Diss. ETH 5511

Research Collection
Doctoral Thesis
Die Bedeutung des RNS-abbauenden Enzymsystems für die
Anreicherung von 5'-Nukleotiden in zubereiteten Kartoffeln
Author(s):
Dumelin, Erich
Publication Date:
1975
Permanent Link:
https://doi.org/10.3929/ethz-a-000107266
Rights / License:
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Diss. ETH 5511
Die
Bedeutung des RNS-abbauenden Enzymsystems für die
Anreicherung
von
5'-Nukleotiden in zubereiteten Kartoffeln
ABHANDLUNG
zur
Erlangung
des Titels eines Doktors der technischen Wissenschaften
der
EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE
ZÜRICH
vorgelegt
von
ERICH DUMELIN
dipl. Ing. Agr. ETH
geboren
von
am 1.
April
1946
Hüttlingen (Kt. Thurgau)
Angenommen auf Antrag
von
Prof. Dr. J. Solms, Referent
Prof. Dr. H. Neukom, Korreferent
Juris Druck +
Verlag
1975
Zürich
ISBN 3 260 03960 0
für Ruth
und meine Eltern
Meinem verehrten Lehrer,
Herrn Professor Dr. J. Solms
danke ich fUr seine wertvollen
Ratschläge, Diskussionen
Mein besonderer Dank
Eidgenössischen Alkoholverwaltung, Bern,
die finanzielle
gilt
der
und
Anregungen.
fUr
Unterstützung.
Ferner danke ich:
den
Eidgenössischen Forschungsanstalten
Changins (VD)
und
Zürich-Reckenholz,
fUr Landwirtschaftlichen
für die
Beschaffung
der
Pflanzenbau,
Kartoffelproben,
sowie
allen Mitarbeitern des Instituts fUr Lebensmittelwissenschaft ETHZ, die mir bei
der
Ausführung
der
vorliegenden Arbeit behilflich
waren.
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-
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-
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-7-
Inhaltsverzeichnis
9
1.
Einleitung
2.
Literaturbesprechung
10
Vorkommen und
2.2.
Ribonukleinsäuren und Nukleotide
2.2.1.
Angriff
Bedeutung
von
von
13
Ribonukleinsäuren durch
2.2.1.1.
Einteilung
2.2.1.2.
Vorkommen,
und
10
5'-Nukleotiden
2.1.
Enzyme
Wirkungsweise
unter besonderer
der
Enzyme
3.
Angriff
Experimenteller
3.1.
3.2.
von
13
Berücksichtigung
18
der Kartoffeln
2.2.2.
13
Ribonukleinsäuren durch Säuren und Basen
20
21
Teil
21
Materialien
21
3.1.1.
Kartoffeln, Herkunft und
3.1.2.
Herstellung
3.1.3.
Testsubstrate für Enzyme
24
3.1.4.
Testenzyme
25
des
Sorte
21
Enzymextraktes
26
Methoden
3.2.1.
Bestimmung
der
Enzymaktivitäten
mit
spezifischen
26
Substraten
3.2.2.
26
3.2.1.1.
Ribonuklease
3.2.1.2.
Phosphodiesterase
I
3.2.1.3.
Phosphodiesterase
II
3.2.1.4.
Phosphatase
3.2.1.5.
Phosphatase
Bestimmung
der
29
30
und 5'-Nukleotidase
Enzymaktivitäten durch RNS-Abbau
3.2.2.1.
Gesamter RNS-Abbau
3.2.2.2.
Analyse
von
27
RNS-Abbauprodukten
31
32
32
33
-8-
3.2.3.
Bestimmung
der gesamten
Enzymaktivitäten
im
Kartoffelhomogenisaf
4.
3.2.4.
Intrazelluläre
3.2.5.
pH-Messungen
36
Lokalisierung
von
37
Enzymen
in frischen Kartoffeln
37
Resultate
4.1.
39
Charakterisierung
von
Enzymaktivitäten
mit
spezifischen
Substraten
4.2.
39
Charakterisierung
von
Enzymaktivitäten beim Abbau
Ribonukleinsäure
4.3.
Enzymaktivitäten
4.4.
Intrazelluläre
4.5.
pH-Werte
von
54
im
Kartoffelhomogenisaf
Lokalisierung
von
in der Kartoffelknolle
Enzymen
63
65
65
5.
Diskussion
71
6.
Zusammenfassung
78
7.
Literaturverzeichnis
80
-9-
1.
Einleitung
Kaum ein
Nahrungsmittel
wie die Kartoffel. Die
dene zunehmende
bezug
auf die
ben sich
Bedeutung
Schwierigkeiten
de dessen
Abhängigkeit
von
(3)
eine
so
Lebensgewohnheiten
zentrale
Stellung
ein
und die damit verbun¬
kuchenfertigen Erzeugnissen brachten jedoch
Farbe, Textur
in der
und
neutrale Flavor wird
in
Geschmacksbildung
jedoch sehr geschätzt,
der Kartof¬
und
so wur¬
Sorte, Wachstumsbedingungen, Reifegrad, Lagerung und
von
oft diskutiert. Neuere Arbeiten
sammengefasst bei NURSTEN
BURI
der
Ernährung
der Kartoffeln verschiedene Probleme mit sich. So erga¬
angenehme
Verarbeitung schon
unserer
Aenderungen
Veredelung
fel. Gerade der
nimmt in
und SHEEN
weist im besonderen auf die
(1),
zu
diesem Thema finden sich
zu-
sowie bei LIPSITS und SIKILINDA
(2).
nichtflüchtigen, niedermolekularen Inhalts¬
stoffe der Kartoffeln und ihre Bedeutung für den Flavor hin. Neben den freien Amino¬
säuren wurden dabei die
Zusammenhänge zwischen Geschmack
und Gehalt
kleotiden untersucht; denn schon früher zeigte sich ein relativ hoher
in zubereiteten Kartoffeln
Schwankungen
(4).
Dieser kann aber
unterworfen sein.
Untersuchungen
je
(6)
von
KLEIN
Die
vorliegende
Enzymsystem
Enzyme
RNS in genügender
über die
und der
Menge
Anreicherung
von
einem
von
Nukleotidgehait
Bildung
dieser Nukleotide
Kochprozesses durch
angereichert
werden
einen
(5). Nach Angaben
vorhanden.
Arbeit soll daher einen Ueberblick
der Kartoffelknolle und
gen. Dabei wird
gangen.
wäre
Abbau der RNS
5'-Nu¬
nach Herkunft und Sorte starken
Hessen die Vermutung aufkommen, dass sie während des
spezifischen, enzymatischen
an
geben über
Beziehungen zwischen
den
das RNS-abbauende
Eigenschaften
dieser
5'-Nukleotiden in zubereiteten Kartoffeln aufzei¬
Enzymextrakt als natürlich gegebenem Mischsystem
ausge¬
-
10-
Literaturbesprechung
2.
2.1.
Die
Vorkommen und
Speisequalität
Bedeutung
von
5'-Nukleotiden
Nahrungsmittels
eines
wird nach
Nährwert, Farbe, Textur, Be¬
kömmlichkeit, Aroma und Geschmack beurteilt. Aroma und Geschmack bilden die
Gesamtheit der für den Flavor verantwortlichen und erfassbaren Merkmale. In frü¬
heren Jahren hat sich das Interesse
vor
allem auf die flüchtigen Aromastoffe kon¬
zentriert, wobei deren Erforschung durch die Anwendung neuartiger Trenn- und
Identifikationsmethoden einen
Bearbeitung
ungeahnten Aufschwung
der Geschmacksstoffe wurde
siologischen Wert
genommen. Es
hingegen eher
mittelkomponenten
immer
auch direkt in
Unlösliche oder kolloidal
deutlicher,
Beziehung
zu
dass viele
Nahrungsmittel entscheidend beeinflussen,
grosse
Bedeutung besitzt,
Beurteilung
Für die
von
mit
gerade bei
der Kartoffel
geschmackliche
ist die Konzentration eines Geschmacksstoffes
gehört
die
in ihrer
Wirkung
und durch Interaktionen abschwächen oder verstärken. Be¬
geschmacklichen Eigenschaften
die als sogenannte Geschmacksverstärker wirken können. Zu den
zu
wie z.B. die
Bedeutung. Zudem können sich Geschmackskomponenten
sonders interessant sind dabei die
oder ihrer
sind.
einbezogen (7).
überlagern, überdecken
Nukleotide
wichtig
Da sie aber die Textur
werden Einflüsse dieser Stoffe oft in die
Geschmackswahrnehmung
grosser
und diese
vor¬
nichtftüchtige Nahrungs¬
Substanzen,
Stärke, können kaum Geschmacksempfindungen hervorrufen.
der
phy¬
flüchtige Aromastoffe
ihrem Geschmackswert
meist hochmolekulare
gelöste,
Die
im Hinblick auf ihren
oder auf ihre Rolle als Precursoren für
zeigte sich aber
(1).
genommen hat
Eigenschaft,
der
5'-Nukleotide,
Eigenheiten
dieser
dass sie im Konzentrationsbereich ihres Vorkommens
Anwendung keinen wahrnehmbaren Eigengeschmack aufweisen. Bei Zugabe
Fleisch- oder
GemUsegerichten vermögen
sie aber den Flavor des
Nahrungsmittels
-11
stark
zu
steigern und
bei einer
Mischung
das 10 bis 15fache
von
zudem
Wirkung
Glutamat durch eine
ist besonders ausgeprägt
erniedrigt,
0,01-proz. 5'-IMP-Lösung
um
und anderseits der Geschmacksschwellenwert
von
5'-IMP und 5'-AMP durch eine
herabgesetzt (9).
Diese
Glutamat und 5'-Nuk!eofiden. So wird einerseits der Ge¬
von
schmacksschwellenwert
(8).
verbessern
zu
-
Diese
0,1-proz. Glutamatlösung
um
das Hundertfache
Verstärkung zeigt jedoch keinen linearen Verlauf
temperaturabhängig. Geschmacksverstärkende Eigenschaften
Nukleotiden aber auch in Kombination mit anderen Aminosäuren
und ist
kommen den
(10),
zu
ganz
(11).
besonders bei Kartoffeln
Nukleotide sind chemisch recht stabil und werden bei normalen Koch- und Lagerungs¬
bedingungen nicht
verändert. Sterilisationsverluste
sehr niedrigem
eintreten
pH
(bei
(12). Grosse Verluste können
len Lebensmitteln vorkommenden
Phosphomonoesterasen
störung dieser Enzyme ist daher bei technologischer
eine
vorangehende Erwärmung
Nachdem 1960 in
auf 75
Japan erstmals
ribonukleotiden und
120
vor
allem durch die in vie¬
verursacht werden. Zur Zer¬
Anwendung
von
5'-Nukleotiden
85 C erforderlich.
-
eine
C) können hingegen bei
geschmacksverstärkende Mischung
Mononatrium-1-glutamat
zum
Verkauf
erschienen in der Folge zahlreiche wissenschaftliche
angeboten
Arbeiten,
von
5'-Purin-
wurde
(13),
die über das Vorkommen
und Verhalten der 5'-Nukleotide in Lebensmitteln berichten. Die meisten Veröffent¬
lichungen befassen sich aber
und anderen Materialien
Nach SHIMAZONO
muster in vier
und
mit tierischen Produkten und
(12,
(12)
14
Gruppen eingeteilt.
Der
aus
Verbindung, freigesetzt
allem Nukleotide, die
hauptsächlich
am
von
nur
wenige
mit
pflanzlichen
20).
werden die
Adenosinnukleotide, welche
vorhandenen
-
Nahrungsmittel nach
dem
Nukleotidverteilungs-
Fleischtyp (1. Gruppe) enthält
ATP, einer
in Gewebe
werden. Der
vom
vor
allem Inosin-
"Energietyp" reichlich
Pflanzentyp (2. Gruppe) enthält
vor
Uridinderivaten abgeleitet sind. Die Nukleotide sind hier
Aufbau und Umbau der Zucker und
Polysaccharide beteiligt;
man
-12-
spricht daher eher
Pilze. Die Milch
vom
Stoffwechselt/p.
(3. Gruppe)
nimmt eine besondere
ist aber besonders reich
wenig Nukleotide,
gehören
Dazu
an
Stellung
Orotsäure,
Pyrimidinnukleotide. Beim Autolysaftyp (4. Gruppe)
allem Gemüse und
vor
ein. Sie enthält
nur
dem Precursor der
werden die Nukleotide durch
autolvtischen Abbau der RNS freigesetzt. Besonders bekannt ist dafür die Nu-
kleotidanreicherung
Die
Untersuchungen
in Shii-take
(21).
der niedermolekularen Inhaltsstoffe in
zeigten einen überraschend hohen Gehalt
dadurch im
besondere
pflanzlichen Bereich
Stellung
zwischen den
der RNS
der
neben dem bereits erwähnten Shii-take Pilz eine
nichtfluchtigen Inhaltsstoffen
(11). Nach
Nahrungsmittel, bei denen
freigesetzt
5'-Nukleotiden. Kartoffeln nehmen
ein. Anhand rekonstituierter Extrakte konnten die
toffeln deutlich gezeigt werden
Gruppe
an
gekochten Kartoffeln
werden.
und der
BURI
Beziehungen
Geschmacksqualität der
(5) gehören
Kar¬
die Kartoffeln
zur
die Nukleotide durch autolvtischen Abbau
-
2.2.
