Aus der Klinik und Poliklinik für Hals-,Nasen
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Aus der Klinik und Poliklinik für Hals-,Nasen- und Ohrenheilkunde der Universität zu Köln Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h. c. K.-B. Hüttenbrink Untersuchung des Hörvermögens Stickstoffmonoxidsynthase II und (NOS II) der Morphologie defizienten der Mäusen Cochlea sowie von deren Peroxynitritbildung im Vergleich zum korrespondierenden Wild Typ während der Alterung. Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Daniel Theodor Labbé aus Unna promoviert am 1. Februar 2017 2 Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h.c. Th. Krieg 1. Berichterstatter: Professor Dr. med. O. Michel 2. Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. W. Bloch 3. Berichterstatter: Privatdozent Dr. med. K. Helling Erklärung: Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskriptes habe ich Unterstützungsleistungen von folgenden Personen erhalten: Herrn Professor Dr. med. O. Michel Herrn Universitätsprofessor Dr. med. W. Bloch Herrn Universitätsprofessor Dr. med. K. Addicks Herrn Universitätsprofessor Dr. med. B. Schick Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe einer Promotionsberaterin/eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation in Verbindung stehen. Die Dissertationsschrift wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Köln 12.05.2016 Daniel Labbé 3 Die in dieser Arbeit angegebenen Experimente sind nach entsprechender Anleitung durch Herrn Professor Dr. med. O. Michel, Herrn Universitätsprofessor Dr. med. W. Bloch, Herrn Universitätsprofessor Dr. med. K. Addicks, Herrn Universitätsprofessor Dr. med. B. Schick, Herrn Dr. med. Axel Mickenhagen, Frau Svanhild Heger und Frau Jolanta Koslowzki von mir selbst durchgeführt worden. 4 Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Besonders danke ich meinem Doktorvater, Herrn Professor Dr. Olaf Michel. Ihm verdanke ich meine heutige Berufswahl und die Begeisterung für die experimentelle Innenohrforschung. Ich denke heute noch oft an die inspirierenden Gespräche und die hervorragenden Arbeitsbedingungen in unserem Kölner Labor. Mein aufrichtiger Dank gilt Herrn Professor Dr. Wilhelm Bloch für seine kritische und geduldige Auseinandersetzung mit den Ideen rund um die Arbeit und für seine praktische Anleitung im Bereich der morphologischen und immunhistochemischen Auswertung. Meinem klinischen Lehrer Herrn Professor Dr. Bernhard Schick möchte ich für seinen Rat und seine Geduld bei der Umsetzung der Veröffentlichung und für die wertvollen Kommentare bei der Erstellung des Manuscripts an dieser Stelle besonders danken. Für die Bereitstellung der Knockout Mäuse möchte ich an dieser Stelle Herrn Professor Dr. Eddy Liew danken. Frau Svanhild Heger und Frau Jolanta Koslowzki möchte ich für die außerordentlich nette und kompetente Unterstützung rund um die technischen Probleme der Histologie und Immunhistochemie danken. Von beiden durfte ich von der Pike auf alles lernen. Dr. rer. nat. Axel Mickenhagen möchte ich herzlich für seine Unterstützung bei der Elektronenmikroskopie und für seinen unerschütterlichen Optimismus danken. Der Jean Uhrmacher-Stiftung gilt mein tiefer Dank für die Bereitstellung eines Teils der finanziellen Mittel für den Kauf der Verbrauchsmaterialen und Tiere. Nicht zuletzt möchte ich der Stiftung Maria Pesch für das Stipendium zur Unterstützung der Promotion danken, welches es mir ermöglichte, zumindest frei von finanzieller Sorge die umfangreichen Experimente für diese Arbeit durchzuführen. 5 Meinen Eltern 6 Inhalt Abkürzungen ............................................................................................. 8 1. Einleitung .............................................................................................. 9 1. 1. Eigenschaften von Stickstoffmonoxid (NO) .................................................................. 9 1.1.1. Der NO/sGC/cGMP Signalweg ............................................................................... 9 1.1.2. Direkte NO Wirkung auf intrazelluläre Signalkaskaden ........................................ 10 1.1.3. NO Wirkung auf die Genexpression und Transkriptionsfaktoren ......................... 10 1.1.4. Reactive nitrogen Species (RNS) ........................................................................... 11 1.2. Komplexe Wirkung von NO auf die Apoptose ............................................................. 11 1.2.1. Proapoptotische Eigenschaften von NO ................................................................. 12 1.2.2. Antiapoptotische Eigenschaften von NO ............................................................... 12 1.3. NO Synthasen ................................................................................................................ 13 1.4. NO im Innenohr ............................................................................................................ 13 1.4.2. Physiologische Funktion von NO im Innenohr ...................................................... 14 1.4.3. Pathophysiologische Prozesse von NO im Innenohr ............................................. 15 1.5. Modell und Fragestellung.............................................................................................. 16 2. Methodik und Ergebnisse ....................................................................... 17 2.1. Gruppen und Tiere ........................................................................................................ 17 2.2. Methodik der BERA Untersuchung .............................................................................. 17 2.3. Herstellung der Lösungen und Puffer ........................................................................... 19 2.4. Methodik der Rasterelektronenmikroskopie (REM) ..................................................... 21 2.4.1. Vorbereitung der Proben für die REM Analyse ..................................................... 21 2.4.2. REM Analyse ......................................................................................................... 22 2.5. Methodik der Immunhistochemie ................................................................................. 22 2.6. Ergebnisse der BERA Untersuchung ............................................................................ 25 2.6.1. Vergleich der Hörschwelle Click-Stimulus............................................................ 26 2.6.2. BERA 4 kHz Stimulus ........................................................................................... 27 2.6.3. BERA 8 kHz Stimulus ........................................................................................... 28 2.6.4. BERA 12 kHz Stimulus ......................................................................................... 29 2.7. Ergebnisse der Rasterelektronenmikroskopie ............................................................... 30 2.7.1. Innere Haarzellen (IHC) ......................................................................................... 30 3.2.2. Äußere Haarzellen (OHC) ...................................................................................... 30 7 2.8. Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen ............................................. 34 2.8.1. Immunhistochemische Untersuchung mit anti-NOS II ......................................... 34 2.8.2. Immunhistochemische Untersuchung mit anti-Nitrotyrosine ................................ 36 3. Diskussion ........................................................................................... 40 3.1. Hereditäre Hörstörung bei NOS II defizienten Tieren? ................................................ 40 3.2. Verlauf der Hörstörung im Beobachtungszeitraum ...................................................... 41 3.3. Kritische Betrachtung von Model und Methoden ......................................................... 44 3.3.1. Einsatz der BERA zur Bestimmung des Hörvermögens ........................................ 44 3.3.2. Kritische Betrachtung des Mausmodel .................................................................. 44 3.3.3. Einsatz von Immunhistochemie und REM............................................................. 45 4. Zusammenfassung ............................................................................... 46 5. Literaturverzeichnis .............................................................................. 47 6. Vorabveröffentlichung von Ergebnissen ................................................... 55 7. Anhang ............................................................................................... 56 7.1. Abbildungsverzeichnis .................................................................................................. 56 8. Lebenslauf ........................................................................................... 57 8 Abkürzungen Abb. AP-1 Aqua dest. BERA BSA Ca²+ cGMP DAB DAF-2 dB SPL DC DNS ERK1/2 GDA H2O2 HC HCl HSP IHC JNK kHz KO l L-NAME MAPK NaCl NaOH NADP NADPH NF-κ B NO NOS OOHC ONOOp38 MAPK PARP PB PBS PFA PKB PKG RNS ROS sGC SGC VEGF WT Abbildung Activator-Protein 1 Destilliertes Wasser Brainstem evoked response audiometry Bovine Serum Albumin Fraktion V Kalzium cyclic guanosine monophosphate Diaminobenzidin 4,5-Diaminofluorescein Dezibel sound pressure level Deiter’sche Zelle Desoxyribonukleinsäure extracellular regulated Kinase 1/2 Glutaldialdehyd Wasserstoffperoxid Hensen'sche Zelle Salzsäure heat shock protein innere Haarzelle c-Jun N-Terminal Kinase Kilohertz Knock out Liter NG-Nitroarginin-Methylester mitogen activated kinase Natriumchlorid Natronlauge Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat reduzierte Form von NADP Nucleärer Faktor Kappa B Stickstoffmonoxid Stickstoffmonoxidsynthase Superoxid äußere Haarzelle Peroxynitrit p38 stress activated MAPK Poly-ADP-ribose-Polymerase Phosphatpuffer Phosphatpuffer mit Salz Paraformaldehyd Proteinkinase-B Proteinkinase-G reactive nitrogen species reactive oxygen species lösliche Guanylatzyklase Spiralganglionzellen vascular endothelial growth factor Wildtyp 9 1. Einleitung 1. 