Nicht-thermische Aktivierung eines Stress-Signalwegs

Differentiation (2002) 70:120-129
Dariusz Leszczynski . Sakari Joenväärä . Jukka Reivinen . Reetta Kuokka
Nicht-thermische Aktivierung des hsp27/p38MAPK-Stress-Signalweges
durch Mobilfunkstrahlung in menschlichen Endothel-Zellen: Molekularer
Mechanismus für Effekte, die mit Krebs und der Blut-Hirn-Schranke
zusammenhängen
Zusammenfassung ...
Einführung
xxx
Methoden
Zellkultur
...
RF-EMF-Expositions-System und Expositions-Ablauf
Analyse der Protein-Expression und –Phosphorylation?
Nachweis von hsp27-Expression in Zellkulturen
Nachweis von hsp27-Phosphorylation?
...
Western blots?
...
Immunoprecipitation?
...
...
...
...
Ergebnisse und Diskussion
Über 1200 unterschiedliche Protein-Spots wurden identifiziert. Darunter waren in den
Sham-Zellen 110 Phosphoproteine. Nach RF-EMF-Exposition stieg die Zahl der
Phosphoproteine auf 372, was einen mehr als 3-fachen Anstieg in der 32P-Aufnahme?
bedeutet. Die Analyse der 2D-Autoradiogramme der 32P-Phosphoproteine zeigte, dass 43 der
Phosphoproteine sowohl in Sham- als auch in exponierten Zellen auftraten (Veränderungen in
der Phorphorylations-Stärke wurden auch festgestellt). 67 Phosphoproteine traten nur in
Sham-Zellen auf, was darauf hindeutet, dass sie während der 1-stündigen Exposition
dephosphorylisiert? wurden. 324 Phosphoproteine traten nur in exponierten Zellen auf. Aber
bei der Analyse von Veränderungen in der Protein-Phosphorylation ist es wichtig sich daran
zu erinnern, dass die Identifikation von Phosphoproteinen schwierig ist, wenn sie nur auf
deren Molekulargewicht und pI? basiert. Veränderungen in der Phosphorylation können auch
die pI eines Proteins verändern und dann wird sich das Phosphoprotein in einem anderen Spot
sammeln als die nicht oder weniger phosphorylisierte? Form desselben Proteins. Daher ist,
um Phosphorylations-Änderungen von Phosphoproteinen richtig zuzuordnen, die
Identifizierung dieser Phosphoproteine mittels Massen-Spektrometrie nötig (Experimente sind
unterwegs, über die Ergebnisse wird später berichtet). Aber obwohl die besondere Identität
der Phosphoprotein-Spots unbekannt bleibt, deuten der 3-fache Anstieg der Aufnahme des
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P-Markers? und die Erhöhung der Anzahl der Phosphoprotein-Spots klar darauf hin, dass
eine Vielzahl von zellulären Signal-Wegen? der EA.hy926 Endothel-Zellen auf die nichtthermische RF-EMF-Bestrahlung reagiert hat.
Hsp27 wurde als eines der Phosphoproteine identifiziert, die in phosphorylisierter Form
sowohl in Sham- als auch in exponierten Zellen vorkamen. Dieses Stress-Protein wird in der
EA-hy926-Zelllinie kontinuierlich exprimiert? (Wagner et al., 1999). Immunofluorescence
staining? zeigte auf, dass einige EA.hy926-Zellen sowohl in den Kontroll- als auch in den
Sham-Kulturen hohe Levels an hsp27 exprimierten. Die Zahl der hsp27-Zellen steigerte sich
bei den exponierten Zellen. Hitze-Schock war ein noch stärkerer Auslöser der hsp271
Expression. Hsp27 wurde entweder im Zytoplasma oder im Nukleus festgestellt, und an
dieser Stelle ist noch unklar, ob die hsp27-Expression in irgendeinem der Zellteile durch die
RF-EMF-Exposition beeinträchtigt wurde. Die 2D-elektrophoretische Trennung der ProteinLysate? der Sham- oder exponierten Zellen, gefolgt von Western-Blotting?, zeigte, dass hsp27
in den EA.hy926-Zellen in zwei unterschiedlichen molekularen Arten exprimiert wurde, beide
mit einem Molekulargewicht von 27 kDa, aber mit unterschiedlichen isoelektrischen Punkten
(pI=5,7 und pI=6,1). Die Markierung der Phosphoproteine mit 32P-Orthophosphat erlaubte
uns zu folgern, dass die Form hsp27pI=5,7 in den Sham-Kulturen phosphorylisiert war. Nach
der Exposition vergrößerte sich der hsp27pI=5,7-Spot. Es gibt drei Erklärungen für diese
Beobachtung. Erstens, die nicht-phosphorylisierten Moleküle von hsp27pI=6,1 wurden als
Reaktion auf RF-EMF phosphorylisiert, so dass deren pI auf 5,7 verringert wurde. Zweitens,
die RF-EMF-Exposition verursachte eine neue Bildung von hsp27, was dann phosphorylisiert
war uns sich im hsp27pI=5,7-Spot sammelte. Drittens, verstärkte sich möglicherweise die
Phosphorylation von schon phosphorylisierten Molekülen, aber die experimentellen
Methoden dieser Studie ließen nicht zu, diese Möglichkeit zu testen. Allerdings erscheinen
die erste und zweite Erklärung wahrscheinlicher. Es wurde gezeigt, dass die Phosphorylation
von hsp27 ein Aktivierungsmechanismus für hsp27 in Endothel-Zellen ist (...). Diese Studie
gibt auch Hinweise (siehe weiter unten) darauf, dass RF-EMF-Bestrahlung eine kurzzeitige
Erhöhung im Expressions-Level des hsp27-Proteins verursacht. Der hsp27pI=6,1-Spot blieb,
wie erwartet, sowohl in Sham- als auch in exponierten Zellen nicht-phosphorylisiert.