13
Ribonukleinsäuren und Nukleotide
2.2.1. Angriff
2.2.1.1.
Ribonukleinsäuren durch Enzyme
von
Einteilung
und
Wirkungsweise
der Enzyme
RNS-abbauende Enzyme lassen sich wie
bei die Einteilung gemäss den
gewählt
wurde
zubauen. Dazu
Oligo-
wo¬
Enzymkommission
und Mononukleotide ab¬
Ribonukleasen
(3.1.4.)
Phosphodiesterasen
(3.1.4.)
Nukleasen
(3.1.4.)
Polynukleotid-Phosphorylasen
(2.7.7.)
Dazu
Sie
die Nukleotide in Nukleoside und
spalten
gehören:
5'-Nukleotidasen
(3.1.3.)
3'-Nukleotidasen
(3.1.3.)
Phosphatasen
(3.1.3.)
Ribose-1-phosphat
folgenden
Hauptgruppen einteilen,
der Internationalen
gehören:
Nukleosid-spaltende Enzyme.
Im
Empfehlungen
in drei
Sie vermögen die RNS in
Nukleotid-spaltende Enzyme.
Orthophosphat.
folgt
(22).
RNS-spaltende Enzyme.
oder
-
Sie
spalten
und Purin- bzw.
die Nukleoside in die
Pyrimidinbasen.
Dazu
gehören:
N-Glykosidasen
(3.2.2.)
Nukleosid-Phosphorylasen
(2.4.2.)
werden die einzelnen
Endprodukte Ribose
Enzyme eingehender besprochen.
-14-
NH2
Figur
Die
1:
Primärstruktur der RNS
Ribonukleasen
oder Purin-Nukleotidrests eines
Pyrimidin-
des benachbarten Nukleotids auf die
Nukleotids
unter
einen Transfer-Mechanismus und wurden daher
Nukleotidyl-Transferasen zugeordnet (23).
früher den
eines
katalysieren
unter
Auflösung
Bildung
des
eines
zyklischen
spezifisch
aus
zu
einer
3'-Phosphat
5'-Stellung
oder Purin-
In einem zweiten Schritt wird
Diesters das 3'-Nukleotid
sie heute
das
der
2'-Stellung desselben Pyrimidin-
diesterasen, wobei klassische Ribonukleasen als
(22).
übertragen
Polynukleotids
zyklischen Nukleotids.
Bindung spaltende Enzyme gehören
sind
Sie
gebildet. Als Internukleotid-
speziellen Gruppe
Endoenzyme
von
Phospho¬
wirken und sehr basen¬
-15-
Phosphodiesterasen
spalten,
wobei ihre
sind
Enzyme
Spezifität aber nicht
zeigen auf Oligonukleotide
Sie
die
stets
Phosphorsäurediester hydrolytisch
auf Nukleotidderivate beschränkt ist.
Exoenzymaktivität
Zuckerspezifität
auf. Eine
nicht erkennbar.
Aufgrund ihrer Substratspezifität
in drei
setzen. Sie
welche
Phosphodiesterasen,
an
-
und
I
partielle
nukleotidartigen Substraten
und
Produktbildung
werden sie
welche
zum
Typ
der
Oligonukleotid 5'-Mononukleotide
dem Ende des
an
Oligonukleotids
an,
des Zuckeranteils aufweist und
frei¬
das eine
gehören
zum
(Schlangengift-Typ),
aus
greifen gewöhnlich
gehören
einem
3'-Hydroxylgruppe
Typ der Phosphodiesterase
setzen. Sie
aus
greifen gewöhnlich
nicht veresterte
-
nur
Typen aufgeteilt (24, 25):
Phosphodiesterasen,
-
ist bei
Basenspezifität
und weisen
einem
am
Oligonukleotid 3'-Mononukleotide
freien
5'-Hydroxyl-Ende
Phosphodiesterase
Phosphodiesterasen, welche zyklisch
veresterte
II
frei¬
des Zuckeranteils
(Milz-Typ),
Nukleosidphosphate hydrolisieren.
Wobei eine weitere Unterteilung vorgenommen wird in:
3',5'-zyklische Phosphodiesterasen (Produkte: 5'-Nukleotide)
2',3'-zyklische Phosphodiesterasen (Produkte: 3'-Nukleotide)
Die
Nukleasen
hydrolytisch
zu
gehören ebenfalls
spalten
Pentosebausteine auf und sprechen
tur
an.
zu
den
vermögen. Sie weisen
vor
Zudem weisen sie oft Exo- und
Endoenzymaktivität
Phosphodiesterasen bezeichnet werden,
Diester
(27).
jedoch
die
Phosphorsäurediester
eine zusätzliche
für
Spezifität
allem bei DNS-Substraten stark auf die Struk¬
nicht trennbarer Weise mit anderen Enzymen
als
Enzymen,
auf und sind in bisher
gekoppelt (26).
denn diese
Sie sollten daher nicht
spalten definitionsgemäss
nur
-16-
Den
Polynukleotid-Phosphory
grosse
wird
Bedeutung zugeschrieben (28). Doch haben
phosphat
von
RNS auch Nukleotide
den vermögen
am
vor
(29, 30, 31).
Je nach
Abbau der RNS beteiligt.
abzuspalten
und
Bedingungen
allem für die
neuere
Polynukleotid-Nukleotidyltransferasen
dass diese als
oder
lasen
RNS-Synthese
Untersuchungen gezeigt,
in Anwesenheit
von
Ortho-
Nukieosiddiphosphate
sind sie daher
an
der
zu
bil¬
Synthese
Spezifische Untersuchungen beschränkten
sich
aber bisher auf Mikroorganismen.
Die 5'-Nukleotidasen
monoesterasen und
entsprechende
katalysieren
Nukleosid und
eine erhebliche
gehören
Bedeutung
den
zu
den streng
spezifischen
Orthophosphat.
in der
Analytik
substratspezifischen Phospho¬
Abbau
Sie haben
von
5'-Nukleotiden in das
von
aufgrund ihrer Spezifität
Nukleinsäuren und ihrer Abbau¬
produkte erlangt.
Die
3 '-Nukleotidasen
monoesterasen,
Gegensatz
zu
gehören ebenfalls
katalysieren jedoch spezifisch
zu
die
Hydrolyse
den 5'-Nukleotidasen scheinen sie streng
Unterteilung
esterasen
erfolgt
der
am
gruppenspezifischen Phosphatasen
der Tradition
So wird unterschieden in
che
von
saure
entsprechend
nach dem
oder alkalische
3'-Nukleotiden. Im
spezifisch
Derivate, benötigen sie doch eine freie 2'-Hydroxylgruppe
Eine
spezifischen Phospho¬
den streng
zu
sein auf RNS-
Zuckerrest
oder
(32).
Phosphomono¬
pH-Optimum ihrer Wirkung.
Phosphatasen,
die aber alle die
systematische Bezeichnung Orthophosphomonoester-Phosphohydrolasen
glei¬
tragen
(22).
-17-
Die
Nukleosidasen
die
entsprechende Base.
ergab,
sich später
spalten
die Nukleoside
hydrolytisch
Sie sind in ihrer Aktivität schon
mussten sie
jedoch
zum
Teil den
vor
in die Pentose und
lange bekannt (33).
Wie
allem in Tieren und Mikro¬
organismen weit verbreiteten Nukleosid-Phosphorylasen zugeteilt werden (34).
Nukleosid-Phosphorylasen
Anwesenheit
phosphat
an
von
Orthophosphat
verestert wird. Das
der Reaktion direkt
insofern eine besondere
der
Orthophosphat
zu
am
Stellung ein, als
RNS-Abbau direkt
den Reaktionsverlauf
wandlung
von
der Zuckeranteil
ist dabei also nicht
Mydrolasen.
den
Nukleosidsynthese beteiligt
Neben den
lösen, wobei
zu
N-glykosidische Bindung
Zwischenprodukten
bilden die
lytische Abspaltung
Aminogruppe
Spezifität bezüglich
es
ist
von
Aminopurinen
oder
Verknüpfung
Enzyme
oder Um¬
welche durch
-pyrimidinen
um
Enzyme
Eine
hydro¬
Veränderun¬
mit hoher
Bedeutung, ob diese in freier Form oder als
(-sid) gebunden vorliegt (36). Weit verbreitet
deaminasen
(37),
während der
Fleischreifung durch Desaminierung
die in der Lebensmittelchemie
aktivere 5'-IMP umzuwandeln vermögen
weitere
Reaktionsgleichgewicht entziehen.
gen der Basen bewirken können. Es handelt sich dabei meist
der Base;
in die Klasse
(35).
N ukl eodeaminasen,
in
sondern
je nach Reaktionsbedingungen auch
indem sie durch erneute
diese dem
Pentose¬
Aktivator,
beteiligten Enzymen können noch
beeinflussen,
der
sie
in
nur
Sie nehmen im RNS-Metabolismus
sein können
Gruppe solcher Enzyme
Nukleotid
zum
beteiligte Komponente. Diese Enzyme gehören
der Transferasen und nicht
an
vermögen die
(12).
vor
sind tierische Adenosin-
allem bekannt sind, weil sie
das 5'-AMP in das
geschmacks¬
-18-
2.2.1.2.
Einige
Vorkommen,
der
RNS-Abbau
am
untersucht oder zumindest
(39)
PITT
Die
men.
hat die
besonderer
unter
beteiligten Enzyme
der Kartoffeln
wurden auch in Kartoffeln schon
nachgewiesen.
Anreicherung
Aktivitätsmessungen
Ribonukleasen kommen
Berücksichtigung
einer
Ribonuklease
wurden dabei bei
praktisch
aus
Kartoffeln vorgenom¬
pH 5,0 durchgeführt.
in sämtlichen lebenden Zellen
vor.
tersucht ist die Rinder-Pankreas-Ribonuklease, die auch als erstes
Primärstruktur bekannt
(40). Einige
war
nukleasen weisen eine sehr hohe
In Kartoffeln wurden auch
sen.
Das
pH-Optimum
aber
am
praktisch überall
eingehendsten
Identifizierung
ihrer Aktivität
vor.
(47,
Die zwei
55
-
von
pH-Optima
auf
liegt
im Bereich
nachgewiesen
Schlangengift-
Die
in
von
Charakterisierung
von
in ihrer
-
46).
Typen nachgewie¬
pH 4,5
-
9,3 (47
-
51).
Schlangengift (52),kommen
Milzphosphodiesterasen
und die
untersucht worden und werden oft als
und
(41
Enzym
un¬
pflanzlichen Ribo¬
aller drei
Phosphodiesterasen
pflanzliche Phosphodiesterasen
auf
Temperaturstabilität
wurden erstmals
Phosphodiesterasen
der bisher bekannten
Am besten
analytische Hilfsmittel
Nukleinsäuren verwendet
weisen ebenfalls eine hohe
sind
zur
(53, 54), Einige
Temperaturstabilität
58).
BJOERK
zwischen
(59)
pH 5,2
aus
-
6,1
über 60 C rasch inaktiviert. Die
erleidet bei einem
Kartoffeln isolierten E ndonuk leasen
pH-Optimum
resp.
von
von
pH 6,0
-
7,0 auf und werden bei
NOMURA et al.
weisen
Temperaturen
(60) beschriebene Endonuklease
pH 7,0 nach 30-minütiger Vorerwärmung bei
-19-
54 C keine
Aktivitätsverluste,
Am besten bekannt ist die
bereits einige weitere
wird aber bei 83 C rasch inaktiviert.
Staphylokokken-Nuklease (61),
pflanzlichen
Aus Kartoffeln wurden bisher auch zwei
es
aber noch nicht
gelungen ist,
Phosphatase abzutrennen.
Enzym
eine
zweiten
So
diese
zeigt das
gemischte Aktivität bei
Aktivitäts-Optimum
bei
5 '-N ukl eotidasen
völlig
von
einem
von
einem zweiten
von
KORNBERG und PRICER
pH-Optimum
pH 9,4 zeigt
dieses
eine
Optimum bei pH 9,3 grössere
pH 5,0. Bei
Enzym jedoch
eine
einem
spezifische
p-Nitrophenylphosphat
und
Aktivität auf 3'-Nukleotide, aber
p-Nitrophenylphosphat.
praktisch vollständige Inaktivierung
Vorerwärmung bei
von
(64) isolierte
(65) isolierte 5'-Nukleotidase hingegen zeigt bei
KLEIN
ebenfalls keine Aktivität auf
isoliert, wobei
einer 3'-Nukleotidase oder
5'-Nukleotidase-Wirkung, aber keine Aktivität auf
3'-Nukleotide. Die
doch wurden auch
Nukleasen eingehender untersucht (62, 63).
NOMURA et al.
(60) zeigen
der 5'-Nukleotidase durch eine
30-minütige
54 C.
Entdeckt wurden die 5'-Nukleotidasen zuerst in tierischen Geweben und in Schlan¬
gengift (66, 67).
Die Aktivität der 3'-Nukleotidase
ist bei
Kartoffeln,
wie auch bei
einigen
anderen Pflanzen, eng verbunden mit der 5'-Nukleotidase. Das Enzym weist aber
eine höhere
Temperaturstabilität
Temperaturen
um
80 C inaktiviert
Das Vorkommen dieser
sie schon
aus
auf und wird bei schwach alkalischem
Enzyme
pH
erst
bei
(60).
ist bei Tieren bisher nicht klar
verschiedenen Pflanzen isoliert
(68).
bewiesen; doch
wurden
-20-
Phosphatase
Die
bekannt
schen 5,0
(69).
