Mikrobielle Diversität
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Mikrobiologisches Praktikum Wintersemester 2007/2008 Block „Mikrobielle Diversität“ Betreuung durch Jörg Simon, Juliane Scheithauer, Anke Mager und Oliver Schürmann Yvonne Voges und Melanie Thompson Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Inhalt 1. Versuch: Winogradsky-Säule ................................................................................................... 2 2. Versuch: Rhodospirillaceae ................................................................................................... 23 3. Versuch: Cyanobakterien ...................................................................................................... 32 4. Versuch: Bakterienisolierung ................................................................................................ 40 5. Versuch: Sequenzierung des 16S rRNA-Gens ........................................................................ 48 6. Versuch: Biofilm .................................................................................................................... 58 7. Versuch: Hyphomicrobium .................................................................................................... 64 8. Versuch: Biotransformation .................................................................................................. 67 9. Quellenangaben .................................................................................................................... 72 10. Anhang............................................................................................................................... 72 1|Seite Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson 1. Versuch: Winogradsky-Säule Einleitung Werden Mikroben, ihre Stoffwechselwege und Eigenschaften, im Labor untersucht, finden verschiedene Arten von Nährmedien Anwendung: Es gibt Vollmedien, die das Wachstum einer ganzen Reihe Mikroben unterstützen, aber auch definierte Medien, die auf den Stoffwechsel einzelner, zu untersuchender Mikroben, ausgerichtet sind. Mit Hilfe dieser Techniken lassen sich einzelne Mikroben isolieren, in sog. Reinkulturen im Labor heranzüchten und betrachten. Möchte man jedoch das Zusammenspiel verschiedener Mikroben in einem Ökosystem untersuchen, muss man die im jeweiligen Biotop herrschenden Zustände so authentisch wie möglich im Labor nachempfinden. Die Winogradsky-Säule, benannt nach dem russischen Mikrobiologen Sergei Nikolajewitsch Winogradsky (1856-1953), ist ein Beispiel für ein im Labor genutztes System um ein abgeschlossenes Biotop (in diesem Fall angelehnt an ein See mit Sediment) möglichst authentisch wiederzugeben; sie dient in erster Linie der Kultivierung unterschiedlicher Mikroorganismen über einen langen Zeitraum hinweg. Material und Methoden Siehe Skript wobei sich die vier im weiteren Verlauf betrachteten Säulen wie folgt unterschieden: Tabelle 1: Unterschiedliche Zusammensetzung der Säulen Nr. 1-4 Säule Wasser Erde/Sediment Pepton Laub/Gras Gips CaCO3 1 + + + - - - 2 + + + - + - 3 + + - + - - 4 + + + - - + 2|Seite Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Das See-Sediment und -Wasser stammten aus dem Maasgrund in Oberursel. Ergebnisse Die Säulen wurden über einen Zeitraum von 15 Tagen beobachtet. Über diesen Zeitraum hinweg konnten bei einigen Säulen leichte, bei anderen stärkere Veränderungen beobachtet werden, wobei erwähnt werden muss, dass die Säulen über den Betrachtungszeitrum hinaus einer fortlaufenden Entwicklung unterworfen sind. Säule Nr. 1 wurde näher betrachtet und im Vergleich zu den anderen drei Säulen gesetzt. Am ersten Tag nach dem Ansetzen der Säulen, zeigte Säule Nr. 1 eine massive Eintrübung der Wasserzone, in Abbildung 1 zu sehen. Abbildung 1: Winogradsky-Säule Nr. 1 am ersten Tag nach Ansetzen der Säulen, eine massive Eintrübung der Wasserzone ist erkennbar 3|Seite Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Am vierten Tag nach Ansetzen der Säulen hatte sich das Sediment weitestgehend abgesetzt, das Wasser verblieb jedoch trüb mit leicht gelblich/bräunlichem Farbton. Das Sediment machte an der Grenze zur Wasserzone einen homogeneren Eindruck als weiter unten in der Säule (Abb. 2). Abbildung 2: Winogradsky-Säule Nr. 1 vier Tage nach Ansatz der Säulen, das Sediment hat sich weitestgehend abgesetzt Betrachtet man die vier Säulen im Vergleich, ist die verbleibende Eintrübung von Säule Nr. 1 deutlich erkennbar. 4|Seite Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Abbildung 3: Die Winogradsky-Säulen 1-4 (v.l.n.r.) im Vergleich am vierten Tag nach dem Ansetzen Zu allen vier Säulen lässt sich sagen, dass das Wasser vollständig geklärt war, und abgesehen von Säule Nr. 4, bei der das Sediment von vornherein wesentlich homogener wirkte, das Sediment der anderen Säulen einheitlich inhomogen erschien (Abb. 3). Am sechsten Tag der Beobachtung setzte sich die Schichtung des Sediments von Säule Nr. 1 fort, wobei es oben (zur Wassergrenze hin) heller, und ca. 1cm darunter dunkler wirkte, ganz unten in der Säule war das Sediment weiterhin inhomogen. Das Wasser verblieb eingetrübt (Abb. 4). 5|Seite Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Abbildung 4: Säule Nr. 1 sechs Tage nach Ansetzen der Säulen, das Wasser ist weiterhin trüb, das Sediment schichtet sich Der Vergleich von Säule Nr. 1 mit den drei weiteren Säulen präsentierte sich wie folgt (Abb. 5). 6|Seite Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Abbildung 5: Säulen Nr. 1-4 (v.l.n.r.) im Vergleich am sechsten Tag der Beobachtung Säule Nr. 2 zeigte eine leichte Schichtung der oberen Sedimentschicht (ca. 5mm), ansonsten war das Sediment weiterhin inhomogen und das Wasser klar. Im Sediment von Säule Nr. 3 waren ersten Schwarzfärbungen an einigen Stellen erkennbar, wobei das Sediment weiterhin inhomogen und das Wasser klar verblieb. Die Wasserzone von Säule Nr. 4 zeigte eine leichte, helle Schichtung ca. 10cm unter der Wasseroberfläche, sowie leichten Algenbewuchs an der Säule, ca. 5cm unter der Wasseroberfläche. Weiterhin waren erste Schwarzfärbungen im Sediment zu erkennen, dies ca. 10cm unter der Sedimentoberfläche. Am achten Tag nach Beginn des Versuches zeigte Säule Nr. 1 eine fortsetzende Schichtung des Sediments (ca. 1,5cm Breite, Abb. 6), wobei im Detail fünf Schichten zu erkennen waren (1. helle Schicht, 2. graue Schicht, 3. helle Schicht, 4. Schicht bräunlich, 5. Schicht breit und dunkel, Abb. 7), unter dieser Schichtung begann das Sediment homogener zu werden, im unteren Teil der Säule präsentierte es sich jedoch weiterhin inhomogen und zeigte erste schwarze Verfärbungen. Das Wasser verblieb trüb, nahm jetzt jedoch eine gräuliche Färbung, im Vergleich zu der vorher gelblich/bräunlichen Verfärbung ein. 7|Seite Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Abbildung 6: Säule Nr. 1 acht Tage nach Ansetzen der Säulen, das Wasser verfärbt sich gräulich Abbildung 7: Achter Tag der Beobachtung: Nahaufnahme des Sediments von Säule Nr. 1 8|Seite Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Die vier Säulen im Vergleich betrachtet, machen die Unterschiede weiter deutlich (Abb. 8). Abbildung 8: Säulen Nr. 1-4 (v.l.n.r.) am achten Tag der Beobachtung Das Wasser von Säule Nr. 2 verblieb klar, wobei eine helle Schichtung ca. 10cm unter der Oberfläche zu erkennen war. Auch das Sediment zeigt eine beginnende Schichtung (ca. 5-7mm), wobei der Farbverlauf von hell (oben) nach dunkel (unten) geht, ansonsten ist das Sediment weiterhin inhomogen. Säule Nr. 3 zeigte deutliche schwarze Fleckenbildung im Sediment, sowie Gasbildung, die durch aufsteigende Bläschen erkennbar war. Das Wasser verblieb klar. Die Wasserzone von Säule Nr. 4 war sehr klar. Das Sediment zeigte weitere schwarze Flecken und war ansonsten homogen. 9|Seite Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Am elften Tag der Beobachtung war die deutlichste Veränderung von Säule Nr. 1 zu erkennen. Das Wasser hatte sich schwarz Verfärbt, wobei diese Farbveränderung ca. 7cm über dem Sediment am deutlichsten zu erkennen war. Die Schichtung des Sediments setzte sich fort, wobei die Sedimentoberfläche ebenfalls eine schwarze Färbung annahm. Gasbildung war durch aufsteigende Bläschen erkennbar (Abb. 9 und 10). Abbildung 9: Säule Nr. 1 am elften Tag nach Ansetzen der Säulen, eine deutliche Schwarzfärbung des Wassers ist erkennbar 10 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Abbildung 10: Sediment von Säule Nr. 1, Nahaufnahme am elften Tag der Beobachtung Im Vergleich betrachtet wird die sprunghafte Entwicklung von Säule Nr. 1 besonders deutlich (Abb. 11). 