Die Erhöhung in der Phophorylation von hsp27 während der einstündigen
Bestrahlungsdauer wurde durch Immunopecipitation? bestätigt. Die von der RF-EMFExposition hervorgerufende Phosphorylation von hsp27 wurde durch SB203580, einem
spezifischen Hemmstoff von p38MAPK (Lee et al., 1999), aufgehoben. Es ist interessant,
dass RF-EMF-Exposition auch die Expression von p38MAPK-Kinase, welche indirekt (...) an
der Phosphorylation von hsp27 beteiligt ist (Ono und Han, 2000), kurzzeitig zu erhöhen
schien.
[Die hsp27-Reaktion dauerte nur kurz, ähnlich wie bei anderen Stressfaktoren] ... Daher
deuten die beobachteten Veränderungen in der Expression und Phosphorylation von hsp27
und in der Expression von p38MAPK darauf hin, dass EA.hy926-Zellen Mobilfunkstrahlung
als Stressfaktor erkennen und als Reaktion den p38MAPK/hsp27-Stress-Signal-Pfad
aktivieren. Daher zeigen unsere Ergebnisse auch, dass RF-EMF-Strahlung eine neuer Eintrag
für die Liste der äußeren Stressfaktoren ist, die zelluläre Stress-Kinasen aktivieren können.
Die Änderungen in der Protein-Phosphorylation und die Aktivierung des
p38MAPK/hsp27-Stress-pathway?, was in dieser Studie beobachtet wurde, stimmen mit
früheren Studien überein, die darauf hinweisen, dass RF-EMF-Strahlung bei nichtthermischen Intensitäten eine zelluläre Stressreaktion verursacht. In vitro behauptete Cleary et
al. (1997), dass RF-EMF-Exposition keinen Effekt auf Stress-Proteine ausübt. Aber weil die
Indentifizierung der Stress-Proteine nur auf deren Molekulargewicht in liquid
chromatography? basierte, bleibt die exakte Identität der Proteine, von denen behauptet
wurde, sie seien Stress-Proteine, unklar. Fritze et al. (1997b) haben bei Benutzung eines
Ratten-Modells eine Erhöhung in der Expression des Stress-Proteins hsp70 in den Gehirnen
der Tiere, die für 4 h gegenüber RF-EMF (890 – 9115 MHz) bei einer SAR von 1,5 W/kg
exponiert waren, gezeigt. Daniells et al. (1998) und de Pomerai et al. (2000) haben gezeigt,
dass die in vivo-Bestrahlung von Nematoden-Würmern über Nacht mit RF-EMF (750 MHz)
bei einer SAR von 0,001 W/kg eine Erhöhung in der Expression von Hitze-Schock-Proteinen
verursacht. Kwee et al. (2001) hat eine Induktion des Stress-Proteins hsp70, aber nicht hsp27,
in Kulturen von transformierten menschlichen epithelialen amnion? Zellen, die für 20 min
einem RF-EMF (960 MHz) bei einer SAR von 0,0021 W/kg exponiert waren, gezeigt.
Aufgrund des bekannten breiten Spektrums von physiologischen Prozessen, die durch
Stress-Proteine (Tibbles und Woodgett, 1999) und im Besonderen durch hsp27 reguliert
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werden, wird hier die Hypothese aufgestellt, dass zelluläre Stress-Reaktionen, die von einer
durch Mobilfunkstrahlung hervorgerufenen Aktivierung von hsp27/p38MAPK abhängen, (i)
zur Entwicklung von Gehirntumoren aufgrund der Hemmung der Zellapoptose (Anm.:
programmierter Zelltod) führen und (ii) eine erhöhte Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke
aufgrund einer Stabilisierung von endothelialen Zellstressfasern verursachen können.