-
Sie wurde auch
Isoenzyme (71)
sind sehr weit
Enzyme
nur saure
eingehender untersucht
Phosphatasen
oder mehrere
von
Optimum
2.2.2.
es
sich dabei
(72) handeln
dass in
von
Säurehydrolyse
zur
fuhrt
die Aktivität
(73)
von
N uk leosidasen
vorgenommen. Das
weist bei einem
zur
Abspaltung
Freisetzung
durchwegs
es zur
Zellen
pH-Optimum
von
in Kartoffeln
nachgewiesene AdenosinpH 4,1
-
4,6
ein
Temperatur-
Ribonukleinsäuren durch Säuren und Basen
Hydrolysetemperaturen
kommt
muss.
pflanzlichen
Ribonukleinsäuren können durch Säure und Alkali angegriffen werden
führt
min¬
um
50 C auf.
von
Angriff
zuspalten;
lange
zeigt pH-Optima zwi¬
Formen
es,
und schon
vorkommen.
REES und DUNCAN
spaltende Enzymsystem
multiple
verbreitet, doch scheint
Spezifische Untersuchungen über
wurden
und
Enzym
5,8 (70). Neuere Untersuchungen zeigen, dass
destens zwei
Diese
in der Kartoffel ist ein stark aktives
zur
der
erforderlich. Eine
von
sind höhere Säurekonzentrationen und
Behandlung
der Ribonukleinsäuren mit Alkali
2'- und 3'-Nukleotiden. In einem ersten Schritt
Bildung zyklischer 2',3'-Nukleotide,
werden können.
Eine
der Basen. Die Purine sind besonders leicht ab¬
Pyrimidine
Freisetzung
(38).
die anschliessend weiter
gespalten
-21
3.
-
Experimenteller Teil
3.1.
Materialien
3.1.1.
Kartoffeln, Herkunft und Sorte
Für die
enzymatischen Untersuchungen
wurden Kartoffeln der Sorte
landwirtschaftlichen Schule Rutti-Zollikofen verwendet. Für die
wurden Kartoffeln der Sorten
schungsanstalt Changins
bei 4 C,
3.1.2.
Herstellung
des
halt
von
0,002
M
wurden nicht verwendet.
enzymatischen
18,6 Prozent wurden
Cystein enthaltend,
Aktivitäten mit Hilfe
g
spezifischer Substrate
geschälte Kartoffeln
mit 1000 ml Na-Citrat-Puffer
in einem
eisgekühlten
und der Ueberstand
wurde in 80 ml desf. Wasser
gelöst
und
am
Mixer
x
100
cm) aufgetragen.
Extinktion bei 280
Stockholm)
nm
mit einem TS-Ge-
homogenisiert.
gefriergetrocknet.
Das Homo¬
Das erhaltene Pul¬
Vakuum durch eine G 3 Glasfilter-
Sephadex
G-25 M
Es wurde mit bidest. Wasser eluiert und die
kontinuierlich mit Hilfe eines Uvicords II
gemessen und
wurde
(0,05 M, pH 6,0),
nutsche abfiltriert. Die Lösung wurde in 2 Portionen auf eine
(5
pH-Untersuchungen
Enzymextraktes
genisat wurde zentrifugiert
Kolonne
der
und Maritta durch die landwirtschaftliche For¬
vorgereinigter Extrakt hergestellt. 100
ein
von
Verfügung gestellt. Die Lagerung der Kartoffeln erfolgte
zur
Keimhemmungsmittel
Zum Nachweis der
ver
Bintje
Bintje
aufgezeichnet.
Das Elutionsbild ist in
(LKB Producter,
Figur
2
dargestellt.
22
ri
i
800
400
Figur
2:
Fraktionierung
i
i
1200
i
i
1600
des Rohextraktes
von
2000
Kartoffeln
an
i
i
2400
Sephadex
2800
ml Eluat
G-25 M
Elutionsmittel: bidest. Wasser
Es wurden 4 Peaks
die Aktivität der
gaben,
hielten
waren
vor
erhalten; diese
wurden
gesammelt, gefriergetrocknet
RNS-angreifenden Enzyme geprüft. Wie
die
und auf
Untersuchungen
alle Aktivitäten im Peak I konzentriert. Die weiteren Peaks
allem
Polyphenole, Aminosäuren, Salze
er¬
ent¬
und weitere niedermolekulare
Inhaltsstoffe, aber keine enzymatisch aktiven Substanzen.
-23
-
Die verwendeten Kartoffeln, der Kartoffelextrakt und der getrocknete Enzym¬
extrakt wiesen die in Tabelle 1 zusammengestellten
Proteingehalte auf.
nach
nach
KJELDAHL
(N
x
2000
Rohextrakt, Ueberstand
1860
Rohextrakt, Sediment
140
Enzymextrakt (Peak I)
790
Proteingehalte
(mg/100
g
Pulver.
betrug
65
(75)
755
Kartoffeln und Kartoffelextrakten
frische Kartoffeln)
Der nach POTTY bestimmte
Peak I
von
POTTY
6,25)
Kartoffelknolle
Tabelle 1:
(74)
Proteingehalt
Prozent, bezogen
des
angereicherten Enzymextraktes
auf das nach der
von
Gefriertrocknung erhaltene
-24-
3.1.3.
Testsubstrate für Enzyme
Für die
spezifischen Bestimmungen
der
Enzymaktivitäten
wurden die
Substrate, alles reinste Produkte des Handels, verwendet:
-
Cytidin-2',3'-cyclophosphat Bariumsalz (cycl. 2',3'-CMP)
(C9HnN307P)2Ba
-
MG:
(ot-N-TMP)
C20H20N2Na°8P
MG:
470'3
2'-Desoxythymidin-3 '-phosphorsäure-4-nitropheny lester
Ammoniumsalz
(TMP-PNP)
C16H21N4°10P
MG:
4-Nitrophenylphosphat
C6H4NNa206P
-
m3
2'-Desoxythymidin-5'-phosphorsäurenaphthyl-(l)-ester
Natriumsalz
-
34°'2
(PNP-TMP)
C16H21N4°10P
-
MG:
2'-Desoxythymidin-5'-phosphorsäure-4-nitrophenylester
Ammoniumsalz
-
745,7
Bis-(4-nitrophenyl)-phosphat (BiPNPP)
C12H9N2°8P
-
MG:
+
6
Dinatriumsalz
H20
Adenosin-5'-monophosphorsäure
C10H12N5Na2°7P
460'3
(PNPP)
MG:
Dinatriumsalz
MG:
371,1
(5'-AMP)
391'2
folgenden
-25-
Für die
Aktivitätsmessungen
wurden die
folgenden Puffersysteme gewählt (76):
Na-Citrat/HCI
Na-Citrat/NaOH
Imidazol/HCI
Na-Borat/HCI
Glycin/NaOH
3.1.4.
Testenzyme
FUr die
spezifischen Bestimmungen
Alkalische
Phosphatase
aus
wurden die
Escherichia coli
folgenden Enzyme
(25 U/mg),
Boehringer, Mannheim
5'-Nukleotidase
aus
Crotalus adamanteus
Sigma Chemical Company,
St. Louis, USA
(115 U/mg Protein),
verwendet:
-26-
Methoden
3.2.
3.2.1.
Bestimmung der Enzymaktivitäten
3.2.1.1.
Die
Ribonuklease
Bestimmung
Hilfe
von
spezifischen Substraten
mit
der Ribonuklease-Aktivität wurde nach CROOK et al.
(77)
mit
cycl. 2',3'-CMP durchgeführt.
Bei kontinuierlicher
Messung
der Reaktion wurden im
(Perkin-Elmer 402) zweimal 2,8 ml
einer
0,01
-proz.
Zweistrohlspektrophotometer
gepufferten Substratlösung
in
QuarzkUvetten in einem thermostatisierten Küvetrenhalter vorgelegt. In eine
KUvette wurden
0,2 ml einer 0,8-proz. Extraktlösung gegeben,
0,2 ml dest. Wasser. Die
von
der Zeit
Extinktionsänderung wurde bei 284
in
Abhängigkeit
aufgezeichnet.
Bei diskontinuierlicher
Messung
Puffer mit 0,1 ml einer
0,8-proz. Extraktlösung inkubiert.
mit
nm
in die andere
wurden
0,2 ml 0,3-proz. Substratlösung und 0,5 ml
0,5 ml 20-proz. Trichloressigsäure abgestoppt,
verdünnt und die
Extinktionsänderung
bei 284
Prozenten der grössten gemessenen Aktivität
nm
Nach 30 Minuten wurde
in der Kälte
zentrifugiert,
1
:
gemessen. Die Werte wurden in
angegeben.
3
-27-
NH,
CH,OH
Figur 3: Spaltung
der
Esterbindung
in
2'-Stellung
von
cycl. 2',3'-CMP durch
Ribonuklease
3.2.1.2.
Wegen
und der
die
Phosphodiesterase
der
Bedeutung
I
dieser
Enzymwirkung
problematischen Spezifität
Bestimmung
der
zur
für die Freisetzung
von
der Aktivitäten nach drei verschiedenen Methoden
Es wurden dabei die
folgenden Substrate
5'-Nukleotiden
Verfügung stehenden Substrate, erfolgte
verwendet:
(25, 49, 50).
-28-
o,n-/
y-o-r-o-f
\-no,
BiPNPP
OH
oc-N-TMP
CH,
CHr-O-P-O—^
sS^H^
y^V
OH
V-NO,
^^
PNP-TMP
OH
Figur 4: Spaltung
von
BiPNPP, oc-N-TMP und PNP-TMP durch Phosphodiesterase I
-29-
Für die
mit BiPNPP und PNP-TMP wurden
Aktivitätsmessungen
lösung (8 mM/ml)
und
0,5 ml Puffer
inkubiert. Nach einer Reaktionszeit
gabe
von
2 ml 0,5 N NaOH. Das
0,1 ml
mit
von
einer
0,2 ml Substrat¬
0,05-proz. Extraktlösung
30 Minuten wurde
abgestoppt
freigesetzte p-Nirrophenol (PNP)
alkalischen Milieu bei einer Wellenlänge
von
405
nm
direkt
durch Zu¬
konnte im
photometrisch
be¬
stimmt werden.
Bei den Aktivitätsmessungen mit oc-N-TMP wurden die
einer
0,025-proz. Extraktlösung während
enthielt zusätzlich 1 Prozent
einer modifizierten Methode
eisgekühlt. Nach
geben
5 Minuten wurden
mit
Substratlösung
und 1 Prozent Aethanol. Nach
SELIGMAN et al.
0,5 ml 1,5-proz. Na-Laurylsulfat in 1 M
und
30 Minuten inkubiert. Die
Dimethylformamid
von
gleichen Ansätze
(78)
wurden die Ansätze mit
Glycin/NaOH-Puffer pH 9,2 abgestoppt
0,5 ml 0,1-proz. Diazoechtblau B beige¬
und nach weiteren 10 Minuten mit 2 ml
Dimethylformamid
verdünnt. An¬
schliessend wurden die Proben während 10 Minuten auf 50 C erwärmt. Nach 30 Mi¬
nuten konnte der
durch das freigesetzte
oc-Naphtol (cc-N)
gebildete Farbstoff photometrisch bei 590
3.2.1.3.
Den
Phosphodiesterase
Untersuchungen
von
TMP-PNP bestimmt. Die
diesterase I-Aktivität
0,4 Prozent
nm
bestimmt werden.
II
RAZZELL
(25) entsprechend
Messungen
wurden wie bei der
durchgeführt, jedoch
verwendet.
und das Diazoechtblau
wurde diese Aktivität mit
Bestimmung
der
Phospho¬
wurde eine Extraktkonzentration
von
-30-
•CH,
^^
H*
II
S*f^n
•
CHtOH
y
pi
°iK>°Figur
5:
3.2.1.4.
Spaltung
TMP-PNP durch
Phosphodiesterase
zur
schen Spaltung
diesterase I
Bestimmung
von
PNPP
beschrieben,
der
(79).
Phosphatase-Aktivität beruht
Die
Messungen
1°
OH
6:
Spaltung
von
wurden
vorgenommen. Es wurde
verwendet.
•=\
Figur
II
Phosphatase
Die Methode
losung
von
PNPP durch
Phosphatase
analog
jedoch
eine
auf der
enzymati-
wie bei
Phospho¬
0,0125-proz.
Extrakt¬
-31
3.2.1.5.
Phosphatase
und 5'-Nukleotidase
Bestimmung erfolgte
Die
mit 5'-AMP als
5'-Nukleotidase als auch durch die
kann. Der Abbau setzt sich daher
Eine
die
-
Substrat, wobei
dieses sowohl durch die
unspezifischere Phosphatase gespalten
aus
den Aktivitäten beider
Bestimmung der spezifischen 5'-Nukleotidase-Aktivität
Phosphatase abgetrennt
KLEIN
(6) entsprechend,
oder total
setzte
20-proz. Trichloressigsäure.
folgende,
Zur
Messung
abgestoppt
des
nur
durch
versetzt.
sulfonsäure-Lösung zugegeben
und
Natriumhydrogensulfit
sorgfältig verrieben,
sung in dest. Wasser
hergestellt.
