Korrelation der klinischen Strahlenempfindlichkeit mit
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Aus dem Universitätsklinikum Münster Institut für Humangenetik -Direktor: Univ.-Prof. Dr. med. J. Horst- Korrelation der klinischen Strahlenempfindlichkeit mit Chromosomenaberrationen nach Teilkörperdosis +/- in-vitro-Bestrahlung INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des doctor medicinae der Medizinischen Fakultät der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster vorgelegt von Holtmann, Lina Lin aus Coesfeld 2007 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster Dekan: Univ.-Prof. Dr. med. V. Arolt 1. Berichterstatter: Univ.-Prof. Dr. med. J. Horst 2. Berichterstatter: Univ.-Prof. Dr. med. N. Willich Tag der mündlichen Prüfung: 15.02.2007 Aus dem Universitätsklinikum Münster Institut für Humangenetik -Direktor: Univ.-Prof. Dr. med. Jürgen HorstReferent: Univ.-Prof. Dr. med. Jürgen Horst Koreferent: Univ.-Prof. Dr. med. N. Willich Zusammenfassung Korrelation der klinischen Strahlenempfindlichkeit mit Chromosomenaberrationen nach Teilkörperdosis +/- in-vitro-Bestrahlung Holtmann, Lina Lin Bei einer Strahlentherapie kommt es neben der Zerstörung von Tumorgewebe bei 1-5% der Patienten zu erheblichen langfristigen Normalgewebsveränderungen. Ein wichtiges Ziel in der onkologischen Strahlentherapie ist daher, die Strahlenempfindlichkeit von Patienten unter der Annahme einer genetischen Disposition prädiktiv zu erfassen, um eine Individualisierung von Behandlungskonzepten zu ermöglichen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde mittels einer Paar-Analyse der Zusammenhang zwischen der individuellen klinischen Strahlenempfindlichkeit und genetischer Korrelate untersucht. Das Ausmaß der akuten Normalgewebsreaktionen definierte hierbei die klinische Strahlenempfindlichkeit, die Anzahl der Chromosomenaberrationen in Lymphozyten des peripheren Blutes die genetische Korrelation. Die Studie umfasste 30 Patientenpaare. Diese setzten sich jeweils aus Patienten mit auffälliger Strahlenreaktion und solchen ohne Auffälligkeiten zusammen. Die zugeordneten Patienten waren jeweils bezüglich des Tumors, der Therapie und der Kofaktoren vergleichbar. Die klinische Einteilung erfolgte mittels der EORTC/RTOG Klassifikation. Um die genetisch bedingte Strahlenempfindlichkeit zu bestimmen, wurde den Patienten zum Zeitpunkt des Auftretens einer klinisch als empfindlich eingestuften Akutreaktion (nach Teilkörperdosis) eine Blutprobe entnommen. Mittels der konventionellen Metaphasen-Technik wurde die Zahl von Chromosomenaberrationen bestimmt, sowohl mit als auch ohne zusätzliche in-vitro-Bestrahlung mit 2 Gy. Für die Zahl der spontanen, sowie der strahleninduzierten Chromosomenaberrationen fand sich keine Abhängigkeit von der Teilkörperdosis oder klinischen Faktoren, die bei der Zuordnung nicht berücksichtigt wurden. Es zeigten sich signifikant unterschiedliche Werte für das Auftreten dizentrischer Chromosomen, azentrischer Fragmente, die Summe aller Bruchereignisse und Brüche pro Zelle sowie für dizentrische Chromosomen nach in-vitro-Bestrahlung. In der logistischen Regression blieb die Rate dizentrischer Chromosomen signifikant. Dabei ging eine Sensitivität von 70% mit einer Spezifität von ebenfalls ca. 70% einher. Um einen Ansatz zum echten präradiotherapeutischen Screening zu entwickeln, müssen die Ergebnisse an einem größeren Patientenkollektiv und unter Vereinfachung der Methodik überprüft werden. Tag der mündliche Prüfung: 15.02.2007 1 INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG................................................................................................ 4 1.1 ALLGEMEINE GRUNDLAGEN DER NORMALGEWEBSREAKTIONEN ....................5 1.2 GENETISCHE FAKTOREN DER NORMALGEWEBSREAKTION ...............................7 1.3 CHROMOSOMENABERRATIONEN ALS INDIKATOR DER INDIVIDUELLEN STRAHLENEMPFINDLICHKEIT ...........................................................................9 1.4 KLASSIFIKATION AKUTER UND SPÄTER NEBENWIRKUNGEN ..........................10 1.5 THERAPIEKONZEPTE DES MAMMACARCINOMS ..............................................12 1.6 THERAPIEKONZEPTE DER KOPF-HALS-TUMOREN ..........................................12 2 ZIELSETZUNG........................................................................................... 14 3 MATERIAL UND METHODEN ............................................................... 15 3.1 MATERIALIEN ................................................................................................15 3.1.1 Puffer und Lösungen.........................................................................15 3.1.2 Geräte und Sonstiges ........................................................................15 3.2 METHODEN ....................................................................................................17 3.2.1 Klinisch empfindliche Patienten und zugeordnete Partner ..............17 3.2.2 Paar-Zuordnung ...............................................................................17 3.2.3 Klassifikation und Dokumentation der Nebenwirkungen .................18 3.2.4 Bestrahlung und Dosimetrie .............................................................19 3.2.5 Nachweis von Chromosomenschäden mittels der Metaphasen-Technik 19 3.2.6 Mikroskopie und Auswertung ...........................................................22 3.3 STATISTISCHE METHODEN .............................................................................23 3.3.1 Kruskal-Wallis-Test ..........................................................................23 3.3.2 Mann-Whitney-U-Test ......................................................................23 3.3.3 Wilcoxon für verbundene Stichproben..............................................23 3.3.4 Logistische Regression .....................................................................24 4 ERGEBNISSE.............................................................................................. 25 4.1 BESCHREIBUNG DES PATIENTENKOLLEKTIVS ................................................25 4.1.1 Basisstatistik im Gesamtkollektiv der 60 Patienten..........................25 4.1.1.1 Geschlecht, Alter, Allgemeinzustand ...........................................25 4.1.1.2 Nikotin ..........................................................................................25 4.1.1.3 Alkohol .........................................................................................25 4.1.1.4 Begleiterkrankungen.....................................................................26 4.1.1.5 Medikamentöse Begleittherapien .................................................26 4.1.1.6 Bestrahlungsgebiet........................................................................27 4.1.2 Paar-Zuordnung ...............................................................................27 4.1.2.1 Subgruppe Mamma.......................................................................27 4.1.2.2 Subgruppe HNO ...........................................................................27 4.1.2.3 Zuordnungs-Tabelle für Patientinnen mit Brustbestrahlung, Hauptkriterien ...............................................................................29 4.1.2.4 Zuordnungs-Tabellen für Patientinnen mit Brustbestrahlung, zusätzliche Informationen.............................................................30 4.1.2.5 Zuordnungs-Tabelle für Patienten mit Mundhöhlenbestrahlung, Hauptkriterien ...............................................................................32 2 4.1.2.6 Zuordnungs-Tabelle für Patienten mit Mundhöhlenbestrahlung, zusätzliche Informationen.............................................................34 4.1.2.7 Einschlussdosis bei Blutentnahme – Betrachtung der einzelnen Paare..............................................................................................36 4.1.3 Ausprägung der akuten Nebenwirkungen.........................................37 4.1.3.1 Akute Nebenwirkungen der Brustbestrahlung..............................38 4.1.3.2 Akute Nebenwirkungen der Mundhöhlenbestrahlung..................39 4.1.4 Strahlenbiologische Charakterisierung............................................40 4.1.4.1 Dizentrische Chromosomen..........................................................40 4.1.4.2 Azentrische Fragmente .................................................................42 4.1.4.3 Translokationen ............................................................................43 4.1.4.4 Tetraploidie...................................................................................44 4.1.4.5 Summe aller Bruchereignisse und Bruchereignisse pro Zelle ......44 4.2 EINFLUSS KLINISCHER PARAMETER AUF DIE AUSPRÄGUNG BIOLOGISCHER MESSWERTE...................................................................................................46 4.2.1 Einfluss auf dizentrische Chromosomen...........................................47 4.2.2 Einfluss auf azentrische Fragmente..................................................48 4.2.3 Einfluss auf Translokationen ............................................................49 4.2.4 Einfluss auf Tetraploidie...................................................................50 4.2.5 Einfluss auf die Summe aller Bruchereignisse und Bruchereignisse pro Zelle ............................................................................................50 4.2.6 Zusammenfassung.............................................................................51 4.3 CHROMOSOMENABERRATIONEN ....................................................................51 4.3.1 Chromosomenaberrationen bei empfindlichen Patienten nach Teilkörperdosis..................................................................................53 4.3.2 Chromosomenaberrationen bei unempfindlichen Patienten nach Teilkörperdosis..................................................................................54 4.3.3 Chromosomenaberrationen bei empfindlichen Patienten nach in-vitro Bestrahlung mit 2 Gy ........................................................................55 4.3.4 Chromosomenaberrationen bei unempfindlichen Patienten nach invitro Bestrahlung mit 2 Gy ................................................................56 4.4 CHROMOSOMENABERRATIONEN ALS BIOLOGISCHER PARAMETER DER ZELLULÄREN STRAHLENEMPFINDLICHKEIT IM VERGLEICH ZWISCHEN DEN EMPFINDLICHEN UND DEN ZUGEORDNETEN, UNEMPFINDLICHEN PARTNERN ..57 4.4.1 Man-Whitney-U-Test ........................................................................57 4.4.1.1 Dizentrische Chromosomen..........................................................57 4.4.1.2 Azentrische Fragmente .................................................................58 4.4.1.3 Translokationen ............................................................................58 4.4.1.4 Tetraploidie...................................................................................59 4.4.1.5 Summe der Bruchereignisse .........................................................59 4.4.1.6 Bruchereignisse pro Zelle .............................................................60 4.4.2 Wilcoxon-Test für verbundene Stichproben......................................60 4.4.2.1 200 Zellen .....................................................................................60 4.4.2.2 50 Zellen .......................................................................................61 4.4.3 Zusammenfassung.............................................................................61 4.5 LOGISTISCHE REGRESSION DER PARAMETER .................................................61 4.6 ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE ..........................................................62 5 DISKUSSION............................................................................................... 64 3 6 ZUSAMMENFASUNG ............................................................................... 71 7 LITERATUR................................................................................................ 73 8 DANKSAGUNG........................................................................................... 79 Einleitung 4 1 Einleitung Die moderne Strahlentherapie ist neben der Chirurgie die wichtigste Behandlungsform von bösartigen Tumorerkrankungen. Diese stellen in Deutschland nach wie vor die zweithäufigste Todesursache nach den Herz- und Kreislauferkrankungen dar. Angesichts des zunehmenden Alterns der Bevölkerung wird die Bedeutung der Tumorerkrankungen weiter zunehmen, so dass die Optimierung der Therapiemöglichkeiten ein wichtiges Ziel in der Strahlentherapie ist. Eine Strahlentherapie wird als primäre Therapie eingesetzt, wenn die Tumoren sehr strahlenempfindlich sind (z.B. Lymphome) oder ohne Operation die gleiche Heilungschance besteht, jedoch ein kosmetisch und vor allem funktionell besseres Ergebnis zu erwarten ist. Als adjuvante Therapie wird die Strahlentherapie prä- und postoperativ durchgeführt. Ziele der präoperativen Bestrahlung sind die Verkleinerung eines inoperablen Tumors, um diesen operabel zu machen, die Zerstörung von Tumorzellen zur Vermeidung einer operativen Tumorzellverschleppung, sowie eine bessere Tumorwirkung und geringere Strahlenfolgen im operativ nicht veränderten Gewebe. Eine postoperative Bestrahlung wird angewandt, um tatsächlich oder möglicherweise verbliebene Tumorzellen im Operationsgebiet abzutöten und Tumorzellen in manifest oder wahrscheinlich befallenen Ausbreitungswegen (z.B. regionäre Lymphwege) zu devitalisieren (Richter und Feyerabend 2002). Bei einer strahlentherapeutischen Behandlung kommt es neben der Zerstörung des Tumorgewebes immer auch zu einer Schädigung von Normalgewebe. Dieses Phänomen wird als Normalgewebsreaktion bezeichnet. Einige Patienten zeigen an den bestrahlten Normalgeweben besonders frühe und/ oder besonders schwere Nebenwirkungen. Dies kann zum einen durch äußere Einflussfaktoren wie Rauchen, Alkohol oder exzessive Pflege verursacht werden, zum anderen durch andere Erkrankungen wie zum Beispiel Diabetes mellitus und Anämie (Baumann 1995). Bei 5-10% der Patienten liegt jedoch eine erhöhte Strahlenempfindlichkeit ohne erkennbare Ursache vor, so dass bei diesen eine genetische Disposition diskutiert wird. Einleitung 5 Gäbe es einen prädiktiven Test, der die Strahlenempfindlichkeit und die zu erwartende Normalgewebsreaktion verlässlich vorhersagen würde, könnte dies zu einer Individualisierung von Behandlungskonzepten führen (Budach 1997). Patienten, die so schon vor Bestrahlungsbeginn als empfindlich identifiziert würden, könnten zur Vermeidung von Bestrahlungspausen mit den bekannten negativen Folgen auf die Tumorkontrolle individueller behandelt werden. Diese Behandlung könnte eine intensivere Prophylaxe, frühzeitige therapeutische Interventionen, geänderte Fraktionierung oder sogar eine geänderte Gesamtdosis beinhalten. Diese Patienten würden aus Dosisintensivierungsstudien ausgeschlossen, wohingegen bei als nicht empfindlich identifizierten Patienten eine Dosissteigerung in Betracht gezogen werden könnte (Tucker et al. 1996). Mackay et al. halten dadurch eine Zunahme der Tumorkontrollrate von bis zu 30% für möglich (Mackay et al. 1999). Diese Suche nach einer verwendbaren und zuverlässigen Prädiktion der Reaktion des Normalgewebes auf eine Strahlentherapie wurde 1990 von Peters als „the holy grail of radiation biology“ bezeichnet (Peters 1990). Patienten, die aufgrund einer genetischen Grunderkrankung biologisch und klinisch strahlenempfindlich sind, z.B. Patienten mit dem Syndrom Ataxia teleangiectasia (AT) (Hart et al. 1987, West 1995), wiesen gegenüber Normalprobanden in-vitro eine erhöhte Fragilität von Chromosomen auf. Es fanden sich vermehrt direkte und indirekte chromosomale Bruchereignisse. Durch diese Beobachtungen haben sich direkte und indirekte Methoden zu Messungen von chromosomalen Bruchereignissen bzw. Chromosomenaberrationen an Lymphozyten zur Bestimmung einer in-vitroStrahlenempfindlichkeit etabliert. Bisher konnte jedoch die Korrelation solcher Parameter mit der Ausprägung von Normalgewebsreaktionen nur in kleinen retrospektiven Analysen an Patienten festgestellt werden (Borgmann et al. 2002). 