Man weiß, dass Stress-Proteine die Zellapoptose regulieren (Mehlen et al., 1996; Creagh
et al., 2000; Pandey et al., 2000). Eine RF-EMF-induzierte Deregulation von apoptotischen
Prozessen könnte ein Risikofaktor für die Entwicklung von Tumoren sein, weil dies zum
Überleben von Zellen führen könnte, die eigentlich sterben sollten. Diese Idee wurde in der
Hypothese, die kürzlich von French et al. (2001) vorgestellt wurde, vorgeschlagen. Wir
schlagen vor, dass der apoptotische pathway?, der durch hsp27/p38MAPK reguliert wird, das
Ziel der RF-EMF-Strahlung sein könnte. Hsp27, das –wie diese Studie zeigt– durch
Mobilfunkexposition beeinflusst wird, ist Mitglied einer Familie von kleinen Hitze-SchockProteinen, die in den meisten Zellen unter normalen Bedingungen ständig in der Form von
groß-molekularen Komplexen exprimiert werden. Als Reaktion auf Stress, tritt eine schnelle
Phosphorylation von hsp27 ?Serine-Rückstände? (in menschlichen Zellen Ser-78 und Ser-82)
auf, was zur Aufteilung der groß-molekularen Komplexe in kleinere Einheiten führt (Kato et
al., 1994). Es wurde von verschiedenen Stress-Faktoren gezeigt, dass sie Auslöser von
Änderungen in der Expression (Anhäufung) und/oder Phosphorylation (Aktivität) von hsp27
sind (...). Es wurde gezeigt, dass aktiviertes (phosphorylisiertes) hsp27 die Apoptose hemmt,
indem es einen Komplex mit dem Apoptosom (...) oder einigen seiner Komponenten bildet
und die proteolytic? Aktivierung von pro-caspase-9 in die aktive Form caspase-9 verhindert
(...). [Weitere Erklärung: Überleben von transformierten Zellen] Weiterhin wurde gezeigt,
dass hsp27 im Besonderen für eine Resistenz von Tumorzellen gegenüber Anti-KrebsMedikamenten verantwortlich ist (...). Daher scheint es möglich, dass von RF-EMFExposition hervorgerufene Veränderungen in der Phosphorylation/Expression von hsp27
nicht nur die Tumor-Entwicklung, sondern auch dessen Medikamenten-Resistenz
beeinflussen könnte.
Die Erhöhung der Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke durch RF-EMF-Exposition,
worauf durch einige Tier- und in vivo-Studien hingedeutet wird, ist eines der kontroversen
Gesundheits-Probleme, die in Verbindung mit dem Gebrauch von Mobiltelefonen aufkamen.
Es gilt schon als gesichert, dass Mikrowellenstrahlung bei thermischen Expositionsstärken
eine Erhöhung der Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke verursacht (siehe xxx). Aber der
Effekt einer nicht-thermischen RF-EMF-Exposition auf die Blut-Hirn-Schranke ist noch
unklar. Einige Studien deuten darauf hin, dass Mobilfunkstrahlung bei nicht-thermischen
Expositionsstärken die Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke in vivo (Salford et al., 1994) und
in vitro (Schirmacher et al., 2000) erhöht, während andere ein Fehlen solcher Effekte
berichten (Fritze et al., 1997a; Tsurita et al., 2000). Aber das negative Ergebnis, das von
Fritze et al. (1997a) behauptet wurde, ist nicht so klar wie von den Autoren angedeutet, weil
sie die Verursachung einer Stressreaktion und einer Erhöhung der Permeabilität der BlutHirn-Schranke unmittelbar nach der Bestrahlung berichten. Dieser Effekt dauerte nur kurz
und wurde daher von den Autoren als nicht signifikant betrachtet. Auch die Reaktion der
Blut-Hirn-Schranke auf wiederholte Expositionen gegenüber Mobilfunkstrahlung bleibt
unklar, weil der Effekt wiederholter Expositionen noch nicht untersucht wurde. Die erhöhte
Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke aufgrund einer Erhöhung der endothelialen Pinozytose
wurde von Neubauer et al. (1990) vorgeschlagen, der eine Erhöhung in der Pinozytose von
cerebral? cortex? Kapillaren, die gegenüber 2,45 GHz Mikrowellenstrahlung exponiert waren,
zeigte. Schließlich hat die kürzlich veröffentlichte Studie von Töre et al. (2001) gezeigt, dass
eine zweistündige Exposition von Ratten gegenüber RF-EMF (900 MHz) bei einer SAR von 2
W/kg (über das Gehirn gemittelt) eine Erhöhung in der Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke
