dem NTerminus von CNGC12 und schwächer mit dem C-Terminus (Abb. 28 A). Bei CNGC20 war es umgekehrt. Hier war die Bindung an den C-Terminus stärker (Abb. 28 B). Abbildung 28: Interaktion zwischen CNGC12 bzw. CNGC20 mit CDPKs in planta. BiFC-Versuche. Mittelwerte der aus Blattscheiben ermittelten Fluoreszenzintensitäten und Standardfehler zu jeweils einem repräsentativen Versuch zur Interaktion zwischen CNGC12 (A) bzw. CNGC20 (B) mit CDPKs. Neg – Negativkontrolle (VN-CNGC oder CNGC-VN + VC), Pos – Positivkontrolle (CNGC20-VN + VCCaM2), p19 – Hier wurde der Helferstamm p19 alleine infiltriert. n=4. 48 2. Ergebnisse Des Weiteren wurden unterschiedliche Bindestärken zwischen den CDPKs und CNGCs beobachtet. An CNGC12 band CPK34 am stärksten, gefolgt von CPK3 und CPK31. CNGC20 interagierte besser mit CPK3 als mit CPK34. Des Weiteren wurde eine konstitutiv aktive Variante von CPK34 (CACPK34) hinzugezogen, da zu diesem Zeitpunkt eine weitere Veröffentlichung erschien, die die Interaktion zwischen dem C-Terminus von CNGC18 und CPK32 unter Verwendung der konstitutiv aktiven Variante (CACPK32) zeigte. Die Interaktion aller getesteten Kanäle war mit CACPK34 jedoch schwächer als mit CPK34. Abbildung 29 stellt ein weiteres Beispiel eines BiFC-Versuches dar, in dem die Interaktion zwischen CPK1, CPK3, CPK9, CPK21, CPK23, CPK31, CPK34, sowie der konstitutiv aktiven Variante von CPK34 (CACPK34) und CNGC9 mit N- und C-terminaler Fusion der Fluorophorhälfte untersucht wurde. Neben CPK34 zeigte auch CPK3 eine stärkere Interaktion mit CNGC9, wie auch bei den anderen CNGCs (Abb. 29 C und D). Während unter Verwendung der meisten CDPKs BiFC-Signale im ER und am Rand der Zelle zu sehen waren, war die gelbe Fluoreszenz bei demselben Kanal mit CPK1 in großen und kleineren Aggregaten in den Zellen oder an deren Rand zu erkennen. Schwach ist auch eine leichte Netzstruktur zu erkennen, jedoch überwiegen unregelmäßig große Punkte (Abb. 29 A und B). Diese unterschiedliche Lokalisierung vor allem in stark leuchtenden Aggregaten schränkt die Vergleichbarkeit der BiFC-Signale ein, da die Fluoreszenz unterschiedlich verteilt ist und punktuelle Sättigungen des Verstärkers möglich sind, welche nicht unbedingt von dem Plattenlesegerät erkannt werden. Das erschwerte auch die Aufnahmen am konfokalen Laser-ScanningMikroskop (KLSM), da der Photomultiplier nicht sehr hoch gestellt werden konnte und somit weitere, gleichmäßiger verteilte Fluoreszenzen teilweise sehr schwach ausfielen. Ob die Kinasen einen Einfluss auf die Lokalisierung der Kanäle haben, wird im nächsten Kapitel (2.2.4) erläutert. Bei stärker leuchtenden Zellen waren bei Interaktionstests mit anderen CDPKs neben einer gleichmäßigen, feinen Netzstruktur am Rand der Zellen auch Streifen zu erkennen (Abb. 29 C-N). Ob dies von der Lokalisierung von CNGC9 oder von den CDPKs verursacht wird, ist unklar. Eine weitere Auffälligkeit war die stark geschwächte Interaktion mit der konstitutiv aktiven Variante von CPK34 (Abb. 29 O, P). Bei CACPKs fehlt die regulatorische Domäne, die ohne Ca2+-Bindung an die vier EF Hände der CaM-ähnlichen Domäne die Kinasedomäne blockiert. Der Abschnitt 2.1 dieser Doktorarbeit beschäftigt sich intensiv mit der Bindung von CaMs an CNGCs. Da CDPKs eine CaMähnliche Domäne besitzen und die BiFC-Signale durch deren Deletion stark geschwächt wurden, lag nun die Vermutung nahe, dass die Interaktion von CDPKs mit CNGCs darüber stattfinden könnte. Untersuchungen dazu werden in Kapitel 2.2.5 dargestellt. In planta konnten also mit Hilfe der BiFC-Methode Interaktionen zwischen vier CNGCs und CDPKs nachgewiesen werden, wobei die Kinasen an beiden Termini der Kanäle unterschiedlich stark banden und verglichen untereinander unterschiedliche Affinitäten aufwiesen. 49 Abbildung 29: Interaktion zwischen CNGC9 und CDPKs in planta. BiFC-Versuch. Konfokalmikroskopische Aufnahmen des Venus BiFC-Signals. Kombinationen aus VN-CNGC9 (linke Spalte) bzw. CNGC9-VN (rechte Spalte) und CPK1, CPK3, CPK9, CPK21, CPK23, CPK31, CPK34, sowie CACPK34. Größenstandard = 50 µm. 50 2. Ergebnisse 2.2.4 CDPKs beeinflussen die Lokalisierung von CNGCs nicht In Abschnitt 2.2.3 wurde beobachtet, dass die BiFC-Signale bei Verwendung derselben Kanaluntereinheit mit unterschiedlichen CDPKs subzellulär voneinander abwichen. Aus diesem Grund wurde untersucht, ob CDPKs einen Einfluss auf die Lokalisierung der Kanaluntereinheiten haben. Hierfür wurden sowohl N- als auch C-terminale GFP-Fusionen von CNGC9 und CNGC17 alleine oder mit CPK1-mCherry bzw. CPK34-mCherry in Tabak ko-exprimiert. Diese Untersuchungen werden folgend am Beispiel von CNGC9 erläutert. Abbildung 30: Ko-Expression von CNGC9 mit CPK1 und CPK34 in Tabakepidermiszellen. Konfokalmikroskopische Aufnahmen transformierter Tabakepidermiszellen. A-C: CNGC9-GFP, D-F: GFPCNGC9, B, E: + CPK1-mCherry, C, F: + CPK34-mCherry. Größenstandard = 50 µm. CNGC9-GFP zeigte eine undefinierbare Lokalisierung in großen Aggregaten in der Zelle (Abb. 30 A), welche nicht mit den Punkten bei CNGC20 (Abb. 22 R) vergleichbar ist. Mit einer N-terminalen GFP-Fusion (GFP-CNGC9) war der Kanal hauptsächlich im ER aufzufinden (Abb. 30 D). Man erkennt eindeutig eine Netzstruktur und einen Ring um den Kern. Häufig waren größere Aggregate um den Kern und kleinere am Rand aber auch in der Zelle zu beobachten, welche eine unregelmäßige Größe aufweisen. Ein Teil des Kanals könnte sich aber auch in der PM befinden. Das bedeutet, dass die Position des GFP am Kanal einen starken Einfluss auf dessen Lokalisierung hat. Dies wurde jedoch in der vorliegenden Arbeit nicht näher untersucht. CPK1 zeigte immer eine sehr schwache Fluoreszenz, war aber hauptsächlich im ER zu erkennen (Abb. 30 B und E, rot). CPK34-mCherry leuchtete am Rand der Zellen an der Plasmamembran und schwächer auch in Kern und Cytosol (Abb. 30 C und F, rot). Die Membranassoziation beider sonst löslicher CDPKs wird durch eine N-terminale 51 Myristoylierung ermöglicht (Cheng et al., 2002). CNGC9-GFP behielt die Lokalisierung in größeren Aggregaten bei Ko-Expression mit CPK1 bzw. CPK34 bei (Abb. 30 B bzw. C, grün). GFP-CNGC9 zeigte seine Lokalisierung hauptsächlich im ER auch in Anwesenheit von CPK1 (Abb. 30 E, grün/gelb). Eine Überlagerung der roten und grünen Fluoreszenz in der Netzstruktur um den Kern ist gelb dargestellt (Abb. 30 E, gelb). Bei der Ko-Expression von GFP-CNGC9 und CPK34-mCherry befindet sich die Überlagerung beider Signale hauptsächlich am Rand der Zelle (gelb), wobei diese Kinase weniger am ER assoziiert ist, da der Ring um den Kern (ER) in der Mitte der fokussierten Zelle nur grün ist und die lösliche, wahrscheinlich nicht myristoylierte CPK34 dazwischen im Kern rot leuchtet (Abb. 30 F). Obwohl sich die rote Fluoreszenz am Rand der Zelle, also an der PM konzentrierte, waren vermutlich myristoylierte und nicht-myristoylierte Varianten der CPK34 in diesen Zellen vorhanden (Abb. 30 C und F). Zusammenfassend konnte mit diesem Versuch gezeigt werden, dass die Lokalisierung von CNGC9 nicht von den beiden untersuchten CDPKs beeinflusst wurde. Jedoch war dabei eine Abhängigkeit von N- und C-terminaler GFP-Fusion an die Kanaluntereinheit zu beobachten. 2.2.5 CDPKs interagieren vermutlich über die CaM-ähnliche Domäne In Abschnitt 2.2.3 wurde beobachtet, dass das Signal zwischen CNGCs und CPK34 viel stärker war als in Kombination mit der konstitutiv aktiven Variante CACPK34 (Abb. 28, 29 M-P). Um zu überprüfen, ob die CaM-ähnliche Domäne in CDPKs für die Interaktion mit CNGCs verantwortlich ist, welche CaMs binden können, wurden weitere BiFC-Interaktionstests in Tabak mit ausgewählten CDPKs und CNGC20-Varianten durchgeführt. Wie bereits gezeigt wurde, erhielt man ein schwächeres BiFC-Signal zwischen CaM2 und CNGC20, wenn die IQ-Domäne fehlte (2.1.9.3). So war die gelbe Fluoreszenz schwächer bei der Kombination zwischen CNGC20∆IQ bzw. CNGC20∆C34 und CaM2 als mit der Volllänge des Kanals (Abb. 31). In diesem Versuch wurde eine starke Interaktion zwischen CNGC20 und CPK3 sowie CPK34 und eine schwächere mit CPK23 gezeigt. Bei allen CPK-Kombinationen mit CNGC20∆IQ bzw. CNGC20∆C34 war die Fluoreszenz im Vergleich zu der entsprechenden CNGC20-Volllänge-Kombination stark reduziert und verhielt sich somit wie die Interaktion mit CaMs. Dies würde darauf hindeuten, dass CDPKs über die CaMähnliche Domäne mit CNGCs interagieren. Allerdings kann ein schwächeres Signal der Kombinationen mit CNGC20∆C34 und CNGC20∆IQ auch auf eine reduzierte Proteinmenge zurückzuführen sein. Vielleicht werden die beiden Kanalproteine schneller abgebaut. Um dieses Ergebnis zu bestätigen, müssten jedoch noch weitere Versuche und Wiederholungen durchgeführt werden. Eine Bestimmung des Expressionslevels bzw. der Proteinmenge der Kanalvarianten ist für weitere Versuche ratsam. 52 2. Ergebnisse Abbildung 31: CDPKs interagieren schwächer mit CNGC20-Varianten, die keine IQ-Domäne enthalten. BiFC-Versuch. Mittelwerte der aus Blattscheiben ermittelten Fluoreszenzintensitäten und Standardfehler zu einem repräsentativen Versuch zur Interaktion zwischen CNGC20-Varianten-VN und VC-CaM2, CPK3-VC, CPK23-VC, CPK34-VC bzw. der löslichen C-terminalen Venushälfte als Nagativkontrolle. CPK34-VC: n=3; VC-CaM und VC: n=12. Da für CPK3-VC und CPK23-VC n=2 ist, wird dort kein Standardfehler angegeben. 2.2.6 CNGCs und CDPKs interagieren in Oocyten Zwischen CNGCs und CDPKs wurden Interaktionen mit Hilfe der BiFC-Methode in Tabak nachgewiesen. Parallel wurde ein anderes Expressionssystem hinzugezogen, in dem elektrophysiologische Untersuchungen von Ionenkanälen durchgeführt werden: Oocyten des Krallenfroschs Xenopus laevis. Auch in diesem System sollten die Interaktionen zwischen Kanal und Kinase untersucht werden. Dazu wurden gatewaykompatible BiFC-Vektoren für die Expression in Oocyten hergestellt, indem die komplette BiFC-Gatewaykassette aus den Tabak-BiFC-Vektoren (Gehl et al., 2009) in einen Expressionsvektor für Oocyten kloniert wurde. Die resultierenden Plasmide wurden wie folgt bezeichnet: pGEM-VYNE und pGEM-VYNE(R) für C- bzw. N-terminale Fusion der Nterminalen Hälfte von Venus, pGEM-VYCE und pGEM-VYCE(R) für C- bzw. N-terminale Fusion der C-terminalen Hälfte von Venus. Die Funktionalität der Vektoren wurde mit verschiedenen Kombinationen aus CNGC20 und CaM2, deren Interaktion bereits bekannt war (Fischer et al., 2013), getestet (Abb. 32 A). Des Weiteren wurden die cRNAs von CNGC20 und CaM2 in einem 1:4Verhältnis gemischt und injiziert. Auch mit reduziertem Anteil von CaM2 war eine deutliche Fluoreszenz erkennbar (Abb. 32 B). Somit war die Verwendung von Gemischen aus mehreren Kinasen mit CNGCs möglich. Da CNGC20 spezifisch mit nur einer der getesteten Phosphatasen am N-Terminus interagierte (Abb. 24) und für CNGC9 Phosphorylierungen durch CDPKs am N-Terminus nachgewiesen wurde (Curran et al., 2011), wurde CNGC20 zunächst mit N-terminaler Fusion einer Fluorophorhälfte (VCCNGC20) auf Interaktion mit CDPKs in Oocyten getestet. 53 Abbildung 32: Interaktion zwischen CNGCs und CDPKs in Oocyten. BiFC-Versuch. Konfokalmikroskopische Aufnahmen der gelben Fluoreszenz von Venus in Xenopus laevis Oocyten. Ausschnitte aus diesen Oocyten. Kombinationen können den einzelnen Bildern entnommen werden. E und F bzw. I und J zeigen zwei Oocyten, die dieselbe Kombination von Proteinen herstellen und demonstrieren wie unterschiedlich stark die BiFC-Signale in zwei Oocyten ausfallen können. 54 2. Ergebnisse Dazu wurden mehrere CPKs gleichzeitig mit CNGC20 in einer Oocyte exprimiert (Abb. 32 E-K). Überall wurde eine Fluoreszenz beobachtet, wobei diese sehr unterschiedlich ausfiel und einige Oocyten gar nicht leuchteten. Zur Injektion wurden selbst hergestellte Kanülen aus ausgezogenen Glaskapillaren verwendet. Die feinen dünnen Spitzen konnten sehr leicht beim Berühren der ersten Oocyte abbrechen. Außerdem kam es immer wieder vor, dass die Kapillaren währen des Injizierens verstopften. Daher konnte die Injektionsmenge nicht genau kontrolliert werden und eine Quantifizierung der Fluoreszenzintensitäten war nicht möglich. Oocyten, die VC-CNGC20 alleine als Negativkontrolle exprimierten, wiesen gar keine Fluoreszenz auf (Abb. 32 D). Nachdem aus den BiFC-Versuchen in Tabak bekannt war, dass CNGC20 stärker über den C-Terminus mit CDPKs interagierte (Tab. 3, Abb. 28), wurde der Kanal mit einer C-terminalen Fusion der Fluorophorhälfte (CNGC20-VC) zusammen mit CNGC19 (CNGC19-VC), mit dem der Kanal die Untergruppe IVA bildet (Mäser et al., 2001), auf Interaktion mit CPK3 untersucht (Abb 32 L). Auch hier konnte eine starke Fluoreszenz beobachtet werden. CNGC9 wurde sowohl auf Interaktion an N- als auch an CTerminus mit ausgewählten CDPKs (CPK3, CPK23, CPK30 und CPK34) getestet. Bei allen Kombinationen wurden Fluoreszenzen detektiert (Abb. 32 M-T). Die Interaktion mit CPK30 war immer sehr schwach, was mit den Ergebnissen aus den Tabak-BiFC-Versuchen einhergeht (für CNGC12 und CNGC20 in Abb. 28 gezeigt). Zur Überprüfung, ob die Kanäle auch in der Plasmamembran lokalisiert sind, wurde ein weiterer gatewaykompatibler Zielvektor für eine Cterminale GFP-Fusion hergestellt. CNGC20-GFP leuchtete am Rand der Oocyten (Abb. 32 C). Eine Anfärbung der Oocyten mit FM4-64 zeigte eine Überlagerung der grünen und roten Fluoreszenz (nicht gezeigt). So konnte davon ausgegangen werden, dass der Kanal die Plasmamembran erreicht. Mit diesen Versuchen wurde gezeigt, dass CNGCs und CDPKs in Oocyten interagieren und die Kanäle die Plasmamembran erreichen. Somit wurde der Grundstein für zukünftige funktionelle Expressionsstudien gelegt. 2.2.7 Die Herstellung löslicher rekombinanter CNGC-Termini erweist sich als schwierig In den bisherigen Versuchen wurde sowohl in Pflanzen als auch in Oocyten gezeigt, dass CDPKs mit CNGCs interagierten. Eine tatsächliche Proteinmodifikation der CNGCs durch Phosphorylierung wurde damit noch nicht nachgewiesen und bedarf weiterer Versuche. Für einen in vitro-Kinaseassay werden rekombinante N- bzw. C-Termini der CNGCs und CDPKs benötigt. Da die CDPKs stärker mit dem C-Terminus von CNGC20 (CNGC20-C) interagierten als mit dem N-Terminus (Tab. 3, Abb. 28), sollte der C-Terminus in E. coli exprimiert und affinitätschromatographisch aufgereinigt werden. Des Weiteren eignet sich dieses Protein auch für in vitro-Interaktionsstudien mit CaMs (MST MicroScale Thermophoresis; ITC - isothermal titration calorimetry), um weitere Untersuchungen zur Ca2+-Abhängigkeit der Interaktion durchzuführen. 1. Ansatz: CNGC20-C wurde mit einem His-Tag gekoppelt von E. coli exprimiert. Nach Aufschluss der induzierten Zellen wurde ein Löslichkeitstest durchgeführt. Das hergestellte Protein war 55 hauptsächlich in der nicht-löslichen Fraktion vorhanden. In silico-Analysen ergaben, dass der Isoelektrische Punkt (pI) für den C-Terminus von CNGC20 wie auch bei einigen weiteren Termini der CNGCs (Anhang) sehr hoch ist. Daher wurde vermutet, dass das Protein in den Bakterien nicht löslich ist und/oder in Einschlusskörperchen festgehalten wird. 2. Ansatz: Um die Löslichkeit zu verbessern, wurden mehrere Schritte vorgenommen: (i) Eine kürzere Form des C-Terminus wurde hergestellt (Aminosäuren 593-764). Diese kürzere Version hat einen leicht niedrigeren pI (Anhang). (ii) Ein anderer Bakterienstamm, SoluBL21, wurde ausgewählt. Dies ist ein verbesserter BL21-Stamm zur Herstellung sonst unlöslicher und selbst toxischer Proteine in löslicher Form (Angabe des Herstellers). (iii) Statt des His-Tags wurde ein größerer globulärer Tag, ein Maltosebindeprotein (MBP), ausgewählt. Dieser Tag sollte die Löslichkeit weiter erhöhen. Nun war es möglich, ein lösliches Protein herzustellen und aufzureinigen. Bei diesem Ansatz traten allerdings zwei Probleme auf. Die Ausbeute des gereinigten Proteins war sehr niedrig und der CTerminus konnte nicht von dem Tag getrennt werden. Bei dem Versuch den an der Säule gebundenen C-Terminus von dem MBP mit Proteasen abzuschneiden, wurde kein C-Terminus eluiert. Wahrscheinlich war das Protein ohne Tag instabil und fiel unter den für die MBP-Affinitätssäule optimalen Bedingungen aus. Abbildung 33: Proteinaufreinigung von CNGC20-C593-764. Coomassie-gefärbte SDS-Gele. A: Lauf1, B: Lauf2. Links der Gelbilder Größen des Proteinstandards in Kilodalton (kDa). P – Pellet, Ü – Überstand, DF1/2, Durchfluss Fraktion 1 und 2, W – Waschfraktion, S – PageRuler Prestained Proteinstandard, weitere Zahlen – Fraktionsnummern. Siehe Text (3. Ansatz). Die zugehörigen Chromatogramme befinden sich im Anhang. 3. Ansatz: Das Problem der geringen Ausbeute sollte mit einem doppelten Tag gelöst werden. Die für den kürzeren C-Terminus (Aminosäuren 593-764) kodierende cDNA-Sequenz wurde in den Vektor pVP13 kloniert. Das resultierende Protein S-His-MBP-CNGC20-C-Terminus593-764 konnte nun mit Hilfe des His-Tags aufgereinigt werden und war durch das MBP löslich. Die Reinigung wurde weiter optimiert, indem His-getagte Proteine zunächst unter Standardbedingungen über eine „HisTrap FF crude“-Affinitätssäule aus dem Zellextrakt isoliert wurden. Fraktionen, die das gewünschte Protein enthielten, wurden vereint, in Waschpuffer mit 20 mM Imidazol umgepuffert und wieder auf die Säule 56 2. Ergebnisse geladen. An der Säule gebundene Proteine wurden mit Waschpuffer, der 60 mM Imidazol enthielt, gewaschen und somit von unspezifisch gebundenen Proteinen getrennt. Letztendlich wurde ein saubereres Protein von der Säule eluiert. Das gewünschte Protein war auf einem SDS-Gel auf Höhe von ca. 68 kDa zu sehen und ein weiteres Protein auf Höhe von ca. 50 kDa konnte stark reduziert werden (Abb. 33). In Fraktion 9 des zweiten Laufs (Abb. 33 B) sieht man trotzdem noch weitere Banden. Diese könnten durch Größenausschluss weiter aufgetrennt werden. Das erfordert allerdings einen größeren Ansatz mit mehr Ausgangsprotein. Nun besteht leider immer noch das Problem, dass der C-Terminus ausfallen wird, wenn der Tag abgetrennt wird. Hierfür wird eine weitere Strategie benötigt. Mit 4,3 µM war die Konzentration für einen Kinaseassay hoch genug, welcher in Kooperation durchgeführt werden sollte. Leider hat sich dieser Versuch zeitlich verzögert und kam noch zu keinem Ergebnis. Mit diesen Ansätzen wurden neue Informationen für die Aufreinigung pflanzlicher CNGC-Termini gewonnen. Durch die Optimierung der Reinigung kann mehr und reines Protein hergestellt werden. Mit Hilfe von in vitro-Versuchen können nun weitere Informationen über CNGCs, deren Interaktionspartner und Regulation gewonnen werden. 57 3. Diskussion 3. DISKUSSION In dieser Arbeit wurde die Interaktion zwischen CNGCs und cytosolischen Proteinen untersucht, um Aufschluss über die Regulation der Kanäle zu erhalten. Aufgrund vorangehender Versuche wurde eine Regulation durch zwei antagonistische Paare angenommen. Zur Inaktivierung durch Calmoduline und Aktivierung durch zyklische Nukleotide lagen bereits erste Ergebnisse vor (Kaplan et al., 2007). Für eine posttranskriptionelle Modifikation der CNG-Kanäle durch Proteinkinasen und -phosphatasen existierten zu Beginn dieser Arbeit nur wenige Hinweise (Curran et al., 2011). Der Vergleich mit hyperpolarisationsaktivierten Kanälen, sowie tierischen CNGCs, ließ jedoch vermuten, dass auch die pflanzlichen CNG-Kanäle durch Phosphorylierung reguliert werden können (Kramer und Molokanova, 2001; Stoelzle et al., 2003; Chae et al., 2007). 3.1 Mögliche Regulation der CNGCs durch Phosphorylierung Im Rahmen dieser Arbeit wurde in Kollaboration mit der AG Grill (TU München) gezeigt, dass sowohl N-, als auch C-Termini einiger CNGCs mit Phosphatasen aus der Gruppe der PP2Cs interagierten (Abb. 24). Von sechs getesteten CNGCs waren drei (CNGC9, CNGC12, CNGC15) in der Lage Phosphatasen über beide Termini zu binden, zwei (CNGC2, CNGC20) über einen der beiden Termini und nur einer (CNGC3) zeigte keine Interaktion. Außerdem wurde festgestellt, dass manche Termini spezifisch nur eine Phosphatase banden und andere bis zu sechs der acht getesteten Phosphatasen. Interaktionen zwischen pflanzlichen CNGCs und Phosphatasen wurden bisher noch nicht gezeigt, wodurch diese Ergebnisse eine wichtige Grundlage zu weiteren Untersuchungen der Regulation der Kanäle bieten. Eine Dephosphorylierung setzt eine vorherige Phosphorylierung voraus. Wenn also eine Phosphorylierung durch eine bestimmte Kinase nachgewiesen wird, kann dann überprüft werden, ob eine oder mehrere dieser Phosphatasen das angefügte Phosphat wieder abspalten können. Mit Hilfe der Bimolekularen Fluoreszenzkomplementation (BiFC) wurden Interaktionen zwischen CNGCs und CDPKs nachgewiesen (Abb. 28, 29). Dabei banden alle getesteten CDPKs die verwendeten Kanäle unterschiedlich stark (CNGC9, CNGC12, CNGC17 und CNGC20, Abb. 28, 29). Zusätzlich wurden stärkere BiFC-Signale bei den Kombinationen der getesteten CNGCs mit CPK3 beobachtet, welche somit als Kandidat für zukünftige in vitro-Versuche in Frage kommt. Curran und Kollegen (2011) wiesen für Peptide von CNGC6, CNGC7, CNGC9 und CNGC18 Phosphorylierungen durch CPK1 und CPK34 nach, für CNGC7 zusätzlich durch CPK10. Diese entsprechen Regionen im N-Terminus von CNGC6 und CNGC9 und im C-Terminus von CNGC7 und CNGC18. Ein Großteil der Peptide wurde von CPK34 phosphoryliert (Curran et al., 2011). Somit scheint CPK34 - mit den vorliegenden BiFC-Versuchen übereinstimmend - relativ unspezifisch Zielproteine zu binden und zu phosphorylieren. 