1.1 Allgemeine Grundlagen der Normalgewebsreaktionen Eine Vielzahl von Parametern wird für das Auftreten einer Normalgewebsreaktion verantwortlich gemacht (West et al. 1991, Herrmann und Baumann 1997). Die wichtigsten sind die Höhe der Strahlendosis und das Bestrahlungsvolumen (West et al. 1995). Das Risiko eine Normalgewebsreaktion zu entwickeln bzw. das Ausmaß derselben nehmen mit der Dosis zu (Bentzen und Overgaard 1994, Turesson 1990, Einleitung 6 Turesson et al. 1996, Dörr 1997). Weiter zählen zu den Parametern, von denen die Strahlenwirkung auf die Organe abhängt, die Gesamtdosis, das zeitliche Verteilungsmuster, die Dosisapplikation (z.B. Fraktionierung) und die räumliche Dosisverteilung (wie Größe des bestrahlten Volumens). Daneben spielen auch die Ausgangssituation des bestrahlten Gewebes sowie begleitende Behandlungen (z.B. Operation, Chemotherapie) eine Rolle. Frühe (akute) Strahlenfolgen manifestieren sich bereits unter der Bestrahlungsserie, per definitionem innerhalb der ersten 90 Tage nach deren Beginn. Demgegenüber werden chronische (späte) Strahleneffekte erst Monate bis Jahre nach der Behandlung beobachtet. Als Folgespätschäden („consequential late effects”) werden späte Nebenwirkungen bezeichnet, die als Folge einer akuten Reaktion zu betrachten sind (z.B. Vernarbungen) (Dörr und Hendry 2001). Akute Strahlenfolgen treten in der Regel in Geweben mit einem hohen Zellumsatz (z.B. Schleimhaut) auf (Hermann und Baumann 1997). Durch die Bestrahlung kommt es zu einer Hemmung der Zellproliferation und konsekutiv zur Zelldepletion. Hierbei ist die Zeit bis zur klinischen Manifestation abhängig von der Umsatzzeit des Gewebes. Bei der akuten Strahlenreaktion findet sich regelmäßig eine Gefäßreaktion, die sich in begleitenden Entzündungsprozessen manifestiert. Diese geht meist der klinisch wichtigsten Reaktion, der Reduktion der Anzahl funktioneller Zellen (Hypoplasie) beispielsweise im Rahmen der Epitheliolyse voraus. Ausgehend vom Zusammenbruch der normalen epithelialen Struktur kommt es bei der Strahlenreaktion von Oberflächenepithelien häufig zu einer Phase sekundärer Infektionen, welche die Epithelreaktion bis hin zu septischen Zuständen verstärken können. Abschließend wird außer bei sehr ausgeprägten Reaktionen die Heilungsphase beobachtet, die von innerhalb des Bestrahlungsgebietes überlebenden oder von einwandernden Stammzellen ausgeht. Während die Manifestation akuter Strahlenfolgen durch einen relativ einheitlichen Mechanismus gekennzeichnet ist, ist die Pathogenese chronischer Strahlenfolgen weitaus komplexer und variabler. Die entscheidenden pathologischen Vorgänge laufen im Organparenchym, im Bindegewebe und dem versorgenden Gefäßnetz ab. In der Regel liegt auch eine Beteiligung des Immunsystems (Makrophagen) vor. Die Einleitung 7 Latenzzeit für chronische Strahlenfolgen ist im Gegensatz zu Frühreaktionen abhängig von der Strahlendosis. Für das Auftreten von Hautreaktionen nach der Bestrahlung von Mammacarcinomen wurde gezeigt, dass das Ausmaß der Spätreaktionen selbst bei identischem Fraktionierungsschema eine große Variation zeigt (Tucker et al. 1992, Turesson et al. 1996). Die Strahlensensibilität der einzelnen Gewebe und Organe variiert erheblich. Entsprechend unterschiedlich sind die gewebespezifischen Toleranzdosen (Richter und Feyerabend 2002). Als Toleranzdosis wird dabei die Dosis bezeichnet, die bei Bestrahlung eines bestimmten Organs mit einem bestimmten Fraktionierungsschema allgemein akzeptiert wird. Bei der strahlentherapeutischen Behandlung ist das Ziel eine möglichst komplikationsfreie Tumorkontrolle. Deshalb ist bei der Festlegung der Gesamtdosis zwischen einer maximalen Inaktivierung des Tumors und der Toleranz des umgebenden Normalgewebes abzuwägen. Die Nebenwirkungen bestimmen so die maximal applizierbare Gesamtdosis ganz wesentlich mit. Erstmals beschrieben wurde dieses Konzept der therapeutisch benötigten und gesundheitlich möglichen Dosis von Holthusen (Holthusen 1936). 1.2 Genetische Faktoren der Normalgewebsreaktion Die genetischen Faktoren, die die Ausprägung einer Normalgewebsreaktion bestimmen, sind vielfältig. Der wichtigste zur Zeit diskutierte Parameter ist die genetisch festgelegte zelluläre Strahlenempfindlichkeit. Beobachtungen an Patienten mit dem Syndrom Ataxia teleangiectasia (AT) lieferten diesbezüglich erste Hinweise. Nach einer Bestrahlung zeigten diese Patienten eine ausgeprägte Normalgewebsreaktion, was sich auf eine extrem hohe zelluläre Strahlenempfindlichkeit zurückführen ließ (Hart et al. 1987). Auch für weitere Syndrome (Bloom-Syndrom, Fanconi-Anämie (FA), Li-Fraumeni-Syndrom (LFS), Naevusbasalzell-Syndrom, Neurofibromatose (NF), Nijmegen-Syndrom (NBS) und Retinoblastom (RB)) konnte ein ähnlicher Zusammenhang beobachtet werden (Peters 1990, Streffer 1997). In einer Analyse von sechs Patienten wurde beobachtet, dass das Ausmaß der Teleangiektasien bzw. des Hauterythems mit der zellulären Strahlenempfindlichkeit Einleitung 8 korrelierte. So wurde 1992 erstmalig postuliert, dass es nicht nur bei Patienten mit bestimmten Syndromen, sondern möglicherweise bei allen Patienten einen grossen Zusammenhang zwischen der genetisch determinierten individuellen Strahlenempfindlichkeit und dem Ausmaß der Normalgewebsreaktion gibt (Burnet et al. 1992). Zuvor hatten schon Woods et al. und Plowman et al. auf diesen Zusammenhang hingewiesen, da sie fanden, dass die zelluläre Empfindlichkeit strahlenempfindlicher Patienten deutlich über der von gesunden Spendern lag. (Woods et al. 1988, Plowman et al. 1990) Frühere Studien konnten einen solchen Unterschied nicht feststellen (Smith et al. 1980, Weichselbaum et al. 1976). Eine spätere Studie, in der die zelluläre Empfindlichkeit von Fibroblasten betrachtet wurde, zeigte ebenfalls, dass es eine Korrelation gab zwischen dem Ausmaß der Normalgewebsreaktion und der zellulären Empfindlichkeit (Burnet et al. 1994). Dies wurde 1996 in einer Untersuchung mit 31 Brustkrebspatientinnen bestätigt. Probanden mit einer erhöhten zellulären Strahlenempfindlichkeit zeigten hierbei im Mittel ein gößeres Risiko für die Entwicklung einer Fibrose als solche mit einer geringen Empfindlichkeit. Dieser Zusammenhang galt allerdings nur für späte, nicht aber für akute Normalgewebsreaktionen (Johansen et al. 1996). Auch in weiteren Studien wurde von einer Korrelation zwischen dem Ausmaß der Normalgewebsreaktion und der individuellen Strahlenempfindlichkeit berichtet (Dunst et al. 1998, Ramsay und Birrell 1995, Rached et al. 1998, Rogers et al. 2000). Es erschienen allerdings auch Publikationen, die keine entsprechende Korrelation zeigten. In einer Studie mit zwölf Brustkrebspatientinnen wurde beobachtet, dass zwischen der individuellen Strahlenempfindlichkeit und den akuten Nebenwirkungen der Haut keine Beziehung bestand (Begg et al. 1993). Es schlossen sich weitere Untersuchungen an, in denen weder für die akuten noch die späten Reaktionen ein Zusammenhang mit der individuellen Empfindlichkeit festgestellt werden konnte (Brock et al. 1995, Rudat et al. 1997, Rudat et al. 1999). Eine weitere Studie kam für die späten Nebenwirkungen zu dem gleichen Ergebnis (Peacock et al. 2000). Einleitung 1.3 9 Chromosomenaberrationen als Indikator der individuellen Strahlenempfindlichkeit Die Analysen zur Bestimmung der individuellen Strahlenempfindlichkeit wurden in den zuvor erwähnten Studien auf verschiedene Weise durchgeführt. Zum einen wurden die Untersuchungen an aus Hautbiopsien isolierten Fibroblasten durchgeführt, zum anderen an Lymphozyten des peripheren Blutes. Dies wird als ein Grund für das zum Teil widersprüchliche Bild bezüglich der Korrelation zwischen der individuellen Strahlenempfindlichkeit und dem Auftreten einer Normalgewebsreaktion nach Strahlentherapie diskutiert. Ältere Arbeiten betonen den Stellenwert von Fibroblasten (Burnet et al. 1994, Geara et al. 1993) und sehen den von Lymphozyten eher als gering an (Budach et al. 1998), jedoch wurden die Analysen häufig an kleinen Kollektiven durchgeführt. Später rückten Untersuchungen an Lymphozyten mehr in den Vordergrund und wurden vermehrt in Studien verwendet (Price et al. 1995, West et al. 1995, Jones et al. 1995). Die Strahlenempfindlichkeit der Lymphozyten wurde dabei entweder direkt mittels Kolonietest oder indirekt über die Zahl der strahleninduzierten Chromosomenaberrationen ermittelt. Die indirekte Methode ist für Lymphozyten die einfachere und wahrscheinlich auch genauere, da Lymphozyten auch nach Stimulation nur noch sehr begrenzt teilungsfähig sind. Außerdem muss der Kolonietest bei Lymphozyten unter ganz besonderen Bedingungen durchgeführt werden, um überlebende Zellen zu identifizieren (Geara et al. 1993), was die Aussagekraft des Kolonietests im Falle der Lymphozyten zusätzlich einschränkt. Sehr leicht und eindeutig zu erkennen sind dagegen Chromosomenaberrationen in Lymphozyten. Die am häufigsten angewandte Methode nennt sich Metaphasen- oder auch G1-Assay. Die Lymphozyten werden im nicht stimulierten Zustand bestrahlt und später mit Phytohämagglutinin (PHA) zur Teilung stimuliert. Mit Hilfe eines Spindelfasergiftes (z.B. Colcemid) werden die Zellen dann nach Inkubation in der Metaphase angehalten, um dann nach einem hypotonischen Schock ausgespreizt, trypsinisiert, gefärbt und lichtmikroskopisch analysiert zu werden. Bei diesem Verfahren führen ionisierende Strahlen zu typischen Veränderungen. Neben dizentrischen Chromosomen sind dies terminale und interstitielle Deletionen, aber auch komplexe und unvollständige Aberrationen nach höheren Strahlendosen. Einleitung 10 Terminale Deletionen in Lymophozyten sind seltene Ereignisse, dizentrische Chromosomen treten weitaus häufiger auf, die häufigsten Schäden sind jedoch interstitielle Deletionen (Fomina et al. 2000). Ab einer Dosis von 5 Gy sind komplexe und unvollständige Aberrationen die häufigsten Veränderungen. Sie müssen aber auch schon bei Dosen von 1-2 Gy berücksichtigt werden (Cornforth 2001). Bei vielen der oben beschriebenen Veränderungen entstehen azentrische Fragmente. Dies bedeutet ein letales Ereignis für die Zelle, da dem azentrischen Fragment der Anknüpfungspunkt für die Spindelfasern fehlt. Dadurch verbleiben die Fragmente während der Metaphase in der Äquatorialebene und können während der Anaphase nicht zu einem der Spindelpole gezogen werden. In der Zytokinese wird das azentrische Fragment von einer Extramembran umschlossen und als Mikrokern aus der Zelle geschleust. Folglich geht genetische Information verloren, da den jeweiligen Tochterzellen Teile der DNA fehlen. Hierdurch kann die Expression essentieller Proteine abnehmen, was zur Folge hat, dass die Zelle ihre Teilungsfähigkeit nach spätestens 2-3 Tagen verliert. Aber auch dizentrische Chromosomen können über das Entstehen von Anaphasebrücken zum Verlust der Teilungsfähigkeit führen. In vielen Untersuchungen sowohl mit Lymphozyten als auch anderen Normal- oder Tumorzellen wurde gezeigt, dass die Zahl der letalen Chromosomenaberrationen direkt mit der Strahlenempfindlichkeit der Zellen korreliert (Coco-Martin et al. 1994, Cornforth und Bedford 1987, Russell et al. 1995, Schwartz 1992). Hierbei zeigte sich, dass eine grössere Strahlenempfindlichkeit immer mit einer vermehrten Zahl an Aberrationen einherging und die Strahlenempfindlichkeit von Lymphozyten sehr gut durch die Zahl der Chromosomenaberrationen bestimmt werden kann. 1.4 Klassifikation akuter und später Nebenwirkungen Bereits frühzeitig wurde in der Strahlentherapie die Notwendigkeit erkannt, akute und späte Normalgewebsreaktionen zu klassifizieren und zu erfassen. Mitte der achtziger Jahre wurde eine Einteilung von einer Arbeitsgruppe der EORTC/ RTOG (Europäische und nordamerikanische radioonkologische Gesellschaften) für akute und späte Nebenwirkungen erarbeitet. Diese Klassifikation berücksichtigte: Einleitung 11 den Zeitpunkt des Auftretens (akute oder späte Reaktion), die Schwere der Ausprägung, die Reversibilität bzw. chronische Ausbildung einer Veränderung und eine objektive Beurteilung, sowie eine Darstellung in bildgebenden Verfahren (Röntgen, CT, MR). Zudem ist sie organspezifisch. Es wurden folgende Schweregrade festgelegt: Grad 0 = keine, Grad I = gering, Grad II = mäßig, Grad III = stark, Grad IV = lebensbedrohlich und Grad V = Tod des Patienten. In den kommenden Jahren wurde diese Einteilung weiter spezifiziert und für die späten Nebenwirkungen das LENT-Einteilungs-System entwickelt (engl.: late effect normal tissue). Es wurden vier Kategorien zur Beschreibung der Reaktion miteinander verknüpft (SOMA): die subjektive Beschreibung, der objektive Befund, das Management (Behandlungsnotwendigkeiten) und die Analytik (Erfassung objektiver Befunde in Spezialuntersuchungen). Auch hier erfolgte eine Einteilung der Nebenwirkungen in die Schweregrade 0 (keine) bis V (tödlicher Ausgang). Mit diesem Einteilungssystem ist es möglich, die Belastung von Normalgeweben nach einer strahlentherapeutischen Tumortherapie zu klassifizieren und verschiedene Behandlungsverfahren, nicht nur hinsichtlich ihrer Tumorwirkung, sondern auch ihrer Nebenwirkungsgrade zu vergleichen (Hermann und Baumann 1997). Organspezifisch für die akuten Nebenwirkungen an Haut und Schleimhaut, die in der vorliegenden Arbeit vorwiegend betrachtet wurden, um die klinische Einteilung in empfindliche und nicht empfindliche Patienten vorzunehmen, bedeutet dies nach EORTC/ RTOG: Haut Grad 0 Grad I Grad II Grad III Grad IV Unauffällig Leichtes Erythem, Epilation, trockene Desquamation Deutliches Erythem, einzelne feuchte Epitheliolysen (< 50%), mäßiges Ödem Fleckförmige Mucositis, mäßiges Ödem, mäßige Schmerzen Konfluierende feuchte Epitheliolysen (>50%), ausgedehntes Ödem Konfluierende fibrinöse Mucositis, massives Ödem, massive Schmerzen Ausgedehnte Ulzeration, Konfluierende Nekrose, massige Blutungen Ausgedehnte Ulzeration, konfluierende Nekrose, massive Blutungen Schleim Unauffällig -haut Leichtes Enanthem, geringe Schmerzen Tab.1: Nebenwirkungen an Haut und Schleimhaut Einleitung 1.5 12 Therapiekonzepte des Mammacarcinoms Bei der Behandlung des Mammacarcinoms ist die Klassifikation des Tumors von größter Bedeutung. So unterscheiden sich die therapeutischen Ansätze bei der Behandlung des duktalen Carcinoma in situ, des lobulären Carcinoma in situ und des invasiven Carcinoms erheblich. Grundsätzlich gibt es 1. die operative Therapie, bei der je nach Tumorgröße, histologischem Typ, Multifokalität und Multizentrizität eine brusterhaltende Therapie (BET) oder eine Ablatio mammae durchgeführt wird. 2. die medikamentöse Therapie, die sich in die primär systemische (präoperative) Chemotherapie, die adjuvante Chemo- und/ oder Hormontherapie und die palliativen Therapieformen einteilen lässt. Adjuvant wird die Chemotherapie bei Patientinnen mit höherem Risiko sowie präoperativ beim inflammatorischen Mammacarcinom und bei metastasierendem Tumor durchgeführt. 