11 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Abbildung 11: Säulen Nr. 1-4 (v.l.n.r.) im Vergleich am elften Tag der Beobachtung Am elften Tag der Beobachtung zeigte Säule Nr. 2 ersten Algenbewuchs ca. 7cm unter der Wasseroberfläche bei weiterhin klarem Wasser. Die Schichtung des Sediments setzte sich weiterhin fort, wobei die oberste Schicht, die Grenze zum Wasser, nun eine leicht grünliche Färbung aufwies. Das Wasser von Säule Nr. 3 war weiterhin klar. Das Sediment begann sich schwarz zu verfärben, wobei die oberste Schicht, ähnlich Säule Nr. 2, eine grünliche Färbung zu entwickeln begann. Die Wasserzone von Säule Nr. 4 war weiterhin sehr klar, wobei nun einzelne Schwebeteilchen zu beobachten waren, die helle Schichtung im Wasser war nicht mehr zu erkennen. Auch hier verfärbte sich die Sedimentoberfläche leicht grünlich, hinzu kam eine durch starken Blasenaufstieg erkennbare massive Gasbildung. Am 13. und 15. Tag der Beobachtung setzte sich die Schichtung des Sediments von Säule Nr. 1 weiterhin fort, wobei die schwarze Oberschicht dicker wurde und eine Art Flaum aufwies. Weitere Gasbildung wurde durch größer werdende Lufteinschlüsse 12 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson im Sediment deutlich. Der ca. 5cm breite schwarz gefärbte Streifen in der Wasserzone, befindlich ca. 5cm über der Sedimentoberfläche wurde nach oben und unten hin breiter, und das Wasser trübte sich weiter ein und erschien am Ende der Beobachtungszeit grau-grünlich (Abb. 12 und 13). Abbildung 12: Säule Nr. 1 am 13. Tag der Beobachtung, die Schwarzfärbung nimmt weiterhin zu 13 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Abbildung 13: Nahaufnahme des Sediments von Säule Nr. 1 am 13. Tag nach dem Ansetzen der Säulen Auch die Säulen Nr. 2, 3 und 4 zeigten am 13. und 15. Tag der Beobachtung eine schnell voranschreitende Entwicklung (Abb. 14). Abbildung 14: Säulen Nr. 1-4 (v.l.n.r.) am 13. Tag der Beobachtung 14 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Säule Nr. 2 zeigte eine sich weiter fortsetzende deutliche Schichtung des Sediments sowie eine starke Flaum-Bildung auf dem Sediment (grünlich), deutliche Lufteinschlüsse zeigen auch hier Gasbildung im Sediment an. Das Wasser ist weiterhin verhältnismäßig klar. Am Glaszylinder war weiterhin Algenbewuchs zu erkennen, dieser reichte ca. 10cm tief in die Säule hinein, das Wasser ist ansonsten klar (Abb. 15). Abbildung 15: Sediment der Säule Nr. 2 am 13. Tag der Beobachtung Säule Nr. 3 zeigt nur noch leicht aufsteigende Bläschen, jedoch sind weiterhin deutliche Lufteinschlüsse im Sediment erkennbar genau wie zahlreiche schwarze Flecken. Es ist ein deutlicher grüner Flaum auf der schwarzen Sedimentoberfläche erkennbar. Auch diese Säule zeigt Algenbewuchs am Rand des Zylinders, der ca. 15cm in die Tiefe ragt, das Wasser ist ansonsten verhältnismäßig klar (Abb. 16). 15 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Abbildung 16: Sediment der Säule Nr. 3 am 13. Tag der Beobachtung Säule Nr. 4 zeigte massive Lufteinschlüsse im Sediment und Austreten von Gasblasen aus selbigem. Auf dem Sediment war eine beginnende grünliche Verfärbung zu erkennen. Auch Säule Nr. 4 zeigt Algenwuchs am Zylinder, dieser reicht hier, wie bei Säule Nr. 3, 15cm tief, das Wasser war auch hier noch verhältnismäßig klar (Abb. 17). 16 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Abbildung 17: Sediment von Säule Nr. 4 am 13. Tag der Beobachtung Am letzten Tag der Beobachtung wurden Proben aus dem oberen, dem mittleren und dem unteren Teil der Wassersäule entnommen und mikroskopiert, wobei folgende Beobachtungen gemacht werden konnten. Abbildung 18: Mikroskopische Aufnahme einer Wasserprobe aus dem oberen Teil der Wassersäule am 13.Tag 17 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson In der oberen Wasserschicht der Säule war nur eine kleine Anzahl verschiedener Mikroorganismen zu beobachten, darunter zahlreiche ca. 1µm große kokkoide Organismen und wenige ca. 7-10µm lange eukaryotische Organismen (Abb. 18). Abbildung 19: Mikroskopische Aufnahme einer Wasserprobe aus dem mittleren Teil der Wassersäule am 13.Tag Im mittleren Teil der Wasserschicht konnten ausschließlich ca. 1µm lange kokkoide Organismen gefunden werden, hier jedoch noch weitaus zahlreicher als in der oberen Schicht des Wassers (Abb. 19). 18 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Abbildung 20: Mikroskopische Aufnahme einer Wasserprobe aus dem unteren Teil der Wassersäule am 13.Tag Die Vielfalt der Mikroorganismen im unteren Teil der Wasserschicht war immens höher als in den beiden höher gelegenen Schichten. So waren die größten, hier abgebildeten Organismen ca. 20-25µm lang und nur in kleiner Zahl vertreten, den Hauptanteil machten die auch in den höheren Schichten vorhandenen, ca. 1-2µm langen Organismen aus (Abb. 20). Diskussion In diesem Versuch wurde ein natürliches Biotop im Labor so authentisch wie möglich nachempfunden und damit aufzuzeigen, dass die in einem Biotop vorkommenden Organismen versuchen Nischen zu füllen, um ihr Überleben zu sichern, sich so mit weiteren Organismen ergänzen, aber auch auf Stoffwechselendprodukte wieder anderer Organismen angewiesen sind. Die z.B. in Säule Nr. 1 beobachtete Schwarzverfärbung rührt von der Umsetzung des vorhandenen Eisens her, dieses wird durch das von sulfatreduzierenden Bakterien gebildetete Sulfid umgesetzt zu Eisensulfid, welches eine schwarze Färbung aufweist. Diese Verfärbung bildet sich über die Zeit zurück. Die weiteren 19 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Entwicklungen in den Säulen innerhalb der nächsten Wochen lässt sich anhand des Konzepts der Winogradsky-Säule abschätzen. Erwartungsgemäß passiert in einer Winogradsky-Säule nämlich folgendes: Zunächst erscheinen Algen und Cyanobakterien in der oberen Schicht des Wassers, betreiben dort Photosynthese und erzeugen als Nebenprodukt Sauerstoff, wodurch der obere Bereich der Säule oxigen gehalten wird. Es entwickelt sich ein Sauerstoffgradient, wobei die Sauerstoffkonzentration im Bereich der Wasseroberfläche am höchsten ist und sich nach unten hin verringert. Im Bereich des Sediment/Erd-Gemisches kommt es zu Verrottungsvorgängen, so können z.B. Clostridium-Arten und andere anaerobe Bakterien am Boden der Säule anaerob Cellulose in den dort vorhandenen Blättern vergären und so organische Säuren, Alkohol und H2 als Nebenprodukte erzeugen. Diese Nebenprodukte wiederum benötigen andere Mikroorganismen, z.B. Desulfovibrio-Arten, die zum einen die organischen Substrate als Kohlenstoffquelle und zum anderen Sulfat als finalen Elektronenakzeptor in der Atmungskette nutzen. Bei letzterem entsteht H2S als Endprodukt. Dies resultiert in einem H2S-Gradienten, wobei die H2S-Konzentration am Boden der Säule am höchsten ist, und nach oben hin abnimmt. Zwei Arten photosynthetischer Baktieren nutzen H2S als Elektronendonor, dies sind zum einen grüne Schwefelbaktieren, zum anderen Schwefelpurpurbakterien. Grüne Schwefelbakterien halten höhere H2SKonzentrationen aus als Schwefelpurpurbakterien, so finden sich erste weiter unten in der Säule, bei höheren H2S-Konzentrationen, und letztere weiter oben, wo die O2Konzentrationen höher sind. Über der Schicht der Schwefelpurpurbakterien wachsen schwefelfreie Purpurbakterien und betreiben eine ähnliche Art der Photosynthese wie Schwefelpurpurbakterien, mit dem Unterschied, dass sie organische Säuren oder Alkohole als Elektronendonoren nutzen. In der Zone über den schwefelfreien Purpurbakterien, der sog. mikroaerophilen Zone, wachsen Organismen wie Beggiatoa, dieses nutzt das vorhandene H2S als Elektronendonor und oxidiert es zu H2SO4, wobei es die Energie nutzt um CO2 zu fixieren und organische Moleküle herzustellen. Die Schichtung in einer Winogradsky-Säule kommt somit in erster Linie durch die unterschiedlichen Stoffgradienten zustande, die einzelnen Mikroorganismen können bei unterschiedlichen O2- bzw. H2S-Konzentrationen unterschiedlich gut wachsen, wobei phototrophe Bakterien gleichzeitig auf das Vorhandensein von Licht 20 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson angewiesen sind, die Mikroorganismen versuchen sich an dem Ort in der Säule aufzuhalten, der für sie und ihren Stoffwechsel am günstigsten ist. Die Trübung der Säulen kurz nach dem Ansetzen rührt aufgrund des eingegossenen Wassers her. Die sehr starke Trübung von Säule Nr. 1 resultierte vermutlich aufgrund zu steilen Einfüllen des Wassers. Die Aufklärung der Säulen in den folgenden Tagen vollzog sich durch Absetzen der in der Wasserzone vorhandenen Schwebeteilchen. Säule Nr. 1 verblieb eingetrübt, hier hat sich vermutlich etwas von dem hinzugegebenen Pepton aus dem Sediment gelöst und in der Wasserphase verteilt. Die zu den Säulen hinzugefügten einzelnen Komponenten, fördern gezielt das Wachstum einzelner Organismen in der Winogradsky Säule. So fördert die Zugabe von Pepton die Entwicklung von gärenden Organismen, da diese Pepton als Nährstoffquelle verwenden. So war zu erwarten, dass die Säule Nr. 1 schnell Gasbildung, sichtbar durch Lufteinschlüsse im Sediment, aufweist. Bei dieser Gasbildung handelt es sich um Gärungsvorgänge im Sediment, verursacht z.B. durch Organismen der Gattung Clostridium. Diese vergären anaerob Cellulose, wobei im Zuge dessen als Nebenprodukte organische Säuren, Alkohol und H2 entstehen, geeignete Verbindungen für sulfatreduzierende Bakterien. Sulfatreduzierende Bakterien benötigen eine Sulfatquelle. Diese wird in den angesetzten Säulen durch die Hinzugabe von Gips gestellt, vorhanden in Säule Nr. 2. Zu erwarten wäre nun, dass die Kombination aus Pepton und Gips (Säule Nr. 2), dafür sorgt, dass gärende, und damit u.a. Wasserstoff-produzierende