1. Eigenschaften von Stickstoffmonoxid (NO) Das Molekül Stickstoffmonoxid (NO) ist leicht diffusibel und ungeladen. Es ist sehr reaktiv und hat im Gewebe eine Halbwertszeit von weniger als 1 Sekunde. Es ist in der Lage leicht Membranen zu passieren. Durch Interaktion mit anderen Molekülen wie z.B. Sauerstoffradikalen (O-) kann NO auch als NO+ oder NO- vorkommen. Außerdem sind Derivate, sogenannte reactive nitrogen species (RNS), aus der Verbindung von NO mit anderen Molekülen beschrieben. Eine dieser RNS ist das Peroxynitrit (ONOO-), welches ebenfalls hochreaktiv ist [72]. Diese Eigenschaften machen NO zu einem idealen autokrinen als auch parakrinen Botenstoff. NO wird von 3 Isoformen der Stickstoffmonoxidsynthase (NOS) synthetisiert. Bei der enzymatischen Spaltung von L-Arginin zu Citrullin entsteht NO. Kofaktoren der NOS sind dabei NADPH, Kalzium und Calmodulin [4]. Die Relaxierung der glatten Muskulatur in Blutgefäßen ist eine der als Erstes beschriebenen Funktionen von NO [55]. Diese Eigenschaft wird bei nitrathaltige sublingual Sprays in der antihypertensiven Therapie genutzt. Bis heute ist eine Fülle von Veröffentlichungen über die Funktion von NO bei nahezu allen physiologischen Prozessen erschienen. Beispielhaft gilt NO als wichtiger Botenstoff im Gehirn, im Darm, bei der Immunabwehr und der Blutgerinnung [2,54]. Daneben gibt es viele Krankheitsbilder wie z.B. M. Parkinson, septischer Schock und Myokardinfarkt, bei denen pathologisch hohe Mengen von NO und ROS gefunden wurden. NO wird dabei für einen Teil der Zellschäden verantwortlich gemacht [59]. Seine Wirkung entfaltet NO auf verschiedenen Signalwegen. 1.1.1. Der NO/sGC/cGMP Signalweg An erster Stelle ist der „klassische“ NO/sGC/cGMP Signalweg zu nennen. Das NO aktiviert hierbei direkt die lösliche (soluble) Guanylatzyklase (sGC), die den „second messenger“ cyclic guanosine monophosphat (cGMP) synthetisiert. Das cGMP aktiviert wiederum cGMP abhängige Proteinkinasen wie die Proteinkinase G (PKG), die weitere Enzyme phosphorilieren und so deren katalytischen Zustand ändern. Die NO-vermittelte Aktivierung dieses Signalweges ist z.B. bei der oben angesprochenen Blutdruckregulation entscheidend. In diesem speziellen Beispiel fungiert das in Endothelzellen gebildete NO als parakriner Botenstoff, der in den glatten Muskelzellen die sGC aktiviert und über oben beschriebenen Weg den Muskeltonus senkt. Die 10 Regulation der NO-Synthese und somit des cGMP Spiegels der Zielzelle ist in erster Linie abhängig von der intrazellulären Kalziumkonzentration. Der Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration führt zu einer Steigerung der NO-Synthese [11]. Daneben kann die NO-Synthese auch durch Wachstumsfaktoren wie „vascular endothelial growth factor“ (VEGF) gesteigert werden. Durch die Stimulation der Wachstumsfaktor-Rezeptoren wird eine Signalkaskade initiiert, die zur Aktivierung der Proteinkinase B (PKB) führt. Diese wiederum steigert durch Phosphorilierung der NOS namentlich der NOS III die NO-Synthese. Der PKB/NO/sGC/cGMP Signalweg spielt eine zentrale Rolle beim sogenannten „survival signaling“ und kann das Absterben geschädigter Zellen verhindern [86]. 1.1.2. Direkte NO Wirkung auf intrazelluläre Signalkaskaden Unabhängig vom cGMP Spiegel der Zelle aktiviert NO den „mitogen activated kinase“ Signalweg (MAPK). NO entfaltet seine Wirkung dabei „upstream“ innerhalb des Signalwegs durch S-Nitrosilierung membrangebundener Wachstumsfaktor- und Zytokinrezeptoren oder über die direkte Wirkung auf die intrazellulären Kinasen, wie beispielsweise die Januskinase. Zu den MAPK gehören ihre wichtigsten Vertreter, die „extracellular regulated Kinase 1/2“ (ERK1/2), „c-Jun N-Terminal Kinase“ (JNK) und die „p38 stress activated MAPK“ (p38 MAPK). Sie spielen eine wichtige Rolle in der Regulation von Mitose, Migration und Apoptose von Zellen [15,43,47]. 1.1.3. NO Wirkung auf die Genexpression und Transkriptionsfaktoren Über oben genannte Signalkaskaden hat NO indirekten Einfluss auf die Genexpression der Zelle. So führt eine Aktivierung des PKB/NO/sGC/cGMP Signalweges wiederum cGMP-abhängig zu einer Steigerung der Expression von Faktoren wie VEGF, die für die Gefäßneubildung von entscheidender Bedeutung sind [61]. Promotorelemente, die direkt von NO aktiviert werden, sind bisher nicht bekannt. Dennoch wirkt NO durch Beeinflussung des Redoxstatus der Zelle auf verschiedene Transkriptionsfaktoren. Möglich ist dies durch reaktive Thiolreste innerhalb der DNSBindestellen von Transkriptionsfaktoren. Je nach Nitrosilierungszustand dieser Reste wird eine Bindung an die DNS erleichtert oder erschwert [88]. Beschrieben ist die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren NF-κ B und activator-Protein 1 (AP-1) durch NO-Agonisten [44,69]. Nach vorheriger Zytokinstimulation ist dagegen eine inhibitorische Wirkung durch NO-Agonisten auf die oben genannten Transkriptionsfaktoren beschrieben. Im letzteren Fall fungiert NO möglicherweise als 11 „Fänger“ (scavanger) von O- und inhibiert dadurch die Transkriptionsfaktoren NF- κ B und activator-Protein 1 (AP-1) [63]. In mehreren Studien wurde gezeigt, dass NO einen Einfluss auf die Genexpression der sGC hat. NO führt dabei zu einer sogenannten Downregulation der Expression der sGC. Dieser Effekt wird unter anderem verantwortlich gemacht für die NO-Resistenz von Zellen bei längerer hoher NO Exposition und hat negativen Einfluss auf die physiologische Zellfunktion. [19,67,80]. 1.1.4. Reactive nitrogen Species (RNS) Direkt protektive Wirkung kann NO durch Reduktion von freien Sauerstoffradikalen oder Wasserstoffperoxid (H2O2) entfalten. Ebenso können aus der Reaktion von NO und freien Radikalen auch schädigende „reactive nitrogen Species“ (RNS) wie Peroxynitrit (ONOO-) entstehen [31,60]. ONOO- schädigt Zellen durch oxidative und irreversible Veränderung von Proteinen, Lipidmembranen und DNS. Diese Veränderungen führen zu Störungen der normalen Zellfunktion. Die sowohl protektiven als auch schädigenden Einflüsse sind abhängig vom Konzentrationsverhältnis der freien Radikale und NO in der Zelle. Es ist bekannt, dass NO je nach molarem Verhältnis zu O- dieses abfangen und entgiften kann oder aber zur Bildung von ONOO- beiträgt: Während äquimolare sowie hypomolare Mengen an NO im Verhältnis zu O. zur Bildung des schädlichen ONOO- führen, begünstigt ein NO-Überschuss die protektive Funktion [13,40]. Die Bildung von ONOO- und anderen RNS ist oft vergesellschaftet mit der Induktion der Stickstoffmonoxidsynthase II (NOS II), die sehr hohe NO Mengen synthetisiert. Allerdings ist auch eine protektive Wirkung der NOS II Induktion in verschiedenen Modellen beschrieben, die sich aus oben Genanntem erklären lässt [41]. 1.2. Komplexe Wirkung von NO auf die Apoptose Apoptose ist der programmierte „Selbstmord“ der Zelle. Sie spielt eine wichtige Rolle in der Elimination geschädigter oder maligne entarteter Zellen [68]. Sie wird für die degenerativen Veränderungen bei vielen chronischen Erkrankungen und im Alter verantwortlich gemacht. Gekennzeichnet ist die Apoptose durch die Aktivierung zytoplasmatischer Caspasen, die Endonukleasen im Zellkern aktivieren. Die Endonukleasen zerschneiden die DNS im Zellkern, wodurch die Zelle schließlich untergeht. Man unterscheidet üblicherweise 3 Phasen des apoptotischen Zelltodes: Induktionsphase, Effektorphase und Exekutionsphase [9]. Vor einigen Jahren ging man von einem einbahnstraßenartigen Ablauf der Apoptose aus. Aktuell gibt es viele Hinweise, dass man an verschiedenen Stellen aktiv in den 12 Prozess der Apoptose eingreifen und so Zellen vor dem Untergang bewahren kann. Dies macht ein besseres Verstehen der Abläufe beim apoptotischen Zelltod therapeutisch interessant. Als wichtiger Regulator der Apoptose besitzt NO sowohl antiapoptotische als auch proapoptotische Eigenschaften. Diese lassen sich aus den oben angesprochenen Wegen der Signalübertragung ableiten, sie sollen aber noch einmal kurz erläutert werden [9]. 1.2.1. Proapoptotische Eigenschaften von NO Eine schädigende Funktion des gebildeten NO ist in der Regel mit der Bildung von ONOO- verbunden. Das hochreaktive Metabolit ONOO- entsteht aus der Reaktion zwischen NO und Superoxid (O-). Wenn die kompensatorische Kapazitäten der Zelle wie z.B. durch Reduktion von Thion erschöpft sind, kommt es zu oxidativem Zellstress der zum apoptotischen oder nekrotischen Untergang der Zellen führen kann [13,40] Dabei können die DNS-Schäden zu einer Aktivierung der poly(ADP-ribose) Polymerase führen, die als wichtiges Protein der Effektorphase der Apoptose im Kern gilt [74,75]. Schäden an Mitochondrien durch ONOO- können zu dem Austreten von Cytochrom-C führen, welches als starker Aktivator der Caspasen fungiert [29]. Außerdem ist die direkte Aktivierung von Caspasen wie der Caspase 3 durch NO beschrieben [5]. 