Das
1 ml
von
freigesetzten Orthophosphates (P.)
(80)
Amino-naphthol
Wellenlänge
werden 2 g
von
660
zum
Reagens
gemessen. Für
l-Amino-2-Naphthol-4-
und 12 g Natriumsulfit
und
nm
(wasserfrei)
ist im Kühlschrank 1 Woche halt*"".
Vi
.
«
OH
Figur
7:
Spaltung
von
OH
5'-AMP durch
in
Gebrauch wird eine 2,5-proz. Lö¬
00
1
zur
2,5-proz.
NH,
HO—f- O-CH,
0,2 ml
wird sofort gut durchmischt. Nach weiteren
es
Amino-naphthol-sulfonsäure-Lösung
einer Reibschale
von
Zugabe
Nach 20 Minuten wird 0,1 ml
10 Minuten wird die Extinktion bei einer
g
wenn
Extraktlö¬
modifizierte Methode nach FISKE und SUBBAROW
Ammoniummolybdatlösung
Sulfonsäure, 12
möglich,
0,4-proz.
Anwendung. Dabei wird 1 ml Probe mit je 1 ml 2 N H.SO, und 1 ml
die
zusammen.
zusammen aus
ml Puffer und 0,1 ml einer
Reaktion wurde nach 30 Minuten
sung. Die
ist
werden kann. Der Methode
sich der Reaktionsansatz
5'-AMP-Lösung (25 mM/ml), 0,5
kam die
gehemmt
Enzyme
werden
Phosphatase
und 5'-Nukleotidase
-
-32-
Bestimmung
3.2.2.
Enzymaktivitäten durch RNS-Abbau
der
Gesamter RNS-Abbau
3.2.2.1.
Zur Bestimmung der gesamten
nukleinsäure purum
Enzymaktivitäten
(Fluka A.G., Buchs)
100 g RNS wurden in 500 ml Wasser
ein fünffaches Volumen
an
gebildete Niederschlag
mit
Wasser-Eisessig (1
Niederschlag
nm
gelöst (pH
mehr festzustellen
war.
Die Bestimmung des RNS-Abbaus
de, wie dies
in
Figur
gelöst,
und der
gelassen.
abgesaugt, zweimal
Relnigungsprozess
Der
wurde
nennenswerte Extinktion
Schliesslich wurde der Niederschlag mit abso¬
gespült
und
getrocknet.
erfolgte nach ANFINSEN
der säurelöslichen
et
al.
(81) durch
Abbauprodukte nach Ausfällung
die Gesamtaktivität der RNS-abbauenden
8 schematisch
wurde
96-proz. Aethanol gewaschen.
gefällten Probe keine
lutem Aethanol und zuletzt mit Aether
Perchlorsäure, wobei
und 15 Minuten stehen
und dreimal mit 20 ml
im Ueberstand einer
quantitative Bestimmung
7,0). Anschliessend
unter
wurde Über einem Büchnertrichter
wurde sodann in 400 ml Wasser
wiederholt, bis
bei 260
5)
:
folgt vorgereinigt.
verwendet und wie
Eisessig zugegeben
Der
durch RNS-Abbau wurde Ribo¬
mit
Enzyme erfasst
wur¬
dargestellt ist.
-OH
"OH
HO
Phosphodiesterase
Figur
8:
II
Angriffsstellen
Ribonuklease
der RNS-abbauenden
Enzyme
Phosphodiesterase
I
-33
1 ml einer
-
0,2-proz. gepufferten RNS-Lösung
Extraktlösung
wurde mit
Uranylazetat-Perchlorsäure (0,75/25 %) abgestoppt.
Nacht in der Kälte stehen
gelassen, zentrifugiert
wurde die Extinktion bei 260
(Zeiss, PMQ II)
Extinktion
von
1
0,2 ml
einer
0,1-proz.
inkubiert. Die Reaktion wurde nach 30 Minuten mit 0,5 ml
von
nm
gegen einen
gemessen. Nach WILSON
Die Proben wurden über
und 1
10 verdünnt. Sodann
:
Blindwert im
(45) entspricht
1,0 einer Zunahme der Konzentration
an
Spektrophotometer
eine Zunahme der
RNS-Abbauprodukten
uM/ml.
3.2.2.2.
Analyse
von
RNS-Abbauprodukten
In dieser Versuchsserie wurden die beim RNS-Abbau
freigesetzten 3'-Nukleotide,
5'-Nukleotide und Nukleoside durch eine besondere
analytische Versuchsanord¬
nung erfasst. Durch Variation der
te
Reaktionsbedingungen (Temperatur
dabei das Zusammenwirken der verschiedenen
quantitative Bestimmung
fische
Analysen
führt. So
die
mit
erfolgte
der verschiedenen Produkte wurde
Reinenzymen,
die
Enzyme verfolgt
Bestimmung
zum
der Nukleotide indirekt durch
oder die
Abbauprodukte
abgetrennt.
Säureausfällung,
wurden durch Ultrafiltration
Ein Schema der
Teil durch
Versuchsanordnung
ist in
vom
konn¬
spezi¬
durchge¬
Messung
wurden die
sondern durch
pH)
werden. Die
Teil mit chemischen Methoden
Reinenzyme freigesetzten Orthophosphates. Daher
im Versuchsansatz nicht durch
zum
und
des durch
Kartoffelenzyme
Erhitzung inaktiviert;
Enzym-Substrat-Gemisch
Figur
9
dargestellt.
min)
Nukleoside
P.2
+
P.l
Nukleoside
i
P.3
+
ULTRAFILTRATION
+
i
P.l
tidase
3'-Nukleotide
+
i
P.3
5'-Nukleo-
(MG < lO'OOO)
P.2
Nukleoside
5'-Nukleotide
1
:
3'-Nukleotide
+
Nukleoside
3'-, 5'-Nukleotide
(Oligonukleotide)
Enzymextrakt
i
:
Nukleoside
Phosphatase
P.l
3'-, 5'-Nukleotide
RNS, Oligonukleotide
Hefe-RNS
tidase
RNS, Oligo¬
nukleotide,
3'-Nukleotide
Nukleoside
P.3-P.1
i
i
P.2-P.3
i
Gesamt-Nukleotide
RNS-Abbauprodukten
von
+
5'-Nukleo-
RNS, Oligonukleotide
3'-, 5'-Nukleotide
12
HITZEINAKTIVIERUNG
(100°C,
Phosphatase
+
i
:
:
Schema der
i
Analyse
RNS, Oligonukleotide
9:
Nukleoside
Figur
i
P.l
i
P.2-P.1
-35-
Für die Versuchsansätze wurden je 11 ml einer
Lösung
mit 1 ml einer
gepufferten 0,22-proz. RNS-
1-proz. Extraktlösung inkubiert. Nach
30 Minuten wurden
die Proben inaktiviert.
Für die
Hitzeinaktivierung
wurde rasch auf 100 C erhitzt und 12 Minuten die
Temperatur eingehalten.
Sodann wurde
Analysen
analoger Blindwert
verwendet. Ein
und vorerhitztem Extrakt
Für die
"Inaktivierung"
und später bei
2°C
zentrifugiert
und der Ueberstand für die
wurde mit erhitzter
Substratlösung
zusammengestellt.
durch Ultrafiltration wurden die Proben sofort
auf einem
AMICON-Ultrafiltrationsgerät,
eingefroren
Modell 12, durch
eine UM-10 Diaflo-Membran filtriert. Als Blindwert diente eine reine Substrat¬
lösung. Das Filtrat
wurde in Fraktionen
1 ml
von
aufgefangen;
sowie die letzten zwei Fraktionen wurden verworfen. Die
die ersten drei
übrigen
wurden für die
späteren Analysen verwendet.
Der gesamte RNS-Abbau wurde nach der bereits beschriebenen Methode durch
Ausfällung
mit
Uranylazetat-Perchlorsäure
und
spektrophotometrischer Messung
bestimmt.
Die Nukleoside wurden
mittelt. Um störende
Trübungen
Probe wurde mit 0,5 ml
fugiert.
aufgrund
Sodann wurden
der
zu
Menge
des
freigesetzten Orthophosphates
vermeiden wurde wie
Uranylazetat-Perchlorsäure
folgt
vorgegangen.
versetzt und in der Kälte zentri¬
0,1 ml einer 0,1-proz. Rinderserumalbumin-Lösung
0,5 ml 20-proz. Trichloressigsäure zugegeben, über Nacht
wahrt und nochmals zentrifugiert. Die anschliessende
und
im Kühlschrank aufbe¬
Phosphatbestimmung erfolgte
wie bereits beschrieben.
Zur
zur
Bestimmung
der
freigesetzten Nukleotide
spezifischen Bestimmung
er¬
0,5 ml
wurde alkalische
Phosphatase
der 5'-Nukleotide 5'-Nukleotidase verwendet.
und
-36-
Für die
Analyse
HCl-Puffer auf
Phosphatase
mit
wurde
pH 8,0 eingestellt,
Tris/HC I -Puffer, 0,05
(entsprechend
Das
1
0,1 ml (entsprechend 1 U) Enzymlösung
0,5 ml Probe
mit 5'-Nukleotidase wurde
Bestimmung
M
MgC ^enthaltend,
auf
mit
0,4 ml 0,25 M
pH 9,0 eingestellt,
versetzt und 30 Minuten
U) Enzymlösung
freigesetzte Orthophosphat
0,4 ml 1 M Tris/
mit
inkubiert.
versetzt und 30 Minuten bei 25 C
Für die
mit
0,5 ml Probe
mit
0,1 ml
bei 3/ C inkubiert.
Nukleosid-Bestimmung be¬
wurde wie bei der
schrieben gemessen.
3.2.3.
Zur
Bestimmung
Untersuchung
eigenen Enzyme,
homogenisat
wie
der gesamten
des
in
Angriffs
-
ten. Das
tem
ein
6,5) gegeben.
Homogenisat
Rühren
gehalten.
aliquoter
von
folgt hergestellt.
zu
Kartoffelhomogenisat
im
kartoffeleigenen RNS durch
der
Abhängigkeit
wurden in einem Mixer
pH 5,0
Enzymaktivitäten
Temperatur
250 g
und
gewaschene
pH,
und
die kartoffel¬
wurde Kartoffel¬
geschälte Kartoffeln
500 ml vorerwärmtem Na-Cirrat-Puffer
Die
Homogenisation erfolgte bei
(0,1 M,
52 C während 6 Minu¬
wurde sodann weitere 24 Minuten bei 52 C unter leich¬
Nach einer Inkubationszeit
von
total 30 Minuten wurde
Teil entnommen, rasch auf 100 C erhitzt, 15 Minuten bei dieser
Temperatur belassen
und sodann
zenrrifugiert.
quantitativen Analysen verwendet,
RNS-Abbauprodukten beschrieben
Der Ueberstand wurde für die
wie dies im
wurde.
Kapitel
3.2.2.2.
Analyse
von
-37-
3.2.4.
Intrazellulare
FUr die Versuche
zur
Kartoffelgewebe
im
Lokalisierung
intrazellulären
Lokalisierung der RNS-abbauenden Enzyme
Zellorganellen
Dabei wurde versucht, die Zellen
organellen möglichst wenig
so
von
Saccharose und 0,002 M
Die
Organellen
send
erfolgten
die
Phosphodiesterase
3.2.5.
Die
pH-Messungen
pH-Werte
g, 10
Minuten)
USA)
Der Ueberstand wurde
während 10 Sekunden
Phosphatase
wurde sodann
abge¬
entsprechenden Menge
aufgeschlossen. Anschlies¬
Ribonuklease, Phosphodiesterase I,
von
nach den üblichen Methoden.
in frischen Kartoffeln
in Kartoffeln wurden mit einer besonderen Einstichelektrode
Zürich), Einstichtiefe
in
Ultraschallbehandlung (Sonifier,
wurden durch
Aktivitätsmessungen
II und
Cyste in enthaltend,
aufgearbeitet. Das Homogenisat
110'OOOg zentrifugiert.
LS-75, Branson Instruments,
(0,05 M, pH 6,5),
Zentrifugation (500
trennt, und das Sediment wurde in einer dem Ueberstand
gelöst.
abgetrennt.
Sand, ZelltrUmmern und Zellwänden. Eine parallele
Probe wurde in reiner Pufferlösung
während 120 Minuten bei
speziell aufge¬
loslichen Anteil
und 20 ml Na-Citrat-Puffer
(Gewicht/Volumen)
befreite das Homogenisat
vom
in
schonend aufzuschliessen, dass die Zell¬
einem Mörser zerrieben. Eine anschliessende
Puffer
(82)
zerstört wurden. Dazu wurden 10 g Kartoffeln mit
gewaschenem Quarzsand
15 Prozent
Enzymen
wurden nach CASTELFRANCO et al.
arbeiteten Proben die intakten
10 g
von
25 mm,
J0
(Ingold AG,
6 mm, gemessen. Der 3 Minuten nach dem Einstich
an¬
gezeigte Wert wurde abgelesen.
Frische Kartoffeln der Sorten Binrje und Maritta wurden auf die Abhängigkeit des
pH-Wertes
an
vom
Standort untersucht. Es standen Produkte des
verschiedenen Orten
wurde,
zur
Verfügung.
gleichen Saatgutes, das
(Alberswil, Changins, Grangeneuve, Witzwil) angepflanzt
-38-
In einer weiteren Serie wurde der Einfluss des Pflanzdatums und der
von
Vorkeimung
Bintje-Kartoffeln (Standort Changins) geprüft.