3. die Strahlentherapie, die als primäre Therapie nur bei lokaler oder allgemeiner Inoperabilität eingesetzt wird. Obligat ist die adjuvante Strahlentherapie nach brusterhaltender OP (Preiß et al. 2002). Sie erfolgt nach CT-gestützter, rechneroptimierter Planung über tangentiale Gegenfelder mit einer Gesamtherddosis von 50 Gy mittels 6 MV Photonen am Linearbeschleuniger mit einer Fraktionierung von beispielsweise 5x2 Gy pro Woche. Das Bestrahlungsfeld umschliesst dabei die gesamte Brust. Parallel erfolgt mit gleicher Fraktionierung und Gesamtherddosis die Bestrahlung des regionalen Lymphabflusses am Telekobalttherapiegerät in einer appa-Feldanordnung mit einer Wichtung von 2:1 von ventral dosiert auf den halben Durchmesser. Zusätzlich kann diese Dosis mit einem anschließenden Boost von 16 Gy aufgesättigt werden, was vor allem bei unter 40-Jährigen Lokalrezidive deutlich vermindert, über 60-Jährige profitieren kaum noch davon (Bartelink et al. 2001). 1.6 Therapiekonzepte der Kopf-Hals-Tumoren Die Therapie der Kopf-Hals-Tumoren ist immer abhängig vom Ausbreitungsstadium der Erkrankung sowie von Sitz und Größe des Primärtumors. Die Stadien I und II (AJCC) sind in der Regel kurativ operabel. Beim Larynx-Carcinom im Stadium I-II zieht man jedoch nach Möglichkeit die organ- und funktionserhaltende Therapie im Sinne der alleinigen Strahlentherapie mit einem kurativen Ansatz oder der laserchirurgischen Abtragung vor. Bei resektablen Tumoren in den Stadien III und Einleitung 13 IV und/ oder bei jedem Lymphknotenbefall, sowie bei R1/ R2- Resektionen ist eine postoperative Strahlentherapie indiziert. Eine primäre Radio-Chemotherapie kommt sowohl bei inoperablen Patienten als auch bei solchen Patienten zum Einsatz, denen ein operativer Eingriff mit entscheidender Beeinträchtigung der Lebensqualität nicht zugemutet werden kann (Preiß et al. 2002). Bei der konventionellen strahlentherapeutischen Behandlung werden 50-66 Gy appliziert mit einer Fraktionierung von 1,8 oder 2 Gy täglich. Eine Gesamtherddosis von 36 Gy wird über seitlich opponierende Gegenfelder auf Körpermitte mittels Telekobalttherapiegerät mit einer Fraktionierung von 5x2 Gy pro Woche appliziert. Für die restliche Dosis erfolgt zur Rückenmarkschonung die Feldteilung. Ventral werden in gleicher Technik weitere 24 Gy Herddosis appliziert. Dorsale Lymphknotenareale werden beidseits mit einem Elektronenfeld und einer Fraktionierung von 5x2,5 Gy Einzeldosis aufgesättigt. Parallel erfolgt die Bestrahlung des kaudalen Lymphabflusses über ein ventrales Stehfeld mit 54 Gy dosiert auf 5 cm Tiefe mit einer Fraktionierung von 5x2 Gy pro Woche. Patienten mit primärer Strahlentherapie und guter Herz- und Nierenfunktion werden nach einem spezifischen Protokoll (Wendt) behandelt. Sie erhalten simultan nach einem bestimmten Protokoll eine Chemotherapie mit Cisplatin und/oder 5 FU sowie eine hyperfraktionierte Bestrahlung (1,8 Gy, 2x täglich) am Tag 3-11, 17-25 und 3140 bis zur endgültigen Dosis von 70,2 Gy. In frühen Stadien von z.B. Nasopharynxcarcinomen wird die Strahlentherapie auch primär ohne Chemotherapie als kurative Behandlungsform eingesetzt. Die postoperative adjuvante Strahlentherapie erfolgt mit einer Herddosis von 60-66 Gy im Bereich des Tumorbettes und der angrenzenden Lymphknoten, sowie mit 50 Gy im Bereich der supraclaviculären Lymphknoten. Die simultane postoperative Radio-Chemotherapie mit Cisplatin erfolgt mit einer Gesamtdosis von 66 Gy sowie der dreimaligen Gabe von 100 mg/ m Cisplatin alle drei Wochen. Diese Therapieform erbringt nach neuen Ergebnissen einer randomisierten Phase-III-EORTC-Studie ein signifikant besseres rezidivfreies und Gesamt-Überleben (Bernier et al. 2001). Zielsetzung 14 2 Zielsetzung Ziel dieser Arbeit war es, mittels einer prospektiven Paar-Analyse (matched-pairAnalyse) zu überprüfen, ob es einen Zusammenhang zwischen der individuellen klinischen Strahlenempfindlichkeit, gemessen an der Akutreaktion während der Strahlentherapie, und strahlenbiologischen Parametern gibt. Eine Paar-Analyse beinhaltet, dass Untersuchungen an zwei Gruppen von Patienten vorgenommen werden, die sich in einem Parameter grundlegend unterscheiden, ansonsten jedoch bezüglich des Tumors, der Therapie und der Kofaktoren vergleichbar sind. Die biologische Strahlenempfindlichkeit wurde über den Nachweis von Chromosomenaberrationen in Lymphozyten nach Teilkörperdosis und nach zusätzlicher in-vitro Bestrahlung mit 2 Gy bestimmt. Die Blutentnahme wurde jeweils zum Zeitpunkt des Auftretens einer als empfindlich eingestuften Akutreaktion durchgeführt. Zu diesen, klinisch als empfindlich eingestuften Patienten, wurden vergleichbare Patienten (Match-Partner) gesucht, die während der Strahlentherapie nicht als klinisch empfindlich auffielen. Diese Blutentnahme wurde dann nach Möglichkeit zum gleichen Zeitpunkt während der Strahlentherapie durchgeführt. So ergaben sich folgende Untersuchungen: 1. Akutreaktion: Dokumentation der akuten Nebenwirkungen der Patienten während und nach Ende der Strahlentherapie. 2. Individuelle Strahlenempfindlichkeit: Anzahl der Chromosomenaberrationen (azentrische Fragmente, RingChromosomen, dizentrische Chromosomen, trizentrische Chromosomen, double minutes, Translokationen, Tetraploidien, Gap-Junctions und Brüche) in Lymphozyten nach Teilkörperdosis sowie in mit 2 Gy in-vitro bestrahlten Lymphozyten. 3. Vergleich der Akutreaktion mit der individuellen Strahlenempfindlichkeit Material und Methoden 15 3 Material und Methoden 3.1 Materialien 3.1.1 Puffer und Lösungen Reagenz: Zusammensetzung / Hersteller: HAM´S-F-10 Medium 20 ml fötales Kälberserum (FBS), 1,0 ml Penicillin/ Streptomycin und 0,5 ml Glutamin auf 100 ml Medium / Biochrom AG Penicillin/ Streptomycin Biochrom AG Glutamin Biochrom AG Phytohämagglutinin (PHA-L) Biochrom AG BrdU-Stammlösung 5-Brom-2´-desoxyuridin, 6,4 mg BrdU in 20 ml Aqua dest. gelöst / Serva Colcemid Gibco Hank´s-Salzlösung mit 0,35 g/ l NaHCO3 / Biochrom AG KCl-Lösung 0,0075 M KCl, 5,59 g auf 1 Liter Aqua dest. / Merck Karnoy´s Fixativ Methanol/ Essigsäure im Verhältnis 3:1 / Roth Hoechst N° 33258 0,0125 g in 250 ml Aqua dest. gelöst / Sigma PBS-Puffer phosphat-buffered saline, 1:10 verdünnt mit Aqua dest. / Gibco Soerensen-Puffer 11,88 g Na2HPO4 x 2H2O + 9,08 g KH2PO4/ l Aqua dest. Giemsa-Phosphat-Puffer-Gemisch 7%: 7 ml Giemsa und 93 ml Soerensen-Puffer ph 6,8 / Merck Eukitt 3.1.2 O. Kindler GmbH & Co Geräte und Sonstiges Geräte: Hersteller: Phasen-Kontrast-Mikroskop Leitz Lichtmikroskop Leitz Megafuge 1.0 Heraeus (Sepatech) UV-Lampe (UVC 30) Kendro Wärmeplatte Jürgens Material und Methoden 16 Sonstiges: Hersteller: Lithium-Heparin-Monovetten Sarstedt Zellkulturflaschen Becton Dickinson Material und Methoden 3.2 3.2.1 17 Methoden Klinisch empfindliche Patienten und zugeordnete Partner Eingeschlossen wurden Patienten mit soliden Tumoren, die eine Strahlentherapie im Kopf-Hals- oder Brustbereich erhielten. Patienten mit einer vorausgegangenen Therapie, die eine Veränderung der Testergebnisse erwarten ließ, mussten ausgeschlossen werden (frühere Strahlen- oder Chemotherapie). Eine kombinierte Strahlen-Chemotherapie hat ein bekanntes Nebenwirkungsspektrum, so dass diese Patienten berücksichtigt werden konnten. Auch bei einer vorhergehenden bzw. parallel durchgeführten antihormonellen Behandlung ist eine Veränderung der strahlenbiologischen Parameter nicht zu erwarten; dennoch wurde bei Frauen die antihormonelle Therapie dokumentiert, da kleine Untersuchungen mittels Chromosomenanalysen eine erhöhte Strahlenempfindlichkeit von Zellen in Anwesenheit hoher Östradiolkonzentrationen zeigten (Kanda und Hayata 1999). Aus dem oben beschriebenen Kollektiv wurden zwei Gruppen für die Analysen herauskristallisiert: zum einen Patienten mit auffälligen Strahlenreaktionen (nach den unten beschriebenen Kriterien klinisch empfindliche Patienten), zum anderen zu diesen bezüglich des Tumors, der Therapie und der Kofaktoren vergleichbare Patienten, die klinisch jedoch als nicht empfindlich eingestuft wurden (zugeordnete Partner). Insgesamt ergaben sich 30 Patientenpaare, davon 19 Paare mit Bestrahlung im Kopf-Hals-Bereich und elf Paare mit Bestrahlung im Brustbereich. Eine genauere Beschreibung des Patientenkollektivs findet sich im Ergebnisteil. 3.2.2 Paar-Zuordnung Nach der Auswahl der 30 empfindlichen Patienten und ihrer 30 nicht empfindlichen Partner stellte sich bei der Analyse der Daten heraus, dass nur einige der Parameter, die bei der Paar-Zuordnung berücksichtigt wurden, die klinische Strahlenreaktion oder die in-vitro Untersuchungsergebnisse beeinflussen. Daraufhin wurden die 30 Paare nach den relevanten Kriterien zum Teil noch einmal neu geordnet. Hierbei wurde eine Rangliste erstellt, wobei eine Übereinstimmung von Chemotherapie und Gesamtdosis (einschließlich Fraktionierung) vordringlich war und doppelt gewichtet wurde (2 Punkte bei Übereinstimmung). Weiterhin wurden Alter (+/- 15 Jahre), Geschlecht und der Allgemeinzustand berücksichtigt und mit je einem Punkt Material und Methoden 18 gewichtet. Bei den Patientinnen mit Brustbestrahlung wurde zusätzlich je ein Punkt vergeben, wenn die Patientinnen hinsichtlich der antihormonellen Therapie übereinstimmten und wenn im Rahmen der Chemotherapie die gleichen Medikamente eingesetzt worden waren. Bei den Patienten mit Mundhöhlenbestrahlung wurden als zusätzliche Kriterien die Lokalisation des Tumors (Mundhöhle/ Oropharynx/ Hypopharynx/ Kieferknochen/ Speicheldrüse, im Gegensatz zu allen anderen Lokalisationen) und die Zahl der Schleimhautareale im Feld (Differenz bei der Anzahl der Areale <5) eingesetzt und mit je einem Punkt einfach gewichtet. So konnte jedes Paar maximal 9 Punkte erreichen. Ziel war eine Übereinstimmung in mindestens einem der beiden doppelt gewichteten Parameter und insgesamt nicht weniger als 5 Punkte. 3.2.3 Klassifikation und Dokumentation der Nebenwirkungen Folgende Tabelle zeigt die Kriterien, nach denen die klinische Strahlenempfindlichkeit beurteilt wurde. Auf dieser Grundlage wurden Patienten, die besonders früh, besonders ausgeprägt oder zu lang anhaltend akute Nebenwirkungen aufwiesen, als klinisch strahlenempfindlich eingestuft. Haut Sehr früh Sehr ausgeprägt Schleimhaut a b Erythem bei < 10 Gy WD Grad II bei < 14 Gy WD Epitheliolyse bei < 30 Gy WD Grad III bei < 30 Gy WD Grad II an der Fläche der Mamma Grad II Reaktion an > 4 bei < 20 Gy WD Arealen bei < 20 Gy WD Grad III Reaktion an der Fläche der Grad III Reaktion an > 4 Mamma (außer Axilla/ Mamille) Arealen bei < 30 Gy WD Grad III Reaktion an Wange o. Hals bei < 40 Gy WD ( außer Stoma, Ohrläppchen, OP-Naht) Zu lang anhaltend Grad III Reaktion nach zwei Grad III Reaktion nach zwei Wochen Wochen Tab. 2: Definition „klinisch strahlenempfindlich“ a b WD = Wirkdosis Grad II bzw. Grad III nach EORTC/ RTOG Material und Methoden 19 Nach Aufnahme der Patienten in die Studie wurde die detaillierte Dokumentation der Verteilung von Veränderungen, bezogen auf die Mundschleimhaut bzw. Haut als Zielorgan der Untersuchung, zweimal wöchentlich auf dazu vorhandenen Dokumentationsbögen durchgeführt. Kriterium der Strahlenreaktion an der Mundschleimhaut bzw. Haut war das Ausmaß der sichtbaren Läsion. Zur Vermeidung von Unterschieden in der subjektiven Beurteilung diente ein Fotokatalog mit Beispielen (Riesenbeck 1998) als Referenz, wodurch die Beurteilung deutlich vereinheitlicht wurde. Zudem wurde diese nur von zwei Personen durchgeführt, die sich zusätzlich gegenseitig kontrollierten. 3.2.4 Bestrahlung und Dosimetrie Die Bestrahlung der Blutproben erfolgte an einem Telekobalttherapiegerät. Bei einem Abstand von 80 cm, einer 1 cm Vorschaltschicht aus Plexiglas und einer Feldgröße von 15x15 cm wurden 2 Gy auf 5 mm Tiefe dosiert. 3.2.5 Nachweis von Chromosomenschäden mittels der Metaphasen-Technik Die Untersuchung der strahleninduzierten Chromosomenaberrationen erfolgte an Lymphozyten des peripheren Blutes. Diese wurden mittels Blutentnahme unter Verwendung von Lithium-Heparin-Monovetten (10ml) gewonnen. Das Blut wurde in sterile Spitzbodenröhrchen gegeben und über Nacht gekühlt. Am darauffolgenden Morgen wurden jeweils drei Parallelkulturen mit je 1 ml Lymphozytengemisch für die unbestrahlte und ebenso für die mit 2 Gy bestrahlte Probe in 25 ml Zellkulturflaschen angesetzt, um in jedem Fall eine ausreichende Präparatqualität für die Auszählung von 200 Metaphasen zu erzielen. Hierzu wurde durch vorsichtiges Schwenken der Spitzbodenröhrchen die lymphozytenreiche Zellschicht (buffy coat) aufgewirbelt und aus dieser mit einer Spritze eine Blutprobe von 2 ml entnommen und auf zwei Kulturflaschen, die jeweils 10ml warmes (37°C) Kulturmedium (HAM`S-F-10-Medium) enthielten, verteilt. Im Anschluss wurden zu den Kulturen 15 Tropfen Phytohämagglutinin (PHA-L) und 0,2% BrdU-Stammlösung hinzugefügt. PHA ist ein Lektin aus Phaseolus vulgaris (gemeine Bohne). Es bewirkt spezifisch die Stimulierung differenzierter T-Lymphozyten aus der G0-Phase in den Zellzyklus. 