Induktion und Reparatur Strahlen-induzierter DNA
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Aus der Abteilung Toxikologie und Krebsrisikofaktoren am Deutschen Krebsforschungszentrum Heidelberg (DKFZ) (Direktor: Prof. Dr. rer. nat. H. Bartsch) Induktion und Reparatur Strahlen-induzierter DNA-Schäden in Lymphozyten von Brustkrebspatientinnen: Korrelation mit akuten Hautreaktionen nach Radiotherapie INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Brsg. Vorgelegt 2004 von Reinhard Frank Wilhelm Ebbeler geboren in Osnabrück Dekan Prof. Dr. med. Josef Zentner 1. Gutachter Prof. Dr. rer. nat. Helmut Bartsch 2. Gutachter Prof. Dr. med. Dr. h.c. Hermann Frommhold Jahr der Promotion 2004 I | Widmung iii Meiner Mutter, R eg i na Ebbel er , geb. K es tenu s , und meinem Vater, R e i n h o l d E b b e l e r II | Zitate iv Ein guter Mann bleibt immer Anfänger (Bonus vir semper tiro) MARTIAL, EPIGR. 12, 51 Der Mensch muß das Gute und Große wollen, das Übrige hängt vom Schicksal ab. ALEXANDER FREIHERR VON HUMBOLDT III | Danksagung III. v DANKSAGUNG Bei Herrn P r of . Dr . r er . nat. Hel mu t B ar t s ch möchte ich mich für die hervorragende Unterstützung und die Möglichkeit bedanken, daß ich in seiner Abteilung für Toxikologie und Krebsrisikofaktoren am Deutschen Krebsforschungszentrum in Heidelberg diese Arbeit durchführen konnte. Herrn P r o f . D r . m ed . D r . h . c . H e r m a n n F r o m m h o l d , Ärztlicher Direktor der Abteilung Strahlentherapie in der Radiologischen Universitätsklinik der Albert-LudwigsUniversität Freiburg i. Brsg., danke ich für die Übernahmen des zweiten Referats. Besonders herzlich danke ich Frau P D . D r . r e r . nat . O d i l i a P o p a n d a für ihre immerwährende Unterstützung und ihr besonderes Engagement, sowohl in der experimentellen Phase als auch bei der Niederschrift dieser Arbeit. Dieses wurde durch die räumliche Entfernung in dieser Phase der Arbeit noch verkompliziert. Daher mein ganz besonderer Dank an sie. Ein herzlicher Dank geht auch an Herrn Dr. rer. nat. Peter Schmezer , der mir bei Fragen immer tatkräftig zur Seite stand. Ebenfalls bedanken möchte ich mich bei Frau P D. Dr . J enny Chang - Cl au de als Projektleiterin. Eine Danksagung auch an Frau Dr . P . H. Dorothee T wa r del l a und Frau I r mg ar d Hel mbol d von der Abteilung Genetische Epidemiologie des DKFZ für die Bearbeitung und Bereitstellung der epidemiologischen Daten. Besonders herzlich danken möchte ich Herrn R ei nhar d Gl i ni or z sowie Herrn Otto Zel e zny und in ganz besonderer Weise Herrn P ete r Waas , die mir jederzeit während der Versuchsdurchführungen im Labor – und bei Fragen auch später – zur Seite gestanden haben. Schließlich möchte ich Ri ta M ar ti na Wi l ma Ebbel er , T i na K r amer , And r ea Roos , Daniel Do ischer, Matthias Kö hnlein und Timo Schnitt für ihre Unterstützung bei der Niederschrift dieser Arbeit danken. Sie alle haben mir bei Fragen zur Datenverarbeitung und beim Korrekturlesen sehr geholfen. Darüberhinaus gebührt Dank auch all den Patienten für ihre Zustimmung zur Teilnahme an dieser Versuchsreihe und an das Personal in den beteiligten Kliniken für ihre Arbeit im Rahmen dieser Studie. In diesem Zusammenhang möchte ich mich auch bei den klinischen Partnern III | Danksagung vi bedanken: Der A b t e i l u n g f ü r g y n ä k o l o g i s c h e R a d i o l o g i e der Heidelberger Universitätsklinik; der K l i n i k f ü r R a d i o t h e r a p i e u n d R a d i o o n k o l o g i e der St. Vincentius-Klinik in Karlsruhe; der K l i n i k f ü r R a d i o t h e r a p i e , Städtisches Klinikum Karlsruhe gGmbH, und der A b t e i l u n g f ü r R a d i o o n k o l o g i e im Institut für klinische Radiologie des Universitätsklinikums Mannheim. Schließlich geht noch mein Dank an das Bundesamt für Strahlenschutz in Salzgitter, das diese Arbeit unterstützt hat (Projektnummern ST. Sch. 4116 und 4233). IV | Inhaltsverzeichnis IV. vii INHALTSVERZEICHNIS TITELBLATT ........................................ i .................................... ii I. WIDMUNG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . iii II. ZITATE iv III. DANKSAGUNG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v - vi IV. INHALTSVERZEICHNIS vii - x 1. ZUSAMMENFASSUNG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2. EINLEITUNG ZWEITE SEITE .............................................. ........................... ...................................... 1 2 - 12 2.1 Induktion von DNA-Schäden durch γ-Strahlen ....................... 3 2.1.1 Reparaturmechanismen von Strahlen-induzierten DNA-Schäden . . . . . . . . . . 4 2.2 Epidemiologie des Brustkrebses .......................................... 5 2.3 Brustkrebstherapie ............................................................ 6 2.4 Vorhersehbarkeit der klinische Wirkung einer Strahlentherapie ... 7 2.5 Eignung des Komet-Assay für die Messung von DNA-Schäden ... 9 2.6 Bestimmung der DNA-Reparaturkapazität als Marker für klinische Strahlenempfindlichkeit ........................................ 12 2.S 2.S 3. Abbildung 2.2 Abbildung 2.3 SKIZZE ZUR SCHÄDIGUNGSMÖGLICHKEIT FÜR .............. DAS MENSCHLICHE ERBGUT 13 SKIZZE ZUR SCHADENSETZUNG 14 MATERIAL UND METHODEN .............. .................... 15 - 31 IV | Inhaltsverzeichnis viii 3.1 MATERIALIEN .................................................................... 3.1.1 Lösungen und Reagenzien 3.1.1.1 15 ................................................... 15 Zellkulturmedien .............................................................. 15 3.1.1.2 Lösungen/Puffer .............................................................. 15 3.1.2 Chemikalien .................................................................... 16 3.1.3 Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 18 3.1.4 Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 3.2 METHODEN 22 3.2.1 Das Kollektiv der zu untersuchenden Patientinnen 3.2.2 Dosis-Wirkungs-Kurve 3.2.3 Isolierung von Lymphozyten vor Versuchsbeginn 3.2.4 Bestimmung der DNA-Reparaturkapazität 3.2.5 Kultivierung und Bestrahlung der Lymphozyten 3.2.6 Einstellen der Zellkonzentration für den Komet-Assay 3.2.7 Bestrahlen der Zellen 3.2.8 Inkubation und Aufbringen auf die Objektträger 3.2.9 Lyse und Elektrophorese 3.2.10 Auswertung im Fluoreszenzmikroskop und Dokumentation 3.2.11 Standardisierung der Technik 3.S1 Abbildung 3.1 – Graphiken A bis F SKIZZE ZUM VERSUCHSAUFBAU Abbildung 3.2 SKIZZE 3.S2 ...................................................................... .................. 22 ....................................................... 23 ...................... 24 ............................. 24 ...................... 25 .............. 26 ......................................................... 26 ...................... 26 ................................................... 28 ....... 29 .............................................. 31 ................ 32 - 34 ZUR DARSTELLUNG DES ABLAUFS DER EPIDEMIOLOGISCHEN DATENER-HEBUNG .......... 35 4. 4.1 4.2 ERGEBNISSE ........................................ Optimierung der Einzelzell-Mikrogelelektrophorese (Komet- Assay) für die Bestimmung der Reparatur von durch γ-Strahlen- induzierten DNASchäden/Technische Verbesserungen des Versuchs ..................................... Bestimmung einer optimalen Dosis für die Charakterisierung der Reparaturkapazität in Lymphozyten .................................... 36 - 59 36 37 IV | Inhaltsverzeichnis ix 4.3 Definition der DNA-Reparaturkapazität 4.4 Einführung einer Referenzprobe 4.5 Beschreibung der untersuchten Patientinnen ......................... 44 4.5.1 Das Patientinnenkollektiv/Aufschlüsselung der Auswertung der Patientinnenproben ........................................................... 44 4.5.2 Klinische Merkmale der Patientinnen 45 4.6 Ausschluß von Proben aufgrund von experimentellen Parametern 48 4.7 Vergleich mit der Referenzprobe .......................................... 49 4.8 Induktion eines DNA-Schadens und Feststellung der DNAReparaturkapazität in γ-bestrahlten Lymphozyten von Brustkrebspatientinnen .................................................................... 49 Vergleich der DNA-Reparaturkapazität mit der klinisch ermittelten Strahlenempfindlichkeit in Form von Hautreaktionen 54 4.9 5. ................................. 40 .......................................... 41 ................................... DISKUSSION ........................................ 60 - 72 5.1 Grundlagen der vorliegenden Arbeit ........................................ 60 5.2 Bestimmung von Strahlensensitivität durch Messung der DNAReparatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 Einsatz des alkalischen Komet-Assay für die Identifizierung von Patienten mit verstärkter in vitro-Radiosensitivität .................... 64 5.3 5.4 Korrelation der in vitro-bestimmten Strahlenempfindlichkeit mit den klinischen Daten 69 5.5 Weitere Faktoren, welche die individuelle Strahlensensitivität beeinflussen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 6. AUSBLICK .......................................... 73 - 74 7. LITERATUR ........................................ 75 - 90 V. TABELLENANHANG ............................. xi - xix V.1 Tabelle der Patientenproben in numerischer Reihenfolge ........... xi V.2 Tabelle der Referenzproben in numerischer Reihenfolge ........... xviii IV | Inhaltsverzeichnis x VI. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .................... VII. VERÖFFENTLICHUNGEN AUS DER ARBEIT VIII. LEBENSLAUF IX. SELBSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG ... ...................................... .............. xx - xxi xxii xxiii - xxv xxvi II. Kapitel 1 | Zusammenfassung 1. 1 ZUSAMMENFASSUNG Zielsetzung: Die Reparatur von Strahlen-induzierten DNA-Schäden ist ein wichtiger Faktor für die Empfänglichkeit eines Patienten, ungewünschte Nebeneffekte bei der Strahlentherapie zu entwickeln, und für seine Neigung, später weitere Tumoren auszubilden. Mit dem Komet-Assay sollte ermittelt werden, ob eine Korrelation besteht zwischen den in vitro gemessenen Daten der Strahlenempfindlichkeit von Zellen und den klinischen Nebenwirkungen der Strahlentherapie von Brustkrebspatientinnen. Material/Methoden: Eine Gruppe von Brustkrebspatientinnen, die nach brusterhaltendender Operation eine therapeutische Strahlenbehandlung erhalten haben, wurde in einer prospektiven epidemiologischen Studie zusammengefaßt. Als Anzeichen einer klinischen Radiosensitivität galt das Auftreten von ungewünschten Nebenreaktionen der Haut im Bestrahlungsfeld. Kryokonservierte, periphere Lymphozyten von 113 Patientinnen dieser Studie wurden mit γ-Strahlen (je 5 Gy) bestrahlt und mit dem alkalischen Komet-Assay untersucht. Um die Wiederholbarkeit dieses Versuchs zu testen, lief in 26 Versuchsdurchgängen jeweils die Probe eines gesunden Lymphozytenspenders mit. Daraus wurde ein Variationskoeffizient von 0,3 errechnet. Ergebnisse: Zur Charakterisierung der experimentell ermittelten Strahlenempfindlichkeit wurde die Schädigung nach Bestrahlung und die Reparaturkapazität nach 15 und 30 min sowie zwischen 15 und 30 min herangezogen. Diese Parameter schwankten bei den Patientinnen mehr als bei den Kontrollpersonen. Bei 11 Patientinnen konnte eine deutlich gesteigerte DNA-Schädigung nach Bestrahlung der Zellen festgestellt werden, bei jeweils sieben Patientinnen eine deutlich reduzierte DNA-Reparaturfähigkeit nach 15 und nach 30 min. Im klinischen Vergleich zeigten sich sechs Patienten als radiosensitiv, indem sie (nach einer Gesamtdosis von 50 Gy) eine feuchte Desquamation der Haut im Bestrahlungsfeld aufwiesen. Der Vergleich der beiden Gruppen von empfindlichen Patientinnen (i n v i v o / i n v i t r o ) zeigte nur eine geringe Übereinstimmung. Schlußfolgerungen: Durch Verwendung des alkalischen Komet-Assays, wie hier beschrieben, zeigte sich, daß Brustkrebspatientinnen identifiziert werden konnten, die abnormale zelluläre Effekte nach Bestrahlung aufwiesen. Diese Reparaturdefizite korrelierten allerdings nur zu einem sehr geringen Ausmaß mit der Ausbildung einer akuten klinischen Strahlensensitivität im Bestrahlungsfeld der Haut. Da verminderte DNA-Reparaturkapazität bei der Ausbildung von späten Bestrahlungseffekten eine Rolle spielen kann, sollte für weitere Korrelationen das Auftreten von Spätschäden im weiteren Verlauf der Studie erfaßt werden. Kapitel 2 | Einleitung 2. 2 EINLEITUNG Die Stabilität des menschlichen Genoms ist lebenslang vielfach durch äußere und innere Faktoren bedroht [aus: Hoeijmakers, 2001; vgl. auch Ames, 1983; Guyton et Kensler, 1993; Martin et al . , 1997; Gatti, 1998; Colleu-Durel et al . , 2001, u.a..; s.a. Abbildung 2.2 auf der Seite 13 – „Schadensmöglichkeit an DNA-Strukturen“]: - Chemikalien und Strahlenbelastung aus der Umwelt (UV-Strahlen der Sonne, ionisierende Strahlung, chemisch-toxische Stoffe etc.). - Zwischenprodukte des normalen Zellmetabolismus (Superoxid-Anionen, Hydroxylradikale, Hydrogenperoxide etc.). - Spontaner Zerfall bestimmter DNA-Strukturen unter physiologischen Bedingungen (Deaminisierung von Adenin, Cytosin, Guanin). Alle diese Faktoren können Schäden in der DNA auslösen, die zum Zelltod, aber auch zu Mutationen und letztendlich zur malignen Entartung von Zellen führen können. Um dies zu verhindern, hat die Zelle Reparaturmechanismen entwickelt, die sehr spezifisch für die einzelnen Schadensarten sind [De Laat et al . , 1999; Mol et al. , 1999; De Boer et Hoeijmakers, 2000; Zhou et al. , 2000; Hoeijmakers, 2001]. Gerade die Wirkung einer Strahlentherapie, deren klinische Nebenwirkungen sowie ihre auslösenden Faktoren Gegenstand dieser Arbeit sind, beruht darauf, daß die DNA in den Tumorzellen – aber auch in den Normalzellen – geschädigt wird. Es ist daher anzunehmen, daß das Reparaturvermögen von Normalzellen ein wichtiger Faktor für die Verträglichkeit einer Strahlentherapie sein kann. In dieser Arbeit wurde die zelluläre Reparaturfähigkeit nach γ-Bestrahlung ermittelt und geprüft, ob sich aufgrund dieser Reparaturfähigkeit die klinischen Nebenwirkungen eines Patienten auf die Strahlentherapie vorhersagen lassen. Kapitel 2 | Einleitung 2.1 3 Induktion von DNA-Schäden durch γ-Strahlen Nach γ-Bestrahlung von Zellen beobachtet man in der Hauptsache Einzel- und Doppelstrangbrüche sowie zahlreiche oxidative DNA-Schäden. Diese entstehen aufgrund von OH-Radikalen, die während der Bestrahlung gebildet werden. Diese Schäden werden durch verschiedene DNAReparaturmechanismen beseitigt [Thacker, 1986]. Darüber hinaus verlieren einzelne Zellen die Fähigkeit zur Zellteilung: Sie gehen zugrunde. Dies ist der häufigste Effekt radioaktiver Strahlung (deterministischer Schaden ) und ist bei der Strahlentherapie von Tumoren erwünscht [Dewey et al., 1995; Yarnold, 1997]. Überleben die Zellen trotz veränderter, nicht reparierter Erbinformation, teilen sie sich weiter, und die veränderte Erbinformation wird so auf die Tochterzellen weitergegeben. Dadurch kommt es zur Mutation oder gar zu Transformation der betroffenen Zelle. Bei Schäden in bestimmten Genbereichen, die zu Mutationen in Tumorsuppressorgenen und Proto-Onkogenen führen, können die Zellen weiterleben und sich teilen, so daß Tumore entstehen [Rosen et al., 1999]. Auf diese Weise kann eine der am meisten gefürchteten Spätfolgen einer Therapie entstehen, nämlich ein Sekundärkarzinom. Durch die Zerstörung der DNA – und mangelhafte Reparaturmöglichkeiten, s.u. – kann es zu den malignen Zweiterkrankungen oder sonstigen Leiden kommen, da dadurch das Genom in sich instabil wird [Jasin, 2000]. In der Klinik findet man schädliche Folgen einer Strahlentherapie als Nebenwirkungen im gesunden Gewebe. Man unterscheidet zwischen akuten Schäden und Spätschäden einer Therapie: Bei der Brustbestrahlung treten akute Frühschäden bis zu 90 Tagen nach Therapiebeginn auf [Perez et Brady, 1993 a]: Erytheme im Bestrahlungsfeld, leichte bis mittelstarke Ödeme, eine sich entwickelnde reduzierte Schweißsekretion sowie feuchte Desquamationen, Ulzerationen, Haemorrhagien und Nekrosen. Im Gesamtorganismus kann es darüber hinaus zu Übelkeit, Erbrechen, Mukositis und Dermatitis kommen. Demgegenüber können Spätschäden noch mehr als 5 Jahre nach Therapiebeginn auftreten [Perez et Brady, 1993 b]. Im Falle einer Brustbestrahlung versteht man unter Spätschäden vor allem die Entwicklung von schweren Hautveränderungen wie Fibrosierungen und Teleangiektasien. In weiteren bestrahlten Gebieten handelt es sich um das Auftreten von Pneumonitis und radiogener Lungenfibrose, Perikarditis oder auch das Auftreten von Augenlinsentrübung, Sterilität, das Lhermitte - Syndrom oder teratogene Schäden (bei Bestrahlungen in utero ). Darüber hinaus Kapitel 2 | Einleitung 4 treten Zweitneoplasien auf, die sich häufig erst Jahre nach Abschluß der Strahlentherapie entwickeln. 2.1.1 Reparaturmechanismen von Strahlen-induzierten DNA-Schäden Angesichts der vielfältigen Anzahl von Schäden existieren mehrere Reparatursysteme, die sich auf jeweils einzelne, spezifische Schadensvorfälle spezialisiert haben (eine Übersicht über die verschiedenen Schädigungsarten, der gesetzten Schäden und deren Reparaturmöglichkeiten ist in Abbildung 2.3 auf der Seite 14 dargestellt): Die Nukleotid-Exzisions-Reparatur (NER) repariert Helix-Distorsions-Schäden, welche die Basenpaarung stören und die Transkription und Replikation beeinträchtigen. Allerdings spielt dieser Mechanismus bei der Reparatur von γ-induzierten Schäden nur eine geringe Rolle, er wird häufiger gefunden bei UV-induzierten DNA-Schäden. Wenn das Reparatursystem der NukleotidExzisions-Reparatur aufgrund eines Gendefekts nicht funktioniert, können Erkrankungen entstehen: Z.B. Xeroderma pigmentosum , das Cockayne- Syndrom und die Trychothio- dystrophie . Die Basen-Exzisions-Reparatur (BER) stellt den Ausgangszustand bei Veränderungen von Basen – durch oxidative Schäden – und bei Einzelstrangbrüchen, wie sie bei γ-Strahlung entstehen, wieder her. Die Veränderung der Basen ist gering, so daß die Transkription und Replikation bei diesen Schäden nicht unbedingt beeinträchtigt sein müssen, es kommt aber häufig zu Miskodierungen bei der Weitergabe der DNA-Information an die Tochterzelle. Es wurden bisher keine menschlichen Erkrankungen bei BER-Insuffizienz festgestellt [Hoeijmakers, 2001]. Bei Doppelstrangbrüchen (DS) ist die Reparatur schwieriger, weil der entsprechende komplementäre DNA-Strang ebenfalls zerstört ist (und falsch reparierte DS-Brüche bilden einen Risikofaktor für verstärkte zelluläre Strahlenempfindlichkeit [Powell et al., 1998]). Zwei Reparatursysteme haben sich herausgebildet: Die homologe Rekombination (HR) und das End- Joining (EJ), die in verschiedenen Zellzyklusphasen zum Einsatz kommen [Shiloh, 2001]). Kapitel 2 | Einleitung 5 Das End-Joining kann jedoch fehleranfällig sein, so daß es zu unpassender Rekombination der DNA-Stränge kommt. Bei etwaigen Defekten in der Reparatur von Doppelstrangbrüchen können Krankheiten entstehen, die eine Krebsdisposition darstellen oder Immundefekte, Übersensitivität gegenüber Röntgenstrahlen oder chromosomale Instabilitäten beinhalten: Z.B. die Ataxi a teleangiectasia selbst, eine Ataxia-teleangiectasia- Variante oder das NijmegenBreakage-Syndrom . Es kann bei Vorliegen der o.a. Gendefekte zu extremen Nebenwirkungen der Strahlentherapie kommen mit der Gefahr einer malignen Zweiterkrankung [Gatti, 2001]. 