Organismen eine ausreichende Nährstoffversorgung besitzen, genau wie sulfatreduzierende Bakterien, die nicht nur Wasserstoff, sondern auch Sulfat in ausreichenden Mengen zu Verfügung haben. Diese Säule müsste sich also in der Theorie als erstes schwarz verfärben. Da jedoch Säule Nr. 1 als erstes eine deutliche Schwarzverfärbung aufwies, lässt sich hier nun spekulieren, dass entweder die Menge an Pepton stärker variierte als erwartet, oder aber in Säule Nr. 1 eine Sulfatquelle vorhanden war, die mit dem Sediment eingebracht wurde. Auch eine nicht ausreichende Durchmischung der Erde mit dem hinzugefügten Pepton/Gips-Gemisch könnte die Entwicklung von Säule Nr. 2 gebremst haben. Eventuell gab es auch zufällig signifikante Unterschiede in der in die Säule eingebrachten Bakteriendichte. So war bei Säule Nr. 1 eine 21 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Gasbildung nur schwach zu beobachten, wäre hier die Dichte an sulfatreduzierenden Bakterien zufällig deutlich höher gewesen als in den anderen Säulen, so würde sich erklären, warum durch schnelle Umsetzung des durch die gärenden Organismen gebildeten Wasserstoffes nur wenig Gasblasen zu beobachten waren und die Schwarzverfärbung aufgrund des in großen Mengen gebildeten Sulfides und die anschließende Umsetzung letzteren zu Eisensulfid so massiv vonstatten ging. Die Hinzugabe eines Laub/Gras-Gemisches hat einen ähnlichen Effekt wie die Hinzugabe von Pepton, es fördert die Entwicklung gärender Organismen. Diese Beobachtung lieferte Säule Nr. 3, die mit dem Laub/Gras-Gemisch ausgestattet wurde. Hier konnte als erstes Gasbildung in Form von aufsteigenden Bläschen beobachtet werden. Versetzt man die Säule mit Calciumcarbonat (CaCO3), wie es im Falle von Säule Nr. 4 in Kombination mit Pepton geschehen ist, so liefert man den dort vorhandenen Organismen eine Kohlenstoffquelle. Diese ist vor allem für autotrophe Organismen wie den phototrophen Bakterien sehr wichtig, da diese CO2 als ausschließliche Quelle des Zellkohlenstoffs verwenden. Diese Säule sollte also bald eine grünliche bzw. rötliche Verfärbung, aufgrund des Wachstums von grünen phototrophen Bakterien, Cyanobakterien, Algen und Purpurbakterien aufweisen. Die Entwicklung der Säulen zeigt jedoch, dass die grünliche Verfärbung von Säule Nr. 3 deutlich stärker war, als die von Säule Nr. 4 zum Ende des Betrachtungszeitraumes. Der Algenwuchs am Rand beider Säulen war vergleichbar, sodass hier nur geschlossen werden kann, dass die in Säule Nr. 3 natürlich einbegrachten Kohlenstoffquellen wie Cellulose, mengenmäßig die Versorgung durch das Calciumcarbonat überstiegen. Auch ein zufälliger Unterschied der Bakteriendichte autotropher Organismen könnte für die abweichenden Entwicklungen gesorgt haben. Da der Betrachtungszeitraum von 15 Tagen jedoch verhältnismäßig kurz für ein im Labor angesetztes Biotop wie die Winogradsky Säule ist, können sich die einzelnen Entwicklungen noch stark verändert haben, die hier genannten Beobachtungen entsprachen nur den ersten Eindrücken zwei Wochen nach Ansetzen der Säulen. 22 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson 2. Versuch: Rhodospirillaceae Einleitung Die Nicht-Schwefelpurpurbakterien (Rhodospirillaceae) sind in der Lage unter Verwendung von organischen Stoffen als Elektronendonor, anoxygene Photosynthese zu betreiben. Die einzige Energiequelle ist, wie auch bei der oxygenen Photosynthese, das Licht. Teilweise können auch reduzierte Schwefelverbindungen als Elektronendonor verwendet werden, jedoch in einem weitaus geringeren Maß, als es bei den Schwefelpurpurbakterien der Fall ist. Ihre Lebensweise ist somit größtenteils photoorganotroph. In diesem Versuch sollen drei verschiedene Arten der Rhodospirillaceae – Rhodospirillum rubrum, Rubrivax gelatinosus und Rhodomicrobium vannielii – in Hinblick auf ihre Absorptionsspektren untersucht werden. Die Messung der Spektren erfolgt zum einen in situ (hier sind die photosynthetischen Pigmente noch mit der Membran assoziiert) und zum anderen nach dem Herauslösen der Pigmente aus der Membran, so dass diese nicht mehr mit den entsprechenden Proteinen interagieren können – in vitro. Material und Methoden Wie im Skript angegeben. Ergebnisse In Abb. 21 sind die drei mit R. rubrum, R. gelatinosus und R. vannielii angeimpten Kulturen zu sehen. Gut zu erkennen sind die unterschiedlichen Färbungen der Kulturen. 23 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Abbildung 21: Zeigt die drei angesetzten Kulturen, v.l.n.r.: Rhodospirillum rubrum, Rubrivivax gelatinosus, Rhodomicrobium vannielii Anhand der Farbe der Kulturen und der Morphologie der Zellen, waren die drei Proben äußerlich gut zu unterscheiden. Die Merkmale sind in der nachfolgenden Tabelle 2 zusammengefasst: Tabelle 2: Gegenüberstellung der Eigenschaften der untersuchten Proben Kulturfarbe R. rubrum R. gelatinosus R. vannielii (Dunkel-)rosa/ purpur bräunlich bräunlich/orange Spirillen gekrümmte ovale Stäbchen Mikroskop. Aufnahme Zellform Stäbchen Zellgröße 5-7,5µm Bewegung „zittrige“ 5µm 1µm Fortbewegung Besonderheit Fortpflanzung durch en Knospung 24 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Rhodospirillum rubrum (Gruppe 1) Abbildung 22: Absorptionsspektrum von Rhodospirillum rubrum Abb.22: Auf der x-Achse ist die Wellenlänge [nm] angegeben, wohingegen die yAchse die Absorption darstellt. Die blaue Kurve ist das Ergebnis der in vitro- und die rote Kurve beschreibt die in situ- Messung. Das Ergebnis in Abb.22 weist zwei eindeutige Maxima der in situ-Kurve bei 375nm (UV-Bereich), sowie bei 880nm im langwelligen Infrarot-Bereich auf. Zwischen diesen beiden Optima liegen weitere kleinere Peaks bei 508nm, 590nm (beide im grünen Spektralbereich) und 798nm. Die in vitro-Kurve liegt bezüglich der Absorption über dem in situ-Graphen. Hier sind Peaks bei 361nm, 495nm und 776nm erkennbar. Die nachfolgenden Abbildungen sind die repräsentativsten Ergebnisse der ermittelten Spektren des Kurses. Der rote Graph stellt wiederum das in situ, der blaue das in vitro Ergebnis dar. 25 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Rhodospirillum rubrum (Gruppe 17) Abbildung 23: Referenzabsorptionsspektrum von Rhodospirillum rubrum Abb.23: Bei Rhodospirillum rubrum von Gruppe 17 sind bei der in situ-Kurve mehrere Maxima zu erkennen. Die beiden höchsten Peaks, mit der stärksten Absorption, liegen bei 376nm und 880nm. Zwischen diesen sind wieder einige schwächere Maxima erkennbar. Jeweils bei 514nm, 550nm und 799nm. Der in vitro-Graph in Abb.23 liegt in Hinblick auf die Absorptionsstärke über der in situ-Kurve. Ausnahme hier, ist der Peak bei 880nm des in situ-Graphen. Dieser übersteigt die blaue Kurve in Bezug auf die Absorption. Ebenfalls auffällig ist, dass die Maxima der blauen Kurve generell eine geringere Intensität ausweisen, als diese der roten Kurve (dies ist auch bei den nachfolgenden Graphen erkennbar). Die Maxima der blauen Kurve (in vitro) liegen bei 362nm, 503nm, 538nm und 774nm. 26 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Rubrivivax gelatinosus (Gruppe 5) Abbildung 24: Absorptionsspektrum von Rubrivivax gelatinosus Zu Abb.24: Rubrivivax gelatinosus (Gruppe 5) weist drei eindeutige Peaks bei 377nm, 803nm und 859nm auf. Dazwischen sind wieder einige kleinere Maxima bei 480nm und 510nm vorzufinden. Auch bei dieser Art liegt der blaue – in vitro – Graph, bezüglich der Absorptionsstärke, über dem Kurvenverlauf der in situ-Probe. Die auffälligsten Peaks liegen bei 462nm, 494nm und 776nm. Rhodomicrobium vannielii (Gruppe 6) Abbildung 25: Absorptionsspektrum von Rhodomicrobium vannielii 27 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Das in Abbildung 25 gezeigte Ergebnis von Rhodomicrobium vannielii (Gruppe 6) ähnelt sehr dem Graphen von Rubrivivax gelatinosus (Abb.24). Auch hier (Abb.25) liegen die drei stärksten Peaks des in situ-Ergebnisses, hinsichtlich ihrer Intensität, bei 376nm, 774nm und 858nm. Zwischenliegend sind wieder kleinere Peaks bei 479nm und 591nm erkennbar. Die in vitro-Kurve in Abb.25 zeigt einige Maxima im Bereich von etwa 460nm, 490nm und 774nm. In Tabelle 3 sind die Ergebnisse der Absorptionspektren der Gruppen nochmals zusammengefasst. Hierbei sind zwischen den Absorptionsspektren der einzelnen Arten keine großen Abweichungen erkennbar. Tabelle 3: Zusammenfassung der Absorptionsspektren (in situ) R. rubrum R. rubrum R. gelatinosus R. vannielii (Gruppe 1) (Gruppe 17) (Gruppe 5) (Gruppe 6) 880 nm 880 nm 859 nm 858 nm 798 nm 799 nm 803 nm 803 nm 580 nm 580 nm 591 nm 591 nm 550 nm 550 nm --- --- 375 nm 376 nm 377 nm 376 nm 475 nm 480 nm 480 nm 479 nm 508 nm 514 nm 510 nm 510 nm 28 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Diskussion Hierbei sei vorerst noch einmal erwähnt, dass die verschiedenen Chlorophylle, sowie weitere akzessorischen Pigmente1 (wie Carotinoide und Phycobiliproteine) für die Unterschiede der jeweiligen Absorptionsspektren verantwortlich sind. Diese Pigmente absorbieren das Licht unterschiedlicher Wellenlänge, wobei das kurzwellige Licht (violett/UV-Bereich) am energiereichsten ist. Diese Energie wird mit Hilfe der Pigmente von den phototrophen Organismen für das Antreiben der