5-Brom-2´-desoxyuridin (BrdU) ist ein Thymidinanalogon. Wird dieses Material und Methoden 20 den Zellen während der Zellkultivierung angeboten, wird es an Stelle von Thymidin in die DNA eingebaut. Die Zellkulturflaschen wurden in Aluminiumfolie eingeschlagen und für 72 h bei 37°C in einem Brutschrank inkubiert. 72 h nach Stimulation durch PHA wurde den Kulturen 0,4ml Colcemid zugegeben. Danach erfolgte eine weitere Inkubation von 2 h bei 37°C im Brutschrank. Colcemid ist die Produktbezeichnung des Wirkstoffs Colchicin. Dieses Spindelfasergift ist ein Alkaloid der Herbstzeitlosen (Colchicum antumnale) oder der afrikanischen Ruhmeskrone (Glorisa superba). In der Teilungsphase werden die Schwesterchromatiden eines Chromosoms durch Microtubuli zu den entgegengesetzten Zellpolen bewegt. Colchicin greift in die GTP und Mg²+-regulierte Microtubulipolymerisation und Depolymerisation ein (Alberts et al. 1995) und verhindert damit die Trennung der Chromatiden, so dass die Zellen in der Metaphase angehalten werden und die Chromosomen intakt in der Äquatorialebene verbleiben. Die Lympozytenzellkulturen wurden in je zwei Spitzbodenröhrchen überführt und bei 1200 U/min. und 20°C für zehn Minuten zentrifugiert, anschließend wurde der Überstand entfernt. Das Zellsediment wurde mit einer Pasteurpipette aufgewirbelt und durch Zugabe von 10 ml Hank´s-Salzlösung gewaschen. Nach erneuter Zentrifugation bei 1200 U/min. 20°C für zehn Minuten wurde wiederum der Überstand verworfen, um Serum und Reste des Mediums zu entfernen. Die Zellen wurden dann durch Zugabe von 0,0075M KCL (vorgewärmt bei 37°C im Wasserbad) langsam hypotonisiert. Erneut wurden die Zellen in der Zentrifuge bei 1200 U/min. und 20°C für zehn Minuten zentrifugiert und der Überstand entfernt. Dieser Arbeitsschritt wurde ein zweites Mal wiederholt. Die Behandlung der Zellen mit der hypotonen Salzlösung führt zur Lyse der Zellmembran und zur Freisetzung des Kernmaterials. Die Fixierung und Konservierung der Zellkerne erfolgte mittels Methanol/ Essigsäure im Verhältnis 3:1, welches unter ständigem Vermischen tropfenweise auf die Zellkerne gegeben wurde. Dadurch wurde ein Verklumpen der Zellkerne bei der Fixierung verhindert. Anschließend wurden die so vorbehandelten Zellkerne bei 1200 U/min. und 20°C erneut für zehn Minuten zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Dieser Arbeitsschritt wurde so lange wiederholt, bis sich das Material und Methoden 21 Kernsediment weiß darstellte und der Überstand klar blieb. Das Sediment wurde mit Fixativ verdünnt bis eine milchig trübe Suspension entstand. Für die Herstellung von lichtmikroskopisch auswertbaren Präparaten wurden Objektträger mit einem homogenen Wasserfilm (aqua dest.) bedeckt. Auf den waagerecht gehaltenen Objektträger wurde mit einer Pasteurpipette ein Tropfen der Zellkernsuspension aufgegeben. Der Alkohol verdrängt den Wasserfilm, verteilt die hypotonisch vergrößerten Zellkerne auf dem Objektträger und bringt sie aufgrund der Wechselwirkungen zwischen Alkohol und Wasser zum Platzen, so dass die Chromosomen auf dem Objektträger gespreizt werden. Mit dem Phasen-KontrastObjektiv wurde die Zellkerndichte überprüft, um gegebenenfalls die Zellkernsuspension noch weiter mit Fixativ zu verdünnen. Bei zu geringer Dichte wurde erneut zentrifugiert. Die Zellkernsuspension wurde vollständig auf Objektträger aufgetragen, anschließend luftgetrocknet und für fünf Tage dunkel gelagert. Es folgte die Färbung der Präparate nach dem Standardprotokoll der Fluoreszenz-plus-Giemsa-Färbung. Die gealterten Präparate wurden zwölf Minuten in Hoechst N° 33258 gefärbt und danach in Aqua dest. gespült. Daraufhin wurden die Objektträger mit Hilfe einer Pasteurpipette mit PBS-Puffer überschichtet und mit einem Deckglas versehen. Die Präparate wurden zehn Minuten auf einer Wärmeplatte bei 60°C unter UV-Licht inkubiert. Die BrdU-substituierte DNA ist sehr lichtempfindlich. Mit dem UV-Licht tritt eine Photolyse der BrdU-substituierten DNA ein, dass heißt sie wird durch das Licht abgebaut und geht dann verloren. Nachdem die Deckgläser in Aqua dest. abgespült wurden, folgte die Färbung der Präparate für 4 Minuten in einem 7% Giemsa-Phosphat-Puffer-Gemisch. Die substituierten DNA-Stränge lassen sich durch den Verlust der DNA nicht so intensiv mit Giemsa-Farbstoff anfärben. Im zweiten Zellzyklus, dass heißt bei der zweiten DNA-Synthese mit BrdU, liegt eine der beiden Chromatiden des Chromosoms bifilär BrdU-substituiert vor. Nach der Färbung erscheint eine Chromatide somit heller und lässt sich gut von den Chromosomen, die erst eine Synthesephase durchlaufen haben und einheitlich dunkel gefärbt sind, unterscheiden (Abb 1a und b). Ausgewertet wurden nur die Zellen, die erst eine Synthesephase durchlaufen hatten. Anschließend wurden die Präparate in PBS-Puffer gespült und bei Raumtemperatur luftgetrocknet. Am nächsten Tag wurden die Präparate permanent in Eukitt eingebettet. Durch die Material und Methoden 22 spezifische Anlagerung des Giemsa-Farbstoffes an die DNA erscheinen die Chromosomen im Lichtmikroskop blau/ violett. Abb. 1a: 1. Zellzyklus/ Synthesephase 3.2.6 Abb. 1b: 2. Zellzyklus/ Synthesephase Mikroskopie und Auswertung Die Auswertung der Chromosomenpräparate erfolgte an einem Lichtmikroskop unter der Verwendung einer Ölimmersion bei einer 1250-fachen Vergrößerung. Je Spender wurden 200 Metaphasen in der ersten Zellteilung der unbestrahlten sowie der mit 2 Gy bestrahlten Probe ausgewertet (Abb. 2a und b). Dokumentiert wurde die Anzahl von Ringchromosomen, di- und trizentrischen Chromosomen, Fragmenten, double minutes, Translokationen, Tetraploidien, Brüchen und Gap-Junctions, sowie die Summe aller Bruchereignisse. Abb. 2a: nach Teilkörperdosis Abb. 2b: nach zusätzlicher in-vitroBestrahlung mit 2 Gy Material und Methoden 3.3 23 Statistische Methoden Die Analysen zur Bestimmung des Einflusses klinischer Parameter auf die Ausprägung von Chromosomenaberrationen wurden mittels Kruskal-Wallis-Test durchgeführt: 3.3.1 Kruskal-Wallis-Test Der Kruskal-Wallis-Test stellt eine „Varianzanalyse“ für Rangdaten dar. Er ist eine Erweiterung des U-Tests auf mehr als zwei Gruppen. Er prüft die Nullhypothese, dass p Populationen sich nicht unterscheiden. Dabei werden keine Voraussetzungen an die Verteilungen der Populationen (verteilungsfrei) postuliert. In den Daten wird nur die ordinale oder Ranginformation verwendet. Zum Vergleich der untersuchten Parameter zwischen den empfindlichen Patienten und den unempfindlichen Partnern wurden zwei grundsätzlich verschiedene Methoden, der Mann-Whitney-U-Test und der Wilcoxon-Test, verwendet: 3.3.2 Mann-Whitney-U-Test Mit dem Mann-Whitney-U-Test wird überprüft, ob zwei Grundgesamtheiten die gleiche Lage besitzen. Das bedeutet, die Werte der einen Gruppe (empfindlich) werden denen der anderen Gruppe (unempfindlich) gegenübergestellt. Durch einen Vergleich der Verteilung der Werte (Mittelwert, Median, Standardabweichung) wird geprüft, ob der Unterschied der Verteilung eher zufällig ist oder eher auf einem echten Unterschied zwischen den Gruppen beruht. Liegt der p-Wert unterhalb von 0,05 wird mit einer Wahrscheinlichkeit von 95% davon ausgegangen, dass die Gruppen wirklich unterschiedlich sind. 3.3.3 Wilcoxon für verbundene Stichproben In diesem Test werden die Werte als Paar angegeben, und berechnet wird zunächst der Unterschied innerhalb jedes Paares, dass heißt, ob sie gleich sind oder nicht. Findet sich in 95% der Paare ein Wert ungleich Null, dann ist das Ergebnis als signifikant anzusehen. Dieser Test berücksichtigt nicht, ob der Unterschied auf einer Seite ist (immer die Empfindlichen haben höhere Werte) oder ob er wechselt (in einem Paar hat der empfindliche Patient höhere Werte, im nächsten Paar der Material und Methoden 24 unempfindliche). Der Test stellt nur die Differenzen fest und nimmt jede Differenz als Beweis für den Unterschied. Um den tatsächlichen Vorhersagewert der Parameter zu bestimmen wurde eine logistische Regression der Paramter durchgeführt: 3.3.4 Logistische Regression Bei der logistischen Regression wird ein gerichteter Zusammenhang zwischen einer oder mehreren Einflussvariablen (hier: dizentrische Chromosomen usw.) und einer kategorialen Zielvariablen (hier: Empfindlichkeit) untersucht. Es wird also mit diesem Verfahren überprüft, ob bestimmte Faktoren die Verteilung einer kategorialen Zielvariablen beeinflussen. Dabei besteht eine gewisse Ähnlichkeit zum linearen Regressionsmodell; der Unterschied besteht in der Zielvariablen, die beim linearen Regressionsmodell eine quantitative und keine kategoriale (dichotome/ nominale/ ordinale) Variable ist. Das logistische Regressionsmodell modelliert die logit-transformierte Wahrscheinlichkeit für das Auftreten der Zielvariablen in Abhängigkeit von den Einflussgrößen. Die Modellparameter werden mit der Maximum-LikelihoodMethode geschätzt. Das Verfahren birgt hohe Flexibilität an Modellierungsmöglichkeiten für Einflussgrößen unterschiedlicher Skalenniveaus. Vorgegangen wurde mittels stepwise selection, als Vorgabe für die Aufnahme wurde ein Signifikanzniveau von 20% gewählt. Ergebnisse 25 4 Ergebnisse 4.1 4.1.1 Beschreibung des Patientenkollektivs Basisstatistik im Gesamtkollektiv der 60 Patienten Wie schon in der Einleitung beschrieben, gibt es eine Vielzahl von Faktoren, die die Normalgewebsreaktion beeinflussen und bei der Datenerhebung erfasst wurden. Im Folgenden wird die Verteilung dieser Faktoren im Gesamtkollektiv dargestellt: 4.1.1.1 Geschlecht, Alter, Allgemeinzustand Das Verhältnis von Männern zu Frauen lag bei 25:35, dass heißt 41,6% der Patienten waren männlich, 58,4% weiblich. Die 60 Patienten waren zwischen 37 und 78 Jahre alt mit einem Mittelwert von 58,8 Jahren. Der Anteil der Patienten über 60 lag bei 43%, der Anteil der Patienten über 70 Jahre bei 8%. Der Allgemeinzustand der Patienten wurde anhand des Karnofsky Index (KI) beurteilt. Dieser bewertet die Aktivität von Patienten unter Berücksichtigung körperlicher und sozialer Faktoren. 66,7% waren in einem sehr guten Allgemeinzustand (KI 100%) und 25% in einem guten (KI 90%). Bei 6,7% der Patienten wurde ein mäßig reduzierter Allgemeinzustand (KI 80%) festgestellt und bei 1,6% ein reduzierter Allgemeinzustand (KI 70%). Die Einhaltung der Pflegeanweisungen wurde bei 97% der Patienten als gut festgehalten. 4.1.1.2 Nikotin Der Nikotinkonsum wurde während der Bestrahlung von neun Patienten (15%) fortgeführt, in drei Fällen war es mehr als ein Päckchen Zigaretten am Tag. Weitere 13 Patienten (22%) gaben an, vor der Bestrahlung im Rahmen der Tumordiagnose das Rauchen aufgegeben zu haben. Mehr als ein Päckchen hatten zuvor sieben Patienten konsumiert. Die übrigen 38 Patienten (63%) hatten nie geraucht oder schon vor Jahren damit aufgehört. 4.1.1.3 Alkohol 17 Patienten (28%) gaben an Alkohol zu konsumieren. Bei offensichtlichen Falschangaben wurde vom Arzt der Alkoholkonsum festgehalten. Dabei wurde bei Ergebnisse 26 23,5% dieser Subgruppe ein häufiger und bei den übrigen ein seltener Alkoholkonsum angegeben. Neun Patienten nahmen vorwiegend Wein oder Sekt zu sich, in acht Fällen wurde Bier bevorzugt, scharfe Alkoholika wurden nicht konsumiert. 4.1.1.4 Begleiterkrankungen Als Begleiterkrankungen wurden bei 25% der Patienten ein arterieller Hypertonus dokumentiert, eine koronare Herzkrankheit (KHK) bei 5%, Herzrhythmusstörungen lagen bei 6,7% vor und andere Herzerkrankungen bei 3,3%. Eine chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) hatten 6,7%, andere Lungenerkrankungen ebenfalls 6,7%, Erkrankungen des Nervensystems 10%, Knochen- / Gelenkserkrankungen 23% und Erkrankungen des Gastro-Intestinal-Trakts 11,7% der Patienten. Bei 5% der Patienten wurde Diabetes mellitus festgestellt, eine Schilddrüsenerkrankung bei 18,3%, andere Stoffwechselerkrankungen kamen bei 6,7% der Patienten vor. Mit 6,7% hatten ebenso viele Patienten bereits früher einen bösartigen Tumor. Bei je einem Patienten waren eine peripher arterielle Verschlusskrankheit (pAVK), Erkrankungen des Auges, des Blutes oder des Immunsystems dokumentiert. 4.1.1.5 Medikamentöse Begleittherapien 17% der Patienten hatten in den 14 Tagen vor Therapiebeginn eine AntibiotikaTherapie erhalten. 35% der Patienten erhielten eine Chemotherapie, bei acht Patienten wurde diese sequentiell durchgeführt, bei zwei Patienten sequentiell und simultan und bei elf Patienten simultan. 14 Patientinnen mit Mamma-Carcinom (23,3%) erhielten eine Antihormontherapie. Des Weiteren wurden von 26,7% kardial wirksame Medikamente eingenommen, Diuretika und Mukolytika von 1,7%, Bronchospasmolytika von 6,7%, nichtsteroidale Antiphlogistika (NSAID) von 10%, nicht-opioide Schmerzmittel ebenfalls von 10% sowie Opioide von 5%. Steroide nahmen 3,3% der Patienten ein, Magenmedikamente 16,7%, Antidiabetika 3% und Schilddrüsen-Hormone 13,3%. Vitamine/ Elektrolyte wurden von 15% angegeben, pflanzliche Mittel und Antidepressiva von 1,7%, andere neurologische Medikamente von 8,3%, Ergebnisse 27 Stoffwechselmedikamente von 13,3%, Gerinnungshemmer von 8,3%, Enzyme von 3,3% und andere Medikamente von 6,7%. Homöopathische Mittel wurden nicht eingenommen. 4.1.1.6 Bestrahlungsgebiet 22 Patienten (37%) wurden im Bereich der Brust bestrahlt, wobei in 63,6% die rechte und in 36,4% die linke Mamma betroffen war. 38 Patienten (63%) wurden im KopfHals-Bereich bestrahlt. In diesem Subkollektiv sind die Patienten mit Bestrahlung unter Einschluss der Mundhöhle überrepräsentiert, was dadurch zu erklären ist, dass eine auffällige Akutreaktion häufiger die Schleimhaut betrifft als die Haut. Insgesamt handelte es sich in 5% der Fälle um eine Behandlung im Rezidiv, wobei kein Patient an dieser oder anderer Stelle vorbestrahlt war, da dies als Ausschlusskriterium definiert war. 4.1.2 Paar-Zuordnung 4.1.2.1 Subgruppe Mamma Wie in Material und Methoden (Kap. 3.2) beschrieben, wurden die Paare einander nach bestimmten Kriterien zugeordnet, so dass sie bei den Übereinstimmungen mindestens 5 und maximal 9 Punkte erreichten. Bei den elf Paaren mit Mammacarcinom ergaben sich im Durchschnitt 8,1 Punkte. Es fand sich ein Paar mit nur 5 Punkten, jedoch Übereinstimmung bezüglich der Gesamtdosis. Ein weiteres Paar hatte 6 Punkte, die übrigen Paare 8 oder 9 (Tab. 4a). 