2.2 Epidemiologie des Brustkrebses Am Mamma-Karzinom (eine maligne Entartung von Drüsenepithelien der Brust) erkrankt in westlichen Ländern durchschnittlich jede 8.- 10. Frau, das entspricht rund 23 % aller malignen Erkrankungen der Frau [Possinger et Grosse, 2000]. Der Erkrankungsgipfel liegt zwischen dem 45. und 65. Lebensjahr. In der Bundesrepublik Deutschland lag die Zahl der Krebsfälle zwischen 1986 und 1990 bei 86 203, davon 12 235 im Osten und 73 968 im Westen Deutschlands [Becker et Wahrendorf, 1998]. Neben Lungenkrebs ist das Mamma-Karzinom somit die am häufigsten auftretende Krebsart in der westlichen Welt, an der die Patientinnen versterben [Abraham et Allegra, 2001]; besonders bei Frauen zwischen dem 35. und 45. Lebensjahr ist es die häufigste Todesursache. Bei Männern ist diese Krebsart sehr viel seltener: Es besteht ein Verhältnis von weniger als 1 zu 100 000 Männern; im Jahre 2000 wurden in den gesamten USA z.B. lediglich 1 400 Fälle von Brustkrebs bei Männern diagnostiziert [Abraham et Allegra, 2001]. Das Auftreten des Mamma-Karzinoms erhöht sich mit dem Alter, die Rate des Inzidenz-Anstiegs verlangsamt sich jedoch nach der Menopause. Seit 1994 konnte eine ein- bis zweiprozentige Verringerung der Inzidenz in einigen Ländern der westlichen Welt (USA, Kanada, Schweden, GB) festgestellt werden, was hauptsächlich auf das Screening der Frauen mit Hilfe der Mammographie zurückgeführt wird [Abraham et Allegra, 2001]. Bei Patientinnen über 50 Jahren konnte sogar ein Abfall der Mortalität von 25 - 50 % erreicht werden, in den USA nahm die Gesamt-Mortalität von 1991 bis 1995 um 5,3 % ab [Hoeksema et Law, 1996]. Kapitel 2 | Einleitung 2.3 6 Brustkrebstherapie Gegenwärtig wird das Mamma-Karzinom auf drei verschiedene Arten therapiert: Entweder durch Operationen, durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder durch Chemotherapie. Hierzu kommt auch eine Hormontherapie in Frage. Alle diese Methoden können auch abgestuft miteinander kombiniert werden. Die wichtigste Therapie im Rahmen der Brustkrebserkrankung ist die Operation. In der PrimärOperation erfolgt die Sichtung der Ausbreitung des Tumors und die Feststellung, ob Lymphknoten mitbetroffen („ i n v as i v “ ) sind oder nicht. Das Ausmaß des Befalls der Lymphknoten ist ein wichtiger Hinweis für die Ausbreitung des Tumors. Bei allen Operationen wird heute versucht, möglichst brusterhaltend vorzugehen. Auch der Hormonrezeptorstatus der Primärtumorzellen wird untersucht, damit man die Empfänglichkeit der Zellen gegenüber einer möglichen Hormontherapie bewerten kann. Das weitere therapeutische Vorgehen kann aus einer - Chemotherapie (z.B. C y c l o p h o s p h a m i d , M e th o t r ex a t , F l u or ur a c i l ) oder einer - Antiöstrogentherapie (z.B. mit T a m o x i f en oder Aromatasehemmern wie z.B. L e t r o z o l ) oder einer - Strahlentherapie bestehen. Bei einer adjuvanten Strahlentherapie wird nach der Tumorexstirpation das verbliebene Brustgewebe bestrahlt, um ein intramammäres Rezidiv zu vermeiden. Man bestrahlt das Zielgebiet der Brust dabei mit einer Dosis von bis zu 60 Gy, mittels Fraktionen von 2 Gy an fünf Tagen pro Woche. Darüber hinaus versieht man das Gebiet der Tumorexstirpation nach der Grundbestrahlung zusätzlich mit einer sog. B o os t - Bestrahlung, deren Dosis sich im Bereich von 10 Gy bewegt. Damit versucht man in dieser Region, in der am häufigsten Karzinom-Rezidive auftreten, die Bildung von Rückfällen zu verhindern. Wenn Brustkrebs früh erkannt wird, ist er mittels chirurgischer Maßnahmen, Bestrahlung und/oder Chemotherapie hochgradig heilbar, da zu diesem frühen Zeitpunkt bei 90 % der Frau- Kapitel 2 | Einleitung 7 en noch keine Metastasen aufgetreten sind [Abraham et Allegra, 2001]. Die gesamte 5-JahresÜberlebenszeit liegt bei 75 % [Pfleiderer et al . , 2000], wobei es aber individuell sehr unterschiedliche Prognosen geben kann. 2.4 Vorhersehbarkeit der klinische Wirkung einer Strahlentherapie Unser Ziel war es, einen Test zu entwickeln, mit dem sich im Vorfeld einer Strahlentherapie klinische Zeichen von Strahlenempfindlichkeit, besonders Hautschäden im Bestrahlungsfeld, vorhersagen lassen. Da eine Strahlentherapie das Genom schädigt, ist anzunehmen, daß das Reparaturvermögen der Zellen ein wichtiger Faktor für die Verträglichkeit einer Strahlentherapie sein kann. Daher sollte das Reparaturvermögen nach γ-Bestrahlung in peripheren Lymphozyten von Patienten bestimmt werden, die sich einer therapeutischen Strahlenbelastung unterziehen mußten. Dieses Reparaturvermögen sollte mit den klinischen Nebenwirkungen der Behandlung korreliert werden. Somit könnten Therapie-Schemata jeweils abgestimmt für sensitive und nicht-strahlensensitive Patienten eingesetzt werden [Tucker et al., 1996], denn mehr als 5 % aller Brustkrebspatientinnen zeigen akute Störungen oder aber Spätschäden im Verlauf ihrer Radiotherapie [Turesson et al., 1996; Rosen et al., 1999]; bei den Patientinnen fallen i ntra- [De Méo et al., 1991], aber auch v.a. inter individuelle Unterschiede ins Gewicht [Singh et al., 1990; Singh et al., 1991; Betti et al., 1994; Hartmann et al., 1994; Alapetite et al., 1999]. Bislang sind prospektiv ausgerichtete Studien über die Korrelation zwischen DNAReparaturfähigkeit und klinisch festgestellter Radiosensitivität noch nicht ausreichend durchgeführt worden [Dubray et al., 1999]. In der Radiobiologie wurden schon seit einiger Zeit Versuche durchgeführt, um die Radiosensitivität in vitro zu bestimmen [Joiner et al., 1996; Lambin et al., 1996; Skov, 1999], so z.B. die Messung - des klonogenen Zellüberlebens ( clonogenic survival ) nach Bestrahlung [Weisenthal et Lippman, 1985; Geara et al., 1993; West et al., 1995; Johansen et al., 1996; Dorr, 1998; Alsbeih et al., 2000; Peacock et al., 2000; West et al. , 2001], - der chromosomalen Aberrationen [Barber et al., 2000 b; Scott, 2000] und Kapitel 2 | Einleitung - 8 der Reparatur von Strahlen-induzierten DNA-Schäden wie Doppel- oder Einzelstrangbrüche [Kiltie et al., 1999 a; Oppitz et al., 1999; Dikomey et al., 2000, und Müller et al., 2001]. Diese Versuchsansätze stellten sich in bestimmten Aspekten jedoch nicht als ideal heraus [Bentzen et al., 1993; Geara et al., 1993]; sei es, weil sich nicht die Ergebnisse zeigten, die erwartet worden waren, oder, daß sich der Test als zu kompliziert und zeitaufwendig für ein generelles Patienten-Screening erwies (z.B. wurde in vielen Tests mit Fibroblasten- statt wie in der vorliegenden Arbeit mit Lymphozytenzellen gearbeitet [Burnet et al . , 1996 a; Barber et al . , 2000 b; Peacock et al . , 2000]). Daher sind nun seit beinahe über zehn Jahren Versuche durchgeführt worden, um in vitro- Radiosensitivität mit weiteren Tests zu bestimmen und diese mit akuten oder später einsetzenden Strahlenschäden zu vergleichen, dies jedoch mit wechselndem Erfolg [Burnet et al., 1998; Brock et Tucker, 2000; Dikomey et al., 2000]. Mit Hilfe des Komet-Assay konnte die Radiosensitivität von Ataxia-tel eangiectasia (AT)Patienten in vitro bestimmt werden [Djuzenova et al., 1999; Brammer et al., 2001]. Dabei fielen zwei Besonderheiten auf: Zum einen war die durch die Bestrahlung ausgelöste Schädigung (die sog. „Grundschädigung“ des Zellerbgutes) erhöht, zum anderen war die Reparaturfähigkeit herabgesetzt. Auch in Patienten mit schweren Hautreaktionen nach Bestrahlung wurde eine gegenüber „normal“ reagierenden Patienten signifikant herabgesetzte DNA-Reparaturfähigkeit mit dem Komet-Assay festgestellt [Alapetite et al., 1999; Oppitz et al., 1999]; allerdings haben diese Studien aus epidemiologischer Sicht einige Schwachstellen was die Zusammensetzung der Kollektive und die Charakterisierung der Therapie-Modalitäten sowie die Dokumentation der Nebeneffekte betrifft [in: Twardella et Chang-Claude, 2002; s.a. Dubray et al . , 1999]. Daher haben wir entschieden, die Korrelation von DNA-Reparatur und akuten klinischen Nebenwirkungen einer Strahlentherapie im Rahmen einer prospektiven Studie mit Brustkrebs-Patientinnen durchzuführen, die nach einer brusterhaltenden Operation eine Strahlentherapie erhalten. Für die Strahlentherapie wurden standardisierte Protokolle entwickelt. Die auftretenden Nebenwirkungen an der Haut sind einer Erfassung leicht zugänglich. Ziel war es, einen sowohl schnellen als auch kostengünstigen Test zu entwickeln, der schon vor der adjuvanten Radiotherapie das Risiko der jeweiligen Patientinnen festzustellen vermag [Barber et al., 2000 b], starke Nebenwirkungen zu entwickeln. Es gibt nämlich Patientinnen, die besonders gefährdet sind, solche Strahlenschäden zu bekommen [Turesson et al., 1996]. Somit sollte Kapitel 2 | Einleitung 9 die Möglichkeit gegeben werden, die Bestrahlung individuell auf die besonderen Bedingungen und genetischen Voraussetzungen der Patientin auszurichten [Barber et al., 2000 b], um eine möglichst nebenwirkungsfreie Therapie zu erreichen. Der Erfolg der Radiotherapie hängt nämlich in nicht geringem Ausmaß von der Gesamt-Strahlendosis ab. Deren Maximum wiederum beruht auf der Toleranz des Normal-Gewebes in der zu bestrahlenden Körperregion [Burnet et al., 1996 b]. Um diesen Zusammenhang zwischen der Strahlenempfindlichkeit von in vitrokultivierten, peripheren Lymphozyten und dem Auftreten von radioaktiv induzierten Hautschäden nachzugehen, wurde in dieser Arbeit der Komet-Assay verwendet. 2.5 Eignung des Komet-Assay für die Messung von DNA-Schäden Die Anfänge der Entwicklung des Komet-Assayα liegen im Jahre 1984, als Östling und Johanson erstmalig die Methode einer Einzelzell-Analyse vorstellten, die auf einer Alkali-Lyse von zuvor bestrahlten Zellen beruhte [Östling et Johanson. , 1984]. Diese Grundtechnik wurde in den darauf folgenden Jahren immer weiter verfeinert. Der KometAssay an sich basiert auf vorher schon entwickelten Methoden wie z.B. der NukleotidSedimentation (Nucleoi d-Sedimentation ) [Cook et Brazell, 1976] und dem Halo-Assay [McKelvey-Martin et al., 1993], der alkalischen Sedimentation (Alkaline-Sedimentation ) [Kohn et al., 1981] und der alkalischen ( Alkaline ) Elution [McGrath et Williams, 1966; McBurney et al., 1972]. Entscheidender Schritt der meisten dieser Assays ist das Erkennen von Einzelstrangbrüchen durch Denaturierung der Doppelstrang-DNA bei hohem pH-Wert [Ahnström et Erixon, 1973; Rydberg, 1975] und Messung der entstehenden Einzelstränge [Ahnström et Edvardsson, 1974; Rydberg, 1975; Ahnström, 1988]. Östling und Johanson stellten 1987 ein Modell vor, in dem die Bildung von kometförmigen Schweifen aus DNA-Partikeln nach Bestrahlung und der Elektrophorese beschrieben wird [Östling et Johanson, 1987]. Schließlich führte PL Olive den Namen „ Comet-Assay“ ein [Olive, 1989] und wenig später wurden die ersten Meß-Programme entwickelt, mit denen man quantitativ den DNA-Gehalt und die Länge des Kometen bestimmen konnte [Olive et al., 1990]. Kapitel 2 | Einleitung 10 Seitdem wurden diverse Veränderungen in verschiedenen Aspekten des ursprünglichen Versuchsaufbaus vorgenommen [Bauch et al., 1999] und der Komet-Assay-Test konnte sich bei der Suche nach DNA-Schädigungen und deren Reparatur etablieren [siehe dazu besonders Östling et al. , 1987; Olive et al. , 1990; Olive et Durand, 1992; Olive et al . , 1993; Fairbairn et al . , 1995; Hu et al . , 1995; Plappert et al. , 1995; Cerda et al. , 1997; Pool-Zobel et Leucht, 1997; Ivancsits et al . , 2000; Tice et al . , 2002 etc.]. In Abbildung 2.1 ist das Resultat einer Komet-Analyse zu sehen: Die größeren DNABruchstücke, die im Zellkern verblieben und nicht gewandert sind, bilden den Kopf, die kleineren, im elektrischen Feld gewanderten Partikel formen den Schweif des „Kometen“ (in der Abbildung links oben zu sehen). Im rechten unteren Teil ist eine völlig zerstörte Zelle zu erkennen, in der keine Reparatur stattgefunden hat: Die gesamte DNA ist zerfallen, der Kopf ist nicht wahrzunehmen; viele kleine gewanderte Partikel bilden die große, schwammige Wolke eines „ghosts“ aus! Abbildung 2.1: Darstellung eines „Kometen“ und eines „ghost“ Der Komet-Assay hat sich in den letzten 20 Jahren als eine geeignete Technik erwiesen, mit deren Hilfe man DNA-Schäden in kleinen Zellmengen und in relativ kurzer Zeitspanne feststellen kann [Singh et al ., 1988; Schmezer et al ., 2001; Mayer et al., 2002]; der ganze Versuch ist innerhalb von 24 Stunden durchführbar und Zellen jeden Gewebetyps können problemlos eingebracht α Im folgenden Text wird einfachheitshalber der amerikanische Fachbegriff „KOMET-ASSAY“ (abgekürzt KA) verwendet; im Deutschen lautet die offizielle Bezeichnung „ALKALISCHE EINZELZELLMIKROGELELEKTROPHORESE“. Eine weitere Schreibvariante ist „COMET-ASSAY“. Kapitel 2 | Einleitung 11 werden [Deely et Moore, 1992; McKelvey-Martin et al., 1993; Fairbairn et al., 1995; Tice et Strauss, 1995; Collins et al., 1997]. Darüber hinaus hat er mittlerweile in vielen Bereichen der molekularen Untersuchung von DNASchäden Einzug gehalten [Olive et Durand, 1992; Olive et al. , 1993; Hu et al., 1995; Plappert et al., 1995; Frenzilli et al., 1996; Cerda et al., 1997; Frenzilli et al . , 1997; McKelvey-Martin et al., 1997; Pool-Zobel et Leucht, 1997; Speit et Hartmann, 1999; Rajeswari et al., 2000; Tice et al., 2002 etc.]. Bei der γ-Bestrahlung in vitro treten einerseits einige Doppelstrangbrüche auf, insgesamt aber nur ca. 5 % [Olive, 1999]; sie sind jedoch in ihrer biologischen Wirkung sehr bedeutend [Iliakis, 1991]. Andere Verfahren sind zu ihrer Bestimmung allerdings besser geeignet als der alkalische Komet-Assay [Olive et al., 1991; Hu et Hill, 1996; Marples et al., 1998; Sarkaria et al., 1998]. In der Hauptsache bilden sich bei der γ-Bestrahlung jedoch Einzelstrangbrüche und alkaliempfindliche DNA-Schäden, die dann als solche mit dem alkalischen Komet-Assay gemessen werden können [McKelvey-Martin et al., 1993; Fairbairn et al., 1995]; aber auch Crosslin- king- Schäden sind mit diesem Assay feststellbar [Tice et al., 2000]. Im Folgenden ist der prinzipielle experimentelle Ablauf des Komet-Assay dargestellt. Einzelheiten sind dem Kapitel 3 – „Material/Methoden“ – zu entnehmen, die Abbildungsangaben beziehen sich auf die Graphiken 3.1 A - F auf den Seiten 33 bis 35: - Die zu untersuchenden Zellen werden – nach entsprechender Vorbehandlung (Abbildung 3.1 - A) – radioaktiver Strahlung ausgesetzt und anschließend in eine Gelschicht auf einem Objektträger aufgebracht (Abbildung 3.1 - B und 2.3 - C). - Anschließend werden die Zellen in eine Lyse-Lösung eingebracht, welche die Zellmembranen und Proteine auflöst (Abbildung 3.1 - D). Bei der anschließenden Inkubation im alkalischen Elektrophoresepuffer kann sich die Doppelstrang-DNA entfalten, so daß sich die aufgrund der Einzelstrangbrüche verkürzten DNA-Bruchstücke später im elektrischen Feld bewegen können (Abbildung 3.1 - E). - Für einen bestimmten Zeitraum wird in der Elektrophorese ein elektrisches Feld einer definierten Stärke angelegt, in dem sich die DNA-Bruchstücke zur Anode bewegen können (Abbildung 3.1 - E). Kapitel 2 | Einleitung - 12 Zur Auswertung wird die gewanderte DNA mit einem interkalierenden Farbstoff, der im UV-Licht fluoresziert, angefärbt; anschließend wird die Wanderungsstrecke der Bruchstücke der einzelnen Zellen im Fluoreszenz-Mikroskop gemessen. Man verwendet dazu die Messung des Tail-Momentsβ, das die Ausbreitung der DNSBruchstücke im Agarosegel darstellt (Abbildung 3.1 - F). 2.6 Bestimmung der DNA-Reparaturkapazität als Marker für klinische Strahlenempfindlichkeit Ziel unseres Versuches war, einen Vergleich herzustellen zwischen der Reparaturfähigkeit nach der in vitro- Bestrahlung von Lymphozyten von Brustkrebspatientinnen und dem Auftreten von frühzeitigen Hautveränderungen im Bestrahlungsfeld dieser Patientinnen in vivo . Dazu haben wir die Lymphozytenproben mit γ-Strahlung behandelt und mittels des Komet-Assay die Reparaturkapazität dieser Zellen bestimmt. Danach wurden die Ergebnisse des Komet-Assays mit den klinischen Befunden, die während der Therapie für die Brustkrebs-Patientinnen erhoben wurden, verglichen, um mögliche Zusammenhänge zwischen eventueller mangelhafter Reparaturkapazität der Lymphozyten-Zellen in vitro und dem Auftreten von Früh-Nebenwirkungen der Radiatio im Bestrahlungsfeld in vivo erkennen zu können. β Das "Tail-Moment" ist definiert als das Produkt der Wanderungsstrecke der DNA-Partikel des Schweifes im elektrischen Feld mit der Gesamtmenge an DNA im Schweif (siehe dazu auch Kapitel 4 – „Ergebnisse“). Kapitel 2 | Einleitung 2.S - Graphik I - 13 GRAPHIK: SCHÄDIGUNGSMÖGLICHKEITEN DES MENSCHLICHEN 1 ERBGUTS 3 Exogener UVStrahleneinfluß, z.B. durch Sonnenstrahlung 5 ALTER PHAENOTYP Einfluß des Alters/ Phaenotyps 6 7 4 Einfluß chemisch-toxischer Stoffe Punktmutation, z.B. durch Zwischenprodukte des Zellmetabolismus ( wie z.B. Hydroxylradikale) oder Einfluß ionisierender Strahlen Einfluß von Medikamenten °C d Abbildung 2.2: Exogene Faktoren, wie z.B.Temperatur Schadensmöglichkeiten an DNA-Strukturen Abbildung 2.3: Rekombinations-Reparaturen (HR, EJ) „Mismatch Repair“ “A-G Mismatch” “T-C Mismatch” Insertion Deletion Beispiele der durch sie induzierten DNA-Schäden Nucleotid-Excisions Reparatur (NER) „Interstrand crosslink” Doppelstrangbrüche Replikationsfehle r 14 Basen-Excisions Reparatur (BER) (6-4)PP “Bulky Adduct" CPD (= Mitomycin C)] Röntgenstrahlen Krebstherapeutika [cis-Pt (= Cis-Platin), MMC DNA-Schädigungsmöglichkeiten Uracil “Abasic site” 8-Oxoguanine Einzelstrangbrüche Radioaktive Strahlung UV-Licht Sauerstoff-Radikale Polyzyklische Alkylierende Kohlenwasserstoffe Agentien Spontane Reaktionen Schädliche Einflüsse Kapitel 2.S | Einleitung - Graphik II - Reparatur -wege Schadensetzung an der DNA und Reparaturfolgen sowie die auf die einzelnen Schadensarten spezialisierten Reparaturmechanismen Kapitel 3 | Material 15 3. MATERIAL UND METHODEN 3.1 MATERIALIEN 3.1.1 Lösungen und Reagenzien 3.1.1.1 Zellkulturmedien Das Basis-Medium besteht aus 100 ml RPMI 1640-Medium, welches mit 1 ml L-Glutamin und 1 ml Penicillin-Streptomycin versetzt wird. Das Nähr-Medium (N-Basic) besteht aus 100 ml Basis-Medium, zu dem man 10 ml Fetales Kälber-Serum (FCS) gibt. Das Nährmedium ist auch die Grundlösung für das Inkubationsmedium. Dieses Inkubationsmedium erhält man durch das Mischen von 100 ml Nähr-Medium mit 1 ml 10 mM HEPES-Puffer. Das Fetale Kälber-Serum (FCS) wird von Life Technologies bezogen; 30 min bei 56 °C inaktiviert und dann in Portionen von 3 ml bzw. 5 ml aufgeteilt. 