58 3. Diskussion Des Weiteren wurden bei den BiFC-Versuchen Fluoreszenzsignale in Kombinationen aus CDPKs und CNGCs festgestellt, unabhängig davon ob sich die Fusion der Fluorophorhälfte am N- oder am CTerminus des Kanals befand. Dies könnte zwar darauf hindeuten, dass die CDPKs sowohl mit N- als auch mit C-Terminus eines Kanals interagieren. Allerdings dominierten jeweils Kombinationen mit Fusion an einem Terminus über die mit der Fluorophorhälfte an dem anderen Terminus (Tab. 4). Dies könnte durch folgendes Modell erklärt werden (Abb. 34): Obwohl die Interaktion nur an einem Terminus des Kanals stattfindet, können sich die Fluorophorhälften auch in einer anderen Konstellation finden, da die CDPKs viel größer sind als CaMs (CPK34 ~ 58 kDa, CaM2 ~ 17 kDa). Für die Substraterkennung ist hauptsächlich die N-terminale variable Domäne der Kinasen zuständig (Ito et al., 2011). Wenn die Kinase nun über die N-terminale Domäne mit einem Terminus des CNGKanals interagiert, befindet sich die an die Kinase C-terminal fusionierte Fluorophorhälfte in einem unbekannten Abstand zu der Bindestelle des Interaktionspartners. Somit kann sich die andere Fluorophorhälfte, mit der das Fluorophor komplementiert wird, auch an einer anderen Position des Kanals befinden. Bei tierischen CNGCs ist bekannt, dass N- und C-Terminus interagieren (Trudeau und Zagotta, 2002), somit wäre eine räumliche Nähe für Möglichkeit 2 aus Abbildung 34 gegeben. Abbildung 34: Möglichkeit zum Erhalt N- und C-terminaler BiFC-Signale. Schematische Darstellung wie N- und C-terminale BiFC-Signale zustande kommen können, wenn ein großes Protein (hier: CDPK) an einen der Termini eines CNG-Kanals bindet. 1: Bindung an den C-Terminus des Kanals ermöglicht Komplementation mit der C-terminal an den Kanal fusionierten Fluorophorhälfte. 2: Bindung an den C-Terminus des Kanals könnte auch eine Komplementation mit der N-terminal an den Kanal fusionierten Hälfte ermöglichen. Sobald sich die Fluorophorhälften in räumlicher Nähe befinden - das kann ein Abstand von mehr als 10 nm sein (Hu et al., 2002) - bilden sie zusammen die typische Tonnenstruktur des Fluorophors aus und bleiben zusammen. Je länger man bis zur Auswertung wartet, desto mehr Fluorophorhälften finden sich durch Zufall. Dadurch entstehen falsch positive Signale. Deshalb wird die Eignung der BiFC-Methode zum Nachweis von Protein-Interaktionen stark diskutiert (Horstman et al., 2014). So wird zum Beispiel auch über das hier verwendete Vektorset berichtet, dass starke Hintergrundsignale auftraten und auch Negativkontrollen mit nicht rekombinierten Vektoren („Leervektoren“) Signale 59 zeigten (Gookin und Assmann, 2014). Dies wurde in dieser Arbeit auch in Kombination mit löslichen Proteinen (VN + CPK34-VC) beobachtet (nicht gezeigt). Jedoch weisen Kontrollen mit Membranproteinen sowie die vorliegenden Ergebnisse auf spezifische Interaktionen hin: (I) Negativkontrollen mit Kanal und Leervektor (CNGC-VN + VC) waren stets zuverlässig und wiesen Fluoreszenzen im Bereich des Hintergrundes auf. (II) In vorherigen Studien wurde mit CaMs gezeigt, dass Kombinationen mit VN-CNGC20 keine oder nur schwache Fluoreszenzen produzierten und somit eine spezifische Bindung nur am C-Terminus (CNGC20-VN + VC-CaM2) nachgewiesen wurde (Fischer, 2010). (III) Abgesehen davon kann man aufgrund der unterschiedlich starken Fluoreszenzen, die aus den Kombinationen mit verschiedenen CDPKs bzw. der Kopplung der Fluorophorhälfte an die verschiedenen Termini der Kanäle hervorgehen, (Abb. 28) und deren Reproduzierbarkeit davon ausgehen, dass es sich dabei um tatsächliche Interaktionen handelt. (IV) Außerdem befanden sich die BiFC-Signale subzellulär abhängig von der Lokalisierung der Interaktionspartner (Kap. 3.2). Seit der ersten Beschreibung der Zusammenlagerung von Fluorophoruntereinheiten und der Entwicklung zur Anwendung in Pflanzen wurde die Technik der Fluoreszenzkomplementation weiterentwickelt (Ghosh et al., 2000; Walter et al., 2004; Kodama und Hu, 2012). Um ähnliche Expressionslevel der beiden BiFC-Partner sicherzustellen, werden sie über ein gemeinsames Expressionsplasmid zusammen in die Zelle gebracht. Zusätzlich enthält das Plasmid ein Gen, das für ein weiteres anderes Fluorophor kodiert, welches zur Normalisierung der BiFC-Signale verwendet werden kann (Grefen und Blatt, 2012). Diese ratiometrische BiFC (rBiFC)-Methode erleichtert den Vergleich unterschiedlich exprimierender Blätter. Ein Nachteil ist die Notwendigkeit der Klonierung jeder einzelnen Kombination im Gegensatz zur bisherigen Verwendung eines Vektorsets, das nach Bedarf in verschiedenen Kombinationen eingesetzt werden kann. Im Gegensatz zu den BiFC-Versuchen wiesen direkte Interaktionsstudien in Hefen keine Bindung der getesteten CDPKs mit den N- oder C-Termini von CNGC20 und CNGC9 nach (Abb. 26, 27). Wie bereits erwähnt stimmen die BiFC-Ergebnisse mit bereits veröffentlichten Daten zur Phosphorylierung von Peptiden aus CNGCs bezüglich der geringen Spezifität von CPK34 und der Phosphorylierung durch/Interaktion mit mehreren CPKs überein. In einer später erschienenen Studie wurde eine Interaktion zwischen CPK32 und CPK34 mit CNGCs in Hefen untersucht (Zhou et al., 2014). Dort wurden die C-Termini aller 20 CNGCs mit diesen beiden CDPKs getestet, und es wurde nur eine Bindung zwischen dem C-Terminus von CNGC18 und CPK32 gefunden. Hier war also eine einzige von 40 Kombinationen positiv. Dies weist darauf hin, dass die YTH-Methode nicht so sensitiv ist wie BiFC oder dass weitere Faktoren die Interaktion in planta begünstigen. Dass die Interaktionen mit den CDPKs schwach sind, könnte zudem ein Grund für die geringe Zahl an nachgewiesenen CDPKBindungen im weniger sensitiven YTH sein. Denn in dem Versuch von Zhou und Kollegen band CPK34 keinen der C-Termini, auch nicht CNGC7 oder CNGC18, bei denen Peptide aus dem CTerminus in der Studie von Curran und Kollegen (2011) von CPK34 phosphoryliert worden waren. In Kapitel 3.4 werden mögliche Unterschiede zwischen diesen beiden Methoden näher erörtert. 60 3. Diskussion Prinzipiell besteht jedoch die Möglichkeit eine Interaktion mit CDPKs mit der YTH-Methode darzustellen. Die Kinasen wurden bereits in YTH-Versuchen eingesetzt und Bindungen nachgewiesen (Patharkar und Cushman, 2000; Lee et al., 2003; Rodriguez Milla et al., 2006). Zhou und Kollegen verwendeten in ihren YTH-Versuchen konstitutiv aktive CDPKs, also CDPKs ohne regulatorische Domäne (2014). Dies könnte für weitere Versuche in Hefen berücksichtigt werden. In dieser Arbeit wurde die konstitutiv aktive Variante von CPK34 (CACPK34) in BiFC-Versuchen eingesetzt, damit unabhängig von der umgebenden Ca2+-Konzentration die aktive Form für Interaktion und mögliche Phosphorylierung vorliegt. Die BiFC-Signale waren unter Verwendung von CACPK34 immer schwächer als jene mit CPK34 (Abb. 28, 29). Wurde CACPK34 in Oocyten exprimiert, starben diese Zellen schneller als solche, in denen Volllängen CDPKs hergestellt wurden (nicht gezeigt). Vermutlich phosphorylierte die konstitutiv aktive Variante aufgrund der geringen Spezifität auch einige endogene Proteine der Oocyten. Somit ist der Einsatz von CACPK34 in diesem System nicht möglich. Ob das BiFC-Signal in Tabak bei Kombinationen mit CACPK34 deshalb niedriger war, weil das Protein aufgrund seiner unspezifischen Aktivität abgebaut wurde, müsste per Western Blot nachgewiesen werden. Außerdem könnte die konstitutiv aktive Variante einer anderen CDPK, zum Beispiel von CPK3, in weiteren Versuchen getestet werden. Zur Überprüfung, ob die in den CACDPKs fehlende CaM-ähnliche Domäne direkt oder indirekt einen Einfluss auf die Interaktion zwischen CNGCs und CDPKs hat, wurden weitere BiFC-Versuche mit CDPKs und Varianten von CNGC20 durchgeführt (Abb. 31). Von CNGC20 wurden die Volllänge und zwei Deletionsvarianten eingesetzt, bei denen entweder nur die IQ-Domäne fehlt (CNGC20∆IQ) oder die letzten 34 Aminosäuren, die die IQ-Domäne beinhalten (CNGC20∆C34), deletiert sind. Die Bedeutung der IQ-Domäne als CaMBD wird in Kapitel 3.3 vertieft diskutiert. Die verwendeten CDPKs interagierten, wie bereits in Abbildung 28 gezeigt, unterschiedlich stark mit CNGC20. Diese Interaktion, wie auch die mit CaM2, war unter Verwendung von CNGC20-Deletionsvarianten geschwächt. Da sich die CDPKs ähnlich CaM2 bezüglich der Bindung an die CNGC20-Varianten verhielten, lag zunächst die Vermutung nahe, dass die IQ-Domäne als CaMBD einen Einfluss auf die Bindung hat. In der Literatur konnten trotz intensiver Suche keine Hinweise gefunden werden, dass die Substratbindung über die CaM-ähnliche Domäne der CDPKs erfolgt. Diese bindet nur das Pseudosubstrat zur Regulation der Kinase (Liese und Romeis, 2013). Somit ist die Interaktion der CDPKs mit CNGCs über die CaM-ähnliche Domäne fraglich. Für weitere Analysen könnten isolierte Komponenten, wie zum Beispiel die CaM-ähnliche Domäne und/oder die CaMBD für Interaktionsstudien eingesetzt werden. Des Weiteren sollte wie oben schon angedeutet in zukünftigen Experimenten überprüft werden, ob im Tabak eine vergleichbare Proteinmenge der CNGC-Varianten hergestellt wird, denn eine geringere Fluoreszenz bedeutet nicht unbedingt eine schwächere Bindung. Unterschiedliche Expressionen von CNGC-Varianten wurden bereits in Bakterien gezeigt (Ali et al., 2006). Die Proteinmenge kann zum Beispiel mit Hilfe von Myc- und HA-Tags, die sich an den BiFCKonstrukten befinden, überprüft werden. 61 Insgesamt konnten mit Hilfe der BiFC-Methode Interaktionen zwischen CDPKs und CNGCs in zwei verschiedenen Expressionssystemen (Tabak, Oocyten) nachgewiesen werden. Letztendlich muss nun gezeigt werden, dass CDPKs tatsächlich CNGCs phosphorylieren. Das kann mit Hilfe eines in vitro Kinaseassays erfolgen. Ein weiterer möglicher Ansatz wäre, die Versuche von Wang und Kollegen, die cGMP-aktivierte (Ba2+/)Ca2+-Ströme in Schließzellen gemessen und mit CNGC5 und CNGC6 in Verbindung gebracht haben, mit dem Einsatz von Kinaseinhibitoren zu erweitern (Molokanova et al., 1997; Stoelzle et al., 2003; Wang et al., 2013). Wenn man eine Veränderung dieser Ströme in Schließzellen durch einen Kinaseinhibitor hervorrufen könnte, erhielte man einen weiteren Hinweis zu einer möglichen Regulation der CNGCs durch Kinasen. CDPKs sind Serin/Threonin-Kinasen. Für CNGCs wurden aber auch Phosphorylierungen an Tyrosinen nachgewiesen (Anhang, PhosPhAt 4.0; Heazlewood et al., 2008; Durek et al., 2010). Abgesehen davon, dass Arabidopsis noch viele andere S/T-Kinasen besitzt, bedeutet das, dass neben CDPKs einige weitere Kinasen als Kandidaten zur Regulation der CNGCs in Fragen kommen. 3.2 Lokalisierung von CNGCs Die Ergebnisse dieser und anderer Arbeiten deuten darauf hin, dass die PM die Zielmembran für die meisten CNGCs darstellt: Für CNGC10 wurde durch Immunelektronenmikroskopie gezeigt, dass der Kanal in ER, Golgi und letztendlich der PM detektiert wurde und über die Endomembranen und Vesikel zur PM transportiert wird (Christopher et al., 2007). CNGC19 und CNGC20 besitzen einen längeren N-Terminus als alle anderen CNGCs aus Arabidopsis thaliana. Für sie wird durch verschiedene Algorithmen eine Lokalisierung in Chloroplasten vorhergesagt (Schwacke et al., 2003; Schwacke et al., 2007). Ein Targeting der GFP-Fusionen wurde weder zur Chloroplastenmembran noch zum Tonoplasten beobachtet (Fischer et al., 2013; Yuen und Christopher, 2013). Zusätzlich wurde gezeigt, dass CNGC20 unabhängig von N- oder C-terminaler GFP-Fusion zur Plasmamembran gesteuert wird (Fischer et al., 2013). Die Lokalisierung von CNGC9 war jedoch davon abhängig, an welcher Position das Fluorophor an den Kanal fusioniert war. Eine C-terminale Fusion beeinflusste das Targeting an die PM und die detektierte Fluoreszenz war hauptsächlich in Aggregaten zu sehen (Abb. 30 A). Dies wurde auch für andere CNGCs beobachtet. CNGC17-GFP wurde in unterschiedlich großen, rundlichen Gebilden detektiert (nicht gezeigt), auch für CNGC6 wurden Akkumulationen beschrieben (Lenz, 2015). Für den Kaliumkanal KAT2 wurde veröffentlicht, dass der C-Linker, die Verbindung zwischen der letzten Transmembrandomäne und der CNBD, zu der subzellulären Lokalisierung und Aktivität in der PM beiträgt (Nieves-Cordones et al., 2014). Für pflanzliche CNGCs wurde zudem gezeigt, dass die Kanaluntereinheiten über den C-Terminus (stärkstes BiFC-Signal mit Fluorophorhälften an den CTermini) miteinander interagieren (Lenz, 2015). Tierische CNGCs bestehen in den Stäbchenrezeptoren der Retina aus drei CNGA-Untereinheiten und einer CNGB-Untereinheit. Die 62 3. Diskussion CNGA-Untereinheiten werden durch einen C-terminalen auf die CNBD folgenden Leucinzipper miteinander verbunden (Zhong et al., 2003; Shuart et al., 2011). Aufgrund dieser Argumente wird nun die Hypothese aufgestellt, dass eine C-terminale Fusion von GFP die korrekte Lokalisierung von CNGC9 und weitere CNGCs wie CNGC6, CNGC14 (Lenz, 2015) und CNGC17 verhindert. Dahingegen hat die C-terminale Fusion von nur einem halben Fluorophor keinen negativen Einfluss auf das Targeting, denn in den BiFC-Versuchen von CNGCs mit CDPKs (Abb. 29 C-N), sowie mit sich selbst und mit anderen CNGCs (Lenz, 2015) erreichten die Kanäle ER und PM. Für CNGC6 und CNGC14 wurde beobachtet, dass die Fluoreszenz des komplementierten Venus bei Kanalfusionen mehr an der PM und weniger im ER detektiert wurde, als die GFP-Fluoreszenzen der Kanalfusionen, welche mehr am ER detektiert wurden (Lenz, 2015). Kürzlich wurde jedoch für CNGC15 aus Medicago truncatula eine Lokalisierung und Funktion als Ca2+-Kanal in der Kernmembran, die zum ER gehört, nachgewiesen (Charpentier et al., 2016). Somit könnte die beobachtete Lokalisierung im ER für z.B. CNGC2 und CNGC9 auch auf eine zusätzliche Funktion in diesem Organell hinweisen. Die C-Termini einiger CNGCs besitzen innerhalb der IQ-Domäne eine funktionelle Kernlokalisierungssequenz (NLS, nuclear localisation sequence) des Typs [YFW]RRRR[PL], die in CNGC20 funktionell ist und dessen isolierten C-Terminus in den Zellkern leitet (Rost et al., 2004; Fischer et al., 2013). Eine NLS im spannungsabhängigen Ca2+-Kanal CaV1.2 führt dessen C-Terminus in den Kern, wo dieser eine Funktion als Transkriptionsregulator hat (Gomez-Ospina et al., 2006). Eine Kernlokalisierung von CNGC20-GFP wurde noch nicht beobachtet (Fischer et al., 2013). Des Weiteren könnte dieser Bereich auch als Arginin-basiertes ER-Retentions- oder Entlassungssignal fungieren (Zerangue et al., 2001; Michelsen et al., 2005). Jedoch zeigte eine Deletion der letzten, dieses Motiv einschließenden 34 Aminosäuren (CNGC20∆C34-GFP) keinen Einfluss auf die Lokalisierung des Kanals (Fischer et al., 2013). Da CNGC20 in Hefen nicht wie in Pflanzen (Fischer et al., 2013) an die PM geleitet wurde (Abb. 25, konnten neue Interaktionspartner für den Kanal nicht mit Hilfe eines Split-Ubiquitin-Screens gesucht werden. GFP-Fusionen mit der Volllänge, als auch mit N- oder C-terminal verkürzten Verianten von CNGC20 wurden stets im ER detektiert. In anderen Arbeiten wurden ebenfalls CNGCs (CNGC1 und CNGC2) in Hefen lokalisiert (Mercier et al., 2004; Ali et al., 2006). GFP-Kanal-Fusionen leuchteten wie CNGC20 nicht nur in der Peripherie der Zellen, wie zum Beispiel von Wahl und Kollegen (2010) für die Lokalisierung eines Zuckertransporters gezeigt wurde, sondern in Aggregaten in den Zellen und in deren Peripherie. Obwohl ein Großteil der CNG-Kanäle in der Hefe in endogenen Aggregaten zu finden war, wurde die K+-Aufnahmedefizienz von Hefen durch CNGC1 und CNGC2 komplementiert (Mercier et al., 2004; Ali et al., 2006). Diese Komplementation lässt darauf schließen, dass ein geringer Teil der Kanäle die Plasmamembran erreichte. Dies ist in Analogie für CNGC20 ebenfalls anzunehmen. Bei den BiFC-Versuchen mit CNGC9 und CNGC17 fiel auf, dass die Signale bei Verwendung von CPK1 in unterschiedlich großen, punktuellen Strukturen innerhalb der Tabakzellen detektiert wurden 63 und bei den anderen CDPKs vornehmlich im ER und an der PM (Abb. 29). In Ko-Expressionsversuchen wurde daher überprüft, ob die Kinasen einen Einfluss auf die Lokalisierung von CNGCs haben (Kapitel 2.2.4). GFP-CNGC9 befand sich unabhängig der Ko-Expression mit CPK1 oder CPK34 im ER und zum Teil an der Plasmamembran (Abb. 30). Da CPK1 in Peroxysomen lokalisiert ist (Dammann, 2003), ist es möglich, dass die Formierung eines BiFC-Komplexes im ER zu einer teilweisen Mislokalisierung der CNGCs führt. Im Gegensatz dazu sind die anderen in diesen Versuchen verwendeten CDPKs (Abb. 29) hauptsächlich an der PM oder löslich im Cytosol lokalisiert (Boudsocq und Sheen, 2013) und stören somit das Targeting und Trafficking des CNG-Kanals nicht. Duale subzelluläre Lokalisierungen von CDPKs sind bereits bekannt (Chehab et al., 2004; Myers et al., 2009; Gutermuth et al., 2013). Eine zu große Menge des gebildeten Proteins wird oft in Aggregate weggeschlossen (Yokota et al., 1999; Khachatoorian et al., 2015). Sowohl in den verwendeten BiFC-, als auch in den GFP-Vektoren befindet sich ein 35S-Promotor. Dieser ist einer der stärksten Promotoren, die in Pflanzen aktiv sind (Strasburger et al., 2014) und sorgt für eine Überexpression der entsprechenden Gene. Für weitere Versuche bezüglich der Lokalisierung der CNGCs sollte ein weniger starker Promotor verwendet werden. Für CNGC20 wurde ein Konstrukt aus 2000 bp der CNGC20-Promotorsequenz und der genomischen Sequenz in einen GFP-Expressionsvektor kloniert und Arabidopsis stabil transformiert. In der ersten Generation selektionierter Pflanzen konnte jedoch gar keine Fluoreszenz detektiert werden (nicht gezeigt). Der Promotor von CNGC20 ist sehr schwach (Winter et al., 2007). 3.3 IQ-Domänen fungieren als CaMBDs in CNGCs Zu Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass pflanzliche CNGCs über den C-Terminus mit CaMs interagieren, aber nicht mit bisher getesteten CMLs (Kaplan, 2007; Fischer, 2010). Des Weiteren wurde die letzte α-Helix der CNBD, die αC-Helix, als CaMBD vorhergesagt und bestätigt (Köhler und Neuhaus, 2000; Arazi et al., 2000 a; Hua et al., 2003 a). Um auszuschließen, dass CMLs aufgrund ihrer subzellulären Lage nicht mit CNGCs interagierten, wurden diese und die CaMs in Tabak als GFP-Fusionen exprimiert. CaMs sowie CML8 und CML9 befinden sich in Cytosol und Kern (Abb. 9), CNGCs in der Plasmamembran und im ER (in Kapitel 3.2 besprochen). Daher wäre die Interaktion durch räumliche Nähe per se möglich. Eine tatsächliche Bindung wurde in Hefen bisher nur mit CaMs, aber nicht mit CMLs gezeigt (Fischer et al., 2013). Mit der BiFC-Methode wurden neben starken Fluoreszenzen unter Verwendung von CNGC20-VN und VC-CaM2 auch schwache Fluoreszenzen mit VC-CMLs beobachtet (Fischer et al., 2013), sodass eine schwache Interaktion mit CMLs in planta nicht ausgeschlossen werden kann (vgl. Kapitel. 3.1 Sensitivität der Methoden). CaMs interagierten mit dem C-Terminus von CNGC20 nicht in dem Bereich, der die αC-Helix beinhaltet, sondern in einem 34 Aminosäuren umschließenden Bereich dahinter, in dem ein IQ-Motiv 64 3. Diskussion vorhergesagt wurde (Fischer, 2010). Dieser neue Aspekt gab Anlass, die Untersuchung der CaMBindung in CNGCs zu vertiefen und alle 20 CNGCs einzubeziehen. Die Analysen wurden zunächst in Hefen durchgeführt. CaMs banden nicht an die N-Termini, aber an alle C-Termini, außer jene von CNGC11 und CNGC17 (Abb. 13). Demgegenüber interagierten die isolierten IQ-Domänen von CNGC11 und CNGC17 stark mit CaMs (Abb. 13). Das bedeutet, dass alle CNGCs aus Arabidopsis prinzipiell in der Lage sind, CaMs über ihren C-Terminus zu binden. Der Zugang zu den Domänen scheint in CNGC11 und CNGC17 aufgrund der Tertiärstruktur des C-Terminus nicht oder schwer möglich. Den Hefeversuchen zufolge findet die CaM-Bindung über IQ-Domänen statt (Abb. 10, 11, 13, 16, 17), welche zunächst als die einzigen CaMBDs in den C-Termini der CNGCs schienen. Sie alleine banden CaMs. Deletionen der IQ-Domänen aus dem C-Terminius verhinderte diese Interaktion (Abb. 10, 11, 17). Je weiter man den Bereich um die IQ-Domäne von CNGC19 wählte, desto stärker wurde die Interaktion (Abb. 16). So sind 16-30 Aminosäuren im Bereich um das IQ-Motiv für die CaM-Bindung verantwortlich. Bei einigen CNGCs reichte aber schon das 16-17 Aminosäuren lange Peptid aus, um stark mit CaMs zu interagieren (Abb. 13). Ali und Kollegen (2006) bewiesen mit den Komplementationsversuchen in Hefen indirekt auch eine wichtige Funktion der IQ-Domäne von CNGC1. Dieser Kanal konnte im Gegensatz zu CNGC2 und CNGC4 das Wachstum der K+-aufnahmedefizienten Hefen in Medium mit geringen K+-Konzentrationen weniger verbessern. CNGC1 mit C-terminalen Deletionen verbesserte das Hefewachstum stärker. So wurde vermutet, dass der Kanal durch das endogene CaM der Hefen inhibiert wird und durch Deletion eines Teils der αC-CaMBD diese Inhibierung verhindert wurde. Die IQ-Domäne wurde dabei nicht betrachtet. Abbildung 35: Sequenzausschnitt aus dem C-Terminus von CNGC1. Die Sequenzen der in dieser Arbeit verwendeten αC (gestrichelt) und IQ-Peptide (durchgehend) sind unterstrichen. Der graue Balken markiert, bis zu welcher Aminosäure die Deletionsmutante CNGC1M2 aus Ali et al. (2006) reicht. Abbildung 35 stellt einen Ausschnitt des C-Terminus des 716 Aminosäuren langen CNGC1 dar. Der Deletionsmutante M2 fehlten die Aminosäuren ab dem Lysin 622. Aus Sicht der in der hier vorliegenden Arbeit erhaltenen Informationen könnte man die Ergebnisse von Ali et al. auch so interpretieren, dass die CaM-bindende IQ-Domäne deletiert wurde und CNGC1M2 entweder durch die fehlende Inhibition durch endogenes CaM aktiv war oder die IQ-Domäne per se essentiell für die Funktion des Kanals ist. Somit konnte die Mutante diesen Hefen zu besserem Wachstum bei geringen K+-Konzentrationen verhelfen. 