4.1.2.2 Subgruppe HNO Bei den 19 Paaren mit Mundhöhlenbestrahlung ergab sich ein Durchschnitt von 7,8 Punkten. Ein Paar erreichte nur 6 Punkte, bei diesem Paar lag eine Übereinstimmung bezüglich der Chemotherapie, nicht jedoch bezüglich der Gesamtdosis vor. fünf Paare erreichten 7 Punkte, die übrigen hatten 8 oder 9 Punkte (Tab. 5a). Um einen direkten Einblick in das Zuordnungs-Verfahren zu ermöglichen, folgen einige klinische Daten im Vergleich der beiden Gruppen (empfindlich versus Ergebnisse 28 unempfindlich) (Tab.3), im Anschluss daran der detaillierte Vergleich der einzelnen Paare (Tab.4a,b,c sowie Tab.5a,b). Durchschnittsalter Geschlecht (m/f) HNO – bis 66 Gy HNO – 70,2 / 72 Gy Mamma – 50 Gy Mamma > 50 Gy HNO – Rauchen akt. Chemotherapie ja empfindlich 58 13 / 6 Pat. 14 Pat. 5 Pat. 7 Pat. 4 Pat. 4 Pat. 10 Pat. unempfindlich 59 12 / 7 Pat. 12 Pat. 7 Pat. 7 Pat. 4 Pat. 2 Pat. 10 Pat. Tab.3: Vergleich empfindlich/ unempfindlich Ergebnisse 29 4.1.2.3 Zuordnungs-Tabelle für Patientinnen mit Brustbestrahlung, Hauptkriterien Die folgende Tabelle zeigt die Hauptkriterien für jedes zugeordnete Paar der Subgruppe Mamma: Pat_ID Paar Gr. CTa ZVOLb Alter Sex PSc Hormone CT-Med.d w w 100 1 90 1 nein ja CMF CMF 1 8 1 EC EC 1 9 1 keine keine 1 9 Su m 343 475 ee ee E sim. M sequ. vor 2 50 50 2 59 69 1 476 484 u u E sequ. vor M sequ. vor 2 66 66 2 46 52 1 w w 100 90 1 nein nein 125 210 v v E M 66 66 2 54 52 1 w w 100 1 100 1 nein nein 199 493 w w E sim./sequ. M nein 60 66 2 55 48 1 w w 100 1 100 1 nein ja EC/CMF keine 433 536 x x E M nein nein 2 50 50 2 57 72 1 w w 100 1 80 ja nein keine keine 1 6 212 403 y y E M nein nein 2 50 50 2 49 64 1 w w 100 1 100 1 nein nein keine keine 1 9 558 z E 51 w 100 nein 73 z M nein sequ. nach 2 38 1 w 1 100 1 nein 470 517 w w 100 1 100 1 nein nein 2 66 2 66 aa aa E sim. M sequ. vor 2 50 50 2 56 66 1 126 444 bb bb E sequ. vor M sequ. vor 2 50 50 2 66 64 1 w w 208 214 cc cc E M 2 50 50 2 67 72 1 128 346 dd dd E sim./sequ. M sequ. vor 2 50 50 2 50 59 1 nein nein 1 5 keine 1 nach 1 9 nein nein 1 EC EC 1 9 90 1 90 1 nein nein 1 CMF EC 8 w w 100 1 100 1 nein nein 1 keine keine 1 9 w w 100 1 100 1 nein ja EC/CMF EC 1 8 Tab. 4a: Patientinnen mit Brustbestrahlung, Hauptkriterien a d Chemotherapie (CT), bGesamtdosis (ZVOL), cAllgemeinzustand nach EOCG (PS), Medikamente der Chemotherapie (CT-Med.) Ergebnisse 30 4.1.2.4 Zuordnungs-Tabellen für Patientinnen mit Brustbestrahlung, zusätzliche Informationen Pat_ID Paar 343 ee 475 ee Gr. E M EDe 50 Gy 48 Gy BMI 29,4 24,7 Nikf nein nein Alkg nein selten Diab.h nein nein Hypert.i nein nein Steroide nein nein 476 484 u u E M 30 Gy 32 Gy 21,8 40,1 nein nein nein nein nein nein nein nein nein nein 125 210 v v E M 28 Gy 28 Gy 29,8 26,4 nein ja nein nein nein nein nein nein nein nein 199 493 w w E M 50 Gy 20 Gy 35,5 23,7 nein nein selten selten nein nein nein nein nein nein 433 536 x x E M 20 Gy 22 Gy 34,6 27,5 nein nein selten nein nein nein nein nein nein nein 212 403 y y E M 50 Gy 56 Gy 30,1 22,3 nein nein nein selten nein nein ja nein nein nein 558 73 z z E M 28 Gy 0 Gy 26,8 22,9 ja nein selten nein nein nein nein nein nein nein 470 517 aa aa E M 50 Gy 48 Gy 31,5 25,9 nein nein nein selten nein nein nein nein nein nein 126 444 bb bb E M 50 Gy 50 Gy 25,4 28 nein ja nein nein nein ja nein ja nein nein 208 214 cc cc E M 50 Gy 50 Gy 25,3 30,5 nein nein nein nein ja nein ja nein nein nein 128 346 dd dd E M 50 Gy 50 Gy 35,1 18,4 ja nein nein selten nein nein ja nein nein nein Tab. 4b: Patientinnen mit Brustbestrahlung, zusätzliche Informationen e Einschlussdosis (ED), fNikotin (Nik), gAlkohol (Alk), hDiabetes (Diab.), iHypertonie (Hypert.) Ergebnisse 31 Pat_ID Paar Gr. TNMSystem Stad.i Histol.k RTvRTl Konzept EDOSm 343 475 ee ee E M T2N1M0 T2N0M0 IIB IIA inv.duc. gemischt nein nein adjuvant adjuvant 2 2 476 484 u u E M T1N0M0 T2N0M0 I IIA gemischt gemischt nein nein adjuvant adjuvant 2 2 125 210 v v E M T1N0M0 T1N0M0 I I inv.duc. inv.lob. nein nein adjuvant adjuvant 2 2 199 493 w w E M T4N1M0 T1N0M0 IIIB I inv.duc. tubulär nein nein adjuvant adjuvant 2 2 433 536 x x E M T1N0M0 T2N0M0 I IIA inv.duc. gemischt nein nein adjuvant adjuvant 1,8 2 212 403 y y E M T1N1M0 T1N1M0 IIA IIA inv.duc inv.duc. nein nein adjuvant adjuvant 2 2 558 73 z z E M T1N0M0 T2N0M0 I IIA inv.duc. medullär nein nein adjuvant adjuvant 2 2 470 517 aa aa E M T1N0M0 T2N1M0 I IIB inv.duc. inv.duc. nein nein adjuvant adjuvant 2 2 126 444 bb bb E M T2N0M0 T1N1M0 IIA IIA inv.lob. tubulär nein nein adjuvant adjuvant 2 2 208 214 cc cc E M T1N0M0 T1N0M0 I I inv.duc. inv.duc. nein nein adjuvant adjuvant 2 2 128 346 dd dd E M T2N1M0 T2N1M0 IIB IIB inv.duc. gemischt nein nein adjuvant adjuvant 2 2 Tab. 4c: Patientinnen mit Brustbestrahlung, zusätzliche Informationen i Stadium (Stad.), kHistologie (Hist.): invasiv-duktal, invasiv-lobulär, gemischt, tubulär, medullär, lVorbestrahlung (RTvRT), mEinzeldosis (Gy) pro Tag, 5x pro Woche (EDOS) Ergebnisse 32 4.1.2.5 Zuordnungs-Tabelle für Patienten mit Mundhöhlenbestrahlung, Hauptkriterien Pat_ID Paar Gr. ZVOLb 209 a E 60 539 a M 72 CTa Alter Sex PSc nein 46 m 90 nein 2 53 1 m 1 90 1 Lok.n OP HP Su Lokgr. Feldo m Mund 14 Mund 1 14 1 7 NHH KK Nase Nase 1 17 16 1 6 MH OP Mund Mund 1 13 12 1 7 1 11 15 1 8 17 17 1 8 8 277 519 b b E M 60 72 nein nein 2 68 71 1 m m 100 1 80 182 535 c c E M 66 72 nein nein 2 78 61 1 w w 70 1 80 1 213 481 d d E M 60 66 nein 2 nein 2 58 62 1 m w 100 MH/NP Mund 100 1 MH Mund 528 555 e e E M 60 58 nein 2 nein 2 52 37 1 m m 100 MB Mund 1 100 1 KH/STH Nase 124 540 f f E M 66 66 nein 2 nein 2 67 54 1 m w 100 100 1 OP SPD Mund Mund 1 11 11 1 334 378 g g E M 66 nein 70-2 2 Sim. 60 63 1 w w 90 1 90 1 MH MH Mund Mund 1 17 18 1 7 557 122 h h E M 70,2 Sim. 70,2 2 Sim. 2 55 59 1 m w 100 MH Mund 1 90 1 OP/HP Mund 1 15 8 8 522 556 i i E M 70,2 Sim. 70,2 2 Sim. 2 66 66 1 m m 90 1 100 1 MH KK Mund Nase 16 7 7 445 547 k k E M 66 60 Sim. 2 Sim. 2 47 60 1 w m 100 100 1 MH KH Mund Mund 1 11 91 8 491 554 l l E M 66 66 nein 2 nein 2 66 64 1 w m 90 100 1 MH MH Mund Mund 1 13 12 1 8 550 541 m m E M 72 72 nein 2 nein 2 68 65 1 m m 100 1 80 MH Mund OP/HP Mund 1 15 17 1 8 114 365 n n E M 72 72 nein 2 nein 2 53 53 1 m m 100 1 90 1 MH OP Mund Mund 1 11 91 9 267 553 o o E M 60 60 nein 2 nein 2 66 66 1 w w 100 1 100 1 NP KK Nase Nase 1 17 5 8 559 533 p p E M 72 66 sim. sim. 2 52 47 1 m m 100 1 100 1 OP MH Mund Mund 1 17 17 1 7 129 551 q q E M 60 60 nein 2 nein 2 73 57 1 m m 90 1 90 1 HP NHH Mund Nase 5 81 8 191 280 r r E M 60 66 nein 2 nein 2 63 57 1 m m 100 1 100 1 MH MH Mund Mund 1 15 14 1 9 123 282 s s E M 60 60 nein 2 nein 2 58 57 1 w w 90 1 100 1 MH MH Mund Mund 1 16 18 1 9 127 396 t t E M 60 60 nein 2 nein 2 52 63 1 m m 100 1 100 1 MH HP Mund Mund 1 11 91 9 Ergebnisse 33 Tab.5a: Patienten mit Mundhöhlenbestrahlung, Hauptkriterien Chemotherapie (CT), bGesamtdosis (ZVOL), cAllgemeinzustand nach EOCG (PS), n Lokalisation (Lok.): Oropharynx (OP), Nasenhaupthöhle (NHH), Kieferknochen (KK), Mundhöhle (MH), Nasopharynx (NP), Mundboden (MB), Kieferhöhlen (KH), Stirnhöhlen (STH), Speicheldrüsen (SPD), oZahl der Schleimhautareale im Feld (Feld) a Ergebnisse 34 4.1.2.6 Zuordnungs-Tabelle für Patienten mit Mundhöhlenbestrahlung, zusätzliche Informationen Pat_ID Gr. EDe Nikf Alkg Diab.h Hyp.i Stadium Histol.k RTvRTl 209 E 52 ja ja nein nein T2N2M0 PEC nein 539 M 25 ja nein nein nein T4N3M0 PEC nein Konzept adjuvant conco EDOSm 2 1,8 277 519 E M 30 nein nein 56 ja ja nein nein nein T2N0M0 Adeno ja(a.R.) nein T2N2M1 PEC nein adjuvant conco 2 1,8 182 535 E M 60 nein nein 32 nein nein nein nein ja T4N2M0 PEC nein T4N2M0 PEC nein nein adjuvant conco 2 1,8 213 481 E M 28 nein nein 62 ja nein nein nein nein T1N0M0 PEC ja T4N2M0 PEC nein nein adjuvant adjuvant 2 2 528 555 E M 20 ja ja 8 nein nein nein nein nein TxN1M0 PEC ja T2N0M0 Adeno nein nein adjuvant adjuvant 2 2 124 540 E M 22 nein nein 42 nein nein ja nein ja T1N0M0 PEC nein T2N0M0 Adeno nein nein adjuvant adjuvant 2 2 334 378 E M 34 22 ja ja nein ja nein nein nein T2N0M0 PEC ja T3N1M0 PEC nein nein adjuvant adjuvant 2 2 557 122 E M 5,4 22 ja ja nein ja nein nein ja T4N0M0 PEC nein T3N1M0 PEC nein nein Wendt Wendt 1,8 1,8 522 556 E M 61 nein nein 5,4 ja nein nein nein nein T2N1M0 PEC nein T3N2M0 PEC nein nein Wendt Wendt 1,8 1,8 445 547 E M 32 nein nein 24 nein nein nein nein ja T4N0M0 PEC nein T4N0M0 PEC nein nein adjuvant adjuvant 2 2 491 554 E M 32 nein nein 0 nein nein nein nein nein T2N2M0 PEC ja T4N2M0 PEC nein nein adjuvant adjuvant 2 2 550 541 E M 20 26 nein nein nein nein nein T4N0M0 PEC ja T4N2M0 PEC nein nein Concoboost conco 1,8 1,8 114 365 E M 72 ja ja 72 nein nein nein nein nein T2N0M0 PEC nein T4N2M0 PEC nein nein conco adjuvant 1,8 1,8 267 553 E M 38 nein nein 10 ja nein nein nein nein T4N2M0 PEC ja T2N1M0 PEC nein primär kurativ nein adjuvant 559 533 E M 36 nein ja 30 nein nein nein nein nein T3N2M0 PEC nein T4N3M1 PEC nein nein conco adjuvant 1,8 2 129 551 E M 38 ja nein 10 nein nein nein nein nein T4N2M0 PEC nein T4N0M0 Adeno nein nein adjuvant palliativ 2 2 191 280 E M 28 nein nein 28 ja nein nein nein nein T2N2M0 PEC nein T2N2M0 PEC nein nein adjuvant adjuvant 2 2 123 282 E M 30 nein nein 30 nein nein nein nein nein T1N1M0 PEC nein T4N2M0 PEC nein nein adjuvant adjuvant 2 2 127 396 E M 32 58 nein nein nein T3N0M0 PEC ja T2N1M0 PEC nein nein adjuvant adjuvant 2 2 ja ja ja ja ja ja 2 2 Ergebnisse 35 Tab. 5b: Patienten mit Mundhöhlenbestrahlung, zusätzliche Informationen Einschlussdosis (ED), fNikotin (Nik), gAlkohol (Alk), hDiabetes (Diab.), iHypertonie (Hyp.), kHistologie (Hist.): Plattenepithel-Carcinom (PEC), Adeno-Carcinom (Adeno), lVorbestrahlung (RTvRT), mEinzeldosis (Gy) pro Tag, 5x pro Woche (EDOS) e Ergebnisse 36 4.1.2.7 Einschlussdosis bei Blutentnahme – Betrachtung der einzelnen Paare Auch die Teilkörperdosis bei Blutentnahme war ein wesentlicher Faktor. Bei der Blutentnahme sollte bei dem zugeordneten unempfindlichen Partner die gleiche Teilkörperdosis erreicht sein wie bei den jeweiligen empfindlichen Patienten. Aus den Schwierigkeiten, in dem festgesetzten Zeitraum genügend unempfindliche Partner zu finden, ergab sich, dass dies nicht in allen Fällen erfüllt werden konnte. Bei 17 Paaren wurde das Blut bei gleicher Teilkörperdosis abgenommen (+/- 2 Gy). Bei vier Paaren betrug die Differenz zwischen 3 und 6 Gy, bei zwei Paaren zwischen 10 und 20 Gy und bei sieben Paaren mehr als 21 Gy (vgl. Abb. 3 und 4). Dosis bei Blutentnahme/Paar 80 70 Dosis/Gy 60 50 Empfindlich 40 Unempfindlich 30 20 10 28 25 22 19 16 13 10 7 4 1 0 Paare Abb. 3: Dosis bei Blutentnahme im Vergleich der zugeordneten Paare 40 35 30 25 20 15 10 5 0 29 27 25 23 21 19 17 15 13 9 11 7 5 3 Diff Dos 1 Dosis/Gy Dosisdifferenz bei Blutabnahme Paare Abb. 4: Differenz der Dosis bei Blutentnahme für alle Paare Ergebnisse 37 Nachdem die Paare, wie in 3.2.2 beschrieben, neu sortiert wurden, da sich einige Parameter als besonders relevant herausstellten, ergab sich ein anderes Bild. Es fanden sich noch elf Paare mit einer Differenz bis 2 Gy, vier mit einer Differenz von 4 bis 9 Gy, fünf mit Unterschieden von 10 bis 20 Gy und zehn mit Unterschieden von mehr als 22 Gy. Da jedoch die Zuordnung zur Gruppe (empfindlich und unempfindlich) gleichblieb, ist es für die Bewertung der strahlenbiologischen Ergebnisse (Kap. 4.1.4 und Kap. 4.4) ohne Relevanz. 4.1.3 Ausprägung der akuten Nebenwirkungen Die Ausprägung der akuten Nebenwirkungen wurde im Vergleich empfindliche/ unempfindliche Patienten betrachtet. Neben den akuten Reaktionen an Haut und Schleimhaut wurde auch eine Reihe weiterer Nebenwirkungen wie zum Beispiel reduzierter Allgemeinzustand, Übelkeit und Schmerzen erfasst, um einen möglichen Zusammenhang zwischen dem Auftreten der Nebenwirkungen erkennen zu können. Wegen der unterschiedlichen Toxizitätsmuster der beiden Tumorentitäten werden auch hier wieder die Patientinnen mit Brustbestrahlung von den Patientinnen und Patienten mit Mundhöhlenbestrahlung getrennt dargestellt. Ergebnisse 38 4.1.3.1 Akute Nebenwirkungen der Brustbestrahlung Eingeschlossen sind elf empfindliche sowie elf unempfindliche Patientinnen. Für die folgenden Organe und Funktionen wurden keine Nebenwirkungen angegeben: Pharynx, Ernährung, Diarrhoe, Auge und Ohr. Die Verteilung der anderen Nebenwirkungen ist in Tabelle 6 dargestellt: Allgemeinbefinden I° II° Speicheldrüse I° Übelkeit I° Larynx I° ZNS I° Lymphödem I° II° Lunge I° II° Herz Fatigue I° II° Schmerzen I° II° III° Geschmack I° Haut I° II° III° empfindlich 45,5% 0% 18% 0% 18% 27% 9% 18% 18% 64% 63% 27% 45% 9% 36% 63% unempfindlich 72% 9% 27% 9% 9% 0% 27% 18% 9% 55% 36% 27% 9% 9% 9% 72% 27% Tab. 6: Akute Nebenwirkungen der Brustbestrahlung Vergleicht man hier die empfindlichen mit den unempfindlichen Patienten, so finden sich nur bezogen auf die Haut deutliche Unterschiede. Alle anderen Parameter sind vergleichbar. Somit scheint ein Zusammenhang zwischen der Normalgewebsreaktion an der Haut und Reaktionen an anderen Geweben nicht gegeben. Ergebnisse 39 4.1.3.2 Akute Nebenwirkungen der Mundhöhlenbestrahlung In diese Gruppe sind 19 empfindliche sowie 19 unempfindliche Patienten eingeschlossen. Im Bereich der Lunge fandem sich keine Nebenwirkungen. Auch gab kein Patient Diarrhoe als Beschwerde an. Die Verteilung der anderen Nebenwirkungen ist in Tabelle 7 dargestellt: Allgemeinbefinden I° II° III° IV° Ernährung I° II° III° Übelkeit I° II° III° Larynx I° II° III° ZNS I° II° Lymphödem I° II° III° Auge II° III° Ohr I° II° Herz I° Fatigue I° II° III° Schmerzen I° II° III° Geschmack I° II° III° Pharynx I° II° III° Haut I° II° III° Schleimhaut I° II° III° empfindlich 26% 21% 42% 26% 21% 42% 21% 21% 10% 21% 42% 21% 5% 10% 47% 10% 5% 10% 10% 5% 31% 53% 16% 5% 27% 86% 10% 42% 26% 5% 26% 68% 21% 47% 32% 100% unempfindlich 21% 42% 10% 5% 10% 32% 42% 32% 16% 21% 21% 5% 5% 10% 10% 5% 10% 5% 37% 47% 16% 21% 8% 20% 26% 32% 5% 10% 47% 26% 16% 58% 26% 5% 42% 47% Tab. 7: Akute Nebenwirkungen der Mundhöhlenbestrahlung Ergebnisse 40 Bei einem Vergleich der Ausprägungen wird deutlich, dass sich nur die Parameter klar unterscheiden, die direkt mit dem Ausmaß der Schleimhautreaktion zusammenhängen. Dies sind im Einzelnen der reduzierte Allgemeinzustand, Schmerzen und gestörte Geschmackswahrnehmung. Als Schlussfolgerung ergibt sich, dass die auf dem Unterschied der Schleimhautreaktion beruhende klinische Einteilung in empfindlich und unempfindlich ausschließlich für diese Organe gilt und nicht mit einer erhöhten Inzidenz oder Schwere anderer Normalgewebsreaktionen einhergeht. 