3.1.1.2 Lösungen/Puffer Der PBS-Puffer ( „phosphat-gepufferte Kochsalzlösung“ ) wird als Fertiglösung von Life Technologies bezogen. Der Lyse-Puffer wird aus 146,4 g NaCl (2,5 M) sowie 1,2 g Trizma-Base (10 mM) und 37,2 g Na2EDTA (100 mM) und 10 g N-Laurylsarcosin-Na-Salz (1%-ig) hergestellt (alle Angaben pro Liter). Die einzelnen Komponenten werden getrennt angesetzt und erst nach ihrem Lösen vereinigt. Der pH-Wert der Lösung wird auf 10 eingestellt (zunächst mit NaOH-Plätzchen, dann mit 1 M NaOH). Vor jedem Versuch wird ein entsprechendes Aliquot von Triton X100 und DMSO zugegeben, um eine Endkonzentration 1 % Triton X100 und 10 % DMSO zu erhalten. Kapitel 3 | Material 16 Den Elektrophorese-Puffer erhält man durch Mischen von 24 g NaOH (fest) und 0,744 g Na2EDTA (die Angabe gelten jeweils pro 2 Liter). Der Puffer wird vor der Elektrophorese angesetzt und dann auf 4 °C heruntergekühlt. Die Low-Melting-Agarose (0,7 %-ig in PBS-Puffer) wird unter kurzem Erhitzen in der Mikrowelle aufgelöst, das dabei verdunstete Wasser ergänzt und bis zur weiteren Verwendung bei 42 °C im Wasserbad aufbewahrt. Das Phytohemagglutinin wird mit 10 ml sterilem Wasser aufgefüllt und nach dem Portionieren bis zum Einsatz im Versuch bei 4 °C gelagert. Vom Sybr-Green©-Farbstoff (10 mM) wird vor dem Anfärben jeweils 1 µl Farbstoff in 10 ml TEPuffer gegeben. Die Lösung kann dann maximal eine Woche bei 4 °C gelagert werden. 3.1.2 Chemikalien Tabelle 3.A.: Verwendete Chemikalien Chemikalien Konzentration Riedel-De Haen, Ethanol Seelze, Deutschland Life Technologies/Invitrogen Fetales Kälber-Serum HEPES-Puffer L-Glutamin Bezugsquelle Karlsruhe, Deutschland 10 mM 200 mM Life Technologies/Invitrogen Karlsruhe, Deutschland Life Technologies/Invitrogen Karlsruhe, Deutschland Kapitel 3 | Material Tabelle 3.A. [Fortsetzung]: Chemikalien 17 Verwendete Chemikalien Konzentration Bezugsquelle Seakem Low Melting Agarose Low-Melting Agarose 0,7 %-ig Biozym Oldendorf, Deutschland Na2-EDTA 100 mM Diverse Hersteller NaCl 2,5 M Diverse Hersteller N-Laurylsarcosin-Na-Salz 1 %-ig Diverse Hersteller NaOH Diverse Hersteller Life Technologies/Invitrogen Penicillin-Streptomycin Phytohemagglutinin (PHG) Karlsruhe, Deutschland 2 %-ig Life Technologies/Invitrogen Karlsruhe, Deutschland Life Technologies/Invitrogen RPMI-Medium 1640 Karlsruhe, Deutschland Sybr-Green©-Farbstoff 10 mM Trizma-Base 10 mM Biozol Staining Solution Eching, Deutschland Diverse Hersteller Kapitel 3 | Material 18 Tabelle 3.A. [Fortsetzung].: Verwendete Chemikalien Chemikalien Konzentration Trypanblau 3.1.3 Bezugsquelle Diverse Hersteller Geräte Tabelle 3.B: Verwendete Geräte Geräte Bemerkungen Bestrahlungsgerät „Gammacell 1000“ Edmonton, Kanada Unterhaching, Deutschland Schott div. Glasgeräte Mainz, Deutschland Becton & Dickinson Einweg-Transferpipetten Färbewanne I Atomic Energy of Canada Ltd. Jonsen CO2-Brutschrank Elektrophorese-Einheit Bezugsquellen Heidelberg, Deutschland “LKB 2117 Multiphor II” Amersham Pharmacia Biotec Freiburg, Deutschland Glaswerk Wertheim Wertheim, Deutschland Kapitel 3 | Material Tabelle 3.B. [Fortsetzung]: Geräte 19 Verwendete Geräte Bemerkungen Bezugsquellen Neolab Heidelberg Färbewanne II Glaswerk Wertheim Wertheim, Deutschland Fluoreszenzmikroskop Kunststoff-Reagenzröhrchen „Blue Cap“ Leucosep®-Tubes Lichtmikroskop Neubauer-Zählkammer Leica Leitz Laborlux 11 15 ml/50 ml Leica Bensheim, Deutschland Becton & Dickinson Heidelberg, Deutschland Greiner Labortechnik Frickenhausen, Deutschland Leica Bensheim, Deutschland Brand Landshut, Deutschland Trevigen Gaithersburg, MD, USA Objektträger für Komet-Assay „Comet Slide“ Vertrieben von: Biozol Diagnostika Vertrieb GmbH Eching, Deutschland Kapitel 3 | Material Tabelle 3.B. [Fortsetzung]: 20 Verwendete Geräte Geräte Bemerkungen Sterile Pipettenspitzen div. Größen Tischzentrifuge Modell 5415c Eppendorf Hamburg, Deutschland Eppendorf Hamburg, Deutschland Stratagene Weitbohr-Pipettenspitzen Amsterdam, Niederlande Köttermann Wärmebad 3.1.4 Bezugsquellen Uetze, Deutschland Wärmebad mit Schüttelfläche Zentrifuge Modell „Minifuge RF“ Köttermann Uetze, Deutschland Heraeus Hanau, Deutschland Software Die Tabelle 3.C führt die in unserem Versuch zur Auswertung der Komet-Schweife verwendete Software auf. Mit ihrer Hilfe können die DNA-Reparaturkapazitäten bestimmt (durch Messung der Schweiflänge bzw. -dichte = „Tail Moment“ ) und anschließend berechnet werden. Kapitel 3 | Material Tabelle 3.C.: 21 Verwendete Software Software Bemerkungen Bezugsquellen Kinetik Imaging Ltd. Analysis Software Version 4.0 Statistical Analysis Software Release 8.12 (1999) Liverpool, Großbritannien SAS Institute Inc. Cary, NC, USA Kapitel 3 | Methoden 22 3.2 Methoden 3.2.1 Das Kollektiv der zu untersuchenden Patientinnen Bei dem Patientinnenkollektiv handelte es sich um eine unselektierte Kohorte von 478 Brustkrebspatientinnen, die in Kliniken in Heidelberg, Mannheim und Karlsruhe wegen ihrer Brustkrebserkrankung mit einer Strahlentherapie behandelt wurden. Im Rahmen des Projektes wurden sie in eine prospektive epidemiologische Studie aufgenommen; dabei wurden allerdings Patientinnen, die bereits eine Chemotherapie erhalten hatten, von der Studie ausgenommen. Der Studie wurde vom Ethik-Komitee der Medizinischen Fakultät der Universität Heidelberg zugestimmt (Referenz-Nummer 37/98). Die Patientinnen stimmten ebenfalls ihrer Beteiligung an der Untersuchung vor Versuchsbeginn schriftlich zu. Aus logistischen Gründen wurde die Strahlen-induzierte DNA-Reparatur in Proben von 149 Patientinnen untersucht, die bis Dezember 1999 gesammelt wurden; die Ergebnisse von 113 Patientinnen konnten schließlich ausgewertet werden. Das Alter dieser Patientinnen reichte von 36 bis 80 Jahren mit einem Durchschnittsalter von 61 Jahren. Die klinischen Merkmale unterschieden sich im Patientenkollektiv nicht allzu stark: 72 % der chirurgisch entfernten Tumore wurden als Carcinoma-in-situ sowie T1 charakterisiert, 27 waren im Stadium T2. Bei 72 % der Patientinnen konnten keine Metastasen in Lymphknoten gefunden werden (N0), und 72 % der Patientinnen wurden als frei von Fernmetastasen erklärt (M0). Alle Patientinnen erhielten im Rahmen ihrer Strahlentherapie eine tangentiale Bestrahlung der ganzen Brust mit seitlicher und mittlerer Keil-Bestrahlung. Vor der Bestrahlung fand eine Computer-Tomographie statt, die der Therapie-Planung, der Simulation und Verifizierung des Bestrahlungsprozesses sowie der Qualitätssicherung diente. Das Therapie-Schema für alle Patientinnen enthielt ein Dosis-Minimum für die gesamte Brust von 50 Gy. Bestrahlt wurde mit Photonenstrahlen von 4 bis 8 MV, nur eine Patientin wurde mit einem 15 MV-Photonen-Strahl behandelt. Die Fraktionierung lag bei 1,8 bis 2,0 Gy pro Termin mit fünf Bestrahlungen pro Woche; in drei Bestrahlungszentren wurde eine Boost-Bestrahlung des Tumorbettes angehängt, wobei Photonenstrahlung von 4 bis 8 MV (bei 71,7 % der Patienten) oder Elektronenstrahlen von 10 bis 18 MV (bei 23,9 % der Patientinnen) eingesetzt wurden; die Gesamtdosis der Boosttherapie lag zwischen 5 und 20 Gy. Kapitel 3 | Methoden 23 Eine Patientin wurde mit Brachytherapie behandelt und vier Patientinnen erhielten überhaupt keine Boost-Therapie. Die Abbildung „Schematischer Ablauf der Datenerhebung“ zeigt den Ablauf der therapeutischen Maßnahmen bei den Patientinnen (Abbildung 3.2 auf der Seite 35): Die Entnahme der Blutprobe, die für den Komet-Assay in unserer Studie verwendet wurde, fand bei dem Simulationstermin vor dem ersten therapeutischen Bestrahlungsdurchgang zusammen mit dem Erstgespräch des Therapeuten mit der Patientin statt. Informationen über den Tumor, die Therapie und Nebenwirkungen der Strahlentherapie wurden aus den Krankenakten, persönliche Informationen über die Patientinnen mittels eines Fragebogens erworben. Das Sammeln der Blutproben begann im Juni 1998 (Twardella et al ., 2003). Während des Bestrahlungsprozesses, der ca. 18 Wochen dauerte, fanden weitere vier Befragungstermine statt. Dabei wurden akute Nebenwirkungen der therapeutischen Strahlentherapie dokumentiert, die sich im Bestrahlungsgebiet der Brust entwickelten und als Indikator für die klinische Strahlensensitivität angesehen wurden. Dazu diente die Klassifikation der „ Common Toxici- ty Criteria“ der NIH [National Cancer Institut; 1988; Cancer Therapy Evaluation Program, 1998]. Die Entwicklung von Nebenwirkungen von mindestens Grad 2c wurden als schwer wiegende Nebeneffekte der Bestrahlung angesehen und als Kriterium für die Entwicklung von akuter klinischer Radiosensitivität gewertet. In der vorliegenden Arbeit wurden nur Hautreaktionen nach dem dritten Untersuchungszeitpunkt (entsprechend etwa einer erhaltenen Strahlendosis von 50,4 Gy) gewertet, um den Einfluß ungleicher Bestrahlungsintensität zu vernachlässigen, welche die Patientinnen während der Boost-Therapie möglicherweise erhalten haben könnten. 3.2.2 Dosis-Wirkungs-Kurve Vor dem eigentlichen Experiment wurde in einer Reihe von Versuchsdurchgängen die ideale Bestrahlungsdosis bestimmt, um eine möglichst optimale Schadenssetzung und daraus folgend eine aussagekräftige Reparaturmöglichkeit erzeugen zu können. Aufbauend auf dieser DosisWirkungs-Kurve (s.a. Abbildung 4.A. auf der Seite 38) und angesichts der begrenzten Anzahl von Lymphozyten-Proben haben wir uns entschieden, die Proben mit nur einer einzigen Bestrahlungsdosis von 5 Gy zu versehen und den durch die Bestrahlung induzierten DNA-Schaden bzw. dessen Reparatur nach 0, 15 und 0 min zu messen. Kapitel 3 | Methoden 3.2.3 24 Isolierung von Lymphozyten vor Versuchsbeginn (Die Abbildungen zu den folgenden Kapiteln [die Graphiken 3.1 – A bis F: „Schematische Kurzdarstellung des Komet-Assays“] findet man auf den Seiten 33 bis 35). Aus der Blutprobe (20 ml in einer Zitrat-Monovette) der Patientin wurden die Lymphozyten mittels Gradientenzentrifugation der Blutprobe bzw. der sog. Lymphozytenmanschette ( buffy- coat ) über einer Schicht Lymphoprep T M in Leucosep - Röhrchen abgetrennt. Die Zentrifugation fand bei 800 x g für 15 min bei Raumtemperatur statt. Danach wurde die Schicht, welche die Lymphozyten enthält, entfernt und in zwei Wasch-Schritten mit Phosphat-gepufferter Salzlösung gereinigt. Aliquots von jeweils ca. 2 x 106 Lymphozyten wurden in eine Nährlösung (RPMI-1640-Medium mit 50 % inaktiviertem fetalen Kälber-Serum und 10 % Dimethylsulfoxid) eingebracht, in einem Neolab-Gefrierbehälter langsam auf -80 °C tiefgefroren (bei -1 °C min-1) und anschließend bis zum Versuchsbeginn in flüssigem Stickstoff tiefgefroren gelagert. 3.2.4 Bestimmung der DNA-Reparaturkapazität Die Induktion von γ-Strahlen-induzierten Schäden und die anschließende Reparaturfähigkeit der DNA wurden mittels Komet-Assay bei 149 Brustkrebs-Patientinnen untersucht. Die Versuchsablauf läßt sich in vier Abschnitte einteilen: Zuerst die Bestrahlung der kultivierten Proben, dann die Reparatur der DNA-Schäden, welche die Zellen im erwärmten Wasserbad erfahren und die durch Abkühlen und Lyse der Zellen beendet wird, und abschließend die Elektrophorese und die Auswertung am Mikroskop mit anschließender Bearbeitung der Ergebnisse mit Hilfe eines Computerprogramms und die Dokumentation. Die einzelnen Schritte werden im Folgenden (Kapitel 3.2.5. bis 3.2.10) näher behandelt: 3.2.5 Kultivierung und Bestrahlung der Lymphozyten Nachdem die im flüssigen Stickstoff bei -160 °C tiefgefrorenen Lymphozyten durch langsame Erwärmung kurz vor dem vollständigen Auftauen standen, wurden sie quantitativ in ein 50 ml Bluecap - Röhrchen überführt und mit PBS auf ein Volumen von 20 ml aufgefüllt. Kapitel 3 | Methoden 25 Danach wurden sie 10 min lang in einer Zentrifuge bei 1200 U/min zentrifugiert (= 250 x g). Mit Einmalpipetten wurde der Überstand vorsichtig abpipettiert. Das Pellet wurde in 5 ml PBS resuspendiert, in ein 15 ml Bluecap - Röhrchen überführt und der verbliebene Rest mit 5 ml PBS nachgespült. Von der Ausgangslösung wurden 50 µl entnommen, mit 50 µl Trypanblau gemischt und in der Neubauer-Zählkammer die Zellzahl bestimmt. Die Anzahl der Zellen, die jeweils in standardisierter Menge in die Bestrahlungsröhrchen eingebracht wurden, errechnete sich nach folgender Formel: X x 2 x 104 x 10 = Zellzahl X = gezählte Zellen im 16er Feld Die Zellsuspension wurde erneut 10 min bei 1200 U/min zentrifugiert, der Überstand wieder verworfen. Zum Rückstand wurden pro 106 Zellen jeweils 1 ml Basis-Medium zugegeben; pro Milliliter Basis-Medium wurden dann noch jeweils 20 µl PHG (2 %-ig) für die Stimulierung zugegeben. Bsp.: 200 000 Zellen = 200 µl Basis-Medium + 4 µl PHG Die Röhrchen wurden (ohne den Deckel ganz zu schließen, um somit die Sauerstoffzufuhr zu gewährleisten) bei 37 °C und 5 % CO2-Anteil der Luft im CO2-Brutschrank mindestens 20 h inkubiert. Diesen Vorgang nennt man Reaktivieren der tiefgefrorenen Lymphozyten oder auch Stimulierung. Durch die Lagerung im Stickstofftank wurden einige Zellen geschädigt. In der Stimulierung werden die Zellen, die das Tiefgefrieren überstanden haben, regeneriert; Zellen, welche stark geschädigt wurden, sterben ab: So bleiben nur gesunde Zellen für die Versuche übrig. 3.2.6 Einstellen der Zellkonzentration für den Komet-Assay Nach der 20-stündigen Inkubationszeit wurden die Zellen aus dem Brutschrank entnommen und 10 min bei 1200 U/min zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde abdekantiert, der Rückstand in 1 ml Basis-Nährlösung resuspendiert und die Zellzahl bestimmt (Vorgehensweise s.o.), diesmal nach der Formel: Kapitel 3 | Methoden 26 X x 2 x 104 = Zellen/ml X = gezählte Zellen im 16er Feld Pro Meßpunkt wurden 105 Zellen benötigt. Aufgrund der ermittelten Zellzahl wurde die Menge Zellsuspension, welche die 105 Zellen enthält, errechnet, auf die entsprechenden Röhrchen verteilt und mit Basis-Medium auf 500 µl aufgefüllt [Abbildung 2.1 – A]. 3.2.7 Bestrahlen der Zellen Vor der Bestrahlung wurden die Röhrchen zum Kühlen in eine Eiswanne verbracht. Mittels eines Bestrahlungsgerätes (ein 137 Cs-Strahler) wurden alle Probenröhrchen – bis auf die Kontrollen – mit jeweils 5 Gy bestrahlt. Dazu wurden jeweils vier Röhrchen in das Bestrahlungsgerät eingebracht. Dabei befanden sich nur die Röhrchen eines experimentellen Zeitpunktes im Bestrahlungsgerät (z. B. alle Röhrchen der verschiedenen Patienten, die im späteren Verlauf 15 min inkubiert werden sollen), der Rest verblieb in der Eiswanne. In dem Bestrahlungsgerät befand sich eine drehbare Platte, welche die Reagenzgläser an der Strahlenquelle vorbeiführte, so daß alle Proben die gleiche Strahlungsintensität erhalten hatten [Graphik 2.1 – B]. Nacheinander wurden nun alle Proben bestrahlt; die gerade nicht bestrahlten Proben wurden weiterhin in der Eiswanne gekühlt, so sollten spontane Reparaturvorgänge in den gerade bestrahlten Proben weitestgehend verhindert werden. 3.2.8 Inkubation und Aufbringen auf die Objektträger Ab diesem Versuchsschritt wurde unter Rotlicht-Bedingungen gearbeitet, um zu verhindern, daß das UV-Licht aus der Leuchtstoff-Röhre weitere DNA-Schäden (wie z.B. Strangbrüche) induzieren konnte. Die intrazellulär ablaufende Reparatur der Strahlenschäden verlief in ungekühltem Zustand relativ schnell, so daß z.T. schon nach ca. 30 min. (bei Raumtemperatur) die Ausgangswerte der unbestrahlten Zellen erreicht waren; ein Großteil der Schäden war schon nach fünfzehn Minuten repariert [siehe auch McKelvey-Martin et al., 1993]. Es war jedoch entscheidend, allen Zellen den gleichen Startpunkt für den Beginn der Reparatur zuzuteilen, damit man die Reparaturkapazität der einzelnen Zellpopulationen vergleichen konnte. Deshalb mußte in den nächsten Schritten Kapitel 3 | Methoden 27 so zeitsparend wie möglich gearbeitet werden, damit die Messung der Reparaturkapazität von Lymphozytenzellen unter standardisierten Bedingungen ermöglicht wurde: Vor dem Inkubationsschritt wurde daher für jede Bestimmung ein Röhrchen mit 350 µl 0,7 %iger Low-Melting-Agarose vorbereitet und bei 42 °C im Wasserbad temperiert; die Objektträger wurden entsprechend der Zuordnung beschriftet und bereitgelegt. Die Röhrchen der Zellen, an denen die Ursprungsschädigung der Bestrahlung gemessen werden sollte (t1 = 0 min), verblieben bis zur Weiterverarbeitung im Eisbad: Bei diesen kam dadurch die Reparaturfähigkeit der Zellen zum Erliegen (dies war bei ca. 4 °C der Fall). Die Röhrchen mit den Zellen hingegen, welche die Bestrahlungsschäden ihrer DNA reparieren sollten, wurden zu diesem Zweck im Wasserbad bei 37 °C inkubiert und nach bestimmten Zeitpunkten (t2 = 15 min und t3 = 30 min) auf die Objektträger übertragen: Nach nochmaliger Resuspendierung des Röhrcheninhalts mit der Weitbohr-Pipette wurden 50 µl der Zellensuspension entnommen und in einem Röhrchen mit 350 µl der warmen Low-MeltingAgarose resuspendiert, vermischt, und die ganze so entstandene Flüssigkeit nochmals 5 mal resuspendiert, um dadurch eine optimale Durchmengung des Gemisches zu erreichen. Aus der so entstandenen homogenen Flüssigkeit wurden 50 µl entnommen und mit WeitbohrPipetten auf vorher beschrifteten Objektträger-Feldern verteilt. Für jeden Zeitpunkt (t1, t2, und t3) wurden vier Felder mit jeweils 50 µl der Agarose-Zell-Suspension versehen [Abbildung 2.1 – C]. Die mit dem Gemisch beschichteten Objektträger wurden sofort auf eine mit Eis gekühlte Metallplatte gelegt, damit die Agarose in möglichst kurzer Zeit erstarren konnte und die Reparaturmöglichkeit der Zellen nach der jeweils vorgegebenen Zeit exakt beendet wurde. Genauso wurden die Zellen der Zeitpunkte t2 und t3 (15 bzw. 30 Minuten) behandelt. Die Proben, die nicht reparieren sollten (t1 = 0 min), wurden im Agarosegemisch sofort nach dem Bestrahlungsvorgang auf die Objektträger aufgebracht und nicht inkubiert, so daß ihnen keine Zeit zur Reparatur blieb. 