Der Verlauf des
pH-Wertes
während des Kochens der Kartoffeln wurde ebenfalls
untersucht. Die Kartoffeln wurden in strömendem
pH-Wert
wurde die
Temperatur
von
zur
Messung
von
Versuche
sagen
mindestens
erfolgte nach
Über die
parallel
der durchschnittlichen
-
zum
pH-Werte
Standort, Pflanzdatum und Vorkeimung eine Probegrösse
20 Knollen bei einer statistischen Sicherheit
grenze
und
gemessen.
Vorversuche haben gezeigt, dass
Abhängigkeit
Dampf erhitzt,
(P )
von
in
von
95 Prozent eine Vertrauens¬
0,06 pH-Einheiten gewährleisten. Die Auswertung dieser
einer
Signifikanz
von
DUNCAN
der Unterschiede
(83) beschriebenen Methode,
ermöglichte.
die Aus¬
-39-
4.
Resultate
4.1.
Charakterisierung
von
Enzymaktivitäten
Künstliche Substrate haben in der
lytische Wirkung
Im
folgenden
Regel
den
relativ einfach auch in
mit
spezifischen Substraten
Vorteil, dass
eine
spezifisch
Mischsystemen nachgewiesen
werden die Resultate solcher
Messungen für
kata-
werden kann.
wichtigsten RNS-an-
die
greifenden Enzyme zusammengestellt.
In den
mit
Figuren
10 und 11 ist die
cycl. 2',3'-CMP
gestellt. Die
Daten
Ribonuklease
als Substrat in
zeigen
ein
Abhängigkeit
Aktivität des
-
von
eindeutiges Optimum
pH
und
Enzymextraktes
Temperatur
der Aktivitäten bei
zusammen¬
pH 5,0
und
70°C.
Allerdings soll beigefügt werden, dass Aktivitätsmessungen
gen ihrer
Empfindlichkeit sehr problematisch sind, besonders
hochgereinigte Enzympräparate handelt;
halt des Ansatzes können die
der Aktivität des
sene
mit
Aktivität.
Messung
denn
Begleitstoffe
der Reaktion
Enzyms erfolgte daher
cycl. 2',3'-CMP
wenn es
und ein hoher
empfindlich
in Prozenten
sich nicht
bezogen
we¬
um
Proteinge¬
stören.Die
Angabe
auf die grösste gemes¬
-40-
Aktivität
%
100
V
60
20
'
4,0
Figur
10:
'
5*0
6^0
'
7,0
pH
Ribonuklease
pH-Abhängigkeit
Substrat:
bei 70 C
cycl. 2',3'-CMP
Aktivität
%
100
A
60
20
-
'
"
30
50
°C
70
Figur 11: Ribonuklease
Temperaturabhängigkeit
bei
Substrat: cycl. 2,,3,-CMP
pH 5,0
-41
-
Phosphodiesterase
In den Tabellen 2 bis 4 ist die Aktivität der
mengestellt.
optimalen
von
Der in den
Figuren
gezeigte Aktivitätsverlauf
zusam¬
unter
Bedingungen bezieht sich auf eine einheitliche Extraktkonzentration
0,05 Prozent (Messungen
chen eine
12 und 13
I
im linearen Bereich des Reaktionsverlaufes
Anpassung). Entsprechend
der
Bedeutung, die diesem Enzym
ermögli¬
zugemessen
wurde, wurden 3 verschiedene Substrate verwendet, nämlich BiPNPP, oc-N-TMP
und PNP-TMP.
unabhängig
Die Resultate zeigen, dass
vom
verwendeten Substrat der Verlauf der
der Aktivität
Aktivität ähnlich ist. Das
pH-Optimum
Temperatur-Optimum bei
50 C. Die grössere
esterase II
te
(vgl. später),
Verschiebung
vität der
setzt
des
Phosphatase,
Temperaturstabilität
die BiPNPP ebenfalls
Temperatur-Optimums.
die auf das
liegt bei pH 5,5
zu
Die
spalten
der
und das
Phosphodi¬
vermag, bewirkt eine leich¬
Störung der Messung durch
Spaltprodukt PNPP,
welches
aus
BiPNPP
die Akti¬
freige¬
wird, wirken kann, ist eher gering. Geringe Abweichungen können auch
dem Substrat OC-N-TMP beobachtet werden;
mit der strengen
wurde,
in
Spezifität
dieses
Substrates,
es
mit
kann nicht gesagt werden, ob dies
wie sie
von
LERCH
(50) beschrieben
Zusammenhang steht.
Im stark alkalischen Bereich wurde mit dem Substrat PNP-TMP ein zweites Aktivi¬
das in den
täts-Optimum gefunden,
tät
wurde bereits früher
von
Prozent der Aktivität bei
Figuren 14
RAZZELL
pH 5,5.
und 15
dargestellt
(49) beschrieben
und
ist. Diese Aktivi¬
beträgt
etwa 30
-
40
-42-
\.pH
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
30
57
61
63
58
52
43
15
40
82
88
90
82
75
62
21
50
100
112
120
124
95
70
30
60
45
90
135
140
121
86
15
70
25
56
91
105
90
59
8
°C
\
Tabelle 2:
Aktivität der
pH
\pH
und
Phosphodiesterase
I auf BiPNPP in
Temperatur (freigesetztes
PNP in
4,0
4,5
30
12
16
24
26
40
15
27
34
35
50
11
27
40
49
60
5
15
25
70
2
3
5
°c
5,0
pM
von
_3
10 /Ansatz)
6,5
7,0
21
9
5
27
14
9
35
15
10
24
12
3
2
3
2
1
1
5,5
6,0
x
Abhängigkeit
\.
Tabelle 3: Aktivität der
von
pH
und
Phosphodiesterase
I auf
or-N-TMP in
Temperatur (freigesetztes
oc-N in uM
Abhängigkeit
_o
x
10
/Ansatz)
Tabelle 4:
80
(freigesetztes
Aktivität der
-
-
PNP in uM
x
10
-
I auf PNP-TMP in
/Ansatz)
_3
-
-
Abhängigkeit
-
5
20
42
Phosphodiesterase
-
51
58
39
20
70
-
-
-
65
-
20
56
108
125
120
90
50
60
-
50
96
116
137
129
106
83
50
-
25
63
79
96
89
85
78
40
-
10
7,0
31
6,5
55
6,0
65
5,5
63
5,0
54
4,5
55
\^
4,0
30
°C
\pH
von
-
pH
und
-
-
Temperatur
-
-
44
24
9
-
-
-
-
-
9,0
-
-
-
-
8,5
-
-
-
-
8,0
18
-
-
-
45
-
-
15
38
48
36
3
-
-
-
-
13
-
10,0
-
9,5
-
9,3
-44
-
PNP
resp.ot-N
pM
0,12
'
-
0,08
/
A
/
0,04
^-A
4,0
Figur
12:
6,0
5,0
Phosphodiesterase
7,0
pH
I
pH-Abhängigkeit bei 50°C
(»^oc-N-TMP (A),
Substrate: BiPNPP
PNP-TMP
()
PNP
resp.«-N
pM
0,12
0,08
'
0,04
30
Figur
13:
40
60
50
Phosphodiesterase
70
°C
I
Temperatur-Abhängigkeit bei pH 5,5
Substrate: BiPNPP
(•),
«-N-TMP
(A),
PNP-TMP
()
-45
-
PNP
pM
0,06
•
0,02
8,0
Figur
14:
9,0
Phosphodiesterase
pH-Abhängigkeit
10,0
pH
I
bei 65 C
Substrat: PNP-TMP
PNP
pM
0,06
/"\
0,02
30
Figur
15:
70
50
Phosphodiesterase
I
Temperatur-Abhängigkeit
Substrat: PNP-TMP
bei
pH 9,3
°C
-46-
Die Aktivität der
Phosphodiesterase
II ist in Tabelle 5 und den
Figuren
16 und
17 charakterisiert. Als Substrat wurde hier TMP-PNP verwendet.
Es
ergibt sich
ist als
reich,
liegt.
diejenige
um
Im
Enzymaktivität,
eine
der
Phosphodiesterase
pH 5,5, während
Gegensatz
die
zur
das
grossenordnungsmässig wesentlich geringer
I. Das
pH-Optimum liegt
Temperatur-Optimum höher
Phosphodiesterase
und
im
gleichen Be¬
zwar
bei 60 C
I konnte keine Aktivität im alkalischen
Bereich gefunden werden.
N.
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
30
36
40
46
54
66
61
48
40
67
70
81
93
107
91
62
50
88
105
118
128
132
98
71
60
60
100
125
143
131
84
34
70
23
41
50
75
62
39
19
pH
°c\
Tabelle 5: Aktivität der
pH
und
Phosphodiesterase
II auf TMP-PNP in
Temperatur (freigesetztes
PNP in
pM
x
10
Abhängigkeit
/Ansatz)
von
•47
PNP
pM
/
0,14
0,10
0,06
0,02
4,0
Figur
16:
1
iii
1
5,0
6,0
Phosphodiesterase
II
pH-Abhängigkeit
bei
i
7,0
pH
60°C
Substrat: TMP-PNP
PNP
pM
0,14
0,10
0,06
0,02
30
Figur
17:
40
Phosphodiesterase
70
60
50
II
Temperatur-Abhängigkeit
Substrat: TMP-PNP
bei
pH 5,5
°C
-48-
Phosphatase
Phosphatase
den
Figuren
ist das
am
besten untersuchte Enzym der Kartoffel; Kartoffel-
ist sehr aktiv. Mit dem Substrat PNPP wurden die in Tabelle 6 und
18 und 19
\pM
dargestellten Werte erhalten.
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
°C\v
30
23
39
71
72
70
48
11
40
38
71
126
115
92
50
13
45
62
105
146
142
93
42
13
50
57
100
136
131
70
31
8
60
51
77
81
64
38
21
5
70
13
22
30
18
11
6
4
Tabelle 6: Aktivität der
Phosphatase
Temperatur (freigesetztes
Es
45
ergeben sich
-
pH-Optimum
50 C. Somit ist die
Optimum
vität
ein
im
nachgewiesen
werden.
PNP in
pM
das
Enzym
Abhängigkeit
x
bei 5,0 und ein
Phosphatase
Enzymextrakt.
auf PNPP in
10
von
pH
und
/Ansatz)
Temperatur-Optimum
mit dem tiefsten
um
Temperatur-
Im alkalischen Bereich konnte mit PNPP keine Akti¬
-49-
PNP
pM
0,14
0,10
•
0,06
0,02
i
i
4,0
Figur
1
i
i
6,0
5,0
i
7,0
pH
Phosphatase
18:
pH-Abhängigkeit
bei 45 C
Substrat: PNPP
PNP
pM
/N
0,14
0,10
0,06
0,02
'
"T
t
— ——
30
Figur
19:
»
50
""
'"T"
I"
70
Phosphatase
Temperatur-Abhängigkeit bei pH 5,0
Substrat: PNPP
°C
-50-
Phosphatase
kann bekantlich durch
anorganisches Phosphat leicht gehemmt
werden, wobei frühere Untersuchungen gezeigt haben, dass die Hemmwirkung
mit sinkender
Temperatur
eingehender untersucht
zunimmt. In Tabelle 7 und
und
dargestellt worden;
es
Figur
20 ist diese
ergibt sich
Hemmung
ein ausgeprägter
Effekt.
pM PO~~~/Ansatz
Tabelle 7:
Hemmung
Aktivität
_
100
0.284
69
1.420
25
2.840
16
14.200
9
der
Phosphatase
in
Abhängigkeit
(Reaktionstemperatur A/Q, pH 5,0)
der
(%)
Phosphatkonzentration
-51
-
Aktivität
%
100-
•
1
1
•
1
\
50-
\
\.
'
—i
i
i
10
Figur
15
/Ansatz
PO
pM
Phosphatase
20:
Hemmung
bei
47°C
in
Abhängigkeit
und
Phosphatkonzentration
der
pH 5,0
Substrat: PNPP
Die
Bestimmung
k I eoti dase
der Gesamtaktivität
zusammen
von
Phosphatase
und
5'-Nu-
kann mit 5'-AMP als Substrat vorgenommen werden.
Die erhaltenen Aktivitäten sind in Tabelle 8 und den
Figuren
21 und 22
zusam¬
mengestellt.
Es
ergeben
sich zwei
Temperatur-Optimum
pH-Optima, und
zwischen 45
-
zwar
bei
pH 5,0
und bei
pH 9,3
und ein
50 C. Dieser Aktivitätsverlauf kann
vergli¬
chen werden mit den Daten, die mit dem Substrat PNPP erhalten wurden (Tabelle 6,
Figuren
18 und
19).
Ein abweichender Aktivitätsverlauf kann auf Verschiedenhei¬
ten im
Verhalten der Enz/ms/steme hinweisen. So zeigen die Figuren 21 und 22 im
sauren
Bereich einen ähnlichen Verlauf wie die Figuren 18 und 19.
die im alkalischen Bereich
einer
nachgewiesene Aktivität unterschiedlich
spezifischen 5'-Nukleotidase zugeschrieben
schen Bereich
beträgt
nur
etwa 35 Prozent
Hingegen
ist
und kann wohl
werden. Die Aktivität im alkali¬
derjenigen
im
sauren
Bereich.