Photosynthese verwendet. Die Rhodospirillaceae enthalten als Chlorophyllpigmente die so genannten Bakteriochlorophylle. Hierzu kommen noch zusätzlich Carotinoide, welche im Bereich von 400-550nm Licht absorbieren können. Bisher sind fünf verschiedene Bakteriochlorophylle (BChl.) bekannt, BChl. a (Absorptionsbereich: 850-890nm – Infrarot-Bereich), BChl. b (1020-1035nm – Infrarot-Bereich) sowie BChl. c, d und e (715-755nm – rot-Bereich). Hinzu kommt noch eine Absorption aller Bakteriochlorophylle bei <450nm, sowie bei etwa 800nm und ca. 590nm (Grün-Bereich). Das kurzwellige Licht unter 450nm ist das energiereichste, und somit wird dieses von allen Bakteriochlorophyllen absorbiert. Die weiteren spezifischen Absorptionswellenlängen sind von Art zu Art unterschiedlich, um sich so gegen andere konkurrierende Arten durchsetzen zu können. Die bei diesem Versuch untersuchten Arten besitzen alle drei das Bakteriochlorophyll a, sowie zusätzliche Carotionoide. In Tabelle 4 sind die erhaltenen Ergebnisse nochmals im Vergleich zu den Literaturwerten aufgeführt, wobei keine großen Diskrepanzen zu erkennen sind. Somit ist das Ergebnis verhältnismäßig akzeptabel. Tabelle 4: Zusammenfassung der Absorptionsspektren (in situ) im Vergleich mit den Literaturwerten Absorptions- R. R. gelatinosus R. R. rubrum Literatur- pigment rubrum (Gruppe 5) vannielii (Gruppe wert 1 Akzessorische Pigmente dienen nur der Lichtsammlung und sind an der Energieumwandlung nicht direkt beteiligt. 29 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson (Gruppe (Gruppe 6) 1) 17) BChl. a 880nm 859nm 858nm 880nm 870nm 799nm 803nm 803nm 798nm 800nm 580nm 591nm 591nm 580nm 590nm 550nm --- --- 550nm --- alle BChl. 376nm 377nm 376nm 375nm 360nm Carotinoide 480nm 480nm 479nm 475nm 475nm 514nm 510nm 510nm 508nm 525nm Die stärkste Absorption der in situ-Kurve erfolgt in Abbildung 22 bei 880nm. Diese entspricht somit dem Wellenlängenbereich des Bakteriochlorophyll a, in diesen Wellenlängenbereich einzuordnen ist ebenfalls der schwache Peak bei 798nm. Im UV-Bereich absorbieren, wie bereits oben schon erwähnt, alle Baktriochlorophylle, in unserem Fall bei 375nm. Die Peaks zwischen den Absorptionsbereichen des Bakteriochlorophyll stellen die Absorptionsbereiche der Carotinoide dar. In Abb. 24 deutlich bei 508nm und einen schwachen Peak bei 475nm zu erkennen. Die schwachen Maxima bei 550nm und etwa 580nm (beide Grün-Bereich) gehören ebenfalls zur Absorption des Bakteriochlorophyll a. Die in vitro-Kurve liegt, wie schon im Ergebnisteil erwähnt, bezüglich der Absorption höher als der in situ-Graph. Diese Verschiebung ist durch das Lösungsmittel zu erklären. Um einen korrekten Wert zu erhalten, müsste die Eigenabsorption des Lösungsmittels (Nullprobe) von den erhaltenen Ergebnissen abgezogen werden. Allgemein ist im Vergleich der beiden Graphen (in situ und in vitro) zu erkennen, dass sich diese sowohl von den Intensitäten der Absorption, aber auch in Hinblick auf die absorbierte Wellenlänge stark unterscheiden. So ist von Abb.22 bis einschließlich Abb.25 zu sehen, dass nach dem Herauslösen der Bakteriochlorophylle aus dem Pigment/Protein-Komplex der Membran, statt 2 Maxima nur noch eins, bei jeweils etwa 775nm, vorzufinden ist. Daraus lässt sich 30 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson schließen, dass die entsprechende Absorption nicht allein durch die Pigmente bestimmt wird, sondern auch die Umgebung, in welchen diese Pigmente vorzufinden sind, eine entscheidende Rolle bezüglich der Absorption spielt. Ebenfalls auffällig ist, dass das Spektrum der in vitro-Kurve im Vergleich zur in situ – Kurve immer ca. 20 - 30nm in den kurzwelligen Bereich verschoben ist: Abb.22 – in situ: 375nm; in vitro: 361nm. Dieses Phänomen ist ebenfalls bei den Carotinoiden zu beobachten, jedoch weitaus geringer ausgeprägt, als beim Bakteriochlorophyll a. Diese Verschiebungen könnten ebenfalls mit der Interaktion bzw. dem Ausbleiben der Interaktion des Pigment/Protein-Komplex in Verbindung stehen. Im Vergleich des repräsentativen Ergebnisses von Gruppe 17 mit unserem Ergebnis von Rhodospirillum rubrum, sind keine besonders starken Abweichungen zu erkennen. Jedoch ist die Absorption der Carotionide, sowohl bei der in situ-, also auch bei der in vitro-Kurve, bei Gruppe 17 auffallender. Wenn man nun die in situ Kurvenverläufe der drei Arten gegenüberstellt, ist zu erkennen, dass die Absorption des Bakteriochlorophyll a, welche bei Rhodospirillum rubrum 798nm bzw. 799nm (Abb.22 bzw. Abb.23), bei Rubrivax gelatinosus (Abb.24) und Rhodomicrobium vannielii (Abb.25) jeweils 803nm beträgt, bei den beiden letzteren weitaus intensiver ausfällt als bei R. rubrum. Dies ist ebenfalls bei 590nm zu beobachten. Hier ist die Absorption bei Rubrivax gelatinosus und Rhodomicrobium vannielii wiederum größer ausgeprägt als bei R. rubrum. Hierbei sei allerdings erwähnt, dass man anhand der Absorptionspektren allein, nicht auf die Farbe der Kultur schließen kann. Anhand der ermittelten Wellenlängen, welche in Tabelle 4 aufgeführt sind, ist im Vergleich zu den Literaturwerten keine großen Abweichungen zu erkennen und stellen somit ein recht akzeptables Ergebnis dar. 31 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson 3. Versuch: Cyanobakterien Einleitung Cyanobakterien sind phototrophe Bakterien, wobei sie oxygene Photosynthese betreiben, bei der als Nebenprodukt Sauerstoff entsteht. Sie besitzen kein einheitliches Erscheinungsbild, so treten einige Vertreter dieser Klasse als Einzelzellen (z.B. Synechococcus, Synechocystis), andere in Form von Filamenten (z.B. Anabaena, Nostoc, Cylindrospermum) auf. Ihr gemeinsames Merkmal ist, dass sie nur eine Form Chlorophyll, das sog. Chlorophyll a besitzen, nebst Carotinoiden und Phycobilinen (Phycocyanobilin - blau-grün - und Phycoerythrobilin - rot), die an Chromoproteine (Phycoerythrine, Phycocyanine) gebunden, auf der Thylakoidmembran hochgeordnete Strukturen in Form von sog. Phycobilisomen bilden, als zusätzliche Lichtsammelkomplexe agieren und die gesammelte Lichtenergie an die Photosysteme der Photosynthese weiterreichen. Auch Zelldifferenzierungen werden in dieser Gruppe nicht selten beobachtet, so können Zellen zu Überdauerungsstadien ausdifferenzieren, den sog. Akineten, wobei wesentlich bedeutsamer das Phänomen der Heterocystenbildung ist, bei dem Zellen unter Stickstoffmangel zu den sog. Heterocysten ausdifferenzieren und nach weitreichenden Veränderungen ihrer Zellbestandteile in der Lage sind Luftstickstoff zu fixieren. Material und Methoden Siehe Skript. Ergebnisse Nach wenigen Tagen der Inkubation unter Dauerlicht konnte beobachtet werden, dass die Bakterienkolonien, die im nitrathaltigen Medium angereichert wurden, einen 32 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson deutlich stärkeren Wuchs zeigten als solche, die in nitratarmem Medium inkubiert wurden (Abb. 26). Abbildung 26: Kulturen der Gattung Nostoc, links ohne Nitrat, rechts mit Nitrat, letztere zeigt deutlich stärkeren Bewuchs (Grünfärbung) Mehrfache mikroskopische Untersuchungen zeigten ein einheitliches Bild, die Cyanobakterien, die in der Lage sind Filamente auszubilden, sprich die Gattungen Anabaena, Nostoc, Cylindrospermum bildeten in Kolonien ohne Nitrat bald ausdifferenzierte stickstofffixierende Heterocysten aus (Abb. 27 und 28), wobei solche, die nur als Einzelzellen vorkommen, sprich die Gattungen Synechococcus, Synechocystis nur sehr schwachen Bewuchs zeigten. Abbildung 27: Nostoc-Kolonie mit Nitrat, keine Differenzierung einzelner Zellen erkennbar 33 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Abbildung 28: Nostoc-Kolonie ohne Nitrat, die Heterocysten (Kreis) sind deutlich erkennbar Die Bestimmung des Pigmentgehaltes führte zu folgendem Ergebnis für Nostoc mit und ohne Nitrat: Abbildung 29: Absorptionsspektrum der Nostoc-Kolonie mit Nitrat, rot: in situ, blau: in vitro 34 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Abbildung 30: Absorptionsspektrum der Nostoc-Kolonie ohne Nitrat, rot: in situ, blau: in vitro Zu erkennen ist zunächst, dass die Spektren der Nostoc-Kolonie mit Nitrat (Abb. 29) keinen signifikanten Unterschied zu der Nostoc-Kolonie ohne Nitrat (Abb. 30) zeigen, von daher werden die Spektren im Folgenden als eins beschrieben. Die Spektren zeigen in situ Absorptionsmaxima bei 438nm (blauer Bereich des sichtbaren Lichts), 564nm (grün/gelber Bereich, Siehe Referenzspektrum Abb. 31), 618nm (orange/roter Bereich des sichtbaren Lichts) und 678nm (roter Bereich des sichtbaren Lichts), in vitro verschieben sich die Maxima leicht auf 432nm und 666nm, die mittleren Absorptionsmaxima bei 618nm und 564nm sind in vitro nicht mehr vorhanden (Siehe auch Referenzspektrum Abb. 31). Des Weiteren ist erkennbar, dass die Absorption in vitro stärker ist als in situ. Im Vergleich hierzu das Referenz-Absorptionsspektrum für Nostoc (Abb. 31): 35 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Abbildung 31: Referenz-Absorptionsspektrum von Nostoc, rot: in situ, blau: in vitro Die Absorptionsspektren der verbleibenden Cyanobakterien sahen wie folgt aus (Abb. 32 35): Abbildung 32: Absorptionsspektrum von Anabaena, rot: in situ, blau: in