Aktivierung von GTPasen der Rho-Familie - Ruhr

ZUSAMMENFASSUNG
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6. Zusammenfassung
Als molekulare Schalter übernehmen die Rho-GTPasen eine zentrale Rolle in der
intrazellulären Signaltransduktion. Dabei kontrollieren sie eine Reihe von zellulären
Prozessen, zu denen die Organisation des Aktinzytoskelettes, die Regulation von Proliferation
und Differenzierung und die Genexpression gehören. Die Aktivierung der Rho-Proteine
erfolgt durch Nukleotidaustauschfaktoren (GEFs) der Dbl-Familie. Im Gegensatz zu den RasGTPasen, sind bisher keine mutierten Rho-Proteine in Tumoren gefunden worden. Dennoch
spielen sie eine Schlüsselrolle in Tumorprogression und Metastasierung, die im wesentlichen
durch die Deregulation ihrer GEFs bedingt ist. Die Details der Aktivierung durch die GEFs
und deren Regulation sind biochemisch bisher wenig untersucht.
Ziel
dieser
Arbeit
war
die
detaillierte
biochemische
Untersuchung
der
Nukleotidbindungseigenschaften verschiedener Rho-GTPasen (RhoA, Rac1, Rac2, Rac3,
Rac1b), sowie das Prinzip ihrer Aktivierung durch Nukleotidaustauschfaktoren. Im Rahmen
dieser Arbeit wurden dazu die GEFs p190, p115, Tiam1, Cdc24, hPem-2 und Abr bezüglich
ihrer Aktivität, Spezifität und etwaiger Regulationsmechanismen charakterisiert.
Mit
Ausnahme
von
Rac2
und
Rac1b
ergab
die
Bestimmung
der
Nukleotidbindungseigenschaften vergleichbare Werte mit einer Nukleotidaffinität im
picomolaren
Bereich,
bedingt
durch
langsame
Dissoziations-
und
sehr
schnelle
Assoziationgeschwindigkeitskonstanten. Rac2 wies im Vergleich zu Rac1 eine deutlich
reduzierte Nukleotidassoziationsgeschwindigkeit auf, was in einer 20fach reduzierten
Nukleotidaffinität resultierte und auf eine durch wenige Aminosäureabweichungen geänderte
Moleküldynamik zurückzuführen ist. Rac1b, eine Spleiß-Variante von Rac1, zeigte eine
deutlich beschleunigte, intrinsische Nukleotiddissoziation, die durch den Rac-GEF Tiam1
nicht weiter beschleunigt werden konnte und lag in der Zelle in einem aktiven, GTPgebundenen Zustand vor. Die Kristallstruktur von Rac1b beweist, dass für die im Vergleich
zu Rac1 geänderten Proteineigenschaften die Insertion von 19 Aminosäuren hinter der
Schalter II-Region verantwortlich ist, die zu einer gesteigerten Mobilität der an der
Nukleotidbindung essentiell beteiligten Schalter-Regionen führt.
Versuche mit p115- und p190-RhoGEF ergaben, dass die Affinität dieser GEFs nicht
ausreicht, um das Nukleotid dauerhaft aus dem Komplex mit der GTPase zu verdrängen. Wie
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weitere Experimente bewiesen, konnte keines der verwendeten Dbl-GEFs in Anwesenheit von
freiem Nukleotid einen stabilen, binären Komplex aus GEF und GTPase bilden, was ein
allgemein gültiges Charakteristikum dieser GEFs darzustellen scheint.
Ähnlich wie p190-RhoGEF, ist p115 ein Rho-spezifischer Austauschfaktor und zeigt keine
Aktivität auf andere Mitglieder der Rho-Familie. Die Quantifizierung der Nukleotidaustauschaktivitäten von p115 und p190 zeigte, dass beide GEFs in der Lage sind, die
Nukleotiddissoziation von RhoA um mehr als den Faktor 104 zu beschleunigen.