1.2.2. Antiapoptotische Eigenschaften von NO Es konnte gezeigt werden, dass NO-Agonisten in vielen Modellen eine Apoptoseinduktion verhindern können [46,51]. Außerdem nimmt NO als Botenstoff direkten Einfluss auf die Steuerung der Apoptose. In verschiedenen Modellen wurde gezeigt, dass NO die apoptotische Signalkaskade (z.B. Caspase 3, Caspase 8) inhibieren kann [34]. Durch cGMP vermittelt kann NO die Kalziumkonzentration der Zelle vermindern. Dadurch kann z.B. die Aktivierung wichtiger Apoptose-Effektoren wie der Poly-ADP-ribose-Polymerease (PARP) verhindert werden [37,39,48]. NO kann zu einem Anstieg der Genexpression von Hitzeschockproteinen (HSP) wie HSP70 und HSP32 führen. Diese antiapoptotischen Signalmoleküle verhindern eine Initialisierung der Apoptose Signalkaskade [38]. Durch einen NO vermittelten Anstieg der Genexpression von Wachstumsfaktoren wie z.B. VEGF können Zellen zudem resistenter gegen die Apoptoseinduktion gemacht werden [86]. Pro- und antiapoptotische Eigenschaften von NO sind stark abhängig vom Redoxstatus der Zelle und müssen in jedem Modell kritisch geprüft werden. 13 1.3. NO Synthasen Es existieren 3 NOS Isoformen, deren Eigenschaften im Folgenden kurz beschrieben werden. NOS I spielt vor allem eine Rolle im Nervensystem und hat eine wichtige Funktion in der Modulation und Freisetzung von Neurotransmittern. Die NOS I ist Kalzium-Calmodulin abhängig. Durch den Anstieg des intrazellulären Kalziums kommt es zur Verbindung der NOS I und Calmodulin, was die NO Synthese steigert [8,10]. Neben Kalzium und Calmodulin wurde das Co-Enzym Tetrahydrobiopterin als wichtiger Faktor der NO Synthese identifiziert. Es gibt Hinweise, dass die NOS I und NOS III in der Abwesenheit von Tetrahydrobiopterin kein NO, sondern Superoxid synthetisieren [81,82]. Der Tetrahydrobiopterin- Spiegel kann durch Nikotinabusus, Fehlernährung und im Alter vermindert sein. Eine exogene Zufuhr kann die Funktionsfähigkeit der NOSynthasen wiederherstellen [20,22,27]. In vielen Geweben, wie Skelettmuskel, Nervenzellen und im Innenohr ist die NOS I konstitutiv exprimiert [3,53,57]. Im Zentralnervensystem nimmt die NOS I z.B. Einfluss auf die Langzeitpotenzierung im Hippocampus, die für das Lernen und die Erinnerung von entscheidender Bedeutung ist [28]. Eine zellschädigende Wirkung hat die NOS I vermittelte Aktivierung von N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren bei einer Hirnischämie. Hier verstärkt die NO-Synthese das Absterben von Nervenzellen [62]. Ebenfalls konstitutiv exprimiert ist die NOS III. Die NOS III wird vor allem im Endothel der Blutgefäße exprimiert. Eine wichtige Funktion ist hierbei die Regulation des Muskeltonus der glatten Gefäßmuskulatur. NO diffundiert hierbei als parakriner Botenstoff von der Endothelzelle in die benachbarten glatten Muskelzellen und senkt über die Aktivierung der löslichen Guanylatzyklase (sGC) den Muskeltonus des Blutgefäßes. Dieser Mechanismus wurde zuerst 1987 beschrieben [32]. Die NOS II ist in den meisten Zellen unter physiologischen Bedingungen nicht exprimiert. Sie wurde daher ursprünglich als induzierbare NOS (iNOS) bezeichnet. Die NOS II synthetisiert unabhängig vom intrazellulärem Ca²+ hohe Mengen NO, denn sie bindet das Ca²+ und Calmodulin als Untereinheit kovalent [7]. Eine wichtige Rolle der NOS II ist in Makrophagen nachgewiesen, wo die hohe NOS II abhängige NOProduktion zur Immunabwehr genutzt wird. Die NO-Produktion in Makrophagen hilft bei der gezielten Zerstörung von viral oder bakteriell infizierten Zellen [85]. Bei NOS II defizienten Tieren wurde eine erhöhte Anfälligkeit gegen Infekte nachgewiesen [83]. 1.4. NO im Innenohr Der erste indirekte Nachweis einer NO Bildung im Innenohr gelang Fessenden et al. durch histochemische Versuche mit der NADPH-Diaphorase Methode [17]. Diese 14 Methode ermöglicht nicht die Unterscheidung zwischen den 3 bekannten NOS Isoformen, sie kann aber als indirekter Nachweis einer NO-Bildung genutzt werden [65]. Eine erhöhte Bildung von NO im Innenohr wurde indirekt nach Glutamat Exposition 1999 mit Hilfe der NADPH-Diaphorase Methode nachgewiesen [66]. In der Folge wurde der direkte Nachweis einer NO-Bildung im Innenohr in den äußeren Haarzellen (OHC) erbracht. Als Methode verwendete die Arbeitsgruppe um Takumida 4,5- Diaminofluorescein (DAF-2), einen Fluoreszenzfarbstoff, der intrazellulär aufgenommen werden kann und durch die Reaktion mit NO bei einer Wellenlänge von 495 nm grün fluoresziert [76]. Einen Überblick über die Expression der NOS-Isoenzyme im Meerschweinchen mittels Immunhistochemie lieferten mehrere Arbeitsgruppen [17,21,53]. Die Autoren kamen hierbei zu unterschiedlichen Ergebnissen. Die Expression der NOS III wurde von Michel et al. im Meerschweinchen in äußeren Haarzellen nicht gefunden wurde [53], während die andere Arbeitsgruppe eine Expression in äußeren Haarzellen beschreiben [21]. Die NOS I wurde von allen Autoren im sensorischen Epithel und dem Spiralganglion gefunden aber auch im Ligamentum spirale. Die unterschiedlichen Ergebnisse könnten auf die verschiedenen kommerziellen Antikörper und Unterschiede in der Methodik zurückzuführen sein. In der Maus ist die Expression der NOS III und NOS I in äußeren Haarzellen von der Arbeitsgruppe um Michel beschrieben, hier gibt es aber keine Vergleichsarbeit [23]. Diese Arbeitsgruppe beschrieb zudem im Meerschweinchen als auch in der Maus das Vorkommen der löslichen Guanylat Cyclase (sGC) und des sekundären Botenstoffes cGMP in Haarzellen, Stützzellen, der Stria vascularis, dem Spiralligament und dem Spiralganglion [53]. Unstrittig ist zwischen allen Autoren ist, dass die NOS II unter physiologischen Bedingungen nicht exprimiert wird [16,18,53,77]. 1.4.2. Physiologische Funktion von NO im Innenohr Michel et al. folgerten aus der Expression der NOS Synthasen, der sGC und dem sekundären Botenstoff cGMP, dass der NO/sGC/cGMP-Signalweg auch im Innenohr eine wichtige physiologische Funktion haben könnte [53]. Auch die anderen Autoren vermuten, dass NO über cGMP vermittelt im Innenohr an der Durchblutungsregulation, Neurotransmission und Signaltransduktion beteiligt ist [18,53,77]. In einer Untersuchung von Matsunobu konnte gezeigt werden, dass NO den Kalziumspiegel in Stützzellen senken kann [52]. Das NO eine wichtige Funktion in der Kalziumhomöostase der inneren Haarzelle spielt und durch einen negativ Feedback Mechanismus den Kalziumeinstrom begrenzt wurde ebenfalls beschrieben. Es wurde vermutet, dass NO 15 so einen Einfluss auf die Transmitterfreisetzung an den Synapsen der inneren Haarzelle ausübt [70]. Es wurde außerdem gezeigt, dass ein Ansteigen der Kalziumkonzentration in der äußeren Haarzelle zu einer Steigerung der NO-Synthese führt [71]. In vielen Organsystemen spielt NO eine wichtige Rolle in der Durchblutungsregulation. Im Innenohr wurde bisher gezeigt, dass die lokale Applikation des unspezifischen NOSBlockers N-nitro-L-arginine-methyl ester (L-NAME) die Durchblutung vermindert. Hierbei fanden Hoshijima et al. heraus, dass bei systemischer Gabe von L-NAME in erster Linie die großen Widerstandsgefäße den cochleären Blutfluss mindern und bei Applikation über die Rundfenstermembran die Kapillaren im Spiralligament den Widerstand erhöhen [30]. Über die Funktion der konstitutiv exprimierten NOS I und NOS III im Spiralganglion gibt es bisher keine weiterführenden Untersuchungen. Auch hier wurde eine Rolle in der Signaltransduktion vermutet [78]. Durch die Arbeitsgruppe um Michel wurden weitere Proteine des NO/sGC/cGMP Signalweges im Innenohr identifiziert. Hess et al. beschrieben die Expression der „Extracellular Regulated Kinase 1/2“ (ERK1/2), die als wichtige Kinase des MAPKSignalweges gilt und NO-abhängig aktiviert werden kann. Sie beschrieben, dass die ERK1/2 unter physiologischen Bedingungen in der Cochlea inaktiv ist [26]. In einer weiteren Untersuchung der Arbeitsgruppe wurde eine Aktivierung der ERK1/2 nach VEGF Stimulation im Innenohr gezeigt. Ein Hinweis der darauf hindeuten könnte, dass Wachstumsfaktoren auch im Innenohr Einfluss auf die längerfristige NO-Homöostase haben [24]. Auch die Expression der Proteinkinase-B, die steigernden Einfluss auf die NO-Synthese hat, wurde im Innenohr beschrieben [25]. Weiterführende Untersuchungen dieser Signalwege im Innenohr stehen noch aus. 1.4.3. Pathophysiologische Prozesse von NO im Innenohr Es wird angenommen, dass NO eine wichtige Rolle bei verschiedenen Erkrankungen des Innenohres spielt. In den meisten Modellen für diese Erkrankungen wurde eine Induktion der NOS II beobachtet und vermutet, dass diese Induktion zu einer pathologisch gesteigerten NO-Synthese führt. Namentlich wurde eine NOS II Induktion bei lokaler Behandlung mit Lipopolysacchariden im Meerschweinchen [79], nach Lärmtrauma im Meerschweinchen [6,12], nach experimentell erzeugtem endolymphatischem Hydrops im Meerschweinchen [42], so wie in Spiralganglionzellen von alternden Mäusen [84] nachgewiesen. Die letztere Arbeit wurde nur an Spiralganglionzellen durchgeführt. Die Frage, ob der Alterungsprozess in den anderen Bereichen des Innenohres ebenfalls zu einer NOS II Induktion führt, wurde nicht untersucht. 16 Nach experimentell erzeugtem Hydrops in Meerschweinchen wurde außerdem die vermehrte Bildung von ONOO- detektiert. Es wurde vermutet, dass die Bildung von ONOO- zu vermehrter Apoptose als auch zu funktionellen Störungen führen könnte [42] 1.5. Modell und Fragestellung Die vorliegende Arbeit verwendet eine NOS II defiziente Maus (KO-Maus) und seinen korrespondierenden Wildtyp (WT-Maus). Die genauen Angaben zu den Tieren sind unter 2.1. dargestellt. Im Experiment wurden KO-Mäuse und WT-Mäuse im Verlauf der natürlichen Alterung untersucht. Die Tiere wurden 3 Altersgruppen zugeordnet: 1-2 Monate, 6-8 Monate und 12-14 Monate. Zunächst wurde das Hörvermögen der KO- und WT-Mäuse bestimmt. Als Methode wurde hierbei die Ableitung von frühen akustisch evozierter Hirnstammpotentialen in Form einer BERA („brainstem evoked response audiometry“ angewandt. Die BERA sollte als funktionelle Untersuchung die Frage beantworten, ob eine Hörstörung der genetisch veränderten Tiere vorläge. Zusätzlich wurden rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen durchgeführt, um Haarzellverluste festzustellen und ggfs. zu quantifizieren. Ferner wurde untersucht, ob es bei WT-Mäusen des verwendeten Inzuchtstammes (SV129S6) zu einer Induktion der NOS II während der Alterung kommt. Hierbei wurde die Cochlea an Schnittpräparaten beurteilt [84]. Abschließend wurden vergleichende Färbungen von WT- und KO-Mäusen mit einem Nitrotyrosin-Antikörper durchgeführt, um indirekt die Bildung von ONOO- nachzuweisen und zwischen WT-Mäusen und KO-Mäusen zu vergleichen. 