45
40
30
590
605
585
385
4,0
493
700
700
690
435
4,5
550
754
798
720
520
5,0
490
715
731
708
542
5,5
135
300
550
562
550
520
6,0
95
120
180
358
350
330
6,5
45
60
78
94
100
85
7,0
-
78
-
-
8,0
50
300
285
10
_3
/Ansatz)
-
-
-
10,0
-
9,5
200
-
9,3
-
215
-
-
150
9,0
-
268
-
220
8,5
-
-
306
-
-
-
230
-
-
-
120
Temperatur
280
und
212
-
von
pH
-
Abhängigkeit
-
-
60
350
x
und 5'-Nukleotidase auf 5'-AMP in
275
P. in uM
Phosphatase
195
von
70
Tabelle 8: Aktivität
(freigesetztes
53
P.
pM
0,60
0,40
A
0,20
/
4,0
Figur
21:
6,0
Phosphatase
\
8,0
10,0
pH
und 5'-Nukleotidase
pH-Abhängigkeit
bei 50 C
Substrat: 5'-AMP
P.
i
pM
0,60
0,40
0,20
•-
I
50
30
Figur
22:
Phosphatase
70
und 5'-Nukleotidase
Temperatur-Abhängigkeit
Substrat: 5'-AMP
bei
pH 5,0 (o)
und
pH 9,3 (•)
-54
Charakterisierung
4.2.
von
Um den Verhältnissen des
nahe
zu
kommen, wurden
-
Enzymaktivitäten beim Abbau
enzymatischen Angriffs
von
von
Ribonukleinsäure
RNS in Kartoffeln
möglichst
in einer weiteren Serie Versuche mit Hefe-RNS als Substrat
angestellt, wobei mögliche Abbauprodukte differenziert analytisch erfasst
Die
Ergebnisse
dieser Serie sind im
Beim gesamten
folgenden zusammengestellt.
RNS-Abbau
wurden die
RNS in
enzymatischen Vorgänge einzig
von
Als Variable wurden
Temperatur gewählt.
9 und den
Bei einer
Figuren
70 C verschiebt
in
ten
um
es
von
40
-
sich gegen
vom
50 C
ergibt sich
pH 5,0.
von
der
es
der Reaktion
es
Das
bei
Enzyme
beteiligt
pH 5,5; bei
pH-Optimum
aus
den
um
ist
70 C und bei
vorherigen Resulta¬
mit verschiedenen
sind.
kleinerer
Temperatur-Optimum
liegt bei pH 5,0
auch bereits
darauf schliessen, dass mehrere
an
pH-Optimum
Temperatur.
pH ebenfalls nicht stabil;
Temperatur-Abhängigkeiten
ein
Ferner zeigt sich ein
60 C. Diese Daten lassen, wie
hervorgeht,
Die erhaltenen Daten sind in Tabelle
zusammengestellt.
pH 9,5, unabhängig
Abhängigkeit
pH 6,0
23 und 24
Temperatur
Aktivität bei
und
durch
Uranylazetat-Perchlorsäure charakterisiert.
die Zunahme der Löslichkeit
pH
wurden.
pH-
und
(Abbauprodukte
in uM
x
10
/Ansatz)
_3
pH
und
Temperatur
-
82
245
340
1006
1155
344
107
80
von
100
170
369
785
1475
2118
1648
680
70
Abhängigkeit
102
272
170
68
80
-
412
639
984
1582
1620
984
312
60
Gesamter RNS-Abbau in
-
-
-
Tabelle 9:
-
-
-
-
-
387
540
564
712
589
-
-
-
-
-
40
245
153
88
136
50
85
80
95
153
172
-
-
238
-
10,0
294
-
9,5
209
-
9,0
51
8,5
17
8,0
40
-
7,5
10
7,0
15
6,5
17
6,0
9
5,5
5
5,0
5
4,5
3
\
4,0
30
°C
\pH
-56-
lösl.
Abbau Produkte
pM
2,0
A
•
1,2
\
0,4
^ \
A^A"
4,0
Figur
23:
^^-A^A-A-A^i^^i
10,0
8,0
6,0
pH
Gesamter RNS-Abbau
pH-Abhängigkeit
bei
40°C (A)
und bei
70°C ( )
•
Substrat: RNS
lös).
Abbauprodukte
2,0
•
1,2
0,4
Figur
JS
•
24: Gesamter RNS-Abbau
Temperatur-Abhängigkeit bei pH 5,0 ( )
•
Substrat: RNS
und
pH 6,0 (i
-57-
Beim
RNS-Abbau
mit
Anal/se
der
Abbauprodukte
wurde ähnlich vorgegan¬
bei der vorstehenden Versuchsserie; doch wurden im Inkubationsmedium mit
gen wie
spezifischen Analysenmethoden 3'-Nukleotide, 5'-Nukleotide
trennt
erfasst. Dabei wurde einerseits die
mit anschliessender
Hitzeinaktivierung
pH
wiederum
Die
10 und
-
Die
Figur
Ultrafiltrations-Methode,
Anal/se
der nach der Ultrafiltration vorgenommenen
25
zusammengestellt. Sie zeigen
Nukleotid-Anreicherung
bei eine ausgeprägte
ist
Nukleosid-Freisetzung
Die Summe der
freigesetzten Nukleotide
Temperatur bis
50 C
-
ist
am
gebnisse
der
Figuren
23 und
Bei einer
lichen
pH 6,0. Auffallend
und Nukleoside ist in
pH-Abhängigkeit
Verminderung
Verschiebung
stimmen mit
50 C und
grössten bei pH 6,0. Eine weitere
der
ist da¬
des
5,5.
-
Abhängigkeit
der
Temperaturerhöhung
gegen ein
Optimum bei pH 5,0
Freisetzung bei höherem pH.
Beim RNS-Abbau zeigt sich bei einer
auf 60 C eine
-
am
Veränderung
und einer starken
sind in Tabelle
folgende:
grössten bei 50 C und pH 5,0
-
einer
Anal/sen
pH-Abhängigkeit.
Die
zu
das
optimal bei
-
fuhrt
anderseits die
angewendet. Als Variablen wurden
Temperatur gewählt.
und
Ergebnisse
und Nukleoside ge¬
Erhöhung
pH-Optimums
der
von
Reaktionstemperatur
pH 5,5
gegen
von
40 C
pH 5,0. Diese
Er¬
denjenigen des gesamten RNS-Abbaus überein (Tabelle 9,
24).
Reaktionstemperatur
RNS-Abbauprodukte
von
Oligonukleotide
Temperatur
Produkte, welche
aufweisen.
entsprechen sich
und die Summe der
Nukleotide. Eine Erhöhung der
der säurelöslichen
40 C
die
Menge
der säurelös¬
freigesetzten Nukleoside
führt
jedoch
zu
und
einer stärkeren Zunahme
einen zunehmenden Anteil niedermolekularer
6,0
244
6,5
288
875
5,0
66
310
873
5,5
203
395
703
6,0
154
250
464
6,5
164
386
1779
5,0
120
330
1543
5,5
106
249
873
6,0
104
142
393
6,5
60
5,5
259
240
66
38
50
5,0
329
251
146
143
40
267
232
110
210
C
pH
217
55
222
Temperatur,
RNS-Abbau
39
96
und Nukleoside
Summe der Nukleotide
Nukleotide
192
der Produkte durch Ultrafiltration
244
Abtrennung
222
mit
94
Ansatz)
pH
141
_3
10 /ml
und
177
x
Temperatur
von
178
RNS-Abbau in
in uM
Abhängigkeit
Nukleoside
Tabelle 10:
(Abbauprodukte
Figur
pH
von
+
()
Temperatur
(•)
Nukleoside
Abhängigkeit
6,0
Summe der Nukleotide
RNS-Abbau
RNS-Abbau in
5,0
V
und
pH
mit
Abtrennung
6,0
pH
1
\
5,0
der
Nukleoside
Nukleotide
(o)
(•)
pH
Ansatz)
(pM/ml
60"C
6,0
\
der Produkte durch Ultrafiltration
0,2
0,2
O.
0,2
O
0,4
l«7
pM
0,4
50°C
RNS in
Abbauprodukte
0,4
•
der
0,8
1,7
RNSinuM
Abbauprodukte
0,8
temperatur: 40 C
Reaktions¬
der
0,8
1,7
pM
25:
RNS in
Abbauprodukte
>o
Ol
-60-
Abtrennung
Die
gere
der niedermolekularen Produkte durch Ultrafiltration stellte gerin¬
Anforderungen
Inaktivierung
die
die Reinheit der fUr die
an
durch
Erhitzung.
Erste
Analysen
Untersuchungen
Enzyme als
verwendeten
haben aber gezeigt, dass
die während der Ultrafiltration verbleibende Aktivität der Nukleotid-abbauenden
Enzyme
40
-
Ergebnisse empfindlich
die
50 C und
sonders
Diese
aus.
kleotide
pH-Werten
von
Beobachtung gab bereits Hinweise,
durchgeführt.
eine
werden. Höhere
der Nukleotid-abbauenden
Aus diesen Gründen wurden
Eine rasche
Reinenzyme ermöglichten
dass die
Spezifität
der
zur
führen
Hitzeinaktivierung
zu
einer In¬
der
erwiesen. Die anschliessenden
der
Ergebnisse
verwendeten
Enzyme
der Proben auf 100 C hat sich für
eine differenzierte
Vergleich
Analyse
in welchem Bereich die Nu¬
Temperaturen
mit
12-minütige Erhitzung
und der 5'-Nukleotide. Ein
von
Enzyme.
gleiche Versuche
völlige Inaktivierung als genügend
Hilfe der
Temperaturbereich
über pH 5,0 wirkte sich dieser Nukleotid-Abbau be¬
überhaupt angereichert
aktivierung
stören kann. Vor allem im
Analysen
mit
Erfassung der 3'-Nukleotide
der beiden Methoden
Enzyme auch bei
zeigte,
der Hitzeinakti¬
vierung genügte.
Tabelle 11 und Figur 26 zeigen die nach der Hitzeinaktivierung erhaltenen Ergebnis¬
se.
-
Es
Die
geht
Bestimmung
50 C und
-
Die
folgendes hervor:
daraus
der 5'-Nukleotide
pH 6,0. Auch hier
Anreicherung
Abhängigkeit,
Vergleich
von
ist eine überaus starke
pH-Abhängigkeit festzustellen.
3'-Nukleotiden zeigt eine wesentlich andere
ist sie doch erst bei
mit den
zeigt eine grösstmögliehe Anreicherung bei
Temperaturen
Temperatur-
über 50 C stark zunehmend. Ein
Ergebnissen beim gesamten RNS-Abbau
lässt vermuten, dass
C
Tabelle 11:
(Abbauprodukte
in uM
x
10
von
Temperatur
/ml Ansatz)
_3
RNS-Abbau in Abhängigkeit
und
pH
38
148
214
225
92
192
241
mit
Inaktivierung der Enzyme durch Erhitzung
223
89
145
180
178
Nukleoside
214
101
136
97
92
20
13
20
87
23
4
17
3'-Nukleotide
48
110
34
300
6,5
23
69
130
52
41
55
74
36
20
5'-Nukleotide
359
6,0
262
384
5,5
211
345
5,0
60
170
253
6,5
120
342
6,0
161
50
150
306
5,5
65
284
5,0
61
142
97
40
und Nukleoside
37
231
6,5
Nukleotide
6,0
242
5,5
220
5,0
40
215
Summe der Nukleotide
pH
Temperatur,
CM
-
•
Reaktions¬
temperatur:
'"
40 C
•
^'^-
O^
°„
-\
m'
6,0
pH
+
von
der RNS
Abbauprodukte
pM
0,40-
0,20
und
5,0
Temperatur
Nukleoside ()
(•)
(O)
RNS-Abbau In Abhängigkeit
5,0
••—•—'
A—*
O
Abbauprodukte
RNS
uM
0,40
26:
0,20
Figur
Summe der Nukleotide
Nukleotide
Nukleoside
pH
mit
6,0
50°C
pH
5,0
t
s
Abbauprodukte
der RNS
pM
0,40
0,20
(•)
(A)
der Enzyme durch Erhitzung
5'-Nukleotide
Inaktivierung
3'-Nukleotide
Ansatz)
PH
60°C
\
/
6,0
(pM/ml
-63
das
Optimum
gen sich zwei
erst
-
bei 70 C erreicht wird.
Optima,
eines bei
pH 5,0
Bezüglich
der
pH-Abhängigkeit
und ein ausgeprägteres bei
pH 6,5
zei¬
oder
höher.
-
Übrigen Ergebnisse stimmen,
Die
mit einer
Ausnahme,
erhaltenen Resultaten überein. So zeigt die
hängigkeit
vom
Nukleotidanreicherung
pH entgegengesetzte Ergebnisse. Nach
mit zunehmendem
aktivierung
mit den mittels Ultrafiltration
pH
wird mit zunehmendem
pH
der Ultrafiltration zeigt sich
Nukleotidanreicherung. Bei
eine verminderte
eine vermehrte
bei 60 C in Ab¬
der Hitzein-
Nukleotidanreicherung be¬
obachtet.
4.3.