3.2.9 Lyse und Elektrophorese Nachdem die Objektträger jeweils 10 min auf der gekühlten Metallplatte zum Auskühlen und Härten der Agarose gelegen hatten, wurden die Objektträger zur Lyse in eine mit vorgekühltem Kapitel 3 | Methoden 28 Lysepuffer gefüllte Färbewanne eingebracht und bei 4 °C im Kühlschrank mindestens eine Stunde dort belassen. Von jedem Ansatz wurde mit einem Aliquot die Vitalität der Zellen mit dem Trypanblau-Verfahren bestimmt [Abbildung 2.1 – D]. Danach wurden die Objektträger in eine sich im Eisbad befindlichen Elektrophorese-Wanne, die bis zu der Fläche mit vorgekühltem alkalischem Elektrophoresepuffer gefüllt war, eingelegt. Dazu gab man jeweils einen Tropfen des Puffers auf die Unterseite des Objektträgers und schob ihn mittels Pinzetten an die gewünschte Position auf der Auflagefläche, damit eine entsprechende Haftung vorhanden war. Dies sollte verhindern, daß die Objektträger beim anschließenden Vorgang der Elektrophorese durch die eingefüllte Pufferflüssigkeit von der Unterlage gelöst wurden: Das hätte die Messung der Wanderungsstrecke unmöglich gemacht, da die OT sich zueinander verschoben hätten, so daß die Ausrichtung der Agaroseschicht in bezug auf die Kathode und Anode verrückt wäre. Wenn sich alle Objektträger, deren Ränder exakt aneinander anschließen mußten, damit standardisierte Bedingungen herrschten, auf der Auflagefläche der Wanne befanden, gab man vorsichtig weiter von dem gekühlten Elektrophoresepuffer hinzu, bis die Objektträger gerade von einer Flüssigkeitsschicht bedeckt waren. Der Elektrophoresepuffer wirkte daraufhin 20 min auf die Objektträger ein. Unter diesen alkalischen Bedingungen wurde eine Denaturierung der Doppelstrang-DNA bewirkt, so daß sie zumindest partiell einzelsträngig vorlag; im anschließenden Elektrophoreseschritt konnten die DNA-Partikel in der Gelschicht im elektrischen Feld wandern. Daran schloß sich eine zwanzigminütige Elektrophorese bei 25 Volt und 300 mA an. Die gewünschte Stromstärke wurde über das Hinzufügen oder Entfernen von Pufferflüssigkeit reguliert, da sich dadurch der elektrische Widerstand in dem Becken veränderte [Abbildung 2.1 – E]. Nach der Elektrophorese wurden die Objektträger aus der Wanne genommen, 5 min lang in einer Färbewanne in ein Ethanolbad getaucht und anschließend ca. eine Viertelstunde an der Luft getrocknet. Dann wurden die Objektträger beschriftet und in einem Aufbewahrungskasten an einem geeigneten Ort bei 4 °C bis zur abschließenden Auswertung gelagert. Kapitel 3 | Methoden 3.2.10 29 Auswertung im Fluoreszenzmikroskop und Dokumentation Unter dem Fluoreszenz-Mikroskop ermittelte man die Wanderungsstrecke der DNA-Partikel in der Agaroseschicht, die während der Elektrophorese zur Anode gewandert waren: Während man bei den Methoden der Lichtmikroskopie mit sichtbarem Licht der Wellenlänge 400 - 800 nm arbeitet, macht es die Verwendung von kurzwelligem Licht – im Wellenbereich 300 - 400 nm – möglich, bestimmte Strukturen oder Substanzen der Zelle selektiv anzufärben. Man beleuchtet dabei das Objekt mit kurzwelligem Licht und beobachtet das langwellige Licht (Fluoreszenzlicht), was von dem an die DNA-Partikel angelagertem Sybr-Green - Farbstoff emittiert wird. Unmittelbar vor Beginn der Auswertung wurde die Zell-DNA in der Agaroseschicht auf dem Objektträger mit 50 µl einer 0,1 % -igen Sybr-Green - Lösung (einem interkalierendem Farbstoff in TE-Puffer) bedeckt, um die DNA-Partikel sichtbar zu machen. Der Einwirkvorgang dauerte mindestens 10 min. Danach wurden Deckgläschen aufgelegt und die Auswertung konnte beginnen: Mit einem Laborlux K-Mikroskop (Leica) und bei 400facher Vergrößerung wurde die Migrationstrecke der jeweiligen Zell-DNA fluoreszenzmikroskopisch ausgewertet und die Länge mittels eines rechnergestützten Meßprogramms bestimmt [Abbildung 2.1 – F]. Pro Objektträger wurden jeweils die Kometen von 51 Zellen ausgemessen. Bei der Messung wurde die Kometenlänge des Schweifes erfaßt und jeweils die Intensität des Kopfes und des Schweifes, was jeweilig auf die Anzahl der DNA-Partikel schließen läßt. Aus den Daten der 51 Einzelwerte wurde anschließend der Median gebildet. So konnten folgende Parameter ermittelt werden: a.) Der Median der Kometen-Tail-Länge (in µm), also der Länge des Schweifes; b.) Der Median der Menge der Tail-DNA (in %), kann aus der Intensität der Fluoreszenz des Kometen-Schweifes bestimmt werden; Kapitel 3 | Methoden c.) 30 Der Median des Tail-Moments (der Median ist der mittlere Tail-Moment der ausgewerteten Zellen; in der Regel, bei 51 Zellen, der 26. Wert). Das Tail-Moment wird folgendermaßen berechnet: Tail-Moment = Wanderungsstrecke der DNA-Partikel des Schweifes x Gesamtmenge der DNA im Schweif d.) Die Anzahl der Zellen, die vom Auswertsystem nicht erfaßt werden können („ghosts“) : Zellen, die im Versuchsverlauf so geschädigt wurden, daß ihr Schweif so groß und blaß wird, daß er nicht mehr erfaßt werden konnte, wurden „ ghosts“ genannt. Sie wurden ermittelt und ihre Zahl in einer Tabelle aufgenommen und prozentual ausgewertet, ohne daß sie den Median beeinflussen. Anschließend wurden die Ergebnisse mit der Statistical Analysis Software weiter verarbeitet (Dokumentation des Versuches, Statistik, Versuchsauswertung mit eindeutiger Versuchsbeschreibung und eine graphische Auswertung). Um eine Korrelation zwischen den drei AssayParametern herauszufinden, wurde der Spearman - Rank-Correlation-Koeffizient verwendet. Gezeichnet wurden die Graphiken mit SigmaPlot 2001 für Windows , Version 7.0. Die Objektträger mit den Zellen wurden danach für spätere (Zweit-) Untersuchungen unter trockenen und kühlen (4 °C) Bedingungen aufbewahrt. Mit Hilfe dieses Versuchsaufbaues war es möglich, folgende fünf zelluläre Reparaturparameter zu untersuchen: a.) Die Grundschädigung bei nicht-bestrahlten Zellen; b.) Die durch die Bestrahlung ausgelösten DNA-Schäden, direkt gemessen nach der Bestrahlung (t=0 min); c.) DNA-Reparaturkapazität nach fünfzehn Minuten, definiert als [1 - (mittleres Tail-Moment nach 15 min Reparaturzeit / mittleres Tail-Moment nach 0 min Reparaturzeit)] d.) DNA-Reparaturkapazität nach dreißig Minuten (gemäß modifizierter o.a. Formel); Kapitel 3 | Methoden e.) 31 DNA-Reparaturkapazität zwischen fünfzehn und dreißig Minuten gemäß der Formel [1 - (mittleres Tail-Moment nach 30 min Reparaturzeit / mittleres Tail-Moment nach 15 min Reparaturzeit)] 34 der untersuchten 149 Blutproben wurden nicht verarbeitet, da zu wenig lebensfähige Zellen nach der Stimulierung zur Verfügung standen. Weitere zwei Patientinnen erfüllten nicht die an die Probandinnen gestellten Kriterien. Somit konnten schließlich die Proben von insgesamt 113 Patientinnen für diesen Versuch verwendet werden. 3.2.11 Standardisierung der Technik Um experimentelle Variabilität festzustellen, ließen wir in jedem 2. bis 3. Versuchsdurchgang in identischer Weise einen „internen Standard“ mitlaufen. Die Zellen stammten von einer Blutprobe (450 ml) eines gesunden Spenders der Blutbank der Universität Heidelberg. So konnte man an dem Versuchsergebnis erkennen, ob eine hohe Anzahl an „ghosts“ an etwaigen Fehlern im Versuchsablauf lag oder an im Vorfeld des Versuchs stark geschädigten Zellen der Probandinnen. Insgesamt wurde diese Referenzprobe in 26 Versuchsdurchläufen mitgeführt und anschließend ausgewertet. Kapitel 3.S1 | Material... Abbildung 3.1 – A bis F: Schematische Kurzdarstellung des Komet-Assays A: Gewinnen, Auftrennen und Vorbehandeln der Lymphozyten t3= 30 min Kontrolle 1 3 4 3 4 2 t1= 0 min t2= 15 min 2 1 1 2 3 2 1 1 3 2 4 3 2 4 Zur Bestrahlung (3.A – B) 1 - Gr aphik zum Ver s uchsauf bau - 32 3 4 4 Auftrennung der bestrahlten bzw. unbehandelten Zellen in Gruppen: Zum einen die bestrahlten Proben, die sofort und ohne Reparaturmöglichkeit auf die Objektträger aufgebracht werden (t1= 0 min); dann die, welchen eine bestimmte Zeit in der Inkubation zur Reparatur gegeben wird (t2= 15 min und t3= 30 min) und schließlich dann die unbestrahlten Zellen der „Kontrollgruppe“. Bleiben von der Bestrahlung ausgeschlossen: Kontrollgruppe Kapitel 3.S1 | Material... Abbildung 3.1 – A bis F [Fortsetzung]: 33 - Gr aphik zum Ver s uchsauf bau - Schematische Kurzdarstellung des Komet-Assays B: Bestrahlung der Zellen Bestrahlungsvorgang Zellproben in Behältern für die Bestrahlung C: Aufbringen der Zellen auf Objektträger Zellen in der Agaroseschicht auf dem Objektträger Low-melting Agarose D: Lysevorgang Objektträger mit aufgebrachten Zellen in der Agarose Lyse-Lösung Kapitel 3.S1 | Material... Abbildung 3.1 – A bis F [Fortsetzung]: E: Elektrophorese 34 - Gr aphik zum Ver s uchsauf bau - Schematische Kurzdarstellung des Komet-Assays ANODE + Im elektrischen Feld wandernde DNABruchstücke aus den Zellkernen Angelegtes elektrisches Feld KATHODE – Anfärben mit Sybr-Green [ohne Abbildung] F: Auswertung UV-Strahlenquelle des Mikroskops Gewanderte DNA-Bruchstücke in der Agaroseschicht auf dem Objektträger Sichtbarmachung der gewanderten Kometen mit dem Farbstoff unter dem UVMikroskop Gemessene Wanderstrecke der DNABruchstücke in der Elektrophorse Kapitel 3.S2 | Material... 3.S2 - Ablauf der Datenerhebung - 35 SKIZZE ZUR DARSTELLUNG DES EPIDEMIOLOGISCHEN DATENERHEBUNG ABLAUFS DER Folgende Skizze zeigt die Darstellung des Ablaufs der prospektiven epidemiologischen Studie zur Bestimmung der Strahlenempfindlichkeit. Beginn der Datenerhebung war im Jahr 1998. Vor der Strahlentherapie wurde die Blutprobe zur experimentellen Bestimmung der Dokumentation von Nebenwirkungen, der Lebensqualität und Hautpflege 6 Wochen Abbildung 3.2: Schematischer Ablauf der Datenerhebung NAHME -Einwilligung -Fragebogen -BLUTENT- Einige Tage X Wochen 1,5 Wochen BoostBestrahlung Basistherapie (Bestrahlungszyklen) SimulationsBestrahlung Erstgespräch Schematischer Ablauf der Datenerhebung: Nachsorg e Strahlenempfindlichkeit entnommen: Kapitel 4 | Ergebnisse 36 4. ERGEBNISSE 4.1 Optimierung der Einzelzell-Mikrogelelektrophorese (Komet-Assay) für die Bestimmung der Reparatur von durch γ-Strahlen-induzierten DNA-Schäden/Technische Verbesserungen des Versuchs Bevor der Komet-Assay in unserer Studie eingesetzt werden konnte, mußten einige Arbeitsschritte optimiert und das in der Abteilung verwendete Protokoll insbesondere in den folgenden zwei Punkten verbessert werden: 1) In der ursprünglichen Versuchsanordnung (erstmals beschrieben von Östling et Johanson, 1984) wurden die Objektträger vor dem Aufbringen des Zell-AgaroseGemisches aufwendig präpariert, damit die aufzubringende Schicht auf dem Objektträger hält. Diese Arbeiten wurden durch die Einführung von neuen Objektträgern [CometSlides-Objektträger, Trevigen/USA] mit schon industriell aufgebrachten AgaroseOberflächen vereinfacht, so daß die Zell-Agarose-Suspensionen direkt ohne weitere Zwischenschritte auf die Objektträger-Felder aufgebracht werden können. Dies ermöglicht sehr kurze Prozessierungszeiten zwischen γ-Bestrahlung und Lyse, so daß die in dieser Zeit bereits ablaufenden Reparaturvorgänge so gering wie möglich gehalten werden können. 2) Für die Anfärbung der DNA im Fluoreszenzmikroskop wurde als Farbstoff das weniger toxische Sybr-Green statt des vorher verwendeten Ethidiumbromids eingeführt. Dadurch wurde zusätzlich der Nachweis der DNA empfindlicher. Darüber hinaus kann Sybr-Green zu Auswertungszwecken auch auf getrockneten Objektträgern angewandt werden, was eine Lagerung der Objektträger für spätere Analysen oder Zwischenuntersuchungen ermöglicht. Dies gestattet auch Nachuntersuchungen nach einer längeren Zeit des Lagerns der Objektträger (unter entsprechend geeigneten Bedingungen). Kapitel 4 | Ergebnisse 4.2 37 Bestimmung einer optimalen Dosis für die Charakterisierung der Reparaturkapazität in Lymphozyten Ausgangsmaterial für die Bestimmung der DNA-Reparaturkapazität nach γ-Bestrahlung in vitro waren kryo-konservierte periphere Blutlymphozyten von Brustkrebspatientinnen. Eine detaillierte Bestimmung der Fähigkeit einer Patientin, die durch γ-Strahlen ausgelösten DNASchäden zu reparieren, würde erfordern, das Ausmaß der Schädigung nach steigenden Dosen und ihr Verschwinden nach verschiedenen Reparaturzeiten zu messen. Für diesen hohen experimentellen Aufwand konnten aus den erhaltenen Blutproben aber nicht genügend periphere Blutzellen gewonnen werden. Daher sollte mit Hilfe von – den eigentlichen Untersuchungen vorgeschalteten – Dosis-Wirkungs-Experimenten und der entsprechenden Zeitkinetik die Dosis und Zeit ermittelt werden, bei denen sowohl die Anfangsschädigung als auch die Reparaturfähigkeit am besten charakterisiert werden können. Abbildungen 3.1 – A bis F (Seite 32 - 34) zeigen schematisch die Durchführung des Experiments. Die Lymphozyten eines gesunden Spenders wurden jeweils mit 0, 2.5, 5 und 10 Gy bestrahlt. Die dadurch verursachten DNA-Schäden – Einzelstrangbrüche und alkali-sensitive DNA-Schäden – wurden sofort nach der Bestrahlung (t1=0 min) sowie nach t2=15 min und t3=30 min nach Bestrahlung bestimmt. Um die DNA-Schädigung zu quantifizieren, wurde das Olive-Tail-Moment nach Durchführung der alkalischen Elektrophorese mit einem automatischen Meßsystem bei der fluoreszenzmikroskopischen Auswertung gemessen [Schmezer e t a l . , 2001]. Abbildung 4.1 zeigt die Ergebnisse der Dosis-Wirkungs-Untersuchung. Die angegebenen Werte sind Mittelwerte von jeweils 3 Medianen der 51 Einzelwerte. Man erkennt, daß direkt nach der Bestrahlung das Tail-Moment mit der Dosis ansteigt. Bei Zellen, die nicht bestrahlt wurden, blieb das Tail-Moment bei 1.0. Es wurde kein Schaden festgestellt. In den Abbildungen 4.2 und 4.3 sind zwei Zellen abgebildet: Abbildung 4.2 zeigt eine Zelle nach Bestrahlung und geringer Reparaturleistung, in der Abbildung 4.3 ist eine ebenfalls bestrahlte Zelle nach erfolgreicher Reparatur dargestellt. Nach 15 bzw. 30 min nimmt die DNA-Schädigung bei allen Dosen ab, die Zellen haben repariert. Dabei wird nach 30 min eine Reparatur-Leistung erreicht, die mindestens eine Halbierung Kapitel 4 | Ergebnisse 38 des ursprünglich gesetzten Schadens bewirkt und bis zu einer Reparaturleistung von 70 % reicht. In weiteren Experimenten wurden ähnliche Ergebnisse erzielt. Eine Messung des Tail-Moments der Zellen, die mit 20 Gy bestrahlt wurden, ist verworfen worden, da die erzielte Schädigung zu stark ist und nicht mehr als Fluoreszenz erfaßt werden kann. Diese sich bildenden Partikelwolken werden „ghosts“ genannt. Sie entstehen, wenn die Zellen (sei es durch etwaige Vorschädigungen – z.B. wenn keine ausreichenden Reparaturmechanismen mehr vorhanden sind – oder durch den Bestrahlungsprozeß an sich) so stark geschädigt sind, daß ihre DNA zerstört ist und nicht mehr repariert werden kann. Sie bestehen jeweils aus einer Wolke kleiner und kleinster DNAPartikelchen des zerstörten und nicht wieder reparierten Genommaterials. Diese „ghosts“ sind für eine automatische maschinelle Auswertung ungeeignet. In Abbildung 4.4 sind einige solcher nicht-auswertbaren „ghosts“ dargestellt. 30 25 TailMoment 20 15 10 5 0 0 Gy 2.5 Gy 5.0 Gy 10.0 Gy γ−Bestrahlung Reparaturzeit = 0 min Abbildung 4.1: Reparaturzeit = 15 min Reparaturzeit = 30 min Die Dosis-Wirkungs-Kurve von bestrahlten Lymphozyten einer ReferenzBlutprobe Kapitel 4 | Ergebnisse 39 Aufgrund der Dosis-Wirkungs-Kurve und der Vorstellung, daß für den Versuch nur eine begrenzte Anzahl von Patienten-Lymphozytenproben zur Verfügung steht, entschieden wir uns, die Zellen im Hauptversuch mit 5 Gy zu bestrahlen, da bei höheren Werten (10 bzw. 20 Gy) zu viele „ghosts“ entstehen würden, die nicht mehr automatisch ausgewertet werden könnten. Dadurch wurden die Meßwerte zu unsicher. Außerdem ist eine schnelle Auswertung deswegen nicht mehr möglich. Komet mit Kopf und Schweif, unter dem Fluores- zens-mikroskop sichtbar ge- macht. Abbildung 4.2: Lymphozyt nach Bestrahlung Eine Zelle ohne Schweifbildung nach einer Reparaturzeit von t3=30 min; hier sind alle Schäden DNArepariert worden. Abbildung 4.3: Bestrahlter Lymphozyt nach 30 min Reparaturzeit Bei Bestrahlungswerten von 2.5 Gy konnte die Schädigung zwar deutlich vom Hintergrund unterschieden werden; auch ist die Reparaturkapazität prozentual gleich wie bei der Bestrahlung mit Kapitel 4 | Ergebnisse 40 5 Gy. Dennoch ist bei letzterer der Meßbereich größer, was die Datenerhebung der Meßwerte sicherer macht. Als Meßpunkte wurde eine Reparaturdauer von 0, 15 und 30 min gewählt; um den Hintergrundschaden bestimmen zu können, wurde auch eine unbestrahlte Lymphozytenprobe als Referenzprobe hinzugefügt (siehe dazu auch Kapitel 3 – „Material/Methoden“). Abbildung 4.4: 4.3 Mehrere nicht auswertbare Zellen (sog. „ghosts“ ) Definition der DNA-Reparaturkapazität Die DNA-Schäden nach γ-Bestrahlung wurden im Komet-Assay als sogenanntes „Tail- Moment“ gemessen. Dies ist definiert als durchschnittliche Wanderungsstrecke der DNA im elektrischen Feld, multipliziert mit dem Prozentsatz an DNA im Kometen-Schweif: die sog. „Comet-Tail-Length“ spiegelt die Größe der gewanderten DNA wieder (je kleiner die Partikelchen, desto länger der Schweif, desto stärker ist die DNA geschädigt); die Intensität und die Helligkeit des Schweifes zeigen dagegen das Verhältnis von relaxierten zu den wirklich freien Partikeln an. Denn, wie Östling und Johanson beobachteten, ist das Ausmaß freigesetzter DNA aus dem Kometenkopf in den Schweif eine Funktion der Bestrahlungsdosis [Östling et Johan- Kapitel 4 | Ergebnisse 41 son, 1984]. Dabei spielen zwei Faktoren eine Rolle: Zum einen die Größe der DNA-Bruchstücke und zum anderen die Anzahl an „broken ends“ . Diese können zwar noch an größeren DNAPartikeln haften, aber auch schon eine gewisse Strecke selbst wandern [Fairbairn at al ., 1995]. Die DNA-Reparaturkapazität ist der Anteil des Schadens, der nach 15 oder 30 min repariert werden konnte. In einer Formel ausgedrückt heißt dies: DNA- Reparatur-Kapazität = 1 – (Tail-Moment bei 30 [15] min / Tail-Moment bei 0 min) Gemäß dieser Definition sind die Unterschiede zwischen guten und schlechten Reparierern deutlich zu erkennen. Gute Reparierer haben Werte, die sich nahe an der 1.0 befinden, während schlechte Reparierer Werte bei der DNA-Reparatur-Kapazität haben, die sich mehr der 0 annähern. 4.4 Einführung einer Referenzprobe Als interne Referenzprobe lief in unseren Versuchen in regelmäßigen Abständen die Probe eines gesunden Lymphozytenspenders aus der Blutbank der Heidelberger Universitätsklinik mit. Damit sollte überprüft werden, ob unerwartete Ergebnisse (z.B. viele „ghosts“ oder ein erhöhtes TailMoment der unbehandelten Kontrollen) durch experimentelle Faktoren – was dann in der Referenzprobe zu sehen wäre – oder durch etwaige Vorschädigung der Blutprobe – ohne Auswirkung auf die Referenzprobe – bedingt sind. Zusätzlich konnte damit der Variationskoeffizient der Methode bestimmt werden. Die in den einzelnen Versuchen erzielten Ergebnisse sind in der Tabelle V.B in Kapitel V.2 – „Tabelle der Referenzproben in numerischer Reihenfolge“ – im Anhang (Seite XVIII) aufgeführt. Bei den 16 Experimenten mit Zellen des Kontrollspenders fällt auf, daß das Tail-Moment der unbehandelten Kontrollen in allen Fällen unter 5 liegt, darüber hinaus liegen nicht mehr als 16 nichtauswertbare Zellen pro Objektträgerfeld vor. Kapitel 4 | Ergebnisse 42 Auffallend ist die hohe Schwankung der Daten in den verschiedenen Versuchsdurchgängen, die für die bestrahlten Zellen jeweils für die Kontrolle und die Meßzeiten t1, t2 und t3 bestimmt wurden. In Form eines Graphen stellen sich die Daten wie in Abb. 4.5. gezeigt dar. Median-Tail-Momente Verteilung der Referenz-Ergebnisse nach Reparaturzeit 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Kontrolle 0 min 15 min 30 min Reparaturzeit # 1 # 7 # 13 Abbildung 4.5: # 2 # 8 # 14 Verteilung der Reparaturzeiten # 3 # 9 # 15 Ergebnisse # 4 # 10 # 16 der # 5 # 11 Referenz-Probe, # 6 # 12 Median geordnet nach In einer anderen Darstellung dieser Werte (Abbildung 4.6) kann jedoch erkannt werden, daß die Reparatur in den einzelnen Versuchsdurchgängen unabhängig von der Höhe der Anfangsschädigung voranschreitet, die Schaden zu einem ähnlichen Prozentsatz repariert werden und die Ausgangswerte ( c f . „Kontrolle“) nahezu erreicht bzw. teilweise sogar überschritten werden. Die erhaltenen Daten der Referenzprobe wurden mit denen der Patientenproben verglichen, mit dem Ergebnis, daß die Streuung der Werte in der Patientengruppe größer war als bei den Referenzproben: Die Mittelwerte sind in den Abbildungen 4.5 und 4.6 jeweils neben den Einzelwerten der jeweiligen Referenzproben gesondert dargestellt. Kapitel 4 | Ergebnisse 43 Weil die Referenz-Probe von einer gesunden Person stammt, die daher normal auf Strahlung reagieren sollteχ, wurde der 90 %-Bereich der erhaltenen Werte dazu benutzt, sog. „Cut- Points“ , also Grenzwerte, zu bestimmen, um so den Bereich der normalen Strahlenreaktion zu begrenzen. Mit Hilfe des Mittelwertes und der Standardabweichung der Referenzprobe wurde für die Bestimmung der DNA-Reparaturkapazität ein Variationskoeffizient von 0.3 berechnet. Verteilung der Referenz-Ergebnisse nach Versuchsdurchgängen 20 18 Median-Tail-Momente 16 14 12 10 8 6 4 2 0 # 1 # 4 # 7 # 10 # 13 # 16 Median Proben-Nummer Kontrolle Abbildung 4.6: 0 min 15 min 30 min Verteilung der Ergebnisse der Referenz-Probe, geordnet nach Versuchsdurchgängen Obwohl die i n t r a - individuelle Variation bei unserem Einsatz des Komet-Assay bei 30 % lag, konnten Patientinnen mit Reparaturdefekten identifiziert werden, da der i n t er - individuelle Schwankungsbereich der DNA-Reparaturkapazität bedeutend höher ist als die experimentelle Variabilität des Komet-Assay. χ Wie weitergehende Untersuchungen in unserer Arbeitsgruppe zeigten, liegen die Werte des Lymphozytenspenders im Rahmen der Werte, die auch bei den Lymphozytenproben anderer Spender ermittelt wurden [Mayer e t a l ., 2002]. Kapitel 4 | Ergebnisse 4.5 44 Beschreibung der untersuchten Patientinnen In diesem Kapitel findet man eine Aufstellung darüber, welche Patientinnen mit ihren Proben in die Auswertung aufgenommen werden konnten und welche Kriterien dazu angelegt wurden. Darüber hinaus werden noch Angaben gemacht über die Probengewinnung und es wird auf die Versuchsdurchführung eingegangen. 