17 2. Methodik und Ergebnisse 2.1. Gruppen und Tiere Die NOS II defizienten Tiere wurden unserer Arbeitsgruppe freundlicherweise vom Institut für Mikrobiologie der Universität Glasgow von Prof. Dr. Liew zur Verfügung gestellt. Bei diesen Tieren war die DNS so verändert, dass eine nicht zur NO-Synthese fähige NOS II exprimiert wird. Wie die NOS II defizienten Tiere hergestellt wurden, ist an anderer Stelle beschrieben [83]. Die Wildtypen wurden von M+B (Møllegaard and Bomholtgård Breeding and Research Center, Denmark) gekauft. Für alle Versuche wurden weibliche, homozygote Mäuse mit Genotyp NOS II (-/-) oder Genotyp NOS II (+/+) vom Inzuchtstamm SV129S6 benutzt. Vereinfachend werden die Tiere mit Genotyp NOS II (-/-) im folgenden Test als Knockouts (KO) und die Tiere mit Genotyp NOS II (+/+) als Wildtypen (WT) bezeichnet. Alle Tiere wurden unter Standardbedingungen mit 24h Tag-Nacht Rhythmus, Futter und Wasser ad libidum gehalten. Insgesamt wurden 59 Mäuse für das Experiment verwendet. Das Experiment wurde durch die zuständige Behörde genehmigt (Bezirksregierung Köln, Genehmigung K03/00). Die Gruppen bestanden aus folgenden Tieren: Gruppe 1: WT 1-2 Monate (N=10 WT Alter 1.4±0.5 Monate) Gruppe 2: KO 1-2 Monate (N=8 KO Alter 1.4±0.5 Monate) Gruppe 3: WT 6-8 Monate (N=8 Alter 7.1±0.8 Monate) Gruppe 4: KO 6-8 Monate (N=10 Alter 7.3±0.4 Monate) Gruppe 5: WT 12-14 Monate (N=12 Alter 13.1±1.0 Monate) Gruppe 6: KO 12-14 Monate (N=11 Alter 12.6±0.8 Monate ) 2.2. Methodik der BERA Untersuchung Die Funktion der Hörbahn wurde durch das Ableiten akustisch evozierter Hirnstammpotenziale in „far-field-Technik“ gemessen („brainstem evoked response audiometry“ BERA). Hierzu wurde für alle Messungen ein Nicolet Pathfinder 1 (Nicolet Biomedical Instruments, Wisconsin, USA) verwendet. 18 Die Mäuse wurden vor Beginn der Messung durch die intramuskuläre Gabe von 100mg/kg Körpergewicht Ketamin-Hydrochlorid (Sigma-Aldrich, München, Deutschland) und 2mg/kg Körpergewicht Medetomidin-Hydrochlorid (Dormitor®, Pfizer, Deutschland) anästhesiert. Anschließend wurde mit einem Handotoskop eine Otitis media inspektorisch ausgeschloßen. Die Hörschwelle beider Ohren wurde getrennt bestimmt. Zur Messung des rechten Ohres wurde eine Nadelelektrode subkutan hinter dem rechten Mastoid eingestochen (Referenzelektrode). Eine zweite Nadelelektrode wurde am Vertex eingestochen (aktive Elektrode) und die dritte (Erde) wurde hinter dem linken Mastoid platziert. Zur Messung des linken Ohres wurde analog vorgegangen. Das Gehör wurde mit Click-Bursts von 3 ms Dauer und einer „Rise-Fall-Time“ von 1 ms stimuliert, während das kontralaterale Ohr gleitend mit einer um –20 dB geringeren Intensität vertäubt wurde. Neben der Hörprüfung mit Click-Bursts wurden frequenzspezifische Messungen mit Reintönen in „notched-noise“ Technik für 4 kHz, 6 kHz und 12 kHz durchgeführt. Bei allen Messungen wurden die Artefaktfiltereinstellungen auf 3000 Hz Hochpassfilter und 300 Hz Tiefpassfilter gesetzt. Die Sensitivität der Messung wurde auf 50 µv festgelegt. Eine Messkurve wurde aus 250 Mittelungen erstellt. Zur Bestimmung der Hörschwelle wurden zunächst stark überschwellige Reize verwendet, die bis zur Hörschwelle in 5 dB-Schritten vermindert wurden. Die Hörschwelle wurde definiert durch das Verschwinden reproduzierbarer BERA-Messkurven unter Beachtung von Welle V. Während der Messung wurde die Körpertemperatur der Tiere mit Hilfe einer selbstgefertigten Messsonde überwacht und durch den Einsatz einer selbstgefertigten manuell regulierbaren Wärmematte konstant bei 37,5°C ±-1°C gehalten. 19 2.3. Herstellung der Lösungen und Puffer Die Zusammensetzung der für die Rasterelektronenmikroskopie und die Immunhistochemie verwendeten Lösungen und Puffer ist in diesem Abschnitt aufgelistet. Cacodylatepuffer 0,1 M - 250 ml Aqua dest. - 10,75 g Na-Cacodylat - pH auf 7,4 mit HCl und NaOH titrieren Diaminobenzidin-Lösung (DAB-Lösung) - 15 ml 0,1 M PB - 7,5 mg Diaminobenzidin (DAB) - 300 µl 0,05 M Nickel-II-Sulfat - 300 µl 10% β-D-Glucose - 50 µl Glucose Oxidase [1,2 mg/ml] - Frischen Ansatz nach dem Mischen filtrieren (593 ½ Porendichte) und direkt verbrauchen Paraformaldehyd 4% in PBS (4% PFA) - 4 g/l Paraformaldehyd in 40 ml Aqua dest. unter Erwärmen auf 50-60°C lösen - Die trübe Lösung durch Zugabe von 1 n NaOH klären und erkalten lassen. - Die Lösung filtrieren - Nun 50 ml 0,2 M PBS hinzugeben - Auf pH 7,4 mit HCl titrieren und auf 100 ml auffüllen 20 Phosphatpuffer 0,1 M (PB) -1 l Aqua dest. - Dinatrium-Hydrogenphosphat-Dihydrat 14,4 g - Natrium-Dihydrogenphosphat-Monohydrat 2,6 g - pH auf 7,4 mit HCl und NaOH titrieren Phosphatpuffer gesalzen 0,1 M (PBS) - 1 l Aqua dest. (für 0,2 M PBS 500 ml Aqua dest.) - Dinatrium-Hydrogenphosphat-Dihydrat 14,4 g - Natrium-Dihydrogenphosphat-Monohydrat 2,6 g - Natriumchlorid 8,766g - pH auf 7,4 mit HCl und Natronlauge (NaOH) titrieren Trispuffer gesalzen 0,05 M (TBS) - 6,057 g Tris(hydroxymethyl)-aminomethan in 250 mg Aqua dest. lösen - 8,766 g Natriumchlorid dazugeben - mit 1 n Salzsäure (HCl) auf pH 7,6 titrieren - mit Aqua dest. auf 1000 ml auffüllen - Erneute pH Kontrolle und ggfs. mit HCl und Natronlauge (NaOH) titrieren 21 2.4. Methodik der Rasterelektronenmikroskopie (REM) 2.4.1. Vorbereitung der Proben für die REM Analyse Nach der Bestimmung der Hörschwelle wurden die anästhesierten Mäuse durch zervikale Dislokation getötet. Die Felsenbeine wurden daraufhin entnommen und direkt in 4 °C kaltem 2% Glutaldialdehyd (Sigma-Aldrich, München Deutschland) in Cacodylatpuffer (2% GDA) fixiert. Unter einem Stereomikroskop Stemi SV6 (Carl Zeiss, Jena Deutschland) wurden die Felsenbeine daraufhin eröffnet. Für ein besseres Eindringen des 2% GDA wurde mikroskopisch der Stapes exartikuliert und das runde Fenster eröffnet. Ein drittes artifizielles Fenster wurde durch vorsichtige FeinnadelPräparation am Apex der Cochlea nahe dem Helikotrema angelegt. Durch dieses 3. Fenster wurde anschließend die Cochlea mit Hilfe einer feinen Insulinspritze mit 2% GDA perfundiert, um eine rasche Fixation für einen guten Strukturerhalt des Gewebes zu erreichen. Die Proben wurden dann für weitere 6 h in derselben Lösung bei 4 °C immersionsfixiert. Nach Ablauf der 6 h wurde das Fixiermittel durch dreimaliges Spülen mit Cacodylatpuffer ausgewaschen. Nun folgte die Häutchenpräparation unter dem Mikroskop. Zunächst wurde mit einer feinen Pinzette das knöcherne Labyrinth um die Cochlea vollständig entfernt. Danach wurde mit einer spitzen Pinzette das Spiralligament und die Stria vascularis reseziert und die Tektorialmembran vorsichtig vom Helikotrema beginnend mit der Pinzette abgehoben. Das fertige Präparat wurde dann direkt für 1 h in 2 % Osmiumtetraoxid in Cacodylatpuffer nachfixiert, um die Elektronendichte für eine bessere Bildschärfe bei der späteren Analyse zu erhöhen. Das überschüssige Osmiumtetraoxid wurde durch dreimaliges Waschen mit Cacodylatpuffer entfernt. Nun wurden die Proben in einer aufsteigenden Alkoholreihe (2 x 40 % Ethanol, 2 x 70 % Ethanol, 2 x 96 % Ethanol, 2 x 100 % Isopropanol) entwässert. Jeder Spülschritt dauerte 12 h bei 4 °C. Als Intermedium diente Chloroform, das ebenfalls für 2 x 12 h einwirkte. Die Proben wurden anschließend getrocknet. Hierzu wurde die kritische PunktTrocknung mit einem CPD 030 (Bal-Tec, Witten, Deutschland) in flüssigem CO2 durchgeführt. Durch wiederholtes Spülen wurde in dem Gerät das Chloroform durch flüssiges CO2 ersetzt. Danach wurde bei einer Temperatur von 31 °C der Druck in der Kammer langsam auf 73,8 bar erhöht. An diesem sogenannten kritischen Punkt ging das flüssige CO2 in den gasförmigen Zustand über. Nun wurde das gasförmige CO 2 langsam aus der Druckkammer abgelassen. Die Proben konnten so bei bestem Strukturerhalt getrocknet werden. Nach dem Trocknen wurden die Proben auf einen 22 Probenteller geklebt und im SC7640 High Resolution Sputter Coater (Quorumtech, Hailsham, England) mit einem 3 nm elektronendichten Gold Film überzogen. 2.4.2. REM Analyse Es folgte die rasterelektronenmikroskopische Analyse der Proben unter einem DSM 962 REM (Carl Zeiss, Jena Deutschland). Hierzu wurden die beschädigten, verlorenen und intakten Haarzellen kontinuierlich vom Apex bis zur Rundfenstermembran gezählt. Als Merkmale einer intakten Haarzelle wurde auf das Vorhandensein von Stereozilien sowie die Anordnung der Zellen im räumlich streng organisierten Corti’schen Organ geachtet. Für die weitere Analyse war hierbei nicht die totale Anzahl der Haarzellen ausschlaggebend, es wurde deren Verlust in Prozent angegeben. 