65 Die Ergebnisse der BiFC-Versuche mit Varianten von CNGC20 deuten darauf hin, dass die Interaktion mit CaMs in vivo nicht ausschließlich über die IQ-Domäne stattfindet, da CNGC20∆IQ und CNGC20∆C34 noch BiFC-Signale mit CaM2 ermöglichten (Abb. 22). Erst kürzlich wurden in vitro zwei weitere CaMBDs in CNGC12 nachgewiesen, wovon eine im N-Terminus und eine Cterminal von der IQ-Domäne lokalisiert ist (DeFalco et al., 2016). Spannungsaktivierte Ca2+-Kanäle, deren vier Shaker-like Domänen sich auf einer Aminosäurekette befinden, besitzen zwei CaMBDs am C-Terminus, eine IQ-Domäne und eine Prä-IQ-Domäne (Findeisen und Minor, 2010). Tierische CNGKanäle sind als Heterotetramere zusammengesetzt und manche Untereinheiten (UE) weisen zwei CaMBDs auf. CNG-Kanäle aus olfaktorischen Rezeptorneuronen bestehen aus zwei CNGA2-, einer CNGA4 und einer CNGB1b-UE, CNG-Kanäle aus retinalen Stäbchenrezeptoren haben drei CNGA1und eine CNGB1a-UE (Pifferi et al., 2006; Ungerer et al., 2011). Die CNGB1-UE besitzt eine Nterminale IQ-Domäne und eine weitere CaMBD am C-Terminus (Weitz et al., 1998). Für die Untereinheiten CNGB1b und CNGA4 wurde eine physiologisch relevante Funktion ermittelt (Bradley et al., 2004). Die IQ-Domäne von CNGB1b ist verantwortlich für die Ca2+-abhängige Desensibilisierung gegenüber cAMP (Waldeck et al., 2009). In aktiven CNG-Kanälen der Stäbchenrezeptoren interagieren der N-Terminus von CNGB1 und der C-Terminus von CNGA1 miteinander. Die Bindung von Ca2+/CaM an die N-terminale IQ-Domäne von CNGB1a unterbricht die Verbindung der Kanaluntereinheiten. Damit wird die cGMP-Sensitivität reduziert (Trudeau und Zagotta, 2002; Trudeau und Zagotta, 2004). In pflanzlichen CNG-Kanälen wurden Assemblierung und Interaktionen zwischen den Untereinheiten noch nicht genau untersucht, aber BiFC-Versuche zeigten für CNGC6 unter Verwendung von Kombinationen aus CNGC6-VN und VC-CNGC6 BiFC-Signale, auch wenn diese sehr viel schwächer waren, als die von der Kombination CNGC6-VN und CNGC6VC (Lenz, 2015). 3.4 Ca2+-Abhängigkeit der CaM-Bindung an CNGCs Der Overlay-Assay mit CNGC20-C aus dieser Arbeit zeigte wie bereits in den Versuchen von Köhler und Neuhaus (2000) mit CNGC1-C, dass die Interaktion zwischen C-Terminus und CaMs in vitro Ca2+-abhängig ist (Abb. 20). Auch die Ergebnisse der Hefeexperimente mit mutiertem CaM2 deuteten darauf hin, dass die Bindung an CNGC19-C und CNGC20-C über den CaM C-Lobe Ca2+-abhängig stattfindet (Abb. 21). Diese C-Termini banden CaM2, aber nicht oder nur sehr schwach CaM2E3,4A. Der C-Terminus von CNGC2 interagierte mit CaM2 und CaM2E3,4A gleichermaßen. Somit unterscheiden sich die CNGCs in ihren Bindeeigenschaften. Im Gegensatz zu den C-Termini von CNGC19 und CNGC20 interagierten die IQ-Peptide von CNGC2, CNGC19 und CNGC20 Ca2+unabhängig mit dem C-Lobe von CaM2, denn es wurde kein Unterschied im Hefewachstum in Gegenwart von CaM2 oder CaM2E3,4A beobachtet und die Hefen wuchsen nicht in Gegenwart des CaM2 N-Lobes (Abb. 19, 21). Die Ca2+-Unabhängigkeit besteht in Übereinstimmung mit dem 66 3. Diskussion Verhalten von IQ-Motiven in tierischen Proteinen, bei denen IQ-Motive als Ca2+-unabhängige CaMBindemotive etabliert sind (Rhoads und Friedberg, 1997). Aus dem unterschiedlichen Verhalten von IQ-Peptiden und C-Termini ergibt sich die Frage, wie es zu einer Ca2+-Abhängigkeit kommt, wenn die IQ-Domänen für eine Ca2+-unabhängige Bindung zuständig sind, aber die C-Termini ohne IQ-Domäne keine CaMs mehr binden können (Deletionsanalysen Abb. 21, 10, 11, 17). Die GT-Mutationen im N-terminalen Bereich der IQ-Domänen demonstrierten, dass die Alanine an Position -3 und -4 (mit Isoleucin an Position 0 und Glutamin an Position +1) vor dem IQ-Motiv von großer Bedeutung für die CaM-Bindung sind. In den Arbeiten zur Untersuchung von IQ-Domänen betrachteten Black und Persechini (2010) auch die Aminosäuren bis -4, in einer späteren Arbeit auch bis Position -8 (2011). In tierischen spannungsabhängigen Ca2+-Kanälen (CaV) wurde in der Gruppe der CaV1 Interaktionen zwischen CaM und aromatischen Aminosäuren der Kanäle von Position -6 bis +7 in Bezug auf das IQ-Motiv in Kristallstrukturen gezeigt. Bei CaV2-Kanälen geht der Bereich von -9 bis +5 (Findeisen und Minor, 2010). Bei der Erweiterung der IQ-Domäne von CNGC19 wurden auch Aminosäuren bis Position -7 eingeschlossen. Das erweiterte IQ-Peptid band nun CaMs im Gegensatz zu dem 16 Aminosäuren langen Peptid, das ab Position -4 begann (Abb. 16). Zudem wurde durch Kristallisierung bestätigt, dass die Länge des verwendeten IQ-Peptids einen Einfluss auf die Bindung von CaM daran hat. IQ-Domänen von CaV1-Kanälen werden parallel gebunden (Fallon et al., 2005), die von CaV2-Kanälen antiparallel (Kim et al., 2008). Eine parallele Bindung bedeutet, dass sich der N-Lobe von CaM am Anfang der α-Helix befindet, der C-Lobe weiter C-terminal. Bei der antiparallelen Interaktion befindet sich der C-Lobe weiter vorne am IQ-Peptid als der N-Lobe. Unter Verwendung eines längeren Peptids (25 Aminosäuren), das die Position -9 einschließt, band CaM antiparallel an CaV2.1 und CaV2.3 (Kim et al., 2008), an einem kürzeren Peptid ohne den Anker an Position -9 parallel (Mori et al., 2008). Eine ähnliche Vielfalt an CaM-Bindungsmodalitäten scheint aus den hier vorgelegten Ergebnissen auch für pflanzliche CNGCs wahrscheinlich. Unter den sich in vivo ändernden Ca2+-Konzentrationen ist überdies eine dynamische Assoziation und Dissoziation mit dem N- und C-Lobe von CaM wahrscheinlich, sodass sich auch die mit CaM interagierenden Aminosäuren je nach Zugänglichkeit und Ca2+-Konzentration verändern können. So wurde zusätzlich zu der Ca2+-abhängigen Regulation von tierischen Kanälen durch CaM nachgewiesen, dass CaM bereits unter Ruhebedingungen als Apo-CaM mit den Kanälen assoziiert ist (Erickson et al., 2001; Bradley et al., 2004). Dies ermöglicht eine Wahrnehmung der Änderung der Ca2+-Konzentration in der Nähe des Kanals und eine schnelle Feedbackregulierung durch ein Ca2+-induziertes Rearrangement der CaM-Bindung, welche notwendig ist, da hohe Ca2+-Konzentrationen auf Dauer toxisch für die Zellen sind. Reddy und Kollegen (2011) wiesen darauf hin, dass die YTH-Methode wegen der Schwierigkeit der Manipulation der zellulären Ca2+-Konzentration kein ideales System zur Untersuchung von ProteinProtein-Interaktionen mit CaMs darstellt. Jedoch muss berücksichtigt werden, dass die in dieser Arbeit erhaltenen YTH-Ergebnisse reproduzierbar waren und keinen Schwankungen unterlagen. Es ist jedoch 67 möglich, dass mit der YTH-Methode ein bestimmter Modus der Interaktion darstellbar ist, während die BiFC-Signale einen anderen Modus beleuchten. Angenommen dieser Unterschied kann mit der Ca2+-Abhängigkeit der Interaktion in Verbindung gebracht werden. Nun wird aufgrund der vorliegenden Ergebnisse postuliert, dass man in Hefen nur Interaktionen bei geringeren Ca2+-Konzentrationen bzw. Ca2+-unabhängige Interaktionen darstellen kann. Der C-Terminus von CNGC2 interagierte sehr gut mit CaM2E3,4A, also unabhängig davon, ob der Ca2+-affinere C-Lobe Ca2+ gebunden hatte. Eine Bindung des N-Lobes wurde mit dieser Methode nicht gezeigt. Mit der Mutation der beiden Alanine an Position -3 und -4 zu Glycin und Threonin im C-Terminus von CNGC2 könnte der Kd-Wert dieser Interaktion erhöht werden, sodass CNGC2CGT schlechter mit CaM2E3,4A interagierte, weniger Reportergen exprimiert wurde und die Hefen schlechter auf Selektionsmediumplatten wuchsen. Mit der BiFC-Methode konnte aber auch noch die Interaktion zwischen CNGC2GT und CaM2E3,4A gut dargestellt werden und somit sieht man hier keinen Unterschied zwischen der Stärke der CaM2E3,4A-Bindung an CNGC2 oder CNGC2GT. Ob dies daran liegt, dass hier die Bindung des Apo-C-Lobes aufgrund höherer Sensitivität der Methode oder die Bindung des N-Lobes aufgrund höherer Ca2+-Konzentrationen in den Pflanzenzellen dargestellt wird oder es eine Kombination aus beidem ist, ist bislang unklar. Ein Einfluss weiterer Faktoren, die unter Verwendung des Volllängenkanals hinzukommen, kann nicht ausgeschlossen werden. Diese Annahme eines Unterschieds in der Ca2+-Abhängigkeit der beiden verwendeten Methoden ist bisher nur spekulativ und muss mit weiteren Experimenten überprüft werden. Zu solchen Versuchen gehört zum Beispiel die Bestimmung der Kds für die Interaktion zwischen IQ-Domäne und CaM bei verschiedenen Ca2+-Konzentrationen sowie der Vergleich der CaM-Bindeeigenschaften zwischen IQDomäne und C-Terminus und der Einfluss der GT-Mutation darauf. 3.5 Modell zur CaM-abhängigen Regulation der CNGCs Die in dieser Arbeit vorgelegten Ergebnisse sind nicht mehr kompatibel mit dem einfachen kompetitiven Modell zur Regulation der pflanzlichen CNGCs durch zyklische Nukleotide und CaMs, welches darauf basiert, dass die αC-Helix als ein Teil der CNBD zugleich als Bindedomäne für CaMs fungiert (Arazi et al., 2000 b; Kaplan et al., 2007). Mit Hilfe der in dieser Arbeit erhaltenen Daten und mit Kenntnissen aus CaM-Interaktionsstudien zu tierischen Kanälen wird ein verändertes und erweitertes Modell erarbeitet, welches auf den folgenden Ergebnissen basiert: 1. Pflanzliche CNGCs bilden Homo- und Heterotetramere (Finn et al., 1996; Lenz, 2015). Somit stehen vier C-Termini mit jeweils einer CNBD sowie einer IQ-Domäne als CaMBD zur Verfügung (siehe 2.). Spannungsänderung, aber besonders die Bindung zyklischer Nukleotide führen zu einer allosterischen Konformationsänderung und Öffnung des Kanals. 68 3. Diskussion 2. Jeder C-Terminus besitzt eine CNBD (Kaplan et al., 2007) und eine IQ-Domäne als CaMBD (Abb. 13, 16). 3. Der C-Lobe von CaM bindet Ca2+-unabhängig an die IQ-Domäne (Abb. 19, 21). 4. CaM kann auch Ca2+-abhängig an den C-Terminus binden (Abb. 20, 21, Kapitel 3.4). 5. Der N-Lobe bindet Ca2+-abhängig an den C-Terminus/die IQ-Domäne (19, 21, Kapitel 3.4). 6. Die IQ-Domänen unterscheiden sich in Bezug auf die mit CaM interagierenden Reste sowie die Ca2+-Abhängigkeit der Interaktionen mit C- und N-Lobes der CaMs. (Abb. 13, 15, 16, 21). Bei Ca2+-Abwesenheit nimmt Calmodulin am N-Lobe einen geschlossenen und der C-Lobe einen halboffenen Zustand ein (Swindells und Ikura, 1996). Letzterer präsentiert somit einen hydrophoben Bereich zur Interaktion mit IQ-Domänen. So kann CaM unter Ruhebedingungen hauptsächlich über den C-Lobe mit Zielproteinen interagieren (Chin und Means, 2000). Werden IQ-Domänen Ca2+unabhängig von CaMs gebunden, dann sind diese bereits unter Ruhebedingungen präassoziiert (Abb. 36). Dies wurde bereits für tierische CNG-Kanäle gezeigt (Erickson et al., 2001; Bradley et al., 2004). Da die IQ-Domäne in diesen Kanälen außerhalb der CNBD liegt, wird angenommen, dass die Präassoziation von CaM die Bindung von zyklischen Nukleotiden nicht beeinflusst. Dieser Zustand ermöglicht jedoch die schnelle Wahrnehmung lokaler Konzentrationsänderungen von Ca2+, die durch das Öffnen der Kanalpore der CNGCs verursacht wird. Die Ca2+-induzierte Änderung der CaMAssoziation durch Ca2+-Besetzung und Bindung des N-Lobes kann somit in einer schnellen FeedbackRegulation der Kanäle resultieren. Der CaM-präassoziierte Kanal kann auch der Wahrnehmung globaler [Ca2+]-Änderungen dienen und eine Modifizierung/Desensitivierung des Kanals hervorrufen. Die Aufgaben der Wahrnehmung von globalen und lokalen Änderungen der Ca2+-Konzentration wurde bei tierischen CaMs an CaV-Kanälen den verschiedenen Lobes zugeordnet (Tadross et al., 2008). Um dies auf pflanzliche CNGCs übertragen zu können, müssen diese zunächst näher elektrophysiologisch charakterisiert werden. Der C-Lobe von CaM besitzt eine höhere Affinität für Ca2+ als der N-Lobe (Teleman et al., 1986; Chin und Means, 2000; Astegno et al., 2016). Bei steigender [Ca2+] binden beide Lobes bis zu vier Ca2+ und gehen eine Konformationsänderung zum offenen Zustand ein. Dabei zeigen beide Lobes größere hydrophobe Bereiche, besonders Methionine, und können amphiphile α-Helices binden (O'Neil und DeGrado, 1990; Vogel und Zhang, 1995). Das Vorhandensein der IQ-Domäne, der αCHelix als CaMBD, sowie kürzlich gezeigt auch einer weiteren C-terminalen CaMBD (DeFalco et al., 2016) lässt nun die Spekulation über verschiedene Möglichkeiten der CaM-Bindung oder umorientierung zu: (a) CaM bleibt mit dem C-Lobe unabhängig von der Ca2+-Konzentration an der IQ-Domäne gebunden und der N-Lobe bindet zusätzlich (Abb. 36 A). – Vollständige Bindung von CaM. – Ob dies parallel oder antiparallel stattfindet, muss individuell untersucht werden (Fallon et al., 2005; Kim et al., 2008). 69 (b) Da der an die IQ-Domäne präassoziierte C-Lobe auch Ca2+ bindet und sich strukturell umorientiert, könnte sich das ganze CaM umlagern und an einen anderen Bereich des Kanals binden. Außerdem könnte Ca2+-geladenes CaM aus der Umgebung an eine der möglichen CaMBDs binden (Abb. 36 B). – Bindung an eine andere CaMBD (Kim et al., 2010; Ben-Johny und Yue, 2014; DeFalco et al., 2016). (c) Aus (a) oder (b) hervorgehend kann man außerdem annehmen, dass die beiden Lobes eines CaMs unterschiedliche Reste binden und somit verschiedene Bereiche eines C-Terminus einer Kanaluntereinheit (c1) oder gar zwei Kanaluntereinheiten miteinander (c2) verbinden (Abb. 36 C). – Verbindung von CNGC-Strukturen, eine Beteiligung der N-Termini ist dabei nicht ausgeschlossen (Ben-Johny und Yue, 2014; DeFalco et al., 2016). Abbildung 36: Modell zur Regulation von CNGCs durch CaM. TMDs einer Untereinheit sind jeweils zusammen in einem großen Zylinder dargestellt. Vier Zylinder (I, II und III, IV dahinter – Beschriftung verdeckt) bilden ein Kanal-Tetramer. Zur Vereinfachung ist mit Ausnahme von c2 (C-Termini von zwei Untereinheiten) nur ein C-Terminus einer Kanaluntereinheit dargestellt. Erläuterung zum Regulationsmechanismus in Text. Wie genau die Bindung von CaM an pflanzliche CNGCs erfolgt, muss in zukünftigen Experimenten vertieft untersucht werden. In bisherigen Studien mit wenigen pflanzlichen CNGCs wurde die Inhibition der Transportaktivität der Kanäle durch CaMs beleuchtet. (Hua et al., 2003 a; Kaplan et al., 2007; DeFalco et al., 2016). Hier wird die Inaktivierung und/oder Schließung des Kanals 70 3. Diskussion angenommen. Die IQ-Domäne und/oder Assoziation mit CaM stellt jedoch wahrscheinlich eine für die Funktion des Kanals essentielle Eigenschaft dar. An dieser Stelle stehen noch einige Fragen offen, die durch in vitro Versuche sowie Kristallstrukturen geklärt werden können. Des Weiteren ist es wichtig die CNGCs in ein größeres Bild einzufügen. Es ist zwar bekannt, an welchen physiologischen Funktionen die Kanäle beteiligt sind (s. Kap. 1.5.1), aber an welcher Stelle der Signalkette sie eingeordnet werden können, ist zumeist unklar. Ein erster Ansatz zeigt durch Interaktionsstudien die Zusammenfügung von CNGC17 mit einer Rezeptorkinase über einen Ko-Rezeptor und mit einer H+-ATPase (Ladwig et al., 2015). Des Weiteren wäre interessant zu wissen, ob die CNGCs unmittelbar Ca2+-Signale erzeugen, oder ob sie an sekundären Signalen beteiligt sind (Rentel und Knight, 2004; Ranf et al., 2011; Charpentier et al., 2016). 3.6 Ausblick Durch direkte Interaktionsstudien wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass CDPKs CNGCs binden. Für die Identifizierung neuer Interaktionspartner bietet sich der Pulldown-Assay mit ArabidopsisZellextrakten an, da das Hefesystem aufgrund von Mislokalisierungen weniger geeignet scheint. Mit dieser Methode wäre es vermutlich nicht möglich Partner schneller, transienter Interaktionen zu finden. Eine weitere sehr interessante Methode ist die BioID, mit der Proteine, die sich in räumlicher Nähe zu dem zu untersuchenden Protein befinden, markiert werden und somit mögliche Reaktionseinheiten identifiziert werden können. Bei diesem Ansatz wird eine Biotinligase-POI (protein of interest)-Fusion in lebenden Zellen hergestellt. Dadurch werden Proteine biotinyliert, die in räumliche Nähe dieses Komplexes kommen. Nach Zelllyse können diese Proteine affinitätsgereinigt und mit Massenspektrometrie identifiziert werden (Roux et al., 2012). Andererseits werden mit Hilfe diverser Datenbanken weitere Kinasen, unter anderem auch Rezeptorkinasen als mögliche Interaktionspartner für CNGCs vorhergesagt, die mit direkten Interaktionsansätzen untersucht werden können. Diese Datenbanken tragen unter anderem experimentelle Daten, aber auch Vorhersagen aufgrund von Ko-Expressionsdaten zusammen (Reddy et al., 2011; Chatr-Aryamontri et al., 2015; Szklarczyk et al., 2015; Aoki et al., 2016). Gegen Ende der experimentellen Phase zu der vorliegenden Arbeit war angedacht, in einem Kinaseassay zu untersuchen, ob und wo die interagierenden CDPKs CNGCs phosphorylieren, was jedoch leider aus zeitlichen Gründen nicht mehr stattfinden konnte. Sofern eine solche Position bekannt ist, können funktionelle Studien der Kanäle mit phosphomimetischen Ansätzen durchgeführt werden, bei denen die Funktion entweder durch in planta Komplementation oder durch funktionelle Expression in heterologen Systemen analysiert wird. Weiterhin wurde in der vorliegenden Studie die Interaktion mit CaMs genauer untersucht. Dort wurde gezeigt, dass die C-Termini von CNGCs unterschiedlich stark von den beiden CaM-Lobes gebunden wurden (Abb. 19). Ziel zukünftiger Arbeiten wäre eine genauere Bestimmung der CaM-Bindeaffinität 71 und der Ca2+-Abhängigkeit, um ein Modell zur Ca2+-Regulation der CNG-Kanäle aufstellen zu können. Hierfür könnten in vitro-Methoden wie ITC, MST oder Biacore dienen, die jedoch die Produktion von teilweise größeren Mengen aufgereinigter Proteine erfordern. In dieser Arbeit gelang bereits die Aufreinigung der C-Termini von CNGC20 und CNGC2 in E. coli als S-His-MBP-Fusion, welches in größerem Maßstab für die Gewinnung des nötigen Proteinmaterials genutzt werden kann. Des Weiteren wäre von großer Bedeutung herauszufinden, welche Aminosäuren an der Interaktion mit CaM beteiligt sind und ob und wie sich das CaM bei unterschiedlichen Ca2+-Konzentrationen umlagert. Um diese Fragen zu klären, wären Kristallstrukturen sehr hilfreich (Kristallisierung unter verschiedenen Ca2+-Bedingungen). Das Problem der schlechten Löslichkeit der C-Termini ohne Tag besteht noch immer (Kapitel 2.2.7). Daher müssten zunächst die Versuche mit Tag durchgeführt und der Tag alleine ohne Fusion mit einem C-Terminus als Kontrolle verwendet werden. Statt den CTerminus über einen großen, globulären Tag aufzureinigen, könnte man einen N-terminal getagten CTerminus - da die Interaktion im hinteren Bereich des C-Terminus erwartet wird - mit CaM koexprimieren. Der isoelektrische Punkt von CaM2 ist im Gegensatz zu dem des C-Terminus von CNGC20 saurer und liegt bei 4,1. Wenn die beiden Proteine stark interagieren, können sie so gemeinsam affinitätschromatografisch isoliert werden. Eine weitere Möglichkeit wäre, die beiden Proteine über einen flexiblen Linker miteinander zu verbinden und dieses Fusionsprotein nach Reinigung unter verschiedenen Ca2+-Bedingungen zu kristallisieren. Die genaue Bindung der CaMs zu erforschen würde insofern weiterhelfen, den Gatingmechanismus zu verstehen und durch gezielte Mutationen die Kanäle aktiv zu bekommen oder leichter aktivierbar zu machen. Außerdem ist zu betrachten, dass die Funktionalität und Aktivität der Kanäle von weiteren Faktoren beeinflusst wird. So spielt die Assemblierung der Homo- oder Heterotetramere eine wichtige Rolle. Wenn man die CNGA1-, CNGCA2- oder CNGA3-Untereinheiten der tierischen CNGCs in heterologen Systemen exprimiert, bilden sie funktionelle Kanäle, die durch zyklische Nukleotide aktiviert werden können. Die anderen Untereinheiten können das nicht (Pifferi et al., 2006). Mit Hilfe von BiFC-Versuchen mit pflanzlichen CNGCs wurden sowohl Interaktionen zwischen denselben Untereinheiten, als auch zwischen unterschiedlichen Untereinheiten gezeigt (Lenz, 2015).Vielleicht wurden von den pflanzlichen CNG-Kanälen noch nicht die zueinander passenden Kombinationen zusammen exprimiert. Spannungsabhängige Ca2+-Kanäle der Gruppen 1 und 2 besitzen zwar alle vier Untereinheiten auf einer Aminosäurekette, benötigen aber ein weiteres Protein, die β-Untereinheit, zum Transport an die richtige Membran und für biophysikalische Eigenschaften (Dolphin, 2003; Buraei und Yang, 2010). Weitere Regulatoren von tierischen CNGCs und HCNs sind membrangebundene Phosphoinositide. PI(3,4)P2 und PI(2,3,5)P3 inhibieren diese Kanäle (Womack et al., 2000; Bright et al., 2007), während die Aktivierung der HCNs positiv beeinflusst wird (Pian et al., 2007). So könnten sich zukünftige Untersuchungen auch in diese Richtungen vertiefen. 