4.5.1 Das Patientinnenkollektiv/Aufschlüsselung der Auswertung der Patientinnenproben Insgesamt umfaßt die Studie 478 Brustkrebspatientinnen. Alle erhielten eine Brust-erhaltende Operation, der eine Bestrahlung der Brust folgte. Im Rahmen unserer Teil-Studie zur experimentellen Messung der Strahlenempfindlichkeit wurden kryo-konservierte Lymphozyten-Proben der Patientinnen mit dem Komet-Assay analysiert. Es wurden 153 Proben untersucht, vier davon jedoch doppelt, so daß effektiv 149 einzelne Blutproben untersucht worden sind. Zusätzlich führten wir in unregelmäßigen Abständen 16-mal Lymphozyten-Proben eines gesunden Spenders als interne Kontrolle mit (s.o.). Von den 149 Patientinnen mußten 34 von der weiteren Auswertung ausgeschlossen werden, da sich zu Anfang des Versuchs, im Vitalitätstest nach der Stimulation, herausstellte, daß die Proben zu wenig lebende Zellen aufwiesen (bei vierzehn Proben konnte das Sichtfeld der NeubauerKammer mangels intakter Zellen noch nicht einmal ausgezählt werden), oder sich nach der Auswertung zu viele „ghosts“ etc. zeigten (näheres zu den Auswahlkriterien s.u.). Des weiteren konnten zwei Proben nicht verwendet werden, da die Patientinnen nicht den übrigen Auswahlkriterien der Studie genügten (z.B. schon einmal vorher bestrahlte Patientinnen; stattgefundene Boost-Therapie etc.). Daher blieben die Daten von 113 Patientinnen für den Vergleich mit der klinischen Strahlenempfindlichkeit übrig. Deren Auswertung ergab folgendes Bild: Kapitel 4 | Ergebnisse - 45 76 von ihnen waren in der Auswertung unauffällig, es gab keine Besonderheiten nach den oben angesprochenen Kriterien (Einzelheiten dazu siehe weiter unten in Kapitel 4.6. – „Ausschluß von Proben aufgrund von experimentellen Parametern“). - 22 Proben hatten kleinere, aber unbedeutende Auffälligkeiten (z.B. vereinzelt eine etwas größere Anzahl „ghosts“ als erwartet). - 15 Blutproben waren auffällig (deutlichere Abweichungen, mehr Meßpunkte sind betroffen). Allerdings war eine deutliche Reparaturleistung erkennbar. Die einzelnen Ergebnisse sind in der Tabelle V.A – „Patientenproben in numerischer Reihenfolge“ – im Anhang ab der Seite X zusammengefaßt. 4.5.2 Klinische Merkmale der Patientinnen Im Rahmen der TNM-Tumorklassifikation ließen sich die Patientinnen folgendermaßen zuordnen: Tabelle 4.A: Klinische Merkmale des Studienkollektivs Anzahl der Patienten Charakterisierungen (n=113) Prozent [%] To 1 0,9 T1 72 63,7 T2 31 27,4 Carcinoma in situ (CIS) 9 8,0 Tumor-Stagingδ δ Die einzelnen Staging-Untergruppen werden bei den Patientinnen addiert; so hat jede Patientin eine T, N und M-Charakterisierung des Tumors. Diese verschiedenen Stadien sind dann in einer Patientin jeweils noch kombiniert, so daß jede Patientin ihre eigene TNM-Klassenzusammensetzung hat (z.B. kann die Patientin XY einen Tumor im T2N1M0-Stadium haben). Kapitel 4 | Ergebnisse Tabelle 4.A [Fortsetzung]: 46 Klinische Merkmale des Studienkollektivs Anzahl der Patienten Charakterisierungen (n=113) Prozent [%] N0 81 71,7 N1 23 20,3 Nx 9 8,0 M0 81 71,7 M1 1 0,9 Mx 29 25,7 M unbekannt 2 1,8 Gut differenziert 20 17,7 Mäßig differenziert 73 64,6 Hoch undifferenziert 16 14,2 unbekannt 4 3,5 Gesamt-Dosis bis zu 50.4 Gy 4 3,5 52.0 Gy bis 56.4 Gy 20 17,7 56.8 Gy bis 60.4 Gy 47 41,6 62.0 Gy bis 66.4 Gy 41 36,3 70 Gy 1 0,9 5 x 2 Gy/Woche 92 81,4 5 x 1.8 Gy/Woche 21 28,6 Tumor-Grading Bestrahlung der Brust Aufteilung der GesamtBrustbestrahlung Kapitel 4 | Ergebnisse 47 Das Alter der Patientinnen liegt zwischen 36 und 80 Jahren, mit einem Durchschnittsalter von 60 Jahren. Im Tumor-Grading ergab sich, daß 70 Frauen (63,6 %) einen mäßig differenzierten, 20 (18,2 %) einen gut und 16 (14,5 %) einen wenig differenzierten Tumor hatten. Bei vier Patientinnen war der Tumorstatus unbekannt. Die histologische Untersuchung, also die feingewebliche Überprüfung der entarteten Zellen, zeigt, welche Tumor-Form vorliegt. Es gibt Unterschiede in der Malignität bei den verschiedenen Tumor-Arten. Tabelle 4.B gibt eine Übersicht über die Verteilung der verschiedenen Tumorarten in dem untersuchten Patientinnenkollektiv. Von den ursprünglich 478 Patientinnen erhielten 396 (83 %) eine begleitende Hormontherapie, 70 (15 %) erhielten keine; bei zwölf Patientinnen (2 %) war dies unbekannt. Die Strahlentherapie dauerte, je nach BK-Klassifikation der Patientinnen, zwischen 35 und 63 Tage mit einem Median von 46 Tagen. Bei den 113 Patientinnen, die schlußendlich in unsere Studie als auswertbar einfließen konnten, hatte die Gesamtdosis der Bestrahlung eine Verteilung von 50,4 bis 70 Gray mit einer Häufung bei 50,4 bis 56,4 Gy (20 Patienten oder 18 %), 56,4 bis 60,4 Gy (47 Patienten/42 %) und 60,6 bis 66,4 Gy (41 Patienten/36 %); vier Patientinnen wurden mit weniger als 50,4 Gy bestrahlt (entspricht 4 %) und eine Patientin (1 %) mit 70 Gy. Der Median hierbei lag bei 60 Gy. Die Boost-Dosis hatte eine Breite von 5 Gy bis zu 20 Gy, dabei lag der Median bei 10 Gy (die Boost-Dosis ist eine stärkere Strahlendosis, die zumeist am Ende eines Bestrahlungszyklus liegt und die Tumorzellen verstärkt abtöten soll). Tabelle 4.B: Vorkommen der verschiedenen histologischen Tumortypen unter den Patientinnen Histologischer Typ Vorkommen (n=113) Prozentualer Anteil [%] - rein speziell 14 12,4 - invasiv lobulär 18 15,9 Kapitel 4 | Ergebnisse Tabelle 4.B [Forts.] 48 Vorkommen der verschiedenen histologischen Tumortypen unter den Patientinnen - invasiv duktal 66 58,4 8 7,1 - gemischt 1 0,9 - unbekannt 6 5,3 - duktales Karzinom in situ 4.6 Ausschluß von Proben aufgrund von experimentellen Parametern Nicht alle bearbeiteten Blutproben (s.o.) konnten in die Auswertung mit einbezogen werden, da einzelne Versuchskriterien von den Normwerten abwichen. Die Proben wurden nicht in das Versuchsergebnis eingebracht, wenn folgende Kriterien negativ ausfielen: 1) Es wurden im Vitalitätstest nach der Stimulierung (mit Trypanblau durchgeführt) weniger als 50 % lebende Zellen gefunden. Durch die hohe Anzahl toter Zellen, die nicht reparieren können, würde die Auswertung des Komet-Assays verfälscht werden. 2) Es wurden während der Auswertung auf dem untersuchten Objektträgerfeld mehr als 20 „ghosts“ gefunden. Dies bedeutet, daß mehr als 50 % der im Mikroskop erscheinenden Zellen nicht ausgemessen werden können. Daher würde auch hier nur ein kleiner Teil der bestrahlten Population in das Versuchsergebnis eingehen. 3) Die unbestrahlten Kontrollen wiesen ein Tail-Moment größer als 15 auf. Dies bedeutet, daß bei diesen Blutproben eine Vorschädigung unbekannten Ursprungs vorlag; die Ergebnisse wären also nicht mit denen anderer Blutproben bzw. Patientinnen zu vergleichen. Kapitel 4 | Ergebnisse 4.7 49 Vergleich mit der Referenzprobe Betrachtet man die 16 Einzelergebnisse der mitlaufenden Referenzprobe, stellt man fest, daß bei diesen keine Überschreitungen der Ausschlußparameter vorkommen, wie Anzahl der „ghosts“ , Vitalität nach der Stimulation etc. Zu bemerken bleibt weiterhin, daß die Ergebnisse der mitlaufenden Referenz genau im Rahmen der Ergebnisse liegen, die wir in Versuchen mit anderen Spender-Lymphozyten erhalten haben, welche in weiteren Versuchen zur Zeit in unserem Labor untersucht werden [Mayer e t a l . , 2002]. Daher ist anzunehmen, daß der Spender der Referenzprobe normal auf Bestrahlungen reagiert. Induktion eines DNA-Schadens und Feststellung der DNA-Reparaturkapazität in γbestrahlten Lymphozyten von Brustkrebspatientinnen 4.8 Die Proben der 113 Patientinnen wurden mit γ-Strahlen behandelt. Zur Bewertung der Untersuchung der Blutproben mit dem Komet-Assay wurden vier Parameter ausgewählt: - Liegt eine Vorschädigung oder ein Hintergrundschaden vor? Dann weisen auch Zellen ohne Bestrahlung ein erhöhtes Tail-Moment auf. - Sensitivität: Das Tail-Moment direkt nach der Bestrahlung mit 5 Gy ohne Reparaturzeit zeigt den ursprünglich gesetzten DNA-Schaden an. - Die DNA-Reparaturkapazität, bestimmt nach t2=15 min und t3=30 min. - Die DNA-Reparaturkapazität für das Zeitintervall zwischen 15 und 30 min. Im folgenden werden drei Boxplots dargestellt. Dies ist eine visualisierte schematische Häufigkeitsverteilung: Zwischen dem ersten und dritten Quartil wird ein Kasten aufgebaut, in diesen Bereich fallen 50 % der Beobachtungen. Die seitlich angesetzten „Schnurrhaare“ vermitteln einen Eindruck, wie weit die restlichen 50 % der Werte streuen. Die nachfolgend aufgeführten Boxplots stellen zum einen die Hintergrund- bzw. Vorschädigung in nicht-bestrahlten Zellen (der Proben der Brustkrebspatientinnen) im Vergleich zur ebenfalls Kapitel 4 | Ergebnisse 50 nicht bestrahlten Referenzprobe (des gesunden Spenders) dar (Boxplot 1/Abbildung 4.8); den induzierten DNA-Schaden (Boxplot 2/Abbildung 4.9) und die DNA-Reparaturkapazität nach t2=30 min für die Patienten- und die Referenzgruppe (Boxplot 3/Abbildung 4.10) (mit den Daten der t1-Gruppe wurde ähnlich verfahren): 60 Hintergrundschäden in nichtbestrahlten Zellen Tail-Momente] 50 40 30 20 10 0 0 1 Referenzprobe 2 Brustkrebspatientinnen 3 Abbildung 4.8: Boxplot 1: Hintergrund-Schädigung in nicht-bestrahlten Zellen In den Boxplots sind jeweils die Daten aller Patientinnen für einen Reparaturparameter zusammengefaßt. Besonders hervorgehoben sind die Mediane und die 10., 25., 75. und 90. Perzentile. Gegenübergestellt findet man die Ergebnisse der Referenzprobe des gesunden Lymphozytenspenders, jeweils im linken Boxplot dargestellt. Aus den drei Abbildungen (Boxplot 1 bis 3) läßt sich erkennen, daß sowohl die Patienten- als auch die Referenzprobe nahezu identische Median- (durchgezogene Linien) und Mittelwerte (gestrichelte Linien) haben. Ebenfalls ähnliche Werte ergeben sich, wenn man die Ergebnisse der Patienten-Zellen und der Referenz-Proben innerhalb der 25. und 75. Perzentile betrachtet: Patienten-Zellen werden als „normal“ reagierend auf die γ-Strahlen beschrieben, wenn ihre Werte innerhalb des 25-75 %-Bereichs des internen Standards liegen. Auch die Patienten, die weniger Schaden in nicht-bestrahlten oder bestrahlten Zellen aufweisen (Boxplot 4.1 und 4.2) oder eine höhere DNA-Reparaturkapazität haben (Boxplot 4.3), als es im 25-75 %-Intervall festgelegt ist, werden als normal-reparierend dargestellt. Es fällt allerdings auf, daß die Streuung der Einzelergebnisse bei den Patientinnen breiter ist. Kapitel 4 | Ergebnisse 51 DNA-Schäden, induziert durch γStrahlung [Tail-Momente] 60 50 40 30 20 10 0 1 Referenzprobe DNA-Reparaturkapazität [1-(Tail-Moment30min/ Tail-Moment0min)] Abbildung 4.9: 2 Brustkrebspatientinnen Boxplot 2: Durch Bestrahlung mit 5 Gy induzierte DNA-Schäden 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Abbildung 4.10: 0 1 Referenzprobe 2 Brustkrebspatientinnen 3 Boxplot 3: DNA-Reparaturkapazität nach 30 min Für den Vergleich zwischen den Ergebnissen der in vitro- Experimente und den klinisch ermittelten Reaktionen der Patientinnen auf die Bestrahlung wurden die Ergebnisse der Referenzprobe herangezogen, die von einem guten Reparierer stammen. Die Grenzwerte bei der Berechnung wurden so gesetzt, daß 75 % der Blutbank-Ergebnisse als normal angesehen wurden; die Ergeb- Kapitel 4 | Ergebnisse 52 nisse, die außerhalb dieser 75 %-Grenze liegen, wurden als schlecht (15 %) oder sehr schlecht (10 %) bewertet. Die Tabelle 4.C faßt die Grenzen für die Bewertungen zusammen. Tabelle 4.C: Parameter Grenzwerte der Bewertungs-Parameter normal erniedrigt/erhöht niedrig/hoch 1,00 – 0,47 < 0,47 - 0,32 < 0,32 Sensitivität 0 - 14,4 > 14,4 - 18,7 > 18,7 Vorschädigung 0 - 2,43 > 2,43 - 3, 53 > 3,53 Reparaturkapazität Betrachtet man die einzelnen Parameter der 113 untersuchten und in die Statistik aufgenommenen Patientinnenproben, so wurde eine Häufigkeitsverteilung gefunden, die in Tabelle 4.D dargestellt ist. Errechnet man die Korrelationen zwischen den einzelnen Assay-Parametern, so erhält man eine kleine, aber signifikante Rang-Korrelation zwischen den DNA-Schäden, die in nicht-bestrahlten Zellen vorliegen, und dem dann induzierten DNA-Schaden (r=0.68 und p=0.0001); sowie eine ebenfalls schwache, aber dennoch signifikante Korrelation zwischen dem induzierten DNASchaden und der DNA-Reparaturkapazität nach 30 min Reparaturdauer (r=0.28, p=0.0032). Das bedeutet, daß eine hohe Vorschädigung (ein großes Tail-Moment in der unbestrahlten Kontrolle) mit einer hohen Sensitivität (einem großen Tail-Moment bei 0 Minuten Reparatur) verbunden ist. Eine signifikante Korrelation zwischen DNA-Schäden, die in nicht-bestrahlten Zellen vorlagen, und der DNA-Reparaturkapazität nicht gefunden werden. Kapitel 4 | Ergebnisse Tabelle 4.D: 53 Häufigkeit verschiedener Kategorien von Reparaturkapazität, Sensitivität und Vorschädigung im Patientinnen-Kollektiv erniedrigt/ Parameter normal Reparaturkapazität 92 (82 %) 14 (12 %) 7 (6 %) 113 (100 %) Sensitivität 91 (80 %) 10 (9 %) 12 (11 %) 113 (100 %) Hintergrundschaden 99 (88 %) 6 (5 %) 8 (7 %) 113 (100 %) erhöht niedrig/ hoch gesamt Von all den Proben der Patientinnen, die wir untersucht haben, wichen einige Daten offensichtlich deutlich von dem gesetzten Rahmen ab, der in den Boxplots 4.1 bis 4.3 als schraffierte Fläche dargestellt ist: All die Patientinnen, deren in vitro- Ergebnisse außerhalb der 90. Perzentile des internen Standards lagen, wurden als nicht normal angesehen: Sie weisen abnormale experimentelle Marker auf und zeigen daher eine „hochsensitive“ Reaktion der Zellen auf γBestrahlung. Dies betrifft acht Patientinnen, deren Hintergrund-Schaden sehr stark ist (Boxplot 4.1); zwölf Patientinnen mit stark erhöhtem DNA-Schaden in den bestrahlten Zellen (Boxplot 4.2); sieben Patientinnen mit erniedrigter DNA-Reparaturkapazität nach jeweils 15 und 30 min (Boxplot 4.3) und zwölf Patientinnen, deren DNA-Reparaturkapazität, bestimmt im Zeitintervall zwischen 15 und 30 min, reduziert ist (siehe Tabelle 4.D). Sie gehören daher in die Kategorie „sehr sensitiv“ in bezug auf Strahlensensitivität. Patientinnen wiederum, deren Werte zwischen der 76. und 89. Perzentile der Referenzprobe liegen, wurden als „mäßig sensitiv“ eingestuft. Dies waren sechs Patientinnen mit erhöhtem Hintergrund-Schaden; zehn mit verstärkten DNA-Schäden durch Bestrahlung und jeweils 26, 14 und 15 Kapitel 4 | Ergebnisse 54 mit reduzierter DNA-Reparaturkapazität, jeweils betrachtet nach der DNA-Reparaturkapazität nach 15 und 30 min und im Zeitintervall zwischen diesen beiden Werten. In keinem Fall wurden Abweichungen vom Normbereich in einem jeden der vier oben aufgeführten experimentellen Parameter gefunden; drei von sieben Patientinnen entwickelten jedoch eine sehr geringe DNA-Reparaturkapazität sowohl zu den Zeitpunkten t1 als auch t2. 4.9 Vergleich der DNA-Reparaturkapazität mit der klinisch ermittelten Strahlenempfindlichkeit in Form von Hautreaktionen Wie weiter oben schon angemerkt, wurden als Klassifikationsmerkmale für die Feststellung der klinischen Radiosensitivität die akuten Strahlenschäden der Haut im Bestrahlungsgebiet der Brust untersucht. Dies fand bei allen 113 Brustkrebs-Patientinnen, die in unsere Studie eingeschlossen waren, nach einer Bestrahlungsdosis von 50.4 Gy, also zum Zeitpunkt der dritten Nachkontrolle im Behandlungszyklus (siehe Graphik 3.2 – „Schematischer Ablauf der Datenerhebung“), statt, denn bis zu diesem Zeitpunkt verläuft das Bestrahlungsprotokoll für alle Patientinnen in allen Kliniken etwa gleich. Sechs Patientinnen zeigten keinerlei Nebenwirkungen, sie tolerierten die Strahlentherapie ohne Probleme. 