2.5. Methodik der Immunhistochemie Nach der Bestimmung der Hörschwelle wurden die anästhesierten Mäuse durch zervikale Dislokation getötet. Die Felsenbeine wurden daraufhin entnommen und direkt in 4 °C kaltem 4% Paraformaldehyd (4% PFA) fixiert. Unter einem Stereomikroskop Stemi SV6 (Carl Zeiss, Jena, Deutschland) wurden die Felsenbeine daraufhin eröffnet. Für ein besseres Eindringen des 4% PFA wurde mikroskopisch der Stapes exartikuliert und das runde Fenster eröffnet. Ein drittes artifizielles Fenster wurde durch vorsichtige Feinnadel-Präparation am Apex der Cochlea nahe dem Helikotrema angelegt. Durch dieses 3. Fenster wurde anschließend die Cochlea mit Hilfe einer feinen Insulinspritze mit 4% PFA perfundiert, um eine rasche Fixation für einen guten Strukturerhalt des Gewebes zu erreichen. Die Proben wurden dann für weitere 12 h in derselben Lösung bei 4 °C immersionsfixiert. Nach Ablauf der 12 h wurde das Fixiermittel durch dreimaliges Spülen mit Phosphatpuffer (PBS) ausgewaschen. Anschließend wurden die Proben in einer aufsteigenden Alkoholreihe (2 x 40 % Ethanol, 2 x 70 % Ethanol, 2 x 96 % Ethanol und 2 x 100 % Isopropanol) entwässert. Jeder Spülschritt dauerte 12 h bei 4 °C. Als Intermedium diente Chloroform, das ebenfalls für 2 x 12 h einwirkte. Die Proben wurden danach in 60 °C warmes Paraffin für weitere 12 h gegeben und anschließend zur histologischen Aufarbeitung in Blöcke gegossen. Die fertig eingebetteten Präparate wurden dann in Serie an einem HM 360 Rotationsmikrotom (Microm, Walldorf, Deutschland) in 8 µm Dicke geschnitten und im warmen Wasserbad gestreckt. Anschließend wurden die Schnitte auf mit 0,1 % Silansäure beschichtete Objektträger 23 transferiert und nach dem Trocknen archiviert. Die besten Schnittebenen dienten der folgenden immunhistochemischen Untersuchung. Die fertigen Schnitte wurden zunächst in einer absteigenden Alkoholreihe analog zur Entwässerung entparaffiniert. Als Intermedium diente auch hier Chloroform. Anschließend wurden die entparaffinierten und rehydrierten Proben 3-mal in TBS gewaschen. Die immunhistochemische Färbung wurde nach der Streptavidin-BiotinMethode durchgeführt. Alle Spül- und Inkubationsschritte erfolgten bei Tageslicht und Raumtemperatur falls nicht gesondert erwähnt. Die unten aufgeführten Zwischenschritte dienten dazu, unspezifische Hintergrundfärbung zu vermeiden und die Affinität der verwendeten Primär- und Sekundärantikörper zu erhöhen. Folgende Primärantikörper wurden verwendet: Anti-NOS II, rabbit, polyclonal IgG mit einer Verdünnung von 1:1000 (Biomol Deutschland) und Anti-Nitrotyrosin, rabbit, polyclonal IgG 1:500 (Upstate USA). Als Sekundärantikörper wurde für beide Primärantikörper Goat-anti-rabbit-IgG (DAKO, Carpinteria, USA) mit einer Verdünnung von 1:400 verwendet. Das genaue Versuchsprotokoll ist im Folgenden tabellarisch dargestellt. 24 1. Versuchstag 1. 1-mal 30 Minuten spülen im Dunkeln mit 3 % Wasserstoffperoxid in TBS 2. 1-mal 15 Minuten spülen mit 0,5 M Ammoniumchlorid unter Zusatz von 0,25% Triton-X-100 (Sigma-Aldrich, München, Deutschland) in TBS. 3. 1-mal 5 Minuten spülen mit 1:10 Tween 20® (Sigma-Aldrich, München, Deutschland) in Aqua dest. 4. 1-mal 5 Minuten spülen mit TBS 5. 1-mal 60 Minuten spülen mit 5% Bovine Serum Albumin Fraktion V (BSA, SigmaAldrich, München, Deutschland) in TBS 6. Inkubation mit den Primärantikörpern für mindestens 12 h bei 4 °C 2. Versuchstag 7. 1-mal 10 Minuten spülen mit Tween 20® (1:10 in Aqua dest.) 8. 3-mal 10 Minuten spülen mit TBS 9. 1-mal 60 Minuten spülen mit dem Sekundärantikörper 10. 4-mal 10 Minuten spülen mit TBS 11. 1-mal 60 Minuten spülen mit Meerrettich-Peroxidase 1:150 in TBS 12. 4-mal 10 Minuten spülen mit TBS 13. Entwicklung der Färbung mit DAB-Lösung unter dem Lichtmikroskop 14. Abstoppen der Entwicklung durch Spülen mit TBS und zügiges Überführen der Proben in 70 % Ethanol. 15. Langsame Dehydrierung der Proben in einer aufsteigenden Alkoholreihe bis zur Überführung in Chloroform. 16. Eindecken der vollständig entwässerten Proben mit Entellan® (Merck, Darmstadt, Deutschland). Nach der Färbung erfolgte die lichtmikroskopische Beurteilung und Foto-dokumentation der Präparate unter einem Zeiss Axiophot Lichtmikroskop. Die Proben aus einem Versuch, die unter gleichen Bedingungen gefärbt wurden, wurden in ihrer Farbintensität miteinander verglichen. 25 2.6. Ergebnisse der BERA Untersuchung Die Hörschwelle wurde mittels BERA mit Click-Stimulus sowie frequenzspezifisch wie in 2.2 beschrieben bestimmt. In Tabelle 1 sind die Mittelwerte mit Standardabweichung der einzelnen Gruppen auf 1 Kommastelle gerundet angegeben. Außerdem kann in der Tabelle das durchschnittliche Alter der Tiere mit Standardabweichung und die Anzahl der Tiere pro Gruppe in der Spalte N abgelesen werden. Die Rohdaten der Hörschwellen wurden mittels student t-Test verglichen. Das Signifikanzniveau (p-Wert) wurde auf α ≤ 0.05 festgelegt. In der Tabelle 1 wurden signifikante Unterschiede zwischen WT und KO Tieren der gleichen Altersstufe fett hervorgehoben. Daneben wurden von den Rohdaten Boxplot Diagramme angefertigt und die Daten mittels des non paremetrischen Mann-Whitney U-Test zusätzlich statistisch verglichen. Signifikante Unterschiede (α ≤ 0.05 ) im Mann-Whitney U-Test sind im Folgenden durch Sterne über den Interquartilen angegeben. Abbildung 1 : BERA-Hörschwellen in dB SPL Genotyp Alter N Click 4 kHz 8 kHz 12 kHz 1-2 WT 1,4 ±0,5 10 44,3 ±7,9 74,0 ±14,1 21,4 ±14,4 17,4 ±11,4 Monate KO 1,4 ±0,5 8 51,4 ±8,6 78,2 ±11,5 31,1 ±10,4 22,9 ±9,6 6-8 WT 7,1 ±0,8 8 58,1 ±16,1 87,2 ±9,7 34,7 ±12,0 35,6 ±11,7 Monate KO 7,3 ±0,4 10 70,8 ±19,7 98,3 ±16,3 48,3 ±20,9 48,3 ±23,7 12-14 WT 13,1 ±1,0 10 71,3 ±16,1 101,3 ±11,9 50,5 ±15,6 53,5 ±14,2 Monate KO 12,6 ±0,8 10 82,8 ±15,4 102,0 ±13,0 55,5 ±16,8 61,0 ±13,1 26 2.6.1. Vergleich der Hörschwelle Click-Stimulus Die Hörschwelle betrug in Gruppe 1 (WT 1-2 Monate) 44,3 ±7,9 dB(SPL) (n=10) und Gruppe 2 (KO 1-2 Monate) 51,4 ±8,6 dB(SPL) (n=8). In den 6-8 Monate alten Tieren wurden 58,1 ±16,1 dB(SPL) in Gruppe 3 (WT 6-8 Monate) (n=8) und 70,8 ±19,7 dB(SPL) in Gruppe 4 (KO 6-8 Monate) (n=10) gemessen. Die Differenz von mehr als 10 dB(SPL) bestand ebenfalls im Vergleich der Gruppen 5 und 6. Hier wurden 71,3 ±16,1 dB(SPL) (n=10) in Gruppe 5 (WT 12-14 Monate) und 82,8 ±15,4 dB(SPL) in Gruppe 6 (KO 12-14 Monate (n=10) gemessen. In allen untersuchten Altersstufen zeigte der student t-Test einen signifikanten Unterschied zwischen NOS II defizienten Tieren (KO) und dem Wildtyp (WT). Als signifikant wurde ein p-Wert α ≤ 0,05 gewertet. In Abb. 1 sind die Unterschiede in Form eines Boxplot Diagramms visualisiert. Auch der Mann-Whitney U-Test zeigte signifikante Unterschiede im Vergleich der Gruppen. Abbildung 2: BERA, Hörschwellen Click-Stimulus 27 2.6.2. BERA 4 kHz Stimulus Bei 4 kHz gab es für beide statistischen Verfahren nur bei den 6-8 Monate alten Tieren einen signifikanten Unterschied der Hörschwelle. Gruppe 3 (WT 6-8 Monate) hörte 87,2 ±9,7 dB(SPL) (n=8) und Gruppe 4 (KO 6-8 Monate) hörte durchschnittlich 98,3 ±16,3 dB(SPL) (n=10). In Gruppe 5 wurden 101,3 ±11,9 dB(SPL) (n=10) und in Gruppe 6 102,0 ±13,0 dB(SPL) (n=10) gemessen. Ein signifikanter Unterschied bestand im Vergleich der 12-14 Monate alten Mäuse nicht. Die Hörleistung der jungen Wildtypen in Gruppe 1 war mit 74,0 ±14,2 dB(SPL) (n=10) nahezu identisch mit den NOS II defizienten Tieren der Gruppe 2, bei denen 78,04 ±11,5 dB(SPL) (n=7) gemessen wurde. Unten ist die Box Plot Darstellung zu sehen. Abbildung 3: BERA, Hörschwellen 4 kHz-Stimulus 28 2.6.3. BERA 8 kHz Stimulus In der Messung für 8 kHz wurde ein signifikanter Unterschied bei den 1-2 Monate alten Tieren gefunden. Gruppe 1 hörte 21,4 ±14,4 dB(SPL) (n=10), während Gruppe 2 31,1 ±10,4 dB(SPL) (n=8) hörte. Ein signifikanter Unterschied von fast 15 dB SPL ergab sich bei den 6-8 Monate alten Tieren. Hier wurden 34,7 ±12,0 dB(SPL) (n=8) in Gruppe 3 und 48,3 ±20,9 dB(SPL) (n=10) in Gruppe 4 gemessen. Die 12-14 Monate alten Tiere hörten unabhängig vom Genotyp wiederum nahezu gleich gut. Bei den 12-14 Monate alten WT-Mäusen (Gruppe 5) wurde eine Schwelle von 50,5 ±15,6 dB(SPL) bestimmt, während die NOS II defizienten Tiere (Gruppe 6) 55,5 ±16,8 dB(SPL) hörten. Abbildung 4: BERA, Hörschwellen 8 kHz-Stimulus 29 2.6.4. BERA 12 kHz Stimulus Bei den 1-2 Monate alten Mäusen ergab sich ein nicht signifikanter Unterschied von etwa 5 dB in beiden Gruppen. Die WT-Mäuse hörten 17,4 ±11,4 dB(SPL) und die NOS II defizienten Tiere 22,9 ±9,6 dB(SPL). Die 6-8 Monate alten Wildtyptiere (Gruppe 3) hörten mit 35,6 ±11,7 dB(SPL) signifikant besser als die NOS II defizienten Tiere (Gruppe 4) mit 48,3 ±23,7 dB(SPL). Auch bei den 12-14 Monate alten Tieren wurde ein besseres Hörvermögen in Gruppe 5 als in Gruppe 6 gemessen. Gruppe 5 zeigte eine Hörschwelle von 53,5 ±14,2 dB(SPL) und Gruppe 6 eine Hörschwelle von 61,0 ±13,1 dB(SPL). Der Unterschied von 10 dB(SPL) war hier statistisch nicht signifikant. Abbildung 5: BERA, Hörschwellen 12 kHz-Stimulus 30 2.7. Ergebnisse der Rasterelektronenmikroskopie 2.7.1. Innere Haarzellen (IHC) Bei den 1-2 Monate alten Tieren waren die IHC intakt. Die 12-14 Monate alten WTMäuse zeigten ebenfalls keine degenerierten IHC. Von 6 gezählten Proben zeigten nur 2 der 12-14 Monate alten NOS II defizienten Tiere verlorene IHC. Auch bei diesen beiden Tieren war die Degeneration auf die apikalen Anteile der Cochlea begrenzt. Der Haarzellverlust in den beiden Tieren ging in den oberen Anteilen sogar über 50% hinaus. 