72 4. Material und Methoden 4. MATERIAL UND METHODEN 4.1 Material 4.1.1 Organismen Tabelle 5: Verwendete Bakterienstämme. Stamm Genotyp/Resistenz Referenz E. coli DB3.1 F–, gyrA462, endA1, Δ(sr1-recA), mcrB, mrr, hsdS20(rB–, mB–), Invitrogen, Karlsruhe supE44, ara-14, galK2, lacY1, proA2, rpsL20(SmR) xyl-5, λ–, leu, mtl1 DH5α F–, Φ80lacZΔM15, Δ(lacZYA-argF) U169, recA1, endA1, Hanahan (1983) hsdR17 (rK–, mK+), phoA, supE44, λ–, thi-1, gyrA96, relA1 SoluBL21 F-, ompT, hsdSB (rB- mB-), gal, dcm, (DE3) AMS Biotechnology A. tumefaciens C58C1 p19 Deblaere et al. (1985) RifR, AmpR, KmR Voinnet et al. (2003) Tabelle 6: Verwendete Hefestämme. Stamm Genotyp AHA109 Mat a, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4∆, gal80∆,LYS2 : : GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2, URA3 : : MEL1UAS-MEL1TATA-LacZ, MEL1 SEY2102 Mat a, ura3-52, leu2-3, 112, his4-519, suc2-∆9,gal2 Referenz Clontech A. Holz, nicht veröffentlicht Emr et al. (1983) Tabelle 7: Verwendete Arabidopsis thaliana-Linien. Linie Beschreibung Referenz Col-0 Ökotyp, Wildtyp NASC, UK Col-0 Aeq Expression von Aequorin in Col-0 unter Kontrolle des Petra Dietrich 35S-Promotors dnd1=cngc2-1 Mutantenlinie, Punktmutation in CNGC2 dnd1/VL Expression von CNGC2 im dnd1-Hintergrund, 35S- Ignatz (2008) Promotor, CNGC2/pMDC32 dnd1/CaM Expression von CNGC2 mit Mutation in αC (FRY Ignatz (2008) 645-647 zu AAA) im dnd1-Hintergrund, 35SPromotor, CNGC2FRY645-647AAA/pMDC32 dnd1/∆C Expression von CNGC2 ohne C-Terminus im dnd1- Ignatz (2008) Hintergrund, 35S-Promotor, CNGC21-517/ pMDC32 dnd1/2M Expression von CNGC2 mit Mutationen in der CNBD Ignatz (2008) im dnd1-Hintergrund, 35S-Promotor, Clough et al. (2000) 73 CNGC2G599A,D600A/pMDC32 dnd1/IQm1 Expression von CNGC2 mit Mutationen in der IQ- diese Arbeit Domäne im dnd1-Hintergrund, 35S-Promotor, CNGC2RKR681-683AAA/pMDC32 dnd1/IQm2 Expression von CNGC2 mit Mutationen in der IQ- diese Arbeit Domäne im dnd1-Hintergrund, 35S-Promotor, CNGC2RRR678-680AAA/pMDC32 dnd1/IQm3 Expression von CNGC2 mit Mutationen in der IQ- diese Arbeit Domäne im dnd1-Hintergrund, 35S-Promotor, CNGC2RRK680-682AAA/pMDC32 dnd1/∆IQ Expression von CNGC2 mit Deletion der IQ-Domäne diese Arbeit im dnd1-Hintergrund, 35S-Promotor, CNGC2∆669725/pMDC32 dnd1/GT Expression von CNGC2 mit Mutationen in der IQ- diese Arbeit Domäne im dnd1-Hintergrund, 35S-Promotor, CNGC2AA669-670GT/pMDC32 Für Interaktions- und Lokalisierungsstudien wurden außerdem Nicotiana benthamiana transient transformiert und Oocyten des Krallenfroschs Xenopus laevis verwendet. 4.1.2 Antibiotika Tabelle 8: Verwendete Antibiotika und deren eingesetzte Konzentrationen. Antibiotikum Endkonzentration Ampicillin 100 mg/l Cefotaxim 250 mg/l Gentamycin 25 mg/l Hygromycin 50 mg/l Kanamycin 100 mg/l Rifampicin 10 mg/l Spectinomycin 100 mg/l Streptomycin 50 mg/l 4.1.3 Primer/Oligonukleotide Tabelle 9: Primer zur Klonierung der Eingangs-/Zwischenklonierungsvektoren. Nr. 1 2 3 4 5 74 Name CNGC2Nterm_CACC_fw CNGC2Nterm+stop_rev CNGC7_fw CNGC7+8_Nt+st_rv CNGC8_fw Sequenz 5'-3' CACCATGCCCTCTCACCCCAACTT TCATTTGAGACGTCGGAATCTGGT CACCATGATGATGCAGAGAAAC CTATGTTTTGTCTTGAGGATC CACCATGTACAAATCTCAATATATAAG 4. Material und Methoden 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 CNGC10_fw CNGC10_Nt+st_rv CNGC13_fw CNGC13_Nt+st_rv CNGC15_fw CNGC15_Nt+st_rv CNGC16_fw CNGC16_Nterm+st_rv CNGC17_fw CNGC17_Nterm_rv CNGC18_fw CNGC18_Nterm+st_rv CNBT1 Gf CNGC20N-term rev CNGC2_502_fw CNGC2 VL rev CNGC7+8_Cterm_fw_CACC CNGC7_rev_wob CNGC8_rev_wob CNGC10_Cterm_fw_CACC CNGC10_rev_wob CNGC13_Cterm_fw_CACC CNGC13_rev_wob CNGC15_Cterm_fw_CACC CNGC15+st_rv CNGC16_Cterm_fw_CACC CNGC16_rev_wob CNGC17_Cterm_fw_CACC CNGC17+st_rv CNGC17sCt_fw CNGC18_Cterm_fw_CACC CNGC18_rev_wob CNGC1alphaC_fw CNGC1alphaC+st_rv CNGC2_alphaC_fw CNGC2_alphaC+st_rv CNGC2_alphaCmitAA+st_rv CNGC3_alphaC_fw CNGC3_alphaC+st_rv CNGC4_alphaC_fw CNGC4_alphaC+st_rv CNGC5_alphaC_fw CNGC5_alphaC+st_rv CNGC7_alphaC_fw CNGC7_alphaC_+st_rv CACCATGGCATTTAGCCATG CTAGTTCTGGAGAAACGAATCCTG CACCATGGCTTTTGGCCG CTAGTTCTGTAAAAAAGATCCTTGTGG CACCATGGGTTATGGTAACTC CTATCTTCGTATCGTTTGTCCACG CACCATGAGCAACCTCCACCTC CTAAGTTTTGTCACGGAGCTTGG CACCATGGAGTTAAGGAAGGACAAGC CTACTCACTTCCTGGATCAAGAATAG CACCATGAATAAAATCCGGTC CTAGTTGCTGTCCGGGTCCAGG CACCATGGCTTCCCACAACGAA CTATGCGTGTTTCAAAACGAACTCATC CACCATGGAGCTAGAACTTATACATGATTTGCC TTATTCGAGATGATCATGCGG CACCATGCAGACTTATCTTCAGTC GGATCMTTCAGCATCAAAATCAG GGATCMGTTCAAGTCATCTGTATC CACCATGCAGAAATATTTGGAGTCAACAAC GGATCMAGGGTCAGTTGTATG CACCATGCAGAAATACTTGGAATC GGATCMAGGGTTTCGGAGACTG CACCATGCAGACTTATTTACAGTCAAC TCATTCACTAGAAAAATCTGGC CACCATGCAGAACTATCTGCAATCG GGATCMGAAGAATCCTGGATC CACCATGCAGACATATCTGCAATCTTTG TCAATCATCATGCTCAGCAGAG CACCATGTGTGGGGAAGAGCTTCTTTC CACCATGCAATCTTCTCTGCAATC GGATCMAACGTCTTCTTTATCT CACCATGTTCAGACGTCTTCACAGCAAAC CTACCAAGTCTTCCATTGTTGTG CACCATGTTCCGTTATAAATTCGCGAAC CTACCACGTCCTCCAGTTTGAGG CTACGCTGCCCACGTCCTCC CACCATGTATCGTCGCCTCCATAGC CTACCATGTCTGCCATTGCAC CACCATGTTTCGTTACACTTTTGTTAAC CTACCAAGTCCGCCATCCGG CACCATGTTCCGGCGCTTACATAGC CTACCAAGTCCTCCATTGGTGAG CACCATGTTTAGGAGACTTCATAGTCG CTACCAAGTTCTCCATTGCTGAG 75 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 76 CNGC9_alphaC_fw CNGC9_alphaC+st_rv CNGC11_alphaC_fw CNGC11_alphaC+st_rv CNGC12_alphaC_fw CNGC12_alphaC+st_rv CNGC13_alphaC_fw CNGC13_alphaC+st_rv CNGC14_alphaC_fw CNGC14_alphaC+st_rv CNGC15_alphaC_fw CNGC15_alphaC+st_rv CNGC16_alphaC_fw CNGC16_alphaC+st_rv CNGC17_alphaC_fw CNGC17_alphaC+st_rv CNGC18_alphaC_fw CNGC18_alphaC+st_rv CNGC19_alphaC_fw CNGC19_alphaC+st_rv alphaCExt_fw alphaExt_rev CNGC1IQ_fw CNGC1IQ+st_rv CNGC2_IQ_fw CNGC2_IQ+st_rv CNGC3_IQ_fw CNGC3_IQ+st_rv CNGC4_IQ_fw CNGC4_IQ+st_rv CNGC5_IQ_fw CNGC5_IQ+st_rv CNGC6_IQ_fw CNGC6_IQ+st_rv CNGC7_IQ_fw CNGC7_IQ+st_rv CNGC8_IQ_fw CNGC8_IQ+st_rv CNGC9_IQ_fw_neu CNGC9_IQ+st_rv CNGC10_IQ_fw CNGC10_IQ+st_rv CNGC12_IQ_fw CNGC12_IQ+st_rv CACCATGTTCAGAAGACTACACAGCAG CTACCAAGTTCTCCATTGTTGC CACCATGTATCGTCGCCTCCATAGC CTACCATGTCTGCCATTGCAATG CACCATGTTAAATGTCTTTCAAAGACAAAAAC CTACCATGAGCGCCATTGCTG CACCATGTTCAGACGACTACATAGCAAAC CTACCAAGTTCTCCATTGAACCG CACCATGTTCAGGCGTTTACATAGC CTACCAAGTTCTCCACTGATGG CACCATGTTTAGAAGACTACATACTAAG CTACCAAGTCCTCCATTGATGC CACCATGTTCAGACGTCTTCACAGC CTACCATGCTCTCCATTGATGC CACCATGTTTAGGCGGTTACACAGCAAG CTACCAAGTTCTCCAATGGTGAG CACCATGTTCAAACGTCTTCAAAGC CTACCATGCTCTCCATTGATGTG CACCATGTTTTCAAGATTCTTAAGAAGC CTATCGTAACCTCCAATAAGGAG CACCATGTTTTCGAGATTCTTGA CTATCGTAGCCTCCAATATGGAG CACCATGGCCGCTTGCTTCATACAAG CTAGAGTTTCTTCTTAATGTATCTTC CACCATGGCAGCGGTAAATATTCAG CTAACGGGTTCTTTTCCTACGCC CACCATGGCAGCATGTTTTATAC CTAGAGCTTCCTTCTACAATG CACCATGGCCGCGGTTGCGGTTC CTACGTTAGCCTATGCTTG CACCATGGCTGCTTGTTTCATCCAGG CTATTTCTTCCTCTTGCAGTATCTAC CACCATGGCCGCTTGCTTCATG CTATTTCTTCCTCTTTATGTAC CACCATGGCTTCTTGCTTCATC CTAGTTTTTCCTTCTTGAATAG CACCATGGCTGCTTGTTTCATC CTAGATTTTCCTTCTTAAATG CACCATGGCTGCTATCTTCATAC CTATTTCTTCTTCTTCACGTATC CACCATGAGCGTGTCTTTTATAC CTATAACTTCCTCCGACAGTATC CACCATGGCAGCATTCTTCATTC CTAAAGCTTCCTTTTGCAATG 4. Material und Methoden 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 CNGC13_IQ_fw CNGC13_IQ+st_rv CNGC14_IQ_fw CNGC14_IQ+st_rv CNGC15_IQ_fw CNGC15_IQ+st_rv CNGC16_IQ_fw CNGC16_IQ+st_rv CNGC17_IQ_fw CNGC17_IQ+st_rv CNGC18_IQ_fw CNGC18_IQ+st_rv CNGC19_IQ_fw CNGC19_IQ+st_rv eigIQ_fw eigIQ_rev CNGC1_grHelix_fw CNGC1_grHelix_rv CNGC1_Cterm_fw_CACC CNGC1+st_rv CNGC1daC_fw 116 CNGC1daC_rv 117 118 119 120 121 CNGC1dIQ_fw CNGC1dIQ_rv CNGC2dIQ_fw CNGC2dIQ_rv CNGC2IQmut1_fw 122 CNGC2IQmut1_rv 123 CNGC2IQmut2_fw 124 CNGC2IQmut2_rv 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 CNGC2IQmut3_fw CNGC2IQmut3_rv CNGC2_IQ_AA->GT_fw CNGC2IQ_GT_fw CNGC2IQ_GT_rv CNGC9_IQ_AA->GT_fw CNGC13_IQ_GAS->AAC CNGC16_IQ_GT->AA_fw CNGC19grIQ_fw CNGC19grIQ_rv CNGC20dIQ_fw CACCATGGGTGCGTCTTTCATAC CTATAGTTTCCTCCGGCAATG CACCATGGCTGCTTGTTTTGTAC CTACAACTTCTTTCTCTTATAC CACCATGGCGGCTTGTTTTATAC CTAGTACTTCCTCTTCCTGTGC CACCATGGGAACTTGTTTTATAC CTATAATTTCCTCTTCATGTATC CACCATGGCTGCTTGCTTCATAC CTACATAACTCTTCTCTTGTACC CACCATGGGAGCATGTTTTGTCC CTAAAGCTTTCTTCGCTTGTATC CACCATGGCAGCTATGCAGATCC CTAGAGTTGTCTCTTTCGGTATC CACCATGGCGGCTAGGCAGATTC CTAAAGCCGTCTCCTACGGTATC CACCATGGCACTTAAAGCTGATGAC CTAGAAGCAAGCGGCCCAAG CACCATGCAGACGTATCTGCAATCC TTAATCATCACTGTTGAAATCTG CTCAAATTCGTGGCTTCCCAGTCACAACAATGGAAG ACTTG CAAGTCTTCCATTGTTGTGACTGGGAAGCCACGAAT TTGAG CAATGGAAGACTTGGGAAGAGTCTCTTAAAG CTTTAAGAGACTCTTCCCAAGTCTTCCATTG CAAACTGGAGGACGTGGCGTGGTGAAAACATC GATGTTTTCACCACGCCACGTCCTCCAGTTTG GCGTGGCGCCGGCGTGCGGCAGCAACCCGTGGTGA AAAC GTTTTCACCACGGGTTGCTGCCGCACGCCGGCGCCA CGC ATTCAGATGGCGTGGGCCGCGGCTAGGAAAAGAAC CCG CGGGTTCTTTTCCTAGCCGCGGCCCACGCCATCTGA AT GTGGCGCCGGGCTGCGGCAAGAACCCGTG CACGGGTTCTTGCCGCAGCCCGGCGCCAC CACCATGGGAACGGTAAATATTC GGAGGACGTGGGGAACGGTAAATATTCAG CTGAATATTTACCGTTCCCCACGTCCTCC CACCATGGGTACTATCTTCATAC CACCATGGCTGCGTGTTTCATAC CACCATGGCAGCTTGTTTTATAC CACCATGAGGTTACGAGCAGCTATG CTAGTTGGAATTGGAGTGAGC CATATTGGAGGCTACGACATAGATTATGCACTC 77 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 CNGC20dIQ_rv BT1Cf1 CNBT1 Gr CNGC20_IQ_AA->GT_fw CNGC20_IQ_GT_fw CNGC20_IQ_GT_rv CNGC2 VL fwd CNGC2 dstop rev CNGC17_fw CNGC17+st_rv CNGC17-st_rv CNBT1 Gst CNGC20dC34+stop_rv CNGC20dC34-st_rv_as CAM2+1_CACC-FW CaM2_rev CaM2 N-lobe+st_rv CaM2 C-lobe_fw CaM2 E3A_fw CaM2 E3A_rv CaM2 E4A+st_rv länger At3g51920+1_CACC_fw At3g51920+453_wob_rev CPK9_fw CPK9-st_rv cpk34_1f cpk34_1r CACPK34-st_rv CNGC20CtkurzTEV_fw 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 CNGC20dN23_EcoRI_fw CNGC20-stop_NcoI_rv CNGC20dN99_EcoRI_fw CNGC20_EcoRI_fw CNGC20dC34-st_NcoI_rv attR2_HindIII_rv XbaI_attR1_fw XbaI_VenusN_fw XbaI_VenusC_fw VenusN_HindIII_rv VenusC_HindIII_rv HindIII_attR1 attR2_AD_fw 178 attR2_AD_rv 78 GAGTGCATAATCTATGTCGTAGCCTCCAATATG CACCATGGCTCTTGGTAAAA CTAAAGGCTATAACTAGACTGAGGAGTG CACCATGGGGACTAGGCAGATTC GGAGGCTACGAGGGACTAGGCAGATTCAAG CTTGAATCTGCCTAGTCCCTCGTAGCCTCC CACCATGCCCTCTCACCCCAAC TTCGAGATGATCATGCGGTC CACCATGGAGTTAAGGAAGGACAAGC TCAATCATCATGCTCAGCAGAG ATCATCATGCTCAGCAGAGAAATC AAGGCTATAACTAGACTGAGGAGTGCA CTAGTCGTACCTTATGGCTCCTTGG GTCGTACCTTATGGCTCC CACCATGGCGGATCAGCTCACAGA TCACTTAGCCATCATAACCTTC CTACTTCATTTTCCTAGCCATTAG CACCATGGACACTGACTCTGAGG CATCTCAGCTGCTGCATTGAGACATGTG CACATGTCTCAATGCAGCAGCTGAGATG TCACTTAGCCATCATAACCTTCACAAACGCTTC CACCATGGCGGATGCTTTCA GGATCMATAAGAGGCAGCA CACCATGGGAAATTGTTTTGCC GAACAGCCGAGGTTGTTGTTG CACCATGGGAAATTGTTGCTCTCATG TTTGAATGATAGTTCACGCCG ATCCTCCTTGATCCATGGATG CACCGAAAACTTGTATTTCCAGGGCATGTTTTCGTT GATGGATGAAC GAATTCATGGCCAGAGCTTTCACTTCCAGGAG CCATGGTAAGGCTATAACTAGACTGAGGAGTGC GAATTCATGGAGAGGTATCCTTCTTTTGCTG GAATTCATGGCTTCCCACAACGAAAACG CCATGGTGTCGTACCTTATGGCTCCTTG AAGCTTACCACTTTGTACAAGAAAGCTG TCTAGAACAAGTTTGTACAAAAAAGCTGAACG TCTAGAATGGTGAGCAAGGGCGAGG TCTAGAATGGACAAGCAGAAGAACGG AAGCTTCTACTCGATGTTGTGGCGG AAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG AAGCTTACAAGTTTGTACAAAAAAGCTGAACG TCTTGTACAAAGTGGTCATGGATAAAGCGGAATTA AT ATTAATTCCGCTTTATCCATGACCACTTTGTACAAG A 4. Material und Methoden 179 180 181 AD_HindIII SalI_attR2_fw mGFP6_HindIII_rv AAGCTTCTACTCTTTTTTTGGGTTTGGTG GTCGACCATAGTGACTGGATATGTTG AAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTG Tabelle 10: Weitere Primer für Genotypisierung, Sequenzierung und Colony-PCR. Nr. 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 Name dnd1_i2_fw dnd1_i3_rv dnd1_seq CNGC2_Ct_fw NosT_seq_rv CNBT1Sfw3 C-term_Seq2_fwd CPK5seq_fwd dN23/99_seq_fw VYNE_seq1 VYNE_seq2 VYCE_seq1 VYCE_seq2 VYCER_seq1 CNBT1 LC 10 fwd C-term_Seq2_fwd Gal-BD_seq_fw Gal-BD_seq2_fw CNGC17_seq1_fw CNGC17_seq2_rv GAD-CF_seq CPK1_seq2 NosT_rv VYNER_seq1 VYNER_seq2r pGAD_seq pGBT9_seq_fw 35S_seq_fw pGEM_seq_vorT7P pGEM_seq_r_hinterSP6 CPK1_seq CPK1_seq2 CPK3_Colony_fw CPK9_Colony_fw CPK21_Colony_fw CPK23_Colony_fw CPK30_Colony_fw CPK31_Colony_fw Sequenz 5'-3' CAGAACAACCTTCCAACTATTCC CTTAGGACAGACCTTAGTAGTAC GGTTAGTTGTGCCGAAACTG GAGCTAGAACTTATACATGATTTG GGAAATTCGAGCTCCACC GATTGGCCGATGACTAAAGC CGATCTGGAAGACGTAACGAGC GGAGCTTTGTGCTGGAGGTG CCTCTACCGTTTCTTGCTG GTGAACAGCTCCTCGCCCTTG CAAGTCGTTCGGCTTCATCTGG CCTGTGACGGAAGATCACTTCGC CCAGCCTACTCGCTATTGTCCTC GTTACGGTGAAAACCTGGCC CCTCGAACGCTCTTCTGTAAA CGATCTGGAAGACGTAACGAGC GGCTTCAGTGGAGACTGATATGCC GTGCGCCAAGTGTCTGAAGAAC CCGGTTTGATCATAACAACAATGC CTTGTAGAAGATGGTAAATTCAAGG CCATGCAGAATGAAGCCCGTCGTC CGCATAGAAGAACTGATGCGC GCGCGATAATTTATCCTAGTTTGCGC CCGAGGTGAAGTTCGAGG GGTGTCCCTGTTGATACCG GATGTCGTTGTTCCAGAGCTG GATGCCGTCACAGATAGATTG CTTCGCAAGACCCTTCCTC CATTCAGGCTGCGCAACTG CAATACGCAAACCGCCTC GGGTTGTAGAGGCTTGCCATTC CGCATAGAAGAACTGATGCGC GTACACCGCATTCCAGTTC CAAAGACAGCAGCGGATAC CAGCGGGCACATAACTAG GGAATATGGAATGGGAGATG CTGATTGGAGAAAGGCATC GAGCATGGTGTGGGAGATG 79 4.1.4 Vektoren Tabelle 11: Eingangsvektoren. Insert in pENTR/D-TOPO. KmR. AS – Aminosäuren. +st – mit Stopp-Codon. –st – ohne Stopp-Codon. VL – Volllänge. unveröff. – unveröffentlicht. Pr – Primer (Kapitel 4.1.3) Insert N-Termini CNGC1N+st CNGC2N+st CNGC3N+st CNGC4N+st CNGC5N+st CNGC6N+st CNGC7N+st CNGC8N+st CNGC9N+st CNGC10N+st CNGC11N+st CNGC12N+st CNGC13N+st CNGC14N+st CNGC15N+st CNGC16N+st CNGC17N+st CNGC18N+st CNGC19N+st CNGC20N+st C-Termini CNGC1C+st CNGC2C+st CNGC3C+st CNGC4C+st CNGC5C+st CNGC6C+st CNGC7C+st CNGC8C+st CNGC9C+st CNGC10C+st CNGC11C+st CNGC12C+st CNGC13C+st CNGC14C+st CNGC15C+st CNGC16C+st CNGC17C+st CNGC17sC+st CNGC18C+st CNGC19C+st αC-Domänen CNGC1αC+st CNGC2αC+st CNGC2αCAA+st 80 Beschreibung Herstellung/Referenz AS 1-88 AS 1-107 AS 1-82 AS 1-85 AS 1-94 AS 1-109 AS 1-68 AS 1-104 AS 1-109 AS 1-73 AS 1-39 AS 1-39 AS 1-78 AS 1-71 AS 1-78 AS 1-44 AS 1-77 AS 1-46 AS 1-164 AS 1-123 C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. Pr. 1+2, diese Arbeit C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. Pr. 3+4, diese Arbeit Pr. 5+4, diese Arbeit C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. Pr. 6+7, diese Arbeit C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. Pr. 8+9, diese Arbeit C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. Pr. 10+11, diese Arbeit Pr. 12+13, diese Arbeit Pr. 14+15, diese Arbeit Pr. 16+17, diese Arbeit C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. Pr. 18+19, diese Arbeit AS 403-716 AS 502-726 AS 394-706 AS 420-694 AS 415-717 AS 431-747 AS 390-709 AS 425-753 AS 430-733 AS 390-711 AS 353-621 AS 353-649 AS 391-696 AS 398-726 AS 388-678 AS 375-705 AS 398-720 AS 550-720 AS 366-706 AS 483-729 C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. Pr. 20+21, diese Arbeit C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. Pr, 22+23, diese Arbeit Pr. 22+24, diese Arbeit C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. Pr. 25+26, diese Arbeit C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. Pr. 27+28, diese Arbeit C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. Pr. 29+30, diese Arbeit Pr. 31+32, diese Arbeit Pr. 33+34, diese Arbeit Pr. 35+34, diese Arbeit Pr. 36+37, diese Arbeit C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. AS 602-624 AS 645-668 AS 645-670 Pr. 38+39, diese Arbeit Pr. 40+41, diese Arbeit Pr. 40+42, diese Arbeit 4. Material und Methoden CNGC3αC+st AS 591-613 CNGC4αC+st AS 610-633 CNGC5αC+st CNGC7αC+st CNGC11αC+st AS 614-636 AS 618-640 (≙ AS 623-646 von CNGC8) AS 629-651 (≙ AS 630-652 von CNGC6) AS 549-571 CNGC12αC+st AS 545-567 CNGC13αC+st CNGC14αC+st AS 590-612 (≙ AS 590-611 von CNGC10) AS 597-619 CNGC15αC+st AS 587-609 CNGC16αC+st AS 573-595 CNGC17αC+st AS 597-619 CNGC18αC+st AS 565-587 CNGC19αC+st AS 678-701 CNGC20αC+st AS 713-736 CNGC9αC+st IQ-Domänen CNGC1IQ+st CNGC2IQ+st CNGC3IQ+st CNGC4IQ+st AS 625-641 AS 669-685 AS 614-630 (≙ AS 572-588 von CNGC11) AS 634-650 CNGC5IQ+st CNGC6IQ+st AS 637-653 AS 653-669 CNGC7IQ+st AS 641-657 CNGC8IQ+st AS 647-663 CNGC9IQ+st AS 652-668 CNGC10IQ+st AS 612-627 CNGC12IQ+st CNGC13IQ+st CNGC14IQ+st CNGC15IQ+st AS 568-584 AS 613-629 AS 620-636 AS 610-626 CNGC16IQ+st AS 596-612 Pr. 43+44, M. Birkenbach + diese Arbeit1 Pr. 45+46, M. Birkenbach + diese Arbeit1 Pr. 47+48, diese Arbeit Pr. 49+50, M. Birkenbach + diese Arbeit1 Pr. 51+52, M. Birkenbach + diese Arbeit1 Pr. 53+54, M. Birkenbach + diese Arbeit1 Pr. 55+56, M. Birkenbach + diese Arbeit1 Pr. 57+58, M. Birkenbach + diese Arbeit1 Pr. 59+60, J. Keseler + diese Arbeit1 Pr. 61+62, J. Keseler + diese Arbeit1 Pr. 63+64, J. Keseler + diese Arbeit1 Pr. 65+66, J. Keseler + diese Arbeit1 Pr. 67+68, J. Keseler + diese Arbeit1 Pr. 69+70, J. Keseler + diese Arbeit1 Pr. 71+72, J. Keseler + diese Arbeit1 Pr. 73+74, diese Arbeit Pr. 75+76, diese Arbeit Pr. 77+78, O. Hügelschäfer + diese Arbeit1 Pr. 79+80, O. Hügelschäfer + diese Arbeit1 Pr. 81+82, diese Arbeit Pr. 83+84, O. Hügelschäfer + diese Arbeit1 Pr. 85+86, O. Hügelschäfer + diese Arbeit1 Pr. 87+88, O. Hügelschäfer + diese Arbeit1 Pr. 89+90, O. Hügelschäfer + diese Arbeit1 Pr. 91+92, O. Hügelschäfer + diese Arbeit1 Pr. 93+94, J. Wartha + diese Arbeit1 Pr. 95+96, J. Wartha + diese Arbeit1 Pr. 97+98, J. Wartha + diese Arbeit1 Pr. 99+100, J. Wartha + diese Arbeit1 Pr. 101+102, J. Wartha + diese Arbeit1 81 CNGC17IQ+st AS 620-636 CNGC18IQ+st AS 588-604 CNGC19IQ+st AS 702-717 CNGC20IQ+st AS 737-752 weitere Peptide, Mutationen/Deletionen in C-Termini CNGC1grHelix+st AS 589-628 AS 404-601_618-716 CNGC1C∆αC+st AS 404-624_642-716 CNGC1C∆IQ+st CNGC2CFRY->AAA+st AS 502-726_FRY645-647AAA CNGC2C∆IQ+st CNGC2CIQmut1+st CNGC2CIQmut2+st CNGC2CIQmut3+st CNGC2IQGT+st CNGC2CGT+st CNGC9IQGT+st AS 502-668_685-726 AS 502-726_RKR681-683AAA AS 502-726_RRR678-680AAA AS 502-726_RRK680-682AAA AS 669-685_AA669-670GT AS 502-726_AA669-670GT AS 652-668_AA652-653GT CNGC13IQAAC+st AS 613-629_GAS613-615AAC CNGC16IQAA+st AS 596-612_GT596-597AA CNGC19IQext+st CNGC19IQNext+st CNGC19IQCext+st CNGC20C∆IQ+st CNGC20CR748-750A+st AS 699-728 AS 699-717 AS 702-728 AS 517-736_753-764 AS 517-764_R748-750A CNGC20CR748-750A-st AS 517-764_R748-750A CNGC20IQGT+st AS 737-752_AA737-738GT CNGC20CGT+st AS 517-764_AA737-738GT CNGC-Volllängenkonstrukte CNGC2FRY-> AAA+st VL_ FRY645-647AAA CNGC2IQmut1+st VL_RKR681-683AAA CNGC2IQmut2+st VL_RRR678-680AAA CNGC2IQmut3+st VL_RRK680-682AAA CNGC2∆IQ+st AS 1-668_685-726 CNGC2GT+st VL_AA669-670GT CNGC2+st CNGC2-st CNGC2GT-st VL VL VL_AA669-670GT 82 Pr. 103+104, J. Wartha + diese Arbeit1 Pr. 105+106, J. Wartha + diese Arbeit1 Pr. 107+108, J. Wartha + diese Arbeit1 Pr, 109+110, diese Arbeit Pr. 111+112, diese Arbeit Pr. 113-116, diese Arbeit Pr. 113, 114, 117, 118, diese Arbeit Pr. 20+21, Template:CNGC2FRY-> 1 AAA+st, M. Beer + diese Arbeit Pr. 20, 21, 119, 120, diese Arbeit Pr. 20, 21, 121, 122, diese Arbeit Pr. 20, 21, 123, 124, diese Arbeit Pr. 20, 21, 125, 126, diese Arbeit Pr. 127+76, diese Arbeit Pr. 20, 21, 128, 129, diese Arbeit Pr. 130+90, M. Birkenbach + diese Arbeit1 Pr. 131+96, M. Birkenbach + diese Arbeit1 Pr. 132+102, J. Keseler + diese Arbeit1 Pr. 133+134, diese Arbeit Pr. 133+108, diese Arbeit Pr. 107+134, diese Arbeit Pr. 135-138, diese Arbeit Pr. 137+138, Template: CNGC20R748-750A-st, diese Arbeit Fischer et al. (2013) Pr. 139+110, diese Arbeit Pr. 137, 138, 140, 141, diese Arbeit M. Ignatz (2008) Ligation: CNGC2+st, CNGC2CIQmut1+st, SpeI/ApaLI, diese Arbeit Ligation: CNGC2+st, CNGC2CIQmut2+st, SpeI/ApaLI, diese Arbeit Ligation: CNGC2+st, CNGC2CIQmut3+st, SpeI/ApaLI, diese Arbeit Ligation: CNGC2+st, CNGC2C∆IQ+st, SpeI/ApaLI, diese Arbeit Ligation: CNGC2+st, CNGC2CGT+st, SpeI/ApaLI, diese Arbeit D. Guinot (2008) D. Guinot (2008) Pr. 142, 143, 128, 129, diese Arbeit 4. Material und Methoden CNGC9+st CNGC9-st CNGC12+st CNGC12-st CNGC17+st CNGC17-st CNGC19-st CNGC20+st CNGC20-st CNGC20∆IQ-st CNGC20∆C34+st CNGC20∆C34-st CNGC20R748-750A-st VL VL VL VL VL VL VL VL VL AS 1-736_753-764 AS 1-730 AS 1-730 VL_R748-750A CNGC20GT-st VL_AA737-738GT Calmoduline CaM2+st VL CaM2-st VL CaM2 N-Lobe+st AS 1-78 CaM2 C-Lobe+st AS 79-149 CaM2E3,4A+st VL, E105,141A CaM4+st VL CaM6+st VL CaM7+st VL CML8+st VL CML9+st VL CDPKs CPK1-st VL CPK3-st VL CPK5-st VL CPK7-st VL CPK9-st VL CPK13-st VL CPK15-st VL CPK21-st VL CPK23-st VL CPK27-st VL CPK28-st VL CPK30-st VL CPK31-st VL CPK33-st VL CPK34-st VL CACPK34-st AS 1-329 Insert zur rekombinanten Herstellung von CNGC20-C TEVCNGC20594-764+st TEV + AS 594-764 C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. Pr. 144+145, diese Arbeit Pr. 144+146, diese Arbeit A. Kugler (2010) A. Kugler (2010) Fischer et al. (2013) Pr. 18, 135, 136, 147, diese Arbeit Pr. 18+148, diese Arbeit Pr. 18+149, diese Arbeit Ligation: CNGC20-st, CNGC20CR748-750A-st, SpeI/ApaLI, diese Arbeit Pr. 18, 140, 141, 147, diese Arbeit Pr. 150+151, diese Arbeit C. Fischer (2010) Pr. 150+152, diese Arbeit Pr. 153, 151, diese Arbeit Pr. 150, 154-156, diese Arbeit Fischer et al. (2013) Fischer et al. (2013) Fischer et al. (2013) Fischer et al. (2013) Pr. 157+158, diese Arbeit T. Romeis, Berlin T. Romeis, Berlin T. Romeis, Berlin T. Romeis, Berlin Pr. 159+160, diese Arbeit T. Romeis, Berlin T. Romeis, Berlin T. Romeis, Berlin T. Romeis, Berlin T. Romeis, Berlin T. Romeis, Berlin T. Romeis, Berlin T. Romeis, Berlin T. Romeis, Berlin Pr. 161+162, diese Arbeit Pr. 161+163, diese Arbeit Pr. 164+138, diese Arbeit 1 Gemeinsame Erstellung während Bachelorarbeiten (Beer, 2012; Hügelschäfer, 2013; Wartha, 2013; Birkenbach, 2014, Keseler, 2014). 