Strukturelle und biophysikalische Charakterisierung der

Zusammenfasung
Denn trotz der großen Homologie zwischen den LG-Domänen sind gerade die
Aminosäuren die in der hGBP1 Dimerisierung den größten Beitrag leisten, im hGBP2
verändert. Das R240 aus hGBP1 ist im hGBP2 ein Tryptophan und das R244 und R245
liegen im hGBP2 als Lysine vor.
Es ist zu berücksichtigen, dass bei Verwendung von GDP*AlFx dauerhaft ein Zustand
dargestellt wird, der bei der Hydrolyse von GTP sehr kurzlebig ist. Um zu zeigen, dass
dieser Zustand während der GTP-Hydrolyse lang genug anhält, damit die Interaktion
zustande kommt, wurde der Versuch zeitabhängig unter multi turnover Bedingungen mit
GTP durchgeführt. Nach der Zugabe des GTP ist eine Zunahme der Akzeptorfluoreszenz
zu beobachten, die nur durch die Interaktion von hGBP1 und hGBP2 erfolgen kann.
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Zusammenfassung
Die Selbstassemblierung von Proteinen der Dynamin Familie ist ein wichtiger Bestandteil
ihrer Funktion. In vorangegangenen Arbeiten konnte bereits für das hGBP1 eine
Assemblierung zu einem dimeren Komplex beobachtet werden, die eine starke
Beschleunigung der Hydrolyse zur Folge hat. Des Weiteren konnte auch die
Oligomerisierung zu einem tetrameren Komplex gezeigt werden, in der die Helices α12/13
als Interaktionsdomäne dienten.
Ziel dieser Arbeit war es, unter biophysikalischen und biochemischen Gesichtspunkten die
Selbstassemblierung von hGBP1 zu untersuchen und die Rolle der helikalen Subdomäne
α12/13 innerhalb dieses Vorgangs zu klären. Diese Arbeit beschäftigt sich ebenfalls mit
der biochemischen Charakterisierung von hGBP2 und gibt die ersten Hinweise auf eine
Interaktion zwischen hGBP1 und hGBP2.
In einer detaillierten Betrachtung der full length Struktur von hGBP1 ist zu erkennen, dass
die Helix α4´ aus der LG-Domäne mit den Helices α12-13 interagiert. Diese Interaktion
zwischen der LG-Domäne und dem C-Terminus ist ein elektrostatischer Kontakt
bestehend aus einem Lysin (K228) und einem Arginin (R227) auf Seiten der Helix α4´ und
mehreren Glutaminsäuren (E563, E568, E556 und E575) auf Seiten von α12-13. Durch die
Bindung von GDP*AlFx durch den Wildtyp erfolgt die Tetramerisierung des Proteins.
Aufgrund einer Konformationsänderung, bei der sich die Helix α4´ verschiebt, wird beim
Wildtyp die elektrostatische Interaktionen zwischen der LG-Domäne und der Subdomäne
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Zusammenfasung
α12-13 gelöst. Dadurch stehen die Helices α12-13 als Interaktionsdomäne zur Verfügung.
Um diese These zu stützen, wurde in dieser Arbeit erfolgreich eine Mutation in hGBP1
eingefügt (R227E/K228E), die diese elektrostatische Interaktion dauerhaft unterbricht. Das
hat zur Folge, dass diese Mutante in nukleotidfreier Form bereits als helikal assoziiertes
Dimer vorliegt. Die Bindung des nicht hydrolysierbaren GTP Analogon GppNHp bewirkt
die Assemblierung zu einem Tetramer, was beim Wildtyp nur im Komplex mit GDP*AlFx
geschieht.
Durch
die
Unterbrechung
des
elektrostatischen
Kontakts
ist
die
Konformationsänderung der α4´nicht mehr notwendig und die Helices α12-13 stehen
dauerhaft für eine Interaktion zur Verfügung. Somit kann bereits im nukleotidfreien
Zustand eine Assemblierung an der helikalen Domäne stattfinden. Dadurch konnte gezeigt
werden, dass diese elektrostatische Interaktion verantwortlich für eine Weiterleitung der
Information der GTP Hydrolyse an die helikale Domäne ist.
Diese Unterbrechung des elektrostatischen Kontakts zeigt auch einen Einfluss auf die
Nukleotid-Hydrolyse. Die Konzentrationsabhängigkeit der Hydrolysegeschwindigkeit
zeigt einen sigmoidalen Verlauf. Dabei ist zwar die maximale Hydrolysegeschwindigkeit
der Mutante dem Wildtyp sehr ähnlich, jedoch besitzt sie schon bei geringen
Proteinkonzentrationen eine relativ hohe Aktivität.
Bei der Deletionsmutanten 1-481, aber auch bei den isolierten LG-Domänen konnte die
Bindung und Umsetzung von GDP festgestellt werden (Kunzelmann 2006, Ghosh et al.,
2006). Diese veränderte Substratspezifität konnte auch bei der Punktmutante R227E und
bei der Doppelmutante R227E/K228E beobachtet werden. Jedoch ist die GDP
Hydrolysegeschwindigkeit dieser Mutanten 10mal kleiner als die der Deletionsmutante
1-481, zeigt aber den Einfluss der α12-13 im Bezug auf die Substratspezifität.
Um die Interaktion an der helikalen Domäne untersuchen zu können, wurden zusätzlich
zur Doppelmutante R227E/K228E unterschiedliche Deletionsmutanten hergestellt und
hinsichtlich ihrer Affinität an der mT-Jump-Apparatur analysiert. Dabei zeigte sich, dass
die Tetramerisierung nicht nur über die Subdomäne α12/13 vermittelt wird. Bei der
zusätzlichen Anwesenheit von weiteren Domänen (α7-11 bzw. LG-Domäne), sind die
Affinitäten um bis zu einer Größenordnung höher.
Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der biochemischen und
biophysikalischen Charakterisierung von hGBP2. Im Gegensatz zur GTP-Hydrolyse durch
hGBP1 ist bei der Hydrolyse durch hGBP2 GDP das Hauptprodukt. Die Produktion von
GMP konnte nicht festgestellt werden. Auch in der nukleotidabhängigen Oligomerisierung
konnten Unterschiede zum Wildtyp festgestellt werden. In Gegenwart von GppNHp liegt
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Zusammenfasung
hGBP2 als Monomer vor, während für hGBP1 eine Dimerisierung in Gegenwart von
GppNHp beschrieben wird. Dagegen liegt hGBP2 im Komplex mit GDP*AlFx in einem
oligomeren Zustand vor, welcher im Vergleich zum hGBP1 einem Trimer entspricht.
Die GTP-Hydrolyse von hGBP2 ist wie die von hGBP1 kooperativ. Die maximale
spezifische Aktivität von 15 min-1 bei sättigenden Proteinkonzentrationen ist allerdings
niedriger als die von hGBP1 (22,8 min-1).
Unter Verwendung Fluoreszenz-markierter Proteine konnte eine Interaktion zwischen
hGBP1 und hGBP2 nachgewiesen werden. Diese Interaktion wird über die α12-13 von
hGBP1 vermittelt.
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