3.2.2. Äußere Haarzellen (OHC) Die OHC wurden vom Apex der Cochlea bis zum runden Fenster gezählt. Zur besseren Übersicht und zur Auswertung wurde die Cochlea hierbei in 12 metrisch gleiche Teile unterteilt. Die Daten zeigten, dass die Struktur der OHC bei den 1-2 Monate alten Tieren unabhängig vom Genotyp erhalten war. Es gab keine wesentlichen Verluste. Entlang der gesamten Cochlea gab es bei den 12-14 Monate alten WT-Mäusen keine Haarzellverluste die 10% überstiegen. Dagegen war bei den alten KO-Mäusen (Gruppe 6) ein Haarzellverlust festzustellen. Der Verlust der äußeren Haarzellen war in den tiefen Frequenzen, also apikal stark ausgeprägt und nahm nach basal ab. Die größten Verluste von ca. 30% fanden sich allerdings nicht genau am Apex sondern etwas weiter basal, und nahmen bis etwa zur Hälfte der Cochlea wieder ab. Die basale Windung, die den hohen Frequenzen entspricht, zeigte nur geringfügige Verluste an OHC. Das Diagramm Abb. 5 zeigt den Verlust an Haarzellen in Bezug zur Distanz vom Apex. In Abb. 6 sind beispielhafte REM Aufnahmen der Cochela von WT und KO Mäusen gezeigt. 31 Abbildung 6: Verlust der äußeren Haarzellen. Abb. 6: In der Y-Achse ist der Verlust in % angegeben. Die X-Achse stellt die Distanz vom Apex ausgehend dar. Man erkennt, dass vornehmlich die tiefen Frequenzen bis zu 30% Verlust an äußeren Haarzellen aufwiesen. Die basalen Anteile der Cochlea waren nicht so stark betroffen. Bei den 12-14 Monate alten Wildtypen, sowie den 1-2 Monate alten Tieren beider Genotypen gab es keine relevanten Haarzellverluste. Es wurden je n=6 Cochleae ausgezählt. 32 Abbildung 7a und 7b: REM Ultrastruktur der WT und KO Tiere Abb. 7a: Der Maßstab entspricht 10µm (Balken). Die Bezeichnung OHC in allen Bildern steht für die äußeren Haarzellen, während die Reihe der inneren Haarzellen durch IHC gekennzeichnet sind. In der oberen Reihe sind repräsentative Aufsichten auf das Corti'sche Organ von WT Tieren zu sehen. Ganz links oben erkennt man eine erhaltene unauffällige Ultrastruktur ohne Verluste von Haarzellen (OHC, IHC) bei einem 2 Monate alten Tier. In den folgenden Spalten sind Aufnahmen von Tieren aus Gruppe 5 und 6 gezeigt (12-14 Monate alte Tiere). Oben rechts ist die basale Windung von einem Wildtypen zu sehen. Unten rechts ist die basale Windung einer KO-Maus abgebildet. In der basalen Windung ist bei beiden Genotypen kein Schaden erkennbar. 33 Abb. 7b: Der Maßstab entspricht 10µm (Balken). Die Bezeichnung OHC in allen Bildern steht für die äußeren Haarzellen, während die Reihe der inneren Haarzellen durch IHC gekennzeichnet sind. In der oberen Reihe sind repräsentative Aufsichten auf das Corti'sche Organ von WT Tieren zu sehen. Gezeigt ist der mittlere Anteil der Cochlea (links) sowie der apikale Anteil (rechts). Die Pfeile zeigen beispielhaft stellen an denen der Verlust einer Haarzelle durch eine Deiter’sche Zelle aufgefüllt wurde. Die Verluste kommen sowohl im Wildtyp als auch im Knockout vor. Die KO-Mäuse sind im Vergleich jedoch deutlich stärker geschädigt (unter Reihe). Die Sterne (rechts unten) zeigen ein fast vollständig vernarbtes Corti'sches Organ mit nur noch wenig intakten äußeren Haarzellen im apikalen Anteil einer 12 Monate alten KO-Maus. 34 2.8. Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen 2.8.1. Immunhistochemische Untersuchung mit anti-NOS II Schnittpräparate aus den Gruppen 1, 3 und 5 (WT-Mäuse je N=6) wurden wie in 2.4. beschrieben mit anti-NOS II inkubiert und gefärbt. Probeweise wurden auch einige KOMäuse mit anti-NOS II inkubiert. Die 1-2 Monate alten WT-Mäuse (Gruppe 1) zeigten keine Färbung während in Gruppe 3 (WT 6-8 Monate) und Gruppe 5 (WT 12-14 Monate) ein Färbung für NOS II festgestellt werden konnte. In Gruppe 3 wurde NOS II in Deiter’schen Zellen und schwächer in Hensen’schen Zellen nachgewiesen. Die Haarzellen blieben ungefärbt. Eine deutliche Färbung konnte zudem in Fibrozyten und Blutgefäßen des Spiralligamentes festgestellt werden. Die Stria vascularis blieb in Gruppe 3 ungefärbt. Besonders stark konnte eine NOS II in den Neuronen des Spiralganglion nachgewiesen werden. In Gruppe 5 fand sich ebenfalls eine Anfärbung im Corti'schen Organ, und hier ähnlich wie in Gruppe 3 wurde NOS II im Stützzellapparat detektiert, während die Haarzellen ungefärbt blieben. Im Bereich des Corti'schen Organs konnte zudem festgestellt werden, dass die Färbung für NOS II von apikal nach basal abnimmt. Gleiches galt jedoch nicht für das Spiralligament und das Spiralganglion. Hier gab es eine gleichbleibend starke Färbung in apikalen und basalen Anteilen der Cochlea. 35 Abbildung 8: anti-NOS II Färbung bei 12-14 Monate alten Wildtypen Abb. 8: Der Maßstab entspricht 10 µm. (Balken). Links oben erkennt man eine geringe Reaktion im Stützzellapparat. Die Haarzellen (OHC) wurden als negativ gewertet. Rechts oben ist die Färbung im Spiralligament (SL) dargestellt. Links unten ist eine deutliche Färbung der Spiralganglionzellen zu erkennen. Der Stern zeigt eine zytoplasmatische Färbung. Der Pfeil deutet auf eine Zelle mit einen Signal im Nucleus. Ganz rechts unten ist eine Negativkontrolle (Control) zu sehen. Der Primäre Antikörper wurde hier nicht hinzugegeben um die Spezifität des insgesamt nicht starken Signals zu überprüfen. 36 2.8.2. Immunhistochemische Untersuchung mit anti-Nitrotyrosine Die Färbung für anti-Nitrotyrosin wurde in allen 6 Gruppen durchgeführt. Es wurden je 6 Cochleae aus jeder Gruppe mit dem Nitrotyrosin Antikörper inkubiert. In der Auswertung wurde auf Unterschiede zwischen WT- und KO-Mäusen gleichen Alters geachtet. Im Vergleich zwischen Gruppe 1 und Gruppe 2 fanden sich keine Unterschiede. Eine geringe Färbung konnte im Spiralligament und den Hensen’schen- und Deiter’schen Zellen nachgewiesen werden. Im Spiralganglion konnte ebenfalls eine leichte Färbung in beiden Gruppen festgestellt werden. In Gruppe 3 und 4 war der Nachweis von Nitrotyrosin in Gruppe 4 am stärksten. Hier zeigte sich eine starke Färbung vornehmlich im Spiralganglion. Aber auch der Stützzellapparat des Corti’schen Organs war stärker angefärbt. Gleiches galt für die Fibrozyten des Spiralligamentes in Gruppe 4. Wenn man die Färbung in Gruppe 4 mit der in Gruppe 2 vergleicht (1-2 Monate alte KO mit 6-8 Monate alten KO) war ebenfalls ein Anstieg mit zunehmendem Alter der KO-Mäuse festzustellen, während Gruppe 1 und 3 (WT Mäuse) in der Färbeintensität vergleichbar waren. Am stärksten konnte Nitrotyrosin in den 12-14 Monate alten Tieren detektiert werden. Hier zeigten wiederum die KO-Mäuse in Gruppe 6 die stärkste Farbintensität. Vor allem das Spiralganglion zeigte in Gruppe 6 eine sehr starke Färbung. Im Corti’schen Organ konnte ebenfalls eine starke Färbung detektiert werden. Es war auffällig, dass eine starke Färbung im oberen Drittel der Cochlea zu finden war. In diesen Bereichen war zum Teil die Struktur des Corti’schen Organs verändert und die äußeren Haarzellen abgestorben. Weiter basal war die Struktur dagegen intakt und die Färbung etwas geringer. Ein starker Nachweis von Nitrotyrosin konnte auch im Spiralligament erbracht werden. Gruppe 5 zeigte ebenfalls eine verstärkte Nitrotyrosinbildung, diese war jedoch viel geringer als die in Gruppe 6. Im Vergleich zu den 6-8 Monate alten Tieren zeigten sowohl die Proben der WT-Mäuse als auch KO-Mäuse eine deutlich stärkere Färbung. 37 Abbildung 9: Anti-Nitrotyrosin im Corti’sches Organ Abb. 9: Immunhistochemischer Nachweis von anti-Nitrotyrosin. Maßstab 10 µm (Balken). In der oberen Reihe sind Aufnahmen von WT Mäusen gezeigt. Von links nach rechts steigt das Alter der Tiere an. In der unteren Reihe sind Aufnahmen von KO Mäusen gezeigt. In der Abbildung erkennt man eine deutlich Zunahme der Färbung in den Stützzellen und den Haarzellen, je älter die Tiere werden. Wie im Ergebnisteil dargestellt weisen die KO-Tiere der Gruppe 5 und 6 die stärkeren Signale auf als ihre korrespondierenden WT-Mäuse. 38 Abbildung 10: Anti-Nitrotyrosin im Spiralganglion Abb. 10: Immunhistochemischer Nachweis von anti-Nitrotyrosin. Maßstab 10 µm (Balken). In der oberen Reihe sind Aufnahmen von WT Mäusen gezeigt. Von links nach rechts steigt das Alter der Tiere an. In der unteren Reihe sind Aufnahmen von KO Mäusen gezeigt. In der Abbildung erkennt man eine deutlich Zunahme der Färbung im Zytoplasma und den Zellkernen, je älter die Tiere werden. Wie im Ergebnisteil dargestellt weisen die KO-Tiere der Gruppe 5 und 6 die stärkeren Signale auf als ihre korrespondierenden WT-Mäuse. 39 Abbildung 11: Anti-Nitrotyrosin im Spiral Ligament und der Stria vascularis 40 Abb. 11: Immunhistochemischer Nachweis von anti-Nitrotyrosin. Maßstab 10 µm (Balken). In der oberen Reihe sind Aufnahmen von WT Mäusen gezeigt. Von links nach rechts steigt das Alter der Tiere an. In der unteren Reihe sind Aufnahmen von KO Mäusen gezeigt. In der Abbildung erkennt man eine deutlich Zunahme der Färbung in den Fibrozyten des Spiralligamentes, je älter die Tiere werden. Wie im Ergebnisteil dargestellt weisen die KO-Tiere der Gruppe 5 und 6 die stärkeren Signale auf als ihre korrespondierenden WT-Mäuse. 