83 Tabelle 12: Zwischenklonierungsvektoren. Insert in pCR-Blunt II-TOPO. KmR. AS – Aminosäuren. +st – mit Stopp-Codon. –st – ohne Stopp-Codon. VL – Volllänge. Pr – Primer (Kapitel 4.1.3) Insert Beschreibung Insert zur Lokalisierung in Hefen CNGC20∆N23-stEN AS 24-764, EcoRI/NcoI CNGC20∆N99-stEN AS 100-764 CNGC20-stEN VL CNGC20∆C34-stEN AS 1-730 Inserts zur Herstellung neuer Gateway-Zielvektoren (Kapitel 4.2.1.9) VYNE Gateway-BiFC-Kassette VYNE(R) Gateway-BiFC-Kassette VYCE Gateway-BiFC-Kassette VYCE(R) Gateway-BiFC-Kassette GAD-CF-Ins GAL4-Aktivierungsdomäne-Gateway-Kassette GFP-SH Gateway-Kassette-GFP Insert zur rekombinanten Herstellung von CNGC20-C CaM2_BamHI_PstI VL, BamHI/PstI CNGC20C594-764 AS 594-764, XmnI/HindIII Herstellung/Referenz Pr. 165+166, diese Arbeit Pr. 167+166, diese Arbeit Pr. 168+166, diese Arbeit Pr. 168+169, diese Arbeit Pr. 171+174, diese Arbeit Pr. 172+170, diese Arbeit Pr. 171+175, diese Arbeit Pr. 173+170, diese Arbeit Pr. 176-179, diese Arbeit Pr. 180+181, diese Arbeit Fischer et al. (2013) Fischer et al. (2013) Tabelle 13: Zielvektoren. Name pGBT9 pGAD424 pGAD-CF pEX-TAG2 pMDC32 pMDC43 pMDC83 pK7FWG2,0 pMDC201-mCherry pDEST-GWVYNE pDEST-VYNE(R)GW pDEST-GWVYCE pDEST-VYCE(R)GW pGEM-VYNE pGEM-VYNE(R) pGEM-VYCE pGEM-VYCE(R) pGEM-GFP pASK-IBA5+ pMAL-c2x pVP13 1 Beschreibung1 YTH, GAL4-Bindedomäne-GW, Ampr YTH, GAL4-Akivierungsdomäne-GW, Ampr YTH, GW-GAL4-Aktivierungsdomäne, Ampr Hefeexpression, C-terminales GFP, Ampr Pflanzenexpression, GW, Kmr Pflanzenexpression, GFP-GW, Kmr Pflanzenexpression, GW-GFP, Kmr Pflanzenexpression, GW-GFP, Strepr/Specr Pflanzenexpression, GW-mCherry, Kmr BiFC in Pflanzen, GW-VN, Kmr BiFC in Pflanzen, VN-GW, Kmr BiFC in Pflanzen, GW-VC, Kmr BiFC in Pflanzen, VC-GW, Kmr BiFC in Oocyten, GW-VN, Ampr BiFC in Oocyten, VN-GW, Ampr BiFC in Oocyten, GW-VC, Ampr BiFC in Oocyten, VC-GW, Ampr Lokalisierung in Oocyten, GW-GFP, Ampr Expression rekombinanter Proteine in Bakterien, N-Terminaler Strep-Tag, Ampr Expression rekombinanter Proteine in Bakterien, N-Terminaler MBP-Tag, Ampr Expression rekombinanter Proteine in Bakterien, S-Tag-His-MBP-GW, Ampr Herstellung/Referenz F. Börnke, Potsdam F. Börnke, Potsdam Kap. 4.2.1.9, diese Arbeit (Meyer et al., 2000) Curtis und Grossniklaus (2003) Curtis und Grossniklaus (2003) Curtis und Grossniklaus (2003) Karimi et al. (2002) Fischer et al. (2013) Gehl et al. (2009) Gehl et al. (2009) Gehl et al. (2009) Gehl et al. (2009) Kap. 4.2.1.9, diese Arbeit Kap. 4.2.1.9, diese Arbeit Kap. 4.2.1.9, diese Arbeit Kap. 4.2.1.9, diese Arbeit Kap. 4.2.1.9, diese Arbeit IBA, Göttingen NEB, Schwalbach Thao et al. (2004) GW-Gatewaykassette, VN-N-terminale Venushälfte, VC-C-terminale Venushälfte. Vermittelte Resistenzen in Bakterien: AmpR-Ampicillin, KmR-Kanamycin, StrepR-Streptomycin, SpecR-Spectinomycin. Karten s. Anhang. 84 4. Material und Methoden Tabelle 14: Vektoren für die Expression in Pflanzen. Name1 Referenz Expression – hier zur stabilen Transformation von A. thaliana CNGC2IQmut1+st/pMDC32 diese Arbeit CNGC2IQmut2+st/pMDC32 diese Arbeit CNGC2IQmut3+st/pMDC32 diese Arbeit diese Arbeit CNGC2∆IQ+st/pMDC32 CNGC2GT+st/pMDC32 diese Arbeit Lokalisierung in N. benthamiana CaM2+st/pMDC43 diese Arbeit CaM4+st/pMDC43 diese Arbeit CaM6+st/pMDC43 diese Arbeit CaM7+st/pMDC43 diese Arbeit CML8+st/pMDC43 diese Arbeit CML9+st/pMDC43 diese Arbeit A. Kugler (2010) CNGC20∆N192+st/pMDC43 A. Kugler (2010) CNGC20∆N192-st/pMDC83 CNGC20+st/pMDC43 Fischer et al. (2013) CNGC20-st/pK7FWG2,0 Fischer et al. (2013) Fischer et al. (2013) CNGC20∆C34+st/pMDC43 CNGC9+st/pMDC43 C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. CNGC9-st/pK7FWG2,0 C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. CPK1-st/pMDC201-mCherry diese Arbeit CPK34-st/pMDC201-mCherry diese Arbeit BiFC in N. benthamiana CNGC20-st/pDEST-GWVYNE Fischer et al. (2013) diese Arbeit CNGC20∆IQ-st/pDEST-GWVYNE GW diese Arbeit CNGC20∆C34-st/pDEST- VYNE CNGC20R748-750A-st/pDEST-GWVYNE diese Arbeit CNGC20GT-st/pDEST-GWVYNE diese Arbeit CNGC20+st/pDEST-VYNE(R)GW Fischer et al. (2013) CNGC2-st/pDEST-GWVYNE diese Arbeit CNGC2GT-st/pDEST-GWVYNE diese Arbeit GW CNGC9-st/pDEST- VYNE C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. CNGC9+st/pDEST-VYNE(R)GW C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. CNGC12-st/pDEST-GWVYNE diese Arbeit CNGC12+st/pDEST-VYNE(R)GW diese Arbeit GW CNGC17-st/pDEST- VYNE C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. CNGC17+st/pDEST-VYNE(R)GW C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. CaM2+st/pDEST-VYCE(R)GW Fischer et al. (2013) CaM2E3,4A+st/pDEST-VYCE(R)GW diese Arbeit CPK1-st/pDEST-GWVYCE diese Arbeit CPK3-st/pDEST-GWVYCE diese Arbeit CPK9-st/pDEST-GWVYCE diese Arbeit GW CPK21-st/pDEST- VYCE diese Arbeit CPK23-st/pDEST-GWVYCE diese Arbeit CPK30-st/pDEST-GWVYCE diese Arbeit GW CPK31-st/pDEST- VYCE diese Arbeit CPK34-st/pDEST-GWVYCE diese Arbeit CACPK34-st/pDEST-GWVYCE diese Arbeit 1 Name besteht aus Insert und Zielvektor. Herstellung durch Rekombination aus entsprechendem pENTR/DTOPO-Klon und Zielvektor (Tabellen x und y). 85 Tabelle 15: Vektoren für die Expression in Hefen. Name1 Lokalisierung CNGC20∆N23-stEN/pEX-TAG22 CNGC20∆N99-stEN/pEX-TAG22 CNGC20-stEN/pEX-TAG22 CNGC20∆C34-stEN/pEX-TAG22 YTH CNGC1N+st/pGBT9 CNGC2N+st/pGBT9 CNGC3N+st/pGBT9 CNGC4N+st/pGBT9 CNGC5N+st/pGBT9 CNGC6N+st/pGBT9 CNGC7N+st/pGBT9 CNGC8N+st/pGBT9 CNGC9N+st/pGBT9 CNGC10N+st/pGBT9 CNGC11N+st/pGBT9 CNGC12N+st/pGBT9 CNGC13N+st/pGBT9 CNGC14N+st/pGBT9 CNGC15N+st/pGBT9 CNGC16N+st/pGBT9 CNGC17N+st/pGBT9 CNGC18N+st/pGBT9 CNGC19N+st/pGBT9 CNGC20N+st/pGBT9 CNGC1C+st/pGBT9 CNGC2C+st/pGBT9 CNGC3C+st/pGBT9 CNGC4C+st/pGBT9 CNGC5C+st/pGBT9 CNGC6C+st/pGBT9 CNGC7C+st/pGBT9 CNGC8C+st/pGBT9 CNGC9C+st/pGBT9 CNGC10C+st/pGBT9 CNGC11C+st/pGBT9 CNGC12C+st/pGBT9 CNGC13C+st/pGBT9 CNGC14C+st/pGBT9 CNGC15C+st/pGBT9 CNGC16C+st/pGBT9 CNGC17C+st/pGBT9 CNGC17sC+st/pGBT9 CNGC18C+st/pGBT9 CNGC19C+st/pGBT9 CNGC20C+st/pGBT9 CNGC1αC+st/pGBT9 CNGC2αC+st/pGBT9 CNGC2αCAA+st/pGBT9 CNGC3αC+st/pGBT9 86 Referenz diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. diese Arbeit C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. diese Arbeit diese Arbeit C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. diese Arbeit C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. diese Arbeit C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. diese Arbeit C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. diese Arbeit C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. diese Arbeit C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. diese Arbeit diese Arbeit C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. diese Arbeit C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. diese Arbeit C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit C. Šubert, Uni Erlangen, unveröff. Fischer et al. (2013) diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit M. Birkenbach + diese Arbeit3 4. Material und Methoden CNGC4αC+st/pGBT9 CNGC5αC+st/pGBT9 CNGC7αC+st/pGBT9 CNGC9αC+st/pGBT9 CNGC11αC+st/pGBT9 CNGC12αC+st/pGBT9 CNGC13αC+st/pGBT9 CNGC14αC+st/pGBT9 CNGC15αC+st/pGBT9 CNGC16αC+st/pGBT9 CNGC17αC+st/pGBT9 CNGC18αC+st/pGBT9 CNGC19αC+st/pGBT9 CNGC20αC+st/pGBT9 CNGC1IQ+st/pGBT9 CNGC2IQ+st/pGBT9 CNGC3IQ+st/pGBT9 CNGC4IQ+st/pGBT9 CNGC5IQ+st/pGBT9 CNGC6IQ+st/pGBT9 CNGC7IQ+st/pGBT9 CNGC8IQ+st/pGBT9 CNGC9IQ+st/pGBT9 CNGC10IQ+st/pGBT9 CNGC12IQ+st/pGBT9 CNGC13IQ+st/pGBT9 CNGC14IQ+st/pGBT9 CNGC15IQ+st/pGBT9 CNGC16IQ+st/pGBT9 CNGC17IQ+st/pGBT9 CNGC18IQ+st/pGBT9 CNGC19IQ+st/pGBT9 CNGC20IQ+st/pGBT9 CNGC1grHelix+st/pGBT9 CNGC1C∆αC+st/pGBT9 CNGC1C∆IQ+st/pGBT9 CNGC2CFRY->AAA+st/pGBT9 CNGC2C∆IQ+st/pGBT9 CNGC2CIQmut1+st/pGBT9 CNGC2CIQmut2+st/pGBT9 CNGC2CIQmut3+st/pGBT9 CNGC2IQGT+st/pGBT9 CNGC2CGT+st/pGBT9 CNGC9IQGT+st/pGBT9 CNGC13IQAAC+st/pGBT9 CNGC16IQAA+st/pGBT9 CNGC19IQext+st/pGBT9 CNGC19IQNext+st/pGBT9 CNGC19IQCext+st/pGBT9 CNGC20C∆IQ+st/pGBT9 CNGC20CR748-750A+st/pGBT9 CNGC20IQGT+st/pGBT9 CNGC20CGT+st/pGBT9 M. Birkenbach + diese Arbeit3 diese Arbeit M. Birkenbach + diese Arbeit3 M. Birkenbach + diese Arbeit3 M. Birkenbach + diese Arbeit3 M. Birkenbach + diese Arbeit3 M. Birkenbach + diese Arbeit3 J. Keseler + diese Arbeit3 J. Keseler + diese Arbeit3 J. Keseler + diese Arbeit3 J. Keseler + diese Arbeit3 J. Keseler + diese Arbeit3 J. Keseler + diese Arbeit3 Fischer et al. (2013) diese Arbeit diese Arbeit O. Hügelschäfer + diese Arbeit3 O. Hügelschäfer + diese Arbeit3 diese Arbeit O. Hügelschäfer + diese Arbeit3 O. Hügelschäfer + diese Arbeit3 O. Hügelschäfer + diese Arbeit3 O. Hügelschäfer + diese Arbeit3 O. Hügelschäfer + diese Arbeit3 J. Wartha + diese Arbeit3 J. Wartha + diese Arbeit3 J. Wartha + diese Arbeit3 J. Wartha + diese Arbeit3 J. Wartha + diese Arbeit3 J. Wartha + diese Arbeit3 J. Wartha + diese Arbeit3 J. Wartha + diese Arbeit3 Fischer et al. (2013) diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit M. Beer + diese Arbeit3 diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit M. Birkenbach + diese Arbeit3 M. Birkenbach + diese Arbeit3 J. Keseler + diese Arbeit3 diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit J. Keseler + diese Arbeit3 diese Arbeit 87 CaM2+st/pGAD424 CaM2-st/pGAD-CF CaM2 N-Lobe+st/pGAD424 CaM2 C-Lobe+st/pGAD424 CaM2E3,4A+st/pGAD424 CaM4+st/pGAD424 CaM6+st/pGAD424 CaM7+st/pGAD424 CML8+st/pGAD424 CPK1-st/pGAD-CF CPK3-st/pGAD-CF CPK5-st/pGAD-CF CPK7-st/pGAD-CF CPK13-st/pGAD-CF CPK15-st/pGAD-CF CPK23-st/pGAD-CF CPK27-st/pGAD-CF CPK28-st/pGAD-CF CPK30-st/pGAD-CF CPK31-st/pGAD-CF CPK33-st/pGAD-CF CPK34-st/pGAD-CF Fischer et al. (2013) diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit Fischer et al. (2013) Fischer et al. (2013) Fischer et al. (2013) Fischer et al. (2013) M. Beer + diese Arbeit3 M. Beer + diese Arbeit3 M. Beer + diese Arbeit3 M. Beer + diese Arbeit3 M. Beer + diese Arbeit3 M. Beer + diese Arbeit3 M. Beer + diese Arbeit3 M. Beer + diese Arbeit3 M. Beer + diese Arbeit3 M. Beer + diese Arbeit3 M. Beer + diese Arbeit3 M. Beer + diese Arbeit3 diese Arbeit 1 Name besteht aus Insert und Zielvektor. Herstellung durch Rekombination aus entsprechendem pENTR/DTOPO-Klon und Zielvektor (Tabellen x und y), außer: 2 Ligation des Inserts in Zielvektor, Klonierung über Schnittstellen EcoRI, NcoI. 3 Gemeinsame Erstellung während Bachelorarbeiten (Beer, 2012; Hügelschäfer, 2013; Wartha, 2013; Birkenbach, 2014, Keseler, 2014). Tabelle 16: Expressionsvektoren für Oocyten. Name CNGC20-st/pGEM-VYCE1 CNGC19-st/pGEM-VYCE1 CNGC20+st/pGEM-VYCE(R) 1 CNGC20-st/pGEM-GFP1 CNGC9+st/pGEM-VYCE(R) 1 CNGC9-st/pGEM-VYCE1 CaM2-st/pGEM-VYNE1 CPK1-st/pNB1uYN CPK2-st/pNB1uYN CPK3-st/pNB1uYN CPK4-st/pNB1uYN CPK5-st/pNB1uYN CPK6-st/pNB1uYN CPK7-st/pNB1uYN CPK9-st/pNB1uYN CPK10-st/pNB1uYN CPK13-st/pNB1uYN CPK15-st/pNB1uYN CPK21-st/pNB1uYN CPK23-st/pNB1uYN CPK27-st/pNB1uYN CPK28-st/pNB1uYN CPK29-st/pNB1uYN 88 Referenz diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit D. Geiger, Würzburg D. Geiger, Würzburg D. Geiger, Würzburg D. Geiger, Würzburg D. Geiger, Würzburg D. Geiger, Würzburg D. Geiger, Würzburg D. Geiger, Würzburg D. Geiger, Würzburg D. Geiger, Würzburg D. Geiger, Würzburg D. Geiger, Würzburg D. Geiger, Würzburg D. Geiger, Würzburg D. Geiger, Würzburg D. Geiger, Würzburg 4. Material und Methoden CPK30-st/pNB1uYN CPK31-st/pNB1uYN CPK32-st/pNB1uYN CPK33-st/pNB1uYN CPK34-st/pGEM-VYNE1 D. Geiger, Würzburg D. Geiger, Würzburg D. Geiger, Würzburg D. Geiger, Würzburg diese Arbeit 1 Name besteht aus Insert und Zielvektor. Herstellung durch Rekombination aus entsprechendem pENTR/DTOPO-Klon und Zielvektor (Tabellen x und y). Tabelle 17: Expressionsvektoren für die Herstellung rekombinanter Proteine. Name1 CaM2+st/pASK-IBA5+ CNGC20594-764+st/pMALc2x TEV-CNGC20594-764+st/pVP13 rekombinantes Protein Strep-CaM2 MBP-CNGC20594-764 S-Tag-His-MBP-TEV-CNGC20594-764 Referenz Fischer et al. (2013) Fischer et al. (2013) diese Arbeit 1 Name besteht aus Insert und Zielvektor. Herstellung durch Ligation 4.2.6.1 oder Rekombination aus entsprechendem pENTR/D-TOPO-Klon und Zielvektor (Tabellen z, x und y). 4.1.5 Medien Tabelle 18: Verwendete Medien. Medium Inhalt CAA 0,67 % (w/v) Yeast Nitrogen Base, 1 % (w/v) Casaminosäuren, 2 % (w/v) Glukose; 2 % (w/v) Agar-Agar KobeI für Festmedien LB 1 % (w/v) Trypton, 0,5 % (w/v) Hefeextrakt, 1 % (w/v) NaCl; 1,5 % (w/v) Agar-Agar KobeI für Festmedien ½ MS 0,24 % (w/v) MS-MES (Duchefa), 1 % (w/v) Saccharose, pH (KOH) 5,8 0,8 % (w/v) Phytoagar (Duchefa) für Festmedien SCAD 2 % (w/v) Glukose, 0,66 % (w/v) Yeast Nitrogen Base, 0,066 % (w/v) AS-Mix; pH (KOH) 5,8 SOB 1 % (w/v) Trypton, 0,5 % (w/v) Hefeextrakt, 1 % (w/v) NaCl, 20 mM MgSO4, 10 mM KCl SOC SOB-Medium + 1/50 Vol. 20 % (v/v) steril filtrierte Glukose YEB 0,5 % (w/v) Trypton, 0,5 % (w/v) Hefeextrakt, 0,5 % (w/v) Saccharose, 1,23 % (w/v) MgSO4 x 7 H2O; pH (KOH) 7,8 YPD 1 % (w/v) Hefeextrakt, 2 % (w/v) Pepton, 2 % (w/v) Glukose; 2 % (w/v) Agar-Agar KobeI für Festmedien Tabelle 19: Aminosäuremix-Zusammensetzung für SCAD-Medien. Komponente Adenin-Hemisulfat p-Aminobenzoesäure Arginin Histidin Isoleucin myo-Inositol -W-L 2,0 g 0,2 g 2,0 g 2,0 g 2,0 g 2,0 g -W-L-H 2,0 g 0,2 g 2,0 g --2,0 g 2,0 g 89 Lysin HCL Methionin Phenylalanin Serin Threonin Tyrosin Uracil Valin 2,0 g 2,0 g 3,0 g 2,0 g 2,0 g 2,0 g 1,2 g 9,0 g 2,0 g 2,0 g 3,0 g 2,0 g 2,0 g 2,0 g 1,2 g 9,0 g 4.1.6 Lösungen Tabelle 20: Verwendete Lösungen. Lösung Inhalt Alkalische-Lyse-Puffer 1 (P1) 50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH (HCl) 8, + 0,1 mg/ml RNase frisch vor Verwendung Alkalische-Lyse-Puffer 2 (P2) 200 mM NaOH, 1 % (w/v) SDS Alkalische-Lyse-Puffer 3 (P3) 3M Kaliumacetat, pH (Eisessig) 5,5 TE 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA TAE 40 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8, 20 mM Eisessig gDNA-Extraktionspuffer 200 mM Tris/HCl pH 7,5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA pH 8, 0,5 % (w/v) SDS TFBI 30 mM KAc, 100 mM RbCl, 10 mM CaCl2, pH (HCl) 5,8, 50 mM MnCl2, 15 % (v/v) Glycerin TFBII 10 mM Na-MOPS, 75 mM CaCl2, 10 mM RbCl, pH (NaOH), 15 % (v/v) Gycerin Infiltrationspuffer 10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,7 + 100 µM Acetosyringon frisch vor Verwendung ND96 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM Hepes, pH (NaOH) 7,4, π=220 (Sorbitol) SDS-Sammelgelpuffer 0,139 M Tris-HCl pH 6,8, 0,11 % SDS (w/v) SDS-Trenngelpuffer (3x) 1,126 M Tris-HCl pH 8,8, 0,3 % SDS (w/v) SDS-Sammelgel (2 Gele) 3,4 ml Sammelgelpuffer, 1,2 ml Rotiphorese Gel 30 (Roth), 5 µl TEMED, 30 µl 10 %iges APS SDS-Trenngel 4 ml Trenngelpuffer, 3,2 ml H2O, 4,8 ml Rotiphorese Gel 30 (Roth), 10 µl TEMED, 150 µl 10 %iges APS (2 Gele, 12 %) SDS-Laufpuffer 25 mM Tris, 250 mM Glycin, 0,1 % (w/v) SDS SDS-Ladepuffer (4 x) 250 mM Tris-HCl pH 6,8, 20 % Glycerin, Spatelspitze Bromphenolblau, 8 % SDS, 20 % β-Mercaptoethanol Coomassie 25 % (v/v) Isopropanol, 10 % (v/v) Essigsäure, Spatelspitze Coomassie Brilliantblau Westerntransferpuffer 20 mM Tris, 150 mM Glycin, 0,02 % (w/v) SDS; auf Seite der Anode mit 20 % (v/v) Methanol 90 4. Material und Methoden Overlay2+ Blockierungslösung (Ca ) OverlayBlockierungslösung (EGTA) 100 mM NaCl, 50 mM Tris, 1 mg/ml BSA, 0,05 % (v/v) Tween 20, 5 mm CaCl2, pH (HCl) 7,5 100 mM NaCl, 50 mM Tris, 1 mg/ml BSA, 0,05 % (v/v) Tween 20, 5 mm EGTA, pH (HCl) 7,5 Strep-Waschpuffer 100 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA Strep-Elutionspuffer 100 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2,5 mM Desthiobiotin Strep-Regenerationspuffer 100 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM HABA His-Waschpuffer (20) 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol, pH (NaOH) 8 His-Waschpuffer (65) 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 65 mM Imidazol, pH (NaOH) 8 His-Elutionspuffer 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol, pH (NaOH) 8 4.1.7 Antikörper, Chemikalien, Enzyme, Verbrauchsmaterial Antikörper • • Anti-Strep (IBA, Göttingen) Anti-Maus IgG HRP-Konjugat (Sigma-Aldrich, Taufkirchen) Soweit nicht anders angegeben, wurden Chemikalien der Firmen AppliChem GmbH (Darmstadt), Sigma-Aldrich (Taufkirchen), Roth (Karlsruhe), Fluka Chemie AG (Buchs, Schweiz), PeqLab Biotechnology GmbH (Erlangen) und Duchefa Biomedicals (Haarlem , Niederlanden) genutzt. Für Restriktionsanalysen wurden Enzyme der Firma New England Biolabs (NEB, Schwalbach) verwendet. Plastikwaren und weiteres Verbrauchsmaterial wurden hauptsächlich von den Firmen Hartenstein (Würzburg), Roth (Karlsruhe) und Sarstedt AG & Co. (Nümbrecht) erstanden. 4.1.8 Geräte ÄKTApurifier GE Healthcare, München Autoklav 2540 EL Systec, Wettenberg CLSM Leica TCS SP2 und SP5 Leica Microsystems, Bensheim Electroporator GenePulserII Biorad Laboratories GmbH, München Kühlzentrifuge 5810R Eppendorf, Hamburg Kühlzentrifuge Avanti J-25 Beckman Coulter (USA) MiniSpin Plus Tabletop Zentrifuge Eppendorf, Hamburg NanoPhotometer, P330 Implen, München Optimac Entwicklungsmaschine Protec, Oberstenfeld PCR Mastercycler personal Eppendorf, Hamburg 91 pH-Meter CG 842 Schott, Mainz Picospritzer III Parker Hannifin Corp, Hollis (USA) Pipettenziehgerät, PP-830 Narishige, Tokyo (Japan) Proteingel und –blot-Ausrüstung Biorad, München TECAN infinite F200 Plattenlesegerät Tecan Trading AG, Männedorf (Schweiz) TissueLyser Quiagen, Hilden Vakuumkonzentrator, Concentrator 5301 Eppendorf, Hamburg Neben diesen Geräten wurde die Standardausstattung eines molekularbiologischen Labors verwendet. 4.1.9 Software, Internetseiten Adobe Design Premium CS5 Adobe Systems, San Jose (USA) CorelDRAW X5 Corel Corporation, Ottawa (Kanada) EndNote X7 Thomson, Carlsbad (USA) Leica Confocal Software 2.5, LCS lite Leica Microsystems, Bensheim LAS AF, LAS AF lite Leica Microsystems, Bensheim Microsoft Office 2010 Microsoft Corporation, Redmond (USA) Vector NTI Advance 9.1/11 Invitrogen, Karlsruhe http://www.arabidopsis.org/ http://www.aramemnon.botanik.uni-koeln.de/ http://bar.utoronto.ca/ http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ http://elm.eu.org/ https://www.gatc-biotech.com/de/index.html https://www.genevestigator.com/gv/index.jsp http://www.neb.com/nebecomm/DoubleDigestCalculator.asp http://phosphat.uni-hohenheim.de/ http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do http://www.uniprot.org/ http://web.expasy.org/compute_pi/ http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi 92 4. Material und Methoden 4.2 Methoden 4.2.1 Molekularbiologische Methoden Wenn nicht anders angegeben, wurden Methoden nach Anleitung des Herstellers oder Standardmethoden verwendet (Sambrook und Russell, 2001). 4.2.1.1 Anzuchtbedingungen für Bakterien Die Anzucht von E. coli-Zellen erfolgte aerob in LB-Medium bei 37 °C. Agrobakterien wurden aerob bei 29 °C in LB- oder YEB-Medium angezogen. Zur Selektion auf bestimmte Plasmide wurden den Medien entsprechende Antibiotika hinzugefügt. Nach der Transformation oder bei Anzucht aus Dauerkulturen wurden die Bakterien auf LB-Nährböden ausgebracht, die 1,5 % Agar-Agar und entsprechende Antibiotika enthielten. Agrobakterien benötigten zwei Tage Inkubation nach der Transformation, sonst erfolgte die Inkubation über Nacht. 4.2.1.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli 1,5 ml einer Über-Nacht-Kultur wurde bei 20000 x g 30 Sekunden pelletiert und das Pellet mit 300 µl P1 wieder gelöst. Nach Zugabe von 300 µl P2 wurde das Gemisch invertiert und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden 300 µl P3 zugegeben, durch Invertieren gemischt und 10 Minuten bei 4 °C inkubiert. Nach einem Zentrifugationsschritt von 10 Minuten bei 20000 x g wurde der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und 600 µl Isopropanol hinzugegeben. Dies wurde wieder invertiert und 15 Minuten bei 20000 x g gekühlt zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet mit 70 % Ethanol gewaschen. Nach einer weiteren Zentrifugation von 10 Minuten bei 20000 x g wurde Ethanol vorsichtig mit der Pipette abgezogen und das Pellet bei 37 °C getrocknet. Die DNA wurde in 30 µl sterilem Wasser gelöst. Größere, reinere Mengen DNA wurden mit dem NucleoBond PC 100 Kit (Macherey-Nagel, Düren) nach Protokoll aufgereinigt. Plasmide wurden aus einer 100 ml Über-Nacht-Kultur isoliert und die DNA am Ende in 50 µl sterilem Wasser aufgenommen. 4.2.1.3 Polymerasekettenreaktion – Polymerase Chain Reaction (PCR) Zur Klonierung bestimmter DNA-Fragmente für die Herstellung neuer Zwischenklonierungsvektoren oder zur Überprüfung auf erfolgreiche Transformation von Agrobakterien oder Pflanzen wurde die Methode der PCR verwendet. Zur Amplifizierung fehlerfreier DNA-Fragmente, die später per Sequenzierung überprüft wurden, wurde die Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase verwendet. Wenn das Vorhandensein eines Vektors per PCR überprüft wurde, z.B. per „Colony-PCR“, wurde die Phire-Polymerase verwendet. 93 Tabelle 21: Typische PCR-Ansätze. Phusion-Ansazt Phire-Ansatz Komponente Menge Plasmid, g- oder cDNA Komponente Menge 1 µl Bakteriensuspension oder gDNA 5 x HF Phusion Puffer 10 µl 5 x Phire Puffer dNTPs 10 mM 1-2 µl 4 µl 1 µl dNTPs 10 mM 0,4 µl Fwd-Primer 20 µM 1,5 µl Fwd-Primer 20 µM 0,5 µl Rev-Primer 20 µM 1,5 µl Rev-Primer 20 µM 0,5 µl Phusion-Polymerase 0,5 µl Phire-Polymerase 0,2 µl Wasser Ad 50 µl Wasser Ad 20 µl Typische PCR-Ansätze wurden in Tabelle x und deren Programme in Tabelle x zusammengefasst. Für eine „Colony-PCR“ wurde eine kleine Menge Agrobakterien von Agarnährplatten entnommen und in Wasser gelöst. 