vitro 36 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Abbildung 33: Absorptionsspektrum von Cylindrospermum, rot: in situ, blau: in vitro Abbildung 34: Absorptionsspektrum von Synechococcus, rot: in situ, blau: in vitro Abbildung 35: Absorptionsspektrum von Synechocystes, rot: in situ, blau: in vitro 37 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Im Vergleich aller Spektren ist erkennbar, dass in situ die Absorptionsmaxima zwischen 434-439nm, 619-623nm sowie 678-679nm liegen, und diese sich in vitro auf 433-434nm sowie 666-667nm verschieben. Das mittlere Absorptionsmaximum um 619-623nm fehlt auch hier in vitro völlig, genau wie das Absorptionsmaximum bei 564nm bei Nostoc. Diskussion Heterocysten sind spezialisierte Zellen, die unter Veränderung ihrer Zellbestandteile in der Lage sind, bei Stickstoffmangel, Luftstickstoff zu fixieren. Diese Veränderungen umfassen den Aufbau einer dicken Zellwand mit hohem Gehalt an Glykolipiden um die Diffusion von Sauerstoff in die Zelle zu verhindern, den Abbau von Photosystem II, um das Entstehen von Sauerstoff als Nebenprodukt der Photosynthese zu unterbinden und schlussendlich die Produktion des Enzyms Nitrogenase. Letztere ist in der Lage Luftstickstoff N2 in Form von Ammoniak NH3 zu fixieren, wird jedoch durch Sauerstoff inaktiviert, weshalb die Zelle die oben genannten Veränderungen vollziehen muss, um die Nitrogenase (bestehend aus zwei Komponenten - der Nitrogenase-Reduktase und der eigentlichen Nitrogenase) zu schützen. Da die Zelle, die sich zur Heterocyste ausdifferenziert, nicht mehr in der Lage ist sich selbst zu versorgen, muss sie mittels interzellulären Verbindungen durch benachbarte Zellen mit Substraten versorgt werden; was im Austausch gegen den fixierten Stickstoff geschieht. Dies ist jedoch der Grund, warum nur einige filamentös wachsende Cyanobakterien (wie Anabaena, Nostoc und Cylindrospermum) in der Lage sind, Heterocysten auszubilden. Nur durch den Stoffaustausch mit benachbarten Zellen bleibt die Heterocyste am leben und kann die Zellen des Filaments mit Stickstoff versorgen. Die Nachbarzellen der Heterocyste betreiben weiterhin oxygene Photosynthese, wobei sie die Energie des Lichtes mittels Absorption ihrer photosynthetisch aktiven 38 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Pigmente in chemische Energie umwandeln. Die Absorption der einzelnen Pigmente lässt sich anhand obiger Absorptionsspektren untersuchen und abschätzen, um welche Pigmente es sich im Detail handelt. Da kein signifikanter Unterschied der Absorptionsspektren von Nostoc mit bzw. ohne Nitrat erkennbar waren, lässt sich daraus schließen, dass der Mangel an vorhandenem Nitrat, die damit verbundene Ausbildung von Heterocysten und die Fixierung von Luftstickstoff keinen nennenswerten Einfluss auf die Pigmentausstattung der Organismen hat. Die Absorption der Pigmente wird also in keinster Weise verändert. Die Absorption der Pigmente wird jedoch im Vergleich in situ und in vitro verändert. Zunächst scheint die Absorption auf den ersten Blick in vitro stärker zu sein, als in situ, dies rührt jedoch vermutlich vom verwendeten Lösungsmittel her, welches eine Eigenabsorption aufweist. Diese stärkere Absorption ist also vernachlässigbar. Hinzu kommt, dass die Absorptionsmaxima in vitro im Vergleich zur Absorption in situ leicht in den kurzwelligen Bereich verschoben sind. Dies lässt sich mit der Assoziation der Pigmente an Proteine in situ erklären. Chlorophylle z.B. sind in und an Proteinkomplexe assoziiert, wobei diese durch den Einsatz von Lösungsmitteln denaturieren und das Chlorophyll freisetzen. Phycocyanin- und PhycoerythrinPigmente, sind kovalent an Proteine gebunden, und bleiben mit den Proteinen verbunden, auch wenn diese bereits durch Lösungsmittel denaturiert wurden. Vergleicht man nun Literaturwerte für Absorptionsmaxima verschiedener Pigmente mit den obigen Spektren, lässt sich schnell darauf schließen, dass es sich zum einen um das Pigment Chlorophyll a (Absorptionsmaxima laut Literatur bei ca. 430nm und ca. 680nm = 1. und 3. Peak), und zum anderen um die Pigmente Phycocyanin (Absorptionsmaximum laut Literatur bei ca. 615-620nm) und Phycoerythrin (Absorptionsmaximum laut Literatur bei ca. 555nm) handeln muss. Der Peak des Phycocyanins, sowie der des Phycoerythrins lässt sich aufgrund der kovalenten Bindung an die Proteine in vitro nicht isolieren, ein eindeutiges Zeichen, dass es sich bei diesem Peak nicht um ein Absorptionsmaximum des Chlorophyll a handelt. Evolutiv haben sich die verschiedenen photosynthetisch aktiven Pigmente entwickelt, um möglichst viel Licht unterschiedlicher Wellenlängen zu absorbieren und so die Konkurrenz der photosynthetisch aktiven Organismen untereinander um das teilweise wenig vorhandene Licht etwas zu entschärfen. 39 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson 4. Versuch: Bakterienisolierung Einleitung Dieser Versuch diente der Demonstration eines kleinen Ausschnittes der mikrobiellen Diversität anhand von Bakterienisolierungen aus Bodenproben. Mittels unterschiedlicher, teilweise definierter Medien, wurden gezielt Kolonien herangezogen, um im zweiten Teil des Versuches interessante Organismen zu isolieren und durch verschiedene Tests näher zu charakterisieren. Interessante Kolonien wurden in Versuch 5 im Hinblick auf eine phylogenetische Einordnung weiter bearbeitet. Material und Methoden Die Erdprobe stammte aus einem Waldstück in Offenbach/Bieber. Siehe Skript. Ergebnisse 40 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Bevor die Isolierung interessanter Organismen erfolgte, haben wir unsere Erdsuspensionen in verschiedenen Konzentrationen (1:10 und 1:100) auf unterschiedliche Medien (siehe Tab.8) ausplattiert und für drei Tage inkubiert. Die folgende Tabelle 5 zeigt die entsprechende Kolonienanzahl pro ml Ausgangsprobe [K/ml]: Tabelle 5: Zellzahl pro Milliliter der Ausgangsprobe Medium 1:10 1:100 Bebrütungszeit M1 --- --- 3 Tage M2 93 Kolonien 19 Kolonien 3 Tage 9,3 ∙103 K/ml 19 ∙103 K/ml 5 Kolonien --- 3 Tage 67 Kolonien 23 Kolonien 3 Tage 67 ∙103 K/ml 23 ∙103 K/ml 83 Kolonien 38 8,3 ∙103 K/ml 38 ∙103 K/ml 45 Kolonien 6 Kolonien 4,5 ∙103 K/ml 6 ∙103 K/ml 39 Kolonien 10 Kolonien 3,9 ∙103 K/ml 10 ∙103 K/ml 63 Kolonien 10 Kolonien 6,3 ∙103 K/ml 10 ∙103 K/ml --- --- M3 5 ∙103 K/ml M4 M5 M6 M7 M8 M9 2 Tage 3 Tage 3 Tage 3 Tage 3 Tage 41 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson In nähere Betrachtung fielen die folgenden vier Kolonien der Platte M5 (Komplexmedium), die im weiteren Verlauf nur noch als „gelb“, „glatt“, „wellig“ und „orange“ aufgrund ihrer Morphologie bezeichnet werden. Tabelle 6 zeigt die Morphologie der beiden ausgewählten Kolonien „gelb“ und „glatt“. Bei „gelb“ handelte es sich um (Diplo-)Kokken, welche gelbe Kolonien ausbildeten und bei der Probe „glatt“ waren milchig-weiße Kolonien zu erkennen. Diese waren unter dem Mikroskop als unbewegliche Stäbchen identifizierbar. Tabelle 6: Morphologie der ausgewählten Kolonien "gelb" und "glatt" Morphologie Kolonie Zellen gelb glatt gelb milchig-weiß glatter Rand glatter Rand einheitlich, rund einheitlich, rund 1mm 0,6cm (Diplo-)Kokken Stäbchen 2,5µm Einzelzellen unbeweglich Länge 1-2µm In Tabelle 7 sind die Ergebnisse der Morphologiebeobachtung der Klone “wellig“ und „orange“. Kolonie „wellig“ weist einen welligen Rand und eine milchig-weiße Färbung auf. Mikroskopisch waren einzelne und unbewegliche Stäbchen zu erkennen. Bei Probe „orange“ ergaben sich orange Kolonien mit einem glatten Rand. Hierbei waren die Kolonien hervorstehend. In Hinblick auf die Morphologie der Zellen waren ebenfalls einzelne, allerdings möglicherweise begeißelte Stäbchen erkennbar. Tabelle 7: Morphologie der ausgewählten Kolonien "wellig" und "orange" Morphologie Kolonie wellig milchig-weiß orange orange 42 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson welliger Rand glatter Rand einheitlich, rund einheitlich, rund 0,4cm hervorstehend 2mm Zellen Stäbchen Stäbchen Einzelzellen Einzelzellen unbeweglich mögl. begeißelt Länge 2,5µm Länge 5µm Diese wurden nach Isolierung und Aufreinigung der Kolonie auf ihre Stoffwechseleigenschaften anhand verschiedener Medien und Tests untersucht. In Tabelle 8 werden die ausgewählten Kolonien auf unterschiedlichen Medien ausplattiert, wobei jedes Medium eine spezielle Stoffwechseleigenschaft nachweisen soll. Tabelle 8: Beschreibung der einzelnen Medien Medium Stoffwechseleigenschaft M1 Abbau von Naphthalin (Aromaten) M2 Abbau von Glucose M3 Abbau von Cellulose M4 Stickstofffixierung M5 Komplexmedium M6 Nitratatmung M7 Oligotrophie M8 unbekannte Wuchsstoffe M9 Sporenbildung 43 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Hohe Schicht Abhängigkeit von Sauerstoff Dabei kam es zu folgendem Ergebnis: In Tabelle 9 ist jeweiliges Wachstum bzw. Ausbleiben des Wachstums aufgeführt. Hier entspricht ein +-Zeichen jeweiliges Wachstum, wogegen bei einem - -Zeichen kein Wachstum feststellbar war. Auffällig ist, dass keine der vier Klone fähig war, auf den M1-, als auch auf den M3Platten zu wachsen. Alle Klone zeigten sehr gutes Wachstum auf den M5- und M6Platten. Im Vergleich zu den anderen drei Organismen, welche alle fakultativ anaerob waren, ist Klon „orange“ strikt aerob. Tabelle 9: Wachstum der Klone auf den jeweiligen Medien gelb M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 HS - - - + +++ ++ (+) (+) - fak. anaerob glatt - + - + +++ ++ - - - fak. anaerob wellig - - - + +++ ++ - (+) - fak. anaerob orange - - - (+) +++ ++ (+) (+) - strikt aerob Der Oxidase-Test ermittelt das Vorhandensein einer Cytochrom-c-Oxidase als Komponente der aeroben Atmungskette. Diese reduziert im letzten Schritt der aeroben Elektronentransportkette den Elektronenakzeptor Sauerstoff zu Wasser oder Wasserstoffperoxid. Der Katalase-Test überprüft das Vorkommen des Enzyms Katalase, benötigt zur Zerlegung der toxischen Wasserstoffperoxid-Verbindung in Sauerstoff und Wasser. 