3. Diskussion 3.1. Hereditäre Hörstörung bei NOS II defizienten Tieren? Untersucht wurden WT- und KO-Mäuse in verschiedenen Altersgruppen. Als erste Altersgruppe wurden 1-2 Monate alte Mäuse gewählt. Im Gegensatz zum Menschen wird die Maus nicht mit vollständig entwickelter Cochlea geboren. Etwa am 14. postnatalen Tag ist die Cochlea soweit gereift, dass sich der Gehörgang öffnet und die Tiere zu hören beginnen. Morphologisch ist die Cochlea am 18. postnatalen Tag vollständig gereift. Mit 1 Monat, dem Beginn unseres Beobachtungszeitraums ist die Cochlea also voll entwickelt [49]. Im Vergleich der WT- und KO-Mäuse zeigte sich in den Gruppen 1 und 2 eine signifikant schlechtere Hörleistung der KO-Mäuse für Click-Stimuli sowie bei dem frequenzspezifischen Stimulus für 8 kHz. In der Messung mit dem frequenzspezifischen Stimulus von 4 kHz und 12 kHz schnitten die KO-Mäuse ebenfalls schlechter ab. In diesen Frequenzen ergab sich jedoch im student t-Test kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen. Während die BERA-Untersuchung in der vorliegenden Arbeit deutliche Hinweise auf einen Hörschaden liefert ist dieser morphologisch bei den jungen Tieren nicht fassbar. In der REM-Untersuchung wurden keine signifikanten Haarzellverluste in Gruppe 1 und 2 festgestellt. Ebenso gab es keine morphologischen Auffälligkeiten an den Schnittpräparaten, die für die immunhistochemischen Experimente verwendet wurden. Auch in der immunhistochemischen Färbung für Anti-Nitrotyrosin konnte in Gruppe 1 und 2 kein Unterschied, der eine Hörstörung erklärt, festgestellt werden. Der Grund für die Hörstörung kann mit den verwendeten Methoden somit nicht eruiert werden. Spekulativ könnte ein Fehlen der NOS II während der Embryonalentwicklung bzw. Reifung der Rezeptoren zu einer hereditären Hörstörung führen. Hinweise für eine wichtige Funktion der NOS II während der Embryonalentwicklung lieferte die Arbeit von Arnhold et Al. [1]. In der Arbeit wurde gezeigt, dass es zu einer 41 transienten Induktion der NOS II zwischen dem 16. Tag der Embryonalentwicklung und dem 6. postnatal Tag kommt. Wie von verschiedenen Autoren beschrieben, wird die NOS II unter physiologischen Bedingungen im Säuger und in der menschlichen Cochlea nicht exprimiert [18,23,53,64,77]. In der vorliegenden Arbeit wurde dieser Befund an den untersuchten Mäusen erneut geprüft und bestätigt. Die immunhistochemische Untersuchung zeigte keine Expression der NOS II in Gruppe 1 (WT 1-2 Monate). Im Gegensatz zur adulten Cochlea konnte die Arbeitsgruppe um Arnhold et. Al. zeigen, dass die NOS II vom 14. Embryonaltag bis zum 6. postnatalen Tag exprimiert wird, während die anderen Isoformen noch nicht nachweisbar sind [1]. Ein Fehlen des NOS II in den KO-Mäusen könnte also bereits während der Reifung der Cochlea zu dem oben beschriebenen Hörschaden führen. Da der gewählte Beobachtungszeitraum in dieser Arbeit die Embryonalentwicklung nicht umfasste, sind weitere Experimente zur Klärung erforderlich. 3.2. Verlauf der Hörstörung im Beobachtungszeitraum Es wurden 2 weitere Beobachtungspunkte nach 6-8 Monaten (Gruppen 3 WT und 4 KO). und 12-14 Monaten (Gruppen 5 WT und 6 KO) gewählt. Auch hier wurde das Hörvermögen mittels BERA verglichen. Nach 6-8 Monaten konnte ein signifikant schlechteres Hörvermögen der KO-Mäuse für Click-, 8 kHz und 12 kHz- Stimuli gemessen werden. Dagegen gleichen sich die Hörschwellen von WT- und KO-Tieren nach 12-14 Monaten nahezu an, wobei beide Genotypen eine deutliche Altersschwerhörigkeit aufzeigten. Dieser Umstand könnte durch die zur Verfügung stehenden Tiere bedingt sein, welche aus einem Inzuchtstamm der Reihe 129 stamten. Zheng et Al. beschrieben in einer Grundlagenarbeit das Hörvermögen von 80 Inzuchtstämmen, die häufig zur Herstellung von Knockouts verwendet werden. Sie stellten unter anderem fest, dass viele der 129 Substämme unter einer langsam progredienten Altersschwerhörigkeit leiden [87]. Die genaue Bezeichnung des in dieser Arbeit verwendeten Inzuchtstamm lautet 129 S6/SvEv, welche in o.g. Arbeit nicht untersucht wurden. Eine erste Beschreibung des Hörvermögens des in dieser Arbeit verwendeten Stamm 129 S6/SvEv lieferten Ohlemiller und Gagnon. Die von ihnen gewonnen Daten decken sich gut mit den Ergebnissen dieser Arbeit [56]. Übereinstimmend wurde ein progredienter Hörverlust in genetisch unveränderten 129 S6/SvEv gemessen. NOS II KO-Mäuse waren zum Zeitpunkt der Untersuchung nur von einem weiteren Inzuchtstamm verfügbar. Die Alternative für den verwendeten 129 S6/SvEv Stamm 42 wären Inzuchtmäuse der C57Bl6J Reihe gewesen. Diese Tiere wurden jedoch direkt als ungeeignet angesehen, da sie einen schwerwiegenden Gendefekt aufweisen, der zu einer frühen und schnell verlaufenden Altersdegeneration führt. [36,73] Die Fragestellung in der vorgelegten Arbeit geht über die Beschreibung des Hörvermögens von Wildtypen hinaus. Ziel war es, den Effekt einer NOS II Deletion während der Alterung zu untersuchen. Der langsam progrediente Hörverlust der Wildtypen macht die Untersuchung der KO-Tiere problematisch: Der Effekt der NOS II Deletion vermischt sich wahrscheinlich mit dem Effekt des progredienten Hörverlustes in den WT bei zunehmendem Alter. Abgeleitet werden kann dies aus dem Umstand, dass es zu einer Angleichung der Hörschwellen bei KO- und WT-Mäusen in Gruppe 5 und Gruppe 6 kommt. In der immunhistochemischen Untersuchung konnte gezeigt werden, dass es ab einem Alter von 6 Monaten zu einer Induktion der NOS II in der Cochlea der untersuchten Tiere kommt, die nach 12-14 Monaten noch weiter zunimmt. Hierbei wurde eine NOS II Induktion in erster Linie im Spiralganglion gefunden. Schwächer wurde die NOS II in den Stützzellen und im Spiralligament nachgewiesen. Die Haarzellen blieben ungefärbt (Abb. 8). Vorbeschrieben ist eine Induktion der NOS II im Innenohr unter verschiedenen pathophysiologischen Bedingungen, wie nach lokaler Behandlung mit Lipopolysacchariden im Meerschweinchen [79], nach Lärmtrauma im Meerschweinchen [6,12], nach experimentell erzeugtem endolymphatischem Hydrops im Meerschweinchen [42], so wie in Spiralganglionzellen von alternden Mäusen [84] gefunden. Durch den Einsatz des NOS II KO Modells sollte in der vorliegenden Untersuchung die Rolle der NOS II in der alternden Cochlea weiter geklärt werden. Hierzu war zunächst der Nachweis einer NOS II Induktion in der alternden Cochlea von Wildtypen erforderlich. Eine NOS II Induktion setzt in dem untersuchten Model nach 6 Monaten (oder früher) ein. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass es zu einer NOS II Induktion über das Spiralganglion hinaus auch im Spiralligament und in verschiedenen Zellen des Corti’schen Organs kommt. Einen Hinweis auf die Rolle der NOS II während des Alterungsprozesses liefert die vorliegende Untersuchung im Hinblick auf die Bildung von Nitrotyrosin. Der verwendete Antikörper gegen Nitrotyrosin dient als indirekter Nachweis einer vermehrten ONOOBildung. ONOO- schädigt Zellen durch oxidative und irreversible Veränderung von Proteinen, Lipidmembranen und DNS. Diese Veränderungen führen zu Störungen der normalen Zellfunktion [13,40]. Durch den verwendeten Antikörper kann dann die irreversible Nitrierung von Tyrosinresten (also Nitrotyrosin) nachgewiesen werden [33]. 43 Der immunhistochemische Nachweis von Nitrotyrosin war bei 6-8 Monate alten WTMäusen im Vergleich zu den 1-2 Monate alten WT-Mäusen kaum erhöht. Erst nach 1214 Monaten nach dem Einsetzen des altersbedingten Hörverlustes war eine vermehrte ONOO- Bildung detektierbar. Verschiedene Arbeiten haben den Zusammenhang zwischen altersbedingter Degeneration der Cochlea und dem Nachweis von freien Radikalen propagiert [35,45,73]. Auch in dem untersuchten Stamm kommt es im Alter von 12-14 Monaten zu einer vermehrten Bildung freier Radikale. Bei den KO-Tieren ist die Bildung von Nitrotyrosin sowohl nach 6-8 Monaten als auch nach 12-14 Monaten im Vergleich zu den korrespondieren WT-Mäusen stärker ausgeprägt. Dies könnte auf einen relativen NO-Mangel durch das Fehlen der NOS II Induktion in den KO-Tieren hindeuten. Die sowohl protektiven als auch schädigenden Einflüsse von NO sind abhängig vom Konzentrationsverhältnis von O- und NO in der Zelle. Es ist bekannt, dass NO je nach molarem Verhältnis zu O- dieses abfangen und entgiften kann oder aber zur Bildung des toxischen ONOO- beiträgt: Während äquimolare sowie hypomolare Mengen an NO im Verhältnis zu O- zur Bildung des schädlichen ONOO- führen, begünstigt ein NO-Überschuss die protektive Funktion [13,14]. Mutmaßlich besteht also in den KO ein relativer NO-Mangel bzw. eine im Verhältnis zu O- hypomolare NO Menge, welche die ONOO- Bildung begünstigt. Die immunhistochemischen Ergebnisse deuten darauf hin. Einen signifikanten Einfluss von NO und ONOO- auf die Degeneration der Cochlea im Alter konnte die Arbeit jedoch nicht nachweisen, da KO- und WT-Mäuse sich im Alter in ihrem Hörvermögen angleichen. Auf die möglichen Gründe für diese Angleichung wurde weiter oben bereits eingegangen. Die REM Untersuchung brachte weitere Hinweise, dass ein Fehlen der NOS II einen Einfluss auf die Degeneration der Cochlea haben könnte. Der Verlust an OHC lag bei 12-14 Monate alten KO-Mäusen mit 20-30 % im Vergleich zu den WT-Mäusen (10%) deutlich höher. Einschränkend muss jedoch erneut auf die nahezu gleichen Hörschwellen der Tiere nach 12-14 Monaten verwiesen werden, was gegen einen funktionell relevanten Haarzellverlust spricht. Zudem beschränkte sich der Haarzellverlust auf die apikalen Anteile der Cochlea. Dies ist untypisch für einen altersbedingten Haarzellverlust oder eine altersbedingte Schwerhörigkeit. Typischerweise beginnt im Alter die Degeneration der Cochlea bei Mäusen und Menschen basal und schreitet nach apikal fort [50]. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit herausgearbeitet, dass bei NOS II KOMäusen des untersuchten Stammes (129S6 Sv/Ev) eine leichte angeborene Hörstörung vorliegt. Auch wenn in der Immunhistochemie und der REM Analyse Anhaltspunkte für 44 eine beschleunigte Degeneration der Cochlea bei KO- Tieren zu finden sind, sind diese in der BERA nicht nachweisbar. Grund hierfür könnte die Überlagerung anderer genetischer Defekte in der 129S6 Sv/Ev Maus sein. Eine ähnliche Untersuchung in einem anderen, von langsam progredienter Schwerhörigkeit nicht betroffenen Stamm, könnte die Rolle der NOS II im Innenohr weiter klären. 