Ein Charakteristikum der GEFs der Dbl-Familie ist eine PH-Domäne, die sich direkt Cterminal an die katalytisch aktive DH-Domäne anschließt. Im Gegensatz zu p190-RhoGEF
schien die p115 PH-Domäne einen stabilisierenden Einfluß auf die DH-Domäne auszuüben,
ist aber in beiden Fällen an der eigentlichen, durch die DH-Domäne katalysierten
Austauschreaktion, anders als bei GEFs wie Trio oder Dbs, bei denen das Fehlen der PHDomäne eine mehr als 100fache Reduktion der Austauschaktivität bewirkt, nicht beteiligt.
Ferner konnte ein regulatorischer Einfluß der zweiten funktionellen Untereinheit von p115,
des RGS-Moduls, auf die GEF-Aktivität nachgewiesen werden. Der beobachtete
autoinhibitorische Effekt der N-terminalen RGS-Region auf die DH-Domäne ist damit
wahrscheinlich ein wichtiger Bestandteil des Regulationsmechanismus von p115-RhoGEF.
Dagegen ist eine Regulation durch Phosphorylierung von Tyrosin568 in der DH-Domäne von
p115 nach den Ergebnissen der durchgeführten Mutationsstudien nicht zu vermuten. Falls
eine Regulation durch Phosphorylierung des GEFs erfolgt, findet diese höchstwahrscheinlich
an einer anderen Position statt.
Spezifitätsmessungen mit Tiam1 DHPH zeigten, dass dieser GEF Rac-spezifisch ist, aber
innerhalb der Rac-Isoformen zwischen Rac1, 2 und 3 zu differenzieren vermag. Die
Quantifizierung der GEF-Aktivität ergab, dass Tiam1 eine deutliche Spezifität für Rac2
aufweist, und die Nukleotiddissoziation dieser GTPase etwa 10fach besser beschleunigen
kann, als die von Rac1 und Rac3. Während die Austauschaktivität von Tiam1 für Rac1 und
Rac3 damit eher schwach ist, erreicht sie für Rac2 zu p115-/p190-RhoGEF und RhoA
vergleichbare Werte. Diese Unterschiede innerhalb der hochhomologen Rac-Isoformen sind
durch eine, durch wenige Aminosäureabweichungen geänderte molekulare Dynamik von
Rac2 im Vergleich zu Rac1 und 3 begründet. Die gemessenen Daten lassen vermuten, dass es
sich bei Tiam1 um einen Rac2-spezifischen Austauschfaktor handelt – eine Annahme die
durch die nahezu ausschließliche Expression beider Proteine in hämatopoetischen Zellen
unterstützt wird.
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Experimente mit den Cdc42-GEFs Cdc24 und hPEM-2 konnten zeigen, dass Cdc24 die
Cdc42-Orthologe aus Homo sapiens und Saccharomyces cerevisiae zu aktivieren vermag,
während die hPEM-2 Funktion auf das menschliche Ortholog beschränkt ist. Diese hohe
Spezifität findet ihre Ursache in einigen Aminosäureabweichungen, die hPEM-2 im
Gegensatz zu Cdc24 erlauben, zwischen nahe verwandten Cdc42-Proteinen zu unterscheiden.
Die Quantifizierung der Cdc24-Aktivität zeigte, dass dieses GEF die Dissoziationsreaktion
des Nukleotids zwar nur um den Faktor 103 zu steigern vermochte, dafür aber eine im
Vergleich zu p190, p115 und Tiam1 deutlich höhere Affinität für die nukleotidgebundene
Form der GTPase aufwies.
Mit Abr konnte weder Bindung an noch Aktivität für die verschiedenen Rho-GTPasen
gemessen werden. Es ist in dieser Hinsicht mit anderen GEFs wie α- und β-Pix, Sos1 und
Ect-2 vergleichbar, für die ebenfalls keine in vitro GEF-Aktivität gezeigt werden konnte. Es
ist durchaus möglich, dass bei diesen Dbl-GEFs die DH-Domäne einem bisher unbekannten
Regulationsmechanismus unterliegt oder mit einer anderen Klasse von Proteinen interagiert.
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