1 µl dieser Zellsuspension wurde dann in einem PCR-Ansatz eingesetzt. Mutationen wurden bei großen Inserts durch Overlap-PCR eingefügt, bei kurzen Fragmenten in einem Schritt. Die entstandenen PCR-Produkte wurden dann per Agarose-Gelelektrophorese nach Größe aufgetrennt. Von Phusion-Ansätzen wurden die entstandenen Banden ausgeschnitten, die DNA aufgereinigt (Kap. 4.2.1.4) und in Ligationsansätzen (Kap. 4.2.1.9) oder zum Sequenzieren (Kap. 4.2.8.1) verwendet. Tabelle 22: Typische PCR-Protokolle. Annealingtemperaturen und Elongationszeiten wurden entsprechend den verwendeten Primern und der erwarteten Fragmentlänge angepasst. Phusion-Ansatz Phire-Ansatz Temperatur Zeit Temperatur Zeit 98 °C 30 sek 98 °C 30 sek 98 °C 10 sek 98 °C 5 sek 58 °C 15 sek 58 °C 5 sek 72 °C 15-30 sek/kb 72 °C 10-15 sek/kb 72 °C 5 min 72 °C 5 min 10 °C ∞ 10 °C ∞ 30-35 Zyklen 4.2.1.4 DNA-Extraktion aus Gelfragmenten DNA-Fragmente wurden per Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und gewünschte Banden ausgeschnitten. Zur Isolierung der DNA aus dem Gelstück wurde das innuPREP Gel Extraction Kit von Analytik Jena (Jena) nach Angaben des Herstellers verwendet. 94 4. Material und Methoden 4.2.1.5 Herstellung kompetenter Bakterien Zur Herstellung chemisch kompetenter E. coli-Zellen wurde eine Über-Nacht-Kultur in 100 ml SOCMedium mit E. coli angesetzt und bei 37 °C und 180 rpm (Innova 2300 Platform Shaker, New Brunswick Scientific) inkubiert. Die Zellen wurden am nächsten Tag mindestens zehn Minuten auf Eis abgekühlt und danach 15 Minuten bei 3200 x g bei 4 °C sedimentiert. Das Pellet wurde in 30 ml TFBI resuspendiert und wieder gekühlt. Nach einer weiteren Zentrifugation von zehn Minuten bei 3200 x g und 4 °C wurde das entstandene Pellet in einem ml TFBII resuspendiert. Die Zellen wurden in 50 µlAliquots in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert. Zur Herstellung elektrisch kompetenter Agrobakterien wurde eine Kultur von 100 ml LB-Medium und 10 µg/ml Rifampicin mit Agrobakterien angesetzt und über Nacht bei 29 °C und 180 rpm (Innova 2300 Platform Shaker, New Brunswick Scientific) inkubiert. Die Zellen wurden am nächsten Tag 10 Minuten bei 3200 x g sedimentiert und dreimal mit je 50 ml 10 %igem eiskalten Glycerin gewaschen. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt wurden die Zellen in 1 ml 10 %igem eiskalten Glycerin aufgenommen, in 40 µl-Aliquots verteilt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert. 4.2.1.6 Transformation von Bakterien Chemisch kompetente E. colis wurden auf Eis aufgetaut und mit 1 µl DNA bzw. ganzen Ligationsoder LR-Ansätzen gemischt. Nach 15 Minuten Inkubation auf Eis erfolgte ein Hitzeschock von 40 Sekunden bei 42 °C. Danach wurden die Ansätze sofort wieder zwei Minuten auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 450 µl SOC-Medium wurden die Zellen eine Stunde bei 37 °C schüttelnd inkubiert. Bei einer Retransformation wurden 100 µl des Ansatzes auf Selektionsplatten ausgebracht. Bei Klonierungen wurden die Zellen sedimentiert, der Überstand grob abgekippt und die Zellen im Rücklauf resuspendiert. Hier wurden alle Zellen auf Selektionsplatten ausgebracht. Elektrokompetente Agrobakterien wurden auf Eis aufgetaut, mit 1 µl DNA gemischt und in vorgekühlte Elektroporationsküvetten gegeben. Die Zellen wurden bei folgenden Einstellungen elektroporiert: 25 µF, 2,4 kV und 200 Ω (Gene Pulser II, Biorad Laboratories GmbH, München). Nach Zugabe von 1 ml YEB-Medium wurden die Zellen 2-3 Stunden bei 29 °C und 180 rpm (Innova 2300 Platform Shaker, New Brunswick Scientific) inkubiert. 70 µl der Ansätze wurden auf LB-Platten mit entsprechenden Antibiotika ausgebracht. 4.2.1.7 Anlegen von Dauerkulturen 300 µl einer Über-Nacht-Kultur wurden mit 300 µl 70 % Glycerin gemischt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert. 95 4.2.1.8 Sequenzierung von Plasmiden oder DNA-Fragmenten Plasmid-DNA oder DNA-Fragmente wurden von GATC Biotech AG (Konstanz) sequenziert. Hierfür wurden entweder Standardprimer der Firma verwendet oder eigene Primer (Tab. 9 + 10) mitgeliefert. 4.2.1.9 Klonierungsstrategien Sofern entsprechende Zielvektoren vorhanden waren, wurde die Gateway Technologie (Invitrogen, Karlsruhe, jetzt ThermoFisher Scientific Inc.) verwendet. PCR-Fragmente wurden über die CACCSequenz in den pENTR/D/TOPO-Vektor ligiert und per LR-Reaktion in Zielvektoren gebracht. Wenn Eingangs- und Zielvektor die gleiche Resistenz in Bakterien vermittelten, wurde der pUC-ori aus den Eingangsvektoren mit dem Restriktionsenzym MluI ausgeschnitten. Wurden nicht-Gatewaykompatible Zielvektoren verwendet, wurden die PCR-Produkte in den pCR-Blunt II-TOPO-Vektor ligiert. Diese Klonierungen wurden nach Angaben des Herstellers durchgeführt. DNA-Sequenzen wurden aus dem pCR-Blunt II-TOPO-Vektor per Restriktionsverdau mit entsprechenden Enzymen an den im PCR-Produkt eingefügten Schnittstellen ausgeschnitten und mit einer 4:1 (Insert:Vektor) – Ligation in einen gewünschten Zielvektor eingebracht. Für einige Versuche wurden neue Gateway-kompatible Zielvektoren hergestellt: pGAD-CF Um bei YTH-Versuchen eine C-terminale Fusion der Aktivierungsdomäne an ein zu untersuchendes Protein zu ermöglichen, wurde ein neuer Gateway-kompatibler YTH-Vektor hergestellt. Als Vorlage wurde pGAD424 (Frederik Börnke, Uni Potsdam, IGZ Großbeeren) verwendet. Per PCR wurden Gatewaykassette und Sequenz für die Aktivierungsdomäne unter Verwendung der Primer 176-179 vertauscht. Zunächst wurden beide Fragmente einzeln amplifiziert und dann mit einer Overlap-PCR zusammengefügt. Mit einem Zwischenschritt über den Vektor pCR-Blunt II-TOPO wurde das neue Insert getestet und sequenziert und dann über die HindIII-Schnittstellen in das Grundgerüst des pGAD-Vektors gebracht. pGEM-VYNE, pGEM-VYNE(R), pGEM-VYCE, pGEM-VYCE(R) Zur Herstellung von Gateway-BiFC-Vektoren zur Expression in Oocyten wurden die Gateway-BIFCKassetten der BiFC-Vektoren zur Expression in Tabak (Gehl et al., 2009) unter der Verwendung der Primer 170-175 amplifiziert und in den Zwischenklonierungsvektor pCR-Blunt II-TOPO ligiert. Daraus wurde die Kassette mit XbaI und HindIII ausgeschnitten und in den Oocytenexpressionsvektor pGEMHE ligiert, der vorher mit XbaI und HindIII linearisiert wurde. 96 4. Material und Methoden pGEM-GFP Außerdem wurde zur Expression in Oocyten ein weiterer Gateway-kompatibler Vektor hergestellt, der mit einer C-terminalen GFP-Fusion die Lokalisierung von untersuchten Proteinen ermöglicht. Hierfür wurde die GFP-Sequenz aus pMDC83 (Curtis und Grossniklaus, 2003) unter der Verwendung der Primer 180+181 amplifiziert und dabei die Sequenzen für SalI und HindIII angefügt. Das PCRProdukt wurde zunächst in den Zwischenklonierungsvektor pCR-Blunt II-TOPO gebracht, getestet und sequenziert. Daraufhin wurde das Fragment per Restriktionsverdau ausgeschnitten, sowie der Zielvektor pGEMHE-GW mit SalI und HindIII aufgeschnitten und somit linearisiert. Die GFPSequenz wurde per Ligation in den Gateway-kompatiblen Oocytenexpressionvektor eingebracht. 4.2.2 Methoden zur Arbeit mit Pflanzen 4.2.2.1 Anzucht von Pflanzen Samen von Arabidopsis thaliana wurden auf mit Previcurlösung (2,5 ml/l) gegen Wurzelfäule angegossener Anzuchterde (65 % P-Erde, 25 % Sand, 10 % Lavagrus) ausgebracht, und 2 Tage bei 4 °C stratifiziert. Danach erfolgte zunächst eine Anzucht unter Kurztagbedingungen (8 h Licht-, 16 h Dunkelphase, 22 °C, 60 % Luftfeuchtigkeit), wobei die Keimlinge entweder nach zwei Wochen in neue Töpfe pikiert wurden oder wenn die Samen vor Aussaat abgezählt und einzeln ausgebracht wurden, in den Töpfen belassen. Nach vier bis sechs Wochen wurden die Pflanzen bis zur Blüte und Samenproduktion unter Langtagbedingungen (16 h Licht-, 8 h Dunkelphase, 22 °C, 60 % Luftfeuchtigkeit) angezogen. Zur Selektion transformierter Pflanzen wurden Samen von Arabidopsis thaliana sterilisiert (siehe Kapitel 4.2.2.2) und auf Selektionsplatten (1/2 MS, 1 % Saccharose, 30 µg/µl Hygromycin, 250 µg/µl Cefotaxim - nur bei F1 -, 0,8 % Phytoagar) ausgebracht. Diese wurden zwei Tage bei 4 °C stratifiziert und danach nach Harrison et al. (2006) einer Schnellselektion unterzogen. Hierfür wurden die Platten für mindestens vier Stunden Licht ausgesetzt und dann 3 Tage im Dunkeln verpackt. In dieser Zeit bildeten resistente Pflanzen ein langes Hypokotyl aus, was nicht-resistenten Pflanzen nicht möglich war. Nach weiteren Tagen Inkubation in der Platten-Langtagkammer (16 h Licht-, 8 h Dunkelphase, 22 °C) wurden jene Pflanzen auf Erde pikiert, die ein langes Hypokotyl und starke Keimblätter bzw. schon die ersten Blätter gebildet haben, sodass sie mit einer Pinzette transferiert werden konnten. Die Anzucht erfolgte weitere zwei Wochen unter Kurztagbedingungen (s.o.), damit die Pflanzen eine kräftige Rosette ausbildeten und danach bis zur Samenbildung unter Langtagbedingungen (s.o.). Samen von Nicotiana benthamiana wurden wie auch die Samen von Arabisopsis thaliana zunächst auf Anzuchterde (s.o.) ausgesät. Die Keimlinge wurden nach einer Woche in T-Erde pikiert. Die Anzucht erfolgte ab Aussaat im Gewächshaus. 97 4.2.2.2 Sterilisierung von Samen Samen, die auf Agarplatten ausgebracht wurden, mussten an der Oberfläche sterilisiert werden, damit die zuckerhaltigen Platten nicht verpilzen. Eine Spatelspitze Samen wurde in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und fünf Minuten in 1 ml Sterilisierungslösung (40 % Danklorix, 1 % Tween 20) gemischt. Die Samen wurden 30 Sekunden bei 14000 x g sedimentiert, die Sterilisierungslösung entfernt und dreimal mit sterilem Wasser gewaschen. Nach dem vierten Zentrifugationsschritt wurden die Samen in einer 0,1 %igen Agaroselösung aufgenommen und auf den Selektionsplatten verteilt. 4.2.2.3 Stabile Transformation von Arabidopsis thaliana Verschiedene Linien von Arabidopsis thaliana wurden nach der Floral dip-Methode mit Hilfe von Agrobakterien, die entsprechende Plasmide enthielten, stabil transformiert (Clough und Bent, 1998). 4.2.2.4 Isolierung genomischer DNA aus Arabidopsis thaliana Blattmaterial wurde mit einer Edelstahlkugel und 400 µl Extraktionspuffer in ein 2 ml Reaktionsgefäß gegeben und in einer Kugelmühle (TissueLyser, Quiagen, Hilden) zwei Minuten bei 25 Hz aufgeschlossen. Nach einer Ruhezeit von maximal einer Stunde zum Absetzen des gebildeten Schaums wurden Gewebereste für acht Minuten bei 20000 x g sedimentiert. 300 µl des Überstandes wurden in ein neues Reaktionsgefäß überführt und 300 µl Isopropanol dazugegeben. Die beiden Lösungen wurden gemischt und zwei Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach erfolgte eine fünfminütige Zentrifugation bei 20000 x g. Der Überstand wurde ebenfalls abgenommen und das Pellet mit 500 µl 70 % Ethanol gewaschen. Ethanol wurde nach einer fünfminütigen Zentrifugation bei 20000 x g mit der Pipette abgenommen und das Pellet bei Raumtemperatur trocknen gelassen. Die genomische DNA wurde in 70 µl sterilem Wasser gelöst. 4.2.2.5 Selektion transformierter dnd1-Pflanzen und Komplementationsanalysen Die Selektion transformierter dnd1-Pflanzen (Ignatz, 2008) erfolgte wie in 4.2.2.1 beschrieben mit Hilfe von Hygromycin. Diese wurden so viele Generationen selektioniert, bis 100 % der getesteten Pflanzen der nächsten Generation resistent waren. Das zeigte, dass die Insertion auf beiden Allelen vorlag. Von positiven Pflanzen wurde genomische DNA isoliert (4.2.2.4) und per PCR überprüft, ob das gewünschte Konstrukt in die Pflanzen eingebracht wurde. Unter Verwendung der Primer 185 und 186 wurde somit das Vorhandensein des eingebrachten Konstrukts mit Erhalt einer Bande bestätigt, deren Größe einen ersten Hinweis auf die Richtigkeit des Konstrukts gab. Das erhaltene DNAFragment wurde mit Primer 186 sequenziert und nach Auswertung bestätigt, dass es sich um das gewünschte, fehlerfreie Konstrukt handelte, welches in die Pflanzen eingebracht wurde. Weiter wurde 98 4. Material und Methoden überprüft, ob die Pflanzen im homozygoten dnd1-Hintergrund vorlagen. Da es sich bei der dnd1Mutation um eine Punktmutation (G->A) handelt, die zu einem Vorzeitigen Stopp-Codon führt, musste dies per PCR und Sequenzierung getestet werden. Primer 182 und 183 wurden verwendet, um einen Bereich der gDNA zu amplifizieren, der diese Punktmutation enthalten sollte. Mit Primer 184 wurde dieses Fragment sequenziert und mit Sequenzvergleich überprüft, ob das Triplett an entsprechender Stelle TGG ist und für Tryptophan kodiert oder TGA ist und somit ein Stopp-Codon darstellt. Wenn an dritter Stelle des Tripletts eindeutig ein Guanin gewesen wäre, würden die Pflanzen im Wildtyphintergrund vorliegen. Bei den verwendeten Pflanzen zeigte die Sequenzierung an dieser Stelle eindeutig ein Adenin und kein Guanin. Somit konnte man schlussfolgern, dass sie im homozygoten dnd1-Hintergrund vorlagen. Bei heterozygoten Pflanzen sieht man an dieser Stelle eine Überlagerung der Spektren für Guanin und Adenin. In dem eigentlichen Versuch wurde untersucht, ob der Ca2+-Phänotyp von dnd1 (Chan et al., 2003) in den Transformationslinien komplementiert werden konnte. Samen der zu untersuchenden Linien wurden oberflächensterilisiert (4.2.2.2) und auf ½ MS + 1 % Saccharose-Platten ausgebracht. Die Platten wurden drei Tage bei 4 °C stratifiziert und 5 Tage in der Platten-Langtagkammer wachsen gelassen. Danach wurden einzelne Pflanzen auf neue ½ MS + 1 % Saccharose und auf ½ MS + 1 % Saccharose + 18,5 mM CaCl2-Platten umgesetzt. Diese Platten wurden weitere 13 Tage bei Langtagbedingungen inkubiert. Zur Frischgewichtbestimmung wurden bis zu fünf Pflanzen in einem Reaktionsgefäß gewogen. Die Pflanzen wurden in den offenen Gefäßen über Nacht in einem Trockenschrank inkubiert und am nächsten Tag wurde das Trockengewicht bestimmt. Das Gewicht einer Pflanze wurde berechnet. 4.2.2.6 Transiente Transformation von Nicotiana benthamiana Zur transienten Tabaktransformation wurden Agrobakterien über Nacht bei 29 °C aerob in 3-5 ml YEB-Medium mit entsprechenden Antibiotika angezogen. Der Helferstamm p19 (Voinnet et al., 2003) wurde je nach Bedarf in entsprechender Menge YEB-Medium mit Rifampicin, Ampicilin und Kanamycin angezogen. Am nächsten Tag wurden die optischen Dichten der Kulturen bestimmt und eine bestimmte Menge Zellen sedimentiert, damit eine OD600 von 1 erreicht wurde, wenn die Zellen in 3 ml Infiltrationspuffer (mit Acetosyringon versetzt) aufgenommen wurden. Die Kulturen wurden 1:1 mit p19 gemischt, der auch auf OD600=1 eingestellt wurde. Die Bakteriensuspensionen wurden drei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und dann mit einer 1 ml Spritze von der Blattunterseite in die Tabakblätter gespritzt. Zur Transformation wurden 6-8 Wochen alte N. benthamiana verwendet. Infiltrierte Bereiche wurden mit einem Filzstift markiert. Nach zwei Tagen wurden die Versuche ausgewertet. 99 4.2.2.7 BiFC – Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation in N. benthamiana Zur Untersuchung von Protein-Interaktionen in Pflanzen wurde die BiFC-Methode gewählt. Diese ermöglicht im Gegensatz zu YTH-Versuchen die Verwendung ganzer Membranproteine. Für diese Versuche wurde ein Vektorset von Gehl und Kollegen (2009) verwendet. CNGCs wurden als Fusionen mit der N-terminalen Venus-Hälfte (VN) eingesetzt, mögliche Interaktionspartner mit der Cterminalen Hälfte (VC). Agrobakterien wurden mit den einzelnen Konstrukten transformiert, getestet („Colony-PCR“) und über Nacht angezogen. Die Vorbereitung für die transiente Transformation von N. benthamiana erfolgte ähnlich wie oben beschrieben. Der einzige Unterschied bestand darin, dass die Konstrukte in 1,5 ml Infiltrationspuffer (+ Acetosyringon) auf OD600=1 eingestellt und dann Paare, der auf Interaktion zu untersuchenden Konstukte enthalternder Agrobakterien 1:1 gemischt wurden, bevor dieses Gemisch 1:1 mit p19 vereint wurde. Das bedeutet, dass jede Bakteriensuspension 3 Agrobakterienstämme (1:1:2) enthielt. Als Negativkontrollen wurden Agrobakterien verwendet, die einen Vektor enthielten, der die Herstellung von VC ohne Fusion ermöglichte. Wenn möglich, wurden alle Konstrukte auf einem Blatt aufgebracht, sodass ein direkter Vergleich zwischen den Kombinationen innerhalb eines Blattes möglich war. Außerdem wurden mehrere technische Replikate angefertigt (mehrere Blätter infiltriert), um dies statistisch auswerten zu können. Versuche von verschiedenen Tagen konnten meist nicht miteinander verglichen werden, da sich die Expression in den Tabakpflanzen teilweise sehr unterschied, was womöglich an Schwankungen der Anzuchtbedingungen im Gewächshaus lag. Nach zwei Tagen wurden die Versuche mikroskopisch und quantitativ ausgewertet. Die Quantifizierung erfolgte mit einem TECAN infinite F200 Plattenlesegerät (Tecan Trading AG, Männedorf, Schweiz). In schwarzen 96-Well-Platten wurden 80 µl Wasser vorgelegt. Blattscheiben aus den infiltrierten Bereichen wurden mit einem Korkbohrer (Größe 3) ausgestanzt und mit der Blattunterseite nach oben in die Wells auf das Wasser gelegt. Mit einem 485 ± 20 nm Anregungsfilter und einem 535 ± 25 nm Emissionsfilter wurde die relative Fluoreszenzmenge pro Blattscheibe bestimmt. Die technischen Replikate wurden statistisch ausgewertet. 4.2.3 Mikroskopie Fluoreszenzbilder wurden an einem Leica TCS SP2 oder SP5 (Leica Microsystems, Bensheim) aufgenommen. Zur Auswertung von BiFC-Versuchen wurden Blattscheiben aus infiltrierten Blattbereichen von Nicotiana benthamiana mit einem Korkbohrer (Größe 1) ausgestanzt und mit der Blattoberseite nach unten mit Hilfe eines doppelseitigen Klebebands an einem Objektträger befestigt. Zur Verdrängung der Luft aus den Zellzwischenräumen wurde die Oberflächenspannung mit einem Tropfen Perfluorodecalin (Sigma-Aldrich, Taufkirchen) verringert und inkubiert, bis sichtbar wurde, dass 100 4. Material und Methoden dieses die Luft aus dem Blatt verdrängt hat. Dann wurde das Präparat mit einem Deckglas versehen und mit einem 20 x Wasserobjektiv und 2 x digitalem Zoom mikroskopiert. Hefen wurden aus einer Über-Nacht-Kultur auf HistoBond+ adhäsive Objektträger (MarienfeldSuperior, Lauda-Königshofen) gegeben und mit einem Deckglas mit „Knetfüßchen“ versehen. Dies wurde mit einem 63 x Immersionsobjektiv mit digitalem Zoom mikroskopiert. Oocyten wurden in ihrer Aufbewahrungslösung (ND96) in der Mitte kleiner Petrischalen positioniert und diese Schale auf einen Objektträger gestellt. Mit einem 4 x Luftobjektiv wurden einzelne Oocyten ohne digitalen Zoom aufgenommen. Zur Detektion der verschiedenen Fluorophore wurden folgende Lasereinstellungen gewählt: Tabelle 23: Anregungswellenlänge und Detektionsbereiche für verwendete Fluorophore. Fluorophor Anregungswellenlänge Detektierter Emissionsbereich GFP 488 nm 500-520 nm mCherry 488 nm 600-650 nm Venus (BiFC) 514 nm 530-550 nm 4.2.4 Methoden zur Arbeit mit Hefen 4.2.4.1 Anzuchtbedingungen für Hefen Die Anzucht von Hefen erfolgte in YPD (Vollmedium) oder zur Selektion in Minimalmedien (CAA, SCAD-W-L, SCAD-W-L-H, SCAD-W-L-H+3-AT), in dem ausgewählte Aminosäuren fehlten, aerob bei 29 °C. Die Inkubation von Flüssigmedien erfolgte über Nacht. Platten wurden zwei Nächte inkubiert. 4.2.4.2 Transformation von Hefen Zur Transformation wurden Über-Nacht-Kulturen der entsprechenden Hefen in 2,2 ml YPD bei 29 °C angezogen. Diese wurden am nächsten Tag 10 Minuten bei 1700 x g sedimentiert. Das Pellet wurde mit 1 ml sterilem Wasser gewaschen. Weitere Zentrifugationsschritte wurden auf eine Minute reduziert. Die Hefen wurden mit 500 µl und dann mit 250 µl 100 mM Lithiumacetat gewaschen. Nach dem letzten Schritt wurden die Zellen in 100 µl Aliquots aufgeteilt bevor sie wieder zentrifugiert wurden. Der Überstand wurde entfernt und zu den Zellen wurden 240 µl 50 % PEG, 36 µl 1 M Lithiumacetat, 5 µl DNA und 79 µl steriles Wasser gegeben. Wurden die Hefen mit verschiedenen DNAs ko-transformiert (YTH), so wurden 5 µl jeder DNA und entsprechend weniger Wasser verwendet. Nachdem die Komponenten durch Auf- und Abpipettieren gemischt wurden, folgten eine Inkubation von 30 Minuten bei 30 °C und ein Hitzestress für 20 Minuten bei 42 °C. Die Zellen wurden nun eine Minute bei 1700 x g pelletiert und das Pellet in 175 µl 0,9 % NaCl aufgenommen und das ganze Volumen auf Selektionsplatten ausgebracht. 101 4.2.4.3 Yeast Two-Hybrid (YTH) Nach Ko-Transformation wurden Hefen mit entsprechenden zu testenden Kombinationen in SCADW-L-Selektionsmedium über Nacht angezogen. Am nächsten Tag wurden die Hefen auf OD600=2 in 500 µl 0,9 % NaCl eingestellt und zwei 1:10 Verdünnungen (OD600=0,2 und 0,02) hergestellt. Von jeder Konzentration wurden 5 µl auf drei verschiedene Platten getropft: SCAD-W-L zur Überprüfung, dass die Hefen beide Vektoren aufgenommen haben, SCAD-W-L-H zum Testen auf Interaktion und SCAD-W-L-H+3-AT um festzustellen, wie stark eine Interaktion ist. Als Positivkontrolle wurde immer die Kombination BD-CNGC20C-Terminus + AD-CaM2 mitgeführt, deren Interaktion bereits mit verschiedenen Methoden nachgewiesen wurde (Fischer, 2010). Als Negativkontrollen wurden „Leervektoren“ als Interaktionspartner eingesetzt, die nur BD oder AD exprimierten. 