Enzymaktivitäten
Aufgrund
setzung
von
pH
der vorstehenden
von
und
geschätzt
im Kartoffel homogenisat
Untersuchungen
kann angenommen werden, dass die Frei¬
5'-Nukleotiden in der Kartoffelknolle durch einen kombinierten Effekt
Temperatur bewirkt wird, wobei auch
die
entsprechenden
Bereiche ab¬
werden können.
Es wurden daher
Kartoffelhomogenisate
im
pH-Bereich
von
5,0 bis 6,5 hergestellt
und bei 52 C ohne weitere Zusätze inkubiert. Anschliessend wurde die
ihren Gehalt
an
5'-Nukleotiden und 3'-Nukleotiden
sind in Tabelle 12 und
Eindeutig ergibt sich
vom
pH
des
Figur
27
analysiert.
Die
Mischung
auf
Analysendaten
zusammengestellt.
eine starke
Abhängigkeit
Mediums, wobei sich bei pH 6,0
der
grosse
Freisetzung
von
5'-Nukleotiden
Mengen anreichern.
-64
PH
-
5,0
6,0
6,5
5'-Nukleotide
485
1138
628
3'-Nukleotide
119
12
243
Gesamt-Nukleotide
604
1150
871
Tabelle 12: Freisetzung
von
3'-Nukleotiden und 5'-Nukleotiden in Kartoffel-
homogenisaten bei
52 C
(Werte
in
u^kg
frische Kartoffeln)
Nukleotide
uM
1000
1
•
500
5,0
Figur
27:
Freisetzung
6,0
von
homogenisaten
I
6,5
pH
3'-Nukleotiden und 5'-Nukleotiden in Kartoffel
in
Abhängigkeit
frische Kartoffeln)
3'-Nukleotide
(Q)
5'-Nukleotide
(0)
vom
pH bei 52°C (Werte
in
-
uM/kg
-65-
Intrazelluläre Lokalisierung
4.4.
Es kann nicht
Enzymen
von
ausgeschlossen werden,
spezifische Freisetzung
dass die
von
5'-Nu-
kleotiden wenigstens teilweise durch den intrazellulären Aufbau der Zellen bedingt
ist. Aus diesen Gründen wurde auch eine intrazelluläre
angestrebt.
Es wurde dazu eine isotonische
teilung
enzymatischen
der
Aktivitäten
tiv kleine Unterschiede in der
scher Lösung,
Zu ähnlichen
verglichen
Lokalisierung
Ergebnissen gelangten
Enzymen
Lösung hergestellt. Die intrazelluläre Ver¬
geht
Tabelle 13 hervor. Sie zeigt
aus
Aktivitätsverteilung nach
mit einem
von
et
(84)
al.
rela¬
einem Aufschluss in isotoni¬
vollständigen Aufschluss
auch PITT
nur
in reiner
in ihren
Pufferlösung.
Untersuchungen
Über die Lokalisierung einer Ribonuklease in Kartoffeln.
4.5.
pH-Werte
in der Kartoffelknolle
Die
bisherigen Ergebnisse haben gezeigt,
der
5'-Nukleotidanreicherung auch
chen
keit
Untersuchungen
der
wurde daher dem
Beachtung geschenkt. Figur
28
dass neben der
pH
von
zeigt
den
Knolle während des Erhitzens in strömendem
ein ganz leichtes Abfallen des
Bereich der
zen
pH-Wertes
Verkleisterungstemperatur
wird der
zwischen 40
pH aber
-
doch
nur
60 C wird in
zu
Bedeutung
grosser
pH-Wert
Temperatur-Abhängigkeit
und dessen
pH-
und
Dampf.
Temperatur-Abhängig¬
Temperaturverlauf
Zu
Beginn
der
der Stärke bei 60
-
5 Minuten durchlaufen.
in der
Erwärmung ist
beobachten, doch steigt
dieser im
70 C wieder
unwesentlich beeinflusst. Der
ca.
ist. In zusätzli¬
an.
Im gan¬
Temperaturbereich
Phosphodiesterase
1
Phosphodiesterase
II
Ribonuklease
PNPP
Phosphatase
Puffer
Enzym
cycl. 2',3'-CMP
isotonisch
92
TMP-PNP
92
PNP-TMP
92
Substrat
90
8
Puffer
isotonisch
91
8
isotonisch
Puffer
82
8
Puffer
88
10
isotonisch
78
9
Medium
Ueberstand
18
Abhängigkeit
Probeaufarbeitung
12
Intrazelluläre Verteilung der enzymatischen Aktivitäten in Prozenten in
der
22
von
Sediment
Tabelle 13:
-67-
20
Figur
28:
pH-Werte (-
und
30
)
Temperaturverlauf (
min
in erhitzten
Kartoffeln
In weiteren
Untersuchungen
Kartoffeln in
Tabelle 14
Abhängigkeit
von
Standort und
oder Nabelende,
Abhängigkeit
gezeigt. Alle Messungen
durchgeführt.
wurde.
pH-Werte
16 hervor.
und
Signifikanz
an
rohen
vom
signifikanten
keine
Ort der
wurden daher
Es standen Kartoffeln der Sorten
Verfügung, wobei dasselbe Saatgut
von
Klimabedingungen untersucht.
zusammengestellte Untersuchungen haben
schiede der gemessenen Werte in
Knollen
pH-Wertes
wurde die Variation des
am
Kronenende der
Bintje
gehen
aus
Unter¬
Messung, Kronen-
und Maritta
vier verschiedenen Orten
der Resultate
In
zur
angepflanzt
den Tabellen 15 und
-68-
Ort der
Messung
pH
Krone
6,04
Mitte
6,08
Nabel
6,08
Tabelle 14:
pH-Werte
Ort der
von
frischen
in
-
-
0,04
0,05
0,04
Abhängigkeit
vom
Messung ( | ohne signifikanten Unterschied)
Standort
Bintje
Maritta
pH
pH
Grangene uve
6,00
-
Witzwil
5,93
-
Alberswil
pH-Werte
0,03
6,08
-
0,05
6,06
-
6,06
-
5,97
-
5,90^0,05
5,82^0,05
Changins
Tabelle 15:
Bintje-Kartoffeln
-
von
hängigkeit
frischen
Bintje-
des Standortes
(
|
0,04
0,03
0,03
0,05
und Maritta-Kartoffeln in Ab¬
ohne signifikanten Unterschied)
-69-
Sorte
Standort
Maritta
pH
Grangene uve
6,08
ii
Changins
6,06
ii
Witzwil
6,06
Bintje
Grangene uve
6,00
Maritta
Alberswil
5,97
Bintje
Witzwil
5,93
ii
Changins
5,90
ir
Alberswil
5,82
Tabelle 16:
Signifikanz
hängigkeit
der
von
pH-Unterschiede
von
Standort und Sorte
(
|
frischen Kartoffeln in Ab¬
ohne signifikanten Unterschied)
Tabelle 15 zeigt, dass innerhalb der gleichen Sorte, in
ort,
nur
zwischen den Extremwerten
schied besteht. Eine
gibt
Gegenüberstellung
Bintje-Kartoffeln
von
doch mehrere eindeutige Unterschiede
dass die
ten
von
Reihenfolge
dieselbe ist.
der
Abhängigkeit
ein
vom
Stand¬
signifikanter Unter¬
Sorten und Standorten
(Tabelle 16). Zudem
ist
hingegen
er¬
festzustellen,
Standorte, geordnet nach den pH-Werten, bei beiden Sor¬
-70-
In einer weiteren Serie wurde der Einfluss
auf den
pH-Wert geprüft.
Die
Ergebnisse
von
Pflanzdatum und
sind in Tabelle 17
Vorkeimung
zusammengestellt;
signifikante Unterschiede konnten keine festgestellt werden.
nicht
Pflanzdatum
3.
7. Mai
pH-Werte
keit
(
|
von
ohne
von
12 Wochen
vorgekeimt
0,04
5,85
-
0,05
5,77-0,06
5,80
-
0,06
5,85
April
Tabelle 17:
vorgekeimt
-
Bintje-Kartoffeln (Standort Changins)
Pflanzdatum und
Vorkeimung
signifikanten Unterschied)
in
Abhängig¬
-71
-
Diskussion
5.
Die
vorliegenden Untersuchungen zeigen,
system enthalten, das RNS rasch
abbaut, wobei Temperatursind. Die
und
zu
dass Kartoffeln ein
verschiedenen Zwischen- und
pH-Verhältnisse eindeutig
in drei Themenkreise
Ergebnisse lassen sich
komplexes Enzym¬
von
Endprodukten
grosser
diskutieren;
und
gruppieren
Bedeutung
diese umfassen:
spezifischen Substraten,
-
die
Charakterisierung
von
Enzymaktivitäten
-
die
Charakterisierung
von
Enzymaktivitäten beim
systemen und
-
die
Die
nähere
von
Enzymaktivitäten
Temperatur-
mit
der einzelnen
und
Enzymkomponenten,
pH-Abhängigkeit.
Figur 29 sind die entsprechenden Resultate
gefasst.
-
ein
Daraus
geht folgendes
wichtiges
zweites
pH 9,3
im
Optimum
sauren
Enzym
ist die
Dagegen können die erhaltenen
Systems übertragen
experimentellen
Teils
Phosphodiesterase I;
werden.
zusammen-
das Akrivitäfs-
Bereich bei pH 5,5 und einer Temperatur
im alkalischen Bereich
und 65 C. Die Gesamtheit dieser
Verhalten einer in Hafer
des
vor
eine
allem der wichti¬
hervor:
und sehr aktives
Optimum liegt
RNS in Modell¬
spezifischen Substraten erlauben
Werte nicht ohne weiteres auf die Gesamtaktivität des
In
von
in frischen Kartoffeln.
Charakterisierung
gen Faktoren
Abbau
Homogenisaten,
in
pH-Verhältnisse
Messungen
mit
(Tabelle 4, Figuren
Eigenschaften
ist
von
14 und
50 C. Ein
15) liegt bei
vergleichbar
nachgewiesenen Phosphodiesterase (58).
mit dem
Abbau
Substrat
C
1,4
1,0
0,6
0,2
•
Substrat-
V
A
-
4,0
—,
Abbau
/
6,0
\
temperatur: 30
Reaktions-
A"
4,0
40°C
1
6,0
y-O-O.
,
(•)
(o)
(•)
(A)
pH
Substrat-
Abbau
Substrat-
1,0
1,4
3,2
Abbau
50°C
\.
0,6
0,2
"
pM
•
A
oi.A\
/
/
?-.-•-**-.
pH
pH
pH
60"C
\
6,0
1 /"^
und
4,0
uM
1,4
1,0
0,6
0,2
6,0
vonTemperatur
5'-AMP
TMP-PNP
«-N-TMP
RNS
Abhängigkeit
Substrate:
in
4,0
Zusammenstellung der Aktivitäten der RNS-angreifenden Enzyme
(bezogen auf die gleiche Menge Enzymextrakt)
pH
uM
29:
uM
1,4
1,0
0,6
0,2
Figur
Enzyme: RNS-abbauende Enzyme
Phosphodiesterase I
Phosphodiesterase II
Phosphatase+5'-Nukleotidase
-73
ferner findet sich eine
-
-
Phosphodiesterase
II mit einem
pH 5,5 und 60 C. Diese Aktivität scheint aber
von
Aktivitäts-Optimum
geringerer Bedeutung
sein für den RNS-Abbau. Es handelt sich dabei vermutlich
erwähntes
die
-
zu
ein schon früher
Enzym (48),
spezifische Ribonuklease-Aktivität,
vorgeht, zeigt ihr Optimum bei
wie sie
70 C und
turstabilität ist sie mit Ribonukleasen
avs
Figuren 10
den
pH 5,0. Aufgrund
vergleichbar,
und 11 her¬
der hohen
wie sie in
Tempera¬
Erbsen, Tabak
und
(46, 85) nachgewiesen wurden,
Mais
der Nukleotid-Abbau
-
um
bei
Von den
erfolgt
vor
beteiligten Enzymen
allem bei 40
wurden eine
-
50 C und einem
Phosphatase
pH
von
5,0.
und eine 5'-Nukleotidase
nachgewiesen.
Wenn auch ein
quantitativer Vergleich
straten nicht direkt
Phosphodiesterase
möglich ist,
I mit der
optimalsten Bedingungen
50 C und
Die
pH-Werten
Bestimmungen
höheren
den
sich
der
5'-Nukleotidanreicherung
So ist
Enzyme, dass
bei
die
Temperaturen
um
von
pH 6,0
gegen
I und der
Hinweise für eine
dieser
anzunehmen, dass bei Temperaturen
50 C
pH 5,0.
Ein
Ribonuklease,
Erklärung
jedoch diejenige
bevorzugt bei
der Aktivität verschiebt
geht. Das pH-Optimum
Phosphodiesterase
Phosphodiesterase, bei über
wiegt. Wird
der Nukleotid-abbauenden
pH 5,5 und höher liegen.
vor
sprochen wurden, ergibt
der
Wirkung
für eine
steigender Temperatur
Eigenschaften
hängigkeit.
zeigt doch ein Vergleich der Eigenschaften der
des gesamten RNS-Abbaus zeigen, dass dieser
Temperaturen
sich dabei mit
ab
so
der Aktivitäten bei den verschiedenen Sub¬
um
Vergleich
mit
wie sie vorhin be¬
Temperatur-/pH-Ab-
40
-
50 C die Aktivität
der Ribonuklease über¬
dazu die Aktivität der Nukleotid-abbauenden
Enzyme berücksichtigt,
-74-
so
zeigt sich, dass spezifische Untersuchungen der einzelnen Enzyme allein
zur
des Problems wenig
Lösung
kleotiden,
einem
Zwischenprodukt
schen den verschiedenen
rakterisierung
der
der
Reaktionen,
Die
und ihre
Abhängigkeiten
der
-
mit
zusammen
zu
die Aktivität der
die Nukleotid-abbauenden
Temperatur-,
verglichen
Diese
von
mit der
mit der
Die verschiedenen
Reaktionstemperaturen
den beiden
Phosphodiesterase
Enzyme
an
Es
Nukleosidfreisetzung.