87 Patientinnen hingegen entwickelten leichte bis mittelschwere Hautreaktionen. Weitere 20 Patientinnen zeigten bereits stärkere Hautreizungen, von denen sechs Patientinnen eine so schwere Hautschädigung ( Desquamation) aufwiesen, daß daraufhin deren Therapie unterbrochen werden mußte. Diese sechs Patientinnen fallen daher in die Kategorie „hohe klinische Radiosensitivität“. Die Tabelle 4.E zeigt eine Aufstellung der Häufigkeiten der Nebenwirkungen der 113 Patientinnen. Kapitel 4 | Ergebnisse Tabelle 4.E: Stufe 55 Einteilung der Nebenreaktionen, die nach der Bestrahlung der 113 Brustkrebspatientinnen mit 50 Gy aufgetreten sind Nebenreaktionen der Haut nach der dritten Patienten mit Haut- Kontrolluntersuchung oder Bestrahlung mit ca. reaktionen in absolu- 50 Gy ten Zahlen ... in Prozent 0 - Keine Veränderungen 6 (5,3 %) 1 - schwaches Erythem, 43 (38,1 %) - Epilation; - trockene Desquamation; - reduzierte Schweißsekretion; - leichtes Ödem - stärkeres Erythem; 44 (38,9 %) - mäßiges Ödem 2b - schweres Erythem 14 (12,4 %) 2c - Mindestens eine feuchte Desquamation; 6 (5,3 %) - Therapieunterbrechung wegen zu star- 0 --- 2a ker Nebenwirkungen 3 - verschiedene oder sich vereinigende Desquamationen Kapitel 4 | Ergebnisse Tabelle 4.E [Forts.]: Stufe 56 Einteilung der Nebenreaktionen, die nach der Bestrahlung der 113 Brustkrebspatientinnen mit 50 Gy aufgetreten sind Nebenreaktionen der Haut nach der dritten Patienten mit Haut- Kontrolluntersuchung oder Bestrahlung mit ca. reaktionen in absolu- 50 Gy ten Zahlen ... in Prozent - 4 - Ulzerationen; - Hämorrhagie; - Nekrosen 0 --- In der klinischen Radiosensitivitäts-Prüfung wurden sechs Patientinnen erkannt, die schwere Hautreaktionen des Typs 2c vor der dritten Inspektion zeigten. Bei unserer Studie wurde vorab definiert, daß das Auftreten von Hautveränderungen des Typs 2c bis zur 3. Untersuchung (also bis zum Beginn der Boost-Bestrahlung) als besonders auffällig gilt. Nach unserer Arbeitshypothese sollten nun die Patientinnen, die eine klinische Empfindlichkeit auf die Bestrahlung zeigten, auch Auffälligkeiten in den experimentell ermittelten Parametern zeigen. Tabelle 4.F zeigt eine Gegenüberstellung der Patientinnen mit Hautreaktionen nach der klinischen Bestrahlung und der Patientinnen mit veränderten Reparaturparametern aus dem Patientinnenkollektiv. Aus dieser Gegenüberstellung ist erkennbar, daß von den sechs in der klinischen Reaktion auffälligen Patientinnen bei der Bestrahlung mit 5 Gy in vitro sich in nur einem Falle eine erhöhte und in einem Fall eine hohe Sensitivität zeigte. Verglichen mit der Gruppe der 107 klinisch unauffälligen Patientinnen, von denen in unserer Studie 9 eine erhöhte und 11 eine hohe Sensibilität nach dem Bestrahlungsvorgang in vitro zeigten, muß diese Beobachtung jedoch als nicht signifikant gelten. Eine statistische Berechnung der Signifikanz ist aufgrund der geringen Gruppengröße nicht möglich. Kapitel 4 | Ergebnisse 57 Anhand der Daten von Tabelle 4.F ist zudem sichtbar, daß die sieben als sensitiv in bezug auf DNA-Reparatur-Kapazität nach 15 min herausgefundenen Patientinnen nicht dieselben sind, die auch in der klinischen Bestrahlung die auffälligen Hautveränderungen zeigten. Zusammenfassend läßt sich daher sagen, daß keine der klinisch-auffälligen (sensitiven) Patientinnen ebenfalls abnorme Werte in einem der drei experimentellen Parametern zeigten oder hohen Hintergrundschaden in den Lymphozyten oder sehr geringe DNA-Reparaturkapazität nach 15 oder 30 min. Das zeigt an, daß keine offensichtliche Korrelation besteht zwischen akuter Hautreaktion nach Bestrahlung in vivo und den in vitro - bestimmten Strahleneffekten in Lymphozyten, die in unseren Versuchen untersucht wurden. Sieht man den DNA-Schaden (gesetzt mit 5 Gy) als einen experimentellen Marker an, der die klinische Radiosensitivität bestimmt, so zeigen zwei der sechs sensitiven Patienten einen verstärkten oder hohen Schaden. Daneben zeigen auch zwei der sechs Patientinnen mit 2c-Reaktionen während der Radiotherapie eine reduzierte DNSReparaturkapazität im Zeitintervall zwischen 15 und 30 min. Weil diese Studie prospektiv angelegt war, konnte nur eine kleine Anzahl von Patientinnen anhand der Versuche als „strahlensensitiv“ erkannt werden: Es wurden aus logistischen Gründen nur die Frühschäden nach der Bestrahlung erfaßt; Spätschäden, die bis zu mehreren Jahren nach Abschluß einer Strahlen-Therapie auftreten können, müssen in gesonderten Studien betrachtet werden (weiteres dazu siehe im Kapitel 5 – „Diskussion“ und Kapitel 6 – „Ausblick“). Die statistische Signifikanz unserer Beobachtungen konnte daher rechnerisch nicht verifiziert werden. In der abschließenden Tabelle (auf den folgenden beiden Seite abgebildet) sind verschiedene Komet-Assay-Parameter wie Reparaturkapazitäten nach verschiedenen Zeiten (15 Minuten, 30 Minuten sowie der Zeitraum zwischen 15 und 30 Minuten) und Vorschädigungs- und Sensitivitätswerte dargestellt und werden den Ergebnissen der klinischen Strahlenempfindlichkeit gegenübergestellt, wie sie bis zur dritten Untersuchung erkannt wurden. Kapitel 4 | Ergebnisse Tabelle 4.F: 58 Komet-Assay-Parameter in Abhängigkeit von der klinischen Strahlenempfindlichkeit, definiert als Auftreten von 2c-Reaktionen bis zur 3. Untersuchung Auftreten von Typ-2c-Reaktionen bis zur 3. Untersuchungε ja (n=6) nein (n=107) Reparaturkapazität nach 15 minφ - normal 5 73 - erniedrigt 1 25 - niedrig 0 7 Reparaturkapazität nach 30 min - normal 5 87 - erniedrigt 1 13 - niedrig 0 17 Reparaturkapazität zwischen 15 und 30 minφ - normal - erniedrigt 4 80 - niedrig 2 13 0 12 - Vorschädigung ε - normal 6 93 - erhöht 0 6 - hoch 0 8 Patientinnen, die eine feuchte Desquamation der Haut entwickelten oder die Strahlentherapie wegen der Nebeneffekte unterbrechen mußten, wurden gemäß den „ C o m m o n T o x i c i t y C r i t e r i a “ [Cancer Therapy Evaluation Program, 1998] als „Typ 2c“ klassifiziert. φ Für zwei Patientinnen konnte die DNA-Reparaturkapazität nach 15 min nicht bestimmt werden. Kapitel 4 | Ergebnisse Tabelle 4.F [Forts.]: 59 Komet-Assay-Parameter in Abhängigkeit von der klinischen Strahlenempfindlichkeit, definiert als Auftreten von 2c-Reaktionen bis zur 3. Untersuchung Sensitivität (= DNA-Schaden bei 5 Gy) - normal 4 87 - erhöht 1 9 - hoch 1 11 Kapitel 5 | Diskussion 60 5. DISKUSSION 5.1 Grundlagen der vorliegenden Arbeit Bei der Strahlentherapie gelten sowohl akute als auch erst später auftretende Überempfindlichkeitsreaktionen des bestrahlten gesunden Gewebes (und ggf. seiner Umgebung) als Dosislimitierende Faktoren, da nicht nur die entarteten Krebszellen, sondern alle Gewebe – mehr oder minder – strahlensensitiv sind und daher Einfluß auf des Bestrahlungsendergebnis nehmen können [Brock et al . , 1995; Sekine et al . , 2000]. Zu den wichtigsten Zielen eines Therapiekonzeptes zählt daher – neben dem Überleben des Patienten und der Tumorremissionsrate – das Auftreten von unerwünschten Nebenwirkungen im gesunden Gewebe zu vermindern oder im besten Falle ganz zu verhindern, was großen Einfluß auf die Lebensqualität hat [vgl. Seegenschmiedt et al . , 1999]. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine Möglichkeit zu finden, um Patientinnen schon vor einer Strahlentherapie ihr individuelles Risiko für das Auftreten unerwünschter Nebenreaktionen (wie z.B. Hautschäden) zu nennen, um dann – im Falle einer erhöhten Sensitivität dieser Patientinnen – entweder alternative Behandlungswege zu beschreiten oder die geplante Therapie bei den gefährdeten Patientinnen ihrer veränderten Verträglichkeit entsprechend zu modifizieren [Dubray et al . , 1997]. Die auslösenden Faktoren einer erhöhten Strahlenempfindlichkeit bei einem Patienten sind nur teilweise bekannt [Ben-Josef et al . , 1998; Choi et al . , 2001]. Da aber die in der Therapie verwendeten γ-Strahlen das Genom schädigen [Wheeler et Wierowski, 1983; Little, 1998; Belli et al . , 2003; Hande et al . , 2003; Heinloth et al . , 2003], liegt die Vermutung nahe, daß die Schädigung der DNA und die Fähigkeit, diese DNA-Schäden wieder aus dem Genom zu entfernen, wesentlich zur individuellen Strahlenempfindlichkeit beiträgt. Folglich lautete unsere Hypothese, daß die intrazellulären DNA-Reparaturmechanismen eine essentielle Rolle in der Vermeidung von zellulären Reaktionen auf die Bestrahlungsvorgänge bilden: eine effiziente DNA-Reparatur sorgt für eine verminderte Strahlenempfindlichkeit der betroffenen Zellen. Kapitel 5 | Diskussion 61 Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit wurden daher in einer prospektiven epidemiologischen Studie periphere Blutlymphozyten von Patientinnen, die sich einer Strahlentherapie unterziehen sollten, auf DNA-Schäden nach in vitro- Bestrahlung und deren Reparatur hin untersucht. Dazu wurde eine optimierte Version des alkalischen Komet-Assay eingesetzt. Die experimentell bestimmten Reparaturparameter wurden mit dem Auftreten von akuten Hautreaktionen im Bestrahlungsfeld während der Therapie verglichen. Als schädigendes Agens wurde in vitro γStrahlung verwendet: Zwar haben frühere Versuche gezeigt, daß radioaktive Strahlung ein relativ schwaches Karzinogen ist [Chadwig et al . , 1989; Little, 1989]; aber gegenüber Chemikalien, wie z.B. polyzyklischen Kohlenwasserstoffen, weist sie Vorteile auf: Die Strahlung kann Zellmembranen ungehindert durchdringen und erlaubt somit eine gleichmäßige, homogene Schädigung des Genoms [Fairbain et al . , 1995], die weitestgehend unabhängig von Zelleigenschaften ist. Darüberhinaus werden die Patientinnen in vivo therapeutisch ebenfalls mit γ-Strahlen behandelt. Mit derart identischen Strahlungsarten ist es möglich, die Reparaturkapazität der Zellen nach der in-vitro- Bestrahlung mit γ-Strahlen unmittelbar mit den klinischen ( in vivo ) Symptomen nach der therapeutischen γ-Bestrahlung zu korrelieren. Daher ist ein direkter Vergleich zwischen den experimentellen Ergebnisse und den klinischen Effekten möglich. 5.2 Bestimmung von Strahlensensitivität durch Messung der DNA-Reparatur Radiosensitivität von Geweben beruht auf verschiedenen Zell- und Enzymsystemen, die durch die Strahlung geschädigt werden können. Viele genetische Faktoren sind beteiligt. Unter anderem werden Veränderungen verschiedener Entzündungsreaktionen als ein wesentlicher Faktor bei der Entstehung der Strahlenschäden angesehen [Senyuk et al . , 2002; Wong et al . , 2003]. Allerdings ist eine intakte DNA unabdingbare Voraussetzung dafür, daß die Zelle normal funktioniert. Daher war unsere Hypothese, daß das Wiederherstellen der Integrität der DNA eine wichtige Rolle im Vermeiden von unerwünschten Zellreaktionen nach Bestrahlung des Genoms spielt und somit eine adäquate Reparatur von DNA-Schäden die Strahlensensitivität der Zelle heruntersetzt. Zusätzlich spielen bei der Entstehung des Mamma-Karzinoms defekte Tumorsuppressorgene eine nicht unbedeutende Rolle, wie z.B. Mutationen in den Brustkrebs-typischen BRCA 1 / 2 -Genen [Coleman, 1999; Leong et al., 2000] oder im p53-TumorsuppressorGen. Gerade diese Gene sind mit der Regulation von Reparaturvorgängen, der Zell-ZyklusKontrolle, dem Zell-Wachstum und bei Apoptosevorgängen beteiligt [Deng et Brodie, 2000]. Kapitel 5 | Diskussion 62 Tests, um diese DNA-Defekte direkt spezifisch herauszufinden, sind zur Zeit teilweise allerdings sehr aufwendig [Angele et Hall, 2000] und klinisch bis aus weiteres noch nicht einsetzbar. Nach γ-Bestrahlung können in der Zellkern-DNA verschiedene Arten von DNA-Schäden entdeckt werden: Sowohl Einzel- als auch Doppelstrangbrüche sowie darüber hinaus eine große Anzahl von weiteren Veränderungen des Erbgutes werden durch diese hervorgerufen. Entweder sind dies direkte Schäden durch die Strahlen oder sie werden durch freie Radikale vermittelt, die entstehen, wenn es durch die Strahleneinwirkung zur Radiolyse des Wassers kommt [von Sonntag, 1999; Ward, 1999]. Es kommt außerdem zu Cluster-DNA-Schäden, wenn die ionisierende Strahlung an einigen Stellen stochastisch bedingt konzentrierter auf das genetische Material auftrifft als an anderen DNA-Abschnitten (s.o.) und dieses daher dann dementsprechend stärker schädigt [Ward, 1999]. Der in dieser Arbeit eingesetzte alkalische Komet-Assay besitzt die Möglichkeit, auch geringe Mengen dieser DNA-Schäden (hauptsächlich Einzelstrangbrüche und Schäden an alkali-labilen Stellen [Henderson et al . , 1998; Tice et al . , 2000]) zu erkennen. Hingegen werden Doppelstrangbrüche und ihre Reparatur, die als grundlegend für das Zell-Überleben angesehen werden [Carlomagno et al., 2000], durch den Komet-Assay nicht in ausreichendem Maße erkannt und aufgedeckt [Iliakis, 1991; vgl. auch Kapitel 1 – „Einleitung“]. Diese werden, nach fehlender oder falscher Reparatur, als ursächlich sowohl für Chromosomenabnormalitäten als auch für GenMutation in diesen Zellen angesehen, die bis hin zum Zelltod oder – für den Organismus fataler – zu malignen Entartungen führen können; sie korrelieren also mit Strahlenschäden auf zellulärer Ebene [Dikomey et al ., 1998]. Sie sind seltener als die Einzelstrangbrüche, allerdings wegen ihrer Auswirkungen besonders relevant, da sich auch nach vielen Zellteilungen in den nachfolgenden Generationen Mutationen und andere Veränderungen im Erbgut ergeben können [Little, 2000]. Auch lokale Häufungen mehrerer Schäden kommen vor und addieren sich dann in ihrer schädigenden Potenz. Darüber hinaus sind Strangbrüche auch noch für die höhergradige Chromatin-Struktur schädlich, da sie das Super-Coiling und die dichte Packung innerhalb des Nucleus stören. Da aber bei der Bestrahlungsdosis von 5 Gy, die in unserem Versuch bei den Zellen in vitro angewandt wurde, die DSB nur in geringer Anzahl entstehen, überwiegen die zum überwiegenden Teil mit dem Komet-Assay gut detektierbaren Einzelstrangbrüche. Daher ist ihre Reparaturkapazität repräsentativ für die entstehende Schadensbeseitigung. Kapitel 5 | Diskussion 63 Für die Untersuchungen wurden periphere Blutlymphozyten gewählt, die sehr einfach durch Blutentnahme vom Patienten gewonnen werden können. Diese Zellen sind allerdings nicht die Zielzellen, welche die Nebenreaktionen bei der Brustkrebs-Bestrahlung bedingen; dies sind hauptsächlich die Epidermiszellen im Bestrahlungsfeld [Johansen et al . , 1996; Kiltie et al., 1999 b]. Gemäß unserer Hypothese nehmen wir aber an, daß ein genetischer Hintergrund für mögliche DNA-Reparaturprozesse besteht [Gatti, 2001], so daß die Strahlensensitivität – als Konsequenz eines fehlgeleiteten Reparaturprozesses – auch in Surrogat-Zellen wie Lymphozyten meßbar sein sollte [Barber et al., 2000 b; West et al., 2001]. Die Zellantwort auf Schäden an der DNA, die (in unserem Fall) durch Bestrahlung entstehen, besteht hauptsächlich in der Reparatur dieser Schäden sowie Veränderungen der normalen Zellphysiologie wie dem temporären Innehalten des Zellzyklus an spezifischen „cell -cyclus- checkpoints“ in den G 1 -, G 2 - und M-Phasen [Lowndes et Murguia, 2000; Zhou et Elledge, 2000], so daß ein weiteres Durchlaufen des Zyklus’ dieser geschädigten Zelle auf diese Weise verhindert wirdγ. Es gibt durch Radioaktivität hervorgerufene genetischen Instabilitäten, die zu Mutationen in Tochterzellen der bestrahlten Zelle führen und von Generation zu Generation akkumulieren können [Chang et Little, 1992; Little et al., 1997; Little, 2000]. Auch benachbarte, nicht bestrahlte Zellen können durch Inter-Zell-Verbindungen ( „gap junctions“ ) Veränderungen erfahren (cf. „bystander-effect“ ) [Azzam et al., 1998; Prise et al . , 1998; Little, 2000]. Mit Hilfe des Komet-Assays haben wir die DNA-Reparaturfähigkeit nach spezifischen, durch γStrahlung hervorgerufenen Schädigungen (oxidative Schädigung, Doppel- und Einzelstrangbrüche, Schädigungen an alkali-labilen Stellen, s.o.) messen können; diese Schädigungen werden dabei prinzipiell festgestellt [Trenz et al . , 2002]. Um andere wichtige Faktoren, Schädigungen (insbesondere Doppelstrangbrüche) und Biomarker zu untersuchen und um deren Einfluß auf die auftretenden Strahlenschäden zu untersuchen, müssen alternative Versuche angesetzt werden, entweder mit einer Abwandlung des Komet-Assay oder anderen Untersuchungsmethoden [Alapetite et al., 1999; Oppitz et al., 1999; Müller et al., 2001]. γ Anmerkung: Der Zustand der DNA spielt auch bei ihrem Verhalten im KOMET-ASSAY eine Rolle: DNA von Zellen, die sich in der S-Phase befinden, zeigen deutlich mehr Schäden als Zellen aus anderen Zell- Kapitel 5 | Diskussion 64 Mittlerweile sind eine ganze Anzahl von verschiedenen, individuellen Tests zu diesem Zweck entwickelt worden, wie z.B. der Klonogene-Zellüberlebens-Nachweis ( Cl onogenic-SurvivalTest) [Weisenthal et Lippman, 1985; Geara et al., 1993; West et al., 1995; Dorr, 1998; Peacock et al., 2000], der MTT-Reduktionstest ( M TT-Dye-Conversion ) [Bank et al., 1991; Weichert et al., 1991] und der Mikronukleus- ( Micronuclei ) - Test [Scott et al., 1998; Scott et al., 1999; Barber et al., 2000 b; Scott, 2000] sowie der Halo-Assay- Test [Roti Roti et Wright, 1987], die Pu l s -Feld-Gelelektr ophor ese ( Pulsed-Field-Gel- Electrophoresis , PFGE) oder der von uns verwendete alkalische Komet-Assay [Sarkaria et al., 1998 u.a., siehe Kapitel 2 – „ Einleitung“]. All diese Tests waren jedoch in der Praxis nicht zufrieden stellend anzuwenden, zumindest nicht im Hinblick auf einen möglichen klinischen Einsatz als allgemeine Screening-Methode (vgl. Kapitel 2). Wie weiter oben schon bemerkt, sind die Reparaturgeschwindigkeiten bei den verschiedenen Schädigungsarten (Einzel- und Doppelstrangbrüche sowie Cluster-Schäden oder Schäden an alkali-labilen Stellen) unterschiedlich: Beispielsweise werden die Einzelstrangschäden schneller repariert (innerhalb von Minuten nach der Bestrahlung) als Doppelstrangschäden, deren Reparatur mehr als zwei Stunden dauern kann [Ward, 1999]. Um dieser Tatsache gerecht zu werden, wurde das späte Reparaturintervall zwischen t2=15 und t3=30 min. separat untersucht, da so die Schäden bzw. ihre Reparatur – auch in Hinsicht auf ihre klinische Relevanz – getrennt betrachtet werden können. So kann die Tatsache, daß zwei Patienten mit Grad-2c-Hautreaktionen im (späten) Reparaturintervall zwischen 15 und 30 min. eine reduzierte DNA-Reparaturkapazität zeigen, darauf hinweisen, daß die Beobachtung von DNA-Schäden mit „langsamer Reparaturkinetik“ mehr Informationen liefern, um die klinischen Symptome erklären, als dies bei der Betrachtung von DNA-Läsionen einer „schnellen“ Reparaturkinetik (wie es z.B. bei Einzelstrangbrüche oder Schäden an alkali-labilen Stellen) der Fall wäre. 5.3 Einsatz des alkalischen Komet-Assay für die Identifizierung von Patienten mit verstärkter in vitro- Radiosensitivität Die experimentelle Identifizierung von strahlenempfindlichen Patientinnen erfolgte durch Messung der Strahlenschädigung und DNA-Reparaturfähigkeit nach γ-Bestrahlung mit der alkalischen Mikrogelelektrophorese/Komet-Assay. Die generelle Vorgehensweise beim Komet-Assay zyklus-Phasen, was man darauf zurückführt, daß die Struktur der sich replizierenden DNA die Wanderung derselben im elektrischen Feld hemmt [McKelvey-Martin e t a l . , 1993]. Kapitel 5 | Diskussion 65 ist in Kapitel 3 – „Material/Methoden“ – beschrieben worden. Als wichtig herauszustellen bleibt, daß vor dem Start des eigentlichen Versuchs die Bedingungen zunächst optimiert wurden, u.a. durch die Einführung neuer Objektträger und dem Mitlaufenlassen einer Referenzprobe in 26 Versuchsdurchgängen, bestehend aus Lymphozyten eines gesunden Spenders (vgl. dazu Kapitel 4.1 – „Optimierung der Einzelzell-Mikrogelelektrophorese [...]