4.2.5 Methoden zur Arbeit mit Oocyten 4.2.5.1 Herstellung von cRNA Zur Herstellung von cRNA wurden 10-15 µg mit dem NucleoBond PC100 Kit (Macherey-Nagel, Düren) aufgereinigte DNA (Oocytenexpressionsvektoren) mit einem 5‘-Überhang nach der 3‘-UTR linearisiert. Der Ansatz wurde mit Proteinase K und SDS behandelt und die DNA mit RotiPhenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Carl Roth GmbH, Karlsruhe) extrahiert und mit 100 %igem Ethanol gefällt. Danach erfolgte die in vitro Transkription mit dem mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit (Ambion Inc., Huntington, UK) nach Protokoll des Herstellers. Die RNA wurde zunächst in 30 µl Kit-Wasser gelöst und nach Bestimmung der Konzentration auf 0,5 µg/µl eigestellt. 4.2.5.2 Oocyteninjektion Für Versuche mit Oocyten wurden präparierte Oocyten von Dr Robert Rauh, Uni Erlangen, bereitgestellt. Diese wurden in ND96-Lösung mit Gentamycin bei 16 °C gelagert. Zur Injektion wurden Kanülen aus Glaskapillaren (3-000-203-G/X, Drummond Scientific Company, Broomall, USA) selbst hergestellt. Diese wurden zunächst in einem vertikalen Pipettenziehgerät (PP-830, Narishige, Tokyo, Japan) in zwei Stufen (72/74,4; 3 Gewichte) zu zwei Pipetten ausgezogen. Die feinen Spitzen wurden schräg angebrochen und die neu entstandene Spitze durch Schmelzen an einem glühenden Draht fein ausgezogen. 1 µl cRNA (einzeln oder Gemisch) wurde mit Hilfe eines Picospritzer III (Parker Hannifin Corp, Hollis, USA) in die feine Kanüle aufgezogen und auf bis zu 20 Oocyten verteilt injiziert. Einstellungen der Zeiten für Aufsaugen der cRNA oder für die Injektion waren abhängig von der Öffnungsweite der Kanülen, welche aufgrund manueller Herstellung und durch Verstopfen variierte. Die Oocyten wurden zwei bis vier Tage bei 16 °C inkubiert und dann mikroskopisch ausgewertet. 102 4. Material und Methoden 4.2.6 Methoden zur Arbeit mit Proteinen 4.2.6.1 Herstellung rekombinanter Proteine CaM2 wurde über die Schnittstellen BamHI und PstI in den Vektor pASK-IBA5+ (IBA, Göttingen) kloniert. Dieser Vektor ermöglicht somit die Expression von Strep-CaM2. SoluBL21-Zellen wurden mit diesem Konstrukt transformiert. 500 ml LB + Ampicillin wurden mit einer Über-Nacht-Kultur auf OD600=0,1 angeimpft und bis OD600=0,6 bei 37 °C und 180 rpm (Innova 2300 Platform Shaker, New Brunswick Scientific) inkubiert. Die Induktion erfolgte durch 1 µg/ml Doxyzyklin. Das gewünschte Protein wurde in vier Stunden von den Zellen hergestellt. Die Inkubation erfolgte wie zuvor, nur dass der Kolben wegen der Lichtempfindlichkeit des Doxyzyklins in Alufolie eingepackt wurde. Die Zellen wurden in zehn Minuten bei 5000 x g und 4 °C geerntet. CNGC20594-764 wurde über die Schnittstellen XmnI und HindIII in den Vektor pMALc2x (NEB, Schwalbach) kloniert. Dieser Vektor ermöglicht somit die Expression von MBP-CNGC20594-764. SoluBL21-Zellen wurden mit diesem Konstrukt transformiert. 500 ml LB + Ampicillin wurden mit einer Über-Nacht-Kultur auf OD600=0,1 angeimpft und bis OD600=0,6 bei 37 °C und 180 rpm (Innova 2300 Platform Shaker, New Brunswick Scientific) inkubiert. Die Induktion erfolgte durch 2 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG). Das gewünschte Protein wurde in drei Stunden von den Zellen hergestellt. Die Inkubation erfolgte wie zuvor. Die Zellen wurden in zehn Minuten bei 5000 x g und 4 °C geerntet. Außerdem wurde CNGC20594-764 mit einer vorangehenden Sequenz, die für eine TEV-Schnittstelle kodiert, über die Gateway-Methode in pVP13 (Thao et al., 2004) kloniert. Dieser Vektor ermöglicht somit die Expression von S-Tag-His-MBP-TEV-CNGC20594-764. SoluBL21-Zellen wurden mit diesem Konstrukt transformiert. Ein Liter LB + Ampicillin wurden mit einer Über-Nacht-Kultur auf OD600=0,05 angeimpft und bis OD600=0,6 bei 37 °C und 180 rpm (Innova 2300 Platform Shaker, New Brunswick Scientific) inkubiert. Die Induktion erfolgte durch 1 mM IPTG. Das gewünschte Protein wurde in vier Stunden von den Zellen hergestellt. Die Inkubation erfolgte wie zuvor. Die Zellen wurden in zehn Minuten bei 5000 x g und 4 °C geerntet. 4.2.6.2 Reinigung rekombinanter Proteine Strep-CaM2 wurde über eine Strep-Tactin-Handsäule aufgereinigt. Die Zellen wurden per Ultraschall aufgeschlossen und übrige Zelltrümmer sowie nicht aufgeschlossene Zellen per Zentrifugation (15 Minuten bei 14000 x g und 4 °C) und Filtration (0,4 µm) ausgeschlossen. Zur Affinitätsreinigung wurde eine 0,75 ml Säule nach Anleitung des Herstellers der Strep-Tactin-Sepharose (IBA, Göttingen) verwendet. Die Elution erfolgte mit 2,5 mM Desthiobiotin. Strep-CaM2 wurde für den Overlay-Assay verwendet. S-Tag-His-MBP-TEV-CNGC20594-764 wurde über eine „HisTrap FF crude“-Säule mit Hilfe eines Äkta Purifiers (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg) aufgereinigt. Die Zellen wurden wie oben 103 beschrieben aufgeschlossen und das Filtrat an die Säule gebunden. Insgesamt wurde das Protein zweimal an die Säule gebunden. Im ersten Lauf wurde die Säule mit einem 20 mM ImidazolWaschpuffer gewaschen, und mit einem 250 mM Imidazol-Elutionspuffer eluiert. Das erhaltene Protein wurde mit Hilfe von Konzentratorröhrchen in 20 mM Imidazol-Waschpuffer umgepuffert und erneut auf die Säule geladen. Im zweiten Lauf wurde ein 65 mM Imidazol-Waschpuffer verwendet und am Ende das Protein wieder mit dem 250 mM Imidazol-Elutionspuffer eluiert. Somit konnten unerwünschte Proteine der Größe 50 kDa, die nach dem ersten Lauf in hoher Konzentration vorlagen, ausgeschlossen und das gewünschte Protein mit einer Größe von 67,9 kDa angereichert werden. Die Reinheit der rekombinanten Proteine wurde per SDS-PAGE überprüft. 4.2.6.3 Overlay-Assay Ein Zellextrakt von MBP-CNGC20-C-Terminus wurde nach Zellaufschluss über SDS-PAGE aufgetrennt. Hierbei wurden Zellextrakt und Strep-CaM2 dreifach aufgetragen. 1/3 des Gels wurde mit Coomassie-Färbelösung gefärbt und 2/3 des Gels auf eine Membran geblottet. Letzteres erfolgte mit einer semi-dry Methode. Die Membran wurde halbiert und eine Hälfte in Blockierungslösung mit CaCl2, die andere mit in Lösung mit EGTA blockiert. Nachdem die Membranen mit Wasser gewaschen wurden, wurden sie in frische Blockierungslösung (mit CaCl2 oder EGTA) gelegt und je 1 µg/ml Strep-CaM2 zugegeben. Dies wurde 30 Minuten geschwenkt. Die Konzentration von StrepCaM2 wurde an einem NanoDrop (Thermo Scientific) vermessen. Danach wurden die Membranen gewaschen und wieder in neuem Blockierungspuffer über Nacht mit 1:2500 verdünntem Anti-StrepAntikörper inkubiert. Am nächsten Tag erfolgte nach weiteren Waschschritten die Inkubation mit dem zweiten, POD-gekoppelten Antikörper. Ungebundener Antikörper wurde wieder abgewaschen. Die Detektion erfolgte mit Hilfe des Lumi Light Western Blotting Substrats (Roche, Basel, Schweiz). Somit wurde an den C-Terminus von CNGC20 gebundenes CaM auf Höhe des C-Terminus (62 kDa) nachgewiesen. Durch das Mitführen von Strep-CaM im SDS-Gel und Blot auf die Membran, wurde auf beiden Membranen bestätigt, das die Übertragung auf die Membran funktioniert hat, da dieses auf beiden Membranen auf Höhe von 19,6 kDa detektiert wurde. 4.2.7 Statistik Statistische Auswertungen wurden mit Microsoft Excel 2010 durchgeführt. Mittelwerte und Standardfehler wurden berechnet. Hier wurde der t-Test verwendet und ein Signifikanzniveau von 5 % angewandt. 104 5. Zusammenfassung 5. ZUSAMMENFASSUNG Pflanzliche CNGCs (zyklisch Nukleotid-gesteuerte Kanäle) sind PM-lokalisierte Ca2+-permeable Ionenkanäle, die in diverse Funktionen wie Ionenhomöostase, Fortpflanzung und biotische Stressantworten involviert sind. Im Gegensatz zu tierischen CNGCs sind die pflanzlichen Kanäle nur oberflächlich untersucht. Ein Grund dafür ist die Schwierigkeit, sie in heterologen Systemen funktionell zu exprimieren. Da in dieser fremden Umgebung womöglich wichtige Regulatoren fehlen, wurden in dieser Arbeit Studien zur Interaktion der CNGCs mit regulatorischen Proteinen durchgeführt. Dafür wurden Calcium-abhängige Proteinkinasen (CDPKs), Proteinphosphatasen der Gruppe 2C (PP2Cs) und Calmoduline (CaMs) ausgewählt. Die Bindung von CNGCs durch PP2Cs wurde in Yeast two-Hybrid- (YTH-) Versuchen gezeigt. Mit Hilfe der Bimolekularen Fluoreszenzkomplementation (BiFC) wurden weiterhin Interaktionen zwischen CDPKs und CNGC9, CNGC12, CNGC17 und CNGC20 in zwei verschiedenen Expressionssystemen, Nicotiana benthamiana und Oocyten des Krallenfroschs Xenopus laevis, nachgewiesen. Alle getesteten Kinasen banden entweder N- oder C-Terminus der in diesen Versuchen verwendeten Kanäle unterschiedlich stark. Somit wurde ein Grundstein für funktionelle Expressionsstudien gelegt. Sofern eine Phosphorylierung der CNGCs durch CDPKs stattfindet, kann untersucht werden, ob PP2Cs diese Phosphate wieder entfernen. Das Hauptaugenmerk richtete sich auf die Untersuchung der Interaktion zwischen CNG-Kanälen und CaMs. CaMs sind wichtige Regulatoren im Ca2+-Signaling, da sie durch die Bindung an Zielproteine, z.B. auch CNGCs, die Veränderung der intrazellulären Ca2+-Konzentration vermitteln können. Dabei sind die exakten Zielstrukturen und Regulationsmechanismen noch nicht genau untersucht. YTHVersuche ergaben, dass alle CNG-Kanäle aus Arabidopsis thaliana mit allen CaM-Isoformen über eine IQ-Domäne im C-Terminus der Kanäle interagierten. Deletionsversuche an CNGC1, CNGC2 und CNGC20 bestätigten dies, da eine Interaktion mit den C-Termini der Kanäle ohne IQ-Domäne nicht mehr möglich war. Des Weiteren unterschieden sich die CNGCs in ihren Eigenschaften, CaMs zu binden. Sie interagierten unterschiedlich stark mit den einzelnen CaM-Isoformen und wiesen unterschiedlich große Bereiche um das IQ-Motiv auf, die für eine CaM-Bindung notwendig waren. Die das IQ-Motiv umgebenden Aminosäuren haben einen wichtigen Einfluss auf die Bindeeigenschaften der CaMBDs. Dazu gehören zwei aufeinanderfolgende Alanine an Position -3 und -4 relativ zu dem Isoleucin der Kernsequenz. Während die IQ-Peptide Ca2+-unabhängig mit der Cterminalen Hälfte von CaM, dem C-Lobe, interagierten, trugen Aminosäuren aus der Umgebung zu einer Ca2+-Abhängigkeit der CaM-Bindung an die C-Termini von CNGC19 und CNGC20 bei. Um die Bindeeigenschaften in in vitro-Untersuchungen noch näher analysieren zu können, wurde die Reinigung der in E. colis hergestellten C-Termini optimiert. Zusätzlich wurden Unterschiede zwischen den Methoden BiFC und YTH festgestellt, wobei YTH wahrscheinlich Interaktionen bei geringeren Ca2+-Konzentrationen darstellt, während die sensitivere ΒiFC-Methode Ca2+-unabhängige Bindungen zeigte. 105 Das neu aufgestellte Modell zur Regulation der CNGCs durch CaMs postuliert eine Präassoziation des Apo-CaMs über den C-Lobe an die IQ-Domäne unter Ruhebedingungen der Zelle. Ein Anstieg der Ca2+-Konzentration durch den geöffneten Kanal kann zu verschiedenen Umorientierungen des CaM am C-Terminus des CNG-Kanals führen. So kann entweder nur der N-Terminus zusätzlich binden, das gesamte Calmodulin nach Ca2+-Bindung mit einem anderen Bereich im Kanal interagieren oder CaMs gar Kanaluntereinheiten oder Bereiche miteinander verbinden, wie es bei tierischen Kanälen gezeigt wurde. Eine weitere Untersuchung der CaM-Bindung an CNGCs unter verschiedenen Ca2+Bedingungen kann dieses Modell noch weiter verfeinern. SUMMARY Plant cyclic nucleotide-gated channels (CNGCs) are PM-localized Ca2+-permeable ion channels, which are involved in a broad range of cellular activities including ion homeostasis, reproduction and biotic stress reactions. In contrast to their animal counterparts, detailed knowledge on plant CNGCs is still scarce. A functional expression of these channels in heterologous systems is challenging, which is most likely due to the fact that they depend on other, so far unknown, regulators for activation. To better understand CNGC regulation, the roles of group 2C protein phosphatases (PP2C), Ca2+dependent protein kinases (CDPKs) and calmodulins (CaMs) as putative regulators were studied. Interactions between CNGCs and PP2Cs could be shown in yeast-two-hybrid experiments and interactions between CNGC9, CNGC12, CNGC17 and CNGC20 with CDPKs was demonstrated via bimolecular fluorescence complementation (BiFC) in Nicotiana benthamiana and Xenopus laevis oocytes. All tested CDPKs were able to bind to either the N- or C- terminus of all tested CNGCs with varying affinity. Binding of PP2Cs or CDPKs to CNGC is a prerequisite for potential CNGC activation via dephosphorylation or phosphorylation respectively. Therefore, these results might enable characterization of plant CNGC isoforms via electrophysiological methods in the future. The main focus of this work was the study of CNGC and CaM interaction. CaMs are important players in Ca2+ signaling because they can mediate changes in intracellular Ca2+ concentrations by binding to CaM-binding domains of many different target proteins, including CNGCs. However, the precise nature of these binding motifs and the precise mode of regulation is yet unknown. Using the yeast twohybrid system interactions between all Arabidopsis thaliana CNGC and CaM isoforms could be demonstrated via an IQ-domain in the channel C-terminus. Deletion of the IQ-domain abolished this interaction as demonstrated for CNGC1, CNGC2 and CNGC20. Interestingly, the strength of CaM binding to CNGC varied with the IQ peptide size and its surrounding amino acids. Two alanines in position -3 and -4 relative to the isoleucine in the core sequence of the IQ motif strongly influenced the affinity. Furthermore, differences in the Ca2+ dependency of the interaction were found during the use of either C-termini or IQ-domains and of different methods. While peptides of the IQ domain interacted with the C-terminal half of CaM in a Ca2+-independent manner, entire C-termini of 106 5. Zusammenfassung CNGC19 and CNGC20 bound CaM Ca2+-dependently. In contrast to yeast-two-hybrid experiments, where only interactions at low Ca2+ concentrations seemed possible, interactions at variable Ca2+ concentrations could successfully be demonstrated in BiFC experiments. Since cellular Ca2+ concentrations can vary greatly, it is likely that different modes of CaM-CNGC interaction exist. Based on the results of this work, a new model regarding the regulation of CNGCs by CaMs was established. During cellular resting conditions Apo-CaMs are pre-associated with the IQ-domains of CNGCs via their C-lobe. Opening of CNG channels leads to an increase of cellular Ca2+ concentration and a rearrangement of CaM at the channel C-terminus. Upon CaM binding Ca2+, either its N-lobe also binds to the C-terminus of CNGC, the entire CaM interacts with a different channel region or CaM connects different channel subunits with one another. It will be interesting to further refine this model and to discover the precise mode of CNGC regulation by calmodulins in the future. 107 6. ANHANG 6.1 Literaturverzeichnis Abel S, Savchenko T, Levy M (2005) Genome-wide comparative analysis of the IQD gene families in Arabidopsis thaliana and Oryza sativa. 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Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Kugler A (2010) Studies on the expression and localisation of cyclic nucleotide-gated channels in Arabidopsis. Dissertation. Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Lenz J (2015) Über die Bedeutung von nichtselektiven Kationenkanälen für das Wurzelwachtum von Arabidopsis thaliana. Masterarbeit. Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Wartha J (2013) Untersuchungen zur Calmodulin-Bindung an IQ-Domänen aus CNG-Kanälen und zur Bedeutung von CNGC19 für die Cäsium-abhängige Wachstumsinhibition bei Arabidopsis thaliana. Bachelorarbeit. Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg 119 6.2 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Schematische Darstellung einer EF-Hand. ........................................................................ 2 Abbildung 2: Fließschema zum Ablauf einer Signaltransduktionskette. ................................................ 3 Abbildung 3: Fließschema zum ABA-induzierten Ca2+-abhängigen Stomaschluss................................ 5 Abbildung 4: Calmoduline – Konformation und Bindedomänen............................................................ 6 Abbildung 5: Struktureller Aufbau von CDPKs...................................................................................... 8 Abbildung 6: Phylogenetischer Stammbaum der CNGCs aus Arabidopsis thaliana. ............................. 9 Abbildung 7: Struktureller Aufbau von CNG-Kanälen. ........................................................................ 11 Abbildung 8: Modell zur kompetitiven Regulation von CNGCs. ......................................................... 14 Abbildung 9: Subzelluläre Lokalisierung von CaMs und CMLs in Tabakepidermiszellen. ................. 17 Abbildung 10: CNGC20 interagiert mit CaMs über die IQ-Domäne. ................................................... 18 Abbildung 11: CNGC1 interagiert mit CaMs über eine IQ-Domäne. ................................................... 19 Abbildung 12: Alignment der CNGCs im Bereich putativer CaMBDs. ............................................... 21 Abbildung 13: CaMBDs der CNGCs sind IQ-Domänen im C-Terminus. ............................................ 22 Abbildung 14: Die C-Termini von CNGC11 und CNGC17 interagieren nicht oder sehr schwach mit CaMs. .................................................................................................................................................... 23 Abbildung 15: Aminosäuren vor dem IQ-Motiv beeinflussen die Interaktion mit CaMs. .................... 25 Abbildung 16: CNGC19 besitzt eine funktionelle IQ-Domäne. ........................................................... 26 Abbilduung 17: Ausführliche Untersuchung der CaMBD in CNGC2. ................................................. 28 Abbildung 18: CNGC2 komplementiert den dnd1-Wachstumsdefekt auch mit Mutationen in der αCDomäne.................................................................................................................................................. 31 Abbildung 19: CaM interagiert über den C-Lobe mit C-Termini von CNGCs. .................................... 33 Abbildung 20: CaM2 bindet den C-Terminus von CNGC20 Ca2+-abhängig. ....................................... 35 Abbildung 21: Unterschiedliche Ca2+-Abhängigkeiten bei der CaM-Bindung zwischen den CNGCs. 36 Abbildung 22: CaM interagiert in planta mit CNGC20, unabhängig davon, ob der C-Lobe Ca2+ bindet. .................................................................................................................................................... 39 Abbildung 23: CNGC2 bindet CaM Ca2+-unabhängig in planta, jedoch hat die GT-Mutation einen Einfluss auf die Ca2+-Abhängigkeit. ...................................................................................................... 41 Abbildung 24: CNGCs interagieren mit Phosphatasen. ........................................................................ 43 Abbildung 25: Lokalisierung von CNGC20-Varianten in Hefen in Vergleich zu TabakEpidermiszellen. .................................................................................................................................... 45 Abbildung 26: Ausgewählte CDPKs interagieren nicht mit CNGC20 in Hefen. .................................. 46 Abbildung 27: Ausgewählte CDPKs interagieren nicht mit CNGC9 in Hefen..................................... 47 Abbildung 28: Interaktion zwischen CNGC12 bzw. CNGC20 mit CDPKs in planta. ......................... 48 Abbildung 29: Interaktion zwischen CNGC9 und CDPKs in planta. ................................................... 50 Abbildung 30: Ko-Expression von CNGC9 mit CPK1 und CPK34 in Tabakepidermiszellen. ............ 51 Abbildung 31: CDPKs interagieren schwächer mit CNGC20-Varianten, die keine IQ-Domäne enthalten. ............................................................................................................................................... 53 Abbildung 32: Interaktion zwischen CNGCs und CDPKs in Oocyten. ................................................ 54 Abbildung 33: Proteinaufreinigung von CNGC20-C593-764.................................................................... 56 Abbildung 34: Möglichkeit zum Erhalt N- und C-terminaler BiFC-Signale. ....................................... 59 Abbildung 35: Sequenzausschnitt aus dem C-Terminus von CNGC1. ................................................. 65 Abbildung 36: Modell zur Regulation von CNGCs durch CaM. .......................................................... 70 120 6. Anhang 6.3 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Weitere Komplementationslinien......................................................................................... 32 Tabelle 2. Übersicht der in BiFC-Versuchen verwendeten CNGC20-Varianten und Vergleich der Ergebnisse der YTH- und BiFC-Studien zur Interaktion zwischen CNGC20 und CaM2. ................... 38 Tabelle 3:Vergleich von YTH- und BiFC-Ergebnissen für CNGC20 und CNGC2. ............................ 42 Tabelle 4: Relative Fluoreszenzergebnisse aus den BiFC-Versuchen mit CNGCs und CDPKs. ......... 48 Tabelle 5: Verwendete Bakterienstämme.............................................................................................. 