3.3. Kritische Betrachtung von Model und Methoden 3.3.1. Einsatz der BERA zur Bestimmung des Hörvermögens In der vorliegenden Arbeit wurde das Hörvermögen von NOS II defizienten Tieren charakterisiert. Als Methode diente die BERA. Die BERA ist auch im HNO-ärztlichen Alltag von großer Bedeutung. Sie zeichnet sich durch einfache Durchführbarkeit, Genauigkeit und hohe Reproduzierbarkeit aus. Auch im Tierexperiment ist dieses Verfahren bei Mäusen weit verbreitet. In der Untersuchung wurde ein Nicolet Pathfinder 1 verwendet. Das verwendete Gerät wurde ursprünglich für den Einsatz beim Menschen konzipiert. Grundsätzlich spricht aber nichts gegen den Einsatz auch im Tierexperiment. Nachteilig war der Umstand, dass mit diesem Gerät neben Click Stimuli nur Reize bis zu einer Frequenz von 12 kHz generiert und abgeleitet werden konnten. Eine frequenzspezifische Messung der Hörschwelle in den basalen Anteilen der Mauscochlea war aus diesem technischen Grund nicht möglich. Auffällig waren die sehr hohen gemessenen Schwellen bei 4 kHz. Ähnlich hohe absolute Schwellenwerte bei niedrigen Frequenzen sind allerdings bei Mäusen, speziell auch des 129S6 Sv/Ev Inzuchtstammes, beschrieben, so dass nicht von einer fehlerhaften Messung ausgegangen werden muss. Hierbei sei auf vergleichbare Untersuchungen anderer Autoren in 129 S6/SvEv Mäusen verwiesen [56,58]. Im Rahmen der technischen Möglichkeiten waren die Ergebnisse mit dem Nicolet Pathfinder 1 jedoch stets gut reproduzierbar und das Gerät zeichnete sich durch eine hohe Zuverlässigkeit und Sensitivität aus. 3.3.2. Kritische Betrachtung des Mausmodel Auf die Problematik bezüglich der Auswahl der Tiere wurde bereits weiter oben eingegangen. Für Studien an KO-Tieren die sich mit der altersbedingten Degeneration der Cochlea beschäftigen sollten nach Möglichkeit nur Tiere verwendet werden, deren WT keinen langsam progredienten Hörverlust aufweisen. Aufgrund der Verfügbarkeit von KO-Mäusen sind solche Gedanken allerdings weitestgehend theoretischer Natur. Speziell für die NOS II gibt es KO-Mäuse von 2 Stämmen; den untersuchten 129S6 Sv/Ev (welcher zur Verfügung gestellt wurde und nicht kommerziell erhältlich ist) und den C57Bl6J (C57). Die C57 Tiere standen ebenfalls zur Verfügung und wurden anfangs 45 auch untersucht. Bei den C57-Mäusen ist aber eine rapide Degeneration der Cochlea beschrieben. Diese beruht auf einem definierten genetischen Defekt (Johnson et al., 1997). Die eigenen Vorversuche zeigten ebenfalls eine rapide Degeneration der C57 WT-Mäuse und der KO-Mäuse, was eine Differenzierung zwischen Genedefekt und NOS II Deletion unmöglich machte. Die C57 NOS II KO-Mäuse wurden daraufhin für ungeeignet erachtet. Zu Beginn der Arbeiten 2001 war der Stamm 129S6 Sv/Ev bezüglich seines Degenerationsverhaltens noch nicht untersucht. Erst 2005 lieferten Ohlemiller und Gagnon [56] grundlegende Daten hierzu, welche etwa zeitgleich erarbeitet wurden und sich mit den Ergebnissen in dieser Arbeit gut decken [56]. Eine mögliche Lösung für weitere Studien mit den vorhandenen NOS II KO-Mäusen stellen Rückkreuzungen dar. Durch Rückkreuzungen verschiedener Stämme konnte gezeigt werden, dass das rasche Degenerationsverhalten der Inzuchtstämme so verschwindet [58]. In der zitierten Arbeit wird ebenfalls auf die Lebenszeit der 129 S6/SvEv eingegangen. Während die Lebenspanne der Maus etwa 3 Jahre beträgt, endete der Beobachtungszeitraum in der vorliegenden Arbeit mit 14 Monaten. Eine Erweiterung des Beobachtungszeitraumes wäre für die Beurteilung der Rolle der NOS II vorteilhaft. Ebenso wichtig wäre eine Untersuchung der KO-Mäuse während der Embryonalentwicklung. Arnhold et Al. Zeigten, dass zwischen E14 und P6 die NOS II exprimiert wird und diese möglicherweise Einfluss auf die Differenzierung von Haarzellen und Neuronen nimmt [1]. 3.3.3. Einsatz von Immunhistochemie und REM Vorteilhaft hat sich die Verwendung verschiedener Techniken in der vorliegenden Arbeit erwiesen. Die BERA zeigte, dass am Ende des Beobachtungszeitraumes keine funktionellen Unterschiede zwischen KO- und WT-Mäusen mehr bestehen. Durch den Einsatz von Immunhistochemie und REM konnten jedoch deutliche Unterschiede bei der Bildung von ONOO- und dem Verlust äußerer Haarzellen aufgezeigt werden. Diese Ergebnisse lassen weitere Untersuchungen, beispielsweise Rückkreuzungen interessant erscheinen. Daneben wurde in der vorliegenden Arbeit erstmalig immunhistochemisch die Induktion der NOS II in der gesamten alternden Cochlea nachgewiesen. In einer vorausgegangenen Arbeit wurde lediglich die Induktion der NOS II im Spiralganglion von C57 Mäusen beschrieben [84]. Die Induktion der NOS II in Stützzellen, dem Spiralganglion und dem Ligamentum Spirale alternder Mäuse deutet auf eine Rolle während der Alterung hin. 46 4. Zusammenfassung Die vorgelegte Arbeit untersucht das Hörvermögen und die Altersdegeneration von Stickstoffmonoxidsynthase II (NOS II) defizienten Mäusen (sog. Knockout- oder KOMäuse). Die NOS II ist eine von 3 bekannten Stickstoffmonoxid-Synthasen (NOSynthasen). Das Besondere Merkmal der NOS II ist, ihre Fähigkeit unter pathologischen Bedingungen große Mengen NO zu synthetisieren. Eine übermäßige NO Bildung kann Zellschäden durch reaktive Metabolite wie z.B. Peroxinitrit (ONOO-) verursachen. Es werden aber auch protektive Eigenschaften von NO diskutiert. Die Untersuchung am Knockout-Modell sollte einen möglichen schädigenden oder schützenden Einfluss der NOS II Induktion auf die Altersdegeneration der Cochlea untersuchen. Bei den adulten KO-Tieren und Wildtypen wurde die Hörschwelle mittels BERA nach 2,6- und 12 Monaten bestimmt. Die Höruntersuchungen zeigten eine milde Hörstörung bei den adulten KO-Mäusen. Im Verlauf der Alterung wurde eine schnellere Abnahme des Hörvermögens bei den KO-Tieren beobachtet. Rasterelektronenmikroskopisch wurden strukturelle Schäden vornehmlich an äußeren Haarzellen der oberen Windung bei in diesen Tieren beobachtet. Zur weiteren Klärung wurden Schnittpräparate der Cochlea immunhistochemisch untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die NOS II nach 6 und 12 Monaten regelhaft in Wildtyptieren nachgewiesen werden kann. Zudem wurde immunhistochemisch eine vermehrte Bildung von Nitrotyrosin als indirekter Nachweis einer vermehrten ONOO- Bildung gefunden. Aus den Ergebnissen wird gefolgert, dass die NOS II Induktion wahrscheinlich ein protektiver Mechanismus im Rahmen der Altersdegeneration der Mauscochlea ist. 47 5. Literaturverzeichnis 1. Arnhold, S., Klinz, F. J., Bloch, W., Hess, A., Andressen, C., and Addicks, K. (1999) Selective expression of the NOS II isoform during mouse vestibulocochlear receptorgenesis. Eur.J.Neurosci. 11: 2187-2193 2. Arnhold, S., When, M., Labbe, D., Andressen, C., and Addicks, K. (2004) Transient expression of NOS-II during development of the murine enteric nervous system. J.Mol.Histol. 35: 741-748 3. Blottner, D. and Luck, G. (1998) Nitric oxide synthase (NOS) in mouse skeletal muscle development and differentiated myoblasts. Cell Tissue Res. 292: 293302 4. Busse, R. and Mulsch, A. 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Abbildungsverzeichnis Abbildung 1 : BERA-Hörschwellen in dB SPL ...................................................... 25 Abbildung 2: BERA, Hörschwellen Click-Stimulus ................................................. 26 Abbildung 3: BERA, Hörschwellen 4 kHz-Stimulus ................................................ 27 Abbildung 4: BERA, Hörschwellen 8 kHz-Stimulus ................................................ 28 Abbildung 5: BERA, Hörschwellen 12 kHz-Stimulus ............................................... 29 Abbildung 6: Verlust der äußeren Haarzellen. ...................................................... 31 Abbildung 7a und 7b: REM Ultrastruktur der WT und KO Tiere ................................. 32 Abbildung 8: anti-NOS II Färbung bei 12-14 Monate alten Wildtypen .......................... 35 Abbildung 9: Anti-Nitrotyrosin im Corti’sches Organ ............................................... 37 Abbildung 10: Anti-Nitrotyrosin im Spiralganglion .................................................. 38 Abbildung 11: Anti-Nitrotyrosin im Spiral Ligament und der Stria vascularis .................. 39 57 8. Lebenslauf Daniel Theodor Labbé Persönliche Daten: Geburtsdatum : Geburtsort : Staatsangehörigkeit: Konfession : Fremdsprachen: Verheiratet: Kinder: 21. November 1977 Unna, Westfalen deutsch katholisch Englisch, Französisch, Latein Sonja Weyers-Labbé Jakob André, * 31. Januar 2007 Helena Petronela * 05.Juni 2010 Schulbildung: Sept. 1984 – Juni 1988 Sept. 1988 – 1997 Juni 1997 Juli 1997 – Aug. 1998 Friedrich-Ebert Grundschule, Kamen Hermann-Ehlers Gesamtschule, Kamen Abitur Ersatzdienst im Städtischen Hellmig-Krankenhaus Kamen Hochschulstudium: April 1999 – Oktober 2004 März 2001 März 2002 September 2004 Oktober 2004 Oktober 2004 – Oktober 2005 06.12. 2005 Studium der Humanmedizin an der Universität zu Köln Ärztliche Vorprüfung 1. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung Studium der Humanmedizin an der RWTH Aachen praktisches Jahr am Elisabeth-Krankenhaus in Rheydt und am Maria-Hilf-Krankenhaus in Mönchengladbach mit Wahlfach Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde. Approbation als Arzt Klinische Tätigkeit: Dezember 2005 – Juni 2007 28. September 2011 Assistenzarzt HNO-Heilkunde an der Klinik für Hals-, Nasen-, Ohrenheilkunde und Plastische Kopf- und Halschirurgie der RWTH Aachen; Direktor Univ.-Prof. Dr. med. M. Westhofen. Assistenzarzt HNO-Heilkunde an der Klinik für Hals-, Nasen-, Ohrenheilkunde der Universität des Saarlandes in Homburg; Direktor Univ.-Prof. Dr. med. B. Schick. Anerkennung Facharzt für HNO-Heilkunde 06. Mai 2014 Zusatzbezeichnung Palliativmedizin Seit Juli 2007 Stipendien : Juni 2002 bis Juni 2003 Stipendium der Stiftung Maria Pesch zur Unterstützung der Dissertation. Unterschrift