“). Durch den Vergleich mit der Referenzprobe konnte die Reproduzierbarkeit des Komet-Assays bestimmt und mit den daraus gewonnen Daten die intra-experimentelle Variabilität (ca. 30 %) festgestellt werden [siehe dazu Graphik 4.5 bzw. Abbildung 4.6]. Weiterhin wurde bei den einzelnen Versuchsdurchgängen während des Versuchsablaufs auf eine möglichst einheitliche Vorgehensweise geachtet, so daß versucht wurde, hohe interexperimentelle Variabilitäten zu vermeiden. Problem bei der Studie war, daß einige Blutproben sehr viele tote oder vorgeschädigte Zellen enthielten (von den 149 insgesamt an dem Versuch teilgenommenen Proben waren es 13, bei denen weniger als die 51 erforderlichen Zellen auszählbar waren; weitere 13 Proben konnten wegen mangelnder Zellzahlen überhaupt nicht ausgewertet werden; vgl. Tabelle IV.A. – „Patientenproben in numerischer Reihenfolge“ – im Anhang), was sich schon bei der Vitalitätsüberprüfung nach der Stimulation an der geringen Zellanzahl zeigte. Diese Blutproben wurden ausgesondert und konnten nicht in den Vergleich mit der klinischen Strahlenempfindlichkeit mit einbezogen werden; dazu wurden Ausschlußkriterien aufgestellt, die von den Probenergebnissen zu erfüllen waren (nähere Einzelheiten zu diesen Kriterien in Kapitel 4.6 – „Ausschluß von Proben aufgrund von experimentellen Parametern“). Als problematisch erwies sich auch das Auftreten der sog. „ghosts“ in den experimentellen Ergebnissen, welche in einigen Patientinnenproben wegen der vorgeschädigten Zellen überhand nahmen, so daß es schwierig wurde, in diesen Proben überhaupt die Standards der Versuche einhalten zu können. Alle prä-experimentellen Bedingungen und äußere Einwirkungen, die vor Beginn des eigentlichen Versuchs an den Proben vorgenommen wurden, konnten von unserer Seite nicht beeinflußt werden. Allerdings könnte in den früheren Schritten der Behandlung der Zellen ein Grund für das Auftreten etwaiger Fehler liegen, denn die Lymphozyten wurden im Rahmen der Experimente vielen Bearbeitungsschritten unterzogen: Probenentnahme in den peripheren Krankenhäusern (mit der Gefahr unterschiedlicher Behandlung), das Verschicken nach Heidelberg ins Labor, die Kapitel 5 | Diskussion 66 Aufbereitung und Trennung der Lymphozyten von den übrigen Blutbestandteilen, die Lagerung im flüssigen Stickstoff und das Stimulieren bis zum endgültigen Versuch mit Bestrahlung, dem Reparaturschritt, Fixation und der Auswertung. Nur bei den letzten Schritten (ab der Stimulierung) konnten wir für die standardisierten und kontrollierten Bedingungen garantieren. Da man allerdings im Nachhinein nicht mehr feststellen kann, ob die Schädigungen (erkennbar an einer geringen Zellanzahl nach der Stimulation) entweder durch prä-experimentelle Bedingungen entstanden sind oder sie aber einen Hinweis darstellen auf eine klinisch bedeutsame Empfindlichkeit in Bezug auf radioaktive Strahlung, haben wir solche Proben von der Auswertung ausgeschlossen. Allerdings ist es schwierig, einen einzelnen Versuchsschritt für die Fehler verantwortlich zu machen, beispielsweise die Kryo-Konservierung an sich [Tice et al., 1992]. Auch längerfristiges Lagern in flüssigem Stickstoff (länger als 371 Tage) führt zu keiner zunehmenden Sensitivität auf Mutagene bzw. zu einer Änderung der DNA-Reparaturkapazität, wie durch eine unserer vorangegangenen Studien festgestellt werden konnte [Schmezer et al., 2001]. Wenn man den Hintergrundschaden der nicht-bestrahlten Zellen betrachtet, stellt man fest, daß 34 (das entspricht rd. 23 %) der 149 ursprünglich untersuchten Proben eine große Menge an toten Zellen zeigten, oder eine so hohe Hintergrundschädigung aufwiesen, daß eine Induktion der DNA-Zellschädigung nicht gemessen werden konnte. Nur zwei dieser 34 Patientinnen (5,8 %) wiesen Nebeneffekte vom Grad 2c auf. Dies ist in naher Übereinstimmung mit den 5,3 % sensibler Patientinnen, die in dem Kollektiv auftraten, für welche Ergebnisse des Komet-Assay verfügbar sind. Damit ist der erhöhte Hintergrundschaden kein Hinweis auf eine besondere Empfindlichkeit der Patientinnen. Im Rahmen unserer Studie wurden von epidemiologischer Seite diese Patientinnen auf besondere Lebensumstände, wie z.B. Zigarettenkonsum oder Medikamente, die die DNA angreifen, hin untersucht. Es konnten aber keine besonderen Einflußmerkmale festgestellt werden (Twardella et Chang-Claude, 2000). Daher haben wir die Proben dieser Patientinnen von den weiteren Untersuchungen im Rahmen dieser Studie ausgeschlossen, da die hohe Hintergrundschädigung in diesen Proben auf unbekannte Störfaktoren hinweisen könnte. Insgesamt kann man dennoch davon ausgehen, daß die prä-experimentellen Schädigungen insgesamt keinen allzu starken negativen Einfluß auf das Gesamtergebnis aufweisen, da die überwiegende Anzahl an Zellproben auszuwerten war. Das heißt, daß wir mit Hilfe des Komet-Assay in vitro auch tatsächlich Patienten identifizieren konnten, die eine herabgesetzte Reparaturfähigkeit ihres Genoms nach der Bestrahlung aufweisen. Aufgrund dieses gestörten Reparaturvermögens Kapitel 5 | Diskussion 67 ist nach unserer Hypothese wahrscheinlich, daß sie auch in vivo nach der Bestrahlung Kandidaten für die Ausbildung von unerwünschten Nebenwirkungen sind. Zur Beurteilung der experimentellen Ergebnisse wurden folgende Parameter herangezogen: - Hintergrundschaden in nicht-bestrahlten Zellen; - Strahlen-induzierter DNA-Schaden; - DNA-Reparaturkapazität nach 15 bzw. 30 min. Anhand der Einteilung der Reparatur-Kapazitäten in drei Gruppen (normal, sensitiv, sehr sensitiv – siehe auch Kapitel 4 – „Ergebnisse“) konnte festgestellt werden, daß sieben Patientinnen eine DNA-Reparaturkapazität von weniger als 32 % aufwiesen und sich somit als sehr radiosensitiv herausstellten. In der Klinik entwickelten sechs der Patientinnen eine feuchte Hautepidermiolyse, die sie (nach unserem Schema) als Patientinnen mit schweren akuten klinischen Symptomen für Strahlensensitivität auswiesen. Der direkt unmittelbar durch die Bestrahlung gesetzte DNA-Schaden wird von einigen Autoren [Alapetite et al . , 1996; Boothman et al . , 1997] als maßgeblich angesehen für die klinische Strahlenempfindlichkeit, da nämlich eine große Anzahl von DNA-Schäden für die Zelle – auf einmal auftretend – schädlich ist. In unserer Untersuchung haben sich sechs Patientinnen klinisch als besonders strahlenempfindlich herausgestellt, da sie sehr starke Nebenwirkungen entwickelten (Stufe 2c der CTC). Allgemein hat sich gezeigt, daß der induzierte DNA-Schaden durch eine einzige Bestrahlungsdosis in der Lymphozyten-Zell-Linie einer strahlensensitiven Maus bis zu dreimal stärker ist als in deren Eltern-Zell-Linie [Mori et Dizdaroglu, 1994]. Auch von anderen Forschungsgruppen wurde gefunden, daß diese Parameter zwischen verschiedenen Individuen beträchtlich schwanken, auch wenn die applizierte Dosis gleich ist [Alapetite et al., 1999; Kiltie et al., 1999 a; Oppitz et al., 1999; Dikomey et al., 2000; Müller et al., 2001]. Eine Erklärung für die großen Unterschiede könnte sein, daß die effektive Dosis, die die DNA erreicht, beeinflußt wird von in den Zellen enthaltenen sog. Scavenger-Enzymen und anderen Zell-Metaboliten [Wardman et al., 1992; Mazur, 2000]. Kapitel 5 | Diskussion 68 Dazu kommt noch, daß Mutationen in DNA-Reparaturgenen an sich den initial gesetzten Schaden am Genommaterial verstärken oder zumindest beeinflussen können (siehe dazu Kapitel 1 – „Einleitung“), wie es bei AT-Patienten der Fall ist [Djuzenova et al., 1999]. Dazu paßt, daß genetische Variationen in den Basen-Exzisions-Reparatur-Genen (die für die Reparatur der geschädigten Basenabschnitte der DNA verantwortlich sind) die Gesamtschadenssumme beeinflussen können, welche durch die Bestrahlung gesetzt wird [Jones et al., 2002]. Man stellt sich vor, daß die mit dem Komet-Assay entdeckte Variabilität der Anfangsschädigung der Zellen mit unterschiedlichen genetischen Voraussetzungen auf Unterschiede in der Anhaftung der DNA in der Zellkern-Matrix oder in der Dichte des Chromatins hinweisen könnte [Brammer et al., 2001]. In den meisten der oben zitierten Arbeiten, die sich mit den klinischen Aspekten beschäftigten, wurde gezeigt, daß der initiale DNA-Schaden mit der Strahlenempfindlichkeit an sich korreliert, was sich besonders deutlich zeigt, wenn die Spätschäden betrachtet werden: In einer Studie, die die akuten Strahlenschäden separat von den Spätschäden untersuchte, konnte keine derartige Korrelation aufgezeigt werden [Alapetite et al., 1999]. Daher sollte auch unser Patientinnenkontingent auf Spätschäden hin untersucht werden (vgl. Kapitel 6 – „Ausblick“). Der dritte experimentelle Parameter, die DNA-Reparatur-Kapazität, ist eine Charakterisierung der Fähigkeit der Zellen, die DNA-Schäden zu reparieren und so die Intaktheit des Genoms wiederherzustellen. In bisherigen Arbeiten wurde meist die DNA-Reparatur-Kapazität nach Bestrahlung untersucht [Alapetite et al., 1999; Kiltie et al., 1999 a; Oppitz et al., 1999; Dikomey et al., 2000; Müller et al., 2001] und/oder die Anzahl von übrig bleibenden DNA-Schäden nach Abschluß des Reparaturintervalls [Kiltie et al., 1999 b; Dikomey et al., 2000]. Häufig wurde ein Zusammenhang gefunden zwischen dem Einfluß von unvollständiger DNA-Reparatur auf späte Strahlenschäden, die sich größtenteils in Bildung von Fibrose im Bestrahlungsfeld äußert. Zusammenfassend läßt sich sagen, daß der Komet-Assay in unserer Ausführung geeignet ist, einen Großteil der durch die γ-Strahlung hervorgerufenen Schäden zuverlässig anzuzeigen. Prinzipiell steht auch einer Eignung als klinischer Screening-Test – zumindest, was die Effektivität des Arbeitsablaufs angeht – nichts im Wege. Kapitel 5 | Diskussion 5.4 69 Korrelation der in vitro-bestimmten Strahlenempfindlichkeit mit den klinischen Daten Das Ziel, eine Übereinstimmung zwischen den in vivo- auftretenden (bei der therapeutischen Bestrahlung der Operation) und den durch unsere experimentelle Bestrahlung in vitrohervorgerufenen Auffälligkeiten bei der DNA-Reparatur festzustellen, konnte leider nicht erreicht werden: Es wurden keine eindeutigen Übereinstimmungen erkannt. Patientinnen, die klinisch eine Haut-Reaktion des Grades 2c nach den „Common Toxicity Criteria“ des NCI zeigten (s.a. Kap. 1 – „Einleitung“), waren nicht identisch mit denen, deren Lymphozyten in unserem Versuch durch abweichende Reparaturfähigkeit nach der Bestrahlung auffielen. Aus diesem Ergebnis folgt, daß die DNA-Reparaturkapazität, die wir in unseren Versuchen bei den einzelnen Zellen mit dem Komet-Assay bestimmt haben, nicht repräsentativ ist für die Schäden, die zu den akuten Hautveränderungen führen. Das kann folgende Gründe haben: Es existieren viele endogene und exogene pathogenetische Einflüsse, die auf die Entwicklung von Brustkrebs einen Einfluß haben, von unserem Test, der sich ausschließlich auf DNASchäden bezieht, aber nicht erfaßt werden können (z.B. die histologische Unterklasse des Brustkrebses; Alkohol-Konsum, Ernährung, Lebensstil [Chen et al . , 1997] oder Mutationen in den BRCA-Genen [siehe dazu Abraham et Allegra, 2001]). Der Komet-Assay, der die Reparatur von Einzel- und Doppelstrangbrüchen bestimmen kann, mißt dadurch womöglich die Schädigungen, die keinen so gravierenden Einfluß auf die akuten Hautsymptome haben, aber ihm entgehen die Faktoren, deren Einfluß auf diese Form von somatischer Schädigung besonders stark ist, wie z.B. genetische Polymorphismen. Zum anderen kann es sein, daß die Schädigungen, die durch die Bestrahlung hervorgerufen werden, also die Einzel- und Doppelstrangbrüche und deren nicht-ordnungsgemäß verlaufende Reparatur, nicht für die vorliegenden kurzfristig auftretenden Hautschäden verantwortlich sind, sondern für längerfristige und erst später auftretende Bestrahlungsschäden der Grund sind (wie zum Beispiel Degenerationen von Geweben, Atrophien, Fibrosierungen, Teleangiektasien oder gar später auftretende Nekrosen sowie vor allem Sekundärtumoren). Kapitel 5 | Diskussion 70 Dazu zählen das Röntgenoderm, das im Gegensatz zu unseren Frühschäden erst relativ spät auftritt und das Bild von diffusen Atrophien der Haut mit dem Auftreten von Hautpigmentierungsstörungen (kleinfleckige De- und Hyperpigmentierung), psoriasisförmige Schuppenbildung und Gefäßveränderungen in Form von vereinzelten Teleangiektasien und ebenfalls kleinfleckigen und mitunter zusammenfließenden Erythemen bietet. Später kann es dann noch zum Verlust von Hautanhangsgebilden und der Bildung von äußerst festem und gefäßarmem Bindegewebe kommen, wie man es bei der Strahlenfibrose beobachten kann. Auf dem Boden eines Röntgenoderms mit allen seinen Folgen kann es darüber hinaus zum Auftreten eines Strahlenulkus kommen; diese Ulzeration hat eine sehr schlechte Heilungstendenz. All dies sind solche Spätschäden, die erst in weiteren Befragungen und Untersuchungen der Patientinnen in prospektiven Studien evaluiert und in Verbindung zu den experimentellen Ergebnissen gesetzt werden können. Wie oben bereits erwähnt wurde, haben die meisten bisher durchgeführten Studien, die den Einfluß von strahlenbedingten DNA-Schäden und deren Reparatur untersuchten, eine Korrelation zwischen der herabgesetzten DNA-Reparatur und den späten Strahlenschäden herausgefunden. Diese Spätschäden sind als Nebenreaktionen bei der Strahlentherapie definiert, die sich erst mehrere Jahre nach Ende der Therapie herausstellen (siehe dazu auch Kapitel 1 – „Einleitung“). Zum Zeitpunkt der Versuchsanalysen unserer Untersuchung (diese prospektive Studie begann 1998) waren etwaige Spätschäden noch nicht sichtbar. In unserer Studie konnten daher nur akute und Frühschäden berücksichtigt werden, die während der Therapie oder einige Wochen später sichtbar wurden. Da es keine eindeutige Beziehung zwischen Früh- und Spätschäden bei der Radiotherapie gibt [Rosen et al., 1999; Barber et al., 2000 b], konnte auch keine Extrapolation durchgeführt werden. 5.5 Weitere Faktoren, welche die individuelle Strahlensensitivität beeinflussen Bis zu 5 % aller Brustkrebs-Patientinnen entwickeln nach Abschluß der Strahlentherapie frühe oder späte Nebenreaktionen im gesunden Gewebe [Turesson et al . , 1996; Rosen et al . , 1999]. Neben dem individuellen Risiko, das von der genetischen Prädisposition abhängt, haben noch physikalische Parameter [Little, 2000] und stochastische Unterschiede der Beziehungsdichte eine Einfluß auf das Ausbilden dieser Strahlenschäden. Kapitel 5 | Diskussion 71 Zusammengefaßt sind die bekannten Faktoren für die Strahlenempfindlichkeit einer Patientin folgende: - Umfang des bestrahlten Gewebes; - Gesamtdosis und deren Fraktionierung; - Geschlecht, Alter und Phänotyp der bestrahlten Person; - Genotyp der Patientin (cf. Gendefekte wie z.B. Ataxia teleangiectasia , d i e Fanconi-Anämie oder das Nijmegen-breakage-Syndrome [vgl. auch Kapitel 1 –„Einleitung“]); - Prämedikation; - Bestimmte, den Verlauf der Therapie beeinflussende andere Erkrankungen sowie - eine etwaige dem Bestrahlungsvorgang vorausgegangene Chemotherapie. Aus der Literatur ist bekannt, daß auch der Vergleich zwischen den durch die Strahlen induzierten DNA-Schäden und den klinischen Spätschäden keine vollständige Übereinstimmung zwischen der experimentellen in vitro- und der klinischen in vivo- Strahlensensitivität bringt [Alapetite et al., 1999; Müller et al ., 2001]. Nicht nur ein DNA-Reparaturdefekt allein trägt zur Strahlensensitivität bei, auch noch andere Faktoren müssen hierbei vermutet werden, da es nur eine unvollständige Beziehung dieser beiden Parameter zueinander gibt [Boyle et al., 2002]. Diese Vermutung wird auch durch den Vergleich der Ergebnissen unseres Versuchs mit den dazugehörigen klinischen Patientendaten bestätigt. Auch andere Gewebeeigenarten – wie die Neigung zu Entzündungsreaktionen oder der Zytokinproduktion – können eine größere Rolle in der Entwicklung von Nebenreaktionen im bestrahlten Hautareal spielen [Rosen et al., 1999]. Wie bei malignen Erkrankungen im Allgemeinen häufig, so kann auch die Radiosensitivität durch externe und interne Faktoren beeinflußt werden. Ein Beispiel dafür ist z.B. Adipositas (siehe dazu auch die Arbeit von Gray et al . , 1991; Fernando et al . , 1999 und Araham et Allegra, 2001); dies kann auch in unserer Studie als ein Störfaktoren wirken. Wie festgestellt werden konnte, zeigten sich die Patientinnen, die eine ausgeprägte klinische Radiosensitivität aufwiesen, auch als solche, die ein mehr als durchschnittliches Körpergewicht zeigten als der gesamte Durchschnitt des beteiligten Patientinnenkollektivs (sie wiesen einen durchschnittlichen Body Mass Index (B M I ) von 28,4 auf im Gegensatz zur Durchschnitt des Gesamtkollektivs mit einem BMI von 25,4). In übergewichtigen Patienten werden häufig Nebeneffekte der Strahlentherapie in sub- Kapitel 5 | Diskussion 72 mammillären Hautfalten gefunden. Bei unseren Patientinnen zeigten sich diese Nebeneffekte aber nicht nur in diesen Hautflächen (bei 4 Patientinnen), sondern auch in anderen Bereichen des bestrahlten Hautareals (bei 3 Patientinnen) [vgl. dazu auch Twardella et al . , 2003]. Ein weiterer Störfaktor kann das Alter der untersuchten Patienten sein: Wegen anderer Begleiterkrankungen (Ko-Morbidität) können ältere Patienten schlechtere klinische Reaktionen haben; jüngere Patienten hingegen können schon in dem jungem Alter an Krebs erkrankt sein, da sie eine verminderten DNA-Reparaturfähigkeit bzw. einen Gendefekt aufweisen [in: Scott et al., 1998]; daher besteht auch bei ihnen die Gefahr eines verstärkten Auftretens von nicht zu beeinflussenden Störgrößen. Es zeigte sich, daß die Patientinnen mit Hautreaktionen von Typ 2c nach CTC durchschnittlich jünger waren als der Durchschnitt der gesamten Studiengruppe (dieses Phänomen wurde auch schon in anderen Arbeiten festgestellt [Denham et al . , 1995; Pignon et al . , 1997; Barber et al . , 2000 a]): Während hier das Durchschnittsalter bei 61 Jahren lag (mit einer Bandbreite von 36 bis 80 Jahren), wiesen die sensibilisierten Patientinnen ein Durchschnittsalter von 55 Jahren auf; bei ihnen reicht das Alterspektrum von 36 bis 69 Jahren. Betrachtet man nun die zellulären Sensitivitätsparameter, so sah die Altersverteilung folgendermaßen aus: Für beide Gruppen (sensitiv und nicht sensitiv) fanden wir ein Durchschnittsalter von 60 Jahren; für die Patienten mit einem gesteigerten DNA-Schadens-Potential nach einer Bestrahlung mit 5 Gy zeigte sich eine Altersspektrum von 45 bis 70 Jahren; für die Gruppe mit einer reduzierten DNA-Reparaturkapazität eine Altersverteilung von 50 bis 76 Jahren. Darüber hinaus wurden die zellulären DNA-Reparaturparameter aber nicht vom Alter der Patienten beeinflußt. Weitere, detailliertere Untersuchungen in dieser Richtung wurden vor kurzem veröffentlicht [Twardella et al. , 2003]. In unserer Arbeit konnte gezeigt werden, daß es möglich ist, experimentell die Patientenproben zu bestimmen, die eine herabgesetzte DNA-Reparaturfähigkeit aufweisen. In Zukunft sollte der Test nun dahingehend verbessert werden, daß es mit ihm auch möglich ist, eindeutig auch die klinisch gefährdeten Patientinnen zu erkennen und herauszufiltern. Kapitel 6 | Ausblick 6. 