4.1.4 Strahlenbiologische Charakterisierung Im Folgenden wurde untersucht, ob die einzelnen Chromosomenaberrationen durch die jeweilige Teilkörperdosis bei Blutentnahme beeinflusst werden und ob sich die Anzahl der Veränderungen nach in-vitro-Bestrahlung erhöht. 4.1.4.1 Dizentrische Chromosomen Bei der einfachen Auftragung der dizentrischen Chromosomen über die Gesamtgruppe der 60 Patienten zeigt sich eine deutliche Streubreite der Werte von 0 bis 103 dizentrische Chromosomen pro 200 ausgezählten Zellen im ersten Teilungszyklus (Abb. 5). Eine eindeutige Steigerung der Zahl dizentrischer Chromosomen in Abhängigkeit von der Teilkörperdosis bei Blutentnahme (BE) findet sich nicht (Abb.6). Dicentrics Dizentrische 120 100 80 60 40 Reihe1 20 0 0 20 40 60 80 Patienten Abb. 5: Dicentrics sortiert nach Wert, alle 60 Patienten Ergebnisse 41 Dicentrics in Abh. von Dosis bei BE 120 Dizentrische 100 80 60 Dizentrics 40 20 0 0 20 40 60 80 Dosis/Gy Abb. 6: Dicentrics in Abhängigkeit von der Dosis bei Blutentnahme (alle 60 Pat.) Dies gilt genauso für die Zahl der dizentrischen Chromosomen nach zusätzlicher Bestrahlung der Probe mit 2 Gy und setzt sich auch fort, wenn die Differenz der Werte zwischen unbestrahlter und bestrahlter Probe betrachtet wird (Abb. 7 und 8). Dizentrische Chromosomen dicrad Diff rad-unrad Dizentr 57 53 49 45 41 37 33 29 25 21 17 13 9 5 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 1 Dizentrische dic Patienten Abb. 7: Dicentrics nach Teilkörperdosis (dic), nach in-vitro-Bestrahlung (dicrad) und die Differenz beider Werte (diffradunraddic) Ergebnisse 42 Dizentrische nach Dosis bei BE Dizentrische dic dicrad 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Dosis/Gy Abb: 8: Dicentrics abhängig von der Dosis bei Blutentnahme im Frischblut (dic) und nach in-vitro-Bestrahlung (dicrad) 4.1.4.2 Azentrische Fragmente Die Zahl der azentrischen Fragmente zeigt nach Teilkörperdosis und Bestrahlung mit 2 Gy höhere Werte als ohne in-vitro Bestrahlung sowie eine größere Streubreite. Es zeigt sich keine Abhängigkeit von der Dosis der Teilkörperbestrahlung bei Blutentnahme (Abb. 9 und 10). Fragmente frag fragrad Diff rad-unrad Frag Fragmente 400 300 200 100 57 53 49 45 41 37 33 29 25 21 17 13 9 5 1 0 Patienten Abb. 9: Fragmente im Frischblut (frag), nach in-vitro-Bestrahlung (fragrad) und die Differenz beider Werte (Diff rad-unrad Frag) Ergebnisse 43 Fragmente abh. von Dosis bei BE frag fragrad Fragmente 400 300 200 100 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Dosis/Gy Abb. 10: Fragmente abhängig von der Dosis bei Blutentnahme im Frischblut (frag) und nach in-vitro Bestrahlung (fragrad) 4.1.4.3 Translokationen Auch die Inzidenz von Translokationen, soweit diese in der verwandten Färbung ohne Bänderung auffielen, zeigt eine gewisse Streuung und ist nicht abhängig von der Teilkörperosis bei Blutentnahme (Abb. 11 und 12). Translokationen trans transrad Diff rad-unrad Trans 70 Translokationen 60 50 40 30 20 10 57 53 49 45 41 37 33 29 25 21 17 9 13 -10 5 1 0 Patienten Abb. 11: Translokationen nach Teilkörperdosis (trans), nach in-vitroBestrahlung (transrad) und die Differenz beider Werte (Diff rad-unrad Trans) Ergebnisse 44 Translokationen nach Dosis bei BE trans transrad 70 Translokationen 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Dosis/Gy Abb. 12: Translokationen abhängig von der Dosis bei Blutentnahme im Frischblut (trans) und nach in-vitro-Bestrahlung (transrad) 4.1.4.4 Tetraploidie Die Zahl der tetraploiden Zellen war insgesamt sehr gering, so dass eine getrennte Auswertung nicht sinnvoll erschien. Sie wurde jedoch bei der Summe der Bruchereignisse und den Bruchereignissen pro Zelle berücksichtigt. 4.1.4.5 Summe aller Bruchereignisse und Bruchereignisse pro Zelle Für die zusammenfassende Bewertung der Chromosomenanalyse wurden zwei weitere Parameter eingeführt. Zum einen wurden alle in den zweihundert Zellen beobachteten Bruchereignisse addiert (Summe der Bruchereignisse). Zum anderen wurde diese Zahl durch 200 geteilt, um so einen Wert für die Bruchereignisse pro Zelle zu bekommen. Auch die Summe der Bruchereignisse zeigt eine gewisse Streuung. Die Zahl zeigt keinen eindeutigen Anstieg abhängig von der Teilkörperdosis bei Blutentnahme. Dieser Anstieg erfolgt jedoch nach Bestrahlung der Probe mit 2 Gy (Abb. 13 und 14). Ergebnisse 45 Summe aller Bruchereignisse Sumrad Diff Sum 600 500 400 300 200 100 57 53 49 45 41 37 33 29 25 21 17 13 9 5 0 1 Summe aller Bruchereignisse Sum Patienten Abb. 13: Summe aller Bruchereignisse nach Teilkörperdosis (sum), nach in-vitro-Bestrahlung (sumrad) und die Differenz beider Werte (diffsum) Summe aller Bruchereignisse nach Dosis bei BE Sum Sumrad Summe aller Bruchereignisse 600 500 400 300 200 100 0 0 20 40 60 80 Dosis/Gy Abb. 14: Summe aller Bruchereignisse abhängig von der Dosis bei Blutentnahme im Frischblut (sum) und nach in-vitro-Bestrahlung (sumrad) Betrachtet man die Bruchereignisse pro Zelle (BpZ) so zeigen sich ähnliche Verläufe der Kurven: es gibt eine gewisse Streuung, jedoch keine Abhängigkeit von der Teilkörperdosis bei Blutentnahme (Abb. 15 und 16). Ergebnisse 46 Brüche pro Zelle BpZ BpZ rad BpZrad - BpZ unrad Brüche pro Zelle 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 Patienten Abb. 15: Bruchereignisse pro Zelle im Frischblut (BpZ), nach in-vitroBestrahlung (BpZ rad) und die Differenz beider Werte (BpZ radBpZ unrad) Brüche pro Zelle nach Dosis bei BE BpZ BpZ rad Brüche pro Zelle 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 0 20 40 60 80 Dosis/Gy Abb. 16: Bruchereignisse pro Zelle nach Dosis bei Blutentnahme im Frischblut (BpZ) und nach in-vitro-Bestrahlung (BpZ rad) 4.2 Einfluss klinischer Parameter auf die Ausprägung biologischer Messwerte Alle statistischen Analysen in diesem Unterkapitel wurden mittels Kruskal-WallisTest durchgeführt. Es wurde untersucht, ob verschiedene klinische Faktoren wie zum Beispiel der BMI (Untergewicht, Normalgewicht bis leichtes Übergewicht, extremes Übergewicht), Resektionsstatus (R0, R1, R2, nur PE (Probe-Entnahme)), Begleiterkrankungen und Medikamenteneinnahme Einfluss auf die biologischen Messwerte, dass heißt auf die verschiedenen Chromosomenaberrationen, haben. Ein Ergebnisse 47 Problem ist die Vielzahl der Tests. Da es sich um eine explorative Analyse in einem kleinen Kollektiv von nur 60 Patienten handelt, wurden die Ergebnisse anhand der Zusammenhänge innerhalb des Projekts, der im eigenen Labor erhobenen Normwerten und der Erfahrungen aus der Literatur bewertet. Insgesamt wurden 19 Einflussfaktoren untersucht. Folgende der untersuchten klinischen Einflussfaktoren beeinflussen keinen der biologischen Parameter: - BMI (sowohl gruppiert nach Einzelgruppen als auch zusammengefasst in drei Gruppen nach Untergewicht, Normalgewicht bis leichtes Übergewicht, extremes Übergewicht, getestet mit Kruskal-Wallis) - Resektionsstatus (R0, R1, R2, nur PE, getestet mittels Kruskal-Wallis-Test) - Hämoglobin (kleiner/ gleich 11 mg/dl vs. größer 11 mg/dl) - Einnahme eines Antibiotikums in den 14 Tagen vor Beginn der Strahlentherapie (ja versus nein) - Einnahme von Wachstumsfaktoren im Rahmen einer vorhergehenden Chemotherapie (ja versus nein) - Allgemeinkrankheiten (COPD, Diabetes mellitus, Blutkrankheiten, Autoimmunkrankheiten; erhöhte Leberwerte, erhöhte Nierenwerte) - Einnahme von Medikamenten (NSAID, Gerinnungshemmer) Andere Faktoren wie Chemotherapie und Allgemeinzustand haben Einfluss auf die Chromosomenaberrationen. 4.2.1 Einfluss auf dizentrische Chromosomen Die Zahl dizentrischer Chromosomen variiert signifikant in Abhängigkeit von einer Chemotherapie. Patienten ohne Chemotherapie haben mehr dizentrische Chromosomen (p=0,002) wenn nur Chemotherapie ja versus Chemotherapie nein getestet wird; auch in der mit 2 Gy bestrahlten Probe findet sich diese Signifikanz (p=0,015). Dies gilt auch bei Untersuchung der einzelnen Möglichkeiten für Chemotherapie (nicht, simultan, sequentiell, simultan/ sequentiell) mittels KruskalWallis-Test für die nicht-bestrahlte (p=0,003) und die bestrahlte Probe (p=0,028). Der Allgemeinzustand der Patienten hat keinen Einfluss auf dizentrische Chromosomen. Ergebnisse 48 Abb. 17: Dizentrische Chromosomen und Chemotherapie (ja = Chemother., nein = keine) Abb. 17a: Dizentrische Chromosomen nach Teilkörperdosis 4.2.2 Abb. 17b: Dizentrische Chromosomen nach Teilkörperdosis und in-vitroBestrahlung mit 2 Gy Einfluss auf azentrische Fragmente Patienten ohne Chemotherapie haben weniger azentrische Chromosomen (p=0,016), wenn nur Chemotherapie ja versus Chemotherapie nein getestet wird. Dies gilt auch bei Untersuchung der einzelnen Möglichkeiten für Chemotherapie (nicht, simultan, sequentiell, simultan/ sequentiell) mittels Kruskal-Wallis-Test (p=0,02). Abb. 18: Azentrische Fragmente und Chemotherapie Abb. 18a: Azentrische Fragmente nach Teilkörperdosis Abb. 18b: Azentrische Fragmente nach Teilkörperdosis und in-vitro-Bestrahlung mit 2 Gy Patienten mit einem höheren Karnofsky-Index (100 oder 90, ECOG 0) weisen in der Probe weniger azentrische Fragmente auf als Patienten mit einem reduzierten Ergebnisse 49 Allgemeinzustand (p=0,003). Dies bestätigt sich auch in der Untersuchung der Fragmente nach Bestrahlung der Blutprobe mit 2 Gy (p=0,014). Abb. 19: Azentrische Fragmente und Allgemeinzustand Abb. 19a: Azentrische Fragmente nach Teilkörperdosis 4.2.3 Abb. 19b: Azentrische Fragmente nach Teilkörperdosis und in-vitro-Bestrahlung mit 2 Gy Einfluss auf Translokationen Patienten ohne Chemotherapie haben weniger Translokationen (p=0,0034), wenn nur Chemotherapie ja versus Chemotherapie nein getestet wird. Dies gilt auch bei Untersuchung der einzelnen Möglichkeiten für Chemotherapie (nicht, simultan, sequentiell, simultan/ sequentiell) mittels Kruskal-Wallis-Test (p=0,006). Nach Bestrahlung der Probe mit 2 Gy findet sich kein relevanter Einflussfaktor. Der Allgemeinzustand hat keinen Einfluss auf das Auftreten von Translokationen. Abb. 20: Translokationen und Chemotherapie Abb. 20a: Translokationen nach Teilkörperdosis Abb. 20b: Translokationen nach Teilkörperdosis und in-vitro-Bestrahlung mit 2 Gy Ergebnisse 4.2.4 50 Einfluss auf Tetraploidie Dieser Parameter wird weder in der unbestrahlten noch in der bestrahlten Probe von einem der untersuchten klinischen Einflussfaktor relevant verändert. Abb. 21: Tetraploidie und Chemotherapie nach Teilkörperdosis 4.2.5 Einfluss auf die Summe aller Bruchereignisse und Bruchereignisse pro Zelle Bei der Patientengruppe ohne Chemotherapie finden sich signifikant weniger Bruchereignisse insgesamt (p=0,0056) und auch weniger Bruchereignisse pro Zelle (p=0,0056), wenn nur Chemotherapie ja versus Chemotherapie nein getestet wird. Gleiches findet sich in der bestrahlten Probe sowohl für die Bruchereignisse insgesamt (p=0,048) als auch für die Bruchereignisse pro Zelle (p=0,048). Dies gilt in der unbestrahlten Probe auch bei Untersuchung der einzelnen Möglichkeiten für Chemotherapie (nicht, simultan, sequentiell, simultan/ sequentiell) mittels KruskalWallis-Test (p=0,009 für beide Parameter), nicht jedoch in der mit 2 Gy bestrahlten Probe. Der Allgemeinzustand hat keinen Einfluss auf die Summe aller Bruchereignisse pro Zelle. Ergebnisse 51 Abb. 22: Bruchereignisse pro Zelle und Chemotherapie Abb. 22a: Chemotherapie ja vs. Chemo- Abb. 22b: keine Chemotherapie (nein) therapie nein vs. sequentielle Chemoth. (sequ.), vs. simultan u. sequentiell durchgeführte Chemoth. (simsequ.) vs. simultan durchgeführte Chemoth. (sim.) 4.2.6 Zusammenfassung Die Chemotherapie ist der einzige klinische Faktor, der eine größere Zahl von Parametern wesentlich beeinflusst. Alle Paare stimmten hinsichtlich dieses Parameters überein, so dass ein Unterschied zwischen empfindlichen und den zugeordneten unempfindlichen Patienten nicht auf einer Ungleichverteilung der Chemotherapie in der Vorgeschichte beruht. Auch der Allgemeinzustand, der einen Einfluss auf die Anzahl der Fragmente hat, wurde in der Paar-Zuordnung berücksichtigt. Es war zwar nicht möglich, ein Verhältnis von 1:1, bezogen auf den Karnofsky-Index, zu erzielen, aber doch innerhalb der ECOG-Gruppierung. Bezüglich des Geschlechts wurde bei der Zuordnung nur in einem Fall abgewichen. Daraus lässt sich schliessen, dass die Aussagen, die unter 4.4 für den Unterschied zwischen Empfindlichem und zugeordnetem unempfindlichen Partner folgen, wirklich auf diese Eigenschaft zurückzuführen sind und nicht durch ein Ungleichgewicht vorstellbarer klinischer Faktoren bedingt sind. 4.3 Chromosomenaberrationen Für die Untersuchungen der Chromosomenaberrationen wurde den Patienten nach Teilkörperdosis Blut entnommen und Metaphasen-Präparate von unbestrahlten sowie von mit 2 Gy in-vitro bestrahlten Lymphozyten hergestellt (siehe Material und Ergebnisse 52 Methoden). Tabelle 8 und 9 zeigen die Verteilung der Aberrationen der jeweils 200 ausgezählten Zellen für klinisch empfindliche Patienten und klinisch unempfindliche Patienten nach Teilkörperdosis ohne in-vitro-Bestrahlung. Tabellen 10 und 11 zeigen die Anzahl der Chromosomenaberrationen nach in-vitro-Bestrahlung mit 2 Gy. In diesen Tabellen ist die Anzahl der Ringchromosomen, der trizentrischen Chromosomen, der double minutes und der Gap-Junctions nicht dokumentiert. In der Summe der Aberrationen wurden diese jedoch berücksichtigt, wodurch sich die zum Teil höheren Summen ergeben. Für einen empfindlichen Patienten (126) gab es leider keine Ergebnisse. Ergebnisse 4.3.1 53 Chromosomenaberrationen bei empfindlichen Patienten nach Teilkörperdosis PAT_ID Gr. Zellen ohne Dizen- Fragmente TransBefund trische lokationen 343 476 125 199 433 212 558 470 126 208 128 209 277 182 213 528 124 334 557 522 445 491 550 114 267 559 129 191 123 127 E E E E E E E E 200 200 200 200 200 200 200 200 163 195 193 175 187 158 196 190 12 0 2 6 2 16 1 2 49 1 3 26 11 18 5 8 E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 158 159 118 133 137 159 162 149 123 189 183 166 165 160 129 111 190 138 137 118 142 24 25 82 35 51 51 30 39 99 4 6 26 26 24 68 75 1 43 44 66 43 46 25 148 98 91 87 40 50 169 5 16 45 40 50 57 143 5 49 42 63 49 Tetraploidien Summe Brüche pro Zelle 5 0 2 2 1 5 0 0 5 0 0 7 1 16 3 0 78 5 8 46 16 64 9 12 0,39 0,03 0,04 0,23 0,08 0,32 0,05 0,06 7 2 8 11 16 12 10 8 6 2 0 9 11 9 10 