verursacht. Allerdings sind der molekulare Mechanismus und die zellulären Signal-Wege, die
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in die Auslösung der Blut-Hirn-Schranken-Permeabilität verwickelt sind, immer noch
unbekannt. Wir schlagen vor, dass die Induktion der Phosphorylation und einer erhöhten
Expression von hsp27 durch RF-EMF-Exposition, das – wie diese Studie zeigt – in vitro in
menschlichen Endothel-Zellen auftritt, das molekulare Signal-Ereignis sein könnte, das die
Kaskade von Ereignissen auslöst, die zur Erhöhung der Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke
führt. [Genauere Beschreibung des Mechanismus: Stabilisierung von Stress-Fasern? führt zu
unterschiedlichen Ereignissen, die die BHS öffnen und möglicherweise die Apoptose
beeinflussen]
Der vorgeschlagene hypothetische molekulare Mechanismus für eine mögliche Rolle von
Mobilfunkstrahlung bei der Entwicklung von Hirntumoren und bei der Erhöhung der
Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke, wenngleich eine Hypothese, wird von der Beweislage
sowohl die Effekte von Mikrowellen auf die Stress-Reaktion als auch die Effekte von hsp27
(erhöhte Expression und Aktivität) auf die Zellphysiologie betreffend vernünftig unterstützt.
Der Beweis dieser Hypothese oder ihr Gegenbeweis bei Benutzung von in vitro- und in vivoModellen wird Beweismittel erbringen, um die Existenz von einigen der möglichen
Gesundheitsrisiken, die mit dem Gebrauch von Mobiltelefonen verbunden werden, entweder
zu unterstützen oder abzulehnen.
Die kürzlich publizierte Hypothese von French et al. (2001), die die mögliche Induktion
von abnormal hohen Levels von Stress-Proteinen in Zellen aufgrund von chronischer/häufiger
Exposition gegenüber Mobilfunkstrahlung betrachtet, benötigt immer noch die experimentelle
Bestätigung, dass wiederholte Expositionen gegenüber RF-EMF solch eine Erhöhung
hervorrufen können. Auf der anderen Seite beruht der hypothetische Mechanismus des
Effekts der Mobilfunkstrahlung auf das Gehirn, der von uns vorgeschlagen wurde, auf kurzen
Erhöhungen der hsp27-Phosphorylation und –Expression, die durch eine einzelne Exposition
hervorgerufen werden. Wir schlagen vor, dass die kurzzeitigen Effekte, die durch wiederholte
Expositionen hervorgerufen werden, durch Zeit-Zufall? zum Überleben von
beschädigten/transformierten Zellen führen und vorübergehend die Permeabilität der BlutHirn-Schranke erhöhen könnten. Wiederholtes Auftreten dieser Ereignisse (auf täglicher
Basis) über eine lange Zeit (Jahre) könnte aufgrund einer möglichen Anhäufung von
Hirngewebe-Schäden ein Gesundheitsrisiko werden. Weiterhin schlägt unsere Hypothese vor,
dass andere Faktoren als RF-EMF, die Zellen schädigen, an der Tumorentwicklung, die von
Mobilfunkstrahlung ausgelöst ist, mitwirken könnten.
Schließlich deutet das Ausmaß der Veränderungen im Gesamtmuster der ProteinPhosphorylation, welches in unserer Studie beobachtet wurde, zusätzlich zu den vom
p38MAPK/hsp27-Stress-Weg? induzierten Effekten darauf hin, dass wahrscheinlich
zahlreiche Signal-Pfade durch die RF-EMF-Exposition beeinflusst werden können. Die
Identifikation dieser Pfade wird dabei helfen, das Ausmaß der biologischen Effekte, die von
einer RF-EMF-Exposition hervorgerufen werden, zu bestimmen. Entscheidend ist, dass die in
dieser Studie beobachteten zellulären Effekte durch RF-EMF-Bestrahlung bei nichtthermischen Stärken verursacht wurden, bei den größten SAR-Werten, die von europäischen
Sicherheits-Standards erlaubt sind. Dies deutet darauf hin, dass die zur Zeit erlaubten
Strahlungs-Emissions-Werte für Mobiltelefone, wenngleich sie niedrig sind, ausreichen
könnten, biologische Effekte zu verursachen. Aber die Feststellung, ob diese Effekte
irgendwelche signifikanten Gesundheitseffekte verursachen können, bedarf weiterer
Forschung.
Anerkennungen
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Literatur
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