44 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson In Tabelle 10 wurden die vier Klone (gelb“, „glatt“, „wellig“ und „orange“) auf das Vorhandensein der Cytochrom-c-Oxidase und des Enzyms Katalase untersucht. Ebenfalls wurde jede Probe hinsichtlich des Gramverhaltens geprüft. Hierbei ergab, dass außer Klon „gelb“, die anderen drei Proben gramnegativ waren. Das Enzym Katalase dagegen war bei allen Klonen aufweisbar. Tabelle 10: Untersuchung der Klone auf Gram-Verhalten, Oxidase- und Katalase-Aktivität gelb glatt wellig orange Gram + - - - Oxidase - - + + Katalase + + + + Diskussion Die zusammengefassten Stoffwechseleigenschaften der Organismen „gelb“ und „glatt“ lässt folgende Vermutungen zu, zu welcher Gattung sich die Organismen einteilen lassen. In folgender Tabelle 11 sind morphologische, als auch die Ergebnisse der einzelnen Tests hinsichtlich der Stoffwechseleigenschaften aufgeführt. In der rechten Spalte sind die jeweiligen Eigenschaften der vermuteten Gattung dargestellt. Tabelle 11: Zusammenfassung der Eigenschaften und mögliche Gattung des Organismus' "gelb" gelb Kolonie gelb Micrococcus spp. zitronengelbe, glatter Rand glänzende einheitlich, rund Kolonien bekannt 1mm (M. luteus) 45 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Morphologie Zellen (Diplo-)Kokken Kokken in Form 2,5µm von Trauben, Gram-positiv kurzen Ketten, paarweise Gram-positiv fak. anaerob StickstoffFixierung Nitratatmung bekannt (M. denitrificans) anspruchslose Eigenschaften und Nitratatmung Stoffwechsel anspruchslos Arten bekannt (M. Oxidase-negativ luteus) Katalase-positiv Oxidase-positive und -negative Arten bekannt Katalase-positiv Anhand vieler Übereinstimmungen, in Tabelle 11 dargestellt, bezüglich der Morphologie, als auch der Stoffwechseleigenschaften, könnte die Einteilung in die Gattung Micrococcus spp. denkbar sein, da es sich hier auch um gram-positive Kokken handeln, welche gelbe Kolonien ausbilden. Auch im Stoffwechsel sind viele Parallelen erkennbar, wie beispielsweise die Fähigkeit zur Nitratatmung, sowie der Oligotrophie. In Tabelle 12 wurden Morphologie und Stoffwechseleigenschaften des Organismus „glatt“ aufgelistet. Hierbei könnte es sich um die Gattung Klebsiella handeln. Die entsprechenden Eigenschaften sind in der rechten Spalte aufgeführt: Tabelle 12: Zusammenfassung der Eigenschaften und mögliche Gattung des Organismus' "glatt" glatt Kolonie Klebsiella spp. milchig-weiß glatter Rand 46 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson einheitlich, rund 0,6cm Morphologie Zellen Stäbchen Stäbchen Einzelzellen, nicht beweglich unbeweglich Gram-negativ Länge 1-2µm Gram-negativ fak. anaerob fakultativ anaerob Verwertung von Verwertung von Glucose Eigenschaften und Stoffwechsel Glucose Stickstoff- Stickstoff- Fixierung Fixierung Nitratatmung Nitratatmung Oxidase-negativ Oxidase-negativ Katalase-positiv Katalase-positiv Bei Organismus „glatt“ ist die Gattung Klebsiella, hinsichtlich vieler Parallelen in Morphologie und Stoffwechsel (Tab.12) sehr wahrscheinlich. Klebsiella spp. sind gramnegativ Stäbchen, sie sind fakultativ anaerob und verwerten Glucose. Ebenso ist Kelbsiella Oxidase negativ und Katalase positiv. Diese genannten Eigenschaften waren ebenfalls bei unserem isolierten Organismus „glatt“ vorzufinden. Die Organismen „wellig“ und „orange“ gingen in den Versuch 5 ein, weshalb sich die Zusammenfassung ihrer Eigenschaften mitsamt der ermittelten Gattung in diesem Teil wieder findet. 47 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson 5. Versuch: Sequenzierung des 16S rRNA-Gens Einleitung Die in Versuch 4 isolierten Klone „wellig“ und „orange“ wurden in diesem Versuchsteil anhand eines Ausschnitts des 16S rRNA-Gens versucht, phylogenetisch einzuordnen. Ein ca. 1kbp langes, stark konserviertes Fragment der 16S rDNA (insgesamt ca. 1,5kbp lang) wurde amplifiziert, sequenziert und unter Zuhilfenahme einer Datenbank mit den 16S rDNAs einer Vielzahl von Mikroben abgeglichen. Die ermittelten Organismen wurden ihren in der Literatur angegebenen Stoffwechseleigenschaften nach mit den isolierten unbekannten Klonen verglichen und auf Übereinstimmungen hin überprüft. Material und Methoden Siehe Skript mit Ausnahme, dass keine Gelextraktion vorgenommen werden musste. Ergebnisse Die Auftrennung der DNA mittels eines Agarosegels wurde zwei Mal vorgenommen, und führte zu folgenden Ergebnissen: Abbildung zeigt den ersten Durchgang der gelelektrophoretischen Auftrennung, anhand derer die Reinheit der DNA überprüft wurde. 48 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Abbildung 36: Gelelektrophoretische Auftrennung, erster Durchgang, grüner Kasten = Organismus "wellig", roter Kasten = Organismus "orange" Der erste Durchgang der gelelektrophoretischen Auftrennung zeigt, dass die DNA der Organismen „wellig“ (grün) und „orange“ (rot) isoliert vorliegen, es also keine störenden Fragmente gibt, die die anschließende Sequenzierung beeinträchtigen könnten (Abb. 36). Bei der Auftrennung ganz links auf dem Gel handelt es sich um den Marker Im zweiten Durchgang wurde nun der Gehalt an DNA kontrolliert: Abbildung 37: Gelelektrophoretische Auftrennung, zweiter Durchgang, grüner Kasten = "wellig", roter Kasten = "orange" 49 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Im zweiten Durchgang war zu sehen, dass der Gehalt an DNA immernoch ausreichend für eine Sequenzierung war, beide Banden, die des Organismus „wellig“ (grün) und die von „orange“ (rot) waren noch deutlich zu erkennen (Abb. 37). Die Sequenzierung des Organismus‘ „wellig“ führte zu folgendem Ergebnis: Abbildung 38: Sequenz des Organismus' "wellig" Diese Sequenzierung ist aussagekräftig, da keine Unklarheiten im Bezug auf die Sequenz zu erkennen sind (Abb. 38, Unklarheiten wären in Form von gelben Sequenzvorschlägen zu erkennen). Laut Datenbankanalyse handelt es sich hierbei um einen Organismus der Gattung Burkolderia, wobei die 20 ähnlichsten Datenbankeinträge folgende sind: 50 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Abbildung 39: Datenbankergebnisse für den Organismus "wellig" Hier ist zu erkennen, dass es sich sehr wahrscheinlich um einen Vertreter der Gattung Burkholderia handelt, wobei folgende Arten vorgeschlagen wurden: B. pyrrocinia (1. Hit, 100% max. ident.), B. cenocepacia (acht Hits von 20, max. ident. 99%) sowie B. cepacia (zwei Hits von 20, max. ident. 99%) (Abb. 39). Die fünf zutreffendsten Sequenzvergleiche sind im Anhang vorzufinden, diese sind Sequenzen der fünf ähnlichsten Organismen und geben Auskunft über die effektive Ähnlichkeit der Sequenz des Organismus „wellig“ zu den vorgeschlagenen Arten. Die Sequenzierung vom Organismus „orange“ brachte folgendes Ergebnis: 51 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Abbildung 40: Sequenzergebnis des Organismus "orange" Diese Sequenz ist ob der vielen unklaren Basen nicht aussagekräftig, und im letzten Teil des Templates gar nicht mehr entschlüsselbar gewesen (Abb. 40) Dabei förderte die Datenbank folgende 20 Ergebnisse zutage: 52 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Abbildung 41: Datenbankergebnisse für den Organismus "orange" Die vorgeschlagenen Gattungen lauten: Wolinella (elf von 20 Hits, max. ident. 88%) mit den Arten: W. succinogenes (sechs Hits von elf, max. ident. 81%), W. africanus (zwei Hits von elf, max. ident. 75%) sowie Helicobacter (sieben von 20 Hits, max. ident. 77%) mit den Arten: H. felis (zwei von sieben Hits, max. ident. 77%), H. pylori (drei Hits von sieben, max. ident. 76%), H. heilmannii (einer von sieben Hits, max. ident. 75%), H. hepaticus (einer von sieben Hits, max. ident. 