25 1 13 9 9 9 4 6 10 6 4 5 4 2 9 1 5 12 4 4 6 5 5 6 3 1 2 85 63 270 164 174 168 88 105 305 14 32 101 91 95 155 263 14 115 119 162 114 0,43 0,32 1,35 0,82 0,87 0,84 0,44 0,53 1,53 0,07 0,16 0,51 0,46 0,48 0,78 1,32 0,07 0,58 0,60 0,81 0,57 Tab. 8: Chromosomenaberrationen, absolute Zahlen - empfindliche Patienten nach Teilkörperdosis Ergebnisse 4.3.2 54 Chromosomenaberrationen bei unempfindlichen Patienten nach Teilkörperdosis PAT_ID Gr. Zellen ohne Befund Dizentrische Fragmente Translokationen Tetraploidien Summe Brüche pro Zelle 475 484 210 493 536 403 73 517 444 214 346 539 519 535 481 555 540 378 122 556 547 M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 181 193 160 198 182 189 200 185 194 159 187 189 148 143 167 189 184 171 148 195 193 8 1 15 0 5 11 0 8 0 12 0 2 44 46 24 8 12 14 33 1 0 19 1 23 2 5 9 0 12 12 39 4 11 73 75 48 12 9 45 59 3 3 2 0 10 0 7 2 0 1 0 2 0 1 19 15 3 0 2 5 10 0 0 2 0 4 0 0 3 0 0 1 3 9 3 1 3 7 0 2 6 0 0 2 33 7 68 3 22 26 0 21 14 64 14 20 152 143 87 21 25 76 107 5 8 0,17 0,04 0,34 0,02 0,11 0,13 0,00 0,11 0,07 0,32 0,07 0,10 0,76 0,72 0,44 0,11 0,13 0,38 0,54 0,03 0,04 554 541 365 553 533 551 280 282 396 M M M M M M M M M 200 200 200 200 200 200 200 200 200 197 172 167 191 146 196 98 174 153 0 25 19 8 55 2 103 8 9 2 35 48 6 121 2 100 20 54 0 12 9 3 18 0 8 0 5 0 4 8 0 11 0 8 13 4 3 80 92 17 214 6 291 48 82 0,02 0,40 0,46 0,09 1,07 0,03 1,46 0,24 0,41 Tab.9: Chromosomenaberrationen, absolute Zahlen - unempfindliche Patienten nach Teilkörperdosis Ergebnisse 4.3.3 55 Chromosomenaberrationen bei empfindlichen Patienten nach in-vitro Bestrahlung mit 2 Gy PAT_ID Gr. Zellen 343 476 125 199 433 212 558 470 126 208 128 209 277 182 213 528 124 334 557 522 445 491 550 114 267 559 129 191 123 127 ohne Dizen- Fragmente Befund trische Translokationen Tetraploidien Summe Brüche pro Zelle E E E E E E E E 200 200 200 200 200 200 200 200 127 161 164 138 145 166 181 152 19 26 14 39 32 39 5 27 93 31 24 96 53 35 24 60 18 1 3 18 5 1 1 12 1 12 1 8 9 12 4 8 143 80 50 166 108 124 37 108 0,72 0,40 0,25 0,83 0,54 0,62 0,19 0,54 E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 104 94 57 85 124 114 133 81 59 155 163 145 135 91 70 32 170 94 81 73 88 54 71 175 52 75 81 72 101 165 15 16 48 47 106 172 95 13 59 64 113 97 121 81 340 220 140 134 137 97 310 60 43 120 84 208 115 226 20 74 108 112 97 14 12 16 24 31 32 21 20 19 9 3 21 12 49 11 60 4 25 34 18 16 9 10 18 16 3 5 20 11 8 1 12 12 5 3 11 10 9 11 1 2 1 210 188 627 341 261 277 270 248 515 93 84 218 166 392 342 493 56 184 252 271 247 1,05 0,94 3,14 1,71 1,31 1,39 1,35 1,24 2,58 0,47 0,42 1,09 0,83 1,96 1,71 2,47 0,28 0,92 1,26 1,36 1,24 Tab. 10: Chromosomenaberrationen, absolute Zahlen - empfindliche Patienten nach in-vitro-Bestrahlung (2 Gy) Ergebnisse 4.3.4 56 Chromosomenaberrationen bei unempfindlichen Patienten nach invitro Bestrahlung mit 2 Gy PAT_ID Gr. Zellen ohne Dizentrische Fragmente TransBefund lokationen Tetraploidien Summe Brüche pro Zelle 475 484 210 493 536 403 73 517 444 214 346 539 519 535 481 555 540 378 122 M M M M M M M M M M M M M M M M M M M 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 110 173 95 176 115 147 138 149 174 91 168 173 99 117 134 164 131 115 66 50 11 42 9 27 17 20 26 4 59 12 11 99 71 56 24 48 56 84 108 22 118 21 54 49 60 43 27 145 34 11 191 138 99 34 111 158 146 5 10 20 2 63 2 15 11 2 10 3 4 45 34 17 6 14 21 53 11 1 17 4 3 4 2 0 4 2 10 13 4 5 2 1 4 21 1 177 47 229 45 170 76 116 83 39 234 61 43 359 271 185 69 192 275 310 0,89 0,24 1,15 0,23 0,85 0,38 0,58 0,42 0,20 1,17 0,31 0,22 1,80 1,36 0,93 0,35 0,96 1,38 1,55 556 M 200 142 37 64 5 2 115 0,58 547 554 541 365 553 533 551 280 282 396 M M M M M M M M M M 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 172 169 152 115 149 106 168 81 157 116 8 4 29 65 30 107 13 158 39 52 33 21 64 174 64 223 34 191 61 146 6 2 12 23 11 37 3 21 3 19 3 0 8 17 2 18 3 5 10 9 52 30 117 303 115 398 56 463 138 237 0,26 0,15 0,59 1,52 0,58 1,99 0,28 2,32 0,69 1,19 Tab. 11: Chromosomenaberrationen, absolute Zahlen - unempfindliche Patienten nach in-vitro-Bestrahlung (2 Gy) Ergebnisse 4.4 Chromosomenaberrationen 57 als biologischer Parameter der zellulären Strahlenempfindlichkeit im Vergleich zwischen den empfindlichen und den zugeordneten, unempfindlichen Partnern Die Ergebnisse wurden anhand von zwei statistischen Tests ausgewertet: 4.4.1 Man-Whitney-U-Test Bei dem Man-Whitney-U-Test werden die Werte der beiden Gruppen (empfindlich/ unempfindlich) gegenübergestellt; dann wird durch einen Vergleich der Verteilung der Werte geprüft, ob tatsächlich ein Unterschied zwischen den Gruppen vorlag. 4.4.1.1 Dizentrische Chromosomen Das Ergebnis für dizentrische Chromosomen ist sowohl nach Teilkörperdosis (p=0,019) als auch nach zusätzlicher in-vitro-Bestrahlung der Probe mit 2 Gy (p=0,04) signifikant erhöht, das heißt es zeigen sich bei den empfindlichen Patienten signifikant mehr dizentrische Chromosomen. Abb.23: Vergleich dizentrischer Chromosomen - empfindlich (E) vs. unempfindlich (U) Abb. 23a: nach Teilkörperdosis Abb.23b: nach Teilköroerdosis und invitro-Bestrahlung mit 2 Gy Ergebnisse 58 4.4.1.2 Azentrische Fragmente Das Ergebnis für azentrische Fragmente ist nach Teilkörperdosis signifikant erhöht (p= 0,036). Nach Bestrahlung der Probe in-vitro mit 2 Gy ergab sich keine Signifikanz. Abb. 24: Vergleich azentrischer Fragmente - empfindlich (E) vs. unempfindlich (U) Abb. 24a: nach Teilkörperdosis Abb. 24b: nach Teilkörperdosis und invitro-Bestrahlung mit 2 Gy 4.4.1.3 Translokationen Das Ergebnis für die Translokationen ist weder nach Teilkörperdosis, noch nach zusätzlicher in-vitro-Bestrahlung mit 2 Gy signifikant verändert. Abb. 25: Vergleich der Translokationen - empfindlich (E) vs. unempfindlich (U) Abb. 25a: nach Teilkörperdosis Abb. 25b: nach Teilkörperdosis und invitro-Bestrahlung mit 2 Gy Ergebnisse 59 4.4.1.4 Tetraploidie Tetraploide Chromosomen kamen insgesamt selten vor. In der unbestrahlten Probe fanden sie sich signifikant häufiger bei den empfindlichen Patienten (p=0,039). Nach Bestrahlung der Probe in-vitro mit 2 Gy ergab sich kein signifikanter Unterschied. Abb. 26: Vergleich der Tetraploiden - empfindlich (E) vs. unempfindlich (U) Abb. 26a: nach Teilkörperdosis Abb. 26b: nach Teilköroerdosis und invitro-Bestrahlung mit 2 Gy 4.4.1.5 Summe der Bruchereignisse Werden alle Bruchereignisse summiert (für 200 Zellen) zeigt sich ein deutlich höherer Wert für die empfindlichen im Vergleich zu den unempfindlichen Patienten. Das Ergebnis für die Summe der Bruchereignisse ist somit nach Teilkörperdosis signifikant erhöht (p=0,024). Nach Bestrahlung der Probe in-vitro mit 2 Gy ergaben sich keine signifikanten Unterschiede. Abb. 27: Vergleich der Summe der Bruchereignisse - empfindlich (E) vs. unempfindlich (U) nach Teilkörperdosis Ergebnisse 60 4.4.1.6 Bruchereignisse pro Zelle Das Ergebnis für die Bruchereignisse pro Zelle ist nach Teilkörperdosis signifikant erhöht (p=0,024). Nach Bestrahlung der Probe in-vitro mit 2 Gy ergab sich keine signifikante Änderung. Abb. 28: Vergleich der Bruchereignisse pro Zelle - empfindlich (E) vs. unempfindlich (U) Abb. 28a: nach Teilkörperdosis 4.4.2 Abb. 28b: nach Teilköroerdosis und invitro-Bestrahlung mit 2 Gy Wilcoxon-Test für verbundene Stichproben Bei dem Wilcoxon-Test für verbundene Stichproben werden die Werte als Paar (empfindlich/ unempfindlich) angegeben und der Unterschied innerhalb eines jeden Paares bestimmt. 4.4.2.1 200 Zellen Mit Hilfe dieses Tests ergeben sich signifikante Erhöhungen bei empfindlichen gegenüber unempfindlichen Patienten für dizentrische Chromosomen (p=0,019), für Fragmente (p=0,0056), für Translokationen (p=0,0058), für die Summe der Bruchereignisse (p=0,0065) und die Brüche pro Zelle (p=0,0065) nach Teilkörperdosis. Der Test ist knapp nicht signifikant für die dizentrischen Chromosomen nach Bestrahlung der Probe mit 2 Gy (p=0,051). Die Auswertung der Daten mit dem Wilcoxon-Test ergab keine signifikanten Unterschiede für Translokationen nach Bestrahlung der Probe, tetraploide Chromosomen mit und ohne Bestrahlung, Fragmente nach Bestrahlung der Probe, sowie die Summe der Bruchereignisse und die Rate der Bruchereignisse pro Zelle nach Bestrahlung. Ergebnisse 61 4.4.2.2 50 Zellen Um herauszufinden, ob langfristig auch eine Vereinfachung der Methode möglich wäre, wurde diese Rechnung mit dem Ergebnis der ersten 50 Zellen pro Auszählung in der Chromosomenbruchanalyse wiederholt. Hierbei zeigt sich, dass bereits nach Auszählung von 50 Zellen der Unterschied der Bruchereignisse zwischen Empfindlichen und Unempfindlichen für einige Parameter signifikant ist, und zwar für dizentrische Chromosomen (p=0,042), azentrische Fragmente (p=0,0099) und die Summe aller Bruchereignisse (p=0,011). Die anderen Parameter zeigen keinen signifikanten Unterschied. 4.4.3 Zusammenfassung Bei der Untersuchung des Zusammenhangs von biologischem Parameter und klinischer Beurteilung der Strahlenempfindlichkeit zeigen sich konsistent die Parameter der direkten Chromosomenbruchanalyse in der unbestrahlten Probe als signifikant erhöht. Hierzu zählen dizentrische Chromosomen und azentrische Fragmente, die Summe aller Bruchereignisse und Bruchereignisse pro Zelle. Diese Parameter sind am ehesten geeignet, um im Rahmen prädiktiver Assays eingesetzt zu werden. Es kann postuliert werden, dass die Unterscheidung anhand von dizentrischen Chromosomen möglich ist, auch wenn nur 50 Zellen berücksichtigt werden. Zur Bestimmung des tatsächlichen Vorhersagewertes wird im Folgenden eine logistische Regression der Paramter durchgeführt. 4.5 Logistische Regression der Parameter Das Modell führt als ersten Parameter die dizentrischen Chromosomen ein. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein höherer Wert für Dizentrische mit einer höheren Empfindlichkeit einhergeht liegt bei p=0,0305 und ist damit signifikant. Bei der 1:1 Testung der Einzelwerte gegeneinander sind 67% der Ergebnisse mit dieser Annahme konkordant. Ergebnisse 62 Die Wahrscheinlichkeit für Empfindlichkeit lässt sich ausdrücken als Funktion: ____1___________ 1 + e –(-6304+0,0267 Dic) Keiner der anderen Parameter erfüllte die Einschlusskriterien eines Signifikanzniveaus von 20%. Die aus dieser Berechung hervorgehende ROC Kurve sieht folgendermaßen aus: Abb. 29: ROC-Kurve An der fehlenden Glätte der ROC-Kurve kann man erkennen, dass die Zahl berücksichtigter Patienten insgesamt zu klein ist, um einen gleichförmigen Verlauf der Kurve zu erzielen. 4.6 Zusammenfassung der Ergebnisse Sind Patienten nach klinischer Auffälligkeit prospektiv und nach definierten Kriterien unter Berücksichtigung aller bekannten Einflussfaktoren in Gruppen eingeteilt, so zeigen sich in den nach Teilkörperbestrahlung gewonnenen Lymphozyten signifikant unterschiedliche Werte für das Auftreten dizentrischer Chromosomen, azentrischer Fragmente, für die Summe aller Bruchereignisse und Ergebnisse 63 Brüche pro Zelle sowie für dizentrische Chromosomen nach in-vitro Bestrahlung. In der logistischen Regression ergibt sich ein positiver Vorhersagewert nur für die dizentrischen Chromosomen in dem Sinne, dass bei höheren Werten für Dicentrics mit höherer Wahrscheinlichkeit eine klinische Empfindlichkeit vorliegt. Spezifität und Sensitivität der Vorhersage anhand eines vorliegenden Wertes sind aber noch zu ungenau und liegen bei ungefähr 67%. Somit ist zwar eine Korrelation gegeben, der mit diesem Modell berechnete Vorhersagewert bleibt jedoch gering. Diskussion 64 5 Diskussion Die Strahlentherapie hat neben ihrem eigentlichen Ziel, der Zerstörung von Tumorgewebe, immer auch eine Schädigung des Normalgewebes zur Folge. Das Ausmaß dieser Schädigung ist bei gleicher Bestrahlungsdosis individuell unterschiedlich. Neben verschiedenen äußeren Einflussfaktoren, durch die besonders frühe oder besonders schwere Normalgewebsreaktionen ausgelöst werden (Baumann 1995), besteht ein Zusammenhang zwischen der genetisch determinierten Strahlenempfindlichkeit und dem Ausmaß der Normalgewebsreaktion (Burnet et al. 1992). Mit dieser Arbeit wurde in einer prospektiven Paar-Analyse überprüft, ob das Ausmaß der akuten Normalgewebsreaktionen mit der genetischen Strahlenempfindlichkeit, gemessen an der Anzahl der Chromosomenaberrationen in Lymphozyten des peripheren Blutes, korreliert. Zusammengefasst konnten im Rahmen dieser Arbeit die folgenden Ergebnisse erzielt werden: - Deutliche Unterschiede bezüglich des Ausmaßes akuter Nebenwirkungen zwischen den empfindlichen und unempfindlichen Patienten ergaben sich nur bezogen auf die Haut bzw. Schleimhaut und auf direkt mit dem Ausmaß dieser Reaktionen zusammenhängende Nebenwirkungen wie Allgemeinzustand, Schmerzen und Geschmack. - Eine chemotherapeutische Behandlung und der Allgemeinzustand der Patienten hatten Einfluss auf die Ausprägung der Chromosomenaberrationen. - Die Teilkörperdosis bei Blutentnahme hatte keinen Einfluss auf die Ausprägung der Chromosomenaberrationen. - Ein Zusammenhang Chromosomenaberrationen zwischen der und Ausprägung der Ausprägung der der akuten Nebenwirkungen konnte sowohl in den in-vitro nicht zusätzlich bestrahlten Diskussion 65 Proben als auch in den in-vitro mit 2 Gy bestrahlten Proben festgestellt werden: - Es zeigten sich signifikante Erhöhungen der Werte für dizentrische Chromosomen, azentrische Fragmente, die Summe aller Bruchereignisse und Brüche pro Zelle in der unbestrahlten Probe der empfindlichen Patienten. - In der in-vitro bestrahlten Probe ergaben sich signifikant höhere Werte für dizentrische Chromosomen bei klinisch empfindlichen Patienten. - Unter Berücksichtigung von nur 50 Zellen zeigte sich ebenfalls eine deutliche Signifikanz für dizentrische Chromosomen. - In der logistischen Regression wurde ein positiver Vorhersagewert für die dizentrischen Chromosomen in dem Sinne festgestellt, dass bei höheren Werten für dizentrische Chromosomen mit höherer Wahrscheinlichkeit eine klinische Empfindlichkeit vorliegt. Deutliche Unterschiede bezüglich des Ausmaßes akuter Nebenwirkungen zwischen den empfindlichen und unempfindlichen Patienten ergaben sich nur bezogen auf die Haut bzw. Schleimhaut und auf direkt mit dem Ausmaß dieser Reaktionen zusammenhängende Nebenwirkungen wie Allgemeinzustand, Schmerzen und Geschmack. Die klinische Einteilung der Patienten in empfindlich/ unempfindlich fand anhand dieser Parameter (akute Nebenwirkungen an Haut und Schleimhaut) statt. Als Schlussfolgerung ergibt sich, dass die auf dem Unterschied der Haut- bzw. Schleimhautreaktion beruhende klinische Einteilung wirklich nur für diese Organe