73 Tabelle 6: Verwendete Hefestämme. .................................................................................................... 73 Tabelle 7: Verwendete Arabidopsis thaliana-Linien. ........................................................................... 73 Tabelle 8: Verwendete Antibiotika und deren eingesetzte Konzentrationen. ....................................... 74 Tabelle 9: Primer zur Klonierung der Eingangs-/Zwischenklonierungsvektoren. ................................ 74 Tabelle 10: Weitere Primer für Genotypisierung, Sequenzierung und Colony-PCR. ........................... 79 Tabelle 11: Eingangsvektoren. .............................................................................................................. 80 Tabelle 12: Zwischenklonierungsvektoren. .......................................................................................... 84 Tabelle 13: Zielvektoren. ...................................................................................................................... 84 Tabelle 14: Vektoren für die Expression in Pflanzen............................................................................ 85 Tabelle 15: Vektoren für die Expression in Hefen. ............................................................................... 86 Tabelle 16: Expressionsvektoren für Oocyten. ..................................................................................... 88 Tabelle 17: Expressionsvektoren für die Herstellung rekombinanter Proteine. .................................... 89 Tabelle 18: Verwendete Medien. .......................................................................................................... 89 Tabelle 19: Aminosäuremix-Zusammensetzung für SCAD-Medien. ................................................... 89 Tabelle 20: Verwendete Lösungen. ....................................................................................................... 90 Tabelle 21: Typische PCR-Ansätze. ..................................................................................................... 94 Tabelle 22: Typische PCR-Protokolle................................................................................................... 94 Tabelle 23: Anregungswellenlänge und Detektionsbereiche für verwendete Fluorophore. ............... 101 6.4 Abkürzungsverzeichnis °C 3-AT ABA Abb. ABI AD Amp AS ATP BD BiFC bp BSA CAA CACDPK CAD CaM CaMBD cAMP CAMTA CaV Grad Celsius 3-Aminotriazol Abscisinsäure Abbildung ABA insensitive Aktivierungsdomäne Ampicillin Aminosäure(n) Adenosintriphosphat DNA-Bindedomäne Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation Basenpaare Bovine serum albumin Casamino acids konstitutiv aktive CDPK CDPK-aktivierende Domäne Calmodulin CaM-Bindedomäne zyklisches Adenosinmonophosphat Ca2+/CaM-aktivierter Transkriptionsaktivatore spannungsgesteuerter Ca2+-Kanal 121 CBL CCaMK CDPK cGMP CIPK CML CN CNBD CNGC CRK cRNA Cub DNA dnd EDTA EGTA ELM EMS ER GFP GLR GORK HA HAB HAI HCN HEK HR HRP HvCBT1 Hz IgG ITC Kap. KAT kb Kd kDa KLSM Km kV LB MAPK MBP µF µg min ml µl mM µM MS MST NLS nM nm 122 Calcineurin B-ähnliches Protein Ca2+/CaM-abhängige Kinase Ca2+-abhängige Proteinkinase zyklisches Guanosinmonophosphat CBL-interagierende Proteinkinase CaM-ähnliches Protein zyklisches Nukleotid Bindedomäne für zyklische Nukleotide zyklisch Nukleotid-gesteuerter Kanal CDPK-verwandte Kinase komplementäre Ribonukleinsäure C-terminale Hälfte des Ubiquitin Desoxyribonukleinsäure defense, no death Ethylendiamintetraessigsäure Ethylenglycoltetraessigsäure Eukaryotic Linear Motif Resource Ethylmethansulfonat Endoplasmatisches Retikulum Grün fluoreszierendes Protein Glutamatrezeptor guard cell outward-rectifying potassium channel Hämagglutinin HOMOLOGY TO ABI HIGHLY ABA-INDUCED PP2C GENE Hyperpolarization-Activated Cyclic Nucleotide-Gated Human embryonic kidney hypersensitive response Meerrettichperoxidase Hordeum vulgare calmodulin binding transporter 1 Hertz Immunglobulin G isothermal titration calorimetry Kapitel POTASSIUM CHANNEL IN ARABIDOPSIS THALIANA Kilobasen Dissoziationskonstante Kilodalton konfokales Laser-Scanning-Mikroskop Kanamycin Kilovolt lysogeny broth Mitogen Activated Protein Kinase Maltosebindeprotein Mikrofarad Mikrogramm Minute(n) Milliliter Mikroliter Millimolar Mikromolar Murashige-Skoog-Medium MicroScale Thermophoresis Kernlokalisierungssequenz Nanomolar Nanometer 6. Anhang NtCBP4 Nub OD OST PAMP PCR PIP PM POI PP2C PR PYR/PYL/RCAR Rif rpm ROS s. SA SDS sek SnRK SLAC SOB SOC Spec Strep S-Typ Tab. TAE TE TEMED TEV TMD TPC VC vgl. VN VL xg YPD YTH ZK Nicotiana tabacum calmodulin binding protein 4 N-terminale Hälfte des Ubiquitin optische Dichte OPEN STOMATA pathogen-associated molecular patterns Polymerasekettenreaktion Phosphatidylinositolphosphat Plasmamembran protein of interest Proteinphosphatase der Gruppe 2C pathogen related PYRABACTIN RESISTANCE 1/PYR-LIKE1/ REGULATORY COMPONENTS OF ABA RECEPTORS Rifampicin Umdrehungen pro Minute Reaktive Sauerstofspezies siehe Salicylsäure Natriumdodecylsulfat Sekunde Sucrose Non-Fermenting-Related Kinase SLOW ANION CHANNEL-ASSICIATED super optimal broth super optimal broth with catabolite repression Spectinomycin Streptomycin slow-type Tabelle Tris, Essigsäure, EDTA Tris-EDTA Tetramethylethylendiamin Tobacco Etch Virus Transmembrandomäne Two-pore channel C-terminale Hälfte von Venus vergleiche N-terminale Hälfte von Venus Volllänge Vielfaches der Gravitationsbeschleunigung Hefeextrakt, Pepton, Dextrose Yeast two-hybrid Zellkern Aminosäuren wurden nach dem Ein- und Dreibuchstaben-Code abgekürzt. Chemische Elemente und Formeln wurden mit entsprechenden Symbolen bezeichnet. 123 6.5 Zusatzmaterial Arabidopsis-Genloci Gen Lokus Gen Lokus CNGC1 CNGC2 CNGC3 CNGC4 CNGC5 CNGC6 CNGC7 CNGC8 CNGC9 CNGC10 CNGC11 CNGC12 CNGC13 CNGC14 CNGC15 CNGC16 CNGC17 CNGC18 CNGC19 CNGC20 CaM2 CaM4 CaM6 CaM7 CML8 CML9 ABI1 ABI2 HAB1 HAB2 HAI1 HAI2 HAI3 PP2CA CPK1 CPK2 CPK3 CPK4 CPK5 CPK6 CPK7 CPK9 At5g53130 At5g15410 At2g46430 At5g54250 At5g57940 At2g23980 At1g15990 At1g19780 At4g30560 At1g01340 At2g46440 At2g46450 At4g01010 At2g24610 At2g28260 At3g48010 At4g30360 At5g14870 At3g17690 At3g17700 At2g41110 At1g66410 At5g21274 At3g43810 At4g14640 At3g51920 At4g26080 At5g57050 At1g72770 At1g17550 At5g59220 At1g07430 At2g29380 At3g11410 At5g04870 At3g10660 At4g23650 At4g09570 At4g35310 At2g17290 At5g12480 At3g20410 CPK10 CPK13 CPK15 CPK21 CPK23 CPK27 CPK28 CPK29 CPK30 CPK31 CPK32 CPK33 CPK34 At1g18890 At3g51850 At4g21940 At4g04720 At4g04740 At4g04700 At5g66210 At1g76040 At1g74740 At4g04695 At3g57530 At1g50700 At5g19360 124 6. Anhang Alignment CNBDs CNGC20 CNGC2 CNGC12 CNGC1 CNGC16 AgERG DrKCNH MlotiK1 MmHCN1 HsHCN4 HsHCN2 MmHCN2 Pore H6 AGNQVPSYFLGEVFFTMGIIGLGLLLFALLIGNMQNFLQALGKRNLEMTLRRRDVEQWMS ANDLEPTSNWLEVIFSIVMVLSGLLLFTLLIGNIQVFLHAVMAKKRKMQIRCRDMEWWMK GQNLETSNSAGEIFFAIIICVSGLLLFAVLIGNVQKYLQSSTTRVDEMEEKRRDTEKWMS GQNLKTSTYIWEICFAVFISIAGLVLFSFLIGNMQTYLQSTTTRLEEMRVKRRDAEQWMS GQSLAASTLSSETIFSCFICVAGLVFFSHLIGNVQNYLQSTTARLDEWRVRRRDTEEWMR GFGNVAPNTDAEKIFTICVMLVGSLMYASIFGNVSAIIQRLYSGTARYHTQMLRVREFIR GFGNVSANTDSEKIFSICTMLIGALMHAAVFGNVTAIIQRMYSRRSLYHTRTKDLKDFIR GYGDTIPQSFAGRVLAGAVMMSGIGIFGLWAGILA------------------------GYGAQAPVSMSDLWITMLSMIVGATCYAMFVGHATALIQSLDSSRRQYQEKYKQVEQYMS GYGRQAPVGMSDVWLTMLSMIVGATCYAMFIGHATALIQSLDSSRRQYQEKYKQVEQYMS GYGRQAPESMTDIWLTMLSMIVGATCYAMFIGHATALIQSLDSSRRQYQEKYKQVEQYMS GYGRQAPESMTDIWLTMLSMIVGATCYAMFIGHATALIQSLDSSRRQYQEKYKQVEQYMS . :: * . * CNGC20 CNGC2 CNGC12 CNGC1 CNGC16 AgERG DrKCNH MlotiK1 MmHCN1 HsHCN4 HsHCN2 MmHCN2 HRRLPDGIRRRVREAERFNWAATRGVNEELLFENMPDDLQRDIRRHLF-KFLKKVRIFSL RRQLPSRLRQRVRRFERQRWNALGGEDELELIHDLPPGLRRDIKRYLCFDLINKVPLFRG YRVIPEYLKERIRRFEDYKWRETKGTEEEALLRSLPKDLRLETKRYLYLDMLKRVPWLNI HRLLPENLRKRIRRYEQYKWQETRGVDEENLLSNLPKDLRRDIKRHLCLALLMRVPMFEK HRQLPDELQERVRRFVQYKWLTTRGVDEEAILRALPLDLRRQIQRHLCLALVRRVPFFAQ FHQIPNPLRQRLEEYFQHAWTYTNGIDMNSVLKGFPECLQADICLHLNRNLLNNCSAFEA VHRLPKALAQRMLECFQTTWSVNNGIDVSELLKDFPDELRADIAMHLNKELLQ-LPLFES ------------TGFYQEVR-------------------RGD--FVRNWQLVAAVPLFQK FHKLPADMRQKIHDYYEHRYQG-KIFDEENILSELNDPLREEIVNFNCRKLVATMPLFAN FHKLPPDTRQRIHDYYEHRYQG-KMFDEESILGELSEPLREEIINFNCRKLVASMPLFAN FHKLPADFRQKIHDYYEHRYQG-KMFDEDSILGELNGPLREEIVNFNCRKLVASMPLFAN FHKLPADFRQKIHDYYEHRYQG-KMFDEDSILGELNGPLREEIVNFNCRKLVASMPLFAN : : :: : CNGC20 CNGC2 CNGC12 CNGC1 CNGC16 AgERG DrKCNH MlotiK1 MmHCN1 HsHCN4 HsHCN2 MmHCN2 MDEP-ILDAIRERLKQRTYIGSSTVLHRGGLVEKMVFIVRGEMESIGEDGSV------LP MDDL-ILDNICDRAKPRVFSKDEKIIREGDPVQRMIFIMRGRVKRIQSL--SKGVLATST MDDGWLLEAVCDRVKSVFYLANSFIVREGHPVEEMLIVTRGKLKSTTGSHEMGVRNNCCD MDEQ-LLDALCDRLQPVLYTEESYIVREGDPVDEMLFIMRGKLLTITTNGGRTGFLNSEY MDDQ-LLDAICERLVPSLNTKDTYVIREGDPVNEMLFIIRGQMESSTTDGGRSGFFNSIT ASPG-CLRALSLKFKTTHAPPGDILVHKGDVLTYLYFIARGSIEILKDDVVM------AI ASRG-CLRSLSLIIKTSFCAPGEFLIRQGDALQAIYFVCSGSMEVLKDNTVL------AI LGPA-VLVEIVRALRARTVPAGAVICRIGEPGDRMFFVVEGSVSVATPN--P------VE ADPN-FVTAMLSKLRFEVFQPGDYIIREGAVGKKMYFIQHGVAGVITKSSKE------MK ADPN-FVTSMLTKLRFEVFQPGDYIIREGTIGKKMYFIQHGVVSVLTKGNKE------TK ADPN-FVTAMLTKLKFEVFQPGDYIIREGTIGKKMYFIQHGVVSVLTKGNKE------MK ADPN-FVTAMLTKLKFEVFQPGDYIIREGTIGKKMYFIQHGVVSVLTKGNKE------MK : : : : * : :: * CNGC20 CNGC2 CNGC12 CNGC1 CNGC16 AgERG DrKCNH MlotiK1 MmHCN1 HsHCN4 HsHCN2 MmHCN2 LYEGDVCGEELLTWCLERSSVNPDGTRIRMPSKGLLSSRNVRCVTNVEAFSLSVADLEDV LEPGGYLGDELLSWCLRRPFLD----------RLPPSSATFVCLENIEAFSLGSEDLRYI LQDGDICGELLFN-------GS----------RLPTSTRTVMTLTEVEGFILLPDDIKFI LGAGDFCGEELLTWALDPHSSS----------NLPISTRTVRALMEVEAFALKADDLKFV LRPGDFCGEELLTWALVPNINH----------NLPLSTRTVRTLSEVEAFALRAEDLKFV LGKDDIFGENPCIH-------S----------TLGKSNSNVKALTYCDLHKIHRDDLLDV LGKGDLIGSDSLTK-------E----------QVIKTNANVKALTYCDLQYISLKGLREV LGPGAFFGEMALIS-------------------GEPRSATVSAATTVSLLSLHSADFQML LTDGSYFGEICLLT-------------------KGRRTASVRADTYCRLYSLSVDNFNEV LADGSYFGEICLLT-------------------RGRRTASVRADTYCRLYSLSVDNFNEV LSDGSYFGEICLLT-------------------RGRRTASVRADTYCRLYSLSVDNFNEV LSDGSYFGEICLLT-------------------RGRRTASVRADTYCRLYSLSVDNFNEV * *. . .. : : : 125 CNGC20 CNGC2 CNGC12 CNGC1 CNGC16 AgERG DrKCNH MlotiK1 MmHCN1 HsHCN4 HsHCN2 MmHCN2 TSLFSRFLR---SHRVQG---AIRYD--------------SPYWRLRAARQIQVAWRYRR TDHFRYKFA---NERLKR---TARYY--------------SSNWRTWAAVNIQMAWRRRR ASHLNV-FQ---RQKLQR---TFRLY--------------SQQWRSWAAFFIQAAWRKHC ASQFRR-LH---SKQLRH---TFRYY--------------SQQWKTWAACFIQAAWRRYI ANQFRR-LH---SKKLQH---AFRYY--------------SHQWRAWGTCFIQAAWRRYM LDLFPEFYDSFVNSLE--ITYNMRDE----------EQAGV-ELRHR--------YM--LRLYPEYAQKFVSEIQHDLTYNLREG----------SGADL-DWESNGGLVKKLPAI--CSSSPEIAEIFRKTALERRGAAASA----------------------------------LEEYPMMRRAFETVAIDRLDRIGKKNSILLQKFQKDLNTGVFNNQENEILKQIVKHD--LEEYPMMRRAFETVALDRLDRIGKKNSILLHKVQHDLNSGVFNYQENEIIQQIVQHD--LEEYPMMRRAFETVAIDRLDRIGKKNSILLHKVQHDLNSGVFNNQENAIIQEIVKYD--LEEYPMMRRAFETVAIDRLDRIGKKNSILLHKVQHDLSSGVFNNQENAIIQEIVKYD--- CNGC20 CNGC2 CNGC12 CNGC1 CNGC16 AgERG DrKCNH MlotiK1 MmHCN1 HsHCN4 HsHCN2 MmHCN2 RRLHRLCTPQSSYSL--------------------------------------------KRTRGENIGGSMSPVS------------------ENSI----E---------GNS-ERRL KRKLSKTRDNE----------------------------NIPQ---------GTQLNLAS KKKLEESLKEEENRLQ-------------------DALAKEAC---------GSSPSLGA KRKLAMELARQEEEDDYFYDDDGDYQFEEDMPESNNNNGDENS---------SNNQNLSA -RTGSQDRE-----------------------SETRSYVRK-----------L-------REDEEN-D-----------------------EEQNSVSRAP-RSPLRLTRALSSPLRSP ------------------------------------------------------------REMVQAIP-----------------------PINYPQMTALNCTSSTTTPTSRMRTQSP -REMAHCAH-----------------------RVQAAASATPTPTPVIWTPLIQAPLQAA -REMVQQAE-----------------------LGQRVGLFPPPPPPPQVTSAIATLQQ--REMVQQAE-----------------------LGQRVGLFPPPP-PPQVTSAIATLQQ-- Alignment C-terminaler Regionen verschiedener CNBD enthaltender Ionenkanäle beginnend in der Porenregion. Verwendet wurden die Sequenzen von sieben Kanälen, deren CNBD kristallisiert wurde: HCN-Kanäle aus Mensch (Homo sapiens - Hs) und Maus (Mus musculus - Mm) sowie ein ERG Kanal aus Anopheles gambiae (Ag), KCNH aus Danio rerio (Dr) und CNGK1 aus Mesorhizobium loti) und fünf Arabisopsis CNGCs (je ein Kanal pro Untergruppe). Das K+-Kanal-typische GYGD-Motiv sowie die in CNGC2 entsprechende ANDL Sequenz sind grün eingezeichnet (Heginbotham et al., 1994; Durell et al., 1998; Köhler et al., 1999). Die Sequenz der letzten Transmembranhelix von CNGC20 wurde grau hinterlegt (Vorhersage aus Uniprot http://www.uniprot.org/). Helix (gelb)- und β-Faltblatt (blau) -bildende Sequenzen wurden entsprechend der vorhandenen Kristallstrukturen (4L11, 3UKN, 4MUV, 3U0Z, 3OTF, 3U10/(2MPF), 1Q3E, http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) gekennzeichnet. Außerdem wurden in CNGC20 αC (gestrichelt)- und IQ (durchgehend)-Peptid unterstrichen. 126 6. Anhang Kontrollen zu Abbildung 13 CaMs interagieren mit CNGCs über IQ-Domänen im C-Terminus der Kanäle. YTH-Versuche. A-E: Hefewachstum auf Medium ohne Tryptophan, Leucin (-W-L) zur Selektion der kotransformierten Zellen. A-C: Die Hefen jeder Kombination wurden in einer Konzentration von OD600=2 aufgetragen. Gezeigt werden die Kontrollen zu den Kombinationen aus A: 20 CNGC-N-Termini, B: 20 αCDomänen, C: 20 IQ-Domänen mit allen CaM-Isoformen und CML8. Die Ergebnisse wurden teilweise aus Bachelorarbeiten entnommen und entsprechend oberhalb der Streifen markiert (Olivia Hügelschäfer (2012) °; Julia Wartha (2012) #; Markus Birkenbach (2013) *; Johannes Keseler (2013) +). Die Doppelverwendung von Ergebnissen zur Vervollständigung der Grafik wird im folgenden Text erläutert. D + E stellen die vollständigen YTH-Versuche zu den positiven Kombinationen aus CNGC C-Termini bzw. IQPeptiden mit CaMs und CML8 dar. Hefewachstum auf Medium ohne Tryptophan und Leucin (-W-L) zur Selektion der ko-transformierten Zellen; in Abwesenheit von Tryptophan, Leucin und Histidin (-W-L-H) zur Analyse der Interaktion und auf Medium -W-L-H mit einem Zusatz von 3 mM 3-AT zur Überprüfung der Interaktionsstärke. Die Hefen jeder Kombination wurden in einer Konzentration von OD600=2, 0,2 und 0,02 nebeneinander aufgetragen. Interaktionstest zwischen D: C-Termini, E: IQ-Domänen und den CaM-Isoformen sowie CML8. Genaue Aminosäureangaben können der Tabelle 11 entnommen werden. 127 128 6. Anhang Eigenschaften der IQ-Peptide CNGC1 CNGC2 CNGC3 CNGC4 CNGC5 CNGC6 CNGC7 CNGC8 CNGC9 CNGC10 CNGC11 CNGC12 CNGC13 CNGC14 CNGC15 CNGC16 CNGC17 CNGC18 CNGC19 CNGC20 Hydrophobicity (H) hydrophobic moment (µH) Interaktion mit CaMs 0,463 0,294 ja -0,011 0,229 ja 0,398 0,264 ja 0,379 0,242 nein 0,288 0,292 ja 0,27 0,265 nein 0,196 0,253 nein 0,412 0,274 ja 0,286 0,273 ja 0,385 0,377 nein 0,398 0,264 ja 0,414 0,258 ja 0,285 0,302 nein 0,317 0,102 nein 0,204 0,16 ja 0,407 0,262 nein 0,399 0,326 ja 0,224 0,167 nein 0,338 0,224 nein 0,148 0,347 ja AS 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 16 16 Die Eigenschaften der IQ-Peptide bezüglich ihrer Hydrophobizität wurden mit HeliQuest (Gautier et al., 2008) bestimmt. Zusätzlich sind die Länge der Peptide in Aminosäuren (AS) und die Fähigkeit mit CaMs zu interagieren angegeben. Aus den Angaben zur Hydrophobizität lässt sich nicht ableiten, warum manche Peptide die CaM-Isoformen banden und andere nicht. 129 Isoelektrischer Punkt der CNGC-Termini 130 6. Anhang Chromatogramme zur Affinitätsreinigung des CNGC20-C (Abb. 33) 1. Lauf: 131 2. Lauf: 132 6. Anhang Phosphorylierte Peptide aus CNGCs (PhosPhAt-Datenbank) CNGC1: LQPVL(pY)(pT)EE(pS)(pY)IVR PAEPDFN(pS)DD TS(pS)DVEYSG(K*) CNGC4: CA(pS)LGEDKLR CNGC6: ASSG(pS)F(K*)(K*) SIGLGV(pS)R YSQSSETGLNK(C*)(pT)LNIQGGPK CNGC7: TAGAFAEGAWAGAAYYLLW(pY)MLA(pS)HI(pT)GAFWY(oxM)LSVER CNGC8: TAGAFAEGAWAGAAYYLLW(pY)MLA(pS)HI(pT)GAFWY(oxM)LSVER CNGC9: (pY)DQYKWLETR GGGAQGNNV(s)(s)G(pS)FKK KAVKSQVI(pS)GR YDQ(pY)KWLETR CNGC11: (pT)VQAL(pT)EVEGFVISADDLK LD(pS)TGVDG(K*) CNGC12: (pY)LYLDMLK CNGC14: (s)(s)H(s)DH(t)(t)NALVLIVLVQ(pY)IPR CNGC15: FINK(y)F(y)CLWWGLK VF(pS)EDLER CNGC20: (pS)R(pS)V(pS)L(pS)NP(t)(s)(s)IEGFD(pT)(pS)(pT)VVLG(pY)(pT)GPLR pS, pT, pY - phosphoryliertes S, T oder Y s, t, y - unsicher oxM - oxidiertes Methionin C* - Carbamidmethylierung K* - iTRAQ144 133 Vektorkarten Eingangs- und Zwischenklonierungsvektoren Zielvektoren Expression in Hefen 134 6. Anhang Expression in Pflanzen Vektorkarten der BiFC-Vektoren für die Expression in Pflanzen können der Veröffentlichung von Gehl und Kollegen (2009) entnommen werden. 135 Expression in Oocyten 136 6. Anhang Herstellung rekombinanter Proteine in Bakterien 137 LEBENSLAUF Der Lebenslauf ist in der Online-Version aus Gründen des Datenschutzes nicht enthalten. 138 AUSZEICHNUNGEN 2013 2011 - Posterpreis „Student & Early Career Researcher Award for an Outstanding Poster“, ICAR 2013 - Fritz und Maria Hofmann-Preis für eine hervorragende wissenschaftliche Abschlussarbeit (Masterarbeit) PRÄSENTATIONEN 2015 2014 2013 2011 - Molekularbiologie der Pflanzen, Dabringhausen (Vortrag) PCS2014, Münster (Poster) 24th ICAR, Sydney, Australien (Poster) Botanikertagung, Berlin (Vortrag) VERÖFFENTLICHUNGEN 2017 2016 2014 2013 - Fischer C*, DeFalco TA*, Karia P, Snedden WA, Moeder W, Yoshioka K, Dietrich P (2017) Calmodulin as a Ca2+-sensing subunit of Arabidopsis cyclic nucleotide-gated channel complexes. (in Revision) - Fischer C, Sauter M, Dietrich P (2016) BiFC Assay to Detect Calmodulin Binding to Plant Receptor Kinases. Methods Mol Biol (accepted) - Hartmann J, Fischer C, Dietrich P, Sauter M (2014) Kinase activity and calmodulin binding are essential for growth signaling by the phytosulfokine receptor PSKR1. Plant J 78: 192-202 - Fischer C, Kugler A, Hoth S, Dietrich P (2013) An IQ domain mediates the interaction with calmodulin in a plant cyclic nucleotide-gated channel. Plant Cell Physiol 54: 573-584 139 DANKSAGUNG An dieser Stelle möchte ich mich ganz herzlich bei Prof. Dr. Petra Dietrich dafür bedanken, dass sie mir ermöglicht hat, die Regulation der CNGCs noch vertiefter zu erforschen. Ihre zahlreichen Ideen und Ratschläge verhalfen mir zu erfolgreichem Forschen und Publizieren. Sie hat mir ermöglicht, verschiedene nationale und internationale Kooperationen einzugehen und mehrere Konferenzen zu besuchen. Vielen Dank für so viel Unterstützung und dass ich mich in deiner Arbeitsgruppe entfalten und so viel forschen durfte! Bei Prof. Dr. Stefan Hoth bedanke ich mich sehr für die Übernahme des Zweitgutachtens. Gudrun Steingräber, Dr. Joanna Bogdanska-Urbaniak und zu Beginn der Arbeit Tanja Bender haben mich in meinen „Großprojekten“ unterstützt. Vielen Dank für die angenehme Zusammenarbeit. Vielen Dank an alle derzeitigen und ehemaligen Mitglieder des Lehrstuhls der Molekularen Pflanzenphysiologie für hilfreiche Diskussionen, aber auch angenehmes und lustiges Zusammenkommen. Besonders möchte ich Angelika Wolf erwähnen. Danke für die fürsorgliche Pflege aller Pflanzen und für viel mehr! Ich bedanke mich sehr bei Judith Schick, die mir zwischenzeitlich als Hiwi zur Seite stand. Des Weiteren bedanke ich mich bei meinen Bachelorstudenten Maria Beer, Julia Wartha, Olivia Hügelschäfer, Johannes Keseler und Markus Birkenbach, deren Bachelorarbeiten zu Teilprojekten dieser Arbeit beitrugen. Vielen Dank auch an alle weiteren Studenten für angenehme Praktika. Nun möchte ich mich noch bei meinen Kooperationspartnern bedanken: Christian Kornbauer hat die YTH-Versuche mit Phosphatasen durchgeführt und Prof. Dr. Erwin Grill (TU München) hat mir diese Daten zur Verfügung gestellt. Dr. Nadine Rehm (damals Mikrobiologie) hat mir die Proteinaufreinigung mit einem Strep-Tag gezeigt. Dr. Nadine Meitinger (Pharmazeutische Biologie) hat mir geholfen, die Reinigung der C-Termini zu optimieren. Dr. Jens Hartmann und Prof. Dr. Margret Sauter (Uni Kiel) haben sich an uns gewandt, um Interaktionen mit Rezeptorkinasen zu untersuchen. Vielen Dank auch an Margret für die Möglichkeit noch ein kleines Buchkapitel zu schreiben und Dr. Heiner Busch für die tollen Fotos dafür. Herzlichen Dank an Thomas DeFalco, Dr. Wolfgang Moeder, Prof. Dr. Keiko Yoshioka und ihr Team (University of Toronto, Kanada), die sich zur Erforschung der CaM-Regulation von CNGCs mit uns zusammengeschlossen haben. Ich danke Dr. Robert Rauh (Physiologie) für die Bereitstellung der Oocyten. Des Weiteren möchte ich mich bei allen bedanken, die mit mir ihre Vektoren zur Verwendung oder als Templates geteilt haben. Ein herzliches Dankeschön geht dabei geht auch an meine Freunde, die für mich und auch für tolle Abende und Unternehmungen da waren, besonders an Anja Lauter und Dr. Ulrich Wenig, Doris Klein, Mandy Kalina, Mira Maschke, Jessica Van Harsselaar, Dr. Dagmar Werner, Kay Schwabe. Dr. Wolfgang Zierer, Joachim Fischer und Mira Maschke danke ich für die hilfreichen Kommentare. Zum Schluss danke ich meiner Familie, die immer an mich geglaubt hat, für mich da war und mich in allem unterstützt haben. Wolfgang danke ich für die gemeinsamen letzten Jahre in Erlangen und alles Schöne, was wir zusammen erlebt haben. 140 ERKLÄRUNG Ich versichere, dass ich die Arbeit ohne fremde Hilfe und ohne Benutzung anderer als den angegebenen Quellen angefertigt habe und dass die Arbeit in gleicher oder ähnlicher Form noch keiner anderen Prüfungsbehörde vorgelegen hat und von dieser als Teil einer Prüfungsleistung angenommen wurde. Ausführungen, die wörtlich oder sinngemäß aus anderen Arbeiten übernommen wurden, sind als solche gekennzeichnet. Erlangen, Dezember 2016 .......................... Cornelia Fischer 141