74%) (Abb. 41). Die fünf zutreffendsten Sequenzvergleiche finden sich im Anhang, diese sollen, wie im Fall des Organismus „wellig“, Auskunft über die Sequenzen der ähnlichsten Organismen im Verhältnis zu unserem Testorganismus liefern. Hierbei ist deutlich zu erkennen, dass innerhalb der Sequenzen große Lücken bestehen, die aufgrund zu großer Ungenauigkeit nicht gefüllt werden konnten. Diskussion Der Vergleich des isolierten Organismus „wellig“ mit der in der Datenbankanalyse ermittelten Gattung Burkolderia sieht wie folgt aus (Tab. 13): 53 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Tabelle 13: Zusammenfassung der Eigenschaften von "wellig" und der ermittelten Gattung Burkholderia wellig Kolonie Burkolderia spp. milchig-weiß welliger Rand einheitlich, rund 0,4cm Morphologie Zellen Stäbchen Stäbchen Einzelzellen bewegliche und unbeweglich unbewegliche Arten Länge 2,5µm bekannt Gram-negativ Gram-negativ fakultativ obligat aerob bis anaerob StickstoffEigenschaften und Stoffwechsel Fixierung Nitratatmung Oxidase-positiv Katalase-positiv fakultativ anaerob Stickstofffixierende Arten bekannt (B. vietnamiensis) bei einigen Arten Nitratatmung bekannt Oxidase-positive und -negative Arten Katalase-positiv Anhand dieser Ergebnisse ist es wahrscheinlich, dass es sich bei dem isolierten Organismus „wellig“ um einen Vertreter der Gattung Burkholderia handelt. Vergleicht man nun, das für den Organismus „orange“ erhaltene Ergebnis der Datenbank mit den in folgender Tabelle (Tab. 14) aufgeführten Eigenschaften, finden sich wenige Übereinstimmungen: 54 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Tabelle 14: Vergleich der Stoffwechseleigenschaften des Organismus "orange" mit den Eigenschaften der Gattung Wolinella aus den Datenbankergebnissen orange Kolonie Wolinella spp. orange glatter Rand einheitlich, rund hervorstehend Morphologie 2mm Zellen Stäbchen Stäbchen Einzelzellen begeißelt und schnell mögl. begeißelt Länge 5µm beweglich Gram-negativ Gram-negativ strikt aerob anaerob Stickstoff- keine Stickstoff- Fixierung Fixierung Eigenschaften und Nitratatmung Oxidase-positiv Stoffwechsel anspruchslos Katalase-negativ Oxidase-positiv Katalase-positiv An der Sequenz und den Datenbankergebnissen lässt sich bereits abschätzen, dass keine eindeutige Zuordnung aufgrund der Sequenz möglich ist. Diese scheint durch eine weitere, sie überlagernde Sequenz verunreinigt zu sein, weshalb eine phylogenetische Zuordnung nur anhand der Ergebnisse im Versuchsteil 4 möglich ist. Dies führte zu folgendem Ergebnis: Die im Versuchsteil 4 ermittelten Stoffwechseleigenschaften des Organismus „orange“ wurden mit verschiedensten Organismengattungen verglichen, wobei der Organismus vermutlich aus der Gattung Pseudomonas kommt, da hier deutliche Parallelen der Stoffwechseleigenschaften ergaben (Tab. 15). 55 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Tabelle 15: Vergleich der Stoffwechseleigenschaften des Organismus "orange" mit den Eigenschaften der Organismen der Gattung Pseudomonas orange Kolonie Pseudomonas spp. orange glatter Rand einheitlich, rund hervorstehend Morphologie 2mm Zellen Stäbchen Stäbchen Einzelzellen begeißelt mögl. begeißelt Gram-negativ Länge 5µm Gram-negativ strikt aerob aerob Stickstoff- Nitratatmung bekannt Fixierung (P. aeroginosa, P. Eigenschaften und Nitratatmung stutzeri, P. Stoffwechsel anspruchslos denitrificans) Oxidase-positiv Katalase-positiv Stickstoff-Fixierung bekannt (P. azotogensis) Oxidase-positive und -negative Arten Katalase-positiv Wann genau die Verunreinigung mit DNA-Fragmenten von Wolinella auftraten, kann im Nachhinein nicht mehr nachvollzogen werden, diese führten jedoch durch Überlagerung mit der DNA des Organismus „orange“ zu der unklaren Sequenz (Abb. 40), anhand derer der Abgleich mit der Datenbank vorgenommen wurde (Abb. 41). Diese Verunreinigung war bei der gelelektrophoretischen Auftrennung weder im ersten (Abb. 36) noch im zweiten (Abb. 37) Durchgang ersichtlich. Dies rührt vermutlich daher, dass das verunreinigende Fragment die gleiche Länge (ca. 1kbp), 56 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson wie das zu untersuchende Fragment aufwies und die Fremd-DNA so erst bei der Sequenzierung offensichtlich wurde. 57 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson 6. Versuch: Biofilm Einleitung Biofilme können nahezu überall entstehen, wo Bakterien imstande sind, sich an festen Oberflächen anzusiedeln. Er kann aus mehreren verschiedenen Arten von Bakterien bestehen, wobei nur wenige in der Lage sind, sich als erste Organismen an die Oberflächen anzuheften. Somit ist der Aufbau eines Biofilms abhängig von solchen „Primärbesiedlern“, welche spezifische Adhäsionsproteine oder auch klebrige Polysaccharide ausscheiden (Phase I – siehe Abb.42) Diese verstärken somit die Anheftung der Mikroorganismen auf der Oberfläche. Nach und nach lagern sich immer mehr Zellen auf der Oberfläche an und es entsteht somit ein mehrschichtiger Film aus Bakterien - in Abb.42 sind die einzelnen Entstehungsphasen eines Biofilms aufgezeigt – vorerst „…werden reichlich extrazelluläre polymere Substanzen (Polysaccharide, Proteine, auch Nukleinsäuren) freigesetzt, die den Bakterienrasen stabilisieren und die bis zu 85% des Volumens des entstehenden Biofilms ausmachen können.“2 Ab einem gewissen Zeitpunkt pendelt sich ein stabiles Gleichgewicht ein (Phase IV). Aufgrund verschiedener Scherkräfte (Phase V) weisen Biofilme unterschiedliche Ausmaße auf. Dieses Geflecht aus Zellen ist mit Kanälen ausgestattet, welche die Substratversorgung, den Transport von Stoffwechselprodukten, als auch für die interzelluläre Kommunikation eine entscheidende Rolle spielen.3 2 Zitat aus: Fuchs: Allgemeine Mikrobiologie; 8. Auflage (2006); Georg Thieme Verlag S.540 Abb.1 ebenfalls aus: Fuchs: Allgemeine Mikrobiologie; 8. Auflage (2006); Georg Thieme Verlag S.540 58 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Abbildung 42: Entstehungsphasen eines Biofilms Abb.42 zeigt die fünf verschiedenen Entstehungsphasen eines Biofilms. Wie bereits schon oben beschrieben werden vorerst verschiednen Polysaccharide von Primärbesiedlern ausgeschieden, welche für die Anheftung weiterer Bakterien essentiell sind. Durch das Wachstum der Bakterien, wächst somit auch der Biofilm (Phase III – Reifung). Es wird daraufhin ein Gleichgewicht erreicht (Phase IV), wobei dieses durch verschiedenste Scherkräfte wiederum gestört werden kann (Phase V). Aufgrund der Stoffwechselaktivität der Mikroorganismen, ergibt sich ein Nachteil für die unteren Schichten des Biofilms. Da der Sauerstoff bei einem mehrlagigen Rasen nur noch senkrecht zur Oberfläche nachdiffundieren kann, werden somit die unteren Schichten anaerob. 4 Daher kann man in einem Biofilm verschiedene Stoffwechselvorgänge (Atmung und Gärung) parallel vorfinden. Abb.1 ebenfalls aus: Fuchs: Allgemeine Mikrobiologie; 8. Auflage (2006); Georg Thieme Verlag S.540 59 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Material und Methoden Unsere nährstoffarme Wasserprobe stammte aus einer Regentonne in MörfeldenWalldorf. Durchführung wie im Skript angegeben. Ergebnisse Am 23.Okt. konnte man schon vereinzelte Stäbchen auf dem Objektträger sehen. Diese waren 2,5 - 5 µm groß und kaum beweglich. Teilweise waren auch kleinere Aggregate zu erkennen (Pfeil in Abb.43). Abbildung 43: Foto vom 24.Oktober 2007, einige Zellhaufen sind zu erkennen Am darauf folgenden Tag (siehe Abb.43) waren keine großen Unterschiede erkennbar. 60 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Abbildung 44: Foto vom 26. Oktober 2007, eine höhere Zelldichte ist erkennbar Abb. 44: Am 26.Okt. zeigte sich schon eine deutlich höhere Zelldichte. So sind hier die Stäbchen in größeren Aggregaten angesiedelt. Im Vergleich zu Abb. 43 ist der Biofilm in Abb.44 bereits zweischichtig. Dies ist zu erkennen, wenn man durch die einzelnen Zellschichten hindurch fokussiert. Abbildung 45: Foto vom 29. Oktober 2007, Eukaryoten beginnen den Biofilm abzugrasen 61 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson In Abb.45 (Foto von Montag 29.Okt.) sind einige Eukaryonten, wie beispielsweise Pantoffeltierchen, auf den Objektträgern zu sehen. Diese sind dabei den Biofilm zu vertilgen (siehe Pfeil). Auch bei dieser Probe ist der Biofilm nur zweischichtig erkennbar. Diskussion Vorerst sollte erwähnen werden, dass unsere Probe nicht besonders nährstoffarm erschien, da das Wasser generell eine grünliche Trübung aufwies. Dies könnte einer der Gründe sein, weshalb sich bei unserer Probe kein mehrschichtige Biofilm aufgebaut hat, da in unserer Wasserprobe vermutlich eine zu hohe Konzentration von bereits enthaltenen Polysacchariden, Huminstoffe oder auch Proteinen vorhanden war. Eine weitere Ursache für das Ausbleiben der Mehrschichtigkeit des Films könnte einen Zusammenhang damit haben, dass der Biofilm über das Wochenende vom 27.-28.Okt. seinen Höhepunkt erreicht hatte. Da die Beobachtungen allerdings erst am Montag darauf wieder aufgenommen wurden, haben in dieser Zeit verschiedene Eukaryonten den Biofilm schon nahezu abgegrast. Wie in Abb.46 unten zu erkennen ist, ist hier ein Eukaryont dabei, Teile des Biofilms abzugrasen. 