73 AUSBLICK Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß sich der Komet-Assay sehr gut eignet, um DNASchäden aufzuspüren und ihre Reparatur im Zeitverlauf zu messen. Es konnten auch Patientinnen identifiziert werden, deren Lymphozyten besonders empfindlich auf die Bestrahlung reagierten oder deren Reparaturkapazität besonders schlecht war. Leider war die Verbindung zwischen der im Versuch gemessenen DNA-Reparaturkapazität und dem Auftreten von akuten Strahlenschäden im Bestrahlungsgebiet der Brustkrebspatientinnen nicht hinreichend signifikant. Das liegt vor allem darin, daß wir uns bei unserer Arbeit auf Frühschäden konzentriert haben. Im Gegensatz dazu haben andere Gruppen in der Vergangenheit die Beziehung „prädikativer Test – Spätschäden nach Radiotherapie“ untersucht. In Zukunft sollte die Fähigkeit des Komet-Assay, Spätschäden vorhersagen zu können, weiter analysiert werden. Darüberhinaus kann die Wirkung von radioaktiver Strahlung auch durch diverse Störfaktoren, wie z.B. gewisse Medikamente, beeinflußt werden. Ebenso läßt sich eine Tendenz erkennen, daß Frauen mit einem höheren BMI und geringerem Alter eine größere Wahrscheinlichkeit haben, akuten Reaktionen der Haut nach der therapeutischen Bestrahlung zu entwickeln [Twardella et al. , 2003]. Die Einflußmöglichkeiten dieser Nebenpunkte sollten auch in Zukunft im Rahmen weiterer klinischer Studien untersucht werden. Darüberhinaus wird vorgeschlagen, die Reparatur-Kinetik verschiedener strahlenbedingter DNASchäden genauer zu bestimmen und eine Technik zu entwickeln, um die Genauigkeit der Reparatur spezifischer DNA-Schäden messen zu können. Daraus könnten sich Informationen ergeben, um Nebeneffekte von strahlenbedingten Schäden adäquat voraussagen zu können. Insbesondere sollte auf die Akquirierung ausreichend intakter Blutproben geachtet werden, daher sollte die Entnahme standardisiert und die Zeit bis zum Einsatz im Komet-Assay- Test verkürzt werden. Eine adäquate Zellanzahl zu Beginn des Versuches ist Grundvoraussetzung für die Auswertung des Versuchs. Kapitel 6 | Ausblick 74 Darüberhinaus wäre eine weitergehende Standardisierung in der Durchführung des Komet-Assay der verschiedenen Arbeitsgruppen, die sich mit diesem Test beschäftigen und bislang noch mit zum Teil verschiedenen Versuchsaufbauten arbeiten, hinsichtlich einer besserer Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu begrüßen [Bocker et al . , 1997; Rojas et al . , 1999; Tice et al . , 2000]. Kapitel 7 | Literatur 75 7. LITERATUR [1] Abraham J, Allegra CJ (eds.) (2001) Breast Cancer Bethesda Handbook of Clinical Oncology. Lippincott Williams & Wilkins Philadelphia, pp 127-141 [2] Ahnström G, Erixon K (1973) Radiation-induced strand breakage in DNA from mammalian cells. Strand separation in alkaline solution. I n t J R a d i a t B i o l ; 23 (3): 285 - 289 [3] Ahnström G, Edvardsson KA (1974) Radiation-induced single-strand breaks in DNA determined by rate of alkaline strand separation and hydroxyapatite chromatography: an alternative to velocity sedimentation. 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Patientenproben in numerischer Reihenfolge Kontrolle 0 min 15 min 30 min 15 30 15-30 Ghosts (Anzahl) DNA-Reparaturkapazität Patientennummer Meßwerte (Median-Tail-Moments) 102 1,1 4,6 3 2,4 0,35 0,48 0,2 4 103 1,6 9,7 4,4 2,9 0,55 0,70 0,34 2 105 1,9 10,4 3,5 2,5 0,66 0,76 0,29 2 108 1,8 6,9 3,1 2,4 0,55 0,65 0,23 2 115 --- --- --- --- --- --- --- --- 122 0,8 5,4 2 1,2 0,63 0,78 0,4 32 125 0,6 6,6 2,3 1,2 0,65 0,82 0,48 44 129 0,6 3,5 1,7 1,1 0,51 0,69 0,35 9 148 0,3 5,3 1,5 0,9 0,72 0,83 0,4 6 167 0,5 9 0,9 1 0,9 0,89 - 0,11 8 177 0,4 5,6 4 0,9 0,29 0,84 0,78 1 191 0,9 12,8 3,8 2,3 0,70 0,82 0,39 5 192 0,6 10,8 4 2,4 0,63 0,78 0,4 3 193 0,6 11 3,9 1,9 0,65 0,83 0,51 4 194 0,5 4,5 2,3 2,6 0,49 0,42 - 0,13 3 Ausschlußkriterien Tabelle V.A: D V | Tabellenanhang xii Tabelle V.A [Fortsetzung]: Patientenproben in numerischer Reihenfolge 0 min 15 min 30 min 15 30 15-30 Ghosts (Anzahl) 196 0,4 4,2 2 2,3 0,52 0,45 - 0,15 4 197 0,3 5,5 1,7 1 0,69 0,82 0,41 5 198 0,8 7,8 5,3 3,2 0,32 0,59 0,40 1 200 0,4 2,4 1 0,6 0,58 0,75 0,4 1 202 --- --- --- --- --- --- --- --- C 203 28 63,9 45,6 38,8 0,29 0,39 0,15 27 A 204 33,8 40,7 38,8 43,1 0,05 - 0,06 - 0,11 36 205 26,5 50,2 48,4 37,4 0,04 0,25 0,23 50 A 206 --- --- --- --- --- --- --- --- D 209 2,4 11,3 10,3 5,4 0,09 0,52 0,48 54 210 0,6 12,4 3,2 1,8 0,74 0,85 0,44 9 211 1,3 11 6,6 2,6 0,40 0,76 0,61 25 212 3 12,2 9,4 6,2 0,23 0,49 0,34 11 215 1,5 14,7 8,3 5 0,44 0,66 0,40 7 220 14 36 32 22,6 0,11 0,37 0,29 92 222 --- --- --- --- --- --- --- --- 224 1 3,6 1,3 0,9 0,64 0,75 0,31 10 225 1,5 3,4 2,9 3,6 0,15 - 0,06 - 0,24 3 226 1,1 4,3 3 2 0,30 0,53 0,33 1 227 1,6 8,8 6,6 1,5 0,25 0,83 0,77 2 228 0,4 4,7 2,2 2,5 0,53 0,47 - 0,14 2 229 0,7 6,9 4,3 2,2 0,38 0,68 0,49 6 231 1,6 5,6 4,1 2,6 0,27 0,54 0,37 10 232 0,7 2,3 2 2 0,13 0,13 0 2 233 24,7 14,4 6,2 12 0,57 0,17 - 0,94 18 Ausschlußkriterien Kontrolle DNA-Reparaturkapazität Patientennummer Meßwerte (Median-Tail-Moments) D B A V | Tabellenanhang xiii Tabelle V.A [Fortsetzung]: Patientenproben in numerischer Reihenfolge Kontrolle 0 min 15 min 30 min 15 30 15-30 Ghosts (Anzahl) Ausschlußkriterien DNA-Reparaturkapazität Patientennummer Meßwerte (Median-Tail-Moments) 235 --- --- --- --- --- --- --- --- D 236 --- --- --- --- --- --- --- --- D 237 32,3 34,3 34 17,4 0,01 0,49 0,49 89 237 --- --- --- --- --- --- --- --- D 238 --- --- --- --- --- --- --- --- D 239 9,3 21,7 4,5 2,1 0,79 0,90 0,53 134 A 240 --- --- --- --- --- --- --- --- D 242 37,4 26,4 30,9 5,1 - 0,17 0,81 0,83 12 A 244 24,3 49,2 1,9 0,4 0.96 0,99 0,79 31 245 1,5 22,4 5,5 5,3 0,75 0,76 0,04 4 246 0,9 5,9 5,4 2,9 0,08 0,51 0,46 3 247 0,1 4,6 1,4 1,3 0,70 0,72 0,07 3 248 0,1 3,8 2,4 2,4 0,37 0,37 0 1 249 3,2 32,2 8,1 6,8 0,75 0,79 0,16 7 250 2 1,3 0,5 5 0,62 - 2.85 -9 55 A 251 3,5 2,7 --- 3,3 --- - 0,22 --- 5 B 253 40,1 18,8 22 55,3 - 0,17 - 1,94 - 1,5 22 A 254 37,9 44,8 54,6 5,6 - 0,22 0,88 0,90 37 A 255 0,4 3,1 1,9 2,4 0,39 0,23 - 0,26 5 257 --- --- --- --- --- --- --- --- C 259 --- --- --- --- --- --- --- --- C 260 2,4 23,1 10,3 9,4 0,55 0,59 0,09 5 B 260 0,8 7,7 4,9 1,8 0.36 0,77 0,63 4 2003 0,5 6,6 --- 3,8 --- 0,42 --- 1 2004 0,6 6 2,2 1,4 0,63 0,77 0,36 5 B * V | Tabellenanhang xiv Patientenproben in numerischer Reihenfolge Kontrolle 0 min 15 min 30 min 15 30 15-30 Ghosts (Anzahl) DNA-Reparaturkapazität Patientennummer Meßwerte (Median-Tail-Moments) 2005 2,9 11,2 7,5 6,4 0,33 0,43 0,15 56 2006 1 5,5 1,7 1,2 0,70 0,78 0,29 4 2007 1,1 7 7,2 3,7 - 0,03 0,47 0,49 24 2500 13,7 40,2 25,8 13 0,36 0,68 0,50 2 2502 1,6 7,4 5,8 4,6 0,22 0,38 0,21 2 2503 0,8 5,7 5,2 3,2 0,09 0,44 0,38 11 2504 1 6,5 2,5 1,9 0,62 0,71 0,24 25 2507 15,1 47,4 10,5 3,3 0,77 0,93 0,69 18 2507 0,7 6,9 3,7 3,8 0,46 0,45 - 0,03 7 2508 0,6 9,3 5,4 3,3 0,42 0.65 0,39 40 2509 0,4 2,5 0,9 0,6 0,64 0,76 0,33 37 2511 3,4 13,6 4,9 4,6 0,64 0,66 0,06 6 2513 15,8 30 15,3 14,2 0,49 0,53 0,07 40 2516 1 10,4 4,1 2,9 0,61 0,72 0,29 6 2520 0,4 4 1,4 0,8 0,65 0,8 0,43 18 2521 1 11,6 8,1 4,9 0,30 0,58 0,40 6 2522 2,3 9,1 3,2 1,9 0,65 0,79 0,41 15 2523 3 8 4,1 1,6 0,49 0,8 0,61 13 2524 0,9 10,6 5,5 3,2 0,48 0,70 0,42 5 2525 0,5 4,2 2,2 1,6 0,48 0,62 0,27 9 2526 0,8 3,4 3,9 2 - 0,15 0,41 0,49 3 2533 0,3 3,3 0,9 0,7 0,73 0,79 0,22 2 2539 1,1 6,7 2 1,1 0,70 0,84 0,45 5 2540 0,7 4,7 3,5 1,5 0,26 0,68 0,57 0 2541 0,4 3,5 1,2 1,2 0,66 0,66 0 3 Ausschlußkriterien Tabelle V.A [Fortsetzung]: A V | Tabellenanhang xv Tabelle V.A [Fortsetzung]: Patientenproben in numerischer Reihenfolge 0 min 15 min 30 min 15 30 15-30 Ghosts (Anzahl) 2542 0,4 3,9 1,4 1,1 0,64 0,72 0,21 4 2545 0,7 9,1 2,4 1,5 0,74 0,84 0,38 2 2546 0,3 4 1,4 1 0,65 0,75 0,29 2 2548 5,1 13,6 7,4 0,1 0,46 0,99 0,99 5 A 2549 0,9 4 1,5 0,3 0,63 0,93 0,8 21 A 2549 0,6 13 3,1 0,2 0,76 0,98 0,94 22 2550 5,1 10,4 2 4,1 0,81 0,58 - 1.05 25 A 2554 --- --- --- --- --- --- --- --- D 2556 0,3 2,9 1,5 1 0,48 0,66 0,33 3 4001 1,2 5,9 4,6 3,9 0,22 0,34 0,15 17 4003 0,6 3,9 3,2 3,1 0,18 0,21 0,03 17 4004 0,9 7,9 4,4 3,6 0,44 0,54 0,18 35 4007 0,9 9,8 1,6 1,6 0,84 0,84 0 5 4008 1,7 16,3 6,6 1,8 0,60 0,89 0,73 13 4009 4,2 8,8 10,4 4,9 - 0,18 0,44 0,53 6 4012 1,1 4,9 3,3 1,8 0,33 0,63 0,45 7 4016 0,5 5,1 1,3 1,3 0,75 0,75 0 4 4018 0,5 10,7 3,5 0,9 0,67 0,91 0,74 16 4019 1,1 6,9 1,6 1,3 0,77 0,81 0,19 4 4024 1,1 11,6 7,9 9,7 0,32 0,16 - 0,23 35 4029 0,7 4,4 1,9 1 0,57 0,77 0,47 1 4036 5,2 8,9 19,5 7 - 1,19 0,21 2,79 74 4037 7 25,7 41,1 17,6 - 0,60 0,32 0,57 46 4038 0,8 4,9 4,1 2,9 0,16 0,41 0,29 74 4039 --- --- --- --- --- --- --- --- Ausschlußkriterien Kontrolle DNA-Reparaturkapazität Patientennummer Meßwerte (Median-Tail-Moments) B D V | Tabellenanhang xvi Tabelle V.A [Fortsetzung]: Patientenproben in numerischer Reihenfolge Kontrolle 0 min 15 min 30 min 15 30 15-30 Ghosts (Anzahl) Ausschlußkriterien DNA-Reparaturkapazität Patientennummer Meßwerte (Median-Tail-Moments) 4040 1,6 10 3,8 2,1 0,62 0,79 0,45 5 B 4041 1,2 8,9 7,1 2,8 0,20 0,69 0,61 49 4042 1 5 3,1 2,1 0,38 0,58 0,32 15 4043 19,2 20,8 22,2 10,2 - 0,07 0,51 0,54 7 4044 4 22,6 15,5 8,6 0,31 0,62 0,45 22 4045 1,6 10,1 8,9 5,3 0,12 0,48 0,40 4 4046 --- --- --- --- --- --- --- --- D 4047 --- --- --- --- --- --- --- --- D 4048 --- --- --- --- --- --- --- --- D 4049 0,5 6,5 7,2 8,2 - 0,11 - 0,26 - 0,14 23 B 4050 0,5 4,2 2,4 1,4 0,43 0,67 0,42 4 B Legende zur Spalte “Ausschlußkriterien”: Abkürzung Bedeutung A Es liegen weniger als die für die Auswertung benötigten 51 Zellen pro Objektfeld vor. B Es konnten nicht die benötigten drei Objektfelder ausgewertet werden, da sich mindestens zwei der vier Felder während des Lyse- oder Elektrophoreseprozesses vom Objektträger gelöst haben. Deswegen beruht die Auswertung auf der Auszählung von nur einem oder zwei Ojektträgerfeldern. C Der Versuchsdurchgang mußte aus technischen Gründen abgebrochen werden. D Nach der Stimulierung lagen in der Ausgangslösung zu wenige Zellen vor; der Versuch konnte daher nicht durchgeführt werden. V | Tabellenanhang xvii Legende zur Spalte “Bemerkungen” [Fortsetzung] Abkürzung Bedeutung * Sonstiger Defekt und technische Schwierigkeiten, die zum Versuchsabbruch geführt haben. Anmerkungen zum Aufbau der Tabelle: - In der ersten Spalte sind die Patientennummern (gemäß der vorher festgelegten Verschlüsselung) aufgeführt. Wenn zweimal dieselbe Nummer aufgeführt ist, lief die Probe dieser Patientin zwei verschiedenen Versuchen mit. Dies ist dann der Fall, wenn z.B. ein Versuch abgebrochen werden mußte etc. (siehe dazu die Legende zur Spalte „Bemerkungen“). - Die nächsten vier Spalten führen die im Rahmen der Auswertung mit der Software unter dem UV-Mikroskop gemessenen Median-Tail-Moments der untersuchten Zellen auf. Dargestellt sind zum einen die Werte der unbestrahlten Kontrolle und dann die der γ-bestrahlten Zellen, jeweils zu den Zeitpunkten t1=0 min, t2=15 min und t3=30 min. - Die folgenden drei Spalte enthalten die nach den entsprechenden Formeln (siehe dazu Kapitel 3 „Material/Methoden“) berechneten Werte der DNA-Reparaturkapazität nach 15 min, nach 30 min und im Zeitraum von 15 bis 30 min nach Abschluß des Bestrahlungsvorgangs. - Die letzte Spalte verweist auf Bemerkungen über besondere Vorkommnisse während des Experimentes oder sonstige Angaben über die ausgewerteten Zellen. Weitergehende Erläuterungen dazu siehe in der Legende zur Spalte “Bemerkungen” weiter oben. Die in kursiv gedruckten Zeilen zeigen die Proben an, deren Ergebnisse aus o.a. Gründen nicht verwendet werden konnten. V | Tabellenanhang V.2 xviii Tabelle der Referenzproben in numerischer Reihenfolge Nachstehend erfolgt eine Darstellung aller in den Patientinnen-Versuchsdurchgängen mitgelaufenen Proben des Referenzspenders. Tabelle V.B: Zusammenfassung der für die Referenzprobe ermittelten Werte Probennummer Kontrolle 0 Min 15 Min 30 Min 15 30 15-30 Ghosts (Anzahl) DNA-Reparaturkapazität Versuchsdurchgang der Patientenproben, bei dem die Spenderprobe als Kontrolle mitlief Meßwerte (Median-TailMoments) Versuch #2 Probe1 2,1 20 7,7 4,6 0,62 0,77 0,40 6 Versuch #3 Probe2 4,3 16,2 10 10,7 0,38 0,34 - 0.07 1 Versuch #5 Probe3 4,5 10,8 6 2 0,44 0,81 0,67 5 Versuch #8 Probe4 2,2 12,2 5,4 2,6 0,56 0,79 0,52 6 Versuch #9 Probe5 1 8,1 7,6 4,6 0,06 0,43 0,39 2 Versuch #11 Probe6 2,4 4,2 2,5 2,1 0.40 0,5 0,16 6 Versuch #12 Probe7 1,1 8,4 4,8 3,7 0,43 0,56 0,23 6 Versuch #13 Probe8 1,3 17,3 6,6 3,1 0,62 0,82 0,53 5 Versuch #14 Probe9 3,6 13,4 7 5,3 0,48 0,60 0,24 16 Versuch #15 Probe10 0,9 8,6 6,3 3,7 0,27 0,57 0,41 6 Versuch #16 Probe11 2,8 7,6 6,4 5,1 0,16 0,33 0,20 6 Versuch #17 Probe12 1,3 13,8 2,1 1,4 0,85 0,90 0,33 6 Versuch #21 Probe13 0,5 9,1 3,1 1,5 0,66 0,84 0,52 5 Versuch #25 Probe14 0,8 4,9 3,0 1,5 0,39 0,69 0,50 13 Versuch #27 Probe15 1,4 7,6 6,3 5,2 0,17 0,32 0,17 3 Versuch #30 Probe16 0,1 2 1 0,6 0,5 0,7 0,4 2 V | Tabellenanhang xix Anmerkungen zum Aufbau der Tabelle: Die Tabelle der Referenzproben ist so aufgebaut wie die der Patientenproben. Besonderheiten, die zu besonderen Bemerkungen geführt hätten, gab es keine. Lediglich die 1. und 2. Spalte unterscheidet sich von Tabelle IV.A: - Die erste Spalte gibt an, bei welchem Versuchdurchgang der Patientinnenproben die Spenderlymphozyten jeweils als Referenzprobe mitgelaufen sind. - Zu Spalte zwei: Da es sich immer um denselben Spender handelt, wird nur die jeweilige Aliqot-Nummer (Probennummer) angegeben. VI | Abkürzungsverzeichnis xx VI. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS AT .................................... Ataxia teleangiectasia BER .................................... Basen-Exzisions-Reparatur BMI .................................... “Body-Mass-Index” BRCA1/2 .................................... Brustkrebs-Gen 1 bzw. 2 ca. .................................... circa CTC .................................... “Common-Toxicity-Criteria” 137 CS .................................... Isotop 137 des Elements Cäsium DMSO .................................... Dimethylsulfoxid DNA .................................... “Desoxyribo-Nucleic-Acid” DSB .................................... Doppelstrangbruch EJ .................................... End-Joining ESB .................................... Einzelstrangbruch FCS .................................... fetales Kälber-Serum g .................................... Fallbeschleunigung Gy .................................... Gray h .................................... Stunde HEPES .................................... N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2ethansulfonsäure HR .................................... homologe Rekombination M .................................... Molar mA .................................... milli-Ampere min .................................... Minute mM .................................... milli-Mol MV .................................... Mega-Volt Na2EDTA N-Basic ................................. .................................... Dinatrium-Ethylendiamintetraessigsäure Nähr-Medium VI | Abkürzungsverzeichnis xxi NCI .................................... National Cancer Institute NER .................................... Nucleotid-Exzisions-Reparatur NIH .................................... National Institutes of Health p .................................... Grundwahrscheinlichkeit der Binominal- verteilung PBS .................................... Phosphat-gepufferte Salzlösung pH .................................... pondus Hy drogenii , negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration PHG .................................... Phytohemagglutinin r .................................... Produktmoment-Korrelationskoeffizient nach Spearman RPMI 1640 ................................. Standardmedium für humane Lymphozyten nach M o o r e e t a l . / R o s w e l l P a r k M e m oriam Institute Nr. 1640 s .................................... Standardabweichung t1 - 3 .................................... Zeitpunkte (t1 =0 min, t2 =15 min und t3 =30 min), nach denen jeweils die Reparaturmöglichkeit der Zellen nach dem Bestrahlungsvorgang durch Einbringen in das Agarosegemisch und anschließendes Auflegen auf die Kälteplatte beendet wird. TE-Puffer TM ................................. .................................... TNM-Klassifikation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Tris-/EDTA-Puffer Tail-Moment Stadieneinteilung von malignen Tumoren; dabei beschreibt T die Tumorgröße, L die Lymphknotenbeteiligung/-metastasen und M die Bildung von (Fern-)Metastasen. UV-Licht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ultra-violettes Licht U/min Umdrehung pro Minute .................................... VII | Veröffentlichungen VII. xxii VERÖFFENTLICHUNGEN AUS DER ARBEIT Popanda O, Ebbeler R, Twardella D, Helmbold I, Gotzes F, Schmezer P, Thielmann HW, von Fournier D, Haase W, Sautter-Biehl ML, Wenz F, Bartsch H et Chang-Claude J ( 2 0 0 3 ) Radiation-induced DNA damage and repair in lymphocytes from breast cancer patients and their correlation with acute skin reactions to radiotherapy. I n t J R a d i a t O n c o l B i o l P h y s ; 55 (5): 1216-25 Twardella D, Popanda O, Helmbold I, Ebbeler R, Benner A, von Fournier D, Haase W, SautterBihl ML, Wenz F, Schmezer P e t Chang-Claude J ( 2 0 0 3 ) Personal characteristics, therapy modalities and individual DNA repair capacity as predictive factors of acute skin toxicity in an unselected cohort of breast cancer patients receiving radiotherapy. R a d i o t h e r O n col; 69 (2): 145-153 VIII | Lebenslauf VIII. xxiii LEBENSLAUF P ERSÖNLICHE I NFORMATION Name: Reinhard Frank Wilhelm Ebbeler Geburtsdatum: 03. Januar 1976 Geburtsort: Os nabr ü ck /Nds. Adresse: Barsinghäuserstr. 10 30989 Gehrden/Nds. Kartäuserstr. 18 79102 F r eibu r g /BW [email protected] Eltern: Reinhold Ebbeler Regina Ebbeler, geb. Kestenus A USBILDUNG 1982 - 1986 Grundschule Gas te/Nd s . , B ad Salzdethfurt/Nds., Gehrden/Nds. 1986 - 1988 Orientierungsstufe Gehr den/Nds . 1988 - 1996 Matthias-Claudius-Gymnasium Gehrden/ Nds. 1996 Abschluss Allgemeine Hochschulreife U NIVERSITÄRE A USBILDUNG 1996 - 1998 Vorklinischer Studienabschnitt an der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH); Hannover/Nds. VIII | Lebenslauf xxiv 1998 Medizinische Vorprüfung (Physikum) 1998 - 1999 Erster Klinischer Abschnitt an der Al ber tLudwigs-Universität Freiburg i. B r s g ./BW 1999 Erstes Medizinisches Staatsexamen United States Medical Licensing Examination (USMLE) Step I 1999 - 2002 Zweiter Klinischer Abschnitt an der A l ber tLudwigs-Universität Freiburg i. B r s g . / BW 2002 Zweites Medizinisches Staatsexamen 2002 - 2003 Praktisches Jahr (s.u.) 2003 Drittes Medizinisches Staatsexamen P RAKTISCHES J AHR Tertial Innere Medizin: Onkologische Ambulanz und Station, Internistische Onkologie, I ns el s pi tal Bern/CH Tertial Chirurgie: Lebertransplantation/Allgemeinchirurgie, Mount Sinai Hospital, New Yo rk/USA Lebertransplantation/Kinderchirurgie, U niver sity of Calif or nia L os Ang eles (UCLA)/USA Tertial Radiologie: Radiolog ische U niver sitätsklinik mit den Abteilungen Röntgendiagnostik, Strahlenheilkunde, Nuklearmedizin und der Sektion Neuroradiologie, A l b e r t - L u d w i g s - U n iv e r s i t ä t F r e i b u r g i . B r s g ./BW VIII | Lebenslauf xxv F AMULATUREN 1999 Innere Medizin, Robert-KochKrankenhaus, Gehrden/Nds. Chirurgische Praxis Dr s. L ü hr /S chl eg el , B a r s i n g h a u s e n / Nds. 2000 Neurochirurgie, Inselspi tal Ber n/CH Plastische Chirurgie, U ni v er s i ty of Toronto, Toronto/Kanada 2001 Anästhesiologische Universitätsklinik Charité, Berlin/B Bernhard-Nocht-Institut für T r o p e n m e d i z i n , H a m b u r g / HH Chirurgische Ambulanz, K l i ni k u m der A l b e r t - L u d w i g s - U n iv e r s i t ä t F r e i b u r g i . B r s g . / BW K LINISCHE T ÄTIGKEIT 2004 Ab Februar: Arzt im Praktikum in der Abteilung Gastroenterologie/Endokrinologie am Klinikum der G e o r g - A u g u s t - U n i v e r s i t ä t Göttingen/Nds. IX | Selbständigkeitserklärung IX. xxvi SELBSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG Ich erkläre, daß ich die vorliegende Arbeit selbständig und nur unter Verwendung der angegebenen Hilfsmittel und Literatur angefertigt habe: Heidelberg, den ______________________ ______________________________________ (Reinhard Ebbeler)