gilt und nicht mit einer erhöhten Inzidenz oder Schwere anderer Normalgewebsreaktionen einhergeht. So mussten keine weiteren Parameter für die klinische Einteilung berücksichtigt werden. Für die Ermittlung der akuten Nebenwirkungen wurden in der Literatur unterschiedliche Vorgehensweisen vorgestellt. Das RTOG/ EORTC-Schema von Grad 0 bis 4 für die Bewertung der akuten Nebenwirkungen wurde von Geara et al. verwendet (Geara et al. 1993). In einer anderen Studie wurde die Stärke des Hauterythems am Ende der Strahlentherapie für die Klassifizierung der akuten Diskussion 66 Nebenwirkungen eingesetzt (Johansen et al. 1996). Neubauer et al. verwendeten eine Skala von –1 bis 4, wobei –1/0 einer niedrigen bis durchschnittlichen Reaktion entsprach, 1 einer gegenüber der durchschnittlichen Reaktion leicht erhöhten Reaktion, 2 einer stärker erhöhten Reaktion, 3 einer starken Reaktion und 4 einer extremen Reaktion auf die Strahlentherapie entsprach (Neubauer et al. 1996). Diese Gruppierung wurde anhand der WHO-Klassifikation zur Beschreibung der Nebenwirkungen einer Strahlentherapie ausgerichtet. Rudat et al. und Dunst et al. verwendeten das WHO/ CTC-Einteilungssystem zur Beurteilung der akuten Nebenwirkungen (Rudat et al. 1997, Dunst et al. 1998) . Dies zeigt, dass es verschiedene Ansätze gibt, die akuten Nebenwirkungen zu beurteilen. Um in dieser Studie die Patienten anhand der akuten Nebenwirkungen in „klinisch strahlenempfindlich“ einzustufen, wurde in Anlehnung an die EORTC/ RTOGEinteilungsskalen eine eigene Einteilung entwickelt (Tab.2). Eine chemotherapeutische Behandlung und der Allgemeinzustand der Patienten hatten Einfluss auf die Ausprägung der Chromosomenaberrationen Von den 19 untersuchten klinischen Einflussfaktoren waren die oben genannten die einzigen Faktoren, die die Ausprägung der Chromosomenaberrationen beeinflussten. Zu erwarten war, dass es bei Patienten, die schon eine Chemotherapie abgeschlossen hatten zu mehr chromosomalen Veränderungen kommt. Dies konnte bezüglich der azentrischen Fragmente, der Translokationen, der Summe aller Bruchereignisse und der Bruchereignisse pro Zelle bestätigt werden. Bei der Betrachtung der dizentrischen Chromosomen kam es jedoch zu einem genau gegensätzlichen Ergebnis: Patienten ohne Chemotherapie zeigten signifikat mehr dizentrische Chromosomen als Patienten, die eine Chemotherapie vollendet hatten. Hierfür fand sich keine Erklärung. Da bei der Paar-Zuordnung diese Parameter jedoch berücksichtigt wurden und es bei den insgesamt 30 Paaren bezüglich der Chemotherapie nur in zwei Fällen, bezüglich des Allgemeinzustandes in nur drei Fällen zu einer fehlenden Übereinstimmung kam, wurden die Ergebnisse hierdurch nicht beeinflusst. Bei der Analyse einer Gruppe von Patienten mit M. Hodgkin fanden Kacher et al. mit der konventionellen Chromosomenbruchanalyse eine Häufung gemischter chromosomaler Defekte gegenüber Normalprobanden, die nach Diskussion 67 Chemotherapie und Bestrahlung ansteigt und innerhalb von sechs Monaten nach der Therapie wieder rückläufig ist; einzelne Veränderungen bleiben aber noch jahrelang nachweisbar (Kacher et al. 2003). Die Teilkörperdosis bei Blutentnahme hatte keinen Einfluss auf die Ausprägung der Chromosomenaberrationen. Da es studienorganisatorisch nicht möglich war allen Patienten schon vor Studieneinschluss Blut zu entnehmen und es soweit aufzuarbeiten, dass es zur weiteren Auswertung verwendbar blieb, wurde den Patienten das Blut jeweils zum Zeitpunkt des Auftretens einer klinisch als empfindlich eingestuften Reaktion entnommen. Aus organisatorischen Gründen und nach Neusortierung der Paare waren die jeweiligen Einschlussdosen bei den zugeordneten Partnern nicht immer identisch. Verschiedene Studien in der Vergangenheit zeigten, dass die Strahlentherapie Einfluss auf die Empfindlichkeit der Lymphozyten hat (Vorobtsova 2001). Deshalb war zu Beginn dieser Studie nicht sicher, ob dieses Vorgehen die Studienergebnisse beeinflussen würde. Bei Blutentnahme nach der Strahlentherapie wurden in mit 6 Gy in-vitro bestrahlten Lymphozyten deutlich mehr Chromosomenfragmente gefunden als bei einer Entnahme vor Beginn der Therapie, wobei die unbestrahlten Lymphozyten keinen Unterschied zeigten (Borgmann et al. 2002). Eine ähnliche Beobachtung wurde in einer Studie mit 26 Strahlentherapiepatienten gemacht. Bei Blutentnahme nach Strahlentherapie wurde bei einer in-vitro-Bestrahlung mit 0,7 oder 2 Gy eine deutlich höhere Anzahl an Chromosomenaberrationen gefunden als bei einer Entnahme vor der Therapie (Neubauer et al. 1996). In der vorliegenden Studie ergab sich jedoch, dass die Teilkörperdosis bei Blutentnahme keinen Einfluss auf die Ausprägung der Chromosomenaberrationen hatte (Kap. 4.1.4). Aufgrund der Erhebung an einem kleinen Patientenkollektiv wäre es dennoch empfehlenswert in einem größeren Patientenkollektiv die Blutentnahme vor Beginn der Bestrahlung durchzuführen und die Werte dann erneut mit der klinischen Akut- und Spätreaktion zu vergleichen. Unter Vereinfachung der Methodik könnte sich so ein Ansatz zum echten präradiotherapeutischen Screening entwickeln. Diskussion 68 Ein Zusammenhang zwischen der Ausprägung der Chromosomenaberrationen und der Ausprägung der akuten Nebenwirkungen konnte sowohl in den in-vitro nicht zusätzlich bestrahlten Proben als auch in den in-vitro mit 2 Gy bestrahlten Proben festgestellt werden Die Zahl der Chromosomenaberrationen wurde in nach Teilkörperbestrahlung gewonnenen Lymphozyten und in zusätzlich mit 2 Gy bestrahlten Lymphozyten bestimmt (Abb. 2a+b). Hierfür wurden die zu untersuchenden Lymphozyten nach Stimulation in den Zellzyklus in der Metaphase arretiert und die Zahl der Chromosomenaberrationen lichtmikroskopisch ausgezählt. Der Ansatz, dass eine Zelle als Stellvertreter für alle Endzellen des Organismus aussagekräftig sein soll, wird von manchen Forschern grundsätzlich abgelehnt. Die Frage, ob die Reaktion aller Gewebe eines Individuums durch die Reaktion eines nicht näher definierten Lymphozyten vorhersagbar ist, kann auch nicht durch ein einzelnes Experiment entkräftet werden. Allerdings spricht die Zahl der positiven Experimente insgesamt dafür, dass der Lymphozyt des peripheren Blutes eine gewisse Disposition des Organismus zur Reaktion auf Bestrahlung widerspiegelt (z.B. Jones et al. 1995). Insbesondere zeigen sich Lymphozyten besser geeignet als Fibroblasten (Borgmann et al. 2002, Almodovar 2002), was das Vorgehen in dieser Studie bestätigte. Insgesamt ergaben sich in dieser Arbeit signifikant höhere Werte für dizentrische Chromosomen, azentrische Fragmente, die Summe aller Bruchereignisse und Brüche pro Zelle in den unbestrahlten Proben der klinisch empfindlichen Patienten. In den in-vitro-bestrahlten Proben konnte dies nur für die dizentrischen Chromosomen nachgewiesen werden. Für Translokationen ergaben sich in dieser Arbeit keine signifikanten Ergebnisse. Es ist jedoch nicht auszuschließen, dass dies mit der hier verwendeten Färbetechnik ohne Bänderung zusammenhängt, da Translokationen in dieser Färbung weniger häufig auffallen. Um die Methodik für eine anschließende Studie zu vereinfachen, wurde die Auswertung unter Berücksichtigung von nur 50 Zellen wiederhohlt. Hier zeigte sich ebenfalls eine deutliche Signifikanz für dizentrische Chromosomen. In der logistischen Regression wurde ebenfalls ein positiver Vorhersagewert für die dizentrischen Chromosomen festgestellt. Bei höheren Werten für dizentrische Chromosomen liegt mit höherer Wahrscheinlichkeit eine klinische Empfindlichkeit Diskussion 69 vor. Dabei geht eine Sensitivität von 70% mit einer Spezifität von ebenfalls ca. 70% einher. Eine Korrelation ist somit gegeben, der mit diesem Modell berechnete Vorhersagewert bleibt jedoch gering. Auch Gershkevitz et al. fanden, dass die Rate dizentrischer Chromosomen in peripheren Lymphozyten des Frischblutes deutlich niedriger ist als nach Teilkörperbestrahlung, wobei der Wert von Dosis und Bestrahlungsvolumen beeinflusst wird. Es wurde eine Korrelation von bestrahltem Knochenmark und Zahl der dizentrischen Chromosomen aufgezeigt, eine Korrelation zur Normalgewebsreaktion fand sich hier nicht (Gershkevitz et al. 2002). Eine andere Arbeitsgruppe betrachtete als Indikator der individuellen Strahlenempfindlichkeit die Anzahl der zusätzlichen, azentrischen Fragmente. Unter der Annahme, dass ein dizentrisches Chromosom immer zusammen mit einem azentrischen Fragment auftritt, wurde aus der Differenz der beiden Messgrößen die Zahl der zusätzlichen azentrischen Fragmente berechnet. Hier fand sich, dass die Anzahl der zusätzlichen azentrischen Fragmente mit dem Grad der Spätreaktion nach Strahlentherapie korrelierte (Borgmann et al. 2002). Viele neuere Arbeiten befassen sich mit der genetischen Analyse mittels Microarray, die simultan eine Vielzahl von Genen und Gendefekten aufzeigen kann. In der Arbeitsgruppe von Andreassen et al. wurden sieben single nucleotice polymorphisms (SNP’s) auf Kandidatengenen untersucht; zwischen diesen Mutationen und der klinischen Strahlenreaktion (Fibrose) findet sich eine gute Korrelation (Andreassen et al. 2002). Sprung et al. untersuchten das Vorkommen von Micronuclei in Zelllinien (Fibroblasten und Lymphoblasten) von klinisch strahlenempfindlichen Patienten und fanden ein signifikant höheres Vorkommen von Micronuclei als bei Patienten mit normalen Reaktionen im Rahmen der Strahlentherapie (Sprung et al. 2005). Es wird deutlich, dass zur Zeit viele verschiedene Ansätze untersucht werden, um eine genetische Prädisposition bei klinisch strahlenempfindlichen Patienten zu identifizieren und gleichzeitig einen prädiktiven Test zu entwickeln. Das Editorial von Russel und Begg zeigt in der Zeitschrift Radiotherapy Oncology sehr systematisch die verschiedenen methodischen Probleme der prädiktiven Tests auf (Russel und Begg 2002). Neben den labortechnischen Aspekten (Temperatur, Substanzen, Konstanz der Protokolle über die Zeit) werden vor allem die klinischen Diskussion Probleme 70 (scoring, Einflussfaktoren, Strahlentherapie, Einheitlichkeit von Maßnahmen der Prophylaxe und Therapie der Nebenwirkungen) ausführlich beleuchtet. In einem Zwischenabsatz zur klinischen Seite wird formuliert, wie ein optimales Projekt zu prädiktiven Tests klinischerseits zu führen sei; in dieser Studie werden diese Parameter alle adäquat berücksichtigt. Die hier vorgelegten Daten tragen dazu bei, die Bedeutung der biologischen Strahlenempfindlichkeit für das Ausmaß der akuten Normalgewebsreaktionen zu bekräftigen. Sie helfen, dem Ziel näher zu kommen, einen prädiktiven Test zu entwickeln, mit dem die klinische Strahlenempfindlichkeit vorhergesagt werden kann. Zusammenfasung 71 6 Zusammenfasung Bei einer Strahlentherapie kommt es neben der Zerstörung von Tumorgewebe bei 15% der Patienten zu erheblichen langfristigen Normalgewebsveränderungen. Ein wichtiges Ziel in der onkologischen Strahlentherapie ist daher, die Strahlenempfindlichkeit von Patienten unter der Annahme einer genetischen Disposition prädiktiv zu erfassen, um eine Individualisierung von Behandlungskonzepten zu ermöglichen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde mittels einer Paar-Analyse der Zusammenhang zwischen der individuellen klinischen Strahlenempfindlichkeit und genetischer Korrelate untersucht. Das Ausmaß der akuten Normalgewebsreaktion definierte hierbei die klinische Strahlenempfindlichkeit, die Anzahl der Chromosomenaberrationen in Lymphozyten des peripheren Blutes die genetische Korrelation. Die Studie umfasste 30 Patientenpaare. Diese setzten sich jeweils aus Patienten mit auffälliger Strahlenreaktion und solchen ohne Auffälligkeiten zusammen. Die zugeordneten Patienten waren jeweils bezüglich des Tumors, der Therapie und der Kofaktoren vergleichbar. Die klinische Einteilung erfolgte mittels der EORTC/ RTOG Klassifikation. Um die genetisch bedingte Strahlenempfindlichkeit zu bestimmen, wurde den Patienten jeweils zum Zeitpunkt des Auftretens einer klinisch als empfindlich eingestuften Akutreaktion (nach Teilkörperdosis) eine Blutprobe entnommen. Mittels der konventionellen Metaphasen-Technik wurde die Zahl von Chromosomenaberrationen bestimmt, sowohl mit als auch ohne zusätzliche in-vitroBestrahlung mit 2 Gy. Für die Zahl der spontanen, sowie der strahleninduzierten Chromosomenaberrationen fand sich keine Abhängigkeit von der Teilkörperdosis oder klinischen Faktoren, die bei der Zuordnung nicht berücksichtigt wurden. Es zeigten sich signifikant unterschiedliche Werte für das Auftreten dizentrischer Chromosomen, azentrischer Fragmente, für die Summe der Gesamt-Bruchereignisse und die Brüche pro Zelle sowie für dizentrische Chromosomen nach in-vitroBestrahlung. Dieser Unterschied findet sich bereits bei der Auszählung der ersten 50 Zellen. In der logistischen Regression blieb nur die Rate dizentrischer Chromosomen signifikant. Dabei ging eine Sensitivität von 70% mit einer Spezifität von ebenfalls Zusammenfasung 72 ca. 70% einher. Somit war zwar eine eindeutige Korrelation gegeben, der mit diesem Modell berechnete Vorhersagewert ist jedoch als gering einzustufen. Um einen Ansatz zum echten präradiotherapeutischen Screening zu entwickeln, müssen die Ergebnisse an einem größeren Patientenkollektiv und unter Vereinfachung der Methodik überprüft werden. Literatur 73 7 Literatur 1. Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson JD (1995) Molecular biology of the cell. Garland Publishing, Inc. 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Ich bedanke mich bei allen Mitarbeitern der Abteilung für Strahlentherapie der Universitätsklinik Münster, insbesondere bei Frau Dr. Dorothea Riesenbeck, die das Projekt ins Leben gerufen hat und die auch nach Abschluss des Projektes und dem Antritt einer neuen Arbeitsstelle stets ein offenes Ohr für mich hatte. Meiner Mutter, Marianne Saß und Mahvash Dorenkamp danke ich für die Einführung in die Laborarbeit und die stetige Hilfe bei der mikroskopischen Auswertung. Ein grosses Dankeschön an Caren Liebscher, die die Statistik durchführte. Julia und Jürgen, Euch ein Riesendank für all die Tipps und Tricks, die mir halfen, mit dem Computer fertig zu werden. Astrid: Danke für das Korrekturlesen dieser Doktorarbeit und manch hilfreichen Tipp. Danke an alle, die an den Abschluss dieser Arbeit geglaubt haben und mich diesbezüglich immer wieder ermunterten und motivierten! Konrad, Dir danke ich für Deine Geduld und Fürsorge, wann immer ich ein kleiner Griesgram war... Mama und Papa: Danke für alles, Ihr seid die Besten! Danksagung 80