62 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Abbildung 46: Eukaryote beim Abgrasen des Biofilms 63 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson 7. Versuch: Hyphomicrobium Einleitung Ziel dieses Versuches war es aus einer unsterilen Wasserprobe, einem Tümpel entnommen, mittels eines definierten Mediums Hyphomicrobien zu isolieren und zu kultivieren. Hyphomicrobien haben die Besonderheit sich über Zellfortsätze Prostheka genannt - zu vermehren, nicht, wie üblich, durch Querteilung des Zellkörpers. Die Zellen sind durch ihre Stiele charakteristisch und können so unter dem Mikroskop identifiziert werden. Material und Methoden Siehe Skript. Ergebnisse Dieser Versuch hat leider kein eindeutiges Ergebnis, da in keiner der vorhandenen Kulturen gestielte Zellen beobachtet werden konnten. Es konnten auch keine anderen Organismen in der Probe ausgemacht werden. Diskussion Warum die Hyphomicrobien in keiner der angesetzten Proben gewachsen sind, lässt sich nicht mit Sicherheit sagen, da aber keine der Kulturen ausreichendes Wachstum zeigte, die Proben jedoch auch unterschiedlichen Gewässern stammen, liegt es nahe, dass das angesetzte Medium bzw. die dafür verwendeten Komponenten nicht einwandfrei waren. Das hier verwendete Medium sollte den Umstand ausnutzen, dass viele Hyphomicrobien durch anaerobe Nitrat-Atmung wachsen können. Die Oxidation von Methanol ist an die Reduktion von Nitrat gekoppelt, weshalb des Medium zum einen 5ml Methanol als Elektronendonor und 0,5g Ammoniumsulfat ((NH4)2SO4) als 64 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Stickstoffquelle enthielt und durch das Durchblasen mit Stickstoff auf weitestgehend anaerobe Bedingungen eingestellt wurde. Gerade hierbei kann es zu Fehlern im Versuchsablauf gekommen sein, weshalb dieses definierte Medium keine Wachstumgrundlage für Hyphomicrobien und auch nicht für andere Organismen bildete. Hyphomicrobien vermehren sich über das Ausbilden von Hyphen. Diese Hyphe, auch Prostheka genannt, ist eine direkte zelluläre Verlängerung der Mutterzelle, wobei letztere häufig an einem Untergrund festgehaftet ist. Die Knospe besteht aus einer ganz gewöhnlichen Zellwand und enthält, nebst natürlich der Kopie des Genoms, eine Cytoplasmamembran, Cytoplasma, sowie Ribosomen zur Proteinbiosynthese. Ist eine Kopie des Chromosomensatzes in der Hyphe vorhanden, formt sich im nächsten Schritt ein die Mutterzelle und die Tochterzelle trennendes Septum und separiert die Zellen voneinander. Im nächsten Schritt bildet sich am Ende der Hyphe ein Flagellum aus, die Hyphe bricht ab und entfernt sich von der Mutterzelle. Im späteren Stadium verliert die Tochterzelle ihr Flagellum, reift aus, formt selbst eine Hyphe und schnürt diese ab. Die Mutterzelle beginnt kurz nach dem Abschnüren der Tochterzelle erneut mit der DNA-Replikation und der Ausbildung einer neuen Hyphe (Abb. 47). 65 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Abbildung 47: Entwicklungszyklus von Hyphomicrobium, Quelle: Brock - Biology of Microorganisms 66 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson 8. Versuch: Biotransformation Einleitung Biotransformationen oder Biokonversionen sind biologische Stoffumwandlungen, welche durch einige Bakterien, darunter Actinomyceten, aber auch höhere und niedere Pilze durchgeführt werden können. Diese Organismen besitzen Enzyme, die es ihnen ermöglichen mit einer sehr hohen Selektivität und auch Stereospezifität bestimmte Verbindungen, wie Steroidhormone umzusetzen. Meist handelt es sich dabei um Exoenzyme, die von den Organismen an die Umgebung abgesondert werden und dort auch die Reaktion katalysieren. Bei diesem Versuch wird die Biotransformation von Androstendiol zu Androstendion mit Hilfe des Bakteriums, Agromyces mediolanus, untersucht und chromatographisch ausgewertet. Material und Methoden Wie im Skript angegeben. 67 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Ergebnisse Abbildung 48: Dünnschichtchromatographie In Abb.48 entsprechen die Probennummern der Gruppennummern, wobei Probe Nummer 2 als Kontrolle dient, da hier die A. mediolanus Kultur bei 100°C hitzeinaktiviert wurde, und man in diesem Fall auch kein Ergebnis bei dieser Probe erhalten darf. R1 entspricht der Referenz von Androstendiol, R2 ist die Referenz für das Testosteron und R3 die Referenz für Androstendion. Bei Probe Nr. 1 in Abb.48 ist eine leichte orange/braune Bande zu erkennen, welche bei Nr. 3 weitaus stärker ausgeprägt ist. Ebenfalls ist bei beiden Gruppen eine leichte Bande am oberen Rand zu erkennen, wobei Probe Nummer 3 eine weitaus stärkere Bande aufweist (schwarzer Pfeil) als Nr.1 (blauer Pfeil). Diese obere Bande von Probe Nummer 1 ist auf dem Foto besonders schwer zu erkennen, allerdings war auf der Original-Platte eine schwache Bande auffindbar. 68 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Probe Nr. 2 zeigt eine dunklere Bande, welche unter den beiden anderen liegt. Abbildung 49: Dünnschichtchromatographie unter UV-Licht In Abb.49 wurden mithilfe des Sprühreagenz nun die einzelnen Komponenten unter UV-Licht sichtbar gemacht. Allerdings kann man auch hier die obere Bande von Probe Nummer 1 nicht deutlich erkennen, da diese Bande genau auf den Rändern der UV-Lampe liegt (blauer Pfeil). In Tabelle 16 sind nun die ermittelten Rf-Werte aufgeführt. Diese ergeben sich durch die Division von der Wanderstrecke der Substanz auf der Platte durch die Wanderstrecke der Laufmittelfront: Rf = a (Wanderungstrecke der Substanz) / b (Wanderungsstrecke des Laufmittels) Diese Werte stehen für das Maß der Wechselwirkung zwischen der aufgetragenen Substanz mit dem Trägermaterial und sind für jede Substanz in einem bestimmten 69 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson Lösungsmittel eine Stoffkonstante. Sie sind somit für die Charakterisierung der Substanzen wichtig, wenn man keine Referenzproben „mitlaufen“ lässt. Tabelle 16: Ermittelten Rf-Werte 1. Bande 2. Bande Laufmittel Rf-Wert Probe 1 4,6cm 6,7cm 6,9cm 0,66; 0,97 Probe 2 4,3cm --- 6,9cm 0,62 Probe 3 4,6cm 6,7cm 6,9cm 0,66; 0,97 Referenz 1 4,2cm --- 6,9cm 0,61 Referenz 2 5cm --- 6,9cm 0,73 Referenz 3 6,8cm --- 6,9cm 0,99 In diesem Fall waren die zu untersuchenden Proben mit den Referenzen direkt vergleichbar, somit werden hier die Rf-Werte für die Auswertung nicht benötigt. Diskussion Da es sich bei der „Verarbeitung“ von Androstendiol über Testosteron zu Androstendion, jeweils um Oxidationsreaktionen handelt, sind die hierbei verwendeten Enzyme Dehydrogenasen oder Oxidasen. Agromyces mediolanus ist somit in der Lage entsprechende Exoenzyme zu produzieren, welche diese Oxidationen katalysieren. Die Trennung bei der Dünnschichtchromatographie unterliegt dem Prinzip der Adsorption. Hierbei verteilen sich die Stoffe zwischen der Oberfläche der stationären Phase (Kieselgeldünnschichtplatte) und der mobilen Phase (Laufmittel). Für die Laufstrecke ist nun entscheidend, wie stark der Stoff an die stationäre Phase bindet und wie stark sich dieser im Laufmittel löst. In unserem Fall ist unser Laufmittel unpolar, und da sich nur unpolare Substanzen in unpolar Lösungsmitteln und polare Stoffe in polaren Lösungsmitteln besonders gut 70 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson lösen, löst sich hier die unpolarste Substanz (Androstendion) besonders gut in unserem Laufmittel. Dementsprechend ist die Wanderstrecke des Androstendion am weitesten. Androstendiol ist mit seinen beiden Hydroxylgruppen besonders polar und löst sich dementsprechend schlecht in unserem verwendeten Laufmittel. Somit ist bei diesem Steroidhormon die Wanderungsstrecke nicht besonders weit. Testosteron liegt mit seiner Polarität zwischen Androstendiol und Androstendion, und weist somit eine Wanderungsstrecke zwischen diesen beiden Steroiden auf. Anhand des Ergebnisses der Dünnschichtchromatographie in Abb.45 lässt sich sagen, dass die Kontrolle mit der hitzeinaktivierten Probe positiv ausgefallen ist. Somit ist bei Probe Nummer 2 keine weitere Umsetzung des Androstendiol erfolgt. Dies ist mit dem Vergleich von Referenz 1 (R1) zu sehen. Bei Probe Nummer 1 ist eine Umsetzung zu Testosteron zu erkennen und nur ein geringer Teil ist zu Androstendion weiter oxidiert worden (blauer Pfeil in Abb. 48). Bei Probe Nummer 3 ist sowohl auf der Stufe des Testosterons, als auch eine sehr schwache Bande am oberen Rand der Dünnschichtplatte (schwarzer Pfeil in Abb. 48) zu sehen, welche dem Androstendion entspricht. Da sich hier ebenfalls eine weitaus stärkere Bande des Testosterons ergibt, ist davon auszugehen, dass in den Proben die Oxidation des Testosterons zu Androstendion nahezu ausblieb (Ausnahme ist bei Probe 3 – hier ist ein geringer Teil zu Androstendion oxidiert worden Pfeil). Die unvollständige Weiteroxidation könnte womöglich dadurch umgangen werden, indem man den Proben mehr Inkubationzeit, oder aber auch mehr der Androstendiollösung zur Verfügung stellt. 71 | S e i t e Gr. 1: Yvonne Voges, Melanie Thompson 9. Quellenangaben Anleitung „Mikrobiologisches Praktikum, Block Mikrobielle Diversität“ der Universität Frankfurt am Main (Hauptstudium, WS 2007/2008) Michael T. Madigan, John M. Martinko, Brock – Biology of Microorganisms, 11. Auflage, Pearson Prentice Hall, United States of America, 2006 Michael T. Madigan, John M. Martinko, Jack Parker, Brock - Mikrobiologie, 9.Auflage, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg - Berlin, 2003 Hans G. Schlegel, Georg Fuchs, Allgemeine Mikrobiologie, 8.Auflage, Thieme Verlag, Stuttgart, 2006 http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/microbiology/winogradsk y.html http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi?PAGE=Nucleotides&PROGRAM =blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHO W_DEFAULTS=on 10. Anhang Alignments zu Versuch 5 o Aligments der fünf ähnlichsten Sequenzen zum Organismus „wellig“ o Aligments der fünf ähnlichsten Sequenzen zum Organismus „orange“ 72 | S e i t e