Figuren
um
25 und 26
50 C vorwiegend auf
I, bei höheren
weisen im RNS-abbauenden
Temperaturen
Kartoffelenzyme bei
der
System
eine
pH-Abhängigkeit auf,
I.
zu
einer
optimalen Anreicherung
50 C und
Nukleotidanreicherung
pH 6,0.
beim RNS-Abbau in
Analysenmethoden (Ultrafiltration, Hitzeinaktivierung)
lassen sich wie folgt erklären. Der bei den
grössere Gehalt
verfolgen.
Ribonuklease,
Phosphodiesterase
Ergebnisse
zu
im Verlaufe
folgenden Aussagen:
die
aber eine stark verschiedene
5'-Nukleotiden durch die
von
Die Cha¬
vorangehenden Charakterisierung
Eigenschaften des komplexen Systems führen
Abhängigkeit
zwi¬
spezifischen Substraten,
an
und der
spezifischen Substraten
der RNS-Abbau beruht bis
ähnliche
5'-Nu-
wichtig.
gegenseitigen Beziehungen
Nukleotidanreicherung
der Aktivität der "erwünschten"
-
Aktivitäten ebenso
von
Beziehungen
sind die
wie sie in den Tabellen 10 und 11, bzw. den
Enzymaktivitäten
überwiegt
RNS-Abbaus,
bisherigen Beobachtungen
dargestellt sind, ermöglichen
der
Anreicherung
möglichst natürlichen, komplexen System
im
sich dabei die
Ergebnisse,
die
Enzymaktivitäten beim RNS-Abbau ermöglicht schliesslich,
spezifischen Eigenheiten
die
des
enzymatischen
die
bestätigen
beitragen. Für
Analysen
Nukleotiden bei höheren
nach der
Hitzeinaktivierung
Reaktionstemperaturen
wird durch die
-75-
Erfassung endständiger 3'-Phosphatreste
se
Oligonukleotiden hervorgerufen;
an
werden bei der Ultrafiltrations-Methode
ter
Nukleotidgehalt vorgetäuscht,
enzymen verursacht wird. Die bei
abgetrennt. Dadurch
Die mit
bei
Die
Temperatur
wie
er
ser
um
von
Temperaturgradient
lenartigen
BURI
52 C
durchgeführten Untersuchungen haben
pH 6,0
wurden
ist sicherlich ein weiterer
Aufbau der Kartoffel
von
wichtiger Faktor,
begründet liegt. Zudem lassen
5'-Nukleotiden, rasches Erhitzen hingegen
3'-Nukleotiden
diesterase I,
begünstigt. Man kann annehmen,
im zweiten Falle
hingegen
abbauenden Enzyme in der Kartoffelknolle
gemacht werden. Tabelle
durch freies
phosphat
pro
7 und
Orthophosphat.
kg,
Figur
die
der im knol¬
sich auch die
von
Erwärmen die An¬
Anreicherung
dass im ersten Falle die
von
Phospho¬
die Ribonuklease bevorteilt wird.
Ueber das Vorhandensein eines natürlichen
Inhibitionssystems
auf die Nukleotid-
mUssten zuerst genauere
20 zeigen die starke
Untersuchungen
Hemmung
Frische Kartoffeln enthalten 500
-
der
Phosphatase
600 mg Ortho-
doch kann nicht gesagt werden, wie gross die Bedeutung dieser
Phosphatkonzentration
ist. Nach KLEIN
(65)
ist auch eine starke
5'-Nukleotidase durch Nukleoside, nicht aber
Die
Temperaturbereich,
ganzen Kartoffelknollen langsam durchlaufen wird. Die¬
(3) gemachten Beobachtungen erklären, wonach langsames
reicherung
Figur 27).
12 und
bevorzugt 5'-Nukleotide freigesetzt.
52 C erweist sich dabei als ein mittlerer
beim Erhitzen
Endo-
(59).
optimaler Temperatur bestätigt (Tabelle
Bei Inkubation bei 52 C und
von
pH 6,5 auffallende 3'-Nukleotidanretcherung
Kartoffelhomogenisaten bei
pH-Abhängigkeit
wird ein erhöh¬
der tatsächlich durch die Aktivität
ist eher einer bereits bekannten Endonuklease zuzuschreiben
die
die¬
Untersuchungen
(Tabelle 13) ergaben
zur
nur
intrazellulären
vage
Phosphat,
Hemmung der
nachweisbar.
Lokalisierung der enzymatischen Aktivitäten
Anhaltspunkte.
Doch
fragt sich, ob
im
vorliegenden
-76
eine
System
Lokalisierung überhaupt
-
Bedeutung
von
sein kann. Einerseits hat
sich bereits früher gezeigt, dass erst eine Erwärmung des Gewebes
(5),
bau führt
Zerstörung
fällig
bekannt,
und anderseits ist
der inneren Zellstruktur
dass
Temperaturen über
zum
40 C
RNS-Abzu
einer
führen, wobei jeder Lokalisierungseffekt hin¬
wird.
Die
Ergebnisse
dem
pH
der
Untersuchungen über
in der Kartoffelknolle
den RNS-Abbau haben dazu
Beachtung geschenkt
wurde. Die
geführt,
Bedeutung
dass
des
pH-
Wertes für das biochemische System der Kartoffelknolle wurde in Zusammenhang
mit der
Eignung
für die
Verarbeitung bereits früher erkannt (86, 87).
in der Kartoffelknolle im für die
gen
haben gezeigt, dass sich der
von
5'-Nukleotiden günstigen Bereich
durch die Erwärmung
zeigt
die
von
pH 5,5
-
Tatsache,
hingegen durch
dass die nach den
die
Offen bleibt
jedoch,
ob die verschiedenen
die in
Abhängigkeit
halte,
oder sogar deren
von
er
pH-Werten
Wachstumsbedingun¬
der Proben geordnete
der Herkünfte verschiedener Kartoffelsorten identisch ist
Reihenfolge
Anreicherung
6,5 bewegt. Zudem wird
unwesentlich verändert. Eine Beeinflussung des physio¬
der Knollen besteht
logischen Zustandes
gen. Dies
nur
pH
Die Messun¬
pH-Werte
allein
signifikant sind,
der Herkunft der Kartoffeln verschiedenen
Speisequalität,
beurteilen
zu
(Tabelle 16).
um
Nukleotidge-
können. Innerhalb der
glei¬
chen Sorte weisen die Proben nämlich eine erstaunliche Homogenität auf. Auch
die
Untersuchungen über
Vorkeimung
hen
zu
die
Abhängigkeit
wiederholt
müssten
pH zwischen
Abschliessend kann
werden kann und
von
um
BURTON
Kronen- und Nabelende nicht
festgestellt werden,
in Kartoffeln bei der
pH-Wertes
durchgeführt werden,
können. Schliesslich konnten die
schiede im
des
Zubereitung
dass die
auf das
von
Pflanzdatum und
eindeutige Schlüsse
zie¬
(88) angegebenen Unter¬
bestätigt
Anreicherung
werden.
von
5'-Nukleotlden
gesamte,freie Enzymsystem zurückgeführt
Lokalisierungsphänomene
nicht
von
Bedeutung
sein dürften.
-77
Aufgrund
dieser
Ergebnisse
-
kann das RNS-abbauende Enzymsystem der Kartoffel¬
knolle mit anderen bereits früher beschriebenen Systemen
sie etwa bei
Hefen, Pilzen, Süssmais
und
Spargeln (14, 21, 85, 89, 90)
Aehnliche Systeme sind naturgemäss in jedem
pflanzlichen
Indessen dürften in der Kartoffelknolle zusätzliche
eine Rolle
spielen.
Von besonderer
Bedeutung
vorkommen.
Gewebe vorhanden.
Eigenheiten
dürften
wie
jedoch
des
Enzymsystems
sein:
Kartoffelknolle, sowie
-
der
pH-Wert
-
die
Temperaturverhältnisse
in der
verglichen werden,
während der
Verarbeitung
wobei auch die Erscheinungsform der Knolle und ihr
und
Zubereitung,
Wärmeleitungsverhalten wichtig
sind.
Es dürfte sicherlich
von
Interesse sein, diese Faktoren in Zukunft beim Anbau und
bei der
von
Kartoffeln vermehrt
Verwertung
sammenhänge
mit der
Speisequalität
häufig durchgeführte Vorerwärmung
Veränderungen und
Anreicherung
von
zur
Erhaltung
zu
von
zu
berücksichtigen
und
mögliche
Zu¬
beachten. So ist auch bekannt, dass die
Kartoffeln, die der Verhinderung oxydativer
einer erwünschten Textur dient
5'-Nukleotiden eine günstige Wirkung besitzt.
(91),
auch auf die
-78-
6.
Zusammenfassung
1.
In der
Eigenschaften
dieser
Enzyme
zubereiteten Kartoffeln
und
Beziehungen zwischen
Anreicherung
und der
von
Die
Abbau
5'-Nukleotiden in
RNS und im besonderen über das
wurde vorerst
von
ausgegangen. Die
einerseits mit
spezifischen
Die
men,
wurden
einem
an
Kartoffeln der Sorte
Bintje
durch¬
Enzymextrakt als natürlich gegebenem
Charakterisierung
der
Enzymaktivitäten erfolgte
wurden die
von
gezeigten Abhängigkeiten
RNS in
in einem Kar¬
überprüft.
pH-Messungen
wobei die
enzymatische
Substraten und anderseits beim Abbau
Modellsystemen. Schliesslich
toffel homogenisat
der
gegeben.
enzymatischen Untersuchungen
Mischsystem
Bedeutung
Ferner wird eine Uebersicht über den chemischen
von
der Kartoffeln
geführt. Dabei
den
aufgezeigt.
hingewiesen.
enzymatischen
Abbausystem
4.
und
In einem einleitenden Teil wird auf das Vorkommen und die
5'-Nukleotide
3.
gegeben
der Kartoffelknolle
Enzymsystem
2.
wurden ein Ueberblick über das RNS-abbauende
vorliegenden Arbeit
wurden
an
Kartoffeln der Sorten
Abhängigkeiten
von
Bintje
und Maritta vorgenom¬
der Sorte, Herkunft und
Temperatur geprüft
worden sind.
5.
Es
zeigte sich, dass das für die Freisetzung
wichtige Enzym Phosphodiesterase
aufweist. Das
Optimum
5'-Nukleotiden im
die verschiedenen
liegt bei
Enzyme bei 45
komplexen System
pH-Abhängigkeiten
5'-Nukleotiden in Kartoffeln
Aktivitäts-Optimum
der Ribonuklease
der Nukleotid-abbauenden
von
I ein
von
der
C und
70 C und
pH 5,0.
bei 50 C und
pH 5,5
pH 5,0; dasjenige
Für die
sind daher neben der
Anreicherung
Temperaturführung
Enzyme verantwortlich. So
ergibt sich
-79-
für die
Anreicherung
Temperaturen
und
optimaler Bereich bei
ein
niedrigerer pH fuhren
zu
einem
Nukleotide, höhere Temperaturen allgemein
von
3'-Nukleotiden und
tisch
6.
ausgeschlossen
Die
pH-Messungen
was
für die
vom
50 C und
zu
weitgehenden Abbau
einer vermehrten
schiede in der
ergaben Werte
von
pH 6,0 genügen,
geschmacklichen Qualität
gehender geprüft
Anreicherung
werden.
in Kartoffeln
Wert
der
Oligonukleotiden. Lokalisierungseffekte konnten prak¬
im Bereiche
Anreicherung der 5'-Nukleotide günstig
optimalen
pH 6,0. Tiefere
werden.
um
von
ist. Wieweit
pH 5,5
-
6,5,
Abweichungen
eindeutige Aussagen über Unter¬
der Kartoffeln
zu
machen,
mUsste ein¬
-80-
7.
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Geboren
1946
am
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April
in
Huttlingen, TG
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1959
Primarschule in Mettendorf, TG
1959
-
1961
Sekundärschule in Frauenfeld
1961
-
1965
Kantonsschule in Frauenfeld,
1966
-
Maturität
1970
Studium
Typus
an
Abteilung
Diplom
der
Oberrealabteilung,
C
Eidgenössischen Technischen Hochschule,
für Landwirtschaft.
als
Ingenieur Agronom
mit
Spezialausbildung
in
Agrotechnologischer Richtung (heute: Lebensmittel-Ingenieur)
seit Feb. 1971
Wissenschaftlicher Mitarbeiter
wissenschaft (früher
Ausfuhrung
am
Institut fUr Lebensmittel¬
Agrikulturchemisches Institut), ETH,
einer Promotionsarbeit unter der
Dr. J. Solms.
Leitung
von
Zürich.
Prof.